(57)【要約】【課題】MEP経路の阻害剤、特にMEP経路のIspGの阻害剤を提供すること。【解決手段】本発明は、式（Ｉ）： 2011178743.tif 000009（式中、ｎは０または１を示し、Ｒ１は、極性を有する芳香族官能基を示し、Ｒ２は水素原子、置換されてもよいヒドロキシル基、又はアミノ基を示す。）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするイソプレノイド生合成系非メバロン酸経路の酵素IspGの阻害剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）： 
【化１】
2011178743.tif 000007
（式中、ｎは０または１を示し、Ｒ１は、極性を有する芳香族官能基を示し、Ｒ２は水素原子、置換されてもよいヒドロキシル基、又はアミノ基を示す。）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするイソプレノイド生合成系非メバロン酸経路の酵素IspGの阻害剤。
【請求項２】
Ｒ１が、4-ヒドロキシフェニル、5-インドリル、5-インダゾリル、5-ベンゾトリアゾリル、5-インドロニル、5-イミダゾロニル、及び5-ベンゾオキサゾロニルからなる群から選択される１種以上の芳香族官能基であり、これらのヘテロ原子上の水素原子がメチル基、エチル基又はアセチル基で置換されていてもよい、請求項１に記載のIspG阻害剤。
【請求項３】
式（Ｉ’）： 
【化２】
2011178743.tif 000008
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、請求項１又は２に記載のIspG阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレノイド生合成系非メバロン酸経路の酵素1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル 4-ジホスフェートシンターゼ（1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate synthase）（IspG）の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド、テルペノイドなどのイソプレノイド化合物は、生体成分として生命維持に必須な役割をもつ重要な化合物群である。イソプレノイドは、前駆体であるイソペンテニル二リン酸（IPP）とその異性体ジメチルアリル二リン酸（DMAPP）との縮合により生合成され、前駆体IPPはメバロン酸を経由するメバロン酸経路、又は、メバロン酸を経由せず２−メチル−D−エリスリトール−４−リン酸（MEP）を経由する、非メバロン酸（MEP）経路により生合成されることが知られている。これまでの研究で、ヒトを含む哺乳動物、古細菌、カビ、酵母、真正細菌の一部、および高等植物の細胞質ではメバロン酸経路が利用され、多くの真正細菌、緑藻、ラン藻、および高等植物の色素体ではMEP経路が利用されていることが明らかとなっている。
【０００３】
MEP経路は、７つの酵素（Dxs、Dxr、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH）の反応によって構成され、出発原料であるピルビン酸及びD−グリセルアルデヒド−３−リン酸からIPPが生合成される。これまでの研究で、Dxs阻害剤としてクロマゾンとその類縁体（非特許文献１及び２）、Dxr阻害剤としてホスミドマイシン（特許文献１及び非特許文献３）、IspD阻害剤としてシチジン誘導体（非特許文献４）が報告されており、IspEおよびIspFに関してはタンパク質の結晶構造を基にしたドラッグデザインによる阻害剤開発（非特許文献５及び６）の報告例があるが、IspG及びIspHの阻害剤は知られていない。また、MEP経路の阻害剤として、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１９６４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】浅見忠男、雄谷友美、葛山智久、笠原博幸、永田典子、山口信次郎、神谷勇治、吉田茂男、白化作用を有する除草剤クロマゾンはMEP経路中の1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthaseが触媒する反応の阻害剤か？, 植物化学調節学会研究発表記録集, 37巻, 2, 2002
【非特許文献２】松江由紀子、浅見忠男、葛山智久、西山真  2007年度日本農芸化学会要旨集、MEP経路阻害剤ketoclomazoneの阻害機構に関する研究、2007
【非特許文献３】Kuzuyama T., Shimizu, T., Takahashi, S.  Seto, H. Fosmidomycin, a specific inhibitor of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in the nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis. Tetrahedron Lett.39, 7913-7916, 1998
【非特許文献４】Crane C.M., Hirsch A.K., Alphey M.S., Sgraja T., Lauw S., Illarionova V., Rohdich F., Eisenreich W., Hunter W.N., Bacher A., Diederich F., Synthesis and characterization of cytidine derivatives that inhibit the kinase IspE of the non-mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis,  ChemMedChem.,1, 91-101, 2008
【非特許文献５】Hirsch A.K., Lauw S., Gersbach, P., Schweizer W.B., Rohdich F., Eisenreich W., Bacher A., Diederich F., Nonphosphate inhibitors of IspE protein, a kinase in the non-mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis and a potential target for antimalarial therapy, ChemMedChem, 2, 806-810, 2007
【非特許文献６】Baumgartner C., Eberle C., Diederich F., Lauw S., Rohdich F., Eisenreich, W., Bacher A., Structure-based design and synthesis of the first weak non-phosphate inhibitors for IspF, an enzyme in the non-mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis Helv. Chim. Acta 90, 1043-1068, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、MEP経路の阻害剤を探索し、特にMEP経路のIspGの阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、MEP経路の阻害剤について鋭意研究した結果、ジケトピペラジンのシクロチロシルプロリン（cycloTyrPro）がMEP経路の阻害剤と考えられることを見出した。さらに検討した結果、cycloTyrProが大腸菌IspG過剰生産株で認められる細胞異常伸長を抑制し、MEP経路の中のIspGと結合することから、IspGを阻害している一方で、シクロフェニルアラニルプロリンではMEP経路阻害活性が認められないことを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねることによって完成したものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）  式（Ｉ）： 
【０００９】
【化１】
2011178743.tif 000002
【００１０】
（式中、ｎは０または１を示し、Ｒ１は、極性を有する芳香族官能基を示し、Ｒ２は水素原子、置換されてもよいヒドロキシル基、又はアミノ基を示す。）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするイソプレノイド生合成系非メバロン酸経路の酵素IspGの阻害剤。
（２）  Ｒ１が、4-ヒドロキシフェニル、5-インドリル、5-インダゾリル、5-ベンゾトリアゾリル、5-インドロニル、5-イミダゾロニル、及び5-ベンゾオキサゾロニルからなる群から選択される１種以上の芳香族官能基であり、これらのヘテロ原子上の水素原子がメチル基、エチル基又はアセチル基で置換されていてもよい、上記項１に記載のIspG阻害剤。
（３）  式（Ｉ’）： 
【００１１】
【化２】
2011178743.tif 000003
【００１２】
で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、上記項１又は２に記載のIspG阻害剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、一部の生物が有するイソプレノイド生合成MEP経路中のIspG阻害剤を提供する。本発明の化合物を有効成分として含有するIspG阻害剤は、病原性微生物や植物葉緑体でのイソプレノイド生合成を阻害するため、抗菌剤、抗原虫剤、除草剤等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】式（Ｉ’）の化合物がIspG過剰発現株の細胞形状に与える影響を示す写真であり、（ａ）は正常株、（ｂ）はIspG過剰発現株、（ｃ）はIspG過剰発現株＋式（Ｉ’）の化合物10 mMの写真である。
【図２】QCM法による式（Ｉ’）の化合物とタンパク質との相互作用解析結果を示すグラフであり、（ａ）はBSAと式（Ｉ’）の化合物、（ｂ）はIspDと式（Ｉ’）の化合物、（ｃ）はIspGと式（Ｉ’）の化合物の相互作用を示すグラフである。
【図３】ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物とIspG過剰発現株の可溶性タンパク質との相互作用解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の化合物は、式（Ｉ）： 
【００１７】
【化３】
2011178743.tif 000004
【００１８】
（式中、ｎは０または１を示し、Ｒ１は、極性を有する芳香族官能基を示し、Ｒ２は水素原子、置換されてもよいヒドロキシル基、又はアミノ基を示す。）（以下、「式（Ｉ）の化合物」という場合もある）である。
【００１９】
Ｒ１における極性を有する芳香族官能基として、4-ヒドロキシフェニル、5-インドリル、5-インダゾリル、5-ベンゾトリアゾリル、5-インドロニル、5-イミダゾロニル、5-ベンゾオキサゾロニル等が挙げられる。これらの官能基のヘテロ原子（Ｏ又はＮ）上の水素原子は、メチル基、エチル基又はアセチル基で置換されていてもよい。Ｒ１として、4-ヒドロキシフェニルが好ましい。
【００２０】
Ｒ２における置換されていてもよいヒドロキシル基の置換基として、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基等を挙げることができる。
【００２１】
ここで、Ｃ１−６アルキル基として、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
【００２２】
Ｃ２−６アルケニル基として、例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル等が挙げられる。
【００２３】
Ｃ２−６アルキニル基として、例えば、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル等が挙げられる。
【００２４】
Ｃ３−６シクロアルキル基として、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。
【００２５】
Ｃ６−１４アリール基として、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。
【００２６】
Ｃ７−１６アラルキル基として、例えば、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル等が挙げられる。
【００２７】
アシル基として、例えば、アセチル基、プロパノイル基、ベンゾイル基等が挙げられる。
【００２８】
なお、式（Ｉ）の化合物は、従来の方法に従って塩（特に酸付加塩）を形成することができる。形成された化合物の塩も、本願発明に含まれる。
【００２９】
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、酢酸塩等が挙げられる。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物の塩基付加塩としては無機塩基又は有機塩基との塩が挙げられる。無機塩基との塩として、例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等が挙げられる、有機塩基との塩として、例えば、第１級、第２級及び第３級脂肪族及び芳香族アミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、４種のブチルアミン異性体、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、キヌクリジン、ピリジン、キノリン及びイソキノリン、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、ヒドラバミン）との塩、ならびに例えばアルギニン、リシンなどのようなアミノ酸との塩が挙げられる。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物又はその塩は溶媒和物としても提供され得る。溶媒和物として、例えば、水和物、アルコール（例えば、メタノール、エタノール等）和物等が挙げられる。
【００３２】
上記式（Ｉ）で表される化合物の中で、ｎが１であり、Ｒ１が4-ヒドロキシフェニル基であり、Ｒ２が水素原子である化合物が好ましい。すなわち、下記式（Ｉ’）： 
【００３３】
【化４】
2011178743.tif 000005
【００３４】
で表される化合物（シクロチロシルプロリン）（以下、「式（Ｉ’）の化合物」という場合もある）が好ましい。
【００３５】
式（Ｉ’）の化合物は、Stierleらによって真菌から単離され、構造決定が行われた既知の化合物であり、構造決定方法及び諸性状は、Stierle A. C., Cardellina J. H. II, Strobel G. A., Maculosin, a host specific phytotoxin for spotted knapweed from Alternaria alternata, Proc Natl Acad Sci, 85, 21, 8008-8011, 1988に記載の通りである。
【００３６】
式（Ｉ’）の化合物（式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が4-ヒドロキシフェニル基、Ｒ２が水素原子である化合物）は、公知の方法、例えば、後述する製造例１に記載する方法に従って製造することができる。
【００３７】
その製造方法において、Boc-L-チロシンに代えてBoc-4-ヒドロキシフェニルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が4-ヒドロキシフェニル基、Ｒ２が水素原子である化合物を合成することができる。
【００３８】
また、Boc-トリプトファンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が5-インドリル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-インドリルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が5-インドリル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-インダゾリルアラニンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が5-インダゾリル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-インダゾリルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が5-インダゾリル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-ベンゾトリアゾリルアラニンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が5-ベンゾトリアゾリル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-ベンゾトリアゾリルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が5-ベンゾトリアゾリル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-インドロニルアラニンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が5-インドロニル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-インドロニルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が5-インドロニル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-イミダゾロニルアラニンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が5-イミダゾロニル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-イミダゾロニルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が5-イミダゾロニル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-ベンゾオキサゾロニルアラニンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが１、Ｒ１が5-ベンゾオキサゾロニル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。Boc-5-ベンゾオキサゾロニルグリシンを用いることにより、式（Ｉ）において、ｎが０、Ｒ１が5-ベンゾオキサゾロニル基、Ｒ２が水素原子である化合物が得られる。
【００３９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、下記の実施例に示すように、大腸菌IspG過剰生産株で認められる細胞異常伸長を抑制し、MEP経路の中のIspGと結合してIspGを阻害するので、IspGの阻害剤として用いることができる。式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有するIspG阻害剤は、病原性微生物、又は植物葉緑体でのイソプレノイド生合成を阻害することから、抗菌剤、抗原虫剤、除草剤等として有効である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を製造例、及び試験例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
製造例１
式（Ｉ’）の化合物であるシクロチロシルプロリンの合成
Milne らの方法（Milne P. J., Oliver D.W., Roos H. M., Cyclodipeptides:Structure and conformation of cyclo(tyrosyl-prolyl）, J Crystallog Spect Res., 22, 6, 643-649, 1992)に準じて、下式に示すように、シクロチロシルプロリンを調製した。
【００４１】
【化５】
2011178743.tif 000006
【００４２】
出発原料であるL−プロリン1.15 g (10 mmol) をメタノール10mLに溶かし、塩化チオニル1mL (13.7mmol) をゆっくり加え、一晩、室温で撹拌した。反応後、溶媒を留去してから乾燥させ、メチルエステル誘導体2を得た。続いて、ジメチルホルムアミド中、誘導体2 (1.75 g, 10.6 mmol) とBoc-L-チロシン 2.98 g (10.6 mmol) をEDC 1.62 g (12.0 mmol) およびHOBt 1.62 g (12.0 mmol) を用いて縮合した。反応後、トリエチルアミン 2 mLをゆっくり加え、撹拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、溶媒を留去した。次にシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/ 酢酸エチル＝1：２）で精製し、誘導体3を得た。誘導体3 (1.14 g, 2.9 mmol) をCH2Cl2 5 mLに溶かし、TFA 5 mLを加え、Boc基を脱保護した。溶媒を留去して得られた誘導体4 (0.71 g, 2.15 mmol) に飽和NaHCO3水溶液 10 mLを加え、一晩、室温で撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、溶液を飽和食塩水で洗浄後、溶媒を留去した。最終的にC18を用いた逆相HPLCで精製し、式（Ｉ’）の化合物を0.62ｇ得た(収率24％)。
【００４３】
以下に、式（Ｉ’）の化合物のスペクトルデータを示す。
MS（ESI）: m/z  261.5 [M+H]+、分子式：C14H16N2O3、1H-NMR(CDCl3, 400MHz): δppm  1.88(2H, m), 1.95(2H, m), 2.31(1H,m), 2.72（1H, dd, J=10.3, 14.9）, 3.44 (1H, m), 3.47-3.68(2H, m), 4.06（1H, t, J=8.5）, 4.20（1H, dd, J=10.3, 3.1）, 5.90(1H, s) , 6.75（2H, d, J= 8.2）, 7.04（2H, d, J=8.2）, 13C-NMR(CDCl3, 100MHz): δppm  22.6, 28.4, 36.0, 45.5, 56.3, 59.2, 116.2(2C), 126.9, 130.4(2C), 155.8, 165.3, 169.8
上記スペクトルデータと、上述の文献（Proc Natl Acad Sci, 85, 21, 8008-8011, 1988）中の化合物のスペクトルデータとを比較することにより、式（Ｉ’）の化合物をシクロチロシルプロリンと同定した。
【００４４】
製造例２
Boc-L-チロシンをBoc-L-フェニルアラニンに変更した以外は、上記製造例１と同様にして、シクロフェニルアラニルプロリンを得た。
【００４５】
試験例１（IspG過剰発現株の細胞伸長量の測定）
大腸菌JM109のIspG過剰発現株および緑色蛍光タンパク質結合IspG（IspG-GFP）過剰発現株をYPG培地(polypeptone 10.0 g, glucose 5.0 g, NaCl 5.0 g, yeast extract 5.0 g, H2O 1L) に植菌し、前培養した。新しいYPG培地に前培養液（終濃度0.5%）、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG、終濃度0 μM−10 mM）、式（Ｉ’）の化合物（終濃度0 μM−10 mM）を加え、振とう培養した（30℃, 120 rpm, 18hr）。この培養液を蒸留水で10倍希釈した後、顕微鏡下で写真撮影し、画像処理した。その後、画像処理ソフトを用いて細胞数および細胞の長さを測定した。その結果を図１に示す。図１において、IspG過剰発現株の細胞形状は、野生株の大腸菌（図1（ａ））に比べ、長くなることが確認された（図1（ｂ））。中には形状の正常な菌が確認されたが、IspG-GFP過剰発現株を用いて確認したところ、正常な形状をもった菌にはIspG-GFPが過剰に発現せず蛍光を発していなかった。次にIspG過剰発現株に式（Ｉ’）の化合物を10 mM加えたところ、IspG過剰発現状態で確認されたような細胞の長い菌がほとんど存在しなくなった（図1（ｃ））。これは、式（Ｉ’）の化合物がIspGを阻害することにより、IspG過剰発現状態が解消され、野生株と同じ細胞形状になったと考えられる。一方、シクロフェニルアラニルプロリンでは、上記のような変化は認められなかった。
【００４６】
試験例２（水晶発振子マイクロバランス（QCM）法を用いた式（Ｉ’）の化合物の結合蛋白質の解析）
MEP経路を構成する全７酵素（Dxs、Dxr、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH）過剰発現株をLB培地（3 mL, クロラムフェニコール 30 μg/mL)に植菌し、前培養した。新しいLB培地に前培養液を終濃度1%になるよう加え、振とう培養した（37℃, 120 rpm）。6時間後、IPTG（終濃度1 mM）を加え、同条件でさらに6時間培養した。培養液を遠心分離し（4℃, 6,000G, 5 min）、菌体を得た。菌体を破砕液（0.2M リン酸緩衝液pH 7.8、5M塩化ナトリウム）20 mLに再懸濁し、超音波破砕（5 sec×4 cycle, 4℃）した後、さらに遠心分離（4℃ 15,000 G, 30 min）して上清を得た。これをHis-accept 4 mLをつめたカラムに通塔し、洗浄液（0.2Mリン酸緩衝液 pH 6.0、5M塩化ナトリウム）40 mLで洗浄した。最終的に洗浄液に0.5 M イミダゾールを加えた溶出液で溶出し、目的のタンパク質画分を得た。タンパク質画分は限外濾過膜（分子量10,000）を用いて、リン酸緩衝液で遠心洗浄（4℃, 7,500 G, 15min）し、分子量をSDS-PAGEで確認した。
精製したタンパク質溶液を0.5〜1.0 mg/mLに調製した。センサーチップ中央の金膜上にタンパク質溶液を5 μL滴下し、5分静置して固定化した。QCM装置にセンサーチップをとりつけ、カップ内にトリス−塩酸緩衝液（pH 7.0〜9.0）を8 mL入れた。センサーチップをゆっくりおろし、溶液中で十分安定化させた後、式（Ｉ’）の化合物50 μM溶液を5 μLインジェクションし、各タンパク質と式（Ｉ’）の化合物との結合を解析した（図2）。その結果、式（Ｉ’）の化合物はIspGのみに相互作用が確認され（図2（c））、コントロールであるウシ血清アルビミンBSAを含む他のタンパク質には相互作用を示さなかった（図2（a）及び（b））。
【００４７】
試験例３（ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物を用いた結合タンパク質の解析）
大腸菌の野生株JM109株および Dxs、Dxr、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH過剰発現株をLB培地（3 mL, クロラムフェニコール 30 μg/mL)に植菌し、振とう培養した（30℃, 120 rpm, overnight）。新しいLB培地（200 mL）に前培養液をすべて加え、振とう培養した（37℃, 150 rpm）。6時間後、OD600 0.5付近になったことを確認し、IPTGを最終濃度1 mMになるように加え、振とう培養した（37℃, 150 rpm, 14 hr）。培養液を遠心分離（4℃, 6,000 G, 5 min）して集菌し、破砕液（0.2M リン酸緩衝液pH 7.8、5M塩化ナトリウム）3 mLに再懸濁して超音波破砕（4℃, 5 sec×4 cycle）した後、さらに遠心分離（4℃, 15,000 G, 30 min）して可溶性タンパク質を含む大腸菌破砕液上清を得た。この大腸菌破砕液上清300 μLにビオチン化した式（Ｉ’）の化合物（8 nmol/mL)を2〜6 μL加え、ゆるやかに撹拌した（4℃, 12 hr）。これにNeutrAvidin agarose (Thermoscientific社) を200 μL加え、ゆるやかに撹拌しながらインキュベートした（4℃, 10hr）後、遠心分離（4℃, 1,000 G, 3min）と洗浄液（リン酸緩衝液＋0.25% ドデシル硫酸ナトリウム）での洗浄を3〜6回行った。SDS-PAGE sample buffer (2×)を10 μL加え、加熱処理した（90℃, 3 min）。各サンプル上清20μLをSDS-PAGEで分析した。その結果を図3に示す。
【００４８】
図３において、レーン1〜11は以下を示す：
レーン1：IspG過剰発現株の全タンパク質、
レーン2：IspG過剰発現株の可溶性タンパク質画分、
レーン3：IspG過剰発現株の可溶性タンパク質画分＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物2 μL＋3回wash、
レーン4：IspG過剰発現株の可溶性タンパク質画分＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物4 μL＋3回wash、
レーン5：IspG過剰発現株の可溶性タンパク質画分＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物6 μL＋3回wash、
レーン6：JM109の可溶性タンパク質画分＋NeutrAvidin agarose resin、
レーン7：JM109の可溶性タンパク質画分＋NeutrAvidin agarose resin＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物2 μL＋6回wash、
レーン8：JM109の可溶性タンパク質画分＋NeutrAvidin agarose resin＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物4 μL＋6回wash、
レーン9：JM109の可溶性タンパク質画分＋NeutrAvidin agarose resin＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物6 μL＋6回wash、
レーン10：JM109株の可溶性タンパク質画分＋ビオチン化した式（Ｉ’）の化合物6 μL＋3回wash、
レーン11：マーカー
図３の結果から、式（Ｉ’）の化合物はIspGとのみ相互作用を示すことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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