(57)【要約】      （修正有）【課題】コハク酸およびその塩類からＮ−アルキルピロリドンを製造するにあたり、中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的に回収することによって、Ｎ−アルキルピロリドンを安価に製造する方法を提供する。【解決手段】バイオマス資源由来のコハク酸誘導体およびその塩を含む組成物とアルキル化剤を反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、反応終了後の反応混合物のｐＨを９．８以下に調整することを特徴とするＮ−アルキルコハク酸イミドを含む組成物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸およびその塩を含む組成物とアルキル化剤を反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、反応終了後の反応混合物のｐＨを９．８以下に調整することを特徴とする下記一般式（ＩＩ）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを含む組成物の製造方法。
【化１】
2011206020.tif 000007
（式中、ＸおよびＹは水素原子，ＮＨ４＋または他の１価のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【化２】
2011206020.tif 000008
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状のＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。）
【請求項２】
上記コハク酸およびその塩を含む組成物がバイオマス資源由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記Ｒ１がメチル基又はエチル基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸およびその誘導体は、ポリエステル等の樹脂原料や溶剤その他の化学品の重要な前駆体であり、種々の樹脂原料および化学品の前駆体への誘導化が研究されている。その中でも、環状アミド化合物であるピロリドン類は、洗浄溶剤や抽出剤として、金属、電子材料分野で用いられている。
具体的には、（Ｎ−アルキル）ピロリドンの合成法として、Ｎ−アルキルコハク酸イミドと水素から、還元触媒存在下でＮ−アルキルピロリドンを合成する方法が知られており（特許文献１，２）、コハク酸およびその塩類、酸無水物、またはコハク酸エステルから（Ｎ−アルキル）コハク酸イミドを経由するか、または直接的に（Ｎ−アルキル）ピロリドンを得る方法（特許文献３、４）が一般的である。また、コハク酸およびその塩類、酸無水物からコハク酸イミドおよび２−ピロリドンを経由してＮ−アルキルピロリドンを得ることもできる（特許文献５、６）。
コハク酸は、従来はブタンより合成した無水マレイン酸から石油化学的方法によって製造されるのが一般的であったが、近年、バイオマス資源を原料とした発酵製造法での研究が進み、発酵による工業的規模でのコハク酸製造の可能性も期待される（非特許文献１，２）。
特許文献４および６には、発酵製造法によるコハク酸を原料としたＮ−メチルピロリドンの合成法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６２-２８９５５７号公報
【特許文献２】特開昭６３-２７４７４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００２/１０２７７２号パンフレット
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００４/０５８７０８号パンフレット
【特許文献５】特開昭６３-２７４７６号公報
【特許文献６】特表２００８-５３１０６７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，Ｖｏｌ．１０７，Ｎｏ．６，２４１７−２４２１
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．，２００９，１１，１３−１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
コハク酸およびその誘導体からピロリドン類を製造する方法において、例えばコハク酸アンモニウム塩またはコハク酸とアンモニアの混合物とアルコールから合成したＮ−アルキルコハク酸イミドを、触媒存在下で水素化してＮ−アルキルピロリドンを製造する場合、触媒反応を良好に実施し、低コストで製造するためには、中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的に回収することが好ましい。
【０００６】
中間体の回収方法としては、晶析、蒸留、抽出、クロマトグラフィなどから選択することができるが、発酵製造法によるコハク酸およびその塩類を原料とした場合、発酵工程で使用した水との分離が問題となる。晶析や蒸留によりＮ−アルキルコハク酸イミドを回収
する場合、反応後の濃縮工程で多量の水を留去しなければならないため、エネルギーコストがかかる。クロマドグラフィによる分離も濃縮が必要であり、また、大規模な工業生産には不向きである。
【０００７】
ここで、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを有機溶媒により抽出する場合は、水を留去する必要がないため、水分離でのエネルギーを低減でき、大規模な工業生産に適しているため、有用と考えられる。
しかしながら、コハク酸およびそのアンモニウム塩類、特に発酵製造法によるコハク酸アンモニウム塩水溶液、からＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する場合には、反応混合物中のＮ−アルキルコハク酸イミド濃度は、加水分解反応により経時的に低下することが判明した。Ｎ−アルキルコハク酸イミドの加水分解生成物であるＮ−アルキルスクシナミン酸は、水との親和性が高く有機溶媒に抽出されにくいため回収率が低下し、結果として製品コストを上げることになる。
【０００８】
本発明は、コハク酸およびその塩類からＮ−アルキルピロリドンを製造するにあたり、中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的に回収することによって、Ｎ−アルキルピロリドンを安価に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、コハク酸およびそのアンモニア塩類、酸無水物、コハク酸エステル、その他のコハク酸誘導体およびそれらとアンモニアの混合物からＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する反応終了後に反応混合物のｐＨを特定範囲に調整することにより、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に回収できることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は以下のとおりである。
[１] 下記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸およびその塩を含む組成物とアルキル化剤を
反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、反応終了後の反応混合物のｐＨを９．８以下に調整することを特徴とする下記一般式（ＩＩ）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを含む組成物の製造方法。
【００１１】
【化１】
2011206020.tif 000002
【００１２】
（式中、ＸおよびＹは水素原子，ＮＨ４＋または他の１価のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【００１３】
【化２】
2011206020.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状のＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。）
[２] 上記コハク酸およびその塩を含む組成物がバイオマス資源由来であることを特徴と
する[１]に記載の方法。
[３] 上記Ｒ１がメチル基又はエチル基であることを特徴とする[１]又は[２]に記載の方
法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安価にＮ−アルキルピロリドンを製造することができる。特に、バイオマス資源由来の発酵製造法によるコハク酸およびその塩類を原料として、中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的に回収し、Ｎ−アルキルピロリドンの製造コストを下げることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施形態の一例(代表例)であり、本発明のその要旨を超えない限り、これらの内容に特定はされない。
＜コハク酸およびその塩を含む組成物＞
本発明に係るコハク酸およびその塩とは、下記式（Ｉ）で表される化合物である。
【００１７】
【化３】
2011206020.tif 000004
【００１８】
ＸおよびＹとは、水素原子，ＮＨ４＋または他の１価のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋である。
本発明に係る他の１価のカチオンとしては、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンが挙げられる。
本発明に係るコハク酸およびその塩は、具体的には、コハク酸ジアンモニウム、コハク酸モノアンモニウム、コハク酸アンモニウムナトリウム等のアンモニウム塩が挙げられる。その中でも好ましくは、コハク酸ジアンモニウム、コハク酸モノアンモニウムのような他の１価のカチオンを含まないアンモニウム塩である。これらの化合物の混合物であっても良い。
【００１９】
なお、本発明に係るコハク酸およびその塩は、コハク酸二ナトリウム、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二カリウム、コハク酸一カリウム、コハク酸マグネシウム、コハク酸カ
ルシウム等のＮＨ４＋を含まないコハク酸塩にＮＨ４＋を含有する化合物を加えて調製することもできる。ＮＨ４＋を含有する化合物は、特段の制限はないが、アンモニア水、炭酸アンモニウム等が挙げられる。化合物（Ｉ）を含む組成物のＮＨ４＋の含有量は、コハク酸１モルに対して、通常１モル以上、より好ましくは１．２モル以上、一方、通常５モル以下、好ましくは３モル以下である。少なすぎると、反応収率が下がるという傾向があり、多すぎると、加水分解等の好ましくない副反応が起こりやすくなるという傾向がある。
【００２０】
本発明に係るコハク酸およびその塩を含む組成物は、石油や石炭を原料として石油化学的手段によって製造されたものでもよいが、バイオマス資源由来のものであるのが環境保護の点から好ましい。
本発明に係る組成物中のコハク酸及びその塩の濃度は、特段の制限はないが、コハク酸濃度として通常１重量%以上、好ましくは１０重量%以上、一方、通常８０%重量以下、好
ましくは７０重量%以下である。該濃度が薄すぎると、反応工程での操作性や効率性に問
題が生じる可能性があり、該濃度が濃すぎると、コハク酸及びその塩が析出する問題が生じる可能性がある。
【００２１】
バイオマス資源としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣であり、最も好ましくはとうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシである。これらのバイオマス資源は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属、アルカリ土類金属を含有する。
【００２２】
そしてこれらのバイオマス資源は、特に限定はされないが、例えば酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その工程には、特に限定はされないが、例えば、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。こうして微細化されたバイオマス資源は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導されるが、その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法や、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的方法、微生物や酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。  
【００２３】
上記のバイオマス資源から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の脂肪酸、グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、これらの中では、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等
のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類が好ましく、このうちグルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セルロースが好ましい。
【００２４】
本発明においては、これらのバイオマス資源から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸が誘導される。具体的には、例えば、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法や加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応・還元反応等の反応工程を含む化学変換法ならびにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによりジカルボン酸が合成されるが、これらの中でも脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法が好ましい。  
【００２５】
脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物は脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物であるかぎり特に制限されないが、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌、酵母菌などが挙げられ、好気性微生物、通性嫌気性微生物または微好気性微生物を使用することが好ましい。
好気性微生物としては、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌などが挙げられ、コリネ型細菌がより好ましい。
【００２６】
コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌が挙げられる。
【００２７】
脂肪族ジカルボン酸生産菌としてコハク酸生産菌を用いる場合、後述の実施例に記載のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下した株を用いることが好ましい。
微生物変換における反応温度、圧力等の反応条件は、選択される菌体、カビなど微生物の活性に依存することになるが、ジカルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
【００２８】
微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、通常には中和剤を使用する。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加によりｐＨを調節する。ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整される。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
【００２９】
中和剤としてはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩が挙げられる。好ましくはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素である。なお上記アルカリ（土類）金属の水酸化物としてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｍｇ（ＯＨ）２等、或いは
これらの混合物などが挙げられ、アルカリ（土類）金属の炭酸塩としては、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３、ＮａＫＣＯ３等、或いはこれらの混合物などが挙げられる。
【００３０】
本発明においては、微生物変換後の発酵液は、その後の精製工程での操作性や効率性を考慮して適宜濃縮しても良い。濃縮方法としては、特に限定されないが、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法、減圧で水を留去させる方法ならびにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。
なお、本発明の方法において発酵液を用いる場合、微生物を除去した後の発酵液を用いることが好ましい。微生物の分離方法は、限外ろ過膜や遠心分離等既存の方法を任意に用いることができる。また、微生物変換後の発酵液をオートクレーブ滅菌、加熱滅菌又は低温殺菌しても良い。
【００３１】
本発明に係るコハク酸およびその塩を含む組成物は、上記のようにして得られた発酵液に含まれるコハク酸およびその塩をそのまま用いることができるが、後述する発酵液に含まれるコハク酸およびその塩をコハク酸への変換方法およびその精製方法を用いて得られたコハク酸を、必要に応じて前記ＮＨ４＋を含有する化合物とともに用いてもよい。
以下に発酵液に含まれるコハク酸の塩をコハク酸へ変換する方法および精製する方法を例示するが、これに限定されるものではない。また、コハク酸に変換された以降の精製工程のうち、任意の工程から取り出して用いてもよい。
【００３２】
＜コハク酸変換方法＞
コハク酸への変換は、目的とするコハク酸よりもｐＨの高い弱酸性の有機酸を使用した反応晶析方法によりコハク酸に変換しても良い。このような有機酸としては、例えば、酢酸が挙げられる。また、別法として、上記発酵により得られたコハク酸およびその塩を無機酸でコハク酸に変換しても良い。ここで、使用する無機酸としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが例示される。より具体的には、コハク酸発酵の場合、生成したコハク酸をアンモニアや水酸化マグネシウムで中和しながら発酵を行うと、発酵液中にはコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムが生成する。このようなコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムを含む発酵液を硫酸等で処理すると、コハク酸を含む水溶液が得られる。
【００３３】
コハク酸を含む溶液或いは水溶液とはコハク酸を主体として含む溶液或いは水溶液である。従って、上記のようなコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムのようなコハク酸塩を主体として含む溶液或いは水溶液はコハク酸塩を含む溶液或いは水溶液と表す。ここでいう「主体として含む」状態とは、溶媒を除く全成分の重量に対する該成分の重量が、通常５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、特に好ましくは９０重量％以上含まれる状態を示す。
【００３４】
＜コハク酸精製＞
上記の無機酸でコハク酸に変換した水溶液は、特には限定されないが、有機溶媒を用いて該水溶液からコハク酸を抽出したり、濃縮および晶析、塩析しても良い。    
さらに上記で得られたコハク酸はその用途に応じ、乾燥処理またはさらに高度精製処理を施すこともできる。例えば活性炭等の吸着剤による脱色工程、イオン交換樹脂により共存イオン類を除去するイオン交換工程、共存する不飽和ジカルボン酸を水添処理する工程、さらに高度精製するための晶析工程などの処理が考えられる。
【００３５】
＜アルキル化剤＞
本発明に係るアルキル化剤は、特段の制限はないが、直鎖、分岐または環状のＣ１〜Ｃ６のアルキルアルコールまたはアルキルアミン類が挙げられる。その中でも好ましくは、
直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ４のアルキルアルコールまたはアルキルアミン類である。具体的には、メタノール、エタノール、プロパノールまたはブタノール、メチルアミン類、エチルアミン類、プロピルアミン類またはブチルアミン類が挙げられ、これらの混合物であってもよい。より好ましくは、メタノールまたはエタノールが用いられ、これらのアルコールと対応するアルキルアミン類との混合物も有利に用いられる。
【００３６】
本発明において、コハク酸およびその塩を含む組成物中のコハク酸およびその塩に対して、化学量論または化学量論量を超えるアルキル化剤が用いられる。好ましくは該コハク酸およびその塩に対して、通常１倍モル以上、一方、通常１００倍モル以下、好ましくは５０倍モル以下、より好ましくは、２５倍モル以下のアルキル化剤が用いられる。アルキル化剤が少なすぎると、反応収率が下がる傾向にあり、アルキル化剤が多すぎると、副反応が生じる傾向にある。また、触媒を使用しても良い。
【００３７】
＜Ｎ−アルキルコハク酸イミド＞
本発明に係るＮ−アルキルコハク酸イミドとは、下記式（ＩＩ）で表される化合物である。
【００３８】
【化４】
2011206020.tif 000005
【００３９】
本発明に係るＲ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状のＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。
本発明に係るＲ１の直鎖、分岐または環状のアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロ
プロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。その中でも好ましくは直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ４のアルキル基であり、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、tert-ブチル基である。最も
好ましくは、メチル基、エチル基である。上記Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基は置換されていても良い。
【００４０】
置換されていても良い置換基とは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、エーテル基、チオエーテル基、ハロゲン原子等である。
＜イミド化反応条件＞
本発明において、該コハク酸およびその塩を含む組成物と該アルキル化剤を反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、反応終了後の反応混合物のｐＨを９．８以下に調整することを特徴とする。
【００４１】
＜イミド化反応終了後の反応混合物のｐＨ制御＞
コハク酸およびその塩類とアルキル化剤を原料としたＮ−アルキルピロリドンの製造の中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドの製造工程の反応終了後の反応混合物のｐＨは９．８以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９以下、更に好ましくは８．５以下、特に好ましくは８以下、一方、下限に特段の制限はないが、通常２以上、好ましくは３
以上、より好ましくは４以上、更に好ましくは５以上、特に好ましくは５．５以上に調整される。
【００４２】
反応混合物のｐＨが低すぎると、反応器の腐蝕という問題が生じる傾向にあり、反応混合物のｐＨが高すぎると、反応混合物中のＮ−アルキルコハク酸イミドの加水分解反応が進行し、該加水分解生成物であるＮ−アルキルスクシナミン酸は、水との親和性が高く有機溶媒に抽出されにくいためＮ−アルキルコハク酸イミドの回収率が低下し、結果として製品コストが上がるという問題が生じる。
【００４３】
反応終了後の反応混合物のｐＨ制御は、例えば以下のように行われるが、これに限定されるものではない。また、反応中にｐＨ制御を行ってもよい。
反応終了後のｐＨ制御の方法としては、例えば、反応で発生した塩基性成分を反応終了後速やかに除去する方法を挙げられる。具体的には、標準圧力下または減圧下で低沸点の塩基性成分を留去する方法や、反応混合物中に不活性ガスを吹き込み、低沸点成分を揮発させて除去する方法などが有効である。また、反応終了後、反応混合物が所定のｐＨ範囲となるように、中和剤を添加する方法も有効である。
【００４４】
反応中のｐＨ制御の方法としては、例えば、反応進行に伴って発生する低沸点の塩基性成分を反応系中から除きながら反応する方法が挙げられる。具体的には、冷却管を備えた耐圧の反応器を用いて低沸点のガス成分のみを留去し、その他の成分は凝集させて反応系中に戻しながら反応する方法や、反応系中に不活性ガスを吹き込み、低沸点成分を気相に分配させ、気相の一部をパージしながら反応する方法などが有効である。また、反応中に反応混合物のｐＨをモニターし、反応系中が所定のｐＨ範囲に保持されるように、中和剤を逐次添加しながら反応する方法も有効である。あるいは、反応混合物を所定のｐＨに保持することが出来る緩衝液の存在下で反応を行ってもよい。
【００４５】
ここで、反応中または反応終了後の反応混合物のｐＨ制御に用いられる中和剤は、反応混合物を所定のｐＨ範囲に保持できるものであれば限定されるものではなく、無機または有機の酸化合物を用いることができる。酸化合物の形態は、気体であっても、液体であっても、固体であってもよい。例えば、無機酸としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが挙げられる。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、乳酸などの脂肪族カルボン酸類、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、などのスルホン酸類、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、アジピン酸、シクロヘキサンジカルボン酸などの脂肪族ジカルボン酸類などが挙げられる。固体酸としては、スルホン酸型イオン交換樹脂やスルホン酸基を無機支持体に担持した無機固体酸などが挙げられる。
【００４６】
例えば、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造において、原料となるコハク酸およびその塩類としてコハク酸発酵液やコハク酸ジアンモニウム塩を用いた場合、反応開始時の原料混合物のｐＨは通常６〜８程度の範囲であるが、反応の進行に伴って塩基性成分が遊離し、反応中および反応終了直後における反応混合物のｐＨは１０を超える範囲まで上昇する。反応混合物のｐＨが高い塩基性を示すようになると、反応混合物中のＮ−アルキルコハク酸イミドの加水分解反応が進行し、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの収率が低下する。Ｎ−アルキルピロリドン製造の中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドの効率的な回収方法として、有機溶媒により抽出する方法が挙げられるが、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの加水分解生成物であるＮ−アルキルスクシナミン酸は、水との親和性が高く有機溶媒に抽出されにくいためにＮ−アルキルコハク酸イミドの回収率が低下し、結果として製品コストを上げることになる。反応中または反応終了後の反応混合物のｐＨを１０以下に調整することにより、Ｎ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルスクシナミン酸への加水分解反応が抑制され、より効率的にＮ−アルキルピロリドン製造の中間体であるＮ−アルキ
ルコハク酸イミドを回収することができ、工業的にも有利である。
【００４７】
＜イミド化反応温度＞
本発明に係るイミド化反応温度は、特段の制限はないが、通常５０℃以上、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃であり、一方、通常５００℃以下、好ましくは４５０℃の範囲、より好ましくは４００℃以下である。温度が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、温度が高すぎると、好ましくない副反応が起こったり、反応器内で有機物が焦げ付くという問題が生じる傾向がある。
【００４８】
＜イミド化反応圧力＞
本発明に係るイミド化反応圧力は、特段の制限はないが、通常大気圧以上、好ましくは０．５ＭＰａ以上、より好ましくは１ＭＰａ以上であり、一方、通常３０ＭＰａ以下、好ましくは２５ＭＰａ以下、より好ましくは２０ＭＰａ以下である。反応実施温度での原料および反応物の蒸気圧であっても、その他のガス成分により加圧されていてもよく、気相及び／または液相で実施される。
【００４９】
＜イミド化反応方法＞
本発明に係るイミド化反応方法は例えば以下の手順で行われるが、これに限定されるものではない。
a) コハク酸およびその塩を含む組成物とアルキル化剤を所定の反応温度・圧力にて反応
させる。
b) コハク酸およびその塩を含む組成物とアルキル化剤を所定の反応温度で反応させた後
、再度所定の反応温度・圧力で反応させ、それぞれの反応温度・圧力は同じでも異なっていてもよい。
c) コハク酸およびその塩を含む組成物のみを予め所定の反応温度・圧力にて処理した後
、アルキル化剤を加えて所定の反応温度・圧力で反応させ、それぞれの反応温度・圧力は同じでも異なっていてもよい。
【００５０】
反応温度・圧力を変えて２段階で反応する場合で、特に１段目をコハク酸組成物のみ２段目をアルキル化剤を加えて反応する場合においては、通常２段目の反応条件は１段目より高温・高圧下で実施することが好ましく、１段目の反応を１００℃〜３００℃の温度で、２段目の反応を１５０℃〜４００℃の温度で実施することが有利である。これは、コハク酸およびそのアンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とからＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する過程において、コハク酸骨格から窒素原子を含む５員環であるコハク酸イミド構造に環化する過程と、アルコール等のアルキル化剤により窒素原子をアルキル化する過程とでは、前者より後者において、より高い反応温度を必要とするためである。反応温度は、高いほど環化およびアルキル化に有利であるが、副反応の抑制と省エネルギーの観点から、上述の温度範囲がより有利である。
【００５１】
＜Ｎ−アルキルコハク酸イミドの精製＞
後述する触媒存在下で水素化してＮ−アルキルピロリドンを製造する場合、触媒反応を良好に実施し、低コストで製造するためには、コハク酸およびその塩を含む組成物とアルキル化剤を反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドが合成された混合物から、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に回収する必要がある。水素化反応に供するＮ−アルキルコハク酸イミドは、反応混合物をそのまま使用するか、反応混合物中の軽沸成分を留去し、濃縮して使用することもできるが、目的とする触媒反応を良好に実施し、低コストで製造するためには、精製して使用することが好ましい。特に、コハク酸およびその塩を含む組成物がバイオマス資源由来である場合には、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの回収および精製方法としては、晶析、蒸留、抽出、クロマトグラフィなど、公知の方法から選択するこ
とができ、複数の方法を組み合わせてもよい。その中でも好ましくは有機溶媒による抽出である。というのも、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを有機溶媒により抽出する場合は、水を留去する必要がないため、水分離でのエネルギーを低減でき、大規模な工業生産に適しているため、有用である。また、発酵由来の水溶性の不純物の大部分を水と共に分離することが出来るため、精製効果も高い。
【００５２】
アルキル化剤として使用したアルコールの未反応分が、Ｎ−アルキルコハク酸イミド抽出後の有機溶媒と水との分離を悪くする場合には、抽出前にアルコールを分離しても良い。
本発明に係る抽出用有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ヘキセン、オクテン等の不飽和炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、蟻酸プロピル、プロピオン酸メチル等のエステル系溶媒、ブタノール、ヘキサノール、オクタノール、２−エチルヘキサノール等のアルコール系溶媒、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート等のカーボネート系溶媒が挙げられる。好ましくは、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、蟻酸プロピル、プロピオン酸メチル等のエステル系溶媒、ブタノール、ヘキサノール等のアルコール系溶媒、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート等のカーボネート系溶媒が挙げられる。
【００５３】
抽出は一段で行っても、多段で行ってもよい。また溶剤は反応液に対してクロスフローで流しても、カウンターフローで流しても構わない。一段の抽出では充分な収率が得られない場合は、抽残相と新たな溶剤を向流多段抽出で混合し、収率を向上させても良い。
続く還元工程に供する際には、抽出溶媒が水素化反応に悪影響を及ぼさない限り、そのまま抽出液を用いても、抽出溶媒を分離して用いてもよい。抽出溶媒として使用した有機溶媒は、例えば蒸留により分離することができ、有機溶媒は水と比較してその潜熱が小さいため、蒸留分離にかかる熱エネルギーが小さく、環境的への負荷も小さい。
【００５４】
上記記載のｐＨ制御工程と抽出工程を組み合わせることで、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に抽出することができる。Ｎ−アルキルコハク酸イミドの選択率は、特段の制限はないが、Ｎ−メチルコハク酸イミドの場合には、通常８３．５％以上、好ましくは８４％以上、より好ましくは８４．５％以上である。Ｎ−アルキルスクシナミン酸に対するＮ−アルキルコハク酸イミドの比は、特段の制限はないが、２５℃におけるＮ−メチルスクシナミン酸に対するＮ−メチルコハク酸イミドの比の場合には、通常１０．５以上、好ましくは１１以上、より好ましくは１２以上、更に好ましくは１３以上、特に好ましくは１４以上であり、一方、上限に特段の制限はないが、通常２００以下、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、更に好ましくは２５以下である。
【００５５】
＜Ｎ−アルキルピロリドンを含む組成物への還元工程＞
本発明に係るＮ−アルキルコハク酸イミド含む組成物からＮ−アルキルピロリドンを含む組成物への還元工程は、触媒の存在下で水素を用いる接触水素化反応、複合水素化物を用いる水素化反応、または、例えばメタノールやイソプロパノール等のアルコールがアルデヒドやケトンに変換されながら水素を供給する水素移動反応等によって行われる。その中でも好ましくは、接触水素化反応であり、気相または液相で実施することができる。バッチ式、連続式いずれの反応形式でもよく、従来の公知の方法に従って行うことができる
。水素化反応に供するＮ−アルキルコハク酸イミド含む組成物は、そのまま用いても、反応に悪影響を及ぼさない溶媒で希釈して用いてもよい。目的とする触媒反応を良好に実施し、低コストで製造するためには、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを精製して使用することが好ましい。
【００５６】
本発明に係る水素化反応温度は、特段の制限はないが、通常５０℃以上、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃以上、一方、通常４００℃以下、好ましくは３５０℃以下、より好ましくは３００℃以下である。温度が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、温度が高すぎると、炭素窒素結合が水素化分解される等の好ましくない副反応が進行するという問題が生じる傾向がある。
【００５７】
本発明に係る水素化反応圧力は、特段の制限はないが、通常大気圧以上、好ましくは０．５ＭＰａ以上、より好ましくは１ＭＰａ以上であり、一方、通常３０ＭＰａ以下、好ましくは２５ＭＰａ以下、より好ましくは２０ＭＰａ以下である。圧力が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、圧力が高すぎると、目的物の水添反応が進行し、過水添副生物が多くなるという問題が生じる傾向がある。
【００５８】
反応実施温度での原料および反応物の蒸気圧であっても、その他のガス成分により加圧されていてもよく、気相または液相で実施される。
水素化反応の具体的な方法としては、加圧反応器にＮ−アルキルコハク酸イミド含む組成物と水素化触媒とを共存させ、この混合物を撹拌しながら水素ガスを導入して水素処理を行い、処理後の反応混合物を水素化触媒と分離して反応器から取り出す方法、固定床多管式または単管式の反応器を用いてＮ−アルキルコハク酸イミド含む組成物および水素ガスを反応器の上部または下部から流通させながら水素処理を行い、処理後の反応混合物を取り出す方法あるいは水素ガスを反応器の下部から、Ｎ−アルキルコハク酸イミド含む組成物は上部から流通させて水素処理を行い、処理後の反応混合物を取り出す方法、また、流動床反応器を用いた方法などが挙げられる。
【００５９】
＜接触水素化触媒＞
本発明に係る接触水素化触媒としては、公知の均一系ならびに不均一系の水素化触媒を用いることができる。具体的には、特に限定はされないが、好ましくは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、レニウム、白金、銅、ニッケル、コバルト、鉄、マンガン、クロム、亜鉛、スズ、インジウムおよびアンチモンなどの金属を１種以上含む水素化触媒が用いられ、より好ましくは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、レニウム、白金、銅、ニッケル、コバルト、クロム、亜鉛、スズなどの金属を１種以上含む水素化触媒が用いられる。
【００６０】
これら水素化触媒は上記の金属を含む化合物をそのまま使用したり、有機ホスフィンなどの配位子を共存させて使用することができるが、触媒分離の容易性の理由から不均一系の金属含有触媒が好ましい。
これらの触媒活性成分となる金属を含む化合物をシリカやチタン、ジルコニア、活性アルミナなどの金属酸化物またはこれらの複合金属酸化物、或いは活性炭共存下で用いるか、または上記の金属をシリカやチタン、ジルコニア、活性アルミナなどの金属酸化物またはこれらの複合金属酸化物、或いは活性炭などの担体に担持した担持触媒とが好適に使用される。ここで用いられる担体は、モンモリロナイト、シリケートおよびゼオライトのように特異な構造を有しているものでもよい。また、上記の触媒活性成分となる金属を酸化物或いは複合酸化物として含む、沈殿触媒として用いてもよく、担体成分の存在下で生成させた沈殿触媒を用いることもできる。触媒活性成分金属の含有量は、触媒全体に対して
、通常約０．１〜９０重量％以下である。貴金属担持触媒においては、好ましくは約０．１〜約５０重量％の含有量であり、金属酸化物の沈殿触媒においては、好ましくは約１０〜約９０重量％の含有量である。
【００６１】
本発明において、上述の水素化触媒の触媒活性金属の種類、多種金属の組み合わせ、担体との組み合わせや、触媒活性金属の含有量および調製方法は、目的とする水素化反応に悪影響を及ぼさない限り、任意の組み合わせが可能であり、限定されるものではない。
不均一触媒の使用においては、反応開始時に存在する水素によって、反応系中で活性化して使用することができるが、使用前に水素存在下で活性化した触媒を用いてもよい。使用前の触媒活性化は、触媒に悪影響を及ぼさない溶媒の存在下あるいは非存在下で、バッチ式反応器内で水素処理する方法、連続式の固定床反応器あるいは流動床反応器に触媒を入れ、水素を流通させて水素処理する方法などが挙げられる。水素処理における温度および圧力は、それぞれの触媒に適した範囲から選択される。
【００６２】
＜水素＞
使用する水素は、純水素でもよいが、窒素、ヘリウム、アルゴンなどの不活性ガスで希釈させたものも使用できる。水素ガス中の一酸化炭素濃度は、水素処理効率への影響が懸念される為、通常、１００００ｐｐｍ以下、好ましくは、２０００ｐｐｍ以下、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下である。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明の実施例を示して本発明について更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
下記例における酸類、糖類、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）及びＮ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）の定量分析はLCを用い、アミノ酸の定量分析はアミノ酸分析計を用い、以下の条件で測定を行った。
【００６４】
＜酸類、糖類の分析＞
カラム；信和加工（株）製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩ．Ｄ．  ×  ３０ｃｍ
溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
【００６５】
＜アミノ酸の分析＞
装置：日立アミノ酸分析計  Ｌ−８９００
分析条件：生体アミノ酸分離条件-ニンヒドリン発色法(５７０ｎｍ,４４０ｎｍ)
標準品：ＰＦ（和光アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型０．８ｍｌ＋Ｂ型０．８ｍｌ→１０ｍｌ）
注入量：１０μｌ
定量計算：Ｐｒｏは、４４０ｎｍ、他のアミノ酸は５７０ｎｍのピークの面積から、一点外部標準法にてアミノ酸含有を算出
【００６６】
＜コハク酸、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）及びＮ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）の定量分析＞
カラム：イオン交換カラム  ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＨ  ８ｍｍ  ×  ３００ｍｍ
温度：５０℃
溶離液：０.１％−トリフルオロ酢酸水溶液
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２０μｌ
検出器：ＲＩ検出器
【００６７】
＜ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）増強株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒３０５-８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番
号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００６８】
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４
０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ
４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲ
の鋳型ＤＮＡに使用した。
【００６９】
（Ｂ）ＰＣ遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：
ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ
製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【００７０】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μ
Ｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バ
ッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅ
ｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
【００７１】
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモ
ーター：：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【００７２】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、実施例１（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、
１ｍＭ ＭｇSＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温
度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩ
ＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン
酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ
−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０
．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
【００７３】
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＰＣ遺伝子の５’上流領域
とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した。
【００７４】
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.１４４, p.１８１-
１８５, １９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ２５μｇ／ｍＬ
を含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上
に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した
。
【００７５】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性の測定
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をグルコース２％を含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯ
Ｎ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００mM Tris/HCl緩衝
液（ｐＨ７.５）、 ０.１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
炭酸水素ナトリウム、５ｍＭピルビン酸ナトリウム 、５ｍＭアデノシン３リン酸ナトリ
ウム、０.３２ ｍＭ  ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１.５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
（ＷＡＫＯ製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼの発現を強化した無細胞抽出液における比活性は  ０.１Ｕ／ｍｇ蛋白質
であった。尚、親株であるＭＪ２３３/△ＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、本活性測
定方法検出限界以下であった。
以下、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を有機酸生産菌として菌体調製用培養、および有機酸生産反応に用いた。
【００７６】
［コハク酸塩含有培養液の調製］
＜種培養＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬを添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨを接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００７７】
＜本培養＞
硫酸アンモニウム：１．０ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、塩化カリウム：１．６７ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１．０ｍｇ、塩酸チアミン：１．０ｍｇ、酵母エキス１０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：１．０ｇ及び蒸留水：１０００ｍＬの培地４００ｍＬを１Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した７２％グルコース水溶液：２０ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を２０ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは９．３％アンモニア水を用いて７．０以下にならないように保ち、通気は毎分３００ｍＬ、攪拌は毎分６００回転で２４時間本培養を行った。溶存酸素濃度は培養開始直後から徐々に低下し、培養開始後４時間でほぼ０となった。その後、培養開始後１５時間で溶存酸素濃度が上昇したため、あらかじめ滅菌した７２％グルコース水溶液を３８０μＬ添加したところ、再び急速に低下し、ほぼ０となった。約１３分後同様に溶存酸素濃度の上昇が観察されため、あらかじめ滅菌した７２％グルコース水溶液を３８０μＬ添加し再び低下させた。以後、約１３分毎に同様の上昇が見られたが、その都度同様の方法で低下させた。培養２４時間後のOD６６０は８７．３であった。
【００７８】
＜コハク酸生産＞
リン酸１アンモニウム：８４．４ｍｇ、リン酸２アンモニウム：７５．８ｍｇ、塩化カ
リウム１４９．１ｍｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、１Ｌのジャーファーメンターに入れた。この懸濁液２００ｍＬに上記の本培養により得られた培養液９０ｍＬ、あらかじめ滅菌した７２％グルコース溶液：４０ｍＬ、滅菌水：１２５ｍＬを添加して混合し、３５℃に保温した。ｐＨは炭酸アンモニウム：１５４ｇ、２８％アンモニア水：２３９ｍｌ、蒸留水：６５０ｍＬの水溶液を用いて７．６に保ち、毎分２００回転で攪拌しながら有機酸生産反応を行った。反応開始後２１時間における生産コハク酸濃度は３４．８ｇ／Ｌ、生産リンゴ酸濃度は３．１ｇ／Ｌ、生産フマル酸濃度は１．１ｇ／Ｌ、生産酢酸濃度は５．０ｇ／Ｌ、アラニン濃度は２．１ｇ／Ｌ、バリン濃度は１．４ｇ／Ｌであった。
また、本培養液には、トレハロース０．２７ｇ／Ｌ、未反応グルコース０．３７ｇ／Ｌが含有していた。
このようにして調整したコハク酸発酵液を分画分子量１３００の限外ろ過膜により菌体を分離し、減圧加温下で濃縮して以下の実施例、比較例に供した。
【００７９】
［実施例１］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、上記有機酸生産培養で得られたコハク酸濃度２５．０６重量％のコハク酸発酵液１０．０２５ｇとメタノール１５．０１６ｇを仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、生成物組成を上記の分析方法にて分析した。コハク酸転化率９７．３％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率８３．８％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率５．５６％であった。該反応液を１Ｎ−塩酸にてｐＨを９．５に調整し、５日後に生成物組成を分析し、それぞれのｐＨでのＮ−メチルコハク酸イミド選択率／Ｎ−メチルスクシナミン酸選択率の比（ＭＳＩ／ＮＭＳＡ比）を求め、表１に示す。
【００８０】
［実施例２］
反応後のｐＨを９．０４に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表1に示
す。
［実施例３］
反応後のｐＨを８．５０に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００８１】
［実施例４］
反応後のｐＨを７．９９に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
［実施例５］
反応後のｐＨを７．５３に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００８２】
［実施例６］
反応後のｐＨを７．０６に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
［実施例７］
反応後のｐＨを６．５１に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００８３】
［実施例８］
反応後のｐＨを６．００に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示
す。
［比較例１］
反応後のｐＨ調整を行わなかったこと以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００８４】
［比較例２］
反応後のｐＨを１０．０１に調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００８５】
【表１】
2011206020.tif 000006
【００８６】
表１に示すように、反応混合物を反応後のｐＨのまま保存した場合（比較例１）および、ｐＨ１０を超えるｐＨに調整して保存した場合（比較例２）に対して、反応混合物のｐＨを９．８以下に調整して保存した場合（実施例１〜８）では、ＭＳＩ／ＮＭＳＡ比が高く維持されていることが見出された。