(57)【要約】【課題】可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）に関連する組成物および方法の提供。【解決手段】可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）に関連する組成物および方法が開示される。本発明は、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、１つまたは複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）（本明細書では内部ＬＲＲと呼ぶ）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および連結ペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供するが、このとき連結ペプチドはαヘリックスを含んでいる。ポリペプチドの長さは、約１３０という少数のアミノ酸または約２２５という多数のアミノ酸を含むことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年５月２１日に出願した米国特許仮出願第６０／５７３，５６３号の利益を要求する。これは本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＡＩＳ助成金ＡＩ３９８１６およびＨＧ０２５２６−０１、ならびにＮＳＦ助成金ＭＣＢ−０３１７４６０およびＩＢＮ−０３２１４６１の下での政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
有顎類脊椎動物における適応免疫応答は、抗原が特異的リンパ球受容体によって認識されると開始される。抗原受容体多様性は、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子座における可変性遺伝子セグメント、多様性遺伝子セグメントおよび結合遺伝子セグメントの組み換えによって生成される。この組み換え再配列は、処理されていない抗原に対する抗体ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子の先端内で提示された抗原フラグメントを認識するＴＣＲの膨大なレバートリーを生成する。そこでクローン性が多様なリンパ球は、主要造血組織および胸腺内で幹細胞前駆体から分化する、Ｉｇを有するＢ細胞およびＴＣＲを有するＴ細胞の形態で、脊椎動物の適応免疫の基礎を形成している。この組み換え免疫系の重要なエレメントは全有顎類脊椎動物において保存されており、多重遺伝子のＴＣＲ遺伝子座およびＩｇ遺伝子座は、最も基本的な有顎類の代表であるサメ、ガンギエイ、およびエイにおいてさえ顕著に複雑である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
早期の脊椎動物の分散（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）から生き残っている極めて少数の末裔の無顎類脊椎動物であるヤツメウナギおよびメクラウナギにおいても適応免疫についての豊富な証拠がある（非特許文献４）。これらの無顎類については、体液性タイプおよび細胞媒介性タイプの免疫応答が報告されている。例えば、ヤツメウナギは一次抗原刺激に応答して特異的循環性アグルチニンを産生し、追加免疫後にはより高度のアグルチニンレベルを生成し（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）、加速された速度で第２セットの表皮同種移植片を拒絶し（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献９；非特許文献１３）、そして遅延型の過敏性反応を示す（非特許文献５；非特許文献９）。無顎類の適応免疫応答は、有顎類脊椎動物のリンパ造血組織および血液中で見いだされるリンパ球に形態学的に似ている細胞に起因していた（非特許文献５；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献９；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１３；非特許文献１９；非特許文献２０）。それらの哺乳動物対応物と同様に、ヤツメウナギリンパ球は他の血球タイプよりはるかに照射感受性であり（非特許文献９）、抗原刺激に応答して凝集かつ増殖し（非特許文献５；非特許文献１４；非特許文献１５）、そしてＰＵ．１／Ｓｐｉ−ＢおよびＩｋａｒｏｓなどの哺乳動物リンパ球分化に関係している転写因子を発現する（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。しかし驚くべきことに、Ｉｇ遺伝子、ＴＣＲ遺伝子、およびＭＨＣ遺伝子は、以前には無顎類脊椎動物または無脊椎動物の尾索類Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓのゲノム配列内では同定されていなかった（非特許文献２５）。本発明は、新規なリンパ球受容体および新規なリンパ球受容体をコードする核酸に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒａｓｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｋ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｔｒｏｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｕｅｒ，Ｃ，Ｌｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｔ．，および  Ｌｉｔｍａｎ，Ｇ．Ｗ．α，β，ｇ，ａｎｄ  δ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅｓ  Ａｒｏｓｅ  Ｅａｒｌｙ  ｉｎ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９７）６：１−１１
【非特許文献２】Ｆｌａｊｎｉｋ  ＭＦおよびＫａｓａｈａｒａ  Ｍ、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ：ｇｌｉｍｐｓｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１５：３５１−６２
【非特許文献３】Ｆｌａｊｎｉｋ  ＭＦ、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ：ｓｕｒｐｒｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｒｔｅｎｔｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）２：６８８−９８
【非特許文献４】Ｆｏｒｅｙ  ＰＬおよびＪａｎｖｉｅｒ  Ｐ、Ａｇｎａｔｈａｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｊａｗｅｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６１：１２９−１３４
【非特許文献５】Ｆｉｎｓｔａｄ  Ｊ，Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ  ＢＷおよびＧｏｏｄ  ＲＡ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＩＩＩ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９６４）１３：４９０−５１２
【非特許文献６】Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ＪＪおよびＥｄｅｌｍａｎ  ＧＭ、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．３．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅａ  ｌａｍｐｒｅｙ，Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９６８）１２７：８９１−９１４
【非特許文献７】Ｌｉｔｍａｎ  ＧＷ，Ｆｒｏｍｍｅｌ  Ｄ，Ｆｉｎｓｔａｄ  ＦＪ，Ｈｏｗｅｌｌ  Ｊ，Ｐｏｌｌａｒａ  ＢＷおよびＧｏｏｄ  ＲＡ、Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＶＩＩＩ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｍｐｒｅｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９７０）１０５：１２７８−８５
【非特許文献８】Ｐｏｌｌａｒａ  Ｂ，Ｌｉｔｍａｎ  ＧＷ，Ｆｉｎｓｔａｄ  Ｊ，Ｈｏｗｅｌｌ  ＪおよびＧｏｏｄ  ＲＡ、Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＶＩＩ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ”Ｏ”ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎ  ｌａｍｐｒｅｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９７０）１０５：７３８−４５
【非特許文献９】Ｇｏｏｄ，Ｒ．Ａ．，Ｆｉｎｓｔａｄ，Ｊ．＆Ｌｉｔｍａｎ，Ｇ．Ｗ．、Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌａｍｐｒｅｙｓ  ＩＩ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編者  Ｈａｒｄｉｓｔｙ，Ｍ．Ｖ．＆Ｐｏｔｔｅｒ，ＬＣ．）（１９７２）４０５−４３２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）
【非特許文献１０】Ｈａｇｅｎ  Ｍ，Ｆｉｌｏｓａ  ＭＦおよびＹｏｕｓｏｎ  ＪＨ、Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｓｅａ  ｌａｍｐｒｅｙ｛Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ  Ｌ．）：ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９８５）８２：２０７−１０
【非特許文献１１】Ｆｉｎｓｔａｄ  Ｊ，Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ  ＢＷおよびＧｏｏｄ  ＲＡ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＪＪ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９６４）１３：４９０−５１２
【非特許文献１２】Ｐｅｒｅｙ  ＤＹ，Ｆｉｎｓｔａｄ  Ｊ，Ｐｏｌｌａｒａ  ＢおよびＧｏｏｄ  ＲＡ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＶＩ．Ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｅｔ  ｓｋｉｎ  ｈｏｍｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｆｉｓｈｅｓ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９６８）１９：５９１−７
【非特許文献１３】Ｆｕｊｉｉ  ＴおよびＨａｙａｋａｗａ  Ｉ、Ａ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ａｍｍｏｃｏｅｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．（１９８３）２３１：３０１−１２
【非特許文献１４】Ｃｏｏｐｅｒ  ＡＪ、Ａｍｍｏｃｏｅｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．：４ｔｈ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｏ．Ｒ．Ｍｃｌｎｔｙｒｅ（編）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ（１９７１）ｐｐ．１３７−  ４７
【非特許文献１５】Ｐｉａｖｉｓ  ＧＷおよびＨｉａｔｔ  ＪＬ、Ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅａ  ｌａｍｐｒｅｙ  Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ（Ｐｉｓｃｅｓ：Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｔｉｄａｅ）．Ｃｏｐｅｉａ（１９７１）４：７２２−８
【非特許文献１６】Ｋｉｌａｒｓｋｉ  ＷおよびＰｌｙｔｙｃｚ  Ｂ、Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｍｐｒｅｙ（Ａｇｎａｔｈａ）．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８１）５：３６１−６
【非特許文献１７】Ｚａｐａｔａ  Ａ，Ａｒｄａｖｉｎ  ＣＦ，Ｇｏｍａｒｉｚ  ＲＰおよびＬｅｃｅｔａ  Ｊ、Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｍｏｃｏｅｔｅ  ｏｆ  Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．（１９８１）２２１：２０３−８
【非特許文献１８】Ｆｕｊｉｉ  Ｔ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｈｌｏｓｏｌｅ  ｉｎ  ａｍｍｏｃｏｅｔｅｓ，ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ（１９８２）１７３：８７−１００
【非特許文献１９】Ａｒｄａｖｉｎ  ＣＦおよびＺａｐａｔａ  Ａ、Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｖａｌ  ａｎａｄｒｏｍｏｕｓ  ｓｅａ  ｌａｍｐｒｅｙ  Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１１：７９−９３
【非特許文献２０】Ｍａｙｅｒ  ＷＥ，Ｕｉｎｕｋ−Ｏｏｌ  Ｔ，Ｔｉｃｈｙ  Ｈ，Ｇａｒｔｌａｎｄ  ＬＡ，Ｋｌｅｉｎ  ＪおよびＣｏｏｐｅｒ  ＭＤ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｍｐｒｅｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ（２００２ａ）９９：１４３５０−５
【非特許文献２１】Ｈａｉｒｅ  ＲＮ，Ｍｉｒａｃｌｅ  ＡＬ，Ｒａｓｔ  ＪＰおよびＬｉｔｍａｎ  ＧＷ、Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｋａｒｏｓ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：３０６−１２
【非特許文献２２】Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｓ，Ｔｅｒｚｉｃ  Ｊ，Ｓａｔｏ  Ａ，Ｓａｒａｇａ−Ｂａｂｉｃ  Ｍ，Ｏ’ｈＵｉｇｉｎ  Ｃ，Ｔｉｃｈｙ  ＨおよびＫｌｅｉｎ  Ｊ、Ｄｏ  ｌａｍｐｒｅｙｓ  ｈａｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ？  Ｔｈｅ  Ｓｐｉ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（２０００）９７：７４１７−２２
【非特許文献２３】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＭＫ，Ｓｕｎ  Ｘ，Ｍｉｒａｃｌｅ  ＡＬ，Ｌｉｔｍａｎ  ＧＷおよびＲｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  ＥＶ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ：  Ｔｈｒｅｅ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＵ．１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ａ  ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｆｉｓｈ，Ｒａｊａ  ｅｇｌａｎｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００１）９８：５５３−８
【非特許文献２４】Ｍａｙｅｒ  ＷＥ，Ｏ’Ｈｕｉｇｉｎ  Ｃ，Ｔｉｃｈｙ  Ｈ，Ｔｅｒｚｉｃ  ＪおよびＳａｒａｇａ−Ｂａｂｉｃ  Ｍ、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｉｋａｒｏｓ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｌａｍｐｒｅｙ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２ｂ）５５：１６２−７０
【非特許文献２５】Ａｚｕｍｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｕｒｏｃｈｏｒｄａｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：”ｗａｉｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｇｏｄｏｔ”Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３）５５：５７０−８１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本明細書に具体的かつ広範囲に記載する本発明の目的によると、本発明は、１つの態様では、新規なリンパ球受容体またはそのフラグメントを含むポリペプチドに関する。本発明は、前記リンパ球受容体またはフラグメントをコードする核酸にさらに関する。前記ポリペプチドおよび核酸を作製かつ使用する方法もまた提供される。そのような使用には、広範囲の精製、治療および診断方法が含まれる。
【０００７】
本発明の追加の長所は、一部は以下の説明の中に記載され、そして一部は本説明から明白になるか、または本発明の実践によって学習することができるであろう。本発明の長所は、添付の特許請求の範囲の中で特別に指摘された要素および組み合わせによって実現かつ達成されるであろう。上記の一般的説明および下記に詳述する説明の両方は、代表的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求されるように本発明を限定するものではないことを理解されたい。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
１つのＮ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、１つまたは複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、１つのＣ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および１つの連結ペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、前記連結ペプチドがαヘリックスを含む、ポリペプチド。
（項目２）
前記連結ペプチドがＬＲＲＣＴへ連結している、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
柄領域およびグリコシル−ホスファチジル−イノシトールアンカーをさらに含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４）
疎水性尾部をさらに含む、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記柄領域がトレオニン−プロリンリッチ領域を含む、項目３に記載のポリペプチド。
（項目６）
１つのシグナルペプチドをさらに含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目７）
１〜９個のＬＲＲが存在する、前記ＬＲＲＮＴに隣接するＬＲＲ１を備える、項目１に記載のポリペプチド。
（項目８）
ＬＲＲ１が約２０個未満のアミノ酸を含む、項目７に記載のポリペプチド。
（項目９）
ＬＲＲ１が約１８個のアミノ酸を含む、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１０）
ＬＲＲ２〜９の各々が約２５個未満のアミノ酸を含む、項目７に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ＬＲＲＮＴが約４０個未満のアミノ酸を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記ＬＲＲＮＴが配列番号１５７のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ＬＲＲＮＴが１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１５７のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ＬＲＲＣＴが約６０個未満のアミノ酸を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ＬＲＲＣＴが配列番号１５８のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ＬＲＲＣＴが１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１５８のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記連結ペプチドが約１５個未満のアミノ酸を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ＬＲＲのアミノ酸配列が相互に相違する、そしてＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴと相違する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記ポリペプチドが約１３０〜約２２５アミノ酸長である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ポリペプチドが選択的に作用因子へ結合する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記作用因子が病原体である、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記病原体が細菌である、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記作用因子が毒素である、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２４）
項目１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
（項目２５）
発現制御配列に機能的に連結した項目２４に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目２６）
項目２５記載のベクターを含む培養された細胞。
（項目２７）
前記ポリペプチドが固体支持体へ結合している、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記固体支持体が可動固体支持体である、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記固体支持体がカラムである、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記固体支持体がチップである、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記固体支持体がマルチウエルプレートである、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記ＬＲＲがポリペプチド全体で高度に可変性である、項目１記載の複数のポリペプチド。
（項目３３）
前記複数が固体支持体へ結合している、項目３２に記載の複数のポリペプチド。
（項目３４）
前記固体支持体が可動固体支持体である、項目３２に記載の複数のポリペプチド。
（項目３５）
前記固体支持体がカラムである、項目３２に記載の複数のポリペプチド。
（項目３６）
前記固体支持体がチップである、項目３２に記載の複数のポリペプチド。
（項目３７）
前記固体支持体がマルチウエルプレートである、項目３２に記載の複数のポリペプチド。
（項目３８）
サンプル中の作用因子を検出する方法であって、
ａ．前記サンプルを項目２０記載のポリペプチドとを、前記サンプル中の前記作用因子へ前記ポリペプチドが結合するための条件下でと接触させる工程と；
ｂ．前記サンプル中の前記作用因子へ結合したポリペプチドを検出する工程であって、結合したポリペプチドが前記サンプル中の作用因子を指示する工程と、を含む方法。
（項目３９）
前記ポリペプチドが検出可能な成分で標識される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記サンプル中の前記作用因子の定量をさらに含む、項目３８記載の方法。
（項目４１）
作用因子の活性を遮断する方法であって、前記作用因子を項目２０に記載の前記ポリペプチドとを、前記ポリペプチドが前記作用因子に結合するための条件下で接触させる工程を含み、前記ポリペプチドの前記作用因子への結合が前記作用因子の活性を遮断する方法。
（項目４２）
接触させる工程がインビトロである、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
接触させる工程がインビボである、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
被験者に有効量の項目１に記載のポリペプチドを投与する工程、および前記被験者において結合したポリペプチドの所在位置を検出する工程、を含むイメージング法。
（項目４５）
前記ポリペプチドが検出可能な成分で標識される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
サンプルからの作用因子を精製する方法であって、
ａ．前記サンプルを項目２０記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドが作用因子に結合してポリペプチド／作用因子複合体を形成する条件下で、接触させる工程と；
ｂ．前記サンプルから前記ポリペプチド／作用因子複合体を単離する工程と；
ｃ．前記ポリペプチド／作用因子複合体から前記作用因子を単離する工程と、を含む方法。
（項目４７）
被験者における病原性作用を減少または予防する方法であって、前記被験者に有効量の項目２１のポリペプチドを投与する工程を含む方法。
（項目４８）
ポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で項目２６に記載の細胞を培養する工程と、前記ポリペプチドを細胞または細胞の培地から精製する工程と、を含む方法。
（項目４９）
被験者における１つまたは複数の可変性リンパ球受容体をスクリーニングする方法であって、被験者において、１つのＮ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、１つまたは複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、１つのＣ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および１つの連結ペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドを同定する工程を含み、このとき前記連結ペプチドがαヘリックスを含む、方法。
（項目５０）
遺伝子の機能を決定する方法であって、遺伝子を発現する細胞の細胞質内へ前記遺伝子のタンパク質産物に対して特異的なポリペプチドを導入する工程、および機能が知られていない遺伝子のタンパク質産物の消失に起因する作用を監視する工程、を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本明細書に組み込まれていてその一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を図示しており、下記の説明とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。
【図１】図１は、ヤツメウナギの白血球およびＶＬＲを示した図である。図１ａは、抗原／マイトジェンカクテルを用いた免疫賦活前後の白血球についての光散乱分析を示している。図１ｂは、選別された免疫賦活白血球：小リンパ球（Ｒ１）、大リンパ球（Ｒ２）または骨髄性細胞（Ｒ３）を示している。Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色、１００×。スケールバー＝１０μｍ。図１ｃは、ＶＬＲおよびＧＡＰＤＨ（コントロール）の視覚的なノーザンブロットを示している。免疫賦活および非免疫賦活幼生の組織から、または造血器官および血液由来の選別された細胞から増幅させたｃＤＮＡが示されている。図１ｄは、ＶＬＲスティックモデル：シグナルペプチド、Ｎ末端ＬＲＲ、９個のＬＲＲ、連結ペプチド、Ｃ末端ＬＲＲ、トレオニン−プロリンリッチ柄部、ＧＰＩアンカーおよび疎水性尾部を示している（クローン１２．２６、４１７残基、ＡＹ５７７９７４）。図１ｅは、細菌ＧＰＩ−ホスホリパーゼＣを用いて処理した（＋ＰＬＣ）または用いずに処理した（−ＰＬＣ）マウス胸腺腫細胞内で発現したエピトープタグ付きＶＬＲおよびＦｃγＲＩＩｂ（コントロール）の細胞表面発現を示している。図１ｆは、２回転させて見たＶＬＲ多様性領域の３Ｄモデルを示している（クローン１２．２６）。
【図２】図２は、２匹のヤツメウナギの幼生におけるＶＬＲ多様性についての調査を示した図である。リンパ球からＰＣＲ増幅した２０の多様性領域のアライメント。ＰＣＲプライマーは、全ＶＬＲ配列内に保存された領域内に所在した：ＬＲＲＮＴの５’側およびＬＲＲＣＴの３’側近くのシグナルペプチド。ドナー動物およびクローン数が指示されている。ＬＲＲモチーフの位置もまた示されている。黒色：１００％同一性；灰色：６０〜９９％同一性；白色：６０％同一性。配列１．３〜２．１０は、本明細書では各々配列番号１〜２０に対応する。
【図３】図３は、１３匹の個々の幼生におけるＶＬＲタンパク質多様性の評価を示した図である。ｃＤＮＡおよびゲノムＰＣＲクローン由来の１１２のＶＬＲ多様性領域の遺伝子距離デンドログラム（樹系図）。幼生数およびクローン数（例、６．２０＝ドナー６、クローン２０）は、免疫賦活ドナー（Ｎ＝２７）については赤色および非免疫賦活ドナー（Ｎ＝４１）については緑色で指示されている。星印（＊）は、１つの単離体由来の２個のＶＬＲ（９．１６Ｓ、９．１６Ｌ）を含む単一の細胞単離体（Ｎ＝１２）由来のクローンを示している；そしてコントロール１０細胞プール由来のクローンは１０Ｃと表示されている（Ｎ＝４）。ゲノムＤＮＡ由来の成熟ＶＬＲ配列は青色である（Ｎ＝２８；血液＃１０、１２；死体＃１１、１３）。全セットについての平均多様性は１．３６±０．０３であり、１３の固体からの配列群内で０．２８〜０．５４の範囲である。
【図４】図４は、ＶＬＲのＮ末端またはＣ末端のプローブを用いてハイブリダイズした制限酵素消化ＤＮＡのＶＬＲゲノムブロットを示した図である。図４（ａ）は、３匹のヤツメウナギのブロットを示している（血液ＤＮＡ  ＃１０、１２；死体＃１３）。動物１３だけが多型ＢａｍＨＩパターンを示した。図４ｂは、１０匹のヤツメウナギからプールされた赤血球からゲノムの広がりを示している。パルスフィールドブロット・ハイブリダイゼーションは両方のプローブに対して適合するパターンを示し、さらなる３５０ｋｂのＮｏｔＩ  Ｎ末端バンドは５’ｇＶＬＲ重複に対応する。
【図５】図５は、ＶＬＲ遺伝子座のゲノム組織を示した図である。図５ａは、２０ｋｂにわたってオーバーラップするクローンＰＡＣ１６（４４ｋｂ）およびＰＡＣ３（３３ｋｂ）から融合された５７ｋｂのｇＶＬＲコンティーグ（ＡＹ５７７９４１）内で同定されたモチーフを示している。点線はＰＡＣ挿入物を表している；赤いバーは、Ｎ末端およびＣ末端プローブを指示している。図５ｂは、ＰＡＣ４（５８ｋｂ、ＡＹ５７７９４２）が１１．７ｋｂにわたってｇＶＬＲコンティーグとアライメントすることを示している（ヌクレオチド４５，８８２〜５７，６０９）。１〜３個のＬＲＲのカセットは順方向または逆方向で配置されている：８個はｇＶＬＲコンティーグ内であり、１７個はＰＡＣ４内である。図５ｃは、ｇＶＬＲのＬＲ−ＰＣＲ分析を示している。血液（＃１０）または死体（＃１３）由来のＤＮＡはプライマーｇＶＬＲ．Ｆ１＋ｇＶＬＲ．Ｒ１を用いて増幅させた（図５ａおよび図５ｅに示した）。ＰＡＣ１６アンプリコンがコントロールとして機能した。約２０ｋｂのバンドは生殖細胞系ＶＬＲに対応し、約８ｋｂのバンドは成熟ＶＬＲに対応する。図５ｄは、成熟ＶＬＲのリンパ球特異的再配列を示している。選別された１００個のリンパ球または赤血球のプール由来のＬＲ−ＰＣＲ。約１４ｋｂのバンドは生殖細胞系ＶＬＲに対応し、約〜１ｋｂのバンドはリンパ球ＤＮＡからのみ増幅された成熟ＶＬＲに対応する。図５ｅは、８ｋｂの成熟ＶＬＲアンプリコンを例示している。
【図６】図６は、ＥＳＴクローンから予測された２２個のＶＬＲタンパク質の複合アライメントを示した図である（シングルパス５’配列、一部不完全なＣ末端）。黒色：完全同一性；黄色：８０〜９９％同一性；緑色：６０〜７９％同一性；白色：６０％未満の同一性。ＬｙＥＳＴ３０９０〜ＬｙＥＳＴ５２６６に対するアミノ酸配列は、各々配列番号２１〜４２に対応する。
【図７】図７は、代表的なＶＬＲ（ｃＤＮＡクローンＬｙＥＳＴ２９１３、ＡＹ５７８０５９）のＯＲＦを示した図である。開始メチオニンはヌクレオチド１１８〜１２０にあり、終止コドンはヌクレオチド９３７〜９３９にある。生殖細胞系ＶＬＲのエクソン２およびエクソン４内に保存されたヌクレオチド配列は赤色で表示されている；エクソン３に対応する多様な５’ＬＲＲＣＴは緑色で表示されている。構造モチーフはタンパク質配列の上方に表示されている；ＧＰＩ開裂部位は青色で表示されている。図示したアミノ酸配列は配列番号４３に対応し、図示した核酸配列は配列番号１５６に対応する。
【図８−１】図８は、１３匹のヤツメウナギからＰＣＲ増幅させた１１２のＶＬＲ多様性領域の複合アライメントを示した図である。免疫賦活ヤツメウナギおよび非免疫賦活ヤツメウナギからのゲノムクローンおよびＲＴ−ＰＣＲクローン。非免疫賦活動物：＃１〜４と指定された動物（Ｎ＝４１）、＃８と指定された動物由来の選別された単リンパ球（Ｎ＝４）および＃８．１０Ｃと指定された動物由来の１０個の細胞のプール由来のクローン（Ｎ＝４）；免疫賦活動物：２個のＶＬＲ（９．１６Ｓ、９．１６Ｌ）を備える１つの単離体を含む、＃５〜７と指定された動物（Ｎ＝２７）および＃９と指定された動物由来の選別された単リンパ球（Ｎ＝８）；成熟ＶＬＲ：＃１０〜１３（Ｎ＝２８）または死体（＃１１、１３）と指定された血液から抽出した幼生ゲノムＤＮＡ。黒色：８０〜１００％同一性；黄色：６０〜７９％；緑色：４０〜５９％；白色：＜４０％。アライメントの上部から、１．１に対するアミノ酸配列は配列番号１３に対応し、アミノ酸配列７．２７〜４．７は配列番号４５〜５２に対応し、アミノ酸配列１．５は配列番号１２に対応し、アミノ酸配列４．１４は配列番号５４に対応し、アミノ酸配列１．７は配列番号８に対応し、アミノ酸配列３．１５は配列番号５６に対応し、アミノ酸配列２．１は配列番号５に対応し、アミノ酸配列２．２は配列番号１０に対応し、アミノ酸配列２．７は配列番号１１に対応し、アミノ酸配列４．８〜６．２２は配列番号６０〜６５に対応し、アミノ酸配列２．４は配列番号３に対応し、アミノ酸配列１．８は配列番号２に対応し、アミノ酸配列７．３〜６．２１は配列番号６８〜７２に対応し、アミノ酸配列１．２は配列番号５に対応し、アミノ酸配列２．１４は配列番号６に対応し、アミノ酸配列３．７は配列番号７５に対応し、アミノ酸配列１．６は配列番号７に対応し、アミノ酸配列５．３は配列番号７７に対応し、アミノ酸配列１０．１は配列番号７８に対応し、アミノ酸配列２．１４は配列番号４に対応し、アミノ酸配列１．３は配列番号１に対応し、アミノ酸配列６．１６〜７．２６は配列番号８１〜１１９に対応し、アミノ酸配列２．１５は配列番号１４に対応し、アミノ酸配列２．８は配列番号１７に対応し、アミノ酸配列５．６〜７．３３は配列番号１２２〜１２５に対応し、アミノ酸配列１．１０は配列番号１９に対応し、アミノ酸配列２．１０は配列番号２０に対応し、アミノ酸配列１．４は配列番号１５に対応し、アミノ酸配列１２．１９〜４．３は配列番号１２９〜１３２に対応し、アミノ酸配列１．９は配列番号１６に対応し、アミノ酸配列５．５〜３．３は配列番号１３４〜１４４に対応し、アミノ酸配列２．１３は配列番号１８に対応し、およびアミノ酸配列３．６〜３．９は配列番号１４６〜１５５に対応する。
【図８−２】（図８−１の続き）
【図９】図９は、進化的に保存された無顎類ＶＬＲを示した図である。沿岸メクラウナギ（Ｅｐｔａｔｒｅｔｕｓ  ｂｕｒｇｅｒｉ）、太平洋メクラウナギ（Ｅ．ｓｔｏｕｔｉｉ）、ウミヤツメ（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５７７９４６）、アメリカカワヤツメ（Ｌａｍｐｅｔｒａ  ａｐｐｅｎｄｉｘ）および北部カワヤツメ（Ｉｃｈｔｈｙｏｍｙｚｏｎ  ｆｏｓｓｏｒ）を表しているＶＬＲアミノ酸配列。青色の影：１００％同一性；黄色：６０〜９９％同一性；緑色：４０〜５９％同一性；赤色：疎水性尾部領域。
【図１０】図１０は、太平洋メクラウナギＶＬＲ多様性領域（ＬＲＲＮＴからＬＲＲＣＴ）間の遺伝子距離を示した図である。５匹の動物からの、ＰＣＲ増幅リンパ球様ｃＤＮＡクローンまたは血液ゲノムＰＣＲアンプリコンから予測されるタンパク質。スケールバーは５％アミノ酸多様性を表している。Ａ．ＶＬＲ−Ａ（Ｎ＝１３９）。Ｂ．ＶＬＲ−Ｂ（Ｎ＝７０）。緑色：非免疫賦活；赤色：免疫賦活；青色：ゲノム成熟ＶＬＲ；星印−関連配列。
【図１１】図１１は、メクラウナギＶＬＲ遺伝子座を示した図である。図１１Ａは、太平洋メクラウナギＶＬＲ−Ａを示している。図１１Ｂは、沿岸メクラウナギＶＬＲ−Ａを示している。図１１Ｃは、太平洋メクラウナギＶＬＲ−Ｂを示している。図１１Ｄは、沿岸メクラウナギＶＬＲ−Ｂを示している。４個のＢＡＣクローンからの挿入物の配列であり、占められていないギャップがマーキングされている。逆方向または順方向にあるＶＬＲ生殖細胞系遺伝子およびフランキングカセットの位置はキロベース単位で指示されている（図は一定尺度から外れている）。ＧｅｎＳｃａｎ遺伝子予測は青色で表示されている：太平洋メクラウナギ生殖細胞系ＶＬＲ−Ａ遺伝子から上流の非関連性ＬＲＲ遺伝子ならびに沿岸メクラウナギＶＬＲ−Ａおよび太平洋メクラウナギＶＬＲ−Ｂ遺伝子座における２つの隣接するトランスポザーゼＯＲＦ。
【図１２】図１２は、無顎類ＶＬＲ遺伝子、転写産物および系統発生を示した図である。図１２Ａは、太平洋メクラウナギおよびウミヤツメの生殖細胞系および成熟ＶＬＲ遺伝子の略図を示している。着色したバーは、コーディング領域を示している；ヌクレオチド単位のサイズ；メクラウナギＶＬＲを増幅させるために使用したＰＣＲプライマーの位置（表５）は矢印で指示され、Ｆ（順方向）、Ｒ（逆方向）と指示されている。図１２Ｂは、リンパ球様転写産物（ＲＴ−ＰＣＲ）または血液ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた太平洋メクラウナギＶＬＲを示している。アガロースゲル画像；左には分子量マーカーが表示されている（キロベース）；生殖細胞系および成熟ＶＬＲアンプリコンの位置は右側に表示されている。図１２Ｃは、無顎類ＶＬＲの系統発生的分析を示している。メクラウナギおよびヤツメウナギＶＬＲタンパク質の近隣結合系統樹（図９の配列と同一配列）；ブートストラップ値が指示されている。スケールバーは１０％アミノ酸多様性を表している。図１２Ｄは、無顎類ＶＬＲの進化のモデルを示している。
【図１３】図１３は、沿岸メクラウナギＶＬＲ多様性領域（ＬＲＲＮＴからＬＲＲＣＴ）間の遺伝子距離を示した図である。タンパク質は、３匹の動物の白血球ｃＤＮＡクローンまたはゲノムＤＮＡ由来の成熟ＶＬＲアンプリコンから予測した。スケールバーは５％アミノ酸多様性を表している。Ａ．ＶＬＲ−Ａ（Ｎ＝６６）。Ｂ．ＶＬＲ−Ｂ（Ｎ＝１８）。赤色：メクラウナギ＃７；緑色：＃８；青色：メクラウナギ＃９由来のゲノム成熟ＶＬＲ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（詳細な説明）
最古の脊椎動物の中で現代に生きる代表であるウミヤツメＰｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓの脊椎動物免疫系の原始エレメントを対象にリンパに集中した調査が開始された。ヤツメウナギ造血組織由来のリンパ球様細胞によって発現した転写産物の初期の分析は、免疫系分子の数種のホモログを同定したが（Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｕｉｎｕｋ−Ｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｕｉｎｕｋ−Ｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、有顎類脊椎動物が特異的適応免疫のために使用する基本的なＩｇスーパーファミリー受容体エレメントは同定されなかった。血流中に存在する活性化リンパ芽球は適応応答に含まれる遺伝子を発現する可能性が高いと判断して、本試験は、免疫賦活ヤツメウナギ幼生由来リンパ球のトランスクリプトームの調査から開始した。この研究により、本明細書に記載する新規なタイプの高可変性リンパ球受容体が明らかになった。
【００１０】
本発明は、本明細書に含まれた本発明の好ましい実施形態および実施例についての下記の詳細な説明および図面ならびにそれらについての上記や下記の説明を参照することによってより容易に理解することができる。
【００１１】
本発明の化合物、組成物、製品、装置、および／または方法を開示および説明する前に、当然ながらそれらは変動することがあるので、本発明は、他に特に規定しない限り、特定の合成方法、特定の組み換えバイオテクノロジー方法にも限定されず、他に規定しない限り特定の試薬にも限定されないことを理解されたい。さらにまた、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明するために使用されたに過ぎず、限定的であることは意図されていないことも理解されたい。
本明細書および添付の特許請求項において使用する単数形の「１つの」および「その」には、状況が他の場合を明確に指さない限り、複数対象が含まれる。そこで、例えば「１つの医薬担体」との言及には、２つ以上のそのような担体などの混合物が含まれる。
【００１２】
本明細書での範囲は、「約」１つの特定値から、および／または「約」別の特定値までを表すことができる。そのような範囲が明示される場合は、別の実施形態は、１つの特定値から他の特定値までを含んでいる。同様に、先行詞「約」の使用によって近似値として数値が明示される場合は、特定値が別の実施形態を形成することを理解されたい。さらに、範囲各々の終点は、他方の終点と関連して、および他方の終点からは独立してのどちらにおいても重要であることを理解されたい。
【００１３】
「任意の」または「任意で」は、引き続いて記載される事象または状況が発生しても発生しなくてもよく、そしてその説明は前記事象または状況が発生する場合およびそれが発生しない場合を含んでいることを意味する。
【００１４】
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、アミノ酸配列について言及するために互換的に使用される。
【００１５】
本発明は、１〜１２個のロイシンリッチリピートを含み、適応免疫において機能できる体細胞性再配列が可能なポリペプチドである可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）に関する。
【００１６】
本発明は、Ｎ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、１つまたは複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）（本明細書では内部ＬＲＲと呼ぶ）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および連結ペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供するが、このとき連結ペプチドはαヘリックスを含んでいる。ポリペプチドの長さは、約１３０という少数のアミノ酸または約２２５という多数のアミノ酸を含むことができる。ポリペプチドおよびコーディング核酸の一般構造および特定配列の例は図に示されている。さらに様々な領域（シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴ、ＬＲＲ、ＬＲＲＣＴ、連結ペプチド、柄部および疎水性尾部を含む）の極めて多数の例は図の中に見いだすことができる。
【００１７】
任意で、連結ペプチドはＬＲＲＣＴのＮ末端側に位置しており、より具体的には内部ＬＲＲおよびＬＲＲＣＴの間に位置している。連結ペプチドは、内部ＬＲＲおよびＬＲＲＣＴへ連結させることができる。したがって、本明細書ではＬＲＲＮＴ、１つまたは複数の内部ＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴをその順序で含むポリペプチドが開示される。さらに、ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴ間の内部ＬＲＲ領域が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のロイシンリッチリピートを含むポリペプチドが開示され、ＬＲＲ１はＬＲＲＮＴに隣接して位置するかまたは近位に位置する。本明細書で使用するようにＬＲＲ１、ＬＲＲ２、ＬＲＲ３、ＬＲＲ４、ＬＲＲ５、ＬＲＲ６、ＬＲＲ７、ＬＲＲ８、またはＬＲＲ９は、ＬＲＲＮＴからＬＲＲＣＴへ連続的に進むとみなされる。そこで本明細書には、ＬＲＲＮＴ、ＬＲＲ１、ＬＲＲ１〜２、ＬＲＲ１〜３、ＬＲＲ１〜４、ＬＲＲ１〜５、ＬＲＲ１〜６、ＬＲＲ１〜７、ＬＲＲ１〜８、またはＬＲＲ１〜９、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴをその順序で含むポリペプチドが開示される。
【００１８】
ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）は、タンパク質対タンパク質相互作用に典型的に関係する短い配列モチーフであり、ＬＲＲは複数のロイシン残基を含んでいる。ＬＲＲは、例えば２位、５位、７位、１２位、１６位、２１位および２４位でロイシンまたは他の脂肪族残基を含有する。しかし、ロイシンまたは他の脂肪族残基は２位、５位、７位、１２位、１６位、２１位および２４位での残基の場所に加えて、またはそれらの代わりに他の位置に存在し得ると理解されており、本明細書では企図されている。例えば、ロイシンは２位ではなく３位に存在し得る。構造的には、モチーフがβシート構造を形成することもまた理解されたい。そこで、例えばＬＲＲＮＴ、５個のＬＲＲ、ＬＲＲＣＴ、および連結ペプチドを含む開示されたポリペプチドは、７つのβシート構造および連結ペプチドのαヘリックスを含むであろう。
【００１９】
各ＬＲＲの長さおよび配列は、ポリペプチド内の他のＬＲＲならびにＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴとは相違することがあると理解されたい。例えば、本発明の１つの実施形態は、ＬＲＲＮＴ、１〜９個のＬＲＲ、連結ペプチド、およびＬＲＲＣＴを含むポリペプチドであるが、このとき第１内部ＬＲＲはＬＲＲ１であり、ＬＲＲ１は約２０個未満のアミノ酸を含んでいる。さらにＬＲＲ１が約１８個のアミノ酸を含むポリペプチドが開示される。任意で、このポリペプチドはさらにＬＲＲ２〜９を含むが、このときＬＲＲ２〜９は各々約２５未満のアミノ酸である。さらにＬＲＲ２〜９が各々約２４個のアミノ酸を含むポリペプチドが開示される。ＬＲＲ１〜９は、長さおよび特異的アミノ酸配列の両方において所定のポリペプチド内で同一であっても、または相互から相違していてもよい。
【００２０】
ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴと指される末端ＬＲＲは、典型的には各内部ＬＲＲより長い。ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴは、不変領域（類似の可変性リンパ球受容体と比較してポリペプチドの残りに比してほとんど変化を有していない領域）を含む。可変領域は、特異性を備える受容体を提供するが、不変領域および受容体にわたる一般構造類似性は保護免疫機能を維持するのに役立つ。ポリペプチドはＬＲＲＮＴを含むことができ、このときＬＲＲＮＴは約４０未満のアミノ酸を含んでいる。そこで、ＬＲＲＮＴは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、任意でアミノ酸配列ＣＰＳＱＣＳＣ（配列番号１５７）、ＣＰＳＲＣＳＣ（配列番号３０７）、ＣＰＡＱＣＳＣ（配列番号３０８）、ＣＰＳＱＣＬＣ（配列番号３０９）、ＣＰＳＱＣＰＣ（配列番号３１０）、ＮＧＡＴＣＫＫ（配列番号３１１）、またはＮＥＡＬＣＫＫ（配列番号３１２）を含んでいる。さらにまた、ＬＲＲＣＴが約６０アミノ酸長未満、および任意で４０〜６０アミノ酸長であるＬＲＲＣＴを含むポリペプチドが開示される。詳細には、特に、ＬＲＲＣＴが保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、アミノ酸配列ＴＮＴＰＶＲＡＶＴＥＡＳＴＳＰＳＫＣＰ（配列番号１５８）、ＳＧＫＰＶＲＳＩＩＣＰ（配列番号３１３）、ＳＳＫＡＶＬＤＶＴＥＥＥＡＡＥＤＣＶ（配列番号３１４）、またはＱＳＫＡＶＬＥＩＴＥＫＤＡＡＳＤＣＶ（配列番号３１５）を含むポリペプチドが開示される。
【００２１】
すべてのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質と同様に、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の性質または機能を変化させないＬＲＲＣＴおよびＬＲＲＮＴのアミノ酸配列における置換が発生する可能性があると理解されたい。そのような置換は、保存的アミノ酸置換を含んでおり、下記でより詳細に考察する。
【００２２】
開示された組成物は、連結ペプチドも含むことができる。典型的には、そのようなペプチドは１５アミノ酸長未満の短いペプチドであり、αヘリックスを含んでいる。そこで、例えばαヘリックスを含む１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、および１５アミノ酸長の連結ペプチドが特異的に開示される。連結ペプチドは、ポリペプチドの構造的成分を連結させるために機能すると理解されたい。さらに、ポリペプチドの連結ペプチドは、ＬＲＲＣＴへ連結できると理解されたい。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、可溶形または膜結合形を含むことができる。ポリペプチドを可溶形または膜結合形にさせる多数の機序が存在する。例えば、膜貫通ドメインを有していないポリペプチドは細胞によって直接的に分泌されることがある。または、ポリペプチドは、膜表面上にそのポリペプチドを維持するグリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含むことができる。このため、本明細書ではＧＰＩアンカーを含むポリペプチドが開示される。表面へ結合したポリペプチドを維持するための他の機構は、当技術分野において知られている。例えば、本ポリペプチドは、膜の脂質二重層との共有相互作用を形成するシングルパスまたはマルチパス膜貫通領域を通して疎水層へ結合させることができる。または、本ポリペプチドは、表面タンパク質との非共有相互作用を通して表面へ結合させることができる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、表面結合ポリペプチドであってよい。細胞表面へのトラフィッキングは、細胞の表面へポリペプチドを送達するための細胞内輸送機構についてのインジケータを提供するシグナルペプチドによって実施することができる。そこで、本発明のまた別の実施形態では、本発明のポリペプチドは本ポリペプチドのＮ末端のシグナルペプチドを含んでいる。
【００２５】
本ポリペプチドが疎水性尾部を含むことができることは理解されており、本明細書で企図されている。
【００２６】
本ポリペプチドは、柄領域を含むことができる。柄領域は、トレオニン−プロリンリッチ領域を含んでおり、ＧＰＩアンカーおよび疎水性尾部とともに、任意で本ポリペプチドの膜結合形で存在する。
【００２７】
本発明のポリペプチドの例には、配列番号１〜４３、４５〜５２、５４、５６、６０〜６５、６８〜７２、７５、７７〜７８、８１〜１１９、１２２〜１２５、１２９〜１３２、１３４〜１４４、および１４６〜１５５のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。配列には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５７７９４１〜ＡＹ５７８０５９およびＣＫ９８８４１４〜ＣＫ９８８６５２が含まれる。配列番号１〜２０のアミノ酸配列を含む配列は、全長ＶＬＲの例を表している。配列番号４３のアミノ酸配列を含む配列は、シグナルペプチドを備える全長ＶＬＲの例である。さらなる全長ＶＬＲおよびそのアミノ酸配列を含むフラグメントは図の中に見いだすことができる。本発明のポリペプチドについて本明細書で教示される構造に基づいて、これらの配列は１つの属のポリペプチドの例であることは理解されるであろう。本発明は全長ＶＬＲおよびそのフラグメントを含んでいると理解されたい。
【００２８】
開示された組成物を調製するために使用される構成成分ならびに本明細書に開示した方法の中で使用される組成物自体が開示される。これらやその他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合は、これらの化合物の各々の様々な個別および集合的組み合わせおよび順列についての具体的な参照は明示的には開示されないかもしれないが、各々は本明細書に詳細に企図かつ説明されていると理解されたい。例えば、特定のポリペプチドが開示かつ考察され、多数のポリペプチドへ加えることのできる多数の修飾が考察される場合は、ポリペプチドのありとあらゆる組み合わせおよび順列ならびにそれの反対が特別に指示されない限り可能である修飾が特別に企図されている。そこで、１クラスの分子Ａ、Ｂ、およびＣが開示され、ならびに１クラスの分子Ｄ、Ｅ、およびＦと組み合わせ分子の例Ａ〜Ｄが開示される場合は、各々が個別に言及されていない場合でさえ、各々が個別に、そしてＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの集合的に企図された意味の組み合わせが開示されると考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた開示されている。そこで、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが開示されると考えられる。この概念は、本明細書に開示した組成物の製造方法および使用方法における工程を含むがそれらに限定されない本出願のすべての態様に当てはまる。そこで、実施できる様々な追加の工程が存在する場合は、これらの追加の工程の各々は本明細書に開示した方法の任意の特定実施形態または実施形態の組み合わせにより実施できると理解されたい。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、所望の機能を有する。本明細書に記載したポリペプチドは、抗体が選択的に抗原または作用因子へ結合するのとほとんど同様に、抗原または作用因子に選択的へ結合する。ポリペプチドは、任意に可変性リンパ球受容体（天然型または非天然型）またはそのフラグメントもしくは変異体である。用語「可変性リンパ球受容体」は、本明細書では広範囲の意味で使用され、同様に用語「抗体」は様々な特異性を有する様々なバージョンを含んでいる。ポリペプチドは、本明細書に記載したインビトロアッセイを使用してまたは類似方法によってそれらの所望の活性について試験され、その後にそれらの治療的、診断的、またはその他の精製活性が公知の試験方法にしたがって試験される。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、細胞外物質（例、病原体）または抗原へ結合できる。作用因子または抗原には、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、およびタンパク質を含むことができるが、それらに限定されない。作用因子または抗原は、病原生物を含むがそれらに限定されない様々な起源に由来することがある。作用因子または抗原への結合は、選択的であると理解されたい。「選択的に結合」または「特異的に結合」は、他の抗原または作用因子を部分的または完全に除外して１つの作用因子または抗原へ結合することを意味する。「結合」は、アッセイ方法のバックグラウンドの少なくとも約１．５倍での検出可能な結合を意味する。選択的または特異的結合については、そのような検出可能な結合は所定の抗原または作用因子については検出できるが、コントロール抗原または作用因子については検出できない。そこで、例えばウイルス、細菌、真菌、または原生動物の抗原または作用因子に選択的に結合するポリペプチドが開示される。
【００３１】
ポリペプチドが詳細に開示されるが、前記ポリペプチドは作用因子へ結合し、このとき前記作用因子は病原性作用因子である。さらに、病原性作用因子に選択的に結合する本発明のポリペプチドが開示されるが、このとき前記病原体はウイルスである。多数のウイルスが存在することが知られている。ウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水疱・帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、ヒトヘルペスウイルス８型、痘瘡ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＲＳ（呼吸系合胞体）ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デング熱ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｆｅｖｅｒ）ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ型、ロタウイルスＢ型、ロタウイルスＣ型、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、およびヒト免疫不全ウイルス２型からなるウイルス群から選択できる。
【００３２】
さらにまた、病原体が細菌である本発明のポリペプチドが開示される。多数の細菌が存在することが知られている。本明細書では、病原体に選択的に結合するポリペプチドが特別に企図かつ開示されるが、このとき前記病原体は結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結核菌株ＢＣＧ、ＢＣＧ亜株、トリ型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、トリ型結核菌亜種パラ結核菌（ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ノカルジア・アステオロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、その他のノカルジア種、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、その他のレジオネラ種、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、その他のサルモネラ種、赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、動物パスツレラ症病原菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、その他のパスツレラ種、アクチノバチルス胸膜肺炎菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・イヴァノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、その他のブルセラ種、コードリア・ルミナンチウム（Ｃｏｗｄｒｉａ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オーム病病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、コクシエラ・バーネッティイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）、その他のリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ）種、エールリヒア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）種、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、その他のシュードモナス種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、その他のヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、その他のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびその他のエルシニア種からなる細菌リストから選択される細菌である。
【００３３】
さらに、病原体に選択的に結合する本発明のポリペプチドが開示されるが、前記病原体は原生動物または他の寄生虫である。多数の寄生虫性感染症が存在することが知られている。本明細書では病原体に選択的に結合するポリペプチドが特別に企図かつ開示されるが、前記病原体は、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、その他のプラズモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ・ブルース（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、その他のリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、その他の住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、および赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される寄生虫性感染である。
【００３４】
さらに、病原体に選択的に結合する本発明のポリペプチドが開示されるが、前記病原体は真菌である。多数の真菌が存在することが知られている。本明細書には特別にポリペプチドが企図かつ開示されているが、このとき病原体は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコックス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ
ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラジル・パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブラストミセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍｉｔｉｄｉｓ）、カリニ肺炎（Ｐｎｅｏｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉ）、ペニシリウム症（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｉ）、およびアルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）からなる真菌群から選択される真菌である。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、毒素にもまた選択的に結合できる。本明細書では、「毒素」は、それ（毒素）が接触した任意の細胞を効果的に破壊する任意の化学的または生物学的物質を意味する。毒素の著明な例には、リシン、百日咳毒素、サリン、細菌内毒素、中毒性ショック症候群毒素１、コレラ毒素、およびヘビ毒毒素が挙げられる。そこで、毒素へ結合するポリペプチドが特別に開示される。
【００３６】
本明細書に記載したポリペプチドは、所望の機能が維持される限り修飾および変化させることができる。任意の変異体および誘導体または本明細書に開示した遺伝子およびタンパク質から発生する可能性のある変異体および誘導体を規定する１つの方法は、特異的な既知配列との相同性によって変異体および誘導体を規定することによると理解されたい。例えば、配列番号１は、本発明の任意の数の核酸によってコードされたポリペプチドの特定アミノ酸配列を規定している。特に開示されているのは、上記の配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性を有する本明細書に開示されたこれらや他の遺伝子およびタンパク質の変異体である。当業者であれば、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解できる。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルにあるように２つの配列をアライメントした後に計算できる。
【００３７】
一般に、任意の公知の変異体および誘導体または本明細書に開示した遺伝子およびタンパク質から発生する可能性のある変異体および誘導体を規定する１つの方法は、特異的な既知配列との相同性によって変異体および誘導体を規定することによる方法であると理解されたい。本明細書に開示した特定配列のこの同一性については、本明細書の他の場所においても考察する。一般に、本明細書に開示した遺伝子およびタンパク質の変異体は、典型的には、上記の配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性を有する。当業者であれば、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解できる。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルにあるように２つの配列をアライメントした後に計算できる。
【００３８】
相同性を計算するまた別の方法は、発表されたアルゴリズムによって実施できる。比較のための配列の最適アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータを使用した実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ワイオミング州マディソン）によって、または目視検査によって実施できる。
【００３９】
核酸についての同一タイプの相同性は、例えば少なくとも核酸アライメントに関する材料について参照して本明細書に組み込まれるＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９の中で開示されたアルゴリズムによって入手できる。典型的にはこれらの方法のいずれかを使用できること、そして所定の場合にはこれらの様々な方法の結果は相違することがあるが、当業者であれば、これらの方法の少なくとも１つを用いて同一性が見いだされると、それらの配列は規定された同一性を有しており、本明細書に開示されていると理解することができることが理解されよう。
【００４０】
例えば、本明細書で使用するような他の配列との特定パーセンテージの相同性を有すると言及された配列は、任意の１つまたは複数の上記に記載した計算方法によって計算された言及された相同性を有する配列を意味する。例えば、第１配列は、第１配列がＺｕｋｅｒ計算法を用いて第２配列と８０％相同性を有すると計算された場合は、たとえ第１配列が他の任意の計算方法によって計算した場合に第２配列との８０％相同性を有していない場合でさえ、本明細書に規定したように第２配列との８０％相同性を有する。また別の例として、第１配列は、第１配列がＺｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算法の両方を用いて第２配列と８０％相同性を有すると計算された場合は、たとえ第１配列がＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ計算法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、または任意の他の計算方法によって計算した場合に第２配列との８０％相同性を有していない場合でさえ、本明細書に規定したように第２配列との８０％相同性を有する。さらにまた別の例として、第１配列は、第１配列が各計算法を用いて第２配列と８０％相同性を有すると計算された場合は、本明細書に規定したように第２配列との８０％相同性を有する（だが、実際に様々な計算法はしばしば相違する計算相同性パーセンテージを生じさせるであろう）。
【００４１】
タンパク質の変異体および誘導体は、当業者には明確に理解されており、アミノ酸配列修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列の修飾は、３つのクラス：置換、挿入または欠失変異体の１つまたは複数に分類される。挿入には、単一または複数アミノ酸残基のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに配列内挿入が含まれる。挿入は、通常は、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入より少ない挿入、例えばおよそ１〜４個の残基であろう。実施例に記載された誘導体などの免疫原性融合タンパク質誘導体は、標的配列へ免疫原性を付与するために十分に大きなポリペプチドをインビトロ架橋結合によって融合させる工程によって、またはその融合をコードするＤＮＡを用いて形質転換された組み換え細胞培養によって作製される。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去を特徴とする。典型的には、約２〜６未満の残基がタンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失している。これらの変異体は、通常はタンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的突然変異によって調製され、それによってその変異体をコードするＤＮＡが産生され、その後に組み換え細胞培養内でＤＮＡが発現させられる。知られている配列を有するＤＮＡ内の規定部位で置換突然変異を作製するための技術、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発はよく知られている。アミノ酸置換は、典型的には単一残基の置換であるが、１回に多数の相違する場所で発生してもよい；挿入は、通常はおよそ約１〜１０アミノ酸残基であろう；また欠失は約１〜３０残基の範囲に及ぶであろう。欠失または挿入は、好ましくは隣接対、すなわち２残基の欠失または２残基の挿入で作製される。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせは、最終構築物に達するために組合わせることができる。突然変異は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生成できる相補的領域を作製しないであろう。置換変異体は、少なくとも１つの残基が取り除かれており、異なる残基がその場所に挿入されている変異体である。そのような置換は、一般の表１および２にしたがって作製され、保存的置換と言われる。
【００４２】
【表１】
2011206060.tif 000002
【００４３】
【表２】
2011206060.tif 000003
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表２に記載の置換より保存的ではない置換を選択することによって、すなわち（ａ）例えばシートまたはヘリックス立体構造のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ、を維持する作用がより大きく相違する残基を選択する工程によってなされる。一般にタンパク質特性における最大の変化を生じさせると予測される置換は、（ａ）例えばセリルもしくはトレオニルのような親水性残基が、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルのような疎水性残基と（によって）置換されている；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基と（によって）置換されている；（ｃ）例えばリシル、アルギニル、もしくはヒスチジルのような陽性側鎖を有する残基が、例えばグルタミルもしくはアスパルチルのような陰性残基と（によって）置換されている；（ｄ）例えばフェニルアラニンのようなかさの大きな側鎖を有する残基が、この場合にはグリシンのような側鎖を有していない残基と（によって）置換されている、または（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位数を増加させる、ことによる置換であろう。
【００４４】
例えば、１つのアミノ酸残基と生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基との置換は、当業者には保存的置換として知られている。例えば、保存的置換は１つの疎水性残基と別の疎水性残基とを置換させ、または１つの極性残基と他の極性残基とを置換させるであろう。置換には、例えば、ＧＩｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。各々明示的に開示された配列のそのような保存的に置換された変形は、本明細書に提供したモザイクポリペプチドの範囲内に含まれる。
【００４５】
置換または欠失突然変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するために使用できる。システインまたはその他の易変残基の欠失もまた望ましいことがある。潜在的タンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１つを欠失させる工程によって、または１つをグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基で置換する工程によって遂行される。
【００４６】
所定の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチド上の組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、しばしば対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基へ翻訳後に脱アミド化される。または、これらの残基は弱酸性条件下では脱アミド化される。その他の翻訳後修飾にはプロリンおよびリシンの水酸化、セリルもしくはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および一部の例では、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用する用語「可変性リンパ球受容体」は、被験者に投与されると減少した免疫原性を有するように修飾されているポリペプチドも意味することがある。例えば、ヒトアミノ酸配列は、抗体がヒト化されるのとほとんど同様に、ヒト被験者にとって低免疫原性のバージョンにするためにポリペプチドに挿入または追加することができる。多数の非ヒト可変性リンパ球受容体（例、ヤツメウナギ、マウス、ラット、またはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて天然抗原性である可能性があり、したがってヒトへ投与すると望ましくない免疫応答を発生させることがある。このため、本発明の方法における修飾されたポリペプチドの使用は、ヒトに投与されたポリペプチドが望ましくない免疫応答を惹起する可能性を低下させるために役立つことがある。
【００４８】
修飾技術は、可変性リンパ球受容体分子の１つまたは複数のポリペプチド領域をコードするＤＮＡ配列を操作するための組み換えＤＮＡテクノロジーの使用を含むことができる。したがって、可変性リンパ球受容体（またはそのフラグメント）のヒト化形は、キメラ可変性リンパ球受容体、好ましくはヒト（レシピエント）アミノ酸配列に組み込まれた、非ヒト（ドナー）可変性リンパ球受容体由来の抗原（作用因子）結合部位を含有する可変性リンパ球受容体の抗原（作用因子）結合部分である。
【００４９】
これらのタンパク質配列、その変異体およびフラグメントをコードできる核酸もまた開示されることを理解されたい。これには、特異的タンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち１つの特定タンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびに本明細書に開示したタンパク質配列の変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸が含まれるであろう。そこで、各特定核酸配列は本明細書に書き出されない可能性があるが、ありとあらゆる配列が開示されたタンパク質配列を通して本明細書に実際に開示かつ記載されていると理解されたい。
【００５０】
ヒト化可変性リンパ球受容体はさらにまた、レシピエントの可変性リンパ球受容体にも取込まれたヒト配列内にも見いだされないアミノ酸配列を含有することがある。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、融合タンパク質を作製するためにも使用できる。これらのポリペプチドは、融合タンパク質におけるターゲッティング機能に役立つことができる。そこで本発明のポリペプチドは、第２成分へ、組み換え技術によってコンジュゲートするか、さもなければ連結することができる。第２成分は、例えば細胞殺滅が所望であれば、毒素を含むことができる。そこで、例えば原生動物に選択的に結合するポリペプチドは、原生動物を標的とすることができ、融合タンパク質の毒素成分は細胞を殺滅できる。同様に、本発明のポリペプチドは送達機能を実行できる。そこで第２成分は治療薬であってよい。
【００５２】
本発明のポリペプチドは、検出可能なタグに連結させることができる。「検出可能なタグ」は、インビボまたはインビトロでイメージング法または検出法を用いて視認できる任意のタグである。検出可能なタグは、放射線不透過性物質、放射標識、化学発光標識、蛍光標識、または磁気標識であってよい。検出可能なタグは、γ線エミッター、β線エミッター、α線エミッター、γ線エミッター、ポジトロンエミッター、Ｘ線エミッターおよび蛍光エミッターからなる群から選択できる。適切な蛍光化合物には、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、およびテキサスレッドスルホニルクロリド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｃｙ５−ＰＥ、ＣＹ７−ＡＰＣ、およびカスケードイエローが挙げられる。
【００５３】
標識のために適合する放射性同位体には、ヨウ素１３１、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０５、レニウム１０１、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、テクネチウム９９ｍおよびフッ素１８が挙げられる。
【００５４】
任意で、検出可能なタグは、組織化学的技術、ＥＬＩＳＡ様アッセイ、共焦点顕微鏡、蛍光検出法、セルソーティング法、核磁気共鳴法、ラジオイムノシンチグラフィー、Ｘ線検査、陽電子放射断層撮影法、コンピュータ体軸断層撮影法、磁気共鳴イメージング法、および超音波検査法を用いて視認できる。
【００５５】
または、ポリペプチドをビオチニル化して、蛍光標識ストレプトアビジンのようなその後に検出可能な標識を使用するとポリペプチドを間接的に検出できる。ビオチンは、当技術分野において知られている数種の技術のいずれかによって検出される。例えば、ビオチンは蛍光標識アビジンと結合する工程によって検出可能であり、アビジンは各結合事象に関連するシグナルを増加させるためにフィコエリトリンまたは連鎖蛍光標識を用いて標識される。
【００５６】
任意で、ポリペプチドはスライド、培養皿、マルチウエルプレート、カラム、チップ、アレイまたは安定性ビーズなどの固体支持体へ結合させられる。「アレイ」には、マイクロプレートまたはスライドなどの１つまたは複数のマルチウエルアレイ化手段が挙げられる。
【００５７】
任意で、ポリペプチドは、例えばセルソーティングテクノロジーを用いてソーティングできるビーズなどの可動性固体支持体へ結合させられる。「可動性固体支持体」とは、１セットの識別可能に標識されたマイクロスフェアまたはビーズを意味する。好ましくは、マイクロスフェアは、ポリスチレン・ジビニルベンゼンビーズである。特異的蛍光色素でマークされ、特異的蛍光プロフィールを有するマイクロスフェアのセットは、例えばＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（テキサス州オースティン）から市販で入手できる。
【００５８】
本発明は、さらに複数の本発明のポリペプチドを提供する。任意で、ポリペプチドのＬＲＲは、ポリペプチド全体にわたり高度に可変性である。そこで、大多数は、内部ＬＲＲの変動性に基づいて、相違する結合特異性を備えるポリペプチドを含むことができる。
【００５９】
さらにまた、本発明のポリペプチドを備える容器または本発明のポリペプチドを備える固定性固体支持体もしくは可動性固体支持体を含むキットもまた提供される。任意で、ポリペプチドは固体支持体またはキットへ結合させられる。任意で、キットは、ポリペプチド、固体支持体、およびポリペプチドを固体支持体へ結合させるための連結手段を含有している。
【００６０】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。そのような核酸の１つの例は、配列番号１５６のヌクレオチド配列（代表的ＶＬＲのＯＲＦ）を含んでいる。ＶＬＲまたはそのフラグメントをコードする核酸の他の例には、配列番号４４、配列番号５３〜５５、配列番号５７〜５９、配列番号６６〜６７、配列番号７３〜７４、配列番号７６、配列番号７９〜８０、および配列番号１７２〜３０２が挙げられる。ＶＬＲ遺伝子に関連する種々の配列には、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ５７７９１〜ＡＹ５７８０５９、ＡＹ９６４７１９〜ＡＹ９６４９３１、ＡＹ９６５５２０〜ＡＹ９６５６１２、ＡＹ９６５６５８〜ＡＹ９６５６８１、およびＣＫ９８８４１４〜ＣＫ９８８６５２を有する様々な配列がある。これらの配列は、全体が、ならびにその中に含まれる個別のサブ配列（領域またはフラグメント）が参照として本明細書に援用される。
【００６１】
そのような核酸配列は、一例として核酸の属によって提供されるが、限定することは意図されていない。さらに、これらの核酸を含む発現ベクターも提供されるが、このとき核酸は発現制御配列へ機能的に連結している。さらに発現ベクターを含む培養細胞も提供される。そのような発現ベクターおよび培養細胞を使用すると、本発明のポリペプチドを作製できる。
【００６２】
本明細書では、例えばＶＬＲまたはそのフラグメントもしくは変異体をコードする核酸を含む、核酸に基づく様々な分子が開示されている。開示された核酸は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換基から作製される。
【００６３】
ヌクレオチドアナログは、塩基、糖、またはリン酸塩成分のいずれかへの一部のタイプの修飾を含有するヌクレオチドである。塩基成分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕの天然および合成修飾、ならびにウラシル−５−イル（．ｐｓｉ．）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９−イルなどの様々なプリンもしくはピリミジン塩基の天然および合成修飾を含む。修飾された塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられるが、それらに限定されない。追加の塩基修飾は、例えば米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に見いだすことができる。５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンなどの所定のヌクレオチドアナログならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンは、二本鎖形成の安定性を増加させることができる。多くの場合、塩基修飾は例えば、二本鎖安定性上昇などの独特の特性を達成するために、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖修飾と組み合わせることができる。広範囲の塩基修飾について詳述している第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；および第５，６８１，９４１号などの多数の米国特許がある。これらの各特許は、参照して本明細書に組み込まれる。
【００６４】
ヌクレオチドアナログは、さらに糖成分の修飾を含むことができる。糖部分の修飾は、リボースおよびデオキシリボースの天然修飾ならびに合成修飾を含むであろう。糖修飾は、２’位での以下の修飾を含むがそれらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。このときアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。２’糖修飾には−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が含まれるがそれらに限定されない。
【００６５】
２’位でのその他の糖修飾には：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基、および類似の特性を有する他の置換基が含まれるがそれらに限定されない。類似の修飾は、糖の上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’〜５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行なうことができる。修飾された糖は、例えばＣＨ２およびＳなどの架橋環状酸素での修飾を含有する糖も含むであろう。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル成分などの糖ミメティックもまた有する可能性がある。そのような修飾された糖構造の調製を教示する第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号などの多数の米国特許が存在しており、それらは各々全体として参照して本明細書に組み込まれる。
【００６６】
ヌクレオチドアナログは、さらにリン酸塩成分で修飾することもできる。修飾されたリン酸塩成分には、２つのヌクレオチド間の連結がホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように修飾できる成分が含まれるがそれらに限定されない。これらのホスフェートまたは２つのヌクレオチド間の修飾ホスフェート結合は３’−５’結合または２’−５’結合を通して行なうことができ、この結合は３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’などの逆極性を含有できることを理解されたい。様々な塩、混合塩および遊離酸形もまた含まれる。多数の米国特許が修飾リン酸エステルを含有するヌクレオチドの作製方法および使用方法を教示しており、それらにはその各々が参照して本明細書に組み込まれる第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号が含まれるがそれらに限定されない。
【００６７】
ヌクレオチドアナログは必ずしも単一修飾を含有している必要はなく、成分の１つの中または相違する成分間に複数の修飾を含有していてよいことも理解されたい。
【００６８】
ヌクレオチド置換基は、ヌクレオチドと類似の機能的特性を有する分子であるが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などはリン酸エステル成分を含有していない。ヌクレオチド置換基は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識するであろうが、リン酸エステル成分以外の成分を通して連結される分子である。ヌクレオチド置換基は、適切な標的核酸と相互作用すると二本鎖型構造に適合することができる。
【００６９】
ヌクレオチド置換基は、リン酸エステル成分および／または糖成分が置換されているヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換基は、標準的なリン原子を含有していない。リン酸エステルに対する置換基は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合であってよい。これらには、モルホリノ結合（一部にはヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸エステル骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有するその他が含まれる。多数の米国特許がリン酸エステル置換基の作製方法および使用方法を教示しており、それらにはその各々が参照して本明細書に組み込まれる第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号が含まれるがそれらに限定されない。
【００７０】
さらにヌクレオチド置換基ではヌクレオチドの糖およびリン酸部分の両方の成分が、例えばアミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換されてよいことを理解されたい。各々が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の製造方法および使用方法を教示している。（さらに、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００も参照されたい）。
【００７１】
例えば細胞取り込みを強化させるために、他のタイプの分子（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログへ結合させることも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログへ化学的に結合させることができる。そのようなコンジュゲートには、コレステロール成分などの脂質成分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ
Ｊ，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル成分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７が含まれるがそれらに限定されない。多数の米国特許がそのようなコンジュゲートの調製を教示しており、それらには各々が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７，第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；および第５，６８８，９４１号が含まれるがそれらに限定されない。
【００７２】
ＶＬＲ遺伝子、または匹敵する遺伝子と相互作用できるプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。所定の実施形態では、プライマーはＤＮＡ増幅反応を支援するために使用される。典型的には、プライマーは配列特異的方法で延長させることができるであろう。配列特異的方法でのプライマーの伸長には、それにプライマーがハイブリダイズされる、さもなければ関連付けられる核酸分子の配列および／または組成がプライマーの伸長によって生成する生成物の組成または配列を指示する、または影響を及ぼす任意の方法が含まれる。このため配列特異的方法でのプライマーの伸長には、ＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が含まれるがそれらに限定されない。配列特異的方法でプライマーを増幅させる技術および条件が好ましい。所定の実施形態では、プライマーはＰＣＲまたは直接的シーケンシングなどのＤＮＡ増幅反応のために使用される。所定の実施形態では、プライマーはさらにまた非酵素的技術を用いて伸長させることもできることを理解されたいが、このとき例えばプライマーを伸長させるために使用されるヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドは、それらが配列特異的方法でプライマーを伸長させるように化学的に反応するように修飾させられる。
【００７３】
所定の実施形態においてＶＬＲ遺伝子と相互作用するためのプライマーもしくはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅などのプライマーの所望の酵素的操作またはプローブもしくはプライマーの単純なハイブリダイゼーションを支援する任意のサイズであってよい。典型的なＶＬＲプライマーもしくはプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長であろう。
【００７４】
本発明のポリペプチドおよび核酸は、様々な技術において使用できる。例えば、本ポリペプチドは選択された作用因子を検出するため、選択された作用因子の活性を遮断するため、作用因子を精製するために、イメージングツールとして、および治療薬として使用できる。
【００７５】
本明細書では、サンプル中の作用因子を検出する方法であって、ポリペプチドがサンプル中の作用因子へ結合できる条件下でサンプルをポリペプチドと接触させる工程、およびサンプル中の作用因子へ結合したポリペプチドを検出する工程、を含む方法が提供される。結合したポリペプチドは、サンプル中に作用因子が含まれることを示す。検出方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、ポリペプチドは、上述したように検出可能なタグを用いて標識できる。検出方法を使用すると、サンプル中の作用因子の存在または不在を記録することができる。しかし、検出方法はさらに定量方法と結合することができる。インビトロアッセイ法には、標準物質に比較して量を確定するために使用できる知られている作用因子量のコントロールサンプルとの比較に基づいて作用因子の定量を可能にするＥＬＩＳＡなどの比色アッセイ法が含まれる。この方法は、さらに、放出された放射線に基づいて定量を可能にする放射分析アッセイおよび蛍光アッセイまたは上述した可視化および定量の任意の手段を含むことができる。
【００７６】
サンプルは、任意の生物学的サンプルを含む、試験される任意のサンプルであってよい。サンプルには、液体サンプル（水、血液、尿など）、組織サンプル、培養サンプル、細胞サンプルなどを含むことができる。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、さらにまた遮断抗体に匹敵して、それへ結合する作用因子の活性を遮断するために使用することもできる。そこで、作用因子の活性を遮断する方法であって、作用因子にポリペプチドが結合できる条件下でその作用因子を本発明のポリペプチドと接触させる工程を含む方法もまた開示される。作用因子へのポリペプチドの結合は、その作用因子の活性を遮断する。接触させるステップは、インビボまたはインビトロのいずれであってもよい。そこで、例えば、サンプルの汚染を減少させるために、毒素へ結合するポリペプチドをサンプルに添加して、毒素活性を遮断することができる。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、さらにまた拮抗抗体に匹敵して、それへ結合する任意の作用因子の活性を促進するために使用することもできる。そこで、作用因子の活性を促進する方法であって、作用因子にポリペプチドが結合できる条件下でその作用因子を本発明のポリペプチドと接触させる工程を含む方法もまた開示される。作用因子へのポリペプチドの結合は、その作用因子の活性を促進する。
【００７９】
本明細書に開示したポリペプチドは、知られていない機能を備える遺伝子の機能を決定するために使用することができる。そこで、開示されたポリペプチドをタンパク質ノックダウンアッセイにおいて使用する方法が開示される。例えば、開示されたポリペプチドは、機能が知られていない遺伝子を含む細胞の細胞質内で発現させることができる。ＲＮＡ転写産物が細胞の細胞質内で翻訳されている場合は、開示されたポリペプチドは問題の遺伝子のタンパク質産物へ結合することができる。タンパク質発現の消失が細胞に及ぼす作用を監視することによって、タンパク質機能を決定することができる。そこで、機能が知られていない遺伝子産物に対して特異的なポリペプチドが特別に開示される。さらに、遺伝子の機能を決定する方法であって、遺伝子のタンパク質産物に対して特異的なポリペプチドを、その遺伝子を発現する細胞の細胞質内へ導入する工程、および機能が知られていない遺伝子のタンパク質産物の消失に起因する作用を監視する工程、を含む方法もまた開示される。
【００８０】
本発明のポリペプチドは、イメージング法においても使用できる。例えば、本発明は、被験者に有効量のポリペプチドを投与する工程、および被験者において結合したポリペプチドの所在位置を検出する工程、を含むイメージング法を提供する。イメージング法の例は、上述されている。
【００８１】
本発明は、さらに精製方法を提供する。本明細書では、サンプルから作用因子を精製する方法であって、ポリペプチドがそのサンプルへ結合してポリペプチド／作用因子複合体を形成する条件下でサンプルをポリペプチドと接触させる工程；およびその作用因子をポリペプチド／作用因子複合体から単離する工程、を含む方法が開示される。例えば、ポリペプチドはカラムへ結合させ、サンプルは、サンプル内の作用因子が結合したポリペプチドへ結合できる条件下でカラムを通過させることができる。作用因子は、引き続いて所望の溶離剤中でカラムから溶出させることができる。精製方法は、研究方法として、および商業的方法として有用であろう。例えば、そのような方法は、薬理学的化合物から汚染物質を除去する際に有用であろう。
【００８２】
本ポリペプチドは、治療方法においても使用できる。例えば、本明細書では、被験者における病原性作用を減少させる、または予防する方法であって、病原体へ結合する有効量のポリペプチドを被験者に投与する工程を含む方法が提供される。さらにまた、有害作用を減少させられる、または有効な作用を促進できるように作用因子の活性を遮断または促進する方法も提供される。
【００８３】
本明細書では、本発明のポリペプチドまたは核酸および医薬上許容される担体を含む組成物が提供される。本発明の組成物は、インビボで投与することもできる。組成物は、経口、非経口（例、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮的、体外、局所的などによって投与されてよいが、典型的には局所的鼻腔内投与または吸入剤による投与が好ましい。本明細書で使用する「局所的鼻腔内投与」は、鼻孔の一方または両方を通して鼻および鼻腔内への組成物の送達を意味しており、スプレー機構もしくは滴下機構、または核酸もしくはベクターのエーロゾル化を通しての送達を含むことができる。後者は、大量の動物を同時に治療しなければならない場合には有効なことがある。吸入剤による組成物の投与は、スプレーまたは滴下機構による送達を介して鼻または口を通して行なうことができる。送達は、挿管を通して呼吸器系の任意の領域（例、肺）へ直接的に行なうこともできる。必要とされる組成物の正確な量は、被験者の種、年齢、体重および全身状態、治療されるアレルギー性障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、投与様式などに依存して、被験者毎に相違するであろう。そこで、各組成物について正確な量を規定するのは不可能である。しかし、適切な量は、当業者が本明細書の教示を前提に日常的な実験器具を使用さえすれば決定することができる。
【００８４】
使用する場合、組成物の非経口投与は一般に注射を特徴とする。注射剤は、液剤もしくは懸濁剤、注射前に液体中の懸濁液にするために適合する固体形、またはエマルジョンとしてのいずれかの便宜的形態で調製できる。非経口投与のために最近改良されたアプローチは、一定用量が維持されるような徐放系または持続放出系の使用が含まれる。例えば、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００８５】
物質は、（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞内に組み込まれて）溶液、懸濁液中にあってよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定細胞タイプを標的とすることができる。下記の参考文献は、腫瘍組織へ特異的タンパク質をターゲッティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクルおよびその他の抗体結合リポソーム（大腸癌を標的とする脂質媒介性薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性ターゲッティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲッティング、およびインビボのマウス神経膠腫細胞に対する高度に特異的な治療的レトロウイルスターゲッティング。下記の参考文献は、腫瘍組織へ特異的タンパク質をターゲッティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に含まれている。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に進入し、その中で受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、そして次に細胞表面へ再循環する、細胞内に蓄積される、またはリソソーム内で分解される、のいずれかとなる。内在化経路は、栄養素取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベル調節などの様々な機能に役立つ。多数の受容体は、細胞タイプ、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に依存して、２つ以上の細胞内経路にしたがう。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機序は精査されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９  （１９９１））。
【００８６】
「医薬上許容される」は、生物学的またはその他の点で不都合ではない物質を意味しており、すなわちその物質は、何の不都合な生物学的作用を誘発することなく、またはそれが含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく本発明のポリペプチドと一緒に被験者に投与することができる。担体は、当業者にはよく知られているように、当然ながら有効成分の分解を最小限に抑えるように、そして被験者における有害な副作用を最小限に抑えるように選択されるであろう。適切な担体およびそれらの調製物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）編者Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、調製物を等張性にするために、調製物中では適切な量の医薬上許容される塩が使用される。医薬上許容される担体の例には、食塩液、リンゲル液およびデキストロース液が含まれるがそれらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。その他の担体には、可変性リンパ球受容体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれるが、そのマトリックスは成形製品、例えばフィルム、リポソームまたは微粒子の形状にある。当業者には、例えば投与経路、投与される可変性リンパ球受容体の濃度に依存して所定の担体がより好ましいことは明白であろう。
【００８７】
医薬担体は、当業者には知られている。これらは、最も典型的には無菌水、食塩液、および生理的ｐＨにある緩衝液などの溶液を含むヒトに薬物を投与するための標準的担体であろう。本組成物は、例えば筋肉内または皮下投与することができる。その他の化合物は、当業者によって使用される標準方法にしたがって投与されるであろう。
【００８８】
本医薬組成物は、精選分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存剤、界面活性剤などを含むことができる。本医薬組成物は、さらに抗菌物質、抗炎症薬、麻酔薬などの１つまたは複数の有効成分を含むことができる。
【００８９】
非経口投与のための本調製物には、無菌の水性または非水性液剤、懸濁剤、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、食塩液および緩衝溶媒を含むアルコール性／水性の溶液、エマルジョンもしくは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が含まれる。静注用ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースをベースとする補充剤など）などが含まれる。例えば抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤およびその他の添加剤もまた存在していてよい。
【００９０】
局所適用のための本調製物は、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤および散剤を含むことができる。従来型医薬担体、水性、粉末状または油性基剤、増粘剤などが必要になる、または望ましいことがある。
【００９１】
経口投与のための本組成物には、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性溶媒中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が含まれる。増粘剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいことがある。
【００９２】
本組成物の一部は、もしかすると塩酸塩、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸と、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールエミンならびに置換されたエタノールアミンなどの有機塩基との反応によって生成される医薬上許容される酸付加塩もしくは塩基付加塩として投与できる。
【００９３】
組成物を投与するための用量範囲は、症状や障害に有効である所望の作用を生じさせるために十分な量である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を惹起するほど大量であってはならない。一般に、用量は、患者における年齢、状態、性別および疾患の程度に伴って変動するが、当業者であれば決定することができる。用量は、万一何らかの禁忌がある場合に個々の医師によって調整することができる。用量は変動することがあり、１日もしくは数日にわたって、１回または複数回の投与で投与することができる。
【００９４】
本発明の可変性リンパ球受容体および可変性リンパ球受容体フラグメントおよび変異体は、さらにまた患者もしくは被験者に、その患者もしくは被験者自身の細胞が核酸を取り込んで、コードされた可変性リンパ球受容体もしくは可変性リンパ球受容体フラグメントを生成かつ分泌するように、可変性リンパ球受容体または可変性リンパ球受容体フラグメントもしくは変異体をコードする核酸調製物（例、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）として投与することもできる。
【００９５】
インビトロまたはインビボのいずれかで、核酸を細胞に送達するために使用できる多数の組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、大きく分けると次の２つのクラスに分類できる：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降法、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどの多数の直接送達系を通して、またはカチオン性リポソームなどの細胞もしくは担体中の遺伝物質の輸送を介して送達できる。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタントを含むトランスフェクションのための適切な手段、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散法などの物理−機械的方法は、例えばＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）によって記載されている。そのような方法は当技術分野においてよく知られており、本明細書に記載した組成物および方法と一緒に使用するために容易に適合させることができる。所定の場合には、これらの方法は大きなＤＮＡ分子とともに特異的に機能するように修飾されるであろう。さらに、これらの方法を使用すると、担体のターゲッティング特性を使用することによって、所定の疾患および細胞集団を標的とすることができる。
【００９６】
トランスファーベクターは、核酸を細胞内へ送達するために、または遺伝子を送達するための一般的戦略の一部として、例えば組み換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部として使用される任意のヌクレオチド構造（例、プラスミド）であってよい（Ｒａｍ
ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））。本明細書で使用するプラスミドまたはウイルスベクターは、ＶＬＲなどの開示された核酸を細胞内へ分解させずに輸送する作用因子であり、その中にそれが送達される細胞内での遺伝子の発現を生じさせるプロモーターが含まれる。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン栄養ウイルス、シンドビスウイルス、およびＨＩＶ骨格を備えるウイルスを含むその他のＲＮＡウイルスである。さらに好ましいのは、それらをベクターとして使用するために適合させるこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーである。レトロウイルスには、マウスマロネー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてのＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きな遺伝的ペイロード、すなわち導入遺伝子またはマーカー遺伝子を運ぶことができ、このために一般的に使用されるベクターである。しかし、それらは非増殖細胞中では有用ではない。アデノウイルスベクターは比較的安定性であり、作業するのが容易であり、高い力価を有し、エーロゾル調製物中で送達することができ、非分割細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するための幾つかの部位を有しており、それらは熱安定性で、室温で保管することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって惹起される、宿主生体の免疫応答を抑制できるように組み換えられているウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のためのコーディング領域を有するであろう。
【００９７】
ウイルスベクターは、細胞内へ遺伝子を導入するために化学的または物理的方法より高度のトランスアクション能力（遺伝子を導入する能力）を有する可能性がある。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写産物、複製およびエンカプシデーションのために必要な逆方向末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含有する。ベクターとして組み換えられると、典型的にはウイルスから１つまたは複数の初期遺伝子が除去され、遺伝子もしくは遺伝子／プロモーターカセットが除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。このタイプの構築体は、約８ｋｂまでの外来遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように組み換えられている細胞系によって補充される。
【００９８】
レトロウイルスは、任意のタイプ、サブファミリー、属、または向性を含むレトロウイルスのウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、参照して本明細書組み込まれるＶｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）の中に記載されている。遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、それらの教示が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４，８６８，１１６号および第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ国際特許公開ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されている。
【００９９】
レトロウイルスは、本質的に核酸カーゴ内にパッキングされているパッケージである。核酸カーゴは、それとともにパッケージングシグナルを運ぶが、これは複製された娘分子がパッケージコート内に効率的にパッケージングされることを保証する。パッケージングシグナルに加えて、複製、および複製されたウイルスのパッケージングのためにシス形に必要とされる多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートを作製する際に関係しているｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有している。標的細胞へ輸送されるべき異質ＤＮＡによって典型的に置換されるのはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的にはパッケージコート内に組み込むためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始をシグナルする配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーへ結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写のために必要なエレメント、ＤＮＡ合成中のＲＮＡストランドのスイッチを誘導する末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２ストランドの合成のための開始部位として機能する３’ＬＴＲに対して５’のプリンリッチ配列、および宿主ゲノム内に挿入するためにＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入を可能にするＬＴＲの両末端近くの特異的配列を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの異質配列をウイルスゲノム内に挿入し、逆転写させ、複製後には新規なレトロウイルス粒子内にパッケージングすることを可能にする。この核酸の量は、各転写産物のサイズに依存して、１つから多数までの遺伝子を送達するために十分である。挿入物内に他の遺伝子と一緒に陽性または陰性いずれかの選択可能なマーカーを含めることが好ましい。
【０１００】
大多数のレトロウイルスベクター内の複製機構およびパッケージングタンパク質は除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、これらのベクターは典型的にはそれらをパッケージング細胞系内へ配置することによって生成される。パッケージング細胞系は、複製およびパッケージング機構を含有するが、任意のパッケージングシグナルが欠けているレトロウイルスを用いてトランスフェクトまたは形質転換されている細胞系である。精選ＤＮＡを運ぶベクターがこれらの細胞系内にトランスフェクトされると、当該遺伝子を含有するベクターが複製され、ヘルパー細胞によってシス形で提供される機構によって新規なレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。この機構のためのゲノムは、それらに必要なシグナルが欠如しているためにパッケージングされない。
【０１０１】
複製欠損アデノウイルスの構築については記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用する有益性は、それらが初期感染細胞内で複製できるが、新規な感染性ウイルス粒子を形成することはできないために、それらが他の細胞タイプへ拡大できる程度が限定されることにある。組み換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位へ直接的なインビボ送達後に高い効率の遺伝子導入を達成することが証明されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組み換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体へ結合することによって遺伝子形質導入を達成するが、その後にウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一方法で受容体媒介性エンドサイトーシスによって内在化される（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１０２】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されているアデノウイルスをベースとするウイルスベクターであってよく、これらのバイロン（ｖｉｒｏｎ）はヒト２９３細胞系などの細胞系において生成される。また別の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方がアデノウイルスゲノムから除去される。
【０１０３】
また別のタイプのウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）をベースとしている。この欠陥のあるパルボウイルスは、多数の細胞タイプを感染させることができ、ヒトにとって非病原性であるので好ましい。ＡＡＶ型ベクターは約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは１９番染色体中へ安定性で挿入できることが知られている。この部位特異的組み込み特性を含有するベクターが好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ（カリフォルニア州サンフランシスコ）によって製造された、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含有することのできるＰ４．１Ｃベクターである。
【０１０４】
また別のタイプのＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、異種遺伝子に機能的に連結した細胞特異的発現を指令するプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットを挟んでいる１対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有している。この状況における異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスにとって自然ではない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を意味する。
【０１０５】
典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コーディング領域は、安全な非細胞毒性ベクターを生じさせるように欠失させられている。ＡＡＶ  ＩＴＲ、またはそれらの修飾は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞毒性は付与せず、そしてこのプロモーターは細胞特異的発現を指令する。ＡＡＶベクターに関連する物質については、本明細書に参照して組み込まれる米国特許第６，２６１，８３４号に記載されている。
【０１０６】
そこで本発明のベクターは、実質的毒性を伴わずに哺乳動物染色体内へ組み込むことのできるＤＮＡ分子を提供する。
【０１０７】
ウイルスおよびレトロウイルス内に挿入された遺伝子は、通常は、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含有している。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相当に固定された場所にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用のために必要とされるコアエレメントを含有しており、上流エレメントおよび応答エレメントを含有していてよい。
【０１０８】
大きなヒトヘルペスウイルスを用いた分子的遺伝学実験は、それによって大きな異種ＤＮＡフラグメントをクローン化し、増殖させ、そしてヘルペスウイルスを用いた感染のために許容される細胞内で確立することができる手段を提供してきた（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））は、特定細胞へ１５０ｋｂを超えるヒト異種ＤＮＡのフラグメントを送達する能力を有している。ＥＢＶ組み換え体は、エピソームＤＮＡとしての感染したＢ細胞内に大きなＤＮＡの塊を維持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を運ぶ個別クローンは、遺伝的に安定性であると思われた。これらのエピソームを維持するためには、ＥＢＶによる感染中に構成的に発現した特異的ＥＢＶ核タンパク質ＥＢＮＡ１を必要とする。さらに、これらのベクターは、大量のタンパク質をインビトロで一時的に生成できるトランスフェクションのために使用できる。ヘルペスウイルスアンプリコン系もまた、２２０ｋｂを超えるＤＮＡ破片をパッケージングし、ＤＮＡをエピソームとして安定性で維持できる細胞を感染させるために使用されている。
【０１０９】
その他の有用な系には、例えば、複製および宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
【０１１０】
開示された組成物は、様々な方法で標的細胞へ送達することができる。例えば、本組成物はエレクトロポレーション、またはリポフェクション、またはリン酸カルシウム沈降法を通して送達できる。選択される送達機構は、一部には標的とされる細胞のタイプ、およびその送達が例えばインビボまたはインビトロのどちらで発生するのかに依存するであろう。
【０１１１】
そこで、本組成物は、開示されたベクターに加えて、例えばカチオン性リポソーム（例、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームなどのリポソームのような脂質を含むことができる。リポソームは、所望であれば特定細胞をターゲッティングすることを促進するためのタンパク質をさらに含むことができる。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官へ輸入性の血液に投与する、または気道の細胞へターゲッティングするために気道内へ吸入させることができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００  （１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７  （１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。さらに、化合物はマクロファージなどの特定細胞タイプへターゲッティングできる、またはマイクロカプセルからの化合物の拡散もしくは化合物の送達が特定の速度もしくは用量のために設計されているマイクロカプセルの構成成分として投与できる。
【０１１２】
投与および被験者の細胞内への外因性ＤＮＡの取り込み（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を含む上述した方法では、細胞への組成物の送達は様々な機構を介して行なうことができる。１つの例として、送達は、市販で入手できるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲーサーズバーグ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、独国ヒルデン）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，、ワイオミング州マディソン）などのリポソーム調製物、ならびに当技術分野において標準的な方法にしたがって開発された他のリポソームを使用して、リポソームを介して行なうことができる。さらに、本発明の核酸またはベクターは、エレクトロポレーションによってインビボで送達することができ、そのためのテクノロジーはＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）から、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、アリゾナ州トゥーソン）によって入手できる。
【０１１３】
物質は、（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞内に組み込まれて）溶液や懸濁液中に含まれていてよい。これらは、ＶＬＲ、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定細胞タイプを標的とすることができる。下記の参考文献は、腫瘍組織へ特異的タンパク質をターゲッティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。これらの技術は、様々な他の特定細胞タイプに対して使用できる。「ステルス」などのビヒクルおよびその他の抗体またはＶＬＲ結合リポソーム（大腸癌を標的とする脂質媒介性薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性ターゲッティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲッティング、およびインビボのマウス神経膠腫細胞に対する高度に特異的な治療的レトロウイルスターゲッティング。下記の参考文献は、腫瘍組織へ特異的タンパク質をターゲッティングするためのこのテクノロジーの使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に含まれている。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に進入し、その中で受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、そして次に細胞表面へ再循環する、細胞内に蓄積される、またはリソソーム内で分解される、のいずれかとなる。内在化経路は、栄養素取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベル調節などの様々な機能に役立つ。多数の受容体は、細胞タイプ、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に依存して、２つ以上の細胞内経路にしたがう。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機序は精査されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
１０：６，３９９−４０９  （１９９１））。
【０１１４】
宿主細胞ゲノム内に組み込まれるべき細胞へ送達される核酸は、典型的には組み込み配列を含有している。これらの配列は、特にウイルスをベースとする系が使用される場合は、ウイルス関連配列であることが多い。これらのウイルス組み込み系は、送達系内に含有される核酸を宿主ゲノム内に組み込むことができるように、リポソームなどの非核酸をベースとする送達系を用いて送達されるべき核酸内に組み込むこともできる。
【０１１５】
その他の宿主ゲノム内に組み込むための一般的技術には、例えば、宿主ゲノムとの同種組み換えを促進するように設計された系が含まれる。これらの系は、典型的には、送達された核酸が宿主ゲノム内に組み込まれるのを誘発するように、ベクター核酸と標的核酸との組み換えが発生する宿主細胞ゲノム内で標的配列と十分な相同性を有する、発現する核酸に隣接する配列に依存している。同種組み換えを促進するために必要なこれらの系および方法は、当業者には知られている。
【０１１６】
上述したように、本組成物は医薬上許容される担体中で投与することができ、当技術分野においてよく知られている様々な機構（例、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介してのＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど）によって、被験者の細胞へインビボおよび／またはエックスビボで送達することができる。
【０１１７】
エクソビボ法を使用する場合は、細胞または組織を取り出し、当技術分野においてよく知られている標準プロトコールにしたがって体外で維持することができる。本組成物は、例えばリン酸カルシウム媒介性遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームなどの任意の遺伝子輸送機構を介して細胞内へ導入することができる。形質導入された細胞は、次に（例えば医薬上許容される担体中で）注入する、または細胞もしくは組織タイプにとって標準的方法によって被験者に同位置へ逆移植することができる。被験者に様々な細胞を移植または注入するための標準方法は知られている。
【０１１８】
細胞へ送達される核酸は、典型的には発現制御系を含有している。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス内に挿入された遺伝子は、通常は、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つようにプロモーター、および／またはエンハンサーを含有している。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された場所にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用のために必要とされるコアエレメントを含有しており、上流エレメントおよび応答エレメントを含有していてよい。
【０１１９】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノムの様々な起源から、または異種哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから入手できる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、便宜的には、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして入手される（Ｆｉｅｒｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、便宜的にはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして入手される（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。当然ながら、宿主細胞または関連種由来のプロモーターもまたこの場合に有用である。
【０１２０】
エンハンサーは、一般に転写開始部位から固定されない距離で機能し、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであってよいＤＮＡの配列を意味する。さらに、エンハンサーはイントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））ならびにコーディング配列自体の内側（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にあってよい。それらは通常は１０〜３００塩基対長であり、それらはシス形で機能する。エンハンサーは、隣接プロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーは、さらにまた転写の調節を媒介する応答エレメントを含有することが多い。プロモーターは、さらにまた転写の調節を媒介する応答エレメントを含有することができる。エンハンサーは、しばしば遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列は哺乳動物遺伝子から現在では知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテインおよびインスリン）、典型的には一般的発現のためには真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。好ましい例は、複製起点の後期側（１００〜２７０塩基対）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１２１】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を始動させる光線または特異的化学事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節できる。ガンマ線照射などの照射への曝露、またはアルキル化化学療法薬によってウイルスベクター遺伝子発現を強化する方法もある。
【０１２２】
所定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写されるべき転写ユニットの領域の発現を最大限にするための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして機能することができる。所定の構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定時間に特定タイプの細胞中でしか発現しないとはいえ、全真核細胞タイプで活性な可能性がある。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。その他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１２３】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）中で使用される発現ベクターは、さらにまたｍＲＮＡ発現に影響を及ぼすことのできる転写の終結のために必要な配列を含有することができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。転写ユニットがさらにポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の１つの利点は、転写されたユニットがプロセッシングされてｍＲＮＡと同様に輸送される可能性をそれが増加させることにある。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は、明白に確立されている。導入遺伝子構築物中で同種ポリアデニル化シグナルが使用されるのが好ましい。所定の転写ユニットでは、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから引き出され、約４００塩基からなる。さらにまた、転写されたユニットは他の標準配列を単独で、または上記の配列と組み合わせて含有し、その構築物からの発現、またはその構築物の安定性を改良するのが好ましい。
【０１２４】
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含有することができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されているかどうか、送達されている場合は発現しているかどうかを決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
【０１２５】
一部の実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。哺乳動物細胞のために適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイドロマイシン、およびピューロマイシンである。そのような選択可能なマーカーを哺乳動物宿主細胞内へ移すのに成功すると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択的圧力下に置かれたときに生存することができる。選択的レジメンには広く使用されている２つの明確なカテゴリーが存在する。第１カテゴリーは細胞の代謝、および補給された培地とは無関係に増殖する能力が欠如する突然変異細胞系の使用に基づいている。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに増殖する能力が欠如している。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路のために必要な所定の遺伝子が欠如しているので、それらは欠けているヌクレオチドが補給培地中に提供されない限り生存することはできない。培地への補給の代替策は、各遺伝子が欠けている細胞中へ無傷ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入すること、これによりそれらの増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を用いて形質転換されなかった個々の細胞は、非補給培地中では生存することができないであろう。
【０１２６】
第２カテゴリーは、任意の細胞タイプで使用される選択スキームに関する、突然変異細胞系の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には宿主細胞の増殖を停止させるための薬剤を使用する。新規な遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を備えるタンパク質を発現し、その選択を生き延びるであろう。そのような優性選択の例は、薬物のネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７  （１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２  （１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３  （１９８５））を使用する。これら３つの例は、適切な薬剤Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ゲネシチン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシン各々に対する耐性を備える真核生物制御下の細菌遺伝子を使用する。その他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびｐｕｒａｍｙｃｉｎが含まれる。
【０１２７】
被験者の細胞内への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を含んでいる上述した方法では、本発明の核酸は裸のＤＮＡもしくはＲＮＡの形状にあってよい、または、当業者には明白であるように、それによって抗体をコードするＤＮＡフラグメントがプロモーターの転写調節下となるように、これらの核酸は核酸を細胞へ送達するためのベクター内に含まれていてよい。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カナダ国ケベック州ラバル）などの市販で入手できる調製物であってよい。細胞への核酸またはベクターの送達は、様々な機構を介して行なわれる。１つの例として、送達は、市販で入手できるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲーサーズバーグ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、独国ヒルデン）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，、ワイオミング州マディソン）などのリポソーム調製物、ならびに当技術分野において標準的な方法にしたがって開発された他のリポソームを使用して、リポソームを介して行なうことができる。さらに、本発明の核酸またはベクターは、エレクトロポレーションによってインビボで送達することができ、そのためのテクノロジーはＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、アリゾナ州トゥーソン）によって入手できる。
【０１２８】
１つの例として、ベクターの送達は、組み換えレトロウイルスゲノムをパッケージできるレトロウイルスベクター系などのウイルス系によって行なうことができる（例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６を参照されたい）。組み換えレトロウイルスは、感染させ、それによって感染した細胞へ本発明の広範な中和抗体をコードする核酸（またはその活性フラグメント）を送達するために使用できる。変化した核酸を哺乳動物細胞中へ導入する正確な方法は、当然ながらレトロウイルスベクターの使用に限定されない。この方法のためには、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６）、シュードタイプ化レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用を含む他の技術を広汎に利用できる。リポソーム送達および受容体媒介性ならびにその他のエンドサイトーシス機構などの物理的形質導入技術もまた使用できる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８７：４７２−４７８，１９９６を参照されたい）。本発明は、これらやその他の一般に使用される遺伝子導入法のいずれかと結び付けて使用できる。
【０１２９】
１つの例として、本発明の抗体をコードする核酸がアデノウイルスベクター内で被験者の細胞へ送達される場合は、ヒトへアデノウイルスを投与するための用量は注射１回当たり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲に及んでよいが、注射１回当たり１０１２ｐｆｕという高用量でもよい（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１，１９９７；ＡｌｖａｒｅｚおよびＣｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３，１９９７）。被験者は単回注射を受けることができる。または追加の注射が必要な場合は、６カ月間隔（または熟練の医師によって決定される他の適切な時間間隔）で無期限の期間にわたり、および／または治療の有効性が確定されるまで繰り返すことができる。
使用する場合、本発明の核酸またはベクターの非経口投与は一般に注射を特徴とする。注射剤は、液剤もしくは懸濁剤、注射前に液体中の懸濁液にするために適合する固体形、またはエマルジョンとしてのいずれかの従来の形態で調製できる。非経口投与のために最近改訂されたアプローチは、一定用量が維持されるような徐放系または持続放出系の使用が含まれる。例えば、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。適切な調製物および治療用化合物の様々な投与経路についてのこれ以上の考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）編者Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５を参照されたい。
【０１３０】
本発明は、さらに本発明のポリペプチドの製造方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む細胞を培養する工程と、およびそのポリペプチドを細胞から、または培地から精製する工程と、を含む方法を提供する。さらにまた、タンパク質合成技術を使用した本発明のポリペプチドの製造方法が提供される。
【０１３１】
さらに、被験者における１つまたは複数の可変性リンパ球受容体をスクリーニングする方法であって、被験者においてＮ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＮＴ）、１つまたは複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、Ｃ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲＣＴ）、および連結ペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドを同定する工程を含む方法が開示されるが、このとき連結ペプチドはαヘリックスを含んでいる。
【実施例】
【０１３２】
下記の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求した化合物、組成物、製品、装置および／または方法の製造方法および評価方法に関する完全な開示および説明を提供できるように提示するものであり、純粋に本発明の例示となることを意図しており、本発明者らが本発明であると見なす本発明の範囲を限定することは意図されていない。数字（例、量、温度など）に関して正確さを保証できるように努力はしてきたが、いくらかの誤差および偏差が含まれる可能性がある。他に特に記載しない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、そして圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１３３】
（実施例１：ウミヤツメにおける可変性リンパ球受容体）
（免疫賦活された血液リンパ球由来の転写産物の分析）
活性化リンパ球のトランスクリプトームを調査するために、生きている大腸菌、ヒツジ赤血球、フィトヘマグルチニンおよびアメリカヤマゴボウマイトジェンを含有する抗原／マイトジェンカクテルの腹腔内注射によって、ヤツメウナギの幼生を１週間間隔で２〜４回免疫賦活した。第２回追加免疫賦活から３日後の末梢白血球中の大リンパ球の分画は、非免疫賦活個体に比して１３倍大きく、骨髄細胞の分画もまた６倍大きかった（図１ａ）。小リンパ球に比較して、大リンパ球はサイズがほぼ２倍であり、広範囲のアズール親和性細胞質を有し、顕著な核小体を特徴とした（図１ｂ）。これらの細胞を選別し、ヤツメウナギ活性化骨髄細胞または赤血球由来のｃＤＮＡに対する差引きによって活性化リンパ球のメッセージが富裕なｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用した。
【０１３４】
差引きされたライブラリーからの１，５０７クローン中で同定された最も豊富な配列群から、非免疫賦活リンパ球転写産物の調査からの１セットの５２個のＬＲＲを含有する発現配列タグ（ＥＳＴ）とともにクラスター化した、可変数の様々なロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）モチーフを備える３１９種のタンパク質が予測された。３’末端配列をパージングした後、１セットの２３９種の固有に多様なＬＲＲタンパク質が同定され、それらのうちの２２種が２３９〜３０４アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の大多数または全部をコードしていた（図６）。これらのヤツメウナギタンパク質は、これらの２３９の配列各々が固有であり、それらの転写産物は主としてリンパ球によって発現することが見いだされたために、暫定的に可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）と命名された（図１ｃ）。造血細胞組織由来のリンパ球は非免疫賦活動物において最高ＶＬＲレベルを示し、そして免疫賦活は大リンパ球によるＶＬＲ転写の増強を生じさせた。これらのＶＬＲの基本的組成は、保存されたシグナルペプチド、Ｎ末端ＬＲＲ（ＬＲＲＮＴ）、可変数の多様なＬＲＲ、および連結ペプチドを含んでおり、その後にＣ末端ＬＲＲ（ＬＲＲＣＴ）ならびにトレオニンリッチおよびプラリンリッチ柄部、全体的グリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）−アンカー部位および疎水性尾部から構成される保存されたＣ末端が続いた（図１ｄおよび図７）。エピトープタグ付きＶＬＲをコードするレトロウイルス構築物が哺乳動物細胞系内にトランスフェクトされると、免疫蛍光分析により、タンパク質の細胞表面局在化が確証され、細菌性ＧＰＩ特異的ホスホリパーゼＣを用いた処置は、細胞表面発現のレベルを有意に減少させ（図１ｅ）、上清中へＶＬＲタンパク質を放出した。３次元構造モデルを生成するために、１１個のＬＲＲからなる最長ＶＬＲ配列を関連ＬＲＲタンパク質の結晶構造座標上に通した（Ｓｃｈｗｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。このモデルは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）エクトドメインのために予測されたモデル（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に類似して、９つのβシートがＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴによって両端上でキャップされる凹状ソレノイド構造（図１ｆ）を提供する。
【０１３５】
（ＶＬＲレパートリーは個々のヤツメウナギにおいて高度に多様である）
個々のヤツメウナギにおいてＲＴ−ＰＣＲによってＶＬＲ多様性について調査した。３匹の免疫賦活幼生および４匹の非免疫賦活幼生由来の白血球ｍＲＮＡを、ＶＬＲ多様性領域に隣接するプライマーを用いて増幅させた。動物１匹に付き約１０クローンのシーケンシングにより６９個の固有のＶＬＲが生じ、１匹の個体から同一のクローンは２個しか生じなかった。２匹の動物由来の２０個のＶＬＲの可変性配列は、タンパク質多様性を示している（図２；図３および図８に含まれた全セット）。１３４〜２１４アミノ酸のサイズ変動は、主としてＬＲＲモジュール数における差に起因した。各配列は、ＬＲＲＮＴ、１８アミノ酸ＬＲＲ１、ほぼ変わりなく２４アミノ酸長の１〜９個のＬＲＲ、１３アミノ酸の連結ペプチドおよびＣ末端ＬＲＲＣＴを含有する；ＬＲＲＮＴは、３０〜３８アミノ酸を有し、ＬＲＲＣＴは４８〜５８アミノ酸を有する。顕著な配列多様性の領域は各ＬＲＲモチーフから明白であるが、ＬＲＲＮＴにおける最初から７個の残基およびＬＲＲＣＴにおける最終２０個の残基はほぼ不変である。
【０１３６】
個々のリンパ球のレベルでのＶＬＲ多様性を評価するために、全ＯＲＦに隣接するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用した。単細胞単離体を免疫賦活および非免疫賦活幼生の血液から選別した。非免疫賦活動物からの６回の単細胞反応および免疫賦活幼生からの７回の反応から入手したＰＣＲ産物の分析は、リンパ球１３個中１２個が単一ＶＬＲを発現し（図３）、１０個の非免疫賦活細胞のコントロールプールからのＶＬＲクローン６個中５個が固有であることを証明した。１個の細胞単離体は２個のＶＬＲ（９．１６Ｓ、９．１６Ｌ）を生じたが、この単離体が２個のリンパ球を含有していた可能性を排除することはできない。３個のＶＬＲは、短縮されたタンパク質を予測させるインフレーム終止コドンを有していた。興味深いことに、免疫賦活幼生由来の５個のリンパ球（９．１＝９．１６Ｓ；９．２＝９．１６Ｌ；９．７＝９．９）間では、同一ＶＬＲの組み合わせが同定された。追加の３匹の免疫賦活幼生（＃５〜７）由来の血液サンプルの分析では固有のＶＬＲしか明らかにならなかった（Ｎ＝２７）。これらの所見は、多様なＶＬＲの単一対立遺伝子発現を示唆しており、ＶＬＲを有するリンパ球のクローン性増殖についての予備的証拠を提供する。
【０１３７】
（ＶＬＲ遺伝子座の複雑性）
保存されたＣ末端プローブを用いたゲノムブロット・ハイブリダイゼーションにより単一バンドが明らかになった（図４ａ）。保存された５’ＵＴＲおよびシグナルペプチドからなるＮ末端プローブは、そのブロットが２つの追加のＢａｍＨＩハンドを示した個体を除いて、使用した制限酵素に依存して、２〜３つのバンドと反応した。さらに、ゲノムパルスフィールドＣＨＥＦブロットにより、全６個の消化物中でＣ末端プローブとの単一ハイブリダイゼーションバンドが明らかになったが、他方Ｎ末端プローブは１つの追加の３５０ｋｂのＮｏｔＩバンドとのマッチングパターンを生じた（図４ｂ）。これらの所見は、１００〜１５０ｋｂのゲノム内に含有される生殖細胞系ＶＬＲ遺伝子（ｇＶＬＲ）のＮ末端およびＣ末端を備える単一ＶＬＲ遺伝子座を示している（図４ｂ；ＰａｃＩ消化物）。この遺伝子座を詳細に特性付けるために、これらのプローブを使用して、成体の赤血球ＤＮＡから構築された大きな挿入物ウミヤツメＰ１細菌人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリーをスクリーニングした。両方のプローブを用いてハイブリダイズした５つのＰＡＣの分析では、単一の１４ｋｂのＶＬＲ遺伝子（ｇＶＬＲ）アンプリコンが、ＯＲＦフランキングプライマーを用いたロングレンジＰＣＲ（ＬＲ−ＰＣＲ）によって同定された。ＰＣＲ産物の制限酵素分析では、同一のＥｃｏＲＩバンドおよび２つの対立遺伝子ＢａｍＨＩパターンが明らかになった。２つのｇＶＬＲ対立遺伝子を表しているＰＡＣクローンは、各々３３および４４ｋｂ挿入物を備えるＰＡＣ３およびＰＡＣ１６であるとシーケンシングされた。それらの配列はｇＶＬＲを含有する２０ｋｂの領域にわたりオーバーラップしていた；ＰＡＣ１６は、ｇＶＬＲから２５ｋｂ上流に伸長し、ＰＡＣ３は１８ｋｂ下流に伸長した。ＰＡＣ３および１６の間のオーバーラップ領域は、ＰＡＣ１６のｇＶＬＲにおける短い欠失を除いて、ほぼ同一であった（２４、４３および７８塩基対）。これらの配列は、このためＰＡＣ３のわずかに長い配列を保存しているｇＶＬＲコンティーグ内へ融合させられた（図５ａ）。
【０１３８】
ＰＡＣ３／１６コンティーグ内のｇＶＬＲは４つのエクソンからなる。第１は５’ＵＴＲの一部を含有する；エクソン２は５’ＵＴＲの残り、シグナルペプチドおよびＬＲＲＮＴの５’側半分を含有する；エクソン３はＬＲＲＣＴの５’側半分を含有し、そしてエクソン４はＬＲＲＣＴの３’側半分、Ｃ末端および３’ＵＴＲをコードする。標準的な真核細胞スプライス部位は５’ＵＴＲイントロンでしか同定されなかったが、他方ｇＶＬＲ内の他のエクソン／イントロン境界はｃＤＮＡ配列とのアライメントによって決定された。注目すべきことに、ｇＶＬＲ配列は、３’ＬＲＲＮＴ、ＬＲＲ１または２４アミノ酸ＬＲＲのいずれも含有していなかった。このｇＶＬＲから上流では、順方向または逆方向のいずれかに配置されたＬＲＲＮＴ、ＬＲＲ１およびＬＲＲを含む、一重または二重の可変性ＬＲＲモジュールの６つのカセットが同定された。これらのＬＲＲカセットはコンティーグの最初の６ｋｂに及んだが、他方２つの多様な５’ＬＲＲＣＴカセットはｇＶＬＲから７ｋｂ下流に位置した。
【０１３９】
また別のクローンのＰＡＣ４は、Ｎ末端プローブを用いた場合しかハイブリダイズしなかったが、ＬＲＲＮＴおよびＬＲＲ１コンセンサスプライマーを用いるＰＣＲによって同定された複数のＬＲＲをコードすることが見いだされた。全挿入物は５８ｋｂ長であり（図５ｂ）、この配列は小さなギャップ（ＰＡＣ４内の２１０〜７３８塩基対の４つのギャップおよびＰＡＣ３／１６コンティーグ内の２５〜５５塩基対の８つのギャップ）を備える１１．７ｋｂのｇＶＬＲコンティーグとオーバーラップした。このオーバーラップはｇＶＬＲエクソン２と３の間の介在配列内に伸長したが、ＰＡＣ４の５５３塩基対の末端配列は固有であった。総計３０の、１〜３個の多様なＬＲＲモジュールの１７のカセットは、部分ｇＶＬＲから１５ｋｂ上流に位置したＰＡＣ４内の３１ｋｂ領域内でコードされた。ＰＡＣ３／１６ｇＶＬＲコンティーグとＰＡＣ４配列との比較により、追加の１〜５ｋｂの領域が９０％を超える同一性を備えることが明らかになったが、これらは非関連配列によって中断された。ＰＡＣ４は、５’フランクおよび約半分のｇＶＬＲを含む約１２ｋｂの重複、または高度に相違するＶＬＲ対立遺伝子のいずれかを表すことができよう。これらの可能性を区別するために、これらのＰＡＣ挿入物からのｇＶＬＲ内の制限部位のマップに対するＮ末端プローブ（図４ａ）とゲノムハイブリダイゼーションのパターンを比較した。ブロットパターンおよび制限マップは、ブロット内の２ｋｂバンドとは相違していたＰＡＣ４からの５．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを除いて、全フラグメントについて匹敵していた（図４ａ）。３つのブロットされたゲノムおよびＰＡＣライブラリーからのゲノム間のそのような限定された変動性を考えると、ＰＡＣ４は多型性ｇＶＬＲ対立遺伝子を表している可能性はないと思われる。限定されたＶＬＲ対立遺伝子変動は、マイクロサテライト遺伝子座においてさえ低対立遺伝子多様性の他の証拠と一致しており（Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、北米五大湖内のウミヤツメ集団およびその他の淡水に生息する集団が高度に近親交配されていることを示している。そこでこの分析は、単一ヤツメウナギｇＶＬＲ遺伝子座がｇＶＬＲのＮ末端半分の追加のコピーを有していることを示している。
【０１４０】
（体細胞性ｇＶＬＲ再配列は多様な成熟ＶＬＲを生成する）
ＶＬＲ多様性領域に隣接するプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって幼生ＤＮＡサンプルを分析すると、６個の固有のイントロンレスＶＬＲ  ＯＲＦが得られた（図３、動物番号＃１０、１２）。この興味のある所見にしたがって、ＯＲＦフランキングプライマーを用いた幼生ＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅は、５’ＵＴＲイントロンを含む１．５〜２ｋｂのＶＬＲクローンを生成し、これはクローン１４個中１３個の固有の配列を明らかにした（＃１０、１１）。これらのゲノムＰＣＲクローンは連続したＶＬＲ  ＯＲＦを含有していたので、それらは「不完全」生殖細胞系ＶＬＲからそれらを区別するために暫定的に成熟ＶＬＲと名付けられた。配列分析は、これらの成熟ＶＬＲがＮ末端プローブとハイブリダイズする１〜１．３ｋｂの多型性ＥｃｏＲＩバンドを生成することを示唆したが、これらのバンドはリンパ球ＤＮＡブロット内でしか観察されなかった（図４ｃが含まれる）。これらの観察は、ペレット化された赤血球または幼生全身から抽出されたヤツメウナギＤＮＡサンプルが成熟ＶＬＲを含有しているが、これらのサンプルからのＤＮＡブロットで検出されるほど十分に豊富なのは生殖細胞系ＶＬＲのコピーだけであることを指摘している。
【０１４１】
この不可解な謎を解決するために、ヤツメウナギリンパ球内での体細胞性遺伝子再配列が、生殖細胞系ｇＶＬＲからの非コーディングＤＮＡを上流および下流カセットからの多様なＬＲＲと置換して、小さな成熟ＶＬＲを生成すると理論付けた。この仮説を試験するために、生殖細胞系ｇＶＬＲにわたるＰＣＲ増幅のための、上流の約３ｋｂおよび下流フランクの約３ｋｂを含むプライマーを設計した（図５ａ）。幼生ＤＮＡサンプルからのＬＲ−ＰＣＲ増幅は、ＰＡＣ１６プラスミドからのｇＶＬＲアンプリコンに類似する約２０ｋｂの小さなバンドにプラスして約８ｋｂの追加の顕著なバンドを生じた（図５ｃ）。２匹の幼生サンプルからの８ｋｂアンプリコンの配列分析は、クローン１０個中９個が固有の成熟ＶＬＲをコードすることを明らかにし（図３）、それらのフランクはｇＶＬＲのフランクと同一であった（図５ｄ）。全２８個の固有の成熟ＶＬＲは、４つの幼生ＤＮＡサンプルからのＰＣＲ産物間で同定された。リンパ球ＤＮＡは、おそらくこれらのＤＮＡサンプルを抽出するために使用されたペレット化赤血球または幼生全身の小さな分画としての、これらの成熟ＶＬＲにとってのテンプレートであった。明らかに、ＬＲ−ＰＣＲ中にはリンパ球成熟ＶＬＲのより短いテンプレートが優先的に増幅された。ｇＶＬＲ  ＯＲＦに隣接するプライマーを用いて増幅した場合に、１．５〜２ｋｂの成熟ＶＬＲおよび１４ｋｂのｇＶＬＲの２つのアンプリコンを生じさせる類似のＰＣＲバイアスが観察された。
【０１４２】
そこでヤツメウナギにおける適応免疫応答を惹起するであろうリンパ球受容体についての探索は、有顎類脊椎動物のＩｇおよびＴＣＲとは完全に相違する可変性リンパ球受容体の系を同定する。ＶＬＲは、複数のＬＲＲモジュールおよびＧＰＩアンカーを介してリンパ球血漿膜へ結合させられている不変柄領域からなる。Ｎ末端およびＣ末端ＬＲＲのフランキングチップは不変であり、介在ＬＲＲの数および配列における変化は顕著なＶＬＲ多様性の一因となる。潜在的ＶＬＲ多様性は３５４の固有配列中３４５を備えて膨大であり、免疫賦活リンパ球由来の同一ＶＬＲは３対に過ぎず、ほぼ同一のＶＬＲは３個であった。したがってＶＬＲは、この代表的無顎類に多様なリンパ球受容体レバートリーを与えている。
【０１４３】
これらの高度に多様なＶＬＲは、病原体の認識において役割を果たす。多様なＬＲＲモジュールを特徴とするタンパク質は、それらが並外れた広範囲のリガンドアレイと相互作用する傾向を示すために、動物および植物の主要な本質的免疫受容体である。動物ＴＬＲは、ウイルス、細菌、真菌および原生動物上で保存されたエピトープの認識に関係しており、炎症反応において最高点に達するシグナル伝達カスケードを活性化する（Ｂｅｕｔｌｅｒ，２００４）。可溶形でも見いだされるＧＰＩ固定ＬＲＲタンパク質であるＣＤ１４は、細菌リポ多糖およびリン脂質へ結合して、ＴＬＲ４受容体とのシグナリング複合体を形成する（Ｌａｎｄｍａｎｎ，２０００）。さらにまた別のサイトゾルＬＲＲタンパク質の哺乳動物ファミリーであるＮＢＳ−ＬＲＲは、細胞内病原体を認識する（Ｃｈａｍａｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。植物疾患耐性遺伝子は、数百種ものＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質、ＬＲＲ受容体様キナーゼおよびＬＲＲ受容体様タンパク質を含む大きな多重遺伝子ファミリーのメンバーであり、それらの多くは抗病原体反応の特異的活性化に関係することが証明されている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。顕著な多様性を備える抗原結合ＶＬＲは、ヤツメウナギにおいて観察される適応免疫応答を媒介する。リンパ球の表面へのＶＬＲのＧＰＩ固定は、これらの受容体のＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ放出を許容し（Ｉｋｅｚａｗａ  ２００２）、ＶＬＲに予想免疫系における表面受容体および体液性アグルチニンの両方としての二重機能性を付与する。
【０１４４】
ゲノムＰＡＣクローンのシーケンシングにより、シグナルペプチド、５’ＬＲＲＮＴ、５’ＬＲＲＣＴ、３’ＬＲＲＣＴおよびＣ末端だけをコードする４つのエクソンからなる生殖細胞系ｇＶＬＲが同定された。ｇＶＬＲは５’ＬＲＲＣＴを除いて多様性ＬＲＲモジュールを欠如しており、これは修飾しないと高度に多様なＶＬＲメッセージをコードできないであろうことを示唆していた。しかし、複数の多様なＬＲＲカセットはｇＶＬＲの上流および下流で見いだされ、これらは成熟ＶＬＲ遺伝子を組み立てるためにｇＶＬＲ内へ挿入するために利用できよう。成熟ＶＬＲは上流および下流ＬＲＲカセットを備える生殖細胞系ｇＶＬＲ内の非コーディングＤＮＡの体細胞性置換を通して生成されるという仮説を試験するために、ＬＲ−ＰＣＲを使用して生殖細胞系および成熟ＶＬＲ遺伝子両方の存在を検出した。ｇＶＬＲからの約２０ｋｂの予想された産物は２匹のヤツメウナギのゲノムＤＮＡ、そしてさらに、多様なセットの成熟ＶＬＲをコードすることが見いだされた成熟ＶＬＲからの予測８ｋｂのアンプリコンから入手された。さらに、少数の例では、候補ＬＲＲドナーはＶＬＲ配列に対する同一性に基づいてｇＶＬＲ隣接カセット間で同定することができ、そしてｇＶＬＲ  ５’ＬＲＲＮＴおよび３’ＬＲＲＣＴ内の高度に保存された配列は遺伝子変換プロセスのための固定領域として潜在的に機能できるであろう。ＶＬＲは、体細胞性ＤＮＡ再配列の機構によって生成される。
【０１４５】
非減数分裂性ＤＮＡ再配列は、他の系から知られている。例えば、表面構成成分をコードする遺伝子の再配列は、慢性感染中の免疫認識から逃れるために数種の病原体によって使用される戦略である。淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のピリンにおける抗原性変化は、ｐｉｌＥ遺伝子座と複数のサイレントなｐｉｌＳコピーとの間の非可逆的組み換えを含んでおり（Ｈａｍｒｉｃｋ，２００１）、ライム病ボレリア属スピロヘータ類（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）における抗原性変化は１アレイの１５のサイレントカセットとｖｌｓＥ発現部位間の遺伝子変換によって生成される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。同様に原生動物ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）は反復されたＤＮＡ再配列によるそれらの変異体表面コート糖タンパク質の発現を交互に繰り返し（Ｄｏｎｅｌｓｏｎ，２００３）、ならびにマラリア原虫熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および腸常在菌であるランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）は複数の表面抗原遺伝子間で頻回に切り替わる。宿主と寄生虫との間の進化上の武器競争（ａｒｍ  ｒａｃｅ）において、脊椎動物は生殖細胞系受容体の体細胞性再配列によって感染性疾患に対抗するために類似の戦略を採用した。多様なリンパ球抗原受容体は、有顎類では対のトランスポザーゼ様ＲＡＧ１およびＲＡＧ２のカットアンドペースト活性によって（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）および無顎類ではいまだ特性付けられていない機構によって組み立てられる。
【０１４６】
ヤツメウナギＶＬＲ系の特徴は、２つの顕著な相違とともに、有顎類脊椎動物リンパ球のＩｇおよびＴＣＲとの類似性を有する。第１に、ヤツメウナギＶＬＲはＬＲＲモジュールからなるが、他方有顎類抗原受容体はＩｇドメインからなる。ヤツメウナギの免疫は、祖先の生殖細胞系をコードするＬＲＲ受容体の多様性を、その生殖細胞系ＶＬＲ遺伝子を体細胞性で多様化したものである可変性リンパ球ＬＲＲ受容体の系と置換する、段階的進化プロセスを受ける。これとは対照的に、有顎類脊椎動物の組み換えリンパ球受容体のコア成分としてのＩｇドメインは、Ｉｇスーパーファミリーメンバーが有顎類脊椎動物以外の動物における病原体または同種移植片の任意のタイプの免疫認識において何らかの役割を果たすことは証明されていないので、それらの祖先からの興味深い追跡不能な進化的推進力である。（Ｋａｕｆｍａｎ，２００２）。第２に、ヤツメウナギ中のＭＨＣ分子の存在についての証拠は見いだされていない。有顎類脊椎動物においては、抗原ペプチドをＴ細胞へ効率的に提示させるためには多型性ＭＨＣ分子が必須であるが、他方近親交配されたＭＨＣホモ接合体は疾患耐性の損傷に苦しむと思われる（Ｐｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｇｒｉｍｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ヤツメウナギは五大湖内の近親交配集団として成長するので、これはそれらのＶＬＲ系が多型性構成成分とは無関係に機能するように進化してきた可能性を示している。
【０１４７】
（動物）
ウミヤツメの幼生（体長８〜１３ｃｍ）はミシガン湖の支流（Ｌａｍｐｒｅｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ミシガン州ラジントン）、またはヒューロン湖の支流（Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｂａｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ミシガン州ミラーズバーグ）からであった。免疫賦活のための幼生は鎮静させ（１００ｍｇ／Ｌ  ＭＳ２２２；Ｓｉｇｍａ）、１０７大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、１０７ヒツジ赤血球、５０μｇのフィトヘマグルチニンおよび２５μｇのヤマゴボウマイトジェン（Ｓｉｇｍａ）を含有する７５μＬの０．６７×ＰＢＳを腹腔内注射した。免疫賦活は１週間間隔で２または４回繰返し、細胞は最終免疫賦活の３〜４日後に採取した。尾を切断した幼生から採血し、０．５７×ＰＢＳおよび３０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて１：１に希釈した。バフィコート白血球を５０ｇでの５分間の遠心によって収集した。ＭｏＦｌｏ血球計算器を用いて（Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）に記載されたように細胞を選別した。
【０１４８】
（差引きした免疫賦活白血球ｃＤＮＡライブラリー）
Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成法（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１週間間隔で４回免疫賦活した幼生から選別した大リンパ球、骨髄細胞および赤血球からのｍＲＮＡとともに使用した。２回の反応において活性化リンパ球ｃＤＮＡは、骨髄細胞または赤血球のｃＤＮＡに対して差引きした（ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。差引きした産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内でクローン化し、１，５０７配列について分析した。
【０１４９】
【表３】
2011206060.tif 000004
（ＶＬＲ  ＲＴ−ＰＣＲ）
非免疫賦活幼生（＃１〜４）、または１週間間隔で２回免疫賦活した幼生（＃５〜７）からのバフィコート白血球を３００ｇで５分間かけてペレット化した。第１鎖ｃＤＮＡは５０ｎｇのランダムヘキサマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプライミングした。ＶＬＲ多様性領域は、ＬＲＲ．Ｆ１＋ＬＲＲ．Ｒ１を用いるＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して増幅させた（表３）。熱サイクルは次のとおりであった：９４℃で１分間、次に９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の３５サイクル。動物１匹当たり１０〜１２クローンをシーケンシングした。
【０１５０】
（ＶＬＲ単細胞ＲＴ−ＰＣＲ）
非免疫賦活幼生（＃８）、および１週間間隔で２回免疫賦活した幼生（＃９）のバフィコート由来の単一リンパ球、または１０−細胞プールを０．２ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ選別した。第１鎖ｃＤＮＡはＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ２を用いてプライミングした。ＶＬＲは、最初はＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＳｌｉｔ．Ｆ＋ＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ２および次にＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを用いるＬＲＲ＿Ｎ．Ｆ１＋ＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ１の２ラウンドのネステッドＰＣＲによって増幅させた。サイクリングパラメータは次のとおりであった：９４℃で１分間、次に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間の４０サイクル。ベクタープライマーを用いたコロニーＰＣＲによって、１２個の細胞各々からの６コロニー内で単一サイズ挿入物が明らかになり、それらのうちの３つをシーケンシングした。細胞９．１６からのコロニーは２サイズであることが明らかになり、３つの短い挿入物および３つの長い挿入物をシーケンシングした。１０個の非免疫賦活細胞プールからは、６個のクローンをシーケンシングした。
【０１５１】
（ゲノムＤＮＡおよびゲノムＰＣＲ）
ゲノムＤＮＡは、幼生全身の１／３、５０ｇで５分間かけてペレット化した０．２５ｍＬの血液からの赤血球、または１０７の選別されたリンパ球から単離した。ＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４００ｎｇのｇＤＮＡから実施した。ＶＬＲ多様性領域は、ＬＲＲ．Ｆ１＋ＬＲＲ．Ｒ１を用いて幼生＃１０および１２から増幅させた。成熟ＶＬＲは、Ｓｌｉｔ．Ｆ＋ＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ２またはＬＲＲ＿Ｎ．Ｆ１＋ＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ１を用いて、動物＃１０および１１から増幅させた。ｇＶＬＲを超える増幅は、ｇＶＬＲ．Ｆ１＋ｇＶＬＲ．Ｒ１を用いて動物＃１０および１３からであった。８ｋｂバンドは、ｐＣＲ−ＸＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でクローン化し、Ｍ１３．Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｍ１３．Ｒｅｖｅｒｓｅ、Ｓｌｉｔ．ＦおよびＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ２を用いてシーケンシングした。
【０１５２】
（実際のノーザンブロットおよびＤＮＡブロット）
実際のノーザンは、推奨されたように調製した（Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴマニュアル）。２０サイクルで増幅させたｃＤＮＡは、幼生尾部、肝臓ならびに非免疫賦活動物の血液、盲樋および腎臓から選別したリンパ球から、または１週間間隔４回免疫賦活した幼生の血液から選別した小および大リンパ球、骨髄細胞および赤血球からであった。
【０１５３】
１レーン当たり１０μｇの幼生＃１０、１２および１３からのゲノムＤＮＡは、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて消化した；５μｇのリンパ球ＤＮＡはＥｃｏＲＩを用いて消化した。パルスフィールドＣＨＥＦブロットのために、１０匹の幼生からの赤血球をアガロース中に包埋し、１レーン当たり２０μｇのＤＮＡはＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、またはＳｆｉＩを用いて消化した。
【０１５４】
次の３２Ｐ標識プローブを使用した：Ｓｌｉｔ．Ｆ＋Ｓｌｉｔ．Ｒを用いてクローンＬＲＲ−２９１３からＰＣＲ増幅させたＶＬＲ  Ｎ末端プローブ（１９６塩基対）、およびＬＲＲ＿Ｃ．Ｆ１＋ＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ１を用いて増幅させたＣ末端プローブ（２０８塩基対）；ＧＡＰＤＨ．Ｆ＋ＧＡＰＤＨ．Ｒを用いてクローンＰｍＧＡＰＤＨから増幅させたＧＡＰＤＨプローブ（３１４塩基対）。
【０１５５】
（ＰＡＣライブラリーおよびクローン）
ｐＣＹＰＡＣ６（ＡＦ１３３４３７）中のアレイ化ウミヤツメＰＡＣライブラリーは、部分ＭｂｏＩ消化物を用いて１匹のミシガン湖成体の赤血球ＤＮＡから構築した。６×１０４クローンは、１〜２倍のゲノム被度を有する６５ｋｂの平均挿入物を有していた。ライブラリーは、Ｎ末端およびＣ末端プローブ両方を用いてスクリーニングした。陽性クローンのプラスミドは、ＥｃｏＲＩ消化し、ブロッティングし、そしてＮ末端またはＣ末端プローブのどちらかとハイブリダイズした。５種のＰＡＣは両方のプローブとハイブリダイズし（２、３、１５、１６、１７）、５種のＰＡＣはＮ末端プローブとのみハイブリダイズした（４、９、１４、３５、４２、４３）。
【０１５６】
ｇＶＬＲは、Ｓｌｉｔ．Ｆ＋ＬＲＲ＿Ｃ．Ｒ２を用いてＰＡＣ２、３、１５、１６および１７のプラスミドからのＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いて増幅させた。全ＰＣＲ産物は、２セットのＢａｍＨＩパターン（ＰＡＣ２、３および１５〜１７）を含む１４ｋｂであった。ＰＡＣ３、４および１６はＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（カナダ国ケベック州）でシーケンシングされた。
【０１５７】
（ＶＬＲ  ＧＰＩアンカー）
ＬＲＲＮＴから終止コドンまでのＶＬＲ挿入物は、Ｄｉｓ＿ＬＲＲ．Ｆ＋Ｄｉｓ＿ＬＲＲ．Ｒ１を用いるＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを使用してクローンＬＲＲ−２９１３から増幅させ、ｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内のＩｇκシグナルペプチドおよびヘマグルチニンエピトープへ融合させた。表面局在化およびＶＬＲ  ＧＰＩアンカーは、ＢＷ１５４７細胞、またはｍＦｃγＲＩＩｂを発現するコントロール中で分析した。細胞は、３０℃で４５分間にわたり１単位／ｍＬの細菌性ＧＰＩ特異的ホスホリパーゼＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。エピトープタグ付けタンパク質は、抗ＨＡ−タグｍＡｂ  １２ＣＡ５を用いて表面染色した。
【０１５８】
（配列分析）
配列変動性は、ＭＥＧＡ２．１  ＵＰＧＭＡ（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を用いて推定した。ＧＰＩアンカー部位は：ｈｔｔｐ：／／１２９．１９４．１８５．１６５／ｄｇｐｉ／によって同定した。ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  ＶＬＲ  ３Ｄ構造は：ｈｔｔｐ：／／ｃｕｂｉｃ．ｂｉｏｃ．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ／ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ／ｓｕｂｍｉｔ＿ｍｅｔａ．ｈｔｍｌによって同定した。クローン１２．２６からの残基２２〜３１９は、ＣＤ４２ａ（１ｍ１０．ｐｄｂ）およびＮＯＧＯ−６６受容体（ｌｐ８ｔ．ｐｄｂ）の結晶座標上に進ませた。
【０１５９】
（実施例２：メクラウナギにおける可変性リンパ球受容体）
（円口類ＶＬＲホモログ）
ＶＬＲの２つの明確なタイプであるＶＬＲ−ＡおよびＶＬＲ−Ｂは、沿岸メクラウナギであるＥｐｔａｔｒｅｔｕｓ  ｂｕｒｇｅｒｉの１２，０００個の白血球ｃＤＮＡクローンから発現した配列タグ間で同定された（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４Ｂ）。適合するＶＬＲは次に、太平洋メクラウナギＥ．ｓｔｏｕｔｉｉのリンパ球様細胞の転写産物からＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。図９は、メクラウナギＶＬＲ−ＡおよびＶＬＲ−Ｂ、ウミヤツメＶＬＲ（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ）および２つの非寄生性ヤツメウナギのＶＬＲ、アメリカカワヤツメ（Ｌａｍｐｅｔｒａ  ａｐｐｅｎｄｉｘ）および北部カワヤツメ（Ｉｃｈｔｈｙｏｍｙｚｏｎ  ｆｏｓｓｏｒ）のアミノ酸配列のアライメントを描出している。これらのＶＬＲは類似の構造的ドメインを共有している：シグナルペプチド（ＳＰ）、Ｎ末端ＬＲＲ（ＬＲＲＮＴ）、１８残基ＬＲＲ１、その後に可変数の２４残基ＬＲＲ、１３残基連結ペプチド（ＣＰ）およびＣ末端ＬＲＲ（ＬＲＲＣＴ）が続く。Ｃ末端の最初では、ヤツメウナギＶＬＲおよびメクラウナギＶＬＲ−Ｂはトレオニン／プロリンリッチ領域を有しているが、この領域はメクラウナギＶＬＲ−Ａ内では明確には保存されていない。全ＶＬＲタンパク質は、グリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）細胞表面膜アンカーを加えるためにタンパク質を修飾するために必要とされる疎水性尾部領域で終了する。ウミヤツメＶＬＲと同様に、メクラウナギＶＬＲ−ＡはＧＰＩ固定タンパク質であると予測されたが、ω開裂部位は同定されなかった（ＤＧＰＩ  ｈｔｔｐ：／／１２９．１９４．１８５．１６５／ｄｇｐｉ／）；ＶＬＲ−ＢについてのＣ末端疎水性プロファイルもまたＧＰＩ修飾の予測因子である。
【０１６０】
メクラウナギＶＬＲの転写産物はリンパ球様細胞中では豊富であるが、それらの光散乱特性によって選別された骨髄細胞または赤血球中では豊富ではない。ＶＬＲ−Ａ転写産物レベルは、白血球サンプル中のＶＬＲ−Ｂレベルより約３倍高かった。太平洋メクラウナギの両方のＶＬＲタイプは高度に異質であり（図１０ＡおよびＢ）、これは可変数の２４残基のＬＲＲモジュールおよび顕著なＬＲＲ配列多様性を示していた。匹敵する多様性は沿岸メクラウナギからのＶＬＲ−Ａ配列（Ｎ＝６６）およびＶＬＲ−Ｂ配列（Ｎ＝１８）について観察された（図１３）。興味深いことに、同一であった、または１〜２個の残基しか相違していなかった２〜４個のＶＬＲ−Ａクローンの５つのクラスターは、抗原とマイトジェンとのカクテルの４回にわたる週１回の注射が投与されたメクラウナギ＃５（図１０Ａにおいて星印で表示した）からの４０の転写産物間で見いだされた。このメクラウナギからのＶＬＲ−Ａ転写産物の３０％が関連配列のクラスターから構成されるという所見は、リンパ球を有するＶＬＲ−Ａのクローン性増殖を示唆している。１〜２のアミノ酸置換を備えるクローンは、体細胞性超変異を通しての追加のＶＬＲ多様化を反映している。
【０１６１】
固有の配列である太平洋メクラウナギＶＬＲ−Ａのデータセット（Ｎ＝１３０）から、２４残基ＬＲＲの転写産物による２〜６コピーが明らかになる（Ｎ＝５２７；平均４）。ＶＬＲ−Ｂデータセット（Ｎ＝６９）内には、１〜６コピーの２４残基ＬＲＲが存在したが（Ｎ＝１９５；平均２．８）、他方１２９のウミヤツメＶＬＲ（１９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５７７９４３〜ＡＹ５７８０５９）のデータセット内には１〜９コピーの２４残基ＬＲＲが存在した（Ｎ＝３２５；平均２．５）。そして、これらのＶＬＲの個別構成成分を、確実なアライメントのために種間で相違し過ぎるＬＲＲＮＴおよびＬＲＲＣＴを除いて（表４；３２８個のＬＲＲ１ドメイン、３２８個のＣＰドメイン、および２４残基ＬＲＲの１，０４７個の単一ドメイン）、近隣結合系統樹において個別に分析した。
【０１６２】
【表４】
2011206060.tif 000005
これらのクラスターは、ほぼ排他的に同一タイプおよび種起源、すなわち太平洋メクラウナギＶＬＲ−Ａ、ＶＬＲ−Ｂ、またはウミヤツメＶＬＲクラスタリングであった。相違するＶＬＲタイプ間に同一ＬＲＲドメインの例はなかった。しかし、メクラウナギＶＬＲ−Ａクラスター内およびヤツメウナギＶＬＲクラスター内のＬＲＲ１およびＣＰドメインの大部分は同一であった（表４）。これとは対照的に、メクラウナギＶＬＲ−Ｂ内のＬＲＲ１ドメインは９８％固有であった；２４残基ＬＲＲのセットは、さらに主として固有配列から構成された：９７％はメクラウナギＶＬＲ−Ｂ中で、９０％はＶＬＲ−Ａ中で、および８３％はウミヤツメＶＬＲ中で固有であった。この顕著に高度の多様性は、２４残基ＬＲＲタイプ各々について引き出されたコンセンサス配列が少なくとも１０フレームワーク残基を共有することを前提にすると特に注目に値する。
【０１６３】
（メクラウナギＶＬＲ遺伝子）
太平洋メクラウナギおよび沿岸メクラウナギのＶＬＲ遺伝子座のゲノム組織は、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーから単離した大きな挿入物のゲノムクローンの配列から決定したが、ＢＡＣは各ＶＬＲタイプに対して１つであった（図１１）。メクラウナギゲノム内では、各ｇＶＬＲについて１コピーしか同定されなかった。遺伝子座の配列および組織は、両方の種でほぼ同一であり、ｇＶＬＲ−ＡおよびｇＶＬＲ−Ｂ間で相当に保存されている。メクラウナギｇＶＬＲは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）で始まり、２つのコーディング領域が続く（図１２Ａ）。ウミヤツメｇＶＬＲにおけると同様に、５’ＵＴＲは、太平洋メクラウナギｇＶＬＲ−Ａ内では６．４ｋｂ長およびｇＶＬＲ−Ｂ中では２２０塩基対であるイントロンによって分割されている。メクラウナギｇＶＬＲ内の第１コーディング領域は、ｇＶＬＲ−Ａ内のシグナルペプチドおよびＬＲＲＮＴドメインならびにｇＶＬＲ−Ｂ内の２３残基シグナルペプチド中の残基１〜１３だけをコードする。次に、ｇＶＬＲ−ＡおよびｇＶＬＲ−Ｂに対して各々１７１および２１１塩基対の短い介在配列が存在する。第２コーディング領域は、ＬＲＲＣＴの５’末端をコードするヤツメウナギ領域が欠けていること以外は、ウミヤツメｇＶＬＲ中と同様に、ＬＲＲＣＴの３’末端およびＣ末端からなる。メクラウナギｇＶＬＲは、開始コドンから終止コドンまでがｇＶＬＲ−Ａ内では６７１塩基対そしてｇＶＬＲ−Ｂ内では４１０塩基対とコンパクトである。
【０１６４】
メクラウナギｇＶＬＲ遺伝子座は、生殖細胞系遺伝子から約２０〜４０ｋｂ下流に位置する多様なＬＲＲモチーフをコードするカセットを有している（図１１）。ＶＬＲ−Ａ遺伝子座では、多様なＣＰドメインの６〜８末端残基およびｇＶＬＲ−Ａ  ３’ＬＲＲＣＴとの４残基の同一オーバーラップを含む５’ＬＲＲＣＴをコードするカセットが存在する。さらに下流には、ｇＶＬＲ−Ａに比較して逆方向に配置された２つの多様なＬＲＲおよび次に逆方向不完全５’ＬＲＲＣＴを含むカセットが存在する。ｇＶＬＲ−Ｂ遺伝子座には、シグナルペプチドの残基７〜２３および５’ＬＲＲＮＴ、次に多様なＣＰドメインおよび５’ＬＲＲＣＴ、１つの逆方向ＬＲＲをコードするカセットがあり、さらにより下流では、ＬＲＲの１２末端残基および８個の近位残基からなる別の逆方向ＬＲＲカセットが存在する。ｇＶＬＲから約５０ｋｂ上流および約７０ｋｂ下流にわたるフランキングＤＮＡ内では他の多様なＬＲＲモジュールは同定されなかった。しかし、リンパ球様細胞からのゲノムＰＣＲアンプリコンのサンプル：２匹の動物からの３５個の固有の成熟ＶＬＲ−Ａおよび３８個のＶＬＲ−Ｂ配列中で同定された成熟ＶＬＲ遺伝子の欠如している構成成分を提供するために多様なＬＲＲエレメントがゲノム内のどこかに存在すると思われる（図１０）。そこで、メクラウナギ成熟ＶＬＲ遺伝子は、ヤツメウナギのための場合と同様に、体細胞性組み換えを通して組み立てられなければならない。
【０１６５】
メクラウナギリンパ球様細胞中の生殖細胞系ＶＬＲ遺伝子は、遺伝子再配列の前に能動的に転写される。ＶＬＲ−Ａ生殖細胞系転写産物のＰＣＲアンプリコンは、約０．７ｋｂ長およびＶＬＲ−Ｂについては約０．５ｋｂであるが（図１２Ｂ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＰＣＲプライマーの位置は図１２Ａに示されている）、他方より大きなアンプリコンは再配列された成熟ＶＬＲ遺伝子からの転写産物に対応して、ＶＬＲ−ＡおよびＶＬＲ−Ｂに対して各々約１．１および約０．８ｋｂであった。血中ゲノムＤＮＡからの対応するＰＣＲアンプリコンは、生殖細胞系遺伝子に対しては約０．７ｋｂならびに成熟ＶＬＲ−Ａ遺伝子および成熟ＶＬＲ−Ｂ遺伝子に対して約１．１ｋｂである（図１２Ｂ、ゲノムＰＣＲ）。生殖細胞系および成熟ＶＬＲ遺伝子からの転写産物中では、５’イントロンはスプライシングされて出され、対応するゲノムＰＣＲアンプリコンより短いＲＴ−ＰＣＲ産物が産生する（図１２ＢにおけるＶＬＲ−Ｂを参照；ｇＶＬＲ−Ａアンプリコンは６．４ｋｂイントロンを含んでいない）。しかし、コーディングエクソン間の介在配列は、それらにコンセンサスな真核細胞のスプライス部位が欠けているために、生殖細胞系転写産物中に保持されている。それに対して生殖細胞系スイッチ領域転写が必須である哺乳動物抗体クラススイッチ組み換えにおける場合と同様に、ｇＶＬＲ再配列のために生殖細胞系転写が必要とされることがある（Ｂｏｔｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１６６】
（ＶＬＲ系統発生学）
無顎類ＶＬＲタンパク質の系統発生学的分析により、ヤツメウナギＶＬＲ配列、メクラウナギＶＬＲ−Ａ配列およびＶＬＲ−Ｂ配列によって各々構成される３つの別個のクラスターが明らかになる（図１２Ｃ）。メクラウナギＶＬＲ−ＢおよびヤツメウナギＶＬＲは、メクラウナギＶＬＲ−Ａとの分科とは別個の分科でクラスターを形成している。ＶＬＲ多様性領域であるＬＲＲＮＴ〜ＬＲＲＣＴまたはＬＲＲ１〜ＣＰだけがアライメントされた場合は同一樹形が見られた。そこでメクラウナギＶＬＲ−Ａは祖先遺伝子の重複によって発生した（図１２Ｄ）か、あるいは４億９，９００万年±３，８００万年前のカンブリア紀においてメクラウナギとヤツメウナギ系統に分裂した後にＶＬＲ−Ａオルソログを消失した（Ｈｅｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ヤツメウナギＶＬＲ−Ａオルソログが存在するが、それは極めて低レベルで発現する、または非リンパ系細胞中では発現しないために、ヤツメウナギリンパ球様細胞由来の１８，０００を超えるｃＤＮＡ配列中では検出されなかった可能性もある（Ｐａｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１６７】
現存する円口類の両方種類におけるＶＬＲの存在は、脊椎動物が先行の分子認識系を発達させるための強力な進化圧力の指標である。この分析は、カンブリア紀における４，０００万年未満以内に、ＬＲＲまたはＩｇいずれかの遺伝子フラグメントが組み換えアッセンブリーを受けてリンパ球受容体の多様なレパートリーを生成する２つの根本的に相違する系が無顎類および有顎類において進化したことを示唆している。この進化のシナリオは、多くの興味深い疑問を引き起こすが、それらの１つは２つの適応免疫戦略が収束進化を意味するかどうか、または一方が他方の先祖であるかどうかという問題に関する。ＶＬＲが先駆脊椎動物免疫受容体であったのか、または個別に進化したＶＬＲおよびＩｇの再配列であったのかは、現存および絶滅無顎類および有顎類脊椎動物の群間での系統発生的関係が明確に解決された場合にしか明らかにならないであろう（Ｍａｌｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしこの点について、現代の無顎類の両方の種類におけるＶＬＲの存在は、円口類の単一系統起源に好都合な追加の分子的証拠を提供している。
【０１６８】
（動物）
太平洋メクラウナギＥｐｔａｔｒｅｔｕｓ  ｓｔｏｕｔｉｉ（体長３０〜６０ｃｍ）の生きている標本は、Ｍａｒｉｎｕｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州ロングビーチ）から購入し、１２℃の人工海水（Ｏｃｅａｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、テキサス州ダラス）中で２カ月間維持した。アメリカカワヤツメ（Ｌａｍｐｅｔｒａ  ａｐｐｅｎｄｉｘ）および北部カワヤツメ（Ｉｃｈｔｈｙｏｍｙｚｏｎ  ｆｏｓｓｏｒ）の幼生（体長：１５〜２０ｃｍ）は、五大湖の支流から入手した（Ｌａｍｐｒｅｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ミシガン州ラジントン）。
【０１６９】
メクラウナギはｐＨ＝７に緩衝した０．５ｇ／ＬのＭＳ２２２（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）中へ１５分間浸漬することにより鎮静し、その後に０．５ｍＬのメクラウナギＰＢＳ中の抗原／マイトジェンカクテル（１Ｌに付き：２８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣＬ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４、１オスモル）を用いて腹腔内注射した。このカクテルは、１０９の生きている大腸菌ＴＧ１細菌、１０９のヒツジ赤血球（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、コロラド州デンバー）ならびに各１００μｇのフィトヘマグルチニンおよびヤマゴボウマイトジェン（Ｓｉｇｍａ）を含有していた。免疫賦活は１週間間隔で繰返し、第４回目の免疫賦活から４日後にシリンジを用いて尾血洞から血液を採取し、３０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するメクラウナギＰＢＳを用いて１：１に希釈した。５０×ｇでの５分間の遠心後に採取したバフィコート白血球は報告されたように（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒａｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ＭｏＦｌｏ血球計算器（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，コロラド州フォートコリンズ）を用いて光散乱特性によって選別した。
【０１７０】
（メクラウナギＶＬＲ）
沿岸メクラウナギＥｐｔａｔｒｅｔｕｓ  ｂｕｒｇｅｒｉのＶＬＲホモログは、非免疫賦活動物＃７、８の白血球ＲＮＡから発現した配列タグのデータベースに対するＢＬＡＳＴクエリーとしてヤツメウナギＶＬＲを用いて同定した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４Ｂ）。両方のストランド上の有意な適合を有するクローンを：６４個のＶＬＲ−Ａ  ｃＤＮＡクローンおよび１５個のＶＬＲ−Ｂ  ｃＤＮＡクローン上でシーケンシングした。太平洋メクラウナギに対しては、３匹の非免疫賦活個体（＃１〜３、６）からの分離されていない血球およびバフィコート白血球、および２匹の免疫賦活動物（＃４、５）からのバフィコート白血球を血液ゲノムＤＮＡおよび白血球ＲＮＡを抽出するために使用した。ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて行い、ポリＡ  ＲＮＡはＤｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ精製キット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニューヨーク州レークサクセス）を用いて選択した。第１ストランドｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＶＬＲ−Ａについては２０ｐｍｏｌｅのＨｇＶＬＲＡ．Ｆ１（表５）、またはＶＬＲ−ＢについてはＨｇＶＬＲＢ．Ｆ１を用いてプライムし、生成物はカラム精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製；ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）。
【０１７１】
【表５】
2011206060.tif 000006
ＶＬＲは次に、１０ｐｍｏｌｅ／μＬでフォワードプライマーおよびリバースプライマーのセット（Ｆ１またはＦ２およびＲ１またはＲ２）各１μＬ、５μＬの１０×バッファー、３６．２５μＬのＤＤＷ、５μＬのｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ（２５０ｎｇ）および０．７５μＬの伸長酵素を含有する５０μＬ反応液中で、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。反応液は、９４℃で１分間の１サイクル、次に９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１分間の３５サイクル、および最後に７２℃で７分間の伸長を用いて増幅させた。生成物をカラム精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローン化し、挿入物をシーケンシングした。太平洋メクラウナギについては、１０９個のＶＬＲ−Ａ  ＲＴ−ＰＣＲクローンをシーケンシングし（４個はインフレーム終止コドンを含有していた）、そして３６個のゲノム成熟ＶＬＲ−Ａアンプリコンをシーケンシングした（２個がインフレーム終止コドンを含有していた）。ＶＬＲ−Ｂについては、３７個のＲＴ−ＰＣＲクローンをシーケンシングし（１個はインフレーム終止コドンを含有していた）、そして３８個のゲノム成熟ＶＬＲ−Ｂアンプリコンをシーケンシングした（４個がインフレーム終止コドンを含有していた）。沿岸メクラウナギ＃９からの肝臓ゲノムＤＮＡ（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４Ｂ）をＰＣＲクローニングのために使用し、成熟ＶＬＲについてシーケンシングした：４個の成熟ＶＬＲ−Ａアンプリコン（２個はインフレーム終止コドンを含有していた）および３個の成熟ＶＬＲ−Ｂアンプリコン。
【０１７２】
（非寄生性ヤツメウナギＶＬＲ）
第１鎖ｃＤＮＡは、リバースプライマーＶＬＲ＿３ＵＴ．Ｒ（ウミヤツメ３’ＵＴＲプライマー、表５）を用いて上述したように合成した。アメリカカワヤツメについてはフォワードプライマーおよびリバースプライマーはＳｌｉｔ．Ｆ（ウミヤツメ５’ＵＴＲプライマー）であり、北部カワヤツメについてはＬＲＲ＿Ｎ．Ｆ１（また別のウミヤツメ５’ＵＴＲプライマー）であった。アメリカカワヤツメの総計１３個および北部カワヤツメの７個の固有のＶＬＲクローンをシーケンシングした。
【０１７３】
（ＢＡＣライブラリーおよびクローン）
沿岸メクラウナギＢＡＣライブラリー（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４Ａ）は、上述したようにＶＬＲプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングした（Ｆ１またはＦ２およびＲ１またはＲ２）。太平洋メクラウナギＢＡＣライブラリー（ＶＭＲＣ２３）は、ベクターｐＣＣＢＡＣＥ１（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワイオミング州マディソン）内の単一標本からの赤血球ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化物から構築した。このライブラリーは、約１８４，０００個の組み換え体からなり、メクラウナギゲノムの約５×の有効範囲を含んでいる。全ライブラリーは５’および３’のＶＬＲ−ＡプローブおよびＶＬＲ−Ｂプローブを用いたハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、陽性クローンはＰＣＲによって正しいことを確証された。太平洋および沿岸メクラウナギ由来の各ＶＬＲタイプについて１つのＢＡＣを約１０×有効範囲でシーケンシングし、コンティーグに組み立てた（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、韓国ソウル）。挿入物の不完全配列の場合は、コンティーグ内にギャップを占めないｇＶＬＲおよびＬＲＲカセットを含有する部分だけを含めた：Ｅｂ＿ｇＶＬＲ−Ａ、４３，３６２ｂｐ；Ｅｂ＿ｇＶＬＲ−Ｂ、９２，０７２ｂｐ；Ｅｓ＿ｇＶＬＲ−Ａ、８１，６４８ｂｐ；Ｅｓ＿ｇＶＬＲ−Ｂ，７６，７３０ｂｐ。
【０１７４】
（配列分析）
隣接結合およびＵＰＧＭＡ樹は、ＭＥＧＡ３  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓからのプログラムを用いてペアワイズ欠失選択を用いて構築した（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＢＡＣ挿入物中の遺伝子の予測は、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／およびＧｅｎＳｃａｎサーバー：ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌからダウンロードしたローカルＢＬＡＳＴを使用することによって遂行した。
【０１７５】
本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術の現在の状態をより十分に記載するために、これにより全体として本出願に組み込まれる。開示した参考文献は、その参考文献が依拠している文章の中で考察されている、その中に含有される物質については、本明細書に個別かつ詳細に参照して組み込まれる。
【０１７６】
当業者には、本発明において、本発明の範囲または精神から逸脱せずに様々な修飾および変化を加えられることは明白であろう。本発明のその他の実施形態は、当業者には本明細書に開示した本明細書の説明および実践の考察から明白であろう。本明細書および実施例は例示に過ぎないと見なされ、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって指示されることが意図されている。
【０１７７】
【表６】
2011206060.tif 000007
【０１７８】
【表７】
2011206060.tif 000008
【０１７９】
【表８】
2011206060.tif 000009
【０１８０】
【表９】
2011206060.tif 000010
【０１８１】
【表１０】
2011206060.tif 000011
【数１】
2011206060.tif 000012
【数２】
2011206060.tif 000013
【数３】
2011206060.tif 000014
【数４】
2011206060.tif 000015
【数５】
2011206060.tif 000016
【数６】
2011206060.tif 000017
【数７】
2011206060.tif 000018
【数８】
2011206060.tif 000019
【数９】
2011206060.tif 000020
【数１０】
2011206060.tif 000021
【数１１】
2011206060.tif 000022
【数１２】
2011206060.tif 000023
【数１３】
2011206060.tif 000024
【数１４】
2011206060.tif 000025
【数１５】
2011206060.tif 000026
【数１６】
2011206060.tif 000027
【数１７】
2011206060.tif 000028
【数１８】
2011206060.tif 000029
【数１９】
2011206060.tif 000030
【数２０】
2011206060.tif 000031
【数２１】
2011206060.tif 000032
【数２２】
2011206060.tif 000033
【数２３】
2011206060.tif 000034
【数２４】
2011206060.tif 000035
【数２５】
2011206060.tif 000036
【数２６】
2011206060.tif 000037
【数２７】
2011206060.tif 000038
【数２８】
2011206060.tif 000039
【数２９】
2011206060.tif 000040
【数３０】
2011206060.tif 000041
【数３１】
2011206060.tif 000042
【数３２】
2011206060.tif 000043
【数３３】
2011206060.tif 000044
【数３４】
2011206060.tif 000045
【数３５】
2011206060.tif 000046
【数３６】
2011206060.tif 000047
【数３７】
2011206060.tif 000048
【数３８】
2011206060.tif 000049
【数３９】
2011206060.tif 000050
【数４０】
2011206060.tif 000051
【数４１】
2011206060.tif 000052
【数４２】
2011206060.tif 000053
【数４３】
2011206060.tif 000054
【数４４】
2011206060.tif 000055
【数４５】
2011206060.tif 000056
【数４６】
2011206060.tif 000057
【数４７】
2011206060.tif 000058
【数４８】
2011206060.tif 000059
【数４９】
2011206060.tif 000060
【数５０】
2011206060.tif 000061
【数５１】
2011206060.tif 000062
【数５２】
2011206060.tif 000063
【数５３】
2011206060.tif 000064
【数５４】
2011206060.tif 000065
【数５５】
2011206060.tif 000066
【数５６】
2011206060.tif 000067
【数５７】
2011206060.tif 000068
【数５８】
2011206060.tif 000069
【数５９】
2011206060.tif 000070
【数６０】
2011206060.tif 000071
【数６１】
2011206060.tif 000072
【数６２】
2011206060.tif 000073
【数６３】
2011206060.tif 000074
【数６４】
2011206060.tif 000075
【数６５】
2011206060.tif 000076
【数６６】
2011206060.tif 000077
【数６７】
2011206060.tif 000078
【数６８】
2011206060.tif 000079
【数６９】
2011206060.tif 000080
【数７０】
2011206060.tif 000081
【数７１】
2011206060.tif 000082
【数７２】
2011206060.tif 000083
【数７３】
2011206060.tif 000084
【数７４】
2011206060.tif 000085
【数７５】
2011206060.tif 000086
【数７６】
2011206060.tif 000087
【数７７】
2011206060.tif 000088
【数７８】
2011206060.tif 000089
【数７９】
2011206060.tif 000090
【数８０】
2011206060.tif 000091
【数８１】
2011206060.tif 000092
【数８２】
2011206060.tif 000093
【数８３】
2011206060.tif 000094
【数８４】
2011206060.tif 000095
【数８５】
2011206060.tif 000096
【数８６】
2011206060.tif 000097
【数８７】
2011206060.tif 000098
【数８８】
2011206060.tif 000099
【数８９】
2011206060.tif 000100
【数９０】
2011206060.tif 000101
【数９１】
2011206060.tif 000102
【数９２】
2011206060.tif 000103
【数９３】
2011206060.tif 000104
【数９４】
2011206060.tif 000105
【数９５】
2011206060.tif 000106
【数９６】
2011206060.tif 000107
【数９７】
2011206060.tif 000108
【数９８】
2011206060.tif 000109
【数９９】
2011206060.tif 000110
【数１００】
2011206060.tif 000111
【数１０１】
2011206060.tif 000112
【数１０２】
2011206060.tif 000113
【数１０３】
2011206060.tif 000114
【数１０４】
2011206060.tif 000115
【数１０５】
2011206060.tif 000116
【数１０６】
2011206060.tif 000117
【数１０７】
2011206060.tif 000118
【数１０８】
2011206060.tif 000119
【数１０９】
2011206060.tif 000120
【数１１０】
2011206060.tif 000121
【数１１１】
2011206060.tif 000122
【数１１２】
2011206060.tif 000123
【数１１３】
2011206060.tif 000124
【数１１４】
2011206060.tif 000125
【数１１５】
2011206060.tif 000126
【数１１６】
2011206060.tif 000127
【数１１７】
2011206060.tif 000128
【数１１８】
2011206060.tif 000129
【数１１９】
2011206060.tif 000130
【数１２０】
2011206060.tif 000131
【数１２１】
2011206060.tif 000132
【数１２２】
2011206060.tif 000133
【数１２３】
2011206060.tif 000134
【数１２４】
2011206060.tif 000135
【数１２５】
2011206060.tif 000136
【数１２６】
2011206060.tif 000137
【数１２７】
2011206060.tif 000138
【数１２８】
2011206060.tif 000139
【数１２９】
2011206060.tif 000140
【数１３０】
2011206060.tif 000141
【数１３１】
2011206060.tif 000142
【数１３２】
2011206060.tif 000143
【数１３３】
2011206060.tif 000144
【数１３４】
2011206060.tif 000145
【数１３５】
2011206060.tif 000146
【数１３６】
2011206060.tif 000147
【数１３７】
2011206060.tif 000148
【数１３８】
2011206060.tif 000149
【数１３９】
2011206060.tif 000150
【数１４０】
2011206060.tif 000151
【数１４１】
2011206060.tif 000152
【数１４２】
2011206060.tif 000153
【数１４３】
2011206060.tif 000154
【数１４４】
2011206060.tif 000155
【数１４５】
2011206060.tif 000156
【数１４６】
2011206060.tif 000157
【数１４７】
2011206060.tif 000158
【数１４８】
2011206060.tif 000159
【数１４９】
2011206060.tif 000160
【数１５０】
2011206060.tif 000161
【数１５１】
2011206060.tif 000162
【数１５２】
2011206060.tif 000163
【数１５３】
2011206060.tif 000164
【数１５４】
2011206060.tif 000165
【数１５５】
2011206060.tif 000166
【数１５６】
2011206060.tif 000167
【数１５７】
2011206060.tif 000168
【数１５８】
2011206060.tif 000169
【図１】
2011206060.tif 000170
【図２】
2011206060.tif 000171
【図３】
2011206060.tif 000172
【図４】
2011206060.tif 000173
【図５】
2011206060.tif 000174
【図６】
2011206060.tif 000175
【図７】
2011206060.tif 000176
【図８−１】
2011206060.tif 000177
【図８−２】
2011206060.tif 000178
【図９】
2011206060.tif 000179
【図１０】
2011206060.tif 000180
【図１１】
2011206060.tif 000181
【図１２】
2011206060.tif 000182
【図１３】
2011206060.tif 000183
【配列表】
2011206060000001.app
【外国語明細書】
2011206060000001.pdf