(57)【要約】【課題】  骨や歯の欠損部・損傷部で、病巣周囲の細胞と良好な親和性を持ち、これらの細胞に安全に遺伝子を導入して新生骨を誘導することのできる医療用材料及び歯科用材料として好適に使用することのできる、遺伝子、及び細胞接着因子を含有する複合体を提供する。【解決手段】  基材の表面にリン酸カルシウム層を設け、該リン酸カルシウム層の層内部に、骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持する遺伝子と細胞接着因子を含有させることにより、非ウイルス系・非脂質系の遺伝子導入用の生体材料の提供を可能とするものであり、特に、細胞接着因子としてフィブロネクチンを用いることにより、上記目的を効果的に達成しうる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ウイルス系・非脂質系の遺伝子導入用の生体材料であって、基材の表面に設けられたリン酸カルシウム層を有し、該リン酸カルシウム層が層内部に骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持する遺伝子と細胞接着因子を含むことを特徴とする生体材料。
【請求項２】
前記細胞接着因子がフィブロネクチンであることを特徴とする請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
前記骨誘導機能を有する分子がbone  morphogenetic  protein-2  (BMP-2)である請求項１又は２に記載の生体材料。
【請求項４】
前記基材は、該表面にリン酸カルシウム捕捉層を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項５】
前記リン酸カルシウム層がアパタイトを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生体材料。
【請求項６】
前記遺伝子がプラスミド単体に保持された遺伝子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体材料上に、細胞を備えることを特徴とする再生体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材の表面に、骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持している遺伝子と、細胞との親和性を高める因子（細胞接着因子）を含むリン酸カルシウム層を設け、該リン酸カルシウム層がウイルスまたは脂質を含まないことを特徴とする生体材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
欠損または損傷した骨や歯の補修や治癒を促進することは臨床医学的に大きなテーマの１つである。骨や歯の欠損部・損傷部を生体材料で充填し治療することは臨床医学・歯学では一般的に施行されていることである。この生体材料に新生骨の形成（骨新生）を誘導する機能（新生骨誘導機能）を付与して周囲の組織との早期癒合、骨や歯の欠損・損傷の早期治癒を促すことは、治療期間の短縮、患者のQuality of Lifeの改善や早期社会復帰を期待できることから重要なことと思われる。
【０００３】
骨や歯の欠損・損傷の治療に用いられる生体材料としては、骨伝導性・組織親和性の優れている基材が用いられているが、これら基材で特別に新生骨誘導機能を有するものはない。一般的にはアパタイト系の基材が骨伝導性・組織親和性が優れているとして使用されることが多いが、アパタイト系の生体材料の使用でも自家骨の使用と比較すると、骨癒合は遅れると報告されている。
【０００４】
近年、表面にリン酸カルシウムとタンパク質の複合層を設けた高分子材料基材（特許文献１）及び金属材料基材（特許文献２）が開発された。上記の複合層中のタンパク質として細胞接着因子を用いると、同基材上への細胞接着性が向上することが報告されている。従って同基材を骨や歯の治療用の生体材料として用いると、大幅な組織親和性の向上を得ることができる。しかしこのシステムだけでは、生体材料上で新生骨の形成を誘導し、早期骨癒合を図ることは困難である。
【０００５】
他方、2000年頃から、生体材料表面に遺伝子を担持させることにより、生体材料上の接着細胞に遺伝子を導入し、同細胞の増殖、分化をコントロールしようとする研究が行なわれている。しかし、従来の手法では、遺伝子の細胞への導入効率はそれほど高くないことが問題であった。遺伝子導入効率を改善するため各種高分子を使用して遺伝子を生体材料に担持しているシステムも報告されている。Sheaらは遺伝子導入効率を上げるために、polyethylenimineと遺伝子の複合体を作り、これを生体材料表面に担持させている（非特許文献１）。しかし遺伝子導入に用いられる高分子にはしばしば細胞毒性が報告されており、高濃度で生体内に投与することには安全上の問題があると思われる。
【０００６】
比較的安全な遺伝子導入用材料としては、古くからリン酸カルシウムと遺伝子の複合体が用いられてきた（非特許文献２）。このシステムは、遺伝子を含むリン酸カルシウム粒子を細胞の上にふりかけて、細胞近傍の粒子から遺伝子を細胞内に導入しようとするものである。従ってこのシステムを治療に用いる場合には生体材料とは別に遺伝子導入システムを準備する必要があり、臨床で用いるには煩雑である。また遺伝子導入の範囲・投与量も症例ごとにまちまちになると思われ、生体内で適切な範囲及び濃度に管理される必要がある生理活性タンパク質を発現させる遺伝子療法には適切でないと思われる。
【０００７】
近年赤池らは、レポーター遺伝子と細胞接着因子を含むリン酸カルシウム粒子を細胞へふりかけると、遺伝子を含むリン酸カルシウム粒子を用いた場合に比べ、遺伝子導入効率が向上することを報告している（非特許文献３）。しかしこのシステムでは、粒子を用いているので上記のように遺伝子を導入する範囲・投与量を厳密に規定するのは困難である。
【０００８】
他方、本発明者らは、人工材料の表面に遺伝子と細胞接着因子を含むリン酸カルシウムの薄層を形成させると、同材料表面の細胞に高効率に遺伝子導入を行えることを報告した（特許文献３、非特許文献４）。さらに本発明者らは、上記の複合層に溶解性制御因子を担持させることにより、同表面における遺伝子導入の効率と時期をコントロールできることも提案している（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−１１２８４８号公報
【特許文献２】特開２００５−０２１２０８号公報
【特許文献３】特開２００８−０４９１４６号公報
【特許文献４】特願２００９−００１４２４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Surface  absorption  of  DNA  to  tissue  engineering  scaffolds  for  efficient  gene  delivery.  by  Jang  JH,  Bengali  Z,  Houchin  L,  Shea  LD,   J.  Biomed.  Mater.  Res.  77A:  50-58,  2006.
【非特許文献２】A  new  technique  for  the  assay  of  infectivity  of  human  adenovirus  5  DNA.  by  Graham  FL,  van  der  Eb  AJ,  Virology  52:  456-467,  1973.
【非特許文献３】Fibronectin  in  collaboration  with  Mg2+  enhances  transgene  expression  by  calcium  phosphate  coprecipitates.  by  Chowdhury  EH,  Zohra  FT,  Tada  S,  Kitamura  C,  Akaike  T,  Analytical  Biochemistry  335:  162-164,  2004.
【非特許文献４】Fibronectin-DNA-apatite  composite  layer  for  highly  efficient  and  area-specific  gene  transfer.  by  Ayako  Oyane,  Masami  Murayama,  Atsushi  Yamazaki,  Yu  Sogo,  Atsuo  Ito,  Hideo  Tsurushima1,  Journal  of  Biomedical  Materials  Research  Part  A:1038-1047,2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の本発明者らの遺伝子導入システムにおいて用いられてきた遺伝子はレポーター遺伝子であって遺伝子導入効率を測定しただけであり、骨新生を誘導する機能は有していなかった。しかも、細胞接着因子であるラミニンによる遺伝子導入効率の向上効果は、骨関連細胞に対しては十分高くなかった。また、同じ条件下であっても、ラミニンの製造ロットや作製された材料ごとに、遺伝子導入効率のばらつきが大きく、安定的に細胞内に遺伝子を導入することは困難であった。その上、遺伝子導入効率の向上効果を発揮させるためには、多量のラミニンを用いる必要があり、高コストであった。これらの理由により、従来の材料の表面において新生骨の形成を誘導することは困難であった。
【００１２】
リン酸カルシウム以外の遺伝子導入用材料としては、ウイルスベクターやカチオニックな脂質などが広く用いられている。しかしカチオニックな脂質は細胞毒性が強く、生体内での使用は不可能と思われる。またウイルスベクターはそのウイルス性タンパク質が強い抗原性を持っているものが多く、生体内投与部位に強い炎症を引き起こすことが知られている。この強い炎症は組織を破壊したり組織再生を妨害すると考えられ、生体内投与には問題があると思われる。
【００１３】
従って、骨や歯の欠損部及び損傷部で、病巣周囲の細胞と良好な親和性を持ち、これらの細胞に安全に遺伝子を導入して新生骨を誘導することのできる医療用材料及び歯科用材料が強く望まれているのが現状である。
【００１４】
本発明は、前述の従来技術における問題点を鑑みてなされたものであって、第１の目的は、骨や歯の欠損部・損傷部で、病巣周囲の細胞と良好な親和性を持ち、これらの細胞に安全に遺伝子を導入して新生骨を誘導することのできる医療用材料及び歯科用材料として好適に使用することのできる、遺伝子、及び細胞接着因子を含有する複合体を提供することにある。第２の目的は、上記複合体を素材として用いた医療用材料及び歯科用材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、人工材料の表面に骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持する遺伝子と細胞接着因子を含むリン酸カルシウムの薄層を形成させることにより上記目的が達成しうるという知見を得た。また、細胞接着因子として、特にフィブロネクチンを用いることにより、上記目的を効果的に達成しうることも判明した。
【００１６】
本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］非ウイルス系・非脂質系の遺伝子導入用の生体材料であって、基材の表面にリン酸カルシウム層を有し、該リン酸カルシウム層が層内部に骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持する遺伝子と細胞接着因子を含むことを特徴とする生体材料。
［２］前記細胞接着因子がフィブロネクチンであることを特徴とする［１］に記載の生体材料。
［３］前記骨誘導機能を有する分子がbone  morphogenetic  protein-2  (BMP-2)である［１］又は［２］に記載の生体材料。
［４］前記基材は、該表面にリン酸カルシウム捕捉層を備えることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の生体材料。
［５］前記リン酸カルシウム層がアパタイトを含むことを特徴とする［１］〜［４］のいずれかに記載の生体材料。
［６］前記遺伝子がプラスミド単体に保持された遺伝子であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれかに記載の生体材料。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の生体材料上に、細胞を備えることを特徴とする再生体。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の生体材料の構成成分であるアパタイト等のリン酸カルシウムは、硬組織だけでなく軟組織とも高い親和性を示す。また、他方の構成成分である細胞接着因子は細胞の接着を促す性質を有する。本発明の生体材料においては、骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持する遺伝子（以下、単に「骨新生を促進するための遺伝子」ということもある。）と細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層が、リン酸カルシウム捕捉層を介して基材表面に強固に固定されている。生体内や培養液中の細胞はまず、基材表面に担持された細胞接着因子により、生体材料表面に接着する。材料表面に設けられた、骨新生を促進するための遺伝子と細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層は、生体内及び培養液中で部分的に溶解して、細胞との接着面に該遺伝子を放出する。該遺伝子は、リン酸カルシウムの成分であるカルシウムイオンとともに放出されるので、その一部は遺伝子−カルシウムコンプレックスを形成すると考えられる。この遺伝子−カルシウムコンプレックスは、電荷的に細胞表面に吸着しやすいため、高効率に、細胞内に骨新生を促進するための遺伝子を導入することができる。すなわち、本発明においては、骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持している遺伝子を用いているので、本発明の生体材料を骨や歯の欠損・損傷部の治療に用いれば、材料周囲の細胞に骨誘導機能を有する分子を発現させることができ、これら発現した分子の機能によって骨や歯の欠損・損傷部の骨新生が促進されることにより、治癒が早まることが期待される。
【００１８】
また、上記の生体材料の表面に、骨髄間葉系幹細胞、組織幹細胞、またはiPS細胞などの分化機能を有する細胞を接着させた再生体も、骨や歯の欠損・損傷治療に有用である。上記の再生体を体外で培養すると、生体材料の表面に接着した分化機能を有する細胞は、遺伝子導入によって骨分化が促進された状態になる。このように骨分化の進んだ細胞を含む再生体も、骨や歯の欠損・損傷治療に有用と考えられる。
【００１９】
本発明の生体材料に用いられている細胞接着因子、遺伝子、及びリン酸カルシウムは生体の構成成分であり低毒性である。他の遺伝子導入剤には高毒性のものが多く、生体内投与が制限されることを考えると、本システムの低毒性は生体内応用において大きな利点である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１のEVOH-CP、EVOH-DNA及びEVOH-DNA-FB表面のSEM写真（上段；高倍率、下段；低倍率）である。
【図２Ａ】実施例１のEVOH-DNA及びEVOH-DNA-FB上でのMC3T3-E1細胞及び10T1／2細胞への遺伝子（pGL3controlプラスミド）導入効率を、luciferase assayにより評価した結果を示す図である。
【図２Ｂ】実施例２のEVOH-CP、EVOH-BMP、及びEVOH-BMP-FB上で培養されたMC3T3-E1細胞及び10T1／2細胞によるBMP-2遺伝子の発現をreal-time PCRで評価した結果を示す図である。
【図３Ａ】実施例２のEVOH-CP、EVOH-BMP、及びEVOH-BMP-FB上で種々の期間（Day 9, 18, 27）培養されたMC3T3-E1細胞のALP活性を測定した結果を示す図である。
【図３Ｂ】実施例２のEVOH-CP、EVOH-BMP、及びEVOH-BMP-FB上で27日間培養されたMC3T3-E1細胞が産生したOCタンパク質の濃度を測定した結果を示す図である。
【図４Ａ】実施例３の頭蓋骨欠損部を形成術で修復するたに使用するHAPセラミックボタンの形状を示す図である。
【図４Ｂ】実施例３の頭蓋骨形成術を施行して得られた標本から組織切片を作製するときの切線方向の表示、ならびに新生骨が形成される部位を示した図である。
【図５Ａ】実施例３の頭蓋骨形成術施行２週間後の骨欠損部の組織中のBMP-2遺伝子の発現量をHAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で比較した図である。
【図５Ｂ】実施例３の頭蓋骨形成術施行２週間後の骨欠損部の組織中のBMP-2タンパク質濃度をHAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で比較した図である。
【図６Ａ】実施例３の頭蓋骨形成術施行８週間後の骨欠損部における骨新生の程度をHAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で組織学的に比較した図である。（点線領域；New  bone）
【図６Ｂ】実施例３の頭蓋骨形成術施行８週間後の骨欠損部における骨新生をExtensionとThicknessで評価し、HAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で比較した図である。
【図６Ｃ】実施例３の頭蓋骨形成術施行８週間後の骨欠損部におけるALPとOCの遺伝子発現量を、HAP-CP群、HAP-BMP群及びHAP-BMP-FB群で比較した図である。
【図７】比較例１のEVOH-DNA-LN及びEVOH-DNA-FB上でのCHO-K1細胞、BHK-21細胞、及びMG63細胞への遺伝子（pGL3 controlプラスミド）導入効率（EVOH-DNA上での導入効率に対する比）を、luciferase assayにより評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の生体材料は、基材の表面に、骨誘導機能を有する分子を発現し得る遺伝情報を保持する遺伝子（以下、単に「骨関連遺伝子」という。）、及び細胞の親和性と遺伝子導入効率を高めるための細胞接着因子（以下、単に「細胞接着因子」という。）を含むリン酸カルシウム層を形成させたことを特徴としている。また、本発明の生体材料における前記基材は、好ましくは、その表面にリン酸カルシウム捕捉層を備えており、好ましくは、前記細胞接着因子として、フィブロネクチンが用いられる。
本発明の生体材料は上記のような特有な構造を有することから、リン酸カルシウム由来の生体適合性と細胞接着活性を併せ示す。しかも、材料の表面に接着した細胞に高効率に骨関連遺伝子が導入されて、周囲の骨新生を促進する特性を有している。
【００２２】
本発明の生体材料においては、細胞接着因子は材料表面への細胞の接着を促進する機能だけでなく、同細胞への遺伝子導入効率を高める機能も有している。特に、細胞接着因子として、従来のラミニンにかわってフィブロネクチンを用いると、骨芽細胞などの骨関連細胞に対して、より安定的に、かつ十分高効率に遺伝子を導入することができる。これによって、材料の表面において新生骨の形成を効果的に誘導することができる。
【００２３】
上記のような、ラミニンとフィブロネクチンによる効果の違いは次のように説明される。ラミニンには、ラミニン分子を構成する３本のサブユニット鎖（α鎖：５種類、β鎖とγ鎖：３種類）の組み合わせに応じて、１２種類のラミニンアイソフォームが存在する。
表１は、ラミニンの発現部位とそのインテグリン受容体結合特異性を示したものである（関口清俊：多細胞体の構築と細胞接着システム（関口清俊,鈴木信太郎編,pp100-123,  共立出版,東京,2001.参照）。
【００２４】
【表１】
2011229661.tif 000002
【００２５】
ラミニン1は、α１β１γ１という組成をもち、胎児の基底膜にはよく発現しているものの、成体組織の基底膜にはほとんど発現していない。他のラミニンも、α鎖のタイプによって組織特異的な発現を示す（Miner  JH,  Patton  BL,  Lentz  SI,  Gilbert  DJ,  Snider  WD,  Jenkins  NA,  Copeland  NG,  Sanes  JR,  The  laminin  alpha  chains:  expression,  developmental  transitions,  and  chromosomal  locations  of  alpha1-5,  identification  of  heterotrimeric  laminins8-11,  and  cloning  of  a  novel  alpha3  isoform.  J.  Cell  Biol.,  137:685-701,  1997.参照）。
ラミニンの細胞接着性はそれに対する受容体との親和性によって発揮されている。ラミニン受容体には、インテグリンファミリー、それに属さないα−ジスロトグリカン、シンデカンなどが知られている。インテグリン受容体は表１のようにラミニンアイソフォームに対して特異的親和性を示している。従ってラミニンを細胞接着因子として用いた場合には、細胞の種類によって親和性の強さが異なり、骨芽細胞などの骨関連細胞に高効率に遺伝子を導入することは困難である。
【００２６】
本発明の生体材料は主に体内間質内で使用されると考えられる。ラミニンは基底膜の中核的な細胞接着因子であるのに対して、フィブロネクチンは間質（結合組織の細胞外マトリックス）の代表的な細胞接着因子である。フィブロネクチンにも、ラミニンの様に複数のアイソフォームが存在しているが、これらの違いは遺伝子のスプライシングによるものであり、その生物学的意義は主に細胞接着性の違いである（Manabe  R,  Ohe  N,  Maeda  T,  Fukuda  T,  Sekiguchi  K,  Modulation  of  cell-adhesive  activity  of  fibronectin  by  te  alternatively  spliced  EDA  segment.  J.  Cell  Biol.  139:  295-307,1997.参照）。従ってフィブロネクチンを細胞接着因子として用いると、ラミニンを用いた場合とは異なり、骨芽細胞、骨組織幹細胞などの骨関連細胞に対しても高い親和性を示すようになり、これによって、これらの細胞に高効率に遺伝子を導入することができる。
【００２７】
本発明では、少なくともその表面が親水性である基材を用いる必要がある。基材表面が親水性でないと、基材表面と処理溶液との接触が不十分となり、基材の表面全面にリン酸カルシウム捕捉層が導入されず、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層を形成させることが困難となるからである。また、親水性でない基材表面に骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層を形成させたとしても、基材との接着強度が不十分となるからである。ここで、少なくともその表面が親水性を有する基材とは、基材自体が親水性を有するものはもちろんのこと、基材自体は親水性を有するものではないが、親水化処理（粗面化処理を含む）によって、表面が親水性となるもの、水溶液中で徐々に親水性に変化するものも包含される。
親水化処理としては、それ自体公知のものが何れも適用でき、グロー放電処理、コロナ放電処理、アルカリ溶液処理、酸溶液処理、酸化剤処理、親水性官能基のグラフト処理、シランカップリング処理、陽極酸化処理、粗面化処理、等を採ればよい。
【００２８】
上記条件を満たすものであれば、基材は特に限定されず、無機、有機何れの材料も使用できるし、それらの複合体であっても良い。無機基材としては、金属、セラミックス、無機高分子等が、有機基材としては、有機高分子等が使用される。基材の大きさは、医療用材料及び歯科用材料といった生体代替材料として機能するよう、0.4mm以上200mm以下、好ましくは0.4mm以上100mm以下、さらに好ましくは1mm以上50mm以下である。
【００２９】
具体的には、金属としては、例えば、チタン、タンタル、ニオブ、コバルト、クロム、モリブデン、プラチナ、アルミニウム、またはこれらの２種以上の金属の合金、ステンレス、真ちゅう等が、セラミックスとしては、例えば、焼結水酸アパタイト、シリカ、チタニア、アルミナ、ジルコニア、部分安定化ジルコニア、コージェライト、ゼオライト、炭化ケイ素、窒化ケイ素、窒化ホウ素、炭化チタン、ダイアモンド、シリカガラス、ソーダ石灰ガラス、ケイ酸塩ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸塩ガラス、アルミノケイ酸塩ガラス、リン酸塩ガラス、カルコゲンガラス、ハンダガラス、コパール用ガラス、Pyrexガラス、これらの結晶化ガラス等が、無機高分子としてはシリコーンポリマー等のケイ素含有高分子等が、有機高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリスルフォン、ポリアミン、ポリウレア、ポリイミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル等の合成高分子、こられの共重合体、セルロース、アミロース、アミロペクチン、キチン、キトサン等の多糖類、コラーゲン等のポリペプチド、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸等のムコ多糖類等の天然高分子が好ましく挙げられる。
【００３０】
また、本発明で用いる上記基材の形状は限定されない。例えば、ブロック状、平板状、フィルム状、膜状、棒状、筒状、メッシュ状、繊維状、多孔体状、粒子状、スポンジ状、織物状、編み物状等が好ましく挙げられる。
【００３１】
本発明において、リン酸カルシウム捕捉層とは、リン酸カルシウム過飽和水溶液中においてリン酸カルシウムの形成を促し、該リン酸カルシウムを基材表面に堅固に固定化できる層を意味する。リン酸カルシウム捕捉層を構成する物質としては、Si-OH基、Ti-OH基、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基、水酸基等の官能基（末端にこれらの官能基を有するシランカップリング剤やグラフト鎖、金属酸化物ゲル等も包含される）や、それらの官能基にアルカリ金属またはアルカリ土類金属イオンを結合させたものや、炭酸カルシウム、アパタイトやアパタイトの前躯体であるリン酸カルシウム等、少なくともリン及び／又はカルシウムを含む化合物が有効である。
【００３２】
この中でも、リン酸カルシウムの形成を誘起する速度の観点から、アパタイト、及び、アモルファスリン酸カルシウム等のアパタイトの前躯体が好ましく使用される。
【００３３】
リン酸カルシウム捕捉層は、基材の少なくとも表面に設けられていればよい。必ずしも第１層、第２層、という多重層構造をとる必要はなく、基材の表面及び内部の全体に渡ってリン酸カルシウム捕捉層が存在していてもよい。リン酸カルシウム捕捉層は、化学処理等によって基材の表面に設けても良いし、焼結リン酸三カルシウム、焼結水酸アパタイト、リン酸カルシウム硬化体等のリン酸カルシウムを含有する基材のように、初めからリン酸カルシウム捕捉層を少なくとも表面に有する基材を用いても良い。
【００３４】
本発明に係る骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層とは、リン酸カルシウムマトリックス層と、同層の内部及び表面に存在する骨関連遺伝子及び細胞接着因子とからなる複合体層と定義される。このような複合体層中においては、骨関連遺伝子、及び細胞接着因子は周囲のリン酸カルシウムマトリックス中に物理的に担持されているだけでなく、骨関連遺伝子や細胞接着因子の官能基とリン酸カルシウムとの相互作用により、リン酸カルシウムマトリックス中に化学的に結合、固定化されている。
【００３５】
本発明で用いるリン酸カルシウムとしては、水酸アパタイト、オキシアパタイト、ピロリン酸アパタイト、水酸アパタイトのイオンの一部が炭酸イオン、塩化物イオン、フッ化物イオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン等で置換された化合物、アモルファスリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、二リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、二リン酸二水素カルシウム、ホスフィン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸二水素カルシウム一水和物、ホスホン酸カルシウム一水和物、ビス(リン酸二水素)カルシウム一水和物、これらの無水物、又はこれらの混合物等からなるリン酸カルシウム系化合物を挙げることができる。また、リン酸三カルシウムは、マグネシウム、亜鉛等６配位イオン半径が0.5オングストローム以上0.8オングストローム以下の２価金属イオンを含有して水溶液から沈殿するリン酸三カルシウムを含む。特に、生体組織との親和性、体内環境における安定性から水酸アパタイト（各種イオンで置換された水酸アパタイトを含む）を好ましく挙げることができる。
【００３６】
本発明で用いる細胞接着因子は、ある細胞に対して接着性を有する物質を指す。そのような物質としては、ある細胞に対して接着性を有するタンパク質、ペプチド鎖、糖鎖、抗体、酵素、合成分子、及びそれらを含む物質を挙げることができる。
細胞接着性を有するタンパク質の例としては、インテグリンスーパーファミリー、コラーゲンファミリー、ラミニンファミリー、エピリグリン、VCAM  (vascular  cell  adhesion)、フィブロネクチン、MAdCAM  (mucosal  addression  cell  adhesion  molecule)、テナイシンファミリー、ビトロネクチン、ICAM  (intercellular  adhesion  molecule)、NCAM  （neural  cell  adhesion  molecule）、フィブリノーゲン、第Ｘ因子、フォンビルブランド因子、カドヘリンスーパーファミリー、カテニン、トロンボスポンジン、セレクチンファミリー、プロテオグリカンファミリー（シンデカン、アグリカン、デコリン、ビグリカン、ニューロカン、オスファカンなど）、アネキシン、ロイシンリッチリピートスーパーファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー（免疫グロブリン、主要組織適合抗原複合体、Ｔ細胞受容体複合体、細胞増殖因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、CD2、CD4、CD8、ICAM、VCAM、Thy1、OX2、L1、MAG（myelin  associated  glycoprotein）、コンタクチン等）、オステオポンチン、VAP-1、バーシカン、APCタンパク質、レクチン等を挙げることができるが、なかでも特に、フィブロネクチンが好ましく用いられる。
細胞接着性を有するペプチド鎖の例としては、YIGSR、IKVAV、RGD、RGDS、GRGDS、RGDSPA、RVDSPA、GRGDSP、LDV、REDV、DEGA、EILDV、GPRP、KQAGDV、RNIAEIIKDI、KHIFSDDSSE、VPGIG、FHRRIKA、KRSR、NSPVNSKIPKACCVPTELSAI、APGL、VRN、AAAAAAAAA、NRWHSIYITRFG、TWYKIAFQRNRK、RKRLQVQLSIRT等の配列を有するペプチド鎖を挙げることができる。
細胞接着性を有する糖鎖の例としては、マンノース含有糖鎖、α−グルコシル化N型糖鎖、シアル酸含有糖鎖、HNK-1抗体、シアリルLewisｘ、N型糖鎖、三及び四本鎖複合型糖鎖、ヘパリン、ヘパラン硫酸、アシアロ二本鎖糖鎖、GPIアンカー糖鎖、糖脂質GM4、シアリルTn抗原等を挙げることができる。
細胞接着性を有する酵素の例としてはリゾチーム等を挙げることができる。
細胞接着性を有する合成分子の例としては、ポリ−Ｌ−リジン、ポリカチオニックフェリチン、ポリビニルラクトンアミド等を挙げることができる。
【００３７】
本発明に係る骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層に担持させる細胞接着因子の種類、量、及び濃度を変化させることによって、層の表面に接着する細胞の種類や数を変えたり、細胞と生体材料との親和性の特異性や強さを調節することができる。さらには、細胞への骨関連遺伝子導入効率を調節することや、遺伝子導入の場所特異性を調節することもできる。
【００３８】
本発明で用いる細胞接着因子は、基材表面に形成されるリン酸カルシウム層への担持効率の観点から、リン酸カルシウムと親和性を有することが望ましいが、リン酸カルシウムとの親和性の低い細胞接着因子を、ポリアクリル酸、テトラサイクリン、アルブミン等のリン酸カルシウムとの親和性の高い分子と複合化させて用いても良い。リン酸カルシウムとの親和性の低い細胞接着因子と、リン酸カルシウムとの親和性の高い分子との複合化には、両者の官能基や表面電荷等を利用すればよく、種々の公知の方法で複合化させることができる。
【００３９】
本発明で用いる細胞接着因子は水溶性であることが望ましいが、非水溶性の細胞接着因子をアルブミン等の水溶性担体タンパク質またはポリエチレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリピニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ１，３，６−トリオキサン、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸類等の水溶性高分子と複合化させることにより水溶性化してもよい。非水溶性の細胞接着因子と上記水溶性分子との複合化には、両者の官能基や表面電荷等を利用すればよく、種々の公知の方法で複合化させることができる。
【００４０】
本発明で用いる骨関連遺伝子としては、例えばプラスミド単体、あるいは、カルシウムイオン、リン酸カルシウムクラスター、有機高分子等に保持されたプラスミドが挙げられる。
【００４１】
本発明で用いる遺伝子が持つ遺伝情報は骨関連遺伝子であり、それらの発現亢進によって骨新生が誘導されるものである。例えば、bone  morphogenetic  protein-2  (BMP-2)等のbone  morphogenetic  protein  (BMP),  LIM  mineralization  protein  (LMP),  vascular  endothelial  growth  factor  (VEGF),  fibroblast  growth  factor  (FGF),  receptor  activator  of  nuclear  factor  kappa  B  (RANK),  RANK  ligand  (RANKL),  osteoclast  inhibitory  protein  (OIP),  osteonectin  (ON),  sialoprotein,  collagen  (Col),  osteoprotegerin  (OPG),  alkaline  phosphatase  (ALP),  insulin-like  growth  factor  (IGF),  runt-related  transcription  factor  2  (RUNX2／Cbfa-1),  matrix  metalloproteinase,  dentin  matrix  protein  (DMP),  phosphate  regulating  gene  (PHEX),  vitamine  D  receptor  (VDR),  osteocalcin  (OC),  cyclooxygenase-2  (COX2),  glucocorticoid-induced  leucine  zipper  (GILZ),  osterix  (OSX),  Nell-1,  activin  receptor-like  kinase  2  (ALK2),  Wnt,  osteopontinなどの生理活性タンパク質、酵素そして転写因子等の相補的遺伝子が挙げられる。新生骨誘導作用があるものであれば上記に限定されないが、新生骨誘導能が高いことが知られている、bone  morphogenetic  protein-2  (BMP-2)が好ましく用いられる。また、特定の遺伝子発現をダウンレギュレーションさせて新生骨誘導を図るsiRNA機能を持つ遺伝子も含まれる。
【００４２】
本発明においては、リン酸カルシウム層に担持させる骨関連遺伝子の量及び濃度を変化させることによって、層の表面に接着する細胞への遺伝子導入効率を調節することができる。
【００４３】
本発明に係る骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層には、さらに溶解性制御因子が含まれていても良い。溶解性制御因子は、リン酸カルシウム層と複合化して、その溶解性を変化させることのできる物質を指す。これによって、リン酸カルシウム層から放出された骨関連遺伝子が細胞内に導入される時期、及び骨関連遺伝子導入効率を調節することができる。溶解性制御因子としては、それ自体公知のものが何れも適用でき、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、鉄、ナトリウム、炭酸、ケイ素、チタン、ジルコニウム、ビスフォスフォネート等、及びその化合物等を挙げることができる。これらの溶解性制御因子は、層中のリン酸カルシウム相に応じて、溶解性増大、または低下効果を発揮することができる。例として、マグネシウムや亜鉛はリン酸三カルシウムやアモルファスリン酸カルシウムに対しては溶解性低下効果があり、ハイドロキシアパタイトに対しては溶解性増大効果がある。さらに、炭酸はアモルファスリン酸カルシウムに対しては溶解性低下効果があり、ハイドロキシアパタイトに対しては溶解性増大効果がある。但し、リン酸カルシウム層に溶解性増大あるいは低下効果をもたらす溶解性制御因子の組合せはこれらの例に限定されるものではない。
【００４４】
本発明の生体材料を作製するには、たとえば、基材表面にリン酸カルシウム捕捉層を形成させた後（第１工程）、同基材を、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を添加したリン酸カルシウム過飽和水溶液に浸漬して、基材表面に骨関連遺伝子、及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層を形成させる（第２工程）ことにより行われる。
【００４５】
第１工程は、具体的には、例えば次のように行えばよい。高分子基材を、２００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に１０秒間、次いで超純水に１秒間浸漬した後、風乾する。続いて、基材を２００ｍＭのリン酸水素二カリウム・三水和物水溶液に１０秒間、次いで超純水に１秒間浸漬した後、風乾する。以上の操作を交互に３回繰り返す。同処理によって、基材表面にリン酸カルシウム捕捉層が形成される。リン酸カルシウム捕捉層の厚みに特別な制限はないが、０．００１ｎｍ〜１μｍ、好ましくは０．０１〜３００ｎｍである。
【００４６】
第２工程は、表面にリン酸カルシウム捕捉層を有する基材を、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を添加したリン酸カルシウム過飽和溶液に浸漬することにより、基材表面に骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層を形成させる方法が好ましく採用される。骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層の厚みに特別な制限はないが、好ましくは100nm〜10μｍ、さらに好ましくは500nm〜3μmである。焼結リン酸三カルシウム、焼結ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウム硬化体等のリン酸カルシウムを含有する基材のように、初めからリン酸カルシウム捕捉層を少なくとも表面に有する基材であれば、第１工程を省略し、第２工程だけで基材表面に、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層を形成させても良い。
【００４７】
ここで、リン酸カルシウム過飽和溶液とは、リン酸カルシウムの溶解度以上のカルシウムイオン及びリン酸イオンを含む（過飽和である）溶液のことを意味する。リン酸カルシウム過飽和溶液の安定性は、溶液の成分濃度、温度、及びpHによって決まる。リン酸カルシウム過飽和溶液は、溶液調整完了後、７日以内に自発核形成によるリン酸カルシウムの析出を誘起するような不安定な溶液であってもいいし、８日以上リン酸カルシウムの析出を誘起しない安定な溶液であってもいい。溶液調製直後は安定な溶液であって、その後、濃度や温度、pH変化等によって不安定溶液に変化する溶液であっても良い。また、溶液調製直後は不飽和で、その後、濃度や温度、pH変化等によって過飽和に変化する溶液であっても良い。
【００４８】
リン酸カルシウム過飽和溶液は、種々の公知の方法で調整することができる。リン酸カルシウム過飽和溶液としては、例えば、Hank’s溶液、ヒトの体液とほぼ等しい無機イオン濃度を有する擬似体液（SBF）、SBFと同等の塩化ナトリウム濃度、及び、SBFの1.5倍のリン酸及びカルシウムイオン濃度を有する溶液、SBFの5倍のイオン濃度を含む溶液等を挙げることができる。
【００４９】
骨関連遺伝子及び細胞接着因子は、変成や失活を惹起しない限り、リン酸カルシウム過飽和溶液の調整前、調整中、調整後のいずれのタイミングで溶液に添加しても構わない。また、骨関連遺伝子及び細胞接着因子は、同時にリン酸カルシウム過飽和溶液に添加してもいいし、それぞれ別のタイミングで添加してもいい。添加する骨関連遺伝子及び細胞接着因子は、凍結乾燥粉体のような固体状でも良いし、培養液や生理食塩水のような溶液に溶解された液状でも良い。
【００５０】
リン酸カルシウム過飽和溶液に添加する骨関連遺伝子、及び細胞接着因子は、それぞれ１種でも良いし、２種以上の遺伝子及び細胞接着因子を添加しても良い。複数の細胞接着因子を添加した溶液を用いると、複数の細胞接着因子を含有するリン酸カルシウム層が基材表面に形成される。複数の骨関連遺伝子を添加した溶液を用いると、複数の骨関連遺伝子を含有するリン酸カルシウム層が基材表面に形成される。
【００５１】
基材表面のリン酸カルシウム層の成長を完全には阻害しない限り、また、細胞の接着性制御に必要とされる最低密度以上の細胞接着因子が基材表面のリン酸カルシウム層中に含有される限り、リン酸カルシウム過飽和溶液中に添加される細胞接着因子の濃度、及び基材表面のリン酸カルシウム層中に含有される細胞接着因子の量は限定されない。リン酸カルシウム過飽和溶液中に添加される細胞接着因子の濃度が高いほど、該溶液中において基材表面に形成されるリン酸カルシウム層中に含有される細胞接着因子の量も増大する。リン酸カルシウム過飽和溶液中に添加される細胞接着因子の最適濃度は細胞接着因子の種類によって異なり、ラミニンの場合には5〜80 μg/mL、好ましくは40 μg/mLであり、フィブロネクチンの場合には5〜30 μg/mL、好ましくは10〜20 μg/mL、さらに好ましくは10 μg/mLである。基材表面のリン酸カルシウム層中に含有される細胞接着因子の最適量は、細胞接着因子の種類によって異なり、ラミニンの場合には8〜40 μg/cm2、好ましくは15〜25 μg/cm2であり、フィブロネクチンの場合には5〜33 μg/cm2、好ましくは20〜26 μg/cm2である。
【００５２】
基材表面のリン酸カルシウム層の成長を完全には阻害しない限り、また、細胞への導入に必要とされる最低密度以上の遺伝子が基材表面のリン酸カルシウム層中に含有される限り、リン酸カルシウム過飽和溶液中に添加される骨関連遺伝子の濃度、及び基材表面のリン酸カルシウム層中に含有される骨関連遺伝子の量は限定されない。リン酸カルシウム過飽和溶液中に添加される骨関連遺伝子の濃度が高いほど、該溶液中において基材表面に形成されるリン酸カルシウム層中に含有される骨関連遺伝子の量も増大する。リン酸カルシウム過飽和溶液中に添加される骨関連遺伝子の最適濃度は、5〜80 μg/mL、好ましくは20〜40 μg/mL、さらに好ましくは40 μg/mLである。基材表面のリン酸カルシウム層中に含有される骨関連遺伝子の最適量は、6〜19 μg/cm2、好ましくは8〜16 μg/cm2である。
【００５３】
以上に示した方法を用い、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を添加したリン酸カルシウム過飽和溶液とアパタイト捕捉層を有する基材とを接触させることにより、基材上に、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層が形成される。その結果、骨関連遺伝子及び細胞接着因子を含むリン酸カルシウム層を表面に有する生体材料が得られる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明はこの実施例に限定されるものではない。
［細胞と遺伝子］
使用した細胞はマウス由来骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1細胞（理化学研究所細胞開発銀行）、マウス由来胎児骨髄間葉系幹細胞である10T1／2細胞（理化学研究所細胞開発銀行）、ヒト子宮頸癌由来HeLa細胞（理化学研究所細胞開発銀行）、チャイニーズハムスター卵巣由来CHO-K1細胞（理化学研究所細胞開発銀行）、ハムスター繊維芽細胞由来BHK-21細胞（理化学研究所細胞開発銀行）、ヒト骨肉腫由来MG63（理化学研究所細胞開発銀行）である。細胞培養液としては10％の牛胎児血清を含むminimum  essential  medium  (MEM)またはbasal  mediumeagle  (BME)を用いた。
骨関連遺伝子としてはpGL3controlプラスミド（Promega）及びpCI-BMPプラスミドを用いた。pGL3controlプラスミドはluciferaseのcDNAを含んでおり、細胞内へ導入された場合にはluciferaseを発現する。従って、細胞融解液中のluciferase活性を測定することにより、細胞への遺伝子導入の有無、程度（遺伝子導入効率）を評価することができる。またpCI-BMPプラスミドは、pCI-neoプラスミド（Gibco-BRL）のmultiple  cloning  siteの制限酵素サイトEcoRIサイトとNotIサイトの間にヒト由来bone  morphogenetic  protein-2（BMP-２）のcDNAを挿入することにより調整した。BMP-2のcDNAは、以下のプライマーを用いてHeLa細胞から作製したcDNAライブラリーから増幅して調整した。プライマー（上流）:5’-GCGGAATTCGACTGCGGTCTCCTAAAGGTC-3’、プライマー（下流）：5’-GCGGCGGCCGCTTGCTGTACTAGCGACACCCAC-3’。HeLa細胞由来cDNAライブラリーはRNA抽出キット（Qiagen）を用いてtotoal RNAを抽出し、PrimeScript  II  1st  strand  cDNA  synthesisキット(タカラバイオ株式会社）を用いて作製した。
【００５５】
（実施例１）
［基板の作製］
大きさ10×10×1 mm３のエチレン−ビニルアルコール共重合体を＃2000のSiC研磨紙で研磨し、アセトン及びエタノールで超音波洗浄した後、100 ℃で24時間真空乾燥させた。上記基板を、200 mM  CaCl2水溶液 20 mLに10秒間、同量の超純水に1秒間浸した後乾燥させ、次いで、200 mM  K2HPO4・3H2O水溶液  20 mLに10秒間、同量の超純水に1秒間浸浸した後乾燥させた。同操作を3回繰り返した。細胞培養用試料については、上記処理の後に、エチレンオキサイドガスで基板を滅菌した。以上により作製された基板を以後、EVOHと略称する。
【００５６】
［EVOH表面への、アパタイト層、遺伝子担持アパタイト層、及び遺伝子-フィブロネクチン担持アパタイト層のコーティング］
超純水に、NaCl  142 mM、K2HPO4・3H2O  1.5 mM、HCl  40 mM、CaCl2  3.75 mM、となるように各試薬を溶解し、その後トリスヒドロキシメチルアミノメタン 50 mMと必要最小量の1M塩酸を用いて25 ℃でpH 7.40となるように調整した。以後この溶液をCP溶液と呼ぶ。また、CP溶液に遺伝子（pGL3controlプラスミド）を加えた溶液（D溶液）、及びフィブロネクチン及び遺伝子を加えた溶液（DF溶液）を調製した。いずれの溶液中においても、フィブロネクチン濃度は10 μg/mL及び遺伝子濃度は40 μg/mLとした。
CP、D、及びDF溶液 3 mLに、EVOHを25℃で24時間浸漬した。浸漬後、表面構造解析用試料については超純水で、細胞培養用試料についてはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で基板を洗浄した。以上の処理により得られた試料をそれぞれ次のように略記する。
・EVOH-CP（CP溶液浸漬後のEVOH）
・EVOH-DNA（D溶液浸漬後のEVOH）
・EVOH-DNA-FB（DF溶液浸漬後のEVOH）
【００５７】
［試料の表面構造解析１］
前記で得た各試料（EVOH-CP、EVOH-DNA、EVOH-DNA-FB）の表面構造を走査型電子顕微鏡（SEM）により観察した。図１は、各試料のSEM写真であり、上段は高倍率、下段は低倍率の写真である。
その結果、いずれの試料の表面にも、ナノ〜マイクロスケールの微細構造を有する均一な層の形成が認められた。
【００５８】
［アパタイト層中の遺伝子、及びフィブロネクチン担持量の分析］
EVOHの浸漬による、CP、D、DF溶液中の遺伝子、及びフィブロネクチン濃度変化を紫外可視分光光度計により測定した。フィブロネクチン濃度の測定には、BioRad  Protein  Assay  Kitを用いた。各溶液中の遺伝子、及びフィブロネクチン濃度の変化量から、各試料表面のアパタイト層中に担持された遺伝子、及びフィブロネクチンの量を求めた。
表２はEVOH-CP、  EVOH-DNA、及びEVOH-DNA-FBの表面（単位面積当たり）に担時されたCa、P、遺伝子（DNA）、フィブロネクチン（Fibronectin）の量を示した表である。
該表から明らかなように、EVOH-DNA、及びEVOH-DNA-FB表面には12〜14μg／cm2の遺伝子が、EVOH-DNA-FB表面には約18 μg／cm2のフィブロネクチンが担持されたことが分かった。
【００５９】
【表２】
2011229661.tif 000003
【００６０】
［試料表面での細胞培養］
実施例１で得られたEVOH-CP、EVOH-DNA、及びEVOH-DNA-FBを、24-wellの細胞培養用マイクロプレート上に静置した。各ウェルに、MC3T3-E1細胞及び10T1／2細胞を105 cell／mLとなるように懸濁させた細胞培養液  0.5  mLを注いだ。その後、37 ℃、5 ％炭酸ガス雰囲気で3日間細胞培養を行った。
【００６１】
［試料表面で培養された細胞のluciferase活性（遺伝子導入効率）の評価］
EVOH-DNA及びEVOH-DNA-FB上でのMC3T3-E1細胞及び10T1/2細胞への遺伝子（pGL3  controlプラスミド）導入効率を、培養後の各試料から得られた細胞融解液の上清中のluciferase活性を測定することにより評価した。
lucifrease活性測定においては、上記の上清10μLと90μLのluciferase発光基質（Promega  luciferase  assay  kitに含まれる）を混合し、ルミノメーターで発光強度を測定した。この発光強度値を上清中のタンパク質濃度（micro  BCA  Protein  Assay  Kit（Thermo  Fisher  Scientific  Inc.）を用いて測定）で割ることにより、細胞数による補正を行い、luciferase  活性（RLU）とした。
図２Ａは、その結果を示すものであり、Student-t検定で、＊；p＜0.05,＊＊＊；p＜0.001とした。
図２Ａから明らかなように、いずれの細胞についても、EVOH-DNA-FB表面で培養された細胞のluciferase  活性がEVOH-DNA表面で培養された細胞のそれよりも高かった。この結果は、EVOH-DNA-FB表面において、細胞への遺伝子導入がEVOH-DNA表面よりも効率良く行なわれたことを示している。
【００６２】
（実施例２）
[試料の作製（担時する遺伝子の変更）]
pGL３controlプラスミドの代わりにpCI-BMPプラスミドを用い、実施例１と同様にしてCP、D、及びDF溶液を調製した。
CP、D、及びDF溶液 3mLに、実施例１と同様にして作製したEVOHを25℃で24時間浸漬した。溶液から取り出した基板は、PBSで洗浄した。以上の処理により得られた試料をそれぞれ次のように略記する。
・EVOH-CP（CP溶液浸漬後のEVOH）
・EVOH-BMP（D溶液浸漬後のEVOH）
・EVOH-BMP-FB（DF溶液浸漬後のEVOH）
【００６３】
[試料表面で培養された細胞のBMP-2遺伝子発現の評価]
実施例２で得られたEVOH-CP、EVOH-BMP、及びEVOH-BMP-FB上でMC3T3-E1細胞または10T1／2細胞を7日間培養し、培養されたMC3T3-E1細胞及び10T1／2細胞によるBMP-2遺伝子の発現をreal-time  PCRで、以下のようにして評価した。
培養後の細胞からRNA抽出キット（Qiagen）を用いてtotoal  RNAを抽出し、PrimeScript  II  1st  strand  cDNA  synthesisキット(タカラバイオ株式会社)を用いてcDNAライブラリーを作製した。これをテンプレートとし、プライマー（上流）：5’-AAGGCACCCTTTGTATGTGG-3’、プライマー（下流）：5’-CATGCCTTAGGGATTTTGGA-3’を用いてreal-time  PCRを施行してBMP-2の遺伝子発現を半定量化した。遺伝子発現の内部コントロールとしてはGAPDHを使用し、プライマー（上流）：5’-AACTCCCATTCCTCCACCTT-3’、プライマー（下流）： 5’-GAGGGCCTCTCTCTTGCTCT-3’を用いて評価した。
図２Ｂは、その結果を示すものであり、Student-t検定で、＊＊；p＜0.01,  ＊＊＊；p＜0.001とした。
図２Ｂから明らかなように、10T1／2細胞では、EVOH-BMP-FB上での培養により、BMP-2の遺伝子発現がEVOH-BMP上での培養に比べて約9倍に増強された。またMC3T3-E1細胞のBMP-2の遺伝子発現は、EVOH-BMP-FB上での培養により、EVOH-BMP上での培養に比べて約2倍に増強された。
【００６４】
[試料表面で培養された細胞の骨分化マーカー（ALP）の評価]
実施例２で得られたEVOH-CP、EVOH-BMP、及びEVOH-BMP-FB上でMC3T3-E1細胞を種々の期間（Day  9,  18,  27）培養し、骨分化マーカーとしてアルカリフォスファターゼ（Alkaline  Phosphatase;  ALP）活性を測定した。培養後の細胞を試料ごとに引き上げ、PBSで洗浄した。次に1％  Triton  Xを含むPBS  400μLを加えてピペッティングして細胞を破壊した後、遠心分離（4℃、10000  rpm、３分間）した。この上清をALPの酵素液として使用し、ラボアッセイTM  キット（和光純薬）を用いて、405nmでの吸光度を測定した。ALP活性は検量線により、p-nitrophenolの濃度（nmol／mL）をタンパク質濃度mg／mL（micro BCA Protein Assay Kitを用いて測定）で補正した値（nmol／mg）で示した。
図３Ａは、その結果を示すものであり、Student-t検定で、＊；p＜0.05,  ＊＊；p＜0.01とした。
図３Ａに示すように、いずれの試料上でも、細胞のALP活性は培養期間が長くなるにつれて上昇した。Day18及びDay 27では、EVOH-BMP-FB上で培養されたMC3T3-E1細胞のALP活性が、他の培養条件と比較して有意に上昇していた。
【００６５】
[試料表面で培養された細胞の骨分化マーカー（OC）の評価]
実施例２で得られたEVOH-CP,  EVOH-BMP,  及びEVOH-BMP-FB上でMC3T3-E1細胞を27日間培養し、骨分化誘導マーカーとしてオステオカルシン（Osteicalcin;OC）産生量を測定した。細胞培養液をサンプルとし、Rat osteocalcin  enzyme  immunometric  assay  kit  (Biomedical  Technologies  Inc.)を用いてOC産生量を測定した。
図３Ｂは、その結果を示すものであり、Student-t検定で、＊；p＜0.05,＊＊＊；p＜0.001とした。
図３Ｂに示すように、MC3T3-E1細胞のOC産生量は、EVOH-BMP-FB上での培養で最も高い値を示した。以上の骨分化マーカー（ALP及びOC）の定量結果は、BMP-2遺伝子導入によって産生されたBMP-2タンパク質が生物学的に活性を持っており、MC3T3-E1細胞を刺激し骨分化を促進したことの証明であると考えられた。
【００６６】
（実施例３）
[頭蓋骨形成用ボタンの作製（基材の変更）]
水酸アパタイト（Hydroxyapatite;  HAP）の粉を98MPaで加圧・成型した後、1150℃で焼結して、図４ＡのようなHAPセラミックボタンを作製した。このHAPセラミックボタンは、直径5mm、厚さ1mmの円板で、両端が直線によって切り落とされた形を有しており、片面の面積は15.94mm2であった。このHAPセラミックボタンを、実施例２で調製したCP、D、DF溶液中に25℃で24時間浸漬した。溶液から取り出したボタンは、PBSで洗浄した。以上の処理により得られた試料をそれぞれ次のように略記する。
・HAP-CP（CP溶液浸漬後のHAPセラミックボタン）
・HAP-BMP（D溶液浸漬後のHAPセラミックボタン）
・HAP-BMP-FB（DF溶液浸漬後のHAPセラミックボタン）
【００６７】
[水酸アパタイト層中の遺伝子、及びフィブロネクチン担持量の分析]
実施例２と同様にして、各試料表面の水酸アパタイト層中に担持された遺伝子、及びフィブロネクチンの量を求めた。
表３は、HAP-CP, HAP-DNA、及びHAP-DNA-FBの表面（単位面積当たり）に担時されたCa、P、遺伝子（DNA）、及びフィブロネクチン（Fibronectin）の量を示した表である。
該表から明らかなように、HAP-BMP、及びHAP-BMP-FB表面には16〜19μg/cm2の遺伝子が、HAP-BMP-FB表面には約20 μg/cm2のフィブロネクチンが担持されたことが分かった。
【００６８】
【表３】
2011229661.tif 000004
【００６９】
[動物実験]
７−８週齢のWisterラット（日本クレア株式会社）に麻酔を施行し、頭皮を切開して頭頂骨を露出後、右頭頂骨にドリルで直径5mmの穴を開けた。
この骨欠損部に対して上記HAP-CP,  HAP-BMP,及びHAP-BMP-FBを用いて頭蓋骨形成術を施行した。
【００７０】
[生体内におけるBMP-2遺伝子の発現の評価]
頭蓋骨形成術施行２週間後の骨欠損部の組織少量を採取し、実施例２と同様の方法を用いてtotal  RNAを抽出し、BMP-2遺伝子の発現をreal-time  PCRで半定量化した。
図５Ａは、頭蓋骨形成術施行２週間後の骨欠損部の組織中のBMP-2遺伝子の発現量をHAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で比較した図であり、Student-t検定で、＊；p＜0.05,＊＊；p＜0.01とした。
図５Ａから分かるように、組織中のBMP-2遺伝子は、HAP-BMP-FBを使用した群  (n=3)でHAP-CP群（n=3）に比して90倍以上の発現上昇が確認された）。これに対してHAP-BMP群（n=3）ではHAP-CP群に比して23倍程度の発現上昇に留まった。
【００７１】
[生体内におけるBMP-2タンパク質産生の評価]
頭蓋骨形成術施行２週間後の骨欠損部の組織を400μLのPBSに入れホモジェナイザーで破砕し、遠心分離して上清を採取した。この上清中に含まれるBMP-2タンパク質濃度を、human／mouse／rat  BMP-2  ELISA  kit  (R&D  Systems  Inc.,MN,  USA)を用いて測定した。この値は上清中のタンパク質濃度（micro  BCA  Protein  Assay  Kitを用いて測定）により補正された。
図５Ｂは、頭蓋骨形成術施行２週間後の骨欠損部の組織中のBMP-2タンパク質濃度をHAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で比較した図であり、Student-t検定で、＊；p＜0.05とした。
図５Ｂから分かるように、BMP-2タンパク質濃度は、HAP-BMP-FB群  (n=3)で108pg/mg、HAP-BMP群（n=3）で46pg/mg、そしてHAP-CP群（n=3）で58pg/mgであり、HAP-BMP-FB群では高いBMP-2タンパク質濃度が測定された。
【００７２】
[生体内における骨新生の定量的評価]
頭蓋骨形成術施行８週間後に頭蓋骨欠損部を含む頭頂骨を一塊として標本摘出し、10%ホルマリン固定後脱灰した。HAPセラミックボタンを除去した後、パラフィン包埋して厚さ10mmの切片を作製、hematoxylin-eosinで染色した。
図４Ｂに、頭蓋骨形成術を施行して得られた標本から組織切片を作製するときの切線方向の表示、ならびに新生骨が形成される部位を示す。
こうして得られた組織標本を光学顕微鏡で観察することによって、骨新生の程度を評価した。
図６Ａは、頭蓋骨形成術施行8週間後の骨欠損部における骨新生の程度をHAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で組織学的に比較した図である。
図６Ａから分かるように、HAP-BMP-FB群（n=5）では新生骨（new bone）がしばしば観察された。これに対してHAP-BMP群（n=5）及びHAP-CP群（n=5）では骨新生は著明ではなかった。新生骨は頭蓋骨のInner layer側の部分と骨欠損断端から欠損部へ伸展した部分に観察された。
それぞれの部分について頭蓋骨の厚み（Thickness）と骨欠損部への伸展の長さ（Extension）を計測した。計測箇所は一標本につき骨欠損部の両端が２カ所あるので、各評価群（n=5）で10カ所であった。
図６Ｂは、頭蓋骨形成術施行8週間後の骨欠損部における骨新生をExtensionとThicknessで評価し、HAP-CP群、HAP-BMP群、及びHAP-BMP-FB群で比較した図であり、Student-t検定で、＊；p＜0.05、＊＊；p＜0.01とした。
図６Ｂからわかるように、Extensionの計測値はHAP-BMP-FB群で長く、HAP-BMP群及びHAP-CP群と比較して有意であったThicknessの計測値はHAP-BMP-FB群で厚く、HAP-CP群と比較して有意であった。以上より、HAP-BMP-FB群では、HAP-BMP群及びHAP-CP群と比較して有意に骨新生が促進された。
【００７３】
[生体内における骨分化マーカーの上昇]
頭蓋骨形成術施行８週間後、頭蓋骨欠損部の組織を一部採取し、実施例２と同様の方法を用いてtotal  RNAを抽出してcDNAライブラリーを作製した。これをテンプレートとして以下のプライマーを用いてreal-time  PCRでALPとOCの遺伝子発現を半定量化した。ALP発現検出用にプライマー（上流）：5’-GAGCAGGAACAGAAGTTTGC-3’、プライマー（下流）：5’-GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA-3’を用い、OC発現検出用にプライマー（上流）：5’-AGCTCAACCCCAATTGTGAC-3’、プライマー（下流）  ：5’-AGCTGTGCCGTCCATACTTT-3’を用いた。内部コントロールにはGAPDHを用いた。
図６Ｃは、頭蓋骨形成術施行8週間後の骨欠損部におけるALPとOCの遺伝子発現量を、HAP-CP群、HAP-BMP群及びHAP-BMP-FB群で比較した図であり、Student-t検定で、＊；p＜0.05、＊＊；p＜0.01とした。
図６Ｃからわかるように、ALP  の遺伝子発現量はHAP-BMP-FB群ではHAP群及びHAP-CP群と比較して有意に上昇していた。またOCの遺伝子発現量も、HAP-BMP-FB群ではHAP群及びHAP-CP群と比較して有意に上昇していた。これらの骨分化マーカーがHAP-BMP-FB群で上昇していたことは、HAP-BMP-FB群での骨新生の増強を示唆する所見であると考えられた。
【００７４】
（実施例４）
[試料の作製（担時する細胞接着因子の変更）]
実施例１と同様にしてCP、D及びDF溶液を調製した。また、CP溶液に遺伝子（pGL3controlプラスミド）及びラミニンをそれぞれ40μg/mLの濃度で加えた溶液（DL溶液）も調製した。
D、DF及びDL溶液  3mLに、実施例１と同様にして作製したEVOHを25℃で24時間浸漬した。溶液から取り出した基板は、PBSで洗浄した。以上の処理により得られた試料をそれぞれ次のように略記する。
・EVOH-DNA（D溶液浸漬後のEVOH）
・EVOH-DNA-FB（DF溶液浸漬後のEVOH）
・EVOH-DNA-LN（DL溶液浸漬後のEVOH）
【００７５】
［試料表面で培養された細胞のluciferase活性（遺伝子導入効率）の評価］
実施例４で得られたEVOH-DNA、EVOH-DNA-FB、及びEVOH-DNA-LNの表面で、CHO-K1細胞、BHK-21細胞、及びMG63細胞を実施例１と同様にして培養した後、試料表面で培養された細胞のluciferase活性（遺伝子導入効率）を実施例１と同様にして評価した。lucifrease活性評価においては、EVOH-DNA-FB及びEVOH-DNA-LN  表面で培養された細胞のRLUを、EVOH-DNA  表面で培養された細胞のRLUで割ることにより、各細胞に対するラミニン、及フィブロネクチンの遺伝子導入効率向上効果を比較した。
図７は、その結果を示すものである。CHO-K1細胞は、遺伝子が非常に導入されやすい細胞であるので、細胞接着因子としてフィブロネクチンを用いた場合（EVOH-DNA-FB）とラミニンを用いた場合（EVOH-DNA-LN）とで、遺伝子導入効率の向上効果に有意差は認められなかった。繊維芽細胞由来のBHK-21細胞に対しては、フィブロネクチンを用いた場合（EVOH-DNA-FB）よりもラミニン（EVOH-DNA-LN）を用いた場合の方が、遺伝子導入効率がより向上した。一方、骨肉腫由来のMG63細胞に対しては、ラミニンを用いた場合（EVOH-DNA-LN）よりもフィブロネクチンを用いた場合（EVOH-DNA-FB）の方が、遺伝子導入効率がより向上した。すなわち、骨関連細胞に対しては、細胞接着因子としてフィブロネクチンを用いることにより、より高効率に遺伝子導入を行えることが分かった。
【００７６】
（実施例５）
[試料の作製（細胞接着因子の濃度の変更）]
実施例１と同様にして、ただし溶液中へのフィブロネクチンの添加濃度を変化させてDF溶液を調製した。このDF溶液  3mLに、実施例１と同様にして作製したEVOHを25℃で24時間浸漬した。実施例１と同様にして、各試料表面の水酸アパタイト層中に担持された遺伝子、及びフィブロネクチンの量を求めた。
水酸アパタイト層中のフィブロネクチン担持量は、DF溶液中のフィブロネクチン濃度が0から5、10、20μg/mLと増加するのに対応して、0から12.46±2.16、23.05±3.03、23.81±9.66μg/cm2まで増大したが（ただし、フィブロネクチン濃度10μg/mLと20μg/mLでは優位差なし）、フィブロネクチン濃度30μg/mL以上の条件では減少に転じた。一方、水酸アパタイト層中の遺伝子担持量は10.12±1.02〜13.65±2.85μg/cm2であり、フィブロネクチン濃度に関わらず、試料間で有意差は認められなかった。
【００７７】
[試料表面で培養された細胞のluciferase活性（遺伝子導入効率）の評価]
実施例５で得られた試料の表面で、CHO-K1細胞を実施例１と同様にして培養した後、試料表面で培養された細胞のluciferase活性（遺伝子導入効率）を実施例１と同様にして評価した。
試料表面における遺伝子導入効率は、上記のフィブロネクチン担持量変化と同様に、DF溶液中のフィブロネクチン濃度が0から5、10、20μg/mLと増加するのに対応して、lucifrease発光強度値で165±130から721±517、15497±14579、30349±27984countまで向上し（ただし、フィブロネクチン濃度10μg/mLと20μg/mLでは優位差なし）、フィブロネクチン濃度30μg/mL以上の条件では減少に転じた。
【図１】
2011229661.tif 000005
【図２Ａ】
2011229661.tif 000006
【図２Ｂ】
2011229661.tif 000007
【図３Ａ】
2011229661.tif 000008
【図３Ｂ】
2011229661.tif 000009
【図４Ａ】
2011229661.tif 000010
【図４Ｂ】
2011229661.tif 000011
【図５Ａ】
2011229661.tif 000012
【図５Ｂ】
2011229661.tif 000013
【図６Ａ】
2011229661.tif 000014
【図６Ｂ】
2011229661.tif 000015
【図６Ｃ】
2011229661.tif 000016
【図７】
2011229661.tif 000017