(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子を提供する。【解決手段】Ｐｈｌ  ｐ  ６分子はＮ末端及び／又はＣ末端を欠失することにより該分子がＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如する。また、（ｉ）Ｎ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子、及び（ｉｉ）Ｃ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子を含み、かかる２つの分子が共同してＰｈｌ  ｐ  ６の完全な配列を含む、Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子の組合せに関する。さらに、減感作及び診断における低刺激性免疫原性分子又は分子混合物の使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子であって、該Ｐｈｌ  ｐ  ６分子はＮ末端及び／又はＣ末端を欠失することにより該分子がＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如している、低刺激性免疫原性分子。
【請求項２】
Ｐｈｌ  ｐ  ６分子がＮ末端でトランケートされている、請求項１に記載の免疫原性分子。
【請求項３】
Ｐｈｌ  ｐ  ６分子がＣ末端でトランケートされている、請求項１に記載の免疫原性分子。
【請求項４】
組換え手法によって生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性分子。
【請求項５】
ペプチド合成化学によって生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性分子。
【請求項６】
Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子の組合せであって、（ｉ）Ｎ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子、及び（ｉｉ）Ｃ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子を含み、かかる２つの分子が共同してＰｈｌ  ｐ  ６の完全な配列を含む、免疫原性分子の組合せ。
【請求項７】
タンパク質アレルゲンに対するＩｇＥ仲介のアレルギーに罹患している哺乳類の減感作のための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項６に記載の免疫原性分子の組合せの有効量に対して生体内で当該哺乳類の免疫系を提示する段階を含む方法。
【請求項８】
哺乳類において抗体応答を誘導するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項６に記載の免疫原性分子の組合せを投与することを含む方法。
【請求項９】
哺乳類においてＴ細胞応答を誘導するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項６に記載の免疫原性分子の組合せを投与することを含む方法。
【請求項１０】
哺乳類において抗体応答を調節し、誘導するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項６に記載の免疫原性分子の組合せを投与することを含む方法。
【請求項１１】
哺乳類個体におけるＩ型アレルギーの生体外診断のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原又は請求項６に記載の免疫原性分子の組合せの使用。
【請求項１２】
Ｉ型アレルギーに罹患している哺乳類個体の減感作において使用される薬剤の調製のため、又はＩ型アレルギーの生体内診断において使用される試薬の調製のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原又は請求項６に記載の免疫原性分子の組合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重要なチモシー（オオアワガエリ）牧草花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ６の非アナフィラキシー性、すなわち低刺激性形態ならびに減感作及び診断のためのかかる形態の使用に関する。本発明はまた、Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンに対するＩ型アレルギーに罹患している哺乳類個体、代表的にはヒト個体の減感作のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型アレルギーは、工業国において人口の２０％以上が罹患する遺伝的に決定された過敏性疾患である（１）。この免疫障害の結果、アレルギー患者は、花粉、ダニ、カビ及び動物の毛／ふけからのそれ自体は無害な、主として空気伝達されるタンパク質に対してＩｇＥ抗体を産生する。Ｉ型アレルギーの症状（アレルギー性鼻炎、結膜炎、アレルギー性喘息及びアナフィラキシーショック）は、アレルゲンが誘導する、エフェクター細胞（肥満細胞、好塩基球）結合ＩｇＥ抗体とその後の炎症伝達物質遊離のクロスリンクによって生じる（２）。アレルギー個体の約４０％が牧草花粉との接触後に症状を起こすことから、タンパク質及び免疫化学法による関連する牧草花粉アレルゲンの特定に関して研究が進められてきた（３）。大部分の牧草種で生じる交叉反応の一部分として主要なアレルゲンのグループが同定されたが（４）、それらの性質や生物学的機能に関しては全く不明であった。
【０００３】
アレルゲンの特定に対して、最近の分子生物学手法を応用することにより、アレルゲンの一次構造が明らかになり、診断及び治療を目的とする組換えアレルゲンの産生が容易となった（５）。植物細胞骨格の成分（たとえばプロフィリン）（６）ならびにカルシウム結合花粉タンパク質（７）が関連アレルゲンとして同定された。アレルギー患者が種々の無関係なアレルゲン源との接触時に即時型反応を示すという事実は、それ故、遍在するアレルゲンとそれらのＩｇＥ抗体との交叉反応性によって説明することができる。１群の牧草花粉アレルゲンが細胞壁弛緩タンパク質（エクスパンシン）のファミリーに属し（８）、牧草５群アレルゲンがＲＮＡｓｅ活性を有すると考えられる（９）証拠によって、所与のタンパク質の生物学的機能はそのアレルゲン性に関連するとの説が再燃している。主要な牧草花粉アレルゲンは、小粒子に付着する（たとえばディーゼル排気に対する１群アレルゲン（１０））か、若しくは小さな花粉小画分として空気伝達されうる（たとえばアミロプラスト中の５群アレルゲン（１１））という最近の所見は、一部のアレルゲンが患者の気道深部に達し、アレルギー性喘息を惹起するという作用機序の解明の可能性を提供するであろう。
【０００４】
Ｉ型アレルギー疾患の治療は、現在、薬理学的治療と特異的免疫療法によって行われている。特異的免疫療法は今世紀の初頭に既に確立されており（Ｎｏｏｎ，Ｌａｎｃｅｔ  １（１９１１）１５７２−１５７３）（３８）、長期間にわたって漸増量のアレルゲンを全身投与することを含む。特異的免疫療法は有効な治療として認められているが、アナフィラキシー副作用の発生がこの治療の主要な問題点の１つとなっている。アナフィラキシー反応を低減するために、最近アレルゲン特異的免疫療法のためにＴ細胞エピトープの使用が提案された（Ｂｒｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）７６０８−７６１２及びＮｏｒｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１９９３）９８６−９７３）（３９）（４０）。アレルゲンは、連続抗原決定基であるＩｇＥエピトープと重複しうる、極めて多様なＴ細胞エピトープを内包する（Ｅｂｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）１０４７−１０５４；Ｊｏｏｓｔ−ｖａｎ−Ｎｅｅｒｖｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２３２６−２３３５；及びＳｃｈｅｎｋｅｔら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６（１９９５）９８６−９９６）（４１）（４２）（４３）。エフェクター細胞（肥満細胞、好塩基球）結合ＩｇＥと伝達物質遊離の架橋を防ぐためには、Ｔ細胞エピトープとＩｇＥエピトープを詳細に検討する必要がある。
【０００５】
Ｖｒｔａｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９（７）１６７３−１６８１（１９９７）（２３）及びＷＯ９９／１６４６７号は、大腸菌のアミノ酸１−７４と７５−１６０で表されるＢｅｔ  ｖ  １  ｃＤＮＡの２つの部分を発現することによりその三次元構造を崩壊することによって主要なカバアレルゲンＢｅｔ  ｖ  １のアナフィラキシー活性を低下させるという新しい戦略を開示している。完全な組換えＢｅｔ  ｖ  １と異なって、組換え断片はほとんどアレルゲン性を示さなかった。両方の非アナフィラキシー性断片がヒトＢｅｔ  ｖ  １特異的Ｔ細胞クローンの増殖を誘導し、それらがすべての優性Ｔ細胞エピトープを内包し、それ故安全で特異的なＴ細胞免疫療法のために使用しうることを示唆した。この戦略の成功の秘訣は、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンが、他の多くのアレルゲンの場合のように連続ＩｇＥエピトープではなく不連続（すなわち立体的）ＩｇＥエピトープを有するという事実によるものと考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９９／１６４６７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｙ，  Ａ．  Ｂ．  １９９７．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ．
【非特許文献２】Ｓｅｇａｌ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｄ．  Ｔａｕｒｏｇ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｍｅｔｚｇｅｒ．  １９７７．  Ｄｉｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ  ｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４１：４５７．
【非特許文献３】Ｆｒｅｉｄｈｏｆｆ，  Ｌ．  Ｒ．，  Ｅ．  Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｋａｕｔｚｋｙ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｇｒａｎｔ，  Ｄ．  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇ．  Ｍａｒｓｈ．  １９８６．  Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  （ｒｙｅ）  ｐｏｌｌｅｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，  Ｌｏｌ  ｐ  Ｉ  ａｎｄ  Ｌｏｌ  ｐ  ＩＩ  （ｒｙｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｒｙｅ  ｌｌ）．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７８：１１９０．
【非特許文献４】Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒ，  Ｖ．，  Ｓ．  Ｌａｆｆｅｒ，  Ｒ．Ｆｒｏｓｃｈｌ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  Ｈ．  Ｒｕｍｐｏｌｄ，  Ｓ．  Ｋａｐｉｏｔｉｓ，  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓｐｉｔｚａｕｅｒ．  １９９８．  ＩｇＥ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  （Ｐｈｌ  ｐ  １，  Ｐｈｌ  ｐ  ２，  Ｐｈｌ  ｐ  ５，  ａｎｄ  Ｂｅｔ  ｖ  ２）  ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ  ａ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：２５８．
【非特許文献５】Ｖａｌｅｎｔａ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ．  １９９５．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：  ７５１．
【非特許文献６】Ｖａｌｅｎｔａ，  Ｒ．，  Ｍ．  Ｄｕｃｈｅｎｅ，  Ｋ．  Ｐｅｔｔｅｎｂｕｒｇｅｒ，  Ｃ．  Ｓｉｌｌａｂｅｒ，  Ｐ．  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｐ．  Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ，  Ｍ．  Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ，  Ｈ．  Ｒｕｍｐｏｌｄ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  ａｎｄ  ０．  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ．  １９９１．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｆｉｌｉｎ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ；  ＩｇＥ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５５７．
【非特許文献７】Ｓｅｉｂｅｒｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｏ．  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  Ｄ．  Ｌｏｎｓｄａｌｅ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９４．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｒｃｈ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ，  Ｂｅｔ  ｖ  ３，  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｔｕｒｅ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｎｄ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ＩｇＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  Ｃａ２＋．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３４８１．
【非特許文献８】Ｓｈｃｈｅｒｂａｎ，  Ｔ．  Ｙ．，  Ｊ．  Ｓｈｉ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｄｕｒａｃｈｋｏ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｇｕｉｌｔｉｎａｎ，  Ｓ．  Ｊ．  ＭｃＱｕｅｅｎＭａｓｏｎ，  Ｍ．  Ｓｈｉｅｈ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｊ．  Ｃｏｓｇｒｏｖｅ．  １９９５．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：９２４５．
【非特許文献９】Ｂｕｆｅ，  Ａ．，  Ｇ．  Ｓｃｈｒａｍｍ，  Ｍ．  Ｂ．  Ｋｅｏｗｎ，  Ｍ．  Ｓｃｈｌａａｋ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍ．  Ｂｅｃｋｅｒ．  １９９５．  Ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｐｈｌ  ｐ  ５ｂ  ｉｎ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｌｅｎ  ＲＮａｓｅ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６３：６．
【非特許文献１０】Ｋｎｏｘ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｃ．  Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕ，  Ｐ．  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｒ．．  Ｄｅｓａｉ，  Ｈ．  Ｃ．  Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｐｅｎｇ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ａ．  Ｂｕｒｓｉｌｌ．  １９９７．  Ｍａｊｏｒ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｌｏｌ  ｐ  １  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｄｉｅｓｅｌ  ｅｘｈａｕｓｔ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ａｉｒ  ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２７：２４６．
【非特許文献１１】Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕ，  Ｃ．，  Ｍ．  Ｂ．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｐ．  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｒ．  Ｂｅｌｌｏｍｏ，  Ｐ．  Ｈｏｌｍｅｓ，  Ｒ．  Ｐｕｙ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｋｎｏｘ．  １９９２．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：５６９．
【非特許文献１２】Ｖａｌｌｉｅｒ，  Ｐ．，  Ｃ．  Ｄｅｃｈａｍｐ，  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ，  Ｏ．  Ｖｉａｌ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄｅｖｉｌｌｅｒ．  １９９２．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｅｒｙ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｔｈｅｒ  ｐｌａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｆｉｌｉｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２２：７７４．
【非特許文献１３】Ｖｒｔａｌａ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ｓｕｓａｎｉ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｓｐｅｒｒ，  Ｐ．  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｓ．  Ｌａｆｆｅｒ，  Ｃ．  Ｄｏｌｅｃｅｋ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９６．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ  （Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  （Ｐｈｌ  ｐ  １，  Ｐｈｌ  ｐ  ２，  Ｐｈｌ  ｐ  ５）．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９７：７８１．
【非特許文献１４】Ｖｒｔａｌａ，  Ｓ．，  Ｗ．  Ｒ．  Ｓｐｅｒｒ，  Ｉ．  Ｒｅｉｍｉｔｚｅｒ，  Ｒ．  ｖａｎ  Ｒｅｅ，  Ｓ．  Ｌａｆｆｅｒ，  Ｗ．−Ｄ．  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｐ．  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｋ．  Ｌｅｃｈｎｅｒ，  Ｈ．  Ｒｕｍｐｏｌｄ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  Ｏ．  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９３．  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  （Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）  ｐｏｌｌｅｎ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈｌ  ｐ  Ｖ  ａｌｌｅｒｇｅｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：４７７３．
【非特許文献１５】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ａ．，  Ａ．  Ｂｕｆｅ，  Ｇ．  Ｓｃｈｒａｍｍ，  Ｍ．  Ｓｃｈｌａａｋ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍ．  Ｂｅｃｋｅｒ．  １９９５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｇｒｏｕｐ  ＶＩ  ｉｎ．  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ  （Ｐｈｌ  ｐ  ６）．ＩＩ．  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈｌ  ｐ  ６  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｇｒａｓｓ  ｇｒｏｕｐ  Ｖ．  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０８：５５．
【非特許文献１６】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ．  １９８９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．
【非特許文献１７】Ｓａｎｇｅｒ，  Ｆ．，  Ｓ．  Ｎｉｃｋｌｅｎ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｒ．  Ｃｏｕｌｓｏｎ．  １９７７．  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５４６３．
【非特許文献１８】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  Ｐ．  Ｈａｅｂｅｒｌｉ，  ａｎｄ  Ｏ．  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ．  １９８４．  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＶＡＸ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７．
【非特許文献１９】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｊ．  Ｇｉｂｓｏｎ．  １９９４．  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３．
【非特許文献２０】Ｒｏｓｔ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓａｎｄｅｒ．  １９９３．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  ｂｅｔｔｅｒ  ｔｈａｎ  ７０％  ａｃｃｕｒａｃｙ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３２：５８４．
【非特許文献２１】Ｂａｌｌ，  Ｔ．，  Ｓ．  Ｖｒｔａｌａ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｓｐｅｒｒ，  Ｐ．  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｍ．  Ｓｕｓａｎｉ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９４．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ＩｇＥ−ｈａｐｔｅｎ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ；  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２８３２３．
【非特許文献２２】Ｖａｌｅｎｔ，  Ｐ．，  Ｊ．  Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｍ．  Ｍｕｈｍ，  Ｏ．  Ｍａｉｊｄｉｃ，  Ｋ．  Ｌｅｃｈｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ．  １９８９．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｂａｓｏｐｈｉｌｓ  ｖｉａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．  Ｐｒｏｃ．．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５５４２．
【非特許文献２３】Ｖｒｔａｌａ，  Ｓ．，  Ｋ．  Ｈｉｒｔｅｎｌｅｈｎｅｒ，  Ｌ．  Ｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，  Ａ．  Ｐａｓｔｏｒｅ，  Ｈ．−Ｇ．  Ｅｉｃｈｌｅｒ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｓｐｅｒｒ，  Ｐ．  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｃ．  Ｅｂｎｅｒ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９７．  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｂｉｒｃｈ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ，  Ｂｅｔ  ｖ  １，  ｉｎｔｏ  ｔｗｏ  ｎｏｎａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９：１６７３．
【非特許文献２４】Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．  １９７０．  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０．
【非特許文献２５】Ｆｌｉｎｇ，  Ｓ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｓ．  Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎ．  １９８６．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌａｒｉｔｙ  ｉｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｕｒｅａ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５５：  ８３．
【非特許文献２６】Ｔｏｗｂｉｎ，  Ｈ．，  Ｔ．  Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇｏｒｄｏｎ．  １９７９．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｈｅｅｔｓ：  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：４３５０．
【非特許文献２７】Ｇｒｏｔｅ，  Ｍ．，  Ｃ．  Ｄｏｌｅｃｅｋ，  Ｒ．  ｖａｎＲｅｅ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９４．  Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  （Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）  ｐｏｌｌｅｎ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  Ｐｈｌ  ｐ  １  ａｎｄ  Ｐｈｌ  ｐ  ５  ａｆｔｅｒ  ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｒｏｌｅｉｎ  ｖａｐｏｒ．  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４２：４２７．
【非特許文献２８】Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｈ．  １９７８．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｏｆ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｐｏｌｌｅｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３３：３０．
【非特許文献２９】Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ，  Ｆ．，  Ｌ．  Ｆｒｉｂｅｒｇ，  Ｍ．  Ｏｌｓｅｎ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ．  １９９３．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ  （ｔｉｍｏｔｈｙ）  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｐｈｌ  ｐ  ６．  Ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ  ａｎｄ．  Ａ．  Ｓｅｈｏｎ  ｅｄｓ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ｐｐ．  １８９−１９１．
【非特許文献３０】Ｄｏｌｅｃｅｋ，  Ｃ．，  Ｓ．  Ｖｒｔａｌａ，  Ｓ．  Ｌａｆｆｅｒ，  Ｐ．  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  Ｏ．  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ．  １９９３．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｌ  ｐ  ＩＩ，  ａ  ｍａｊｏｒ  ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  （Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３３５：２９９．
【非特許文献３１】Ｇａｊｈｅｄｅ，  Ｍ．，  Ｐ．  Ｏｓｍａｒｋ，  Ｆ．  Ｍ．  Ｐｏｕｌｓｅｎ，  Ｈ．  Ｉｐｓｅｎ，  Ｊ．  Ｎ．  Ｌａｒｓｅｎ，  Ｒ．  Ｊ．  ｖａｎ  Ｎｅｅｒｖｅｎ，  Ｃ．  Ｓｃｈｏｕ，  Ｈ．  Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｄ．  Ｓｐａｎｇｆｏｒｔ．  １９９６．  Ｘ−ｒａｙ  ａｎｄ  ＮＭＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｅｔ  ｖ  １，  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｂｉｒｃｈ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３：１０４０．
【非特許文献３２】Ｆｅｄｏｒｏｖ，  Ａ．  Ａ．，  Ｔ．  Ｂａｌｌ，  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｃ．  Ａｌｍｏ．  １９９７．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ＩｇＥ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｒｃｈ  ｐｏｌｌｅｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎ：  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３３．
【非特許文献３３】Ｌａｆｆｅｒ，  Ｓ．，  Ｌ．  Ｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，  Ｐ．  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ，  Ａ．  Ｐａｓｔｏｒｅ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｌｅｎｔａ，  １９９６．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｐ  １，  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ＩｇＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｂｉｒｃｈ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ，  Ｂｅｔ  ｖ  ｌ  ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：４９４３．
【非特許文献３４】Ｖａｌｅｎｔａ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｋｒａｆｔ．  １９９６．  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｏｏｄ：  Ａ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９７：８９３．
【非特許文献３５】Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ．  １９８２．  Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ  ｔｕｂｅ：  ｌ  ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  （“Ｐ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”）  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｐｉｃａｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １１２：７１．
【非特許文献３６】Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｙ．  Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓ．  Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ．  １９９７．  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｕｎｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ｇｒａｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｓｉｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｗａｌｌ−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｂｏｄｉｅｓ  （Ｐ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）．  Ｓｅｘ．  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．  １０：６５．
【非特許文献３７】Ｖｒｔａｌａ，  Ｓ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｓ．，  Ｇｒｏｔｅ，  Ｍ．，  Ｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，  Ｌ．，  Ｐａｓｔｏｒｅ，  Ａ．，  Ｓｐｅｒｒ，  Ｗ．，  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｐ．，  Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，  Ｒ．，  Ｋｒａｆｔ，  Ｄ．，  Ｖａｌｅｎｔａ，  Ｒ．  １９９９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ，  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｌ  ｐ  ６，  ａ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ａｎｄ  Ｐ−ｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ  （Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）  ｐｏｌｌｅｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：５４８９．
【非特許文献３８】Ｎｏｏｎ，Ｌａｎｃｅｔ  １（１９１１）１５７２−１５７３
【非特許文献３９】Ｂｒｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）７６０８−７６１２
【非特許文献４０】Ｎｏｒｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１９９３）９８６−９７３
【非特許文献４１】Ｅｂｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）１０４７−１０５４
【非特許文献４２】Ｊｏｏｓｔ−ｖａｎ−Ｎｅｅｒｖｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２３２６−２３３５
【非特許文献４３】Ｓｃｈｅｎｋｅｔら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６（１９９５）９８６−９９６
【発明の概要】
【０００８】
主要カバアレルゲンＢｅｔ  ｖ  １と異なって、主要チモシー牧草花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ６は連続（一連の）ＩｇＥエピトープを含むので、上記のようなアナフィラキシー活性低下の断片化戦略には適応しないであろう。
【０００９】
しかしながら、驚くべきことに且つ意外にも、本発明に従えば、遺伝的（組換え）又は合成断片化によってＰｈｌ  ｐ  ６欠失変異体が構築でき、かかる断片は低いアナフィラキシー副作用で牧草花粉アレルギーの特異的免疫療法のために使用しうることが認められた。そのようなアナフィラキシー能力が大きく低下した断片を、以下に非アナフィラキシー性又は低刺激性と称する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｒＰｈｌ  ｐ  ６アイソフォーム及び断片のＩｇＥ反応性。２つのＰｈｌ  ｐ  ６アイソフォーム（ｃ１４２、ｃ２２３）、Ｐｈｌ  ｐ  ６断片（ｃ１２１、ｃ１４６、ｃ１７１、ｃ２３３）を発現する組換えλｇｔ１１ファージ、及び対照としてλｇｔ１１野生型ファージ（０）からのタンパク質を含むニトロセルロースフィルターを、９名の牧草花粉アレルギー患者（１−９）及び１名の非アレルギー個人（１０）からの血清ＩｇＥで試験した。
【図２Ａ】組換えチモシー牧草花粉アレルゲンの純度。精製組換えチモシー牧草花粉アレルゲン（Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６、チモシー牧草花粉プロフィリン）及び天然チモシー牧草花粉抽出物（チモシー）を含む、クマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｍ）分子量マーカー。
【図２Ｂ】円偏光二色性分析。平均残基楕円性（［Θ］）として表わしたｒＰｈｌ  ｐ  ６の遠紫外遠偏光二色性スペクトル（ｙ軸）をｘ軸に表示した波長範囲で２０℃（実線）、８５℃（点線）及び８５℃から冷却後２０℃（破線）で記録した。
【図２Ｃ】円偏光二色性分析。２２０ｎｍでモニターした精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６の熱変性と冷却（ｘ軸：℃で表示した温度；ｙ軸：折りたたみタンパク質の見かけ分画）。
【図３Ａ】ｒＰｈｌ  ｐ  ６は好塩基球のヒスタミン遊離を誘導する。牧草花粉アレルギー患者からの顆粒球を種々の濃度（ｘ軸）の精製組換えＰｈｌ  ｐ  ６（三角）、Ｐｈｌ  ｐ  ５（点）又はモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（四角）と共にインキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミンのパーセンテージをｙ軸に示す。結果は３回の測定の平均値（＋／−ＳＤ）である。
【図３Ｂ】感作アレルギー患者でのｒＰｈｌ  ｐ  ６による即時型皮膚反応の誘発。２名の牧草花粉アレルギー患者（ａ）ＬＷ、（ｂ）ＨＰ及び非アレルギー個人（ｃ）ＳＶを、（ｄ）に示すような漸増濃度のｒＰｈｌ  ｐ  ６とｒＰｈｌ  ｐ  ５ならびにヒスタミン（Ｈｉｓｔ）とＮａＣｌで前腕に穿刺した。膨疹部分をボールペンで囲んでいる。
【図４】Ｐｈｌ  ｐ  ６の組織特異的発現、種々の単子葉植物からのニトロセルロースブロットした牧草花粉抽出物をウサギ免疫前Ｉｇ（レーン１）又はウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６  Ｉｇ（レーン２）でプローブした。Ｂ、同等の量のニトロセルロースブロットしたチモシー牧草花粉、葉及び根からのタンパク質抽出物をウサギ抗プロフィリンＩｇ（レーン１）、ウサギ抗Ｐｈｌ  ｐ  ６  Ｉｇ（レーン２）又はウサギ免疫前Ｉｇ（レーン３）と共にインキュベートした。  Ｃ，Ｄ，Ｐｈｌ  ｐ  ６の超微細構造局在。チモシー牧草花粉の超薄切片をウサギ抗Ｐｈｌ  ｐ  ６  Ｉｇ（Ｃ）及びウサギ免疫前Ｉｇ（Ｄ）で染色した。結合ウサギ抗体を金複合ヤギ抗ウサギＩｇ抗血清（金粒子＝黒い点）で検出した。矢印はＰ粒子上のＰｈｌ  ｐ  ６免疫反応性を示す。略語：Ｅ：外膜；Ｉ：内膜；Ｐ：Ｐ粒子。バーは０．２５０μｍである。
【図５Ａ】Ｐｈｌ  ｐ  ６欠失変異体の低いＩｇＥ結合能。等量の組換えＰｈｌ  ｐ  ６を、チモシー牧草花粉アレルギー患者からの血清（レーン１−１３）及び非アレルギー対照個人からの血清（レーン１４）とのＩｇＥ反応性について試験した。レーン１５とレーン１６はウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清及びウサギ免疫前血清との反応性を示す。結合ＩｇＥ抗体を１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、結合ウサギ抗体を１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギ抗体で検出して、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【図５Ｂ】Ｐｈｌ  ｐ  ６欠失変異体の低いＩｇＥ結合能。等量の組換えＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−５７を、チモシー牧草花粉アレルギー患者からの血清（レーン１−１３）及び非アレルギー対照個人からの血清（レーン１４）とのＩｇＥ反応性について試験した。レーン１５とレーン１６はウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清及びウサギ免疫前血清との反応性を示す。結合ＩｇＥ抗体を１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、結合ウサギ抗体を１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギ抗体で検出して、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【図５Ｃ】Ｐｈｌ  ｐ  ６欠失変異体の低いＩｇＥ結合能。等量の組換えＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０を、チモシー牧草花粉アレルギー患者からの血清（レーン１−１３）及び非アレルギー対照個人からの血清（レーン１４）とのＩｇＥ反応性について試験した。レーン１５とレーン１６はウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清及びウサギ免疫前血清との反応性を示す。結合ＩｇＥ抗体を１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、結合ウサギ抗体を１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギ抗体で検出して、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【図６】牧草花粉に対するアレルギー患者からの顆粒球を様々な濃度（１、１０−１、１０−２、１０−、１０−５、及び１０−７μｇ／ｍｌ）の精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６（点）、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−５７（上向き三角）、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０（下向き三角）、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−３３（菱形）又は抗ＩｇＥ  ｍＡｂ（四角）と共にインキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミンをＲＩＡによって測定し、ｙ軸に示している。結果は３回の測定の平均値である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の最初の態様としては、Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子を提供するが、該Ｐｈｌ  ｐ  ６分子は、Ｎ末端及び／又はＣ末端を欠失しており、これにより該分子はＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如している。
【００１２】
Ｎ末端又はＣ末端の欠失はアレルゲンの末端トランケーションであると考えられる。かかる欠失はまた、それぞれアレルゲンのＮ末端又はＣ末端部分の内部でも存在しうる。
【００１３】
アレルゲン分子の断片は、それ自体当業者には周知であり、組換えＤＮＡ手法又はペプチド合成化学によって作製することができる。
【００１４】
第二の態様としては、本発明は、（ｉ）Ｎ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子、及び（ｉｉ）Ｃ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子を含み、かかる２つの分子が共同してＰｈｌ  ｐ  ６の完全な配列を含む、免疫原性分子の組合せを提供する。
【００１５】
共同してＰｈｌ  ｐ  ６の完全なアミノ酸配列を含むため、２つのＰｈｌ  ｐ  ６分子のそれぞれの配列は重複し又は隣接しうる。
【００１６】
本発明のために有用である断片に必要な（ｉ）免疫原性であって、且つ（ｉｉ）非ＩｇＥ反応性であるＰｈｌ  ｐ  ６アレルゲンのＮ末端及びＣ末端欠失部分の大きさは、当業者には容易に決定できるであろう。特定のＮ末端又はＣ末端欠失分子のＩｇＥ結合能の存否は容易に決定でき、ＩｇＥ反応性の欠如は、その分子がアナフィラキシー副作用を誘発する危険性なしに又は低い危険性で適用できることを示唆する。該分子の免疫原性は、完全なＰｈｌ  ｐ  ６アレルゲンに対するポリクローナル抗血清によって認識される能力によって測定することができる。このようにして、完全なアレルゲンに対する防御免疫応答を惹起することができる可能性が非常に高い断片及び断片の組合せを選択しうる。
【００１７】
本発明の第三の態様は、特異的減感作療法である。かかる療法はタンパク質アレルゲンについての公知技術として実施され、アレルゲンに対するＩ型アレルギーに罹患している哺乳類、代表的にはヒト個体に、当該アレルゲンに対するＩｇＧ免疫応答を惹起することができる免疫原を繰り返し投与することを含む。免疫原は酸化アルミニウムのような適当なアジュバントと混合することができる。投与は全身的に、たとえば注射、注入等々によって実施しうるが、免疫系の腸管部分にさらすために経口経路も示唆されてきた。Ｎｏｒｍａｎ  ＰＳ、「アレルギー及びアナフィラキシー反応のための免疫療法の現状（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｒｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」Ａｄｖ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４１（１９９６）６８１−７１３も参照のこと。
【００１８】
ここでは、投与する免疫原は本発明の最初の態様による免疫原性分子、又はそのような分子の混合物、好ましくは本発明の第二の態様による、（ｉ）Ｎ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子、及び（ｉｉ）Ｃ末端が欠失することによりＩｇＥ結合能を少なくとも実質的に欠如しているＰｈｌ  ｐ  ６分子であって、かかる２つの分子が共同してＰｈｌ  ｐ  ６アレルゲンの完全なアミノ酸配列を含む、Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される上記の低刺激性免疫原性分子の組合せでありうる。
【００１９】
より明細には、免疫原は、患者において抗体応答を誘導するため、及び／又はＴ細胞応答を惹起するため、及び／又は寛容を誘導するように抗体及びＴ細胞応答を調節させるために使用しうる。
【００２０】
本発明の第四の態様は、第一の態様による免疫原又は第二の態様による免疫原の組合せの、当該免疫原が由来するＰｈｌ  ｐ  ６アレルゲンに対するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭクラスの特異性抗体を検出するための免疫測定法における抗原としての使用を提供する。適切なアッセイ変法は、免疫原、サンプル抗体及び対象とするＩｇクラスに対する抗体間での三重複合系の形成を含む。サンプルは、Ｉｇを含有するあらゆる生物学的液体、たとえば血液由来のサンプル（血清、血漿、全血）、ＣＳＦ、等々でありうる。特に、低刺激性断片は、治療において当該断片に対する新たな免疫応答を誘導するときの診断モニタリング（たとえばＩｇＧ測定、Ｔ細胞応答の測定）のために使用しうる。
【００２１】
本発明を以下の非制限的実施例によって説明する。
【実施例】
【００２２】
実験材料及び方法
生物学的材料、患者血清、抗血清、組換えアレルゲン。
【００２３】
チモシー牧草（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ケンタッキースズメノカタビラ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  ｂｌｕｅ  ｇｒａｓｓ）（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、カラスムギ（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｏａｔ）（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）及びヨシ（ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅｅｄ）（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）からの花粉はＡｌｌｅｒｇｏｎ  ＡＢ（Ｖａｌｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。チモシー牧草の種子をＡｕｓｔｒｏｓａａｔ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入し、４週間生育させて生葉と根を入手した。牧草花粉に対してアレルギー性の患者は（４）の記載のように特定した。ウサギ抗セロリプロフィリン抗血清（ＲＰ１）が（１２）に記載されている。フロイントアジュバントを用いて、精製組換えＰｈｌ  ｐ  ６に対するウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清を作製した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｋｉｓｓｌｅｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。組換えチモシー牧草花粉アレルゲン、ｒＰｈｌ  ｐ  １、ｒＰｈｌ  ｐ  ２及びｒＰｈｌ  ｐ  ５を（１３）に記載されているように精製した。組換えチモシー牧草花粉プロフィリンをポリ（Ｌ−プロリン）アフィニティークロマトグラフィー（６）によって精製した。
【００２４】
Ｐｈｌ  ｐ  ６アイソフォーム／断片をコードするｃＤＮＡの単離と特定。
【００２５】
ファージλｇｔ１１（１４）において成熟チモシー牧草花粉から構築した発現ｃＤＮＡライブラリーから、３５０のＩｇＥ反応性クローンを単離した。Ｐｈｌ  ｐ  ６をコードするｃＤＮＡと配列相同性を有する６個のｃＤＮＡ（ｃ１２１、ｃ１４２、ｃ１４６、ｃ１７１、ｃ２２３、ｃ２３３）をプラスミドｐＵＣ１８にサブクローニングし、配列決定した（１６、１７）。ＭｃＶｅｃｔｏｒプログラム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて配列を分析した。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのＦａｓｔＡプログラム（ＧＣＧパッケージ）（１８）によりＰｈｌ  ｐ  ６に相同なタンパク質配列について検索を行った。ＥＭＢＬデータベースからＨｏｌ  ｌ  ５及びＨｏｒ  ｖ  ５アレルゲンの配列を取り出した。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１９）で多配列アラインメントを作製し、手動で編集した。ＧＤＥ配列エディター（Ｓ．Ｓｍｉｔｈ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＣＯＬＯＲＭＡＳＫ（Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＥＭＢＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、関連した特性を有する保存された残基に着色した（１９）。ＥＭＢＬ  ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｒｖｅｒ（２０）でＰＨＤプログラムによりタンパク質二次構造及び表面可触性の予測を行った。
【００２６】
Ｐｈｌ  ｐ  ６  ＩｇＥエピトープのマッピング、組換えＰｈｌ  ｐ  ６の発現と精製。
【００２７】
Ｐｈｌ  ｐ  ６アイソフォーム及び断片を発現するファージクローンのＩｇＥ結合能をプラークリフトアッセイ（２１）によって検討した。成熟Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンをコードするＤＮＡをクローン１４２  ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ−１７ｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ  ＲＩ部位にサブクローニングした。組換えＰｈｌ  ｐ  ６を液体培養中でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ  ２１（ＤＥ  ３）において発現させた。細胞を２５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に懸濁し、リゾチーム（２０μｇ／ｇ細胞）の室温で３０分間の添加と凍結融解サイクルによって溶解した。ＤＮＡを室温で２０分間ＤＮＡｓｅ  Ｉ（０．１ｍｇ／ｇ細胞ペレット）で消化した。タンパク質抽出物を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ；ＳＳ３４ローター）、不溶性物質を除去した。得られた沈殿物中に硫酸アンモニウム（４０−６０％ｗ／ｖ）を加えてｒＰｈｌ  ｐ  ６を濃縮した。沈殿物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６に溶解し、この緩衝液を透析し、遠心分離（２０分間、１０，０００ｇ，Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ；ＳＳ３４ローター）後、ジエチルアミノエチルセルロース−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入した。非結合タンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６、４％ｖ／ｖイソプロパノールで溶出した。８０％以上の純度のＰｈｌ  ｐ  ６を含む分画をＮａＯＨでｐＨ８の調整し、ジエチルアミノエチルセルロース−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで第二のクロマトグラフィー段階に供した。ｐＨ８の０−０．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配での結合タンパク質の溶出により純ｒＰｈｌ  ｐ  ６を含む分画を得て、それをＨ２Ｏｄｄで透析した。
【００２８】
精製組換えＰｈｌ  ｐ  ６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス援用レーザー脱着イオン化−飛行時間型）及びＣＤ（円偏光二色性）分析。
【００２９】
飛行時間型Ｃｏｍｐａｃｔ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ装置（Ｋｒａｔｏｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いて線形モードでレーザー脱着質量スペクトルを得た（ｐｉＣＨＥＭ，Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）。Ｊａｓｃｏ  ＰＴＣ−３４８ＷＩペルチエ型温度制御システムを取り付け、Ｆｉｓｏｎｓ  ＨＡＡＫＥ  ＧＨ水浴に結合したＪａｓｃｏ  Ｊ−７１０分光偏光計でＣＤスペクトルを記録した。７μＭのタンパク質濃度で２ｍｍ幅−長さの石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ，Ｍｕｌｌｈｅｉｍ，Ｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で２０℃で遠紫外ＣＤスペクトルを記録した。２２０ｎｍで温度上昇の間（５０℃／時）の楕円性を記録することにより、Ｐｈｌ  ｐ  ６の熱変性をモニターした。開始温度（２０℃）まで冷却したとき（５０℃／時）のＣＤシグナルの回復を測定することにより、変性プロセスの可逆性を調べた。折りたたみタンパク質の分画をＦ＝１−Ｕ［式中、Ｕ＝（Θ２２０−ΘＮ）／（ΘＵ−ΘＮ）］として算出した。ΘＮは天然状態でのタンパク質の楕円性であり、ΘＵは変性タンパク質の楕円性である。ｒＰｈｌ  ｐ  ６については、ΘＵは８５℃でΘ２２０に等しいと仮定し、ΘＮは２０℃でΘ２２０に等しいと仮定した。
【００３０】
組換えＰｈｌ  ｐ  ６のＩｇＥ結合能、天然Ｐｈｌ  ｐ  ６及び他のチモシー牧草花粉アレルゲンとの交叉反応性。
【００３１】
ＩｇＥ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６反応性の発生率を、１７１名の牧草花粉アレルギー患者からの血清及び対照として非アトピー個人からの血清においてＥＬＩＳＡによって測定した（１３）。天然及びｒＰｈｌ  ｐ  ６上の交叉反応性ＩｇＥエピトープの存在をＩｇＥ免疫ブロット阻害実験によって検討した（４）。ｒＰｈｌ  ｐ  ６と組換えチモシー牧草花粉アレルゲン（ｒＰｈｌ  ｐ  １、ｒＰｈｌ  ｐ  ２及びｒＰｈｌ  ｐ  ５）との間の免疫学的関係（１３）を（４）の記載のようにＥＬＩＳＡ競合によって検討した。
【００３２】
ヒスタミン遊離実験。
【００３３】
ｒＰｈｌ  ｐ  ６反応性ＩｇＥ抗体を有する牧草花粉アレルギー個人のヘパリン化血液サンプルから、デキストラン沈降によって（２２）顆粒球を単離した。細胞を漸増濃度の精製ｒＰｈｌ  ｐ  ５、ｒＰｈｌ  ｐ  ６、及び抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｅ１２４．２．８  Ｄε２，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）と共にインキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミンを放射免疫測定法（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって測定した。
【００３４】
皮膚試験。
【００３５】
インフォームドコンセントを得たあと、（２３）の記載のように各人の前腕に皮膚穿刺試験を実施した。種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）の精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６、ｒＰｈｌ  ｐ  ５を含む２０μｌアリコート及びチモシー牧草花粉抽出物、ヒスタミン及び塩化カリウム（ＡＬＫ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で各人を穿刺した。
【００３６】
他の牧草種におけるＰｈｌ  ｐ  ６関連アレルゲン存在の分析及びＰｈｌ  ｐ  ６の組織特異的発現。
【００３７】
ＳＤＳ−サンプル緩衝液中で組織を均質化することによって花粉、葉及び根からのタンパク質抽出物を得た（２４）。抽出物を遠心分離して（１０，０００×ｇ、２０分間；Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ，ＳＳ３４ローター）不溶性物質を除去した。タンパク質抽出物を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し（２５）、ニトロセルロースにブロッティングした（２６）。ニトロセルロース細片をウサギ抗セロリプロフィリン抗血清、ＲＰ１（１２）、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清及び後者のウサギ免疫前血清で試験した。結合ウサギ抗体を１：１０００希釈した１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギＩｇ抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
【００３８】
イムノゴールド電子顕微鏡検査によるＰｈｌ  ｐ  ６のｉｎ  ｓｉｔｕ局在。
【００３９】
チモシー牧草花粉粒を（２７）の記載のように無水的に固定した。超薄切片を等濃度のウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６  Ｉｇ（Ｉｇ：Ｇタンパク質精製免疫グロブリン分画）又は免疫前Ｉｇのいずれかと共にインキュベートした。結合ウサギ抗体を、１０ｎｍのコロイド状金粒子（Ｐｌａｎｏ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合したヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体で検出した（２７）。
【００４０】
低刺激性Ｐｈｌ  ｐ  ６（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）欠失変異体の構築。
【００４１】
Ｎ末端及びＣ末端のＰｈｌ  ｐ  ６欠失変異体を作製し、ａａ１−５７及びａａ３１−１１０と称した。Ｐｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−５７及びＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０をコードするｃＤＮＡを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰｈｌ  ｐ  ６  ｃＤＮＡ（クローン＃１４２）のＰＣＲ増幅によって得た：
【００４２】
【化１】
2011236217.tif 000002
Ｅｃｏ  ＲＩ及びＫｐｎ  Ｉ部位をイタリック体で示し、Ｎｄｅ  Ｉ部位及びＣ末端に導入されたＨｉｓ標識に下線を付している。
【００４３】
ＰＣＲ産物をＮｄｅ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉ（ａａ１−５７）又はＮｄｅ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ（ａａ３１−１１０）で切断し、分取アガロースゲル電気泳動によって精製して、プラスミドｐＥＴ−１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ  ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。ウサギ抗Ｐｈｌ  ｐ  ６抗血清を用いた免疫スクリーニングにより、正しい欠失変異体を発現するコロニーを同定した。陽性クローンからのＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ｔｉｐｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、配列決定した（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００４４】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰｈｌ  ｐ  ６欠失変異体の発現及びＩｇＥ結合能の試験
組換えＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−５７及びＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０を、液体培地中０．８のＯＤ６００、３７℃で５時間、０．５ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドで誘導することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ  ２１（ＤＥ３）において発現させた。等量のｒＰｈｌ  ｐ  ６、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−５７及びｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースにブロッティングした。ニトロセルロース細片を、アレルギー個人、非アレルギー対照個人からの血清ＩｇＥ、ウサギ抗Ｐｈｌ  ｐ  ６抗血清及びウサギ免疫前血清と共にインキュベートした。結合ＩｇＥ抗体を１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、結合ウサギ抗体を１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギ抗体で検出した。
【００４５】
結果
Ｐｈｌ  ｐ  ６のアイソフォーム／断片をコードするｃＤＮＡの単離と特定。
【００４６】
Ｐｈｌ  ｐ  ６アイソフォーム／断片をコードする６個のｃＤＮＡクローン（ｃ１４２、ｃ２２３、ｃ１７１、ｃ１２１、ｃ２３３、ｃ１４６）を、牧草花粉アレルギー患者からの血清ＩｇＥでチモシー牧草花粉λｇｔ１１ライブラリーから単離した。上述したクローンの配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託した（アクセス番号：Ｙ１６９５５−Ｙ１６９６０）。Ｐｈｌ  ｐ  ６（クローン１４２）の推定アミノ酸配列は２８ａａ疎水性リーダーペプチドを含んだ。グリシン残基から始まり、アラニン残基の高い含量（２０．９％）を示す成熟Ｐｈｌ  ｐ  ６（クローン１４２）タンパク質について、分子量１１．８ｋＤａ、ｐＩ  ５．５と算定した。Ｐｈｌ  ｐ  ６のコンピュータ援用二次構造分析は顕著ならせん含量を示唆し、溶媒可触性の算定によって、Ｎ末端アミノ酸の多くが溶媒にさらされているのに対し、Ｃ末端アミノ酸は埋め込まれていることが予測される。配列モチーフについての検索によって、１つの潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（ＮＡＳ：ａａ１５−１７）、１つのＮ末端ミリストイル化部位（ＧＫＡＴ：ａａ１−４）、２つのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位（ＫＡＴＴ：ａａ２−５；ＫＹＫＴ：ａａ３３−３６）及び２つのペルオキシソーム標的部位（ＧＫＡ：ａａ１−３；ＳＫＡ：ａａ５４−５６）の存在が明らかになった。推定Ｐｈｌ  ｐ  ６アミノ酸配列は、最近提供されたＰｈｌ  ｐ  ６配列（１５）と同一性を示し、また５群牧草花粉アレルゲンのＮ末端部分と類似性を示した。しかし、Ｐｈｌ  ｐ  ６特異的ＩｇＥは５群アレルゲンとほとんど若しくは全く交叉反応性を示さない。５群牧草花粉アレルゲンとの比較はＶｒｔａｌａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６３（１０）：５４８９−５４９６（３７）（その開示は参照してここに組み込まれる）に述べられている。その中の図１Ａは、Ｐｈｌ  ｐ  ６変異体及び５群アレルゲンの多配列整列、二次構造及び溶媒可触性の予測を示している。
【００４７】
Ｐｈｌ  ｐ  ６のＮ末端はＩｇＥ結合に関連する。
【００４８】
ニトロセルロース結合β−ｇａｌ融合完全ｒＰｈｌ  ｐ  ６（ｃ２２３、ｃ１４２）、Ｎ末端トランケートｒＰｈｌ  ｐ  ６（ｃ１７１、ｃ１２１、ｃ２３３、ｃ１４６）及び対照としてβ−ｇａｌ単独を、９名の牧草花粉アレルギー個人及び１名の非アレルギー個人からの血清ＩｇＥに接触させた（図１）。結果は、２つの完全なＰｈｌ  ｐ  ６アイソフォーム及び４個のＮ末端アミノ酸のみ欠失するＰｈｌ  ｐ  ６断片は試験したすべての牧草花粉アレルギー患者からのＩｇＥに強く結合し、部分的Ｐｈｌ  ｐ  ６クローンのＩｇＥ結合能はタンパク質のＮ末端から欠如しているアミノ酸の数に依存して低下することを示した。Ｎ末端の３０個のアミノ酸を欠失する部分クローン（クローン１２１）は既にそのＩｇＥ結合能を完全に喪失していた（図１）。
【００４９】
組換えＰｈｌ  ｐ  ６のＥ．ｃｏｌｉ発現と精製。精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６のＩｇＥ結合能。
【００５０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ  ２１（ＤＥ３）においてｒＰｈｌ  ｐ  ６を過剰発現させた。いくつかの精製段階の組合せによって純粋な可溶性ｒＰｈｌ  ｐ  ６（約５ｍｇタンパク質／リットルＥ．ｃｏｌｉ培養）を生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより低分子量チモシー牧草花粉アレルゲンの１つとして同定した（図２Ａ）。精製組換えＰｈｌ  ｐ  ６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、サンプルのＭＨ＋及びＭ２Ｈ２＋種に対応する１１７９０と５８９６の２つの質量／電荷ピークを生じ、推定Ｐｈｌ  ｐ  ６分子量（１１７８９Ｄａ）と一致した。
【００５１】
１７１名の牧草花粉アレルギー患者からの１２８の血清においてｒＰｈｌ  ｐ  ６特異的ＩｇＥ抗体が検出されたが、１０名の非アレルギー個人からの血清からは検出されなかった。ｒＰｈｌ  ｐ  ６を有する牧草花粉アレルギー患者からの血清の前吸収は、ニトロセルロースにブロッティングしたチモシー牧草花粉抽出物における１０−１４ｋＤａ部分へのＩｇＥ結合を大きく低下させ、ｒＰｈｌ  ｐ  ６と天然Ｐｈｌ  ｐ  ６がＩｇＥエピトープを共有することを示唆した。ＥＬＩＳＡ競合実験は、低率（＜２０％）のＰｈｌ  ｐ  ５特異的ＩｇＥだけがｒＰｈｌ  ｐ  ６と共に前吸収されうることを明らかにした。ｒＰｈｌ  ｐ  １、ｒＰｈｌ  ｐ  ２及び組換えチモシー牧草プロフィリンへのＩｇＥ結合は、ｒＰｈｌ  ｐ  ６との血清のプレインキュベーション後も低下しなかった。これらの結果により、Ｐｈｌ  ｐ  ６が他の牧草花粉アレルゲンとは異なる重要なアレルゲンとして同定された。
【００５２】
安定なすべてのαらせんコンフォメーションにおけるｒＰｈｌ  ｐ  ６の折りたたみ
精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６の遠紫外ＣＤスペクトル（図２Ｂ）は、このタンパク質がかなりの量のαらせん二次構造を含むことを示す。スペクトルは、２０８ｎｍと２２０ｎｍの２つの広い最小量と１９１ｎｍの最大量を特徴とする。二次構造予測（３７）は、顕著なαらせん二次構造含量を示し、ＣＤ測定とかなり一致する。ｒＰｈｌ  ｐ  ６の変性推移は一相性であり、６１℃の融点と高度に協同する。８５℃では、ｒＰｈｌ  ｐ  ６は２００ｎｍの典型的最小量を有するランダムコイル構造をとる。ｒＰｈｌ  ｐ  ６は、冷却曲線プロフィール（図２Ｃ）及び８５℃から冷却後２０℃で記録した遠紫外スペクトル（図２Ｂ）から明らかなように、高度の折りたたみ可逆性を示す。
【００５３】
組換えＰｈｌ  ｐ  ６は牧草花粉アレルギー患者において用量依存的な好塩基球のヒスタミン遊離と即時型皮膚反応を誘導する。
【００５４】
精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６は、牧草花粉アレルギー患者の好塩基球から特異的で用量依存的なヒスタミンの遊離を誘導した（図３Ａ）。活性が高い牧草花粉アレルゲンであるｒＰｈｌ  ｐ  ５（１４、ＶａｌｅｎｔａとＦｌｉｃｋｅｒ、未発表データ）は、ｒＰｈｌ  ｐ  ６に比べてより低濃度でも最大の遊離を誘導した。４名の牧草花粉アレルギー患者においてｒＰｈｌ  ｐ  ６、ｒＰｈｌ  ｐ  ５及びチモシー牧草花粉抽出物は即時型皮膚反応を誘発したが、非アレルギー患者では反応を生じなかった（表１；図３Ｂ）。塩化ナトリウムに対する反応は認められなかったが、ヒスタミンは試験したすべての個人で膨疹反応を誘発した（表１；図３Ｂ）。
【００５５】
６群アレルゲンは花粉特異的タンパク質である。
【００５６】
牧草花粉アレルゲンの主要な群はほとんどの牧草種で起こるが（４）、６群アレルゲンはチモシー牧草（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）花粉において広汎に生じることが報告された（１５）。ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清は、２５−２８ｋＤａの間で様々な単子葉植物（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）からのニトロセルロースブロッティングした花粉抽出物中の５群アレルゲンと交叉反応した（図４Ａ、レーン２）。１１ｋＤａでＰｈｌ  ｐ  ６又はＰｈｌ  ｐ  ６関連アレルゲンがＰｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ及びＰｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓからの花粉において広汎に検出された。Ｐｈｌ  ｐ  ６  ｃＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列内に推定Ｎグリコシル化部位が認められたが、天然と組換えのＰｈｌ  ｐ  ６について同等の分子量が観察されたことから、天然Ｐｈｌ  ｐ  ６の多グリコシル化は排除される（図４Ａ、２Ａ）。ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗体は、ニトロセルロースブロッティングしたチモシー牧草花粉中１１ｋＤａでＰｈｌ  ｐ  ６と強く反応したが、葉あるいは根の抽出物とは反応しなかった（図４Ｂ、レーン２）。約１４ｋＤａで３つの組織すべてにおいてプロフィリンが検出された（図４Ｂ、レーン１）。
【００５７】
チモシー牧草花粉におけるＰｈｌ  ｐ  ６の免疫電子顕微鏡的局在。
【００５８】
包埋後イムノゴールド電子顕微鏡を用いて、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗体を成熟チモシー牧草花粉粒内のかなりの部分を満たす多数の多糖類（Ｐ−）粒子に結合した（図４Ｃ）。金粒子の最大の蓄積はＰ粒子の断面図上の表面に認められ、Ｐｈｌ  ｐ  ６はＰ粒子内ではなくＰ粒子上に存在することを示唆した。花粉粒子の他の部分ではほとんど（細胞質ゾル、外膜）若しくは全く（ミトコンドリア、内膜）抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６免疫反応性を認めなかった。同様にアミロプラストではほとんど金粒子が検出されなかった。この局在パターンは、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ５抗血清がＰ粒子を標識することができなかったという我々の所見（データは示していない）と合わせて考えると、Ｐ粒子の免疫標識が交叉反応性５群アレルゲンの存在から生じた可能性を排除する。免疫前Ｉｇに関して実施した対照実験は、いくつかの非特異的に吸収された金粒子だけを生じた（図４Ｄ）。
【００５９】
Ｐｈｌ  ｐ  ６欠失変異体（ａａ１−５７、ａａ３１−１１０）はＩｇＥ結合能が大きく低下したことを示す。
【００６０】
ニトロセルロースブロットした完全なｒＰｈｌ  ｐ  ６（図５Ａ）、ｒＰｈｌ  ｐ  ６変異体ａａ１−５７（図５Ｂ）及びｒＰｈｌ  ｐ  ６変異体ａａ３１−１１０（図５Ｃ）を、牧草花粉アレルギー患者からの１３の血清、非アトピー個人からの血清及びウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清に接触させた。１３名の牧草花粉アレルギー患者全員が完全な組換えＰｈｌ  ｐ  ６に対してＩｇＥ反応性を示し（図５Ａ）、変異体ａａ１−５７は、血清１１によって認識され、血清１３によって認識は弱くかった（図５Ｂ）。Ｐｈｌ  ｐ  ６変異体ａａ３１−１１０は血清７及び１１とのみ弱く反応した（図５Ｃ）。非アトピー個人からの血清は完全なｒＰｈｌ  ｐ  ６及び欠失変異体と反応することができなかった。ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６抗血清は完全なｒＰｈｌ  ｐ  ６及び２つの欠失変異体に対して同等の強度の反応性を示した（図５Ａ−Ｃ；レーン１５）が、ウサギ免疫前血清は当該分子の分子量の範囲内で反応性を示さなかった（図５Ａ−Ｃ；レーン１６）。
【００６１】
ｒＰｈｌ  ｐ  ６に対するマウス抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６又はｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０抗血清のＩｇＧ１反応性
完全なｒＰｈｌ  ｐ  ６及びｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０に対して惹起したマウスＩｇＧ１はｒＰｈｌ  ｐ  ６と反応する（表ＩＩ）。
【００６２】
ｒＰｈｌ  ｐ  ６誘導体はヒスタミンの遊離誘導能がかなり低下している。
【００６３】
牧草花粉に対してアレルギー性の患者からの顆粒球を様々な濃度の精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−５７、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０、ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−３３又は抗ＩｇＥ  ｍＡｂ（Ｅ１２４．２．８  Ｄε２，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）と共にインキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミンをＲＩＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）によって測定した（図６）。精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６は、牧草花粉に対してアレルギー性の患者の好塩基球から特異的で用量依存性のヒスタミン遊離を誘導したが、ｒＰｈｌ  ｐ  ６誘導体ａａ１−５７及びａａ３１−１１０は１μｇ／ｍｌの濃度までヒスタミンの遊離を誘導しなかった。Ｐｈｌ  ｐ  ６  ａａ１−３３は１μｇ／ｍｌの濃度でヒスタミンの５０％遊離を誘導し、これは完全なｒＰｈｌ  ｐ  ６に比べて約１０００倍のヒスタミン遊離の低下に相当する。
【００６４】
（考察）
アレルギー患者の約４０％が牧草花粉との接触後に即時型症状を示す（３）。我々は、Ｐｈｌ  ｐ  ６と称する、主要なチモシー牧草花粉アレルゲンのアイソフォーム及び断片をコードするｃＤＮＡを単離した。Ｐｈｌ  ｐ  ６は、牧草花粉アレルギー患者の７５％のＩｇＥ抗体によって認識される１１．８ｋＤａのタンパク質アレルゲンである。従ってｒＰｈｌ  ｐ  ６のＩｇＥ認識の発生率は先に報告された天然Ｐｈｌ  ｐ  ６についての発生率と一致し、炭水化物はＰｈｌ  ｐ  ６のＩｇＥ認識に関連する役割を果たしていないことを示唆する（２８、２９）。天然Ｐｈｌ  ｐ  ６について得られたペプチド配列データと一致して、我々は、ｒＰｈｌ  ｐ  ６の推定繹アミノ酸配列が、２５−３５ｋＤａの主要牧草花粉アレルゲンのファミリーである５群牧草花粉アレルゲンのＮ末端部分と高度の配列相同性を示すことが認められた（２９、１４）。Ｎ末端の疎水性リーダーペプチドの存在により、Ｐｈｌ  ｐ  ６は、５群アレルゲン断片と異なる独立したアレルゲンである。ｃＤＮＡクローンをコードするＰｈｌ  ｐ  ６を分析した他の著者（１５）の提案と一致して、我々は、５群及び６群アレルゲンが、１群及び２／３群牧草花粉アレルゲンについて記述されている（３０）と同様に、共通の祖先遺伝子から進化したのであろうと推測する。Ｐｈｌ  ｐ  ６が牧草花粉アレルゲンの独立した群に属するという仮説も、Ｐｈｌ  ｐ  ６が５群及び他の牧草花粉アレルゲンと交叉反応性ＩｇＥエピトープをほとんど共有しないという我々の所見に裏付けられる。溶媒可触性の予測からは、Ｐｈｌ  ｐ  ６のＮ末端アミノ酸の多くが溶媒に接触しているのに対し、Ｃ末端アミノ酸残基の大部分は被覆されていることが示された。証明されてはいないが、この所見はＩｇＥエピトープマッピング実験から得られたデータと一致しており、この実験は、タンパク質のＮ末端がＩｇＥ認識に決定的に関与することを示している。しかしまた、Ｎ末端自体が優性ＩｇＥエピトープである、若しくはＮ末端の欠失が立体的Ｐｈｌ  ｐ  ６  ＩｇＥエピトープに影響を及ぼすという可能性も存在する。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰｈｌ  ｐ  ６の発現は、αらせん二次構造をほとんど独占的に含む可溶性の折りたたみ組換えタンパク質を多量に生成した。Ｐｈｌ  ｐ  ６のαらせん折りたたみは、ある種のタンパク質がアレルゲンとして働く傾向として共通の構造的特徴が存在しないことがさらに確認された。Ｐｈｌ  ｐ  ６はおそらくすべてαらせんタンパク質である可能性が高いが、主要カバ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １（３１）、及びカバプロフィリン、Ｂｅｔ  ｖ  ２（３２）はαβ混合折りたたみを有する。ＣＤ分光分析によって明らかにされたように、ｒＰｈｌ  ｐ  ６は、他の免疫学的に無関係な花粉アレルゲン（たとえばＢｅｔ  ｖ  １（３３）、Ｂｅｔ  ｖ  ２（６、３２））と、変性後再び安定な構造に折りたたまれるという顕著な内在傾向を共有する。Ｐｈｌ  ｐ  ６と他の重要な植物アレルゲンが共有するもう１つの特徴は、花粉組織におけるその高い発現である。これまでに特定された植物アレルゲンの大部分が主として成熟花粉において発現されるという事実により、気道を通じた感作の軌跡と解釈することができる（３４）。
【００６６】
イムノゴールド電子顕微鏡検査によると、Ｐｈｌ  ｐ  ６は主として成熟花粉のＰ粒子上に局在した。Ｐ粒子は、休眠花粉粒の含量の３０％までを占め、花粉の発芽の際に成長する花粉管壁内に物質を運ぶ、小さな多糖類含有体である（３５、３６）。Ｐ粒子は小さなサイズであり（＜２．５ミクロン）、それ故Ｐｈｌ  ｐ  ６を気管支粘膜と直接接触させる呼吸性アレルゲン担体として働くことができるので、Ｐ粒子上にＰｈｌ  ｐ  ６が生じることと決定的な関連性を有すると考えられる。従って、いくつかの牧草種（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）だけが低分子量範囲内（１０−１２ｋＤａ）にウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６反応性部分を含むが、Ｐ粒子と結合したＰｈｌ  ｐ  ６の気道深部への侵入により、アレルゲン感作の発生率が高い（７５％）ことの説明となるであろう。
【００６７】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｋａ  ｃｏｌｉ）に発現させた精製組換えｒＰｈｌ  ｐ  ６アレルゲンは、牧草花粉アレルギー患者の大半のＩｇＥ抗体と反応し、好塩基球のヒスタミン遊離ならびに即時型皮膚反応を誘発した。それ故、このアレルゲンは牧草花粉アレルギーの生体外及び生体内（皮膚試験）診断のために使用しうる。Ｐｈｌ  ｐ  ６のＮ末端部分の欠失がアレルゲンのＩｇＥ結合能を著しく低下させたという我々の所見により、アフィラキシー副作用の少ない牧草花粉アレルギーの特異的免疫療法のために使用しうるＰｈｌ  ｐ  ６欠失変異体を構築することが可能であろうという発想に至った。同様の戦略が最近、主要カバ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １の立体的ＩｇＥエピトープを崩壊するために適用された（２３）が、Ｐｈｌ  ｐ  ６分子は連続ＩｇＥエピトープであるので、Ｐｈｌ  ｐ  ６については予測できなかったであろう。我々は、Ｐｈｌ  ｐ  ６のＮ末端及びＣ末端がトランケートされた変種を作製したが、その中で変異体ａａ１−５７とａａ３１−１１０はＩｇＥ結合能をほとんど完全に消失していた。我々は、組換え分子として又はペプチド化学によって作製したこれら２つの低刺激性Ｐｈｌ  ｐ  ６を牧草花粉アレルギーに対するワクチン候補として使用することを提案する。
【００６８】
（表の簡単な説明）
（表Ｉ）
ｒＰｈｌ  ｐ  ６に対する即時型皮膚反応。４名の牧草花粉アレルギー患者（ＨＰ、ＳＦ、ＣＳ、ＬＷ）及び２名の非アレルギー個人（ＳＶ、ＳＳ）を、精製ｒＰｈｌ  ｐ  ６、ｒＰｈｌ  ｐ  ５、天然チモシー牧草花粉抽出物、ヒスタミン及び等張塩化ナトリウムで皮膚試験した。結果は膨疹反応の平均直径（ｍｍ）で表わしている。
【００６９】
（表ＩＩ）
ｒＰｈｌ  ｐ  ６に対するマウス抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６又は抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６  ａａ３１−１１０抗血清のＩｇＧ１反応性。
【００７０】
【表１】
2011236217.tif 000003
2011236217.tif 000004
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2011236217.tif 000006
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【００７１】
【表２】
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【００７２】
【表３】
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【図１】
2011236217.tif 000010
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年7月14日(2011.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子であって、該Ｐｈｌ  ｐ  ６分子はＮ末端又はＣ末端でトランケートされることにより該分子がＩｇＥ結合能を欠如している、低刺激性免疫原性分子。
【請求項２】
Ｐｈｌ  ｐ  ６分子がＮ末端でトランケートされている、請求項１に記載の免疫原性分子。
【請求項３】
Ｐｈｌ  ｐ  ６分子がＣ末端でトランケートされている、請求項１に記載の免疫原性分子。
【請求項４】
組換え手法によって生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性分子。
【請求項５】
ペプチド合成化学によって生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性分子。
【請求項６】
Ｉ型アレルギーに罹患している哺乳類個体の減感作において使用される薬剤の調製のため、又はＩ型アレルギーの生体内診断において使用される試薬の調製のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性分子の使用。
【外国語明細書】
2011236217000001.pdf