(57)【要約】【課題】  ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを工業的に高生産することが可能な微生物を遺伝子工学的に作製するためのポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドにより得られた微生物、および前記微生物を用いたＦｃγＲＩの製造方法を提供すること。【解決の手段】  ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含む発現ベクターを導入して酵母を形質転換することで得られる形質転換体、および前記形質転換体を用いたヒトＦｃγＲＩの製造方法により、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すポリヌクレオチドのうち、少なくとも６４番目から８６７番目までのポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドを含む、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
６４番目から８６７番目までのポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドが、配列番号３に示すポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを導入することで酵母を形質転換して得られる、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母。
【請求項５】
請求項４に記載の酵母を用いた、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃレセプターの一つであるＦｃγＲＩを酵母を用いて生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプターなどがある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（ＵｎｉＰｌｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までがシグナル配列および細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９０のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）または動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内に発現するため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化などの操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。さらに、ＦｃγＲＩ遺伝子を導入したプラスミドベクターでバチルス属細菌を形質転換することでＦｃγＲＩを発現させた例も知られている（特許文献２）が、バチルス属細菌はプロテアーゼ活性が高いため、生産されたＦｃγＲＩが分解されてしまう問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２０１４０３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献５】Ｄ．Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２
【非特許文献６】Ｍａｓａｙａ  Ｎａｇａｏ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，６７０，１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを工業的に高生産することが可能な微生物および前記微生物を遺伝子工学的に作製するためのポリヌクレオチドを提供することである。また、前記微生物を用いてＦｃγＲＩを製造する方法を提供することも、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、前記課題に関し鋭意検討した結果、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換後、変換したポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、前記ポリヌクレオチドを挿入したベクターにより形質転換した酵母を用いることで、可溶化などの操作が不要な活性型ヒトＦｃγＲＩを直接分泌発現させることができ、かつその発現量もヒト型コドンを用いたときと比較して向上することを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号１に示すポリヌクレオチドのうち、少なくとも６４番目から８６７番目までのポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドを含む、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
【００１２】
（２）６４番目から８６７番目までのポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドが、配列番号３に示すポリヌクレオチドである、（１）に記載のポリヌクレオチド。
【００１３】
（３）（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【００１４】
（４）（３）に記載の発現ベクターを導入することで酵母を形質転換して得られる、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な酵母。
【００１５】
（５）（４）に記載の酵母を用いた、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヒトＦｃレセプターの一つであるヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＢＣ１５２３８３の４番目から１１２５番目までのポリヌクレオチドに相当）のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド（配列番号１のアミノ酸番号２２のアラニン（Ａｌａ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）をコードするポリヌクレオチド）のコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドを含むことを特徴としており、前記６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドの好ましい態様として、配列番号３に示すポリヌクレオチドが例示できる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すポリヌクレオチドのうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在する酵母におけるレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、酵母の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換することにより得られる。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列解析などから推測することが可能であり、例えば、酵母の一種であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるレアコドンとしては、アルギニン（Ａｒｇ）ではＣＧＣ、ＣＧＡやＣＧＧが、アラニン（Ａｌａ）ではＧＣＧが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＧとＧＧＣが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＧが、それぞれあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）など）から得ることができる。なお、ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型から酵母型へのコドン変換は、実施例に記載のように、ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型から酵母型に変換（配列番号２）してもよいし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチドのうち６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドにあるレアコドンをヒト型から酵母型に変換（配列番号３）してもよい。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを作製するには、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組み合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／、非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）などを用いて、配列番号１に示すポリヌクレオチドに存在するレアコドンを酵母において利用頻度の高いコドンへ変換することで作製することができる。特に、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製すると好ましい。前記好ましい方法では、ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により前記オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよく、シグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。前記シグナルペプチドは、酵母細胞質内で発現した前記ペプチドを付加したヒトＦｃγＲＩが細胞膜を通過後、酵母が有するプロテアーゼによって前記ペプチドが切断されることで、細胞膜外にヒトＦｃγＲＩを分泌可能なペプチドであればよく、配列番号１のアミノ酸番号１から１５までの領域からなるオリゴペプチドや、配列番号１のアミノ酸番号１から２０までの領域からなるオリゴペプチドが例示できる。また、出芽酵母の性フェロモンであるαファクターも前記シグナルペプチドとして用いることができる。
【００２１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、発現したヒトＦｃγＲＩを簡便に精製するために有用なタグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。前記タグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、ヒトＦｃγＲＩとしての生物活性を損なわなければ、配列番号１に示すヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの、５’末端側に付加してもよいし、３’末端側に付加してもよい。前記タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ）などが例示できる。前記タグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、遺伝子工学的手法を用いた公知の方法で付加すればよい。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドを含む本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを公知のベクターの適切な位置に遺伝子工学的に挿入することにより得ることができる。前記公知のベクターとしては、酵母の形質転換に利用されるＹＥＰタイプのベクター、ＹＩＰベクター、ｐＲＳベクター、ｐＫＳベクターなどが例示できる。また、前記ベクターの適切な位置とは、ベクターの複製機能、所望の抗生物質耐性遺伝子、または伝達性に関わる領域を破壊しない位置のことをいう。
【００２３】
前記方法で作製した本発明の発現ベクターを導入して酵母を形質転換することにより、ヒトＦｃγＲＩを発現可能な本発明の酵母を得ることができる。形質転換に用いる酵母としては、通常遺伝子工学で用いる、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが例示できる。特に、胞子形成関連遺伝子が破壊され、かつプロテアーゼ遺伝子が破壊されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換用酵母として用いるのが好ましい。また、前記酵母を変異処理することにより誘導される酵母変異株を利用することもできる。前記酵母の変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線、放射線といった当業者が通常用いる公知の変異処理剤を利用して行なえばよい。酵母を形質転換する方法としては、実施例に記載した方法や、遺伝子工学の分野で通常用いられているエレクトロポレーション法、酢酸リチウム法などが例示できる。
【００２４】
ヒトＦｃγＲＩを発現可能な本発明の酵母は、前記酵母が増殖し、かつヒトＦｃγＲＩを発現可能な培地を用いて培養することで、ヒトＦｃγＲＩを製造することができる。培地の構成要素のうち、炭素源としては廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源としてはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕などの天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシンなどのアミノ酸類が、無機塩としてはリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムなどのリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンとしては塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどが、それぞれ使用できる。なお、本発明の発現ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含んでいる場合は、前記抗生物質を前記培地に添加すると、本発明の発現ベクターが導入された本発明の酵母を選択的に増殖できるため好ましい。例えば、本発明の発現ベクターがネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合はネオマイシンを、Ｇ４１８耐性遺伝子を含んでいる場合はＧ４１８を、それぞれ培地に添加して培養すればよい。さらに、前記培地には、前述した炭素源、窒素源、無機塩、金属イオン、ビタミン類の他に、適当な栄養源を添加してもよく、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を添加してもよい。
【００２５】
本発明の酵母を増殖させる際の培養温度は、概ね２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃であり、より好ましくは３０℃前後である。また、培地のｐＨは、概ね５から１０、好ましくは７前後である。培養時間は２４から９６時間、好ましくは４０から５０時間であるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度および通気量といった条件により変化するため、ヒトＦｃγＲＩの発現量や活性などを測定して決定するのが好ましい。
【００２６】
本発明の発現ベクターが酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ由来のプロモータを含んでいる場合は、培地中のグルコースの消費によりグルコース濃度が一定値以下になると前記プロモーターが活発に機能する。そのため、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ由来のプロモータを含んだ本発明の発現ベクターで形質転換した本発明の酵母を培養する場合は、培養液中のグルコース濃度を測定し、グルコース濃度減少後に引き続き培養することによりヒトＦｃγＲＩを発現させることができる。
【００２７】
本発明の酵母の培養液からヒトＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離により除去して得られる培養上清からヒトＦｃγＲＩを精製して取得すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により集菌後、酵素処理剤や界面活性剤などを添加して菌体を破砕し、その破砕液を精製することでヒトＦｃγＲＩを取得することができる。ヒトＦｃγＲＩを分離／精製する方法としては、当業者が通常用いる液体クロマトグラフィーを用いた方法があげられる。液体クロマトグラフィーによる分離／精製方法に特に限定はなく、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独または組み合わせて分離／精製すればよい。
【００２８】
本発明の酵母から得られたヒトＦｃγＲＩは、固定相に固定化することにより抗体を含んだ溶液を前記固定相に吸着させて分離することができる。ヒトＦｃγＲＩを固定化するための固定相としてはセルロース、アガロースなどの多糖類、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレンなどのプラスチック素材、ガラス、セラミックスなどが例示できる。また、ヒトＦｃγＲＩを固定相に固定したものをカラムに充填することにより抗体を分離／精製するためのクロマトグラフィーゲルとして用いることができる。さらに、ヒト血清を試料にすることにより特異性の高いイムノアッセイが可能であり各種診断材料としても利用することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換したポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドをベクターの適切な場所に挿入し、それを用いて酵母を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、ヒトＦｃγＲＩを可溶化などの操作なく大量に発現させることができる。そのため、本発明のヒトＦｃγＲＩ製造方法は、工業生産規模におけるＦｃγＲＩの生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図。
【図２】ヒトＦｃγＲＩのヒト型コドンと酵母型コドンとでヌクレオチド配列を比較した図。図中、Ｓ．ｃｅｒＦｃＲが酵母型コドンに変換したヒトＦｃγＲＩのヌクレオチド配列（配列番号２）、ＨｕｍａｎＦｃＲがコドン変換前のヒトＦｃγＲＩのヌクレオチド配列（配列番号１）である。
【図３】プラスミドベクターｐＫＳ１の構造、およびマルチクローニングサイトを示す図。
【図４】ヒトＦｃγＲＩを酵母で発現させるためのプラスミドベクターｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈの構築図。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３３】
実施例１  ヒトＦｃγＲＩをコードするヌクレオチド配列の設計
配列番号１に記載のヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのアミノ酸配列を基にＤＮＡｗｏｒｋｓ法（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／、非特許文献５）により、コドンを酵母型に変換した。前記方法によりコドンを酵母型に変換したヒトＦｃγＲＩのヌクレオチド配列（配列番号２）とコドン変換前のヒトＦｃγＲＩのヌクレオチド配列（配列番号１）とを比較した結果を図２に示す。図２に示す通り、アミノ酸配列はそのままにヌクレオチド配列の変換が行なわれ、ヌクレオチド配列間の類似性は８４％であった。
【００３４】
実施例２  ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの作製
ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型から酵母型に変換した配列からなるポリヌクレオチドを以下の方法で作製した。
（１）実施例１で設計した、コドンをヒト型から酵母型に変換したヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを作製するために、配列番号４から５１に示す配列からなるオリゴヌクレオチドを人工的に合成した。なお、前記オリゴヌクレオチドにより作製されるヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド（配列番号５２）は、その５’末端側に細胞外領域へ発現させるためのαファクターをコードするオリゴヌクレオチドを、その３’末端側には定量や精製を容易にするためのポリヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）をコードするオリゴヌクレオチドを、それぞれ付加している。
（２）（１）で合成したオリゴヌクレオチドから、下記に示す二段階のＰＣＲによりヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（２−１）一段階目のＰＣＲを下記に示す条件で行なった。なお、配列番号４から５１のオリゴヌクレオチド混合液とは５０ｐｍｏｌ／μＬの各オリゴヌクレオチド溶液を等量ずつ混合したものである。
【００３５】
（反応液組成）
水  ３３．５μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー（タカラバイオ社製）  １０μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社製）  ４μＬ
配列番号４から５１のオリゴヌクレオチド混合液  ２μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲポリメラーゼ（タカラバイオ社製）  ０．５μＬ
（反応条件）
９８℃で２分間熱処理後、９８℃で１０秒間−５７℃で５秒間−７２℃で９０秒間
の温度サイクルを２５回繰り返し、７２℃で４分間処理することで、ＰＣＲ反応を
行なった。
（２−２）二段階目のＰＣＲを下記に示す条件で行なった。
【００３６】
（反応液組成）
水  ３１．５μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー（タカラバイオ社製）  １０μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社製）  ４μＬ
（２−１）のＰＣＲ産物  ２μＬ
１０ｐｍｏｌ／μＬ  配列番号４のオリゴヌクレオチド溶液  １μＬ
１０ｐｍｏｌ／μＬ  配列番号５１のオリゴヌクレオチド溶液  １μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲポリメラーゼ（タカラバイオ社製）  ０．５μＬ
（反応条件）
９８℃で２分間熱処理後、９８℃で１０秒間−５７℃で５秒間−７２℃で９０秒間
の温度サイクルを２５回繰り返し、７２℃で４分間処理することで、ＰＣＲ反応を
行なった。
（２−２）のＰＣＲ産物を１％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのポリヌクレオチドバンド（約１１００塩基対）を確認することができた。
（３）前記ポリヌクレオチドバンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、キアゲン社製）後、制限酵素ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩにより消化し、ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、キアゲン社製）にて精製した。
（４）あらかじめＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩで制限酵素消化し、アルカリフォスファターゼ処理したプラスミドｐＫＳ１（コスモバイオ社製、図３）に、（３）で制限酵素処理したポリヌクレオチドを挿入することで、クローニングした。
（５）クローニングしたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ培地（トリプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／Ｌ）にて培養し、プラスミドを抽出した。作製したプラスミドベクター（ｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈ）の構造を図４に示す。
【００３７】
実施例３  ヌクレオチド配列の確認
実施例２で作製したプラスミド（ｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈ、図４）中の挿入したポリヌクレオチドの配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なおシークエンス用プライマーとして、配列番号５３（５’−ＡＴＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＣ−３’）および５４（５’−ＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＣ−３’）からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３８】
解析の結果、実施例２で作製したプラスミドベクター（ｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈ）に挿入したポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。プラスミドｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈにより発現される、ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号５５に示す。なお、前記配列にはシグナルペプチド（αファクター）配列（アミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から８９のアラニン（Ａｌａ）までの配列）およびポリヒスチジン配列が含まれている。
【００３９】
実施例４  酵母形質転換体の作製および培養
実施例３で配列を確認したプラスミドベクター（ｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈ、図４）を用いて以下に示す方法により、酵母を形質転換した。
（１）ＰＤ培地（ペプトン  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０ｇ／Ｌ、グルコース  ２０ｇ／Ｌ）１０ｍＬに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＳＹ−５株、コスモバイオ社製）を植菌し、３０℃で１５時間振とう培養した。
（２）濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．８から１．０になったことを確認後、遠心分離により上清を取り除き、ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（フナコシ社製）に添付のＥＺ１液を１０ｍＬ加えて懸濁し、再度遠心分離した。
（３）上清を取り除いたペレットに対して前記ｋｉｔに添付のＥＺ２液を１ｍＬ加えて再懸濁し、それを５０μＬずつ分注することで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＳＹ−５株のコンピテントセルを調製した。
（４）（３）のコンピテントセル５０μＬに実施例２で作製したプラスミド（ｐＫＳ＿ＡＦｓｃＦｃＲ６Ｈ、図４）１μｇを加え、前記ｋｉｔに添付のＥＺ３液５００μＬを加えて混合し、３０℃で４５分間振とう培養した。
（５）（４）の培養液をＹＰＤプレート（ペプトン  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０ｇ／Ｌ、グルコース  ２０ｇ／Ｌ、寒天  １３ｇ／Ｌ、Ｇ４１８  １００μｇ／ｍＬ）に１００μＬ塗布後、３０℃で３日間静置培養し、形質転換体を作製した。
（６）育成したコロニーを選択し、Ｇ４１８含有ＹＰＤ培地５ｍＬを入れた５０ｍＬコニカルチューブに植菌し、３０℃で振とう培養した。
（７）適度に育成した時点（約６時間培養後）で、Ｇ４１８含有ＹＰＤ培地２０ｍＬを入れた５０ｍＬコニカルチューブ中に全量植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。
（８）ＯＤ６００ｎｍが０．２となるよう、Ｇ４１８含有ＹＰＤ培地３０ｍＬを入れた５０ｍＬ三角フラスコへ植菌し、３０℃で１６０ｒｐｍにて振とう培養した。
（９）ＯＤ６００ｎｍが０．８となったところでサンプリングを行ない、発現前のコントロール試料とした。２４時間培養後、グルコース濃度が０ｇ／Ｌであることを確認し、培養液を回収した。
（１０）（９）の培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）により菌体と培養上清に分離した。
【００４０】
比較例１  非酵母型コドンからなるヒトＦｃレセプターをコードするポリヌクレオチドを用いたヒトＦｃレセプターの生産
実施例２から４で示した酵母型コドンからなるヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを用いたヒトＦｃγＲＩの生産と比較するため、ヒト型コドンからなるヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）を用いたヒトＦｃγＲＩの生産を実施例２および４と同様な方法で行なった。
【００４１】
実施例５  酵母形質転換体培養上清の抗体結合活性評価
実施例４で調製した酵母形質転換体の培養上清を下記に示すＥＬＩＳＡ反応により抗体結合活性を評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬに希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することにより固定した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３）同様に、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、実施例４で調製した培養上清または比較例１で調製した培養上清を１００μＬ添加し、固定化したガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
結果を表１に示す。表１に示す通り、酵母型コドンからなるヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを用いて得られた酵母形質転換体（実施例２から４）でのヒトＦｃγＲＩ発現量（培養上清中の抗体結合活性）は、ヒト型コドンからなるヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを用いて得られた酵母形質転換体（比較例１）での発現量と比較し、有意に高いことが明らかとなった。すなわち、ヒトＦｃγＲＩを酵母において発現させる場合、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型（非酵母型）から酵母型に変換したポリヌクレオチドの方が、ヒトＦｃγＲＩ発現量が３．０μｇ／Ｌから３．６μｇ／Ｌに発現量が向上することが確認できた。前記結果は、宿主（酵母）にとっては、非酵母型コドンであるヒト型コドンを利用するより酵母型コドンを利用した方がタンパク質を高発現に生産できるため、従来技術と比較しタンパク質の生産に有用であるといえる。
【００４３】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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