(57)【要約】【課題】本発明の目的は、特別な実験設備を得る必要なく一般的な醸造工場に適用でき、その使用がこれらの細菌の識別に必要な時間を最大限に短縮する、ペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別のための培地を提供することである。【解決手段】本発明は、少なくとも一つの炭素源、少なくとも一つの窒素源、少なくとも一つのアミノ酸源、少なくとも一つのビタミン源、少なくとも一つの硫黄源、少なくとも一つの生体金属源、少なくとも一つの酸化還元電位を低下させる物質及び緩衝成分を含む、ペクチネータス属菌の培養及び識別のための培地であって、１０〜８０ｍｇ／ｌの濃度のイソα酸及び／又はそれらの還元水素化誘導体をさらに含むことを原則とする上記培地に関する。  さらに本発明は、サンプリングヘッドを有する綿棒を用いた綿棒サンプルの採取方法であって、綿棒サンプルを採取する前に、０．２５から３ｇ／ｌの濃度の酸化還元電位を低下させる物質を添加した滅菌蒸留水の溶液に綿棒のサンプリングヘッドを浸し、採取した綿棒サンプルを本発明の培地に置くことを原則とする上記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの炭素源、少なくとも一つの窒素源、少なくとも一つのアミノ酸源、少なくとも一つのビタミン源、少なくとも一つの硫黄源、少なくとも一つの生体金属源、少なくとも一つの酸化還元電位を低下させる物質及び緩衝成分を含む、特にビール及び／又は醸造工場及び／又は醸造設備から採取したサンプルから得た、ペクチネータス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）属菌の培養及び識別のための培地であって、１０〜８０ｍｇ／ｌの濃度のイソα酸及び／又はその還元水素化誘導体をさらに含むことを特徴とする上記培地。
【請求項２】
５０ｍｇ／ｌの濃度のイソα酸及び／又はそれらの還元水素化誘導体を含むことを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
０．０５〜０．３重量％の寒天をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
イソα酸の還元水素化誘導体としてテトラヒドロイソα酸を含むことを特徴とする請求項１から３までのいずれか一項に記載の培地。
【請求項５】
イソα酸の還元水素化誘導体としてジヒドロイソα酸を含むことを特徴とする請求項１から４までのいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
イソα酸の還元水素化誘導体としてヘキサヒドロイソα酸を含むことを特徴とする請求項１から５までのいずれか一項に記載の培地。
【請求項７】
サンプリングヘッドを有する綿棒を用いた綿棒サンプルの採取方法であって、綿棒サンプルを採取する前に、０．２５から３ｇ／ｌの濃度の酸化還元電位を低下させる物質を添加した滅菌蒸留水の溶液に綿棒のサンプリングヘッドを浸し、採取した綿棒サンプルを、請求項１から６までのいずれか一項に記載の培地に置くことを特徴とする上記方法。
【請求項８】
酸化還元電位を低下させる成分が、０．２５から１ｇ／ｌの濃度の塩酸システイン、チオグリコール酸ナトリウム、アスコルビン酸の群からの物質、又はこれらの物質のうち少なくとも２つの混合物であり、同時にそれらのどの濃度も１ｇ／ｌの値を越えないことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの炭素源、少なくとも一つの窒素源、少なくとも一つのアミノ酸源、少なくとも一つのビタミン源、少なくとも一つの硫黄源、少なくとも一つの生体金属源、少なくとも一つの酸化還元電位を低下させる物質及び緩衝成分を含む、ペクチネータス属菌の培養及び識別のための培地に関する。
【０００２】
さらに本発明は、サンプリングヘッドを有するサンプリング用綿棒によってサンプルを採取する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ビール中の酸素含有量を１ｍｇ／ｌを限度に減少させるビールのボトリング技術の改良、例えば、ホップの少ないビール、低アルコール、ノンアルコール又は非殺菌のビールのような、その性質に基づき細菌汚染を受けやすい、ある種類のビールの生産の増加、及びビールのフローパスツリゼーション又は冷滅菌の使用により、現在、嫌気性微生物によるビールの汚染のリスクが増大している。これらの微生物は、ビールの官能特性に悪影響を与え、酸性度を高め、特徴的なひどい濁り及び不快な匂いを生じるいくつもの化合物（プロピオン酸、酢酸、硫化水素など）をそのライフサイクルの間に産生する際、二次的、即ち殺菌後の汚染物質として主に生じ、ビールを「腐らせる」。例外的な事例では、これらの微生物が産生したより大量のガスの蓄積によって、ビンの爆発をひき起すことすらあり得る。
【０００４】
この観点から、ペクチネータス属は最も重要な嫌気性微生物に属し、現在、ビール腐敗の３０％を超える原因であると推定される。これらの細菌は、４．５％（ｗ／ｖ）までのアルコール、３．７の値まで低下したｐＨ、並びにホップの苦み化合物に耐性があり、完全に嫌気性の細菌であっても、一定期間、エアロゾルの中でも生存できる。例えば、Ｈｅｌａｎｄｅｒ  Ｉ．Ｍ．、Ｈａｉｋａｒａ  Ａ．、Ｓａｄｏｖｓｋａｙａ  Ｉ．、Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  Ｅ．、Ｓａｌｋｉｎｏｊａ−Ｓａｌｏｎｅｎ  Ｍ．Ｓ．（２００４）：「嫌気性ビール腐敗ペクチネータス属菌のリポ多糖−グラム陰性属のリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂｅｅｒ  ｓｐｏｉｌａｇｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ−ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ａ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｕｓ）」；  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２８：５４３−５５２を参照のこと。
【０００５】
しかし、ビール及び／又は醸造工場若しくは設備でのペクチネータス属菌の存在は検知し難く、これらの細菌は特定の成長要件があるため、従来の膜濾過はその識別には使用できない。Ｈａｉｋａｒａ  Ａ．（１９８４）：「ビール中のペクチネータス混入の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｂｅｅｒ．）」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．４３（１）：４３−４６及びＨａｉｋａｒａ  Ａ．（１９８５）：「ビール中の嫌気性グラム陰性細菌の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ，ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｂｅｅｒ）」Ｍｏｎａｔｓ．Ｂｒａｕｗｉｓｓ．６：２３９−２４３によると、ペクチネータス属菌は、前還元した培地を用いてＣＯ２大気中で行った膜濾過を適用しても識別できない。
【０００６】
同じ理由からペトリ皿の一般的な培地での培養を用いることもできないが、いくつもの国内外の機関がこのやり方を推奨する。例えば、ヨーロッパ醸造協議会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）は、ＭＲＳ、ＮＢＢ、ＰＹＦ、Ｒａｋａ−Ｒａｙ、ＳＤＡ及びＵＢＡタイプの非選択前還元固体培地の使用又はＳＭＭＰ選択液体培地を推奨する。例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ−ＥＢＣ，２００５を参照のこと。
【０００７】
上記タイプの非選択培地の使用の欠点は、この培地が腐敗ビール並びに／又は醸造環境及び／若しくは設備に存在するさらなる種の微生物の成長を妨げず、これらの微生物（酵母、大腸菌群、乳酸菌など）は培地上のペクチネータス属菌とよく競合し、その培養を抑制し、またその代謝物の生成やｐＨの変化などによって培養を阻害することである。この理由から、ペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別のための非選択培地の使用は十分に確証的ではなく、故に一般的な醸造慣習への適用にも適さない。
【０００８】
これらの培地の適用はさらに、膜濾過のための固体の前還元型及び嫌気性条件での培養において推奨され、その結果として、所定の実験室がＮ２及びＨ２制御空気の嫌気性チャンバーを備えるという条件下でのみ、それらの培地は確実に役割を果たすが、それは醸造工場の一般的な設備ではない。
【０００９】
これらの欠点の一部は、ＳＭＭＰタイプの液体選択培地の使用によって部分的に改善される。ここで、酸化還元電位を低下させる物質及び抗生物質（例えば、アクチノン）を含むため、酵母の成長が阻害されるが、ペクチネータス属菌の存在を決定するには、調査するビール、その中での濁りの生成、及び培地の着色変化を１４日に渡って監視する必要がある。これは醸造設備への適用には全く適していない期間である。さらに、この培地は本来、腐敗ビールに直接存在する細菌の培養及び識別のみのためであり、醸造設備から採取した、及び／又は醸造施設にある綿棒サンプルから得たペクチネータス属菌の培養には適さない。
【００１０】
Ｌｅｅ  Ｓ．Ｙ．、Ｍｏｏｒｅ  Ｓ．Ｅ．、Ｍａｂｅｅ  Ｍ．Ｓ．の論文では、「他の醸造微生物からのペクチネータスの単離及び区別のための選択識別培地（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｂｒｅｗｅｒｙ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．）」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：３８６−３８７，１９８１は、ペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別のための、いわゆるＬＬ寒天の適用案であり、培地に存在する酢酸鉛を有する細菌によって産生された硫化水素の化学反応によって生じる黒い着色によって、これらの細菌の存在が現れる。この培地の使用の欠点は、一般的には入手可能でなく、関連取得原価並びに運用費が高い、いわゆる二重壁のＬｅｅ試験管を使用する必要があることである。さらに、このペクチネータス属菌の培養及び識別方法は、調製に比較的時間を要し（通常、５、６日）、試料中で少数の時に、これらの細菌の検出が可能でない。
【００１１】
従来技術の上記の欠点を除くため、専門の文献及び特許文献、例えばＪＰ２００４１２１２５９、ＪＰ２００５００６５５６又はＵＳ５８６９６４２には、これらの細菌のＤＮＡの特定領域の検出に基づくさらなるいくつかのペクチネータス属菌の識別方法案がある。しかし、これらの方法は時間及び費用の両方を要し、その実行のために、複雑な分子技術に熟練した専門の人材だけでなく、特定の実験設備を要する。通常、それ自体の識別は、細菌の培養及び単離、或いはさらなる工程が先行し、その結果、全ての工程では数日かかり得る。さらにこれらの方法の生産物は、多くの場合、明らかでなく、間違った陽性／陰性識別が起こり得る。このことによって、これらの方法は一般的な醸造工場での適用にさえ適さない。
【００１２】
上記欠点に関して、ビール中、並びに／又は醸造工場及び／若しくは設備中のペクチネータス属菌の識別のため、現在はいわゆる「フォーシングテスト（ｆｏｒｃｉｎｇ  ｔｅｓｔ）」を用いる。このテストで採取した試料を、ペクチネータス属菌の成長を支える物質により強化されたビールに接種し、密閉した瓶を２８から３０℃の温度で培養する。同時に、接種から１から６週間以内に、ペクチネータス属菌の存在に付随する影響である濁りの形成を観察する。このやり方の欠点は明らかである。無菌状態で個々の濃縮成分をビールに加える必要がある時、培養及び識別に特に長時間必要であること、このやり方の作業が困難であること、また、ビール瓶の大きさに対する生物培養器の体積への要求の増加がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、特別な実験設備を得る必要なく一般的な醸造工場に適用でき、その使用がこれらの細菌の識別に必要な時間を最大限に短縮する、ペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別のための培地を提供することである。同時に、この培地の使用は汚染されたビールにおけるペクチネータス属菌の識別に限定されないが、醸造工場において及び／又は醸造設備から採取された綿棒サンプルにおいてもまた、その識別を可能にするであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、少なくとも一つの炭素源、少なくとも一つの窒素源、少なくとも一つのアミノ酸源、少なくとも一つのビタミン源、少なくとも一つの硫黄源、少なくとも一つの生体金属源、少なくとも一つの酸化還元電位を低下させる物質及び緩衝成分などの培地の一般的な成分を含む、ペクチネータス属菌の培養及び識別のための培地であって、１０〜８０ｍｇ／ｌの濃度のイソα酸及び／又はそれらの還元水素化誘導体をさらに含むことを原則とする上記培地によって達成された。これらの成分は、その存在によってペクチネータス属菌の培養を促進し、同時に競合する微生物の培養を全体的又は少なくとも部分的に阻害する。その結果、接種後早くも２４時間後に、ペクチネータス属菌を一般的な顕微鏡のみによって観察して識別し得る。
【００１５】
実験中、イソα酸及び／又はその還元水素化誘導体の最も適当な濃度は５０ｍｇ／ｌと規定した。
【００１６】
サンプリング又は運搬物としての本発明の培地の使用において、この培地は０．０５〜０．３重量％の寒天をさらに含み、この寒天は操作中及び運搬中の培地の酸化を制限する。
【００１７】
本発明の培地は、イソα酸の還元水素化誘導体としてテトラヒドロイソα酸及び／又はジヒドロイソα酸及び／又はヘキサヒドロイソα酸を含む。
【００１８】
最良の結果を得るため、本発明の培地の使用中に、本発明のサンプリングヘッドを有する綿棒による綿棒サンプルの採取方法をこの培地と組み合わせて同時に用いると、さらに有利である。本発明は、綿棒サンプルを採取する前に、０．２５から３ｇ／ｌの濃度の酸化還元電位を低下させる物質を添加した滅菌蒸留（ｄｅｓｔｉｌｌｅｄ）水の溶液に綿棒のサンプリングヘッドを浸し、採取した綿棒サンプルを本発明の培地に置くことを原則とする。
【００１９】
酸化還元電位を低下させる物質として、０．２５から１ｇ／ｌの濃度の塩酸システイン、チオグリコール酸ナトリウム又はアスコルビン酸、或いはこれらの物質のうち少なくとも２つの混合物であり、同時にそれらのいずれの濃度も１ｇ／ｌの値を越えないものを使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】他のペクチネータス属菌を含む、醸造設備から採取した綿棒サンプルを接種してから２４時間後の培地の写真である。
【図２】醸造設備から得た同じ綿棒サンプルを接種してから２４時間後の本発明の培地の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の培地は、その組成により嫌気性ペクチネータス属菌の培養を促進し、同時に競合する微生物の培養を阻害する。ペクチネータス属菌及び乳酸菌を同時に接種（実際によく起こる）すると、早くも２４時間後に、特徴的な蛇のような動きをするペクチネータス属菌の独特な細長い細胞を一般的な顕微鏡で観察し、これらの特徴に従ってこの菌を支障なく識別することが可能である。乳酸菌は同時に、本発明の培地の組成により全体的又は少なくとも部分的に阻害され、その結果、乳酸菌はペクチネータス属菌の培養も識別も決して妨げない。本発明の培地は、必要に応じて、サンプリング用、運搬用、並びに診断用に適用できる。培地の組成は表１に大まかに示され、それに加えて培地のｐＨは５．５から５．９までの範囲である。
【表１】
2011224001.tif 000002
【００２２】
本発明の培地は、表１に示す個々の成分ａからｅを混合することによって、容易で安価に所要の割合で調製し得る。しかし、成分ａ、ｂ及びｃは現行で市販のＭＲＳタイプの非選択培地に適当な濃度で既に含まれており、少なくとも場合によっては、残りの成分ｄ及びｅを添加した本発明の培地の基礎としてこの非選択培地を用いると、より有利である。ＭＲＳタイプの非選択培地は、成分ａ、ｂ及びｃに加えて、例えば、１ｇ／ｌの濃度の界面活性物質−ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイーン８０又はポリソルベート８０として市販される）、いくつかの微生物のエネルギー源として同時に働く選択成分−２ｇ／ｌの濃度のクエン酸アンモニウム及び５ｇ／ｌの濃度のＣＨ３ＣＯＯＮａの混合物などの他の成分もまた含むが、それらの存在は、本発明の調製培地の望ましい効果に決して影響を及ぼさないし、ペクチネータス属菌の培養も識別も妨げない。本発明の培地の他の調製手順では、これらの成分を用いる必要はなく、同じ又は類似の機能をもつ他の物質に置き換えられる。
【００２３】
成分ａ−炭素源、窒素源、アミノ酸源及びビタミン源は、１つの適当な物質、またさらに頻繁には２つ以上の種々の物質の混合物により生成される。ＭＲＳタイプの非選択培地を本発明の培地の基礎として用いる場合、それは１０ｇ／ｌの濃度のペプトン、１０ｇ／ｌの濃度の肉エキス、５ｇ／ｌの濃度の酵母エキス及び２０ｇ／ｌの濃度のグルコースの混合物である。しかし、個々の成分を混合して本発明の培地を調製する場合、２〜１５ｇ／ｌの範囲で任意の濃度のペプトン、肉エキス及び酵母エキス、或いは同じ又は類似の機能をもつ他の物質を用いてよいが、例えばペプトンはトリプトン、酵素的カゼイン加水分解物などと適切に置き換えてよい。グルコースは１〜２５ｇ／ｌの任意の濃度で用いてよく、或いはフルクトース、乳酸などと置き換えてよい。
【００２４】
成分ｂ−硫黄源及び生体金属源は、１つの適当な物質、またさらに頻繁には２つの混合物により、或いはより様々な物質により生成される。ＭＲＳタイプの非選択培地を使用する場合、０．２ｇ／ｌの濃度のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び０．０５ｇ／ｌの濃度のＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏの混合物である。個々の成分を混合して本発明の培地を調製する場合、０．０２５〜０．２５ｇ／ｌの範囲の濃度で同じ物質を、或いは同じ又は類似の機能をもつ他の物質、例えば０．００５〜０．０２ｇ／ｌなどの範囲の濃度でＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及びＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、又は２つ以上の適当な物質の混合物を用いてよい。
【００２５】
成分ｃ−緩衝成分は、通常１つの物質により生成される。ＭＲＳタイプの非選択培地を使用する場合、それは２ｇ／ｌの濃度のＫ２ＨＰＯ４である。個々の成分を混合して本発明の培地を調製する場合、１〜３ｇ／ｌの範囲の濃度のＫ２ＨＰＯ４を、或いは同じ又は類似の機能をもつ他の物質、例えばＮａ２ＨＰＯ４など、又は２つ以上の適当な物質の混合物を用いてよい。
【００２６】
成分ｄ−酸化還元電位を低下させる成分は、本発明の培地におけるその存在によりその酸化還元電位を低下させることで、ペクチネータス属菌などの偏性嫌気性微生物の培養を可能にする。本発明の培地中での濃度が０．２５〜１ｇ／ｌの範囲で変化する１つの物質、主に塩酸システイン、アスコルビン酸又はチオグリコール酸ナトリウム、或いは、本発明の培地中の濃度が０．２５ｇ／ｌ〜３ｇ／ｌで変化し、いずれの物質の濃度が１ｇ／ｌの値を越えない、これらの物質の混合物のいずれかである。この目的のさらなるバリアントにおいて、記載の物質に加えて、同じ又は類似の効果をもつ他の物質、或いはかかる物質の混合物を用いてもよい。
【００２７】
成分ｅ−イソα酸及び／又はそれらの誘導体は、その存在によりさらにペクチネータス属菌の培養を促進し、同時に競合する微生物の培養を全体的又は部分的に阻害する。この群はイソα酸（トランス−及びシス−異性体の混合物）及びそれらの還元水素化誘導体、或いはそれらの混合物を含む。最も適当と思われるのは、テトラヒドロイソα酸の使用であるが、それらに加えて、ジヒドロイソα酸若しくはヘキサヒドロイソα酸、これらのイソα酸の還元水素化誘導体の混合物、又はイソα酸及びそれらの還元水素化誘導体の任意の混合物もまた、同様の結果を持って使用し得る。この成分の本発明の培地中の濃度は１０〜８０ｍｇ／ｌの範囲で変化し、好ましくは５０ｍｇ／ｌに達する。
【００２８】
そのバリアントのいくつかにおいてのみ用いられる本発明の培地の別の成分は、寒天である。本発明の培地に存在することで操作中又は運搬中の酸化を阻害し、嫌気性微生物の存在に適した条件を作るのを容易にする。本発明の培地は、実験室において、特に直接塗布に指定されるが、全く寒天を含む必要がない。
【００２９】
本発明の培地の効率を確認するため、ＭＲＳタイプの非選択培地及び様々な濃度の成分ｄ及びｅの組み合わせで生成した、ＭＲＳタイプの非選択培地及び本発明の培地のいくつかのバリアントを用いた多くの比較実験を行った。試験された培地の特定の組成を表２に示す。
【表２】
2011224001.tif 000003
【００３０】
まず、本発明の培地中の成分ｄ及びｅの様々な濃度の、最も一般的なペクチネータス属菌の培養に対する効果を観測した。
【００３１】
（例１）
表２によるバリアントＡからＦにおける培地の成分を１０００ｍｌの蒸留水中で撹拌し、得られた溶液を微生物試験管に１０ｍｌ注ぎ、続いて１２１℃の温度のオートクレーブで１５分間殺菌した。冷却後、微生物試験管中の培地の全てのバリアントに、ペクチネータス属菌の３つの収集株、即ちペクチネータス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ２０４６５、ペクチネータス・フリシンゲンシスＣＣＭ６２１７及びペクチネータス種ＲＩＢＭ２−８６の高密度懸濁液を０．１ｍｌ接種した。２８℃の温度での２４時間の培養後、濁り及び沈殿物の生成を評価し、培地ＡからＦの各バリアントの顕微鏡検査を行った。
【００３２】
培地（ＭＲＳ）のバリアントＡでは濁りは観察されなかった。顕微鏡検査の間、ごく少数のペクチネータス属菌の不規則な存在だけが観察された。
【００３３】
ペクチネータス属菌の存在に付随する影響である強い濁りが、培地のバリアントＢで観察された。顕微鏡検査にて、その特徴的な蛇のような形及び動きに基づいて、さらなる処置なしで容易に支障なく特定できたこれらの細菌の良好な培養が確認された。
【００３４】
培地のバリアントＣからＦでは強い濁りが観察された。顕微鏡検査によって、その特徴的な蛇のような形及び動きに基づいて容易に支障なく特定できたペクチネータス属菌の非常に良好な培養が確認された。
【００３５】
続いて、本発明の培地における成分ｄ及びｅの様々な濃度の、乳酸菌の最も一般的な株の培養に対する影響を観察した。
【００３６】
（例２）
例１と同様の方法で、培地ＡからＦのバリアントを調製した。培地の全てのバリアントに、最も一般的な乳酸菌の２５の収集株の高密度懸濁液を０．１ｍｌ接種した。ある事例において、菌株はＶＵＰＳ収集物から得たラクトバチルス属菌株であった。２８℃の温度での２４時間の培養後、濁り及び沈殿物の生成を評価し、培地ＡからＦの各バリアントの顕微鏡検査を行った。
【００３７】
乳酸菌の存在に付随する影響である強い濁りが、培地（ＭＲＳ）のバリアントＡで観察された。顕微鏡検査の間、乳酸菌の全ての菌株の良好な培養が確認された。
【００３８】
培地のバリアントＢでは強い濁りが観察された。顕微鏡検査にて、乳酸菌の全ての菌株の良好な培養が確認された。
【００３９】
バリアントＣの培地の１９本の試験管では強い濁りが観察された。その後、顕微鏡検査にて、１９の乳酸菌株の培養が確認された。バリアントＡ及びＢの培地と比較すると、本発明の培地の組成によって、６つの乳酸菌株が阻害された。
【００４０】
バリアントＤの培地の１０本の試験管では強い濁りが観察された。その後、顕微鏡検査にて、１０の乳酸菌株のみの培養が確認された。バリアントＡ及びＢの培地と比較すると、本発明の培地の組成によって、１５の乳酸菌株が阻害された。
【００４１】
培地のバリアントＥ及びＦでは濁りは観察されなかった。顕微鏡検査にて、接種した乳酸菌株の培養は確認されなかった。したがって、２５の全ての乳酸菌株は、本発明の培地の組成によって阻害された。
【００４２】
この次に、本発明の培地における成分ｄ及びｅの様々な濃度の、ペクチネータス属菌及び乳酸菌の並行培養に対する、並びに顕微鏡検査によるペクチネータス属菌の識別可能性に対する影響を観測した。
【００４３】
（例３）
例１と同様の方法で、培地ＡからＦのバリアントを調製した。培地の全てのバリアントに、例１のペクチネータス属種ＲＩＢＭ２−８６の菌株の高密度懸濁液を０．１ｍｌ接種し、同時に例２に記載の乳酸菌の２５の収集株の高密度懸濁液を０．１ｍｌ接種した。２８℃の温度での２４時間の培養後、濁り及び沈殿物の生成を評価し、培地ＡからＦの各バリアントの顕微鏡検査を行った。
【００４４】
培地（ＭＲＳ）のバリアントＡにおける強い濁り。顕微鏡検査にて、全ての乳酸菌株の非常に良好な培養が確認された。ペクチネータス属菌は全く観察されなかった。
【００４５】
培地のバリアントＢでは強い濁りが観察された。顕微鏡検査にて、全ての乳酸菌株の良好な培養が確認され、同時にペクチネータス属菌もまた不規則に観察された。
【００４６】
培地のバリアントＣからＦでは強い濁りが観察された。顕微鏡検査にて、ペクチネータス属菌の特性である蛇のような形並びに動きの特徴的な細胞が非常にはっきりと観察されたが、このことにより、これらの細菌が非常に確実に識別され得る。バリアントＣ及びＤの培地では、いくつかの乳酸菌株の培養もまた同時に起こったが、それらの存在がペクチネータス属菌の確実な識別を妨げなかった。バリアントＥ及びＦではペクチネータス属菌が試料中を完全に支配した。
【００４７】
さらなる実験において、本発明の培地のバリアントＣからＦのみを用いたが、ペクチネータス属菌の培養及び識別への適用の可能性は、腐敗したビールの試料中において直接検査した。
【００４８】
（例４）
例１と同様の方法で、バリアントＣからＦにおける本発明の培地を調製し殺菌した。ペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別を実験室で実施したため、本発明の培地はいずれのバリアントにおいても寒天を含まなかった。
【００４９】
ペクチネータス属菌及び他の微生物に汚染されたビールの入った容器の下部から、０．１ｍｌのビールを採取し、１０ｍｌの培地の各バリアントをピペットで各試験管に入れた。２８から３０℃の温度での２４時間の培養後、顕微鏡検査を行い、本発明の培地の全てのバリアントにおける特徴的な蛇のような形及び動きの細胞の存在により、ペクチネータス属菌を支障なく識別した。このことから、汚染されたビール中に直接あるペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別への本発明の培地の適用の可能性が確認された。
【００５０】
本発明の培地のバリアントＣからＦ及び培地のバリアントＢにて、醸造設備から直接採取した綿棒サンプルにおけるペクチネータス属菌の培養及びそれに続く識別の可能性をさらに検査し、先行技術から公知の方法で、ペクチネータス属菌の存在を先立って確認した。
【００５１】
（例５）
例１と同様の方法で、バリアントＣからＦにおける本発明の培地及びバリアントＢにおける培地を調製し殺菌した。醸造環境に綿棒サンプルを入れて採取し、培地の全てのバリアントに接種し、実験室に運搬した。２８から３０℃の温度での２４時間の培養後、顕微鏡検査を行った。
【００５２】
バリアントＢの培地において、醸造環境に典型的な微生物、特に酵母、さらに円形又は楕円形の細菌が存在した。動く楕円形の細菌のいくつかは、同時にペクチネータス属菌とも考えられたが、これらの細菌は特徴的な蛇のような動きを示さなかったため、識別が十分信頼できなかった。
【００５３】
例示のため、図１は６３０倍率の顕微鏡写真を示す。
【００５４】
それにもかかわらず、バリアントＣからＦにおける本発明の培地において、蛇のような形及び動きの独特な細菌が目立って支配し、それはペクチネータス属菌としてかなり確実に識別できた。同時に他の微生物のほとんどが阻害されたか、又はその存在が識別を妨げなかった。
【００５５】
例示のため、図２はバリアントＦにおける本発明の培地の顕微鏡検査で得られた６３０倍率の顕微鏡写真を示す。
【００５６】
行った実験から、炭素源、窒素源、アミノ酸源、ビタミン源、硫黄源、生体金属源、酸化還元電位を低下させる物質（ある事例において、０．２５ｇの塩酸システイン及び０．２５ｇのチオグリコール酸ナトリウムの混合物）及びイソα酸の還元脱水素化誘導体（ある事例において、１０ｍｇのテトラヒドロイソα酸）などの少量の特定成分を加えた緩衝成分などの主要成分を含む本発明の培地が、これらの細菌の純粋培養の直接接種でも、腐敗したビール又は醸造環境にて、及び／若しくは醸造設備から採取した綿棒サンプルから得られた様々な種の細菌の混合物を含む培地の接種でも、ペクチネータス属菌の識別に適用できるという結果になる。同時に、接種からわずか２４時間後に、本発明の培地の使用によるペクチネータス属菌の識別が可能であるため、これが今まで使用された技術よりも何倍も早い。さらに、この方法は一般的な光学顕微鏡を用いて本発明の培地の顕微鏡検査によってペクチネータス属菌が確実に識別され得るため、特別な実験設備の取得を必要としない。
【００５７】
さらなるバリアントにおいて、本発明の培地は他の補助成分を含み得るが、その機能は重要でない。例えば、１〜３ｇ／ｌの濃度のＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩類源、０．０５〜０．１ｇ／ｌの濃度のクロロフェノールレッドなどの酸塩基指示薬、０．００１〜０．００３ｇ／ｌの濃度のメチレンブルー、レサズリンなどの酸化還元指示薬などがある。
【００５８】
ペクチネータス属菌の識別において最良の結果を得るため、醸造工場及び／又は設備から、或いは他の場所から得た綿棒サンプルを、サンプル採取前に、酸化還元電位を低下させる物質を０．２５〜０．１ｇ／ｌの範囲で、或いは０．２５〜３ｇ／ｌの濃度でいくつかのかかる物質の混合物を加え、ただしこれらのどの物質の濃度も１ｇ／ｌの値を越えない滅菌蒸留水にそのサンプリングヘッドを浸した綿棒を用いて採取すれば、さらに有利である。酸化還元電位を低下させる物質は好ましくは塩酸システインであるが、例えば、チオグリコール酸ナトリウム、アスコルビン酸など、或いはかかる物質の混合物など、同じ効果を持つ他の物質もまた使用可能である。採取した綿棒サンプルはすぐに本発明の培地に配置する。
【図１】
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【図２】
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【外国語明細書】
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