(57)【要約】  【課題】  本発明は、術後死亡率の少ない、免疫不全動物に対する全身麻酔の方法およびそれを用いて再生医療のための移植物および／または薬物を評価する方法を提供することを目的とする。  【解決手段】  本発明は、免疫不全動物に、外科手術のために吸入麻酔により全身麻酔を施す方法、および該方法を用いた移植物および／または薬物の評価方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全動物に、外科手術のために吸入麻酔により全身麻酔を施す方法。
【請求項２】
麻酔薬の最小肺胞濃度（ＭＡＣ）値の０．５倍以上１．２倍未満の濃度で維持麻酔を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
吸入麻酔による維持麻酔の前に、動物の鎮静あるいはスムーズな気管内挿管を行うために導入麻酔を行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
免疫不全動物が、自然突然変異あるいは免疫機能が低下するように遺伝子改変された動物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
移植物および／または薬物の評価方法であって、
（１）請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を用いて全身麻酔を施す工程、および
（２）移植物および／または薬物を、全身麻酔が施された免疫不全動物に、外科手術によって移植および／または投与する工程
を含む、前記方法。
【請求項６】
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウスに、麻酔薬のＭＡＣ値の０．５〜１．１倍の濃度での吸入麻酔による維持麻酔中に開胸手術を施し、ヒト由来の移植物を移植することを含む、移植物の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫不全動物に、外科手術のために吸入麻酔により全身麻酔を施す方法、および該方法を用いた移植物および／または薬物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている。このように、再生医療の分野において、移植によって失った組織を回復させる試みは、近年注目を集めている。
【０００３】
一般的に、再生医療研究において作成された細胞・組織を評価する目的においては、動物に移植して経過を観察するという方法が用いられる。しかしながら、ヒトに対する再生医療への応用において、動物に対して外科手術を施し、ヒト由来の移植片、すなわち異種細胞を移植する場合、免疫反応により該異種細胞が排除されることが考えられるため、かかる評価目的においては、免疫機能を遺伝的に欠損させた免疫不全モデル動物がしばしば用いられる。
【０００４】
通常、動物に対して外科手術を施す際、痛みを緩和させ、施術しやすくするために、施術前に麻酔処置を施すが、一般的に静脈注射、腹腔内注射、吸入などにより、全身麻酔を施して施術する。いずれの麻酔処置方法を用いるかは、施す手術方法や対象の状態によって選択されるのが通常である。例えば非特許文献２には、体重２００〜２５０ｇ程度のＬｅｗｉｓラットの心臓への人工組織の移植において、キシラジンの腹腔内投与による導入麻酔後、イソフルランにより維持麻酔をすることが紹介されている。また、長時間にわたって安全に全身麻酔を行う場合は、吸入による維持麻酔がしばしば用いられている。吸入麻酔薬は肺から吸入され、血液を介し脳へ作用する。その麻酔薬の麻酔効果を表す指標として、ＭＡＣ値（麻酔薬の最小肺胞濃度）がしばしば用いられるが、ＭＡＣとは、１気圧下において、動物の半数（５０％）を不動化させるのに必要な肺胞内における吸入麻酔薬の濃度であり、動物の半数が痛みを伴う刺激（皮膚切開、尾にクランプを挟むなど）に反応しなくなる麻酔薬の濃度のことをいう。このＭＡＣ値が小さいほど強い麻酔薬であるといえる。ＭＡＣの１．２〜１．５倍ほどの濃度で約９９．９％が外科的刺激に反応しなくなり、したがって外科手術の際の維持麻酔には、通常ＭＡＣの１．２〜１．５倍の濃度の麻酔薬が用いられている（非特許文献１）。しかしながら、通常、マウスなどの小動物で作製される免疫不全動物に対しては、外科手術のために長時間吸入により全身麻酔を施すことは、通常の動物に比べて実施数が圧倒的に少なく、実施方法に関する知見も少ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Laboratory Animal Instruments、ハムリー株式会社
【非特許文献２】Sill et al., J. Vis. Exp., 2009, Jun 24;(28)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような中、本発明者らは、免疫不全動物に対し、外科手術のために長時間安定して維持麻酔を施すことができ、また術中から術後の当該免疫不全動物の死亡率が少ない方法を見出すことができれば、再生医療分野の発展に大きく貢献し得ることに着目した。したがって、このような新たな視点のもと、本発明の課題は、免疫不全動物に対する適切な全身麻酔の方法およびそれを用いて再生医療のための移植物および／または薬物を評価する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、心筋再生の研究の中で、移植片の評価を行うためにＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）にヒト由来の移植片を心臓に移植しようとしたところ、ほとんどのＮＯＧマウスがチアノーゼを起こして術中から術後すぐに死んでしまうという新たな課題に直面した。そして通常のマウスには適正な吸入麻酔濃度がＮＯＧマウスにとっては過量であるとの新たな知見に基づき研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、免疫不全動物に、外科手術のために吸入麻酔により全身麻酔を施す方法に関する。
本発明はまた、麻酔薬の最小肺胞濃度（ＭＡＣ）値の０．５倍以上１．２倍未満の濃度で維持麻酔を行う、上記の方法に関する。
本発明はさらに、吸入麻酔による維持麻酔の前に、動物の鎮静あるいはスムーズな気管内挿管を行うために導入麻酔を行う、上記の方法に関する。
本発明はさらにまた、免疫不全動物が、自然突然変異あるいは免疫機能が低下するように遺伝子改変された動物である、上記の方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、移植物および／または薬物の評価方法であって、
（１）上記の方法を用いて全身麻酔を施す工程、および
（２）移植物および／または薬物を、全身麻酔が施された免疫不全動物に、外科手術によって移植および／または投与する工程
を含む、前記方法に関する。
さらに、本発明は、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウスに、麻酔薬のＭＡＣ値の０．５〜１．１倍の濃度での吸入麻酔による維持麻酔中に開胸手術を施し、ヒト由来の移植物を移植することを含む、移植物の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、免疫不全動物に吸入麻酔による全身麻酔を施して、長時間にわたる外科手術を行うことができ、かかる手術中から手術後の生存率を格段に上げることができる。したがって、免疫不全動物を用いた再生医療用の移植物や薬物の評価をすることが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明において、「動物」とは、ヒトを除く脊椎動物を意味し、好ましくはヒトを除く哺乳動物を意味する。
本発明において「免疫不全動物」とは、免疫機能が健常な動物と比較して有意に低下している動物を意味する。
【００１２】
本発明は、免疫不全動物に、外科手術のために吸入麻酔により全身麻酔を施す方法に関する。
一般的に全身麻酔には、導入麻酔および維持麻酔の２種類の処置段階がある。本発明において維持麻酔を施すという場合、全身麻酔を施すことと同義であり、本明細書において互換的に用いることができる。また、維持麻酔とは手術中の麻酔のことであり、動物の状態を安定に保ち、手術を遂行できるように管理することが求められる。なお、導入麻酔とは、動物の鎮静あるいはスムーズな気管内挿管を行うために維持麻酔の前に行う麻酔のことであり、導入麻酔は吸入麻酔によって施される。
【００１３】
一般的に全身麻酔を施す方法としては、例えば静脈麻酔、腹腔内麻酔、筋肉内麻酔などの注射麻酔と、吸入麻酔がある。注射麻酔に用いられる麻酔薬は作用特異性が高いことから、一剤では十分な麻酔状態が得られ難く、複数の麻酔薬を使用する場合が多いという特徴があり、麻酔深度の調節が難しいという欠点がある。それに対し、吸入麻酔に用いられる揮発性麻酔薬などは、注射麻酔薬に比べて作用特異性が低いという特徴があり、それゆえに一剤の吸入麻酔薬だけでも必要な麻酔状態・麻酔深度を得ることができる。また、吸入麻酔は麻酔深度を調節しやすいという利点があるものの、肺から血液を介して脳へと作用して麻酔効果を発揮するため導入が遅く、術者も吸入する恐れがあるという欠点がある。
【００１４】
吸入麻酔は、麻酔深度の管理が容易であるために、維持麻酔に使用されることが多い。吸入麻酔薬の評価には最小肺胞濃度（ＭＡＣ）が用いられる。ＭＡＣは動物の半数が痛みを伴う刺激（皮膚切開、尾にクランプを挟むなど）に反応しなくなる麻酔薬の濃度のことをいい、麻酔薬および対象動物種によって変化する数字である。例えば、麻酔薬がイソフルランである場合、ＭＡＣはマウスでは１．３５〜１．４１％であり、ラットでは１．１７〜１．５２％である。
【００１５】
通常吸入麻酔薬の効力はＭＡＣを用いて比較し、ＭＡＣが小さいほど強力な麻酔薬である。外科手術を施すための全身麻酔を吸入麻酔で施す場合、一般的にＭＡＣの１．２〜１．５倍の濃度で維持麻酔を行う。ＭＡＣは処置対象の様々な因子によって変化し得、例えば処置対象が高齢である場合やオピオイドやトランキライザーなどの前投与を行った場合などにおいては、ＭＡＣが減少することが知られているが、免疫不全であることは、ＭＡＣと関係するとは考えられていなかった。
【００１６】
驚くべきことに、本発明者らは、免疫不全モデルマウスに対して通常と同様の濃度で維持麻酔を施したところ、大部分の免疫不全モデルマウスでチアノーゼが認められ死亡例が多く見られるという、免疫不全と麻酔の関係について無関係であると考えられていた従来の知見からは予想外の知見を得た。
【００１７】
そこで本発明者らは、免疫不全動物に対して最適な維持麻酔濃度を模索し、ＭＡＣの０．５倍以上１．２倍未満が免疫不全動物に最適な維持麻酔濃度であることを新たに見出した。ＭＡＣの０．５倍未満の濃度だと、十分な麻酔効果が得られず手術中に覚醒してしまい、１．２倍以上であると、死亡率が大きくなってしまう。
【００１８】
本発明において、手術の容易さの観点から、好ましい動物は、マウス、ラットなどの齧歯類動物、チンパンジーなどの霊長類動物、イヌ、ネコ、ブタなどである。免疫不全モデル動物作製の容易さや使用頻度などの観点から、最も好ましくはマウスである。
免疫不全動物は、自然突然変異かまたは遺伝子改変により作製された動物であり、これに限定するものではないが、例えばＮＯＤ．ＣＢＤ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス）、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス（登録商標））などが挙げられる。
【００１９】
ＮＯＧマウス（登録商標）は実験動物中央研究所で２０００年に樹立された免疫不全モデルマウスであり、２種類の免疫不全マウスを結びつけて作製されたマウスである（特許第３７５３３２１号明細書参照）。ＮＯＧマウス（登録商標）は、重度複合免疫不全マウスであるため、ヒト細胞などの異種細胞や組織を移植しても拒絶反応を起こすことなく、細胞・組織が定着し、分化・増殖する。したがって「ヒト化マウス」の作製に広範に使われ始めており、とくに、感染症研究、がん研究、再生医療研究などの医学研究分野において広汎に用いられている。
【００２０】
本発明において、免疫不全動物の導入麻酔には、揮発性麻酔薬を使用すること、すなわち吸入麻酔による導入麻酔が好ましい。具体的な導入麻酔方法は、動物が入る大きさの密閉容器に一定濃度の揮発性麻酔薬を充満させ、そこに動物を入れるというものである。この際は一定濃度の揮発性麻酔薬を適用すればよく、注射薬を使用する場合に比べて簡便であり、かつ麻酔深度も調整しやすいという利点がある。特に、エーテルのような麻酔深度を調整できない麻酔薬を使用した場合に比べ、安全に導入麻酔を行うことができる。
【００２１】
本発明に用いることができる麻酔薬は、吸入麻酔薬であれば特に限定されないが、動物実験で汎用されているという観点から、好ましくは揮発性麻酔薬、より好ましくはイソフルラン、セボフルランである。
【００２２】
本発明の外科手術の術式は、特に限定されない。吸入麻酔による管理のしやすさに鑑みれば、長時間にわたる外科的処置が必要な外科手術、例えば開胸手術、開腹手術などにおいて、特に好適に本発明の方法を用いることが可能である。
【００２３】
本発明の方法を用いることで、高い生存率を維持したまま、様々な外科手術を免疫不全動物に施すことが可能となるため、本発明の方法は、外科手術後に生存し続けることが必要である、移植物および／または薬物の評価などに好適に用いることが可能である。したがって本発明には、移植物および／または薬物の評価方法であって、（１）請求項１〜６のいずれかに記載の方法を用いて全身麻酔を施す工程、および（２）移植物および／または薬物を、全身麻酔が施された免疫不全動物に、外科手術によって移植および／または投与する工程を含む、前記方法もまた包含される。
本発明において、「移殖物および／または薬物の評価」とは、これに限定するものではないが、例えば、該移殖物および／または薬物の生体内での有効性や毒性ならびに移植および／または投与後の経過などを検査、観察および検討することを含む。
【００２４】
上述したように、ＮＯＧマウス（登録商標）は、重度複合免疫不全マウスであり、異種細胞に対しても拒絶反応を起こすことがないため、「ヒト化マウス」の作製に広範に使われ始めており、とくに、感染症研究、がん研究、再生医療研究などの医学研究分野において広汎に用いられている。したがって、ヒト由来の移植物の有効性を評価する方法に特に好適に用いることができる。
【００２５】
したがって本発明には、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス（登録商標））に、麻酔薬のＭＡＣ値の０．５〜１．１倍の濃度での吸入麻酔による維持麻酔中に開胸手術を施し、ヒト由来の移植物を移植することを含む、移植物の評価方法もまた包含される。
【００２６】
以下、例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
例１：野生型マウスと免疫不全モデルマウスにおける致死率の比較
実験に汎用されているＣｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウス（以下、ＩＣＲマウスとする、日本チャールス・リバーから入手）と、免疫不全モデルマウスのＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊマウス(ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス、日本チャールス・リバーから入手）に対して、１．５〜２％の吸入麻酔濃度のイソフルランでの維持麻酔下において、開胸手術を施行した。
【００２８】
開胸は次のようにして行った：
沈静や鎮痛のためのトランキライザーやオピオイドなどの麻酔前投与は行わず、イソフルランで導入麻酔を施した後、マウスに気管内挿管した。挿管チューブには留置針のカテーテル（２２〜２４Ｇ）を用いた。気管内挿管後はベンチレーターに接続し、強制呼吸させた。ベンチレーターの設定は、呼吸回数を１００〜１２０回／分、呼吸量を０．４〜１ｍＬ／回の範囲で適宜調整し、動物の血色や胎動の有無を確認しながら、呼吸回数、呼吸量および麻酔濃度を適宜調整した。動物を保温マット上に仰臥位に固定し、左胸部を剃毛した後、サージカルテープで保温マット上に固定した。剃毛した部分を手術用イソジン液で消毒した後、手術用ルーペ使用下で腋下から正中に向かって皮膚および筋層を小剪刀でそれぞれ切開した。肋間の筋肉をマイクロ持針器で鈍的に切開し、切開部を開創器（小児用開瞼器）で広げ、固定した。心臓表面を露出させ、生理食塩水投与や細胞移植等を行った後、６−０丸針付縫合糸を用いて、肋間および胸部の筋層をそれぞれ縫合して閉創した。６−０角針付縫合糸を用いて皮膚を縫合した後、縫合部位に手術用イソジンゲルを塗付した。皮膚の閉創中から麻酔濃度を０％に設定して強制呼吸を続け、自発呼吸および覚醒を確認した後に気管から挿管チューブを抜管した。手術時間はおよそ３０分であった。なお、麻酔はキャリアーガスとしてＯ２を用いた。
【００２９】
使用した動物の詳細と麻酔濃度を以下の表１に示す。
【表１】
2011229851.tif 000002
【００３０】
ＩＣＲマウスでは、麻酔による死亡はほとんど見られなかったが、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスでは術中からチアノーゼが認められ、死亡する例が散見された。死亡率は８０％程度であった。
【００３１】
例２：ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに対する低濃度吸入麻酔
維持麻酔濃度を１％に低く調整した条件でＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの開胸手術を、例１と同様に施行した。
使用した動物の詳細と麻酔濃度を以下の表２に示す。
【表２】
2011229851.tif 000003
【００３２】
維持麻酔濃度を１％に設定しても、開胸手術中にマウスが覚醒することはなく、術中のチアノーゼは軽減され、死亡率が４０％まで低下した。
【００３３】
例３：ＮＯＧマウスに対する低濃度吸入麻酔
次に、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスよりもさらに重度の免疫不全マウスＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス（登録商標））を用いて、例１と同様に開胸手術を施行した。
使用した動物の詳細と麻酔濃度を以下の表３に示す。
【表３】
2011229851.tif 000004
【００３４】
ＮＯＧマウスでは、導入麻酔は２．５〜３％で十分であった。また、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスと同様に、ＮＯＧマウスにおいても、低濃度の維持麻酔でも施術中に覚醒することはなかった。雌雄ともに術中のチアノーゼは認められず、死亡率は雄で２４％、雌で１７％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の方法によれば、免疫不全動物に様々な外科手術を施すことが可能となり、さらに再生医療に用いるための移植物や薬物の有効性を好適に評価することが可能となる。