(57)【要約】      （修正有）【課題】検出精度を向上し得るサンプル像取得装置、サンプル像取得方法及びサンプル像取得プログラムを提案する。【解決手段】対物レンズ１２Ａにより拡大されるサンプルＳＰＬの像が結像される撮像素子１５と、上記サンプルが含まれる範囲で上記対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、上記撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大されるサンプルの像と上記撮像素子との上記光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御部と、上記移動制御部が移動させる間、上記撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得部とを有する。【選択図】図１
2011180442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズにより拡大されるサンプルの像が結像される撮像素子と、
上記サンプルが含まれる範囲で上記対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、上記撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大されるサンプルの像と上記撮像素子との上記光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御部と、
上記移動制御部が移動させる間、上記撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得部と
を有するサンプル像取得装置。
【請求項２】
上記移動制御部は、
上記サンプルが含まれる範囲で上記対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、上記撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大される部位の像と上記撮像素子との面方向の相対位置を、中心位置が同一でかつ開始位置が異なるように円移動させる
請求項１に記載のサンプル像取得装置。
【請求項３】
上記移動制御部は、
上記円移動における面方向の中心位置で、上記サンプルが含まれる範囲を上記対物レンズの光軸方向にだけ焦点を移動させ、
上記サンプル像取得部は、
上記移動制御部により上記焦点が光軸方向にだけ移動させている間、上記撮像素子を露光させることにより上記サンプルの像を取得する
請求項２に記載のサンプル像取得装置。
【請求項４】
上記移動制御部は、
上記サンプルが含まれる範囲を上記対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、上記撮像素子に結像される上記対物レンズにより拡大される部位の像と上記撮像素子との面方向の相対位置を、移動方向が異なるように直線移動させる
請求項１に記載のサンプル像取得装置。
【請求項５】
上記サンプル像における上記サンプルの像の上記撮像素子での移動軌跡に基づいて、上記サンプルの光軸方向の位置を算出する算出部と
をさらに有する請求項１乃至４に記載のサンプル像取得装置。
【請求項６】
サンプルが含まれる範囲を上記対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、対物レンズにより拡大されて撮像素子に結像されるサンプルの像と上記撮像素子との上記光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御ステップと、
上記移動制御ステップが移動させる間、上記撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得ステップと
を有するサンプル像取得方法。
【請求項７】
コンピュータに対して、
サンプルが含まれる範囲を上記対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、対物レンズにより拡大されて撮像素子に結像されるサンプルの像と上記撮像素子との上記光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御ステップと、
上記移動制御ステップが移動させる間、上記撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得ステップと
を実行させるサンプル像取得プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサンプル像取得装置、サンプル像取得方法及びサンプル像取得プログラムに関し、例えば生体サンプルを拡大して観察する分野に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプルは、組織切片等をスライドガラスに固定し、必要に応じて染色を施した後に保管される。一般に、保管期間が長期間となると、組織切片の劣化や退色等により生体サンプルに対する顕微鏡での視認性が悪くなる。また、生体サンプルは、作成された病院等の施設以外の施設で診断されることもあるが、該生体サンプルの受け渡しは一般に郵送であり、一定の時間を要する。
【０００３】
このような実情等に鑑み、生体サンプルを画像データとして保存する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２２２８０１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで近年、特定の蛋白質又は遺伝子間の相互作用により薬剤や阻害剤などの効果が大きく異なってしまう場合があることが発見されており、該蛋白質又は遺伝子間の距離を正確に測定することが求められている。
【０００６】
そこで、本出願人により、特定の蛋白質又は遺伝子に蛍光マーカが標識された生体サンプルの厚さ方向に対物レンズの焦点を移動させながら、該厚さ方向とは垂直な面方向にステージを移動させ、その間、撮像素子を露光させて１つの画像データを取得する装置が提案された（特願2009-148758公報）。
【０００７】
この装置では、取得された画像データにおいて蛍光マーカに焦点があっている位置で最も輝度値が高く、また面方向の移動に応じた軌跡の像として写るので、該軌跡の像に基づき蛍光マーカの厚さ方向の位置を検出することができる。
【０００８】
しかしながら、異なる２つ以上の蛍光マーカの軌跡の像が画像上で重なっている場合、それぞれの蛍光マーカの像を分離することが困難であり、従って蛍光マーカの位置を正確に検出することができなくなる恐れがある。
【０００９】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、検出精度を向上し得るサンプル像取得装置、サンプル像取得方法及びサンプル像取得プログラムを提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するため本発明においては、サンプル像取得装置であって、対物レンズにより拡大されるサンプルの像が結像される撮像素子と、サンプルが含まれる範囲を対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、撮像素子に結像される対物レンズにより拡大されるサンプルの像と撮像素子との光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御部と、移動制御部が移動させる間、撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得部とを有する。
【００１１】
また本発明においては、サンプル像取得方法であって、サンプルが含まれる範囲を対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、対物レンズにより拡大されて撮像素子に結像されるサンプルの像と撮像素子との光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御ステップと、移動制御ステップが移動させる間、撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得ステップとを有する。
【００１２】
さらに本発明においては、サンプル像取得プログラムであって、コンピュータに対して、サンプルが含まれる範囲を対物レンズの焦点を光軸方向に移動させながら、対物レンズにより拡大されて撮像素子に結像されるサンプルの像と撮像素子との光軸方向とは直交する面方向の相対位置を、光軸方向の同じ位置で異なる方向に移動させる移動制御ステップと、移動制御ステップが移動させる間、撮像素子を露光させることによりサンプル像を取得するサンプル像取得ステップとを実行させる。
【００１３】
これにより、同じ位置で異なる方向に移動されて撮像されたサンプル像のいずれかにおいては、検出対象の像が他の像と重なることなく撮像され、その像の軌跡に基づいて該対象の光軸方向の位置を算出することができる。
【発明の効果】
【００１４】
以上のように本発明によれば、同じ位置で異なる方向に移動されて撮像されたサンプル像のいずれかにおいては、検出対象の像が他の像と重なることなく撮像され、その像の軌跡に基づいて該対象の光軸方向の位置を算出することができ、かくして検出精度を向上し得るサンプル像取得装置、サンプル像取得方法及びサンプル像取得プログラムを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】サンプル像取得装置の構成を示す略線図である。
【図２】厚さ方向の生体サンプルを示す略線図である。
【図３】データ処理装置の構成を示す略線図である。
【図４】ＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。
【図５】生体サンプルに対する撮像範囲の割当を示す略線図である。
【図６】可動ステージをＺ軸方向だけに移動させた際の焦点面の移動、及び蛍光像を示す略線図である。
【図７】可動ステージをＺ軸方向に移動させながらＸＹ平面で円移動させた際の焦点面の移動を示す略線図である。
【図８】可動ステージをＺ軸方向に移動させながらＸＹ平面で円移動させた際の蛍光像を示す略線図である。
【図９】同一の蛍光マーカを撮像した場合の第１生体サンプル像、第２生体サンプル像及び第３生体サンプル像を示す略線図である。
【図１０】ＺＹ平面及びＺ軸方向に近接した蛍光マーカを撮像した場合の第１生体サンプル像、第２生体サンプル像及び第３生体サンプル像を示す略線図である。
【図１１】円弧傾き角の算出を示す略線図である。
【図１２】サンプル像取得処理手順（１）の説明に供するフローチャートである。
【図１３】サンプル像取得処理手順（２）の説明に供するフローチャートである。
【図１４】他の実施の形態における円弧傾き角の算出を示す略線図である。
【図１５】他の実施の形態におけるサンプル像取得装置の構成を示す略線図である。
【図１６】他の実施の形態における焦点面の移動、及び蛍光像を示す略線図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．第１の実施の形態
２．他の実施の形態
【００１７】
＜１．第１の実施の形態＞
［１−１．生体サンプル像取得装置の構成］
図１において、本一実施の形態によるサンプル像取得装置１を示す。このサンプル像取得装置１は、顕微鏡１０及びデータ処理部２０を含む構成とされる。
【００１８】
顕微鏡１０は、組織切片、細胞又は染色体等の生体高分子でなる生体サンプルＳＰＬを配置可能な面をもち、その面に対して平行方向（ＸＹ平面方向）及び直交方向（対物レンズ１２Ａの光軸と平行なＺ軸方向）に移動可能なステージ（以下、これを可動ステージとも呼ぶ）１１を有する。
【００１９】
生体サンプルＳＰＬは、図２に示すように、厚さ（Ｚ軸）方向に約４〜８［μｍ］の厚さを有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれるようにして所定の固定手法により固定され、必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色のみならず、ＦＩＳＨ(Fluorescence In-Situ Hybridization)や酵素抗体法等の蛍光染色が含まれる。
【００２０】
可動ステージ１１の一方の面側には光学系１２が配され、該可動ステージ１１の他方の面側には照明灯１３が配される。照明灯１３の光は、可動ステージ１１に対して穿設される開口から、該可動ステージ１１の一方の面に配される生体サンプルＳＰＬに対する照明光として到達する。
【００２１】
顕微鏡１０は、この照明光で得られる生体サンプルＳＰＬにおける一部の像を、光学系１２の対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂによって所定の倍率に拡大する。そして顕微鏡１０は、これら対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂにより拡大される像を、カラーフィルタが前面に配された撮像素子１５の撮像面に結像するようになされている。なお顕微鏡１０は、一般染色された生体サンプルの像を取得する場合、ダイクロイックミラー１２Ｃ及びエミッションフィルタ１２Ｄを光路から外せるようになされている。
【００２２】
一方、この顕微鏡１０の所定位置には、光源１４及び励起フィルタ１２Ｅが設けられる。顕微鏡１０は、光源１４から光が照射された場合、該光のうちの蛍光染色に対する励起波長のみを励起フィルタ１２Ｅで透過させた励起光を、対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂ間に設けられるダイクロイックミラー１２Ｃで反射させて対物レンズ１２Ａに導く。そして顕微鏡１０は、この励起光を、対物レンズ１２Ａによって可動ステージ１１に配される生体サンプルＳＰＬに集光する。
【００２３】
スライドガラスＳＧに固定される生体サンプルＳＰＬに対して蛍光染色が施されていた場合、励起光により蛍光マーカが発光する。この発光によって得られる光（以下、これを発色光とも呼ぶ）は対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１２Ｃを透過する。そしてこの発色光は、ダイクロイックミラー１２Ｃ及び結像レンズ１２Ｂ間に設けられるエミッションフィルタ１２Ｄを介して、該結像レンズ１２Ｂに到達する。
【００２４】
顕微鏡１０は、発色光の像を対物レンズ１２Ａによって拡大し、該発色光以外の光（励起フィルタ１２Ｅを透過した光、および顕微鏡の外部より入射する光などの光、以下、これを外光とも呼ぶ）をエミッションフィルタ１２Ｄによって吸収する。そして顕微鏡１０は、外光が喪失された発色光の像を、結像レンズ１２Ｂによって拡大し、撮像素子１５の撮像面に結像するようになされている。
【００２５】
データ処理部２０は、撮像素子１５を用いて、生体サンプルＳＰＬ全体の像（以下、これを生体サンプル像とも呼ぶ）を生成し、これを所定形式のデータ（以下、これをサンプルデータとも呼ぶ）として保存するようになされている。
【００２６】
このようにこのサンプル像取得装置１は、スライドガラスＳＧに配される生体サンプルＳＰＬを、鏡検状態の画像として保存することができるようになされている。したがってこのサンプル像取得装置１は、スライドガラスＳＧ自体を保存する場合に比して、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって生体サンプルＳＰＬを保存することが可能となる。
【００２７】
［１−２．データ処理部の構成］
次に、データ処理部２０の構成について説明する。このデータ処理部２０は、図３に示すように、制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)２１に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。
【００２８】
具体的にはＲＯＭ(Read Only Memory)２２、ＣＰＵ２１のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)２３、ユーザの操作に応じた命令を入力する操作入力部２４、インターフェイス２５、表示部２６及び記憶部２７がバス２８を介して接続される。
【００２９】
ＲＯＭ２２には、蛍光染色された生体サンプルＳＰＬの像を取得するサンプル像取得プログラムを含む各種の処理を実行するためのプログラムが格納される。インターフェイス２５には、顕微鏡１０（図１）が接続される。
【００３０】
表示部２６には、液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro Luminescence）ディスプレイ又はプラズマディスプレイ等が適用される。また記憶部２７には、ＨＤ（Hard Disc）に代表される磁気ディスクもしくは半導体メモリ又は光ディスク等が適用される。
【００３１】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２に格納される複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、該展開したプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。
【００３２】
またＣＰＵ２１は、展開したプログラムにしたがって、インターフェイス２５を介して顕微鏡１０を適宜制御するようになされている。
【００３３】
［１−３．サンプル像取得処理］
ＣＰＵ２１は、サンプル像取得プログラムの実行命令を操作入力部２４から受けた場合、該実行命令に対応するサンプル像取得プログラムをＲＡＭ２３に展開する。そしてＣＰＵ２１は、サンプル像取得プログラムに従って、図４に示すように、光源制御部３１、移動制御部３２、サンプル像取得部３３、データ記録部３４及び算出部３５として機能する。
【００３４】
光源制御部３１は、光源１４を駆動させ、光を出射させて該生体サンプルＳＰＬに照射させる。
【００３５】
移動制御部３２は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべき部位（以下、これをサンプル部位とも呼ぶ）が撮像範囲ＡＲに位置するように、可動ステージ１１を順次移動させ、例えば図５に示すように、該撮像範囲ＡＲに対して生体サンプルＳＰＬを割り当てる。この図５では、撮像範囲ＡＲに割り当てるべき生体サンプルＳＰＬの領域が重ならない態様となっているが、隣接する領域の一部が重なる態様であってもよい。
【００３６】
移動制御部３２は、１回目の撮影において、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向にだけ等速で移動させる。すなわち移動制御部３２は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動された際の可動ステージ１１のＸＹ平面での位置（Ｘ０、Ｙ０）を移動させることなく、可動ステージ１１のＺ軸方向の位置を次式
【００３７】
Ｚ＝Ｚ０＋（ＤＺ／Ｔ０）Ｔ                              ……（１）
【００３８】
に従って移動させる。式（１）において、ＺはＺ軸方向における可動ステージ１１の位置を示し、Ｚ０はＺ軸方向の可動ステージ１１の初期位置を示し、ＤＺは可動ステージ１１の総移動距離を示し、Ｔ０は可動ステージ１１の総移動時間を示し、Ｔは時刻を示す。すなわち、（ＤＺ／Ｔ０）は、Ｚ軸方向における単位時間あたりの移動速度を示す。なお、初期位置Ｚ０及び総移動距離ＤＺは、少なくとも生体サンプルＳＰＬを全て含む範囲で対物レンズ１２Ａの焦点がＺ軸方向に移動されるよう設定される。
【００３９】
このとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図６（Ａ）に示すように、ＸＹ平面上では固定されたまま、生体サンプルＳＰＬのカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へＺ軸方向に等速で移動される。
【００４０】
サンプル像取得部３３は、可動ステージ１１がＺ軸方向に移動されている間、撮像素子１５を露光させて生体サンプルＳＰＬを撮像させ、サンプル部位の像（以下、サンプル部位像とも呼ぶ）を取得する。
【００４１】
移動制御部３２及びサンプル像取得部３３は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させ、その間、撮像素子１５を露光させてサンプル部位像を取得する。
【００４２】
データ記録部３４は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに撮像されるサンプル部位像を連結して第１生体サンプル像を生成する。
【００４３】
このように対物レンズ１２Ａの焦点がＺ軸方向に移動された場合、撮像素子１５に結像される蛍光マーカＥＭの像ＣＰは、図６（Ｂ）に示すように、ぼやけた大きな状態から、はっきりとした小さな状態に変化していき、その後またぼやけた大きな状態に変化する。
【００４４】
そのため、第１生体サンプル像においては、図６（Ｃ）に示すように、所定閾値以上の画素のかたまりとして抽出される蛍光マーカＥＭの像（以下、これを蛍光像とも呼ぶ）ＥＰ１が点拡がり関数（ＰＳＦ（Point Spread Function））に応じてぼけた略円形の像として写る。
【００４５】
データ記録部３４は、第１生体サンプル像の全部又は該第１生体サンプル像を復元可能な一部を示す画素情報を含む第１サンプルデータを生成し、第１サンプルデータを記憶部２７に記憶する。
【００４６】
また移動制御部３２は、２回目の撮影において、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら、ＸＹ平面において等速で円弧を描くように移動させる。
【００４７】
このときステージ移動制御部３２は、可動ステージ１１を、１回目の撮影における各撮像範囲ＡＲでの可動ステージ１１のＸＹ平面の位置（Ｘ０、Ｙ０）を基準位置とし、該基準位置を中心として向きを変えることなく円移動させる。
【００４８】
具体的に、移動制御部３２は、可動ステージ１１の位置を、Ｚ軸方向に次式
【００４９】
Ｚ＝Ｚ０＋（ＤＺ／Ｔ１）Ｔ                              ……（２）
【００５０】
に従って移動させながら、ＸＹ平面に次式
【００５１】
Ｘ＝Ｘ０＋Ｌ０ｓｉｎ（ωＴ），Ｙ＝Ｙ０＋Ｌ０ｃｏｓ（ωＴ）……（３）
【００５２】
に従って移動させる。式（２）において、ＺはＺ軸方向における可動ステージ１１の位置を示し、Ｔ１は可動ステージ１１の総移動時間を示し、Ｔは時刻を示す。すなわち、（ＤＺ／Ｔ１）は、Ｚ軸方向における単位時間あたりの移動速度を示す。
【００５３】
また、式（３）において、ＸはＸ軸方向における可動ステージ１１の位置、ＹはＹ軸方向における可動ステージ１１の位置を示し、Ｌ０は円移動における半径を示し、ωは角速度を示し、Ｘ０は円移動の中心のＸ座標、Ｙ０は円移動の中心のＹ座標を示す。
【００５４】
尚、初期位置Ｚ０、総移動距離ＤＺ、総移動時間Ｔ１、中心座標（Ｘ０，Ｙ０）、半径Ｌ０、角速度ωは、適宜設定される。例えば、移動速度（ＤＺ／Ｔ０）及び移動速度（ＤＺ／Ｔ１）を同一の値とすると、１回目の撮影時（Ｚ軸方向にのみ移動させた撮影）に取得した第１生体サンプル像において蛍光像が明るくなりすぎ、後述する円弧の中心位置を正確に検出できない場合がある。従ってこの場合には、移動速度（ＤＺ／Ｔ０）を移動速度（ＤＺ／Ｔ１）よりも早くするなど、１回目及び２回目の両方において適切な生体サンプル像が取得されるように移動速度（ＤＺ／Ｔ０）及び移動速度（ＤＺ／Ｔ１）の値が設定される。
【００５５】
このとき対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰは、図７に示すように、生体サンプルＳＰＬを含む範囲をカバーガラスＣＧ側からスライドガラスＳＧ側へＺ軸方向に等速で移動されると同時に、ＸＹ平面で円弧を描くように移動される。
【００５６】
サンプル像取得部３３は、このように可動ステージ１１が移動されている間、撮像素子１５を露光させてサンプル部位を撮像素子１５に撮像させ、サンプル部位像を取得する。
【００５７】
移動制御部３２及びサンプル像取得部３３は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向及びＸＹ平面に移動させ、その間撮像素子１５を露光させてサンプル部位像を取得する。
【００５８】
データ記録部３４は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに撮像されるサンプル部位像を連結して第２生体サンプル像を生成する。
【００５９】
このように対物レンズ１２Ａの焦点がＺ軸方向に移動されながらＸＹ平面上に円移動された場合、撮像素子１５に結像される蛍光マーカＥＭの像ＣＰは、図８（Ａ）に示すように、円軌道で、ぼやけた大きな状態から、はっきりとした小さな状態に変化していき、その後またぼやけた大きな状態に変化する。
【００６０】
そのため、第２生体サンプル像において蛍光像ＥＰ２は、図８（Ｂ）に示すように、蛍光マーカＥＭに焦点があっている位置の輝度値が最も高く、その部分が細い略円弧状の像として写る。
【００６１】
データ記録部３４は、第２生体サンプル像が生成された場合、該第２生体サンプル像の全部又は第２生体サンプル像を復元可能な一部を示す画素情報を含む第２サンプルデータを生成する。そして第２サンプルデータを第１サンプルデータと対応付けて記憶部２７に記憶する。
【００６２】
さらに移動制御部３２は、３回目の撮影において、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向（光軸方向）に移動させながら、２回目の撮影時とは開始位置が９０°異なるようにしてＸＹ平面上を円移動させる。
【００６３】
具体的に、移動制御部３２は、可動ステージ１１の位置を、Ｚ軸方向に（２）式に従って移動させながら、ＸＹ平面上を次式
【００６４】
Ｘ＝Ｘ０＋Ｌ０ｓｉｎ（ωＴ＋９０°），
Ｙ＝Ｙ０＋Ｌ０ｃｏｓ（ωＴ＋９０°）                    ……（４）
【００６５】
に従って移動させる。従って移動制御部３２は、３回目の撮像において、２回目の撮像時に対してＸＹ平面上での円移動の移動中心（Ｘ０、Ｙ０）が同じ位置で位相（開始位置及び終了位置）を９０°進めて移動させる。
【００６６】
サンプル像取得部３３は、このように可動ステージ１１が移動されている間、撮像素子１５を露光させてサンプル部位を撮像素子１５に撮像させ、サンプル部位像を取得する。
【００６７】
移動制御部３２及びサンプル像取得部３３は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに、可動ステージ１１をＺ軸方向及びＸＹ平面に移動させ、その間撮像素子１５を露光させてサンプル部位像を取得する。
【００６８】
データ記録部３４は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに移動されるごとに撮像されるサンプル部位像を連結して第３生体サンプル像を生成する。
【００６９】
データ記録部３４は、第３生体サンプル像が生成された場合、該第３生体サンプル像の全部又は第３生体サンプル像を復元可能な一部を示す画素情報を含む第３サンプルデータを生成する。そして第３サンプルデータを第１サンプルデータ及び第２サンプルデータと対応付けて記憶部２７に記憶する。
【００７０】
因みに第１サンプルデータ、第２サンプルデータ及び第３サンプルデータは、対象となる生体サンプルＳＰＬに関する識別情報を示すデータが付加される。この識別情報は、例えば、生体サンプルＳＰＬの採取者名、採取者性別、採取者年齢及び採取日付等といった情報である。データ記録部３４は、この識別情報を入力すべきことを、生体サンプルＳＰＬのデータ保存命令が与えられたタイミングや、スライドガラスＳＧをセットすべきタイミング等といった所定のタイミングで通知するようになされている。
【００７１】
ところで図９に示すように、同一の蛍光マーカＥＭを撮像した第１生体サンプル像ＳＩＭ１、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３においては、蛍光像ＥＰ１は略円形状の像、蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３は略円弧状の像として写る。
【００７２】
また、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得する際、可動ステージ１１が第１生体サンプル像ＳＩＭ１を取得した際のＸＹ平面の位置を中心としてＸＹ平面を円移動する。従って、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３における蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３の中心（円弧の中心Ｏｐ）は、蛍光像ＥＰ１の中心（すなわち最も輝度値の高い位置）Ｏｐと同一位置となる。
【００７３】
また図１０（Ａ）に示すようなＸＹ平面及びＺ軸方向に隣接した蛍光マーカＥＭａ及びＥＭｂを撮像した場合、図１０（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示すような第１生体サンプル像ＳＩＭ１、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３が取得される。
【００７４】
この場合、第２生体サンプル像ＳＩＭ２又は第３生体サンプル像ＳＩＭ３においては、どちらか一方の像で蛍光マーカＥＭａ及びＥＭｂの像（蛍光像ＥＰ２ａ及びＥＰ２ｂ、又は蛍光像ＥＰ３ａ及びＥＰ３ｂ）が重なってしまう場合がある（図１０においては第２生体サンプル像ＳＩＭ２）。
【００７５】
このような場合、蛍光マーカＥＭａ及びＥＭｂが異なる波長の光を発する（異なる色で光る）のであれば、画像処理によってそれぞれの色成分を抽出することにより第２生体サンプル像ＳＩＭ２からそれぞれの蛍光像ＥＰ２ａ及びＥＰ２ｂを分離することができる。
【００７６】
しかしながら蛍光マーカＥＭａ及びＥＭｂが同一又は近い波長の光を発する場合にはそれぞれの蛍光像ＥＰ２ａ及びＥＰ２ｂを分離することができない。
【００７７】
しかしながら、サンプル像取得装置１では、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３がＸＹ平面上で９０°の位相差をもって撮像される。そのため、たとえ第２生体サンプル像ＳＩＭ２で蛍光像ＥＰ２ａ及びＥＰ２ｂが重なってしまっても、もう一方の第３生体サンプル像ＳＩＭ３では蛍光像ＥＰ３ａ及びＥＰ３ｂが重ならない（ぼやけた部分で重なることはあるが所定閾値以上の輝度値の部分を抽出すれば重ならない）。
【００７８】
そこで算出部３５は、以上の点を考慮して、取得された第１生体サンプル像ＳＩＭ１、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を基に、生体サンプルＳＰＬの蛋白質や遺伝子等に標識された蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出する。
【００７９】
具体的には算出部３５は、第１サンプルデータを記憶部２７から読み出し、第１生体サンプル像ＳＩＭ１から所定閾値以上の画素のかたまりを蛍光像ＥＰ１として抽出し、該蛍光像ＥＰ１の点拡がり関数を算出する。そして算出部３５は、算出した点拡がり関数の逆関数（点拡がり逆関数）を用いて蛍光像ＥＰ１を鮮明化する。
【００８０】
算出部３５は、鮮明化した蛍光像ＥＰ１の中心位置Ｏｐを算出し、該算出した中心位置（中心座標）Ｏｐと、可動ステージ１１のＸＹ平面の位置（Ｘ０、Ｙ０）との位置関係により、蛍光像ＥＰ１に対応する蛍光マーカＥＭのＸＹ平面の位置（ｘ、ｙ）を算出する。
【００８１】
算出部３５は、例えば第２サンプルデータを記憶部２７から読み出し、検出した蛍光像ＥＰ１に対応する蛍光像ＥＰ２（同一の蛍光マーカＥＭの像）を第２生体サンプル像ＳＩＭ２から検出する。
【００８２】
具体的には算出部３５は、例えば第２サンプルデータを記憶部２７から読み出すと、第２生体サンプル像ＳＩＭ２から所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを蛍光像ＥＰ２として抽出する。
【００８３】
そして算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２において、第１生体サンプル像ＳＩＭ１における蛍光像ＥＰ１の中心位置Ｏｐと同一位置（同一座標）を基準として、可動ステージ１１の移動半径Ｌ０に相当する範囲内に存在し、かつ円弧の中心が該位置とされる蛍光像ＥＰ２を抽出する。
【００８４】
ここで、蛍光マーカＥＭに対して対物レンズ１２Ａの焦点が合っているとき、第２サンプル像ＳＩＭ２には蛍光像ＥＰ２の輝度値が最も高く写る。従って１つの蛍光像ＥＰ２に２つ以上の輝度値のピークがある場合、ピークの数と同数の蛍光マーカＥＭの像が重なっていると判断する。
【００８５】
逆に、１つの蛍光像ＥＰ２に１つの輝度値のピークしかない場合、その蛍光像ＥＰ２は１つの蛍光マーカＥＭの像であると判断する。この場合、蛍光像ＥＰ２において所定閾値以上の輝度値である画素のまとまりが形成する円弧の傾きは、蛍光マーカＥＭに対して焦点が合っていたときの、可動ステージ１１のＸＹ平面の円移動における移動方向を示している。
【００８６】
そこで算出部３５は、抽出した蛍光像ＥＰ２に１つの輝度値のピークしかないと判断した場合、対応する蛍光像ＥＰ１の中心位置Ｏｐと同一座標の位置を蛍光像ＥＰ２の円弧の中心位置Ｏｐとして設定する。
【００８７】
算出部３５は、図１１に示すように、蛍光像ＥＰ２の輝度値が最も高い位置（座標）Ｂｐを算出し、当該位置Ｂｐと設定した円弧の中心位置Ｏｐとを結ぶ直線Ｌ１とＸ軸とのなす角を円弧傾き角θとして算出する。
【００８８】
ここで可動ステージ１１がＸＹ平面上において角速度ωで移動すると共に、Ｚ軸方向に移動速度（ＤＺ／Ｔ１）で移動している場合、単位角度あたりの焦点面ＦＰの移動距離は（ＤＺ／Ｔ１）／ωとなる。
【００８９】
そこで算出部３５は、算出した円弧傾き角θと（ＤＺ／Ｔ１）／ωとを乗算することにより、Ｚ軸方向の初期位置であるＺ０を基準とした、蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出する。
【００９０】
このように算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２において１つの輝度値のピークしかない全ての蛍光像ＥＰ２について、該蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカＥＭの３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する。
【００９１】
一方、算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２において１つの蛍光マーカ像ＥＰ２に２つ以上の輝度値のピークがある場合、第３生体サンプル像ＳＩＭ３を用いて対応する蛍光マーカＥＭの３次元位置が算出する。
【００９２】
算出部３５は、記憶部２７に記憶された第２生体サンプル像ＳＩＭ２に対応付けられた第３生体サンプル像ＳＩＭ３を読み出す。
【００９３】
そして算出部３５は、読み出した第３生体サンプル像ＳＩＭ３から、該第３生体サンプル像ＳＩＭ３から所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを蛍光像ＥＰ３として抽出する。
【００９４】
算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２において２つ以上の輝度値のピークがあるとされた蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光像ＭＰ１の中心位置Ｏｐと同一位置（同一座標）を基準として、可動ステージ１１の移動半径Ｌ０に相当する範囲内に存在し、かつ円弧の中心が該位置とされる蛍光像ＥＰ３を抽出する。
【００９５】
算出部３５は、抽出した蛍光像ＥＰ３に１つの輝度値のピークしかないと判断した場合、抽出した蛍光像ＥＰ３の円弧の中心Ｏｐを、対応する蛍光像ＥＰ１の中心位置Ｏｐと同一座標に設定する。
【００９６】
算出部３５は、蛍光像ＥＰ３の輝度値が最も高い位置（座標）Ｂｐを算出し、当該位置Ｂｐと設定した円弧の中心Ｏｐとを結ぶ直線Ｌ１とＸ軸とのなす角から９０°減算した角を円弧傾き角θとして算出する。
【００９７】
算出部３５は、算出した円弧傾き角θと（ＤＺ／Ｔ１）／ωとを乗算することにより、Ｚ軸方向の初期位置であるＺ０を基準とした蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出する。
【００９８】
このように算出部３５は、第３生体サンプル像ＳＩＭ３において１つの輝度値のピークしかない全ての蛍光像ＥＰ３について、該蛍光像ＥＰ３に対応する蛍光マーカＥＭの３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する。
【００９９】
ところで２つ以上の蛍光マーカＥＭがＸＹ平面上でほぼ同じ位置にあり、かつＺ軸方向に離れている場合、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３の両方でそれぞれの蛍光マーカＥＭの像が連続して写ることがある。この場合、第１生体サンプル像ＳＩＭ１における蛍光像ＭＰ１の中で、対応する蛍光マーカＥＭの３次元位置が第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を用いても算出されない。
【０１００】
そこで算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３の両方において、対応する蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３の両方に２つ以上の輝度値のピークがある場合、２つ以上の蛍光マーカＥＭがＸＹ平面上でほぼ同じ位置にあり、かつＺ軸方向に離れていると判断する。
【０１０１】
この場合、算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３における対応する蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３のどちらか一方を抽出する。なお、この実施の形態では蛍光像ＥＰ２とする。
【０１０２】
算出部３５は、２つ以上の蛍光マーカＥＭがそれぞれ異なる色で発光している場合には色成分ごとにそれぞれの蛍光像を分離することができるので、抽出した蛍光像ＥＰ２を例えば赤、青及び緑色成分に分ける。
【０１０３】
そして算出部３５は、分離した色成分ごとの蛍光像ＥＰ２に対して再び輝度値のピーク数を検出し、色成分ごとの蛍光像ＥＰ２に１つのピークしかない場合、その色成分の蛍光像ＥＰ２を用いて上述と同様にして３次元位置を算出する。このようにして算出部３５は、ピーク数と同数の蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出する。
【０１０４】
一方、算出部３５は、色成分ごとに分離した蛍光像ＥＰ２に輝度値のピークを複数検出した場合、ほぼ同色の光を発する蛍光マーカＥＭの像が重なっていると判断する。
【０１０５】
この場合、算出部３５は、蛍光像ＥＰ２の円弧の中心Ｏｐを、対応する蛍光像ＥＰ１の中心位置Ｏｐと同一座標に設定する。
【０１０６】
そして算出部３５は、蛍光像ＥＰ２の輝度値がピークとなる位置（座標）Ｂｐをそれぞれ算出し、それぞれの位置Ｂｐと設定した円弧の中心Ｏｐとを結ぶ直線Ｌ１とＸ軸とのなす角を、円弧傾き角θとして算出する。
【０１０７】
算出部３５は、算出した円弧傾き角θと（ＤＺ／Ｔ１）／ωとを乗算することにより、蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を複数算出する。
【０１０８】
このようにして算出部３５は、対応する蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３の両方に輝度値のピークが複数ある場合、該蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３に対応する蛍光マーカＥＭの３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）を複数算出する。
【０１０９】
データ記録部３４は、第１生体サンプル像ＳＩＭ１における各蛍光像ＭＰ１に対して、算出した３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）をそれぞれ対応付けて記録する。
【０１１０】
［１−４．サンプル像取得処理］
次に上述したサンプル像取得処理の手順について、図１２及び図１３に示すフローチャートに従って説明する。実際上、ＣＰＵ２１は、ルーチンＲＴ１の開始ステップから入って次のステップＳＰ１に移る。
【０１１１】
ステップＳＰ１においてＣＰＵ２１は、操作入力部２４を介した入力、又は予めＲＯＭ２２に記憶された１回目、２回目及び３回目の撮影における可動ステージ１１の移動条件を設定し、次のステップＳＰ２に移る。
【０１１２】
ステップＳＰ２においてＣＰＵ２１は、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向にだけ等速で移動させ、その間、撮像素子１５を露光させて得られるサンプル部位像を連結して第１生体サンプル像ＳＩＭ１を取得し、次のステップＳＰ３に移る。
【０１１３】
ステップＳＰ３においてＣＰＵ２１は、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させながらＸＹ平面において等速で円移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１を移動させている間、撮像素子１５を露光させて得られるサンプル部位像を連結して第２生体サンプル像ＳＩＭ２を取得し、次のステップＳＰ４に移る。
【０１１４】
ステップＳＰ４においてＣＰＵ２１は、設定した移動条件に従って、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させながらＸＹ平面において２回目の撮像に対して９０°の位相差をもって円移動させる。ＣＰＵ２１は、可動ステージ１１を移動させている間、撮像素子１５を露光させて得られるサンプル部位像を連結して第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得し、次のステップＳＰ５に移る。
【０１１５】
ステップＳＰ５においてＣＰＵ２１は、第１生体サンプル像ＳＩＭ１から蛍光像ＥＰ１を抽出し、該蛍光像ＥＰ１に対して点拡がり逆関数を用いて鮮明化し、次のステップＳＰ６に移る。
【０１１６】
ステップＳＰ６においてＣＰＵ２１は、第１生体サンプル像ＳＩＭ１の蛍光像ＥＰ１の中心位置を検出し、該中心位置に基づいて対応する蛍光マーカＥＭのＸＹ平面上の位置（ｘ、ｙ）を算出し、次のステップＳＰ７に移る。
【０１１７】
ステップＳＰ７においてＣＰＵ２１は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２から、第１生体サンプル像ＳＩＭの蛍光像ＥＰ１に対応する蛍光像ＥＰ２をそれぞれ抽出し、次のステップＳＰ８に移る。
【０１１８】
ステップＳＰ８においてＣＰＵ２１は、抽出した蛍光像ＥＰ２に輝度値のピークが複数あるか否かを判断する。ここで否定結果が得られると、このことは、抽出した蛍光像ＥＰ２に輝度値のピークが１つしかない、すなわち該蛍光像ＥＰ２が１つの蛍光マーカＥＭの像であることを表しており、このときＣＰＵ２１は次のステップＳＰ９に移る。
【０１１９】
ステップＳＰ９においてＣＰＵ２１は、輝度値のピークが１つしかない蛍光像ＥＰ２の円弧傾き角θを算出し、該円弧傾き角θに基づいて対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出し、次のステップＳＰ１８に移る。
【０１２０】
これに対してステップＳＰ８において肯定結果が得られると、ＣＰＵ２１は次のステップＳＰ１０に移り、第３生体サンプル像ＳＩＭ３から、輝度値のピークが複数ある蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカ像ＥＭ３を抽出し、次のステップＳＰ１１に移る。
【０１２１】
ステップＳＰ１１においてＣＰＵ２１は、抽出した蛍光像ＥＰ３に輝度値のピークが複数あるか否かを判断する。ここで否定結果が得られると、このことは、抽出した蛍光像ＥＰ３に輝度値のピークが１つしかない、すなわち該蛍光像ＥＰ３が１つの蛍光マーカＥＭの像であることを表しており、このときＣＰＵ２１は次のステップＳＰ１２に移る。
【０１２２】
ステップＳＰ１２においてＣＰＵ２１は、輝度値のピークが１つしかない蛍光像ＥＰ３の円弧傾き角θを算出し、該円弧傾き角θに基づいて対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出し、次のステップＳＰ１８に移る。
【０１２３】
これに対してステップＳＰ１１において肯定結果が得られると、このことは、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３の両方で対応する蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３に輝度値のピークが複数あることを表している。すなわち、蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３は、ＸＹ平面上でほぼ同じ位置にあり、かつＺ軸方向に離れている２つ以上の蛍光マーカＥＭの像が重なっていることを表している。
【０１２４】
このときＣＰＵ２１は次のステップＳＰ１３に移り、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３でともに輝度値のピークが複数ある蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３のうちの蛍光像ＥＰ２を第２生体サンプル像ＳＩＭ２から抽出し、次のステップＳＰ１４に移る。
【０１２５】
ステップＳＰ１４においてＣＰＵ２１は、抽出した蛍光像ＥＰ２を例えば赤、青及び緑色成分ごとに分離し、次のステップＳＰ１５に移る。
【０１２６】
ステップＳＰ１５においてＣＰＵ２１は、色成分ごとに分離した蛍光像ＥＰ２に輝度値のピークが複数あるか否かを判断する。ここで否定結果が得られると、このことは、ＸＹ平面上でほぼ同じ位置にあり、かつＺ軸方向に離れている２つ以上の蛍光マーカＥＭがそれぞれ異なる波長（色）の光を発していることを表しており、このときＣＰＵ２１はステップＳＰ１６に移る。
【０１２７】
ステップＳＰ１６においてＣＰＵ２１は、分離した色成分の蛍光像ＥＰ２の円弧傾き角θを算出し、該円弧傾き角θに基づいて対応するピーク数と同数の蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出し、次のステップＳＰ１８に移る。
【０１２８】
これに対してステップＳＰ１５において肯定結果が得られると、このことは、蛍光像ＥＰ２にはほぼ同色の光を発する複数の蛍光マーカＥＭの像が重なっていることを表しており、このときＣＰＵ２１はステップＳＰ１７に移る。
【０１２９】
ステップＳＰ１７においてＣＰＵ２１は、蛍光像ＥＰ２の輝度値がピークとなる位置Ｂｐをそれぞれ算出し、それぞれの位置Ｂｐと設定した円弧の中心Ｏｐとを結ぶ直線Ｌ１とＸ軸とのなす角を、円弧傾き角θとして算出する。そしてＣＰＵ２１は、算出した円弧傾き角θに基づいてピーク数と同数の蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出し、次のステップＳＰ１８に移る。
【０１３０】
ステップＳＰ１８においてＣＰＵ２１は、第１生体サンプル像ＳＩＭ１の蛍光像ＥＰ１に対して、対応する蛍光マーカＥＭの３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）を対応付けて記録し、次のステップに移って処理を終了する。
【０１３１】
［１−５．動作及び効果］
以上の構成においてサンプル像取得装置１は、生体サンプルＳＰＬを含む範囲で可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら、中心位置が同一で開始位置が９０°異なるようにＸＹ平面でそれぞれ円移動させる。サンプル像取得装置１は、その間それぞれ撮像素子１５を露光させて第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得するようにした。
【０１３２】
これによりサンプル像取得装置１は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３から抽出した蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３の少なくともどちらか一方において、ＸＹ平面で近接し、かつＺ軸方向に近接した２つ以上の蛍光マーカＥＭの像が重なることなく抽出できる。
【０１３３】
サンプル像取得装置１は、２つ以上の蛍光マーカＥＭの像が重なっていない蛍光像ＥＰ２又はＥＰ３の傾きに基づいて、該蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置を算出するので、それぞれの蛍光マーカＥＭの位置を精度よく算出することができる。
【０１３４】
またサンプル像取得装置１は、ＸＹ平面における円移動させた際の中心位置で、生体サンプルＳＰＬを含む範囲で可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させ、その間、撮像素子１５を露光させて第１生体サンプル像ＳＩＭ１を取得するようにした。
【０１３５】
これによりサンプル像取得装置１は、蛍光マーカＥＭのＸＹ平面上での位置を精度よく検出できると共に、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３の蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３の円弧の傾きも精度よく算出することができる。かくしてサンプル像取得装置１は、生体サンプルＳＰＬのターゲットに標識した蛍光マーカＥＭの３次元位置をより精度よく算出することができる。
【０１３６】
以上の構成によれば、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら、中心位置が同一で開始位置が９０°異なるようにＸＹ平面で円移動させ、その間それぞれ撮像素子１５を露光させて第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得するようにした。これによりサンプル像取得装置１は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３において２つ以上の蛍光マーカＥＭの像が重なることなく抽出できるので、蛍光マーカＥＭの位置を精度よく検出することができる。
【０１３７】
＜２．他の実施の形態＞
上述した実施の形態においては、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を撮像する際、可動ステージ１１をＸＹ平面上で９０°の位相差となるように円移動させるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば可動ステージ１１をＸＹ平面上で３０°や４５°の位相差となるように円移動させて生体サンプル像をそれぞれ取得するようにしてもよい。
【０１３８】
上述した実施の形態においては、３回の撮影で得られた第１生体サンプル像ＳＩＭ１、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を用いて蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出するようにした場合について述べた。
【０１３９】
本発明はこれに限らず、異なる位相差で可動ステージ１１を円移動させた３つ以上の生体サンプル像を取得し、該生体サンプル像を用いて蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出するようにしてもよい。
【０１４０】
また、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を用いて蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出するようにしてもよい。
【０１４１】
この場合、上述した場合と同様にサンプル像取得部３２は、移動制御部３２により可動ステージ１１を移動させ、その間、撮像素子１５を露光させて撮像された第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得する。データ記録部３４は、第２サンプルデータ及び第３サンプルデータを対応付けて記憶部２７に記録する。
【０１４２】
算出部３５は、例えば第２サンプルデータを記憶部２７から読み出し、第２生体サンプル像ＳＩＭ２から所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを蛍光像ＥＰ２として抽出する。
【０１４３】
算出部３５は、輝度値のピークが１つしかない蛍光像ＥＰ２に対して、図１４に示すように、抽出した蛍光像ＥＰ２の形状を円弧とみなし、円弧の中点Ｏａと円弧の両端を結ぶ直線の中点Ｏｂとを結ぶ直線（すなわち円弧の中心と円弧の中点Ｏａとを通る直線）Ｌ２を算出する。算出部３５は、算出した直線Ｌ２とＸ軸とのなす角を円弧傾き角θとして算出する。
【０１４４】
算出部３５は、算出した円弧傾き角θと（ＤＺ／Ｔ１）／ωとを乗算することにより、蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出する。
【０１４５】
また算出部３５は、抽出した蛍光像ＥＰ２を外挿する円を例えば最小自乗法を用いて算出し、算出した円の中心位置と、可動ステージ１１のＸＹ平面の初期位置（Ｘ０、Ｙ０）との位置関係により、蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカＥＭのＸＹ平面上の位置（ｘ、ｙ）を算出する。
【０１４６】
このように算出部３５は、１つの輝度値のピークしかない全ての蛍光像ＥＰ２について、該蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光マーカＥＭの３次元的な位置（Ｘ、Ｙ、Ｚ）を算出する。
【０１４７】
一方、算出部３５は、蛍光像ＥＰ２に２つ以上の輝度値のピークがある場合、ピークの数と同数の蛍光マーカＥＭの像が重なっていると判断し、記憶部２７に記憶された第２サンプルデータに対応付けられた第３サンプルデータを読み出す。
【０１４８】
そして算出部３５は、第３生体サンプル像ＳＩＭ３から所定閾値以上の輝度値である複数の画素のまとまりを蛍光像ＥＰ３として抽出する。
【０１４９】
また算出部３５は、抽出した蛍光像ＥＰ３から、第２生体サンプル像ＳＩＭ２において２つ以上の輝度値のピークをもつ蛍光像ＥＰ２に対応する蛍光像ＥＰ３をピークの数だけ抽出する。
【０１５０】
この抽出方法として、例えば第２生体サンプル像ＳＩＭ２における２つ以上の輝度値のピークをもつ蛍光像ＥＰ２の中心位置（座標）を算出する。そして第２生体サンプル像ＳＩＭ２における該位置（座標）と対応する第３生体サンプル像ＳＩＭ３の位置を中心とする蛍光像ＥＰ３を抽出する。
【０１５１】
算出部３５は、上述したように、抽出した蛍光像ＥＰ３の形状を円弧とみなし、円弧の中点Ｏａと円弧の両端を結ぶ直線の中点Ｏｂとを結ぶ直線Ｌ２を算出し、該直線Ｌ２とＸ軸との円弧傾き角θを算出する。また算出部３５は、算出した円弧傾き角θと（ＤＺ／Ｔ１）／ωとを乗算することにより、蛍光像ＥＰ３に対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出する。
【０１５２】
さらに算出部３５は、抽出した輝点群を近似する円を例えば最小自乗法を用いて算出し、算出した円の中心位置と、可動ステージ１１のＸＹ平面の初期位置（Ｘ０、Ｙ０）との位置関係により、蛍光像ＥＰ３に対応する蛍光マーカＥＭのＸＹ平面上での位置（ｘ、ｙ）を算出する。
【０１５３】
このように算出部３５は、第３生体サンプル像ＳＩＭ３において抽出された全ての蛍光像ＥＰ３について、該蛍光像ＥＰ３に対応する蛍光マーカＥＭの３次元的な位置（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する。
【０１５４】
さらに算出部３５は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３の両方で２つ以上のピーク値を持つ蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３に対しては上述した場合と同様にしてピーク数と同数の蛍光マーカＥＭの３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）を算出する。
【０１５５】
このようにしてサンプル像取得装置１は、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を用いて蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出するようになされている。因みに、第１生体サンプル像ＳＩＭ１、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を用いた方が、蛍光マーカＥＭのＸＹ平面上での位置が正確に算出することができるので、より精度よく蛍光マーカＥＭの３次元位置を算出できるものである。
【０１５６】
上述した実施の形態においては、生体サンプルＳＰＬを含む範囲で対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰを移動させる際に、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば、対物レンズ１２ＡをＺ軸方向に可動させ得る移動機構を設け、該対物レンズ１２ＡをＺ軸方向に移動させることによって焦点面ＦＰを生体サンプルＳＰＬに対してＺ軸方向に移動させるようにしてもよい。
【０１５７】
上述した実施の形態においては、ＸＹ平面に可動ステージ１１を動かすことによって焦点面ＦＰをＸＹ平面に動かすようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば、撮像素子１５をＸＹ平面に可動させ得るステージを設け、該ステージを介して撮像素子１５をＸＹ平面に移動させるようにしてもよい。
【０１５８】
上述した実施の形態においては、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながらＸＹ平面を円移動させることにより、撮像素子１５に結像される上記サンプル部位の像の向きを変化させることなく円移動させるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、図１５に示すようなサンプル像取得装置１００を用いて、撮像素子１５に結像されるサンプル部位の像を、向きを変化させることなく円移動させるようにしてもよい。
【０１５９】
このサンプル像取得装置１００は、顕微鏡１１０及びデータ処理部２０を含む構成とされる。顕微鏡１１０は、モータ１１１、回転軸１１２、傾斜台座１１３及び透明板１１４からなる結像位置移動部１１５が設けられる。
【０１６０】
モータ１１１は、データ処理部２０の制御に基づき、回転軸１１２を介して透明板１１４を回転させる。
【０１６１】
傾斜台座１１３は、回転軸１１２の外周に設けられ、該回転軸１１２に対して透明板１１４を所定の傾斜角度に傾けさせる。
【０１６２】
透明板１１４は、空気とは異なる屈折率の透明なガラスやプラスチック材により上面及び下面が平行な所定厚さの円板に形成され、その中心に回転軸１１２が挿通されて固定される。
【０１６３】
結像位置移動部１１５は、回転軸１１２が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の光軸と平行になるように配置される。また結像位置移動部１１５は、透明板１１４の一部が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間に位置するように顕微鏡１１０の所定位置に固定される。
【０１６４】
従って顕微鏡１１０では、モータ１１１が回転されて該モータ１１１の回転に従って透明板１１４が回転すると、透明板１１４が結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間の光軸方向に対してその角度を変化させながら上下に移動する。
【０１６５】
顕微鏡１１０では、光源１４から励起光が生体サンプルＳＰＬに照射された場合、該生体サンプルＳＰＬに染色された蛍光マーカＥＭから発色光が発せられる。この発した発色光は、対物レンズ１２Ａ、ダイクロイックミラー１２Ｃ及びエミッションフィルタ１２Ｄを介して透明板１１４に到達する。
【０１６６】
透明板１１４に到達した発色光は、該透明板１１４の下面及び上面で屈折して透過し、結像レンズ１２Ｂを介して撮像素子３０に集光される。
【０１６７】
透明板１１４が回転している場合、透明板１１４に到達した発色光は、結像レンズ１２Ｂとエミッションフィルタ１２Ｄとの間における透明板１１４の傾斜角度に応じて屈折する方向が変化される。従って透明板１１４を透過した発色光の光軸は、透明板１１４に入射する前の光軸を中心として円を描くように移動される。
【０１６８】
顕微鏡１１０は、発色光の像を、対物レンズ１２Ａによって拡大し、透明板１１４により結像位置を移動させた後、結像レンズ１２Ｂによって集光し、撮像素子３０の撮像面に結像するようになされている。
【０１６９】
この顕微鏡１１０に対して、移動制御部３２は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに位置するたびに、Ｚ軸方向にだけ可動ステージ１１を移動させる。サンプル像取得部３３は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子１５を露光させてサンプル部位像を取得し、各撮像範囲ＡＲに割り当てられたサンプル部位像を連結することによって第１生体サンプル像ＳＩＭ１を取得する。
【０１７０】
また移動制御部３２は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに位置するたびに、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共に、透明板１１４を例えば半回転させる。サンプル像取得部３３は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子１５を露光させてサンプル部位像を取得し、各撮像範囲ＡＲに割り当てられたサンプル部位像を連結することによって第２生体サンプル像ＳＩＭ２を取得する。
【０１７１】
さらに移動制御部３２は、生体サンプルＳＰＬの対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ＡＲに位置するたびに、可動ステージ１１をＺ軸方向に等速で移動させると共に、第２生体サンプル像ＳＩＭ２が取得された時の開始位置とは９０°回転させた位置から透明板１１４を例えば半回転させる。サンプル像取得部３３は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子１５を露光させてサンプル部位像を取得し、各撮像範囲ＡＲに割り当てられたサンプル部位像を連結することによって第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得する。
【０１７２】
このようにしてサンプル像取得装置１００は、透明板１１４を回転させることにより撮像素子１５に結像される像を向きを変えることなく円移動させて第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得するようになされている。
【０１７３】
なお、透明板１１４を回転させることにより撮像素子１５に結像される生体サンプルＳＰＬの像を、傾きを変化させることなく円移動させる以外にも、エミッションフィルタ１２Ｄを移動させることにより撮像素子１５に結像される生体サンプルＳＰＬの像を、傾きを変化させることなく円移動させるようにしてもよい。
【０１７４】
上述した実施の形態においては、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３の蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３が形成する円弧の傾き（円弧傾き角）θを算出し、該円弧傾き角θに基づいて対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出するようにした場合について述べた。本願発明は、これに限らない。
【０１７５】
例えば、第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３から所定の閾値よりも高い輝度値の画素を抽出すると、蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３が、Ｚ軸方向の位置に応じた傾きの略楕円形を形成する場合がある。この場合、ＣＰＵ２１は、例えば蛍光像ＥＰ２及びＥＰ３が形成する楕円の長軸とＸ軸とのなす角を算出し、当該なす角の角度差に基づいて対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を算出するようにしてもよい。
【０１７６】
上述した実施の形態においては、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながらＸＹ平面を円移動させることにより、撮像素子１５に結像される上記サンプル部位の像の向きを変化させることなく円移動させる。そして、可動ステージ１１を移動させている間、撮像素子１５を露光して第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３を取得する。そして第２生体サンプル像ＳＩＭ２及び第３生体サンプル像ＳＩＭ３における円弧状の蛍光像ＥＰの傾き角度に応じて、対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置を算出するようにした場合について述べた。
【０１７７】
本発明はこれに限らず、図１６に示すように、移動制御部３２は、例えば可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら例えばＸ軸方向に移動速度が変化するように加速又は減速させながら移動させる。サンプル像取得部３３は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子１５を露光して撮像されるサンプル部位像を結合して生体サンプル像（以下、これを第４生体サンプル像とも呼ぶ）を取得する。
【０１７８】
また移動制御部３２は、例えば可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら例えばＹ軸方向に移動速度が変化するように加速又は減速させながら移動させる。サンプル像取得部３３は、可動ステージ１１が移動している間、撮像素子１５を露光して撮像されるサンプル部位像を結合して生体サンプル像（以下、これを第５生体サンプル像とも呼ぶ）を取得する。
【０１７９】
これにより第４生体サンプル像及び第５生体サンプル像から所定閾値以上の画素のかたまりを蛍光像として抽出すると、図１０（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、可動ステージ１１のＸＹ面上での移動速度に応じて長軸／短軸比が異なる略楕円形の蛍光像ＥＰとして写る。
【０１８０】
また第４生体サンプル像及び第５生体サンプル像は、可動ステージ１１がＸＹ平面上で直交する方向に移動された際に撮像されている。このため、２つ以上の蛍光マーカＥＭがＸＹ平面上に近接しており、かつＺ軸方向にほぼ同じ位置にある場合においても、それらの蛍光マーカＥＭの蛍光像ＥＰがどちらか一方では重なることはない。
【０１８１】
従って算出部３５は、第４生体サンプル像及び第５生体サンプル像から所定閾値以上の画素のかたまりを蛍光像ＥＰとし、輝度値のピークが１つしかない蛍光像ＥＰの長軸／短軸比を算出する。そして算出部３５は、算出した長軸／短軸比と、予め輝点ＢＰの長軸／短軸比とＺ軸方向の位置とが対応付けられたテーブルとを比較して、対応する蛍光マーカＥＭのＺ軸方向の位置（ｚ）を検出する。
【０１８２】
また算出部３５は、算出した蛍光像ＥＰの中心位置を対応する蛍光マーカＥＭのＸＹ平面上の位置（ｘ、ｙ）として検出する。
【０１８３】
このようにしてサンプル像取得装置１は、可動ステージ１１をＺ軸方向に移動させながら例えばＸ軸方向又はＹ軸方向に移動速度が変化するように移動させて撮像された第４生体サンプル像及び第５生体サンプル像を基に蛍光マーカＥＭの３次元位置（ｘ、ｙ、ｚ）を算出することができる。
【０１８４】
なお、第４生体サンプル像及び第５生体サンプル像に写し出させる蛍光像の長軸／短軸比が例えば１．３〜１．５程度となるように可動ステージ１１をＺ軸方向及びＸＹ平面上に移動させる。
【０１８５】
上述した実施の形態においては、対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂが設けられている場合について述べた。本発明はこれに限らず、対物レンズ１２Ａだけであってもよい。また対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂをレボルバー等を適用して倍率が可変できるようにしてもよい。
【０１８６】
上述した実施の形態においては、サンプルとして生体に関する生体サンプルが適応された場合について述べたが、本発明はこれに限らず、例えばガラス台に配された蛍光ビーズをサンプルとして適応してもよい。
【０１８７】
上述した実施の形態においては、サンプル像取得処理により得られたサンプルデータは記憶部２７に保存された。記憶部２７は、データ処理部２０内に設ける場合に限定されるものではなく、該データ処理部２０の外部としてもよい。また記憶部２７に対するデータの通信媒体はバス２８に限定されるものではなく、例えば、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体としてもよい。
【０１８８】
上述した実施の形態においては、ＣＰＵ２１がＲＯＭ２２に格納されているサンプル像取得プログラムに従い、上述したサンプル像取得処理を行うようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、記憶媒体からインストールしたり、インターネットからダウンロードしたサンプル像取得プログラムに従って上述したサンプル像取得処理を行うようにしても良い。またその他種々のルートによってインストールしたサンプル像取得プログラムに従って上述したサンプル像取得処理を行うようにしても良い。
【０１８９】
上述した実施の形態においては、撮像素子として撮像素子１５、移動制御部として移動制御部３２、サンプル像取得部としてサンプル像取得部３３が設けられるようにした場合について述べた。しかしながら本発明は、その他種々の構成でなる撮像素子、移動制御部及びサンプル像取得部を設けるようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【符号の説明】
【０１９１】
１、１００……サンプル像取得装置、１０、１１０……顕微鏡、１１……可動ステージ、１２……光学系、１２Ａ……対物レンズ、１２Ｂ……結像レンズ、１２Ｃ……ダイクロイックミラー、１２Ｄ……エミッションフィルタ、１２Ｅ……励起フィルタ、１３……照明灯、１４……光源、１５……撮像素子、２０……データ処理部、２１……ＣＰＵ、２２……ＲＯＭ、２３……ＲＡＭ、２４……操作入力部、２５……インターフェイス、２６……表示部、２７……記憶部、３１……光源制御部、３２……移動制御部、３３……サンプル像取得部、３４……データ記録部、３５……算出部、１１１……モータ、１１２……回転軸、１１３……傾斜台座、１１４……透明板、ＣＧ……カバーガラス、ＳＧ……スライドガラス、ＳＰＬ……生体サンプル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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