(57)【要約】【課題】  アナライトの検出、特に均一系試験を用いるアナライトの検出における測定シグナルの改善。【解決手段】  １個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーＲ１に会合しており、特異的結合パートナーＸのための追加の結合部位を有する第１の担体分子、および１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーＲ２に会合しており、特異的結合パートナーＹのための追加の結合部位を有する第２の担体分子、を有する、複合体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーＲ１に会合しており、特異的結合パートナーＸのための追加の結合部位を有する第１の担体分子、および１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーＲ２に会合しており、特異的結合パートナーＹのための追加の結合部位を有する第２の担体分子、を有する、複合体。
【請求項２】
担体分子が、デキストラン、シクロデキストリン又はデンドリマー又は一緒に共有結合している抗体、アルブミン分子、酵素又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
特異的結合パートナーＸ又はＹのための追加の結合部位が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール又は一本鎖核酸鎖からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
担体分子が、１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに共有結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
特異的結合パートナーＸ又はＹのための少なくとも２個、好ましくは５個より多い、特に好ましくは１０個より多い、更に特に好ましくは１５個より多い、最適には１８個より多い追加の結合部位を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
抗体がマウス又はヤギＩｇＧ抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体が、微粒子に結合した特異的結合パートナーＸ又はＹによって結合されている微粒子、特にラテックス粒子。
【請求項８】
シグナル生成系の成分として、光増感剤又は化学発光物質に会合している、請求項７に記載の微粒子。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の１個若しくはそれ以上の複合体及び／又は請求項７又は８に記載の微粒子を含む試薬。
【請求項１０】
請求項９に記載の試薬を含有する試験キット。
【請求項１１】
サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的の均一系又は不均一系結合試験における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体、請求項７又は８に記載の微粒子又は請求項９に記載の試薬の使用。
【請求項１２】
シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＸ及びＹのそれぞれのための特異的結合部位を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で使用する結合試験。
【請求項１３】
特異的結合パートナーＸ及びＹの各々のための結合部位の数が、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、更に特に好ましくは少なくとも１５個である、請求項１２に記載の結合試験。
【請求項１４】
Ｘ及びＹが、同一の特異的結合パートナー又は異なる特異的結合パートナーである、請求項１２又は１３に記載の結合試験。
【請求項１５】
Ｘ又はＹが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素に特異的に結合できる抗体からなる群より選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の結合試験。
【請求項１６】
シグナル生成系の成分が、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔てられ、この隔たりが、これらの成分間の相互作用、特にエネルギー移動を可能にし、そしてこの相互作用の大きさを測定する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の結合試験。
【請求項１７】
シグナル生成系の成分が、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔られ、この隔たりが、これらの成分間の相互作用を可能にしないか又は極めて僅かな相互作用だけを可能にし、特にエネルギー移動を全く可能にしないか又は極めて僅かなエネルギー移動だけを可能にし、そしてこの相互作用の残留した大きさを測定する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の結合試験。
【請求項１８】
シグナル生成系の成分が、微粒子、好ましくはラテックス粒子である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の結合試験。
【請求項１９】
シグナル生成系の成分が、微粒子に会合した光増感剤及び微粒子に会合した化学発光物質である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の結合試験。
【請求項２０】
試験がイムノアッセイである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の結合試験。
【請求項２１】
試験が均一系結合試験である、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の結合試験。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する方法及びこの目的に適する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アナライトを検出する目的で、結合試験がしばしば用いられ、この結合試験では、検出すべきアナライトがアナライト特異的結合パートナーに特異的に結合することが、サンプル中のアナライトの存在、欠乏又は量に関する結論を導き出すのを可能にする。イムノアッセイ又はオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドをハイブリダイズする方法は、結合試験の例である。
【０００３】
「不均一系結合試験」と呼ばれるものは、一つ又はそれ以上の分離段階及び／又は洗浄段階を特徴とする。分離は、例えば、免疫沈降、ポリエチレングリコール若しくは硫酸アンモニウムのような物質を用いる沈殿、濾過、磁気分離又は固相への結合により行うことができる。このような「固相」は、たいてい水に不溶性の多孔質及び／又は無孔質材料である。それは、例えば：容器、小さいチューブ、マイクロタイタープレート、球体、微粒子、ロッド若しくはストリップ、又は濾紙若しくはクロマトグラフィー紙、その他の極めて広範囲の形態をとることができる。サンドイッチフォーマットでの不均質系結合試験の場合には、一方のアナライト特異的結合パートナーは、たいてい固相に結合し、そして「アナライト／アナライト特異的結合パートナー」結合複合体を液相から分離するために用いられるが、他方のアナライト特異的結合パートナーは、結合複合体を検出する目的で検出可能なラベル（例えば酵素、蛍光ラベル又は化学発光ラベルなど）を担持している。これらの試験方法は、２個の特異的結合パートナーをサンプルと同時にインキュベートする一段階サンドイッチ試験と呼ばれる方法、及びサンプルを先ず第一に固相試薬と共にインキュベートし、そして分離及び洗浄段階の後に、アナライト及びアナライト特異的結合パートナーからなる固相に結合した複合体を検出試薬と共にインキュベートする二段階サンドイッチ試験と呼ばれる方法にさらに細分される。
【０００４】
「均質系結合試験」においては、シグナル生成系の遊離成分と、系中の「アナライト／アナライト特異的結合パートナー」複合体に結合した成分との分離は行われない。アナライト特異的結合パートナー、シグナル形成成分及びサンプルを含有する試験混合物は、結合反応の後に、又はその間でさえも、さらに分離及び／又は洗浄することなく測定され、そして相当する測定シグナルが決定される。均一系イムノアッセイの例（Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology, 7: 401-414 も参照）は、多くの濁度法又は比濁法（これにより、検出のために用いられるアナライト特異的結合パートナーをラテックス粒子に会合（associate）させることができる）；EMIT（登録商標）試験；CEDIA（登録商標）試験；蛍光−偏光イムノアッセイ；発光酸素チャネリングイムノアッセイ（「ＬＯＣＩ」、EP-A2-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5426-5430; Ullman et al., (1996) Clinical Chemistry, 42: 1518-1526）；その他である。均一系サンドイッチイムノアッセイ、例えば比濁ラテックス試験においては、抗体試薬をサンプルと一緒にインキュベートし、そしてシグナルをインキュベーションの間及び／又はその後に測定するが、測定に先立って分離又は洗浄段階を行わない。別の言葉で表現すれば：抗体に結合したアナライトは、遊離アナライトから、又はどのアナライトも結合していない抗体から分離されない。
【０００５】
均一系及び不均一系結合試験はまた、「サンドイッチアッセイ」と呼ばれる試験の形態で行うことができる。この場合、アナライトは、例えば不均一系結合試験では、固相に会合したアナライト特異的結合パートナー及びシグナル生成系の成分に会合しているアナライト特異的結合パートナーによって結合される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体又は抗原又はハプテンは、アナライト特異的結合パートナーであってよい。
【０００６】
「間接イムノアッセイ」は、均一系及び不均一系結合試験の別の特定の実施形態である。この場合、アナライトは抗体である。一方のアナライト特異的結合パートナーは、検出すべき抗体（＝アナライト）の抗原、又は修飾抗原であり、そして他方のアナライト特異的結合パートナーは、たいてい免疫グロブリン結合タンパク質、例えば検出すべき抗体（＝アナライト）に特異的に結合できる抗体である。
【０００７】
均一系及び不均一系「競合的結合試験」において、サンプルアナライト及び試薬アナライト（例えば標識したアナライト、アナライト断片又はアナライト類似体のような「修飾アナライト」）は、限られた数のアナライト特異的結合パートナーへの結合をめぐって競争する。原理を説明するための例は：(ｉ)サンプルアナライトが、シグナル生成系の成分に会合している試薬アナライトと、固相に会合したアナライト特異的結合パートナーへの結合をめぐって競争するか、又は(ii)サンプルアナライトが、固相に会合したアナライト（＝試薬アナライト）と、シグナル生成系の成分に会合しているアナライト特異的結合パートナーへの結合をめぐって競争する。
【０００８】
しかしながら、多くの結合試験において、試薬を調製する際に大きな困難が生じる。なぜならば、アナライト特異的結合パートナーが固相又はシグナル生成系の粒状成分（例えば微粒子）に結合することは、このように結合しているアナライト特異的結合パートナーに活性を失わせ、そして／又はこれらの結合パートナーの特性（例えば立体構造又は安定性に関する）の変化を生じさせるからである。これは、結合しているアナライト特異的結合パートナーがタンパク質、例えば抗体又は酵素である場合に、特に当てはまる。
【０００９】
従って、「万能試薬」と呼ばれるものを導入することにより、この問題を改善する試みがなされている（例えば、EP-0 105 714 参照）。このように、EP-0 245 926 によれば、万能固相試薬として、ビオチニル化アナライト特異的結合パートナーが結合されるアビジン被覆固相を用いることにより、アナライトを検出することができる。他の方法は、例えば、万能検出試薬として用いられるストレプトアビジン／酵素複合体に結合できるビオチニル化アナライト特異的結合パートナーを使用する。しかしながら、これらの試験において、分離段階、例えば洗浄段階は、試験を行う際に必須の要素である。
【００１０】
万能試薬の使用に関する特別の困難は、粒状万能試薬（例えばストレプトアビジン被覆微粒子）の使用に基づく均一系結合試験において特に生じる。アナライト特異的結合パートナーが２価又は多価であるならば、すなわち、粒状万能試薬のための２個又はそれ以上の結合部位を有するならば（例えば、それが、２個又はそれ以上のビオチン分子が結合された抗体であるならば）、これは、サンプル中にアナライトが存在しなくても、微粒子を凝集させることになるだろう。これは次いで間違った決定値をもたらすだろう。従って、EP-0 356 964、EP-0 349 988 及び EP 0 444 561 によれば、このような均一系試験を実
施できるためには、アナライト特異的結合パートナーが万能試薬に関して１価であること、すなわち結合パートナーが万能試薬（例えばストレプトアビジン−ラテックス粒子）のための１個だけの結合部位を有することが不可欠であると考えられる。均一系ＬＯＣＩ試験の場合にも（EP-0 515 194 参照）、発明者らは、測定シグナルの生成が、それぞれの
場合に１個の増感剤粒子及び１個の化学発光体粒子からなる粒子ペアの形成に依存することを指摘している（Ullman et al., (1996) Clinical Chemistry, 42: 1518-1526）。こ
れらの方法の欠点は、相当するアナライト特異的結合パートナー上の結合部位の数を正確に制御しなければならないことである。
【００１１】
EP-0 138 297 は、別のアプローチを行っている。この場合、アビジン被覆ラテックス
粒子に結合されるべきであるビオチニル化抗体の数は、遊離ビオチンの添加を必要とすることによって制御される。しかしながら、この種の手段は、試薬安定性及び試験の分析感度の両者に対して負の効果を有する。さらに、この場合の万能試薬は、実際の試験方法に先立って相当するアナライト特異的結合パートナーと反応し、すなわちビオチン／アビジン橋によってラテックス粒子に結合された抗体が、試験に採用されるべき試薬を構成する。これは、万能試薬を、実施されるべき試験に応じて、異なるアナライト特異的結合パートナーと共に分析装置において使用できないという欠点をこうむる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、特に均一系試験手順を用いてアナライトを検出するための、上記の欠点を示さない改善された方法を開発することであった。この種の方法は、自動分析装置において特に有利に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この目的は、請求項に記載されている新規な方法及び材料を提供することによって達成される。
【００１４】
新規方法は、この目的を、アナライト特異的試薬（アナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２）から独立して特定の関心物に対して調節できる万能試薬（アナライト特異的結合パートナーＸ又はＹ、それらの各々はシグナル生成系の成分に関連している）を利用できるようにすること、そしてアナライトを高度の感度及び精度で検出できるようにすることによって達成する。
【００１５】
シグナル生成成分のアナライト特異的結合パートナーは、互いに独立して使用できるので、そしてアナライト特異的結合パートナー及びシグナル生成成分は、互いに独立して所定の必要条件に対して最適に調節できるので、本発明はまた、均一系結合試験の下記の一般的問題、すなわち最適な区別及び最適な感度に関する互いに相反する必要条件をも解決する：一方では、できるだけ低いバックグラウンドシグナルを確保するように試薬の濃度を限定すべきであり、そして他方では、単位時間当たりの満足すべきシグナルの変化を達成するために、試薬は高度に濃縮され且つ高度に標識されるべきである。
【００１６】
新規アナライト特異的結合パートナーＲ１及び／又はＲ２は、それらが、シグナル生成系の成分に会合している各自の特異的結合パートナーＸ又はＹのための２個以上の結合部位を示すという事実を特徴としている。新規方法においては、例えばエネルギー移動の形態で、極めて短い距離で、互いに相互作用できるシグナル生成系の成分を含む万能試薬を使用することが好ましい。
【００１７】
驚くべきことに、所定の万能試薬のための２個以上の結合部位を有するアナライト特異的結合パートナーの均一系試験方法における新規使用は、間違った測定値に導かず、それどころか、バックグラウンドシグナルのアナライト特異的測定シグナルに対する比率の改善でさえある測定値に導くことを見出した（表３及び４参照）。
【００１８】
所定の万能試薬のためのアナライト特異的結合パートナーの結合部位は、好ましくは、アナライト特異的結合パートナーに好ましくは共有結合している小さい分子、例えばハプテン、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、ＤＮＰ又はＦＩＴＣからなることが好ましいので、Ｒ１又はＲ２のアナライト特異的活性又は結合能は、概して損なわれないか又は酷くは損なわれない。結合部位はまた、未変化のアナライト特異的結合パートナーの部分であってもよい。従って、アナライト特異的結合パートナーは、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体によって別の種から特異的に識別される幾つかの結合部位を有するヒトＩｇＧ抗体であってよい。
【００１９】
本発明は、好ましくは、一例において、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出するための均一系方法に関し、アナライト特異的結合パートナーＲ１は、シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＸのための特異的結合部位を有し、そしてアナライト特異的結合パートナーＲ２は、シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＹのための特異的結合部位を有し、これは、シグナル生成系の成分に会合している各自の特異的結合パートナーのための２個以上の結合部位を有するＲ１及び／又はＲ２を含んでいる。本発明の特別の利点は、特異的結合パートナーＸ及び／又はＹ（例えばアビジン、ストレプトアビジン、その他）が、EP-0 138 297 に記載されているよう
に、遊離の「特異的結合部位」（例えばビオチン）の添加により飽和させる必要がないことである。
【００２０】
この新規方法は、特に好ましくは、均一系結合試験、特に均一系イムノアッセイである。既に上記で説明したように、この均一系結合試験は、特にサンドイッチアッセイ、間接的イムノアッセイ又は競合的結合試験の形態で行うことができる。
【００２１】
本発明は、以下の通り特徴づけることができる。
（１）１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに会合している担体分子からなる複合体であって、この複合体が特異的結合パートナーＸ又はＹのための追加の結合部位を有する、上記複合体。
（２）担体分子が、デキストラン、シクロデキストリン又はデンドリマー又は一緒に共有結合している抗体、アルブミン分子、酵素又はそれらの混合物からなる、（１）に記載の複合体。
（３）追加の結合部位が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール又は一本鎖核酸鎖である、（１）又は（２）に記載の複合体。
（４）担体分子が、１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに一緒に共有結合している、（１）〜（３）のいずれかに記載の複合体。
（５）特異的結合パートナーＸ又はＹのための少なくとも２個、好ましくは５個より多い、特に好ましくは１０個より多い、更に特に好ましくは１５個より多い、最適には１８個より多い追加の結合部位を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の複合体。
（６）担体分子が、一緒に共有結合している抗体、好ましくはマウス又はヤギＩｇＧ抗体からなる、（１）〜（５）のいずれかに記載の複合体。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の複合体が、微粒子に結合した特異的結合パートナーＸ又はＹによって結合されている微粒子、特にラテックス粒子。
（８）シグナル生成系の成分として、光増感剤又は化学発光物質に会合している、（７）に記載の微粒子。
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載の１個若しくはそれ以上の複合体及び／又は（７）又は（８）に記載の微粒子を含む試薬。
（１０）（９）に記載の試薬を含有する試験キット。
（１１）サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的の均一系又は不均一系結合試験における、（１）〜（６）のいずれかに記載の複合体、（７）又は（８）に記載の微粒子又は（９）に記載の試薬の使用。
（１２）シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＸのための特異的結合部位を有する（１）〜（６）のいずれかに記載の複合体を、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で使用する結合試験。
（１３）シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＹのための結合部位を有する（１）〜（６）のいずれかに記載のもう一つの他の複合体を、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的でさらに使用する、（１２）に記載の結合試験。
（１４）特異的結合パートナーＸのための結合部位の数が、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、更に特に好ましくは少なくとも１５個である、（１２）又は（１３）に記載の結合試験。
（１５）特異的結合パートナーＹのための結合部位の数が、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、更に特に好ましくは少なくとも１５個である、（１２）又は（１３）に記載の結合試験。
（１６）Ｘ又はＹが、同一の特異的結合パートナー又は異なる特異的結合パートナーである、（１２）〜（１５）のいずれかに記載の結合試験。
（１７）Ｘが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素に特異的に結合できる抗体である、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の結合試験。
（１８）Ｙが、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素に特異的に結合できる抗体である、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の結合試験。
（１９）シグナル生成系の成分が、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔てられ、この隔たりが、これらの成分間の相互作用、特にエネルギー移動を可能にし、そしてこの相互作用の大きさを測定する、（１２）〜（１８）のいずれかに記載の結合試験。
（２０）シグナル生成系の成分が、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔られ、この隔たりが、これらの成分間の相互作用を可能にしないか又は極めて僅かな相互作用だけを可能にし、特にエネルギー移動を全く可能にしないか又は極めて僅かなエネルギー移動だけを可能にし、そしてこの相互作用の残留した大きさを測定する、（１２）〜（１８）のいずれかに記載の結合試験。
（２１）シグナル生成系の成分が、微粒子、好ましくはラテックス粒子である、（１２）〜（２０）のいずれかに記載の結合試験。
（２２）シグナル生成系の成分が、微粒子に会合した光増感剤及び微粒子に会合した化学発光物質である、（１２）〜（２１）のいずれかに記載の結合試験。
（２３）試験がイムノアッセイである、（１２）〜（２２）のいずれかに記載の結合試験。
（２４）試験が均一系結合試験である、（１２）〜（２０）のいずれかに記載の結合試験。
【００２２】
本発明を記述するために使用してきた幾つかの用語を、以下にさらに詳細に説明する：
「定量的検出」は、系中のアナライトの量、濃度又は活性を測定する。「定性的検出」という用語はまた、系中のアナライトのおよその量、濃度若しくは活性だけを記録するか又は相対的な量、濃度若しくは活性の指示を与えるためにだけ使用できる半定量的方法を包含する。「定量的検出」は、単純に、アナライト又はその活性がサンプル中に存在するか存在しないかを検出するか、又はサンプル中のアナライトの量、濃度又は活性が一つの特定の閾値又は幾つかの特定の閾値よりも高いか低いかを示すことを意味すると理解すべきである。
【００２３】
「アナライト」という用語は、新規方法で検出すべき物質を意味すると理解すべきである。アナライトの例は、EP-A2-0 515 194の８〜15頁に列記されている。アナライトは、
特異的結合ペアの構成員であってよい。アナライトは、１個の結合部位（１価、普通はハプテン）又は幾つかの結合部位（多価）を有することができる。免疫化学的試験において、このような結合部位は、多くの場合にエピトープとも呼ばれる。加えて、アナライトは、少なくとも１個の単一共有結合部位を有する単一化合物又は化合物群であってよい。
【００２４】
１価のアナライトは、約 100〜2000、特に 125〜1000 の分子量を一般的に有する。多
くのオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、医薬品、薬剤、代謝物、農薬、その他が、１価アナライトという用語によって包含される。多価アナライトは、2000 を超
える、普通は 10,000 を越える超の分子量を一般的に有する。多価アナライトの例は、ポリペプチド、多糖、核酸、細胞、細胞成分（染色体、遺伝子、ミトコンドリア及び他の細胞小器官を包含する）、細胞膜、その他である。タンパク質は多くの場合に、検出すべき物質である。これらのタンパク質は、類似の構造的特性及び／又は類似の生物学的機能を特徴とするタンパク質ファミリーの構成員であってよい。分析的に関心のあるタンパク質ファミリーの例は、病原性タンパク質、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、腫瘍マーカー、代謝マーマー、組織特異的抗原、ヒストン、アルブミン、グロブリン、硬タンパク質、燐タンパク質、ムチン、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、受容体、ＨＬＡ、凝固因子、心筋梗塞マーカー（例えばミオグロブリン、トロポニン、プロ−ＢＮＰなど）、その他である。分析的に関心のある他の物質の例は、一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明の意義の範囲内で、「サンプル」は、検出すべき物質（「アナライト」）を含有することが疑われる物質であることを意味すると理解すべきである。例えば、サンプルという用語は、特にヒト又は動物に由来する生物学的な液体又は組織、例えば、血液、血漿、血清、唾液、滲出液、気管支肺胞洗浄液、リンパ液、滑液、精液、膣粘液、糞便、尿、髄液、毛髪、皮膚及び組織のサンプル又は組織切片を包含する。この用語はまた、細胞培養サンプル、植物の液体又は組織、法医学サンプル、水及び廃液のサンプル、食品及び医薬品を含む。
【００２６】
加えて、「サンプル」という用語はまた、担体物質から放出されるか又は増幅される形態で検出すべき物質（「アナライト」）を含有していてもよい前処理したサンプルを包含する：多数のサンプルは、アナライトを検出方法に利用できるようにするため、又は干渉するサンプル成分を除去するために前処理しなければならない。サンプルのこのような前処理は、細胞の分離及び／又は溶解、タンパク質のようなサンプル成分の沈殿、加水分解又は変性、サンプルの遠心分離、アルコール、特にメタノールのような有機溶剤によるサンプルの処理；又は界面活性剤によるサンプルの処理を伴うことができる。サンプルは多くの場合、検出方法へのできるだけ少ない干渉を意図した別の媒質、普通は水性媒質に移される。アナライトを増幅してもよい。核酸の増幅は、例えば、検出すべき核酸鎖の一つ又はそれ以上のコピーの生成に導く。このような増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑベータレプリカーゼを用いる増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、単一プライマー増幅（ＡＳＰＰ）、その他は、当業者によく知られている。
【００２７】
「アナライト特異的結合パートナー」は、アナライトに特異的に結合できる特異的結合パートナー、又は別のアナライト特異的結合パートナーに結合できる特異的結合パートナー（例えば修飾アナライト）のいずれかであると理解すべきである。概して、「修飾アナライト」は、アナライト特異的結合パートナーに少なくとも結合できるが、結合部位を持たないか又は追加の結合部位を有する点でサンプルアナライトとは異なる物質、例えばビオチニル化アナライトであるか、又はシグナル生成系の成分に関連しているアナライトである。修飾アナライトは、例えば競合的試験に用いられる。
【００２８】
「特異的結合パートナー」は、特異的結合ペアの構成員であると理解すべきである。特異的結合ペアの構成員は、２個の分子であり、それらの各々は、他方により所有される構造と相補的である少なくとも一つの構造を有し、２個の分子は相補的構造間での結合によって特異的に一緒に結合することができる。これに関して、分子という用語はまた、分子複合体、例えばアポ酵素及び補酵素からなる酵素、幾つかのサブユニットからなるタンパク質、タンパク質及び脂質からなるリポタンパク質、その他を包含する。特異的結合パートナーは、天然に由来する物質、又はそのほかに、例えば化学合成、微生物学的技術及び／又は組み換えＤＮＡ方法により製造される物質であってよい。このように、今では、ファージ提示ライブラリー、合成ペプチドデータベース又は組み換え抗体ライブラリー（Larrick & Fry (1991) Human Antibodies and Hybridomas, 2: 172-189）を用いて特異的結合パートナーを選択することが可能である。特異的結合パートナーという用語を説明する目的で、下記のものを例として挙げることができるが、これは如何なる限定とも考えられない：チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結合タンパク質、その他。特異的結合ペアの例は：抗体−抗原、抗体−ハプテン、ジゴキシゲン／抗ジゴキシゲン抗体、フルオレセイン／抗フルオレセイン抗体、オペレーター−リプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、レクチン−多糖、ステロイド−ステロイド結合タンパク質、活性化合物−活性化合物受容体、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡ、補体オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、その他である。均一系遺伝子プローブ試験と呼ばれるものにおいて、特異的結合パートナーは、概して、検出すべき核酸鎖のセグメントに少なくとも部分的に相補的である核酸鎖である。
【００２９】
本発明の意義の範囲内で、「抗体」という用語は、免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4又はＩｇＭのクラス又
はサブクラスの免疫グロブリンを意味すると理解すべきである。抗体は、抗原又はハプテン上のエピトープ（しばしば抗原決定基とも呼ばれる）のための少なくとも１個の結合部位（しばしばパラトープと呼ばれる）を有する。このようなエピトープは、例えば、その空間的構造、及び／又は極性基及び／又は無極性基の存在を特徴とする。抗体により所有される結合部位は、エピトープに相補的である。抗原−抗体反応又はハプテン−抗体反応は、「キー−ロック原理」と呼ばれるものによって機能し、そして概して高度に特異的であり、すなわち抗体は、抗原又はハプテンの一次構造、電荷、空間的配置及び立体的配列の僅かな相違を識別することができる。抗体により所有される相補的決定領域と呼ばれるものは、抗体が抗原又はハプテンに結合するのに特に貢献する。
【００３０】
「抗原」という用語は、１価又は多価の抗原を包含する。多価抗原は、２個以上の免疫グロブリンが同時に結合できる分子又は分子複合体であるが、１価抗原には、常に１個だけの単一抗体が結合することができる。それ自体は免疫原性でないが、普通には免疫付与の目的で担体に結合する分子は、一般的にハプテンと呼ばれる。
【００３１】
本発明の意義の範囲内で、抗体という用語は、完全な抗体だけでなく、明示的に、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂ’；そしてまた、キメラ、ヒト化、二重特異的、オリゴ特異的又は一本鎖の抗体；さらに、抗原又はハプテンに結合する特性が保持される限り、免疫グロブリン及び／又はそれらの断片の凝集体、ポリマー及び複合体も意味すると理解すべきである。抗体断片は、例えば、ペプシン又はパパインのような酵素を用いて抗体を酵素的に切断することにより製造することができる。抗体凝集体、抗体ポリマー及び抗体複合体は、広範囲の方法を用いて、例えば熱処理、グルタルアルデヒドのような物質との反応、免疫グロブリン結合分子との反応、抗体のビオチニル化及びその後にそれらとストレプトアビジン又はアビジンとの反応、その他によって作製することができる。
【００３２】
本発明の意義の範囲内で、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。抗体は、慣用方法を用いて、例えば、ヒト又は動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ラクダ、ウマ、ヒツジ、ヤギ又はニワトリ（Messerschmid (1996) BIOforum, 11: 500-502 も参照）に免疫付与し、その後に抗血清を単離すること；又はそのほかに、ハイブリドーマ細胞を確立し、その後に分泌された抗体を精製すること；又はそのほかに、天然抗体が抗原及び／又はハプテンに結合する原因であるアミノ酸配列をコードする核酸配列又はその修飾バージョンをクローン化し、そして発現することによって製造されたものであってよい。組み換えＤＮＡ方法もまた、適切ならば、植物、例えば酵母細胞（Fischer et al. (1999) Biol. Chem., 380: 825-839; Hiatt et. al. (1992) Genetic Engineering, 14, 49-64）、動物細胞、原核細胞（例えば、WO 95/25172 参照）及び単離ヒト細胞において抗体を製造するために用いることもできる。
【００３３】
「シグナル生成系」は、１個又はそれ以上の成分からなっていてよく、成分の少なくとも１個は検出可能なラベルである。ラベルは、それ自体がシグナルを生成するか又はシグナル、例えば蛍光物質、放射性物質、酵素又は化学発光物質の生成を誘導できる任意の分子であると理解すべきである。シグナルは、例えば、酵素活性、発光、光吸収、光散乱、放出された電磁波若しくは放射能の放射、又は化学反応を用いて検出又は測定することができる。
【００３４】
「ラベル」は、それ自体が、他の成分を必要としないで、検出可能なシグナルを生成することができる。多くの有機分子は紫外線及び可視光線を吸収し、これらの分子は、光の吸収によりエネルギーが移動された結果として、励起されたエネルギー状態になることができ、そして吸収されたエネルギーを入射光とは異なる波長の光の形態で放出する。さらにまた、他のラベル、例えば放射性同位体、染料又は磁性及び非磁性微粒子は、検出可能なシグナルを直接生成することができる。
【００３５】
さらにまた、他のラベルは、シグナルを生成するためにさらなる成分を必要とし、すなわち、このような場合には、シグナル生成系は、シグナルを生成するために必要である全ての成分、例えば基質、補酵素、消光剤、促進剤、追加の酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、活性剤、補因子、阻害剤、イオン、その他を含む。
【００３６】
好適なシグナルの例（EP-A2-0 515 194; US 5,340,716; US 5,545,834; Bailey et al.(1987) J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 5: 649-658 も参照）は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを包含する酵素；染料；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、臭化エチジウム、5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホニルクロリド及び希土類の蛍光キレートを包含する蛍光物質；ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質；エオシン、9,10−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、ポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル及びローズベンガルを包含する増感剤；補酵素；酵素基質；125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、59Ｆｅ、57Ｃｏ及び75Ｓｅを包含する放射性同位体；磁性粒子、又はそれら自体が例えば染料、増感剤、蛍光物質、化学発光物質、同位体若しくは他の検出可能なラベルで標識されていてもよい粒子、好ましくはラテックス粒子を包含する粒子；金ゾル又は銀ゾルを包含するゾル粒子；それら自体が検出可能なラベルで標識されていてもよいリポソーム又は細胞；その他である。
【００３７】
シグナル生成系はまた、相互に空間的に接近したときに、例えば、エネルギー供与体及びエネルギー受容体、例えば光増感剤及び化学発光物質（EP-A2-0 515 194）、光増感剤及び発蛍光団（WO 95/06877）、放射性ヨウ素125及び発蛍光団（Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676）、発蛍光団及び発蛍光団（Mathis (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959）又は発蛍光団及び蛍光消光剤（US 3,996,345）の形態で、検出可能な相互作用に入ることのできる成分を含んでいてもよい。
【００３８】
成分間の相互作用は、例えば、光又は電子の放射の結果として、そしてまた短命の化学分子による成分間のエネルギーの直接移動を包含する。加えて、それはまた、１個の成分の活性が１個又はそれ以上の成分により阻害又は増大される過程、例えば酵素活性の阻害又は増加、又は影響された成分により放出された電磁波放射の阻害、増加又は変化（例えば波長シフト、分極）を包含する。成分間の相互作用はまた、酵素カスケードを包含する。この場合に成分は酵素であり、それらの少なくとも１個は別の酵素のための基質を供給し、これによって最大又は最小速度を有する共役基質反応が生じる。
【００３９】
概して、成分間の有効な相互作用は、これらの成分が空間的に隣接している場合に、すなわち、例えば数μｍの距離範囲内で、特に 600 nm 未満、好ましくは 400 nm 未満、実に特に好ましくは 200 nm 未満の距離範囲内で行われる。
【００４０】
実に特に好ましい本発明に係る方法において、シグナル生成系は、微粒子に関連した光増感剤及び微粒子に関連した化学発光物質を含む。
【００４１】
微粒子は、多くの場合に固相として及び／又はラベルとして用いられる。本発明の意義の範囲内で、「微粒子」という用語は、少なくとも 20 nm、そして 20μm 以下、一般的に 40 nm〜10μm、好ましくは 0.1〜10μm、特に好ましくは 0.1〜５μm、実に特に好ましくは 0.15〜２μmの概略直径を有する粒子を意味すると理解すべきである。微粒子は、規則的又は不規則的な形状を有していてよい。それらは、球体、回転楕円球体、又は大きいか若しくは小さいサイズの空洞若しくは孔を有する球体であってよい。微粒子は、有機材料若しくは無機材料から、又は両方の材料の混合物若しくは組み合わせからなっていてよい。それらは、多孔質又は無孔質材料から、そして膨潤性又は非膨潤性材料からなっていてよい。微粒子は、原則として如何なる密度のものであってもよいが、水に近似する密度、例えば約 0.7〜約 1.5g／ml の密度の粒子が好ましい。好ましい微粒子は、水溶液に懸濁することができ、そして懸濁液中でできるだけ長期間安定である。それらは、透明、半透明又は不透明であってよい。微粒子は、複数の層からなっていてよく、例えばコア−シェル粒子と呼ばれるものからなっていてよく、これはコア及び一つ又はそれ以上の被膜層を有する。微粒子という用語は、例えば、染料結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、磁性粒子、ポリマー粒子、油滴、脂質粒子、デキストラン及びタンパク質凝集体を包含する。好ましい微粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料、特に置換されたポリエチレンからなる粒子である。実に特に好ましいものは、ラテックス粒子、例えばポリエチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートである。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子（これらの基は特異的結合パートナーが、例えば、ラテックス粒子に共有結合するのを可能にする）は、特に興味深い。ラテックス粒子の製造は、例えば、EP 0 080 614、EP 0 227 054 及び EP
0 246 446 に記載されている。
【００４２】
「会合している（会合した）」という用語は、広く考えるべきであり、そして例えば、共有結合及び非共有結合、直接結合及び間接結合、表面への吸収及び陥入部又は空洞中の封入、その他を含む。共有結合の場合には、特異的結合パートナーは、例えば、化学結合によってラベルに結合される。共有結合は、一般的に、第一の分子の少なくとも１個の原子核が第二の分子の少なくとも１個の原子核と電子を共有する場合に２個の分子間に存在すると言われる。非共有結合の例は、表面吸着、空洞中の封入又は２個の特異的結合パートナーの結合である。ラベルの直接結合に加えて、特異的結合パートナーはまた、他の特異的結合パートナーとの特異的相互作用によって間接的にラベルに結合されることができる。これは一例として、次のように説明されるだろう：ビオチニル化された抗フルオレセイン抗体は、ラベルに結合したアビジンによって結合されることができる。
【００４３】
微粒子は、例えばサンプル成分が粒子表面に非特異的に結合するのを抑制又は防止するために、又は例えば懸濁安定性、貯蔵中の安定性、立体構造安定性又はＵＶ線、微生物若しくは破壊効果を有する他の物質に対する抵抗性に関して改善を達成するために、例えばタンパク質、炭水化物、バイオポリマー、有機ポリマー又はそれらの混合物から構成された一つ又はそれ以上の層からなるコーティングを有することができる。従って、このコーティングは、特に、微粒子に共有結合又は吸着により施されたタンパク質層又はポリマー層、例えばシクロデキストリン、デキストラン、ヒドロゲル、アルブミン又はポリアルブミンからなることができる。
【００４４】
本発明方法において、Ｒ１及び／又はＲ２は、アナライトとの結合反応の前、その間又はその後に、Ｘ及び／又はＹによってシグナル生成系の成分に結合させることができる。サンプルを最初にアナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２と共にインキュベートし、次いでその後に特異的結合パートナーＸ及びＹを添加する。しかしながら、試薬はまた、別の順序で添加することができる。
【００４５】
新規な均一系結合試験の特に好ましい実施形態を実施する場合に、サンプルを先ず第一にアナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２と順次に又は同時に混合し、その後に、この混合物に、シグナル生成系の成分を特異的結合パートナーＸ及びＹと一緒に、順次に又は同時に添加する。
【００４６】
新規なアナライト特異的結合パートナーＲ１が特異的結合パートナーＸのために有する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、実に特に好ましくは少なくとも１５個であり、そして新規なアナライト特異的結合パートナーＲ２が特異的結合パートナーＹのために有する結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、実に特に好ましくは少なくとも１５個である。
【００４７】
新規なアナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２はまた、同一のアナライト特異的結合パートナー又は異なるアナライト特異的結合パートナーであってよい。従って、サンドイッチイムノアッセイにおいて、例えば、モノクローナル抗体を、アナライトがこの抗体のための２個以上のエピトープを有するならば、アナライト特異的結合パートナーＲ１及びアナライト特異的結合パートナーＲ２の両者として用いることができる。
【００４８】
新規方法において、アナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２は両者とも、サンドイッチアッセイ又は間接イムノアッセイの場合に、アナライトを特異的に結合することができる。サンドイッチアッセイの場合には、例えば、アナライト特異的結合パートナーは、アナライト特異的抗体であってよく、又はアナライトそれ自体が抗体であるならば、その抗原又は「修飾抗原」又は抗原類似体であってよい。競合的試験セットアップにおいて、新規なアナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２の一方は、修飾アナライトであるべきである。
【００４９】
新規なアナライト特異的結合パートナーＲ１が特異的結合パートナーＸのために有する結合部位は、好ましくはハプテンである。新規なアナライト特異的結合パートナーＲ１が有する結合部位は、特に好ましくはビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸鎖又はジニトロフェノールである。しかしながら、何れの場合にも特異的結合ペアの構成員である他の分子を用いることも可能である。
【００５０】
新規なアナライト特異的結合パートナーＲ２が特異的結合パートナーＹのために有する結合部位は、好ましくはハプテンである。新規なアナライト特異的結合パートナーＲ２が有する結合部位は、特に好ましくはビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸鎖又はジニトロフェノールである。しかしながら、何れの場合にも特異的結合ペアの構成員である他の分子を用いることも可能である。
【００５１】
新規な特異的結合パートナーＸ及びＹは、同一の特異的結合パートナー又は異なる特異的結合パートナーであってよい。新規な特異的結合パートナーＸは、好ましくはアビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖又は抗ハプテン抗体である。しかしながら、それはまた、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素を特異的に結合できる抗体であってよい。新規な特異的結合パートナーＹはまた、アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖又は抗ハプテン抗体であってよい。しかしながら、それはまた、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素を特異的に結合できる抗体であってよい。
【００５２】
新規方法の特に好ましい実施形態において、シグナル生成系の成分は、アナライトがＲ１及び／又はＲ２に結合された結果として、相互に隔てられ、この隔たりは、これらの成分間の相互作用、特にエネルギー移動を可能にする。次いで、この相互作用の残留した大きさを、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で測定する。この方法は、サンドイッチアッセイ及び間接イムノアッセイのために特に適している。
【００５３】
新規方法の別の特に好ましい実施形態において、シグナル生成系の成分は、アナライトがＲ１又はＲ２に結合された結果として、相互に隔てられ、この隔たりは、これらの成分間の相互作用を可能にしないか又は極めて僅かな相互作用だけを可能にし、特にエネルギー移動を全く可能にしないか又は極めて僅かなエネルギー移動だけを可能にする。次いで、この相互作用の残留した大きさを、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で測定する。この方法は、競合的結合試験のために特に適している。
【００５４】
アナライト特異的結合パートナーの特異性又は感度を低下することなく、アナライト特異的結合パートナーが特異的結合パートナーＸ及びＹのために有する結合部位の数の増加を可能にするために、アナライト特異的結合パートナー及び結合部位の両者が結合できる担体分子を導入することが可能である。従って、新規方法において、Ｒ１が担体分子に関連している１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーであり、担体分子が特異的結合パートナーＸのための結合部位を有することができる場合が有利である。さらに、Ｒ２もまた、担体分子に関連している１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーであり、担体分子が特異的結合パートナーＹのための結合部位を有することができる場合が有利である。
【００５５】
本発明に係る特に好ましい実施形態において、Ｒ１及び／又はＲ２は、それぞれの場合にこのような担体分子に関連している。好適な担体分子の例は、タンパク質、例えば抗体、酵素、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン若しくはヒト血清アルブミン、又はタンパク質ポリマー、デキストラン、シクロデキストリン、デンドリマー若しくは類似の構造体である。特に好ましいタンパク質ポリマー又はタンパク質凝集体は、互いに関連しており、好ましくは共有結合している抗体、アルブミン分子、酵素、又はそれらの混合物からなることができる。実に特に好ましいことは、担体分子としてビオチニル化デキストラン及びビオチニル化タンパク質ポリマー（例えばビオチニル化抗体ポリマー）を用いることである。
【００５６】
特に好ましい担体分子は、実施例７に記載したようにして製造することができる。この場合に、ネズミ抗体、好ましくはネズミＩｇＧ抗体は、カップリング試薬を用いて互いに共有結合される。本発明に係る担体分子はまた、同様の方法により、酵素、抗体（例えばマウス又はヤギ抗体、特にＩｇＧ抗体）、アルブミン又はそれらの混合物から製造することができる。特異的結合パートナーＸ又はＹ、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸鎖、ジニトロフェノール、その他を結合するための部位は、当業者に公知の方法を用いて、これらのタンパク質ポリマーに結合させることができ、共有結合が好ましい。
【００５７】
担体分子に会合しているアナライト特異的結合パートナーは、例えば次のようにして製造することができる：アナライト特異的結合パートナー、好ましくは抗体、特に好ましくは抗体断片を、当業者に公知の方法を用いて、例えばカップリング試薬を用いて担体分子に結合させる。この結合は、可能な限り共有結合であるべきである。好適な担体分子は、例えば、ビオチニル化デキストラン（実施例５参照）、又はそのほかに上記の他の担体分子の一つ、特に実施例７に記載した抗体ポリマーのようなものである。ビオチニル化デキストランの場合のように、特異的結合パートナーＸ又はＹを結合するための部位は、アナライト特異的結合パートナーと担体分子との間の反応の前、又は実施例７に記載したように、その後に導入することができる。１個だけよりはむしろ幾つかのアナライト特異的結合パートナーもまた、担体分子に結合させることがでる。しかしながら、幾つかの担体分子を１個のアナライト特異的結合パートナーに結合させることも可能である。
【００５８】
本発明の主題の別の部分は、１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに関連している、好ましくは共有結合している担体分子である。この主題の一つの実施形態において、担体分子は、タンパク質ポリマー、例えば、相互に共有結合している抗体（実施例７参照）、アルブミン分子、酵素又はそれらの混合物であり、これらは特異的結合パートナーＸ又はＹのための結合部位、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、一本鎖核酸鎖、ジニトロフェノール、その他をさらに有することができる。結合部位の数は、１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに関連している担体分子当たり、少なくとも２個、より良好には５個より多く、好ましくは１０個より多く、特に好ましくは１５個より多く、実に特に好ましくは１８個より多くあるべきである。本発明に係るこの実施形態において、アナライト特異的結合パートナーは、好ましくは抗体若しくは抗体断片、抗原、ハプテン又は核酸鎖である。
【００５９】
１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに会合している上記の担体分子を、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で均一系又は不均一系結合試験に、特に均一形又は不均一形イムノアッセイに使用することもまた、本発明による。
【００６０】
以下において、本発明に係る担体分子に会合しているアナライト特異的結合パートナーは、複合体とも呼ばれる。これらの複合体もまた、不均一系結合試験並びに均一系結合試験に有利に使用できることは当然である。
【００６１】
本発明に係る複合体は、１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに関連している担体分子からなり、この複合体は、特異的結合パートナーＸ又はＹのための追加の結合部位を有する。複合体の特別の実施形態において、担体分子は、デキストラン、シクロデキストリン又はデンドリマー又は一緒に結合している抗体、一緒に結合しているアルブミン分子、又は一緒に結合しているそれらの混合物からなる。それらの結合は、好ましくは共有結合であるべきである。本発明に係る複合体により所有される追加の結合部位は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール又は一本鎖核酸鎖であってよい。本発明に係る複合体の特に好ましい実施形態において、担体分子は、１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに共有結合している。本発明に係る複合体は、少なくとも２個、好ましくは５個より多い、特に好ましくは１０個より多い、実に特に好ましくは１５個より多い、最適には１８個より多い、特異的結合パートナーＸ又はＹのための追加の結合部位を有するべきである。実に特に好ましいものは、担体分子が、一緒に共有結合している抗体、好ましくはマウス又はヤギＩｇＧ抗体からなる複合体である。本発明はまた、１個又はそれ以上のこれらの複合体を含有する試薬、及びこのような試薬を含有するキットに関する。
【００６２】
本発明に係る複合体は、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で均一系又は不均一系結合試験（例えばイムノアッセイ）に用いることができる。本発明に係る結合試験、特に均一系結合試験の一つの実施形態において、シグナル生成系の成分に関連している特異的結合パートナーＸを有する本発明に係る複合体は、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で用いることができる。別の実施形態において、シグナル生成系の成分に関連している特異的結合パートナーＹを有する本発明に係るもう一つの複合体は、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的でさらに用いることができる。特異的結合パートナーＸ又はＹのための結合部位の数は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましくは少なくとも１０個、実に特に好ましくは少なくとも１５個であるべきである。Ｘ及びＹは、同一の特異的結合パートナー又は異なる特異的結合パートナーである。アビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗ジニトロフェノール抗体、一本鎖核酸鎖、抗ハプテン抗体、酵素、酵素基質、又は特定のポリペプチド、オリゴペプチド若しくは酵素に特異的に結合できる抗体は、特異的結合パートナーＸ又はＹとして好ましく用いられる。本発明の意義の範囲内で、実に特に好ましいものは、１個又はそれ以上の本発明に係る複合体を用いる結合試験、好ましくは均一系結合試験であり、シグナル生成系の成分は、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔てられ、この隔たりは、これらの成分間の相互作用、特にエネルギー移動を可能にし、次いで、この相互作用の大きさを測定するか、又はシグナル生成系の成分は、アナライト特異的結合パートナーの結合の結果として、相互に隔てられ、この隔たりは、これらの成分間の相互作用を可能にしないか若しくは極めて僅かな相互作用だけを可能にし、特にエネルギー移動を全く可能にしないか若しくは極めて僅かなエネルギー移動だけを可能にし、次いで、この相互作用の残留した大きさを測定する。このような試験において、微粒子、特にラテックス粒子は、シグナル生成系の成分として好ましく用いられる。実に特に好ましいことは、微粒子に関連した光増感剤及び微粒子に会合した化学発光物質をこのような試験方法におけるシグナル生成系の成分として用いることである。
【００６３】
微粒子、特にラテックス粒子を新規方法におけるシグナル生成系の成分として用いることが可能である。微粒子に会合した増感剤、特に光増感剤、及び微粒子に会合した化学発光物質は、シグナル生成系の成分として実に特に好ましい。
【００６４】
従って、微粒子に結合している特異的結合パートナーＸ又はＹによって本発明に係る複合体が結合されている微粒子、特にラテックス粒子、及び新規方法におけるこの微粒子の使用は、本発明の主題の別の部分である。これに関して、好ましいものは、シグナル生成系の成分として、光増感剤及び化学発光物質に会合している微粒子である。
【００６５】
EP-0 515 194 に詳述されたＬＯＣＩ方法に基づく試験は、本発明に係る新規方法の特
に好ましい実施形態である。この試験は、光増感剤及び受容体と呼ばれるものをシグナル生成成分として使用することに基づいている。光を照射すると、光増感剤は、化学発光成分である受容体と反応する一重項酸素を生じる。活性化された化学発光成分は光を生成し、これを測定する。この好ましい方法は、本発明に係るサンドイッチアッセイに基づいて
、より詳細に説明されるだろう：アナライトは、例えば、特異的結合パートナーＸによって、増感剤粒子と呼ばれるものに結合されている担体分子に会合していてもよいアナライト特異的結合パートナーＲ１に結合される。励起状態において、増感剤粒子に会合している増感剤分子は、一重項酸素を生成することができる。この一重項酸素は、化学発光体粒子と呼ばれるものに会合している化学発光体化合物と反応することができ、形成された準安定性化合物はもう一度分解して光フラッシュを生成する。担体分子に会合していてもよいアナライト特異的結合パートナーＲ２は、特異的結合パートナーＹによって化学発光体粒子に結合される。一重項酸素は水溶液中で短時間しか安定でないので、アナライト特異的結合パートナーに会合しており、且つサンドイッチ複合体の形成の結果として、光によって刺激された増感剤粒子の直近に到達した化学発光体粒子は、例えば、刺激されて光を放出する。測定すべき放出された光の波長は、化学発光体粒子において適切な蛍光染料を用いて変更することができる。この方法において、サンプルを好ましくは最初にアナライト特異的結合パートナーＲ１及びＲ２と共にインキュベートし、その後に、それぞれ増感剤粒子及び化学発光体粒子に会合している特異的結合パートナーＸ及びＹを添加する。
【００６６】
新規方法に同様に使用できる他のエネルギー移動方法は、Foerster によるエネルギー移動（Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959; US 5,527,684）、又は光増感剤及び発蛍光団の使用（WO 95/06877）、又は放射線照射及び発蛍光団の組み合わせ（S. Udenfriend et al. (1985) Proc. Math. Acad. Sci. 82: 8672-8676）、又は好適な酵素カスケードの使用（US 4,663,278）に基づいている。
【００６７】
新規方法の別の実施形態において、アナライト特異的結合パートナーＲ１はシグナル生成系の成分に会合しており、そしてアナライト特異的結合パートナーＲ２は、シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＹのための特異的結合部位を有し、Ｒ２は、シグナル生成系の成分に会合している所定の特異的結合パートナーＹのための２個以上の結合部位を有する。
【００６８】
本発明はまた、１個又はそれ以上の本発明に係る担体分子（その担体分子はそれぞれの場合に１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーに会合している）を含有するか、又は本発明に係る微粒子を含有する、液体又は凍結乾燥形態にある試薬に関する。本発明はまた、このような試薬を含有するキットを包含する。これは、サンプル中のアナライトを定量的又は定性的に検出する目的で均一系又は不均一系結合試験を実施するための、好ましくは特許請求項に記載された均一系方法の一つを実施するための、この試薬の使用及び／又は試験キットにも当てはまる。
【００６９】
本発明はまた、本発明に係る均一系結合試験を実施するための試験キットに関する。この試験キットは、それが、シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＸのための２個以上の特異的結合部位を有するアナライト特異的結合パートナーＲ１を含有するという事実、そしてこの試験キットが、シグナル生成系の成分に会合した特異的結合パートナーＹのための２個以上の特異的結合部位を有するアナライト特異的結合パートナーＲ２を含有するという事実を特徴としている。
【００７０】
本発明に係る試験キットはまた、シグナル生成系の成分に会合している特異的結合パートナーＸ及び／又はＹをさらに含有することができる。加えて、本発明に係る試験キットはまた、パック情報説明書、希釈緩衝液、基準物、対照物、系の試薬及び／又は他の試薬及び試験の実施に必要な材料（例えばキュベット及びサンプル抜き取り器具）を含有することができる。
【００７１】
本発明に係る試験キットは、好ましくは、ビオチニル化デキストラン、ビオチニル化タンパク質ポリマー、ビオチニル化抗体ポリマー又別の担体分子に会合している１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーからなるアナライト特異的結合パートナーＲ１、及び／又はビオチニル化デキストラン、ビオチニル化タンパク質ポリマー、ビオチニル化抗体ポリマー又の別の担体分子に会合している１個又はそれ以上のアナライト特異的結合パートナーからなるアナライト特異的結合パートナーＲ２を含有する。
【００７２】
以下に記載する実施例は、本発明の個々の態様を説明するのに役立ち、そして限定を示すと考えるべきでない。
【実施例】
【００７３】
〔実施例１〕
増感剤粒子又は化学発光体粒子の製造
増感剤粒子及び化学発光体粒子の製造は、EP 0 515 194、Clin. Chem. (1996) 42: 1518-1526 及び Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 5426-5430に詳細に記載されている。
粒子は、例えば、デキストラン被膜を担持し、結合したストレプトアビジンをさらに有することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 5426-5430も参照）。増感剤粒子及び化学発光体粒子の変種の製造を、下記に一例として記載する（さらなる詳細についてはEP 0 515 194の実施例８も参照）：
【００７４】
増感剤粒子の製造：
ベンジルアルコール中のクロロフィル−ａの溶液（1.0ml；0.6mM）を、105℃に加熱したベンジルアルコール0.8mlに加える。水中のラテックス粒子（175nm、カルボキシルで修飾したラテックス、Bangs Laboratories, Carmel, IN）の懸濁液（10％；1.0ml）を上記ベンジルアルコール溶液に加える。この混合物を105℃で５分間攪拌し、次いで室温に冷却する。エタノール10mlを加え、この混合物を遠心分離する。ペレットを１：１の水−エタノール混合物（10ml）に再懸濁し、この懸濁液を再度遠心分離する。同じ手順を水を用いて繰り返し、次いでペレットを生理食塩水に入れる。
【００７５】
化学発光体粒子（＝受容体粒子）の製造：
カルボキシルで修飾したラテックス粒子懸濁液（水中の10％懸濁液）20mlを2−エトキシエタノール20mlと混合する。この混合物を90℃に加熱する。2−エトキシエタノール中の10mM ジオキサン、20mM 物質 3−(2−チエノイル)-1,1,1−トリフルオロアセトンとのユーロピウムキレート（Kodak, CAS # 14054-87-6）（EuTTA）及び60mM トリオクチルホスフィンオキシド（TOPO）からなる溶液20mlを上記粒子懸濁液に加える。この混合物を97℃でさらに７分間加熱する。室温に冷却した後、エタノール40mlを加え、この混合物を遠心分離する。次いでペレットを80％エタノールに再懸濁し、遠心分離する。この洗浄工程を10％エタノールを用いて繰り返す。最後に、粒子を生理食塩水に入れる。
【００７６】
〔実施例２〕
万能試薬の製造
ストレプトアビジンを含有する化学発光体粒子（＝受容体粒子）：
受容体粒子 20mgを、ストレプトアビジン（Gerbu から、高純度、#3058）2.0mg及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Sigmaから、S 8628）0.2mgと、カップリング緩衝液（0.05
M β−モルホリノ−エタンスルホン酸；Serva から、Art. 29834）中で一緒に混合し、この混合物を＋37℃で 24時間インキュベートした。インキュベーション中のカップリング条件は：粒子 50mg／カップリング液ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム 0.5mg／カップリング液ml、ストレプトアビジン２mg／粒子 20mgであった。
インキュベーションの後、カルボキシメトキシルアミン半塩酸塩（Aldrich から、98％濃度、Cat. No. C1,340-8）の 0.48 M 溶液 65.6μl を加えて混合し、この混合物を＋37℃でさらに２時間インキュベートした。
上澄み液を遠心分離により分離し、粒子をカップリング緩衝液（0.6 M NaCl を含有する、Merck から）に再懸濁した。その後に、上澄み液を遠心分離により再度分離し、粒子を取り出し、貯蔵緩衝液（0.1 M tris-HCl、0.3 M NaCl、25mM EDTA、0.1％ BSA、0.1％ デキストラン T-500、0.1％ 両性洗浄剤 3-14、0.01％ ゲンタマイシン、15 ppm の ProClin-300、pH 8.0）に再懸濁した。
【００７７】
ストレプトアビジンを含有する増感剤粒子：
増感剤粒子を、「ストレプトアビジンを含有する化学発光体粒子（＝受容体粒子）」のカップリングと同様にしてカップリングさせた。
【００７８】
抗ジゴキシゲニンを含有する増感剤粒子：
増感剤粒子 15mgを、抗ジゴキシゲニン抗体（Mab DIG 2H6、Dade Behring Inc. から）３mg 及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Sigma から、S 8628）0.15mgと、カップリング緩衝液（0.05 M β−モルホリノエタンスルホン酸；Serva から、Art. 29834）中で一緒に混合し、この混合物を＋37℃で 24時間インキュベートした。インキュベーション中のカップリング条件は：粒子 32.8mg／カップリング液ml、抗体 6.6mg／カップリング液ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム 0.33mg／カップリング液ml、抗体３mg／粒子 15mgであった。
インキュベーションの後、カルボキシメトキシルアミン半塩酸塩（Aldrich から、98％濃度、Cat. No. C1,340-8）の0.48M 溶液 49.2μlを加えて混合し、この混合物を＋37℃でさらに２時間インキュベートした。
上澄み液を遠心分離により分離し、粒子をカップリング緩衝液（0.6 M NaCl を含有する、Merck から）に再懸濁した。その後に、上澄み液を遠心分離により再度分離し、粒子を取り出し、貯蔵緩衝液（0.1 M tris-HCl、0.3 M NaCl、25mM EDTA、0.1％ BSA、0.1％ デキストラン T-500、0.1％ 両性洗浄剤 3-14、0.01％ ゲンタマイシン、15ppm のProClin-300、pH 8.0）に再懸濁した。
【００７９】
抗ジゴキシゲニン又は抗トロポニンを含有する化学発光体粒子（＝受容体粒子）：
受容体粒子を、「抗ジゴキシゲニンを含有する増感剤粒子」のカップリングと同様にして、ジゴキシゲニン対して又はトロポニンに対して誘導した抗体にカップリングさせた。
下記に実施例において、万能試薬Ａ（ストレプトアビジンを含有する受容体粒子）を万能試薬Ｂ（抗ジゴキシゲニンを含有する増感剤粒子）と組み合わせて用いるか、又は万能試薬Ａ（抗ジゴキシゲニンを含有する受容体粒子）を万能試薬Ｂ（ストレプトアビジンを含有する増感剤粒子）と組み合わせて用いる。
【００８０】
〔実施例３〕  ＰＳＡアッセイ
ＰＳＡ特異的試薬の製造
複合体Ｃ１（ビオチニル化抗ＰＳＡ抗体）：
DMSO（RdH から、34943）に溶解したビオチン−LC−NHS（Pierce から、Art. 21336、免疫学的に純粋）0.23mgを、抗ＰＳＡ抗体（MAK <PSA> 92-284/03、Dade Behring Marburg HmbH から、0.1 M 炭酸ナトリウム（RdH から、31432）中）2.3mgに加えて混合し、こ
の混合物を＋４℃で 16 時間インキュベートした。採用したモル比 ［Ab］：［ビオチン−LC−NHS］＝ 1：35 。
この複合体を、リン酸塩緩衝液（0.15 M 塩化ナトリウムを含有する0.05 M リン二酸水素ナトリウム、pH 7.5）を用い、PD-10 Sephadex G-25M（Pharmacia Biotech から、Code 17-0851-01）のカラムに通して精製した。
【００８１】
複合体Ｃ２（ジゴキシゲニンで標識した抗ＰＳＡ抗体）：
抗ＰＳＡ抗体（MAK <PSA> 92-283/029 Dade Behring Marburg HmbH）を、DIG−抗体標識キット（Behringer Mannheim Biochemica から、Order No. 1367200、実施：タンパク質を DIG-NHS 1. モノクローナル抗体で標識する）の使用上の指示／注意に従ってジゴキシゲニンで標識した。
【００８２】
アッセイ緩衝液
Ttris 0.1mol／l ＋ NaCl 0.3mol／l ＋ EDTA 25mmol／l ＋ 0.1％ RSA ＋ 0.1％ デキストラン T-500 ＋ 0.1％ 両性洗浄剤 3-14 ＋ 0.01％ ゲンタマイシン ＋ ProClin-300 15 ppm、pH 8.00 。
【００８３】
ＰＳＡアッセイの実施
試験を行うために、下記のように成分を混合してインキュベートした：
10μlのサンプル
75μlのアッセイ緩衝液
25μlの複合体Ｃ１（ビオチニル化抗ＰＳＡ抗体）及び複合体Ｃ２（ジゴキシゲニン化抗ＰＳＡ抗体）、それぞれの場合 0.96μg／ml
371秒間の＋37℃でのインキュベーション
100μlのアッセイ緩衝液
20μlの抗ジゴキシゲニン含有増感剤粒子（0.2mg／ml）
20μlのストレプトアビジン含有受容体粒子（0.2mg／ml）
762.5秒間の＋37℃でのインキュベーション
【００８４】
測定
試験を行い、改良 Tecan Sample Processor により測定し、Ullman et al. （Clinical
Chemistry 42:1518-1526, 1996, EP 0515194 A2）参照、シグナルを記録した。
【００８５】
結果
【表１】
2011227102.tif 000002
【００８６】
【表２】
2011227102.tif 000003
【００８７】
上記の表は、新規方法で決定した値が、正常範囲内で、比較方法（Abbott IMx total PSA, list No. 1D85）の値と一致したことを示している。これは、本発明に係る方法が機能することを実証している。
【００８８】
〔実施例４〕
抗体当たりのビオチンラベルの数の変化
実施例３に記載したビオチニル化方法により、抗ＰＳＡ抗体（Mab <PSA> 92-284/03、Dade Behring Marburg HmbH）を変化する量のビオチン分子に複合させ、そして抗ＰＳＡ抗体（Mab <PSA> 92-283/09、Dade Behring Marburg HmbH）を変化する量のジゴキシゲニン分子に複合させた。抗体ペアを用いて得られた結果を下記の表に示す。
【表３】
2011227102.tif 000004
【００８９】
〔実施例５〕
デキストラン−抗体−ビオチン複合体の製造
N−スクシンイミジル S−アセチルチオアセテート（SATA）による抗体の活性化
0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液（Riedel de Haen から、31432）中の抗ＰＳＡ抗体（Mab <PSA> 92-284/03、Dade Behring Marburg HmbH）10.4mgを、混合緩衝液（LiBO3／20％ ジオキサン）、pH  8.5 中で再緩衝し、DMF（２mg／ml）中の SATA（Pierce から）104μlと混合する。この混合物を 37℃で 1.5 時間インキュベートした後、NH2OH 200μl と共に 45 分間インキュベートする。
次いで複合体を、0.1 M リン酸塩緩衝液、pH 6.0 を用い、PD-10 カラムに通して脱塩する。
【００９０】
活性化したビオチン−デキストランの製造
FlukaBioDex（70000 kDa、製品番号 14402、ビオチン置換 20mol／mol）3.9mg（1.95ml）を混合緩衝液（２mg／ml）に入れ、ジオキサン（６mg／ml）中の GMBS 溶液（N−マレインイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Pierce から）26μl と混合する。この混合物を 18℃で１時間インキュベートする。次いで複合体を、0.1 M リン酸塩緩衝液、pH 6.0 を用い、PD-10 カラムに通して脱塩する。
【００９１】
活性化したビオチン−デキストランへの活性化した抗体のカップリング
複合体１：
抗体−SATA 溶液（１mg／ml）1.7mlを、FlukaBioDex−GMBS 溶液（1.32mg／ml）509μlと混合する。この混合物を 37℃で２時間インキュベートし、次いでｎ−エチルマレインイミドの 0.1 M 溶液 220μl で停止する。精製／脱塩を、0.1 M TRIS/HCl、150mM NaCl、pH 7.4 を用い、Sephacryl S300（直径 1.6 cm、ゲル床高さ 90 cm、負荷量約２ml）に通して行う。複合体を含有する分画をプールし、1.7ml（約 0.65mg／ml）まで濃縮した。
【００９２】
複合体２：
抗体−SATA 溶液（１mg／ml）1.7mlを、FlukaBioDex−GMBS 溶液（1.32mg／ml）102μlと混合する。この混合物を 37℃で２時間インキュベートし、次いでn−エチルマレインイミドの 0.1 M 溶液 180μl で停止する。精製／脱塩を、0.1 M TRIS/HCl、150mM NaCl、pH 7.4 を用い、Sephacryl S300（直径 1.6 cm、ゲル床高さ 90 cm、負荷量約 ２ml）に通して行う。複合体を含有する分画をプールし、1.7ml（約 0.64mg／ml）まで濃縮した。
【００９３】
処方が異なるため、複合体１については抗体当たり約 18 ビオチン分子が得られ、そして複合体２については抗体当たり約３ビオチン分子が得られた。
【００９４】
これらは複合体は、上記のＰＳＡアッセイにおいて、増加する抗体／ジゴキシゲニン比を有する上記のジゴキシゲニン化抗ＰＳＡ抗体と組み合わせて用いた。デキストラン複合体の濃度は 9.75μg／ml であり、ジゴキシゲニン化抗ＰＳＡ抗体は 8.8μg／ml の濃度で用いた。結果を下記の表４に示す。
【表４】
2011227102.tif 000005
【００９５】
〔実施例６〕
風疹ＩｇＭアッセイ
風疹ＩｇＭ特異的試薬の製造
複合体Ｃ１（ビオチニル化抗ヒトＩｇＭ抗体）：
ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（Pab <h-IgM> 62FX022, Dade Behring Marburg HmbH）を抗ＰＳＡ抗体のビオチニル化と同様にしてビオチニル化した（実施例３参照）。
【００９６】
複合体Ｃ２（ジゴキシゲニンで標識した抗風疹抗体）：
抗風疹抗体（Mab <rubella> 93-9/08, Dade Behring Marburg HmbH）を、DIG-抗体標識キット（Behringer Mannheim Biochemica から、Order No. 1367200、実施：DIG-NHS 1. モノクローナル抗体を用いてタンパク質を標識する）の使用上の指示／注意に従ってジゴキシゲニンで標識した。
【００９７】
アッセイ緩衝液：
tris 0.1mol／l ＋ NaCl 0.3mol／l ＋ EDTA 25mmol／l ＋ 0.1％ RSA ＋ 0.1％ デキストラン T-500 ＋ 0.1％ 両性洗浄剤 3-14 ＋ 0.01％ ゲンタマイシン ＋ ProClin-300 15 ppm、pH 7.3 。
【００９８】
リウマチ因子（ＲＦ）吸着剤：
Dade Behring Marburg HmbH からのリウマチ因子（ＲＦ）吸着剤、製品番号 OUCG 。
【００９９】
風疹抗原：
Intergen から、CDP (lot 8320)
風疹ＩｇＭアッセイの実施
試験を行うために、下記のように成分を混合してインキュベートした：
10μlのサンプル、ＲＦ吸着剤中に１＋９部に希釈
40μlのアッセイ緩衝液
25μlの複合体Ｃ１（ビオチニル化抗ヒトＩｇＭ抗体、８μg／ml）及び複合体Ｃ２（ジゴキシゲニン化抗風疹抗体、２μg／ml）
25μlの風疹抗原（４μg／ml）
453.5 秒間の＋37℃でのインキュベーション
75μlのアッセイ緩衝液
25μlの抗ジゴキシゲニン含有受容体粒子（0.05mg／ml）
50μlのストレプトアビジン含有増感剤粒子（0.4mg／ml）
432.5 秒間の＋37℃でのインキュベーション
【０１００】
測定
試験を行い、改良 Tecan Sample Processor により測定し、Ullman et al. （Clinical
Chemistry 42:1518-1526, 1996, EP 0515 194 A2）参照、シグナルを記録した。
【０１０１】
風疹ＩｇＭアッセイの結果
【表５】
2011227102.tif 000006
【０１０２】
上記の表から明らかなように、本発明に係る方法を用いて得られた結果は、正常範囲内で、比較方法（DiaSorin, ETI-RUBEK-M reverse, P2471）で得られた結果と一致する。これは、本発明に係る方法が間接試験手順においても機能することを実証している。
【０１０３】
〔実施例７〕
ビオチン標準複合体をビオチニル化担体分子−Ｆａｂ’複合体と比較するためのトロポニンアッセイの使用
ビオチニル化担体分子−Ｆａｂ’複合体（「Ｍ−ＩｇＧ−ビオチン抗トロポニン複合体」）の製造
0.1 M リン酸塩緩衝液（５mM EDTA、pH 7.0）中のネズミＩｇＧ抗体（「Ｍ−ＩｇＧ」
）の溶液（15.0ml、M-IgG 2.6mg／ml、0.26mmol）を、スルホスクシンイミジル (4−ヨードアセチル)アミノ−ベンゾエートの水溶液（0.66ml、2.0mg／ml）と混合する。25℃で１時間の反応時間の後、この混合物をゲル濾過カラム（AcA22, Ciphergen, Fermont, CA）
を用いて濃縮し、精製する。単量体の活性化Ｍ−ＩｇＧ（ＨＰＬＣで試験）を含有する分画をプールする。
【０１０４】
0.1 M リン酸塩緩衝液（５mM EDTA、pH 6.0）中の抗トロポニン抗体のＦ（ａｂ’）2断片の溶液（3.0ml、10mg／ml）を、ジチオトレイトール（15.4mg／ml）及び 2−メルカプトエタノール（15.6μl／ml）の混合物 0.091mlと混合する。37℃で１時間の反応時間の後、この混合物をゲル濾過カラム（AcA22, Ciphergen, Fermont, CA）を用いて濃縮し、精製した。Ｆａｂ’抗体断片を含有する分画をプールする。
【０１０５】
活性化Ｍ−ＩｇＧ（20.5mg；0.14mmol）及びＦａｂ’断片（20.5mg；0.14mmol）の混合物を、リン酸塩緩衝液 pH 7.0（５mM EDTA）中に Amicon 限外濾過セルを用いて再緩衝する。この混合物をタンパク質 5.0mg／ml まで濃縮し、２〜８℃で 24〜70 時間インキュベートする。その後に、N−エチルマレインイミド（20mg／ml；タンパク質溶液１ml 当たり 50μl）を加える。室温で１時間の後、この溶液をゲル濾過カラム（AcA22, iphergen, Fermont, CA）を用いて 10mM リン酸塩緩衝液（300mM NaCl、pH 7.0）中で濃縮し、精製する。タンパク質分画をプールする。
【０１０６】
ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンの溶液（Pierce Chemical Company, Rockford, ILL；0.095ml、0.5mg／ml）を、pH 7.0 リン酸塩緩衝液中のＦａｂ’−Ｍ−ＩｇＧ複合体（６ml；0.8mg／ml；16μmol）に加える。室温で４時間の反応時間後、この混合物をpH 7.0 リン酸塩緩衝液に対して透析する。
【０１０７】
Ｆａｂ’−ビオチン複合体（「標準ビオチン抗トロポニン複合体」）の製造
10mM リン酸塩緩衝液（300mM NaCl、pH 7.0）中の抗トロポニン抗体のＦａｂ’断片の溶液（５mg／タンパク質溶液ml ２ml）を、Pierce Chemical Company, Rockford, III からのＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン溶液（10mg／ml；ＤＭＦ中４mmol）0.22mlと混合する。室温で４時間の反応時間後、この混合物を pH 7.0 リン酸塩緩衝液に対して透析する。タンパク質濃度を、Pierce Chemical Company により供給されたＢＣＡタンパク質アッセイを用いて決定する。
【０１０８】
トロポニンイムノアッセイ
Ａ）試験の実施
試験を行うために、下記のように成分を混合してインキュベートした：
20μlのサンプル
10μlの水
15μlの複合体（標準ビオチン抗トロポニン複合体：12.5μg／ml 又はＭ−ＩｇＧ−ビオチン抗トロポニン複合体：８μg／ml）
13μlの抗トロポニン含有受容体粒子（210μg／ml）
435 秒間の＋37℃でのインキュベーション
13μlのストレプトアビジン含有増感剤粒子（1.5mg／ml）
10μlの水
87 秒間の＋37℃でのインキュベーション
169μlの水
【０１０９】
測定
試験を行い、改良 Tecan Sample Processor により測定し、Ullman et al. （Clinical Chemistry 42:1518-1526, 1996, EP 0515194 A2）参照、シグナルを記録した。
【０１１０】
Ｂ）結果
【表６】
2011227102.tif 000007
【０１１１】
ビオチニル化担体分子−Ｆａｂ’複合体（＝Ｍ−ＩｇＧ−ビオチン抗トロポニン複合体）は、よりいっそう鋭い較正曲線を与え、これによって試験により高い精度が与えられる。