(57)【要約】【課題】新規な糖尿病予防・改善剤の発見が可能な糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を提供することにあり、更には従来の糖尿病予防・改善剤とは異なる、すなわちインスリンの作用とは異なる新たな作用機序による糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）を標的分子としてスクリーニングすることを特徴とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法であり、被検対象物による、肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量の増加の有無又は程度を評価してスクリーニングする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法、及び、該スクリーニング方法を使用する糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キットにより課題を解決した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）を標的分子としてスクリーニングすることを特徴とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検対象物による、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量の増加の有無又は程度を評価してスクリーニングする請求項１に記載の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
少なくとも、以下の工程（１）、（２）及び（３）
（１）実験動物に被検対象物を投与する工程
（２）工程（１）によって得られた実験動物の肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量を測定する工程
（３）工程（２）で測定されたグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量が、陰性対照より増加している被検対象物を選択する工程
を有する請求項１又は請求項２に記載の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３に記載の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を使用して、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量を測定するように組み上げられたものであることを特徴とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）を標的分子とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法と、そのスクリーニング方法を使用するように組み上げられたスクリーニング用キットに関する。
【０００２】
グルコースは生体に必須の分子であるが、グルコースが生体膜を通過するためには、細胞膜上に糖輸送担体（グルコーストランスポーター：以下、「ＧＬＵＴ」と略記する）と呼ばれる膜タンパク質が必要である。ＧＬＵＴとして、いくつかのクラス、分子が同定されているが、その発現部位や役割が比較的よく解明されているのはクラスIに属するＧＬＵＴ１からＧＬＵＴ４の４種類の分子である。
【０００３】
このうち、ＧＬＵＴ４は、脂肪組織と骨格筋等の横紋筋に見出される主要なＧＬＵＴの一つである。ＧＬＵＴ４は、通常は細胞内部に存在しているが、インスリン感受性でインスリンの刺激に応答して細胞膜上に移行（トランスロケーション）し、グルコースを血中から組織に輸送して血糖値を低下させる役割を有している。このような役割を有するＧＬＵＴ４を過剰発現させたマウスは、通常マウスに比べて高脂肪食により糖尿病になりにくいことも報告されている（非特許文献１）。このため、ＧＬＵＴ４をインスリンの関係する糖尿病等の疾患や各種障害に対する薬剤の標的分子として用いる検討が行われており、ＧＬＵＴ４の発現増強剤（例えば、特許文献１及び特許文献２）や、その検出方法（特許文献３等）に関する多くの報告がなされている。
【０００４】
このように、従来は、糖の取り込み系の評価方法は、脂肪細胞や骨格筋細胞のＧＬＵＴ４の細胞膜へのアンカーリング（結合）を指標にした方法に限られていた。
【０００５】
また、ＧＬＵＴの一つであるＧＬＵＴ２は、腎の尿細管上皮細胞及び小腸の上皮細胞、それに肝細胞とすい臓のβ細胞に発現している。すい臓のβ細胞に存在するＧＬＵＴ２はインスリンの分泌に関係しており、食事等によって血糖値が上がるとβ細胞の膜にあるＧＬＵＴ２を介してグルコースがすい臓のβ細胞内に取り込まれ、その刺激によってインスリンが分泌される仕組みとなっている。この仕組みがうまく働かないと、β細胞からのインスリンの分泌が阻害される結果となる。そのため、このすい臓のβ細胞のＧＬＵＴ２をII型糖尿病の薬剤開発のための標的分子とする報告がなされている（特許文献４）。
【０００６】
一方、ＧＬＵＴ２のもうひとつの発現部位である肝臓においては、ＧＬＵＴ２は、インスリンによる刺激前に最初から細胞膜に存在しており、他のＧＬＵＴは実質的に存在しないため、肝臓では細胞内へのグルコースの取り込みはインスリンの作用に依存しないとされている。そのため肝臓の細胞膜におけるＧＬＵＴ２は、すい臓のβ細胞に存在するＧＬＵＴ２とは異なり、糖尿病等の疾患用薬剤の作用を評価したり、新たな薬剤をスクリーニングしたりするための標的分子として用いることは従来行われていない。
【０００７】
本発明者は、高血糖カイコを用いた糖尿病治療薬のスクリーニング系を用いて見出された単糖類であるガラクトースが、高血糖マウスの血糖値を低下させることを見出した（特許文献５）。そもそも、ガラクトースにはインスリンの分泌を促進する作用はないとされているので、ガラクトースは、インスリンとは異なる機序で血糖値を低下させている可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２５６３０９号公報
【特許文献２】特開２００３−０８１８２５号公報
【特許文献３】特開２００３−３０４９００号公報
【特許文献４】特表２００３−５２９３７９号公報
【特許文献５】ＷＯ／２０１０／００４９１６
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ikemoto,S., et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 923086-89, （1995）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の特許文献１及び特許文献２に記載されているＧＬＵＴ４の発現増強剤は、結局のところ、インスリンの作用が増強することによって、細胞内からのＧＬＵＴ４の細胞膜への移動が増強されているものと考えられる。また、特許文献４のすい臓のβ細胞のＧＬＵＴ２を標的分子とするその発現増強剤も、インスリンの作用を増強又は回復させることが、その剤の作用の主体となっているものと考えられる。
【００１１】
すなわち、これまで報告されているＧＬＵＴ４や、すい臓のβ細胞のＧＬＵＴ２を標的分子として見出された薬剤は、結果的にインスリンの作用を主体として働くインスリンの作用増強剤、インスリンの作用回復剤の範疇の薬剤であり、インスリンの作用に依存しない新たな作用機序と、それによる新たな効能を有する糖尿病予防・改善剤を提供するものではなかった。すなわち、従来は、糖の取り込み系の評価方法は、脂肪細胞や骨格筋細胞のＧＬＵＴ４の細胞膜へのアンカーリング（結合）を指標にした方法に限られていた。
【００１２】
本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、新規な糖尿病予防・改善剤の発見が可能な糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を提供することにある。更に、以上のような従来の糖尿病予防・改善剤とは異なる、すなわちインスリンの作用とは異なる新たな作用機序による糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記したように、本発明者は、高血糖カイコを用いて、ガラクトースが血糖値を低下させることを見出した（特許文献５）。そもそも、ガラクトースにはインスリンの分泌を促進する作用はないとされており、かかる結果から、インスリンの関与しない新たな血糖値低下のメカニズムが存在するのではないかと考えた。
【００１４】
そこで、ガラクトースの血糖値低下作用のメカニズムを解明することによって、上記課題を解決するための有力な情報を得ることができると考え、ガラクトースによる血糖値低下作用のメカニズム解明のための検討を行った結果、驚くべき事実が明らかとなった。
【００１５】
すなわち、ガラクトースの血糖降下作用が、肝臓の細胞膜へのＧＬＵＴ２の発現上昇によることを発見した。具体的には、高血糖化したマウスにガラクトースを投与し、その後に該マウスの肝臓の細胞膜画分中のＧＬＵＴ２の発現状況を、抗ＧＬＵＴ２抗体を用いたウェスタンブロット法で評価したところ、ガラクトースを投与したマウスの肝臓の細胞膜においては、ＧＬＵＴ２の発現量が増加していることを見出した。
【００１６】
肝臓の細胞膜上にはＧＬＵＴ２が元々存在しており、インスリンによる刺激によりその発現量は影響を受けないとされ、また、ガラクトースは、インスリンの分泌にはなんら作用を示さないとされている。ガラクトースにより、ＧＬＵＴ２の発現量が変化することは予想できるものではなかった。
【００１７】
血糖値低下作用のあるガラクトースは、肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量を増加させる、という新たな発見により、かかる「肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量の増加」を目安として、新たな糖尿病予防・改善剤がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。更に、新たな作用機序と効能を有する糖尿病予防・改善剤がスクリーニングできることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、以下である。
［１］肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）を標的分子としてスクリーニングすることを特徴とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法。
［２］被検対象物による、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量の増加の有無又は程度を評価してスクリーニングする［１］に記載の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法。
【００１９】
［３］少なくとも、以下の工程（１）、（２）及び（３）
（１）実験動物に被検対象物を投与する工程
（２）工程（１）によって得られた実験動物の肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量を測定する工程
（３）工程（２）で測定されたグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量が、陰性対照より増加している被検対象物を選択する工程
を有する［１］又は［２］に記載の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法。
【００２０】
［４］［１］ないし［３］に記載の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を使用して、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量を測定するように組み上げられたものであることを特徴とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、血糖降下作用を有する薬剤の探索、糖尿病予防・改善剤の探索において、肝臓の細胞膜へのＧＬＵＴ２の発現上昇を見る、という新しいスクリーニング方法を提供する。インスリンからは独立した、新たな糖尿病予防・改善剤をスクリーニングする方法を提供することができる。更に、従来の糖尿病予防・改善剤に比べて、新たな効能を有する糖尿病予防・改善剤を見出すことができるスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ガラクトースを被検対象物として、本発明スクリーニング方法を使用したときの、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量を陰性対照のＰＢＳと比較した図である。縦軸は、デンシトメーターで測定したＧＬＵＴ２バンドの強度を内部標準のバンド強度で補正した後の強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００２４】
本発明は、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−２）（以下、「ＧＬＵＴ２」と略記する）を標的分子としてスクリーニングすることを特徴とする糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法である。ここで、「肝細胞の膜画分」には、動物の肝臓の細胞の膜画分と、培養肝細胞の膜画分を含む。すなわち、本発明においては、操作上、実験動物の肝臓の細胞を用いる場合と、培養肝細胞を用いる場合とがある。
【００２５】
「糖尿病予防・改善剤」とは、糖尿病を予防する薬剤及び／又は糖尿病を改善する薬剤のことをいう。本発明において、「糖尿病予防・改善剤」における糖尿病には、Ｉ型糖尿病とII型糖尿病の何れをも含まれる。また、「ＧＬＵＴ２を標的分子として」とは、ＧＬＵＴ２を定性的又は定量的に検知して、その発現量の増加の有無又はその発現量の増加の程度を評価することをいう。
【００２６】
更に、本発明は、被検対象物による、肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量の増加の有無又は程度を評価してスクリーニングする上記の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法である。すなわち、被検対象物を投与することによって、肝細胞の細胞膜中のＧＬＵＴ２の発現量の増加が有ったか否か、又は、肝細胞の細胞膜中のＧＬＵＴ２の発現量の増加の程度を測定し、それらを評価することによって被検物質を取捨選択する糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法である。
【００２７】
本発明に用いられる実験動物としては、特に限定はないがマウス等を挙げることができ、特に、ストレプトゾトシン処理等により高血糖状態にしたマウス等の実験動物が好ましい。実験動物に被検対象物を投与し、一定時間経過後に肝臓を摘出し、細胞膜の画分を得て、各種のＧＬＵＴ２測定系でＧＬＵＴ２の発現量を測定する。被検対象物は、ＰＢＳ等の陰性対照に溶解して実験動物に投与することが好ましい。また、陰性対照のみを実験動物に投与して比較対照することが好ましい。
【００２８】
被検対象物の実験動物への投与方法（投与経路、投与量等）は、実験動物の種類、実験動物の状態、被検対象物の性状、試験の目的等を考慮して適宜決定する。具体的には、例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈注射、食餌等が挙げられる。本発明は、スクリーニング方法であることから、処理数、処理時間、処理の手間等を考慮して、投与方法を選択することが好ましい。
【００２９】
本発明に培養肝細胞を用いる場合は、動物の肝臓から肝実質細胞を調製し初代培養したものや、市販の肝細胞培養キットを用いることができる。培養肝細胞を用いる場合、グルコースを高濃度添加した培養液中に陰性対照と被検対象物をそれぞれ投与し、その後に、肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量を測定し、その増加の有無又は程度を評価して比較する。
【００３０】
被検対象物の培養肝細胞への投与は、培養液中に添加する形で投与すればよい。添加のために被検対象物を溶解する液については、肝細胞の生育やＧＬＵＴ２の発現量測定にできるだけ影響を与えないものを選択することが好ましい。そのようなものとして、例えば、ＰＢＳ、生理食塩液、培地液等を挙げることができる。
【００３１】
ＧＬＵＴ２の発現量の増加の有無又は程度の評価方法には特に限定はないが、具体的には、例えば、肝細胞の細胞膜画分を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、抗ＧＬＵＴ２抗体を用いてウェスタンブロット法によりバンドを検出する方法が好ましいものとして挙げられる。その際、内部標準として、元々膜画分に存在するＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ等を用い、抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ抗体等を用いたウェスタンブロット法を用いることができる。
【００３２】
本発明の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法の被検対象物は、特にその種類を問わないが、例えば、ペプチド、タンパク質、糖、糖ペプチド、糖タンパク質、非ペプチド化合物、既存合成化合物、新規合成化合物、天然物、発酵生産物、微生物培養物、各種の動物組織、植物組織、無機物等を挙げることができる。
【００３３】
本発明の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法において、スクリーニングにより候補薬剤を選択する基準は、測定方法や測定機器によって異なるものであるが、基本的な基準は、陰性対照の示す値に比して統計的に有意な差を認めるか否かによることが好ましい。例えば、ウェスタンブロットによって得られたバンドの強度は、デンシトメーター等によって定量化できるが、陰性対照の示す強度との比較で、統計的有意差ありと判定して選択することが好ましい。統計的有意差ありとの判定にはｔ検定を用いることが好ましく、その場合のｐは、特に限定はないが、ｐ＜０．１とすることも、ｐ＜０．０５とすることもできる。
【００３４】
本発明は、少なくとも、以下の工程（１）、（２）及び（３）を有する上記した糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法であることが特に好ましい。
（１）実験動物に被検対象物を投与する工程
（２）工程（１）によって得られた実験動物の肝細胞の膜画分中のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量を測定する工程
（３）工程（２）で測定されたグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）の発現量が、陰性対照より増加している被検対象物を選択する工程
【００３５】
工程（１）における実験動物については特に限定はないが高血糖状態にした動物であることが好ましい。また、工程（１）において、実験動物に被検対象物を投与するが、同時に陰性対照も投与することが好ましい。実験動物の種類や投与方法は上記した通りである。
【００３６】
工程（２）は、上記工程（１）によって得られた実験動物の肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量を測定する工程である。工程（１）と工程（１）の間に、ＧＬＵＴ２の発現量が増加する被検対象物の場合には増加するに十分な時間を経過させることが好ましい。かかる時間は特に限定はないが、通常１０分〜１０時間、好ましくは２０分〜７時間、特に好ましくは３０分〜４時間である。
【００３７】
肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量の測定方法としては前記した方法が挙げられる。工程（２）の後、被検対象物を投与された実験動物における肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２発現量を、陰性対照を投与された実験動物における肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２発現量と比較・評価する。
【００３８】
工程（３）は、上記工程（２）で測定されたＧＬＵＴ２の発現量が、陰性対照より増加している被検対象物を選択する工程である。増加していることの判定は、特に限定はなく、例えば前記した統計的処理をして判定することが好ましい。
【００３９】
本発明の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法を使用して、肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２の発現量を測定するように組み上げられた「糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キット」を用いれば、簡便に糖尿病予防・改善剤のスクリーニングができる。「糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キット」の構成は、実験動物用であるか培養肝細胞用であるかによりその構成内容が異なり、更にその測定方法がブロッティング法を用いるのか、その他の方法を用いるのか等によっても異なるが、前記したスクリーニング方法を知れば、常法に従って「糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キット」を組み立てることができる。
【００４０】
本発明のＧＬＵＴ２の発現量を測定するためのキットには、少なくともＧＬＵＴ２に特異的に結合するプローブに相当する構成品が含まれる。その例として、標識抗ＧＬＵＴ２抗体、ＧＬＵＴ２用ＤＮＡプローブ、あるいは抗ＧＬＵＴ２抗体とその抗体に特異的に結合する標識物の組み合わせ等を挙げることができる。また、ブロッティング法用キットであるならば、内部標準用の抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ抗体等を含んでいることが好ましい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例、検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
＜被検対象物の投与＞
被検対象物としてガラクトースを用い、実験動物として高血糖モデルマウスを用いた。ストレプトゾトシン処理により高血糖となったマウスに、ＰＢＳに溶解したガラクトースを、２００ｍｇ／（マウス体重ｋｇ）となるように腹腔内に投与した。また、陰性対照としてＰＢＳのみを同量、同方法で投与した。マウスは、それぞれ４匹を使用した。
【００４３】
＜肝細胞の膜画分の調製法＞
投与後、２時間経過したマウスの肝臓を摘出し、以下の方法で肝細胞の膜画分を調製した。すなわち、肝臓の組織を１０ｍｇ程度切り取り、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）中で、ハサミで細かく切り、３３００ｒｐｍで１０分間遠心した上清を、更に４５０００ｒｐｍで１時間遠心した。得られた沈殿を、１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー５０μＬで、懸濁した膜画分とした。
【００４４】
＜ＧＬＵＴ２の発現量の測定法＞
上記の膜画分を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動し、抗ＧＬＵＴ２抗体（ＡＬＰＨＡ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  社製）、及び、抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  社製）を用いたウェスタンブロット法によりバンドを検出した。バンドの検出にはデンシトメーターを用いた。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅは、肝細胞の膜に局在することが知られているタンパク質であり、内部標準として使用した。
【００４５】
＜結果＞
ガラクトース投与後の肝細胞の膜画分においては、抗ＧＬＵＴ２抗体を用いて検出されたバンド強度が、陰性対照であるＰＢＳ投与群のバンド強度と比べて強かった。そして、ｔ検定を行ったところ、Ｐ＜０．０５で統計的有意差が認められた（図１参照）。
【００４６】
ガラクトースの投与により、高血糖マウスの肝臓の膜画分におけるＧＬＵＴ２の量が増加した。図１に示した結果は、ガラクトースにより、肝臓におけるＧＬＵＴ２の膜移行の亢進による糖取り込みの促進が起こることを示唆している。前記したように、ガラクトースには血糖値を降下させる作用があるので（特許文献５参照）、ＧＬＵＴ２を標的分子としてスクリーニングすれば、糖尿病予防・改善剤をスクリーニングできることが分かった。
【００４７】
ＧＬＵＴ２の膜への移行を促進させることにより、血糖値を低下させるという作用機序の血糖降下物質はこれまでに報告されておらず、ガラクトースが初めてである。ガラクトースによる、ＧＬＵＴ２を介した組織へのグルコースの取り込み促進が認められことから、肝細胞の膜画分中のＧＬＵＴ２を標的分子としてスクリーニングすれば、新たな血糖降下剤や糖尿病予防・改善剤の発見、及び新たな作用機序の糖尿病予防・改善剤の開発につながることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の糖尿病予防・改善剤のスクリーニング方法と糖尿病予防・改善剤のスクリーニング用キットは、新たな作用機序又は効能を有する糖尿病予防・改善剤を提供することを可能にするという産業上の利用可能性を有している。
【図１】
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