(57)【要約】【課題】基板上に遺伝子断片や抗体を固定する場合に、非特異吸着を抑制し、固定率を上げた、反応基板及びそれを備えた分析装置を提供する。【解決手段】遺伝子断片の塩基配列を、酵素を用いた塩基伸長反応を用いて解析する分析装置に用いる反応基板であり、遺伝子断片が固定される磁性体の支持基体１０２と、非磁性体の基台１０１とを備え、非磁性体の基台１０１上に磁性体の支持基体１０２を配置する。この構成により、非特異吸着を抑制でき遺伝子断片の固定率を上げることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子断片の塩基配列を、酵素を用いた塩基伸長反応を用いて解析する分析装置に用いる反応基板であって、
遺伝子断片が固定される第１の磁性体と、非磁性体とを備え、
非磁性体上に複数の第１の磁性体が配置されていることを特徴とする反応基板。
【請求項２】
遺伝子断片の塩基配列を、酵素を用いた塩基伸長反応を用いて解析する分析装置に用いる反応基板であって、
遺伝子断片と特異的に反応する別の遺伝子断片が固定される第１の磁性体と、非磁性体とを備え、
非磁性体上に複数の第１の磁性体が配置されていることを特徴とする反応基板。
【請求項３】
試料中の特定成分を分析する分析装置に用いる反応基板であって、
特定成分または特定成分と特異的に反応する成分が固定される第１の磁性体と、非磁性体とを備え、非磁性体上に複数の第１の磁性体が配置されていることを特徴とする反応基板。
【請求項４】
第１の磁性体の長手方向の長さが１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応基板。
【請求項５】
遺伝子断片が第２の磁性体によって担持されていることを特徴とする請求項１に記載の反応基板。
【請求項６】
特定成分が第２の磁性体によって担持されていることを特徴とする請求項３に記載の反応基板。
【請求項７】
第１の磁性体が非磁性体上に規則的に配列していることを特徴とする請求項１または３に記載の反応基板。
【請求項８】
第１の磁性体が格子状に非磁性体上に配列していることを特徴とする請求項７に記載の反応基板。
【請求項９】
特定成分が遺伝子断片から成るプローブであることを特徴とする請求項３に記載の反応基板。
【請求項１０】
特定成分がプローブに相補性を持ち特異的に結合する遺伝子断片であることを特徴とする請求項３に記載の反応基板。
【請求項１１】
各第１の磁性体には、プローブを単分子状態で固定した第２の磁性体が固定されていることを特徴とする請求項３に記載の反応基板。
【請求項１２】
第２の磁性体は、微粒子であることを特徴とする請求項５または６に記載の反応基板。
【請求項１３】
光透過性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応基板。
【請求項１４】
遺伝子断片がデオキシリボ核酸またはリボ核酸であることを特徴とする請求項１に記載の反応基板。
【請求項１５】
遺伝子断片と特異的に反応する別の遺伝子断片が、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の誘導体、またはデオキシリボ核酸またはリボ核酸の擬似化合物、であることを特徴とする請求項２に記載の反応基板。
【請求項１６】
石英及びガラスなど紫外光又は可視光を通す素材であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応基板。
【請求項１７】
光学測定により試料中の遺伝子断片を、酵素を用いて塩基伸長反応させ、これを蛍光観察することにより塩基配列を解析する分析装置において、
特定成分が固定される第１の磁性体が複数配列した非磁性体を備えた反応基板と、励起光を照射するレーザ光源と、蛍光を検出する検出部を備えた分析装置。
【請求項１８】
エバネッセント波を用いて蛍光検出を行うことを特徴とする請求項１７に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応基板および分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子分析、即ちＤＮＡやＲＮＡを分析することにより、固体識別や疾患を予測するため近年ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を解析する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離パターンを計測して解析する。
【０００４】
近年、非特許文献１にあるように、基板にＤＮＡ若しくは酵素などを固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子若しくは数分子ずつ固定化し、伸長反応を行い、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。金属若しくは石英などの板を基板、特定成分を固定する場を支持基体、支持基体を有する基板を反応基板と称する。
【０００５】
１分子若しくは数分子の伸長反応を観察する場合、分析速度・精度の向上などのために、多数の反応を観察する必要がある。これらの反応はランダムな場所にて行われても観察可能であるが、反応場の間隔を制御することにより、観察や解析が容易になる。そのため、デバイスにはナノパタンを有し、そこに単分子ＤＮＡ或いは酵素（プローブ）を固定することが行われている。観察方法として光を基板の支持基体及び対象分子側より当てる落射型は、装置構成が簡易で基板の素材の選択肢が広く経済的に優れるが、基板表面の光路上に存在する物質も検知されるためノイズが大きくなる。基板に石英など光透過性が良い素材を用い、基板の支持基体及び対象分子の反対側より一定の角度で光を当てると、エバネッセント光と呼ばれる基板表面の例えば１００ｎｍ程度の限定された範囲内にのみ及ぶ光が発生し、その範囲内にある物質のみを検知することができ、選択性が高く単分子観察にはより適していると考えられる。
【０００６】
デバイス上の化学修飾基と生体分子を直接反応させ、生体分子固定する方法では、デバイス表面の加工に高い純度が必要である。すなわち、表面加工の領域の大きさや均一性により固定される生体分子数が影響され、パターン以外への化学修飾基の汚染は非特異吸着の原因となる。また、生体分子は比較的高濃度にしないと固定率が上がらず、固定率を上げるために高濃度にするとデバイスの基板上への非特異的吸着も増えるのが一般的である。本発明は予め微小磁性体に生体分子を結合させ、その微小磁性体をデバイス上の磁性体よりなるナノパタンに固定することにより、生体分子の固定率を上げると共にデバイス上への非特異吸着を抑制するものである。生体分子を支持基体に化学固定を行う場合には、支持基体及びデバイス素材のそれぞれの化学的均一性、即ち石英基板上に酸化チタン（ＴｉＯ2）の支持基体を作成した場合には、石英基板上はＳｉＯ2分子のみが配列し、支持基体はＴｉＯ2分子のみが配列していることが望ましい。しかし現実には製造過程における他元素の蒸着膜への混入やレジストなど被覆剤の残渣、及び製造後の表面処理や空気中の浮遊物質の吸着など他分子が存在し、非特異吸着の原因になる。また、これらの物質が支持基体と生体分子の結合を妨害することもある。
【０００７】
特許文献２において磁性を以って標的物質を規則的に固定化することが提案されている。しかし、該特許に於いては磁気ピンを以って固定するために、固定化密度を上げることが難しく、固定される磁性体も０.５〜５μｍと大きくなる。固定化密度を上げることは、ハイスループット解析に重要である。また担持される標的分子，遺伝子やタンパク質の大きさは数ｎｍから数十ｎｍであり、それを担持する磁性体や固定場が大きくなることは、単分子固定が著しく困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００７−５０１３９１号公報
【特許文献２】特表２００３−５２３１８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
基板上に遺伝子断片や抗体を固定する場合に、非特異吸着を抑制し、固定率を上げた、反応基板及びそれを備えた分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の反応基板は、非磁性体上に、解析したい遺伝子断片が固定される第１の磁性体を配列させて構成する。ここで、第１の磁性体へ固定するものは、解析したい遺伝子断片特異的に反応する別の遺伝子断片でもよい。さらに、第１の磁性体に固定するものは、遺伝子断片に限定されず、抗体などでもよい。
【発明の効果】
【００１１】
非磁性体の上に、第１の磁性体を配列させることにより、固定したい特定成分（例えば、遺伝子断片）を磁性体に付けた状態で用意することにより、非磁性体部分に特定成分が付くという非特異吸着を抑制でき、第１の磁性体の特性成分の固定率を上げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施例における分析デバイスの一部を示す概略図。
【図２】生体分子を固定化の一例を説明するための図。
【図３】反応デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図４】反応デバイスを使用形態の一例を説明するため概略図。
【図５】反応デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための概略図。
【図６】図４における一つの反応領域４０２を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔反応基板の構成〕
反応基板は非磁性体の平滑な基板１０１上に磁性の支持基体１０２をグリッド状など一定間隔で規則的に配列したものである。図１は基板１０１の一部を拡大したもので、同一基板上に複数の支持基体１０２を有する。核酸などのプローブを有するナノ磁気ビーズなどの磁性微粒子１０３が支持基体１０２上に固定される。本明細書では、磁性微粒子が固定される前のものを反応基板と呼び、固定された後のものを反応デバイスと呼ぶ。反応デバイスの観察には落射型や透過型などの光学検出も用いることができるが、エバネッセント波を用いるときは励起光を基板１０１の下方より照射する。また基板は例えば石英のみよりなる板のみではなく、石英を周囲に樹脂など補助材料を用いて取り扱いやすくしたものも含む。
【００１４】
〔プローブの微粒子への固定方法及び発色方法〕
プローブの固定方法及び発色方法の例について図２を用いて説明する。
【００１５】
基板１０１上に微小の支持基体１０２が配列されている。ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸断片などプローブを単分子状態で固定した磁性微粒子１０３を用いて基板１０１を処理し、磁性微粒子１０３と支持基体１０２を磁性によって固定する。例えば支持基体１０２と磁性微粒子１０３の大きさを同じにすることにより磁性微粒子１０３が１対１で固定され、結果的に一つの支持基体１０２上に単分子のプローブが固定される。
【００１６】
プローブが核酸の場合、相補鎖若しくは相補鎖を利用して特異的に取り込まれる分子に標識を行い、プローブ上に標識化遺伝子断片２０４を存在させる。例えば蛍光検出を行うため、その標識が蛍光色素であれば、上図の状態で検出できる。更に高感度に検出するためには、例えば下図のようにその標識をビオチンとし、アビジン２０５を特異的に結合させ、更に蛍光標識抗体２０６を結合させることにより高感度に検出することも可能である。
【００１７】
〔反応デバイスの製造方法〕
（１）磁性薄膜の形成
プローブを固定した反応デバイスの製造方法を、図３を用いて説明する。
【００１８】
平滑な基板１０１上に磁性薄膜３０５を形成する。基板１０１には、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板等が用いられる。基板１０１における磁性薄膜３０５を形成した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、基板１０１として光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。
【００１９】
磁性薄膜３０５は、上記裏面より励起光を照射する場合にはその厚さは薄いほど好ましく、より好ましくは５〜１００ｎｍである。磁性薄膜３０５はエピタキシャル成長，スパッタリング，化学気相成長（化学蒸着、Chemical Vapor Deposition、ＣＶＤ），物理気相成長（物理蒸着、Physical Vapor Deposition、ＰＶＤ）などを用いて作られる。
【００２０】
（２）レジスト塗布，（３）パターニング（描画・現像）
レジスト３０６をスピンナーで磁性薄膜３０５上に塗布する。レジスト３０６としては、電子線用のネガ型ポジストを用いることができる。具体的には、ＴＥＢＮ−１（株式会社トクヤマ社製）が挙げられる。レジスト３０６を磁性薄膜３０５上に塗布した後、ホットプレートで２〜５分程度プリベイクする。加速電圧５０〜１００ＫＶの電子線で幅４０ｎｍ，長さ８０ｎｍの方形を描画した後、乳酸エチル，イソプロパノール、またはエタノールで現像する。
【００２１】
（４）エッチング，（５）レジスト除去
パターニングされたレジスト３０６をマスクとして、エッチング処理などで支持基体１０２を形成する。パターン精度を高めるために、微細加工が可能な反応性イオンエッチング（Reactive Ion Etching、ＲＩＥ）などを用いることが望ましい。エッチングの後、レジスト３０６を除去する。レジスト３０６の除去には、広く一般的に用いられるオゾンアッシングのプロセスを用いることができる。
【００２２】
（６）プローブ固定
希薄なプローブ溶液を過剰な磁性微粒子と反応させることにより、プローブを高い確率で一つの磁性微粒子上に１分子のみ固定することができる。プローブに特異的に相互作用するアフィニティや、プローブが十分大きなときは大きさを利用してプローブを持たない磁性微粒子を除去することができ、一つの磁性微粒子上に１分子のプローブを有する磁性微粒子１０３を得ることができる。またプローブに蛍光標識をつけることにより、フローサイトメトリーにより１分子のプローブを持つ磁性微粒子を精製することもできる。このようにして調製したプローブを有する磁性微粒子１０３を分散溶液として反応基板上に展開し、支持基体１０２と磁性を以って結合させる。
【００２３】
例えば短径約６０ｎｍ，長径約８０ｎｍの磁性微粒子を用いた場合、支持基体１０２のサイズとほぼ同じため、１つの支持基体１０２に１つの磁性微粒子が固定される確率が高い。一つの磁性微粒子には１分子のプローブが結合しているので、プローブが支持基体１０２上に単分子固定される。
【００２４】
磁性の支持基体を基板上に作成する別の方法について以下に記述する。デバイス上にＥＢレジスト（日本ゼオン製，ＺＥＰ−５２０）を塗布し、１６０℃，２０minのベーキングをした後、加速電圧５０ｋＶ，ビーム電流２０ｐＡで電子線描画を行った。レジスト厚は約３２０ｎｍである。描画パターンは、幅４０ｎｍ，長さ８０ｎｍの正方形の規則配列とし、電子ビーム描画装置（日本電子製，ＪＢＸ−５０００ＬＳ）を用いてＥＢ露光を行い、描画パターンを形成した。次に、ＥＢレジストで形成した描画パターンをマスクとし、ＣＦ4ガスを用いて４００ＷのＲＦプラズマ源によるドライエッチングを行い、深さ１５０ｎｍ程度のピットを形成した。
【００２５】
ＥＢレジストを剥離したデバイス上に、Ｎｉ80Ｆｅ20を埋め込み磁性材料として電子ビーム蒸着法により堆積した。Ｎｉ80Ｆｅ20の膜厚は、ピットの深さより約３０ｎｍ厚くした。
【００２６】
次に、化学機械研磨（Chemical mechanical polishing、ＣＭＰ）法により試料表面を研磨し、ピットの外側に堆積されたＮｉ80Ｆｅ20を研磨して平坦化させることにより、デバイス内に埋め込んだ微細な磁性支持基体の規則構造を形成した。デバイスを酸素アッシング及びエキシマＵＶで表面洗浄処理する。
【００２７】
〔反応デバイスの使用形態〕
反応デバイスの使用形態の一例について図４を参照しながら説明する。基板１０１の上に、磁性の支持基体がグリッド（格子）状に配置されている反応領域４０２が複数搭載されている。
【００２８】
反応領域４０２の配置の間隔は、解析しようとする核酸試料，光学検出装置の仕様によって適切に設定できる。例えば、基板１０１の大きさを２５mm×７５mmとしたとき、磁性の支持基体をグリッド状に１マイクロ・メートル間隔で配置した反応領域４０２を５mm×８mmとすると、１領域当たり４０００万種類の核酸分子を解析でき、その領域を８個程度、基板１０１上に搭載することができる。
【００２９】
各反応領域４０２には、図６に示すように、支持基体１０２が格子状に配列しており、各支持基体１０２には、磁性微粒子１０３が固定している。また、支持基体１０２間の間隔は１μｍであり、支持基体１０２の大きさは長辺が１００ｎｍである。
【００３０】
したがって、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分に正確に行うことができ、一枚の基板上で８解析程度行うことができる。前記のような、複数の反応領域４０２を持つ基板１０１で効率良く反応を行うには、予め流路４０４を設けた反応チャンバー４０３を光透過性の基板１０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー４０３は、流路４０４の溝を予め形成したＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体からなり、デバイス上に張り合わせて使用することになる。具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット４０５，反応液を送り出す分注ユニット４０６，液の流れを制御するバルブ４０７，廃液タンク４０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応終了時には、洗浄液が反応チャンバー４０３の流路４０４を通じて供給され、廃液タンク４０８に収納される。このシステムは支持基体上の反応場の用意にも、分析にも用いることができる。
【００３１】
核酸分析装置の実施例について図５を用いて説明する。本実施例では、反応デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記反応デバイスに光を照射する手段と、前記反応デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。
【００３２】
より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバーに前記の反応デバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓５０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）５０７から発振するレーザ光５０８および５０９を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１０によって円偏光し、波長４１０ｎｍ以下の光を反射するダイクロイックミラー５１１によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ５１２によって集光し、その後、プリズム５１３を介して反応デバイス５０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、レーザ照射により、反応デバイス５０５表面上に存在する金属体において局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属に結合したプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は、対物レンズ５１４（例えば倍率６０倍，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ５１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ５１６により２次元ＣＣＤカメラ５１７上に結像される。
【００３３】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献４）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【００３４】
さらに、本実施例では、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2008, vol. 105, pp 1176-1181（非特許文献５）に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の反応デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，反応デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【００３５】
〔補足説明〕
単分子計測は微小な変化の観測や、感度向上を目的に生化学分野において注目されている。単分子計測には、遺伝子（ＤＮＡ及びＲＮＡ）やタンパク質及びそれらの断片など特定成分１分子を金属若しくは石英などの板（基板）上に固定し、光学計測する場合が多い。この時グリッド（格子）状など一定間隔で規則的に固定場（支持基体）を配列することにより、観察及びデータ処理を効率化が行える。本発明では磁性により特定成分を支持基体上に固定することにより、低い非特異吸着で、特定の場所に効率的に特定成分を導入することができる。
【００３６】
本実施形態のように固定に磁性を用いることにより、基板と支持基体への選択性が向上する他、夾雑物等により支持基体が被覆されていても、該成分を固定することが可能になる。即ち、基板作成プロセスやその後の取り扱いにおいて、化学的に固定するよりも低い清浄度・精度で取り扱うことが可能となり、製造コストの減少や実用性の向上が期待できる。
【００３７】
また支持基体上への単分子固定において複数分子が固定される問題も、反応デバイス上の磁性体のサイズを、生体分子を結合させる微粒子の直径より小さくすることより、単分子固定の確立を向上することができる。
【００３８】
基板上における伸長反応を用いて塩基配列を解析する場合、ＤＮＡ或いは酵素を基板上に固定する必要がある。ランダム的に生体分子を固定するより、規則的、例えばグリッド状に配列した場所に固定する方が、観察と解析も簡便になる。
【００３９】
また、本実施形態によれば、反応デバイス上にグリッド状に配列した場所に生体分子を単分子レベルで固定する反応デバイスを提供することができる。
【００４０】
さらに、反応デバイスに規則的に磁性素材を配置し、生体分子を固定できる微小磁性体を、反応デバイス上の磁性素材に結合させることにより、生体分子を反応デバイス上にその数量を制御しながら固定する手法及び反応デバイスを提供することもできる。
【符号の説明】
【００４１】
１０１  基板
１０２  支持基体
１０３  プローブを有する磁性微粒子
２０４  標識化（例えば蛍光色素もしくはビオチン）遺伝子断片
２０５  アビジン
２０６  蛍光標識化抗体
３０５  磁性材料膜
３０６  レジスト
４０２  反応領域
４０３  反応チャンバー
４０４  流路
４０５  温調ユニット
４０６  分注ユニット
４０７  バルブ
４０８  廃液タンク
５０１  カバープレート
５０２  検出窓
５０３  注入口
５０４  排出口
５０５  反応デバイス
５０６  ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
５０７  ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
５０８，５０９  レーザ光
５１０  λ／４板
５１１  ダイクロイックミラー
５１２  レンズ
５１３  プリズム
５１４  対物レンズ
５１５  光学フィルタ
５１６  結像レンズ
５１７  ２次元ＣＣＤカメラ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2011200141.tif 000006
【図５】
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【図６】
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