(57)【要約】      （修正有）【課題】本態性高血圧症の素因を有する個体を同定するための診断試験、およびその試験の実施のための遺伝子学的、細胞学的、生化学的な手段を提供する。【解決手段】Ｄ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞を得て、該Ｄ１受容体の翻訳後修飾の程度を測定する。また、ＧＲＫ４活性を測定する。さらに、ＧＲＫ４タンパク質を産生するトランスジーンを含有するニ倍性ゲノムを含むトランスジェニック動物と腎細胞が該ＧＲＫ４タンパク質を発現しない正常血圧の動物と比較する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ６５Ｌ変異、Ａ１４２Ｖ変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６Ｖの二重変異またはＲ６５ＬとＡ１４２とＡ４８６Ｖの三重変異を有するＧＲＫ４タンパク質をコードする単離された精製核酸。
【請求項２】
Ｒ６５Ｌ変異、Ａ１４２Ｖ変異、Ａ４８６Ｖ変異、Ｒ６５ＬとＡ１４２Ｖの二重変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６の二重変異またはＲ６５ＬとＡ１４２とＡ４８６Ｖの三重変異をコードする配列を有するＧＲＫ４遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ＧＲＫ４遺伝子のエキソン３、５、８、１４または１６にハイブリダイズし、そして、該遺伝子のヌクレオチド４３１−５０３（エキソン３）、５９４−６９７（エキソン５）、８５７−９９５（エキソン８）、１６６２−１７９８（エキソン１４）、１９３７−１９９１（エキソン１６）を含むＤＮＡ配列を増幅するのに有用であるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
本態性高血圧症の素因を有する個体を同定する方法であって、
該個体からＤ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞を得て、
該細胞をアッセイして、概Ｄ１受容体の翻訳後修飾の程度を測定する（なお、該Ｄ１受容体の翻訳後修飾における変化が、正常血圧の個体から単離され、Ｄ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞におけるＤ１受容体の翻訳後修飾の程度と比較して、本態性高血圧症の素因の指標となる）、
ことを含む方法。
【請求項５】
該細胞を該Ｄ１受容体のパルミトイル化の程度についてアッセイする、請求項４の方法。
【請求項６】
該細胞を該Ｄ１受容体のリン酸化の程度についてアッセイする、請求項４の方法。
【請求項７】
該細胞を該Ｄ１受容体の過リン酸化についてアッセイする、請求項４の方法。
【請求項８】
該腎細胞が腎近位尿細管細胞または皮質集合管細胞である、請求項４の方法。
【請求項９】
本態性高血圧症の素因を有する個体を同定する方法であって、
個体から核酸のサンプルを得て、
該サンプルからの、ＧＲＫ４をコードする核酸またはその断片を、ＧＲＫ４発現細胞にドーパミン作動性シグナルを翻訳せしめないようなＧＲＫ４変異について、分析する（なお、ＧＲＫ４の該変異は本態性高血圧症の素因についての指標である）、
ことを含む方法。
【請求項１０】
ＧＲＫ４の該変異が、ＧＲＫ４の該変異を発現する該細胞におけるＤ１受容体／アデニリルシクラーゼ共役欠損を起す、請求項９の方法。
【請求項１１】
ＧＲＫ４の該変異が、ＧＲＫ４の該変異を発現する該細胞におけるＤ１受容体／Ｇタンパク質共役欠損を起す、請求項９の方法。
【請求項１２】
該核酸のサンプルがＤＮＡのサンプルである、請求項９の方法。
【請求項１３】
該核酸のサンプルがＲＮＡのサンプルである、請求項９の方法。
【請求項１４】
該核酸のサンプルがゲノムＤＮＡのサンプルである、請求項９の方法。
【請求項１５】
該核酸のサンプルがｃＤＮＡのサンプルである、請求項９の方法。
【請求項１６】
ＧＲＫ４をコードする核酸の断片を分析する、請求項９の方法。
【請求項１７】
ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌについて分析する、請求項９の方法。
【請求項１８】
ＧＲＫ４核酸を変異Ａ１４２Ｖについて分析する、請求項９の方法。
【請求項１９】
ＧＲＫ４核酸を変異Ａ４８６Ｖについて分析する、請求項９の方法。
【請求項２０】
ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌ、Ａ４８６Ｖについて分析する、請求項９の方法。
【請求項２１】
ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖについて分析する、請求項９の方法。
【請求項２２】
ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２、Ａ４８６Ｖについて分析する、請求項９の方法。
【請求項２３】
該検出工程がＰＣＲでなされる、請求項９の方法。
【請求項２４】
本態性高血圧症に関連するＧＲＫ４の変異を検出する方法であって、
高血圧の個体からの核酸サンプルを得て、
該サンプル由来のＧＲＫ４をコードする遺伝子の配列を決定する、
ことを含む方法。
【請求項２５】
ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含み、ＧＲＫ活性を測定する再構築システム。
【請求項２６】
該ＧＲＫ４基質がＤ１受容体またはその機能的断片である、請求項２５の再構築システム。
【請求項２７】
該ＧＲＫ４および該ＧＲＫ４基質を発現する全細胞である、請求項２６の再構築システム。
【請求項２８】
該全細胞が、Ｄ１受容体をコードする第１異種性遺伝子および高血圧に関連のＧＲＫ４タンパク質をコードする第２異種性遺伝子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２７の再構築システム。
【請求項２９】
該ＧＲＫ４タンパク質が本態性高血圧症と関連している、請求項２５の再構築システム。
【請求項３０】
高血圧に関連するＧＲＫ４タンパク質と、抗高血圧活性について分析する物質との相互作用において概ＧＲＫ４タンパク質の検出可能な立体配座的変化を提供する薬剤との複合体。
【請求項３１】
不死化ヒト腎近位尿細管細胞。
【請求項３２】
高血圧のヒトから得られる単離された精製腎近位尿細管細胞。
【請求項３３】
不死化された、請求項３２の高血圧のヒトから得られる単離された精製腎近位尿細管細胞。
【請求項３４】
腎細胞中で発現されるＧＲＫ４タンパク質をコードし、該ＧＲＫ４タンパク質を産生するトランスジーンを含有するニ倍性ゲノムを含むトランスジェニック動物（なお、該トランスジーンの発現によって、概トランスジェニック動物において発揮される本態性高血圧症の状態が、腎細胞が該ＧＲＫ４タンパク質を発現しない正常血圧の動物と比較される）。
【請求項３５】
該腎細胞が、該ＧＲＫ４タンパク質を発現しない腎細胞の正常血圧の動物に比して、低いナトリウム拒否能力を持つ、請求項３４のトランスジェニック動物。
【請求項３６】
げっ歯類である、請求項３４のトランスジェニック動物。
【請求項３７】
マウスである、請求項３４のトランスジェニック動物。
【請求項３８】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
少なくとも１つの候補薬剤を請求項２５の再構築システムに加え、
ＧＲＫ４活性を検出する（該活性は推定の抗高血圧物質の指標である）、
ことを含む方法。
【請求項３９】
ＧＲＫ４活性を検出する該工程が、アデニレート・シクラーゼ活性を測定することを含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】
ＧＲＫ４活性を検出する該工程が、リン酸塩を付加し得る基質およびリン酸塩源を該培地に加えて該基質のリン酸化を測定することを含む、請求項３８の方法。
【請求項４１】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
少なくとも１つの候補薬剤を請求項３０の複合体に接触せしめ、
該ＧＲＫ４の立体配座的変化が起きたかどうかを検出する（該活性は推定の降圧物質の指標である）、
ことを含む方法。
【請求項４２】
該検出が、分光測定、蛍光、核磁気共鳴、エバネセント波法または原子間力顕微鏡で行う、請求項４１の方法。
【請求項４３】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
少なくとも１つの候補薬剤を、高血圧動物から単離の、Ｄ１受容体およびＧＲＫ４を発現する不死化腎細胞に加え、
該細胞のドーパミン作動性シグナルの形質導入の変化を検出する（ドーパミン作動性シグナルの形質導入の変化は推定の抗高血活性の指標である）、
ことを含む方法。
【請求項４４】
推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、
該薬剤を投与した請求項３４の第１トランスジェニック動物と、該薬剤を投与していない請求項３４の第２トランスジェニック動物との電解質出力を比較する（推定の抗高血圧剤の同定は、該第１トランスジェニック動物の電解質出力が該第２トランスジェニック動物に比して増加することでなされる）、
ことを含む方法。
【請求項４５】
ナトリウム利尿を増加する方法であって、本態性高血圧症の個体に、ＧＲＫ４と相互作用する薬剤を投与して、該個体におけるナトリウム利尿を増加することを含む方法。
【請求項４６】
該薬剤が、該高血圧個体の腎細胞におけるＧＲＫ４の発現を変化する、請求項４５の方法。
【請求項４７】
該薬剤が、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはＤＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡを含む、請求項４５の方法。
【請求項４８】
該薬剤が、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂するリボチームを含む、請求項４５の方法。
【請求項４９】
該薬剤が、優性阻害変異ＤＮＡ分子を含む、請求項４５の方法。
【請求項５０】
該薬剤がＧＲＫ４タンパク質に結合する、請求項４５の方法。
【請求項５１】
インビトロおよびインビボでＧＲＫ４のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
アンチセンスＲＮＡ分子である、請求項５１のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
優性阻害変異ＤＮＡ分子である、請求項５１のオリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂するリボチーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の本発明につながる研究は、アメリカ国立衛生研究所の補助金ＮＩＨ：ＤＫ３９３０.ＨＬ.２３０８１により一部資金を受けた。従って、米国政府が本発明になんらかの権利を有し得る。
【０００２】
(技術分野)
本発明は、本態性高血圧、より詳細にはこの疾患を診断および治療する方法における遺伝マーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
(背景技術)
本態性高血圧すなわち原因不明の高血圧は、アメリカ合衆国における白人の２５−３０％が冒される疾患である。高血圧症を治療せずに放置すると、心臓疾患、卒中、心筋梗塞および末期腎臓病に至る。高血圧患者は、通常病気だと感じないので、末期の臓器不全が始まるまでしばしば診断を受けず、治療しないまま放置する。従って、高血圧はヒトにおける心臓血管の罹患率および死亡率の主な原因である。多くの高血圧患者は、高塩分の食事が血圧を上昇させ、またはすでに上昇した血圧を悪化させるという点で塩分に敏感である。高血圧を発症させる性質を測定する方法がわかれば、心臓血管疾患の減少に重要な影響を与えるだろう。
【０００４】
ヒトにおいて遺伝的要因が血圧の変動性の３０−４０％を占めると考えられている(Ward R. (1990) In Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis and Management, Laragh JH. And Brenner BM eds., (Raven Press, Ltd., New York, NY), pp81-100)。しかしながら、別の意見では、１つの主要遺伝子が４０％を占めた状態で、高血圧の遺伝率は８０％であると示唆された(Cavalli Sporza LL., Boomer WF. In The Genetics of Human Population (1971), (WH Freeman Co., South San Francisco, CA) pp534-536)。単一の主要遺伝子が、血圧に作用して、有意な程度に、血圧制御において副次的役割を果たす多くの他の遺伝子に優性であるのかも知れない。
【０００５】
高血圧の発症と持続における腎臓の中心的役割は充分に確立された。正常な腎臓を高血圧ラットに移植すると、その血圧は正常化する。一方、高血圧のラットの腎臓を正常血圧のラットに移植すると、高血圧を発症する。従って、高血圧は腎臓に従うようである。また、大部分のヒトの高血圧遺伝子の型は、腎臓におけるナトリウムの高い再吸収に関連することがわかっている。腎臓のナトリウム排出および血圧を調節する多くのホルモン性システムがあるが、ドーパミンの腎臓パラクリン機能が長期の血圧調節における重要なメカニズムとして充分に確立されている。高血圧におけるナトリウムに対する近位尿細管の結合性の増加は、ドーパミンの欠陥的な腎臓のパラクリン作用により引き起こされる。ドーパミンはナトリウムの再吸収を減少させる。従って、ドーパミン作用の欠陥がナトリウム再吸収の増加および高血圧をまねく。
【０００６】
ドーパミンは、Ｇタンパク質結合受容体のロドプシン様ファミリーに属する細胞表面受容体のある種類によってその機能を発揮する；これらの受容体は通常７つの膜貫通ドメインを有する。ＣＮＳおよびいくつかの内分泌器におけるドーパミン受容体は、２つの主な種類、Ｄ１様受容体およびＤ２様受容体に分類される。ＣＮＳ以外の腎臓などの臓器においては、Ｄ１様受容体はＤＡ１受容体と呼ばれ、Ｄ２様受容体はＤＡ２受容体と呼ばれている。ドーパミン受容体がＣＮＳの内または外で独占的に発現はしないので、これらの区別はおそらくもはや必要ではない。しかしながら、神経組織と腎臓組織とにおいてＤ１受容体の異なる調節がある。Ｄ１受容体遺伝子の２つのエキソンが神経組織では転写されるのに対し、第２エキソンのみが腎臓組織では転写される。短いおよび長いＤ１転写物の異なる発現は、活性化因子タンパク質の組織特異的発現がＤ１受容体遺伝子の５’非コード領域におけるプロモータからの転写を行うためである。Ｄ２様ドーパミン受容体のサブタイプは各々、いくつかのイソ形を有する。しかしながら、特定のイソ形が末梢神経で特異的に発現されることはない。参照、Jose, et al., Pharmac. Ther. 80:149-182(1998)。
【０００７】
２つのＤ１様受容体：Ｄ１およびＤ５受容体は、哺乳動物において発現し、各々げっ歯類のＤ１ＡおよびＤ１Ｂとして知られている。２つの付加的Ｄ１様受容体、Ｄ１ＣおよびＤ１Ｄは、非哺乳類において発現する。Ｄ１様受容体はアデニリルシクラーゼの刺激に関係している。Ｄ１Ａ受容体はまた、ホスホリパーゼＣ活性を刺激するが、アデニリルシクラーゼの刺激に対して補助的である。Ｄ１様受容体は、まだクローン化されてなく、百日咳毒素非感受性のＧタンパク質、Ｇｑを通してホスホリパーゼＣ(ＰＬＣ)に結合し、Ｄ１およびＤ５受容体とは異なるようである(Jose et al, Pharmacol. Ther. 80:149-182(1998)。３つのＤ２様受容体は哺乳動物において発現する：Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体である。Ｄ２様受容体はアデニリルシクラーゼおよびＣａ2+チャネルの阻害に関連する。Ｄ２およびＤ３受容体はＮＧ１０８−１５細胞における電位依存性カリウム電流を減少すると報告されているが、Ｄ２様受容体はまたＫ＋チャネルを刺激する。シナプス前神経に存在するＤ２およびＤ３受容体の両方がまた、ドーパミンおよびノルエピネフリン両方の放出を減少するのに役立ち得る。
【０００８】
すべての哺乳動物のドーパミン受容体は、最初に脳からクローン化され、腎臓および尿路において発現することがわかった。ドーパミン受容体サブタイプは、腎臓血管系、糸球体および尿細管に従って特徴的に発現をする。腎臓血管系、糸球体および尿細管において、このサブタイプは、腎臓血行動態、電解質および水の輸送、およびレニン分泌を調節する。外因性ドーパミンは低用量で、腎臓血管抵抗力を低下させ、腎臓の血流を増加するが、糸球体濾過値に変動的な効果を有する。付加的な腎臓効果には、血行動態および細管メカニズムにより生じる溶質および水の排出の増加がある。近位尿細管のドーパミンを産生する能力とこれらの細管における受容体の存在は、ドーパミンが自己分泌またはパラクリン方法で作用し得ることを示唆している。外因性腎臓ドーパミンはいくつかのネフロンセグメント(近位細管、ヘンレの髄質の厚い上行性の脚(mTAL)、皮質性集合管(ＣＣＤ))における作用により溶質と水の排出を増加する。各ネフロンセグメントにおけるドーパミンの阻害効果の大きさは、穏やかであるが、ネフロンに沿った多数の部位の作用により、溶質および水の排出が著しく増加する。ドーパミンの腎臓効果は溶質(例えば、ナトリウム、リン酸塩)またはタンパク質負荷の条件下において最も明らかである。Ｄ１様受容体、おそらくＤ１サブタイプの受容体は、腎臓を血管拡張し、管腔膜におけるナトリウム/水素交換体活性の阻害および側底膜におけるナトリウム/カリウムＡＴＰ分解酵素活性の阻害により近位尿細管におけるナトリウム輸送を阻害する。Ｄ１様受容体はまたｍＴＡＬおよびＣＣＤにおけるナトリウム輸送を減少させる。腎臓における主な機能的Ｄ１様受容体は、Ｄ１受容体である。シナプス前Ｄ２様受容体はまた血管拡張性である。シナプス後Ｄ２様受容体は単独で、腎臓近位ナトリウム輸送を刺激し、ＣＣＤにおけるバソプレシン作用を阻害する。しかしながら、Ｄ１様受容体とともに、シナプス後Ｄ２様受容体は相乗的に作用して、近位尿細管においてナトリウム輸送を阻害する。近位尿細管における主なＤ２様受容体は、Ｄ３受容体であり、ＣＣＤにおける主なＤ２様受容体は、Ｄ４受容体である。おそらくＤ３サブタイプのシナプス後Ｄ２受容体がレニン分泌を阻害する能力は、レニン分泌に対するＤ１様受容体の刺激効果を中和し、相乗的作用をもたらして、ナトリウム補充状態におけるナトリウム排出を増加する(Jose et al., 前出)。
【０００９】
結果、長年の熱心な努力により、本態性高血圧の病因について多くのことがわかったにもかかわらず、血圧を制御する単一の主要遺伝子は発見されていない。従って、血圧の調節に関する主要遺伝子の発見が、本態性高血圧を引き起こすメカニズムを理解するのに重要であり、重要な新しい診断法および治療法を導くであろう。
【発明の概要】
【００１０】
(本発明の要約)
キナーゼは、リン酸基のタンパク質への付加を触媒する酵素である。Ｇタンパク質結合受容体キナーゼ(ＧＲＫ)は、セリンおよびスレオニン残基におけるＧタンパク質結合受容体タンパク質をリン酸化するタンパク質キナーゼのファミリーである。ＧＲＫはアレスチンと呼ばれる他のタンパク質とともに、ホルモン性反応の相同的脱感作を媒介する。参照、Premont, et al., FASEB J. 9:175-182(1995)。６つのＧＲＫ、つまりＧＲＫ１−ＧＲＫ６が同定された。参照、Premont, et al., 前出.;Palczewski, Protein Sci. 3:1355-1361(1994); および Inglese, et al, J. Biol. Chem. 268:23735-23738(1993)。ＧＲＫ４は最もわかっていないＧＲＫファミリーのメンバーである。Premont et al., J. Biol. Chem. 271:6403-6410(1996)は、精巣にその実質的存在を測定し、ＧＲＫ１を除くいかなるＧＲＫのなかで最も分布していない。Premontの文献は、どのような具体的な型の精巣細胞がＧＲＫ４を発現するのかわからないことを認めているが、ＧＲＫ４が、ＬＨ／ＣＧ受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、および卵胞刺激ホルモン受容体および種々の嗅覚受容体を含む多くの受容体のいずれにも結合し得ると推測する。後に、Gros, J. Clin. Invest. 99(9):2087-2093(1997)は、高血圧者のリンパ球におけるアデニリルシクラーゼ活性化の減少におけるＧＲＫ２の活性を示唆した。Grosはまた、ＧＲＫ活性の増加がＧＲＫ２発現の増加のみに関連し、他のＧＲＫの活性が変わらないことを観察した。
【００１１】
出願人はいくつかの重要な発見をした。第１にＧＲＫ４イソ形発現は、腎臓、特に近位尿細管および皮質集合管細胞において有意な程度に生じる。第２に、いくつかの既知のＧＲＫ４の多形性型および３つの以前知られていなかった多形性高血圧者に多い。第３に、本態性高血圧者に関すると知られている近位尿細管細胞におけるＤ１受容体/アデニリルシクラーゼ共役欠損が、限定しないが、Ｄ１受容体の過剰リン酸化に関係することである。
【００１２】
本発明の実際上の態様は、３つの基本的領域、つまり診断、薬剤の発見、治療に分類される。従って、本発明の第１の態様は、本態性高血圧にかかりやすい個体を同定する方法に関する。該方法は、個体から単離したＤ１受容体およびＧＲＫ４を発現する腎臓細胞のサンプルを用いて行い得る。該方法において、細胞をアッセイして、例えばリン酸化またはパルミトイル化などのＤ１受容体の翻訳後修飾の範囲を測定する。正常血圧者から単離した細胞に関する受容体の翻訳後修飾の変化は、本態性高血圧の素因を示唆している。別法として、ＧＲＫ遺伝子またはその断片を分析して、本態性高血圧に関連のＧＲＫ４を検出するために、核酸サンプルを個体から単離する。本発明において本態性高血圧に関連するとして同定した具体的な変異体には、次のものが含まれる：Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、Ａ４８６Ｖ、２つ二重変異体Ｒ６５ＬとＡ４８６ＶおよびＲ６５ＬとＡ１４２Ｖおよび３重変異体Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖ。本態性高血圧に関連の他の変異体ＧＲＫ４をさらに同定することは、単に、本態性高血圧と診断された個体から単離したＧＲＫ４を分析し、ＧＲＫ４遺伝子の配列を分析することにより行い得る。さらに本発明において、非腎臓細胞におけるこれらのＧＲＫ４の発現により、これらの非腎臓細胞がドーパミン作動性シグナルを正常というより“適切に”形質導入し得ないことが明らかになった。
【００１３】
本発明の関連態様は、Ｒ６５ＬとＡ１４２Ｖの二重変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６Ｖの二重変異、またはＲ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖの３重変異を有するＧＲＫ４タンパク質をコードする単離および精製された核酸に関する。前出の変異を含有するＧＲＫ４遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも開示されている。さらに本態性高血圧に関連の変異を含有するＧＲＫ４遺伝子の断片をハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、またはプライマー対が開示されている。好ましいプライマーは、ＧＲＫ４遺伝子のエキソン３、５、８、１４または１６に特異的にハイブリダイズし、ＧＲＫ４遺伝子のヌクレオチド４３１−５０３(エキソン３)、５９４−６９７(エキソン５)、８５７−９９５(エキソン８)、１６６２−１７９８(エキソン１４)または１９３７−１９９１(エキソン１６)を含むＤＮＡ配列を増幅するのに有用である。
【００１４】
本発明の別の態様は、抗高血圧活性のための物質を、ＧＲＫ４の立体配座および／または活性において変化をもたらすそれらの能力により試験する様々なシステムに関する。これらのシステムは、例えば、本態性高血圧に関連の野生型またはイソ形または変異体などのＧＲＫ４タンパク質と、検出しようとする抗高血圧剤との相互作用があるとＧＲＫ４タンパク質の立体配座的変化を引き起こす薬剤との間の複合体から、ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含有する再構築されたシステムまでの範囲に及ぶ。ＧＲＫ４とＧＲＫ４基質間の相互作用を測定し得るいかなるシステムも、潜在的な抗高血圧剤のスクリーニングに使用し得る。従って、システムは、人工膜、例えば脂質ミセルなどの細胞様部分から全細胞までに及ぶ。好ましい全細胞には、Ｄ１受容体遺伝子(またはその機能的断片)で形質導入された細胞および野生型または変異体のＧＲＫ４遺伝子および不死化されたヒト近位細管細胞がある。これら種々のシステムに生じるＧＲＫ４活性の変化は、例えばいかなる２次メッセンジャー成分または(限定するわけではないが)アデニリルシクラーゼにより発生するｃＡＭＰ、Ｇタンパク質活性、ナトリウム輸送体またはポンプ活性などの終末点およびリン酸化またはパルミトイル化などの翻訳後修飾などの細胞活性における卵管通気を測定することにより検出し得る。本態性高血圧に関連のＧＲＫ４タンパク質をコードするトランスジーンを含有するトランスジェニック動物などのインビボシステムも開示されている。該システムにおいて、トランスジーンは腎臓細胞において発現して、トランスジェニック動物に本態性高血圧の状態を起こす。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、インビトロまたはインビボの近位尿細管細胞においてナトリウム輸送を減少(ナトリウム利尿を増加)する方法に関する。この治療を適用する基本的な目的は、ＧＲＫ４活性を変えることである。一つの好ましい方法は、高血圧者の腎臓細胞においてＧＲＫ４の発現を減少または防止する１つまたは複数の薬剤を投与することを含む。ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはＤＮＡは、転写または翻訳を防止するアンチセンスＲＮＡまたは優性阻害変異体などのオリゴヌクレオチドで攻撃される。ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂するリボザイムも有用である。他の治療の適用には、ＧＲＫ４活性(阻害または刺激のいずれか)を阻害するかまたは高めるなど、変更する薬剤が含まれる。
【００１６】
いかなる特定の作用理論にも拘束されるわけではないが、出願人の考えでは、ヒト被験者において腎欠陥は高血圧のなんらかの原因であり、ＧＲＫ４変異は特に、Ｄ１受容体の直接または間接のリガンド非依存性セリン過剰リン酸化を引き起こし、Ｇタンパク質/エフェクター複合体の結合をはずす。結果、ドーパミンのナトリウム利尿作用が低下され、腎臓がナトリウムと水分の適切な平衡を保てなくなり、ナトリウムの滞留と血圧の上昇をもたらす。特に、正常血圧の被験者からではなく、高血圧の被験者から得た近位尿細管は、ドーパミンＤ１受容体のアデニリルシクラーゼによる欠損結合を示す。欠損結合はＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化に関連する。出願人は、少なくとも６つの変異した遺伝子をキナーゼ型４(ＧＲＫ４)関連Ｇタンパク質に発見し、該遺伝子は高血圧の被験者におけるＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化を調節する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、正常血圧者からではなく高血圧者からの近位尿細管細胞においてＤ１様アゴニストがＧＲＫ活性を刺激することを示すグラフである。
【図２】図２は、ＧＲＫ４の発現を防止すると、高血圧者からの近位尿細管細胞の能力が正常値に回復し、Ｄ１様アゴニストによって生じるｃＡＭＰ産生物を増加することを示すグラフである。
【図３】図３は、休眠近位尿細管細胞におけるＤ１受容体のリン酸化は、正常血圧の被験者より高血圧者において大きく、Ｄ１様アゴニスト刺激に反応しないことを示すグラフである。ＧＲＫ４発現が防止される場合、Ｄ１受容体のリン酸化は停止する。
【図４】図４は、正常血圧者ではなく高血圧者でＤ１様アゴニスト刺激に対する反応において、近位尿細管におけるＧＲＫ４ガンマ/∂の発現が増加することを示すグラフである。
【図５】図５は、ＧＲＫ４ガンマの変異により、ＧＲＫ４ガンマおよびＤ１受容体を過発現するチャイニーズハムスターの卵巣細胞においてＤ１様アゴニスト刺激に反応するＤ１受容体の能力が減少することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
(本発明を実行する最適な方法)
ヒトＧＲＫ４遺伝子転写の構造は、多量の選択的スプライシングを受けて、ＧＲＫ４タンパク質の４つの型をコードする４つの異なるＧＲＫ４のｍＲＮＡの型を産生する。選択的スプライシングはＧＲＫ４のアミノおよび／またはカルボキシル末端領域で生じ、４つのイソ形を産生する。
【００１９】
ＧＲＫ４は初め、Ambrose, et al., Hum. Mol. Genet. 1:697-703(1993)において報告され、次いでPremont et al., J. Biol. Chem. 271(11):6403-6410(1996)においてより広範囲に特徴付けられた。Premontにおいて、ＧＲＫ４は精巣においてのみ非常に豊富で、ＧＲＫ４のｍＲＮＡは脳細胞および骨格筋肉においてわずかに存在すると報告されている。ＧＲＫ４遺伝子はプロモータ領域を除いて、約７５キロベース(ｋＤａ)に及び、１６エキソンから構成されている。ＧＲＫ４の最長型は、無傷のアミノおよびカルボキシル末端の選択的エキソン配列を有し、ＧＲＫ４アルファと呼ばれた。推測されるタンパク質配列は、予測分子量６６.５ｋＤａを有する５７８アミノ酸を含有する。次に短い型、ＧＲＫ４ベータは、コドンから構成されるアミノ酸末端の選択的エキソンのみを欠失し、分子量６２.５ｋＤａを有する５４６アミノ酸を含有する。ＧＲＫ４ガンマは、４６コドンであるカルボキシル末端の選択的エキソンのみを欠失するイソ形である。従って、このイソ形は５３２アミノ酸を含有し、予測分子量６１.２ｋＤａを有する。ＧＲＫ４ガンマは正式にはＧＲＫ４Ａと呼ばれていた。参照、Sallese et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:848-854(1994)。ＧＲＫ４デルタは予測分子量５７.６ｋＤａを有する５００アミノ酸を含有し、最短のイソ形である。ＧＲＫ４デルタは両方の選択的エキソンを欠失する。ＧＲＫデルタは初めＩＴ１１およびＧＲＫ４Ｂと呼ばれていた。参照、Sallese et al., 前出、およびAmbrose, et al., 前出。さらに最近、２つの付加的イソ形が発見された、つまり：エキソン１３および１５を欠失し、予測分子量５３.６ｋＤａを有する４６６アミノ酸を含有するＧＲＫ４イプシロンと、エキソン２、１３および１５を欠失し、予測分子量４９.９ｋＤａを有する４３４アミノ酸を含有するＧＲＫ４ゼータである。
【００２０】
また、ＧＲＫ４の５つの単一ヌクレオチド多形性、つまり：Ｒ６５Ｌ(ＣＧＴ−ＣＴＴ)；Ａ１４２Ｖ(ＧＣＣ−ＧＴＣ)；Ｖ２４７Ｉ(ＧＴＡ−ＡＴＡ)；Ａ４８６Ｖ(ＧＣＧ−ＧＴＧ)およびＤ５６２Ｇ(ＧＡＣ−ＧＧＣ)が知られている。参照、Premont, et al.,  前出。出願人は、Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２ＶおよびＡ４８６Ｖの多形性が本態性高血圧に関係することを発見した。出願人はまた、高血圧者に多い３つの付加的多形性を発見した、つまり：二重変異体、Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶおよびＲ６５ＬとＡ４８６Ｖ；および３重変異体Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖ。表１は、６つのＧＲＫ４イソ形のアミノ酸配列と対応するヌクレオチド配列を示す。本態性高血圧に関連の多形において変化するアミノ酸および対応するヌクレオチドは、太字で示されている。イプシロンおよびゼータのイソ形の５’非翻訳領域の配列は示されていない。
【００２１】
【表１】
2011036253.tif 000002
【表２】
2011036253.tif 000003
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００２２】
本発明の第１の態様は、本態性高血圧症になりやすいまたは素因がある危険性の個体、または誰がそうであるかをスクリーニングする方法に関する。本態性高血圧症は、未知の病因の高血圧症として定義される。完全に特徴付けされているいくつかの高血圧症と異なり、本態性高血圧症の既知の原因はない。ＧＲＫ４遺伝子、その基本的機能およびＤ１受容体との相互作用と、本態性高血圧症との間の関連または関係の同定は、個体のスクリーニングを可能にし、彼等が測定された高血圧症に関する遺伝的基礎を有するかどうか、または彼等が正常血圧である場合その素因を有するかどうかを決定できる。患者が正常血圧であるが(偽の低血圧読取を導く種々の条件がある)、高血圧症の臨床的証拠もある場合(終末器官疾病のような)、高血圧症変異のスクリーニングが、高血圧症の存在の確認に使用できる。このように、本態性高血圧症の素因を有するとして同定された個体は、次いで血圧をより綿密にモニターし、食事療法などの方法で、疾病の初期の段階において処置される。
【００２３】
このような診断法の一つは、個体からの、Ｄ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞の単離を必要とする。本方法の実施に有用な腎細胞は、腎近位尿細管細胞および皮質集合管細胞を含む。それらは、尿サンプルから簡便に得られる。次いで細胞内のＤ１受容体の翻訳後修飾の程度を測定する。正常血圧の個体から単離された細胞と比べたＤ１受容体の翻訳後修飾における変化は、ＧＲＫ４活性の変化によりもたらされると考えられ、それは、本態性高血圧症の素因の指標である。パルミトイル化およびリン酸化のような数個の翻訳後事象が、このような細胞内で起こり得る。高血圧症個体から単離されたこのような細胞内のＤ１受容体は、過リン酸化として知られる事象を示す。この期間までに、結合したリン分子を有するＤ１受容体の量が増加することを意味する。翻訳後修飾は、Ｄ１受容体とＤ１受容体抗体による免疫沈降およびホスホセリン抗体に対する免疫ブロット、または放射活性パルミチン酸による細胞の標識およびＤ１受容体抗体との免疫沈降のような、標準法にしたがって検出および測定できる(Ng et al., Eur. J. Pharmacol. 267:7-19 (1994))。
【００２４】
他のこのような方法は、核酸サンプル、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを個体から得、個体のＧＲＫ４遺伝子の核酸配列を変異に関して分析することを必要とする。それによる変異の存在が、個体の本態性高血圧症に対する素因の指標である。核酸サンプルは、ＧＲＫ４のＤＮＡが遍在するため、任意の細胞タイプから得ることができる。血液からのＤＮＡ抽出物は、特に適当な源である。ＧＲＫ４α番号付けに関して、本方法で同定される好ましいＧＲＫ４変異体は、アミノ酸残基６５でＡｒｇ→Ｌｅｕ(Ｒ６５Ｌ)、アミノ酸残基１４２でＡｌａ→Ｖａｌ(Ａ１４２Ｖ)、アミノ酸残基４８６でＡｌａ→Ｖａｌ(Ａ４８６Ｖ)、二重変異体Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２ＶおよびＲ６５Ｌ、Ａ４８６Ｖ、および三重変異体Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、Ａ４８６Ｖを含む。ＧＲＫ４対立遺伝子は、本態性高血圧症の変異に関して、直接またはクローニングに続いてスクリーニングし得る。クローニングは、例えば、ゲノムＤＮＡの適当な断片サイズへの消化、および得られる断片のベクターへのライゲートによる、慣用法を使用して連続できる。一方、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を、ＧＲＫ４遺伝子の特異的エキソン、例えば、エキソン３、５、８、１４および１６で行い得る。このようなプライマーの例は、表２に示す。ＰＣＲは、野生型または変異のＧＲＫの任意の配列で行うことができる。ＰＣＲはまた、ＧＲＫ４のｍＲＮＡでも行うことができる。このように、当業者は、ＧＲＫ４対立遺伝子の増幅のためのプライマーまたはプライマー対が、全てのイソ形および多形性(表１に示すような)において同一のヌクレオチド配列に基づいて設計し得るか、またはそれらは活性化変異をもたらす特異的ヌクレオチド置換を含む配列に基づき得る。本発明のこの態様の実施に有用な他のプライマーは、ヌクレオチド４３１−５０３(エキソン３)、ヌクレオチド５９４−６９７(エキソン５)、ヌクレオチド８５７−９９５(エキソン８)、ヌクレオチド１６６２−１７９８(エキソン１４)、およびヌクレオチド１９３７−１９９１(エキソン１６)を含むＤＮＡ配列を増幅する。
【００２５】
【表８】
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* GenBank Accession #U33153からU33168
ＧＲＫ４対立遺伝子は、クローン化対立遺伝子または増幅断片のヌクレオチド配列を決定し、それを正常対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより、正常対立遺伝子と異なる核酸配列の存在に関して試験する。他の既知の方法は、活性化対立遺伝子の存在の確認について、より完全であるが、まだ幾分は間接的な試験を提供する。これらの方法は、一本鎖確認分析(ＳＳＣＡ)、変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)、E. coli mutSタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用、および対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む。これらの方法は、Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770 (1989); Sheffield et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:232-236 (1989); Finkelstein et al., Genomics 7:167-172 (1990)およびKinszler et al., Science 251:1366-1370 (1991); Conner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:278-282 (1983); Modrich, Ann. Rev. Genet. 25:229-253 (1991); およびRano & Kidd, Nucl. Acids Res. 17:8392 (1989)に各々記載されている。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関して、その３'末端で特定のＧＲＫ４変異にハイブリダイズするプライマーを使用する。ＧＲＫ４変異が存在しない場合、増幅産物は検出されない。増幅産物の検出は、ＥＰＡ０３３２４３５に記載のように、Amplification Refractory Mutation System (ARMS)により行い得る。
【００２６】
最初の３つの方法(ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ)において、新規電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＡは、一本鎖分子内塩基対形成の変化によりもたらされる配列変化のために異なって移動するバンドを検出する。ＲＮａｓｅ保護は、２個またはそれ以上の小さい断片への変異ポリヌクレオチドの開裂を含む。ＤＧＧＥは、変性勾配ゲルを使用して、野生型配列と比較した変異配列の移動速度の差異を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいて、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、アッセイを、ハイブリダイゼーションシグナルの存在または非存在の検出により行う。ｍｕｔＳアッセイにおいて、タンパク質は、変異体と野生型配列の間のヘテロ二本鎖のヌクレオチドミスマッチを含む配列とのみ結合する。
【００２７】
本発明のミスマッチは、二つの鎖が１００％相補的でないハイブリダイズした核酸二本鎖である。完全な相同性の欠如は、欠失、挿入、反転または置換によるものであり得る。ミスマッチ検出は、遺伝子またはそのｍＲＮＡ生産物における点突然変異の検出に使用できる。これらの方法は配列決定よりも感受性が低いが、多数のサンプルについて行うのに簡便である。ミスマッチ開裂法の例は、ＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実施において、この方法は、ヒト野生型ＧＲＫ４遺伝子コード配列に相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボプローブおよび腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡは、共にアニール(ハイブリダイズ)され、続いて二本鎖ＲＮＡ構造内のあるミスマッチを検出できる酵素ＲＮａｓｅ  Ａで消化される。ミスマッチがＲＮａｓｅ  Ａで検出された場合、それはミスマッチの部位を開裂する。このように、アニールＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離するとき、ミスマッチがＲＮａｓｅ  Ａにより検出および開裂されている場合、ＲＮＡ生産物は、リボプローブの完全長二本鎖ＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡより短いように見える。リボプローブは、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたは遺伝子の完全長である必要はなく、いずれかのセグメントであり得る。リボプローブがＧＲＫ４のｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントのみを含む場合、ミスマッチに関して全ｍＲＮＡをスクリーンするために、これらのプローブの多くを使用することが望ましい。
【００２８】
同様の形態で、ＤＮＡプローブは酵素的または化学的な開裂を介してミスマッチの検出に使用できる。例えば、Cotton et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Shenk et al., (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:989; およびNovack et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:586参照。
【００２９】
あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖と比べてミスマッチ二本鎖の電気泳動移動性のシフトにより検出できる。例えば、Cariello, (1988), Human Genetics 42:726参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかで、変異を含んでいるはずの細胞性ｍＲＮＡまたはＤＮＡをＰＣＲプローブハイブリダイゼーションを使用して増幅できる。ＧＲＫ４遺伝子のＤＮＡにおける変化は、特に、変化が欠失および挿入のような正味の再配置である場合、サザンハイブリダイゼーションを使用してまた検出できる。
【００３０】
ＰＣＲの使用により増幅されているＧＲＫ４遺伝子のＤＮＡ配列は、また対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングし得る。これらのプローブは核酸オリゴマーであって、既知の変異を担持する各々ＧＲＫ４遺伝子配列の領域を含む。例えば、一つのオリゴマーは約３０ヌクレオチド長であり得、ＧＲＫ４遺伝子配列の部分に対応する。このような対立特異的遺伝子プローブの１組を使用することにより、ＰＣＲ増幅生産物をスクリーニングし、ＧＲＫ４遺伝子における先に同定された変異の存在を同定する。対立遺伝子特異的プローブと増幅ＧＲＫ４配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブへのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡサンプル中の対立遺伝子特異的プローブと同じ変異の存在を示す。このような対立遺伝子特異的の例は、表３に示す。
【表９】
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＊ＧＲＫ４、GenBank Accession # U33054に基づく
【００３１】
ＧＲＫ４のコード領域の外側の変異は、イントロンのような非コード領域およびＧＲＫ４遺伝子の近くまたはその中の調節配列の試験により検出できる。非コード領域の変異は重要であるという先の指摘は、ノーザンブロット実験によるものであって、対照個体と比較して、高血圧症患者における異常サイズまたは多数のメッセンジャーＲＮＡ分子が示される。
【００３２】
ＧＲＫ４のｍＲＮＡ発現の変化は、当分野で既知の方法で検出できる。これらは、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。減少したｍＲＮＡ発現は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化は、また野生型アンギオテンシノーゲンの変化に関するスクリーニングにより検出できる。例えば、ＧＲＫ４に免疫反応性のモノクローナル抗体は、組織のスクリーニングに使用できる。同源抗原の欠失は、ＧＲＫ４遺伝子変異を示す。変異対立遺伝子に特異的な抗体は、また変異ＧＲＫ４遺伝子生産物の検出にも使用する。このような免疫学的アッセイは、当分野で既知の簡便な形態で行うことができる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む。変化したＧＲＫ４を検出する任意の手段を野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化の検出に使用できる。変異ＧＲＫ４遺伝子産物の発見は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。
【００３３】
出願人は、上記の６個のＧＲＫ４変異体以外のＧＲＫ４変異体が、本態性高血圧症に関連することを推測する。このような変異体のインビトロでの同定は、変異体挿入のＤ１受容体含有細胞がドーパミン作動性シグナルを伝達し得なくする変異体の能力を測定することによりなされる。このことは、ドーパミン受容体がＧタンパク質ユニットの活性化をしないか、またはナトリウム輸送体を阻害するために必要な細胞質性二次メッセンジャーの産生をしないことを意味する。ドーパミン作動性の伝達の欠失は、特に、Ｄ１受容体／アデニリルサイクラーゼ(ＡＣ)またはＧタンパク質結合欠陥、および上記のタイプの翻訳後修飾でとりわけ明白である。これらの減少の測定は、ドーパミンまたはそのアゴニストの刺激に対する能力：(ａ)アデニリルサイクラーゼ活性またはｃＡＮＰ産生または活性化タンパク質キナーゼＡ、(ｂ)活性化ホスホリパーゼＣまたは活性化タンパク質キナーゼＣ、(ｃ)ホスホリパーゼＡ２活性および(ｄ)Ｇ−タンパク質活性またはナトリウム／水素交換体またはナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅのようなナトリウム輸送タンパク質の阻害の測定で行える。
【００３４】
本態性高血圧症に関連する他のＧＲＫ４は、本態性高血圧症に罹患している個体から得られまたはクローン化されたＧＲＫ４遺伝子の配列決定により、簡単に同定できる。
【００３５】
野生型ＧＲＫ４または本態性高血圧症と関連するＧＲＫ４は、抗高血圧症活性について多くの異なるタイプの物質のスクリーニングのための種々のシステムに包含し得る。一般に、ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含むシステム、およびＧＲＫ４の立体配座または活性(およびその変化)を測定できるシステムを、抗高血圧症活性の物質のスクリーニングのために使用し得る。このように、本発明のこの態様の最も広い意味においては、細胞全体を必要としない。システムは、本質として人工的であり得、例えば、脂質ミセル内に入れられている。分子相互作用を研究するための無細胞システムの説明としては、Hammond et al., Nature 327:730-732 (1987)を参照。しかし細胞全体が好ましく、ＧＲＫ４基質として、Ｄ１受容体またはその機能的断片である。“機能的断片”なる用語は、リン酸化、パルミトイル化またはインビトロの他の手段で翻訳後修飾されている受容体の一部を意味する。本発明の好ましい方法は、ＧＲＫ４核酸で形質転換した細胞の使用を含む。一般に、哺乳類、細菌および昆虫細胞を含む種々の細胞のタイプを使用できる。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト胚腎(ＨＥＫ)繊維芽(ＬＴＫ)細胞、ＭＤＣＫおよびＬＬＣＰ細胞のような哺乳類細胞が好ましい。ＣＨＯ細胞は、それらがインビボで近位尿細管と同じように行動すると予測されるため、より好ましい。ＧＲＫ４およびＤ１受容体核酸での細胞の形質転換は、標準法にしたがって行い得る。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons (1994)参照。
【００３６】
本出願のこの態様のより好ましい具体的態様において、本方法は、正常血圧または高血圧症の動物、例えば、ヒトから単離した細管細胞を使用して調製した不死化腎近位尿細管を使用して行う。一般に、細管細胞は、皮質を小切片(例えば、１mm3)に切断して腎臓から単離し、容器の適当な生育表面(例えば、コラーゲン被覆Ｔ−フラスコ)に置く。接着が容器の転倒により認められたら(例えば、室温で約３０分)、容器を起し、適当な培地を添加する。好ましい培地は、物質(wt/ml)：インシュリン(５マイクログラム)、トランスフェリン(５マイクログラム)、セレニウム(５ナノグラム)、ヒドロコルチゾン(３６ナノグラム)、トリヨードチロニン(４ピコグラム)および表皮成長因子(１９ナノグラム)を添加したダルベッコ最小必須およびＦ−１２培地である。組織をインキュベートし、約３日間、９５％空気、５％ＣＯ2で分配しないままにした。Detrisac, et al., Kidney Int. 25:383-390 (1984)。あるいは、皮質の切片を、コラゲナーゼで消化させ、連続的に２１２および１４０マイクロメーターにふるって、培養前に４０マイクロメーターふるいで濃縮し得る。Courjault-Gautier et al., J. Am. Soc. Nephrol. 5:1949-1963 (1994)参照。“不死化”なる用語は、細胞が培養においていつまでも生育することを意味する。単離の腎近位尿細管細胞を、ＳＶ４０ウイルス、例えば、ＳＶ４０ｔｓＡ変異体ウイルスで感染させ、次いで、感染約７−８週間後の過成長を得ることにより不死化し得る。これらの細胞は、ＧＲＫ４タンパク質が機能するインビボ環境をより密接に模倣している利点を提供する。高血圧症患者からの不死化細胞は、しばしば抗高血圧症活性のための薬剤のスクリーニングに使用できる細胞について殆ど無限の供給を提供する。
【００３７】
抗高血圧症特性を有すると推定される物質または薬剤は、物質または薬剤のＧＲＫ４システムへの添加によるＧＲＫ４の立体配座または活性の変化の測定により同定し得る。ＧＲＫ４活性は、アデニレートキナーゼ活性の測定のように間接的に、または培養に添加したリン酸化可能な物質のリン酸化の程度の測定のように直接的に測定し得る。ＧＲＫ４活性化または不活性化変異体、例えば、各々ＧＲＫ４活性の増加またはＧＲＫ４活性の減少を導くＧＲＫ４の変異体または多形性は興味深い。ＧＲＫ４活性の変化は、Ｄ１受容体により例示されるＧタンパク質結合受容体の機能の変化を導くことができる。ＧＲＫ４は、レニン−アンギオテンシン系、カリクレイン−キニン、エンドセリン、房および脳のナトリウム排泄増加性ペプチド、セロトニン、バソプレッシン、カルシウム検出受容体および上皮ナトリウムチャンネルのような本態性高血圧症に関与する他のタンパク質の機能を調節し得る。
【００３８】
他のタイプのスクリーニング薬剤は、ＧＲＫ４タンパク質、例えば野生型またはイソ形または本態性高血圧症に関与する変異体と、検出する抗高血圧症剤との相互作用によりＧＲＫ４タンパク質の立体配座的変化をもたらす薬剤との間の複合体を含む。複合薬剤の選択は、立体配座的分析を行う方法に依存する。このような分析は、分光測光法、フルオレッセンス、核磁気共鳴、エバネッセント波法および原子間力顕微鏡により行い得る。
【００３９】
さらに別のタイプのスクリーニング剤およびプロトコールは、本態性高血圧症のトランスジェニック動物モデルの使用を含み、動物は本発明の野生型ＧＲＫ４または変異ＧＲＫ４をコードする核酸を発現する。変異ＧＲＫ４の発現は、高血圧症により特徴付けられる表現型を明らかにし、動物が急性または慢性のナトリウム負荷を排出する能力を減少させる。トランスジェニックモデルはまた、ＧＲＫ４の発現および活性における、血圧を減少することが示されている高カルシウム、高カリウムおよび高マグネシウムのような食事操作の効果の試験にも使用できる。明らかに、排出システムを有する動物は、本態性高血圧症のモデルとして使用できる。マウスのような齧歯類が好ましい。
【００４０】
トランスジェニック動物は、当分野で既知の方法により製造できる。トランスジェニック動物の製造に適用できる方法は、動物の核ＤＮＡ内へのトランスジーンの挿入である。これらのトランスジェニック動物は、例えば、米国特許４,８７３,１９１；５,８４９,５７８；５,７３１,４８９；５,６１４,３９６；５,４８７,９９２；５,４６４,７６４；５,３８７,７４２；５,３４７,０７５；５,２９８,４２２；５,２８８,８４６；５,２２１,７７８；５,１７５,３８４；５,１７５,３８３；４,８７３,１９１および４,７３６,８６６ならびにBurke and Olson, Methods in Enzymology 194:251-270 (1991), Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989), Davies et al., Nucleic Acids Research 20(11):2693-2698 (1992), Dickinson et al., Human Molecular Genetics 2(8):1299-1302 (1993), Huxley et al., Genomics 9:742-750 (1991), Jakobovits et al., Nature 362:255-261 (1993), Lamb et al., Nature Genetics 5:22-29 (1993), Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10578-10582 (1993), Rothstein, Methods in Enzymology 194:281-301 (1991), Schedl et al., Nature 362:258-261 (1993), およびStrauss et al., Science 259:1904-1907 (1993)に明示の当分野で既知の標準法を使用して構築される。更に、公開国際特許出願ＷＯ９４／２３０４９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８およびＷＯ９４／２８１２３は、これらに関する更なる関連の教示を提供する。
【００４１】
当分野で既知の方法を、標的遺伝子トランスジーンを動物に挿入し、トランスジェニック動物の創始系を製造する。このような方法は、前核マイクロインジェクション(Hoppe, P. C. and Wagner, T. E., 1989, 米国特許４,８７３,１９１)；生殖細胞系へのレトロウイルス仲介遺伝子移入(Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985))；胚幹細胞への遺伝子標的化(Thompson et al., Cell 56:313-321 (1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo. Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983))および精子仲介遺伝子移入(Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723 (1989))を含むが、これらに限定されない。これらの方法に関する一般的総説は、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989)参照。
【００４２】
本発明は、全細胞にＧＲＫ４トランスジーンを担持するトランスジェニック動物、および全てではないが、いくつかの細胞にトランスジーンを担持する動物、即ち、モザイク動物を提供する。トランスジーンは、単一トランスジーンまたは、例えば、頭と頭のタンデム、頭と尾のタンデムのコンカタマーとして統合され得る。トランスジーンはまた、例えば、Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992)の教示にしたがって、特定の細胞タイプに選択的に挿入し、その中で活性化され得る。当業者は、このような細胞タイプ特異的活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞タイプに依存することを認める。標的遺伝子トランスジーンが内因性標的遺伝子の染色体部位に統合されるのが望ましいとき、遺伝子標的化が好ましい。簡単に述べると、このような方法を用いるとき、目的の内因性標的遺伝子と相同的なあるヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体配列との相同的組換えを介して、内因性標的遺伝子のヌクレオチド配列に統合し、機能を中断する目的で設計する。トランスジーンはまた、例えば、Gu et al., Science 265:103-106 (1994)の教示にしたがって、特定の細胞タイプに選択的に挿入し、そしてその細胞タイプのみで目的の内因性遺伝子を不活化し得る。このような細胞タイプ特異的不活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞タイプに依存し、当業者には明らかである。
【００４３】
トランスジェニック動物を産生したら、組換え標的遺伝子およびタンパク質の発現を、標準法を使用してアッセイし得る。最初のスクリーニングは、動物組織の分析のためにサザンブロット分析またはＰＣＲ法を使用して達成し得、トランスジーンの統合が起きているかをアッセイする。トランスジェニック動物の組織内のトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルは、また動物から得た組織のノーザンブロット分析、インシチュハイブリダイゼージョン、およびＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらに限定されない方法を使用して評価し得る。標的遺伝子発現組織のサンプルは、また、目的の標的遺伝子トランスジーン遺伝子生産物に特異的な抗体を使用して、標的細胞化学的に評価し得る。
【００４４】
標的遺伝子ｍＲＮＡまたは標的遺伝子トランスジーンペプチド(標的遺伝子産物エピトープを指向する抗体を使用して、免疫細胞化学的に検出)を容易に検出可能なレベルで発現する標的遺伝子トランスジェニック動物を、次いで更に評価し、本態性高血圧症の特徴的症状を示す動物を同定する。
【００４５】
好ましい具体的態様において、ＧＲＫ４トランスジーンを適当なベクターに挿入し、テトラサイクリン感受性プロモーターに操作不可能的に結合し、次いで、胚性幹(ＥＳ)細胞に導入する。ＥＳ細胞は、次いで遺伝的に変えたＥＳ細胞を宿主胚盤胞にマイクロインジェクションすることにより、または桑実胚共培養により再導入する。創始系動物を得、次いで、ＧＲＫ４トランスジーンに同型接合の動物を使用する。Thompson, et al., Am. J. Physiol. 269:E793-E803 (1995)参照。
【００４６】
治療様相は、標的ＧＲＫ４活性をナトリウム尿排泄亢進まで増加させることを伴うか、またはそうでなければナトリウムと水の適当なバランスに関する正常性に近づく。例えば、ＧＲＫ４発現は、ＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルで、腎細胞のＧＲＫ４の発現を変える薬を投与することにより予防できる。このような薬剤は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、優性阻害変異体ＤＮＡ分子、およびＧＲＫ４  ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、またはＧＲＫ４  ＤＮＡの結合によりＧＲＫ４発現を減少するまたは防止するリボザイムのようなオリゴヌクレオチド分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの高血圧者への投与は、米国特許５,８５６,０９９；５,８５６,１０３；５,７８３,６８３；５,８４０,７０８；および５,５９１,６００；５,８４９,９０３；５,１３５,９１７；５,０９８,８９０；および５,０８７,６１７に記載の製剤および媒体にしたがって行うことができる。現在当分野で既知のアンチセンス法は、また、Uhlmann et al., Chem. Rev. 90:543-584 (1994); Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (Cohen, ed. 1989); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, CRC press (Saghir Akhtar, et. 1995); およびStein, C. A., and Cohen, Jack S., "Oligodeoxynucleotides as Inhibitors of Gene Expression: A Review," Cancer Research, 48:2659-2668 (1988)にも記載されている。
【００４７】
合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、所望の効果、例えば、ｍＲＮＡ分子の翻訳の遮断を発揮するのに十分な長さでなければならない。しかし、相対的に小さいオリゴヌクレオチドを使用するのが有利である。なぜなら、それらは、細胞にインビボでより効率的に取りこまれ、より多い数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡの位置に送達されるようである。好ましくは、十分な特異性を達するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは２０ヌクレオチド長でなければならない。好ましいアンチセンスは、５'ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＴ３'(塩基２５５−２７５に相補的)および５'ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＧ３')塩基２４３−２６０に相補的)である。
【００４８】
上記のような小さいオリゴヌクレオチドは、雑多なヌクレアーゼの分解に非常に感受性である。更に、このような分子は、不十分な膜貫通のために、細胞内に入ることができないことがある。この理由のために、当業者は、一般に、安定性および膜貫通を増加する種々の方法で修飾したオリゴヌクレオチドを合成する。修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、本発明で好ましい。“アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログ”なる用語は、下記のような、このような修飾オリゴヌクレオチドを意味する。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、簡便には既知の方法の固相法を使用して合成し、本明細書に記載の配列をコードする標的ＧＲＫのＤＮＡまたはＲＮＡの予め選択した配列と相補的および／または特異的にハイブリダイズできるように設計する。核酸合成装置は商品として入手可能であり、その使用は、妥当な長さの所望のオリゴヌクレオチドの製造に有効であるとして当業者に理解されている。
【００５０】
ＧＲＫ４  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡの分解を触媒する、例えば、ハンマーヘッドまたはハリピンタイプのリボザイムを設計でき、標準法にしたがって製造できる。治療的使用のリボザイムの設計、製造および製剤に関する詳細な教示は、例えば、米国特許５,８５６,４６３(およびその中に引用されている刊行物)参照。
【００５１】
ＧＲＫ４活性はまた、タンパク質に直接作用することにより完全にまたは部分的に発現されたＧＲＫ４タンパク質の触媒活性、例えば、リン酸化または非リン酸化作用を変化(例えば、阻害または促進)する薬理的アンタゴニストのような薬剤の投与により標的化できる。他の治療的作用は、ＧＲＫ４タンパク質とペプチド様薬剤の直接の結合を伴う。これらの方法および薬剤の全ては、ＧＲＫ４を発現する腎細胞におけるＤ１受容体／ＡＣ結合の正常化をもたらし、その結果、腎近位尿細管におけるナトリウム輸送を減少させる。
【００５２】
本発明を、以下の詳細な実施例を参照して更に記載する。これらの実施例は説明の目的のみで提供され、特記しない限り、本明細書に記載の本発明の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００５３】
実施例
組織培養
ヒト腎を、腎癌腫のため片側の腎を摘出した患者から新鮮な外科的標本として得た。患者記録を調べて、正常血圧（ｎ＝９）と本態性高血圧症（ｎ＝１４）とに分類した。収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ未満で弛緩期血圧が９０ｍｍＨｇ未満の者を正常血圧者とした。収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上で弛緩期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の者および／または抗高血圧剤服用者を高血圧者とした。
【００５４】
組織学的に確認された正常な腎切片からの腎近位尿細管細胞の培養物（０．０７５％タイプＩコラーゲンで被覆した２４ウエルプラスチック管における５ｘ１０5細胞／ウエル）を、３７℃で９５％Ｏ2／５％ＣＯ2中でインキュベートし、デルベッコ修飾イーグル培地とハムＦ１２培地との１：１の混合物からなる血清を含まない培地で生育した。この培地には、セレニウム（５ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（３６ｎｇ／ｍｌ）、トリヨードチロシン（４ｐｇ／ｍｌ）、表皮成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）（５）が補充されている。半コンフルエント（９０−９５％）のときは、細胞を継代培養して（６−８継代）、トリプシンＥＤＴＡ（０．０５％、０．０２％）を使用する実験プロトコールに用いた。この培養条件は、腎近位尿細管細胞の特性を保持するヒト腎近位尿細管の成長に役立つ。Sanada, H. et al., J. Invest. Med. 45: 277A (1997)。
【００５５】
光学顕微鏡による免疫組織化学
HISTOCHOICE中に不死した培養物における腎の組織および細胞について免疫組織化学的検査を、Sanada, H. et al.（前出）に記載のように行った。アフィニティー・カラム精製ポリクローナル・ヒトＤ1受容体抗体が合成ペプチド配列ＧＳＧＥＴＱＰＦＣ（アミノ酸２９９−３０７）に対して生じる。参照、Sanada, H. et al.（前出）。２種の市販（Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA）のＧＲＫ４イソ形抗体を使用した。１つのＧＲＫ４抗体がαイソ形とβイソ形の両方を認識し、他の１つが両αβイソ形を認識した。これらの抗体の特異性はすでに報告されている。Sanada, H. et al.（前出）および Guyton A. C. Circulatory Physiology III, Arterial Pressure and Hypertension, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1980)。
【００５６】
免疫組織化学的検査によると、ＧＲＫ４α／βおよびＧＲＫ４α／σのイソ形発現が腎の近位および遠位の尿曲細管のみでみられた（ヘレン係蹄、皮質および髄質の集合管、糸球体、腎動脈ではみられなかった）。ＧＲＫ４α／σは管腔膜および基底膜の両方でみられたが、ＧＲＫ４α／βは管腔膜のみでみられた。これら２種のＧＲＫ４の腎発現について、高血圧者と正常者とで差異がなかった（表示せず）。ＧＲＫ４α／βおよびＧＲＫ４α／σの発現は、培養物の腎近位尿細管細胞において持続した（写真は示さず）。
【００５７】
ＧＲＫ活性の測定
ＧＲＫ活性を Benovic, Methods Enzymol. 200: 351-362 (1991)に従って測定した。腎近位尿細管抽出物の調製は、氷冷の融解緩衝液中での均質化によった。この緩衝液は、２５トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ＥＤＴＡ、５ＥＧＴＡ、ロイペプシン（１０μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）および１ＰＭＳＦを含む。粗均質物を３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットの抽出を２００ｍＭのＮａＣｌで３０分間行い、３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。上澄み液をＧＲＫアッセイおよびイムノブロッティグに用いた。２０μｇのタンパク質抽出液を、ロドプシン強化桿外側セグメントとともに、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および０．１ｍＭのＡＴＰ（γ32Ｐ−ＡＴＰ含有）中でインキュベートした。白色光で１５分間室温でのインキュベーション後、反応を氷冷の融解緩衝液で停止し、３０，０００ｇで１５分間遠心分離した。ペレットをラエムリ緩衝液に再懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けた。ゲルにオートラジオグラフィを行い、リン酸化ロドプシンの定量を、密度計測と適当なサイズでの切除バンドの放射活性計測で行った。また、ＧＲＫ活性の測定をＧＲＫイソ形抗体の存在および不存在で行った。
【００５８】
図１は、Ｄ1様アゴニストであるフェノルドパムがＧＲＫ活性に対する作用を有さないことを示す。これは、正常血圧者からの腎近位尿細管細胞におけるロドプシンのリン酸化により調べられた。このデータによると、基質としてロドプシンを使用し得るＧＲＫ（すなわち、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４α、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６）は、血圧が正常であるとき、腎近位尿細管細胞におけるＤ1受容体の脱感作に関与しない。また、培養物中の腎近位尿細管細胞におけるＤ1受容体およびＧＲＫ４の発現は、高血圧者と正常血圧者とで類似していた（データは示さず）。しかし、高血圧者からの腎近位尿細管細胞において、フェノルドパムがＧＲＫ活性を増加した。さらに、腎近位尿細管細胞における基本的ＧＲＫ活性は、高血圧者において正常血圧者におけるよりも大きかった。これらの研究から高血圧における腎近位尿細管細胞でのＧＲＫの異常な機能がわかる。
【００５９】
フェノルドパムによりつくられたＧＲＫ活性の増加（高血圧における）は、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３およびＧＲＫ４α／σに対する抗体によって遮断され、これらのＧＲＫの１つまたはすべての活性がＧＲＫ４活性のフェノルドパム仲介増加に関与し得ることを表す。Tiberi et al., J. Biol. Chem. 271: 3771-3778 (1996)。しかし、ＧＲＫ２およびＧＲＫ３の偏在的発現は、げっ歯類およびヒトの本態性高血圧の病因において認識されている腎の特徴と適合しない。Guyton, W. B. Saunders Co. Phil., PA (1980); Guidi et al., J. Am. Soc. Nephrol 7: 1131-1138 (1996)。ＧＲＫ２のコード領域の配列には、高血圧者と正常血圧者との間に差異がみられなかった（データは表示せず）。このことから、高血圧患者のリンパ球のおけるＧＲＫ２活性の増加が高血圧にとって二次的であり（Gros et al., J. Clin. Invest. 99: 2087-2093 (1997))、遺伝的および誘発された高血圧のげっ歯類おけるＧＲＫ５の活性および発現の増加について示唆されていたことと同様である。Ishizaka et al., J. Biol. Chem. 272: 32482-32488 (1997)。
【００６０】
ｃＡＭＰ蓄積の測定
細胞をダルベッコ・リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）で２回洗い、次いで各ウエルに１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを加えた。細胞を３７℃で３０分間、薬剤とともに、または薬剤なしでインキュベートした。薬剤は、ドパミンおよびＤ1様受容体アゴニスト、フェノルドパム、Ｄ1様受容体アンタゴニスト、ＳＣＨ２３３９０（Research Biochemicals International, Natick, MA）、およびフォルスコリン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）である。次いで、細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗い、−８０℃に冷凍して、さらに０．１ＮのＨＣｌで分解した。ｃＡＭＰの濃度を放射免疫検定法で測定した。Sanada, H. et al.,（前出）、Kinoshita, S. J. Chlin. Invest. 84: 1849-1856 (1989)。タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ・キットで測定した。
【００６１】
ＧＲＫ４活性の増加が高血圧での腎近位尿細管細胞におけるＤ１受容体の非共役に関与しているかどうかを確認するために、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるＧＲＫ４翻訳の阻害後のｃＡＭＰに対するＤ１様アゴニスト刺激作用を調べた。図２からわかるように、Ｄ１様アゴニストのフェノルドパムによるｃＡＭＰの蓄積は、高血圧者よりも正常血圧者の腎近位尿細管細胞において大きい。センス／スクランブルまたはアンチセンスのいずれのＧＲＫ４オリゴヌクレオチドも基底性またはフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ産生に作用しなかった。フェノルドパムのみに比べると、センスまたはスクランブルのいずれのＧＲＫ４オリゴヌクレオチドもいずれのグループでのｃＡＭＰ蓄積に作用しなかった。しかし、アンチセンスＧＲＫ４オリゴヌクレオチドはフェノルドパムの能力を高め、高血圧者由来の細胞でのｃＡＭＰの蓄積を促進し（正常血圧者からでは、しない）、その値は、フェノルドパムで処置された正常血圧者の細胞で見られる値とほぼ同じであった。
【００６２】
免疫沈降
近位管細胞を、運搬物、フェノルドパム、センス、スクランブルまたはアンチセンスのプロピン／ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）とともに、上記のようにインキュベートした。膜を氷冷融解緩衝液（ＰＢＳと、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ，１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプシン）で溶解した。溶解物を、ＩｇＧ精製アンチＤ1受容体抗体とともに氷上１時間、そしてタンパク質Ａアガロースとともに１２時間ゆすりながら４℃でインキュベートした。ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜上に電気泳動で移した。移行ブロット・シートを、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ツィン２０中で５−１０％の脂肪なし乾燥乳で阻害し、希釈の親和性精製ポリクローナル・アンチホスホセリン抗体（Zymed Lab, San Francisco, CA）とともにインキュベートした。Sanada, H. et al.（前出）。オートラジオグラムおよび免疫ブロットをＥＣＬシステム（Amersham, Arlington Heights, Il）で可視化し、エンシトメトリーで定量した。Sanada, H. et al.（前出）。
【００６３】
次の検討は、アンチセンスＧＲＫ４オリゴヌクレオチドの示差作用がＤ1受容体のリン酸化まで及ぶかどうかである。図３からわかるように、腎近位尿細管細胞でのセリン−リン酸化Ｄ1受容体の基底レベルは、正常血圧者よりも高血圧者で高く、高血圧者でのＧＲＫ活性の基底レベルの増加に相関する（図１に示す）。フェノルドパムは、セリン−リン酸化Ｄ1受容体の量を正常血圧者で増加せしめたが、高血圧者では増加せしめない。このことは、以前の報告 Sanada, H. et al.（前出）に一致する。センスまたはスクランブルのいずれのＧＲＫ４オリゴヌクレオチドは、両グループの対象者のフェノルドパム処置細胞におけるＤ1受容体のリン酸化に作用しなかった。一方、ＧＲＫ４アンチセンス処置は、高血圧者からのフェノルドパム処置腎近位尿細管細胞におけるＤ1受容体のリン酸化を、基底値より低いレベルまでほとんど消失せしめた。ＧＲＫ４アンチセンス処置は、正常血圧者からのフェノルドパム処置腎近位尿細管細胞におけるＤ1受容体のリン酸化も下げたが、基底値よりは高かった。高血圧者の腎近位尿細管細胞においてＧＲＫ４に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドによりＤ1受容体のリン酸化がほとんど完全に抑制されることから、高血圧のおけるＤ1受容体のリン酸化および脱感作に関与する主要なＧＫＲがＧＲＫ４であって、このネフロン切片で発現される他のＧＲＫでないことがわかる。
【００６４】
遺伝子型決定
ホモ接合性ＧＲＫ４遺伝子変異体の発生率が高血圧者で約６０％および一般人で１６％であるという当初の観察に基づくと、能力分析（能力：０.８、α：０.０５、効果：４５％）がグループにつき１４−２１のサンプルサイズで、グループ間の有意な差違が検出できる。従って、さらに高血圧者１８名および正常血圧者１１名の末梢血によるＤＮＡを入手した。少なくとも２人の研究者で全志願者を検査し、医療記録を検討した。高血圧症の病歴および潜在的高血圧症の臨床徴候をもたず、降圧剤薬物治療を行なっておらず、血管拡張療法または血圧に影響し得る他の薬剤を受けず、および最近の３回の診療訪問で収縮期血圧が１４０mmＨgより低く、弛緩期血圧が９０mmＨより低い状態であった者を正常圧として、被検者を分類した。高血圧症の患者らは、顕著であり持続的な血圧上昇(収縮期血圧１６０mmＨg以上で弛緩期血圧が９５mmＨg以上)を少なくとも３回の機会で有していた。高血圧者 (腎臓由来のＤＮＡ：ｎ＝１４、末梢血由来のＤＮＡ：ｎ＝１８)は全員２０歳以上であった。各個体の本態性高血圧の後期発症についての先天性な問題を除去するため、正常血圧者(腎臓由来のＤＮＡ：ｎ＝９、末梢血由来のＤＮＡ：ｎ＝１１)は全員４５歳以上であった。
【００６５】
培養中の腎臓近位尿細管細胞および腎組織または任意の末梢白血球から、ゲノムＤＮＡを抽出した(塩析法)。多形性ヌクレオチドを含むＧＲＫ４のエキソンを、表２で示すプライマーで増幅した。反応混合物 ２０μlは、それぞれ、１ＸＰＣＲ緩衝液、０.２mＭの各ｄＮＴＰ、１.２５mＭ ＭｇＣｌ2、０.２μＭの各プライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ０.５単位およびゲノムＤＮＡ ５０ngを含んでいた。反応混合物を９４℃で５分間変性し、次いで、９４℃の３０秒間変性、５５℃のリアニール  ３０秒間および７２℃の３０秒伸長を３０サイクル行なった。７２℃での５分間の最終伸長でＰＣＲが完了した。ＰＣＲ産物 ２μlをバイオダインＢ＋膜上にスポットした。下記の野生型および変異体の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブそれぞれについてドットブロットを行った(表４)。プローブ標識化、膜調製、ハイブリダイゼーション、および洗浄条件は公知の手順である。Song et al., Clin. Chem. 43:1857-1861 (1997)参照。任意の被検者２５０人の１８０１位ヌクレオチドは変異体(Ｇ)であった。９９３位の多形性ヌクレオチドの頻度は高血圧者と正常血圧者で違いがないことも判明した。従って、調査の結果、４４８、６７９、１７１１位の３つのみ(表４)の多形性部位が存在する。サンガー・ジデオキシ連鎖停止法でｃＤＮＡ配列を決定した。
【００６６】
表４．正常血圧者および高血圧者のＧＲＫ４変異体
【表１０】
2011036253.tif 000011
【００６７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用したドットブロット分析で遺伝子型を決定した。高血圧者の４名は２つの部位(６５位および１４２位アミノ酸)で相同性があった。高血圧者のＲ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖおよび/またはＡ４８６Ｖのホモ接合性変異体の頻度(５３％、３２中の１７)は、正常血圧者で示されたもの(５％、２０中の１)と有意に異なっていた(Ｘ2＝１０.５６、Ｐ＝０.００１２)。ホモ接合性変異体Ａ１４２Ｖの頻度もまた、高血圧者(３４％、３２中の１１)および正常血圧者(０％、２０中の０)で有意に異なっていた(Ｘ2＝６.７８、Ｐ＝０.００９２)。
【００６８】
ヒト腎臓由来ＧＲＫ４のｃＤＮＡの配列決定、さらに、腎臓および末梢白血球細胞由来のＤＮＡ中の５つの多形性部位の遺伝子型決定から、３つの変異体が明らかになった：ヌクレオチド４４８、ＣＧＴからＣＴＴ(アミノ酸Ｒ６５Ｌ)、ヌクレオチド６７９、ＧＣＣからＧＴＣ(アミノ酸Ａ１４２Ｖ)、およびヌクレオチド１７１１、ＧＣＧからＧＴＧ(アミノ酸Ａ４８６Ｖ)(オートラジオグラフは示していない)の変異体が、正常血圧者より高血圧者で頻繁に現われた(表４)。高血圧者におけるＲ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、および/またはＡ４８６Ｖのホモ接合性変異の頻度(５３％，３２中の１７)は、正常血圧者で示されたもの(５％，２０中の１)と有意な違いがあり(Ｘ2＝１０.５６，Ｐ＝０.００１２)(表4)、無作為成人被検者５０人でみられたものと異なっていた(Ｘ2＝１０.９９，Ｐ＝０.０００９)。この血圧不明の無作為集団の中で、１６％がＲ６５Ｌおよび／またはＡ４８６Ｖでホモ接合性であり、および５０％がＲ６５ＬまたはＡ４８６Ｖの何れかでヘテロ接合性であった；ホモ接合性対立遺伝子の頻度１６％は、本態性高血圧症の発生率に近い（Lifton R P. Science 272:676-680 (1996)）。ＧＲＫ４ Ａ１４２Ｖ位のホモ接合性変異も、それ自体は、高血圧症 (３４％、３２中の１１) の方が正常血圧者(０％、２０中の０)より頻繁であった(Ｘ2＝６.７８，Ｐ＝０.００９２)。
【００６９】
ＧＲＫ４αは、リン酸化ロドプシンにレポートされる唯一のＧＲＫ４イソ形である(Sallese et al., J. Biol. Chem. 272:10188-10195 1997))が、我々の研究では、フェノルドパムによるＤ1アゴニスト刺激は、正常血圧者の腎臓近位尿細管細胞中のＧＲＫ活性を増強しなかった(図１)。従って、ＧＲＫ４αはＤ1受容体の脱感作に関与していないと結論した。その確信によると、ロドプシンを普通はリン酸化しないＧＲＫ４イソ形(例えばＧＲＫ４γ)(Premont et al., J. Biol. Chem. 271:6403-6410 (1996); Sallese et al., supra.; and Virlon et al., Endocrinol. 139:2784-2795 (1998))は、高血圧症で活性となり得る。たしかにＧＲＫ活性中のＤ1様アゴニスト介在増加は、高血圧者の腎臓近位尿細管細胞中のＧＲＫ４αδの膜発現の増加と関連があることが分かったが、正常血圧者(図４)では関連しない。
【００７０】
トランスフェクションおよび細胞培養
ラットＤ1(rＤ1)またはヒトＤ1(hＤ1)受容体ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＰＵＲ(Clontech, Palo Alto, CA)またはｐｃＤＮＡ３.１/Ｚｅｏ(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で、それぞれ、ＥｃｏＲ１およびＸｂａＩ部位でサブクローン化した。得られた作成物を使用し、ｐＴｅＴ−オフ レギュレータープラスミドを発現するＣＨＯ細胞を、安定してトランスフェクトした(Clontech, Palo Alto, CA)。この操作にリン酸化カルシウムを使用した。Yamaguchi et al., Mol. Pharmacol. 49:373-378 (1996)参照。ヒト腎臓皮質由来ｍＲＮＡのＲＴ/ＰＣＲから得られた、ＧＲＫ４γおよびＧＲＫ４δのcＤＮＡを、pＴｅｔ-オフ 応答プラスミド中へ入れサブクローン化した(ｐＴＲＥ−ｒＤ１またはｐＴＲＥ−ｈＤ1とｐＴＫ−Ｈｙｇをそれぞれ２０：１の割合で混合した)(Clontech, Palo Alto, CA)。
【００７１】
ＧＲＫ４α遺伝子の変異が他の機能的結果を有するかどうか測定するために、Ｄ1様アゴニストの効果を、Ｄ1受容体および野生型または変異体ＧＲＫ４α cＤＮＡの両方をトランスフェクトする、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞中のｃＡＭＰ産物について調べた。 ＧＲＫ４δを対照として使用した。ＧＲＫ４α欠損下におけるＣＨＯ細胞中の投与応答カーブは、ＨＥＫ-２９３細胞(低い内因性ＧＲＫ活性を有する細胞)で示されるものと類似していた。Premont et al, 前出。野生型ＧＲＫ４αの発現は、Ｄ1アゴニストのｃＡＭＰ産物を刺激する能力を減少させた(図５)。しかし、Ｄ1アゴニスト活性の阻害は、ＧＲＫ４α変異体Ｒ６５Ｌおよび/またはＡ４８６Ｖよりも大きくなった。野生型または変異体のＧＲＫ４αの効果は、Ｄ1受容体またはＧＲＫ４αの何れかの発現量の違いからではない(データは示していない)。野生型ＧＲＫ４αまたはその変異体は、フォルスコリンの能力に作用せず、ＧＲＫ４αとＤ1受容体の相互作用の特異性を表わすｃＡＭＰ蓄積を刺激する。フェノルドパムの作用はＤ1受容体に対して選択的であり、フェノルドパム効果は、Ｄ1様アンタゴニストＳＣＨ２３３９０によって遮蔽されたことによるからである(データは示していない)。他の研究では、野生型ＧＲＫ４δは、野生型ＧＲＫ４αによって誘発されたＤ1受容体の脱感作と比較し、Ｄ1様アゴニスト介在のｃＡＭＰ蓄積に対して効果がない(データは示していない)。腎臓近位尿細管細胞の機能的研究およびＣＨＯ細胞の発現研究では、ＧＲＫ４αの活性増加が、Ｄ1受容体リガンドの能力の減少の原因であり、高血圧症でエフェクター酵素およびイオン輸送タンパク質と結合することを提唱する。言いかえると、高血圧者における腎臓近位尿細管中のＤ1受容体の脱感作は、腎臓の能力増強につながり、塩化ナトリウムの負荷を除去する。腎臓の塩化ナトリウム排出の不足は、高血圧症の進行に極めて重要であると考えられる。 Guyton, A.C., Circulatory Physiology III. Arterial Pressure and Hypertension, W.B. Saunders Co.,, Philadelphia, PA (1980); Guidi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 7:1131-1138 (1996)。確かに、腎臓ナトリウム輸送を調節する遺伝子は、血圧の調製に重要であると記されている。Lipton, R.P. Science 272:676-680 (1996)およびKaret & Lifton, Recent Prog. Horm. Res. 52:263-276 (1997)。
【００７２】
物質または薬剤を生物体中へ注入し、引き起こされたＧＲＫ４活性の減少が抗高血圧療法として役立ち得るかどうかを調べるために、自発性高血圧症ラット(ＳＨＲ)でさらなる実験を行なった。６匹の雌ラット(４週齢、体重１００g)を左一側性腎摘出し、２週間そのままにしておいて、手術から回復させた。回復後、単独のアウトレットカテーテルを装備する３０日浸透圧ミニポンプを、ホスホロチオネート/プロピン介在アンチセンスＧＲＫ４オリゴヌクレオチド(５nＭ、１マイクロリットル/時間)またはスクランブルＧＲＫ４オリゴヌクレオチドで充填し、残された左腎臓の腎皮質中へ移植する。カテーテルのアウトレットを残された腎臓の腎皮質中のほぼ１mm深さに挿入し、スーパーグルーで固定した。ラットを手術から回復させ、血圧と尿出量を毎日測定した(容量と電解液)。３０日後、ラットを屠殺し、残された腎臓をＧＲＫ４のウエスタンブロット分析に使用した。我々の研究によると、血圧は、スクランブルＧＲＫ４オリゴヌクレオチド(ｎ＝３)を処置したラットのときと比較して、ＧＲＫ４(ｎ＝３)にアンチセンスオリゴヌクレオチドを処置したラットで減少した。さらに、ウエスタンブロット分析で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは腎臓ＧＲＫ４の発現を減少させることを証明した。
【００７３】
結果として、この例では、本態性高血圧者由来の腎臓近位尿細管細胞におけるＤ1受容体/アデニリルシクラーゼ共役で欠損が示された。ヒト本態性高血圧症の腎臓近位尿細管細胞のＧＲＫ活性の増加は、ＧＲＫ４の活性化ミスセンス変異によるものであり、この効果はトランスフェクトされた細胞モデルで再現された。その上、ＧＲＫ４の翻訳を防止し、高血圧症におけるＤ1受容体のアデニリルシクラーゼに対する結合を正常化した。さらに何れの特定の理論に拘束されることを意図することなく、出願人は、ホモ接合性アミノ酸変異は、Ｄ1受容体のリガンドに依存しないセリン-リン酸化を引き起こし、Ｇタンパク質/エフェクター複合体からその結合解離をもたらすと考える。腎臓近位尿細管中のＤ1受容体の脱感作は、ドーパミンのナトリウム排泄作用を低下し、最終的にナトリウム保持および高血圧症となる。これらの結論は、ＧＲＫ４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを自発性高血圧症ラットの腎臓内に注入すると、腎臓内でＧＲＫ４濃度が減少し、平均動脈血圧が低下するという上記実験の結果に対応している。従って、ＧＲＫ４の濃度または活性を変える物質または薬剤は、降圧性薬物治療の新規段階を表わす。
【００７４】
ドーパミンＤＩＡ受容体とＧプロテイン/エフェクター酵素複合体とのネフロンセグメント特異的欠損結合は、自発性高血圧症ラット(ＳＨＲ)の腎臓ナトリウム保持の原因となり得る。腎臓近位尿細管中でナトリウム輸送を阻害する外因性および腎臓内因性のドーパミンの能力減少は、ＳＨＲと正常圧対照(ウィスター-キョート(ＷＫＹ)ラット)とのＦ２交配において高血圧症を同様におこす。同様の欠損がダール塩過敏性ラットで判明した。さらに重要なことに、本態性高血圧症のヒトでも判明した。従って、高血圧症ヒト由来の腎臓近位尿細管の初期の培養は、腎臓Ｄ1様受容体とアデニリルシクラーゼ(ＡＣ)の欠損結合を有しており、同様な結合欠損が高血圧症齧歯動物でもみられた。これらのインビトロデータは、欠損Ｄ1様受容体を証明するインビボ研究（Ｇタンパク質/エフェクター酵素複合体は、相同性または異種性脱感作、受容体下方制御、Ｇタンパク質またはエフェクター酵素“欠損”またはＤ1様受容体の１次配列における変異によらない）に一致する。むしろ、Ｄ1様受容体の脱共役は、Ｄ-l受容体(腎臓中の主要なＤ1様受容体)のリガンドに依存しない過リン酸化の結果であり、限られた器官およびネフロンの発現を伴うＧＲＫ４イソ形のホモ接合性変異体の結果である。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
産業上の利用可能性
本発明の診断検査は、個体をスクリーニングし、その本態性高血圧症の素因を同定できるであろう。これらの検査の実施に関する、遺伝、細胞および生化学的手段も提供する。本発明は、薬剤を発見するための手段および方法も提供し、および抗高血圧性の活性または特性を有する物質を同定する。組成物および方法は、それぞれ本態性高血圧症を有する個体の腎細胞中のナトリウム輸送を正常化するものであり、この疾患の処置手段を提供する。
【００７６】
本明細書で引用したすべての特許および非特許の刊行物は、本発明の属する当業者の技術のレベルを示している。すべての出版物または特許出願は、出典明示により本明細書の一部とすることを具体的に個々に示したのと同様に、出典表示より本明細書の一部とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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