(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞活性化についての新規な樹状細胞（ＤＣ）特異的補助刺激分子をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】補助刺激タンパク質分子であるＢ７−ＤＣは、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、これをコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡを含む発現ベクターが記載される。Ｂ７−ＤＣタンパク質、フラグメント、融合ポリペプチド／タンパク質および他の機能的誘導体、ならびにＢ７−ＤＣを発現する形質転換された細胞は、ワクチン組成物および方法に有用である。抗腫瘍性免疫および抗ウイルス性免疫に利用され得る、強力なＴ細胞媒介性応答を誘導するための組成物および方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７−ＤＣと称される哺乳動物タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、該タンパク質は、活性化したマクロファージと比較して樹状細胞上に選択的に発現される、核酸分子。
【請求項２】
配列番号１または配列番号５より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１または２に記載の核酸分子とハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、配列番号２および配列番号４より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするか、または該タンパク質の生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする、核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、配列番号２の配列を有するタンパク質をコードするか、または配列番号２の生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする、核酸分子。
【請求項７】
前記Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは一部をコードする、請求項５または６に記載の核酸分子の、フラグメント。
【請求項８】
Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸分子であって、該分子は、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のＢ７−ＤＣタンパク質の全てまたは一部である、第一のポリペプチドをコードする、第一の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて、該第一の核酸配列とインフレームで融合される、リンカーポリペプチドをコードする、リンカー核酸配列；および
（ｃ）該第一の核酸配列または該リンカー核酸配列にインフレームで連結されかつ第二のポリペプチドをコードする、第二の核酸配列、
を含む、核酸分子。
【請求項９】
前記第二のポリペプチドがＩｇ重鎖定常領域の１以上のドメインからなる、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記第二のポリペプチドがヒトＩｇＧ定常領域の２つのドメインからなる、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクターであって、以下：
（ａ）プロモーター、および
（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞において該核酸の発現を調節する、さらなる調節配列、
に作動可能に連結された、発現ベクター。
【請求項１２】
プラスミドである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
ウイルスベクターである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
ベクター組成物であって、以下：
（ａ）第一の組み換え体発現ベクターであって、その核酸中に、免疫応答が誘導される目的の抗原をコードするヌクレオチド配列が組み込まれている、ベクター；および
（ｂ）第二の組み換え体発現ベクターであって、その核酸中に、補助刺激ポリペプチドをコードする１以上のヌクレオチド配列が組み込まれており、ここで、該補助刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、Ｂ７−ＤＣであるか、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体である、ベクター、
を含み、ここで、該発現ベクターは、抗原と、該補助刺激ポリペプチド、フラグメント、ホモログもしくは誘導体との同時発現を生じる宿主細胞に同時感染され得るかまたは同時トランスフェクトされ得る、ベクター組成物。
【請求項１５】
前記第二のベクターが配列番号１または配列番号５を含む、請求項１４に記載のベクター組成物。
【請求項１６】
前記第二のベクターが配列番号１を含む、請求項１４または１５に記載のベクター組成物。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子を用いて形質転換またはトランスフェクトされる、細胞。
【請求項１８】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされる、細胞。
【請求項１９】
哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ヒト細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
樹状細胞またはその前駆体である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
腫瘍細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２３】
外因性核酸分子でトランスフェクトされた、単離された哺乳動物腫瘍細胞であって、該核酸分子は、哺乳動物Ｂ７−ＤＣタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードし、その結果、該タンパク質、フラグメント、ホモログまたは誘導体は、該腫瘍細胞によって発現され、そして該腫瘍細胞は、Ｔ細胞と接触され、
（ｉ）該Ｂ７−ＤＣタンパク質、フラグメント、ホモログまたは誘導体は、該Ｔ細胞に結合し；そして
（ｉｉ）該腫瘍細胞は、該Ｔ細胞を補助刺激して増殖ならびに／またはサイトカインを生成および分泌する、
腫瘍細胞。
【請求項２４】
前記外因性核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号５の配列、または該配列のフラグメントを含む、請求項２３に記載の腫瘍細胞。
【請求項２５】
ポリペプチドであって、活性化されたマクロファージと比較して樹状細胞上に選択的に発現されかつ以下の機能的特性：
（ａ）Ｔ細胞上の結合パートナーに結合すること；および
（ｂ）増殖ならびに／またはサイトカインを生成および分泌するようにＴ細胞を補助刺激すること、
を有する、ポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１もしくは配列番号５の配列を有する核酸分子、または該核酸分子のフラグメント、ホモログもしくは等価物によってコードされる、請求項２５に記載のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列、または該ポリペプチドのフラグメント、ホモログもしくは等価物を有する、ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸の組み換え体発現によって生成される、ポリペプチド、または該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体。
【請求項２９】
Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、該ドメインは、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸残基２６〜２２１、または該ドメインの補助刺激フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項３０】
Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインを実質的に含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、該ドメインは、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸残基２６〜２２１、または残基２６〜２２１の補助刺激フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項３１】
Ｂ７−ＤＣタンパク質の全てまたは一部を含む第一の融合パートナーを有する、Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチドであって、該Ｂ７−ＤＣタンパク質は：
（ｉ）第二のポリペプチドに直接融合されるか、または
（ｉｉ）必要に応じて、該第二のポリペプチドに融合されるリンカーペプチド配列に融合される、
Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチド。
【請求項３２】
第二のポリペプチドに融合される請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載の融合ポリペプチドであって、Ｔ細胞上の結合パートナー分子に結合し、そしてＴ細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下で該Ｔ細胞を補助刺激する、融合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記結合パートナー分子がＰＤ−１である、請求項３３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記第二のポリペプチドがＩｇ重鎖定常領域の１以上のドメインである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドであって、前記第一の融合パートナーは、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸２６〜２２１、またはその補助刺激フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、融合ポリペプチド。
【請求項３７】
請求項３６に記載の融合ポリペプチドであって、前記第一の融合パートナーは、配列番号２のアミノ酸２６〜２２１、またはその補助刺激フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、融合ポリペプチド。
【請求項３８】
ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの直列に連結されたダイマーまたはトリマーである、ダイマー融合ポリペプチドまたはトリマー融合ポリペプチド。
【請求項４０】
末端と末端とで、直接にか、または前記モノマーの反復の間に存在するリンカー配列を有して連結された、前記第一の融合パートナーのモノマーが２以上反復する直鎖状マルチマーを含む、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
Ｂ７−ＤＣタンパク質のエピトープに特異的である抗体であって、該エピトープは、Ｂ７ファミリータンパク質の既知のメンバー中には存在しない、抗体。
【請求項４２】
前記エピトープは、配列番号２または配列番号４のポリペプチドの線状エピトープまたは立体的エピトープである、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
前記エピトープは、配列番号２のポリペプチドの線状エピトープまたは立体的エピトープである、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
モノクローナル抗体である、請求項４１または４２に記載の抗体。
【請求項４５】
ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４６】
細胞集団中の、その表面上にＢ７−ＤＣポリペプチドを発現する細胞を同定または定量化する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該集団の細胞を、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の抗体と接触させて、その結果、該抗体が該エピトープを発現する細胞に結合する、工程；および
（ｂ）該抗体が結合する細胞の存在を評価する工程、または該抗体が結合する細胞の数を定量化する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
その表面上にＢ７−ＤＣポリペプチドを発現する細胞を細胞集団から単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該集団の細胞を、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の抗体と接触させて、その結果、該抗体が該エピトープを発現する細胞に結合する、工程；
（ｂ）該抗体が結合している細胞をポジティブに選択する工程、または該抗体が結合していない細胞をネガティブに選択する工程、
を包含し、これにより該細胞を単離する、方法。
【請求項４８】
サンプル中の、Ｂ７−ＤＣポリペプチド、フラグメントもしくはホモログの存在を検出するか、またはＢ７−ＤＣポリペプチド、フラグメントもしくはホモログを定量化する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルを、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の抗体と接触させて、その結果、該抗体が該エピトープを保有する任意のポリペプチドまたはフラグメントに結合する、工程；および
（ｂ）該抗体に結合する該ポリペプチドもしくはフラグメントの存在を検出する工程、または該抗体に結合する該ポリペプチドもしくはフラグメントを定量化する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
Ｔ細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下にて、インビトロまたはインビボでＴ細胞を補助刺激する抗原提示細胞またはその前駆体の能力を増加するために、該抗原提示細胞またはその前駆体中にＢ７−ＤＣポリペプチドの発現を誘導するかまたは増加する方法であって、該方法は、該抗原提示細胞またはその前駆体細胞を請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトし、その結果、該Ｂ７−ＤＣポリペプチドの発現が該細胞上で誘導または増加される工程を包含する、方法。
【請求項５０】
Ｔ細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下にて、インビトロまたはインビボでＴ細胞を補助刺激する抗原提示細胞またはその前駆体の能力を増加するために、該抗原提示細胞またはその前駆体中にＢ７−ＤＣポリペプチドの発現を誘導するかまたは増加する方法であって、該方法は、該抗原提示細胞またはその前駆体細胞を請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトし、その結果、該Ｂ７−ＤＣポリペプチドの発現が該細胞上で誘導または増加される工程を包含する、方法。
【請求項５１】
前記抗原提示細胞は樹状細胞であり、そして前記前駆体は樹状細胞前駆体である、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加する方法であって、該方法は、請求項１７〜２４にいずれか１項に記載の、有効量の細胞を、抗原とともに該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該細胞は、該抗原性刺激に対する該被験体のＴ細胞応答を増加するために効果的である、方法。
【請求項５３】
腫瘍関連抗原を用いる抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加する方法であって、該方法は、請求項２２〜２４にいずれか１項に記載の、有効量の腫瘍細胞を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該腫瘍細胞は、該抗原を発現し、該腫瘍細胞の投与は、該腫瘍抗原刺激に対する該被験体のＴ細胞応答を増加するために効果的である、方法。
【請求項５４】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加する方法であって、該方法は、請求項２５〜３０にいずれか１項に記載の、有効量のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体を、抗原とともに該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドの投与は、該抗原性刺激に対する該被験体のＴ細胞応答を増加するために効果的である、方法。
【請求項５５】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加する方法であって、該方法は、請求項３１〜４０にいずれか１項に記載の、有効量の融合ポリペプチドを、抗原とともに該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドの投与は、該抗原性刺激に対する該被験体のＴ細胞応答を増加するために効果的である、方法。
【請求項５６】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を阻害する方法であって、該方法は、請求項４１〜４５にいずれか１項に記載の、有効量の抗体を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該抗体の投与は、Ｔ細胞の刺激をブロックするかまたは抗原反応性Ｔ細胞を排除して、それによりＴ細胞応答を阻害するために効果的である、方法。
【請求項５７】
前記Ｔ細胞応答は、組織移植物または自己抗原に対して指向され、その結果、移植物拒絶または自己免疫反応を阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）該被験体、（ｉｉ）該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナー、または（ｉｉｉ）免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された細胞株、よりＴ細胞を得る工程；
（ｂ）該Ｔ細胞を、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の、有効量の細胞とエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性刺激に対する該Ｔ細胞の応答を増加するために効果的である、工程；および
（ｃ）該被験体に工程（ｂ）の該Ｔ細胞を投与する工程、
を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。
【請求項５９】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）該被験体、（ｉｉ）該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナー、または（ｉｉｉ）免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された細胞株、よりＴ細胞を得る工程；
（ｂ）該Ｔ細胞を、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の、有効量の細胞とエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性刺激に対する該Ｔ細胞の応答を増加するために効果的である、工程；および
（ｃ）該被験体に工程（ｂ）の該Ｔ細胞を投与する工程、
を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。
【請求項６０】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）該被験体、（ｉｉ）該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナー、または（ｉｉｉ）免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された細胞株、よりＴ細胞を得る工程；
（ｂ）該Ｔ細胞を、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の、有効量のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体とエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性刺激に対する該Ｔ細胞の応答を増加するために効果的である、工程；および
（ｃ）該被験体に工程（ｂ）の該Ｔ細胞を投与する工程、
を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。
【請求項６１】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）該被験体、（ｉｉ）該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナー、または（ｉｉｉ）免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された細胞株、よりＴ細胞を得る工程；
（ｂ）該Ｔ細胞を、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の、有効量の融合ポリペプチドとエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性刺激に対する該Ｔ細胞の応答を増加するために効果的である、工程；および
（ｃ）該被験体に工程（ｂ）の該Ｔ細胞を投与する工程、
を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。
【請求項６２】
病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する保護免疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下：
（ａ）必要に応じて該抗原を発現する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の形質転換された細胞またはトランスフェクトされた細胞；
（ｂ）（ａ）の細胞が該抗原を発現しない場合、該抗原のさらなる供給源；
（ｃ）必要に応じて、一般的な免疫刺激剤またはアジュバント；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のための薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項６３】
病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する保護免疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下：
（ａ）免疫応答が所望される抗原の供給源；
（ｂ）請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；
（ｃ）必要に応じて、一般的な免疫刺激剤またはアジュバント；ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のための薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項６４】
病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する保護免疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下：
（ａ）免疫応答が所望される抗原の供給源；
（ｂ）請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド；
（ｃ）必要に応じて、一般的な免疫刺激剤またはアジュバント；ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のための薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項６５】
抗原またはワクチンの免疫原性を増加するために、抗原またはワクチンと使用するための補助刺激組成物であって、以下：
（ａ）請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；ならびに
（ｂ）薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、補助刺激組成物。
【請求項６６】
抗原またはワクチンの免疫原性を増加するために、抗原またはワクチンと使用するための補助刺激組成物であって、以下：
（ａ）請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド；ならびに
（ｂ）薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、補助刺激組成物。
【請求項６７】
請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の、有効量のワクチン組成物を、被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体において抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法。
【請求項６８】
請求項６５または６６に記載の補助刺激組成物を、抗原またはワクチンとともに被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体において抗原またはワクチンに対する免疫応答を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生化学および医薬の分野における本発明は、樹状細胞の表面上で選択的に発現され、そして免疫応答を刺激するために細胞表面分子として用いられ得るか、またはワクチン組成物において可溶性形態で用いられ得る新規なタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球応答の生成は、細胞間相互作用および可溶性メディエーター（サイトカインまたはリンホカイン）の生成に関与する複雑なプロセスである。この応答は、「レセプター」として働くいくつかのＴ細胞表面分子によって調節される。このＴ細胞表面分子としては、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体、および他の「補助的な」表面分子（その多くはモノクローナル抗体によって最初に規定された細胞表面の「ディファレンシャル抗原」（「ＣＤ分子」）である）が挙げられる。
【０００３】
全てのリンパ球の至適な活性化には、以下の２つのシグナルを要すると考えられる：抗原特異的シグナルまたはクローン（ｃｌｏｎａｌ）シグナル、および第二の抗原非特異的シグナル（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５４：１〜１４（１９８９））。リンパ球が、いわゆる補助刺激分子（例えば、以下に記載のＢ７）による補助刺激なしに、単独の抗原に接触する場合、リンパ球は、「アネルギー」とも呼ばれるクローン性不活性（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１３４９（１９９０））、またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）のいずれかに応答する；補助刺激シグナルが提供される場合、それは刺激抗原に特異的なクローン性増殖に応答する。所定の抗原に対する免疫応答の有意な増大は、補助刺激なしには生じない（Ｊｕｎｅら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １５：３２１〜３３１，１９９４）；Ｃｈｅｎら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：４８３〜４８６）；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，ＳＥおよびＡｌｌｉｓｏｎ，ＪＰ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３６８〜３７０）。
【０００４】
免疫応答の質および力価は、大部分は、Ｔ細胞に対して抗原を処理して提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の型に依存する。ＴＣＲの係合に利用可能なペプチド抗原／ＭＨＣリガンドの密度、ならびにＴ細胞の係合および活性化の時点でのＡＰＣによる可溶性のおよび／または膜結合型の補助刺激シグナルの提供が重要である。これらの理由によって、免疫治療ストラテジーは、（ａ）標的抗原を適切な型のＡＰＣに提供すること、そして（ｂ）適切な補助刺激分子を提供してＴ細胞活性化を増強することに、集中し始めてきている。
【０００５】
Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルを提供するＡＰＣとしては、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、そして最も重要である樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。過去には、活性化されたマクロファージは、インビボにおいてＴ細胞応答を開始する重要なＡＰＣであると考えられた。この知見はマクロファージが抗原を効率的に食菌し、そして表面ディスプレイおよび提示のために抗原を処理する能力に基づく。より最近では、抗原特異的Ｔ細胞応答のインビボにおける主なイニシエータとして、ＤＣに注意が移ってきた。ＤＣは、活性化マクロファージ由来の異なる表現型を有し、そして異なる免疫応答を開始し得る異なるサブタイプに分類される。ＤＣの機能的な欠点は、インビトロにおいてナイーブなＴ細胞を活性化する能力がマクロファージよりも約１００倍大きいことである。今日まで、この力価の解釈は、抗原提示に重要であると考えられる分子の量的な差異に基づいていた。本発明は、重要な量的差異の発見に基づく。
【０００６】
抗原提示における最初のシグナルは、ＡＰＣ上におけるクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の状況で提示された抗原とＴＣＲとの相互作用によって開始される（Ａｌｌｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：２７０（１９８７））。補助刺激シグナルは、他の分子に由来する。その分子のうちの最も特徴づけされたものはＢ７ファミリー（すなわち、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびおそらくＢ７．３）であり、これはＡＰＣ上にも存在する。
【０００７】
Ｔ細胞の表面上に発現した２つのタンパク質は、Ｂ７のような補助刺激分子の最も特徴付けられたリガンドまたは対応レセプターである。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化において機能する最も成熟したヒトＴ細胞で見出された免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：８５７３〜８５７７（１９８７））のホモダイマー糖タンパク質である。ＣＤ２８は、休止しているＴ細胞で構成的に発現され、そして活性化後に増大する。Ｔ細胞レセプターを通じたシグナル伝達後、ＣＤ２８の連結は、Ｔ細胞が増殖してＩＬ−２を分泌するように誘導する（Ｌｉｎｓｌｅｙ，ＰＳら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３、７２１〜７３０；Ｇｉｍｍｉ，ＣＤら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８，６５７５〜６５７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，１３３３〜１３３７；Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．１１，２１１〜６；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ．３５６，６０７〜６０９）。ＣＤ２８は、免疫応答に必須である抗原依存性の細胞間相互作用の形態である、細胞間接触（「細胞間接着」）を媒介する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２２３〜２５２（１９８７））。
【０００８】
ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８に非常に相同であるＴ細胞表面分子であるが、休止しているＴ細胞では発現されず、そしてＴ細胞活性化後に生じる（Ｂｒｕｎｅｔ，Ｊ．Ｆら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８，２６７〜２７０）。ＣＴＬＡ−４は、マウス細胞傷害性Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーの示差的スクリーニングによってもともと同定された（Ｂｒｕｎｅｔら、前出）。Ｂ７の第二のレセプターとしてのＣＴＬＡ−４の役割は、Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１〜５６９（これはまた、Ｂ７がＣＤ２８についてよりもＣＴＬＡ４について高い親和性を有することを注記している）に考察されている。Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０７〜９０９は、Ｂ７欠損マウスにおけるＣＴＬＡ−４を考察した。ＣＴＬＡ−４のリガンドは、Ｌｅｎｓｃｈｏｗら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１０５４〜１１０５８に記載されている。
【０００９】
Ｔｈ細胞は、Ｔｈ細胞に対して抗原を提示するＢ細胞のみの活性化を確実にするように働き、そしてバイスタンダーＢ細胞の活性化を回避する、Ｔｈ細胞−Ｂ細胞接触の領域において、おそらく集中的な様式で、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−６のような増殖および分化誘導のサイトカインを分泌する。
【００１０】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４は、Ｂ７として一般に公知の補助刺激分子と相互作用する。Ｂ７は、Ｂ細胞活性化抗原としてもともと記載されている。なぜなら、Ｂ７はＢ細胞上で見出され、そしてＢ７／ＢＢ−１と名づけられたからである（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：５０３１〜５０３５（１９９０））。本明細書中において以降は、この分子をＢ７、Ｂ７−１、またはＢ７．１と呼ぶ。Ｂ７（より詳細には、Ｂ７ホモログと呼ばれる）はまた、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と比較して、Ｂ７は、２つの細胞外Ｉｇドメイン（Ｎ末端可変（Ｖ）様ドメイン、それに続く定常（Ｃ）様ドメイン）を含む。
【００１１】
Ｂ７ファミリーメンバーは、一般にＡＰＣ上で発現され、そして注記されるように、ナイーブＴ細胞の活性化に非常に重要なものである。これらのファミリーのマンバーとしては、Ｂ７−１（＝Ｂ７、ＣＤ８０とも呼ばれる）、およびＢ７−２（ＣＤ８６とも呼ばれる）が挙げられる。Ｂ７−１を記載する参考文献としては、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．Ｃｅｌｌ ７１：１０６５〜１０６８，１９９２；Ｃｈｅｎ，Ｌら、Ｃｅｌｌ ７１：１０９３〜１１０２、１９９２；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３：２７１４〜２７２２，１９８９；およびＦｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５〜６３１，１９９１が挙げられる。Ｂ７−２を記載する参考文献としては、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９〜９１１ ８１３〜９６０、１９９３が挙げられる。現在まで、マウスＢ７−１およびＢ７−２ならびにヒトＢ７−１およびＢ７−２の両方が記載されている（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９、前出；１９９１、前出；および１９９３、前出）。活性化ヒトＢリンパ球は、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合カウンターレセプターであるＢ７−２およびＢ７−３を発現する。これは両方ともＣＤ２８またはＣＴＬＡ４のいずれかを介してＴ細胞に補助刺激シグナルを送達し得る。
【００１２】
Ｂ７−２は、抗ＩｇクラスＩＩｍＡｂまたは抗ＭＨＣクラスＩＩｍＡｂのいずれかでの刺激後約２４時間でＢ細胞によって発現される。Ｂ７−２は、検出可能ＩＬ−２分泌およびＴ細胞増殖を誘導する。活性化後約４８時間〜７２時間で、Ｂ細胞は、Ｂ７−１およびＢ７−３と名づけられた第三のＣＴＬＡ４対応レセプター（ｍＡｂ ＢＢ−１によって同定された）（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔら（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８，８２３〜８２７）の両方を発現する。Ｂ７−３はまた、Ｂ７陰性活性化Ｂ細胞で発現され、そして検出可能なＩＬ−２産生なしにＴ細胞増殖を補助刺激し得、このことは、Ｂ７−１分子およびＢ７−３分子が異なることを示す。Ｂ７−３は、活性化Ｂ細胞、活性化単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、およびケラチノサイトを含む広範な種々の細胞で発現される。Ｂ細胞活性化後７２時間で、Ｂ７−１およびＢ７−３の発現が低下し始める。活性化Ｂリンパ球の表面でのこれらのＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合対応レセプターの存在によって、Ｔ細胞補助刺激が、部分的には、Ｂ細胞活性化後のこれらの分子の一時的発現によって調節されることが示される。
【００１３】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４補助刺激経路の重要性は、インビトロおよびインビボで実証されている。Ｔ細胞活性化の増大とＢ７発現の増大との間に直接的な関係が存在する（Ｒａｚｉ−Ｗｏｌｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２１０〜４２１４（１９９２））。Ｔ細胞は、それが補助刺激リガンド（この補助刺激経路のＣＤ２８遮断に結合する）を欠く細胞上のペプチド抗原に接触した場合、アネルギーにされ、マウスおよびヒトの系において抗原特異的寛容の発生を生じる（Ｈａｒｄｉｎｇら、前出；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５７，７８９〜７９２；Ｔｕｒｋａ、ＬＡら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９，１１１０２〜１１１０５；Ｇｉｍｍｉ，ＣＤら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、６５８６〜６５９０；Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．ら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８、１７５３〜１７６３）。逆に、Ｂ７−陰性マウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶によって付随するＴ細胞媒介特異的免疫、および腫瘍チャレンジに対する長期防御を誘導する（Ｃｈｅｎ，Ｌら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：１０９３〜１１０２；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、前出；Ｂａｓｋａｒ、Ｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０，５６８７〜５６９０）。従って、Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路の操作によって、ヒトにおいて免疫応答を刺激または抑制する大きな能力が得られる。
【００１４】
ＣＤ２８とＢ７との間の相互作用は、Ｂ７またはＣＤ２８の細胞外部分とＩｇ Ｃγ１鎖の遺伝子融合を用いて特徴づけされた（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１〜７３０（１９９１））。Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質を固定するか、またはＢ７を細胞（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の表面で発現する場合、それらはＴ細胞増殖を補助刺激する。Ｂ７＋ＣＨＯ細胞でのＴ細胞刺激はまた、ＩＬ−２の転写物のレベルの増大を特異的に刺激する。
【００１５】
米国特許第５，５２１，２８８号は、ＣＤ２８陽性Ｔ細胞を、Ｂ７をコードするＤＮＡの一部によってコードされるフラグメント（Ｂ７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に主に対応する）と接触させることによって、免疫応答を調節するための方法を記載する。免疫応答はまた、Ｂ７ ＥＣＤの少なくとも一部および別のタンパク質（例えば、Ｂ７の可溶性、結合親和性、および／または原子価を変化させるヒトＩｇＣγ１ドメイン）を含む融合タンパク質構築物であるＢ７の誘導体によって調節された。例えば、Ｂ７ ＥＣＤの位置１〜２１５に由来するアミノ酸残基をコードするＤＮＡは、ヒトＩｇＣγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応する配列のアミノ酸残基をコードするＤＮＡに連結され、Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質をコードしたＤＮＡ融合産物を形成する。また、ＣＤ２８レセプターを結合することによって、Ｔ細胞と反応するＢ７またはＢ７Ｉｇ融合タンパク質を投与することにより、Ｔ細胞によって媒介される免疫系疾患を処置するための方法が開示されている。対宿主性移植片病におけるＴ細胞増殖を、ＣＤ２８＋Ｔ細胞を、Ｂ７抗原またはＢ７Ｉｇ融合タンパク質と、免疫抑制剤と組み合わせて、反応させることによって阻害した。
【００１６】
米国特許第５，８６１，３１０号は、１つ以上のＴ細胞補助刺激分子（Ｂ７−２およびＢ７−３を含む）を発現するように改変された腫瘍細胞を開示する。１つの実施形態は、Ｂ７のさらなる発現を含む。改変は、Ｂ７−２タンパク質、Ｂ７−３タンパク質またはＢ７タンパク質をコードする核酸でのトランスフェクションによるものであった。腫瘍細胞はまたインビボで遺伝的に改変され得る。このような改変腫瘍細胞は、腫瘍を有する患者の処置に有用であり、腫瘍の転移性伝播を防止もしくは阻害するために、または腫瘍の再発を阻害するために有用であると言われている。本明細書は、腫瘍に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を特異的に誘導するための方法を開示している。
【００１７】
米国特許第５，９４２，６０７号は、Ｔ細胞活性化を補助刺激する新規なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドをコードする単離された核酸を開示する。１つの実施形態において、単離された核酸は、Ｂ７−２をコードした。また、開示された全長Ｂ７−２配列の少なくとも一部を含む核酸を開示している、本明細書に従って、核酸配列は、哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む種々の宿主細胞においてタンパク質またはペプチドに対応する合成を指向し得る種々の発現ベクター中に組み込まれ得る。これらの核酸配列によってコードされるタンパク質またはペプチド、および単離されたタンパク質およびペプチド（Ｂ７−２配列の少なくとも一部を含む）を生成するように形質転換された宿主細胞がまた開示されている。
【００１８】
Ｄｏｎｇ Ｈら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９９ ５：１３６５〜１３９９は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、またはＩＣＯＳ（誘導性補助刺激因子）に結合しないＢ７−Ｈ１と名付けられたＢ７ファミリーの第三のメンバーを記載している。Ｂ７−Ｈ１の連結は、Ｔ細胞応答をポリクローナル刺激およびアロ抗原に対して補助刺激し、そして優先的にインターロイキン１０の生成を刺激した。少量生成されたＩＬ−２は、Ｂ７−Ｈ１補助刺激の効果を必要とした。この研究によって、細胞媒介性免疫応答の負の調節に関与し得る、以前には未知であった補助刺激分子が規定された。同じ研究室（Ｗａｎｇ Ｓら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２８０８〜２８１３）は、Ｂ７−Ｈ２と名付けられた新しいヒトＢ７様遺伝子を記載している。この遺伝子の発現は単球由来の未成熟ＤＣの表面で検出された。可溶性のＢ７−Ｈ２およびＩｇの融合タンパク質である、Ｂ７−Ｈ２Ｉｇは、活性化Ｔ細胞には結合したが休止Ｔ細胞には結合しない。この結合は、ＩＣＯＳの可溶性形態（ＩＣＯＳＩｇ）により阻害されたが、ＣＴＬＡ４Ｉｇによっては阻害されなかった。ＩＣＯＳＩｇは、Ｂ７−Ｈ２遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を染色した。刺激因子としてＣＤ３の最適以下の架橋を用いて、Ｂ７−Ｈ２ＩｇによるＴ細胞増殖の補助刺激は、用量依存性でありそしてＩＬ−２の分泌と関連しており、一方至適ＣＤ３連結は好ましくはＩＬ−１０生成を刺激したことが見出された。著者らは、Ｂ７−Ｈ２がＩＣＯＳ Ｔ細胞分子の推定リガンドであると結論した。
【００１９】
Ｓｗａｌｌｏｗ ＭＭら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９，１１：４２３〜４３２は、ＡＰＣ上で発現されるＢ７分子の近接するホモログ（相同体）である、新規な遺伝子ｂ７ｈのクローニングを報告した。Ｂ７ｈは、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４由来の異なるレセプター上で作用することにより精製したＴ細胞の増殖を補助刺激した。驚くべきことに、Ｂ７ｈは、刺激されていないＢ細胞で発現されたが、その発現は、ＴＮＦαで処理した非リンパ球性細胞（３Ｔ３細胞；胎児性線維芽細胞）で誘導され、そしてＬＰＳ（ＴＮＦαの強力なアクチベータ）で処理されたマウスの非リンパ球性組織で上方制御された。これらの研究は、Ｔ細胞の新規な補助刺激リガンドを規定し、そしてＴＮＦαによるＢ７ｈの誘導は、炎症中の自己の認識を直接増強し得る。
【００２０】
Ｙｏｓｈｉｎａｇａ ＳＫら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９９、４０２：８２７〜８３２は、新しいマウス補助刺激レセプターリガンド対を記載している。このレセプター（ＣＤ２８に関連する）は、ヒトタンパク質ＩＣＯＳのマウスホモログであり、そして活性化Ｔ細胞および休止している記憶Ｔ細胞で発現された。Ｂ７分子に相同であるリガンドは、Ｂ７関連タンパク質−１（Ｂ７−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（Ｂ７ＲＰ−１）と呼ばれる。Ｂ７ＲＰ−１は、それぞれマウスＢ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）に対して、２０％アミノ酸同一性および１９％アミノ酸同一性である１型膜貫通タンパク質である。この相同性は、２７％アミノ酸同一性しか共有しないＢ７．１およびＢ７．２として有意である（Ｆｒｅｅｍａｎ，ＧＪら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５〜２１９２（１９９３））。この相同性は、保存位置でＩｇループ形成に重要であるシステインを含む（開始メチオニンから残基６２、１３８、１８５および２４２）。Ｂ７ＲＰ−１の膜貫通ドメインの全体的長さおよび相対的位置は、Ｂ７分子の長さおよび位置と類似している（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ＥＡら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３８９〜４１８（１９９８））。Ｂ７ＲＰ−１は、Ｂ細胞およびマクロファージで発現されることが示された。ＩＣＯＳおよびＢ７ＲＰ−Ｉは、ＣＤ２８−Ｂ７経路においてタンパク質と相互作用せず、そしてＢ７ＲＰ−１は、ＣＤ２８と独立してＴ細胞を補助刺激した。Ｂ７ＲＰ−１とＩｇのＦｃ部分との間の融合タンパク質（「Ｂ７−ＲＰ１−Ｆｃ」）を発現するトランスジェニックマウスは、脾臓においてリンパ過形成、リンパ節およびパイアー斑を有した。インビボにおけるＢ７ＲＰ−１の補助刺激活性は、抗原チャレンジの時点でＢ７ＲＰ−１−Ｆｃで処理された抗原提示化マウスにおいて、増強した遅延型過敏症を実証することによって見出された。著者らは、ＩＣＯＳおよびＢ７ＲＰ−１が、ＣＤ２８−Ｂ７に構造的に関連し、そして適応的免疫反応に関与する異なる新しいレセプター−リガンド対を規定すると結論した。
【００２１】
Ｙｏｓｈｉｎａｇａ ＳＫら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００ Ｏｃｔ，１２：１４３９〜１４４７は、ヒトＢ７ＲＰ−１およびＩＣＯＳ相互作用を通じたヒトＴ細胞の補助刺激を報告した。このリガンド−レセプター対は、約３３ｎＭのＫＤおよび１０分より長いｔ（１／２）を有するオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）で相互作用した。ＴＮＦαは、Ｂ細胞、単球、およびＤＣ上のヒトＢ７ＲＰ−１の発現を示差的に調節した。ＴＮＦαは、Ｂ細胞および単球上のＢ７ＲＰ−１発現を増強したが、ＤＣの発現は阻害した。ヒトＢ７ＲＰ−１−Ｆｃタンパク質または膜結合したＢ７ＲＰ−１を発現した細胞は、インビトロにおいてＴ細胞増殖を補助刺激した。特定のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０）は、Ｂ７ＲＰ−１補助刺激によって誘導された。ＩＬ−２レベルは有意に増大しなかったが、Ｂ７ＲＰ−１が誘導した補助刺激は、ＩＬ−２に依存した。これらの研究により、マウスＢ７ＲＰ−１に対するヒトオルソログが規定され、そしてヒトＩＣＯＳとの相互作用が特徴付けられた。
【００２２】
ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞によって発現された免疫阻害レセプターである。ＰＤ−１欠損マウスは、末梢寛容の損失に起因して自己免疫の複数の形態を示した。Ｆｒｅｅｍａｎ、ＧＪら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７〜１０３４（２０００）は、ＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ１）のリガンドが、Ｂ７遺伝子ファミリーのメンバーであることを報告した。ＰＤ−Ｌ１によるＰＤ−１の係合によって、ＴＣＲ媒介リンパ球活性化（増殖、サイトカイン分泌）の阻害が生じた。さらに、ＰＤ−１シグナル伝達は、ＣＤ２８媒介補助刺激の至適以下のレベルを阻害した。ＰＤ−Ｌ１は、ＡＰＣ（ＩＦＮγで刺激されたヒト単球、活性化ヒトＤＣ）により発現される。さらに、ＰＤ−Ｌ１は、心臓および肺において発現されることが示された。著者らは、ＡＰＣ上の阻害性ＰＤ−Ｌ１シグナルおよび補助刺激Ｂ７−１／Ｂ７−２シグナルの相対的な大きさが、Ｔ細胞活性化の程度および寛容と自己免疫との間の閾値を決定し得ることを推測した。非リンパ性組織でのＰＤ−Ｌ１の存在は、炎症の部位での免疫応答の大きさに寄与し得る。
【００２３】
上記の文献の引用は、前述のいずれの文献も先行技術に関連するという承認とは解釈されない。これらの文献の内容についての、今日までの全ての記述または説明は、本出願人に対して利用可能な情報に基づき、そしてこれらの文献の日付または内容の正確さに関してなんらの承認をも構成しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
Ｔ細胞活性化についての新規な樹状細胞（ＤＣ）特異的補助刺激分子をコードする遺伝子を同定するために、本発明者らは、ＤＣと活性化マクロファージとの間のサブトラクトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このｃＤＮＡのサブトラクションアプローチによって、ＤＣによって発現されたが、活性化マクロファージによって発現されない遺伝子が規定される。このアプローチを用いて、Ｔ細胞の活性化に依存するワクチンの力価を増強するのに有用ないくつかの新規なＤＣ特異的遺伝子の発見がもたらされた。本出願はこのような遺伝子の１つに焦点をあてる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
ＤＣライブラリーにおいて存在し、活性化マクロファージライブラリーから非存在であることに基づいて、新規なコード配列（「Ｂ７−ＤＣ」と名付けられた）を同定した。Ｂ７−ＤＣ遺伝子は、補助刺激分子をコードする遺伝子のＢ７ファミリーのメンバーである。Ｂ７−ＤＣは、ＤＣ特異的発現および異なるレセプター特異性を有する第一のＢ７ファミリーメンバーである。この遺伝子の産物は、ＤＣがＴ細胞を刺激する特有の能力を媒介するのにおいて重要な役割を有する。機能的分析によって、Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を刺激する際に、Ｂ７−１よりもＢ７−ＤＣがさらに活性であることが示された。従って、Ｂ７−ＤＣ ＤＮＡおよびポリペプチドは、抗原特異的であろうとなかろうと、細胞性および分子性のワクチン組成物の効力を増強するための組成物および方法において有用である。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明は、活性化マクロファージと比べて樹状細胞上で選択的に発現されるＢ７−ＤＣと名付けられた哺乳動物タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は好ましくは、配列番号１（ヒト起源）、または配列番号５（マウス起源）から選択されたヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸に関する。好ましいストリンジェントな条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのインキュベーション、続いて約５０℃の温度での約０．２×ＳＳＣ中での洗浄を含む。好ましくは、上記の核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。上記のような好ましい核酸分子は、配列番号２および配列番号４から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするか、またはこのタンパク質の生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコードする。好ましくは、この核酸分子は、配列番号２（ヒト起源のＢ７−ＤＣ）の配列を有するタンパク質をコードするか、または配列番号２の生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコードする。
【００２７】
好ましい実施形態において、核酸分子は、Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメイン（残基２６〜２２１を含む）をコードする。この核酸分子は、その補助刺激ホモログ、フラグメントまたは他の機能的誘導体をコードする。
【００２８】
別の実施形態において、上記の核酸分子は、Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質をコードし、この核酸分子は以下：
（ａ）Ｂ７−ＤＣタンパク質（好ましくは、配列番号２または配列番号４）の全てまたは一部である第一のポリペプチドをコードする第一の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて、この第一の核酸配列とインフレームで融合した、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸；および
（ｃ）この第一の核酸配列またはこのリンカー核酸配列にインフレームで結合し、そして第二のポリペプチドをコードする第二の核酸配列、
を含む。この第二のポリペプチドは、好ましくは、Ｉｇの重鎖定常領域の１つ以上のドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ（好ましくはＩｇＧ１）の２つのＣドメイン、から構成される。
【００２９】
発現ベクターであって、以下：
（ａ）プロモーター、および
（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞において核酸の発現を調節するさらなる調節配列、
に作動可能に連結された上記の任意の核酸分子、
を含む発現ベクターも提供される。
【００３０】
上記の発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。これらのベクターとしては、自己複製するＲＮＡレプリコン（ＤＮＡ−ランチャー、またはＲＮＡ）、自殺ＲＮＡベクター、ＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなど）、およびＲＮＡビリオン（パッケージング細胞株で増殖する）が挙げられる。
【００３１】
ベクターＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば、所望の標的細胞および組織への送達を増強する、徐放性処方物中で、宿主への遺伝子銃媒介導入のための金粒子に複合体化されてもよいし、または他のポリマーと複合体化されてもよい。
【００３２】
また、以下：
（ａ）第一の組み換え発現ベクターであって、該ベクターは、免疫応答が誘導される目的の抗原をコードするヌクレオチド配列を、その配列中に組み込んでいる、ベクター；および
（ｂ）第二の組み換え発現ベクターであって、該ベクターは、補助刺激ポリペプチド（このポリペプチドの少なくとも１つは、Ｂ７−ＤＣであるか、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体である）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をその核酸配列中に組み込んでおり、ここで該発現ベクターは、宿主細胞に同時感染または同時トランスフェクトし得、抗原および補助刺激ポリペプチド、複合体、ホモログもしくは誘導体の同時発現を生じる、ベクター、
を含むベクター組成物も含まれる。
【００３３】
上記の実施形態の改変において、本発明は、以下：（ｉ）細胞間（好ましくは、ＡＰＣ）で発現された産物（抗原）の伝播を促進し、（ｉｉ）核酸が発現されるＡＰＣでの抗原の提示を増大し、そして／または（ｉｉｉ）ベクターが導入されている宿主のＡＰＣにおける抗原の再提示（交差プライミング）および提示を促進する、標的タンパク質をコードする第三の核酸配列を提供する。この標的化タンパク質コード核酸は、抗原または補助刺激因子またはその両方をコードする核酸に融合され得る。第一または第二のベクターは、核酸を含む。１つの実施形態において、このベクター組成物は、これらの抗原コード核酸、補助刺激コード核酸（好ましくはＢ７−ＤＣ）、および「標的化」タンパク質コード核酸を、単一の融合構築物中に組みあわせる。
【００３４】
本発明は、上記の任意の核酸分子または発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む。この細胞は、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。この細胞は、樹状細胞またはその前駆体であり得る。別の実施形態において、この細胞は、腫瘍細胞、好ましくは抗原（宿主における腫瘍上の抗原（それに対して免疫応答が所望される）と同じであるか、またはその抗原と交差反応性である抗原）を保有する腫瘍細胞である。
【００３５】
好ましい実施形態は、哺乳動物Ｂ７−ＤＣタンパク質（好ましくは配列番号２または配列番号４）、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコードする外因性核酸分子でトランスフェクトされた単離された哺乳動物腫瘍細胞であり、その結果、この腫瘍細胞によって、このタンパク質、フラグメント、ホモログ、または誘導体が発現される場合、そしてこの腫瘍細胞がＴ細胞と接触する場合、
（ｉ）Ｂ７−ＤＣタンパク質、フラグメント、ホモログ、または誘導体が、Ｔ細胞に結合し；そして
（ｉｉ）この腫瘍細胞は、Ｔ細胞を補助刺激して増殖し、そして／またはサイトカインを産生し、そして分泌する。
【００３６】
本発明はまた、活性化マクロファージと比べて樹状細胞で選択的に発現され、そして以下：
（ａ）Ｔ細胞上の結合パートナーに結合する；
（ｂ）Ｔ細胞を補助刺激して増殖し、そして／またはサイトカインを産生し、そして分泌する、
という機能的特性を有するポリペプチドに関連する。
【００３７】
このポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体もまた含まれる。
【００３８】
このポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体は、好ましくは、配列番号１または配列番号５の配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子のフラグメント、ホモログもしくは等価物によってコードされる。好ましいポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
このポリペプチドまたはこのポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体は、上記核酸の一つの組換え発現によって、生成され得る。
【００４０】
好ましいポリペプチドは、Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメインを含み、好ましくは、以下：
（ａ）配列番号２（ヒト）のアミノ酸残基２６〜２２１または
（ｂ）配列番号４（マウス）のアミノ酸残基２６〜２２１
である。上記ポリペプチドは、Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインから「本質的になり」得る。
【００４１】
（ｉ）第二のポリペプチドに直接的に融合しているか、または
（ｉｉ）必要に応じて、この第二のポリペプチドに融合したリンカーペプチド配列に融合している、
Ｂ７−ＤＣタンパク質の全てまたは一部を含む、第一の融合パートナーを有するＢ７−ＤＣ融合ポリペプチドもまた、提供される。
【００４２】
上記Ａ Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質はまた、第二のポリペプチドに融合し得、この第二のポリペプチドは、好ましくは、Ｉｇ重鎖定常領域の１つ以上のドメインであり、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有する。
【００４３】
上記融合タンパク質の１つの実施形態において、第一の融合パートナーは、Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメインであり、これの全長配列は、配列番号２または配列番号４である。
【００４４】
この融合タンパク質は、好ましくは、Ｔ細胞上の結合パートナーに結合し、そしてＴ細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下で、Ｔ細胞を補助刺激する。
【００４５】
上記融合タンパク質のダイマーまたはトリマーである、ダイマーまたはトリマーの融合タンパク質もまた提供される。好ましくは、これらの鎖は、ジスルフィド結合または他の鎖間共有結合を介して、縦列で連結される。
【００４６】
好ましいダイマー融合タンパク質において、このダイマーは、Ｉｇ重鎖の２つのＣＨ領域のＣｙｓ残基の共有結合から生じ、これらのＣｙｓ残基は、二量化した通常のＩｇ Ｈ鎖において、ジスルフィド結合しているものと同じＣｙｓ残基である。
【００４７】
本発明の融合タンパク質は、直接的にかまたは１つ以上の単量体間のリンカー配列を伴って、末端同士で結合した第一の融合パートナーの２つ以上の繰返し体のマルチマーを含み得る。
【００４８】
本発明はまた、Ｂ７−ＤＣタンパク質のエピトープに対して特異的な抗体を提供し、このエピトープは、Ｂ７ファミリータンパク質の公知のメンバーには存在しない。このエピトープは、配列番号２または配列番号４のポリペプチドの「直鎖またはコンホメーション」エピトープであり得る。この抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、ヒトまたはヒト化（操作による）モノクローナル抗体である。
【００４９】
上記抗体を使用して、細胞集団においてＢ７−ＤＣポリペプチドをその表面において発現する細胞を同定または定量する方法もまた提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）この抗体がこのエピトープを発現する細胞に結合するように、この集団の細胞を、上記抗体と接触させる工程；
（ｂ）この抗体が結合する細胞の数の存在を評価するかまたはその細胞の数を定量する工程。
【００５０】
細胞集団から、その表面でＢ７−ＤＣポリペプチドを発現する細胞を単離するための、別の方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）この抗体がこのエピトープを発現する細胞に結合するように、この集団を、上記抗体に接触させる工程；
（ｂ）この抗体が結合する細胞をポジティブに選択するか、またはこの抗体が結合しない細胞をネガティブに選択する工程。
【００５１】
サンプル中のＢ７−ＤＣポリペプチド、フラグメントまたはホモログの存在を検出するかまたは定量する方法もまた提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）この抗体が、このエピトープを保有する任意のポリペプチドまたはフラグメントに結合するように、このサンプルを請求項４３の抗体と接触させる工程；
（ｂ）この抗体に結合するポリペプチドまたはフラグメントの存在を検出するか、または定量する工程。
【００５２】
本発明はまた、抗原提示細胞またはその前駆細胞におけるＢ７−ＤＣポリペプチドの発現を誘導または増加して、この細胞が、インビトロまたはインビボで、Ｔ細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下で、Ｔ細胞を補助刺激する能力を増加させる方法に関し、この方法は、Ｂ７−ＤＣポリペプチドの発現がその細胞において誘導または増加されるように、抗原提示細胞または前駆細胞を上記のような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程を包含する。この抗原提示細胞は、好ましくは、樹状細胞であり、そして前駆細胞は、樹状細胞前駆細胞である。
【００５３】
本発明は、細胞補助刺激組成物およびポリペプチド補助刺激剤を使用して、免疫応答を刺激するための方法を提供する。抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加させるための１つの方法は、この被験体に、有効量の上記細胞（好ましくは、腫瘍細胞）を、抗原性刺激と組み合わせて投与する工程を包含し、ここで、これらの細胞は、この抗原性刺激に対するこの被験体のＴ細胞応答を増加するために効果的である。上記のことは、好ましくは、抗原と補助刺激組成物との同時注入によって、達成される。
【００５４】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を、腫瘍関連抗原で増加させるための方法は、この被験体に、有効量の上記のような腫瘍細胞を投与する工程を包含し、ここで、これらの腫瘍細胞は、この抗原を発現し、この腫瘍細胞の投与は、腫瘍抗原刺激に対するこの被験体のＴ細胞応答を増加させるために効果的である。
【００５５】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加させるための方法は、この被験体に、有効量のポリペプチド、上記のようなフラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体、または上記のような融合ポリペプチドもしくはタンパク質を、抗原性刺激と組み合わせて投与する工程を包含し、ここで、このポリペプチドの投与は、抗原性刺激に対するこの被験体のＴ細胞応答を増加させるために効果的である。
【００５６】
本発明はまた、抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を阻害するための方法を提供し、この方法は、この被験体に、有効量の上記のような「抗体」を投与する工程を包含し、ここで、この抗体の投与は、Ｔ細胞の刺激をブロックするかまたは抗原反応性Ｔ細胞を排除するために効果的であり、これによって、Ｔ細胞応答を阻害する。これらの方法は、組織または器官の移植を有する被験体を処置して、移植片の拒絶を阻害するためおよび／または移植を促進するために、特に有用である。自己抗原の場合には、この方法は、自己免疫応答およびこれらの病理学的続発症をブロックまたは低下させる。
【００５７】
本発明は、本発明の組成物でのエキソビボ刺激を受けたＴ細胞を使用する、治療方法を提供する。抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加させるための１つの方法は、以下：
（ａ）この被験体から、この被験体に免疫学的に適合性のドナーから、または免疫学的に受容可能な培養細胞株から、Ｔ細胞を得る工程；
（ｂ）このＴ細胞を、エキソビボで、有効量の上記のような細胞と接触させる工程であって、ここで、この接触は、抗原性刺激に対するＴ細胞の応答を増加させるために効果的である、工程；および
（ｃ）工程（ｂ）のＴ細胞を、この被験体に投与する工程、
を包含し、これによって、この被験体の免疫応答を増加させる。
【００５８】
別の実施形態において、抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加させるための方法は、以下の工程：
（ａ）被験体から、この被験体に対して免疫学的に適合性のドナーから、または免疫学的に受容可能な培養細胞株から、Ｔ細胞を得る工程；
（ｂ）このＴ細胞をエキソビボで有効量の以下：（ｉ）上記のようなポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体、あるいは（ｉｉ）上記のような融合ポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、この接触は、抗原性刺激に対するＴ細胞の応答を増加させるために効果的である、工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）のＴ細胞をこの被験体に投与する工程、
を包含し、これによって、この被験体の免疫応答を増加（または発生）させる。
【００５９】
本明細書中にはまた、ワクチン組成物もまた提供され、このワクチン組成物は、以下を含有する：
（ａ）（ｉ）Ｂ７−ＤＣ構築物を発現する、上記のような細胞、（ｉｉ）Ｂ７−ＤＣポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体、（ｉｉｉ）Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチドまたはタンパク質；
（ｂ）一般に、免疫応答が所望される抗原のさらなる供給源（これは、細胞自体がこの抗原を発現する、細胞に基づくワクチンの場合には、必要とされないかもしれないが（腫瘍抗原を保有する腫瘍細胞の場合のように））；
（ｃ）必要に応じて、一般的な免疫刺激因子またはアジュバント；ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のための薬学的かつ免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア。
【００６０】
哺乳動物被験体において抗原に対する免疫応答を増加または増強するための方法は、この被験体に、有効量の上記ワクチン組成物を投与する工程を包含する。
【００６１】
抗原またはワクチンと共に使用するための、補助刺激組成物もまた提供され、この組成物は、以下を含有する：
（ａ）Ｂ７−ＤＣポリペプチド（好ましくは、配列番号２または配列番号４）、そのフラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体、あるいはＢ７−ＤＣ融合ポリペプチド、ならびに
（ｂ）薬学的かつ免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア。
【００６２】
哺乳動物被験体において、抗原またはワクチンに対する免疫応答を相乗するための方法は、この被験体に、この抗原またはワクチンと組み合わせて、上記補助刺激組成物を投与する工程を包含する。
【００６３】
被験体において、腫瘍に対する全身性免疫応答を刺激する方法は、この被験体に、遺伝子改変された腫瘍細胞を投与する工程を包含し、この細胞は：
（ａ）この被験体中の腫瘍細胞由来であり、そして
（ｂ）上記のようなＢ７−ＤＣ核酸のエキソビボでの導入によって遺伝子改変されており、
この核酸の発現は、この被験体において補助刺激シグナルを提供し、ここで、この投与は、この腫瘍に対する全身性免疫応答の刺激を生じる。
【００６４】
これらの腫瘍細胞は、これらが投与された後のこれらの増殖が防止されるように、好ましくは照射によって、好ましくは処理されている。
【００６５】
この被験体は、上記治療組成物の投与の前に、化学療法、照射または外科的切除の腫瘍減少レジメンに供され得る。
【００６６】
抗原陽性腫瘍を有する哺乳動物において、抗腫瘍応答を誘導する方法もまた提供され、この方法は、以下：
（ａ）（ｉ）この哺乳動物の腫瘍と共通する抗原を発現し；
（ｉｉ）上記のようにＢ７−ＤＣコード核酸ベクターでトランスフェクトされ、これは、Ｂ７−ＤＣ分子として発現される場合に、この細胞に、この腫瘍の抗原に対するＴ細胞応答を補助刺激させ；
（ｉｉｉ）必要に応じて、工程（ｂ）の前に照射される、腫瘍または腫瘍細胞株の細胞を提供する工程；
（ｂ）有効数の細胞をこの哺乳動物に投与する工程であって、この細胞は、この抗原およびＢ７−ＤＣ分子を発現する、工程；
を包含し、これによって、抗腫瘍応答を誘導する。
【００６７】
上記方法において、抗腫瘍応答は、以下によって特徴付けられる：
（Ａ）全ての測定可能な病巣の最大垂直直径の積の合計の、少なくとも５０％の減少；
（Ｂ）新たな病巣の証拠がないこと、および
（Ｃ）任意の先在病巣の進行がないこと。
【００６８】
腫瘍を保有する哺乳動物において、腫瘍の一次増殖または再増殖の抑制または弱化を誘導する方法もまた提供され、この方法は、以下：
（ａ）（ｉ）この哺乳動物の腫瘍と共通する抗原を発現し；
（ｉｉ）上記のようにＢ７−ＤＣコード核酸ベクターでトランスフェクトされ、これは、Ｂ７−ＤＣ分子として発現される場合に、この細胞に、この腫瘍の抗原に対するＴ細胞応答を補助刺激させ；
（ｉｉｉ）必要に応じて、工程（ｂ）の前に照射される、腫瘍または腫瘍細胞株の細胞を提供する工程；
（ｂ）有効数の細胞をこの哺乳動物に投与する工程であって、この細胞は、この抗原およびＢ７−ＤＣ分子を発現する、工程；
を包含し、これによって、黒色腫の腫瘍細胞に対して特異的な全身性免疫応答を誘導し、これによって、この抑制または弱化を誘導する。
【００６９】
哺乳動物における抗原陽性腫瘍の反復性の増殖を阻害する方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）（ｉ）この哺乳動物の腫瘍と共通する抗原を発現し；
（ｉｉ）上記のようにＢ７−ＤＣコード核酸ベクターでトランスフェクトされ、これは、発現される場合に、この細胞に、この腫瘍の抗原に対するＴ細胞応答を補助刺激させ；
（ｉｉｉ）必要に応じて、工程（ｂ）の前に照射される、腫瘍または腫瘍細胞株の細胞を提供する工程；
（ｂ）有効数の細胞をこの哺乳動物に投与する工程であって、この細胞は、この抗原およびＢ７−ＤＣ分子を発現する、工程；
を包含し、これによって、この哺乳動物において腫瘍抗原に対して特異的な全身性免疫応答を誘導し、この免疫応答が、腫瘍の反復性の増殖を阻害する。
【００７０】
別の実施形態は、哺乳動物被験体に局所的に投与された抗原の近隣に、補助刺激シグナルを提供して、この抗原に対する全身性免疫の状態を生じる炎症応答および免疫応答の局所的発生を促進する方法に関し、この方法は、被験体における局所部位に、以下：
（ａ）補助刺激に有効な量の、上記のようなＢ７−ＤＣポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体を発現する細胞、および
（ｂ）抗原
を投与する工程を包含し、その結果、この抗原に物理的に近い位置での補助刺激が、この応答の局所的発生を促進し、そして全身性免疫の状態を生じる。
【００７１】
上記方法において、抗原は、好ましくは、工程（ｂ）において、腫瘍細胞または非細胞抗原性物質の形態で投与される、腫瘍抗原である。この腫瘍細胞はまた、工程（ａ）において、Ｂ７−ＤＣポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは誘導体を発現する細胞であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ヒト染色体９ｐ２４に局在したｈＢ７−ＤＣのマップを示す、ダイヤグラムである。ｈＢ７−ＤＣは、ＢＡＣクローンＲＰＣＩ−１１．２にマッピングされる。
【図２】図２は、Ｂ７−ＤＣが、ＤＣとマクロファージとの間で差示的に発現されることを示す。骨髄ＤＣ、脾性ＤＣ、マクロファージ、マクロファージ株および組織におけるＢ７−ＤＣ ｍＲＮＡの分布を、０．５μｇ／レーンの精製したＤＮＡを使用して、１％アガロースゲルで泳動する、バーチャルノーザンブロット分析によって評価した。Ｇ３ＰＤＨを、コントロールとして使用した。Ｊ７７４Ａ１細胞、Ｒａｗ２６４．７細胞、Ｐｕ５−１．８細胞およびＷＥＨＩ細胞は、マクロファージ細胞株である。ＢＭ：骨髄。
【図３】図３は、ヒトＤＣにおけるＢ７−ＤＣ発現のバーチャルノーザンブロットを示す。レーン１は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ−３Ｌと共に培養されたヒトＤＣを示し、レーン２は、ヒト胎盤を示し、そしてレーン３は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４と共に培養されたヒトＤＣを示す。ヒトＢ７−ＤＣの５’および３’ＵＴＲ由来のオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトＤＣの全ＲＮＡのバーチャルノーザン分析のためのＰＣＲ ＤＮＡプローブを作製した。β−アクチンをコントロールとして使用して、ｍＲＮＡの品質を確認した。
【図４】図４は、成熟ＢＭ−ＤＣにおけるＢ７−ＤＣの表面発現を示す、フローサイトメトリー分析を代表する。９日目に、マウスＢＭ−ＤＣをＦｃブロックし、そしてコントロール抗体またはＢ７−ＤＣ抗血清を用いて染色した。結合の特異性を、ＤＣの表面への抗Ｂ７−ＤＣの結合に対して競合するためのＢ７−ＤＣ−Ｉｇを添加することによって、実証した。
【図５】図５は、Ｂ７−ＤＣがＰＤ−１に結合するが、ＣＴＬＡ−４にもＣＤ２８にも結合しないことを示す。２９３Ｔ細胞を、ｐＣＡＧＧＳ−Ｂ７．１ ｏ ｐＣＡＧＧＳ−Ｂ７−ＤＣを用いて、一時的にトランスフェクトした。トランスフェクト体を、ＰＤ−１−Ｉｇ融合分子、２８−Ｉｇ融合分子およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合分子で染色し、続いてＰＥ標識した二次抗体で染色した。ｐＣＡＧＧＳ（空のベクター）トランスフェクト体の染色は、ネガティブであった（示さず）。
【図６】図６（左右のパネル）は、抗ＣＤ３およびＢ７−ＤＣ−ＩｇによるＴ細胞増殖の補助刺激を示す。左側のグラフ：精製Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８）を、次第に増加する濃度の抗ＣＤ３（ｍＡｂ ２Ｃ１１）および一定濃度（０．１μｇ／ｍｌ）の固定したＢ７．１−Ｉｇ（黒菱形）、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（黒丸）またはアイソタイプコントロール（黒三角）で予めコートしたウェル内で培養した。結果は、３つのうちの１つの代表的な実験を示す。細胞を、７２時間インキュベートし、そして３Ｈ−チミジンで標識した。ＣＰＭとは、１分間あたりの計数である。右側のグラフ：精製ＣＤ８ Ｔ細胞を、次第に増加する濃度の抗ＣＤ３および一定濃度の固定したＢ７．１−Ｉｇ（黒菱形）、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（黒丸）またはアイソタイプコントロール（黒三角）で（ａ）においてと同様に予めコートしたウェル内で、培養した。結果は、２つのうちの１つの代表的な実験のものである。細胞を７２時間インキュベートし、そして３Ｈ−チミジンで標識した。ＣＰＭとは、１分間あたりの計数である。
【図７】図７は、抗原特異的Ｔ細胞増殖応答の補助刺激を示す。ＲＥＮＣＡ細胞をＩＦＮγで７２時間処理して、ＭＨＣクラスＩＩの発現を誘導し、そして１２．５μｇ／ｍｌのＨＡ１１０−１２０ペプチドとともにインキュベートした。精製したＨＡおよびＩ−Ｅｄ特異的トランスジェニックＴ細胞を、次第に増加する濃度のＢ７．１−Ｉｇ（黒菱形）、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（黒丸）またはアイソタイプコントロール（黒三角）のいずれかと共に、可溶化形態で添加した。細胞を４８時間インキュベートし、そして３Ｈ−チミジンで標識した。ＣＰＭとは、１分間あたりの計数である。結果は、３つのうちの１つの代表的な実験である。
【図８】図８は、Ｂ７−ＤＣによって補助刺激されたＴ細胞のサイトカイン分泌を示す。上のパネル：精製したＴ細胞を、抗ＣＤ３（０．１２μｇ／ｍｌ）および０．１μｇ／ｍｌの固定化Ｂ７．１−Ｉｇ（黒菱形）、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（黒丸）またはアイソタイプコントロール（黒三角）で、図６（左）と同様に予めコートしたウェル内で培養した。結果は、３つのうちの１つの代表的な実験を示す。下のパネル：１２．５μｇ／ｍｌ ＨＡ（１１０−１２０）ペプチドで負荷したγ−ＩＦＮ処理したＲＥＮＣＡ細胞を、精製したＨＡおよびＩ−Ｅｄ特異的トランスジェニックＴ細胞と共に、２μｇ／ｍｌの可溶性Ｂ７．１−Ｉｇ、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇまたはアイソタイプコントロール（記号は上記のとおり）と一緒にインキュベートした。結果は、２つのうちの１つの代表的な実験を示す。上清を、２４時間および４８時間の培養の後に収集し、そしてＥＬＩＳＡを使用して、示されるリンホカインについてアッセイした。
【図９】図９は、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇが、インビボ補助刺激の後に、抗原特異的増殖を大いに増強することを示す。ＨＡに対して特異的な２．５×１０６のＴＣＲトランスジェニック細胞の養子移入の後に、３群のマウスを、ＨＡペプチド（１１０−１２０）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）のいずれかで、単独でかまたはＢ７−ＤＣ−ＩｇおよびＩＦＡまたはＩＦＡを含むアイソタイプコントロール抗体のいずれかとの組合せで、後肢裏において皮下で免疫した。リンパ節の排液を、７日目に獲得した。１．５×１０５のＬＮ細胞を、ＨＡペプチドと共に４８時間インキュベートし、１μＣｉ［３Ｈ］チミジンでパルス化し、そして１２時間後に組み込んだ放射能を、決定した。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明者らは、ここで、改善された免疫治療組成物および方法のための基礎として働く、新たなタンパク質および核酸を同定した。ヒトおよびマウス形態の、新規補助刺激タンパク質（Ｂ７−ＤＣと命名された）が発見され、そして本明細書中に開示される。
【００７４】
ヒトＢ７−ＤＣをコードするＤＮＡは、以下に示す配列番号１のヌクレオチド配列を有する：
【００７５】
【化１】
2011224008.tif 000003
ヒトＢ７−ＤＣタンパク質は、以下に示す配列番号２のアミノ酸配列を有する（リーダー配列、膜貫通ドメインおよび細胞質テイルが注釈を付けられている）：
【化２】
2011224008.tif 000004
このタンパク質の細胞外ドメインは、残基Ｐ２６〜残基Ｗ２２１由来である。
【００７６】
マウスＢ７−ＤＣをコードするコード配列を含むＤＮＡクローンは、以下に示す配列番号３のヌクレオチド配列を有する。このコード配列（下線を引かれた、三つ組みで示される）は、ヌクレオチド２１０で開始するメチオニンコドンａｔｇ（太字）から開始し、そしてｔａｇ終止コドン（太字）（ヌクレオチド９５１〜９５３）で終止する。
【化３】
2011224008.tif 000005
配列番号５は、配列番号３のコード配列部分である。
【００７７】
配列番号３のコード領域によって（すなわち、配列番号５によって）コードされるマウスＢ７−ＤＣタンパク質は、以下に示す配列番号４のアミノ酸配列を有する（リーダー配列、膜貫通ドメインおよび細胞質テイルが注釈をつけられている）：
【化４】
2011224008.tif 000006
このタンパク質の細胞外ドメインは、残基Ｐ２６〜残基Ｗ２２１由来である。
マウスＢ７−ＤＣの完全ＤＮＡ配列（もともとは「ブチロフィリン様タンパク質」または「Ｂｔｄｃ」と称された）は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１４２７８０．２を有する。
【００７８】
（基本的な分子アプローチ）
このアプローチは、実施例により詳細に記載される。本発明者らは、２つの重要な特徴を組み込むＰＣＲ Ｓｅｌｅｃｔアプローチを利用した。第１に、ハイブリダイゼーション工程前の最初のＰＣＲ反応は、少量のＲＮＡのみを必要とする。この技術は、夾雑するマクロファージ、前駆体細胞または他の潜在的な夾雑細胞を実質的に含まないようになった高度に精製された成熟ＤＣの使用を可能にする。このような高度に精製されたＤＣを非常に多数で得ることが困難であることは公知である。第２に、ＰＣＲ Ｓｅｌｅｃｔ手順は、低いコピー数の差次的に発現される遺伝子のクローニングを可能にする。
【００７９】
その細胞性の対応物である活性化マクロファージと比較して、ＤＣによって差次的に発現される遺伝子を同定するために、ならびにＤＣ特異的機能と関連する遺伝子を同定するために、本発明者らは、ｃＤＮＡサブトラクションアプローチを適用した。これは、抑制ＰＣＲ（ＰＣＲ ＳｅｌｅｃｔＴＭ）と組み合わせた、改変型ＰＣＲベースの「代表差次的分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）」（ＲＤＡ）を使用した（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：６６０２５−６０３０（１９９６））。
【００８０】
（一般的な組み換えＤＮＡ方法）
分子生物学の一般的な方法を開示する基本書（それらの全てが、参考として援用される）としては、以下が挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（最新版）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＭ，編，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５；Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）；Ｗａｔｓｏｎ，ＪＤら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２版，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；ならびにＯｌｄ，ＲＷら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）。
【００８１】
他に示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的置換（例えば、縮重コドン置換）改変体および相補配列を含むことが意図される。用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」と同義であり、そして遺伝子、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ならびにこれらのいずれかのフラグメント（例えば、オリゴヌクレオチド）を含み、そしてさらに、これらの等価物を含むことが意図される（より完全に以下に説明される）。核酸のサイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで示される。これらは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）から、使用者によって決定される核酸配列から、または公開される核酸配列から誘導される推定値である。タンパク質サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）の分子量または長さ（アミノ酸残基の数）で示される。タンパク質サイズは、ＰＡＧＥから、配列決定から、コード核酸配列に基づく推定アミノ酸配列から、または公開されるアミノ酸配列から概算される。
【００８２】
詳細には、Ｂ７−ＤＣまたはそのフラグメントもしくは誘導体に対応するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子は、本明細書中に開示されるタンパク質の配列由来のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）によって合成され得る。次いでこれらのｃＤＮＡ配列は、真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターに組み立てられ得、そして生じるベクターが使用されて、適切な宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）によってＢ７−ＤＣまたはそのフラグメントもしくは誘導体の合成を指向し得る。
【００８３】
本発明は、新規Ｂ７−ＤＣをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸、そのフラグメントまたはその等価物を含む。用語、核酸は、本明細書中に使用される場合、そのようなフラグメントまたは等価物を含むことが意図される。本発明の核酸配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。好ましい核酸は、配列番号１の配列を有するヒトＢ７−ＤＣをコードするｃＤＮＡまたはその等価物である。
【００８４】
好ましくは、本発明の核酸は、Ｂ７−ＤＣの少なくとも一部をコードするｃＤＮＡ分子である。このｃＤＮＡは、成熟ＤＣまたはこのタンパク質を天然に発現する他の細胞から抽出されたｍＲＮＡから作製され得る。Ｂ７−ＤＣをコードする核酸配列は、ＤＣゲノムＤＮＡから入手可能である。従って、Ｂ７−ＤＣをコードするＤＮＡは、公知のプロトコールに従ってｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからクローン化され得る。
【００８５】
Ｂ７−ＤＣをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列は、適切な細胞株から総ｍＲＮＡを単離することによって入手され得る。二本鎖ｃＤＮＡが総ｍＲＮＡから調製される。ｃＤＮＡが、多数の公知の技術のうちのいずれか１つを用いて、適切なプラスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターに挿入され得る。
【００８６】
ヌクレオチド配列に関して、用語「等価」は、構造的に相同なタンパク質および／または機能的に等価なタンパク質をコードする配列を含むことが意図される。例えば、Ｂ７−ＤＣヌクレオチド配列の天然の多型（特にコドンの第３の塩基において）は、アミノ酸配列を変更しない「サイレント」な変異として公知であり得る。しかし、Ｂ７−ＤＣ中のアミノ酸配列変化を含む多型が、ヒト（または他の哺乳動物）集団中に存在し得る。１つ以上のヌクレオチド中に変化を有するこれらの対立遺伝子改変体（コード配列の総数のうちの約３〜４％まで）が、天然の対立遺伝子バリエーションに起因してヒト集団中におそらく見出されるということを、当業者は認識する。Ｂ７−ＤＣをコードするＤＮＡにおける、これらの対立遺伝子改変体ならびに生じる核酸多型およびポリペプチド多型のいずれかおよび全てが、本発明の範囲内である。
【００８７】
さらに、本明細書中に記載されるＢ７−ＤＣタンパク質の、１つ以上の天然に存在するアイソフォームまたは関連する免疫学的に交差反応性のファミリーのメンバーが存在し得る。このようなアイソフォームまたはファミリーのメンバーは、たとえそれらが異なる遺伝子座の遺伝子によってコードされるとしても、Ｂ７−ＤＣに対して機能アミノ酸配列の類似性を共有するタンパク質として規定される。
【００８８】
（核酸のフラグメント）
核酸配列のフラグメントは、全長Ｂ７−ＤＣタンパク質をコードするヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として規定される。本発明は、（１）Ｔ細胞上でその天然のリガンドに結合するＢ７−ＤＣの能力を保持し、かつ（２）活性化Ｔ細胞媒介免疫応答（一次活性化シグナルを受けたＴ細胞によるサイトカイン産生および／またはＴ細胞増殖として測定される）を（それらがどのように提示されるかに依存して）増強または阻害するポリペプチドをコードする、核酸フラグメントを含む。
【００８９】
例えば、本明細書中に意図されるような核酸フラグメントは、未だ同定されていない（しかし、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ではないようである）レセプターに対してＴ細胞表面に結合し、そして補助刺激シグナルをＴリンパ球に送達する能力を保持するＢ７−ＤＣポリペプチドをコードする。別の基準によって、本発明の核酸フラグメントは、別の動物種由来の核酸とハイブリダイズする核酸フラグメントであり、ゆえに、Ｂ７−ＤＣと「交差反応性」である新規タンパク質を検出するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。
【００９０】
一般的に、Ｂ７−ＤＣポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列は、成熟タンパク質をコードする配列由来のヌクレオチドを含む。しかし、いくつかの場合、核酸のリーダー配列部分の全てまたは一部を含むことが、望ましくあり得る。本発明の核酸配列はまた、リンカー配列、天然または改変された制限エンドヌクレアーゼ部位、およびコードされるタンパク質もしくはフラグメントのクローニング、発現または精製に関連する操作のために有用である他の配列を含み得る。核酸配列のこれらおよび他の改変は、本明細書中に記載されるか、または当該分野で周知である。
【００９１】
１つの実施形態において、Ｂ７−ＤＣのＥＣＤに対応するアミノ酸配列（おおよそ２６〜２２１位のアミノ酸を含む）をコードするＤＮＡは、ＰＣＲを用いて、ヒトＩｇＣγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡに連結されて、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質として発現される構築物を形成する。
【００９２】
Ｂ７−Ｉｇ融合タンパク質をコードする類似のＤＮＡ分子は、米国特許第５，５２１，２８８号に開示され、そして登録番号６８６２７の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）に寄託されている。
【００９３】
Ｂ７−ＤＣおよび可溶性Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質をコードするＤＮＡを組み立て、そして発現させるための技術（例えば、オリゴヌクレオチド合成、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ベクターの構築、発現系など）は、当該分野で十分に確立されている。当業者は、特定の条件および手順のための標準的な供給原材料に精通している。
【００９４】
他の実施形態において、Ｂ７−ＤＣのドメインまたはフラグメントをコードするＤＮＡは、別のＢ７ファミリータンパク質（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７．３）の残りの部分のほとんどまたは全てをコードする核酸と融合される。ヒトＢ７．１（ＣＤ８０）の完全ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６０９５８を有し；マウス配列についての登録番号は、Ｘ６０９５８であり；ラット配列についての登録番号は、Ｕ０５５９３である。ヒトＢ７．２（ＣＤ８６）の完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ２５２５９を有し；マウス配列についての登録番号は、Ｌ２５６０６である。
【００９５】
（発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたＢ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。「作動可能に連結された」は、コード配列の発現を可能にする条件下で、コード配列が調節配列に連結されていることを意味する。既知の調節配列が選択されて、適切な宿主細胞中での所望のタンパク質の発現を指向する。従って、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。
【００９６】
当業者は、本発明の発現ベクターの特定の設計が、考慮（例えば、トランスフェクトされる宿主細胞および／または発現されるタンパク質の型）に依存することを、認識する。
【００９７】
本発明の発現ベクターは、Ｂ７−ＤＣの種々の実施形態（全長タンパク質およびその機能的誘導体（本明細書中に規定される）（ポリペプチドフラグメント、改変体、融合タンパク質などを含む））をコードする核酸分子の完全な範囲を含む。従って、１つの実施形態において、発現ベクターは、単独または別のタンパク質に融合した、Ｂ７−ＤＣタンパク質の少なくとも一部（例えば、ＥＣＤ）をコードする核酸を含む。
【００９８】
このような発現ベクターが使用されて、ＤＮＡの発現のためおよび融合タンパク質またはペプチドを含むコードされるタンパク質の産生のために、宿主細胞にトランスフェクトされる。Ｂ７−ＤＣポリペプチドを発現する遺伝学的に改変された細胞は、細胞が示された目的のために有用であるために十分な時間、外因性ＤＮＡを一過性に発現し得ることが理解される。従って、細胞が、インビボまたはエキソビボにおいて増大した補助刺激能力を有する免疫源として作用する場合、発現が必要とされる時間の長さまたは細胞が生存したままである長さは、細胞がその免疫原性機能および／または補助刺激機能と発揮するために必要とされる時間である。例えば、本発明のＢ７−ＤＣを発現する形質導入された腫瘍細胞の場合、Ｂ７−ＤＣの発現は、少なくとも６時間、好ましくは２４時間、より好ましくは少なくとも２〜４日間であり得る。当然ながら、発現はまた、安定（すなわち、その細胞の寿命の間、安定）であり得る。以下に考察される適切な発現ベクターおよび調節エレメント（例えば、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーター）は、所望または必要とされる発現の安定性に従って選択される。
【００９９】
本発明において、本発明は、Ｂ７−ＤＣタンパク質、フラグメント、および誘導体を産生するための方法を提供する。例えば、Ｂ７−ＤＣタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞は、Ｂ７−ＤＣポリペプチドの発現を可能にする適切な条件下で培養される。
【０１００】
宿主細胞はまた、Ｂ７−ＤＣタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡおよび第２タンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを、単独でかまたは組み合わせて含む１つ以上の発現ベクターを用いてトランスフェクトされ得、その結果、この宿主細胞は、両方の部分を含む融合ポリペプチドを産生する。
【０１０１】
組み換え発現ベクターが、Ｂ７−ＤＣの一部をコードするＤＮＡおよび別のタンパク質（例えば、ヒトＩｇＣγ１）をコードするＤＮＡを含む場合、生じる融合タンパク質は、変更された可溶性、結合親和性および／または結合価を有し得る。例えば、Ｂ７−ＤＣ Ｉｇ融合タンパク質は、好ましくは、培養物においてトランスフェクトされた宿主細胞によって分泌され、ゆえに、この培養培地から単離される。あるいは、タンパク質が細胞質に保持される場合、細胞が収集され、溶解され、そしてタンパク質がこの溶解物から単離される。
【０１０２】
培養は、代表的に、宿主細胞、適切な増殖培地、および他の副生成物を含む。適切な培養培地は、当該分野で周知である。Ｂ７−ＤＣタンパク質は、タンパク質およびペプチドを精製するための従来技術を用いて培地または細胞溶解物から単離され得、これには、硫酸アンモニウム沈澱、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）、および／または電気泳動が挙げられる（一般的に、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２：２３３−５７７（１９７１）を参照のこと）。一旦、部分的または均質的にまで精製されると、本発明の組み換えＢ７−ＤＣタンパク質は、本明細書中により詳細に記載されるように薬学的組成物中に使用され得る。
【０１０３】
形質転換またはトランスフェクトされてＢ７−ＤＣまたはそのホモログもしくは機能的誘導体を発現する、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞は、本発明の範囲内である。例えば、Ｂ７−ＤＣは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはヒト細胞のような哺乳動物細胞中で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）（前出）に見出され得るか、さもなくば当業者に公知である。
【０１０４】
真核生物細胞における発現は、部分的もしくは完全なグリコシル化および／または組み換えタンパク質の関連する鎖間ジスルフィド結合もしくは鎖内ジスルフィド結合の形成を導く。
【０１０５】
酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。培養される昆虫細胞（ＳＦ９細胞）におけるタンパク質発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。一般的に、ＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２）が、哺乳動物細胞における一過性の増殖／発現のためにｐＣＤＭ８のようなベクター（Ａｒｕｆｆｏ Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．（前出））と組み合わせて使用され、一方、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−ネガティブＣＨＯ）細胞が、哺乳動物細胞における安定な増殖／発現のためにｐＭＴ２ＰＣのようなベクター（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）と共に使用される。ＮＳ０骨髄腫細胞株（グルタミンシンセターゼ発現系）が、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｔｄ．から利用可能である。
【０１０６】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、レポーター基および標的タンパク質の連結部に導入されて、融合タンパク質の精製に続く、標的タンパク質のレポーター基からの分離を可能にする。このような切断およびその認識配列に対するタンパク質分解性酵素としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１０７】
代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡを標的組み換えタンパク質に融合する。
【０１０８】
誘導可能な非融合発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。標的遺伝子発現は、ｐＴｒｃにおいてハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存するが、ｐＥＴ１１ｄに挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃＯ融合プロモーターからの転写に依存する。これは、ウイルスポリメラーゼであり、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎ１を保有するレジデントλプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０１０９】
本発明の１つの実施形態は、新規Ｂ７−ＤＣを新規に発現するトランスフェクトされた細胞である。すでにＢ７−ＤＣを発現する細胞（例えば、成熟ＤＣ）の場合、トランスフェクトされた細胞は、細胞表面上に増加した量のＢ７−ＤＣタンパク質またはそのフラグメントを発現させる。
【０１１０】
例えば、腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、白血病、リンパ球、癌腫または神経芽細胞腫）は、腫瘍細胞表面上でのＢ７−ＤＣの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトされる。このようなトランスフェクトされた腫瘍細胞は、本明細書中に記載されるように治療的抗腫瘍免疫を誘導するための免疫原として使用され得る。
【０１１１】
（ベクター構築）
所望されるコード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野で十分に理解された標準的な連結技術および制限技術を使用する。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望される形態に、切断され、調整され、そして連結され得る。
【０１１２】
ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多数の供給源から利用可能である。骨格のベクターおよびコントロール系は、一般的に構築において大量の配列のために使用される利用可能な「宿主」ベクター上に見出される。適切なコード配列について、最初の構築物は、適切な配列をｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーから回収することが問題であるかもしれず、通常はこれが問題である。しかし、一旦配列が開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から開始して、全遺伝子配列をインビトロで合成することが可能である。かなり大きいサイズ（例えば、５００〜１０００ｂｐ）の長さの遺伝子についての全遺伝子配列は、個々の重複する相補オリゴヌクレオチドを合成し、そして一本鎖の非重複部分をデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて充填することによって、調製され得る。このアプローチは、既知配列のいくつかの遺伝子の構築の場合に好首尾に使用されている。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ，Ｋ．Ｐ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；およびＪａｙ，Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
【０１１３】
合成オリゴヌクレオチドは、上記に引用される参考文献によって記載されるようなホスホトリエステル方法によってか、またはＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ（１９８１）２２：１８５９；ならびにＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５によって記載されるようなホスホロアミダイト方法のいずれかによって調製され、そして市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。アニーリング前または標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ジチオスレイトール、１〜２ｍＭ ＡＴＰ、１．７ｐｍｏｌｅ γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（２．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅ）、０．１ｍＭ スペルミジン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、過剰のポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、１ｎｍｏｌｅの基質に対して約１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ）を使用することによって達成される。
【０１１４】
一旦所望されるベクターの成分がこのように利用可能になると、これらは、標準的な制限手順および連結手順を用いて、切り出され、そして連結され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般的に理解される条件下で適切な制限酵素（単数または複数）を用いて処理することによって実行され、そしてこの詳細は、市販の制限酵素の製造業者らによって特定される。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの製品カタログを参照のこと。一般的に、約１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列が、約２０ｍｌの緩衝溶液中で１ユニットの酵素によって切断される；本明細書中の実施例において、代表的に、過剰の制限酵素が、ＤＮＡ基質の完全な消化を確実にするために使用される。３７℃で約１時間〜２時間のインキュベーション時間が、実行可能であるが、バリエーションが許容され得る。各インキュベーション後、タンパク質が、フェノール／クロロホルムを用いた抽出によって除去され、そしてエーテル抽出が続き得、そして核酸が、エタノールを用いる沈澱によって水性画分から回収される。所望される場合、切断されたフラグメントのサイズ分画は、標準的な技術を用いてポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって実行され得る。サイズ分画の一般的な説明は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：４９９−５６０に見出される。
【０１１５】
制限切断されたフラグメントは、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下、２０℃〜２５℃で約１５〜２５分間のインキュベーション時間を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ ＤＴＴおよび０．１〜１．０ｍＭ ｄＮＴＰ中でＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大きなフラグメントを用いて処理することによって、平滑末端化処理し得る。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントは、５’一本鎖オーバーハングを充填するが、たとえ４つのｄＮＴＰが存在していても突出している（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）３’一本鎖を破壊する。所望される場合、選択的な修復が、オーバーハングの性質によって規定される制限内で、１種類のｄＮＴＰだけ、または選択されたｄＮＴＰを供給することによって、実行され得る。Ｋｌｅｎｏｗを用いた処理後、混合物を、フェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノール沈澱する。Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１を用いての適切な条件下での処理は、いずれかの一本鎖部分の加水分解をもたらす。
【０１１６】
連結は、代表的に、例えば、以下の標準的な条件および温度の下で、１５〜５０ｍｌの容量で実行される：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０〜５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、０℃（「粘着性末端」連結について）または１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１４℃（「平滑末端」連結について）のいずれか。分子間「粘着末端」連結は、通常、３３〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの末端濃度）で実行される。分子間平滑末端連結は、１ｍＭの総末端濃度で実行される。
【０１１７】
「ベクターフラグメント」を使用するベクター構築の際、フラグメントは、一般的に、５’ホスフェートを除去し、そして自己連結を回避するために、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用いて処理される。消化は、おおよそ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、ｐＨ８、６０°で、約１時間かけて約１ユニット／ｍｇベクターでＢＡＰまたはＣＩＡＰを用いて実行される。調製物は、フェノール／クロロホルムを用いて抽出され、そしてエタノール沈澱される。あるいは、さらなる制限酵素および所望されないフラグメントの分離によって二重に消化されたベクターにおいて、再連結が回避され得る。
【０１１８】
多数の方法のうちのいずれかが使用されて、コード配列中に変異を誘導して、本発明の改変体を作製する。これらの変異としては、単純な欠失または挿入、体系的な欠失、挿入または塩基クラスターの置換あるいは１塩基の置換が挙げられる。
【０１１９】
例えば、Ｂ７−ＤＣ ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の改変は、プロトコールおよび試薬が市販されている周知技術である部位指向型変異誘発によって作製される（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ，ＪＰら，ＤＮＡ（１９８３）２：１８３−１９３））。プラスミド構築のための正確な連結が、例えば、最初にＥ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｍ．ら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９８０）１３８：１７９−２０７）、または他の適切な宿主を、連結混合物を用いて形質転換することによって確立される。従来方法を用いて、形質転換体は、プラスミド構築の様式に依存して、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、または他の抗生物質耐性遺伝子（または他の選択マーカー）の存在に基づいて選択される。次いで、プラスミドは、任意のクロラムフェニコール増幅（必要に応じてクロラムフェニコール増幅が続く）を用いて形質転換体から調製される（Ｃｌｅｗｅｌｌ，ＤＢら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９６９）６２：１１５９；Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１１０：６６７）。いくつかのミニＤＮＡプレップが、一般的に使用される。例えば、Ｈｏｌｍｅｓ，ＤＳら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８１）１１４：１９３−１９７；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，ＨＣら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９７９）７：１５１３−１５２３を参照のこと。単離されたＤＮＡは、制限によって分析され、そして／またはＭｅｓｓｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９によってさらに記載されるようなＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）のジデオキシヌクレオチド方法、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：４９９の方法によって配列決定される。
【０１２０】
ベクターＤＮＡは、従来の技術、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを介して、哺乳動物細胞に導入され得る。宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）および他の標準的な文書に見出され得る。
【０１２１】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、レポーター基および標的タンパク質の連結部に導入されて、融合タンパク質の精製に続く、標的タンパク質のレポーター基からの分離を可能にする。このような切断およびその認識配列に対するタンパク質分解性酵素としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１２２】
代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡを標的組み換えタンパク質に融合する。
【０１２３】
誘導可能な非融合発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。標的遺伝子発現は、ｐＴｒｃにおいてハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存するが、ｐＥＴ１１ｄに挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃＯ融合プロモーターからの転写に依存する。これは、ウイルスポリメラーゼであり、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎ１を保有するレジデントλプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０１２４】
（プロモーターおよびエンハンサー）
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中に使用される場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖の上に見出されるプロモーターのヌクレオチド配列である。核酸分子の２つの配列（例えば、プロモーター配列およびコード配列）は、両方の配列が同じＲＮＡ転写物上に転写されることを可能にするか、または１つの配列において開始するＲＮＡ転写物が第２配列に伸長されることを可能にする様式で、これらが互いに連結している場合、「作動可能に連結されている」。従って、２つの配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのプロモーター配列およびコード配列）は、プロモーター配列から始まる転写物が作動可能に連結されたコード配列のＲＮＡ転写物を産生する場合、作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」状態であるためには、２つの配列が、直線配列中で互いに直ぐに隣接する必要はない。
【０１２５】
本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞において作動可能でなければならず、そして真核生物プロモーターまたはウイルス性プロモーターのいずれかであり得る。適切なプロモーターは、誘導可能、抑制可能または構成的であり得る。構成的プロモーターの例は、ウイルス性プロモーターＭＳＶ−ＬＴＲであり、これは、種々の細胞において有効であり、かつ活性であり、そしてほとんどの他のプロモーターとは対照的に、停止細胞および増殖中の細胞において同じ高い活性を有する。他の好ましいウイルス性プロモーターとしては、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルス由来）（Ｂａｓｈａｒｔ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１（１９８５））またはＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルス由来）（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７（１９８２））に存在するウイルス性プロモーターが挙げられる。マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））もまた、有用である。プロモーター領域に関連する転写因子および分離活性化および転写因子のＤＮＡ結合の他の例示的記載としては、以下が挙げられる：Ｋｅｅｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１：６９９；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４０：２４５；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：９；Ｌｅｗｉｎ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１６１；Ｐｔａｓｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：３２９；Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：３０６。これらの上記の参考文献全ての関連する開示は、参考として本明細書に援用される。
【０１２６】
プロモーター領域はさらに、特異的な組織に見出される特定のタンパク質との相互作用によって組織特異的エンハンサーとして機能もし得る八量体領域を含み得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされるべき標的細胞に特異的かまたは、このような標的細胞の細胞性因子によって高く活性化されるものである。ベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例は、（Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎら、米国特許第５，１１２，７６７号）に開示される。エンハンサーおよび転写におけるその作用の一般的な議論については、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、（１９９０）、ｐｐ．５５２−５７６を参照のこと。特に有用なものは、レトロウイルスエンハンサー（例えば、ウイルス性ＬＴＲである）。エンハンサーは、好ましくは、プロモーターから上流に配置され、相互作用して遺伝子発現を刺激する。レトロウイルスベクターの使用のために、内因性ウイルスＬＴＲは、エンハンサーがなくされ、そして組織特異性または他の所望の特性（例えば、本発明のＢ７−ＤＣコードＤＮＡ分子に対する転写効果）を与える他の所望のエンハンサー配列で置換され得る。
【０１２７】
本発明の核酸配列はまた、標準的技術を用いて化学的に合成され得る。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する種々の方法は公知であり、市販されるＤＮＡ合成装置で完全に自動化されている固相合成（ペプチド合成など）を含む（例えば、本明細書中に援用されるＩｔａｋｕｒａら、米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号；ならびにＩｔａｋｕｒａ 米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号を参照のこと）。
【０１２８】
（タンパク質およびポリペプチド）
本発明は、配列番号２または配列番号４の配列を有する「単離された」Ｂ７−ＤＣタンパク質を含む。本開示は、全長ヒトおよびマウスＢ７−ＤＣタンパク質（およびＤＮＡ）を例示するが、本明細書中に開示される特徴を所有する他の哺乳動物種由来のＢ７−ＤＣの相同体およびその変異体が、本発明の範囲内であることを意図されることは理解されるべきである。
【０１２９】
含まれるものはまた、アミノ酸置換改変体を意味するＢ７−ＤＣの「機能的な誘導体」、「フラグメント」、またはＢ７−ＤＣの「化学誘導体」である。これらの用語は、下で定義される。機能的誘導体は、測定可能なＢ７−ＤＣ活性、好ましくはＴ細胞上のレセプターに結合する活性および本発明に従ってその有用性を可能にするＴ細胞活性を補助刺激する活性を保持する。「機能的誘導体」は、この用語が本明細書中に接続語でまたは選択肢で使用されるか否かによらず「改変体」および「フラグメント」を含む。
【０１３０】
機能的相同体は、上の生化学的活性および生物学的活性を保有しなければならない。この機能的特徴付けを考慮して、他の種由来の相同体タンパク質Ｂ７−ＤＣ（まだ発見されていないタンパク質を含む）の使用は、これらのタンパク質が配列類似性ならびに上記の生化学的活性および生物学的活性を有する場合、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３１】
２つのアミノ酸配列のまたは、２つの核酸配列のパーセント同一性を測定するために、この配列は、最適な比較目的のためにアラインメントされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために第１のアミノ酸および第２のアミノ酸の１つまたは両方、あるいは核酸配列において導入され得、そして非相同配列は比較目的のために無視され得る）。好ましいアラインメントの方法において、Ｃｙｓ残基がアラインメントされる。
【０１３２】
好ましい実施形態において、比較されるべき配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。例えば、２７６アミノ酸残基を有するヒトＢ７−ＤＣタンパク質アミノ酸配列（配列番号２）に対して第２の配列をアラインメントする場合、少なくとも８３アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１３８アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１６６アミノ酸残基、そしてより好ましくは１９３アミノ酸残基、２２１アミノ酸残基または２４８アミノ酸残基が、アラインメントされる。次いで、対応するアミノ酸位置（またはヌクレオチド位置）におけるアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が、比較される。次いで第１の配列における位置が、第２の配列における対応位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）によって占有される場合、この分子は、その位置で同一性である（本明細書で使用されるアミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、この２つの配列の最適なアラインメントのために誘導される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【０１３３】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して測定される。このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれている。これは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のｇａｐ ｗｅｉｇｈｔおよび１、２、３、４、５、もしくは６のｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔを使用する。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して測定される。これは、ＮＭＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよび４０、５０、６０、７０、もしくは８０のｇａｐ ｗｅｉｇｈｔおよび１、２、３、４、５、もしくは６のｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔを使用する。別の実施形態において、２つのアミノ酸または２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して測定される。これは、ＰＡＭ１２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ、１２のｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙおよび４のｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。
【０１３４】
本発明の核酸およびタンパク質配列は、さらに「クエリー配列」として使用されて、公開されているデータベースに対する探索を実行（例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する）し得る。このような探索は、Ａｌｔｓｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２）を用いて実行されて、ヒトまたはマウスＢ７−ＤＣ核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３）を用いて実行されて、本発明のヒトまたはマウスＢ７−ＤＣタンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を獲得し得る。比較目的のためのギャップを挿入したアラインメントを獲得するために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【０１３５】
従って、上記のＢ７−ＤＣタンパク質の相同体は、（ａ）ネイティブのＢ７−ＤＣ機能的活性、および（ｂ）ネイティブのＢ７−ＤＣタンパク質（例えば、上で測定された配列番号２または配列番号４）に対する配列類似性（少なくとも約３０％（アミノ酸レベルで）、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％）を有すると特徴付けられる。
【０１３６】
Ｂ７−ＤＣの開示された配列に基づくＤＮＡプローブを使用してこのようなタンパク質を得、そして発現することは当該分野の技術範囲内である。次いで、このタンパク質の生化学的活性および生物学的活性は、本明細書中に記載されるような当該分野で認識される方法（例えば、標準的なＴ細胞増殖またはサイトカイン分泌アッセイ）を使用して、容易に試験され得る。Ｔ細胞補助刺激の生物学的アッセイは、相同体が「機能的」相同体として適切であるような必須な活性を有するかどうかを示す。
【０１３７】
好ましいアッセイは、ＴＣＲ（「一次活性化シグナル」）の結合または架橋、および補助刺激シグナルの送達に依存するＢ７−ＤＣの機能的特徴（例えば、サイトカインのＴ細胞合成の刺激）を測定する。Ｔ細胞上のその天然のリガンドへのＢ７−ＤＣの結合は、増加したサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２）を誘導するシグナルを伝達し、ＩＬ−２は、慣用的に測定もされ得る増殖を順番に刺激する。
【０１３８】
Ｂ６−ＤＣの「改変体」とは、１つ以上のアミノ酸残基が置換されている（置換改変体）または１つもしくはいくつかの欠失した残基（欠失改変体）もしくは付加された残基（付加改変体）を有する、全タンパク質あるいはそのフラグメントのいずれかに実質的に同一な分子をいう。Ｂ６−ＤＣの「フラグメント」とは、分子の任意のサブセット、好ましくはＥＣＤを含むサブセット（すなわち、全長タンパク質のより短いポリペプチド）をいう。
【０１３９】
多数のプロセスが使用されて、単離されたＤＮＡ配列のフラグメント、変異体および改変体を産生し得る。Ｂ７−ＤＣタンパク質をコードする核酸の小さなサブ領域またはフラグメント（例えば、１〜３０塩基長）は、標準的な、化学的な合成によって調製され得る。より大きな合成フラグメントの産生において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマー。
【０１４０】
好ましい機能的誘導体は、融合タンパク質（Ｂ７−ＤＣの機能的フラグメントを含むポリペプチド）である。例えば、Ｂ７の有用な誘導体は、Ｂ７−ＤＣのＥＣＤおよびＩｇ Ｃ領域に対応するポリペプチドを含むＢ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質である。融合パートナーの存在は、Ｂ７−ＤＣタンパク質の可溶性、親和性および／または結合価（ここでは１分子あたりの利用可能な結合部位の数として規定される）を変更し得る。可溶性Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質（Ｔ細胞上のレセプターにまだ結合している間）は、ＡＰＣ上に発現されるネイティブタンパク質の効果とは異なる生物学的効果（すなわち、補助刺激よりも競合結合によるＴ細胞刺激の阻害）を有し得る。
【０１４１】
本明細書中に使用される場合、Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＰＤ−１またはＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ−４ではないＴ細胞上の別のレセプターを認識し、そして結合するタンパク質またはその任意のフラグメントの全体の細胞外部分である。好ましくは、Ｂ７−ＤＣのＥＣＤは、配列番号２または配列番号４の約２６位〜約２２１位のアミノ酸残基によりコードされる部分である。
【０１４２】
「可溶性Ｂ７−ＤＣ」によって、産生細胞から流れるか、分泌されるか、または、さもなければ抽出され得るＢ７−ＤＣの無細胞形態が意図される。可溶性Ｂ７−ＤＣとしては、可溶性融合タンパク質（例えば、生物学的に活性な分子に（遺伝的にまたは化学的に）融合されるＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、Ｂ７−ＤＣの遊離ＥＣＤ、またはＢ７−ＤＣ ＥＣＤ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４３】
初期に示されたように、本発明はまた、Ｂ７−ＤＣドメインと別のＢ７ファミリータンパク質のドメインまたはフラグメント（好ましくは補助刺激形態で細胞表面に発現される）との間のハイブリッド融合タンパク質を含む。
【０１４４】
Ｂ７−ＤＣ改変体の好ましい群は、少なくとも１つのアミノ酸残基および好ましくは、たった１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置換されている群である。タンパク質化学およびタンパク質構造の詳細な記載について、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８，およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。タンパク質分子において作製され得る置換の型は、異なる種の相同性タンパク質（例えば、Ｓｃｈｕｌｚら（上記）の表１〜２およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（上記）の表３〜９に示されるタンパク質）間のアミノ酸変化の頻度の分析に基づき得る。このような分析に基づいて、保存的置換は、以下の５つの群のうちの１つにおける交換として本明細書中に定義される。
【０１４５】
【化５】
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上の括弧の３つのアミノ酸残基は、タンパク質構造に特別な役割を有する。Ｇｌｙは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従って鎖に可撓性を与える。その通常ではないジオメトリーのため、Ｐｒｏは、鎖をきつく拘束する。Ｃｙｓは、タンパク質折り畳みに重要なジスルフィド結合形成に関係し得る。
【０１４６】
生物学的、機能的（または免疫学的）特性におけるより実質的な変化は、例えば、上の５つの群の中よりも間でほとんど保存されていない置換を選択することによって作製される。このような変化は、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックス構造）、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対する効果においてより有意に異なる。このような置換の例は、（ｉ）別のアミノ酸によるＧｌｙおよび／もしくはＰｒｏの置換またはＧｌｙもしくはＰｒｏの欠失または挿入；（ｉｉ）疎水性残基（例えば、Ｌｅｕ、Ｌｌｅ、Ｐｈｅ、ＶａｌもしくはＡｌａ）による親水性残基（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）の置換；（ｉｉｉ）任意のほかの残基によるＣｙｓ残基の置換；（ｉｖ）電気陰性の電荷を有する残基（例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐ）による電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓ）の置換；あるいは（ｖ）巨大な側鎖を有さない残基（例えば、Ｇｌｙ）によるこのような側鎖を有する残基（例えば、Ｐｈｅ）の置換である。
【０１４７】
本発明に従う大部分の受容可能な欠失、挿入および置換は、そのＴ細胞補助刺激活性に関するＢ７−ＤＣタンパク質の特徴においてラジカル変化を産生しないものである。しかし、そのようにするより前に、置換、欠失または挿入の確かな効果を予測することが困難な場合、当業者は、この効果が慣習的なスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書に記載される）によって過度の実験を必要とせず評価され得ることを正しく認識する。
【０１４８】
より短い鎖の改変体が化学合成によって作製され得るが、本発明について、好ましいより長い鎖の改変体は、Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸の部位特異的変異誘発、細胞培養における改変体核酸の発現、および必要に応じて細胞培養物からのポリペプチドの精製によって（例えば、（少なくとも１つのエピトープに結合することによって改変体を吸収するため）カラムに固定された特異的な抗体を使用する免疫親和性クロマトグラフィーによって）典型的に作製される。
【０１４９】
（Ｂ７−ＤＣの化学的誘導体）
Ｂ７−ＤＣの「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の一部分ではないさらなる化学的部分を含む。ポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。このような誘導された部分は、可溶性、吸収性、生物学的半減期などを改良し得る。このような効果を媒介し得る部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）に開示される。
【０１５０】
このような修飾は、ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導化因子と反応することによって分子に導入され得る。
【０１５１】
ポリペプチドの化学的誘導体の例は、以下である。
【０１５２】
リジニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボキシル酸無水物で誘導される。環式カルボキシル無水物を用いる誘導は、リジニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アミノ含有残基を誘導するための他の適切な試薬としては、イミドエステル（例えば、メチルピコリンイミデート；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロ水素化ホウ素（ｃｈｌｏｒｏｂｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いるトランスアミラーゼ触媒反応）が挙げられる。
【０１５３】
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）との反応によって選択的に修飾され得る。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニアとの反応によってアスパラギニル残基グルタミニル残基へ変換され得る。
【０１５４】
他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジンのアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記、ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１５５】
含まれるものはまた、１つ以上のＤ−アミノ酸が１つ以上のＬ−アミノ酸の代わりに置換されたペプチドである。
【０１５６】
（マルチマーペプチド）
本発明はまた、Ｂ７−ＤＣの配列から得られた塩基性ペプチド配列が、介在スペーサ−またはリンカーを用いてか、または用いずに約２〜約１００回繰り返される、より長いポリペプチドを含む。このようなマルチマーは、本明細書中に定義される任意のペプチド改変体から構築され得ることが理解される。さらに、ペプチドマルチマーは、ペプチドモノマーおよびその開示された置換改変体の異なる組合せを含み得る。このようなオリゴマーまたはマルチマーペプチドは、化学合成によってか、または本明細書中で考察されるような組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。化学的に産生される場合、オリゴマーは、好ましくは、塩基性ペプチド配列の２〜８回繰り返しを有する。組換え的に産生される場合、マルチマーは、例えば、発現系が２〜約１００回繰り返すことを可能にするのと同じくらい多くの繰り返しを有し得る。
【０１５７】
Ｂ７−ＤＣペプチドまたはポリペプチドのタンデムマルチマー、好ましくはダイマーおよびトリマーにおいて、鎖は、鎖間ジスルフィド結合または鎖間の他の「構造的」共有結合によって結合され、その結果、この鎖は、「末端から末端」よりも「横 対 横」である。好ましいダイマーおよびトリマーは、本明細書に記載されるようなＢ７−ＤＣの融合タンパク質（例えば、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ）間のものである。
【０１５８】
（Ｂ７−ＤＣのエピトープに対して特異的な抗体）
以下の記載において、免疫学、細胞生物学、および分子生物学の当業者に公知の種々の方法論について言及がなされる。刊行物および言及されるこのような公知の方法論を示す他の材料は、まるで全てを示すようにその全体において参考として本明細書中に援用される。免疫学の一般的な原理を記載する標準的な参考著述としては、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００；Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（最新版）Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（１９９９）；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（１９９０）が挙げられる。
【０１５９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその産生および使用のための方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８０）；Ｈ．Ｚｏｌａら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に記載される。
【０１６０】
免疫アッセイはまた、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１（または最新版）；Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．（編）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｂｉｚｏｌｌｏｎ，Ｃｈ．Ａ．編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ＥＬＩＳＡ（２９章），Ｉｎ：ｖａｎ Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ら、（編），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９１；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６；Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，（１９７８）（Ｃｈａｒｄ，Ｔ．による章，「Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」）に記載される。
【０１６１】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Ｉｄｉｏｔｙｐｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌｕｍｅ ７９，１９８４；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｖｏｌｕｍｅ ９０，１９８６，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌｕｍｅ １１９，１９８５；Ｂｏｎａ，Ｃ．ら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｐｐ．３３−８１（１９８１）；Ｊｅｒｎｅ，ＮＫ，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５Ｃ：３７３−３８９（１９７４）；Ｊｅｒｎｅ，ＮＫ，Ｉｎ：Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｓｉｄｅ，Ｗｅｓｔｅｎ−Ｓｃｈｎｕｒｒ，Ｉ．編，Ｅｄｉｔｉｏｎｅｓ Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，１９８２，Ｕｒｂａｉｎ，Ｊら、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３Ｄ：１７９−（１９８２）；Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：５６９−６０７（１９８３）に記載される。
【０１６２】
本発明は、公知のＢ７ファミリータンパク質にないＢ７−ＤＣの新規なエピトープを反応する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）を提供する。抗体は、異種の、同種異系の、同系のまたはそれらの修飾形態（例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体）であり得る。抗Ｂ７−ＤＣ抗体のイディオタイプに対して特異的な抗イディオタイプ抗体もまた、含まれる。用語「抗体」はまた、抗原結合部位を含み、そしてＢ７−ＤＣエピトープに結合し得るインタクトな分子およびそのフラグメントの両方を含むことが意味される。これらは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠くＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント（循環からより速やかに除去され、そしてインタクトな抗体よりも少ない非特異的な組織結合を有し得る）を含む（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。含まれるものはまた、Ｆｖフラグメントである（Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ら、（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０−１１３５；Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．ら、（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１−１５９４））。これらの種々のフラグメントは、従来の技術（例えば、プロテアーゼ切断または化学的切断）を使用して産生される（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：６６３−６９（１９８６）を参照のこと）。
【０１６３】
ポリクローナル抗体は、免疫化動物（ウサギ、ヤギ、げっ歯類など）由来の血清として得られ、そしてさらなる処理をせずに直接使用され得るか、または、慣習的な富化または精製方法（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー）に供され得る（Ｚｏｌａら、前記を参照のこと）。
【０１６４】
免疫原は、完全Ｂ７−Ｄ６タンパク質、あるいはそのフラグメントまたは誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ヒトＢ７−ＤＣのＥＣＤ（アミノ酸残基２６−２２１）の全てまたは一部を含み、ここでこれらの残基は、ネイティブなＢ７−ＤＣ上に見出される翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、従来の組換え方法を使用するクローニングされた遺伝子の発現、起源の細胞からの単離、高いレベルのＢ７−ＤＣを発現する細胞集団など）において産生される。
【０１６５】
ｍＡｂは、従来のハイブリドーマ技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５））、ならびにその改変（上の参考文献を参照のこと）によって導入された手順）を使用して産生され得る。動物、好ましくはマウスは、上のような免疫原を用いる免疫化によってプライムされて、プライムされた動物において所望の抗体応答を誘導する。
【０１６６】
プライムされた動物のリンパ節、脾臓または末梢血由来のＢリンパ球は、一般的に、融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の存在化で骨髄腫細胞と融合させる。任意の多くのマウス骨髄腫細胞株は、このような使用のために入手可能である：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１，Ｐ３−ｘ６３−ｋＯＡｇ８．６５３，Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４，またはＨＬ１−６５３骨髄腫株（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）。次の工程は、選択培地における増殖を含み、その結果、融合されていない親骨髄腫細胞およびドナーリンパ球細胞は、最終的に死亡するが、ハイブリドーマ細胞のみが生存する。これらは、クローニングされ、そして増殖させて、そしてその上清は、例えば、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質を使用する免疫アッセイ技術によって、所望の特異性の抗体の存在についてスクリーニングされる。陽性クローンは、例えば、限界希釈によってサブクローニングされ、そしてｍＡｂが単離される。
【０１６７】
これらの方法に従って産生されたハイブリドーマは、当該分野で公知の技術を使用してインビトロまたはインビボで（腹水中で）増殖され得る（一般的に、Ｆｉｎｋら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，９：１２１−３３（１９８４）を参照のこと）。一般的に、個々の細胞株は、培養において増殖され、そして高い濃度の単一のｍＡｂを含有する培養培地は、デカンテーション、濾過、または遠心沈殿法によって収穫され得る。
【０１６８】
この抗体は、通常のマルチマー構造の代わりに、単鎖抗体またはｓｃＦｖとして生成され得る。単鎖抗体は、目的のＩｇ由来の超可変領域を含み、未知量の標識された抗体（これは、「リポーター分子」として機能する）を含む溶液と接触させた場合、インタクトなＩｇの大きさの一部ではあるが、ネイティブなＩｇの抗原結合部位を再現する（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３８−１０４１；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３−２９９）；Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９；Ｊｏｓｔ ＣＲら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：２６２６７−２６２７３；米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，８５３，８７１号、同第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０Ｋｎ）。標識抗体が、非標識抗体を介して固体支持体に結合した抗原と複合体化するのを可能にするための、二回目のインキュベーション期間の後、この固体支持体は２回目に洗浄され、未反応の標識抗体が除去される。この型の正のサンドイッチアッセイは、抗原が存在するか否かを決定するための単純な「あり／なし」のアッセイであり得るか、または標識抗体の程度と、既知量の抗原を含む標準サンプルについて得られた程度を比較することによって定量的にされ得る。
【０１６９】
別の型の「サンドイッチ」アッセイでは、いわゆる「同時」アッセイおよび「逆」アッセイが使用される。同時アッセイは、固体支持体に結合した抗体および標識抗体の両方が、試験されるサンプルに同時に添加されるので、１回のインキュベーション工程を包含する。このインキュベーションが完了した後、この固体支持体を洗浄して、残りの液体サンプルおよび複合体化されていない標識抗体を除去する。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の存在は、従来の「正」サンドイッチアッセイにおけるのと同じようにして決定される。
【０１７０】
「逆」アッセイにおいて、標識抗体溶液の流体サンプルへの最初の添加、続いて適切なインキュベーション期間後の、固体支持体に結合した非標識抗体の添加という段階的添加が利用される。２回目のインキュベーション後、この固相を従来の様式で洗浄し、試験される残りのサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液が固相にない状態にする。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の決定は、「同時」アッセイおよび「正」アッセイのように決定される。
【０１７１】
上記の抗体は、Ｔ細胞刺激を阻害するための方法および所望されないＴ細胞の活性化に関連する疾患（例えば、移植片拒絶および自己免疫）を処置するための方法において有用である。この方法は、このような処置が必要な被験体にＢ７−ＤＣの補助刺激エピトープに特異的な有効量の抗体、好ましくはｍＡｂ、より好ましくはヒトｍＡｂまたはヒト化ｍＡｂを、投与する工程を包含する。抗体の投与は、Ｔ細胞刺激をブロックするか、または抗原反応性Ｔ細胞を排除し、これによって、標的Ｔ細胞応答を阻害するのに効果的でなければならない。関連する用量範囲を以下に記載する。
【０１７２】
（Ｂ７−ＤＣタンパク質をコードする核酸の使用）
本発明の核酸は、生物学的サンプル由来の細胞中のＢ７−ＤＣの発現を測定することによって、疾患の進行をモニターするために診断的に使用されるかまたはＢ７−ＤＣの発現に対する薬剤の影響をアッセイするために使用される。好ましくは、これは、細胞性ｍＲＮＡレベルの測定によって達成される。このような診断方法での使用のために、この核酸配列は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識またはビオチンで検出可能に標識され、従来のドットブロットまたはノザン−ハイブリダイゼーション手順において使用され、例えば、生物学的サンプル由来の総またはポリ（Ａ＋）ＲＮＡの調製物中に存在するｍＲＮＡ分子がプローブされる。
【０１７３】
（治療的組成物およびその投与）
Ｂ６−ＤＣポリペプチドまたはこのポリペプチドを発現する細胞（例えば、ＤＣまたは腫瘍細胞）は、哺乳動物被験体に、好ましくはヒトに投与される。細胞に結合した形態、固定化された形態、またそうでなければ凝集された形態のポリペプチドを使用して、Ｔリンパ球の反応性および得られる免疫を増強する。Ｂ６−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質はダイマーとして組み立てられる、実施例に示されるようにＴ細胞を補助刺激する。Ｂ６−ＤＣポリペプチドの可溶性単量体形態は、活性を刺激することなくＴ細胞上のレセプターに結合し得、従って、これは、この分子の刺激性形態によるＴ細胞補助刺激の競合的インヒビターまたはアンタゴニストと考えられ得る。このようなＢ６−ＤＣアンタゴニストの結合は、進行中のＴ細胞反応性を抑制し得るか、または内因性のＢ６−ＤＣまたはさらにこれらのレセプター（例えば、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４）を介して作用するＢ７ファミリーの他のメンバーによって提示される補助刺激シグナルの効果を妨害し得る。
【０１７４】
本明細書中に記載のようなＢ７−ＤＣ活性を有する組成物は、生物学的に有効な量または治療的に有効な量で、薬学的に受容可能なキャリア中で投与される。Ｂ７−ＤＣポリペプチド（またはそのポリペプチドを発現する細胞）は、単独で、またはＢ７ファミリーの別のメンバーもしくは別の免疫刺激分子の活性を有するタンパク質もしくはペプチドのような別のタンパク質もしくはペプチドと組合せて、投与され得る。処置はアジュバント（アジュバントの最も広い意味で使用され、インターフェロンのような任意の非特異的免疫刺激化合物を含む）の投与を含み得る。本明細書中で意図されるアジュバントとして、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテル）が挙げられる。
【０１７５】
また、被験体に投与される場合に、以下の用量および量が、本発明の抗体に関連する。
【０１７６】
治療的に有効な量は、効果的な時期に投与される場合に、所望の免疫学的効果または臨床的効果を達成する投与量である。
【０１７７】
Ｂ７−ＤＣ活性を有するポリペプチド（または抗Ｂ７−ＤＣ抗体）の治療的に活性な量は、因子（例えば、個体の疾患状態、年齢、性別および体重）、ならびにペプチドが個体において所望の応答を惹起するための能力によって変化し得る。投与量のレジメは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかに分けられた用量を毎日投与してもよいし、この用量を治療状態の緊急性によって示されるように比例して減少させてもよい。細胞に結合した形態の治療的に有効な量のタンパク質は、タンパク質当量または細胞当量で記述され得る。
【０１７８】
従って、有効な量は、レシピエントの体重１ｋｇ当たり約１ｎｇと約１ｇとの間、より好ましくは約１μｇと１００ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは約１００μｇと１００ｍｇ／ｋｇとの間である。内部投与に適切な投薬形態は、好ましくは、（後者の容量範囲について）１単位当たり約０．１ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分のを含む。活性成分は、組成物の総重量に基づいて、０．５重量％〜９５重量％まで変化し得る。あるいは、Ｂ７−ＤＣを発現する細胞（ＤＣまたは不活化された腫瘍細胞のような、好ましく形質導入された細胞）の有効な用量は、好ましくは分割用量で、被験体当たり、約１０４個との細胞と約１０９個の細胞との間、より好ましくは約１０６個の細胞と１０８個の細胞との間である。免疫療法の当業者は、過度の実験なしにこれらの用量を調整し得る。
【０１７９】
活性な化合物（例えば、Ｂ６−ＤＣポリペプチドまたはＢ６−ＤＣ ＤＮＡで形質導入された細胞）は、便利な様式（例えば、便利でかつ有効な経路による注射）で投与され得る。好ましい経路として、皮下経路、皮内経路、静脈内経路および筋肉内経路が挙げられる。他の可能性のある経路としては、経口投与、くも膜下腔内適用、吸入適用、経皮適用、または直腸投与が挙げられる。完全には除去されていない腫瘍の処置については、腫瘍内への直接注入もまた、意図される。
【０１８０】
投与経路に依存して、活性な化合物は、酵素、酸、およびこの化合物を不活化し得る他の天然の条件の作用からこの化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。従って、Ｂ７−ＤＣ活性を有するポリペプチドまたはペプチドを、経腸経路によって投与するために、Ｂ７−ＤＣ活性の不活化を防止するための材料で組成物をコーティングするか、またはそのような材料と組成物を同時投与する必要があり得る。例えば、ペプチドは、適切なキャリア、希釈液またはアジュバント中で個体に投与され得るか、酵素インヒビター（例えば、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）およびトラシロール（ｔｒａｓｙｌｏｌ））と共に同時投与され得るか、またはリポソーム（水中油中水エマルジョンおよび従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎら（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７：２７）を含む）のような適切なキャリア中で投与され得る。
【０１８１】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」として、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質についてこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、この活性な化合物と不適合である範囲を除いて、治療組成物中でその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、この組成物中に組込まれ得る。
【０１８２】
好ましい薬学的に受容可能な希釈液として、生理食塩液および水性緩衝溶液が挙げられる。注射のために適切な薬学的組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性である場合）または滅菌水性分散剤および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）は、薬学的組成物中に含まれ得る。全ての場合において、組成物は無菌でありかつ流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、そして細菌および真菌のような微生物による汚染を予防する保存剤を含まなければならない。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中に、ならびに油中に調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含み得る。
【０１８３】
キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、必要とされる粒子サイズの維持によって（分散液の場合）、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０１８４】
微生物作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。
【０１８５】
注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
【０１８６】
非経口組成物は、好ましくは、投与の容易さ、および投薬量の均一性のために投薬単位形態で処方される。投薬単位形態は、哺乳動物の被験体のための投薬単位として適切な物理学的に別個の単位を言い；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと結合して所望の治療的効果を生成するように計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態のための詳細は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性を処置するためのこのような活性化合物を配合する分野に固有の制限によって、決定され、そしてこれらに直接的に依存する。
【０１８７】
肺への注入のために、エアゾール化された溶液が使用される。噴霧可能なエアゾール調製物において、活性なタンパク質は、固体または液体の不活性キャリア材料との組合せで存在し得る。これはまた、スクイーズボトルにパッケージングされ得るか、加圧された揮発性（通常は気体の）プロペラントと混合してパッケージングされ得る。エアゾール調製物は、本発明のタンパク質に加えて溶媒、緩衝剤、界面活性剤、および抗酸化剤を含み得る。
【０１８８】
局所適用のために、本発明のタンパク質は、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）または軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）（これは、皮膚への平滑効果および罹患領域への活性成分の直接的な投与のための手段の両方を有する）のような局所適用ビヒクルに組込まれ得る。
【０１８９】
活性成分のためのキャリアは、噴霧可能な形態または噴霧不可能な形態のいずれであってもよい。噴霧不可能な形態は、局所適用に固有のキャリアを含み、かつ、好ましくは水の動的粘度よりも大きな動的粘度を有する半固形または固形であり得る。適切な処方物として、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、リニメント剤、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望である場合には、これらは、滅菌しても、補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧に影響を与えるための塩など）と混合してもよい。噴霧不可能な局所的調製物のための好ましいビヒクルの例として、軟膏基剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）；ＨＥＢクリームのような従来のクリーム；ゲル；ならびにワセリンなどが挙げられる。
【０１９０】
本発明によるＢ７−ＤＣポリペプチドのための他の薬学的に受容可能なキャリアは、リポソームであり、これは、活性なタンパク質が、脂質層に接着した水性の同心層からなる小体に分散しているか、またはその中に多様に存在しているかのいずれかで含まれる、の薬学的組成物である。活性なタンパク質は、好ましくは、水性層および脂質層の内側または外側（すなわち、いずれの事象においても、リポソーム懸濁液として一般的に公知の不均一な系）に存在する。疎水性の層、または脂質層は、一般的には（しかし、排他的にではない）、レシチンおよびスフィンゴミエリンのようなリン脂質、コレステロールのようなステロイド、多少イオン性の界面活性剤（例えば、ジセチルホスフェート、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸）、および／または疎水性の性質の他の物質を含む。
【０１９１】
（Ｂ７−ＤＣおよび複数の補助刺激分子を発現させるための腫瘍細胞の改変）
本発明の別の局面は、複数の補助刺激分子を発現するように改変された細胞（例えば、腫瘍細胞）である。活性化Ｂ細胞での補助刺激分子の時間的な発現は、Ｂ７、Ｂ７−２、およびＢ７−３で異なる。例えば、Ｂ７−２は、Ｂ細胞の活性化に続いて初期に発現されるが、Ｂ７−３は、後期に発現される。従って、この異なる補助刺激分子は、免疫応答の過程の間に、別個の機能を果たし得る。効果的なＴ細胞応答は、Ｔ細胞が複数の補助刺激分子から補助刺激シグナルを受けることを必要とし得る。
【０１９２】
従って、本発明は、遺伝的に改変されるか、または１つより多くの補助刺激分子を発現する腫瘍細胞を含む。例えば、腫瘍細胞を改変して、Ｂ７−ＤＣと、Ｂ７、Ｂ７−２、およびＢ７−３のうちの１つ以上とを発現させ得る。
【０１９３】
改変の前に、細胞（例えば、腫瘍細胞）は、いずれかの補助刺激分子を発現しないかもしれず、または特定の補助刺激分子は発現するが、他の分子は発現しないかもしれない。本明細書中で記載されるように、腫瘍細胞は、Ｂ７−ＤＣのみをコードする核酸または別の補助刺激分子とともにＢ７−ＤＣをコードする核酸を用いるトランスフェクションによって改変され得る。例えば、Ｂ７−ＤＣをコードする核酸でトランスフェトされた腫瘍細胞は、Ｂ７をコードする核酸でさらにトランスフェクトされ得る。ヒトＢ７−ＤＣタンパク質またはマウスＢ７−ＤＣタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号３のコード部分である。あるいは、１より多くの型の改変が使用され得る。例えば、Ｂ７−ＤＣをコードする核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−３の発現を誘導する薬剤で刺激され得る。
【０１９４】
（病原体に関連する抗原）
本発明についての主な有用性は、癌および世界中で罹患率および死亡率を引き起こしている主な慢性的ウイルス感染症についての治療用ワクチンの本願組成物の使用である。このようなワクチンは、感染した細胞を排除する（これは、抗体が無効であるためにＴ細胞応答を必要とする）ように設計される。本発明のワクチンは、抗原性エピトープそれ自身に加えて：
（ａ）ベクター（例えば、裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ、裸のＲＮＡ、自己複製ＲＮＡレプリコン）ならびにウイルス（ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスおよびＲＮＡアルファウイルスを含む）；
（ｂ）抗原標的化シグナルまたはプロセシングシグナル（例えば、ＨＳＰ７０）、カルレティキュリン、Ｆｌｔ−３リガンドの細胞外ドメイン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの菌体外毒素ＥＴＡのドメインＩＩ、単純ヘルペスのＶＰ２２標的化タンパク質など（同一人に譲渡された米国特許出願第０９／４２１，６０８号；同第０９／５０１，０９７号；同第０９／６９３，４５０号；同第６０／２２２，９００２号；同第６０／２２２，９８５号；同第６０／２６８，５７５号およびＣｈａｎｇ，Ｗ−Ｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２３６８−２３７６（２００１）（これらは、その全体が参考として本明細書中で援用される）；ならびに
（ｃ）補助刺激シグナル、好ましくは本発明のＢ７−ＤＣタンパク質またはその融合タンパク質、フラグメントもしくは機能的誘導体（単独でまたはＢ７．１、Ｂ７．２、可溶性ＣＤ４０などのような他の公知の補助刺激タンパク質との組み合わせ）
を含む。
【０１９５】
腫瘍細胞または他の型の宿主細胞（ＡＰＣを含む）は、所望の免疫応答に対する抗原をコードする核酸で形質転換されるか、トランスフェクトされるか、またはそうでなければ、形質導入される。このような抗原は、好ましくは、病原性微生物のエピトープであり、これに対して宿主は、エフェクターＴ細胞応答（細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および遅延型過敏症を含む）によって防御されている。代表的には、これらとして、ウイルス、マラリアのような細胞内寄生生物、およびミコバクテリアおよびリステリアのような細胞内で増殖する細菌が挙げられる。従って、本発明のワクチン組成物に含まれるこの型の抗原は、（もちろん、腫瘍特異性抗原に加えて）このような病原体に関連する抗原のいずれかである。いくつかのウイルス抗原がまた、ウイルスが癌の原因となる因子である場合の腫瘍抗原であることは注目すべきである。
【０１９６】
実際に、世界中で最も一般的な２つの癌、肝癌および子宮頚癌は、ウイルス感染と関連する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、肝癌の病因となる因子として関連付けられてきた（Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ２、１１２９−１１３３（１９８１））。８０〜９０％の子宮頚癌は、以下の４つの「高度に危険な（ハイリスク）」ヒトパピローマウイルス型のうちの１つに由来するＥ６抗原およびＥ７抗原を発現する：ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１およびＨＰＶ−４５（Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．１２０、１９０−２０７（１９８６）；Ｂｅａｕｄｅｎｏｎ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、２４６−２４９（１９８６））。ＨＰＶ Ｅ６抗原およびＥ７抗原は、免疫適格性個体におけるウイルス関連の癌のための最も有望な標的である。なぜなら、これらが、子宮頚癌において遍在的に発現されるからである。治療的癌ワクチンの標的としてのこれらの重要性に加えて、ウイルス関連腫瘍抗原はまた、予防的ワクチンのための理想的な候補である。実際に、アジアにおける予防的ＨＢＶワクチンの導入は、肝癌の発生率を減少させ、癌予防に対する大きな影響を示している（Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６、１８５５−１８５９（１９９７））。
【０１９７】
慢性的なヒトウイルス感染において、とりわけ最も重要なウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。
【０１９８】
ヒトの癌および感染性疾患へのその適用性に加えて、本発明はまた、獣医学的医薬の状況において動物の疾患の処置に使用することが意図される。従って、本明細書中で記載されるこのアプローチは、当業者によって容易に適用されて、獣医学的なヘルペスウイルス感染（ウマのヘルペスウイルス、ウシのヘルペスウイルス、ニワトリおよび他の家禽におけるマレク病ウイルスを含む）；動物のレトロウイルス疾患；仮性狂犬病および狂犬病などを処置し得る。
【０１９９】
以下の参考文献は、基礎的な医学的および獣医学的なウイルス学の分野における原理ならびに現在の情報を示し、これらは、参考として援用される：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＮＹ、１９９６；
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｆｌｉｎｔ，Ｓ．Ｊ．ら編、Ａｍｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１９９９；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第４版、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ．Ａ．Ｊ．ら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９；Ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｈａｇｅｄｏｒｎ，ＣＨら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９９；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、
Ｋｏｓｈｙ，Ｒ．ら編、Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ Ｃｏ、１９９８；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｆ．Ａ．ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９９；Ａｖｉａｎ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｂ．Ｗ．、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｅｓ、２０００；Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，ＭＨＶら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ＮＹ、２０００。
【０２００】
（標的化分子）
種々の作用様式を有する多数のタンパク質が「標的化」分子として関連付けられてきた。この「標的化」分子は、抗原と共に（好ましくは、融合ポリペプチドとして）使用されて、細胞および細胞下区画へ抗原を標的化し、このことは、より強力かつ効果的な様式でＴ細胞に対する抗原提示を促進する。
【０２０１】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）への抗原の結合は、核酸に基づく（および他の）ワクチンの能力を増強するための潜在的アプローチを示す。ＨＳＰは、癌性ワクチン接種およびウイルス性ワクチン接種における天然の生物学的アジュバントとして作用するらしい。小胞体（ＥＲ）に常在するｇｐ９６ ＨＳＰおよび細胞質Ｈｓｐ７０は両方とも、免疫学的アジュバントとして作用する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＰＫら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、５７−６４（１９９１）；Ｕｄｏｎｏ，Ｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、３０７７−３０８１（１９９４））。これらのＨＳＰまたはシャペロニンは、広範なペプチドアレイに結合する（Ｌａｍｍｅｒｔ，Ｅ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、９２３−９２７（１９９７））。Ｈｓｐ７０は、会合したタンパク質をプロテオソーム（ＭＨＣクラスＩ分子と会合するためのペプチドを生成する主な細胞性プロテアーゼ複合体）に標的化し得るシャペロニンである。従って、Ｈｓｐ７０に直接結合する抗原は、ＭＨＣクラスＩによってより効率的に提示される（特に、ＣＴＬ応答を生じる）。２つの特徴が、ＨＳＰのアジュバント活性の原因であるらしい：（１）インビトロでペプチドをロードされたｇｐ９６は、ＭＨＣクラスＩプロセシング経路に抗原を効果的に導入する；（２）ｇｐ９６のマクロファージへの結合は、炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導し、従って、ペプチド性抗原が標的化されている細胞の機能を増強する。
【０２０２】
腫瘍またはウイルスに感染した細胞から単離されたＨＳＰ複合体での免疫は、強力な抗腫瘍免疫（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＰＫら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．３３：４１７−２２、１９８４；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＰＫら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８３：３４０７−１１、１９８６；Ｕｄｏｎｏ，Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３９８−５４０３、１９９４；Ｂｌａｃｈｅｒｅ，ＮＥら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：３５２−６、１９９３；Ｕｄｏｎｏ，Ｈら（前出）；Ｔａｍｕｒａ，Ｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７８：１１７−２０、１９９７；Ｊａｎｅｔｚｋｉ，Ｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：２６９−７６、１９９８）、または抗ウイルス免疫（Ｈｅｉｋｅｍａ，Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．５７：６９−７４、１９９７；Ｓｕｔｏ，Ｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６９：１５８５−８、１９９５）を誘導する。ペプチドとＨＳＰとをインビトロで混合することにより、免疫原性ＨＳＰ−ペプチド複合体が生成された（Ｃｉｕｐｉｔｕ，ＡＭら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８７：６８５−９１、１９９８；Ｂｌａｃｈｅｒｅ，ＮＥら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８６：１３１５−２２、１９９７）。ＨＳＰに基づくいくつかのタンパク質ワクチンは、ＨＳＰへの抗原の融合物を含んだ（Ｓｕｚｕｅ，Ｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：８７３−９、１９９６；Ｓｕｚｕｅ，Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１３１４６−５１、１９９７）。より最近では、本発明者およびその同僚は、キメラＤＮＡまたはＲＮＡレプリコンワクチンの形態でＨＳＰを使用した（例えば、Ｃｈｅｎ，Ｃ−Ｈら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．６０：１０３５−１０４２（２０００））。彼らは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＨＳＰ７０に融合させる抗原としてＨＰＶ−１６ Ｅ７を使用し、そしてＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加した増殖および活性化（これは、確立された腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じた）を示した（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２１−２６．、１９９６）。
【０２０３】
別の有用な標的化分子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素Ａ（ＥＴＡ）（例えば、ＥＴＡのドメインＩＩ（ｄＩＩ）（残基２５３〜３６４にわたる））のトランスロケーションドメインである。トランスロケーションドメインは、細胞の細胞質ゾルに結合するタンパク質またはポリペプチドのトランスロケーションを誘導するポリペプチドである。例えば、同様に適用可能なポリペプチドは、ジフテリア毒素、クロストリジウム属（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、ｔｅｔａｎｉ）毒素、炭疽毒素、エルジニア属毒素、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅの毒素、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素由来である。毒素をコードするＤＮＡの毒素ドメインは、好ましくは、このような組成物の調製物において変異または欠失されている。
【０２０４】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、レクチン活性を示し、そして新生糖タンパク質の折り畳みおよび組立てに関連することが公知である、小胞体（ＥＲ）腔に豊富に存在する４６ｋＤａのタンパク質である（Ｎａｓｈ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３５：７１−７８；Ｈｅｂｅｒｔ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３９：６１３−６２３；Ｖａｓｓｉｌａｋｏｓ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３４８０−３４９０；Ｓｐｉｒｏ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５８８−１１５９４）。ＣＲＴは、抗原プロセシングに関連するトランスポーター（例えば、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２）によってＥＲに輸送されたペプチドと会合する（Ｓｐｅｅ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２４４１−２４４９）。ＣＲＴは、インビトロでペプチドと複合体を形成する。これらの複合体は、マウスに投与された場合に、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起した（Ｂａｓｕ（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７９７−８０２；Ｎａｉｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６４２６−６４３２）。マウス腫瘍から精製されたＣＴＲは、ＣＲＴの供給源として使用される腫瘍に対して特異的な免疫を惹起したが、抗原的に別個の腫瘍に対しては免疫を惹起しなかった（Ｂａｓｕ、前出）。ペプチドに結合するＣＲＴを用いて、ＤＣをインビトロでパルスすることによって、このペプチドは、ＤＣクラスＩ分子の状況において再提示され、そしてペプチド特異的ＣＴＬを刺激した（Ｎａｉｒ、前出）。
【０２０５】
Ｆｌｔ−３リガンドは、ＤＣ前駆体の増殖を刺激し、そしてインビボで多数のＤＣの生成を促進し得る（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ，Ｅ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８４：１９５３−６２、１９９６；Ｓｈｕｒｉｎ，ＭＲ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：１７４−８４、１９９７）。Ｆｌｔ３は、マウスチロシンキナーゼレセプターであり（Ｒｏｓｎｅｔ，Ｏ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１６４１−５０、１９９１）、これは、第ＩＩＩレセプターキナーゼファミリーのメンバーである（概説については、Ｌｙｍａｎ，ＳＤ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．５：１９２−６、１９９８を参照のこと）。造血組織において、Ｆｌｔ３の発現は、ＣＤ３４ポジティブ前駆体に制限される。Ｆｌｔ３を使用して、対応するリガンドであるＦｌｔ３−リガンドを同定し、そして引続いてクローン化した（Ｌｙｍａｎ，ＳＤら、Ｃｅｌｌ ７５：１１５７−６７、１９９３；Ｈａｎｎｕｍ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６４３−８、１９９４）。Ｆｌｔ３−リガンドの主な形態は、膜貫通タンパク質として合成され、機能的に類似の可溶性ＥＣＤは、このタンパク質からタンパク質分解切断によって生成される（Ｌｙｍａｎら、前出）。これらのタンパク質は、固有のチロシンキナーゼレセプターに結合し、そして活性化する。造血細胞の中で、Ｆｌｔ３レセプターの発現は、ＤＣ前駆体を含む最も未分化の前駆体細胞に主に限定される。Ｆｌｔ３−リガンドのＥＣＤは、いくつかのマウスモデル腫瘍（線維肉腫、乳癌、肝癌、肺癌、黒色腫およびリンパ腫を含む）に対する強力な抗腫瘍効果を生成した（Ｌｙｎｃｈ，ＤＨら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．３：６２５−６３１、１９９７；Ｃｈｅｎ，Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３５１１−３５１６、１９９７；Ｂｒａｕｎ，ＳＥら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２１４１−２１５１、１９９９；Ｐｅｒｏｎ，ＪＭら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６１６４−６１７０、１９９８；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，ＰＫら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：６０２８−６０３２、１９９９；Ｅｓｃｈｅ，Ｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３８０−３８３、１９９８）（１９）。本発明者らの同僚らは、ＨＰＶ Ｅｋ７タンパク質をコードするＤＮＡを、Ｆｌｔ３−リガンドＥＣＤをコードするＤＮＡに連結した。この構築物での免疫は、Ｅ７抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化を劇的に増強し、確立されたＥ７発現転移性腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じた。
【０２０６】
ＨＳＶ−１タンパク質ＶＰ２２は、数ある中で、その顕著な細胞内輸送特性が使用され得る（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｇ．およびＰ．Ｏ’Ｈａｒｅ．１９９７．Ｃｅｌｌ ８８：２２３−３３）ことに起因して、抗原の伝播の増強に寄与するプロトタイプタンパク質である。例えば、ｐ５３に連結されたＶＰ２２（Ｐｈｅｌａｎ，Ａ．ら，１９９８，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：４４０−４４３）またはチミジンキナーゼに連結されたＶＰ２２（Ｄｉｌｂｅｒ，ＭＳら，１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：１２−２１）は、連結したタンパク質の、インビトロでの周囲の細胞への伝播およびモデル腫瘍の処置を容易にした。ＤＮＡワクチンの状況でＨＰＶ−１６ Ｅ７抗原に連結されたＶＰ２２は、ワクチン接種したマウスにおいてＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の数における劇的な増加（約５０倍）を導き、そしてあまり有効でないＤＮＡワクチンをＥ７発現腫瘍に対して顕著な効力を有するＤＮＡワクチンへと変換させた。非伝播性ＶＰ２２変異体は、ワクチン効力を増強することができなかった。ＶＰ２２および同様の作用形態を有し得るタンパク質は、以下のいくつかの方法でワクチン効力の増強に寄与する：（１）トランスフェクトされた細胞から周囲のＡＰＣへの抗原の伝播を容易にし、それによってＭＨＣクラスＩ経路を通して抗原を提示するＡＰＣの数を増加させる；（２）抗原を、トランスフェクトされた細胞において、より効率的に提示する；（３）「交叉プライム（ｃｒｏｓｓｐｒｉｍｉｎｇ）」を行い、それによってＶＰ２２／抗原融合タンパク質の放出が、ＭＨＣ−Ｉ拘束経路を介した提示のための、ＤＣ（または他のＡＰＣ）による取り込みおよびプロセシングを導く（Ｈｕａｎｇ，ＡＹら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５）。
【０２０７】
当業者は、本発明に従って使用するための病原体由来の関連タンパク質の適切なエピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）をどのようにして同定するかがわかる。
【０２０８】
（細胞および動物へのＢ７−ＤＣ ＤＮＡの送達）
ＤＮＡ送達（例えば、一般的に「遺伝子治療」として公知であるものをもたらすためのＤＮＡ送達）は、細胞への、そして最終的には生存動物への「外来」ＤＮＡの導入を含む。遺伝子治療についてのいくつかの一般的ストラテジーが研究されており、そして広範に概説されている（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−３５６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（補遺６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）；Ｚｗｉｅｂｅｌ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４−４０４（１９９１）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１−１３５（１９９０）；Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９−１９２（１９８９）（これらの参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【０２０９】
１つのアプローチは、培養中の初代細胞への核酸移入、続いてエキソビボで形質転換された細胞の、全身的または特定の器官もしくは組織へかのいずれかの、宿主への自己移植を含む。
【０２１０】
本発明の目的を達成するために、核酸治療は、インビボでの哺乳動物の体細胞組織または器官への機能的に活性なＤＮＡの直接的移入によって達成される。ＤＮＡ移入は、以下に記載の多数のアプローチを用いて達成され得る。これらの系は、選択マーカー（例えば、Ｇ４１８耐性）の使用によってインビトロでの好首尾の発現について試験されて、ＤＮＡを発現するトランスフェクトされたクローンが選択され得、続いて適切な免疫アッセイにおいてＢ７−ＤＣ発現産物に対する抗体を用いてのこの産物の存在が（誘導性系での場合はインデューサーでの処置後に）検出され得る。この手順（ＤＮＡ取り込み、プラスミド組み込みおよび組み込まれたプラスミドの安定性を含む）の効率は、公知の方法を用いたプラスミドＤＮＡの直鎖化および高分子量哺乳動物ＤＮＡを「キャリア」として用いた同時トランスフェクションによって改善され得る。
【０２１１】
当該分野で報告される好首尾の「遺伝子移入」の例としては、以下が挙げられる：（ａ）マウス筋肉組織へのプラスミドＤＮＡの直接注入（これは、無期限にわたってマーカー遺伝子の発現を導いた）（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０）；Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３：７１（１９９１））；（ｂ）レトロウイルスベクターは、インビボおよびインサイチュでの血管組織の感染に有効である；（ｃ）レトロウイルス調製物の門脈注射および肝臓への直接注射は、遺伝子移入およびインビボでの発現をもたらした（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５（１９９０）；Ｋｏｌｅｋｏ，Ｍ．ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：２７（１９９１）；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３８７（１９９１））；（ｄ）肺組織への組換えアデノウイルスの気管内注入は、肺の気道上皮における外来遺伝子のインビボでの移入および長期発現に有効であった（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１（１９９１）；（ｅ）単純ヘルペスウイルスベクターは、脳組織へのインビボでの遺伝子移入を達成した（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ら編，Ｍｉａｍｉ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ，第１巻，Ｂｏｅｒｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ，１９９１）。
【０２１２】
レトロウイルス媒介ヒト治療は、両栄養性の複製欠損レトロウイルス系を利用する（Ｔｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１１１（１９９０）；Ｔｅｍｉｎら，米国特許４，９８０，２８９；Ｔｅｍｉｎら，米国特許４，６５０，７６４；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第５，１２４，２６３号；Ｗｉｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．米国特許５，１７５，０９９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，米国特許第４，８６１，７１９号）。このようなベクターは、機能的ＤＮＡをヒトの細胞または組織へと（例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ球へと、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子および腫瘍壊死因子遺伝子を腫瘍浸潤性リンパ球へと）導入するために用いられている。レトロウイルス媒介遺伝子送達は一般に、遺伝子移入のために標的細胞の増殖を必要とする（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０））。この条件は、本発明のＤＮＡ分子が導入されるべき特定の好ましい標的細胞（すなわち、活発に増殖する腫瘍細胞）によって満たされる。多数の方法のうちのいずれかを用いたプラスミドによる、およびレトロウイルスベクターによる、トランスフェクションを用いた嚢胞性線維症の遺伝子治療は、Ｃｏｌｌｉｎｓら，米国特許５，２４０，８４６によって記載されている。
【０２１３】
Ｂ７−ＤＣ配列をコードするＤＮＡ分子は、当該分野において周知であるように、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を用いてレトロウイルスベクター中にパッケージングされ得る（例えば、Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９−６３５３（１９８４）；Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｆ．ら，Ｃｅｌｌ ３３：１５３−１５９（１９８３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５）；Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｈｏｃｋ，Ｒ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：２５７（１９８６）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２（１９８６）を参照のこと）。遺伝子移入について効率的でかつ安全な、より新しいパッケージング細胞株もまた記載されている（Ｂａｎｋら，Ｕ．Ｓ．５，２７８，０５６）。
【０２１４】
このアプローチは、レトロウイルスベクターを選り抜きの組織または器官へと送達するために部位特異的様式で利用され得る。従って、例えば、カテーテル送達系が使用され得る（Ｎａｂｅｌ，ＥＧら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３４２（１９８９））。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれかを使用するこのような方法は、発現されるべき核酸を血管壁へと、または腫瘍の血液循環物へと送達するために特に有用である。
【０２１５】
以下を含めた他のウイルスベクターもまた使用され得る：組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，１６７９頁；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−９１９，１９８８），Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＨＳ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４，第１１章）、ニューロン特異的送達および持続性のための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）。ヒトの遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの利点としては、組換えは稀であり、このようなウイルスと関連するヒトの悪性疾患は知られておらず、アデノウイルスゲノムは７．５ｋｂの大きさまでの外来遺伝子を受け入れるように操作され得る二本鎖ＤＮＡであり、そして生のアデノウイルスは、安全なヒトワクチン生物であるという事実が挙げられる。アデノ随伴ウイルスもまた、本発明によるヒトの治療のために有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３９４１（１９９１）。
【０２１６】
本発明のＤＮＡ分子を発現し得、そして（特にヒトにおける）本発明の治療設定において有用である別のベクターは、ワクシニアウイルスであり、ワクシニアウイルスは、非複製性にされ得る（米国特許５，２２５，３３６号；同５，２０４，２４３号；同５，１５５，０２０号；同４，７６９，３３０号；Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０８４７−１０８５１；Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：２５４９−２５５３；Ｆａｌｋｎｅｒ Ｆ．Ｇ．ら；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８７）１５：７１９２；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３−３４０９）。組換えワクシニアウイルスおよび異種ＤＮＡを含む他のウイルス、ならびに免疫およびＤＮＡ治療におけるそれらの使用の説明は、以下に概説されている：Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９３）３：８６−９０；Ｍｏｓｓ，Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）２０：３４５−３６２；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６６２−１６６７；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａら，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（１９８８）３４：４３−６４；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら，Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆ Ａｎａｌ（１９８３）３：２０１−２１３。
【０２１７】
裸のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはウイルスベクターに加えて、操作された細菌はベクターとして使用され得る。以下を含む多数の細菌株：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＢＣＧおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）（ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳｔｏｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２９１，２３８−２３９（１９８１）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，ＴＰらＪ：Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，２５−３２（１９８８）；（Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，３３６−３３８（１９８８）；Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１，４５６−４６０（１９９１）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１，４７９−４８２（１９９１）；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，５３−５９（１９９２）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，２２０９−２２１８（１９９４））。これらの生物は、ワクチンベクターとしての使用のために有望な以下の２つの特徴を提示する：（１）経口ワクチン送達の可能性を提供する、腸感染経路；および（２）単球／マクロファージの感染（それによってプロフェッショナルＡＰＣへと抗原を標的化する）。
【０２１８】
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入に加えて、以下を含めて、当該分野で周知の物理的手段は、ＤＮＡの直接移入のために用いられ得る：プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆら，１９９０，前出）およびパーティクル−ボンバードメント媒介遺伝子移入（Ｙａｎｇ，Ｎ．−Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５６８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４４：６５（１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））。さらに、インビトロで細胞へと遺伝子を移入するための周知の手段であるエレクトロポレーションを用いて、本発明によるＤＮＡ分子をインビボで組織へと移入し得る（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：１３１（（１９９１））。
【０２１９】
「キャリア媒介遺伝子移入」もまた記載されている（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）；Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７１２８（１９８３）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１（１９８２）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましいキャリアは、標的化されたリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１０６８（１９８３）；Ｓｏｒｉａｎｏら，前出）（例えば、免疫リポソーム（これは、アシル化ｍＡｂを脂質二重層へと取り込み得る（Ｗａｎｇら，前出）））である。アシアロ糖タンパク質／ポリリジン（Ｗｕら，１９８９，前出）のようなポリカチオンが用いられ得、ここで、結合体は、標的組織を認識する分子（例えば、肝臓についてはアシアロオロソムコイド）およびトランスフェクトされるべきＤＮＡに結合するＤＮＡ結合化合物を含む。ポリリジンは、ＤＮＡに損傷を与えることなくＤＮＡを結合するＤＮＡ結合分子の一例である。次いで、この結合体は、移入のために本発明に従ってプラスミドＤＮＡと複合体化される。
【０２２０】
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションのために用いられるプラスミドＤＮＡは、当該分野で周知の方法を用いて（例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ手順（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて）調製され得、続いてＤＮＡが、公知の方法（例えば、本明細書中に例示される方法）を用いて精製され得る。
【０２２１】
さらに、上記のように、本発明による形質導入されたＢ７−ＤＣ分子の有用性については、安定な発現を必要としないかもしれない。むしろ、ポリペプチドの一過性の発現は、形質導入された細胞がその免疫原性機能および／または補助刺激機能を果たすために充分であり得る。
【０２２２】
ここで、本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解される。以下の実施例は、例示のために提供され、明記しない限り、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【０２２３】
（実施例Ｉ）
（材料および方法）
（細胞の調製および培養）
６〜１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをＮＣＩから購入し、そしてＤＣおよびマクロファージの調製のために用いた。
【０２２４】
骨髄由来ＤＣを、以前に記載された（２６）ように、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）、非必須アミノ酸（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌ−グルタメート（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）および１０００単位／ｍｌ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）培地中で培養した。８日目の骨髄由来ＤＣを、従来法によってモノクローナル抗体で染色した。ＭＨＣクラスＩＩに対するモノクローナル抗体１４−４−４を、ハイブリドーマ上清から精製した。Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷｉｌｌｉａｍ Ｂａｌｄｗｉｎ博士は親切なことに、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合分子を供給した。ＭＨＣクラスＩについての抗体（２８−１４−８）、Ｆ４／８０についての抗体（Ｃｌ．Ａ３−１）、Ｂ７．１についての抗体（１Ｇ１０）、Ｂ７．２についての抗体（ＧＬ１）、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩについての抗体（２．４Ｇ２）およびＭａｃ−１についての抗体（Ｍ１／７０）を、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。テスターｃＤＮＡ調製のために、８日目の細胞を、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒで１４−４−４ｓおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いてセルソーターによって精製した。選別後のＭＨＣクラスＩＩｈｉおよびＢ７ｈｉ集団の純度は９３％〜９８％であった。
【０２２５】
骨髄由来マクロファージを、１０％ ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌグルタミン、２−メルカプトエタノールおよび２５０単位／ｍｌ組換えマウスＭ−ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、そして以前に記載された（２７）通りにこれらを５００単位／ｍｌのγ−ＩＦＮ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。刺激後、ＭＨＣクラスＩＩおよびＢ７の細胞表面発現を、培養１０日目のフローサイトメトリー分析を用いて確認した。
【０２２６】
マクロファージ細胞株ＷＥＨＩ−３、ＲＡＷ２６４．７、Ｊ７７４．Ａ．１、ＰＵ５−１．８は、親切なことに、ＮＩＡＩＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＪｏｓｈｕａ Ｆａｒｂｅｒ博士によって提供された。これらを、ＡＴＣＣの推奨する培地で培養した。
【０２２７】
（同種混合リンパ球反応）
ＭＨＣクラスＩＩｈｉおよびＢ７ｈｉと特徴付けされた８日目のＢＭ由来ＤＣを、ＭＬＣ中の同種Ｔ細胞を刺激する能力について試験した。ＭＬＣ反応を、３×１０５同種Ｃ５７ＢＬ／６リンパ球へ漸増数のＢＡＬＢ／ｃ刺激細胞を添加することによって、９６ウェル平底マイクロプレートにおいて行った。３日間の培養後、Ｔ細胞増殖を、最後の１８時間の培養にわたる、各ウェルへの１μＣｉの［３Ｈ］−メチル−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加によって評価した。次いで、細胞を収集し、そして放射能の取り込みを、β計数管（Ｐａｃｋａｒｄ ９６）を用いて決定した。
【０２２８】
（ｃＤＮＡ差引きハイブリダイゼーション）
選別したＤＣおよび活性化したマクロファージからの総ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて抽出した。メッセンジャーＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。本発明者らは、ＰＣＲベースのＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成系（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを増幅し、続いてＰＣＲベースの差引き系ＰＣＲ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いた。差引きを、製造業者のプロトコルに従って行った。最後の差引きＰＣＲ後、ＤＮＡフラグメントを、プラスミドベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。形質転換後、各クローンを、プラスミドＤＮＡ増幅およびミニプレップＤＮＡのために増殖させ、次いでＥｃｏＲＩで消化して挿入物の存在を確認した。次いで、プラスミドドットブロットを行って、このｃＤＮＡクローンが樹状細胞特異的であることを確認した。アルカリ変性ミニプレップＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にスポットし、そして選別されたＤＣまたは活性化されたマクロファージ由来のＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。これらのｃＤＮＡプローブを、ランダムプライマー標識法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ）を用いて３２Ｐ標識した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、以前に記載された（２８）通りに行った。メンブレンをフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１日間〜２日間にわたって暴露し、そして現像した。
【０２２９】
（プラスミドドットブロット分析）
アルカリ変性ミニプレップＤＮＡサンプルを、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にスポッティングし、選別されたＤＣまたは活性化したマクロファージから誘導されたＳＭＡＲＴ（登録商標）ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。これらのｃＤＮＡプローブを、ランダムプライマー標識法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ）を用いて３２Ｐ標識した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、以前に記載された通りに行った。オートラジオグラフィーについては、メンブレンを、フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１〜２日間にわたって暴露し、そして現像した。
【０２３０】
（ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング−Ｂ７−ＤＣのクローニング）
骨髄由来ＤＣを８日目に選別をせずに収集した。これらの細胞の約２０％〜４０％は、高いＭＨＣクラスＩＩおよびＢ７を発現した。総ＲＮＡ抽出、続いてポリＡ ＲＮＡ精製を上記に記載された通りに行った。オリゴｄＴプライムＤＣライブラリー構築については、本発明者らは、λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｃＤＮＡ合成系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。Ｂ７−ＤＣのＰＣＲ ＤＮＡフラグメントをプローブし、そしてスクリーニングのために用いた。メンブレン転移、変性、再生を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコルを用いて行った。プローブの放射性標識、ハイブリダイゼーション、洗浄およびオートラジオグラフィーを、上記に記載の通りに行った。陽性クローンを単離し、そして２回目のスクリーニングを行った。２回目のスクリーニングの後、プラスミドをインビボ切り出しによって切り出し、そしてドットブロッティングおよび配列決定によって試験した。配列決定を、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＣｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって行った。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、以前に報告された遺伝子に対する類似性について、このヌクレオチド配列の、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）に対する相同性検索を行った。全長のＢ７−ＤＣ ｃＤＮＡクローンを、ＤＣ ｃＤＮＡライブラリーから取り出した。５’ＲＡＣＥを、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った。５’−ＲＡＣＥ産物をｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングし、そして配列決定した。さらに２つの全長Ｂ７−ＤＣクローンをＲＴ−ＰＣＲによって入手し、そしてそれらの配列を比較して、配列の誤りを回避した。
【０２３１】
ヒトＢ７−ＤＣを以下の通りにクローニングした：ヒトＤＣを、以前に記載（２９）の通りのＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦ＋Ｆｌｔ−３Ｌのいずれかにおける培養によって正常末梢血単核細胞から入手した。ＲＮＡを上記の通りに抽出した。ＢＬＡＳＴ検索は、マウスＢ７−ＤＣに対する相同性を有する、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＫ００１８７９の重複するＥＳＴクローンを同定した。５’ＲＡＣＥを、上記の通りに行った。本発明者らは、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲフラグメントを配列決定し、そしてヒトＢ７ＤＣの５’−ＵＴＲに対応するプライマーを設計した。Ｂ７−ＤＣの５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲにおける以下のプライマーを用いて、全長ヒトＢ７−ＤＣを増幅した：
【化６】
2011224008.tif 000008
ヒトおよびマウスのＢ７−ＤＣ ｃＤＮＡの全長ｃＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＳに登録番号ＡＦ３２９１９３およびＡＦ１４２７８０の下で寄託された。
【０２３２】
（ＢＡＣ（１２９ＳＶＪ）ライブラリーのスクリーニング／ゲノムクローニングおよびマッピング）
ＢＡＣライブラリーのスクリーニングは、製造業者（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のプロトコルに従った。以下のプライマーを用いた：
【化７】
2011224008.tif 000009
ＢＡＣライブラリーのスクリーニングによって、３つの陽性クローンが得られた。染色体位置決定マッピングを、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）によって行った。合計８０個の分裂中期細胞を分析し、７９個が特異的標識を示した。ヒトＢ７−ＤＣマッピングを、入手可能なバイオインフォーマティックツールであるＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムおよびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＲＨ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍを用いることによって行った。ｈＢ７−ＤＣの配列をｈｔｓｇにおいて検索し、そして第９染色体に局在する２つのＢＡＣクローンＲＰ１１−５７４Ｆ１１（ＡＬ１６２２５３）およびＲｐ１１−６３５Ｎ２１（ＡＬ３５４７４４）にマッピングされることが見い出された。
【０２３３】
（仮想ノーザンブロッティング）
４〜６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスをＮＣＩから購入し、そして組織ＲＮＡ調製のために用いた。組織、選別されたＤＣおよび活性化されたマクロファージについてのＲＮＡ抽出およびＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成を、上記の通りに行った。ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡを、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。０．５μｇ／レーンの精製ＤＮＡを１％アガロースゲルに泳動し、そしてＮｙｔｒａｎナイロンメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。放射性プローブを作製するために、本発明者らは、差引きしたライブラリーから誘導されたプラスミドＤＮＡをテンプレートとして増幅した。本発明者らは、プラスミドＤＮＡのクローニング部位にすぐ隣接したプライマーセットを用いるＰＣＲによってＤＮＡを増幅し、そしてクローンの各々の精製したＰＣＲ ＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブのために用いた。これらのプライマーのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【化８】
2011224008.tif 000010
ヒトＤＣおよびコントロールの胎盤の総ＲＮＡの仮想のノーザン分析もまた行った。用いたプローブおよびＲＮＡ調製は、上に記載された。プローブの放射性標識、ハイブリダイゼーション、洗浄およびオートラジオグラフィーを、上記の通りに行った。
【０２３４】
（ハムスター抗ｍＢ７−ＤＣ Ａｂ産生）
ＤＣ２．４細胞株、ＲＡＷ２４６．７細胞株およびＲＥＮＣＡ細胞株中のＢ７−ＤＣの安定なトランスフェクタントを用いて、Ａｒｍｅｎｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒを免疫した。Ｂ７−ＤＣを、改変したｐＣＡＧＧＳベクター（３０）中にクローニングした。このハムスターを、Ｂ７−ＤＣ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を含むプラスミドで３回追加免疫した。この研究において用いた抗Ｂ７−ＤＣ抗体は、免疫した３匹のハムスターのうちの１匹の血清由来であった。
【０２３５】
（ＣＤ２８−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＰＤ−１−Ｉｇの結合アッセイ）
２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いてＢ７．１−ｐＣＡＧＧＳ、Ｂ７−ＤＣ−ｐＣＡＧＧ、ＰＤ−１−ｐＣＡＧＧＳまたはベクター単独でトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＨＢＳＳ、２％仔ウシ血清、１０Ｍ ＨＥＰＥＳおよび０．１％ ＮａＮ３）中に再懸濁し、そして１０００ｒｐｍで５分間、４℃で回転させた。次いで、この緩衝液を棄て、抗体をチューブに添加し、４℃で２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そしてこれを二次抗体について繰り返した。サンプルをＦＡＣＳｃａｎに泳動した。Ｂ７．１抗体を、１：５希釈、１０μｌ／サンプル（Ｇａｌ−Ｔａｇ）で用いた。組換えＣＤ２８−Ｉｇ、ＣＴＬＡ−４−ＩｇおよびＰＤ−１−Ｉｇキメラを、２μｇ／ｍｌ、１０μｌ／サンプル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ）で用いた。ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−ＰＥを、１：２０希釈（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）で用いた。
【０２３６】
（Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇダイマー合成）
Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ構築物を、膜貫通ドメインを含まないＢ７−ＤＣのＮ末端アミノ酸をコードする配列を、ｐＩｇ−Ｔａｉｌ Ｐｌｕｓベクター（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）中のヒトＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端アミノ酸をコードする配列に対してインフレームで融合することによって作製した。ＣＯＳ−７細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）またはＧＩＮＥ ＪＡＭＭＥＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｐＩｇ／Ｂ７−ＤＣで一過性にトランスフェクトした。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質を、飽和硫酸アンモニウム沈澱を用いて無血清上清から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色は、９０％を超える純度を実証した。
【０２３７】
（Ｔ細胞増殖およびサイトカインアッセイ）
抗ＣＤ３を用いた補助刺激アッセイについて、９６ウェル平底プレート（Ｄｙｎｅｘ製のＩｍｍｕｌｏｎ ４）を、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）ｐＨ７．４中に希釈した１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＢ７．１−Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇまたはＩｓｏｔｙｐｅコントロール（Ｓｉｇｍａ）で３７℃で２時間にわたって予めコーティングした。次いで、これらのプレートを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そして１０％ ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌグルタミン、２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で３０分間にわたってブロッキングし、その後、Ｔ細胞を添加した。脾臓およびリンパ節を、６〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから入手した。ＲＢＣをＡＣＫ緩衝液を用いて溶解し、そしてＴ細胞を、間接的方法で、ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２８０（Ｄｙｎｅｘ）を用いて精製した。このビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１％ ＦＣＳで２回洗浄し、その後、この細胞を添加し、そして抗ＩＥｄおよびＢ２２０／ＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ８α（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から構成される抗体カクテルを、この細胞に添加し、そして４℃で３０分間にわたって二方向性混合を用いてインキュベートした。この細胞を、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ中のチューブに５分間配置することによって単離し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１％ ＦＣＳで２回洗浄して未結合のＡｂを除去した。同じ手順を１５分間のインキュベーションを用いて繰り返し、そしてこの細胞を２×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。７２時間のインキュベーション後、１０μｌの３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を各ウェルに添加し、そして１８時間にわたってインキュベートした。細胞をＰａｃｋａｒｄ Ｍｉｃｒｏｍａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて収集し、そしてフィルターをＰａｃｋａｒｄ Ｍａｔｒｉｘ ９６直接β計数管で読み取った。
【０２３８】
ＨＡ抗原を提示するためのＲＥＮＣＡ系を用いた補助刺激アッセイについては、ＲＥＮＣＡ細胞を、１０％ ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。これを、ＭＨＣクラスＩＩ発現について、ＩＦＮ−γ（７５Ｕ／ｍｌ）を用いて７２時間にわたって誘導した。次いで、これらを１３，２００Ｒａｄで照射し、そして２×１０４細胞／ウェル（９６ウェル平底プレート）でプレーティングした。次いで、ＨＡ１１０−１２０ペプチドを２．５μｇ／ウェルで添加し、そして種々の濃度のＩｇ−融合分子を添加した。トランスジェニックＩ−Ｅｄ＋ＨＡ特異的Ｔ細胞（Ｈ．ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの親切な贈与物）を上記の通りに単離し、そして４×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。４８時間のインキュベーション後、１０μｌの３Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル）を各ウェルに添加し、そして１８時間にわたってインキュベートした。細胞を、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｉｃｒｏｍａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて収集し、そしてフィルターをＰａｃｋａｒｄ Ｍａｔｒｉｘ ９６ Ｄｉｒｅｃｔβ計数管で読み取った。
【０２３９】
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン産生の分析について、培養物を上記の通りに設定し、そして上清を指定の時間で収集した。ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ）ならびにＩＬ−４およびＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定した。
【０２４０】
（インビボでの補助刺激）
Ｂ１０．Ｄ２遺伝子バックグランド上のＩ−Ｅｄ拘束ＨＡエピトープ（１１０ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ１２０［配列番号１２］）を認識するＴＣＲを発現するＴＣＲトランスジェニックマウス系統６．５由来のプールされた腋窩、鼡径、頚部、および腸間膜のＬＮを、ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で解離し、１００μｍのナイロン細胞ストレイナーを通過させ、そして滅菌ハンクス緩衝液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で洗浄した。ＦＡＣＳ（登録商標）染色して、クローン型（ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ）ＣＤ４細胞の割合を決定した後、０．２ｍｌの滅菌ハンクス緩衝液中に２．５×１０６クローン型細胞を含む細胞調製物を、レシピエントＢ１０．Ｄ２マウスの尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。この養子移入から３日後、この動物を、後足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによりワクチン接種した。各マウスに、以下の３つの調製物のうちの１つを両側に注射した：
（Ａ）１０μｇの合成ＨＡ（足蹠１つにつき）（ＨＡペプチド（１１０−１２０）を１：１のｖ／ｖ比で不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）と合わせた）
（Ｂ）ＨＡ−ＩＦＡと２５μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇとの混合物、または
（Ｃ）ＨＡ−ＩＦＡと２５μｇのアイソタイプコントロール抗体との混合物。７日後、排出ＬＮ節を採取し；１．５×１０５ＬＮ細胞を丸底９６ウェル組織培養プレート中で示された濃度の合成ＨＡペプチドとともにインキュベートした。４８時間培養物を１μＣｉ［３Ｈ］チミジンでパルスし、そしてさらに１２時間インキュベートした後採取し、そして組み込まれた放射活性の量を決定することにより増殖アッセイを行った。
【０２４１】
（実施例ＩＩ：Ｂ７−ＤＣの同定および特徴づけ）
Ｂ７−ＤＣを、ＤＣと活性化マクロファージとの間の差引きライブラリーから単離した。ｃＤＮＡ差引きに用いた２つの集団は、「テスター」集団としてのＧＭ−ＣＳＦと培養した骨髄由来ＤＣ、および「ドライバー」集団としてのγ−インターフェロン＋ＬＰＳ活性化した接着性骨髄由来Ｍ−ＣＳＦマクロファージであった。８日目に、ＭＨＣクラスＩＩｈｉＢ７ｈｉ「成熟」ＤＣを、テスターｃＤＮＡの供給源として、＞９３％純度までソートした。ＤＣを、フローサイトメトリーにより、マクロファージより約５０倍ＭＨＣクラスＩＩレベルが高いと特徴付けた。両方の集団がＢ７．１およびＢ７．２を発現したが、Ｂ７．２レベルはＤＣにおいて有意に高かった。Ｆ４／８０およびＣＤ１６は、マクロファージ集団で高レベルで発現された。２つの集団の機能的比較により、ＤＣ集団は、同種異系の混合したリンパ球反応を刺激することにおいてマクロファージ集団より約１００倍強力であることが実証された。両方の集団からＲＮＡを抽出した後、本発明者らは、ＰＣＲベースのｃＤＮＡ合成システム、続いてＰＣＲベースの差引き手順であるＰＣＲ Ｓｅｌｅｃｔを用いた。差示的に発現されるクローンのうちの１つが、新規な免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバー（本発明者らは、これをＢ７−ＤＣと名付けた）をコードした。マウスＢ７−ＤＣ ｃＤＮＡは、長さが約１．７ｋｂであり、これは、２３アミノ酸（ａａ）のＮ末端シグナルペプチドを有し、そして推定分子量が約２５ｋｄの２４７アミノ酸（ａａ）の前駆体タンパク質をコードする（表１）。推定リーダー配列および膜貫通ドメインを、ＳＯＳＵＩプログラム（３１）を用いて同定した。２つの荷電ａａは、ｍＢ７−ＤＣの２３ａａ膜貫通ドメイン内に見出される。このことは、あり得る結合パートナーを示唆する。ａａレベルで、マウスＢ７−ＤＣは、ヒトＢ７−ＤＣと７０％同一であり、このことは、それらがオルソログであることを示す（以下の表を参照のこと）。ｈＢ７−ＤＣは、より長い細胞質テイルを有するという点で、マウスＢ７−ＤＣとはわずかに異なる。
【０２４２】
相同性検索を介して、Ｂ７−ＤＣがＢ７−Ｈ１に対して有意な相同性を有し（３４％同一性、４８％類似性）（表２）、より低い程度には、ブチロフィリン（ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ）に対して（３０％同一性、４５％類似性）、そしてＢ７．１およびＢ７．２に対して２０％未満の同一性を有することが見出された（表３）。系統発生的な研究により、エキソンシャッフリング（３２，３３）を介して、ブチロフィリンがＢ７スーパーファミリーに関連する可能性が高いことが示される。これらは、各々、標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＩｇＶ−ＩｇＣ構造および膜貫通ドメインを有する。他のＢ７ファミリーのメンバーとは対照的に、マウスＢ７−ＤＣは、非常に短い細胞質テイル（４ａａ）を有する。
【０２４３】
（表１）
マウスＢ７−ＤＣおよびヒトＢ７−ＤＣのアミノ酸配列比較。ｍＢ７−ＤＣの推定リーダードメインおよび膜貫通ドメインは、上に線を引いた。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌｗ−Ｇｏｎｎｅｔ Ｐａｍ２５０マトリクスを用いて行った。［＊］は、同一アミノ酸を示し、［：］は、保存的置換を示す。免疫グロブリンＶまたはＣドメイン内部のジスルフィド結合の形式に重要であり得るシステイン残基は、斜体にされている。
【表１】
2011224008.tif 000011
（表２：ｍＢ７−ＤＣおよびｍＢ７−Ｈ１のアミノ酸配列比較）
【表２】
2011224008.tif 000012
（表３：Ｂ７−ＤＣとＢ７ファミリーメンバーとのアミノ酸配列比較）
【表３】
2011224008.tif 000013
ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ２検索を用いて比較を行った（マトリクスＢＬＯＳＵＭ６２）。  
１．対応する位置での同一アミノ酸
２．対応する位置での類似アミノ酸−以下のようにグループ分けされる：（Ａ，Ｇ）；（Ｓ，Ｔ）；（Ｅ，Ｄ）；（Ｒ，Ｋ，Ｈ）；（Ｑ，Ｎ）；（Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍ）；（Ｙ，Ｆ）；（Ｗ）；（Ｃ）；（Ｐ）。  
３．マトリクスＢＬＯＳＵＭ６２を用いて有意な類似性は見出されなかった。  
４．ＢＴ＝ブチロフィリン５．＝ＰＤＬ−１。
【０２４４】
ｍＢ７−ＤＣのゲノム構造を決定するために、本発明者らは、５’および３’ＵＴＲに由来するプローブを用いてプールされたＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ライブラリーをスクリーニングすることによりゲノムクローンを単離した。染色体位置のマッピングを、ＢＡＣクローンを用いて行った。Ｂ７−ＤＣの染色体位置は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて行った。１０の特異的に染色した第１９染色体の測定により、ｍＢ７−ＤＣが、第１９染色体の異質染色質−真性染色質境界からテロメアまでの距離（１９Ｃ２と１９Ｃ３のバンドの間の境界に対応する領域）の４７％である位置に位置することが実証された。ハイブリダイズしたスライドをフルオレセイン化抗ジゴキシゲニン抗体中でインキュベートし、続いてＤＡＰＩで対比染色することにより、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。この遺伝子座は、ヒト第９染色体の領域に対応し、この領域においてｈＢ７−Ｈ１がマッピングされている。
【０２４５】
ｈＢ７−ＤＣは２つの第９染色体のＢＡＣクローンに位置することが見出された。さらに、ｈＢ７−ＤＣおよびｈＢ７−Ｈ１はともに、約１６４ｋｂの挿入物サイズを有する、単一の第９染色体のＢＡＣクローンに位置することが見出された（図１）。Ｂ７−ＤＣおよびＢ７−Ｈ１がゲノム上で近位にあることは、Ｂ７．１／Ｂ７．２対を暗示し、この対は、互いに１メガ塩基以内にマッピングされる。
【０２４６】
（実施例ＩＩＩ：Ｂ７−ＤＣは樹上細胞において選択的に発現される）
Ｂ７−ＤＣの発現パターンを決定するために、複数の組織、マクロファージ細胞株、マクロファージ培養物、ならびに骨髄および脾臓の両方から得られた樹上細胞から抽出したＲＮＡを用いて、事実上のノザンブロッティングを行った。未熟（４日目および６日目）および成熟（８日目およびソートされたＭＨＣ ＩＩｈｉＢ７ｈｉ）の骨髄由来ＤＣおよび脾臓由来ＤＣにおいてＢ７−ＤＣプローブを用いて強いハイブリダイゼーションが検出されたが、４つのマクロファージ細胞株、活性化ＢＭマクロファージ、腹膜マクロファージのいずれにおいてもシグナルは検出されなかった（図２）。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４またはＧＭ−ＣＳＦ＋Ｆｌｔ−３Ｌのいずれかを用いて末梢血単球から増殖させたヒトＤＣにおいてｈＢ７−ＤＣの強い発現が検出された（図３）。Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞表面発現を確認するために、抗ｍＢ７−ＤＣ抗体を用いて、ＤＣを染色した。可溶性Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを用いた染色および遮断が、ＤＣで観察された（図４）。
【０２４７】
（Ｂ７−ＤＣは、ＣＤ２８にもＣＴＬＡ−４にも結合しないが、ＰＤ−１には結合する）
Ｂ７−ＤＣはＢ７ファミリーに対して構造的相同性および配列相同性を有するが、推定ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合配列、ＳＱＤＸＸＸＥＬＹ（配列番号１３）も、ＸＸＸＹＸＸＲＴ（配列番号１４）も含まない（３４）（ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸）。結合を直接評価するために、２量体ＣＤ２８−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４−Ｉｇが、Ｂ７−ＤＣまたはＢ７．１のいずれかでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を染色する能力を調査した。Ｂ７．１トランスフェクタントで強い結合が観察された一方、Ｂ７−ＤＣトランスフェクタントに対する結合は観察されなかった（図５）。Ｂ７−ＤＣとＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１との間の相同性およびゲノム上で近位であることに基づいて、Ｂ７−ＤＣについての候補結合パートナーとしてＰＤ−１を試験するために実験を行った。実際に、ＰＤ−１００ＩＧは、Ｂ７−ＤＣトランスフェクタントに結合したが、Ｂ７．１トランスフェクタントには結合しなかった。ＰＤ−１−ＩｇのＢ７−ＤＣトランスフェクタントへの結合は、ＣＴＬＡ−ＩｇおよびＣＤ２８−ＩｇのＢ７．１トランスフェクタントへの結合より低かったが、特異的であった。ＰＤ−１のＢ７−ＤＣへの結合のさらなる確認を、本発明者らは、ＰＤ−１−Ｉｇとの安定なＢ７−ＤＣ−ＧＦＰトランスフェクタントのポジティブな染色から得た。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１と同様に、Ｂ７−ＤＣは、レセプターとしてＣＤ２８もＣＴＬＡ−４も用いないことが結論付けられた。むしろ、ＰＤ−１は、Ｂ７−ＤＣについてのレセプターであるようである。
【０２４８】
（実施例ＩＶ：Ｂ７−ＤＣは、Ｔ細胞についての補助刺激分子として機能する）
Ｔ細胞刺激アッセイに添加され得る可溶性Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質を、Ｂ７−ＤＣが補助刺激活性を有するか否かを試験することにおける使用のために生成した。Ｔ細胞の増殖応答を、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ、Ｂ７．１−Ｉｇまたはアイソタイプコントロールいずれかの存在下で、漸増量の固定化抗ＣＤ３による刺激に対して測定した。図６（左）は、最適未満の抗ＣＤ３濃度の存在下で、Ｂ７−ＤＣがＢ７．１より大きなＴ細胞増殖応答を補助刺激したことを示す。さらに、Ｂ７−ＤＣにより補助刺激された増殖応答は、ＣＤ８細胞よりＣＤ４細胞において高かった（図６、右）。Ｂ７−ＤＣは、ＴＣＲに集中した刺激がない場合にはＴ細胞を刺激できなかった。このことは、Ｂ７−ＤＣが、真の補助刺激シグナルを提供することを示す。
【０２４９】
Ｂ７−ＤＣはまた、「シグナル１」がＭＨＣペプチド複合体により提供された場合に増殖応答を補助刺激した。ＲＥＮＣＡ細胞（ＲＴ−ＰＣＲ分析により内因性Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７−ＤＣを発現しない）を、γ−ＩＦＮで処理して、ＭＨＣクラスＩＩ発現を誘導した。これらの細胞に、Ｉ−Ｅｄ拘束ＨＡ１１０−１２０ペプチド（ＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ）（３５）（配列番号１５）を負荷した。Ｉ−Ｅｄ＋ＨＡ１１０−１２０特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス系統から精製した脾臓Ｔ細胞を添加し、そして増殖応答をＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、Ｂ７．１−Ｉｇまたはアイソタイプコントロールいずれかの存在下で測定した。図７は、Ｂ７−ＤＣがＢ７．１より大きな補助刺激活性を有したことを示す。
【０２５０】
（Ｂ７−ＤＣにより補助刺激されたリンホカイン生成のパターン）
Ｂ７ファミリー分子による補助刺激に対して最もよく特徴付けられたＴ細胞応答は、リンホカイン生成である。これらのリンホカインは、Ｔ細胞効果の重要なメディエーターである。抗ＣＤ３またはＨＡ抗原で刺激し、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ、Ｂ７．１−Ｉｇまたはアイソタイプコントロールいずれかで補助刺激したＴ細胞による多くの異なるリンホカイン生成を分析するための研究を行った（図８）。リンホカイン補助刺激のパターンは、抗ＣＤ３またはＭＨＣペプチド複合体が「シグナル１」として利用されるか否かとかなり一致した。重大なことには、Ｂ７−ＤＣは、Ｂ７．１より大きなレベルのγ−ＩＦＮを補助刺激した。Ｂ７−ＤＣはまた、有意な量のＩＬ−６生成を補助刺激したのに対し、Ｂ７．１は、実質的に補助刺激しなかった。両方の分子が、ＩＬ−２生成を補助刺激したが、Ｂ７．１は、Ｂ７−ＤＣより非常に効率的に刺激した。従って、Ｂ７−ＤＣおよびＢ７．１の補助刺激のパターンは異なり、Ｂ７−ＤＣは重要な前炎症性リンホカインを補助刺激することにおいて効率的である。
【０２５１】
（実施例Ｖ：Ｂ７−ＤＣは、インビボ免疫応答を増強する）
Ｂ７−ＤＣがインビボで生物学的活性を有するか否かを決定するために、本発明者らは、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇがペプチドワクチンに対する免疫応答を増強するか否かを調べた。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇまたはアイソタイプコントロール抗体を、ＨＡ１１０−１２０ペプチドおよびＩＦＡの免疫原性カクテルに添加した。ＨＡ特異的ＣＤ４Ｔ細胞のインビボでの計数を可能にするために、２．５×１０６抗ＨＡ６．５Ｔ細胞を免疫の３日前にマウスに移入した。免疫して７日後、排出ＬＮ細胞を採取し、そしてこの細胞をインビトロで２日間、種々の量のＨＡ１１０−１２０ペプチドで刺激した。図９は、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇの添加が、実際にＨＡに対する増殖応答を劇的に増強したことを示す。排出ＬＮにおけるＨＡ特異的Ｔ細胞の総数は、アイソタイプ抗体コントロールに対して、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを受けた群において約２倍増加した。従って、Ｂ７−ＤＣが１細胞あたりですら抗原特異的応答を増強する能力を有することが結論付けられた。
【０２５２】
（実施例ＶＩ：考察および結論）
本発明者らは、ＤＣに高度に拘束された発現を伴い、Ｔ細胞について独特な補助刺激特性を有する新たなＢ７ファミリーメンバーを発見し、そして特徴づけた。Ｂ７−ＤＣのヒトオルソログもまた、ＤＣにおいて発現される。
【０２５３】
この拘束された発現パターンは、先に記載されたＢ７ファミリーメンバーと対照をなし、このことは、Ｂ７−ＤＣが、公知のＢ７．１／２経路とは異なる免疫応答に関与することを示唆する。弱いＢ７−ＤＣシグナルが、活性化マクロファージにおいてＲＴ−ＰＣＲにより検出されたが、予備のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＤＣにおけるＢ７−ＤＣ ｍＲＮＡ発現が、活性化マクロファージより１５倍高いことが示された。同様に、抗体染色により、活性化マクロファージの表面で非常に低いレベルのＢ７−ＤＣが検出された。このことが、有意なＴ細胞活性化に十分か否かは明瞭ではない。
【０２５４】
Ｂ７−ＤＣが補助刺激するリンホカイン生成の異常なパターンは、他のＢ７ファミリーメンバーと比較して、独特の生物学的役割を示す。サイトカインの伝統的な分類は、以下のとおりである：Ｔｈ１サイトカインは、ＩＬ−２、γ−ＩＦＮおよびリンホトキシンを含む；Ｔｈ２サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１３を含む（３６）。Ｂ７−ＤＣは、いずれの古典的なＴｈ１リンホカインプロフィールもＴｈ２リンホカインプロフィールも誘導しない。Ｂ７−ＤＣは、非常にわずかなＩＬ−４を誘導し、ＩＬ−１０を誘導しない。しかし、ＩＬ−６は、Ｔｈ２サイトカインと考えられる。Ｂ７．１に対して、Ｂ７−ＤＣにより補助刺激されたより低いＩＬ−２およびより高いγ−ＩＦＮは、古典的なＴｈ１パターンに合わない。にもかかわらず、高いγ−ＩＦＮ生成は、Ｂ７−ＤＣが重要なＴ細胞エフェクター機能を誘起することを示唆する。
【０２５５】
Ｂ７−ＤＣは、ＩＬ−６を補助刺激する能力において著しい。Ｂ７−ＤＣにより誘導されたＴ細胞の活発な増殖性応答は、Ｂ７．１では観察されないＩＬ−６生成の強い補助刺激により一部説明される。ＩＬ−６は、（他の増殖刺激と関連して）Ｔ細胞増殖の強力な増幅因子（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）である（３７，３８）。ＩＬ−６は、Ｔ細胞機能のみならず、前炎症性応答、単球分化、Ｂ細胞分化、血小板新生、骨の吸収、および特定の造血性腫瘍の増殖もまた調節する多機能性サイトカインである（３９，４０）。ＩＬ−６は、ケモカインおよび白血球動員の誘導において、可溶性ＩＬ６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）と協同して機能し得る（４１）。これは、Ｓｔａｔ−３活性化を介して強力な抗アポトーシス効果を媒介し得る。Ｔ細胞におけるＩＬ−６依存性Ｓｔａｔ−３活性化は、活性化Ｔ細胞の生存についての重要な経路であると報告されている（４２，４３）が、他の報告では、Ｓｔａｔ−３が休止Ｔ細胞に対してその効果を発揮することが示唆されている。
【０２５６】
Ｂ７−ＤＣは、ＣＤ２８もＣＴＬＡ−４も結合できないが、ＰＤ−１（Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１についてのレセプター）を結合する（２２，４７，４８）。Ｂ７−ＤＣが、ＩＣＯＳ（Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１についてのレセプター）を結合するか否かは未だ決定されていない（２３−２５，４４−４６）。Ｂ７−ＤＣとＢ７−Ｈ１／ＰＤＬ−１との間の顕著な相同性（Ｂ７．１とＢ７．２との間の相同性より大きい）、ｈＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１とｈＢ７−ＤＣとの密接な物理的連鎖、およびそれらの共通するレセプターへの結合により、これらが比較的最近の遺伝子重複事象に関連することが示唆される。このことは、Ｂ７．１とＢ７．２との間の関係と同様であり、Ｂ７．１およびＢ７．２の両方が、マウス第１６染色体およびヒト第３染色体上の１メガ塩基内にマッピングする（４９）。
【０２５７】
Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１に対するＢ７−ＤＣの相対的生物学的役割が、ＰＤ−１および他の推定レセプターにより媒介されると認識することは重要である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化に続いて発現され、そしてＴ細胞活性化を阻害するようである。ＰＤ−１は、高濃度の抗ＣＤ−３でのＴ細胞刺激条件下でアポトーシスを誘導する。ＰＤ−１ノックアウトマウスは、肥大型心筋症の臨床的発現により特徴付けられる自己免疫症候群を発症する（２２）。対照的に、Ｄｏｎｇら（２１）は、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１が、低濃度の抗ＣＤ−３でＴ細胞増殖およびサイトカイン増殖を補助刺激することを報告した。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の関係に類推して、ＰＤ−Ｌ１は、未だ同定されていない活性化レセプターについての対レセプター（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり得る。ＰＤ−１に結合するという特性を共有しているにもかかわらず、Ｂ７−ＤＣおよびＢ７−Ｈ１は、それらのリンホカイン補助刺激パターンが異なる；Ｂ７−Ｈ１は、Ｔ細胞のＩＬ−１０生成を補助刺激するのに対し、Ｂ７−ＤＣはＩＬ−１０生成を補助刺激しない。Ｂ７−ＤＣの異なる細胞発現パターンおよび補助刺激機能は、免疫機能における独特の役割を示唆する。
【０２５８】
上記および以下に引用された参考文献は、これらが具体的に援用されているか否かにかかわらず、全て本明細書中に参考として援用される。
【０２５９】
今や本発明を十分に記載してきたが、本発明が、広範な等価なパラメーター、濃度、および条件の範囲内で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、そして過度な実験なくして実施され得ることは当業者に明らかである。
【０２６０】
本発明は、その具体的な実施形態と関連付けて記載してきたが、さらなる改変が行われ得ることは理解される。本出願は、概して、本発明の原理に従って、そして本発明が属する分野において公知または慣用的な実施の範囲内であり、および添付の特許請求の範囲の範囲に入るように本明細書中で先に記載された本質的特徴に適用され得る、本開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用または適合を含むことが意図される。
【０２６１】
（引用文献）
本願明細書に完全に列挙される文書に加えて、特定の文書は番号のみによって列挙（挿入）され、以下に列挙される。
2011224008.tif 000014
2011224008.tif 000015
2011224008.tif 000016
2011224008.tif 000017
配列表
2011224008.tif 000018
2011224008.tif 000019
2011224008.tif 000020
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2011224008.tif 000028
2011224008.tif 000029
【図１】
2011224008.tif 000030
【図２】
2011224008.tif 000031
【図３】
2011224008.tif 000032
【図４】
2011224008.tif 000033
【図５】
2011224008.tif 000034
【図６】
2011224008.tif 000035
【図７】
2011224008.tif 000036
【図８】
2011224008.tif 000037
【図９】
2011224008.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月8日(2011.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の核酸によってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインからなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸残基２０〜２２１からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドと９０％の配列同一性を有する変異体からなるポリペプチド。
【請求項４】
１アミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
１を超えるアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記変異体が、配列番号２のアミノ酸残基２０〜２２１の機能的活性を含む機能的誘導体である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる第一の融合パートナーを含む融合タンパク質であって、
（ｉ）第二のポリペプチドに融合されるか、または
（ｉｉ）第二のポリペプチドに融合されるリンカーペプチド配列に融合される、
上記融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質がProgrammed Death-1（ＰＤ−１）に結合している、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質がＴ細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下でＴ細胞を補助刺激する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
第二のポリペプチドがＩｇ重鎖定常領域の１以上のドメインを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｉｇ重鎖の１以上のドメインがヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のＣＨ２領域またはＣＨ３領域を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質がＣＨ領域におけるＣｙｓ残基の共有結合によって二量化する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記Ｃｙｓ残基が二量化Ｉｇ重鎖において連結しているジスルフィドと同じＣｙｓ残基である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質のダイマーまたはトリマーである、ダイマー融合タンパク質またはトリマー融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１７】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、ヒトまたは動物の胚性幹細胞または生殖細胞ではない、上記宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する免疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下：
（ａ）抗原；
（ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質；
（ｃ）薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２１】
病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する免疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下：
（ａ）必要に応じて該抗原を発現する、請求項１８に記載の形質転換された細胞またはトランスフェクトされた細胞；
（ｂ）（ａ）の細胞が該抗原を発現しない場合、該抗原のさらなる供給源；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）のための薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２２】
一般的な免疫刺激剤またはアジュバントをさらに含む、請求項１９〜２０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
抗原またはワクチンの免疫原性を増加するために、抗原またはワクチンと使用するための組成物であって、以下：
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質；ならびに
（ｂ）薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、組成物。
【請求項２４】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のＴ細胞応答を増加するための薬剤の製造のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用であって、該薬剤は、該抗原性刺激に対する該被験体のＴ細胞応答を増加するために効果的である、上記使用。
【請求項２５】
抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加するための薬剤の製造のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用であって、該薬剤は、（ｉ）該被験体、（ｉｉ）該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナー、または（ｉｉｉ）免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された細胞株、より得られたＴ細胞の抗原性刺激に対する応答をｅｘ ｖｉｖｏで増加するために効果的である、上記使用。
【請求項２６】
哺乳動物被験体において抗原に対する免疫応答を誘導または増強するための薬剤を製造するための、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２７】
哺乳動物被験体において抗原またはワクチンに対する免疫応答を増強するための薬剤を製造するための、請求項２３に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
哺乳動物被験体において癌に対する免疫応答を誘導または増強するための薬剤を製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２９】
癌がウイルス感染と関連している、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
癌が癌腫および黒色腫からなる群より選択される、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
癌腫が肝癌および子宮頚癌からなる群より選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
癌が癌腫であり、ウイルス感染が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）からなる群より選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
癌が非ウイルス感染性疾患と関連している、請求項２８に記載の使用。
【請求項３４】
ウイルス感染がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり、癌が子宮頚癌である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
哺乳動物被験体においてウイルス感染に対する免疫応答を誘導または増強するための薬剤を製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３６】
ウイルス感染が慢性的ウイルス感染である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
哺乳動物被験体がヒトである、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011224008000001.app