(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＬＡの複雑で高度に多様なＤＮＡの配列要素を同定するための方法の提供。【解決手段】ＨＬＡ−Ｂ遺伝子中の選択された位置番号で、親由来の対立遺伝子の両方において同時に特定の位置の短いＤＮＡ配列要素（２〜６塩基）を一義的に同定することによる、サブグループを作成のための、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡタイピング方法。位置の組は特定の位置からなり、各位置について、ａ）特定の位置の上流のＤＮＡ鎖に、すべての既知の配列変異体に対して相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー）の組み合わせをハイブリダイズする過程、ｂ）停止アナログで置き換えられた、四つのｄＮＴＰ基質の少なくとも一つを用いてプライマー伸長反応を実施する過程、ｃ）質量分析法によって生成物を分析する過程からなり、得られた質量によって、用いられたプライマーと付加された塩基を一義的に同定することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ｂ遺伝子中の選択された位置番号で、親由来の対立遺伝子の両方において同時に特定の位置の短いＤＮＡ配列要素（２〜６塩基）を一義的に同定することによる、サブグループＡ〜Ｐを作成するための、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡタイピング方法であり、位置の組が、１２５位、１９６位、１９７位、２２７位、２６１位、２８６位、２９９位、３０８位、３４１位、および３４５位（エクソン１のｃＤＮＡ配列の１位で開始されるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の番号付けに従う）からなり、各位置について、ａ）特定の位置の上流のＤＮＡ鎖に、すべての既知の配列変異体に対して相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー）の組み合わせをハイブリダイズする過程、ｂ）停止アナログで置き換えられた、四つのｄＮＴＰ基質の少なくとも一つを用いてプライマー伸長反応を実施する過程、ｃ）質量分析法によって生成物を分析する過程からなり、得られた質量によって、用いられたプライマーと付加された塩基を一義的に同定することが可能になるＨＬＡタイピング方法。
【請求項２】
過程ａ）のＤＮＡ鎖がＰＣＲまたはローリングサークル複製のようなＤＮＡ複製手段によって産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーの組み合わせの配列がわずかに変化していることで、ハプロタイプのすべての配列が、完全に適合するプライマーを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
質量シフトタグが個々のプライマー配列に加えられることで、停止塩基がひとたび付加されると該個々のプライマーを一意に区別可能にすることができる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
完全にハイブリダイズしたプライマーをＤＮＡポリメラーゼによってｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰまたはこれらのアナログの組み合わせで伸長することで、特定の停止後産物を生成することにより、既知の対立遺伝子の区別可能な停止後産物が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ質量分析法が産物の質量分析に用いられる、請求項１〜請求項６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ａを分別するためには１２３位、１７４位、２５０位、２７８位、および３１７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｂを分別するためには１９２位、２０３位、２５６位、および２５９位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｃを分別するためには２５６位、２６０位、３１７位、および３５１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｄを分別するためには１５５位、２０４位、２３３位、２３９位、２５６位、３０４位、３５７位、および３６６位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｅを分別するためには１２２位、１７１位、２５７位、および３１７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｆを分別するためには１６４位、１６７位、１７１位、２３０位、２３５位、３０６位、３１７位、３２１位、および３３７位が分析され、サブグループＨＬＡ＿ＤＲＢ１＿Ｇを分別するためには１６４位、２５７位、２６６位、および３０３位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｈを分別するためには１６４位、１８１位、１８８位、２２０位、２２９位、２５６位、２６６位、３１７位、および３１８位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｉを分別するためには２５７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｊを分別するためには１８１位、２３９位、および３５７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｋを分別するためには１２２位、１４４位、２３９位、３０３位、３１７位、３１８位、および３２１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｌを分別するためには１１８位、１６１位、２５７位、２６０位、３１８位、および３２１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｍを分別するためには１６５位、２５７位、２９３位、および３０３位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｎを分別するためには１７７位、２４０位、２５６位、２５７位、および３５７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｏを分別するためには１５０位、１７５位、２３０位、２３６位、および３２１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｐを分別するためには１１５位、２２０位、および３１７位が分析される、請求項１に記載のＨＬＡタイピング方法。
【請求項９】
表６に示されたプライマーのプールからなる、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１０】
組織ドナーのスクリーニングを行うための、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の方法の使用。
【請求項１１】
登録されている骨髄提供者で、頻出するＨＬＡタイプと頻出しないＨＬＡタイプについてスクリーニングするための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡタイピングを実施するための、表６に示されたプライマーのプールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ遺伝子中の選択された位置番号で、親由来の対立遺伝子の両方において同時に特定の位置の短いＤＮＡ配列要素（２〜６塩基）を一義的に決定することによる、ＨＬＡタイピング方法に関するものであり、各位置について、ａ）特定の位置の上流のＤＮＡ鎖に、すべての既知の配列変異体に対して相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー）の組み合わせをハイブリダイズする過程、ｂ）停止アナログで置き換えられた、四つのｄＮＴＰ基質の少なくとも一つを用いてプライマー伸長反応を実施する過程、ｃ）質量分析法によって産物を分析する過程からなり、得られた質量によって、用いられたプライマーと付加された塩基を一義的に同定することが可能になる方法である。この方法は、特に、ＤＮＡに基づくＨＬＡタイピングに、また、試験する部位の適切な選択と組み合わせることに、非常に適合しており、従来のＨＬＡタイピング方法より操作が簡単な点で優れている。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の中でもっとも重要なものであるヒトゲノムの完全な配列決定は完了した。この計画によって、３０億塩基の完全な配列と、このゲノムにおける３００００個と推定されるすべての遺伝子の相対位置とが明らかになった。この配列が得られたことによって、遺伝子機能とさまざまな遺伝子の相互作用を明らかにするための無限の可能性が開かれている。近年では、ヒトゲノム全体にわたって一塩基変異多型（ＳＮＰ）を同定するために体系的な取り組み（ＳＮＰコンソーシアム）が行われてきており、今までのところ、さまざまなヒト個体間における数百万のこれらの差異が同定されてきている（２００３年１０月の時点でｄｂＳＮＰは５５０万のＳＮＰを含んでいる）。
【０００３】
マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ）によって生体分子の質量分析が発展してきている（Ｋａｒａｓ、Ｍ．  ＆  Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ、Ｆ．『Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．』６０、２２９９−２３０１（１９８８年））。質量分析法によるＤＮＡ分析の分野は近年、Ｔｏｓｔ  ａｎｄ  Ｇｕｔ（『Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ』２１、３８８−４１８（２００２年））およびＳａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕｔ（『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ』７８２、７３−８７、（２００２年））によって大規模に見直された。ＭＡＬＤＩは、ＰＣＲ産物の分析から、シングルヌクレオチドプライマー伸長反応およびシーケンシングに対立遺伝子特異的末端を用いるアプローチにわたる、多様なＤＮＡ分析に応用されてきている（Ｌｉｕ、Ｙ．−Ｈ．、ｅｔ  ａｌ．『Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．』９、７３５−７４３（１９９５年）；Ｃｈ’ａｎｇ、Ｌ．−Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．『Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．』９、７７２−７７４（１９９５年）；Ｌｉｔｔｌｅ、Ｄ．Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．『Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．』７５、７４５−７５０（１９９７年）；Ｈａｆｆ、Ｌ．  ＆  Ｓｍｉｒｎｏｖ、Ｉ．Ｐ．『Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．』７、３７８−３８８（１９９７年）；Ｆｅｉ、Ｚ．、Ｏｎｏ、Ｔ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ、Ｌ．Ｍ．『Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．』２６、２８２７−２８２８（１９９８年）；Ｒｏｓｓ、Ｐ．、Ｈａｌｌ、Ｌ．、Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｉ．  ＆  Ｈａｆｆ、Ｌ．『Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．』１６、１３４７−１３５１（１９９８年）；Ｒｏｓｓ、Ｐ．Ｌ．、Ｌｅｅ、Ｋ．  ＆  Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ、Ｐ、『Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．』６９、４１９７−４２０２（１９９７年）；Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｔ．Ｊ．、Ｔａｎｇ、Ｗ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ、Ｌ．Ｍ．『Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．』１５、１３６８−１３７２（１９９７年）；Ｋｏｓｔｅｒ、Ｈ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｇ．Ｓ．  ＆  Ｌｉｔｔｌｅ、Ｄ．Ｐ．米国特許第６０４３０３１号明細書）。これらの方法は、既に同定された変位、ＳＮＰ、または挿入／欠失の遺伝子型を決定するために用いられている。スピンカラム精製および／または磁気ビーズ技術、逆相精製、あるいはイオン交換樹脂が、質量分析法の前に適用されることが多い。
【０００４】
ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙ（Ｉ．Ｇ．Ｇｕｔ  ａｎｄ  Ｓ．Ｂｅｃｋ、米国特許第６２６８８１２号明細書、Ｉ．Ｇ．Ｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６５０３７１０号明細書）は、検出のためにＭＡＬＤＩ質量分析法を用いるＳＮＰ遺伝子型決定法である（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２８、ｅ１３  ａｎｄ  ｅ１００（２０００年））。対立遺伝子の区別はプライマー伸長に基づいている。産物をよりＭＡＬＤＩ分析に供しやすくするためには、プライマーの主な部分を質量分析の前に除去する。さらなる要素として、電荷によるタグ付けが含まれる。このことは、最終的な産物が、一価の正または一価の負の電荷のどちらかを帯びるように調整されるということを意味している。一般的に、このことは、ホスホロチオエート骨格をアルキル化することによって、また、プライマーの最後から二番目の塩基が第四級アンモニウム基を含んでいる場合に、行うことができる。第四級アンモニウム基を付加することで、マルチプレックスの設計についての選択肢が得られ、つまり、最適な分別および分離を行うために、個々のＳＮＰを質量スペクトル中で上方または下方に動かすことができる。
【０００５】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は染色体６ｐ２１上にある遺伝子クラスターである。多くの疾病がゲノムのこの領域にある遺伝子との関連を示しているように、これはもっとも重要である。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードしている全ての遺伝子はＭＨＣに属している。ＨＬＡ遺伝子は非常に多様であり、組織移植、免疫力、および、糖尿病、乾癬、狼瘡、クローン病、結腸炎、関節炎などのような自己免疫疾患に関与している。ＨＬＡクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃなどである。ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子はＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰなどである。
【０００６】
ＨＬＡタイピング方法はそのアプローチによって大幅に異なる。血清検査を行うことができるが、限られた分別しか行うことができない。過去１５年の間、ＭＨＣのＤＮＡ配列は幅広く研究され、現在では、細分別（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）タイピングにおいて豊富なＤＮＡ配列情報が用いられている。ＤＮＡに基づくＨＬＡタイピング方法は、さまざまな対立遺伝子に特異的なプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲを実施するＳＳＡ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、配列特異的な増幅）を範囲としている（米国特許第５５４５５２６号明細書）。プライマーは、存在している塩基の組み合わせをＰＣＲ産物のサイジングによって一義的に決定することができるように、組み合わせる。ＨＬＡのタイプを同定するために、複数の組み合わせが用いられる。手順は、組み合わせを段階的に使用して行い、それにより、まず大まかなクラス分けをし、該クラスから、特異的試薬を用いてさらに試験を行って更に細かくクラス分けを行う。また、この方法はＳＳＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ、配列特異的なプライマー）としても知られている。もう一つの方法はＳＳＯＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ、配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、米国特許第６５０３７０７号明細書）と呼ばれている。ここでは、遺伝子座特異的なＰＣＲが行われ、その後に配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを行う。ここ１０年の間にシーケンシング技術（および、とりわけ配列の読み取りのためのソフトウェア）が劇的に進歩したため、現在では、シーケンシングによってＨＬＡのタイプを良好な程度で同定することも可能となっている（国際公開第９８／３５０５９号パンフレット）。実際、遺伝子座特異的ＰＣＲの産物がシーケンスされる。ここで生じる問題は、ヘテロ接合の個体が、分別することのできない不明瞭なハプロタイプのコールを生じさせることがあるということである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｊ．；Ｗａｌｌｅｒ、Ｍ．Ｊ．；Ｍａｒｓｈ、Ｓｔ．Ｇ．Ｅ．：“Ｅｘｏｎ  Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ”；ＩＭＧＴ／ＨＬＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ；２００３年１０月）。対立遺伝子特異的なＰＣＲが含まれることで、確実性を得ることができる。分別には、遺伝子座ごとに複数の産物が生じ、シーケンスされることが必要とされる。しかし、シーケンシングの結果が複雑になることがあるため、対立遺伝子特異的なＰＣＲを行わないときの解釈は煩雑なものになりうる。配列に基づくタイピングはすべて、実施するときに何回もの反復が必要である。基準となる鎖を介した構造解析（ＲＳＣＡ、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、過去に知られていない配列をＨＬＡに有する可能性のあるサンプルを研究するために用いられる方法である（Ｃｏｒｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、『Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ』５６、８２−８６、２０００年）。最近のＨＬＡタイピングの理論ならびに方法の発展に関する調査についてはＰｅｔｅｒｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．（『Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ』６１、１−１１、２００３年）を参照のこと。
【特許文献１】米国特許第６０４３０３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６２６８８１２号明細書
【特許文献３】米国特許第６５０３７１０号明細書
【特許文献４】米国特許第５５４５５２６号明細書
【特許文献５】米国特許第６５０３７０７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、発明者らは、ゲノムの高度に多型な領域におけるすべての親由来の小さなハプロタイプを同時に決定するための簡単な方法を提供することとした。この方法は、費用対効果のよい遺伝子型決定のプラットフォームで実施可能でなければならない。この方法は特に、ＨＬＡタイピングに適用可能でなければならない。可能な限り、頻出するＨＬＡ対立遺伝子および頻出しないＨＬＡ対立遺伝子を分別することが一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、ＨＬＡ遺伝子中の選択された位置番号で、親由来の対立遺伝子の両方において同時に特定の位置の短いＤＮＡ配列要素（２〜６塩基）を一義的に決定することによる、ＨＬＡタイピング方法であり、各位置について、ａ）特定の位置の上流のＤＮＡ鎖に、既知のすべての配列変異体に相補的なオリゴヌクレオチドの組み合わせ（プライマープール）をハイブリダイズする過程、ｂ）停止アナログによって置き換えられた、四つのｄＮＴＰ基質の少なくとも一つを用いてプライマー伸長反応を行う過程、ｃ）質量分析法によって産物を分析する過程からなる方法であり、得られた質量によって、用いられたプライマーおよび付加された塩基を一義的に同定することができる方法である。
【０００９】
本発明において、
−「ＨＬＡ」とは、染色体６ｐ２１におけるヒト白血球抗原の遺伝子座を意味し、たとえば移植組織のレシピエントとドナーの間での適合度を判定するために用いられている、ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１など）で構成される。
−「ＨＬＡタイピング」とは、特定の遺伝子座において既知のＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１など）を同定することを意味する。
−「ＨＬＡ対立遺伝子」とは、二つの親由来の染色体の一方における、遺伝子座内のヌクレオチド配列を意味する。
−「ＨＬＡ−Ａ」とは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子のエクソン２およびエクソン３のＤＮＡ配列を意味する。
−「ＨＬＡ−Ｂ」とは、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子のエクソン２およびエクソン３のＤＮＡ配列を意味する。
−「ＨＬＡ−ＤＲＢ１」とは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２のＤＮＡ配列を意味する。
−「多型」とは、さまざまな変異体に存在する、ＤＮＡ配列中の個々の位置を意味する。
−「ハプロタイプ」とは、ゲノムの特定の領域における二つの対立遺伝子の一方のＤＮＡ配列を意味する。
−「小さなハプロタイプ」とは、一方の親由来の対立遺伝子における２〜６個の連続した塩基を意味する。
−「プライマープール」または「プライマーのプール」とは、一回のプライマー伸長反応で用いられるプライマーの集合を意味する。既知のＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれに対して、配列が完全に相補的なプライマーが少なくとも一つプール中にある。このことによって、完全なアニーリングが保証される。プライマーの３’末端から４塩基以上離れたところにあるミスマッチは、これらの塩基のすべてがプライマー伸長反応の後に５’ホスホジエステラーゼによって除去されるため、ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙの結果に影響を与えない。最後の少数の塩基中にミスマッチを有するプール中のプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されず、したがって観察されることはない。
−「ＭＡＬＤＩ質量分析計」とは、サンプルの気化にはマトリクス支援レーザー脱離イオン化を用い、質量分離には飛行時間分析を用いる、質量分析計を意味する。
−「サブグループ」とは、選択された位置の最初の組を小さなハプロタイプに分けた結果同一である対立遺伝子を意味する。細分別タイピングでは、１０回の小さなハプロタイプの決定で生じたサブグループを分別する。サブグループを分別するための基準は、ａ）それらが依然として二桁の異なるタイプの対立遺伝子を含んでいること、ｂ）四つ以上の対立遺伝子を有するサブグループであること、ｃ）頻出する対立遺伝子（下記の表参照）を有するサブグループであることである。
【００１０】
これから、ゲノムの非常に多型的な領域における２〜６塩基の配列モチーフを決定する方法論を示すこととする。原則として、この方法は２〜６塩基の小さなハプロタイプを決定することに等しい。親由来の個々の小さなハプロタイプは、一回の反応で一義的に決定することができる。この方法論は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡタイピングのために、選択された位置の組に適用される。ここで開示される組はさまざまな目的を有している。１９個、１９個および１０個の位置からなる第一の組によって、一般集団において頻出する分化対立遺伝子であるか頻出しない分化対立遺伝子であるかを、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１のそれぞれにおいて最大数のＨＬＡ対立遺伝子について区別する。スクリーニングされた頻出する対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ａについては、Ａ*０１０１、Ａ*０２０１、Ａ*０３０１、Ａ*２３０１、Ａ*２４０２、Ａ*２９０２、Ａ*３００１およびＡ*３００２であり、ＨＬＡ−Ｂについては、Ｂ*０７０２、Ｂ*０８０１、Ｂ*１３０２、Ｂ*１５０１、Ｂ*１８０１、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０３、Ｂ*４００１、Ｂ*４４０２、Ｂ*４４０３、Ｂ*５１０１およびＢ*５７０１であり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１については、ＤＲＢ１*０１０１、ＤＲＢ１*０３０１、ＤＲＢ１*０４０１、ＤＲＢ１*０７０１、ＤＲＢ１*１１０１、ＤＲＢ１*１１０４、ＤＲＢ１*１３０２およびＤＲＢ１*１５０１である。マーカーのこの組により、ＨＬＡ−Ａでは９３．４％〜１００％、ＨＬＡ−Ｂでは９７．６％〜１００％、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１では９７．２％〜１００％の確実性で、頻出するＨＬＡ対立遺伝子を一義的に同定することができる。
【００１１】
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１それぞれにおいて１０個の位置からなる第二の組は、それぞれ、最大数のサブグループをもたらすものであり、該サブグループは、サブグループの特定の位置の組を加えることでさらに分別することができる。また、各遺伝子座において１０個の位置を、上記の頻出するＨＬＡ対立遺伝子と残りのＨＬＡ対立遺伝子（頻出しない）とをもっともよく区別するということに基づいて選択した。この結果、遺伝子座に応じて２〜３０個のＨＬＡ対立遺伝子を含むグループが得られた。各グループ内では、多くの位置を、グループ内でのＨＬＡ対立遺伝子間を分別するために試験することができる。追加的に分析する必要のある位置の数は、四桁の分解を行うためには１〜２５にわたる。この技術によって、ＨＬＡタイピングを、実績のあるハイスループットの検出プラットフォーム（ＭＡＬＤＩ質量分析法）を用いて実質的に低いコストで実施することができる。
【００１２】
本発明による方法の好ましい実施態様では、過程ａ）のＤＮＡ鎖は、ＰＣＲまたはローリングサークル複製のようなＤＮＡ複製手段によって産生される。
【００１３】
各遺伝子座を選択的に増幅するための遺伝子座特異的ＰＣＲ反応のセットは、国際組織適合性ワーキンググループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）の技術マニュアル（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌｓ、ｗｗｗ．ｉｈｗｇ．ｏｒｇ／ｔｍａｎｕａｌ／Ｔｍｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）に記載されている。
【００１４】
本発明による方法の非常に好ましい実施態様では、プライマーの組み合わせ（プライマーのプール）は、わずかに異なった配列を含んでおり、その結果、ＨＬＡ対立遺伝子の既知のすべての配列が、完全に適合するプライマーと組になる。
【００１５】
プライマーのプールによって、少なくとも一つのプライマーが完全に適合することが保証される。プライマープールのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、多型の位置の方へ伸長される。必要なことは、付加された塩基がプライマーの塩基組成と共に固有の質量を示すことである。質量分析の結果においてこの質量が検出されると、プライマーの相補的配列と付加された塩基の両方を含む配列が存在するということである。質量によってプライマープールのすべてのプライマーを区別可能にするために、さまざまな質量シフト物質をプライマーに加えることができる。このことを行うためのもっとも簡単な方法は、ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙで用いられているような電荷／質量タグ付け技術を用いることである。プライマーの３’末端の最後から二番目の塩基はアミノ修飾されており、ＮＨＳエステルの化学反応を経てタグを加えるために用いられる。当然、プライマーのプールは、塩基一つ分だけわずかに異なっていることのあるプライマーを含んでいる。塩基の構成が同一である配列も、質量タグの適切な選択によってさらに区別することができる。また、３’末端から８個までの塩基にミスマッチを含んだプライマーは、たとえアニールしていたとしても、ポリメラーゼでは伸長されず、したがってスクリーニングされないことを発見した。これは、ミスマッチがあるときの、不十分なハイブリダイゼーション、または、ＤＮＡポリメラーゼが付着もしくは伸長を行わないことが原因である可能性がある。したがって、我々は、小さなハプロタイプの決定に二つの機能を用いることとした。すなわち、１）対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーション、そして、２）対立遺伝子特異的なプライマー伸長である。伸長プライマーの３’末端から４塩基以上離れたところにあるミスマッチは、ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙの５’ホスホジエステラーゼ消化段階において除去されているため、質量スペクトルがより複雑になるということはない。
【００１６】
本発明による方法の好ましい実施態様では、質量シフトタグがプライマープールの個々のプライマー配列に加えられることで、停止塩基がひとたび加えられると該プライマー配列を一意に区別することができる。
【００１７】
本発明による方法のもう一つの好ましい実施態様では、完全にハイブリダイズしたプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼによってｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰまたはこれらのアナログの組み合わせで伸長することで、特定の停止後産物を生成することによって、既知の対立遺伝子の停止後産物を、それらの質量によって一意に区別することができるようにする。
【００１８】
本発明による方法の好ましい実施態様では、ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙが用いられる。これは典型的には一塩基プライマー伸長を適用するものであり、したがって、四つの停止塩基（ｄｄＮＴＰ）、または、ＤＮＡポリメラーゼに対する抵抗性という点で同質の合成アナログのみが、プライマー伸長に用いられる。α−Ｓ−ｄｄＮＴＰは非常に適したアナログである。
【００１９】
本発明による方法の好ましい実施態様では、質量分析法、特にＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ質量分析法が産物の質量分析のために用いられる。
【００２０】
ＨＬＡタイピングについては、十分な情報内容を得るために、前記小さなハプロタイプの決定の解析の組を実施しなければならない。
【００２１】
ＨＬＡ−ＡのＨＬＡタイピングについては、好ましい解析の組は、９８位、４１４位、５３９位、２８２位、５７１位、３６８位、２５６位、２９２位、２３８位、２７０位、４５３位、５２７位、５０２位、８１位、２６８位、５５９位、９２位、１２３位および３９６位での解析である（エクソン１のｃＤＮＡ配列の１位から開始されるＨＬＡ−Ａ遺伝子の番号付けに従う。図１参照）。これにより、ＨＬＡタイピングの中分別（ｍｅｄｉｕｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が行われる。選択のための入力基準は、ＨＬＡ対立遺伝子の頻度である。
【００２２】
いくつかのＨＬＡタイプが一義的に同定される。
【００２３】
これにならい、ＨＬＡ−ＢのＨＬＡタイピングについては、中分別を行うために、小さなハプロタイプの決定の解析によって以下の位置が好適に分析される：５３９位、４１９位、５５９位、４１２位、２７２位、３６２位、３０２位、３６３位、２０６位、３６９位、２５９位、９７位、５８３位、２９２位、２２２位、５２７位、４１８位、４３５位および５７１位（エクソン１のｃＤＮＡ配列の１位から開始されるＨＬＡ−Ｂ遺伝子の番号付けに従う。図２参照）。
【００２４】
これにならい、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡタイピングについては、中分別を行うためには、小さなハプロタイプの決定によって以下の位置が好適に分析される：１２５位、１９６位、１９７位、２２７位、２６１位、２８６位、２９９位、３０８位、３４１位および３４５位（エクソン１のｃＤＮＡ配列の１位から開始されるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の番号付けに従う。図３参照）。
【００２５】
細分別の好ましい実施態様では、ＨＬＡ−Ａの９８位、４１４位、５３９位、２８２位、５７１位、３６８位、２５６位、２９２位、２３８位および２７０位（エクソン１のｃＤＮＡ配列の１位から開始されるＨＬＡ−Ａ遺伝子の番号付けに従う。図４参照）のＨＬＡタイピングが、サブグループ（ＨＬＡ−Ａ＿Ａ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｂ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｃ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｄ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｅ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｆ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｇ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｈ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｉ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｊ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｋ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｌ、ＨＬＡ−Ａ＿Ｍ、ＨＬＡ−Ａ＿ＮおよびＨＬＡ−Ａ＿Ｏ。表１参照）を作成するための小さなハプロタイプの決定に用いられる。
【００２６】
好ましくは、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ａ（対立遺伝子Ａ*２９０１０１０１およびＡ*２９０１０１０２でエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、２２４位、２６８位、３７６位、５０２位、５６１位および６１６位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｂを分別するためには１２６位および５２６位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｃ（対立遺伝子Ａ*２４０２０１０１、Ａ*２４０２０１０２Ｌ、Ａ*２４０２０３、Ａ*２４０９ＮおよびＡ*２４１１Ｎでエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、８１位、９０位、９２位、２１２位、２１４位、２５７位、２６５位、２９９位、３０２位、４０４位、４２０位、４２７位、４５３位、４８５位、４８９位および５０２位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｄを分別するためには、１６０位、２００位、３６２位および５２４位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｅを分別するためには、１８０位、２９９位、３０１位、３０２位、３４６位、４１８位、４５３位、５１７位、５２４位、５２６位、５２７位、５５７位、５５９位および５６０位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｆを分別するためには、２９９位、３０１位、３０２位、３４１位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｇを分別するためには、１２７位、３４１位、３９９位、４８０位、５０２位、５０３位、５２４位、５２６位、５２７位、５５３位、５５９位、５６０位および５６５位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｈを分別するためには、２２８位、２３３位、４６３位、５１９位、５３０位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｉ（対立遺伝子Ａ*６８０１０２およびＡ*６８１１Ｎでエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、１０２位、２７５位、３１７位、３６２位、４１８位、４１９位、４９７位、５２４位、５５５位、５９５位および６１８位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｊを分別するためには、９２位、３３１位、４５３位、５２４位、５５９位、５６０位および５６４位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｋ（対立遺伝子Ａ*０２０１０１０１、Ａ*０２０１０１０２、Ａ*０２０１０８、Ａ*０２０９、Ａ*０２４３ＮおよびＡ*０２６６でエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、７８位、８１位、１２３位、１２５位、１４２位、１４４位、１９４位、２６８位、２９４位、３２４位、３５５位、３６２位、３９６位、４０３位、４１９位、４５３位、４５６位、４７７位、４９３位、５１７位、５２４位、５２６位、５２７位、５５９位および５６０位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｌを分別するためには、１１３位、２９９位、３０１位、３０２位、３０８位、３１１位、５２３位、５２４位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｍを分別するためには、１７１位、３６３位、４９８位および５５９位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｎを分別するためには、３７６位、４２６位、５２７位、５５５位、５５７位および５９５位が分析され、そしてサブグループＨＬＡ−Ａ＿Ｏを分別するためには２９９位が分析される。
【００２７】
【表１】
2011200244.tif 000002
【００２８】
細分別のための好ましい実施態様では、ＨＬＡ−Ｂの５３９位、４１９位、５５９位、４１２位、２７２位、３６２位、３０２位、３６３位、２０６位および３６９位（エクソン１のｃＤＮＡ配列の１位から開始されるＨＬＡ−Ｂの番号付けに従う。図５参照）のＨＬＡタイピングが、サブグループ（ＨＬＡ−Ｂ＿Ａ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｂ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｃ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｄ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｅ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｆ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｈ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｉ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｊ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｋ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｌ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｍ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｎ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｏ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｐ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｑ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｒ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｓ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｔ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｕ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｖ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｗ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｘ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｙ、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｚ、ＨＬＡ−Ｂ＿ＡＡ、ＨＬＡ−Ｂ＿ＡＢ、ＨＬＡ−Ｂ＿ＡＣ；表２参照）を得るための小さなハプロタイプの決定に用いられた。
【００２９】
好ましくは、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ａ（対立遺伝子Ｂ*０８０１およびＢ*０８１９Ｎでエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、２５９位、３４１位および４７３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｂ（対立遺伝子Ｂ*４４０２０１０１、Ｂ*４４０２０１０２、Ｂ*４４１９ＮおよびＢ*４４２７でエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、１０６位、１４４位、２２２位、２５９位、２７３位、３１１位、３１３位、４１８位、４４５位、４９３位、５２８位および５４０位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｃを分別するためには、３１９位、４１６位、５４５位および５７２位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｄを分別するためには、１０６位、１３１位、１６５位、２１５位、２４３位、２７７位、２９２位、３２２位、４８１位、５８２位、６０３位および６１６位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｅ（対立遺伝子Ｂ*１５０１０１０１およびＢ*１５０１０１０２でエクソン２およびエクソン３が同一の配列）を分別するためには、１０６位、１４６位、１６５位、１８１位、２３８位、２５９位、２６３位、２９２位、３２８．１／３２９位（Ｂ*１５７９Ｎへのインサート）、３７９位、４３５位、４５３位、４６３位、４８５位、５２６位、５７１位、５７２位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｆを分別するためには、１４２位、１７１位、２５５位、２５７位、３９５位、４３０位、５４４位、５６６位および５７２位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｇ（対立遺伝子Ｂ*２７０５０２、Ｂ*２７０５０４、Ｂ*２７１３でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１１７位、２４７位、２４８位、２７７位、３４５位、４１８位、４８９位および５２７位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｈを分別するためには、１３４位、１４１位、２００位、２１３位、２５９位、３０４位および５２７位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｉ（対立遺伝子Ｂ*５１０１０１、Ｂ*５１０１０５、Ｂ*５１１１Ｎ、Ｂ*５１３０およびＢ*５１３２でエクソン２が同一配列）を分別するためには、８３位、１４１位、２１１位、２２２位、２４２位、３２２位、４０４位、４１４位、４３５位、４６３位、５０２位、５２７位、５４４位、５７１位、５７２位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｊ（対立遺伝子Ｂ*４００１０１およびＢ*４００１０２でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１０３位、１４２位、２２２位、２４３位、２５９位、２９２位、４７７位、４８６位および４９９位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｋ（対立遺伝子Ｂ*１８０１０１およびＢ*１８１７Ｎでエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１０３位、２５９位、２９２位、２９５位、５２７位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｌを分別するためには、３２０位および５００位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｍを分別するためには３１１位、５２７位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｎ（対立遺伝子Ｂ*３５０１０１、Ｂ*３５４０ＮおよびＢ*３５４２でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１１９位、２９２位、２５９位、３１９位、４２５位、５２７位、５４６位および５８３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｏを分別するためには、９７位、１４２位、２４５位および５２７位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｐを分別するためには、９７位および１７５位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｑを分別するためには、２４６位および２７７位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｒを分別するためには、２４６位、２９２位、３１１位および５０３位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｓを分別するためには、１０３位、２６１位、３０９位、３１１位および４７４位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｔ（対立遺伝子Ｂ*３９０１０１およびＢ*３９０１０３でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、９７位、１０３位、１０６位、２４３位、２５９位、２９２位、４０４位および５２４位が分析され、サブグループＨＬＡ−Ｂ＿Ｕを分別するためには、２５９位および３２０位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｖを分別するためには１０６位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｗを分別するためには９７位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｘを分別するためには、９７位、１０６位、２５７位、４１８位および４６３位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｙを分別するためには１０６位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿Ｚを分別するためには１０６位および１４４位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿ＡＡを分別するためには、１１７位、２４７位、２４８位、２８３位、３４５位、４１８位、４８９位および５２７位が分析され、ＨＬＡ−Ｂ＿ＡＢを分別するためには１０６位が分析され、そしてＨＬＡ−Ｂ＿ＡＣを分別するためには５４８位が分析される。
【００３０】
【表２ａ】
2011200244.tif 000003
【００３１】
【表２ｂ】
2011200244.tif 000004
【００３２】
好ましい実施態様では、ＨＬＡタイピング方法によりＨＬＡ−ＤＲＢ１のグループＡ〜Ｐが分別される。
【００３３】
細分別には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の１２５位、１９６位、１９７位、２２７位、２６１位、２８６位、２９９位、３０８位、３４１位および３４５位（エクソン１のＤＮＡ配列の１位から開始されるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の番号付けに従う。図６参照。）のＨＬＡタイピングが、サブグループ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｄ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｆ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｈ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｉ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｊ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｋ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｌ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｍ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｎ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｏ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｐ；表３参照）を得るための小さなハプロタイプの決定に用いられる。
【００３４】
非常に好ましい実施態様では、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ａを分別するためには、１２３位、１７４位、２５０位、２７８位および３１７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｂを分別するためには、１９２位、２０３位、２５６位および２５９位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｃを分別するためには、２５６位、２６０位、３１７位および３５１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｄを分別するためには、１５５位、２０４位、２３３位、２３９位、２５６位、３０４位、３５７位および３６６位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｅを分別するためには、１２２位、１７１位、２５７位および３１７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｆを分別するためには、１６４位、１６７位、１７１位、２３０位、２３５位、３０６位、３１７位、３２１位および３３７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｇを分別するためには、１６４位、２５７位、２６６位および３０３位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｈを分別するためには、１６４位、１８１位、１８８位、２２０位、２２９位、２５６位、２６６位、３１７位および３１８位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｉを分別するためには２５７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｊを分別するためには１８１位、２３９位および３５７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｋ（対立遺伝子ＤＲＢ１*１１０１０１およびＤＲＢ１*１１０１０２でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１２２位、１４４位、２３９位、３０３位、３１７位、３１８位および３２１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｌを分別するためには、１１８位、１６１位、２５７位、２６０位、３１８位および３２１位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｍ（対立遺伝子ＤＲＢ１*１２０１０１およびＤＲＢ１*１２０６でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１６５位、２５７位、２９３位および３０３位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｎを分別するためには、１７７位、２４０位、２５６位、２５７位および３５７位が分析され、サブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｏ（対立遺伝子ＤＲＢ１*１５０１０１およびＤＲＢ１*１５１３でエクソン２およびエクソン３が同一配列）を分別するためには、１５０位、１７５位、２３０位、２３６位および３２１位が分析され、そしてサブグループＨＬＡ−ＤＲＢ１＿Ｐを分別するためには、１１５位、２２０位および３１７位が分析される。
【００３５】
本発明のもう一つの目的は、方法を実施するためのキットである。該キットは、プールされたプライマーの組み合わせで構成される。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１のプールに用いられるプライマー、ならびに遺伝子型決定産物の質量はそれぞれ、表４、５および６に示されている。ＣＴは、プールのそのプライマーに付けられた、質量をシフトさせる質量タグを表している。
【００３６】
本発明のもう一つの目的は、組織のドナーをスクリーニングするために本発明による方法を用いることである。
【００３７】
好ましい実施態様では、登録されている骨髄ドナーに本発明による方法を用いて、頻出するＨＬＡタイプおよび頻出しないＨＬＡタイプをスクリーニングする。
【００３８】
さらなる本発明の目的は、ＨＬＡタイピングを実施するための、表４、５および６に示されたプライマーの使用である。
【００３９】
【表３】
2011200244.tif 000005
【００４０】
【表４ａ】
2011200244.tif 000006
【００４１】
【表４ｂ】
2011200244.tif 000007
【００４２】
【表５ａ】
2011200244.tif 000008
【００４３】
【表５ｂ】
2011200244.tif 000009
【００４４】
【表６】
2011200244.tif 000010
【００４５】
ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂのそれぞれに対して１９個のマーカーで得られる分別およびＨＬＡ−ＤＲＢ１に対して１０個のマーカーで得られる分別が、以下の表７から表９に示されている。
【００４６】
【表７】
2011200244.tif 000011
【００４７】
【表８】
2011200244.tif 000012
【００４８】
【表９】
2011200244.tif 000013
【００４９】
ＨＬＡ対立遺伝子と、もっとも詳細な情報を得ることのできる、小さなハプロタイプを決定するマーカー（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１それぞれに対して１０個）によって得られたサブグループとの完全なリストが、以下の表１０から表１２に示されている。
【００５０】
【表１０ａ】
2011200244.tif 000014
【００５１】
【表１０ｂ】
2011200244.tif 000015
【００５２】
【表１０ｃ】
2011200244.tif 000016
【００５３】
【表１０ｄ】
2011200244.tif 000017
【００５４】
【表１０ｅ】
2011200244.tif 000018
【００５５】
【表１１ａ】
2011200244.tif 000019
【００５６】
【表１１ｂ】
2011200244.tif 000020
【００５７】
【表１１ｃ】
2011200244.tif 000021
【００５８】
【表１１ｄ】
2011200244.tif 000022
【００５９】
【表１１ｅ】
2011200244.tif 000023
【００６０】
【表１１ｆ】
2011200244.tif 000024
【００６１】
【表１１ｇ】
2011200244.tif 000025
【００６２】
【表１１ｈ】
2011200244.tif 000026
【００６３】
【表１１ｉ】
2011200244.tif 000027
【００６４】
【表１１ｊ】
2011200244.tif 000028
【００６５】
【表１２ａ】
2011200244.tif 000029
【００６６】
【表１２ｂ】
2011200244.tif 000030
【００６７】
【表１２ｃ】
2011200244.tif 000031
【００６８】
【表１２ｄ】
2011200244.tif 000032
【００６９】
【表１２ｅ】
2011200244.tif 000033
【００７０】
【表１２ｆ】
2011200244.tif 000034
【００７１】
【表１２ｇ】
2011200244.tif 000035
【００７２】
【表１２ｈ】
2011200244.tif 000036
【００７３】
【表１２ｉ】
2011200244.tif 000037
【００７４】
中分別タイピングのための通則的な方法を以下に説明する。
中分別タイピングのために、最大限に詳細な情報を得ることのできるマーカーの位置の組を決定した。これらは、ＨＬＡ−Ａの９８位、４１４位、５３９位、２８２位、５７１位、３６８位、２５６位、２９２位、２３８位、２７０位、４５３位、５２７位、５０２位、８１位、２６８位、５５９位、９２位、１２３位および３９６位（番号付けはエクソン１の転写開始位置から開始している）、ＨＬＡ−Ｂの５３９位、４１９位、５５９位、４１２位、２７２位、３６２位、３０２位、３６３位、２０６位、３６９位、２５９位、９７位、５８３位、２９２位、２２２位、５２７位、４１８位、４３５位および５７１位（番号付けはエクソン１の転写開始位置から開始している）、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１の１２５位、１９６位、１９７位、２２７位、２６１位、２８６位、２９９位、３０８位、３４１位および３４５位（番号付けはエクソン１の転写開始位置から開始している）から構成される。
【００７５】
全般にわたって、位置の順序は、頻出するＨＬＡ対立遺伝子と頻出しないＨＬＡ対立遺伝子（上記の頻出するＨＬＡ対立遺伝子のリスト参照）とを選択する基準についてもっとも詳細な情報を得ることができるものから、もっとも情報が得られないものの順になっている。したがって、良好なタイピング方法のために選択される１０個のマーカー（ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ）は、頻出するＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ）と頻出しないＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ）とを一度で分類するための１９個のマーカーの組のうち、最初の１０個のマーカーである。配列に基づくＨＬＡタイピングを用いるときと同じように、分別できないＨＬＡ対立遺伝子のヘテロ接合の組み合わせがある。しかし、この方法では、小さいハプロタイプが得られるため、不明確さがより少ない。
【００７６】
本発明のもう一つの目的は、本発明による前記方法を、組織ドナー、たとえば登録されている骨髄ドナーを、頻出するＨＬＡ対立遺伝子と頻出しないＨＬＡ対立遺伝子についてスクリーニングすることに使用することである。
【００７７】
ＨＬＡ対立遺伝子の説明は、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｎｏｌａｎデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）に基づいている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
前述した方法に加えて、本発明はさらに、裏付けとなる本発明による実施例に言及している以下の説明ならびに添付の図面および表によって明らかになる構成も含むものである。
【００７９】
図１は、基準となるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ*０１０１０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ａの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１９個の位置を示している。黒のボックスは伸長する位置を示しており、灰色のボックスは、プライマープールの各プライマーによるアニーリングによって検出される多型を示している。プールはフォワード側およびリバース側で用いられる。番号付けはｃＤＮＡの転写開始にしたがっている。
【００８０】
図２は、基準となるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子Ｂ*０７０２０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ｂの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１９個の位置を示している。黒のボックスは伸長する位置を示しており、灰色のボックスは、プライマープールの各プライマーによるアニーリングによって検出される多型を示している。プールはフォワード側およびリバース側で用いられる。番号付けはｃＤＮＡの転写開始にしたがっている。
【００８１】
図３は、基準となるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子ＤＲＢ１*０１０１上にマップされた、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１０個の位置を示している。黒のボックスは伸長する位置を示しており、灰色のボックスは、プライマープールの各プライマーによるアニーリングによって検出される多型を示している。プールはフォワード側およびリバース側で用いられる。番号付けはｃＤＮＡの転写開始にしたがっている。
【００８２】
図４は、さらに分析することのできるサブグループを区別するための、基準となるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ*０１０１０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ａの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１０個の位置を示している。黒のボックスは伸長する位置を示しており、灰色のボックスは、プライマープールの各プライマーによるアニーリングによって検出される多型を示している。プールはフォワード側およびリバース側で用いられる。番号付けはｃＤＮＡの転写開始にしたがっている。
【００８３】
図５は、さらに分析することのできるサブグループを区別するための、基準となるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子Ｂ*０７０２０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ｂの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１０個の位置を示している。黒のボックスは伸長する位置を示しており、灰色のボックスは、プライマープールの各プライマーによるアニーリングによって検出される多型を示している。プールはフォワード側およびリバース側で用いられる。番号付けはｃＤＮＡの転写開始にしたがっている。
【００８４】
図６は、位置ＨＬＡ−Ｂ＿２７２に対する、ＣＥＰＨファミリー（１４１８、０１＝父、０２＝母、０３＝子、０４＝子）の遺伝子型決定の結果を示している。１４０７．３Ｄａはプライマー６、７、８または９に対するＣの付加に対応し、１４２２．３Ｄａはプライマー６、７、８または９に対するＴの付加に対応し、１４３１．４Ｄａ／１４３０．９Ｄａはプライマー６、７、８または９に対するＡの付加に対応し、そして、１４４７．４Ｄａ／１４４８．５Ｄａはプライマー６、７、８または９に対するＧの付加に対応している。
【００８５】
表１は、さまざまなサブグループにおいて１０個のマーカーによって検出されたＨＬＡ−Ａ対立遺伝子と、サブグループを分別するためにタイプ決定する必要のある追加的な位置を示している。
【００８６】
表２は、さまざまなサブグループにおいて１０個のマーカーによって検出されたＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子と、サブグループを分別するためにタイプ決定する必要のある追加的な位置を示している。
【００８７】
表３は、さまざまなサブグループにおいて１０個のマーカーによって検出されたＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子と、サブグループを分解するためにタイプ決定する必要のある追加的な位置を示している。
【００８８】
表４は、ＨＬＡ−Ａの小さなハプロタイプの決定のためのプールを構成するために必要な個々のプライマーのリストを示している（１９個のマーカー）。サブグループを作成するために必要な１０個のマーカーも含まれている。＾は質量／電荷タグを付けるために用いられる塩基を表し、ＣＴは質量／電荷タグの質量の違いを表し、ｓｐはホスホロチオエート基を意味している。質量分析法によって分析される産物は、最も５’側のホスホロチオエート（ｓｐ）の５’側の塩基を含んでいる。
【００８９】
表５は、ＨＬＡ−Ｂの小さなハプロタイプの決定のためのプールを構成するために必要な個々のプライマーのリストを示している（１９個のマーカー）。サブグループを作成するために必要な１０個のマーカーも含まれている。＾は質量／電荷タグを付けるために用いられる塩基を表し、ＣＴは質量／電荷タグの質量の違いを表し、ｓｐはホスホロチオエート基を意味している。質量分析法によって分析される産物は、最も５’側のｓｐの５’側の塩基を含んでいる。
【００９０】
表６は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の小さなハプロタイプの決定のためのプールを構成するために必要な個々のプライマーのリストを示している（１０個のマーカー）。＾は質量／電荷タグを付けるために用いられる塩基を表し、ＣＴは質量／電荷タグの質量の違いを表し、ｓｐはホスホロチオエート基を意味する。質量分析法によって分析される産物は、最も５’側のｓｐの５’側の塩基を含んでいる。
【００９１】
表７は、ＨＬＡ−Ａにおいて頻出するＨＬＡ対立遺伝子を区別するための、１９個のマーカーで行うことのできる分別を示している。
【００９２】
表８は、ＨＬＡ−Ｂにおいて頻出するＨＬＡ対立遺伝子を区別するための、１９個のマーカーで行うことのできる分別を示している。
【００９３】
表９は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１において頻出するＨＬＡ対立遺伝子を区別するための、１０個のマーカーで行うことのできる分別を示している。
【００９４】
表１０は、サブグループを作り出すための、１０個のマーカーで分別されるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のリストを表している。各サブグループは空白行で隔てられている。頻出する対立遺伝子に濃い灰色で影をつけているのに対し、明るい灰色はプライマーが伸長していく位置を指示している。
【００９５】
表１１は、サブグループを作り出すための、１０個のマーカーで分別されるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子のリストを表している。各サブグループは空白行で隔てられている。頻出する対立遺伝子に濃い灰色で影をつけているのに対し、明るい灰色はプライマーが伸長していく位置を指示している。
【００９６】
表１２は、サブグループを作り出すための、１０個のマーカーで分別されるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子のリストを表している。各サブグループは空白行で隔てられている。頻出する対立遺伝子に濃い灰色で影をつけているのに対し、明るい灰色はプライマーが伸長していく位置を指示している。
【実施例１】
【００９７】
ＨＬＡ−Ｂの２７２位における、修正されたＧＯＯＤ  ａｓｓａｙによる、小さなハプロタイプの決定。
【００９８】
ＨＬＡ−Ｂのエクソン２およびエクソン３の遺伝子座特異的ＰＣＲ産物を、国際組織適合性ワーキンググループの技術マニュアル（Ｈｕｒｌｙ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ｖｉｎａ、Ｇａｏ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、Ｎｏｒｅｅｎ、Ｒｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ；ｗｗｗ．ｉｈｗｇ．ｏｒｇ／ｔｍａｎｕａｌ／Ｔｍｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）によって公開されているプライマーの組を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＳＡＰと共にインキュベートすることで、すべての余分なｄＮＴＰを除去した。次に、ＰＣＲ単位複製配列中の２７２位において一塩基プライマー伸長を実施した。小さなハプロタイプを作成するためのプライマーの組は表５に示している。その後、５’ホスホジエステラーゼ消化を行うことで、コア配列に対するプライマーを減少させた。小さなハプロタイプ断片のＤＮＡ骨格をアルキル化した後、産物を、マトリックスを事前に被覆させたＭＡＬＤＩターゲット上に移した。別の方法として、マトリックス溶液をサンプルと混合し、ＭＡＬＤＩターゲット上に移して乾燥することもできる。ＭＡＬＤＩターゲットをＭＡＬＤＩ質量分析計に挿入し、分析した。質量スペクトルは、一つまたは二つの質量ピークを示しており、該ピークは特定の小さなハプロタイプに対応している。
【００９９】
ＰＣＲ：
フォワードプライマー、ＢＡｍｐ１  ５’−Ｇ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＧ−３’（１．８７５ｐｍｏｌ）、リバースプライマー、ＢＡｍｐ２  ５’−ＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ−３’（１．８７５ｐｍｏｌ）、ＢＡｍｐ３  ５’−ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＴＡＴ−３’（１．８７５ｐｍｏｌ）、０．２５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（ＨｉＦｉプラチナＴａｑ）、０．３μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、０．２μｌのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各２ｍＭ）それぞれの混合物、０．２５Ｕの改変ＤＮＡポリメラーゼ（ＨｉＦｉプラチナＤＮＡポリメラーゼ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および５ｎｇのＤＮＡを水に溶解して３μｌとした。サイクル：過程１：９４℃で３分、過程２：９４℃で２０秒、過程３：６４℃で３０秒、過程４：７２℃で３０秒で、過程２から過程４を３５回繰り返し、過程５：７２℃で５分。
【０１００】
ＳＡＰ消化：
１．７５μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩと０．２５μｌのＳＡＰ（ＵＳＢコーポレーション、クリーブランド、アメリカ合衆国）をＰＣＲ産物に添加し、これを３７℃で６０分間インキュベートし、その後、ＳＡＰ酵素を変性させるために９０℃で１０分間インキュベートした。
【０１０１】
一塩基プライマー伸長：
ＳＡＰ処理したＰＣＲ産物に、２μｌの伸長混合物を添加した。この混合物は１５ｍＭのＭｇＣｌ2、それぞれ０．１ｍＭの四つのα−Ｓ−ｄｄＮＴＰ、５ｐｍｏｌの伸長プライマーの組および０．４ＵのＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅを含んでいる。サイクル：過程１：９４℃で２分、過程２：９４℃で１５秒、過程３：５８℃で２０秒、過程４：７２℃で２０秒で、過程２から過程４を５０回繰り返す。
【０１０２】
ＰＤＥ消化：
伸長産物に、０．５ｕｌの０．５Ｍの酢酸と１．５μｌのＰＤＥ（５．１Ｕ）を添加し、３７℃で少なくとも１２０分間インキュベートする。
【０１０３】
アルキル化：
アルキル化は、２１μｌのアルキル化混合物を添加し、４０℃で１５分間インキュベートして行う。アルキル化混合物は、３７７：１５：７５：１７４の無水アセトニトリル、２Ｍトリエチルアミン／ＣＯ2（ｐＨ〜７．５）、２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびヨウ化メチルを含んでいる。
【０１０４】
アルキル化は、１０μｌの脱イオン水を加えて停止する。得られた５μｌの上相を、１０μｌの４０％アセトニトリルで希釈する。
【０１０５】
ＭＡＬＤＩターゲットの調製とＭＡＬＤＩ質量分析計での測定のために、０．５μｌの最終的な希釈物を、事前にマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸メチルエステル）で被覆したＭＡＬＤＩターゲットに移した。測定はＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘで、典型的には−１８ｋＶの加速電圧、２００ｎｓの遅延時間でのパルスイオン引き出し、そして直線検波モードでの検出で実施した。ＣＥＰＨファミリー１４１８に対する結果は図６に示している。
【実施例２】
【０１０６】
ＧＯＯＤ  ａｓｓａｙによるＨＬＡ−ＤＲタイピング。
ＨＬＡ−ＤＲＢに対する遺伝子座特異的ＰＣＲを実施した。したがって、以下に示した対立遺伝子特異的プライマーの組を用いた。これらのプライマーはＪ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．によってｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｈｗｇ．ｏｒｇ／ｔｍａｎｕａｌ／ＴＭｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍの第１０章のＢに公開されている。
【０１０７】
【表１３】
2011200244.tif 000038
【０１０８】
このプライマーの組は、他のＨＬＡ−ＤＲＢ鎖についての遺伝子を共増幅する高い危険性を伴い、不明瞭な結果につながる。しかし、これはＨＬＡ−ＤＲＢ１のＰＣＲについて現状で利用可能な最良の選択肢である。この問題を解決するためには、さらなるなミニハプロタイピング試験を追加することができる。ＨＬＡ−ＤＲＢ＿１２２−１２６の小さなハプロタイプの決定の解析によって、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子が良好に分別され、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のＰＣＲ産物のタイピングについて生じた結果を検証することができる。ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の同定が可能であり、また、存在するその他の増幅されたＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子の同定も可能である。以下に示したプライマーのリストをプライマー伸長反応に用いた。方法の詳細は実施例１と同じである。
【０１０９】
【表１４】
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【０１１０】
１３の可能性のある小さなハプロタイプのうち、４つがＨＬＡ−ＤＲＢ１以外の遺伝子を示した。センス方向でＡＡＣＡＣである小さなハプロタイプＧＴＧＴＴ（１８２１．７Ｄａ）は、１００％の確実度でＨＬＡ−ＤＲＢ９遺伝子の共増幅を示した。センス方向でＡＧＴＡＴである小さなハプロタイプＡＴＡＣＴ（１７６０．８Ｄａ）は、すべてのＨＬＡ−ＤＲＢ１*０７対立遺伝子（ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０７０１０２は除く）またはＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子の共増幅を示した。センス方向でＡＧＴＧＴであるタイプＴＧＴＧＴ（１７４５．７Ｄａ）は、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子もしくはＨＬＡ−ＤＲＢ６遺伝子のすべての変異体の共増幅に対応した。最後に、センス方向でＡＧＴＣＴであるタイプＡＧＡＣＴ（１７９９．７Ｄａ）は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*１１３０とＨＬＡ−ＤＲＢ１*１４４６の他に、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ７遺伝子のすべての変異体の共増幅を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】基準となるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ*０１０１０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ａの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる１９個の位置を示した図。
【図２】基準となるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子Ｂ*０７０２０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ｂの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１９個の位置を示した図。
【図３】基準となるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子ＤＲＢ１*０１０１上にマップされた、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１０個の位置を示した図。
【図４】基準となるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ*０１０１０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ａの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１０個の位置を示した図。
【図５】基準となるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子Ｂ*０７０２０１上にマップされた、ＨＬＡ−Ｂの識別のための小さなハプロタイプの決定の解析に用いられる、１０個の位置を示した図。
【図６】位置ＨＬＡ−Ｂ＿２７２に対する、ＣＥＰＨファミリー（１４１８、０１＝父、０２＝母、０３＝子、０４＝子）の遺伝子型決定の結果を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年7月13日(2011.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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