(57)【要約】【課題】励起光の光軸と蛍光用集光レンズ又は対物レンズの中心軸を同軸としても、励起光の反射による影響を低減することが可能な微生物検査チップと、それを用いた微生物検査装置を提供する。【解決手段】微生物検査チップ１０は、本体１５と菌体検出部１７とを有する。菌体検出部１７は、カバー部材１７１，流路部材１７２を貼り合わせて形成され、菌体検出用流路１７３を有する。菌体検出部１７の入射面における法線ベクトルと励起光の光軸が平行とならないように、微生物検査チップ１０内において菌体検出部１７を傾斜させて配置する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物検査チップ本体に、検体を保持するための検体容器と、染色試薬を保持するための試薬保持容器と、菌検出部と、廃液を保持するための検出液廃棄容器と、前記検体容器と前記試薬保持容器の間を接続する流路と、前記試薬保持容器と前記菌体検出部の間を接続する流路と、前記菌体検出部と前記検出液廃棄容器の間を接続する流路とを有する微生物検査チップであって、
前記菌体検出部の励起光の入射面における法線ベクトルと、前記励起光の光軸が平行とならないように、前記菌体検出部を傾斜させて微生物検査チップ本体内に配置したことを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項２】
本体と、該本体に装着された菌体検出部とを有し、
前記本体は、検体を保持するための検体容器と、染色試薬を保持するための試薬保持容器と、廃液を保持するための検出液廃棄容器と、前記検体容器と前記試薬保持容器の間を接続する流路と、前記試薬保持容器と前記菌体検出部の間を接続する流路と、前記菌体検出部と前記検出液廃棄容器の間を接続する流路とを有する微生物検査チップであって、
前記菌体検出部は、前記流路に接続された菌体検出用流路を有し、カバー部材と溝を有する流路部材とをはり合わせることによって前記菌体検出用流路を形成するように構成されており、
前記本体は、貫通口又は貫通溝である検出用窓枠部を有し、
前記菌体検出部は、前記菌体検出部の励起光の入射面における法線ベクトルと前記励起光の光軸が平行とならないように傾斜させて前記検出用窓枠部に配置されていることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項３】
請求項１または２において、前記菌体検出部の表面と励起光の光軸のなす角度をθとすると、θ＝８０〜３０°の範囲となるように、前記微生物検査チップ本体内に前記菌体検出部を傾斜させていることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項４】
請求項１または２において、前記菌体検出部の表面と励起光の光軸のなす角度をθとすると、θ＝８０〜７０°の範囲となるように、前記微生物検査チップ本体内に前記菌体検出部を傾斜させていることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項５】
請求項１または２に記載の微生物検査チップにおいて、
前記カバー部材は、厚さ０.０５mm以上１mm以下のガラス又は石英の板材によって形成され、前記流路部材は、厚さ０.１mm以上１mm以下のポリジメチルシロキサンの板材によって形成されていることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項６】
請求項１または２に記載の微生物検査チップにおいて、
前記カバー部材及び前記流路部材は、厚さ０.０１mm以上０.３mm以下のシクロオレフィンポリマーまたはポリメタクリル酸メチルエステルまたはポリカーボネイトの板材によって形成されていることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項７】
請求項１または２に記載の微生物検査チップにおいて、
前記本体は、ポリプロピレン，ポリスチレン，ポリエチレンテレフタラート，ポリカーボネイト，アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂，ポリメタクリル酸メチルエステルのうち一種類以上の物質から構成されることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項８】
請求項１または２に記載の微生物検査チップにおいて、
前記本体と前記流路部材は、同一の物質から構成されていることを特徴とする微生物検査チップ。
【請求項９】
請求項１〜９の何れかに記載の微生物検査チップと、前記生物検査チップが着脱可能に取り付けられ、前記生物検査チップをＸＹ方向に移動させるためのＸ−Ｙステージと、前記菌体検出部に励起光を照射し前記菌体検出部からの蛍光を検出する検出装置とを有し、
前記検出装置における前記励起光の光軸と前記蛍光を検出するレンズ系の光軸が同軸であり、
前記微生物検査チップ本体の平面が、前記励起光の光軸に対して直角となるように、前記微生物検査チップを前記Ｘ−Ｙステージに取り付けていることを特徴とする微生物検査装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の微生物検査装置において、前記励起光は、前記菌体検出部の菌体検出用流路に対して垂直に入射されることを特徴とする微生物検査装置。
【請求項１１】
請求項９において、前記蛍光を検出するレンズ系における対物レンズの立体角をδ、前記励起光の入射角度から求められる誤差範囲をβとすると、
前記菌体検出部の表面と励起光の光軸のなす角度θを、θ＝９０°−（１／２）δ±βとしたことを特徴とする微生物検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の計測を行う微生物検査装置及び微生物検査チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生菌数計測の迅速化および簡便化を目的とした様々な菌数測定装置が知られている。菌数測定装置には、蛍光フローサイトメトリ法を用いたものがある。蛍光フローサイトメトリ法は、蛍光色素によって染色した検体を含む流体が、小さな径の流路を通過するとき、検体を一個ずつ直接計測する粒子計測方法である。
【０００３】
蛍光フローサイトメトリ法において、さらに簡易に微生物を検査するようにした技術として、微生物を含む検体液や蛍光色素を含む試薬液（染色液）を収容する容器を微生物検査チップ内に設け、検体液や試薬液を予め微生物チップ内の各容器に保持させ、この微生物検査チップを検出装置に載置又は挿入し、検体液を微生物検査チップ内の流路を流れるようにし、流路途中に設けられた検出部に励起光を照射させて微生物を計数するようにしたものがある（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１５７８２９号公報
【特許文献２】特開２００９−１７８０７８号公報
【特許文献３】特開２００９−２８１７５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献２では、励起光の反射による迷光の発生を回避し、蛍光量の受光量の減少を回避するために、微生物検出部を光透過性の材料によって形成し、微生物検出部の周囲の少なくとも９０度の範囲を露出させるともに、励起光の光軸を微生物検査チップの主面に対して平行にし、また、蛍光検出の蛍光用集光レンズの中心軸を微生物検査チップの主面に対し直交にするように構成している。励起光の光軸と蛍光用集光レンズの中心軸が直交することから、励起光の反射光を迷光として受光光学系が受光しない。
【０００６】
しかしながら、光学系を簡素化するためには、励起光の光軸と蛍光用集光レンズ（または対物レンズ）の中心軸を同軸とした方が望ましい。また、励起光の光軸と蛍光用集光レンズの中心軸を同軸とした方が位置合わせも容易となる。
【０００７】
本発明は、励起光の光軸と蛍光用集光レンズまたは対物レンズの中心軸を同軸としても、励起光の反射による影響を低減することが可能な微生物検査チップと、それを用いた微生物検査装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の微生物検査チップは、菌体検出部の入射面における法線ベクトルと励起光の光軸が平行とならないように、菌体検出部を傾斜させて微生物検査チップ内に配置するようにしたことを特徴とする。
【０００９】
菌体検出部の表面と励起光の光軸のなす角度をθとすると、θ＝８０〜３０°の範囲となるように、微生物検査チップ内に菌体検出部を傾斜させて設ける（菌体検出部の入射面における法線ベクトルと励起光の光軸の間の角度をαとすると、θ＋α＝９０°であり、θ＝８０〜３０°は、言い換えれば、α＝１０〜６０°となる。）。
【００１０】
θは８０〜７０°がより望ましい（αで言い換えれば、１０〜２０°がより望ましい。）。
【００１１】
また、本発明の微生物検査装置は、上記のように構成した微生物検査チップを、励起光の光軸に対して直角に取り付けることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、励起光の光軸と蛍光用集光レンズの中心軸を同軸としても、励起光の反射は受光光学系に入射し難くなるので、励起光の反射による影響を低減することが可能となる。
【００１３】
また、本発明では、微生物検査チップ内の菌体検出部を傾斜させているので、微生物検査チップ全体を傾斜させて検査装置に取り付ける場合と比較して、微生物検査チップを検出装置に取り付けることが容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の微生物検査チップの構成例を示す図である。
【図２】本発明の微生物検査チップの菌体検出部の構成例を示す図である。
【図３】本発明の微生物検査装置の構成例を示す図である。
【図４】本発明の微生物検査装置におけるＸ方向の位置合わせを説明するための模式図である。
【図５】本発明の微生物検査装置におけるＹ方向の位置合わせを説明するための模式図である。
【図６】本発明の微生物検査装置における微生物検査チップの位置合わせの手順を示す図である。
【図７】本発明の微生物検査装置における検出装置の構成例を示す図である。
【図８】本発明の微生物検査装置における微生物検査の手順を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１６】
本実施例で用いられる微生物検査チップは、本体と該本体に装着された菌体検出部とを有する。本体は、貫通口又は貫通溝である検出用窓枠部を有し、菌体検出部は、検出用窓枠部を覆うように配置されている。菌体検出部は、本体に設けられた流路に接続された菌体検出用流路を有する。菌体検出部は、カバー部材と流路部材を有し、該２個の部材を張り合わせることによって形成される。流路部材は溝を有し、２個の部材を張り合わせることによって、流路部材の溝は、菌体検出用流路を形成する。このような微生物検査チップについて、特許出願人は、先に特願２００８−２６３０５５号として提案している。即ち、微生物検査チップは、ディスポーザブルなものとするために安価であることが求められ、また、検出精度を向上させるためには、微生物検査チップ自体からの誘導放射や蛍光が原因の自家蛍光の発生を抑制することが求められる。特願２００８−２６３０５５号で提案した微生物検査チップは、これらの要求を満たす。
【００１７】
以下の説明では、特願２００８−２６３０５５号で提案した微生物検査チップと微生物検査装置を先ず説明し、その後、本発明の微生物検査チップの実施例を詳しく説明する。
【００１８】
図１は、本発明の微生物検査装置によって用いる微生物検査チップ１０の模式図である。最初に微生物検査チップ１０の構成について説明する。微生物検査チップ１０は、検体中に含まれる食品残渣の除去や菌体の染色を行う本体１５と、菌体を検出するための菌体検出部１７を有する。菌体検出部１７は、外部光源より励起光を照射し、微生物の蛍光を観測するための菌体検出用流路１７３を備える。菌体検出部１７の構造の詳細は後に図２Ａ及び図２Ｂを参照して説明する。ここでは、本体１５について説明する。
【００１９】
本体１５は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、死菌染色色素１５２１を保持する反応容器である死菌染色液保持容器１５２と、全菌染色色素１５３１を保持する反応容器である全菌染色液保持容器１５３と、位置合わせ用試薬１５４１を保持するための位置合わせ用試薬保持容器１５４と、希釈液１５５１を保持するための希釈液保持容器１５５と、検体中に含まれる食品残渣を取り除くためのフィルタである食品残渣除去部１６０と、菌体検出用流路１７３を通過した各種の不要な廃液を廃棄するための検出液廃棄容器１５６とを有する。検出液廃棄容器１５６に廃棄する廃液には、検体１５１１，死菌染色色素１５２１、及び、全菌染色色素１５３１の混合液、並びに、位置合わせ用試薬１５４１がある。
【００２０】
これらの容器１５１，１５２，１５３，１５４，１５５の底面は、漏斗状に形成されている。図示のように、微生物検査チップ１０は、これらの容器の底面が下側になるように立てた状態で保持されている。
【００２１】
本体１５は、更に、検体容器１５１，食品残渣除去部１６０，死菌染色液保持容器１５２，全菌染色液保持容器１５３，菌体検出用流路１７３を連結し、検体１５１１や混合液が流動させるための溶液用流路１５７１〜１５７６と、各容器内の検体１５１１や混合液を気圧により流動させるための通気口１５９１〜１５９６と、通気口１５９１〜１５９６と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８６とを備える。溶液用流路１５７１〜１５７６，通気口１５９１〜１５９６及び通気用流路１５８１〜１５８６は連結する容器の名称から、検体容器−死菌染色液保持容器間流路１５７１，死菌染色液保持容器−全菌染色液保持容器間流路１５７２，全菌染色液保持容器−希釈液保持容器間流路１５７３，希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４，位置合わせ用試薬保持容器−菌体検出用流路間流路１５７５，菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６，検体容器通気口１５９１，死菌染色液保持容器通気口１５９２，全菌染色液保持容器通気口１５９３，希釈液保持容器通気口１５９４，位置合わせ用試薬保持容器通気口１５９５，検出液廃棄容器通気口１５９６，検体容器通気流路１５８１，死菌染色液保持容器通気流路１５８２，全菌染色液保持容器通気流路１５８３，希釈液保持容器通気流路１５８４，位置合わせ用試薬保持容器通気流路１５８５，検出液廃棄容器通気流路１５８６とする。
【００２２】
検体容器１５１，食品残渣除去部１６０，死菌染色液保持容器１５２，全菌染色液保持容器１５３，希釈液保持容器１５５，菌体検出用流路１７３、及び、検出液廃棄容器１５６は、溶液用流路１５７１〜１５７４，１５７６により直列に連結されている。位置合わせ用試薬保持容器−菌体検出用流路間流路１５７５は、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４に合流する。
【００２３】
溶液用流路１５７１〜１５７６の深さおよび流路幅は１０μｍ〜３mm、通気用流路１５８１〜１５８６の深さ及び流路幅は１０μｍ〜３mmの範囲で形成され、溶液用流路１５７１〜１５７６の断面積は通気用流路１５８１〜１５８６の断面積より大きくなるように形成される。本体１５の製造方法は特にここで説明しない。特許文献１〜３で引用しているJournal of Biomolecular Techniques、Vol14、Issue2、pp.119-127や特開２００５−２４５３１７号公報に記載されているように、微生物検査チップの製造方法は既知である。
【００２４】
本体１５を構成する材料について説明する。微生物検査チップ１０はディスポーザブルであるため、本体１５は、安価な材料によって形成される。本体１５は、内部に複雑な構造を有する。従って、本体１５は、微細加工が容易で、且つ、加工費が安価な材料によって形成される。ガラス、及び、石英は、自家蛍光が少なく、光学特性が優れているが、微細加工が容易でない。即ち、微細加工を行うと、加工費が高くなる。本体１５は、処理前の検体や染色液を内部に保持する。そのため、本体１５は、耐薬品性の材料によって形成される。以上より、本体１５に用いる材料には、ポリプロピレン，ポリエチレンテレフタラート，ポリカーボネイト，ポリスチレン，アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂，ポリメタクリル酸メチルエステル等がある。本体１５は、これらの物質から選択された少なくとも１種類の物質によって形成される。
【００２５】
死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，位置合わせ用試薬１５４１は、微生物検査チップ１０内に前もって封入されている。検体１５１１は、検査前に通気口１５９１より、検体容器１５１に注入される。希釈液１５５１は、検査前に通気口１５９４から希釈液保持容器１５５に注入される。
【００２６】
検体１５１１は、検査対象の食品に対して質量比１０倍の生理食塩水を加え、ストマッキング処理を行ったものである。希釈液１５５１は主に生理食塩水もしくは純水もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液である。希釈液１５５１は、洗浄液としても使用される。
【００２７】
死菌染色液１５２１には、例えば、ＰＩ（プロピディウムイオダイド）（０.１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）を使用し、全菌染色液１５４１には、例えば、ＤＡＰＩ（４′，６−ヂアミジン−２′−フェニルインドール）（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ），ＡＯ（アクリジンオレンジ）（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ），ＥＢ（エチジウムブロマイド）（１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ），ＬＤＳ７５１（０.１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）などを使用する。
【００２８】
位置合わせ用試薬１５４１には、ＰＩ，ＤＡＰＩ，ＡＯ，ＥＢ，ＬＤＳ７５１などの蛍光色素や、特定の波長の蛍光を発する微粒子を含んだ溶液を使用する。検出のための光学系を共通化するために、位置合わせ用試薬１５４１の波長ピークは、死菌染色液１５２１又は全菌染色液１５３１の波長ピークに近いほうが好ましい。例えば、位置合わせ用試薬１５４１及び死菌染色液１５２１として、ＰＩ（ピーク波長５３２ｎｍ）を使用し、全菌染色液１５３１として、ＬＤＳ７５１を（ピーク波長７１０ｎｍ）を使用してよい。
【００２９】
次に、微生物検査チップ１０における検体及び溶液の流動方法を説明する。微生物検査チップ１０を用いた生菌数測定では、始めに微生物検査チップ１０の位置合わせ、即ち、菌体検出用流路１７３の位置合わせ、を行い、次に生菌数測定を行う。先ず、位置合わせの工程における位置合わせ用試薬１５４１の流動について説明する。微生物検査チップ１０は、図示のように、容器の漏斗状の底面が下側になるように立てた状態で保持される。位置合わせ用試薬１５４１を、菌体検出用流路１７３を経由して検出液廃液容器１５６に流動させる。位置合わせ用試薬保持容器−菌体検出用流路間流路１５７５の最高点は、位置合わせ用試薬１５４１の水位より高くなるように形成される。従って、位置合わせ用試薬保持容器通気口１６９５及び検出液廃棄容器通気口１５９６が閉じられている限り、位置合わせ用試薬保持容器１５４に保持された位置合わせ用試薬１５４１は、検出液廃棄容器通気口１５９６に流動することはない。そこで、位置合わせ用試薬保持容器通気口１６９５を介し、圧力供給装置１４（図３）からの圧力を加え、位置合わせ用試薬保持容器１５４内の気圧を上昇させる。同時に検出液廃棄容器通気口１５９６を介し、検出液廃液容器１５６を大気開放する。気圧差により、位置合わせ用試薬１５４１は、位置合わせ用試薬保持容器−菌体検出用流路間流路１５７５，菌体検出用流路１７３を経由し、検出液廃棄容器１５６に入る。検出装置１１（図３）からの励起光が菌体検出用流路１７３は照射される。そのため、位置合わせ用試薬１５４１は菌体検出用流路１７３を通過するときに蛍光を発する。この蛍光は、検出装置１１（図３）によって検出される。検出装置１１（図３）によって検出される蛍光が最大となるように、微生物検査チップ１０の位置を調整する。位置合わせ後に希釈液１５５１の一部を菌体検出用流路１７３に流動させる。それによって菌体検出用流路１７３が洗浄され、菌体検出用流路１７３に残存する位置合わせ用試薬１５４１が除去される。
【００３０】
次に生菌数測定の工程における各液体の流動について説明する。
【００３１】
１．検体１５１１を死菌染色液保持容器１５２へ流動させる工程。検体容器−死菌染色液保持容器間流路１５７１の最高点は、検体容器１５１に保持される検体１５１１の水位より高くなるように形成される。従って、検体容器通気口１５９１及び死菌染色液保持容器通気口１５９２が閉じられている限り、検体容器１５１に保持された検体１５１１は、死菌染色液保持容器１５２に流動することはない。通気口１５９１を介し、圧力供給装置１４（図３）からの圧力を加え、検体容器１５１内の気圧を上昇させる。同時に死菌染色液保持容器通気口１５９２を介し、死菌染色液保持容器１５２を大気開放する。気圧差により、検体１５１１は、検体容器１５１から、食品残渣除去部１６０を経由して、死菌染色液保持容器１５２に入り、死菌染色液１５３１と混合する。検体１５１１が食品残渣除去部１６０を通過するとき、検体１５１１中の食品残渣は、食品残渣除去部１６０により取り除かれる。検体１５１１中の死菌は、死菌染色液１５２１により染色される。一方、死菌染色液１５３１は生菌の細胞膜を通過しない。そのため検体１５１１中の生菌は染色されない。
【００３２】
死菌染色液保持容器１５２の体積は、検体１５１１と死菌染色液１５２１の合計体積より大きい。死菌染色液保持容器−全菌染色液保持容器間流路１５７２の最高点は、死菌染色液保持容器１５２に保持される２液の混合液の水位より高くなるように形成される。２液の混合液の水位は、死菌染色液保持容器−全菌染色液保持容器間流路１５７２の最高点を越えず、さらに死菌染色液保持容器１５２中に入っている空気は、死菌染色液保持容器通気口１５９２を介し外部に放出される。死菌染色液保持容器１５２の気圧は大気圧と等しいため、２液の混合液は全菌染色液保持容器１５３に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、死菌染色液保持容器１５２に保持することができる。同様に、全菌染色液１５３１は、全菌染色液保持容器１５３に保持される。即ち、全菌染色液１５３１は、希釈液保持容器１５５に押し出されず、また死菌染色液保持容器１５２に逆流もしない。
【００３３】
このとき、混合液の全菌染色液保持容器１５３への流入を防止するために、各通気口１５９３〜１５９６を介し、圧力供給装置からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで全菌染色液保持容器１５３，希釈液保持容器１５４，位置合わせ用試薬保持容器１５５，検出液廃液容器１５６の気圧を上げてもよい。
【００３４】
なお、染色中は、微生物検査チップ１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが良い。
【００３５】
２．検体１５１１と死菌染色液１５２１の混合液を全菌染色液保持容器１５３に流動させる工程。通気口１５９２を介し、圧力供給装置１４（図３）からの圧力を加え、死菌染色液保持容器１５２内の気圧を上昇させる。同時に全菌染色液保持容器通気口１５９３を介し、全菌染色液保持容器１５３を大気開放する。気圧差により、検体１５１１と死菌染色液１５２１の混合液は、死菌染色液保持容器１５２から全菌染色液保持容器１５３に入り、全菌染色液１５３１と混合する。検体１５１１中の死菌と生菌は、全菌染色液１５３１により染色される。
【００３６】
全菌染色液保持容器１５３の体積は、検体１５１１と死菌染色液１５２１と全菌染色液１５３１の合計体積より大きい。全菌染色液保持容器−希釈液保持容器間流路１５７３の最高点は、全菌染色液保持容器１５３に保持される３液の混合液の水位より高くなるように形成される。全菌染色液保持容器１５３の気圧は大気圧と等しいため、３液の混合液は希釈液保持容器１５４に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、全菌染色液保持容器１５３に保持することができる。
【００３７】
３．検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１の混合液を希釈液保持容器１５４に流動させる工程。通気口１５９３を介し、圧力供給装置１４（図３）からの圧力を加え、全菌染色液保持容器１５３内の気圧を上昇させる。同時に希釈液保持容器通気口１５９４を介し、希釈液保持容器１５４を大気開放する。気圧差により、検体１５１１と死菌染色液１５２１と全菌染色液１５３１の混合液は、全菌染色液保持容器１５３から希釈液保持容器１５４に入り、希釈液１５４１と混合する。それによって、混合液中に含まれる未結合色素（微生物を染色しない死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１）の濃度が低下する。未結合色素の濃度が低下することで、検出の際にノイズの原因となる未結合色素の発する蛍光量を低減することができる。
【００３８】
希釈液保持容器１５５の体積は、検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１及び希釈液１５５１の合計体積より大きい。また、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４の最高点は、４液の混合液の水位より高くなるように形成される。希釈液保持容器１５５の気圧は大気圧と等しいため、４液の混合液は検出液廃棄容器１５６に押し出されず、希釈液保持容器１５５に保持することができる。
【００３９】
４．検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，希釈液１５４１の混合液を菌体検出用流路１７３に流動させる工程。通気口１５９４を介し、圧力供給装置１４（図３）からの圧力を加え、希釈液保持容器１５４内の気圧を上昇させる。同時に検出液廃棄容器通気口１５９６を介し、検出液廃棄容器１５６を大気開放する。気圧差により、希釈された混合液は、希釈液保持容器１５４から菌体検出用流路１７３を経由して、検出液廃棄容器１５６に入る。菌体検出用流路１７３に対して垂直方向より、好ましくは、垂直方向に対して偏奇した角度にて、励起光を照射する。それにより、染色された微生物は蛍光を発する。検出装置１１により蛍光を検出する。全菌染色液１５３１による蛍光のピーク波長は、死菌染色液１５２１による蛍光のピーク波長とは異なる。全菌染色液１５３１による蛍光を検出することによって、生菌と死菌の総数を検出することができる。死菌染色液１５２１による蛍光を検出することによって死菌数を検出することができる。両者の差から、生菌数を得ることができる。
【００４０】
次に、微生物検査チップの菌体検出部１７の詳細について図２に基づき説明する。図２Ａは、菌体検出部の励起光入射面における法線ベクトルに沿った断面を示している。菌体検出部は、図７に示すように微生物検査チップの本体に傾斜して設けられている。この傾斜については、図７の説明において詳述する。
【００４１】
図２Ａは、本体１５と菌体検出部１７の接合部の断面図である。図２Ｂは菌体検出部１７の分解斜視図である。本体１５と菌体検出部１７はそれぞれ別工程で作製し、両者は接合される。先ず、菌体検出部１７の製造方法を説明する。菌体検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に、薄い平板からなる。流路部材１７２には、溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には、貫通孔１７４１，１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。それによって、菌体検出部１７が形成される。流路部材１７２の溝１７３１とカバー部材１７１によって菌体検出用流路１７３が構成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１，１７５１によって、菌体検出用流路入口１７４と菌体検出用流路出口１７５が構成される。
【００４２】
一方、本体１５に形成された希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。同様に、菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４の開口は、菌体検出用流路入口１７４に接続され、菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６の開口は、菌体検出用流路出口１７５に接続されている。
【００４３】
本体１５には検出用窓枠部１６１が形成されている。検出用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検出用窓枠部１６１は、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４の開口と菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６の開口の間に形成されている。菌体検出部１７が製造されると、それを本体１５に装着する。図示のように、本体１５の検出用窓枠部１６１の上に、菌体検出用流路１７３が配置されるように、菌体検出部１７を装着する。
【００４４】
染色された菌体１６２は、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４，菌体検出用流路入口１７４，菌体検出用流路１７３，菌体検出用流路出口１７５，菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６の順に流動する。菌体検出用流路１７３に入射した励起光１１３は、菌体検出用流路１７３を流動する菌体１６２を照射する。それによって菌体１６２は蛍光１２１を発し、検出装置１１（図３）により検出される。
【００４５】
本例によると、菌体検出用流路１７３の背後に、本体１５の貫通孔又は貫通溝である検出用窓枠部１６１が設けられている。従って、励起光１１３は、菌体検出部１７のみを照射し、本体１５を照射しない。背景光の増加の原因となる本体１５からの反射光や自家蛍光は発生しない。菌体検出用流路１７３を通過した励起光１１３が、本体１５に照射されないためには、検出用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１１３の放射方向に沿って増加することが好ましい。
【００４６】
図２Ａに示す例では、菌体検出用流路１７３の中心軸線は、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４及び菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６の中心軸線に対して、偏奇している。即ち、菌体検出用流路１７３は、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４及び菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６と同一線上に配置されていない。しかしながら、菌体検出用流路１７３が、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４及び菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６と同一線上に配置されるように構成されてよい。この場合、菌体検出用流路１７３は、希釈液保持容器−菌体検出用流路間流路１５７４及び菌体検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６と直接接続される。
【００４７】
カバー部材１７１の厚さは、０.０１μｍ〜１mmである。流路部材１７２の厚さは、０.０１μｍ〜１mmである。菌体検出用流路１７３の断面形状は、正方形，長方形、又は、台形である。菌体検出用流路１７３の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうがよい。菌体検出用流路１７３の断面の一辺は、１μｍ〜１mmが好ましく、長さは、０.０１mm〜１０mmが好ましい。菌体検出用流路１７３に照射する励起光の光軸は、菌体検出用流路１７３の方向ベクトルに対して垂直になる。
【００４８】
菌体検出部１７を構成する材料について説明する。微生物検査チップ１０はディスポーザブルである。即ち、使用後、菌体検出部１７は本体１５と共に廃棄する。そのため、菌体検出部１７に用いる材料は、安価でなければならない。菌体検出部１７に用いる材料は、蛍光計測に好適なように、光学特性に優れている必要がある。即ち、自家蛍光が低く、光透過性，面精度，屈折率などに優れていることが望ましい。菌体からの蛍光の検出を阻害しないためには、菌体検出部１７自身が発生する自家蛍光量が、菌体からの蛍光量に比べて十分小さいことが好ましい。
【００４９】
菌体検出部１７の表面に、曲面，凹凸等が存在すると、表面における光の屈折、又は、乱反射により菌体計測用流路１７３に照射される励起光１１３の光量が変動する。そのため、検出される蛍光量も変動し、計測精度が低下する。そのため、菌体検出部１７の表面は、所望の平面度を有する必要がある。菌体検出部１７は、凹凸が０.１mm以下の平面度を有することが好ましい。
【００５０】
このような条件を考慮すると、菌体検出部１７に用いる材料には、ガラス，石英，ポリメタクリル酸メチルエステル（ＰＭＭＡ），ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ），シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ），ポリエチレンテレフタラート，ポリカーボネイト等が考えられる。菌体検出部１７は、これらの物質から選択された１種類以上の物質から形成される。菌体検出部１７は好ましくは、本体１５と同一の材料によって形成する。特に、流路部材１７２は、本体１５と同一の材料によって形成する。
【００５１】
カバー部材１７１は単なる平板であるが、流路部材１７２は平板に溝及び貫通孔を形成したものである。従って、流路部材１７２は、微細加工が容易で、且つ、加工費が安価な材料によって形成される。ガラス、及び、石英は、光学特性が優れているが、微細加工が容易でない。即ち、微細加工を行うと、加工費が高くなる。
【００５２】
そこで、カバー部材１７１をガラス又は石英によって構成し、流路部材１７２をポリメタクリル酸メチルエステル，ポリジメチルシロキサン，シクロオレフィンポリマー，ポリエチレンテレフタラート，ポリカーボネイトによって構成してよい。好ましくは、流路部材１７２をポリジメチルシロキサンによって構成してよい。この場合、カバー部材１７１と流路部材１７２の接合は、ポリジメチルシロキサンの自己接着性を利用する。
【００５３】
菌体検出部１７の自家蛍光量は、材料ばかりでなく、菌体検出部の厚さ寸法にも依存する。自家蛍光量を少なくするには、菌体検出部の厚さ寸法を小さくすればよい。菌体検出部１７の厚さが小さいほど、菌体検出部１７から発生する自家蛍光量は少なくなる。しかしながら、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さ寸法を小さくすると、製造が困難になり、平面度が悪化する。必要な平面度を保ち、菌体の蛍光の検出を阻害しないように自家蛍光量を抑制するには、これらの部品の厚さ寸法は、所定の範囲に制限するする必要がある。
【００５４】
ガラス，石英，ポリジメチルシロキサンの自家蛍光量はほぼ同等である。カバー部材１７１を、ガラス、又は、石英によって製造する場合、その厚さは、０.０５mm以上１mm以下が好ましい。流路部材１７２を、ポリジメチルシロキサンによって製造する場合、その厚さは０.１mm以上１mm以下が好ましい。
【００５５】
また、カバー部材１７１及び流路部材１７２を、シクロオレフィンポリマー，ポリメタクリル酸メチルエステル，ポリエチレンテレフタラート、又は、ポリカーボネイトによって製造してもよい。この場合、ガラス、又は、石英によってカバー部材１７１を製造し、ポリジメチルシロキサンによって流路部材１７２を製造する場合より、単位体積あたりの自家蛍光量が約３倍以上増加する。そのため、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さは０.０１mm以上０.３mm以下が好ましい。
【００５６】
図３は、本発明の微生物検査装置１の構成図である。微生物検査装置１は、菌体検出部１７を有する微生物検査チップ１０，微生物検査チップ１０をＸＹ方向に移動させるためのＸ−Ｙステージ１２５，微生物検査チップ１０の菌体検出部１７に励起光を照射し、そこからの蛍光を検出する検出装置１１、及び、微生物検査チップ１０に所定の圧力の気体を供給する圧力供給装置１４を有する。微生物検査装置１には、システム装置１８及び出力装置１９が接続されている。微生物検査チップ１０は、図１を参照して説明した。Ｘ−Ｙステージ１２５は、微生物検査チップ１０を保持（載置または挿入などにより保持）し、システム装置１８からの命令信号により、微生物検査チップ１０をＸＹ方向に移動させ、その位置合わせを行う。図示のように、水平面上にＸ軸とＹ軸をとる。Ｘ軸は、菌体検出部１７の菌体検出用流路１７３に照射される励起光に垂直であり、Ｙ軸は、励起光に平行である。
【００５７】
圧力供給装置１４は、圧力調節装置付のボンベ１４１を有する。ボンベ１４１には高圧の空気，不活性気体等が封入されている。ボンベ１４１と微生物検査チップ１０の各通気口１５９１〜１５９６（図１）は、チップ連結管１４４１〜１４４６によって接続されている。チップ連結管１４４１〜１４４６には、バルブ１４２１〜１４２６がそれぞれ設けられている。バルブ１４２１〜１４２６を開閉することにより、微生物検査チップ１０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査チップ１０の容器を大気開放する。それによって、図１を参照して説明したように、微生物検査チップ１０内にて検体や試薬の搬送を行う。
【００５８】
検出装置１１は、励起光源１１１，励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２，対物レンズ１１４，バンドパスフィルタ１１７，集光レンズ１１８，ピンホール１１９、及び、光検出器１２０を有する。励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２は、励起光１１３を反射させ、蛍光を透過させる機能を有する。即ち、励起光１１３が有する波長付近の波長帯の光を反射し、蛍光が有する波長付近の波長帯の光を透過させる。励起光１１３の光軸と対物レンズ１１４の中心軸が一致するように、励起光源１１１，励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２、及び、対物レンズ１１４は配置される。それによって、対物レンズ１１４と集光レンズ１１８からなるレンズ系の焦点に励起光１１３は集光される。
【００５９】
位置合わせを行うときには、位置合わせ用試薬１５４１を菌体検出用流路１７３に流動させる。菌体数の計測を行うときは、検体を菌体検出用流路１７３に流動させる。
【００６０】
励起光源１１１より出力された励起光１１３は、励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２を反射し、対物レンズ１１４によって集光され、菌体検出用流路１７３に照射される。菌体検出部１７の菌体検出用流路１７３を通過する微生物もしくは位置合わせ用試薬からの蛍光１２１は、対物レンズ１１４によって平行光線化され、励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２を透過し、バンドパスフィルタ１１７を通過し、集光レンズ１１８によって集光され、ピンホール１１９を経由して、光検出器１２０に到達する。ピンホール１１９は、迷光をカットするための空間フィルタとして機能する。検出装置１１からの電気信号は、システム装置１８に送られる。システム装置１８は、電気信号を処理し、得られた計測結果を出力装置１９に出力する。
【００６１】
図４及び図５を参照して、菌体検出用流路１７３の位置合わせ方法を説明する。菌体検出用流路１７３に照射される励起光１１３の光軸に平行に、Ｙ軸をとり、励起光１１３の光軸に垂直にＸ軸をとる。図４及び図５は、菌体検出部１７をＸＹ平面に平行な面によって切断したときの、菌体検出用流路１７３と励起光１１３の位置を模式的描いたものである。
【００６２】
図４を参照して、菌体検出用流路１７３のＸ方向の位置決め方法を説明する。菌体検出用流路１７３に位置合わせ用試薬１５４１を流動させ、Ｘ−Ｙステージ１２５により、微生物検査チップ１０をＸ方向に移動させる。図４Ａに、移動前の菌体検出用流路１７３のＸ方向の位置１７３ａと移動後の菌体検出用流路１７３のＸ方向の位置１７３ｂを示す。図４Ｂに、菌体検出用流路１７３のＸ方向の位置と検出装置１１（図３）によって検出される蛍光量Ｉの関係を示すグラフ１２８の例を示す。菌体検出用流路１７３が励起光１１３の光軸上を通過するとき蛍光量Ｉは最大となる。従って、蛍光量Ｉは最大となるときに、Ｘ−Ｙステージ１２５によりＸ方向の位置を設定すればよい。
【００６３】
図５を参照して、菌体検出用流路１７３のＹ方向の位置決め方法を説明する。菌体検出用流路１７３に位置合わせ用試薬１５４１を流動させ、Ｘ−Ｙステージ１２５により、微生物検査チップ１０をＹ方向に移動させる。図５Ａに、移動前の菌体検出用流路１７３のＹ方向の位置１７３ｃと移動後の菌体検出用流路１７３のＹ方向の位置１７３ｄを示す。図５Ｂは、菌体検出用流路１７３のＹ方向の位置と検出装置１１（図３）によって検出される蛍光量Ｉの関係を示すグラフ１２９の例を示す。菌体検出用流路１７３が励起光１１３の光軸上を通過するとき蛍光量Ｉは最大となる。従って、蛍光量Ｉは最大となるときに、Ｘ−Ｙステージ１２５によりＹ方向の位置を設定すればよい。
【００６４】
図６を参照して、微生物検査チップ１０の位置合わせ、即ち、菌体検出用流路１７３の位置合わせの手順を説明する。ステップＳ１０１にて、微生物検査チップ１０をＸ−Ｙステージ１２５上に装着し、菌体検出用流路１７３に位置合わせ用試薬１５４１を流動させる。位置合わせ用試薬１５４１として、例えばＰＩ（波長ピーク５３２ｎｍ）を使用してよい。ステップＳ１０２にて、Ｘ−Ｙステージ１２５によって、微生物検査チップ１０を励起光１１３の光軸に対し垂直方向に移動させる。即ち、図４Ａに示したように、微生物検査チップ１０をＸ方向に移動させる。同時に、図４Ｂに示したように、Ｘ方向の位置と検出装置１１によって検出される蛍光量Ｉのプロファイルの関係を取得する。このプロファイルは、システム装置１８（図３）に格納する。ステップＳ１０３にて、蛍光量Ｉが最大となる位置、又は、Ｘ方向に対する蛍光量Ｉの一次微分が０となる位置（Ｘ＝Ｘc）を求める。こうして、Ｘ方向の位置が得られる。その位置に微生物検査チップ１０を移動させる。
【００６５】
次に、ステップＳ１０４にて、Ｘ−Ｙステージ１２５によって、微生物検査チップ１０を励起光１１３の光軸に対し平行方向に移動させる。即ち、図５Ａに示したように、微生物検査チップ１０をＹ方向に移動させる。同時に、図５Ｂに示したように、Ｙ方向の位置と検出装置１１によって検出される蛍光量Ｉのプロファイルの関係を取得する。このプロファイルは、システム装置１８（図３）に格納する。ステップＳ１０５にて、蛍光量Ｉが最大となる位置、又は、Ｙ方向に対する蛍光量Ｉの一次微分が０となる位置（Ｙ＝Ｙc）を求める。ステップＳ１０２及びステップＳ１０３は、Ｘ方向の位置決めであり、ステップＳ１０４及びステップＳ１０５は、Ｙ方向の位置決めである。Ｘ方向の位置決めとＹ方向の位置決めを繰り返すことによって、高精度の位置合わせが可能となる。
【００６６】
尚、位置合わせの仕方については、上述の構造，方法の他に、特許出願人が先に提案した特願２００９−１０９１５３号に記載の構造，方法を用いることができる。
【００６７】
図７を参照して、本発明による微生物検査装置の検出装置の構成例を説明する。本例の検出装置１１は、食品由来の検体中の生菌数を計測するのに好適である。即ち、本例の検出装置では、生菌数と死菌数を判別する。検出装置の光学系は、蛍光色素の励起スペクトルと蛍光スペクトルによって異なる場合もある。ここでは、死菌染色液としてＰＩ（励起波長ピーク５３２ｎｍ，蛍光波長ピーク６１５ｎｍ）を使用し、全菌染色液としてＬＤＳ７５１（励起波長ピーク５４１ｎｍ，蛍光波長ピーク７１０ｎｍ）を使用する場合を説明する。本例の検出装置の光学系は、２種類の蛍光色素を使用する場合に好適に構成されている。
【００６８】
本例では、光学系を簡素化するために、励起光の光軸と蛍光用集光レンズの中心軸を同軸としている。また、励起光の光軸と蛍光用集光レンズの中心軸を同軸とすることにより位置合わせが一度に行えて容易となる。検出装置１１は、励起光源１１１（波長５３２ｎｍ）と、励起光１１３を反射し、菌体の蛍光を透過する励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２と、菌体検出用流路１７３を通過する微生物からの蛍光を集光し、平行光にする対物レンズ１１４と、波長６１０ｎｍ以下の光を反射し、波長６１０ｎｍ以上の光を通過させる蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５と、ミラー１１６と、波長６１０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる短波長用バンドパスフィルタ１１７１と、波長７１０ｎｍ近傍の波長の光を通過させる長波長用バンドパスフィルタ１１７２と、平行光を集光させるための短波長用集光レンズ１１８１，長波長用集光レンズ１１８２と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いる短波長用ピンホール１１９１，長波長用ピンホール１１９２と、短波長用バンドパスフィルタ１１７１を通過した光を検出する短波長用光検出器１２０１と、長波長用バンドパスフィルタ１１７２を通過した光を検出する長波長用光検出器１２０２とを有する。
【００６９】
励起光源１１１はレーザーを使用し、短波長光検出器１２０１と長波長光検出器１２０２はフォトマルを使用する。上述のように、微生物検査チップ１０の菌体検出用流路１７３の位置合わせは完了しているものとする。対物レンズ１１４の焦点の位置に、微生物検査チップ１０の菌体検出用流路１７３が配置されている。
【００７０】
励起光源１１１から出力された励起光（波長５３２ｎｍ）は、励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２を反射し、菌体検出用流路１７３に照射される。それによって、菌体検出用流路１７３を流れる微生物を染色したＰＩおよびＬＤＳ７５１は励起される。死菌染色液ＰＩからの蛍光１２１１（ＰＩは中心波長６１０ｎｍ）、及び、全菌染色液ＬＤＳ７５１からの蛍光１２１２（中心波長７１０ｎｍ）は対物レンズ１１４に入射する。死菌染色液ＰＩからの蛍光１２１１は蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５で反射し、全菌染色液ＬＤＳ７５１からの蛍光１２１２は蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５を通過する。こうして、２つの色素由来の蛍光は波長の違いにより分離できる。死菌染色液ＰＩからの蛍光１２１１は短波長用バンドパスフィルタ１１７１を通過し、短波長用集光レンズ１１８１によって集光され、短波長用ピンホール１１９１を通過し、短波長用光検出器１２０１に入射する。全菌染色液ＬＤＳ７５１からの蛍光１２１２は長波長用バンドパスフィルタ１１７２を通過し、長波長用集光レンズ１１８２によって集光され、長波長用ピンホール１１９２を通過し、長波長用光検出器１２０２に入射する。
【００７１】
短波長用光検出器１２０１及び長波長用光検出器１２０２によって検出された蛍光は、それぞれ電気信号に変換され、電気信号はシステム装置１８（図３）に送られる。システム装置１８は、短波長用光検出器１２０１，長波長用光検出器１２０２から送られた電気信号を処理し、微生物数の情報を検査結果として、出力装置１９（図３）に出力する。短波長用光検出器１２０１の出力より、死菌数が得られ、長波長用光検出器１２０２の出力より、全菌数が得られる。両者の差から生菌数が得られる。
【００７２】
特願２００８−２６３０５５号では、励起光源の励起光の一部が菌体検出部で表面反射し、検出装置に戻る可能性があることから、菌体検出部の法線ベクトルと励起光の光軸が平行とならないように、微生物検査チップ全体を検査装置に対して傾斜させて位置するようにし、反射光が検出装置に戻らないようにしている。これに対して、本実施例では、本体１５の平面に対して菌体検出部１７をθだけ傾けて重ね合わせて構成している。
【００７３】
即ち、菌体検出部１７の表面では、励起光源１１１からの励起光１１３の一部が反射し、検出装置１１に戻る可能性がある。それを防止するために、菌体検出部１７の法線ベクトル（図示省略）と励起光１１３の光軸は平行とならないようにしている。即ち、菌体検出部１７の表面と励起光１１３の光軸のなす角度をθとすると、θ＝８０〜３０°の範囲となるように、図７に示すように、微生物検査チップ１０内（本体１５）に菌体検出部１７を傾斜させて設ける（菌体検出部１７の入射面における法線ベクトルと励起光の光軸の間の角度をαとすると、θ＋α＝９０°であり、θ＝８０〜３０°は、言い換えれば、α＝１０〜６０°となる。）。αの最小値は対物レンズ１１４の立体角δのおおよそ１／２である。そのため使用する対物レンズによってαの最適値は変わる。本実施例では光の集光効率や焦点深度を考慮し立体角が３４゜の対物レンズ１１４を使用している。この場合、αは１７°前後が最適となる（θで言えば７３°前後）。δを小さくするとαも小さくなるが、δが小さいレンズは光を集めにくいことから、αの最小値は１０°くらいとなる（θで言えば８０°くらい）。αの最適値からの誤差範囲は、励起光（レーザー光）の入射角を考慮して決められる。励起光（レーザー光）の入射角βは、対物レンズに入射するレーザー光の直径をｄ、レンズと焦点までの距離をＬとすると、β＝arctan（(ｄ／２)／Ｌ）で求められる。これらを考慮すると、θは８０〜７０°がより望ましい（αで言い換えれば、α＝１０〜２０°がより望ましい。）。αが大きい程、励起光の反射光は受光光学系に入りにくくなるが、ガラス層（屈折率１.５）から流路層（水：屈折率１.３）の全反射の臨界角が約６０゜となることから、αは６０°までとする。反射光の影響を低減するには、αは１０°以上とした方が良く、効果をより効果的にするには、１０〜２０°が最も望ましい。
【００７４】
尚、菌体検出部１７の法線ベクトルと励起光１１３の光軸が平行とならないように、菌体検出部１７を傾斜させるが、励起光は、菌体検出用流路１７３（流れ方向）に対して垂直方向より照射する。
【００７５】
また、本体１５に菌体検出部１７をθだけ傾けて重ね合わせて構成した微生物検査チップ１０を検出装置（Ｘ−Ｙステージ１２５など）取り付ける際には、励起光１１３の光軸に対して直角にするようにすれば良いので、微生物検査チップ内に菌体検出部を傾斜させないで設けて微生物検査チップ全体を励起光１１３の光軸に対して傾斜させて検出装置に取り付ける場合と比較して、検出装置への取り付けが容易となる。
【００７６】
図８及び図１を参照して、本発明の微生物検査チップ１０を用いて、食品由来の検体中の生菌数を計測する手順を説明する。死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，位置合わせ用試薬１５４１は、微生物検査チップ１０内に前もって封入されている。希釈液１５５１は、検査前に希釈液保持容器１５５に注入される。ステップＳ２０１にて、検体１５１１を、通気口１５９１より、検体容器１５１に注入する。検体１５１１は、検査対象の食品に対して質量比１０倍の生理食塩水を加え、ストマッキング処理を行ったものである。ステップＳ２０２にて、微生物検査チップ１０を、微生物検査装置のＸ−Ｙステージ１２５に装着する。ステップＳ２０３にて、微生物検査チップの位置合わせ、即ち、菌体検出用流路１７３の位置合わせを行う。位置合わせは、図６を参照して説明したように、位置合わせ用試薬１５４１を、菌体検出用流路１７３に流動させることにより行う。ステップＳ２０４にて、菌体検出用流路１７３に希釈液を流し、流路に付着した位置合わせ用試薬１５４１を洗浄する。
【００７７】
ステップＳ２０５〜ステップＳ２１１は、検体の生菌数の計測処理である。ステップＳ２０５にて、検体１５１１を、検体容器１５１から、食品残渣除去部１６０を経由して、死菌染色液保持容器１５２に流動させる。ステップＳ２０６にて、攪拌により、検体１５１１と死菌染色液１５３１を混合させる。検体１５１１中の死菌は、死菌染色液１５２１により染色されるが、検体１５１１中の生菌は染色されない。ステップＳ２０７にて、検体１５１１と死菌染色液１５２１の混合液を全菌染色液保持容器１５３に流動させる。ステップＳ２０８にて、攪拌により、検体１５１１と死菌染色液１５２１の混合液を、全菌染色液１５３１と混合させる。ステップＳ２０９にて、検体１５１１，死菌染色液１５２１、及び、全菌染色液１５３１の混合液を希釈液保持容器１５４に流動させる。ステップＳ２１０にて、攪拌により、検体１５１１，死菌染色液１５２１、及び、全菌染色液１５３１の混合液を、希釈液１５４１と混合させる。希釈液１５４１を付加することによって、混合液中に含まれる未結合色素の濃度が低下する。未結合色素の濃度が低下することで、検出の際にノイズの原因となる未結合色素の発する蛍光量を低減することができる。ステップＳ２１１にて、検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１、及び、希釈液１５４１の混合液を菌体検出用流路１７３に流動させる。菌体検出用流路１７３に対して垂直方向より、励起光を照射する。但し、菌体検出部１７の法線ベクトルと励起光１１３の光軸は平行でないことが好ましい。それにより、菌体検出用流路１７３を流れる染色された微生物は蛍光を発する。検出装置１１により蛍光を検出する。全菌染色液１５３１による蛍光を検出することによって、生菌と死菌の総数を検出することができる。死菌染色液１５２１による蛍光を検出することによって死菌数を検出することができる。両者の差から、生菌数を得ることができる。
【００７８】
以上本発明の例を説明したが本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは、当業者によって容易に理解されよう。
【符号の説明】
【００７９】
１  微生物検査装置
１０  微生物検査チップ
１１  検出装置
１４  圧力供給装置
１５  本体
１７  菌体検出部
１８  システム装置
１９  出力装置
１１１  励起光源
１１２  励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー
１１３  励起光
１１４  対物レンズ
１１５  蛍光分離用ダイクロイックミラー
１１６  ミラー
１１７  バンドパスフィルタ
１１８  集光レンズ
１１９  ピンホール
１２０  光検出器
１２１  蛍光
１２５  Ｘ−Ｙステージ
１２７  Ｘ方向位置と出力値の関係
１２８  Ｙ方向位置と出力値の関係
１５１  検体容器
１５２  死菌染色液保持容器
１５３  全菌染色液保持容器
１５４  位置合わせ用試薬保持容器
１５５  希釈液保持容器
１５６  検出液廃棄容器
１５７  溶液用流路
１５８  通気用流路
１５９  通気口
１６０  食品残渣除去部
１６１  検出用窓枠部
１６２  菌体
１７１  カバー部材
１７２  流路部材
１７３  菌体検出用流路
１７４  菌体検出用流路入口
１７５  菌体検出用流路出口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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