(57)【要約】【課題】  固定液により固定された組織または細胞の遺伝子の発現情報や発現有無を解析することを課題とする。【解決手段】  固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率をＡ（％）、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率をＢ（％）とするとき、該ＲＮＡが下式を満たすことを判定するステップを有する、ＲＮＡの解析方法。式：Ｂ／Ａ≦１【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率をＡ（％）、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率をＢ（％）とするとき、該ＲＮＡが下式を満たすことを判定するステップを有する、ＲＮＡの解析方法。
式：Ｂ／Ａ≦１
【請求項２】
さらに前記比率Ａ（％）が２５％以上であることを判定するステップを有する、請求項１に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項３】
前記判定されたＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析する、請求項１または２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項４】
前記判定されたＲＮＡを非増幅により解析する、請求項１または２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項６】
前記固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項７】
前記固定液により固定された組織または細胞がパラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病院や研究機関等で莫大な数の検体が保管されている、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に代表されるような、固定液によって固定された組織、細胞の遺伝子を解析する技術に対して大いに期待が高まっている。特に、ＦＦＰＥ組織については、過去の膨大な疾患データが蓄積されていることから、ＦＦＰＥ組織から遺伝子を抽出し、それらの発現を解析できる技術を確立すれば、長期間保存された組織を用いた遡及的な研究が可能となり、将来的には疾患の治療や予防に大きく貢献できる。
【０００３】
しかしながら、ＦＦＰＥ等の固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡは、一般的な固定条件、保管条件において分解、断片化が進行することから、遺伝子発現解析を行うのが難しいと考えられている。また、固定液として最も一般的に用いられているホルムアルデヒド（ホルマリン）により、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、ＲＮＡ−タンパク質間が架橋されることや、ホルムアルデヒドがＲＮＡに付加、修飾されることがあり、ＲＮＡがそのような状態では、酵素反応および／または化学反応が進行しにくく、遺伝子発現解析が困難となる。よって、分解、断片化が進行したＲＮＡサンプルや、架橋、付加、修飾がなされたＲＮＡサンプルからの遺伝子発現解析を実施する技術が求められている。さらに、そのようなＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析を実施するにあたり、解析する前にＲＮＡサンプルの分解・断片化、あるいは架橋や付加・修飾の程度を確認して品質を判断し、解析の可否を確認することは、正確な遺伝子発現解析ならびにｍｉＲＮＡ発現解析を実施する上で非常に有用であり、それを可能にする技術が求められている。
【０００４】
特許文献１〜４には、分解したＲＮＡを増幅して遺伝子発現解析を行う方法に関する技術が開示されている。
【０００５】
特許文献１は、標的ポリヌクレオチドを増幅して、その多数のコピーを産生することに関連する方法、組成物およびキットを提供するものである。１回の増幅反応におけるｍＲＮＡの増幅倍数は、標準的に５０〜１００又は２５０倍まで、又は５００〜１０００倍又は５００〜２０００倍以上であり、ナノグラム量未満の総ＲＮＡからできるだけ多くの増幅ＲＮＡを得るものである。しかしながら、このように、少量のＲＮＡからできるだけ多く増幅して解析する方法を用いると、遺伝子毎の増幅倍率にバラツキが生じる、いわゆる増幅バイアスが大きくなるため、遺伝子の発現量を正確に解析できないといえる。
【０００６】
特許文献２は、全般的な遺伝子発現プロファイリングのために、例えば保管された固定化パラフィン包埋組織材料のようなフラグメント化ＲＮＡ等を使用する方法に関し、非常に小さな、または極めてフラグメント化されたＲＮＡ試料であっても、全般的な増幅を可能にする試料の調製方法を提供するものである。しかしながら、該方法はフラグメント化されたＲＮＡをポリアデニル化する工程が含まれ、当該工程における反応のばらつきが、結果として遺伝子発現プロファイルにも大きく影響する可能性が考えられる。また特許文献２では、新規なリニアＲＮＡ増幅法について開示されている。５’末端にアンカー配列を有し、かつ３’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有する２本鎖ｃＲＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡから前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列依存的にｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡから前記アンカー配列をプライミングすることによって再度ｃＤＮＡを合成する方法により、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションやセルソーターを利用して得られた少量の細胞・組織から得られる微量のＲＮＡを増幅することで、既存の増幅法の問題点であったｃＤＮＡ合成−ｃＲＮＡ合成サイクルを繰り返すたびに生じるｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ上のｍＲＮＡ５’相当領域の欠失を抑制するものである。
【０００７】
特許文献１、特許文献２ともに、増幅バイアスのない方法として記載されており、１サイクルあたりのバイアスは従来と比べて小さいと思われるが、少量のＲＮＡからできるだけ多く増幅することに主眼を置いていることから、増幅倍率としてはかなり大きい。したがって、その分だけバイアスが積み重なり、結局大きな増幅バイアスが生じることが否めない。
【０００８】
特許文献３は、全般的な遺伝子発現プロファイリングのために、例えば保管された固定化パラフィン包埋組織材料のようなフラグメント化ＲＮＡ等を使用する方法に関し、非常に小さな、または極めてフラグメント化されたＲＮＡ試料であっても、全般的な増幅を可能にする試料の調製方法を提供するものである。しかしながら、該方法はフラグメント化されたＲＮＡをポリアデニル化する工程が含まれ、当該工程における反応のばらつきが、結果として遺伝子発現プロファイルにも大きく影響する可能性が考えられる。
【０００９】
特許文献４は、例えば分解度等、核酸サンプル中の核酸の品質測定方法を含む、分解核酸サンプル中のターゲットの増幅用組成物および方法、更には分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成するための方法について開示されている。同一遺伝子に由来する異なるサイズのアンプリコン（増幅産物）の増幅効率を尺度とし、サンプルが分解するにつれて、サイズの大きなアンプリコンの増幅効率が低下することから品質を評価するものである。本方法は１０〜２０数種の遺伝子について、それぞれ複数のサイズのＰＣＲを行うものである。ＲＮＡの分解が進んでいる場合、ＰＣＲのプローブサイズが大きいものほど増幅されないことから、ある程度分解度を確認することはできると考えられるが、ＲＮＡ１サンプルあたり延べ数十種の遺伝子をＰＣＲ増幅する必要があるため、本方式を実際に行うのは困難と考えられる。
【００１０】
特許文献５には、分解していない状態では長鎖分画に含まれるＲＮＡの塩基配列を元にして設計した分解指標核酸プローブを核酸アレイに搭載し、トータルＲＮＡから短鎖を分画したＲＮＡサンプルを該核酸アレイに対してハイブリダイズさせ、分解指標核酸プローブのシグナルの有無によって、ＲＮＡサンプルの分解度を測定する方法、ならびにＲＮＡの分解度測定用核酸アレイに関する技術が開示されている。しかしながら、当該核酸アレイは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの短鎖ＲＮＡに特化したものであり、遺伝子発現解析への適用は困難であると考えられる。さらに、ＦＦＰＥ等の固定組織や固定細胞からＲＮＡを抽出する場合、細胞や凍結組織から抽出する場合とは異なり、多くのＲＮＡを得られないことがしばしばあるが、そのような状況において、ＲＮＡサンプルの品質確認のためだけに数〜数十μｇという大量のサンプルを使って実験を行うのは非現実的であり、コスト面からも決して好ましい方法とはいえない。
【００１１】
特許文献６には、核酸の断片化レベルを測定する方法に関する記載がある。当該特許文献の出願人は、ＲＮＡサンプルに含まれる２種のリボソームＲＮＡ（１８Ｓ、２８Ｓ）の量をそれぞれ測定し、２８Ｓ／１８Ｓの比から分析可能か否かを判定するキットを販売している。ＲＮＡが分解するとき、先ず２８Ｓが分解し、次いで１８Ｓが分解すると言われており、当該キットにおいては、２８Ｓ／１８Ｓが０．１以下の場合、ＲＮＡの品質が悪いと判定する。しかしながら、固定液により固定された組織、細胞から抽出されるＲＮＡは、一般的に固定の際にＲＮＡが分解し、さらに固定組織、細胞は常温保管が一般的であることから、経年につれてさらにＲＮＡが分解する。したがって、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出したＲＮＡは、上記２種のリボゾームＲＮＡが検出されないことが少なからずあり、上記の基準でＲＮＡサンプルの品質を判定した場合、大半のサンプルが解析できないとみなされてしまう。したがって、上述のような、長期間保存された固定組織、固定細胞を用いて遡及的研究を実施するにあたり、当該キットを使用するのは極めて困難である。
【００１２】
特許文献７は、分解したｍＲＮＡを含む保管された組織中における、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と結合した分解されていないｍｉＲＮＡを加熱処理等で遊離させ、ＰＣＲで増幅することで検出するＲＮＡのプロファイリング方法である。ＲＩＳＣからｍｉＲＮＡを遊離させる際、９５℃という高温で処理することから、そこで分解が生じる可能性は否定できず、さらに、ＲＮＡの品質を確認する方法に関して言及していない。
【００１３】
その他、キャピラリー電気泳動システム（例えば、アジレント・テクノロジー社製“バイオアナライザ”）を用いる場合に、ＲＮＡ分解の指標として、アジレント・テクノロジー社が開発した測定基準であるＲＩＮ（ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）が算出される。ＲＩＮは、電気泳動したＲＮＡサンプル全体のエレクトロフェログラムをベースに算定され、その値は０〜１０の範囲である（非特許文献１）。アジレント・テクノロジー社のバイオアナライザは、核酸の品質を評価する際に一般的に用いられる装置となっており、当該装置を使用した場合において、ＲＩＮはＲＮＡの品質を示す一般的な指標となっている。しかしながら、固定組織、固定細胞から抽出したＲＮＡをバイオアナライザで分析したとき、そのエレクトロフェログラムが明らかに異なり、分解挙動が様々であるＲＮＡにおいても、ＲＩＮの値は２〜３の間でほとんど変わらないことから、ＲＩＮは実際のＲＮＡの状態を必ずしも反映できていない可能性があった。さらに、固定液により固定された種々の組織、細胞から抽出されたＲＮＡが、解析に供することができる検体であるか否かを判断する手段は乏しいのが実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２００６−５２０６０３号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１７２号公報
【特許文献３】特表２００７−５１５９６４号公報
【特許文献４】特表２００８−５４１６９９号公報
【特許文献５】特開２００８−３５７７９号公報
【特許文献６】特開２００８−４３３３２号公報
【特許文献７】特表２００９−５０１５３１号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｏ，Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ｓ，Ｓａｌｏｗｓｋｙ  Ｒ，Ｌｅｉｂｅｒ  Ｍ，Ｇａｓｓｍａｎｎ  Ｍ，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ  Ｓ，Ｍｅｎｚｅｌ  Ｗ，Ｇｒａｎｚｏｗ  Ｍ，Ｒａｇｇ  Ｔ：Ｔｈｅ  ＲＩＮ：ａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｆｏｒ  ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｖａｌｕｅｓ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ；ＢＭＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従来技術では固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡを解析するに際して、抽出されたＲＮＡが解析に適するか否かを簡便かつ高い確率で判断する方法がなく、解析で得られたデータの妥当性を知ることは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの遺伝子発現解析を行うにあたり、解析前にＲＮＡを電気泳動して、そのパターンにより解析に適するか否かを判断し、解析に適すると判断したＲＮＡについて解析を行うことで、もとのＲＮＡの存在量に見合った妥当性の高いデータが得られること、また再現性の高いデータが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
また、当該ＲＮＡを増幅するとき、その増幅倍率をもとの２〜２０倍とすれば、増幅によるバイアスを抑えられ、もとのＲＮＡの存在量に見合った妥当性の高いデータが得られることを見出し、またデータの再現性が高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（７）で構成される。
【００２０】
（１）固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率をＡ（％）、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率をＢ（％）とするとき、該ＲＮＡが下式を満たすことを判定するステップを有する、ＲＮＡの解析方法。
式：Ｂ／Ａ≦１。
【００２１】
（２）さらに前記比率Ａ（％）が２５％以上であることを判定するステップを有する、（１）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００２２】
（３）前記判定されたＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析する、（１）または（２）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００２３】
（４）前記判定されたＲＮＡを非増幅により解析する、（１）または（２）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００２４】
（５）ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、（４）に記載のＲＮＡの解析方法。
【００２５】
（６）前記固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡの解析方法。
【００２６】
（７）前記固定液により固定された組織または細胞が、パラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、（１）〜（６）のいずれかに記載のＲＮＡの解析方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のＲＮＡの解析方法により、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、もとの遺伝子の存在量を正確に反映した解析が可能となり、特にマイクロアレイ解析において好ましい効果が得られる。また、本発明のＲＮＡの解析方法により、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡが解析に適するか否かを、解析前に判定することができ、試薬等を無駄に使用することを未然に防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】バイオアナライザによる各種ＲＮＡの１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率をＡ（％）、４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率をＢ（％）としたとき、横軸をＡ、縦軸をＢ／Ａとして各種ＲＮＡの数値をプロットした図を示す。
【図２】各種ＲＮＡのＲＩＮと増幅量についてプロットした図を示す。
【図３】マウス小脳、肝臓のＦＦＰＥ組織からのマイクロアレイによる発現解析を２回行い、１回目、２回目それぞれの解析で得られた各遺伝子のシグナル強度について、両者の小脳／肝臓の比をプロットした散布図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００３０】
本発明の「固定液により固定された組織または細胞」とは、固定液とよばれる溶液に組織、あるいは細胞を浸漬することで、生物試料をできるだけ自然の状態で維持するための処理、すなわち固定処理を施すことをいう。ここで用いられる固定液は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、エタノール、メタノール等のアルコール類、アセトン、クロロホルム等を含む溶液や、ピクリン酸、重クロム酸カリウム等の酸を含む固定液（例えば、ブアン固定液、ザンボニ固定液、オルト固定液）、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の金属を含む溶液等が好適に使用される。また、エタノール、クロロホルム、酢酸からなるカルノア固定液や、メタノール、クロロホルム、酢酸からなるメタカン固定液など、前述の溶液を二種類以上混合して用いることも好ましい。
【００３１】
本発明においては、前記固定液としてホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む溶液がより好ましく用いられる。ホルムアルデヒド溶液は、市販のホルマリン（ホルムアルデヒド濃度３７％）を水で希釈したものを使用してもよいし、水で希釈した溶液のｐＨを炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等で中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用することも好ましい。また、悪臭、刺激臭を取り除き、濃度を調製したホルマリン溶液（商品名：マスクドホルム）を使用してもよい。なお、ホルムアルデヒド溶液中のホルムアルデヒド含量は、１〜３０％が好ましく、２〜２０％がより好ましい。パラホルムアルデヒド溶液は、パラホルムアルデヒドの粉末を水またはリン酸緩衝液などで溶解させたものや、水と少量の水酸化ナトリウムで溶解後、リン酸緩衝液等でｐＨを中性に調整したものを使用してもよいし、市販のパラホルムアルデヒド溶液を使用してもよい。その濃度は、１〜１０％が好ましく、２〜８％がより好ましい。
【００３２】
また、前記固定された組織あるいは細胞は、パラフィンで包埋されていてもよい。固定された組織あるいは細胞をパラフィン包理する場合、当業者に公知である一般的な手法で操作すればよい。すなわち、固定組織または細胞をアルコールで置換して脱水し、次いでキシレン、ベンゼン等で置換した後、熱して液化したパラフィンを流し入れた型枠に組織、細胞を入れて包埋し、パラフィンブロックとする。なお、パラフィン包埋した組織、細胞からＲＮＡを抽出する際は、回転式ミクロトーム、滑走式ミクロトーム等のミクロトームを用いて薄切したものを使用する。そのとき、薄切片の厚さは特に限定されないが、１〜１００μｍが好ましく、２〜５０μｍがより好ましい。その他、パラフィンの代わりに、主に凍結組織切片作製に用いられるＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）コンパウンドを用いてもよい。また、パラフィンブロックを薄切したものをスライドガラス等に貼り付け、一部をレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）やメス等を用いて解析対象となる組織を採取するマクロダイセクション等により取り出した組織からＲＮＡを抽出する方法も、好ましく用いられる。ＬＣＭを実施する場合、視認性を高めて、解析対象とする組織、細胞を確実に取り出すために、組織、細胞を染色してもよい。その際、色素として例えばクレシルバイオレット、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）、ニュークリア・ファスト・レッド（ＮＦＲ）等が利用できる。
【００３３】
本発明の「固定液により固定された組織または細胞から抽出したＲＮＡ」とは、上述の固定液を用いて固定された組織あるいは細胞から、酵素により組織、細胞のタンパク質を消化させることで抽出されるＲＮＡであり、該ＲＮＡとして、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが挙げられるが、好ましくはｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであり、より好ましくはｍｉＲＮＡである。抽出液にはＤＮＡ、タンパク質等の不純物が混入している場合があり、抽出後に精製操作を行うことが好ましい。ここで用いられる精製方法としては特に限定されないが、例えばシリカメンブレンや陰イオン交換樹脂等を搭載したカラムを用いる方法、逆相クロマトグラフィーなど、液体クロマトグラフィーを用いる方法、有機溶媒を用いてＲＮＡを沈殿させる方法、濃度の高い酢酸アンモニウム溶液をＲＮＡが含まれる溶液に添加し、ＲＮＡを選択的に沈殿させる方法、磁気ビーズを用いる方法などが挙げられる。上述の抽出、精製においては、例えば、“ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（トレードマーク）  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＦＦＰＥ”（Ａｍｂｉｏｎ社）、“ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ社）、“ＩＳＯＧＥＮ  ＰＢ  Ｋｉｔ”（ニッポンジーン株式会社）、“ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（Ｎｏｒｇｅｎ社）、“ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（インビトロジェン社）、“Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ”（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）、“Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＦｏｒｍａＰｕｒｅ（商標）Ｋｉｔ”（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、“ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＦＦＰＥ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）等のホルマリン固定パラフィン包埋組織用ＲＮＡ抽出キットを好適に用いることができる。
【００３４】
前述の固定液により固定された組織または細胞から抽出したＲＮＡは、固定液成分によって分解されたり、架橋・修飾されたりするために、該ＲＮＡを該ＲＮＡと直接的または間接的に選択的に結合しうる物質（以下、選択結合性物質ともいう）との分子間相互作用を利用した解析に供することが困難なサンプルが数多く、解析適否を事前に判定することが技術課題となっていたが、本発明者は、後述の実施例等において示されるとおり、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡにおいて、該ＲＮＡの全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率、および該ＲＮＡの全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率を確認する工程により、ＲＮＡの分解や断片化の指標となる分子量の小さいＲＮＡ、および架橋や付加・修飾等の指標となる分子量の大きなＲＮＡの比率が多いＲＮＡサンプルを予め排除し、該ＲＮＡが前記マイクロアレイ解析に適するかどうかを判断可能であることを見いだした。ここでいう「解析に適する」とは、ＲＮＡと選択結合性物質との分子間相互作用を利用したＲＮＡの解析を実施した場合、当該サンプルが保有する情報を正確に測定しうる状態のことをいう。上述の通り、ＲＮＡを解析に供する場合、分解、断片化の程度が大きかったり、架橋あるいは付加・修飾物が多く存在したりすると、選択結合性物質との分子間相互作用が阻害されたり、また、増幅する際に十分な増幅量が得られなかったり、バイアスが生じたりすることがあり、結果として正確な解析ができない可能性が極めて高い。
【００３５】
固定された組織あるいは細胞から抽出したＲＮＡにおいて、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率、および該ＲＮＡの全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率を確認する方法としては、該ＲＮＡを分子量の大きさで分別して、各分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を定量する方法が挙げられる。固定された組織、細胞等から抽出したＲＮＡサンプルを分子量の大きさで分別して分子量分布を確認する手段である電気泳動の具体例としては、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、チップ電気泳動が挙げられるが、特定のヌクレオチド範囲におけるＲＮＡの存在割合を定量する手段として、例えばゲル電気泳動の場合、当業者に公知である各種デンシトメーターや“Ｔｙｐｈｏｏｎ”（ＧＥヘルスケア社）等のイメージャーを使用してバンド強度を数値化する方法が挙げられ、またチップ電気泳動の場合、“Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ”（アジレント・テクノロジー社）のような電気泳動システムを用いて実施する場合は、専用ソフトウェアに備えられたＳｍｅａｒ解析を行うことにより、好適に特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を求めることができる。なお、分解が生じていないＲＮＡ（インタクトなＲＮＡ）を電気泳動で分析した場合、約４７００ヌクレオチドといわれているリボソームＲＮＡの２８Ｓは４０００ヌクレオチドよりやや小さい分子量をピークとしたバンドを示すことがある。これは、２８Ｓの分子に２本鎖領域が多く含まれており、構造がコンパクトになっているため、電気泳動においては実際の分子量より泳動速度が速くなるためと考えられる。この現象に関して、アジレント・テクノロジー社ホームページのＦＡＱにおいても、同様の記載がみられる。したがって、本発明においては、リボソームＲＮＡの２８Ｓは、電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲に実質上含まれるものとする。また、１８Ｓの分子量は１８７４ヌクレオチドであり、電気泳動においても１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲にバンドが見られることから、当該範囲に含まれる。
【００３６】
本発明において、固定された組織あるいは細胞から抽出したＲＮＡが解析に適するかどうかを判断する具体的手法は、該ＲＮＡの全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率Ａ（％）に対して、該ＲＮＡの全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超えるＲＮＡの重量の比率Ｂ（％）が小さいまたは同じ、すなわちＢ／Ａ≦１であることを確認することにより、解析の適否を判定する方法である。４０００ヌクレオチドを超えるＲＮＡが含まれる画分には、架橋が生じているＲＮＡが含まれていると考えられ、それらはプローブにハイブリダイゼーションできないことがあるため、比率Ｂが比率Ａよりも大きいＲＮＡサンプルを解析した場合、実際に存在するｍＲＮＡ量あるいはｍｉＲＮＡ量より定量値が小さくなる傾向にあり、さらには、本来発現しているにもかかわらず検出できないｍＲＮＡあるいはｍｉＲＮＡが見られることすらある。したがって、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析を実施する前に、当該ＲＮＡのＢ／Ａが１以下であるか否かを確認することにより、該ＲＮＡの解析の適否を速やかに判断することができる。
【００３７】
Ｂ／Ａ≦１に該当するＲＮＡの場合、同一組織または細胞から抽出された分解のない（インタクトな）ＲＮＡのマイクロアレイ解析結果と比較すると、高い相関関係が得られる。ここで、相関係数とは、２つのデータの相互関係の強さを定量的に表す指標であって、−１から１の間をとり、正の値であれば正の相関、負の値であれば負の相関、ゼロの時は無相関という。一般に、絶対値が０．５以上なら相関がある、０．５未満なら相関がないと判断することができ、２つのデータの相関の度合いが強いほど、その絶対値は１に近づく。なお、相関係数を“Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ”（マイクロソフト社）で求める場合は、「ｃｏｒｒｅｌ」という関数を使用すればよい。本発明においては、両者で共通に発現が認められた遺伝子について、シグナル強度の相関係数を求めた場合、０．７以上であることが好ましく、０．８以上であることがより好ましく、０．９以上であることがさらに好ましい。
【００３８】
さらに、固定された組織あるいは細胞から抽出したＲＮＡの全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率Ａ（％）が大きいほど、当該ＲＮＡが分解のないインタクトな状態に近いことを示し、その場合、インタクトなＲＮＡに近似した遺伝子あるいはｍｉＲＮＡの発現挙動が得られる傾向が高い。具体的には、Ａの割合は好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上であれば、インタクトな状態に近いＲＮＡであるかどうかをより速やかに判断することができる。
【００３９】
さらに、固定された組織あるいは細胞から抽出したＲＮＡの全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率Ａ（％）と、該ＲＮＡの全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超えるＲＮＡの重量の比率Ｂ（％）の和（Ａ＋Ｂ）の値（０≦（Ａ＋Ｂ）≦１００）が小さいほど、１０００ヌクレオチドより小さいＲＮＡの重量の比率が大きいこと、すなわち分解したＲＮＡが多いことを示すが、分解したＲＮＡが多いと、特に短鎖のｍｉＲＮＡのマイクロアレイ解析を実施する場合、本来ハイブリダイゼーションすべきＲＮＡ以外のＲＮＡがプローブに結合してしまう、いわゆるクロスハイブリダイゼーションと呼ばれる現象が起こる可能性が高くなることがある。その場合、ＲＮＡが実際に存在する量より強く発現したかのような結果が得られたり、発現したＲＮＡの数が実際より多い結果が得られたりすることがある。本発明において、Ａ＋Ｂの値は、（Ａ＋Ｂ）≧１５であることが好ましく、（Ａ＋Ｂ）≧２０であることがより好ましく、（Ａ＋Ｂ）≧２５であることがさらに好ましい。
【００４０】
その他、固定された組織あるいは細胞から抽出したＲＮＡに含まれる特定遺伝子の存在有無を検出することで、該ＲＮＡが解析可能か否かを詳細に判定することも好ましい。この操作を行うことで、より高率で解析の可否を判定することができる可能性がある。この場合、ＲＮＡの逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型として特定遺伝子をＰＣＲによって増幅し、その増幅産物を電気泳動で評価した際に、その存在が認められた場合に解析可能と判定する。なお、ここでいう特定遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子あるいはインターナルコントロールと呼ばれる、サンプル間で発現の変動が理論上殆どないと考えられる遺伝子を選ぶのが好ましく、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ヒポキサンチンリボシル転移酵素、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、サイクロフィリンＡ、β−グルクロニダーゼ等が挙げられる。
【００４１】
本発明は、ＲＮＡと選択結合性物質との分子間相互作用を利用した解析であれば特に限定されないが、好ましい解析ツールとしてマイクロアレイが挙げられる。
【００４２】
マイクロアレイは、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ステンレス、金（めっき）などの金属類、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどの高分子材料からなる基板に、複数種類の選択結合性物質が固定化されてなるものであり、固定化された複数種類の選択結合性物質と被験物質との結合の有無や被験物質の結合量を一度に検出する解析ツールとして有用である。マイクロアレイに固定化される選択結合性物質として、核酸または他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。他の抗原性化合物としては、低分子化合物を含む。特に好ましい選択結合性物質は核酸である。このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、あるいは、合成したもの、生体組織または細胞などの天然源から調製したものでもよい。
【００４３】
マイクロアレイには特に制限はないが、好ましい例として、基板表面に凹凸部を具備していてもよく、さらに凸部の上面にカバーが設けられていてもよい。このとき、カバーには、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を備えることが好ましい。この孔は、核酸溶液、結合用バッファーなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、基板内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３〜６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、上記のようなカバーの製造方法は特に限定されず、例えば、樹脂の場合は射出成形法、ホットエンボス法、削り出しの方法等、ガラスやセラミックの場合はサンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスで使用される方法等が好ましく用いられる。さらに、マイクロアレイとカバーの間の空隙に微粒子を封入することで、空隙に検体溶液をアプライし検体溶液に振動を伝播させた際に、封入した微粒子が液中で激しく動き回る。その結果、攪拌効率が著しく高くなり、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされるため好ましい。ここで、微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミックス（例えばイットリア安定化ジルコニア）、金属類(例えばステンレス)、ポリマー（例えばナイロン、ポリスチレン）、磁性体などが好適に用いられる。中でも、物理的、化学的に安定であり、かつ比重が大きいことから、セラミックスの微粒子が好ましく用いられる。さらに、基板を回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、基板を振盪させる方法、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法などを併用することで、より一層攪拌効率が向上する。
【００４４】
本発明において、前記固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡ（以下、被験物質ともいう）は、増幅せずに（非増幅産物）解析に供しても、増幅産物を解析に供してもよく、被験物質の種類によって適宜選択される。例えばｍｉＲＮＡを解析する場合は非増幅の解析が好ましい。また、ｍＲＮＡの解析の場合、被験物質は非増幅産物であっても増幅産物であってもよいが、増幅バイアスを防ぐ必要のある被験物質を解析する場合は非増幅産物または後述の通り増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物の解析が好ましい。
【００４５】
増幅産物を解析する場合、ＲＮＡを増幅する方法としては特に制限はないが、各社から上市されているＦＦＰＥに対応する増幅用キットを用いることができる。市販のキットを用いる場合は、例えば“ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（ＡｍｐＴｅｃ社）、“ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２”（ＮｕＧｅｎ社）、“Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｐａｒａｄｉｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ”（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が好ましく利用される。また、“ＳｅｎｓｅＡＭＰ  Ｐｌｕｓ”、“ＲｕｍｐＵｐ”、“ＲｕｍｐＵｐ  Ｐｌｕｓ”（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ社）を用いてセンス鎖ＲＮＡを合成し、それから当業者に公知の方法でアンチセンス鎖ＲＮＡを合成することも好ましい。
【００４６】
また、前述の通り増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析することが好ましい。増幅倍率が２倍に満たない増幅産物しか得られないようなＲＮＡは、ＲＮＡの分解、断片化が激しく、ＲＮＡ鎖長が非常に短くなっているため、あるいはＲＮＡ分子間あるいはＲＮＡとタンパク質間で生じる架橋や、固定の際にホルムアルデヒド等の固定液由来物質がＲＮＡに結合することで生じる付加・修飾物の影響で、増幅反応が阻害されるため、増幅しない、あるいは増幅反応が不十分となることが考えられ、その結果として正確な解析ができない場合がある。また、増幅産物が２０倍を超える増幅倍率である場合、分解等の影響が少ないＲＮＡは増幅しやすい一方、分解がかなり進行したＲＮＡはほとんど増幅しないといった、いわゆる増幅バイアスが顕著に現れる可能性が高くなる場合がある。
【００４７】
増幅産物としては、ＲＴ−ＰＣＲ等によって得られるＤＮＡであってもＲＮＡポリメラーゼ等によって合成されたＲＮＡであってもよいが、本発明においてはＲＮＡであることが好ましい。また、増幅産物をＲＮＡとする場合、センス鎖ＲＮＡでも、アンチセンス鎖ＲＮＡでもよく、特に限定されないが、既存のマイクロアレイの大半は、搭載されているプローブがアンチセンス鎖ＲＮＡに対応しているため、既存のマイクロアレイを用いる場合、アンチセンス鎖ＲＮＡとして増幅するのが好ましい。
【００４８】
増幅倍率を２〜２０倍とする方法としては、ＲＮＡの増幅に使用する酵素やプライマー、基質等の濃度を増減させることで、試薬の組成を最適化する方法が挙げられる。また、反応時間を調整することで、増幅倍率を２〜２０倍にする方法もある。例えば、比較的増幅倍率の大きい試薬を用いて固定組織または細胞から抽出したＲＮＡサンプルを増幅する場合、反応時間を定められた時間より短くするとよい。また、増幅回数は１回とすることが好ましい。増幅反応を２回以上繰り返すと、１回目の増幅により増幅産物にわずかでもバイアスが生じた場合、２回目以降そのバイアスが際立つことになる場合がある。ここで、溶液中のＲＮＡ重量を求めるには、例えばＲＮＡ溶液を光路長１０ｍｍのセルを用いて分光光度計で測定したときの２６０ｎｍの値および溶液量から、下式Ａで計算することができる。
【００４９】
式Ａ：（２６０ｎｍの値）×４０（ｎｇ／μＬ）×溶液量（μＬ）。
【００５０】
なお、ＲＮＡを増幅した結果、増幅倍率が２〜２０倍であるかどうかを確認するには、光路長１０ｍｍのセルを用いて分光光度計で測定したときの２６０ｎｍの値および溶液量から、上式Ａより増幅後の溶液のＲＮＡ重量を求め、下式Ｂより増幅倍率を算出すればよい。
【００５１】
式Ｂ：（増幅後のＲＮＡ重量）／（増幅前のＲＮＡ重量）。
【００５２】
被験物質は当業者に公知の核酸の標識物質で標識されることが好ましく、蛍光標識されることがより好ましい。被験物質を蛍光標識する場合、蛍光標識は被験物質と選択結合性物質との結合の前に行ってもよいし、結合の後に行ってもよい。被験物質が非増幅産物の場合、直接標識することが好ましく、ここで用いられる直接標識試薬としては、例えば“ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ”（Ｋｒｅａｔｅｃｈ社；蛍光色素はＤｙｏｍｉｃｓシリーズ（Ｄｙｏｍｉｃｓ社））、“ＵＬＳ（商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ”（Ｋｒｅａｔｅｃｈ社；蛍光色素はＣｙ３、Ｃｙ５）、“ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）ｍｉＲＮＡ  Ｐｏｗｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ”（Ｅｘｉｑｏｎ社；蛍光色素はＨｙ３、Ｈｙ５）、“ＦｌａｓｈＴａｇ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ”（Ｇｅｎｅｓｐｈｅｒｅ社；蛍光色素はＯｙｓｔｅｒ−５５０、Ｏｙｓｔｅｒ−６５０）などが挙げられる。一方、増幅産物を解析する場合、増幅反応の際に用いるヌクレオチド３リン酸（ＮＴＰ）（アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアニジン３リン酸（ＧＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン３リン酸（ＵＴＰ））の一部、例えばＵＴＰの一部にアミノアリル基やビオチンを付加させたものを用いて、増幅産物にアミノアリル基やビオチンといった反応基を導入することで、増幅産物を容易に蛍光標識できるため好ましい。アミノアリル基を導入した場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を末端に持つ蛍光色素と容易にカップリング反応する。ここで用いられる蛍光色素としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｈｙｐｅｒ５（ＧＥヘルスケア社）、“Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ”（登録商標）シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）等が挙げられる。また、アミノアリル基などの反応基を導入せず、非増幅産物と同様に、増幅したＲＮＡを直接蛍光標識する試薬を使用してもよく、その場合は上記の直接標識試薬を好ましく用いることができる。
【００５３】
蛍光標識された被験物質は、マイクロアレイなどの担体に固定化された選択結合性物質との結合反応に供される。被験物質と担体に固定化された選択結合性物質を結合させる方法としては、当業者に公知の方法が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション方法によって結合させることができる。また、核酸と選択結合性物質を結合させる場合の反応液についても、当業者に公知の組成が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション緩衝液を使用することができる。また、担体に固定化された選択結合性物質と結合した被験物質の結合の有無や、結合した被験物質量を検出する方法としては、当業者に公知の蛍光スキャナ装置により、核酸に標識した蛍光の強度を読み取ることで検出・測定することができる。
【実施例】
【００５４】
本発明を以下の参考例、実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５５】
参考例１
（ＲＮＡの蛍光標識操作における収量確認）
“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ２５ｋ  ｃｈｉｐ”（東レ株式会社）を使用してマイクロアレイ解析を行う場合、蛍光標識されたアンチセンス鎖ＲＮＡ（ａＲＮＡ）を１μｇ準備できることが好ましい。そこで、１μｇ以上の蛍光標識ａＲＮＡを得るための条件について検討した。ヒト胃凍結組織から抽出したＲＮＡを逆転写酵素（“ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ”（インビトロジェン社））を用いてＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、次にＤＮＡ合成酵素を添加してＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡに相補的なＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った。シリカベースのカラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製した後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）を４２℃、８時間行うことで、ａＲＮＡの増幅反応を行った。この反応を５回実施し、ａＲＮＡを計５０μｇ合成した。なお、ＩＶＴ反応の際に用いるＮＴＰ混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）に、アミノアリル（ＡＡ）基を付加したＵＴＰ（ＡＡ−ＵＴＰ）を添加することで、合成ａＲＮＡにＡＡ基を導入した。合成したＡＡ−ａＲＮＡ１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇにＣｙ５（ＧＥヘルスケア社）を標識する操作を各３回行った。各サンプルにおける標識後の回収量を表１に示す。マイクロアレイにより網羅的な遺伝子解析を行う際に１μｇの蛍光標識ａＲＮＡを得るには、未標識の増幅ａＲＮＡが２μｇ以上あればよいことが示された。
【００５６】
【表１】
2011200220.tif 000002
【００５７】
実施例１
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
ヒト胃組織のＦＦＰＥ標本３２検体から、それぞれ１０μｍ厚の薄切片を採取し、それぞれ１．５ｍＬのチューブに入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないようにキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないようにエタノールを十分に除去する操作を２回行った。チューブの蓋を開けた状態にして約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により測定した結果、ならびに“Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ”（アジレント・テクノロジー社）（以下、バイオアナライザと略す。）により１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）をそれぞれ算定した結果、さらに、各サンプルのＡ、Ｂの値から、Ｂ／Ａを求めたものを表２および３に、横軸にＡ、縦軸にＢ／Ａをとってプロットし、Ｂ／Ａ≦１のサンプルを“○”、Ｂ／Ａ＞１のサンプルを“×”として示したものを図１にそれぞれ示す。
【００５８】
（ＲＮＡの増幅）
Ｂ／Ａ≦１である１８サンプルについて、それぞれ１μｇから、逆転写酵素（“ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ”（インビトロジェン社））を用いてＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、次にＤＮＡ合成酵素を添加してＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡに相補的なＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った。シリカベースのカラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製した後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＩＶＴ）を４２℃、８時間行い、ａＲＮＡの増幅反応を行った。なお、本反応の際、参考例１と同様にして、ＡＡ−ＵＴＰを用いて増幅ａＲＮＡにアミノアリル基を導入した。シリカベースのカラムを用いて、増幅したａＲＮＡを精製した。増幅後の収量より算定した増幅倍率は表２に示すとおりすべてのサンプルで２倍以上であり、Ｂ／Ａ≦１を満足するサンプルは、本発明のＲＮＡの解析方法に適したサンプルであることがわかった。
【００５９】
（増幅ＲＮＡの蛍光標識、フラグメンテーション）
遠心濃縮機（株式会社トミー精工、ＭＶ−１００）を用いて各増幅ａＲＮＡ溶液を濃縮し、約１μＬとした。そこに“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”（東レ株式会社）のキットに添付のＳｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ添加してピペッティングにより攪拌し、さらにＤＭＳＯに溶解させたＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア社）を５μＬ加えてピペッティングにより攪拌して、４０℃で１時間インキュベートすることでカップリング反応させた。各反応溶液をゲルろ過スピンカラム（バイオラッド社）を用いて未反応のＣｙ５を除去、精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”（東レ株式会社）のキットに添付の“５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”をそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、９４℃で１５分間処理した。各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、“マイクロコンＹＭ−１０”（ミリポア社）で精製した。
【００６０】
（ハイブリダイゼーション）
Ｂ／Ａ≦１である１８サンプルについて、標識、精製後のａＲＮＡを、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）の“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ”を２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ”を２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ”（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社、ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社、ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００６１】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後のチップを洗浄した後、スキャナ（３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ（東レ株式会社））で蛍光シグナル値を測定することにより、有効スポット数を計数した。その結果、表２に示すとおり、有効スポット数は一様に高い結果であった。さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したＲＮＡについて同様の実験を行い、各ＦＦＰＥ標本由来ＲＮＡと共通の有効スポットについて、相関係数を算出した。ここで、相関係数とは、２つのデータの相互関係の強さを定量的に表す指標であって、−１から１の間をとり、正の値であれば正の相関、負の値であれば負の相関、ゼロの時は無相関という。一般に、絶対値が０．５以上なら相関がある、０．５未満なら相関がないと判断することができ、２つのデータの相関の度合いが強いほど、その絶対値は１に近づく。なお、相関係数を“Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ”（マイクロソフト）で求める場合は、「ｃｏｒｒｅｌ」という関数を使用すればよく、本実施例においても当該ソフトウェアを用いた。各サンプルにおける相関係数は表２に示すとおりであり、すべてのサンプルにおいて、凍結組織由来ＲＮＡとの高い正の相関関係が確認された。
【００６２】
比較例１
Ｂ／Ａ＞１である１４サンプルについて、それぞれ１μｇから、上記と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。増幅後の収量より算定した増幅倍率は表３に示すとおり２倍未満のサンプルがほとんどであり、ＲＮＡの標識化に支障をきたした。すなわち、Ｂ／Ａ＞１のサンプルは高い確率でＲＮＡの解析に供するのが困難であることがわかった。
【００６３】
【表２】
2011200220.tif 000003
【００６４】
【表３】
2011200220.tif 000004
【００６５】
実施例２
（ＦＦＰＥからのＲＮＡ抽出）
作成条件、保存期間の異なるマウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳、肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを表５のとおり準備した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ１０枚採取し、１．５ｍＬのチューブに５枚ずつ入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を沈殿させて除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）を算出した結果、ならびにＢ／Ａの値をそれぞれ表４の（ａ）および（ｂ）に示す。
【００６６】
（ＲＮＡの増幅）
各ＲＮＡサンプル１μｇを、実施例１と同様にして、アミノアリル化ａＲＮＡ（ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。このとき、マウス小脳、肝臓の凍結組織からそれぞれ抽出したＲＮＡも同様にして増幅した。増幅後の収量より算定した増幅倍率を表４に示す。Ｂ／Ａ≦１のサンプルはすべて増幅倍率が２倍以上であったのに対し、Ｂ／Ａ＞１のサンプルの増幅倍率は２倍未満であった。
【００６７】
（蛍光標識、フラグメンテーション）
上記で２倍以上増幅して得られたａＲＮＡについて、実施例１と同様にして蛍光標識、フラグメンテーションを行った。標識、精製後のａＲＮＡの収量を表４に示す。
【００６８】
（マイクロアレイ解析）
各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”（東レ株式会社）の“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ”を２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ｐｌｕｓ”を２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ”（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社、ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社、ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００６９】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、“ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）  ４０００Ｂ”）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。その結果、表４の（ａ）および（ｂ）に示すとおり、有効スポット数は各サンプル間で概ね同等であった。
【００７０】
【表４】
2011200220.tif 000005
【００７１】
参考例２
マウス小脳、肝臓、腎臓およびラット小脳、肝臓のＦＦＰＥから、実施例１と同様にしてそれぞれ抽出したＲＮＡを、バイオアナライザで電気泳動した際に算定されたＲＩＮと、各ＲＮＡサンプル１μｇから増幅したときの収量の関係について、図２ならびに表５の（ａ）〜（ｃ）にまとめた。その結果、ＲＩＮと収量の関係には相関関係がみられなかった。さらに、一部のサンプルについては、ＲＩＮを算定できなかったものもあった（表５において“Ｎ／Ａ”と表記）。よって、ＦＦＰＥをはじめとする固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡの場合、それらがＲＮＡの解析に適したサンプルであるかどうかをＲＩＮで判定するのは困難であることが示された。
【００７２】
【表５】
2011200220.tif 000006
【００７３】
実施例３
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
作成条件、保存期間の異なるマウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）について、１０％中性緩衝ホルマリンにより肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを表６のとおり準備した（サンプル（Ａ）〜（Ｄ））。各ブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ２枚採取し、１．５ｍＬのチューブに入れた。キシレン１ｍＬを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないようにキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないようにエタノールを十分に除去する操作を２回行った。チューブの蓋を開けた状態にして約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。ＲＮＡの収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）を算出した結果、ならびにＢ／Ａ、Ａ＋Ｂの値を表７に示す。なお、コントロールとして、マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）肝臓の新鮮凍結組織から抽出したＲＮＡを用いた。
【００７４】
（ＲＮＡの蛍光標識）
実施例１と同様のマウス肝臓ＦＦＰＥから、同様の手法で抽出したＲＮＡを、“ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｐｏｗｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ”（ＥＸＩＱＯＮ社）を用いて、キットのプロトコールに従い、各ＲＮＡ５００ｎｇをＣＩＰ処理した後、酵素反応によりＨｙ５色素を標識した。
【００７５】
（マイクロアレイ解析）
各５００ｎｇ分の標識ＲＮＡを含む溶液にヌクレアーゼフリー水を加えて、１５．４μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”（東レ株式会社）のＢｌｏｃｋ  Ｒｅａｇｅｎｔを０．６μＬ、ｍｉＲＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１０５μＬそれぞれ加えて混合し、減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）マウスｍｉＲＮＡチップ”（東レ株式会社）に１１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社、ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社、ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３２℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００７６】
反応後、チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、“ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂ”）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち２４個をバックグラウンド（ＢＧ）シグナル値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からＢＧシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。その結果、表７に示すとおり、Ｂ／Ａ≦１の検体ではコントロールとほぼ同等ないしやや多かった。一方、Ｂ／Ａ＞１の検体は有効スポット数がコントロールより少なく、検出できないｍｉＲＮＡがあることが示唆された。したがって、Ｂ／Ａの値より、解析可否を判断できることが示された。
【００７７】
（凍結組織から抽出したＲＮＡとのデータ比較）
さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したＲＮＡについて同様の実験を行い、各ＦＦＰＥ標本由来ＲＮＡと共通の有効スポットについて、相関係数を算出した結果を表７に示す。Ｂ／Ａ≦１のとき、凍結組織由来ＲＮＡとの高い正の相関関係が確認された。さらに、Ｂ／Ａ≦１かつＡが２５％以上であるサンプル（Ｃ）は、同一組織の新鮮凍結サンプルとの相関が０．９以上であり、非常に相関が高いことが示された。したがって、Ｂ／Ａの値より、解析の可否を事前に判断できることが示された。
【００７８】
【表６】
2011200220.tif 000007
【００７９】
【表７】
2011200220.tif 000008
【００８０】
実施例４
（マイクロアレイの作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製の基板を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学株式会社、＃３０５０Ｂ）を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００８１】
基板として、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に縦３９．４ｍｍ、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を９２４８箇所設けたポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）樹脂製基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部上面と平坦部上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）を０．５ｍｍとした。
【００８２】
上記の基板Ａを、１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃の温度で１２時間浸漬した。この基板Ａを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
【００８３】
上記のようにして準備した基板Ａに対し、次の条件で、選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてセンス鎖オリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとして、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）ＡＲＯＳ  Ｖ４．０（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、および０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調製したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液を、アレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子、Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、溶液をスポットした基板を、密閉したプラスチック容器に入れて、温度３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に、純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
【００８４】
選択結合性物質を固定化した上記の基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製したカバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを設けた。貫通孔の直径は０．８ｍｍとし、液面駐止用チャンバーの直径は２．０ｍｍとし、カバー部材の四隅に設置した。接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ２５μｍの両面テープを、カバー部材を縁取るようなサイズにカットし、厚さ（クリアランス）が５０μｍとなるように積層させて貼り付けた後、そのカバー部材を基板Ａに貼付した。
【００８５】
上記のようにしてカバー部材を貼付した基板Ａに、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空間部（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に封入した。微粒子の封入は、カバー部材の貫通孔から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、以下の検討に用いた。
【００８６】
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
実施例３と同様にして、作成条件、保存期間の異なるマウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックから薄切片を作製し、ＲＮＡを抽出した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）を算出した結果、ならびにＢ／Ａ、Ａ＋Ｂの値を表８に示す。なお、コントロールとして、マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）肝臓の新鮮凍結組織から抽出したＲＮＡを用いた。
【００８７】
（ＲＮＡの蛍光標識）
実施例３と同様にして抽出したＲＮＡを、“ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ”（ＫＲＥＡＴＥＣＨ）を用いて蛍光標識した。各ＲＮＡ１μｇをＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒで１６μＬにメスアップし、ＵＬＳ試薬および１０×ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ各２μＬを加えて、８５℃で３０分反応させ、ＰｌａｔｉｎｍＢｒｉｇｈｔ６４７色素をｍＲＮＡに標識した。付属の“ＫＲＥＡｐｕｒｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ”を用いて、未反応の色素を除去した。
【００８８】
（マイクロアレイ解析）
各固定組織に含まれるｍＲＮＡについて、以下の手順によりマイクロアレイで解析した。各１μｇ分の標識ＲＮＡを含む溶液にヌクレアーゼフリー水を加えて、１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを２μＬ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂを２３２μＬそれぞれ加えて混合し、減圧下で脱気した後、上記で作製した分析用チップに２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００８９】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、“ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂ”）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち３２個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて、各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。その結果、表８に示すとおり、Ｂ／Ａ≦１の検体は、新鮮凍結マウス肝臓組織から抽出したリファレンスＲＮＡと有効スポット数の差異が小さく、また両社の共通有効スポットにおける相関が高い傾向が確認された。さらに、Ａの値が大きいほど、その傾向は顕著であった。一方、Ｂ／Ａ＞１の検体は有効スポット数がリファレンスＲＮＡより少なく、検出できないｍＲＮＡが存在することが示唆された。
【００９０】
（凍結組織から抽出したＲＮＡとのデータ比較）
さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したＲＮＡについて同様の実験を行い、各ＦＦＰＥ標本由来ＲＮＡと共通のｍＲＮＡ有効スポットについて、相関係数を算出した。各サンプルにおける相関係数は表８に示すとおりであり、Ｂ／Ａ≦１のとき、凍結組織由来ＲＮＡとの高い正の相関関係が確認された。さらに、Ｂ／Ａ≦１かつＡが２５％以上であるサンプル（Ｃ）は、同一組織の新鮮凍結サンプルとの相関が０．９以上であり、非常に相関が高いことが示された。したがって、Ｂ／Ａの値より、解析可否を判断できることが示された。
【００９１】
【表８】
2011200220.tif 000009
【００９２】
実施例５
マウス小脳および肝臓組織のＦＦＰＥ標本から、それぞれ１０μｍ厚の切片を作成し、実施例１と同様の手法でＲＮＡを抽出した。実施例２と同様に、マウス小脳および肝臓の凍結組織から抽出したＲＮＡとともに、ＲＮＡ１μｇから増幅反応を行い、ａＲＮＡを得た。ＲＮＡの収量、純度、バイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）、ならびに増幅倍率を表９に示す。ａＲＮＡをＣｙ３（ＧＥヘルスケア社）で標識し、“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（アジレント・テクノロジー社）のハイブリダイゼーションバッファーと混合し、“Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４ｋ）”（アジレント・テクノロジー社）上で４０時間ハイブリダイズした。洗浄後、“Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ”（アジレント・テクノロジー社）でＤＮＡマイクロアレイのイメージを読み取り、“Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．９．５．３．１）”にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。その結果、表１３の通り、相関係数は小脳：０．８８、肝臓：０．８５と高いことが示された。
【００９３】
【表９】
2011200220.tif 000010
【００９４】
実施例６
実施例５で抽出したマウス小脳、肝臓のＦＦＰＥ由来ＲＮＡ、凍結組織由来ＲＮＡを用いて、実施例１と同様にして各ＲＮＡ５μｇから増幅反応を行い、ａＲＮＡを得た。このとき、アミノアリル基の代わりにビオチン基を導入した。増幅倍率を表１０に示す。ビオチン化ａＲＮＡと所定量のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、２０×Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ、２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ＤＭＳＯ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを混合し、９９℃で５分間処理後、４５℃で５分間処理した。さらに、１６，０００×ｇで５分間遠心した後、“Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  Ａｒｒａｙ”（アフィメトリクス社）にアプライして１６時間ハイブリダイゼーション反応させた。所定の方法で洗浄、染色した後、“ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ  Ｓｙｓｔｅｍ”（アフィメトリクス社）にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。その結果、表１５の通り、凍結組織と比較してＦＦＰＥの有効スポット数は少ない傾向にあったものの、両者の相関係数は小脳：０．８４、肝臓：０．８２であり、高い相関関係が確認された。
【００９５】
【表１０】
2011200220.tif 000011
【００９６】
実施例７
（固定組織からのＲＮＡ抽出）
マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳および肝臓を摘出し、１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液（ホルムアルデヒド４％）に２日間、室温で浸漬して固定後、パラフィン包埋してＦＦＰＥブロックを作製した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ採取し、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）を算出した結果、ならびにＢ／Ａの値を表１１に示す。すべてのサンプルでＢ／Ａ≦１であった。
【００９７】
（ＲＮＡの増幅）
抽出したマウス小脳、肝臓のＲＮＡ１μｇから、実施例１と同様に増幅し、アミノアリル基を導入したａＲＮＡを得た。分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により収量を求め、増幅倍率を算定した結果を表１１に示す。すべてのサンプルで増幅倍率は２〜２０倍の範囲内であった。
【００９８】
（増幅ＲＮＡの蛍光標識、フラグメンテーション、マイクロアレイ解析）
増幅した各ａＲＮＡについて、実施例１と同様にして蛍光標識、フラグメンテーションを行った後、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）の“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ”を２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ”を２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ”（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社、ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社、ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００９９】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、“ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂ”）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。有効スポット数を表１１に示す。同一組織における有効スポット数のバラつきが小さいことが示された。さらに小脳、肝臓の各遺伝子のシグナルの比（小脳／肝臓）より作成した散布図を図３に示す。この結果より、２回の実験の相関が高いことが示された。
【０１００】
【表１１】
2011200220.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のＲＮＡの解析方法を用いることで、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等、病院や研究機関に莫大な数量が保存されている固定組織または細胞の遺伝子の発現増減や発現有無に関する正確な情報を得ることができ、それらの情報は、医薬品開発や遺伝子検査、遺伝子診断技術等に幅広く活用できる。さらに、解析が困難なサンプルを事前に見極め、解析対象から除外することにより、試薬等のコスト削減にも結びつくため、産業上非常に有用である。
【図１】
2011200220.tif 000013
【図２】
2011200220.tif 000014
【図３】
2011200220.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月30日(2011.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後のチップを洗浄した後、スキャナ（３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ（東レ株式会社））で蛍光シグナル値を測定することにより、有効スポット数を計数した。その結果、表２に示すとおり、有効スポット数は一様に多い結果であった。さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したＲＮＡについて同様の実験を行い、各ＦＦＰＥ標本由来ＲＮＡと共通の有効スポットについて、相関係数を算出した。ここで、相関係数とは、２つのデータの相互関係の強さを定量的に表す指標であって、−１から１の間をとり、正の値であれば正の相関、負の値であれば負の相関、ゼロの時は無相関という。一般に、絶対値が０．５以上なら相関がある、０．５未満なら相関がないと判断することができ、２つのデータの相関の度合いが強いほど、その絶対値は１に近づく。なお、相関係数を“Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ”（マイクロソフト）で求める場合は、「ｃｏｒｒｅｌ」という関数を使用すればよく、本実施例においても当該ソフトウェアを用いた。各サンプルにおける相関係数は表２に示すとおりであり、すべてのサンプルにおいて、凍結組織由来ＲＮＡとの高い正の相関関係が確認された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
実施例５
マウス小脳および肝臓組織のＦＦＰＥ標本から、それぞれ１０μｍ厚の切片を作成し、実施例１と同様の手法でＲＮＡを抽出した。実施例２と同様に、マウス小脳および肝臓の凍結組織から抽出したＲＮＡとともに、ＲＮＡ１μｇから増幅反応を行い、ａＲＮＡを得た。ＲＮＡの収量、純度、バイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）、ならびに増幅倍率を表９に示す。ａＲＮＡをＣｙ３（ＧＥヘルスケア社）で標識し、“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（アジレント・テクノロジー社）のハイブリダイゼーションバッファーと混合し、“Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（４×４４ｋ）”（アジレント・テクノロジー社）上で４０時間ハイブリダイズした。洗浄後、“Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ”（アジレント・テクノロジー社）でＤＮＡマイクロアレイのイメージを読み取り、“Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．９．５．３．１）”にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。その結果、表９の通り、相関係数は小脳：０．８８、肝臓：０．８５と高いことが示された。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
実施例６
実施例５で抽出したマウス小脳、肝臓のＦＦＰＥ由来ＲＮＡ、凍結組織由来ＲＮＡを用いて、実施例１と同様にして各ＲＮＡ５μｇから増幅反応を行い、ａＲＮＡを得た。このとき、アミノアリル基の代わりにビオチン基を導入した。増幅倍率を表１０に示す。ビオチン化ａＲＮＡと所定量のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、２０×Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ、２×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ＤＭＳＯ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを混合し、９９℃で５分間処理後、４５℃で５分間処理した。さらに、１６，０００×ｇで５分間遠心した後、“Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  Ａｒｒａｙ”（アフィメトリクス社）にアプライして１６時間ハイブリダイゼーション反応させた。所定の方法で洗浄、染色した後、“ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ  Ｓｙｓｔｅｍ”（アフィメトリクス社）にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。その結果、表１０の通り、凍結組織と比較してＦＦＰＥの有効スポット数は少ない傾向にあったものの、両者の相関係数は小脳：０．８４、肝臓：０．８２であり、高い相関関係が確認された。
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月29日(2011.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの遺伝子発現解析を行うにあたり、解析前にＲＮＡを電気泳動して、そのパターンにより解析に適するか否かを判断し、解析に適すると判断したＲＮＡについて解析を行うことで、もとのＲＮＡの存在量に見合った妥当性の高いデータが得られること、また再現性の高いデータが得られることを見出し、本発明を完成させた。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（６）で構成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
（１）ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率をＡ（％）、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率をＢ（％）とするとき、該ＲＮＡが下式を満たすことを判定するステップを有する、ＲＮＡの解析方法。
式：Ｂ／Ａ≦１。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（６）前記固定液により固定された組織または細胞が、パラフィン包埋またはＯＣＴコ
ンパウンド包埋されてなる、（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡの解析方法。 
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明のＲＮＡの解析方法により、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡについて、もとの遺伝子の存在量を正確に反映した解析が可能となり、特にマイクロアレイ解析において好ましい効果が得られる。また、本発明のＲＮＡの解析方法により、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡが解析に適するか否かを、解析前に判定することができ、試薬等を無駄に使用することを未然に防ぐことができる。 
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の「ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液により固定された組織または細胞」とは、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液とよばれる溶液に組織、あるいは細胞を浸漬することで、生物試料をできるだけ自然の状態で維持するための処理、すなわち固定処理を施すことをいう。ここで用いられるホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液や、それら溶液にエタノール、メタノール等のアルコール類、アセトン、クロロホルム等を含む溶液が好適に使用され、また、これらの溶液を二種類以上混合して用いることも好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ホルムアルデヒド溶液は、市販のホルマリン（ホルムアルデヒド濃度３７％）を水で希釈したものを使用してもよいし、水で希釈した溶液のｐＨを炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等で中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用することも好ましい。また、悪臭、刺激臭を取り除き、濃度を調製したホルマリン溶液（商品名：マスクドホルム）を使用してもよい。なお、ホルムアルデヒド溶液中のホルムアルデヒド含量は、１〜３０％が好ましく、２〜２０％がより好ましい。パラホルムアルデヒド溶液は、パラホルムアルデヒドの粉末を水またはリン酸緩衝液などで溶解させたものや、水と少量の水酸化ナトリウムで溶解後、リン酸緩衝液等でｐＨを中性に調整したものを使用してもよいし、市販のパラホルムアルデヒド溶液を使用してもよい。その濃度は、１〜１０％が好ましく、２〜８％がより好ましい。 
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例２
（ＦＦＰＥからのＲＮＡ抽出）
作成条件、保存期間の異なるマウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）小脳、肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを準備した。各ＦＦＰＥブロックから、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片をそれぞれ１０枚採取し、１．５ｍＬのチューブに５枚ずつ入れた。そこにキシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約１０分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を沈殿させて除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。収量および純度（２６０ｎｍと２８０ｎｍの比）を分光光度計（サーモサイエンティフィック社、“Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ”（登録商標））により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量比率Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量比率Ｂ（％）を算出した結果、ならびにＢ／Ａの値をそれぞれ表４の（ａ）および（ｂ）に示す。 
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡの解析方法であって、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの重量の比率をＡ（％）、該ＲＮＡ全重量に対する電気泳動における４０００ヌクレオチドを超える範囲のＲＮＡの重量の比率をＢ（％）とするとき、該ＲＮＡが下式を満たすことを判定するステップを有する、ＲＮＡの解析方法。
式：Ｂ／Ａ≦１
【請求項２】
さらに前記比率Ａ（％）が２５％以上であることを判定するステップを有する、請求項１に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項３】
前記判定されたＲＮＡを増幅倍率２〜２０倍で増幅した増幅産物を解析する、請求項１または２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項４】
前記判定されたＲＮＡを非増幅により解析する、請求項１または２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項６】
前記固定液により固定された組織または細胞がパラフィン包埋またはＯＣＴコンパウンド包埋されてなる、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡの解析方法。