(57)【要約】      （修正有）【課題】FRET法に基づく遺伝子増幅率や遺伝子変異等の検出法において、高感度且つ優れた正確性を示す新規核酸プローブを、安価に入手可能であり且つ感度や正確性を左右する分光学的性質に優れた色素を用いて、該プローブを用いる分子生物学的検出法を提供する。【解決手段】アゾ−ベンゾアゾール類を基本骨格とする消光色素を、直接或いはリンカーを介して、プローブとなり得る任意のデオキシリボ或いはリボ核酸配列中に少なくとも１つ結合させることで得られる該プローブの製造。又は、該プローブを用いたFRET法に基づく遺伝子増幅率や遺伝子変異等の検出法への応用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
FRET法を利用する遺伝子増幅率或いは遺伝子変異の検出等の分子生物学的検出法における核酸プローブであって、その配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接あるいはリンカーを介してアゾ−ベンゾアゾール誘導体が消光色素として修飾された核酸プローブ。
【請求項２】
アゾ−ベンゾアゾール誘導体が下記の一般式（１）に示す2-アゾ−1,3ベンゾアゾール誘導体である請求項１の核酸プローブ。
【化１】
2011036225.tif 000006
式中、Xは酸素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンズオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンゾチアゾール誘導体、Xが窒素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンズイミダゾール誘導体、Xが酸素原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ピリジルオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ピリジルチアゾール誘導体、X及びYが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ピリジルイミダゾール誘導体であり、本発明の一態様においては、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンゾチアゾール誘導体。
【請求項３】
アゾ−ベンゾアゾール誘導体が下記の一般式（２）に示す3-アゾ−1,2ベンゾアゾール誘導体である請求項１の核酸プローブ。
【化２】
2011036225.tif 000007
式中、Xは酸素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンズオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンゾチアゾール誘導体、Xが窒素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンズイミダゾール誘導体、Xが酸素原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ピリジルオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ピリジルチアゾール誘導体、X及びYが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ピリジルイミダゾール誘導体であり、本発明の一態様においては、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンゾチアゾール誘導体。
【請求項４】
蛍光色素としてアレクサ（Alexa）、ボディピー（BODIPY）、フルオレセイン、ジョー（JOE）、ローダミン、テキサスレッド、シアニンフルオロフォア或いはそれら誘導体等、GFP、RFPの蛍光タンパク等、量子ドットを利用する蛍光試薬等が核酸配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接あるいはリンカーを介して修飾された請求項１〜３の何れかの核酸プローブ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかの核酸プローブを用いる、FRET法を利用した遺伝子増幅率や遺伝子変異等の分子生物学的検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規色素標識核酸プローブ及びこれを利用する遺伝子増幅率・遺伝子変異検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の定量や遺伝子多型（以下SNPsともいう）検出法等の分子生物学的な検出法に利用される測定手法の一つとして、フェルスター共鳴エネルギー転移法（FRET；forster resonance energy transfer）が挙げられる。FRET法は、励起状態にある蛍光物質に隣接して異なる蛍光（消光）物質が存在する際、両者に共鳴が生じることで励起エネルギーの移動が起こり、励起状態にあった蛍光物質がエネルギーの消失を伴って基底状態に戻り、隣接の蛍光（消光）物質にそのエネルギーが転移し励起状態になる現象を指す。FRETを用いた遺伝子発現の定量やSNPsの検出等に使用される試薬には、任意の核酸オリゴマーの任意の位置に蛍光色素及び消光色素（以下クエンチャー色素ともいう）の両方或いは一方を修飾した色素標識核酸プローブ（以下核酸プローブあるいはプローブともいう）が汎用される（非特許文献1及び2参照）。該核酸プローブを用いる検出手法によれば、均一溶液中にて、プローブと標的核酸との二重鎖を形成させることで及び／標的核酸を増幅させることで、プローブに標識された蛍光色素と消光色素間に生ずる蛍光強度の変化が生じ、これを追跡することにより目的とする検出を実施することが可能となる。
【０００３】
該プローブは、様々な種類の蛍光色素（アレクサ（Alexa）、ボディピー（BODIPY）、フルオレセイン、ジョー（JOE）、ローダミン、テキサスレッド、シアニンフルオロフォアまたはその誘導体）と消光色素（ダブシル（DABCYL）、タムラ（TAMRA）、ビーエイチキュー（BHQ）及びその誘導体）の一方あるいは両方が、核酸オリゴマー中の任意の核酸塩基あるいは糖鎖3位及び5位の水酸基又はリン酸基に共有結合した組成体として知られている。当該検出法において、正確且つ高感度に目的の検出を行うには、適切な共鳴エネルギー転移が起こり得る蛍光色素と消光色素の組み合わせを選択することが重要となる。
【０００４】
しかしながら、汎用な蛍光色素であるフルオレセイン等の組み合わせとして良く利用される消光色素のDABCYLは、475nm 付近を極大とする吸収波長を持つ為、蛍光色素との間におけるスペクトルオーバーラップが小さく、クエンチング効果が充分でない為、プローブとしての感度や正確さに疑問が残る。同じく消光色素として用いられるTAMRAは、DABCYLに見られる様なスペクトルオーバーラップへの懸念は少ないが、それ自身が蛍光を呈する為にバックグランドが向上し観察対象となる蛍光色素のスペクトルに影響を与える。その為、S/N比が小さくなり、感度や正確さの点でプローブとして十分な効果が期待できない場合がある。一方、BHQ（BHQ-1）は、530nm 付近を極大とする吸収波長を持ち、非蛍光性であるためDABCYLやTAMRAが持つ様な問題点が解消された消光色素といえるが（特許文献1及び2参照）、DABCYL等と比較して化学構造的に複雑である為、コスト的な観点から見て使い勝手の良いプローブといえず、新たなプローブの提供が嘱望されている。
【０００５】
【非特許文献１】Morrison et al.,Anal. Biochem.,vol.183, 231-244, (1989)
【非特許文献２】Xiangnin Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, 10756-                    10761, (1997)
【特許文献１】COOK, Ronald, M.; LYTTLE, M. WO 01/086001 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の問題点に対して、化学構造が単純で低コストに入手でき且つ感度や正確性を左右する分光学的性質に優れた色素を使用することで、安価に高性能な新規核酸プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に対して鋭意研究を重ねた結果、プローブとなり得る任意のデオキシリボ或いはリボ核酸配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接或いはリンカーを介して、安価に入手可能なアゾ−ベンゾアゾール類を基本骨格とする消光色素を結合させることにより、フルオレセイン等の汎用な蛍光色素に対して優れたスペクトルオーバーラップ及びクエンチング効果を示し、遺伝子増幅率・遺伝子変異等の分子生物学的検出法において有用となり得る当該プローブを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明により、下記の一般式（１）に示す2-アゾ−1,3ベンゾアゾール誘導体が核酸プローブ配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接あるいはリンカーを介して結合した組成体とする該プローブが提供される。
【０００９】
【化１】
2011036225.tif 000002
【００１０】
式中、Xは酸素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンズオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンゾチアゾール誘導体、Xが窒素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンズイミダゾール誘導体、Xが酸素原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ピリジルオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ピリジルチアゾール誘導体、X及びYが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ピリジルイミダゾール誘導体であり、本発明の一態様においては、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である2-アゾ−1,3ベンゾチアゾール誘導体が好ましい。
【００１１】
又、下記の一般式（２）3-アゾ−1,2ベンゾアゾール誘導体がプローブ配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接あるいはリンカーを介して結合した組成体とする該プローブが提供される。
【化２】
2011036225.tif 000003
【００１２】
式中、Xは酸素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンズオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンゾチアゾール誘導体、Xが窒素原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンズイミダゾール誘導体、Xが酸素原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ピリジルオキサゾール誘導体、Xが硫黄原子であり、Yが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ピリジルチアゾール誘導体、X及びYが窒素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ピリジルイミダゾール誘導体であり、本発明の一態様においては、Xが硫黄原子であり、Yが炭素原子であり、a〜gが水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等である3-アゾ−1,2ベンゾチアゾール誘導体が好ましい。
【００１３】
前期プローブ配列中には、汎用される蛍光色素としてアレクサ（Alexa）、ボディピー（BODIPY）、フルオレセイン、ジョー（JOE）、ローダミン、テキサスレッド、シアニンフルオロフォア或いはそれらの誘導体が、配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接あるいはリンカーを介して結合していても良く、更には蛍光体としてGFP等の蛍光性タンパク或いはそれらの誘導体が、配列中の任意のヌクレオチドの少なくとも１つに、直接あるいはリンカーを介して結合していても良い。
【００１４】
本発明の一態様において、該プローブが、色素と核酸オリゴとをリンカーを介して結合した組成体として提供される場合、そのリンカーには下記一般式（３）〜（１１）に示すものが挙げられる。
(化３)
-X-(CH2)n-X-                                                      （３）
-X-CH2CH2-(OCH2CH2)n-X-                                            （４）
-O-CO-O-                                                         （５）
-O-CO-NH-                                                        （６）
-O-CS-NH-                                                        （７）
-O-CO-NH-                                                        （８）
-NH-CO-NH-                                                       （９）
-NH-C(=NH)-NH-                                                   （１０）
-O-PO2-O-                                                        （１１）
式中Xは、O, S, SS, CO, CS, NH, COO, CONH, NHCO, NHCONH, OCO2,OCONH, NHCSO, NHCSNH, OCSNH, maleimide, -O-PO2-O-の何れでも良く、式（３）のｎは１〜20の整数を表し、好ましくは１〜10であり、更に好ましくは１〜5である。式（４）のｎは0〜20の整数を表し、好ましくは0〜10であり、更に好ましくは0〜5である。
【００１５】
又、本発明により、FRET法を利用する遺伝子増幅率或いは遺伝子変異検出等の分子生物学的な検出方法であって、前記アゾ−ベンゾアゾール誘導体修飾色素核酸プローブ存在下において、DABCYL等で見られるスペクトルオーバーラップの低下が解消され、TAMRA等に見られるような蛍光干渉によるバックグランドの向上を引き起こすことなく、各種汎用の蛍光色素に対して良好なクエンチング効果を有することを特徴とする当該検出法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、FRET法に基づく蛍光・消光色素修飾核酸プローブの製造において、安価に入手可能なアゾ−ベンゾアゾール誘導体を消光色素とする高性能な該プローブが提供された。又、本発明により、感度と正確性に優れた遺伝子増幅率・遺伝子変異の検出法が提供された。これらの発明は、国内の長寿命化・少子化傾向による社会構造の変化が齎す現行の医療制度への深刻な影響に対して、ゲノムプロジェクト或いはポストゲノム研究に基づく遺伝子レベルでの病因解明が促す疾患への未然予防・早期治療による健康リスクの低減を促進する上で、有用な材料・手法の一つとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】SBR修飾核酸プローブのHPLC分析結果を示す図である（実施例１）。
【図２】各種クエンチャー色素修飾核酸プローブ（Probe 1, 3, 4）の紫外・可視分光光度計による測定結果及び500〜550nmにおけるスペクトルオーバーラップ度の比較を示す図である（実施例１）。
【図３】SBR修飾核酸プローブを用いた遺伝子変異検出において、SBR修飾核酸プローブ（Probe 2）/フルオレセイン修飾プローブ（Probe 5）混合溶液及びRNaseA処理後の蛍光分光光度計による測定結果を示す図である（実施例１）。
【図４】図３の結果を基に算出した消光率を表したグラフである（実施例１）。
【図５】各種クエンチャー色素修飾核酸プローブ（Probe 6, 7, 8）とSBR修飾核酸プローブにおける消光率の比較を表したグラフである（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明により、提供されるプローブは、FRET法に基づく遺伝子増幅率や遺伝子変異の検出において高感度且つ優れた正確性を示すものであり、クエンチャー色素にアゾ−ベンゾアゾール誘導体を有することを特徴とする色素修飾核酸プローブである。
【００１９】
本発明者は、前記誘導体を該プローブにおける消光色素として用いることによって、フルオレセイン等の汎用な蛍光色素に対して十分なスペクトルオーバーラップ及びクエンチング効果を示すことにより、遺伝子増幅率及び遺伝子変異の検出において有用となり得る当該プローブを見出した。即ち、係る新規なプローブ存在下においては、励起光照射によって蛍光体より生ずる発光波長スペクトルとアゾ−ベンゾアゾール誘導体の吸収波長スペクトルとが490〜700nm付近の波長領域で良好に重なり合う。更に、アゾ−ベンゾアゾール誘導体は無蛍光試薬である為、観察対象となる蛍光試薬の発光エネルギーを吸収しても発光干渉を引き起こすことが無く、スペクトルとノイズの比が顕著となる結果、精度の高い分析が可能となる。
【００２０】
本発明により、該プローブに修飾されるアゾ−ベンゾアゾール誘導体は、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物を挙げることができる。
【化１】
2011036225.tif 000004
【００２１】
【化２】
2011036225.tif 000005
【００２２】
式中、Xは酸素原子、窒素原子、硫黄原子、Yは炭素原子、窒素原子の何れでも良く、a〜gは水素、水酸基、アミノ基、チオール基、ハロゲン基、アルキル基、エーテル基、エステル基、ニトロ基、スルホニル基等が各々用いられる。
【００２３】
本発明によれば、該プローブ存在下、遺伝子増幅率や遺伝子変異検出等の分子生物学的検出を行なうことが可能となる。前記検出方法としては、例えばTed C. Chu et.al., Nucleic Acids Research, Vol. 34, No. 10, e73, 2006或いはGoto, M. et.al., WO 06/088126 A1 2006に記載の手法等、当業界において既に公知の技術と組み合わせることにより、高感度且つ正確に当該の検出結果を提供できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２５】
・  アゾ−ベンゾアゾール誘導体修飾核酸プローブ合成
（実施例１）
本発明のプローブに修飾する一般式（１）に示すアゾ−ベンゾアゾール誘導体として、{ヒドロキシエチル-[4-(5-メトキシ-ベンゾチアゾール-2-イルアゾ)-フェニル]-アミノ}-エタノール（以下SBRともいう）を使用した場合における、該プローブの合成法を示す。
【００２６】
具体的な合成は、先ず、2-アミノ-メトキシベンゾチアゾール（東京化成）及びN-フェニルジエタノールアミン（東京化成）を原料として用い、L. F. Fieser, et．al.,（磯辺稔ほか訳）有機化学実験（第8版），p.367， 丸善（2000）に記載の手法に従ってSBRを合成した後、これをOligonucleotide synthesis a practical approach p.47-49, Oxford (1990)に記載の手法に基づいて固相担体へと固定化した。次いで、M. H. Caruthers, et. Al., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) にて周知のホスホロアミダイト法によって、核酸自動合成装置（ジーンワールド社製H-8）により所望の核酸塩基配列を合成し、3末端の核酸塩基の3位水酸基にリン酸エステルを介して {ヒドロキシエチル-[4-(5-メトキシ-ベンゾチアゾール-2-イルアゾ)-フェニル]-アミノ}-エタノールを核酸オリゴへと結合せしめ、未精製の当該プローブを得た。合成した核酸塩基配列は以下の通りである。
Probe 1 (5→3); TTT TTT TTT-SBR
Probe 2 (5→3); GGC CCC CAA TAC CAC ATC AT-SBR
【００２７】
次いで、未精製プローブの純度をHPLCにて測定した。分析用のカラムには、Lichrosorb RP-18 (4.6×250mm, GL science)を使用した。溶離液は、溶離液A／0.1M TEAA (10%MeCN,pH 7.0)及び溶離液B／0.1M TEAA (50%MeCN,pH 7.0)を用い、分析時のA／B混合割合には、溶離液Bの比率が40min.かけて0%から100%となるリニアーグラジェントを設定した。図１（A）は、Probe 1における未修飾体の分析結果である。図１（B）は、精製後のProbe 1−SBR修飾体の分析結果である。図１（C）は、Probe 2における未修飾体の分析結果である。図１（D）は、精製後のProbe 2−SBR修飾体の分析結果である。精製はHPLCにて行い、分離条件は前記HPLCと同じ条件とした。
【００２８】
２．SBR修飾核酸プローブのスペクトルオーバーラップ評価
作製したSBR修飾Probe 1を用い、フルオレセイン等の汎用蛍光色素に対するプローブのスペクトルオーバーラップ効果を比較するべく、従来用いられている各種クエンチャー色素を修飾したプローブを用意し（標識位置は3末端）、紫外・可視分光光度計（HITACHI U-2001）による分析を行なった。比較対象となるクエンチャー色素修飾プローブには、DABCYL修飾及びBHQ-1修飾プローブ(Probe 3, 4)を用いた。DABCYL修飾及びBHQ-1修飾プローブの合成は、DABCYL及びBHQ-1が固相担体（以下CPGともいう）に固定化されたものを購入し（Glen Research社製）、M. H. Caruthers, et. Al., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) にて周知のホスホロアミダイト法によって核酸自動合成装置を用いて合成した。
Probe 3 (5→3); TTT TTT TTT-DABCYL
Probe 4 (5→3); TTT TTT TTT-BHQ-1
【００２９】
各プローブを滅菌水に溶解し100uM溶液を調製した。この溶液100uLに610uLの滅菌水を加えて全量710uL溶液を調製し、石英セルに700uL注ぎ、紫外・可視分光光度計にて240nm〜700nmまでの波長領域で10nm毎に吸光度を測定した。又、リファレンス（滅菌水）の同吸光度を測定した。各種クエンチャー色素修飾核酸プローブの吸光度からリファレンスの吸光度を差し引いた値を算出し、この数値を該プローブの吸光度とした。図2は、各種クエンチャー色素修飾核酸プローブ（Probe 1,3,4）の測定結果をプロットし、各々を重ね合わせた図である。
【００３０】
一連の結果より、消光色素がSBRである場合には、500〜550nmの波長領域にて汎用の蛍光試薬（例えば、Alexa Fluor 488、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン等）に対するスペクトルオーバーラップ効果が、DABCYLに対しては飛躍的に向上した。又、BHQ-1に対しても優位なオーバーラップ効果が観察され、本発明の有用性が証明された。
【００３１】
３．SBR修飾核酸プローブを用いた遺伝子変異検出
FRET法に基づく遺伝子変異検出を行った。FRET法を利用する遺伝子変異検出方法は、これまでに多くの報告例がある。例えば、S. Tyagi. et. Al., Nat. Biotechnol., 16, 49 (1998)、K. J. Livak., Genet. Anal., 14, 143 (1999)、 R. W. Kwiatkowski et. al., Mol. Diagn., 4, 353 (1999)、Goto, M. et.al., WO 06/088126 A1 (2006)等が挙げられる。ここでは、作製したSBR修飾核酸プローブ（Probe 2）を用い、本発明の一態様としてGoto, M. et.al., WO 06/088126 A1 (2006)の手法を参考に遺伝子変異検出（一塩基多型検出）を実施した。
【００３２】
前記特許文献の変異検出手法によれば、ターゲット遺伝子の配列を有するRNAとこれに対して相補鎖である蛍光・消光核酸プローブとにより形成される二本鎖に、一本鎖RNA分解酵素を共存させることで、ターゲット遺伝子が正常型の場合にはFRET効果による消光作用が、変異型の場合にはFRET効果が解消されフルオレセインの蛍光が観察され、その発光の強弱により変異の検出が可能となる。当該文献では、フルオレセイン及びBHQ-1修飾核酸プローブを組み合わせて使用した場合における変異の検出例が既知であり、本発明の一態様としてBHQ-1の代替としてSBRを修飾した該プローブを用いる同変異検出を実施し、その有用性について検証した。
【００３３】
ターゲット配列RNAは、ホスホロアミダイト法によりを合成した。合成は、S. L. Beaucage, et. Al., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry., vol. 1, pp. 3.3.1-3.3.20, John Wiley & Sons（2000）に記載の手法に従って実施した。RNAの塩基配列は以下の通りである。
target 1 (wild type)
r(GUU UGG CUU UCA GUU AUA UGG AUG AUG UGG UAU UGG GGG CC)
target 2 (mutant)
r(GUU UGG CUU UCA GUU AUA UAG AUG AUG UGG UAU UGG GGG CC)
【００３４】
次いで、フルオレセイン標識核酸プローブ及び比較対象となるクエンチャー色素修飾プローブを合成した。フルオレセインの標識にはフルオレセインホスホロアミダイト試薬を、クエンチャー色素標識には、DABCYL、 BHQ-1、TAMRA CPGを用いた（Glen Research社製）。合成は、M. H. Caruthers, et. Al., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) にて周知のホスホロアミダイト法によって核酸自動合成装置を用いて合成した（Probe 5,6,7,8）。フルオレセイン（FAM）の標識位置は5末端、クエンチャーの標識位置は3末端とした。合成した核酸塩基配列は以下の通りである。
Probe 5 (5→3)；FAM-CCA TAT AAC TGA AAG CCA AA
Probe 6 (5→3)；GGC CCC CAA TAC CAC ATC AT-DABCYL
Probe 7 (5→3)；GGC CCC CAA TAC CAC ATC AT-BHQ-1
Probe 8 (5→3)；GGC CCC CAA TAC CAC ATC AT-TAMRA
【００３５】
正常型の配列を有するターゲットRNA（target 1）を5uMとなる様にTEバッファー（Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, MgCl2 50mM, pH 7.5）に溶解した。同様に、Probe5の20uM溶液及びProbe 2（SBR修飾核酸プローブ）の100uM溶液を、各々TEバッファーを用いて調製した。次いで、前記バッファー1mL中に、RNA溶液 40uL、Probe5溶液 1ul、Probe 2溶液 1ulを混合し、85℃で3分間インキュベートした後に5℃まで冷却し10分間インキュベートした。石英セルに前記混合溶液を加え、蛍光分光光度計（PerkinElmer社製 LS-55）にて蛍光強度を測定した。測定後、RNaseA グリセロール溶液(ニッポンジーン社製)を1uL加えて十分に混合し、再度蛍光強度を測定した。又、リファレンスとしてProbe5とProbe 2との混合溶液における蛍光強度を測定した。図３(A)は、SBR修飾核酸プローブ/フルオレセイン修飾プローブ混合溶液、図３(B)は、RNaseA処理後の蛍光分光光度計による測定結果を示す図である。変異型の配列を有するターゲットRNA（target 2）についても同操作を行なった。図３(C)は、RNaseA処理後の蛍光分光光度計による測定結果を示す図である。図４は、図３より得られた結果を基に、前記特許文献に従って算出した消光率を表すグラフである。
【００３６】
更に、正常型と変異型におけるFRET効果（消光率）の差を、従来のクエンチャー色素修飾核酸プローブ（DABCYL、BHQ-1、TAMRA）と比較するべく、前記操作をProbe5とProbe 6、Probe5とProbe 7、Probe5とProbe 8の組み合わせ対しても行なった。図５は、各種クエンチャー色素修飾核酸プローブを用いた場合に算出した消光率をSBRのデータと比較したグラフである。
【００３７】
一連の結果より、ターゲット配列RNAサンプルと色素標識プローブが完全相補鎖（正常型）となるときには、プローブに修飾されたフルオレセインとSBRとの間におけるFRET由来の消光現象が観測され、一方、検出対象となる塩基において相補性を有さない（変異型）場合には著しいフルオレセイン由来の蛍光が観測され、該プローブが遺伝子検出に有用であることを示した。更に、従来のクエンチャー色素修飾核酸プローブを用いた同検出結果を比較すると、何れの場合においても同等以上の遺伝子変異検出能を有していることが示され、その有用性が証明された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のより提供される該プローブは、遺伝子増幅の定量や遺伝子変異の検出等に代表されるようなFRETを利用する分子生物学的検出法に適応可能であり、これに係る様々な検査薬、診断薬等の医療産業への利用が期待される。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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