(57)【要約】 【課題】ナノ秒パルス電界の繰り返し周波数を制御するうことでアポトーシスなどの細胞死を引き起こすことを可能とする。【解決の手段】組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、繰り返し周波数は0.0１pps超過0.5pps未満であることを特徴とするナノ秒パルス電界を用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法、繰り返し周波数は50pps以上であることを特徴とするナノ秒パルス電界を用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法、前記ナノ秒パルス電界複数回を1回としたクラスターとして印加して、クラスターの繰り返し周波数が0.01回/秒超過0.5回/秒未満であることを特徴とするナノ秒パルス電界印加シークエンスを用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法を特徴とする。【選択図】図1
2011224102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、
アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、
前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、
繰り返し周波数は0.0１pps超過0.5pps未満であることを特徴とする
ナノ秒パルス電界を用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法。
【請求項２】
組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、
アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、
前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、
繰り返し周波数は50pps以上であることを特徴とする
ナノ秒パルス電界を用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法。
【請求項３】
組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、
アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、
前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、
前記ナノ秒パルス電界複数回を1回としたクラスターとして印加して、
前記クラスターの繰り返し周波数が0.01回/秒超過0.5回/秒未満である
ナノ秒パルス電界印加シークエンスを用いたことを特徴とする
アポトーシスなど細胞死誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞に効果的に高電界を印加し、アポトーシスなどの細胞死を誘発させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞治療の一環として、交流波パルスやマイクロ秒からミリ秒のパルスを用いるものが多かった。
【０００３】
近年ナノ秒パルス高電界を用いて、例えばメラノーマ（がん細胞）にアポトーシスを引き起こす技術が研究されてきた（例えば、特許文献1）。
【０００４】
【特許文献１】特許2009-532077号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献1によれば、持続時間約10〜300ナノ秒、電界強度10~350KV/cm、繰り返し周波数0.5Hz(pps)のナノ秒パルス電界を複数回印加することで細胞死や組織中の血流阻害を引き起こすことを開示している。
【０００６】
しかしながら、特許文献1によれば、繰り返し周波数が0.5pps(pulse per second)のみのデータで開示されているため、細胞によっては最適な繰り返し周波数ではなく、電界強度に頼った治療になるため目的の治療部位以外の周囲の正常な細胞を死なせたり、なんらかの異常を誘因したりなど好ましくない影響がでる虞がある。
【０００７】
そこで上述の課題に鑑み、本発明の目的はナノ秒パルス電界の繰り返し周波数を変化させ用いることにより、目的臓器および細胞、例えば、がん細胞を含有する臓器などを標的とし、高効率にアポトーシスを誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項1の発明は、組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、繰り返し周波数は0.01pps超過0.5pps未満であることを特徴とするナノ秒パルス電界を用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法を用いることを特徴とする。
【０００９】
請求項2の発明は、組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、繰り返し周波数は50pps以上であることを特徴とするナノ秒パルス電界を用いたアポトーシスなど細胞死誘導方法を用いることを特徴とする。
【００１０】
請求項3の発明は、組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、前記ナノ秒パルス電界複数回を1回としたクラスターとして印加して、前記クラスターの繰り返し周波数が0.01回/秒超過0.5回/秒未満であるナノ秒パルス電界印加シークエンスを用いたことを特徴とするアポトーシスなど細胞死誘導方法を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
請求項1の発明によれば、組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、繰り返し周波数は0.0１pps超過0.5pps未満である構成であるから、2~100秒間隔の低繰り返し周波数を用いることによって、ナノ秒パルス電界による細胞膜上のイオンチャンネルの乱れを常に起きている状態を作り出し、電界にあまり依存せず、目的以外の周囲の細胞への影響をできるだけ抑制した細胞のメカニズムを用いた柔和な条件で高効率にアポトーシスなどの細胞死誘導する方法を提供する。
【００１２】
請求項2の発明によれば、組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、繰り返し周波数は50pps以上である構成であるから、0.2秒間隔以下の連続したパルスによりパルスによって標的細胞に蓄積される熱が積極的に上昇していくことから、電界と温熱効果を併用してアポトーシスなどの細胞死を誘導することができる。
【００１３】
請求項3の発明によれば、組織中の標的細胞に対して、ナノ秒パルス電界を印加して、アポトーシスなどの細胞死を誘導する方法であって、前記ナノ秒パルス電界は、0.5~250KV/cmで、1~300nsのパルス幅で、前記ナノ秒パルス電界複数回を1回としたクラスターとして印加して、前記クラスターの繰り返し周波数が0.01回/秒超過0.5回/秒未満であるナノ秒パルス電界印加シークエンスを用いた構成であるから、例えば250ppsのナノ秒パルスの40ms分、すなわち、10発分を1クラスターとし、前記クラスターを0.01回/秒 超過0.5回/秒未満で繰り返すシークエンスを用いることにより、標的細胞の温度をほとんど上昇させることなくアポトーシスなどの細胞死を誘導させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の実施形態について図を用いて説明する。本実施形態のナノ秒パルス電界（nanosecond
Pulsed Electric Fields以下「nsPEF」という）を用いたnsPEF印加システム20について図1を用いて説明する。本実施形態のnsPEF印加システム20は、nsPEF発生装置1・充電器2・制御装置3・外部繰り返し周波数制御装置4とパルス発生機より作製されたnsPEFを目的の組織もしくは細胞に印加するための電極部5により構成される。
【００１５】
nsPEF発生装置1は1〜300nsのパルス幅で0.5~250KV/cmの電界強度の単極パルスを出力できる装置である。また、充電器2は0.1〜5Jの充電が可能な装置である。さらに制御装置3は、電界強度と0.1〜2000ppsの連続印加型繰り返し周波数を制御する装置である。これらnsPEF発生装置1・充電器2・制御装置3は、例えば、磁気パルス圧縮回路方式（Magnetic Pulse Compression
Circuit: MPC）を使用している末松電子社製の公知の機器類を使用することができる。これらの機器は性能的に同じならば他社製品でも良いものとする。
【００１６】
外部繰り返し周波数制御装置4は、例えば公知のファンクションジェネレーターを用いることができる。外部繰り返し周波数制御装置4は、自己のトリガーパルスを有し、任意の繰り返し周波数を選択でき、さらに印加回数も設定できる。また、外部繰り返し周波数制御装置4により、例えば、図5に示すように250ppsの繰り返し周波数のnsPEF10回印加を１つのクラスター10として設定し、そのクラスターパルスを制御することができる。電界強度は制御装置3により制御される。
【００１７】
本実施形態の電極部5は、キュベットタイプからなる。電極部5は、パルス発生装置1のパルス電界発生部6に接続される電極と、接地電位7に接続される接地電極とを備える。なお、電極部5はキュベットタイプに限るものではなく、上皮系組織に刺すニードルタイプ・組織を挟むパットタイプ外部から組織内部に電界を送り込めるアンテナタイプなど用途に適合したものを用いることができる。
【００１８】
（実施例1）: nsPEFによるHeLa S3細胞アポトーシス誘導
材料および方法
ヒト子宮頸ガン由来のHeLa S3細胞をATCC(Manassas,VA)から入手し、培養を行い細胞を増殖させた後、上記本実施形態のnsPEF印加システム20を用いて実験を行った。本実施例1では、前記電極5はキュベットタイプ電極を用いた。0.5〜１×106cells/mlの濃度に調節した細胞含有培地を4mmキュベット電極に約800μl入れ、電極支持部8にキュベット電極を差し込み。nsPEFを印加した。オシロスコープ9などで電界値の観察を行い、実施例1では12.5〜25KV/cmの電界強度を使用した。
【００１９】
繰り返し周波数の影響測定
実施例1において、電界値を12.5KV/cm、印加回数を100回に固定し、繰り返し周波数を250pps, 10pps, 0.5ppsの条件で細胞死への影響を調べた（図2）。細胞死判定にはヨウ化プロピジウム(PI)染色法を行い、フローサイトメトリー法で解析した。その結果、2時間後、0.5ppsがもっとも細胞死を誘導することがわかった。さらに、低繰り返し周波数を詳細に調べるために電界強度25KV/cm,印加回数25回の条件で、0.01~250pps繰り返し周波数を用いて実験を行い、細胞死判定を行ったところ、0.33〜0.05ppsを中心に細胞死が強く誘導された(図3)。しかし、0.01ppsではあまり細胞死が誘導されなかった。そこで、我々は0.01pps超過0.5pps未満で細胞死が強く誘導される可能性があるという知見を得た。
【００２０】
xCelligence測定
細胞増殖活性を継時測定可能なxCelligenceシステム（Roche）を用いて、15分置きに3日間測定した。電界条件12.5KV/cm、印加回数100回で、繰り返し周波数を250pps, 10pps, 1pps, 0.5pps, 0.2pps, 0.1ppsの条件で細胞増殖活性を測定したところ、250pps,10ppsは無処理の細胞と同じ増殖を示したが、1pps, 0.5pps, は数時間後に一時的に細胞増殖が止まり、0.2pps, 0.1ppsでは48時間は細胞増殖が停止していることが示唆された。
【００２１】
Caspase3活性
アポトーシス時に活性が高くなる活性型Caspase3をActive-Caspase抗体（Abcam）を用いてフローサイトメトリー法で測定した。電界強度12.5KV/cm, 印加回数100回で、高繰り返しの250pps, 低繰り返し0.5ppsで行ったところ、2時間後に0.5ppsの条件でCaspase3の活性化が確認された。この結果、低繰り返しで誘導される細胞死はアポトーシスに近い細胞死であると推測できる。アポトーシスならば、ネクローシスとは異なり、死んだ細胞は生体に再吸収されやすいので、アポトーシス誘導部の傷跡などは残りにくいと考えられる。
【００２２】
（実施例2）50pps以上の繰り返しnsPEFによるHeLa S3細胞アポトーシス誘導
ヒト子宮頸ガン由来のHeLa S3細胞をATCC(Manassas,VA)から入手し、培養を行い細胞を増殖させた後、上記本実施形態のnsPEF印加システム20を用いて実験を行った。本実施例2では、前記電極5はキュベットタイプ電極を用いた。0.5〜１×106cells/mlの濃度に調節した細胞含有培地を4mmキュベット電極に約800μl入れ、電極支持部8にキュベット電極を差し込み、nsPEFを印加した。実施例2では12.5KV/cmの電界強度を使用した。
【００２３】
印加回数の影響測定
HeLa S3細胞などの培養液は抵抗が約10Ωと導電性が高いため、50pps以上の繰り返し周波数で積算的に加熱されることが、レーザー干渉法から割り出された。そこで、繰り返し周波数250ppsで印加回数を変えて調べたところ、印加して2時間経過の死亡率が200〜300回にかけて上昇し、その後、印加回数増加に伴い細胞死率は上昇する(図4)。このときの温度上昇率は印加回数300回でおよそ27ケルビンで、実際の細胞の温度は一時的に約50度前後となる。このときの温度上昇に使用された時間は約1秒で、その後、外気によってすばやく冷却される。このことから、温熱効果だけではなく、温熱と電界の併用効果により細胞死が誘導されると考えられる。この結果より、細胞死を短時間の処理で引き起こせることがわかった、しかし、熱や印加回数が必要となり、総エネルギー投入率の割合が多くなるため、この方法で細胞死を引き起こす部分は再生力の高い臓器や死亡率優先したいときなど限定して使用する方が良いと考えられる。
【００２４】
（実施例3）nsPEFによる成熟脂肪細胞脂肪球減少
マウス3T3L-1細胞をヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手し、分化誘導剤（DEX, IBMX, Insullin）で分化誘導し、分化開始から10日目の成熟脂肪細胞を材料として使用した。100回印加条件で、電界強度、繰り返し周波数を変えて実験を行った結果、繰り返し周波数には依存せず、電界強度に依存し、脂肪球の減少が確認された。このようなアポトーシス以外の現象のいくつかには,250pps以上の高繰り返し周波数かつ高電界の使用が最適なものが存在する。
【００２５】
（実施例4）nsPEFシークエンスと繰り返し周波数を組み合わせたアポトーシスなど細胞死誘導方法
ヒト子宮頸ガン由来のHeLa S3細胞をATCC(Manassas,VA)から入手し、培養を行い細胞を増殖させた後、上記本実施形態のnsPEF印加システム20を用いて実験を行った。本実施例4では、前記電極5はキュベットタイプ電極を用いた。0.5〜１×106cells/mlの濃度に調節した細胞含有培地を4mmキュベット電極に約800μl入れ、電極支持部8にキュベット電極を差し込み、nsPEFを印加した。実施例4では12.5KV/cmの電界強度を使用した。
【００２６】
例えば、約100ナノ秒のパルス幅とパルス間隔約4ミリ秒の10回計40ミリ秒のパルス集団を1つのクラスター10とし、このときクラスター10をクラスター（250:10）と表記する（図5）。このクラスター（250:10）の印加繰り返し周波数を調べたところ、クラスター（250:10）の印加数10回で、クラスターパルスの繰り返し周波数が0.025回/秒~0.2回/秒の範囲で細胞死誘導効果が強く現れた（図6）。この結果、実施例1の単発パルスと同様のメカニズムで0.01回/秒超過0.5回/秒未満のときに細胞死が強く誘導されると考えられた。また、総エネルギー量（電界強度の2乗×印加回数：抵抗値は一定）から鑑みると、クラスターパルスを適切な繰り返し周波数で用いる方が効率的にもよく、また、総印加時間的にも単発パルス印加時よりも早く処理が終わる。このような前記クラスター10を複数回印加するシークエンスを用いることで、単発パルスよりも有効にアポトーシスなどの細胞死を誘導できる。
【００２７】
クラスターは約2〜100発の0.5pps以上の繰り返し周波数のパルスで形成され、クラスター自体の繰り返し周波数でクラスター間隔11の時間を調整し、温熱効果を含むか、非加熱にするかを決められるので、細胞や臓器の特性に対して適応した処理が可能となり、有効なアポトーシス誘導効果を得ることができると推測される。
【００２８】
以上のように、繰り返し周波数に対して反応する細胞活動の場合、ppsを0.01pps超過〜0.5pps未満の範囲の低繰り返し周波数の方が細胞死誘導効果が高く、ppsに対して反応しない細胞活動の場合は50pps以上の早いppsを使用して300発程度印加することが細胞死誘導に対して効率的である。また、電界強度を高くすると、細胞が焼け、皮膚などに行うとネクローシスやケロイドなどの痕ができる虞があるため、2時間後の細胞死亡率が50％程度の電界強度でアポトーシス誘導を行うことが望ましいと考えられる。さらに、50〜500ppsを2〜30回を１つのクラスターとし、低繰り返し周波数の間欠暴露も細胞死誘導効果がある。
【００２９】
さらに図７のように１つの変形クラスター12の中に電界強度やパルス幅が異なるnsPEFを複数入れることで、より強力な細胞死の誘導を可能にすると予測される。もしくは、ドラッグデリバリーや細胞分化制御などへの応用も期待できる。
【００３０】
アンテナ型電極などでは、使用時に繰り返し周波数を低くすることで目的の細胞や臓器に効果的な影響を与える。また、アンテナ型電極で広範囲にアポトーシスを誘導する際には、繰り返し周波数が高い状態で印加する場所を移動させながら、印加起点と印加終点までを10秒ほどの時間をかけて複数回印加することで、同じ部位に対し0.1ppsの低繰り返しシークエンスを印加したときと同じ条件になり、効果的にアポトーシスを誘導できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、ガン治療やメタボリックシンドローム治療などに用いられる医療機器に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本実施例のである繰り返し周波数ナノ秒パルス電界を用いた治療方法を示した説明平面図である。
【図２】nsPEF繰り返し周波数と細胞死との関係を示すグラフである。
【図３】nsPEF繰り返し周波数と細胞死との関係を示すグラフである。
【図４】250ppsの繰り返し周波数と細胞死との関係を示すグラフである。
【図５】クラスターの例の説明図である。
【図６】クラスターパルスの繰り返し周波数と細胞死との関係を示すグラフである。
【図７】クラスターパルスシークエンスの変形例の説明図である。
【符号の説明】
【００３３】
1・・・nsPEF発生装置
2・・・充電器
3・・・制御装置
4・・・外部繰り返し周波数制御装置
5・・・電極
6・・・パルス電界発生部
7・・・接地電位
8・・・電極支持部
9・・・オシロスコープ
10・・・クラスター
11・・・クラスター間隔
12・・・変形クラスター
20・・・nsPEF印加システム
【図１】
2011224102.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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