(57)【要約】      （修正有）【課題】医農薬原料として重要な光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを製造するための操作性に優れた工業的に実施可能な方法を提供する。【解決手段】酸根を含有する水溶液中でｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させた後、反応液に塩基を添加し、続いて反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液中の酸根のうち酢酸根が４５ｍｏｌ％以上であると共に、貧溶媒がアルコール類である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸根を含有する水溶液中でｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させた後、反応液に塩基を添加し、続いて反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液中の酸根のうち酢酸根が４５ｍｏｌ％以上であると共に、貧溶媒がアルコール類であることを特徴とする、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項２】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒がキサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属もしくはミコプラナ属に属する微生物、またはこれら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換法により誘導される組換株より調製された、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物である、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項３】
アルコール類が２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールから選ばれる一種以上である、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項４】
アルコール類が２−メチル−１−プロパノールである、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項５】
光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンがＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである、請求項１〜４の何れか一項に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬中間体として重要な光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの、操作性に優れた工業的に実施可能な製造方法に関する。詳しくは、原料基質のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択性を有する生体触媒を用いて加水分解した後、貧溶媒に置換して光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の方法によって得られる光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、ＨＩＶやＨＣＶのプロテアーゼ阻害剤等の医薬品原料として重要な中間体である（例えば、特許文献１、２参照）。従来、立体選択性を有する生体触媒、即ち、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物をＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させてＬ体またはＤ体選択的加水分解を行うことにより、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを生成させた後、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより未反応のＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを有機溶媒に溶解させ、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる方法が知られている（例えば、特許文献３，４，５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９９／０３６４０４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３５０６０号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−１１０３４号公報
【特許文献４】特開２００１−３２８９７０号公報
【特許文献５】特開２００２−２５３２９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、生体触媒反応の際、生体触媒の至適ｐＨにおいて行われることが望ましい。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｐＨは、使用する生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、例えばＬ体選択的加水分解活性を有する遺伝子組換菌株であるｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）由来の酵素を用いた場合はｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９において好適に反応が進行する。遊離のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、立体選択的加水分解を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整しなければならない。至適ｐＨに合わせるために塩酸などの無機酸を加えるのが一般的であるが、加えられた酸は未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用して有機溶媒に対して溶解性の低い酸塩を形成してしまうため、有機溶媒中に析出した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを分離取得する際に、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンにその対掌体のＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が混入してしまう。対掌体のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が混入した光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを原料として誘導体を製造した場合、ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度が高いにもかかわらずｔｅｒｔ−ロイシンアミドがｔｅｒｔ−ロイシンと類似の反応性を示すことによりｔｅｒｔ−ロイシン誘導体の光学純度を低下させる場合がある。従って、Ｄ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩の混入を防ぐ必要があり、生体触媒反応後にｔｅｒｔ−ロイシンアミドより強い塩基を加えてアミドを遊離化する操作が必要になる。
【０００５】
ところが、酵素反応後にアルカリ金属水酸化物などの無機塩基を加えてアミドを遊離化した後、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる操作を行うと、有機溶媒のゲル化が生じ、流動性が失われてしまう問題が発生した。
【０００６】
また、原料としてｔｅｒｔ−ロイシンアミド塩酸塩などの酸塩を使用し、アルカリ金属水酸化物などの無機塩基でｐＨ調整を行って生体触媒反応を行った場合も、溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作に伴って同様に溶媒のゲル化が生じた。
【０００７】
その際、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、溶媒の流動性が失われたことにより回収することが困難であった。また、流動性が失われたことによりｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離することができなくなり、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの純度を著しく低下させる問題が生じた。反応液のゲル化には塩の存在が関係しており、ゲル化を回避するために有効と考えられる脱塩操作を行った場合には、工程数の増加に伴い収率の低下を免れない。さらに、流動性を回復するために大量の有機溶媒を添加した場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドは除去することができるが、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率の低下を招く結果となった。工業的な面からも大量の有機溶媒の使用は好ましくない。文献にはゲル化については記載されていないが、文献記載の方法ではこのように、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法として工業的に実施することが困難であることが判明した。
【０００８】
生体触媒反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することによりｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる操作を行うと、有機溶媒のゲル化が生じる理由の詳細は明らかではないが、例えば、ｔｅｒｔ−ロイシンの構造異性体であるイソロイシンなどの誘導体では、水素結合の分子間相互作用により低分子でありながらゲルを生成する性質が知られている（英謙二，  高分子論文集，  ５２７７３，１９９５年、英謙二，  高分子論文集，  ５５，５８５，１９９８年）。ｔｅｒｔ−ロイシンにおいても同様の現象が起こっていると考えられ、ゆえに、有機溶媒のゲル化が生じていると考えられるが、本課題の解決法を示した報告は認められない。
【０００９】
本発明の目的は、従来技術における上記した課題を解決し、医農薬原料として重要な光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを製造するための操作性に優れた工業的に実施可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの工業的に実施可能な製造方法に関して鋭意検討した。
【００１１】
一般的な酸、たとえば塩酸、硫酸等の存在下で、アミドを遊離化しないまま反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒に析出させると、未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンと共に析出し、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの純度を低下させた。そのため、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作の前に塩基を添加してアミドの遊離化を行う必要がある。ここでアミドの遊離化のために添加する塩基として水酸化ナトリウムなどの無機塩基を使用した場合、生成する塩により、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作中に反応混合物がゲル化してしまい、工業的操作が困難となるという問題点がある。反応液のゲル化という現象は、塩酸、硫酸をはじめとする鉱酸および蟻酸、プロピオン酸をはじめとする有機酸など多くの酸でｐＨ調整して生体触媒反応を行い、アミドを遊離化して反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換した場合に観察された。
【００１２】
ゲル化に関与すると考えられる成分について広く検討したところ、溶媒置換に供する液に含まれる酸根として酢酸根を含む場合にゲル化を防止できることを見出した。遊離のｔｅｒｔ−ロイシンアミドを原料とし無機酸によるｐＨ調整下で生体触媒反応を行った後に無機塩基により未反応のアミドを遊離化する場合や、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの無機酸塩を原料とし無機塩基によるｐＨ調整下で生体触媒反応を行った後に無機塩基をさらに加えて未反応のアミドを遊離化する場合など、反応系内にｔｅｒｔ−ロイシンアミド酸塩以外の塩が存在する場合には溶媒置換中にゲル化が起こることがあるが、これらの塩のほかに反応液に酢酸根を含ませることによりゲル化を防止することが可能である。このように、ゲル化を回避しながらｔｅｒｔ−ロイシンアミドまたはその塩を含まない高純度の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを取得できることを見出した。
さらに貧溶媒として相応しい溶媒の種類について検討したところ、酢酸添加下でゲル化を起こさないこと、水と共沸し沸点も比較的低いこと、析出する光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンに対する溶解性が低く、しかもｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩の溶解性が高いこと、その他溶媒としての安全性や経済性の面から、炭素数３〜７のアルコール類、特に２−メチル−１−プロパノールが好適に使用できることを見出した。
【００１３】
このように、溶媒置換前の反応液に酢酸根を存在させ、反応液の溶媒を水からアルコール類へ置換すれば、反応液をゲル化させることなく、かつ光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させｔｅｒｔ−ロイシンアミドまたはその酸塩から分離取得することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを得るための（１）から（６）に示す製造方法に関する。
（１）酸根を含有する水溶液中でｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させた後、反応液に塩基を添加し、続いて反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液中の酸根のうち酢酸根が４５ｍｏｌ％以上であると共に、貧溶媒がアルコール類であることを特徴とする、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（２）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒がキサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属もしくはミコプラナ属に属する微生物、またはこれら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換法により誘導される組換株より調製された、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物である、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（３）アルコール類が２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールから選ばれる一種以上である、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（４）アルコール類が２−メチル−１−プロパノールである、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（５）光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンがＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである、（１）〜（４）の何れか一項に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに立体選択的加水分解活性を有する酵素を作用させ、続いて反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒に析出せしめる際に反応混合物をゲル化させることなくＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを高純度かつ高収率に取得することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態はｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、酸根を含む液中でｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンならびにその対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその塩を含む反応液を得、該反応液に塩基を添加することによってｔｅｒｔ−ロイシンアミドを遊離させ、その後、反応液中に酢酸根が存在する状態で、溶媒を水からｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒に置換することにより、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させるものである。
【００１７】
［生体触媒反応］
まず、生体触媒反応により、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解を行う。すなわち、酸根を含む水溶液中で、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させて、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとその対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得る。酸根としては、塩酸根、硫酸根、リン酸根などの無機酸根、蟻酸根、酢酸根、プロピオン酸根などの有機酸根が例示される。
【００１８】
生体触媒反応に使用される生体触媒は、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対応するＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒であればよく、このような生体触媒を有する微生物として例えば、キサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属またはミコプラナ属等に属する微生物、具体的にはキサントバクター  フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ）ＮＣＩＢ  １００７１Ｔ、プロタミノバクター  アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ８４５８、ミコバクテリウム  メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＢＴ−８４（ＦＥＲＭ  Ｐ８８２３）、ミコバクテリウム  メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）Ｐ−２３（ＦＥＲＭ  Ｐ８８２５）、ミコプラナ  ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ）ＮＣＩＢ９４４０Ｔ、ミコプラナ  ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、バリオボラックス  パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＤＳＭ１４４６８が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換法等の遺伝学的手法により誘導される組換株、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）等の何れの菌株であっても上記能力を有するものであれば本発明に使用できる。また、これら微生物は、菌体または菌体処理物、例えば菌体濃縮液、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物もしくは精製酵素、またはこれらの担体固定物等の形態で使用することができる。
【００１９】
生体触媒反応に適したｔｅｒｔ−ロイシンアミド初期濃度は０．０１ｗｔ％〜飽和濃度、好ましくは１〜２０ｗｔ％、より好ましくは５〜２０ｗｔ％である。低濃度域では反応液体積当りの生産性が非常に低くなり、高濃度域では酵素の失活を招きやすい。なお、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの塩を原料として使用することも可能である。
【００２０】
生体触媒の使用量はその比活性または活性量によって決定され、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）の場合にはｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して乾燥重量として重量比０．０００５〜３とするのが好ましく、０．０００５〜０．０５がより好ましい。
【００２１】
生体触媒反応に適した反応温度は生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、一般的には１０〜７０℃の範囲が好ましい。
【００２２】
生体触媒反応に適したｐＨは使用する生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）の場合にはｐＨ６〜１０が好適であり、ｐＨ６〜９がより好適である。遊離ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを原料とする場合、原料水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、生体触媒反応を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整する必要がある。添加する酸の量は、使用する酵素により異なり一概に規定することはできないが、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）の場合には、ｐＨ調整に効果を有する範囲としてｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して０．００５〜１ｍｏｌ倍量、好ましくは０．００５〜０．５ｍｏｌ倍量である。また、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩を原料として使用し、その水溶液のｐＨよりも生体触媒の至適ｐＨが高い場合には、塩基を添加して至適ｐＨ付近で生体触媒反応を行うことが好ましい。原料としてｔｅｒｔ−ロイシンアミドを使用して酸を添加した場合においてもｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩を使用した場合においても、ｐＨが調整された水溶液は、添加した酸またはｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩に由来する酸根を含有する。
【００２３】
生体触媒を用いた反応系にさらに、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などの各種金属イオンを反応溶液中に１〜５０ｐｐｍ添加することにより、立体選択的加水分解速度を向上させることができる。この際、添加する金属イオンは反応液内において非常に低濃度で添加するため、ゲル化の要因としては無視し得る。ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液への添加順序は特に限定されないが、より高い反応速度を得るために酸、金属イオン、生体触媒の順であることが好ましい。
【００２４】
生体触媒反応の反応様式は、回分でも連続でも良い。反応装置は、撹拌機を備えた槽でも、固定化触媒を充填した塔でも、それらの組み合わせでも良い。
【００２５】
生体触媒反応は、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの９５％以上がＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されるまで、好ましくはＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドが検出されなくなるまで行うと、収率上のみならず品質上も好適である。
【００２６】
生体触媒反応終了後、反応液中に存在する生体触媒は、例えば遠心分離、濾過膜あるいは吸着分離などの通常の分離手段により生体触媒を除くことが望ましい。さらに限外濾過し、または活性炭等の吸着剤を用いて微生物由来の有機物の大部分を除去するとより好適である。また、生体触媒反応に使用した生体触媒は、反応に使用した後も、遠心分離もしくはろ過操作などにより回収し、生体触媒反応の容器に戻すことにより再利用することができる。
【００２７】
［アミドの遊離化］
生体触媒反応終了後または生体触媒除去後の反応液はｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその塩を含有している。塩酸や硫酸等の無機酸とｔｅｒｔ−ロイシンアミドの塩はアルコールへの溶解挙動がｔｅｒｔ−ロイシンと類似しているが、後工程で光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとその対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離する目的から、塩基を添加してｔｅｒｔ−ロイシンアミドと塩を形成している酸と添加した塩基との塩を形成させることによりアミドの遊離化を行い、ｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドの溶解性を大幅に異なる状態とする。塩基としては金属水酸化物、金属アルコラートなど通常用いられる強塩基および、アルカリ金属酢酸塩などの酢酸塩を用いることができる。ただし、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩は、アルコールへの溶解度が高いことから、塩基添加による遊離化を行うことなくｔｅｒｔ−ロイシンアミドとｔｅｒｔ−ロイシンを分離できる。従って、塩基添加は溶媒置換に供する液に含まれる酢酸根以外の酸根を対象として行えばよく、塩基の添加量は、好ましくは溶媒置換に供する液に含まれる酢酸根以外の酸根に対して０．９５〜１．０５当量、さらに好ましくは１当量である。これより不足の場合には、得られる光学活性ｔｅｒｔ−ロイシン中にその対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドが含有されるために好ましくなく、また過剰の場合にはｔｅｒｔ−ロイシンアミド塩として溶解除去されるべき酢酸分までもが酢酸塩として光学活性ｔｅｒｔ−ロイシン中に残留するために不要な塩分増加を招き好ましくない。
【００２８】
［酢酸根の添加］
溶媒置換の際にゲル化を引き起こさないという観点から、溶媒置換に供する液に含まれる酸根のうち４５ｍｏｌ％以上を酢酸根とすることが必要であり、含まれる酸根のうち５０ｍｏｌ％以上を酢酸根とすることがより好ましい。溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませるには、酢酸、酢酸塩等を溶媒置換の前までに反応液に添加すればよい。また、アミドの遊離化と酢酸根の添加の両方の目的を兼ね、アルカリ金属酢酸塩などの酢酸塩を添加することも有効である。
【００２９】
［溶媒置換］
続いて、溶媒置換を行う。反応液の溶媒を水からｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒へと置換し、未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドは溶解させ、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させたのちに回収する方法により、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを容易に取得することができる。溶媒置換の方法は、減圧または常圧で濃縮した後にｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒（以下単に貧溶媒とする）を加える方法、貧溶媒を加えて水と共沸させる方法など、通常の溶媒置換方法を用いることができる。
【００３０】
貧溶媒として用いる有機溶媒は、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの溶解度が高く、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの溶解度が低い溶媒としてアルコール類が好適である。より好適には、２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノール等の炭素数３〜７のアルコール類が好適に使用される。さらには水と共沸し、水への溶解性が低い性質を有する有機溶媒は、溶媒の置換操作が容易になることから、より好適であり、特に２−メチル−１−プロパノールが有効である。この場合、生体触媒を除去した反応液、または該反応液を濃縮した後に有機溶媒を添加し、常圧または減圧下にて共沸させながら水を留去させ、貧溶媒へ置換していく方法を用いることができる。貧溶媒中の水分量は少ないほど光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの収率が高くなる。貧溶媒中の水分量は、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満である。さらに、貧溶媒への置換を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させたのちに回収する操作の温度は、特に限定されず、常用の温度域である。
【００３１】
［光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの回収］
析出した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、遠心分離や濾過などの通常の固液分離手段により容易に回収することができる。回収された光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは残留するｔｅｒｔ−ロイシンアミドを抽出する溶媒で洗浄した後、通風乾燥や真空乾燥などにより乾燥させ、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの混入のないものとして得られる。
【実施例】
【００３２】
次に、本発明を実施例および比較例をもってより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの例にのみ制限されるものではない。なお、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびｔｅｒｔ−ロイシンの定量には以下に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件を用いた。
〔ＨＰＬＣ分析条件１〕
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
〔ＨＰＬＣ分析条件２〕
カラム：スミキラルＯＡ−５０００（４．６φ×５０ｍｍ）
溶離液：硫酸銅１ｍＭ水溶液
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ  ２５４ｎｍ
【００３３】
実施例１
［生体触媒の培養］
生体触媒としては、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド立体選択的加水分解酵素を有する形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）の菌体を用いた。該株を下記の培地にて回分培養を行い、さらに遠心分離濃縮によって培養濃縮液を得た。
培地組成（ｐＨ７．０）
グリセリン                                  ６０ｇ
ポリペプトン                                ４８ｇ
チアミン塩酸塩                              ４．８ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                ４．８ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                        １．８ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                        １２ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                        ７２ｍｇ
Ｈ２Ｏ                                      １２００ｍＬ
［光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造］
１００ｍＬのフラスコに６．５１ｇ（０．０５００ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドと水５８．１ｇを加えて溶解した後、３５％塩酸０．５２ｇ（０．００５０ｍｏｌ）を添加して溶液ｐＨを１０．５から８．６に調整した。さらに、塩化マンガン四水和物２．３ｍｇを添加し、生体触媒としてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド立体選択的加水分解酵素を有する形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００５６）を上記の培養濃縮液０．７５ｇ（乾燥菌体の重量として０．０６５ｇを含有）を接種し、４０℃において２０時間撹拌により立体選択的加水分解を行った。
反応の進行は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件１で確認した。生体触媒添加後２０時間で原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドが検出限界以下となるまでＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。
反応後、反応液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体を除去した濾液を取得した。濾液に酢酸０．３０ｇ（０．００５０ｍｏｌ、溶媒置換に供する液中の酸根における酢酸根（以下単に酢酸根）は５０モル％）、水酸化ナトリウム０．２０ｇ（０．００５０ｍｏｌ）を加えた後、濾液に２−メチル−１−プロパノール８０ｍＬを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出した光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過により濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール２２ｍＬで洗浄し、さらに２０℃のアセトン５５ｍＬで洗浄した後、４０℃で真空乾燥を行い、白色粉末を３．８５ｇ取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度は９１．５％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン以外に塩化ナトリウムを含んでいた。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその酸塩は検出されなかった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は９６．０ｍｏｌ％であった。
【００３４】
実施例２
実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、菌体を除去した後、添加する酢酸量を０．６０ｇ（０．０１００ｍｏｌ、酢酸根６７モル％）、水酸化ナトリウム量を０．２０ｇ（０．００５０ｍｏｌ）とした以外は実施例１と同様の操作を行った。白色粉末３．４３ｇを取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度は９１．５％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン以外に塩化ナトリウムを含んでいた。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその酸塩は検出されなかった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は９５．６ｍｏｌ％であった。
【００３５】
実施例３
菌体除去後に酢酸および水酸化ナトリウムに代えて酢酸ナトリウム０．４１ｇ（０．００５０ｍｏｌ、酢酸根５０モル％）を添加してから溶媒置換を行った以外は実施例１と同様の操作を行った。溶媒置換に際し、ゲル化は起こらず、白色粉末３．４１ｇを取得した。ＨＰＬＣ条件１で分析したところ、この粉末中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度は９１．４％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンのほかに塩化ナトリウムが含まれていた。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその酸塩は検出されなかった。ＨＰＬＣ条件２で分析したところ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は９５．１ｍｏｌ％であった。
【００３６】
実施例４
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに代えてＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩８．６１ｇ（０．０５００ｍｏｌ、酢酸根１００％）を用い、３５％塩酸に代えて水酸化ナトリウム１．６０ｇ（０．０４００ｍｏｌ）を加えてｐＨを８．４に調整し、菌体除去後、酢酸を添加せずに水酸化ナトリウム０．４０ｇ（０．０１００ｍｏｌ）を添加してから溶媒置換を行った以外は実施例１と同様の操作を行い、白色粉末７．２３ｇを取得した。ＨＰＬＣ条件１で分析したところ、この粉末中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度は４３．３％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンのほかに酢酸ナトリウムが含まれていた。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその酸塩は検出されなかった。ＨＰＬＣ条件２で分析したところ、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は９５．６ｍｏｌ％であった。
【００３７】
比較例１
実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、菌体を除去した後、酢酸を添加しない以外は実施例１と同様の操作を行った。溶媒を水から２−メチル−１−プロパノールに置換する途中、反応混合物全体がゲル化し、流動性が失われたため、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収することができなかった。
【００３８】
比較例２
実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、菌体を除去した後、添加する酢酸量を０．０６ｇ（０．００１０ｍｏｌ、酢酸根１７モル％）とした以外は実施例１と同様の操作を行った。溶媒を水から２−メチル−１−プロパノールに置換する途中、反応混合物全体がゲル化し、流動性が失われたため、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収することができなかった。
【００３９】
比較例３
実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、菌体を除去した後、添加する酢酸量を０．２０ｇ（０．００３３ｍｏｌ、酢酸根４０モル％）とした以外は実施例１と同様の操作を行った。溶媒を水から２−メチル−１−プロパノールに置換する途中、反応混合物全体がゲル化し、流動性が失われたため、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収することができなかった。
【００４０】
比較例４〜１０
実施例１と同様に立体選択的加水分解反応を行い、菌体を除去した後、酢酸に換えて表１の化合物（０．００５０ｍｏｌ）を添加した以外は実施例１と同様の操作を行った。いずれも溶媒を水から２−メチル−１−プロパノールに置換する途中、反応混合物全体がゲル化し、流動性が失われたため、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収することができなかった。
【表１】
2011036135.tif 000002