(57)【要約】【課題】視野内の空間位置に基づいて褪色補正を行うことができる蛍光検出装置および蛍光顕微鏡を実現すること。【解決手段】蛍光染色した試料に励起光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光検出装置および蛍光顕微鏡であり、  前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を補正する手段を設けたことを特徴とするもの。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光染色した試料に励起光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光検出装置において、
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
蛍光染色した試料にレーザ光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光顕微鏡において、
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記蛍光顕微鏡は共焦点顕微鏡として構成されていることを特徴とする請求項２記載の蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出装置および蛍光顕微鏡に関し、詳しくは、蛍光染色された試料の褪色補正に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
たとえば細胞を顕微鏡で撮影する有力な手法として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ:Green Fluorescent Proteins）による細胞の染色などのように試料の特定部位を蛍光指示薬で蛍光染色し、蛍光染色した試料にレーザ光などの励起光を照射して励起し、試料が発生する蛍光の２次元の強度情報を画像として検出する方法が確立されている。
【０００３】
ところが、この手法の弱点の一つとして、蛍光褪色という現象がある。これは、蛍光物質を励起するレーザの強度が強いと、蛍光物質の構造が改変されて、蛍光強度が弱まり色褪せてしまう現象で、褪色と呼ばれている。
【０００４】
蛍光顕微鏡による観察では、試料の蛍光の量を正確に測光することが重要である。これは、蛍光物質が細胞内のどの部位にどれだけ分布しているかを定量化したいからである。しかし、褪色現象があると、蛍光の量が減少し、本来の計測量よりも低い測定値しか得られなくなってしまう。
【０００５】
一般に褪色量はレーザの照射量に依存し、強度に対して非線形な性質を示し、同一の積分量でも、強い光を短時間当てるほうが、弱い光を長時間当てるよりも褪色が大きいという性質を持つ。
【０００６】
正確な測光を行うため、たとえば特許文献１に記載されているように、褪色を定量化して補正するという考えがある。図６は、特許文献１に記載されている蛍光色素の褪色特性例図である。図６において、Ｔｌは試料をスキャン開始波長からスキャン終了波長までスキャンするのに要する時間であり、Ｔｉはｉ回目のスキャン時の時刻であってその時の輝度値をＦ（Ｔｉ）と表す。また、Δｔは試料を１回スキャンするのに要する時間とする。
【０００７】
特許文献１では、レーザ照射による褪色を測定し、この測定結果を元に積算照射量に依存した補正を行うという技術を提案している。特許文献１に記載されている技術では、褪色を積算照射量（照射時間の積算）の関数として取り扱っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２１４７２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、２次元的あるいは３次元的な画像を撮影する場合、空間的には、視野内の基準点になるある一定位置での照射しか考慮しておらず、視野内の位置によって照射量が異なる効果は考慮していない。
【００１０】
実際には、照明の光源や、照明光学系の周辺減光（シェーディング）などにより、視野内の光軸付近と視野の端では照射量が異なるため、褪色の程度も異なるが、従来技術ではこの効果を考慮していないため、画像を形成する視野内の位置ごとに異なる褪色が生じる効果を補正することができないという問題がある。
【００１１】
本発明は、このような問題点を解決するものであって、その目的は、蛍光の褪色を、視野内の空間的な位置に関連する関数として扱うことにより、視野内の空間位置に基づいて褪色補正を行うことができる蛍光検出装置および蛍光顕微鏡を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような課題を達成する請求項１の発明は、
蛍光染色した試料に励起光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光検出装置において、
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする。
【００１３】
請求項２の発明は、
蛍光染色した試料にレーザ光を照射することにより前記試料が発生する蛍光画像を画像検出器で検出するように構成された蛍光顕微鏡において、
前記画像検出器で検出される前記試料画像の位置別に蛍光褪色を定量化して補正する手段を設けたことを特徴とする。
【００１４】
請求項３の発明は、請求項２に記載の蛍光顕微鏡において、
前記蛍光顕微鏡は共焦点顕微鏡として構成されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
このように構成される蛍光検出装置および蛍光顕微鏡によれば、照射量および空間位置に基づき蛍光の褪色補正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施例の主要部分を示すブロック図である。
【図２】本発明の他の実施例を示す回路図である。
【図３】本発明に基づく褪色補正の動作の流れを示すフローチャートである。
【図４】本発明に基づく褪色補正を用いた画像処理システムの具体例を示すブロック図である。
【図５】本発明に基づく褪色補正機能を備えた共焦点顕微鏡の具体例を示すブロック図である。
【図６】蛍光色素の褪色特性例図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について、図面を用いて説明する。図１は本発明の一実施例の主要部分を示すブロック図である。図１において、蛍光情報検出部１０は、ＣＣＤやＣＭＯＳなどの画像検出器２０で検出される試料３０の画像の位置別に、蛍光に関連した各種の情報を検出し、蛍光褪色を補正する情報を生成するものであり、視野内位置情報格納部１１、位置別蛍光強度情報取得部１２、位置別蛍光強度情報格納部１３、位置別褪色量演算部１４、褪色係数格納部１５、位置別蛍光強度情報補正部１６などで構成されている。
【００１８】
視野内位置情報格納部１１には、画像検出器２０の画素に対応した視野内の位置情報が格納されている。実際の装置における蛍光褪色は、光軸に対称な関数として記述できる場合が多い。したがって、画像検出器２０のすべての画素に対して褪色の係数を持つ必要はなく、たとえば光軸の位置と光軸からの距離の関数として褪色係数を持っても構わない。つまり、半径Ｒ,角度θの極座標で半径Ｒのみの関数として視野内の位置情報を持つようにしてもよい。
【００１９】
位置別蛍光強度情報取得部１２は、視野内位置情報格納部１１に格納されている視野内の位置情報および画像検出器２０で検出される試料３０の表面画像に基づいて２次元の画像データの形式で蛍光強度情報を取得し、取得した蛍光強度情報を位置別蛍光強度情報格納部１３に格納する。
【００２０】
位置別褪色量演算部１４は、位置別蛍光強度情報取得部１２で取得した２次元データの位置（画素）ごとに蛍光の褪色量を演算する。なお、これらの演算結果をまとめて、光軸からの距離に対する褪色量として半径Ｒのみの関数にしてもよい。
【００２１】
褪色係数格納部１５には、位置別褪色量演算部１４の演算結果に基づく褪色に関する係数が２次元の画像データの形式で格納される。褪色係数を格納するのにあたり、場合によっては複数の係数を持ってもよいし、前述のように極座標で半径Ｒの関数としてもよい。
【００２２】
位置別蛍光強度情報補正部１６は、求めた係数を用いて位置と時間（過去の露光量）の関数として褪色の割合を求め、その褪色の割合で補正することにより褪色前の蛍光強度を求める。
【００２３】
図１の動作について、詳しく説明する。
蛍光を発光可能な有効な蛍光物質の量をｇ(r)と表す。ここで、ｇはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を表し、変数ｒは視野内の光軸を原点とする２次元極座標の動径方向を表す。一般には角度方向θも変数であるが、ここでは簡単のためｒのみ記している。なお、２次元直交座標で記述してもよいが、ここでは概念を説明するため、極座標で示す。褪色は光を発する能力を持つ蛍光物質の減少なので、次式（１）で表すことができる。
【００２４】
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【００２５】
ここで、ａは蛍光物質に依存する正の定数、Ｂは入射光量の強度、ｆｉ（ｒ）は照明（励起）光学系の周辺減光を表す規格化された（光軸で値が１となる）関数である。入射光量に対する非線形な褪色を表すため、ここでは簡単に「べき」がｎのべき関数型と仮定して、ｎ＞＝１と考える。一般には異なる関数形でもよい。関数ｆｉ（ｒ）の「ｆｉ」は、flat-field of incoming ray を表している。この（１）式から分かることは、励起光強度の空間分布があるため、褪色も空間の位置ｒによって異なることである。
【００２６】
（１）式を解くと、Ａを積分定数として（２）式のようになる。
【００２７】
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【００２８】
簡単のため、照明光学系の周辺減光ｆｉ（ｒ）が２次元ガウス関数で表されるとする。本発明の考え方を説明するため、解析的に演算可能な関数で説明を行うが、実際には任意の関数形に対して数値的に演算を行えばよい。
【００２９】
2011247656.tif 000005
【００３０】
蛍光物質が（３）式のような分布になっているとき、実際に観察される画像は、照明光学系の周辺減光ｆｉ(ｒ)と撮像光学系の周辺減光ｆｏ(ｒ)を積算したものであり、撮像光学系の周辺減光ｆｏ(ｒ)も２次元ガウス関数で表されるものとすると次式（４）のようになる。なお、関数ｆｏ（ｒ）の「ｆｏ」は、flat-field of outgoing ray を表している。
【００３１】
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【００３２】
図２は、画像検出器２０の撮像面における光量変化特性例図であり、横軸は撮像面の位置（任意単位）を示し、縦軸は観察される光量（任意単位）を示している。１０００×１０００画素の２次元画像で、ｎ＝１、観察光学系の周辺減光σi＝５００で励起光学系の周辺減光σo＝５００、ｒ＝０の光軸上における１回の露光による褪色が３％（ａ＝０．０３）として（４）式をプロットしたものである。
【００３３】
４本のグラフＡ〜Ｄは、撮影回数に応じた光量の変化を示し、上から順にグラフＡは０回目、グラフＢは１０回目、グラフＣは１００回目、グラフＤは２００回目の撮影で観察される光量変化を表している。グラフＡやＢでは光軸付近の光量が周辺よりも高いが、この部分では褪色も大きく、撮影回数とともに急速に褪色してやがて周辺部のほうが明るく見える状態になる。すなわち、グラフＣの１００回目の露光では周辺のほうが明るくなり始め、グラフＤの２００回目の露光では周辺のほうが光軸付近よりも明るくなる。
【００３４】
フラットフィールドは位置と時間の関数となっていて、このような褪色を補正するためには、時間（積分照射量）だけでなく、照明や光学系に依存した位置の関数として補正する必要があることは明らかである。
【００３５】
実際の撮影にあたっては、撮影された生の画像に対して、（４）式を用いてフラットフィールド補正を行えばよい。
【００３６】
図３は、本発明に基づく褪色補正の動作の流れを示すフローチャートである。
はじめに、補正前の画像データを読込む（ステップＳ１）。
続いて、読込んだ画像について、過去の照射量データを取得する（ステップＳ２）。過去の照射量データは、計算したり、記録されているデータベースから読み出す。
【００３７】
次に、画像の各画素を走査する（ステップＳ３）。
そして、画像の位置（画素）ごとに、ステップＳ２で取得した過去の照射量データと画像内の位置の関数として、フラットフィールド（減光量）を演算する（ステップＳ４）。
【００３８】
該当する画素の蛍光光度を、ステップＳ４で演算したフラットフィールド（減光量）で除算し、褪色補正を行う（ステップＳ５）。
画像の各画素について走査が終了すると（ステップＳ６）、補正済み画像データを所定の格納部に格納し、次の演算に利用する（ステップＳ７）。
【００３９】
ここで、（４）式のａ，ｎ，σｉ，σｏなどのパラメータは、細胞の種類、蛍光物質の種類、染色方法、観察波長、光学系の性質（設定）などによって決まるものであり、予め同一条件で基準となるデータを取得し、減光の様子からこれらのパラメータを最小２乗法などによるフィッティングで決定できる。前もって基準となるデータの取得が困難な場合は、実データから推定してもよい。
【００４０】
図４は、本発明に基づく褪色補正を用いた画像処理システムの具体例を示すブロック図である。図４において、画像検出器２０として用いるカメラは、共焦点顕微鏡４０を介して試料３０の蛍光染色画像を撮影し、その画像出力データを画像取得用のＰＣ５０に入力する。
【００４１】
画像取得用のＰＣ５０には、スイッチ６０およびネットワークＮＷを介して、蛍光情報検出部１０を含むクライアントとしての複数のＰＣ、サーバー７０、ストレージ８０などが接続されている。
【００４２】
このような構成において、カメラ２０で撮影されてＰＣ５０に取り込まれた試料３０の蛍光染色画像データは、サーバー７０を経由してストレージ８０に逐次格納される。
【００４３】
クライアントとしてのＰＣ１０は、画像処理すべき所望の画像データをサーバー７０を介してストレージ８０から読み出すとともに、必要に応じて画像処理結果をサーバー７０を介してストレージ８０に格納する。
【００４４】
これにより、ストレージ８０に格納されている画像データをクライアントとしての複数のＰＣ１０で共有でき、システム全体として画像処理の効率を高めることができる。
【００４５】
図５は本発明に基づく褪色補正機能を備えた蛍光顕微鏡としての共焦点顕微鏡の具体例を示すブロック図である。図５において、レーザ光源４１の出力光は、共焦点スキャナ４２および対物レンズ４３を介して蛍光指示薬で蛍光染色された試料３０に照射される。
【００４６】
試料３０は、レーザ光が照射されることにより、蛍光を発生する。試料３０が発生する蛍光画像は、対物レンズ４３および共焦点スキャナ４２を介して分光光学系４４に入力されて分光される。
【００４７】
分光光学系４４の分光出力は２次元画像検出器４５に入力されて電気信号に変換され、電気信号はＡ／Ｄ変換器４６に入力されてデジタルデータに変換され、デジタルデータはＰＣ４７に入力されて褪色補正処理が施される。
【００４８】
ＰＣ４７には、ＣＰＵ４７ａ、データメモリ４７ｂ、視野内の位置ごとの褪色量を演算する位置別褪色量演算プログラム４７ｃ、視野内の位置ごとの褪色量を補正する位置別褪色量補正プログラム４７ｄなどが設けられている。
【００４９】
ＰＣ４７は、位置別褪色量演算プログラム４７ｃに基づいてＡ／Ｄ変換器４６から変換入力されるデジタルデータの視野内の位置ごとの褪色量を演算し、位置別褪色量補正プログラム４７ｄに基づいてＡ／Ｄ変換器４６から変換入力されるデジタルデータの視野内の位置ごとの褪色量を補正する。
【００５０】
そして、表示装置４８は、このようにしてＰＣ４７で視野内の位置ごとの褪色量が補正された２次元画像を表示する。
【００５１】
たとえば生きている細胞（ライブセル）を長時間観察する場合においては、時間とともに細胞が視野内を移動する。すなわち、ある時刻でのある細胞の褪色は、その細胞が過去に移動を行った位置での照明の周辺減光に依存する。
【００５２】
したがって、図５に示すように構成された共焦点顕微鏡を用いて、細胞の移動位置を時刻とともに追跡して履歴に応じた褪色を積分することで、細胞の褪色をより正確に推定でき、より正確な観察が行える。
【００５３】
なお、上記実施例では、撮影した画像を一旦保存し、その後のデータ解析の段階で褪色量の補正を行うようにしているが、褪色量補正は撮影と同時に行ってもよい。たとえば、カメラの筐体内や画像取得ボードに設けられているＣＰＵ，ＤＳＰ,ＦＰＧＡなどの演算ブロックを用いて撮影直後に褪色量の補正演算を行い、これら撮影直後に補正された画像を保存するとともに表示装置に表示するようにしてもよい。
【００５４】
また、上記実施例では、蛍光指示薬で蛍光染色された試料を励起する照明の強度は一定としているが、時間の経過（撮影枚数）に応じて変化させてもよい。その場合、（４）式に対応する適切な補正関数の関数形は、解析的または数値的に求めればよい。
【００５５】
また、励起光はレーザ光に限るものではなく、たとえば水銀ランプなどと単色用のフィルタを組み合わせたものであってもよい。
【００５６】
さらに、上記実施例では、蛍光顕微鏡として共焦点顕微鏡を用い、撮影対象を細胞とする例について説明したが、これに限るものではなく、撮影のための照射によって撮影対象に褪色が発生する各種の撮影対象の撮影にも適用できる。
【００５７】
以上説明したように、本発明によれば、照射量および空間位置に基づき褪色補正が行える蛍光検出装置および蛍光顕微鏡を実現できる。
【符号の説明】
【００５８】
１０  蛍光情報検出部
１１  視野内位置情報格納部
１２  位置別蛍光強度情報取得部
１３  位置別蛍光強度情報格納部
１４  位置別褪色量演算部
１５  褪色係数格納部
１６  位置別蛍光強度情報補正部
２０  画像検出器（カメラ）
３０  試料
４０  共焦点顕微鏡
４１  レーザ光源
４２  共焦点スキャナ
４３  対物レンズ
４４  分光光学系
４５  ２次元画像検出器
４６  Ａ／Ｄ変換器
４７  ＰＣ
４７ａ  ＣＰＵ
４７ｂ  データメモリ
４７ｃ  位置別褪色量演算プログラム
４７ｄ  位置別褪色量補正プログラム
４８  表示装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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