(57)【要約】【課題】脊椎動物の分化組織の秩序ある空間構成の形成及び維持に幅広く関わるものであり、試験管内及び生体内の両方において様々な脊椎動物組織のアレイを作成及び／又は維持するために用いることが可能で新規なｅｒｂＢレセプタ・リガンド族（たんぱく質）を提供する。【解決手段】本発明は、「小脳由来成長因子」又は「ＣＤＧＦ」と呼称する新規なｅｒｂＢレセプタ・リガンドの発見に関し、このたんぱく質は、明らかに、脊椎動物の分化組織の秩序ある空間構成の形成及び維持に幅広く関わるものであり、また、試験管内及び生体内の両方において様々な脊椎動物組織のアレイを作成及び／又は維持するために用いることができるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離された及び／又は組換え体であるＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２】
配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すアミノ酸配列又はその一部分に対して少なくとも７０パーセント相同のＣＤＧＦアミノ酸配列を含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項３】
配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに相当するＥＧＦ様ドメインを含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項４】
哺乳類のＣＤＧＦ遺伝子に対して緊縮条件下で交雑する核酸により符号化されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項５】
配列同定番号第２番、第４番又は第７番のいずれかの示すＣＤＧＦたんぱく質に特異的な抗体に対して交差反応性のアミノ酸配列を含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項６】
ｅｒｂＢレセプタに特異的に結合する、請求項１又は４のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項７】
ｅｒｂＢレセプタがｅｒｂＢ４である、請求項２、３、５又は６のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項８】
ｅｒｂＢ型レセプタを発現する細胞の細胞活性を変更する、請求項２、３、５又は６のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項９】
前記細胞の増殖、分化、細胞対細胞の接触及び生存率のうち少なくとも一つを変更する、請求項８に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１０】
前記ｅｒｂＢ型レセプタの媒介する細胞内シグナル形質導入経路を刺激する、請求項８に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１１】
前記ｅｒｂＢ型レセプタの媒介する細胞内シグナル形質導入経路に拮抗する、請求項８に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１２】
前記ｅｒｂＢ型レセプタのリン酸化を誘発する、請求項２、３、５又は６のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１３】
可溶性、かつ約７８乃至８３ｋＤの分子重量を有する、請求項１乃至５のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１４】
可溶性、かつ約３１乃至３６ｋＤの分子重量を有する、請求項１乃至５のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＣＤＧＦ遺伝子がヒトＣＤＧＦ遺伝子である、請求項４に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１６】
前記ヒトＣＤＧＦ遺伝子が、配列同定番号第６番の示すコーディング配列を含む、請求項１５に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１７】
配列同定番号第１番、第５番及び第６番のいずれかの表す核酸配列に緊縮条件下で交雑する核酸により符号化される、請求項４に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１８】
配列同定番号第１番のヌクレオチド１８０乃至６９５又はヌクレオチド８７０乃至９２９の少なくとも一つに相当する核酸配列に緊縮条件下で交雑する核酸により符号化される、請求項４に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＥＧＦ様ドメインが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも７０パーセント相同である、請求項３に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＥＧＦ様ドメインが、一般式ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣで表されるアミノ酸を含む、請求項３に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＣＤＧＦアミノ酸配列が、配列同定番号第２番のアミノ酸残基１乃至３１４に相当する配列又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＣＤＧＦアミノ酸配列が、配列同定番号第４番のアミノ酸残基１乃至３３０に相当する配列又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２３】
炭水化物成分を含むように翻訳後に変更された、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２４】
ＣＤＧＦポリペプチド配列に加えて、前記ＣＤＧＦポリペプチドに関係のないアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド配列を更に含む融合たんぱく質である、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２５】
前記融合たんぱく質が、前記融合たんぱく質の存在を検出する検出可能な標識として、又は、前記融合たんぱく質を固定するマトリックス結合ドメインとして働くポリペプチドを、第二のポリペプチド配列として含む、請求項２４に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２６】
自然に結び付いたその他の細胞たんぱく質を概ね持たない、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２７】
組換えポリペプチドである、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２８】
哺乳類を源とする、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項２９】
ヒトを源とする、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１乃至５のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドのエピトープに対して特異的反応性を有する抗体製剤。
【請求項３１】
組換えＣＤＧＦポリペプチドを符号化するポリペプチド・コーディング配列を含む概ね純粋な核酸。
【請求項３２】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すアミノ酸配列又はその一部分に対して少なくとも７０％相同のＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、かつ、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに相当するＥＧＦ様ドメインを含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３４】
前記ポリペプチド・コーディング配列が、哺乳類のＣＤＧＦ遺伝子に対して緊縮条件下で交雑するＣＤＧＦコーディング配列を含む、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３５】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの示すＣＤＧＦたんぱく質に特異的な抗体に対して交差反応性のアミノ酸配列を含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３６】
前記ＣＤＧＦポリペプチドがｅｒｂＢレセプタに特異的に結合する、請求項３１又は３４のいずれかに記載の核酸。
【請求項３７】
前記ｅｒｂＢレセプタがｅｒｂＢ４である、請求項３２、３３、３５又は６３のいずれかに記載の核酸。
【請求項３８】
前記ＣＤＧＦ遺伝子がヒトＣＤＧＦ遺伝子である、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３９】
前記ヒトＣＤＧＦ遺伝子が配列同定番号第６番の示すコーディング配列を含む、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
前記ＣＤＧＦコーディング配列が、配列同定番号第１番、第５番及び第６番のいずれかの表す核酸配列に緊縮条件下で交雑する、請求項３４に記載の核酸。
【請求項４１】
前記ＣＤＧＦコーディング配列が、配列同定番号第１番のヌクレオチド１８０乃至６９５又はヌクレオチド８７０乃至９２９の少なくとも一つに相当する核酸配列に緊縮条件下で交雑する、請求項３４に記載の核酸。
【請求項４２】
前記ＥＧＦ様ドメインが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも７０パーセント相同である、請求項３３に記載の核酸。
【請求項４３】
前記ＥＧＦ様ドメインが、一般式ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣで表されるアミノ酸を含む、請求項３３に記載の核酸。
【請求項４４】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番のアミノ酸残基１乃至３１４に相当するＣＤＧＦアミノ酸配列、又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項３１に記載の核酸。
【請求項４５】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第４番のアミノ酸残基１乃至３３０に相当するＣＤＧＦアミノ酸配列、又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項３１に記載の核酸。
【請求項４６】
配列同定番号第１番、第３番又は第６番の少なくとも６０の連続したヌクレオチドが表す配列を有する核酸プローブに緊縮条件下で交雑する、請求項３１に記載の核酸。
【請求項４７】
前記核酸を前記組換えＣＤＧＦポリペプチドの発現ベクタとして用いるのに適切なものにするために、前記ポリペプチドコーディング配列に操作可能に結び付けられた転写調節配列を更に含む、請求項３１に記載の核酸。
【請求項４８】
請求項３１に記載の前記核酸を含む、原核細胞及び真核細胞のうち少なくとも一方において複製を作ることが可能である発現ベクタ。
【請求項４９】
請求項４８に記載の発現ベクタで形質移入させた、組換えＣＤＧＦポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項５０】
請求項４９に記載の前記細胞を細胞培地で培養して組換えＣＤＧＦポリペプチドを発現させ、前記細胞培養物から前記組換えＣＤＧＦポリペプチドを分離するステップを含む、組換えＣＤＧＦポリペプチドを生成する方法。
【請求項５１】
請求項３１に記載の前記核酸を含む移植遺伝子を持つか、あるいは、一つ又は複数の内生ＣＤＧＦ遺伝子が破壊された、組換えにより操作された細胞を含む遺伝子導入動物。
【請求項５２】
（ｉ）請求項１３１７の前記核酸を含むと共に、真核細胞において前記組換えＣＤＧＦポリペプチドの発現を起こさせるために転写調節配列に操作可能に結び付けられた遺伝子構造物であって、前記組換えＣＤＧＦポリペプチドはｅｒｂＢ型レセプタへの結合能力を特徴とするものである、遺伝子構造物と、（ｉｉ）前記遺伝子構造物を細胞に運搬すると共に、前記細胞に前記遺伝子構造物で形質移入させる遺伝子運搬組成物とを含む、組換え体形質移入系。
【請求項５３】
前記遺伝子運搬組成物が、組換えウィルス粒子、リポソーム、及びポリ−陽イオン性核酸結合物質のいずれかから選択される、請求項５２に記載の組換え体形質移入系。
【請求項５４】
配列同定番号第１番、第３番又は第６番のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生変異体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドに緊縮条件下で交雑するヌクレオチド配列の一領域を含む、概ね精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマ。
【請求項５５】
配列同定番号第１番、第３番又は第６番のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生変異体の少なくとも６０の連続したヌクレオチドに緊縮条件下で交雑する、請求項５４に記載のプローブ／プライマ。
【請求項５６】
配列同定番号第１番のヌクレオチド１８０乃至６９５又はヌクレオチド８７０乃至９２９の少なくとも一つに相当するセンス又はアンチセンス核酸配列に緊縮条件下で交雑する、請求項５４に記載のプローブ／プライマ。
【請求項５７】
付着した検出可能な標識群を更に含む、請求項５４に記載のプローブ／プライマ。
【請求項５８】
細胞の試料中で、ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する核酸のレベルを測定する請求項５４に記載のプローブ／プライマを含む、ＣＤＧＦｍＲＮＡの写しを含む細胞を検出するテスト器具。
【請求項５９】
ｉ．ＣＤＧＦポリペプチド、ｅｒｂＢレセプタたんぱく質、及びテスト化合物を化合させるステップと、ｉｉ．前記ＣＤＧＦポリペプチド及び前記ｅｒｂＢレセプタたんぱく質を含む錯体の形成を検出するステップとを含み、前記テスト化合物がある状態のときの前記錯体の形成の変化は、ＣＤＧＦとｅｒｂＢレセプタとの間の相互作用の調節物質であることを示すものである、ＣＤＧＦポリペプチドのｅｒｂＢ型レセプタとの結合を調節するテスト化合物をスクリーニングする検定。
【請求項６０】
前記ｅｒｂＢ型レセプタがｅｒｂＢ４レセプタである、請求項５９に記載の検定。
【請求項６１】
好ましくない細胞増殖又は分化を特徴とする疾患の危険性のある、一つの細胞又は複数の細胞を判別する診断的検定であって、（ｉ）ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する遺伝子の異常な変更又は変異、（ｉｉ）前記遺伝子の誤発現、（ｉｉｉ）異常なレベルの可溶性ＣＤＧＦたんぱく質、のうち少なくとも一つを特徴とする遺伝子の病変があるかないかを、細胞試料中で検出するステップを含む、検定。
【請求項６２】
前記病変の検出が、ｉ．前記遺伝子のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生変異体、あるいは前記ＣＤＧＦ遺伝子に自然に結び付いた５’又は３’フランキング配列に交雑するヌクレオチド配列の一領域を含む核酸を含む診断用プローブを提供するステップと、ｉｉ．前記プローブを前記細胞試料の核酸に化合させるステップと、ｉｉｉ．前記遺伝子からの一つ又は複数のヌクレオチドの削除、前記遺伝子への一つ又は複数のヌクレオチドの追加、前記遺伝子の一つ又は複数のヌクレオチドの置換、前記遺伝子の全部又は一部の総体的染色体再配列、前記遺伝子のｍＲＮＡ写しレベルの総体的変化、又は前記遺伝子のｍＲＮＡ写しの非野生型スプライシング・パターン、のうち少なくとも一つの存在を、前記細胞核酸への前記プローブの交雑により、検出するステップとを含む、請求項６１に記載の検定。
【請求項６３】
前記プローブの交雑が、前記プローブ及び細胞核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にさらすステップと、増幅された生成物中に異常を検出するステップとを更に含む、請求項６２に記載の検定。
【請求項６４】
前記プローブの交雑が、前記プローブ及び細胞核酸を結紮連鎖反応（ＬＣＲ）にさらすステップと、増幅された生成物中に異常を検出するステップとを更に含む、請求項６２に記載の検定。
【請求項６５】
遺伝子の病変の検出が、組織試料の細胞に関連する、及び／又は、体液中の可溶性たんぱく質として、ＣＤＧＦたんぱく質、又はその一部分があるかないかを検出するステップを含む、請求項６１に記載の検定。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、以下「小脳由来成長因子」又は「ＣＤＧＦ」と呼称する新規なｅｒｂＢレセプタ・リガンド族に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  発明の背景パターン形成という活動は、これにより、胚細胞が、分化した組織の秩序ある空間配列を構成するものである。高等生物の身体上の雑性は、胚形成の段階で、細胞に内在する系譜と細胞外因性のシグナリングとの相瓦作用により生じる。最も初期の身体計画の策定から器官系のパターニング、そして組織の分化における多様な細胞種の発生に渡るまで、脊椎動物の発生における胚のパターニングにとって誘導的相互作用は重要である（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．，（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８：３６５−３８９；Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１８５−１９９；Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：２５７−２７０）。発生における細胞相互作用の効果は様々である。典型的には、反応細胞は、その反応細胞の未誘導の状態及び誘導後の状態の双方と異なる誘導細胞により細胞分化の一経路から別の経路に外れる（誘導）。細胞が、隣り合う細胞に対して自分自身と同じように分化するよう誘導すること（同質誘導）もあれば、細胞が、隣り合う細胞に自分のように分化することを抑制することもある。発生の初期における細胞の相互作用が順番に起き、その結果二つの細胞種間の最初の誘導が進むにつれ、多様性が累進的に増幅されていくこととなるものもある。更に、誘導的相互作用は胚だけでなく成体細胞でも同様に起き、形態発生パターンを作り出して維持するだけでなく分化を誘導するよう作用することもある（Ｊ．Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１８５−１９９）。【０００３】  胚形成中、そして成体動物の組織の維持において、数多くの種類の情報交換が行われる。これらには、例えば血中を循環して適したレセプタを持つ身体内の細胞にそれらがどれほど遠くても作用を及ぼす比較的安定したホルモンの作用のように長距離に渡る作用から、僅かに数ミクロンの距離に渡って作用する大変不安定な神経伝達物質の小さな作用まで、多様である。発生において特に重要なのは、胚誘導として上述したクラスの細胞相互作用であり、これには隣接する細胞間で作用する影響や、場合によっては１０個の細胞の直径よりも長い距離に渡って作用する影響も含まれる（Ｓａｘｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３３：２１−４８；及びＧｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９９：２８５−３０６）。胚誘導は、一つの（誘導）組織又は細胞と別の（反応）組織又は細胞との間の相互作用であり、その結果反応細胞の分化の方向が変化するものであると定義されている。この相互作用は多くの場合、細胞間の違いや、組織及び器官への細胞の器化へとつながる、脊椎動物の発生における最も重要な仕組みの一つであると考えられている。【０００４】  レセプタ・チロシン・キナーゼは、細胞の分化、増殖、胚の発生、そして場合によっては腫瘍の成長を含む数多くの異なるプロセスに関連することが明らかである。可溶性又はマトリックスを伴った特異的な成長因子リガンドの高親和性結合により、この活性化されたレセプタが特定のレパートリの細胞質シグナリング分子に結び付くことができ、それにより細胞内シグナリングのカスケードが生じ、そ���結果、例えば分化及び／又は成長に関連する細胞遺伝子プログラムの活性化又は不活化が起きる。従って、このようなレセプタ・チロシン・キナーゼに対するリガンドであるペプチド成長因子は、重要な発生上の役割を持った細胞内シグナリング分子として有力な候補である。実際、これらのリガンドは、生存、増殖、分化、接着、移行及び軸索の案内を含む、試験管内における幅広い範囲の細胞活動に大きな作用を及ぼすことが知られている。これらの分子が強力なシグナリング作用を持つことは、更に、このリガンド及びレセプタの両方は突然変異又は過発現により活性化すると強力な腫瘍遺伝子となり、劇的な細胞形質転換を起こす能力を有することからも強く分かる（Ｃａｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：２８１．３０２；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ及びＵｌｌｒｉｃｈ（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９：３８３−３９１；及びＦａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：４５３−４８１により観察された）。【０００５】  実例を挙げると、いくつかの成長因子又はそれらのチロシン・キナーゼ・レセプタについては特定の発生上の役割が示されている。例えば、マウスのＷ座で符号化されるｃ−ｋｉｔレセプタ・チロシン・キナーゼ（Ｃｈａｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３５：８８−８９；及びＧｅｉｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５：１８５．１９２）と、マウスのＳ１座で符号化されるそのリガンドＫＬ（Ｆｌａｎａｇａｎ及びＬｅｄｅｒ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：１８５−１９４；Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：１７５−１８３；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：２２５−２３３；及びＺｓｅｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：２１３−２２４）とは、始原細胞、造血細胞、及び神経堤前駆細胞の増殖、生存及び／又は移動を決定する。その他の例は、発生の段階にある哺乳類の神経系において著しい特定の働きを持つｔｒｋ族のリガンド及びレセプタ（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１１３−１２２；及びＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６：９８９−９９９）、及び、アフリカツメガエルの中胚葉誘導（Ａｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６：２５７−２７０）で関連づけられたＦＧＦレセプタである。脊椎動物においても、レセプタ・チロシン・キナーゼや、セブンレス（原語：ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）、ボス（原語：ｂｏｓｓ）、トルソ（原語：ｔｏｒｓｏ）、ブレスレス（原語：ｂｒｅａｔｈｌｅｓｓ）及びｌｅｔ−２３等のリガンドは、一次胚軸が形成されてから、オンマチジウム（原語：ｏｍｍａｔｉｄｉｕｍ）の単個細胞の宿命が特定されるに至るまでの過程において主要な役割を果たすことが知られている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ及びＲｕｂｉｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：２７１−２８１；Ｓｈｉｌｏ（１９９２）Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ６：２９１５−２９２２；及びＺｉｐｕｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５７：３８１−３８９）。総合すると、レセプタ・チロシン・キナーゼ及びそれらのリガ���ドの発生上の働きについて浮かび上がる図は、これらの分子が胚発生のすべての段階で、そして著しく幅広い異なる種類のパターニング・プロセスにおいて、主要な役割を果たすという点で驚くべきものがある。【０００６】  レセプタ・チロシン・キナーゼは構造上の相同性、そして少なくともいくつかの場合において共有していることの明らかな機能的特徴に基づいて族に分けることができる（Ｆａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：４５３−４８１）。興味深いことに、ｅｒｂＢ族には数多くの仲間があるにもかかわらず、これらの分子はすべて、リガンドのはっきりしない弧児のレセプタとされていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．，（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８：３６５−３８９
【非特許文献２】Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１８５−１９９
【非特許文献３】Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：２５７−２７０
【非特許文献４】Ｊ．Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１８５−１９９
【非特許文献５】Ｓａｘｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３３：２１−４８
【非特許文献６】Ｇｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９９：２８５−３０６
【非特許文献７】Ｃａｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：２８１．３０２
【非特許文献８】Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ及びＵｌｌｒｉｃｈ（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９：３８３−３９１
【非特許文献９】Ｆａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：４５３−４８１
【非特許文献１０】Ｃｈａｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３５：８８−８９
【非特許文献１１】Ｇｅｉｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５：１８５．１９２
【非特許文献１２】Ｆｌａｎａｇａｎ及びＬｅｄｅｒ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：１８５−１９４
【非特許文献１３】Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：１７５−１８３
【非特許文献１４】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：２２５−２３３
【非特許文献１５】Ｚｓｅｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６３：２１３−２２４
【非特許文献１６】Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１１３−１２２
【非特許文献１７】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６：９８９−９９９
【非特許文献１８】Ａｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６：２５７−２７０
【非特許文献１９】Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ及びＲｕｂｉｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：２７１−２８１
【非特許文献２０】Ｓｈｉｌｏ（１９９２）Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ６：２９１５−２９２２
【非特許文献２１】Ｚｉｐｕｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５７：３８１−３８９
【非特許文献２２】Ｆａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：４５３−４８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  ｅｒｂＢ族には数多くの仲間があるにもかかわらず、これらの分子はすべて、リガンドのはっきりしない孤児のレセプタとされていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明の内、請求項１に記載された発明は、分離された及び／又は組換え体であるＣＤＧＦポリペプチドである。【００１０】  請求項２に記載された発明は、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すアミノ酸配列又はその一部分に対して少なくとも７０パーセント相同のＣＤＧＦアミノ酸配列を含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１１】  請求項３に記載された発明は、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに相当するＥＧＦ様ドメインを含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１２】  請求項４に記載された発明は、哺乳類のＣＤＧＦ遺伝子に対して緊縮条件下で交雑する核酸により符号化されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１３】  請求項５に記載された発明は、配列同定番号第２番、第４番又は第７番のいずれかの示すＣＤＧＦたんぱく質に特異的な抗体に対して交差反応性のアミノ酸配列を含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１４】  請求項６に記載された発明は、ｅｒｂＢレセプタに特異的に結合する、請求項１又は４のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１５】  請求項７に記載された発明は、ｅｒｂＢレセプタがｅｒｂＢ４である、請求項２、３、５又は６のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１６】  請求項８に記載された発明は、ｅｒｂＢ型レセプタを発現する細胞の細胞活性を変更する、請求項２、３、５又は６のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１７】  請求項９に記載された発明は、前記細胞の増殖、分化、細胞対細胞の接触及び生存率のうち少なくとも一つを変更する、請求項８に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１８】  請求項１０に記載された発明は、前記ｅｒｂＢ型レセプタの媒介する細胞内シグナル形質導入経路を刺激する、請求項８に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００１９】  請求項１１に記載された発明は、前記ｅｒｂＢ型レセプタの媒介する細胞内シグナル形質導入経路に拮抗する、請求項８に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２０】  請求項１２に記載された発明は、前記ｅｒｂＢ型レセプタのリン酸化を誘発する、請求項２、３、５又は６のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２１】  請求項１３に記載された発明は、可溶性、かつ約７８乃至８３ｋＤの分子重量を有する、請求項１乃至５のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２２】  請求項１４に記載された発明は、可溶性、かつ約３１乃至３６ｋＤの分子重量を有する、請求項１乃至５のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２３】  請求項１５に記載された発明は、前記ＣＤＧＦ遺伝子がヒトＣＤＧＦ遺伝子である、請求項４に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２４】  請求項１６に記載された発明は、前記ヒトＣＤＧＦ遺伝子が、配列同定番号第６番の示すコーディング配列を含む、請求項１５に記載のＣＤＧＦポリペプチドで���る。【００２５】  請求項１７に記載された発明は、配列同定番号第１番、第５番及び第６番のいずれかの表す核酸配列に緊縮条件下で交雑する核酸により符号化される、請求項４に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２６】  請求項１８に記載された発明は、配列同定番号第１番のヌクレオチド１８０乃至６９５又はヌクレオチド８７０乃至９２９の少なくとも一つに相当する核酸配列に緊縮条件下で交雑する核酸により符号化される、請求項４に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２７】  請求項１９に記載された発明は、前記ＥＧＦ様ドメインが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも７０パーセント相同である、請求項３に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２８】  請求項２０に記載された発明は、前記ＥＧＦ様ドメインが、一般式ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣで表されるアミノ酸を含む、請求項３に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００２９】  請求項２１に記載された発明は、前記ＣＤＧＦアミノ酸配列が、配列同定番号第２番のアミノ酸残基１乃至３１４に相当する配列又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３０】  請求項２２に記載された発明は、前記ＣＤＧＦアミノ酸配列が、配列同定番号第４番のアミノ酸残基１乃至３３０に相当する配列又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３１】  請求項２３に記載された発明は、炭水化物成分を含むように翻訳後に変更された、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３２】  請求項２４に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチド配列に加えて、前記ＣＤＧＦポリペプチドに関係のないアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド配列を更に含む融合たんぱく質である、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３３】  請求項２５に記載された発明は、前記融合たんぱく質が、前記融合たんぱく質の存在を検出する検出可能な標識として、又は、前記融合たんぱく質を固定するマトリックス結合ドメインとして働くポリペプチドを、第二のポリペプチド配列として含む、請求項２４に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３４】  請求項２６に記載された発明は、自然に結び付いたその他の細胞たんぱく質を概ね持たない、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３５】  請求項２７に記載された発明は、組換えポリペプチドである、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３６】  請求項２８に記載された発明は、哺乳類を源とする、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３７】  請求項２９に記載された発明は、ヒトを源とする、請求項１に記載のＣＤＧＦポリペプチドである。【００３８】  請求項３０に記載された発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載のＣＤＧＦポリペプチドのエピトープに対して特異的反応性を有する抗体製剤である。【００３９】  請求項３１に記載された発明は、組換えＣＤＧＦポリペプチドを符号化するポリペプチド・コーディング配列を含む概ね純粋な核酸である���【００４０】  請求項３２に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すアミノ酸配列又はその一部分に対して少なくとも７０％相同のＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、かつ、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項３１に記載の核酸である。【００４１】  請求項３３に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに相当するＥＧＦ様ドメインを含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項３１に記載の核酸である。【００４２】  請求項３４に記載された発明は、前記ポリペプチド・コーディング配列が、哺乳類のＣＤＧＦ遺伝子に対して緊縮条件下で交雑するＣＤＧＦコーディング配列を含む、請求項３１に記載の核酸である。【００４３】  請求項３５に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの示すＣＤＧＦたんぱく質に特異的な抗体に対して交差反応性のアミノ酸配列を含むと共に、ｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、請求項３１に記載の核酸である。【００４４】  請求項３６に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドがｅｒｂＢレセプタに特異的に結合する、請求項３１又は３４のいずれかに記載の核酸である。【００４５】  請求項３７に記載された発明は、前記ｅｒｂＢレセプタがｅｒｂＢ４である、請求項３２、３３、３５又は６３のいずれかに記載の核酸である。【００４６】  請求項３８に記載された発明は、前記ＣＤＧＦ遺伝子がヒトＣＤＧＦ遺伝子である、請求項３４に記載の核酸である。【００４７】  請求項３９に記載された発明は、前記ヒトＣＤＧＦ遺伝子が配列同定番号第６番の示すコーディング配列を含む、請求項３８に記載の核酸である。【００４８】  請求項４０に記載された発明は、前記ＣＤＧＦコーディング配列が、配列同定番号第１番、第５番及び第６番のいずれかの表す核酸配列に緊縮条件下で交雑する、請求項３４に記載の核酸である。【００４９】  請求項４１に記載された発明は、前記ＣＤＧＦコーディング配列が、配列同定番号第１番のヌクレオチド１８０乃至６９５又はヌクレオチド８７０乃至９２９の少なくとも一つに相当する核酸配列に緊縮条件下で交雑する、請求項３４に記載の核酸である。【００５０】  請求項４２に記載された発明は、前記ＥＧＦ様ドメインが、配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかの表すＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも７０パーセント相同である、請求項３３に記載の核酸である。【００５１】  請求項４３に記載された発明は、前記ＥＧＦ様ドメインが、一般式ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣで表されるアミノ酸を含む、請求項３３に記載の核酸である。【００５２】  請求項４４に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第２番のアミノ酸残基１乃至３１４に相当するＣＤＧＦアミノ酸配列、又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項３１に記載の核酸である。【００５３】  請求項４５に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、配列同定番号第４番のアミノ酸残基１乃至３３０に相当するＣＤＧＦアミノ酸配列、又は分泌シグナルペプチドを欠いたその配列を含む、請求項３１に記載の核酸である。【００５４】  請求項４６に記載された発明は、配列同定番号第１番、第３番又は第６番の少なくとも６０の連続したヌクレオチドが表す配列を有する核酸プローブに緊縮条件下で交雑する、請求項３１に記載の核酸である。【００５５】  請求項４７に記載された発明は、前記核酸を前記組換えＣＤＧＦポリペプチドの発現ベクタとして用いるのに適切なものにするために、前記ポリペプチドコーディング配列に操作可能に結び付けられた転写調節配列を更に含む、請求項３１に記載の核酸である。【００５６】  請求項４８に記載された発明は、請求項３１に記載の前記核酸を含む、原核細胞及び真核細胞のうち少なくとも一方において複製を作ることが可能である発現ベクタである。【００５７】  請求項４９に記載された発明は、請求項４８に記載の発現ベクタで形質移入させた、組換えＣＤＧＦポリペプチドを発現する宿主細胞である。【００５８】  請求項５０に記載された発明は、請求項４９に記載の前記細胞を細胞培地で培養して組換えＣＤＧＦポリペプチドを発現させ、前記細胞培養物から前記組換えＣＤＧＦポリペプチドを分離するステップを含む、組換えＣＤＧＦポリペプチドを生成する方法である。【００５９】  請求項５１に記載された発明は、請求項３１に記載の前記核酸を含む移植遺伝子を持つか、あるいは、一つ又は複数の内生ＣＤＧＦ遺伝子が破壊された、組換えにより操作された細胞を含む遺伝子導入動物である。【００６０】  請求項５２に記載された発明は、（ｉ）請求項１３１７の前記核酸を含むと共に、真核細胞において前記組換えＣＤＧＦポリペプチドの発現を起こさせるために転写調節配列に操作可能に結び付けられた遺伝子構造物であって、前記組換えＣＤＧＦポリペプチドはｅｒｂＢ型レセプタへの結合能力を特徴とするものである、遺伝子構造物と、（ｉｉ）前記遺伝子構造物を細胞に運搬すると共に、前記細胞に前記遺伝子構造物で形質移入させる遺伝子運搬組成物とを含む、組換え体形質移入系である。【００６１】  請求項５３に記載された発明は、前記遺伝子運搬組成物が、組換えウィルス粒子、リポソーム、及びポリ−陽イオン性核酸結合物質のいずれかから選択される、請求項５２に記載の組換え体形質移入系である。【００６２】  請求項５４に記載された発明は、配列同定番号第１番、第３番又は第６番のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生変異体の少なくとも２０の連続したヌクレオチドに緊縮条件下で交雑するヌクレオチド配列の一領域を含む、概ね精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマである。【００６３】  請求項５５に記載された発明は、配列同定番号第１番、第３番又は第６番のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生変異体の少なくとも６０の連続したヌクレオチドに緊縮条件下で交雑する、請求項５４に記載のプローブ／プライマである。【００６４】  請求項５６に記載された発明は、配列同定番号第１番のヌクレオチド１８０乃至６９５又はヌクレオチド８７０乃至９２９の少なくとも一つに相当するセンス又はアンチセンス核酸配列に緊縮条件下で交雑す��、請求項５４に記載のプローブ／プライマである。【００６５】  請求項５７に記載された発明は、付着した検出可能な標識群を更に含む、請求項５４に記載のプローブ／プライマである。【００６６】  請求項５８に記載された発明は、細胞の試料中で、ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する核酸のレベルを測定する請求項５４に記載のプローブ／プライマを含む、ＣＤＧＦｍＲＮＡの写しを含む細胞を検出するテスト器具である。【００６７】  請求項５９に記載された発明は、ｉ．ＣＤＧＦポリペプチド、ｅｒｂＢレセプタたんぱく質、及びテスト化合物を化合させるステップと、ｉｉ．前記ＣＤＧＦポリペプチド及び前記ｅｒｂＢレセプタたんぱく質を含む錯体の形成を検出するステップとを含み、前記テスト化合物がある状態のときの前記錯体の形成の変化は、ＣＤＧＦとｅｒｂＢレセプタとの間の相互作用の調節物質であることを示すものである、ＣＤＧＦポリペプチドのｅｒｂＢ型レセプタとの結合を調節するテスト化合物をスクリーニングする検定である。【００６８】  請求項６０に記載された発明は、前記ｅｒｂＢ型レセプタがｅｒｂＢ４レセプタである、請求項５９に記載の検定である。【００６９】  請求項６１に記載された発明は、好ましくない細胞増殖又は分化を特徴とする疾患の危険性のある、一つの細胞又は複数の細胞を判別する診断的検定であって、（ｉ）ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する遺伝子の異常な変更又は変異、（ｉｉ）前記遺伝子の誤発現、（ｉｉｉ）異常なレベルの可溶性ＣＤＧＦたんぱく質、のうち少なくとも一つを特徴とする遺伝子の病変があるかないかを、細胞試料中で検出するステップを含む、検定である。【００７０】  請求項６２に記載された発明は、前記病変の検出が、ｉ．前記遺伝子のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生変異体、あるいは前記ＣＤＧＦ遺伝子に自然に結び付いた５’又は３’フランキング配列に交雑するヌクレオチド配列の一領域を含む核酸を含む診断用プローブを提供するステップと、ｉｉ．前記プローブを前記細胞試料の核酸に化合させるステップと、ｉｉｉ．前記遺伝子からの一つ又は複数のヌクレオチドの削除、前記遺伝子への一つ又は複数のヌクレオチドの追加、前記遺伝子の一つ又は複数のヌクレオチドの置換、前記遺伝子の全部又は一部の総体的染色体再配列、前記遺伝子のｍＲＮＡ写しレベルの総体的変化、又は前記遺伝子のｍＲＮＡ写しの非野生型スプライシング・パターン、のうち少なくとも一つの存在を、前記細胞核酸への前記プローブの交雑により、検出するステップとを含む、請求項６１に記載の検定である。【００７１】  請求項６３に記載された発明は、前記プローブの交雑が、前記プローブ及び細胞核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にさらすステップと、増幅された生成物中に異常を検出するステップとを更に含む、請求項６２に記載の検定である。【００７２】  請求項６４に記載された発明は、前記プローブの交雑が、前記プローブ及び細胞核酸を結紮連鎖反応（ＬＣＲ）にさらすステップと、増幅された生成物中に異常を検出するステップとを更に含む、請求項６２に記載の検定である。【００７３】  請求項６５に記載された発明は、遺伝子の病変の検出が、組織試料の細胞に関連する、��び／又は、体液中の可溶性たんぱく質として、ＣＤＧＦたんぱく質、又はその一部分があるかないかを検出するステップを含む、請求項６１に記載の検定である。【００７４】  発明の概要  本発明は、以下「小脳由来成長因子」又は「ＣＤＧＦ」と呼称する新規なｅｒｂＢレセプタ・リガンド族の発見に関し、このたんぱく質は、明らかに、脊椎動物の分化組織の秩序ある空間構成の形成及び維持に幅広く関わるものであり、また、試験管内及び生体内の両方において様々な脊椎動物組織のアレイを作成及び／又は維持するために用いることができるものである。【００７５】  概略的には、本発明はＣＤＧＦポリペプチド、例えば、好ましくはＣＤＧＦポリペプチドの概ね純粋な製剤、又は組換えにより発現したＣＤＧＦポリペプチドを特徴とする。ある好適な実施例においては、当該ポリペプチドは、ｅｒｂＢレセプタによるシグナル形質導入を作動させる又は拮抗し得るものであるが、ｅｒｂＢレセプタに対するその結合に関連する生物学的活性を有する、例えばｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３又はｅｒｂＢ４レセプタに対する結合能力を保持したものである。本ポリペプチドには、配列同定番号第２番に示す哺乳類のＣＤＧＦポリペプチド（ＣＤＧＦ−１）と同一の又は相同のアミノ酸配列が含まれていてもよい。【００７６】  同様に、本ポリペプチドには、配列同定番号第４番又は第７番に示す哺乳類のＣＤＧＦポリペプチド（ＣＤＧＦ−２）と同一又は相同のアミノ酸配列が含まれていてもよい。例えば、本ポリペプチドは配列同定番号第２番、第４番及び第７番のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％相同のアミノ酸配列を有することが好ましいが、例えば８０％、８５％、９０％又は９５％といった、より高い配列相同性も考察されている。本ポリペプチドには、配列同定番号第２番又は第４番で表される全長たんぱく質を含んでいてもよく、あるいはこのたんぱく質の断片を含んでいてもよいが、この断片の長さは、例えば少なくとも５，１０，２０、５０又は１００のアミノ酸分であるであろう。断片の例を配列同定番号第５番又は第７番に示す。好適なＣＤＧＦポリペプチドは、例えば配列同定番号第２番又は第４番のＣｙｓ２５３からＣｙｓ２８９、又は、配列同定番号第７番のＣｙｓ１０１からＣｙｓ１３７、あるいはこれらに対して相同の配列を含む、例えば一般式ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣで表されるＥＧＦ様モチーフ等のＥＧＦ様モチーフを含むものである。更により好適なＥＧＦ様ドメインは一般式ＫＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣＬＥＫＬＰＬＲＬ又はＫＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣＱＱＦＡＭＶＮＦで表されるものである。更にもう一つの好適なＣＤＧＦポリペプチドには、例えば配列同定番号第２番の残基１４３から３１４に相当するアミノ酸残基、又は配列同定番号第４番のアミノ酸残基１４３から３３０、又は配列同定番号第７番のアミノ酸残基１から１８２を含むポリペプチド等、コア配列モチーフが含まれる。【００７７】  ＣＤＧＦ−１ポリペプチドの例には、例えばシグナルペプチドを持つ分子重量約８２ｋ���のもの、及びシグナルペプチドを持たない約７９ｋＤのもの等、分子重量約７８−８３ｋＤのコアアミノ酸配列を有する膜関連ポリペプチドや、例えばシグナルペプチドを持つ分子重量約３５ｋＤのもの及びシグナルペプチドを持たない分子重量約３２ｋＤのもの等、分子重量約３１−３６ｋＤのコアアミノ酸配列を有する可溶性のＣＤＧＦ−１ポリペプチドがある。【００７８】  ＣＤＧＦ−２ポリペプチドの例には、例えばシグナルペプチドを持つ分子重量約３６ｋＤのもの、及びシグナルペプチドを持たない約３４ｋＤのもの等、分子重量約３２−３８ｋＤのコアアミノ酸配列を有する可溶性のＣＤＧＦ−２ポリペプチドがある。【００７９】  ポリペプチドに糖付加してもよく、あるいは、これが生成される発現系の働きによるか、又はたんぱく質配列を糖付加を妨げるように変更することにより、還元炭水化物類似体を提供することができる。同様に、内因性のシグナル配列（これはたとえたんぱく質の前の形で存在していたとしても切り取られることが多い）を欠いた、又は膜内外及び細胞質ドメインを欠いたＣＤＧＦポリペプチドを生成することができる。後者の場合、これらのＣ末端ドメインが落ちたことでたんぱく質が可溶性の型になっていてもよい。具体的には、配列同定番号第２番のＬｅｕ３１７までのアミノ酸残基Ｃ末端を欠いたポリペプチド（膜内外ドメインで先端の切り取られたＣＤＧＦ−１の等価物）が好ましいが、配列同定番号第２番のＣｙｓ２８９及びＴｈｒ３１８の等価物の間のいずれかの箇所で先端の切り取られたポリペプチドも考察されている。膜内外ドメイン及び細胞質ドメインの両方を明らかに欠いたＣＤＧＦ−２成熟アミノ酸配列は、ポリペプチド配列を更に操作しなくとも、特定の条件の下では可溶性であると考えられる。【００８０】  更に、当該ＣＤＧＦポリペプチドは分泌シグナル配列を含んでいてもよいが、成熟ＣＤＧＦポリペプチドは、このシグナル配列を除去する能力のある細胞上で発現することから、この分泌シグナル配列を欠いていてもよい。当該のＣＤＧＦポリペプチドの成熟した型は、例として、ポリペプチドのＮ末端から５から２３のアミノ酸残基を欠いたものである。ある好適な実施例では、成熟した、可溶性のＣＤＧＦ−１ポリペプチドは配列同定番号第２番のＳｅｒ２４−Ｌｙｓ３１４に相当するアミノ酸配列を有し、そして成熟した、可溶性のＣＤＧＦ−２ポリペプチドは配列同定番号第４番のＳｅｒ２４−Ａｓｎ３３０に相当するアミノ酸配列を有する。【００８１】  更に、以下に述べるように、例えば当該ポリペプチドがｅｒｂＢレセプタを発現する細胞の成長及び／分化を調節することができるものである等、本ポリペプチドは自然発生型のたんぱく質の生物学的活性の作動物質（例えば擬態）でも、又は拮抗物質でもよい。
ある好適な実施例では、当該ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を有するペプチドのアミノ酸配列は、配列同定番号第２番、第４番又は第７番の配列とは異なっていてもよいが、このような違いにより、天然ＣＤＧＦたんぱく質と同じ又は同様の態様で機能するか、又は天然ＣＤＧＦたんぱく質と同じ又は同様の性質を有する変性たんぱく質が生じる。しかしながら、自然発生したたんぱく質の相同体であって、自然発生したたんぱく質の正常な生理学的役割に対して拮抗するものが考察されている。例えば、この相同体は、自然発生した型のＣＤＧＦの、例えば発生又は成長の調節された遺伝子等、遺伝子発現を調節する能力に干渉することができるものでもよい。【００８２】  更に別の好適な実施例では、ＣＤＧＦたんぱく質は、例えばＣＤＧＦに関係のないアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド等、第二ポリペプチド部分を含んだ組換え融合たんぱく質であり、例えば第二ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第二ポリペプチド部分が、アルカリホスファターゼ等の酵素活性であると共にＣＤＧＦレセプタを検出するための試薬である。別の実施例では、第二ポリペプチド配列は、ＣＤＧＦ部分のその同系のレセプタへの結合により、ある細胞を標的にすることのできる細胞毒性又は細胞増殖抑制性のたんぱく質を提供するものである。【００８３】  本発明の更に別の態様は、免疫原製剤中のＣＤＧＦポリペプチドを含む免疫原に関しており、同免疫原は、例えば体液反応、例えば抗体反応、例えば細胞反応など、あるＣＤＧＦポリペプチドに特異的な免疫反応を引き出すことのできるものである。好適な実施例では、免疫原には、配列同定番号第２番、配列同定番号第４番又は配列同定番号第７番の表すたんぱく質から得た、例えば特有決定基などの抗原決定基が含まれる。【００８４】  本発明の更に別の態様はＣＤＧＦ免疫原のエピトープに対して特異的反応性を有する抗体製剤を特徴とする。好適な抗体は、ＣＤＧＦたんぱく質とニューレグリンとを区別することができるものである（例えば、少なくとも一桁、二桁又は三桁大きいニューレグリンたんぱく質に対して、ＣＤＧＦたんぱく質についてｋａ’ｓにより）。【００８５】  本発明のもう一つの態様はＣＤＧＦポリペプチドを符号化するヌクレオチド配列を有する分離された核酸を提供する。好適な実施例では、符号化されたポリペプチドは、ｅｒｂＢレセプタたんぱく質と特異的に結合し、及び／又は、ｅｒｂＢレセプタの媒介するシグナル形質導入という事象を作動させるか、又は拮抗することができるものである。核酸のコーディング配列は、配列同定番号第１番、第３番又は第６番の示すｃＤＮＡのコーディング配列（又はその一部分）と同一でもよい一配列を含んでいてもよく、あるいは、この配列に単に相同であってもよい。例えば、ＣＤＧＦを符号化する配列は、配列同定番号第１番、第３番及び第６番のいずれかのヌクレオチドに少なくとも７０％相同の配列を有していると好ましいが、例えば８０％、９０％又は９５％等、より高い配列相同性も考察されている。核酸の符号化するポリペプチドに、全長たんぱく質である配列同定番号第２番、第４番又は第７番の表すアミノ酸配列が含���れていてもよく、あるいは、この核酸の一断片が含まれていてもよいが、この断片は、例えば長さで少なくとも５、１０、２０、５０又は１００のアミノ酸（例えば配列同定番号第５番のＣＤＧＦ−２の断片等）であろう。好適なＣＤＧＦポリペプチドには、例えば、一般式ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣで表されるＥＧＦ様モチーフ等のＥＧＦ様モチーフが含まれる。核酸の符号化するポリペプチドは、自然発生型のたんぱく質の生物学的活性の作動物質（例えば擬態）でも、あるいは拮抗物質でもよい。【００８６】  更に、いくつかの好適な実施例では、当該ＣＤＧＦ核酸は、例えば少なくとも一つの転写プロモータ又は転写エンハンサ配列等、転写調節配列を含むこととなろうが、ただしこの調節配列はＣＤＧＦ遺伝子配列に操作可能に結び付けられる。このような調節配列を用いて、ＣＤＧＦ遺伝子配列を発現ベクタとして用いるのに適したものにすることができる。【００８７】  更に好適な実施例では、当該核酸は、緊縮条件下で、配列同定番号第１番の少なくとも１２の連続したヌクレオチド、好ましくは配列同定番号第１番の少なくとも２０の連続したヌクレオチド、より好ましくは配列同定番号第１番の少なくとも４０の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブに交雑するものである。例えば、配列同定番号第１番の（スペーサ１に相当する）ヌクレオチド１８０−６０５及び／又は（スペーサ２に相当する）ヌクレオチド８７０−９２９、あるいはこれらに対して相補性の配列に特異的に交雑する核酸が提供される。【００８８】  更に好適な実施例では、当該の核酸は、緊縮条件下で、配列同定番号第３番の少なくとも１２の連続したヌクレオチド、好ましくは配列同定番号第３番の少なくとも２０の連続したヌクレオチド、より好ましくは配列同定番号第３番の少なくとも４０の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブに交雑するものである。例えば、配列同定番号第１番の（スペーサ１に相当する）ヌクレオチド１−４２６及び／又は（スペーサ２に相当する）ヌクレオチド６９１−７５０、あるいはこれらに対して相補性の配列に特異的に交雑する核酸が提供される。【００８９】  更に好適な実施例では、当該の核酸は、緊縮条件下で、配列同定番号第６番の少なくとも１２の連続したヌクレオチド、好ましくは配列同定番号第６番の少なくとも２０の連続したヌクレオチド、より好ましくは配列同定番号第６番の少なくとも４０の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブに交雑するものである。例えば、配列同定番号第１番の（スペーサ２の一部分に相当する）ヌクレオチド１−１００又はこれに対して相補性の配列に特異的に交雑する核酸が提供される。【００９０】  本発明はまた、移植遺伝子を有する例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、カエル又はブタ等のヒト以外の遺伝子導入動物、例えばここで述べるＣＤＧＦ遺伝子の異種型を含む（又は好ましくは発現する）動物や、内因性のＣＤＧＦ遺伝子を誤発現している動物、例えば問題のＣＤＧＦたんぱく質の発現が断たれている動物を特徴とする。このような遺伝子導入動物は、突然変異した又は誤発現したＣＤＧＦ対立遺伝子を含む細胞又は組織の異常を研究したり、薬品のスクリーニングに用いられたりする動物モデルとして役立てることができる。【００９１】  本発明はまた、概ね精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマを提供するが、ただしこのオリゴヌクレオチドには、配列同定番号第１番、第３番及び／又は第６番のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生突然変異体の少なくとも１０の連続したヌクレオチドに緊縮条件下で交雑するヌクレオチド配列の一領域、が含まれる。好適な実施例では、プローブ／プライマは更に、それに付着した検出可能な標識群を含む。この標識群は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、及び酵素共同因子のいずれかから選択することができる。本発明のプローブは、形質転換した細胞を判別する診断検査器具の一部として用いることができ、例えば患者から分離した細胞試料中において、当該ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する核酸レベルを検出したり、細胞中のＣＤＧＦｍＲＮＡレベルを測定したり、あるいはゲノムＣＤＧＦ遺伝子が突然変異を起こしたか消去されたかを調べるのに用いることができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドが長さで少なくとも１０のヌクレオチドであるとよいが、例えば長さで２０，３０，５０，１００，又は１５０のヌクレオチドのプライマも考察されている。【００９２】  更に別の態様では、本発明は、ＣＤＧＦとｅｒｂＢレセプタとの間の相互作用に対する抑制物質、又は強化物質をテスト化合物についてスクリーニングするための検定を提供する。例としてその方法は、（ｉ）テスト化合物がない状態のときにはＣＤＧＦたんぱく質及びｅｒｂＢレセプタが相互作用可能であるような条件下でｅｒｂＢレセプタ、ＣＤＧＦポリペプチド、及びテスト化合物を化合させるステップと、（ｉｉ）ＣＤＧＦたんぱく質及このレセプタを含む錯体の形成を検出するステップとを含む。（テスト化合物がないときに見られるものと比べて）テスト化合物のあるときに錯体の形成に、例えば減少しているなどの大きな統計上の変化があれば、ＣＤＧＦとレセプタとの相互作用に、例えば抑制などの調節があることが分かる。例えば、細胞溶解産物及び再構成たんぱく質混合液から選択される無細胞系中でＣＤＧＦたんぱく質及びレセプタたんぱく質を化合させ、テスト化合物に接触させるプライマリ・スクリーン（原語：ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎ）が提供される。【００９３】  本発明のもう一つの態様は、ＣＤＧＦたんぱく質に反応したある細胞の増殖を引き起こす、及び／又は生存率を高めることとなる分化させられた状態を、その細胞をＣＤＧＦ作動物質又はＣＤＧＦ拮抗物質に接触させることで誘発及び／又は維持する方法に関連する。例えば、本発明は、例えば生存又は分化状態がＣＤＧＦの働きに依存するニューロン細胞又はその他の細胞を培養する場合など、細胞培養技術に応用することができる。更にＣＤＧＦ作動物質又は拮抗物質を治療的介入、例えば中枢神経系及び末梢神経系の両方のニューロン及びその他の神経細胞の生存率及び維持率を高めたり、また、外胚葉パターニングや特定の中胚葉及び内胚葉分化プロセスなどのその他脊椎動物の器官形成経路に影響を及ぼしたりする際に、用いることができる。【００９４】  本発明のもう一つの態様は、��トの患者等、ある被験者に、好ましくない細胞の増殖又は分化のアブヘレント（原語：ａｂｈｅｒｅｎｔ）な制御を特徴とする疾患の危険性があるかどうかを判定する方法を提供するものである。この方法は、（ｉ）例えば配列同定番号第２番、第４番又は第７番あるいはこれらの相同体等のＣＤＧＦたんぱく質を符号化する遺伝子の突然変異、又は（ｉｉ）ＣＤＧＦ遺伝子の誤発現のうち少なくとも一つを特徴とする遺伝子の病変があるかないかを、被験者の組織において検出することを含む。好適な実施例では、遺伝子の病変の検出は、ＣＤＧＦ遺伝子からの一つ又は複数のヌクレオチドの削除、この遺伝子に対する一つ又は複数のヌクレオチドの追加、この遺伝子の一つ又は複数のヌクレオチドの置換、この遺伝子における総体的染色体再配列、この遺伝子の伝令ＲＮＡの写しのレベル変化、この遺伝子の伝令ＲＮＡの写しに非野生種のスプライシング・パターンがあること、又はこのたんぱく質の非野生種のレベル、のうち少なくとも一つが存在することを確認することを含む。【００９５】  例えば、遺伝子の病変の検出には、（ｉ）あるＣＤＧＦ遺伝子のセンス又はアンチセンス配列、例えば配列同定番号第１番、第３番、第５番又は第７番の表す核酸あるいはこれらの自然発生突然変異体、あるいは、そのＣＤＧＦ遺伝子に自然に結び付いた５’又は３’フランキング配列等、に交雑するヌクレオチド配列の一領域を含んだオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマを提供するステップと、（ｉｉ）このプローブ／プライマを組織の核酸に暴露するステップと、（ｉｉｉ）プローブ／プライマを組織の核酸に交雑させることで遺伝子の病変があるかないかを検出するステップとが含まれ、例えばこの病変の検出ステップには、ＣＤＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列及び選択に応じてフランキング核酸配列のヌクレオチド配列をプローブ／プライマを用いて調べることが含まれる。例えば、プローブ／プライマをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は結紮反応（ＬＣＲ）で利用することができる。変更例では、ＣＤＧＦたんぱく質のレベルを、ＣＤＧＦたんぱく質に対して特異的免疫反応性を有する抗体を用いた免疫検定で検出する。【００９６】  本発明の実施にあたっては、特にそうでないと言及していない限り、当業において通常の技術範囲の細胞生物学、細胞培養学、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ学、及び免疫学を利用することとなるであろう。このような技術は文献に十二分に説明されている。例えば分子クローニング・研究室用手引，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡのクローニング，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．，１９８５）；オリゴヌクレオチドの合成（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；核酸の交雑（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；転写及び翻訳（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ  ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；動物細胞の培養（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，���ｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；固定細胞及び酵素（ＪＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，分子クローニングへの実践的ガイド（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓ，酵素学における方法（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；哺乳類細胞のための遺伝子転移ベクタ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；酵素学における方法，Ｖｏｌｓ  １５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．），細胞及び分子生物学における免疫化学的方法（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；実験免疫学ハンドブック，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；マウスの胚の操作，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。【００９７】  本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な記載、並びに請求の範囲から明白となるであろう。
【発明の効果】
【００９８】  本発明に係る「小脳由来成長因子」又は「ＣＤＧＦ」と呼称する新規なｅｒｂＢレセプタ・リガンド族（たんぱく質）は、明らかに、脊椎動物の分化組織の秩序ある空間構成の形成及び維持に幅広く関わるものであり、試験管内及び生体内の両方において様々な脊椎動物組織のアレイを作成及び／又は維持するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】図１Ａは、ラットのＣＤＧＦｃＤＮＡの配列、特に、推定されるラットのＣＤＧＦ−１のアミノ酸配列、及びＣＤＧＦ−２のＥＧＦ様ドメインを示す。ＣＤＧＦ−１については、矢印を付けた下線は推定上のシグナル配列を示すものである。免疫グロブリン様ドメインは点線の四角で囲まれている。太い線の四角はＥＧＦ様ドメインを示す。ＥＧＦ様ドメインの六つの特徴的なシステインを星印で示す。考えられるＮ−糖付加部位は矢印の頭部で示す。推定上の膜内外領域は下線が引かれている。一つの矢印は考えられる蛋白分解部位を示すものである。ＣＤＧＦ−２については、７７のヌクレオチドの付加エクソンを矢印間の下線で示す。ＥＧＦ様ドメインは太線の四角で囲まれている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ２の部分の間のアミノ酸配列を整列させた図であり、二つの転写生成物の間でスプライシングの違いがあることを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣＤＧＦ−１の構造上のドメイン及びモチーフを概略的に示した図である。
【図２Ａ】図２Ａ及２Ｂは、ＣＤＧＦ間及び関連するたんぱく質間の配列相似性を示した図である。図２Ａは、ＣＤＧＦ−１、ヘレグリンβ１（ヒト）、及びＧＧＦＩＩ（ヒト）のＮ末端のアミノ酸配列を整列させた図である。点は配列を整列させたときのすきまを表す。Ｉｇ様ドメインは四角で囲まれている。太線の四角で囲まれた箇所はＥＧＦ様ドメインを表す。推定上の膜内外ドメインには下線が引かれている。同一のアミノ酸残基は背景を黒くして白い活字で示し、相似のアミノ酸残基は灰色で陰を付けてある。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＤＧＦのＥＧＦ様ドメインと、ニューレグリン（ＨＲＧα１、ヒトヘレグリンα１：ＨＲＧβ１，ヒトヘレグリンβ１；ＡＲＩＡ、ニワトリ）のうちの選択されたものと、ラットの上皮成長因子との間の配列を比較した図である。二つ又は三つ以上の遺伝子に共通のアミノ酸残基は背景を黒くして白い活字で示してある。六つの特徴的なシステイン残基は星印で示されている。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、ラットの組織におけるＣＤＧＦの写しの発現を示す図である。図３Ａは、約２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを各列に加えた、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料を用いたノーザン・ブロット分析である。三つの検出された帯域（３，３．８，６ｋｂ）を片側に示す。Ｌｖは肝臓、Ｌは肺臓、Ｍは骨格筋、Ｂは脳、Ｓｃは脊髄、を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂはラットの組織におけるＣＤＧＦｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、組換えＣＤＧＦ−１たんぱく質は、ｅｒｂＢ４を通じてｅｒｂＢ族のレセプタのチロシン・リン酸化を誘発することを示す。図４Ａでは、ＣＤＧＦ−１が、ＭＢ−ＭＤＡ４５３及びＴ４７Ｄ細胞株でｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４のチロシン・リン酸化を誘発する。
【図４Ｂ】図４Ｂでは、ｅｒｂＢレセプタを通じたＣＤＧＦ−１のシグナリングが示されている。ＣＤＧＦ−１は、ｅｒｂＢレセプタのうち規定の仲間で形質移入させた細胞株で調べた。ｅｒｂＢレセプタを持つ細胞のみが活性化した。Ｅ１はＥＧＦレセプタ、Ｅ２はｅｒｂＢ２、Ｅ３はｅｒｂＢ３、Ｅ４はｅｒｂＢ４である。免疫沈降抗体は（ＩＰ  Ａｂ）で、ａ１は抗ＥＧＦレセプタ、ａ２は抗ｅｒｂＢ２、ａ３は抗ｅｒｂＢ３、ａ４は抗ｅｒｂＢ４である。Ｂはベータセルリン（原語：ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、Ｈｒｇはヘレグリンβ１ＥＧＦ様ドメイン、ＴＧＦα；ＴＧＦα；ＣＭはＣＤＧＦ−１調整培地；−は負の調節培地を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】  発明の詳細な説明  レセプタ・チロシン・キナーセにとってリガンドである成長因子は幅広い細胞の活性を支配している。性質が明らかにされてきたこれらのリガンドは、そのほとんどすべてが、発生上及び／又は生理学上重要な機能を持ち、そして少なくともいくつかの場合において臨床上も有用であることが知られている。未だに未知のリガンドが数多く存在することを、その構造から細胞表面レセプタであると思われながら、まだリガンドが解明されていないチロシン・キナーゼがここ数年の間に数多く発見されていることが意味している。これらの孤児のレセプタの発見が急速に行われてこれたのは、多くの場合、キナーゼ触媒ドメインの強力な配列保存力を利用したポリメラーゼ連鎖反応等の技術を利用したことによる。しかしながら、対照的に、レセプタ・チロシン・キナーゼのリガンドの判別は更に難しい。
【０１０１】  更に、細胞間のシグナリングが脊椎動物の発生全体に重要な役割を果たしていることは広く認められている。初期のパターニングの事象のいくつかに介在するシグナルの理解には大きな進歩がある。しかしながら、原腸胚形成及び初期の器官形成が進行するときに展開する重要な事象の多くを規制するシグナル、特に遺伝子プログラムの発現を支配する細胞対細胞のシグナリング分子についてはほとんど何も解明されていない。ｅｒｂＢ族のレセプタ（例えばｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、等々）の仲間等、たんぱく質チロシン・キナーゼ・レセプタはこの点で特に興味を引くが、それは特に、これらのレセプタのための発現ドメインが発生においてこれらの段階を含んでいるからである。
【０１０２】  いくつかのｅｒｂＢ族レセプタについて決定された発現パターンが意味するものは、初期の脊椎動物発生におけるこれらの分子の重要な役割である。特に、原腸胚形成及び初期の器官形成の段階の間のレセプタの発現タイミング及びパターンは、この段階において胚のパターニングに関係する重要な細胞相互作用にこれらのレセプタが果たす機能を示唆している。更に、ｅｒｂＢレセプタは、その発現パターンにより、胚及び成体の身体におけるほとんどすべての組織の発生及び維持に関連付けられてきた。例えば、ｅｒｂＢレセプタは神経系、精巣、骨格の軟骨モデル、歯の原基、脳下垂体の漏斗状部分、多種の上皮組織、肺臓、膵臓、肝臓及び腎臓組織を通じて検出されている。
【０１０３】  このような観察は、ｅｒｂＢ族のレセプタ・キナーゼの発生上及び生理学上の重要かつ特有な役割を示すものであるが、更に、これらの作用の解明に向けた進歩は、これらのリガンドに関する情報が不足しているために著しく阻まれてきた。今日までのところ、僅かに二、三のリガンドが判明したに過ぎない。例えば、４５ｋＤのたんぱく質ヘレグリン−α（ＨＲＧ−α）が、ｍＲＮＡ由来のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞ライブラリからクローン形成されたことが最近報告されている。加えて、関連するＨＲＧを符号化するいくつかの相補的ＤＮＡのクローンも明らかにされており、このＨＲＧはすべて、表皮成長因子（ＥＧＦ）族中のたんぱく質にある程度ではあるが相似である（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：１２０５）。
【０１０４】  更に、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）と呼ばれる、形質転換したラットの繊維芽細胞から分泌される４４ｋＤの糖蛋白をクローン形成させて発現させ（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｃｅｌｌ６９：５５９）、たものがｅｒｂＢレセプタに結合するということも報告されている。
【０１０５】  その他の分子でｅｒｂＢリガンドであると判明したものの中には、活性を誘発するアセチルコリン・レセプタ（″ＡＲＩＮ″，Ｃｏｒｆａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０：１６２４−１６２８）及びグリア成長因子（ＧＧＦ、Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３１２−３２８）がある。
【０１０６】  添付の例で述べるように、新規なｅｒｂＢレセプタ・リガンドを符号化する遺伝子が明らかにされ、この遺伝子の符号化する様々な写しがクローン形成された。この遺伝子をここでは「小脳由来成長因子」（ＣＤＧＦ）と呼称することにする。ＣＤＧＦ遺伝子の遺伝子生成物は少なくとも二つのイソフォーム（原語：ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在し、またＡＲＩＡ、ヘレグリン、ＮＤＦ又はＣＧＦたんぱく質に対して僅かに約５０％の相同性があるのみである。ＣＤＧＦ遺伝子から生じた写しの構造に基づけば、多種の哺乳類ＣＤＧＦイソフォーム間で共通の特徴は、例えばＥＧＦ様ドメインのコンセンサス配列ＣＮＥＴＡＫＳＹＣＶＮＧＧＶＣＹＹＩＥＧＩＮＱＬＳＣＫＣＰＸＧＸＸＧＸＲＣと同一又は相同性の配列を有するもの等のＥＧＦ様ドメインがあることである。
【０１０７】  更に、ＣＤＧＦはいくつかのｅｒｂＢレセプタと相互作用する。例えば、組換え型のＣＤＧＦ−１たんぱく質が生成されたが、その結果はこの分子がｅｒｂＢ４たんぱく質に結合してチロシン・リン酸化を誘発することができることを示すものである。
【０１０８】  このリガンド及びその相同体を同定することに加えて、多数の異なる組織におけるこのたんぱく質の発現の空間的配分が行われたが、その結果は、ＣＤＧＦが、神経及び非神経組織の両方の多種の発生及び維持に中心的な重要性を持つものであることを示唆していた。組織間の誘発的シグナルの媒介におけるＣＤＧＦたんぱく質の明白な役割を考慮に入れると、このデータは、この族のたんぱく質が成長及び発生上の遺伝子プログラムを調節するための重要な治療上の標的であることを示している。例えば、本発明によるＣＤＧＦポリペプチドのｅｒｂＢレセプタとの結合は、成長又は分化の多様なプログラムを開始及び策定すること、そして発生上協調性ある組織パターニングが確実に行われるようにするメカニズムを提供することにとって重要であるかも知れない。
【０１０９】  更に、例えばｅｒｂＢ２及び／又はｅｒｂＢ４レセプタ等のいくつかのｅｒｂＢレセプタが腫瘍形成においても一端を担っているかも知れないことが示唆されている。結論的には、ｅｒｂＢレセプタの当該ＣＤＧＦポリペプチドのいくつかとの相互作用は、器官形成の調整又は分化した組織の維持において、そしてリンパ性白血病等の腫瘍性の疾患の発生において、細胞内恒常性の調節に大きな意味を持っているかもしれない。
【０１１０】  従って、本発明のいくつかの態様は、ＣＤＧＦ遺伝子のアブヘレント（原語：ａｂｈｅｒｅｎｔ）な発現に関連する疾患を検出及び治療するための診断及び治療的検定並びに試薬に関連するものである。更に、ＣＤＧＦたんぱく質のｅｒｂＢレセプタへの結合を調節することのできる物質を明らかにするための薬品発見検定が提供される。このような物質は、細胞の成長及び／又は分化を変更するのに治療的に有用であると考えられる。本発明のその他の態様を以下に述べるが、本開示を参照すれば当業者には明らかであろう。
【０１１１】  便宜的に、本明細書、例及び付属の請求の範囲で用いられたいくつかの用語をここに収集する。
【０１１２】  「ＣＤＧＦポリペプチド」とは、配列同定番号第２番、第４番、第５番及び／又は第７番の表すポリペプチドの全部又は一部と同一であるか又はある程度の配列相同性を有することが、その特徴の少なくとも一部であるポリペプチドの一族を言う。本ＣＤＧＦポリペプチドは、多数の真核生物、特に脊椎動物、及び特に哺乳類（ヒトを含む）のいずれかからクローン形成又は精製することができる。
【０１１３】  更に、自然では通常存在せず、非自然的な突然変異誘発技術から生成されるその他のＣＤＧＦポリペプチドを、本発明に基づき生成することができる。
【０１１４】  付属の例で述べるプロトコルにより分離される多種のクローンの分析から、本ＣＤＧＦたんぱく質は少なくとも二つの代替スプライシング型を含むものとする。「ＣＤＧＦ−１」型に相当する写しは、細胞外ドメイン（配列同定番号第２番のＭｅｔ１−Ｌｙｓ３１４）、膜内外ドメイン（配列同定番号第２番のＴｈｒ３１８−Ｌｙｓ３３９）、及び細胞質ドメイン（配列同定番号第２番のＴｈｒ３４０−Ｌｅｕ７５４）を有するたんぱく質（図１Ｃを参照されたい）を符号化する開放読み取り枠を提供するものである。二塩基配列（Ｋ３１４／Ｒ３１５）は膜内外ドメインの近傍に位置しているが、これから、蛋白分解による開裂及び細胞外ドメインの解放があったと考えられる。
【０１１５】  他方、「ＣＤＧＦ−２」の写しの開放読み取り枠は、あるたんぱく質を符号化するが、このたんぱく質は細胞外ドメインのＥＧＦ様モチーフのすぐ後ろで切り落とされているものであり、その結果おそらくは、膜内外ドメイン及び細胞質ドメインを欠くことによりこのたんぱく質の可溶性の形であろうと考えられるたんぱく質が生まれる。図１Ｂでは、７７のヌクレオチド配列の挿入により枠がちょうど３’プライム分ＥＧＦ様ドメインの終点に向けてシフトし、停止コードンがその直後の枠内に来ていることが注目される。
【０１１６】  この族のたんぱく質が持つ多くの特徴を、種々のＣＤＧＦポリペプチドを互いに、そしてその他のｅｒｂＢレセプタ・リガンドに比較すると観察することができる。特に、ＣＤＧＦたんぱく質の外側ドメインは六つのシステイン残基を含み、この残基は明らかに、公知のｅｒｂＢレセプタ・リガンドのそれぞれの一次配列内にほぼ同じ特徴的な間隙を持った状態で保存されたものであることが注目される。この「ＥＧＦ様」モチーフは、全長（成熟した）たんぱく質の特定の生物学的活性、例えばｅｒｂＢレセプタを結合させる能力、を保持した断片を表すものでもよい。例として挙げるＣＤＧＦポリペプチドでは、このＥＧＦ様モチーフは、配列同定番号第２番（ラットのＣＤＧＦ−１）及び配列同定番号第４番（ラットのＣＤＧＦ−２）の残基Ｃｙｓ２５３−Ｃｙｓ２８９、及び、配列同定番号第７番（ヒトのＣＤＧＦ−２）のＣｙｓ１０１−Ｃｙｓ１３７で表される。ＥＧＦ様ドメインに加えて、同定された両ＣＤＧＦたんぱく質は、免疫グロブリン様ドメイン（Ｔｈｒ１４３−Ｖａ１２３０）、並びに、細胞外ドメインのアミノ末端側の半分にある二本のアミノ酸残基を含むが、これをここでは、配列同定番号第２番又は第４番のＭｅｔ１−Ａｌａ１４２に相当する「スペーサ−１」、及び配列同定番号第２番又は第４番のＡｒｇ２３１−Ａｒｇ２５１に相当する「スペーサ−２」と呼ぶことにする（図１Ｃを参照されたい）。ＣＤＧＦの細胞外ドメインを特徴づけるこれらの特徴に加えて、この全長たんぱく質には更に膜内外ドメイン及び細胞質ドメインを含めることができる。
【０１１７】  ＥＧＦ族のマイトジェンのシステイニル結合コアアミノ酸配列は、コンセンサス配列ＣＹ１ＣＹ２ＣＹ３ＣＹ４ＣＹ５Ｃを有するが、このときＣはシステイン、Ｙ１は同じ又は異なっていてもよい７つのアミノ酸、Ｙ２は同じ又は異なっていてもよい４つ乃至５つのアミノ酸、Ｙ３は同じ又は異なっていてもよい１０乃至１３のアミノ酸、Ｙ４はすべてのアミノ酸、そしてＹ５は同じ又は異なっていてもよく、かつ一般的には長さで３６乃至４０の残基である８つのアミノ酸を表す。この全体的配列のシステイン残基に基づいて、ＥＧＦ様モチーフと呼ばれる密接な関係のあるモチーフが数多くのたんぱく質で同定されている。ここで用いられる「「ＥＧＦ様」アミノ酸配列は、一般式ＣＸ１ＣＸ２ＣＸ３ＣＸ４ＣＸ５Ｃで表され、このときＣはシステイン、Ｘ１は同じ又は異なっていてもよい４つ乃至１４のアミノ酸、Ｘ２は同じ又は異なっていてもよい３つ乃至８つのアミノ酸、Ｘ３は同じ又は異なっていてもよい４つ乃至１４のアミノ酸、Ｘ４はすべてのアミノ酸、そしてＸ５は同じ又は異なっていてもよい８つ乃至１４のアミノ酸を表す。
【０１１８】  最後に、ｃｏ−型及び翻訳後の変更された型のＣＤＧＦポリペプチドは本発明の考察するところである。「成熟した」ＣＤＧＦポリペプチドとは、（例えばそのたんぱく質の少なくとも一部分の細胞外分泌を起こさせるペプチジル部分等）
あるシグナル配列を欠いたＣＤＧＦポリペプチドを言う。
【０１１９】  「糖付加した」ＣＤＧＦポリペプチドは、（例えば炭水化物で誘導化される）グリコシル基との間に共有結合による結び付きを有するＣＤＧＦポリペプチドである。例えば、例として挙げたＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ−２たんぱく質は、Ａｓｎ結合糖付加部位と成り得る部位を含む。糖付加していないＣＤＧＦポリペプチドを生成するには、ポリペプチドを例えばバクテリア細胞等、糖付加にとって欠陥のある系統で発現させることができる。あるいは既存の糖付加部位を突然変異させて炭水化物の付着を妨げることもできる。同様に、例えばＮ結合又はＯ結合糖付加について、新しい糖付加部位を組換え技術で加えることができる。
【０１２０】  ここで用いられるときの、「ｅｒｂＢレセプタ」又は「ｅｒｂＢ型レセプタ」とは少なくとも三つのパラロガスな遺伝子を含む、ある一つのクラスのレセプタ・チロシン・キナーゼを言うが、ただし、例えば異なる種の相同体等、このクラスにはより多くのオルトログが存在する。ｅｒｂＢレセプタは、一般的には、相同性により関連付けられ、かつ容易に認識が可能な、レセプタの別々のグループである。例えば、これらは一般に、特徴的なシステイン残基のスペーシング（原語：ｓｐａｃｉｎｇ）を含む細胞外ドメイン、疎水性の膜内外ドメイン、及び保存率の高いチロシン・キナーゼ・ドメインを含む細胞外領域とを特徴としている。代表的なｅｒｂＢレセプタにはｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３及びｅｒｂＢ４レセプタが含まれる。「ｅｒｂＢレセプタ」という用語は、膜型のレセプタたんぱく質、並びに本発明のリガンドに結合する能力を維持した可溶性の細胞外断片を言う。
【０１２１】  「オルトログ」という用語は、例えば密接に関連し、構造及び機能から考えて共通の子孫を有すると考えられるものなど、種形成を通じた相同体である遺伝子又はたんぱく質を言う。オルトログのたんぱく質は認識できる限り同じ活性として様々な種において働く。
【０１２２】  「パラログ」という用語は、例えばゲノム中の遺伝子の複製された変異体など、遺伝子の複製を通じた相同体である遺伝子又はたんぱく質を言う。フリッツ・ＷＭ氏著、（１９７０）Ｓｙｓｔ  Ｚｏｏｌ  １９：９９−１１３も参照されたい。
【０１２３】  当該ＣＤＧＦポリペプチドの生物学的活性に関する「細胞活性を変更する」及び「細胞活性を調節する」という文言は、例えばＣＤＧＦのその他の細胞たんぱく質との相互作用による、一次又は二次等、細胞内シグナルの活性化により細胞内で起きる変化を言う。例えば、ＣＤＧＦにより影響を受けると考えられるこのような細胞活性には、細胞の増殖、分化又は生存、並びに細胞対細胞の接着及びその他の表現型における変更が含まれる。ある態様では、ＣＤＧＦポリペプチドで変更することのできる細胞活性は、ニューロンの結び付きの維持に関するものである。一般的には、この細胞の変更は、シグナル形質導入という事象の比較的直接的な生化学的結果であっても、あるいはより間接的に、例えば特定の遺伝子又は遺伝子プログラムのＣＤＧＦに依存した活性化又は不活化で起こしてもよい。細胞活性を「変更する」ＣＤＧＦポリペプチドとは、そのたんぱく質の野生型に対する正常な細胞の反応をまねる（例えば作動させる）又は抑制する（例えば拮抗する）相同体を言うものと考えてもよい。
【０１２４】  ここで用いられるときの「核酸」という用語はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や、適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチドを言う。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドの類似体から作成したＲＮＡ又はＤＮａのいずれかの類似体や、また述べられている実施例に該当する場合には一本鎖（センス又はアンチセンスの）及び二本鎖のポリヌクレオチドを包含するものとして理解されねばならない。
【０１２５】  ここで用いられるときの「遺伝子」又は「組換え遺伝子」とは、エクソン及び（選択に応じて）イントロン配列を含む、本発明のＣＤＧＦポリペプチドを符号化する開放読み取り枠を含む核酸を言う。「組換え遺伝子」とは、ＣＤＧＦポリペプチドを符号化すると共にＣＤＧＦを符号化するエクソン配列を含む核酸を言うが、選択に応じて、染色体ＣＤＧＦ遺伝子又は関係のない染色体遺伝子のいずれかから得られたイントロン配列が含まれていてもよい。当該ＣＤＧＦポリペプチドを符号化する組換え遺伝子の一例を配列同定番号第１番に示すが、もう一つのものを配列同定番号第３番に、そして更にもう一つのものを配列同定番号第５番に示す。「イントロン」という用語は、たんぱく質に翻訳されておらず、かつ一般にエクソン間で見られる、任意のＣＤＧＦ遺伝子中にあるＤＮＡ配列を言う。
【０１２６】  ここで用いられるときの「形質移入」という用語は、例えば発現ベクタ等の核酸を、核酸を媒介した遺伝子の転移によりレシピエント細胞に導入することを意味する。ここで用いられるときの「形質転換」とは、外因性のＤＮＡ又はＲＮＡをある細胞が取り込んだ結果、細胞の遺伝子型が変化し、そして例えば形質転換した細胞が組換え型のＣＤＧＦポリペプチドを発現する、あるいは、転移された遺伝子からアンチセンスの発現が起きて、自然発生型のＣＤＧＦたんぱく質の発現が妨げられる場合等の過程を言う。
【０１２７】  ここで用いられるときの「ベクタ」という用語は、自らが結び付けられた別の核酸を運搬することのできる核酸分子を言う。好適なベクタの一種類として、エピソーム、つまり染色体外複製を行うことのできる核酸である。好適なベクタとは、自らが結び付いた核酸の自律複製及び／発現の可能なものを言う。操作により自らが結び付けられた遺伝子の発現を指示することのできるベクタをここでは「発現ベクタ」と呼ぶことにする。一般には、組換えＤＮＡ技術で用いられる発現ベクタは、ベクタの型では染色体に結合しない環状の二本鎖ＤＮＡループを言う「プラスミド」の形状であることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクタ」は、プラスミドが最も普通に用いられる形のベクタであるため、互換的に用いられている。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすものであって、かつ以下の説明から公知となるその他の形の発現ベクタをも包含するものとして意図されている。
【０１２８】  「転写調節配列」は、本明細書を通じて、開始シグナル、エンハンサ及びプロモータ等、操作により自らが結び付けられたたんぱく質コーディング配列の転写を誘発又は制御するＤＮＡ配列を言う包括的用語である。好適な実施例では、組換えＣＤＧＦ遺伝子の転写は、発現を意図している細胞種にある組換え遺伝子の発現を制御するプロモータ配列（又はその他の転写調節配列）の制御下にある。
【０１２９】  更に、組換え遺伝子は、自然発生型のＣＤＧＦたんぱく質の転写を制御する配列と同じ又は異なる転写調節配列の制御下にあってもよいことは理解されよう。
【０１３０】  ここで用いられるときの「組織特異的プロモータ」という用語は、プロモータとして働くＤＮＡ配列、例えばこのプロモータに操作により結び付けられた選択されたＤＮＡ配列の発現を調節する配列や、例えばニューロンが起源の細胞、例えばニューロン細胞等、組織の特定の細胞中の選択されたＤＮＡ配列の発現を行わせるものを意味する。この用語はまた、選択されたＤＮＡの発現を、主にある一つの組織において調節するがその他の組織でも発現を起こさせる所謂「リーキー（原語：ｌｅａｋｙ）」プロモータも含むものである。
【０１３１】  ここで用いられるときの「遺伝子導入動物」とは、例えば当業において公知の遺伝子導入技術等、ヒトが介在して導入された異種の核酸をその動物の一つ又は複数の細胞が含んでいる、好ましくはヒト以外の哺乳類、トリ又は両生類である動物である。核酸は、例えば顕微注射又は組換えウィルスに感染させることで、人為的な遺伝子操作を介してその細胞の前駆体に導入することで直接又は間接的に細胞に導入される。この遺伝子操作という用語は古典的な交雑育種や試験管受精は含まず、組換えＤＮＡ分子の導入に向けられている。この分子は染色体に組み込まれても、あるいは染色体外でＤＮＡを複製するものでもよい。ここで述べる典型的な遺伝子導入動物では、移植遺伝子は細胞に、例えば作動型又は拮抗型等、組換え型の当該ＣＤＧＦたんぱく質を発現させる。しかしながら、組換えＣＤＧＦ遺伝子が沈黙している遺伝子導入動物もまた考察されており、その中には例えば以下に述べるＦＬＰ又はＣＲＥリコンビナーゼ依存型の構造物がある。本発明における「ヒト以外の動物」には、例えばげっ歯動物、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、ハ虫類、等々の脊椎動物が含まれる。
【０１３２】  好適なヒト以外の動物は、最も好ましいマウス等、ラット及びマウスを含むげっ歯科から選択されるが、アフリカツメガエル属の仲間等の遺伝子導入した両生類や、遺伝子導入したニワトリも、例えば胚形成を理解するための重要なツールとすることができる。「キメラ動物」とは組換え遺伝子が見られる、又は、組換え体がその動物のすべての細胞ではなく特定の細胞で発現している動物を言うものとしてここでは用いられている。「組織特異的キメラ動物」とは、この組換えＣＤＧＦ遺伝子が、特定の組織に存在する及び／又は発現し、別の組織では存在及び／又は発現していないことを表すものである。
【０１３３】  ここで用いられるときの「移植遺伝子」とは、これを導入しようとしている遺伝子導入動物又は細胞に対して部分的に又は完全に異種、つまり外来であるか、あるいはこれを導入しようとしている遺伝子導入動物又は細胞の内生の遺伝子に対して相同ではあるが、これを挿入しようとしている細胞のゲノムが変更されるような態様で（例えば自然遺伝子の位置とは異なる位置に挿入したり、その挿入によりノックアウトが起きるよう）その動物のゲノムに挿入されるよう構成された、又は挿入される、（例えばＣＤＧＦポリペプチドを符号化する）核酸配列を意味するものである。移植遺伝子には、選択された核酸の最適な発現に必要であろうと考えられる、一つ又は複数の転写調節配列及び、例えばイントロン等のその他の核酸を含めることができる。
【０１３４】  よく知られているように、ある一個体のゲノム中には、特定のポリペプチドのための遺伝子が一つ又は複数のコピーの形で存在していることがある。このような重複した遺伝子は、同一であったり、あるいは、やはり概ね同じ活性を有するポリペプチドのための符号であるヌクレオチドの置換、付加及び削除を含む特定の改変が含まれていることもある。従って、「ＣＤＧＦポリペプチドを符号化するＤＮＡ配列」とは、ある特定の個体内の一つ又は複数の遺伝子を言うものと考えてよいであろう。更に、ヌクレオチドの配列にはいくつかの違いが個々の生体間であることがあるが、これはアレルと呼ばれている。このようなアレルの違いは符号化されたポリペプチドのアミノ酸配列の違いを生んだり生まなかったりするが、それでも尚同じ生物学的活性を持つたんぱく質を符号化するものである。
【０１３５】  「相同性」とは二つのペプチド間又は二つの核酸分子間の配列の相似性を言う。相同性は、比較のために配列を整列させておき、その配列中のある一つの位置を比較することで調べることができる。比較した配列中のある一つの位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められているのであれば、その分子はその位置で相同性があることになる。配列間の相同性の程度は、その配列が共有する適合している又は相同の位置の数の関数である。「関連のない」又は「非相同性の」配列は、本発明のＣＤＧＦ配列と１０％未満、好ましくは５％未満の同一性を有するものである。
【０１３６】  「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」はここでは互換的に用いられる用語である。このような用語は特定の対象となる細胞だけでなく、このような細胞の子孫又は子孫である可能性のあるものを言うことと理解されている。いくつかの改変が突然変異又は環境による影響から次世代に発生することもあるため、このような子孫は、実際には親細胞に対して同一ではないこともあるが、それでもやはりここで用いられる用語の範疇に含まれるものである。
【０１３７】  「キメラたんぱく質」又は「融合たんぱく質」は、当該ＣＤＧＦポリペプチドを符号化する第一のアミノ酸配列と、このＣＤＧＦたんぱく質のすべてのドメインに対して外来でありかつ概ね相同でないドメインを規定する第二のアミノ酸配列とが融合したものである。キメラたんぱく質は、第一のたんぱく質も発現する生体で（異なるたんぱく質ではあるが）見られる外来のドメインを呈していても、あるいは、異なる種類の生体が発現するたんぱく質構造の「種間」、「遺伝子間」等々融合たんぱく質であってもよい。一般には、融合たんぱく質は一般式Ｘ−ＧＦ−Ｙで表すことができ、このときＧＦはＣＤＧＦたんぱく質から得られるたんぱく質の一部分を表し、そしてＸ及びＹはそれぞれ存在しないか、又はＣＤＧＦ配列に関係しないアミノ酸配列を表すものである。
【０１３８】  ＣＤＧＦポリペプチドを符号化する核酸配列に関する「進化上関連する」という用語は、自然発生した突然変異体を含む、ある生体において自然に発生した核酸配列を言う。この用語は更に、自然発生したＣＤＧＦ遺伝子から得られた核酸配列であって、以下に述べる組合せ突然変異誘発技術等による突然変異誘発で変更されながらもＣＤＧＦポリペプチドの少なくとも一つの活性を有するポリペプチドを符号化する核酸配列をも言う。
【０１３９】  例えばＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に関してここで用いるときの「分離された」という用語は、高分子の天然源に存在するそれぞれその他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を言う。例えば、当該ＣＤＧＦポリペプチドを符号化する分離された核酸は、自然状態でゲノムＤＮＡのＣＤＧＦ遺伝子の隣の１０キロ（ｋｂ）ベース以下の核酸フランキング配列、より好ましくは５ｋｂ以下のこのような自然発生するフランキング配列、そして最も好ましくは１．５ｋｂ以下のこのような自然発生するフランキング配列を含むことが好ましい。ここで用いられるときの分離されたという用語は更に、組換えＤＮＡ技術で生まれたときには細胞物質、ウィルス性物質、又は培地、あるいは化学合成されたときには化学的前駆体又はその他の化学物質を概ね含まない核酸又はペプチドも意味する。更に、「分離された核酸」は、断片としては通常発生しない、そしてまた天然状態ではみつからない核酸断片を含むものとして意図されている。
【０１４０】  以下に述べるように、本発明の一態様は、ＣＤＧＦポリペプチドを符号化するヌクレオチド配列を含む分離された核酸、及び／又はこのような核酸の等価物に関連するものである。ここで用いられるときの核酸という用語は、断片を等価物として含むものとして意図されている。等価物という用語は、例えばｅｒｂＢ２及び／又はｅｒｂＢ４レセプタ等のｅｒｂＢ族のチロシン・キナーゼ・レセプタに結合する能力を保持した機能的に等価のＣＤＧＦポリペプチド又は機能的に等価のペプチドを符号化するヌクレオチド配列を含むものとして理解されている。
【０１４１】  等価のヌクレオチド配列には、アレル変異体等、一つ又は複数のヌクレオチドの置換、付加又は削除があることを違いとする配列が含まれ、従って、遺伝子コードの縮退が原因で配列同定番号第１番、第３番又は第６番の示すＣＤＧＦコーディング配列のヌクレオチド配列とは異なるものとなった配列も含まれることとなるであろう。等価物には更に、緊縮条件下（具体的には約１Ｍの塩中で形成されるＤＮＡの二重鎖の溶融温度（Ｔｍ）より低い約２０−２７℃に相当する）で配列同定番号第１番、第３番及び／又は第６番の示すヌクレオチド配列と交雑するヌクレオチド配列が含まれるであろう。好適な実施例では、等価物には配列同定番号第１番、第３番又は第６番のいずれかに示すヌクレオチド配列から得られる及び進化上関連のある核酸配列が含まれる。
【０１４２】  更に、特定の条件下においては、ＣＤＧＦたんぱく質の作動物質又は拮抗物質のどちらか一方として限られた能力で機能する当該ＣＤＧＦポリペプチドの相同体を提供すると、このたんぱく質の自然発生型の生物学的活性のうちごく一部を促進又は抑制するのに有利な場合があることは広く認識されよう。このように特定の生物学的効果を、限られた機能を有する相同体で処理することで引き出すことができ、また、その際の副作用は、自然発生型のＣＤＧＦたんぱく質の生物学的活性のすべてに向けられる作動物質又は拮抗物質で処理したときに比べて小さい。例えば、ｅｒｂＢ２及び／又はｅｒｂＢ４レセプタたんぱく質と錯体を形成する野生種のたんぱく質の能力に干渉しながら、その他のシグナル形質導入のメカニズムに関連すると考えられるもの等、ＣＤＧＦポリペプチド及びその他の仲間のｅｒｂＢレセプタ族の間の錯体の形成は概ね干渉しないようなＣＤＧＦ相同体を作成することができる。
【０１４３】  当該ＣＤＧＦたんぱく質の相同体は、例えば個別の点突然変異又は先端切断等、突然変異誘発により生成することができる。例えば、突然変異によれば、基となったＣＤＧＦポリペプチドと概ね同じ生物学的活性又はその一部分を維持した相同体を得ることができる。あるいは選択に応じて、例えばｅｒｂＢレセプタに競合結合する等、自然発生型のそのたんぱく質の機能を抑制することのできる、そのたんぱく質の拮抗型を生成することもできる。
【０１４４】  たんぱく質は以下の性質のうち一つ又は複数を有していればＣＤＧＦポリペプチド生物学的活性を有していることとなる。ｅｒｂＢ２又はｅｒｂＢ４レセプタ等のｅｒｂＢレセプタを発現する細胞の増殖、生存及び／又は分化を調節する能力、沿軸中胚葉由来の組織等、中胚葉由来の組織の増殖、生存及び／又は分化を調節する能力、神経管、神経堤、又は頭部間葉等由来の組織等、外胚葉由来の組織の増殖、生存及び／又は分化を調節する能力、原腸由来の組織等、内胚葉由来の組織の増殖、生存及び／分化を調節する能力である。一般には、例えばｅｒｂＢ２及び／又はｅｒｂＢ４等のｅｒｂＢレセプタたんぱく質に結合する能力があれば、本発明のＣＤＧＦポリペプチドの生物学的活性を有していると性格付けるには十分である。従って、本発明によれば、ポリペプチドは、自然発生型のＣＤＧＦたんぱく質の特異的作動物質又は拮抗物質であれば生物学的活性を有することとなる。
【０１４５】  好適な核酸は、配列同定番号第２番、第４番又は第７番のいずれかが示すアミノ酸配列に少なくとも約７５％相同、より好ましくは約８０％相同、そして最も好ましくは約８５％相同のアミノ酸配列を含むＣＤＧＦポリペプチドを符号化するものである。ＣＤＧＦポリペプチドの活性を有すると共に、配列同定番号第２番、第４番又は第７番のいずれかが示す配列と少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも約９５％相同、そして最も好ましくは少なくとも約９８−９９％相同のアミノ酸配列を有するポリペプチドを符号化する核酸もまた本発明の範囲に包含されるものである。ある実施例では、この核酸は、当該ＣＤＧＦポリペプチドの少なくとも一つの活性を有するペプチドを符号化するｃＤＮＡである。
【０１４６】  好ましくはこの核酸が配列同定番号第１番、第３番又は第６番で表されたヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含むｃＤＮＡ分子であるとよい。このｃＤＮＡ分子の好適な部分は遺伝子のコーディング領域を含む部分である。
【０１４７】  本発明のもう一つの態様は、高又は低緊縮条件下で、配列同定番号第２番、第４番又は第７番の示すアミノ酸配列の全部又は一部分を有するペプチドを符号化する核酸に交雑する核酸を提供するものである。例えば約４５℃の６．０倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を加え、５０℃の２．０倍のＳＳＣで洗浄する等、ＤＮＡの交雑を促進する適切な緊縮条件が当業において公知であり、また、ニューヨーク、ジョン・ワイリー＆サンズ刊の分子生物学の現在のプロトコル、６．３．１−６．３．６に見ることができる。例えば、この洗浄ステップの塩濃度は５０℃の約２．０倍のＳＳＣという低緊縮条件から、５０℃の約０．２倍のＳＳＣという高緊縮条件のうちから選択することができる。加えて、この洗浄ステップの温度は約２２℃の室温という低緊縮条件から約６５℃の高緊縮条件まで上昇させることができる。
【０１４８】  遺伝子コードの縮退のために、配列同定番号第１番、第３番又は第６番の示すヌクレオチド配列とは異なる配列を有する核酸もまた、本発明の範囲内である。
【０１４９】  このような核酸は機能的に等価のペプチド（例えばＣＤＧＦポリペプチドの生物学的活性を有するペプチド）を符号化するが、その配列は、遺伝子コードにおける縮退のためにリストに挙げた配列から異なるものである。例えば、数多くのアミノ酸は二つ以上のトリプレットで指示されるものである。同じアミノ酸を特定するコードン、又はシノニム（例えばＣＡＵ及びＣＡＣはそれぞれヒスチジンを符号化する）があると、ＣＤＧＦポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えない「静かな」突然変異が起きることがある。しかしながら、当該ポリペプチドのアミノ酸配列の変化に結び付かないＤＮＡ配列の多型現象が脊椎動物間で存在すると予測される。当業者であれば、ＣＤＧＦポリペプチドの活性を有するポリペプチドを符号化する核酸の一つ又は複数のヌクレオチド（上限はヌクレオチドの約３−５％まで）におけるこれらのばらつきが、自然のアレルのばらつきを原因としてある任意の種の個体間に存在するのだと考えられることは理解されよう。このようなヌクレオチドの違いのすべて、そしてその結果生じるアミノ酸の多型は本発明の範囲内である。
【０１５０】  ＣＤＧＦたんぱく質の活性部分を符号化する核酸の断片もまた、本発明の範囲内である。ここで用いられるときの、ＣＤＧＦポリペプチドの活性部分を符号化する核酸の断片とは、配列同定番号第２番、第４番又は第７番の表すＣＤＧＦたんぱく質の全アミノ酸配列を符号化するヌクレオチド配列よりも少ない数のヌクレオチドを有するが、しかしＣＤＧＦポリペプチドの生物学的活性を有するペプチドを符号化する断片を言い、例えばこの断片がｅｒｂＢレセプタへの結合能力を保持している場合である。例えば、内生のシグナル配列又は膜内外／細胞質ドメインを欠いたＣＤＧＦ−１ポリペプチドを提供することができる。本発明の範囲内に入る核酸断片には、ＣＤＧＦ相同体を検出するスクリーニング・プロトコルで用いられる、その他の種から得た核酸と高又は低緊縮条件下で交雑することができるものや、例えばｍＲＮＡスプライシング変異体等、代替的なイソフォームを含め、当該ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する核酸の存在を検出するのに用いられる、ヒトの標本から得た核酸と交雑することのできるものが含まれる。本発明の範囲内にある核酸には更に、組換え型の当該ＣＤＧＦポリペプチドを分子クローニング、発現又は精製するために用いられるリンカ配列、改変制限エンドヌクレアーゼ部位及びその他の配列が含まれよう。
【０１５１】  以下に述べる例で示すように、ＣＤＧＦポリペプチドの活性を有するペプチドを符号化する核酸は、数多くの真核細胞のいずれにもあるｍＲＮＡから採取してもよい。更に、本発明のＣＤＧＦポリペプチドを符号化する核酸配列は、両成体及び胚から得られたゲノムＤＮＡから得ることも可能であるに違いない。例えば、ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する遺伝子は、ここで述べるプロトコルに基づいて、そして当業者にとって広く公知のプロトコルに基づいてｃＤＮＡ又はゲノムのライブラリからクローン形成することができる。ＣＤＧＦたんぱく質を符号化するｃＤＮＡは、胚細胞を含む、例えばヒトの細胞等の哺乳類の細胞等、細胞から全ＲＮＡを分離することで得ることができる。次に二本鎖のｃＤＮＡをこの全ＲＮＡから作成し、次に、数多くある公知の技術のどれかを用いて適したプラスミド又はバクテリアファージ・ベクタに挿入する。ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する遺伝子はまた、本発明の提供するヌクレオチドの配列に関する情報に基づき、確定されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてクローン形成することができる。本発明の核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。好適な核酸の一つは、配列同定番号第１番、第３番又は第６番の示すヌクレオチド配列により表されるｃＤＮＡである。
【０１５２】  本発明のもう一つの態様は、「アンチセンス」療法における分離された核酸の使用に関するものである。ここで用いられるときの「アンチセンス」療法とは、細胞条件下で、ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと特異的に交雑する（例えば結合する）オリゴヌクレオチドのプローブ又はそれらの誘導体を投与又はインシチュ生成して、そのたんぱく質の発現を、例えば転写及び／又は翻訳を抑制することにより、抑制するものを言う。この結合は通常の塩基対相補性によるものでも、又は例えばＤＮＡの二重鎖への結合の場合は、二重らせんの主要な溝の特定の相互作用によるものでもよい。一般には、「アンチセンス」療法とは当業において広く用いられる範囲の技術を言い、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依拠する療法はいかなるものもこれに含まれる。
【０１５３】  本発明のアンチセンス構造物は、細胞中で転写されたときにＣＤＧＦたんぱく質を符号化する細胞ｍＲＮＡの少なくとも特有部分に対して相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミドとして提供することができる。あるいは選択に応じて、このアンチセンス構造物は、生体外で作成され、かつ細胞内に導入されたときにＣＤＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列と交雑することで発現を抑制するオリゴヌクレオチドのプローブである。このようなオリゴヌクレオチド・プローブは、例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ等の内因性のヌクレアーゼに対して耐性を有し、従って生体内でも安定しているよう改質されたオリゴヌクレオチドであるとよい。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとして用いられる核酸分子の例は、ホスホールアミデート（原語：ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホチオエート（原語：ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）、及びＤＮＡのメチルホスホネート（原語：ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）類似体である（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号、及び第５，２５６，７７５号も参照されたい）。更に、アンチセンス療法において有用なオリゴマーを構成する一般的方法が、例えばバンダー・クロル氏他著、（１９８８）バイオ技術６：９５８−９７６；及びシュタイン他著（１９８８）がん研究４８：２６５９−２６６８で研究されている。
【０１５４】  従って、本発明の改質されたオリゴマーは、治療上、診断上及び研究上の意味で有用である。治療上の使用にあたっては、オリゴマーは概ねアンチセンス療法にとって適した態様で利用される。このような療法の場合は、本発明のオリゴマーは、全身及び局所又は局部的投与を含む多種の投与量用に調製することができる。技術及び製剤法は、ペンシルバニア州、イーストン、ミード・パブリッシング社刊、レミントンズ・ファーマスーティカル・サイエンス誌に見ることができる。全身投与の場合は、筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射、及び皮下注射を含む注射が好ましく、本発明のオリゴマーは液体の溶液、好ましくは例えばハンク溶液又はリンガー溶液等の生理学的に適合性の緩衝液として調製することができる。加えて、このオリゴマーを固体型で調製しておき、使用直前に再溶解又は懸濁させてもよい。凍結乾燥型も含まれる。
【０１５５】  全身投与は更に経粘膜又は経皮的手段によってもよく、あるいはこの化合物を経口投与することもできる。経粘膜又は経皮投与の場合、防壁を透過するのに適した浸透剤をこの調剤中に用いる。このような浸透剤は当業において一般に公知であり、経粘膜投与の場合は胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体がこれに含まれる。
【０１５６】  加えて、界面活性剤を用いて透過を促進してもよい。経粘膜的投与は、鼻スプレーを通じて行っても、又は座薬を用いてもよい。経口投与には、本オリゴマーを、例えばカプセル、錠剤及び強壮剤等、従来の経口投与用形状に調剤する。局所的投与には、本発明のオリゴマーを、当業において公知のように軟膏、軟膏剤、ゲル又はクリームに調剤する。
【０１５７】  治療における利用に加えて、本発明のオリゴマーは、これらに特異的に結合する標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列があるかどうかを検出するための診断上の試薬として用いてもよい。このような診断テストを以下に更に詳述する。
【０１５８】  同様に、本発明のアンチセンス構造物は、ＣＤＧＦの正常な生物学的活性に拮抗させることで、組織の操作、例えば生体内及び生体外の組織培養の両方で組織分化の操作に用いることができる。
【０１５９】  本発明はまた、少なくとも一つの転写調節配列に操作可能に結び付けられたＣＤＧＦポリペプチドを符号化する核酸を含む発現ベクタを提供する。操作可能に結び付けられたとは、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドの配列の発現が可能なような態様で調節配列に結び付けられていることを意味するものとして意図されている。調節配列は当業において認識されており、対象となるＣＤＧＦたんぱく質の発現を指示するよう選択されるものである。従って、転写調節配列という用語には、プロモータ、エンハンサ及びその他の発現制御要素が含まれる。このような調節配列は、カリフォルニア州、サンディエゴ、アカデミック・プレス社刊、ゴーデル氏著、遺伝子発現技術：酵素学における方法１８５（１９９０）に説かれている。例えば、操作によりあるＤＮＡ配列に結び付けられたときにそのＤＮＡ配列の発現を制御する多種の発現制御配列のうちのいかなるものも、本発明のＣＤＧＦポリペプチドを符号化するＤＮＡ配列を発現させるべく、これらのベクタに用いてよい。このような有用な発現制御配列には、例えばモロニー・マウス白血病ウィルスのＬＴＲ、ＳＶ４０の初期及び後期のプロモータ、アデノウィルス又はサイトメガロウィルス隣接初期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりその発現が指示されるＴ７プロモータ、ファージλの主要なオペレータ及びプロモータ領域、ｆｄ膜たんぱく質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ又はその他の糖分解酵素のプロモータ、例えばＰｈｏ５等の酸性ホスファターゼプロモータ、酵母α−交配因子や、原核又は真核細胞又はそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られているバキュロウィルス系又はその他の配列の多面体プロモータ及びこれらの多種の組合せ、が含まれる。発現ベクタの設計は、形質転換しようとしている宿主細胞、及び／又は、発現を期待するたんぱく質の種類の選択等のファクタに依拠することがあることは理解されねばならない。更に、ベクタのコピー数や、そのコピー数及びベクタが符号化する、抗生のマーカ等のその他のたんぱく質の発現を制御する能力、も考慮されねばならない。ある実施例では、この発現ベクタは、当該ＣＤＧＦポリペプチドの作動的活性を有するペプチドを符号化する、あるいは選択に応じてそのＣＤＧＦたんぱく質の拮抗型であるペプチドを符号化する組換え遺伝子を含む。このような発現ベクタを用いて細胞に形質移入し、それによりここで述べたような核酸により符号化される、融合たんぱく質又はペプチドを含むたんぱく質又はペプチドを生成することができる。
【０１６０】  更に、本発明の遺伝子構造物は、当該ＣＤＧＦたんぱく質の作動又は拮抗型のいずれかを符号化する核酸を提供するために、遺伝子治療プロトコルの一部として用いることができる。このように、本発明のもう一つの態様は、ＣＤＧＦが誤発現している組織中のＣＤＧＦの機能を再構成する、又は選択に応じてその機能を阻止すべく、あるいは、ｅｒｂＢレセプタの生物学的機能を調節することで、組織の分化を変更する又は腫瘍性の形質転換を阻害する型のたんぱく質を提供すべく、特定の細胞種におけるＣＤＧＦポリペプチドの生体内形質移入及び発現のための発現ベクタを特徴とするものである。
【０１６１】  当該ＣＤＧＦポリペプチド、及びその突然変異体の発現構造物は、生物学的に効果的な担体、例えば生体内の細胞にＣＤＧＦ遺伝子を効果的に運搬することのできる調剤又は組成物として投与してもよい。方法には、組換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、及び単純疱疹ウィルス１、又は組換えバクテリア又は真核プラスミドを含むウィルスベクタに対する当該遺伝子の挿入が含まれる。ウィルスベクタは細胞に直接形質移入する。プラスミドＤＮＡは、例えば陽イオンリポソーム（リポフェクチン）又は誘導化（例えば抗体共役の）ポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工ウィルスエンベロープ又はその他のこのような細胞内担体や、遺伝子構造物又は生体内で行われるＣａＰＯ４沈降液の直接注射により運搬することができる。適切な標的細胞の形質導入は遺伝子治療において重要な第一歩であるために、特定の遺伝子運搬系の選択は、意図した遺伝子の表現型及び局部投与又は全身投与などの投与の経路といった因子に左右されることは理解されるであろう。更に、ＣＤＧＦ発現の生体内形質導入のために提供される特定の遺伝子構造物は、以下に述べる生体外組織培養システムに利用するなど、細胞の試験管内形質導入にとっても有用であることは認識されよう。
【０１６２】  細胞への核酸の生体内導入の好適な方法は、所望の特定の型のＣＤＧＦポリペプチドを符号化するｃＤＮＡ等の核酸を含むウィルスベクタを利用することである。ウィルスベクタへの細胞の感染は、標的とされた細胞のうち大部分にその核酸を受け取らせることができるという利点がある。更に、例えばウィルスベクタ内に閉じ込められたｃＤＮＡ等、ウィルスベクタ内で符号化された分子は、ウィルスベクタの核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現する。
【０１６３】  レトロウィルスベクタ及びアデノ関連ウィルスベクタは、生体内での外因性遺伝子の転移、特にヒトへの転移のために選択される組換え遺伝子運搬システムであると広く理解されている。これらのベクタは細胞内への遺伝子の運搬を効率的に行い、転移された核酸は宿主の染色体ＤＮＡに安定的に組み込まれる。レトロウィルスの使用において大きな必須条件は、これらの使用の安全性、特に細胞母集団内において野生種のウィルスが拡がる可能性に関する安全性を確認することである。複製欠陥的レトロウィルスだけを生じる特殊な細胞株（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発は、遺伝子治療におけるレトロウィルスの利用性を向上させ、欠陥レトロウィルスは遺伝子治療を目的とした遺伝子の転移における使用についてよく性格付けられている（参考にはミラー・Ａ．Ｄ．氏著（１９９０）血液７６：２７１を参照されたい）。このように、組換えレトロウィルスは、レトロウィルスのコーディング配列（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ）の一部分が、問題のレセプタの一つを符号化する核酸と置き換えられたことでこのレトロウィルスが複製欠陥的になるよう、構成することができる。この複製欠陥的レトロウィルスを次にビリオン内に被包するが、このビリオンを用いると、標準的な技術によりヘルパウィルスを利用することで標的の細胞を感染させることができる。
【０１６４】  組換えレトロウィルスを生成するプロトコル及び試験管内又は生体内でこのようなウィルスに細胞を感染させるプロトコルは、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ社刊（１９８９）オースベル・Ｆ・Ｍ氏他著（編集）分子生物学の現在のプロトコル、９．１０−９．１４部及びその他の標準的研究室用手引に見ることができる。適したレトロウィルスの例には、当業者において広く公知のｐＬｊ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭがある。環境栄養性及び両栄養性レトロウィルス系の両方を生成するのに適したパッケージングウィルス株の例には、ψｃｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２及びψＡｍがある。レトロウィルスを用いて多種の遺伝子が、ニューロン細胞を含む数多くの様々な細胞種に試験管内及び／又は生体内で導入されてきた（例えばＥｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５号、及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい）。
【０１６５】  更に、レトロウィルスの感染範囲、ひいてはレトロウィルスを基にしたベクタの感染範囲を、ウィルス粒子の表面上のウィルス被包たんぱく質を改質することで制限できることが示されている（例えばＰＣＴ公報ＷＯ９３／２５２３４号及びＷＯ９４／０６９２０号を参照されたい）。例えば、レトロウィルスベクタの感染範囲を変更するための戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体をウィルスのｅｎｖたんぱく質にカップリングすること（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）ＰＮＡＳ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２５１−３２５５；及びＧｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１．２５４）；又は細胞表面レセプタリガンドをウィルスのｅｎｖたんぱく質にカップリングすること（Ｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１４１４３−１４１４６）が含まれる。カップリングは、たんぱく質又はその他の多種の（例えばｅｎｖたんぱく質をアシアログリコプロテインに変えるためのラクトース）ものへの化学的交差結合の形でも、また融合たんぱく質を生成することによるものでもよい（例えば一本鎖の抗体／ｅｎｖ融合たんぱく質）。この技術は特定の組織種に感染を制限する又は向けるのに有用であるが、更にこの技術を用いれば環境栄養性のベクタを両栄養性のベクタに変えることもできる。
【０１６６】  更に、レトロウィルスによる遺伝子運搬の利用は、レトロウィルスベクタのＣＤＧＦ遺伝子の発現を制御する、組織特異的又は細胞特異的転写調節配列を用いると更に可能性を拡げることができる。
【０１６７】  本発明において有用なもう一つのウィルスによる遺伝子運搬系はアデノウィルス由来のベクタを利用するものである。アデノウィルスのゲノムを操作して、対象となる遺伝子生成物を符号化及び発現しながら、正常な溶ウィルス生命サイクルにおいてその複製能力という点で不活化されているようにすることができる。
【０１６８】  例えばバークナー氏他著（１９８８）バイオ技術６：６１６；ローゼンフェルド氏他著（１９９１）サイエンス誌２５２：４３１−４３４；及びローゼンフェルド氏他著、（１９９２）細胞６８：１４３−１５５を参照されたい。アデノウィルスの菌株５ｄ１３２４型又はその他のアデノウィルスの菌株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等々）から得られる適したアデノウィルスベクタは当業者に公知である。組換えアデノウィルスはいくつかの場合で有利であるが、それは、これらが非分割性の細胞を感染させることができ、またこれらを用いて、上皮細胞を含む幅広い細胞種を感染させることができるからである（上述したローゼンフェルド氏他著（１９９２）の文献）。更にこのウィルス粒子は比較的安定しており、精製及び濃縮に適合しており、また感染性の範囲が影響されるように改質することも可能である。加えて、導入されたアデノウィルスのＤＮＡ（及びそこに含まれた外来のＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれずにエピソーム型のままでいるため、導入されたＤＮＡが宿主のゲノム（例えばレトロウィルスＤＮＡ）に組み込まれた場合に挿入的突然変異誘発の結果生じる可能性のある問題を避けることができる。更に、外来のＤＮＡを運搬するアデノウィルスゲノムの能力はその他の遺伝子運搬ベクタに比較して大きい（最大８キロベース）（上述したバークナー氏他著の文献、ハージ・アーマンド氏及びグラハム氏（１９８６）ウィルス学ジャーナル５７：２６７）。現在最もよく用いられている複製欠陥アデノウィルスベクタ、従って本発明が好適とするものは、ウィルスＥ１及びＥ３遺伝子の全部又はすべてが削除されながら、そのアデノウィルスの遺伝子材料の最大８０％が保たれているものである（例えばＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）ｃｅｌｌ  １６：６８３；上述のＢｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の文献、及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ  Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，（１９９１）ｖｏｌ．７中、ｐｐ１０９−１２７のＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．の文献を参照されたい）。挿入されたＣＤＧＦ遺伝子の発現は、例えばＥＩＡプロモータ、主要後期プロモータ（ＭＬＰ）、及び関連するリーダ配列、Ｅ３プロモータ、又は外因的に加えられたプロモータ配列の制御下におくことができる。
【０１６９】  当該ＣＤＧＦ遺伝子の運搬にとって有用な更に別のウィルスベクタ系はアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連ウィルスは、例えばアデノウィルス又はヘルペスウィルスなど別のウィルスを効率的な複製及び生産的な生命サイクルのためのヘルパウィルスとして必要な自然発生型欠陥ウィルスである。参考としてはＭｕｚｙｅｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照されたい）。これはまた、非分割性の細胞にそのＤＮＡを組み込ませることができ、また安定した組み込みがあることを高い率で呈する数少ないウィルスのうちの一つである（例えばＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照されたい）。ＡＡＶの少なくとも３００の塩基対を含んだベクタを被包して組み込むことができる。外因性のＤＮＡのための空間は約４．５ｋｂに限られている。トラッチン他著、（１９８５）分子細胞生物学５：３２５１−３２６０に述べられたもののようなＡＡＶベクタを用いればＤＮＡを細胞内に導入することができる。多種の核酸がＡＡＶベクタを用いることで異なる様々な細胞種に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照されたい）。
【０１７０】  上述のもののようなウィルスによる転移方法に加えて、非ウィルス法を用いても動物の組織においてＣＤＧＦポリペプチドの発現を起こさせることができる。
【０１７１】  遺伝子転移の非ウィルス法のほとんどは、哺乳類の細胞が高分子の取込み及び細胞内運搬に使う正常なメカニズムに依拠している。好適な実施例では、本発明の非ウィルス的遺伝子運搬系は、標的細胞による当該ＣＤＧＦポリペプチド遺伝子の取込みの細胞飲食作用経路に依拠するものである。この種類の遺伝子運搬系の例にはリポソーム由来系、ポリリジン結合体、及び人工的ウィルスエンベロープがある。
【０１７２】  代表的実施例では、当該ＣＤＧＦポリペプチドの一つを符号化する遺伝子を、その表面に正電荷を持つ（例えばリポフェクチン）と共に（選択に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体の標識を付けたリボソーム内に捕捉することができる（水野氏他（１９９２）脳神経外科２０：５４７−５５１；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０６３０９；日本特許出願第１０４７３８１号；及びヨーロッパ特許公報ＥＰ−Ａ４３０７５号）。例えば、細胞のリポフェクションを、腫瘍細胞上に存在する細胞表面抗原、例えばこれもまたｈｅｋレセプタを発現するリンパ芽球の細胞株ＬＫ６３／ＣＤ２０＋上で検出されたＣＤ２０抗原等に対する単クローン性の抗体で標識を付けたリポソームを用いて行うことができる（Ｗｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ８９：１６１１−１６１５）。
【０１７３】  臨床上の設備としては、治療用のＣＤＧＦ遺伝子のための遺伝子運搬系を、数多くの方法のうちいずれを用いても患者に導入することができるが、この方法はそれぞれ当業において公知である。例えば、遺伝子運搬系の薬学的製剤を例えば静脈注により全身に導入することができ、このたんぱく質の標的細胞への特異的形質導入は、レセプタ遺伝子の発現を制御している転写調節配列を原因とする、遺伝子運搬伝播体、細胞種又は組織種の発現によりもたらされる形質移入の特異性を大きな拠り所として達成する。別の実施例では、その動物への導入をより局部化して組換え遺伝子の最初の運搬をより制限されたものとする。例えば遺伝子運搬伝播体をカテーテルに導入する（米国特許第５，３２８，４７０号）か又は定位注射とすることができる（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４−３０５７）。
【０１７４】  遺伝子治療用構造物の薬学的製剤は、容認可能な希釈剤中の本遺伝子運搬系から概ね構成することができ、あるいは遅延放出マトリックス中に本遺伝子運搬伝播体を埋め込んだものとすることができる。あるいは選択に応じて、遺伝子運搬系全体を例えばレトロウィルスベクタ等の組換え細胞から無損傷の状態で生成できる場合には、この薬学的製剤には一つ又は複数の、遺伝子運搬系を生成する細胞を含めてもよい。
【０１７５】  本発明のもう一つの態様は、例えばヒト等の哺乳類等の真核生体から得られる遺伝子が符号化する当該ＣＤＧＦたんぱく質の組換え型に関するものである。本発明にとって好適な組換えたんぱく質は、天然ＣＤＧＦポリペプチドに加えて、配列同定番号第２番、第４番又は第７番のいずれかの示すアミノ酸配列に対して少なくとも７５％相同、より好ましくは少なくとも８０％相同、そして最も好ましくは少なくとも８５％相同のものである。当該ＣＤＧＦポリペプチドの活性（作動的又は拮抗的のいずれにおいても）を有し、配列同定番号第２番、第４番又は第７番のポリペプチド配列に対して少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８−９９％相同であるポリペプチドもまた本発明の範囲内である。
【０１７６】  「組換えたんぱく質」という用語は本発明のポリペプチドを言うが、本発明のポリペプチドとは、概ねＣＤＧＦポリペプチドを符号化するＤＮＡを適した発現ベクタに挿入した後、このベクタを用いて宿主細胞を形質転換して異種のたんぱく質を生成させる、組換えＤＮＡ技術により生成されるものである。更に、「から得た」という文言は、組換えＣＤＧＦ遺伝子に関する限り、「組換えたんぱく質」の意味において、天然ＣＤＧＦポリペプチドのアミノ酸配列、又は自然発生型のＣＤＧＦたんぱく質の置換及び削除（切端を含む）を含む突然変異により生じた、これらに対して相似のアミノ酸配列を有するたんぱく質を含むものとして意図されている。例えば、ＣＤＧＦたんぱく質のＮ−糖付加部位を改変して（例えば突然変異させて）糖付加ができないようにし、より相同性の、還元された炭水化物類似体の発現を哺乳類、昆虫及び酵母の発現系において可能としてもよい。
【０１７７】  同様に、内因性のシグナル配列（これは多くの場合、そのたんぱく質のプロフォームに存在していても切り落とされるが）又は膜内外ドメイン／細胞質ドメインを欠いたＣＤＧＦポリペプチドを作成することができる。後者の場合、Ｃ末端を取り外すとそのたんぱく質の可溶型が生じるであろう。特に、Ｌｅｕ３１７位置又はその前で切端されたＣＤＧＦ−１ポリペプチドのＮ末端断片が、そのたんぱく質の可溶型として好ましい。
【０１７８】  本発明は更に、脊椎動物の生体、特に哺乳類（例えばヒト）から得た遺伝子により符号化され、かつ配列同定番号第２番、第４番又は第７番の表すＣＤＧＦたんぱく質に進化上関係のあるアミノ酸配列を有する当該ＣＤＧＦポリペプチドの組換え型に関するものである。このような組換えＣＤＧＦポリペプチドは、付属の配列表のＣＤＧＦポリペプチドの生化学的／生物学的活性の少なくとも一つに対して作動物質又は拮抗物質の役割の一方を担うことができると好ましい。「進化上関連のある」という用語は、本組換えＣＤＧＦポリペプチドのアミノ酸配列に関する限り、自然発生したアミノ酸配列を有するＣＤＧＦポリペプチドと、例えば組合せ突然変異誘発により得られたＣＤＧＦポリペプチドの突然変異による変異体とを言う。本発明にとって好ましいこのような進化的に得られたＣＤＧＦポリペプチドは、配列同定番号第２番、第４番、第５番及び／又は第７番の示すアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、より好ましくは少なくとも８０％相同、、そして最も好ましくは少なくとも８５％相同であるものである。配列同定番号第２番、第４番、第５番又は第７番の示す配列と少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８−９９％の相同性を有するものも、本発明の範囲内にある。
【０１７９】  本発明は更に、当該ＣＤＧＦポリペプチドの生成方法に関するものである。例えば、当該ＣＤＧＦポリペプチドを符号化するヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクタで形質移入させた宿主細胞を、ペプチドの発現が起きるような適切な条件下で培養することができる。このペプチドは、組換えＣＤＧＦポリペプチドを含む細胞及び媒質の混合液から分泌及び分離してもよい。あるいは選択に応じて、このペプチドを、組換えＣＤＧＦ遺伝子からシグナルペプチド配列を取り除き、細胞を回収し、溶解させ、たんぱく質を分離することで細胞質的に保持してもよい。細胞培養は宿主細胞、媒質及びその他の副産物を含む。細胞培養に適した媒質は当業において公知である。組換えＣＤＧＦポリペプチドのペプチドは、細胞培養媒質、宿主細胞、又は両方から、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、限外濾過、電気泳動法、及びこのようなペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製を含む、たんぱく質を精製するための当業において公知の技術を用いることで分離することができる。ある好適な実施例では、組換えＣＤＧＦポリペプチドは、例えばＣＤＧＦ／ＧＳＴ融合たんぱく質又はｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）で標識を付けたＣＤＧＦたんぱく質等、その精製を容易とするドメインを含む融合たんぱく質である。
【０１８０】  本発明はまた、当該ＣＤＧＦポリペプチドの組換え型を発現するよう形質移入させた宿主細胞に関連する。宿主細胞はいかなる原核細胞又は真核細胞でもよく、またその選択は糖付加のような翻訳後の改質が望まれるものかどうかに少なくとも一部基づいて行うことができる。このように、全長たんぱく質の全部又は選択された一部分を符号化する、ＣＤＧＦのクローン形成により得たヌクレオチド配列を用いて、微生物又は真核細胞の処理を通じて組換え型のＣＤＧＦポリペプチドを生成することができる。遺伝子構造物、例えば発現ベクタへのポリヌクレオチド配列の結紮、及び、真核（酵母、鳥類、昆虫又は哺乳類）又は原核（バクテリアの細胞）のいずれかである宿主への形質転換又は形質移入は、その他の公知のたんぱく質、例えばＥＧＦ、インターフェロン、ヘレグリン、ｎｅｕ分化因子、等々を生成するのに用いられる標準的な方法である。同様の方法、又はその変更法を利用して、本発明に基づいて微生物学的手段又は組織培養技術により組換えＣＤＧＦポリペプチドを生成することができる。
【０１８１】  組換えＣＤＧＦ遺伝子は、当該ＣＤＧＦたんぱく質を符号化する核酸又はその一部分を、原核細胞、真核細胞、又は両方における発現に適したベクタに結紮することで生成することができる。組換え型の当該ＣＤＧＦポリペプチドを生成するための発現ベクタには、プラスミド及びその他のベクタが含まれる。例えば、ＣＤＧＦポリペプチドの発現に適したベクタには、プラスミドの種類で、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及び例えば大腸菌等の原核細胞における発現に向いたｐＵＣ由来プラスミドが含まれる。
【０１８２】  数多くのベクタが、酵母中の組換えたんぱく質の発現のために存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、及びＹＲＰ１７はクローン形成及び発現の伝播体としてサッカロミセス・セレビジエへの遺伝子構造物の導入に有用である（例えば、ここに参考文献として編入することとするＢｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ８３を参照されたい）。これらのベクタは、大腸菌ではｐＢＲ３２２複製起点があるために、そしてサッカロミセス・セレビジエでは酵母の２ミクロンのプラスミドの複製決定因子があるために、複製を行うことができる。加えて、アンピシリン等の薬品耐性マーカを用いることができる。例として挙げる実施例では、ＣＤＧＦポリペプチドを、配列同定番号第１番、第３番、第５番又は第７番の表すＣＤＧＦ遺伝子のコーディング配列をサブ・クローン形成して作成した発現ベクタを用いることで、組換えにより生成する。
【０１８３】  好適な哺乳類の発現ベクタは、バクテリア中のベクタの繁殖を促進する原核配列と、真核細胞で発現する一つ又は複数の真核転写単位との両方を含むものである。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇから得たベクタが、真核細胞の形質移入に適した哺乳類発現ベクタの例である。これらのベクタのうちいくつかを、原核及び真核細胞の両方において複製及び薬品耐性選別が容易となるよう、例えばｐＢＲ３２２等のバクテリアプラスミドから得た配列で変更する。あるいは選択に応じて、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ−１）、又はエプスタイン−バーウィルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来のもの及びｐ２０５）等のウィルスから得たものも、真核細胞におけるたんぱく質の過渡的な発現のために用いることができる。プラスミドの調製及び宿主の生体の形質転換に用いられる様々な方法は当業において公知である。両原核及び真核細胞にとって適したその他の発現系、並びに一般的な組換え技術については、サムブロック氏、フリッツ氏及びマニアティス氏編集の分子クローニングの研究室用手引、第二版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス社刊、１９８９）の第１６章及び第１７章を参照されたい。いくつかの場合においては、バキュロウィルス発現系を用いて組換えＣＤＧＦポリペプチドを発現させることが好ましい場合もあり得る。このようなバキュロウィルスの発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクタ（例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクタ（例えばｐＡｃＵＷ１）及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクタ（例えばβｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）がある。
【０１８４】  Ｎ末端の一部を欠いた形、つまりシグナルペプチドを欠いた切端変異体等、ＣＤＧＦたんぱく質の一部分のみを発現することが好ましい場合、この発現が好ましい配列を含むオリゴヌクレオチド断片に開始コードン（ＡＴＧ）を加える必要があるであろう。Ｎ末端にあるメチオニンは、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を用いることで酵素的に切り落とすことができることは当業において公知である。ＭＡＰは大腸菌（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７５７）及びサルモネラチフィムリウムからクローン形成されたものであり、その試験管内活性が組換えたんぱく質上で確認されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ８４：２７１８．１７２２）。従って、所望の場合、Ｎ末端のメチオニンの除去は、ＭＡＰ（例えば大腸菌又はＣＭ８９あるいはサッカロミセス・セレビジエ）を生成する宿主中でＣＤＧＦ由来のポリペプチドを発現させることで生体内で、あるいは精製されたＭＡＰを使用（例えば上述のミラー氏他著の文献の方法等）することにより試験管内で行うことができる。
【０１８５】  あるいは、ポリペプチドのためのコーディング配列を、異なるポリペプチドを符号化するヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み込むこともできる。この種類の発現系は、ＣＤＧＦたんぱく質の免疫原性断片を生成することが好ましい場合に有用である。例えば、ロタウィルスのＶＰ６カプシドたんぱく質を、単一遺伝子性の形又はウィルス粒子の形のいずれかで、ＣＤＧＦポリペプチドの部分のための免疫原性担体たんぱく質として用いることができる。抗体が立ち上がるはずの当該ＣＤＧＦたんぱく質部分に相当する核酸配列を、後期ワクチンウィルスの構成たんぱく質のためのコーディング配列を含む融合遺伝子構造物に組み込むことで、ＣＤＧＦエピトープをビリオンの一部として含む融合たんぱく質を発現する一群の組換えウィルスを生成することができる。Ｂ型肝炎表面抗原融合たんぱく質を用いた免疫原性融合たんぱく質を用いることで、組換えＢ型肝炎ビリオンもこの役割に用いることができることも確認されている。同様に、ＣＤＧＦたんぱく質の一部分を含む融合たんぱく質及びポリオウィルスのカプシドたんぱく質のために符号化を行うキメラ構造物を作成すれば、この一群のポリペプチド抗原の免疫原性を高めることができる（例えばＥＰ公報Ｎ  ｏ：０２５９１４９；及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３８５；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３８５５；及びＳｈｌｉｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２を参照されたい）。
【０１８６】  ペプチドを基にした免疫化のための多価抗原ペプチド系を用いても免疫原性を作ることができるが、この場合、ＣＤＧＦポリペプチドの所望の部分は、ペプチドをオリゴマーの分岐するリシンのコアに有機的化学合成することで直接得る（例えばＰｏｓｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＪＢＣ２６３：１７１９及びＮａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：９１４を参照されたい）。ＣＤＧＦたんぱく質の抗原決定因子もバクテリア細胞で発現及び提供させることができる。
【０１８７】  免疫原性を高めるために融合たんぱく質を用いることに加えて、融合たんぱく質は、本発明のＣＤＧＦポリペプチドを含むたんぱく質の発現を促進することもできることが広く認識されている。例えば、ＣＤＧＦポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−融合たんぱく質）として生成することができる。このようなＧＳＴ−融合たんぱく質があれば、例えばグルタチオン誘導マトリックスを用いることで、ＣＤＧＦポリペプチドの精製を簡単に行うことができる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１）を参照されたい）。別の実施例では、例えばｐｏｌｙ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼの切断部位配列等、精製リーダ配列をコードする融合遺伝子を用いると、ＣＤＧＦたんぱく質のＮ末端に天然で存在するシグナル配列を置き換えることができ、Ｎｉ  ２＋金属樹脂を用いた親和性クロマトグラフィによるｐｏｌｙ（Ｈｌｓ）−ＣＤＧＦたんぱく質の精製が可能となる。次に精製リーダ配列をエンテロキナーゼによる処理で取り除くことができる（例えばＨｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；及びＪａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ８８：８９７２を参照されたい）。
【０１８８】  更に、ＣＤＧＦ融合たんぱく質の生成を、ＣＤＧＦたんぱく質のクラスタ化、例えばオリゴマー化を促進するための手段として用いると、例えばレセプタの架橋結合に関連する特定の活性を高めることができる。例えばＣＤＧＦ／アルカリホスファターゼ融合たんぱく質はこのような機能を果たすことができるが、それは二つ又はより多くのＣＤＧＦ／ＡＰたんぱく質の間の錯体形成を促進できるアルカリホスファターゼドメインの能力に依存するものである。更に、オリゴマー化のために分子間の相補性に依存するのではなく、同じ分子に複数のＣＤＧＦドメインを提供することが好ましい場合もあろう。例えば、未構成のポリペプチドリンカ領域を融合たんぱく質の二つのＣＤＧＦ部分に導入することができる。このリンカは融合たんぱく質の柔軟性が高まるのを促進できるものであり、それによりこのＣＤＧＦドメインが、例えばこの二つの断片の間の立体的障害が減るために、分子間結合を通じて自由に相互作用することが可能となり、また各断片が適切に折りたたまれることとなる。リンカは天然源から得るもの、例えばあるたんぱく質の二つのドメイン間の任意のらせんにあると判明した配列でもよい。あるいは選択に応じて、このリンカを合成源から得てもよい。例えば、配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を合成の未構成のリンカとして用いることができる。この種類のリンカは、ここに参考文献として編入することとするハストン氏他著、（１９８８）ＰＮＡＳ８５：４８７９及び米国特許第５，０９１，５１３号に説かれている。
【０１８９】  融合遺伝子を作る技術は当業者に公知である。基本的には、様々なポリペプチド配列をコードする多種のＤＮＡ断片の接合が、結紮のためには丸くなった又はとがった末端を、適切な末端を提供するためには制限酵素を、適切な場合には付着端の充填を、好ましくない接合を防ぐためにはアルカリ・ホスファターゼ処理を、そして酵素結紮、を利用して、通常の技術に基づいて行われる。別の実施例では、融合遺伝子を自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅をアンカ・プライマを用いて行い、その結果二つの連続した遺伝子断片の間に生じた相補的な張り出し部分を次にアニールすることでキメラ遺伝子配列を作成することができる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。
【０１９０】  ＣＤＧＦポリペプチドはまた、例えばグリコシル基、リピド、リン酸塩、アセチル基、等々、その他の化学成分との共有結合体又は凝集結合体を形成させることで化学的に改質してＣＤＧＦ誘導体を作らせることができる。ＣＤＧＦの共有結合誘導体はこの化学的成分を、ＣＤＧＦのアミノ酸の側鎖上にある官能基、又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端位置に繋げることで調製できる。例えば、ＣＤＧＦたんぱく質と天然に結び付いた配列以外の成分であって、細胞外マトリックスの組成部分と結合してそのＣＤＧＦ類似体の細胞表面への局在化を促進する成分を含んだＣＤＧＦたんぱく質を作成できる。例えばテトラペプチド配列Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｓ（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３０−３；及びＫｏｍｂｌｉｈｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  ４：１７５５−９）等のフィブロネクチン「タイプＩＩＩ−リピート」から得た配列をＣＤＧＦポリペプチドに加えると、ＥＣＭ組成部分の結合を通じてキメラ分子の細胞への付着を（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４９１−４９７；Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７２９４−８；Ｈｙｎｅｓ（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８；５４９−５４；及びＨｙｎｅｓ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：１１．２５）、特にＣＤＧＦポリペプチドがＣ末端の膜内外ドメイン及び細胞質ドメインを欠く場合に助けることができる。
【０１９１】  更に本発明により、分離された形の、又は、通常ＣＤＧＦポリペプチドに結び付いている、その他の細胞又は細胞外たんぱく質、特にｅｒｂＢレセプタたんぱく質又はその他の細胞外因子が概ねない分離された形である、分離されたＣＤＧＦポリペプチドを得ることが可能となる。「その他の細胞又は細胞外たんぱく質が概ねない」という用語（これはまたここでは「汚染たんぱく質」を言うが）又は「概ね純粋な又は生成された調剤」は、２０％未満の（乾燥重量で）汚染たんぱく質、及び好ましくは５％未満の汚染たんぱく質を有するＣＤＧＦポリペプチドの調剤を包含するものとして定義される。当該ＣＤＧＦポリペプチドの機能上の形は、初回では、ここで述べるようにクローン形成された遺伝子を用いることで精製された調剤として調製することができる。あるいは、当該ＣＤＧＦポリペプチドは例えばマトリックスに結合させたｅｒｂＢレセプタたんぱく質を用いた親和性精製により分離することができる。「精製された」とは、ペプチド又はＤＮＡあるいはＲＮＡ配列について言うときは、指示の分子が、その他のたんぱく質などその他の生物学的高分子がほとんどない状態で存在することを言う。ここで用いられるときの「精製された」という用語は、同じ種類の生物学的高分子が、乾燥重量による重量比で少なくとも８０％、より好ましくは９５−９９％の範囲で、そして最も好ましくは少なくとも９９．８％存在することを意味することが好ましい（しかし水、緩衝液、及びその他の小さな分子、特に５，０００未満の分子重量を有する分子は存在していてもよい）。ここで用いられるときの「純粋な」という用語は、「すぐ上に述べた「精製された」と同じ数字上の限定を有するものであると好ましい。「分離された」及び「精製された」は、自然状態の自然物質や、あるいは化合物（例えばアクリルアミドゲル中に）に分割された自然物質であって、純粋（例えば汚染たんぱく質がない状態又は変性剤やアクリルアミド又はアガロース等の重合体等のクロマトグラフィ用の試薬がない状態）な物質又は溶液の状態では得られないもの、を包含するところではない。
【０１９２】  組換えポリペプチドについて上述したように、分離されたＣＤＧＦポリペプチドには、配列同定番号第２番、第４番、第５番又は第７番の表すアミノ酸配列又はそれらに相同の配列の全部又は一部が含まれる。この配列の誘導体の例には、糖付加部位を欠いたたんぱく質（例えば糖付加されていないたんぱく質を生じるため）、あるいはＮ末端及び／又はＣ末端の配列を欠いたたんぱく質、例えば（レセプタの結合に関して）ＥＧＦ様ドメインから主に成るＣＤＧＦポリペプチドがある。
【０１９３】  更に、ＣＤＧＦたんぱく質の分離したペプチジル部分も、このようなペプチドを符号化する核酸の対応する断片から組換えにより生成させたペプチドをスクリーニングすることで得ることができる。加えて、断片は、通常のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学法等、当業において公知の技術を用いて化学的に合成することができる。例えば本発明のＣＤＧＦポリペプチドを、任意で、断片の重なりのない所望の長さの断片に分割するか、あるいは好ましくは所望の長さの重なりのある断片に分割してもよい。この断片を（組換えにより又は化学的合成により）生成し、ＣＤＧＦポリペプチドの作動物質又は拮抗物質として機能できるペプチジル断片を、例えば生体内競合検定又はｅｒｂＢレセプタを用いた試験管内のたんぱく質結合検定により判別するために調べることができる。
更に、当該ＣＤＧＦポリペプチドの構造を、治療上又は予防上の効験、あるいは安定性（例えば生体外の保管寿命、及び生体内における蛋白分解による劣化に対する耐性）を高める目的で改質することも可能である。このような改質ペプチドは、自然発生型のたんぱく質の活性のうち少なくとも一つを保持しているよう設計されれば、ここでより詳しく述べるＣＤＧＦポリペプチドの機能上の等価物とみなされる。このような改質ペプチドは例えばアミノ酸置換、削除、又は付加により生成することができる。
【０１９４】  例えば、ロイシンをイソロイシン又はバリンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、スレオニンをセリンに、あるいはアミノ酸を構造的に関係のあるアミノ酸に換える（つまり保存的変異）ような同じような交換を行うのみでは、その結果生じる分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないであろうと予測することは妥当である。保存的交換は、その側鎖において関連性を持つ、あるアミノ酸の一つの族の中で行われるものである。一般的には符号化されたアミノ酸は四つの仲間（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニールアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、に分けることができる。フェニールアラニン、トリプトファン、及びチロシンは芳香族のアミノ酸として組み合わせて分類されることがある。
【０１９５】  同様な態様で、このアミノ酸の品目は（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、このとき、セリン及びスレオニンは選択に応じて更に別に脂肪族ヒドロキシルに；（４）芳香族＝フェニールアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン、；及び（６）硫黄を含有する＝システイン及びメチオニンに分類することができる。（例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｅｄ．ｂｙ  Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：１９８１を参照されたい）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的なＣＤＧＦ相同体を生む（例えば野生種型を模倣する又は拮抗する作用をするという意味で機能的に）かどうかは、野生種型のＣＤＧＦたんぱく質と同様な態様で細胞中において反応を生じるか、あるいはこのような反応を競合的に抑制する、この変異体ペプチドの能力を評価することで容易に調べることがてきる。複数の交換が行われたペプチドについても同じ方法で調べることができる。
【０１９６】  従って本発明は、ここに開示された新規なＣＤＧＦポリペプチドの一群の組合せ変異体、及び切断形及び分断形の変異体の作成方法を考察するものであり、ｅｒｂＢレセプタへの結合に機能的な変異体配列を判別するのに特に有用である。
【０１９７】  このような組合せのライブラリをスクリーニングする目的の一つは、例えば、野生型（「基準」）たんぱく質の生物学的活性の作動物質又は拮抗物質のいずれかとして働く、あるいは全体的に新規な活性を有する新規なＣＤＧＦ相同体を分離するためである。具体的には、本方法により作り出されるＣＤＧＦ相同体は、ｅｒｂＢレセプタと結合しながら、そのレセプタの活性に通常伴うシグナル形質導入経路から生じるレセプタ媒介遺伝子転写を阻止する（拮抗する）たんぱく質となるものである。このようなたんぱく質は、組換えＤＮＡ構造物から発現させた場合には、遺伝子治療プロトコルに用いることができ、あるいは薬学的な製剤として形成し、このような態様で運搬することもできる。
【０１９８】  同様に、突然変異誘発により、対応する野生型のたんぱく質とは大きく異なる細胞外半減期を有するＣＤＧＦ相同体を生じさせることができる。例えば、変更されたたんぱく質を、ＣＤＧＦポリペプチドの破壊、又はそうでないにしても不活化につながるような蛋白分解又はその他の細胞外プロセスに対してより安定的なもの又はあまり安定していない程度にすることができる。このようなＣＤＧＦ相同体を用いると、例えばたんぱく質の血漿内半減期を調節することで組換えＣＤＧＦたんぱく質に関する生物学的利用能の包絡線を変更することができる。例えば、半減期が短くなると、ある特定の組換えＣＤＧＦポリペプチドに関する生物学的作用がより過渡的なものになるため、ある特定の組織内、又はその周囲におけるたんぱく質のレベルをより細かく制御することができる。上述のように、このようなたんぱく質、及び特にそれらの組換え核酸構造物は遺伝子治療プロトコルに利用できるだけでなく、薬学的製剤に形成することができる。
【０１９９】  本方法の例示的実施例においては、ＣＤＧＦ相同体又はその他の関係するたんぱく質の一母集団のためのアミノ酸配列を、好ましくは最も高い相同性が促進されるように整列させる。変異体のこのような一母集団には、例えば、一つ又は複数の種、例えば多種の哺乳類からのＣＤＧＦ相同体、又は同じ種のものであるが突然変異のために異なるＣＤＧＦ相同体を含めることができる。整列させた配列の各位置にあるアミノ酸を選び出して組合せ配列の変性群を作る。ある好適な実施例では、ＣＤＧＦ変異体の変化に富ませたライブラリを、核酸レベルにおいて組合せ突然変異誘発を行うことにより作成し、変化に富ませた遺伝子ライブラリで符号化する。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に遺伝子配列に結紮して、可能性のあるＣＤＧＦ配列の変性群が個々のポリペプチド、又は場合によっては、前記一群のＣＤＧＦ配列を中に含んだ、一群のより大型の融合たんぱく質（例えばファージで見た場合に）として発現可能であるようにすることもできる。
【０２００】  可能性のＣＤＧＦ相同体のライブラリを縮重オリゴヌクレオチド配列から作成するには数多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成を自動ＤＮＡ合成装置で行い、その後合成遺伝子を適切な発現ベクタに結紮することが可能である。
【０２０１】  縮重群遺伝子の目的は、可能性のあるＣＤＧＦ配列の所望の群を符号化する配列を一回の混合ですべて供給することにある。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当業において公知である（例えばＮａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ３ｒｄＣｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい。このような技術はその他のたんぱく質の定向発展にも用いられてきた（例えばＳｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａｅｔａｌ，（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：６３７８−６３８２；並びに米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号及び第５，０９６，８１５号を参照されたい）。
【０２０２】  上述の組合せ突然変異誘発に代わる方法も存在する。例えば、ＣＤＧＦ相同体（作動及び拮抗の両方の型で）は、例えばアラニン・スキャンニング突然変異誘発等々（Ｒｕｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９．１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８−２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；及びｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）、リンカ・スキャンニング突然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）、飽和突然変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）、又はランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：及びＧｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２．３４）を用いたスクリーニングにより一ライブラリから作成及び分離することができる。
【０２０３】  組合せライブラリの遺伝子生成物をスクリーニングする、そして特定の性質を有する遺伝子生成物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためには、幅広い技術が当業において公知である。このような技術は、ＣＤＧＦ相同体の組合せ突然変異誘発で作成した遺伝子ライブラリを迅速にスクリーニングするためにも概ね適合可能である。大型の遺伝子ライブラリをスクリーニングするのに最も広く用いられている技術は、典型的に、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクタにクローン形成することと、その結果生じたベクタのライブラリで適した細胞を形質転換することと、所望の活性の検出が容易にでき、その結果生成物の検出された遺伝子を符号化するベクタを比較的容易に分離できるような条件下で組合せ遺伝子を発現させることとを含む。以下に例として説明する検定はそれぞれ、組合せ突然変異誘発技術でできた多数の縮重ＣＤＧＦ配列をスクリーニングするのに必要な高スループット分析になじむものである。
【０２０４】  あるスクリーニング検定においては、候補のＣＤＧＦポリペプチドを細胞又はウィルス粒子表面上で表示させ、特定の細胞又はウィルス粒子の、この遺伝子生成物を介してｅｒｂＢレセプタたんぱく質に結合する能力を「パンニング検定」で検出する。例えば、遺伝子ライブラリを、バクテリア細胞の表面膜たんぱく質のための遺伝子にクローン形成し、その結果生じた融合たんぱく質をパンニングにより検出することができる（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ８８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７１；及びＧｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＴＩＢＳ  １８：１３６．１４０））。同様な方法で、検出可能なように標識づけされたｅｒｂＢレセプタを用いて機能的にＣＤＧＦ相同体であると考えられるものに印を付けることもできる。例えば、アルカリホスファターゼ−ｅｒｂＢ２又はＡｐ−ｅｒｂＢ４融合たんぱく質、あるいは等価の蛍光的に標識付けしたレセプタを用いて、レセプタ結合活性を保持したＣＤＧＦ相同体を検出することができる。蛍光的に標識付けしたレセプタの利用にあたっては、細胞を蛍光顕微鏡の下で視覚的に検査して分離することができ、あるいはその細胞の形態から可能なときは、蛍光発色セルソータで分離することができる。
【０２０５】  ある代替的な実施例では、遺伝子ライブラリをウィルス粒子の表面上に融合たんぱく質として発現させる。例えば、繊維状ファージ系の場合には、外来のペプチド配列を感染ファージの表面上で発現させると二つの大きな利点がもたらされる。一つは、これらのファージは大変高い濃度で親和性マトリックスに付着させることができるため、数多くのファージを一度にスクリーニングすることができる。第二に、各感染ファージはその表面上で組合せ遺伝子生成物を表示するため、特定のファージの親和性マトリックスからの回収率が低い場合は、このファージをもう一回感染させて増幅することができる。ほとんど同一の大腸菌繊維状ファージＭ１３、ｆｄ、及びｆ１のグループが最もよくファージ表示ライブラリに用いられているが、それはファージｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩのどちらの被膜たんぱく質を用いても、ウィルス粒子の最終的な被いを破壊することなく融合たんぱく質を作ることができるからである（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公報ＷＯ９０／０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０９６９０；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；及びｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：４４５７−４４６１）。
【０２０６】  例示的な実施例では、組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、ファーマシア社製、カタログ番号２７−９４００−０１）は、ＣＤＧＦ組合せライブラリを発現及びスクリーニングするのに用いるために容易に改質することができる。例えば、このＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドはファージｇＩＩＩ被膜たんぱく質を符号化する遺伝子を含んでいる。ＣＤＧＦ組合せ遺伝子ライブラリをｇＩＩＩシグナル配列に隣接するファージミドにクローン形成してこれをｇＩＩＩ融合たんぱく質として発現させることができる。結紮後、このファージミドを用いてコンピテント大腸菌ＴＧ１細胞を形質転換する。形質転換した細胞を次にＭ１３ＫＯ７ヘルパファージに感染させてファージミド及びその候補ＣＤＧＦ遺伝子インサートを回収する。その結果得られた組換えファージは特定の候補ＣＤＧＦを符号化するファージミドＤＮＡを含むものであり、対応する融合被膜たんぱく質の一つ又は複数のコピーを表示する。ＣＤＧＦレセプタを結合させることのできるこのファージが表示した候補ＣＤＧＦたんぱく質を選別するか又はパンニングにより濃縮する。例えば、ファージのライブラリをグルタチオンで固定したｅｒｂＢレセプタ／ＧＳＴ融合たんぱく質にのせて、ｅｒｂＢレセプタに結合する能力を保持したＣＤＧＦ相同体について濃縮することができる。結合したファージを次に分離し、組換えファージが少なくとも一つの野生型ｇＩＩＩ被膜たんぱく質コピーを発現していれば、これらは大腸菌を感染させる能力を保持するであろう。従って、大腸菌の再感染、及びパンニングを連続して数回行えば、ＣＤＧＦ相同体について濃縮されるであろう。
【０２０７】  次に、これらの相同体の各々を更に生物学的活性についてスクリーニングして、作動物質及び拮抗物質を区別することができる。例えば組合せライブラリから分離したレセプタ結合相同体を、このたんぱく質の野生型に比較したときのこれらの細胞増殖に対する作用について調べることができる。あるいは、この相同体で処理したときのｅｒｂＢレセプタの自己リン酸化反応を検出すれば、この相同体を作動物質についてスクリーニグすることができる（例えばＭｉｌｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：８３５−８４６を参照されたい）。同様に、拮抗物質についても、濃縮された留分から、野生型のＣＤＧＦたんぱく質によりレセプタの自己リン酸化反応を抑制するそれらの能力に基づいて判別することができる。
【０２０８】  別の実施例では、組合せライブラリを細胞外的にもたらされるよう（例えば自然発生する）、そして、選択に応じてではあるが分泌されるように構成する（例えばライブラリのポリペプチドがすべてシグナル配列を含むが膜内外又は細胞質ドメインを含まない等）。この遺伝子を用いて、例えばｅｒｂＢ２又はｅｒｂＢ４レセプタ等の機能的ｅｒｂＢレセプタを発現すると共に野生型の可溶性のＣＤＧＦを用いた処理に感受性を持つ細胞と共培養できる真核細胞に形質移入させることができる。組合せライブラリを発現する細胞が分泌する機能的ＣＤＧＦ相同体は近辺のｅｒｂＢ＋細胞に広がり、表現型の変化を誘発する。例えばＣＤＧＦ処理に反応して生じる又は破壊されるエピトープに向けられた抗体を用いれば、ＣＤＧＦ誘発の検出パターンが勾配関数に近づき、活性ＣＤＧＦ相同体を生じる細胞を分離する（一般には数回の選別過程を経て）ことが可能となるであろう。
【０２０９】  同様に、ＣＤＧＦ拮抗物質も同様な方法で、機能的拮抗物質を生じる細胞が培地に加えられた天然のＣＤＧＦの作用から近辺の細胞を保護する能力に基づいて選別することができる。
【０２１０】  実例を挙げると、標的細胞を２４ウェルのマイクロタイタ皿で培養する。標的細胞は、例えばＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞等、ｅｒｂＢ及び／又はｅｒｂＢ４レセプタを本来発現する細胞、あるいはこのようなレセプタを符号化する遺伝子を形質移入させた細胞であってよい。ＣＯＳ−７細胞を組合せＣＤＧＦ遺伝子ライブラリで形質移入し、（選択に応じて）このマイクロタイタ皿のウェルに合わせることのできる細胞培養インサート（例えばコラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社製、カタログ番号４０４４６番）中で培養する。この細胞培養インサートは、インサート中で細胞が分泌した組換えＣＤＧＦ相同体がインサートの多孔質底面を通じて拡がり、このマイクロタイタ皿中の標的細胞に接触するようにこのウェル中に配置する。機能的型のＣＤＧＦが標的細胞中で測定可能な反応を生じるのに充分な時間経過後、インサートを除去し、標的細胞に対するＣＤＧＦ相同体の作用を調べる。活性について陽性を記録したウェルに対応するインサートから得た細胞を分割して複数のインサート上で再培養し、このプロセスを活性クローンが判明するまで繰り返す。
【０２１１】  本発明はまた、本発明のＣＤＧＦポリペプチドのｅｒｂＢレセプタとの結合を破壊することのできるペプチド又は非ペプチド物質等の擬態を作成するためのＣＤＧＦポリペプチドの還元法を提供する。従って、上述したような突然変異誘発技術は、当該ポリペプチドのｅｒｂＢレセプタとの結合に関連する、又はレセプタのオリゴマー化に関連するたんぱく質対たんぱく質の相互作用に参加するＣＤＧＦポリペプチドの決定因子を作図するためにも有用である。実例を挙げると、ｅｒｂＢレセプタの分子認識に関わる当該ＣＤＧＦポリペプチドの重要な残基を調べ、この残基を用いて、天然のＣＤＧＦたんぱく質のこのレセプタとの結合を競合的に抑制するＣＤＧＦポリペプチド由来のペプチド擬態を作成することができる。例えばｅｒｂＢレセプタの結合に関わるＣＤＧＦたんぱく質のアミノ酸残基を作図するためにスキャンニング突然変異誘発を利用することで、レセプタに結合する際のこれらの残基を擬態し、そして結果的にレセプタへのＣＤＧＦの結合を抑制してその機能に干渉することのできるペプチド擬態化合物を作成することができる。
【０２１２】  例えば、このような残基の非加水分解可能なペプチド類似体をベリゾジアゼピン（例えば  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照されたい）、アゼピン（例えば  Ｈｕｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照されたい）、置換ガマラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）、ケト−メチレン擬ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２９：２９５；及び  Ｅｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）、β−ターンジペプチド・コア（Ｎａｇａｉｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２６：６４７；及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ：１２３１）、及びβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２６：４１９；及び  Ｄａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １３４：７１）を用いて作成することができる。
【０２１３】  本発明のもう一つの態様は、ＣＤＧＦたんぱく質に対して特異的に反応性の抗体に関する。例えばｃＤＮＡ配列に基づいてＣＤＧＦたんぱく質から得た免疫原を利用すれば、抗たんぱく質／抗ペプチドの抗血清又は単クローン性抗体を標準的なプロトコルにより作成可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｅｄ．ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照されたい）。
【０２１４】  マウス、ハムスタ又はウサギ等の哺乳類は、免疫原型のペプチド（例えば抗体反応を引き出すことのできるＣＤＧＦポリペプチド又は抗原性断片）で免疫性を与えることができる。たんぱく質又はペプチドに免疫原性をもたらすための技術には、担体への接合又は当業において公知のその他の技術がある。ＣＤＧＦたんぱく質の免疫原性部分をアジュバントのある状態で投与してもよい。免疫形成の進行は、血漿又は血清中の抗体価を検出して観察することができる。標準的なＥＬＩＳＡ検定又はその他の免疫検定を、免疫原を抗原として用いれば、抗体のレベルを評価することができる。ある好適な実施例では、対象となる抗体は、例えば配列同定番号第２番、第４番又は第７番の表すたんぱく質の抗原性決定因子、又は近い関係のヒト又はヒト以外の哺乳類の相同体（例えば少なくとも８５パーセント相同、好ましくは少なくとも９０パーセント相同、そしてより好ましくは少なくとも９５パーセント相同のもの）等、本発明のＣＤＧＦたんぱく質の抗原性決定因子に対して免疫特異的である。本発明の更に好適な実施例では、抗ＣＤＧＦポリペプチド抗体は、例えば配列同定番号第２番に対して８５パーセント未満相同、例えば配列同定番号第２番のうちの一つに対して９５パーセント未満相同、例えば配列同定番号第２番のうちの一つに対して９８−９９パセヤント未満相同、配列同定番号第４番に対して８５パーセント未満相同、例えば配列同定番号第４番のうちの一つに対して９５パーセント未満相同、例えば配列同定番号第４番のうちの一つに対して９８−９９パーセント未満相同、配列同定番号第７番に対して８５パーセント未満相同、例えば配列同定番号第７番のうちの一つに対して９５パーセント未満相同、例えば配列同定番号第７番のうちの一つに対して９８−９９パーセント未満相同であるたんぱく質とは概ね交差反応しない（つまり特異的に反応しない）。「概ね交差反応しない」とは、その抗体が、配列同定番号第２番、第４番及び／又は第７番のたんぱく質に対する抗体の結合親和性よりも少なくとも一桁、より好ましくは少なくとも二桁、そして更に好ましくは少なくとも三桁小さい、非相同性のたんぱく質（例えばヘレグリン、ＮＤＦ、ＧＧＦ又はＡＲＩＡたんぱく質）に対する結合親和性を有することを意味する。
【０２１５】  免疫形成後、抗ＣＤＧＦ抗血清を得ることができ、所望の場合は多クローン性の抗ＣＤＧＦ抗体をその血清から分離することができる。単クローン性抗体を生成するには、抗体生成細胞（リンパ球）を免疫化した動物から取り出して骨髄種等の不滅化細胞で標準的体細胞融合法により融合させてハイブリドーマ細胞を生じさせる。このような技術は当業において公知であるが、この中には例えばハイブリドーマ法（もともとはＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７により開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及び、ヒト単クローン性抗体を生成するＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、本発明のＣＤＧＦポリペプチドと特異的な反応性を持つ抗体の生成について免疫化学的にスクリーニングすることができ、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単クローン性抗体を分離することができる。
【０２１６】  ここで用いられるときの抗体という用語は、当該ＣＤＧＦポリペプチドのうちの一つに対しても特異的反応性を有する抗体断片も含むものとして意図されている。抗体は通常の技術を用いれば断片化することができ、この断片は抗体全体に関して上述したのと同じ態様により応用能についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は抗体をペプシンで処理すると作成が可能である。その結果得たＦ（ａｂ）２断片を処理してジスルフィド架橋を還元すればＦａｂ断片を生成することができる。本発明の抗体は更に、その抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域によりもたらされるＣＤＧＦ親和性を有する一本鎖の二重特異性キメラ分子を含むものとして意図されている。
【０２１７】  ＣＤＧＦポリペプチド又はＣＤＧＦポリペプチド変異体に向けられた単クローン性及び多クローン性抗体（Ａｂ）の両方、及び、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２等の抗体断片を用いてＣＤＧＦの作用をブロックすれば、例えば胚形成及び／又は腫瘍形成におけるＣＤＧＦの役割の研究が可能となる。例えば、精製された単クローン抗体をヒヨコ又はマウスの胚の肢芽に直接注入してもよい。このようにすれば、この発生段階における抗ＣＤＧＦ抗体の使用により、ＣＤＧＦの生体内での四肢の形成に及ぼす作用を評価することができる。同じような方法で、抗ＣＤＧＦ単クローン性抗体を精製するハイブリドーマ、又は抗ＣＤＧＦ抗体を懸濁させた生分解性のゲルを、ＣＤＧＦの作用をブロックしようとしている範囲の近位又はその範囲内の部位に移植することができる。この性質の実験は、四肢のパターニング及び組織の形成に関わると考えられるこの因子及びその他の因子の役割を解読するのに資するであろう。
【０２１８】  ＣＤＧＦポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体は、当該ＣＤＧＦポリペプチドのそれぞれの発現の発生量及びパターンを評価するときに組織試料の免疫組織化学的染色に用いることもできる。抗ＣＤＧＦ抗体を免疫沈降及び免疫ブロッティングに診断において用いれば、臨床検査法の一部として組織又は体液中のＣＤＧＦたんぱく質レベルを検出及び評価することができる。例えば、このような測定は、除神経様又は廃用性の症状を特徴とするものなど、神経疾患の発症又は進行の予測的判断に有用であろう。同様に、ある個体におけるＣＤＧＦレベルを観察できることにより、このような疾患に侵されたある個体についてのある任意の処理養生法の効験を調べることができる。ＣＤＧＦポリペプチドのレベルは脳脊髄液の試料中等、体液中で測定しても、あるいは生検によるなど、組織中で測定してもよい。抗ＣＤＧＦ抗体を用いた診断的検定は、例えば神経変性性の疾患、特に出生時に明らかなものなどの早期診断に役立つよう設計された免疫検定を含むものと考えてよい。抗ＣＤＧＦポリペプチド抗体を用いた診断的検定にはまた、腫瘍性又は過形成性疾患の早期診断及び表現型判定に役立つよう設計された免疫検定を含めることができる。
【０２１９】  本発明の抗ＣＤＧＦ抗体のもう一つの利用法は、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ、及びλＯＲＦ８等の発現ベクタ中に構成されたｃＤＮＡライブラリの免疫学的スクリーニングへの利用である。この種類の伝令ライブラリは、正しい読み取り枠に正しい向きで挿入されたコーディング配列を有しているために、融合たんぱく質を生成することができる。例えば、λｇｔ１１の生成するたんぱく質は、そのアミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列から成り、またそのカルボキシル端は外来のポリペプチドから成るものである。次に、ＣＤＧＦたんぱく質の抗原性エピトープを、抗体を用いて、例えば抗ＣＤＧＦ抗体に感染した皿から引き揚げたニトロセルロースのフィルタが反応することで検出することができる。こうして、この検定で陽性と検出されたファージを感染した皿から分離することができる。このようにしてＣＤＧＦ相同体（オルトログ）の存在を検出し、別の動物から、互生のイソフォーム（スプライシング変異体を含む）としてクローン形成することができる。
【０２２０】  更に、ＣＤＧＦ遺伝子のクローン形成から判定されたヌクレオチド配列により、例えば別の組織から等、別の細胞種でのＣＤＧＦ相同体、並びに、ヒト等の別の動物からのＣＤＧＦ相同体を同定及び／クローン形成するのに用いられるよう設計されたプローブ及びプライマの作成が可能となるであろう。例えば、本発明は、概ね精製されたオリゴヌクレオチドを提供するものでもあるが、このオリゴヌクレオチドは、配列同定番号第１番、第３番及び／又は第６番のセンス又はアンチセンス配列、あるいは自然発生したその突然変異体の少なくとも１０の連続したヌクレオチドに、緊縮条件下で交雑するヌクレオチド配列の一領域を含む。
【０２２１】  例えば、配列同定番号第１番、第３番又は第６番の表す核酸に基づくプライマをＰＣＲ反応に用いることで、ＣＤＧＦ相同体をクローン形成することができる。同様に、配列同定番号第１番、第３番及び第６番のＣＤＧＦ遺伝子配列に基づくプローブを用いてＣＤＧＦの写し又はゲノム配列を検出することができる。好適な実施例では、このプローブには更に、このプローブに付着した検出可能な標識群が含まれ、例えばこの標識群は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素及び酵素共同因子のいずれかから選択される。このようなプローブは、例えばＣＤＧＦｍＲＮＡレベルを検出する、又はゲノムＣＤＧＦ遺伝子が突然変異を起こしたか又は削除されたかを調べる等、被験者から採取した細胞試料中の核酸を符号化するＣＤＧＦのレベルを測定するなどしてＣＤＧＦが誤発現している細胞を判別する診断検査器具の一部として用いることができる。
【０２２２】  実例を挙げると、ＣＤＧＦポリペプチドｍＲＮＡの存在について、無損傷の組織及び組織試料の組織学的スクリーニングを容易にするヌクレオチド・プローブをＣＤＧＦ遺伝子から作成することができる。抗ＣＤＧＦポリペプチド抗体の診断上の利用と同様、ＣＤＧＦのメッセージに向けた、又はゲノムＣＤＧＦ配列に向けたプローブの利用は、例えば腫瘍性又は過形成性の疾患（例えば望ましくない細胞成長等）あるいは異常な組織分化となって顕れる可能性のあるアレル突然変異の予測的及び治療的評価の両方において用いることができる。抗ＣＤＧＦ免疫検定と連係させて用いれば、このヌクレオチド・プローブにより、ＣＤＧＦポリペプチドの発現（又は発現のないこと）にまつわる何らかの奇形を伴うことのある発生上の異常について、分子ベースの判断を行うことが容易となる。例えば、ＣＤＧＦポリペプチドの合成の違いをＣＤＧＦコーディング配列の突然変異と区別することができる。
【０２２３】  従って、本方法は、望ましくない細胞増殖又は分化のアブヘレント（原語：ａｂｈｅｒｅｎｔ）な制御を特徴とする疾患の危険性が被験者にあるかどうかを調べる方法を提供するものである。好適な実施例では、当該の方法は、被験者（例えばヒトの患者）の組織試料において、（ｉ）ＣＤＧＦポリペプチドを符号化する遺伝子の突然変異、又は（ｉｉ）ＣＤＧＦ遺伝子の誤発現、のうち少なくとも一つを特徴とする遺伝子上の病変があるかないかを検出するステップを含むことを概ね特徴とする。実例を挙げると、このような遺伝子上の病変は、（ｉ）ＣＤＧＦ遺伝子からの一つ又は複数のヌクレオチドの削除、（ｉｉ）このようなＣＤＧＧＦ遺伝子への一つ又は複数のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）ＣＤＧＦ遺伝子の一つ又は複数のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＣＤＧＦ遺伝子の総体的な染色体再配列、（ｖ）ＣＤＧＦ遺伝子の伝令ＲＮＡの写しのレベルの総体的変化、（ｖｉ）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの変更等、ＣＤＧＦ遺伝子の異常な変更、（ｖｉｉ）ＣＤＧＦ遺伝子の伝令ＲＮＡの写しの非野生型のスプライシング・パターンの存在、及び（ｖｉｉｉ）ＣＤＧＦポリペプチドの非野生型レベル、のうち少なくとも一つの存在を確認することで検出することができる。本発明の一態様においては、配列同定番号第１番、第３番、第５番及び／又は第７番のセンス又はアンチセンス配列、あるいはその自然発生型変異体、あるいはあるＣＤＧＦ遺伝子に自然に結び付いた５’又は３’フランキング配列又はイントロン配列に交雑することのできるヌクレオチド配列の一領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマが提供される。このプローブを組織試料の核酸に暴露し、試料の核酸に対するこのプローブの交雑を検出する。いくつかの実施例では、病変の検出にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号を参照されたい）又は結紮連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７−１０８０；及びＮａＫａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９４４）ＰＮＡＳ  ９１：３６０−３６４を参照されたい）にこのプローブ／プライマを利用することが含まれるが、後者はＣＤＧＦ遺伝子内の点突然変異を検出するのに特に有用である。あるいは、免疫検定を用いても、可溶性又は膜結合したＣＤＧＦたんぱく質のレベルを調べることができる。
【０２２４】  更に、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子の顕微注射、又は、写しがＣＤＧＦｍＲＮＡ又は遺伝子配列に対してアンチセンスであるプラスミドによる形質移入）を用いても、発生上の事象におけるＣＤＧＦの役割、並びに成体組織におけるＣＤＧＦの正常な細胞機能を調べることができる。このような技術は細胞培養で利用することができるが、遺伝子導入動物の作成にも用いることができる。
【０２２５】  更に、精製され、かつ組換え体のＣＤＧＦポリペプチドを入手可能としたことで本発明は数々の検定の進歩した形を提供しており、その進歩した形の検定を用いることで、当該ポリペプチドの正常な細胞機能の作動物質又は拮抗物質である薬品又はＣＤＧＦ相同体について、あるいは細胞の増殖及び／又は分化の病因発生、並びにこれらに関する異常におけるそれらの役割をスクリーニングすることができる。ある実施例では、この検定で、ある化合物の、ＣＤＧＦポリペプチド及びｅｒｂＢレセプタ間の結合を調節する能力を評価する。多種の検定フォーマットがあれば当業者には充分であり、また多種の検定フォーマットは、本発明を参考にして当業者に理解されるところであろう。
【０２２６】  化合物及び天然抽出物のライブラリを調べる数多くの薬品スクリーニング・プログラムでは、所定時間内に調査される化合物の数を最大にするために高処理量の検定が望まれる。無細胞系、例えば精製された又は半精製されたたんぱく質で得られる系などで行われる検定はよく「プライマリ」・スクリーンと呼ばれるが、それはなぜなら、テスト化合物が媒介する分子標的中の変化を急速に展開させ、かつその検出を比較的簡単に行えるよう、それらを作成することが可能だからである。更に、テスト化合物の細胞毒性の作用及び／又は生物学的利用能を試験管内系では概ね無視することができ、その代わりにこの検定では、レセプタたんぱく質との結合親和性の変化で明らかになったときの標的分子に対する薬品の作用に主に焦点を絞る。従って、本発明のスクリーニング検定の一例としては、対象となる化合物を、通常はＣＤＧＦたんぱく質に結合可能であるｅｒｂＢレセプタポリペプチドに接触させる。次にこの化合物とレセプタとの混合液にＣＤＧＦポリペプチドを含む組成物を加える。レセプタ／ＣＤＧＦの錯体の検出及び数量化が、レセプタたんぱく質とＣＤＧＦポリペプチドとの間の錯体形成を抑制する（又は促進する）上でのこの化合物の効験を調べる手段となる。化合物の効験は、多様な濃度のテスト化合物を用いて得たデータから用量反応曲線を作成すると評価が可能である。更に、対照検定を行って比較のための底線を設けることができる。対照検定では、分離され、かつ精製されたＣＤＧＦポリペプチドを、レセプタたんぱく質を含む組成物に加え、レセプタ／ＣＤＧＦ錯体の形成をテスト化合物のない状態で数量化する。
【０２２７】  ＣＤＧＦポリペプチドとｅｒｂＢレセプタとの間の錯体形成は様々な技術により検出してもよい。例えば、錯体形成の増減を、放射性の標識、蛍光性の標識、又は酵素的な標識等、標識を検出可能に付したＣＤＧＦポリペプチドを用いることで、免疫検定又はクロマトグラフィ検出法により数量化することができる。
【０２２８】  多くの場合、ｅｒｂＢレセプタ又はＣＤＧＦポリペプチドのいずれかを固定することで、このたんぱく質の一方の錯体未形成型からのレセプタ／ＣＤＧＦ錯体の分離を容易にし、またこの検定の自動化にも対応すると好ましいであろう。ある実施例では、一ドメインが加えられたことで、そのたんぱく質がマトリックスに結合可能となった融合たんぱく質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／レセプタ（ＧＳＴ／レセプタ）融合たんぱく質をグルタチオン・セファロース・ビード（ミズーリ州、セントルイス、シグマ・ケミカル社製）上又はグルタチオン誘導化マイクロタイタ皿上に吸着させ、次に、これを３５Ｓで標識付けしたＣＤＧＦポリペプチド等のＣＤＧＦポリペプチド及びテスト化合物に化合させ、錯体形成を誘導する条件、例えば塩及びｐＨについて生理的条件でインキュベートする。この条件については、例えば４℃の０．６ＭのＮａＣｌ又は０．１％のトリトンＸ−１００等の界面活性剤を含む緩衝液中等、もう少し緊縮された条件が好ましい。インキュベート後、ビードを洗浄して未結合のＣＤＧＦポリペプチドを取り除き、マトリックス・ビードに結合した放射性の標識を、直接調べる（例えばシンチラントにビードを置く）か、又はレセプタ／ＣＤＧＦ錯体を解離させた後に上澄み液で調べる。あるいは、この錯体をビードから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、ビードの分画に見つかったＣＤＧＦポリペプチドのレベルを、標準的な電気泳動技術を用いてそのゲルから数量化することもできる。
【０２２９】  たんぱく質又はマトリックスを固定するその他の技術も当該検定に利用可能である。例えば、ｅｒｂＢレセプタたんぱく質は、ビオチン及びストレプタビジンの共役結合を利用して固定できる。例えば、ビオチニル処理したレセプタ分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシミド）から当業者において公知の技術（例えばイリノイ州、ロックフォード、ピアス・ケミカルズ社製、ビオチニレーション・キット等）を用いて調製し、ストレプタビジンの被膜を形成した９６ウェル皿（ピアス・ケミカルズ社製）のウェル中に固定することができる。あるいは、ｅｒｂＢレセプタに反応性であるが、ＣＤＧＦの結合に干渉しない抗体をこの皿のウェルに誘導化し、抗体抱合によりレセプタをウェルに捕捉することができる。上述したように、ＣＤＧＦポリペプチド及びテスト化合物の製剤をレセプタの存在するこの皿のウェル中でインキュベートし、ウェル中で捕捉されたレセプタ／ＣＤＧＦ錯体の量を数量化することができる。このような錯体を検出する方法の例には、ＧＳＴで固定化した錯体について上述したものに加えて、ＣＤＧＦポリペプチドに対して反応性の抗体、又はレセプタたんぱく質に対して反応性であると共にＣＤＧＦポリペプチドとの結合について競合する抗体を用いた錯体の免疫検出法や、ＣＤＧＦポリペプチドに関係のある酵素活性を検出することに依拠する酵素結合検定法が含まれる。後者の場合、酵素を化学的に結合するか、又はＣＤＧＦポリペプチドとの融合たんぱく質として提供することができる。
【０２３０】  実例を挙げると、ＣＤＧＦポリペプチドをアルカリ・ホスファターゼと化学的に交差結合又は遺伝子的に融合させて、その錯体に捕捉されたＣＤＧＦポリペプチドの量を、パラニトロフェニールホスフェート等のその酵素の色素産生物質で評価することができる。同様に、ＣＤＧＦポリペプチド及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合たんぱく質を提供し、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いたＧＳＴ活性の検出（Ｈａｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ（１９７４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４９：７１３０）により錯体形成を数量化することができる。
【０２３１】  錯体中に捕捉されたたんぱく質の一つを数量化するための免疫検出に依拠する方法の場合は、たんぱく質に対する抗体、例えばここで述べる抗ＣＤＧＦ抗体を利用できる。あるいは、錯体中で検出しようとしているたんぱく質に、ある融合たんぱく質の形の「エピトープの標識を付ける」ことができるが、この融合たんぱく質には、ＣＤＧＦポリペプチド又はｅｒｂＢレセプタ配列に加えて、抗体が簡単に（例えば市販のもので）手に入る第二のポリペプチドが含まれる。例えば、上述のＧＳＴ融合たんぱく質も、このＧＳＴ成分に対する抗体を用いて結合の数量化に利用することができる。その他の有用なエピトープの標識には、ｃ−ｍｙｃから１０個の残基配列を含んだｍｙｃエピトープ（例えばＥｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２１１５０−２１１５７を参照されたい）や、ｐＦＬＡＧ系（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社製）又はｐＥＺＺプロテインＡ系（ニュージャージー州、ファーマシア社製）が含まれる。
【０２３２】  本発明のもう一つの態様は、細胞をＣＤＧＦ作動物質又はＣＤＧＦ拮抗物質に接触させることで、ＣＤＧＦたんぱく質に対するその細胞の分化した状態を誘発及び／又は維持する、生存率を高める、及び／又は増殖を促進する方法に関するものである。例えば、脊椎動物の分化した組織の秩序ある空間構成の形成及び維持には明らかにＣＤＧＦたんぱく質が広く関わっているという本発見を鑑みれば、当該の方法を用いれば、異なる脊椎動物の組織のアレイを試験管内及び生体内の両方で作成及び／又は維持できるであろうということを本発明は考察する。このＣＤＧＦ物質は、該当する場合、上述の製剤のうちのいかなるものでもよいが、分離されたペプチド、遺伝子治療用構造物、アンチセンス分子、ペプチド擬態、又はここで提供された薬品検定で明らかにされた物質が含まれる。
【０２３３】  例えば、本方法は細胞培養技術に応用可能である。試験管内ニューロン培養系は、ニューロンの発生の研究や、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体栄養因子（ＣＮＴＦ）、及び脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）等の神経栄養性因子を明らかにするための基本的かつ欠くことのできない道具であることが立証されている。
【０２３４】  ニューロン細胞は、いったん最終分化した状態になると、別の最終分化細胞種に変化することは、一般的にはない。しかしながら、ニューロン細胞は簡単にその分化した状態を失う。このことは、これらの細胞が成体の組織から得た培養で成長するとき、そしてこれらが再生の過程で再生芽を形成するときによく観察される。本方法は、ニューロン細胞を分化の様々な段階に維持するために充分に制限的な環境に確実に置く手段を提供するものであり、また本方法はその他の栄養因子の特異的活性を調べるために設計された細胞培養に利用することができる。本方法のこのような実施例では、（例えば幹細胞の）ニューロンの分化を誘発するため、あるいは最終分化したニューロン細胞の培養物の統一性を、分化状態を失うことを防ぐことで維持するために、培養された細胞をＣＤＧＦポリペプチドに、又は上述の検定で明らかにされた物質に接触させることができる。培養におけるＣＤＧＦのソースは、例えば細胞培養培地に直接加えられた精製済又は半精製済のたんぱく質組成物や、又は、ＣＤＧＦたんぱく質を添加した、多種のニューロン細胞の成長を助ける重合体のデバイスから放出させた精製済又は半精製済のたんぱく質組成物から得ることができる。ＣＤＧＦのソースはまた、対象のニューロン細胞と共培養されると共にあるＣＤＧＦたんぱく質の組換え型又は自然型のいずれかを生じる細胞でもよい。あるいは、このソースは、組換えＣＤＧＦを生じるよう予め操作されたそのニューロン細胞自体でもよい。実施例の一例としては、処置を受けていないニューロン細胞（例えば幹細胞）をＣＤＧＦ作動物質で処理して、その細胞の、例えば感覚ニューロン又は運動ニューロンへの分化の誘発を試みる。このようなニューロン培養物は、便利な検定系として用いたり治療的処置のための移植可能な細胞のソースとして用いたりすることができる。例えば、ＣＤＧＦポリペプチドは米国特許第５，３１８，９０７号、等々の述べる嗅覚ニューロン培養物を策定及び維持するのに有用であろう。
【０２３５】  用途として可能性のある実例を更に述べると、脳内移植が中枢神経系の治療の更なる方法として浮上してきたことが注目される。例えば、損傷した脳の組織をを補修する方法の一つは、胎児又は新生児の動物から成体の脳に細胞を移植することを含むものである（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １２３：２６５−２８９；及びＦｒｅｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５：６０３−６１６）。多種の脳領域から採った胎児のニューロンは成功裡に成体の脳に組み込むことができ、このような移植は行動上の欠点を緩和することができる。例えば、ドーパミン作動性突起から基底核までの病変に誘発される運動障害は胚のドーパミン作動性ニューロンを移植することで防止することができる。新皮質の損傷後に損なわれる複合認知機能もまた、胚皮質細胞の移植で部分的に回復させることができる。このように、ニューロン細胞培養物の維持のための本ｅｒｂＢレセプタリガンドの利用は移植可能なニューロン組織のソースを提供するのに資することができる。培養物へのＣＤＧＦポリペプチドの利用は分化の損失を防止するためでもよく、あるいは胎児の組織を用いる場合、特にニューロン幹細胞の場合は、ＣＤＧＦポリペプチドを用いて分化を誘発することができる。
【０２３６】  本発明で有用な幹細胞は広く公知である。例えば、複数の神経堤細胞が明らかにされているが、その中のうちいくつかは多分化能であり、未委任の神経堤細胞に相当すると考えられ、またその他は感覚ニューロンなど一つの種類の細胞しか作成できず、委任前駆細胞に相当すると考えられるものである。本方法で用いられるＣＤＧＦたんぱく質の、このような幹細胞を培養する役割は、この未委任の前駆物質の分化を誘発し、委任前期細胞を生じさせるか、あるいは、委任前駆細胞の発生上の宿命を、最終分化したニューロン細胞になるまで更に制限するためでもよい。例えば、本方法を試験管内で用いて、神経堤細胞の、グリア細胞、シュヴァン細胞、クロム親和性細胞、コリン作動性交感又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を誘発及び／又は維持することができる。ＣＤＧＦポリペプチドは単体で用いても、あるいはニューロン前駆細胞の特定の分化の宿命をより特定的に高めるよう作用するその他の神経栄養因子と組み合わせて用いてもよい。後者の場合、処置した細胞が特定の表現型状態を達成し、その結果その細胞が特定の発生の経路上で平衡を保っており、第二の神経栄養因子と接触すれば適切に誘発される状態に確実に置くものとしてＣＤＧＦポリペプチドは捉えられよう。同様な態様で、比較的に未分化の幹細胞又はプライマティブ（原語：ｐｒｉｍａｔｉｖｅ）神経芽細胞を、ＣＤＧＦポリペプチドによる処理で培養において維持し、分化させることができる。プライマティブ細胞培養物の例は、顕性の大きな分化が起きる前の胚の神経板又は神経管から採取した細胞を含む。
【０２３７】  機能的ＣＤＧＦ活性のある状態で培養した細胞の移植に加えて、本発明の更にもう一つの目的は、中枢神経系及び末梢神経系の両方のニューロン及びその他のニューロン細胞の生存率を高めるためのＣＤＧＦポリペプチド又は擬態の治療的利用法に関する。神経系の発生の段階、そしておそらくであるが成体の段階におけるニューロンの分化及び生存を調節するＣＤＧＦの能力に基づけば、正常な細胞の維持、機能的能力、及び加齢、そして化学的又は物理的に損傷した細胞の補修及び再生プロセス、及び、分化の消失が原因で特定の病理学的条件で生じる退化及び早期死の予防に関し、成体のニューロンをＣＤＧＦにより容易に制御できるのではないかと考えるのは妥当であろう。この理解から、本発明は具体的には当該たんぱく質の（ｉ）外傷性損傷、化学的損傷、及び欠損（脳卒中を原因とした虚血等）や感染性／炎症性及び腫瘍誘発性損傷を含む、急性、亜急性、又は慢性の神経系に対する損傷、（ｉｉ）アルツハイマー病を含む神経系の加齢、（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、デンプン栄養性側索硬化症等々や脊髄小脳変性症を含む神経系の慢性神経変性性疾患、（ｉｖ）多発性硬化症を含む神経系の又は神経系に影響を与える慢性の免疫学的疾患、及び（ｖ）感覚ニューロンの異常及び網膜の消耗疾患を由来とした神経状態の治療（予防及び／又はその重篤度の軽減）への適用を考察する。
【０２３８】  多くの神経疾患は、ニューロン要素の個別の母集団の変性を伴い、ＣＤＧＦポリペプチド（又はその等価物）を含む治療的養生法で治療可能であると考えられる。例えば、アルツハイマー病には、新皮質まで延びるものと皮質に留まっているものの両方の神経伝達系のうちいくつかの欠損が伴う。例えば、アルツハイマー病の患者の基底核は、同じ年齢の対照に比較して深在性の（７５％）ニューロンの消失が観察されている。アルツハイマー病ははるかに最も普通の形の痴呆であるが、その他の疾患も痴呆を生じることがある。これらの中のいくつかは、中枢神経系、特に大脳皮質の多種の部分におけるニューロンの死を特徴とする消耗疾患である。しかしながら、痴呆のいくつかの形には大脳皮質の下にある視床又は白質の変性を伴う。こうして輸出部分及び輸入部分の変性により皮質領域が分離して認識機能不全が起きる。ハンチントン病は、線条内及び皮質のコリン作動性ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性を伴う。ピック病は、時に線条においてニューロンの死を伴う、前頭葉及び前側頭葉の新皮質における重篤なニューロン変性である。このような変性状態に苦しむ患者の治療には、例えばニューロンの消失を起こすニューロンの脱分化及びアポプトーシスを操作するための、ＣＤＧＦポリペプチド、又はそれらの作用を模倣する物質の適用を含めることができる。好適な実施例ではＣＤＧＦ物質のソースを変性の領域内又は近位に定位的に提供する。
【０２３９】  変性誘発性の痴呆に加えて、ＣＤＧＦ相同体の薬学的製剤は、振戦及び不随意運動を症状として有する神経変性性の疾患の治療に時宜を得て適用することができる。例えばパーキンソン病は皮質下構造を主に侵し、黒質線状体経路、縫線刻、及び迷走神経の運動核の変性を特徴とする。多くの場合血管の事故を原因とした視床下核への損傷には典型的にバリスムスが伴う。更に、最終的には末梢神経系の体細胞分裂に影響を及ぼし、神経筋疾患として顕れる神経性及びミオパチー性の疾患も含まれる。例には、筋萎縮性側索硬化症、ギラン−バレー症候群及び慢性末梢神経疾患等の慢性の萎縮症や、進行性の球麻痺又は棘筋の萎縮として症状の顕れることのあるその他の疾患が含まれる。本方法は、病変と同側の四肢に異常を生じるような小脳の病変等、筋緊張低下又は運動失調を引き起こす小脳の疾患の治療になじむものである。例えば、ＣＤＧＦ相同体の製剤は、アルコール中毒の患者に通常見られるものなど、前葉（虫部及び脚部領域）に関係する制限された形の小脳皮質の変性を治療するのに用いることができる。
【０２４０】  更にもう一つの実施例では、本方法を筋萎縮性側索硬化症の治療に用いる。ＡＬＳは、上位及び下位運動ニューロンを含む異常の混合に与えられた名称である。患者には進行性の棘筋萎縮、進行性の球麻痺、原発性側索硬化証、又はこれらの状態の組み合わせがあることがある。主な病理学的異常は、脊髄の下位運動ニューロン及び大脳皮質の上位運動ニューロンの選択的かつ進行性の変性である。
【０２４１】  ＡＬＳの患者の運動ニューロンの変性を防ぐ及び／又は逆行させるためには、例えば配列同定番号第２番、第４番又は第６番のいずれかの表すポリペプチド又はそのペプチド擬態の可溶性の形等、ＣＤＧＦ治療物質の治療的適用を単独で利用しても、あるいはＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ又はＮＧＦ等のその他の神経栄養因子と連係させて用いてもよい。
【０２４２】  本発明のＣＤＧＦポリペプチドは、平滑筋及び内分泌組織（例えば腺組織等）の神経支配を侵す異常を含む、末梢神経系の自律神経障害の治療にも用いることができる。例えば、ＣＤＧＦ組成物は、心臓の横紋筋の神経支配をしている神経の変性状態から生じることのある頻脈及び心房不整脈の治療に有用でろう。
【０２４３】  従って、ここで述べるＣＤＧＦ相同体又はその他のＣＤＧＦ物質を含む組成物を、いくつかの種類の中枢及び末梢のガングリオン・ニューロン、交感及び感覚ニューロンや、運動ニューロンの生存率及び再延出を促進する又は拮抗するために用いられよう。実例を挙げると、このような治療用組成物は、網膜神経節、内耳及び聴覚神経、及び運動ニューロンを病変誘発性の死から救ったり、このような損傷後にこれらのニューロンの再延出を導いたりするように設計された治療に有用であろう。このような疾患及び状態には、ＣＮＳ損傷、梗塞、感染（例えば水痘−帯状疱疹へのウィルス感染など）、代謝性疾患、栄養欠乏症、毒性物質（例えばシスプラチン治療など）が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０２４４】  更に、ＣＤＧＦ物質の中には（おそらくは拮抗型で）、例えば慢性疼痛症候群の治療等の治療における感覚ニューロンの選択的切除に有用であろう。
【０２４５】  ＣＤＧＦは、中枢及び末梢神経の損傷の補修用の義神経に用いることができる。特に、潰れた又は切断された軸索を人工器官を利用して管状に形成する場合は、ＣＤＧＦポリペプチドをこの人工器官に加えればこの樹状突起の成長率及び再生率を高めることができる。神経案内の経路の例は、米国特許第５，０９２，８７１号及び第４，９５５，８９２号に説かれている。従って、ＣＤＧＦポリペプチド又は擬態を含む半固体の調剤を含むか、あるいはその内側壁面に沿ってＣＤＧＦたんぱく質で誘導化された義神経ガイドにより、切断された軸索の突起を神経の切断された末端に向けることができる。
【０２４６】  更に別の実施例では、当該ＣＤＧＦポリペプチドを、特に中枢神経系及びリンパ系の腫瘍性又は過形成性の転換の治療に用いることができる。例えば、いくつかのＣＤＧＦ相同体は、転換したニューロン細胞が分裂終了細胞又は可能であれば自滅細胞に分化することを誘発できると考えられる。その他のＣＤＧＦ相同体を使った処置では、いくつかのニューロンの腫瘍の腫瘍性形質転換に関連があると考えられている、例えばＴＧＦ−β又はＰＤＧＦ自己刺激ループ等のオートクライン（原語：ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）・ループの破壊を伴うことがある。従って、ＣＤＧＦ相同体は、例えば悪性神経膠種、髄芽細胞腫、神経外胚葉腫、及び上衣細胞腫の治療に有用であろう。
【０２４７】  本発明の更にもう一つの態様は、ＣＤＧＦたんぱく質は、上述のようなニューロンの分化に加えて、その他の脊椎動物の器官形成経路に関わる誘発シグナルであると考えられるため、外胚葉のパターニングや、中胚葉及び内胚葉の両方の分化過程において果たす役割を有するという発見の応用に関するものである。このように、ＣＤＧＦたんぱく質を含む組成物は更に、細胞培養や、原腸を由来とする消化管、肝臓、肺臓、及びその他の器官、筋肉骨格組織及び皮膚の結合組織を含む沿軸中胚葉由来の構造、腎臓及びその他の腎臓及び泌尿性器組織等の中間中胚葉由来構造、そして頭部結合組織及び頭蓋骨並びに鰓弓軟骨、眼組織、筋肉及び心臓組織等の頭部間葉及び神経堤由来の組織等から得た組織の発生及び維持を制御するなど、ニューロン以外の組織の形成及び維持に関する治療方法の両方に利用することができることも本発明の考察するところである。上記の表は網羅した表と考えられてはならず、ＣＤＧＦポリペプチドの作用が及ぶと考えられるその他の組織も想到される。
【０２４８】  本発明のＣＤＧＦポリペプチド、又は薬学上容認可能なその塩は、水、緩衝食塩水、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、等々）又は適したこれらの混合液等の生物学的に容認可能な媒質と共に、投与に向けて適宜製剤にしてもよい。選択された媒質中の有効成分の最適濃度は薬品化学者に公知の方法に基づき、経験的に決定することができる。ここで用いられるときの「生物学的に容認可能な媒質」には、この薬学的製剤の所望の投与経路に適切なすべての溶媒、分散媒、等々が含まれる。薬学的有効物質のためのこのような媒質の利用は当業において公知である。従来の媒質又は物質がＣＤＧＦポリペプチドの活性に不適合である場合を除き、本発明の薬学的製剤へのその使用は考察されるところである。その他のたんぱく質を含む適した伝播体及びそれらの構成は、例えば書籍、レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，ＵＳＡ  １９８５）に説かれている。これらの伝播体には、注射の可能な「デポジット製剤」が含まれる。上述に基づき、このような薬学的製剤には、一つ又は複数の薬学上容認可能な伝播体又は希釈剤と組み合わせられた、適したｐＨの、かつ生理的流体と等浸透圧の緩衝媒質に含まれたＣＤＧＦポリペプチドの溶液又は凍結乾燥した粉末が含まれるが、その他にはない訳ではない。説明を目的として、かつ同事項に制限されることなく例を挙げると、ＣＤＧＦポリペプチドで神経系の疾患を治療するための溶液の形で調製できる組成物又は製剤は米国特許第５，２１８，０９４号に述べられているものである。凍結乾燥製剤の場合には、他にもあるが例を挙げるとマンニトール又はグリシン等の支持付形剤を用いてもよく、また、所望のｐＨの適切な等張性の緩衝液を得るには、所望量の適した緩衝液が提供されるであろう。
【０２４９】  同様な溶液を、ＣＤＧＦポリペプチドの薬学的組成物を所望量の等張液の状態で得るためにも用いてもよく、その例には、他にもあるが、適した濃度のホスフェート又はクエン酸を有する緩衝食塩水を使用することで、所望のｐＨ（例えば中性ｐＨ）の等張性の薬学的製剤を常に得ようとする場合である。
【０２５０】  治療部位で外生のＣＤＧＦポリペプチドを導入する方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、及び鼻腔内が含まれるがこれらに限定されるものではない。加えて、本発明の薬学的組成物は、心室内及び鞘内注射を含む適した経路により中枢神経系に導入することが好ましいこともあろう。心室内注射は、例えばオマヤ・レザバ等のレザバに取り付けた心室内カテーテルを用いると容易であろう。
【０２５１】  導入方法は更に、特に組織中のＣＤＧＦ濃度が勾配になることが好ましい場合には、再充填可能な又は生分解性のデバイスでも提供されよう。多種の遅延放出重合体デバイスが開発されており、たんぱく質系の生物薬剤を含む薬品の制御された運搬について、近年生体内でテストされている。生分解性及び非生分解性の重合体を含む、多種の生体適合性重合体（ヒドロゲルを含む）を用いて、ある特定の標的部位でのＣＤＧＦの放出を維持するための埋没物を形成することができる。本発明のこのような実施例を、予めこの重合体デバイスに組み込まれた外因的に精製されたＣＤＧＦポリペプチドの運搬、又は、この重合体デバイス内に被包された細胞により生じたＣＤＧＦポリペプチドの運搬に用いることができる。
【０２５２】  このような埋没物の作成は、広く、当業において公知である。例えば、ディビッド・ウィリアムス氏編集による内科及び歯科材料辞典（ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９０）、セーベル氏他の米国特許第４，８８３，６６６号、イービッシャ氏他の米国特許第４，８９２，５３８号、イービッシャ氏他の米国特許第５，１０６，６２７号、リム氏の米国特許第４，３９１，９０９号、及びセフトン氏の米国特許第４，３５３，８８８号を参照されたい。
本発明の更にもう一つの実施例では、薬剤のＣＤＧＦポリペプチドは、その他の物質との組合せ治療の一部として投与することができる。例えば組合せ治療には、少なくとも一つの栄養因子を持つＣＤＧＦたんぱく質を含めることができる。栄養因子の例には、神経成長因子、毛様体神経栄養性成長因子、シュヴァン鞘腫由来成長因子、グリア成長因子、スチアタル（原語：ｓｔｉａｔａｌ）由来ニューロン栄養性因子、血小板由来成長因子、及び散乱因子（ＨＧＦ−ＳＦ）が含まれる。
【０２５３】  本発明のもう一つの態様は、本発明の異種ＣＤＧＦ遺伝子を発現する、又は、一つ又は複数のゲノムＣＤＧＦ遺伝子がその動物の組織又は細胞種のうちの少なくとも一つで破壊された、ヒト以外の遺伝子導入動物を特徴とする。従って、本発明は、誤発現したＣＤＧＦアレルを持つ、発生的疾患の動物モデルを特徴とする。例えば、一つ又は複数のＣＤＧＦアレルが削除された又は不活化されたマウスを生むことができる。このようなマウス・モデルを、誤発現したＣＤＧＦ遺伝子が原因で生じる疾患を研究するのに用いることができる。
【０２５４】  本発明のもう一つの態様は、本発明の移植遺伝子を含む（その動物の）細胞を含む遺伝子導入動物に関するものであるが、前記細胞は、好ましくは（選択に応じてではあるが）その動物の一つ又は複数の細胞で外生のＣＤＧＦたんぱく質を発現するものであるとよい。このＣＤＧＦ移植遺伝子はこのたんぱく質の野生型を符号化するか、又はその相同体を符号化することができ、このたんぱく質又はその相同体には作動物質及び拮抗物質の両方、並びにアンチセンス構造物が含まれる。好適な実施例では、移植遺伝子の発現を、特定の細胞小集団、組織又は発生上の段階に、例えば所望のパターンで発現を制御するｃｉｓ作用性の配列を用いることにより制限する。本発明においては、当該ポリペプチドのこのようなモザイク状の発現は多くの形の系譜分析にとって重要であり、更に、例えば正常な胚において小さな一部分の組織の発生を総体的に変更し得る、ＣＤＧＦの発現の欠如の作用を評価する手段とすることができる。この目的のために、組織に特異的な調節配列及び条件付き調節配列を用いて、移植遺伝子の発現を特定の空間パターンで制御することができる。更に、例えば条件付き組換え系又は原核生物の転写調節配列により、発現の時間的パターンを提供することができる。
【０２５５】  生体内での部位特異的遺伝子操作を通じて移植遺伝子の発現を調節することを可能とする遺伝子技術は当業者に公知である。例えば、遺伝子組換えを標的配列に触媒するリコンビナーゼの調節された発現を可能とする遺伝子系が入手可能である。ここで用いられるときの「標的配列」とは、リコンビナーゼにより遺伝子的に組換えられるヌクレオチド配列を言う。標的配列は、リコンビナーゼ認識配列をフランキング配列に持ち、また一般には、リコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切除又は反転されるものである。リコンビナーゼが触媒となった組換え事象は、標的配列の組換えの結果、当該ＣＤＧＦポリペプチドの発現の活性化又は抑制が起きるように設計することができる。例えば、組換えＣＤＧＦ遺伝子の発現に干渉する標的配列、例えば、拮抗物質である相同体を符号化するものなど、の切除をその遺伝子の発現を活性化するように設計することができる。このたんぱく質の発現に対するこの干渉は、例えばプロモータ要素又は内部の停止コドンからのＣＤＧＦ遺伝子の空間的分離等、多様なメカニズムで生じさせることができる。更に、遺伝子のコーディング配列が、フランキング配列を従えたリコンビナーゼ認識配列であり、かつ、プロモータ要素に対して３’から５’の方向で細胞中に形質移入された移植遺伝子を作成することができる。このような場合、標的配列の反転の結果、当該遺伝子の方向が変わり、コーディング配列の５’端がプロモータ要素方向に配置されるため、プロモータ駆動型の転写活性化が可能となる。
【０２５６】  具体的な実施例では、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーセ系（Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：６８６１−６８６５）又はサッカロミセス・セレビジエのＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５；ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１５６９４号）のいずれかを用いて、部位特異的遺伝子組換え系を生体内で作成することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列間に位置する介在標的配列の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼが媒介する遺伝子組換えに必要な配列である。ｌｏｘＰ配列の方向は、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在するときに、介在標的配列が切除されるか又は反転されるかを決定するものであり（Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９−１５１４）、ｌｏｘＰ配列がそのまま反復配列の方向にあるときには標的配列の切除を触媒し、ｌｏｘＰ配列が反転された反復配列の方向にあるときには、標的配列の反転を触媒する。
【０２５７】  従って、標的配列の遺伝子組換えは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現に左右される。リコンビナーゼの発現は、外部から加えられた物質により誘発可能又は抑制可能である、例えば組織特異的、発生段階特異的な調節的制御の対象となるプロモータ要素により調節することができる。この調節された制御の結果、リコンビナーゼの発現がプロモータ要素により媒介された細胞でのみ、標的配列の遺伝子組換えが起きるであろう。このように、組換えＣＤＧＦたんぱく質の活性化発現は、リコンビナーゼ発現の制御により調節することができる。
【０２５８】  組換えＣＤＧＦたんぱく質の発現を調節するのにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用するには、遺伝子導入動物の構造に、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び当該たんぱく質の両方を符号化する移植遺伝子が含まれていることが必要である。
【０２５９】  Ｃｒｅリコンビナーゼ及び組換えＣＤＧＦ遺伝子の両方を含んでいる動物は、「二重」遺伝子導入動物の構造を通じて提供することができる。このような動物を提供するのに便利な方法は、それぞれが移植遺伝子、例えばＣＤＧＦ遺伝子及びリコンビナーゼ遺伝子を含む二匹の遺伝子導入動物を交配させることである。
【０２６０】  リコンビナーゼにより媒介される発現可能なフォーマットでＣＤＧＦ移植遺伝子を含む遺伝子導入動物を構成することで主に得られる利点の一つは、当該たんぱく質が、遺伝子導入動物での発現が起きると有害になる可能性があることである。このような場合、当該移植遺伝子が全組織中で沈黙している創始者集団を増殖させ、維持することができる。この創始者集団の個々を、リコンビナーゼを例えば一つ又は複数の組織で発現している動物と交配させてもよい。このようにして、例えば拮抗的なＣＤＧＦ移植遺伝子が沈黙している創始者集団を作ることで、特定の組織又は発生上の段階でＣＤＧＦの媒介する誘発が破壊されたことで致命的表現型が生じるであろう創始者から、後代の研究が可能となるであろう。
【０２６１】  同様の条件付き移植遺伝子は、移植遺伝子の発現を促進するために原核性たんぱく質が同時に発現することを必要とする原核性プロモータ配列を用いて提供することができる。プロモータ及び対応する転写促進原核性たんぱく質の例は米国特許第４，８３３，０８０号に説かれている。更に、条件付き移植遺伝子の発現は、この転写促進たんぱく質、例えばリコンビナーゼ又は原核性たんぱく質等を符号化する遺伝子を組織に送り込み、発現させるという、細胞種特異的な方法等、遺伝子治療のような方法で誘発することができる。この方法により、ＣＤＧＦ移植遺伝子を、成体期になって転写促進物質が導入されて「スイッチ−オン」されるまで沈黙させておくことができるであろう。
【０２６２】  一例としてあげる実施例では、本発明の「遺伝子導入されたヒト以外の動物」を、このヒト以外の動物の生殖系列に移植遺伝子を導入することで生成する。様々な発生段階にある胚芽標的細胞を用いて移植遺伝子を導入することが可能である。胚芽標的細胞の発生段階に応じて異なる方法を用いる。顕微注射には受精体が最良の標的である。マウスでは、オスの前核は直径で約２０マイクロメータにも達するため、１−２ｐ１のＤＮＡ溶液の注射を再現可能に行うことができる。遺伝子転移に標的として受精体を用いることには、注射されたＤＮＡが、多くの場合一回目の卵割の前に宿主の遺伝子に組み込まれるという大きな利点がある（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ  ８２：４４３８−４４４２）。結果的に、この遺伝子導入したヒト以外の動物の細胞はすべて、組み込まれた移植遺伝子を持つこととなる。このことは、生殖細胞の５０％が移植遺伝子を持つこととなるため、移植遺伝子が創始者の子孫に効率的に伝えられることにも概ね反映している。受精体の顕微注射は、本発明を実施する上で移植遺伝子を組み込むための好適な方法である。
【０２６３】  レトロウィルス感染を用いてもヒト以外の動物に移植遺伝子を組み込むことは可能である。発生中のヒト以外の胚は胞胚の段階まで試験管内で培養することができる。この間に、分割細胞をレトロウィルス感染の標的にしてもよい（Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｒ．（１９７６）ＰＮＡＳ  ７３：１２６０−１２６４）。分割細胞の効率的な感染は、酵素処理で透明帯を除去して達成されている（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｈｏｇａｎ  ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８６））。移植遺伝子を導入するために用いられるウィルスベクタ系は移植遺伝子を持つ複製欠陥性のレトロウィルスであることが多い（Ｊａｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ  ８２：６９２７−６９３１；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ８２：６１４８−６１５２）。形質移入は、分割細胞をウィルスを生成する細胞の単層上で培養すると容易かつ効率的に行われる（上述のＶａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ；Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３８３−３８８）。あるいは、より後期の段階で感染を行ってもよい。ウィルス又はウィルスを生成する細胞は分割腔内に注射することができる（Ｊａｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２３−６２８）。創始者のほとんどは移植遺伝子についてはモザイク状になるが、これは組み込みが、遺伝子導入されたヒト以外の動物を形成した細胞の小集団でのみ行われるからである。
【０２６４】  更に、創始者は、一般的には子孫で分裂することとなるゲノムの異なる位置に、移植遺伝子の様々なレトロウィルスの挿入を含んでいてもよい。加えて、妊娠中期の胚の子宮内レトロウィルス感染により生殖細胞系に移植遺伝子を導入することも可能である（上述のＪａｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２））。
【０２６５】  移植遺伝子導入に向けた第三番目の種類の標的細胞は、胚幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞を試験管内で培養した移植前の胚から取り出し、胚と融合させる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ  ８３：９０６５−９０６９；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８）。移植遺伝子は、ＤＮＡ形質移入又はレトロウィルス媒介形質導入により、効率的にＥＳ細胞に導入することができる。このような形質転換したＥＳ細胞を次に、ヒト以外の動物から得た胚盤胞に結合させる。その後ＥＳ細胞は胚に集落形成し、最終的に得られるキメラ動物の生殖細胞に貢献する。参考には例えば、ジャーニッシュ・Ｒ氏著（１９８８）サイエンス誌２４０：１４６８−１４７４を参照されたい。
【０２６６】  ノックアウト又は破壊遺伝子導入動物を作る方法もまた広く公知である。例えば、マウスの胚の操作（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。リコンビナーセ依存性のノックアウトも、例えば、ＣＤＧＦアレルの不活化の組織特異的及び／又は時間的制御が上述のように行えるよう、内生ＣＤＧＦ遺伝子のリコンビナーゼ標的配列フランキング部分を挿入する相同性の組換えを行うなどして、作成することができる。
【０２６７】  以上、本発明を大まかに説明したところで、以下の例を参照すればより容易に理解されようが、同例は本発明のいくつかの態様及び実施例の説明のためにのみまれるものであり、本発明の限定を意図したものではない。
【実施例】
【０２６８】  例証  本発明をこうして一般的に説明したが、特定の様態及び実施例の例示の目的であって本発明を限定することは意図しないで含まれた以下の例を参照することによって、更に容易に理解ができるはずである。【０２６９】  ニューレグリン（ＡＲＩＡ、ＧＧＦ、ヘレグリン、ＮＤＦとも呼ばれる。Ｆａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−１５；Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３１２−８；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１０．；及びＷｅｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：５５９−７２を参照）は、単一遺伝子の代替ＲＮＡスプライシングから発生するポリペプチド因子のグループである。ｅｒｂＢ族のレセプタ（ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４）との相互作用を通して、ニューレグリンは多くの組織における細胞の成長及び分化の調節に重要な役割を果たしていると考えられている（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：３３４−５；Ｌｅｍｋｅ  Ｇ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２９１−２；及びＣａｒｒａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５：６０６−６１２）。ここで述べたように、ＣＤＧＦと呼ばれる第二のニューレグリン様遺伝子が既にクローンされている。ＣＤＧＦ  ｃＤＮＡクローンの配列分析では、ニューレグリンのモチーフ構造に似たモチーフ構造（例えば、様々な転写を生む差異スプライシングが起きること）を持つことが示されている。成体組織のノーザン・ブロット分析によって、ＣＤＧＦの写しが主に神経組織で検出されることが示されている。ＥＧＦ様のドメイン内の代替スプライシング部位は、タイプ１及びタイプ２の二つのＣＤＧＦイソフォームを生む。組換えＣＤＧＦ−１は、これら全てのｅｒｂＢ族レセプタを発現する細胞株内でｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４のチロシン・リン酸化を誘発する。しかし、ｅｒｂＢの定義された組合せを備えた細胞株内では、ＣＤＧＦ−１は、ｅｒｂＢ４を備えたものしか活性化せず、これはＣＤＧＦシグナリングがｅｒｂＢ４レセプタを介することを示唆している。【０２７０】  ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４（Ｐｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０：１７４６−５０）は、ＥＧＦレセプタ（ＥＧＦＲ）も含むレセプタ・チロシン・キナーゼの亜族に含まれる。直接的又は間接的相互作用によって、ニューレグリンがｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４レセプタを活性化できることは実証されているが（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１４６６１−５）、最近の実験によると、それ以外のリガンドが存在することが示唆されている（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：３８６−９０；Ｇａｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：３９０−４；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７８：３９４−８）。ＣＤＧＦ  ｃＤＮＡをクローン形成するには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく戦略を用いて成体ラットの小脳ｃＤＮＡライブラリの中でニューレグリン関連の配列の探索が行われた。この新しい遺伝子である小脳由来成長因子（ＣＤＧＦ）は、幾つかの組織で発現している。【０２７１】  ＣＤＧＦの写しのクローニング縮退オリゴヌクレオチドの２つのプールを、ニューレグリン配列の２つの保存された領域（１つは免疫グロブリン・ドメイン、もう一方はＥＧＦ様ドメイン）に基づいて合成した。成体ラット小脳ｃＤＮＡライブラリからのファージをＰＣＲのテンプレートとして使用した。２つの段階を用いて、ニューレグリン配列を還元し、またニューレグリンに関連した配列を選択した。ラット・ニューレグリンｃＤＮＡにはＢｃ１−Ｉ部位があるので、第一に、ＰＣＲ生成物が、Ｂｃ１−Ｉによって消化され、アガロース・ゲル電気泳動によって分離された。期待された大きさのＤＮＡがアガロース・ゲルから分離され、同じプライマを用いて再増幅された。最終ＰＣＲ生成物は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩベクタ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にサブクローンされた。次に、個々のクローンは、ニューレグリンプローブと低緊縮条件下で交雑され、陽性クローンのみが配列化された。私は、ニューレグリンとかなりの相同性を示す一つのクローンｎ９を同定した。ｎ９インサートからの３２Ｐで標識付けされたプローブを用いて、上記のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングし（５００，０００までのクローンがスクリーニングされた）、幾つかの陽性クローンが判別された。各クローンのインサートは両方向に配列化され、分析された。とりわけ、二つの部分的で、重なり合ったクローン（指定クローン２ｂ及び２ｄ）は、ＣＤＧＦ−１たんぱく質を符号化するものとして同定された。クローン２ｂは、配列同定番号第１番の核酸配列１−１２５２に相当し、クローン２ｄは配列同定番号第１番のヌクレオチド５９２−３４４１に相当する。【０２７２】  別のクローン（指定クローン３）は、ＣＤＧＦたんぱく質（配列同定番号第５番を参照のこと）のＣ末端断片に相当する部分クローンで、この断片にはスペーサ１配列及びＩｇ様ドメインのＮ末端の半分が欠けていた。更に、この核酸配列は、ＥＧＦ様コーディング配列の３’端において７７個のヌクレオチド・インサート（図１Ｂを参照）があることを呈しており、その結果フレームのシフトがあって、停止コードンに至るため、膜内外及び細胞形質のドメインが欠けた切端たんぱく質を形成していた。【０２７３】  クローン２ｂ、２ｄ、及び３は夫々、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩファージミドベクタ（カリフォルニア州ラホヤ、ストラタジーン社製）にＥｃｏｒＲＩインサートとして存在していた。ＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ−２たんぱく質は、ＡＲＩＡ、ＧＧＦ、ヘレグリン、ＮＤＦたんぱく質の何れとも約５０％の相同性しか持たない。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔクローン２ｂ、２ｄ、及び３を含んだ核酸ライブラリが、ブタペスト条約に従って、１９９５年９月８日に米国代表菌株培養収集（メリーランド州ロックビル）に預託された。この預託には、ＡＴＣＣ（米国代表菌株培養収集）受入番号９７２７４が与えられている。各クローンは、少なくとも一つのプライマが、例えばライブラリのうちただ一つのクローンに特有の核酸配列にアニール化されるプライマセットを用いたＰＲＣ増幅によってＡＴＣＣ預託物から別々に分離することができる。具体的には、プライマセット５’−ＡＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＣＣ及び５’−ＧＣＣＧＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＣＣを使って、ライブラリからのクローン２ｂの符号化配列を増幅することができる。同様に、プライマセット５’−ＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＣＡＡＣ−ＣＣＧＧと５’−ＧＧＣＣＴＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡ、及び５’−ＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＣと５’−ＣＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＧＴを使って、クローン２ｄ及びクローン３の符号化配列を夫々増幅することができる。【０２７４】  更に、クローン２ｄ及びクローン３から生成される断片を用いて、クローン２ｂからの断片をアニール化して夫々ＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ−２相同体の各々に関して全長構造が生成可能なことは明らかである。例えば、プライマ５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧ及び５’−ＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＧＣＧを用いて、Ｍｅｔ１−Ｇｌｕ２５５に相当するクローン２ｂの二本鎖断片を提供することは可能であり、これはＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ−２に共通である。上述のように、プライマセット５’−ＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＣＡＡＣ−ＣＣＧＧと５’−ＧＧＣＣＴＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡ及び５’−ＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＣと５’−ＣＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＧＴを用いて、夫々クローン２ｄ及び３の二本鎖断片を提供することは可能である。クローン２ｂのＰＣＲ生成物は、クローン２ｄ又は３のどちらかのＰＣＲ生成物と変性条件下で混合されて、その後に復元される。復元後には、単一鎖領域をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートして満たし、得られたＣＤＧＦ符号化遺伝子は配列同定番号第２番または４番によって表されるたんぱく質を提供するよう発現ベクタにクローン形成される。【０２７５】  図１Ａは、ＣＤＧＦ−１の推定上のアミノ酸配列を示し、これは二つの重なり合ったｃＤＮＡクローンの複合物から得られたものである。この複合物は、７５４のアミノ酸たんぱく質を符号化する開放読み取り枠（ＯＲＦ）を含んでいる。【０２７６】  配列分析によって、推理したアミノ酸配列の中に４つの構造的モチーフがあるのが明らかになった（図１Ｃ参照）。Ｎ末端近くには、疎水性の残基からなる部分がシグナル配列として作用している可能性もある。システイン残基１６５及び２１９とその周囲の配列は、Ｃ２タイプ免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインの定義に合致する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：３８１−４０５）。更に下流では、ＥＧＦ様ドメイン（残基２５２乃至２９７）が６つの特徴的なシステインを含んでいる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：７７０９−１２）。２３の疎水性のアミノ酸からなる第二の部分を膜内外ドメインとみなすことが出来、配列全体を３１５残基細胞外ドメインと４１４残基細胞形質ドメインに別けている。興味深いことに、付加的７７塩基対エキソンがＥＧＦ様ドメインの４番目と５番目のシ���テイン残基の間に挿入された（図１Ｂを参照）もう一つのＣＤＧＦ  ｃＤＮＡクローン（ＣＤＧＦ−２）は、異なったＥＦＧ様ドメインを備えたＣＤＧＦの代替的にスプライスされた変異体を符号化するものである。この付加的エキソンが挿入されたことで枠が下方配列にシフトし、ＯＲＦ３３アミノ酸の末端がＥＦＧ様ドメインの下流にシフトするため、ＣＤＧＦ−２イソフォームも膜内外ドメインを欠いている。この二つの変異体ＥＧＦ様ドメインを備えたＣＤＧＦは、ＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ−２と命名されている。ＣＤＧＦ−１とＣＤＧＦ−２はニューレグリンαまたはニューレグリンβからほぼ等距離離れているが、ニューレグリン遺伝子は、α及びβサブタイプ・ニューレグリンをもたらす類似の代替スプライシング部位も備えている。さらにＣＤＧＦの細胞形質ドメインの中の別の代替スプライシング部位も、ニューレグリン遺伝子のａ／ｂ／ｃの尾のスプライシング部位に応じて、他のＣＤＧＦ  ｃＤＮＡクローン中に観察されている（データは示さない）。よって、ＣＤＧＦとニューレグリンは、類似の配列を備えているだけでなく、類似の遺伝子構造も備えているように思われる。【０２７７】  たんぱく質データベース検索によって、ＣＤＧＦはニューレグリン（ニューレグリンのイソホーム中ではヘレグリンβ１）に非常に類似していることが明らかになった。全体的に見てＣＤＧＦ−１は、ヘレグリンβ１と４５％の同一性を持ち、ＧＧＦＩＩとは４０％の同一性を持っている。この同一性は、Ｉｇ様ドメインでは約３８％で、ＥＧＦ様ドメインでは約５０％である。ＣＤＧＦ−１のＮ末端以外は、ＣＤＧＦ−１とヘレグリンβ１との相似性は、配列全体に及んでいる（図２Ａを参照）。一方、ＣＤＧＦ−１のＮ末端は、ＧＧＦＩＩのＮ末端とかなりの同一性（４３％）を持っている（図２Ａを参照）。興味深いことに、ＣＤＧＦ−１とヘレグリンβ１との最も相似性の高い領域は、膜内外ドメイン（９０％の同一性）及び隣接した配列である。推定たんぱく分解部位（ＫＲ）も保存されるが、これはＣＤＧＦ−１の細胞外部分が、ニューレグリンに関して示唆されるように、その前駆体から開放される可能性を示唆している。高度に保存された領域もＣＤＧＦ−１とヘレグリンβ１の細胞形質の尾には存在し、これは細胞質ドメインが重要な生物学的機能を担うことを示唆している。互いに遠い脊椎動物種から得られたニューレグリン細胞質の尾の間に比較的高い保存性があることは以前から注目されてきた。ニューレグリンのＥＧＦ様ドメインはレセプタ結合及び細胞反応を刺激するのに十分であると報告されているため、私はＣＤＧＦのＥＧＦ様ドメインと他のＥＧＦ様モチーフ（図２Ｂ参照）との詳細な比較を行なった。既知の全てのＥＧＦ様モチーフの中では、ＣＤＧＦのＥＧＦ様ドメインがニューレグリンのものに対して最も相似性が高い（ヘレグリンβ１の場合は、末端システインに４５％の同一性）。ニューレグリンの次には、ラットの上皮成長因子（ＥＧＦ）で、末端システインの間に４３％の同一性がある。【０２７８】  ヒトＣＤＧＦ相同体をクローン形成するために、ヒトの肺ｃＤＮＡライブラリ（ＣｌｏｎｔｅｃｈＨＬ３００２ａ）をラットＣＤＧＦ−２クローンのＥＧＦ様ドメインからのプローブを用いてスクリーニングした。２．２ｋｂインサートを分離して、ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫベクタ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にサブクローン形成した。このインサートの最初の６６７の塩基対までの配列を配列同定番号第６番に示す。ヒトのクローンのＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列（配列同定番号第７番）は、ラットＣＤＧＦ−２に対して１００％保存されている。【０２７９】  得られたヒトＣＤＧＦ−２配列の範囲では、ラットとヒトのクローンは７０．２％相同であった。【０２８０】  ＣＤＧＦの発現パターンＣＤＧＦ  ｍＲＮＡの大きさ及び組織分布を調べるため、ｐｌｏｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いたノーザン・ブロット交雑実験を、ＥＧＦ様ドメインからＩｇ様ドメインに亘るプローブ（図３Ａ参照）を用いて行なった。簡単に言うと、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で組織から直接洗浄した。ＲＮＡ試料をアガロースゲル上で分離し、通常のプロトコルによってナイロン・フィルタに移した。フィルタは３２Ｐで標識付けしたプローブと高緊縮条件下で交雑させた。ＥＧＦ様ドメイン及びＩｇ様ドメインに亘るＣＤＧＦ  ｃＤＮＡの断片を無作為プライミングしてプローブを生成した。高度に保存された膜内外ドメイン及び隣接する配列は除外された。このプローブはＣＤＧＦα及びＣＤＧＦ−２の写しの両方と交雑するはずである。【０２８１】  検査した成体のラット組織の中では、ＣＤＧＦの写しは神経組織（脳及び脊髄）及び肺に最も多く見られた。ＲＮＡ試料全体での別の実験では、小脳を除いた脳及びその他の成体組織と比べて、小脳に最も多くの量のＣＤＧＦの写しがあることが示されている（データは示さない）。脳の試料の中で３つの帯が注目された（図３Ａ）。３ｋｂの顕著な帯、及び３．８と６ｋｂの２つの付加的な帯がそれである。３及び３．８ｋｂの写しのみが脊髄及び肺の試料中に検出された。３つの主たる写しの一般的なパターンは、ニューレグリン遺伝子にも観察されている。しかし、ノーザン・ブロットによって検出されるレベルでは、成体のラット中のＣＤＧＦの写しの組織分布は、ニューレグリンのそれと比べてより限定的なようである。【０２８２】  私は、より感受性の高いリヴァーストランスクリプターゼを組み合わせたｐＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）技法も用いて、異なる成体のラット組織の中におけるＣＤＧＦの写し存在を検出した。ＲＴ−ＰＣＲ実験では、様々な組織からのＲＮＡ全体をチオシアン酸グアニジウム／酸フェノール法によって分離し、ｐｌｏｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＭｉｃｒｏＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡ全体から精製した。ｃＤＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて合成した。プライマは、ＣＤＧＦ  ｃＤＮＡのＥＧＦ様領域を増幅するよう設計された。ＰＣＲ増幅は、摂氏９４度で１分間、５５度で４５秒、７２度で１分間を３５サイクル、行なった。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル上で分離され、臭化エチジウム染色法で観察された。図３Ｂに示した様に、ＣＤＧＦ−１の写しがこれまで検査したすべての組織（肝臓、心臓、腎臓、脾臓、骨格筋、肺、脳、脊髄）の中に検出された。ＣＤＧＦ−２は、神経組織、肺、及び脾臓に検出された。二つのイソフォームは両方とも生後のラットの脳（Ｐ２脳）に検出された。ｃＤＮＡ合成中にリヴァーストランスクリプターゼを用いなかった対照試料は、帯を示さなかった（データは示さない）。【０２８３】  ＣＤＧＦによるｅｒｂＢレセプタの自己燐酸化誘発ＣＤＧＦとニューレグリンとの構造的相似性は、ＣＤＧＦがｅｒｂＢ族レセプタのリガンドとしても作用するかもしれないことを示唆している。この可能性をテストするために、私は、ＣＤＧＦ−１の細胞外ドメインの全て及びその細胞形質ドメインの一部を含んだクローンの、哺乳類発現ベクタ中へのインサートを、サブクローン形成した。推定たんぱく分解部位の周囲の配列はＣＤＧＦとニューレグリンとの間で高度に保存されているため、ＣＤＧＦ−１たんぱく質の可溶性形態は、ニューレグリンの場合のように膜結合先駆物質から培養培地に放出されるはずである。【０２８４】  簡単に言うと、ＥＧＦ様ドメインを含むＣＤＧＦ−１配列を、ｐＲｃ／ＣＭＶ発現ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローン形成し、ＣＨＯ細胞に安定的に形質移入させた。無血清条件媒体を集めた。負の対照媒体は、ＣＨＯ細胞から又は、関連性の無い遺伝子で形質移入させたＣＨＯ細胞からの調製培地である。図４Ａを参照すると、ＣＤＧＦ−１調製培地か、負の対照培地か、ヘレグリンβ１（細胞外部分、２０ｎｇ／ｍｌ。Ｓｔｅｖｅｎ  Ｊ．Ｂｕｒｄｅｎ教授提供）を加える前に、細胞を無血清培地の中で２乃至６時間の間、飢餓させた。室温にて５乃至１０分間インキュベートした後、細胞をＲＩＰＡ緩衝剤（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬでｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％のデオキシコール酸塩ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのアプロチニン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）中で溶解させ、ｅｒｂＢ２（Ｃ１８）、ｅｒｂＢ３（Ｃ１７）、又はｅｒｂＢ４（Ｃ１８）に対して特異的なウサギの抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で免疫沈降させた。免疫沈降させたたんぱく質は、プロテインＡ−セファロース・ビードに収集し、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてウェスターン・ブロットによって分析された。抗体結合が、強化化学ルミネヤンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）によって検出された。【０２８５】  図４Ｂを参照すると、ｅｒｂＢ族レセプタの定義された組合せで形質移入させたＢａ／Ｆ３及びΨ２細胞株の確立が、これまでに発表されている（Ｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：５７７０−５７７６）。フィッシャーラット３Ｔ３（Ｆ３Ｔ３）におけるＥＧＦＲ及びｅｒｂＢ２の発現は、更に以前に説かれている（Ｄｏｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１１５１−１１５９）。ヒト組換え型ベータセルリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を２００ｎｇ／ｍｌで使用した。ヒト組換え型ＴＧＦ−α（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を１００ｎｇ／���ｌで使用した。化学的に合成したヘレグリン−β１を６５ｍｅｒ（Ｂａｒｂａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９５８５−９５８９）を９４ｎｇ／ｍｌで使用した。細胞処理、免疫沈降、及びウェスターン・ブロットは、上述とほぼ同様に行われた（Ｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．上述）。【０２８６】  安定して形質移入させたＣＨＯ細胞からの調製培地を収集して、ｅｒｂＢ族レセプタ（ＭＤＡ−ＭＢ４５３及びＴ４７Ｄ乳癌細胞株）を発現する細胞を処理するのに用いた。個々のｅｒｂＢ族レセプタは、各ｅｒｂＢレセプタに対する抗体を持つ細胞から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体で分析した。図４Ａに示した様に、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４レセプタはＣＤＧＦ−１調製培地によって活性化した。しかし、ｅｒｂＢ族レセプタは、リガンド誘発ヘテロダイマを形成可能であり、またこれらの細胞株はｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４レセプタ全てを発現するため、ｅｒｂＢ族レセプタの各タイプの活性化は、ＣＤＧＦ−１との直接的又は間接的な相互作用による可能性もある。【０２８７】  どのｅｒｂＢ族レセプタがＣＤＧＦ−１シグナリングに関係しているかを確かめるため、私は、定義された組合せのｅｒｂＢレセプタを発現する細胞株を使用した。私は、Ｂａ／Ｆ３（ＥＧＦＲ）細胞株中のＥＧＦレセプタ、Ｂａ／Ｆ３（ｅｒｂＢ２＋ｅｒｂＢ３）細胞株中のｅｒｂＢ２及びｅｒｂＢ３レセプタ、及びフィッシャーラット３Ｔ３細胞株中のｅｒｂＢ２レセプタのチロシン燐酸化を検定した（図４Ｂ参照）。ｅｒｂＢ４を発現しないこれらの細胞株は、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２及びｅｒｂＢ３のＣＤＧＦ−１活性化を示さなかった。正の対照要因（ベータセルリン、ＴＧＦα、ヘレグリンβ１）は、これらの細胞株中のＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２及びｅｒｂＢ３レセプタが刺激を受けることが可能である事を実証した。他方、ｅｒｂＢ４レセプタは、Ｂａ／Ｆ３（ｅｒｂＢ４）及びΨ２（ｅｒｂＢ４）細胞株のようなｅｒｂＢ４を発現する細胞株中で刺激される（図４Ｂ参照）。これらを総合すると、上述の実験は、ＣＤＧＦ−１シグナリングがｅｒｂＢ４レセプタとの直接的な相互作用を介して行われることを強く示唆している。【０２８８】  ＩＬ−３独立成長アッセイ（Ｒｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：５７７０−５７７６）の予備結果は、ＣＤＧＦ−１がＢａ／Ｆ３（ＥＧＦＲ＋ｅｒｂＢ４）細胞からのＩＬ−３の独立性を示しているが、Ｂａ／Ｆ３（ｅｒｂＢ２＋ｅｒｂＢ３）細胞からのＩＬ−３の独立性を示しておらず、この結果はチロシン燐酸化アッセイとも矛盾なく一致している（データは示さない）。【０２８９】  関連した一連の実験で、私は大腸菌中でＣＤＧＦ−１及びＣＤＧＦ−２のＥＧＦ様ドメインを発現させた。発現させたたんぱく質は不溶性である。しかし、このたんぱく質ペレットを変性溶液（６ＭのＧｕａｎｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ）で可溶化し、再生工程を経た後は、再生されたたんぱく質はｅｒｂＢレセプタをＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞（上述）上で活性化させることが観察された。【０２９０】  要約すると、ニューレグリン遺伝子と相似の構造を持ったＣＤＧＦ遺伝子が、ｅｒｂＢ４レセ���タのリガンドを符号化することを、私は実証したのである。それらの発現の時間的及び空間的調整を含め、ＣＤＧＦと、ニューレグリンやｅｒｂＢ族レセプタのその他のリガンドとの詳細な比較は、この複数リガンド／複数レセプタ・シグナリングネットワークの生物学的機能の理解には不可欠であろう。【０２９１】  上記の明細書中で引用された参考文献及び刊行物の全ては、ここに言及して編入される。【０２９２】  等価物  当業者であれば、ここに記載された本発明の特定の実施例の多くの同等物を認知し、また通常の実験を行なってこうした同等物を確かめることが可能なはずである。こうした同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。【０２９３】  政府の助成  ここに述べる研究は米国国立保健研究所から助成金ＮＩＨ  ＥＹ０８３９７号及びＮＩＨ  ＮＳ１４５０６号の下で援助を受けてなされた。合衆国政府はこの発明に対して何らかの権利を有するものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年9月27日(2010.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＧＦポリペプチド及びアジュバントを含む免疫原性製剤であって、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドがｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合し、前記免疫原性製剤が、前記ＣＤＧＦポリペプチドに特異的な免疫応答を惹起することができる、免疫原性製剤。
【請求項２】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性製剤。
【請求項３】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性製剤。
【請求項４】
ＣＤＧＦポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法であって：
ａ）請求項１の免疫原性製剤で哺乳動物を免疫するステップと、
ｂ）前記哺乳動物から抗体産生細胞を得るステップと、
ｃ）前記抗体産生細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生じさせるステップと、
ｄ）ＣＤＧＦポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を前記ハイブリドーマ細胞から単離するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がマウスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法により作製された、ＣＤＧＦポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により作製された、ＣＤＧＦポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
組織試料中のＣＤＧＦポリペプチドを免疫組織化学的染色する方法であって、請求項８又は９に記載のモノクローナル抗体で組織を染色するステップを含む、方法。
【請求項１１】
体液試料中のＣＤＧＦポリペプチドのレベルを観察する方法であって、請求項８又は９に記載のモノクローナル抗体に前記体液試料を接触させるステップを含む、方法。
【請求項１２】
ＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを調製する方法であって、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドはｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合し、前記方法は、コンビナトリアル変異誘発法によりＣＤＧＦポリペプチドのバリアントを生成することでＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを調製するステップを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法により調製された、ＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリー。
【請求項１４】
ＣＤＧＦポリペプチドのアゴニストを同定する方法であって、請求項１３に記載のＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを、前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性を刺激するバリアントについてスクリーニングすることで、前記ＣＤＧＦポリペプチドのアゴニストを同定するステップを含む、方法。
【請求項１５】
ＣＤＧＦポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法であって、請求項１３に記載のＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを、前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性を阻害するバリアントについてスクリーニングすることで、前記ＣＤＧＦポリペプチドのアンタゴニストを同定するステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性が、前記ＣＤＧＦポリペプチドのｅｒｂＢレセプタへの結合である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性が、ｅｒｂＢレセプタの自己リン酸化の誘導である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法により同定された、ＣＤＧＦポリペプチドのアゴニスト。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法により同定された、ＣＤＧＦポリペプチドのアンタゴニスト。
【請求項２０】
ＣＤＧＦポリペプチドに対して応答性の細胞の分化状態を誘導及び／又は維持する、増殖を起こさせる、及び／又は、生存を亢進する方法であって、前記細胞を請求項１８に記載のアゴニストに接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
ＣＤＧＦポリペプチドに対して応答性の細胞の分化状態を誘導及び／又は維持する、増殖を起こさせる、及び／又は、生存を亢進する方法であって、前記細胞を請求項１９に記載のアンタゴニストに接触させるステップを含む、方法。
【請求項２２】
ＣＤＧＦポリペプチド及び生物学的に許容可能な媒質を含む医薬組成物であって、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドがｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、医薬組成物。
【請求項２３】
前記生物学的に許容可能な媒質が、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口及び鼻腔内から成る群より選択される投与経路により前記医薬組成物を投与するのに適している、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
対象のニューロン及び／又は神経細胞の生存及び／又は維持を亢進する方法であって、対象に請求項２２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記対象が：
（ｉ）感染性／炎症性及び腫瘍誘発性傷害と共に、外傷性傷害、化学傷害、脈管傷害及び欠陥（例えば卒中を原因とする虚血など）を含む、急性、亜急性又は慢性の傷害；（ｉｉ）アルツハイマー病を含む、神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症及び脊髄小脳変性症を含む、神経系の慢性神経変性疾患；（ｉｖ）多発性硬化症を含む、神経系の、又は神経系に影響する慢性の免疫性疾患；及び（ｖ）感覚ニューロンの障害や網膜の変性疾患、から選択される神経状態に苦しむ、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象に栄養因子を投与するステップを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記栄養因子が、神経成長因子、毛様体神経栄養成長因子、神経鞘腫由来成長因子、グリア成長因子、線条体由来神経栄養因子、血小板由来成長因子及び散乱因子（ＨＧＦ−ＳＦ）から成る群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の内、請求項１に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチド及びアジュバントを含む免疫原性製剤であって、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドがｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合し、前記免疫原性製剤が、前記ＣＤＧＦポリペプチドに特異的な免疫応答を惹起することができる、免疫原性製剤である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
請求項２に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性製剤である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
請求項３に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性製剤である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
請求項４に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法であって：
ａ）請求項１の免疫原性製剤で哺乳動物を免疫するステップと、
ｂ）前記哺乳動物から抗体産生細胞を得るステップと、
ｃ）前記抗体産生細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生じさせるステップと、
ｄ）ＣＤＧＦポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を前記ハイブリドーマ細胞から単離するステップと
を含む、方法である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
請求項５に記載された発明は、前記哺乳動物がマウスである、請求項４に記載の方法である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
請求項６に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
請求項７に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
請求項８に記載された発明は、請求項６に記載の方法により作製された、ＣＤＧＦポリペプチドに対するモノクローナル抗体である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
請求項９に記載された発明は、請求項７に記載の方法により作製された、ＣＤＧＦポリペプチドに対するモノクローナル抗体である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
請求項１０に記載された発明は、組織試料中のＣＤＧＦポリペプチドを免疫組織化学的染色する方法であって、請求項８又は９に記載のモノクローナル抗体で組織を染色するステップを含む、方法である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
請求項１１に記載された発明は、請求項に記載された発明において、体液試料中のＣＤＧＦポリペプチドのレベルを観察する方法であって、請求項８又は９に記載のモノクローナル抗体に前記体液試料を接触させるステップを含む、方法である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
請求項１２に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを調製する方法であって、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドはｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合し、前記方法は、コンビナトリアル変異誘発法によりＣＤＧＦポリペプチドのバリアントを生成することでＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを調製するステップを含む、方法である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
請求項１３に記載された発明は、請求項１２の方法により調製された、ＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーである。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
請求項１４に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチドのアゴニストを同定する方法であって、請求項１３に記載のＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを、前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性を刺激するバリアントについてスクリーニングすることで、前記ＣＤＧＦポリペプチドのアゴニストを同定するステップを含む、方法である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
請求項１５に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法であって、請求項１３に記載のＣＤＧＦポリペプチドのバリアントのふ入りライブラリーを、前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性を阻害するバリアントについてスクリーニングすることで、前記ＣＤＧＦポリペプチドのアンタゴニストを同定するステップを含む、方法である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
請求項１６に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性が、前記ＣＤＧＦポリペプチドのｅｒｂＢレセプタへの結合である、請求項１４又は１５に記載の方法である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
請求項１７に記載された発明は、前記ＣＤＧＦポリペプチドの活性が、ｅｒｂＢレセプタの自己リン酸化の誘導である、請求項１４又は１５に記載の方法である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
請求項１８に記載された発明は、請求項１４に記載の方法により同定された、ＣＤＧＦポリペプチドのアゴニストである。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
請求項１９に記載された発明は、請求項１５に記載の方法により同定された、ＣＤＧＦポリペプチドのアンタゴニストである。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
請求項２０に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチドに対して応答性の細胞の分化状態を誘導及び／又は維持する、増殖を起こさせる、及び／又は、生存を亢進する方法であって、前記細胞を請求項１８に記載のアゴニストに接触させるステップを含む、方法である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
請求項２１に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチドに対して応答性の細胞の分化状態を誘導及び／又は維持する、増殖を起こさせる、及び／又は、生存を亢進する方法であって、前記細胞を請求項１９に記載のアンタゴニストに接触させるステップを含む、方法である。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
請求項２２に記載された発明は、ＣＤＧＦポリペプチド及び生物学的に許容可能な媒質を含む医薬組成物であって、前記ＣＤＧＦポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又は４で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０パーセント相同なＣＤＧＦアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドがｅｒｂＢ型レセプタに特異的に結合する、医薬組成物である。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
請求項２３に記載された発明は、前記生物学的に許容可能な媒質が、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口及び鼻腔内から成る群より選択される投与経路により前記医薬組成物を投与するのに適している、請求項２２に記載の医薬組成物である。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
請求項２４に記載された発明は、対象のニューロン及び／又は神経細胞の生存及び／又は維持を亢進する方法であって、対象に請求項２２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
請求項２５に記載された発明は、前記対象が：
（ｉ）感染性／炎症性及び腫瘍誘発性傷害と共に、外傷性傷害、化学傷害、脈管傷害及び欠陥（例えば卒中を原因とする虚血など）を含む、急性、亜急性又は慢性の傷害；（ｉｉ）アルツハイマー病を含む、神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症及び脊髄小脳変性症を含む、神経系の慢性神経変性疾患；（ｉｖ）多発性硬化症を含む、神経系の、又は神経系に影響する慢性の免疫性疾患；及び（ｖ）感覚ニューロンの障害や網膜の変性疾患、から選択される神経状態に苦しむ、請求項２４に記載の方法である。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
請求項２６に記載された発明は、対象に栄養因子を投与するステップを更に含む、請求項２４に記載の方法である。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
請求項２７に記載された発明は、前記栄養因子が、神経成長因子、毛様体神経栄養成長因子、神経鞘腫由来成長因子、グリア成長因子、線条体由来神経栄養因子、血小板由来成長因子及び散乱因子（ＨＧＦ−ＳＦ）から成る群より選択される、請求項２６に記載の方法である。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】削除
【補正の内容】