(57)【要約】【課題】免疫測定法により加熱加工食品中の豚肉を、非特異的反応を惹起すること無く高性能、かつ高感度に行なうための最適な検体由来成分の調製と、それを用いて得られたポリクローナル抗体を用いる簡便かつ高精度な検出法ならびにそのための検査キットを提供することである。【解決手段】イムノクロマトグラフィー法により試料中の検出対象物を検出する際に、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識する抗体として、少なくとも一方または両方にポリクローナル抗体を検出抗体として用いることによって、加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出をする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出法。
【請求項２】
検出法がイムノクロマトグラフィー検出法である請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
免疫用抗原が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質である請求項１または２に記載の検出法。
【請求項４】
豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を動物に免疫して得られるポリクローナル抗体。
【請求項５】
加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出用装置。
【請求項６】
試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されているイムノクロマトグラフィー装置である請求項５に記載の検出用装置。
【請求項７】
試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出用キット。
【請求項８】
免疫用抗原が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質である請求項７に記載の検出用キット。
【請求項９】
抗体が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を動物に免疫して得られるポリクローナル抗体である請求項７または８に記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加工食品、特に加熱処理された加工食品中の豚肉を検出する方法およびその検出キットに関するものである。さらに、本発明は、加工食品、特に加熱処理された加工食品中の動物種由来の検出用抗原を調製する方法ならびにその検出用抗原から得られる抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）といった牛感染症のヒトへの感染の危険性が、ＥＵ科学運営委員会の意見として報告されて以来、ＢＳＥ感染牛の肉骨粉の家畜飼料への使用が問題視され、また、ブランド牛肉に対する偽装ブランド肉の問題や他の肉類の牛肉への偽装といった問題にも一般消費者の関心が集まってきている。
一方で、食品中に含まれる食物アレルゲンに対して食物アレルギー患者は、喘息、皮膚炎、胃腸障害、アナフィラキシーショックといったさまざまなアレルギー症状を引き起こし、時には深刻な事態に至るケースもある。食物アレルギー患者は増加傾向にあることもあって、食品への安全性に関する消費者の関心は非常に高まっている。
【０００３】
食物アレルゲン含有物質として代表的な食品としては、穀類（そば、小麦等）、卵類、肉類（牛、豚、鶏など）、魚類（サバ、イワシ等々）、牛乳類、甲殻類（カニなど）、軟体動物類、豆類（落花生、大豆など）、果実類（マンゴーなど）、野菜類（ニンニクなど）などが一般的には良く知られており、これらの食物アレルギー誘発食品中には、グルテン、ゼラチン、カゼイン、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等々といった食物アレルギー誘発成分が含まれている。加工食品中には、多数の食品や多数の食物アレルゲンが含まれているが、これらを簡便に検出することは出来ないのが現状である。
【０００４】
さらに加工処理（加熱、加圧、酵素処理、凍結、乾燥、塩蔵など）された食品は、処理により食品中のたんぱく質成分が分子構造的に変性もしくは分子修飾されてしまうため、加工食品中のこれらの成分を簡便に検出するには、加工処理された成分と加工処理されていない生の成分とでは、それぞれに対応した適切な抗原やエピトープを用いることが肝要であり、その模索と研究が進められてきた。
【０００５】
例えば、缶詰食品や家畜用飼料といった試料中に存在する高温、例えば１００℃を超える温度条件で加熱処理された牛、豚、鶏に代表される動物性組織由来原料を検出するための検出試薬として、前記動物性組織由来原料を１２０℃以上の温度で加熱処理された動物性組織由来原料中の血清アルブミンに対する抗体またはその抗原接合性フラグメントが、標識物質により標識された標識抗体と、前記動物性組織由来原料中の血清アルブミンに対する抗体またはその抗原接合性フラグメントが固定された検出領域を備えた担体とを有する検出試薬が開発されている。すなわち、血清アルブミンを加熱して変性したタンパク質を免疫原として免疫した動物から生産される抗体が、加熱変性した血清アルブミンを特異的に認識し、非加熱の血清アルブミンに対しては交差反応性を示さないことを見出し、試料中の加熱処理された動物性組織由来原料の存在を検出する手法（イムノクロマト法含む）を提供している。
（特許文献１、特許文献２参照）
【０００６】
また、未変性および／または変性物質からなる食物アレルゲンの混合物（蛋白質）を動物に免疫して得られるＩｇＥ（イムノグロブリンＥ）抗体、及び当該抗体を用いる食物アレルゲン並びに食物アレルギー誘発性食品の検出方法（イムノクロマト法含む）が公知である。（特許文献３参照）
【０００７】
更に、寄託された特定細胞（加熱した豚肉中の特定タンパクを動物に免疫し得られる細胞）から生産されるモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ（免疫学的測定の１種）法で用い加熱食品中の豚肉を検出できることが公知である。（特許文献４参照）
【０００８】
しかしながら、この検出法は、特定細胞（加熱した豚肉中の特定タンパクを動物に免疫し得られる細胞）から生産されるモノクローナル抗体を用いているため、正確に検出可能であるが、モノクローナル抗体の調製には高額な費用がかかり、医療分野において多くの患者さんに普及を図る場合には適切でない。
本発明者等は、上記モノクローナル抗体を用いる代わりにポリクローナル抗体を用いて同様の実験をイムノクロマトグラフ法で行なったところ、加熱食品中の豚肉以外の牛肉などに交差反応性が見られ、精度の点で満足な結果が得られなかった。
このように、試料中の検出対象物である加熱食品中の豚肉をポリクローナル抗体を用いてイムノクロマトグラフ法により検出する際、非特異的反応が起こることを観察しており、非特異的反応を十分に抑制できないという課題が依然としてあった。
【０００９】
また、食品中のアレルゲン物質（タンパク質）を免疫学的測定で検出する際に用いる検体希釈液として、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤や塩化ナトリウムのような無機塩を含有させることが公知である。（特許文献５参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、免疫測定法により加熱加工食品中の豚肉を、非特異的反応を惹起すること無く高性能、かつ高感度に検出を行なうための最適な検体由来成分の調製と、それを用いて得られたポリクローナル抗体を用いる簡便かつ高精度な検出法ならびにそのための検査キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出に係る。本発明に用いられる展開液組成や試験キットに用いられる化学物質（生体物質以外）の組成は、従来イムノクロマト法で多用される試薬である。例えば展開液においては、精製水あるいは緩衝液に非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ−１００など）と塩化ナトリウム、場合によってはカゼイン（脱脂粉乳）などを加えたものである。
【００１２】
本発明者等は、加熱食品検出系において使用する抗体を調製するための免疫用抗原としては、意外にも豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質が最も適切であることを知見したものである。
このため、本発明の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出で使用される検出抗体（生体物質）は、加熱食品検出系に特に適したものであり、非加熱食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出系と異なるのみならず、従来公知の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の免疫学的検出で使用される検出抗体（生体物質）とも異なっている。その検出抗体を特定したうえで、イムノクロマト法による加熱加工食品中の豚肉の有無を検査（検知）する方法および検査（検知）キットの発明を、本発明者等が初めて完成した。
本発明の加熱食品検出系では、例えば１００℃以上で加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体として好適に用いるものである。
【００１３】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｈ）の検出法およびそれに使用する抗体ならびに検出用装置および検出用キットを提供するものである。
（ａ）本発明の第１の特徴は、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出法にある。
（ｂ）本発明の第２の特徴は、検出法がイムノクロマトグラフィー検出法である前記（ａ）に記載の検出法にある。
【００１４】
（ｃ）本発明の第３の特徴は、免疫用抗原が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質である前記（ａ）または（ｂ）に記載の検出法にある。
（ｄ）本発明の第４の特徴は、抗体が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を動物に免疫して得られるポリクローナル抗体にある。
【００１５】
（ｅ）本発明の第５の特徴は、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出用装置、にある。
（ｆ）本発明の第６の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されているイムノクロマトグラフィー装置である前記（ｅ）に記載の検出用装置にある。
にある。
（ｇ）本発明の第７の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出用キットにある。
【００１６】
（ｈ）本発明の第８の特徴は、免疫用抗原が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質である前記（ｇ）に記載の検出用キットにある。
（ｉ）本発明の第９の特徴は、抗体が豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を動物に免疫して得られるポリクローナル抗体である前記（ｇ）に記載の検出用キットにある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出においては、豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質をウサギ又はヤギ（これに限らず、これ以外の動物、即ち、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット等でも良い。）に免疫して得られるポリクローナル抗体を検出抗体（生体物質）として使用するため、モノクローナル抗体を用いる場合に比して、安価であり、多くの需要者に、例えば、医療分野において多くの患者さんに普及を図る場合には有効である。
また、本発明では、ポリクローナル抗体であっても、豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を免疫抗原に用いて動物に免疫して得られるポリクローナル抗体を検出抗体（生体物質）として使用しているため、大豆といった植物由来蛋白質のみならず、牛、鶏、羊といった豚以外の動物由来蛋白質に対する交差反応が完無であり、感度の低下がなく、正確かつ容易に加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出の結果の判定が可能である。
本発明の加熱処理された豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出法は、加熱加工食品のみならず、蛋白質の変性を引き起こすような温度条件での加工処理（加熱、加熱加圧、乾燥等）を施した健康食品、医薬品、家畜飼料、ペットフードなどに含有される豚肉由来蛋白質の検出においても、簡便かつ安価に活用することが可能である。そのため、本発明は、豚肉に対してアレルギー反応を引き起こす患者さんや、嗜好上または食文化上、豚肉を食さない一般消費者の方々に対して、その問題の解決に貢献できる。
本発明のイムノクロマトグラフィー検出法は、ＰＣＲ法やＥＬＩＳＡ法に比べて、簡便な装置で迅速かつ安価に、加熱加工された食品中の豚肉由来蛋白質の検出が可能であるため、一般消費者のニーズに貢献できるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のイムノクロマトグラフィー検出用キットの使用概略図
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明の加熱食品検出系においては、例えば１００℃以上で加熱処理した豚肉中に含まれる２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を検出抗体として好適に用いるというものである。
本発明の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出法においては、豚生肉からの抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を免疫用抗原として使用し、これを動物（ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット等々。）に免疫して得られるポリクローナル抗体を検出抗体（生体物質）として使用するというものである。
【００２０】
この「５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近」という意味は、当業者に於いて特に技術的に問題にするような表示ではないが、特に、定量的に表示すれば、天然物であるという不規則な事情を考慮して、生豚肉から抽出された蛋白質のイオン交換カラム精製フラクションをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、クマシー染色で蛋白質を染色して解析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析）したところ、豚生肉に特徴的でかつメジャーな蛋白質として一応経験上可能な表示範囲として、専ら４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の程度の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量、即ち、「５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近」の蛋白質が、フラクション１〜フラクション５に集中して大部分を占める範囲として存在し、この蛋白質は、一量体としてだけでなく、それ以外に二量体、三量体などの多量体になっているものを含むことが有り得ることも一応想定できるが、いずれにせよ、この分子量解析に於いて、「５０ｋＤ付近」の分子量の蛋白質が、豚肉に特徴的でかつ免疫用抗原として適切なメジャーな蛋白質であることを知見した。
【００２１】
本発明においては、生豚肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質が、免疫用抗原として好適に用いられる。その免疫用抗原は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分析方法で５０ｋＤ付近を示すタンパク質画分のみからであっても良いし、あるいは、５０ｋＤ付近を示すタンパク質画分を主体として含むタンパク質群であっても良い。
【００２２】
また、本発明では、豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を免疫抗原に用いて動物に免疫して得られるポリクローナル抗体を検出抗体（生体物質）として使用しているため、大豆といった植物由来蛋白質のみならず、牛、鶏、羊といった豚以外の動物由来蛋白質に対する交差反応が完無であり、感度の低下がなく、正確に、かつ容易に加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出の結果の判定において優れた性能を発現する。
【００２３】
さらに、本発明は、加工豚肉を比較的容易に、しかも正確に認識する手法を検討した結果、加工豚肉に含まれる蛋白質に注目して、その認識できる蛋白質の特性と認識する抗体の関係を追及した。その結果、加工豚肉に含まれる蛋白質として、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ解析（以下、「ＷＢ解析」と略す。）によりその分子量を確認したところ、一応経験上可能な表示範囲として、２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の加工豚肉に含まれる蛋白質を特異的に認識するものであることを知見したものである。
【００２４】
加工肉類を構成するタンパク質の分子量としては、全ての肉類が天然の蛋白質であるという性格からすれば、低分子量のものから超高分子量のものが混在していることは容易に予測されることである。豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質を免疫抗原に用いて動物に免疫して得られるポリクローナル抗体を使用して、各種の加工肉類から抽出した蛋白質を電気泳動後、ＷＢ解析により、０ｋＤ（分子量０）〜２５０ｋＤ（分子量２５０，０００）程度の範囲に含まれる各種分子量について解析したところ、一応経験上可能な表示範囲として、専ら２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の程度の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量、即ち、「２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近」のブタ蛋白質を強く認識するものであり、豚蛋白質以外の牛、羊、鶏の蛋白質は認識しないものであった。豚トロポニンＩを認識するモノクローナル抗体を使用して、同様に各種の加工肉類から抽出した蛋白質を電気泳動後、ＷＢ解析したところ、本願発明と同様な結果が得られた。
【００２５】
本発明において２３ｋＤ付近のブタ蛋白質という認識をしたとしても、この２３ｋＤ付近とは、加工豚肉を検出対象とする蛋白質の分子量としては、慣用の測定法に従って蛋白質の分子量を特定したものであって、２３ｋＤという特定値は、検出の為の蛋白質の取り扱い上において何等格別支障となることなく非常に有効に機能する特定値である。そして、２３ｋＤ付近の蛋白質と特定しただけで、加工豚肉の検出上においては技術的に当業者が十分に有効に測定および認識できる分子量に従った表示法である。強いて、その「２３ｋＤ付近」という意味を定量的に表示すれば、加工肉という天然物であるという分子量、構造などにおいて不規則な事情を考慮して、一応数値上可能な表示範囲として２０ｋＤ〜２６ｋＤの程度の範囲に属する分子量の蛋白質が集中して大部分を占める範囲であると表現すれば、より明確な定量的な表示であるということもできる。いずれにせよ、その範囲は、ＷＢ解析により、２３ｋＤ付近の分子量の蛋白質と特定するだけで本発明の検出法を正確に実施することができる。なお、加工豚肉の２３ｋＤ付近の蛋白質を本発明者等が作製したポリクロ−ナル抗体が特異的に認識するということを発見して、その原理に従って、容易に、迅速かつ安価に検出する手法を達成したということは、本発明者等の知見に基づくものである。
【００２６】
本発明に用いる展開液組成や試験キットに用いられる化学物質（生体物質以外）の組成は、従来イムノクロマト法で多用される試薬である。このようなイムノクロマトグラフィー用試薬には、緩衝剤、非イオン性界面活性剤、場合によってはキレート剤といった各種の化学物質が種々の機能／役割の下に用いることができる。
【００２７】
本発明の抽出展開液などのイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中に使用される緩衝剤としては、試料の添加や試料の蒸発や希釈による濃度の変化、外部からの多少の異物の混入によっても致命的な影響を生じない作用（緩衝作用）を持つものであれば特に制限はない。
本発明において、緩衝剤としては、酢酸緩衝液（酢酸＋酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液（リン酸＋リン酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム）、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン＋塩酸）、ＴＥ緩衝液（トリス＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＡＥ緩衝液（トリス＋酢酸＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス＋ホウ酸＋エチレンジアミン四酢酸）又はＨＥＰＥＳ緩衝液（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸）等が挙げられる。好ましくは、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液ＨＥＰＥＳ緩衝液である。
【００２８】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中に使用される緩衝剤の濃度としては、０．０１〜２５０ｍＭの範囲であり、１０〜２００ｍＭの範囲が好ましく、３０〜１８０ｍＭの範囲がより好ましい。濃度が０．０１ｍＭより低くなると緩衝作用が不十分になる。２５０ｍＭ以上では、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
【００２９】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中に使用できる非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル等を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上を混合しても用いることが出来る。
【００３０】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中に使用する非イオン性界面活性剤の含有量としては、０．０１〜１０重量％の範囲であり、好ましくは０．０５〜５重量％の範囲でイムノクロマトグラフィー用試薬組成物に含有させることができる。０．０５重量％未満では、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行なえない。１０重量％以上では、必要以上の濃度となり、非特異的反応の抑制には好ましい影響を与えることがないばかりか、経済的でなく無駄となる。
その他の非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤などを配合して使用することも可能である。
【００３１】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中に必要に応じて使用されるキレート剤としては、複数の配位座を持つ配位子となり得る作用をもつであれば特に制限はない。
本発明において、キレート剤としては、エチレンジアミン、ジピリジン、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ＥＤＴＡ誘導体（例えば、ＥＤＴＡ・２ＮＨ４、ＥＤＴＡ・３Ｋ、ＥＤＴＡ・特殊アミン塩等）、ＥＤＴＡ金属塩（例えば、ＥＤＴＡ・Ｃａ・２Ｎａ等）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）系、ジヒドロキシエチルエチレンジアミン二酢酸（ＤＨＥＤＤＡ）系、１，３−プロパンジアミン四酢酸（１，３ＰＤＴＡ）系、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）系、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）系、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）系、グルコン酸系、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）系、Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）系、アミノトリメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）系、ヒドロキシエタンホスホン酸（ＨＥＤＰ）系、３−ヒドロキシ−２，２’−イミノジコハク酸４ナトリウム、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等が挙げられる。
【００３２】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中に必要に応じて使用されるキレート剤の濃度としては、０．０１〜１０ｍＭの範囲であり、０．１〜５ｍＭの範囲が好ましく、０．５〜２ｍＭの範囲がより好ましい。０．０１ｍＭ未満では、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行なえない。１０ｍＭ以上では、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
【００３３】
また、本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物には、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異的反応を抑制することが公知の添加剤、例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するための蛋白質（例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸等）防腐剤あるいは抗菌剤等々の１種もしくは２種以上を添加して使用することも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。また、これらの抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するための蛋白質、高分子化合物、イオン性界面活性剤又はポリアニオン、防腐剤あるいは抗菌剤等々の１種もしくは２種以上を、固定相を構成するクロマトグラフィー媒体上の、移動相の移動経路上に保持させておくことも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
【００３４】
本発明に使用するイムノクロマトグラフィー用試薬組成物の使用態様としては、イムノクロマトグラフィー装置におけるサンプルパッド（試料添加部分）中へ塗布又は含浸させた後、乾燥させる方法により、サンプルパッド中へ保持させる態様とすることができる。本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物をイムノクロマトグラフィー媒体上に保持させる他の態様としては、試料添加部位の端部と吸収部位との間の任意の場所に、添加剤保持部を設けて、そこに保持させる態様とすることができる。例えば、試料添加部分の近辺、標識物質保持部位やその近辺とすることもできる。なかでも試料添加部分および／または標識物質保持部のみに保持させる態様が好ましい。
【００３５】
本発明に使用するイムノクロマトグラフィー用試薬組成物の使用方法としては、上記の使用方法に限定されるものではなく、抽出展開液として用いることもできるし、試料の希釈液としても使用することができる。例えば、本発明の抽出展開液においては、精製水あるいは緩衝液に非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ−１００など）と塩化ナトリウム、場合によってはカゼイン（脱脂粉乳）などを加えたものを使用している。
抽出展開液としては、通常、溶媒として水を用い、これに緩衝液、および非イオン界面活性剤、さらに蛋白質や高分子化合物、必要に応じて更にキレート剤など、を加える。加える順序は特に特定されず、同時に加えても差支えない。抽出展開液として用いる場合には、検出する試料が固体状であるか、ペースト状であるかといった状態に応じて、適宜抽出展開液の使用態様を最適にするようにできる。検出する試料と展開液を予め混合したものを、サンプルパッド（試料添加部）上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に試料をサンプルパッド（試料添加部）上に供給・滴下して後、展開液をサンプルパッド（試料添加部）上に供給・滴下して展開させてもよい。試料希釈液として使用する場合には、試料を希釈した希釈液は、そのまま展開液としてサンプルパッド（試料添加部）上に供給・滴下することにより使用できる。
【００３６】
本発明の検出対象物を含む試料（検体）としては、例えば、主として加熱加工や殺菌処理といった蛋白質が変性を受けるような温度で処理された食品、健康食品等が、代表的なものとして挙げられるが、これに限らず、家畜飼料や医薬品といったものでも試料（検体）として適用できる。
【００３７】
本発明においては、生豚肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質が、免疫用抗原として好適に用いられる。その免疫用抗原は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分析方法で５０ｋＤ付近を示すタンパク質画分のみからであっても良いし、あるいは、５０ｋＤ付近を示すタンパク質画分を主体として含むタンパク質群であっても良い。
【００３８】
本発明の免疫用抗原の調製方法は、以下のとおりである。
［試薬］  （肉１ｋｇあたりの使用量）
・塩化ナトリウム                ・・・  ０．１４Ｍ  水溶液  ２Ｌ
・酢酸ナトリウム              ・・・      １Ｍ  水溶液  ２００ｍＬ
０．１Ｍ  水溶液  ５００ｍＬ
・硫酸アンモニウム                ・・・  ２８７２ｇ
・１Ｎ  塩酸                      ・・・  適量（目安：２５０ｍＬ）
・ポリエチレングリコール  ２００００  ・・・  ３０％  水溶液  １Ｌ
・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．７）  ・・  ０．１Ｍ  溶液  ３．２Ｌ
【００３９】
［機材等］
・ハサミ、ピンセット（肉処理用）
・ビーカー  
・フードプロセッサ
・超音波ホモジナイザー
・遠心機＆遠沈管（コクサン製遠心機）
・吸引ろ過器具（吸引びん、ブフナーロート）
・マグネチックスターラー
・ｐＨメーター
・透析膜（使用前に煮沸して、グリセロール、硫黄を除去したもの）
・ＡＫＴＡ（タンパク質精製装置）
【００４０】
［操作手順］
Ｉ．（抗原以外のタンパク除去）
（１）脂肪を取り除いた赤身肉（豚ヒレ肉）５００gを、フードプロセッサを使用してミンチにし、０．１４Ｍ塩化ナトリウム水溶液を１Ｌ加える。超音波ホモジナイザーで分散させ、スラリーを作製する。１時間室温でインキュベート後、遠心（１００００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）、上澄をキムワイプでろかする。Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．４２  ろ紙で吸引ろ過して、ろ液をＩＥＷで１９００ｍＬに希釈して、１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を１００ｍＬ加える。氷上で撹拌しながら、硫酸アンモニウム７２２ｇを加えて、氷上（４℃）で２時間撹拌する。４℃で一晩インキュベートする。
（２）沈殿物をよく撹拌し、遠心（１００００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）して上清を分取（ペレットを捨てる）後、１Ｎの塩酸を加えてｐＨ４．９に調整する。４℃で一晩インキュベートする。
（３）沈殿物をよく撹拌し、遠心（１００００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）して上清を分取（ペレットを捨てる）後、１Ｎの塩酸を加えてｐＨ３．７に調整する。４℃で一晩インキュベートする。
【００４１】
（４）遠心（１００００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）して上清を分取（ペレットを捨てる）後、氷上で撹拌しながら、硫酸アンモニウム７１４ｇをゆっくり加えて、４℃で２時間撹拌する。４℃で一晩インキュベートする。
（５）遠心（１９０００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）して上清を捨て、１２０ｍＬの滅菌精製水でペレットを懸濁させる。４℃で一晩インキュベートする。
（６）遠心（１９０００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）して上清を透析膜中に分取し、２〜３Ｌの滅菌精製水で透析する。さらに２〜３Ｌの滅菌精製水で透析する。
（７）ＰＥＧ２００００の３０％水溶液１〜２Ｌで透析し、４０ｍＬに濃縮する。０．０１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ３．７）２０００ｍＬで透析。さらに０．０１Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ３．７）２０００ｍＬで透析する。
【００４２】
ＩＩ．（抗原の精製）
上記（１）〜（７）の手順により得られた抗原の精製を以下の手順により行なう。
（８）上記（７）で得られたものを遠心（１００００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）し、上澄を陽イオン交換カラムに通して精製する。最初に行なうカラム平衡化、カラム洗浄には、０．０１Ｍ  酢酸バッッファー（ｐＨ３．７）を使用し、サンプル溶出とその直後のカラム洗浄には、０．８Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ３．７）を使用した。陽イオン交換精製分画としてｆ１〜Ｆ１０が得られた。
（９）主要なピーク部分のフラクション（ＵＶスペクトルからタンパク濃度が最も高いフラクション）を集める。これを適当な量のＰＢＳ（０．０１Ｍリン酸塩バッファー化食塩水）で透析後、ＰＥＧ２００００の３０％水溶液１０００ｍＬで透析して２ｍｇプロテイン／ｍＬに濃縮する。
（１０）ｆ１〜ｆ５までのフラクションを集めてタンパク定量（プロテインアッセイ）を行なった。このような操作により生豚肉から免疫用抗原を調製した。
【００４３】
イオン交換精製分画ｆ１〜ｆ１０を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５０Ｖ、４５〜５５ｍｉｎ）後、クマシー染色で蛋白を染色した。ｆ１〜ｆ５までのフラクションは、５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近に強くバンドが見られた。
【００４４】
イオン交換精製分画ｆ１〜ｆ１０を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５０Ｖ、４５〜５５ｍｉｎ）後、田中貴金属工業（株）作製のポリクローナル抗体を使用して反応させるＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（１５Ｖ、６０ｍｉｎ）解析を行なった。ｆ１〜ｆ５までのフラクションは、５０ｋＤ付近に強くバンドが見られた。
【００４５】
［ポリクローナル抗体の調製］
生豚肉から上記のようにして調製した免疫用抗原を用いて、常法に従ってウサギに免疫して、抗血清を得る。抗血清からのポリクローナル抗体の精製は、５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析後、ＤＥＡＥカラム（陰イオン交換カラム）を用いて精製回収する手法により得る。
【００４６】
このようにして得た田中貴金属工業（株）作製のポリクローナル抗体を使用して、１００℃加熱処理をした市販の４種の肉（豚、牛、羊、鶏）をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ解析すると、２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の豚肉由来タンパクを強く認識するバンドが検出された。豚以外の多種の肉に比べて、豚特異性が高い抗体であることが解った。また、このポリクローナル抗体は、豚生肉中に含まれる５０ｋＤ付近のタンパク質を認識することがＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ解析により確認され、その豚生肉中に含まれる５０ｋＤ付近のタンパク質が本発明の免疫原として好適であることが解った。
【００４７】
本発明におけるイムノクロマトグラフィー装置もしくは検出キットの構成について以下に説明する。
試料添加部は、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へと試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成されている。多孔質シートとしては、セルロース濾紙、ガラス濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。本発明の多孔質シートとしては、ガラス濾紙が好ましく用いられる。本発明においては、非特異的反応を抑制するために、サンプルパッド（試料添加部）中に、緩衝液、非イオン界面活性剤、および蛋白質などの添加剤、必要に応じてキレート剤、を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を予め含浸させて後、乾燥させる等の手段により保持させる態様とすることができる。
【００４８】
標識物質保持部には、標識成分によって試薬成分を標識した標識試薬を保持させてなる。標識成分としては、金コロイド粒子、銀コロイド粒子等の金属コロイド粒子、各種のモノマーを（共）重合させて合成した合成高分子を染色して得られる着色ラテックス粒子、酵素、蛍光化合物、その他を用いることができる。それらのうち、発色が強く製造が容易であり、標識が簡単に行える金コロイド粒子が好適に用いられる。金コロイド粒子の大きさとしては、１ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくは３０〜１００ｎｍの粒径のものを用いることができる。試薬成分としては、分析物を認識する能力を有する粒子又は分子であり、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントである（第二試薬）。
【００４９】
クロマトグラフィー媒体は、膜担体上に検出部（もしくは「反応部」ともいう）を作成したものである。膜担体としては、毛細管現象により試料検体を吸収し移動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択される。検出部には、ポリクローナル抗体若しくはそのフラグメント（第一試薬）が、ニトロセルロースのシート上に担持固定されている。
【００５０】
吸収部は、過剰の試料を迅速に吸収する能力を有する材料、ガラス濾紙等が用いられる。
【００５１】
バッキングシートは、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体（検出部が設けられている）、および吸収部の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシートは、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
【００５２】
検出部（もしくは「反応部」ともいう）に用いる試薬成分（第一試薬）および標識物質保持部に用いる試薬成分（第二試薬）は、その一方又は両方がポリクローナル抗体であるが、特異性を保った上で製造コストや抗体の安定供給を考慮する場合は両方がポリクローナル抗体とすることが可能である。
【００５３】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントは、公知の方法により調製することができる。抗体産生動物種としては、通常、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット等々である。
モノクローナル抗体は、常法に従って、抗原（豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質）で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する。例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照。
【００５４】
ポリクローナル抗体は、常套手法により、抗原（豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近の蛋白質）を産生動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ、ブタ、鶏等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより収得する。例えば、ベルガーらの文献（Ｊ．ＡＳＳＯＣ．ＯＦＦ．ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ．ＶＯＬ．７１，ＮＯ．２，１９８８）を参照。
【００５５】
判定の原理を概説すると、
１．試料（例えば、肉類を含む加熱加工食品の抽出展開液）を、サンプルパッド上に、所定量(通常、０．１〜２ｍｌ)滴下する。試料が滴下されると、サンプルパッド中を、試料が移動を始める。サンプルパッド中に特定のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物が含浸されたりしている場合には、イムノクロマトグラフィー用試薬組成物は試料の水分に溶解し、試料と共に移動を始める。
２．試料（例えば、肉類を含む加熱加工食品の抽出展開液）又はイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を溶解した試料は、まず標識物質保持部へと移動する。ここを試料が通過する際、標識物質保持部に保持されていた標識試薬（第二試薬）が試料の水分に溶解し、試料と共に移動する。
３．ついで、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体上の検出部を通過する。ここでは、抗原・抗体の特異的結合反応により、試料中に豚肉が含まれている場合には、検出部に保持、即ち、担持固定されている抗体と標識試薬とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する。試料中に豚肉が含まれていない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。
４．最後に、試料の水分は、吸収部へと移動する。
このように、試料中の豚肉の有無を正確に判定することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に、本発明で使用するイムノクロマトグラフィー装置を詳細に説明するが、あくまでも一例として示すものであって、本発明はこれに限定されるものではない。
１．クロマトグラフ媒体上への反応部位の作製
２５×２．５ｃｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製:ＨＦ１２０)に、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて２％のＳｔａｂｉｌｉＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社）および５％のイソプロピルアルコール、炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で０．６５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗Ｐｏｒｋポリクローナル抗体を塗布し、４０〜５０℃で６０分間乾燥させた後、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体上の反応部位を作製した。
【００５７】
２．標識物質溶液の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業（株）製：平均粒子径６０ｎｍ）０．５ｍＬにＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗Ｐｏｒｋポリクローナル抗体を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。次いで、ＣＥ５１０（ＪＳＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を０．１ｍＬ加え、リン酸カリウム溶液（ｐＨ７．５）に溶解した１％ポリエチレングリコールを０．０５ｍＬ加えて十分撹拌した後、室温で１０分間静置した。８０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。上清を除去した後、１重量％の牛血清アルブミンを含む緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍＬを加え、標識物質溶液とした。
【００５８】
３．クロマトグラフ媒体の作製
上記作製した標識物質溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、検出試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製した反応部位が作製されたクロマトグラフ媒体、検出試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料や不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後にラミネートシールを貼り付けて裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体とした。
【００５９】
４．抽出展開液の調製
ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ８．０)にｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを０．２％、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１５％、塩化ナトリウムを０．０５Ｍとなるように加えさらに防腐剤としてアジ化ナトリウムを０．１％となるように加えて混和した。
【００６０】
５．試料の作製
上記した抽出展開液０．５ｍＬに対して、加工豚肉あるいは豚以外の動物種由来の加工肉０．１〜０．２ｇを加えて手で３０秒間振とうする。
【００６１】
６．測定
上記作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中の豚肉の存在の有無を測定した。上記作製した豚肉が含まれる試料を陽性検体、また上記作製した豚以外の動物種由来の肉が含まれる試料を陰性検体とし、クロマトグラフ媒体の先端を各試料溶液に浸した。金コロイドがグラスファイバー製パッドから流出するのを確認した後、浸していたクロマト媒体を溶液から取り出して水平な台の上に置き、１０〜１５分後に目視判定する。
【００６２】
上記のように作製したクロマトグラフ装置（検査キット）を用いて、試験食品中の豚肉の有無の検査法を図１に示す。検査は、以下の手順１〜５により行なう。
１．試験食品０．１〜０．２ｇ程度を上記した抽出展開液０．５ｍＬ入りチューブに添加する。
２．チューブの蓋をしっかり閉め、手でチューブを約３０秒程度振とうする。
３．蓋を開け、検査キットの試料添加部先端を溶液中に浸し、赤色溶液が検査キット上に
展開されることを確認する。
４．赤色溶液の上昇を確認後、検査キットを取り出し、水平な場所に置く。
５．１０〜１５分後にラインの有無を確認する。
【００６３】
以下に、本発明の試験例を説明するが、これらの試験例に限定されるものではない。
試料滴下後１０分で目視判定を行い、判定部位におけるテストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、強く（濃い色で）よりはっきりと確認できるものを「＋＋」、極めて強く確認されるものを「＋＋＋」、赤い線を確認できないものを「−」、弱く（薄い色で）確認されるものを（±）とした。
【００６４】
［試験例１］
試験加工食品として牛肉中に含まれている豚肉の割合（豚肉／牛肉）が、０重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、５重量％の各場合について、評価した結果を表１に示す。
【００６５】
製造Ｌｏｔ  Ｎｏ．１〜３においては、豚生肉から得られた抽出物（タンパク質）を、ウサギに免疫して得られるポリクローナル抗体を検出試薬として用いて評価を行なったものである。
その結果は、非特異反応（偽陽性）を伴わず、牛肉中に含まれる０．１重量％以上の豚肉を検出できた。この試験例において、製造ロット間差及び繰り返し試験にばらつきは生じなかった。
【００６６】
比較例は、豚生肉を過熱処理して得られた抽出物（タンパク質）を、ウサギに免疫して得られるポリクローナル抗体を検出試薬として用いて、試験例と同様な検出を行なったものである。
その結果は、非特異反応（偽陽性）が生じた。牛肉も検出してしまい、豚肉特異性が低いものであった。
【００６７】
【表１】
2011169755.tif 000002
【００６８】
［試験例２］
試験加工食品として鶏肉中に含まれている豚肉の割合（豚肉／鶏肉）が、０重量％、０．２５重量％、０．５重量％、１重量％、５重量％の各場合について、評価した結果を表２に示す。
【００６９】
製造Ｌｏｔ  Ｎｏ．１〜３においては、豚生肉から得られた抽出物（タンパク質）を、ウサギに免疫して得られるポリクローナル抗体を検出試薬として用いて評価を行なったものである。
その結果は、非特異反応（偽陽性）を伴わず、鶏肉中に含まれる０．２５重量％以上の豚肉を検出できた。この試験例において、製造ロット間差及び繰り返し試験にばらつきは生じなかった。
【００７０】
【表２】
2011169755.tif 000003
【００７１】
［試験例３］
本発明の検出キットを用いて、豚肉、牛肉、鶏肉、ラム肉、大豆の各加熱単一食品（１００％）からの抽出液を検出試料としたものについて、その評価を測定した。結果を表３に示す。
その結果は、牛肉、鶏肉、ラム肉、大豆から抽出されるタンパク質は検出されず、豚肉由来タンパク質のみが検出された。この結果から、豚肉の特異性が明らかとなった。この試験例においても、製造ロット間差及び繰り返し試験にばらつきは生じなかった。
【００７２】
【表３】
2011169755.tif 000004
【００７３】
［試験例４］
＜本発明の検出キット（イムノクロマト法）とＰＣＲ法の比較＞
本発明の検出キットを用いて、市販されている加熱食品類からの抽出液を検出試料としたものについて、該加熱食品類中に含まれている材料表示（豚肉、牛肉または鶏肉）に対する判定評価を行なった。また、本発明の検出キットに代えて遺伝子学的手法として知られているＰＣＲ法でも同様に該加熱食品類からの抽出液を検出試料として用いて判定評価を行なった。その結果を表４に示す。
その結果は、イムノクロマト法による本発明の検出キットの結果とＰＣＲ法による検出結果は略同じ結果が得られた。どちらの方法においても、ラベルに豚と表示された食品を検出した。牛肉、鶏肉から抽出されるタンパク質は検出されず、豚肉由来タンパク質のみが検出された。この結果から、豚肉の特異性が明らかとなった。この結果からみて、イムノクロマト法による本発明の検出キットの結果は、特異性が高く高性能とされるＰＣＲ法に劣らない精度で、加熱食品類中に含まれている豚肉を特異的に検出できるものである。
【００７４】
【表４】
2011169755.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の検出キットは、イムノクロマトグラフィー法に基づくものであるため、本発明の抗原、抗体を不溶性担体に固定して使用すれば、免疫学的測定法を適用する分野において広く使用できる。簡便かつ迅速に、特異的に過熱加工食品中の豚肉の有無を検出できるので、豚肉に対してアレルギー反応を引き起こす患者さんや、嗜好上または食文化上、豚肉を食さない一般消費者の方々に対して、それらの問題の解決に貢献できる。
本発明のイムノクロマトグラフィー検出法は、ＰＣＲ法やＥＬＩＳＡ法に比べて、簡便、迅速かつ安価に実施できるため、産業上の利用可能性が大である。
【符号の説明】
【００７６】
１  試験食品
２  抽出展開液
３  チューブ
４  蓋
５  検出チップ
【先行技術文献】
【特許文献】
【００７７】
【特許文献１】特開２００６−３１７２２６
【特許文献２】特開２００５−１６４５８３
【特許文献３】特開２００３−１５５２９７
【特許文献４】米国特許第６２８８２１５
【特許文献５】特開２００９−０８５９１１
【図１】
2011169755.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月12日(2010.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出法。
【請求項２】
豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体。
【請求項３】
加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用装置。
【請求項４】
試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されている請求項３に記載のイムノクロマトグラフィー検出用装置。
【請求項５】
試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｅ）の検出法およびそれに使用する抗体ならびに検出用装置および検出用キットを提供するものである。
（ａ）本発明の第１の特徴は、豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出法にある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（ｂ）本発明の第２の特徴は、豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体にある。

【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（ｃ）本発明の第３の特徴は、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用装置にある。
（ｄ）本発明の第４の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されている前記（ｃ）に記載のイムノクロマトグラフィー検出用装置にある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（ｅ）本発明の第５の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識する抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、豚生肉中に含まれる４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属する５０ｋＤ（分子量５０，０００）を主として含む分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）を主として含む分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用キットにある。
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月1日(2010.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のクマシー染色による解析で４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属するフラクションに含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出法。
【請求項２】
豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のクマシー染色による解析で４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属するフラクションに含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のポリクローナル抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、請求項２に記載のポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用装置。
【請求項４】
試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されている請求項３に記載のイムノクロマトグラフィー検出用装置。
【請求項５】
試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ請求項２に記載のポリクローナル抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、請求項２に記載のポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｅ）の検出法およびそれに使用する抗体ならびに検出用装置および検出用キットを提供するものである。
（ａ）本発明の第１の特徴は、豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のクマシー染色による解析で４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属するフラクションに含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出法にある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（ｂ）本発明の第２の特徴は、豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のクマシー染色による解析で４０ｋＤ（分子量４０，０００）〜６０ｋＤ（分子量６０，０００）の範囲に属するフラクションに含まれる５０ｋＤ（分子量５０，０００）付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる２０ｋＤ（分子量２０，０００）〜２６ｋＤ（分子量２６，０００）の範囲に属する２３ｋＤ（分子量２３，０００）付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体にある。

【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（ｃ）本発明の第３の特徴は、請求項２に記載のポリクローナル抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、請求項２に記載のポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用装置にある。
（ｄ）本発明の第４の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されている前記（ｃ）に記載のイムノクロマトグラフィー検出用装置にある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（ｅ）本発明の第５の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ請求項２に記載のポリクローナル抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、請求項２に記載のポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用キットにある。