(57)【要約】【課題】糖尿病治療薬、心不全治療薬等のスクリーニングに使用できる糖尿病、心不全等モデル非ヒト動物などが求められていた。【解決手段】ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物又はその一部からなる、糖尿病、心不全等モデル動物又はその一部。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物又はその一部からなる、ＩＬ２７シグナル不活性化関連疾患モデル動物又はその一部。
【請求項２】
ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下しているノックダウン非ヒト動物又はその一部からなる、ＩＬ２７シグナル不活性化関連疾患モデル動物又はその一部。
【請求項３】
ＩＬ２７シグナル不活性化関連疾患が、糖尿病、糖尿病性合併症、及び心不全からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１又は２記載の動物又はその一部。
【請求項４】
糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の動物又はその一部に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物又はその一部における糖尿病又は糖尿病性合併症の状態と、対照の糖尿病又は糖尿病性合併症の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の糖尿病改善効果又は糖尿病性合併症改善効果を評価し、
（ｄ）糖尿病改善効果又は糖尿病性合併症改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項５】
心不全治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の動物又はその一部に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物又はその一部における心不全の状態と、対照の心不全の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の心不全改善効果を評価し、
（ｄ）心不全改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノックアウト非ヒト動物の疾患モデル動物としての使用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は生活習慣病のひとつであり、わが国でも推定罹患者数が１６００万人ともいわれている。糖尿病は、インシュリン作用の不足、つまりインシュリンの供給不足と、インシュリン標的臓器での感受性の低下が原因となり、血液中のブドウ糖が増えすぎて（高血糖）尿の中に糖が溢れてきた状態（糖尿）をいう。実際は血液中のブドウ糖の量（血糖値）を測定することにより診断される。さらに、糖尿病は、神経障害、網膜症、腎症などの合併症を引き起こすことも知られており、また、他の生活習慣病である、肥満、高脂血症及び高血圧などと重複した代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、心筋梗塞、脳梗塞などの心血管疾患の主要な原因になるといわれている。したがって、糖尿病の原因解明とそれに立脚した根本的な予防法や治療法の確立がきわめて重要であり、糖尿病のモデル動物の作製が望まれてきた。
【０００３】
また、心不全は、心臓が各臓器の需要に見合う血液を拍出できないために生じる症候群の総称であり、５年生存率が約５０％という極めて予後不良の疾患である。現在、利尿薬・ジギタリス・カテコラミン・アンジオテンシン変換酵素阻害薬・β遮断薬等が心不全治療に用いられているものの、病態の進行を完全に抑制し、あるいは完全な健康体へと快復させる治療法は心移植術以外に存在せず、より有用な新しい心不全治療薬の発見が望まれている。新たな心不全治療薬の発見には、心不全モデル動物を用いたスクリーニングが重要であり、心不全モデル動物の作製が望まれていた。
【０００４】
ところでインターロイキン２７（ＩＬ２７）は、ＩＬ２７−ｐ２８とＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ３（ＥＢＩ３）の２つの異なるサブユニットを含むサイトカインである。一方、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）は、ＷＳＸ−１とｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １３０とのヘテロダイマーで構成される。ＩＬ２７は、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞で発現する。抗原提示細胞で発現したＩＬ２７は、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の増殖を促す。また、ＩＬ２７は、ＩＬ１２と共にＣＤ４＋ナイーブＴ細胞に作用し、ＴＨ１型サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生を促す。さらに、ＩＬ２７は、ＴＨ１型免疫応答に特異的な転写因子であるＴ−ｂｅｔをアップレギュレートさせ、これにより、ＴＨ２型免疫応答に特異的な転写因子であるＧＡＴＡ−３をダウンレギュレートさせる。ＩＬ２７は、免疫細胞の増殖に必要なＩＬ２の産生を抑制し、また炎症が関わる疾患の病態形成に重要な役割を果たすＴＨ１７型細胞の分化を抑制する。また、ＩＬ２７は、様々な炎症性サイトカインの産生を抑制する作用を有している。したがって、ＩＬ２７は、様々な免疫・炎症反応を抑制する作用を有する。
【０００５】
ここで、特許文献１：特表２００７−５２３１６９号公報には、ＩＬ２７Ｒノックアウトマウスは、ＴＨ１型免疫応答が失われており、例えば、（ａ）ＩＦＮγの産生量が減少する、（ｂ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａのような細胞内病原体に対して過敏になる、（ｃ）ＴＨ１型Ｔ細胞依存性抗体（ＩｇＧ２ａサブタイプ）の産生量が少なくなる、（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓに応答して異常な肉芽腫を形成する、などの症状が見られることが記載されている。さらに、ＩＬ２７Ｒに対するアンタゴニストを投与することにより、皮膚の炎症状態、関節炎、クローン病、気道過敏性、気道の炎症、アテローム性動脈硬化症などが改善できることも記載されている。
【０００６】
特許文献２：特表２００７−５２５４１５号公報には、ＩＬ２７Ｒに対するリガンドを使用することにより、免疫疾患又はヘルパーＴ細胞媒介性疾患を治療できることが記載されている。
【０００７】
非特許文献１：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，  ５６９−７８には、ＩＬ２７の作用が失われたマウスにおいて、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ感染後のＴｈ１型免疫反応の低下が記載されている。
【０００８】
非特許文献２：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９，  ６５７−６６７には、ＩＬ２７の作用が失われたマウスにおいて、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ感染後に炎症性サイトカインの過剰生産が生じることが記載されており、非特許文献３：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７，  ５３７７−８５には、ＩＬ２７がリンパ球に作用して、様々なサイトカインの産生を抑制することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５２３１６９号公報
【特許文献２】特表２００７−５２５４１５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｓｅｎａｌｄｉ，  Ｇ．，  Ｃｏｖｅｙ，  Ｔ．，  Ｆａｇｇｉｏｎｉ，  Ｒ．，  Ｍｕ，  Ｓ．，  Ｘｉａ，  Ｍ．，  Ｗａｋｅｈａｍ，  Ａ．Ｃ．，  Ｎｉｓｈｉｎａ，  Ｈ．，  Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｓａｒｉｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｍａｋ，  Ｔ．Ｗ．  （２００１）  ＷＳＸ−１  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｌ．  ｍａｊｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，  ５６９−７８．
【非特許文献２】Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｈｉｍｅｎｏ，  Ｋ．，  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｙ．，  Ｉｓｈｉｉ，  Ｋ．，  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ａ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ａ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．，  Ｈｉｓａｅｄａ，  Ｈ．，  Ｍａｋ，  Ｔ．Ｗ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ａ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．  （２００３）  ＷＳＸ−１  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９，  ６５７−６６７．
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ａ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｙ．，  Ｋｉｎｊｙｏ，  Ｉ．，  Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ａ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．  （２００６）  Ｔｗｏ−Ｓｉｄｅｄ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＩＬ−２７：  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｎａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＩＬ−２３−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩＬ−１７  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ＳＴＡＴ３−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７，  ５３７７−８５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記状況において、糖尿病治療薬、心不全治療薬等のスクリーニングに使用できる糖尿病、心不全等モデル非ヒト動物などが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＩＬ２７又はＩＬ２７Ｒの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物が、糖尿病治療薬、心不全治療薬等のスクリーニングに有用であることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下に示す、糖尿病、心不全等モデル非ヒト動物、その非ヒト動物を用いた糖尿病治療薬、心不全治療薬等のスクリーニング方法などを提供する。
（１）  ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物又はその一部からなる、ＩＬ２７シグナル不活性化関連疾患モデル動物又はその一部。
（２）  ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下しているノックダウン非ヒト動物又はその一部からなる、ＩＬ２７シグナル不活性化関連疾患モデル動物又はその一部。
（３）  ＩＬ２７シグナル不活性化関連疾患が、糖尿病、糖尿病性合併症、及び心不全からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である、上記（１）又は（２）記載の動物又はその一部。
（４）  糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の動物又はその一部に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物又はその一部における糖尿病又は糖尿病性合併症の状態と、対照の糖尿病又は糖尿病性合併症の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の糖尿病改善効果又は糖尿病性合併症改善効果を評価し、
（ｄ）糖尿病改善効果又は糖尿病性合併症改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
（５）  心不全治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の動物又はその一部に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物又はその一部における心不全の状態と、対照の心不全の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の心不全改善効果を評価し、
（ｄ）心不全改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物又はその一部からなる、糖尿病、心不全等の疾患モデル動物又はその一部を提供する。該モデル動物は、例えば、糖尿病治療薬、心不全治療薬等をスクリーニングするために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はストレプトゾトシン投与前（０日目）、投与後７，１４，２１，２８日目の空腹時血糖を示すグラフである。野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）において、ストレプトゾトシン投与後７，１４，２１，２８日目の空腹時血糖が高い傾向にあることを示している。「＊」は、２８日目のＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）の血糖が同日の野生型マウス（ＷＴ）に比して有意に高いことを示し（ｐ＜０．０５）、また、「＊＊」は、１４日目及び２８日目のＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−１−／−）の血糖が、それぞれ、１４日目及び２８日目の野生型マウス（ＷＴ）に比して有意に高いことを示す（ｐ＜０．０５）。
【図２】図２は、ストレプトゾトシン投与後１４日目の膵臓ランゲルハンス島のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色（上段：ＨＥ）とプロインスリンに対する蛍光抗体像（下段：ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ）を示す図である。野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）においてＨＥ染色ではより多くの白血球浸潤が生じており、また、プロインスリンに対する蛍光抗体像ではプロインスリンがより減少している。
【図３】図３は、ストレプトゾトシン投与後１４日目の膵臓ランゲルハンス島のインスリン前駆体量（プロインスリン量）の定量結果を示すグラフである。野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）においてプロインスリンが減少している。
【図４】図４は、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）に対してストレプトゾトシン（ＳＴＺ）とリコンビナントマウスＩＬ２７又は対照溶媒とを投与した時の、空腹時血糖を示すグラフである。ストレプトゾトシンの投与開始前（０日目）と、投与７，１４日後の空腹時血糖を測定した。図４において、「＋」は、リコンビナントマウスＩＬ２７投与群を、「−」は、対照溶媒投与群を示す。野生型マウス及びＥＢＩ３ノックアウトともにリコンビナントマウスＩＬ２７投与により空腹時血糖が低下した。「＊」は、野生型マウス（ＷＴ）ではストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与１４日後に対照溶媒投与群がリコンビナントマウスＩＬ２7投与群に比して血糖が高かったことを示し（ｐ＜０．０５）、また、「＊＊」は、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）ではストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与７日後及び１４日後に対照溶媒投与群がリコンビナントマウスＩＬ２7投与群に比して血糖が高かったことを示す（ｐ＜０．０５）。
【図５】図５は、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）に対してストレプトゾトシン（ＳＴＺ）とリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７）又は対照溶媒とを投与した時の、ＭＯＭＡ２の染色像を示す図（Ａ）とＭＯＭＡ２陽性細胞の細胞数を計測した結果を示すグラフ（Ｂ）である。図５に示されているように、ランゲルハンス島に浸潤したＭＯＭＡ２陽性マクロファージ数は野生型マウス（ＷＴ）に比してＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）において多く、リコンビナントマウスＩＬ２７の投与により、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）ともに浸潤マクロファージ数は減少した。
【図６】図６は、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）に対してストレプトゾトシン（ＳＴＺ）とリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７）又は対照溶媒とを投与した時の、ＣＤ４抗原の染色像を示す図（Ａ）とＣＤ４抗原陽性細胞の細胞数を計測した結果を示すグラフ（Ｂ）である。図６に示されているように、膵臓ランゲルハンス島に浸潤したＣＤ４陽性Ｔリンパ球数は野生型マウス（ＷＴ）に比してＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）において多く、リコンビナントマウスＩＬ２７の投与により、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）ともに浸潤ＣＤ４陽性Ｔリンパ球数が減少した。「＊」は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与群では野生型マウス（ＷＴ）に比してＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）においてＣＤ４陽性Ｔリンパ球数が多かったことを示す（ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は、野生型マウス（ＷＴ）、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）にイソプロテレノール（ＩＳＯ（＋））又は対照溶媒（ＩＳＯ（−））とリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又は対照溶媒（ｒＩＬ２７（−））とを投与して７日後に摘出した心臓の重量（体重補正値）の測定結果を示すグラフである。ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）において野生型マウス（ＷＴ）に比べてイソプロテレノール投与による心臓重量の増加が大きい傾向にあった。また、イソプロテレノール投与による心臓重量の増加は、リコンビナントマウスＩＬ２7（ｒＩＬ２７）の投与により抑制された。「＊」は、対照溶媒を投与した野生型マウス（ＷＴ）に比して有意に体重補正心重量が重いことを示し（ｐ＜０．０５）、「＊＊」は、イソプロテレノールを投与した野生型マウス（ＷＴ）に比して有意に体重補正心重量が重いことを示す（ｐ＜０．０５）。
【図８】図８は、野生型マウス（ＷＴ）、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）にイソプロテレノール（ＩＳＯ（＋））又は対照溶媒（ＩＳＯ（−））とリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又は対照溶媒（ｒＩＬ２７（−））とを投与して７日後に摘出した心臓の心筋細胞サイズの測定結果を示すグラフである。ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）において野生型マウス（ＷＴ）に比べてイソプロテレノール投与による心筋細胞サイズの増加が大きい傾向にあった。また、イソプロテレノール投与による心筋細胞サイズの増加は、リコンビナントマウスＩＬ２7（ｒＩＬ２７）の投与により抑制された。「＊」は、対照溶媒を投与した野生型マウス（ＷＴ）に比して有意に心筋細胞サイズが大きいことを示し（ｐ＜０．０５）、「＊＊」は、イソプロテレノールを投与した野生型マウス（ＷＴ）に比して有意に心筋細胞サイズが大きいことを示す（ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ラット新生児心筋細胞にリコンビナントＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又は対照溶媒（ｒＩＬ２７（−））を投与し、その心筋細胞を位相差顕微鏡で観察した写真（Ａ）と、その心筋細胞の細胞表面積を測定した結果を示すグラフ（Ｂ）である。イソプロテレノール（ＩＳＯ）投与による培養心筋細胞表面積の増加をリコンビナントＩＬ２７が抑制した。尚、図９（Ｂ）において、縦軸の単位は、ピクセルである。「＊」は、リコンビナントＩＬ２７（ｒＩＬ２７）の非存在下でイソプロテレノール（ＩＳＯ）の代わりに対照溶媒を投与した心筋細胞に比して、リコンビナントＩＬ２７（ｒＩＬ２７）の非存在下でイソプロテレノール（ＩＳＯ）を投与した心筋細胞の細胞表面積が有意に大きいことを示し、「＊＊」は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）存在下でリコンビナントＩＬ２７（ｒＩＬ２７）を投与した心筋細胞の細胞表面積が、イソプロテレノール（ＩＳＯ）の非存在下でリコンビナントＩＬ２７（ｒＩＬ２７）の代わりに対照溶媒を投与した心筋細胞に比して有意に小さいことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【００１７】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）遺伝子の全部又は一部の機能が喪失するように作出されたものである。
【００１８】
本発明のノックアウト非ヒト動物にストレプトゾトシンを投与してインスリン産生減少及び高血糖を誘発させたとき、本発明のノックアウト非ヒト動物に誘発したインスリン産生減少及び高血糖は、野生型非ヒト動物に誘発したインスリン産生減少及び高血糖と比較して、重度であることが分かった。また、本発明のノックアウト非ヒト動物にβ１アドレナリン作動薬を投与して心肥大を誘発させたとき、本発明のノックアウト非ヒト動物に誘発した心肥大は、野生型非ヒト動物に誘発した心肥大と比較して、重度であることが分かった。これらのことから、本発明の動物は、糖尿病、心不全等に類した病態を表すモデル動物として使用できる。
【００１９】
１．本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部
本発明のノックアウト非ヒト動物とは、該動物のＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように破壊されているか、又は組み換えがなされている動物を意味する。ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ゲノム上の一方のアリルが機能しないように破壊又は変異されたヘテロノックアウト（ヘテロ接合体）でもよく、両方のアリルが破壊又は変異されたホモノックアウト（ホモ接合体）でもよい。本発明のノックアウト非ヒト動物には、このような動物の子孫も含まれる。
【００２０】
「遺伝子の全部の機能が失われた」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部の機能が失われた」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「その本来の機能を発揮しない」とは、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が低下又は喪失していることを意味する。
【００２１】
「ノックダウン」とは、特定の遺伝子の発現量を抑制することを意味する。遺伝子の発現量の抑制は、例えば、遺伝子の転写量を減少させること、翻訳を阻害することなどにより、達成することができる。本発明のノックダウン非ヒト動物とは、該動物ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している動物をいう。
【００２２】
ＩＬ２７遺伝子は、ＩＬ２７をコードする遺伝子であり、ＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子である。ＩＬ２７は、ＩＬ２７−ｐ２８とＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ３（ＥＢＩ３）の２つの異なるサブユニットを含むサイトカインである。一方、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）は、ＷＳＸ−１とｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １３０とのヘテロダイマーで構成される。ＩＬ２７は、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞で発現する。
【００２３】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＩＬ２７遺伝子は、例えば、ＥＢＩ３遺伝子、及び／又はＩＬ２７−ｐ２８遺伝子である。また、本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ＷＳＸ−１遺伝子である。したがって、本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる「ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子」とは、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を意味する。本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる「ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子」は、好ましくは、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子、又はＷＳＸ−１遺伝子である。
【００２４】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子は公知であり、その塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等のアクセッション番号から知ることができる。以下に、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号を例示する。
【００２５】
・マウスＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０１５７６６（配列番号：１）、
・マウスＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿０５６５８１（配列番号：２）、
・ラットＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００１１０９４２１（配列番号：３）、
・ラットＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿００１１０２８９１（配列番号：４）、  
【００２６】
・マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿１４５６３６（配列番号：５）、
・マウスＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列：ＮＰ＿６６３６１１（配列番号：６）、  
【００２７】
・マウスＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０１６６７１（配列番号：７）、
・マウスＷＳＸ−１のアミノ酸配列：ＮＰ＿０５７８８０（配列番号：８）。  
【００２８】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる非ヒト動物は、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を有するヒト以外の動物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サル等が用いられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、病態動物モデル系の作製の面から個体発生及び生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯動物、とりわけマウス又はラット等が特に好ましい。
【００２９】
本発明において動物の一部とは、当該動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液を意味し、特に限定されるものではない。非ヒト動物由来の組織としては、例えば、心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、骨髄、甲状腺、胸腺、乳腺、リンパ節、血液等が挙げられる。
【００３０】
本発明において動物由来の細胞としては、上記組織、臓器又は体液に含まれる細胞を意味し、単離及び培養して得られる培養細胞も含まれる。細胞は、例えば、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨髄細胞、リンパ球等の各種の細胞が挙げられる。培養細胞としては、初代培養細胞及びその株化細胞の両者を含む。発生段階（胎生期）における組織、各器官、細胞、破砕物又は抽出物及び体液も非ヒト動物の一部に含まれる。
【００３１】
さらに、動物由来の血液、リンパ液、尿等の体液も本発明において動物の一部に含まれる。
【００３２】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、ストレプトゾトシンを投与した時などにインスリン産生減少及び高血糖を生じ、その生じたインスリン産生減少及び高血糖は、野生型非ヒト動物に誘発したインスリン産生減少及び高血糖と比較して、重度である。したがって、本発明のノックアウト又はノックダウン非ヒト動物は、糖尿病又は糖尿病性合併症モデル動物又はその一部として使用することができる。
【００３３】
糖尿病性合併症としては、糖尿病性の神経障害、網膜症、腎症、動脈硬化を含む血管障害、糖尿病性昏睡等を挙げることができる。
【００３４】
また、本発明のノックアウト非ヒト動物にβ１アドレナリン作動薬を投与した時などに心肥大を生じ、その生じた心肥大は、野生型非ヒト動物に誘発した心肥大と比較して、重度である。したがって、本発明のノックアウト又はノックダウン非ヒト動物は、心不全モデル動物又はその一部として使用することができる。
【００３５】
心不全としては、心肥大、心機能低下、不整脈、心不全関連死等を挙げることができる。
【００３６】
２．ノックアウト非ヒト動物又はノックダウン非ヒト動物の作製
２．１．ノックアウト非ヒト動物の作製
本発明のノックアウト非ヒト動物は、例えば、標準的な方法で作製して入手することができる。
標準的な方法としては、例えば、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法を挙げることができる。
【００３７】
当該方法は、
（ａ）遺伝子のターゲティングによりＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製すること、
（ｂ）ＥＳ細胞を用いて、キメラ非ヒト動物を作製すること、
（ｃ）キメラ非ヒト動物を野生型マウスと交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製すること、
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製すること、を含む。
以下、上記各工程について詳細に説明する。
【００３８】
工程（ａ）：遺伝子ターゲティング
遺伝子ターゲティングでは、先ず、目的遺伝子（ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子）がその機能を喪失させ、或いはその機能が低下するように破壊又は組換えたＤＮＡ断片を作製する。目的遺伝子のターゲティングベクターは、目的遺伝子を破壊することにより当該遺伝子の全部又は一部を喪失させ、機能を全く失わせるか、或いは機能を低下させるものである。「遺伝子の全部を喪失させ」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部を喪失させ」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「遺伝子の全部又は一部を喪失させ」とは、目的遺伝子がコードするタンパク質の発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が失われているか、又は野生型と比較して低下していることを意味する。
【００３９】
ターゲティングベクターは、相同組換えを起こさせた後の組換え体のスクリーニングが容易となるように構築することが好ましい。例えば、ポジティブ−ネガティブ選択をするために、ベクターに薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子などの選択マーカーを連結することができる。ポジティブ−ネガティブ選別法は、当分野において周知である。すなわち、ポジティブ選別は、選択マーカー遺伝子が組み込まれなかった細胞は、薬剤を含む培養液で培養すると、耐性遺伝子を含まないために死ぬことを利用するものであり、ネガティブ選別法は、組み込みがランダムに起こった細胞では、ネガティブ選別用遺伝子が発現するために、細胞が死ぬことを利用するものである。その結果、相同組換えを起こした細胞のみが生き残り、選別される。
【００４０】
選択マーカー遺伝子は、ポジティブ選択用として例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などを使用することができ、ネガティブ選択用として例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などを使用することができる。
【００４１】
上記の方法により作製したターゲティングベクターを用いて、相同組換えを行う。現在確立されている遺伝子ターゲティング法では、ノックアウト非ヒト動物を作製する場合には、ＥＳ細胞を使用することが望ましい。ＥＳ細胞として、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞等を適宜選択して使用することができる。
【００４２】
相同組換えを起こさせるために、目的遺伝子の機能を喪失させたターゲティングベクターを細胞中に導入する。ターゲティングベクターを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム法などを使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。そして細胞中の目的とするゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクターの相同組換えによって置換する。
【００４３】
相同組換え効率を高めるために、例えば、バクテリオファージＰ１由来の組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを使用することができる。Ｃｒｅは組換え酵素であり、ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基の配列を認識して、この部位で組換えを起こさせることが可能となる。従って、ターゲティングしたい遺伝子（目的遺伝子）をｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間にはさみ、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込むことにより、部位特異的及び時期特異的にＣｒｅが産生されてｌｏｘＰで挟んだ遺伝子を切り取る（すなわち、目的遺伝子の機能を喪失させる）ことができる。
【００４４】
その後、ＰＣＲ法、サザンブロット法等により、目的遺伝子がターゲティングされているか否かを確認する。
【００４５】
ＰＣＲにおいて、プライマーは、例えばターゲティングベクターの外側のゲノムＤＮＡ領域上、及びターゲティングベクターの配列のうち薬剤耐性遺伝子上から設計することができる。
【００４６】
サザンブロット解析は、例えば以下の通り行うことができる。ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識する１又は２種類のプローブを設計する。目的遺伝子ゲノムを含むクローンを適当な制限酵素で処理することにより得られるＤＮＡ断片と、上記プローブとのハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的遺伝子の破壊の有無を確認することができる。
【００４７】
工程（ｂ）：キメラ非ヒト動物の作製
相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期又は胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製する。
【００４８】
ＥＳ細胞を胚内に移植する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。
【００４９】
マウスの場合、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ卵管又は子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、相同組換えを行ったＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製する。
【００５０】
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、その後出産させることによりキメラマウスを作製することができる。
【００５１】
マウス以外の非ヒト動物についても、上記と同様にして、キメラ非ヒト動物を作製することができる。
【００５２】
工程（ｃ）：ヘテロノックアウト非ヒト動物の作製
上記のようにして得たキメラ非ヒト動物の中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄キメラ非ヒト動物を選択する。マウスの場合、選択したＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ＥＳ細胞に由来するマウス（ＥＳ細胞に組み込まれたゲノムを有していたマウス）の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。そして、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された目的遺伝子欠損ヘテロノックアウト非ヒト動物を繁殖する。
【００５３】
工程（ｄ）：ホモノックアウト非ヒト動物の作製
上記のようにして得た目的遺伝子ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配させて、遺伝子欠損ホモノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
【００５４】
工程（ｃ）又は（ｄ）においてノックアウト非ヒト動物が得られたことの確認については、組織から染色体ＤＮＡを抽出しサザンブロット法やＰＣＲ法で行うことができる。さらに、組織からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。目的遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なってもよい。
【００５５】
また、樹立した動物系統について、ヘテロノックアウト非ヒト動物及びホモノックアウト非ヒト動物の表現型を解析することもできる。表現型の解析は、肉眼的観察、解剖による内部の観察、各臓器の組織切片、Ｘ線撮影による観察、行動や記憶の観察、血液検査や血清生化学検査行う。解析時期は、胎生期から成体までの任意の時期であってよく、特に限定されるものではない。
【００５６】
尚、ＥＢＩ３遺伝子ノックアウトマウスの作製方法は、例えば、Ｉｇａｗａ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，  Ｈ．，  Ｓａｄａｎａｇａ，  Ａ．，  Ｍａｓｕｔａｎｉ，  Ｋ．，  Ｍｉｙａｋｅ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｓ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ａ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．  （２００９）  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ＥＢＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ３  （ＥＢＩ３）  ｉｎ  ＭＲＬ／ｌｐｒ  ｍｉｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ．  Ｍｏｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９，  ３３−４１．などにも記載されている。また、ＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスの作製方法は、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｓｅｎａｌｄｉ，  Ｇ．，  Ｃｏｖｅｙ，  Ｔ．，  Ｆａｇｇｉｏｎｉ，  Ｒ．，  Ｍｕ，  Ｓ．，  Ｘｉａ，  Ｍ．，  Ｗａｋｅｈａｍ，  Ａ．Ｃ．，  Ｎｉｓｈｉｎａ，  Ｈ．，  Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｓａｒｉｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｍａｋ，  Ｔ．Ｗ．  （２００１）  ＷＳＸ−１  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｌ．  ｍａｊｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，  ５６９−７８．などにも記載されている。
【００５７】
２．２．ノックダウン非ヒト動物の作製
本発明のノックダウン非ヒト動物は、公知の方法に従って、非ヒト動物のＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現を抑制することにより、作製することができる。
【００５８】
ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現抑制には、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができるが、特にこれに限定されるものではない。例えば、ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで非ヒト動物に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００５９】
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを非ヒト動物に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００６０】
（１）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡの設計は、以下の通り行なうことができる。
（ａ）ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である
（ｂ）  選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８〜３０塩基のもの、あるいは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０〜７０％となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。
（ｃ）  選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。
（ｄ）  ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
【００６１】
さらに、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、遺伝子の発現をより効果的に抑制できることがある。
【００６２】
ｓｉＲＮＡ合成の別法としてＤｉｃｅｒ法がある。Ｄｉｃｅｒ法の概要とは以下の通りである。まず、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子の配列のスタートコドンから５００  ｂｐ〜１  ｋｂｐの遺伝子配列をベクター等に組み込み、その遺伝子配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを転写させた後、アニーリングしてｄｓＲＮＡを作製する。次に、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅにより、このｄｓ−ＲＮＡを３’末端側に２塩基の突出末端をもつ２１−２３塩基のｓｉＲＮＡにプロセッシングさせる。
【００６３】
（２）ｓｈＲＮＡ
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡ  とは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。このステムループ構造を有するＲＮＡ分子は生体内のＤｉｃｅｒ等によりプロセッシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
【００６４】
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を「配列Ａ」とし、配列Ａに対する相補鎖を「配列Ｂ」とすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４２〜１２０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１８〜５０塩基、好ましくは２１〜３０塩基である。
【００６５】
また、ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現抑制には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００６６】
ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子のｍＲＮＡを認識するように設計することができる。そのように設計するｍｉＲＮＡの塩基配列の長さは、例えば、１８〜２５塩基（例、約２２塩基）である。
【００６７】
３．糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬のスクリーニング方法
本発明は、糖尿病又は糖尿病性合併症を発症した本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部（以下、本発明のノックアウト非ヒト動物等とする。）に、糖尿病又は糖尿病性合併症治療のための薬物の候補物質（被験物質）を接触することにより、糖尿病治療薬又は糖尿病性合併症治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、糖尿病又は糖尿病性合併症を発症した本発明のノックアウト非ヒト動物等に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた本発明の非ヒト動物等において標的とする疾患と相関関係を有する指標（例えば、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生量、血糖値等）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、糖尿病又は糖尿病性合併症の症状を軽減又は消滅させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
【００６８】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物を候補物質で接触させる方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６９】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部を候補物質で接触させる方法としては、例えば、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させる方法を用いることができる。より具体的には、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部の培養容器に候補物質を添加すること、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部と候補物質とを混合すること、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部を候補物質の存在下で培養すること等が挙げられる。また、接触させる候補物質量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００７０】
糖尿病は、例えば、ストレプトゾトシンを投与することにより本発明のノックアウト非ヒト動物等及び野生型非ヒト動物に誘発させることができる。
【００７１】
比較のための対照は、例えば、被験物質を接触させない野生型非ヒト動物又はその一部、被験物質を接触させた野生型非ヒト動物又はその一部、糖尿病又は糖尿病性合併症改善作用を有することが分かっている物質（既知の糖尿病治療薬等）を接触させた野生型非ヒト動物又はその一部、被験物質を接触させない本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部、既知の糖尿病治療薬等を接触させた本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部のいずれをも意味し、目的に応じて少なくとも１つの対照を適宜選択することができる。
【００７２】
ここで、「野生型非ヒト動物又はその一部」とは、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子のいずれもが正常に発現し、機能している非ヒト動物又はその一部を意味する。
【００７３】
例えば、対照が被験物質を接触させない本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生量又は血糖値（以下、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度等とする。）を測定し、当該測定された膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度等が、対照における膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度等よりも改善したときは、前記候補物質を、糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬として選択することができる。この場合の「改善」とは、対照と比較して、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度が低下（例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上低下）すること、インスリン産生量が増加（例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上増加）すること、又は血糖値が低下（例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上低下）することを意味する。
【００７４】
あるいは、対照が被験物質を接触させない野生型非ヒト動物の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生量又は血糖値（以下、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度等とする。）を測定し、当該測定された膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度等が、対照における膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度等と同程度まで又はそれよりも改善したときは、前記候補物質を、糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬として選択することができる。この場合の「改善」とは、対照と比較して、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度が同程度となるか又は低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）すること、インスリン産生量が同程度となるか又は増加（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上増加）すること、又は血糖値が同程度となるか又は低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）することを意味する。
【００７５】
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、有機酸又は無機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、或いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７６】
例えば、ある候補物質を投与した場合に、糖尿病又は糖尿病性合併症の症状が緩和若しくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬として選択することが可能である。
【００７７】
４．心不全治療薬のスクリーニング方法
本発明は、心不全を発症した本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部（以下、本発明のノックアウト非ヒト動物等とする。）に、心不全治療のための薬物の候補物質（被験物質）を接触することにより、心不全治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、心不全を発症した本発明のノックアウト非ヒト動物等に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物等において標的とする疾患と相関関係を有する指標（例えば、心肥大の程度、心機能、死亡率等）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、心不全の症状を軽減又は消滅させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
【００７８】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物を候補物質で接触させる方法としては、前記「糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬のスクリーニング方法」の項で説明した方法と同様の方法を挙げることができる。
【００７９】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部を候補物質で接触させる方法も、前記「糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬のスクリーニング方法」の項で説明した方法と同様の方法を挙げることができる。
【００８０】
心不全のうち心肥大は、例えば、β１アドレナリン受容体作動薬（例、イソプロテレノール）を投与することにより本発明のノックアウト非ヒト動物等及び野生型非ヒト動物に誘発させることができる。
【００８１】
比較のための対照は、被験物質を接触させない野生型非ヒト動物、被験物質を接触させた野生型非ヒト動物、心不全改善作用を有することが分かっている物質（既知の心不全治療薬等）を接触させた野生型非ヒト動物、被験物質を接触させない本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部、既知の心不全治療薬等を接触させた本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部のいずれをも意味し、目的に応じて少なくとも１つの対照を適宜選択することができる。
【００８２】
例えば、対照が被験物質を接触させない本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の心肥大の程度を測定し、当該測定された心肥大の程度が、対照における心肥大の程度よりも改善したときは、前記候補物質を、心不全治療薬として選択することができる。心肥大の程度は、例えば、心臓重量（体重補正値）を測定すること、心筋細胞サイズを測定すること等により数値化することができる。この場合の「改善」とは、対照と比較して、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の心肥大の程度が減少すること、例えば、心臓重量（体重補正値）が減少（例えば、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上減少）すること、又は心筋細胞サイズが減少（例えば、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上減少）することを意味する。
【００８３】
あるいは、対照が被験物質を接触させない野生型非ヒト動物の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の心肥大の程度を測定し、当該測定された心肥大の程度が、対照における心肥大の程度と同程度まで又はそれよりも改善したときは、前記候補物質を、心不全治療薬として選択することができる。この場合の「改善」とは、対照と比較して、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の心肥大の程度が同程度となるか又は減少すること、例えば、心臓重量（体重補正値）が同程度となるか又は減少（例えば、２％以上、５％以上、１０％以上減少）すること、又は心筋細胞サイズが同程度となるか又は減少（例えば、２％以上、５％以上、１０％以上減少）することを意味する。
【００８４】
候補物質としては、前記「糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬のスクリーニング方法」の項で説明したものと同様のものを挙げることができる。
【００８５】
例えば、ある候補物質を投与した場合に、心不全の症状が緩和若しくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、心不全治療薬として選択することが可能である。
【００８６】
発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
尚、下記実施例において、有意差の検定は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行った。
【実施例】
【００８７】
実施例１：ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトマウスの作製
（１）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトＥＳ細胞の作製
Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｓｅｎａｌｄｉ，  Ｇ．，  Ｃｏｖｅｙ，  Ｔ．，  Ｆａｇｇｉｏｎｉ，  Ｒ．，  Ｍｕ，  Ｓ．，  Ｘｉａ，  Ｍ．，  Ｗａｋｅｈａｍ，  Ａ．Ｃ．，  Ｎｉｓｈｉｎａ，  Ｈ．，  Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｓａｒｉｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｍａｋ，  Ｔ．Ｗ．  （２００１）  ＷＳＸ−１  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｌ．  ｍａｊｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，  ５６９−７８．記載の方法に準じて、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトＥＳ細胞を作製した。
【００８８】
すなわち、マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の第１〜第４エクソンをｐｇｋプロモーター配列に接続されたネオマイシン耐性遺伝子で置換できる構造を持つターゲティングベクターを作成し、このターゲティングベクターをエレクトロポレーション法により、ＥＳ細胞であるＥ１４細胞に導入した。遺伝子導入細胞の選別のため、ネオマイシン存在下で培養することにより耐性を獲得した細胞クローンを得た後、ＰＣＲ法により、正しく相同組み換えが生じＩＬ２７−ｐ２８遺伝子第１〜第４エクソンがネオマイシン耐性遺伝子で置換された細胞クローンを選別し、さらに、サザンブロット法により相同組み換えの確認を行った。
【００８９】
（２）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損キメラマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損キメラマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（１）により得られたＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の片側アリール（片側遺伝子）が破壊されたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ６マウス由来の杯盤胞に注入、これを偽妊娠マウスに移植することにより、ＥＳ細胞及びＣ５７ＢＬ６マウス由来の細胞からなるキメラマウスを得た。毛色及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子に変異を持つＥＳ細胞の寄与が多いと推測される雄個体を選別した。
【００９０】
（３）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（２）により得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ６雌マウスと交配することにより仔を得て、毛色によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子に変異を持つＥＳ細胞由来の仔を選別した。さらにこれらの仔の体組織からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の片側アリルに変異を持つマウスを選別しヘテロノックアウトマウスを得た。
【００９１】
（４）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ホモノックアウトマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ホモノックアウトマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（３）により得られたヘテロノックアウトマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配し、その仔からヘテロノックアウトマウスを選別、この過程を６回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝子背景を持つＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスを作成した。この雄雌を交配することにより仔を得て、これらの仔の体組織からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の両側アリルに変異を持つマウスを選別しホモノックアウトマウスを得た。
【００９２】
尚、以下の実施例において、ＥＢＩ−３遺伝子ホモノックアウトマウスは、本発明者らの研究室で以前作製したものを用いた（Ｉｇａｗａ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，  Ｈ．，  Ｓａｄａｎａｇａ，  Ａ．，  Ｍａｓｕｔａｎｉ，  Ｋ．，  Ｍｉｙａｋｅ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｓ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ａ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．  （２００９）  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ＥＢＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ３  （ＥＢＩ３）  ｉｎ  ＭＲＬ／ｌｐｒ  ｍｉｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ．  Ｍｏｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９，  ３３−４１．）。
ＷＳＸ−１遺伝子ホモノックアウトマウスは、アムジェン社より分与を受けたものを用いた（Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．，  Ｈａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ｓｅｎａｌｄｉ，  Ｇ．，  Ｃｏｖｅｙ，  Ｔ．，  Ｆａｇｇｉｏｎｉ，  Ｒ．，  Ｍｕ，  Ｓ．，  Ｘｉａ，  Ｍ．，  Ｗａｋｅｈａｍ，  Ａ．Ｃ．，  Ｎｉｓｈｉｎａ，  Ｈ．，  Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｓａｒｉｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｍａｋ，  Ｔ．Ｗ．  （２００１）  ＷＳＸ−１  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｌ．  ｍａｊｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，  ５６９−７８．）。
野生型マウスは、Ｃ５７ＢＬ６（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を用いた。
【００９３】
実施例２：膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生量及び血糖値の定量・比較
野生型マウス、ＥＢＩ−３遺伝子ノックアウトマウス、及びＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスの各ノックアウトマウスにストレプトゾトシン（シグマ社製）を投与した後、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生量及び血糖値を、以下のように比較検討した。
【００９４】
（１）空腹時血糖値
ストレプトゾトシン（体重あたり５μｇ）を１日一回、５日間腹腔内に投与し、投与開始前（０日目）と、投与開始後７，１４，２８日後に空腹時の血糖を測定した。空腹時血糖の測定は、次のように行った。すなわち、１２時間絶食後静脈血を採取し、血糖測定器（商品名：グルコースパイロット；テクニコンインターナショナル社製）で空腹時の血糖値を測定した。
【００９５】
その結果を図１に示す。
図１はストレプトゾトシン投与前（０日目）と、投与後７，１４，２１，２８日目の空腹時血糖を示すグラフである。図１に示されているように、野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）において、ストレプトゾトシン投与後７，１４，２１，２８日目の空腹時血糖が高い傾向にある。
【００９６】
（２）膵臓ランゲルハンス島のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像
ストレプトゾトシンの投与開始後１４日目の膵臓ランゲルハンス島のＨＥ染色像を、次のようにして得た。すなわち、麻酔下に脱血した後、ホルマリンで還流固定し、膵臓を摘出した。摘出した膵臓を、ホルマリン固定及び脱水した後、パラフィンに包埋した。その後、薄切しＨＥ染色し、顕微鏡像をＣＣＤカメラ（商品名：ＡｘｉｏＣａｍ；Ｚｅｉｓｓ社）で得た。
【００９７】
その結果を、図２の上段（ＨＥ）に示す。
【００９８】
図２には、野生型マウス（ＷＴ）に比べ、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）の膵臓ランゲルハンス島に、核を青紫色に染色された細胞がより多く集積している様子が示されている。このことは、野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）においてより多くの白血球浸潤が生じていることを示す。
【００９９】
（３）膵臓ランゲルハンス島のインスリン前駆体（プロインスリン）に対する蛍光抗体像
ストレプトゾトシンの投与開始後１４日目の膵臓ランゲルハンス島のプロインスリンに対する蛍光抗体像を、次のようにして得た。すなわち、麻酔下に脱血した後、ホルマリンで還流固定し、膵臓を摘出した。摘出した膵臓をホルマリン固定した後、コンパウンド（商品名Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ；Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）に包埋し液体窒素で急速凍結した。これを薄切した後、抗プロインスリン抗体（タカラバイオ社製）とＦＩＴＣラベルした２次抗体（ジャクソン社製）を用いて染色した。蛍光顕微鏡像を冷却ＣＣＤカメラ（商品名：ＡｘｉｏＣａｍ；Ｚｅｉｓｓ社製）で得た。
【０１００】
その結果を、図２の下段（ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ）に示す。
【０１０１】
図２には、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）の膵臓ランゲルハンス島では、蛍光染色されたタンパク質の量が、野生型マウス（ＷＴ）に比べ少ない様子が示されている。このことは、野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）においてプロインスリンがより減少していることを示す。
【０１０２】
次に、蛍光抗体法により膵臓ランゲルハンス島のインスリン前駆体量（プロインスリン量）の定量を、次のようにして行った。すなわち、上記で得られた蛍光抗体像から、米国ＮＩＨが無料配布しているＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトで単位面積当たりの蛍光強度を測定した。
【０１０３】
その結果を、図３に示す。
【０１０４】
図３の縦軸は、野生型マウス（ＷＴ）の蛍光強度を１とした相対的蛍光強度を示す。図３に示されているように、野生型マウス（ＷＴ）に比べＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）においてプロインスリンが有意に減少している（＊：ｐ＜０．０５）。
【０１０５】
（４）リコンビナントＩＬ２７投与による効果
リコンビナントマウスＩＬ２７は、Ｐｆｌａｎｚ，  Ｓ．，  Ｊ．  Ｃ．  Ｔｉｍａｎｓ，  Ｊ．  Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｒ．  Ｒｏｓａｌｅｓ，  Ｈ．  Ｋａｎｚｌｅｒ，  Ｊ．  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｌ．  Ｈｉｂｂｅｒｔ，  Ｔ．  Ｃｈｕｒａｋｏｖａ，  Ｍ．  Ｔｒａｖｉｓ，  Ｅ．  Ｖａｉｓｂｅｒｇ，  Ｗ．  Ｍ．  Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｍａｔｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｗ．  Ｔｏ，  Ｓ．  Ｚｕｒａｗｓｋｉ，  Ｔ．  Ｋ．  ＭｃＣｌａｎａｈａｎ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｏｒｍａｎ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｂａｚａｎ，  Ｒ．  ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ，  Ｄ．  Ｒｅｎｎｉｃｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ａ．  Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ．  ２００２．  ＩＬ−２７，  ａ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ＥＢＩ３  ａｎｄ  ｐ２８  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：７７９−７９０．に記載の方法に従って作製した。具体的には、ＣＨＯ細胞においてＦＬＡＧタグ付マウスＩＬ２７発現ベクターを発現させ、培養上清中に分泌されたリコンビナントマウスＩＬ２７を、抗ＦＬＡＧタグ抗体付ビーズ（シグマ社製）を用いてカラム法で精製した。
上記作製したものに加え、リコンビナントマウスＩＬ２７として、Ａｂｎｏｖａ社の市販のものも使用した。
【０１０６】
ストレプトゾトシン（体重あたり５μｇ）を１日一回、５日間腹腔内に投与した。また、精製したリコンビナントマウスＩＬ２７又は対照溶媒をストレプトゾトシン投与開始時から１日一回、７日間腹腔内に投与した。対照溶媒として、チトレート緩衝液（和光純薬社製）を用いた。リコンビナントマウスＩＬ２７の１回の投与量は、５００  ｎｇ／０．２  ｍｌであり、対照溶媒の１回の投与量は、０．２  ｍｌである。そして、ストレプトゾトシン投与開始前（０日目）と、投与開始後７，１４日後に空腹時の血糖を測定した。
【０１０７】
また、リコンビナントマウスＩＬ２７投与による膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度及びインスリン産生量を、次のように比較検討した。すなわち、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度は、摘出した膵臓から組織切片を作成し、マクロファージマーカーＭＯＭＡ２及びＣＤ４抗原を、ニチレイ社製ヒストファインを用いた免疫組織染色により染色し、顕微鏡観察によりランゲルハンス島内のＭＯＭＡ２あるいはＣＤ４陽性細胞の細胞数を計測することにより求めた。ここで、浸潤ＭＯＭＡ２陽性マクロファージ数及び浸潤ＣＤ４陽性Ｔリンパ球数が多いことは、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度がより重度であることを示す。また、インスリン産生量は、実施例２（３）と同様にプロインスリン量を測定することにより求めた。
【０１０８】
その結果を、図４、図５及び図６に示す。
【０１０９】
図４は、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）に対してストレプトゾトシンとリコンビナントマウスＩＬ２７又は対照溶媒とを投与した時の、空腹時血糖を示すグラフである。図４に示されているように、野生型マウス及びＥＢＩ３ノックアウトともにリコンビナントマウスＩＬ２７投与により空腹時血糖が低下した。
【０１１０】
図５は、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）に対してストレプトゾトシンとリコンビナントマウスＩＬ２７又は対照溶媒とを投与した時の、ＭＯＭＡ２の染色像を示す図（Ａ）とＭＯＭＡ２陽性細胞の細胞数を計測した結果を示すグラフ（Ｂ）である。図５に示されているように、ランゲルハンス島に浸潤したＭＯＭＡ２陽性マクロファージ数は野生型マウス（ＷＴ）に比してＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）において多く、リコンビナントマウスＩＬ２７の投与により、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）ともに浸潤マクロファージ数は減少した。このことは、リコンビナントマウスＩＬ２７のマクロファージ浸潤抑制作用を示している。
【０１１１】
図６は、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）に対してストレプトゾトシンとリコンビナントマウスＩＬ２７又は対照溶媒とを投与した時の、ＣＤ４抗原の染色像を示す図（Ａ）とＣＤ４抗原陽性細胞の細胞数を計測した結果を示すグラフ（Ｂ）である。膵臓ランゲルハンス島に浸潤したＣＤ４陽性Ｔリンパ球数は野生型マウス（ＷＴ）に比してＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）において多く、リコンビナントマウスＩＬ２７の投与により、野生型マウス（ＷＴ）及びＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）ともに浸潤ＣＤ４陽性Ｔリンパ球数が減少したことを示す。このことは、リコンビナントマウスＩＬ２７のＣＤ４陽性Ｔリンパ球数浸潤抑制作用を示している。
【０１１２】
以上の実施例に示したように、ＥＢＩ−３遺伝子ノックアウトマウス及びＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスにおいて、野生型マウスと比較して、膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生減少及び高血糖が、重度であった。また、野生型マウス、ＥＢＩ−３遺伝子ノックアウトマウスにおける膵臓ランゲルハンス島の炎症の程度、インスリン産生減少及び高血糖は、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより軽減された。これらの実施例は、本発明のノックアウト非ヒト動物における糖尿病又は糖尿病性合併症の状態を指標として、被検物質の中から糖尿病又は糖尿病性合併症治療薬の候補物質をスクリーニングできることも示している。
【０１１３】
実施例３：心肥大の程度の定量・比較
野生型マウス、ＥＢＩ−３遺伝子ノックアウトマウス、及びＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスの各ノックアウトマウスにβ１アドレナリン作動薬であるイソプロテレノール（シグマ社製）又は対照溶媒を浸透圧ポンプにより投与した後、心肥大の程度を、以下のように定量的に比較検討した。具体的には、浸透圧ポンプ（商品名：Ａｌｚｅｔ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ；Ａｌｚｅｔ社製）によりイソプロテレノール又は対照溶媒を７日間投与し、連日、「テイルカフ法」（Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊｏｈｎｓ  Ｃ，  Ｇａｖｒａｓ  Ｉ，  Ｈａｎｄｙ  ＤＥ，  Ｓａｌｏｍａｏ  Ａ，  Ｇａｖｒａｓ  Ｈ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  １９９６  ２８：１０６４−１０６９.）により血圧及び脈拍を測定した。このときのイソプロテレノールの投与量は、３０  ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。また、対照溶媒は生理食塩水であり、対照溶媒の投与量は、イソプロテレノール溶液と同容量である。イソプロテレノール又は対照溶媒の投与開始から７日後に麻酔下に心臓超音波法（Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｒｏｔｔｍａｎ  ＪＮ，  Ｎｉ  Ｇ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｍ．  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ．  ２００７  ２４：８３−８９.）により心臓パラメーターを測定後ＬＶ  ｍａｓｓを算出した。心臓摘出後、心臓重量（体重で補正）の測定、及び心臓組織における心筋細胞サイズ（心筋細胞の細胞表面積）の測定を行った。ここで、心臓重量（体重で補正）の測定及び心筋細胞サイズの測定を、それぞれ、次のようにして行った。心臓重量については、摘出した心臓の重量を電子天秤を用いて測定した。そして、測定した心臓の重量（mg）を、心臓摘出直前の生存時の時点で測定したマウスの体重(g)で補正、すなわち、心臓の重量を体重で除することにより求めた値を、体重補正心臓重量（mg/g）とした。尚、図７の縦軸では、このように求めた体重補正心臓重量（mg/g）を数値で示している。心筋細胞サイズについては、摘出心臓から作成した組織標本の切片をＤＡＫＯ社製のＦＩＴＣ−ｌｅｃｔｉｎで染色した後、染色組織標本切片を顕微鏡で観察し、これをＣＣＤカメラで撮像し、得た像をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（米国ＮＩＨが無料配布）で解析、すなわち、ｌｅｃｔｉｎで認識される単一細胞面積を測定することにより求めた値を心筋サイズ（ｎｍ２）とした。尚、図９では心筋細胞の細胞表面積を、単位ｎｍ２ではなく、単位ピクセルで示しているが、これは、上記と同一条件でコンピューター解析して得られた面積を単位ピクセルで示したものである。
【０１１４】
また、リコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７）を次のように作製し、投与した。
実施例２（４）と同様にして、ＣＨＯ細胞においてＦＬＡＧタグ付マウスＩＬ２７発現ベクターを発現させ、培養上清中に分泌されたリコンビナントマウスＩＬ２７を、抗ＦＬＡＧタグ抗体付ビーズ（シグマ社製）を用いてカラム法で精製した。
精製したリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又はその対照溶媒（ｒＩＬ２７（−）をイソプロテレノール又はその対照溶媒の投与開始後１、３、５日後に腹腔内投与した。リコンビナントマウスＩＬ２７の対照溶媒として、チトレート緩衝液（和光純薬社製）を用いた。リコンビナントマウスＩＬ２７の１回の投与量は、５００  ｎｇ／０．２  ｍｌであり、その対照溶媒の１回の投与量は、０．２  ｍｌである。
【０１１５】
その結果を図７、図８及び図９に示す。
【０１１６】
図７は、野生型マウス（ＷＴ）、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）にイソプロテレノール（ＩＳＯ（＋））又は対照溶媒（ＩＳＯ（−））とリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又は対照溶媒（ｒＩＬ２７（−））とを投与して７日後に摘出した心臓の重量（体重補正値）の測定結果を示すグラフである。ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）において野生型マウスに比べてイソプロテレノール投与による心臓重量の増加が大きい傾向にあった。また、イソプロテレノール（ＩＳＯ）投与により増加した心重量は、リコンビナントマウスＩＬ２７の投与により野生型マウス（ＷＴ）とＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）において抑制される傾向にあった。
【０１１７】
図８は、野生型マウス（ＷＴ）、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−／−）にイソプロテレノール（ＩＳＯ（＋））又は対照溶媒（ＩＳＯ（−））とリコンビナントマウスＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又は対照溶媒（ｒＩＬ２７（−））とを投与して７日後に心臓を摘出し、摘出した心臓の心筋細胞サイズの測定結果を示すグラフである。図８に示されているように、野生型マウス（ＷＴ）、ＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）及びＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−１−／−）ともにイソプロテレノール（ＩＳＯ）投与により対照溶媒投与に比して心筋細胞サイズが増加した。ＩＳＯ投与後の心筋細胞サイズは、野生型マウス（ＷＴ）に比してＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）で統計学的に優位に大きく、ＷＳＸ−１ノックアウトマウス（ＷＳＸ−１−／−）において大きい傾向にあった。また、
図８に示されているように、イソプロテレノール（ＩＳＯ）投与により増加した心筋細胞サイズは、リコンビナントマウスＩＬ２７の投与により野生型マウス（ＷＴ）とＥＢＩ３ノックアウトマウス（ＥＢＩ３−／−）において抑制される傾向にあった。
【０１１８】
また、図９は、ラット新生児心筋細胞にリコンビナントＩＬ２７（ｒＩＬ２７（＋））又は対照溶媒（ｒＩＬ２７（−））を投与し、その心筋細胞を位相差顕微鏡で観察した写真（図９Ａ）と、その心筋細胞の細胞表面積を測定した結果を示すグラフ（図９Ｂ）である。図９に示されているように、イソプロテレノール（ＩＳＯ）投与による培養心筋細胞表面積の増加をリコンビナントＩＬ２７が抑制した。
【０１１９】
以上の実施例で示したように、ＥＢＩ−３遺伝子ノックアウトマウス及びＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスにおいて、野生型マウスと比較して、心肥大の程度が、重度であった。また、野生型マウス、ＥＢＩ−３遺伝子ノックアウトマウスにおける心肥大の程度は、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより軽減された。これらの実施例は、本発明のノックアウト非ヒト動物における心不全の状態を指標として、被検物質の中から心不全治療薬の候補物質をスクリーニングできることも示している。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
［配列番号：１］マウスＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１５７６６）。
［配列番号：２］マウスＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５６５８１）。
［配列番号：３］ラットＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１０９４２１）。
［配列番号：４］ラットＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０２８９１）。
［配列番号：５］マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１４５６３６）。
［配列番号：６］マウスＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿６６３６１１）。
［配列番号：７］マウスＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１６６７１）。
［配列番号：８］マウスＷＳＸ−１のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５７８８０）。
【図１】
2011092026.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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