(57)【要約】【課題】抗体を修飾した電気化学発光物質内包リポソームと電極基板に固定された抗原との結合反応の立体障害を抑制し、高いシグナルが得られる免疫センサを提供する。【解決手段】複数の標識物質を内包してその表面に抗体が配置された集合体を用いて抗原抗体反応を測定するための免疫センサにおいて、前記集合体を捕捉するための作用電極と前記作用電極に電界を与えるための対電極とを備え、前記作用電極表面に前記集合体を捕捉するための抗体を設けた格子状の電極層を電気的に接続した免疫センサ。【選択図】図１
2011080784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の標識物質を内包してその表面に抗体が配置された集合体を用いて抗原抗体反応を測定するための免疫センサにおいて、
前記集合体を捕捉するための作用電極と前記作用電極に電界を与えるための対電極とを備え、
前記作用電極表面に前記集合体を捕捉するための抗体を設けた格子状の電極層を電気的に接続した免疫センサ。
【請求項２】
前記電極層は、直径が１から１００μｍまで繊維を織った織布に導電層を形成し、前記導電層に前記抗体を設けた請求項１に記載の免疫センサ。
【請求項３】
前記繊維はＰＥＴからなり、前記ＰＥＴ表面に設けられたＮｉ層とそのＮｉ層の表面に形成されたＡｕ層とからなる導電層を有する請求項２に記載の免疫センサ。
【請求項４】
複数の標識物質を内包してその表面に抗体が配置された集合体を用いて抗原抗体反応を測定するための免疫センサにおいて、
前記集合体を捕捉するための複数の抗体が形成された作用電極と前記作用電極に電界を与えるための対電極とを備え、
前記作用電極表面に少なくとも一つ以上の凹部を有する免疫センサ。
【請求項５】
前記凹部が溝であり、且つその断面が半径１０ｎｍ〜１００μｍの円形状である請求項４に記載の免疫センサ。
【請求項６】
前記凹部が半球状の窪みであり、且つ且つその断面が半径１０ｎｍ〜１００μｍの円形状である請求項４に記載の免疫センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学発光物質を内包した集合体を用いた免疫分析における免疫センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体標識法は、抗体に酵素、蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質等の標識物質を結合した標識抗体を被検抗原と結合反応させ、被検抗原濃度に応じて結合した標識抗体から発せられるシグナルを検出することで被検抗原を定量する免疫分析方法である。
【０００３】
抗体に酵素を標識した酵素標識抗体を用いる酵素免疫分析方法は、酵素が有する基質に対する触媒活性の高さから容易に高感度分析できる。しかしながら、酵素の安定性や、抗体に対して酵素の分子サイズが大きいことにより、抗原抗体反応の立体阻害を生じてしまう。そのため、近年では、分子サイズが小さくかつ比較的安定なトリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体を抗体に標識した電気化学発光免疫分析方法が用いられている。この方法では、電極に電圧を印加して電極表面のごく近傍の電解質溶液に電位勾配を与えることにより酸化・還元反応を起こさせ、溶液内のイオンが電極への吸着、拡散を繰り返す。これらの酸化・還元反応の際に、電気化学発光物質は励起され、この励起状態から基底状態に戻る際に発光反応を起こす。この発光を計測することで免疫分析を行う。
【０００４】
この方法は、標識物質自体の発光を計測するため、極低濃度の被検抗原を検出する場合には、高精度で複雑な光学系を必要とする。そのため、リポソーム表面に抗体を修飾させた数十〜数百ｎｍの粒径を有する電気化学発光物質内包リポソームを標識剤に用いることでシグナルを上げる方法が用いられている。この方法では、まず、被検抗原と、抗体を修飾した電気化学発光物質内包リポソーム、及び作用電極に抗原を固定した免疫センサを準備し、電極基板上で、電気化学発光物質内包リポソームに対し、被検抗原と作用電極に固定された抗原とで競合反応させる。次いで、電極基板上に固定された抗原に結合した電気化学発光物質内包リポソームを破壊して、漏出された電気化学発光物質の電気化学発光強度を測定し、その電気化学発光強度に基づいて被検抗原を定量する。
【０００５】
この際に用いられる免疫センサ基板には、抗原と特異的に結合できる結合部位を少なくとも含む化学物質が固定された作用電極、作用電極と共に電解質溶液に電位勾配を与えるための対電極、および作用電極−対電極間の電解質溶液に一定の電圧を印加するための参照電極が含まれている。これらの電極は、ガラス基板等の電気絶縁基板上に接着層（Ｔｉ、Ｃｒ等）電極層（Ａｕ等）の２層構造で構成され、接着層及び電極層は、スパッタや蒸着法を用いて成膜される。したがって、抗原抗体反応が行われる作用電極は、平滑な表面を有したものが用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１０１３３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、免疫分析を行うと、電気化学発光物質内包リポソームが大きいので、電極基板に固定された化学物質と結合するときに、電気化学発光物質内包リポソーム同士で立体障害を生じてしまう。そのため、シグナル感度が低下して正確な測定ができないという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、抗体を修飾した電気化学発光物質内包リポソームと電極基板に固定された抗原との結合反応の立体障害を抑制し、高いシグナルが得られる免疫センサを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明の免疫センサは、複数の標識物質を内包してその表面に抗体が配置された集合体を用いて抗原抗体反応を測定するための免疫センサにおいて、前記集合体を捕捉するための作用電極と前記作用電極に電界を与えるための対電極とを備え、前記作用電極表面に前記集合体を捕捉するための抗体を設けた格子状の電極層を電気的に接続したことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫センサによれば、電気化学発光物質内包リポソームが作用電極に固定化された化学物質に結合する際に、作用電極表面に立体障害を抑制する構造を有しているので、高いシグナルを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施の形態１における免疫センサの全体図
【図２】本発明の実施の形態１における凹部の断面図
【図３】本発明の実施の形態１における凹部の製造工程図
【図４】本発明の実施の形態１におけるメッシュの凹部のパターン図
【図５】本発明の実施の形態１における効果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の免疫センサの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１３】
（実施の形態１）
＜電極の構成、製造方法＞
図１は、本発明の実施の形態１における免疫センサの全体図を示す。図１において、１０１は免疫センサであり、電極絶縁基板１０２上に、作用電極１０３、対電極１０４、参照電極１０５、および電極パット１０６が形成されている。１０７は凹部であり、作用電極１０３上に形成されている。本実施例では、電極絶縁基板１０２に０．７ｍｍ厚のガラス板（縦横２０ｍｍ×４０ｍｍ）を用いた。
【００１４】
作用電極１０３はφ３ｍｍの円形状であり、この作用電極１０３上の凹部１０７に抗体が固定されている。対電極１０４は、作用電極１０３との間に電圧を印加するためのものであり、参照電極１０５は、作用電極１０３と対電極１０４との間に電解液を介して印加された電圧を一定にするためのものである。電極パッド１０６は、装置側の電極プローブと作用電極１０３、対電極１０４、参照電極１０５を電気的に接続するための配線である。この電極パッド１０６を通して、外部の装置から各電極に電圧印加や測定信号の取得を行う。
【００１５】
これらの作用電極１０３、対電極１０４、参照電極１０５および電極パッド１０６は、導電性を持つ金属薄膜から成る。その作製には、スパッタ装置により、電極絶縁基板１０２上に接着層としての膜厚１０ｎｍのチタン層を設け、その表面に膜厚５００ｎｍの金を形成し電極層を作製する。
【００１６】
図２は、本発明の第１の実施の形態における二種類の凹部パターン図を示す。第一の凹部パターン２０１は、作用電極１０３上に形成した複数の平行微細溝を凹部１０７とし、その断面を半円形状にしたものである。この平面図と凹部の断面図を図２（Ａ）に示す。本実施例では、凹部１０７を形成する半円の半径を１０ｎｍ〜１００μｍとした。このような凹部パターンを設けることで、抗原抗体反応時の電気化学発光物質内封リポソーム同士の距離が広がり、立体障害が抑制できる。
【００１７】
また、第二の凹部パターン２０２は、作用電極１０３上に半球形の窪みからなる凹部１０７を複数設けたものである。この平面図と凹部の断面図を図２（Ｂ）に示す。本実施例では、凹部１０７を形成する半球の半径を１０ｎｍ〜１００μｍとした。このような凹部パターンを設けることで、抗原抗体反応時の電気化学発光物質内封リポソーム同士の距離が広がりることで、立体障害が抑制できる。
【００１８】
図３に、本発明の実施の形態１における第一の凹部パターン２０１の製造工程図を示す。図３（Ａ）は露光工程である。最初に、作用電極１０３、対電極１０４、及び参照電極１０５が成膜された電極絶縁基板１０２の表面に光感光性フォトレジスト３０１を塗布する。本実施例では、Ｓｈｉｐｌｅｙ社製ポジ型フォトレジスト１３５０Ｊをスピナーにより回転数５０００ｒｐｍで３０秒間、スピンコートした。塗布したフォトレジスト３０１の膜厚を測定した結果、１．５μｍであった。その後、熱対流式オーブンを用いて、９０℃で２０分間プリベークをした。次に、第一の凹部パターン２０１が描かれているフォトマスク３０２をフォトレジスト３０１上に密着させ、フォトマスク３０２側から２０秒間、ＵＶ光を照射し露光した。このとき、フォトレジスト３０１は、フォトマスク３０２の光透過部３０３下に位置するレジスト露光部３０４のみが露光される。
【００１９】
図３（Ｂ）は、現像工程である。スピンコートしたフォトレジスト３０１をレジスト専用現像液に浸漬させることで、レジスト露光部３０３のみを溶解させ、フォトレジスト３０１にライン＆スペースのパターンを転写する。その後、ポストベークとして対流式オーブンを用いて１２０℃で２０分間ベークした。
【００２０】
図３（Ｃ）は、エッチング工程である。現像後の電極絶縁基板１０２をエッチング液（ＫＩ４ｇ＋Ｉ2１ｇ＋Ｈ2Ｏ４０ｍｌ）に３０秒間浸漬することで、露出している露出部３０５の金薄膜をエッチングし、断面が円形となる凹部１０７が形成できる。
【００２１】
図３（Ｄ）は、レジスト除去工程である。エッチング後の電極絶縁基板１０２を、アセトンに１分間浸漬することで電極絶縁基板上１０２上に残留しているフォトレジスト３０１を除去する。
【００２２】
以上の工程により、電極絶縁基板１０２の作用電極１０３上に第一の凹部パターン２０１を有する凹部１０７を形成することができる。また、第二の凹部パターン２０２の作製も露光工程でのフォトマスク３０２を第一の凹部パターン２０２用に代え、エッチング時間を適宜調節することで、断面が円形となる凹部１０７が形成できる。
【００２３】
なお、本実施例では、二つの凹部パターンの例を示したが、図４に示すメッシュ状凹部パターンでも良い。すなわち、抗原抗体反応時の電気化学発光物質内封リポソーム同士の距離が広がるような凹部を作用電極１０３上に設けることが重要である。
【００２４】
図４は、第三の凹部パターンであるメッシュで作製した凹部パターンを示す。図４の凹部１０７は、作用電極１０３上にメッシュ電極層が形成されている。このメッシュ電極層は、メッシュ電極を作用電極１０３上に半田付けして電気的に接続する。
【００２５】
メッシュ電極層は、ＰＥＴ織布の表面に無電解ニッケルめっきでニッケルを成膜した後に、ニッケル表面に金を置換型無電解金めっきで成膜することで電極層を作製する。１０７は、メッシュの凹部である。本実施例では、織布材料に直径が１から１００μｍまでのＰＥＴ繊維を織った織布ＰＥＴを用いたが、金属やプラスチック等無電解めっきが可能なものであればよい。
【００２６】
以下に、メッシュ電極層の形成方法を説明する。まず、作用電極１０３とほぼ同形状のＰＥＴ織布を塩化第一スズ１０ｇ／Ｌと塩酸２０ｍＬ／Ｌを含んだ液に浸漬し、樹脂部分を溶出させ水洗する。次に、このＰＥＴ織布を塩化パラジウム１ｇ／Ｌ塩酸２０ｍＬ／Ｌを含んだ液に浸漬して、触媒化を行い水洗した。次に、硫酸ニッケルめっき液を８０℃に加熱して１時間浸漬後、水洗及び乾燥させることにより厚さ５μｍのニッケル層が得られる。別途、亜硫酸金ナトリウム３ｇ／Ｌ、亜硫酸アンモニウム３０ｇ／Ｌ、エチレンジアミン４酢酸２カリウム３０ｇ／Ｌおよびトリエタノールアミン５ｇ／Ｌを含む置換型無電解金めっき液を調整して置き、この置換型無電解金めっき液を８５℃に保つ。このめっき液中にニッケル層を有するＰＥＴ織布を１０分間浸漬することにより、厚さ４０μｍの金層を持つメッシュ電極が得られる。こうして得られたメッシュ電極を作用電極１０３上に設置し、作用電極１０３の電極パッド１０６と金めっき済みＰＥＴ織布を半田付けして接続固定する。
【００２７】
以上のようにして作製されたメッシュ電極を持つ免疫センサと、従来の免疫センサとの感度比較を次のように行った。
【００２８】
＜金属錯体内包リポソームを用いた免疫分析方法＞
本発明の免疫センサは、リポソーム内に金属錯体を内包した金属錯体内包リポソームを用いた免疫分析を行う際に使用される。以下に、金属錯体内包リポソームを用いた免疫分析方法（以下、免疫分析方法と略す。）について説明する。
【００２９】
本発明の免疫センサで行われる免疫分析方法は、検体液または検体液を調整した被検抗原含有液と、抗体を表面に結合させたルテニウム（２＋）錯体を内包したリポソーム含有液を、電極に固定した抗原と競合反応させることにより実施される。競合反応により、リポソームは被検抗原の濃度に依存して電極に結合する。次に、電極上に結合したリポソームを破壊すると、リポソームに内包されたルテニウム（２＋）錯体が漏れ出し、電極に吸着する。このとき、電極を加熱することにより吸着を促進させることができる。その後、緩衝液で電極を洗浄することで、電極上に残っているリポソームを除去する。さらに、吸着させたルテニウム（２＋）錯体に電解液を加え、電圧を印加して電解発光させる。その発光強度を測定し、予め抗原の標準品を用いて同様の操作により作成した検量線を基に検体液中の被検抗原を定量する。
【００３０】
検体液および被検抗原は特に限定するものではない。検体液は、必要であれば蒸留水または緩衝液を用いて、濃縮、希釈または溶解して使用する。このとき、緩衝液はリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す。）、トリス―塩酸緩衝液（以下、ＴＢＳと略す。）等を用いる。
【００３１】
本発明の免疫センサを使用したリポソーム内包法で用いられるルテニウム（２＋）錯体としては、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体を基本構造とする、金電極への吸着能が高いチオール基、ジスルフィド基およびアミノ基を有する側鎖を持つ錯体を使用する。以下、本発明の免疫センサを使用した免疫分析方法で用いられるルテニウム（２＋）錯体の例としては、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（２＋）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（２＋）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（２＋）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（２＋）錯体が挙げられる。
【００３２】
本発明の免疫センサを使用した免疫分析法で用いられるリポソームは、多重層膜リポソーム、一枚膜リポソームいずれでもよく、好ましくは一枚膜リポソームである。リポソームは、必要に応じて修飾された不活性または負に帯電したリン脂質、（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等を使用し、ルテニウム（２＋）錯体含有液の存在下、常法により調整することができ、各種架橋剤を使用し、ハプテン化、さらには抗体を会合させ、抗原を表面に結合させて調整する。ハプテン化、抗体の会合は、抗原に応じて公知の方法により行うことができる。
【００３３】
本発明の免疫センサ上に予め抗原を固定する。この固定も、固定すべき物質に応じて公知の方法により行うことができる。
【００３４】
本発明の免疫センサ上において、被検抗原と、抗体を結合させたルテニウム（２＋）錯体を内包したリポソームとの電極上に固定した抗体に対する競合反応は、通常、４℃〜室温において、５〜１２０分間行う。
【００３５】
次に、緩衝液等で電極を洗浄後、プロパノールを添加して、電極上に結合したリポソームを破壊してルテニウム（２＋）錯体を漏出させ、電極に吸着させる。このとき、電極を３０〜６０℃に加熱し、５〜６０分間静置し、ルテニウム（２＋）錯体の電極への吸着を促進する。吸着後、緩衝液等で洗浄し、リポソームを除去する。
【００３６】
洗浄後、トリエチルアミンを含有する電解液を添加して、電圧を印加し、電解発光させ、その発光強度を測定し、被検抗原を定量する。
【００３７】
以下、本発明の免疫センサを使用したリポソーム内包法で用いられるルテニウム（２＋）錯体の例としては、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−｛４，４’−ビス［フタルイミノブチル］−２，２’−ビピリジン｝ルテニウム（２＋）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−アミノブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（２＋）錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）−（４−アミノブチル−４’−メチル−２，２’−ビピリジン）ルテニウム（２＋）錯体またはビス（２，２’−ビピリジン）−［４，４’−ビス（４−メルカプトブチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（２＋）錯体が挙げられる。
【００３８】
本発明の免疫センサを使用した免疫分析法で用いられるリポソームは、多重層膜リポソーム、一枚膜リポソームいずれでもよく、好ましくは一枚膜リポソームである。リポソームは、必要に応じて修飾された不活性または負に帯電したリン脂質、（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等を使用し、ルテニウム（２＋）錯体含有液の存在下、常法により調整することができ、各種架橋剤を使用し、ハプテン化、さらには抗体を会合させ調整する。ハプテン化、抗体の会合は、抗原に応じて公知の方法により行うことができる。
【００３９】
本発明の免疫センサ上に予め抗原を固定する。この固定も、固定すべき物質に応じて公知の方法により行うことができる。
【００４０】
本発明の免疫センサ上において、被検抗原と、抗体を結合させたルテニウム（２＋）錯体を内包したリポソームとの電極上に固定した抗体に対する競合反応は、通常、４℃〜室温において、５〜１２０分間行う。
【００４１】
次に、緩衝液等で電極を洗浄後、プロパノールを添加して、電極上に結合したリポソームを破壊してルテニウム（２＋）錯体を漏出させ、電極に吸着させる。このとき、電極を３０〜６０℃に加熱し、５〜６０分間静置し、ルテニウム（２＋）錯体の電極への吸着を促進する。吸着後、緩衝液等で洗浄し、リポソームを除去する。
【００４２】
洗浄後、トリエチルアミンを含有する電解液を添加して、電圧を印加し、電解発光させ、その発光強度を測定し、被検抗原を定量する。
【００４３】
＜リポソームの調整＞
発明の免疫センサを使用した免疫分析方法で用いられるリポソームの調整方法について以下に説明する。
【００４４】
１０μｍｏｌ（６．９２ｍｇ／７００μＬ（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ＝９：１））のホスファチジルエタノールアミンジパルミトイル（以下、ＤＰＰＥと略す。）と、１２μｍｏｌ（３．７５ｍｇ／３００μＬ（ＣＨ3ＯＨ））のＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、ＳＰＤＰと略す。）さらに、３０μｍｏｌ（２．８μＬ／２００μＬＣＨＣｌ3））のトリエチルアミンを加え、室温で２時間攪拌しながら反応させた。ついで、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ加え、攪拌後、振とうすると２層に分かれるので、その水層を除去した。この操作を３回繰り返した後、得られた下層（クロロホルム層）をＮ2気流下でエバポレートし、溶媒を留去した。得られた活性型のＮ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニル  ジパルミトイル  ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＤＴＰ−ＤＰＰＥと略す。）を濃度が４ｍＭになるようにクロロホルム：メタノール＝９：１溶液で溶解した。
【００４５】
次に、ホスファチジルコリンジパルミトイル（以下、ＤＰＰＣと略す。）１０μｍｏｌ、コレステロール５μｍｏｌ、ＤＴＰ−ＤＰＰＥ０．１５μｍｏｌから脂質フィルムを形成し、前述した方法で合成したルテニウム（２＋）錯体（５ｍＭ）を含む１ｍＬＰＢＳ加え水和し、多重層リポソーム（以下、ＭＬＶと略す。）を得た。超音波を１０分間照射し、さらに遠心によりチタンを取り除いた後、ゲル濾過クロマトグラフィー、蛍光強度測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ）を行い、目的の一枚膜リポソーム（以下、ＳＵＶと略す。）を得た。
【００４６】
１ｍｇ（５．２×１０-9ｍｏｌ）／１ｍＬ（ＰＢＳ）のＢＳＡ抗体（コスモ・バイオ株式会社製）に、２０ｍＭのＳＰＤＰ架橋剤１．３μＬ（２．６×１０-8ｍｏｌ）を加え、室温で３０分間インキュベートした。この反応溶液を３日間４℃で透析した。透析は酢酸緩衝液生理食塩水（ｐＨ４．５）で行った。
【００４７】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ：５×１０-5Ｍ）と活性化ＢＳＡ抗体（２００μｇ／ｍＬ＝１．３３×１０-6Ｍ）を窒素雰囲気下、室温で２４時間反応させた。ついで、ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出して、遊離した抗体を除去し、ＢＳＡ抗体結合リポソームを得た。
【００４８】
＜ＢＳＡの測定＞
本発明の効果を検証するために、本発明の免疫センサ（実施例）と従来の電極（比較例）を用いて、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す。）を測定した。以下に、実験手順の詳細を記す。
【００４９】
電極を室温でピラニア液（濃ＨＯ4：Ｈ2Ｏ2（３０％）＝３：１）４μＬで１分間洗浄後、蒸留水で洗浄した。この電極をジチオジブチリック酸溶液（７１．５ｍｇ／３０ｍＬエタノール）に浸漬し、１２時間室温で攪拌することにより電極表面にＡｕ−Ｓ結合を形成し、その後エタノールで洗浄した。電極表面に結合したカルボキシル基を活性化するために、水溶性カルボジイミド（以下、ＷＳＣと略す。）５０ｍｇおよびＮ−ヒドロ  キシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと略す。）３０ｍｇ／１０ｍＬ  ＰＢＳの溶液に室温で６０分間電極を浸漬し、その後ＰＢＳで洗浄した。ＢＳＡ０．２ｍｇ／１０ｍＬ  ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液に電極を加え、４℃で１５時間静置した後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液で洗浄した。
【００５０】
このようにして得たＢＳＡ固定電極に、前述した方法で調整したＢＳＡ抗体結合リポソームＰＢＳ溶液５μＬと各種濃度のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２５μＬを加え、室温で１時間インキュベートして競合的な抗原抗体反応を行った。その後、電極上に残ったリポソームを除去するために、電極をＰＢＳで洗浄した。
【００５１】
この電極に７μＬのエタノールを加え電極上に結合したリポソームを破壊した後、６０℃で１０分間加熱した。この電極を室温で１０分間放置し、ＰＢＳで洗浄した。
【００５２】
次に、電極に電解液（０．０５Ｍトリエチルアミン含有０．１Ｍ  ＰＢＳ）を６０μＬ加えた後、＋１．２Ｖ（ｖｓ．参照電極）を印加し、電解発光測定を行った。
【００５３】
本発明の免疫センサ（実施例）と従来の電極（比較例）を用いて、同一の試料を、同一の条件下において、その電気化学発光測定をした。８種類のＢＳＡ濃度１〜３０００ｐｇ／ｍＬについて測定した結果を表１に記す。
【００５４】
【表１】
2011080784.tif 000003
【００５５】
図５は、本発明の第１の実施の形態における有効性の確認実験の結果を示す。表１と図５に示した実験結果より、実施例のシグナル（発光カウント数）は、比較例の同濃度のそれと比較して、約１．５倍程度高い値を示している。また、実施例のＲ2値が０．９２に対して、比較例のそれと比較して０．８８に良化していることから、得られた検量線の精度が向上したことを示している。これは、本発明による実施例が、結合反応の立体障害を抑制することで、比較例に比べて、正確かつ高いシグナルが得られたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明にかかる免疫センサは、電気化学発光物質内封リポソームを標識剤とした競合免疫分析において、抗原が固定化された作用電極を立体障害の影響を抑制する構造を有することで、高いシグナルかつ正確な測定結果を得ることができる免疫センサとして有用である。
【符号の説明】
【００５７】
１０１  免疫センサ
１０２  電極絶縁基板
１０３  作用電極
１０４  対電極
１０５  参照電極
１０６  電極パッド
１０７  凹部
２０１  シリンドリカル部
２０２  ディンプル部
３０１  フォトレジスト
３０２  フォトマスク
３０３  光透過部
３０４  レジスト露光部
３０５  露出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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