(57)【要約】      （修正有）【課題】水性媒体の高分散性を有する表面修飾された、又は内部コアが、半導性または金属性材料で構成された表面修飾されたナノ粒子を提供する。【解決手段】半導性または金属性の材料を含む疎水性ナノ粒子の表面に多重両親媒性分散剤のコーティングを塗布することにより、水分散性ナノ粒子が調製される。この多重両親媒性分散剤は、２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を有し、代表的にポリマーである。好ましいポリマー分散剤は、（１）親水性分枝を有する疎水性骨格、（２）疎水性分枝を有する親水性骨格、または（３）疎水性もしくは親水性のいずれかであり得、そして親水性分枝および疎水性分枝の両方で置換されている骨格を含む。水分散性ナノ粒子の単分散集団もまた提供される。水分散性ナノ粒子と親和性分子（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど）との結合体も同様に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導性材料または金属性材料から構成される内部コア；および多重両親媒性分散剤から構成される、該内部コアを取り囲む外部層、を含む、水分散性ナノ粒子。
【請求項２】
前記内部コアが半導性材料を含む、請求項１に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３】
前記半導性材料が無機物である、請求項２に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項４】
前記半導性材料が結晶質である、請求項３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項５】
前記内部コアが、前記半導性材料に対する親和性を有する水不溶性有機コーティングをさらに含む、請求項２に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項６】
前記有機コーティングが、トリオクチルホスフィンオキシド、トリオクチルホスフィン、トリブチルホスフィン、またはこれらの混合物を含む、請求項５に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項７】
前記水不溶性有機コーティングと前記外部層との間にシェル層をさらに含む、請求項５に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項８】
前記シェル層が、前記内部コアよりも大きいバンドギャップエネルギーを有する半導性材料を含む、請求項７に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項９】
前記内部コアが金属性材料を含む、請求項１に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１０】
前記内部コアが、前記金属性材料に対する親和性を有する水不溶性有機コーティングをさらに含む、請求項９に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１１】
前記水不溶性有機コーティングが疎水性界面活性剤を含む、請求項１０に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１２】
前記疎水性界面活性剤が、オクタンチオール、ドデカンチオール、ドデシルアミン、テトラオクチルアンモニウムブロミド、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１１に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１３】
前記多重両親媒性分散剤が、２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を有するポリマーである、請求項１に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１４】
前記ポリマーが、直鎖状または分枝状である、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１５】
前記ポリマーが分枝状である、請求項１４に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１６】
前記ポリマーが超分枝状または樹状である、請求項１５に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１７】
前記疎水性領域が、各々、少なくとも１つの非イオン化可能、非極性モノマー単位を含む、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１８】
前記疎水性領域が、各々、エチレン、プロピレン、アルキル（Ｃ４〜Ｃ１２）置換エチレンイミン、アルキルアクリレートおよびメタクリレート、フェニルアクリレートおよびメタクリレート、アルキルアクリルアミド、スチレン、疎水性に誘導体化されたスチレン、ビニルエーテル、ビニルエステル、ビニルハライド、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのモノマー単位を含む、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項１９】
前記疎水性領域が、各々、アルキルアクリレート、アルキルメタクリレート、およびアルキルアクリルアミドからなる群より選択される少なくとも１つのモノマー単位を含む、請求項１８に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２０】
前記親水性領域が、各々、イオン化可能部分または極性部分を含む少なくとも１つのモノマー単位を含む、請求項１３または１８に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２１】
前記親水性領域が、各々、イオン化可能部分を含む少なくとも１つのモノマー単位を含む、請求項２０に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２２】
前記イオン化可能部分が、カルボン酸置換基、スルホン酸置換基、リン酸置換基、およびアミン置換基からなる群より選択される、請求項２１に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２３】
前記親水性領域が、各々、水溶性エチレン性不飽和Ｃ３〜Ｃ６カルボン酸、アルキルアミン、アルキルアミンの無機酸付加塩、ジ−Ｃ１〜Ｃ３−アルキルアミノ−Ｃ２〜Ｃ６−アルキルアクリレートおよびメタクリレート、オレフィン性不飽和ニトリル、ジオレフィン性不飽和モノマー、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルホルムアミド、アクリルアミド、低級アルキル置換アクリルアミド、低級アルコキシ置換アクリルアミド、Ｎ−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルイミダゾリン、スチレンスルホン酸、およびアルキレンオキシドからなる群より選択される少なくとも１つのモノマー単位を含む、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２４】
前記親水性領域が、各々、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸、アクリルアミド、およびメタクリルアミドからなる群より選択される少なくとも１つのモノマー単位を含む、請求項２３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２５】
前記親水性領域が、各々、カルボキシレート、チオカルボキシレート、アミド、イミド、ヒドラジン、スルホネート、スルホキシド、スルホン、スルファイト、ホスフェート、ホスホネート、ホスホニウム、アルコール、チオール、ニトレート、アミン、アンモニウム、およびアルキルアンモニウム基−［ＮＨＲ１Ｒ２］＋からなる群より選択される少なくとも１つの親水性部分で置換されたビニルモノマーを含み、ここで、Ｒ１およびＲ２はアルキル置換基である、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２６】
前記親水性部分が、ポリマー骨格の炭素原子に直接結合している、請求項２５に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２７】
前記親水性部分が、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリールレン、ヘテロアリールレン、アルカリーレン、アラルキレンなどからなる群より選択される連結を通してポリマー骨格の炭素原子に結合している、請求項２５に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２８】
前記両親媒性分散剤が、アクリル酸、メタクリル酸、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される親水性モノマーと、アルキル（Ｃ６〜Ｃ１２）アクリルアミドからなる群より選択される疎水性モノマーとのコポリマーである、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項２９】
前記ポリマーが、約５００〜５０，０００の範囲の分子量を有する、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３０】
前記ポリマーが、約１０００〜１０，０００の範囲の分子量を有する、請求項２９に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３１】
前記疎水性領域が、前記ポリマーの約２５重量％〜９０重量％の範囲に存在する、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３２】
前記ポリマーがポリペプチドであり、該ポリペプチド中の前記疎水性領域が、少なくとも１つの疎水性アミノ酸を含み、そして前記親水性領域が少なくとも１つの親水性アミノ酸を含む、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３３】
前記ポリマーが架橋されている、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３４】
前記ポリマーが官能基化可能な基を含む、請求項１３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３５】
前記官能基化可能な基が、連結部分を通して前記ポリマーに結合している、請求項３４に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項３６】
水分散性ナノ粒子の集団を調製する方法であって、以下：
（ａ）（ｉ）２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を有するポリマーを含む両親媒性分散剤と、（ｉｉ）複数の疎水性ナノ粒子とを、（ｉｉｉ）非水性溶媒中で混合し、溶液状態の分散剤およびナノ粒子の混合物を提供する工程；
（ｂ）該ナノ粒子による該分散剤の吸着を生じるのに有効な条件に該混合物を供する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において調製された該分散剤でコーティングされたナノ粒子を水性媒体に移す工程、を包含する、方法。
【請求項３７】
前記親水性領域がイオン化可能基を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記工程（ｂ）の前に、前記混合物が、前記イオン化基をイオン化するのに有効なイオン化剤で処理される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記工程（ｂ）が、前記混合物から前記溶媒を除去する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程（ａ）における、前記両親媒性分散剤  対  前記複数のナノ粒子の数の比が、約５０：１〜約５０００：１の範囲である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノ粒子に吸着した前記両親媒性分散剤を架橋する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
半導性材料または金属性材料を含む内部コア、および結合対の第１のメンバーとして作用する親和性分子に結合体化した多重両親媒性分散剤を含む水分散性ナノ粒子を含む組成物であって、ここで、該親和性分子は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素インヒビター、多糖類、および約１５００グラム／モル未満の分子量を有する低分子からなる群より選択される、組成物。
【請求項４３】
前記組成物が、共有結合性または非共有結合性相互作用のいずれかを通して、前記結合対の前記第１のメンバーと会合した前記結合対の第２のメンバーをさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ナノ粒子の前記内部コアが半導性材料を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
複数の請求項１に記載の水分散性ナノ粒子を含む、表面が修飾された半導性または金属性ナノ粒子の単分散集団。
【請求項４６】
前記単分散粒子集団が、照射された場合に、半波高全幅値（ＦＷＨＭ）で約２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲のバンド幅の光を発する点で特徴付けられる、請求項４３に記載の水分散性ナノ粒子。
【請求項４７】
前記単分散粒子集団が、前記内部コアの直径において約１０％ｒｍｓ超えない偏差を示す点で特徴付けられる、請求項４３に記載の水分散性ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、表面修飾されたナノ粒子に関し、さらに詳細には、水性媒体中で高められた分散性を有するとともに優れたコロイド安定性および光物理的安定性を有する、表面修飾された半導性ナノ粒子および金属ナノ粒子に関する。本発明はさらに、新規な表面修飾されたナノ粒子を作製し、そして使用するための方法に関する。本発明は、種々の分野（生物学、分析化学およびコンビナトリアル化学、医療診断、および遺伝子分析を含む）において有用性を見い出す。
【背景技術】
【０００２】
半径がバルク励起子ボーア半径より小さな半導性ナノ結晶（これはまた量子点粒子として公知である）は、分子形態および物質のバルク形態の間のクラスの材料を構成する。全ての三次元における電子およびホールの両方の量子閉じ込めは、結晶サイズが減少するにつれて材料の効果的なバンドギャップにおける増加を生じる。結果的に、半導性ナノ結晶の光学吸収および発光の両方は、ナノ結晶のサイズが小さくなるにつれて、青（より高いエネルギー）へとシフトする。
【０００３】
半導性ナノ結晶は、無機、結晶性半導性材料で構成されるナノ粒子であり、そして量子サイズ効果から生じる固有の光物理学、光化学および非直線状の光学特性を有し、それ故、種々の状況における潜在的な適用性（例えば、生物学的適用における検出可能な標識として、そして光触媒、電荷移動デバイスおよび分析化学の領域における有用な材料として）に関して非常に多くの関心がはらわれてきた。半導性ナノ結晶における興味を高めた結果として、このようなナノ結晶を製造するための方法に関する文献のかなり実質的な部分が存在する。広く、これらの経路は、以下を含むものとして分類され得る：ガラス中の調製物（Ｅｋｉｍｏｖら（１９８１）ＪＥＴＰ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４：３４５(非特許文献１)を参照のこと）、水性調製物（逆ミセル、ゼオライト、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、およびキレート化ポリマーの使用を含む調製物を含む）；Ｆｅｎｄｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ９０：９０(非特許文献２)，およびＨｅｎｇｌｅｉｎら（１９８４）Ｂｅｒ．Ｂｕｎｓｅｎｇｅｓ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：９６９(非特許文献３)を参照のこと）、ならびに有機金属性半導性前駆体材料の高温熱分解物（Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８７０６(非特許文献４)；Ｋａｔａｒｉら（１９９４）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８：４１０９(非特許文献５)）。２つの前者の方法は、ほとんどの適用のためには容認できない、低い量子収率、多分散性の程度が高いこと、コロイド安定性が乏しいこと、内部欠陥の程度が高いこと、および不動態化された表面トラップ部位が乏しいこと、を有する粒子を生じる。それに加えて、第１の経路によって作製されるナノ結晶は、ガラスマトリックスに物理的に制限され、さらに合成の後に加工することができない。
【０００４】
現在まで、有機金属試薬の高温熱分解物のみが、内部に欠陥のない、高いバンドエッジ発光およびトラップされない発光を有し、ほぼ単分散性を示す半導性ナノ結晶を生じていた。その上、この半径は、調製された粒子サイズを超えてかなりの程度の制御を合成化学者に与える。Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）（前出：非特許文献４）を参照のこと。しかし、この方法の１つの欠点は、粒子が、配列された疎水性界面活性剤分子の逆ミセル中に配列することである。このような場合、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、トルエンおよびピリジンのような有機溶媒のみに分散性である。このことは、半導性ナノ結晶の蛍光発光が、ナノ結晶が水溶解性または少なくとも水分散性であることが必要とされる場合に依存するような、多くの適用の範囲において問題である。
【０００５】
半導性ナノ結晶に水分散性を付与するためのいくつかの方法が報告されているが、処理された半導性ナノ結晶が、広い適用性を制限する重大な不都合を被る場合においては、なお問題である。例えば、Ｓｐａｎｈｅｌら（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：５６４９（Ｃｄ（ＯＨ）２−キャップド（ｃａｐｐｅｄ）ＣｄＳゾルを開示する）(非特許文献６)を開示する；しかし、このゾルの光発光性は、ｐＨ依存であった。このゾルは、非常に狭いｐＨ範囲（ｐＨ８〜１０）においてのみ調製され得、１０を超えるｐＨでのみ狭い蛍光バンドを示した。このようなｐＨ依存性は、この材料の有用性を非常に制限し；特に、生物学的システムにおける使用のために適切でない。
【０００６】
他のグループは、半導性ナノ結晶の有機保護層を水溶解性部分と交換した；しかし、得られた誘導体化された半導性ナノ結晶は、高い発光ではない。単鎖チオール（例えば、２−メルカプトエタノールおよび１−チオ−グリセロール）は、水溶解性のＣｄＴｅナノ結晶の調製物における安定剤として使用されてきた。Ｒｏｇａｃｈら（１９９６）Ｂｅｒ．Ｂｕｎｓｅｎｇｅｓ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：１７７２(非特許文献７)およびＲａｊｈら（１９９３）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９７：１１９９９(非特許文献８)を参照のこと。他のさらに外来性のキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）化合物は、同様の結果で報告されている。Ｃｏｆｆｅｒら（１９９２）Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９（キャッピング化合物としてのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の使用を開示する）(非特許文献９)を参照のこと。これらのシステムの全てにおいて、コーティングされた半導性ナノ結晶は、安定ではなく、時間がたつと光発光性が低下する。
【０００７】
従って、水性媒体を必要とする適用において、これらの高い量子収量材料を使用するために、有機コーティングの極性を変え、それによって、これらの粒子の水に対する移動を容易にする方法を見い出さなければならない。非常に多くの研究が、ナノ結晶表面上の親油性の炭化水素コーティングと、ある範囲の二官能性極性分子とを交換するために探索する表面交換反応において行われてきた。ここで、キャッピング分子の１つの官能基は、ナノ結晶の表面に対していくらか親和性を有し、一方、他の官能基は、そのイオン化能または高い程度の水和によって、ナノ結晶の水溶性を付与する。例えば、Ｂａｗｅｎｄｉらに対する国際特許公開番号ＷＯ  ００／１７６５５(特許文献１)は、モノマーの界面活性剤が分散剤として使用される場合、ナノ結晶に関連して促進する界面活性剤の疎水性領域を用いて、半導性ナノ結晶に水分散性を付与し、一方、親水性領域が、水性媒体に対して親和性を有し、ナノ結晶の水性懸濁液を安定化するための方法を記載する。Ｂａｗｅｎｄｉらに対する国際特許公開番号ＷＯ  ００／１７６５６(特許文献２)は、同様の方法を記載し、ここで、式ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘのモノマー化合物（ここで、ｎは、好ましくは≧１０であり、Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートである）が、モノマーの界面活性剤の代わりに使用される。
【０００８】
Ｋｕｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６：９８６９−９８８２(非特許文献１０)，Ｍｉｋｕｌｅｃ，「Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ：Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｄｏｐｅｄ  Ｃａｄｍｉｕｍ  Ｓｅｌｅｎｉｄｅ，（Ｃｏｒｅ）Ｓｈｅｌｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ，ａｎｄ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃａｄｍｉｕｍ  Ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ」，ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９）(非特許文献１１)、およびＢａｗｅｎｄｉらに対する国際出願番号ＷＯ  ００／１７６５６（上：特許文献２で引用）は、疎水性ナノ結晶の水分散性を向上するように設計された表面交換反応の詳細な説明を与える。一般的に、これらの参考文献は、ナノ結晶表面上の元の疎水性界面活性剤層の交換が、決して完全ではなく、界面活性剤の約１０％〜約１５％のみが残っている（複数の交換反応の後でさえ）ことを示し；決して定量的に交換されないが、元のホスフィン／ホスフィンオキシド界面活性剤層と、より極性のリガンドとの交換は、量子収量のかなりの減少を生じ、これは決して完全には回復されず；一旦水中に分散されると、粒子は、コロイド安定性が限定され；そして、これらの粒子を用いてさらに化学的に実行するための企て（例えば、ペンダントカルボキシル官能性を介してこれらが生体分子に連結する）は、高度に再生不可能であり、ナノ結晶のサイズに依存する。
【０００９】
従って、元の粒子の量子効率を保存し、コロイド安定性を維持し、そして粒子径分布の任意の変化を避けるかまたは最小にしながら、水性媒体において疎水性半導性ナノ結晶に分散性を付与するための信頼できる、再生可能な方法に関する当該分野における必要性が存在する。理想的には、このような方法は、半導性ナノ粒子を用いて有用なだけではなく、疎水性表面を有する他の型のナノ粒子（例えば、結晶性である必要がない半導性ナノ粒子、および表面修飾されていてもされていなくてもよい金属性ナノ粒子）を用いて有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際特許公開番号ＷＯ  ００／１７６５５
【特許文献２】国際特許公開番号ＷＯ  ００／１７６５６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｋｉｍｏｖら（１９８１）ＪＥＴＰ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４：３４５
【非特許文献２】Ｆｅｎｄｌｅｒら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ９０：９０
【非特許文献３】Ｈｅｎｇｌｅｉｎら（１９８４）Ｂｅｒ．Ｂｕｎｓｅｎｇｅｓ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：９６９
【非特許文献４】Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８７０６
【非特許文献５】Ｋａｔａｒｉら（１９９４）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８：４１０９
【非特許文献６】Ｓｐａｎｈｅｌら（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：５６４９
【非特許文献７】Ｒｏｇａｃｈら（１９９６）Ｂｅｒ．Ｂｕｎｓｅｎｇｅｓ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：１７７２
【非特許文献８】Ｒａｊｈら（１９９３）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９７：１１９９９
【非特許文献９】Ｃｏｆｆｅｒら（１９９２）Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９
【非特許文献１０】Ｋｕｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６：９８６９−９８８２
【非特許文献１１】Ｍｉｋｕｌｅｃ，「Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ：Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｄｏｐｅｄ  Ｃａｄｍｉｕｍ  Ｓｅｌｅｎｉｄｅ，（Ｃｏｒｅ）Ｓｈｅｌｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ，ａｎｄ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃａｄｍｉｕｍ  Ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ」，ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９）
【発明の概要】
【００１２】
（発明の要旨）
従って、本発明の第１の目的は、水性媒体における高められた分散性を有する表面修飾されたナノ粒子を提供することによって、当該分野における上述の必要性に対処することであり、ここで、ナノ粒子は、疎水性表面を有する内部コアおよび多重両親媒性の分散剤の外部層で構成される。
【００１３】
本発明のなお別の目的は、内部コアが、半導性または金属性材料で構成される、このような表面修飾されたナノ粒子を提供することである。
【００１４】
本発明のなお別の目的は、多重両親媒性分散剤が、２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を有するポリマーである、このようなナノ粒子を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、上述の水分散性ナノ粒子の集合を調製するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明のなおさらなる目的は、結合対の第１メンバーとして役立つ親和性分子に接合される、ナノ粒子結合体（すなわち、上述のような水分散性ナノ粒子）で構成される組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のなおさらなる目的は、結合対の第２のメンバーが、共有もしくは非共有の相互作用を介して、第１のメンバーと関連する、このような組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、水分散性ナノ粒子の単分散集合を提供することであり、ここで、この集合は、内部コアの直径において、約１０％ｒｍｓ偏差、好ましくは約５％ｒｍｓ偏差を超えないことを特徴とする。
【００１９】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、ある部分は以下の記述において記載され、ある部分は、以下の実施の際に当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって知られ得る。
【００２０】
次いで、本発明の１つの局面において、水分散性ナノ粒子は、内部コアおよび多重両親倍性の分散剤（すなわち、２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を有する化合物）で構成されて提供される。内部コアは、半導性または金属性材料を含み、好ましくは、結晶性状態にある無機半導性材料を含む。一般的に、内部コアはまた、半導性または金属性材料上に疎水性保護層を含み、これらの疎水性保護層は、ナノ粒子製造中に使用される溶媒および／または界面活性剤から生じる。従って、内部コアの表面は、疎水性であり、従って、分散剤の疎水性領域は、コア表面に対して親和性を有し、コア表面に結合する一方、分散剤の親水性領域は、ナノ分子から外部側に延び、水中での分散性を提供する。好ましい実施形態において、分散剤は、ポリマー性であり、疎水性領域および親水性領域の両方を複数有し、従って、ナノ粒子の水分散性を高めるとともに、コア表面に対する分散剤の親和性を高める。特に好ましい分散剤は、超分枝型ポリマーまたは樹枝状ポリマーであり、これらは、モノマーの分散剤を含む従来の方法と比較して、ナノ粒子の水分散性およびコロイド安定性を実質的に高める。好ましい実施形態において、ナノ粒子は、発光半導性ナノ結晶であり、内部コアと多重両親媒性の外部層の間にオーバーコーティング「シェル」層を含み、蛍光効率を増加させる。シェル材料は、ナノ結晶コアよりもより高いバンドギャップエネルギーを有し、また、ナノ結晶コアに対して良好な伝導性を有し、価電子帯オフセットを有するべきである。さらに、「親和性分子」（すなわち、結合対の１つのメンバー）は、表面修飾された分子の外部層に結合し得、標的分子の存在または量を検出するのに有用であるナノ粒子「結合体」を提供し、この標的分子は、結合対の第２のメンバーを含む。例えば、親和性分子は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素インヒビター、多糖、または約１５００グラム／Ｍｏｌ未満の分子量を有する低分子であり得る。
【００２１】
ついで、本発明の関連局面において、結合対の第２のメンバーに関連して、上述のナノ粒子複合体で構成される組成物が提供され、ここで、この関連は、共有または非共有の相互作用のいずれかを含み得る。
【００２２】
本発明の別の局面において、表面修飾されたナノ粒子の単分散集合が提供され、この単分散集合は、複数の水分散性ナノ粒子を含み、このナノ粒子は、各々内部コアを有し、内部コアを取り囲む半導性または金属性材料、上に記載されるような多重の両親媒性分散剤で構成される外部層で構成され、ここで、この集合が、ナノ粒子が実質的に同じサイズおよび形状（すなわち、内部コアの直径において１０％ｒｍｓ偏差を超えない、好ましくは、内部コアの直径において、５％ｒｍｓ偏差を超えない集合）を有することによって特徴付けられる。単分散集合の狭いサイズ分布は、粒子の発光（すなわち、所定のナノ粒子組成物に対して得られる別個の発光の数）の結果として得られ得る「情報密度」を増加させる。
【００２３】
本発明の別の局面において、本明細書中に記載される表面修飾されたナノ粒子を作製するための方法が提供される。この方法は、以下：（ａ）（ｉ）２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を有するポリマーで構成される両親媒性の分散剤と、（ｉｉ）複数の疎水性ナノ粒子とを、（ｉｉｉ）非水溶媒中で混合して、溶液中の分散剤およびナノ粒子の混合物を提供する工程；（ｂ）上記混合物を、ナノ粒子によって分散剤の吸着が生じるのに効果的な状態に供する工程；および（ｃ）工程（ｂ）で調製された分散剤でコーティングされたナノ粒子を、水性媒体（例えば、水または水性緩衝液）に、移す工程。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義および命名法）
本発明を詳細に記載する前に、他に示されない限り、特定のナノ粒子材料、両親媒性の分散剤、または製造プロセス、に限定されないことを理解すべきである。というのは、これらは変動しうるからである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図するわけではないことをまた、理解すべきである。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲にて使用される場合、単数形態「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、本文で明確に他に言及しない限り、複数の対象を含むことに注目しなければならない。従って、例えば、「１つの分散剤」は、単一の分散剤ならびに２つ以上の分散剤の混合物をいう。「１つのナノ粒子」は、単一のナノ粒子だけではなく、２つ以上のナノ粒子などを含む。
【００２６】
本発明の記載および特許請求の範囲において、以下の用語が、以下に定義される定義に従って使用される。
【００２７】
用語「両親媒性の」は、本明細書中で使用される分散剤をいい、これは、従来の意味で使用され、疎水性領域および親水性領域を有する分子種を示す。本明細書中の分散剤は、２つ以上の疎水性領域および２つ以上の親水性領域を含む「多重両親媒性」である。
【００２８】
用語「結合された」は、例えば、分散剤のナノ粒子表面への「結合」は、共有結合、吸着、および物理的固定を含む。用語「関連する」「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「結合（ｂｏｕｎｄ）」は、用語「結合された」と意味上では同一である。
【００２９】
本発明の多重両親媒性の分散剤の金属性ナノ粒子もしくは半導性ナノ粒子の表面への結合は、一般的に、「吸着」を含み、ここで、「吸着」は、基材表面によって分子を非共有的に保持することをいう。すなわち、吸着は、基材表面と吸着される分子上の吸着部分との間の非共有相互作用の結果として生じる。吸着は、水素結合、ファンデルワールス力、極性引力または静電力（すなわち、イオン結合を介して）を介して生じ得、この場合において、疎水性表面に関して、分子の疎水性領域の通常の親和性を含む。
【００３０】
用語「ナノ粒子」は、一般的には、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲、好ましくは、約２ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは、約２ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲の直径を有する半導性粒子または金属性粒子をいう。本明細書中の他で議論される場合、半導性および金属性「ナノ粒子」は、一般的に、このようなナノ粒子を製造するために使用される方法によって生じる水不溶性の有機材料の保護層を含む。本明細書中で使用されるような用語「表面修飾されたナノ粒子」および「水分散性ナノ粒子」は、本発明の修飾されたナノ粒子のことをいうが、用語「ナノ粒子」は、限定されなければ、表面修飾された水分散性ナノ粒子の内部コアとして働く疎水性ナノ粒子をいう。
【００３１】
用語「半導体性（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）ナノ粒子」および「半導性（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）ナノ粒子」は、上に規定されるようなナノ粒子をいい、このナノ粒子は、無機半導性材料、無機半導性材料のアロイもしくは他の混合物、有機半導性材料、または１つ以上の半導性オーバーコート層内に含まれる無機もしくは有機半導性コアで構成される。
【００３２】
用語「金属性ナノ粒子」は、上に規定されるようなナノ粒子をいい、このナノ粒子は、金属性材料、金属性材料のアロイもしくは他の混合物、または１つ以上の金属性オーバーコート層内に含まれる金属性コアで構成される。
【００３３】
用語「半導性ナノ結晶」「量子点」および「ＱｄｏｔＴＭナノ結晶」は、本明細書中で交換可能に使用され、発光性である（すなわち、励起の際に、電磁放射線を発光し得る）無機結晶性材料で構成される半導性ナノ粒子をいい、１つ以上の第１の半導性材料の内部コアを含み、この第１の半導性材料は、必要に応じて、第２の半導性材料のオーバーコーティングまたは「シェル」内に含まれる。半導性シェルによって取り囲まれる半導性ナノ結晶コアは、「コア／シェル」半導性ナノ結晶という。周囲のシェル材料は、好ましくは、コア材料のバンドギャップエネルギーよりも大きいバンドギャップエネルギーを有し、そしてコア基材の原子空間に近接した原子空間を有するように選択され得る。コアおよび／またはシェルのための適切な半導性材料としては、限定されないが、以下が挙げられる：元素の周期律表の２族および１２族から選択される第１の元素および１６族から選択される第２の元素（例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ（ＣＤｓ）、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅなど）で構成される材料；元素の周期律表の１３族から選択される第１の元素および１５族から選択される第２の元素（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂなど）で構成される材料；１４族元素（Ｇｅ、Ｓｉなど）で構成される材料；ＰｂＳ、ＰｂＳｅなどのような材料；ならびにそれらのアロイおよび混合物。本明細書中で使用される場合、元素の周期律表およびそれらの族に対する全ての参照は、元素群に番号付けするための新しいＩＵＰＡＣシステムに対してであり、これは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，第８１版，（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載される。
【００３４】
「発光」は、物体から電磁放射線（光）を放射するプロセスを意味する。発光は、システムが、光子の形態で対応するエネルギーを放出して、励起状態からより低いエネルギー状態への移動を起こす場合に生じる。これらのエネルギー状態は、電気エネルギー、振動エネルギー、回転エネルギー、またはこれらの組み合わせであり得る。この移動は、化学的にシステム中に保持されるエネルギーの放出を介して刺激され得る発光の原因となるか、または外部供給源からシステムに添加される。エネルギーの外部供給源は、種々の型のエネルギーであり得る（化学供給源、熱供給源、電気供給源、磁気供給源、電磁気供給源、および物理供給源、または基底状態よりも高いエネルギーの状態へと励起されうるシステムを生じる他の型のエネルギー供給源）。例えば、システムは、光の光子を吸収することによって、電場に置かれることによって、または化学的な酸化還元反応によって、励起され得る。発光の間に放射される光子のエネルギーは、低エネルギーのマイクロ波照射から高エネルギーＸ線照射までの範囲であり得る。典型的に、発光は、ＵＶからＩＲの範囲の照射における光子をいう。
【００３５】
用語「単分散（の）」は、粒子の集団（例えば、コロイド系）をいい、ここで、これらの粒子は、実質的に同一のサイズおよび形状を有する。本発明の目的のために、粒子の「単分散の」集団は、少なくとも約６０％の粒子、好ましくは約７５％〜約９０％の粒子が、特定の粒子サイズの範囲内であることを意味する。単分散粒子の集団は、直径が１０％ｒｍｓ（平方自乗平均）未満、そして好ましくは、５％ｒｍｓ未満偏向する。
【００３６】
成句「１つ以上のサイズのナノ粒子」は、成句「１つ以上の粒子サイズ分布のナノ粒子」と同義で使用される。当業者は、半導性ナノ結晶のような粒子サイズのナノ粒子が、粒子サイズ分布として実際に得られることを理解する。
【００３７】
半導性ナノ結晶の電磁放射線放射に関する、用語「狭い波長帯域」または「狭いスペクトル線幅」の使用は、約６０ｎｍを超えない放射の波長帯域を意味し、そして好ましくは、約３０ｎｍの幅を超えず、より好ましくは、約２０ｎｍの幅を超えず、そして中心について対称である。参照される帯域幅は、半分のピークの高さでの放射の全幅値（ＦＷＨＭ）の測定から決定され、２００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲で適切である。
【００３８】
半導性ナノ結晶の励起に関して、用語「広範な波長帯域」の使用は、開始放射線の波長以下の波長を有する放射線の吸収を意味する（開始放射線は、半導性ナノ結晶によって吸収され得る最も長い波長（最も低いエネルギー）の放射線であると理解される）。この開始は、励起の「狭い波長帯域」に近いがこれよりわずかに高いエネルギーで生じる。このことは、色素分子の「狭い吸収帯域」と対照的であり、これは、高エネルギー側の放射ピーク近くで生じるが、その波長から離れると迅速に減少し、しばしば、放射由来の１００ｎｍより長い波長で無視できる。
【００３９】
用語「放射ピーク」は、最も高い相対強度を示す特定の半導性ナノ結晶サイズ分布によって示される特徴的な放射スペクトル中の光の波長をいう。
【００４０】
用語「励起波長」は、第１の検出試薬において使用される半導性ナノ結晶の放射ピークより低い波長を有する光をいう。
【００４１】
「疎水性」化合物（例えば、「疎水性」モノマー）は、約５０％より大きい分配係数を有し、誘電率≦５で、水相から有機相に、特に水から水と混合しない有機非極性溶媒に移る化合物をいう。「疎水性モノマー単位」は、それがポリマー中に存在する場合、疎水性モノマーをいう。「疎水性領域」は、疎水性分子セグメント（例えば、ポリマー中の分子セグメント）をいう。「疎水性領域」は、同じであっても異なってもよく、そして隣接してもしてなくてもよい、単一の疎水性モノマー単位または２つ以上の疎水性モノマー単位であり得る。
【００４２】
「親水性」化合物（例えば、「親水性」モノマー）は、約５０％より大きい分配係数を有し、誘電率≦５で、有機相から水相に、特に水と混合しない有機非極性溶媒から水に転移する化合物をいう。「親水性モノマー単位」は、それがポリマーセグメントまたはポリマー中に存在する場合、親水性モノマーをいう。「親水性領域」は、親水性分子セグメント（例えば、ポリマー中の親水性分子セグメント）をいう。「親水性領域」は、同じであっても異なってもよく、そして隣接してもしてなくてもよい、単一の親水性モノマー単位または２つ以上の親水性モノマー単位であり得る。
【００４３】
用語「イオン化可能な」は、特定のｐＨで電気的に中性であるが、より高いｐＨまたはより低いｐＨで、イオン化し得、従って、それぞれ正に荷電するかまたは負に荷電する基をいう。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシルおよびテトラコシル、ならびにシクロペンチルおよびシクロヘキシルのようなシクロアルキル基のような、１〜約２４個の炭素原子の分枝または非分枝の飽和炭化水素基をいう。用語「低級アルキル」は、１〜４個の炭素原子のアルキル基をいい、従って、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔ−ブチルを含む。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「アルキレン」は、１〜約２４個の炭素原子、代表的には、１〜約１２個の炭素原子を含む、分枝または非分枝の二官能性の飽和炭化水素鎖をいい、例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２−メチルプロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、ヘキシレン（−（ＣＨ２）６−）などが挙げられる。本明細書中の任意のカップリング薬剤の低級アルキレン結合における場合、「低級アルキレン」は、１〜４個の炭素原子のアルキレン基をいう。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「アルケニル」は、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニルなどのような、２〜約２４個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を必ずしも含むとは限らないが、代表的には含む、分枝または非分枝の炭化水素基をいう。一般に、必ずしも必要ではないが、本明細書中で、アルケニル基は、２〜約１２個の炭素原子を含む。用語「低級アルケニル」は、２〜４個の炭素原子のアルケニル基をいい、用語「アルケニレン」は、二官能性のアルケニル基をいい、同じ様式で、用語「アルキレン」は、二官能性アルキル基をいう。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「アルキニル」は、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソブチニル、オクチニル、デシニルなどのような、２〜約２４個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を必ずしも含むとは限らないが、代表的には含む、分枝または非分枝の炭化水素基をいう。一般的に、また必ずしも必要ではないが、本明細書中のアルキニル基は、２〜約１２個の炭素原子を含む。用語「低級アルキニル」は、２〜４個の炭素原子、好ましくは、３または４個の炭素原子のアルキニル基をいう。
【００４８】
「ヘテロ原子含有アルキル」および「ヘテロアルキル」における場合、用語「ヘテロ原子含有」および接頭語「ヘテロ」は、１つ以上の炭素原子が炭素以下の原子（例えば、窒素、酸素、硫黄、リンまたはケイ素）で置換される分子または分子フラグメントをいう。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「アルコキシ」は、Ｒが上に定義されるようなアルキルである、置換基−Ｏ−Ｒをいう。用語「低級アルコキシ」は、Ｒが上に定義されるような低級アルキル（例えば、メトキシ、エトキシなど）であるような基をいう。本明細書中で使用される場合、用語「アリール」は、他に特定されない限り、１〜３個の芳香族環を含む芳香族部分をいう。１以上の芳香族環を含むアリール基について、環は、縮合され得るかまたは結合され得る。アリール基は、必要に応じて、１つの環当り、１つ以上の不活性な非水素置換基で置換され；適切な「不活性な非水素」置換基としては、例えば、ハロ、ハロアルキル（好ましくは、ハロ置換低級アルキル）、アルキル（好ましくは、低級アルキル）、アルケニル（好ましくは、低級アルケニル）、アルキニル（好ましくは、低級アルキニル）、アルコキシ（好ましくは、低級アルコキシ）、アルコキシカルボニル（好ましくは、低級アルコキシカルボニル）、カルボキシ、ニトロ、シアノおよびスルホニルが挙げられる。他に示さない限り、用語「アリール」はまた、ヘテロ芳香族部分（すなわち、芳香族複素環）を含むことが意図される。一般的に、必ずしも必要ではないが、ヘテロ原子は、窒素、酸素、または硫黄である。用語「アリーレン」は、用語「アルキレン」が二官能性アルキル基をいうのと同じ様式で、二官能性のアリール部分をいう。
【００５０】
用語「アラルキル」は、アリール置換基を有するアルキル基をいい、用語「アルキレン」は、アリール置換基を有するアルキレン基をいう；用語「アルカリル」は、アルキル置換基を有するアリール基をいい、用語「アルカリーレン」は、アルキル置換基を有するアリーレン基をいう。
【００５１】
用語「ハロ」および「ハロゲン」は、従来の意味で使用されて、クロロ、ブロモ、フルオロ、またはヨード置換基をいう。用語「ハロアルキル」は、この基の水素原子の少なくとも１つが、ハロゲン原子で置換されたアルキル基をいう。
【００５２】
用語「ペプチド」は、構成要素のモノマーがアミド結合を介して結合されたαアミノ酸である、任意の長さのオリゴマーまたはポリマーをいい、アミノ酸二量体ならびにポリペプチド、ペプチドフラグメント、ペプチドアナログ、天然に存在するタンパク質、変異タンパク質、改変体タンパク質、または化学的に改変されたタンパク質、融合タンパク質などを包含する。ペプチド分子のアミノ酸は、２０種の従来のアミノ酸、従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、従来のアミノ酸の構造的改変体（例えば、イソバリン）、またはα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、β−アラニン、ナフチルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、およびノルロイシンのような天然に存在しないアミノ酸のいずれかであり得る。さらに、用語「ペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾を有するペプチドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態を含むように本明細書中で使用される。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、三本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを含む。これはまた、例えば、メチル化および／またはキャッピングによる修飾、ならびにオリゴヌクレオチドの未改変形態を含む。より詳細には、この用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー）を含む他のポリマー、および他の合成配列特異的核酸ポリマーを含むが、但し、このポリマーは、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような、塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」の間で意図される長さの区別はなく、これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホラミダイト、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含み、そしてまた、公知の型の修飾、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、アナログによる１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミダイト、カーバメートなど）、負に荷電した結合（例���ば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正に荷電した結合（例えば、アミノアルキルホスホラミダイト、アミノアルキルホスホトリエステル）を有する修飾のようなヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）のようなペンダント部分を含む修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）有する修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）を含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾された結合を有する修飾（例えば、αアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの未修飾形態を含む。
【００５３】
用語「ポリマー」は、その従来の意味で、本明細書中で使用されて、２つ以上のモノマー単位を有する化合物をいい、そして直鎖または分枝ポリマーを含むことが意図され、用語「分枝ポリマー」は、単純な分枝構造ならびに超分枝ポリマーおよび樹状ポリマーを包含する。用語「モノマー」は、ポリマーではない化合物をいうために本明細書中で使用される。本明細書中の「ポリマー」は、天然に存在し得るか、化学的に修飾され得るか、または化学的に合成され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「水分散性の」は、約２ｎｍ〜５０ｎｍの分散した粒子が高濃度（１０〜２０μＭ）で無限に保持されるような、本質的に凝集しない粒子の分散をいう。
【００５５】
用語「結合対」は、互いに特異的に結合する第１および第２の分子をいう。サンプル中の結合対の第１のメンバーの、結合対の第２のメンバーへの「特異的結合」は、サンプル中の他の成分に対するよりも、大きい親和性および特異性での、第１のメンバーの第２のメンバーへの結合（またはその逆）によって証明される。結合対のメンバー間での結合は、代表的に非共有結合である。用語「親和性分子」および「標的分析物」はまた、それぞれ、結合対の第１のメンバーおよび第２のメンバーをいうように、本明細書中で使用される。例示的な結合対としては、対応する抗体もしくは結合部分またはそのフラグメントと組み合わせた、任意のハプテン化合物または抗原性化合物（例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン；マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン）および非免疫学的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン［例えば、チロキシンおよびコルチゾール］−ホルモン結合タンパク質、レセプター−レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アセチルコリンレセプター−アセチルコリンまたはそのアナログ）、ＩｇＧ−プロテインＡ、レクチン−炭水化物、酵素−酵素補助因子、酵素−酵素インヒビター、および核酸二重鎖を形成し得る相補的なポリヌクレオチド対）などが挙げられる。
【００５６】
「ナノ粒子結合体」は、両親媒性分散剤の外部層を介して、サンプル（例えば、生物学的サンプル）中に存在する検出可能な基質に選択的に結合する「結合対」のメンバーに結合されたナノ粒子をいう。ナノ粒子に結合された結合対の第１のメンバーは、ナノ粒子に結合され得、そして結合される場合に結合対の第２のメンバーを特異的に認識し得る、任意の分子または任意の分子の一部を包含し得る。
【００５７】
本明細書中に特定される全ての分子量は、数平均分子量である。
【００５８】
（ＩＩ．ナノ粒子）
多重両親媒性分散剤を用いる表面修飾の前に、本発明のナノ粒子は、疎水性表面を有するナノ粒子であり、この粒子は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲、好ましくは、約２ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲、より好ましくは、約２ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲の直径を有する。一般に、ナノ粒子は、半導性材料または金属性材料から構成され、半導性ナノ粒子が好ましい。また、以下により詳細に説明されるように、半導性材料または金属性材料は、代表的にナノ粒子の製造の間に溶媒および／または界面活性剤の使用から生じる疎水性不動態化層のコーティングを有する。ナノ粒子の疎水性表面は、両親媒性分散剤に親和性を有し、従って、分散剤中の疎水性領域によって両親媒性分散剤に結合するように機能する。
【００５９】
半導性ナノ粒子は、有機半導性材料または無機半導性材料から構成され得る。有機半導性材料は、一般に、結合体化ポリマーである。適切な結合体化ポリマーとしては、例えば、シスおよびトランスのポリアセチレン、ポリジアセチレン、ポリパラフェニレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリビオチオフェン、ポリイソチアナフタレン、ポリチエニルビニレン、ポリフェレンスルフィド、ポリアニリン、ポリフェニレンビニレン、およびポリフェニレンビニレン誘導体（例えば、ポリ（２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−フェニレンビニレン（「ＭＥＨ−ＰＰＶ」）（Ｗｕｄｌらに対する米国特許第５，１８９，１３６号を参照のこと）、ポリ（２，５−ビスケロスタノキシ（ｂｉｓｃｈｅｌｏｓｔａｎｏｘｙ）−１，４−フェニレンビニレン）（「ＢＣＨＡ−ＰＰＶ」）（例えば、国際特許公開番号ＷＯ９８／２７１３６に記載されるような）、およびポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニレンビニレン）（Ｓｔｅｎｇｅｒ−Ｓｍｉｔｈらに対する米国特許第５，６０４，２９２号に記載される））が挙げられる。しかし、無機半導性ナノ粒子が好ましく、そして最適には、天然で結晶である；このようなナノ粒子は、本明細書中で「半導性ナノ結晶」と呼ばれる。半導性ナノ結晶は、光によって励起される場合、発光し得、一般に蛍光し得る。現在、光ルミネセンスによる生物学的化合物の検出は、蛍光有機色素および化学発光化合物を利用する。特に、生物学的系において、発光マーカーとしての半導性ナノ結晶の使用は、既存の蛍光色素を超える利点を提供する。これらの利点の多くは、ナノ結晶のスペクトル特性（例えば、ＵＶ〜可視〜ＩＲ領域における任意の波長で蛍光発光を有するナノ結晶を構築するのを可能にする、ナノ結晶の組成およびサイズを制御する能力）に関する。組成に関して、例えば、可視域でエネルギーを放射する半導性ナノ結晶は、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、およびＧａＡｓを含むが、これらに限定されない。近赤外域でエネルギーを放射する半導性ナノ結晶は、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、およびＰｂＳｅを含むが、これらに限定されない。最後に、青〜近紫外でエネルギーを放射する半導性ナノ結晶は、ＺｎＳおよびＧａＮを含むが、これらに限定されない。任意の特定のナノ結晶組成について、粒子サイズ分布を制御することによって、所望の波長に放射を調整することがまた可能である。好ましい実施形態において、５〜２０の個別の放射（互いに区別可能な５〜２０の異なるサイズ集団またはサイズ分布）、より好ましくは、１０〜１５の個別の放射が、任意の特定の組成について得られるが、当業者は、５より少ない放射および２０より多い放射が、半導性ナノ結晶粒子集団の単分散性に依存して得られ得ることを理解する。高情報密度が必要な場合、従って、より多くの数の別個の放射が必要な場合、ナノ結晶は、好ましくは、上に与えられるサイズ範囲内で、実質的に単分散である。
【００６０】
上に説明されるように、「単分散」は、粒子が実質的に同一のサイズおよび形状を有する粒子の集団（例えば、コロイド系）をいう。高情報密度の適用のための好ましい実施形態において、単分散粒子は、直径が１０％ｒｍｓ未満、好ましくは５％ｒｍｓ未満偏向する。単分散半導性ナノ結晶は、Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８７０６、およびＭｕｒｒａｙ「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＩ−ＶＩ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎｔｏ  ３−Ｄ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｓｕｐｅｒｌａｔｔｉｃｅｓ」、博士論文、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）に詳細に説明されている。当業者はまた、所定の組成について明瞭に観察され得る個別の放射の数は、粒子の単分散性だけでなく、使用される逆重畳積分技術にも依存することを理解する。半導性ナノ結晶は（色素分子と異なり）、ガウスとして容易にモデル化され得、従ってより容易に、そしてより正確に逆重畳積分される。
【００６１】
しかし、いくつかの適用について、高情報密度は、必要ではなく、より多分散の粒子を使用することが経済的により魅力的であり得る。従って、高情報密度を必要としない適用について、放射の線幅は、４０〜６０ｎｍの範囲であり得る。
【００６２】
半導性ナノ結晶は、当該分野で公知の技術を使用して作製され得る。例えば、米国特許第６，０４８，６１６号、同第５，９９０，４７９号、同第５，６９０，８０７号、同第５，５０５，９２８号および同第５，２６２，３５７号、ならびに国際特許公開番号ＷＯ９９／２６２９９（１９９９年５月２７日公開）を参照のこと。詳細には、本発明の生物学的アッセイおよび化学的アッセイにおける半導性ナノ結晶としての使用のための例示的な材料は、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＳ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＧｅおよびＳｉならびにその三元および四元混合物のような群２〜１６、１２〜１６、１３〜１５、および１４の半導体を含む、上記の材料を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
好ましい実施形態において、半導性ナノ結晶の表面は、オーバーコート層またはシェルを半導性ナノ結晶に付加することによって、多重両親媒性分散剤で表面を修飾する前に、放射の効率を強化するように修飾される。このシェルは、好ましい。なぜなら、半導性ナノ結晶の表面において、表面欠損は、半導性ナノ結晶の電気的特性および光学的特性を低下させる電子の捕捉または穴を生じ得る。半導性ナノ結晶の表面における絶縁層は、電子の捕捉および穴として機能し得るエネルギー状態を除去する界面において、化学的ポテンシャルにおける原子の突然のジャンプを提供する。これは、発光プロセスにおいてより高い効率を生じる。
【００６４】
シェルに適切な材料としては、半導性ナノ結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有する半導性材料が挙げられる。半導性ナノ結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有することに加えて、シェルに適切な材料は、コア半導性ナノ結晶に関して、良好な伝導性および原子価バンドオフセットを有するべきである。従って、伝導性バンドは、コア半導性ナノ結晶の伝導性バンドよりも望ましくは高く、そして原子価バンドは、コア半導性ナノ結晶の原子価バンドよりも望ましくは低い。可視で（例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、ＧａＡｓ）または近赤外で（例えば、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）エネルギーを放出する半導性ナノ結晶コアについて、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。例示的な材料としては、ＺｎＳ、ＧａＮおよびマグネシウムカルコゲニド（例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅおよびＭｇＴｅ）が挙げられる。近赤外で放出する半導性ナノ結晶コアについて、可視でバンドギャップエネルギーを有する材料（例えば、ＣｄＳまたはＣｄＳｅ）もまた使用され得る。コーティングされた半導性ナノ結晶の調製は、例えば、Ｄａｂｂｏｕｓｉら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０１：９４６３、Ｈｉｎｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：４６８−４７１、Ｐｅｎｇら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：７０１９−７０２９、およびＫｕｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０６：９８６９において見出され得る。
【００６５】
本発明のナノ粒子はまた、金属であり得る。このような粒子は、例えば、ラマン反応性部分（例えば、染料または色素、あるいは特徴的ラマンスペクトルを示す官能基）が吸着または付着されるナノメートルサイズの粒子を使用する、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）において、有用である。金属ナノ粒子は、任意の金属または金属合金もしくは複合材料からなり得るが、ＳＥＲＳにおける使用については、ＳＥＲＳ活性金属（例えば、銀、金、銅、リチウム、アルミニウム、白金、パラジウムなど）が使用される。さらに、粒子は、コア−シェル構成であり得る（例えば、金のコアは、銀のシェルによって覆われ得る）；例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：７１８−７２４、または粒子は、溶液中で小凝集体を形成し得る。Ｋｎｅｉｐｐら（１９９８）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ５２：１４９３を参照のこと。
【００６６】
一般に、そして上記で暗示されるように、非修飾ナノ粒子（従って、本発明の表面修飾ナノ粒子の内部コア）はまた、ナノ粒子製造において使用される溶媒および／または界面活性剤から得られる、半導性材料または金属材料上の疎水性コーティングを含む。例えば、製造される場合、半導性ナノ粒子は、代表的に、半導性材料に親和性を有する水不溶性有機コーティングを有し、このコーティングは、調整溶媒（例えば、ヘキシルデシルアミンまたはトリアルキルホスフィンもしくは酸化トリアルキルホスフィン（例えば、酸化トリオクチルホスフィン（ＴＯＰＯ）、トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）またはトリブチルホスフィン（ＴＢＰ））の使用から生じる不動態層からなる。金属ナノ粒子の製造およびこの金属ナノ粒子上のコーティングの形成において代表的に使用される疎水性界面活性剤としては、例として、オクタンチオール、ドデカンチオール、ドデシルアミンおよび臭化テトラオクチルアンモニウムが挙げられる。金属内部コアは、代表的に、金属材料に親和性を有する界面活性剤コーティングを有し、このコーティングは、同様に、金属ナノ粒子の製造において使用される界面活性剤化合物に由来する。界面活性剤コーティングは、疎水性界面活性剤からなる。
【００６７】
（ＩＩＩ．分散剤：）
ナノ粒子の疎水性表面を修飾するために使用される分散剤は、多重両親媒性分散剤（すなわち、２以上の疎水性領域および２以上の親水性領域を有する化合物）である。好ましい実施形態において、多重両親媒性分散剤は、ポリマーであり、そして、天然に存在するか、化学的に修飾されたか、または化学的に合成されたかにかかわらず、線状ポリマーまたは分枝ポリマーのいずれか空から構成され得る。構造的に、ポリマーは、線状または分枝のいずれかとして分類され、ここで、用語「分枝」は、一般に、分枝の個々の分子単位（すなわち、モノマー単位）が、ポリマー骨格とは別個であり、そしてポリマー骨格と同じ化学的構成を有しても有さなくてもよいことを意味する。
【００６８】
当業者によって認識されるように、最も単純な分枝ポリマーは、「櫛形分枝」ポリマーであり、ここで、線状骨格は、１以上の実質的に線状のペンダント側鎖を有する。分枝のこの単純な形態は、規則的または不規則であり得る（後者の場合、分枝は、ポリマー骨格上に不均一またはランダムな様式で分布する）。規則的な櫛型分枝の１つの例は、Ａｌｔｏｒｅｓら（１９６５）Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ  Ａ  ３：４１３１−４１５１によって記載されるような櫛型分枝ポリスチレンであり、そして不規則な櫛型分枝の１つの例は、Ｓｏｒｅｎｓｏｎら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第二版、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２１３−２１４頁（１９６８）によって記載されるような、グラフトコポリマーによって示される。
【００６９】
両親媒性分散剤はまた、架橋ポリマーまたは網目構造ポリマーの形態（すなわち、ポリマー構造）の分枝ポリマーであり得、ここで、個々のポリマー鎖またはポリマー分枝は、二官能性化合物（例えば、ジアミンリンカーによって架橋（ｂｒｉｄｇｅｄまたはｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ）されるアクリル酸モノマー単位）の使用によって連結される。この型の分枝において、個々の分枝の多くは線状ではなく、各分枝自体は、線状の鎖からの側鎖ペンダントを含み得、そして骨格と分枝との間をおそらく区別しない。より重要なことに、網目構造の分枝において、各ポリマー高分子（骨格）は、他のポリマー高分子と２以上の部位で架橋される。また、架橋の化学的構成は、ポリマー高分子の化学的構成から変化し得る。この架橋ポリマーまたは網目構造分枝ポリマーにおいて、種々の分枝または架橋が、構造的に類似であり得るか（「規則的」架橋と称される）、またはこれらは、構造的に異なり得る（「不規則な」架橋と称される）。
【００７０】
両親媒性分散剤はまた、他の構造的構成を有し得、例えば、これは、米国特許第４，５９９，４００号および同第４，６９０，９８５号に記載のような星型／櫛型の分枝型ポリマーか、または米国特許第４，６９４，０６４号に開示されるようなロッド形状のデンドリマーであり得る。
【００７１】
本明細書中の特に好ましい両親媒性分散剤は、超分枝（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ）（２以上の分枝の生成を含む）またはデンドリマーである。超分枝ポリマーとは対照的に、デンドリマーは、規則的な分枝高分子であり、各反復単位に分枝点を有する。また、超分枝ポリマーは、重合反応によって得られ、一方、最も規則的なデンドリマーは、一連の段階的なカップリングおよび活性化工程によって得られる。デンドリマーの例としては、Ｔｏｍａｌｉａら（１９８５）Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１７：１１７のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（登録商標）デンドリマー、Ｈａｗｋｅｒら（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７６３８の収束性デンドリマー、およびＴｏｍａｌｉａら（１９９０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３５−１７５に記載されるジアミノブタンデンドリマーが挙げられる。しかし、超分枝ポリマーおよびデンドリマーの両方を用いて、ナノ粒子表面に対する親和性（すなわち、ナノ粒子の疎水性表面に対する分散剤の疎水性領域の親和性）および（漸増数の親水性領域またはセグメントの結果としての）水分散性の両方に関して、漸増数の疎水性領域および親水性領域は、ナノ粒子コアに対する分散剤の効果を増幅する。
【００７２】
親水性領域は、両親媒性分散剤の約３０重量％〜７５重量％を示し、そしてイオン化可能部分または極性部分、好ましくは、イオン化可能部分（例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸またはアミン置換基）を含む、少なくとも１つのモノマー単位からなる。親水性モノマー単位の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
水溶性エチレン性不飽和Ｃ３〜Ｃ６カルボン酸（例えば、アクリル酸、アルキルアクリル酸（特に、メタクリル酸）、イタコン酸、リンゴ酸、フマル酸、アクリルアミドメチル−プロパンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸、ビニル乳酸およびスチレンスルホン酸；
アリルアミンおよび無機酸（例えば、塩酸）を用いて形成される；
ジ−Ｃ１〜Ｃ３−アルキルアミノ−Ｃ２〜Ｃ６−アルキルアクリレートおよびメタクリレート（例えば、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリレート、ジメチルアミノブチルアクリレート、ジメチルアミノネオペンチルアクリレートおよびジメチルアミノネオペンチルメタクリレート）；
オレフィン性不飽和ニトリル（例えば、アクリロニトリル）；
ジオレフィン性不飽和モノマー、特に、ジアリルアンモニウム化合物（例えば、塩化ジメチルジアリルアンモニウム、臭化ジメチルジアリルアンモニウム、塩化ジエチルジアリルアンモニウム、メチル−ｔ−ブチルジアリルアンモニウムメトサルフェート、メチル−ｎ−プロピルジアリルアンモニウムクロリド、ジメチルジアリルアンモニウムヒドロゲンスルフェート、二リン酸水素ジメチルジアリルアンモニウム、ジ−ｎ−ブチルジアリルアンモニウムブロミド、ジアリルピペリジニウムブロミド、ジアリルピロリジニウムクロリドおよびジアリルモルホリニウムブロミド；
Ｎ−ビニルピロリドン；
Ｎ−ビニルホルムアミド；
アクリルアミドおよび置換アクリルアミド（例えば、Ｎ−メチロールアクリルアミドおよびＣ１〜Ｃ３アルキルアクリルアミド、特に、メタクリルアミド）；
Ｎ−ビニルイミダゾールおよびＮ−ビニルイミダゾリン；ならびに
他のモノマー、特に、エチレン性不飽和モノマー、好ましくは、少なくとも１つの親水性官能基（例えば、カルボキシレート基、チオカルボキシレート基、アミド基、イミド基、ヒドラジン基、スルホネート基、スルホキシド基、スルホン基、亜硫酸基、ホスフェート基、ホスホネート基、ホスホニウム基、アルコール基、チオール基、ニトレート基、アミン基、アンモニウム基またはアルキルアンモニウム基）で置換されたビニルモノマー、  −［ＮＨＲ１Ｒ２］＋、ここで、Ｒ１およびＲ２は、アルキル置換基であり、そして、この基は、負に荷電したアミノ（例えば、ハロゲンイオン、ニトレートなど）と会合する。この親水性官能基は、ポリマー骨格中の炭素原子に直接結合し得るが、ポリマー骨格と親水性官能基との間にいくらかの間隔を提供する結合を介して通常結合する。適切な結合としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：分枝または非分枝のアルキレン、分枝または非分枝のアルケニレン、分枝または非分枝のヘテロアルキレン（代表的には、１以上のエーテル結合または−ＮＨ−結合を含むアルキレン）、分枝または非分枝のヘテロアルケニレン（再び、代表的には、１以上のエーテル結合または−ＮＨ−結合を含むアルケニレン）、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルカリーレン、アラルキレンなど。この結合は、代表的に、２〜２４個、より代表的には  ２〜１２個の炭素原子を含む。
【００７３】
親水性領域はまた、部分的または完全に加水分解されたポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレンアルコール）、ポリ（エチレンオキシド）、高水酸化ポリ（アルキレンオキシド）（例えば、ポリ（エチレンオキシド））、セルロースセグメント（例えば、セルロース自体、またはセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロースなどからなる）、および多糖（例えば、キトサンまたはデキストラン）からなり得る。
【００７４】
疎水性領域は、約２５重量％〜９０重量％の両親媒性分散剤を示し、そして少なくとも１つのイオン化不能な非極性モノマー単位からなり、ナノ粒子の疎水性表面との非共有結合を容易にする。このようなモノマー単位の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
アクリレート（例えば、メタクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、イソデシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、フェニルメタクリレート、イソプロピルアクリレート、イソブチルアクリレートおよびオクタデシルアクリレート）、
アルキレン（例えば、エチレンおよびプロピレン）；
Ｃ４〜Ｃ１２−アルキル置換エチレンイミン；
アルキルアクリルアミド（ここで、アルキル基は、低級アルキルより大きい（特に、アルキルアクリルアミドにおいて、このアルキル基は、６個以上の炭素原子、代表的には６〜１２個の炭素原子を有する（例えば、ヘキシルアクリルアミド、オクチルアクリルアミドなど）））；
スチレンおよび疎水的に誘導体化されたスチレン（すなわち、１以上の疎水性置換基で置換されたスチレン、例えば、Ｃ５〜Ｃ１２ヒドロカルビル基）；
ビニルエーテル；
ビニルエステル（例えば、酢酸ビニル）；および
ビニルハライド（例えば、塩化ビニル）。
【００７５】
疎水性領域はまた、ポリクロロプレン、ポリブタジエン、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリイソブチルレンもしくはポリウレタンブロックからなり得るか、あるいは、２−ポリ（ヒドロキシアルカン酸）（例えば、２−ヒドロキシプロパン酸、２−ヒドロキシブタン酸、２−ヒドロキシイソブタン酸、２−ヒドロキシペンタン酸、１０−ヒドロキシデカン酸、１２−ヒドロキシドデカン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸、２−ヒドロキシステアリン酸、２−ヒドロキシ吉草酸）のポリ縮合物またはラクトンから得られる対応する縮合物、ジオールおよびジカルボン酸（例えば、ポリエチレンアジパート）の縮合物またはポリラクタム（例えば、ポリカプロラクタム）であり得る。
【００７６】
任意の上記モノマー単位およびポリマーセグメントは、当業者によって慣用的に使用される技術および試薬を使用することによって修飾され得る。このような修飾としては、例えば、慣用的な置換、化学基（例えば、アルキル基およびアルキレン基）の付加、ヒドロキシル化、酸化などが挙げられる。疎水性セグメントおよび親水性セグメントからなるこのような分枝ポリマーは、代表的に、以下：（１）親水性分枝を有する疎水性骨格、（２）疎水性分枝を有する親水性骨格、または（３）疎水性もしくは親水性のいずれかであり得る骨格、からなり、そして親水性分枝および疎水性分枝の両方で置換される。このようなポリマーは、当業者に容易に公知の任意の適切な方法ならびに／または適切な教科書および文献に記載される方法によって、調製され得る。例えば、（１）型のポリマーは、親水性側鎖（分枝）が骨格に移植され得る適切な反応性基を含む第二のモノマーとの、疎水性モノマーの共重合によって調製され得る。あるいは、（１）型のポリマーは、適切な反応性側基を用いる、単一疎水性モノマーの重合によって調製され得、そして、これらの反応性側基の部分は、親水性側鎖を移植することによって、重合後に修飾され得る。同様に、（２）型のポリマーは、疎水性側鎖（分枝）が骨格に移植され得る適切な反応性基を含む第二のモノマーとの、親水性モノマーの共重合によって調製され得る。あるいは、（２）型のポリマーは、適切な反応性側基を用いる、単一親水性モノマーの重合によって調製され得、そしてこれらの反応性側基の部分は、疎水性側鎖を移植することによって、重合後に修飾され得る。（３）型のポリマーは、骨格全体に反応性部位を有する線状ポリマーを最初に合成し、次いで、順序立っていてもいなくてもよい様式で、この骨格上に、親水性および疎水性の側鎖を移植することによって調製され得る。
【００７７】
特に好ましい両親媒性分散剤としては、疎水性領域を含むように修飾されたアクリル酸およびメタクリル酸ポリマー、ならびに疎水性コモノマーを有するアクリル酸および／またはメタクリル酸のコポリマー（例えば、アルキルアクリルアミド）が挙げられる。このようなポリマーの例は、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−オクチルアクリルアミド）、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−ヘキシルアクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−オクチルアクリルアミド）、およびポリ（メタクリル酸−ｃｏ−ヘキシルアクリルアミド）であり、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−オクチルアクリルアミド）が最も好ましい。多重両親媒性分散剤として適切なポリマーを合成するために使用される特定の方法論は、使用される特定のモノマー型に依存する。当業者に認識されるように、適切な重合技術としては、ステップ重合、ラジカル鎖重合，エマルジョン重合、イオン性鎖重合、連鎖重合、開環重合、リビング重合、ポリ縮合反応および移植重合が挙げられる。好ましい実施形態において、この両親媒性  分散剤は、エチレン性不飽和モノマーの付加重合によって形成される。このような重合反応は、一般に、金属触媒（例えば、遷移金属ベースのメタロセン、Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｎａｔｔａ触媒、Ｂｒｏｏｋｈａｒｔ型触媒など）を使用して触媒され、そして代表的には、適切な温度で、陰圧、陽圧または大気圧で、不活性雰囲気下で、所望のポリマーを生成するのに十分な時間にわたって、モノマー、触媒および触媒活性化剤（例えば、メチルアルミノキサン（ａｌｕｍｉｎｏｘａｎｅ）すなわち「ＭＡＯ」）を含む。所望の場合、添加された溶媒が使用され得るか、またはモノマー化合物は、溶媒として作用し得る。この反応は、溶液もしくはスラリーの条件下で、懸濁物において、または気相において実行され得る。上に示されるように、分枝ポリマーは、重合の間にポリマー骨格に反応性部位を導入することによって、（例えば、ペンダント反応性部位を有するモノマー単位のいくつかの部分を取り込むことによって）、続いて、この反応性部位で分枝を合成または移植することによって、この技術を使用して調製され得る。
【００７８】
好ましい実施形態において、この両親媒性分散剤は、疎水性アンカー基（すなわち、ナノ粒子表面に分散剤を「アンカーする」ように働く疎水性側鎖）を含むように修飾された親水性骨格からなる。例えば、（例えば、ポリ（アクリル酸）、［−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）］ｎ中のような）ペンダントカルボン酸基を含む親水性ポリマーは、当該分野で公知の方法を使用して、制御された数の分枝または非分枝の疎水性側鎖を含むように容易に修飾され得る。１つのこのような方法において、ポリ（アクリル酸）のペンダントカルボン酸基は、適切な活性化剤（例えば、塩化チオールまたはカルボジイミド）を用いて活性化され得、その後、長鎖アルキルアミン（例えば、Ｃ４〜Ｃ１２アルキルアミン（たとえば、オクチルアミン））と反応し、そして最後に、水のような加水分解剤と反応する。アルキルアミンおよび加水分解剤の相対量に依存して、得られたポリマーは、親水性骨格（部分的加水分解後に存在するカルボン酸基による）および疎水性側鎖（アミド結合を介して骨格に結合した長鎖アルキル基）を有する両親媒性ポリマーである。
【００７９】
疎水的に修飾された親水性ポリマーの上記の群には、疎水的に修飾されたペプチド、好ましくは疎水的に修飾された合成ポリペプチドが存在する。合成ポリペプチドの使用によって、多数の因子（親水性骨格の分子量の単分散性、骨格上の修飾可能な基の位置の数、および修飾の規則性（すなわち、疎水性基が、ポリペプチド鎖全体にランダムに分布するか、または順序立った「規則的な」様式で分布するか））にわたって制御が可能になる。
【００８０】
適切なポリペプチドは、トリブロック（Ａ−Ｂ−Ａ）コポリマー（例えば、アスパラギン酸およびノルロイシンのトリブロックコポリマー）であり、この場合、ポリノルロイシンは、好ましくは、中心ブロック「Ｂ」である。このようなトリブロックコポリマーは、疎水性側鎖が豊富な領域を提供する。１つの代替において、この中心ブロック「Ｂ」は、親水性アミノ酸（例えば、ポリ（リジン））を含み得、これは、疎水性側鎖を含むように、標準的な化学によって修飾され得る。カルボン酸リッチなアスパラギン酸側鎖（Ａ）は、ナノ結晶を水分散性にする際に助けをするだけではなく、さらなる化学（例えば、親和性分子との結合体化）のための反応性部位または官能化可能な部分を提供する、極性のイオン性基を提供する。
【００８１】
本発明のポリペプチド組成物はまた、天然に単官能性であり得る（例えば、ポリリジンまたはポリアスパラギン酸、ジブロックコポリマー（Ａ−Ｂ）もしくは３種の異なるアミノ酸のトリブロックコポリマー（Ａ−Ｂ−Ｃ））。これらの組成物はまた、リジンまたはアスパラギン酸に限定されないが、任意の数の既知のアミノ酸の組合わせを使用し得る。一般に、ポリペプチドの疎水性領域は、少なくとも１つの疎水性アミノ酸からなり、そして親水性領域は、少なくとも１つの親水性アミノ酸からなる。当業者に理解されるように、疎水性アミノ酸としては、例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインが挙げられ、そして疎水性側鎖を含むように修飾された親水性アミノ酸を含み、一方、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンが挙げられる。
【００８２】
両親媒性分散剤は、一般に、必ずしも約５００〜５０，０００の範囲内の分子量を有する必要はないが、好ましくは約１０００〜１０，０００の範囲内、より好ましくは、約１０００〜５０００の範囲内の分子量である。この分散剤は、外側分子部分に共有結合または非共有結合するのに有用な官能化可能部位を含むように修飾され得る。この官能化可能部位は、上で議論したイオン化可能基に加えて存在し得るか、またはこのイオン化可能基は、外側分子部分に結合するのに適切な官能化可能部位として、それ自体作用し得る。官能化可能部位としては、例えば、単純な従来の化学技術を使用して修飾される任意の従来の官能基（例えば、アミノ基、ニトリル、カルボン酸、エステル、酸塩化物など）が挙げられる。好ましくは、必須ではないが、これらの官能化可能部位は、分散剤構造から、不活性結合部分（例えば、アルキレン鎖またはオキシアルキレン鎖、代表的には、約２〜２０個の炭素原子、好ましくは約４〜１０個の炭素原子からなる）または他の結合部分（例えば、親水性官能基をポリマー骨格に結合させる、存在し得るスペーサー結合に関して上記された結合部分）の分だけ間隔が空いている。
【００８３】
（ＩＶ．表面修飾ナノ粒子の調製）
疎水性ナノ粒子は、両親媒性分散剤での表面修飾により水分散性にされ得る。すなわち、分散剤の疎水性領域は疎水性ナノ粒子表面に結合し、そして親水性領域は外側に面し、水分散性を提供する。ナノ粒子の表面修飾は以下のように実施される。
【００８４】
最初に、両親媒性分散剤の溶液は、選択された両親媒性分散剤と適切な非水溶媒、好ましくはｎ−ヘキサンまたはクロロホルムのような非極性の水混和性溶媒との混合により調製される。次いで分散剤のイオン化可能基は、存在する場合、イオン化剤として使用される適切な酸または塩基で処理されることにより塩形態に転換される。イオン化可能酸性基に対して適切な塩基は、一般的に無機塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたはアルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）あるいはアルカリ土類金属（例えば、マグネシウムまたはカルシウム）の水酸化物である。この疎水性ナノ粒子は、（前述のイオン化工程の前または後のいずれかで）同一の溶媒中に分散される。しかし、代表的に、ナノ粒子はイオン化後にイオン化された分散剤の攪拌溶液に添加（好ましくは滴下）される。あるいは、ナノ粒子は最初に溶液中に分散され、そして分散剤がそこへ添加される。別の選択肢として、分散剤を含む一方の溶液およびナノ粒子を含む他方の溶液（好ましくは、両方の溶液は同じ溶媒を含む）の２つの別個の溶液が調製され得、そして混合され得る。全ての場合において、ナノ粒子−分散剤−溶媒の混合物の調製後、この混合物は、好ましくは数分間攪拌され、成分を完全に混合する。
【００８５】
このプロセスの次の工程において、ナノ粒子、分散剤および溶媒の混合物は、ナノ粒子によって分散剤の吸収を生じるのに有効な条件に供される。例えば、混合物は、溶媒を除去するために加温され得るか、または減圧下（分散剤でコートしたナノ粒子を得る乾燥プロセスのような）に置かれ得る。あるいは、この条件は溶媒の極性の変化および／またはポリマーのイオン状態の変化に関連し得る。
【００８６】
次に、分散剤でコートされたナノ粒子は、溶媒交換（分散剤でコートしたナノ粒子が予め乾燥されていない場合）または水もしくは水性緩衝液の添加（分散剤でコートしたナノ粒子が予め乾燥されている場合）を用いて、水のような水性媒体に移行し得る。水性緩衝液は、使用される場合、水性媒体中のナノ粒子の分散を促進するのに有効であるべきである。次いで水分散液は濾過され、溶液において粒子と結合していない過剰な分散剤によって形成される任意の大きなミセル構築物を除去する。次いで、これらの物質は、ナノ結晶の水性ベースのゾルを必要とする任意の用途において使用され得る。これらの粒子を使用する前に、粒子は、分散剤コーティングの個々のポリマー鎖を化学的架橋により、各ポリマーが、粒子上の他のポリマー鎖に対して潜在的な多数の化学結合を有するように、両親媒性コーティングの安定性をさらに増強し得る。当業者は、使用される架橋剤が分散物コーティングの特性に合うように作られ得ることを認識する。例えば、ジアミンは、カルボン酸を含む分散剤コーティングを架橋するために使用され得る。特定の有用性は、電荷または本明細書中に記載されるような分散コロイドを安定化し得る他の基を有する架橋剤である。ジアミノカルボン酸塩またはジアミノスルホン酸塩およびジアミノポリエチレングリコール架橋剤が特に有用である。同様の化学は、多くのアミノ部分（例えば、デンドリマー、修飾されたデンドリマーなど）を有する架橋剤に適用する。
【００８７】
生じる分散剤でコートされたナノ粒子において「内部コア」の単位質量あたり（すなわち、元々の修飾されていないナノ粒子の単位質量あたり）の両親媒性分散剤の量は、ナノ粒子のサイズおよび表面面積に比例する。一般的に、内部コアに対する分散剤の比は、約５０：１〜約５０００：１の範囲内である。この比は、より小さいナノ粒子（すなわち、直径約５ｎｍ未満のナノ粒子（例えば、グリーンＣｄＳｅ量子ドット））では５０：１に近づき、そしてより大きなナノ粒子（すなわち、直径約５ｎｍ〜１０ｎｍのナノ粒子（例えば、レッドＣｄＳｅ量子ドット））では５０００：１に近づく。
【００８８】
（Ｖ．ナノ粒子結合体および結合組成物）
本発明は、本発明の表面修飾半導性ナノ粒子の結合体および標的分析物に結合したこれらの結合体を含む組成物にさらに関する。
【００８９】
すなわち、本発明の表面修飾半導性ナノ粒子は、結合対の第１のメンバーとして働く親和性分子に結合し得る。一般的に、必ずではないが、これは、親和性分子への結合手段を提供するナノ粒子表面上の両親媒性分散剤である。上記のように、両親媒性分散剤の親水性領域内に存在するイオン化可能基は、親和性分子への結合手段を提供し得、そして／または分散剤分子内に存在または導入される他の官能基が、親和性分子への結合手段を提供し得る。この結合は一般的に共有結合であり、そして適切な結合は上記のセクションＩＩＩで議論される。親和性分子に分子および分子セグメントを結合する適切な方法が、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６）に記載される。
【００９０】
親和性分子によるこのような半導性ナノ粒子「結合体」は、生物学的化合物および化学的化合物の存在および／または量、生物系、生物学的プロセスにおける相互作用、生物学的プロセスの変更あるいは生物学的化合物の構造における変化を検出するために使用され得る。すなわち、半導性ナノ粒子に結合した場合、親和性分子は、結合対の第２のメンバーとして働く生物学的標的と相互作用し、生物学的プロセスまたは応答を検出するか、あるいは生物学的分子またはプロセスを変化させ得る。好ましくは、親和性分子および生物学的標的の相互作用は、特異的結合を伴い、そして共有結合、非共有結合、疎水性、親水性、ファンデルワールスまたは磁性の相互作用を伴い得る。好ましくは、親和性分子は生物学的標的と物理的に相互作用する。
【００９１】
半導性ナノ粒子に結合する親和性分子は、天然に存在し得るかまたは化学的に合成され得、そして所望の物理学的、化学的または生物学的特性を有することが選択され得る。このような特性としては以下が挙げられるが、これらに制限されない：タンパク質、核酸、シグナル伝達分子、原核生物細胞または真核生物細胞、ウイルス、細胞内オルガネラおよび他の任意の生物学的化合物との共有結合および非共有結合。このような分子の他の特性としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない：生物学的プロセス（例えば、細胞周期、血液凝固、細胞死、転写、翻訳、シグナル伝達、ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ切断、ラジカル生成、ラジカル除去など）に影響を与える能力、および生物学的化合物の構造（例えば、架橋、タンパク質分解切断、ラジカル損傷など）を変化させる能力。
【００９２】
好ましい実施形態において、ナノ粒子結合体は、調整可能な波長で光を放射する半導性ナノ粒子を含み、そして核酸に結合される。結合は、直接的または間接的であり得る。核酸は、任意のリボ核酸、デオキシリボ核酸、ジデオキシリボ核酸または任意の誘導体およびその組み合わせであり得る。核酸はまた、任意の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、三本鎖またはより高位の立体配置（例えば、ホリデー結合、環状一本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ立方体（Ｓｅｅｍａｎ（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２７：２２５２４８を参照のこと）であり得る。とりわけ好ましい本発明の組成物および方法の使用は、以下のような核酸の検出および／または定量である：（ａ）ウイルス核酸；（ｂ）細菌核酸；および（ｃ）目的の多くのヒトの配列（例えば、単鎖ヌクレオチド多型）。本発明の範囲を制限することなしに、ナノ粒子結合体は、個々のヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドまたは任意の誘導体およびその組み合わせに結合するナノ結晶を含み得、そしてＤＮＡ重合反応（例えば、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において使用される。ヌクレオチドとしてはまた、一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩ならびに環状誘導体（例えば、環状アデニン一リン酸（ｃＡＭＰ））が挙げられる。核酸に結合したナノ粒子の他の使用は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が含まれる。この好ましい実施形態において、ナノ結晶はインビボで特異的な配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドに結合される。ハイブリダイゼーションに関して、蛍光ナノ結晶タグは、細胞において所望のＤＮＡ配列の位置を可視化するために使用される。例えば、そのＤＮＡ配列が部分的または完全に既知である遺伝子の細胞内局在は、ＦＩＳＨを用いて決定され得る。その配列が部分的または完全に既知である任意のＤＮＡまたはＲＮＡは、ＦＩＳＨを用いて視覚的に標識され得る。例えば、本発明の範囲を制限することなしに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡテロメア、他の高反復ＤＮＡ配列および他のコードされていないＤＮＡ配列がＦＩＳＨにより標的化され得る。
【００９３】
ナノ粒子結合体はまた、生物学的化合物（例えば、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、細胞内オルガネラ、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロール、細胞膜、シグナル伝達に関する分子、レセプターおよびイオンチャネル）の検出のための分子または試薬と結合して、本明細書中で提供されるような表面修飾半導性ナノ粒子を含む。結合体はまた、細胞形態および流体の流れ；細胞生存能力、増殖および機能；エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス（Ｂｅｔｚら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６（３）：３６５−７１）；および反応性酸素種（例えば、スーパーオキシド、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、酸素ラジカル）を検出するために使用され得る。さらに、結合体は、生物系の疎水性領域または親水性領域を検出するために使用され得る。
【００９４】
半導性ナノ結晶の結合体はまた、他の多くの生物学的および非生物学的な用途における有用性を見い出し、ここで、発光マーカー、特に蛍光マーカーが代表的に使用される。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ．第６版１９９６；Ｗｅｂｓｉｔｅ，ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ．）を参照のこと。本発明の発光ナノ粒子結合体が有用である領域の例としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない：蛍光免疫細胞化学、蛍光顕微鏡法、ＤＮＡ配列分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、フローサイトメトリー（蛍光活性化セルソーター；ＦＡＣＳ）および生物系についての診断アッセイ。上記の領域におけるナノ結晶結合体の有用性に関するさらなる議論については、Ｂａｗｅｎｄｉらに対する国際特許公開ＷＯ  ００／１７６４２を参照のこと。
【００９５】
本発明は、その特に好ましい実施形態とともに記載されているが、上記の説明およびに以下に続く実施例は、本発明の例示を意図するものであり、本発明の範囲を制限しないことが理解される。他の局面において、本発明の範囲内の利点および修飾は、本発明に関連する当業者に明らかである。
【００９６】
以下の実施例は、本発明の新規の組成物の作製および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供することが意図される。試行は、使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確性を確実にするためになされ得るが、ある程度の実験誤差および偏差は当然認められるべきである。他に示されなければ、部は重量部であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は雰囲気下または雰囲気下付近である。
【００９７】
本発明の実施は、他に示されなければ、合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｉｎｅｓ  ＆  Ｓ  Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；およびＨｏｕｓｅ’ｓ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓを参照のこと）。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
（疎水性に修飾された親水性ポリマーの合成）
１００ｇ［０．４８モル  ＣＯＯＮａ］のポリ（アクリル酸、ナトリウム塩）（Ａｌｄｒｉｃｈ製、分子量１２００）を希釈することによって調製した修飾されたポリアクリル酸を、水で２倍に希釈し、そして１．０Ｌ丸底フラスコ中において１５０ｍｌ（１．９モル）の濃ＨＣｌで酸性化した。酸性化したポリマー溶液を、ロータリーエバポレーター（１００ｍｂａｒ、８０℃）で乾固するまで濃縮した。乾燥ポリマーを＜１０ｍｂａｒで１２時間にわたってエバキュエートし、水を確実に除去した。攪拌子および４７．０ｇ（０．２４モル）の１−［３−（ジメチル−アミノ−プロピル］−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ９８％）をフラスコに添加し、次いでこのフラスコを密封しＮ２でパージし、そしてバルーンを装着した。５００ｍｌの無水Ｎ−Ｎ，ジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、陽圧下でカニューレを通してこの混合物に移し；そしてこのフラスコを穏やかにスワールし固体を溶解した。３２ｍｌのオクチルアミン（０．１９ｍｏｌ）を、陽圧下でカニューレを通して、密封したオーブン乾燥メスシリンダーから攪拌中のポリマー／ＥＤＣ溶液に滴下し、そして１２時間にわたって攪拌を続けた。この溶液を、＜１００ｍｌまでロータリーエバポレーター（３０ｍｂａｒ、８０℃）で濃縮し、そしてこのポリマーを、冷却濃度に対して２００ｍｌ  ｄｉ−Ｈ２Ｏの添加により沈降させ、粘着性白色物質を生成した。この物質を上清から分離し、１００ｍｌ  ｄｉ−Ｈ２Ｏと一緒に３回より多く摩砕した。この生成物を、穏やかに加温しながら４００ｍｌの酢酸エチル（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解し、そして２００ｍｌ  ｄｉ−Ｈ２Ｏおよび１００ｇのＮ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−テトラメチルアンモニウムヒドロキシド五水和物（０．５５  ｍｏ）を用いて、１２時間にわたって塩基性化した。水層を除去し、４００ｍｌの１．２７Ｍ  ＨＣｌを用いて粘着性白色生成物を沈降させた。この生成物をデカントし、そして１００ｍｌのｄｉ−Ｈ２Ｏと一緒に２回より多く摩砕した。
水性洗浄後、酢酸エチルの６×１００ｍｌ部分に逆抽出した。この酢酸エチル溶液を生成物のフラスコに添加し、乾固するまで濃縮した（１００ｍｂａｒ、６０℃）。粗ポリマーを３００ｍｌのメタノール中に溶解し、流速３ｍｌ／分でＬＨ−２０（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−５．５ｃｍ×６０ｃｍカラム）で２アリコートに精製した。画分を純度についてＮＭＲで試験し、そして純粋な画分をプールし、不純な画分をＬＨ−２０カラムで再精製した。純粋な画分を全てプールした後、このポリマー溶液をロータリーエバポレーターで乾固するまで濃縮し、＜１０ｍｂａｒで１２時間にわたってエバキュエートした。この生成物は白色粉末であり（２５．５ｇ、理論上の収率４５％）、ＣＤ３ＯＤにおいて広範なＮＭＲピーク［δ＝３．１ｂ（９．４），２．３ｂ（９．７），１．９  １．７  １．５  １．３ｂ（６３．３）０．９ｂｔ（１１．３）］を示し、そしてカルボン酸（１７１２ｃｍ−１）およびアミド基（１６２６ｃｍ−１、１５４４ｃｍ−１）の両方について明らかなＩＲシグナルを明らかにした。
【００９９】
（実施例２）
（表面修飾ナノ結晶の調製）
２０ミリリットルの３〜５μＭ（３〜５ｎｍｏｌ）のＴＯＰＯ／ＴＯＰコートＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ結晶（Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８７０６を参照のこと）を、２０ミリリットルのメタノールで沈殿させた。凝固物を３０００×ｇで３分間遠心分離し、ナノ結晶のペレットを形成した。その後、上清を除去し、そして２０ミリリットルのメタノールをこの粒子に再び添加した。この粒子をボルテックスし、メタノール中に凝固物をおおまかに分散させた。この凝固物をナノ結晶のペレットが形成されるまでさらに遠心分離した。この沈降／遠心分離の工程をさらに繰り返し、ナノ結晶合成から残存する全ての過剰な反応物を除去した。２０ｍｌのクロロホルムを、ナノ結晶ペレットに添加し、十分に分散したゾルを生成した。
【０１００】
３００ミリグラムの疎水性に修飾されたポリ（アクリル酸）を、２０ｍｌのクロロホルムに溶解した。テトラブチルアンモニウム水酸化物（メタノール中、１．０Ｍ）を、ポリマー溶液に添加し、溶液をｐＨ１０まで上昇させた（ｐＨを、ｐＨ試験紙上にクロロホルム溶液の低アリコートをスポットし、溶媒をエバポレートし、その後ｐＨ試験紙を蒸留水で湿らせることにより測定した）。その後ポリマー溶液を、攪拌子の備えられた２５０ｍｌの丸底フラスコにおいて２０ｍｌのクロロホルムに添加した。この溶液を１分間攪拌し、ポリマー溶液の混合を完全にした。攪拌しながら上記の洗浄したナノ結晶分散物を、ポリマー溶液に滴下した。ついで、この分散物を２分間攪拌し、この成分の混合を完全にし、そしてクロロホルムを減圧下にて低温加熱で除去し、フラスコ壁に粒子−ポリマー複合体の薄いフィルムを得た。２０ミリリットルの蒸留水をフラスコに添加し、フラスコ壁に沿ってスワールし、そして水性媒体において粒子が分散するのに役立てた。次いでこの分散物を室温にて一晩で攪拌させた。この時点でナノ結晶は、水性溶媒中に十分に分散し、付属の化学官能性を有し、それゆえ生物標識実験に関する当該分野で周知の方法を用いて所定の親和性分子に連結される。さらに、ナノ結晶が高位に荷電された表面を有するという事実は、これらが薄いフィルムおよび複合性物質の形成に関する高分子電解質層状実験において、容易に利用され得ることを意味する。
【０１０１】
（実施例３）
（ナノ結晶結合体の調製）
官能性および特異的な生物学的標識を、以下のような本発明の物質を用いて作製する：実施例１からのポリマー安定化粒子を、１リットルの蒸留水および１リットルの５０ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．９）に対して、１００Ｋ  ポリエーテルスルホン膜を用いるタンジェンシャルフローダイアフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって、過剰な（吸着していない）ポリマーおよびテトラブチルアンモニウム水酸化物から精製した。精製した分散物を、２０ミリリットルまで濃縮し、そしてこの分散物の１０ミリリットルを、７９μモル（１５ｍｇ）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１５８μモル（３４ｍｇ）のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドで３０分間、室温にて活性化した。次いで粒子分散物を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対するダイアフィルとレーションによって、ｐＨ８．０に緩衝液を交換した。粒子分散物がｐＨ８．０に達したとき、この粒子にストレプトアビジンを５：１のタンパク質：粒子の比（１７５ｎｍｏｌ、１０．５ｍｇ）で添加し、そしてこの反応混合物を室温にて一晩で攪拌しながらインキュベートした。一晩のインキュベーション後、この結合粒子を、２リットルのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に対して１００，０００ＭＷポリエーテルスルホン膜を用いるタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションによって、反応していない過剰なタンパク質から分離した。
【０１０２】
この時点で、これらの物質は、多くの任意の生物学的緩衝液において保管され得、そして所定のビオチン標識分析物を検出するための蛍光生物学的標識として使用され得る。本明細書中では例示としてストレプトアビジンを使用したが、上記の結合化学の単純および一般性は、所定の多くの任意の生物学的分子（例えば、抗体、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド）との官能基結合を形成するために効果的に拡大され得る。
【０１０３】
（実施例４）
（ポリマーにより安定化されたナノ結晶のデンドリマーによる架橋）
実施例２に記載されるように安定化された、１０ｍＬのナノ結晶（３．５μＭ）を、実施例３に記載されるように、１Ｌの蒸留水に対するタンジェンシャルフローフィルトレーションにより精製し、過剰なポリマーを除去した。このナノ結晶を１０ｍＬに濃縮し、そして水性分散物のｐＨを、０．１Ｍ  ＨＣｌを５０μＬ添加することによりｐＨ６．５に低下させた。６７ｍｇ（３１５μｍｏｌ）のＥＤＣを、攪拌しながらナノ結晶分散物に添加した。この反応を、１０分間進行させ、その後、３．９４μｍｏＬの架橋剤Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（登録商標）（ＰＡＭＡＭ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ０）を含有する１ｍＬの０．５Ｍ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）をこの混合物に添加した。この反応混合物を室温にて２時間攪拌し、次いで、５０，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン透析バッグに移した。透析を、４Ｌの水（２回交換）に対して２４時間実施した。
【０１０４】
（実施例５）
（ポリマーにより安定化されたナノ結晶のジアミノ架橋剤による架橋）
実施例２に記載されるように安定化された、１０ｍＬのナノ結晶（３．５μＭ）を、実施例３に記載されるように、１Ｌの蒸留水に対するタンジェンシャルフローフィルトレーションにより精製し、過剰なポリマーを除去した。このナノ結晶を１０ｍＬに濃縮し、そして水性分散物のｐＨを、０．１Ｍ  ＨＣｌを５０μＬ添加することによりｐＨ６．５に低下させた。６７ｍｇ（３１５μｍｏｌ）のＥＤＣを、攪拌しながらナノ結晶分散物に添加した。この反応を、１０分間進行させ、その後、３．９４μｍｏｌの架橋剤リジン（ジアミノカルボン酸）を含有する１ｍＬの０．５Ｍ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）をこの混合物に添加した。この反応混合物を室温にて２時間攪拌し、次いで、５０，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン透析バッグに移した。透析を、４Ｌの水（２回交換）に対して２４時間実施した。
【０１０５】
（実施例６）
（ポリペプチドを有する表面が修飾されたナノ結晶の調製）
（アスパラギン酸）４−（ノルロイシン）８−（アスパラギン酸）４を含むトリブロックポリペプチドを用いて、以下の方法により、水中の疎水性ナノ結晶を安定化させた。５ｍＬの３．５μＭナノ結晶溶液を実施例１に記載されるように洗浄し、そして５ｍＬのクロロホルム中の再分散した。７５ｍｇの（アスパラギン酸）４−（ノルロイシン）８−（アスパラギン酸）４トリブロックポリペプチドを、５ｍＬのクロロホルム：メタノール＝５０：５０混合物中に溶解し、水酸化テトラブチルアンモニウム（メタノール中に１．０Ｍ）のアリコートによりポリペプチド溶液のｐＨを１０に上昇させた。次いで、このポリペプチド溶液を、５０ｍＬの丸底フラスコ中で５ｍＬのクロロホルムに添加した。この溶液を１分間攪拌し、完全に混合した。次いで、洗浄したクロロホルム中のナノ結晶分散物を攪拌しながらポリペプチド溶液に滴下し、そして混合物全体をさらに２分間攪拌させた後、全ての溶媒を低温加熱（４０℃）により真空下（ｉｎ  ｖａｃｕｏ）で除去して、フラスコの壁に粒子−ポリマー複合体の薄膜を得た。次いで、５ｍＬの蒸留水をフラスコに添加し、そしてナノ結晶の水性媒体中での十分な分散を補助するために攪拌した（ｓｗｉｒｌｅｄ）。実施例１において安定化されたナノ結晶のように、これらのポリペプチドで安定化されたナノ結晶は、透析、タンジェンシャルフローフィルトレーション、または当該分野で公知の種々の形態のクロマトグラフィーにより過剰なポリペプチドから効果的に精製され得る。
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月28日(2010.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導性材料または金属性材料から構成される内部コア；および多重両親媒性分散剤から構成される、該内部コアを取り囲む外部層、を含む、水分散性ナノ粒子。