(57)【要約】【課題】熱変性工程を要することなく、２本鎖を形成している試料核酸と２本鎖形成核酸プローブとを効果的に反応させることにより、標的塩基配列を識別する方法の提供。【解決手段】反応液中に、２本鎖を形成している状態の試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとを共存させて、鎖置換反応が生じた程度を測定することにより、前記２本鎖形成試料核酸中の塩基配列と、標的塩基配列との同一性を識別する識別工程を有し、前記２本鎖形成核酸プローブが、標的塩基配列と相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第１プローブと、前記第１プローブと相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第２プローブとからなり、前記第２プローブの塩基長と前記第１プローブの塩基長の比（［第２プローブの塩基長］／［第１プローブの塩基長］）が０．５以上１未満であり、前記反応液の温度が６５℃未満であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列を識別する方法であって、
反応液中に、２本鎖を形成している状態の試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとを共存させて、鎖置換反応が生じた程度を測定することにより、前記試料核酸中の塩基配列と、標的塩基配列との同一性を識別する識別工程を有し、
前記２本鎖形成核酸プローブが、標的塩基配列と相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第１プローブと、前記第１プローブと相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第２プローブとからなり、
前記第２プローブの塩基長と前記第１プローブの塩基長の比（［第２プローブの塩基長］／［第１プローブの塩基長］）が０．５以上１未満であり、
前記反応液の温度が６５℃未満であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法。
【請求項２】
前記反応液の温度が、４０〜６０℃の範囲内であることを特徴とする請求項１記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項３】
前記第１プローブの突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項４】
前記第１プローブ及び前記第２プローブの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長反応の阻害物質により修飾されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項５】
前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一方が、核酸類縁体を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項６】
前記第１プローブ及び前記第２プローブが、互いに異なる種類の標識物質によりそれぞれ標識されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項７】
前記第１プローブ又は第２プローブが、前記部分２本鎖形成核酸プローブ中の２本鎖形成領域において、標識物質により標識されていることを特徴とする請求項６記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項８】
前記第１プローブを標識する標識物質と前記第２プローブを標識する標識物質との間で、エネルギー移動が可能であることを特徴とする請求項６又は７記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項９】
前記第１プローブ及び前記第２プローブのいずれか一方が、固相担体と結合可能な標識物質により標識されていることを特徴とする請求項６又は７記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項１０】
前記試料核酸が、核酸増幅反応により増幅された核酸であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部分２本鎖形成核酸プローブの自発的相互作用による鎖置換反応を利用して、試料に含まれる２本鎖形成核酸が、標的塩基配列を有するか否かを識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの解読、特にＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）地図を作成する国際ハップマッププロジェクトにより、ヒトゲノムに関する情報は増加の一途をたどっている。さらに、得られたゲノム情報と個人の体質との関連を見出し、遺伝子レベルで個人の体質の違いを把握し、個人の特性に応じた病気の診断・治療・予防や薬剤の投与を可能とする「個人の遺伝情報に応じた医療」（オーダーメード医療）の実現をめざした研究が、世界全体で大規模に展開されている。ここでの遺伝子の違いは、個々人のゲノムの塩基配列上での違いを意味し、その主たる違いは一塩基の違い（ＳＮＰ）である。また、最近では、短い塩基配列が繰り返される回数（コピー数）の違い（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＮＶ）も、ゲノム全体に広がっていることがわかり、このＣＮＶの違いと病気との関連性も指摘されている。
【０００３】
近年では、各個人の遺伝子型を調べる遺伝子検査も行われている。遺伝子検査には、各遺伝子型の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を有するプライマーやプローブを用いて、核酸増幅やハイブリダイゼーションの有無を検出する方法がある。一般的には、遺伝子検査に供される核酸は２本鎖形成された核酸であり、このため、プライマーやプローブと試料核酸との間のハイブリダイゼーション反応を効率良く且つ優位に促すために、予め２本鎖形成核酸鎖を１本鎖化する変性処理が行われる。変性処理は、主に熱変性処理と化学変性処理があるが、一般的には熱的手法をとることが多く、大抵は１００℃近い温調操作を行っている。例えば、核酸増幅反応として汎用されているＰＣＲでは、各サイクルに熱変性工程がある。また、等温環境下で核酸増幅反応を行うＬＡＭＰ法やＳＭＡＰ法においても、反応初期段階に、試料核酸を熱処理（９５℃、数分間）しなくてはならない。このように、多くの遺伝子検査において用いられる核酸試薬の反応過程では、熱変性等の変性処理が必須となる。
【０００４】
しかしながら、このような熱処理は、反応工程を煩雑化するばかりか、反応の安定性や再現性等にも大きな影響を来たしている。さらに、熱処理を実行する装置や反応容器には熱的負荷が与えられてしまうため、これらに耐熱機能を付加させなければならないが、耐熱機能を確保するためには、多くの開発の費用、時間を費やすことにもなる。
【０００５】
一方で、核酸鎖分子間の局所的な相互作用を機に広範囲にわたる鎖長間相互作用が誘導される反応形態として、ブランチ・マイグレーションという概念がある。ブランチ・マイグレーションは、遺伝子の組み換えにおいて見られる現象であり、遺伝子の相同組み換え機構を解明すべく、ブランチ・マイグレーションについても解析が進められている（例えば、非特許文献１〜４参照。）。これらの研究においては、主に、２本鎖形成核酸に１本鎖核酸を作用させることにより生じる鎖置換反応を解析する手法が採用されており、核酸が相補的な２本鎖構造を有した状態からブランチ・マイグレーションに転じる反応機構についての議論は含まれていない。
【０００６】
ブランチ・マイグレーションを利用して、標的塩基配列を識別する方法が幾つか開示されている。突出末端を有する２本鎖形成核酸プローブは、溶液中において１本鎖核酸と自発的に相互作用をすることができる。そこで、２本鎖形成核酸プローブを構成する一方の核酸鎖と別の１本鎖核酸とよって新たに２本鎖形成核酸が形成される程度（鎖置換反応の程度）を調べることにより、標的塩基配列を識別する方法が開示されている（例えば、特許文献１〜５及び非特許文献５〜９参照。）。これらの方法では、まず、２本鎖形成状態と、１本鎖状態又は他の１本鎖核酸と新たに２本鎖を形成した状態とで、検出されるシグナルが異なるように、蛍光物質等を用いて２本鎖形成核酸プローブを予め標識しておく。そして、この標識済み２本鎖形成核酸プローブをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のシグナルを検出し、２本鎖形成状態のシグナルと比較することにより、鎖置換反応により新たに２本鎖形成核酸が形成されたかを検出する。標識済み２本鎖形成核酸プローブを、予め１本鎖化した試料核酸と混合した後のシグナルを検出し、２本鎖形成状態のシグナルと比較することによっても、鎖置換反応により新たに２本鎖形成核酸が形成されたかを検出することができる。
【０００７】
これらの方法は、ブランチ・マイグレーションを利用した核酸識別システムであるが、いずれの報告も１本鎖の核酸鎖と２本鎖形成された核酸鎖とを反応させる形態であり、核酸プローブと試料核酸のうち、すくなくともどちらか一方の核酸鎖は、１本鎖として存在できる環境を与えて反応を実行させるシステムとなっている。このため、２本鎖形成核酸プローブと２本鎖形成核酸との間でブランチ・マイグレーションによる鎖置換反応を起こさせる場合には、熱変性工程を必須とするＰＣＲを行うか、若しくは、ＬＡＭＰ法等と同様に、鎖置換反応前に熱処理等による変性工程を設けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／３０９４６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，８０４，３７５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５９３，０９１号明細書
【特許文献４】国際公開第０５／０１２５７１号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０２２７２５７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９２８，８６２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ウェトマ（Wetmur）、クリティカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology）、１９９１年、第２６（３／４）巻、第２２７〜２５９ページ。
【非特許文献２】ビスワス（Biswas）、外２名、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）、１９９８年、第２７９巻、第４号、第７９５〜８０６ページ。
【非特許文献３】レイナルド（Reynaldo）、外３名、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）、２０００年、第２９７巻、第２号、第５１１〜５２０ページ。
【非特許文献４】ネカスノバ（Neschastnova）、外６名、バイオケミストリー（Biochemistry）、２００２年、第４１巻、第７７９５〜７８０１ページ。
【非特許文献５】リ（Li）、外３名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００２年、第３０巻、第２号、第ｅ５ページ。
【非特許文献６】チェン（Cheng）、外２名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００４年、第３２巻、第７号、第ｅ６１ページ。
【非特許文献７】ヒラタ（Hirata）、外４名、ヌクレイック・アシッズ・シンポジウム・シリーズ（Nucleic Acids Symposium Series）、２００４年、第４８巻、第７号、第２６７〜２６８ページ。
【非特許文献８】イシイ（Ishii）、外４名、ヌクレイック・アシッズ・シンポジウム・シリーズ（Nucleic Acids Symposium Series）、２００６年、第５０巻、第７号、第３２５〜３２６ページ。
【非特許文献９】ファン（Huang）、外９名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００７年、第３５巻、第１６号、第ｅ１０１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はこのような状況下、熱変性工程を要することなく、２本鎖を形成している試料核酸と２本鎖形成核酸プローブとを効果的に反応させることにより、標的塩基配列を識別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、突出末端を有する２本鎖形成核酸プローブにおいて、２本鎖形成核酸プローブの全長に対する突出末端領域の鎖長の比を調整することにより、試料核酸と２本鎖形成核酸プローブの双方に対して、予め熱変性処理を行うことなく、鎖置換反応により標的塩基配列を識別できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）  標的塩基配列を識別する方法であって、
反応液中に、２本鎖を形成している状態の試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとを共存させて、鎖置換反応が生じた程度を測定することにより、前記試料核酸中の塩基配列と、標的塩基配列との同一性を識別する識別工程を有し、
前記２本鎖形成核酸プローブが、標的塩基配列と相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第１プローブと、前記第１プローブと相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第２プローブとからなり、
前記第２プローブの塩基長と前記第１プローブの塩基長の比（［第２プローブの塩基長］／［第１プローブの塩基長］）が０．５以上１未満であり、
前記反応液の温度が６５℃未満であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法、
（２）  前記反応液の温度が、４０〜６０℃の範囲内であることを特徴とする前記（１）記載の標的塩基配列の識別方法、
（３）  前記第１プローブの突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％以上であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的塩基配列の識別方法、
（４）  前記第１プローブ及び前記第２プローブの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長反応の阻害物質により修飾されていることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（５）  前記第１プローブ及び前記第２プローブの少なくとも一方が、核酸類縁体を含むことを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（６）  前記第１プローブ及び前記第２プローブが、互いに異なる種類の標識物質によりそれぞれ標識されていることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（７）  前記第１プローブ又は第２プローブが、前記部分２本鎖形成核酸プローブ中の２本鎖形成領域において、標識物質により標識されていることを特徴とする前記（６）記載の標的塩基配列の識別方法、
（８）  前記第１プローブを標識する標識物質と前記第２プローブを標識する標識物質との間で、エネルギー移動が可能であることを特徴とする前記（６）又は（７）記載の標的塩基配列の識別方法、
（９）  前記第１プローブ及び前記第２プローブのいずれか一方が、固相担体と結合可能な標識物質により標識されていることを特徴とする前記（６）又は（７）記載の標的塩基配列の識別方法、
（１０）  前記試料核酸が、核酸増幅反応により増幅された２本鎖形成核酸であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の標的塩基配列の識別方法により、大きな負荷が掛かる熱変性処理を施すことなく、２本鎖形成核酸である試料核酸中の標的塩基配列を高確度且つ高精度に識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の標的塩基配列の識別方法の一態様において、反応液中に存在していると推定される核酸を、熱変性工程を必須とする従来法と比較して模式的に示した図である。
【図２Ａ】実施例１において、平滑末端プローブを含む各反応液に対して、蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図２Ｂ】実施例１において、突出末端プローブを含む各反応液に対して、蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図３】実施例２において、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図４】実施例３において、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図５】実施例３において、反応開始後から８０分経過時点における蛍光強度比と変異遺伝子含有濃度との関係を示した図である。
【図６】実施例４において、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図７Ａ】実施例５において、Ｔｙｐｅ１プローブを含む反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図７Ｂ】実施例５において、Ｔｙｐｅ２プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図７Ｃ】実施例５において、Ｔｙｐｅ３プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図７Ｄ】実施例５において、Ｔｙｐｅ４プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図８Ａ】実施例６において、Ｔｙｐｅ１プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図８Ｂ】実施例６において、Ｔｙｐｅ２プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図８Ｃ】実施例６において、Ｔｙｐｅ３プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図８Ｄ】実施例６において、Ｔｙｐｅ４プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図８Ｅ】実施例６において、Ｔｙｐｅ５プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【図８Ｆ】実施例６において、Ｔｙｐｅ６プローブを含む各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明及び本願明細書において、「標的塩基配列を識別する」とは、識別の対象となる試料核酸が、標的塩基配列を有する核酸であるか否かを識別することを意味する。
【００１６】
本発明の標的塩基配列の識別方法は、部分２本鎖形成核酸プローブと試料核酸との間で起こる鎖置換反応が生じた程度を指標として、標的塩基配列を識別する方法に関する。本発明においては、塩基長の比が特定の範囲である２本の核酸鎖がアニールしてできた突出末端を有する２本鎖形成核酸をプローブとして用いることにより、当該プローブと２本鎖を形成している状態の試料核酸との間に鎖置換反応を起こすことができる。すなわち、試料核酸に対して、予め熱変性等の１本鎖化するための変性処理を施すことなく、プローブの自発的相互作用を用いて、試料核酸中の標的塩基配列と反応させて鎖置換反応を引き起こすことにより、特異的な塩基配列の識別を行うことができる。
【００１７】
本発明において用いられる部分２本鎖形成核酸プローブは、標的塩基配列と相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第１プローブと、前記第１プローブと相補的な塩基配列からなる１本鎖核酸である第２プローブとからなる。第１プローブと第２プローブは、互いに長さ（塩基長）が異なる１本鎖核酸である。当該部分２本鎖形成核酸プローブは、第１プローブの３’末端側が突出末端であってもよく、第１プローブの５’末端側が突出末端であってもよく、第１プローブの両末端が突出末端であってもよい。本発明において用いられる部分２本鎖形成核酸プローブとしては、第１プローブの３’末端側又は両末端が突出末端であることが好ましい。
【００１８】
本発明において用いられる部分２本鎖形成核酸プローブでは、第２プローブの塩基長と第１プローブの塩基長の比（［第２プローブの塩基長］／［第１プローブの塩基長］）は、０．５以上１未満である。第２プローブの塩基長と第１プローブの塩基長の比が大きいほど、標的塩基配列の識別能は高くなるが、自発的鎖置換効率は低くなる傾向がある。逆に、第２プローブの塩基長と第１プローブの塩基長の比が小さくなるほど、標的塩基配列の識別能が低くなるが、自発的鎖置換効率は高くなる傾向がある。第２プローブの塩基長と第１プローブの塩基長の比を上記範囲とすることにより、２本鎖を形成している状態の試料核酸との間で、十分な識別能を発揮しつつ効率よく鎖置換反応を引き起こすことができる。
【００１９】
第２プローブの塩基長と第１プローブの塩基長の比が上記範囲内である限り、第１プローブ及び第２プローブの長さは、特に限定されるものではないが、第２プローブの長さ（すなわち、部分２本鎖形成核酸プローブ中で、第１プローブと第２プローブとが塩基対を形成する領域）が長くなるほど、反応液の温度を高くするか、若しくは反応時間を長くする必要がある。
【００２０】
２本鎖形成核酸プローブでは、突出末端領域の配列種により、自発的相互作用能は影響を受けるため、自発的鎖置換効率を高くするためには、突出末端領域の塩基配列は、試料核酸中の標的塩基配列と安定的に結合できる配列であることが好ましい。本発明において用いられる部分２本鎖形成核酸プローブでは、第１プローブの３’末端側の突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％以上であることが好ましい。突出末端領域におけるＧＣ含有量が高いほど、自発的鎖置換効率が高くなり、試料核酸との鎖置換反応を効率よく行うことができる。
【００２１】
ここで、「部分２本鎖形成核酸プローブ中の突出末端領域」とは、第１プローブ中の、第２プローブと塩基対を形成しない領域を示す。両末端が突出末端である部分２本鎖形成核酸プローブの場合には、各末端の突出末端（１本鎖）領域ごとにそれぞれＧＣ含有量の合計が５０％以上であることがより好ましい。
【００２２】
本発明において、第１プローブ及び第２プローブは、ＤＮＡ鎖であってもよく、ＲＮＡ鎖であってもよく、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ鎖であってもよい。また、核酸類縁体を含むものであってもよい。核酸類縁体を含む核酸鎖とは、核酸鎖を構成する一部又は全てのヌクレオチドとして、ＤＮＡ等の天然の核酸に替えて核酸類縁体が用いられているものを意味する。
【００２３】
本発明及び本願明細書において、核酸類縁体とは、非天然の核酸であり、天然の核酸であるＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものをいう。すなわち、核酸類縁体は、ＤＮＡ等と同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、核酸類縁体を用いて形成されたプライマーやプローブは、天然の核酸のみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、ＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いることができる。このような核酸類縁体として、例えば、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体等がある。ここで、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、ＬＮＡ（ＢＮＡ）は、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つ化合物である。
【００２４】
また、第１プローブと第２プローブは、互いにアニール可能な核酸鎖であればよく、互いの核酸種が異なっていてもよい。例えば、第１プローブと第２プローブが共にＤＮＡ鎖であってもよく、いずれか一方がＤＮＡ鎖であり、他方がＲＮＡ鎖であってもよい。さらに、第１プローブと第２プローブのいずれか一方のみが核酸類縁体を含んでいてもよく、両者が核酸類縁体を含んでいてもよい。
【００２５】
さらに、第１プローブ及び第２プローブを構成する核酸又は核酸類縁体は、修飾されていてもよい。核酸や核酸類縁体の修飾に用いられる物質は、本発明の効果を損なわない限り、特に限定されるものではなく、核酸等の修飾に通常用いられる物質を用いることができる。修飾核酸や修飾核酸類縁体として、例えば、アミノ基、カルボキシビニル基、リン酸基、メチル基等の官能基により修飾された核酸、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾された核酸、ホスホロチオエート化修飾された核酸、蛍光物質等の後述する標識物質により修飾された核酸等が挙げられる。
【００２６】
また、第１プローブと第２プローブの３’末端は、伸長阻害構造をとることが望ましく、それぞれ、ポリメラーゼによる伸長反応の阻害物質により修飾されていてもよい。各プローブの３’末端が阻害物質により修飾されている場合には、反応液中にポリメラーゼが混入している場合でも、第１プローブや第２プローブが伸長反応のプライマーとして消費されることを防止することができる。このため、ＰＣＲ産物を試料核酸とする場合に、精製することなく、ＰＣＲ後の反応液をそのまま試料核酸として反応液に添加することができる。
【００２７】
このような阻害物質として、アミノ基、リン酸基、メチル基、チオール基等が挙げられる。各プローブの３’末端のヌクレオチドが、アミノ化、リン酸化、メチル化、又はチオール化等がなされていることにより、当該プローブを起点とするポリメラーゼによる伸長反応を阻害することができる。
【００２８】
本発明において用いられる第１プローブ及び第２プローブは、核酸増幅反応を利用して調製することもできるが、公知の化学合成によって調製することが好ましい。化学合成法のほうが、標識物質の導入位置等の自由度が高いためである。化学合成法としては、トリエステル法、亜リン酸法等が挙げられる。例えば、液相法又は不溶性の担体を使った固相合成法等を利用した通常の自動合成機（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社３９２等）を使用して１本鎖のＤＮＡを大量に調製し、その後アニーリングを行うことにより２本鎖ＤＮＡを調製することができる。
【００２９】
具体的には、本発明の標的塩基配列の識別方法は、反応液中に、２本鎖を形成している状態の試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとを共存させて、鎖置換反応が生じた程度を測定することにより、前記試料核酸中の塩基配列と、標的塩基配列との同一性を識別する識別工程を有する。
【００３０】
本発明においては、２本鎖を形成している状態の試料核酸を、２本鎖を形成している状態の部分２本鎖形成核酸プローブと反応させる。例えば、反応液に、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブを、２本鎖を形成している状態でそれぞれ添加した後、熱変性処理や化学変性処理を行わずに、反応液の温度を６５℃未満の所望の温度にすることにより、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとを２本鎖を形成している状態のまま鎖置換反応に供することができる。熱変性処理がなされた試料核酸を用いる場合には、反応液に添加する前に、試料核酸のＴｍ値未満の温度（例えば、室温等）で十分な時間置いて２本鎖を形成させた後に鎖置換反応に供する。また、ＰＣＲ産物を試料核酸として用いる場合、ＰＣＲ反応溶液に予め部分２本鎖形成核酸プローブを添加しておき、ＰＣＲ反応終了後、熱変性処理を行わずに、反応液の温度を６５℃未満の所望の温度にして鎖置換反応を行ってもよい。ＰＣＲの最終ステップであるアニーリング工程から、直接鎖置換反応へ移行させることにより、ＰＣＲ産物を、２本鎖を形成している状態のまま鎖置換反応に供することができる。
【００３１】
本発明において用いられる試料核酸は、２本鎖形成核酸であれば特に限定されるものではなく、生物から抽出された核酸であってもよく、核酸増幅反応により増幅された核酸であってもよい。増幅産物が１本鎖核酸である場合には、プライマー伸長反応等により２本鎖化した後に用いることができる。このような核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。
【００３２】
本発明においては、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとを共存させる反応液の温度は、６５℃未満とする。反応液の温度が高すぎると、部分２本鎖形成核酸プローブや試料核酸が解離して１本鎖化し易くなるためである。特に、反応液の温度は、部分２本鎖形成核酸プローブの解離温度以下の温度とすることが好ましい。
【００３３】
鎖置換反応を行う反応液の温度は、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブの両方が２本鎖を形成している状態となる温度であればよいが、部分２本鎖形成核酸プローブの第１プローブの鎖長に応じて、適宜調整することが好ましい。例えば、第１プローブの鎖長が比較的長い部分２本鎖形成核酸プローブを用いる場合には、第１プローブの鎖長が比較的短いものを用いる場合よりも、反応温度を高くすることにより、鎖置換反応を効率よく進行させることができる。具体的には、本発明においては、反応液の温度を４０〜６０℃とすることが好ましい。
【００３４】
反応液には、部分２本鎖形成核酸プローブの自発的相互作用をより効果的に促す作用を有する物質を添加してもよい。このような物質としては、ポリカチオン類が挙げられる。ポリカチオン類は潤滑剤として機能するため、ポリカチオン類の存在下で試料核酸と作用させることにより、部分２本鎖形成核酸プローブの自発的相互作用の高速化が期待される。中でも、親水性側鎖を有するポリカチオンを添加することが好ましい。親水性側鎖を有するポリカチオンとしては、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等のアミノ酸、グルコサミン等の糖、アリルアミン、エチレンイミン等のカチオン性単量体のうち、１種類又は複数種類を重合して得られた重合体や、これらの誘導体を主鎖とし、デキストラン、アミロース、セルロース等の多糖類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル、及びこれらの誘導体を側鎖とする物質が挙げられる。中でも、デキストラン側鎖修飾ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）やデキストラン側鎖修グアニジド化ポリ（Ｌ−リジン）（ＧＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）（例えば、Nucleic Acids Symposium Series (2006) vol.50, p27-28、又はNucleic Acids Symposium Series (2007) vol.51, p339-340参照。）を反応液に添加することが好ましい。
【００３５】
さらに、反応液には、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとの間の相互作用を阻害しない限り、その他の物質を添加することもできる。例えば、反応液のｐＨを調整する緩衝剤や、２本鎖形成に必要な１価あるいは２価の陽イオン、２本鎖形成核酸の安定性に影響を与える有機溶媒等を添加することができる。緩衝剤としては、例えば、トリス塩酸等が挙げられる。陽イオンとしては、例えば、ナトリウムイオンやマグネシウムイオン等が挙げられる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）等が挙げられる。
【００３６】
鎖置換反応の反応時間は、平衡状態に達するのに十分な時間であればよく、標的塩基配列の配列や塩基長、第２プローブの配列や塩基長、反応温度、反応液の組成等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３７】
反応液中に、鎖置換反応により形成された新たな２本鎖形成核酸が十分量存在していた場合には、試料核酸は標的塩基配列を有していると判断する。一方、十分量の新たな２本鎖形成核酸が存在していなかった場合には、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとの間で鎖置換反応が起こらず、試料核酸は標的塩基配列を有していないと判断することができる。なお、本発明において、「鎖置換反応が生じた程度を測定する」とは、反応液に添加した部分２本鎖形成核酸プローブ全体に対する、試料核酸と鎖置換反応を引き起こしたプローブの割合（試料核酸とアニールした第１プローブの割合）を測定することを意味する。
【００３８】
鎖置換反応が生じた程度の測定は、鎖置換反応後（エンドポイント）においてのみ行ってもよく、鎖置換反応中に経時的に（リアルタイムに）行ってもよい。また、鎖置換反応の開始時及び終了時に行い、両者の測定値を比較することにより、試料核酸が標的塩基配列を有しているか否かを識別してもよい。
【００３９】
部分２本鎖形成核酸プローブの第１プローブと第２プローブを予め標識物質により標識しておくことにより、当該標識物質を指標として、鎖置換反応が生じた程度を定量的若しくは半定量的に測定することができる。中でも、第１プローブ及び第２プローブが、互いに異なる種類の標識物質によりそれぞれ標識されていることが好ましい。このように予め標識した場合には、鎖置換反応により形成された２本鎖形成核酸は１種類の標識物質でのみ標識されており、２種類の標識物質により標識されている部分２本鎖形成核酸プローブと区別して検出することができる。
【００４０】
また、２種類の標識物質のうち、いずれかの標識物質を固相単体に結合可能な物質とした場合には、汎用されている固液分離作業を行うことにより、試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとの間で鎖置換反応が生じた程度を測定することができる。例えば、第１プローブ又は第２プローブのいずれか一方のプローブを標識物質Ａで標識し、他方のプローブを固相単体に結合可能な標識物質Ｂで標識し、鎖置換反応後の反応液を、標識物質Ｂが結合可能な固相単体に接触させる。その後、当該固相担体に結合している２本鎖形成核酸中の標識物質Ａを検出する。鎖置換反応が起こった場合には、固相担体に結合している２本鎖形成核酸中の標識物質Ａにより標識されている２本鎖形成核酸の割合が減少する。
【００４１】
標識物質としては、非放射性、放射性物質のどちらを用いてもよいが、好ましくは非放射性物質が用いられる。非放射性の標識物質としては、直接標識可能なものとして蛍光物質［例えばフルオレッセイン誘導体（フルオレッセインイソチオシアネート等）、ローダミン及びその誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシアネート等）］、化学発光物質（例えばアクリジン等）等が挙げられる。また、標識物質と特異的に結合する物質を利用することにより、間接的に標識物質を検出することができる。このような標識物質としては、ビオチン、リガンド、特定の核酸あるいはタンパク質ハプテン等が挙げられる。そして、標識物質と特異的に結合する物質としては、ビオチンの場合にはこれに特異的に結合するアビジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場合はこれに特異的に結合する抗体が、リガンドの場合はレセプターが、特定の核酸あるいはタンパク質の場合はこれと特異的に結合する核酸、核酸結合タンパク質あるいは特定のタンパク質と親和性のあるタンパク質等が利用できる。 上記ハプテンとしては２，４−ジニトロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンを使うことができ、更にはビオチンあるいは蛍光物質等もハプテンとして使用することができる。これらの標識物質は、いずれも単独又は必要があれば複数種の組み合わせで公知の手段（特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−１４８７９８号公報、特開昭５９−２０４２００号公報参照。）により、導入することができる。
【００４２】
特に、本発明においては、互いにエネルギー移動可能な２種類の標識物質（例えば、励起により蛍光を発生するドナー標識物質と、その蛍光を吸収するアクセプター標識物質）を用いて、これらの標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを指標として、鎖置換反応が生じた程度を測定することが好ましい。
【００４３】
標識物質間のエネルギー移動とは、エネルギーを発生するドナー標識物質とこのドナー標識物質から発生したエネルギーを吸収するアクセプター標識物質との少なくとも２種の標識物質が、互いに近接した状態にある場合に、ドナー標識物質からアクセプター標識物質へのエネルギーの移動をいう。例えば、２種の標識物質が蛍光物質である場合、ドナー標識物質を励起して生じる蛍光をアクセプター標識物質が吸収し、このアクセプター標識物質が発する蛍光を測定するか、又はドナー標識物質を励起して生じる蛍光をアクセプター標識物質が吸収することにより起こるドナー標識物質の消光を測定することができる（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４，３５７−３６２（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４９−５３（１９９８））。なお、ドナー標識物質の蛍光波長とアクセプター標識物質の吸収波長に重なりがなくてもエネルギー移動が起こる場合があるが、このようなエネルギー移動も本発明に含まれるものである。また、アクセプター標識物質は消光物質であってもよい。このようなくクエンチャーとして、例えばＤＡＢＣＹＬやブラックホール等が挙げられる。
【００４４】
互いにエネルギー移動可能な２種類の標識物質としては、互いに近接した状態でエネルギー移動可能なものであれば特に制限されないが、中でも蛍光物質、遅延蛍光物質が好ましく、場合によっては化学発光物質、生物発光物質等を用いることもできる。このような標識物質の組み合せとしては、フルオレセイン及びその誘導体（例えばフルオレセインイソチオシアネート等）とローダミン及びその誘導体（例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネート、テトラメチルローダミン−５−（ａｎｄ−６−）ヘキサノイックアシッド等）との組み合わせ、フルオレセインとＤＡＢＣＹＬとの組み合わせ等が挙げられ、これらの中から任意の組み合わせを選択することができる（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。その他、近接させた場合に熱エネルギーの放出が生じる組み合わせの分子であってもよい。このような標識物質の組み合わせとしては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ  ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ  ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１とＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２との組み合わせ等が挙げられる。
なお、グアニンは、ＦＡＭが近接した場合にクエンチする能力があるため(Nucleic acids Research 2002,vol.30.no.9 2089-2195)、これを利用してもよい。例えば、第１プローブの５’末端が平滑末端であり、３’末端が突出末端である部分２本鎖形成核酸プローブにおいては、第１プローブの５’末端をＦＡＭで標識した場合に、第２プローブの３’末端の塩基がグアニンである場合には、当該第２プローブを標識物質で標識せずともよい。
【００４５】
第１プローブ又は第２プローブに標識物質を導入する方法としては、一般的な核酸への標識導入方法を採用することができる。例えば、標識物質を核酸に直接化学的に導入する方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４，４８４−４８９（１９９８））、ＤＮＡポリメラーゼ反応あるいはＲＮＡポリメラーゼ反応により標識物質結合モノヌクレオチドを導入する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６−３３４１（１９８７））、標識物質を導入したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより導入する方法（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２，３４−４０（１９９２））等が挙げられる。
【００４６】
第１プローブ又は第２プローブに標識物質を導入する際には、各プローブと標識物質とを、リンカーを介して結合させてもよい。当該リンカーとしては、核酸の標識の際に一般的に用いられるリンカーの中から適宜選択して用いることができる。このようなリンカーとしては、例えば、１〜５塩基のオリゴヌクレオチド等が挙げられる。なお、リンカーとしてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、第１プローブのリンカーと第２プローブのリンカーとを、同一の塩基配列としてもよく、互いに相補的な塩基配列としてもよく、ランダムな塩基配列としてもよい。
【００４７】
部分２本鎖形成核酸プローブ中の突出末端領域を標識物質等で修飾した場合には、部分２本鎖形成核酸プローブの試料核酸に対する自発的相互作用能が低下する傾向がある。よって、第１プローブ又は第２プローブに標識物質を導入する位置は、両プローブが塩基対を形成する領域、すなわち、部分２本鎖形成核酸プローブ中の２本鎖形成領域であることが好ましい。特に、部分２本鎖形成核酸プローブが平滑末端を有する場合には、第１プローブ及び第２プローブの平滑末端部位に標識物質を導入することが好ましい。例えば、第１プローブ及び第２プローブを、互いにエネルギー移動可能な標識物質でそれぞれ標識する場合には、両者がアニールしている場合（部分２本鎖形成核酸プローブの場合）にはエネルギー移動が生じる位置に標識することが必要である。両プローブの平滑末端部位にそれぞれ標識物質を導入することにより、部分２本鎖形成核酸プローブでエネルギー移動を起こすことができる。
【００４８】
本発明の標的塩基配列の識別方法では、試料核酸を予め変性して１本鎖化する高温処理過程を行わない。このため、遺伝子検出を本発明の標的塩基配列の識別方法によって行うことにより、検出反応やその検出装置システムを簡素化、簡便化することが可能となる。また、検出装置システム等の開発に費やされる費用、時間を削減でき、さらに、検出反応の安定性及び再現性についての改善も併せて期待される。
【００４９】
特に、後記実施例２等で示すように、本発明の標的塩基配列の識別方法は、試料核酸を予め１本鎖化した後に部分２本鎖形成核酸プローブの自発的相互作用により鎖置換反応を行う従来法よりも、塩基配列の識別性能に優れている。つまり、本発明の標的塩基配列の識別方法は、２本鎖を形成している状態の試料核酸中の標的塩基配列を、煩雑な操作なしに低ノイズレベルで検出することができる。部分２本鎖形成核酸プローブを用いて標的塩基配列を識別する際に、熱変性工程を行わないことにより、既存の熱変性システムを用いた核酸識別法よりも塩基配列の識別性能を改善し得ることは、本発明者によって初めて見出された知見である。
【００５０】
本発明の標的塩基配列の識別方法が優れた識別性能を有する理由は明らかではないが、以下に示す反応機構のためではないかと推察される。図１は、本発明の標的塩基配列の識別方法の一態様において、反応液中に存在していると推定される核酸を、熱変性工程を必須とする従来法と比較して模式的に示した図である。上段（「変温反応ＤＳＰ」）が熱変性工程後に反応液の温度を降下させてハイブリダイゼーションを行う従来法を示し、下段（「等温反応ＤＳＰ」）が熱変性工程を行わずに６５℃未満の温度で鎖置換反応を行う本発明の方法を示す。図中、「Ｔ１」及び「Ｔ２」は試料核酸を構成する各核酸鎖を示し、「Ｐ１」は第１プローブを示し、「Ｐ２」は第２プローブを示す。「Ｐ１」は、「Ｔ１」の部分領域と相補的な塩基配列からなる。
【００５１】
熱変性処理を施した従来法では、反応液中の核酸は、元の試料核酸（Ａ）、第１プローブと第２プローブがアニールしている部分２本鎖形成核酸プローブ（Ｂ）、元の試料核酸と部分２本鎖形成核酸プローブとの間で鎖が組み換えられて新たに形成された２種類の２本鎖形成核酸（Ｃ）の３通りのハイブリダイゼーション・グループに分けることができる。反応液中では、１本鎖化された試料核酸と、同じく１本鎖化された部分２本鎖形成核酸プローブとの間において、非競争的なハイブリダイゼーションが進行し、塩基配列特異的なハブリダイゼーションが難しくなることが予想される。
【００５２】
これに対して、熱変性処理を施さない本発明の方法では、非競争的なハイブリダイゼーション環境は存在せず、元の試料核酸（Ａ）、部分２本鎖形成核酸プローブ（Ｂ）、自発的相互作用により、第１プローブが元の試料核酸の「Ｔ１」とアニールしたもの（Ｃ）が存在する。このように、非競争的なハイブリダイゼーションではなく、部分２本鎖形成核酸プローブと試料核酸との間の自発的相互作用による配列特異的な反応が進行することとなり、結果的に、より厳密な識別が行われることになると考えられる。
【００５３】
本発明の識別方法は、標的塩基配列の識別性能に優れているため、遺伝子変異の識別に好適に用いることができる。具体的には、遺伝子変異の変異部位を含む領域の塩基配列を標的塩基配列とする。この際、標的塩基配列は、第１プローブ中の変異部位を認識する部位が、第２プローブとアニールした際に塩基対を形成する領域に設けられるように設計してもよく、第２プローブとアニールした際に１本鎖となる領域（突出末端領域）に設けられるように設計してもよい。
【００５４】
なお、本発明において遺伝子変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違を意味し、変異部位とは、塩基配列中の相違する部位を意味する。具体的には、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されていることにより、塩基配列の相違は生じる。このような遺伝子変異として、例えば、ＳＮＰやＣＮＶ多型等が挙げられる。また、本発明において遺伝子変異とは、ＳＮＰ等の遺伝子多型のような先天的な変異に加えて、同一個体中の細胞間において存在する遺伝子の塩基配列の相違である体細胞変異等のように後天的な変異も含む。
【００５５】
本発明の識別方法において、標的となる遺伝子変異としては、がん関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、薬剤の代謝や効き目に関する遺伝子、ウィルス遺伝子、及び細菌遺伝子における変異と呼ばれるものである。がん関連遺伝子としては、例えばｋ−ｒａｓ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、又はＡＰＣ遺伝子等が挙げられる。遺伝病に関連する遺伝子としては、各種先天性代謝異常症等との関連が報告されている遺伝子等が挙げられる。薬剤の代謝に関しては薬剤の代謝に関わる酵素であるシトクロムＰ４５０やトランスポーター等の遺伝子が挙げられる。ウィルス遺伝子、細菌遺伝子としては、例えばＣ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス等の遺伝子が挙げられる。さらに、病気等の原因とは必ずしも直接は関係のないヒト白血球抗原遺伝子であるＨＬＡ等も移植の適合性や薬の副作用等と関連して重要である。さらに、ミトコンドリアにコードされている遺伝子変異も病気との関連が示唆されており、これらの遺伝子の変異も標的となりうる。
【００５６】
本発明の識別方法は、その高い識別精度及び簡便性から、臨床検査等においても有用である。医療現場における遺伝子検査の実用性を考えた場合に、測定工程の簡略化は非常に重要である。本発明の識別方法により、ＳＮＰ等の生殖細胞変異のみならず、体細胞変異も高精度にかつ簡便に識別することができる。
【００５７】
例えば、Ｋ−ｒａｓはシグナル伝達系のタンパク質であり、プロトオンコ―ジーンである。多くのがん細胞においてＫ−ｒａｓ遺伝子に変異が生じていることが報告されている。特にＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２、１３にアミノ酸置換を伴う変異が顕著に見られ、１３種類の変異パターンが存在することが知られている。最近、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に変異がある患者では、抗がん剤であるＥＧＦＲ抗体薬(セツキシマブ、パニツムマブ)等が効力を発揮できないことが次々に明らかとなっている。このような抗がん剤治療は副作用のみならず高額な費用を要する。したがって、治療前にＫ−ｒａｓ変異の検査を行い、効く患者のみを選別して治療することがオーダーメード医療の一環として提案されている。
【００５８】
また、ＥＧＦＲ抗体薬であるセツキシマブは、大腸がん治療薬として使用されている。大腸がんの年間罹患数は１０万人弱であり、平成１７年の死亡者数は４万８００人であった。食生活の欧米化により増え続ける傾向にあり、４年後には４０，０００人の大腸がん患者がＥＧＦＲ抗体薬治療の対象となるとのＥＧＦＲ抗体薬のメーカーによる試算もある。当該試算が正しければ、Ｋ−ｒａｓの検査市場は日本国内だけで４年後には４億円を越すものと予想される。
【００５９】
しかしながら、従来の識別法では、体細胞変異を十分な精度で迅速に識別することは困難であり、擬陽性が多い、と言う問題があった。本発明の識別方法は、体細胞変異をも非常に精度よく迅速に識別可能であることから、臨床検査における精度改善のみならず、医療費の削減にも資することが期待できる。
【００６０】
また、本発明の標的塩基配列の識別方法は、部分２本鎖形成核酸プローブを直接細胞や生体内に導入することにより、生体内の試料核酸中の標的塩基配列を識別することも可能である。例えば、第１プローブ及び第２プローブを、生物体外からも検出可能な標識物質によって予め修飾処理しておくことにより、生体内において鎖置換反応が生じた程度をインビボで測定することができる。
【００６１】
その他、本発明の標的塩基配列の識別方法において用いられる部分２本鎖形成核酸プローブを、直接生物体内に導入して、標的塩基配列を有する２本鎖形成核酸と自発的相互反応させることにより、当該２本鎖形成核酸が有する機能を任意阻害させることも可能である。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、少なくとも一方の末端が突出端である２本鎖形成プローブ（本発明において用いる部分２本鎖形成核酸プローブを含む）を突出末端プローブ、両末端が平滑端である２本鎖形成プローブを平滑末端プローブという。また、実施例で用いられる各プローブ及び核酸鎖は、特段の記載が無い限り、常法の化学合成法により調製した。
【００６３】
［実施例１］
突出末端プローブと標的塩基配列を有する２本鎖形成核酸との自発的相互作用の検討を行った。
具体的には、遺伝子変異の変異部位を含む領域を標的塩基配列とし、反応液中に、正常型を検出する突出末端プローブと、正常型アレル又は変異型アレルの塩基配列からなる２本鎖形成核酸（オリゴＤＮＡ：４９ｂｐ）とを共存させ、鎖置換反応が生じた程度を測定した。対照として、平滑末端プローブを用いて同様に測定した。
突出末端プローブは、正常型のアレルと相補的な塩基配列からなり、５’末端が蛍光物質Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によって修飾されており、かつ３’末端がアミノ基で修飾されているＤＰＳ−Ｗ２５−１プローブ（本発明の第１プローブに相当）と、ＤＰＳ−Ｗ２５−１プローブと相補的な塩基配列からなり、３’末端が消光物質Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １によって修飾されているＤＰＳ−Ｗ２１−２プローブを突出末端プローブ（本発明の第２プローブに相当）とにより形成した。この突出末端プローブは、ＤＰＳ−Ｗ２５−１プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％である。また、平滑末端プローブは、ＤＰＳ−Ｗ２５−１プローブと相補的な塩基配列からなり、３’末端が消光物質Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １によって修飾されているＤＰＳ−Ｗ２５−２プローブと、ＤＰＳ−Ｗ２５−１プローブとにより形成した。
各プローブ、並びに正常型アレル及び変異型アレルの２本鎖形成核酸を構成する各核酸鎖の塩基配列を表１に示す。表１中、「Ａｌｅ４８８」はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識を示し、「ＢＨＱ１」はＢｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １標識を示し、「ｗＴ４９」及び「ｒｃ−ｗＴ４９」は、正常型アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示し、「ｍＴ４９」及び「ｒｃ−ｍＴ４９」は、変異型アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示し、右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を示す。また、各塩基配列中、下線が付されている塩基が、変異部位である。
【００６４】
【表１】
2011206017.tif 000002
【００６５】
まず、表２に記載の組成に従って、Ｓｏｌ．Ａ１（平滑末端プローブ溶液）とＳｏｌ．Ａ２（突出末端プローブ溶液）とをそれぞれ室温下にて調製し、１５分間放置した。表２及び３に記載の１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒと２．５ｍＭ  ｅａｃｈ ｄＮＴＰは、それぞれ、Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ社製）に付属のバッファ溶液及びｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを用いた。また、表２に記載の「Ａｌｅ５９４ ｓｅ ｄｙｅ」は、蛍光物質Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を意味する。この蛍光物質は、蛍光強度の測定におけるウェル間の測定誤差を補正するために添加した。
【００６６】
【表２】
2011206017.tif 000003
【００６７】
また、Ｓｏｌ．Ａ１等とは別に、表３に記載の組成に従って各種溶液（Ｓｏｌ．Ｂ１〜８）を調製した。表３中、「ＮＴＣ」は、２本鎖形成核酸が含まれないネガティブコントロールである。また、「Ｗｔ」は正常型のジェノタイプを、「Ｈｔ」は変異ヘテロ型のジェノタイプを、「Ｍｔ」は変異ホモ型のジェノタイプを、それぞれ想定して調製された２本鎖形成核酸溶液である。
【００６８】
【表３】
2011206017.tif 000004
【００６９】
次に、Ｓｏｌ．Ａ１を等量（２０μＬ）ずつ、Ｓｏｌ．Ｂ１〜４に添加し、総量４０μＬの反応溶液を調製した。同様に、Ｓｏｌ．Ａ２を等量（２０μＬ）ずつ、Ｓｏｌ．Ｂ５〜８に添加し、総量４０μＬの反応溶液を調製した。これらの反応溶液は、調製後直ちに蛍光検出装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、まず、昇温速度２０℃／秒で４０℃にして５０分間保持した後（温調領域Ａ）、昇温速度２０℃／秒で９５℃まで上昇させて３０秒間保持し（温調領域Ｂ）、その後降温速度０．１℃／秒で４０℃に下げて３０秒間保持する（温調領域Ｃ）という温調条件にて、蛍光経時測定を行った。なお、蛍光検出装置による測定は、励起波長を４７０ｎｍ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光測光波長を５２０ｎｍ（ｇａｉｎ １）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒの蛍光測光波長を６４０ｎｍ（ｇａｉｎ １）として行った。
【００７０】
図２は、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。図２Ａが平滑末端プローブを含む反応液の結果を、図２Ｂが突出末端プローブを含む反応液の結果を示す。また、図中、「ＮＴＣ」、「Ｗｔ」、「Ｈｔ」、「Ｍｔ」は、表３と同様に、それぞれ、反応液に添加した２本鎖形成核酸溶液（Ｓｏｌ．Ｂ）の種類を示す。図中、Ｙ軸は、プローブの片側に修飾されたＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光（Ｆ１）と、ウェル間差補正を目的として添加されたＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４の蛍光（Ｆ２）との強度比（Ｆ１／Ｆ２）を示す。Ｆ１／Ｆ２が高くなるほど、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８に対するＢｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １によるクエンチング効果が低下していることを示す。つまり、この強度比をモニタリングすることによって、２本鎖形成核酸プローブと２本鎖形成核酸間の相互作用の様子を示唆することができる。
【００７１】
平滑末端プローブでは、温調領域Ａ（４０℃等温環境）において、いずれのジェノタイプの２本鎖形成核酸に対しても蛍光強度比に変化は認められなかった。一方、突出末端プローブでは、変異ホモ型（Ｍｔ）は、２本鎖形成核酸が含まれないネガティブコントロール（ＮＴＣ）と同様に蛍光強度比に変化は認められなかったのに対して、正常型（Ｗｔ）及び変異ヘテロ型（Ｈｔ）において顕著な強度比変化が現れた。特に、正常型（Ｗｔ）では、変異ヘテロ型（Ｈｔ）のおよそ２倍の強度比増加を認めた。このことから、突出末端プローブは、等温環境下にあっても、２本鎖形成核酸と相互作用することが分かり、塩基配列特異的に反応が促進され、ジェノタイピング能をも有することも明らかとなった。
【００７２】
温調領域Ｂの熱変性処理後に、温調領域Ｃのリハイブリダイゼーションを行うことにより、プローブ配列特異的に標的塩基配列を有する核酸とプローブとをハイブリダイゼーションさせることが可能である。温調領域Ｃにおいては、平滑末端プローブでも２本鎖形成核酸のジェノタイプに応じた蛍光強度比（ジェノタイピング能）を確認することができた。しかしながら、温調領域Ｂの蛍光強度比の最大値を鑑みると、熱変性処理後の反応効率は決して高いものではないことがうかがえる。これは、比較的長鎖の２本鎖形成核酸が１本鎖化されて得られた核酸鎖と、比較的短鎖のプローブとの競争的ハイブリダイゼーションにおいて、Ｔｍの高い長鎖の核酸鎖同士が優位にハイブリダイゼーションした結果と考えられる。
【００７３】
これに対して、突出末端プローブでは、温調領域Ｃにおいて、極めて高い反応効率のジェノタイピング能を認めることができた。ここで驚くべきことは、温調領域Ａにおける自発的ジェノタイピング能が、温調領域Ｃのジェノタイピング能に匹敵する高効率で反応していた点である。
【００７４】
［実施例２］
突出末端プローブの自発的相互作用による核酸配列検出精度の検討を行った。
突出末端プローブは、ＤＰＳ−Ｗ２５−１プローブを、５塩基のポリＡ配列を介して蛍光物質Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によって修飾されるようにし、かつ３’末端のアミノ基の修飾を外したＤＰＳ−Ｗ２１＋５Ａプローブと、ＤＰＳ−Ｗ２１−２プローブを、５塩基のポリＡ配列を介して消光物質Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １によって修飾されるようにしたＤＰＳ−Ｗ２１＋５Ａプローブとにより形成した。ＤＰＳ−Ｗ２１＋５Ａプローブ及びＤＰＳ−Ｗ２１＋５Ａプローブの塩基配列を表４に示す。表４中、「Ａｌｅ４８８」、「ＢＨＱ１」、及び右欄の数字は表１と同じである。
【００７５】
【表４】
2011206017.tif 000005
【００７６】
具体的には、まず、表５に記載の組成に従って各種溶液（Ｓｏｌ．Ａ１〜３）を室温下にて調製し、１５分間放置した。また、Ｓｏｌ．Ａとは別に、表６に記載の組成に従って各種溶液（Ｓｏｌ．Ｂ１〜３）を調製した。Ｓｏｌ．Ｂ１は２本鎖形成核酸が含まれないネガティブコントロールであり、Ｓｏｌ．Ｂ２は突出末端プローブとマッチしている正常型のジェノタイプを、Ｓｏｌ．Ｂ３は突出末端プローブとミスマッチの変異ホモ型のジェノタイプを、それぞれ想定して調製された２本鎖形成核酸溶液である。なお、表５及び６中、「１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ」、「Ａｌｅ５９４ ｓｅ ｄｙｅ」、「ｗＴ４９」、「ｒｃ−ｗＴ４９」、「ｍＴ４９」、及び「ｒｃ−ｍＴ４９」は、表２及び３と同じである。
【００７７】
【表５】
2011206017.tif 000006
【００７８】
【表６】
2011206017.tif 000007
【００７９】
次に、Ｓｏｌ．Ａ１〜３をＳｏｌ．Ｂ１〜３にそれぞれ添加し、総量２０μＬの反応溶液を調製した。これらの反応溶液は、調製後直ちに蛍光検出装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、まず、昇温速度２０℃／秒で４０℃にして２０分間保持した後（温調領域Ａ）、昇温速度２０℃／秒で５５℃にして２０分間保持し（温調領域Ｂ）、さらに昇温速度２０℃／秒で９５℃まで上昇させて３０秒間保持し（温調領域Ｃ）、その後降温速度２０℃／秒で４０℃にまで下げて２０分間保持する（温調領域Ｄ）という温調条件にて、蛍光経時測定を行った。なお、蛍光検出装置による測定は、励起波長を４７０ｎｍ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光測光波長を５２０ｎｍ（ｇａｉｎ １）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒの蛍光測光波長を６４０ｎｍ（ｇａｉｎ １５）として行った。
【００８０】
図３は、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。この結果、温調領域ＡにおけるＳ／Ｎ比は１２であり、温調領域ＢにおけるＳ／Ｎ比は１１であり、温調領域ＤにおけるＳ／Ｎ比は３であった。これらの結果から、部分２本鎖形成核酸プローブは、試料核酸を９５℃等で熱変性処理して１本鎖化した後に相互作用させる場合（温調領域Ｄ）よりも、変性処理を施さずに２本鎖を形成した状態の試料核酸と相互作用させたほうが（温調領域Ａ及びＢ）、より高いＳ／Ｎ比で標的塩基配列を識別できることが明らかとなった。
【００８１】
［実施例３］
突出末端プローブの自発的相互作用による標的核酸の定量検出の検討を行った。
具体的には、ゲノムＤＮＡが正常型であるｃｅｌｌ ｌｉｎｅ及びゲノムＤＮＡが変異型であるｃｅｌｌ ｌｉｎｅから、それぞれゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、正常型の２本鎖形成核酸と変異型の２本鎖形成核酸との含有費が異なる複数の試料核酸溶液を調製し、これらの試料核酸溶液と正常型を検出する突出末端プローブとを用いて、鎖置換反応が生じた程度を測定した。正常型としてＮＡ１７２４７  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを、変異型としてＮＡ１７２２２  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを、それぞれ用いた。なお、各ｃｅｌｌ ｌｉｎｅは、Ｃｏｒｉｅｌｌ細胞バンクから入手した。
【００８２】
まず、表７に記載の組成となるよう、各ＰＣＲ溶液を調製した。表７中、「ＮＡ１７２４７（Ｗ）  １００％」は、ＰＣＲ溶液中に含まれているゲノムＤＮＡは全てＮＡ１７２４７由来のゲノムＤＮＡであることを意味し、「ＮＡ１７２２２（Ｍ）  １００％」は、ＰＣＲ溶液中に含まれているゲノムＤＮＡは全てＮＡ１７２４７由来のゲノムＤＮＡであることを意味し、「ＮＡ１７２４７（Ｗ）／２２２（Ｍ）  Ｘ％」は、ＰＣＲ溶液中に含まれているゲノムＤＮＡのうち、ＮＡ１７２４７由来のゲノムＤＮＡがＸ％含まれていることを意味する。また、表７中、「１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ」及び「２．５ｍＭ  ｅａｃｈ ｄＮＴＰ」は表２と同様である。さらに、「Ｈｓ  Ｔａｑ  ＴＡＫＡＲＡ」は、Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ社製）に付属のＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを示す。
【００８３】
【表７】
2011206017.tif 000008
【００８４】
調製されたＰＣＲ溶液をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃３分間の処理後、９５℃（３０秒間）→６８℃（３０秒間）を１サイクルとして、これを４５サイクル行った。なお、ＰＣＲ中の昇温速度及び降温速度は、いずれも２０℃／秒とした。Ｆ３３プライマー及びＲ３０プライマーの塩基配列を表８に示す。表８中、右欄の数字は表１と同じである。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、正常型遺伝子配列領域と変異型遺伝子配列領域の双方のＰＣＲ産物（１９７ｂｐ）が、異なる量比で含まれる２本鎖形成核酸溶液が得られる。
【００８５】
【表８】
2011206017.tif 000009
【００８６】
ＰＣＲとは別に、表９に記載の組成に従ってＳｏｌ．Ａ（突出末端プローブ溶液）を室温下にて調製し、１５分間放置した。表９中の「ＤＰＳ−Ｗ２５−１」及び「ＤＰＳ−Ｗ２１−２」は、表２と同じである。
【００８７】
【表９】
2011206017.tif 000010
【００８８】
次いで、ＰＣＲ反応後の各ＰＣＲ溶液に、Ｓｏｌ．Ａをそれぞれ１．５μＬずつ分注混合して反応液を調製した。これらの反応溶液は、調製後直ちに蛍光検出装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、まず、昇温速度２０℃／秒で４０℃にして４０分間保持し（温調領域Ａ）、次いで昇温速度２０℃／秒で５０℃にして４０分間保持し（温調領域Ｂ）、さらに昇温速度２０℃／秒で６０℃にして４０分間保持した後（温調領域Ｃ）、昇温速度２０℃／秒で９５℃まで上昇させて３０秒間保持し（温調領域Ｄ）、その後降温速度０．１℃／秒で４０℃に下げて３０秒間保持する（温調領域Ｅ）という温調条件にて、蛍光経時測定を行った。なお、蛍光検出装置による測定は、励起波長を４７０ｎｍ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光測光波長を５２０ｎｍ（ｇａｉｎ １００）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒの蛍光測光波長を６４０ｎｍ（ｇａｉｎ １００）として行った。
【００８９】
図４は、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。この結果、温調領域ＡからＢにかけて、及び温調領域Ｂの経時過程において、蛍光強度比が減少するものと、増加するものとの両者が観察された。ただし、温調領域Ａ〜Ｃでは、平衡に達した時点では、正常型遺伝子の含有量順位に相関した蛍光強度比を示した（正常型配列塩基の含有量が低いものほど蛍光強度比が低かった）。また、温調領域ＤからＥにかけては、リハイブリダイゼーションによるジェノタイピングを示しているが、この温調領域でも正常型配列塩基の含有量に依存した蛍光強度比を確認することができた。温調領域Ｅの結果は、先の温調領域Ｂの蛍光強度比パターンと類似していた。これらの結果から、試料核酸としてＰＣＲ産物を用いた場合でも、２本鎖形成核酸プローブの自発的相互作用による鎖置換反応を利用して標的塩基配列を識別できることが明らかとなった。
【００９０】
温調領域Ｂの経時ポイント一点（サンプリングポイント：反応開始後から８０分経過時点）における蛍光強度比と変異遺伝子含有濃度との関係を図５に示した。この結果、Ｒ二乗値が０.９９９３となる高い相関性が得られ、２本鎖形成核酸プローブと２本鎖を形成している状態の試料核酸との相互作用が、高い定量性を示すことが明らかとなった。
【００９１】
［実施例４］
突出末端プローブを用いたゲノムＤＮＡのジェノタイピングの検討を行った。具体的には、ゲノムＤＮＡの増幅反応の反応溶液中に予め突出末端プローブを添加しておき、ゲノムＤＮＡのジェノタイピングをホモジーニアスな系で試みた。
ゲノムＤＮＡは、実施例３で用いたＮＡ１７２４７  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（正常型）及びＮＡ１７２２２  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（変異型）に加えて、ＮＡ１７２０４  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（正常型）、ＮＡ１７２５２  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（変異へテロ型）、及びＮＡ１７２６６  ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（変異へテロ型）から抽出されたＤＮＡを用いた。各ｃｅｌｌ ｌｉｎｅはＣｏｒｉｅｌｌ細胞バンクから入手した。
【００９２】
まず、表１０に記載の組成となるよう、各ＰＣＲ溶液を調製した。表１０中の「ＤＰＳ−Ｗ２５−１」及び「ＤＰＳ−Ｗ２１−２」は表２と同じであり、「Ｆ３３」及び「Ｒ３０」は表９と同じである。調製されたＰＣＲ溶液をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、実施例３と同じ条件でＰＣＲを実行し（温調領域Ａ）、引き続き降温速度４℃／秒で４０℃まで下げて１０分間保持し（温調領域Ｂ）、次いで昇温速度４℃／秒で４５℃にして１０分間保持し（温調領域Ｃ）、さらに昇温速度４℃／秒で５０℃にして１０分間保持し（温調領域Ｄ）、最後に昇温速度４℃／秒で５５℃にして１０分間保持した（温調領域Ｅ）。温調領域Ａ〜Ｅの全工程において、蛍光経時測定を行った。蛍光検出装置による測定は、励起波長を４７０ｎｍ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光測光波長を５２０ｎｍ（ｇａｉｎ １５）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒの蛍光測光波長を６４０ｎｍ（ｇａｉｎ １５）として行った。
【００９３】
【表１０】
2011206017.tif 000011
【００９４】
図６は、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。ＰＣＲ終了直後（温調領域Ａの直後）には、ＰＣＲ産物（本発明の試料核酸に相当）は二本鎖形成の状態であり、その後等温環境を維持し（温調領域Ｂ）、予め内在させておいた突出末端プローブの自発的相互作用を利用してジェノタイピングを試みたものである。この結果、ＰＣＲ後の温調領域ＢからＥに移行する過程で、突出末端プローブは、正常型遺伝子（ＮＡ１７２０４、ＮＡ１７２４７）では高い蛍光強度比を示し、変異へテロ型遺伝子（ＮＡ１７２５２、ＮＡ１７２６６）では正常型と変異ホモ型の蛍光強度比の中間値を示した。特に、温調領域Ｄ（５０℃）においては、ジェノタイプごとに蛍光強度比が収束する傾向にあり、突出末端プローブの高いジェノタイピング能を確認することができた。
なお、温調領域Ａにおいて、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含まないＮＴＣ１（ネガティブコントロール１）とゲノムＤＮＡを含まないＮＴＣ２（ネガティブコントロール２）の間で、蛍光強度比の顕著な差異が認められたが、これはポリメラーゼ酵素の存在有無に起因することが分かっている。
【００９５】
［実施例５］
突出末端プローブの突出末端領域におけるＧＣ含有量と自発的相互作用の検討を行った。
具体的には、正常型（Ｇ１２Ｇ）と２種類の変異型（Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ）を有する実施例１で検出した遺伝子変異とは異なる種類の遺伝子変異の変異部位を含む領域を標的塩基配列とし、反応液中に、正常型を検出する突出末端プローブと、各遺伝子型のアレルの塩基配列からなる２本鎖形成核酸（オリゴＤＮＡ：５４ｂｐ）とを共存させ、鎖置換反応が生じた程度を測定した。
【００９６】
突出末端プローブとしては、Ｔｙｐｅ１〜４の４種類を用いた。
Ｔｙｐｅ１プローブは、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５プローブとＧ１２Ｇ／ＳＰ２１プローブとにより形成され、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％である。
Ｔｙｐｅ２プローブは、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５プローブとＧ１２Ｇ／ＳＰ１７＿Ｖ．３プローブとにより形成され、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５プローブの３’末端側の６塩基分と５’末端側の２塩基分が１本鎖であり、３’末端側の突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％である。
Ｔｙｐｅ３プローブは、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２１＿Ｖ．３プローブとＧ１２Ｇ／ＳＰ１７＿Ｖ．３プローブとにより形成され、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２１＿Ｖ．３プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が７５％である。
Ｔｙｐｅ４プローブは、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５＿Ｖ．２プローブとＧ１２Ｇ／ＳＰ２１＿Ｖ．２プローブとにより形成され、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５＿Ｖ．２プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が７５％である。
Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２５プローブ、Ｇ１２Ｇ／ＬＰ２１＿Ｖ．３プローブ、及びＧ１２Ｇ／ＬＰ２５＿Ｖ．２プローブは、いずれも５’末端が蛍光物質Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によって修飾されており、かつ３’末端がアミノ基で修飾されている。一方で、Ｇ１２Ｇ／ＳＰ２１プローブ、Ｇ１２Ｇ／ＳＰ１７＿Ｖ．３プローブ、及びＧ１２Ｇ／ＳＰ２１＿Ｖ．２プローブは、いずれも３’末端が消光物質Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １によって修飾されている。
各プローブ、並びに各遺伝子型のアレルの２本鎖形成核酸を構成する各核酸鎖の塩基配列を表１１に示す。表１１中、「Ａｌｅ４８８」、「ＢＨＱ１」、及び右欄の数字は表１と同じである。また、「Ｔ５４−Ｇ１２Ｇ」及び「ｒｃＴ５４−Ｇ１２Ｇ」は正常型（Ｇ１２Ｇ）アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示し、「Ｔ５４−Ｇ１２Ｄ」及び「ｒｃＴ５４−Ｇ１２Ｄ」は変異型（Ｇ１２Ｄ）アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示し、「Ｔ５４−Ｇ１２Ｖ」及び「ｒｃＴ５４−Ｇ１２Ｖ」は変異型（Ｇ１２Ｖ）アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示す。また、各塩基配列中、下線が付されている塩基が変異部位である。
【００９７】
【表１１】
2011206017.tif 000012
【００９８】
まず、表１２に記載の組成に従って、各種溶液（Ｓｏｌ．Ａ１〜１６）をそれぞれ室温下にて調製し、１５分間放置した。また、Ｓｏｌ．Ａ１等とは別に、表１３に記載の組成に従って各種溶液（Ｓｏｌ．Ｂ１〜１６）を調製した。表１２及び１３中、「１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ」、「２．５ｍＭ  ｅａｃｈ ｄＮＴＰ」、「Ａｌｅ５９４ ｓｅ ｄｙｅ」は、表２と同様である。
【００９９】
【表１２】
2011206017.tif 000013
【０１００】
【表１３】
2011206017.tif 000014
【０１０１】
次に、Ｓｏｌ．Ａ１〜１６をＳｏｌ．Ｂ１〜１６にそれぞれ添加し、総量２０μＬの反応溶液を調製した。これらの反応溶液は、調製後直ちに蛍光検出装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、まず、昇温速度２０℃／秒で４０℃にして３０分間保持した後（温調領域Ａ）、昇温速度２０℃／秒で４５℃にして３０分間保持し（温調領域Ｂ）、次いで昇温速度２０℃／秒で５０℃にして３０分間保持し（温調領域Ｃ）、次いで昇温速度２０℃／秒で５５℃にして３０分間保持し（温調領域Ｄ）、次いで昇温速度２０℃／秒で６０℃にして３０分間保持し（温調領域Ｅ）、その後昇温速度２０℃／秒で９５℃まで上昇させて１分間保持した後（温調領域Ｆ）、降温速度０．１℃／秒で４０℃にまで下げて１分間保持し（温調領域Ｇ）、再度昇温速度２０℃／秒で９５℃まで上昇させて１分間保持した後に（温調領域Ｈ）、降温速度２０℃／秒で４０℃にまで下げて１分間保持する（温調領域Ｉ）という温調条件にて、蛍光経時測定を行った。なお、蛍光検出装置による測定は、励起波長を４７０ｎｍ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光測光波長を５２０ｎｍ（ｇａｉｎ １）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒの蛍光測光波長を６４０ｎｍ（ｇａｉｎ １５）として行った。
【０１０２】
図７は、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。図７Ａ〜Ｄは、それぞれ、Ｔｙｐｅ１〜４プローブを用いた結果である。各図中に、用いた突出末端プローブの塩基配列を示した。塩基配列中、太字が変異部位であり、四角で囲われた塩基がプローブ中の突出末端領域である。
【０１０３】
この結果、Ｔｙｐｅ１プローブ（図７Ａ）よりも、Ｔｙｐｅ４プローブ（図７Ｄ）を用いた場合のほうがＳ／Ｎ比が高く、自発的鎖置換効率に顕著な差が出ていた。ここで、Ｔｙｐｅ１プローブでは、突出末端プローブのうちの２本鎖形成領域のＧＣ含量は５７％、突出末端領域のＧＣ含量は５０％、より塩基長の長いＧ１２Ｇ／ＬＰ２５プローブ（本発明の第１プローブに相当）のＧＣ含量は５６％である。一方、Ｔｙｐｅ４プローブでは、突出末端プローブのうちの２本鎖形成領域のＧＣ含量は５２％、突出末端領域のＧＣ含量は７５％、より塩基長の長いＧ１２Ｇ／ＬＰ２５＿Ｖ．２プローブ（本発明の第１プローブに相当）のＧＣ含量は５６％である。つまり、Ｔｙｐｅ１プローブとＴｙｐｅ４プローブでは、本発明の第１プローブに相当する核酸鎖中のＧＣ含量は等しい。にもかかわらず、Ｔｙｐｅ４プローブのほうが塩基配列の識別性能が高かったことから、部分２本鎖形成核酸プローブの自発的鎖置換効率には、突出末端領域におけるＧＣ含量比が寄与しており、このＧＣ含量比が高いほど、自発的鎖置換効率が高くなるものと推察された。
【０１０４】
また、Ｔｙｐｅ４プローブ（図７Ｄ）において、熱変性処理前の４０℃（温調領域Ａ）における自発的鎖置換反応を用いた変異識別精度（Ｓ／Ｎ比）が７〜１２であったのに対して、熱変性処理後の４０℃（温調領域Ｇ及び温調領域Ｉ）でのリハイブリダイゼーションによる変異識別精度（Ｓ／Ｎ比）は２以下であり、いずれも低かった。これらの比較から、熱変性処理を行わずに自発的鎖置換反応を用いた方が、より高精度に塩基変異を識別できることが分かった。
【０１０５】
［実施例６］
突出末端プローブを構成する２本の核酸鎖の鎖長比と自発的相互作用の検討を行った。
具体的には、実施例１で検出したものと同じ遺伝子変異の変異部位を含む領域を標的塩基配列とし、反応液中に、正常型を検出する突出末端プローブと、各遺伝子型のアレルの塩基配列からなる２本鎖形成核酸（オリゴＤＮＡ：１５０ｂｐ）とを共存させ、鎖置換反応が生じた程度を測定した。
【０１０６】
突出末端プローブとしては、Ｔｙｐｅ１〜６の６種類を用いた。
Ｔｙｐｅ１プローブは、実施例１で用いたＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブとＤＳＰ−Ｗ２１−２プローブとにより形成され、ＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％である。
Ｔｙｐｅ２プローブは、実施例１で用いたＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブとＤＳＰ−Ｗ１７−２プローブとにより形成され、ＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブの３’末端側の４塩基分及び５’末端側の４塩基分が１本鎖であり、３’末端側の突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％であり、５’末端側の突出末端領域におけるＧＣ含有量が７５％である。
Ｔｙｐｅ３プローブは、実施例１で用いたＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブとＤＳＰ−Ｗ１６−２プローブとにより形成され、ＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブの３’末端側の９塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が４４％である。
Ｔｙｐｅ４プローブは、ＤＳＰ−Ｗ２５−ＬＮＡプローブと、ＤＳＰ−Ｗ２１−２プローブとにより形成され、ＬＮＡで置換されている３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％である。なお、ＤＳＰ−Ｗ２５−ＬＮＡプローブは、実施例１で用いたＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブの３’末端側の４塩基分がＬＮＡに置換されたものである。
Ｔｙｐｅ５プローブは、ＤＳＰ−Ｗ４０−１プローブとＤＳＰ−Ｗ３６−２プローブとにより形成され、ＤＳＰ−Ｗ４０−１プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が５０％である。
Ｔｙｐｅ６プローブは、ＤＳＰ−Ｗ１６−１プローブとＤＳＰ−Ｗ１２−２プローブとにより形成され、ＤＳＰ−Ｗ１６−１プローブの３’末端側の４塩基分が１本鎖であり、この突出末端領域におけるＧＣ含有量が７５％である。
【０１０７】
ＤＳＰ−Ｗ２５−１プローブ、ＤＳＰ−Ｗ２５−ＬＮＡプローブ、ＤＳＰ−Ｗ４０−１プローブ、及びＤＳＰ−Ｗ１６−１プローブは、いずれも５’末端が蛍光物質Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によって修飾されており、かつ３’末端がアミノ基で修飾されている。一方で、ＤＳＰ−Ｗ２１−２プローブ、ＤＳＰ−Ｗ１７−２プローブ、ＤＳＰ−Ｗ１６−２プローブ、ＤＳＰ−Ｗ３６−２プローブ、及びＤＳＰ−Ｗ１２−２プローブは、いずれも３’末端が消光物質Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ １によって修飾されている。
各プローブ（但し、表１に記載のものを除く）、並びに各遺伝子型のアレルの２本鎖形成核酸を構成する各核酸鎖の塩基配列を表１４に示す。表１４中、「Ａｌｅ４８８」、「ＢＨＱ１」、及び右欄の数字は表１と同じである。また、「ｗＴ１５０」及び「ｒｃ−ｗＴ１５０」は、正常型アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示し、「ｍＴ１５０」及び「ｒｃ−ｍＴ１５０」は、変異型アレルの２本鎖形成核酸を構成する核酸鎖を示す。各塩基配列中、下線が付されている塩基が変異部位である。
【０１０８】
【表１４】
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【０１０９】
まず、表１５及び１６に記載の組成に従って、各種溶液（Ｓｏｌ．Ａ１〜１８）をそれぞれ室温下にて調製し、１５分間放置した。また、Ｓｏｌ．Ａ１等とは別に、表１７及び１８に記載の組成に従って各種溶液（Ｓｏｌ．Ｂ１〜１８）を調製し、１５分間放置した。表１５〜１８中、「１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ」及び「Ａｌｅ５９４ ｓｅ ｄｙｅ」は、表２と同様である。
【０１１０】
【表１５】
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【０１１１】
【表１６】
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【０１１２】
【表１７】
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【０１１３】
【表１８】
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【０１１４】
次に、Ｓｏｌ．Ａ１〜１８をＳｏｌ．Ｂ１〜１８にそれぞれ添加し、総量２０μＬの反応溶液を調製した。これらの反応溶液は、調製後直ちに蛍光検出装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３３０（Ｒｏｃｈｅ社製）にセットし、まず、昇温速度２０℃／秒で４０℃にして１５分間保持した後（温調領域Ａ）、昇温速度２０℃／秒で４５℃にして１５分間保持し（温調領域Ｂ）、次いで昇温速度２０℃／秒で５０℃にして１５分間保持し（温調領域Ｃ）、次いで昇温速度２０℃／秒で５５℃にして１５分間保持し（温調領域Ｄ）、次いで昇温速度２０℃／秒で６０℃にして１５分間保持し（温調領域Ｅ）、次いで昇温速度２０℃／秒で６５℃にして１５分間保持し（温調領域Ｆ）、その後昇温速度２０℃／秒で９５℃まで上昇させて１分間保持した後（温調領域Ｇ）、降温速度２０℃／秒で４０℃にまで下げて１５分間保持する（温調領域Ｈ）という温調条件にて、蛍光経時測定を行った。なお、蛍光検出装置による測定は、励起波長を４７０ｎｍ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光測光波長を５２０ｎｍ（ｇａｉｎ １）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ ｓｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒの蛍光測光波長を６４０ｎｍ（ｇａｉｎ １５）として行った。
【０１１５】
図８は、各反応液に対して蛍光経時測定を行った結果を示した図である。図８Ａ〜Ｆは、それぞれ、Ｔｙｐｅ１〜６プローブを用いた結果である。各図中に、用いた突出末端プローブの塩基配列を示した。塩基配列中、太字が変異部位であり、四角で囲われた塩基がプローブ中の突出末端領域であり、左上の「Ｌ」が付されている塩基がＬＮＡである。
【０１１６】
Ｔｙｐｅ１プローブとＴｙｐｅ２プローブは、長鎖プローブの塩基長は同じであるが、短鎖プローブの塩基長が異なる。これらの結果を比較すると、鎖置換反応の反応効率は、Ｔｙｐｅ１プローブ（図８Ａ）よりもＴｙｐｅ２プローブ（図８Ｂ）を用いた場合のほうが高かったが、Ｓ／Ｎ比は、Ｔｙｐｅ２プローブよりもＴｙｐｅ１プローブを用いた場合のほうが高かった。これらの結果から、第１プローブ（長鎖）と第２プローブ（短鎖）の塩基長の比（［第２プローブの塩基長］／［第１プローブの塩基長］）が、反応効率や塩基配列の識別能を支配する要因のひとつと考えられ、塩基長比が大きくなるほど、塩基配列の識別能は高くなるが、自発的鎖置換効率は低くなり、逆に塩基長比が小さくなるほど（０．５未満）、識別能は低くなるが、自発的鎖置換効率は高くなる傾向を示すことが分かった。
【０１１７】
また、Ｔｙｐｅ１プローブ（図８Ａ）とＴｙｐｅ４プローブ（図８Ｄ）では、ほぼ同じような結果が得られた。このことから、部分２本鎖形成核酸プローブの突出末端領域の核酸をＬＮＡ等の核酸類縁体に置換した場合でも、置換前のプローブとほぼ同程度の自発的鎖置換反応の反応効率及び塩基配列の識別能を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の標的塩基配列の識別方法は、簡素な試薬構成で、高い耐熱性能（例えば、９０℃以上）を備えた装置を用いることなく簡便な反応システムにて、高精度に標的塩基配列を識別できることから、臨床用遺伝子診断事業等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【配列表】
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