(57)【要約】【課題】ｐ５３−ｍｄｍｘ相互作用を阻害する低分子抗がん剤を提供すること。【解決手段】ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘを発現する細胞の増殖を抑制するための組成物によって上記課題は解決された。したがって、本発明は、ｐ５３−ｍｄｍｘ相互作用に関連するがんを効率よく治療することができる抗がん剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘを発現する細胞の増殖を抑制するための組成物。
【請求項２】
前記化合物は、
【化１】
2011178704.tif 000048
、
【化２】
2011178704.tif 000049
、
【化３】
2011178704.tif 000050
、
【化４】
2011178704.tif 000051
、
【化５】
2011178704.tif 000052
、
【化６】
2011178704.tif 000053
、
【化７】
2011178704.tif 000054
、
【化８】
2011178704.tif 000055
、
【化９】
2011178704.tif 000056
、
【化１０】
2011178704.tif 000057
、
【化１１】
2011178704.tif 000058
および、
【化１２】
2011178704.tif 000059
からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞はｐ５３を発現する細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘの過剰発現に関連する疾患を処置するための組成物。
【請求項５】
前記疾患はがんである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記疾患は乳がんである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記疾患はｐ５３発現とも関連する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記化合物は、
【化１３】
2011178704.tif 000060
、
【化１４】
2011178704.tif 000061
、
【化１５】
2011178704.tif 000062
、
【化１６】
2011178704.tif 000063
、
【化１７】
2011178704.tif 000064
、
【化１８】
2011178704.tif 000065
、
【化１９】
2011178704.tif 000066
、
【化２０】
2011178704.tif 000067
、
【化２１】
2011178704.tif 000068
、
【化２２】
2011178704.tif 000069
、
【化２３】
2011178704.tif 000070
および、
【化２４】
2011178704.tif 000071
からなる群より選択される、請求項４〜７に記載の組成物。
【請求項９】
ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘとｐ５３と間の相互作用の阻害剤。
【請求項１０】
前記化合物は、
【化２５】
2011178704.tif 000072
、
【化２６】
2011178704.tif 000073
、
【化２７】
2011178704.tif 000074
、
【化２８】
2011178704.tif 000075
、
【化２９】
2011178704.tif 000076
、
【化３０】
2011178704.tif 000077
、
【化３１】
2011178704.tif 000078
、
【化３２】
2011178704.tif 000079
、
【化３３】
2011178704.tif 000080
、
【化３４】
2011178704.tif 000081
、
【化３５】
2011178704.tif 000082
および、
【化３６】
2011178704.tif 000083
からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ｐ５３とＭｄｍｘとの相互作用を調節する物質を検出する方法であって、該方法は：
（ａ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＭｄｍｘとの融合タンパク質を、グルタチオンをコーティングした固相上で提供する工程；
（ｂ）エピトープで標識したｐ５３および測定対象物質を該融合タンパク質に提供する工程；および
（ｃ）遊離した該エピトープ標識したｐ５３を、該エピトープに対する抗体を用いて検出または定量する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記エピトープはＦＬＡＧ配列である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出または定量は、前記抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗体を用いて、該西洋ワサビペルオキシダーゼの発色基質を発色させ、該発色の吸光度を測定することによって実行される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品に関する。より特定すると、本発明は、抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん抑制遺伝子ｐ５３は約半数のヒトがんで変異が認められており、がん発生の抑制に重要な役割を担っている。しかしながら、残りの半分のがんではｐ５３が野生型であり、多くの場合、ｐ５３機能に対し抑制的に働く因子（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）が過剰発現していることが報告されている。がん抑制遺伝子がコードするｐ５３タンパク質のＮｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓとしてＥ３ユビキチンリガーゼＭｄｍ２やＭｄｍｘ（非特許文献１）がよく知られており、ｐ５３野生型の遺伝子を持つ多くのがん細胞で過剰発現が認められている。また、２００４年Ｓｃｉｅｎｃｅ誌（非特許文献２）に、ｐ５３−Ｍｄｍ２相互作用を阻害する低分子化合物Ｎｕｔｌｉｎ−３ａが同定され、その低分子化合物が効率良くｐ５３遺伝子を野生型に持つがん細胞を死滅させることが報告されている。
【０００３】
ＭｄｍｘはＭｄｍ２と類似した構造を持つタンパク質である。Ｎｕｔｌｉｎ−３ａは、ｐ５３−Ｍｄｍ２相互作用を強く阻害することができるが、ｐ５３−Ｍｄｍｘの相互作用に対してはあまり阻害効果を示さず、Ｍｄｍｘ過剰発現型がん細胞への効果は認められない（非特許文献３）。そのために、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａではＭｄｍｘを過剰発現しているがん細胞への増殖抑制効果が認められていない。これまでに、ｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用を阻害する低分子化合物は発見されていないため、Ｍｄｍｘを過剰発現しているがん細胞に対する治療法は未だ確立されておらず、そのようながんの治療において副作用の強い抗がん剤を使わざるを得ないのが現状である。また、非特許文献３でも、ｐ５３とｍｄｍｘとの結合を阻害する化合物については言及していない。
【０００４】
本発明者らは、非特許文献４において、この文献では抗がん剤の候補に関する知見を公開したが、タンパク質−タンパク質の結合を阻害することが述べられているが、具体的な分子標的については言及していない。
【０００５】
非特許文献５および６は、ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類およびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類の製造方法を開示するが、ｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用に関する知見は一切記載されていない。
【０００６】
また、本発明者らの一部は、アシルアミノフェニル基を有する抗がん剤という出願をした（特願２００８−２１８６６２）。しかし、この出願では、ｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用については述べられていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｒｕｓｅ  Ｊ．Ｐ，Ｇｕ  Ｗ．，Ｃｅｌｌ，２００９，１３７（４）：６０９−６２２
【非特許文献２】Ｖａｓｓｉｌｅｖ  Ｌ．Ｔ．，Ｖｕ  Ｂ．Ｔ．，Ｇｒａｖｅｓ  Ｂ．，Ｃａｒｖａｊａｌ  Ｄ．，Ｐｏｄｌａｓｋｉ  Ｆ．，Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ  Ｚ．，Ｋｏｎｇ  Ｎ．，Ｋａｍｍｌｏｔｔ  Ｕ．，Ｌｕｋａｃｓ  Ｃ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｃ．，Ｆｏｔｏｕｈｉ  Ｎ．，Ｌｉｕ  Ｅ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（５６５９）：８４４−８４８
【非特許文献３】Ｈｕ  Ｂ，Ｇｉｌｋｅｓ  Ｄ．Ｍ．，Ｆａｒｏｏｑｉ  Ｂ．，Ｓｅｂｔｉ  Ｓ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ  Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，２８１（４４）：３３０３０−３３０３５
【非特許文献４】Ｓａｔｏｓｈｉ  ＹＡＭＡＫＡＷＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３１（５）９１６―９２０（２００８）
【非特許文献５】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．，Ｙｏｎｅｍｏｒｉ  Ｆ．，Ｗａｋｉｔａｎｉ  Ｋ．，Ｍｉｎｏｗａ  Ｔ．，Ｍａｅｄａ  Ｋ．，Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，２０３−２０７（２０００）
【非特許文献６】Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｈ．，Ｍａｅｄａ  Ｋ．，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｔ．，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．，Ｕｃｈｉｄａ  Ｉ．，Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３，３５６６−３５７２（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、Ｍｄｍｘ−ｐ５３の阻害剤を提供すること、およびＭｄｍｘを過剰発現しているがん細胞に対する治療法を開発することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明において、今般、本発明者らは、Ｍｄｍｘを過剰発現しているがん細胞にして、Ｍｄｍｘ−ｐ５３結合を阻害し、高い細胞増殖抑制効果を発揮するビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類およびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、後者の構造に対応する非硫黄含有化合物である［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類を見出すことができた。このことにより、Ｍｄｍｘ高発現型がん細胞に有効な治療効果を示す抗がん剤を開発できる基礎を提供する。
【００１０】
一般に、タンパク質−タンパク質の結合を低分子で阻害することは、困難であると考えられていた。本発明者らは、多くの場合、タンパク質−タンパク質間相互作用部位にシステイン残基が存在することや、システインがタンパクの３次構造維持に重要な役割を果たしていることに着目し、このシステインと−Ｓ−Ｓ−結合を介して、タンパク間相互作用を阻害する化合物を見出すことを計画した。
【００１１】
そして、本発明者らが鋭意検討した結果、その候補化合物として、ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類およびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類を、（Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．，Ｙｏｎｅｍｏｒｉ  Ｆ．，Ｗａｋｉｔａｎｉ  Ｋ．，Ｍｉｎｏｗａ  Ｔ．，Ｍａｅｄａ  Ｋ．，Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，２０３−２０７  （２０００）；  Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｈ．，Ｍａｅｄａ  Ｋ．，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｔ．，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ．，Ｕｃｈｉｄａ  Ｉ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３，３５６６−３５７２（２０００））に基づいて合成した（表１）。これらを含む低分子化合物を、本発明において開発したｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用阻害効果のスクリーニングに供したところ、これらの低分子化合物が有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明者らはｐ５３−Ｍｄｍｘの相互作用をモニタリングする実験系を確立し（図１）、低分子化合物ライブラリーを用いて、その相互作用を阻害する低分子化合物を探索した。その結果、例示的に試験したＫ−１７８およびその類縁体であるＫ−１５４、Ｋ−１７９、Ｋ−１８０、Ｋ−１８１等ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類（なお、Ｋ番号で始まる化合物番号と構造式との対応は、表１を参照）が顕著にその相互作用を抑制することが見出された（図２）。また、実際、野生型ｐ５３遺伝子を持ちＭｄｍｘが過剰発現しているがん細胞に得られた低分子化合物を添加すると、その低分子化合物の添加によりｐ５３の活性化を伴い（図３）、その用量依存的にがん細胞が死滅することがわかった（図４）。また、様々ながん細胞を用いて、Ｋ−１７８の細胞増殖抑制活性を調べたところ、野生型ｐ５３を持つがん細胞は、変異型ｐ５３を持つがん細胞に比べ、Ｋ−１７８による細胞増殖抑制効果が高い傾向にあった（図５）。
【００１３】
本発明は、非特許文献１−６等からは予測できなかったものである。なぜならｐ５３とｍｄｍｘの相互作用を阻害する特定の化合物は、これらの文献からは容易に推測できないからである。
【００１４】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（項目１）ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘを発現する細胞の増殖を抑制するための組成物。
（項目２）前記化合物は、
【００１５】
【化１】
2011178704.tif 000002
、
【００１６】
【化２】
2011178704.tif 000003
、
【００１７】
【化３】
2011178704.tif 000004
、
【００１８】
【化４】
2011178704.tif 000005
、
【００１９】
【化５】
2011178704.tif 000006
、
【００２０】
【化６】
2011178704.tif 000007
、
【００２１】
【化７】
2011178704.tif 000008
、
【００２２】
【化８】
2011178704.tif 000009
、
【００２３】
【化９】
2011178704.tif 000010
、
【００２４】
【化１０】
2011178704.tif 000011
、
【００２５】
【化１１】
2011178704.tif 000012
および、
【００２６】
【化１２】
2011178704.tif 000013
からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）前記細胞はｐ５３を発現する細胞である、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘの過剰発現に関連する疾患を処置するための組成物。
（項目５）前記疾患はがんである、項目４に記載の組成物。
（項目６）前記疾患は乳がんである、項目４または５に記載の組成物。
（項目７）前記疾患はｐ５３発現とも関連する、項目４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８）前記化合物は、
【００２７】
【化１３】
2011178704.tif 000014
、
【００２８】
【化１４】
2011178704.tif 000015
、
【００２９】
【化１５】
2011178704.tif 000016
、
【００３０】
【化１６】
2011178704.tif 000017
、
【００３１】
【化１７】
2011178704.tif 000018
、
【００３２】
【化１８】
2011178704.tif 000019
、
【００３３】
【化１９】
2011178704.tif 000020
、
【００３４】
【化２０】
2011178704.tif 000021
、
【００３５】
【化２１】
2011178704.tif 000022
、
【００３６】
【化２２】
2011178704.tif 000023
、
【００３７】
【化２３】
2011178704.tif 000024
および、
【００３８】
【化２４】
2011178704.tif 000025
からなる群より選択される、項目４〜７に記載の組成物。
（項目９）ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む、Ｍｄｍｘとｐ５３と間の相互作用の阻害剤。
（項目１０）前記化合物は、
【００３９】
【化２５】
2011178704.tif 000026
、
【００４０】
【化２６】
2011178704.tif 000027
、
【００４１】
【化２７】
2011178704.tif 000028
、
【００４２】
【化２８】
2011178704.tif 000029
、
【００４３】
【化２９】
2011178704.tif 000030
、
【００４４】
【化３０】
2011178704.tif 000031
、
【００４５】
【化３１】
2011178704.tif 000032
、
【００４６】
【化３２】
2011178704.tif 000033
、
【００４７】
【化３３】
2011178704.tif 000034
、
【００４８】
【化３４】
2011178704.tif 000035
、
【００４９】
【化３５】
2011178704.tif 000036
および、
【００５０】
【化３６】
2011178704.tif 000037
からなる群より選択される、項目９に記載の組成物。
（項目１１）ｐ５３とＭｄｍｘとの相互作用を調節する物質を検出する方法であって、該方法は：
（ａ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＭｄｍｘとの融合タンパク質を、グルタチオンをコーティングした固相上で提供する工程；
（ｂ）エピトープで標識したｐ５３および測定対象物質を該融合タンパク質に提供する工程；および
（ｃ）遊離した該エピトープ標識したｐ５３を、該エピトープに対する抗体を用いて検出または定量する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）前記エピトープはＦＬＡＧ配列である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）前記検出または定量は、前記抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗体を用いて、該西洋ワサビペルオキシダーゼの発色基質を発色させ、該発色の吸光度を測定することによって実行される、項目１１または１２に記載の方法。
【００５１】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００５２】
このように今回の発明は、治療法が未だ確立されていなかったＭｄｍｘを過剰発現しているがん細胞に対する抗がん剤としての有用性が期待できる。また、分子標的、つまり疾患のメカニズムを診断し、適切な抗がん剤を選択投与することが重要であって、本発明で見出した一連の低分子合成化合物は、分子標的薬として意味を持つといえる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用をモニタリングする実験系の概略図である。グルタチオンを固相化したプレートにグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合したＭｄｍｘ分子と、ＦＬＡＧエピトープ標識したｐ５３との複合体を配置し、これに、候補物質を供し、ＦＬＡＧ配列を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗ＦＬＡＧ抗体を結合させる。結合した抗体複合体をＨＲＰの発色基質に供し、その発色を４９０ｎｍの吸光度を測定することによって、結合量を測定することができる。
【図２】図２は、Ｍｄｍｘ−ｐ５３の結合を阻害する低分子化合物の同定を示す図である。Ａは、図１で示す改良型ＥＬＩＳＡ法を用いて、Ｋ−１７８およびその類縁体であるＫ−１５４、Ｋ−１７９、Ｋ−１８０、Ｋ−１８１等ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィドおよびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレートがＭｄｍｘ−ｐ５３の結合を阻害することを示す。横軸の数値は、濃度（μＭ）を示し、横軸の化合物２はＫ−１５４、３はＫ−１７８を、４はＫ−１７９を、５はＫ−１８０を、６はＫ−１８１を示す。方法としては、グルタチオンを固相化した９６穴プレート（ＰＩＥＲＣＥ社）に１００μｌの１５μｇ／ｍｌ  ＧＳＴ−Ｍｄｍｘ溶液（燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ２０／５％  スキムミルク中）を添加、室温１時間で結合させた。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、１００μｌの１μｇ／ｍｌＦＬＡＧタグしたｐ５３および図中で示す各々の濃度の低分子化合物（燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ２０／５％スキムミルク中）を添加した。１時間反応後、良く洗浄し、ＨＲＰ標識した抗ＦＬＡＧ抗体（１００００倍希釈：Ｓｉｇｍａ社）を室温１時間反応させた。その後、洗浄した後、発色キット（住友ベークライト社）を用いて、呈色反応を行った。Ｂは、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定し、低分子化合物の濃度に対するｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用阻害活性を示す。黒四角（■）は、Ｋ−１５４を示し、黒三角（▲）は、Ｋ−１７８を示し、黒丸（●）はＫ−１７９を示し、クロス（×）はＫ−１８０を示し、アステリスク（＊）はＫ−１８１を示す。実験には、対照（低分子化合物を含有しない）およびブランク（ＦＬＡＧタグしたｐ５３を含まない）を並行して実施し、あらゆるサンプル値はブランク値で差し引いた。そして、各サンプルのｐ５３結合量を対照値に対するパーセントで表した。Ｋ−１５４、Ｋ−１７８、Ｋ−１７９、Ｋ−１８０、Ｋ−１８１の阻害効果のＩＣ５０値はそれぞれ、１．０７μＭ、０．９６μＭ、０．７６μＭ、０．８８μＭ、０．７１μＭであった。
【図３】図３は、低分子化合物Ｋ−１７８によるｐ５３の安定化および活性化を示す図である。ＭＣＦ７細胞（ヒト乳がん細胞）を２ｘ１０５細胞となるように６穴プレートにまき、一晩培養した。その後、Ｋ−１７８およびＮｕｔｌｉｎ−３ａ（カルビオケム社）を図中で示す濃度になるように添加し、２４時間後、その細胞を回収した。その薬剤処理した細胞から全細胞抽出液を調製し、５−２０％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（バイオクラフト社）を行った。そして、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社）にタンパク質を転写させ、クラスリン重鎖（ローディングコントロール）、Ｍｄｍ２、ｐ５３およびｐ２１に対する抗体を用いて、それらタンパク質の発現をウエスタンブロット法で確認した。Ｋ−１７８を添加するとｐ５３の安定化が検出され、その標的遺伝子であるＭｄｍ２やｐ２１の発現誘導が認められた。細胞を処理した化合物としては、１はＤＭＳＯ（対照）を示し、２は１０μＭ  Ｋ−１７８を示し、３は３０μＭ  Ｋ−１７８を示し、４は１００μＭ  Ｋ−１７８を示し、５は１０μＭ  Ｎｕｔｌｉｎ−３ａを示す。上からＣＨＣ、Ｍｄｍ２、ｐ５３およびｐ２１のマーカーを用いた実験結果を示す。
【図４】図４は、低分子化合物Ｋ−１７８による癌細胞のｐ５３依存性増殖抑制効果を示す図である。左側はＫ−１７８濃度をｘ軸として、細胞生存率（％）をｙ軸としてグラフを作成した。黒菱形（◆）は、ｓｉＲＮＡのコントロール（ｓｉ−ｃｏｎｔ．）を示し、黒四角（■）は、ｓｉ−ｐ５３（ｐ５３のｓｉＲＮＡ）を示す。方法としては、ヒト乳がん細胞であるＭＣＦ７細胞を１ｘ１０５細胞となるように６穴プレートにまき、一晩培養後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、図中に示したｓｉＲＮＡ（１００  ｐｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ社）を細胞へ導入した。４８時間後、１ｘ１０４細胞となるように２４穴プレートにまき直し、一晩培養後、各々の濃度のＫ−１７８を添加した。７２時間後、クリスタルバイオレット法を用いて、細胞生存率を算出した。コントロールｓｉＲＮＡおよびｐ５３に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞におけるＫ−１７８による細胞増殖抑制活性のＣＣ５０値はそれぞれ３．４、１２．６μＭであった。また、ｓｉＲＮＡの効果を確認するために、同処置を施した細胞から抽出液を調製し、その全細胞抽出液中のクラスリン重鎖（ローディングコントロール）およびｐ５３の発現をウエスタンブロット法で確認した。右側にウェスタンブロットの結果を示す。上からＣＨＣおよびｐ５３を示し、左は、コントロール（ｓｉ−ｃｏｎｔ．）を示し、右側がｐ５３のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ｐ５３）を示す。
【図５】図５は、低分子化合物Ｋ−１７８による様々ながん細胞の増殖抑制効果を示す図である。左側はＫ−１７８濃度をｘ軸として、細胞生存率（％）をｙ軸としてグラフを作成した。図中に示す様々な細胞（ＴＩＧ−７、ヒト正常繊維芽細胞（縦線（｜））；ＭＣＦ７細胞、ヒト乳がん細胞（黒菱形（◆））；Ａ４２７細胞、ヒト肺がん細胞（黒三角（▲））；ＨＴ１０８０細胞、ヒト繊維芽腫（黒四角（■））；Ｕ２ＯＳ細胞、ヒト骨肉腫（黒丸（●））、以上５種の細胞は野生型ｐ５３を有する；ＰＣ３細胞、ヒト肺がん細胞（白三角（△））；Ａ４３１細胞、ヒト乳がん細胞（白四角（□））；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ヒト乳がん細胞（白菱形（◇））以上３種の細胞は、変異型ｐ５３を有する。）を２ｘ１０４細胞となるように２４穴プレートにまき、一晩培養後、各々の濃度のＫ−１７８を添加した。４８時間後、クリスタルバイオレット法を用いて、細胞生存率を算出した。野生型ｐ５３を持つがん細胞は、変異型ｐ５３を持つがん細胞に比べ、Ｋ−１７８による細胞増殖抑制効果が高い傾向にあった。Ｋ−１７８の感受性の高いがん細胞における細胞増殖抑制活性のＣＣ５０値はそれぞれ１８．２μＭ（ＭＣＦ７細胞）、１８．１μＭ（Ａ４２７細胞）、１４．６μＭ（ＨＴ１０８０細胞）であった。また、実施例１６のＫ−１７８によるＭＣＦ７細胞における細胞増殖抑制活性のＣＣ５０値の違いは細胞をｓｉＲＮＡで処理していることが原因と推測される。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の修飾語等（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等の冠詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００５５】
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は本明細書中、統一した意味で使用し、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わされて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
【００５６】
本明細書において「Ｍｄｍｘ」とは、Ｍｄｍ２と類似した構造を持つタンパク質をいい（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、ＧｅｎｂａｎｋにおいてＮＭ＿００２３９３として登録されている。本明細書では、Ｍｄｍｘとｍｄｍｘとは、特に言及しない限り交換可能に使用され、タンパク質または遺伝子のいずれかまたは両方をさすことが当業者に理解される。Ｍｄｍｘを過剰発現しているがん細胞に対する治療法は未だ確立されておらず、そのようながんの治療において副作用の強い抗がん剤を使わざるを得ないのが現状である。ｐ５３とｍｄｍｘとの結合を阻害する化合物については言及した報告はない。がん抑制遺伝子ｐ５３は約半数のヒトがんで変異が認められており、がん発生の抑制に重要な役割を担っている。しかしながら、残りの半分のがんではｐ５３が野生型であり、多くの場合、ｐ５３機能に対し抑制的に働く因子（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）が過剰発現していることが報告されている。がん抑制遺伝子がコードするｐ５３タンパク質の抑制的に働く因子としてＭｄｍｘ（非特許文献１）が報告されている。また、ｐ５３野生型の遺伝子を持つ多くのがん細胞で過剰発現が認められている。
【００５７】
本明細書において「ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類」とは、以下の構造：
【００５８】
【化３７】
2011178704.tif 000038
を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【００５９】
本明細書において「Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類」とは、以下の構造：
【００６０】
【化３８】
2011178704.tif 000039
ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【００６１】
本明細書において「［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類」とは、以下の構造：
【００６２】
【化３９】
2011178704.tif 000040
ここで、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【００６３】
本明細書において「２−（アシルアミノ）フェノール類」とは、以下の構造：
【００６４】
【化４０】
2011178704.tif 000041
ここで、Ｒ７は、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ７は、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【００６５】
本発明において、今般、本発明者らは、Ｍｄｍｘを過剰発現しているがん細胞にして、Ｍｄｍｘ−ｐ５３結合を阻害し、高い細胞増殖抑制効果を発揮するビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類およびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、並びに、後者の構造に対応する非硫黄含有化合物である［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類を見出すことができた。
【００６６】
本明細書において「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。
【００６７】
本明細書において「炭化水素」とは、炭素と水素だけからなる化合物の総称である。炭素原子の連なり方によって鎖式炭化水素と環式炭化水素とに大別され、鎖の場合もあり、側鎖をもつ場合もあり、前者は、直鎖炭化水素といい、後者は分岐炭化水素をいう。したがって、「炭化水素」には、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、アリサイクリルなどが包含されることが理解される。
【００６８】
本明細書において「アルキル」とは、炭素数１〜１０個の直鎖状又は分枝状のアルキル基を包含し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソぺンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられる。好ましくは、炭素数１〜６または１〜４個のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。
【００６９】
本明細書において「アルケニル」とは、上記「アルキル」に１個又はそれ以上の二重結合を有する炭素数２〜６個、または２〜８個の直鎖状又は分枝状のアルケニルを包含し、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等が挙げられる。
【００７０】
本明細書において「アルキニル」とは、上記「アルキル」に１個又はそれ以上の三重結合を有する炭素数２〜６個、または２〜８個の直鎖状又は分枝状のアルキニルを包含し、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等が挙げられる。さらに１個又はそれ以上の二重結合を有していてもよい。
【００７１】
本明細書において「シクロアルキル」とは、環状飽和炭化水素基をいい、代表的に炭素数３〜１５の環状飽和炭化水素基を包含し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基などが挙げられる。好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基が挙げられる。
【００７２】
本明細書において「シクロアルケニル」は、環状の不飽和脂肪族炭化水素基をいい、代表的に、炭素数３〜１５個の環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包含し、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルが挙げられ、好ましくはシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルである。シクロアルケニルには、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【００７３】
本明細書において「シクロアルキニル」は、１個又はそれ以上の三重結合を有する環状の不飽和脂肪族炭化水素基をいい、代表的に、炭素数９〜１５個の１個又はそれ以上の三重結合を有する環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包含する。
【００７４】
本明細書において「アリール」とは、単環芳香族炭化水素基（例：５〜８員のもの、例えば、フェニル）及び多環芳香族炭化水素基（例：１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等）を包含する。好ましくは、フェニル又はナフチル（１−ナフチル、２−ナフチル）が挙げられる。
【００７５】
本明細書において「ヘテロアリール」とは、単環芳香族複素環式基及び縮合芳香族複素環式基を包含する。単環芳香族複素環式基は、酸素原子、硫黄原子、および／又は窒素原子を環内に１〜４個含んでいてもよい５〜８員の芳香環から誘導される、置換可能な任意の位置に結合手を有していてもよい基を包含する。縮合芳香族複素環式基は、酸素原子、硫黄原子、および／又は窒素原子を環内に１〜４個含んでいてもよい５〜８員の芳香環が、１〜４個の５〜８員の芳香族炭素環もしくは他の５〜８員の芳香族ヘテロ環と縮合している、置換可能な任意の位置に結合手を有していてもよい基を包含する。
【００７６】
本明細書において「脂環式（アリサイクリル；ａｌｉｃｙｃｌｙｌ）」とは、非芳香族複素環式基をいい、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルなどを包含する。
【００７７】
本明細書において「ヘテロサイクリル」とは、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子を環内に１〜４個含んでいてもよく、置換可能な任意の位置に結合手を有していてもよい非芳香族複素環式基を包含する。また、そのような非芳香族複素環式基がさらに炭素数１〜４のアルキル鎖で架橋されていてもよく、シクロアルカン（５〜６員環が好ましい）やベンゼン環が縮合していてもよい。非芳香族であれば、飽和でも不飽和でもよい。好ましくは５〜８員環である。例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
【００７８】
本明細書において「置換もしくは非置換のアルキル」、「置換もしくは非置換のアルケニル」、「置換もしくは非置換のアルキニル」、「置換もしくは非置換のアリール」、「置換もしくは非置換のシクロアルキル」、「置換もしくは非置換のシクロアルケニル」、「置換もしくは非置換のヘテロアリール」、「置換もしくは非置換のアリサイクリル」、「置換もしくは非置換のヘテロサイクリル」、「置換もしくは非置換のアルコキシ」、における置換基としては、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロサイクリル（例：ピペリジル）、ヘテロサイクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ（例：アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等からなる群から選択される。１〜４個の当該置換基で置換されていてもよい。
【００７９】
本発明の化合物の製薬上許容される塩としては、以下の塩が挙げられる。
【００８０】
本発明において利用可能な塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、メグルミン塩、ジエタノールアミン塩またはエチレンジアミン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ベネタミン塩等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００８１】
本発明において利用可能な酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。
【００８２】
本明細書において「溶媒和物」とは、本発明化合物またはその製薬上許容される塩の溶媒和物を意味し、例えば、アルコール（例：エタノール）和物や水和物等が挙げられる。水和物としては、１水和物、２水和物等を挙げることができる。
【００８３】
別の実施形態において、本発明は、上記のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩またはそれらの溶媒和物、あるいはそのプロドラッグ（たとえば、エステル類、アミド類）を含有する医薬組成物を提供する。
【００８４】
本明細書において「プロドラッグ」、「プロドラッグ化合物」とは、化学的又は代謝的に分解し得る基を有し、加水分解や加溶媒分解によって又は生理条件下で分解することによって薬学的に活性を示す本発明化合物の誘導体である。いろいろな形のプロドラッグが、当該技術分野において知られている。このようなプロドラッグ誘導体の例については、次を参照することができる。本発明で使用される化合物のプロドラッグは、その化合物中に存在する官能基を、生体内で開裂すると親化合物が放出されるような修飾方法で修飾することによって製造される。たとえば、プロドラッグは、本発明で使用される化合物中のヒドロキシ基などが、生体内で開裂されるとそれぞれ遊離ヒドロキシ基などを再生する基と結合している化合物を含む。プロドラッグの例は、これらに限定されないが、本発明の化合物中のヒドロキシ官能基のエステル（例えば、アセタート、ホルマート、およびベンゾアート誘導体）、カルバマート（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）などを含む。
（ａ）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２．ｐ．３０９−３９６，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；
（ｂ）Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ；
（ｃ）Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５“Ｄｅｓｉｇｎａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”，ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  ｐ．１１３−１９１（１９９１）；
（ｄ）Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，８，１−３８（１９９２）；
（ｅ）Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７７，２８５（１９８８）；および
（ｆ）Ｎ．Ｋａｋｅｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３２，６９２（１９８４）。
【００８５】
（製造方法）
本発明化合物の一般的製造法を以下に例示する。また、抽出、精製などは、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。
【００８６】
本発明の化合物の合成は、当該分野において公知の手法を参酌しながら実施することができる。
【００８７】
原料化合物は、市販の化合物であるか、他の本明細書中に記載の文献に記載されたもの、このほか本明細書において記載されたものならびに本明細書において他に引用された文献に記載されるものならびに他に公知の化合物を利用することができる。
【００８８】
本発明の化合物の中には、互変異性体が存在し得るものがあるが、本発明は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
【００８９】
本発明のビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類、Ｓ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類は、（非特許文献５および６）に基づいて合成することができる。
【００９０】
例えば、本明細書において本発明のＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類の化合物は、ｏ-アミノチオフェノールに、所望の置換基が結合したカルボニルハロゲンを結合させて、当該置換基を導入することによって合成することができる。置換基は、アミノ基およびチオ基の両方または一方に導入されうる。別々の置換基を導入するには反応性の相違を利用するか、または保護・脱保護により、所望の置換基を結合させた後、他方のものを導入すればよい。
【００９１】
同様に、本明細書において本発明の[２−（アシルアミノ）フェニル]アルカノエート類の化合物は、ｏ-アミノフェノールに、所望の置換基が結合したカルボニルハロゲンを結合させて、当該置換基を導入することによって合成することができる。置換基は、アミノ基およびヒドロキシ基の両方または一方に導入されうる。一方の場合は、下記２−(アシルアミノ)フェノール類と同様になる。別々の置換基を導入するには反応性の相違を利用するか、または保護・脱保護により、所望の置換基を結合させた後、他方のものを導入すればよい。
【００９２】
同様に、本明細書において本発明の２−(アシルアミノ)フェノール類の化合物は、ｏ-アミノフェノールに、必要に応じて、ヒドロキシ基を保護し、所望の置換基が結合したカルボニルハロゲンを結合させて、当該置換基を導入し、必要に応じて脱保護することによって合成することができる。
【００９３】
本明細書において本発明のビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類の化合物は、２−アミノフェニルジスルフィドに、所望の置換基が結合したカルボニルハロゲンを結合させて、当該置換基を導入することによって合成することができる。別々の置換基を導入するには、o-アミノチオフェノールのアミノ基とチオール基との反応性の相違を利用するか、または、両基にカルボニルハロゲンを結合させ所望の置換基を結合させた後、チオエステル基側を選択的に加水分解し、他方のものを導入すればよい。
【００９４】
反応溶媒としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、芳香族炭化水素類（例、トルエン、ベンゼン、キシレンなど）、飽和炭化水素類（例、シクロヘキサン、ヘキサンなど）、ハロゲン化炭化水素類（例、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなど）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなど）、エステル類（例、酢酸メチル、酢酸エチルなど）、ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトンなど）、ニトリル類（例、アセトニトリルなど）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノールなど）、水およびそれらの混合溶媒等が挙げられる。
【００９５】
塩基としては、例えば金属水素化物（例、水素化ナトリウムなど）、金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウムなど）、金属炭酸塩（例、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸セシウムなど）、金属アルコキシド（例、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシドなど）、炭酸水素ナトリウム、金属ナトリウム、有機アミン（例、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＤＢＵ、２，６−ルチジンなど）、ピリジン、アルキルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ、ｓｅｃ−ＢｕＬｉ、ｔｅｒｔ−ＢｕＬｉ）等が挙げられる。塩基は必ずしも使用する必要はないが、必要に応じて用いることができる。
【００９６】
本明細書において使用されうる縮合剤としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスジメチルアミノホスホニウム塩（ＢＯＰ）、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰＴＭ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏｐ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）などを用いることができる。また、これらの試薬は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などと組み合わせて使用することができる。
【００９７】
本明細書において使用されうる場合、反応溶媒としてエーテル類（例、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサンなど）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、塩基として有機アミン（例、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７（ＤＢＵ）、２，６−ルチジンなど）、縮合剤としてＨＡＴＵまたはＰｙＢＯＰを用いて行えばよい。反応温度、反応時間は特に限定されないが、通常は室温にて反応を実施し、反応の進行が遅い場合には加温することによって反応が促進される場合もある。
【００９８】
本発明の製造は、本明細書に記載される実施形態を適宜改変し、あるいは組み合わせ、あるいは公知技術を付加することによって実施することができる。
【００９９】
本発明の化合物は、保護基を用いて保護することができる。たとえば、代表的には、ハロゲン（Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆなど）、低級（ここでは、代表的にＣ１−Ｃ６を示すがこれに限定されない。）アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ等を表す。）において、適宜の置換基を当該分野で公知の手法により保護することによって製造することができる。このような保護基としては、例えばエトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、ベンジル等の、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８１年）等に記載されている保護基をあげることができる。保護基の導入および脱離方法は、有機合成化学で常用される方法［例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８１年）参照］等に記載の方法あるいはそれらに準じて得ることができる。また、各置換基に含まれる官能基の変換は、上記製造法以外にも公知の方法［例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ著（１９８９年）等］によっても行うことができ、本発明の化合物の中には、これを合成中間体としてさらに新規な誘導体へ導くことができるものもある。上記各製造法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される精製法、例えば中和、濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
【０１００】
（好ましい実施形態）
本発明の好ましい実施形態を以下に説明する。本発明は、この形態に拘束されないことが理解される。
【０１０１】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、以下の表１に記載されるビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類およびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類、並びにその類縁体の構造を示す化合物を提供する。表中の化合物番号は、本明細書において適宜使用する。
【０１０２】
（表１．ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィド類およびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート類）
【０１０３】
【表１−１】
2011178704.tif 000042
【０１０４】
【表１−２】
2011178704.tif 000043
【０１０５】
１つの局面では、本発明は、Ｍｄｍｘを発現する細胞の増殖を抑制するための組成物を提供する。代表的には、この組成物は、ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィドおよびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレート、後者の構造に対応する非硫黄含有化合物である［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類からなる群より選択される化合物を含む。
【０１０６】
具体的には、本発明の組成物は、以下の式：
【０１０７】
【化４１】
2011178704.tif 000044
を有する化合物を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【０１０８】
あるいは本発明の組成物は、以下の式：
【０１０９】
【化４２】
2011178704.tif 000045
を有する化合物を含み、ここで、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される）。好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【０１１０】
本発明の組成物は、以下の構造：
【０１１１】
【化４３】
2011178704.tif 000046
を有する化合物を含み、ここで、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【０１１２】
また、本発明の組成物は、以下の構造：
【０１１３】
【化４４】
2011178704.tif 000047
を有する化合物を含み、ここで、Ｒ７は、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロサイクル、および置換もしくは非置換のアルコキシからなる群より選択され、これらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒドロキシ低級アルコキシ、低級アルコキシ低級アルコキシ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、アシルアミノ、低級アルキルアミノ、イミノ、グアニジノ、ヒドロキシイミノ、低級アルコキシイミノ、低級アルキルチオ、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、ヒドロキシ低級アルキルカルバモイル、スルファモイル、低級アルキルスルファモイル、低級アルキルスルフィニル、シアノ、ニトロからなる群から選択される。好ましくは、Ｒ７は、炭素数1から１５の置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐炭化水素、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換のアリサイクリル、および置換もしくは非置換のヘテロサイクリルから選択される。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明は、上記に列挙した具体的な化合物の任意の化合物を含む組成物であって、Ｍｄｍｘ阻害剤であるものを提供する。ここで疾患としては、Ｍｄｍｘに関連するものであればどのような疾患等でも対象とすることができる。代表的には、対象となる疾患はがんであり、そのひとつの例としては、乳がんを挙げることができる。あるいは対象とする疾患は、ｐ５３発現とも関連するものである。したがって、１つの実施形態では、本発明によって、がん患者に投与することによって薬効を発揮する任意の医薬組成物が提供される。
【０１１５】
ここで、Ｍｄｍｘに関連する疾患としては、例えば、がん、心筋症などを挙げることができる。あるいは、Ｍｄｍｘに関連する障害ないし症状としては、心血管系疾患、内分泌代謝異常や老化などを挙げることができる。
【０１１６】
このうち、Ｋ−１５２およびＫ−１５３の２つはインビトロではｐ５３とｍｄｍｘの相互作用を阻害する活性があるが、インビボでは、癌細胞に到達する前に、−Ｓ−Ｓ−結合が容易に切れて代謝的に不安定なＳＨ基が生成すると予測され、活性はそれほど高くないと推定される。したがって、より好ましい化合物としては、−Ｓ−Ｓ−結合が容易に切断されないような化合物、或いは、−ＳＨ基をエステルとして保護したプロドラッグを選択するとよいが本発明はこれに限定されることはない。
【０１１７】
あるいは、本発明は、Ｍｄｍｘとｐ５３と間の相互作用の阻害剤を提供する。この阻害剤は、代表的には、ビス［２−（アシルアミノ）フェニル］ジスルフィドおよびＳ−［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカンチオレートからなる群より選択される化合物を含む。この阻害剤はさらに、後者の構造に対応する非硫黄含有化合物［２−（アシルアミノ）フェニル］アルカノエート類、および２−(アシルアミノ)フェノール類をも含む。
このような阻害剤は、医薬としての用途のほか、試薬としての用途も見出すことができる。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、がんまたは免疫疾患の処置または予防のための医薬であって、上記に列挙した具体的な化合物の任意の化合物を含む医薬を提供する。
【０１１９】
本発明は、ｐ５３−Ｍｄｍｘのスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩として、関連して発症する疾患に対する治療又は予防作用を発揮し得る。例えば、本発明のスクリーニング方法によれば、癌、免疫疾患等に有効な治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【０１２０】
１つの局面では、本発明は、ｐ５３とＭｄｍｘとの相互作用を調節する物質を検出する方法を提供することができる。この方法は：（ａ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＭｄｍｘとの融合タンパク質を、グルタチオン（Ｐｉｅｒｃｅ社等より購入可能）をコーティングした固相上で提供する工程；（ｂ）エピトープで標識したｐ５３および測定対象物質を該融合タンパク質に提供する工程；および（ｃ）遊離した該エピトープ標識したｐ５３を、該エピトープに対する抗体を用いて検出または定量する工程を包含する。
【０１２１】
使用されるＧＳＴは、どのようなものでもよいが、実施例で使用されているもの、あるいは、例えば、ＧＥヘルスケア社から市販されているどのＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターを用いるとよい。
【０１２２】
本明細書では、「エピトープ」とは、抗体結合部位をいい、ここで、使用されるエピトープは、どのようなものでもよいが、代表的にはＦＬＡＧ配列が使用される。
【０１２３】
融合たんぱく質は、当該分野において公知の手法によって製造することができ、代表的には、実施例で使用されているもの、あるいは、例えば、シグマ−アルドリッチ社から市販されているＦＬＡＧ融合タンパク質発現ベクターを用いることができる。
【０１２４】
本発明では、コーティングは、どのような方法でも実現でき、例えば、Ｐｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１４２４６−１４２５４．の文献で使用されている方法、例えば、グルタチオンは構造の中心に位置するスルフヒドリル基を介してプレートウェルに固定する方法などを用いて実現することができる。
【０１２５】
本発明では、固相としては抗原抗体反応において用いられるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、Ｐｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１４２４６−１４２５４．の文献で使用されているもの、例えば、ポリスチレン表面などを用いることができる。
【０１２６】
１つの実施形態では、検出または定量は、抗原抗体反応を検出ないし定量しうる任意の公知の方法を使用することができるが、抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗体を用いて、該西洋ワサビペルオキシダーゼの発色基質を発色させ、該発色の吸光度を測定することによって実行される。
【０１２７】
（医薬）
本発明の化合物またはその製薬上許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。
【０１２８】
本発明が主に対象とする疾患である「がん」としては、固形がん、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫及び造血器腫瘍等の種々の悪性新生物が例示され、大腸がん及び肝がん等が包含され、さらにこれらがんの転移をも包含する。本発明は、上記病気を治療する医薬品を製剤化するのに特に有用になるような特定の特性を有する新規の一連の化合物の発見に成功した。特に、本化合物は、充実性腫瘍か、血液の腫瘍のような増殖性の病気の治療において、特に、結腸直腸のがん、乳がん、肺がん、前立腺がん、膵臓がんまたは膀胱がんおよび腎臓がん、同様に、白血病およびリンパ腫のような病気において有用である。
【０１２９】
特に、Ｍｄｍｘの発現あるいはｐ５３−ｍｄｍｘ相互作用に関連するがんとしては、肺癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍、骨肉腫、網膜芽腫などを挙げることができ、このような疾患に対する有効な治療がなかったのが現状であった。
【０１３０】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、該医薬組成物は、発症する疾患に対して、ｐ５３−ｍｄｍｘ相互作用を阻害することを介して作用し得るという優れた効果を発揮する。例えば、本発明の医薬組成物は特に、癌等に対して、ｐ５３−ｍｄｍｘ相互作用を阻害することを介して作用し得るという優れた効果を発揮する。該医薬組成物を癌の治療又は予防に用いる場合は、通常の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、たとえば腫瘍細胞を事前感応化するためのDNA劣化剤を施すのと同時に、又はその前でも使用できる。
【０１３１】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物中における化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物又はその塩を安定に保持し得る種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。
【０１３３】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。
【０１３４】
また、本発明の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。
【０１３５】
１つの実施形態において、本発明が利用しうる投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口または例えば、直腸内、口腔内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口をあげることができる。投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性製剤からなる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
【０１３６】
本発明において使用しうる局所製剤は、活性化合物を１種もしくはそれ以上の媒質、例えば鉱油、石油、多価アルコール等または局所医薬製剤に使用される他の基剤中に溶解または懸濁させて調製する。腸内投与のための製剤は、通常の担体、例えばカカオ脂、水素化脂肪、水素化脂肪カルボン酸等を用いて調製し、座剤として提供される。本発明では、非経口剤においても、経口剤で例示したグリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤（抗酸化剤を含む）、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【０１３７】
１つの実施形態において、本発明の化合物もしくはその製薬上許容される塩の有効用量および投与回数は、投与形態、患者の年令、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、投与量は、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ／人、好ましくは５〜５００ｍｇ／人であり、投与回数は、１日１回または分割して投与するのが好ましい。
【０１３８】
１つの実施形態において、本発明の化合物は、好ましくは、ＩＣ５０が被検物質なしの場合の蛍光値を基準に、被検物質の抑制活性が１以下、好ましくは、０．１μＭ以下、より好ましくは、０．０１μＭ以下の値を有するもの、あるいは、１０ｎＭ〜１０μＭの範囲内、好ましくは、１０μＭ未満、より好ましくは、１μＭ未満のＩＣ５０値をもつような化合物である。
【０１３９】
製剤化に関するさらなる情報については、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ  Ｈａｎｓｃｈ；Ｃｈａｉｒｍａｎ  ｏｆ  Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  Ｂｏａｒｄ），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０年の第５巻の第２５．２章を参照することができる。
【０１４０】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を製造するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
【０１４１】
本発明はまた、本発明の化合物またはその溶媒和物を使用するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
【０１４２】
本発明化合物は、医薬としての有用性を備えた化合物である。ここで、医薬としての有用性としては、代謝安定性がよい点、薬物代謝酵素の誘導も少ない点、他の薬剤を代謝する薬物代謝酵素の阻害も小さい点、経口吸収性の高い化合物である点、クリアランスが小さい点、または、半減期が薬効を発現するために十分長い点などが含まれる。
【０１４３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【０１４４】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【０１４５】
使用機器、及び測定条件などは下記に記載したものを採用した。
【０１４６】
以下に、本発明の代表的な化合物の製造例を記載する。
【０１４７】
（実施例１：Ｎ，Ｎ’−（２，２’−ジスルファンジイルｂｉｓ（２，１−フェニレン）ｂｉｓ（２−メチルプロパンアミド）  Ｋ−１５２）
本発明の化合物は以下の手順に従って製造した。このような製造は、非特許文献５および６などを参酌して適宜改変することができる。
（１）２−アミノフェニルジスルフィド（２．０２  ｍＭ）［ＴＣＩ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶解した。
（２）この溶液にピリジン（４００  μｌ）を加えた。
（３）イソブチリルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶かし、上記の溶液に滴下した。
（４）常温、常圧で１時間撹拌した。
（５）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（６）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（７）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（８）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
m.p.144.5-146.4℃
IR (KBr) cm-1: 3244.0，3186.2，2970.2，2869.9，1660.6，1577.7，1525.6，1460.0，1436.9，1380.9，1276.8，1238.4，1201.6，1157.2，1099.3，1035.7，948.9，937.3，887.2，744.5，686.6，596.0，470.6
1H NMR (CDCl3) d: 1.47 (12H，d，J= 6.8 Hz)，3.43 (2H，septet，J = 7.2 Hz)，7.36 (2H，dt，J = 7.2 Hz)，7.43 (2H，d，J =8.0 Hz)，7.85 (2H，d，J = 8.0 Hz)，7.98 (2H，d，J = 8.0 Hz).
ESI-MS(positive mode) m/z: 389.14 (M + H)+。
【０１４８】
（実施例２：Ｎ，Ｎ’−（２，２’−ジスルファンジイルｂｉｓ（２，１−フェニレン）ｂｉｓ（２，２−ジメチルプロパンアミド）  Ｋ−１５３）
２−アミノフェニルジスルフィド（２．０２ｍＭ）［ＴＣＩ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶解し、ピリジン（４００μｌ）を加えた。トリメチルアセチルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ａｌｄｒｉｃｈ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）溶液を上記溶液に滴下した。ついで、実施例１と同様の操作をし、目的化合物を白色結晶として得た。
m.p. 86.0-87.0℃
IR (KBr) cm-1: 3386.8，3247.9，2869.9，2391.6，1678.0，1643.2，1575.7，1467.7，1433.0，1361.7，1305.7，1226.6，1161.1，1058.8，1035.7，931.6，916.1，771.5，750.3，626.8，455.2.
1H NMR (CDCl3) d: 1.25 (18H，s)，6.94(2H，dt，J = 1.5 and 7.8 Hz)，7.21 (2H，dd，J = 1.5 and 7.8 Hz)，7.40 (2H，dd，J = 1.5and 7.8 Hz)，8.46 (2H，dd，J = 1.5 and 8.4 Hz)，8.52 (2H，br s).
ESI-MS(positive mode) m/z: 417.17 (M + H)+。
【０１４９】
（実施例３：Ｎ，Ｎ’−（２，２’−ジスルファンジイルｂｉｓ（２，１−フェニレン）ジオクタンアミド  Ｋ１５４）
２−アミノフェニルジスルフィド（２．０２  ｍＭ）［ＴＣＩ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶解し、ピリジン（４００  μｌ）を加えた。ｎ−オクタノイルクロリド（４．０４  ｍＭ）［関東化学株式会社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）溶液を上記溶液に滴下した。ついで、実施例１と同様の操作をし、目的化合物を白色結晶として得た。
m.p. 79.0-81.0℃
IR (KBr) cm-1: 3267.2，3192.0，2923.9，2848.7，2405.1，1662.5，1577.7，1523.7，1465.8，1438.8，1409.9，1284.5，1234.4，1033.8，962.4，732.9，686.6，464.8，405.0.
1H NMR (CDCl3) d: 0.89 (6H，m)，1.30(16H，m)，1.65 (4H，m)，2.16 (4H，t，J = 7.6 Hz)，6.99 (2H，dt，J = 7.6 Hz)，7.35 - 7.43(4H，m)，7.97 (2H，br s)，8.40 (2H，brd，J = 7.6 Hz).
ESI-MS(positive mode) m/z: 501.26 (M + H)+。
【０１５０】
（実施例４：Ｎ，Ｎ’−（２，２’−ジスルファンジイルｂｉｓ（２，１−フェニレン）ジシクロペンタンカルボキサミド  Ｋ−２０１）
２−アミノフェニルジスルフィド（２．０２  ｍＭ）［ＴＣＩ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶解し、ピリジン（４００  μｌ）を加えた。シクロペンタンカルボニルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ａｌｄｒｉｃｈ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）溶液を上記溶液に滴下した。ついで、実施例１と同様の操作をし、目的化合物を白色結晶として得た。
m.p. 157-158℃
1H NMR (CDCl3) d: 1.55-1.86(16H，m)，2.47 (4H，quintet，J = 7.6 Hz)，6.98 (2H，brt，J = 7.6 Hz)，7.35 (2H，brd，J =8.0 Hz)，7.40 (2H，brt，J = 8.0 Hz)，8.06 (2H，brs)，8.42 (2H，brd，J = 8.4 Hz)。
【０１５１】
（実施例５：Ｎ，Ｎ’−（２，２’−ジスルファンジイルｂｉｓ（２，１−フェニレン）ジベンザミド  Ｋ−２０２）
２−アミノフェニルジスルフィド（２．０２  ｍＭ）［ＴＣＩ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶解し、ピリジン（４００μｌ）を加えた。ベンゾイルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ａｌｄｒｉｃｈ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）溶液を上記溶液に滴下した。ついで、実施例１と同様の操作をし、目的化合物を白色結晶として得た。
m.p. 144-145℃
1H NMR (CDCl3) d: 6.95 (2H，dt，J= 1.5 and 7.8 Hz)，7.31 (2H，dt，J = 1.5 and 8.4 Hz)，7.40 - 7.60 (8H，m)，7.69 (4H，dd，J= 1.5 and 8.4 Hz)，8.50 (2H，dd，J = 1.5 and 8.4 Hz)，8.93 (2H，br s)。
【０１５２】
（実施例６：Ｓ−２−イソブチラミドフェニル  ２−メチルプロパンチオレート  Ｋ−１７８）
（１）ｏ−アミノチオフェノール（１．８７ｍｍｏｌ）［Ｗａｋｏ社］をＣＨＣｌ３（５ｍｌ）に溶解させ、ピリジン（３５０μｌ）を加えた。
（２）イソブチリルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）溶液を、氷冷下、上記の溶液に滴下した。
（３）常温、常圧で１〜２時間撹拌した。
（４）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（５）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（６）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（７）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
ｍ．ｐ．  ９２−９４℃
IR (KBr) cm-1: 3286.5，2968.2，2871.8，1753.2，1658.7，1606.6，1250.4，1348.1，1298.0，1255.6，1180.4，1099.3，920.0，842.8，758.0，694.3.
1H NMR (CDCl3) d: 1.24 (6H，d，J= 6.9 Hz)，1.33 (6H，d，J = 6.9 Hz)，2.51 (1H，septet，J = 7.2 Hz)，2.94 (1H，septet，J= 7.2 Hz)，7.14 (1H，t，J = 7.6 Hz)，7.38 (1H，d，J = 6.4 Hz)，7.43 (1H，t，J = 8.4 Hz)，7.76(1H，br s)，8.35 (1H，d，J = 8.0 Hz)。
【０１５３】
（実施例７：Ｓ−２−ピバルアミドフェニル  ２−メチルプロパンチオレート  Ｋ−１７９）
（１）ｏ−アミノチオフェノール（１．８７ｍｍｏｌ）［Ｗａｋｏ社］をＣＨＣｌ３（５ｍｌ）に溶解させ，ピリジン（３５０μｌ）を加えた。
（２）トリメチルアセチルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ａｌｄｒｉｃｈ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）の溶液を、氷冷下、上記の溶液に滴下した。
（３）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（４）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（５）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（６）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
（７）この結晶をＭｅＯＨ（５  ｍｌ）に溶解させ、５Ｎ  ＫＯＨ（１  ｍｌ）を加え、常温常圧で２時間撹拌を行った。
（８）反応液をＨＣｌで酸性（ｐＨ  ５〜６）にし、ＣＨＣｌ３（約１００  ｍｌで２回）で抽出した。
（９）飽和ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、飽和食塩水で２回洗浄後、乾燥し、減圧濃縮した。ただちに、残渣にピリジン（４００μｌ）を加え、更に、イソブチリルクロリド（２．０２ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）を加えた。
（１０）常温、常圧で１時間撹拌する。
（１１）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（１２）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（１３）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（１４）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
m.p. 88.5-90.6℃
1H NMR (CDCl3) d: 1.28 (9H，s)，1.29(6H，d)，1.31 (15H，m)，2.93 (1H，septet，J = 7.0 Hz)，7.11 (1H，dt，J = 1.0 and 8.0 Hz)，7.38(1H，dd，J = 8.0 and 1.0 Hz)，7.44 (1H，dt，J = 1.0 and 8.5 Hz)，8.05 (1H，brs)，8.35(1H，brd，J = 9.0 Hz)。
【０１５４】
（実施例８：Ｓ−２−（シクロペンタンカルボキサミド）フェニル  ２−メチルプロパンチオレート  Ｋ−１８０）
（１）ｏ−アミノチオフェノール（１．８７ｍｍｏｌ）［Ｗａｋｏ社］をＣＨＣｌ３（５ｍｌ）に溶解させ，ピリジン（３５０μｌ）を加えた。
（２）シクロペンタンカルボニルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ａｌｄｒｉｃｈ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）の溶液を、氷冷下、上記の溶液に滴下した。
（３）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（４）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（５）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（６）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
（７）この結晶をＭｅＯＨ（５  ｍｌ）に溶解させ、５Ｎ  ＫＯＨ（１  ｍｌ）を加え、常温常圧で２時間撹拌を行った。
（８）反応液をＨＣｌで酸性（ｐｈ  ５〜６）にし、ＣＨＣｌ３で抽出した。
（９）飽和ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、飽和食塩水で２回洗浄後、乾燥し、減圧濃縮した。ただちに、残渣にピリジン（４００  μｌ）を加え、更に、イソブチリルクロリド（２．０２ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）を加えた。
（１０）常温、常圧で１時間撹拌する。
（１１）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（１２）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（１３）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（１４）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
m.p. 86-87℃
1H NMR (CDCl3) d: 1.29 (6H，d，J= 6.8 Hz)，1.58 - 1.93 (8H，m)，2.69 (1H，quintet，J = 8.4 Hz)，2.94 (1H，septet，J =7.2 Hz)，7.１２ (1H，t，J = 7.6 Hz)，7.26 - 7.47 (2H，m)，7.74 (1H，brs)，8.34 (1H，d，J =8.0 Hz)。
【０１５５】
（実施例９：Ｓ−２−ベンザミドフェニル  ２−メチルプロパンチオレート  Ｋ−１８１）
（１）ｏ−アミノチオフェノール（１．８７ｍｍｏｌ）［Ｗａｋｏ社］をＣＨＣｌ３（５ｍｌ）に溶解させ，ピリジン（３５０μｌ）を加えた。
（２）ベンゾイルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ａｌｄｒｉｃｈ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）の溶液を、氷冷下、上記の溶液に滴下した。
（３）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（４）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（５）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（６）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
（７）この結晶をＭｅＯＨ（５  ｍｌ）に溶解させ、５Ｎ  ＫＯＨ（１  ｍｌ）を加え、常温常圧で２時間撹拌を行った。
（８）反応液をＨＣｌで酸性（ｐｈ  ５〜６）にし、ＣＨＣｌ３で抽出した。
（９）飽和ＮａＨＣＯ３で２回、水で１回、飽和食塩水で２回洗浄後、乾燥し、減圧濃縮した。ただちに、残渣にピリジン（４００  μｌ）を加え、更に、イソブチリルクロリド（２．０２ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）を加えた。
（１０）常温、常圧で１時間撹拌する。
（１１）反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、１％ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和食塩水、で順次洗浄。
（１２）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮。
（１３）析出した結晶を酢酸エチルに溶解させ、粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：５）により精製した。
（１４）精製物をエタノールより再結晶化し、白色結晶を得た。
m.p. 65-66℃
1H NMR (CDCl3) d: 1.27 (6H，d，J= 6.8 Hz)，2.95 (1H，septet，J = 6.8 Hz)，7.42 - 7.57 (7H，m)，7.85 (1H，d，J = 8.0 Hz)，8.48(1H，d，J = 8.8 Hz)，8.51 (1H、 brs)。
【０１５６】
（実施例１０：２−イソブチラミドフェニル  イソブチレート  Ｋ−２０５）
２−アミノフェノール（１．８７ｍｍｏｌ）［ＴＣＩ社］をＣＨＣｌ３（５ｍｌ）に溶解させ、ピリジン（３５０μｌ）を加えた。これに、イソブチリルクロリド（４．０４  ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）を加え、氷冷下、上記の溶液に滴下した。次いで、実施例１の場合と同様に処理し、白色結晶を得た。
m.p. 88.5-90.6℃
1H NMR (CDCl3) d: 1.25 (3H，d，J= 7.0 Hz)，1.37 (3H，J = 6.0 Hz)，2.51 (1H，J = 7.0 Hz)，2.88 (1H，J = 7.0 Hz)，7.11(1H，d，J = 3.7 Hz)，7.22 (1H，m)，7.26 (1H，brs)，8.19 (1H，d，J = 7.8 Hz). 
ESI-MS(positive mode) m/z: 250.1443 (M + H)+ 。
【０１５７】
（実施例１１：Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）イソブチラミド  Ｋ−２０４）
Ｋ−２０５を、実施例７の場合と同様に処理し、白色結晶を得た。
m.p.107.4-109.2℃
1H NMR (CDCl3) d: 1.30 (6H，d，J= 6.9 Hz)，2.65 (1H，septet，J = 7.0 Hz)，6.90 (1H，brt，J = 7.0 Hz)，7.01 (1H，brd，J =7.0 Hz)，7.11 (1H，brt，J = 7.0 Hz)，7.54 (1H，br s)，8.89 (1H，br s).
ESI-MS(positive mode) m/z: 180.1025 (M + H)+ 。
【０１５８】
（実施例１２：３−イソブチリルベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−オン  Ｋ−２０９）
２−ヒドロキシベンゾチアゾール（２．０２  ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］をＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）に溶解し、ピリジン（４００  μｌ）を加えた。更に、イソブチリルクロリド（３．０３  ｍＭ）［Ｗａｋｏ社］のＣＨ２Ｃｌ２（５  ｍｌ）を加えた。以降、実施例１の場合と同様に処理をし、油成物を得た。油状物
1H NMR (CDCl3) d: 1.28 (6H，d，J= 6.8 Hz)，3.89 (6H，d，J = 6.8 Hz)，7.15 - 7.40 (3H，m)，8.10 (1H，d，J = 8.0 Hz)。
【０１５９】
（実施例１３：薬理評価−ｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用阻害効果をモニタリングする改良型ＥＬＩＳＡ法）
ｐ５３とＭｄｍｘとの相互作用を阻害する低分子化合物を探索するために、以下の実験手順でその定量法（改良型ＥＬＩＳＡ法）を確立した。代表図を図１に示す。
【０１６０】
まず、１００μｇ／ｍｌアンピシリン抗生物質（シグマ−アルドリッチ社）を含むＬＢ培地（メルク社）に大腸菌を入れ、６００ｎｍの吸光度が１となったところで、イソプロピルβーＤ−ｌ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が０．１ｍＭとなるように添加し、３０℃、４時間培養後、大腸菌を４℃、６０００×ｇ、１５分の遠心で回収した。大腸菌をＰＢＳに懸濁させた後、超音波破砕し、大腸菌の溶解物を得た。その溶解物を４℃、２０，０００×ｇ、１５分の遠心を行い、その上清を取った。その上清をグルタチオンセファロース（ＧＥヘルスケア社）と混合し、４℃、１時間反応、ＰＢＳで４回洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタチオン（シグマ−アルドリッチ社）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で目的のタンパク質を溶出した。このような大腸菌大量発現系を用いて、Ｍｄｍｘ（ＮＭ＿００２３９３）をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（ＧＥヘルスケア社のＰＧＥＸ６Ｐ１ベクターを使用）との融合タンパク質として調製し、グルタチオンセファロースで精製した。そして、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で透析した後、グルタチンコートしたプレート（ピアス社）に固相化した。そして、大腸菌大量発現系を用いて、ＦＬＡＧエピトープ標識したｐ５３を調製し、固相化したＧＳＴ−Ｍｄｍｘと反応させた。反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗ＦＬＡＧ抗体および発色基質を用いて、ｐ５３−Ｍｄｍｘの結合量を定量したところ、加えたｐ５３の容量に依存して増加することがわかった。この系を用いて、ｐ５３−Ｍｄｍｘタンパク質間相互作用を阻害する低分子化合物のスクリーニングを行った。
【０１６１】
（実施例１４：Ｍｄｍｘ−ｐ５３相互作用を阻害する低分子化合物の同定）
Ａ．グルタチオンコートしたプレート（ＰＩＥＲＣＥ社）に１００μｌの１５μｇ／ｍｌ  ＧＳＴ−Ｍｄｍｘ溶液を添加し、室温１時間固相化した。そのプレートを良く洗浄した後、１００μｌの１μｇ／ｍｌＦＬＡＧタグしたｐ５３および各々の濃度の実施例１−１２で製造した低分子化合物を添加した。１時間反応後、良く洗浄し、ＨＲＰ標識したＦＬＡＧ抗体（１００００倍希釈：Ｓｉｇｍａ社）を室温１時間反応させた。その後、洗浄した後、発色キット（住友ベークライト社）を用いて呈色反応を行った。
【０１６２】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定し、低分子化合物の濃度に対するｐ５３−Ｍｄｍｘ相互作用阻害活性を示した。
【０１６３】
結果を図２（Ａ，Ｂ）に示す、Ｋ−１５４、Ｋ−１７８、Ｋ−１７９、Ｋ−１８０、Ｋ−１８１の阻害効果のＩＣ５０値はそれぞれ、１．０７、０．９６、０．７６、０．８８、０．７１ｍＭであった。
【０１６４】
（実施例１５：ウエスタンブロット法による、低分子化合物Ｋ−１７８によるｐ５３の安定化および活性化の評価）
ＭＣＦ７細胞（ヒト乳がん細胞）（大日本住友製薬（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｐｈａｒｍａ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を代理店とし、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））より購入）を２ｘ１０５細胞となるように６穴プレートにまき、一晩培養した。その後、Ｋ−１７８を添加し、２４時間後にその細胞を回収した。その培養には、１０％ウシ胎仔血清（バイオウエスト社）、ストレプトマイシン−ペニシリン（ナカライテスク社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ−アルドリッチ社）を用い、ＣＯ２インキュベーター（ヒラサワ社、テーハー式、ＣＰＤ−３００Ａ）中３７℃で行った。
【０１６５】
（結果）
結果は図３に示す。全細胞抽出液中のクラスリン重鎖（ローディングコントロール）、Ｍｄｍ２、ｐ５３およびｐ２１の発現をウエスタンブロット法で確認した。Ｋ−１７８を添加するとｐ５３の安定化が検出され、その標的遺伝子であるＭｄｍ２やｐ２１の発現誘導が認められた。
【０１６６】
（実施例１６：低分子化合物Ｋ−１７８による、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞のｐ５３依存性増殖抑制効果）
上記の培養条件でＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣより購入）を１ｘ１０５細胞となるように６穴プレートにまき、一晩培養後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、図４中に示したｓｉＲＮＡ（１００  ｐｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ社）を細胞へ導入した。４８時間後、１ｘ１０４細胞となるように２４穴プレートにまき直し、一晩培養後、各々の濃度のＫ−１７８を添加した。７２時間後、クリスタルバイオレット法を用いて、細胞生存率を算出した。クリスタルバイオレット法には、１穴当たり３００μｌのクリスタルバイオレット溶液（０．７５％  クリスタルバイオレット、０．２５％  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１．７５％  ホルムアルデヒド、５０％  エタノール）を使用し、室温１５分反応、大量の水道水で洗浄した後、着色した細胞（ディッシュに接着している生存細胞のみが着色される）をプレートリーダーで６００ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率の算出に使用した。コントロールｓｉＲＮＡおよびｐ５３に対するｓｉＲＮＡ（それぞれ、ｓｉ−ｃｏｎｔ．およびｓｉ−ｐ５３とも表記する。）で処理した細胞におけるＫ−１７８による細胞増殖抑制活性のＣＣ５０値はそれぞれ３．４、１２．６μＭであった。また、ｓｉＲＮＡの効果を確認するために、同処置を施した細胞から抽出液を調製し、その全細胞抽出液中のクラスリン重鎖（ローディングコントロール）およびｐ５３の発現をウエスタンブロット法で確認した。
【０１６７】
（実施例１７：低分子化合物Ｋ−１７８による様々ながん細胞の増殖抑制効果）
以下の細胞は、ＡＴＣＣおよびＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）細胞バンクから入手した：ＴＩＧ−７、ヒト正常繊維芽細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）；ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣより入手）、ヒト乳がん細胞；Ａ４２７細胞（ＡＴＣＣより入手）、ヒト肺がん細胞；ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）、ヒト繊維芽腫；Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣより入手）、ヒト骨肉腫；Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣより入手）、ヒト乳がん細胞；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＡＴＣＣより入手）、ヒト乳がん細胞；ＰＣ３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）、ヒト肺がん細胞。
【０１６８】
図中に示す様々な細胞（ＴＩＧ−７、ヒト正常繊維芽細胞；ＭＣＦ７細胞、ヒト乳がん細胞；Ａ４２７細胞、ヒト肺がん細胞；ＨＴ１０８０細胞、ヒト繊維芽腫；Ｕ２ＯＳ細胞、ヒト骨肉腫；Ａ４３１細胞、ヒト乳がん細胞；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ヒト乳がん細胞；ＰＣ３細胞、ヒト肺がん細胞）（これらの細胞のうち、Ｍｄｍｘに関連するものとしては、ＭＣＦ７細胞、Ａ４２７細胞およびＨＴ１０８０細胞であり、代表的な疾患はがんである）を２×１０４細胞となるように２４穴プレート（ＴＩＧ−７細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に関しては、１０％ウシ胎仔血清（バイオウエスト社）、ストレプトマイシン-ペニシリン（ナカライテスク社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ-アルドリッチ社）、そしてＭＣＦ７細胞、Ａ４２７細胞、Ａ４３１細胞およびＰＣ３細胞に関しては、１０％ウシ胎仔血清（バイオウエスト社）、ストレプトマイシン−ペニシリン（ナカライテスク社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ−アルドリッチ社）を用い、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で行った。）にまき、一晩培養後、各々の濃度のＫ−１７８を添加した。４８時間後、上記クリスタルバイオレット法を用いて、細胞生存率を算出した。
【０１６９】
変異型ｐ５３を持つＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞およびＰＣ３細胞における薬剤のＣＣ５０値は３０μＭ以上であるのに対し、野生型ｐ５３を持つＭＣＦ７細胞、Ａ４２７細胞およびＨＴ１０８０細胞におけるＣＣ５０値はそれぞれ、１８．２μＭ、１８．１μＭ、１４．６μＭであり、野生型ｐ５３を持つがん細胞は、変異型ｐ５３を持つがん細胞に比べ、Ｋ−１７８による細胞増殖抑制効果が高い傾向にあった。
【０１７０】
また、実施例１６のＫ−１７８によるＭＣＦ７細胞における細胞増殖抑制活性のＣＣ５０値の違いは細胞をｓｉＲＮＡで処理していることが原因と推測される。
【０１７１】
Ｍｄｍｘの発現が高く野生型ｐ５３を持つＭＣＦ７細胞やＨＴ１０８０細胞と変異型ｐ５３を持つ細胞を用いて、ここで得られた知見がｉｎ  ｖｉｖｏにおいても再現されるか、Ｋ−１７８およびその類縁体がＭｄｍｘを高発現したがん細胞に対し、抗腫瘍効果を示すのか調べる予定である。
【０１７２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
これまで、Ｍｄｍｘ高発現型がん細胞に対して有効な治療剤がなく、副作用の強い既存の抗がん剤を使用せざるを得なかった。しかし、このたび、Ｍｄｍｘ−ｐ５３相互作用特異的に阻害する低分子化合物を見出したので、有効な治療効果を示す抗がん剤を開発できる見通しを得た。
【図１】
2011178704.tif 000084
【図２】
2011178704.tif 000085
【図３】
2011178704.tif 000086
【図４】
2011178704.tif 000087
【図５】
2011178704.tif 000088