(57)【要約】      （修正有）【課題】オリゴヌクレオチドの標的細胞または組織への効果的なデリバリーの可能なナノ粒子の提供。【解決手段】金ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチド最末端に糖残基を担持したコンジュゲート。式（Ｉ）ＭｅＮＰ（−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ）ｐ（Ｉ）式中、ＭｅＮＰは金または銀等の貴金属ナノ粒子を表し、ｔｈｉｏ−Ｌ１は貴金属ナノ粒子表面とチオール基（１または２以上）の相互作用により当該表面に−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ鎖を結合できる硫黄原子を１個または２個以上含有する基または部分（ｍｏｉｅｔｙ）を表し、ｎｕｃは一本鎖もしくは二本鎖−オリゴ−もしくはポリヌクレオチドを表し、Ｌ２は直接結合またはリンカーを表し、ｃａｒｂは糖残基を表し、そしてｐは５〜１０００００の整数を表す、で表される糖修飾核酸と貴金属ナノ粒子のコンジュゲート。【選択図】図１
2011236194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
ＭｅＮＰ（−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ）ｐ    （Ｉ）
上記式中、ＭｅＮＰは金または銀等の貴金属ナノ粒子を表し、
ｔｈｉｏ−Ｌ１は貴金属ナノ粒子表面とチオール基（１または２以上）の相互作用により当該表面に−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ鎖を結合できる硫黄原子を１個または２個以上含有する基または部分（ｍｏｉｅｔｙ）を表し、
ｎｕｃは一本鎖もしくは二本鎖−オリゴ−もしくはポリヌクレオチドを表し、
Ｌ２は直接結合またはリンカーを表し、
ｃａｒｂは糖残基を表し、そして
ｐは５〜１０００００の整数を表す、
で表される糖修飾核酸と貴金属ナノ粒子のコンジュゲート。
【請求項２】
Ｌ２のリンカーが、下記式で示されるいずれかに由来する部分である請求項１に記載のコンジュゲート。
（ａ）
【化１】
2011236194.tif 000013
上式中、Ｌ２に該当する部分は、Ｒ１及びＲ２を除いた部分であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方がＬ１に結合する一般式（Ｉ）のｎｕｃ部分に相当し、他方が一般式（Ｉ）のｃａｒｂに相当するものであり、Ｌ３及びＬ４は、相互に独立して、Ｃ１−Ｃ６−アルキレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは１〜１２の整数である）であるか、または存在し得る場合には直接結合であり、かつ、Ｒ１またはＲ２がｎｕｃ部分に相当する場合には、Ｌ３及びＬ４は、相互に独立して、Ｌ１とｎｕｃの結合する３’もしくは５’末端に対して、それぞれｎｕｃの逆の５’末端のＨＯＣＨ２−とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成するか、または３’末端のヒドロキシル基とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成し、あるいはまた、
Ｒ１またはＲ２がｃａｒｂに相当する場合には、Ｌ３及びＬ４は、相互に独立して、ｃａｒｂとエーテルまたはエステル結合を形成できる、
（ｂ）
【化２】
2011236194.tif 000014
上式中、Ｌ２に該当する部分は、−Ｏ−Ｎｕｃ及びＣａｒｂが除かれた部分であり、
−Ｏ−Ｎｕｃは一般式（Ｉ）のｎｕｃ部分に相当し、Ｃａｒｂは一般式（Ｉ）のｃａｒｂに相当し、ｎｕｃとＬ２は、Ｌ１とｎｕｃの結合する３’もしくは５’末端に対して、それぞれｎｕｃの逆の５’末端のＨＯＣＨ２−とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成するか、もしくは３’末端のヒドロキシル基とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成し、ｃａｒｂとＬ２の結合はエーテル結合であり、
（ｉ）Ａ及びＢはいずれか一方が、水素原子、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を表し、他方は水素原子、ヒドロキシル基または保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、メトキシにより置換されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表す、あるいはまた、
（ｉｉ）Ａ及びＢは相互に独立して、ヒドロキシル基、または保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、メトキシにより置換されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表し、あるいはまた
（ｉｉｉ）Ａ及びＢは一緒になって、単結合を表す。
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまたｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在しなくてもよく、ただし、ａ、ｂ及びｃは全体で３〜７員環を形成するものとして定義されており、ｍは０〜１２の整数を表し、そしてｎは０〜１２の整数を表す、
（ｃ）下記式（Ｉ−ｃ）
【化３】
2011236194.tif 000015
上式中、Ｌ２に該当する部分は、Ｒ１及びＲ２を除いた部分であり、Ｌ５は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは１〜１２の整数である）であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方がＬ１に結合する一般式（Ｉ）のｎｕｃ部分に相当し、他方が一般式（Ｉ）のｃａｒｂに相当するものであり、かつ、Ｒ１またはＲ２がｎｕｃ部分に相当する場合には、Ｌ５は、Ｌ１とｎｕｃの結合する３’もしくは５’末端に対して、それぞれｎｕｃの逆の５’末端のＨＯＣＨ２−とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成するか、または３’末端のヒドロキシル基とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成し、あるいはまた、Ｒ１またはＲ２がｃａｒｂに相当する場合には、Ｌ５は、相互に独立して、ｃａｒｂと
エーテルまたはエステル結合を形成できる。
【請求項３】
請求項２に記載のコンジュゲートであって、
ＭｅＮＰが金であり、
−ｔｈｉｏ−Ｌ１が、−Ｓ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキレンである、上記コンジュゲート。
【請求項４】
請求項２に記載のコンジュゲートであって、糖残基が、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、キノボース、テベトース、ラムノース、フコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、シマロース、アベクォース、アスカリロース、コリトース、パラトース、チベロース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、フコサミン、キノボサミン、ラムノサミン、ノジリマイシン、アピオース、ストレプトース、エバロース、ハマメロース、ノイラミン酸、ムラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、α，α−トレハロース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、トレハロサミン、コウジビオース、ニゲロース、マルトース、マルチトール、マルツロース、イソマルトース、イソマルツロース、パラチノース、ソホロース、ラミナラビオース、セロビオース、セロビオン酸、ゲンチオビオース、ガラクトスクロース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラクトビオン酸、ラクチトール、ラクツロース、メリビオース、ネオラクトース、プリメベロース、ルチノース、シラビオース、スクラロース、スクロース、ツラノース、ビシアノース、ヒアロビウロン酸、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロース、リコテトラオース、マルトテトラオース、スタキオース、マルトペンタオース、ベルバスコース、マルトヘキサオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、δ−シクロデキストリン、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、デキストリン、グルカン、キチン質、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、シアリルルイスＡ抗原、シアリルルイスＸ抗原、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、α，α−トレハロース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、マルトース、ラクトース、マルトトリオース、シアリルルイスＡ抗原及びシアリルルイスＸ抗原よりなる群から選ばれる糖に由来する、上記コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖修飾核酸と貴金属のコンジュゲートに関し、特に、糖修飾核酸と金ナノ粒子のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代の医薬品としてアンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡなどの核酸医薬品が期待されており、既に眼科領域では製品化されている。今後、これら核酸医薬を様々な部位への疾患に適用させることが望まれている。このために解決すべき課題としては核酸を構成するオリゴヌクレオチドの不安定性及びそれぞれの疾患に適した有効なデリバリー方法の開発が挙げられる。近年ではオリゴ−もしくはポリヌクレオチドの安定性及び安全性の向上を目的として、ヌクレオチドに様々な化学修飾が施され、臨床の場で用いられている。さらにカチオン性のポリマー及びリポソームにオリゴヌクレオチドを内包させることで、全身投与系での臨床試験も行われ始めた。
【０００３】
これらの手法の中、アニオン性分子である核酸をカチオン性のミセルやリポソームを用いて核酸内包ナノ粒子として核酸をデリバリーする手法は遺伝子導入に広く用いられている手法である。しかし、オリゴヌクレオチドを運ぶ際には核酸分子が短いため静電相互作用が弱く生体内でナノ粒子が崩壊してしまい効果的なデリバリーが困難である。また、カチオン性の分子は炎症反応を引き起こすことが知られており、毒性の問題もある。カチオン性の粒子を用いる以外の手法として、金粒子上にオリゴヌクレオチドを結合させ、オリゴヌクレオチドをデリバリーする報告がある（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。
【０００４】
非特許文献１では、チオール化したオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）をポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレートと共に金ナノ粒子上に結合させた構築物を用いることによりｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞内へデリバリーすることに成功したことが記載されている。この構築物はポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレートの存在により構築物全体及びｓｉＲＮＡの生理条件下での優れた安定性が達成されることが示唆されている。非特許文献２及び３では、それぞれ、生理食塩水中及び血清中で安定性を示す金ナノ粒子とオリゴヌクレオチドのコンプレックスまたはコンジュゲート（ＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰ）が記載されている。前者は、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を３’末端に導入したアルキルチオールまたは２つの環状ジスルフィド（ｔｗｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）を介して金ナノ粒子に結合させており、後者は、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）をそのセンス鎖の３’末端に導入したオリゴエチレングリコール−チオールを介して金ナノ粒子に結合させている。後者のＲＮＡ−Ａｕ  ＮＰは、１０％血清中で対応する二本鎖ＲＮＡに比べて６倍大きい半減期を有することも非特許文献３には記載されている。
【０００５】
他方、二本鎖ポリヌクレオチドコンプレックスを安定化または不安定化するポリヌクレオチドと結合する化合物を同定する方法において使用するものとして、オリゴヌクレオチドを結合した機能化ナノ粒子が提案されている（特許文献１）。これらのナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの３’−または５’−末端に導入したアルカンチオール、アルカンジスルフィドまたは環状ジスルフィドを介して金表面にオリゴヌクレオチドを結合して作製されている。また、かようなオリゴヌクレオチドに使用環境下（生物学的流体中等）での安定性を付与する目的でヌクレオチド間の結合を改変したり、ヌクレオチドの糖残基を修飾したり、することも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ  ２００９／０２２１０９５  Ａ１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｉｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００６）３５，１０４６−１０４７
【非特許文献２】Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１２，１０２７−１０３０
【非特許文献３】Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２００９）１３１，２０２７−２０７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術文献によると、ｓｉＲＮＡ等のオリゴヌクレオチドが結合した金粒子またはこのような金粒子に固定化されているｓｉＲＮＡのオリゴヌクレオチドが血清中である程度安定であり、細胞外ヌクレア−ゼに一定の抵抗性を示すことが示唆されている。しかし、未だ、細胞外の生理学的環境下でより安定性の高いオリゴヌクレオチドを担持するコンジュゲートまたはコンプレックスについてのニーズは依然として存在する。したがって、本発明の目的は、例えば、標的とする特定の細胞または組織にオリゴ−もしくはポリヌクレオチドをデリバリーできる新たなオリゴ−もしくはポリヌクレオチドと適当な担体のコンジュゲートまたはコンプレックスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、固相合成法を利用して核酸の糖修飾を簡易に実施できる方法を開発し、先に特願２００９−１６０８８７明細書に開示した。この方法で合成した糖修飾オリゴヌクレオチドをチオール化した後、導入したチオール基と金ナノ粒子表面との相互作用により糖修飾オリゴヌクレオチド結合金ナノ粒子のコンジュゲートを作製したところ、血清中等の細胞外の生理学的環境下で安定なナノ粒子コンジュゲートを提供できることを見出した。さらに、このようなオリゴヌクレオチドの安定性は、金に代え銀などの貴金属ナノ粒子を用い場合も同様である。
【００１０】
したがって、上記課題は、一般式（Ｉ）
ＭｅＮＰ（−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ）ｐ    （Ｉ）
で表される糖修飾核酸と貴金属ナノ粒子のコンジュゲートを提供することにより解決できる。
【００１１】
上記式中、ＭｅＮＰは金または銀等の貴金属ナノ粒子を表し、
ｔｈｉｏ−Ｌ１は貴金属ナノ粒子表面とチオール基（１または２以上）の相互作用により当該表面に−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ鎖を結合できる硫黄原子を１個または２個以上含有する基または部分（ｍｏｉｅｔｙ）を表し、
ｎｕｃは一本鎖もしくは二本鎖−オリゴ−もしくはポリヌクレオチドを表し、
Ｌ２は直接結合またはリンカーを表し、
ｃａｒｂは糖残基もしくはオリゴ糖鎖を表し、そして
ｐは５〜１０００００の整数を表す。
【発明の効果】
【００１２】
このような一般式（Ｉ）で表されるコンジュゲートは、本発明を解釈する上で理論により何ら拘束されるものでないが、水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または血液中等の水性媒体中で最外殻に糖残基を持ったナノ粒子を形成するものと理解される。このようなナノ粒子は、−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ鎖が密集して、例えば金粒子に結合する場合には、あたかも、コア部分（金粒子）−オリゴヌクレオチド部分−糖残基もしくはオリゴ糖鎖部分の三層が静電相互作用でなく、それぞれ共有結合乃至配位結合で結合された構造の新規ナノ粒子を提供する（概念図を図１に示す。）。これらのナノ粒子は最外殻の糖残基もしくはオリゴ糖鎖の存在により、最外殻に糖残基もしくはオリゴ糖鎖を持っていないオリゴヌクレオチド結合金ナノ粒子に比べ、血清等の生体外または生体内環境下での安定性が有意に向上する。さらに、糖残基もしくはオリゴ糖鎖がクラスター状に最外殻層に提示されるため、このクラスター化した糖残基もしくはオリゴ糖鎖と成体組織の相互作用を通して、組織特異的な様式で当該コンジュゲートをデリバリーすることが可能になる。また、理論により拘束されるものでないが、このような安定性は、オリゴヌクレオチドが金ナノ粒子に結合していることと相俟って糖残基の存在がオリゴヌクレオチドに対する周囲環境の化学的もしくは物理的作用による影響を低減し、また、ヌクレア−ゼによる分解に対する抵抗性をオリゴヌクレオチドに付与するものと理解される。したがって、本発明によれば、化学的もしくは物理的に、また、酵素分解性に対して不安定なオリゴヌクレオチドですら安定に標的細胞または組織にデリバリーすることが可能になる。しかも、特定の細胞または組織に標的指向性を有することが知られている糖もしくはオリゴ糖の糖残基もしくはオリゴ糖鎖を最外殻に有するナノ粒子は、向上した標的指向性を示す可能性もある。例えば、ガラクトースを粒子上に多数提示すると肝臓に効率的に取り込まれることが知られており肝臓への特異的なデリバリーへの展開が期待できる。また白血球はシアリルルイスＸを表面に多数有しており、血液中を循環している事に寄与している。また悪性腫瘍が転移する際には細胞表面の糖残基が転移先の組織と相互作用することで転移を可能にしていることがわかっている。これらの系に見られるように粒子上に適当な糖残基を提示すると有益な様々な生物学的活性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】糖鎖を最外殻に有するナノ粒子の構築方法及び糖鎖を３’末端、チオール基を５’末端に持つオリゴ核酸の概念図である。
【図２】実施例３で構築し、測定したナノ粒子の粒経のグラフ表示である。黒丸の付した実線は糖を最外殻に有する粒子の結果であり、単なる実線は核酸がむき出しになった比較の粒子。
【図３】実施例４におけるナノ粒子の血清中での安定性試験（２週間後の凝集）の結果のグラフ表示である。黒丸の付した実線は糖を最外殻に有する粒子の結果であり、単なる実線は核酸がむき出しになった比較の粒子の結果である。
【図４】実施例４におけるナノ粒子の血清中での安定性試験のＵＶ−Ｖｉｓの測定結果のグラフ表示である。実線が実験開始前の両粒子についての測定結果であり、細い破線は糖を最外殻に有する粒子の結果であり、太い破線は核酸のむき出しになった比較の粒子の結果である。
【図５】実施例５における糖修飾核酸金ナノ粒子と糖未修飾核酸金ナノ粒子のラット初代肝細胞への取込み挙動を表すグラフ表示である。
【図６】実施例６におけるガラストースによるコンペティションアッセイの結果を表すグラフ表示である。
【発明の詳細な記述】
【００１４】
以下、本発明を規定する略号または用語についてより具体的に説明する。
【００１５】
金または銀等の貴金属ナノ粒子は、金ナノ粒子が好ましく用いられるので、説明を簡潔にするために専ら金ナノ粒子について説明する。金ナノ粒子の形状は、球、または立方晶
系、正方晶系、斜方晶系（８面体もしくは１２面体）、単斜方晶系、六方晶系等の晶系にみられる形状またはこれら形状のほぼ８０％（各面の長軸または短軸の長さがそれぞれ最大でも２０％変化した）が保持された形状の粒子が挙げられる（特定形状の金ナノ粒子の調製方法は、例えば、Ｗｅｎｘｉｎ  Ｎｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２００９）１３１，６９７−７０３参照）。これらの粒子のサイズは、当該技術分野でナノ粒子のカテゴリーに入ると認識されるものである限り限定されるものでないが、例えば、異なる複数の方向から投射した際にできる影の面積から常法に従って球状の粒子に換算した場合に、平均直径が２ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは、４ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくは４ｎｍ〜１００ｎｍ、特に好ましくは４ｎｍ〜６０ｎｍである。また、同様に限定されるものでないが、斜方（直方）体の場合には、短軸（１または２）が２ｎｍ〜５０ｎｍであり、長軸（１または２）が１０〜５００ｎｍであるサイズを有する粒子を用いることができる。このような形状及びサイズを持つナノ粒子のいくらかは市販のされており（例えば、ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのホームページ（http://www.britishbiocell.co.uk/products/goldreagents.asp?navid=2）参照）、市販されていない場合には、非特許文献２または非特許文献３中で引用された文献に記載の方法に準じて容易に入手できる。
【００１６】
ｔｈｉｏについて定義する、硫黄を１個または２個以上含有する基または部分としては、また、非特許文献１〜３のいずれかにおいてオリゴヌクレオチドをチオール化する際に用いられている、２つの環状ジスルフィド（ｔｗｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ｊｉｓｕｒｕｆｉｄｅｓ（ＤＴＰＡ））、アルキルチオール足場形成（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）基（例えば、−Ｓ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキレン−の場合、−Ｃ１−Ｃ１２−アルキレン−が−Ｌ１−に相当する）等及び下式の（）ｎで表される部分を挙げることができる。
【００１７】
【化１】
2011236194.tif 000003
【００１８】
上記の繰り返し数について規定するｎはＧｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社の化合物ＤＴＡＰ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１０−１９３７−９０）を用いると整数１〜１０が選択可能である。
【００１９】
ｎｕｃについて定義する、一本鎖もしくは二本鎖−オリゴ−もしくはポリヌクレオチドにいうヌクレオチドは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を構成するヌクレオチドを意味し、５〜１００、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜４０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、または５〜１０個のヌクレオチドからなるものであることができる。機能上、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ等に分類できるオリゴヌクレオチド、さらにこれらのオリゴヌクレオチドを鎖内またはいずれかの末端に含むポリヌクレオチドであることもできる。限定されるものでないが、これらのオリゴ−もしくはポリ−ヌクレオチドは、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ等の遺伝子を標的にしたものであることができる。また、本明細書では核酸とオリゴ−もしくはポリヌクレオチドを交換可能な
概念で用いる場合もある。
【００２０】
上記Ｌ１とｎｕｃとの結合は、ヌクレオチドの３’末端のヒドロキシル基とのエーテル結合もしくはエステル結合またはリン酸残基とのリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合であるか、あるいはまたヌクレオチドの５’末端のＨＯＣＨ２−とのエーテル結合もしくはエステル結合またはリン酸残基とのリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合であることができる。
【００２１】
Ｌ２について定義する直接結合またはリンカーにいう、リンカーは、以下の構造式中に含まれる結合を形成することができる。
【００２２】
（ａ）群：
下記式のいずれかに示される後述する部分
【００２３】
【化２】
2011236194.tif 000004
【００２４】
上式中、Ｌ２に該当する部分は、Ｒ１及びＲ２を除いた部分であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方がＬ１に結合する一般式（Ｉ）のｎｕｃ部分に相当し、他方が一般式（Ｉ）のｃａｒｂに相当するものであり、Ｌ３及びＬ４は、相互に独立して、Ｃ１−Ｃ６−アルキレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは１〜１２の整数である）であるか、または存在し得る場合には直接結合であり、かつ、Ｒ１またはＲ２がｎｕｃ部分に相当する場合には、Ｌ３及びＬ４は、相互に独立して、Ｌ１とｎｕｃの結合する３’もしくは５’末端に対して、それぞれｎｕｃの逆の５’末端のＨＯＣＨ２−とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成するか、または３’末端のヒドロキシル基とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成し、あるいはまた、
Ｒ１またはＲ２がｃａｒｂに相当する場合には、Ｌ３及びＬ４は、相互に独立して、ｃａｒｂとエーテルまたはエステル結合を形成できる。
【００２５】
（ｂ）群：
下記式（Ｉ−ａ）で示される後述部分
【００２６】
【化３】
2011236194.tif 000005
【００２７】
で表される糖修飾核酸において、
上式中、Ｌ２に該当する部分は、−Ｏ−Ｎｕｃ及びＣａｒｂが除かれた部分である。
【００２８】
上式中、−Ｏ−Ｎｕｃは一般式（Ｉ）のｎｕｃ部分に相当し、Ｃａｒｂは一般式（Ｉ）のｃａｒｂに相当し、ｎｕｃとＬ２は、Ｌ１とｎｕｃの結合する３’もしくは５’末端に対して、それぞれｎｕｃの逆の５’末端のＨＯＣＨ２−とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成するか、もしくは３’末端のヒドロキシル基とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成し、ｃａｒｂとＬ２の結合はエーテル結合である。
【００２９】
上式中、
（ｉ）Ａ及びＢはいずれか一方が、水素原子、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を表し、他方は水素原子、ヒドロキシル基または保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、メトキシにより置換されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表す。あるいはまた、
（ｉｉ）Ａ及びＢは相互に独立して、ヒドロキシル基、または保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、メトキシにより置換されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表し、あるいはまた
（ｉｉｉ）Ａ及びＢは一緒になって、単結合を表す。
【００３０】
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまたｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在していなくてもよく、ただし、ａ、ｂ及びｃは全体で３〜７員環を形成するものとして定義されており、ｍは０〜１２の整数を表し、そしてｎは０〜１２の整数を表す。
【００３１】
（ｃ）群
下記式（Ｉ−ｃ）
【００３２】
【化４】
2011236194.tif 000006
【００３３】
で表される糖修飾核酸において
上式中、Ｌ２に該当する部分は、Ｒ１及びＲ２を除いた部分であり、Ｌ５は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは１〜１２の整数である）であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方がＬ１に結合する一般式（Ｉ）のｎｕｃ部分に相当し、他方が一般式（Ｉ）のｃａｒｂに相当するものであり、かつ、Ｒ１またはＲ２がｎｕｃ部分に相当する場合には、Ｌ５は、Ｌ１とｎｕｃの結合する３’もしくは５’末端に対して、それぞれｎｕｃの逆の５’末端のＨＯＣＨ２−とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成するか、または３’末端のヒドロキシル基とエーテル結合もしくはエステル結合、リン酸残基とリン酸ジエステル結合またはチオリン酸エステル結合を形成し、あるいはまた、Ｒ１またはＲ２がｃａｒｂに相当する場合には、Ｌ５は、相互に独立して、ｃａｒｂとエーテルまたはエステル結合を形成できる。
【００３４】
上記一般式（Ｉ）の貴金属ナノ粒子に結合する鎖（−ｔｈｉｏ−Ｌ１−ｎｕｃ−Ｌ２−ｃａｒｂ）の数をあらわすｐは、当該ナノ粒子のサイズにより大きく変動し、整数５〜１０００００、好ましくは、１０〜５０００、より好ましくは１０〜３６００である。例えば、オリゴ−もしくはポリオリゴヌクレオチドの細胞または組織へのデリバリー用としては、平均直径が４ｎｍ〜６０ｎｍものもが特に好ましいが、このような粒子を対象とすると、上記のｐは、限定されるものでないが、２０〜３６００であり、例えば、平均直径が４〜１７ｎｍである場合には、ｐは４０〜３００であることができる。このような数は、それ自体公知の方法で確認できるが、例えば後述する実施例に記載の方法によるのが簡便である。
【００３５】
本発明に関して、糖残基もしくはオリゴ糖鎖またはリン酸残基という場合には、リン酸基または糖のヒドロキシル基の１つから水素原子が除去された状態にある基を意味する。このような糖残基もしくはオリゴ糖鎖の起源となる糖としては、各種ペントース、ヘキソース、ヘプトース、ウロン酸、デオキシ糖、アミノ糖、アミノウロン酸、ケトース、及びこれらの糖の２〜１５個からなる直鎖または分岐オリゴ糖を挙げることができる。より具体的には、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、キノボース、テベトース、ラムノース、フコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、シマロース、アベクォース、アスカリロース、コリトース、パラトース、チベロース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、フコサミン、キノボサミン、ラムノサミン、ノジリマイシン、アピオース、ストレプトース、エバロース、ハマメロース、ノイラミン酸、ムラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、α，α−トレハロース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、トレハロサミン、コウジビオース、ニゲロース、マルトース、マルチトール、マルツロース、イソマルトース、イソマルツロース、パラチノース、ソホロース、ラミナラビオース、セロビオース、セロビオン酸、ゲンチオビオース、ガラクトスクロース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラクトビオン酸、ラクチトール、ラクツロース、メリビオース、ネオラクトース、プリメベロース、ルチノース、シラビオース、スクラロース、スクロース、ツラノース、ビシアノース、ヒアロビウロン酸、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロース、リコテトラオース、マルトテトラオース、スタキオース、マルトペンタオース、ベルバスコース、マルトヘキサオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、δ−シクロデキストリン、グリコーゲン、アミロース、アミ
ロペクチン、デキストリン、グルカン、キチン質、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、シアリルルイスＡ抗原、シアリルルイスＸ抗原、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、α，α−トレハロース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、マルトース、ラクトース、マルトトリオース、シアリルルイスＡ抗原、シアリルルイスＸ抗原を糖残基もしくはオリゴ糖鎖の起源として挙げることができる。
【００３６】
上記の結合様式の代表例は、下記の式で表すことができる。
【００３７】
【化５】
2011236194.tif 000007
【００３８】
なお、本明細書では、糖残基と糖鎖は互換可能な概念で用いている。
【００３９】
上記（ｂ）群のリンカーは、本発明者等が先に特願２００９−１６０８８７に開示したものであり、固相合成法の利用により核酸（オリゴ−もしくはポリヌクレオチド）の糖修飾物を簡易に行うことのできる方法で利用されるものであり、本発明の好ましいリンカーといえる。
【００４０】
（ｂ）群のリンカーを含む式（Ｉ−ａ）で表される糖修飾核酸のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドの３’末端または５’末端にＨｒ−ｔｈｉｏ−Ｌ１−（ここで、ｒは整数１または２以上の整数であり、−ｔｈｉｏ−Ｌ１及びＬ１とオリゴ−もしくはポリヌクレオチドとの結合様式は上述したとおりである）を導入することにより、上記式（Ｉ）のコンジュゲートを提供することができる。一方、（ａ）群の糖修飾核酸は、それ自体公知の方法で提供できる。
【００４１】
本発明の好ましい態様である（ｂ）群のリンカーを有する糖修飾核酸を提供でき下記式（Ｉ−ｂ）で表される代表的な配糖体の製造について、以下により具体的に説明する。
【００４２】
【化６】
2011236194.tif 000008
【００４３】
上記式中、
Ｒ１は、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンジル基、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンズヒドリル基またはフェニル環がメトキシ、により置換されていてもよいトリチル基（例えば、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基）、アセタール（例えば、テトラヒドロピラニル）、アリル、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリル、ハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、を表し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、相互に独立して、保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、メトキシにより置換されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表し、あるいはまた（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）
Ｒ２はメトキシにより置換されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基、アセチルアミノ基、アリルオキシカルボニルアミノ基、トリクロロエチルオキシカルボニルアミノ基、Ｎ−フタルイミノ基を表してもよく、あるいはまた
Ｒ４とＲ５は一緒になって、環状アセタールである、イソプロピリデンアセタール、ベンジリデンアセタール、シリルアセタール（例えば、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）を形成する原子団を表してもよい、
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまた
ｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在しなくてもよく、
ただし、ａ、ｂ及びｃは全体で３〜７員環を形成するように定義されており、
ｍは０〜１２の整数を表し、そしてｎは０〜１２の整数を表す。
（ｉ）Ａ及びＢはいずれか一方が、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を表し、他方は上記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５について定義したのと同じ保護されたヒドロキシ基を表し、または
（ｉｉ）Ａ及びＢは相互に独立して、ヒドロキシル基、または上記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５について定義したのと同じ保護されたヒドロキシ基を表し、または
（ｉｉｉ）Ａ及びＢは一緒になって、単結合を表す。
【００４４】
上記の各基の定義は、限定されるものでないが、より詳細には、次の意味を有する。
フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいという場合の、メトキシは、好ましくは、フェニル環が結合するメチル基に対しパラ（ｐａｒａ−）位に結合している。
直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルは、限定されるものでないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルを表す。これらのアルキルがハロゲン原子により置換されている場合のハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、好ましくは、塩素を挙げることができる。したがって、保護されたヒドロキシル基のうちの典型的な好ましい基は、アセチル基、クロロアセチル基、イソプロピルカルボニル基、等である。
Ｒ２は上記のような保護されたヒドロキシル基であることができるが、メトキシにより置換（パラ位において）されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ（例えば、トリメチルシリルオキシ、ジメチルｔ−ブチルシリル）基、フェニルカルボニルオキシ基、アセチルアミノ基、アリルオキシカルボニルアミノ基、トリクロロエチルオキシカルボニルアミノ基、Ｎ−フタルイミノ基、であることができる。
Ｒ４とＲ５も、上記のような保護されたヒドロキシル基であることができるが、一緒になって、環状アセタールである、イソプロピリデンアセタール、ベンジリデンアセタール、シリルアセタール（例えば、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）を形成する原子団（イソプロピルメチレンジオキシ、ベンジルメチレンジオキシ、）であることができる。
【００４５】
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまたｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在しなくてもよくとの定義に該当するものの具体的な組み合わせの例は、限定されるものでないが、ａ＝ｂ＝ｃ＝０、ａ＝ｂ＝０でｃｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝１でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝１、ａ＝１でｂ＝ｃ＝０、ａ＝ｂ＝１でｃ＝０、ａ＝３でｂ＝０でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝１でｂ＝２でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝２、ａ＝ｃ＝１でｂ＝０、ａ＝ｂ＝１でｃ＝１、及びａ＝ｂ＝０でｃ＝３であるものを挙げることができる。これらの中、ａ＝ｂ＝ｃ＝０、ａ＝ｂ＝１でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝１、ａ＝ｂ＝１でｃ＝０、ａ＝ｂ＝０でｃ＝２の組み合わせが好ましく、ａ＝ｂ＝１でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝１、ａ＝ｂ＝１でｃ＝０、の組み合わせが特に好ましい。
【００４６】
また、ヒドロキシル基が保護された糖残基の代表例は下記式で表すことができる。
【００４７】
【化７】
2011236194.tif 000009
【００４８】
Ａｃ、ＣｌＡｃ、Ｂｎの構造を以下に示す。
【００４９】
【化８】
2011236194.tif 000010
【００５０】
さらに、説明を簡潔にするために、限定されるものでないが、本発明の特定の配糖体の製造例について説明する反応スキームを下記に示す。
【００５１】
【化９】
2011236194.tif 000011
【００５２】
化合物１は既知の合成方法（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００３）２５２９）により合成できる。上記反応スキーム中の反応条件は、後述する製造例において具体的に説明する。
【００５３】
このような反応スキーム及びそれに準ずる反応スキームに従い製造できる配糖体は、上述したとおり核酸（アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ等）の修飾、特に、固相合成法を利用する修飾に都合よく用いることができる。固相合成法は、当該技術分野で周知の核酸の固相化学合成に用いられている反応条件、反応試薬、操作法等に従って実施できる。このような固相合成に用いる固体支持体は、当該技術分野で公知のものが使用できる。かような固体支持体は、架橋ポリスチレンをベースとするもの、多孔質ガラスビーズ等であることができ、市販されている種々多様な固体支持体を利用できる。
【００５４】
上記の式（Ｉ−ｂ）で表される配糖体及びそれを利用する糖修飾核酸のより詳細な製造例は、上記の特願２００９−１６０８８７明細書を参照できるが、当該明細書の内容はここに引用することにより、本明細書の内容に組み込まれる。
【実施例】
【００５５】
以下に、本発明の特定の実施態様についてさらに具体的に説明する。
【００５６】
実施例１：糖で３’末端に修飾した核酸の核酸合成機での合成
（１）上記反応スキームに記載された配糖体（化合物８：式中、Ａｃはアセチル基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルチル基である）を担持させたＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（２０ｍｇ）を核酸合成機の反応カラム（グレンリサーチ社製）に入れてホスホロアミダイト法で核酸を合成した。合成した核酸は５’ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ−３’であり合成後、アンモニア／エタノール（３／１）で５５℃において６時間反応させ脱保護及び切り出しを行った。Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ製）で精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分子量を解析したところ、３３６５に目的分子量が得られた。
（２）上記で合成した核酸は以下に示す配列の核酸である：
ＲＮＡ１：５’−ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＣＡＵ  ＣＵＣ  ＵＡＣ  ＡｄＴｄＴ−３’ＲＮＡ２：５’−ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＣＡＵ  ＣＵＣ  ＵＡＣ  ＡｄＴｄＴ−ｇａｌ−３’
ＲＮＡ３：５’−ＵＧＵ  ＡＧＡ  ＧＡＵ  ＧＣＧ  ＧＵＧ  ＧＵＣ  ＣｄＴｄＴ−３’ＲＮＡ４：５’−ＵＧＵ  ＡＧＡ  ＧＡＵ  ＧＣＧ  ＧＵＧ  ＧＵＣ  ＣｄＴｄＴ−ｇａｌ−３’
ここで、ＲＮＡ１及びＲＮＡ３は二本鎖にした場合、Ｓｕｒｖｉｖｉｎに対するｓｉＲＮＡであり、ＲＮＡ２、ＲＮＡ４はそれぞれ３’末端にガラクトースで修飾したものである。
【００５７】
実施例２：糖修飾核酸のチオール化
（１）上記の実施例１によりガラクトースを固定化した固相（２０ｍｇ、０．２μｍｏｌ）及びＧｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社の５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｅｒ  Ｃ６（Ｃａｔａｌｏｇ  ＮＯ．１０−１９２６−９０）を用いて核酸の５’末端にチオ−ル基を導入しさらに核酸の３’末端にガラクトースを導入した核酸を合成した。合成した核酸は５’ＴｒＳ−（ＣＨ２）６−ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ−３’である（式中、Ｔｒはトリチル基である）。合成後、アンモニア水：エタノール（３：１）中の５５℃下で４時間反応させ、脱保護及び固相から切り出しを行った。脱保護後、Ｓｅｐ−Ｐａｃ  Ｃ１８で精製し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製を行った。ＭＡＬＤ１−ＴＯＦ−ＭＳで分子量を解析したところ、６８４５に目的分子量が得られた。精製した核酸を硝酸銀（１ｍＭ）により室温で５分間処理し、その後ジチオトレイトール（１．５ｍＭ）により室温で１時間処理することでチオールを保護しているトリチル基を脱保護した。脱保護した核酸はＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア）により精製し、凍結乾燥した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分子量を解析したところ、６６０３に目的分子量が得られた。
（２）同様に、コントロールとして、ガラストールで修飾していない核酸５’ＴｒＳ−（ＣＨ２）６−ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ−３’（式中、Ｔｒはトリチル基である）も合成した。
【００５８】
実施例３：核酸と金粒子の結合
【００５９】
【化１０】
2011236194.tif 000012
【００６０】
（１）粒径５ｎｍの金粒子（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）６６０μＬにチオール核酸２ｎｍｏｌを加え脱イオン水中で２４時間静置し反応させた。２４時間後１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を用いてＮａＣｌ濃度を０．３Ｍにしさらに２４時間静置して反応させた。反応後、遠心（１４０００ｒｐｍ、２０分）により金粒子を沈殿させて上澄み液を除去し未反応の核酸を除去した。得られた沈殿物にＰＢＳ溶液を１ｍｌ加え、遠心（１４０００ｒｐｍ、２０分）により金粒子を沈殿させて洗浄を行った。この洗浄操作を合計三回行い核酸が結合した金粒子を得た。
（２）上記（１）同様に操作するが、スケールアップして当該金粒子を得た。具体的には、粒径１５ｎｍの金粒子（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）６．６ｍＬに、それぞれ、２０ｎｍｏｌのガラストース修飾チオール核酸及びガラストース未修飾チオール核酸を加え脱イオン水中で２４時間静置し反応させた。２４時間後１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を用いてＮａＣｌ濃度を０．３Ｍにしさらに２４時間静置して反応させた。反応後、遠心（１４０００ｒｐｍ、２０分）により金粒子を沈殿させて上澄み液を除去し未反応の核酸を除去した。得られた沈殿物にＰＢＳ溶液を１ｍｌ加え、遠心（１４０００ｒｐｍ、２０分）により金粒子を沈殿させて洗浄を行った。この洗浄操作を合計三回行い核酸が結合した金粒子を得た。
【００６１】
得られた核酸修飾金ナノ粒子上の核酸の数は、以下のようにして求めることができる。例えば、上記（１）で得られた核酸修飾金ナノ粒子を１０ｍＭのジチオトレイトール中により室温で８時間反応させ、その後金粒子から放出された核酸の濃度をＯｌｉＧｒｅｅｎ（インビトロジェン社）により定量した。その結果、１個の金粒子あたり１１０本の核酸が結合していることが確認された。
【００６２】
上記１により構築した粒子の大きさを（ゼータサイザー、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）により測定した結果を図２に示す。コントロールとして糖を提示していない核酸を金粒子に結合させた系も構築した。共に３０ｎｍ程度の粒径であることが確認された。
【００６３】
実施例４：核酸結合金ナノ粒子の安定性試験
次に糖−オリゴ核酸コンジュゲート及びコントロールとなる未糖修飾オリゴ核酸を金粒子に結合させたナノ粒子（金粒子０．２ｐｍｏｌ）を１０％血清が存在する培地に加え３７℃のインキュベーターで２週間放置し、ナノ粒子の安定性を見た。結果を図３に示す。図３から核酸がむき出しになっている従来のナノ粒子では血清中で不安定であり粒径が大きくなっているが、糖鎖を最外殻に有するナノ粒子は血清中で安定であり粒径がほとんど変化していないことがわかる。
【００６４】
また、ＵＶ−Ｖｉｓの測定結果を図４に示す。この図から、金ナノ粒子は凝集すると長波長側に吸収がシフトすることがわかっている。ＵＶ−Ｖｉｓの結果より糖鎖を最外殻に提示したナノ粒子はシフト幅が小さくナノ粒子が血清中で安定化していることがわかる。
【００６５】
実施例５：ガラクトース修飾金ナノ粒子と未修飾金ナノ粒子のラット初代肝細胞への取り込み試験
８週齢のラットを解剖し初代肝細胞を得てコラーゲンコートされた９６ｗｅｌｌプレート２ｘ１０４個／ｗｅｌｌの濃度で播種した。播種後２４時間後にガラクトース修飾核酸を結合させた金粒子及びガラクトース未修飾核酸を結合させた金粒子を１ｎｍｏｌの濃度になるように細胞に添加し、０．５、１、３、５、１２時間後に細胞を回収し、細胞に取り込まれている金粒子の数をＩＣＰ−ＭＳにより解析した。結果を図５に示す。図５の結果より、ガラクトースを修飾した金ナノ粒子は未修飾の金ナノ粒子よりも高効率でラット初代肝細胞に取り込まれている事が確認できる。
【００６６】
つまり、ガラクトース修飾核酸を結合させた金粒子ガラクトースをクラスター状に最外殻層に提示しているため、粒子が安定化し、レセプターを介した選択的な取り込みにより、高効率で細胞に取り込まれている。
【００６７】
実施例６：ガラクトースによるコンペティションアッセイ
ガラクトースを修飾金ナノ粒子の高効率な取り込みがアシアログリコプロテインレセプター(Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)を介したものである事を確認するため、ガラクトースによるコンペティションアッセイを行った。８週齢のラットを解剖し初代肝細胞を得てコラーゲンコートされた９６ｗｅｌｌプレート２ｘ１０４個／ｗｅｌｌの濃度で播種した。播種後２４時間後にガラクトース修飾核酸を結合させた金粒子を１ｎｍｏｌの濃度になるように細胞に添加し、３０分後に細胞を回収し、細胞に取り込まれている金粒子の数をＩＣＰ−ＭＳにより解析した。コンペティションアッセイにはガラクトース修飾核酸を結合させた金粒子を加える30分前に培地中にガラクトースを４０ｍＭの濃度で加え解析した。結果を図６に示す。ガラクトース修飾した金ナノ粒子の肝細胞への取り込みが、ガラクトースを培地に添加する事で阻害されている事から、この粒子はアシアログリコプロテインレセプターを介して取り込まれていることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明では、糖鎖を最外殻に持つオリゴ核酸医薬用のナノ粒子が提供される。この糖鎖により細胞外の生理学的な環境下でオリゴ核酸が安定化され、かつ、機能化されたナノ粒子は次世代の医薬品として注目の集まっている核酸医薬品の開発に大きく貢献するものであると考える。したがって、本発明は核酸医薬品の製造業で利用できる。
【図１】
2011236194.tif 000016
【図２】
2011236194.tif 000017
【図３】
2011236194.tif 000018
【図４】
2011236194.tif 000019
【図５】
2011236194.tif 000020
【図６】
2011236194.tif 000021
【配列表】
2011236194000001.app