(57)【要約】【課題】糖成分の2’−位置でブロッキング基を有する新規なヌクレオチド及び/又はヌクレオシドの提供。【解決手段】本発明は、糖成分の2’−位置でブロッキング基を有する、ヌクレオチド及び/又はヌクレオシドを含んで成る組成物を提供する。それらの核酸の合成方法がまた、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのヌクレオシド、及び/又は下記式：
【化１】
2011224016.tif 000024
[式中、R1は、H, OH, 親水性基、又は疎水性基であり；
Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；
BGは、ブロッキング基であり；
ZはO又はCH2であり；そして
---- は、単又は二重結合を表わす]
を含んで成る少なくとも１つのヌクレオチドを含んで成り；
ここで前記ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドがラベルされており；そして
前記ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドがまた、G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05R ポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus） ポリメラーゼ、 TMA-25 ポリメラーゼ、TMA-30 ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種（Thermus species） SPS-17 ポリメラーゼ、 E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZ05R ポリメラーゼ、 T7 DNA ポリメラーゼ、Kornberg DNA ポリメラーゼ I、Klenow DNA ポリメラーゼ、 Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカル（Micrococcal）DNA ポリメラーゼ、 αDNA ポリメラーゼ、 逆転写酵素、 AMV 逆転写酵素、 M-MuLV 逆転写酵素、 DNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ、E.コリ（E. coli） RNA ポリメラーゼ、 SP6 RNA ポリメラーゼ、 T3 RNA ポリメラーゼ、 T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ II、 末端 トランスフェラーゼ、 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ及び リボヌクレオチド 組込みDNA ポリメラーゼから成る群から選択された１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒により非延長性にされる組成物。
【請求項２】
前記Bが、下記式：
【化２】
2011224016.tif 000025
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；
R2は、H, OH又はNR4R5であり；
R3は、H, OH又はNR6R7であり；
R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そして
R6及びR7は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記Bが、下記式：
【化３】
2011224016.tif 000026
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；
R2は、O又はSであり；
R3は、H, OH又はNR4R5であり；そして
R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記Bが、下記式：
【化４】
2011224016.tif 000027
[式中、R2は、H, OH又はNR4R5であり；
R3は、H, OH又はNR6R7であり；
R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そして
R6及びR7は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記Bが、下記式：
【化５】
2011224016.tif 000028
[式中、XはCH又はNであり；
R2及びR3は、H, OH及びNHR4から独立して選択され；
R4は、H、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せであり；そして
R5は、OH, NH2, SH, ハロ基、エーテル基、チオエーテル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルアミン基、アルケニルアミン基、アルキニルアミン基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記Bが、下記式：
【化６】
2011224016.tif 000029
[式中、Xは、CH又はNであり；
R2は、O又はSであり；
R3は、H, OH又はNHR4であり；
R4は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せであり；そして
R5は、OH, NH2, SH, ハロ基、エーテル基、チオエーテル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルアミン基、アルケニルアミン基、アルキニルアミン基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記Bが、下記式：
【化７】
2011224016.tif 000030
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；
R2は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そして
R3は、O又はSである]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記Bが、下記式：
【化８】
2011224016.tif 000031
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択され；そして
R4及びR5は、H, NH2, SH, OH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記Bが、下記式：
【化９】
2011224016.tif 000032
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択され；そして
R4は、H, NH2, SH, OH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記Bが、下記式：
【化１０】
2011224016.tif 000033
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記Bが、下記式：
【化１１】
2011224016.tif 000034
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記Bが、下記式：
【化１２】
2011224016.tif 000035
[式中、R2は、O又はSであり；
R3及びR4は、H,NH2、SH、OH、COOH、COOCH3、COOCH2CH3、CHO、NO2、CN、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される；そして
R5は、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケノキシ基、アルキニル基、アルキノキシ基、アリール基、アリールオキシ基、ベンジル基、ベンジルオキシ基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記BGが、負に荷電された基である請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記BGが、大きな基である請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
BGが、CN、 NO2、 N3、シリル基、ハロ基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、酸基、エステル基、アミノ基及びそれらの組合せから成る群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
BGが、下記式：
【化１３】
2011224016.tif 000036
[式中、Xは、O、S、NR3、CR3R4、又はSiR3R4であり；
Yは、CR5R6R7、SiR5R6R7、OR5、SR5、又はNHR5であり；
R2は、H、OH、NHR8、SR8、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、又はそれらの組合せであり；そして
R3, R4, R5, R6, R7及びR8は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
BGが、下記式：
【化１４】
2011224016.tif 000037
[式中、Xは、CR3R4R5、SiR3R4R5、OR3、SR3、又はNHR3であり；
R2は、H, OH, NHR6, SR6, アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はそれらの組合せであり；そして
R3, R4, R5及びR6は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記Bが、前記ラベルを含んで成るか、又は前記ラベルに結合される請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドの糖成分が、前記ラベルを含んで成るか、又は前記ラベルに結合される請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
前記BGが、前記ラベルを含んで成るか、又は前記ラベルに結合される請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
リンカーが、前記ラベルを含んで成るか、又は前記ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドに前記ラベルを結合する請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
前記ヌクレオチドが、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシドを含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
前記ヌクレオチド組込みを触媒の少なくとも１つが、延長されたプライマー核酸の末端で前記ヌクレオチドを組み込む延長されたプライマー核酸を生成するためにプライマー核酸を延長することができる請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
前記ヌクレオチドが、前記5’位置で結合される少なくとも１つのリン酸基を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項２５】
前記ヌクレオチドが、前記5’位置で結合される少なくとも２個のリン酸基を含んで成る請求項23記載の組成物。
【請求項２６】
前記ヌクレオチドが、前記5’位置で結合される少なくとも３個のリン酸基を含んで成る請求項23記載の組成物。
【請求項２７】
前記ラベルが、蛍光色素、弱い蛍光ラベル、非蛍光ラベル、比色ラベル、化学ルミネセンスラベル、生物ルミネセンスラベル、放射性同位体、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン又は酵素を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項２８】
前記ラベルが、ローダミン色素、フルオレセイン色素、ハロフルオレセイン色素、ジクロロローダミン色素、エネルギー移行色素、Lucifer色素、Oregon Green及びシアニン色素から成る群から選択された蛍光色素である請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
前記ラベルが、JOE、 VIC、 TET、HEX、 FAM、 R6G、R110、 TAMRA 及び ROXから成る群から選択された蛍光色素である請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
前記ラベルが、3H、 14C、 22Na、 32P、 33P、 35S、 42K、45Ca、 59Fe、 125I 及び203Hgから成る群から選択された放射性同位体である請求項27記載の組成物。
【請求項３１】
前記ラベルが、少なくとも１つの質量修飾基を含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項３２】
前記質量修飾基が、重水素、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3及びホスホロチオエート基から成る群から選択され、ここで
Xが、O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2 )nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-アルキル), 又は OP(O-アルキル)であり；
ｎが１〜20の整数であり；そして
Yが、H、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化されたポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化されたシリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基、又はポリエチレングリコール基である請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
ポリマーが、前記ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドを含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項３４】
前記ポリマーが、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、アプタマー、DNA−RNAハイブリッド、アンチセンス核酸、RNAi、分子標識、核酸プローブ、核酸プライマー、PNA、PNA-DNA接合体又はPNA-RNA接合体を含んで成る請求項33記載の組成物。
【請求項３５】
１又は複数の延長可能ヌクレオチドをさらに含んで成る請求項１記載の組成物。
【請求項３６】
前記延長できるヌクレオチドが、リボヌクレオチド及び/又はデオキシリボヌクレオチドを含んで成る請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
前記非延長性ヌクレオチド及び延長できるヌクレオチドが、１：１又はそれ以下のモル比で存在する請求項35記載の組成物。
【請求項３８】
ラベルされた非延長性ヌクレオチドの生成方法であって、
ヌクレオシドの糖成分の5’−位置に少なくとも１つのリン酸基を結合し；
前記ヌクレオシドの糖成分の2’−位置に少なくとも１つのブロッキング基を結合し；そして
前記ヌクレオシド糖成分、ブロッキング基、及び/又は塩基に少なくとも１つのラベルを結合し、それにより、ラベルされた非延長性のヌクレオチドを生成することを含んで成り、前記ヌクレオチドが、G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05R ポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus） ポリメラーゼ、 Tma-25 ポリメラーゼ、Tma -30 ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種（Thermus species） SPS-17 ポリメラーゼ、 E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZ05R ポリメラーゼ、 T7 DNA ポリメラーゼ、Kornberg DNA ポリメラーゼ I、Klenow DNA ポリメラーゼ、 Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカル DNA ポリメラーゼ、 αDNA ポリメラーゼ、 逆転写酵素、 AMV 逆転写酵素、 M-MuLV 逆転写酵素、 DNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ、E.コリ（E. coli） RNA ポリメラーゼ、 SP6 RNA ポリメラーゼ、 T3 RNA ポリメラーゼ、 T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ II、 末端 トランスフェラーゼ、 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ及び リボヌクレオチド 組込みDNA ポリメラーゼから成る群から選択された１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒により非延長性にされる方法。
【請求項３９】
前記ラベルされた非延長性のヌクレオチドが、特異的に又は選択的に生成される請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記ブロッキング基が、負に荷電された基である請求項38記載の方法。
【請求項４１】
前記ブロッキング基が、大きな基である請求項38記載の方法。
【請求項４２】
ブロッキング基が、CN、 NO2、 N3、シリル基、ハロ基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、酸基、エステル基、アミノ基及びそれらの組合せから成る群から選択される請求項38記載の方法。
【請求項４３】
前記ブロッキング基が、下記式：
【化１５】
2011224016.tif 000038
[式中、Xは、O、S、NR3、CR3R4、又はSiR3R4であり；
Yは、CR5R6R7、SiR5R6R7、OR5、SR5、又はNHR5であり；
R2は、H、OH、NHR8、SR8、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、又はそれらの組合せであり；そして
R3, R4, R5, R6, R7及びR8は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される] を含んで成る請求項38記載の方法。
【請求項４４】
前記ブロッキング基が、下記式：
【化１６】
2011224016.tif 000039
[式中、Xは、CR3R4R5、SiR3R4R5、OR3、SR3、又はNHR3であり；
R2は、H, OH, NHR6, SR6, アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はそれらの組合せであり；そして
R3, R4, R5及びR6は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項38記載の方法。
【請求項４５】
リンカーが、前記ヌクレオシドの糖成分、ブロッキング基、又は塩基の少なくとも１つに、ラベルを結合する請求項38記載の方法。
【請求項４６】
前記ヌクレオチド組込みを触媒の少なくとも１つが、延長されたプライマー核酸の末端で前記ヌクレオチドを組み込む延長されたプライマー核酸を生成するためにプライマー核酸を延長することができる請求項38記載の方法。
【請求項４７】
請求項38記載の方法により生成される、ラベルされた非延長性ヌクレオチド。
【請求項４８】
前記ラベルが、蛍光色素、弱い蛍光ラベル、非蛍光ラベル、比色ラベル、化学ルミネセンスラベル、生物ルミネセンスラベル、放射性同位体、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン又は酵素を含んで成る請求項38記載の方法。
【請求項４９】
前記ラベルが、ローダミン色素、フルオレセイン色素、ハロフルオレセイン色素、ジクロロローダミン色素、エネルギー移行色素、Lucifer色素、Oregon Green及びシアニン色素から成る群から選択された蛍光色素である請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記蛍光ラベルが、JOE、 VIC、 TET、HEX、 FAM、 R6G、R110、 TAMRA 及び ROXから成る群から選択される請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記放射性同位体が、3H、 14C、 22Na、 32P、 33P、 35S、 42K、45Ca、 59Fe、 125I 及び203Hgから選択される請求項48記載の方法。
【請求項５２】
前記ラベルが、少なくとも１つの質量修飾基を含んで成る請求項38載の方法。
【請求項５３】
前記質量修飾基が、重水素、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3及びホスホロチオエート基から成る群から選択され、ここで
Xが、O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2 )nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-アルキル), 又は OP(O-アルキル)であり；
ｎが１〜20の整数であり；そして
Yが、H、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化されたポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化されたシリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基、又はポリエチレングリコール基である請求項52記載の方法。
【請求項５４】
2’−一リン酸ヌクレオシドの生成方法であって、下記式：
【化１７】
2011224016.tif 000040
[式中、Pは、少なくとも１つのリン酸基であり；
ｎは、０よりも大きな整数であり；
R1は、H, OH, 親水性基、又は疎水性基であり；
Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；
ZはO又はCH2であり；そして
---- は、単又は二重結合を表わす]
を含んで成るヌクレオチドと、三ナトリウムトリメタホスフェートとを、2’−一リン酸ヌクレオシドを生成するための効果的な条件下で反応せしめることを含んで成る方法。
【請求項５５】
前記ヌクレオチドが、２個のリン酸基を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記ヌクレオチドが、３個のリン酸基を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項５７】
前記Bが、下記式：
【化１８】
2011224016.tif 000041
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；
R2は、H, OH又はNR4R5であり；
R3は、H, OH又はNR6R7であり；
R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そして
R6及びR7は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項５８】
前記Bが、下記式：
【化１９】
2011224016.tif 000042
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；
R2は、O又はSであり；
R3は、H, OH又はNR4R5であり；そして
R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載のヌクレオシド。
【請求項５９】
前記Bが、下記式：
【化２０】
2011224016.tif 000043
[式中、R2は、H, OH又はNR4R5であり；
R3は、H, OH又はNR6R7であり；
R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そして
R6及びR7は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６０】
前記Bが、下記式：
【化２１】
2011224016.tif 000044
[式中、XはCH又はNであり；
R2及びR3は、H, OH及びNHR4から独立して選択され；
R4は、H、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せであり；そして
R5は、OH, NH2, SH, ハロ基、エーテル基、チオエーテル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルアミン基、アルケニルアミン基、アルキニルアミン基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６１】
前記Bが、下記式：
【化２２】
2011224016.tif 000045
[式中、Xは、CH又はNであり；
R2は、O又はSであり；
R3は、H, OH又はNHR4であり；
R4は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せであり；そして
R5は、OH, NH2, SH, ハロ基、エーテル基、チオエーテル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルアミン基、アルケニルアミン基、アルキニルアミン基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６２】
前記Bが、下記式：
【化２３】
2011224016.tif 000046
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；
R2は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そして
R3は、O又はSである]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６３】
前記Bが、下記式：
【化２４】
2011224016.tif 000047
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択され；そして
R4及びR5は、H, NH2, SH, OH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６４】
前記Bが、下記式：
【化２５】
2011224016.tif 000048
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択され；そして
R4は、H, NH2, SH, OH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６５】
前記Bが、下記式：
【化２６】
2011224016.tif 000049
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６６】
前記Bが、下記式：
【化２７】
2011224016.tif 000050
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択される]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６７】
前記Bが、下記式：
【化２８】
2011224016.tif 000051
[式中、R2は、O又はSであり；
R3及びR4は、H,NH2、SH、OH、COOH、COOCH3、COOCH2CH3、CHO、NO2、CN、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される；そして
R5は、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケノキシ基、アルキニル基、アルキノキシ基、アリール基、アリールオキシ基、ベンジル基、ベンジルオキシ基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項６８】
前記ヌクレオチド及び三ナトリウムトリメタホスフェートが、約14のpHでのアルカリ性溶液において反応される請求項54記載の方法。
【請求項６９】
前記ヌクレオチド及び三ナトリウムトリメタホスフェートが、室温で反応される請求項54記載の方法。
【請求項７０】
請求項54記載の方法により生成される2’−一リン酸ヌクレオシド。
【請求項７１】
前記2'−一リン酸ヌクレオシドが、3’−一リン酸プリンヌクレオシドを含んでなる混合物において生成される2’−一リン酸プリンヌクレオシドを含んで成り、そして前記方法がさらに、前記3’−一リン酸プリンヌクレオシドから前記2’−一リン酸プリンヌクレオシドを分離することを含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項７２】
前記2’−一リン酸プリンヌクレオシド及び3’−一リン酸プリンヌクレオシドが、液体クロマトグラフィーを用いて、お互い分離される請求項71記載の方法。
【請求項７３】
前記2'−一リン酸ヌクレオシドを、少なくとも１つのラベルによりラベリングすることをさらに含んで成る請求項54記載の方法。
【請求項７４】
前記ラベルが、前記2’−一リン酸ヌクレオシドのBに結合される請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記ラベルが、前記2’−一リン酸ヌクレオシドの糖成分に結合される請求項73記載の方法。
【請求項７６】
前記ラベルが、前記2’−一リン酸ヌクレオシドの2’−一リン酸に結合される請求項73記載の方法。
【請求項７７】
前記リンカーが、前記ラベルを前記2’−一リン酸ヌクレオシドに結合する請求項73記載の方法。
【請求項７８】
前記ラベルが、蛍光色素、弱い蛍光ラベル、非蛍光ラベル、比色ラベル、化学ルミネセンスラベル、生物ルミネセンスラベル、放射性同位体、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン又は酵素を含んで成る請求項73記載の方法。
【請求項７９】
前記ラベルが、ローダミン色素、フルオレセイン色素、ハロフルオレセイン色素、ジクロロローダミン色素、エネルギー移行色素、Lucifer色素、Oregon Green及びシアニン色素から成る群から選択された蛍光色素である請求項78記載の方法。
【請求項８０】
前記蛍光色素が、JOE、 VIC、 TET、HEX、 FAM、 R6G、R110、 TAMRA 及び ROXから成る群から選択される請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記ラベルが、放射性同位体を含んで成る請求項73記載の方法。
【請求項８２】
前記放射性同位体が、3H、 14C、 22Na、 32P、 33P、 35S、 42K、45Ca、 59Fe、 125I 及び203Hgから成る群から選択される請求項81記載の方法。
【請求項８３】
前記ラベルが、少なくとも１つの質量修飾基を含んで成る請求項73記載の方法。
【請求項８４】
前記質量修飾基が、重水素、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3及びホスホロチオエート基から成る群から選択され、ここで
Xが、O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2 )nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-アルキル), 又は OP(O-アルキル)であり；
ｎが１〜20の整数であり；そして
Yが、H、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化されたポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化されたシリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基、又はポリエチレングリコール基である請求項83記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は一般的に、2’−ターミネーターヌクレオチド類及びそれらの生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
核酸配列決定は、特定の核酸分子のヌクレオチドの配列の決定を包含する。核酸分子の配列の知識は典型的には、分子の機能を解明し、そして分子の操作を促進する基礎である。さらに、個々のゲノムの変動はしばしば、疾病に対する敏感性及び処理に対する薬理学的応答の差異の原因である。単一ヌクレオチド多型現象（SNP）として通常、言及される、核酸分子の単一の塩基の変更が、所定の疾病に対する個々の危険性に影響を及ぼすことができる。例えば、それらの変動性を比較することにより、研究者は、SNPの医学的利用能の理解を得、それにより疾病を効果的に診断し、予知し、そして処理する能力を増強する。
【０００３】
核酸配列決定技法は、RNAを配列決定するための努力を伴って、1960年代、後期に始まった。特に、E. コリからのSS−リボソームRNA（Brownlee など. (1967) "Nucleotide sequenceof 5S-ribosomal RNA from Escherichia coli,"Nature 215 (102): 735）及びコートタンパク質をコードするR17バクテリオファージRNA（Adams など. (1969) "Nucleotide sequence from the coat protein cistron of R17 bacteriophage RNA, "Nature 223 (210): 1009）の配列は、DNA配列決定のいくつかの初期例である。その後、Sangerは、DNAポリメラーゼによっての、プライムされた合成によるバクテリオファージf１ DNAの配列決定を記載し（Sanger など. (1973)"Use of DNA polymerase I primed by a synthetic oligonucleotide to determine a nucleotide sequence in phagefl DNA, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (4): 1209）、そしてGilbert及びMaxamは、lacオペレーターのDNAヌクレオチド配列を報告している（Gilbert and Maxam (1973) "The nucleotide sequence of the lac operator, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (12): 3581）。
【０００４】
1977年、Sangerは、鎖延長を終結するためへの修飾されたヌクレオシド三リン酸（ジデオキシリボースを包含する）及びデオキシリボヌクレオチドの使用を記載している（Sanger など. (1977) "DNA sequencing with chain- terminating inhibitors,"Biotechnology 24: 104）。同じ年、Maxam及びGilbertは、グアニン、アデニン、シトシン及びチミンで同等に、及びシトシンで単独に、DNAの化学的分解を選択的に利用するDNAの配列決定方法を報告している（Maxam and Gilbert (1977) "A new method for sequencing DNA," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560）。それらの２種の方法は、放射性マーカーによりラベルされたDNAフラグメントの電気泳動分離、及びオートラジオグラフィーによる続く検出に基づいて、手動的配列決定を促進した。
【０００５】
DNAを配列決定するためのSangerのジデオキシ方法は、Maxam-Gilbertの化学的分解方法よりもかなり広く使用されるようになって来た。Sangerの方法は、特定のプライミング部位から出発し、そして鎖終結又はターミネーターヌクレオチドの組込みにより終結する、DNAの新鎖の合成を包含する。特に、DNAポリメラーゼは、DNA鋳型に対して相補的なデオキシヌクレオチド（dNTP）を組込むことにより、そのDNA鋳型上での特定の位置にアニリーリングされるプライマー核酸を延長する。新しいDNA鎖の合成は、反応がデオキシヌクレオチド（ddNTP）の包含によりランダムに終結されるまで、続く。それらのヌクレオチド類似体は、ddNTPのリボース成分が次の入って来るdNTPとホスホジエステル結合を形成するために必要な3’−ヒドロキシルを欠いているので、さらなる鎖の延長を支持することはできない。これは、限定された又は固定された5’−末端及び種々の3’−末端を、それぞれ有する、切断された配列決定フラグメントの集団を生成する。中でも、デオキシ方法の欠点は、ddNTPの製造に関する。
【０００６】
２種の時折使用される自動化された配列決定方法は、色素−プライマー核酸及び色素−ターミネーター配列決定である。それらの方法は、蛍光ラベル成分との使用のために適切である。配列決定はまた、放射性ラベル成分を用いて行われ得るが、蛍光に基づいての配列決定が非常に好ましい。手短には、色素−プライマー配列決定においては、蛍光ラベルされたプライマーが、ラベルされていないddNTPと組合して使用される。２の方法は典型的には、種々の合成反応、及び配列決定される個々の鋳型についてゲル上で４種までのライン（１つは、塩基特異的終結生成物の個々に対応する）を使用する。プライマー核酸延長に続いて、ジデオキシヌクレオチドを組込まれた終結生成物を含む配列決定反応混合物は、DNA配列決定ゲル上で通常、電気泳動される。
【０００７】
電気泳動による分離に続いて、蛍光ラベルされた生成物は、レーザーによりゲルにおいて励起され、そして蛍光が適切な検出器により検出される。自動化されたシステムにおいては、検出器は、反応がゲルマトリックスを通過するにつれて、どんなラベル成分が使用されたかを検出するために、電気泳動の間、ゲルの底部を走査する（Smithなど.(1986)"Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis, "Nature 321: 674）。４種の別々の配列決定反応が使用された後、混合物が組合され、そして反応が単一ラインのゲル分析にゆだねられ、そして異なった蛍光標識（１つは、４種の異なった塩基−特異的終結生成物の個々に反応する）が個々に検出される。
【０００８】
他方では、色素−ターミネーター配列決定方法が使用される。この方法においては、DNAポリメラーゼが、DNAプライマーの成長する末端上にdNTP及び蛍光ラベルされたddNTPを組込むために使用される（Lee など. (1992)"DNA sequencing with dye-labeledterminators and T7 DNA polymerase: effect of dyes and dNTPs on incorporation ofdye-terminators and probability analysis of terminationfragments,"Nucleic Acid Res. 20: 2471）。この方法は、色素−ラベルされたプライマーを合成しない利点を提供する。さらに、色素−ターミネーター反応は、４種のすべての反応が同じ管において行われ得ることにおいて、より便利である。
【０００９】
配列決定反応混合物を単純化する他の方法は、気相イオン分光測定の使用を包含する。例えば、マトリックス助力されたレーザー吸着/イオン化タイム−オブ−フライト（Time-of-flight）質量分光測定（MALDI−TOF−MS）は、高い処理量の配列決定及びSNP遺伝子型分析に都合良く使用されて来た１つのアプローチである（例えば、Sauer など. (2002) "Facile method for automated genotyping of single nucleotide polymorphisms by mass spectrometry, "Nucleic Acids Res. 30 (5): e22を参照のこと）。
【００１０】
核酸の配列決定及び遺伝子型分類への使用のための追加のターミネーターヌクレオチドが所望される。本発明は、他の用途の他に、配列決定を行うために有用である2’−ターミネーターヌクレオチドを提供する。本発明のそれらの及び種々の他の特徴は、次の開示の完全な再考に基づいて明らかであろう。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要約：
本発明は、先在するターミネーターに変わる経済的な核酸延長ターミネーターに関する。例えば、本明細書に記載される2’−ターミネーターヌクレオチドは、容易な使用を犠牲にしないで種々の配列決定プロトコールで容易に置換される。特に、損なわれていない糖環又は糖類似体環（例えば、炭素環式環、等）を有する、本発明の2’−ターミネーターヌクレオチドは、それらの糖成分の2’−位置でブロッキング基（例えば、負に荷電されたブロッキング基、大きなブロッキング基及び/又は同様のもの）を包含する。本明細書に言及される種々のヌクレオチド組込み生触媒は、鋳型指図された態様で、プライマー核酸の3’−末端でそれらの2’−ターミネーターヌクレオチド（例えば、2’−リン酸−3’−ヒドロキシルNTP又はNDP、等）によりプライマー核酸を延長する（すなわち、プライマー核酸中に2’−ターミネーターヌクレオチドを組込む）能力を包含する。
【００１２】
本明細書において言及される一定のヌクレオチド組込み生触媒、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT; EC 2.7.7.31）、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase; EC 2.7.7.8）、等は、鋳型非依存性態様で核酸を延長することができる。プライマー核酸の3’−末端での2’−ターミネーターヌクレオチドの組込みに基づいて、核酸は典型的には、ヌクレオチド組込み生触媒により延長できなくされる。さらに、2’−ターミネーターヌクレオチドを含んで成る延長されたプライマー核酸はまた、一般的に、プルーフリーディングの酵素活性（例えば、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性、等)に対して耐性である。従って、本明細書に記載される2’−ターミネーターヌクレオチドは、例えば低められたプルーフリーディング活性を欠いているか又は有する触媒を利用するアプローチに関して配列適合性を改良するために、プルーフリーディング酵素の使用を可能にする。組成物の他に、本発明はまた、本明細書に記載される2’−ターミネーターヌクレオチドの生成方法も提供する。
【００１３】
１つの観点においては、本発明は、少なくとも１つのヌクレオシド、及び/又は下記式：
【化１】
2011224016.tif 000002
【００１４】
[式中、R1は、H, OH, 親水性基、又は疎水性基であり；
Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；
BGは、ブロッキング基であり；
ZはO又はCH2であり；そして
---- は、単又は二重結合を表わす]
を含んで成る少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、2’−ターミネーターヌクレオチド）を含んで成る組成物に関する。さらに、前記ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドは典型的には、ラベルされる。
【００１５】
さらに、例えばG46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、AZ05R DNAポリメラーゼ、Z05ポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus）（Tfl） ポリメラーゼ（例えば、本明細書に記載される2’−ターミネーターヌクレオチドを組込む修飾されたTflポリメラーゼ）、サーマトガ・マリチメ（Thermatoga maritime）−又はTma−25ポリメラーゼ、 Tma-25 ポリメラーゼ、Tma -30 ポリメラーゼ、サーマス・サーモフィリス（Thermos thermophilus）Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種（Thermus species） SPS-17 ポリメラーゼ、 E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZ05R ポリメラーゼ、 T7DNA ポリメラーゼ、Kornberg DNA ポリメラーゼ I又はE.コリ（E. coli） DNA ポリメラーゼ、Klenow DNA ポリメラーゼ、 Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカス DNA ポリメラーゼ、 αDNA ポリメラーゼ、 逆転写酵素、 AMV 逆転写酵素、 M-MuLV 逆転写酵素、 DNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ、E.コリ（E. coli） RNA ポリメラーゼ、 SP6 RNA ポリメラーゼ、 T3 RNA ポリメラーゼ、 T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ II、 末端 トランスフェラーゼ、 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNA）、リボヌクレオチド 組込みDNA ポリメラーゼ又は同様のものから選択された１又は複数のヌクレオチド組込みを生触媒により非延長性である。
【００１６】
B及びBGはそれぞれ、多くの異なった態様を包含する。さらに、ヌクレオチド組込み生触媒の少なくとも１つは一般的に、延長されたプライマー核酸の末端でヌクレオチドを組込む延長されたプライマー核酸を生成するために、プライマー核酸を延長することができる（例えば、鋳型無関係又は依存性態様で）。典型的には、ヌクレオチドは、その5’位置で結合される１，２，３又はそれ以上のリン酸基を含んで成る。例示によれば、ヌクレオチドは、本発明にいくつかの態様においては、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシドを含んで成る。
【００１７】
ラベル（例えば、蛍光色素、非蛍光色素、比色ラベル、質量修飾基、放射性同位体、ハプテン、等）は任意には、本発明のヌクレオチド及びヌクレオシド上の種々の部位に結合される（例えば、共有又は非共有）。確かな態様においては、ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドの糖成分は、ラベルを含んで成るか、又はラベルに結合される。いくつかの態様においては、BGは、ラベルを含んで成るか、又はラベルに結合される。他の態様においては、Bは、ラベルを含んで成るか、又はラベルに結合される。典型的には、リンカーは、ラベルを含んで成るか、又はラベルをヌクレオシド及び/又はヌクレオチドに結合する。
【００１８】
組成物は任意には、さらに１又は複数の延長可能ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド及び/又はデオキシリボヌクレオチド）を包含する。非延長性ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドは典型的には、１：１又はそれ以下のモル比で存在する。
いくつかの態様においては、ポリマーは、ヌクレオシド及び/又はヌクレオチドを含んで成る。前記ポリペプチドは任意には、例えばオリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、アプタマー、アンチセンス核酸、RNAi、DNA−RNAハイブリッド、分子標識、核酸プローブ、核酸プライマー、PNA、PNA-DNA接合体、PNA-RNA接合体又は同様のものを含んで成る。
【００１９】
もう１つの態様においては、本発明は、ラベルされた非延長性ヌクレオチドの生成方法を提供する。前記方法は、ヌクレオシド（例えば、リボヌクレオシド、炭素環式ヌクレオシド、等）の糖成分の5’−位置に少なくとも１つのリン酸基を結合し；前記ヌクレオシドの糖成分の2’−位置に少なくとも１つのブロッキング基を結合することを包含する。
【００２０】
前記方法はまた、前記ヌクレオシドの糖成分、ブロッキング基、及び/又は塩基に少なくとも１つのラベルを結合し、それにより、ラベルされた非延長性のヌクレオチドを生成することを含んで成り、前記ヌクレオチドは、G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05R DNAポリメラーゼ、Z05ポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、Tma−25ポリメラーゼ、 Tma -30 ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種SPS-17 ポリメラーゼ、 E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZ05R ポリメラーゼ、 T7DNA ポリメラーゼ、Kornberg DNA ポリメラーゼ I、Klenow DNA ポリメラーゼ、 Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカス DNA ポリメラーゼ、 αDNA ポリメラーゼ、 逆転写酵素、 AMV 逆転写酵素、 M-MuLV 逆転写酵素、 DNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ、E.コリ（E. coli） RNA ポリメラーゼ、 SP6 RNA ポリメラーゼ、 T3 RNA ポリメラーゼ、 T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ II、 末端 トランスフェラーゼ、 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボヌクレオチド 組込みDNA ポリメラーゼ又は同様のものから成る群から選択された１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒により非延長性にされる。
【００２１】
さらに、ヌクレオチド組込み生触媒の少なくとも１つは一般的に、延長されたプライマー核酸の末端で前記ヌクレオチドを組み込む延長されたプライマー核酸を生成するためにプライマー核酸を延長することができる。典型的には、リンカーは、糖成分、ブロッキング基、又はヌクレオチドの塩基の少なくとも１つにラベルを結合する（例えば、共有又は非共有）。
【００２２】
ブロッキング基（又はBG）は典型的には、負に荷電された基及び/又は大きな基である。いくつかの態様においては、例えばブロッキング基は、下記式：
【００２３】
【化２】
2011224016.tif 000003
【００２４】
[式中、Xは、O、S、NR3、CR3R4、又はSiR3R4であり；Yは、CR5R6R7、SiR5R6R7、OR5、SR5、又はNHR5であり；R2は、H、OH、NHR8、SR8、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、又はそれらの組合せであり；そしてR3, R4, R5, R6, R7及びR8は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される] を含んで成る。いくつかの態様においては、ブロッキング基は、下記式：
【００２５】
【化３】
2011224016.tif 000004
【００２６】
[式中、Xは、CR3R4R5、SiR3R4R5、OR3、SR3、又はNHR3であり；R2は、H, OH, NHR6, SR6, アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せであり；そしてR3, R4, R5及びR6は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される] を含んで成る。
さらにもう１つの観点においては、本発明は、2’−一リン酸ヌクレオシドの生成方法を提供する。前記方法は、下記式：
【００２７】
【化４】
2011224016.tif 000005
【００２８】
[式中、Pは、少なくとも１つのリン酸基であり；ｎは、０よりも大きな整数であり；R1は、H, OH, 親水性基、又は疎水性基であり；Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；ZはO又はCH2であり；そして---- は、単又は二重結合を表わす]を含んで成るヌクレオチドと、三ナトリウムトリメタホスフェートとを、2’−一リン酸ヌクレオシドを生成するための効果的な条件下で反応せしめることを包含する。確かな態様においては、ヌクレオチドは２個のリン酸基を含んで成り、そして他においては、ヌクレオチドは３個のリン酸基を含んで成る。
【００２９】
いくつかの態様においては、前記ヌクレオチド及び三ナトリウムトリメタホスフェートは、約14のpH及び/又は室温でのアルカリ性溶液において反応される。確かな態様においては、前記2'−一リン酸ヌクレオシドは、3’−一リン酸プリンヌクレオシドを含んでなる混合物において生成される2’−一リン酸プリンヌクレオシドを含んで成り、そして前記方法がさらに、前記3’−一リン酸プリンヌクレオシドから前記2’−一リン酸プリンヌクレオシドを分離することを含んで成る。例えば、前記2’−一リン酸プリンヌクレオシド及び3’−一リン酸プリンヌクレオシドは、液体クロマトグラフィー及び/又は他の分離技法を用いて、お互い分離される。
【００３０】
他の態様においては、ヌクレオチド合成は、特異的（例えば、位置特異的）又は選択的（例えば、位置選択的）である。いくつかの態様においては、2’−一リン酸ヌクレオシドは、それが例えば水素結合、塩基スタッキング機構及び/又は同様のものを通して、もう１つのヌクレオチドとの塩基対合成反応に関与する限り、実質的にいずれかのBを包含することができる。他の態様においては、Bは、塩基対合相互作用（例えば、TAT、PNPアーゼ及び同様のものにより触媒される反応）に関与する必要性は存在しない。
【００３１】
典型的には、前記方法はまた、少なくとも１つのラベルによる2’−一リン酸ヌクレオシドラベリングを包含する。例えば、ラベルは典型的には、2’−一リン酸ヌクレオシドのB、2’−一リン酸ヌクレオシドの糖成分、及び/又は2’−一リン酸ヌクレオシドの2’−一リン酸に結合される。任意には、リンカーは2’−一リン酸ヌクレオシドにラベルを結合する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図1Aは、本発明の一定の態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図１Ｂ】図1Bは、本発明の一定の態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図１Ｃ】図1Cは、本発明の一定の態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図１Ｄ】図1Dは、本発明の一定の態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【００３３】
【図２Ａ】図２Aは、本発明のいくつかの態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図２Ｂ】図２Bは、本発明のいくつかの態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【００３４】
【図３Ａ】図３Aは、本発明の種々の態様に従っての色素ラベルされた四リン酸を図示する。
【図３Ｂ】図３Bは、本発明の種々の態様に従っての色素ラベルされた四リン酸を図示する。
【図３Ｃ】図３Cは、本発明の種々の態様に従っての色素ラベルされた四リン酸を図示する。
【００３５】
【図４Ａ】図４Aは、本発明の一定の態様に従ってのラベルされたヌクレオチド四リン酸を図示する。
【図４Ｂ】図４Bは、本発明の一定の態様に従ってのラベルされたヌクレオチド四リン酸を図示する。
【図５】図５は、本発明の１つの態様に従ってリンカーを通してヌクレオチド四リン酸に結合されるラベルを図示する。
【００３６】
【図６Ａ】図6Aは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｂ】図6Bは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｃ】図6Cは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｄ】図6Dは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【００３７】
【図６Ｅ】図6Eは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｆ】図6Fは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｇ】図6Gは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｈ】図6Hは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【００３８】
【図６Ｉ】図6Iは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｊ】図6Jは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｋ】図6Kは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【図６Ｌ】図6Lは、本発明の一定の態様に従って蛍光色素を結合した種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【００３９】
【図７】図７は、本発明の１つの態様に従ってのリンカーを図示する。
【図８】図８は、本発明の１つの態様に従って、5’−三リン酸−3’−一リン酸ヌクレオチド及び5’−三リン酸−2’−一リン酸ヌクレオチドの混合物を生成する合成反応を図示する。
【００４０】
【図９】図９は、本発明の１つの態様に従ってのウリジン四リン酸についての固相合成路における一定の段階を図示する。
【図１０】図10は、本発明の１つの態様に従ってのTAMRA−ウリジン四リン酸についての位置特異的合成路における一定の段階を図示する。
【図１１】図11は、本発明の組込まれたシチジン四リン酸ヌクレオチドと共に、鋳型核酸及びプライマー核酸に結合されるポリメラーゼを図示する。
【００４１】
【図１２】図12は、本発明の１つの態様に従ってのウリジン四リン酸についての位置特異的合成路を図示する。
【図１３】図13は、本発明の１つの態様に従って、5’−三リン酸−3’−一リン酸アデニンヌクレオチド及び5’−三リン酸−2’−一リン酸アデニンヌクレオチドの混合物を生成する合成反応を図示する。
【００４２】
【図１４Ａ】図14Aは、本発明のアデノシン四リン酸ヌクレオチドの検出を示すHPLCトレースを示す。
【図１４Ｂ】図14Bは、本発明のアデノシン四リン酸ヌクレオチドの検出を示すHPLCトレースを示す。
【図１４Ｃ】図14Cは、本発明のアデノシン四リン酸ヌクレオチドの検出を示すHPLCトレースを示す。
【００４３】
【図１５】図15は、本発明の１つの態様に従ってのTAMRAラベルされたウリジン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。
【図１６】図16は、図15に示される構造５及び６に従ってのBOC−保護されたプロパルギルウリジン四リン酸の検出を示すHPLCクロマトグラムである。
【図１７】図17は、本発明の１つの態様に従ってのROXラベルされたシチジン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。
【００４４】
【図１８】図18は、本発明の１つの態様に従ってのR6Gラベルされたアデニン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。
【図１９】図19は、本発明の１つの態様に従ってのR110ラベルされたグアニン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。
【００４５】
【図２０】図20のAは、種々の延長されたプライマーの核酸の検出を示す電気泳動図である。図20のBは、種々の延長されたプライマーの核酸の検出を示す電気泳動図である。図20のCは、種々の延長されたプライマーの核酸の検出を示す電気泳動図である。図20のDは、種々の延長されたプライマーの核酸の検出を示す電気泳動図である。
【００４６】
【図２１】図21は、2'−ターミネーターヌクレオチドを用いてのM13mp18 DNA鋳型の配列分析からのデータを示すスペクトルプロフィールである。
【図２２】図22において、A及びBは、ラベルされていないプライマー及び蛍光色素−ラベルされた2’−ターミネーターヌクレオチドを用いてのM13mp18 DNA鋳型の配列分析からのデータを示すスペクトルプロフィールである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な論議：
1. 定義：
本発明を詳細に記載する前、本発明が、もちろん変化することができる、特定の組成物又は方法に制限されないことは、理解されるべきである。本明細書に使用される用語は、特定の態様のみの記載のためであり、そして制限を意図するものではないことがまた、理解されるべきである。さらに、特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技法及び科学用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明の記載においては、次の用語法及びその分法的変形が、下記に示される定義に従って使用されるであろう。
【００４８】
用語“核酸”とは、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、2’−ターミネーターヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、等）、及び線状又は枝分かれされた態様で、一緒に共有結合されるそのようなヌクレオチドを含んで成るポリマー（例えば、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、DNA−RNAハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、cDNA、アプタマー、アンチセンス核酸（PNA）、PNA−DNA接合体、PNA−RNA接合体、等）を意味する。
【００４９】
核酸は典型的には、一本鎖又は二本鎖であり、そして一般的にホスホジエステル結合を含むが、但し本明細書に概略されるように、いくつかの場合、他の主鎖、例えば次のものを包含する（但し、それらだけには限定されない）核酸類似体も包含される：ホスホラミド（Beaucage など. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925) 及びそこにおける引例; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800; Sprinzl など. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger など. (1986)Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai など. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger など. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; 及び Pauwels など. (1986) ChemicaScripta 26: 1419）、ホスホロチオエート（Mag など. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 1437; 及びアメリカ特許第5,644, 048号）、
【００５０】
ホスホロジチオエート（Briu など. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 2321）、O−メチルホスホロアミジット連鎖（Eckstein,Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、及びペプチド核酸主鎖及び連鎖（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Meier など. (1992) Chem. Int. Ed.Engl. 31: 1008 ; Nielsen (1993) Nature 365: 566; Carlsson など. (1996) Nature 380: 207を参照のこと）（それらの文献は、引用により本明細書に組み込まれる）。
【００５１】
他の核酸類似体は、正に荷電された主鎖（Denpcy など. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性主鎖（アメリカ特許第5,386, 023号, 第5,637,684号, 第5,602, 240号,第5, 216,141号 及び第4,469, 863号; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger など. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger など. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13: 1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook; Mesmaeker など. (1994)Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffsなど. (1994) J.Biomolecular NMR 34: 17; Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)）、及び非−リボース主鎖を有するそれら、例えば引用により本明細書に組込まれる、アメリカ特許第5,235, 033号 及び第 5,034, 506号,及び Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cookに記載されるそれらを包含する。
【００５２】
１又は複数の炭素環式糖を含む核酸はまた、核酸の定義内に包含される（Jenkins など. (1995) Chem. Soc. Rev.ppl69-176を参照のこと）。いくつかの核酸類似体はまた、引用におより本明細書に組み込まれる、Rawls, C＆E News Jun.2, 1997, page35に記載される。リボース−リン酸主鎖のそれらの修飾は、追加の成分、例えばラベルの付加を促進するために、又は生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を変更するために行われ得る。
【００５３】
核酸に典型的に見出されるそれらの天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）の他に、核酸類似体はまた、天然に存在しない複素環式塩基を有するそれらも包含し、それらの多くは、本明細書に記載されているか、又は他方では、言及されている。特に、多くの天然に存在しない塩基はさらに、例えばSeela など. (1991) Helv. Chim. Acta 74: 1790, Grein など. (1994)Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 971- 976, 及び Seela など. (1999) Helv. Chim. Acta 82: 1640（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。さらに例示するために、溶融温度（Tm）調節体として作用するヌクレオチドに使用される一定の塩基が任意には包含される。
【００５４】
例えば、それらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ[３，４−d]ピリミジン、プロピニル−dN（例えば、プロピニル−dU、プロピニル−dC, 等）、及び同様のものを包含する。例えば、引用により本明細書に組み込まれる、1999年11月23日に発行された、”SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2'- DEOXYGUANOSINENUCLEOTIDES,”の表題のアメリカ特許第5,990,303号を参照のこと。
【００５５】
他の代表的な複素環式塩基は、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピニルシトシン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル及び同様のものを包含する。
【００５６】
“ヌクレオシド”とは、糖成分（例えば、リボース糖、等）、糖成分の誘導体、又は糖成分の機能的同等物（例えば、類似体、例えば炭素環式環）に共有結合される塩基又は塩基性基（例えば、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、及び/又は同様のものを含んで成る）を含んで成る核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖成分を含む場合、塩基は典型的には、その糖成分の1’−位置に結合される。上記に記載されるように、塩基は、天然に存在するか（例えば、プリン塩基、例えばアデニン（A）又はグアニン（G）、ピリミジン塩基、例えばチミン（T）、シトシン（C）又はウラシル（U））、又は天然に存在しない（例えば、７−デアザプリン塩基、ピラゾロ[３，４−d]ピリミジン塩基、プロピニル−dN塩基、等）。典型的なヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド、炭素環式ヌクレオシド、等を包含する。
【００５７】
“ヌクレオチド”とは、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。例えば、ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖成分の5’位置に共有結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を含むことができる。
“プリンヌクレオチド”とは、プリン塩基を含んで成るヌクレオチドを意味し、そして“ピリミジンヌクレオチド”とは、ピリミジン塩基を含んで成るヌクレオチドを意味する。
【００５８】
“オリゴヌクレオチド”は、少なくとも２個のヌクレオチド、典型的には３個よりも多くのヌクレオチド及びより典型的には10個よりも多くのヌクレオチドを含む核酸を意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは一般的に、種々の要因、例えばオリゴヌクレオチドの究極的機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは任意には、いずれかの適切な方法、例えば適切な配列のクローニング及び制限消化、又は１つの方法、例えば当業界において知られている他の方法の中で、Narang など. (1979) Meth.Enzvmol. 68 : 90-99のホスホトリエステル方法；Brown など. (1979) Meth.Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル方法；Beaucage など. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859- 1862のジエチルホスホラミジット方法；Matteucci など. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191のトリエステル方法；自動化された合成方法；又はアメリカ特許第4,458,066号の固体支持方法による直接的な化学合成により調製される（前記文献は、引用により本明細書に組込まれる。
【００５９】
“プライマー核酸”とは典型的には、鋳型にハイブリダイズし、そして適切な反応条件下で、例えばヌクレオチド組込み生触媒、例えば熱安定性ポリメラーゼを用いて、鎖延長又は拡張を可能にする核酸である。プライマー核酸は典型的には、天然又は合成オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖オリゴデオキシリポヌクレオチド、等）である、他のプライマー核酸の長さが任意には使用されるが、それらは典型的には、15〜35個のヌクレオチドの範囲である。短いプライマー核酸は一般的に鋳型核酸と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度を使用する。鋳型核酸の副配列に対して少なくとも部分的に相補的であるプライマー核酸は、典型的には、存在する延長のための鋳型核酸とハイブリダイズするのに十分である。
【００６０】
プライマー核酸は所望により、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的技法により検出されるラベルを組込むことによりラベルされ得る。例示によれば、有用なラベルは、放射性同位体、蛍光色素、電子濃試薬、酵素（ELISAにおいて通常使用されるような）、ビオチン又はハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるタンパク質を包含する。それらの及び他のラベルの多くは、さらに本明細書に記載されており、そして/又は他方では、当業界において知られている。さらに、プライマー核酸は、単に、鋳型依存性態様でヌクレオチド組込み生触媒のための基質を提供することができる。
【００６１】
“延長されたプライマー核酸”とは、１又は複数の追加のヌクレオチドが付加されているか、又は他方では、組込まれている（例えば、共有結合された）プライマー核酸を意味する。
【００６２】
“鋳型核酸”とは、プライマー核酸がハイブリダイズされ、そして延長され得る核酸を意味する。従って、鋳型核酸は、プライマー核酸に対して少なくとも部分的に相補的である副配列を包含する。鋳型核酸は、実質的にいずれかの源に由来することができる。例示すると、鋳型核酸は任意には、例えば培養された微生物、培養されていない微生物、複雑な生物学的混合物、組織、血清、プールされた血清又は組織、多くの種の集合体、古代の、化石化された又は他の非生存性生物学的残骸、環境単離物、土壌、地下水、廃棄施設、深海環境物、又は同様のものから誘導されるか、又は単離される。
【００６３】
さらに、鋳型核酸は任意には、例えば個々のcDNA分子、クローン化されたcDNA組、cDNAライブラリー、抽出されたRNA、天然のRNA、インビトロ転写されたRNA、特徴づけられているか又は特徴づけられていないゲノムDNA、クローン化されたゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、酵素的にフラグメント化されたDNA又はRNA、化学的にフラグメント化されたDNA又はRNA、物理的にフラグメント化されたDNA又はRNA、又は同様のものを包含するか、又はそれらから誘導される。鋳型核酸はまた、当業界において知られている技法を用いて、化学的に合成され得る。さらに、鋳型核酸は任意には、遺伝子の少なくとも一部に対応するか、又はそれらに対して相補的である。本明細書において使用される場合、“遺伝子”とは、生物学的機能に関連するDNAのいずれかのセグメントを意味する。従って、遺伝子は、コード配列、及び任意には、それらの発現のために必要とされる調節配列を包含する。遺伝子はまた、任意には、例えば他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現DNAセグメントを包含する。
【００６４】
核酸は、追加のヌクレオチド（又は他の類似分子）が核酸中に組込まれる場合、“延長されるか”又は“拡張される”。例えば、核酸は任意には、ヌクレオチド組込み生触媒、例えば典型的には、核酸の3’末端でヌクレオチドを付加するポリメラーゼにより延長される。
【００６５】
“延長できるヌクレオチド”とは、少なくとも１つの他のヌクレオチドが、例えばその延長できるヌクレオチドがヌクレオチドポリマー中に組込まれると、ヌクレオチド組込み生触媒により触媒される反応において、付加されるか又は共有結合され得るヌクレオチドを意味する。延長できるヌクレオチドの例は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。延長できるヌクレオチドは典型的には、その延長できるヌクレオチドの糖成分の3’−位置でもう１つのヌクレオチドを付加することにより延長される。
【００６６】
“非延長性”ヌクレオチドとは、核酸中への組込みに基づいて、例えば少なくとも１つのヌクレオチド組込みを生触媒により、核酸のさらなる延長を妨げるヌクレオチドを意味する。
【００６７】
“2’−ターミネーターヌクレオチド”とは、ヌクレオチドの糖成分の2’−位置でブロッキング基（BG）を含んで成るヌクレオチド類似体を意味する。“ブロッキング基”とは、典型的には、核酸の延長を妨げる化学基又は成分を意味する（すなわち、2’−ターミネーターヌクレオチドは典型的には、１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒により延長できない）。
【００６８】
すなわち、2’−ターミネーターヌクレオチドが核酸中に組込まれると（例えば、核酸の3’−末端で）、ブロッキング基は、例えばG46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05R ポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus） ポリメラーゼ、 TMA-25 ポリメラーゼ、TMA-30 ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、サーマス種（Thermus species） SPS-17 ポリメラーゼ、 E615G Taq ポリメラーゼ、サーマスZ05R ポリメラーゼ、 T7DNA ポリメラーゼ、Kornberg DNA ポリメラーゼ I、Klenow DNA ポリメラーゼ、 Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカス DNA ポリメラーゼ、 αDNA ポリメラーゼ、 逆転写酵素、 AMV 逆転写酵素、 M-MuLV 逆転写酵素、 DNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ、E.コリ（E. coli） RNA ポリメラーゼ、 SP6 RNA ポリメラーゼ、 T3 RNA ポリメラーゼ、 T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ II、 末端 トランスフェラーゼ、 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、 リボヌクレオチド 組込みDNA ポリメラーゼ、及び/又は同様のものから選択された、少なくとも１つのヌクレオチド組込みを生触媒により核酸のさらなる延長を妨げる。
【００６９】
典型的なブロッキング基は、リン酸基である。他の代表的なブロッキング基はまた、本明細書に記載される。典型的な2’−ターミネーターヌクレオチドは、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシド及び2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−二リン酸ヌクレオシドを包含する。他の2’−ターミネーターヌクレオチドはまた、本明細書に記載されている。
【００７０】
“四リン酸ヌクレオチド”とは、４個のリン酸基を含むヌクレオチドを意味する。典型的な四リン酸ヌクレオチドは、2’−一リン酸−5’−三リン酸ヌクレオシド及び3’−一リン酸−5’−三リン酸ヌクレオシドを包含する。
【００７１】
“負に荷電されたブロッキング基”とは、少なくとも１つの負の電荷を含んで成るブロッキング基を意味し、この負の電荷は、入って来るヌクレオチドの静電反発により、それが結合されるヌクレオチドの延長できない性質に少なくとも寄与する。例示すると、本発明のヌクレオチドの2’−位置での負に荷電されたブロッキング基は任意には、典型的には、イオン化に基づいて少なくとも１つの負の電荷を含んで成る、本明細書に言及されるリン酸、カルボキシ又は他の基を包含する。確かな態様においては、複数の要因が、例えばブロッキング基の電荷及びサイズを包含する、本発明のヌクレオチドの延長できない性質に寄与することができる。
【００７２】
“大きなブロッキング基”とは、入って来るヌクレオチドの組込みを立体的に阻止するのに十分なサイズを有するブロッキング基を意味し、それによれば、ブロッキング基が結合されるヌクレオチドの延長できない性質に少なくとも寄与する。上記に示されるように、本発明のいくつかの態様においては、複数の要因が、例えばブロッキング基の電荷及びサイズを包含する、2’−ターミネーターヌクレオチドの延長できない性質に寄与することができる。
【００７３】
“成分”又は“基”とは、何か、例えば分子が分割される部分の１つ（例えば、官能基、置換基又は同様のもの）を意味する。例えば、ヌクレオチドは典型的には、塩基性基（例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、又は類似する塩基性基）、糖成分（例えば、糖環又はその類似体を含んで成る成分）、及び１又は複数のリン酸基を含んで成る。
【００７４】
“質量修飾”基は、前記基を含んで成る分子の、典型的にはドルトンとしての分子量に関して測定される質量を修飾する。例えば、サイズ又は配列における単一の塩基差異により少なくとも２個の核酸間の識別を高める質量修飾基は、例えば分子量決定を用いて配列決定を促進するために使用され得る。
【００７５】
“複素環式環”とは、飽和、不飽和又は芳香族のいずれかであり、そして窒素、酸素及び硫黄から独立して選択された１又は複数のヘテロ原子を含んで成る、単環式又は二環式環を意味する。複素環式環は、ヘテロ原子又は炭素原子を通して本発明のヌクレオチドの糖成分又はその類似体に結合され得る。典型的な複素環式環は、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロイミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、アザインドリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル及び同様のものを包含する。
【００７６】
“単素環式環”とは、飽和又は不飽和（しかし、芳香族ではない）炭素環式環、例えばシクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロヘキセン及び同様のものを意味する。
【００７７】
“アルキル基”とは、線状、枝分かれ鎖又は環状飽和炭化水素成分を意味し、そしてすべての位置異性体、例えば次のものを包含する：メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル及び１−エチル−２−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル及び同様のもの。アルキル基は典型的には、約１〜20個の炭素原子を含んで成り、そしてより典型的には、約２〜15個の炭素原子を含んで成る。アルキル基は、置換され得るか、又は非置換性であり得る。
【００７８】
“アルケニル基”とは、１又は複数の炭素−炭素二重結合を有する、線状、枝分れ鎖又は環状不飽和炭化水素成分を意味する。典型的なアルケニル基は次のものを包含する：エテニル、２−プロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１−エチル−２−プロペニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−３−ブテニル、１，２−ジメチル−２−ブテニル、１，２−ジメチル−３−ブテニル、１，３−ジメチル−２−ブテニル、１，３−ジメチル−３−ブテニル、２，２−ジメチル−３−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−３−ブテニル、３，３−ジメチル−２−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、２−エチル−２−ブテニル、２−エチル−３−ブテニル、１，１，２−トリメチル−２−プロペニル、１−エチル−１−メチル−２−プロペニル、１−エチル−２−メチル−２−プロペニル及び同様のもの。アルケニル基は典型的には、約１〜20個の炭素原子及びより典型的には約２〜15個の炭素原子を含んで成る。アルケニル基は、置換されるか、又は非置換性であり得る。
【００７９】
“アルキニル基”とは、１又は複数の炭素−炭素三重結合を有する、線状、枝分れ鎖又は環状の不飽和炭化水素成分を意味する。代表的なアルキニル基は次のものを包含する：２−プロピニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−ペンチニル、１−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、２−メチル−４−ペンチニル、３−メチル−４−ペンチニル、４−メチル−２−ペンチニル、１，１−ジメチル−２−ブチニル、１，１−ジメチル−３−ブチニル、１，２−ジメチル−３−ブチニル、２，２−ジメチル−３−ブチニル、３，３−ジメチル−１−ブチニル、１−エチル−２−ブチニル、１−エチル−３−ブチニル、２−エチル−３−ブチニル、１−エチル−１−メチル−２−プロピニル及び同様のもの。アルキニル基は典型的には、約１〜20個の炭素原子及び典型的には約２〜15個の炭素原子を含んで成る。アルキニル基は、置換され得るか、又は非置換性であり得る。
【００８０】
“アルコキシ基”とは、酸素原子を含んで成るアルキニル基を意味し、そして例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ及び同様のものを包含する。
“ハロ基”とは、ハロゲン原子、例えばF, Cl, Br又はIを含んで成る基を意味する。
【００８１】
“アリール基”とは、芳香族化合物に由来する原子又は成分の置換基を意味する。典型的なアリール基は、例えばフェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基又は同様のものを包含する。アリール基は任意には、複数の芳香族環（例えば、ジフェニル基、等）を包含する。さらに、アリール基は、置換され得るか、又は非置換性であり得る。
“アリールオキシ基”とは、酵素原子を含んで成るアリール基を意味し、そしてフェノキシ、クロロフェノキシ、メチルフェノキシ、メトキシフェノキシ、ブチルフェノキシ、ペンチルフェノキシ、ベンジルオキシ及び同様のものを包含する。
【００８２】
“アルキル−アリール基”とは、アルキル及びアリール成分を含んで成る基を意味する。
“エーテル基”とは、単一の酸素原子に結合される２個の炭素原子を含んで成る、線状、枝分れ鎖又は環状成分を意味する。典型的にはエーテル基は、例えばメトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、エトキシエチル及び同様のものを包含する。
“チオエーテル基”とは、単一の硫黄原子に結合される２個の炭素原子を含んで成る、線状、枝分れ鎖又は環状成分を意味し、そして例えばメチルチオメチル、メチルチオエチル、メチルチオプロピル、及び同様のものを包含する。
【００８３】
“アルキルアミン基”とは、少なくとも１つのアルキル基を含んで成るアミノ基を意味する。
“アルケニルアミン基”とは、少なくとも１つのアルケニル基を含んで成るアミノ基を意味する。
“アルキニルアミン基”とは、少なくとも１つのアルキニル基を含んで成るアミノ基を意味する。
“エステル基”とは、一般式RCOOR’（式中、R及びR’は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、又はそれらの組合せから独立して選択される）を包含する種類の有機化合物を意味する。
【００８４】
“ポリアミノ酸”とは、複数のアミノ残基を含んで成る化合物又は基を意味する。典型的なポリアミノ酸は、ヘプチド、ポリペプチド、タンパク質及び同様のものを包含する。
“ヘテロオリゴ”とは、複数の異なったヌクレオチド残基を含んで成るオリゴヌクレオチドを意味する。
“ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基”とは、少なくとも１つのヘテロオリゴ成分及び少なくともポリアミノ酸成分の両者を含んで成るハイブリッド基を意味する。
“アルデヒド基”とは、式CHOを包含する有機基を意味する。
“アルコール基”とは、少なくとも１つのヒドロキシ基を包含する有機基を意味する。
【００８５】
“シリル基”とは、一般式SiRR’R’’（式中、R, R’及びR’’は独立して、H、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はそのような基の組合せである）を包含する種類の化合物を意味する。
反応又は一連の反応は、それらが、他の可能性ある異性体生成物よりも卓越した（すなわち、大部分であるが、しかし100％以下）１つの異性体生成物を生成する場合、“選択的”として記載される。例示によれば、3’−一リン酸−2’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシドよりも卓越して2’−一リン酸−3’−ヒドロキシル−5’−三リン酸ヌクレオシドを生成する反応又は一連の反応は選択的である。用語“特異的”とは、１つの異性体生成物が反応又は一連の反応において独占的に形成される場合に使用される。
【００８６】
核酸の“配列”とは、核酸におけるヌクレオチドの順序及び識別を意味する。配列は、典型的には、5’→3’方向で読み取られる。
“十分な長さの配列”とは、参照配列、又はその参照配列に対して少なくとも部分的に相補的である核酸配列と、少なくとも実質的に同じ数のヌクレオチドを含んで成る核酸配列を意味する。本発明の確かな態様においては、延長されたプライマー核酸は、鋳型核酸の十分な長さの配列、又は他の参照配列に対して相補的である。
“副配列”又は“フラグメント”とは、完全な核酸配列のいずれかの部分を意味する。
【００８７】
“遺伝子型”とは、細胞又は対象、又は細胞又は対象グループの遺伝子構成のすべて又は一部を意味する。例えば、遺伝子型は、所定の遺伝子座で存在するか又はゲノムに分布される、特定の突然変異及び/又は対立遺伝子（例えば、多形現象（SNP）又は同様のもの）を包含する。
用途“結合された”とは、相互作用、例えば共有結合、イオン結合、化学吸収、物理吸収、及びそれらの組合せを意味するが、但しそれらだけには限定されない。
【００８８】
“リンカー”とは、固体支持体、もう１つの化合物又は基、又は同様のものに化合物又は置換基を共有又は非共有（例えば、イオン、等）結合する化学成分を意味する。例えば、リンカーは任意には、ラベル（例えば、蛍光色素、放射性同位体、等）を、2’−ターミネーターヌクレオチド又は同様のものに結合せしめる。リンカーは典型的には、二官能価の化学成分であり、そして確かな態様においては、それらは、例えば固体支持体、もう１つの化合物、等から材料又は化合物を放すために、例えば熱、酵素、化学剤、電磁線、等により分離され得る分解性結合対を含んで成る。リンカーの注意した選択は、化合物及びアッセイ方法の安定性と適合できる適切な条件下での分解の実施を可能にする。一般的に、リンカーは、化学的種を一緒に連結するために、又はそのような種間の最小距離又は他の空間的関係を保存するために以外、特異的な生物学的活性を有さない。
【００８９】
しかしながら、リンカーの構成成分は、結合される化学的種のいくつかの性質、例えば三次元コンホメーション、実効電荷、疎水性、等に影響を及ぼすよう選択され得る。リンカー分子のさらなる記載は、例えばLyttle など. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (14): 2793, Shchepino など.(2001) Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids 20: 369, Doronina など (2001) Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids 20: 1007, Trawick など. (2001)Bioconjugate Chem. 12: 900, Olejnik などl. (1998) Methods inEnzvmolosv 291: 135,Pljevaljcic など. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125 (12): 3486, Ward, など. , アメリカ特許第4,711, 955号, Stavrianopoulos, アメリカ特許第4,707, 352号、及び Stavrianopoulos, アメリカ特許第4,707, 440号（引用により本明細書に組み込まれる）に提供される。
【００９０】
“ヌクレオチド組込み生触媒”とは、核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する触媒を意味する。ヌクレオチド組込み生触媒は典型的には酵素である。“酵素”は、他の化合物又は“基質”を包含する、化学反応の活性化エネルギーを低めるよう作用する、タンパク質に基づく触媒である。“ヌクレオチド組込み酵素”とは、核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する酵素である。典型的なヌクレオチド組込み酵素は、例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ及び同様のものを包含する。他の生触媒は、DNAに基づくか（“DNAzymes”）又はRNAに基づく（“リボザイム”）。
【００９１】
“熱安定性酵素”とは、選択された時間、高温にゆだねられる場合、熱に対して安定性であり（すなわち、分解又は変性に対して耐性である）、そして十分な触媒活性を保存する酵素を意味する。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間、高温にゆだねられる場合、続くプライマー延長反応をもたらすために十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業界において良く知られており、そして引用により本明細書に組込まれる、アメリカ特許第4,683,202号及び第4,683,195号に例示される。
【００９２】
本明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは典型的には、温度循環反応、例えばポリメラーゼ鎖反応（“PCR”）への使用のために適切である。熱安定性ヌクレオチド組込み酵素に関しては、酵素活性は、鋳型核酸に対して相補的であるプライマー延長生成物を形成するために適切な態様でのヌクレオチドの組合せの触媒作用を言及する。本明細書において言及される他の熱安定性酵素は、高温にゆだねられる場合、例えば加ピロリン酸分解を最少にするのに十分な活性を同様に保持する熱安定性ピロホスファターゼを包含する。酵素に類似して、DNAzymes及びリボザイムもまた、熱安定性である。
【００９３】
“修飾された”酵素は、モノマー配列の少なくとも１つのモノマーが、２種の配列が最大の識別のために一列整列される場合、参照におけるモノマーとは異なる、モノマー配列を含んで成る酵素、例えば生来の又は野生型の酵素又はもう１つの修飾された形の酵素を意味する。典型的な修飾は、モノマー挿入、欠失及び置換を包含する。本発明の修飾された酵素（すなわち、タンパク質又は核酸に基づく触媒）は、種々の多様性生成方法により創造されており、又は任意には創造される。実質的にいずれかの方法が修飾された酵素を生成するために使用され得るが、確かな典型的な技法は、１又は複数の親酵素をコードする複数の核酸を組換えすること（例えば、反復性組換え、合成組換え又は同様のものを通して）、又は反復性全体的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、特定部位の突然変異誘発又は同様のものを用いて、酵素をコードする１又は複数の核酸を突然変異誘発することを包含する。
【００９４】
親酵素をコードする核酸は典型的には、転写及び翻訳の機構を通して、親酵素、例えば生来形の酵素に対応するアミノ酸配列を生成する遺伝子を包含する。修飾された酵素はまた、複数の親に由来する識別できる成分配列（例えば、構造的及び/又は機能的ドメイン、等）を有するキメラを包含する。参照配列に対して化学的修飾（例えば、結合された置換基、変更された置換基、等）を含んで成るそれら酵素もまた、修飾された酵素の定義内に包含される。酵素に類似して、DNAzymes及びリボザイムもまた、類似する修飾を含んで成ることができる。
【００９５】
“ラベル”とは、分子に結合されるか（共有又は非共有）、又は結合され得る成分を意味し、この成分は、分子についての情報（例えば、説明、識別、等）を提供するか、又は提供することができる。典型的なラベルは、蛍光ラベル、弱い蛍光ラベル、非蛍光ラベル、比色ラベル、化学ルミネセンスラベル、生物ルミネセンスラベル、放射性ラベル、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン又は酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、等）を包含する。
【００９６】
II. 2’―ターミネーターヌクレオシド及びヌクレオチド：
本発明は、2’−ターミネーターヌクレオチド及び/又はヌクレオシドの生成方法、及びそれを含んで成る組成物に関する。手短に言及すれば、本発明のヌクレオチド及び/又はヌクレオシドは、典型的には、損なわれていない糖環の3’−位置でヒドロキシル基、及び糖成分の2’−位置でブロッキング基（例えば、負に荷電されたブロッキング基、大きなブロッキング基、及び/又は同様のもの）を包含する。本明細書に記載される一定のヌクレオチド組込み生触媒は、鋳型指図された態様でそれらの2’−ターミネーターヌクレオチドによりプライマー核酸を延長する能力を含んで成る。
【００９７】
プライマー核酸の3’−末端での2’−ターミネーターヌクレオチドの組込みに基づいて、核酸は典型的には、ヌクレオチド組込み生触媒により非延長性にされる。従って、本発明のターミネーターヌクレオチドは、他の用途の中でも、配列決定ラダーの生成及び3’−ラベリングのために使用され得る。さらに、2’−ターミネーターヌクレオチドを含んで成る延長されたプライマー核酸は一般的に、プルーフリーディング酵素活性（例えば、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性、等）に対して耐性である。
【００９８】
結果的に、例えば本発明のターミネーターヌクレオチドを使用する核酸配列決定プロトコールに使用されるヌクレオチド組込み生触媒は、低められたプルーフリーディング活性を欠いているか又は有する触媒を使用するアプローチに関する配列適合を改良するために3'−5’エキソヌクレアーゼ活性又は“プルーフリーディング活性”を包含することができる。本発明のヌクレオチド及びヌクレオシドに関連する、配列決定方法、システム及び他の観点に関する追加の詳細胞は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Galfandなどにより2003年６月30日に出願された、"2'-TERMINATOR NUCLEOTIDE-RELATED METHODS AND SYSTEMS,"と称するアメリカ仮特許出願第60/483,861号に提供される。
【００９９】
本発明のヌクレオシド及びヌクレオチドは、一般的に、下記式：
【化５】
2011224016.tif 000006
【０１００】
[式中、R1は、H, OH, 親水性基、又は疎水性基であり；Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環（環外へテロ原子を有するか、又は有さない）、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；BGは、ブロッキング基であり；ZはO又はCH2であり；そして---- は、単又は二重結合を表わす]を包含する。さらに、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは典型的には、ラベルされる。さらに、本発明のヌクレオチドは一般的に、5’位置で結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を含んで成る。本発明の１つの態様においては、ヌクレオチドは、2’−一リン酸−3’−ヒドロキシ−5’−三リン酸ヌクレオシドを含んで成る。
【０１０１】
図１A−Dは、本発明の確かな態様に従っての2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。特に、図１Aは、アデノシン四リン酸ターミネーターヌクレオチドを図示し、図１Bは、グアノシン四リン酸ターミネーターヌクレオチドを図示し、図１Cは、ウリジン四リン酸ターミネーターヌクレオチドを図示し、そして図１Dは、シチジン四リン酸ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【０１０２】
A. 塩基：
水素結合又は塩基スタッキング機能を通して、もう１つの核酸と塩基対合することができる実質的にいずれかの複素環又はアリール基（すなわち、塩基又はB基として）は任意には、本発明のヌクレオシド及びヌクレオチドの糖成分の１位置で包含される。従って、使用され得るすべての可能な基を記載する試みは行われない。しかしながら、確かな代表的B基が、本発明をさらに例示するために提供される。いくつかの態様において、Bは、下記式：
【０１０３】
【化６】
2011224016.tif 000007
【０１０４】
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；R2は、H, OH又はNR4R5であり；R3は、H, OH又はNR6R7であり；R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そしてR6及びR7は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]を含んで成る。他の態様においては、Bは、下記式：
【０１０５】
【化７】
2011224016.tif 000008
【０１０６】
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；R2は、O又はSであり；R3は、H, OH又はNR4R5であり；そしてR4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]を含んで成る。いくつかの態様においては、Bは、下記式：
【０１０７】
【化８】
2011224016.tif 000009
【０１０８】
[式中、R2は、H, OH又はNR4R5であり；R3は、H, OH又はNR6R7であり；R4及びR5は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そしてR6及びR7は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択される]を含んで成る。いくつかの態様においては、Bは、下記式：
【０１０９】
【化９】
2011224016.tif 000010
【０１１０】
[式中、XはCH又はNであり；R2及びR3は、H, OH及びNHR4から独立して選択され；R4は、H、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せであり；そしてR5は、OH, NH2, SH, ハロ基、エーテル基、チオエーテル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルアミン基、アルケニルアミン基、アルキニルアミン基、又はそれらの組合せである]を含んで成る。他の態様においては、Bは、下記式：
【０１１１】
【化１０】
2011224016.tif 000011
【０１１２】
[式中、Xは、CH又はNであり；R2は、O又はSであり；R3は、H, OH又はNHR4であり；R4は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せであり；そしてR5は、OH, NH2, SH, ハロ基、エーテル基、チオエーテル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルアミン基、アルケニルアミン基、アルキニルアミン基、又はそれらの組合せである]を含んで成る。確かな態様においては、Bは、下記式：
【０１１３】
【化１１】
2011224016.tif 000012
【０１１４】
[式中、X1及びX2は、CH及びNから独立して選択され；R2は、H, アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基及びそれらの組合せから独立して選択され；そしてR3は、O又はSである] を含んで成る。他の態様においては、Bは、下記式：
【０１１５】
【化１２】
2011224016.tif 000013
【０１１６】
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択され；そしてR4及びR5は、H, NH2, SH, OH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される] を含んで成る。いくつかの態様においては、Bは、下記式：
【０１１７】
【化１３】
2011224016.tif 000014
【０１１８】
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択され；そしてR4は、H, NH2, SH, OH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される] を含んで成る。他の態様においては、Bは、下記式：
【０１１９】
【化１４】
2011224016.tif 000015
【０１２０】
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択される] を含んで成る。いくつかの態様においては、Bは、下記式：
【０１２１】
【化１５】
2011224016.tif 000016
【０１２２】
[式中、R2及びR3は、O及びSから独立して選択される] を含んで成る。他の態様においては、Bは、下記式：
【０１２３】
【化１６】
2011224016.tif 000017
【０１２４】
[式中、R2は、O又はSであり；R3及びR4は、H,NH2、SH、OH、COOH、COOCH3、COOCH2CH3、CHO、NO2、CN、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ベンジル基、アリール基、アリールオキシ基、アルコキシ基、ハロ基及びそれらの組合せから独立して選択される；そしてR5は、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケノキシ基、アルキニル基、アルキノキシ基、アリール基、アリールオキシ基、ベンジル基、ベンジルオキシ基、又はそれらの組合せである]
を含んで成る。
【０１２５】
B. ブロッキング基：
糖成分の2’位置で使用されるブロッキング基（BC）はまた、種々の態様を包含する。いくつかの態様においては、例えばBCは、負に荷電された基及び/又は大きな基である。更なる例示によれば、BGは任意には、例えばCN, NO2, N3, シリル基、ハロ基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、酸性基、エステル基、アミノ基及びそれらの組合せから選択される。より特定には、BGは任意には、下記式：
【０１２６】
【化１７】
2011224016.tif 000018
【０１２７】
[式中、Xは、O、S、NR3、CR3R4、又はSiR3R4であり；Yは、CR5R6R7、SiR5R6R7、OR5、SR5、又はNHR5であり；R2は、H、OH、NHR8、SR8、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、又はそれらの組合せであり；そしてR3, R4, R5, R6, R7及びR8は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される]を含んで成る。図２Aは、この式を有するブロッキング基を含んで成る１つのヌクレオチドを図示する。さらなる例示によれば、BGは任意には、下記式：
【０１２８】
【化１８】
2011224016.tif 000019
【０１２９】
[式中、Xは、CR3R4R5、SiR3R4R5、OR3、SR3、又はNHR3であり；R2は、H, OH, NHR6, SR6, アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せであり；そしてR3, R4, R5及びR6は、H、アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基又はそれらの組合せから独立して選択される]を含んで成る。図２Bは、この式を有するブロッキング基を含んで成る１つの2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【０１３０】
C. ラベリング：
本発明の2’−ターミネーター核酸は典型的には、少なくとも１つのラベルを含んで成る。例えば、ラベルは任意には、例えばアミド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、炭素−炭素、又は他のタイプの共有結合を通して、例えば単素環式環、複素環式環、又は2’−ターミネーターヌクレオチドのアリール基に（ピリミジンのC5、シチジンのN4、プリンのN7、アデノシンのN6、プリンのC8、又は当業界において知られているもう１つの結合部位を通して）、結合される。
【０１３１】
さらに、又は他方では、ラベルは、2’−ターミネーターヌクレオチドの糖成分（例えば、リボース糖、等）、又はその類似体（例えば、炭素環式環、等）、及び/又は2’−ターミネーターヌクレオチドのリン酸基に、例えばアミド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、炭素−炭素、又は他の結合である共有結合により結合される。共有結合は典型的には、ラベルの求電子基及び求核基と本発明のヌクレオチドとの間での反応において形成される。
【０１３２】
ある態様においては、ラベル及びヌクレオチドは、お互い直接的に結合される（例えば、単、二重、三重又は芳香族炭素−炭素結合、又は炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、等を通して）。任意には、リンカーはラベルを2’−ターミネーターヌクレオチドに結合せしめる。広範囲の種類のリンカーが、ラベル及びヌクレオチドの結合への使用のために使用されるか、又は適合され得る。本明細書に言及されるようなリンカーは、非制限的な例示である。
【０１３３】
さらなる例示によれば、図３A−Cは、本発明の確かな態様に従っての色素ラベルされた四リン酸を図示する。特に、図３Aは、リンカー基を通して2’−ターミネーターヌクレオチドの塩基に結合されるレポーター色素を図示し、図３Bは、リンカー基を通して2’−ターミネーターヌクレオチドのブロッキング基に結合されるレポーター色素を図示し、そして図３Cは、リンカー基を通して2’−ターミネーターヌクレオチドの糖成分に結合されるレポーター色素を図示し、ここでXは、H, OH, NHR1, SR1, アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルキル−アリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又は同様のものであるか（ここで、R1は、H、 アルキル基、ベンジル基、アリール基、アルキル−アリール基、アルケニル基、アルキニル基又は同様のものである）、又はO, S, N, C又は同様のものを含んで成り、Yは、OR2、SR2, NHR2又は同様のものであり（ここで、R2は、H、 アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキル−アリール基又は同様のものである）、そしてZは、O, S, N, C, Si又は同様のものを含んで成る。
【０１３４】
図４A及びBはまた、本発明のいくつかの態様に従ってのラベルされたヌクレオシド四リン酸を図示する。より特定には、図４A及びBは、ヌクレオシド四リン酸の塩基にリンカーを通して結合されるラベルを図示し、ここでRは、H, OH、アルキル基、アリール基、枝分れアルキル基、枝分れアルキル−アリール基、アルケニル基、及びアルキニル基から成る群から選択される。さらに、図５は、本発明の１つの態様に従ってリンカーを通してヌクレオシド四リン酸に結合されるラベルを図示する。図６A−Lはまた、本発明の確かな態様に従ってヌクレオチドの塩基に結合された蛍光色素を有する種々の2’−ターミネーターヌクレオチドを図示する。
【０１３５】
特に、図６A−Cは、R6G−ラベルされたアテノシン四リン酸を図示し、図６D−Fは、R110−ラベルされたグアノシン四リン酸を図示し、図６G−Iは、TAMRA−ラベルされたウリジン四リン酸を図示し、そして図６J−Lは、ROX−ラベルされたシチジン四リン酸を図示する。もちろん、ラベルは、本明細書に記載されるように、リンカーを通して、他の位置で2’−ターミネーターヌクレオチドに結合され得る。例示によれば、図７は、リンカーの１つの態様を図示する。いくつかの態様においては、図6C, 6F, 6I及び6Lの2’−ターミネーターヌクレオチドは、図７のリンカーを包含する。
【０１３６】
実質的にいずれかのラベルが任意には、本発明のヌクレオチド及びヌクレオシドをラベルするために使用される。いくつかの態様においては、例えばラベルは、蛍光色素、例えば、ローダミン色素（例えば、R6G、R110、TAMRA、ROX、等）、フルオレセイン色素（例えば、JOE、VIC、TET、HEX、FAM、等）、ハロフルオレセイン色素、シアニン色素（例えば、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、等）、BODIPY（商標）色素（例えば、FL, 530/550, TR, TMR, 等）、ALEXAFLUO（商標）色素 (例えば488、532、546、568、594、555、653、647、660、680、等)、ジクロロローダミン色素、エネルギー移行色素（例えば、BIGDYETM v 1 色素、BIGDYETM v 2 色素、BIGDYETM v 3 色素、等）、Lucifer色素（例えば、Luciferイエロー、等）、CASCADE BLUE（商標）、Oregon Green, 及び同様のものを含んで成る。
【０１３７】
蛍光色素に関する追加の詳細は、例えばHaugland Moleculer Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Ed. (2003)及びそこにおける最初データ（それらは引用により本明細書に組込まれる）に提供される。蛍光色素は一般的に、種々の商業的供給者、例えばMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR), Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ), Applied Biosystems (Foster City, CA), 等  から容易に入手できる。
【０１３８】
他のラベルは、例えばビオチン、弱い蛍光ラベル（Yinなど. (2003) Appl Environ Microbiol. 69(7): 3938, Bavendure など. (2003) Anal. Biochem. 317(1) 及びJankowiakなど. (2003) Chem Res Toxicol. 16(3): 304）、非蛍光ラベル、非色ラベル、化学ルミネセントラベル（Wilson など. (2003) Analyst. 128(5): 480 及びRoda など. (2003) Luminescence 18(2): 72）、Ramanラベル、電子化学ラベル、生物ルミネセントラベル（Kitayama など. (2003) Photochem Photobiol. 77(3): 333, Arakawa など. (2003) Anal. Biochem. 314(2): 206, 及びMaeda (2003) J. Pharm. Biomed. Anal. 30(6): 1725）、及び例えば、2002年11月22日に出願されたアメリカ仮特許出願第60/428,484号に記載されるようなα−メチル−PEGラベリング試薬を包含する（前記引例は、本明細書に組み込まれる）。
【０１３９】
ある態様においては、ラベルは、放射性同位体、例えば3H、 14C、 22Na、 32P、 33P、 35S、 42K、45Ca、 59Fe、 125I 、203Hg、又は同様のものを含んで成る。さらなる例示によれば、ラベルはまた任意には、少なくとも１つの質量修飾基を包含する。例えば、質量修飾基は任意には例えば重水素、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3及びホスホロチオエート基から選択され、ここでXは、O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2 )nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-アルキル), 又は OP(O-アルキル)であり；ｎは１〜20の整数であり；そしてYは、H、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化されたポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化されたシリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基、又はポリエチレングリコール基である。
【０１４０】
核酸ラベリング及び配列分析に関する追加の詳細は、例えばSterky など. (2000) "Sequence analysis of genes and genomes, "J. Biotech. 76 (2000):1, Sensen (Ed.) Biotechnology, Volume5B, Genomics and Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc. (2001), 及び Sensen (Ed. ) Essentials of Genomics and Bioinfonnatics John Wiley & Sons, Inc. (2002)（引用により本明細書に組み込まれる）に提供される。
【０１４１】
多くの種類のリンカーが、核酸にラベルを結合するために入手でき、そして当業者に明らかであろう。リンカーは一般的に、核酸中への組込みのために立体的及び電子的に適切である構造のものである。リンカーは任意には、例えばエーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、ウレア、ウレタン、ヒドラジン又は他の成分を包含する。さらなる例示によれば、リンカーは一般的に、C, N, O, P, Si, S、等から選択された、約１〜約25個の非水素原子を包含し、そして例えばエーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合、及び芳香族又は複素芳香族結合のいずれかの組合せを実質的に含んで成る。いくつかの態様においては、例えばリンカーは、単一の炭素−炭素結合、及びカルボキサミド又はチオエーテル結合の組合せを含んで成る。リンカーのより長い線状セグメントが任意には使用されるが、最長の線状セグメントは典型的には、１又は複数のヘテロ原子を包含する、約３〜約15個の非水素原子を含む。
【０１４２】
リンカー成分の非制限的例は、置換された（例えば、官能化された）又は置換されていない基、例えばイミダゾール/ビオチンリンカー、ポリメチレン基、アリーレン基、アルキルアリーレン基、アリーレンアルキル基、アリールチオ基、アミドアルキル基、アルキニルアルキル基、アルケニルアルキル基、アルキル基、アルコキシル基、チオ基、アミノアルキル基、モルホリン誘導されたホスフェート、ペプチド核酸（例えば、N−（２−アミノエチル）グリシン、等）、及び同様のものを包含する。
【０１４３】
それらの及び他のリンカーは、例えばアメリカ特許第6,339, 392号（Haugland など.） , アメリカ特許第5,047, 519 号（Hobbs, Jr. など. ）, アメリカ特許第4,711, 958号 （Iizuka など.） , アメリカ特許第5,175, 269号（Stavrianopoulos）, アメリカ特許第4,711, 955号 （Ward など.） , アメリカ特許第5,241, 060号 （Engelhardt など.） , アメリカ特許第5,328, 824 号（ Ward など.） , 及び アメリカ特許出願番号2002/0151711号（ Khan など.による）（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。核酸ラベリング及びリンカーに関する追加の詳細は、例えば引用により本明細書に組み込まれるHermanson,Bioconjugate Techniques, Elsevier Science (1996)に提供される。
【０１４４】
ある態様においては、適切なリンカーは、光分解性成分、例えば２−ニトロベンジル成分、α−置換された２−ニトロベンジル成分（たとえば、１−（２−ニトロフェニル）エチル成分）、３，５−ジメトキシベンジル成分、チオヒドロキサム酸、７−ニトロインドリン成分、９−フェニルキサンチル成分、ベンゾイン成分、ヒドロキシフェナシル成分、NHS−ASA成分及び同様のものを含んで成る。光分解性リンカーは、例えばOlejnikなどによるアメリカ特許公開番号2003/0099972号（引用により本明細書に組み込まれる）にさらに記載される。いくつかの態様においては、リンカーは金属、例えば白金原子を包含する。それらはさらに、例えばHouthoffなどによるアメリカ特許第5,714,327号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。種々の長さの多くのリンカーは、種々の供給者、例えばQiagen-Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA), BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA), 及び Molecular BioSciences (Boulder, CO)から市販されている。
【０１４５】
III ．合成：
本発明はまた、本明細書に記載されるヌクレオチド及びヌクレオシドを合成するための種々の方法を提供する。例えば、ラベルされた非延長性ヌクレオチドの１つの生成方法は、少なくとも１つのリン酸基を、ヌクレオシド（例えば、リボヌクレオシド、炭素環式ヌクレオシド、等）の糖成分の5’−位置に結合し、そして少なくとも１つのブロッキング基を、ヌクレオシドの糖成分の2'−位置に結合することを包含する。この方法に使用されるヌクレオシドに任意に包含される典型的なブロッキング基及び塩基が本明細書に記載される。前記方法はまた、ヌクレオシドの糖成分、ブロッキング基、及び/又は塩基に少なくとも１つのラベルを結合することを包含する。適切なラベルは、さらに上記及び下記例に記載される。
【０１４６】
さらに、本発明はまた、下記式：
【化１９】
2011224016.tif 000020
【０１４７】
[式中、Pは、少なくとも１つのリン酸基であり；ｎは、０よりも大きな整数であり；R1は、H, OH, 親水性基、又は疎水性基であり；Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；ZはO又はCH2であり；そして---- は、単又は二重結合を表わす]を含んで成るヌクレオチドと、三ナトリウムトリメタホスフェートとを、2’−一リン酸ヌクレオシドを生成するための効果的な条件下で反応せしめることを包含する、2’−一リン酸ヌクレオチドの生成方法を提供する。確かな態様においては、例えばヌクレオチドは２個のリン酸基を含んで成り、そして他においては、ヌクレオチドは、３個又はそれ以上のリン酸基を含んで成る。
【０１４８】
ヌクレオチドを生成するための効果的条件は一般的に、アルカリ性pHでの溶液において反応を行うことを包含する。例えば、合成は典型的には、約8.0以上のpHで、より典型的には、約10.0以上のpHで、及びさらにより典型的には、約12.0以上（例えば、約12.5, 13.0, 13.5又は14.0）のpHで行われる。種々の塩基性化合物、例えば当業界において良く知られている多くの他のものの中でKOH及びNaOHが、反応混合物のpHを調節するために使用され得る。ヌクレオチドは典型的には、制限試薬である。他の温度条件が任意には、使用されるが、それらの合成反応は一般的に、室温（すなわち、約20〜約30℃、例えば約23℃、24℃、25℃、26℃等）で又はその近くで行われる。さらに、それらの反応は一般的に、少なくとも約４時間、典型的には、少なくとも約６時間、及びさらにより典型的には、少なくとも約16時間、進められる。
【０１４９】
本発明のさらなる例示によれば、図８は、5’−三リン酸−3’−一リン酸ヌクレオシド及び5’−三リン酸−2’−一リン酸ヌクレオシドの混合物（例えば、約50：50のモル比）を生成する合成反応を図示する。プリンヌクレオチドの混合物の合成は、下記例において提供される。特異的又は少なくとも選択的な合成路がまた、本明細書において記載される。ヌクレオチドの混合物が生成される態様においては、前記方法は典型的にはさらに、5’−三リン酸−3’−一リン酸ヌクレオシドから5’−三リン酸−2’−一リン酸ヌクレオシドを分離することを分離することを包含する。種々の分離技法、例えば液体クロマトグラフィーが、5’−三リン酸−2’−一リン酸ヌクレオシドを他の化合物又は不純物から分離するために使用され得る。
【０１５０】
ヌクレオチド合成生成物の精製において有用である種々の分離技法はさらに、例えば引用により本明細書に組み込まれる、Skoog など., Principles of InstrumentalAnalysis, 5* Ed., Harcourt Brace College Publishers(1998) and Currell, Analytical Instrumentation : Performance Characteristics and Quality, John Wiley & Sons, Inc. (2000)に記載される。さらに、多くのポリメラーゼ、例えばG46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、 G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、 及びΔZ05R ポリメラーゼは、プライマー延長反応において、例えば5’−三リン酸−3’−一リン酸−2’−デオキシヌクレオシドのプライマー核酸中への組込みを触媒せず、その結果、それらの方法により生成される混合物は任意には、そのような続く使用の剤、分離されない。
【０１５１】
これは典型的には、生成物分離段階を包含するそれらの工程に関してヌクレオチド合成に関連する生成費用を減じる。しかしながら、それらの混合物における成分の分類はまた、一定の利点を提供することができる。例示によれば、両ヌクレオチド生成物がラベルされる態様においては、使用の前、２種のヌクレオチドの分離は、例えばラベルされた3’−一リン酸−2’−デオキシヌクレオチドをサンプルから排除することにより、検出上でのバックグラウンドシグナルを最少にすることができる。さらに、試薬費用は典型的には、2'−ターミネーターヌクレオチド生成物のみがラベルされる場合、低められる。従って、生成物分離は、そのような選択的ラベリングを提供する。
【０１５２】
上記で言及されたように、本発明はまた、位置特異的又は少なくとも位置選択的合成路を提供し、その結果、生成物の精製は一般的に、完全には排除されない場合、最少にされる。典型的には、糖成分の3’−位置で種々の保護基（例えば、TBDMB, SiR, TOM, BOC, 等）の使用を包含するそれらの合成路が、さらに下記に記載される。
【０１５３】
本発明の合成路は、例えば本発明の１つの態様に従ってのウリジン四リン酸についての固相合成路における一定の段階を図示する図９に例示される。さらに、図10は、本発明の１つの態様に従ってのTAMRA−ウリジン四リン酸についての位置特異的合成路における一定の段階を図示する。本発明のヌクレオチドの生成に関連する追加の合成路及び他の観点は、下記例に提供される。
【０１５４】
本発明の合成プロトコールへの使用のために適合され得る種々の合成技法は一般的に知られており、そして例えば引用により本明細書に組込まれる、March, Advanced Organic Chemistry : Reactions, Mechanisms, and Structure, 4th Ed. , John Wiley & Sons, Inc. (1992), and Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry Part A: Structure and Mechanism, 4th Ed., Plenum Press (2000)に記載されている。本発明のヌクレオチドの合成において有用な化学出発材料及び他の反応成分は、例えばSigma-Aldrich, Inc.（St Louis, NO）を包含する種々の会社から容易に入手できる。
【０１５５】
IV. ヌクレオチド組込み生触媒：
本発明のヌクレオチドの核酸中への組込みに基づいて、その核酸は典型的には、次のものから選択された少なくとも１つのヌクレオチド組込み生触媒により非延長にされる：G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05R ポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、T7DNA ポリメラーゼ、Kornberg DNA ポリメラーゼ I、Klenow DNA ポリメラーゼ、 Taq DNA ポリメラーゼ、ミクロコッカス DNA ポリメラーゼ、 αDNA ポリメラーゼ、AMV 逆転写酵素、 M-MuLV 逆転写酵素、逆転写酵素、DNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ、E.コリ（E. coli） RNA ポリメラーゼ、 SP6 RNA ポリメラーゼ、 T3 RNA ポリメラーゼ、 T4 DNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、 RNA ポリメラーゼ II、 末端 トランスフェラーゼ、 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボヌクレオチド 組込みDNA ポリメラーゼ、及び同様のもの。従って、本発明の2’−ターミネーターヌクレオチドは、核酸配列決定、3’ラベリング及び同様のものに使用され得る。それらのヌクレオチド組込み生触媒の配列は、種々の源、例えばGenBank（商標）及び同様のものから入手できる。本発明の観点のさらなる例示によれば、図11は、本発明の組込まれたシチジン四リン酸ヌクレオチドと共に、鋳型核酸及びプライマー核酸に結合されるポリメラーゼを図示する。
【０１５６】
本発明の2’−ターミネーターヌクレオチドを組み込むことができるが、しかし一般的に延長することができない１つのタイプのポリメラーゼは、酵素のヘリックスOにおけるF→Y突然変異を欠いているか、又は他方では、前記酵素による3’−デオキシヌクレオチドの組込みを増強する突然変異を欠いている。任意には、酵素は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を含んで成り、そして/又は熱安定性酵素である。
【０１５７】
酵素は典型的には、次の生物から誘導される：サーマス・アントラニキアニ（Thermus antranikianii）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）、サーマス・クリアロフィラス（Thermus chliarophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・イグニテラエ（Thermus igniterrae）、サーマス・ラクテウス（Thermus lacteus）、サーマス・オシマイ（Thermus oshimai）、サーマス・ルベル（Thermus ruber）、サーマス・ルベンス（Thermus rubens）、サーマス・スコトダクタス（Thermus scotoductus）、サーマス・シルバヌス（Thermus silvanus）、サーマス種Z05（Thermus species Z05）、サーマス種sps17（Thermus species sps 17）, サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、サーモシホ・アフリカナス（Thermosipho africanus）、アナエロセラム・サーモフィラム（Anaerocellum thermophilum）、バチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、又は同様のもの。
【０１５８】
いくつかの態様においては、酵素は修飾される。典型的な修飾された酵素は、例えばG46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNAポリメラーゼ、ΔZ05Rポリメラーゼ、 E615G Taq DNA ポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。それらの修飾された酵素は一般的に、修飾されていない酵素に関して、2’−ターミネーターヌクレオチドを組込む高められた能力を含んで成る。すなわち、修飾された酵素は典型的には、リボヌクレオチドの組込みを増強する突然変異、リボヌクレオチドの2’−修飾された類似体の組込みを強調する突然変異、及び/又はそれらの１又は複数の突然変異を欠いている酵素に関して、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を低めるか、又は排除する突然変異を含んで成る。
【０１５９】
本発明の方法の実施において有用なヌクレオチド組込みを生触媒に関する追加の詳細は、例えば次の文献に提供される：Gelfandなどに1999年８月17日に発行された、"THERMOSTABLE DNA POLYMERASES HAVING REDUCED DISCRIMINATION AGAINSTRIBO-NTPS,"と称するアメリカ特許第5,939,292号；Gelfandなどに1989年12月26日に発行された、"PURIFIED THERMOSTABLE ENZYME, "と称するアメリカ特許第4,889, 818号； Gelfandなどに1994年12月20日に発行された"DNA ENCODING A THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGAMARITIMA,"と称するアメリカ特許第5,374, 553号； Gelfand などに1995年５月30日に発行された "MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA, "と称するアメリカ特許第5,420, 029号； Abramson などに1995年10月３日に発行された "MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROMTHERMUS SPECIESZ05," と称するアメリカ特許第5,455, 170号； Abramsonなどに1995年11月14日に発行された "5'TO 3' EXONUCLEASE MUTATIONS OF THERMOSTABLE DNA POLYMERASES,"と称するアメリカ特許第5,466, 591号； Gelfandなどに1997年4月8日に発行された "RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FORTHERMUS THERMOPHILUS DNA POLYMERASE, "と称するアメリカ特許第5,618, 711号；
【０１６０】
Gelfandなどに1997年4月29日に発行された "PURIFIED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGAMARITIMA,"と称するアメリカ特許第5,624,833号； Abramson などに 1997年10月7日に発行された"DNA ENCODING THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROMTHERMUS SPECIESZ05,"と称するアメリカ特許第5,674, 738号； Gelfandなどに1998年８月４日に発行された "RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FOR THERMUS THERMOPHILUS DNA POLYMERASE, "と称するアメリカ特許第5,789,224号； Abramson などに1998年8月18日に発行された "5'TO3'EXONUCLEASE MUTATIONS OF THERMOSTABLE DNA POLYMERASES, "と称するアメリカ特許第5,795, 762号； Smith などにより2002年１月31日に公開された"HIGH TEMPERATURE REVERSE TRANSCRIPTION USING MUTANT DNA POLYMERASES, "と称するアメリカ特許第出願公開番号2002/0012970号及び 2003年3月26日に出願されたアメリカ特許第出願公開番号10/401, 403号（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１６１】
2’−ターミネーターヌクレオチドを組込むための増強された効率を有する修飾された酵素の生成は、種々の方法、例えば特定部位の突然変異誘発、化学的修飾、等により達成され得る。より特定には、特定部位の突然変異誘発は一般的に、部位−特異的プライマー指図された突然変異誘発により達成される。この技法は典型的には、所望する突然変異誘発を表わす制限されたミスマッチを除く、突然変異誘発されるべき一本鎖ファージDNAに対して相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ得る。手短に言及すれば、合成オリゴヌクレオチドは、プラスミド又はファージに対して相補的な鎖の合成を指図するためのアプライマーとして使用され、そしてその得られる二本鎖DNAは、ファージ支持の宿主細胞中に形質転換される。得たれる細菌は、所望する突然変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプラークを同定するために、例えばDNA配列分析又はプローブハイブリダイゼーションによりアッセイされ得る。さらなる例示によれば、核酸を修飾するための多くの他のアプローチ、例えば“組換えPCR”方法がまた利用され得る。
【０１６２】
本発明の実施においては（例えば、修飾された酵素の生成、配列決反応の実施、等）、分子生物学及び組換えDNAにおける多くの従来の技法が任意には、使用される。それらの技法は良く知られており、そして例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, VolumesI, II, and III, 1997 (F. M. Ausubeled.) ; Sambrook など., 2001, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc. , San Diego, CA (Berger), DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes I andII, 1985 (D. N. Glover ed. ) ; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed. ) ; Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds. ) ; Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed. ) ; Immobilized Cells and Enzymes, 1986(1RL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning ; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc. ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds. , Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds. , それぞれ)に説明されている。
【０１６３】
V. キット：
本発明の2−ターミネーターヌクレオチドは典型的には、例えば配列決定反応においてプライマー核酸を延長するために、末端ラベリング反応を行うために、及び同様のために、キットに供給される。キットは一般的に、2’−ターミネーターヌクレオチドの他に、本明細書に記載されるようなヌクレオチド組込み生触媒を包含する。例えば、2’−ターミネーターヌクレオチドは任意には、ラベル（例えば、放射性同位体、蛍光色素、質量修飾基、又は同様のもの）を包含する。いくつかの態様においては、キットはさらに、延長できるヌクレオチドを包含し、そして任意には、延長できるヌクレオチドの少なくとも１つは本明細書に記載されるようなラベルを含んで成る。
【０１６４】
任意には、キットはさらに、加ピロリン酸分解を最少にすることへの使用のための少なくとも１つのプロホスファターゼ（例えば、熱安定性ピロホスファターゼ）、持ち越される汚染に対する保護が所望される用途への使用のためのウラシルN−グリコシラーゼ（UNG）（例えば、熱不安定性UNG）を包含する。典型的には、キットはまた、前記ヌクレオチド組込み生触媒及び前記ラベルされた2’−ターミネーターヌクレオチドにより前記プライマー核酸を延長するための１組の説明書を包含する。さらに、キットは典型的にはまた、前記ヌクレオチド組込み生触媒、前記ラベルされた2’−ターミネーターヌクレオチド、及び前記１組の説明書をパッキングするための少なくとも１つの容器を包含する。
【０１６５】
さらなる例示によれば、本発明のキットは任意には、１又は複数の延長可能ヌクレオチド、１又は複数の2’−ターミネーターヌクレオチド、緩衝液、及び１又は複数のヌクレオチド組込み生触媒を含んで成る１又は複数の予備製造された反応混合物を包含する。確かな態様においては、キットはさらに、鋳型核酸及び/又はプライマー核酸（例えば、ラベルされたプライマー核酸）を包含する。任意には、鋳型核酸又はプライマー核酸は、固体支持体に結合される。
次の例は、単なる例示により提供され、そして本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１６６】
例１：ウリジン四リン酸の位置特異的合成：
図12は、本発明の１つの態様に従ってのウリジン四リン酸についての位置特異的合成路を図示する。括弧内の数字はこの例における図12に示される化合物を意味することを注意すること。
【０１６７】
5’−O−DMT−3’−O−TBDMSウリジン2’−O−（ビスシアノエチル）ホスフィット［２］の合成：
化合物［１］（ChemGenesカタログ＃ANP−4845, 0.680g, 0790mモル）を、アセトニトリル（Aldrich, 無水、10ml）に取った。１−H−テトラゾール（Aldrich, 0.211g、3.01mモル）を、一部、前記溶液に添加し、続いて３−ヒドロキシプロピオニトリル（Aldrich, 0.109ml, 1.58mモル）を添加した。溶媒を回転蒸発器上で除去した。残渣をEtOAc(50ml)に取り、そして得られる溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（2×20ml）により洗浄した。有機層を分離し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥した。
【０１６８】
粗生成物を、濾過により得、続いて溶媒を蒸発した。Biotageフラッシュ40Sカトリッジを、生成物混合物を負荷する前、CH2Cl2（200ml）中、２％Et3Nの溶液を溶出することにより再条件付けした。生成物混合物を、最少量のCH2Cl2中、溶液として、Biotageカラムの上部に負荷した。生成物を、2% Et3N/98%CH2C12 (200 mL)、0.5% メタノール/2% Et3N/97.5% CH2C12 (200 mL)、1%メタノール/2％Et3N/97% CH2C12 (200mL)から成る段階づけされたグラジエントにより溶出することにより精製した。精製された生成物を、0.5−1.0%メタノール溶媒強度画分に溶出した。精製された生成物を含む画分を組合し、そして溶媒を回転蒸発器上で除去した。精製された生成物［２］を、白色発泡体（0.510g、78％の収率）として、この態様で得た。
【０１６９】
5’−OH−3’−O−TBDMSウリジン2’−O−（ビスシアノエチル）ホスフェート［４］の合成：
化合物［２］（0.335g、0.403mモル）を、室温でTHF（Aldrich, 無水、6.7ml）に溶解した。ピリジン/THF/水（0.02M、2.2：6.8：１；Glen Research, 24ml, 0.48mモル）中、I2の溶液を、攪拌しながら、前記混合物に添加した。得られる溶液を、周囲温度で20分間、攪拌した。亜硫酸水素ナトリウムの水溶液（3mlの水中、1g）を、I2の色が溶液において消えるまで、滴下した。揮発性溶媒を、回転蒸発器上で除去した。その溶液をEtOAcにより希釈し、100mlの合計体積にした。その溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（50ml）により注意して洗浄した。有機層を分離し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥した。その溶液を濾過し、そして溶媒を回転蒸発器上で除去し、化合物［３］を得た。この粗材料［３］を、攪拌しながら、CH2Cl2（8ml）に取った。
【０１７０】
得られる溶液を-30℃に冷却した。CH2Cl2（4ml）中、トリクロロ酢酸（Fisher, 0.487g, 2.98mモル）の溶液を、ヌクレオシドの冷却された攪拌溶液に添加した。トリチルカチオンの赤/褐色特徴がすぐに出現した。攪拌を-30℃で20分間、続け、この後、トリクロロ酢酸を添加した。メタノール（1.5ml）を添加し、そして得られる溶液を分離用漏斗に移した。その溶液を、CH2Cl2（75ml）により希釈した。得られる溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×30ml）により洗浄した。有機層を分離し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。その溶液を濾過し、そして溶媒を回転蒸発器上で除去した。粗生成物を、Biotage 40Sカートリッジを用いて、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１７１】
生成物を、最少量のCH2Cl2中、溶液としてBiotageカラムの上部に負荷した。生成物を、EtOAc (200 mL)、EtOAc (200mL)中、1 % MeOH 、EtOAc (200 mL)中、2% MeOH、 EtOAc (200 mL)中、3% MeOH、 EtOAc (200mL)中、4% MeOH、 EtOAc (200 mL)中、5% MeOH及び EtOAc（200ml）中、10% MeOHの段階づけされたグラジエントを用いて溶出した。生成物は、10％メタノール溶媒強度を用いて溶出した。精製された生成物を含む画分を組合し、そして溶媒を回転蒸発器上で除去した。粗生成物［４］を、白色発泡体（0.145g、66％の収率）として、この態様で得た。
【０１７２】
化合物［４］のその対応する三リン酸［７］への転換：
5’−OH−3’−O−TBDMSウリジン2’−O−（ビスシアノエチル）ホスフェート（化合物［４］、0.0335g、0.0615mモル）を、ピリジン（３×0.2ml）との同時−蒸発により乾燥した。得られる材料を、ピリジン（Aldrich, 無水、70μl）及びDMF（Aldrich, 無水、180μl）に取った。DMF中、サリチルホスホロクロリジットの溶液（0.5M, 137μl、0.0677mモル）を、前記攪拌溶液に添加した。得られる反応混合物を、周囲温度で20分間、攪拌した。トリ−N−ブチルアミノ（Aldrich、38μl、0.160mモル）を添加し、続いて、DMF中、テトラブチルアンモニウムピロホスフェートの溶液（0.5M, 185μl、0.0925mモル）を添加した。得られる反応混合物を、周囲温度で20分間、攪拌した。ピリジン/水/THF中、I2の溶液（0.02M, Glen Research, 3.6ml、0.072mモル）を添加し、そしてその得られる反応混合物を、周囲温度で、さらに20分間、攪拌した。
【０１７３】
過剰のヨウ素を、ヨウ素の特徴的色彩が消出するまで、亜硫酸水素ナトリウム溶液（3mlの水中、1gのNaHSO3）の滴下により除去した。得られる溶液を、周囲温度で一晩、放置した。−20℃での72時間にわたる静置は、環状三リン酸の線状三リン酸への同じ転換を達成することを注意すること。この点で、環状三リン酸は、流れ注入質量分光計（MS）により検出できなかった。得られる線状三リン酸を、逆相HPLC（カラム: ZorbaxSB-C18, 21.2 mm x 25 cm. 溶媒A: 0.1 M TEAA, 2.5% CH3CN, pH = 7.0 ; 溶媒 B: CH3CN. 流速: 10.0 mL/分. グラジエント: t = 0 分, 100% A; t = 15 分, 50% A/50% B; t = 20 分, 100% B; t = 25 分, 100% B; t = 25.01分, 100% A; t = 30分, 100% A； t =滞留時間: 20.9 分）により単離した。
【０１７４】
3’−O−TBDMS−ウリジン四リン酸［８］の合成：
ウリジン2’−O−ビス（O−シアノエチル）リン酸［７］（9mg, 0.0117mモル）を、メタノール（３×5ml）、CH2Cl2（３×5ml）及び最終的に、無水CH3CN（１×5ml）と共に連続的に同時蒸発した。次に、その材料を、CH3CN（Aldrich, 無水、2.25ml）に取った。１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（DBU, Aldrich, 175μl、1.17mモル）及びクロロトリメチルシラン（Aldrich, 59μl、0.468mモル）を、前記攪拌溶液に添加した。反応混合物を、周囲温度で２時間、攪拌した。水（1ml）を添加し、そして揮発性材料を回転蒸発器により除去した。
【０１７５】
得られる生成物を、逆相HPLC（カラム: ZorbaxSB-C18, 21.2 mm x 25 cm. 溶媒A: 0.1 M TEAA, 2.5% CH3CN, pH = 7.0 ; 溶媒 B: CH3CN. 流速: 10.0 mL/分. グラジエント: t = 0 分, 100% A; t = 15 分, 50% A/50% B; t = 20 分, 100% B; t = 25 分, 100% B; t = 25.01分, 100% A; t = 30分, 100% A； t =滞留時間: 13.6 分）により精製した。凍結乾燥の後、この態様で得られた化合物［８］を、UVにより定量化した（8mg）。ウリジンのモル消衰計数（εmax）は10（mM-1cm-1）であり、そしてその吸光度（λmax）は262nmであった：
【０１７６】
ウリジン四リン酸［９］の合成：
3’−O−TBDMS−ウリジン四リン酸［８］（2.55mg、0.00376mモル）を、CH3CN（Aldrich, 無水、160μl）に取った。THF中、弗化四ブチルアンモニウム（1.0M、Aldrich, 113μl、0.113mモル）及びHOAc（氷酢酸、2.2μl、0.0376mモル）を、前記溶液に添加した。得られる反応混合物を、周囲温度で21時間、攪拌した。この時点での反応のHPLC分析は、残存するシリルエーテルを示されなかった。揮発材料を、回転蒸発器上で除去した。
【０１７７】
生成物混合物を水に再懸濁し、そして生成物を、逆相HPLC（カラム: ZorbaxSB-C18, 9.4 mm x 25 cm. 溶媒A: 0.1 M TEAA, 2.5% CH3CN, pH = 7.0 ; 溶媒 B: CH3CN. 流速: 4.0 mL/分. グラジエント: t = 0 分, 100% A; t = 15 分, 75% A/25% B; t = 15.01分, 100% B; t =20 分, 100% A; t = 27分, 100% A； t =滞留時間: 7.05 分）により精製した。精製された材料を凍結乾燥した。得られる材料を、再懸濁し、そして凍結乾燥し（合計５度）、TEAA塩の完全な除去を確めた。最終の凍結乾燥の後、材料を、UVにより定量化した（2.00mg、94％の収率）。この態様で得られる化合物［９］は、白色固形物であった。
【０１７８】
例II：アデノシン四リン酸の合成：
概略：
この例は、本発明の１つの合成反応に従ってのアデノシン四リン酸の合成を示す。図13に図示されるように、合成反応は、5’−三リン酸−3’−一リン酸アデニンヌクレオシド及び5’−三リン酸−2’−一リン酸アデニンヌクレオシドの混合物を生成した。合成反応においては、ATPを室温で、１NのKOH中、三ナトリウムトリメタホスフェート(NaPO3)3と反応せしめた。反応混合物を、８時間、進行せしめた。5’−四リン酸−一リン酸アデニンヌクレオシド：5’−三リン酸−2’−一リン酸アデニンヌクレオシドのモル比は、約50：50であった。
【０１７９】
図14A−Cは、種々のアデノシンヌクレオチドの検出を示すHPLCトレース（横座標−滞留時間（分）；縦座標−260nmでの吸光度単位（AU））である。トレースは、イオン−対合RP−HPLCクロマトグラフィーを用いてのヌクレオチド分離に従って生成された。特に、分析及び精製を、TEAA−アセトニトリル緩衝液により、SynunetryShieldTM 逆相 カラム (Waters Corporation, Milord, MA)上で行った。図14Aは、アデノシン四リン酸反応のHPLC分析を示し、そして図14B及びCは、精製されたアデノシン四リン酸画分のHPLC分析を示す（それぞれ、滞留時間：4.166及び4.52分）。さらに下記に記載される別のNMR分析（31P NMR ; 2D Proton-Phosphorus NMR）は、4.33分で溶出するピークが2’−PO4−ATPに対応し、そして4.65分でのピークが3’−PO4−ATPに対応することを示した（図14Aを参照のこと）。
【０１８０】
NMR分析：
上記に記載される、HPLC分析において4.33分でピークを有するアデノシン四リン酸の1H及び31P化学シフトが表Iに示されている。プロトン化学シフトの評価は、COSYスペクトル、及びプロトンH−1’が、わずか１つのプロトンカップリングを有し、そしてリボースプロトンの最も遠いダウンフィールドであったので、用意に同定され得る事実により、容易にされた。
【０１８１】
【表１】
2011224016.tif 000021
【０１８２】
プロトン脱カップリングを有する31Pスペクトル及びそれを有さない31Pスペクトルをまた得た。４種のリン酸ピークが、31Pスペクトルにおいて観察された。−22.44、−10.69及び−9.92ppmでの３種のピークが、31P−31Pカップリングを示し、そしてそれらはリボース環の5’−位置で三リン酸基に属した。0.87ppmでの４番目のピークは、31P−31Pカップリングを示さず、そしてそれは一リン酸に属した。しかしながら、一リン酸の31P化学シフトは、両アデノシン四リン酸（すなわち、4.33及び4.65分でのピーク）において非常に類似し（それぞれ、0.87及び1.08ppm）、そして従って、リン酸基の位置の決定において有用ではなかった。さらに、一リン酸及び三リン酸ピークの線幅は、31P−1Hカップリングがプロトン脱カップリングを伴わないで得られた31Pスペクトルにおいて解決されないほど広かった。
【０１８３】
アデノシン−5’−リン酸、アデノシン2’−一リン酸、及びアデノシン四リン酸のH-2’ 及びH−3’化学シフトの比較（4.33分でのピーク）は、一リン酸が4.33分でピークを有するアデノシン四リン酸のC−2’で結合されることを示した（表IIを参照のこと）。さらに、２主の隣接するプロトンを有し、そして従って、ダブレットのブレット又はトリプレットであることが予測されるH−2’は、トリプレットのダブレットであった。追加の8.8Hzカップリングは、３つの結合31P−1Hカップリングである正しい大きさである。それらの結果に基づいて、4.33分でピークを有するアデノシン四リン酸の構造を決定し、そして2’−PO4−ATPに対応する。2’−PO4−ATPの構造は、図13に図示される。
【０１８４】
【表２】
2011224016.tif 000022
【０１８５】
4.65分でのピークを有するサンプルは、ヌクレオチドの混合物であり、そして多量のトリエチルアミン塩であることがわかった。1H及び31Pスペクトルから測定されるように、ヌクレオチドの1H及び31P化学シフト、及び測定されたスプリッティングが、表III に示される。4.33分でピークを有するアデノシン四リン酸のように、プロトン化学シフトの評価は、COSYスペクトル、及びプロトンH−1’が、わずか１つのプロトンカップリングを有し、そしてリボースプロトンの最も遠いダウンフィールドであったので、用意に同定され得る事実により、容易にされた。カップリングされた及び脱カップリングされた31Pスペクトルは、4.33分でピークを有するアデノシン三リン酸についての上記で論じられた同じ理由のために有用ではなかった。
【０１８６】
【表３】
2011224016.tif 000023
【０１８７】
H-2’及びH-3’の化学シフトは、4.65分でピークを有するアデノシン四リン酸サンプルに関して、両者とも約4.8ppmであった。従って、H-2’ は、アデノシン5’−リン酸（4.75ppm）におけるH-2’の化学シフトに接近して、上方に移動した（表IIを参照のこと）。H-3’は、アデノシン5’−リン酸（4.51ppm）及びアデノシン四リン酸（4.33分でのピーク）（4.67ppm）の両者におけるH-3’の化学シフトに対して下方に移動した（表IIを参照のこと）。それらの観察に基づいて、4.65分でピークを有するアデノシン四リン酸の構造を決定し、そして3’−PO4−ATPに対応する。3’−PO4−ATPの構造は図13に図示される。
【０１８８】
例III ：TAMRAラベルされた2’−一リン酸−ウリジン三リン酸及び3’−一リン酸−ウリジン三リン酸の合成：
この例は、本発明の１つの態様に従ってのTAMRAラベルされた2’−一リン酸−ウリジン三リン酸及び3’−一リン酸−ウリジン三リン酸の合成路を例示する。さらなる例示によれば、図15は、この例に記載される路における一定の段階を図示する。括弧内の数字は、この例における図15に示される化合物を意味することを注意すること。
【０１８９】
化合物［３］を、水（300μl）に取り、そしてこの溶液100μlを、円錐状のバイアルに添加した。その円錐状バイアルにおける溶液を、1.0mlの1NのKOHにより希釈した。ナトリウムトリメタホスフェート（50mg）を添加し、そしてその溶液を、周囲温度で１時間、攪拌した。50mgのナトリウムトリメタホスフェートを添加し、そして攪拌をさらに２時間、続けた。次に、追加の50mgのナトリウムトリメタホスフェートを添加し、そして攪拌を周囲温度で一晩、続けた。次の日、80μlの氷酢酸を添加し、pHを約7.0にした。得られる反応混合物を、RP−HPLCにより精製した。最初に、ヌクレオシドを含む反応混合物の一部を、塩から分離した。凍結乾燥の後、四リン酸を出発材料から分離した。図16は、それらの四リン酸の検出を示すクロマトグラム（横座標−滞留時間（分）；縦座標−290nmでの吸光度単位（AU））である。特に、15.9及び16.1分で溶出したピークは、四リン酸に対応し、そして16.8分でのピークは、出発材料に対応する。
【０１９０】
7mgの四リン酸異性体混合物（化合物［４］及び［５］）を、周囲温度で200μlのトリフルオロ酢酸（TFA）に取った。得られる溶液を30分間、攪拌した。次に、その溶液を、液体窒素において冷却し、そしてTFAを凍結乾燥により除いた。前記材料を、さらなる操作を伴わないで、カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（TAMRA−SE）との反応にゆだねた。
【０１９１】
TAMRA−SE原液を、5mgのTAMRA−SEを、350μlのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解することにより調製した。さらに、四リン酸原液（化合物［６］及び［７］を含む）を、6mgの四リン酸混合物を100μlの水に溶解することにより調製した。
【０１９２】
TAMRA−SE原液を、175μlの水と共に、円錐状のバイアルに移した。さらに、1.875μlのラベリング緩衝液（0.1Mの四硼酸ナトリウム）及び四リン酸原液を、前記混合物に添加した。得られる反応混合物を、周囲温度で一晩、暗室（アルミ箔により被覆された円錐状バイアル）において攪拌した。次の日、100μlの反応混合物のHPLC分離は、ラベルされた四リン酸異性体（化合物［８］及び［９］）であると思われる、約17分で溶出する２つのピークを示した。それらのピークに対応する画分を、RP−HPLCにより、反応混合物の残りから単離した。集められたサンプルの凍結乾燥による濃縮の後、流れ注入分析−質量分光法（FIA−MS）は、１質量単位、予測される (M-H)-イオンの質量からずれた、1027.8でのイオンを示した。反応混合物の残りを、周囲温度で一晩、攪拌した。
【０１９３】
蛍光ラベルは正に荷電されるので、１つのプロトン（M-H）の除去が全体的な中性分子を生成すると思われる。従って、（M-2H）は、−1の質量：電荷比としてMSにより検出できる分子を導く。これは、上記に言及される、観察される分子イオンを説明することができる。
【０１９４】
追加のラベルされた四リン酸についての他の典型的な合成路が、図17−19に図示される。特に図17は、ROXラベルされたシチジン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。図18は、R6Gはラベルされたアデニン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。図19は、R110ラベルされたグアニン四リン酸についての合成路における一定の段階を図示する。
【０１９５】
例IV：2’−ターミネーターヌクレオチドを用いてのプライマー核酸延長の終結：
この例は、２種のプライマー核酸延長反応の比較を示す。それらの分析に使用される、鋳型及びプライマー核酸の配列が図20に示され、それぞれ配列名称NJS115及びNJS01*に対応する。図20A及びBは、ターミネーターヌクレオチドに影響しない反応において、NJS01*中へのアデニン及びグアニン基の組込みを示す電気泳動図トレースである。対照的に、図20C及びDは、NJS01*が本発明のアデノシン四リン酸ターミネーターヌクレオチドの組込みに基づいて、非延長性にされることを示す電気泳動図トレースである。
【０１９６】
例V：修飾された熱安定性DNAポリメラーゼ及び蛍光プライマーを用いての自動化された循環DNA配列決定：
この例は、自動化された色素プライマー循環DNA配列決定に、本発明の2’−ターミネーターヌクレオチドの適用を例示する。特に、M13mp18 DNA鋳型を、リボヌクレオシド2’−一リン酸5’−三リン酸を用いて配列決定した。
【０１９７】
循環配列決定反応を、リボヌクレオチド類似体、色素プライマー、及びリボヌクレオシド2’− 一リン酸5’−三リン酸類似体の組込みのために修飾されたG46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ（上記に言及される）により行った。反応は、50 mM のトリシン pH 8.5 ; 40 mMの KOAc ; 4 mM のMg(OAc)2;100μM の個々のdATP,dCTP,dTTP ;150 μMの c7dGTP; 0.5単位/μlの G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ; 1.0単位/μl のrTth 熱安定性ピロホスファターゼ; 及び 20ng/μlの M13mpl8 鋳型から成った。４種の個々の反応（１つは個々の塩基のためである）を行った。個々の塩基のための反応は、上記のもの及び次の試薬を含んだ：
【０１９８】
アデノシン反応（10μl）：
3.5μMのアデノシン2’−一リン酸5’−三リン酸
0.1μMのFR686NHEXプライマー
シチジン反応（10μl）：
7.5μMのシチジン2’−一リン酸5’−三リン酸
0.1μMのFR686NFAMプライマー
グアノシン反応（20μl）：
５μMのグアノシン2’−一リン酸5’−三リン酸
0.1μMのFR686NTAMRAプライマー
ウリジン反応（20μl）：
10μMのウリジン2’−一リン酸5’−三リン酸
0.1μMのFR686NROXプライマー
【０１９９】
アデノシン反応においては、アデノシン2’−一リン酸5’−三リン酸は約95％の純度であった（すなわち、約５％は、アデノシン3’−一リン酸5’−三リン酸であった）。シチジン反応においては、シチジン2’−一リン酸5’−三リン酸及びシチジン3’−一リン酸5’−三リン酸は、50/50混合物として存在した。グアノシン反応においては、グアノシン2’−一リン酸5’−三リン酸は、約94％の純度であった（すなわち、約６％はグアノシン3’−一リン酸5’−三リン酸であった）。ウリジン反応においては、ウリジン2’−一リン酸5’−三リン酸は、100％の純度であった。
【０２００】
オリゴヌクレオチドプライマー配列は、次の通りであった：
FR686NFAM： FCGCCAGGGTTTTCCCAGTEA
E = 2'-アミノ(ribo)C    F = 5'FAM ABD
FR686NHEX： ICGCCAGGGTTTTCCCAGTEA
E = 2'-アミノ(ribo)C    I = 5'HEX ABD
FR686NROX： JCGCCAGGGTTTTCCCAGTEA
E = 2'-アミノ(ribo)C    J = 6-ROX
FR686NTAMRA： LCGCCAGGGTTTTCCCAGTEA
E = 2'-アミノ(ribo)C    L = C6-アミノ TAMRA
【０２０１】
４種の反応の個々を、Perkin-ElmerGeneAmpO PCRシステム 9600熱サイクラーに配置し、そして95℃で45秒、及び次に95℃で15秒、55℃で15秒、70℃で90秒（20サイクル）、続いて95℃で15秒、70℃で90秒（20サイクル）にゆだねた。４種の反応をプールし、そして４℃で15分間、144μlの100％エタノール及び6μlの3MのNaOAc（pH5.2）の添加により沈殿せしめた。プールされた反応を、4℃で15分間、微小遠心分離し、DNAを沈殿し、そして上清液を除いた。ペレットを、350μlの冷70％エタノールにより洗浄し、4℃で5分間、微小遠心分離し、上清液を除き、そしてDNAペレットを乾燥した。沈殿されたDNAを、10μlのHi−Diホルムアミド（Applied Biosystems, Foster City, CA, パート ＃;4311320）に再懸濁し、90℃で3分間、加熱し、そして氷上に配置した。２μlの個々のサンプルを、予備電気泳動された48cmの4.25％アクリルアミド：ビス（29：１）、6Mのウレアゲル上に負荷し、そしてABIPRISMTM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)上で７時間、電気泳動した。
【０２０２】
データを、プライマーファイルDP4%Ac｛KS｝、半適応性ベースカラーバージョン3.3.1b2、及びApplied Biosystemsマニュアル（パート＃903436）における方法に従って生成される、上記で使用される色素プライマーに対して特異的なマトリックスファイルを用いて、Sequencing Analysis Software 3.4. 1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)により分析した。分析ソフトウェアによる自動化されたベースコーリングは、M13mp18参照配列に比較する場合、配列決定プライマーからの塩基＋18〜＋739について100％正確であった。図21は、この配列分析からのデータのスペクトルプロフィールを提供する。
【０２０３】
例VI：修飾された熱安定性DNAポリメラーゼ及び色素−ラベルされたリボヌクレオシド2’−一リン酸5’−三リン酸を用いての循環されたDNAプライマー延長：
熱循環されたプライマー延長反応を、リボヌクレオチド類似体、ラベルされていないプライマー及びTAMRA色素−ラベルされたウリジン2’−一リン酸5’−三リン酸の組込みのために修飾されたG46E E678G CSS DNAポリメラーゼにより行った。20μlの反応は、50 mM のトリシン pH 7.5 ; 25 mMのKOAc ; 2.5 mMの Mg(OAc)2;100μM の個々のdATP,dCTP, 及びdTTP ; 150μMの dITP ; 0.5単位/μl のG46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ ; 1.0単位/μlの rTth 熱安定性無機ピロホスファターゼ; 5 ng/μｌのM13mpl8 鋳型; 0.15 μM のプライマー;及び0. 25 μM のTAMRA- ウリジン 2'-リン酸5'-三リン酸から成った。
【０２０４】
対照反応を、AmpliTaq DNAポリメラーゼ、FS, ラベルされていないプライマー及びTAMRA色素−ラベルされたddTTPにより行った。20μlの反応は、50 mMのトリス pH 9; 2 mMの MgCl2 ; 100μM の個々のdATP,dCTP, 及びdTTP ; 150 μM のdITP ; 0.5単位/μl のAmpliTaq DNAポリメラーゼ, FS; 1.0単位/μlの rTth熱安定性無機ピロホスファターゼ; 5ng/μlの M13mpl8 鋳型; 0.15μM のFR686N プライマー;及び 0.2 μMの TAMRA-ddTTPから成った。
【０２０５】
FR686N： CGCCAGGGTTTTCCCAGTEA
E = 2'-アミノ(ribo) C
反応を、Perkin-ElmerGeneAmpO PCR システム 9600熱サイクラーに配置し、そして96℃で20秒、及び次に96℃で10秒、50℃で５秒、60℃で４分（25サイクル）にゆだねた。循環の後、組込まれなかった色素−ラベルされたターミネーターを、Sephadex-G50 カラム (Sigma, Part No G-50-80)を通しての700×gで２分間の遠心分離により、反応から除去した。サンプルを、95℃で３分間、加熱し、そして氷上に配置した。サンプルを、50cmの細管アレイ及びPOP6ポリマーを用いてStdSeq50_POP6DefaultModuleパラメーターに従ってGeneScanアプリケーションを用いてのApplied Biosystems3100 Genetic Analyzer上で電気泳動した。
【０２０６】
データを、Applied Biosystems GeneScan 3.7フラグメント分析ソフトウェアにより分析した。図22は、プライマーFR686NからのTピーク77〜273個の塩基についてのフラグメントパターンを示す。より特定には、対照AmpliTaq DNAポリメラーゼ、FS及びTAMRA−ddTTPにより生成されたフラグメントパターン（パネルA）に対する、G46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ及びTAMRA−ウリジン2’−一リン酸5’−三リン酸により生成されたフラグメントパターン（パネルB）の比較は、ピークの類似するパターンを示した。
【０２０７】
前述の発明は、明確性及び理解のために、いくらか詳細に記載されて来たが、種々の変更が本発明の範囲内で行われ得ることは、この開示の解釈から当業者に明らかであろう。例えば、上記に記載されるすべての技法及び装置は種々の組合せで使用され得る。本出願に引用されるすべての出版物、特許、特許出願又は他の書類は、あたかも個々の出版物、特許、特許出願又は他の書類が特異的に及び個別にその全体が参考として組込まれるのと同じレベルで、その全体が参照として本明細書に組み込まれるものである。
【図１Ａ】
2011224016.tif 000052
【図１Ｂ】
2011224016.tif 000053
【図１Ｃ】
2011224016.tif 000054
【図１Ｄ】
2011224016.tif 000055
【図２Ａ】
2011224016.tif 000056
【図２Ｂ】
2011224016.tif 000057
【図３Ａ】
2011224016.tif 000058
【図３Ｂ】
2011224016.tif 000059
【図３Ｃ】
2011224016.tif 000060
【図４Ａ】
2011224016.tif 000061
【図４Ｂ】
2011224016.tif 000062
【図５】
2011224016.tif 000063
【図６Ａ】
2011224016.tif 000064
【図６Ｂ】
2011224016.tif 000065
【図６Ｃ】
2011224016.tif 000066
【図６Ｄ】
2011224016.tif 000067
【図６Ｅ】
2011224016.tif 000068
【図６Ｆ】
2011224016.tif 000069
【図６Ｇ】
2011224016.tif 000070
【図６Ｈ】
2011224016.tif 000071
【図６Ｉ】
2011224016.tif 000072
【図６Ｊ】
2011224016.tif 000073
【図６Ｋ】
2011224016.tif 000074
【図６Ｌ】
2011224016.tif 000075
【図７】
2011224016.tif 000076
【図８】
2011224016.tif 000077
【図９】
2011224016.tif 000078
【図１０】
2011224016.tif 000079
【図１２】
2011224016.tif 000080
【図１３】
2011224016.tif 000081
【図１４Ａ】
2011224016.tif 000082
【図１４Ｂ】
2011224016.tif 000083
【図１４Ｃ】
2011224016.tif 000084
【図１５】
2011224016.tif 000085
【図１６】
2011224016.tif 000086
【図１７】
2011224016.tif 000087
【図１８】
2011224016.tif 000088
【図１９】
2011224016.tif 000089
【図２０】
2011224016.tif 000090
【図２１】
2011224016.tif 000091
【図２２】
2011224016.tif 000092
【図１１】
2011224016.tif 000093
【配列表】
2011224016000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月16日(2011.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定を行うための組成物であって、当該組成物は、
１又は複数の延長性ヌクレオチド、及び下記式：
【化１】
2011224016.tif 000094
[式中、R1は、OHであり；
Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；
BGは、下記の式：
【化２】
2011224016.tif 000095
（式中、XはOであり、YはOR5であり、そしてR2及びR5はHである）
を含むブロッキング基であり；
ZはOであり；そして
----は単結合又は二重結合を表す］
を含んで成る少なくとも１つの非延長性ヌクレオシド及び／又は非延長性ヌクレオチドを含んで成り；
ここで前記非延長性ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドはラベルされており、当該ラベルは蛍光色素、弱い蛍光ラベル、非蛍光ラベル、色ラベル、化学ルミネッセンスラベル、生物ルミネッセンスラベル、放射性同位元素、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン又は酵素を含んで成り；そして
前記非延長性ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドが、5'−3'DNAポリメラーゼ活性及び任意に3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有するヌクレオチド組込み生体触媒による延長ができなくさている、
ことを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
前記ヌクレオチド組込みを触媒の少なくとも１つが、延長されたプライマー核酸の末端で前記ヌクレオチドを組み込む延長されたプライマー核酸を生成するためにプライマー核酸を延長することができる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラベルが、少なくとも１つの質量修飾基を含んで成り、当該前記質量修飾基が、重水素、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3及びホスホロチオエート基から成る群から選択され、ここで
Xが、O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2 )nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-アルキル), 又は OP(O-アルキル)であり；
ｎが１〜20の整数であり；そして
Yが、H、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化されたポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化されたシリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基、又はポリエチレングリコール基である、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ラベルされた非延長性ヌクレオチドの生成方法であって、
ヌクレオシドの糖成分の5’−位置に少なくとも１つのリン酸基を結合させ；
前記ヌクレオシドの糖成分の2’−位置にブロッキング基を結合させて、下記式：
【化３】
2011224016.tif 000096
［式中、R1は、OHであり；
Bは、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基、又はそれらの組合せであり；
BGは、下記の式：
【化４】
2011224016.tif 000097
（式中、XはOであり、YはOR5であり、そしてR2及びR5はHである）
を含むブロッキング基であり；
ZはOであり；そして
----は単結合又は二重結合を表す］
を含んで成るヌクレオシドを生成させ；そして
前記糖成分、ブロッキング基、及び／又はヌクレオシドの塩基に少なくとも１つのラベルを結合させ、それにより、ラベルされた非延長性のヌクレオチドを生成することを含んで成り、前記ヌクレオチドが、5'−3'DNAポリメラーゼ活性及び任意に3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有するヌクレオチド組込み生体触媒による延長ができなくされている、ことを特徴とする前記方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチド組込みを触媒の少なくとも１つが、延長されたプライマー核酸の末端で前記ヌクレオチドを組み込む延長されたプライマー核酸を生成するためにプライマー核酸を延長することができる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ラベルが、少なくとも１つの質量修飾基を含んで成り、当該質量修飾基が、重水素、F、Cl、Br、I、S、N3、XY、CH3、SPO4、BH3、SiY3、Si(CH3)3、Si(CH3)2(C2H5)、Si(CH3)(C2H5)2、Si(C2H5)3、(CH2)nCH3、(CH2)nNY2、CH2CONY2、(CH2)nOH、CH2F、CHF2、CF3及びホスホロチオエート基から成る群から選択され、ここで
Xが、O, NH, NY, S, NHC(S), OCO(CH)nCOO, NHCO(CH2 )nCOO, OSO2O, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4O2H2S, OPO(O-アルキル), 又は OP(O-アルキル)であり；
ｎが１〜20の整数であり；そして
Yが、H、重水素、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ポリオキシメチレン基、モノアルキル化されたポリオキシメチレン基、ポリエチレンイミン基、ポリアミド基、ポリエステル基、アルキル化されたシリル基、ヘテロオリゴ、ポリアミノ酸、ヘテロオリゴ/ポリアミノ酸基、又はポリエチレングリコール基である請求項４に記載の方法。
【外国語明細書】
2011224016000001.pdf