(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原特異的T細胞を作製し、単離し、かつ拡大する方法の提供。【解決手段】抗原特異的T細胞を含んでいる細胞集団を、第1薬剤がT細胞上のCD3/TCR複合体をリガンド結合し、かつ第2薬剤が該T細胞上のアクセサリー分子をリガンド結合し、かつ該T細胞の該第1および第2薬剤によるリガンド結合が抗原特異的T細胞の増殖を誘導し、かつ表面が1：2またはそれ以下の表面対T細胞比で存在する、抗原特異的T細胞の集団を拡大する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともその一部が抗原特異的T細胞を含んでいる細胞集団を、第1薬剤および第2薬剤が取り付けられている表面と接触させることを含み、第1薬剤がT細胞上のCD3/TCR複合体をリガンド結合し、かつ第2薬剤が該T細胞上のアクセサリー分子をリガンド結合し、かつ該T細胞の該第1および第2薬剤によるリガンド結合が抗原特異的T細胞の増殖を誘導し、かつ表面が1：2またはそれ以下の表面対T細胞比で存在する、抗原特異的T細胞の集団を拡大する方法。
【請求項２】
表面が常磁性ビーズ、脂質、および細胞表面からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
表面が常磁性ビーズを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ビーズが抗体に結合されたビーズを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
表面が約1：2.5の表面対T細胞比で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
表面が約1：5の表面対T細胞比で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
表面が約1：10の表面対T細胞比で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
表面が約1：25の表面対T細胞比で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
表面が約1：50の表面対T細胞比で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
表面が約1：100の表面対T細胞比で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
抗原特異的T細胞を作製および/または濃縮する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）少なくともその一部が抗原提示細胞を含んでいる第1細胞集団を、抗原が取り付けられている表面に、抗原が取り付けられている前記表面が前記APCによって摂取されるように曝露する段階、
（b）少なくともその一部がT細胞を含んでいる第2細胞集団を（a）の細胞集団に曝露する段階、
その結果として抗原特異的T細胞を作製および/または濃縮する段階。
【請求項１２】
APCが抗原特異的T細胞と直接接触する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
抗原特異的T細胞と直接接触しているAPCが、前記APCを磁場に曝露することによって単離される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
抗原特異的T細胞が、以下の方法に従って拡大される、請求項13記載の方法：
（a）T細胞を、ある表面上に固定化された抗CD3抗体に曝露すること、かつ
（b）T細胞の表面上のアクセサリー分子を、抗CD3抗体と同じ表面上に固定化された抗CD28抗体で刺激すること、
その結果として、前記抗原特異的T細胞の拡大を誘導すること。
【請求項１５】
T細胞をIL-15に曝露する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
T細胞をCD137の天然リガンドに曝露する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
T細胞を抗CD137抗体に曝露する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
T細胞を抗NKG2D抗体またはNKG2Dの天然リガンドに曝露する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
抗原特異的T細胞が、前記抗原特異的T細胞をマイトジェンに曝露することによって拡大される、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
マイトジェンがフィトヘマグルチニン（PHA）、酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびイオノマイシン、リポ多糖（LPS）、ならびにスーパー抗原からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
抗原が、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、抗体/抗原複合体、全腫瘍またはウイルス感染細胞、固定された腫瘍またはウイルス感染細胞、加熱殺滅された腫瘍もしくはウイルス感染細胞、腫瘍溶解物、不溶性細胞残渣、アポトーシス小体、壊死細胞、分裂し続けることができないように処理された腫瘍または細胞株由来の全腫瘍細胞、分裂し続けることができないように処理された同種異系細胞、照射腫瘍細胞、照射同種異系細胞、天然または合成複合糖質、リポタンパク質、リポ多糖、形質転換された細胞または細胞株、トランスフェクトされた細胞または細胞株、形質導入された細胞または細胞株、およびウイルスに感染した細胞または細胞株からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項２２】
抗原が抗体/リガンド相互作用によって表面に取り付けられる、請求項11記載の方法。
【請求項２３】
抗原/リガンド相互作用が、抗MART-1抗体/MART-1抗原、抗WT-1抗体/WT-1、抗PR1抗体/PR1、抗PR3抗体/PR3、抗チロシナーゼ抗体/チロシナーゼ抗原、抗MAGE-1抗体/MAGE-1抗原、抗MUC-1抗体/MUC-1抗原、抗α-フェトプロテイン抗体/α-フェトプロテイン抗原、抗Her2Neu抗体/Her2Neu、抗HIV gp120抗体/HIV gp120、抗インフルエンザHA抗体/インフルエンザHA、抗CMV pp65/CMV pp65、抗C型肝炎抗体/C型肝炎タンパク質、抗EBV EBNA 3B抗体/EBV EBNA 3B抗原、ならびに抗ヒトIg重鎖および軽鎖/骨髄腫癌患者由来のIg、ならびに抗ヒトIg重鎖および軽鎖/CLL癌患者由来のIgからなる群より選択される抗体/リガンド対間の相互作用を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
抗原が表面に化学的に取り付けられる、請求項11記載の方法。
【請求項２５】
表面への抗原の取り付けがビオチン-アビジン相互作用を含む、請求項11記載の方法。
【請求項２６】
少なくともその一部がAPCを含んでいる細胞集団が、白血球アフェレーシス産物、末梢血、リンパ節、扁桃腺、胸腺、組織生検、腫瘍、脾臓、骨髄、臍帯血、CD34＋細胞、単球、および接着細胞からなる群より選択される供給源に由来する、請求項11記載の方法。
【請求項２７】
抗原特異的T細胞を作製し、かつ拡大する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）少なくともその一部が抗原提示細胞を含んでいる第1細胞集団を、抗原に、前記抗原が前記APCによって取り込まれるように曝露する段階、
（b）少なくともその一部がT細胞を含む第2細胞集団を（a）の細胞集団に曝露し、その結果として抗原特異的T細胞を作製する段階、および
（c）（b）の前記抗原特異的T細胞を、ある表面上に固定化された抗CD3抗体に曝露し、かつT細胞表面上のアクセサリー分子を、抗CD3抗体と同じ表面上に固定化された抗CD28抗体で刺激し、その結果として該抗原特異的T細胞の拡大を誘導する段階。
【請求項２８】
抗原特異的T細胞が、T細胞をT細胞活性化マーカーに特異的な抗体と接触させることによって単離される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、抗CD25、抗CD54、抗CD69、抗CD38、抗CD45RO、抗CD62L、抗CD49d、抗CD40L、抗CD137、抗CD62L、および抗CD134からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
請求項1、14、19、27、または28のいずれか一項記載の方法に従って作製される抗原特異的T細胞の集団。
【請求項３１】
請求項30記載の抗原特異的T細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項３２】
哺乳動物に請求項31記載の組成物を投与する段階を含む、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法。
【請求項３３】
哺乳動物における癌細胞の存在を減少させる方法であって、その細胞を請求項31記載の組成物に曝露する段階を含む方法。
【請求項３４】
癌細胞が、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、食道癌、悪性脳腫瘍（brain cancer）、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、および慢性リンパ性白血病（CLL）からなる群より選択される癌に由来する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物に請求項31に記載の組成物を投与する段階を含む、哺乳動物における癌の発達を阻害する方法。
【請求項３６】
癌細胞が、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、食道癌、悪性脳腫瘍、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、および慢性リンパ性白血病（CLL）からなる群より選択される癌に由来する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物に請求項31記載の組成物を投与する段階を含む、哺乳動物における免疫応答機能不全を寛解させる方法。
【請求項３８】
哺乳動物に請求項31記載の組成物を投与する段階を含む、哺乳動物における感染性生物の存在を減少させる方法。
【請求項３９】
生物が、ウイルス、一本鎖RNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A型、B型またはC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、寄生虫、細菌、結核菌（M. tuberculosis）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、カンジダ（Candida）、アスペルギルス（Aspergillus）からなる群より選択される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物に請求項31記載の組成物を投与する段階を含む、哺乳動物における感染性疾患の発生を阻害する方法。
【請求項４１】
生物が、ウイルス、一本鎖RNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A型、B型またはC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、寄生虫、細菌、結核菌、ニューモシスチス・カリニ、カンジダ、アスペルギルスからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は概して抗原特異的T細胞を作製し、単離し、拡大する方法に関する。本発明は抗原特異的T細胞の組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
種々の癌および感染性疾患においてT細胞によって認識される抗原の同定は、抗原特異的免疫療法を使った悪性疾患および感染性疾患の処置に大きな関心が寄せられる一因となっている。抗原特異的T細胞を用いる養子療法は、意図する免疫応答の特異性、表現型および規模を操作する手段を用意することにより、概念的に魅力的な戦略になる。養子療法の臨床試験に使用するための抗原特異的T細胞クローンを日常的に再現性よく拡大する方法が望ましいと考えられる。治療量の抗原特異的T細胞を作製するための現在の技術はまだ不十分であり、注入されるT細胞の機能を維持し、あるいは改善しつつ、製造工程を単純化することによって、改善され得る。
【０００３】
ヒトT細胞の拡大に使用できる種々の技術は、主として、アクセサリー細胞（主として抗原提示細胞（APC））および/またはインターロイキン2（IL-2）などの外因性成長因子の使用に依拠してきた。IL-2は、T細胞増殖を刺激して主にT細胞のCD8＋亜集団を拡大するために、抗CD3抗体と一緒に使用されてきた。最適なT細胞活性化、拡大、および再注入時のT細胞の長期生存には、どちらのAPCシグナルも必要であると考えられる。アクセサリー細胞としてMHC適合APCが必要であることは長期培養系にとって重大な課題を提起する。なぜならAPCは比較的短寿命だからである。したがって長期培養系では、ある供給源からAPCを頻繁に取得し、補充しなければならない。アクセサリー細胞の継続可能な供給の必要性は、アクセサリー細胞が冒される免疫不全の処置にとっては問題になる。また、ウイルス感染を処置する場合は、もしアクセサリー細胞がウイルスを保因していれば、その細胞により、長期培養中にT細胞集団全体が汚染され得る。
【０００４】
さらに、同様の系は、抗原（例えば腫瘍/ウイルス抗原）によるワクチン接種、抗原による抗原提示細胞のパルス処理（pulsing）、次いで細胞の注入を必要とする。抗原特異的T細胞の拡大によって多数の抗原特異的T細胞を作製するには、しばしば、労働集約的で多額の費用を要するクローニング、かつ/または治療上妥当なT細胞数を得るために何ラウンドもの活性化/拡大が必要になる。
【０００５】
したがって当技術分野においては、養子療法の臨床試験に使用するための抗原特異的T細胞クローンを日常的に再現性よく拡大する改良された方法、および抗原特異的T細胞の機能を維持し、あるいは改善する単純化された工程が必要とされている。
【０００６】
本発明は、表面受容体およびサイトカイン産生特性を有する高応答性抗原特異的T細胞を数多く作製する方法であって、他の拡大法よりもはるかに望ましい方法を提供する。本発明は、特定抗原の知識を必要とせず（ただし本発明との関連で既知抗原を使用することはできる）、1ラウンドまたは2ラウンドの拡大により、CD4系統およびCD8系統の両方（所望であればどちらかを選択することもできる）の抗原特異的T細胞を治療上妥当な量で獲得することを可能にする。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は概して抗原特異的T細胞を活性化し、刺激し、単離する方法に関する。本発明は、抗原特異的T細胞の組成物、ならびに癌、感染性疾患、自己免疫疾患、加齢に関係する免疫機能不全、または抗原特異的T細胞が処置にとって望ましい他の疾患状態の処置および予防にそれらを使用する方法にも関する。
【０００８】
本発明の一局面では、抗原特異的T細胞の集団を拡大する方法であって、少なくともその一部が抗原特異的T細胞を含んでいる細胞集団を、第1薬剤および第2薬剤が取り付けられている表面と接触させることを含み、該第1薬剤は該T細胞上のCD3/TCR複合体をリガンド結合し、かつ該第2薬剤は該T細胞上のアクセサリー分子をリガンド結合し、該T細胞の該第1および第2薬剤によるリガンド結合は抗原特異的T細胞の増殖を誘導し、かつ該表面は1：2またはそれ以下の表面対T細胞比で存在する方法を提供する。一定の態様では、表面対T細胞の比が約1：1〜約1：50およびその間の任意の比である。一定の態様では、表面対T細胞の比が約1：2、1：2.5、1：5、1：10、1：25、1：50、1：75、1：100またはそれ以下である。ある態様では、表面に、常磁性ビーズ、脂質、および細胞表面が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一定の態様では、表面が、1つまたは複数の抗体に結合された常磁性ビーズを含む。一定の態様では、表面は、そこに結合された1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上の抗体または天然リガンドを有することができる。
【０００９】
本発明のもう1つの局面は、抗原特異的T細胞の作製方法であって、少なくともその一部が抗原提示細胞（APC）を含んでいる第1細胞集団を、抗原が取り付けられている表面に、抗原が取り付けられている該表面が該APCによって摂取されるように曝露すること、少なくともその一部がT細胞を含んでいる第2細胞集団を（a）の細胞集団に曝露し、その結果として抗原特異的T細胞を作製することを含む方法を提供する。抗原は、当技術分野において公知であり使用することができる本明細書に記載の様々な方法によって、表面に取り付けもしくはカップリングするか、または表面に統合することができる。ある態様では抗原を表面に架橋する。さらにもう一つの態様では、表面への取り付けが、共有結合によって、または非共有結合的な静電結合もしくは疎水結合によって行なわれ、例えば化学的手段、機械的手段、酵素的手段、静電的手段、または抗原が細胞を刺激する能力を有するような他の手段を含む種々の取り付け手段を使って達成することができる。例えば、まず、ある抗原に対する抗体を表面に取り付けるか、ビオチン化抗原に取り付けるための表面にアビジンまたはストレプトアビジンを表面に取り付けることができる。リガンドに対する抗体は抗イディオタイプ抗体を介して表面に取り付けることができる。もう一つの例は、表面に取り付けられたプロテインAもしくはプロテインG、または他の非特異的抗体結合分子を使って、抗体を結合することを含む。または、化学的手段によって、例えば市販されている架橋試薬（Pierce、イリノイ州ロックフォード）もしくは他の手段を使った表面への架橋などによって、抗原を表面に取り付けることもできる。一定の態様では、抗原を表面に共有結合する。さらに、ある態様では、市販されているトシル活性化DYNABEADS（商標）またはエポキシ表面反応性基を有するDYNABEADS（商標）を、関心対象のポリペプチド抗原と共に、製造者の指示に従ってインキュベートする。簡単に述べると、そのような条件には通例、pH4〜pH9.5のリン酸緩衝液での4〜37℃の温度におけるインキュベーションが含まれる。
【００１０】
ある態様では、APCが抗原特異的T細胞と直接接触する。さらにもう一つの態様では、抗原特異的T細胞と直接接触するAPCが、該APCを磁場に曝露することによって単離され、この場合、表面は常磁性、磁性、または磁化可能成分を含む。もう一つの態様では、抗原特異的T細胞が、ある表面に該T細胞を曝露することによって拡大され、該表面にはT細胞の第1T細胞表面部分をリガンド結合する第1薬剤が取り付けられており、同じ表面または第2表面には該T細胞の第2部分をリガンド結合する第2薬剤が取り付けられていて、第1および第2薬剤による該リガンド結合が、該抗原特異的T細胞の増殖（拡大）を誘導する。一定の態様では、少なくとも1つの薬剤が抗体または抗体断片である。別の態様では、第1薬剤が抗体またはその断片であり、第2薬剤が抗体またはその断片である。さらにもう一つの態様では、第1および第2薬剤が異なる抗体である。一定の態様では、第1薬剤が抗CD3抗体、抗CD2抗体、または抗CD3もしくは抗CD2抗体の抗体断片であり、第2薬剤が抗CD28抗体またはその抗体断片である。もう一つの態様では、第1薬剤が抗CD3抗体であり、第2薬剤が抗CD28抗体である。さらなる態様では、抗CD3抗体および抗CD28抗体が約1：1〜約1：100の比で存在する。さらにもう一つの態様では、抗原特異的T細胞が、該抗原特異的T細胞をフィトヘマグルチニン（PHA）、酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびイオノマイシン、リポ多糖（LPS）、ならびにスーパー抗原に曝露することによって拡大される。
【００１１】
さらにもう一つの態様では、本発明の抗原には、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、抗体/抗原複合体、全腫瘍またはウイルス感染細胞、固定された腫瘍またはウイルス感染細胞、加熱殺滅された腫瘍もしくはウイルス感染細胞、腫瘍溶解物、ウイルス溶解物、不溶性細胞残渣、アポトーシス小体、壊死細胞、分裂し続けることができないように処理された腫瘍または細胞株由来の全腫瘍細胞、分裂し続けることができないように処理された同種異系細胞、照射腫瘍細胞、照射同種異系細胞、天然または合成複合糖質、リポタンパク質、リポ多糖、形質転換された細胞または細胞株、トランスフェクトされた細胞または細胞株、形質導入された細胞または細胞株、およびウイルスに感染した細胞または細胞株が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一定の態様では、抗原は抗体/リガンド相互作用によって表面に取り付けられる。抗体/リガンド相互作用には、抗MART-1抗体/MART-1抗原、抗WT-1抗体/WT-1、抗PR1抗体/PR1、抗PR3抗体/PR3、抗チロシナーゼ抗体/チロシナーゼ抗原、抗MAGE-1抗体/MAGE-1抗原、抗MUC-1抗体/MUC-1抗原、抗α-フェトプロテイン抗体/α-フェトプロテイン抗原、抗Her2Neu抗体/Her2Neu、抗HIV gp120抗体/HIV gp120、抗インフルエンザHA抗体/インフルエンザHA、抗CMV pp65/CMV pp65、抗C型肝炎抗体/C型肝炎タンパク質、抗EBV EBNA 3B抗体/EBV EBNA 3B抗原、ならびに抗ヒトIg重鎖および軽鎖/骨髄腫癌患者由来のIg、ならびに抗ヒトIg重鎖および軽鎖/CLL癌患者由来のIgからなる群より選択される抗体/リガンド対間の相互作用が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一定の態様では、抗原は表面に化学的に取り付けられる。ある態様では、表面への抗原の取り付けが、ビオチン-アビジン相互作用を含む。さらにもう一つの態様では、少なくともその一部がAPCを含んでいる細胞集団が、白血球アフェレーシス産物、末梢血、リンパ節、扁桃腺、胸腺、組織生検、腫瘍、脾臓、骨髄、臍帯血、CD34＋細胞、単球、および接着細胞からなる群より選択される供給源に由来する。
【００１２】
本発明のもう一つの局面は、抗原特異的T細胞を作製し拡大する方法であって、少なくともその一部が抗原提示細胞を含んでいる第1細胞集団を、抗原に、該抗原が該APCによって取り込まれるように曝露すること、少なくともその一部がT細胞を含む第2細胞集団を（a）の細胞集団に曝露し、その結果として抗原特異的T細胞を作製すること、および（b）の該抗原特異的T細胞をある表面に曝露することを含み、該表面にはT細胞の第1T細胞表面部分をリガンド結合する第1薬剤が取り付けられており、同じ表面または第2表面には該T細胞の第2部分をリガンド結合する第2薬剤が取り付けられていて、第1および第2薬剤による該リガンド結合が、該抗原特異的T細胞の増殖（拡大）を誘導する方法を提供する。一定の態様では、少なくとも1つの薬剤が抗体または抗体断片である。別の態様では、第1薬剤が抗体またはその断片であり、第2薬剤が抗体またはその断片である。さらにもう一つの態様では、第1および第2薬剤が異なる抗体である。一定の態様では、第1薬剤が抗CD3抗体、抗CD2抗体、または抗CD3もしくは抗CD2抗体の抗体断片であり、第2薬剤が抗CD28抗体またはその抗体断片である。もう一つの態様では、第1薬剤が抗CD3抗体であり、第2薬剤が抗CD28抗体である。さらなる態様では、抗CD3抗体および抗CD28抗体が約1：1〜約1：100の比で存在する。ある態様では、抗原特異的T細胞が、該T細胞をT細胞活性化マーカーに特異的な抗体と接触させることによって単離される。もう一つの態様では、抗体が、抗CD25、抗CD54、抗CD69、抗CD38、抗CD45RO、抗CD49d、抗CD40L、抗CD137、抗CD62L、および抗CD134からなる群より選択される。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの局面は、本明細書に記載する方法のいずれか一つに従って作製される抗原特異的T細胞の集団を提供する。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの局面は、本明細書に記載する方法のいずれかに従う抗原特異的T細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物である。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの局面は、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法であって、その哺乳動物に本発明の抗原特異的T細胞を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明のもう一つの局面は、哺乳動物における癌細胞の存在を減少させる方法であって、抗原特異的T細胞を含む組成物に癌細胞を曝露することを含む方法を提供する。ある態様では、癌細胞が、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、食道癌、悪性脳腫瘍（brain cancer）、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、および慢性リンパ性白血病（CLL）からなる群より選択される癌に由来する。
【００１７】
本発明の一局面は、哺乳動物における癌の発達を阻害する方法であって、その哺乳動物に本発明の抗原特異的T細胞を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。一定の態様では、癌細胞が、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、食道癌、悪性脳腫瘍、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、および慢性リンパ性白血病（CLL）からなる群より選択される癌に由来する。
【００１８】
本発明のさらにもう一つの局面は、哺乳動物における免疫応答機能不全を寛解させる方法であって、その哺乳動物に、本明細書に記載する方法のいずれか一つを使って作製される抗原特異的T細胞を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらにもう一つの局面は、哺乳動物における感染性生物の存在を減少させる方法であって、その哺乳動物に、本明細書に記載する方法のいずれか一つを使って作製される抗原特異的T細胞を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。この場合、感染性生物には、ウイルス、一本鎖RNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A型、B型またはC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、寄生虫、細菌、結核菌（M. tuberculosis）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、カンジダ（Candida）、アスペルギルス（Aspergillus）を含めることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
本発明のもう一つの局面は、哺乳動物における感染性疾患の発生を阻害する方法であって、その哺乳動物に、本明細書に記載する方法のいずれか一つを使って作製される抗原特異的T細胞を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。これに関して、感染性疾患は、ウイルス、RNAウイルス、DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A型、B型またはC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、寄生虫、細菌、結核菌、ニューモシスチス・カリニ、カンジダ、アスペルギルスを含む（ただしこれらに限定されない）感染性生物によって引き起こされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】磁気分離後の抗原特異的T細胞とビーズ負荷抗原提示細胞（APC）細胞との強固な会合を示す写真である。
【図２】エクスビボで拡大した再刺激メモリーCD8 CMVテトラマー+T細胞におけるCD25のアップレギューレションを示す図である。パネルAは、HLA-A2+,CMV-ドナー由来の陰性対照である。パネルBは、HLA-A2+,CMV+ドナー由来の、非被覆ビーズ刺激を示す陰性対照である。パネルCは、HLA-A2+,CMV+ドナー由来の細胞のCMV抗原被覆ビーズ刺激を示す。
【図３】様々なビーズ：細胞比がCMV特異的T細胞の拡大または欠失に及ぼす影響を示す図である。
【図４】パネルAおよびパネルBは、培養中の様々な時点において様々なビーズ：細胞比で行なった逐次的ビーズ添加がT細胞拡大に及ぼす影響を示す棒グラフである。パネルAは、標準静置培養（0日目に1：2.5もしくは1：5のビーズ対細胞比でビーズ）または5日目、7日目、もしくは9日目に1：10、1：25、1：50もしくは1：100のビーズ対細胞比で加えられた追加ビーズを比較した、15日間での総T細胞拡大の比較を表す。パネルBは、パネルAと同じ実験条件でのCMV特異的T細胞拡大を表す。
【図５】メラノーマgp100(M)特異的T細胞において低いビーズ：T細胞比および逐次的ビーズ添加がT細胞拡大に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】様々な比の抗CD3：CD28抗体が取り付けられている抗CD3および抗CD28同時固定化ビーズによる刺激後の経時的なT細胞の増加倍率を表すグラフである。
【図７】様々な比の抗CD3：CD28抗体が取り付けられている抗CD3および抗CD28同時固定化ビーズによる刺激後の経時的なCMVpp65特異的T細胞の増加倍率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明を説明する前に、以下に使用する一定の用語の定義を記載しておくことは、その理解に役立つと思われる。
【００２３】
本明細書において使用する「生体適合性」という用語は、生細胞に対してほとんど無毒性であるという性質を指す。
【００２４】
本明細書において使用する「刺激」という用語は、細胞表面部分のリガンド結合によって誘導される一次応答を指す。例えば受容体に関する場合、そのような刺激は、受容体のリガンド結合およびそれに続くシグナル伝達事象を伴う。T細胞の刺激については、そのような刺激は、T細胞表面部分のリガンド結合を指し、ある態様ではそれが引き続いてシグナル伝達事象、例えばTCR/CD3複合体の結合を誘導する。さらに、刺激事象は細胞を活性化し、分子の発現または分泌をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることがある（例えばTGF-βのダウンレギュレーション）。したがって細胞表面部分のリガンド結合は、たとえ直接的なシグナル伝達がなくても、細胞骨格構造の再編成をもたらすか、細胞表面部分の合体をもたらし、そのそれぞれが、続いて起こる細胞応答を促進、一部変更（modify）、または変化させるように働き得る。
【００２５】
本明細書において使用する「活性化」という用語は、顕著な生化学的または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分リガンド結合後の細胞の状態を指す。T細胞に関する場合、そのような活性化は、細胞増殖を誘導するほど十分な刺激を受けているT細胞の状態を指す。T細胞の活性化はサイトカイン産生および調節機能または細胞溶解性エフェクター機能の遂行も誘導し得る。他の細胞に関する場合、この用語は、特定の物理化学的過程のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味する。
【００２６】
本明細書において使用する「標的細胞」という用語は、細胞表面部分リガンド連結によって刺激しようと考えている任意の細胞を指す。
【００２７】
本明細書にいう「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、霊長類化（例えばヒト化）抗体、ネズミ抗体、マウス-ヒト抗体、マウス-霊長類抗体、ならびにキメラ抗体を包含し、完全な分子、その断片（scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'およびF(ab)'2断片など）、または完全な分子および/もしくは断片の多量体もしくは凝集体であってよく、天然に存在するか、免疫処置、合成または遺伝子操作などによって製造することができる。また、本明細書にいう「抗体断片」とは、抗原を結合する、抗体に由来または抗体に関係する断片を指し、一部の態様では、例えばガラクトース残基を組み入れることなどにより、クリアランスおよび取り込みを容易にする構造上の特徴を示すように誘導体化することもできる。これには、例えばF(ab)、F(ab)'2、scFv、軽鎖可変領域（VL）、重鎖可変領域（VH）、およびそれらの組合せが含まれる。
【００２８】
本明細書において使用する「タンパク質」という用語は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを包含し、完全な分子、その断片、または完全な分子および/もしくは断片の多量体もしくは凝集体であることができ、天然に存在するか、例えば合成（化学的合成および/または酵素的合成を含む）または遺伝子操作などによって製造することができる。
【００２９】
本明細書において使用する「薬剤」「リガンド」または「細胞表面部分を結合する薬剤」という用語は、所定の細胞集団に結合する分子を指す。薬剤は、受容体、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位など、任意の細胞表面部分を結合し得る。薬剤は、タンパク質、ペプチド、抗体およびその抗体断片、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば小分子）などであることができる。本明細書においては、T細胞刺激に関して、そのような薬剤の原型的な例として抗体を使用する。
【００３０】
本明細書において使用する「細胞表面部分を結合する薬剤」および「細胞表面部分」という用語は、リガンド/抗リガンド対との関連で使用される。したがってこれらの分子は、一般に親和性が比較的高い特異的結合（約106M-1またはそれより強固な親和性定数Ka）を示す相補/抗相補分子セットと考えるべきである。
【００３１】
本明細書にいう「抗原提示細胞（APC）」とは、抗原に対するナイーブおよび/またはメモリーT細胞の応答を通常開始する細胞を指す。この点で、APCは抗原提示能力を有する任意の細胞を指す。APCには、樹状細胞、単球、マクロファージ、およびB細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。APCは高レベルのMHCクラスII、ICAM-1およびB7-2を発現させ得る。
【００３２】
本明細書にいう「共刺激シグナル」とは、TCR/CD3リガンド結合などの一次シグナルと共同してT細胞増殖をもたらすシグナルを指す。
【００３３】
本明細書にいう「リガンド/抗リガンド対」とは、一般に親和性が比較的高い特異的結合（少なくとも約106M-1の親和性定数Ka）を示す相補/抗相補分子セットを指す。この親和性が単なる例示であり、本発明との関連で有用なリガンド/抗リガンド対の親和性定数はこれより低いかもしれないし、場合によってはこれより高いかもしれないことは、当業者には理解されると思われる。例えばビオチン/ストレプトアビジンの場合、ストレプトアビジン会合速度はアビジン単量体の会合速度と同等であるのに対して、その解離速度は7分の1である。解離乗数は1.3×10-8Mと決定された。例示的なリガンド/抗リガンド対は、酵素/阻害剤、ハプテン/抗体、レクチン/糖質、リガンド/受容体、およびビオチン/アビジンまたはストレプトアビジンである。本発明明細書においては、受容体および他の細胞表面部分は抗リガンドであり、一方、それと反応する薬剤（例えば抗体および抗体断片）はリガンドとみなされる。
【００３４】
本明細書にいう「分離」には、（例えば濾過、磁気吸引などによって）ある成分を別の成分から実質的に精製する任意の手段が包含される。
【００３５】
本明細書にいう「静止」とは、細胞が活発に増殖していない細胞状態を指す。
【００３６】
本明細書にいう「表面」とは、そこに薬剤を取り付けておくことができる任意の表面を指し、金属、ガラス、プラスチック、コポリマー、コロイド、脂質、細胞表面などを包含するが、これらに限定されるわけではない。本質的に薬剤をそこに結合された状態または取り付けられた状態で保つ能力を有する任意の表面。本明細書において使用する表面の原型的例は、ビーズなどの粒子である。したがって、「表面」および「粒子」という用語は、本明細書においては交換可能に用いられる。
【００３７】
本明細書にいう「免疫応答または応答性」とは、特定の細胞の特定のエフェクター機能が誘導されるような、T細胞を含む（ただしこれに限定されない）免疫系の細胞の活性化を指す。エフェクター機能には、増殖、サイトカインの産生、抗体の分泌、調節および/または接着分子の発現、ならびに細胞溶解を誘導する能力が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
【００３８】
本明細書にいう「免疫応答を刺激する」とは、免疫系の細胞のエフェクター機能の活性化および誘導が達成されるような、任意の刺激を指す。
【００３９】
本明細書にいう「免疫応答機能不全」とは、免疫系の細胞の不適切な活性化および/もしくは増殖またはその欠如、および/またはサイトカインの不適切な分泌もしくはその欠如、および/または免疫系の細胞の他のエフェクター機能、例えば調節、接着、および/またはホーミング受容体の発現、ならびに細胞溶解の誘導などの不適切もしくは不十分な誘導を指す。
【００４０】
本明細書において使用する「癌または癌細胞の発達を予防または阻害する」という用語は、癌の発生が予防されることまたは癌の発症が遅延されることを指す。
【００４１】
本明細書において使用する「処置する」または「癌または癌細胞の存在を減少させる」という用語は、癌成長が阻害されることを意味し、これは腫瘍体積または悪性細胞数に反映される。腫瘍体積は様々な公知の手法によって、例えばダイヤルキャリパーで2つの寸法測定値を得ることなどによって、決定することができる
【００４２】
本発明にいう「感染性疾患の発生を予防または阻害する」とは、感染性疾患の発生を予防するか、感染性疾患の発症を遅延させるか、既存の感染の伝播を反転させることを意味する。
【００４３】
本明細書にいう「寛解させる」とは、より良くすること、改善すること（「The American Heritage College Dictionary」第3版,Houghton Mifflin Company,2000）と定義される。
【００４４】
本明細書にいう「粒子」は、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ビーズなどを包含し得る。ビーズまたは他の粒子などの市販されている表面は、様々な態様で有用である（例えばMiltenyi Particles（Miltenyi Biotec、ドイツ）、Sepharoseビーズ（Pharmacia Fine Chemicals、スウェーデン）、DYNABEADS（商標）（Dynal Inc.、ノルウェイ・オスロ）、PURABEADS（商標）（Prometic Biosciences）、Immunicon（ペンシルベニア州ハンティンドンバレイ）の磁気ビーズ、Bangs Laboratories,Inc.（インディアナ州フィッシャーズ）のミクロスフェアなど）。
【００４５】
本明細書にいう「常磁性粒子」とは、上に定義した粒子であって、磁場に呼応して局在化するものを指す。
【００４６】
本明細書にいう「抗原」とは、1）mAbまたはその誘導体の「イディオタイプ」部分（抗原結合領域）により、全体としてまたはその断片を、特異的に認識され、結合される能力を持ち、2）MHCによって結合されることができ、その上で、MHC提示との関連では、そのコグネイトT細胞抗原受容体を特異的に結合することができるペプチド配列を含有する、任意の分子を指す。
【００４７】
本明細書において、APCに抗原を「負荷する」とは、APCが抗原を取り込み、加工し、MHC分子によって結合した抗原をT細胞に提示するのに十分な期間にわたって、APCを抗原または抗原ペプチドに曝露することを指す。場合によっては、抗原、特にペプチドは、APCによる取り込みと加工を受けることなく、MHC分子に結合されて、T細胞に提示され得る。
【００４８】
本明細書において使用する「動物」または「哺乳動物」という用語は、ヒトを含む全ての哺乳動物を包含する。好ましくは本発明の動物はヒト対象である。
【００４９】
本明細書において使用する「曝露する」という用語は、ごく接近しているか直接接している状態または状況にすることを指す。
【００５０】
本明細書において使用する「溶解物」という用語は、細胞の溶解によって生じる上清および不溶性細胞残渣を指す。当技術分野において公知である数多くの溶解緩衝液を使用できることは、当業者には認識されると思われる（例えば「Current Protocols in Immunology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）参照）。細胞溶解は凍結融解法または他の手段（例えば超音波処理など）によって行なうこともできる。
【００５１】
本明細書において使用する「アポトーシス小体」という用語は、アポトーシス細胞から生じる、小さくなった完全な膜結合断片と定義される。
【００５２】
本明細書において使用する「増殖」という用語は、新しい細胞を産生することによる成長または倍増を意味する。
【００５３】
本明細書において使用する「感染性疾患」という用語は、感染性生物によって引き起こされる任意の疾患を指す。感染性生物は、ウイルス（例えばRNAウイルス、DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A、BおよびC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、ヒトパピローマウイルス（HPV））、寄生虫（例えば、プラスモディウム属（Plasmodia）、リーシュマニア属（Leishmania）、住血吸虫属（Schistosoma）、トリパノソーマ属（Trypanosoma）などの原生動物および後生動物病原体）、細菌（例えばマイコバクテリア（Mycobacteria）、特に結核菌、サルモネラ（Salmonella）、レンサ球菌（Streptococci）、大腸菌（E. coli）、ブドウ球菌（Staphylococci））、真菌（例えばカンジダ属、アスペルギルス属）、ニューモシスチス・カリニ、およびプリオン（公知のプリオンは動物に感染して、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレイピー、ならびにウシ海綿状脳症（BSE）、すなわち「狂牛病」、およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こす）。ヒトを冒すことが知られている4つのプリオン病は、（1）クールー病、（2）クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、（3）ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病（GSS）、および（4）致死性家族性不眠症（FFI）である）を含み得る。本明細書にいう「プリオン」には、使用する任意の動物、特にヒトおよび飼育された家畜において、これらの疾患または他の疾患の全部またはいずれかを引き起こす、あらゆる形態のプリオンが包含される。
【００５４】
T細胞源
T細胞は、末梢血単核球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、腸管関連リンパ節組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または他の任意のリンパ組織、および腫瘍を含む、数多くの供給源から得ることができる。T細胞はT細胞株から得ることができ、自己または同種異系の供給源から得ることができる。T細胞は異種供給源から、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタから得ることもできる。
【００５５】
好ましくは、個体の循環血に由来する細胞を、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得る。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。ある態様では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄することにより、血漿画分を除去し、以後の加工段階に適した緩衝液または培地中に細胞を置くことができる。本発明の一態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。別の態様では、洗浄溶液がカルシウムを欠き、さらにマグネシウムを欠くか、全てのとは言わないまでも多くの二価カチオンを欠いてもよい。当業者にはすぐに理解されると思われるが、洗浄段階は、当業者に公知の方法によって、例えば半自動「フロースルー」カートリッジ（例えばCobe 2991セルプロセッサー、Baxter）を製造者の指示に従って使用することなどによって、達成することができる。洗浄後は、細胞を、例えばCa＋＋/Mg＋＋非含有PBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁することができる。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁することもできる。
【００５６】
もう一つの態様では、赤血球を溶解し、PERCOLL（商標）勾配を通して遠心分離することによって、T細胞を末梢血リンパ球から単離する。CD28＋、CD4＋、CD8＋、CD45RA＋、およびCD45RO＋T細胞などのT細胞の亜集団を、陽性または陰性選択技術により、さらに単離することができる。例えば、CD3＋,CD28＋T細胞は、CD3/CD28結合磁気ビーズ（例えばDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を使って、陽性選択することができる。本発明の一局面では、陰性選択によるT細胞集団の濃縮を、陰性選択される細胞にユニークな表面マーカーに対する抗体の組合せを使って達成することができる。好ましい方法は、陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁気免疫接着法またはフローサイトメトリーによる細胞選別および/または選択である。例えば、陰性選択によってCD4＋細胞を濃縮する場合、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。
【００５７】
刺激用のT細胞を調製するもう一つの方法は、洗浄段階後に細胞を凍結することであり、この方法は単球除去段階を必要としない。理論に束縛されることは望まないが、凍結およびその後の融解段階は、細胞集団中の顆粒球と、ある程度までは単球とを除去することにより、より均一な産物をもたらす。血漿および血小板を除去する洗浄段階後に、細胞を凍結溶液に懸濁することができる。当技術分野においては数多くの凍結溶液および凍結パラメータが公知であるが、ある方法では、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結培地を使用する。次に、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるように、これを培地で1：1に希釈する。次に、毎分1゜の速度で細胞を−80℃まで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存する。
【００５８】
抗原提示細胞（APC）源
抗原提示細胞（APC）源は、典型的には、抗原を負荷しかつ/または必要なサイトカインもしくは因子で処理した時に、インビトロで増殖し、プロフェッショナルAPC（pAPC）に成熟する能力を有するAPC前駆体またはAPCを含む組織供給源である。本明細書にいう「プロフェッショナルAPC」（pAPC）または「抗原提示細胞」（APC）は、抗原に対するナイーブおよび/またはメモリーT細胞の応答を通常開始する細胞を指す。プロフェッショナルAPCには、DC、マクロファージ、およびB細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。pAPCは高レベルのMHCクラスII、ICMA-1およびB7-2を発現させ得る。ある局面では、APC前駆細胞が、インビトロで増殖し、樹状細胞（DC）に成熟する能力を有する。多くの組織供給源を使用し得るが、典型的な組織供給源は、脾臓、胸腺、組織生検、腫瘍、輸入リンパ、リンパ節、骨髄、アフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物、および/または末梢血を含む。一定の態様では、アフェレーシス産物、骨髄および末梢血が好ましい供給源である。胎児組織、胎児または臍帯血も成長因子に富み、やはりAPCおよび/または前駆APCを得るための血液源として使用することができる。例示的な前駆細胞として、胚性幹細胞、CD34＋細胞、単球幹細胞、単球、およびプレB細胞先祖細胞を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
さらに、本発明の一局面によれば、APCを、単球またはCD34＋細胞を含む前駆細胞から導くことができる。
【００６０】
本発明の一局面では、APC源および/または前駆APC源が、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物である。当技術分野において公知のアフェレーシス法を使って、細胞を収集する。例えばBishop et al.,Blood,vol.83,No.2,pp.610-616（1994）を参照されたい。簡単に述べると、通常の装置、例えばHaemonetics Model V50アフェレーシス装置（Haemonetics、マサチューセッツ州ブレーントリー）を使って、細胞を収集する。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。ある態様では、アフェレーシスによって収集した細胞を洗浄することにより、血漿画分を除去し、以後の加工段階に適した緩衝液または培地中に細胞を置くことができる。本発明のもう一つの態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。別の態様では、洗浄溶液がカルシウムを欠き、さらにマグネシウムを欠くか、全てのとは言わないまでも多くの二価カチオンを欠く。当業者にはすぐに理解されると思われるが、洗浄段階は、当業者に公知の方法によって、例えば半自動「フロースルー」カートリッジ（例えばCobe 2991セルプロセッサー、Gambro BCT、コロラド州レイクウッド）を製造者の指示に従って使用することなどによって、達成することができる。洗浄後は、細胞を、例えばCa非含有Mg非含有PBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁することができる。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁することもできる。
【００６１】
APC源として血液を使用する場合は、血液白血球を、その生存能力を維持する通常の方法を使って取得することができる。本発明の一局面によれば、ヘパリン（約100U/ml）または他の適切な抗凝固剤を含んでも含まなくてもよい培地（好ましくはRPMI）に、血液を希釈する。培地に対する血液の体積は約1：1である。血液を培地中、約1000rpm（150g）、4℃で遠心分離することによって、細胞を濃縮する。赤血球を溶解することが当技術分野において知られている数多くの溶液、例えば塩化アンモニウム中に、細胞を再懸濁することにより、血小板および赤血球を枯渇させる。例えば、その混合物は、体積比約1：1の培地および塩化アンモニウム（最終濃度約0.839パーセント）であることができる。細胞を遠心分離によって濃縮し、所望の溶液中で、血小板および赤血球を実質的に含まない白血球の集団が得られるまで、典型的には約2回、洗浄することができる。組織培養によく用いられる等張液は、どれでも、血液白血球を血小板および赤血球から分離するための培地として使用することができる。そのような等張液の例は、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩類溶液、または例えばRPMI 1640、DMEM、MEM、HAMS F12、X-Vivo15、またはX-Vivo20などを含む完全増殖培地である。APCおよび/またはAPC前駆細胞は、エルトリエーションにより、例えばJ5.0ロータおよび40mlエルトリエーションチャンバを装着したBeckman J6ME遠心機を使って、精製することもできる。
【００６２】
本発明の一態様では、フィコール処理した全血またはアフェレーシス処理した末梢血を、1種類または複数の無関係な常磁性粒子または非抗体結合常磁性粒子（1バッチ分の細胞（典型的には約5×108〜約2×1O10個の細胞）に対して約1バイアル分のビーズまたは4×1O9個のビーズ）と共に、約30分〜2時間にわたって22〜37℃でプレインキュべ一トした後、常磁性粒子に付着している細胞または常磁性粒子を包み込んでいる細胞を磁気的に除去することによって、APCおよび/または前駆APCの単離が行なわれる。そのような分離は、当技術分野において使用可能な標準的方法を使って行なうことができる。例えば、任意の磁気分離手法を使用することができ、これには様々なものが市販されている（例えばDYNAL（登録商標）Magnetic Particle Concentrator（DYNAL MPC（登録商標）））。単離の確実さは、例えば該単離の前後にフローサイトメトリー解析を行なうなど、当業者に公知の様々な手法によって監視することができる。
【００６３】
組織供給源の処理によって得たAPCは、適切な培養容器で適切な培地中に初代培養物を形成させるために培養することができる。一定の態様では、培地に1つまたは複数のサイトカインを補足する。本発明によれば、適切な培養容器または培養槽は、組織培養適合性表面を有する任意の容器であることができる。その例には、種々のバッグ（例えばLifecell培養バッグ）、フラスコ、ローラーボトル、ぺトリ皿および組織培養用に製造されたマルチウェルプレートなどがある。細胞接着を促進するために、コラーゲンもしくはポリ-L-リジンなどの物質、または特定の細胞タイプに特異的な抗体で処理された表面プレートも、それらが後述する細胞の差示的な付着が可能な限り、使用することができる。表面は、例えばイオン化などにより、化学的に処理することもできる。細胞は約1O5〜1O7細胞/cm2の初期細胞密度でプレーティングされる。ある局面では、細胞を106細胞/cm2の密度でプレーティングする。
【００６４】
ある態様では、選択した組織供給源に由来する初代培養物を、細胞集団が非接着細胞の分離が可能なほど十分に培養器に接着するまで、標準的な湿度、C02、およびpHの組織培養条件下、約37℃でインキュべートする。血中の一部の未成熟APC、特に未成熟DCは、単球とは対照的に、最初はプラスチックに接着しないので、前駆体は終夜培養後に分離することができる。単球および線維芽細胞は接着細胞の大半を占めると考えられ、通常は約30分〜約24時間以内に培養器に接着する。一定の局面では、非接着細胞が約1〜16時間の間に接着細胞から分離される。非接着細胞は約1〜2時間の時点で分離することができる。著しい量の接着細胞を取り除かない方法であれば、どの方法でも、接着細胞を非接着細胞から分離するために使用することができる。一定の局面では、単に振とうまたはピペッティングすることによって、細胞が取り除かれる。ピペッティングは最も好ましい。
【００６５】
本発明の方法に従って単離された前駆APC（例えば単球）を含む接着細胞は、細胞集団未成熟APC期に到達するまで、標準的な湿度、C02、およびpHの組織培養条件下、約37℃でインキュべートされる。一定の局面では、本発明に従い、接着細胞を4時間〜7日間にわたってインキュべートする。しかし、インキュべーションの時間および条件が変動し得ることは、当業者にはすぐに理解されると思われる。本明細書にいう「未成熟APC」とは、APCの中間的分化状態を指し、この状態では、APCが抗原、異物、壊死および/またはアポトーシスを起こしている組織および/または細胞をエンドサイト一シスまたは貧食する能力を有する。未成熟APCは前駆細胞の起源に依存してCD14-またはCD14＋であり得る。未成熟APCはCD1a、CD40、CD86、CD54、および中間レベルのMHCクラスIIも発現し得る（試料細胞上のマ一カー発現のレベルはフローサイトメトリー解析により、MHCクラスII陰性細胞および高レベルのMHCクラスIIを発現させることがわかっている細胞と比較することができる）。未成熟APCは典型的にはCCR7を発現させない。
【００６６】
本発明の一定の局面では、T細胞をAPCから分離する必要がない。例えばある態様では、APCおよびT細胞を含むPBMCを、本明細書に記載するように、抗原に曝露することができ、その結果得られた抗原特異的T細胞を、本明細書に記載するように、さらに拡大することができる。
【００６７】
本発明の一定の局面では、本明細書に記載のAPCまたはT細胞が自己供給源に由来する必要がない。したがってAPCおよびT細胞は一致ドナ一もしくは不一致ドナ一から得ることができ、または細胞株、T細胞株、もしくはインビトロで成長する他の細胞から得ることができる。ハプロタイプを一致させる方法は当技術分野においては公知である。さらに、APCおよびT細胞またはそこから得られる上清を異種供給源から得ることもでき、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタ細胞などを使用することができる。
【００６８】
抗原源
本発明によれば、抗原源は、糖タンパク質を含むタンパク質、ぺプチド（オーバーラップぺプチドのプールを含む）、スーパー抗原（例えばSEA、SEB、TSST-1）、抗体/抗原複合体、腫瘍溶解物、ウイルス溶解物（例えばCMV溶解物など）、不溶性細胞残渣、アポトーシス小体、壊死細胞、全細胞（生きているもの、固定されたもの、照射されたもの、加熱殺滅されたもの、または他の操作を受けたもの）、分裂し続けることができないように処理された腫瘍または細胞株から得た全腫瘍細胞、分裂し続けることができないように処理された同種異系細胞、照射腫瘍細胞、照射同種異系細胞、天然または合成複合糖質、リボタンパク質、リポ多糖、RNAまたは該RNAの翻訳産物、およびDNAまたは該DNAがコードするポリぺプチドであることができるが、これらに限定されるわけではない。非形質転換細胞は、典型的には、約3000〜3600ラド、より好ましくは約3300ラドのγ線で照射される。リンパ芽球腫または腫瘍細胞株は、典型的には、約6000〜10,000ラド、より好ましくは約8000ラドのγ線で照射される。壊死細胞およびアポトーシス細胞は、物理的、化学的、または生物学的手段によって、作製することができる。壊死細胞は、典型的には、凍結融解によって作製され、一方、アポトーシス細胞は、UV照射を使って作製される。UV照射およびγ照射、ならびに凍結融解法は、当技術分野において周知であり、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」または「Current Protocols in Immunology（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）などに記載されている。
【００６９】
抗原源は、非形質転換、形質転換、トランスフェクト、または形質導入細胞または細胞株も含み得る。細胞は、組換え抗原を発現させるために使用し得る当業者に公知の様々な発現べクターまたはレトロウイルスベクターのいずれかを使って、形質転換、トランスフェクト、または形質導入することができる。発現は、組換え抗原をコードするDNA分子を含有する発現ベクターまたはレトロウイルスベクターで形質転換、トランスフェクト、または形質導入された任意の適切な宿主細胞中で達成することもできる。例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）または市販されている数多くのキット（例えばInvitrogen Life Technologies、カリフオルニア州カールズバッド）に略述されているものなど、当業者に公知の数多くのトランスフェクション、形質転換、および形質導入プロトコールを使用することができる。本発明の一態様では、組換えワクシニアべクターおよび該ワクシニアベクターに感染させた細胞を、抗原源として使用することができる。組換え抗原は、以下に述べる数多くの定義された腫瘍抗原を含み得る。
【００７０】
一定の本発明方法によれば、抗原は、CMV pp65、HIV pg120などのウイルス抗原を含み得る。一定の態様では、抗原は、例えばメラノーマ抗原Melan-A（T細胞によって認識されるメラノーマ抗原（melanoma antigen recognized by T ce11s）またはMART-1とも呼ばれる）、メラノーマ抗原コード遺伝子1、2、および3（MAGE-1、-2、-3）、メラノーマGP100、癌胎児性抗原（CEA）、乳癌抗原、Her-2/Neu、血清前立腺特異抗原（PSA）、ウィルムス腫瘍（WT-1）、PR1、PR3（慢性骨髄性白血病における宿主対自血病（GVL）効果に関係する抗原）、ムチン抗原MUC-1、-2、-3、-4、B細胞リンパ腫イディオタイプなどの定義された腫瘍抗原を含み得る。どの腫瘍抗原でも本発明との関連で有用であると、当業者には理解されると思われる。
【００７１】
抗原特異的T細胞の活性化
本発明の一局面は、異なるビーズ：細胞比を用いることが、抗原特異的T細胞の拡大に関して異なる結果につながり得るという驚くべき発見に由来する。特に、ビーズ：細胞比を変化させることにより、抗原特異的（メモリー）T細胞を選択的に拡大または欠失させることができる。ある態様では、使用する特定のビーズ：細胞比により、抗原特異的T細胞が選択的に拡大される。したがって、本発明の一態様では、少なくともその一部がT細胞（例えば、ある個体から得た白血球アフェレ一シス産物、血液試料、腫瘍生検など）を含んでいる細胞集団を、ある表面と直接接触させることによって、抗原特異的T細胞が活性され、この場合、該表面にはT細胞の第1T細胞表面部分をリガンド結合する第1薬剤が取り付けられており、同じ表面または第2表面に該T細胞の第2部分をリガンド結合する第2薬剤が取り付けられていて、第1および第2薬剤による該リガンド結合が、細胞集団内に存在する抗原特異的T細胞の増殖（拡大）を誘導する。
【００７２】
理論にこだわるわけではないが、抗原特異的T細胞はさらなる刺激に対して感作されると考えられる。したがって鍵はT細胞活性化シグナルの強さであると思われる。すなわち、メモリーT細胞（抗原特異的T細胞）の選択的拡大は「弱い」シグナルで起こり、一方、メモリーT細胞の選択的欠失は「強い」シグナルで起こる。リガンドによって結合されるCD3/TCR（およびCD28）受容体の量が、シグナル強度を決定する、したがって、高いビーズ：細胞比による刺激は高濃度の刺激抗体（すなわち「強いシグナル」）を与えて、抗原特異的T細胞の過剰刺激をもたらし、それが、アポトーシスまたは他の機序によって、それらを死なせる。低いビーズ：細胞比を用いると、抗原特異的T細胞に対して、過剰に刺激するのではなく、むしろこれらの細胞の迅速な増殖を誘導するような刺激シグナルが与えられる。
【００７３】
本発明の一態様では、上述のように単離したT細胞を、抗原を負荷したAPCと共に培養することによって、抗原特異的T細胞が活性化される。
【００７４】
もう一つの態様では、適切なAPCを培養皿にプレーティングし、本明細書に記載の抗原源に、抗原がAPCを結合しかつ/またはAPCによって取り込まれるのに十分な量でかつ十分な時間にわたって曝露する。一定の局面では、抗原を、24時間〜4日間にわたってAPCに曝露する。ある特定態様では、抗原を36時間、48時間、または72時間にわたってAPCに曝露する。さらにもう一つの態様では、抗原を2.5日間、3日間、3.5日間、または4日間にわたってAPCに曝露する。一定の態様では、抗原を、4日間より長い期間にわたって、例えば4.5日間、5日間、5.5日間、6日間、6.5日間、7日間、7.5日間、8日間、8.5日間、9日間、9.5日間、または10日間にわたって、APCに曝露することができる。結合およびAPCによる取り込みを達成するのに必要な量および時間は、抗原の供給源およびタイプに依存して異なる場合があり、当業者は免疫アッセイまたは結合アッセイによってそれを決定することができる。当業者に公知の他の方法も、抗原への曝露後にAPC上のMHCとの関連で抗原の存在を検出するために使用することができる。
【００７５】
さらにもう一つの態様では、対象由来のPBMC（例えば血液、白血球アフェレーシス産物などから得たもの）を、本明細書に記載する抗原の存在下で直接培養することにより、APCに抗原を負荷し、かつPBMC中に存在する抗原特異的T細胞を活性化/刺激する。これに関して、PBMCを個体から収集し、関心対象の抗原、例えば腫瘍抗原、またはウイルス溶解物などと接触させることができる。このようにして、PBMC中に存在するAPCには抗原が負荷され、次にそれが試料中に存在するT細胞に提示される。さらにもう一つの態様では、本発明の抗原特異的T細胞を、ぺプチド-MHCテトラマーで刺激することもできる。例えばAltman et al.,Science 1998 Jun19;280(5371):1821などを参照されたい。
【００７６】
本発明のAPCには遺伝子改変によって抗原を負荷することができる。遺伝子改変は、当技術分野において公知の数多くの技術、例えばエレクトロポレーション（例えばGene Pulser II（BioRad、カリフォルニア州リッチモンド）を使用するもの）、種々のカチオン脂質（LIPOFECTAMINE（商標）、Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）、または他の技術、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）に記載のリン酸カルシウムトランスフェクションなどを使ったRNAまたはDNAトランスフェクションを含み得る。例えば、Opti-MEM 500μl中のRNAまたはDNA 5〜50μgを、10〜100μgの濃度のカチオン脂質と混合し、室温で20〜30分間インキュべートすることができる。他の好適な脂質には、LIPOFECTIN（商標）、LIPOFECTAMINE（商標）が含まれる。次に、その結果得られた核酸-脂質複合体を、総液量約2ml中（例えば0pti-MEM中）の1〜3×106個の細胞、好ましくは2×106個の抗原提示細胞に加え、37℃で2〜4時間インキュべ一トする。APCは、後述のウイルス形質導入法を使って形質導入することもできる。
【００７７】
本発明のもう一つの態様では、ビーズなどの粒子にとりつけるか、コーティングするか、または他の方法で固定化した抗原を、APCに負荷する。例えばMiltenyi Particles（Miltenyi Biotec、ドイツ）、Sepharoseビーズ（Pharmacia Fine Chemicals、スウェーデン）、DYNABEADS（商標）（Dynal Inc．、ニューヨーク）など、市販されているビーズまたは他の粒子は、様々な態様で役立つ。一定の態様では、常磁性粒子または常磁性ビーズが特に好適である。そのような常磁性ビーズまたは常磁性粒子は市販されており、例えばDynal ASがDynabeads（商標）という商標名で販売しているものなどがある。これに関連して例示的なDynabeads（商標）はM-280、M-450、およびM-500である。ある態様では、全細胞（生きているもの、固定されたもの、照射されたもの、加熱殺滅されたもの、または他の操作を受けたもの）を、摂取可能なビーズに、例えば抗体/リガンド特異的手段または化学的手段によって固定化する。同様に、腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞溶解物、または抗原調製物を、ビーズ（これは常磁性であるか、または他の方法で選択可能であることができる）に取り付けるか、他の方法で固定化することもできる。これらの被覆ビーズまたは抗原/細胞/溶解物結合ビーズは、ヒトまたは他の動物の末梢血調製物（または何パーセントかの抗原提示細胞（特に粒子を摂取した後、その粒子に付随する抗原を加工し、提示することができるもの）を含有する他の組成物）と混合することができる。貪食細胞はビーズ/粒子を摂取し、粒子に付随する抗原を加工し、細胞混合物中のT細胞にそれらを提示すると考えられる。本明細書の他の項で述べるように、提示された抗原に対する特異性を有するT細胞だけが、APCと陽性に相互作用すると考えられる。次に、常磁性ビーズまたは他の形で選択可能なビーズを含有するAPCを、抗原特異的T細胞を保持した状態で単離することができる。
【００７８】
ある特定態様では、本発明の粒子が、米国特許第10/336,224号、PCT/US03/00339に記載されているような細胞表面を含む。この場合は、本明細書に記載する抗体/リガンド特異的手段によって、または遺伝子改変によって、抗原を細胞に取り付けることができる。例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）または市販されている数多くのキット（例えばInvitrogen Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）に略述さているものなど、当業者に公知の数多くのトランスフェクション、形質転換、および形質導入プロトコールを使用することができる。そのような技術は、安定な形質転換体をもたらす場合もあるし、一過性である場合もある。好適なトランスフェクション技術の一つはエレクトロポレーションである。エレクトロポレーションは、市販されている装置を使って哺乳類細胞、酵母細胞および細菌を含む様々な細胞タイプに対して行なうことができる。エレクトロポレーションの至適条件（電圧、抵抗およびパルス長を含む）は、当該宿主細胞タイプについて実験的に決定され、エレクトロポレーションを最適化するための一般的な指針は製造者から入手することができる。他の好適なトランスフェクション法は使用する細胞のタイプに依存し（例えば酵母用の酢酸リチウム法）、当業者には明白であると思われる。トランスフェクション後は、細胞内でのポリヌクレオチドの発現を促進する条件下で、細胞を維持することができる。適切な条件は発現系および細胞タイプに依存し、当業者には明白であると思われる。
【００７９】
抗原は、抗体/リガンド特異的手段により、例えば1つまたは複数の抗体に結合したビーズなどの粒子を使って、ビーズなどの粒子に取り付けることができる。好適な抗体/リガンド対には、抗MART-1抗体/MART-1抗原、抗WT-1抗体/WT-1、抗PR1抗体/PR1、抗PR3抗体/PR3、抗チロシナーゼ抗体/チロシナーゼ抗原、抗MAGE-1抗体/MAGE-1抗原、抗MUC-1抗体/MUC-1抗原、抗α-フェトプロテイン抗体/α-フェトプロテイン抗原、抗Her2Neu抗体/Her2Neu、抗HIV gp120抗体/HIV gp120、抗インフルエンザHA抗体/インフルエンザHA、抗CMV pp65/CMV pp65、抗C型肝炎抗体/C型肝炎タンパク質、抗EBV EBNA 3B抗体/EBV EBNA 3B抗原、および抗ヒトIg重鎖および軽鎖/骨髄腫患者またはCLL患者などの癌患者由来のIgを含めることができるが、これらに限定されるわけではない。他のタンパク質：タンパク質結合相互作用も、ビーズなどの粒子に抗原を取り付けるのに好適である場合があり、例えば受容体/リガンド相互作用を利用することができる。一定の態様では、抗原/タンパク質をビーズなどの粒子に化学的手段によって取り付ける。例えば抗原/タンパク質は、抗原とビーズとの非共有結合的会合により、単にそれら2つを、会合が起こるのに十分な時間、会合が起こるのに十分な条件下で、一緒にインキュべートする/接触させることによって、結合させることができる。さらなる態様では、抗原をビーズなどの粒子に、ビオチン/アビジンまたはストレプトアビジン相互作用によって取り付けることができる。一定の態様では、p-トルエンスルホニル（トシル）反応性基を有する疎水性「ネイキッド（naked）」ビーズを使用する。タンパク質は、最初のカップリングで、疎水的に吸着され、1級アミン基（NH2）およびスルフヒドリル基（SH）の共有結合が一晩で起こる。カップリング反応は中性pHで行なうことができるが、高いpHおよび37℃でのインキュべーションは共有結合を促進することができる。
【００８０】
一定の局面では、例えば米国特許第5,827,642号またはRiddell et al.,1990,J. Immunol. Methods,128:189-201に記載されているように、組織供給源から単離されたT細胞を、本明細書に記載の抗原負荷APCに、与えられた抗原に対して特異的なT細胞が活性化されるのに十分な時間にわたって曝露する。ある態様では、およそ数時間〜約0.5日間、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、または約20日間にわたって、T細胞を抗原負荷APCに曝露する。
【００８１】
ある態様では、T細胞を、インビボで、抗原、または本明細書に記載する抗原負荷APCに曝露する。これに関して、T細胞をインビボで刺激し活性化するために、抗原または抗原負荷APCを個体に投与することができる。次に、本明細書に記載する方法を使って、例えば抗CD3/抗CD28ビーズにより、T細胞をインビボまたはエクスビボで拡大することができる。適切な用量は臨床試験によって決めることができるが、投与量および投与頻度は、個体の状態、疾患のタイプおよび重症度などの因子によって決まると考えられる。一定の態様では、疾患の発症前または他の公知療法による処置前に、ある個体中で、インビボの抗原に、T細胞を曝露する。この場合は、抗原特異的T細胞が生成した後、それを単離し、拡大し、後で使用するために保存しておく。
【００８２】
本発明の一態様では、ビーズなどの粒子上に固定化した抗原を負荷したAPCと直接接触している抗原特異的T細胞の単離が、常磁性粒子に付着している細胞または常磁性粒子を包み込んでいる細胞の磁気単離によって行なわれる。そのような分離は、当技術分野において使用できる標準的方法を使って行なうことができ、これには様々なものが市販されている（例えばDYNAL（登録商標）Magnetic Particle Concentrator（DYNAL MPC（登録商標）、MACS（Miltenyi Biotec、ドイツ））。この場合、提示された抗原の種類に対する特異性を有するT細胞だけが、APCと陽性に最適な相互作用をすると考えられる。次に、常磁性（または他の形で選択可能な）ビーズを含有するAPCを、抗原特異的T細胞を保持した状態で（磁石または他の方法により）単離することができる。次に、様々な手段を使って、例えば本明細書ならびに米国特許出願第10/350,305号、同第10/187,467号、同第10/133,236号、同第09/960,264号、同第09/794,230号、PCT/US01/06139、およびPCT/US02/28161に記載されているXCELLERATE（商標）技術などにより、これらの抗原特異的T細胞を活性化/拡大することができる。
【００８３】
本発明のもう一つの態様では、抗原特異的T細胞を陽性選択によって単離する。そのような単離は、対象から単離したばかりのT細胞に対して、または本明細書に記載の抗原もしくは抗原負荷APCに曝露されたT細胞に対して行なうことができる。当業者に公知の数多くの免疫選択法を使用することができる。そのような技術は、例えば「Current Protocols in Immunology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）などに記載されている。抗原特異的細胞の陽性選択に役立ち得るマーカーには、CD25、CD54、CD69、CD38、CD45R0、CD49d、CD40L、CD137、CD62L、およびCD134などがあるが、これらに限定されるわけではない。ある態様では、所望の抗原特異的T細胞を単離するために、蛍光活性化細胞選別法も使用することができる。さらにもう一つの態様では、ペプチド-MHCテトラマーを使って、抗原特異的T細胞を単離することができる。例えばAltman et al.,Science 1998 Jun 19;280(5371):1821を参照されたい。
【００８４】
本発明のさらにもう一つの態様では、抗原特異的T細胞を遺伝子改変することができる。遺伝子改変は、当技術分野において公知の数多くの技術、例えばエレクトロポレーション（例えばGene Pulser II（BioRad、カリフォルニア州リッチモンド）を使用するもの）、種々のカチオン脂質（LIPOFECTAMINE（商標）、Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）、または他の技術、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）に記載のリン酸カルシウムトランスフェクションなどを使ったRNAまたはDNAトランスフェクションを含み得る。例えば、Opti-MEM 500μl中のRNAまたはDNA 5〜50μgを、10〜100μgの濃度のカチオン脂質と混合し、室温で20〜30分間インキュべートすることができる。他の好適な脂質には、LIPOFECTIN（商標）、LIPOFECTAMINE（商標）が含まれる。次に、その結果得られた核酸-脂質複合体を、総液量約2ml中（例えば0pti-MEM中）の1〜3×106個の細胞、好ましくは2×106個の抗原提示細胞に加え、37℃で2〜4時間インキュべ一トする。APCは、後述のウイルス形質導入法を使って形質導入することもできる。
【００８５】
または、本発明の抗原特異的T細胞を、レトロウイルス形質導入技術を使って遺伝子改変することもできる。本発明の一局面では、レトロウイルスベクターが、アンホトロピックレトロウイルスベクター、好ましくは長末端反復配列（LTR）を有することを特徴とするベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾限局巣形成ウイルス（SFFV）、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）などであり得る。大半のレトロウルスベクターはネズミレトロウイルスに由来する。しかし、本発明での使用に適合し得るレトロウイルスは、任意の鳥類または哺乳類細胞供給源に由来し得る。これらのレトロウイルスは好ましくはアンホトロピック、すなわちヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染する能力を有する。ある態様では、発現させるべき遺伝子で、レトロウイルスのgag、polおよび/またはenv配列を置き換える。実例となるレトロウイルス系は数多く記載されている（例えば米国特許第5,219,740号、同第6,207,453号、同第5,219,740号、MillerおよびRosman（1989）BioTechniques 7:980-990、Miller,A.D.（1990）Human Gene Therapy 1:5-14、Scarpa et al.,（1991）Virology 180:849-852、Burns et al.,（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037、ならびにBoris-LawrieおよびTemin（1993）Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。
【００８６】
本発明の一局面では、遺伝子改変された抗原特異的T細胞を、当業者に公知の数多くの免疫選択法のいずれか一つにより、導入遺伝子から発現されるタンパク質またはタンパク質群に特異的な抗体または他の受容体/リガンドを使って単離することができる。そのような技術は当技術分野においては知られており、例えば「Current Protocols in Immunology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）に記載されている。
【００８７】
ある特定態様では、注入された抗原特異的T細胞をインビボで追跡および/または制御するために、自殺遺伝子、例えばBonini et al.,1997 Science,276(5319)：1719-24に記載の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）、および/または他の表面マーカー（例えば切断型神経成長因子（dNGFR））を発現させるように抗原特異的T細胞を改変することができる。さらにもう一つの態様では、T細胞を関心対象の特定組織にターゲティングするためのタンパク質を発現させるように抗原特異的T細胞を遺伝子改変することができる。
【００８８】
本明細書に記載する細胞分離および培養手法が様々な環境（すなわち容器）で行ない得ることは、当業者にはすぐに理解されると思われる。その例には、種々のバッグ（例えばLifecell培養バッグ）、フラスコ、ローラーボトル、バイオリアクター（例えばCell Cube（Corning Science Products）またはCELL-PHARM（フロリダ州ハイアリーアのCD-Medical,Inc.））、ぺトリ皿および組織培養用に製造されたマルチウェルプレート、または細胞を好ましくは滅菌環境下に保持することができる任意の容器が含まれる。本発明の一態様では、バイオリアクターも有用である。例えば、細胞を成長させるために使用することができ、本発明の方法と組み合わせて使用することができる装置は、いくつかの製造者が現在製造している。例えば、Celdyne Corp（テキサス州ヒューストン）、Unisyn Technologies（マサチューセッツ州ホプキントン）、Synthecon,Inc.（テキサス州ヒューストン）、Aastrom Biosciences,Inc.（ミシガン州アナーバー）、Wave Biotech LLC（ニュージャージー州ベッドミンスター）を参照されたい。また、このようなバイオリアクターを対象とする特許には、米国特許第6,096,532号、同第5,985,653号、同第5,888,807号、同第5,190,878号が含まれる。
【００８９】
本発明のAPCおよび抗原特異的T細胞の培養に適した完全増殖培地には、RPMI 1640、DMEM、MEM、α-MEM、AIM-V、HAMS F-12、X-Vivo 15、またはX-Vivo 20などがある。さらなる態様では、培地がIL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ、およびTNF-βなどのサイトカイン、またはビタミンを含むことができる。さらなる態様では、培地が、界面活性剤、抗体、プラスマネートまたは還元剤（例えばN-アセチル-システイン、2-メルカプトエタノール）を含む。本発明方法の各段階における細胞の増殖培地は、APCおよび/または抗原特異的T細胞の生存を許すべきである。細胞を培養するために典型的に使用される増殖培地は、その培地に適切なサイトカイン、血清、抗体、ビタミン、アミノ酸または他の必須添加物が補足されるのであれば、どれでも、本発明の方法に従って使用することができる。本発明によれば、サイトカインは、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）、またはIL-13であることができるが、これらに限定されるわけでない。増殖培地に添加し得る他の例示的なサイトカインおよび成長因子には、インターロイキン1α（IL-1α）およびβ（IL-1β）、IL-2、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン3（IL-3）、単球コロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン15（IL-15）、およびFlt3-リガンドが含まれるが、これらに限るわけではない。好ましい培地には、アミノ酸およびビタミンを添加した、無血清の、または適切な量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモン群、および抗原特異的T細胞の拡大を支えるのに十分な量のサイトカイン類を添加した、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20などがある。ある局面では、好ましい培地は、1リットルのX-Vivo 15（BioWhittaker）を50mlの熱非働化プールヒト血清、20mlの1M Hepes、10mlの200mM L-グルタミンと共に含み、さらに約100,000I.U.のIL-2を含有するか、またはIL-2を含有しない。ある局面では、培地が脂質および/またはタンパク質源を含み得る。1〜5％ヒトAB血清を補足したRPMI 1640は好ましい。サイトカインの混合物を使用することができる。細胞を他の血清、例えばウシ胎仔（ウシ）血清（FCS/FBS）中での成長、他の血清濃度での成長、または無血清培地での成長に適合させることもできる。例えば、APC前駆体の培養にはホルモンを補足した無血清培地も適している。培地は、培養物中での細菌の成長を最小限に抑えるために抗生物質を含み得るが、必ず含むわけではない。ペニシリン、ストレプトマイシンもしくはゲンタマイシンまたはそれらを含む組合せは好ましい。細胞の培養に使用する培地または培地の一部は、GM-CSF、IL-4、IL-13、IL-15および/または他のサイトカインを含む新しい栄養を与えるために、定期的に補充されるべきである。
【００９０】
抗原特異的T細胞の拡大
本発明の抗原特異的T細胞の拡大は、抗原特異的T細胞を増殖するように再刺激する細胞表面部分リガンド結合によって行なわれる。本発明の一態様では、まず、抗原特異的T細胞が、抗原負荷APCへの曝露後に、本明細書に記載の方法によって単離される。本発明のもう一つの態様では、抗原特異的T細胞が、抗原負荷APCが存在する状態での培養物から、単離段階を経ないで直接拡大される。
【００９１】
ある特定態様では、抗原特異的T細胞が、本明細書および米国特許出願第10/350305号、同第10/187,467号、同第10/133,236号、同第09/960,264号、同第09/794,230号に記載のXCELLERATE（商標）法を使って、抗原または抗原被覆粒子を添加せずに活性化され、拡大される。この場合は、本明細書においてさらに詳しく述べるように、インビボで既に刺激または活性化されている抗原特異的T細胞（例えばメモリーT細胞）が、抗CD3抗体などの一次活性化シグナルを与える薬剤および抗CD28抗体などの共刺激シグナルを与える薬剤により、両薬剤を常磁性ビーズなどの同じ表面上に同時に固定化して、拡大される。本明細書においてさらに詳しく説明するように（下記実施例参照）、この拡大期中にビーズ：細胞比を変えること、特に低いビーズ：細胞比を用いることが、抗原特異的T細胞の拡大には有利である。例えば、抗原特異的T細胞を拡大するには、1：200、1：150、1：125、1：110、1：100、1：75、1：50、1：25、1：20、1：15、1：10、1：5または1：2.5のビーズ対細胞比を使用する。本発明のこの局面に特有の利点は、抗原を添加する必要がないということである。
【００９２】
一般に、拡大は、例えば米国特許出願第10/350305号、同第10/187,467号、同第10/133,236号、同第09/960,264号、同第09/794,230号、同第08/253,694号、同第08/403,253号、同第08/435,816号、同第08/592,711号、同第09/183,055号、同第09/350,202号、および同第09/252,150号、ならびに米国特許第5,858,358号、同第6,352,694号、および同第5,883,223号に記載されているように、抗原特異的T細胞の集団を再刺激し、それと同時に、抗原特異的T細胞の表面上のアクセサリー分子を、そのアクセサリー分子を結合するリガンドで刺激することによって行なわれる。
【００９３】
一般に、再刺激は、例えばT細胞受容体（TCR)/CD3複合体またはCD2表面タンパク質などによる細胞表面部分リガンド連結によって達成することができる。多くの抗ヒトCD3モノクローナル抗体が市販されており、例えばクローンBC3（XR-CD3；Fred Hutchinson Cancer Research Center、ワシントン州シアトル）、American Type Culture Collectionから分譲されるハイブリドーマ細胞から調製されるOKT3、およびモノクローナル抗体G19-4Sなどがある。同様に刺激型の抗CD2抗体も公知であり、入手することができる。抗CD2抗体によるCD2を介した刺激は、典型的には、少なくとも2種類の抗CD2抗体の組合せを使って達成される。記載されたことのある抗CD2抗体の刺激性の組合せには以下のものが含まれる：T11.3抗体とT11.1またはT11.2抗体との組合せ（Meuer et al.,Cell 36:897-906,1984）、および9.6抗体（これはT11.1と同じエピトープを認識する）と9-1抗体との組合せ（Ynag et al., J. Immunol. 137:1097-1100,1986）。上述の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。標準的な技術によって、他の抗体または抗体の組合せを調製し、同定することもできる。再刺激は、抗原、ペプチド、タンパク質、ペプチド-MHCテトラマー（Altman et al., Science 1996 Oct 4;274(5284):94-6参照）、スーパー抗原（例えばブドウ球菌エンテロトキシンA（SEA）、ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）、毒素性ショック症候群毒素1（TSST-1）、エンドトキシンとの接触によって、または種々のマイトジェン、例えばフィトヘマグルチニン（PHA）、酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびイオノマイシン、リポ多糖（LPS）、T細胞マイトジェン、ならびにIL-2などを含む（ただし、これらに限定されるわけではない）によって、達成することができる。
【００９４】
抗原特異的細胞集団は、本明細書に記載するように、例えば、ある表面に固定化された抗CD3抗体または抗CD2抗体との接触、またはカルシウムイオノフォアと共役したプロテインキナーゼC活性化因子（例えばブリオスタチン）との接触によって、刺激または再刺激することができる。T細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激には、そのアクセサリー分子を結合するリガンドを使用する。例えば、CD4＋細胞の集団を、抗CD3抗体および抗CD28抗体と、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で接触させることができる。同様に、CD8＋T細胞の増殖を刺激するには、抗CD3抗体および抗CD28抗体B-T3、XR-CD28（Diaclone、フランス・ブザンソン）を、当技術分野で周知の他の方法（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977,1998、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328,1999、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63,1999）と同様に使用することができる。
【００９５】
抗原特異的T細胞の集団をさらに再刺激するには、T細胞表面上の共刺激分子またはアクセサリー分子、例えばCD28を、そのアクセサリー分子を結合するリガンドで刺激する。したがって、抗CD28抗体もしくはCD28分子を架橋する能力を有するその断片、またはCD28の天然リガンドを含む、任意の薬剤をT細胞の刺激に使用できることは、当業者には認識されると思われる。本発明との関連で有用な例示的な抗CD28抗体またはその断片には、モノクローナル抗体9.3（IgG2a）（Bristol-Myers Squibb、ニュージーランド州プリンストン）、モノクローナル抗体KOLT-2（IgG1）、15E8（IgG1）、248.23.2（IgM）、クローンB-T3（XR-CD28、Diaclone、フランス・ブザンソン）およびEX5.3D10（IgG2a）（ATCC HB11373）が含まれる。例示的な天然リガンドには、B7-1（CD80）およびB7-2（CD86）などのB7タンパク質ファミリーが含まれる（Freedman et al., J. Immunol. 137:3260-3267,1987、Freeman et al., J. Immunol. 143:2714-2722,1989、Freeman et al., J. Exp. Med. 174:625-631,1991、Freeman et al.,Science 262:909-911,1993、Azuma et al., Nature 366:76-79,1993、Freeman et al., J. Exp. Med. 178:2185-2192,1993）。
【００９６】
本発明のさらにもう一つの態様では、T細胞集団の活性化を、他のT細胞内在性膜タンパク質の共刺激によって促進することができる。例えばT細胞インテグリンLFA-1とその天然リガンドICAM-1との結合は、細胞の活性化を促進し得る。T細胞の共刺激因子として作用し得るもう一つの細胞表面分子は、T細胞上の最晩期抗原4（VLA-4）を結合するVCAM-1（CD106）である。活性化T細胞上に発現する共刺激受容体4-1BB（CD137）および/またはNKG2Dのリガンド結合も、本発明との関連で、T細胞性免疫を増幅するのに役立ち得る。T細胞の望ましい拡大が起こるように、本明細書に記載の2つまたはそれ以上の共刺激分子を同時に任意の組合せで刺激し得ることに注意すべきである。
【００９７】
また、天然リガンドのホモログを結合することも、天然物であるか化学技術または組換え技術によって合成されたものであるかにかかわらず、本発明に従って使用することができる。他の薬剤には、天然リガンドおよび合成リガンドが含まれ得る。薬剤には、他の抗体もしくはその断片、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、PHAなどのマイトジェン、または他のスーパー抗原が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
【００９８】
T細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって与えることができる。例えば、各シグナルを与える薬剤は、溶液状態にあることができる、または表面にカップリングすることができる。表面にカップリングする場合、それらの薬剤は同じ表面に（すなわち「シス」構成で）カップリングするか、別個の表面に「すなわち「トランス」構成で）カップリングすることができる。または、一方の薬剤をある表面にカップリングし、他方の薬剤は溶液状態にあってもよい。ある態様では、共刺激シグナルを与える薬剤が細胞表面に結合され、一次活性化シグナルを与える薬剤が溶液状態にあるか、表面にカップリングされる。一定の態様では、両方の薬剤が溶液状態にあることができる。別の態様では、薬剤が可溶型であり、表面、例えばFc受容体を発現させる細胞、またはそれらの薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などに架橋することができる。好ましい一態様では、2つの薬剤を同じビーズ上に、すなわち「シス」に固定化するか、別個のビーズに、すなわち「トランス」に固定化する。例えば、一次活性化シグナルを与える薬剤は抗CD3抗体、共刺激シグナルを与える薬剤は抗CD28抗体であって、両薬剤はビーズなどの同じ表面に等モル量で同時固定化される。ある態様では、CD4＋T細胞拡大およびT細胞成長に、ビーズに結合された1：1比の各抗体を使用する。
【００９９】
本発明の一局面は、低い比の、ビーズに結合させた抗CD3：CD28抗体を使用すると、抗原特異的T細胞を含むT細胞の拡大が向上されるという、驚くべき発見に由来している。本発明の一定の局面では、1:1の比を使用した場合に観察される拡大と比較してT細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合された抗CD3：CD28の比を使用する。ある特定態様では、1：1の比を使用した場合に観察される拡大と比較して約0.5〜約3倍の増加が観察される。ある態様では、ビーズに結合されたCD3：CD28抗体の比が100：1〜1：100およびその間のあらゆる整数値に及ぶ。本発明の一局面では、粒子に抗CD3抗体よりも多くの抗CD28抗体を結合させる。すなわち、CD3：CD28の比は1未満である。本発明の一定の態様では、ビーズに結合させる抗CD28抗体対抗CD3抗体の比が、2：1より大きい。ある特定態様では、CD3：CD28比1：100の、ビーズに結合した抗体を使用する。もう一つの態様では、CD3：CD28比1:75の、ビーズに結合した抗体を使用する。さらにもう一つの態様では、CD3：CD28比1：50の、ビーズに結合した抗体を使用する。もう一つの態様では、CD3：CD28比1：30の、ビーズに結合した抗体を使用する。好ましい一態様では、CD3：CD28比1：10の、ビーズに結合した抗体を使用する。もう一つの態様では、CD3：CD28比1：3の、ビーズに結合した抗体を使用する。さらにもう一つの態様では、CD3：CD28比3：1の、ビーズに結合した抗体を使用する。
【０１００】
T細胞を刺激するには、1：500〜500：1およびその間の任意の整数値の粒子対細胞比を使用することができる。当業者には直ぐに理解できるように、粒子対細胞の比は、標的細胞と比較した粒径に依存する。例えば小サイズのビーズは数個の細胞しか結合することができないのに対して、大きいビーズは多くの細胞を結合できると考えられる。一定の態様では、粒子対細胞の比が1：100〜100：1およびその間の任意の整数値に及び、またさらなる態様では、1：9〜9：1およびその間の任意の整数値を含む比も、T細胞の刺激に使用することができる。T細胞刺激およびT細胞拡大をもたらす抗CD3および抗CD28結合粒子対T細胞の比は、上述のように変動し得るが、一定の態様では、その比は1：150またはそれ以下であり得る。一定の好ましい比には、1：150、1：100、1：75、1:50、1:40、1：30、1：25、1：20、1：15、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2.5、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、15：1、および20：1が含まれ、好ましい比の一つはT細胞あたり1：1の粒子である。ある態様では、1：1またはそれ以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定態様では、好ましい粒子：細胞比が1：2.5または1：5である。さらなる態様では、粒子対細胞の比を刺激の日に応じて変化させることができる。例えばある態様では、粒子対細胞の比が1日目は1：5、1：2.5、1：1〜10：1であり、その後、10日までは毎日または1日おきに、1：1、1：5、1：20、1：25、1：50、または1：100（添加日の細胞数に基づく値）から選択される最終比で、追加粒子が細胞に添加される。ある特定態様では、粒子対細胞の比が刺激の1日目は1：2.5、1：5、または1：1であり、刺激の3日目および5日目は1:5に調節される。さらにもう一つの態様では、粒子対細胞の比が、刺激の1日目は1：2.5、1：5、または1:1であり、5日目、7日目、または9日目は1：10、1：20、1：25、1：50、または1：100に調節される。もう一つの態様では、粒子が毎日または一日おきに、刺激の1日目は1：1、刺激の3日目および5日目は1：5の最終比になるように添加される。もう一つの態様では、粒子対細胞の比が刺激の1日目は2：1であり、刺激の3日目および5日目は1：10に調節される。もう一つの態様では、毎日または1日おきに、刺激の1日目は1：1、刺激の3日目および5日目は1：10の最終比になるように、粒子が添加される。他の様々な比も本発明での使用に好適であり得ることは、当業者には理解されると思われる。
【０１０１】
本発明の一局面は、異なるビーズ：細胞比を用いることが、抗原特異的T細胞の拡大に関して異なる結果につながり得るという驚くべき発見に由来する。特に、ビーズ：細胞比を変化させることにより、抗原特異的（メモリー）T細胞を選択的に拡大または欠失させることができる。ある態様では、使用する特定のビーズ：細胞比により、抗原特異的T細胞が選択的に欠失する。さらにもう一つの態様では、使用する特定のビーズ：細胞比により、抗原特異的T細胞が選択的に拡大される。例えば、抗原特異的T細胞を拡大させるには、1：100、1：50、1：25、1：5または1：2.5などのビーズ対細胞比が使用される。低いビーズ：細胞比は、メモリー（抗原特異的）T細胞を保存しその拡大を促進するのに役立ち得る。また、追加ビーズを細胞に対して極めて低い比（1：10、1：25、1：50、1：100）で、様々な培養日数で添加（例えば5日目、7日目、または9日目に逐次的に添加）すると、メモリー細胞の優先的拡大を促進し、さらに促進することができる。1:5または1：2.5のビーズ：細胞比を最初の刺激として使用し、1：10、1:25、かつある程度は、1：50および1：100のビーズ：細胞比で5日目および7日目に添加すると、メモリー細胞が保存され、0日目に単回の刺激を与えただけでは起こらないようなメモリー細胞のさらなる拡大が促進されるようである（具体的には本明細書に記載の実施例を参照されたい）。したがって、本明細書に記載する組成物および方法は、本明細書に記載する多種多様な免疫療法において使用するために、特定のT細胞集団を拡大する目的で、または特定のT細胞集団を欠失させる目的で、使用することができる。
【０１０２】
本明細書に記載する粒子：細胞比は、ビーズに結合された様々な比の抗体との任意の組合せで、使用することができることに注意すべきである。例えば、約1：5〜1：10の比の抗CD3/CD28抗体が結合しているビーズを、約1：5〜1：10の粒子：細胞比で使用することができる。または、1：1の比の抗CD3/抗CD28抗体が結合しているビーズを、約1：5の粒子：細胞比などで使用することができる。したがって、ビーズに結合した抗CD3：抗CD28抗体の比は、100：1〜1：100およびその間の全ての整数値に及び、そのようなビーズは、約1：500〜500：1およびその間の任意の整数値の粒子：細胞比で、任意の組合せで使用することができる。
【０１０３】
特定の手法を用いると、約12日間〜約14日間後に刺激剤からT細胞を分離することにより、最初の活性化および刺激に続いてT細胞集団の長期間刺激を維持することが、有利な場合がある。T細胞増殖の速度は、例えばT細胞のサイズまたは体積をコールターカウンターなどを使って調べることなどにより、定期的に（例えば毎日）監視される。これに関連して、休止T細胞は約6.8μmの平均直径を持ち、刺激リガンドの存在下で最初の活性化および刺激を受けると、T細胞の平均直径は4日目までに12μmより大きくなり、およそ6日目までに減少し始める。平均T細胞直径が約8μmまで減少すると、T細胞のさらなる増殖を誘導するために、T細胞を再活性化および再刺激することができる。または、T細胞増殖の速度およびT細胞再刺激の時間は、活性化T細胞上に誘導されるCD154、CD54、CD25、CD137、CD134などの細胞表面分子の存在についてアッセイすることによって監視することもできる。
【０１０４】
ある態様では、T細胞刺激が、ビーズ上に同時固定化された抗CD3および抗CD28抗体（3×28ビーズ）により、細胞が静止状態（低増殖または無増殖）に戻るのに十分な時間（最初の刺激後、約8〜14日間）にわたって行なわれる。次に、刺激シグナルを細胞から除去し、細胞を洗浄し、患者に注入して戻す。実施例が証明するとおり、刺激期の終わりに細胞は、抗原に応答するその能力およびメモリー様表現型を示すというこれらの細胞の能力によって証明されるように、本発明の方法によって「超誘導性（super-inducible）」になる。したがって、外因的に再刺激されるか、注入後にインビボで抗原によって再刺激されることにより、活性化T細胞は、例えば持続的なCD154発現および増加したサイトカイン産生などのユニークな表現型特性を特徴とする強い応答を示す。
【０１０５】
本発明のさらなる態様では、T細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと混合した後、ビーズと細胞とを分離し、次に細胞を培養する。代替的態様では、培養に先だって、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離せずに、一緒に培養する。さらにもう一つの態様では、まず、力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮して、細胞表面部分リガンド結合をもたらし、それによって細胞刺激を誘導する。
【０１０６】
もう一つの態様では、抗CD3/抗CD28（すなわちCD3×CD28）被覆粒子（例えばビーズ）などの刺激剤への曝露時間を、所望のT細胞表現型が得られるように一部変更または調整する。CD8＋細胞傷害性またはサプレッサーT細胞（TC）に対して、より大きなヘルパーT細胞（TH）、典型的にはCD4＋の集団が望ましい場合がある。なぜなら、TH細胞の拡大は望ましいエフェクター機能（例えば抗腫瘍、抗ウイルス、抗細菌機能など）を誘導し得るからである。CD4＋T細胞は、例えばGM-CSF、CD40L、およびIL-2などの重要な免疫調節分子を発現させる。CD4によるヘルプが好ましい場合は、CD4：CD8比を保存または促進する本明細書に記載するような方法が、かなりの利点を持ち得る。本発明の一局面では、GM-CSFまたはIL-2（これらはいずれも主としてCD4＋T細胞によって発現される）を発現させる細胞の注入数を増加させることが、有益であり得る。または、CD4ヘルプの必要性が低く、より多くのCD8＋T細胞数が望ましい状況では、例えば刺激および/または培養前にCD8＋T細胞を予備選択することなどにより、本明細書に記載のT細胞活性化法も使用することができる。そのような状況は、IFN-γレベルの増加が好ましい場合に存在し得る。さらに、他の応用例では、TH2型細胞に対するTH1型細胞の集団（もしくはその逆）またはそこから得られる上清を使用することが望ましい場合もある。また、一定の応用例では、レギュラトリーT細胞の集団を使用することが望ましい場合もある（Autoimmun Rev. 2002 Aug;1(4):190-7、Curr Opin Immunol. 2002 Dec;14(6):771-8）。
【０１０７】
様々な抗原特異的T細胞集団の単離を達成するには、再刺激（活性化）を誘導する細胞表面部分リガンド結合の時間を変化させ、またはパルスする（pulse）ことができる。例えば、関心対象である特定の表現型を得るために拡大時間を変化させ、かつ/または異なるタイプの刺激剤（例えば抗体またはその断片、ペプチド、ポリペプチド、MHC/ペプチドテトラマー、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、PHAなどのマイトジェン、または他のスーパー抗原）を使用することができる。様々な表現型マーカーの発現は経時的に変化する。したがって、特異的T細胞集団を得るには、特定の時点または刺激剤を選択することができる。したがって、刺激すべき細胞タイプに応じて、刺激および/または拡大時間は4週間またはそれ以下、2週間またはそれ以下、10日間またはそれ以下、または8日間またはそれ以下であり得る（4週間またはそれ以下には4週間から1日間（24時間）までの全ての時間範囲が含まれる）。一部の態様では、刺激および拡大を、6日間またはそれ以下、4日間またはそれ以下、2日間またはそれ以下にわたって行なうことができ、また別の態様では、わずか24時間またはそれ以下、好ましくは4〜6時間またはそれ以下にわたって行なうことができる（これらの範囲はその間の任意の整数値を含む）。T細胞の刺激を短い時間行なうと、T細胞の集団は劇的に数を増やすことはないかもしれないが、集団は、生体内で増殖し続けることができ、天然のエフェクターT細胞プールにより近い、頑強で健常な活性化抗原特異的T細胞を与えると考えられる。
【０１０８】
本発明の一態様では、混合物を数時間（約3時間）〜約14日間またはその間の任意の時間単位での整数値にわたって培養することができる。別の態様では、混合物を21日間培養することができる。本発明の一態様では、ビーズおよびT細胞を約8日間一緒に培養する。別の態様では、ビーズおよびT細胞を2〜3日間一緒に培養する。T細胞の培養時間が60日間またはそれ以上になり得るように、数サイクルの刺激が望ましい場合もある。T細胞培養に適した条件には、増殖および生存に必要な因子、例えば血清（例えばウシ胎仔血清もしくはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ、およびTNF-α、または当業者に公知の他の任意の細胞成長用添加剤などを含有し得る適当な培地（例えば最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 15（BioWhittaker））が含まれる。他の細胞成長用添加物には、系面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチルシステインおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。培地は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20にアミノ酸類およびビタミン類を添加したものであって、無血清であるか、または適当な量の血清（もしくは血漿）または所定のホルモン群、および/またはT細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインを補足したものを含むことができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含められ、対象に注入しようとする細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件、例えば適当な温度（例えば37℃）および雰囲気（例えば空気＋5％CO2）などの下で維持される。
【０１０９】
一定の態様では、抗原特異的細胞の活性化および/または拡大を増大させるために、いくつかのフィーダー細胞を加えることが望ましい場合がある。フィーダー細胞は、種々の細胞タイプ、例えば照射末梢血リンパ球（自己もしくは同種異系）のみ、またはそれをEBV形質転換B細胞株（自己もしくは同種異系）と組み合わせたもの、骨髄単球系統の不死化もしくは非不死化細胞株、例えばマクロファージ、樹状細胞、赤血球、B細胞、腫瘍細胞株、例えばU937、Jurkat、Daudi、MOLT-4、HUT、CEM、Colo 205、HTB-13、およびHTB-70などを包含し得る。フィーダー細胞は、それらがフィーダー機能、例えば初代T細胞の生存および成長を容易にする能力を提供し、抗原特異的クローンを引き出す限り、ヒト由来である必要はない。
【０１１０】
薬学的組成物
本発明のもう一つの局面は、抗原特異的T細胞の集団または組成物を提供する。さらに本発明は、抗原特異的T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。本発明の組成物は、単独で投与するか、薬学的組成物として、希釈剤および/または他の成分、例えばIL-2もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせて投与することができる。簡単に述べると、本発明の薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされた、本明細書に記載の標的細胞集団を含む。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの糖質、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはグルタチオン、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一定の局面では、静脈内投与用に製剤化される。
【０１１１】
本発明の関連態様はさらに、抗原特異的T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容できる担体は、当業者に公知の技術によって滅菌されるべきである。
【０１１２】
本発明の薬学的組成物は、処置（または予防）すべき疾患に適した方法で投与することができる。適当な投与量は臨床試験によって決定することができるが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの因子によって決まると考えられる。
【０１１３】
本発明は、哺乳動物における癌または悪性細胞の存在を予防、阻害、または減少させる方法であって、動物に抗癌有効量の本抗原特異的T細胞を投与することを含む方法も提供する。
【０１１４】
その癌に対する免疫応答を誘導させるか、その存在を予防、阻害、または減少させるべき癌として本発明が予期するものには、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、食道癌、悪性脳腫瘍、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、低悪性度リンパ腫、および当技術分野において公知の他の新生物が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
【０１１５】
または、病原性生物、例えばウイルス（例えば一本鎖RNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A型、B型、およびC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、ヒトパピローマウイルス（HPV））、寄生虫（例えばプラスモディウム属、リーシュマニア属、住血吸虫属、トリパノソーマ属などの原生動物および後生動物病原体）、細菌（例えばマイクバクテリア、サルモネラ、レンサ球菌、大腸菌、ブドウ球菌）、真菌（例えばカンジダ属、アスペルギルス属）ならびにニューモシスチス・カリニなどに対する応答性を誘導または促進するために、本明細書に記載の組成物を使用することもできる。
【０１１６】
一定の態様では、炎症性疾患、自己免疫、および外来移植片受容における特異的免疫抑制のために、本発明の方法を、Tレギュラトリー細胞の作製と一緒に使用することができる。レギュラトリーT細胞は、本発明の方法を使って、作製し、拡大することができる。レギュラトリーT細胞は抗原特異的および/またはポリクローナルであることができる。レギュラトリーT細胞は、当技術分野で認識されている技術を使って、例えばWoo et al.,J Immunol. 2002 May 1;168(9):4272-6、Shevach,E.M.,Annu. Rev. Immunol. 2000,18:423、Stephens et al.,Eur. J. Immunol. 2001,31:1247、Salomon et al.,Immunity 2000,12:431、およびSakaguchi et al.,Immunol. Rev. 2001,182:18などに記載されているように、作製し、拡大することができる。したがって本発明のT細胞は、自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、甲状腺機能亢進症/グレーヴス病、甲状腺機能低下症/橋本病、インスリン依存性糖尿病（1型）、重症筋無力症、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー病、糸球体腎炎、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エヴァンス症候群、第VIII因子阻害物質症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎およびリューマチ熱など（ただしこれらに限定されるわけではない）などの処置に使用することができる。
【０１１７】
本発明の組成物を投与することによって動物に誘導される免疫応答には、腫瘍および感染細胞を殺す能力を有する細胞傷害性T細胞によって媒介される細胞性免疫応答ならびにヘルパーT細胞応答が含まれ得る。B細胞を活性化する能力を持ち、したがって抗体産生をもたらす、ヘルパーT細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も含めることができる。本発明の組成物によって誘導される免疫応答のタイプを解析するには、様々な技術を用いることができ、それらは当技術分野において、例えばColiga et al.,「Current Protocols in Immunology」John Wiley & Sons Inc.（1994）などに詳述されている。
【０１１８】
「免疫有効量」「抗腫瘍有効量」「腫瘍阻害有効量」または「治療量」と表示される場合、投与すべき本発明組成物の正確な量は、患者の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の相違を個別に考慮して、医師によって決定され得る。一般的には、本抗原特異的T細胞を含む薬学的組成物は、104〜107 APC/kg体重、好ましくは105〜106 APC/kg体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与することができると言える。抗原特異的T細胞組成物をこれらの投与量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において広く知られている注入技術を使って投与することができる（例えばRosenberg et al.,New Eng. J. of Med. 319:1676,1988参照）。特定の患者に関して最適な投与量および処置レジメンは、患者を疾患の徴候について監視し、それに応じて処置を調節することにより、医学分野の当業者であれば、容易に決定することができる。
【０１１９】
通例、養子免疫試験では、約2×109〜2×1011個の抗体特異的T細胞を患者に投与する（例えば米国特許第5,057,423号参照）。本発明の一部の局面では、特に同種異系細胞または異種細胞を使用する場合には、106個/キログラム（106〜1011個/患者）の範囲の、より低い細胞数を投与することができる。一定の態様では、1×105個、1×106個、1×107個、1×108個、2×108個、2×109個、1×1010個、2×1010個、1×1011個、5×1011個、または1×1012個のT細胞を、対象に投与する。T細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与することができる。抗原特異的T細胞は、治療を受ける患者にとって自己または非相同であることができる。所望であれば、処置には、免疫応答の誘導を促進するために、本明細書に記載するとおり、マイトジェン（例えばPHA）、リンホカイン、サイトカイン、および/またはケモカイン（例えばGM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1αなど）の投与を含めることもできる。
【０１２０】
本薬学的組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、植込みまたは移植を含む任意の好都合な方法によって行なうことができる。本発明の組成物は患者に皮下投与し、皮内投与し、筋肉内投与し、静脈内（i.v.）注射によって投与し、または腹腔内投与することができる。ある態様では、本発明の抗原特異的T細胞組成物を、皮内注射または皮下注射によって、患者に投与する。もう一つの態様では、本発明の抗原特異的T細胞組成物が、好ましくはi.v.注射によって投与される。抗原特異的T細胞の組成物は、腫瘍またはリンパ節に直接注射することができる。
【０１２１】
さらにもう一つの態様では、薬学的組成物を制御放出系で送達することができる。ある態様では、ポンプを使用することができる（Langer,1990,Science 249:1527-1533、Sefton 1987,CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201、Buchwald et al.,1980；Surgery 88:507、Saudek et al.,1989,N. Engl. J. Med. 321:574参照）。もう一つの態様では、ポリマー材料を使用することができる（「Medical Applications of Controlled Release」（1974,Langer and Wise編,CRC Pres.,フロリダ州ボカラトン）、「Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance」（1984,Smolen and Ball編,Wiley,ニューヨーク）、RangerおよびPeppas,1983；J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい。また、Levy et al.,1985,Science 228:190、During et al.,1989,Ann. Neurol. 25:351、Howard et al.,1989,J. Neurosurg. 71:105も参照されたい）。さらにもう一つの態様では、制御放出系を治療標的の近傍に置くことができるので、全身投与量の一部しか必要にならない（例えば「Medical Applications of Controlled Release」（1984,Langer and Wise編,CRC Pres.,フロリダ州ボカラトン）の第2巻、115〜138頁を参照されたい）。
【０１２２】
本発明の抗原特異的T細胞組成物は、多くのマトリックスを使って投与することもできる。マトリックスは組織工学では何年も前から使用されている（例えばLanza,LangerおよびChick編「Principles of Tissue Engineering」（1997）を参照されたい）。本発明では、そのようなマトリックスを、人工リンパ系器官として、典型的にはT細胞の調整によって免疫系を支持し、維持し、または調整するように作用するという新しい状況で使用する。したがって本発明は、組織工学でその有用性が実証されているマトリックス組成物および製剤を使用することができる。したがって本発明の組成物、装置および方法に使用することができるマトリックスのタイプは事実上無制限であり、生物学的マトリックスおよび合成マトリックスの両方を含み得る。具体例の一つでは、米国特許第5,980,889号、同第5,913,998号、同第5,902,745号、同第5,843,069号、同第5,787,900号、または同第5,626,561号に記載の組成物および装置を使用する。マトリックスは哺乳動物宿主に投与した場合に生体適合性であることに一般に関係する特徴を含む。マトリックスは天然材料または合成材料のどちらで形作られていてもよい。マトリックスは、インプラントなどの永続的構造または除去可能な構造を動物の体内に残すことが望ましい場合には非生分解性であってもよいし、生分解性であってもよい。マトリックスはスポンジ、インプラント、管、テルファパッド（telfa pad）、繊維、中空糸、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとり得る。また、マトリックスは、プレーティングされた細胞または産生されたサイトカインもしくは他の活性剤が徐放されるように設計することができる。一定の態様では、本発明のマトリックスは可撓性および伸縮性であり、無機塩、水性液および酸素を含む溶存気体剤などの物質を透過させる半固体足場と表現することができる。
【０１２３】
本明細書ではマトリックスを生体適合性物質の一例として使用する。しかし本発明はマトリックスに限定されるわけではないので、マトリックスという用語が出てきた場合、これらの用語はいずれも、細胞の保持または細胞の横断を許し、生体適合性であり、その物質の中を高分子が直接横断することを許すのでその物質そのものが半透過性膜であるか、または特定の半透過性物質と一緒に使用することができる、装置または他の物質を包含すると理解すべきである。
【０１２４】
本発明の一定の態様では、本発明の細胞を、数多くの関連処置様式、例えば抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびFK506、抗体、または他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、サイトキシン、フルダリビン（fludaribine）、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および放射線照射などと一緒に（例えば先に、同時に、または後に）患者に投与する。これらの薬物はカルシウム依存性ホスファターゼ、カルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または成長因子が誘導するシグナル伝達にとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）。（Liu et al.,Cell 66:807-815,1991、Henderson et al.,Immun. 73:316-321,1991、Bierer et al.,Curr. Opin. Immun. 5:763-773,1993、Isoniemi（前記））。さらにもう一つの態様では、本発明の細胞組成物を、化学療法剤、例えばフルダラビン、外照射療法（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体を使ったT細胞除去療法と一緒に（例えば先に、同時に、または後に）患者に投与する。もう一つの態様では、B細胞除去療法、例えばCD20と反応するリツキサンなどの薬剤に続いて、本発明の細胞組成物を投与する。患者に投与すべき上記処置薬の投与量は、処置される状態および処置受容者の正確な性質によって変動すると考えられる。ヒトに投与する場合、投与量の調整は当技術分野に受け入れられている慣例に従って行なうことができる。例えばCAMPATHの投与量は、成人患者の場合一般に1〜約100mgの範囲になり、通常は1〜30日間、毎日投与されると考えられる。好ましい1日量は1日あたり1〜10mgであるが、場合によっては1日あたり40mgまでの、より高い用量を使用することもできる（米国特許第6,120,766号に記載）。
【０１２５】
本文中で言及した参考文献はすべて参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。さらにまた、本明細書で使用されるすべての数値範囲は、その範囲内のすべての整数値を明確に含み、個々の用途に応じてその範囲内の特定数値の選択が予期される。さらに、以下の実施例を提供するが、その目的は例示であって、限定ではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例1
CMV抗原被覆ビーズは抗原特異的T細胞を活性化しその単離を容易にする
この実施例では、サイトメガロウイルス（CMV）被覆ビーズを使って、抗原特異的T細胞を活性化し単離した。
【０１２７】
標準的技術を使って調製したCMV溶解物を、Dynabead M-450と、回転させながら、室温で1〜2時間混合した。次にビーズを1回洗浄し、PBMCに加えた。数時間以内にビーズはAPCに貧食された。72時間以内に、CMVpp65-HLA-A2テトラマーが、CMV pp65に特異的なCD25高（活性化）T細胞を検出した。抗原特異的T細胞が会合しているビーズ負荷APCの磁気選択を5日目に行なうことにより、CMV特異的T細胞を濃縮した。図1に示すように、磁気分離後も、CMV特異的T細胞はまだビーズ負荷APCに強固に会合していた。磁気分離は約1日目から約10日目までのどの時点でも行ない得ることに注意すべきである。
【０１２８】
実施例2
エクスビボで拡大したメモリーCD8 CMVテトラマー＋T細胞は、再刺激すると、CD25をアップレギュレートする
この実施例では抗原被覆ビーズを使ってCMV特異的CD8＋T細胞をエクスビボで活性化した。
【０１２９】
CMV pp65テトラマー陽性およびテトラマー陰性ドナー由来のPBMCを、CMV溶解物で被覆した常磁性Dynal M-450ビーズで刺激した。対照として、CMV pp65テトラマー陰性PBMCをCMV溶解物被覆ビーズと共に培養し（図2、パネルA）、CMV pp65テトラマー陽性PBMCを「ネイキッド」ビーズ（CMV抗原なし）と共に培養した（図2、パネルB）。CMV pp65テトラマー陽性PBMCをCMV溶解物被覆ビーズと共に培養した（図2、パネルC）。刺激後、CMV特異的T細胞の活性化を、CMV pp65 HLA-A2テトラマー染色および活性化の指標としてのCD25発現により、10日目に測定した。図2に示すように、CD25のアップレギュレーションが、抗原被覆ビーズを使ってエクスビボで拡大したメモリーCD8 CMVテトラマー＋T細胞に観察された。
【０１３０】
抗原被覆ビーズを使って抗原特異的T細胞を活性化し刺激することができる。次に、これらの抗原特異的T細胞を実施例1および本明細書の他の項に記載されているように濃縮することができる。これらの抗原特異的T細胞は、本明細書および米国特許出願第10/350305号、同第10/187,467号、同第10/133,236号、同第09/960,264号、および同第09/794,230号に記載されているように、さらに拡大することができる。本発明の抗原特異的T細胞は、本明細書に記載する多種多様な免疫療法において使用することができる。
【０１３１】
実施例3
ビーズ：細胞比を変化させることにより、メモリーCD8 T細胞を選択的に拡大または欠失することができる
この実施例では、ビーズ：細胞比が異なるT細胞集団の拡大に大きな影響を持ち得ることを示す。特に、高いビーズ：細胞比（3：1〜10：1、20：1およびそれ以上）は抗原特異的T細胞の死を誘導する傾向があり、一方、低いビーズ：細胞比（1：1〜1：10、1：20、1：30、1：40、1：50またはそれ以下）は抗原特異的T細胞の拡大につながる。さらに、以下のデータは、低いビーズ：細胞比がポリクローナル細胞集団における細胞拡大の向上にもつながることを示している。したがってこの実施例は、低いビーズ：細胞比が総細胞拡大を向上することを示す。
【０１３２】
本質的に米国特許出願第10/187,467号（2002年6月28日出願）に記載されているように、XCELLERATE I（商標）法を使って、細胞を調製し、刺激した。簡単に述べると、この方法では、末梢血単核細胞（PBMC）アフェレーシス産物から、XCELLERATED（商標）T細胞を製造する。医療機関で患者から収集した後、PBMCアフェレーシスを洗浄してから「非被覆」DYNABEADS（登録商標）M-450エポキシTと共にインキュベートした。この期間中に、単球などの貪食細胞がビーズを摂食する。インキュベーション後に、ビーズおよびビーズに付着した単球/貪食細胞と除去するために、細胞およびビーズをMaxSep磁気分離装置で処理する。この単球枯渇段階に続いて、合計5×108個のCD3＋T細胞を含有する液量を取り、1.5×109個のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 Tと共に、XCELLERATE（商標）法を開始する準備をする（約3：1のビーズ：T細胞）。次に、細胞とDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 Tとの混合物を、37℃、5％CO2で約8日間インキュベートすることにより、第1注入用のXCELLERATED T細胞を作製する。残りの単球枯渇PBMCは、2回目またはそれ以降の細胞産物拡大（約21日後）まで低温保存しておき、その時点で融解し、洗浄した後、合計5×108個のCD3＋T細胞を含有する液量を取り、1.5×109個のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 Tと共に、第2注入用のXCELLERATE法を開始する準備をする。37℃、5％CO2で約8日間インキュベートしている間に、CD3＋T細胞が活性化し、拡大する。使用する抗CD3 mAbはBC3（XR-CD3；Fred Hutchinson Cancer Research Center、ワシントン州シアトル）であり、抗CD28 mAb（B-T3、XR-CD28）はDiaclone（フランス・ブザンソン）から入手する。
【０１３３】
下記の実験については、プレーティングおよび培養を行なう前に、下記表1に要約する様々な量のビーズと共に30分間回転させることにより、単球枯渇細胞を混合した。この実施例で使用したビーズは、ビーズに結合したCD3：CD28抗体比が1：1のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 Tを含む。
【０１３４】
（表１）ビーズ：細胞比を変化させることにより、メモリーCD8 T細胞を選択的に拡大または欠失することができる
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【０１３５】
表1に要約し図3に図示した結果は、高いビーズ：細胞比を用いることにより、抗原特異的T細胞を選択的に欠失させることができ、低いビーズ：細胞比を用いると抗原特異的T細胞を選択的に拡大することができることを証明している（同様の結果はインフルエンザ特異的細胞およびEBV特異的細胞でも観察された）。理論にこだわるわけではないが、抗原特異的T細胞はさらなる刺激に対して感作されると考えられる。したがって鍵はT細胞活性化シグナルの強さであると思われる。すなわち、メモリーT細胞（抗原特異的T細胞）の選択的拡大は「弱い」シグナルで起こり、一方、メモリーT細胞の選択的欠失は「強い」シグナルで起こる。リガンドによって結合されるCD3/TCR（およびCD28）受容体の量が、シグナル強度を決定する。したがって、高いビーズ：細胞比による刺激は高濃度の刺激抗体（すなわち「強いシグナル」）を与えて、抗原特異的T細胞の過剰刺激をもたらし、それが、アポトーシスまたは他の機序によって、それらを死なせる。低いビーズ：細胞比を用いると、抗原特異的T細胞に対して、過剰に刺激するのではなく、むしろこれらの細胞の迅速な増殖を誘導するような刺激シグナルが与えられる。
【０１３６】
さらなる実験では、1：30の比および抗4-1BB抗体と結合したビーズを使用すると、抗原特異的細胞（例えばCMVテトラマー陽性細胞）の増加倍率が、優れていることが示された。
【０１３７】
したがってこの実施例では、所望する結果に応じた異なるビーズ：細胞比の使用を裏付ける証拠が得られる。抗原特異的T細胞を拡大するには、低いビーズ：細胞比が好ましい。
【０１３８】
実施例4
培養中にビーズ：細胞比を変化させ、ビーズを逐次的に添加することにより、メモリーT細胞の拡大を向上することができる
この実施例では、培養中に低いビーズ：細胞比でビーズを逐次的に添加することにより、メモリーT細胞の拡大を向上することができることを示す。
【０１３９】
以下の変更を加えて、本質的に実施例3に記載したとおりに、細胞を調製し、刺激した。図4のパネルAおよびBに示すように、細胞を1：2.5もしくは1：5のビーズ：細胞比の出発静置培養で培養するか、または出発比を1：2.5もしくは1：5とし、記載のとおり5日目、7日目、または9日目に、1：10、1：25、1：50もしくは1：100の比で追加のビーズを添加して培養した。15日間での総T細胞拡大を比較すると、培養期間中に逐次的にビーズを添加すると、出発ビーズ：細胞比が1：2.5でも1：5でも、細胞の拡大が増加することがわかる。15日間でのCMV特異的T細胞拡大を比較した場合も、培養期間中に逐次的にビーズを添加すると、抗原特異的T細胞の拡大が増加することがわかる（図4パネルAおよび図4パネルB参照）。静置培養との比較でポリクローナル細胞および抗原特異的T細胞の拡大の最も劇的な増加は、ビーズを0日目に1：2.5のビーズ：細胞比で加え、5日目に1：10の比で逐次的に加えた培養物で観察された。
【０１４０】
関連する実験では、メラノーマgp100(M)をワクチン接種した患者からのT細胞の拡大を調べるために、ビーズ：細胞比を下げて、逐次的添加を使用した。図5に示すように、ビーズ：T細胞比を1：50に下げ、3日目、5日目、11日目、15日目、および19日目に逐次的添加を行なうと、メラノーマgp100(M)特異的T細胞に、劇的な拡大の増加が観察された。
【０１４１】
実施例5
Xcellerate拡大法におけるCD4+ Tメモリー（「抗原経験」）T細胞の評価
この実施例では、Xcellerate（商標）拡大法においてCD4 T細胞サブセットを評価するためのモデル系を説明する。
【０１４２】
毒素性ショック症候群毒素（TSST）は、TCR Vβ2を発現させるCD4+ T細胞を特異的に刺激するスーパー抗原である。PBMCは1〜25％のVβ2 TCR T細胞から構成されている。T細胞が対数増殖期を脱するまでPBMCをTSSTで9〜14日間刺激することによって、CD4＋Vβ2特異的細胞株が作製される。次に、これらの「抗原経験」Vβ2 T細胞を培養物全体に対して様々な割合（例えば10%、2%）で、Vβ2枯渇ナイーブPBMC培養物と共に混合し直し、Xcellerate（商標）法により、本明細書に記載する様々なビーズ：細胞比のCD3/CD28ビーズで刺激する。
【０１４３】
結果は、TSST拡大したCD4+ Vβ2 TCR T細胞の存在が総T細胞Xcellerate（商標）拡大を阻害せず、総T細胞増加倍率は正常範囲内であることを示した。さらに、他の実験を裏付けるように、抗原特異性が拡大中に保たれ、抗原経験Vβ2 TCR T細胞は1:10および1：30のビーズ：細胞比で、よく拡大した。
【０１４４】
実施例6
様々な抗CD3：抗CD28抗体比を使ったT細胞拡大
3×28 DYNABEADS（登録商標）M-450上の様々な濃度の抗CD3：CD28抗体比を使って、T細胞拡大を評価した。ここに記載する実験では、米国特許出願第10/187,467号に記載されているように、XCELLERATE II（商標）と呼ばれる方法を使用した。簡単に述べると、この方法は、実施例3に記載したXCELLERATE I（商標）に似ていて、独立した単球枯渇段階を用いず、一部の方法では、ビーズとの最初の接触前に細胞を凍結し、さらなる濃縮および刺激を行なうなど、いくつかの変更点がある。図6に示すように、驚いたことに、ビーズ上の抗体が1：10の抗CD3：CD28比で、培養8日後に約68倍の拡大が観察された。ビーズ上1：3のCD3：CD28比では、培養8日後にT細胞の35倍の拡大が見られた。1：1の比では、約24倍の拡大が見られた。図7に示すように、CMVpp65特異的CD8＋T細胞でも、1：30という低い抗CD3：抗CD28抗体比を使って、同様の結果が観察された。
【０１４５】
実施例7
Xcellerate法およびWave Bioreactorを使ったT細胞拡大
この実施例では、本質的に米国特許出願第10/350,305号、同第10/187,467号、同第10/133,236号、同第09/960,264号、同第09/794,230号、PCT/US01/06139、およびPCT/US02/28161に記載されているXcellerate II法を使用した後、Wave Bioreactorに細胞をプレーティングすることによるT細胞拡大を説明する。
【０１４６】
Xcellerate法の0日目
Xcellerate法の最初の日は、本質的に、必要な数の低温保存したCryocte（商標）容器を貯蔵冷凍庫から取り出し、融解し、洗浄し、濾過した。
【０１４７】
0日目
次に、約0.5×109個のCD3＋細胞を含有する細胞液量を、Dynabeads M-450 CD3/CD28 Tと、3：1のDynabeads M-450 CD3/CD28 T：CD3＋ T細胞比で混合し、回転させながらインキュベートした。インキュベーション後に、CD3＋T細胞を磁気的に濃縮すると同時に活性化した。次に、CD3＋T細胞をLifecell細胞培養バッグ中の完全培地に再懸濁した。次に、細胞およびビーズを含有するバッグを、患者専用インキュベータ（37℃、5％CO2）に入れた。
【０１４８】
3日目またはその付近
CD3＋細胞を約3日間培養拡大し、その時点で、1つのバッグの内容物を4つの新しいLifecellバッグに分割する。次に、それら4つのバッグを患者専用インキュベータ（37℃、5％CO2）に戻した。
【０１４９】
5日目またはその付近
CD3＋細胞をさらに約2日間培養拡大し、その時点で、培養バッグの内容物を、今度は体積10Lの培地を含有する20L Wave Bioreactorにプレーティングした。次に、15振動/分の揺動運動および1ml/分の灌流速度で、細胞を37℃、5％CO2で培養した。
【０１５０】
細胞数を毎日決定し、静置Xcellerate II法を使って刺激、拡大した細胞と比較した。細胞をWave Bioreactorで培養すると、拡大が劇的に向上された。さらに、細胞密度は、Wave Bioreactorでは、50×106細胞/mlにも達した。これに対し、静置Xcellerate II法で観察された最大細胞密度は5×106だった。Wave Bioreactorを用いることにより、約0.5×109個の出発細胞数から、約8000億個の総細胞数が培養12日目に達成された。
【０１５１】
このようにWave Bioreactorは、拡大工程に予想外の劇的な向上をもたらす。さらに、Wave Bioreactorを用いることにより、これまでに観察されたことのない細胞密度および最終絶対細胞収量が達成された。
【０１５２】
本発明の特定の態様を、例示のために本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を加え得ることは、上記から理解されると思われる。したがって本発明は本願特許請求の範囲による限定以外の限定を受けない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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