(57)【要約】【課題】保存可能な薬剤を用いて、検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させる。【解決手段】検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法は、検査水に対し、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、酒石酸アンチモニルカリウム等のアンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解によりこれらの単糖の一つを生成可能なオリゴ糖や配糖体のような単糖生成化合物からなる群から選ばれた糖類化合物を含む第二水溶液を添加する工程と、第一水溶液および第二水溶液を添加した検査水を６０℃以上に加熱する工程とを含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モリブデン青の生成による、検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法であって、
前記検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、
前記発色試薬を存在させた前記検査水を６０℃以上に加熱する工程と、
を含むりん酸イオンの発色方法。
【請求項２】
前記単糖生成化合物がスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである、請求項１に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項３】
前記発色試薬は、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものである、請求項１または２に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項４】
前記発色試薬は、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、前記糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である、請求項１に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項５】
検査水に含まれるりん酸イオンの定量方法であって、
前記検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、
前記発色試薬を存在させた前記検査水を６０℃以上に加熱する工程と、
加熱後の前記検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する工程と、
を含むりん酸イオンの定量方法。
【請求項６】
前記単糖生成化合物がスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである、請求項５に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項７】
前記発色試薬は、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものである、請求項５または６に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項８】
前記発色試薬は、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、前記糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である、請求項５に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項９】
検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させるための試薬であって、
七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、
炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤と、
を含むりん酸イオンの発色試薬。
【請求項１０】
検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させるための試薬であって、
硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、
七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤とを含み、
前記糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である、
りん酸イオンの発色試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、りん酸イオンの発色方法および定量方法、特に、モリブデン青の生成による、検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
りんは海洋水、湖沼水、河川水および地下水等の富栄養化に関わる原因物質の一つであることから、工場排水等での排出規制が設けられている。このため、工場排水等は、環境への排出前にりんの定量、特に、りん酸イオンの定量が求められる。
【０００３】
水中に含まれるりん酸イオンの公的な定量方法として、非特許文献１に記載のモリブデン青（アスコルビン酸還元）吸光光度法が知られている。この定量方法は、りん酸イオンが七モリブデン酸六アンモニウムおよび酒石酸アンチモニルカリウム（ビス［（＋）−タルトラト］二アンチモン（ＩＩＩ）酸二カリウム）と反応して生成するヘテロポリ化合物をＬ（＋）−アスコルビン酸で還元し、それにより生成するモリブデン青により発色した検査水の吸光度を測定することでりん酸イオンを定量するものである。この定量方法の基本的操作では、所定量の検査水に対して所定量のモリブデン酸アンモニウム−アスコルビン酸混合溶液を加えて振り混ぜた後、２０〜４０℃で約１５分間放置する。そして、この溶液について波長８８０ｎｍ付近の吸光度を測定し、この測定値から予め作成しておいた検量線に基づいて検査水のりん酸イオン濃度（ｍｇＰＯ４３−／Ｌ）を算出する。
【０００４】
この定量方法において用いられるモリブデン酸アンモニウム−アスコルビン酸混合溶液は、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物と酒石酸アンチモニルカリウム三水和物（モリブデン青の生成反応促進剤）とを水に溶かし、これに硫酸とアミド硫酸アンモニウム（モリブデン青の生成を妨害する亜硝酸イオンの分解剤）とをさらに溶かすことで調製したモリブデン酸アンモニウム溶液と、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液とを所定割合で混合したものであり、使用時にモリブデン酸アンモニウム溶液とＬ（＋）−アスコルビン酸溶液とを混合して調製する必要がある。
【０００５】
ここで、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液は、Ｌ（＋）−アスコルビン酸を水に溶解して調製した水溶液であるが、調製後にＬ（＋）−アスコルビン酸の劣化が速やかに進行し、変質（外観的には黄色に変色）する。このため、非特許文献１は、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液を０〜１０℃の暗所に保存するよう指示し、また、着色したものの使用を禁止している。
【０００６】
ところで、環境保全の機運の高まりにより、工場排水等におけるりん酸イオンの定量頻度は増加の一途であるため、その定量操作の自動化装置が望まれている。この自動化装置では、所要の分析用薬剤、すなわち、モリブデン酸アンモニウム溶液とＬ（＋）−アスコルビン酸溶液とを保存し、定量時にこれらを使用する必要がある。しかし、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液は、上述のとおり保存環境に制約があり、また、使用時に着色の有無を確認する必要もあることから、自動化装置において保存しながら用いるのが実質的に困難である。
【０００７】
また、上記定量方法は、非特許文献１に記載のように、定量範囲が２．５〜７５μｇという微量範囲であるため、検査水について、溶存しているりん酸イオンおよび有機物等に由来のりん酸イオン等の総量である全りんを定量する場合において、結果的に定量の上限が１ｍｇ［Ｐ］／Ｌ程度に制限され、検査水によっては全りんの定量に用いることができないという不具合もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本工業規格  ＪＩＳ  Ｋ  ０１０２、工場排水試験方法（２００８）４６．１．１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、保存可能な薬剤を用いて、検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、モリブデン青の生成による、検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法に関するものであり、この発色方法は、検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、当該発色試薬を存在させた検査水を６０℃以上に加熱する工程とを含んでいる。
【００１１】
また、他の観点に係る本発明は、検査水に含まれるりん酸イオンの定量方法に関するものであり、この定量方法は、検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、当該発色試薬を存在させた検査水を６０℃以上に加熱する工程と、加熱後の検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する工程とを含んでいる。
【００１２】
このような発色方法または定量方法において用いられる単糖生成化合物は、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである。また、発色試薬は、例えば、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたもの、或いは、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である。
【００１３】
さらに他の観点に係る本発明は、検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させるための試薬に関する。この発色試薬の一形態は、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤とを含む。また、この発色試薬の他の形態は、硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤とを含み、糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るりん酸イオンの発色方法および定量方法は、りん酸イオンが七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩およびアンチモンの価数が３であるアンチモン化合物と反応して生成するヘテロポリ化合物を炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを用いて還元しており、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースの水溶液および分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物の水溶液は安定であって保存可能であるため、自動化に適している。
【００１５】
本発明に係るりん酸イオンの発色試薬は、所定の第一剤と第二剤とからなるものであり、第一剤および第二剤はいずれも安定であって保存可能であるため、りん酸イオンを定量する場合などにおいてりん酸イオンの発色を自動化するために適している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１で作成した検量線を示す図。
【図２】実施例２で作成した検量線を示す図。
【図３】実施例３で作成した検量線を示す図。
【図４】実施例４で作成した検量線を示す図。
【図５】実施例５で作成した検量線を示す図。
【図６】比較例１の結果を示す図。
【図７】実験例１で測定した、実施例１で用いた第二水溶液の吸収スペクトルを示す図。
【図８】実験例１で測定した、実施例４で用いた第二水溶液の吸収スペクトルを示す図。
【図９】実験例１で測定したアスコルビン酸溶液の吸収スペクトルを示す図。
【図１０】実施例６の結果を示す図。
【図１１】実施例７の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法によりりん酸イオンを定量可能な検査水は、特に限定されるものではないが、通常は工場排水や生活排水等のりんの排出規制が設けられている排水の他、海洋水、湖沼水、河川水および地下水等の天然水である。
【００１８】
検査水のりん酸イオンを定量する際には、先ず、所定量の検査水を採取し、この検査水において発色試薬を存在させる。ここで、検査水の全りんを測定する場合は、発色試薬を存在させる前にりんの発生源となる有機物などのりん化合物を分解し、りん元素をりん酸イオンに変換するための前処理をする。りん化合物の分解方法としては、日本工業規格  ＪＩＳ  Ｋ０１０２  「工場排水試験方法（２００８）」の「４６．３  全りん」に挙げられたペルオキソ二硫酸カリウム分解法、硝酸−過塩素酸分解法および硝酸−硫酸分解法などを採用することができる。
【００１９】
検査水に存在させる発色試薬は、モリブデン化合物、アンチモン化合物、硫酸並びに糖類化合物を含む水溶液からなるものである。
【００２０】
モリブデン化合物としては、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩若しくは重金属塩が用いられる。このうち、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩を用いるのが好ましい。モリブデン酸のアルカリ金属塩の例としては、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸カリウムおよびモリブデン酸リチウムを挙げることができる。モリブデン酸のアルカリ土類金属塩の例としては、モリブデン酸カルシウムおよびモリブデン酸マグネシウムを挙げることができる。モリブデン酸の重金属塩の例としては、モリブデン酸亜鉛およびモリブデン酸アルミニウムを挙げることができる。
【００２１】
アンチモン化合物としては、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物が用いられる。アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物の例としては、酒石酸アンチモニルカリウム、三酸化アンチモン（すなわち、酸化アンチモン（ＩＩＩ））およびアンチモンのハロゲン化物塩などを挙げることができる。アンチモンのハロゲン化物塩としては、加水分解により有害な物質を生成しにくい三塩化アンチモン（すなわち、塩化アンチモン（ＩＩＩ））などを用いるのが好ましい。
【００２２】
なお、アンチモン化合物としては、アンチモンの価数が５のアンチモン化合物を用いることもできる。このアンチモン化合物は、水溶液中において自然にアンチモンの価数が３のアンチモン化合物に変換されるため、アンチモンの価数が３のアンチモン化合物の供給源として用いることができる。ここで利用可能なアンチモンの価数が５のアンチモン化合物の例としては、五酸化アンチモン（すなわち、酸化アンチモン（Ｖ））および価数が５のアンチモンのハロゲン化物塩などを挙げることができる。価数が５のアンチモンのハロゲン化物塩としては、加水分解により有害な物質を生成しにくい五塩化アンチモン（すなわち、塩化アンチモン（Ｖ））などを用いるのが好ましい。
【００２３】
糖類化合物としては、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれたものが用いられる。炭素数５のアルドースの例としては、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースを挙げることができる。炭素数６のアルドースの例としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノースおよびガラクトースを挙げることができる。炭素数６のケトースの例としては、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースを挙げることができる。
【００２４】
また、単糖生成化合物としては、分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能なオリゴ糖または配糖体が用いられる。オリゴ糖としては、例えば、二糖類のスクロース、マルトース、ラクトース、イソマルツロース、マルツロース、ラクツロース、ガラクトスクロース、プリメベロースおよびビシアノース、三糖類のラフィノース、ケストース、ゲンチアノース、プランテオースおよびウンベリフェロース、四糖類のスタキオース並びに五糖類のベルバスコースを挙げることができる。これらの例示のオリゴ糖は、分解により、キシロース（炭素数５のアルドース）、グルコース（炭素数６のアルドース）、ガラクトース（炭素数６のアルドース）またはフルクトース（炭素数６のケトース）を生成することができる。また、配糖体としては、例えば、アルブチンおよびサリシンを挙げることができる。これらの例示の配糖体は、分解によりグルコースを生成することができる。
【００２５】
なお、単糖生成化合物としては、通常、安価に入手可能なスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースを用いるのが好ましい。
【００２６】
発色試薬は、例えば、モリブデン化合物、アンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液（第一剤）と、糖類化合物を含む第二水溶液（第二剤）とを別々に調製し、これらの水溶液を混合することで調製することができる（第１の形態）。或いは、硫酸を含む第一水溶液（第一剤）と、モリブデン化合物、アンチモン化合物および糖類化合物を含む第二水溶液（第二剤）とを別々に調製し、これらの水溶液を混合することで調製することもできる（第２の形態）。
【００２７】
＜第１の形態＞
この形態の発色試薬において、第一水溶液は、精製水、例えば、純水、蒸留水またはイオン交換水等にモリブデン化合物、アンチモン化合物および硫酸を溶解することで調製することができる。ここで、アンチモン化合物として三酸化アンチモン（酸化アンチモン（ＩＩＩ））または三塩化アンチモン（塩化アンチモン（ＩＩＩ））を用いる場合は、第一水溶液の調製時に三酸化アンチモンまたは三塩化アンチモンの溶解を促進させるために、適量の塩酸を添加することができる。
【００２８】
第一水溶液におけるモリブデン化合物の濃度（モリブデン化合物の水和物を用いる場合は、水和水を除いた濃度）は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときのモリブデン化合物の濃度が、通常、０．３〜３．０ｇ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、０．５〜２．０ｇ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。また、第一水溶液におけるアンチモン化合物の濃度（アンチモン化合物の水和物を用いる場合は、水和水を除いた濃度）は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときのアンチモン化合物の濃度が、通常、０．０１〜０．２ｇ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、０．０３〜０．１２ｇ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。一方、第一水溶液における硫酸の濃度は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときの硫酸の濃度が、通常、０．０８〜０．４Ｍになるよう設定するのが好ましく、０．１２〜０．３Ｍになるよう設定するのがより好ましい。
【００２９】
第一水溶液は、その溶存成分であるモリブデン化合物、アンチモン化合物および硫酸が相互に反応して変性するものではなく、精製水中において安定に存在し得るため、室温或いは３〜６０℃程度の広い温度環境において安定に保存することができる。
【００３０】
第二水溶液は、精製水に糖類化合物を溶解することで調製することができる。第二水溶液における糖類化合物の濃度は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときの糖類化合物の濃度が、通常、１〜５０ｇ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、３〜４０ｇ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。ここで、糖類化合物として単糖生成化合物を用いる場合、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときの糖類化合物の濃度は、単糖生成化合物の分解により生成する単糖類の濃度、すなわち、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースの濃度を意味する。
【００３１】
第二水溶液は、糖類化合物が変性せずに安定に存在し得るため、室温或いは３〜６０℃程度の広い温度環境において安定に保存することができる。
【００３２】
＜第２の形態＞
この形態の発色試薬において、第一水溶液は、精製水に硫酸を溶解することで調製することができる。また、第二水溶液は、精製水にモリブデン化合物、アンチモン化合物および糖類化合物を溶解することで調製することができる。但し、第二水溶液において用いる糖類化合物は、分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な非還元性のオリゴ糖、例えば、スクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれたものである。非還元性のオリゴ糖以外の糖類化合物を用いた場合、保存中の第二水溶液において、溶質間で反応が進行してしまう可能性がある。
【００３３】
第二水溶液は、糖類化合物、すなわち、非還元性のオリゴ糖を安定化するために、例えば水酸化ナトリウム水溶液を添加することでアルカリ性に調整するのが好ましい。また、アンチモン化合物として三酸化アンチモンまたは三塩化アンチモンを用いる場合は、三酸化アンチモンまたは三塩化アンチモンの溶解を促進させるために、第二水溶液の調製時に適量の塩酸を添加することができる。
【００３４】
この形態の発色試薬において、第一水溶液における硫酸の濃度、第二水溶液におけるモリブデン化合物、アンチモン化合物および糖類化合物は、いずれも、第１の形態の場合と同様に設定するのが好ましい。
【００３５】
この形態の発色試薬における第一水溶液および第二水溶液は、いずれも、溶質が変性せずに安定に存在し得るため、室温或いは３〜６０℃程度の広い温度環境において安定に保存することができる。
【００３６】
発色試薬は、使用時、すなわち、検査水への添加の直前に第一水溶液と第二水溶液とを混合することで調製してもよいし、検査水へ第一水溶液と第二水溶液とを別々に添加することで検査水中で調製されるようにしてもよい。前者の場合、検査水に対して発色試薬を添加することにより、検査水において発色試薬を存在させることができる。後者の場合、検査水に対して第一水溶液と第二水溶液とを別々に添加することにより、検査水において発色試薬を存在させることができる。
【００３７】
第１の形態の発色試薬を用いる場合、検査水における発色試薬の存在量は、検査水における第一水溶液の存在量が、通常、４０〜１００ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、６０〜８０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。また、第二水溶液の存在量が、通常、１０〜１５０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、２０〜１００ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。但し、検査水において、第一水溶液（Ａ）と第二水溶液（Ｂ）との容積比（Ａ：Ｂ）が、通常、１：２〜２：１になるよう設定するのが好ましく、３：４〜４：３になるよう設定するのがより好ましい。
【００３８】
一方、第２の形態の発色試薬を用いる場合、検査水における発色試薬の存在量は、検査水における第一水溶液の存在量が、通常、５０〜１２０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、６０〜１００ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。また、第二水溶液の存在量が、通常、５０〜１８０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、６０〜１５０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。但し、検査水において、第一水溶液（Ａ）と第二水溶液（Ｂ）との容積比（Ａ：Ｂ）が、通常、１：１〜１：３になるよう設定するのが好ましく、４：５〜２：３になるよう設定するのがより好ましい。
【００３９】
なお、発色試薬は、モリブデン化合物、アンチモン化合物、硫酸および糖類化合物のそれぞれの水溶液を別々に調製し、これらの水溶液を検査水への添加直前に混合することにより調製することもでき、また、これらの水溶液を検査水へ別々に添加することで検査水中で調製されるようにすることもできる。
【００４０】
発色試薬を添加する検査水が予め硫酸を含む場合、例えば、検査水に含まれるりん化合物を分解してりん酸イオンへ変換することで検査水の全りんを定量するときに、りん化合物を分解するための検査水の前処理において硫酸水溶液を用いた場合、この硫酸水溶液を発色試薬のための硫酸として用いることができる。この場合、検査水における硫酸濃度が十分であれば、硫酸以外の成分を含む水溶液を検査水へ添加することで、検査水に発色試薬を存在させることができる。例えば、第２の形態の発色試薬を用いる場合、前処理において検査水へ添加する硫酸水溶液を第一水溶液と見なすことができ、前処理後のりん酸イオンの発色工程では検査水に対して第二水溶液のみを添加することができる。
【００４１】
次に、発色試薬が存在する検査水を加熱する。この際、検査水を適宜攪拌するのが好ましい。加熱温度は、６０℃以上で検査水の沸騰温度までの範囲に設定する。また、加熱時間は、通常、２〜６０分に設定する。発色試薬の糖類化合物として単糖生成化合物を用いた場合、単糖生成化合物は、この加熱により加水分解され、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成する。
【００４２】
加熱された検査水中のりん酸イオンは、発色試薬のモリブデン化合物およびアンチン化合物と反応してヘテロポリ化合物を生成し、また、生成したヘテロポリ化合物は硫酸による酸性環境下で炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースにより還元される。この還元によりモリブデン青が生成し（りん酸イオンの発色）、このモリブデン青により検査水が変色する。
【００４３】
次に、モリブデン青により変色した検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する。そして、当該吸光度とりん酸イオン濃度との関係を予め調べて作成しておいた検量線に基づいて、吸光度の測定値から検査水のりん酸イオン量を判定する。
【００４４】
本発明に係るりん酸イオンの発色方法および定量方法は、モリブデン青を生成させるヘテロポリ化合物の還元剤として水溶液中で安定な単糖類または分解により当該単糖類を生成可能な単糖生成化合物を用いており、これらの糖類化合物の水溶液は安定に保存することができるため、自動化に適している。また、本発明に係るりん酸イオンの定量方法においては、検量線を作成したときに、りん酸イオン濃度と６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度との間の直線関係が比較的高濃度のりん酸イオン濃度の範囲まで良好に成立することから、検査水中に含まれるりん酸イオンの定量上限が４ｍｇ［Ｐ］／Ｌ若しくはそれ以上の範囲まで拡大する。このため、この定量方法は、検査水の全りんを定量する場合において、特に有効である。
【実施例】
【００４５】
試薬
以下の実施例等で用いた試薬および分光光度計は次のものである。
りん標準液（水質試験用）：和光純薬工業株式会社  コード１６０−１９２４１
硫酸(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード１９２−０４６９６
水酸化ナトリウム（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１９８−１３７６５
塩酸（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード０８０−０１０６６
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード０１８−０６９０１
モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１９０−０２４７５
モリブデン酸カリウム：和光純薬工業株式会社  コード１６５−０４００２
酒石酸アンチモニルカリウム三水和物(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード０２０−１２８３２
塩化アンチモン（ＩＩＩ）（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード０１１−０４４９２
酸化アンチモン（ＩＩＩ）（化学用）：和光純薬工業株式会社  コード０１８−０４４０２
Ｄ−リボース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１８２−０１０５２
Ｄ−アラビノース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード０１３−０４５７２
Ｌ−アラビノース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード０１０−０４５８２
Ｄ−キシロース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード２４４−００３０２
Ｄ−リキソース：東京化成株式会社  コードＬ００７３
Ｄ−アロース（生化学用）：和光純薬工業株式会社  コード０１７−２２５９１
Ｄ−アルトロース(生化学用)：和光純薬工業株式会社  コード０１２−２２４２１
Ｄ−グルコース(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード０４７−００５９２
Ｄ−マンノース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１３０−００８７２
Ｄ−ガラクトース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード０７１−０００３２
Ｄ−プシコース（生化学用）：和光純薬工業株式会社  コード１６５−２３８４１
Ｄ−フルクトース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１２７−０２７６５
Ｌ−フルクトース(生化学用)：和光純薬工業株式会社  コード０６７−０５４９１
Ｄ−ソルボース(生化学用)：和光純薬工業株式会社  コード１９５−１５２９１
Ｌ−ソルボース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１９１−０３７６２
Ｄ−タガトース（生化学用）：和光純薬工業株式会社  コード２０８−１７５１１
スクロース（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１９６−０００１５
Ｄ−ラフィノース五水和物（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１８０−０００１２
Ｄ−マルトース一水和物：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１３０−００６１５
ラクトース一水和物（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１２８−０００９５
アスコルビン酸（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード０１４−０４８０１
分光光度計：株式会社島津製作所の商品名「ＵＶ−１６００ＰＣ」
【００４６】
検査水
以下の実施例等で用いた検査水は次のものである。
りん酸イオン濃度が０、０．５、１．０、２．０、３．０および４．０ｍｇ［Ｐ］／Ｌの六種類の検査水を用意した。ｍｇ［Ｐ］／Ｌの単位は、１Ｌの検査水に含まれるりんのｍｇ数を示したものである。りん酸イオン濃度が０ｍｇ［Ｐ］／Ｌの検査水は蒸留水をそのまま用い、また、他の検査水はりん標準液を蒸留水で希釈することでりん酸イオン濃度を調整した。
【００４７】
実施例１
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物を２０ｇ／Ｌ、酒石酸アンチモニルカリウム三水和物を０．８ｇ／Ｌおよび硫酸を３Ｍ含む第一水溶液と、Ｄ−フルクトースを４００ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。
【００４８】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．１ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図１に示す。図１によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００４９】
実施例２
実施例１で用いたものと同じ第一水溶液と、スクロースを４００ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。
【００５０】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．２ｍＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の６３０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図２に示す。図２によると、この検量線は、少なくもりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５１】
実施例３
実施例１で用いたものと同じ第一水溶液と、Ｄ−ラフィノース五水和物を３００ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。
【００５２】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．４ｍＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８９０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図３に示す。図３によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５３】
実施例４
硫酸を３Ｍ含む第一水溶液と、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を１０ｇ／Ｌ、塩化アンチモン（ＩＩＩ）を０．４ｇ／Ｌおよびスクロースを１５０ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。第二水溶液の調製では、スクロースを安定化するために０．１Ｍに調整した水酸化ナトリウム水溶液を添加することでアルカリ性に調整し、また、塩化アンチモン（ＩＩＩ）の溶解を促進するために適量の塩酸を添加した。
【００５４】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．４ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図４に示す。図４によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５５】
実施例５
硫酸を３Ｍ含む第一水溶液と、モリブデン酸カリウムを１０ｇ／Ｌ、酸化アンチモン（ＩＩＩ）を０．４ｇ／ＬおよびＤ−ラフィノース五水和物を１５０ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。第二水溶液の調製では、Ｄ−ラフィノース五水和物を安定化するために０．１Ｍに調整した水酸化ナトリウム水溶液を添加することでアルカリ性に調整し、また、酸化アンチモン（ＩＩＩ）の溶解を促進するために適量の塩酸を添加した。
【００５６】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．４ｍＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８９０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図５に示す。図５によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５７】
比較例１
日本工業規格  ＪＩＳ  Ｋ  ０１０２、工場排水試験方法（２００８）４６．１．１（非特許文献１）に規定されたモリブデン青（アスコルビン酸還元）吸光光度法に従い、六種類の各検査水２．５ｍＬについて８９０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度とりん酸イオン濃度との関係を調べた。結果を図６に示す。図６によると、りん酸イオン濃度２ｍｇ［Ｐ］／Ｌの検査水の吸光度がりん酸イオン濃度１ｍｇ［Ｐ］／Ｌの検査水の吸光度の２倍にならず、りん酸イオンの定量可能範囲が多くても１．５ｍｇ［Ｐ］／Ｌまでの低濃度の範囲に限定されることがわかる。
【００５８】
実験例１
実施例１で用いた第二水溶液、実施例４で用いた第二水溶液および比較例１のモリブデン青（アスコルビン酸還元）吸光光度法で用いる７２ｇ／Ｌのアスコルビン酸溶液について、保存試験を実施した。
【００５９】
ここでは、調製直後の各第二水溶液およびアスコルビン酸溶液を個別に褐色瓶に入れ、５０℃のインキュベータ内に配置した。そして、各溶液について、調製から２４時間後、４８時間後および９６時間後の吸収スペクトルを測定し、これらの吸収スペクトルを調製直後の吸収スペクトルと比較した。結果を図７（実施例１の第二水溶液の結果）、図８（実施例４の第二水溶液の結果）および図９（アスコルビン酸溶液の結果）に示す。
【００６０】
図７および図８によると、実施例１の第二水溶液および実施例４の第二水溶液は、吸収スペクトルに殆ど変化がない（調製直後、２４時間後、４８時間後および９６時間後の各吸収スペクトルが略重なっている）ことから保存安定性が良好である。一方、図９によると、アスコルビン酸溶液は、調製から２４時間後の時点で早くも吸収スペクトルの変化が見られることから、調製後の早い段階で変性が進行しており、安定な保存が困難である。
【００６１】
実施例２および実施例３で用いた第二水溶液および実施例５で用いた第二水溶液についても同様の保存試験を実施したところ、吸収スペクトルに実質的な変化がなく、保存安定性は良好であった。
【００６２】
実施例６
りん酸イオン濃度が２．０ｍｇ／Ｌの検査水について、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、実施例１で用いたものと同じ第一水溶液０．２ｍＬおよび単糖の濃度が５００ｇ／Ｌの糖類水溶液０．１ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
上述の測定は、炭素数５のアルドースであるＤ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロースおよびＤ−リキソース、炭素数６のアルドースであるＤ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースおよびＤ−ガラクトース並びに炭素数６のケトースであるＤ−プシコース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−フルクトース、Ｄ−ソルボース、Ｌ−ソルボースおよびＤ−タガトースの各単糖の糖類水溶液について実施した。
【００６４】
結果を図１０に示す。図１０より、各単糖は、りん酸イオンを十分に発色可能なことが確認できた。
【００６５】
実施例７
りん酸イオン濃度が１．０ｍｇ／Ｌの検査水について、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、実施例１で用いたものと同じ第一水溶液０．２ｍＬおよびオリゴ糖の濃度が２００ｇ／Ｌの糖類水溶液０．２ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定した。この測定は、スクロース、Ｄ−マルトース一水和物、ラクトース一水和物およびＤ−ラフィノース五水和物の各オリゴ糖の糖類水溶液について実施した。
【００６６】
結果を図１１に示す。図１１より、各オリゴ糖は、その分解により生成する単糖によりりん酸イオンを十分に発色可能なことが確認できた。
【図１】
2011227040.tif 000002
【図２】
2011227040.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2011227040.tif 000009
【図９】
2011227040.tif 000010
【図１０】
2011227040.tif 000011
【図１１】
2011227040.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月5日(2011.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モリブデン青の生成による、検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法であって、
前記検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、
前記発色試薬を存在させた前記検査水を６０℃以上に加熱する工程と、
を含むりん酸イオンの発色方法。
【請求項２】
前記糖類化合物がスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである、請求項１に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項３】
前記発色試薬は、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものである、請求項１または２に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項４】
前記発色試薬は、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、前記糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である、請求項１に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項５】
モリブデン青の生成による、硫酸を含む検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法であって、
前記検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、
前記発色試薬を存在させた前記検査水を６０℃以上に加熱する工程と、
を含むりん酸イオンの発色方法。
【請求項６】
前記糖類化合物がスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである、請求項５に記載のりん酸イオンの発色方法。
【請求項７】
検査水に含まれるりん酸イオンの定量方法であって、
前記検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、
前記発色試薬を存在させた前記検査水を６０℃以上に加熱する工程と、
加熱後の前記検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する工程と、
を含むりん酸イオンの定量方法。
【請求項８】
前記糖類化合物がスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである、請求項７に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項９】
前記発色試薬は、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものである、請求項７または８に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項１０】
前記発色試薬は、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および前記糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、前記糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である、請求項７に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項１１】
硫酸を含む検査水に含まれるりん酸イオンの定量方法であって、
前記検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、
前記発色試薬を存在させた前記検査水を６０℃以上に加熱する工程と、
加熱後の前記検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する工程と、
を含むりん酸イオンの定量方法。
【請求項１２】
前記糖類化合物がスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである、請求項１１に記載のりん酸イオンの定量方法。
【請求項１３】
検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させるための試薬であって、
七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、
炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤と、
を含むりん酸イオンの発色試薬。
【請求項１４】
検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させるための試薬であって、
硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、
七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤とを含み、
前記糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖である、
りん酸イオンの発色試薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、りん酸イオンの発色方法および定量方法、特に、モリブデン青の生成による、検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
りんは海洋水、湖沼水、河川水および地下水等の富栄養化に関わる原因物質の一つであることから、工場排水等での排出規制が設けられている。このため、工場排水等は、環境への排出前にりんの定量、特に、りん酸イオンの定量が求められる。
【０００３】
水中に含まれるりん酸イオンの公的な定量方法として、非特許文献１に記載のモリブデン青（アスコルビン酸還元）吸光光度法が知られている。この定量方法は、りん酸イオンが七モリブデン酸六アンモニウムおよび酒石酸アンチモニルカリウム（ビス［（＋）−タルトラト］二アンチモン（ＩＩＩ）酸二カリウム）と反応して生成するヘテロポリ化合物をＬ（＋）−アスコルビン酸で還元し、それにより生成するモリブデン青により発色した検査水の吸光度を測定することでりん酸イオンを定量するものである。この定量方法の基本的操作では、所定量の検査水に対して所定量のモリブデン酸アンモニウム−アスコルビン酸混合溶液を加えて振り混ぜた後、２０〜４０℃で約１５分間放置する。そして、この溶液について波長８８０ｎｍ付近の吸光度を測定し、この測定値から予め作成しておいた検量線に基づいて検査水のりん酸イオン濃度（ｍｇＰＯ４３−／Ｌ）を算出する。
【０００４】
この定量方法において用いられるモリブデン酸アンモニウム−アスコルビン酸混合溶液は、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物と酒石酸アンチモニルカリウム三水和物（モリブデン青の生成反応促進剤）とを水に溶かし、これに硫酸とアミド硫酸アンモニウム（モリブデン青の生成を妨害する亜硝酸イオンの分解剤）とをさらに溶かすことで調製したモリブデン酸アンモニウム溶液と、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液とを所定割合で混合したものであり、使用時にモリブデン酸アンモニウム溶液とＬ（＋）−アスコルビン酸溶液とを混合して調製する必要がある。
【０００５】
ここで、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液は、Ｌ（＋）−アスコルビン酸を水に溶解して調製した水溶液であるが、調製後にＬ（＋）−アスコルビン酸の劣化が速やかに進行し、変質（外観的には黄色に変色）する。このため、非特許文献１は、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液を０〜１０℃の暗所に保存するよう指示し、また、着色したものの使用を禁止している。
【０００６】
ところで、環境保全の機運の高まりにより、工場排水等におけるりん酸イオンの定量頻度は増加の一途であるため、その定量操作の自動化装置が望まれている。この自動化装置では、所要の分析用薬剤、すなわち、モリブデン酸アンモニウム溶液とＬ（＋）−アスコルビン酸溶液とを保存し、定量時にこれらを使用する必要がある。しかし、Ｌ（＋）−アスコルビン酸溶液は、上述のとおり保存環境に制約があり、また、使用時に着色の有無を確認する必要もあることから、自動化装置において保存しながら用いるのが実質的に困難である。
【０００７】
また、上記定量方法は、非特許文献１に記載のように、定量範囲が２．５〜７５μｇという微量範囲であるため、検査水について、溶存しているりん酸イオンおよび有機物等に由来のりん酸イオン等の総量である全りんを定量する場合において、結果的に定量の上限が１ｍｇ［Ｐ］／Ｌ程度に制限され、検査水によっては全りんの定量に用いることができないという不具合もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本工業規格  ＪＩＳ  Ｋ  ０１０２、工場排水試験方法（２００８）４６．１．１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、保存可能な薬剤を用いて、検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、モリブデン青の生成による、検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法に関するものであり、この発色方法は、検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、当該発色試薬を存在させた検査水を６０℃以上に加熱する工程とを含んでいる。
【００１１】
このような発色方法において用いられる糖類化合物は、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである。また、発色試薬は、例えば、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものである。或いは、発色試薬は、例えば、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖のものである。
【００１２】
他の観点に係る本発明は、モリブデン青の生成による、硫酸を含む検査水に含まれるりん酸イオンの発色方法に関するものであり、検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、当該発色試薬を存在させた検査水を６０℃以上に加熱する工程とを含む。
【００１３】
このような発色方法において用いられる糖類化合物は、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである。
【００１４】
さらに他の観点に係る本発明は、検査水に含まれるりん酸イオンの定量方法に関するものであり、この定量方法は、検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物、硫酸並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、当該発色試薬を存在させた検査水を６０℃以上に加熱する工程と、加熱後の検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する工程とを含んでいる。
【００１５】
このような定量方法において用いられる糖類生成化合物は、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである。また、発色試薬は、例えば、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液と、糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものである。或いは、発色試薬は、例えば、硫酸を含む第一水溶液と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む第二水溶液とを混合することで調製されたものであり、かつ、糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖のものである。
【００１６】
さらに他の観点に係る本発明は、硫酸を含む検査水に含まれるりん酸イオンの定量方法に関するものであり、検査水において、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物並びに炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる発色試薬を存在させる工程と、当該発色試薬を存在させた検査水を６０℃以上に加熱する工程と、加熱後の検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する工程とを含む。
【００１７】
このような定量方法において用いられる糖類化合物は、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースである。
【００１８】
さらに他の観点に係る本発明は、検査水に含まれるりん酸イオンをモリブデン青の生成により発色させるための試薬に関する。この発色試薬の一形態は、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれた糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤とを含む。また、この発色試薬の他の形態は、硫酸を含む水溶液からなる第一剤と、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物および糖類化合物を含む水溶液からなる第二剤とを含み、糖類化合物がスクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれた非還元性オリゴ糖のものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るりん酸イオンの発色方法および定量方法は、りん酸イオンが七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩およびアンチモンの価数が３であるアンチモン化合物と反応して生成するヘテロポリ化合物を炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを用いて還元しており、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースの水溶液および分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物の水溶液は安定であって保存可能であるため、自動化に適している。
【００２０】
本発明に係るりん酸イオンの発色試薬は、所定の第一剤と第二剤とからなるものであり、第一剤および第二剤はいずれも安定であって保存可能であるため、りん酸イオンを定量する場合などにおいてりん酸イオンの発色を自動化するために適している。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１で作成した検量線を示す図。
【図２】実施例２で作成した検量線を示す図。
【図３】実施例３で作成した検量線を示す図。
【図４】実施例４で作成した検量線を示す図。
【図５】実施例５で作成した検量線を示す図。
【図６】比較例１の結果を示す図。
【図７】実験例１で測定した、実施例１で用いた第二水溶液の吸収スペクトルを示す図。
【図８】実験例１で測定した、実施例４で用いた第二水溶液の吸収スペクトルを示す図。
【図９】実験例１で測定したアスコルビン酸溶液の吸収スペクトルを示す図。
【図１０】実施例６の結果を示す図。
【図１１】実施例７の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の方法によりりん酸イオンを定量可能な検査水は、特に限定されるものではないが、通常は工場排水や生活排水等のりんの排出規制が設けられている排水の他、海洋水、湖沼水、河川水および地下水等の天然水である。
【００２３】
検査水のりん酸イオンを定量する際には、先ず、所定量の検査水を採取し、この検査水において発色試薬を存在させる。ここで、検査水の全りんを測定する場合は、発色試薬を存在させる前にりんの発生源となる有機物などのりん化合物を分解し、りん元素をりん酸イオンに変換するための前処理をする。りん化合物の分解方法としては、日本工業規格  ＪＩＳ  Ｋ０１０２  「工場排水試験方法（２００８）」の「４６．３  全りん」に挙げられたペルオキソ二硫酸カリウム分解法、硝酸−過塩素酸分解法および硝酸−硫酸分解法などを採用することができる。
【００２４】
検査水に存在させる発色試薬は、モリブデン化合物、アンチモン化合物、硫酸並びに糖類化合物を含む水溶液からなるものである。
【００２５】
モリブデン化合物としては、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩若しくは重金属塩が用いられる。このうち、七モリブデン酸六アンモニウムまたはモリブデン酸のアルカリ金属塩を用いるのが好ましい。モリブデン酸のアルカリ金属塩の例としては、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸カリウムおよびモリブデン酸リチウムを挙げることができる。モリブデン酸のアルカリ土類金属塩の例としては、モリブデン酸カルシウムおよびモリブデン酸マグネシウムを挙げることができる。モリブデン酸の重金属塩の例としては、モリブデン酸亜鉛およびモリブデン酸アルミニウムを挙げることができる。
【００２６】
アンチモン化合物としては、アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物が用いられる。アンチモンの価数が３であるアンチモン化合物の例としては、酒石酸アンチモニルカリウム、三酸化アンチモン（すなわち、酸化アンチモン（ＩＩＩ））およびアンチモンのハロゲン化物塩などを挙げることができる。アンチモンのハロゲン化物塩としては、加水分解により有害な物質を生成しにくい三塩化アンチモン（すなわち、塩化アンチモン（ＩＩＩ））などを用いるのが好ましい。
【００２７】
なお、アンチモン化合物としては、アンチモンの価数が５のアンチモン化合物を用いることもできる。このアンチモン化合物は、水溶液中において自然にアンチモンの価数が３のアンチモン化合物に変換されるため、アンチモンの価数が３のアンチモン化合物の供給源として用いることができる。ここで利用可能なアンチモンの価数が５のアンチモン化合物の例としては、五酸化アンチモン（すなわち、酸化アンチモン（Ｖ））および価数が５のアンチモンのハロゲン化物塩などを挙げることができる。価数が５のアンチモンのハロゲン化物塩としては、加水分解により有害な物質を生成しにくい五塩化アンチモン（すなわち、塩化アンチモン（Ｖ））などを用いるのが好ましい。
【００２８】
糖類化合物としては、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドース、炭素数６のケトースおよび分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な単糖生成化合物からなる糖類化合物群から選ばれたものが用いられる。炭素数５のアルドースの例としては、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースを挙げることができる。炭素数６のアルドースの例としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノースおよびガラクトースを挙げることができる。炭素数６のケトースの例としては、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースを挙げることができる。
【００２９】
また、単糖生成化合物としては、分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能なオリゴ糖または配糖体が用いられる。オリゴ糖としては、例えば、二糖類のスクロース、マルトース、ラクトース、イソマルツロース、マルツロース、ラクツロース、ガラクトスクロース、プリメベロースおよびビシアノース、三糖類のラフィノース、ケストース、ゲンチアノース、プランテオースおよびウンベリフェロース、四糖類のスタキオース並びに五糖類のベルバスコースを挙げることができる。これらの例示のオリゴ糖は、分解により、キシロース（炭素数５のアルドース）、グルコース（炭素数６のアルドース）、ガラクトース（炭素数６のアルドース）またはフルクトース（炭素数６のケトース）を生成することができる。また、配糖体としては、例えば、アルブチンおよびサリシンを挙げることができる。これらの例示の配糖体は、分解によりグルコースを生成することができる。
【００３０】
なお、単糖生成化合物としては、通常、安価に入手可能なスクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、ケストース、スタキオース、イソマルツロースまたはラクツロースを用いるのが好ましい。
【００３１】
発色試薬は、例えば、モリブデン化合物、アンチモン化合物および硫酸を含む第一水溶液（第一剤）と、糖類化合物を含む第二水溶液（第二剤）とを別々に調製し、これらの水溶液を混合することで調製することができる（第１の形態）。或いは、硫酸を含む第一水溶液（第一剤）と、モリブデン化合物、アンチモン化合物および糖類化合物を含む第二水溶液（第二剤）とを別々に調製し、これらの水溶液を混合することで調製することもできる（第２の形態）。
【００３２】
＜第１の形態＞
この形態の発色試薬において、第一水溶液は、精製水、例えば、純水、蒸留水またはイオン交換水等にモリブデン化合物、アンチモン化合物および硫酸を溶解することで調製することができる。ここで、アンチモン化合物として三酸化アンチモン（酸化アンチモン（ＩＩＩ））または三塩化アンチモン（塩化アンチモン（ＩＩＩ））を用いる場合は、第一水溶液の調製時に三酸化アンチモンまたは三塩化アンチモンの溶解を促進させるために、適量の塩酸を添加することができる。
【００３３】
第一水溶液におけるモリブデン化合物の濃度（モリブデン化合物の水和物を用いる場合は、水和水を除いた濃度）は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときのモリブデン化合物の濃度が、通常、０．３〜３．０ｇ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、０．５〜２．０ｇ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。また、第一水溶液におけるアンチモン化合物の濃度（アンチモン化合物の水和物を用いる場合は、水和水を除いた濃度）は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときのアンチモン化合物の濃度が、通常、０．０１〜０．２ｇ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、０．０３〜０．１２ｇ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。一方、第一水溶液における硫酸の濃度は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときの硫酸の濃度が、通常、０．０８〜０．４Ｍになるよう設定するのが好ましく、０．１２〜０．３Ｍになるよう設定するのがより好ましい。
【００３４】
第一水溶液は、その溶存成分であるモリブデン化合物、アンチモン化合物および硫酸が相互に反応して変性するものではなく、精製水中において安定に存在し得るため、室温或いは３〜６０℃程度の広い温度環境において安定に保存することができる。
【００３５】
第二水溶液は、精製水に糖類化合物を溶解することで調製することができる。第二水溶液における糖類化合物の濃度は、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときの糖類化合物の濃度が、通常、１〜５０ｇ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、３〜４０ｇ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。ここで、糖類化合物として単糖生成化合物を用いる場合、検査水へ所定量の第一水溶液と第二水溶液とを添加したときの糖類化合物の濃度は、単糖生成化合物の分解により生成する単糖類の濃度、すなわち、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースの濃度を意味する。
【００３６】
第二水溶液は、糖類化合物が変性せずに安定に存在し得るため、室温或いは３〜６０℃程度の広い温度環境において安定に保存することができる。
【００３７】
＜第２の形態＞
この形態の発色試薬において、第一水溶液は、精製水に硫酸を溶解することで調製することができる。また、第二水溶液は、精製水にモリブデン化合物、アンチモン化合物および糖類化合物を溶解することで調製することができる。但し、第二水溶液において用いる糖類化合物は、分解により炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成可能な非還元性のオリゴ糖、例えば、スクロース、ラフィノース、ケストースおよびスタキオースからなる群から選ばれたものである。非還元性のオリゴ糖以外の糖類化合物を用いた場合、保存中の第二水溶液において、溶質間で反応が進行してしまう可能性がある。
【００３８】
第二水溶液は、糖類化合物、すなわち、非還元性のオリゴ糖を安定化するために、例えば水酸化ナトリウム水溶液を添加することでアルカリ性に調整するのが好ましい。また、アンチモン化合物として三酸化アンチモンまたは三塩化アンチモンを用いる場合は、三酸化アンチモンまたは三塩化アンチモンの溶解を促進させるために、第二水溶液の調製時に適量の塩酸を添加することができる。
【００３９】
この形態の発色試薬において、第一水溶液における硫酸の濃度、第二水溶液におけるモリブデン化合物、アンチモン化合物および糖類化合物は、いずれも、第１の形態の場合と同様に設定するのが好ましい。
【００４０】
この形態の発色試薬における第一水溶液および第二水溶液は、いずれも、溶質が変性せずに安定に存在し得るため、室温或いは３〜６０℃程度の広い温度環境において安定に保存することができる。
【００４１】
発色試薬は、使用時、すなわち、検査水への添加の直前に第一水溶液と第二水溶液とを混合することで調製してもよいし、検査水へ第一水溶液と第二水溶液とを別々に添加することで検査水中で調製されるようにしてもよい。前者の場合、検査水に対して発色試薬を添加することにより、検査水において発色試薬を存在させることができる。後者の場合、検査水に対して第一水溶液と第二水溶液とを別々に添加することにより、検査水において発色試薬を存在させることができる。
【００４２】
第１の形態の発色試薬を用いる場合、検査水における発色試薬の存在量は、検査水における第一水溶液の存在量が、通常、４０〜１００ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、６０〜８０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。また、第二水溶液の存在量が、通常、１０〜１５０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、２０〜１００ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。但し、検査水において、第一水溶液（Ａ）と第二水溶液（Ｂ）との容積比（Ａ：Ｂ）が、通常、１：２〜２：１になるよう設定するのが好ましく、３：４〜４：３になるよう設定するのがより好ましい。
【００４３】
一方、第２の形態の発色試薬を用いる場合、検査水における発色試薬の存在量は、検査水における第一水溶液の存在量が、通常、５０〜１２０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、６０〜１００ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。また、第二水溶液の存在量が、通常、５０〜１８０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのが好ましく、６０〜１５０ｍＬ／Ｌになるよう設定するのがより好ましい。但し、検査水において、第一水溶液（Ａ）と第二水溶液（Ｂ）との容積比（Ａ：Ｂ）が、通常、１：１〜１：３になるよう設定するのが好ましく、４：５〜２：３になるよう設定するのがより好ましい。
【００４４】
なお、発色試薬は、モリブデン化合物、アンチモン化合物、硫酸および糖類化合物のそれぞれの水溶液を別々に調製し、これらの水溶液を検査水への添加直前に混合することにより調製することもでき、また、これらの水溶液を検査水へ別々に添加することで検査水中で調製されるようにすることもできる。
【００４５】
発色試薬を添加する検査水が予め硫酸を含む場合、例えば、検査水に含まれるりん化合物を分解してりん酸イオンへ変換することで検査水の全りんを定量するときに、りん化合物を分解するための検査水の前処理において硫酸水溶液を用いた場合、この硫酸水溶液を発色試薬のための硫酸として用いることができる。この場合、検査水における硫酸濃度が十分であれば、硫酸以外の成分を含む水溶液を検査水へ添加することで、検査水に発色試薬を存在させることができる。例えば、第２の形態の発色試薬を用いる場合、前処理において検査水へ添加する硫酸水溶液を第一水溶液と見なすことができ、前処理後のりん酸イオンの発色工程では検査水に対して第二水溶液のみを添加することができる。
【００４６】
次に、発色試薬が存在する検査水を加熱する。この際、検査水を適宜攪拌するのが好ましい。加熱温度は、６０℃以上で検査水の沸騰温度までの範囲に設定する。また、加熱時間は、通常、２〜６０分に設定する。発色試薬の糖類化合物として単糖生成化合物を用いた場合、単糖生成化合物は、この加熱により加水分解され、炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースを生成する。
【００４７】
加熱された検査水中のりん酸イオンは、発色試薬のモリブデン化合物およびアンチン化合物と反応してヘテロポリ化合物を生成し、また、生成したヘテロポリ化合物は硫酸による酸性環境下で炭素数５のアルドース、炭素数６のアルドースまたは炭素数６のケトースにより還元される。この還元によりモリブデン青が生成し（りん酸イオンの発色）、このモリブデン青により検査水が変色する。
【００４８】
次に、モリブデン青により変色した検査水について、６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度を測定する。そして、当該吸光度とりん酸イオン濃度との関係を予め調べて作成しておいた検量線に基づいて、吸光度の測定値から検査水のりん酸イオン量を判定する。
【００４９】
本発明に係るりん酸イオンの発色方法および定量方法は、モリブデン青を生成させるヘテロポリ化合物の還元剤として水溶液中で安定な単糖類または分解により当該単糖類を生成可能な単糖生成化合物を用いており、これらの糖類化合物の水溶液は安定に保存することができるため、自動化に適している。また、本発明に係るりん酸イオンの定量方法においては、検量線を作成したときに、りん酸イオン濃度と６００から９５０ｎｍの範囲における任意の波長の吸光度との間の直線関係が比較的高濃度のりん酸イオン濃度の範囲まで良好に成立することから、検査水中に含まれるりん酸イオンの定量上限が４ｍｇ［Ｐ］／Ｌ若しくはそれ以上の範囲まで拡大する。このため、この定量方法は、検査水の全りんを定量する場合において、特に有効である。
【実施例】
【００５０】
試薬
以下の実施例等で用いた試薬および分光光度計は次のものである。
りん標準液（水質試験用）：和光純薬工業株式会社  コード１６０−１９２４１
硫酸(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード１９２−０４６９６
水酸化ナトリウム（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１９８−１３７６５
塩酸（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード０８０−０１０６６
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード０１８−０６９０１
モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１９０−０２４７５
モリブデン酸カリウム：和光純薬工業株式会社  コード１６５−０４００２
酒石酸アンチモニルカリウム三水和物(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード０２０−１２８３２
塩化アンチモン（ＩＩＩ）（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード０１１−０４４９２
酸化アンチモン（ＩＩＩ）（化学用）：和光純薬工業株式会社  コード０１８−０４４０２
Ｄ−リボース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１８２−０１０５２
Ｄ−アラビノース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード０１３−０４５７２
Ｌ−アラビノース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード０１０−０４５８２
Ｄ−キシロース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード２４４−００３０２
Ｄ−リキソース：東京化成株式会社  コードＬ００７３
Ｄ−アロース（生化学用）：和光純薬工業株式会社  コード０１７−２２５９１
Ｄ−アルトロース(生化学用)：和光純薬工業株式会社  コード０１２−２２４２１
Ｄ−グルコース(試薬特級)：和光純薬工業株式会社  コード０４７−００５９２
Ｄ−マンノース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１３０−００８７２
Ｄ−ガラクトース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード０７１−０００３２
Ｄ−プシコース（生化学用）：和光純薬工業株式会社  コード１６５−２３８４１
Ｄ−フルクトース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１２７−０２７６５
Ｌ−フルクトース(生化学用)：和光純薬工業株式会社  コード０６７−０５４９１
Ｄ−ソルボース(生化学用)：和光純薬工業株式会社  コード１９５−１５２９１
Ｌ−ソルボース：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１９１−０３７６２
Ｄ−タガトース（生化学用）：和光純薬工業株式会社  コード２０８−１７５１１
スクロース（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１９６−０００１５
Ｄ−ラフィノース五水和物（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１８０−０００１２
Ｄ−マルトース一水和物：和光純薬工業株式会社の和光特級  コード１３０−００６１５
ラクトース一水和物（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード１２８−０００９５
アスコルビン酸（試薬特級）：和光純薬工業株式会社  コード０１４−０４８０１
分光光度計：株式会社島津製作所の商品名「ＵＶ−１６００ＰＣ」
【００５１】
検査水
以下の実施例等で用いた検査水は次のものである。
りん酸イオン濃度が０、０．５、１．０、２．０、３．０および４．０ｍｇ［Ｐ］／Ｌの六種類の検査水を用意した。ｍｇ［Ｐ］／Ｌの単位は、１Ｌの検査水に含まれるりんのｍｇ数を示したものである。りん酸イオン濃度が０ｍｇ［Ｐ］／Ｌの検査水は蒸留水をそのまま用い、また、他の検査水はりん標準液を蒸留水で希釈することでりん酸イオン濃度を調整した。
【００５２】
実施例１
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物を２０ｇ／Ｌ、酒石酸アンチモニルカリウム三水和物を０．８ｇ／Ｌおよび硫酸を３Ｍ含む第一水溶液と、Ｄ−フルクトースを４００ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。
【００５３】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．１ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図１に示す。図１によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５４】
実施例２
実施例１で用いたものと同じ第一水溶液と、スクロースを４００ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。
【００５５】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．２ｍＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の６３０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図２に示す。図２によると、この検量線は、少なくもりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５６】
実施例３
実施例１で用いたものと同じ第一水溶液と、Ｄ−ラフィノース五水和物を３００ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。
【００５７】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．４ｍＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８９０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図３に示す。図３によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００５８】
実施例４
硫酸を３Ｍ含む第一水溶液と、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を１０ｇ／Ｌ、塩化アンチモン（ＩＩＩ）を０．４ｇ／Ｌおよびスクロースを１５０ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。第二水溶液の調製では、スクロースを安定化するために０．１Ｍに調整した水酸化ナトリウム水溶液を添加することでアルカリ性に調整し、また、塩化アンチモン（ＩＩＩ）の溶解を促進するために適量の塩酸を添加した。
【００５９】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．４ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図４に示す。図４によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００６０】
実施例５
硫酸を３Ｍ含む第一水溶液と、モリブデン酸カリウムを１０ｇ／Ｌ、酸化アンチモン（ＩＩＩ）を０．４ｇ／ＬおよびＤ−ラフィノース五水和物を１５０ｇ／Ｌ含む第二水溶液とを調製した。第二水溶液の調製では、Ｄ−ラフィノース五水和物を安定化するために０．１Ｍに調整した水酸化ナトリウム水溶液を添加することでアルカリ性に調整し、また、酸化アンチモン（ＩＩＩ）の溶解を促進するために適量の塩酸を添加した。
【００６１】
六種類の各検査水２．５ｍＬについて、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、第一水溶液０．２ｍＬおよび第二水溶液０．４ｍＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８９０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度に基づくりん酸イオン濃度の検量線を作成した。結果を図５に示す。図５によると、この検量線は、少なくともりん酸イオン濃度が０〜４ｍｇ［Ｐ］／Ｌの範囲で高い直線性を示している。
【００６２】
比較例１
日本工業規格  ＪＩＳ  Ｋ  ０１０２、工場排水試験方法（２００８）４６．１．１（非特許文献１）に規定されたモリブデン青（アスコルビン酸還元）吸光光度法に従い、六種類の各検査水２．５ｍＬについて８９０ｎｍの吸光度を測定し、同吸光度とりん酸イオン濃度との関係を調べた。結果を図６に示す。図６によると、りん酸イオン濃度２ｍｇ［Ｐ］／Ｌの検査水の吸光度がりん酸イオン濃度１ｍｇ［Ｐ］／Ｌの検査水の吸光度の２倍にならず、りん酸イオンの定量可能範囲が多くても１．５ｍｇ［Ｐ］／Ｌまでの低濃度の範囲に限定されることがわかる。
【００６３】
実験例１
実施例１で用いた第二水溶液、実施例４で用いた第二水溶液および比較例１のモリブデン青（アスコルビン酸還元）吸光光度法で用いる７２ｇ／Ｌのアスコルビン酸溶液について、保存試験を実施した。
【００６４】
ここでは、調製直後の各第二水溶液およびアスコルビン酸溶液を個別に褐色瓶に入れ、５０℃のインキュベータ内に配置した。そして、各溶液について、調製から２４時間後、４８時間後および９６時間後の吸収スペクトルを測定し、これらの吸収スペクトルを調製直後の吸収スペクトルと比較した。結果を図７（実施例１の第二水溶液の結果）、図８（実施例４の第二水溶液の結果）および図９（アスコルビン酸溶液の結果）に示す。
【００６５】
図７および図８によると、実施例１の第二水溶液および実施例４の第二水溶液は、吸収スペクトルに殆ど変化がない（調製直後、２４時間後、４８時間後および９６時間後の各吸収スペクトルが略重なっている）ことから保存安定性が良好である。一方、図９によると、アスコルビン酸溶液は、調製から２４時間後の時点で早くも吸収スペクトルの変化が見られることから、調製後の早い段階で変性が進行しており、安定な保存が困難である。
【００６６】
実施例２および実施例３で用いた第二水溶液および実施例５で用いた第二水溶液についても同様の保存試験を実施したところ、吸収スペクトルに実質的な変化がなく、保存安定性は良好であった。
【００６７】
実施例６
りん酸イオン濃度が２．０ｍｇ／Ｌの検査水について、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、実施例１で用いたものと同じ第一水溶液０．２ｍＬおよび単糖の濃度が５００ｇ／Ｌの糖類水溶液０．１ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
上述の測定は、炭素数５のアルドースであるＤ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロースおよびＤ−リキソース、炭素数６のアルドースであるＤ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノースおよびＤ−ガラクトース並びに炭素数６のケトースであるＤ−プシコース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−フルクトース、Ｄ−ソルボース、Ｌ−ソルボースおよびＤ−タガトースの各単糖の糖類水溶液について実施した。
【００６９】
結果を図１０に示す。図１０より、各単糖は、りん酸イオンを十分に発色可能なことが確認できた。
【００７０】
実施例７
りん酸イオン濃度が１．０ｍｇ／Ｌの検査水について、９５℃に加熱されたブロックヒータを用いて３分間予熱した後、実施例１で用いたものと同じ第一水溶液０．２ｍＬおよびオリゴ糖の濃度が２００ｇ／Ｌの糖類水溶液０．２ｍＬを添加し、９５℃で７分間加熱した。加熱終了後、分光光度計を用いて各検査水の８５０ｎｍの吸光度を測定した。この測定は、スクロース、Ｄ−マルトース一水和物、ラクトース一水和物およびＤ−ラフィノース五水和物の各オリゴ糖の糖類水溶液について実施した。
【００７１】
結果を図１１に示す。図１１より、各オリゴ糖は、その分解により生成する単糖によりりん酸イオンを十分に発色可能なことが確認できた。