(57)【要約】      （修正有）【課題】チアゾールオレンジの誘導体である非対称シアニン色素、染色溶液、および本質的に非遺伝子毒性として特徴付けられる精選された蛍光発生的化合物を用いる、固定化された核酸の存在を決定するための方法を提供する。【解決手段】一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである核酸を、固体または半固体の支持体上に固定化する工程、上記固定化した核酸を、非対称シアニン色素化合物と接触させる工程、次いで上記固定化させた核酸を、それによって上記核酸の存在が決定される適切な波長を照射する工程を包含する。【選択図】図３
2011099862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで該方法が、以下：
ａ）非対称のシアニン色素化合物をサンプルと合わせて標識混合物を調製する工程であって、ここで該サンプルが固体または半固体の支持体上に固定化され、そして該非対称のシアニン色素化合物が式
【化１】
2011099862.tif 000021
を有し；
ここでＸはＯ、Ｓ、またはＣ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１は縮合されたベンゼン、メトキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはメトキシであり；
ｔは独立して０、１、２、３または４であり；
ｓは独立して０、１、２、３または４であり、そして
ｎは０、１、２または３である工程；
ｂ）該標識混合物を、該非対称のシアニン色素化合物が該核酸と会合して、インキュベートされたサンプルを調製するために十分な時間、インキュベートする工程；
ｃ）該インキュベートされたサンプルに適切な波長を照射して、照射されたサンプルを調製する工程；および
ｄ）該照射されたサンプルを観察する工程であって、それによって該核酸の存在または非存在が決定される工程；
を包含する方法であって、ただし、該支持体がポリマーのゲルである場合、該非対称のシアニン色素化合物はチアゾールオレンジではない、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記核酸が一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせである、方法。
【請求項３】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが固定化される前に、前記非対称のシアニン色素化合物が前記核酸と合わせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固定化の間に、前記非対称のシアニン色素化合物が前記サンプルと合わせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が固定化された後に、前記非対称のシアニン色素化合物が前記核酸と合わせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記固体または半固体の支持体が、ポリマーのゲル、膜、アレイ、ガラスビーズ、スライドガラス、またはポリマーの微小粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固体または半固体の支持体が、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非対称のシアニン色素化合物が、ポリマーの膜上に固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記シアニン色素が式
【化２】
2011099862.tif 000022
を有し、そして真核生物細胞中で本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる、方法。
【請求項１１】
前記核酸が、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上に固定化されたＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中の核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで該方法が、以下；
ａ）本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる非対称のシアニン色素化合物をサンプルと合わせて、標識混合物を調製する工程であって、ここで該サンプルは固体または半固体の支持体上に固定化される、工程；
ｂ）該標識混合物を、該色素が該核酸と会合して、インキュベートされたサンプルを調製するために十分な時間、インキュベートする工程；
ｃ）該インキュベートされたサンプルに適切な波長を照射して、照射されたサンプルを調製する工程；および
ｄ）該照射されたサンプルを観察する工程であって、それによって該核酸の存在または非存在が決定される工程；
を包含する方法であって、ただし、該支持体がポリマーのゲルである場合、該シアニン色素化合物はチアゾールオレンジではない、方法。
【請求項１３】
前記シアニン色素化合物が式
【化３】
2011099862.tif 000023
を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記シアニン色素が、前記サンプルが固定化される前に前記核酸と合わせられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記シアニン色素が、固定化の間に前記核酸と合わせられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記シアニン色素が、前記サンプルが固定化された後に前記核酸と合わせられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記固体または半固体の支持体が、ポリマーのゲル、膜、アレイ、ガラス、およびポリマーの微小粒子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーのゲルが、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
固体または半固体の支持体上の固定化された核酸の存在または非存在を決定するための染色溶液であって、ここで該溶液が以下：
ｅ）式
【化４】
2011099862.tif 000024
を有する、非対称のシアニン色素化合物であって、
ここでＸはＯ、Ｓ、またはＣ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１は縮合されたベンゼン、メトキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはメトキシであり；
ｔは独立して０、１、２、３または４であり；
ｓは独立して０、１、２、３または４であり、ならびに
ｎは０、１、２または３である非対称のシアニン色素化合物；ならびに
ａ）トリスホウ酸緩衝液または酢酸トリス緩衝液；
を含む溶液であって、ただし、該シアニン色素化合物がチアゾールオレンジではない、溶液。
【請求項２１】
さらに、ポリマー化されていないアガロースまたはポリアクリルアミドを含む、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２２】
さらに、固体または半固体のマトリックスを含む、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２３】
前記シアニン色素が溶液中にあるか、あるいは固体または半固体のマトリックス上に固定化される、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２４】
前記染色溶液が、約６〜約８のｐＨを有する、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２５】
前記核酸が、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２７】
前記シアニン色素が、式
【化５】
2011099862.tif 000025
を有し、そして真核生物細胞中で本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２８】
前記核酸が、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上に固定化されたＤＮＡである、請求項２０に記載の染色溶液。
【請求項２９】
固定化された核酸の存在または非存在を決定するための染色溶液であって、ここで該溶液が以下：
ａ）真核生物細胞中で本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる、非対称のシアニン色素化合物；および
ｂ）酢酸トリス緩衝液、またはトリスホウ酸緩衝液
を含む、染色溶液。
【請求項３０】
さらに、ポリマー化されていないアガロースまたはポリアクリルアミドを含む、請求項２９に記載の染色溶液。
【請求項３１】
さらに、固体または半固体のマトリックスを含む、請求項２９に記載の染色溶液。
【請求項３２】
前記シアニン色素が溶液中にあるか、あるいは固体または半固体のマトリックス上に固定化される、請求項２９に記載の染色溶液。
【請求項３３】
前記シアニン色素が、式
【化６】
2011099862.tif 000026
を有する、請求項２９に記載の染色溶液。
【請求項３４】
前記緩衝液が、約６〜約８のｐＨを有する、請求項２９に記載の染色溶液。
【請求項３５】
前記核酸が一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたは一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、あるいはそれらの組み合わせである、請求項２９に記載の染色溶液。
【請求項３６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項３５に記載の溶液。
【請求項３７】
固体または半固体の支持体上に固定化された核酸の検出のための化合物であって、ここで該化合物が、真核生物細胞中で本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる、非対称のシアニン色素化合物である、化合物。
【請求項３８】
前記化合物が水溶液中にある、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記化合物が、固体または半固体マトリックス上に固定化されているか、または固体または半固体マトリックス中にある、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４０】
前記固体または半固体のマトリックスがアガロースを含む、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
前記固体または半固体のマトリックスがポリマーの膜である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４２】
前記シアニン化合物が、式
【化７】
2011099862.tif 000027
を有する、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４３】
固定化された核酸を検出するためのキットであって、該キットが以下：
ｆ）式
【化８】
2011099862.tif 000028
を有する化合物であって、
ここでＸはＯ、Ｓ、またはＣ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１は縮合されたベンゼン、メトキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはメトキシであり；
ｔは独立して０、１、２、３または４であり；
ｓは独立して０、１、２、３または４であり、そして、
ｎは０、１、２または３である化合物；
を備えるキットであって、ただし、該シアニン色素化合物がチアゾールオレンジではない、キット。
【請求項４４】
前記化合物が水溶液中にある、請求項４３に記載のキット。
【請求項４４】
前記水溶液がトリスホウ酸または酢酸トリスを含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４５】
前記化合物がアルコールまたはＤＭＳＯに溶解される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
前記化合物が、固体または半固体のマトリックス上に固定化される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
前記マトリックスがアガロースを含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記マトリックスがポリマーの膜である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４９】
前記化合物が
【化９】
2011099862.tif 000029
であり、そして本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願の相互参照）
本願は、２００３年９月３０日出願の米国特許出願番号第６０／５０７，６３０号の優先権を主張するものであり、本明細書中にその開示を参考として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、核酸ポリマーと複合される場合に、検出可能な蛍光シグナルを提供する、非対称のシアニンモノマー化合物に関連する。本発明は、分子生物学および蛍光に基づくアッセイの分野における適用を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
固定化された核酸、特にゲル上で分離された核酸の検出は、広く用いられる方法である。数多くの発色団および色素が核酸の検出のために存在するが、エチジウムブロマイドは、比較的検出限界が高いにもかかわらず、部分的には使用の容易さおよび低いコストに起因して、今もなお、最も一般的に用いられる核酸検出試薬の一つである。
【０００４】
エチジウムブロマイドは、核酸が前もって染色されてもよく、後で染色されてもよく、そしてＵＶ光源の他に可視化のための特別な装置を必要としないので、核酸ゲル染料として用いるのが容易である。エチジウムブロマイドは、４００ｎｍ未満のＵＶ光によって励起され、そしてＤＮＡと結合した場合に、約６２０ｎｍの発光スペクトルを有する。従って、染色されたゲルは、代表的には約３００ｎｍの光波長を有する紫外線透過照明装置によって励起され得、そして励起されたエチジウムブロマイド−ＤＮＡ複合体ゲルは、白黒のポラロイドフィルムを用いて撮影される。エチジウムブロマイドの便利性にもかかわらず、この化合物はいくつかの重要な不都合を有する；すなわち、この化合物は、特別な操作手順および特別な廃棄物処分手順を必要とする、公知の変異原性因子および発癌物質であること。エチジウムブロマイドは、数種の生物において、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ合成の双方を妨害することによって複製を阻害すること、エイムス試験において変異促進性であること、ならびに微生物においてフレームシフト突然変異の原因となることが示されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。このことは、エチジウムブロマイドが、ｄｓＤＮＡにインターカレートし、従って複製の間の誤りの原因となると考えられているからである（非特許文献４）。
【０００５】
エチジウムブロマイドのこれらの制限により、本発明者らは、エチジウムブロマイドの利点（使用の容易さおよび低いコスト）を保持し、しかしエチジウムブロマイドの制限を克服する、固定化された核酸を検出するための改善された方法の開発を欲した。従って、この基準を満たすために、方法およびそれに続く色素は、１）大量に合成することが比較的容易であり（低コスト）、２）比較的低濃度で染色溶液中に存在し（低コスト）、３）ＵＶ光で励起され（核酸−色素複合体がＵＶ透過照明装置によって可視化され得るような、使用の容易さ）、４）少なくともエチジウムブロマイドと同じ程度に感受性であり（使用の容易さ）、５）非遺伝子毒性であり（非変異促進性および無毒性）、そして６）水生生物に危険が無く、それゆえ特別な廃棄物処分を必要としないものでなければならない。
【０００６】
本明細書中で、本発明者らは、エチジウムブロマイドと少なくとも同程度に感受性であり、エチジウムブロマイドに比べてさらなる試薬または器械を必要とせず、そして大量に生産し得る、固定化された核酸ポリマーを検出するための、非対称のシアニン色素化合物のクラスの使用（特許文献１および特許文献２）を報告する。本発明者らはまた、非遺伝子毒性であり、それゆえ最終消費者による特別な操作手順または特別な廃棄物処分手順を必要としない、色素化合物のこのクラス中の化合物を報告する。従って、本発明は、現在用いられる核酸検出試薬に対する改善であり、そして過去に解決されなかった問題を解決する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，８８３，８６７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，９５７，８７０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍ．Ｊ．Ｗａｒｉｎｇ、”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”、１９６５年、第１３巻、ｐ．２６９−２８２
【非特許文献２】ＭｃＣａｎｎら、”ＰＮＡＳ”、１９７５年、第７２巻、ｐ．５１３５−５１３９
【非特許文献３】Ｓｉｎｇｅｒら、”Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９９９年、第４３９巻、ｐ．３７−４７
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｎａｇａら、”Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９８４年、第１２７巻、ｐ．３１−３７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、非対称のシアニン色素、染色溶液、および本質的に非遺伝子毒性として特徴付けられる精選された蛍光発生的化合物を用いる、固定化された核酸の存在を決定するための方法を提供する。この方法は、核酸（一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、あるいはそれらの組み合わせ）を固体または半固体の支持体上に固定化する工程、上記固定化された核酸を非対称のシアニン色素化合物と接触させる工程、次いで、上記固定化された核酸を、それによって上記核酸の存在が決定される適切な波長で照射する工程を包含する。上記シアニン色素化合物は代表的には、上記色素化合物、および、その中で溶液が上記色素化合物および上記固定化された核酸の接触を促進する、酢酸トリス緩衝液またはトリスホウ酸緩衝液を含む、水溶性染色溶液中に存在する。代表的には、上記固体または半固体の支持体は、ポリマーのゲル、膜、アレイ、ガラス、およびポリマーの微小粒子からなる群より選択される。好ましくは、上記ポリマーのゲルはアガロースまたはポリアクリルアミドである。
【００１０】
あるいは本発明は、上記核酸が上記シアニン色素化合物と接触されて、上記核酸を前もって染色し、次いで上記核酸が固体または半固体の支持体上に固定化される方法を提供する。この方法がポリマーのゲル（例えば、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル）と共に用いられる場合、上記核酸は前もって染色され、次いで、代表的には電気泳動によって上記ゲル上に固定化される。しかし、上記前もって染色された核酸はまた、他の支持体（例えばスライドガラスまたはポリマーのビーズ）上に固定化され得る。別の局面において、ポリマーのゲルが用いられる場合、上記シアニン色素化合物はポリマー化されていないゲルと混合され得、次いで凝固され得る。この方法において、上記核酸は上記ゲルに固定化され、そしてシアニン色素が上記核酸に結合して、蛍光性の検出可能なシグナルを生成するかたちで検出される。本方法の上記シアニン色素化合物は蛍光発生的であり、核酸と会合していない場合には、低い固有の蛍光を有し、しかし核酸と結合または会合する場合には、蛍光性になる。この点がエチジウムブロマイドを越える改善であり、ここで上記化合物は有意な固有の蛍光を有し、そして核酸の二本鎖領域にインターカレートした場合に、２０〜２５倍の蛍光の増加を示す（Ｊ．Ｂ．ＬｅＰｅｃｑ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７（１９６６）１００−１０７）。
【００１１】
本発明の上記シアニン色素化合物は、米国特許第４，８８３，８６７号明細書および同第４，９５７，８７０号明細書（前出）に開示された任意の化合物を含む。これらのシアニン色素化合物は、以下の式
【００１２】
【化１０】
2011099862.tif 000003
を有し、ここでＸはＯ、Ｓ、またはＣ（ＣＨ３）２であり、Ｒ１は縮合されたベンゼン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり、そしてＲ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、ここでｔは独立して０、１、２、３または４であり、そしてｓは独立して０、１、２、３または４である。ｎは０、１、２または３であるが、ゲル中のＤＮＡを検出するために用いられる場合には、上記色素はチアゾールオレンジではない。
【００１３】
これらのシアニン色素化合物は、以前、血液サンプル中の網状赤血球の検出における使用について開示されたが、本明細書中において本発明者らは、これらの化合物の、固定化された核酸ポリマーについての蛍光発生的色素としての新規の使用を報告する。好ましい実施形態において、上記シアニン色素化合物は、電気泳動によって分離された核酸ポリマー、好ましくはＤＮＡについてのゲル染料として用いられる。
【００１４】
本発明者らは予想外にも、ある精選された非対称のシアニン色素化合物が、本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられ得ることを発見した。最も広く用いられるＤＮＡゲル染料はエチジウムブロマイドであるが、しかしこの化合物は公知の変異原性因子であり、従って特別な操作および特別な廃棄物処分を必要とする。本発明者らは本明細書中で、少なくともエチジウムブロマイドと同程度に感受性であり、そしてエイムス試験、インビトロ形質転換試験、前進突然変異スクリーニング、および染色体異常についてのスクリーニングに基づいて、本質的に非変異促進性かつ無毒性である（実施例２〜５）、非対称のシアニン色素化合物を報告する。それゆえ、少なくともエチジウムブロマイドと同程度に感受性である、本質的に非遺伝子毒性な色素化合物の同定は、過去には解決されなかった、特別な操作および特別な廃棄物処分の問題を解決することによって、エチジウムブロマイドの制限を克服する（実施例７を参照のこと）。加えて、上記色素化合物はＵＶ光によって励起され、大量の使用および合成が容易である。非遺伝子毒性化合物の同定は、変異促進性か、または最終消費者に毒性の危険を有しないＤＮＡゲル染料を提供する。このことは、核酸と結合または会合する化合物は、複製をおそらく妨害することから、強力な変異原性因子であると考えられるので、予想外の発見であった。
【００１５】
比較の目的で、チアゾールオレンジ化合物、エチジウムブロマイド、および式
【００１６】
【化１１】
2011099862.tif 000004
を有する化合物を、その遺伝子突然変異を誘導する能力、および細胞中の毒性レベルについて試験した。この試験は、化合物１（チアゾールオレンジの誘導体）が本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられるが、一方でチアゾールオレンジは、行われた試験に基づくとそのようには特徴付けられ得ないことを示した。それゆえこの化合物は、この化合物が最終消費者にとって遺伝子毒性的（変異促進性または毒性）な危険を有しない点で、固定化された核酸の検出に好ましい。
【００１７】
従って本発明は、本発明のチアゾールオレンジ誘導体シアニン色素化合物および水溶性染色溶液を用いる、固定化された核酸の検出のための改善された方法を提供する。特に好ましい改善は、固定化された核酸の検出のための化合物１の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、チアゾールオレンジ（図１Ａおよび図１Ｂ）および化合物１（図１Ｃおよび図１Ｄ）を用いた、アガロースゲル中の、染色前（図１Ａおよび図１Ｄ）および染色後（図１Ｃおよび図１Ｂ）のＤＮＡの検出を示す。実施例１を参照のこと。
【図２】図２は、エイムス試験における、エチジウムブロマイドおよび化合物１の間の比較を示す。実施例２を参照のこと。
【図３】図３は、エチジウムブロマイド（図１Ａ）および化合物１（図１Ｂ〜図１Ｄ）で染色したＤＮＡの比較を示し、ここで、図１Ａおよび図１Ｂは３０分間の染色後であり、そして図１Ｃは６０分間の染色後であり、そして図１Ｄは９０分間である。実施例６を参照のこと。
【図４Ａ】図４Ａは、ＵＶ透過照明装置およびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化したＥ−ゲル上のＤＮＡの検出を示す。異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌ）をＥ−Ｇｅｌ（２％）にロードし、ここでエチジウムブロマイドを４×濃度の化合物１で置き換えた。ゲルを３０分間電気泳動し、次いで透過照明装置で可視化した。実施例９を参照のこと。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＵＶ透過照明装置およびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化したＥ−ゲル上のＤＮＡの検出を示す。異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌ）をＥ−Ｇｅｌ（２％）にロードし、ここでエチジウムブロマイドを４×濃度の化合物１で置き換えた。ゲルを３０分間電気泳動し、次いで透過照明装置で可視化した。実施例９を参照のこと。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＵＶ透過照明装置およびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化したＥ−ゲル上のＤＮＡの検出を示す。異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌ）をＥ−Ｇｅｌ（２％）にロードし、ここでエチジウムブロマイドを４×濃度の化合物１で置き換えた。ゲルを３０分間電気泳動し、次いで透過照明装置で可視化した。実施例９を参照のこと。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＵＶ透過照明装置およびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化したＥ−ゲル上のＤＮＡの検出を示す。異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌ）をＥ−Ｇｅｌ（２％）にロードし、ここでエチジウムブロマイドを４×濃度の化合物１で置き換えた。ゲルを３０分間電気泳動し、次いで透過照明装置で可視化した。実施例９を参照のこと。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＵＶ透過照明装置およびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化したＥ−ゲル上のＤＮＡの検出を示す。異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌ）をＥ−Ｇｅｌ（２％）にロードし、ここでエチジウムブロマイドを４×濃度の化合物１で置き換えた。ゲルを３０分間電気泳動し、次いで透過照明装置で可視化した。実施例９を参照のこと。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＵＶ透過照明装置およびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により可視化したＥ−ゲル上のＤＮＡの検出を示す。異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌ）をＥ−Ｇｅｌ（２％）にロードし、ここでエチジウムブロマイドを４×濃度の化合物１で置き換えた。ゲルを３０分間電気泳動し、次いで透過照明装置で可視化した。実施例９を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明が特定の組成物または処理工程に限定されるものではなく、これらが変わり得るように理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲中に用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明白に他を指図しない限り、複数形の対象を含む。従って、例えば「シアニン色素化合物」への言及は複数の化合物を含み、そして「核酸」への言及は複数の核酸などを含む。
【００２０】
他に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の関連する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書中に記載されるように、本発明の目的のために定義される。
【００２１】
本発明の特定の化合物は、溶媒和されていない形態で、ならびに水和された形態を含む溶媒和された形態で存在し得る。通常、溶媒和された形態は溶媒和されていない形態と等価であり、そして本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶性の形態で存在しても、非結晶性の形態で存在しても良い。通常、全ての物理的形態は、本発明によって企図される使用について等価であり、そして本発明の範囲内にあると意図される。
【００２２】
本発明の特定の化合物は、非対称の炭素原子（光心）または二重結合を有し；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、および個々の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
【００２３】
本発明の化合物は、単一の異性体（例えば、鏡像異性体、シス−トランス異性体、位置異性体、ジアステレオマー）として調製されても、異性体の混合として調製されても良い。好ましい実施形態において、上記化合物は実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体として純粋な化合物を調製する方法は、当該分野で公知である。例えば、鏡像異性体に富んだ混合物および純粋な鏡像異性体化合物が、鏡像異性体的に純粋である合成中間体から、不斉中心における立体化学を変わらないままにするか、または結果としてその完全な逆位になるかのいずれかである反応と組み合わせて調製され得る。あるいは、合成経路の間の最終生産物または中間体は、単一の立体異性体に分解され得る。特定の立体中心を反転させるか、または変化しないままにするための技術、および立体異性体の混合物を分解するための技術は、当該分野で周知であり、そして特定の状況に対して方法を選択し、そして割り当てることは、当業者の能力の範囲内に十分入る。一般的には、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編）、ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｔｄ．、Ｅｓｓｅｘ、１９９１、ｐｐ．８０９−８１６；およびＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照のこと。
【００２４】
明瞭さのために代表的には示していないが、本発明の任意の化合物に保有される任意の全体的な正の荷電または負の荷電は、必要な対イオンによって平衡を保たせられる。本発明の化合物が正に荷電される場合、対イオンは代表的には、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、硫酸塩、アルカンスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ホスフェート、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、テトラアリールホウ酸塩、硝酸塩、ヘキサフルオロホスフェート、および芳香族カルボン酸または脂肪族カルボン酸の陰イオンから選択されるが、これらに限定されない。本発明の化合物が負に荷電される場合、対イオンは代表的には、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、アンモニウムイオン、または置換されたアンモニウムイオンから選択されるが、これらに限定されない。好ましくは、任意の必要な対イオンは生物学的に適合性であり、使用に当たって毒性でなく、そして生体分子に実質的に有害な効果を有さない。対イオンは当該分野で周知の方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、または選択的沈殿（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ））によって容易に交換される。
【００２５】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する１つ以上の原子において、異常な割合の原子同位体を含み得る。例えば、上記化合物は放射活性な同位体（例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、または炭素−１４（１４Ｃ））によって放射標識され得る。本発明の化合物の全ての同位体の変動は、放射活性であってもなくても、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００２６】
置換基が、左から右へ書かれる従来の化学式によって特定される場合、この置換基は等しく、化学的に同一な置換基を包含し、ここで、上記化学的に同一な置換基とは、その構造を右から左へ書いた結果生じるものである（例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−をまた列挙することを意図する）。
【００２７】
用語「アシル」または「アルカノイル」は、単独で、または他の用語と組み合わせて、他に述べない限り、明白に規定された数の炭素原子、およびアルカンラジカルの少なくとも１つの末端上のアシルラジカルからなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味する。「アシルラジカル」は、その−ＯＨ部分を除くことによってカルボン酸から誘導される基である。
【００２８】
用語「アルキル」は、単独で、または他の置換基の部分として、他に述べない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、それらは完全に飽和されていても、一不飽和（ｍｏｎｏ−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ）であっても、多不飽和であっても良く、そして二価のラジカル（「アルキレン」）および多価のラジカルを含み得、これらは設計された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルの例としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等のホモログおよび異性体のような基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルおよび３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高次のホモログおよび異性体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「アルキル」は、他に記載されない限り、以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体（例えば「ヘテロアルキル」）を含むことも意味される。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と名付けられる。
【００３０】
本発明において有用な例示的なアルキル基は、約１〜約２５個の間の炭素原子を含む（例えば、メチル、エチルなど）。８個以下の炭素原子を有する直線炭化水素鎖、分枝炭化水素鎖、または環状炭化水素鎖はまた、本明細書中で「低級アルキル」と呼ばれる。加えて、本明細書中で用いられるような用語「アルキル」は、炭化水素鎖断片の１つ以上の炭素原子において１つ以上の置換をさらに含む。
【００３１】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、その従来の意味において用いられ、そして、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して、分子の残りに結合したアルキル基をいう。
【００３２】
用語「ヘテロアルキル」は、単独で、または他の用語と組み合わせて、他に述べられない限り、明白に規定された数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる、直鎖もしくは分枝鎖、または環化炭素を含むラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、ここで、窒素原子、リン原子、および硫黄原子は必要に応じて酸化され、そして窒素へテロ原子は必要に応じて四級化され、そして硫黄原子は必要に応じてアルキル置換基またはヘテロアルキル置換基を有する三価である。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＳｉは、上記へテロアルキル基の任意の内部位に位置しても、分子の残りに結合するアルキル基に位置しても良い。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２個までのヘテロ原子は連続し得る（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３）。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、ヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味し、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−を例示するが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖の末端のいずれか、または双方を占め得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なおさらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキレン結合基について、結合基のいかなる配向も、その結合基の式が書かれる方向に含意されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の双方を表す。
【００３３】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、単独で、または他の用語との組み合わせで、他に述べられない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。さらにヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、複素環が分子の残りに結合する位置を占め得る。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
用語「アリール」は、他に述べない限り、単環であっても複数の環（好ましくは１〜４個の環）であっても良い、多不飽和の芳香族の部分を意味し、これらは互いに縮合されるか、または共有結合的に結合される。アリール置換基の特定の例としては、フェニル、ビフェニル、ｏ−テルフェニル、ｍ−テルフェニルまたはｐ−テルフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリルまたは９−アントリル、１−フェナントレニル、２−フェナントレニル、３−フェナントレニル、４−フェナントレニルまたは９−フェナントレニル、および１−ピレニル、２−ピレニルまたは４−ピレニルの置換された誘導体または置換されていない誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアリール置換基は、フェニル、置換されたフェニル、ナフチル、または置換されたナフチルである。
【００３５】
本明細書中で用いられる用語「ヘテロアリール」は、１つ以上の炭素原子が非炭素原子、特に窒素、酸素、または硫黄によって置換された、上に定義したアリール基をいう。例えば、このような基としては、フリル、テトラヒドロフリル、ピロリル、ピロリジニル、チエニル、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、ピリジル、ピリダジイル、トリアジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラジニル、ピペライニル（ｐｉｐｅｒａｉｎｙｌ）、ピリミジニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル、キノリジニル、キノリニル（ｑｕｎｏｌｉｎｙｌ）、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、キヌクリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチジニル、フェノキサジニル、プリニル、ベンズイミダゾリル、およびベンズチアゾリル、ならびにそれらの芳香族環縮合アナログが挙げられるが、これらに限定されない。多くのフルオロフォアはヘテロアリール基に含まれ、キサンテン、オキサジン、ベンズアゾリウム（ｂｅｎｚａｚｏｌｉｕｍ）誘導体（シアニンおよびカルボシアニンを含む）、ボラポリアザインダセン、ベンゾフラン、インドールおよびキナゾロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
環置換基がヘテロアリール置換基である場合、さらなる６員の芳香族環に、あるいは１つの５員または６員のヘテロ芳香族環に必要に応じて縮合する、５員または６員のへテロ芳香族環として定義される。上記ヘテロ芳香族環は、任意の組み合わせでＯ、ＮまたはＳからなる群より選択される、少なくとも１個のへテロ原子、および３個もの数のヘテロ原子を含む。上記ヘテロアリール置換基は単結合によって結合され、そして必要に応じて、以下に定義されるように置換される。
【００３７】
ヘテロアリール部分の特定の例としては、２−フラニルまたは３−フラニル；２−チエニルまたは３−チエニル；Ｎ−ピロリル、２−ピロリルまたは３−ピロリル；２−ベンゾフラニルまたは３−ベンゾフラニル；２−ベンゾチエニルまたは３−ベンゾチエニル；Ｎ−インドリル、２−インドリルまたは３−インドリル；２−ピリジル、３−ピリジルまたは４−ピリジル；２−キノリル、３−キノリルまたは４−キノリル；１−イソキノリル、３−イソキノリルまたは４−イソキノリル；２−（１，３−オキサゾリル）、４−（１，３−オキサゾリル）または５−（１，３−オキサゾリル）；２−ベンゾオキサゾリル；２−（１，３−チアゾリル）、４−（１，３−チアゾリル）または５−（１，３−チアゾリル）；２−ベンゾチアゾリル；３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリルまたは５−イソキサゾリル；Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリルまたは４−イミダゾリル；Ｎ−ベンズイミダゾリルまたは２−ベンズイミダゾリル；１−ナフトフラニルまたは２−ナフトフラニル；１−ナフトチエニルまたは２−ナフトチエニル；Ｎ−ベンズインドリル、２−ベンズインドリルまたは３−ベンズインドリル；２−ベンゾキノリル、３−ベンゾキノリルまたは４−ベンゾキノリル；１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニルまたは４−アクリジニルの置換された誘導体、あるいは置換されていない誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヘテロアリール置換基としては、置換された、または置換されていない４−ピリジル、２−チエニル、２−ピロリル、２−インドリル、２−オキサゾリル、２−ベンゾチアゾリルまたは２−ベンズオキサゾリルが挙げられる。
【００３８】
上の複素環式基はさらに、ヘテロアリール基の１つ以上の炭素原子および／または非炭素原子において、１つ以上の置換基を含み得る（例えば、アルキル；アリール；複素環；ハロゲン；ニトロ；シアノ；ヒドロキシル；アルコキシルもしくはアリールオキシル；チオまたはメルカプト、アルキルチオもしくはアリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアリールアミノ、もしくはアリールアルキルアミノ；アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニルもしくはアリールアルキルアミノカルボニル；カルボキシル、またはアルキルカルボニルもしくはアリールオキシカルボニル；アルデヒド；アリールカルボニルもしくはアルキルカルボニル；イミニル、またはアリールイミニルもしくはアルキルイミニル；スルホ；アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニル；ヒドロキシイミニル、またはアリールイミニルもしくはアルコキシイミニル）。加えて、２つ以上のアルキル置換基が合わせられ得、縮合された複素環式アルキル環系を形成する。複素環式基（例えば、ヘテロアリールオキシ、およびヘテロアラルキルチオ）を含む置換基は、上に記載した用語との類似として定義される。
【００３９】
本明細書中で用いられる用語「ヘテロシクロアルキル」は、上に記載した１つ以上のアルキル基によって親構造に結合された複素環式基をいう（例えば、２−ピペリジルメチルなど）。用語「ヘテロシクロアルキル」は、上に記載した１つ以上のアルキル基によって親構造に結合されたヘテロアリール基をいう（例えば、２−チエニルメチルなど）。
【００４０】
簡潔のために、他の用語と組み合わせて用いられる場合の用語「アリール」（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）としては、上に定義したようなアリール環およびヘテロアリール環の双方が挙げられる。従って、用語「アリールアルキル」は、アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）がアリール基に結合したラジカルを含み、ここで上記アルキル基は、その炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば酸素原子によって置換された（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）アルキル基を含むことを意味する。
【００４１】
上の用語のそれぞれ（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指示されるラジカルの置換された形態および置換されていない形態の双方を含む。それぞれの型のラジカルについての好ましい置換基は、以下に提供される。
【００４２】
アルキルラジカルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとして、しばしば呼ばれる基を含む）についての置換基は一般に「アルキル基置換基」として呼ばれ、そして以下から選択される種々の基の１つ以上であり得るが、これらに限定されない：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’”、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’”）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、および−ＮＯ２であり、その数は０〜（２ｍ’＋１）の範囲であり、ここでｍ’は、このようなラジカル中の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””はそれぞれ、好ましくは独立して、水素、置換された、または置換されていないヘテロアルキル、置換された、または置換されていないアリール（例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換された、または置換されていないアルキル基、アルコキシ基またはチオアルコキシ基、あるいはアリールアルキル基をいう。本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合、例えば、それぞれのＲ基は、１つ以上のＲ’基、Ｒ”基、Ｒ’”基およびＲ””基が存在する場合に、Ｒ’基、Ｒ”基、Ｒ’”基およびＲ””基のそれぞれであるように独立して選択される。Ｒ’およびＲ”が同じ窒素原子に結合する場合、これらは窒素原子と合わせられ得て、５員環、６員環、または７員環を形成する。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが挙げられるが、これらに限定されないことを意味する。上の置換基の議論から、当業者は、用語「アルキル」が水素基以外の基（例えば、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解する。
【００４３】
アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基についての置換基は、一般的に「アリール基置換基」と呼ばれる。上記置換基は、たとえば以下から選択される：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’”、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ’”）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’”、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、その数は０〜芳香族環系上の開放された原子価の総数の範囲であり；そしてここで、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’”およびＲ””は、水素、置換された、または置換されていないアルキル、置換された、または置換されていないヘテロアルキル、置換された、または置換されていないアリール、および置換された、または置換されていないヘテロアリールから、好ましくは独立して選択される。本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合、例えば、それぞれのＲ基は、１つ以上のＲ’基、Ｒ”基、Ｒ’”基およびＲ””基が存在する場合に、Ｒ’基、Ｒ”基、Ｒ’”基およびＲ””基のそれぞれであるように独立して選択される。以下のスキームにおいて、記号Ｘは上に記載した「Ｒ」を表す。
【００４４】
本明細書中に記載されるアリール置換基およびヘテロアリール置換基は、置換されていないか、または必要に応じて、および独立して、Ｈ、ハロゲン、シアノ、スルホン酸、カルボン酸、ニトロ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアルキルアミドによって置換される。
【００４５】
上記アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基の２つは、必要に応じて、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で置換され得、ここで、ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、そしてｑは０〜３の整数である。あるいは、上記アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基の２つは、必要に応じて、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−で置換され得、ここでＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、そしてｒは１〜４の整数である。そのように形成された新しい環上の単結合の１つは、必要に応じて二重結合によって置換され得る。あるいは、上記アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基の２つは、必要に応じて、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ’”）ｄ−の置換基で置換され得、ここでｓおよびｄは独立して０〜３の整数であり、そしてＸは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は、好ましくは独立して、水素、あるいは置換された、または置換されていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【００４６】
本明細書中に用いられるように、用語「ヘテロ原子」としては、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）および珪素（Ｓｉ）が挙げられる。
【００４７】
用語「アミノ」または「アミン基」は、基−ＮＲ’Ｒ”（またはＮＲＲ’Ｒ”）をいい、ここでＲ、Ｒ’およびＲ”は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群より独立して選択される。置換されたアミンは、Ｒ’またはＲ”が水素以外であるアミン基である。第一級アミノ基において、Ｒ’およびＲ”の双方が水素であり、一方で第二級アミノ基において、Ｒ’またはＲ”のいずれかが水素であるが、双方ではない。加えて、用語「アミン」および「アミノ」はプロトン化されたバージョンの窒素、および四級化されたバージョンの窒素を含み得、これらは基−ＮＲＲ’Ｒ”および、その生物学的に適合性の陰イオン性対イオンを含む。
【００４８】
本明細書中で用いられる用語「親和性」は、２つの分子（例えば、抗体およびリガンドまたは抗原、あるいは正に荷電した部分および負に荷電した部分）の結合相互作用の強さをいう。二価の分子（例えば抗体）について、親和性は代表的には、抗原についての１つの結合ドメイン（例えば、抗原についての１つのＦａｂ断片）の結合強度として定義される。抗原についての双方の結合ドメイン同士の結合強度は、「アビディティー」といわれる。本明細書中で用いられるように、「高い親和性」は、１０４Ｍ−１を超える、代表的には１０５〜１０１１Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）有する抗体に結合するリガンドをいい；阻害ＥＬＩＳＡ、または匹敵する技術（例えば、スキャッチャードプロット、またはＫａと相反するＫｄ／解離定数を用いて、など）により決定される相当する親和性によって決定される。
【００４９】
本明細書中で用いられる用語「水溶液」は、主に水であり、そして水の溶液特性を保持する溶液をいう。水に加えて溶媒を含む水溶液の場合、水は代表的には主なる溶媒である。
【００５０】
本明細書中で用いられる用語「複合体」は、通常非共有結合による、２つ以上の分子の会合をいう。
【００５１】
本明細書中で用いられる用語「シアニンモノマー」または「シアニン色素」は、１）置換されたベンザゾリウム部分、２）ポリメチン架橋、および３）置換された、または置換されていないピリジニウム部分またはキノリニウム部分を含む、蛍光発生的化合物をいう。これらのモノマーまたは色素部分は、核酸と非共有結合的な複合体を形成し得、そして核酸−色素複合体の形成後に蛍光シグナルの増強を示し得る。
【００５２】
本明細書中で用いられる用語「検出可能な反応」は、観察によってか、または機器によってのいずれかで、直接的にか、または間接的に検出可能なシグナルの変化または発生をいう。代表的には、上記検出可能な反応は、波長分配パターン、または吸光度もしくは蛍光の強度の変化、あるいは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光、または上のパラメーターの組み合わせにおける変化を結果として生じる光学的な反応である。
【００５３】
本明細書中で用いられる用語「本質的に非遺伝子毒性」は、原核生物細胞および／または真核生物細胞に対して、これらの細胞と接触した場合に、些細な量の毒性または突然変異しか引き起こさない物質をいう。物質の非遺伝子毒性効果は、当該分野で周知の試験およびスクリーニングアッセイによって決定され、これらの試験およびスクリーニングアッセイとしては、エイムス試験、染色体異常試験、前進突然変異スクリーニング、およびＬＣ５０値を決定する試験が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で用いられる用語「遺伝子毒性」は、原核生物細胞および／または真核生物細胞に対して毒性および／または突然変異を引き起こし、結果として、細胞または生物の死および制御されない増殖を含む、異常な細胞増殖を引き起こす物質をいう。
【００５５】
本明細書中で用いられる用語「キット」は、関連した構成成分、代表的には、１つ以上の化合物または組成物の包装されたセットをいう。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「変異原性」は、細胞または生物の核酸に、点変異、フレームシフト変異、および欠失変異を含む突然変異を引き起こす物質をいう。
【００５７】
本明細書中で用いられる用語「核酸ポリマー」は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であるＤＮＡまたはＲＮＡの天然のポリマーまたは合成ポリマーをいう。ポリマーは、長さが２個以上の塩基である。用語「核酸」は本明細書中で、「核酸ポリマー」と交換可能に用いられる。
【００５８】
本明細書中で用いられる用語「サンプル」は、標的核酸を含み得る任意の物質をいう。代表的には、上記サンプルは、固体または半固体の表面（例えば、核酸ポリマー、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを含むポリアクリルアミドゲル、膜ブロット、またはマイクロアレイ）上に固定されるが、しかし、水溶液中または生存可能な細胞培養物中にあってもよい。しかし、上記サンプルは、生きた細胞、内在性の宿主細胞タンパク質、ペプチドおよび緩衝液溶液を含む生物学的流体であり得る。
【００５９】
（化合物および組成物）
本発明は、固定化された核酸、水溶性染色溶液および核酸の複合化合物の存在を決定するための改善された方法を提供する。本発明の一つの局面において、上記の改善は、本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられるシアニン色素化合物の使用からなる。これらの化合物は、一般的に毒性および／または変異促進性であるとして考えられ、そして、核酸検出試薬（例えばエチジウムブロマイド）と使用者との間に直接的な接触が無いことを確実にするための予防策を後に続けることが必要な、最終消費者および環境への健康上の危険を有する、現在用いられる核酸検出因子を越える改善である。従って、非遺伝子毒性核酸検出因子の発見は、最終消費者にとって取り扱いが安全であり、危険でない廃棄物として処分し得る、すなわち環境に安全である、重要な改善である（実施例７）。本明細書中で、本発明者らは、特別な取り扱いまたは特別な廃棄物処分を必要とせず、しかし一般的に用いられるエチジウムブロマイドの利点の全てを保持する核酸の検出のための改善された方法を報告する。
【００６０】
公知であるか、または固定化されたＤＮＡと会合すると考えられる、多くの異なるクラスの化合物が試験された。代表的には、核酸複合体化合物は、商品名ＳＹＢＲ（登録商標）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）として販売される色素、チアゾールオレンジ、これらの誘導体、ならびに米国特許第４，９５７，８７０号明細書；同第４，８８３，８６７号明細書；同第５，４３６，１３４号明細書；同第５，６５８，７５１号明細書、同第５，５３４，４１６号明細書、および同第５，８６３，７５３号明細書に開示される任意のモノマー化合物が挙げられるが、これらに限定されない非対称シアニン色素である。これらの化合物は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ中で突然変異を誘導する能力についてエイムス試験において同時にスクリーニングされ、ここでその目的は、用いられた上記色素化合物が、エチジウムブロマイドと少なくとも、またはそれ以上に感受性であり、しかしエチジウムブロマイドと比べて減少した遺伝子毒性効果を有するような、固定化された核酸の検出のための改善された方法を開発することであった。これらの初期スクリーニングの結果は、２つの化合物（チアゾールオレンジおよび化合物１）が、中程度に変異促進性であるか、または非変異促進性であるかのいずれかであること、および、双方が、電気泳動によってゲル中に固定化された核酸を、ＵＶ光（約３００ｎｍ）によって励起された場合に検出可能であることを示している（実施例１を参照のこと）。比較の目的で、エチジウムブロマイドを、チアゾールオレンジおよび化合物１と共に、適切コントロールと共に試験した（実施例２〜５を参照のこと）。
【００６１】
従って、本発明の一つの局面において、米国特許第４，８８３，８６７号明細書および同第４，９５７，８７０号明細書（前出）に開示される化合物が、固定化された核酸の存在の決定における使用に好ましい。これらのシアニン色素化合物は以下
ａ）
【００６２】
【化１２】
2011099862.tif 000005
の式を有し、ここで、ＸはＯ、ＳまたはＣ（ＣＨ３）２であり、Ｒ１は縮合されたベンゼン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり、そしてＲ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、ここで、ｔは独立して０、１、２、３または４であり、そしてｓは独立して０、１、２、３または４である。ｎは０、１、２または３である。
【００６３】
好ましい実施形態において、上記色素化合物はチアゾールオレンジ
【００６４】
【化１３】
2011099862.tif 000006
または以下の式：
【００６５】
【化１４】
2011099862.tif 000007
を有する化合物１であり、ここで、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はメチルであり、ｎは０であり、Ｒ４は水素であり、そしてＲ３はメチル（チアゾールオレンジ）またはプロピル（化合物１）のいずれかである。しかし、ゲル中のＤＮＡの検出のためのチアゾールオレンジの使用は、本発明の局面ではない（Ｒｙｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（２）（１９９１）３２７−３３）。それゆえ、化合物１が、ポリマー性ゲル上に固定化された核酸の検出に好ましい。
【００６６】
これらの色素は、低い固有の蛍光を有するが、核酸に結合すると蛍光の有意な増加を示す。これらの色素化合物は、４８０ｎｍ〜５２０ｎｍの最大励起を有するが、これらの化合物はＵＶ光によって励起され得、このＵＶ光は代表的には４００ｎｍ未満であるとして理解される。従って、上記シアニン色素化合物は、分離された核酸を含むエチジウムブロマイド染色されたゲルについて代表的に用いられるように、ＵＶ透過照明装置を用いて励起され得る。これらの色素の励起は、代表的には約５３０ｎｍ〜約６００ｎｍの範囲である。エチジウムブロマイドはＵＶ光によって励起され得るが、ＤＮＡと会合した場合、５４０ｎｍの最適吸収および６２０ｎｍの発光を有する。従って、化合物１を含む本シアニン色素化合物は、ＵＶ光によって励起可能であり、そしてエチジウムブロマイドと比較して類似した励起発光を有する基準に適合する。
【００６７】
チアゾールオレンジおよび化合物１がエイムス試験において試験され、そして過去に試験されたエチジウムブロマイドと比較された（Ｓｉｎｇｅｒら、（１９９９）前出）（実施例２）。３つの化合物（エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１）全てが、インビトロ形質転換試験（実施例３）、前進突然変異スクリーニング（実施例４）、および染色体異常についてのスクリーニング（実施例５）において試験された。この試験のパネルは、結果として、遺伝子毒性か非遺伝子毒性のいずれであるかの化合物の識別を与え、ここで遺伝子毒性とは、細胞毒性効果（ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔ）および遺伝子突然変異の双方を含むように定義される。これらの試験が、その遺伝子毒性効果について、固定化された核酸ポリマーの検出に用いられるべき他の化合物をスクリーニングするために用いられ得ることが、当業者によって理解される。予想外に、これらの試験に基づき、チアゾールオレンジは遺伝子毒性であると見なされるが、しかし、チアゾールアナログである化合物１は、本質的に非遺伝子毒性であると特徴付けられる。加えて、化合物１は、この化合物が水生生物に危険または毒性であるかを決定するために試験され、ここで、化合物１は５００ｍｇ／Ｌを超えるＬＣ５０値を有し、そして水生生物に危険ではないとして特徴付けられる（実施例７）。
【００６８】
行われた試験に基き、化合物１は、マウスリンパ腫細胞において、チミジンキナーゼ（ＴＫ）座における突然変異の原因とならず、あるいは、培養されたヒト末梢血リンパ球において、Ｓ９代謝活性化の有り、または無しで、染色体異常を誘導しない。加えて、化合物１はシリアンハムスター胚（ＳＨＥ）細胞培養物を形質転換しなかった。この後者の試験は、げっ歯類の発癌と高い一致（８０％を超える）を有し、それゆえ、陰性試験は、化合物１が非発癌性であることを強く示す。従って、化合物１は、哺乳動物細胞に対する潜在的な遺伝子毒性の３つの独立した診断によって、危険な研究室試薬ではない。対照的に、エチジウムブロマイド試験は、ＳＨＥアッセイにおいて陽性であり、このことは、この染色がげっ歯類に対し発癌性であることが見出されることを示す。エチジウムブロマイドについての２年間の生物検定研究は、まだ報告されていない。
【００６９】
（表１：）
【００７０】
【表１】
2011099862.tif 000008
化合物１は、エチジウムブロマイドおよびチアゾールオレンジと比べて、数種の異なるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株における測定により、エイムス試験においてより少ない突然変異を引き起こす（図１および表２を参照のこと）。この試験における弱く陽性な結果（化合物１）が、７株のうち３株で起き、そして、図１に示されるように、ラットの肝臓から得られた哺乳動物Ｓ９画分による活性化の後にのみであった。
【００７１】
（使用の方法）
染色溶液は様々な方法により調製され得、これは以下に記載されるように、方法、およびサンプルが存在する培地に依存する。具体的には、上記染色溶液は、本発明の非対称シアニン色素、および核酸と適合性の緩衝化成分を含み、必要に応じて上記染色溶液は、有機溶媒、あるいは有機溶媒および付加的なイオン性成分または非イオン性成分の混合物を含む。染色溶液の任意の成分は、一緒に加えられても別々に加えられてもよく、そして特定の順番は無く、そして明白になるように、上記シアニン色素化合物は固体または半固体のマトリックスに固定化され得、ここで上記緩衝化成分がこのマトリックスに加えられて本発明の染色溶液を形成する。それゆえ、上記シアニン化合物は、溶液を形成するために染色溶液中で遊離である必要は無く、しかし、固体または半固体のマトリックス表面上に固定化され得る。あるいは、上記シアニン化合物は、固体または半固体のマトリックス上またはその中に固定化され、ここで上記色素化合物は緩衝液の非存在下において固定化された核酸に移行される。別の局面において、上記シアニン色素化合物は、緩衝液の無い系（例えば、Ｅ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ））であるポリマー性ゲル中に固定化される。
【００７２】
上記染色溶液は代表的には、本発明の非対称シアニン色素化合物を、水性溶媒（例えば水）、緩衝溶液（例えばリン酸緩衝化生理食塩水）、または有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、エタノールまたはアセトニトリル）の中に溶解することで調製される。代表的には、本発明のシアニン色素化合物は、ストック溶液として、まず有機溶媒（例えばＤＭＳＯ）中に溶解される。代表的には、このストック溶液は、使用濃度と比較して約１００倍〜約１０，０００倍に濃縮されている。
【００７３】
一つの局面において、上記ストック溶液は次いで、必要に応じて適切な緩衝化成分を含む水溶液中に効果的な使用濃度まで希釈され、本発明の色素化合物および微量の有機溶媒を含む緩衝溶液を形成する。上記緩衝溶液は代表的には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、酢酸トリス（ＴＡＥ）またはトリスホウ酸（ＴＢＥ）である。好ましくは、上記染色溶液は、本発明のシアニン色素、ＴＡＥまたはＴＢＥ、および微量のＤＭＳＯを含む。本発明の化合物の効果的な使用濃度は、核酸ポリマーと複合体化される場合に、検出可能な蛍光反応を与えるに十分な量である。代表的には、上記効果的な量は約１００ｎｍ〜約１００μＭである。好ましいのは、約６００ｎｍ〜約１０μＭであり、最も好ましいのは約１μＭである。一般的に、染色溶液中に存在する特定の量の上記色素化合物は、サンプルの物理学的性質および行われる解析の性質によって決定されることが理解される。
【００７４】
核酸がインタクトな細胞または細胞性細胞小器官から本質的に遊離している、固体または半固体の支持体上の固定化された核酸の存在を決定するための本発明の水性染色溶液は、本発明の非対称シアニン色素化合物、トリスホウ酸緩衝液または酢酸トリス緩衝液、および上記色素化合物を可溶化するために用いた微量の有機溶媒を含む。上記染色溶液は代表的には、約６〜約８のｐＨを有し、そして上記固体または半固体の支持体は、ポリマー性ゲル、膜、アレイ、ガラス、およびポリマー性微小粒子からなる群より選択される。本発明の一つの局面において、上記溶液は必要に応じてさらに、上記色素化合物がゲルの一部を形成し、そしてゲルが固定化された場合に、上記核酸サンプルが入り、上記色素化合物と接触するように、ポリマー化されていないアガロースまたはポリアクリルアミドを含む。
【００７５】
従って、上記色素ストック溶液は希釈され、そしてアガロースならびに／またはアガロースおよび緩衝液と共に混合され、ここで上記核酸は、本発明の化合物を含むアガロース中に固定化される。上記アガロースは錠剤の形態であっても、プレキャスト（ｐｒｅ−ｃａｓｔ）ゲルの形態であっても、熱されてそしてスラブゲルに流し込まれる状態にある凝固されたアガロースの形態であっても良い。これの一つの可能な形態は、核酸の電気泳動分離のために用いる濃度における、アガロース／ＴＢＥ／および本発明の化合物の混合物である。溶融するまでの混合物の過熱工程、混合工程、および室温までの冷却を許容する工程。将来の任意の時点において、上記固体の混合物は再加熱され得、そして構成成分の測定および使用に先立つ混合の必要なしに、使用のために流し込まれ得る。この概念の別の繰り返しは、固体状態の上記色素を固体粉末状のアガロース（粉末として保存しても、錠剤として圧縮してもいずれでも良い）と混合して、保存することである。必要に応じて上記粉末は計量され、そして別々に計測し、ならびに色素を加える必要なく、使用のために緩衝液に加えられる。
【００７６】
なお別の局面において、本化合物はポリマー性膜（例えばＩｎｓｔＳｔａｉｎ  ｐａｐｅｒ（Ｅｄｖｏｔｅｋ））中に含浸され、ここで上記膜は固定化された核酸と接触されて、結果として上記色素の、膜から核酸への移行を生じる。
【００７７】
本発明の一つの局面において、固体または半固体の支持体上に固定化された核酸の存在または非存在を決定するための方法は、
ｂ）本発明の非対称シアニン色素化合物をサンプルと合わせて、標識混合物を調製する工程であって、ここで上記サンプルは固体または半固体の支持体上に固定化される、工程；
ｃ）上記標識混合物を、上記色素が上記核酸と会合するに十分な時間だけインキュベートし、インキュベートされたサンプルを調製する工程；
ｄ）上記インキュベートされたサンプルを適切な波長で照射し、照射されたサンプルを調製する工程；および
ｅ）それによって上記核酸の存在または非存在が決定される、上記照射されたサンプルを観察する工程
を包含する。
【００７８】
本発明の一つの局面において、サンプル混合物中の上記核酸は、上記方法の過程において、移動度によって（例えば、電気泳動ゲルまたは電気泳動キャピラリー）、または大きさによって（例えば、遠心分離、ペレット化、または密度勾配）、あるいは結合親和性によって（例えば、フィルター膜に）、互いに、またはサンプル中の他の成分から分離される。上記サンプルは、上記色素と上記分析物との接触を促進する任意の手段によって、染色溶液と合わせられる。従って、本発明の化合物は染色溶液であっても、ポリマー性膜上で乾燥されても、上記核酸が固定化される固体または半固体の支持体と前もって混合されても良い。代表的には上記接触は、サンプルが溶液である場合のように、単純な混合を通して起きる。上記色素を含む染色溶液は、分析物溶液に直接的に加えられても、液体分離媒体（例えば、電気泳動液、篩いマトリックス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）またはランニング緩衝液）において、あるいは沈降（例えば、ショ糖）または浮遊密度勾配（例えば、ＣｓＣｌを含む）において、あるいは不活性マトリックス（例えば、ブロットまたはゲル、試験小片、あるいは他の任意の固体または半固体の支持体）上で分析物溶液と接触しても良い。適切な支持体としてはまた、ポリマー性微小粒子（常磁性微小粒子を含む）、ポリアクリルアミドゲルおよびアガロースゲル、ニトロセルロースフィルター、コンピューターチップ（例えばシリコンチップ）、天然膜および合成膜、ならびにガラス（光学フィルターを含む）、ならびに他のシリカを基本とする支持体およびプラスチック支持体が挙げられるが、これらに限定されない。上記色素は必要に応じて、分離の過程で、または核酸が分離された後で、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動、勾配遠心分離、または他の分離工程に先立って、分析物溶液と合わせられる。あるいは、上記色素は、プレキャストゲル、キャピラリー電気泳動、あるいは行われた密度勾配または沈降勾配におけるように、分析物溶液の添加に先立って、不活性マトリックスまたはキャピラリー中の溶液と合わせられる。
【００７９】
上記サンプルは、蛍光性の核酸−色素化合物複合体を形成するに十分な時間だけ、上記色素化合物の存在下にてインキュベートされる。核酸溶液中の検出可能な蛍光は、本質的に瞬間性である。一般に、肉眼で見える検出可能な蛍光は、本発明の実施形態により広範囲の固体または半固体のマトリックス中において、サンプルと合わせられた後約１０分〜約９０分以内に、一般的には約２０分〜約６０分以内に、最も好ましくは約３０分で得られ得る（実施例６を参照のこと）。この事例において、核酸サンプルは、代表的には電気泳動によってポリマー性ゲル上に固定化され、次いで上記ゲルを染色溶液中に浸し、ここで検出可能なシグナルが、核酸の存在を表す。蛍光性の核酸複合体の十分な形成に必要な時間が、個々のサンプルおよびサンプル媒介物の物理的性質および化学的性質に依存することが、当業者にとって容易に明白である。
【００８０】
代替の実施形態において、上記固定化された核酸は、本発明のシアニン色素化合物を含む膜にかぶせられる。数分以内に、代表的には約１０分未満で上記化合物は核酸に移行し、標識されたサンプル混合物を提供する。
【００８１】
核酸−色素化合物複合体の検出を促進するために、蛍光性複合体の励起性質または発光性質が利用される。例えば、上記サンプルは、上記蛍光性複合体の最大吸収波長における、またはその近くの光を提供し得る光源（例えば、紫外線ランプまたは可視光ランプ、アーク灯、レーザー、あるいは太陽光までも）によって励起または照射される。好ましくは、上記蛍光性複合体は、約２８０ｎｍと等しい、またはこれを超える波長において、より好ましくは約３００ｎｍと等しい、またはこれを超える波長において励起される。結果として生じる発光は、可視的検査、写真フィルム、または現在の機器（例えば、蛍光光度計、量子計数管、プレートリーダー、落射蛍光顕微鏡、およびフローサイトメーター）の使用を含む手段によって、あるいはシグナルを増幅するための手段（例えば光電子増倍管）によって検出される。一つの局面において、ＵＶ透過照明装置が、上記核酸−色素化合物複合体の照射に用いられる。別の局面において、可視光透過照明装置（例えば、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＣＯ）が、上記核酸−色素化合物複合体の照射に用いられる。
【００８２】
本発明の一つの局面において、ゲル上に固定化された核酸ポリマーの存在を決定するための方法は、以下の工程：
ａ）核酸ポリマーを、ポリマー性ゲル上にて固定化する工程；
ｂ）上記ゲルを染色溶液と接触させる工程であって、ここで上記染色溶液が、以下；
ｉ）式
【００８３】
【化１５】
2011099862.tif 000009
を有する非対称シアニン色素化合物であって、
ここでＸはＯ、ＳまたはＣ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１は縮合されたベンゼン、メトキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはメトキシであり、ここでｔは独立して０、１、２、３または４であり、そして
ｎは０、１、２または３である非対称シアニン色素化合物；および
ｉｉｉ）トリスホウ酸緩衝液または酢酸トリス緩衝液
を含む、工程、
ｃ）工程ｂ）の上記ゲルおよび上記染色溶液を、上記シアニン色素化合物が上記核酸ポリマーと会合することを許容するに十分な時間だけインキュベートする工程；ならびに、
ａ）上記固定化された核酸−シアニン色素複合体を、それによって上記核酸の存在が決定される適切な波長で照射する工程であって、ただし上記シアニン色素化合物はチアゾールオレンジではない工程
を包含する。
【００８４】
代表的には上記ゲルは約３％〜約０．５％のアガロースゲルである。好ましくは上記アガロースゲルは約１％ゲルである。しかし、ゲルの割合は、分離され、そして固定化される核酸ポリマーの大きさに幾分依存することを、当業者は理解する。上記核酸ポリマーは、代表的には、電気泳動によって固定化され、ここで電流が上記アガロースゲルに適用され、そして荷電された核酸ポリマーが、大きさの関数としてゲルを通して移動する。しかし、上記核酸ポリマーは、ポリマー性ゲル（代表的にはアガロースまたはポリアクリルアミド）上にスポットされ得る。一つの局面において、アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）が、核酸を含むサンプルの分離および固定化に用いられる。
【００８５】
好ましい実施形態において、上記シアニン色素化合物は化合物１によって表される。この事例において、化合物１は本質的に非遺伝子毒性であるとして特徴付けられる。従って、本発明の好ましい実施形態は、本質的に非遺伝子毒性である化合物を用いた、核酸の存在の決定の改善された方法である。この方法は、化合物１が過去に非遺伝子毒性であるとして開示されておらず、または固定化された核酸の検出の使用のために開示されていなかった、核酸を検出するために現今用いられる色素化合物の改善を提供する。
【００８６】
上に記載したように、上記ゲルは、代表的には上記ゲルを上記染色溶液に浸すことで、本発明の染色溶液と接触させられる。上記ゲルは代表的には、上記染色溶液中に約１０分間〜約９０分間、好ましくは約２０分間〜約６０分間、最も好ましくは約３０分間、浸される。しかし、ランニング緩衝液（上記ゲルを通して電流を伝導するために用いられる緩衝液）は、本発明の染色溶液によって置換され得る。この事例において、上記核酸が上記ゲルを通して移動する間に、上記核酸は上記シアニン色素と複合体を形成する。このようにして、インキュベートする工程は、固定化する工程および接触する工程と同時に起きる。
【００８７】
上記染色されたアガロースゲルは代表的には、ＵＶ透過照明装置または可視光透過照明装置によって照射される。しかし、上記核酸−色素複合体の可視化を許容し、フルオロフォアを励起し、そして上記フルオロフォアによって発生された励起波長を記録する任意の適切な機器が、上記核酸−色素複合体の検出に用いられ得る。
【００８８】
本発明の別の局面において、本発明の非対称シアニン色素化合物を含む上記染色溶液は、上記シアニン色素化合物が、凝固されたゲルの一部分を形成するように、ポリマー化していないゲルと合わせられる。この事例において、乾燥アガロースが緩衝液（例えばＴＢＥ）と合わせられ、そして熱せられて上記乾燥アガロースを溶解する。上記シアニン色素化合物のストック溶液を凝固する前に、緩衝液中の融解されたアガロースに加えられる。それゆえ、固定化する工程、接触する工程、およびインキュベートする工程が、本発明のこの局面において同時に起きる。
【００８９】
（サンプル調製）
最終消費者は、サンプル、およびサンプルが調製される方法の選択を決定するが、サンプルは代表的には、インビトロの溶液に基いたアッセイ検出のために核酸を単離するための当該分野で周知の方法、あるいは固体または半固体のマトリックス上に固定化された核酸の検出のための周知の方法を用いて調製される。上記サンプルとしては、核酸ポリマーを含むと考えられる任意の生物学的由来の材料が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、サンプルとしてはまた、核酸ポリマーが、例えばＰＣＲ反応混合物、ポリマーゲル（例えばアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル）、または微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）アッセイ系に加えられた材料が挙げられる。本発明の別の局面において、上記サンプルはまた、異なるアッセイ条件下で理想的である本発明の色素化合物を決定するための、または本質的に非遺伝子毒性である本発明の色素化合物を決定するための、核酸ポリマーを含む緩衝溶液を含み得る。
【００９０】
上記サンプルは生物学的流体（例えば、全血、血漿、血清、鼻汁、痰、唾液、尿、汗、経皮浸出液、脳脊髄液など）であり得る。生物学的流体はまた、目的の分析物が培地中に分泌される、組織および細胞培養培地を含む。あるいは、上記サンプルは、動物由来の器官全体、組織、または細胞であり得る。このようなサンプルの出所の例としては、筋肉、眼、皮膚、生殖腺、リンパ節、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、膵臓、固形腫瘍、マクロファージ、乳腺、中皮などが挙げられる。細胞としては、原核生物細胞（例えば細菌）、酵母、カビ、マイコバクテリアおよびマイコプラズマ、ならびに真核生物細胞（例えば、一次培養物および不死化した細胞株を含む、有核植物細胞および有核動物細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、原核生物細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓが挙げられる。真核生物細胞としては、卵巣細胞、上皮細胞、循環免疫細胞、β細胞、肝細胞、およびニューロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
上記核酸は、天然的（起源が生物学的）または合成的（人工的に調製された）のいずれかであり得る。上記核酸は、核酸断片、オリゴヌクレオチド、または核酸ポリマーとして存在し得る。上記核酸は、凝縮した相（例えば染色体）として存在し得る。上記サンプル中の上記核酸の存在は、成功した、または失敗した実験的方法論、好ましくない汚染、または疾患の状態に起因し得る。核酸はサンプルの全体または一部のみに存在し得、そして核酸の存在は、個々のサンプルを区別するため、または単一のサンプル内の部分または領域を区別するために用いられ得る。
【００９２】
上記核酸は生物学的構造（例えば、ウイルス粒子、細胞小器官、または細胞内に含まれる）に囲まれ得る。生物学的構造に囲まれた上記核酸は、培養細胞、生物体または組織、濾過されていない、または分離された生物学的流体（例えば尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、粘膜、唾液、便、または生理学的分泌物）、あるいは環境的サンプル（例えば、土壌、水および空気）を含む、広範囲の環境から得られ得る。上記核酸は、内生であっても、外部の物質として導入されても（例えば、感染またはトランスフェクトによって）良い。
【００９３】
あるいは、上記核酸は生物学的構造に囲まれないが、サンプル溶液として存在する。上記サンプル溶液は、精製された核酸のサンプル溶液から、粗製混合物（例えば、細胞抽出物、生物学的流体、および環境的サンプル）まで変化し得る。ある場合において、上記核酸を、本発明のシアニン色素化合物と合わせる前に、上記溶液中の生体分子または流体の混合物から分離することが望ましい。多数の周知の技術が、他のタンパク質または他の生物学的分子を含む一般の粗製混合物からの核酸の分離および精製のために存在する。これらは、電気泳動的技術および種々の支持体を用いるクロマトグラフィー技術のような手段を含む。
【００９４】
（照射）
核酸−色素化合物複合体を含むサンプルは、検出可能な光学的反応を与えるために選択される光の波長を照射され、そして上記光学的反応を検出するための手段によって観察される。本発明の化合物および組成物を照射するために有用な装置としては、ＵＶ透過照明装置、携帯型紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、レーザー、レーザーダイオードおよびＤａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ、または米国特許第６，５１２，２３６号明細書および同第６，１９８，１０７号明細書に開示される任意の透過照明装置が挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、あるいは標準の蛍光光度計または小型蛍光光度計に、光学的に組み込まれる。
【００９５】
上記光学的反応は必要に応じて、視覚的検査、または任意の以下のデバイス：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査デバイス、蛍光光度計、フォトダイオード、量子計数管、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、またはシグナルを増幅するための手段（例えば光電子増倍管）によって検出される。
【００９６】
核酸色素化合物の励起帯域および発光帯域の波長は、色素化合物組成によって変化し、広範囲の照射帯域および検出帯域を含む。このことは、特定の励起源または検出フィルターを用いる使用について、個々の色素化合物を選択することを可能にする。
【００９７】
（キット）
核酸−色素化合物複合体を形成し、そして核酸を検出するための適切なキットもまた、本発明の一部を形成する。このようなキットは、容易に利用可能な材料および試薬から調製され得、そして様々な実施形態として機能する。上記キットの内容は、アッセイプロトコールの設計、あるいは検出または測定のための試薬に依存する。全てのキットは、使用説明書、適切な試薬、および本発明の核酸色素化合物を備える。代表的には、使用説明書は、使用者に上に記載された方法または調製の任意の一つを実行することを許容するための、試薬濃度、または互いに加えられる試薬およびサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物についての保守時間期限、温度条件、緩衝液条件等のような、少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを記載する明確な表現を備える。
【００９８】
本発明の一つの局面において、キットは、有機溶媒、および本発明の非対称のシアニン色素化合物を含む溶液を備える。代表的には、上記溶液はさらに緩衝成分を含み、ここで緩衝成分は好ましくは酢酸トリスまたはトリスホウ酸である。上記有機溶媒は代表的にはアルコールまたはＤＭＳＯである。上記キットは、上記染色溶液を濃縮物として、または１×の使用の準備の出来た濃度として備える。
【００９９】
キットはさらに、欧州特許第１０５７００１号明細書および国際公開第９９４２６２０号パンフレットに開示される任意の物品を含むＥｄｖｏｔｅｋ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって提供されるような、ＩｎｓｔａＳｔａｉｎ  ｐａｐｅｒを備え、ここで上記染色溶液は紙に噴霧乾燥されるか、または含浸される。次いで上記紙はゲルに適用され、ここでＩｎｓｔａＳｔａｉｎ  ｐａｐｅｒ中の色素はゲル中に移行される。上記キットはさらにポリマー化されたアガロースを、プレキャストゲル（例えば、Ｅ−ゲル（Ｅｔｈｒｏｇ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国特許第６，５６２，２１３号明細書；同第５８６５９７４号明細書；同第５５８２７０２号明細書；同第６３７９５１６号明細書；公開された米国特許出願公開第２００２０１３４６８０号明細書；同第２００２／０１１２９６０号明細書、ならびに公開された国際公開第９６／３４２７６号パンフレットおよび同第９７／４１０７０号パンフレットに開示された任意のゲルを含む））の形態、または融解され、次いで適切なゲルスラブに注がれる必要のある形態（例えば、Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から販売されるＧｅｌ−Ｏ  Ｓｈｏｏｔｅｒ、またはＩＰＭ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｌｄｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から販売されるＨｅａｔ  ａｎｄ  Ｐｏｕｒ  Ａｇａｒｏｓｅ）のいずれかにおいて備える。この場合において、上記染色溶液はポリマー化されたアガロースと前もって混合され得、液相の間に加えられるか、またはポリマー化の後に加えられる。別の局面において上記キットは、緩衝液を加え、次いでスラブに注がれる必要のある、アガロースの錠剤（例えば、Ｂｉｏｌｉｎｅ（Ｒａｎｄｏｌｆ、ＭＡ）によって販売されるアガロース錠剤）を備える。上記染色溶液は、錠剤中に前もって混合されるか、または最終消費者によって決定される工程においてアガロースに加えられるように、別々のバイアルにおいて提供される。
【０１００】
最終消費者に危険でなく、非遺伝子毒性であり、そしてポリマー性ゲル中に固定化される核酸の検出に用いられるキットについて、上記キット中の上記染色溶液は代表的には、有機溶媒ＤＭＳＯ、緩衝液酢酸トリスまたはトリスホウ酸、および化合物１を含む。
【０１０１】
本発明のキットは必要に応じて、サイズマーカーとして用いられる核酸断片、コントロール、付加的な検出試薬（例えば、ＤＮＡのみに特異的な染色化合物、またはＲＮＡのみに特異的な色素化合物）をさらに備え得る。
【０１０２】
上に提供された本発明の詳細な説明、以下の実施例は、本発明を例証する目的で与えられ、そして本発明の範囲または特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。
【実施例】
【０１０３】
（実施例１：チアゾールオレンジおよび化合物１による、アガロースゲル中のＤＮＡの検出）
異なる濃度のＤＮＡ（６２．５ｎｇ、３１．２５ｎｇ、１５．６３ｎｇ、７．８１３ｎｇ、３．９０６ｎｇ、１．９５３ｎｇ、９７６．６ｐｇ、４８８．３ｐｇ、２４４．１ｐｇ、１２２．１ｐｇ、６１．０４ｐｇおよび３０．５２ｐｇ）をロードし、１％アガロース上で、８０ｖにて０．５×ＴＢＥ中で分離した。上記ゲルを、ＴＢＥ（５０ｍＬ）、およびチアゾールオレンジまたは化合物１（ＤＭＳＯ中の色素ストック溶液４．５４μｌ）のいずれかを含む染色溶液で染色した。あるいは、上記ゲルをチアゾールオレンジまたは化合物１のいずれかを含むように調製し、ここで１ｇのアガロース、１００ｍｌの０．５×ＴＢＥを、９．０８μｌのチアゾールオレンジまたは化合物１のストック溶液のいずれかに混合した。上記ＤＮＡをロードし、０．５×ＴＢＥ中で８０ｖにて分離した。これらのゲルのいくつかをまた、染色溶液で後に染色した。引き続いて全てのゲルの写真を撮影した。これらのゲルは、チアゾールオレンジおよびその誘導体の、ゲル中に分離され固定化された核酸を検出する能力を示す。図１を参照のこと。
【０１０４】
（実施例２：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ／哺乳動物ミクロソーム復帰突然変異アッセイ（エイムス試験））
エイムスアッセイを、Ａｍｅｓによって記載された方法（Ａｍｅｓら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１９７５）３４７−３６４；Ｌｅｖｉｎら、ＰＮＡＳ  ７９（１９８２）７４４５−７４４９；ＭａｒｏｎおよびＡｍｅｓ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１３（１９８３）１７３−２１５）を用いて行った。用いたテスター株（ｓｔａｉｎ）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍヒスチジン栄養要求株ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７およびＴＡ１５３８である。上記アッセイを、６用量の試験化合物（エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１）を用いて、Ｓ９（ラット肝臓抽出物）の存在下および非存在下の双方において、適切なビヒクルおよびポシティブコントロールとともに行った（Ｓｉｎｇｅｒら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３９（１９９９）３７−４７）。上記試験化合物、試験ビヒクルおよびＳ９（適切な場合）を溶融した寒天に合わせ、次いで最小寒天プレートにかぶせた。３７℃でのインキュベートに続いて、復帰突然変異体コロニーを計数した。Ｓ９を用いない場合、テスター株１００μｌ、およびコントロール化合物または試験化合物５０μｌを、２．５ｍｌの選択性上層寒天に加えた。Ｓ９を用いる場合、Ｓ９混合物５００μｌ、テスター株１００μｌ、およびコントロール化合物または試験化合物５０μｌを、２．０ｍｌの選択性上層寒天に加えた。次いで上記上層寒天を、１５×１００ｍｍのペトリ皿に含まれる最小下層寒天２５ｍｌの表面にかぶせた。反転させたプレートを、３７±２℃にて、５２±４時間インキュベートした。
【０１０５】
復帰突然変異体の数を計数し、そして試験化合物を非変異促進性または変異促進性のいずれかとみなした。試験化合物が変異促進性であるかを決定するための判定基準は、少なくとも１種のテスター株（ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、Ｔ１００およびＴＡ１０２）について、適切なビヒクルコントロールのプレート１枚あたりの平均復帰突然変異体に対して、１プレートあたりの平均復帰突然変異体の２倍の増加に基づく。テスター株ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７およびＴＡ１５３８については、陽性の突然変異体を、適切なビヒクルコントロールと比較して、１プレートあたりの平均復帰突然変異体の３倍の増加として識別した。加えて、１プレートあたりの復帰突然変異体の平均数の増加は、試験化合物の濃度の増加への用量反応によって達成されることを必要とした。これらの得点方法論に基づき、Ｓ９の存在下において、化合物１は全てのテスター株について中程度に変異促進性であるか、または非変異促進性であるとみなされ、ここで化合物１は、４種のテスター株の復帰突然変異体について３倍〜４倍の増加を示し、チアゾールオレンジはＳ９の存在下で５種のテスター株について変異促進性であるとみなされ、そしてエチジウムブロマイドは４種のテスター株について４倍〜８０倍の復帰突然変異体の増加を示し、３種のテスター株について変異促進性であるとみなされた（図２および表１を参照のこと）。チアゾールオレンジはまた、Ｓ９の非存在下において、２種のテスター株について変異促進性であるとみなされた。従って、エチジウムブロマイドと比較して、チアゾールオレンジは３〜４倍変異促進性が低く、そして化合物１は４〜５倍変異促進性が低い。エチジウムブロマイドおよびＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは過去に試験され、ここで、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは弱い変異促進性であるとみなされた（Ｓｉｎｇｅｒら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３９（１９９９）３７−４７）。
【０１０６】
（表２：ビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）と比較した、復帰突然変異体の増加）
【０１０７】
【表２】
2011099862.tif 000010
（実施例３：７日間曝露スクリーニングアッセイによる、シリアンハムスター胚（ＳＨＥ）細胞のインビトロ形質転換）
このアッセイの設計は、Ｋｅｒｃｈａｅｒｔら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５６（１９９６）６５−８４に記載された手順に基づき、そしてこれは化学物質の発癌可能性を評価するための、一般に是認された方法である。従って、このアッセイの目的は、試験化合物（エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１）の、７日間の曝露期間にともなう、ビヒクルコントロール培養物に比べた、培養したシリアンハムスター胚細胞の形態学的形質転換の増加を誘導する能力を決定することである。
【０１０８】
ＳＨＥ細胞培養物を、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および４ｍＭのＬ−グルタミンを補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＬｅＢｏｅｕｆの改変（０．７５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、ｐＨ６．６５〜６．７５）中で増殖させた。上記培養物を、加湿空気中の１０±０．５％ＣＯ２の雰囲気下で、３７±１℃で維持した。公知の前発癌物質であるベンゾ［ａ］ピレン（Ｂ［ａ］Ｐ）を陽性コントロールとして用い、ＤＭＳＯに溶解し、そしてＳＨＥ細胞培養物中で１．２５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で用いた。細胞培養物中のＤＭＳＯの最終濃度は約０．２％であった。上記試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解し、そしてＳＨＥ細胞培養物中で０．０４００μｇ／ｍｌ〜０．８００μｇ／ｍｌの最終濃度範囲にて用いた。７日間のインキュベート期間の後、培養皿をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、メタノールで固定し、そして１０％の緩衝化水性ギムザで染色した。上記皿を水道水で洗浄した後、風乾した。１皿あたりのコロニーの平均数を決定し、そしてそれぞれの用量群について、ビヒクルコントロール群と相対的な、平均相対的培養効率（相対的生存、ＲＰＥ）を計算した。形態学的形質転換表現型を示すコロニーを識別するために適用される基準を、１）三次元増殖のランダムな配向性（十文字）に重層した細胞を有するコロニー、２）十文字の細胞、およびコロニーの全体にわたる、増加する細胞質性好塩基性を有するコロニー、および／または３）通常のＳＨＥ細胞と比較して減少した細胞質：核の比を有する細胞を含むコロニーとした。
【０１０９】
上記試験化合物を、同時的なビヒクルコントロールと比較して少なくとも２用量レベルについて、形態学的形質転換頻度の統計学的に有意な増加を引き起こした場合、または１用量が統計学的に有意な増加を示し、そして傾向試験が有意であった場合、上記試験化合物をこのアッセイにおいて陽性であると評価した。形態学的形質転換における統計学的に有意な増加が得られなかった場合、上記試験化合物を陰性であると評価した。この方法論に基づいて、化合物１を陰性であるとみなし、一方チアゾールオレンジおよびエチジウムブロマイドを双方とも、７日間の曝露条件下でのＳＨＥ細胞形質転換アッセイのスクリーニングのおいて陽性であるとみなした。
【０１１０】
具体的には、化合物１は０．０５００μｇ／ｍＬにおいて本質的に非細胞障害性であり（１２０％のＲＰＥ）、０．１５０μｇ／ｍＬにおいてわずかに細胞障害性であり（８８％のＲＰＥ）、そして０．３００μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であり（５９％のＲＰＥ）、ここで、上記の３つの処理群のいずれも、同時的なビヒクルコントロールと比較して、形態学的形質転換の頻度における有意な増加を誘導しなかった。
【０１１１】
（表３：）
【０１１２】
【表３】
2011099862.tif 000011
ＭＴ＝形態学的形質転換した；ＲＰＥ＝相対的培養効率
チアゾールオレンジは０．０４００μｇ／ｍＬにおいて本質的に非細胞障害性（ｎｏｎｃｙｔｏｘｉｃ）であり（９７％のＲＰＥ）、０．１５０μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であり（５２％のＲＰＥ）、そして０．２６０μｇ／ｍＬにおいて大いに毒性であり（２５％のＲＰＥ）、ここで、上記の３つの処理群の内２つ（０．０４００μｇ／ｍＬおよび０．１５０μｇ／ｍＬ）が、同時的なビヒクルコントロールと比較して、形態学的形質転換の頻度における有意な増加を誘導した。
【０１１３】
（表４：）
【０１１４】
【表４】
2011099862.tif 000012
ＭＴ＝形態学的形質転換した；ＲＰＥ＝相対的培養効率
エチジウムブロマイドは０．２００μｇ／ｍＬにおいてわずかに細胞障害性であり（８５％のＲＰＥ）、０．４００μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であり（６６％のＲＰＥ）、そして０．８００μｇ／ｍＬにおいて大いに細胞障害性であった（２８％のＲＰＥ）。上記の３つの処理群の内２つ（０．４００μｇ／ｍＬおよび０．８００μｇ／ｍＬ）が、同時的なビヒクルコントロールと比較して、形態学的形質転換の頻度における有意な増加を誘導した。
【０１１５】
（表５：）
【０１１６】
【表５】
2011099862.tif 000013
【０１１７】
【表６】
2011099862.tif 000014
ＭＴ＝形態学的形質転換した；ＲＰＥ＝相対的培養効率
（実施例４：Ｌ５１７８Ｙ  ＴＫ＋／−マウスリンパ腫前進突然変異スクリーニング）
このアッセイは、Ｓ９（アクロロアー（Ａｃｒｏｌｏｒ）誘導性ラット肝臓に由来する哺乳動物ミクロソーム酵素の外因性代謝活性化系）の存在下または非存在下におけるコロニーの増殖によってアッセイによって、Ｌ５１７８Ｙマウスリンパ腫細胞中のチミジンキナーゼ（ＴＫ）座における有意な変異促進性活性を誘導する能力について、上記試験化合物を評価するものであり、そしてこれは、（ＣｌｉｖｅおよびＳｐｅｃｔｏｒ、３１、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７５）１７−２９；Ｃｌｉｖｅら、５９、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７９）６１−１０８；Ａｍａｃｈｅｒら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２（１９８０）４４７−４７４；Ｃｌｉｖｅら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８９（１９８７）１４３−１５６）によって報告されるアッセイに基づく。上記細胞培養物を、細胞障害性、および突然変異頻度の増加の双方について得点をつけ、ここで陽性の結果は、同時的なビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）の平均突然変異頻度の少なくとも２倍である頻度に基づいた。このアッセイに用いた上記マウスリンパ腫細胞は、ＴＫ座においてヘテロ接合性であり、ＴＫ活性がほとんど、または全く残らないＴＫ−／−遺伝子型に、単一工程の前進突然変異を起こし得る。これらの突然変異体は通常の細胞培養培地中で生存可能であるが、これらの突然変異体はチミジンの毒性アナログをＤＮＡ中に取り込むことが出来ないので、チミジンアナログ５−トリフルオロチミジン（ＴＦＴ）に耐性である。従って、ＴＦＴの存在下においてコロニーを形成するまで増殖する細胞は、それゆえ、自然にか、または上記の試験化合物によってのいずれかで、突然変異したと考えられる。このアッセイの結果は決定的ではないが、むしろ、試験化合物が変異促進性性質を有するか否かの指標である。
【０１１８】
マウスリンパ腫細胞を、ウマ血清（体積で１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０中で培養した（Ａｍａｃｈｅｒら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２（１９８０）４４７−４７４；ＣｌｉｖｅおよびＳｐｅｃｔｏｒ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１９７５）１７−２９）。処理培地は、ウマ血清を体積で５％まで減少させた点を除いて、培養培地について用いたものと同じ培地補充を含むフィッシャー培地（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）であった。クローン化培地は、２０％未満のウマ血清を含み、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含まず、そして半固体状態を達成するために０．２４％のＢＢＬ寒天を加えたＲＰＭＩ１６４０であった。選択培地は、３μｇ／ｍｌのＴＦＴを含むクローン化培地であった（Ｃｌｉｖｅら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８９（１９８７）１４３−１５６）。
【０１１９】
陽性コントロールを、Ｓ９活性化無し、およびＳ９活性化ありについて、それぞれメチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）およびメチルコラントレン（ＭＣＡ）とした。ＭＭＳはＬ５１７８Ｙ  ＴＫ＋／−細胞に大いに変異促進性である、直接作用する変異原性因子であり、１３μｇ／ｍＬの濃度で用いた。ＭＣＡは、Ｌ５１７８Ｙ  ＴＫ＋／−細胞に変異促進性になるには、ミクロソーム酵素による代謝活性化（Ｓ９）を必要とし、そして２μｇ／ｍＬまたは４μｇ／ｍＬの濃度で用いた。上記試験化合物（エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１）を、０．００６２５μｇ／ｍＬ〜４．９３μｇ／ｍＬの濃度でアッセイした。
【０１２０】
上記細胞をペレット化し、そして、Ｓ９の有りおよび無しで、コントロールまたは試験化合物を含む処理培地に再懸濁した。このチューブを３５℃〜３８℃の軌道振盪インキュベーターに置き、そして１分あたり７０±１０軌道（ｏｒｂｉｔａｌ）にて回転した。４時間の曝露期間の後、細胞を２回洗浄し、１０ｍＬの培養培地に再懸濁し、そして軌道振盪器に戻して、そして突然変異体回収のために２日間細胞を増殖させた。２日後における約３×１０５細胞／ｍＬ未満の細胞密度では、突然変異体選択について考慮しなかった。突然変異体を、合計３×１０６細胞を軟寒天上の選択培地中に播種することで回収した。上記の皿を、約５％ＣＯ２／約９５％加湿空気において、約３７℃で１０日〜１４日間インキュベートした。
【０１２１】
突然変異頻度を、播種した細胞の総数に対する、それぞれの突然変異体選抜皿中に発見される突然変異体コロニーの総数の比として計算し、これは、絶対的な選択クローン化効率によって調整される。細胞障害性は、結果として相対的総増殖（ＲＴＧ）数となる、選択時における相対的クローン化効率によって増加される、２日間の発現期間にわたる細胞の相対的懸濁増殖に基づく。この方法論に基づき、３つの全ての試験化合物を非突然変異促進性であるとみなしたが、しかし細胞障害性の種々の度合いを有していた。
【０１２２】
具体的には、処理培地中にＳ９を含まないエチジウムブロマイドは、０．６２０μｇ／ｍＬにおいて弱く細胞障害性であり、２．４７μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であり、そして４．９３μｇ／ｍＬにおいて中程度に高く細胞障害性であった。これらの濃度は、突然変異頻度においては増加を示さず、その突然変異頻度は、同時的なビヒクルコントロールと比較して、最低の基準である２倍の増加を上回った。処理培地中にＳ９を含むエチジウムブロマイドは、２．４７μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であり（３７．１％のＲＴＧ）、４．９３μｇ／ｍＬにおいて中程度に高く細胞障害性であった（２３．１％のＲＴＧ）。突然変異頻度の増加は見られず、それは最低の基準を上回った。
【０１２３】
（表６：）
【０１２４】
【表７】
2011099862.tif 000015
Ｓ９を含まない化合物１は、０．１２５μｇ／ｍＬにおいて非細胞障害性であり（８０．３％のＲＴＧ）、そして０．２５０μｇ／ｍＬにおいて中程度に高く細胞障害性であった（２６．５％のＲＴＧ）。突然変異頻度における増加は見られず、それは同時的なビヒクルコントロールの２倍の頻度を上回った。Ｓ９を含む化合物１は、１．２４μｇ／ｍＬにおいて弱く細胞障害性であり（６５．１％のＲＴＧ）、２．４７μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であり（４７．１％のＲＴＧ）、そして４．９３μｇ／ｍＬにおいて過剰に細胞障害性であった（７．６％のＲＴＧ）。突然変異頻度における増加は見られず、それは同時的なビヒクルコントロールの頻度の２倍であった。
【０１２５】
（表７：）
【０１２６】
【表８】
2011099862.tif 000016
【０１２７】
【表９】
2011099862.tif 000017
Ｓ９を含まないチアゾールオレンジは、０．１００μｇ／ｍＬにおいて弱く細胞障害性であり（６０．９％のＲＴＧ）、そして０．２００μｇ／ｍＬにおいて中程度に細胞障害性であった（２３．４％のＲＴＧ）。突然変異頻度における増加は見られず、それは同時的なビヒクルコントロールの頻度の２倍であった。Ｓ９を含むチアゾールオレンジは、４．９３μｇ／ｍＬにおいて非細胞障害性であり（９０．４％のＲＴＧ）、そして９．８５μｇ／ｍＬにおいて中程度に高く細胞障害性であった（２２．６％のＲＴＧ）。突然変異頻度の増加は見られず、それは同時的なビヒクルコントロールの頻度の２倍であった。
【０１２８】
（表８：）
【０１２９】
【表１０】
2011099862.tif 000018
（実施例５：培養ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における染色体異常のスクリーニングアッセイ）
このアッセイの目的は、試験化合物（エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１）の、外因性代謝活性化系の有りおよび無しで培養したヒトリンパ球中における構造的な染色体異常を引き起こす能力を評価することであった。健康な成人のボランティアから得たヒト静脈血を、ヘパリン処理した採血管（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に引き込んだ。約０．３ｍｌの新鮮なヘパリン処理した血液を十分な体積の培養培地に加えることで、全血培養を１５ｍｌの遠心管中で開始し、試験化合物の添加後に、代謝活性化の有りおよび無しでのアッセイにおいて、最終体積が５ｍＬになるようにした。上記培養培地は、約２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および２％のフィトヘマグルチニンＭ（ＰＨＡ−Ｍ）を補ったＲＰＭＩ１６４０であった。上記培養物を、緩いふたをして、３７℃±２℃において、空気中に約５％のＣＯ２の加湿したチャンバー中でインキュベートした。
【０１３０】
陽性コントロールを、Ｓ９活性化無し、およびＳ９活性化有りについて、それぞれマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）およびシクロホスファミド（ＣＰ）とした。ＭＭＣは、代謝活性化を必要としない直接作用するクラストーゲンであり、０．０２５μｇ／ｍＬ〜３．０μｇ／ｍＬの濃度において用いた。ＣＰは、染色体異常誘発性中間体に変換されるために、ミクロソーム酵素による代謝活性化を必要とし、１０μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの濃度において用いた。上記試験化合物（エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１）を、０．５００μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度においてアッセイした。インビトロ代謝活性系は、ラット肝臓後ミトコンドリア画分（Ｓ９）およびエネルギー産生系（ＮＡＤＰＨ＋イソクエン酸）からなる（ＭａｒｏｎおよびＡｍｅｓ、１１３  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８３）１７３−２１５）。
【０１３１】
培養の開始後２日に、培養物を試験化合物で処理した。Ｓ９代謝活性化混合物を含まない培養物を、さらに２２時間インキュベートし、最後の２±０．５時間はコルセミド（０．１μｇ／ｍＬ）を加えた。Ｓ９代謝活性化混合物を含む培養物を、３時間の曝露期間インキュベートした。曝露の後、細胞をＰＢＳで少なくとも２回洗浄し、そして新鮮な培養培地を加えた。次いで上記細胞培養物をさらに１８時間インキュベートし、インキュベートの最後２±０．５時間はコルセミド（０．１μｇ／ｍＬ）を加えた。
【０１３２】
インキュベート期間の最後に、培養物を遠心分離し、上清を捨て、そして細胞を７５ｍＭのＫＣｌで膨張させ、メタノール：氷酢酸（３：１  ｖ／ｖ）で固定し、スライドガラス上に滴下し、そして風乾させた。このスライドを５％ギムザで染色し、そして風乾し、次いでミトコンドリア毒性（ｍｉｔｏｔｏｘ）指標、倍数性および核内倍加を含む染色体異常について解析した。この方法論に基づき、細胞を個々に上記の３つの試験化合物と、Ｓ９活性化混合物の有りおよび無しで処理し、同時的なビヒクルコントロールと比較して、構造的異常、倍数性または核内倍加を有する細胞の数の有意な増加を示さなかった。従って、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジおよび化合物１を、代謝活性化の有りおよび無しで、構造的な染色体異常について陰性であるとみなした。
【０１３３】
（実施例６：アガロースゲル中で分離され固定化された核酸の染色の、エチジウムおよび化合物１の比較）
異なる濃度のＤＮＡ（６２．５ｎｇ、３１．２５ｎｇ、１５．６３ｎｇ、７．８１３ｎｇ、３．９０６ｎｇ、１．９５３ｎｇ、９７６．６ｐｇ、４８８．３ｐｇ、２４４．１ｐｇ、１２２．１ｐｇ、６１．０４ｐｇおよび３０．５２ｐｇ）をロードし、１％のアガロースゲル上で、６０ｖで０．５×ＴＢＥ中で分離した。ゲルを、ＴＢＥ（５０ｍＬ）、およびエチジウムブロマイド（２．５μｌのストック溶液、水中で１０ｍｇ／ｍＬ）または化合物１（最終濃度１μＭのために、ＤＭＳＯ中での５μｌの色素ストック溶液）のいずれかを含む染色溶液で、３０分間、６０分間および９０分間染色した。引き続いて、全てのゲルの写真を撮影した。これらのゲルは、類似した染色手順を用いるゲル中の核酸の検出について、化合物１がエチジウムブロマイドと少なくとも同じくらい感受性であることを示す。
【０１３４】
（実施例７：危険な廃棄物のスクリーニング試験）
化合物１を、この化合物が水生生物にとって危険または毒性であるかどうかを決定するために試験した。ビヒクルコントロール、ならびに２５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌおよび７５０ｍｇ／Ｌの濃度の化合物１を含む８リットルタンクにそれぞれ、１０匹のファットヘッドミノー（Ｐｉｍｅｐｈａｋｅｓ  ｐｒｏｍｅｌａｓ）を置いた。９６時間の曝露期間の後、生存するミノーの数を計数した。コントロールおよび化合物１に対するミノーの生存率は１００％であった。このように、化合物１は５００ｍｇ／Ｌを超えるＬＣ５０値を有し、この値は、水生生物にとって、ＣＣＲの表題２２（ＣＣＲ  Ｔｉｔｌｅ  ２２）の急性毒性に属する危険性ではないとして分類される。
【０１３５】
（実施例８：生きた真核生物細胞への、化合物１の細胞浸透性）
ＭＲＣ５ヒト肺線維芽細胞を収集し、完全培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ）中で、カバーグラスを供給した後１日間、増殖させた。次いで細胞を完全培地から除き、異なる濃度の化合物１を含む、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００μＭのＬ−グルタミン、および１００μＭのコハク酸を補ったハンクス平衡塩溶液ｗ／炭酸水素ナトリウム（ＨＢＳＳ）中に置いた。試験した濃度としては、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭおよび１０．０μＭが挙げられる。細胞を３７℃／５％のＣＯ２にて５分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中で３０秒間×３回洗浄し、ＨＢＳＳ中の顕微鏡スライドにのせ、そしてパラフィンでシールした。のせた後、スライドをＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８００正立蛍光顕微鏡で調べ、そして標準のＦＩＴＣフィルターセットおよびＴＲＩＴＣフィルターセット、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＭｉｃｒｏＭａｘ冷却ＣＣＤカメラ、ならびにＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像化ソフトウェアで画像化した。化合物１は、生きたＭＲＣ５細胞中で、細胞浸透性であるように見える。標識パターンは核および細胞質であり、標識した細胞の核小体にて顕著なシグナルを有する。化合物１と関連したシグナルはＦＩＴＣフィルターセットおよびＴＲＩＴＣフィルターセットの双方で検出可能であり、ＦＩＴＣセットを用いた場合により強いシグナル強度である。濃度に関係なく、核小体の標識は最も顕著であるようであり、そしてより低い濃度においてやや、より顕著になるようである。細胞以外のバックグラウンドは、全ての場合において最小であった。
【０１３６】
（実施例９：化合物１による、アガロースゲル中のＤＮＡの検出）
異なる量のＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．カタログ番号１００６８−０１３）の１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１３μｌをＥ−Ｇｅｌ  ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、このＥ−Ｇｅｌ  ２％は米国特許第５，５８２，７０２号明細書の記載に従って調製し、ここでエチジウムブロマイドを、１００００×溶液に由来する４×濃度の化合物１で置換した。ゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｇ６２００−０４）を用いて３０分間電気泳動させ、次いで、Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒを用いて画像化した。図４を参照のこと。
【０１３７】
（実施例１０：０．５×ＴＢＥ中の化合物１についての、ＥＰＡ急性経口毒性試験）
試験物質を経口限界用量である５０００ｍｇ／ｋｇ受けた、３匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを用い、ＯＰＰＴＳガイドライン（８７０．１１００）に従って限界スクリーニング試験を行った。上記動物を、２週間の間の死亡率、体重変化および毒性の徴候について観察した。
【０１３８】
上記の用量を投与した後２週間に、全ての３匹のラットが生存したので、上記試験物質についてのＬＤ５０は上記の限界容量を超えるとみなし、これ以上の試験は必要なかった。
【０１３９】
本研究の終了時において動物を安楽死させた。全身の検死を行い、いずれの試験動物においても異常は見られなかった。
【０１４０】
（実施例１１：水質浄化法の遵守についての、ＮＰＤＥＳ（国家汚染物質排出防止システム）試験）
化合物１は、シアン化合物、フェノール類、汚染物質金属、有機塩素農薬、ＰＣＢ、あるいは半揮発性有機化合物または揮発性有機化合物を含まないという、水質浄化法の規定および国家汚染物質排出防止システムの規定に従う。試験を、表９に引用するＥＰＡプロトコールに従って行った。
表９：
【０１４１】
【表１１】
2011099862.tif 000019
（実施例１２：化合物１の合成）
３３．９２ｇのレピジン、および５０．４５ｇのプロピルトシラートの混合物を、１１０℃にて１時間熱する。反応物を室温まで冷却し、そして６００ｍＬの酢酸エチルを加え、そして６０℃にて１時間熱する。この混合物を濾過し、そして７５．７５ｇの中間体４−メチル−１−プロピルキノリウムトシレートを得る。この中間体を、３００ｍＬの塩化メチレン中の７８．０５ｇの３−メチル−２−メチルチオベンゾチアゾリウムトシレートと混合し、そして６４．５３ｇのトリエチルアミンを導入する。反応混合物を室温にて一晩攪拌し、次いで１Ｌの酢酸エチルを加え、生成物を濾過する。
【０１４２】
【化１６】
2011099862.tif 000020
前述の実施例は、前述の実施例の、具体的に記載された核酸染色化合物を、上の記載において一般におよび具体的に記載された化合物で置換することにより、類似の結果で繰り返され得る。当業者は本発明の基本的な特徴を容易に確認し得、そして本発明の精神および範囲から離れることなく、種々の用法および条件に適応するために、本発明の種々の変化および改変をなし得る。
【０１４３】
本明細書中に言及された全ての特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的におよび個々に参考として援用されることを意図されるのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【図１】
2011099862.tif 000030
【図２】
2011099862.tif 000031
【図３】
2011099862.tif 000032
【図４Ａ】
2011099862.tif 000033
【図４Ｂ】
2011099862.tif 000034
【図４Ｃ】
2011099862.tif 000035
【図４Ｄ】
2011099862.tif 000036
【図４Ｅ】
2011099862.tif 000037
【図４Ｆ】
2011099862.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月15日(2010.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで該方法が、以下：
ａ）非対称のシアニン色素化合物をサンプルと合わせて標識混合物を調製する工程であって、ここで該サンプルが固体または半固体の支持体上に固定化され、そして該非対称のシアニン色素化合物が式
【化１】
2011099862.tif 000039
を有し；
ここでＸはＯ、Ｓ、またはＣ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１は縮合されたベンゼン、メトキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはメトキシであり；
ｔは独立して０、１、２、３または４であり；
ｓは独立して０、１、２、３または４であり、そして
ｎは０、１、２または３である工程；
ｂ）該標識混合物を、該非対称のシアニン色素化合物が該核酸と会合して、インキュベートされたサンプルを調製するために十分な時間、インキュベートする工程；
ｃ）該インキュベートされたサンプルに適切な波長を照射して、照射されたサンプルを調製する工程；および
ｄ）該照射されたサンプルを観察する工程であって、それによって該核酸の存在または非存在が決定される工程；
を包含する方法であって、ただし、該支持体がポリマーのゲルである場合、該非対称のシアニン色素化合物はチアゾールオレンジではない、方法。