(57)【要約】【課題】腎細胞癌の治療に、インターロイキン−２（IL-2）及びインターフェロン−α（IFN-α）併用療法が有効な患者を選別する方法を提供する。また当該方法を簡便に実施するために有用な試薬および試薬キットを提供する。【解決手段】HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を指標として、腎細胞癌患者のIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を指標とすることを特徴とする、腎細胞癌患者のIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性検出方法。
【請求項２】
腎細胞癌患者由来の試料を対象としてHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を測定する工程を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量（E1）と、対応する遺伝子の所定発現量（EO）とを対比し、上記発現量（E1）が所定発現量（EO）より高い群をIL2及びIFNα併用療法に対する感受性群と、または低い群をIL-2及びIFN-α併用療法に対する耐性群と決定する工程を有する、請求項１または２に記載する方法。
【請求項４】
腎細胞癌患者のIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性検出用試薬であって、下記（a）に示すプライマー及び（b）に示すプローブの一方または両方を含む試薬または試薬キット：
（a）HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子のmRNAまたはｃDNAを特異的に増幅するための塩基配列を有する少なくとも15塩基長のオリゴヌクレオチドプライマー、及び
（b）HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子のmRNA に派生するDNAに特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する少なくとも15塩基長のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
HLA-DQA1タンパク及びHLA-DQB1タンパク少なくとも一方に対する抗体を含む、腎細胞癌患者のIL2及びIFNα併用療法に対する感受性検出用試薬または試薬キット。
【請求項６】
請求項３に記載する方法によって決定されたIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性群に属する腎細胞癌患者に対して用いられるものであることを特徴とする、IL-2とIFN-αとの組み合わせからなる腎細胞癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者固有の遺伝情報に基づいて、腎細胞癌、特に転移を有する腎細胞癌患者のインターロイキン−２（IL-2）及びインターフェロン−α（IFN-α）併用療法に対する感受性を検出する方法およびその実施に使用する材料（試薬及び試薬キット）に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌は日本人のなかで頻度が高いものではないが、その発生頻度は年々増加傾向にある。特に、転移性の腎細胞癌患者の治療予後は極めて悪いことが知られている。腎細胞癌の治療としては、腫瘍部分の外科的な手術による切除が一般的な方法であるが、患者によっては、切除後数年で、腎臓での再発、又は肺などの他臓器への転移が認められる場合が多い。通常、浸潤やリンパ節への転移の程度が激しく悪性度が高いと診断された腎細胞癌は、癌の転移や再発が起こりやすく、摘出手術後に、免疫治療剤、化学療法、放射線療法やホルモン療法などにより、手術により除去できなかった癌細胞を死滅させる治療が行われている。
【０００３】
免疫治療剤であるインターフェロン−α（以下、「IFN-α」と称する。）やインターロイキン−２（以下、「IL-2」と称する。）などのサイトカインはそれぞれ単独もしくは併用することにより、有効な腎細胞癌の治療法の１つとして臨床現場で用いられている（例えば非特許文献１〜４等参照）。
【０００４】
IFN-αは、他の薬剤に比べると、抗ウィルス作用とともに発ガン予防作用など免疫増強作用を有した治療薬である。IFN-αによる治療効果には、用量依存性が認められており、高用量のIFN-αを使用するほど、その効果が期待できると言われている。そのため、治療効果向上のため、連日投与期間を長くしたり、投与量を極量まで増やしたりするなどの改善を試みる場合が多いが、IFN-αは副作用が強いという問題を含んでいるのも事実である。患者にとって発熱、倦怠感、鬱状態などの副作用による負担が大きくなる割に、治療効果が上がっていないのが現状である。そして、副作用が強ければ、時には投与を中止せざるを得ないという事態も生じている。IFN-αの副作用が除去できない理由は、IFN-αの免疫活性作用を含む各種効果の詳細なメカニズムや、副作用発現機序が明らかにされていないことにあり、より有効で副作用の少ない方法が研究され続けている。
【０００５】
IL-2は、免疫系がん細胞を攻撃する際に中心となるT細胞の増殖を促進するとともに、がん細胞を破壊するNK（ナチュラルキラー）細胞の働きを高め、がんを攻撃する働きがある。IL-2もIFNと同様に投与量が多いほど抗腫瘍効果が高まるが、発熱や悪寒、頭痛、発疹、吐き気・嘔吐、食欲不振、下痢、体重増加、睡眠障害などの副作用が強いため、実際に高用量で使用できる人は限られている。
【０００６】
IFNとIL-2の併用療法は、各単剤での奏功率に比べ高いものの満足できる域に到達していない。実際に、IL-2およびIFN-αでの腎細胞癌の治療では、完全奏功率と部分奏功率がわずか10〜20％に過ぎず、この割合はここ数年変化しておらず、多くの患者は２年以内に死亡しているのが現状である（例えば、非特許文献２及び５〜６参照）。一方、上述のとおり、それぞれのサイトカインの副作用は患者にとって無視できないものであることから、IL-2およびIFN-αによる併用療法実施の決定に際して、その治療効果を予測するための診断手段の開発は急務であるといえる。
【０００７】
ところで、ヒトMHC（主要組織適合性複合体又は主要組織適合抗原）分子であるHLAは、1952年に輸血患者血清中に白血球凝集試験で反応する抗体が見出され、これに対する抗原として発見されたヒト白血球抗原である。HLAは、第６染色体短腕部の6p21.3の約4,000kbp内に存在するMHC領域によりコードされた遺伝子群に支配される遺伝子産物である。このMHC領域は、殆どの真核細胞膜表面上に発現されるHLA-A、B、C抗原系を支配するクラスI遺伝子領域と、B細胞やマクロファージ等の限定された組織あるいは細胞にしか発現していない細胞特異的なHLA-DP、DQ、DR抗原系を支配するクラスII遺伝子領域、及び補体成分と21-ヒドロキシラーゼ等を支配するクラスIII遺伝子領域より構成されている。
【０００８】
HLA-DQA1（Major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 1）及びHLA-DQB1（Major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1）は、それぞれHLAクラスIIα鎖及びβ鎖の側系相同体に属する。このクラスII分子はα鎖（DQA）とβ鎖（DQB）からなるヘテロ二量体であり、その両方が膜につなぎ止められている。細胞外タンパク質由来のペプチド類を提示して免疫系において中心的な役割を果たしていることが知られている。クラスII分子は抗原提示細胞、Bリンパ球、樹状細胞、大食細胞で発現される。α鎖はおよそ33〜35kDaで、その遺伝子は５つのエキソン（エキソン１はリーダーペプチド、エキソン２と３は２つの細胞外領域を、エキソン４は膜貫通領域と細胞質尾を指令する）を含む。またβ鎖はおよそ26〜28kDaで、その遺伝子は６つのエキソン（エキソン１はリーダーペプチド、エキソン２と３は２つの細胞外領域を、エキソン４は膜貫通領域を、エキソン５は細胞質を指令する）を含む。
【０００９】
DQ分子では、α鎖とβ鎖の両方がペプチド結合特異性を指示する多型を含み、最大４つの異なる分子が生じることが知られている。
【００１０】
従来よりHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現量やこれらの遺伝子における多型の存在が、進行性Ｉ型糖尿病のなり易さ、彌慢性B大細胞型リンパ腫 （DLBCL）の治療効果、固形癌のチロシナーゼ阻害剤に対する感受性、抗血小板薬投与による副作用、及び薬物による有害な血液反応の感受性を評価する指標になることが報告されている（特許文献１〜５参照）。しかしながら、これらの遺伝子と腎細胞癌との関連性、並びにこれらの遺伝子の発現が腎細胞癌の免疫療法に対する感受性と相関することについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO2009/149297
【特許文献２】WO2008/134729
【特許文献３】WO2007/099852
【特許文献４】特開2007-117085号公報
【特許文献５】US20060177860
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Negrier S, Escudier B, Lasset C, Douillard JY, Savary J, Chevreau C, Ravaud A, Mercatello A, Peny J, Mousseau M, Philip T, Tursz T. Recombinant human interleukin-2, recombinant human interferon alfa-2a, or both in metastatic renal-cell carcinoma. Groupe Francais d'Immunotherapie. N Engl J Med. 1998;338(18):1272-8
【非特許文献２】Atzpodien J, Hoffmann R, Franzke M, Stief C, Wandert T, Reitz M. Thirteen-year, long-term efficacy of interferon 2alpha and interleukin 2-based home therapy in patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer. 2002;95(5):1045-50
【非特許文献３】Miyake H, Hara I, Sakai I, Harada K, Inoue TA, Eto H, Takechi Y, Fujisawa M. Clinical outcome of combined immunotherapy with low-dose interleukin-2 and interferon-alpha for Japanese patients with metastatic renal cell carcinoma who had undergone radical nephrectomy: a preliminary report. Int J Clin Oncol. 2005;10(5):338-41
【非特許文献４】河合弘二ら「腎細胞癌の肺転移巣に対しては低容量IL-2とIFNα併用療法が有効である(腎腫瘍/薬物療法2,一般演題口演,第97回日本泌尿器科学会総会)」日本泌尿器科學會雜誌  100(2)  pp.298 2009）
【非特許文献５】Tourani JM, Pfister C, Tubiana N, Ouldkaci M, Prevot G, Lucas V, Oudard S, Malet M, Cottu P, Ferrero JM, Mayeur D, Rixe O, Sun XS, Bernard O, Andre T, Tournigand C, Muracciole X, Guilhot J; Subcutaneous Administration Propeukin Program Cooperative Group. Subcutaneous interleukin-2 and interferon alfa administration in patients with metastatic renal cell carcinoma: final results of SCAPP III, a large, multicenter, phase II, nonrandomized study with sequential analysis design--the Subcutaneous Administration Propeukin Program Cooperative Group. J Clin Oncol. 2003;21(21):3987-94.
【非特許文献６】Bukowski RM. Natural history and therapy of metastatic renal cell carcinoma: the role of interleukin-2. Cancer. 1997;80(7):1198-220.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、腎細胞癌患者、好ましくは転移性腎細胞癌患者、特に転移を併発した腎細胞癌患者のIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性に関わる遺伝子（以下、「IL-2/IFN-α併用療法感受性遺伝子」という）を提供し、さらに当該遺伝子の発現量を指標として、腎細胞癌患者、好ましくは転移性腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性を検出する方法を提供することを目的とする。また本発明は、当該方法を実施するために有用な試薬および試薬キットを提供することを目的とする。
【００１４】
なお、本明細書では、転移性の腎細胞癌患者を、既に転移を併発した腎細胞癌患者を含めて「転移性腎細胞癌患者」と総称する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者の遺伝子情報を検討していたところ、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現と当該患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性との間に、有意な統計学的相関があることを見出し、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の発現量を指標とすることで、予め腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法の有効性を判別することができることを確認した。すなわち、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の発現量を指標とすることで、腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者に適した治療方法が選択できる結果、IL-2/IFN-α併用療法が有効でない患者に対しては無効な治療をすることを避けることができると共に、当該療法が有効な患者に対しては有効且つ的確なIL-2/IFN-α併用療法を施すことが可能になる。
【００１６】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の態様を有するものである。
（Ｉ）腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性検出方法
（I-1）HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を指標とすることを特徴とする、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性検出方法。
（I-2）腎細胞癌患者由来の試料を対象としてHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を測定する工程を有する、（I-1）記載の方法。
（I-3）HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量（E1）と、対応する遺伝子の所定発現量（E0）とを対比し、上記発現量（E1）が所定発現量（E0）より高い群をIL-2/IFN-α併用療法に対する奏功群と、また低い群をIL-2/IFN-α併用療法に対する非奏功群と決定する工程を有する、（I-1）または（I-2）に記載する方法。
（I-4）HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現量が、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子で発現するmRNA量またはこれに由来するcDNA量である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する方法。
（I-5）HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現量が、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子で発現するHLA-DQA1蛋白またはHLA-DQB1蛋白のタンパク質量である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する方法。
【００１７】
(I-6) 腎細胞癌患者が転移性腎細胞癌患者である、（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載する方法。
(I-7)転移が肺転移である、（I-6）に記載する方法。
【００１８】
なお、これらの発明は、「腎細胞癌患者の中からIL-2/IFN-α併用療法に対する奏功群を選別する方法」と言い換えることもできる。
【００１９】
（II）腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性検出用試薬または試薬キット
（II-1）腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性検出用試薬であって、下記（a）に示すプライマーおよび（b）に示すプローブのいずれか少なくとも１つを含む試薬または試薬キット：
（a）HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子のmRNAまたはｃDNAを特異的に増幅するための塩基配列を有する少なくとも15塩基長のオリゴヌクレオチドプライマー、
（b）HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子のmRNA に由来するDNAに特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する少なくとも15塩基長のオリゴヌクレオチドプローブ。
【００２０】
（II-2）HLA-DQA1蛋白及びHLA-DQB1蛋白の少なくとも一方に対する抗体を含む、腎細胞癌患者のIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性検出用試薬または試薬キット。
【００２１】
(II-3) 腎細胞癌患者が転移性腎細胞癌患者である、（II-1）または（II-2）に記載する試薬または試薬キット。
(II-4)転移巣が肺である、（II-3）に記載する試薬または試薬キット。
【００２２】
（III）IL-2とIFN-αとの組み合わせからなる腎細胞癌治療薬
（III-1）（I-3）〜（I-7）のいずれかに記載する方法によって決定されたIL-2及びIFN-α併用療法に対する感受性群に属する腎細胞癌患者に対して用いられるものであることを特徴とする、IL-2とIFN-αとの組み合わせからなる腎細胞癌治療薬。
（III-2）IL-2が１回投与あたり70〜210万単位（JRU）を点滴静注により連日１ヶ月間投与し、IFN-αが１回投与あたり300〜1000万単位（IU）を皮下または筋肉内注射により週２〜５回投与して用いられるものである、（III-1）に記載する腎細胞癌治療薬。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者について、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子の発現量を測定することにより、当該患者に対するIL-2/IFN-α併用療法の有効性を判定することができる。具体的には、IL-2/IFN-α併用療法の有効性（IL-2/IFN-α併用療法に対する感受性）が高いと判断された患者（HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子の発現量が高い患者）については、IL-2/IFN-α併用療法・奏功群であるとして、治療方針としてIL-2/IFN-α併用療法を積極的に実施するという選択を行うことができる。
【００２４】
逆に、本発明において、IL-2/IFN-α併用療法の有効性（IL-2/IFN-α併用療法に対する感受性）が低いと判断された患者（HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子の発現量が低い患者）については、IL-2/IFN-α併用療法・非奏功群であるとして、治療方針としてIL-2/IFN-α併用療法以外の治療を施すという選択肢を与えることができる。このことは、不必要（無効）な治療を行うことによって生じる治療の費用（保健）の負担増を低減するとともに、IL-2/IFN-α併用療法によって生じ得る副作用を低減するという両面において有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】腎細胞癌患者のHLA-DQA1遺伝子の発現量とIL-2/IFN-α併用療法の治療反応性との関係を示すROC（Receiver Operating Characteristics）曲線、およびそれから算出されるカットオフ値と腎細胞癌患者42症例（感受性群、耐性群）との関係を示す図である。
【図２】腎細胞癌患者のHLA-DQB1遺伝子の発現量とIL-2/IFN-α併用療法の治療反応性との関係を示すROC（Receiver Operating Characteristics）曲線、およびそれから算出されるカットオフ値と腎細胞癌患者42症例（感受性群、耐性群）との関係を示す図である。
【図３】実施例３で算出したHLA-DQA1及びHLA-DQB1遺伝子の発現量のカットオフ値を基準として、腎細胞癌患者（学習ケース：感受性群[―◆―]、耐性群[―■―]、テストケース感受性群[―▲―]、耐性群[―◆―]）を群分けした図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．IL-2/IFN-α併用療法感受性遺伝子
本発明者らは、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子のいずれか少なくとも一方の遺伝子の発現量が高い腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者（例えば、肺転移を有する腎細胞癌患者（肺転移患者））は、それらの遺伝子の発現量が低い患者に比してIL-2/IFN-α併用療法に対して感受性であり、IL-2/IFN-α併用療法によって高い癌治療効果を享受すること、これに対して、これらの遺伝子の発現量が低い腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者（例えば、肺転移患者）は、それらの発現量の高い患者に比してIL-2/IFN-α併用療法に対して耐性であり、IL-2/IFN-α併用療法によっても有意な癌治療効果が得られないことを見出し、上記HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子が、腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性（有効性）と有意に関係していることを確信した。
【００２７】
このことから、本発明者らは、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子のいずれ１方または両方の遺伝子の発現量を指標とすることによって、個々の腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者に対する癌治療法として、IL-2/IFN-α併用療法が有効か否かを判断することができることを確信した。
【００２８】
斯くして得られた知見に基づいて、本発明は腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性遺伝子（IL-2/IFN-α併用療法感受性遺伝子）として、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子を提供するものである。
【００２９】
これらの遺伝子の配列情報やその発現産物の情報（アミノ酸配列）はいずれも公知である。例えば、ヒト由来のHLA-DQA1遺伝子のmRNAおよびタンパク質（HLA-DQA1蛋白）の情報は、NCBIにおいてそれぞれNM_002122.3およびNP_002113.2として登録されている。またヒト由来のHLA-DQB1遺伝子のmRNAおよびタンパク質（HLA-DQB1蛋白）の情報は、NCBIにおいてそれぞれNM_002123.3およびXP_002343953.1として登録されている。しかし、これらの遺伝子には多数の多型があることが知られているので、これらに登録されている配列情報に特に制限されるものではない。
【００３０】
本発明が対象とするHLA-DQA1遺伝子およびHLA-DQB1遺伝子の由来は、好ましくはヒトである。但し、ヒトに限らず、マウス、ラット、モルモット、サル、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ等の哺乳類に由来するものであってもよい。
【００３１】
２．腎細胞癌の薬効マーカー
本発明は、腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者（例えば、肺転移患者）の中から、癌治療法としてIL-2/IFN-α併用療法が有効な患者（IL-2/IFN-α併用療法感受性群）を選別するためのマーカー（IL-2/IFN-α併用療法感受性群選別マーカー、「腎細胞癌薬効マーカー」ともいう）として、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子のいずれか一方または両方の発現産物を提供する。かかる発現産物としては、HLA-DQA1遺伝子については、当該遺伝子のmRNAまたはその由来のcDNAおよびHLA-DQA1蛋白を、またHLA-DQB1遺伝子については、当該遺伝子のmRNAまたはその由来のcDNAおよびHLA-DQB1蛋白を挙げることができる。
【００３２】
腎細胞癌患者、特に転移患者を対象として、当該IL-2/IFN-α併用療法感受性群選別マーカーを検出し、その量を測定することにより、当該患者についてIL-2とIFN-αの２剤併用療法が当該癌の治療に有効か否かを予め評価し判断することができる。
【００３３】
３．腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性検出方法
本発明は、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性を検出する方法を提供する。当該方法は、個々の腎細胞癌患者について、癌治療前に予めIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性を検出し、当該患者に対してIL-2/IFN-α併用療法が有効であるか否かを判定するために用いられる。かかる方法は、IL-2/IFN-α併用療法に際して、腎細胞癌患者群の中から、IL-2/IFN-α併用療法に対する感受性群（奏功群）を選別し、耐性群（非奏功群）を篩い落とす方法ともいえる。
【００３４】
かかる方法は、腎細胞癌患者、特に転移性腎細胞癌患者（肺転移患者）のうち、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子のいずれか一方または両方の遺伝子の発現量が所定の発現量（E0）よりも多い患者は、IL-2/IFN-α併用療法に対する感受性が高く、IL-2/IFN-α併用療法によって、腎細胞癌（原発巣）や転移巣の縮小などの抗がん作用を有効に享受することができるのに対して、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の発現量が所定の発現量（E0）よりも低い患者は、IL-2/IFN-α併用療法に対して耐性であり、IL-2/IFN-α併用療法によっても有効な抗がん作用を享受することができないという知見に基づくものである。
【００３５】
腎細胞癌患者が、IL-2/IFN-α併用療法に対して感受性であるか（IL-2/IFN-α併用療法の奏功群に属するか）、それともIL-2/IFN-α併用療法に対して耐性であるか（IL-2/IFN-α併用療法の非奏功群に属するか）の検出は、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を指標とすることで行われる。従って、当該検出方法は、腎細胞癌患者の生体試料を対象として、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を測定する工程を有する。
【００３６】
なお、腎細胞癌患者はヒトである。また、これらの患者の腎細胞癌の組織型は特に制限されず、淡明細胞癌型、乳頭状腎細胞癌型または混合型のいずれであってもよい。さらにかかる患者は、腎細胞癌を原発巣とし、且つ転移巣を有する者であってもよい。かかる転移臓器としては好ましくは肺を挙げることができるが、肺以外の臓器に転移巣を有するものであってもよい。本発明が対象とする腎細胞癌患者は、好ましくは転移性腎細胞癌患者、より好ましくは肺転移を有する腎細胞癌患者である。
【００３７】
またこれらの患者に由来する試料としては、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子やその発現産物を含み得る試料であればよく、腎細胞癌患者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む）、組織（例えば、肝臓等。培養組織を含む）、または体液（例えば、血液、唾液、リンパ液、口腔粘膜、気道粘膜、汗、尿等）などの生体試料を材料として調製することができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００３８】
例えば白血球を材料とする場合、まず腎細胞癌患者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウムを加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことにより遺伝子（mRNAを含む）を得る。なお、遺伝子（mRNAを含む）の抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al.,“Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のDNA抽出キット等を利用して行なうことができる。
【００３９】
本発明の検出方法は、まず上記腎細胞癌患者由来の試料を対象としてHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子（以下、両遺伝子を纏めて「HLA-DQA1/B1遺伝子」と総称する）の一方または両方の発現量を測定することによって実施される。
【００４０】
これらHLA-DQA1/B1遺伝子の発現量の測定は、公知の情報に基づいて、慣用の方法に従って行うことができる。例えば、HLA-DQA1/B1遺伝子の発現量（E1）は、当該遺伝子の発現量（mRNA量）を測定することにより測定される。この際、当該mRNA量は、例えば、HLA-DQA1/B1遺伝子の塩基配列またはそれらの一部を含有する核酸をプローブとして用いるノーザンブロット法やマイクロアレイ法、HLA-DQA1/B1遺伝子の塩基配列の一部を含有する核酸をPCRプライマーとして用いるPCR法やRT-PCR法またはそれに準じる方法により測定されうる。またHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現量（E1）は  これらの遺伝子から発現・産生されるHLA-DQA1蛋白またはHLA-DQB1蛋白のタンパク質量をそれぞれ測定することにより測定してもよい。この際、当該タンパク質量は、HLA-DQA1蛋白またはHLA-DQB1蛋白のアミノ酸配列またはそれらの一部を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する当該タンパク質を、ウェスタンブロット法やELISA法、免疫組織化学法などの方法またはそれに準じる方法により測定されうる。なお、本発明の検出方法において、発現量を測定する遺伝子は、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子のいずれか一方のみであってもよいし、双方について発現量を測定し、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性を総合的に判断してもよい。
【００４１】
本発明の検出方法では、続いて、上記工程において測定されたHLA-DQA1/B1遺伝子の発現量（E1）を、各遺伝子に関する所定の発現量（E0）と比較する工程を有する。ここで、「所定の発現量（E0）」とは、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法感受性を判定する際の基準となる発現量であって、予め任意に設定可能な値である。「所定の発現量（EO）」を予め設定するにあたっては、本発明者らによって初めて見出された、「HLA-DQA1/B1遺伝子の発現量が腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性に対して正の相関関係を示す」という知見が考慮される。すなわち、その後の工程で、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法感受性の有無や高低を判断する際に基準となるカットオフ値（この値以上の発現量であれば『IL-2/IFN-α併用療法に感受性がある』と判断され、この値未満の発現量であれば『IL-2/IFN-α併用療法に耐性がある』と判断される閾値）を、所定の発現量（E0）として予め設定することができる。より具体的には、実施例２に示すように、腎細胞癌患者、特に転移患者について、予めHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子のそれぞれの発現量とIL-2/IFN-α併用療法との相関関係を求めておき、ROC（Receiver Operating Characteristics）曲線を用いて、感度（sensitivity）と特異度（specificity）がともに１に近く、且つ式「（1-sensitivity）２＋（1- specificity）２」が最も小さくなる値を求め、これを「所定の発現量（E0）」として設定することができる。
【００４２】
本発明の検出方法は、続いて、上記で行った比較の結果、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現量（E1）が所定の発現量（E0）よりも有意に多いか否かを判断する。有意差の有無の判断手法について特に制限はなく、当業者に周知の統計学的手法が用いられうる。一例として、統計学的に「有意に多い」とは、有意水準0.05（5％）で帰無仮説H0が棄却されることを意味することが多い。そして、この判断の結果に基づき、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性を評価する。すなわち、HLA-DQA1/B1遺伝子の発現量（E1）が所定の発現量（E0）よりも有意に多い場合には、検出の対象とした腎細胞癌患者について「IL-2/IFN-α併用療法に対して感受性がある」または「IL-2/IFN-α併用療法による有効性が高い」と決定することができる。一方、HLA-DQA1/B1遺伝子の発現量（E1）が所定の発現量（E0）よりも有意に多くはない場合には、検出の対象とした腎細胞癌患者について「IL-2/IFN-α併用療法に対して耐性がある」または「IL-2/IFN-α併用療法による有効性は低い」と決定することができる。
【００４３】
このような判定に基づくことで、より適切な治療方針の決定が促進されうる。例えば、本発明の検出方法によってIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性が「ある（高い）」と判定された腎細胞癌患者に対しては、IL-2/IFN-α併用療法を第１選択とした治療方針が決定されることになる。これにより、かかる患者に対しては、肉体的・精神的負担を伴う外科的切除術を回避することも可能となり、当該患者にとってより負担や副作用リスクが少なくしかも有効な治療を提供することが可能となる。一方、本発明の検出方法によってIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性が「ない（低い）」（耐性）と判定された腎細胞癌患者に対しては、IL-2/IFN-α併用療法以外の選択肢による治療を施すことで、有効ではないばかりか副作用をもたらす恐れのある投薬を回避することが可能となる。
【００４４】
４．IL-2/IFN-α感受性検出用試薬、これを含むキット
本発明は、腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性を検出するための試薬、および試薬キットを提供する。
【００４５】
当該試薬または試薬キットの成分としては、下記で説明するプローブ、プライマー及び抗体を例示することができる。
【００４６】
（１）プローブ
当該プローブは、HLA-DQA1遺伝子及びHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の遺伝子の発現量を、当該遺伝子の発現量（mRNA量）を測定するために用いられる。かかるプローブは、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子のmRNA量を、ノーザンブロット法やマイクロアレイ法で測定する際に用いられうる。
【００４７】
かかるプローブとして、具体的にはHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子のmRNA由来のcDNAに特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する少なくとも15塩基長のオリゴヌクレオチドプローブを挙げることができる。具体的には、当該プローブは、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の塩基配列において、15〜500塩基長、好ましくは20〜200塩基長、より好ましくは20〜50塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００４８】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００４９】
なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００５０】
さらに好ましくは、当該プローブは、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。
【００５１】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適にはIL-2/IFN-α併用療法感受性検出用のDNAチップとして利用することができる。
【００５２】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばDNAマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００５３】
（２）プライマー
当該プライマーは、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の一方または両方の発現量を測定するにあたり、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子のmRNA量やその派生物の量を、PCR法やRT-PCRで特異的に増幅するために用いられうる。
【００５４】
かかるプライマーとして、具体的にはHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の遺伝子のmRNAに派生するDNA（cDNA）に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する少なくとも15塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを挙げることができる。具体的には、当該プライマーは、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の少なくとも一方の塩基配列において、15〜500塩基長、好ましくは20〜200塩基長、より好ましくは20〜50塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００５５】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するHLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００５６】
なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００５７】
（３）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、HLA-DQA1遺伝子またはHLA-DQB1遺伝子の発現量を検出するための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００５８】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００５９】
以上の、プローブ（標識されていてもよい）またはプライマー（標識されていてもよい）は、腎細胞癌患者、特に転移を有する患者を対象として、癌治療としてIL-2/IFN-α併用療法が有効であるか否かを判定するための試薬（IL-2/IFN-α併用療法感受性検出用試薬）、言い換えると、腎細胞癌患者、特に転移を有する患者をIL-2/IFN-α併用療法の奏功群と非奏功群とに選別するための試薬として利用することができる。すなわち、上記のプローブ（標識されていてもよい）またはプライマー（標識されていてもよい）は、別の角度から、腎細胞癌患者、特に転移患者について、IL-2/IFN-α併用療法有効者であるか、または非有効者であるかを選別するための試薬として規定することができる。
【００６０】
（４）IL-2/IFN-α感受性検出用の試薬キット
本発明はまた、上記のIL-2/IFN-α併用療法感受性群（奏功群）を検出（選別）するための試薬を、キットとして提供するものである。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明のキットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。さらに本発明の試薬キットには、プライマーやプローブなどの試薬の使用方法や、それを用いたIL-2/IFN-α併用療法感受性群（奏功群）の検出方法（判定基準、所定の発現量（E0））を説明する書面が含まれていても良い。
【００６１】
５．IL-2とIFN-αとの組み合わせからなる腎細胞癌治療薬
本発明は、IL-2とIFN-αとの組み合わせからなる腎細胞癌治療薬を提供する。当該本発明の腎細胞癌治療薬は、前述する本発明の「腎細胞癌患者のIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性検出方法」により、予めIL-2及びIFN-α併用療法に対して感受性があると判断された腎細胞癌患者に対して専ら処方され投与される治療薬である。
【００６２】
ここでIL-2とIFN-αとは、それぞれ別個に包装されてなり、上記腎細胞癌患者に対して異なる投与経路で並行して投与される。具体的には、IL-2は上記腎細胞癌患者に対して、１回投与あたり70〜210万単位（JRU）を点滴静注により連日１ヶ月間にわたって投与するスケジュールで用いられる。一方、IFN-αは、上記腎細胞癌患者に対して、１回投与あたり300〜1000万単位（IU）を皮下または筋肉内注射により週２〜５回の割合で投与するスケジュールで用いられる。
【００６３】
本発明の腎細胞癌治療薬は、上記特有の腎細胞癌患者に対して、例えば上記投与形態で用いられる組み合わせ物であれば、その形態を特に制限されず、予め液剤（点滴液、注射液）の形態を有してもよいが、例えば、用時に生理食塩水や注射用水に溶解して用いられる凍結乾燥製剤の形態を有するものであってもよい。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００６５】
実施例１  患者の選別
肺転移を有する腎細胞癌患者42例（表１参照）を対象に、腎細胞癌非観血的治療効果判定基準（日本泌尿器科学会雑誌83巻4号、1992年）に基づいて臨床効果判定を行った。
【００６６】
【表１】
2011229437.tif 000002
【００６７】
判定結果（奏効率：二方向測定可能病変の縮小率）に基づいて、著効群（CR：Complete Response）、有効群（PR：Partial Response）、不変群（NC：No Change）および進行群（PD：Progressive Disease）に分類した。またこのうち、二方向測定可能病変の縮小率が25％以上50％未満である症例を、やや有効群（MR：Minor Response）とした（表２）。このうち、著効群と有効群の合計15例をIL-2/IFN-α併用療法に対する感受性群（奏功群）として、またやや有効群、不変群及び進行群の合計27例を、IL-2/IFN-α併用療法に対する耐性群（非奏功群）として、実施例２以降で説明する解析を行った。
【００６８】
【表２】
2011229437.tif 000003
【００６９】
実施例２  対象遺伝子のスクリーニング
アレイ解析から得られた38, 500の遺伝子発現情報を用いて、IL-2/IFN-α併用療法感受性群（以下、感受性群）とIL-2/IFN-α併用療法耐性群（以下、耐性群）の間で有意に発現量の異なる遺伝子をスクリーニングした。
【００７０】
肺転移巣の縮小率をもとに、感受性群15症例のうち縮小率の大きい上位10症例と耐性群27症例のうち縮小率の小さい下位18症例（合計28症例）を「学習ケース」とし、その残りを「テストケース」とした。すなわち、「テストケース」には、感受性群15症例のうち縮小率の小さい下から5症例と耐性群27症例のうち縮小率の大きい上から9症例（合計14症例）が含まれる。
【００７１】
かかる「学習ケース」を対象として、random permutation test（Clin Cancer Res., 第11巻、2005年、p2565-2636参照）を用いて解析した（1,000,000回）。そのうえで、(i)p値が5 x 10 -4未満である、(ii)感受性群と耐性群の少なくとも一方の群において発現情報を有する症例が60%以上である、の両条件を満たす遺伝子を解析対象遺伝子とした。その結果、24遺伝子がIL-2/IFN-α併用療法感受性予測候補遺伝子として同定された。これらの24遺伝子のうち14遺伝子については、耐性群に比較して感受性群で高発現していた。
【００７２】
実施例３  治療効果を予測するカットオフ値の算出
実施例２で選別した14遺伝子の中から、さらにHLA−DQA1（random permutation test p value; 2.83E-05）、HLA−DQB1(同；2.66E-04)の２遺伝子を選別し、これらの遺伝子について、各遺伝子の発現量とIL-2/IFN-α併用療法の奏効性（表２）との関連性について詳細な解析を行った。具体的には、各遺伝子についてROC（Receiver Operating Characteristic）曲線を描き、かかる曲線を用いて、感度（sensitivity）及び特異度（specificity）がともに１に近く、「（1-sensitivity）２＋（1-specificity）２」が最も小さくなる値を、各遺伝子の発現量の最良のカットオフ値とした。その結果、HLA−DQA1のカットオフ値は、0.315（図１参照）、HLA−DQB1については1.177（図２参照）であった。
【００７３】
実施例４  HLA−DQA1及びHLA−DQB1遺伝子の発現量と治療効果との相関性
上記で求めた各遺伝子の発現量のカットオフ値を基準にして、学習ケースの感受性群（10例、図３中「―◆―」で示す。）及び耐性群（18例、図３中「―■―」で示す）について、これらのカットオフ値より高い群と低い群に分類した。結果を図３に示す。
【００７４】
図３に示すように、HLA-DQA1遺伝子については、カットオフ値よりも発現量が低い患者が感受性群では10例中1例、耐性群では18例中13例であり、カットオフ値よりも発現量が低い患者（14例）のなかで耐性群患者が占める割合は13例（13例/14例：92.9％の無効率）と高く、テストケースを含めた場合でも85.7％と高かった（カットオフ値よりも発現量が低い患者（21例）のなかで耐性群患者が占める割合は18例（18例/21例））。
【００７５】
一方HLA−DQB1についても、カットオフ値よりも発現量が低い患者が感受性群では10例中2例、耐性群では18例中14例であり、カットオフ値よりも発現量が低い患者のなかで耐性群患者が占める割合は14例（14例/16例：87.5％の無効率）と高く、テストケースを含めた場合でも82.6％と高かった（カットオフ値よりも発現量が低い患者（23例）のなかで耐性群患者が占める割合は19例（19例/23例））。
【００７６】
本研究において腎細胞癌患者を対象としたIL-2/IFN-α併用療法の有効率は35.7％であったが、上記の結果から、HLA−DQA1遺伝子の発現量の低い腎細胞癌患者に対してIL-2/IFN-α併用療法を回避することで、この有効率が64.3%（テストケースを含めると57.1％）まで上昇すること、またHLA−DQB1遺伝子の発現量の低い腎細胞癌患者に対してIL-2/IFN-α併用療法を回避することで、上記有効率が66.6%（テストケースを含めると57.9％）まで上昇することが確認された。
【００７７】
以上のことより、HLA−DQA1遺伝子及びHLA−DQB1遺伝子の発現量を測定することによって、腎細胞癌患者、特に肺転移を有する腎細胞癌患者に対するIL-2/IFN-α併用療法の治療反応性（奏効性）を、治療前に予測することが可能であり、臨床への応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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