(57)【要約】【課題】疾患特異的なバイオマーカーが発見されていない疾患や、画像検査が評価の対象とならないような特定の疾患に対して、早期診断や治療効果の判定、予後診断に適用可能な検査方法を提供する。【解決手段】被検者から採取した検体中の生体成分のうち、特定の有限個の解析対象成分を選別して定量し、多変量解析を行なうことによりメタボローム解析を行い、その解析結果を、予め取得した健常者グループ及び疾患患者グループの解析結果と比較することで、特定の疾患の検査、例えば早期診断、治療効果の判定、予後診断等を容易に行なうことが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む特定疾患の検査方法：
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、メタボローム解析し、当該メタボローム解析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として選別し、当該解析対象生体分子の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法によりメタボローム解析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象生体分子の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する。
【請求項２】
前記工程（Ａ）に記載の解析対象成分の選別が、以下により行なわれる、請求項１に記載の検査方法：
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（２）前記取得したマススペクトルデータから、生体内代謝産物データベースに基づき生体分子を同定する工程；
（３）同定した生体分子のうち、生体内代謝産物データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各生体分子のマススペクトルパターン、各生体分子に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として選別する。
【請求項３】
前記工程（１）におけるマススペクトルデータが、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により得られたものである、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記工程（２）における生体内代謝産物データベースが、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベースである、請求項４に記載の検査方法。
【請求項５】
特定の疾患が、がんである、請求項１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項６】
特定の疾患が、すい臓がん、消化管がん、および／または肺がんである、請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項７】
消化管がんが、食道がん、胃がん、および／または大腸がんである、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記工程（３）における有限個の解析対象生体分子が以下の（ｉ）〜（iii）から選択される請求項５〜７のいずれか１に記載の検査方法：
（ｉ）乳酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、2-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、4-クレゾール、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、マロン酸、L-バリン、尿素、オクタン酸、L-ロイシン、グリセロール、リン酸、L-イソロイシン、allo-イソロイシン、L-プロリン、グリセリン酸、フマル酸、シトラコン酸、L-セリン、L-トレオニン、デカン酸、アスパラギン酸、L-メチオニン、5-オキソプロリン、チオジグリコール酸、4-ヒドロキシプロリン、7-ヒドロキシオクタン酸、2-ヒドロキシグルタル酸、3-ヒドロキシフェニル酢酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、4-ヒドロキシフェニル酢酸、ラウリン酸、酒石酸、アスパラギン、cis-グルタコン酸、アコニット酸、L-グルタミン、イソクエン酸、クエン酸、グルクロノラクトン、ホモゲンチジン酸、ミリスチン酸、L-チロシン、パルミトレイン酸、パルミチン酸、N-アセチルチロシン、尿酸、マルガリン酸、インドール乳酸、ステアリン酸及びL-トリプトファン；
（ii）フェノール、乳酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、カプロン酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、サルコシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、4-クレゾール、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、アミノ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、マロン酸、アミノイソ酪酸、メチルマロン酸、L-バリン、尿素、3-ヒドロキシ吉草酸、2-ヒドロキシ-3-メチル吉草酸、安息香酸、オクタン酸、2-メチル-3-ヒドロキシ吉草酸、L-ロイシン、グリセロール、アセチルグリシン、リン酸、エチルマロン酸、L-イソロイシン、マレイン酸、L-プロリン、グリセリン酸、フマル酸、ウラシル、プロピオニルグリシン、L-セリン、イソブチリルグリシン、L-トレオニン、サクシニルラクトン、デカン酸、リンゴ酸、イソバレリルグリシン、アスパラギン酸、L-メチオニン、5-オキソプロリン、チオジグリコール酸、4-ヒドロキシプロリン、2-ヒドロキシグルタル酸、ピメリン酸、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、L-フェニルアラニン、ラウリン酸、アスパラギン、リジン、アコニット酸、L-グルタミン、イソクエン酸、クエン酸、グルクロノラクトン、ミリスチン酸、カフェイン、4-ヒドロキシフェニル乳酸、L-ヒスチジン、L-チロシン、インドール-3-酢酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、尿酸、マルガリン酸、ステアリン酸、L-トリプトファン；
（iii）乳酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、2-ヒドロキシ酪酸、サルコシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、α-アミノ酪酸、マロン酸、L-バリン、尿素、安息香酸、オクタン酸、エチルマロン酸、L-ロイシン、グリセロール、リン酸、L-イソロイシン、マレイン酸、L-プロリン、コハク酸、グリセリン酸、フマル酸、L-セリン、L-トレオニン、デカン酸、リンゴ酸、イソバレリルグリシン、2-ヘキセン二酸、アスパラギン酸、L-メチオニン、5-オキソプロリン、4-ヒドロキシプロリン、7-ヒドロキシオクタン酸、2-プロピル-グルタル酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、ラウリン酸、アコニット酸、イソクエン酸、クエン酸、グルクロノラクトン、ミリスチン酸、4-ヒドロキシフェニル乳酸、インドール-3-酢酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、尿酸、マルガリン酸、ステアリン酸；または
（iv）乳酸、プロパン酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ブタン酸、サルコシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、エタンイミド酸、マロン酸、L-バリン、尿素、L-ロイシン、グリセロール、リン酸、L-イソロイシン、L-プロリン、コハク酸、グリシン、グリセリン酸、ピリミジン、フマル酸、ウラシル、L-セリン、アミノマロン酸、L-トレオニン、リンゴ酸、アスパラギン酸、メチオニン、5-オキソプロリン、チオジグリコール酸、L-システイン、2-ヒドロキシフェニル酢酸、2-ヒドロキシグルタル酸、L-グルタミン酸、2-ケトグルタル酸、L-フェニルアラニン、4-ヒドロキシフェニル酢酸、ラウリン酸、N-アセチルアスパラギン酸、アスパラギン、d-リボース、α-アミノアジピン酸、L-グルタミン、9H-プリン、DL-オルニチン、イソクエン酸、クエン酸、ミリスチン酸、グルクロノラクトン、d-グルコース、4-ヒドロキシフェニル乳酸、L-リジン、L-チロシン、D-グルコン酸、パルミチン酸、N-アセチルグルコサミン、ウロン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、L-トリプトファン、イノシン、アデノシン、グアニン。
【請求項９】
検体が、血液、組織、尿、糞便から選択されるいずれかである請求項１〜８のいずれか１に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者から採取した検体中の解析対象生体分子についてメタボローム解析を行い、予め取得した健常者グループ及び疾患患者グループの解析結果に基づき、特定疾患の検査を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の疾患診断、特にがん疾患診断は、血液、尿中のバイオマーカー測定による生化学的検査、カメラ、内視鏡等による画像検査が主体である。しかし、現状では、疾患特異的なバイオマーカーが発見されていないものや画像検査が評価の対象とならない疾患も数多く存在し、早期診断や治療効果の判定、予後診断を困難にしている。
【０００３】
現在、がんの検査は血液中の腫瘍マーカー[例えば、CA19-9(糖鎖抗原19-9)、CEA(がん胎児性抗原)、AFP(α-フェトプロテイン)、PIVKA-II、PSA(前立腺特異抗原)、CA125(糖鎖抗原125)]などの数値を指標に一次検査が行われている。すい臓がんは代表的な難治がんであり、その最大の理由は早期診断が困難なことにある。すい臓がんの腫瘍マーカー（診断マーカー）として、CEA、CA19-9、CA-50、エラスターゼ1、Span-1、DUPAN-2等が開発され、臨床診断で利用されている。しかしながら、これら腫瘍マーカーは、すい臓がん以外に、慢性膵炎のみならず、慢性肝炎や肝硬変などの肝良性疾患やすい臓がん以外のがん（例えば、胃がん、大腸がん等）でも陽性を示してしまうという問題や、或いは特定のすい臓がんに対して陰性を示してしまうという問題等があり、すい臓がんを特異的に且つ確実に検出・診断する腫瘍マーカーとしては満足できるものではなかった。すい臓がんの他にも、消化管がん（食道がん、胃がん、大腸がん）や肺がんについて腫瘍マーカーが臨床においてすでに用いられているが、従来の腫瘍マーカーは、十分な感度および特異度を持つに至っていない。
【０００４】
一方、創薬、薬理学、毒性学、診断に供する知見を得るための新たな研究手法として、メタボロームの解析が行われている。また、メタボロームの解析方法として、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小自乗法（ＰＬＳ）などの統計解析を用い、取得したスコアの座標配置による群分けを行い、ローディングプロットによる化合物を同定してマーカーを選別する方法が報告されている。
【０００５】
加えて、上記メタボロームを解析する方法に関する特許文献が公開されている。
特開２００９−５７３３７（特許文献１）は、「多数のメタボロームデータを同時に解析してデータマイニングを行う手段を提供すること」を開示している。特許文献１では、メタボロームデータによるプロファイルのセットを解析するための方法および装置を提供することを目的としており、更に詳しくは、ＭＳ（蛋白質の質量分析方法）から得られたデータを、統計的解析手段を用いてメタボロームデータのプロファイルのセットから、創薬、薬理学、毒性学、診断に有用なマーカー群の抽出およびそれら有用マーカー群に共通する規則を抽出し、データマイニングする方法を提供することを目的としている。特許文献１では、一連の作業を自動化することが可能になり、メタボロームデータのデータマイニングにおいて、解析者の主観に左右されない一意な解析結果を提供することで、正確なメタボロームデータのプロファイルのセットから、データマイニングすることが可能になったことが開示されている。また、主成分分析（ＰＣＡ）では、主成分の寄与が分散すると判定が困難となり、一連の作業の完全自動化が困難であることが述べられ、ＰＣＡの手法が好ましくないことが述べられている。
【０００６】
特開２００７−３１５８５２（特許文献２）は、「被験物質が薬剤誘発性リン脂質症などの脂質代謝異常症を誘発する可能性があるか否かを簡便かつ確実に予測又は診断する方法を提供すこと」を開示している。これらの方法を行なうにあたり、メタボローム解析を行なうことが開示されている。
【０００７】
特開２００９−２００３７（特許文献３）は、「メタボローム解析における生体物質および代謝物の同定方法」を開示している。特許文献３では、多種類の生体成分および代謝物を含む試料を包括的に分析した際の膨大なデータを解析するための手法が提供され、生体成分および代謝物の候補を効率よく絞り込むことができることが開示されている。特許文献３の方法では、質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、または該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る工程を含むことを要件としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−５７３３７号公報
【特許文献２】特開２００７−３１５８５２号公報
【特許文献３】特開２００９−２００３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、疾患特異的なバイオマーカーが発見されていない疾患や、画像検査が評価の対象とならないような特定の疾患に対して、早期診断や治療効果の判定、予後診断に適用可能な検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被検者から採取した検体中の生体成分のうち、特定の有限個の解析対象成分を選別して定量し、多変量解析を行なうことによりメタボローム解析を行い、その解析結果を、予め取得した健常者グループ及び疾患患者グループの解析結果と比較することで、特定の疾患の検査、例えば早期診断、治療効果の判定、予後診断等を容易に行なうことが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の工程を含む特定疾患の検査方法：
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、メタボローム解析し、当該メタボローム解析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として選別し、当該解析対象生体分子の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法によりメタボローム解析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象生体分子の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する。
２．前記工程（Ａ）に記載の解析対象成分の選別が、以下により行なわれる、前項１に記載の検査方法：
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（２）前記取得したマススペクトルデータから、生体内代謝産物データベースに基づき生体分子を同定する工程；
（３）同定した生体分子のうち、生体内代謝産物データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各生体分子のマススペクトルパターン、各生体分子に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として選別する。
３．前記工程（１）におけるマススペクトルデータが、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により得られたものである、前項２に記載の検査方法。
４．前記工程（２）における生体内代謝産物データベースが、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベースである、前項４に記載の検査方法。
５．特定の疾患が、がんである、前項１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
６．特定の疾患が、すい臓がん、消化管がん、および／または肺がんである、前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
７．消化管がんが、食道がん、胃がん、および／または大腸がんである、前項６に記載の検査方法。
８．前記工程（３）における有限個の解析対象生体分子が以下の（ｉ）〜（iii）から選択される前項５〜７のいずれか１に記載の検査方法：
（ｉ）乳酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、2-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、4-クレゾール、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、マロン酸、L-バリン、尿素、オクタン酸、L-ロイシン、グリセロール、リン酸、L-イソロイシン、allo-イソロイシン、L-プロリン、グリセリン酸、フマル酸、シトラコン酸、L-セリン、L-トレオニン、デカン酸、アスパラギン酸、L-メチオニン、5-オキソプロリン、チオジグリコール酸、4-ヒドロキシプロリン、7-ヒドロキシオクタン酸、2-ヒドロキシグルタル酸、3-ヒドロキシフェニル酢酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、4-ヒドロキシフェニル酢酸、ラウリン酸、酒石酸、アスパラギン、cis-グルタコン酸、アコニット酸、L-グルタミン、イソクエン酸、クエン酸、グルクロノラクトン、ホモゲンチジン酸、ミリスチン酸、L-チロシン、パルミトレイン酸、パルミチン酸、N-アセチルチロシン、尿酸、マルガリン酸、インドール乳酸、ステアリン酸及びL-トリプトファン；
（ii）フェノール、乳酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、カプロン酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、サルコシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、4-クレゾール、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、アミノ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、マロン酸、アミノイソ酪酸、メチルマロン酸、L-バリン、尿素、3-ヒドロキシ吉草酸、2-ヒドロキシ-3-メチル吉草酸、安息香酸、オクタン酸、2-メチル-3-ヒドロキシ吉草酸、L-ロイシン、グリセロール、アセチルグリシン、リン酸、エチルマロン酸、L-イソロイシン、マレイン酸、L-プロリン、グリセリン酸、フマル酸、ウラシル、プロピオニルグリシン、L-セリン、イソブチリルグリシン、L-トレオニン、サクシニルラクトン、デカン酸、リンゴ酸、イソバレリルグリシン、アスパラギン酸、L-メチオニン、5-オキソプロリン、チオジグリコール酸、4-ヒドロキシプロリン、2-ヒドロキシグルタル酸、ピメリン酸、L-グルタミン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、L-フェニルアラニン、ラウリン酸、アスパラギン、リジン、アコニット酸、L-グルタミン、イソクエン酸、クエン酸、グルクロノラクトン、ミリスチン酸、カフェイン、4-ヒドロキシフェニル乳酸、L-ヒスチジン、L-チロシン、インドール-3-酢酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、尿酸、マルガリン酸、ステアリン酸、L-トリプトファン；
（iii）乳酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、2-ヒドロキシ酪酸、サルコシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、α-アミノ酪酸、マロン酸、L-バリン、尿素、安息香酸、オクタン酸、エチルマロン酸、L-ロイシン、グリセロール、リン酸、L-イソロイシン、マレイン酸、L-プロリン、コハク酸、グリセリン酸、フマル酸、L-セリン、L-トレオニン、デカン酸、リンゴ酸、イソバレリルグリシン、2-ヘキセン二酸、アスパラギン酸、L-メチオニン、5-オキソプロリン、4-ヒドロキシプロリン、7-ヒドロキシオクタン酸、2-プロピル-グルタル酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、ラウリン酸、アコニット酸、イソクエン酸、クエン酸、グルクロノラクトン、ミリスチン酸、4-ヒドロキシフェニル乳酸、インドール-3-酢酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、尿酸、マルガリン酸、ステアリン酸；または
（iv）乳酸、プロパン酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、L-アラニン、L-グリシン、グリオキシル酸、シュウ酸、2-ヒドロキシ酪酸、ブタン酸、サルコシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシイソ酪酸、エタンイミド酸、マロン酸、L-バリン、尿素、L-ロイシン、グリセロール、リン酸、L-イソロイシン、L-プロリン、コハク酸、グリシン、グリセリン酸、ピリミジン、フマル酸、ウラシル、L-セリン、アミノマロン酸、L-トレオニン、リンゴ酸、アスパラギン酸、メチオニン、5-オキソプロリン、チオジグリコール酸、L-システイン、2-ヒドロキシフェニル酢酸、2-ヒドロキシグルタル酸、L-グルタミン酸、2-ケトグルタル酸、L-フェニルアラニン、4-ヒドロキシフェニル酢酸、ラウリン酸、N-アセチルアスパラギン酸、アスパラギン、d-リボース、α-アミノアジピン酸、L-グルタミン、9H-プリン、DL-オルニチン、イソクエン酸、クエン酸、ミリスチン酸、グルクロノラクトン、d-グルコース、4-ヒドロキシフェニル乳酸、L-リジン、L-チロシン、D-グルコン酸、パルミチン酸、N-アセチルグルコサミン、ウロン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、L-トリプトファン、イノシン、アデノシン、グアニン。
９．検体が、血液、組織、尿、糞便から選択されるいずれかである前項１〜８のいずれか１に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１２】
特定疾患患者及び健常者について、メタボローム解析を用いる本発明の方法により取得した解析モデルをファイルとして保存しておくことで、被験者より採取した血液等の検体の測定時に、このファイルを呼び出し、当該検体の解析結果と比較することで、特定疾患の検査を行なうことができる。即ち、被験者より採取した検体について、上記と同手法により主成分分析を行い、分析パターンが特定の疾患の場合のパターンに重複するか、又は特定疾患のどのステージのパターンに重複するかを確認することで、特定の疾患の検査や、ステージの検査を行うことができる。
【００１３】
本発明の検査方法は、血液等の検体に存在する複数の物質の変動を網羅的に解析することにより、複数の物質の変動を特定疾患の総体として捉えて検査する手法であり、ひとつのバイオマーカーで検査する結果と比較して、迅速かつ容易に精度の高い検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】解析対象生体分子の変動に基づいたすい臓がん患者及び健常者の分布をスコアプロットにより確認した結果を示す図である。（実験例１）
【図２】図１のスコアプロットの結果をもとに作成したローディングプロットを示す図である。図２中の数字は、表２に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例１）
【図３】１３名のすい臓がん患者について、がんのステージの分布をスコアプロットにより確認した結果を示す図である。（実験例２）
【図４】図３のスコアプロットの結果をもとに作成したローディングプロットを示す図である。図４中の数字は、表２に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例２）
【図５】１３名のすい臓がん患者及び健常者について、上記分析した生体分子のうち、乳酸、尿酸及び3-ヒドロキシ酪酸について、健常者を１とした場合のステージIII＋ステージIVaとステージIVbの値を確認した図である。（比較例１）
【図６】解析対象生体分子の変動に基づいた食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者及び健常者の分布をスコアプロットにより確認した結果を示す図である。（実験例３）
【図７】解析対象生体分子の変動に基づいた食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者及び健常者における解析対象生体分子の分布に関するＰＬＳ−ＤＡスコアプロット（上段）およびローディングプロット（下段）を示す図である。ローディングプロット中の数字は、表４に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例３）
【図８】解析対象生体分子の変動に基づいた食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者及び健常者における解析対象生体分子の分布に関するＰＬＳ−ＤＡスコアプロット（上段）およびローディングプロット（下段）を示す図である。ローディングプロット中の数字は、表４に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例３）
【図９】解析対象生体分子の変動に基づいた食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者及び健常者における解析対象生体分子の分布に関するＰＬＳ−ＤＡスコアプロット（上段）およびローディングプロット（下段）を示す図である。ローディングプロット中の数字は、表４に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例３）
【図１０】食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者の６個の生体分子の値について、健常者を１とした場合を示す図である。（実験例４）
【図１１】食道がん、胃がん、大腸がんに関する、生体分子についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。（実験例４）
【図１２】肺がん患者について、がんのステージの分布をスコアプロット（左側）およびローディングプロット（右側）を確認した結果を示す図である。ローディングプロット中の数字は、表７に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例５）
【図１３】肺がん患者について、がんの組織型の分布をスコアプロット（左側）およびローディングプロット（右側）を確認した結果を示す図である。ローディングプロット中の数字は、表７に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。（実験例６）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、以下の工程を含む特定疾患の検査方法に関する。
（Ａ）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、メタボローム解析し、当該メタボローム解析により健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として選別し、当該解析対象生体分子の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｂ）被験者から取得した検体について、上記（Ａ）と同手法によりメタボローム解析を行い、上記（Ａ）で選別した解析対象生体分子の定量値を基にして多変量解析を行なう工程；
（Ｃ）前記（Ａ）で得た多変量解析結果と前記（Ｂ）で得た多変量解析結果の差異を確認する工程；
（Ｄ）前記（Ｂ）で得た多変量解析結果が、前記（Ａ）で得た多変量解析結果のうち特定の疾患患者から取得した検体に基づく解析結果と重複する場合に、特定の疾患であると判断する。
【００１６】
上記において、工程（Ａ）の健常者グループ及び疾患患者グループとは、本発明の検査方法による検査結果を導くための標準となりうる者のグループをいう。健常者グループは、広義の意味で定義することができ、健常者に含まれるヒトが、何らかの疾患を有していても、採取した検体が検査対象となる特定の疾患に対して健常であると判断される場合には、健常者グループに含めることができる。疾患患者グループとしては、特定の疾患患者群、特定の疾患のステージが明らかな患者群、特定の疾患の悪性度が明らかな患者群などから構成される。特定の疾患としては特に限定されないが、がんや炎症性疾患などが挙げられる。がんとしては特に限定されないが、たとえばすい臓がん、消化管がん（食道がん、胃がん、および／または大腸がん）、および／または肺がんが挙げられる。また、炎症性疾患としては、特に限定されないが、例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎）などが挙げられる。
【００１７】
上記において、工程（Ｂ）の被験者とは、特定の疾患に関する検査の対象、例えば特定の疾患に対する検査、早期診断のための検査、あるいは疾患のステージ、悪性度、治療効果の判定、予後診断などの検査について検査対象となる者をいう。
【００１８】
上記において、工程（Ａ）についての解析対象生体分子の多変量解析結果を予め取得しておき、その結果に対して（Ｂ）の被験者についての同分子の多変量解析結果を当てはめ、工程（Ｃ）による差異を確認するのが好適である。（Ａ）についての多変量解析結果を、解析モデルということもできる。
【００１９】
本発明の検査方法を行なうに際し、工程（Ａ）に記載の解析対象成分は、以下の工程により選別することができる。
（１）健常者グループ及び疾患患者グループから取得した検体について、質量分析によりマススペクトルデータを取得する工程；
（２）前記取得したマススペクトルデータから、生体内代謝産物データベースに基づき生体分子を同定する工程；
（３）同定した生体分子のうち、生体内代謝産物データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各生体分子のマススペクトルパターン、各生体分子に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として選別する。
【００２０】
本発明において、採取した検体とは、例えば血液、組織、尿、糞便などが挙げられ、特に限定されないが、血液を検体とするのが最も好適である。また採取する組織は、いずれの組織であっても良いが、例えばがん患者の場合は、がん組織などが挙げられる。本発明において、検体とは生体から採取したものをいい、検体に対して何らかの処理を行い、検査に供されるものを試料ということとする。上記各検体から、水溶性生体分子を、有機溶媒と水とを用いた液相抽出により抽出することができる。ここで水溶性生体分子の例として、例えば糖、アミノ酸、有機酸などが挙げられる。
【００２１】
本発明の検査方法に供するための試料の調製方法は特に限定されず、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。例えば特開2008-5778（細胞からの代謝物の抽出方法）に記載の方法のように、代謝物に超音波処理をしても良い。また、抽出した溶液を凍結乾燥後、メトキシアミンを含むピリジン溶液に生体分子を再溶解し、30℃で90分間インキュベートすることで、オキシム化することができる。続けて、N‐メチル‐N-トリメチルシリル-トリフルオロアセトアミド(N‐Methyl‐N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide)を含むピリジン溶液を加えて、さらに、37℃で30分間インキュベートすることで、生体分子を誘導体化させることができる。そして、得られた溶液を試料として、後述のＧＣ／ＭＳによる測定に供することができる。
【００２２】
本発明における質量分析(Mass spectrometry)「ＭＳ解析」とは、タンパク質等の質量分析を意味する。分析する試料をイオン化させて導入し、電気力や磁気力により質量ごとの差をつくり、イオンの質量を分析することである。上記分析を行う装置である質量分析計を含め以下ＭＳと略する場合がある。より詳しくは、原子、分子、クラスター等の粒子を何等かの方法で気体状のイオンとし、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する事をいう。質量電荷数比に応じて分離・検出されたイオンをもとに、横軸にm/z 、縦軸にイオンの相対強度をとった棒グラフをマススペクトル(Mass spectrum)という。 質量分析をする為の機器を質量分析計といい、試料導入部、イオン源、分析部、イオン検出部そしてデータ処理部から構成される。また、質量分析計を高速液体クロマトグラフィー(HPLC) や ガスクロマトグラフィー(GC)、キャピラリー電気泳動(CE)に直結し、移動相を導入することも可能である。それぞれ ＬＣ／ＭＳ、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、ＣＥ−ＭＳと称される。本発明の質量分析計として最も好適には、ＧＣ／ＭＳが適用される。
【００２３】
本発明のマススペクトルデータの解析は、得られたマススペクトルデータ中における特定のマススペクトルの消失、出現時間、保持時間、及び／又はピーク強度の上昇若しくは減少を解析することにより行うことができる。
【００２４】
前記工程（２）における生体内代謝産物データベースに基づき、上記質量分析により得られたマススペクトルデータから、生体成分を同定することができる。この場合において、質量分析がＧＣ／ＭＳによる場合は、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベースを用いることができる。
【００２５】
前記工程（３）における有限個の解析対象生体分子として、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各生体分子のマススペクトルパターン、各生体分子に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として適宜選別することができる。選別するための検出量の差の程度は、検査目的に応じて決定し、適宜選択することができる。
【００２６】
具体的には、すい臓がんの病態により影響を受ける生体分子として、以下の６１の生体分子を解析対象生体分子として選別することができる。
1. Lactic acid（乳酸）
2. Glycolic acid（グリコール酸）
3. L-Alanine（L-アラニン）
4. L-Glycine（L-グリシン）
5. Glyoxylic acid（グリオキシル酸）
6. Oxalic acid（シュウ酸）
7. 2-Hydroxybutyric acid（2-ヒドロキシ酪酸）
8. 3-Hydroxypropionic acid（3-ヒドロキシプロピオン酸）
9. Pyruvic acid（ピルビン酸）
10. 4-Cresol（4-クレゾール）
11. 3-Hydroxybutyric acid（3-ヒドロキシ酪酸）
12. 3-Hydroxyisobutyric acid（3-ヒドロキシイソ酪酸）
13. 2-Hydroxyisovaleric acid（2-ヒドロキシイソ吉草酸）
14. Malonic acid（マロン酸）
15. L-Valine（L-バリン）
16. Urea（尿素）
17. Octanoic acid（オクタン酸）
18. L-Leucine（L-ロイシン）
19. Glycerol（グリセロール）
20. Phosphoric acid（リン酸）
21. L-Isoleucine（L-イソロイシン）
22. allo-Isoleucine（allo-イソロイシン）
23. L-Proline（L-プロリン）
24. Glyceric acid（グリセリン酸）
25. Fumaric acid（フマル酸）
26. Citraconic acid（シトラコン酸）
27. L-Serine（L-セリン）
28. L-Threonine（L-トレオニン）
29. Decanoic acid（デカン酸）
30. Aspartic acid（アスパラギン酸）
31. L-Methionine（L-メチオニン）
32. 5-Oxoproline（5-オキソプロリン）
33. Thiodiglycolic acid（チオジグリコール酸）
34. 4-Hydroxyproline（4-ヒドロキシプロリン）
35. 7-Hydroxyoctanoic acid（7-ヒドロキシオクタン酸）
36. 2-Hydroxyglutaric acid（2-ヒドロキシグルタル酸）
37. 3-Hydroxyphenylacetic acid（3-ヒドロキシフェニル酢酸）
38. L-Glutamic acid （L-グルタミン酸）
39. L-Phenylalanine（L-フェニルアラニン）
40. 4-Hydroxyphenylacetic acid（4-ヒドロキシフェニル酢酸）
41. Lauric acid（ラウリン酸）
42. Tartaric acid（酒石酸）
43. Asparagine（アスパラギン）
44. cis-Glutaconic acid（cis-グルタコン酸）
45. Aconitic acid（アコニット酸）
46. L-Glutamine（L-グルタミン）
47. Isocitric acid（イソクエン酸）
48. Citric acid（クエン酸）
49. 52. Glucuronic lactone（グルクロノラクトン）
50. Homogentisic acid（ホモゲンチジン酸）
51. Myristic acid（ミリスチン酸）
53. L-Tyrosine（L-チロシン）
54. Palmitoleic acid（パルミトレイン酸）
55. Palmitic acid（パルミチン酸）
56. N-Acetyltyrosine（N-アセチルチロシン）
57. Uric acid（尿酸）
58. Margaric acid（マルガリン酸）
59. Indolelactic acid（インドール乳酸）
60. Stearic acid（ステアリン酸）
61. L-Tryptophan （L-トリプトファン）
上記49及び52のグルクロノラクトンは、異性体を含む。
【００２７】
消化管がんの病態により影響を受ける生体分子として、以下の７７の生体分子を解析対象生体分子として選別することができる。
1. Phenol（フェノール）
2. Lactic acid（乳酸）
3. 2-Hydroxyisobutyric acid（2-ヒドロキシイソ酪酸）
4. Caproic acid（カプロン酸）
5. Glycolic acid（グリコール酸）
6. L-Alanine（L-アラニン）
7. L-Glycine（L-グリシン）
8. Glyoxylic acid（グリオキシル酸）
9. Oxalic acid（シュウ酸）
10. Sarcosine（サルコシン）
11. 3-Hydroxypropionic acid（3-ヒドロキシプロピオン酸）
12. 4-Cresol（4-クレゾール）
13. 3-Hydroxyisobutyric acid（3-ヒドロキシイソ酪酸）
14. 2-Hydroxyisovaleric acid（2-ヒドロキシイソ吉草酸）
15. Aminobutyric acid（アミノ酪酸）
16. 3-Hydroxybutyric acid（3-ヒドロキシ酪酸）
17 .Malonic acid（マロン酸）
18. Aminoisobutyric acid（アミノイソ酪酸）
20. Methylmalonic acid（メチルマロン酸）
21. L-Valine（L-バリン）
22. Urea（尿素）
23. 3-Hydroxyvaleric acid（3-ヒドロキシ吉草酸）
24. 2-Hydroxy-3-methylvaleric acid（2-ヒドロキシ-3-メチル吉草酸）
25. Benzoic acid（安息香酸）
26. Octanoic acid（オクタン酸）
27. 2-Methyl-3-hyroxyvaleric acid（2-メチル-3-ヒドロキシ吉草酸）
28. L-Leucine（L-ロイシン）
29. Glycerol（グリセロール）
30. Acetylglycine（アセチルグリシン）
31. Phosphoric acid（リン酸）
32. Ethylmalonic acid（エチルマロン酸）
33. L-Isoleucine（L-イソロイシン）
34. Maleic acid（マレイン酸）
35. L-Proline（L-プロリン）
37. Glyceric acid（グリセリン酸）
38. Fumaric acid（フマル酸）
39. Uracil（ウラシル）
40. Propionylglycine（プロピオニルグリシン）
41. L-Serine（L-セリン）
42. Isobutyrylglycine（イソブチリルグリシン）
43. L-threonine（L-トレオニン）
44. Succinylactone（サクシニルラクトン）
45. Decanoic acid（デカン酸）
46. Malic acid（リンゴ酸）
47 .Isovalerylglycine（イソバレリルグリシン）
48. Asparatic acid（アスパラギン酸）
49. L-methionine（L-メチオニン）
50. 5-Oxoproline（5-オキソプロリン）
51. Thiodiglycolic acid（チオジグリコール酸）
52. 4-Hydroxyproline（4-ヒドロキシプロリン）
53. 2-Hydroxyglutaric acid（2-ヒドロキシグルタル酸）
54. Pimelic acid（ピメリン酸）
55. L-Glutamic acid（L-グルタミン酸）
56. 4-Hydroxybenzoic acid（4-ヒドロキシ安息香酸）
57. L-Phenylalanine（L-フェニルアラニン）
58. Lauric acid（ラウリン酸）
59. Asparagine（アスパラギン）
60. Lysine（リジン）
61. Aconitic acid（アコニット酸）
62. L-Glutamine（L-グルタミン）
63. Isocitric acid（イソクエン酸）
64. Citric acid（クエン酸）
65. Glucuronoic lactone（グルクロノラクトン）
66. Myristic acid（ミリスチン酸）
67. Caffeine（カフェイン）
68. 4-Hydroxyphenyllactic acid（4-ヒドロキシフェニル乳酸）
69. L-Histidine（L-ヒスチジン）
70. L-Tyrosine（L-チロシン）
71. Indol-3-acetic acid（インドール-3-酢酸）
72. Palmitoleic acid（パルミトレイン酸）
73. Palmitic acid（パルミチン酸）
74. Uric acid（尿酸）
75. Margaric acid（マルガリン酸）
76. Stearic acid（ステアリン酸）
77. L-Tryptophan（L-トリプトファン）
【００２８】
肺がんの病態により影響を受ける生体分子として、血清については以下の５８の生体分子を、肺組織については以下の７１の生体分子を、解析対象生体分子として選別することができる。
〔血清〕
1.  lactic acid（乳酸）
2.  2-hydroxyisobutyric acid（2-ヒドロキシイソ酪酸）
3.  glycolic acid（グリコール酸）
4.  L-alanine（L-アラニン）
5.  L-glycine（L-グリシン）
6.  glyoxylic acid（グリオキシル酸）
7.  oxalic acid（シュウ酸）
8.  2-hydroxybutyric acid（2-ヒドロキシ酪酸）
9.  sarcosine（サルコシン）
10.  3-hydroxypropionic acid（3-ヒドロキシプロピオン酸）
11.  pyruvic acid（ピルビン酸）
12.  3-hydroxybutyric acid（3-ヒドロキシ酪酸）
13.  3-hydroxyisobutyric acid（3-ヒドロキシイソ酪酸）
14.  2-hydroxyisovaleric acid（2-ヒドロキシイソ吉草酸）
15.  α-amino butyric acid（α-アミノ酪酸）
16.  malonic acid（マロン酸）
17.  L-valine（L-バリン）
18.  urea（尿素）
19.  benzoic acid（安息香酸）
20.  octanoic acid（オクタン酸）
21.  ethylmalonic acid（エチルマロン酸）
22.  L-leucine（L-ロイシン）
23.  glycerol（グリセロール）
24.  phosphoric acid（リン酸）
25.  L-isoleucine（L-イソロイシン）
26.  maleic acid（マレイン酸）
27.  L-proline（L-プロリン）
28.  succinic acid（コハク酸）
29.  glyceric acid（グリセリン酸）
30.  fumaric acid（フマル酸）
31.  L-serine（L-セリン）
32.  L-threonine（L-トレオニン）
33.  decanoic acid（デカン酸）
34.  malic acid（リンゴ酸）
35.  isovalerylglycine（イソバレリルグリシン）
36.  2-hexenedioic acid（2-ヘキセン二酸）
37.  aspartic acid（アスパラギン酸）
38.  L-methionine（L-メチオニン）
39.  5-oxoproline（5-オキソプロリン）
40.  4-hydroxyproline（4-ヒドロキシプロリン）
41.  7-hydroxyoctanoic acid（7-ヒドロキシオクタン酸）
42.  2-propyl-glutaric acid（2-プロピル-グルタル酸）
43.  L-glutamic acid（L-グルタミン酸）
44.  L-phenylalanine（L-フェニルアラニン）
45.  lauric acid（ラウリン酸）
46.  aconitic acid（アコニット酸）
47.  isocitric acid（イソクエン酸）
48.  citric acid（クエン酸）
49.  51.  glucuronic lactone（グルクロノラクトン）
50.  myristic acid（ミリスチン酸）
52.  4-hydroxyphenyllactic acid（4-ヒドロキシフェニル乳酸）
53.  indol-3-acetic acid（インドール-3-酢酸）
54.  palmitoleic acid（パルミトレイン酸）
55.  palmitic acid （パルミチン酸）
56.  uric acid（尿酸）
57.  margaric acid（マルガリン酸）
58.  stearic acid（ステアリン酸）
上記49及び51のグルクロノラクトンは、異性体を含む。
【００２９】
〔肺組織〕
1.  lactic acid（乳酸）
2.  propanoic acid（プロパン酸）
3.  2-hydroxyisobutyric acid（2-ヒドロキシイソ酪酸）
4.  glycolic acid（グリコール酸）
5.  L-alanine（L-アラニン）
6.  L-glycine（L-グリシン）
7.  glyoxylic acid（グリオキシル酸）
8.  oxalic acid（シュウ酸）
9.  2-hydroxybutyric acid（2-ヒドロキシ酪酸）
10.  butanoic acid（ブタン酸）
11.  sarcosine（サルコシン）
12.  3-hydroxypropionic acid（3-ヒドロキシプロピオン酸）
13.  pyruvic acid（ピルビン酸）
14.  3-hydroxybutyric acid（3-ヒドロキシ酪酸）
15.  3-hydroxyisobutyric acid（3-ヒドロキシイソ酪酸）
16.  ethanimidic acid（エタンイミド酸）
17.  malonic acid（マロン酸）
18.  L-valine （L-バリン）
19.  urea（尿素）
20.  L-leucine（L-ロイシン）
21.  glycerol（グリセロール）
22.  phosphoric acid（リン酸）
23.  L-isoleucine（L-イソロイシン）
24.  L-proline（L-プロリン）
25.  succinic acid （コハク酸）
26.  glycine（グリシン）
27.  glyceric acid（グリセリン酸）
28.  Pyrimidine（ピリミジン）
29.  fumaric acid（フマル酸）
30.  Uracil（ウラシル）
31.  L-serine（L-セリン）
32.  aminomalonic acid（アミノマロン酸）
33.  L-threonine（L-トレオニン）
34.  malic acid（リンゴ酸）
35.  aspartic acid （アスパラギン酸）
36.  methionine（メチオニン）
37.  5-oxoproline（5-オキソプロリン）
38.  thiodiglycolic acid（チオジグリコール酸）
39.  L-cysteine（L-システイン）
40.  2-hydroxyphenylacetic acid（2-ヒドロキシフェニル酢酸）
41.  2-hydroxyglutaric acid（2-ヒドロキシグルタル酸）
42.  L-glutamic acid（L-グルタミン酸）
43.  2-ketoglutaric acid（2-ケトグルタル酸）
44.  L-phenylalanine（L-フェニルアラニン）
45.  4-hydroxyphenylacetic acid（4-ヒドロキシフェニル酢酸）
46.  lauric acid（ラウリン酸）
47.  N-acetylaspartic acid（N-アセチルアスパラギン酸）
48.  asparagine（アスパラギン）
49.  d-ribose（d-リボース）
50. α-aminoadipic acid（α-アミノアジピン酸）
51.  L-glutamine（L-グルタミン）
52.  9H-purine（9H-プリン）
53.  DL-ornithine（DL-オルニチン）
54.  isocitric acid（イソクエン酸）
55.  citric acid（クエン酸）
56.  myristic acid（ミリスチン酸）
57.  glucuronic lactone（グルクロノラクトン）
58.  d-glucose（d-グルコース）
59.  4-hydroxyphenyllactic acid（4-ヒドロキシフェニル乳酸）
60.  L-lysine（L-リジン）
61.  L-tyrosine（L-チロシン）
62.  D-gluconic acid（D-グルコン酸）
63.  palmitic acid（パルミチン酸）
64.  N-Acetyl glucosamine（N-アセチルグルコサミン）
65.  uric acid（ウロン酸）
66.  margaric acid（マルガリン酸）
67.  stearic acid（ステアリン酸）
68.  L-tryptophan（L-トリプトファン）
69.  inosine（イノシン）
70.  adenosine（アデノシン）
71.  guanine（グアニン）
【００３０】
本発明は、上記選別した有限個の解析対象生体分子、例えばすい臓がんの検査の場合には、上述の６１種類の解析対象生体分子について、網羅的に多変量解析を行なうのが好適である。すい臓がんの場合は、これらの６１種類の解析対象生体分子を主成分とし、分散（つまり、データ群のばらつき）が大きい順に、主成分１、主成分２、主成分３・・・・主成分６１とする。これにより、マススペクトルの変動を定性的に解析することができる。また、これにともない、共線性（＝説明変量間の相関が高いこと）の少ない独立な成分を重回帰分析に使用できるようになる。そして説明変量をスコア（Score）あるいはローディング（Loading）、目的変量を特定の疾患の関連物質量とする重回帰分析を適用することができる。これにより、取得したマススペクトルから特定疾患、具体的にはすい臓がん関連物質量を推定する解析モデルを作成することができる。
【００３１】
これら一連の作業（多変量解析）は主成分回帰法（ＰＣＲ: Principal Component Regression）あるいはＰＬＳ（Partial Least Squares）回帰法として確立されている（参考文献：尾崎幸洋、宇田明史、赤井俊男「化学者のための多変量解析−ケモメトリックス入門」、講談社、2002年）。回帰分析法としてはこのほかにＣＬＳ（Classical Least Squares）法、クロスバリデーション法などが挙げられる。
【００３２】
多変量解析を使用した解析モデルの作成は、自作ソフトウエアや市販の多変量解析ソフトウエアを用いて行うことができる。また、使用目的に特化したソフトウエアの作成により、迅速な解析が可能になる。例えば、市販されているメタボロミクス解析ソフトウエア ProfilerTM AM+、メタボノミクス用UPLC（登録商標）/SynaptTMHDMSTMシステム（販売元：日本ウォーターズ株式会社）等を利用することができる。
【００３３】
このような多変量解析ソフトウエアを用いて組み立てられた解析モデルをファイルとして保存しておき、被験者より採取した検体の測定時にこのファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。これにより、特定疾患、例えばすい臓がんについて、簡易迅速な判定が可能になる。なお解析モデルは、定量モデル、定性モデルなど複数の解析モデルをファイルとして保存しておき、各モデルは適宜更新されることが好ましい。このように、本発明の検査方法では、解析モデル作成、更新、あるいは作成した解析モデルを用いて試料のスペクトルデータから各臨床疾患に関する検査・診断・判定をコンピュータに実行させることも可能である。
【００３４】
なお、本発明の検査方法は、一つのバイオマーカーによるものではなく、マルチマーカーによる検査を主体としたものであり、患者の病態をより詳しく反映することができる。これにより、各種疾患の早期診断、治療効果の判定、予後診断などを行うことができると考えられる。
【実施例】
【００３５】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例および実験例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３６】
（実施例１）すい臓がん検査
神戸大学倫理委員会の承認を得て、下記膵臓がん患者及び健常者から取得した検体について、メタボローム解析を行なった。
【表１】
2011247869.tif 000003
【００３７】
（試料の調製）
上記膵臓がん患者及び健常者から採取した血液を遠心分離（3000rpm、10分間、4℃）して血清を得た。該血清は、使用時まで-80℃で保存した。
次に、溶解した上記血清50μlをエッペンドルフチューブに分注し、抽出溶媒（メタノール：蒸留水：クロロホルム＝2.5：1：1の混合溶液）0.25mlと、内部標準として1mg/mlの2-イソプロピルリンゴ酸溶液（蒸留水に溶解）6μlを添加して、混合した。次に、1200rpmの速度で混合しながら、37℃で30分間インキュベートした。混合液を遠心分離（16000rpm、3分間、4℃）し、得られた上清を225μl回収して、新しいエッペンドルフチューブに移した。そのエッペンドルフチューブに蒸留水200μlを添加して混合した。混合液を遠心分離（16000rpm、3分間、4℃）し、上清を250μl回収して、新しいエッペンドルフチューブに移した。濃縮遠心機により混合液を濃縮した後に凍結乾燥機により水分を完全に除去した。凍結乾燥物に20mg/mlのメトキシアミン溶液（ピリジンに溶解）20μlを添加して、水浴超音波処理を20分間行った後、1200rpmの速度で混合しながら、37℃で90分間インキュベートした。次に、N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミ ド10μlを添加して、1200rpmの速度で混合しながら、37℃で30分間インキュベートした。混合液を遠心分離（16000rpm、3分間、4℃）し、上清を試料とした。
【００３８】
（試料の測定）
ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）（GCMS-QP2010:島津製作所）を用いて上記試料中のマススペクトルを測定した。なお、詳細は、以下の通りである。
試料のインジェクション容量は1μlで、DB-5カラムを用いた。測定条件は、島津製作所社製のGCMSsolutionソフトウエア中で設定されているOA_TMS.qgmメソッドファイルのとおりに従った。
【００３９】
（マススペクトルの解析）
上記測定で得られたマススペクトルのピークを検出し、得られたデータを保持時間の自動修正機能で補正後、ＧＣ／ＭＳ代謝成分データベース中の保持指標つきマススペクトルライブラリ内にある各生体分子のマススペクトルパターン、各生体分子に特異的な確認用イオンの質量、保持指標の情報に基づき、検出されたピークの同定を行った。健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として表２の如く選別した。
なお、表２における49及び52はいずれもGlucuronic lactone（グルクロノラクトン）であり、各々異性体である。
【００４０】
【表２】
2011247869.tif 000004
2011247869.tif 000005
【００４１】
（実験例１）健常者とすい臓がん患者の解析対象生体分子による分布の確認
実施例１により選別した解析対象生体分子について、ケモインフォマティクス用ソフトウエアのＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（Umetrics社）を用いて多変量解析を行なった。主成分分析（ＰＣＡ）のスコアプロットを用い、差異を調べた。合計６１の解析対象生体分子のうち、ＰＣ１（t[1]）、ＰＣ２（t[2]）、ＰＣ３（t[3]）は、各々６１成分中の２０（32.3％）、１５（24.7％）及び７（12.0％）による（Ａ＝３、Ｒ２Ｘ＝0.69）。その結果、すい臓がん患者及び健常者における解析対象生体分子の分布が異なることが確認された（図１）。また、スコアプロットの結果をもとにローディングプロットを作成し、図２に示した。図２中の数字は、表２に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。
【００４２】
（実験例２）すい臓がん患者におけるがんのステージと解析対象生体分子との関係
１３名のすい臓がん患者について、がんのステージと解析対象生体分子の分布との関係を、ケモインフォマティクス用ソフトウエアのＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（Umetrics社）を用いて多変量解析を行なった。主成分分析（ＰＣＡ）のスコアプロットを用い、差異を調べた。合計６１の解析対象生体分子のうち、ＰＣ１（t[1]）、ＰＣ２（t[2]）は、各々６１成分中の２３（37.4％）及び１９（31.2％）による（Ａ＝４、Ｒ２Ｘ＝0.882）。その結果、すい臓がんのステージにより分布が異なることが確認された（図３）。また、スコアプロットの結果をもとにローディングプロットを作成し、図４に示した。図４中の数字は、表２に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。
【００４３】
上記実験例１及び実験例２の結果は、解析モデルをファイルとして保存しておき、被験者より採取した検体の測定時にこのファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。即ち、被験者より採取した検体について、上記と同手法により主成分分析を行い、分析パターンがすい臓がんの場合のパターンに重複するか、又はすい臓がんのどのステージのパターンに重複するかを確認することで、すい臓がんの検査や、すい臓がんのステージの検査を行うことができる。
【００４４】
（比較例１）すい臓がん患者におけるがんのステージと生体分子との関係
１３名のすい臓がん患者について及び健常者について、上記分析した生体分子のうち、乳酸、尿酸及び3-ヒドロキシ酪酸について、正常人を１とした場合のステージIII＋ステージIVaとステージIVbの値を確認した。乳酸及び3-ヒドロキシ酪酸については、ステージに応じて高い値を示し、尿酸については、ステージIVbと健常者において高い値を示したものの、ステージIII＋ステージIVaではやや低い値を示し、疾患のステージと定量値の間に相関は認めなかった。
【００４５】
上記の結果により、個々の成分では、すい臓がんなどの疾患について、的確な検査を行なうことは困難であることが確認された。本発明の解析対象生体分子、すなわちすい臓がんでは６１の生体成分について網羅的に解析することで、より的確な検査を行なうことが可能となった。
【００４６】
（実施例２）消化管がん検査
神戸大学倫理委員会の承認を得て、下記表３に示す消化管がん患者（食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者）及び健常者から取得した検体について、メタボローム解析を行なった。
【表３】
2011247869.tif 000006
【００４７】
（試料の調製）
上記食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者及び健常者から採取した血液を、実施例１と同様の手法により、処理して血清を回収して試料を調製した。
【００４８】
（試料の測定）
得られた試料中のマススペクトルを実施例１と同様の手法により測定した。
【００４９】
（マススペクトルの解析）
上記測定で得られたマススペクトルのピークを検出し、実施例１と同様の手法により、ピークの同定を行い、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として表４の如く選別した。
【００５０】
【表４】
2011247869.tif 000007
2011247869.tif 000008
【００５１】
（実験例３）健常者と食道がん患者、胃がん患者、もしくは大腸がん患者の解析対象生体分子による分布の確認
実施例２により選別した７７個の解析対象生体分子について、実験例１と同様の手法によりＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（Umetrics社）を用いて多変量解析を行なった。主成分分析（ＰＣＡ）のスコアプロットを用い、差異を調べた。ＰＣ１（t[1]）、ＰＣ２（t[2]）、ＰＣ３（t[3]）は、各々変動の30.61％、21.11％及び10.44％である（Ａ＝４、Ｒ２Ｘ＝0.621）。その結果、食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者及び健常者における解析対象生体分子の分布が異なることが確認された（図６）。
【００５２】
また、上記７７個の解析対象生体分子について、ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（Umetrics社）を用いてを用いて、ＰＬＳ判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を行った。ＰＣ１（t[1]）、ＰＣ２（t[2]）、ＰＣ３（t[3]）は、各々変動の25.9％、10.2％及び6.9％である（Ａ＝４、Ｒ２Ｘ＝0.882）。ＰＬＳ−ＤＡのスコアプロット（図７〜９の上段）は、食道がん患者、胃がん患者、大腸がん患者、健常者のクラスタリングを示した。ＰＬＳ−ＤＡローディングプロット（図７〜９の下段）は、食道がん患者の分離にマロン酸とウラシルのレベルにおける変動が寄与し、胃がん患者ではリン酸、イソバレリルグリシン、大腸がん患者では3-ヒドロキシプロピオン酸、リンゴ酸、L-プロリン、L-メチオニン、マレイン酸、およびプロピオン酸が寄与していることを示した。特に、これら１０個の解析対象生体分子のうち、６個（マロン酸、ウラシル、イソバレリルグリシン、3-ヒドロキシプロピオン酸、マレイン酸、リンゴ酸）の血清におけるレベルがこれらのがんにおいて特徴的な変化を示すことがわかった（図１０）。
【００５３】
実験例３の結果は、解析モデルをファイルとして保存しておき、被験者より採取した検体の測定時にこのファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。即ち、被験者より採取した検体について、上記と同手法により主成分分析および／またはＰＬＳ判別分析を行い、分析パターンが食道がん、胃がん、もしくは大腸がんの場合のパターンに重複するかを確認することで、これらのがんの検査を行うことができる。
【００５４】
（実験例４）消化管がんにおける、マーカー感度の比較
消化管がんの診断に従来から用いられている腫瘍マーカー、SCC、CA19-9、CEA、p-53抗原と、実験例３により選択した６個の解析対象生体分子のレベルについて、ＲＯＣ解析を用いて感度と特異度を評価した。結果を図１１と表５に示す。
【表５】
2011247869.tif 000009
上記６個の解析対象生体分子は、従来のマーカー（SCC、CA19-9、CEA、p-53抗原）に比べて優れた感度を有することが分かった。
【００５５】
（実施例３）肺がん検査
神戸大学倫理委員会の承認を得て、下記表６に示す肺がん患者及び健常者から取得した検体について、メタボローム解析を行なった。
【表６】
2011247869.tif 000010
本実施例および以下の実験例では、cもしくはp  stageのIおよびIIを早期がん（early  stage  disease）、IIIおよびIVを進行がん（advanced  stage  disease）と分類した。
【００５６】
（試料の調製）
上記肺がん患者及び健常者から採取した血液を、実施例１と同様の手法により、処理して血清を回収して試料を調製した。
また、肺がん患者から採取した腫瘍組織および非腫瘍組織を小片に分割し、生理食塩水により洗浄して血液を除去し、チューブに移して凍結させ、使用時まで-80℃で保存した。なお非腫瘍組織からは腫瘍領域を十分に取り除いた。
次に、肺組織20mgをチューブに移し、抽出溶媒（メタノール：蒸留水：クロロホルム＝2.5：1：1の混合溶液）1000μlを添加して磨砕した。磨砕物に、内部標準である1.0mg/ml  2-イソプロピルリンゴ酸（蒸留水に溶解）6μlを添加して、混合した。次に、1200rpmの速度で混合しながら、37℃で30分間インキュベートした。混合液を遠心分離（16000rpm、3分間、4℃）し、得られた上清を900μl回収して、新しいエッペンドルフチューブに移した。そのエッペンドルフチューブに蒸留水400μlを添加して混合した。混合液を遠心分離（16000rpm、3分間、4℃）し、上清を800μl回収して、新しいエッペンドルフチューブに移した。濃縮遠心機により混合液を濃縮した後に凍結乾燥機により水分を完全に除去したて使用時まで-80℃で保存した。
使用時には、凍結乾燥物に20mg/mlのメトキシアミン溶液（ピリジンに溶解）30μlと、N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド15μlを添加してインキュベートした。混合液を遠心分離（16000rpm、3分間、4℃）し、上清を試料とした。
【００５７】
（試料の測定）
得られた試料中のマススペクトルを実施例１と同様の手法により測定した。
【００５８】
（マススペクトルの解析）
上記測定で得られたマススペクトルのピークを検出し、実施例１と同様の手法により、ピークの同定を行った。血清について、健常者グループと疾患患者グループとの間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として表７の如く選別した。
なお、表７における49及び51はいずれもグルクロノラクトンであり、各々異性体である。
【００５９】
【表７】
2011247869.tif 000011
【００６０】
また、肺組織について、非腫瘍組織と腫瘍組織との間で検出量に差を認める有限個の生体分子を解析対象生体分子として表８の如く選別した。
【００６１】
【表８】
2011247869.tif 000012
【００６２】
（実験例５）健常者と肺がん患者の解析対象生体分子による分布の確認、および、肺がん患者におけるがんのステージと解析対象生体分子との関係
実施例３により選別した、血清に関する５８個の解析対象生体分子について実験例１と同様の手法によりＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（Umetrics社）を用いて多変量解析を行なった。
【００６３】
ＰＬＳ−ＤＡを用いて血清中の解析対象生体分子についてのスコアプロットを行い、肺がん患者におけるがんのステージにおける差異を調べた。ＰＣ１（t[1]）、ＰＣ２（t[2]）、ＰＣ３（t[3]）は、各々変動の9.8％、11.4％及び10.0％である（Ａ＝３、Ｒ２Ｘ＝0.321）。その結果、肺がんのステージ（早期がん、進行がん、健常者）により分布が異なることが確認された（図１２左側）。また、スコアプロットの結果をもとにローディングプロットを作成し、図１２右側に示した。図１２右側のプロット内の数字は、表７に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。
【００６４】
進行肺がん患者のクラスタリングに、乳酸、2-ヒドロキシイソ酪酸、L-グリシン、2-ヒドロキシイソ吉草酸、サルコシン、安息香酸、オクタン酸、フマル酸、4-ヒドロキシフェニル乳酸が寄与し、グリセロール、リン酸、グリセリン酸、アスパラギン酸、5-オキソプロリン、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニンが健常者のクラスタリングに、アコニット酸が早期肺がん患者のクラスタリングに寄与していることがわかった。
【００６５】
（実験例６）肺がん患者におけるがんの組織型と解析対象生体分子との関係
実験例５と同様の手法によりＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（Umetrics社）を用いて多変量解析を行なった。ＰＬＳ−ＤＡを用いて血清中の解析対象生体分子についてのスコアプロットを行い、肺がん患者におけるがんの組織型における差異を調べた。ＰＣ１（t[1]）、ＰＣ２（t[2]）、ＰＣ３（t[3]）は、各々変動の12.5％、11.5％及び12.3％である（Ａ＝３、Ｒ２Ｘ＝0.363）。その結果、肺がんの組織型（腺癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌）により分布が異なることが確認された（図１３左側）。また、スコアプロットの結果をもとにローディングプロットを作成し、図１３右側に示した。図１３右側のプロット内の数字は、表７に示す解析対象生体分子の番号を示すものである。
【００６６】
腺癌が、グリコリル酸、L-グリシン、L-バリン、エチルマロン酸、およびL-メチオニンにより特徴付けられ、アコニット酸により扁平上皮癌が特徴付けられ、安息香酸、オクタン酸、フマル酸により小細胞肺癌が特徴付けられることがわかった。
【００６７】
上記実験例５及び実験例６の結果は、解析モデルをファイルとして保存しておき、被験者より採取した検体の測定時にこのファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。即ち、被験者より採取した検体について、上記と同手法により主成分分析および／またはＰＬＳ−ＤＡを行い、分析パターンが肺がんの場合のパターンに重複するか、又は肺がんのどのステージのパターンに重複するか、肺がんのどの組織型のパターンに重複するかを確認することで、肺がんの検査や、肺がんのステージ、肺がんの組織型の検査を行うことができる。
【００６８】
（実験例７）肺がんにおける、マーカー感度の比較
肺がんの診断に従来から用いられている腫瘍マーカー、CEA、CYFRA、NSEと、実験例５または６により選択した解析対象生体分子のレベルについて、ＲＯＣ解析を用いて感度と特異度を評価した。結果を表９と表１０に示す。
【表９】
2011247869.tif 000013
【００６９】
【表１０】
2011247869.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上、詳述したように、特定疾患患者及び健常者についての解析モデルをファイルとして保存しておくことで、被験者より採取した血液等の検体の測定時に、このファイルを呼び出し、当該検体に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検定を行うことができる。即ち、被験者より採取した検体について、上記と同手法により主成分分析を行い、分析パターンが特定の疾患の場合のパターンに重複するか、又は特定疾患のどのステージのパターンに重複するかを確認することで、特定の疾患の検査や、ステージの検査を行うことができる。
【００７１】
本発明の検査方法では、血液等に検体に存在する複数の物質の変動を網羅的に解析することにより、複数の物質の変動を特定疾患の総体として捉えて検査する手法であり、ひとつのバイオマーカーで検査する結果と比較して、迅速かつ容易に精度の高い検査を行うことができる。
【図５】
2011247869.tif 000015
【図１】
2011247869.tif 000016
【図２】
2011247869.tif 000017
【図３】
2011247869.tif 000018
【図４】
2011247869.tif 000019
【図６】
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【図７】
2011247869.tif 000021
【図８】
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【図９】
2011247869.tif 000023
【図１０】
2011247869.tif 000024
【図１１】
2011247869.tif 000025
【図１２】
2011247869.tif 000026
【図１３】
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