(57)【要約】【課題】核酸クローニングについての改善されたシステムの提供。【解決手段】本発明は、核酸を互いに連結するための改善された系を提供する。詳細には、本発明は、レシピエント分子に容易かつ直接連結され得る、ＤＮＡ生成物分子を生成するための技術を提供する。本発明はさらに、生成物分子の方向付けられた連結（すなわち、分子のコレクション内の特定の分子の選択的連結）のための方法を提供する。本発明はまた、エキソンシャッフリングの方法を提供し、ここで複数の異なる生成物分子は、単一の連結反応において生成される。本発明のＤＮＡ操作系は、他の核酸操作系（例えば、リボザイム媒介系）に容易に組み込まれ、そしてまた自動化も可能である。【選択図】図２５
2011200257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、同時係属中の米国仮出願番号０９／２２５，９９０および同６０／１１４，９０９（これらの出願の各々は、１９９９年１月５日に出願された）に対して、優先権を主張する。これらの出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（合衆国政府の補助金）
本明細書中に記載される研究のいくつかまたはすべては、米国国立衛生研究所からの助成金番号ＲＯ１  ＧＭ  ５２４０９、および全米科学財団からの助成金番号ＭＣＢ９６０４４５８によって援助された；合衆国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
分子生物学の革命は、二本鎖ＤＮＡを切断し得、その結果、ＤＮＡフラグメント（このＤＮＡフラグメントは、互いに連結されて新規ないわゆる「組換え」ＤＮＡ分子を生成し得る）が産生される、酵素の発見と共に始まった（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７０：１２９３、１９７３；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７０：３２７４、１９７３を参照のこと；米国特許第４，７４０，４７０号；同第４，４６８，４６４号；同第４，２３７，２２４号もまた参照のこと）。この革命は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発見によって拡張された。このＰＣＲは、特定のＤＮＡセグメントの迅速な増幅を可能にし、続いて切断され得、そして他のＤＮＡ分子に連結され得る大量の物質を産生する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；５，３３３，６７５号を参照のこと）。
【０００４】
しかし、これらの消化および増幅技術の能力にも関わらず、実質的な改善の余地が残っている。「制限酵素」と呼ばれる消化酵素に対する依存性は、分子生物学的実験を非常に高価にし得る。さらに、これらの酵素の多くは、効率的ではないか、または所望されない要素が夾雑し得る粗調製物においてのみ利用可能である。
【０００５】
最初に、ＰＣＲ増幅は、伝統的な切り貼り（ｃｕｔ−ａｎｄ−ｐａｓｔｅ）クローニング法に付随する多くの困難さをそれ自体避け得るようであった。なぜなら、ＰＣＲは、最初に制限酵素で切断されることなしに、他の分子に直接連結され得るＤＮＡ分子を生成すると考えられたからである。しかし、経験によって、大部分のＰＣＲ生成物は、直接的クローニングに抵抗性であることが示されている。この観察についての１つの可能性のある説明は、多くの好熱菌のＤＮＡポリメラーゼ（最も一般に使用される酵素であるＴａｑを含む）が、末端の３’−ｄＡＭＰ残基をそれらが増幅する生成物に付加することを示す研究から生じた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、最近、その３’−ｄＡＭＰ残基が連結される分子が単一の不対３’−ｄＴＭＰ残基を含むようにプロセスされる場合に、このような末端ｄＡＭＰタグ化生成物を直接的にクローニングするためのシステム（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（登録商標）；米国特許第５，４８７，９９３号）を開発した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのシステムは、非常に有用であると判明したが、単一のヌクレオチドオーバーハング（Ａ残基）のみを有する生成物の連結に制限されることによってそれ自体は適用において限定され、そして、連結されるＤＮＡ分子の３’末端においてオーバーハングが存在しなくてはならないという点においてさらに制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸クローニングについての改善されたシステムの開発の必要性が存在する。特に所望されるシステムは、制限酵素に最小の依存性を有するＤＮＡ連結を可能にし、効率的な連結を提供し、そして広範な種々の化学構造を有するＤＮＡの連結のために一般に有用である。最適なシステムは、方向付けられた連結（すなわち、一緒に連結されるＤＮＡ分子が、互いに１つの方向でのみ結びつけられる連結）さえ提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、核酸を互いに連結するための改善されたシステムを提供する。詳細には、本発明は、レシピエント分子に容易かつ直接的に連結され得るＤＮＡ生成物分子を産生するための技術を提供する。その生成物分子は、そのような連結を受けるために制限酵素を用いて切断される必要がない。本発明の好ましい実施形態において、そのＤＮＡ生成物分子は、反復するＤＮＡ合成反応を通して生成され、その結果、生成物分子が増幅された生成物分子である。
【０００８】
本発明のシステムは、３’オーバーハングを有するか、５’オーバーハングを有するか、またはオーバーハングを有さない生成物分子を生成するための技術および試薬を提供し、そしてさらに、これらの生成物分子をレシピエント分子と連結するためのツールを提供する。ここでオーバーハングが利用され、オーバーハングの長さおよび配列は、実施者の要求に従って変化され得る。オーバーハングを含有する生成物は、任意の利用可能な手段（例えば、酵素的連結または宿主細胞への形質転換を含む）によって互いに連結され得る。例えば、少なくとも１２ヌクレオチドのオーバーハングを含有する分子は、互いにアニーリングされ得、そして最初に連結されることなしにＥ．ｃｏｌｉへの形質転換によって互いに連結され得る（例えば、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎら、Ａｎｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０６：９１、１９９２を参照のこと）。
【０００９】
本発明のシステムはさらに、生成物分子の方向付けられた連結のための方法（すなわち、分子の収集物中の特定の分子の選択的連結のための方法）を提供し、複数の異なる生成物分子が単一の連結反応中で産生される、エキソンシャッフリングの方法もまた提供する。本発明の好ましい実施形態は、機能的なタンパク質ドメイン、特に、保存された遺伝子ファミリー中で天然に見出されるドメインをコードする生成物分子の連結を包含する。本発明の代替的なまたはさらなる好ましい実施形態は、複数成分の連結反応を包含し、ここでは３つ以上の核酸分子が互いに連結される。いくつかの実施形態において、これらの複数の分子は、単一の配置でのみ連結され；他の場合では、複数の配置が達成され得る。
【００１０】
本発明のＤＮＡ操作システムは、他の核酸操作システム（例えば、リボザイム媒介システム）を用いて容易に組み込まれ得、そしてまた自動化が可能である。詳細には、１つの局面において、ＲＮＡからなる一本鎖オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ分子が提供される。さらに、別の局面において、核酸分子のライブラリーが提供され、ここでライブラリーの各メンバーは、１）ライブラリーのすべてのメンバーに共通である少なくとも１つの核酸部分；および２）ライブラリーの異なるメンバーにおいて異なる、少なくとも２つの核酸部分を含む、核酸分子のライブラリーもまた、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、ライブラリーの核酸部分の各々はタンパク質コード配列をコードし、そして各ライブラリーメンバーは、連続するポリペプチドをコードする。なお別の特に好ましい実施形態において、変動する核酸部分の各々は、タンパク質の機能的ドメインをコードする。この機能的ドメインは、好ましくは、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子ファミリー、動物の脂肪酸シンターゼ遺伝子ファミリー、ポリケチドシンターゼ遺伝子ファミリー、ペプチドシンテターゼ遺伝子ファミリー、およびテルペンシンターゼ遺伝子ファミリーからなる群より選択される遺伝子ファミリーにおいて天然に見出されるものである。
【００１１】
本発明のなお別の局面において、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法が提供される。上記の方法は以下の工程を包含する：１）第１の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程であって、この二本鎖ＤＮＡ分子は、ＲＮＡからなる少なくとも１つの一本鎖オーバーハングを含む、工程；２）第２の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程であって、この二本鎖ＤＮＡ分子は、上記第１の二本鎖ＤＮＡ分子上のＲＮＡオーバーハングに相補的な少なくとも１つの一本鎖オーバーハングを含む、工程；および３）上記第１の二本鎖ＤＮＡ分子および上記第２の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに連結し、その結果、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子が産生される、工程。特定の好ましい実施形態において、この方法は、少なくとも３つの二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程および連結する工程を包含する。
【００１２】
本発明のさらなる局面は、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法を包含し、上記方法は以下の工程を包含する：１）第１および第２のプライマーの伸長によって第１の二本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程であって、上記第１および第２のプライマーの少なくとも１つは、伸長反応の間にコピーされない少なくとも１つの塩基を含み、その結果、上記伸長反応は、第１のオーバーハングを含む生成物分子を産生する、工程；２）上記第１のオーバーハングに相補的な第２のオーバーハングを含む第２の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程；および３）上記第１の二本鎖ＤＮＡ分子および第２の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに連結し、その結果、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子が産生される工程。特定の好ましい実施形態において、この方法は、少なくとも３つの二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程および連結する工程を包含する。
【００１３】
本発明のなおさらなる局面において、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法が提供され、上記方法は以下の工程を包含する：１）第１および第２のプライマーの伸長によって第１の二本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程であって、上記第１および第２のプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの潜在的な切断点を含む、工程；２）第１の二本鎖ＤＮＡ分子を、上記潜在的な切断点で切断可能なプライマーの切断を生じる条件に曝して、その結果、上記第１のオーバーハングが、上記第１のＤＮＡ分子上で生成する、工程；３）上記第１のオーバーハングに相補的な第２のオーバーハングを含む第２の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程；および４）上記第１および第２の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに連結し、その結果、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子が産生される工程。特定の好ましい実施形態において、この方法は、少なくとも３つの二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程および連結する工程を包含する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）ＲＮＡからなる一本鎖オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ分子。
（項目２）核酸分子のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーは、
ライブラリーのすべてのメンバーに共通である少なくとも１つの核酸部分；および
ライブラリーの異なるメンバーにおいて異なる、少なくとも２つの核酸部分
を含む、核酸分子のライブラリー。
（項目３）前記ライブラリーの核酸部分の各々が、タンパク質コード配列をコードし、そして各ライブラリーメンバーは、連続するポリペプチドをコードする、項目２に記載のライブラリー。
（項目４）前記変動する核酸部分の各々が、タンパク質の機能的ドメインをコードする、項目３に記載のライブラリー。
（項目５）前記機能的ドメインが、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子ファミリー、動物の脂肪酸シンターゼ遺伝子ファミリー、ポリケチドシンターゼ遺伝子ファミリー、ペプチドシンテターゼ遺伝子ファミリー、およびテルペンシンターゼ遺伝子ファミリーからなる群より選択される遺伝子ファミリーにおいて天然に見出されるものである、項目４に記載のライブラリー。
（項目６）ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法であって、該方法は以下の工程：
第１の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程であって、この二本鎖ＤＮＡ分子は、ＲＮＡからなる少なくとも１つの一本鎖オーバーハングを含む、工程；
第２の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程であって、この二本鎖ＤＮＡ分子は、上記第１の二本鎖ＤＮＡ分子上のＲＮＡオーバーハングに相補的な少なくとも１つの一本鎖オーバーハングを含む、工程；および
上記第１の二本鎖ＤＮＡ分子および上記第２の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに連結し、その結果、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子が産生される、工程
を包含する、方法。
（項目７）ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法であって、該方法は以下の工程：
第１および第２のプライマーの伸長によって第１の二本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程であって、上記第１および第２のプライマーの少なくとも１つは、伸長反応の間にコピーされない少なくとも１つの塩基を含み、その結果、上記伸長反応は、第１のオーバーハングを含む生成物分子を産生する、工程；
上記第１のオーバーハングに相補的な第２のオーバーハングを含む第２の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程；および
上記第１の二本鎖ＤＮＡ分子および第２の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに連結し、その結果、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子が産生される工程
を包含する、方法。
（項目８）ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子を生成する方法であって、該方法は以下の工程：
第１および第２のプライマーの伸長によって第１の二本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程であって、上記第１および第２のプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの潜在的な切断点を含む、工程；
第１の二本鎖ＤＮＡ分子を、上記潜在的な切断点で切断可能なプライマーの切断を生じる条件に曝して、その結果、上記第１のオーバーハングが、上記第１のＤＮＡ分子上で生成する、工程；
上記第１のオーバーハングに相補的な第２のオーバーハングを含む第２の二本鎖ＤＮＡ分子を提供する工程；および
上記第１および第２の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに連結し、その結果、ハイブリッド二本鎖ＤＮＡ分子が産生される工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、３’オーバーハングを有するＤＮＡ生成物分子を生成するための本発明のプロセスを示す。
【図２】図２は、テンプレート分子を、少なくとも１つのリボヌクレオチドプライマーを含む１つ以上のプライマーとハイブリダイズさせることによって、５’オーバーハングを産生するためのプロセスを示す。
【図３】図３は、１つ以上の５’オーバーハングを有するＤＮＡ生成物分子を生成するための本発明のプロセスを示す。
【図４−１】図４は、１つ（図４Ａ）またはそれより多い（図４Ｂ）５’オーバーハングを有するＤＮＡ生成物分子を生成するための代替的な本発明のプロセスを示す。
【図４−２】図４は、１つ（図４Ａ）またはそれより多い（図４Ｂ）５’オーバーハングを有するＤＮＡ生成物分子を生成するための代替的な本発明のプロセスを示す。
【図５】図５は、平滑末端を有する分子の連結を可能にするプロセスを示す。
【図６】図６は、組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子ファミリーのメンバーを示す。
【図７】図７は、ヒトおよび動物の障害の処置のための薬物として現在使用されている特定のポリケチド化合物の一覧を示す。
【図８】図８は、エリスロマイシンおよびラパマイシンの産生の原因である細菌のポリケチドシンターゼ遺伝子の異なる機能的ドメインを示す。
【図９】図９は、エリスロマイシンおよびラパマイシンの産生の原因である細菌のポリケチドシンターゼ遺伝子の異なる機能的ドメインを示す。
【図１０】図１０は、特定のモジュラーポリケチドシンターゼ遺伝子のタンパク質機能的ドメインを示す。
【図１１】図１１は、薬剤として現在使用されているペプチドシンテターゼによって生成される生成物の一覧を示す。
【図１２】図１２は、特定のモジュラーペプチドシンテターゼ遺伝子のタンパク質機能的ドメインを示す。
【図１３】図１３は、ｓｒｆＡペプチドシンテターゼオペロンの構造を示す。
【図１４】図１４は、イソプレンビルディングブロックの重合を通してのイソプレノイドの合成を示す。
【図１５】図１５は、イソプレノイド、またはテルペンシンターゼによって触媒される、特定の環化および分子間結合形成を示す。
【図１６】図１６は、イソプレノイドシンターゼ中の天然のエキソンと機能的ドメインとの間の対応の概略図を表す。
【図１７】図１７は、方向付けられた連結反応の１つの一般的な例を示す。
【図１８】図１８は、本発明の特定の方向付けられた連結反応の模式図を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、Ｆｌｉｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６４８２９）として公知のグルタミン酸レセプターエキソンのヌクレオチド配列を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ｆｌｏｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６４８３０）として公知の利用されるグルタミン酸レセプターエキソンのヌクレオチド配列を示す。
【図２０】図２０は、本発明の方向付けられた連結反応において産生される増幅されたハイブリッド分子を示す。
【図２１】図２１は、図２０のハイブリッド分子における連結接合部のヌクレオチド配列を示す。
【図２２−１】図２２は、ヒトβグロビン遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図２２−２】図２２は、ヒトβグロビン遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図２２−３】図２２は、ヒトβグロビン遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図２３】図２３は、本発明の同一性エキソンシャッフリング反応を示す。
【図２４】図２４は、本発明の位置的エキソンシャッフリング反応を示す。
【図２５】図２５は、特定の本発明の方向付けられた連結技術のコンビナトリアルポテンシャルを示す。
【図２６】図２６は、本発明に従う、組み合わせたプライマーに基づく／リボザイム媒介核酸操作スキームの１つのバージョンを示す。
【図２７】図２７は、特定の本発明の方法の実施において利用され得るロボットシステムを示す。
【図２８】図２８は、３’オーバーハングを含む本発明の生成物分子を利用する方向付けられた連結反応の模式図を示す。
【図２９】図２９は、本発明の反応におけるプライマーの複製および／または連結の成功を決定するために使用され得る特定のバイオアッセイ技術の概略を示す。
【図３０】図３０は、リボザイムに媒介される方向付けられた連結反応を示す。
【図３１】図３１は、図３０の反応において利用される構築物を示す。
【図３２】図３２は、図３０の反応の生成物を示す。
【図３３】図３３は、図３０の反応の生成物を示す。
【図３４】図３４は、ＤＮＡオーバーハングクローニング（「ＤＯＣ」）を使用して生成される種々のキメラを示す。親の遺伝子を、１行目および２行目に示す。５つのキメラ遺伝子を、親の遺伝子の下に示す。ぎざぎざの端は、イントロン１３および１５の部分のみが増幅されたことを示す。キメラ遺伝子の長さ（塩基対で）が同定される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（定義）
「クローニング」−−用語「クローニング」は、本明細書中で使用される場合、事前に連結されていない核酸断片が互いに連結することを通じての新規な核酸分子の産生を意味する。このような連結によって産生される分子は、複製される前においてでさえ、本願の目的のための「クローン」と見なされる。
【００１６】
「方向付けられた連結」−−用語「方向付けられた連結」とは、本明細書中で生成物分子に適用される場合、制限酵素で最初に切断されることなく、生成物分子が１つ以上のレシピエント分子に連結され得ることを意味する。好ましくは、生成物分子のプロセシングは、連結に先立って、全く必要とされない。
【００１７】
「発現」−−核酸配列の「発現」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、１つ以上の（ｉ）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生；（ｉｉ）ｍＲＮＡを産生するプレｍＲＮＡのプロセシング（例えば、スプライシングおよび／または３’末端形成）；および（ｉｉｉ）ｍＲＮＡの翻訳が生じたことを意味する。
【００１８】
「遺伝子」−−本発明の目的のために、用語「遺伝子」とは、その当該分野で理解されている意味を有する。しかし、当業者は、用語「遺伝子」が、当該分野で種々の意味を有し、いくつかの遺伝子は、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列を含み、そして他の遺伝子は、コード配列に限定されないことを理解する。当該分野の「遺伝子」の定義は、タンパク質をコードしないが、むしろ機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ）をコードする核酸に対する言及することもさらに理解され得る。明確にする目的のために、本発明者らは、本明細書中で使用されるように、用語「遺伝子」は、一般的に、タンパク質をコードする核酸の一部をいうことに注目する；この用語は、必要に応じて、調節配列を含み得る。この定義は、用語「遺伝子」の非タンパク質コード発現単位への適用を除外することを意図するのではないが、むしろ、大部分の場合において、この文書において使用される場合、この用語は、たまたまタンパク質コード核酸に適用されることを明らかにすることを意図する。
【００１９】
「遺伝子フラグメント」−−「遺伝子フラグメント」は、この用語が本明細書中で使用される場合、完全なタンパク質コード分子よりも短いタンパク質コードＤＮＡ分子の断片を意味する。好ましくは、このフラグメントは、少なくとも約１２塩基長、より好ましくは、少なくとも約１５〜２０塩基長であり、そして少なくとも数百から数千塩基対長であり得る。このフラグメントは、タンパク質コード配列を含む必要はないが、むしろもともとの遺伝子の非コード配列を表し得ることが理解されるべきである。
【００２０】
「ハイブリッド核酸」−−「ハイブリッド核酸」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む核酸分子を意味し、これらの各々は、天然に存在するが、天然において他と直接的に連結され、この第１および第２のセグメントが、ハイブリッド核酸において互いに直接的に連結される。
【００２１】
「オーバーハング配列」−−「オーバーハング配列」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、二本鎖領域から突き出した核酸の一本鎖領域を意味する。
【００２２】
「プライマー」−−用語「プライマー」とは、本明細書中で使用される場合、テンプレート核酸分子に対して伸長された能力によって特徴付けられるポリヌクレオチド分子をいい、その結果、その配列がテンプレート分子の少なくとも一部の配列と相補的であるポリヌクレオチド分子が、プライマーと連結される。好ましいプライマーは、少なくとも約１５ｎｔ長である。特に好ましいプライマーは、約１８〜３０の範囲内の長さを有し、好ましくは約２０ヌクレオチドよりも長い。
【００２３】
「生成物分子」−−「生成物分子」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載されるように産生される核酸分子である。好ましくは、この生成物分子は、本発明に従うオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって産生される。生成物分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の特定の好ましい実施形態において、二本鎖部分を含む生成物分子はまた、一本鎖の３’オーバーハングまたは５’オーバーハングを含む。他の好ましい実施形態において、生成物分子は平滑末端を有する。生成物分子が、反復するＤＮＡ合成反応において産生される場合（例えば、ＰＣＲ反応）、これは、「増幅生成物」といわれる。
【００２４】
「レシピエント分子」−−「レシピエント分子」は、この用語が本明細書中で使用される場合、生成物分子が連結される核酸分子である。レシピエント分子は、ベクターであり得るが、ベクターであることが必須であるわけではない。一般的に、レシピエント分子は、実施者によって選択される任意の分子であり得る。
【００２５】
「ベクター」−−「ベクター」は、この用語が本明細書中で使用される場合、分子のインビボまたはインビトロ複製を方向付けるに十分な配列を含む核酸分子である。ベクターがインビボ複製配列を含む場合、これらの配列は、自己複製配列、または細胞内にすでに存在する別の核酸へのベクターの組込みを方向付けるに十分な配列であり得、その結果、ベクター配列は、すでに存在する核酸の複製の間に複製される。このようなすでに存在する核酸は、細胞に対して内因性であり得るか、または実験的操作を通して細胞に導入され得た。好ましいベクターは、外来性核酸分子（好ましくは、本発明の生成物分子）がベクターに導入および連結され得るクローニング部位を含む。特に好ましいベクターは、ベクターに導入された核酸配列のインビボ発現またはインビトロ発現を方向付けるそれらの能力について選択される制御配列をさらに含む。このような制御配列には、例えば、転写制御配列（例えば、１つ以上のプロモーター、調節結合部位、エンハンサー、ターミネーターなど）、スプライシング制御配列（例えば、１つ以上のスプライシングドナー部位、スプライシングアクセプター部位、スプライシングエンハンサーなど）、および翻訳制御配列（例えば、シャイン  ダルガルノ配列、開始コドン、終止コドンなど）を含み得る。ベクターはまた、いくつかのコード配列を含み得、その結果、ベクターに導入された配列の転写および翻訳は、融合タンパク質の産生を生じる。
（特定の好ましい実施形態の説明）
（３’オーバーハングを有する生成物分子）
１つの局面において、本発明は、レシピエント分子に直接連結され得る３’オーバーハングを有する生成物分子を生成するための試薬および方法を提供する。３’オーバーハングの長さおよび配列は、使用者によって決定され得る。
【００２６】
図１は、本発明のこの局面の１つの実施形態を示す。この図において示されるように、テンプレート核酸分子の標的領域に隣接する第１のプライマーおよび第２のプライマーが提供される。少なくともプライマーの１つは、その５’末端に１つ以上のリボヌクレオチドを含む。詳細には、プライマー１がｘヌクレオチド長であり、プライマー２がｙヌクレオチド長であるならば、ｎ１＝０〜ｘの全体数（０を含む）であり、そしてｎ２＝０〜ｙの全体数（０を含む）である。但し、（ｉ）ｎ１およびｎ２は、両方とも０ではあり得ないこと；および、伸長反応において使用されるＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡプライマーを伸長し得る場合、（ｉｉ）ｎ１は単にｘであり得ること（またはｎ２は単にｙであり得ること）を除外する。ＤＮＡポリメラーゼの広範な種々の特徴（例えば、ＲＮＡが単独で、またはハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ分子の一部として示されるか否かに関わらず、ＲＮＡプライマーを伸長する能力、ＲＮＡをＤＮＡにコピーする能力）は、当該分野で周知である（例えば、製造業者のカタログ、Ｍｙｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：７６６１、１９９１を参照のこと）。そしてこのような特徴が特定のＤＮＡポリメラーゼについて公知でない場合、慣用的なアッセイは、これらを決定するために利用可能である（例えば、Ｂｅｂｅｎｅｋら、Ｍｅｔ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６２：２１７、１９９５を参照のこと；実施例３もまた参照のこと）。
【００２７】
本発明の特定の好ましい実施形態において、プライマー１および２の各々は、少なくとも１つの５’末端リボヌクレオチド残基を含む。他の好ましい実施形態において、少なくとも１つのプライマーは、少なくとも２つのリボヌクレオチド残基を含み、これらのうちの１つは、５’末端残基である。このプライマーは、少なくとも３、４、５、６〜１０、またはそれよりも多くのリボヌクレオチド残基を含み得、そしてさらに、上記のように、完全にＲＮＡであり得る。好ましくは、このリボヌクレオチド残基は、互いに連続している。
【００２８】
プライマー１およびプライマー２の各々のヌクレオチド配列は、実施者により選択され、そして標的核酸の配列と十分に相補的である必要はない。当該分野において公知のように、完全な相補性は、首尾のよいＤＮＡ合成には必要とされないが、一般に、プライマーの少なくとも３’末端ヌクレオチドがテンプレートと完全に対合することが所望される。しかし、プライマーの５’端は、対合することが全く必要とされず、そしてさらなる配列をこのプライマー中に含めることによって、標的配列にさらなる配列を付加することが当該分野において一般的である。当然、テンプレートとハイブリダイズしない伸長可能な３’末端の５’の部分を、プライマーに含め、そしてまた、このテンプレートとハイブリダイズするなおさらなる５’部分を含めることもまた受け入れられ得る。本発明の目的のために、プライマー配列における任意のこのようなバリエーション、または任意の他の利用可能なバリエーションは、（ｉ）少なくとも１つのプライマーがこのプライマーの５’端に存在するかまたは、このプライマーから除去されている際には、このプライマーの新しい５’端を作製するか（例えば、アルカリ処理、好ましくは続いて、キナーゼ処理によって）のいずれかであるリボヌクレオチドを含み；および（ｉｉ）各プライマーが、生成物分子が生成される反応条件下で十分満足にかつ十分特異的にハイブリダイズする限り、受け入れられ得る。
【００２９】
プライマー設計の他の考慮は、当該分野において周知であり（例えば、Ｎｅｗｔｏｎら（編）、ＰＣＲ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（編），ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９５；Ｗｈｉｔｅら（編），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｇｒｉｆｆｉｎら（編），ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９９４を参照のこと（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される））。例えば、ハイブリダイズしている残基のおよそ５０％がＧまたはＣであることが、しばしば、所望され；そして最適な伸長のために、３’末端残基もまたＧまたはＣであることが所望され得る。
【００３０】
プライマーの５’末端残基として（または除去が新しい５’末端プライマー残基を作製する残基として）少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む、図１に示されるようなプライマーは、当該分野において利用可能な任意の技術によって調製され得る。例えば、このようなプライマーが、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチド試薬を供給する会社（例えば、Ｏｌｉｇｏｓ，Ｅｔｃ．，Ｉｎｃ．Ｂｅｔｈｅｌ，ＭＥ）は、代表的に、実施者により好まれるように、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡのみのヌクレオチドを調製する。あるいは、ＲＮＡ配列は、標準的な技術（例えば、Ｍｏｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：９９２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ（編），ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８（これらは、特に、ＲＮＡ連結による部位特異的な改変を含むＲＮＡ分子の構築を議論している；これらの参考文献の各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）を使用してＤＮＡ配列に連結され得る。
【００３１】
図１に示されるにように、伸長反応は、ＤＮＡ合成が第１および第２のプライマーの各々からプライムされるように行われ、そして少なくとも一方の鎖の５’端に少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を有する二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子が、作製される。本質的ではないが好ましくは、伸長反応に利用されるＤＮＡポリメラーゼは、外来の３’ヌクレオチドを付加しないものである。また、上記のように、このプライマーの一方または両方が、その３’残基としてリボヌクレオチドを有する場合、伸長工程に利用されるＤＮＡポリメラーゼは、リボヌクレオチドプライマーから伸長し得るものでなければならない。
【００３２】
図１は、次いで、ハイブリッド分子がリボヌクレオチド残基を除去する処理に曝されることを示す。図１に示されるように、この処理は、上昇したｐＨ（例えば、水酸化ナトリウム[ＮａＯＨ]のような塩基での処理）に曝される。あるいは、ＤＮＡ残基を妨げることなくＲＮＡ残基を除去する任意の他の処理（例えば、ＲＮａｓｅに曝すことなど）は、この工程に用いられ得る。
【００３３】
リボヌクレオチド残基がハイブリッド分子から除去される場合、得られる分子は、二本鎖部分および少なくとも一方のその端に一本鎖３’オーバーハングを残す。図１は、両端に一本鎖３’オーバーハングを有する生成物分子を示す。このオーバーハングの配列および長さは、このプライマーの５’端に存在するＲＮＡの配列および長さによって決定された。明らかに、オーバーハングの任意の配列および長さは、選択され得る。本発明の特定の好ましい実施形態において、オーバーハングの配列および長さは、市販の制限酵素による二本鎖ＤＮＡの切断によって生成されるものに対応し、その結果、この生成物分子は、その酵素で切断されているレシピエント分子に連結され得る。３’オーバーハングを残す種々の酵素が、当該分野において公知であり、ＡａｔＩＩ、ＡｌｗｎＩ、ＮｓｉＩ、ＳｐｈＩなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
他の好ましい実施形態において、３’オーバーハングの配列および長さは、別の本発明の生成物分子において作製される３’オーバーハングを有する塩基対に対して選択され、その結果、この２つの分子は、共に容易に連結され得る（例えば、実施例１を参照のこと）。
【００３５】
さらに、生成物分子の２つの端での３’オーバーハングは、同じ配列または長さを有することを必要としないことが理解される（例えば、実施例１を参照のこと）。１つのみの配向においてレシピエント分子に連結され得るか、または特定の配置において２つの異なるレシピエント核酸分子（例えば、３様式の連結）に連結され得る、核酸分子を作製することが、しばしば所望される。従って、本発明の生成物分子の３’オーバーハングの配列および長さを操作し得ることが非常に価値がある。
【００３６】
図１を参照して理解され得るように、リボヌクレオチド除去処理により残される端の性質は、その後の連結反応における生成物分子の挙動に影響し得る。特に、リボヌクレオチドのアルカリ加水分解は、５’−リン酸基ではなく５’−ＯＨ基を残す。当該分野において公知であるように、少なくとも１つの末端リン酸基は、代表的には、核酸分子の首尾のよい連結に必要とされる。従って、図１に示される生成物分子が適切な末端リン酸基を欠くレシピエント分子に連結されるべきである場合（例えば、ホスファターゼでの処理に曝されるために）、連結の前に、レシピエント分子に５’リン酸基を付加することが所望される。任意の利用可能な技術が、このようなリン酸基付加を達成するために利用され得；最も一般的には、リン酸基は、ポリヌクレオチドキナーゼでの処理によって付加される。
【００３７】
図１に示される生成物分子は、任意の所望のレシピエント分子に連結され得る。好ましくは、レシピエント分子は、生成物分子における少なくとも１つの３’オーバーハングの少なくとも一部に相補的である、少なくとも１つの３’オーバーハングを有する。このレシピエント分子は、３’末端部分が生成物分子の３’オーバーハングの３’末端部分に相補的であるが生成物分子３’オーバーハングに相補的でない３’オーバーハングを有する場合、１以上のギャップがハイブリダイゼーション後に存在し、このギャップが、連結前にＤＮＡポリメラーゼで埋められ得ることが理解される。生成物分子の３’オーバーハングの配列および長さは、実施者により選択されるので、このアプローチは、完全な３’オーバーハングハイブリダイゼーションが生じた場合に存在しない組換え分子に配列を付加するために用いられ得る。本発明の目的のために、生成物分子およびレシピエント分子の相補性３’末端部分は、少なくとも１ヌクレオチドの長さであるべきであり、そして２個、３個、４個、５個、６個〜１０個のヌクレオチドの長さ、またはそれを超える長さであり得る。特定の好ましい実施形態において、相補性３’末端部分は、約６個未満のヌクレオチドの長さであり、その結果、連結（通常、４℃または１４℃で行われる）の効率が保存され、そしてより長い配列のアニーリングと関連する問題が、回避される。
【００３８】
好ましいレシピエント分子としては、線状ベクターが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターは、例えば、生成物分子に存在するオーバーハングに相補的な３’オーバーハングを生成する制限酵素での消化によって線状化され得る。あるいは、このような線状ベクターは、実施者により、他の生成物分子に存在する３’オーバーハングと適合するように選択される１以上の３’オーバーハングを含む、本明細書中に記載されるような生成物分子として調製され得る。
【００３９】
当業者は、生成物分子が本発明に従って容易に作製され得、その結果、所定の生成物分子の各端が異なる３’オーバーハングを有することを理解する。このような分子は、指向性クローニング実験において使用され得、ここでそれらは、単一の配向においてのみ、１以上の他の分子に連結され得る。このような指向性連結ストラテジーは、３以上の分子が互いに連結されることが所望される場合に特に有用である。このような多成分連結反応において、個々の分子による自己連結の可能性を最小化し、そしてまた、分子が不適切な配向にある１以上の分子と一緒に連結する機会を低減することは、しばしば有用である。
【００４０】
（５’オーバーハングを有する生成物分子）
図２〜４は、５’オーバーハングを有する生成物分子を生成するための本発明のストラテジーを示す。例えば、図２に示されるように、テンプレート分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む１以上のプライマーとハイブリダイズされ得る。本発明のこの実施形態に関して、リボヌクレオチドがこのオリゴヌクレオチドの５’末端に位置されることは必要とされないが、これは受け入れられ得る。プライマーは、２、３、４、５、６〜１０またはそれよりも多くのリボヌクレオチドを含み得、そして伸長反応に利用されるＤＮＡポリメラーゼがリボヌクレオチドプライマーを伸長する場合には、全体的にリボヌクレオチドであり得る。すなわち、図２において、ｎ１およびｎ２の少なくとも１つは、１以上の全ての数であり、そしてｎ３およびｎ４は、各々、０以上の全ての数である。図３に示される特定の本発明の実施形態は、２つのプライマーを利用する。当業者は、各プライマーが伸長を可能にするに十分満足にテンプレート分子とハイブリダイズする、プライマーの３’残基で終結する部分を含むことを理解する。しかし、このプライマーの残部の配列は、テンプレート分子の配列と相補的である必要がない。さらに、当業者はまた、用いられているＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む場合、エキソヌクレアーゼ活性が伸長が生じ得るプライマー中の位置に戻って破壊することを可能にする限り、プライマーにおいて最も３’の残基がテンプレートとハイブリダイズすることがさらに必須ではないことを理解する。
【００４１】
プライマーとのハイブリダイゼーション後に、伸長反応は、リボヌクレオチドをコピーしないＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。例えば、本発明者らは、ＶｅｎｔR（登録商標）およびＶｅｎｔR（登録商標）（エキソ（ｅｘｏ）-）がテンプレートとしてリボヌクレオチド塩基を使用しないことを見出した（実施例１を参照のこと）；対照的に、ＴｔｈおよびＴａｑポリメラーゼは、もちろん、逆転写酵素と同様に、リボヌクレオチドを複製し得ることが報告されている（Ｍｙｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：７６６１、１９９１）。他のＤＮＡポリメラーゼは、標準的技術、または例えば、実施例３に記載されるような技術に従ってリボヌクレオチドをコピーするそれらの能力について試験され得る。
【００４２】
図２に示される伸長反応は、所望される場合、増幅反応として繰り返され得る。図２に示される実施形態は、生成物が２つの５’オーバーハングを有する二本鎖分子（これらの各々は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む）であるこのような増幅を示す。当業者は、各５’オーバーハングの配列および長さ（ならびにリボヌクレオチド組成）が、実施者により選択されること、ならびに示される２つの生成物分子のオーバーハングが同じでも異なっていてもよいことを理解する。
【００４３】
次いで、この生成物分子は、生成物分子の少なくとも５’末端残基に相補的である５’オーバーハングを含む１以上のレシピエント分子とハイブリダイズされ得る。ギャップがハイブリダイゼーション後に残っている場合、それらは、公知の技術に従ってＤＮＡポリメラーゼにより埋められ得る。ギャップがリボヌクレオチド残基を含む場合、このギャップが埋められることを保障するために、ＲＮＡをコピーするＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましくあり得る。上記のように、このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔｔｈ、Ｔａｑ、および逆転写酵素が挙げられる。他のＤＮＡポリメラーゼは、公知の技術、または例えば、実施例３に記載される技術に従って、ＲＮＡをコピーするそれらの能力について試験され得る。
【００４４】
一旦、任意のギャップが埋められると、この生成物分子およびレシピエント分子は、一緒に連結され得る。ＤＮＡリガーゼは、（ｉ）隣接するデオキシリボヌクレオチドの間；（ｉｉ）デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの間；または（ｉｉｉ）隣接するリボヌクレオチドの間のニック（ｎｉｃｋ）を閉じることが公知である。従って、ＤＮＡ残基およびＲＮＡ残基の両方を含むハイブリッド分子が、生成され得る。この分子は、標準的な技術に従ってインビトロでか、またはこのような分子をコピーし得る宿主細胞中への導入後にインビボでかのいずれかで、ＤＮＡへとコピーされ得る（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、デオキシリボヌクレオチドと塩基対合するリボヌクレオチドを除去し、そして置換し得ることが報告されている−−Ｓａｎｃａｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６６：１９５４、１９９４を参照のこと）。あるいは、連結の実行ではなく、ハイブリダイズした化合物をＤＮＡに複製することが所望され得る（例えば、ＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲによってか、またはリボヌクレオチドをコピーし得るＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによって）。また、いくつかの場合、例えば、酵母細胞の同時形質転換について当該分野において公知であるように、連結が、インビトロではなくインビボで達成され得ることが言及されるべきである。
【００４５】
図２に示されるように、生成物分子は、単一のレシピエント分子のみで、および１つの端にて連結される。当業者は、生成物分子が代わりに単一のレシピエント分子にか、または２つの異なるレシピエント分子にかのいずれかで、その端の両方に連結され得ることを理解する。
【００４６】
図３は、１以上の５’オーバーハングを有する生成物分子を作製する代替アプローチを示す。この実施形態において、リボヌクレオチドプライマー残基およびＲＮＡをコピーし得ないＤＮＡポリメラーゼを用いる代わりに、本発明者らは、プライマーにおける改変塩基を利用する。この改変塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによってコピーされない。広範な種々の改変塩基が当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，６６０，９８５号を参照のこと；またはＯｌｉｇｏｓ，Ｅｔｃ．［Ｂｅｔｈｅｌ，ＭＥ］により提供されるカタログのような種々のカタログもまた参照のこと）；特定のＤＮＡポリメラーゼによりコピーされないものは、例えば、製造業者のカタログを参照することによって、既知の技術に従う慣用的なスクリーニングによって、または例えば、実施例３に記載されるように、同定され得る。
【００４７】
改変塩基は、標準的な技術（例えば、Ｓａｎｃａｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５４，１９９４）に従って、改変塩基をコピーするＤＮＡポリメラーゼを用いるインビトロまたはインビボでのＤＮＡ複製によってか、あるいは塩基の除去、続いてギャップの修復によってかのいずれかで、レシピエント分子へのその連結の前または後に、生成物分子から除去され得る。
【００４８】
図４は、少なくとも１つの５’オーバーハングを有する生成物分子を作製するための本発明の実施形態を示す。図４に示される特定の実施形態において、本発明のストラテジーは、１個（図４Ａ）または２個（図４Ｂ）の３’オーバーハングを含む出発分子に適用され、その結果、この出発分子は、３’オーバーハング含有化合物から５’オーバーハング含有分子に変換される。しかし、当業者は、同じアプローチが平滑末端であるか、または１個または２個の３’または５’オーバーハングを含むかのいずれかである出発分子に、１個または２個の５’オーバーハングを付加するために十分同様に適用され得ることを理解する。
【００４９】
図４に示される出発物質は、任意の利用可能な手段によって得られ得る。この分子は、１個または２個の３’オーバーハングを有し得（Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つが、少なくとも１個のヌクレオチドの長さであることを意味する）、そして例えば、前駆体フラグメントの制限エンドヌクレアーゼ切断によってか、ポリメラーゼ連鎖増幅によってか、または任意の他の手段によって、生成され得る。本発明の特定の好ましい実施形態において、出発分子は、ＰＣＲにより生成され、そして上記のように、各端に、１個の３’ｄＡＴＰを含む。図４Ａは、１個のみの３’オーバーハングを有する出発分子への本発明の方法の適用を示す；図４Ｂは、２個の３’オーバーハングを有する出発分子への本発明の方法の適用を示す。
【００５０】
図４Ａを参照すると、出発物質は、出発分子の３’オーバーハング残基に実質的に隣接する出発分子中の第１配列とハイブリダイズする第１部分、出発分子の３’オーバーハングの少なくとも１つの残基と整列しかつハイブリダイズし得ない第２部分、および出発分子と整列しないが、出発分子の３’オーバーハングの最後の残基を通り越して（プライマーにおける５’）伸長する第３部分を含む少なくとも１つのプライマーとハイブリダイズされる。
【００５１】
プライマーの第１部分の長さおよび配列は、出発分子の３’オーバーハングに隣接する出発分子の配列によって決定される。プライマーの第１部分によるハイブリダイゼーションは、３’オーバーハングの少なくとも１つの残基がプライマーの第２部分と整列しかつハイブリダイズし得ない限り、３’オーバーハングへと伸長し得る。プライマーの第２部分の長さおよび配列は、第２部分が３’オーバーハングの少なくとも１つの残基と、好ましくは（しかし、本質的ではなく）少なくとも３’末端残基とハイブリダイズし得ないという点で、出発分子の３’オーバーハングの長さおよび配列によって、ある程度まで決定される。このようなハイブリダイゼーションが回避される限り、プライマーのこの第２部分の正確な配列が、実施者により選択され得る。プライマーの第３部分の長さ（すなわち、図４Ａにおけるｎの値、これは、１以上の全ての数である）および配列（すなわち、図４ＡにおけるＮの同一性）もまた、実施者により決定される。この第３部分は、生成物分子において５’オーバーハングとなる。
【００５２】
図４Ａに示されるように、本発明のプライマーからの１回または複数回の伸長が、行われる。第２プライマーの非存在（ならびにプライマーと出発分子の３’オーバーハングとの間のミスマッチ、これは出発分子のその鎖の３’端の伸長を妨害する）に起因して、ただの線形的であり、そして指数関数的ではない伸長が達成されることが、当業者によって理解される。もちろん、この伸長反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼが、１以上の末端３’残基を付加するＤＮＡポリメラーゼである場合、この生成物分子は、３’オーバーハングおよび５’オーバーハングを有し得る。
【００５３】
一旦、５’オーバーハングを有する生成物分子が生成されると、これは５’オーバーハングもまた含む、任意のレシピエント分子（この少なくとも一部が生成物分子の５’オーバーハングの一部に相補的である）とハイブリダイズされ得る。このハイブリダイズした化合物は、各鎖上にニック（または、生成物分子およびレシピエント分子の５’オーバーハングが長さにおいて完全には一致していない場合、ギャップをさらに含み得る）、および生成物分子の５’オーバーハングの直前に少なくとも１つのミスマッチを含む。次いで、このハイブリダイズした化合物は、ミスマッチ塩基（これは、プライマーの第２部分とハイブリダイズしない出発分子の３’オーバーハングの部分に対応する）を除去するために、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に曝される。次いで、消化した化合物は、エキソヌクレアーゼ消化により作製されたギャップを埋めて、そして続いて任意の残っているニックを修復するように連結するために、ＤＮＡポリメラーゼに曝される。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、当該分野において周知であり（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｐｆｕ、ＶｅｎｔR（登録商標）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔR（登録商標）などを含む）；他の酵素は、標準的な技術に従ってそれらの能力について試験され得る。
【００５４】
当業者は、図４Ａに示される方法が３’オーバーハングの位置に依存して出発分子のいずれかの鎖に適用され得ることを理解する。図４Ｂに示されるように、この方法は、同時に両方の鎖にさらに適用され得るが、各鎖について一回の伸張反応のみを実行するかまたは独立した伸長反応を実行することは、このような実施形態にとって重要である。増幅（すなわち、複数回の変性および伸長）は、実行されない。なぜなら、このような増幅は、５’オーバーハングおよびこの５’オーバーハングのすぐ３’にミスマッチを有する分子ではなく、プライマーによって運命付けられる配列を有する平滑末端分子（または、３’ヌクレオチドを付加するＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合には、３’オーバーハングを有するもの）の生成を生じるからである。
【００５５】
図４Ｂに示されるように、２つの３’オーバーハングを有する出発分子は、本発明の方法を適用することによって、２つの５’オーバーハングを含む生成物分子へと変換される。この出発分子は、図４Ａの考察において上記されるような第１部分、第２部分および第３部分を含む、２個の本発明のプライマーとハイブリダイズされる。次いで、各プライマーは、一回の（または独立した）伸長反応において伸長される。両方の伸長反応が、同時にまたは同じ厳密な出発分子において実行されることが必要とされないことは、当業者によって理解される。各プライマーの伸長は、異なる反応ベジクル（ｖｅｓｓｉｃｌｅ）においてさらに実行され得る。
【００５６】
伸長反応において生成される二本鎖分子の各々は、配列および長さが第３部分のものに対応する、単一の５’オーバーハングを有する。次いで、これらの二本鎖分子の鎖は、互いに分離される。個々の鎖は、所望される場合に別々に精製され得るが、これは、必要とされない。次いで、鎖は、（それらが、一緒ではない場合）一緒に混合され、そしてアニーリングされ、その結果、プライマーの伸長により合成された２個の新しい鎖は、互いにアニーリングする機会を有する。このアニーリング反応の生成物は、２個の５’オーバーハングを有する本発明の生成物分子である。理解されるように、これらのオーバーハングは、長さおよび／または配列が同じでも異なっていてもよい。
【００５７】
この生成物分子は、１以上のレシピエント分子とハイブリダイズされ得、このレシピエト分子の各々は、５’末端部分（少なくとも１個のヌクレオチドの長さ）が生成物分子の５’オーバーハングの（同じ長さの）５’末端部分と相補的である５’オーバーハングを有する。ハイブリダイゼーション後に残っている任意のギャップが、ＤＮＡポリメラーゼで埋められ得；次いで、生成物分子およびレシピエト分子が、一緒に連結され得る。
【００５８】
（平滑末端生成物分子）
図５は、平滑末端分子の連結を可能にする本発明の実施形態を示す。示されるように、一緒に連結されるべき平滑末端出発分子が、提供される。このような分子は、例えば、１以上の制限酵素での前駆体の消化（必要に応じて、続いて、任意のオーバーハング端を埋めることまたは戻って破壊すること）、ＰＣＲ（例えば、外来３’ヌクレオチドを付加しないＤＮＡポリメラーゼの使用――参照は、特定のＤＮＡポリメラーゼの特徴を決定するために製造業者のカタログに対してなされ得る。例えば、ＶｅｎｔR（登録商標）は、９５％よりも多く平滑末端を生じることが報告されており；ＶｅｎｔR（登録商標）（エキソ（ｅｘｏ）-）は、任意のヌクレオチドのうち、約７０％の平滑末端および３０％の１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを生じることが報告されている；Ｐｆｕは、平滑末端分子のみを生じることが報告されている）、化学合成などを含む、任意の利用可能な技術によって調製され得る。出発分子は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。図５に示されるように、この出発分子は、二本鎖である。
【００５９】
出発分子は、一緒に連結されるべき２つの異なる出発分子の少なくとも１つの末端残基に各々がハイブリダイズする架橋分子にハイブリダイズされる。明確には、出発分子が２本鎖である場合、これらは架橋分子に曝露される前に、架橋分子との首尾よいハイブリダイズか生じ得るように変性されるべきである。架橋分子は、各出発分子の１つより多くの残基にハイブリダイズし得、そして／または２つの出発分子にハイブリダイズする部分の間に、ハイブリダイズしない部分を含み得る。架橋分子はまた、ハイブリダイズ後にそれらが互いに隣接するに十分な長さを有し得るか、または、ギャップが、個々の架橋分子の間でハイブリダイズした化合物に存在するに十分な短さであり得る。好ましくは、少なくとも１つのプライマーが、ハイブリダイズされた化合物の最も３’で出発する分子の３’末端にハイブリダイズする。このプライマーは、所望する場合、５’オーバーハングが生じるように末端を過ぎて伸長され得る。そのようなオーバーハングは、図５に示されない。
【００６０】
次いで、ハイブリダイズした化合物が、利用可能な技術の任意の集合によって２本鎖ＤＮＡ分子に変換される。例えば、ギャップは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて充填され得、そして任意の残存するニックが、ＤＮＡリガーゼを用いて閉じられる。または、一方の鎖にギャップが存在しない場合、その鎖は、最初に連結され得、そしてインビトロまたはインビボにおいて、他方の鎖におけるギャップを閉じるためか、もしくは置換鎖を合成するために、ＤＮＡポリメラーゼが続いて適用される（例えば、出発分子に対して最も３’位置にハイブリダイズした架橋分子からプライムされる）。本発明の１つの好ましい実施形態において、ギャップは充填され、そしてニックが閉じられ、次いで組換え分子の全体が、ＰＣＲ増幅によって複製される。所望される場合、１つ以上の３’末端残基を添加するＤＮＡポリメラーゼが利用され得、その結果、生じた増幅生成物は、１つ以上の３’オーバーハングを有する可能性が高い。上記のように、そのような生成物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（登録商標）システムの使用において生じるように、相補的３’オーバーハングで別の分子に容易に連結され得る。
【００６１】
（適用）
上記に提供された生成物分子および連結ストラテジーは、種々の任意の状況において有用である。制限のためではなく明確化のみの目的で、本発明者らは、本明細書でより詳細に、これらの状況のいくつかを議論する。
【００６２】
上記のように、本発明は、他の分子に直接連結され得る（すなわち、最初に制限酵素を用いて消化されることを伴わない）核酸分子を提供するための技術および試薬を生み出した。本発明はまた、そのような連結を達成するための技術を提供する。本発明は、任意の配列の核酸分子を互いに連結するために使用され得、従って、遺伝子クローニングの分野において最も広く潜在的な適用を有する。
【００６３】
本発明の技術および試薬が、ＤＮＡ分子の特定の配列、それらのタンパク質をコードする能力、または任意の他の特徴に関わらず、任意のＤＮＡ分子を他の任意のＤＮＡ分子に連結するために利用され得ることを、当業者は理解する。この特徴は、例えば、別のフラグメントにおいて所望されない切断を生成する特定の酵素で１つのフラグメントの切断を避けることか、または使用されるタンパク質酵素の挙動を適応させるために他の調整がなされることが所望され得る場合に、連結されている分子の正確な配列がしばしばクローニングストラテジーの設計に影響を与え得る従来の制限エンドヌクレアーゼ依存のクローニング系から、本発明の系を区別する。
【００６４】
（タンパク質をコードする遺伝子の生成）
本発明の特定の好ましい実施形態において、本発明の連結反応に含まれる１つ以上のＤＮＡ分子は、オープンリーディングフレーム（すなわち、タンパク質をコードする配列）を含む。特に好ましい実施形態において、一緒に連結される少なくとも２つのＤＮＡ分子は、オープンリーディングフレーム配列を含み、そしてそれらの連結は、単一ポリペプチドがコードされるように一緒に連結された両方のオープンリーディングフレームを含む、ハイブリッドＤＮＡを生成する。本発明に従って、２つ以上のＤＮＡ分子の連結が、少なくとも１つの連結接合点にわたる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを生成する場合、連結が、ハイブリッドタンパク質をコードする新規の遺伝子を生成したとみなされる。
【００６５】
しかし、タンパク質をコードする遺伝子を生成するために使用される本発明の系の１つの実施形態において、互いに連結されるＤＮＡ分子は、既知の生物学的活性の１つ以上の個別の機能的ドメインをコードするように選択され、その結果、２つ以上のそのようなＤＮＡ分子の連結は、二機能的ポリペプチドまたは多機能的ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子を生成する。多くのタンパク質が個別の機能的ドメインを有することは、当該分野で周知である（例えば、Ｔｒａｕｔ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３、１９８６；Ｇｏら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９：９１、１９８５を参照のこと）。そのようなドメインが、しばしば互いに分離され、そして各個々の機能的ドメインの活性が保存される様式で他の個別の機能的ドメインと連結され得ることもまた、周知である。
【００６６】
機能的タンパク質ドメインをコードする正確なＤＮＡ配列の選択において、幾分かの可撓性が許容されることを、当業者は理解する。例えば、ＤＮＡ配列を、天然に存在するタンパク質の機能的ドメインに含まれる正確なアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列のみに制限することは、しばしば望ましくない。さらなるＤＮＡ配列が、例えば、特定の選択された機能的ドメインとそれが連結される任意の他の機能的ドメイン間の可撓性を提供し得るリンカー配列をコードするＤＮＡ配列が含まれ得る。
【００６７】
あるいはまたはさらに、いくつかの状況において、研究者らによって、特定の機能的ドメインを含む全てよりも少ないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を選択することが有用であることが見出されている（例えば、ＷＯ９８／０１５４６を参照のこと）；そのような場合において、他のアミノ酸が、引き続く連結の結果として添加し戻され得る（すなわち、隣接して連結されたＤＮＡ分子によってコードされ得る）か、または完全に除外され得る。当業者は、目的とするタンパク質ドメインを記載する文献を適切なように参照した後に、彼らの特定の実験的問題にこれらの基本原理を適用させることに容易に彼ら自身を精通させ得る。
【００６８】
本発明に従って連結される個々のＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の組み合わせによってコードされ得る機能的タンパク質ドメインの型のほんのわずかの例を与えると、周知のモジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）ドメインとしては、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ホメオドメイン、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフなど）、ＡＴＰまたはＧＴＰ結合ドメイン、膜貫通スパンニングドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン（例えば、ロイシンジッパー、ＴＰＲ反復、ＷＤ反復、ＳＴＹＸドメイン（例えば、Ｗｉｓｈａｒｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：３０１、１９９８を参照のこと）など）、Ｇタンパク質ドメイン、チロシンキナーゼドメイン（例えば、Ｓｈｏｋａｔ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５０９、１９９５を参照のこと）、ＳＲＣ相同性ドメイン（例えば、Ｓｕｄｏｌ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：１４６９、１９９８を参照のこと）、ＳＨ２ドメイン（例えば、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２８：６１、１９９５を参照のこと）、ＰＴＢドメイン（例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒｅｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０：２７７、２９９５を参照のこと）、ＰＨドメイン（例えば、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉｅ  １８：３４３、１９９３を参照のこと）、特定の触媒ドメイン、細胞表面レセプタードメイン（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：１１、１９９８を参照のこと）、炭水化物認識ドメイン（例えば、Ｋｉｓｈｏｒｅら、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１５：５８３、１９９７を参照のこと）、免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｒａｐｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１３９、１９９５を参照のこと）などが挙げられる（Ｈｅｇｙｉら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ．１６：５４５、１９９７；Ｂａｒｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６：１３、１９９７もまた参照のこと）。
【００６９】
代表的には、そのようなドメインは、公知の生物学的活性のタンパク質内の配列相同性の領域を同定する（少なくとも、相同性を示すタンパク質の部分に関して）、相同性比較によって同定される。任意の特定の機能的ドメインの空間的な干渉は、しばしばＸ線結晶学、ＮＭＲなどのような構造的研究によって確認される。
【００７０】
本発明に従って、タンパク質の有用な「機能的ドメイン」は、たとえその部分が、その活性を維持するためにより大きなポリペプチド分子内に包埋され続けなければならないとしても、その部分が残りのタンパク質から分離された場合に保存されている既知の生物学的活性を有するタンパク質の任意の部分である。関連する生物学的活性は、ドメインが天然に見出される特定のタンパク質の完全な生物学的活性を構成する必要はなく、そして代表的にはそうではないが、通常、その活性の一部分のみを示す（例えば、特に他の分子に結合する能力を示すが、結合分子を切断または修飾するさらなる活性は含まない）。上記のように、多くのそのようなドメインは、すでに文献に記載されている；他のものは、相同性検索、好ましくは生物学的活性に関与する配列を明確にするための当該分野で公知のような変異研究と組み合わせて同定され得る。
【００７１】
本発明は、今や実質的に普遍的に認知された、進化の間の新規遺伝子の生成が、しばしば、２つ以上のすでに存在する機能的タンパク質ドメインをコードするＤＮＡ配列の新規な組合せに関与していたという認識を含む（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９４：７６９８、１９９７；Ｓｔｒｅｌｅｔｓら、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、３６：３７、１９９５を参照のこと）。実際に、タンパク質「ファミリー」は、しばしば、たとえ異なるファミリーのメンバーによって果たされる生物学的役割の全体が、全く関連し得ないとしても、特定の機能的ドメインをそれらが共通して使用することによって規定される（そのようなファミリーのさらなる議論は、以下のエキソンシャッフリングを議論する節を参照のこと）。従って、本発明は、実験室において進化的なプロセスを模倣するために使用され得る技術および試薬を提供する。本発明の系の普遍性および実験室的な単純さは、所望の順序で互いに連結する特定のＤＮＡモジュールを選択し得る研究者らに、目的の新規な結果を生成するために確率的なプロセスを待機しなければならない母なる自然を超える有意な利点を提供する。
【００７２】
従って、本発明に従って利用される好ましいタンパク質の機能的ドメインとしては、遺伝子ファミリー（すなわち、タンパク質ファミリーの異なるメンバーをコードする遺伝子の集合体）を生成するための進化を通じて再利用された機能的ドメインが挙げられる。特定のタンパク質ドメインの再利用によって作製される例示的な遺伝子ファミリーとしては、以下が挙げられる：例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子ファミリー（例えば、図６を参照のこと）；電位作動型（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）ナトリウムチャネルのファミリー（例えば、Ｍａｒｂａｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０８：６４７、１９９８を参照のこと）；接着分子の特定のファミリー（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｕｎｏｌ  ２２８：１３５、１９９８を参照のこと）；種々の細胞外ドメインタンパク質ファミリー（例えば、Ｅｎｇｅｌ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１５：２９５、１９９６；Ｂｏｒｋ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：４９、１９９２；Ｅｎｇｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：７７９、１９９１を参照のこと）；プロテインキナーゼＣファミリー（例えば、Ｄｅｋｋｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３９６、１９９５を参照のこと）；腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（例えば、Ｎａｉｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍ  ４７：１，１９９５を参照のこと）；溶解素ファミリー（例えば、Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．３：１９９、１９９７を参照のこと）；核ホルモンレセプター遺伝子スーパーファミリー（例えば、Ｒｉｂｅｉｒｏら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６：４４３，１９９５；Ｃａｒｓｏｎ−Ｊｕｒｉｃａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１１：２０１，１９９０）；ニューレキシンファミリー（例えば、Ｍｉｓｓｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１３３９、１９９８を参照のこと）；チオレドキシン遺伝子ファミリー（例えば、Ｓａｈｒａｗｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４２：４２２、１９９６を参照のこと）；ホスホリル転移タンパク質ファミリー（例えば、Ｒｅｉｚｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４０７、１９９７を参照のこと）；細胞壁ヒドロラーゼファミリー（例えば、Ｈａｚｌｅｗｏｏｄら、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６１：２１１、１９９８を参照のこと）、および合成タンパク質の特定のファミリー（例えば、脂肪酸シンターゼ、ポリケチドシンターゼ（例えば、ＷＯ９８／０１５４６；米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第５，０９８，８３７号；ＥＰ特許出願第７９１，６５５号；ＥＰ特許出願第７９１，６５６号を参照のこと）、ペプチドシンテターゼ（例えば、Ｍｏｏｔｚら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５４３、１９９７；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ  １２５：３、１９９５を参照のこと）およびテルペンシンターゼ）。
【００７３】
本発明は、これらのファミリー中に存在する異なる機能的ドメインをコードするＤＮＡ分子が、インフレーム融合体を生成するために互いに連結されることを可能にし、その結果、選択された機能的ドメインの異なる配置を含むポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子が生成される。（ｉ）天然の特定の遺伝子ファミリーにおいて利用されるドメインのみが、（新規の配置で）互いに連結されるか、または（ｉｉ）異なる遺伝子ファミリーにおいて天然に利用されるドメインが互いに連結されるかにおいて、実験が、実施され得ることが理解される。
【００７４】
本発明の１つの特に好ましい実施形態において、ともに連結されるように選択されたＤＮＡモジュールは、合成酵素ファミリーのメンバーの少なくとも１つの機能的ドメインまたは機能的ドメインの部分をコードするモジュールを含む。上記のように、種々の酵素ファミリーが公知であり、それらのメンバーは、関連する生物学的に活性な化合物の合成を担う。特定の目的のファミリーとしては、脂肪酸シンターゼファミリー、ポリケチドシンターゼファミリー、ペプチドシンテターゼファミリー、およびテルペンシンターゼファミリー（時折、テルペノイドシンターゼファミリー、またはイソプレノイドシンターゼファミリーと呼ばれる）が挙げられる。これらの酵素ファミリーの個々のメンバーは、マルチドメインタンパク質であり、これは、特定の生物学的に活性な化合物の合成を触媒する。任意の特定のファミリーメンバーについて、異なるタンパク質ドメインが、全体の合成反応において異なる工程を触媒する。各ファミリーメンバーは、異なる化合物の合成を触媒する。なぜなら、各々が、タンパク質の機能的ドメインの異なる集合体または配置を含むからである。本願の文脈において理解されるように、本発明は、これらの遺伝子ファミリーにおいて利用される種々のタンパク質ドメインを新たな方法で互いに連結して、機能的ドメインが選択された遺伝子ファミリーの天然に存在するメンバーによって生成される活性に関連する生物学的活性を有すると予測される新たな化学実体の生成を触媒する新規な合成酵素を生成し得るシステムを提供する。
【００７５】
本発明のこの局面をより明らかに例示するために、本発明者らは、上記の特に好ましい合成酵素タンパク質ファミリーの各々の特定の特徴および性状を以下で議論する。
【００７６】
（動物脂肪酸シンターゼファミリー）
動物脂肪酸シンターゼは、２つの多機能性ポリペプチド鎖を含み、その各々は、７つの別々の機能的ドメインを含む。脂肪酸分子は、アセチル部分と連続的なマロニル部分との反復縮合を含む反応において、２つのポリペプチド鎖の間の境界で合成される（例えば、Ｓｍｉｔｈ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：１２４８，１９９４；Ｗａｋｉｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４５２３，１９８９（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。最も一般的には、この縮合反応において生成されるβ−ケト中間体は、完全に還元されて、パルミチン酸を生成する；しかし、特定の場合において、代替基質または代替の鎖終結機構が使用され、その結果、一連の生成物は、分岐鎖、奇数に番号付けられた炭素（ｏｄｄ  ｃａｒｂｏｎ−ｎｕｍｂｅｒｅｄ）、およびより短い鎖長の脂肪酸分子を含む。これらの分子は、生物学的系において一連の役割を有し、この役割としては、以下が挙げられる：（ｉ）ステロイドのような種々のシグナル伝達分子の生成における前駆体として作用する、ならびに（ｉｉ）コレステロール代謝の調節に関与する。
【００７７】
当業者は、本発明の開示を考慮して、本明細書中に記載される技術および試薬が、脂肪酸シンターゼ分子の１つ以上の機能的ドメインをコードするＤＮＡ分子に望ましく適用され得、その結果、この分子が、他のＤＮＡ分子に連結されて、目的の新たなハイブリッドＤＮＡ、好ましくは、新規な合成能力を有し得るハイブリッド動物脂肪酸シンターゼ遺伝子をコードするものを作製し得ることを容易に認識する。
【００７８】
（ポリケチドシンターゼファミリー）
ポリケチドは、大きくかつ構造的に多様なクラスの天然生成物を示し、この天然の生成物としては、多くの重要な抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、駆虫薬、および免疫抑制化合物（例えば、エリスロマイシン、テトラサイクリン、アンホテリシン、ダウノルビシン、アベルメクチン、およびラパマイシン）が挙げられる。例えば、図７は、特定のポリケチド化合物のリストを示し、これは、ヒトおよび動物の障害の処置において薬学的薬物として現在使用されている。
【００７９】
ポリケチドは、タンパク質酵素（適切に命名されたポリケチドシンターゼ）によって合成され、この酵素は、脂肪酸シンターゼによって使用される様式といくらか類似した様式でアシルチオエステルの反復性の階的な縮合を触媒する。ポリケチドの間の構造多様性は、縮合反応において使用される特定の「スターター」または「エクステンダー」単位（通常は、アセテートまたはプロピオネート単位）の選択および縮合後に観察されるβ−ケト基の異なる程度のプロセシングの両方を介して生成される。例えば、いくつかのβ−ケト基は、β−ヒドロキシアシル基に還元される；他のものは、両方ともこの点まで還元され、続いて、２−エノイル基に脱水される；さらに他のものは、飽和アシルチオエステルに全て還元される。
【００８０】
ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）は、モジュラータンパク質であり、ここでは異なる機能的ドメインが、合成反応の異なる工程を触媒する（例えば、Ｃｏｒｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：１７６，１９９０；ＭａｃＮｅｉｌら、Ｇｅｎｅ  １１５：１１９，１９９２；Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８３９，１９９５を参照のこと）。例えば、図８および９（ＷＯ９８／０１５４６から）は、それぞれ、エリスロマイシンおよびラパマイシンの生成を担う細菌ポリケチドシンターゼ遺伝子の異なる機能的ドメインを示す（図１０もまた、参照のこと）。これらの遺伝子の各々は、いわゆる「クラスＩ」細菌ＰＫＳ遺伝子の例である。示されるように、ポリケチド鎖伸長の各サイクルは、１つ以上の他の機能的ドメイン（アシルトランスフェラーゼ［ＡＴ］ドメイン、β−ケトアシルレダクターゼ［ＫＲ］ドメイン、エノイルレダクターゼ［ＥＲ］ドメイン、デヒドラターゼ［ＤＨ］ドメイン、およびチオエステラーゼ［ＴＥ］ドメインからなる群より選択される）とともに、一方の末端ではβ−ケトアシルＡＣＰシンターゼドメイン（ＫＳ）、および他方の末端ではアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインを含む、機能的ドメインの集合体を含む触媒単位によって達成される。
【００８１】
クラスＩＩ細菌性ＰＫＳ遺伝子はまた、モジュラーであるが、鎖伸長の触媒を担う機能的ドメインの１つのセットのみをコードし、芳香族ポリケチドを生成する；これらのドメインは、連続伸長サイクルにおいて適切なように、再利用される（例えば、Ｂｉｂｂら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２７２７，１９８９；Ｓｈｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２７１７，１９８９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９２７８，１９９２；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：２０１，１９９５を参照のこと）。多様性は、特定の伸長単位（通常、アセテート単位）の選択、および芳香族生成への完全な鎖の環化を触媒する特定のシクラーゼ（異なる遺伝子によってコードされる）の存在によって主に生じる。
【００８２】
クラスＩ  ＰＫＳ機能的ドメインにおける種々の改変およびクラスＩ  ＰＫＳ機能的ドメインの置換は、合成酵素によって生成されるポリケチド生成物の化学組成を変化させ得ることが公知である（例えば、Ｃｏｒｔｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４８７，１９９５；Ｋａｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：９１０５，１９９５；Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：６７５，１９９１；ＷＯ  ９３／１３６３を参照のこと）。クラスＩＩ  ＰＫＳに関して、異なるクラスＩＩ  ＰＫＳ遺伝子クラスター（例えば、異なるシクラーゼ）の状況下で、１つの微生物系統から異なる微生物系統へのＰＫＳ遺伝子の導入が、新規のポリケチド化合物の生成を生じ得ることが公知である（例えば、Ｂａｒｔｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４８１６，１９９０；ＷＯ  ９５／０８５４８を参照のこと）。
【００８３】
本発明は、改変されたＰＫＳ遺伝子を生成するための新規の系を提供し、ここで、改変された遺伝子によってコードされる機能的ドメインの配列および／または数は、任意の天然に存在するＰＫＳ遺伝子において見出されるものと異なる。任意のＰＫＳ遺伝子フラグメントが、本発明に従って使用され得る。好ましくは、このフラグメントは、少なくとも１つの他のＰＫＳ機能的ドメインに連結されて、新規のＰＫＳ酵素を生成し得るＰＫＳ機能的ドメインをコードする。種々の異なるポリケチドシンターゼ遺伝子が、ポリケチドの驚異的なプロデューサーである細菌生物または真菌生物から主にクローニングされている（例えば、Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８３９，１９９５；米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第５，０９８，８３７号；ＥＰ特許出願７９１，６５５；ＥＰ特許出願７９１，６５６（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと；また、ＷＯ  ９８／５１６９５、ＷＯ  ９８／４９３１５およびそれらの中で引用される参考文献（これらもまた、参考として援用される）を参照のこと）。任意のこのような遺伝子のフラグメントが、本発明の実施において使用され得る。
【００８４】
（ペプチドシンテターゼファミリー）
ペプチドシンテターゼは、種々のペプチドの非リボソーム生成を触媒するポリペプチド酵素の複合体である（例えば、Ｋｌｅｉｎｋａｕｆら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２５９，１９８７を参照のこと；米国特許第５，６５２，１１６号；米国特許第５，７９５，７３８号もまた参照のこと）。これらの複合体は、特定のアミノ酸を認識し、そしてポリペプチド鎖へのアミノ酸の付加の触媒を担う、１つ以上の活性ドメイン（ＤＤＡ）を含む。Ｄ−アミノ酸の付加を触媒するＤＤＡはまた、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸へのラセミ化（ｒｅｃｅｍｉｚａｔｉｏｎ）を触媒する能力を有する。この複合体はまた、伸長するアミノ酸鎖を終結し、そして生成物を放出する、保存されたチオエステラーゼドメインを含む。図１１は、現在、薬理学的薬剤として使用されているペプチドシンテターゼによって生成される生成物の例示的な表を示す。
【００８５】
ペプチドシンテターゼをコードする遺伝子は、酵素の機能的ドメイン構造に平行するモジュラー構造を有する（例えば、Ｃｏｓｍｉｎａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：８２１，１９９３；Ｋｒａｔｚｘｃｈｍａｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５４２２，１９８９；Ｗｅｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．１６：１１８４１，１９８８；Ｓｍｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：７４１，１９９０；Ｓｍｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２７４３，１９９０；ＭａｃＣａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２６４６，１９９１；Ｃｏｑｕｅら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１１２５，１９９１；Ｄｉｅｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３５８，１９９０を参照のこと；図１２もまた参照のこと）。例えば、図１３（米国特許第５，６５２，１１６号からの）は、１つの例示的なペプチドシンテターゼ遺伝子オペロンである、ｓｒｆＡオペロンの構造を示す。
【００８６】
特定のペプチドシンテターゼによって生成されるペプチドの配列は、シンテターゼに存在する機能的ドメインの集合体によって決定される。従って、本発明は、互いへの特定のペプチドシンテターゼ機能的ドメインの迅速な連結を可能にする系を提供することによって、新規のペプチドシンターゼ遺伝子（機能的ドメインの配列および／または数は、天然に存在するペプチドシンターゼ遺伝子と比較すると、異なる）が生成され得るメカニズムを提供する。このような新規の遺伝子によってコードされるペプチドシンターゼ酵素が、新規のペプチド生成物を生成することが予期される。従って、本発明は、ハイブリッドペプチドシンターゼ遺伝子の作用を通じた新規のペプチドの生成のための系を提供する。
【００８７】
（テルペンシンターゼファミリー）
イソプレノイドは、構造がイソプレン基礎単位の改変を示す化合物である。このイソプレノイドファミリーとしては、一次代謝生成物（例えば、ステロール、カロテノイド、増殖レギュレーターならびにドリコール、キノンおよびタンパク質のポリプレノール（ｐｏｌｙｐｒｅｂｏｌ）置換基）および二次代謝生成物（例えば、モノテルペン、セスキテルペンおよびジテルペン）のクラスに分けられ得る広範な構造的に多様な化合物が挙げられる。この一次代謝生成物は、生物学的現象（例えば、膜の完全性の保存、光防護、発生プログラムの編成および特定の膜系に対する必須の生化学的活性の係留）に重要である；この二次代謝生成物は、細胞間伝達に関与するプロセスに関与し、そして植物とその環境との間の相互作用を媒介するようである（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｉｓｏｐｅｎｔｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ［Ｎｅｓら、編］，Ｍａｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，６５−８０頁、１９８４；Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：６０８，１９８３；およびＳｔｏｅｓｓｌら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：８５５，１９７６を参照のこと）。
【００８８】
イソプレノイドは、イソプレンビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）の重合を介して合成され、中間分子または最終生成物分子内で環化（または他の分子内結合形成）により結合される。この重合反応は、イソプレン単位上の二重結合において、電子が豊富な炭素原子上での電子欠乏炭素の攻撃を指向するプレニルトランスフェラーゼにより触媒される（米国特許第５，８２４，７７４号からの図１４を参照のこと）。環化および他の分子内結合形成反応は、イソプレノイド（またはテルペン）シンターゼにより触媒される（米国特許第５，８２４，７７４号からの図１５を参照のこと）。
【００８９】
テルペンシンターゼタンパク質は、機能的ドメインが、天然のエキソンと対応する傾向があるモジュラータンパク質である（例えば、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８２４，７７４号を参照のこと）。米国特許第５，８２４，７７４号からの図１６は、イソプレノイドシンターゼ内での天然のエキソンおよび機能的ドメインとの間の対応の模式図を示す。上の図は、ＴＥＡＳ遺伝子内のエキソンの構成を示し、これはＨＶＳ遺伝子およびカスベン（ｃａｓｂｅｎｅ）シンターゼ遺伝子のエキソンの構成とほとんど同一であり；下の図は、ＴＥＡＳ遺伝子およびＨＶＳ遺伝子のエキソンの構成に対する機能的ドメインのアライメントを示す。
【００９０】
本出願の観点から理解されるように、本発明は、イソプレノイドシンターゼ機能的ドメインをコードするＤＮＡ分子が、天然に生じるイソプレノイドシンターゼ遺伝子において観察される機能的ドメインと比較して機能的ドメインの配置および／または数が変化する、新規のハイブリッドイソプレノイドシンターゼ遺伝子を生成するために互いに連結され得る、系を提供する。これらの新規のハイブリッド遺伝子は、新しいイソプレノイド化合物の合成を触媒することが期待される、新規のハイブリッドタンパク質をコードする。
【００９１】
上述するように、本発明のいくつかの実施形態において、１つのタンパク質ファミリー由来の機能的ドメインをコードするＤＮＡ分子が、異なるタンパク質ファミリー由来の機能的ドメインをコードするＤＮＡ分子に連結される。本発明に従って特に興味深いのは、ポリケチドシンターゼ機能的ドメインをコードするＤＮＡが、ペプチドシンテターゼ機能的ドメインをコードするＤＮＡに連結される反応である。代わりの好ましい実施形態は、ポリケチドシンターゼ機能的ドメインおよびペプチドシンテターゼ機能的ドメインのいずれかまたは両方との、脂肪酸シンターゼ機能的ドメインの結合を含む。次いで、このようなファミリー間結合反応により作製されたハイブリッド遺伝子は、ポリケチド、脂肪酸、および／またはペプチドに関する新規な化合物の合成を触媒するタンパク質をコードするそれらの遺伝子の能力を決定するための公知の技術に従って、試験され得る。
【００９２】
また上述されるように、特定の実験において互いに連結されるように選択されるＤＮＡ分子は、機能的ドメインをコードする分子またはその部分に限定されず；「リンカー」アミノ酸をコードする分子がさらに、または代わりに使用され得、同様に、非コード分子が所望の最終生成物に依存して使用され得る。
【００９３】
たった１例を与えるために、連結された分子が宿主細胞またはインビトロの発現系に導入される場合、その制御配列が連結される他のＤＮＡ配列の発現を調節する特定の制御配列を、最後の連結された分子中に含むことが、時々所望され得る。例えば、転写制御配列、ＲＮＡスプライシング制御配列、他のＲＮＡ改変制御配列、および／または翻訳制御配列が、共に連結される１つ以上のＤＮＡ分子に含まれ得る。広範な種々のこのような発現制御配列は、当該分野で周知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）；当業者は、それらの特定の適用における使用のために所望の制御配列を選択することに関する考察に精通している。一般に、このような制御配列が、これらが連結される他のＤＮＡの発現をそれらのＤＮＡ配列が細胞またはインビトロの発現系に導入される場合に指向する限り、このような制御配列は本発明に従う使用のために適切である。
【００９４】
本発明に従って、所望して使用され得る他のＤＮＡモジュールとしては、例えば、検出可能なタンパク質部分（例えば、色の変化または蛍光もしくは発光の誘導のような検出可能な反応を触媒する酵素部分、あるいは公知のモノクローナル抗体と相互作用する部分など）をコードするモジュール、連結される生成物ＤＮＡ分子（例えば、ＧＳＴドメイン、銅キレートドメインなど）によりコードされる任意のポリペプチドの簡単な精製を可能にする部分をコードするモジュールまたは研究者によって所望される任意の他のモジュールが挙げられる。
【００９５】
（指向性連結）
本明細書中に記載されるように、本発明技術の１つの特定の価値の高い適用は、複数の異なる核酸分子の、互いの連結についてである。３’または５’のオーバーハングを有する生成物分子を提供する本発明の実施形態は、それらのオーバーハングの配列および長さが実施者の自由に選択されるのを可能にすることから、分子は、特定の指定されたパートナーとのみの特定の指定された順序での連結のために容易に調製され得、その結果多数のメンバーでの連結反応が、偽の連結生成物または所望されない連結生成物のほんの最小の生成しか伴わずに実施され得る。
【００９６】
図１７は、本発明に従う、このような指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）連結反応の１つの一般的な例の模式図を示す（図１８〜２２および実施例１は、特定の例を記載する）。示されるように、第１の核酸分子（「Ａ」として指定される）は、１方の末端で第１のオーバーハング（「オーバーハング１」として指定される）を含む。第２の核酸分子である「Ｂ」は、オーバーハング１に相補的ある第２のオーバーハング（「オーバーハング１’」）および好ましくはオーバーハング１に関連しないでそして確かに同一でない第３のオーバーハング（「オーバーハング２」）に隣接される。第３の核酸分子である「Ｃ」は、オーバーハング２と相補的な第４のオーバーハング「オーバーハング２’」を含む。当業者によって理解されるように、これらの核酸分子の３つ全てを含む連結反応は、たった１つの反応生成物「ＡＢＣ」を生成し、そして「ＡＣ」生成物または環状の「Ｂ」生成物を、このような生成物を生成するために共に連結されなければならない末端の不一致のために生成しない。
【００９７】
（変異誘発）
別の特に有用な適用において、本発明の技術および試薬は、共に連結される核酸分子のヌクレオチド配列を変更するために利用され得る。別個の変異誘発反応は、必要とされない。むしろ、配列および長さが実施者により選択され得るプライマーおよび／またはオーバーハングは、連結される分子間の一本鎖の領域を作製するために利用され、この一本鎖領域は、所望されるような新しい配列または変更された配列を含む。これらの一本鎖領域は、後に、新しい配列に相補的な鎖を合成するポリメラーゼにより満たされ得る。あるいはまたはさらに、伸長反応または増幅反応においてコピーされる特定の生成物分子鎖に配列を加えるプライマーが用いられ得る。
【００９８】
（エキソンシャッフリング）
本明細書中に記載される技術および試薬の１つの特定の適用は、ＤＮＡ分子の特定のコレクションまたはエキソンが互いに連結された、ハイブリッド核酸分子のライブラリーの生成における。つまり、「エキソンシャッフリング」反応は、単一反応混合物（以下でさらに記載される、例えば、連結混合物またはスプライシング反応）が少なくとも２つ、および好ましくは少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１，０００，０００の異なる生成物分子を生成する反応である。
【００９９】
本明細書中に使用される場合、用語「エキソン」とは、別のＤＮＡ分子に連結されるべき任意のＤＮＡをいう。エキソンは、タンパク質コード配列を含んでもよいか、独占的にタンパク質をコードし得てもよいか、または全くタンパク質コード配列を含まなくてもよい。用語「エキソンシャッフリング」は、本発明の技術および試薬を用いて、１つより多い可能な配置で互いに連結され得るエキソンのコレクションが生成され得ることを示すことが意図される。例えば、図２３において描かれるように、本発明の技術および試薬は、単一の上流エキソンであるＡが、異なる内部エキソン（図２３におけるＢ１〜Ｂ４）のコレクションのいずれか１つに連結され得る連結反応において用いられ得、この内部エキソンは順番に、さらに下流のエキソンであるＣに連結される。
【０１００】
当業者は、図２３が、本発明に従って「同一性エキソンシャッフリング」反応（すなわち、特定のエキソンの同一性が、シャッフリング反応の異なる生成物において異なる反応）のまさに１つの特定の実施形態を示すことを容易に認める。関連する反応の広範なアレイが、本発明の「エキソンシャッフリング」の概念内に、および特定の「同一性エキソンシャッフリング」の概念内に含まれる。例えば、１つより多いエキソンは、特定のシャッフリング反応において変更され得る。実際に、図２３において描かれるように、シャッフリング生成物の中で均一である上流末端エキソンおよび下流末端エキソンを有することは必要とされない。しかし、このような一貫性は、特定の利点（１セットの増幅プライマーを用いて全てのシャッフリング生成物を増幅する能力（以下でより詳細に考察される）を含む）を提供し得る。しかし、不変の隣接エキソンが保存される場合でさえ、１つより多い内部エキソンが変更され得る；付加的な不変の内部エキソンもまた提供される場合でさえ、そうである。
【０１０１】
図２４は、本発明に従って実施され得るエキソンシャッフリング反応の異なる種類の実施形態を示す。図２４において示される特定の実施形態において、上流（Ａ）のエキソンおよび下流（Ｈ）のエキソンは、広範な種々の可能な内部エキソン（Ｂ〜Ｇ）と組み合わせて提供される。全てのエキソンは、適合性のあるオーバーハングを有する。このような反応において、生成物分子において見出される内部エキソンの配置についての可能性は、無限である。また、エキソン（選択的な隣接エキソン以外のエキソン）は、エキソン鎖の特定の位置に制限されないことから、シャッフリングのこの型は、「位置的（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）シャッフリング」といわれる。
【０１０２】
もちろん、当業者は、図２４が本発明の位置的シャッフリング系のほんの１つの例示的な実施形態であることを認識する。例えば、少なくとも２つのセットの適合性のあるオーバーハングを用いること、および潜在的内部エキソンが適合性のある末端により隣接されないことを保証することがたぶん所望され；さもなければ、分子内環化は、本発明の連結における競合反応として重大な複雑化を表し得る。また、固定された他の位置全てを保持し（例えば、図１７）つつ、１つの位置での同一性シャッフリングを可能にすることという極値と全ての位置で完全なシャッフリングを可能にすることという極値との間の中間物を示すエキソンシャッフリング反応を実施することが可能である。ただオーバーハングの適合性を選択することだけより、実施者は、異なる部位でのより高い変動性を可能にするが、特定の鎖の部位で組み込まれ得るエキソンの数を制限し得る。
【０１０３】
本発明の利点の１つは、必要に応じて位置的バリエーションと組み合わせて、同時に多数の部位のバリエーションを可能にすること（すなわち、特定のエキソン配列が異なる生成物分子において異なる位置で終わり得る可能性）である。この現象の重要性のほんの１つの例を与えるために、図２５は、他の技術が、エキソンの鎖の１つの位置を一度に変更し得るライブラリーの生成を可能にし得ることを示す。１０の異なるエキソンが、各々の位置で用いられ得るエキソンの３つの鎖について、３０個の異なる変異体が生成され得る（Ａ１ＢＣ、Ａ２ＢＣ、Ａ３ＢＣ、．．．Ａ１０ＢＣ、ＡＢ１Ｃ、ＡＢ２Ｃ、．．．ＡＢ１０Ｃ、ＡＢＣ１、ＡＢＣ２、．．．ＡＢＣ１０）。対照的に、３つ全ての位置が、同時に変更され得る場合、本発明に従って可能なように、１０００個の異なる変異体が生成され得る。
【０１０４】
上述されるように、進化的プロセスが、既存のエキソンを再分類することにより、しばしば新しい遺伝子を生成することは、現在受け入れられている。大きな遺伝子ファミリーは、明らかにエキソンシャッフリングにより生成されている。本発明に従って、特定の選択された機能的ドメインを互い（上記を参照のこと）に連結することおよびそれらの遺伝子ファミリーにおいて見出されるエキソンをシャッフルすることの両方のために本発明の技術を用いることが所望され、その結果（少なくとも２つの）生成物遺伝子のライブラリーが生成される。
【０１０５】
本発明のエキソンシャッフリング技術は、エキソンの任意の所望されるコレクションに適用され得る。好ましくは、それらの技術は、タンパク質コード配列を含むエキソンに適用される。さらに好ましくは、それらの技術は、異なるメンバーの遺伝子ファミリー（上記の考察を参照のこと）における進化において再使用されているタンパク質コードエキソンに適用される。本発明のエキソンシャッフリング系の１つの特定の好ましい実施形態において、シャッフルされるエキソンは、合成酵素の機能的ドメインを示す。連結に関して、上記で考察されるように、ファミリー内でまたはファミリー間（ｂｅｔｗｅｅｎ）またはファミリーの間で（ａｍｏｎｇ）から、エキソンを再分類する。
【０１０６】
本発明のエキソンシャッフリング技術が適用され得る特定の好ましい遺伝子ファミリーとしては、組織プラスミノーゲン活性化遺伝子ファミリー、動物脂肪酸シンターゼ遺伝子ファミリー、ポリケチドシンターゼ遺伝子ファミリー、ペプチドシンテターゼ遺伝子ファミリー、およびテルペンシンターゼ遺伝子ファミリーが挙げられるがこれらに限定されない。このクラスＩ細菌ポリケチドシンターゼ遺伝子ファミリーは、機能的ドメインの共直線および触媒能力がこのファミリーについて非常に良く確立されるという点で、本発明のエキソンシャッフリング技術の適用のために、特定の魅力のある標的を示す。
【０１０７】
また、クラスＩポリケチドシンターゼと動物脂肪酸シンターゼ、クラスＩＩポリケチドシンターゼ、および／または中間体クラスポリケチドシンターゼ（例えば、真菌性ポリケチドシンターゼで、この機能的構成および触媒的特性が、明らかに細菌クラスＩポリケチドシンターゼとクラスＩＩポリケチドシンターゼとの間の機能的構成および触媒的特性の中間体である）との間の密接な機構的関係は、これらの異なるファミリーのうちの２つ以上の機能的なドメインをコードするＤＮＡを混合するシャッフリング反応を特に興味をそそるものにする。このような反応は、新しい合成酵素のライブラリーを生成し、次いでこのライブラリーは、それらが興味深いかまたは所望される生物学的活性を有するか否かを決定するための任意の利用可能な技術に従ってアッセイされ得る新しい化合物のライブラリーを生成する。
【０１０８】
（既存の技術との統合）
本発明は、選択された核酸分子を互いに連結するために利用可能な方法のみを記載するわけではないことが認識される。例えば、確立された制限酵素に基づく技術は、本発明の系の都合の良さおよび他の利点を有さないが、明らかに、核酸分子の切断および連結を可能にする。また、リボザイムがＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルの核酸の切断および連結を媒介するのに用いられ得る技術が、開発されている（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号；米国特許第５，７８０，２７２号；ＷＯ  ９５０７３５１；ＷＯ  ９８４０５１９、および１９９８年９月２１日出願の米国特許出願番号  ６０／１０１，３２８を参照のこと（これらの各々が本明細書中で参考として援用される；実施例４もまた参照のこと））。
【０１０９】
核酸の操作のためのこれらの異なる系の各々が、特定の利点および不都合を提供する。例えば、リボザイム媒介系は、所望される場合にシャッフリング反応がインビボで実施され得る独特な利点を提供する（例えば、１９９８年９月２１日出願の米国特許出願番号  ６０／１０１，３２８を参照のこと）。さらに、一旦目的のエキソンが第１のトランススプライシングリボザイム成分と連結されているシャッフリングカセットが生成されると、そのエキソンは、単純なトランススプライシング反応における第１のトランススプライシング成分と適合性のある第２のトランススプライシング成分に連結される任意の他のエキソンに連結され得る。従って、リボザイム媒介系が利用されればされるほど、そしてその使用により生成されるシャッフリングカセットの数が多くなればなるほど、その系はより強力になる。
【０１１０】
本明細書中に記載される技術のように、リボザイム媒介核酸操作は、エキソンシャッフリングのために使用され得、そして任意の選択された核酸分子のシームレスな連結を指向するために操作され得る。さらに、本発明の系のように、リボザイム媒介系は、連結を媒介する因子（リボザイム媒介系におけるリボザイム成分；本発明の系におけるオーバーハング）が、特定の選択された他の連結媒介因子とのみ適合性があるように操作され得る。この能力は、図１７において描かれる指向性連結反応（ここで、エキソンのコレクションはともにインキュベートされるが特定の選択されたエキソンのみが互いに連結する状態になり得る）に類似の反応を実施することを能力を可能にする（例えば、実施例４および図２９を参照のこと）。
【０１１１】
本発明の１つの特に好ましい実施形態は、上で参照される特許および特許出願において記載されるリボザイム媒介技術と本明細書中に記載されるプライマーに基づく操作技術の統合を示す。詳細には、本明細書中に記載されるプライマーに基づく核酸操作技術は、リボザイム関連シャッフリングカセットを構築するのに利用され、次いでこれは、ハイブリッド核酸分子を生成するためのスプライシング反応に用いられ、続いて、この分子は、発明のプライマーに基づくストラテジーを用いてクローン化され得そして操作され得る。
【０１１２】
図２６は、このような組合せられたプライマーに基づく核酸操作スキーム／リボザイム媒介核酸操作スキームの１つのバージョンを示す。描かれるように、９つの異なる生成物分子が、発明のプライマーに基づく核酸操作ストラテジーを使用して生成される。これらの分子は、３つの異なるシャッフリングカセットを生成するために共に連結されるように設計される。この第１のシャッフリングカセットは、（ｉ）カセットの転写を指向するプロモーター；（ｉｉ）第１のタグ配列；（ｉｉｉ）上流末端エキソン；および（ｉｖ）第１のリボザイム成分を含む。第２のシャッフリングカセットは、（ｉ）カセットの転写を指向するプロモーター；（ｉｉ）第１のリボザイム成分と適合性のある第２のリボザイム成分（ｉｉｉ）内部エキソン；および（ｉｖ）第３のリボザイム成分（必要に応じて、第２のリボザイム成分との適合性はない）を含む。第３のシャッフリングカセットは、（ｉ）カセットの転写を指向するプロモーター；（ｉｉ）第３のリボザイム成分と適合性のある第４のリボザイム成分（そして必要に応じて、第１のリボザイム成分と適合性がない）；（ｉｉｉ）下流末端エキソン；および（ｉｖ）第２のタグ配列を含む。
【０１１３】
シャッフリングカセットが、本発明のプライマーに基づく技術を用いて生成され得る容易さを考慮すると、シャッフリングカセットがベクターに導入される必要はなく、シャッフリングカセットは直接転写され得る。もちろんそれらは、そう所望される場合には、好ましくは本発明のプライマーに基づく核酸操作技術により、ベクターに導入され得る。各々のカセットは転写され、そして転写生成物は、スプライシング条件下で、インビトロまたはインビボのいずれかで互いにインキュベートされ、３つのエキソンの各々を含むハイブリッド分子を生成する。次いで、このハイブリッド分子は、再び好ましくは本発明のプライマーに基づく操作技術を用いて、ベクターに導入され得まるかまたはさらに操作され得る。
【０１１４】
当業者は、１つより多くの内部カセットが、エキソンシャッフリング（位置的シャッフリングおよび／または同一性シャッフリングを含む）反応かまたは各エキソンのほんの１つのコピーが、予め決定された順番で、ハイブリッド分子に導入される指向性連結反応のいずれかにおいて、図２６の系において用いられ得ることを認識する。あるいはまたはさらに、複数の代わりの上流もしくは下流のエキソンが用いられ得、またはこのような末端エキソンは除かれ得る。同一性エキソンシャッフリング反応の特に好ましい実施形態では、複数の代わりのエキソンが提供され、そしてハイブリッド分子において少なくとも２つの位置（例えば、１つの内部位置および１つの末端位置、２つの内部位置、または２つの末端位置）について、同時にシャッフルされる。
【０１１５】
図２６において示される組み合わされたプライマーに基づく系／リボザイム媒介系の１つの利点は、本発明の方法に従って、示された分子を生成すること、および／またはそれらをベクターもしくは他の所望された場所にクローン化するのに必要とされるプライマーの数の考慮を通して認識され得る。例えば、６７個のプライマーが、１０個の異なる可能なエキソン生成物分子が「Ａ」エキソン、「Ｂ」エキソン、および「Ｃ」エキソンの各々について生成される場合、最初の生成物分子を生成するのに必要とされる。これは、比較的多数のプライマーであるが、シャッフリングカセットの生成のために利用可能な代わりの方法（例えば、標準的な制限酵素に基づくクローニング技術）と比較して、本発明の系を用いて生成物分子が生成されてそして共に連結される容易によって正当化される。ほんの４つのプライマーしか、得られたシャッフリングカセットの増幅のために、またはそれらを他のＤＮＡ分子（例えば、ベクター）に連結するのに必要とされない。最も重要なことには、ほんの２つのプライマーしか、アセンブルされた遺伝子を増幅する（または連結する）ために必要とされない。特にエキソンシャッフリング反応が実施され、そしてアセンブルされた遺伝子のライブラリーが生成される場合、同じ２つのプライマーを用いてそのライブラリーのすべてのメンバーを増幅し得ることに価値がある。
【０１１６】
（自動化）
本発明の技術および試薬の１つの特に魅力的な特徴は、自動化に対するそれらの可能性である。特に、新規のハイブリッド核酸の大きなライブラリーが、本発明のエキソンシャッフリング反応において生成されている場合、多数の異なるサンプルの同時操作を達成するために、自動化されたシステム（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ２０００  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ）を用いることが所望され得る。
【０１１７】
本発明の方法の好ましい自動化された適用のほんの１つの例を与えるために、図２７は、例えば、図２７において描かれるようなエキソンシャッフリングを達成するために、そしてさらに所望される活性についてのシャッフリング反応の生成物をスクリーニングするために利用され得る自動化システムを示す。例えば、図２６の最初の縦の欄に示される生成物分子は、必要な場合にある位置から別の位置にプレートを移動するのにＯＲＣＡロボットアームに頼り、Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００システムをｍｕｌｔｉｍｅｋ  ９６自動化９６−チャンネルピペッターおよびＰＴＣ−２２５  ＤＮＡエンジン（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と組合せて用いて、９６ウェルプレートにおけるＰＣＲによって生成され得る。
【０１１８】
好ましくは、各々のエキソンの生成物分子（例えば、ｎ個の「Ａ」エキソンであるＡ１−Ａｎが調製される；同様にｘ個の「Ｂ」エキソンであるＢ１−Ｂｘ；そしてｙ個の「Ｃ」エキソンである、Ｃ１−Ｃｙが調製される）の複数の代替物が、同時に、Ｔ７／Ｘ、１−４’、Ｔ７／５，６、およびＹ生成物と一緒に調製される。上述されるように、６７個の異なるプライマーが、本明細書中に記載される本発明の方法論に従って、これらの生成物分子を生成するために必要とされる。
【０１１９】
次いで、自動化されたシステムは、所望される連結試薬と共に、一緒に適切な生成物分子をピペッティングするようにプログラムされ、図２６の第２の縦の欄に示される型の３０個のシャッフリングカセットを生成する。次いで、このシステムは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、これらのシャッフリングカセットからＲＮＡを生成するようにプログラムされる。次いで、「Ａ」型、「Ｂ」型、および「Ｃ」型の転写生成物が、全ての可能な組合せで共に混合され、そしてトランス−スプライシング条件下で（なお、自動化システムにおいて）インキュベートされる。全体として、１０００個の異なるスプライシング反応が実施される。
【０１２０】
次いで、各々のスプライシング反応の小さなアリコートが出され、そして増幅生成物がベクターのようなレシピエント分子と容易に連結され得るように本発明のプライマーを用いて増幅される。次いで、得られたプラスミドは、さらなる増幅のために宿主細胞（例えば、細菌細胞）に導入され得るか、またはあるいはインビボもしくはインビトロの発現系に導入され得、その結果アセンブルされてシャッフルされた遺伝子によってコードされる任意のタンパク質生成物が、アッセイされ得る。所望の発現系は、シャッフルされた核酸配列の性質に依存する。ほんの１つの例を与えるために、真菌性ポリケチドシンターゼ遺伝子フラグメント（例えば、真菌性ポリケチドシンターゼタンパク質の機能的ドメインをコードする）がこのアプローチに従ってシャッフルされた場合、それらの合成能を評価するために、１つ以上の真菌性細胞型または哺乳動物細胞型においてそれらにより生成されるハイブリッドタンパク質を発現することが所望され得る。
【０１２１】
（キット）
本発明の実施に有用な試薬は、キット中にともに提供され、アセンブルされることが所望され得る。特定の好ましいキットは、プライマー媒介の核酸操作反応およびリボザイム媒介の核酸操作反応の両方に有用である試薬を含む。
【０１２２】
（実施例）
（実施例１）
（５’オーバーハング配列を有する生成物分子の調製および連結）
本実施例は、３’末端のデオキシリボヌクレオチドおよびこれらの５’末端のリボヌクレオチドを含むハイブリッドプライマーを使用する、５’オーバーハングを有する生成物分子の調製および連結を記載する。
【０１２３】
図１８は、実施された特定の実験の概略図を示す。示されるように、３つの異なる生成物分子が作製され、２つは、ヒトグルタミン酸レセプターのＢサブユニットに対する遺伝子のエキソンに対応し、そして１つは、関連しないヒトβグロブリン遺伝子由来のイントロンに対応する。本発明者らの使用した特定のグルタミン酸レセプターエキソンは、ＦｌｉｐおよびＦｌｏｐとして公知であり、そして図１９Ａおよび図１９Ｂに示され、これらのエキソンのそれぞれのヌクレオチド配列を示す（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６４８２９およびＸ６４８３０）。
【０１２４】
本発明者らは、Ｖｅｎｔ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼおよびヒトＧｌｕＲ−Ｂ＃７（ヒトグルタミン酸レセプターＢサブユニットのエキソン１３〜１６を含むクローニングされたゲノムフラグメント）プラスミドまたはＨβＴ７（ヒトβグロブリン遺伝子のエキソン１〜２を含むクローニングされたゲノムフラグメント）プラスミドを使用するＰＣＲによって、本発明者らの３つの生成物分子のそれぞれを調製した。
【０１２５】
Ｆｌｏｐエキソンを、全体のＤＮＡでありＦｌｏｐエキソンの最初の２０塩基に対応する５’プライマー（図１８のプライマー１；５’−ＡＡＡＴＧＣＧＧＴＴＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧ、配列番号  ）と、最も５’側の４残基が、図１８に小文字で示されるようなＲＮＡである３’プライマー（図１８のプライマー２；５’−ａｃｃｕＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣ、配列番号  ）とを組み合わせて、増幅した。このプライマーは、Ｆｌｏｐエキソンの最後の１８塩基およびイントロンの２塩基に対応する。さらに、これらのプライマーは、ヒトグルタミン酸レセプターＦｌｏｐエキソン（１１５塩基対）およびイントロンの５’末端における最初の２残基の全てに対応するフラグメントを増幅する。
【０１２６】
イントロン１を、ヒトβグロブリンイントロン１の最初の１８塩基に対応する配列であり、そして最も５’側の４塩基がＲＮＡであり、そしてプライマー２の５’末端における４つのＲＮＡ残基に相補的である５’プライマー（図１８のプライマー３；５’−ａｇｇｕＴＧＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡ、配列番号  ）；ヒトβグロブリンイントロン１の最後の２０塩基に対応し、その最も５’側の２塩基がＲＮＡである３’プライマー（図１８のプライマー４、５’−ｃｕＡＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣ、配列番号  ）を組み合わせて増幅した。これらのプライマーは、全体のイントロン（１２９ｂｐ）およびＦｌｏｐエキソンの３’末端における最後の２残基に対応する２つのさらなる残基に対応するフラグメントを、共に増幅する。
【０１２７】
Ｆｌｉｐエキソンを、ヒトグルタミン酸レセプターＦｌｉｐエキソンの最初の１８塩基に対応し、その最も５’側の２残基がＲＮＡであり、そしてプライマー４の５’末端における２つのＲＮＡ残基に相補的である５’プライマー（図１８のプライマー５、５’−ａｇＡＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＡＴＣＴＴＧＣ、配列番号
）と；全体のＤＮＡである最後の２０エキソン塩基に対応する３’プライマー（図１８のプライマー６、５’−ＣＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＧ、配列番号  ）とを組み合わせて増幅した。これらのプライマーは共に、全体のＦｌｉｐエキソン（１１５ｂｐ）およびイントロンの３’末端における最後の２つのヌクレオチドに対応するフラグメントを増幅する。
【０１２８】
それぞれの増幅反応は、以下を含んだ：４００μモルの各々のプライマー、これらのプライマーは、（１００μｌの１×ＮＥＢ  Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて）３７℃で３０分間リン酸化され、続いて２００μｌのヌクレアーゼを含まないｄＨ2Ｏで１０ｐモル／μｌに希釈される；２単位のＶｅｎｔR（登録商標）（エクソ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、１００μｌの１×Ｖｅｎｔ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）；２００μＭ  ｄＮＴＰ；および５ｎｇのテンプレートプラスミド。Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）サーマルサイクラーにおいて、（ｉ）９５℃３分間；（ｉｉ）６０℃３分間；（ｉｉｉ）７２度３分間を１サイクル行った後、（ｉ）９５℃１５秒間；（ｉｉ）６０℃１５秒間；（ｉｉｉ）７２℃３０秒間を３５サイクル行った。
【０１２９】
本発明者らは、ＶｅｎｔR（登録商標）およびＶｅｎｔR（登録商標）（エクソ）は、本発明者らのプライマーにおいてリボヌクレオチドをコピーしないことがわかったので、増幅後、各々の生成物分子は、一末端または両末端に５’リボヌクレオチドオーバーハングを含んだ（Ｆｌｏｐ生成物の３’末端における４ヌクレオチド；βグロブリンイントロン生成物の５’末端における４ヌクレオチド；βグロブリンイントロン生成物の３’末端における２ヌクレオチド；およびＦｌｏｐ生成物の５’末端における２ヌクレオチド）。
【０１３０】
各々の増幅された生成物を、エタノール（ＥｔＯＨ）で沈澱し、そして１０μＬに再懸濁し、３つの増幅生成物の全ての存在を確認するために、これらの２つを６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。次いで、およそ等モル量のそれぞれのフラグメントを含むアリコート（それぞれ２〜４μＬ）を、１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）  Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）および０．５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含有する連結反応において結合した。２０μＬの反応物を、４℃で一晩インキュベートし、連結が生じ得る。次いで、連結の生成物を、プライマー１および３およびＴａｑポリメラーゼを用いて増幅し、これはＲＮＡをコピーする（Ｍｙｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：７６６１、１９９１）。この増幅反応物は、１×Ｔａｑ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、２μＬの連結混合物、および４００μモルの各々のプライマーを含んだ。
【０１３１】
Ｔａｑ増幅の生成物を図２０に示し、そして製造業者の手引きに従って、ＴＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ）に連結した。複数（９つ）のクローンの配列分析（標準ジデオキシ配列決定法、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯｈｉｏからのＵｎｉｖｅｒｓａｌプライマーおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて）によって、全ての連結が正しいことを確認した（図２１および２２を参照のこと）。このストラテジーは、リボヌクレオチド（ｒｕｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）オーバーハングを有する生成物分子を連結したので、これは時々リボヌクレオチドオーバーハングクローニング（ＲＯＣ）と称される。
【０１３２】
（実施例２）
（３’オーバーハング配列を有する生成物分子の調製および連結）
本実施例は、３’末端にデオキシリボヌクレオチド、そして５’末端にリボヌクレオチドを含むハイブリッドプライマーを使用して、３’オーバーハングを有する生成物分子の調製および連結を記載する。
【０１３３】
図２８は、実施された特定の実験の概略図を示す。示されるように、３つの異なる生成物分子が作製され、２つは、ヒトグルタミン酸レセプターのＢサブユニットに対する遺伝子のＦｌｉｐエキソンおよびＦｌｏｐエキソンに対応し、そして１つは、関連しないヒトβグロブリン遺伝子由来のイントロンに対応する（実施例１を参照のこと）。
【０１３４】
３つの生成物分子のそれぞれを、ＲＮＡヌクレオチド、およびヒトゲノムＤＮＡまたはＨＢＴ７のいずれかをコピーするＰｆｕポリメラーゼを使用するＰＣＲによって調製した（実施例１を参照のこと）。Ｆｌｏｐエキソンを、実施例１のプライマー１および２で増幅した；イントロン１を、実施例１のプライマー３および４またはプライマー３および選択的プライマー４（５’−ｕｕｃｕＡＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＧ−３’；配列番号  ）のいずれかで増幅した；Ｆｌｉｐエキソンをプライマー５および６または選択的プライマー５（５’−ａｇａａＣＣＣＡＧＴＡＡＡＴＣＴＴＧＣ；配列番号  ）およびプライマー６のいずれかで増幅した。
【０１３５】
それぞれ１００μＬの反応物は、２．５ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１×Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ緩衝液（１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．８）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、ならびにそれぞれ最終濃度０．５μＭのプライマーを含んだ。ＦｌｏｐおよびＦｌｉｐの反応物は、３７５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを含むが、βグロブリン反応物は、５ｎｇのＨＢＴ７  ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ工程プログラムを、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０において、ＦｌｉｐフラグメントおよびＦｌｏｐフラグメントについて、９５℃５分間；５０℃３分間；７２℃３分間で一度行い、続いて９５℃３０秒間；５０℃３０秒間；７２℃４５秒間を４０サイクルを行い、続いて７２℃５分間を一回行った。アニーリング温度が４６℃であることを除いて、同一のプログラムを使用して、βグロブリンイントロン１を増幅した。ＰｆｕポリメラーゼはＲＮＡをコピーしない（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
生成物文献）（ＰＣＲ生成物文献）ので、ＰＣＲ生成物は５’オーバーハングを含んだ。これらのオーバーハングは、５’ＲＮＡオーバーハングを充填するための５ＵのＴｔｈポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、７２℃３０分間のインキュベーションの間に充填された。（より最近の実験において、ＴｔｈよりもＭ−ＭＬＶ  ＲＴを用いて、オーバーハングを充填することに注意すること。Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴを用いる場合、フラグメントをアガロースゲルで分離した後、１×第一鎖緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ  ｄＮＴＰの２０μＬ中に、２００ＵのＭ−ＭＬＶ  ＲＴで処理した）。このストラテジーにおいて、Ｐｆｕポリメラーゼを使用し得る。これは、増幅反応の間、使用可能な熱安定性のＤＮＡポリメラーゼの最も高い忠実度を有するが、平滑末端反応生成物をまだ作製する。
【０１３６】
増幅された親のＰＣＲ生成物を、アガロースゲルから切り出し、そして精製した。５μｌのそれぞれ精製したサンプルを、質量についてアガロースゲル上で分画した。次いで、平滑末端化生成物を、温和な塩基への曝露を通じたリボヌクレオチドの除去によって３’オーバーハングを含む生成物に転換した。ＮａＯＨ（１Ｎ）をそれぞれ８μｌのゲル単離フラグメントに添加して、最終濃度０．２Ｎにし、そしてサンプルを４５℃で３０分間インキュベートした。塩基を２μｌの１Ｎ  ＨＣｌの添加によって中和した。ＮａＯＨ加水分解は、３’リン酸および５’−ＯＨを作製するので、生成物を連結し得るようにリン酸化する必要がある。ＤＮＡフラグメントを、総量２０μｌの１×Ｔ４  リガーゼ緩衝液（ＵＳＢ）中において、３７℃で３０分間、１０ＵのＰＮＫ（ＵＳＢ）を使用してリン酸化した。約２５ｎｇ（３〜６μｌ）のそれぞれリン酸化した生成物を、２０μｌの最終容量中に結合し、そして５  Ｗｅｉｓｓ  ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＵＳＢ）を有する１×Ｔ４リガーゼ緩衝液中において、１４μＣで１６時間連結した。
【０１３７】
キメラＦｌｏｐ−β−Ｆｌｉｐ生成物を生成するために、二次ＰＣＲ増幅を、一次ＰＣＲに関する上記のように、テンプレートとしての１μｌの連結反応物、プライマー１および６、ならびに５８℃のアニーリング温度を用いて実施した。期待のサイズ（３６０ｂｐ）のキメラ生成物を観察した。この生成物をクローニングし、そして配列決定した；両方の連結接点を配列決定された８クローンの６つ中に回収した。それぞれ２つのクローンは、連結部位の１つにエラーを有した。１つのクローンにおいて、βグロブリンイントロンとＦｌｉｐとの間の境界において３塩基対を喪失した。他方のクローンにおいて、ＡがＴに変化した（データは示さず）。本発明者らは、この手順の充填工程の間に、Ｔｔｈポリメラーゼがこれらのエラーを導入したと推測する。本明細書中に記載されるストラテジーは、ＤＮＡオーバーハングを含む分子の連結を含有するので、これは時々ＤＮＡオーバーハングクローニング（ＤＯＣ）と称される。
【０１３８】
（実施例３）
（プライマーコピーおよび／または連結の成功を決定するためのバイオアッセイ）
本実施例は、特定のＤＮＡポリメラーゼの特定の改変オリゴヌクレオチドプライマーをコピーする（すなわち、テンプレートとして使用する）能力を評価するために使用し得る技術を記載する。例えば、本明細書中に記載される技術は、特定の改変ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド（あるいはそのコレクション）が１つ以上のＤＮＡポリメラーゼによって複製され得るか否かを決定するために有用であり得る。
【０１３９】
図２９は、本発明のバイオアッセイ技術の１つの実施形態を示す。示されるように、テンプレート分子とハイブリダイズする２つのプライマーを提供する。第一のプライマーは、特定のＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であることが公知である；第二のプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる複製をブロックする能力が公知ではない１つ以上の改変ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む。任意のヌクレオチド改変は、この系において研究され得る。
【０１４０】
図２９に示されるように、両方のプライマーが伸長され、その結果、複製がブロックされる場合、５’オーバーハングを有する生成物分子が生成される；複製がブロックされない場合、平滑末端化生成物分子（または、使用されるＤＮＡポリメラーゼに依存する単一ヌクレオチド３’−オーバーハングを含む分子）が生成される。
【０１４１】
次いで、生成物分子を、相補的５’オーバーハングを含み、そして選択マーカー（またはスクリーニングによって同定可能なマーカー）を有するベクターと共にインキュベートする。複製がブロックされた場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じる。次いで、連結を試み、そして特定の改変が相補鎖におけるニックの連結を妨害しない限り、または改変がオーバーハングの５’末端に存在し、隣接する３’末端への連結を妨害する特性である限り、連結はうまくいく。実験を単純化し、任意の特定の反応における可変の数を最小化するために、複製をブロックする能力がすでに公知である場合、改変が、プライマーのまさに５’末端においてのみ組み込まれることが期待され、連結を妨害する能力のみを評価することが所望される。
【０１４２】
次いで、連結生成物を、宿主細胞（好ましくは、細菌）に導入する。問題の改変が複製をブロックし、そして（ｉ）相補鎖における連結をブロックしないか；または、（ｉｉ）相補鎖における連結をブロックするが、インビボにおいてニック対をブロックしないか、のいずれかである場合にのみ、選択可能（またはさもなければ、同定可能）な細胞が増殖し、そして生存する。改変がプライマーの５’末端である場合、改変が複製をブロックしかつ両鎖の連結をブロックしない場合、細胞は増殖するのみである。
【０１４３】
もちろん、改変が１つ以上のリボヌクレオチドまたは他の除去可能なヌクレオチドを構成する場合、複製をブロックする能力がないことに起因するコロニーの非存在は、任意の５’ヌクレオチドと共に改変ヌクレオチドを除去する薬剤で、本来の生成物分子を処理し、次いで、得られた二次生成物分子（共通の３’オーバーハングを含有するベクターとともに、改変ヌクレオチドおよび任意の５’ヌクレオチドに相補な３’オーバーハングを含む）をインキュベートすることによって生じるコロニーの他の非存在から区別され得る。
【０１４４】
（実施例４）
（触媒的なリボザイムエレメントの操作された選択的互換性による、複数の核酸分子の指向性連結）
図３０は、指向性連結反応を示す。これは、互換性のあるリボザイム成分の使用を通じた、特定のエキソンの選択的な連結を可能にする。示されるように、転写物は以下において生成される：（ｉ）第一エキソン（Ａ）は、αＩ５γのＩＩ群イントロン由来の第一のリボザイム成分に連結された；（ｉｉ）第二エキソン（Ｂ）は、（ａ）またαＩ５γのＩＩ群イントロン由来の第二のリボザイム成分（これは、第一のリボザイム成分と互換性がある）、および（ｂ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ  ｌａｃｔｉのＬＴＲＢイントロン由来の第三のリボザイム成分（これは、第二のイントロン成分と互換性がない）によって隣接される；ならびに（ｉｖ）第三エキソンは、ＬＴＲＢイントロン由来の第四のリボザイム成分に連結される（これは、第三のイントロン成分と互換性があるが、第一イントロン成分とはない）。これら３つの転写物は、スプライシング条件下で共にインキュベートされ、そして示されるように、ＡＢＣ生成物のみ（およびＡＣまたは環状Ｂ生成物は含まない）が生成された。
【０１４５】
全部で９つのプラスミドが本研究において使用された：ｐＪＤ２０、ｐＢ．Ｅ５．Ｄ４、ｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂ（２）、ｐＬＥ１２、ｐＢ．５’Ｌａｃ、ｐ３’Ｌａｃ．Ｂ、ｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）Ｂ（２）．５’Ｌａｃ、およびｐ３’Ｌａｃ．Ｂ．Ｅ５．Ｄ４。２回のＰＣＲ増幅を、全長ａＩ５γイントロンを含むプラスミドｐＪＤ２０（Ｊａｒｒｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２３６１、１９８８）をテンプレートとして使用して実施した。第一の反応は、５’エキソンの一部（２７ｎｔ）とともにイントロンの一部（ドメイン１〜３およびドメイン４の７３ｎｔ）を増幅した。以下の使用したプライマー；
【０１４６】
【化１】
2011200257.tif 000003
を設計し、その結果、ＰＣＲ生成物は、その末端にＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位を有した。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてＰＢＳ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、同一の酵素で消化し、その結果、Ｔ７プロモーターの下流に位置した。生じたプラスミドをｐＢ．Ｅ５．Ｄ４と称し、そしてＢ．５’γシャッフリングカセットをコードする（図３１を参照のこと）。
【０１４７】
ｐＪＤ２０をテンプレートとして用いる第二のＰＣＲ反応は、イントロンの異なる部分（ドメイン４の残存する６５ｎｔならびにドメイン５〜６）を、３’エキソンの一部（２９ｎｔ）と共に増幅した。使用したプライマーである
【０１４８】
【化２】
2011200257.tif 000004
を設計し、その結果、ＰＣＲ生成物は、独特のＫｐｎＩ部位およびＢａｍＨＩ部位をその末端に有した。ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして同一の酵素で消化したＰＢＳ−ベクターに連結した。その結果、ＰＣＲ生成物は、Ｔ７プロモーターの下流に位置した。得られたプラスミドを、ｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂと称した（図３１を参照のこと）。
【０１４９】
ｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂプラスミドの配列分析は、３’エキソン配列中に期待しない点変異を示した。期待した配列は、
【０１５０】
【化３】
2011200257.tif 000005
であり；観察した配列は、
【０１５１】
【化４】
2011200257.tif 000006
であった。
【０１５２】
次いで、部位指向性変異誘発反応を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５１８）を用いて実施して、３’エキソン配列にさらなるＢａｍＨＩ部位を挿入した。用いたプライマーは、
【０１５３】
【化５】
2011200257.tif 000007
と称した。部位指向性変異誘発反応の結果として作製されたプラスミドを、ｐＤ４．Ｅ３．（ｄＣ）．Ｂ（２）と称し、そして３’エキソンの長さが１３ｎｔに短くなっている３’γ．Ｂシャッフリングカセットをコードした（図３１を参照のこと）。
【０１５４】
２つのさらなるＰＣＲ反応を、天然の５’エキソンおよび３’エキソンに隣接する全長ＬＴＲＢイントロンをコードするプラスミドｐＬＥ１２（Ｍｉｌｌｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３５３１、１９９６）をテンプレートとして使用して、実施した。第一の反応において、プライマー
【０１５５】
【化６】
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を使用して、ＬＴＲＢイントロンの一部（ドメイン１〜３）および５’エキソンの一部（１５ｎｔ）を増幅した。ＰＣＲ生成物をＴａｑポリメラーゼで作成し、そしてＴｏｐｏ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲ２．１  Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢ．５’Ｌａｃと称し、そしてＢ．５’Ｌａｃシャッフリングカセットをコードした（図３１を参照のこと）。
【０１５６】
同一のＰＣＲ生成物をまた、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂ（２）に連結し、同一の酵素で切断し、３’γ．Ｂ．５’ＬａｃシャッフリングカセットをコードするｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）Ｂ（２）．５’Ｌａｃを作製した（図３１を参照のこと）。
【０１５７】
さらに、プラスミドｐＢ．５’ＬａｃをＳｐｅＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、いくつかの不要な制限部位を除去した。オーバーハングをＫｌｅｎｏｗフラグメントで充填し、そして得られた平滑末端を連結してこのベクターに封入した。これによって作製されたプラスミドを、ｐＢ．５’Ｌａｃ（Ｋ）と称する（図３１を参照のこと）。
【０１５８】
ｐＬＥ１２をテンプレートとして使用した第二のＰＣＲ反応は、プライマー
【０１５９】
【化７】
2011200257.tif 000009
の、３’エキソンの一部（２１ｎｔ）に結合するＰＴＲＢイントロンの一部（ドメイン４〜６）を増幅するための使用を含む。ＰＣＲ生成物が独特のＳａｃＩ部位およびＢａｍＨＩ部位をその末端に有するように、プライマーを設計した。Ｔａｑポリメラーゼを使用してＰＣＲ生成物を作製し、そしてｐＣＲ２．１  Ｔｏｐｏベクターにクローニングした。得られたプラスミドを３’Ｌａｃ．Ｂと称し、そして３’Ｌａｃ．Ｂシャッフリングカセットをコードした（図３１を参照のこと）。
【０１６０】
プラスミドｐ３’Ｌａｃ．ＢをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化して、そしてそれによって作製された１９９３ｂｐのバンドを、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１）を用いてアガロースゲルから精製した。次いで、精製フラグメントを、同一の酵素で消化したｐＥ５．Ｄ４に連結し、３’Ｌａｃ．Ｂ．５’γシャッフリングカセットをコードするプラスミドｐ３’Ｌａｃ．Ｂ．Ｅ５．Ｄ４を生成した（図３１を参照のこと）。
【０１６１】
プラスミドｐＢ．Ｅ５．Ｄ４、ｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂ（２）、ｐＢ．５’Ｌａｃ、ｐ３’Ｌａｃ．ＢおよびｐＤ４．Ｅ３（ｄＣ）Ｂ（２）．５’ＬａｃをＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００１２３）を使用して、４０℃で１時間、６μｇの直線化テンプレートＤＮＡおよび０．５ｍＭの非標識ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰを含有する１００μＬの反応液中において、インビトロで転写した。これらの転写反応において生成されるＲＮＡを、１ＵのＲＱ１  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅを用いて処理し、フェノール−クロロホルムで抽出し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムで脱塩し、そしてＥｔＯＨで沈澱した。引き続いて、沈澱を６μＬの水中に再懸濁した。
【０１６２】
次いで、それぞれの再懸濁したＲＮＡ転写物の１μＬを、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および０．５ＭのＮＨ4Ｃｌまたは０．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4のいずれかを含有する４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で、４５℃で６０分間実施したトランススプライシング反応に使用した。
【０１６３】
トランススプライシング反応後、逆転写／ＰＣＲ反応を実施して、連結されたスプライシング生成物を同定した。検出された生成物は：（ｉ）Ｂ．Ｅ５．Ｄ４およびＤ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂ（２）のトランススプライシングによって生成された連結ａＩγ５エキソンＥ５およびＥ３（図３２、レーン１）；（ｉｉ）３’Ｌａｃ．Ｂおよび３’Ｌａｃ．Ｂのトランススプライシングによって生成された連結ＬＴＲＢ  ５’および３’エキソン（図３３、レーン２）；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ．Ｅ５．Ｄ４、Ｄ４．Ｅ３（ｄＣ）．Ｂ（２）．５’Ｌａｃおよび３’Ｌａｃ．Ｂのトランススプライシングによって生成された３分子の連結生成物（図３３、レーン２および３）。
【０１６４】
（実施例５）
（キメラ生成物の増幅を有さない３’オーバーハング生成物連結のクローニング生成物）
本発明者らは、ＤＯＣ連結反応の生成物を、細菌における複製のためのベクターに、キメラ増幅工程なしに直接クローニングし得ることを見出した。実施例２に上述されるように、本発明者らは、ＤＯＣ実験において使用される場合に、指向的に連結され得るＦｌｏｐ、イントロン１およびＦｌｉｐのＰＣＲ生成物を作製するキメラプライマーを設計した。さらに、ＰＣＲ生成物のＮａＯＨ処理が、Ｆｌｏｐエキソンに上流オーバーハング（これは、ＡｐａＩオーバーハングと互換性がある）およびＦｌｉｐエキソンに下流オーバーハング（これは、ＰｓｔＩオーバーハングと互換性がある）を作製するように、プライマーを設計した。３つのフラグメント全てを、リガーゼならびにＡｐａＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）の存在下で共にインキュベートした。連結混合物のアリコートを、Ｅ．ｃｏｌｉに直接形質転換し、そして期待したキメラクローンを容易に単離し、配列決定し、そして完全であることを見出した（データは示さず）。
【０１６５】
（実施例７）
（ＤＮＡオーバーハングクローニングによる複数のキメラ生成物の構築）
本明細書中に記載される手順の一般性を示すために、本発明者らは、実施例２の技術を適用し、そして種々の異なる分子に適用し、図３５に示される５つの異なるキメラを作製した。５つのキメラ全てを、指向的な３分子の連結によって作製した。これらのキメラを、５’ＲＮＡオーバーハングにおいて充填するために、ＴｔｈよりもＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて作製したことに注意すべきである。Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴを用いる場合、いずれの連結点においてもエラーが検出されなかった。
【０１６６】
（他の実施形態）
当業者には、前述は、本発明の特定の好ましい実施形態の単なる記載であることが明白である；この記載は、添付の特許請求の範囲を参照して規定される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【図１】
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【図２】
2011200257.tif 000011
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
2011200257.tif 000016
【図７】
2011200257.tif 000017
【図８】
2011200257.tif 000018
【図９】
2011200257.tif 000019
【図１０】
2011200257.tif 000020
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2011200257.tif 000023
【図１４】
2011200257.tif 000024
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2011200257.tif 000047
【配列表】
2011200257000001.app
【外国語明細書】
2011200257000001.pdf