(57)【要約】 【課題】神経細胞の維持や修復に用いる薬剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】神経細胞の維持や修復に用いる薬剤の同定方法であって、グリア細胞において、候補薬剤の存在下での脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を測定する工程を含んでなる方法が提供される。この方法では、ＢＤＮＦの発現が亢進された場合に、その候補薬剤が神経細胞の維持や保護に用いる薬剤として有効であると判定される。【効果】脳虚血後の神経細胞障害保護及び修復、種々の神経変性疾患、正常眼圧緑内障等の治療に用いることが期待できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳細胞の維持及び／又は修復する薬剤の同定方法であって、前記脳細胞を構成するグリア細胞において、候補薬剤の存在下におけるＢＤＮＦの発現を測定し、前記候補薬剤により前記ＢＤＮＦの発現が亢進された場合に、前記候補薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする薬剤の同定方法。
【請求項２】
前記ＢＤＮＦのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現が亢進された場合に、前記候補薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする、請求項１に記載の薬剤の同定方法。
【請求項３】
前記グリア細胞がアストロサイトであることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤の同定方法。
【請求項４】
候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合と、ＡＴＰ分解酵素と候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合とを比較し、前記ＡＴＰ分解酵素存在下の方が、ＢＤＮＦの発現が有意に抑えられている場合に、前記薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の薬剤の同定方法。
【請求項５】
候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合と、ＡＴＰ受容体であるＰ２Ｙ１特異的阻害剤と候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合を比較し、前記Ｐ２Ｙ１特異的阻害剤存在下の方が、ＢＤＮＦの発現が有意に抑えられている場合に、前記薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の薬剤の同定方法。
【請求項６】
前記グリア細胞を候補薬剤存在下で培養し、培地内のＡＴＰ濃度が上昇している場合に、前記候補薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の維持や修復に有用な薬剤のスクリーニング関するものであり、より具体的には、グリア細胞のひとつであるアストロサイトで脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）の発現を亢進する薬剤で、脳虚血後または外傷後の神経細胞障害保護及び修復や正常眼圧緑内障の治療に有用な薬剤のスクリーニング法、およびその薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳虚血や外傷によって、神経細胞の障害が起こる。また、うつ病や過剰なストレスによっても、神経細胞の萎縮等障害が起こることが知られている。他にも、アルツハイマー病等の神経変性疾患で神経細胞の障害・萎縮が観察される。これら神経障害・萎縮の原因は疾患ごとに異なるが、神経細胞を構成する細かい樹状突起、軸索が退縮し、結果として神経細胞の退縮、機能障害が引き起こされる（非特許文献１）。
【０００３】
神経細胞の障害や萎縮等の治療には、神経細胞を直接のターゲットとする薬剤が開発されてきた。例えば、脳卒中後の神経細胞障害はグルタミン酸神経細胞の過剰活動による興奮毒性により惹起されることから、神経細胞のグルタミン酸受容体を阻害する化学物質が多く開発された（特許文献１、２）。
【０００４】
しかし、グルタミン酸神経伝達は、通常の脳内の興奮性伝達に必須であること、また記憶・学習などの脳高次機能と非常に強く関連していることから、グルタミン酸受容体を阻害する薬剤を臨床応用するには至っていない。この様に、神経細胞の活動は両刃の剣であり、その活動が過剰であっても過小であっても脳機能の障害が惹起される（非特許文献２）。
【０００５】
その他、うつ病や過剰なストレスによって、神経細胞における脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）の発現が著しく減少するという知見もある。ＢＤＮＦは、神経細胞の新生、生存、成長、シナプスの機能亢進など、神経細胞の成長を調節する脳細胞の増加には不可欠な神経系の液性タンパク質である。
【０００６】
しかしながら、ＢＤＮＦはペプチドであるため、ＢＤＮＦ自体を薬剤として使用することは難しい。よって、ＢＤＮＦの発現を亢進させる薬剤を摂取する方法が考えられる(特許文献３)。
【０００７】
うつ病の治療に用いる抗うつ剤には、ＢＤＮＦの発現を亢進する作用があることが報告されている（非特許文献３）。これまで抗うつ剤の効果は、抗うつ剤が神経細胞のセロトニントランスポーターに作用し、セロトニンの再取り込みを阻害することにより、シナプス間のモノアミン量を増やすためと考えられていた。
【０００８】
しかし最近では、セロトニン系を賦活することによって神経細胞におけるＢＤＮＦの発現が誘導され、うつ病による神経萎縮が改善される効果があるとも考えられるようになっている。しかし、神経細胞の障害や萎縮に対する薬剤として使用されるまでには至っていない。
【０００９】
以上のように、これまでの神経細胞をターゲットとした研究からは、神経細胞の障害の治療や保護に効果的な薬剤の開発は難しい状況にある。
一方で、神経系を構成する神経細胞以外の細胞であるグリア細胞に対しては、これまでほとんど目を向けられてこなかった。グリア細胞は、電気生理学的に不活発であり、神経細胞のような長い軸策突起も持たないので、情報の授受、伝導及び伝達には適切な細胞とは考えられず、当然のように高次脳機能の発現に直接係るとは考えられていなかった。
【００１０】
グリア細胞の機能としては、神経細胞の物理的支持、栄養因子放出、老廃物除去など、神経細胞を支える裏方として働いていると考えられるに過ぎなかったのである。よって、グリア細胞を対象に、脳機能維持や修復を目的とした薬剤は、これまで全く開発されてきていない。
【００１１】
しかし、最近では、グリア細胞が、神経細胞の活動をダイナミックに制御しているとして注目を集めている（非特許文献４）。高等動物の脳には、ニューロンをはるかに越えるグリア細胞が存在する。ヒトの脳においては、神経細胞の１０倍もの数を占める。特に、グリア細胞で最大数を占めるアストロサイトは、神経細胞に寄り添い、シナプスを覆うように存在する。そして、ほとんどすべての神経伝達物質受容体を発現しており、各種神経伝達物質に即時的に応答する。
【００１２】
また、活動依存的にグルタミン酸及びＡＴＰなどの液性伝達物質を放出する信号発信機能を有することなどから、第三のシナプスとして注目されている。以上から、グリア細胞−神経細胞間の積極的なコミュニケーションが脳機能のダイナミズムに重要であり、特にアストロサイト−神経細胞間の協力によってシナプス伝達が成り立っている可能性が強く示唆されている。
【００１３】
よって、グリア細胞から神経細胞に対して、神経細胞の保護や障害の修復を促す信号を発信する薬剤を発見できれば、細胞脳機能の維持や修復に有効な治療法になると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００２−２６５３５９号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９６／２５９２７号公報
【特許文献３】特開２００９−８４２７１号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｕｃｋｎｅｒ ＲＬ． Ｍｅｍｏｒｙ ＡＮＤ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｉｎｇ ＡＮＤ ＡＤ: ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ＡＮＤ ｒｅｖｅｒｓｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ． Ｎｅｕｒｏｎ， ２００４， ４４: １９５−２０８．
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｏｎ， ＭＰ． Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ， ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ: ａ ｔｅｅｔｅｒ−ｔｏｏｔｅｒ ｍｏｄｅｌ ＦＯＲ ｎｅｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ＡＮＤ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２６８: ２１１−２２０．
【非特許文献３】Ｓａｎｔａｒｅｌｌｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＦＯＲ ｔｈｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００３， ３０１: ８０５−８０９．
【非特許文献４】Ｈａｙｄｏｎ ＰＧ． ＧＬＩＡ． Ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ ＡＮＤ ｔａｌｋｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎａｐｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ２００１， ２:１８５−１９３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
脳機能の維持や修復を可能とするため、神経細胞の保護や障害に対する治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法、およびその薬剤を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、これまで軽視されてきたグリア細胞に着目し、グリア細胞においてもＢＤＮＦが発現するかを検討し、グリア細胞においてもＢＤＮＦ発現することを発見した。さらに、抗うつ剤によってグリア細胞におけるＢＤＮＦの発現が亢進することも見出した。
【００１８】
本発明はこれらの知見にもとづくものである。
【００１９】
請求項１に記載の発明は、脳細胞の維持及び／又は修復する薬剤の同定方法であって、
前記脳細胞を構成するグリア細胞において、候補薬剤の存在下におけるＢＤＮＦの発現を測定し、前記候補薬剤により前記ＢＤＮＦの発現が亢進された場合に、前記候補薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする。
【００２０】
前述の通り、ＢＤＮＦは、神経細胞の新生、生存、成長、シナプスの機能亢進など、神経細胞の成長を調節する脳細胞の増加には不可欠な神経系の液性タンパク質であり、神経細胞よりも１０倍多く存在するグリア細胞でＢＤＮＦの発現量が増加すれば、脳細胞の維持や修復に有効な薬剤と考えることができる。
【００２１】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の同定方法であって、前記ＢＤＮＦのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現が亢進された場合に、前記候補薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする。ＢＤＮＦの発現の亢進は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の量を測定することで判定できる。
【００２２】
請求項３の発明は、請求項１又は２に記載の同定方法であって、前記グリア細胞がアストロサイトであることを特徴とする。アストロサイトは、グリア細胞の中で最も数が多く、また炎症・障害時の細胞応答や神経伝達物質の除去・イオン恒常性保持など、多岐にわたる役割を有している。さらに、アストロサイトはほとんどすべての神経伝達物質受容体を発現しており、各種神経伝達物質に即時的に応答すること、また種々の細胞外液性因子を放出することが知られているため、アストロサイトを用いることとした。
【００２３】
請求項４の発明は、請求項１から３のいずれかに記載の発明であって、候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合と、ＡＴＰ分解酵素と候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合とを比較し、前記ＡＴＰ分解酵素存在下の方が、ＢＤＮＦの発現が有意に抑えられている場合に、前記薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする。
【００２４】
ＡＴＰは、アストロサイトから放出され、情報伝達物質として働くことが報告されている。さらに、このＡＴＰがアストロサイトを含む他のグリア細胞や神経細胞との積極的な情報交換に重要であることが知られている。
【００２５】
発明者は、ＢＤＮＦの発現の亢進においても、このＡＴＰが係っていること、より具体的には、ＡＴＰシグナル経路の活性化によりＢＤＮＦの発現が亢進することを発見した。ＡＴＰ生合成の亢進又はＡＴＰの分解の抑制がおこると、アストロサイトの細胞膜上に発現しているＡＴＰ受容体のＰ２Ｙ１受容体に結合するＡＴＰが増加するため、細胞内に伝達されるシグナルが増強され、ＢＤＮＦの発現が亢進される。
【００２６】
請求項５の発明は、請求項１から３のいずれかに記載の発明であって、候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合と、ＡＴＰ受容体であるＰ２Ｙ１受容体特異的阻害剤と候補薬剤の存在下における前記グリア細胞のＢＤＮＦの発現の亢進割合を比較し、前記Ｐ２Ｙ１受容体特異的阻害剤存在下の方が、ＢＤＮＦの発現が有意に抑えられている場合に、前記薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする。
【００２７】
請求項６の発明は、請求項１から３のいずれかに記載の発明であって、前記グリア細胞を候補薬剤存在下で培養し、培地内のＡＴＰ濃度が上昇している場合に、前記候補薬剤を脳細胞の維持及び／又は修復に有効な薬剤として同定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、グリア細胞をターゲットして、グリア細胞におけるＢＤＮＦの発現を亢進させ、ＡＴＰシグナル経路を賦活する薬剤は、神経細胞の障害を治療および保護し、脳機能を修復及び維持することを目的とした薬剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例において、種々の抗うつ剤によって、アストロサイトにおけるＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現が亢進することを示したグラフである。
【図２】実施例において、抗うつ剤fｌｕｏｘｅｔｉｎｅが、アストロサイトにおけるＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現を濃度依存的に亢進させることを示したグラフが図２（ａ）であり、刺激時間によるＢＤＮＦの発現量の変化を示したのが図２（ｂ）である。
【図３】実施例において、抗うつ剤fｌｕｏｘｅｔｉｎｅが、アストロサイトにおけるＢＤＮＦのタンパク質の発現を濃度依存的に亢進させることを示したグラフである。
【図４】実施例において、アストロサイトでのＢＤＮＦの発現の亢進が、セロトニン経路を介したものではないことを示したグラフである。
【図５】実施例において、抗うつ剤fｌｕｏｘｅｔｉｎｅによるＢＤＮＦの発現の亢進は、ＡＴＰシグナル経路の賦活を介すことを示したのが図５である。図５（ａ）は、アストロサイトがＡＴＰ刺激によってＢＤＮＦの発現を亢進することを示している。図５（ｂ）は、抗うつ剤fｌｕｏｘｅｔｉｎｅによるＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現の亢進は、Ｐ２Ｙ１受容体を介することを示したグラフである。ＭＲＳ２１７９は、Ｐ２Ｙ１受容体の特異的阻害剤である。図５（ｃ）は、抗うつ剤fｌｕｏｘｅｔｉｎｅが、アストロサイトに存在する細胞外ＡＴＰ分解酵素を阻害する効果があることを示したグラフである。図５（ｄ）は、ＡＴＰ分解酵素の存在下では、抗うつ剤fｌｕｏｘｅｔｉｎｅによるＢＤＮＦ発現亢進効果が抑えられることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のスクリーニングに用いる細胞は、グリア細胞の中でも、最も数が多く、神経細胞とのコミュニケーションに非常に重要と考えられるアストロサイトを用いる。アストロサイトにおけるＢＤＮＦの発現亢進を検討するためには、培養細胞を用いるのが簡便であり適当である。初代培養を用いても、細胞株を用いてもよい。種についても、ラット、マウス、ヒト他、様々な種の細胞を用いることが可能である。
【００３１】
アストロサイトにおけるＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現量の検討には、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、タンパク質発現量の検討には、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いているが、この限りではない。
【００３２】
アストロサイトにおけるＡＴＰシグナル経路の活性化の検討は、（ａ）ＡＴＰの受容体であるＰ２Ｙ１受容体の阻害物質と候補薬剤とを一緒にアストロサイト作用させて、ＢＤＮＦの発現量を測定し、ＢＤＮＦの発現量が抑えられていれば、候補薬剤にはＡＴＰ経路を活性化する効果があると判断する方法、（ｂ）候補薬剤下でアストロサイトを培養し、ＡＴＰの量を測定して、候補薬剤下でＡＴＰ量が増加していれば、ＡＴＰシグナル経路を活性化する効果があると判断する方法、（ｃ）候補薬剤とＡＴＰ分解酵素とを同時にアストロサイトに作用させてＢＤＮＦ発現量を測定し、候補薬剤のみを作用させたときよりもＢＤＮＦの発現量が抑えられていれば、候補薬剤にはＡＴＰシグナル経路を活性化する効果があると判断する方法、などが考えられる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
[実施例]
種々の抗うつ剤を候補薬剤とし、アストロサイトにおけるＢＤＮＦの発現の亢進する物質、及びＡＴＰシグナル経路の活性化を誘導する物質を探索する。
【００３５】
検討に用いた細胞は、Ｗｉｓｔｅｒ 系ラット生後 1 日齢の海馬からアストロサイトを摘出し１２日間培養した後、６ウェルプレートに播種したものを用いた。
【００３６】
＜アストロサイトにおいて、ＢＤＮＦの発現を亢進する抗うつ剤のスクリーニング＞
前述の初代培養細胞を、抗うつ薬 （fｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、pａｒｏｘｅｔｉｎｅ、iｍｉｐｒａｍｉｎ、mｉｌｎａｃｉｐｒａｎ) で刺激し、ｍＲＮＡの値を調べた。ｍＲＮＡのは、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定を行った。方法としては、まず、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）等用いて抽出した。ＰＣＲ反応には Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ―ＰＣＲ Ｋｉｔ (Ｔａｋａｒａ) を用い、 ＰＣＲの機械は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ) を使用した。
【００３７】
その結果、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅは３０μＭで刺激して１２時間後の値がＢＤＮＦの発現を最も高かった。pａｒｏｘｅｔｉｎｅ、iｍｉｐｒａｍｉｎ、mｉｌｎａｃｉｐｒａｎでは、すべて１０μＭで刺激を行い、刺激後３時間の値が最も高かったが、iｍｉｐｒａｍｉｎでは有意差が認められなかった。この結果を図１に示す。
【００３８】
＜fｌｕｏｘｅｔｉｎｅによるＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現量の変化＞
スクリーニングによってＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現が最も亢進されたfｌｕｏｘｅｔｉｎｅの詳細な検討を行った。アストロサイトをfｌｕｏｘｅｔｉｎｅで、１、３、１０、３０、１００μＭの濃度で１２時間刺激したところ、図２Ａに示すとおり、濃度依存的に海馬アストロサイトのＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現を増加させた。１０μＭから有意差が検出され、ＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現が最も亢進されたのは、３０μＭで刺激を行ったときであった。
【００３９】
また、経時的なＢＤＮＦｍＲＮＡ発現量の変化についても検討した。この結果を図２Ｂに示す。図２Ａの結果から、３０μＭで刺激を行い、１，３，６，１２，２４時間後のＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現量の検討を行った。その結果、刺激後１２時間のものがＢＤＮＦの発現量が最も亢進された。
【００４０】
＜アストロサイトにおけるＢＤＮＦのタンパク質量の変化＞
次に、ＢＤＮＦのタンパク質量についても検討を行った。タンパク質量の測定には、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いた。回収した試料を１０％ゲルで ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェット法によりＰＶＤＦ 膜に転写し、ブロッキング処理後、１次抗体 (ａｎｔｉ ＢＤＮＦ: Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ), (ａｎｔｉ ｐｈｏｓｐｈｏ―ＣＲＥＢ: Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ) および２次抗体と反応させ、Ｓｕｐｅｒ ＳＩＧＮＡＬ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ (Ｐｉｅｒｃｅ) 化学発光反応による発光をＬＡＳ―１０００ (Ｌｕｍｉｎｏ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ,  ＦＵＪＩＦＩＬＭ) を用いて撮影した。刺激したＦｌｕｏｘｅｔｉｎｅの濃度は３０μＭ、刺激時間は１２時間及び２４時間である。この結果を図３に示す。２４時間後において最も発現量が高かった。
【００４１】
＜セロトニン経路の賦活作用の検討＞
神経細胞におけるＢＤＮＦの発現亢進については、セロトニン経路の賦活によることが先行研究により示唆されていたため、アストロサイトにおいてもセロトニン経路の賦活がＢＤＮＦの発現の亢進をもたらすか検討した。その結果を図４に示す。アストロサイトをセロトニン（５−ＨＴ）０．１、１、１０μＭで３時間および６時間刺激し、ＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現量の変化をみた。その結果、ＢＤＮＦの発現量に有意な上昇は見られなかった。よって、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅによるＢＤＮＦの発現の亢進は、セロトニン経路を介さないことが示された。
【００４２】
＜ＡＴＰシグナル経路賦活作用の検討＞
ＡＴＰシグナル経路の賦活により、アストロサイトでのＢＤＮＦの発現が亢進されることを図５（ａ）に示す。アストロサイトをＡＴＰ１００μＭで３時間刺激した結果、グリア細胞内のＢＤＮＦのｍＲＮＡの値が有意に上昇している。
【００４３】
次に、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅによるＢＤＮＦの発現の亢進が、ＡＴＰシグナル経路の賦活によるものかを検討した。方法は、細胞外ＡＴＰ受容体であるＰ２Ｙ１受容体の特異的阻害剤ＭＲＳ２１７９を用い、ＡＴＰによるシグナルがアストロサイト内に送られるのを抑制した状態で、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅの刺激によるＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現量の変化をみた。その結果を図５（ｂ）に示す。ＭＲＳ２１７９の濃度依存的に、ＢＤＮＦのｍＲＮＡの発現が抑えられていることが示されている。具体的には、１０μＭのＭＲＳ２１７９は、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅ単独時のＢＤＮＦを２３％にまで抑制する。
【００４４】
また、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅの存在下では、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅの濃度依存的に、細胞外のＡＴＰの分解が抑制されることを図５（ｃ）に示す。fｌｕｏｘｅｔｉｎｅには、細胞外ＡＴＰ分解酵素阻害効果があると考えられる。
【００４５】
さらに、ＡＴＰ分解酵素ａｐｙｒａｓｅ（２０Ｕ／ｍｌ）の存在下では、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅのＢＤＮＦ発現亢進作用が抑制されることを図５（ｄ）に示す。
以上から、fｌｕｏｘｅｔｉｎｅは、グリア細胞のＡＴＰシグナル経路を賦活することにより、ＢＤＮＦの発現を亢進していると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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