(57)【要約】【課題】親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合でも良好な分離を実現可能な親水性有機化合物の分離方法、および親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤の提供。【解決手段】本発明の親水性有機化合物の分離方法では、下記一般式（Ｉ）で表される官能基（ただし、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3は、炭素数１〜１１の炭化水素基、または、前記炭化水素基の一部がアルコキシ、カルボニル、アミノ、アミド、およびカルボキシから選ばれる１種または２種以上の原子団で置換されるか、前記原子団が炭素鎖中に挿入されたもの。）によってシリカゲルの表面が修飾されてなる表面改質シリカゲルを固定相とし、親水性相互作用クロマトグラフィー法で、原料から親水性有機化合物を分離する。2011007731.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される官能基（ただし、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3は、炭素数１〜１１の炭化水素基、または、前記炭化水素基の一部がアルコキシ、カルボニル、アミノ、アミド、およびカルボキシから選ばれる１種または２種以上の原子団で置換されるか、前記原子団が炭素鎖中に挿入されたもの。）によってシリカゲルの表面が修飾されてなる表面改質シリカゲルを固定相とする親水性相互作用クロマトグラフィー法により、親水性有機化合物を含有する原料から前記親水性有機化合物を分離する
ことを特徴とする親水性有機化合物の分離方法。
【化１】
2011007731.tif 000004
【請求項２】
前記表面改質シリカゲルが、２級アミノ基を有するシランカップリング剤でシリカゲルの表面を改質することにより、シリカゲルの表面に前記２級アミノ基を導入した後、前記２級アミノ基と無水ジカルボン酸を結合させてなるものである
ことを特徴とする請求項１に記載の親水性有機化合物の分離方法。
【請求項３】
前記シランカップリング剤が、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルジメチルメトキシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルメチルジメトキシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルシシラントリオール、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン、Ｎ−３−〔アミノ（ポリプロピレンオキシ）〕アミノプロピルトリメトキシシラン、１，３−ビス（２−アミノエチルアミノメチル）−テトラメチルジシロキサン、ｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、ｔ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノメチルトリメトキシシラン、およびＮ−フェニルアミノプロピルトリメトキシシランの中から選ばれる一種または二種以上である
ことを特徴とする請求項２に記載の親水性有機化合物の分離方法。
【請求項４】
前記無水ジカルボン酸が、無水コハク酸、無水マレイン酸、およびグルタル酸無水物の中から選ばれる一種または二種以上である
ことを特徴とする請求項２または請求項３に記載の親水性有機化合物の分離方法。
【請求項５】
下記一般式（Ｉ）で表される官能基（ただし、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3は、炭素数１〜１１の炭化水素基、または、前記炭化水素基の一部がアルコキシ、カルボニル、アミノ、アミド、およびカルボキシから選ばれる１種または２種以上の原子団で置換されるか、前記原子団が炭素鎖中に挿入されたもの。）によってシリカゲルの表面が修飾されてなる表面改質シリカゲルを備えてなる親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤。
【化２】
2011007731.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性有機化合物の分離方法、および親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィー法は、医薬品、化粧品および電子材料など、有用な有機化合物を高純度で得るための精製方法として有用であり、クロマトグラフィー法による精製は多くの分野で工業的に実施されている。
【０００３】
このクロマトグラフィー法としては、順相、逆相、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーなど多くの方法が開発され、充填剤としては、シリカゲルまたはその表面処理品、アルミナ、活性炭、イオン交換樹脂および多糖類などが使用されている。
【０００４】
分離対象とされる有用な有機化合物は、脂溶性化合物と水溶性化合物に大別されるが、脂溶性物質では、主にシリカゲルを使用した順相クロマトグラフィーが使用される。また、水溶性物質では、シリカゲルにアルキル基を有する疎水性シランカップリング剤を導入したもの（例えば、ＯＤＳ（オクタデシルシラン）シリカゲル）を使用した逆相クロマトグラフィーや、イオン交換樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィーが使用される。
【０００５】
中でも逆相クロマトグラフィーは高分解能であり、移動相に水または緩衝剤を含む水溶液と有機溶媒の混合溶液を用いることから、高極性化合物の試料が溶解しやすいといった特徴がある。
【０００６】
ところで、近年、蛋白質、ペプチドおよび核酸などを基材とした医薬品が多く開発されている。しかし、糖類、核酸塩基、ペプチドのように極度に親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合、従来の充填剤では保持力が低く、分離操作が難しいといった問題があった。
【０００７】
また、有用物質の分離精製には順相クロマトグラフィーが多く用いられてきたが、これは移動相に非水系の有機溶媒を用いるため、親水性の化合物の中にはこの種の溶媒系に溶解しないものがあり、分離操作ができないといった問題もあった。
【０００８】
こうした問題に対し、近年、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）に関する研究が増加している。これは、水と有機溶剤の混合溶液と、それより高極性の固定相を用いる分離方法である。
【０００９】
この親水性相互作用クロマトグラフィーの場合、移動相が水系であるため、高極性の親水性化合物も溶解、分析できるという特徴がある。また、固定相としては、未処理シリカ、アミノプロピル基、アミド基、ジオール、シアノ基、ポリスクシンイミド誘導体、双性イオン、シクロデキストリンのような多様な高極性官能基で修飾されたシリカゲルが対応可能である（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１０】
中でも、分子内にアンモニウムカチオンとスルホン酸アニオンの両方を持つスルフォアルキルベタインを重合修飾した双性イオンタイプのシリカゲルが有効である（例えば、非特許文献文献２〜６参照。）。
【００１１】
また、シリカゲル上にコリンを導入して４級アミンとリン酸のベタイン構造を有する双極イオンタイプもある（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−２５８０１３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hemstrom,P.;Irgum,K. J.Sep.Sci.2006,29,1784-1821
【非特許文献２】Oertel,R.;Renner,U.;Kirch,W. J.Pharm.Biomed.Anal.2004,35,633-638
【非特許文献３】Bengtsson,J. ;Jansson,B. ;Hammarlund-Udenaes,M. Rapid Commun.Mass Spectrom. 2005,19,2116-2122
【非特許文献４】Oertel,R.;Neumeister,V.;Kirch,W. J.Chromatogr.A 2004,1058,197-201
【非特許文献５】Idborg,H.;Zamzni,L.;Edlund,P.O.;Schuppe-Koistinen,I.;Jacobsson,S. J.Chromatogr.B 2005,828,9-13
【非特許文献６】Hagglund,P.;Matthiesen,R.;Elortza,F.;Hojrup,P.;Roepstorff,P.;Jensen,O.M.Bunkenborg,J. J.Proteome Res.2007,6,3021-3031
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、上述したような双性イオンタイプのシリカゲルは、表面修飾の工程が煩雑で非常に高価なものとなるため、特殊な分析用途で使用されるのみに留まっていた。
そのため、医薬品を開発する企業など、極度に親水性の高い高極性化合物を分離対象として扱う技術分野では、従来よりも低コストで良好な分離ができる技術の開発が望まれていた。
【００１５】
このような背景のもと、本件発明者らは、親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、高極性の親水性化合物の分離を良好に行うことができる材料を鋭意検討して探求した。その結果、特定の官能基で表面を修飾したシリカゲルを充填剤として使用することで、親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて良好な分離が得られることを見出した。
【００１６】
本発明は、上記のような知見に基づいて完成されたものであり、その目的は、比較的親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合でも良好な分離を実現可能な親水性有機化合物の分離方法、および親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
以下、本発明において採用した構成について説明する。
本発明の親水性有機化合物の分離方法は、下記一般式（Ｉ）で表される官能基（ただし、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3は、炭素数１〜１１の炭化水素基、または、前記炭化水素基の一部がアルコキシ、カルボニル、アミノ、アミド、およびカルボキシから選ばれる１種または２種以上の原子団で置換されるか、前記原子団が炭素鎖中に挿入されたもの。）によってシリカゲルの表面が修飾されてなる表面改質シリカゲルを固定相とする親水性相互作用クロマトグラフィー法により、親水性有機化合物を含有する原料から前記親水性有機化合物を分離することを特徴とする。
【００１８】
【化１】
2011007731.tif 000002
この親水性有機化合物の分離方法において、表面改質シリカゲルの表面を修飾する官能基は、カルボキシ基および３級アミン相当の分子構造を含む官能基で、これは双性イオンタイプの官能基である。このような官能基で表面が修飾されたシリカゲルを使用すると、比較的親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合でも、親水性相互作用クロマトグラフィー法により、良好な分離を実現することができる。
【００１９】
この事実は、本件発明者らが多くの実験を重ねる中で見いだしたものであり、その効果は後述する実験例を見れば明らかとなる。なお、このような表面改質シリカゲルを親水性相互作用クロマトグラフィーにおける充填剤として利用して親水性有機化合物の分離を行う事例は、過去に報告されたことがない。
【００２０】
このような表面改質シリカゲルは、２級アミノ基を有するシランカップリング剤でシリカゲルの表面を改質することにより、シリカゲルの表面に前記２級アミノ基を導入した後、下記の化学式（II）に示すように、前記２級アミノ基と無水ジカルボン酸を結合させることで得ることができる。
【００２１】
【化２】
2011007731.tif 000003
このような２級アミノ基を有するシランカップリング剤としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルジメチルメトキシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルメチルジメトキシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルシシラントリオール、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン、Ｎ−３−〔アミノ（ポリプロピレンオキシ）〕アミノプロピルトリメトキシシラン、１，３−ビス（２−アミノエチルアミノメチル）−テトラメチルジシロキサン、ｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、ｔ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノプロピルトリメトキシシランなどを挙げることができる。これらは単独で一種だけを使用してもよいし、必要があれば二種以上を使用してもよい。
【００２２】
これらのシランカップリング剤を使用した場合であれば、上記一般式（Ｉ）で表される官能基のうち、−Ｒ1−は、−ＣＨ2（ＣＨ（ＣＨ3））ＣＨ2−、−Ｃ2Ｈ4（Ｃ6Ｈ4）ＣＨ2−、−Ｃ3Ｈ6−、−ＣＨ2−、−Ｃ11Ｈ22−などになる。
【００２３】
また、−Ｒ2は、−Ｃ2Ｈ4（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ2Ｈ4（ＣＯＯＨ）、−Ｃ2Ｈ4（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）、−Ｃ2Ｈ4（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ3Ｈ6（ＣＯＯＨ）、−Ｃ6Ｈ12（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ2Ｈ4（ＣＯＯＨ）、−Ｃ6Ｈ12（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）、−Ｃ6Ｈ12（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ3Ｈ6（ＣＯＯＨ）、−（ＣＨ（ＣＨ3））ＣＨ2（ＣＨ2（ＣＨ（ＣＨ3））Ｏ）2（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ2Ｈ4（ＣＯＯＨ）、−（ＣＨ（ＣＨ3））ＣＨ2（ＣＨ2（ＣＨ（ＣＨ3））Ｏ）2（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ2Ｈ2（ＣＯＯＨ）、−（ＣＨ（ＣＨ3））ＣＨ2（ＣＨ2（ＣＨ（ＣＨ3））Ｏ）2（ＮＨ）（ＣＯ）Ｃ3Ｈ6（ＣＯＯＨ）、−（ｎ−Ｃ4Ｈ9）、−（ｔ−Ｃ4Ｈ9）、−ＣＨ3、−（Ｃ6Ｈ5）などになり、−Ｒ3−は、−Ｃ2Ｈ4−、−Ｃ2Ｈ2−、−Ｃ3Ｈ6−などとなる。
【００２４】
すなわち、上記Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3は、炭素数１〜１１の炭化水素基、または、この炭化水素基の一部がアルコキシ、カルボニル、アミノ、アミド、およびカルボキシから選ばれる１種または２種以上の原子団で置換されるか、前記原子団が炭素鎖中に挿入されたものである。これらＲ1，Ｒ2，Ｒ3中の炭素鎖は、一部または全部が直鎖、分枝、環式いずれでもよく、飽和していても不飽和であってもよく、例えば、一部または全部が芳香環となっていてもよい。
【００２５】
また、無水ジカルボン酸としては、無水コハク酸、無水マレイン酸、グルタル酸無水物などを挙げることができる。これらも単独で一種だけを使用してもよいし、必要があれば二種以上を使用してもよい。
【００２６】
ちなみに、１級アミノ基を有するシランカップリング剤を使用しても、同様の手法にて、カルボキシ基およびアミン相当の分子構造を持つ官能基でシリカゲル表面を修飾することはできる。しかし、この場合、最終的に得られる官能基が２級アミン相当の分子構造を持つ官能基となるため、塩基性が低くなって、その効果が小さくなるので、親水性相互作用クロマトグラフィー用の充填剤として使用することは難しくなる。
【００２７】
また、基材として使用されるシリカゲルは、クロマトグラフィー用に使用される表面積、細孔容積、平均細孔径および平均粒子径を有するものであればよい。例えば、表面積としては２０ｍ2／ｇから７００ｍ2／ｇ程度、細孔容積としては０．３ｍｌ／ｇから１．５ｍｌ／ｇ程度、平均細孔径としては３ｎｍから１００ｎｍ程度、平均粒子径としては３μｍ、５μｍ、１０μｍ、３０μｍ、６０μｍ、１００μｍ、５００μｍ程度のものが好適である。
【００２８】
さらに、上記表面改質シリカゲルは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、カートリッジまたはガラスカラムによる中圧液体クロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、およびオープンカラムクロマトグラフィーにおいて使用できる。
【００２９】
特に、上記表面改質シリカゲルは、従来の充填剤とは異なり、ｐＨ調整のためのバッファーを使用することなく分離を行えるので、分離精製を主目的とする分取液体クロマトグラフィーにおいて利用すると好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（ａ）は実験例１のクロマトグラム、（ｂ）は実験例２のクロマトグラム。
【図２】（ａ）は実験例３のクロマトグラム、（ｂ）は実験例４のクロマトグラム。
【図３】（ａ）は実験例５のクロマトグラム、（ｂ）は実験例６のクロマトグラム。
【図４】（ａ）は実験例７のクロマトグラム、（ｂ）は実験例８のクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
次に、本発明の実施形態について一例を挙げて説明する。
［表面改質シリカの製造例（その１）］
市販の球状シリカゲル（商品名：SUPER PURE SILICA GEL、富士シリシア化学株式会社製、グレード：SPS 100-5ミクロン）１０ｇを、１８０℃で乾燥した後、冷却器および撹拌機を設置した２００ｍｌ三つ口フラスコに入れた。
【００３２】
ここにトルエン１００ｍｌを加え、スラリーを撹拌しながらｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン２．１ｇを加え、窒素雰囲気下で１１０℃３時間加熱撹拌した。冷却後、スラリーを吸引ろ過し、シリカゲルをトルエン２００ｍｌ、メチルアルコール２００ｍｌで洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥させ、アミノ化シリカゲルを１１ｇ得た。
【００３３】
３００ｍｌビーカーに３％無水コハク酸アセトニトリル溶液４０ｇを入れ、アミノ化シリカゲルを１０ｇ加え、室温で３時間撹拌した。その後スラリーを吸引ろ過し、次いでメチルアルコール６０ｍｌで洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥させ、目的とする表面改質シリカゲル（以下、表面改質シリカゲル（Ａ）と称する。）を１０．４ｇを得た。
【００３４】
得られた表面改質シリカゲル（Ａ）の成分分析を行ったところ、炭素分析でＣ＝９．１％、Ｎ＝１．０％、またＮａＯＨを加え、ＨＣｌ逆滴定で、ＣＯＯＨ量は０．４８ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００３５】
［実験例１：表面改質シリカゲル（Ａ）によるカラムの作成と評価（その１）］
上記表面改質シリカゲル（Ａ）試料３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、以下の条件で核酸塩基類の分離を行った。
【００３６】
カラム：表面改質シリカゲル（Ａ）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍベース）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：８５％アセトニトリル／１５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：ウラシル、アデニン、シトシン
その結果、図１（ａ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００３７】
［実験例２：表面改質シリカゲル（Ａ）によるカラムの作成と評価（その２）］
上記表面改質シリカゲル（Ａ）試料３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、以下の条件でペプチド類の分離を行った。
【００３８】
カラム：表面改質シリカゲル（Ａ）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍベース）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：８５％アセトニトリル／１５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
試料：Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
その結果、図１（ｂ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００３９】
［表面改質シリカの製造例（その２）］
市販の球状シリカゲル（商品名：SUPER PURE SILICA GEL、富士シリシア化学株式会社製、グレード：SPS 100-5ミクロン）１０ｇを、１８０℃で乾燥した後、冷却器および撹拌機を設置した２００ｍｌ三つ口フラスコに入れた。
【００４０】
ここにトルエン１００ｍｌを加え、スラリーを撹拌しながらＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、２．２ｇを加え、窒素雰囲気下で１１０℃３時間加熱撹拌した。冷却後、スラリーを吸引ろ過し、シリカゲルをトルエン２００ｍｌ、メチルアルコール２００ｍｌで洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥させアミノ化シリカゲルを１１ｇ得た。
【００４１】
３００ｍｌビーカーに３％グルタル酸無水物アセトニトリル溶液４０ｇを入れ、アミノ化シリカゲルを１０ｇ加え、室温で３時間撹拌した。その後スラリーを吸引ろ過し、次いでメチルアルコール６０ｍｌで洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥させ、目的とする表面改質シリカゲル（以下、表面改質シリカゲル（Ｂ）と称する。）を１０．４ｇを得た。
【００４２】
得られた表面改質シリカゲル（Ｂ）の成分分析を行ったところ、炭素分析でＣ＝１０．３％、Ｎ＝２．１％、またＮａＯＨを加え、ＨＣｌ逆滴定でＣＯＯＨ量は０．５９ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００４３】
［実験例３：表面改質シリカゲル（Ｂ）によるカラムの作成と評価（その１）］
上記表面改質シリカゲル（Ｂ）試料３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、実験例１と同様となる以下の条件で核酸塩基類の分離を行った。
【００４４】
カラム：表面改質シリカゲル（Ｂ）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍベース）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：８０％アセトニトリル／２０％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：ウラシル、アデニン、シトシン
その結果、図２（ａ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００４５】
［実験例４：表面改質シリカゲル（Ｂ）によるカラムの作成と評価（その２）］
上記表面改質シリカゲル（Ｂ）試料３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、以下の条件で有機酸類の分離を行った。
【００４６】
カラム：表面改質シリカゲル（Ｂ）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍベース）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：９５％アセトニトリル／５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：ソルビン酸、安息香酸、１−ナフトエ酸
その結果、図２（ｂ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００４７】
［実験例５：未処理のシリカゲルによるカラムの作成と評価（その１）］
市販の球状シリカゲル（商品名：SUPER PURE SILICA GEL、富士シリシア化学株式会社製、グレード：SPS 100-5ミクロン）３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、実験例１と同様となる以下の条件で核酸塩基類の分離を行った。
【００４８】
カラム：シリカゲル（未処理品）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍベース）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：８５％アセトニトリル／１５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：ウラシル、アデニン、シトシン
結果として、図３（ａ）のクロマトグラムに示されるように分離はされるが、シトシンの分離が悪かった。
【００４９】
［実験例６：未処理のシリカゲルによるカラムの作成と評価（その２）］
市販の球状シリカゲル（商品名：SUPER PURE SILICA GEL、富士シリシア化学株式会社製、グレード：SPS 100-5ミクロン）３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、実験例２と同様となる以下の条件でペプチド類の分離を行った。
【００５０】
カラム：シリカゲル（未処理品）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍ）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：８５％アセトニトリル／１５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
試料：Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
結果として、図３（ｂ）のクロマトグラムに示されるように保持が無く、分離できなかった。
【００５１】
［実験例７：未処理のシリカゲルによるカラムの作成と評価（その３）］
市販の球状シリカゲル（商品名：SUPER PURE SILICA GEL、富士シリシア化学株式会社製、グレード：SPS 100-5ミクロン）３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、実験例４と同様となる以下の条件で有機酸類の分離を行った。
【００５２】
カラム：シリカゲル（未処理品）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍ）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：９５％アセトニトリル／５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：ソルビン酸、安息香酸、１−ナフトエ酸
結果として、図４（ａ）のクロマトグラムに示されるように保持が無く、分離できなかった。
【００５３】
［表面改質シリカの製造例（その３）］
上記表面改質シリカの製造例（その１）において利用したｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシランに代えて、アミノプロピルトリメトキシシランを使用し、それ以外は上記表面改質シリカの製造例（その１）と同様の手順で操作を行い、比較例となる表面改質シリカゲル（以下、表面改質シリカゲル（Ｃ）と称する。）を得た。この表面改質シリカゲルの表面に存在する官能基は、２級アミン相当の分子構造を有するものの、３級アミン相当の分子構造を有する官能基は存在していない。
【００５４】
［実験例８：表面改質シリカゲル（Ｃ）によるカラムの作成と評価］
上記表面改質シリカゲル（Ｃ）試料３ｇを採取し、グリセリン／メチルアルコール混合溶液（１：２）３５ｍｌに加え、超音波で分散させ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍステンレスカラムに３０Ｍｐａの圧力で充填した。これをＨＰＬＣ装置に接続して、実験例４と同様となる以下の条件で有機酸類の分離を行った。
【００５５】
カラム：表面改質シリカゲル（Ｃ）
（シリカゲル細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍベース）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ  ステンレスカラム
移動相：９５％アセトニトリル／５％水
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：ソルビン酸、安息香酸、１−ナフトエ酸
結果として、図４（ｂ）のクロマトグラムに示されるように保持がほとんど無く、分離できなかった。
【００５６】
［変形例等］
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の具体的な一実施形態に限定されず、この他にも種々の形態で実施することができる。
【００５７】
例えば、上記実施形態では、特定のシランカップリング剤を使用する例を示したが、シランカップリング剤としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルジメチルメトキシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノイソブチルメチルジメトキシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルシシラントリオール、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３−アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン、Ｎ−３−〔アミノ（ポリプロピレンオキシ）〕アミノプロピルトリメトキシシラン、１，３−ビス（２−アミノエチルアミノメチル）−テトラメチルジシロキサン、ｎ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、ｔ−ブチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノメチルトリメトキシシラン、Ｎ−フェニルアミノプロピルトリメトキシシランなどを使用でき、この場合でも、上記実施形態同様、良好な分離が得られる。
【００５８】
また、上記実施形態では、無水ジカルボン酸として、無水コハク酸を使用する例、グルタル酸無水物を使用する例を示したが、無水ジカルボン酸はこれらに限定されるものではなく、例えば、無水マレイン酸などを利用しても、上記実施形態同様、良好な分離が得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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