(57)【要約】【課題】人体の実質臓器に対してストレス耐性を誘導するプレコンディショニング法を適用するために用いて好適な超音波照射装置を提供する。【解決手段】超音波照射装置１０は、超音波を発生させるための超音波振動子２０と、超音波振動子において発生した超音波を、液体を含む対象物７０に伝達する伝達部材としてのケーシング３０と、対象物の温度を目標温度に維持するための冷却部４０と、を有している。そして、対象物の温度を冷却部によって目標温度に維持したまま、超音波の照射によって液体にキャビテーションを発生させ、キャビテーションによる化学作用によって生成した活性化学種を酸化ストレスとして対象物に負荷している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波を発生させるための超音波振動子と、
前記超音波振動子において発生した超音波を、液体を含む対象物に伝達する伝達部材と、
前記対象物の温度を目標温度に維持するための冷却部と、を有し、
前記対象物の温度を前記冷却部によって目標温度に維持したまま、超音波の照射によって液体にキャビテーションを発生させ、前記キャビテーションによる化学作用によって生成した活性化学種を酸化ストレスとして前記対象物に負荷する超音波照射装置。
【請求項２】
前記対象物の温度を検出する温度センサと、
前記冷却部の冷却能力を増減制御するコントローラと、をさらに有し、
前記コントローラは、前記温度センサによって検出した前記対象物の温度を一定とするように、前記冷却部の冷却能力を増減制御する、請求項１に記載の超音波照射装置。
【請求項３】
前記液体が水であり、酸化ストレスとしてラジカルや過酸化水素を対象物に負荷する、請求項１または請求項２に記載の超音波照射装置。
【請求項４】
超音波の周波数が、０．１０〜２０ＭＨｚ、より好ましくは、１．０〜１０ＭＨｚである請求項１〜請求項３のいずれか１つに記載の超音波照射装置。
【請求項５】
超音波の出力は、０．１〜２００Ｗ、より好ましくは、１．０〜５０Ｗである請求項１〜請求項４のいずれか１つに記載の超音波照射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波照射装置に関し、さらに詳しくは、人体の実質臓器に対してストレス耐性を誘導するプレコンディショニング法を適用するために用いて好適な超音波照射装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科手術等に代表される高侵襲治療は、技術革新によってその治療効果を高めるとともに医原性臓器障害のリスクも高めることとなった。医療における臓器機能障害の防止は医療の効果と安全性を高めるうえにおいて重要な技術であるが、臓器障害の病態は複雑であり未だ有効な薬剤や技術は開発されていない。
【０００３】
医原性臓器障害のリスクを低減させるための手段として、プレコンディショニング法が提案されている（非特許文献１を参照）。このプレコンディショニング法は、予測される侵襲（例えば、予定手術）を前に、予め軽度の虚血や熱ショック、細胞毒（薬剤）などに細胞を曝露することによってストレスタンパク質合成をはじめとした細胞の自己防御能を人為的に誘導する技術である。
【０００４】
具体的には、ラットの肝臓に対してあらかじめ熱ショックプレコンディショニングを施すと、無処置対照と比較して、肝臓の虚血再灌流障害に対する耐性が獲得され、生存率が改善されることが示されている。このような現象が起こる原因として、非特許文献１では、以下のメカニズムが示唆されている。すなわち、熱ショックプレコンディショニングを施すことによって、虚血再灌流障害による肝細胞におけるミトコンドリア機能の障害が防止される。また、プレコンディショニングによって熱ショックタンパク質（ＨＳＰ；Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の１種であるＨＳＰ７２の産生が増加し、変性タンパク質の細胞内への蓄積が抑制される結果、細胞死が起こりにくくなる、というものである。
【０００５】
このプレコンディショニング法は、生体の自己防御能を喚起することを目的としてはいるものの、その目的達成のためには治療対象部位へのストレス付与を必然的に伴うものである。したがって、プレコンディショニングが実現されうるのは、これにより得られる細胞・組織の保護効果が負荷ストレスによる障害性を上回るときのみということになる。この点、虚血や熱ショックによるプレコンディショニングを人体に対して適用するのは、組織・器官に対して過剰なストレスや苦痛を与えることになるため、実用が困難であるという問題がある。また、有効にストレス応答を誘導できる薬剤もいまだ開発されていないのが現状である。
【０００６】
ところで、超音波は、医療技術において、一方では撮像法における診断用補助手段として使用され、他方では治療的にも適用されている。超音波を組織に対して照射すると、当該組織に対して振動および熱として作用する密度波を生じる。この性質を利用して、超音波の熱的成分は、例えば温熱療法などの用途に用いられている。
【０００７】
超音波キャビテーションは、不可逆の細胞損傷によって細胞膜を崩壊させ、瞬時の細胞溶解並びに壊死をもたらすことが知られている（非特許文献２を参照）。
【０００８】
既往の研究として、浮遊細胞であるＵ９３７を１ＭＨｚの超音波で処理し、ＨＯ−１の発現が誘導されるという報告や（非特許文献３を参照）、ＨＬ−６０に１０ＭＨｚのパルス超音波を照射することで、ＨＳＰ３２、ＨＳＰ４０ならびにＨＳＰ７２が誘導される事が報告されている（非特許文献４を参照）。しかしながら、肝細胞のような接着細胞を照射対象としたＨＳＰの発現誘導については報告されていない。なぜなら、動かない固体に接着した細胞に対して有効な超音波照射条件がいまだ明らかでないことと、浮遊細胞と違って接着細胞は固体に接着した環境でしか生存できず、これに強い超音波振動を照射すると容易に細胞が固着面から脱落し、接着を外れた細胞膜から死滅シグナルが活性化して脱落細胞は生存条件を失ってしまうことからである。すなわち、固体に接着した細胞に有効に超音波エネルギーを与えつつ、しかも細胞接着を破壊しない超音波照射条件は確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】山本雄造、「肝臓を虚血再灌流障害から守るために−熱ショックプレコンディショニング−」、秋田医誌、２００４年、第５４巻、第１号、ｐ．１−９
【非特許文献２】Ｇｏ  Ｋａｇｉｙａ，Ｒｙｏｈｅｉ  Ｏｇａｗａ，Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｔａｂｕｃｈｉ，Ｌｏｒｅｔｏ  Ｂ．Ｆｅｒｉｌ  Ｊｒ．，Ｔｅｔｓｕｏ  Ｎｏｚａｋｉ，Ｓｈｉｇｅｋａｚｕ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｋａｚｕｔａｋａ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔａｋａｓｈｉ  Ｋｏｎｄｏ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−  ｄｕｅ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，３８８−３９６（２００６）
【非特許文献３】Ｇｏ  Ｋａｇｉｙａ，Ｔｏｓｈｉａｋｉ  Ｔａｂｕｃｈｉ，Ｌｏｒｅｔｏ  Ｂ．Ｆｅｒｉｌ  Ｊｒ．，Ｒｙｏｈｅｉ  Ｏｇａｗａ，Ｑｉｎｈｇ−Ｌｉ  Ｚｈａｏ，Ｎｏｂｕｋｉ  Ｋｕｄｏ，Ｗａｋａｋｏ  Ｈｉｒａｏｋａ，Ｋａｔｓｕｒｏ  Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉｒｏ  Ｕｍｅｍｕｒａ，Ｔａｋａｓｈｉ  Ｋｏｎｄｏ，Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，３３，３−１０  （２００６）．
【非特許文献４】Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓｏｎｔａｇ，Ｉｌｊａ  Ｌ．Ｋｒｕｇｌｉｋｏｖ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｉｎ  ＨＬ−６０  ｃｅｌｌｓ，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．６，１０３２−１０４１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、人体の実質臓器に対してストレス耐性を誘導するプレコンディショニング法を適用するために用いて好適な超音波照射装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する超音波照射装置は、超音波を発生させるための超音波振動子と、前記超音波振動子において発生した超音波を、液体を含む対象物に伝達する伝達部材と、前記対象物の温度を目標温度に維持するための冷却部と、を有している。そして、前記対象物の温度を前記冷却部によって目標温度に維持したまま、超音波の照射によって標的細胞内外環境中液体にキャビテーションを発生させ、前記キャビテーションによる化学作用によって生成した活性化学種を酸化ストレスとして前記対象物すなわち標的細胞に負荷している。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、超音波振動やキャビテーションの際に発生する熱によって対象物の温度が上昇することによる熱ストレスが対象物に負荷されることを抑制しながら、酸化ストレスのみを対象物に負荷することができる。これによって、酸化ストレスのみを負荷することによる特有な状態を、対象物に誘導することが可能となる。超音波照射によるＨＳＰの誘導に関する実験を通して、本発明によれば、人体の実質臓器、例えばヒト肝細胞に対してストレス耐性を誘導するプレコンディショニング法を適用するために用いて好適な超音波照射装置を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る超音波照射装置を示す概略構成図である。
【図２】超音波照射装置の制御系を示すブロック図である。
【図３】ＨＳＰの誘導に関する実験に用いた超音波照射装置を示す概略構成図である。
【図４】Ｈ２Ｏ２にて酸化ストレスを負荷したＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図５】実験に用いた超音波照射装置による超音波照射によって生成したＨ２Ｏ２濃度のＫＩ法による測定結果を示す図である。
【図６】温熱処理を行ったＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図７】３７度に培養液の温度を制御するよう冷却水を使用し、出力２．３Ｗの超音波を照射したときの培養液の温度変化を示す図である。
【図８】超音波照射装置による超音波照射を行ったＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す図であり、図８（Ａ）は、出力１．４Ｗの超音波を照射した場合のウエスタンブロット分析結果を示す図、図８（Ｂ）は、出力２．３Ｗの超音波を照射した場合のウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図９】培養液温度を厳密に管理した場合において、出力２．３Ｗの超音波を照射した場合のウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図１０】出力２．３Ｗの超音波を２０分間照射した後のインキュベート時間を変化させたＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図１１】超音波照射を行ったＨｕＨ７細胞をＨ２Ｏ２に暴露したときのＨｕＨ７細胞の生存率についての実験のタイムコースを示す図である。
【図１２】超音波照射を行ったＨｕＨ７細胞をＨ２Ｏ２に暴露したときのＨｕＨ７細胞の生存率の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる。
【００１５】
上述したように、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は細胞保護作用を持つタンパク質であり、熱、重金属、ある種の薬剤、低酸素並びに活性酸素などの様々なストレスによって発現するタンパク質である。ＨＳＰを誘導する方法として、熱ショックや薬剤による方法が研究されている。しかし、それらの方法は人体への負荷が大きく、ＨＳＰを誘導する条件の制御が困難である。苦痛が少なく合理的かつ有効に標的細胞にストレス応答を誘導し、ストレス耐性を獲得させる新技術が求められている。本発明者らは、ＨＳＰの発現を誘導する方法として、超音波キャビテーションによる化学作用（活性化学種）に注目して、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
（超音波照射装置）
図１を参照して、本実施形態の超音波照射装置１０は、概説すれば、超音波を発生させるための超音波振動子２０と、超音波振動子２０において発生した超音波を、液体を含む対象物７０に伝達する伝達部材３０と、対象物７０の温度を目標温度に維持するための冷却部４０と、を有している。図示する実施形態にあっては、超音波照射装置１０は、対象物７０の温度を検出する温度センサ５０と、冷却部４０の冷却能力を増減制御するコントローラ６０と、をさらに有している。そして、対象物７０の温度を冷却部４０によって目標温度に維持したまま、超音波の照射によって標的細胞内外環境中液体にキャビテーションを発生させ、キャビテーションによる化学作用によって生成した活性化学種を酸化ストレスとして対象物７０すなわち標的細胞に負荷している。このとき、コントローラ６０は、温度センサ５０によって検出した対象物７０の温度を一定とするように、冷却部４０の冷却能力を増減制御している。以下、詳細に説明する。
【００１７】
超音波照射装置１０は、超音波振動子２０が内蔵された照射ユニット２１を有している。照射ユニット２１は、超音波照射時に対象物７０に対して接触する伝達部材３０としてのケーシング３０を有している。
【００１８】
超音波振動子２０は、ＰＺＴなどの圧電材料を電極で挟んだ構造を有し、通電時に圧電材料が膨縮駆動して超音波振動を発生する。超音波振動子２０は、発振器２２に接続されている。超音波振動子２０は、ケーシング３０に対してボルトによって積層固定するランジュバン型振動子や、接着剤によって固定する接着型振動子のいずれをも適用できる。
【００１９】
超音波振動子２０において発生させる超音波の周波数は、０．１０〜２０ＭＨｚ、より好ましくは、１．０〜１０ＭＨｚである。また、超音波の出力は、０．１〜２００Ｗ、より好ましくは、１．０〜５０Ｗである。
【００２０】
０．１０ＭＨｚより周波数が低いと、キャビテーション気泡が大きくなり、その圧壊に伴う衝撃で細胞が破壊されやすくなる。周波数が２０ＭＨｚより高くなると、キャビテーションの生成が起こり難くなり、キャビテーション圧壊に伴う化学作用の利用が困難となるからである。また、０．１Ｗより出力が低いと、キャビテーション生成が困難となり、十分な化学特性が得られない。２００Ｗより大きいと、そのエネルギーおよび音圧で細胞を死滅させてしまうからである。後述する実験において示すように、超音波の周波数および出力の範囲を上記のように選択することによって、超音波を用いて細胞環境に活性化学種を生成し、細胞のストレス応答を誘導することが可能となり、プレコンディショニング法を適用するために用いて好適となるからである。
【００２１】
超音波振動子２０において発生させる超音波の周波数は安定した周波数であることが好ましい。超音波照射に基づく作用・効果の再現性を確保でき、ＨＳＰの誘導装置としての超音波照射装置１０の利用価値を高め得るからである。なお、安定した周波数とは、選択した周波数がプラスマイナス約２％以内に収まることをいう。例えば、２００ｋＨｚの周波数を選択したときは、１９６−２０４ｋＨｚの周波数の超音波を放出することができ、仮に１９８ｋＨｚの超音波が放出された場合は、その超音波が連続的に同じ周波数、同じ出力で放出し続けることができることをいう。ただし、超音波照射装置１０の運転モードは、連続的に同じ周波数、同じ出力で超音波を放出し続ける運転モードに限定されるものではない。例えば、安定した周波数で超音波を放出している途中で、周波数や出力を故意に変化させる運転モードを選択することもできる。さらに、放出する超音波は、連続波に限定されるものではなく、パルス波であってもよい。パルス波の場合には、例えば、１０秒間ある出力、ある周波数の超音波を放出して、そのあと１０秒間超音波放出を停止することを繰り返すような制御をすればよい。超音波放出を停止するのは、細胞に損傷を与えないためであり、また、一度停止するという動作を入れることによって化学作用がより強くなる場合もあり得る。
【００２２】
ケーシング３０は、略キャップ形状を有し、その表面に超音波放射面３１が形成されている。ケーシング３０の形成材料は特に限定されないが、例えば、アルミニウムやステンレスなどの金属材料から形成してある。超音波放射面３１と対象物７０とを密着させるために、両者の間にはジェル３２を塗布することが好ましい。
【００２３】
ケーシング３０の側面には、超音波の振動伝達を抑制するための超音波吸収部材３３を設けている。ケーシング３０上面の超音波放射面３１だけから超音波が放出されるようにすることによって、超音波を目的とする対象物７０にだけ照射して、他に誤って照射されることを防ぐためである。超音波吸収部材３３の形成材料は、超音波の振動を伝えない樹脂、スポンジ、空気層を有する材料などから形成することができ、超音波の振動伝達を抑制し得る限りにおいて任意の材料を適用することができる。超音波吸収部材３３は、超音波の振動伝達を抑制する保護材料を、巻き付けたり、コーティングしたり、あるいは接着したりすることによって、ケーシング３０の側面に取り付けている。後述するように、ケーシング３０の外周には冷却チューブ４１を巻き付けてある。そのため、図示例にあっては、冷却チューブ４１を覆うように超音波吸収部材３３を設けてある。
【００２４】
対象物７０が含む液体は、例えば、水であり、キャビテーションによる化学作用によって生成する活性化学種は主にヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）や過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。これらＯＨ・やＨ２Ｏ２を酸化ストレスとして対象物７０に負荷する。後述する実験において、水もしくは液体培地の上にはフィルム部材が被せられており、超音波の直進流による接着細胞の剥がれを抑制している。通常、培養液を満たしたシャーレ底面に固着した接着細胞に超音波を照射すると、振動によって接着細胞がシャーレ底面から剥れて死滅してしまう。そこで、実験においては、フィルム部材によって物理的に接着細胞をカバーし、超音波の振動は通すが、細胞の物理的脱落を抑えるようにした。フィルム部材の材料は特に限定されないが、例えば、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルなどを用いることができる。フィルム部材には、市販されている食品包装用ラップを適用しても良いし、薄い発泡スチロールを適用することもできる。フィルム部材は、水、液体培地に浮いている。なお、フィルム部材によっては培地全体を覆う必要はない。
【００２５】
対象物７０は、超音波振動やキャビテーションの際に発生する熱によって温度が上昇する。このような対象物７０の温度上昇を抑えて、熱ストレスが対象物７０に負荷されることを防止するために、冷却部４０を設けてある。冷却部４０を設けることによって、酸化ストレスのみを対象物７０に負荷することができる。
【００２６】
図示する冷却部４０は、対象物７０に接触するケーシング３０を冷却することによって対象物７０を間接的に冷却する構成を有している。具体的には、冷却部４０は、ケーシング３０の外周に巻き付けた冷却チューブ４１と、冷却チューブ４１内に水などの冷却媒体を循環させるポンプ４２と、冷却チューブ４１に供給する冷却水の温度を調節する温度調節装置４３と、を有している。冷却部４０の冷却能力は、冷却水の供給温度や循環流量を制御することによって増減制御できる。
【００２７】
なお、冷却部４０は、対象物７０の温度を目標温度に維持し得る限りにおいて適宜の構成を採用することができる。例えば、ケーシング３０の外周に放熱フィンを取り付け、空冷によってケーシング３０を冷却し、対象物７０を間接的に冷却する構成としてもよい。また、ペルチェ素子をケーシング３０の外周に取り付けてケーシング３０を冷却し、対象物７０を間接的に冷却する構成としてもよい。さらに、対象物７０を直接的に冷却する構成でもよい。例えば、対象物７０に対して接触するケーシング３０の表面のうち、超音波の照射を阻害しない範囲に、対象物７０に接触する冷却プレートを配置し、この冷却プレートをペルチェ素子などによって冷却すればよい。
【００２８】
温度センサ５０は、対象物７０の温度を検出し得る限りにおいて検出方式や型式などは限定されず、公知の熱電対や測温抵抗体を用いることができる。
【００２９】
図２を参照して、コントローラ６０は、ＣＰＵ６１と、ＲＯＭやＲＡＭなどの記憶部６２と、入出力ポート６３とを有している。発振器２２、温度センサ５０、ポンプ４２、および温度調節装置４３は、入出力ポート６３を介してＣＰＵ６１に接続されている。超音波照射装置１０全体の制御を行うためのプログラムは、記憶部６２のＲＯＭに記憶されており、ＣＰＵ６１はその制御プログラムを呼び出して実行する。ＣＰＵ６１には、対象物７０の温度に関する温度センサ５０からの信号が入力される。一方、ＣＰＵ６１からは、発振器２２、ポンプ４２、および温度調節装置４３に各種の制御信号を出力する。コントローラ６０は、温度センサ５０によって検出した対象物７０の温度を一定とするように、冷却水の供給温度や循環流量を調整して冷却部４０の冷却能力を増減制御する。
【００３０】
超音波照射装置１０の作用を説明する。
【００３１】
コントローラ６０は、ポンプ４２に制御信号を出力して冷却チューブ４１に冷却水を循環させ、温度調節装置４３に制御信号を出力して冷却水の供給温度を調整させる。冷却水の供給温度が安定した後に、照射ユニット２１のケーシング３０の超音波放射面３１を対象物７０に対して接触させる。超音波放射面３１と対象物７０との間にはジェル３２を塗布し、両者を密着させる。
【００３２】
この状態で、コントローラ６０は、発振器２２に制御信号を出力し、超音波振動子２０を振動して超音波を発生させる。発生させる超音波の周波数および出力は、例えば、約１ＭＨｚ、約２．３Ｗである。
【００３３】
水を含む対象物７０に超音波を照射すると、その水の中にキャビテーションが発生し、圧縮、崩壊過程を経て高温高圧の反応場が形成される。キャビテーションによる高温の反応場において水分子が水素ラジカル（・Ｈ）やヒドロキシラジカル（・ＯＨ）に分解される。この超音波キャビテーションによる化学作用によって生成された活性化学種であるラジカルやその２量体であるＨ２Ｏ２を、酸化ストレスとして対象物７０に負荷する。
【００３４】
超音波を照射している間、コントローラ６０は、温度センサ５０によって検出した対象物７０の温度を一定とするように、冷却水の供給温度や循環流量を調整して冷却部４０の冷却能力を増減制御している。
【００３５】
したがって、本実施形態の超音波照射装置１０によれば、熱ストレスが対象物７０に負荷されることを抑制しながら、酸化ストレスとしてラジカルや過酸化水素のみを対象物７０に負荷することができる。これによって、酸化ストレスのみを負荷することによる特有な状態を、対象物７０に誘導することが可能となる。
【００３６】
本実施形態の超音波照射装置１０は、例えば、対象物７０としての細胞に超音波を照射し、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現を誘導するために適用することができる。
【００３７】
（超音波照射によるＨＳＰの誘導に関する実験例）
以下、超音波照射によるＨＳＰの誘導に関する実験例について説明する。
【００３８】
ＨＳＰは、さまざまなタンパク質の三次元構造維持に不可欠な分子シャペロンとして細胞保護作用を持つタンパク質である。ＨＳＰを誘導する方法として熱ショックや投薬による方法が提案されている。しかしながら、熱ショックによる方法では人体への負荷が大きく、投薬による方法ではＨＳＰを誘導する条件の制御が困難であるという問題がある。近年、条件次第では死に至らない可逆的な生命反応を誘導し得る可能性がある超音波が注目されつつある。
【００３９】
本発明者らは、ＨＳＰを誘導する方法として、超音波キャビテーションによる化学作用によって生成される活性化学種に着目し、本実験を行った。本実験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとして、実質臓器形成の主役となる接着細胞であるＨｕＨ７細胞に超音波を照射し、超音波キャビテーションによる化学作用によって生成した活性化学種を酸化ストレスとしてＨｕＨ７細胞に与えることによって、ＨＳＰ７２ならびにヘムオキシゲナーゼ（ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１（ＨＯ−１））（ＨＳＰ３２）の発現を誘導することを試みたものである。超音波キャビテーションを発生させるために、上述した実施形態の超音波照射装置と同じ原理の超音波照射装置を用いている。
【００４０】
細胞として、ヒト肝癌由来細胞であるＨｕＨ７細胞を使用した、培養培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベータにて培養した。
【００４１】
図３を参照して、実験に用いた超音波照射装置１００は、実施形態の超音波照射装置１０と同様に、超音波振動子２０が内蔵されるとともに伝達部材としてのケーシング３０を備える照射ユニット２１（本多電子株式会社製）と、培養シャーレ７１内の対象物７２の温度を目標温度に維持するための冷却部４０と、を有している。照射ユニット２１は、周波数１ＭＨｚ、出力０．５〜２．３Ｗ可変、定常波の超音波を発生させることができる。照射時間は、１〜２０分の範囲で調整した。ケーシング３０の超音波放射面３１と培養シャーレ７１の底面とは、ジェル３２によって密着させた。培養シャーレ７１は、直径３５ｍｍのものを用いた。培養培地は、２ｍＬとした。対象物７２は、実験の内容によって、純水であったり、標的細胞であるＨｕＨ７細胞であったりする。図３には、対象物７２がＨｕＨ７細胞７２ａであるときの実験の状態を示している。液体培地の上には、食品包装用ラップからなるフィルム部材７３を浮かせた。フィルム部材７３によって物理的にＨｕＨ７細胞７２ａをカバーし、超音波を照射してもＨｕＨ７細胞７２ａが培養シャーレ７１から剥れることを抑え、接着細胞であるＨｕＨ７細胞７２ａが死滅しないようにするためである。照射ユニット２１は、タンク４５に貯溜した冷却水４６内に浸漬させてある。液面は、超音波放射面３１の高さ以下となるようにし、超音波照射時に液面が波立ったり、霧化したりすることがないようにした。このように、冷却部４０は、ケーシング３０を冷却することによって対象物を間接的に冷却する構成とした。超音波照射装置１００はさらに、培養シャーレ７１内の培養液の温度を検出するための温度センサ５１と、タンク４５内の冷却水４６の温度を検出する水温センサ５２と、タンク４５内の冷却水４６の温度を調節する温度調節装置４７と、冷却水４６を循環するポンプ４８とをさらに有している。温度センサ５１を培養シャーレ７１の底面に接触させて配置することによって、培養液の温度を間接的に検出した。コントローラ６０によって温度調節装置４７の作動を制御し、タンク４５内の冷却水４６の温度を１０℃に維持した。
【００４２】
なお、動物や人体の実質臓器に対してストレス耐性を誘導するための装置として超音波照射装置１００を応用する場合には、臓器自体がフィルム部材７３の役目を果たすことから、実験に用いたようなフィルム部材７３は不要である。換言すれば、フィルム部材７３を用いることによって、はじめて、臓器レベルの実験を細胞レベルで実験可能になったと言える。
【００４３】
（１）まず、ＨｕＨ７細胞が酸化ストレスによってＨＳＰを発現するかを調査した。酸化ストレスとしてＨ２Ｏ２を負荷し、ＨＳＰ７２ならびにＨＯ−１の発現の有無をウエスタンブロット分析（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって確認した。つまり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、タンパク質をメンブレンに転写し、抗体を用いて特定のタンパク質を検出することによって確認した。
【００４４】
ＨｕＨ７細胞を濃度５〜５０μＭのＨ２Ｏ２に暴露した。そして、６時間インキュベート後、細胞を回収し、ウエスタンブロット分析を行った。
【００４５】
図４に、Ｈ２Ｏ２にて酸化ストレスを負荷したＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す。各レーンは、左から、コントロール、濃度９μＭのＨ２Ｏ２、濃度１８μＭのＨ２Ｏ２、濃度３６μＭのＨ２Ｏ２、濃度５０μＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ添加したＨｕＨ７細胞でのウエスタンブロットであり、上から、ＨＳＰ７２、ＨＯ−１、およびβ−ａｃｔｉｎについてそれぞれ検出したものである。
【００４６】
濃度１８μＭ以下のＨ２Ｏ２を用いて細胞を暴露させた場合、ＨＳＰ７２ならびにＨＯ−１の発現は確認されなかった。しかしながら、濃度３６μＭ以上のＨ２Ｏ２に暴露させた場合はＨＯ−１の発現が確認された。また、ＨＳＰ７２は、Ｈ２Ｏ２による暴露では発現は確認されなかった。この結果から、ＨｕＨ７細胞は酸化ストレスに応答し、ＨＯ−１を誘導する細胞であり、超音波照射により生成するＨ２Ｏ２においても誘導される可能性が示唆された。
【００４７】
（２）次に、超音波照射装置を用いた際の超音波による化学作用の基礎特性を測定した。無細胞シャーレに純水２ｍＬを満たし、出力０．５Ｗ、１．４Ｗ、２．３Ｗの超音波を所定時間照射した。照射後、活性化学種として発生したＨ２Ｏ２濃度を測定し、照射時間と活性化字種の発生量との関係を調べた。シャーレ内純水中に発生するＨ２Ｏ２濃度は、紫外可視分光光度計を使用したＫＩ法によって経時的に測定した。ＫＩ法は、０．１Ｍ／Ｌよう化カリウム（ＫＩ）水溶液から生じるＩ３−イオンの量を、分光光度計で３５０ｎｍの吸光度を測定するものである。
【００４８】
図５に、実験に用いた超音波照射装置による超音波照射によって生成したＨ２Ｏ２濃度のＫＩ法による測定結果を示す。
【００４９】
出力０．５ＷにおいてＨ２Ｏ２の生成は確認されず、出力１．４Ｗと２．３Ｗの超音波を照射した場合に、シャーレ内純水中にＨ２Ｏ２の生成を確認した。出力１．４Ｗに比して２．３Ｗ照射の方が、Ｈ２Ｏ２生成量は高い。また、Ｈ２Ｏ２の濃度は、超音波の照射時間とともに漸増した。２０分間照射した時点において、Ｈ２Ｏ２の濃度は、出力１．４Ｗのときは４．０μＭに達し、出力２．３Ｗのときは１７μＭに達した。この結果から、出力１．４Ｗ以上にてキャビテーションが生じ、生成した活性化学種によるタンパク質の発現誘導効果が期待できると考えられる。
【００５０】
（３）超音波を培養細胞に照射すると、培養細胞は、超音波振動やキャビテーションの際に発生する熱によって温度が上昇する。そこで、熱ストレスによってＨＳＰ７２およびＨＯ−１の発現を誘導する培養液の温度を確認するために、培養細胞への温熱処理実験を行った。温熱処理条件は、温度を４１℃、４２℃、４３℃、４５℃、処理時間を２０分とした。温熱処理後、ＣＯ２インキュベータにて６時間インキュベートした細胞をサンプリングした。そして、ＨＳＰ７２ならびにＨＯ−１の発現の有無をウエスタンブロット分析によって確認した。
【００５１】
図６に、温熱処理を行ったＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す。各レーンは、左から、コントロール、温度４１℃、温度４２℃、温度４３℃、温度４５℃のときのＨｕＨ７細胞でのウエスタンブロットであり、上から、ＨＳＰ７２、ＨＯ−１、およびβ−ａｃｔｉｎについてそれぞれ検出したものである。
【００５２】
温度４２℃以上の温熱処理をしたときには、ＨＳＰ７２の発現が確認され、温度４５℃の温熱処理をしたときには、ＨＯ−１の発現が確認された。この結果から、培養液の温度を４２℃を越えない温度に管理すれば、熱ストレスがＨｕＨ７細胞に負荷されることを抑制できることが明らかとなった。
【００５３】
（４）次に、超音波照射装置を用いて培養細胞への超音波照射実験を行った。超音波照射条件は、出力１．４Ｗ、２．３Ｗ、照射時間１分、５分、１０分、２０分とした。超音波照射後、ＣＯ２インキュベータにて６時間インキュベートした細胞をサンプリングした。そして、ＨＳＰ７２ならびにＨＯ−１の発現の有無をウエスタンブロット分析によって確認した。
【００５４】
図７に、３７度に培養液の温度を制御するよう冷却水を使用し、出力２．３Ｗの超音波を照射したときの培養液の温度変化を示す。
【００５５】
出力２．３Ｗの超音波を２０分間照射しても、培養液の温度は、熱ストレスがＨｕＨ７細胞に負荷される温度を超えない約３６℃であった。この結果から、熱ストレスがＨｕＨ７細胞に負荷されることを抑制しながら、酸化ストレスのみをＨｕＨ７細胞に負荷することが可能であることが明らかとなった。
【００５６】
図８に、超音波照射装置による超音波照射を行ったＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す。図８（Ａ）は、出力１．４Ｗの超音波を照射した場合のウエスタンブロット分析結果を示し、図８（Ｂ）は、出力２．３Ｗの超音波を照射した場合のウエスタンブロット分析結果を示している。各レーンは、左から、コントロール、照射時間１分、照射時間５分、照射時間１０分、照射時間２０分のときのＨｕＨ７細胞でのウエスタンブロットであり、上から、ＨＳＰ７２、ＨＯ−１、およびβ−ａｃｔｉｎについてそれぞれ検出したものである。
【００５７】
図８（Ａ）（Ｂ）に示すように、ＨｕＨ７細胞は、定常状態でＨＳＰ７２の発現を認めないが若干のＨＯ−１を認める。なお、ここでいう「定常状態」とは、熱や超音波によって刺激する前の細胞ということであり、普通の細胞培養環境で特別なストレスシグナルなどが入っていない細胞のことを指している。
【００５８】
図８（Ａ）に示すように、出力１．４Ｗの超音波を照射した場合においては、いずれの照射時間のときにも、ＨＯ−１ならびにＨＳＰ７２の発現は確認されなかった。
【００５９】
図８（Ｂ）に示すように、出力２．３Ｗの超音波を照射した場合において、１０分間超音波を照射したときには、ＨＯ−１の発現が確認された。２０分間超音波を照射したときには、ＨＯ−１およびＨＳＰ７２のバンドが確認された。また、ＨＯ−１の発現量は、照射時間が長くなるにつれて増加した。この結果から、超音波照射によってＨＳＰ７２およびＨＯ−１の発現の誘導が可能であることが明らかとなった。
【００６０】
図９に、培養液温度を厳密に管理した場合において、出力２．３Ｗの超音波を照射した場合のウエスタンブロット分析結果を示す。各レーンは、左から、コントロール、照射時間１０分、照射時間２０分のときのＨｕＨ７細胞でのウエスタンブロットであり、上から、ＨＳＰ７２、ＨＯ−１、およびβ−ａｃｔｉｎについてそれぞれ検出したものである。
【００６１】
培養液温度を管理しないと超音波照射に伴って発熱し細胞にＨＳＰ７２発現を認めたが、厳密に温度管理すると出力２．３ＷでＨＯ−１の誘導は明らかであったがＨＳＰ７２は誘導されなかった。通常、細胞は生存環境のホメオスタンス内で良好に生存している。このホメオスタンスは様々な物理化学的条件を含み、温度もその一つである。通常、哺乳類の細胞は３６℃で生存しており、細胞培養液もこのあたりに温度条件を決定する。しかし、この恒常的温度環境から３〜４℃高い温度環境に細胞を一定時間暴露すると、ストレス応答が活性化されＨＳＰなどの特殊なタンパク質合成が始まる。したがって、ここでいう「厳密に温度管理する」とは、上記細胞のストレス応答が活性化しない温度条件を指しており、最初に設定した細胞環境温度条件（３７℃）から２℃を超えないように常に温度管理することを指している。
【００６２】
図１０に、出力２．３Ｗの超音波を２０分間照射した後のインキュベート時間を変化させたＨｕＨ７細胞のウエスタンブロット分析結果を示す。各レーンは、左から、コントロール、インキュベート時間３時間、インキュベート時間６時間、インキュベート時間９時間、インキュベート時間１２時間のときのＨｕＨ７細胞でのウエスタンブロットであり、上から、ＨＯ−１、およびβ−ａｃｔｉｎについてそれぞれ検出したものである。
【００６３】
インキュベート時間６時間とすることにより、ＨｕＨ７細胞内のＨＯ−１タンパク量が増加していることが明らかとなった。
【００６４】
（４）次に、超音波照射を行ったＨｕＨ７細胞をＨ２Ｏ２に暴露したときのＨｕＨ７細胞の生存率について調査した。
【００６５】
図１１に、実験のタイムコースを示し、図１２に、生存率の経時変化を示す。
【００６６】
図１１に示すように、出力２．３Ｗの超音波を２０分間照射した後に６時間インキュベートした細胞の培地と、無前処置細胞の培地とのそれぞれにＨ２Ｏ２を添加し、Ｈ２Ｏ２濃度２５０μＭでＴ時間（０時間、３時間、５時間、１０時間）インキュベートした。その後、細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を、トリパンブルー色素排除法（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）によって定量した。
【００６７】
図１２に示すように、無前処置のＨｕＨ７細胞に、濃度２５０μＭのＨ２Ｏ２を添加すると、急速に細胞は死滅した。細胞生存率（％）は、０時間で９３．５±３．１％、３時間暴露後には７６．４±２．３％、５時間暴露後には３５．２±１０．１％、１０時間暴露後には１６．２±６．３％となった。
【００６８】
一方、温度管理下において前処置（出力２．３Ｗの超音波を２０分間照射した後に６時間経過）したＨｕＨ７細胞に、濃度２５０μＭのＨ２Ｏ２を添加すると、細胞生存率は、０時間で８５．５±５．２％、３時間暴露後には８１．６±５．５％、５時間暴露後には６４．５±６．２％、１０時間暴露後には２１．４±７．４％となった。前処置した場合の細胞生存率は、無処置細胞の場合に比べて高めに維持された。
【００６９】
以上の結果から、超音波を用いて細胞環境に活性化学種を生成し、細胞のストレス応答を誘導することが可能であった。この超音波前処置である音響化学プレコンディショニング（ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）によって人為的にＨＯ−１を発現させた細胞にストレス耐性を誘導し得ることが明らかとなった。
【００７０】
また、超音波照射装置１００を使用する利点は次のとおりである。
【００７１】
第１に、接着細胞に対するＨＳＰの誘導装置としての利用価値がある。具体的には、超音波照射装置１００は、接着細胞が剥がれないようにフィルム部材７３を被せたこと、接着細胞を冷却して温度制御したこと、再現性が見られるように安定した周波数で振動を加えたことによって、接着細胞に対するＨＳＰの誘導装置としての利用価値がある。
【００７２】
第２に、動物や人体についても利用が可能である。すなわち、動物や人体の実質臓器に対してストレス耐性を誘導するための装置として応用することが可能である。そして、この場合には、ケーシング（伝達部材）３０の周りに振動を伝えない樹脂、スポンジ、あるいは空気層を有する材料を巻き付ける等の手段を講じることが好ましい。標的細胞以外の細胞に振動をできるだけ伝達しないようにするためである。
【符号の説明】
【００７３】
１０    超音波照射装置、
２０    超音波振動子、
２１    照射ユニット、
２２    発振器、
３０    ケーシング（伝達部材）、
３１    超音波放射面、
３２    ジェル、
３３    超音波吸収部材、
４０    冷却部、
４１    冷却チューブ、
４２    ポンプ、
４３    温度調節装置、
４５    タンク、
４６    冷却水、
４７    温度調節装置、
４８    ポンプ、
５０    温度センサ、
５１    温度センサ、
５２    水温センサ、
６０    コントローラ、
７０    対象物、
７１    培養シャーレ、
７２    対象物、
７２ａ  ＨｕＨ７細胞、
７３    フィルム部材、
１００  超音波照射装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図６】
2011206094.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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