(57)【要約】【課題】夾雑物が混在する検体液中で目的の細胞または微生物（生菌）を正確に計測する手段を提供する。【解決手段】計測目的の細胞または微生物を含む検体液に、膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する一種類または複数種類の蛍光色素とグリセリンを検体液に追加し一定時間静置する。グリセリンは検体液と蛍光色素の混合の前後または同時に追加する。計測目的の細胞または微生物を染色後、特定の波長の光を照射し、細胞または微生物から発せられる蛍光を検出することで目的の細胞または微生物を計測する。【選択図】  図１
2011092104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素で細胞または微生物を染色し、前記細胞または微生物に特定の波長の光を照射し前記細胞または微生物から発せられる蛍光によって前記細胞または微生物を検出する細胞または微生物の検査方法において、
前記細胞または微生物を含む検体液と前記蛍光色素を混合する前後または同時にグリセリンを前記検体液に追加するようにした細胞または微生物の検査方法。
【請求項２】
請求項１記載の細胞または微生物の検査方法において、前記検体液とグリセリンの混合時のグリセリン濃度が１％〜３０％であることを特徴とする細胞または微生物の検査方法。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞または微生物の検査方法において、前記蛍光色素として、蛍光スペクトルの異なる複数の蛍光色素を使用することを特徴とする細胞または微生物の検出方法。
【請求項４】
微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記微生物を染色する蛍光色素を保持すると共に前記検体液と前記蛍光色素とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出するための微生物検出部とを有する微生物検査チップと、
前記微生物検査チップと連結され、前記検体液，前記蛍光色素とを前記微生物検査チップ内に搬送する圧力供給装置と、
前記微生物検査チップを保持すると共に、前記微生物検査チップを移動させるステージと、
前記微生物検出部に励起光を照射する光源と、前記微生物検出部の検出用流路を流れる微生物からの蛍光を検出して電気信号に変換する検出器と、
前記微生物を含む検体液と前記蛍光色素を混合する前後または同時にグリセリンを前記検体液に追加する手段を有することを特徴とする微生物の検査装置。
【請求項５】
膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素で細胞または微生物を染色し、前記細胞または微生物に特定の波長の光を照射し前記細胞または微生物から発せられる蛍光によって前記細胞または微生物を検出する細胞または微生物の検査方法において、
前記蛍光色素として、蛍光スペクトルの異なる二種類以上の蛍光色素を使用することを特徴とする細胞または微生物の検査方法。
【請求項６】
請求項５記載の細胞または微生物の検査方法において、蛍光スペクトルのピークが５０ｎｍ以上離れている複数の蛍光色素を用いることを特徴とする細胞または微生物の検査方法。
【請求項７】
微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記微生物を染色する蛍光色素を保持すると共に前記検体液と前記蛍光色素とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出するための微生物検出部とを有する微生物検査チップと、
前記微生物検査チップと連結され、前記検体液，前記蛍光色素とを前記微生物検査チップ内に搬送する圧力供給装置と、
前記微生物検査チップを保持すると共に、前記微生物検査チップを移動させるステージと、
前記微生物検出部に励起光を照射する光源と、前記微生物検出部の検出用流路を流れる微生物からの蛍光を検出して電気信号に変換する検出器とを有し、
前記蛍光色素として、蛍光スペクトルのピークが５０ｎｍ以上離れた、膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する２種類以上の蛍光色素を用いるようにしたことを特徴とする微生物の検査装置。
【請求項８】
膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素を用いて染色した検出目的の細胞または微生物に特定の波長の光を照射し、前記細胞または微生物から発せられる蛍光によって前記目的の細胞または微生物を検出する細胞または微生物の検査方法において、
前記細胞または微生物を含む検体液と前記蛍光色素を混合・静置後、撹拌を行わずに前記細胞または微生物を検出することを特徴とする細胞または微生物の検査方法。
【請求項９】
請求項８記載の細胞または微生物の検査方法において、前記細胞または微生物を含む検体液と前記蛍光色素を混合し、３０〜１２０分静置したのち、撹拌を行わずに前記細胞または微生物を検出することを特徴とする細胞または微生物の検査方法。
【請求項１０】
膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素と、膜不透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素と、動物細胞または植物細胞由来の物質を染色する蛍光色素を用い、食品をホモジナイズした液中の菌体を検出する微生物の検査方法において、
膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素の蛍光スペクトルのピークは５５０ｎｍ未満または６８０ｎｍ以上の範囲内にあり、膜不透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素の蛍光スペクトルのピークは５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の範囲内にあり、動物細胞または植物細胞由来の物質を染色する蛍光色素の蛍光スペクトルのピークは５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の範囲内にあることを特徴とする微生物の検査方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微生物の検査方法において、前記膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素として、蛍光スペクトルが異なる複数の蛍光色素を使用することを特徴とする微生物の検査方法。
【請求項１２】
微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記微生物を染色する蛍光色素を保持すると共に前記検体液と前記蛍光色素とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出するための微生物検出部とを有する微生物検査チップと、
前記微生物検査チップと連結され、前記検体液，前記蛍光色素とを前記微生物検査チップ内に搬送する圧力供給装置と、
前記微生物検査チップを保持すると共に、前記微生物検査チップを移動させるステージと、
前記微生物検出部に励起光を照射する光源と、前記微生物検出部の検出用流路を流れる微生物からの蛍光を検出して電気信号に変換する検出器とを有し、
前記蛍光色素として、蛍光スペクトルのピークが５５０ｎｍ未満または６８０ｎｍ以上の範囲内にある膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する二種類以上の蛍光色素と、蛍光スペクトルのピークが５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の範囲内にある膜不透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素を用いるようにしたことを特徴とする微生物の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物などの検査方法及び検査装置にかかり、特に、蛍光サイトメトリー法を用いた微生物検査装置に関する。なお、本明細書において、微生物検査方法及び検査装置とは、細胞や微生物の検査方法及び検査装置を意味し、微生物のみの検査方法及び検査装置に限定されるものではない。また、本明細書及び特許請求の範囲において、表記を簡単にするため、「細胞または微生物」と表記しないで、単に「微生物」と表記する場合があるがその場合には細胞も含まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
食品中に含まれる生菌数の計測の迅速化および簡便化を目的とした生菌数計測装置（微生物検査装置）が市場に提供されている。その中でも、迅速性と定量性に優れている生菌数計測装置として、蛍光サイトメトリー法を使用した生菌数計測装置が注目されている。蛍光サイトメトリー法は蛍光染色した生菌を短時間に一個ずつ計測する方法で、大きく蛍光イメージサイトメトリー法と蛍光フローサイトメトリー法に大別される。蛍光イメージサイトメトリー法は、蛍光色素で染色した生菌をガラスやフィルタなどに吸着させ、吸着した生菌を一個ずつ計測する方法である。一方、蛍光フローサイトメトリー法は、蛍光色素で染色した生菌を含む検体液の流径を細くすることによって、流路に流れる生菌を一個ずつ計測する方法である。
【０００３】
蛍光サイトメトリー法を使用した生菌数計測装置で食品中の生菌数を測定するときの課題は、計測を行う前に夾雑物を取り除くための精製が必要であることである。夾雑物は、葉緑体，色素体，ミトコンドリア，糖質（でんぷんやグリコーゲン），脂質の塊などの食品由来の物質に加え、死菌や、染色のために使用する蛍光色素の粒子がある。これらの夾雑物は自家蛍光や蛍光色素による染色や吸着により蛍光を発するため、生菌として誤計測する要因となる。生菌を精製する方法には遠心分離法やカラム法などがあり、これらの方法は生菌と夾雑物を高い精製度で分離することが可能である。
【０００４】
一方、精製を実施せずに生菌と夾雑物を判別する例の一つとして、二種類の蛍光色素を用いて生菌と死菌を判別し、生菌を計測する方法がある。この方法は、死菌の膜表面には損傷があるが、生菌の膜表面には損傷がないことを利用した判別方法で、膜透過性の青色の蛍光色素であるＤＡＰＩ（４′，６−ヂアミジン−２′−フェニルインドール）と膜不透過性の赤色の蛍光色素であるＰＩ（プロピディウムイオダイド）を用いて生菌と死菌を判別するものである。膜透過性のＤＡＰＩは損傷の有無にかかわらず菌体の膜を透過するため、ＤＡＰＩの青色の蛍光は生菌・死菌から発するが、膜不透過性のＰＩは損傷のある膜しか透過しないため、ＰＩの赤色の蛍光は死菌からしか発しない。この方法のように、波長が異なる複数の蛍光色素でそれぞれの物質を特異的に染色することで、蛍光の波長の違いにより物質を判別する方法を多重染色法という。
【０００５】
尚、蛍光フローサイトメトリー法において、検体や試薬を微生物検査チップ内に保持させて簡易に微生物を検査するようにした技術として、特許文献１や特許文献２に記載のものがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１５７８２９号公報
【特許文献２】特開２００９−１７８０７８号公報
【特許文献３】特開２０００−３４２３００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
微生物検査装置において、生菌と検体液に含まれる夾雑物を判別して菌数精度を向上させることが重要である。この菌数精度を向上させる上では幾つかの課題がある。
【０００８】
生菌と夾雑物を判別するための第一の課題は、生菌の蛍光染色の度合いが不十分で、生菌の蛍光強度が弱いことである。生菌の蛍光染色の度合いを促進するために、蛍光色素の他に界面活性剤やＥＤＴＡなどのキレート剤を染色促進剤として検体液に追加することが知られている。しかし、界面活性剤には殺菌性があるため生菌を死菌化する問題や、起泡性があるため発生した気泡が測定を阻害する問題がある。一方、ＥＤＴＡは、殺菌性があるため生菌を死菌化する問題や、生分解性がないため、廃棄時の環境負荷が大きくなる問題がある。
【０００９】
次に生菌と夾雑物を判別するための第二の課題は、生菌の蛍光の波長と蛍光強度が同じになるため、判別することが難しい夾雑物が存在することである。上述のＤＡＰＩとＰＩの二重染色を例とすると、生菌はＤＡＰＩの青色の蛍光のみを発するが、ＤＡＰＩの粒子も青色の蛍光のみを発する。生菌の蛍光と同程度の強さの蛍光を発する粒子も存在するため、生菌とＤＡＰＩの粒子を判別することは難しい。生菌と色素粒子の判別の問題はＤＡＰＩに限定した問題ではなく、他の蛍光色素を使用した場合にもあてはまる。
【００１０】
ところで検体液中に含まれる蛍光を発する洗剤，紙片屑と目的の菌種の菌体を正確に選別するために行う方法として、異なる波長の蛍光色素で染色した微小ＤＮＡ（約２００kbp）をもつファージを二種類使用することにより特定の菌体を二重染色する方法が知られている（特許文献３を参照）。この方法では、蛍光を発する洗剤，紙片屑が検体液に含まれていても、特定の菌体は二種類の蛍光を発するため洗剤，紙片屑と目的とする特定の菌体との判別が可能となる。この方法は特定菌種の計測を目的とする場合には、高精度の測定結果を得ることができるが、食品検査のように菌種に係らず全ての生菌を計測する必要のある用途には適さない。また、蛍光色素自体が夾雑物となることについては何等考慮されていない。
【００１１】
次に生菌と夾雑物を判別するための第三の課題は、多重染色法のために使用する蛍光色素の種類が多いと蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりが大きくなり、蛍光の情報から生菌を判別することが難しくなることである。一般的な蛍光サイトメーターでは、蛍光スペクトルの重なりを解析により排除することで生菌と夾雑物を特定しているが、高機能な解析装置が必要になり装置の製造コストが高くなる。
【００１２】
本発明の第一の目的は、細胞または微生物（生菌）に蛍光色素を染色させて細胞または微生物を計測する微生物検査方法において、殺菌性や起泡性、生分解性の問題を低減して、細胞または微生物の蛍光染色を促進させ、細胞または微生物の測定が可能な微生物検査方法と検査装置を提供することにある。
【００１３】
本発明の第二の目的は、細胞または微生物（生菌）計測において、細胞または微生物を染色する蛍光色素により細胞または微生物の計測精度が低下することを抑制することが可能な微生物検査方法と検査装置を提供することにある。
【００１４】
本発明の第三の目的は、多重染色法を用いた微生物検査においても、高機能な解析装置を使用せずに生菌（菌体）の計測精度を向上することが可能な微生物検査方法と検査装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、第一の目的を達成するために、細胞または微生物（生菌）を含む検体液に、膜透過性でかつ核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素と蛍光促進剤としてグリセリンを追加して細胞または微生物を染色し、染色された細胞または微生物に特定の波長の光を照射し、細胞または微生物から発せられる蛍光を検出することで目的の細胞または微生物を計測するようにしたものである。
【００１６】
グリセリンは検体液と蛍光色素の混合の前後または同時に追加することができる。
【００１７】
検体液とグリセリンの混合液の終濃度は１％〜３０％以内となるようすることが好ましい。
【００１８】
また、本発明は、第二の目的を達成するために、細胞または微生物（生菌）を含む検体液に、膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する、蛍光スペクトルが異なる二種類以上の蛍光色素を追加して細胞または微生物を染色し、細胞または微生物に特定の波長の光を照射し、細胞または微生物から発せられる発光スペクトルが異なる蛍光を検出することで目的の細胞または微生物を計測するようにしたものである。
【００１９】
二種類以上の蛍光色素は、それぞれの蛍光スペクトルのピークが少なくとも５０ｎｍ以上離れていることが好ましい。
【００２０】
また、本発明は、細胞または微生物（生菌）を含む検体液に、膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素を追加し、一定時間静置したのち検体液と蛍光色素の混合液に撹拌操作を加えずに、細胞または微生物に特定の波長の光を照射し、細胞または微生物から発せられる蛍光を検出することで目的の細胞または微生物を計測するようにしたものである。
【００２１】
染色後の静置時間は３０分から１２０分の間が好ましい。
【００２２】
また、本発明の第三の目的を達成するために、食品を均質化（ホモジナイズ）した液に、膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素と、膜不透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素と、動物細胞または植物細胞由来の物質を染色する蛍光試薬を追加するようにしたものであって、膜不透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する蛍光色素と動物細胞または植物細胞由来の物質を染色する蛍光色素は、その蛍光スペクトルのピークが５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の範囲内にあるものを選択し、これらの蛍光色素を検体液に追加して液中の生菌を染色し、生菌に特定の波長の光を照射し、生菌から発せられる蛍光を検出することで目的の生菌を計測するようにしたものである。
【発明の効果】
【００２３】
（Ａ）第一の目的に関する発明
グリセリンは、菌体の冷凍保存に使用されているように殺菌性は低く、食品・医薬品へ使用されているように生分解性に優れていることから環境負荷が低く、さらに起泡性も少ないため気泡の発生による測定阻害も発生しにくい。本発明では、このグリセリンを微生物検査における細胞または微生物（生菌）への蛍光色素の染色促進剤として使用することで、従来の使用されていた染色促進剤（界面活性剤やＥＤＴＡなどのキレート剤）における殺菌性や起泡性、生分解性の問題を低減して、細胞または微生物の蛍光染色を促進させることができ、その結果、細胞または微生物の計測精度を向上させることができる。
【００２４】
（Ｂ）第二の目的に関する発明
膜透過性でかつ核酸結合性で、蛍光スペクトルが異なる蛍光色素を複数種類使用することで、目的とする細胞または微生物（生菌）からは複数の蛍光スペクトルが検出され、その結果、検出した蛍光の種類の情報から、目的とする細胞または微生物と、蛍光色素が凝集した粒子を判別でき、その結果、細胞または微生物の計測精度を向上させることができる。
【００２５】
また、染色後に検体液を静置し、蛍光色素が凝集する時間を確保することで検体液中の色素粒子数を低減することができ、その結果、細胞または微生物の計測精度を向上させることができる。
【００２６】
（Ｃ）第三の目的に関する発明
食品をホモジナイズした液中に含まれる生菌を検出する際、死菌用の蛍光色素と動物細胞または植物細胞由来の物質を染色する蛍光色素には蛍光スペクトルのピークが５５０以上６８０ｎｍ未満の範囲にあるものを選択することで、検出対象の生菌の蛍光のみを選別して検出し、死菌，葉緑体，ミトコンドリアなどの排除対象の蛍光を選別せず検出することができるため、解析回路を簡素化することができる。
【００２７】
第一から第三の目的に関する本発明は、それぞれは単独でも細胞または微生物（生菌）の計測の精度を向上させることができるが、組み合わせることにより細胞または微生物（生菌）の計測精度がさらに向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施の形態に係るグリセリンを染色促進剤として使用したときの染色手順を示す図である。
【図２（Ａ）】グリセリンを用いないで蛍光染色した大腸菌の顕微鏡写真の模式図である。
【図２（Ｂ）】本発明の実施の形態に係る蛍光染色した大腸菌の顕微鏡写真の模式図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る蛍光染色した大腸菌の蛍光フローサイトメーターによる測定結果を示す図である。
【図４（Ａ）】一種類の蛍光色素で染色を行ったときの菌体と色素粒子の発光の様子を説明する図である。
【図４（Ｂ）】本発明の実施の形態に係る二種類の蛍光色素で染色を行った時の菌体と色素粒子の発光の様子を説明する図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る各種物質の発光例を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る二種類の蛍光色素で染色を行った時のフローサイトメーターのカウント数と培養法で得られた菌数との関係を説明する図である。
【図７】四種類の野菜の自家蛍光のスペクトルを示す図である。
【図８（Ａ）】本発明の実施の形態に係る四種類の蛍光色素の蛍光スペクトルを示す図である。
【図８（Ｂ）】本発明の実施の形態に係る四種類の蛍光色素の蛍光スペクトルの他の例を示す図ある。
【図９】本発明の実施の形態に係る各種物質の発光例を示す図である。
【図１０】本発明の実施の形態に係る微生物検査装置の概略構成を示す図である。
【図１１（Ａ）】本発明の実施の形態に係る微生物検査装置に用いられる微生物検出チップにおける微生物検出用流路を含む断面例を示す図である。
【図１１（Ｂ）】本発明の実施の形態に係る微生物検査装置に用いられる微生物検出チップにおける微生物検出用流路を含む分解構造例を示す図である。
【図１２】本発明の実施の形態に係る微生物検査装置における分析工程を説明する図である。
【図１３】本発明の実施の形態に係る微生物検査装置に用いられる微生物検査チップの概略構成を示す図である。
【図１４】本発明の実施の形態に係る微生物検査装置に搭載される検出装置の概略構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施の形態同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能である。
【００３０】
（Ａ）染色促進剤を使用した菌体の蛍光強度増加
図１は本発明の実施の形態における染色手順を説明するためのフローチャートである。食品や飲料水などの検体液中に含まれる生菌を蛍光法で計測する手順を一例として示す。
（１）食品のストマッキング液，飲料水などの検査検体から一定量取り出し、検体液とする。
（２）検体液中には目的とする生菌以外の夾雑物が含まれている。生菌（直径約１ミクロン）より大きい夾雑物を遠心分離法などの手段によって取り除く。夾雑物を取り除く他の手段としては、濾過法，カラム法などがある。
（３）検体液にグリセリンを追加し、一定時間（例えば１分〜３０分）静置する。グリセリン追加の目的は菌体内部に蛍光色素が透過しやすい状態をつくり染色性を促進させることである（詳細は後述）。従って、グリセリン追加後、一定時間静置したほうが蛍光色素の染色性が強まるが、蛍光色素とグリセリンを同時もしくは蛍光色素の追加後に追加しても、グリセリンによる蛍光色素の染色促進の効果が得られる。また、グリセリンの終濃度が高すぎると生菌の生体活性が失われる可能性があるが、我々が培養法により検討した結果では、グリセリンの終濃度が３０％以内であれば、生菌の生体活性には影響がないことと、死菌用の染色色素が生菌を染色しないことを確認している。
（４）蛍光色素を追加し、検体を一定時間（３０分〜１２０分）静置する。染色時の一定時間の静置には次の二つの理由がある。第一の理由として、膜透過性かつ核酸結合性の蛍光色素の場合、蛍光色素が生菌内に入り生菌内の核酸に結合するには一定の時間が必要になるからである。第二の理由として、膜透過性かつ核酸結合性の蛍光色素の大半は疎水性であるため、水溶液中では時間とともに凝集する傾向があるからである。一定の静置時間を確保することで色素粒子の凝集を促進し、色素粒子数を減少することができる。撹拌のエネルギーにより色素粒子が分裂することを防ぐため、静置後は撹拌しないことが好ましい。詳細は後述するが、色素粒子と生菌との区別のために複数種類の蛍光色素を使用してもよい。また、染色時に一定の静置時間を確保することが染色促進と色素粒子低減の効果を有することは、グリセリンの使用の有無にはかかわらない。
（５）顕微鏡による蛍光観察や蛍光サイトメトリー（イメージサイトメトリー（以下ＩＣＭ）やフローサイトメトリー（以下ＦＣＭ））などによる蛍光計測手段により蛍光染色した生菌を観察・計測する。
【００３１】
図２は、染色促進剤としてのグリセリンの効果示す顕微鏡画像を模式的に図示したものである（実際の顕微鏡画像は、背景が黒色であり、輝点が白色であるが、模式図では背景が白、輝点が黒で図示されている。）。画像の模式図中の輝点は蛍光色素に染色された菌体（生菌および死菌）であり、蛍光色素に染まった菌体ほど明瞭な像となる。図２（Ａ）は、大腸菌（菌種：ＮＴ９００１，菌濃度：１０8個／ml）を含む液に、膜浸透性かつ核酸結合性の蛍光色素であるシアニン系橙蛍光色素を終濃度０.４μＭとなるよう追加し、室温で４０分静置後に光学顕微鏡で観察した時の顕微鏡画像の模式図である。一方、図２（Ｂ）は、大腸菌（菌種：ＮＴ９００１，菌濃度：１０8個／ml）を含む液に、グリセリンを終濃度１０％、シアニン系橙蛍光色素を終濃度０.４μＭとなるように追加し、室温で４０分静置後に光学顕微鏡で観察した時の顕微鏡画像の模式図である。二枚の顕微鏡画像の模式図を比較し、グリセリンを追加した検体のほうが菌体の像が明瞭になっていることから、グリセリンを追加することで蛍光色素の菌体への染色性が促進されたことがわかる。発明者はグリセリンを追加することで菌体の膜蛋白の働きが阻害され、蛍光色素が菌体内部に透過しやすくなったため染色性が促進されたものと考えている。
【００３２】
図３は、染色促進剤としてのグリセリンの効果を示すもので、蛍光フローサイトメーターを用い、蛍光色素で染色した大腸菌の大きさと蛍光量を測定した結果を示す。横軸は粒子の大きさを示す前方散乱光の強度、縦軸は蛍光量を示す。測定した検体は以下の（１）コントロール（蛍光色素，グリセリン追加なし）、（２）蛍光色素を追加、（３）蛍光色素，グリセリンを追加の３条件で処理したものである。以下にそれらの測定手順を示す。
（１）コントロールとして、大腸菌（菌種：ＮＴ９００１，菌濃度：１０5個／ml）を含む検体にグリセリン，蛍光色素を追加せずにフローサイトメーターで測定した。
（２）大腸菌（菌種：ＮＴ９００１，菌濃度：１０5個／ml）を含む検体に膜浸透性かつ核酸結合性の蛍光色素であるシアニン系青蛍光色素を終濃度０.８μＭとなるように追加し、室温で４０分静置後にフローサイトメーターで測定した。
（３）大腸菌（菌種：ＮＴ９００１，菌濃度：１０5個／ml）を含む検体に、グリセリンを終濃度１０％、シアニン系青蛍光色素を終濃度０.８μＭとなるように追加し、室温で４０分静置後にフローサイトメーターで測定した。
【００３３】
図３から、グリセリンを追加した検体のほうが菌体の蛍光が強くなっていることから、グリセリンを追加することで蛍光色素の全菌への染色性が促進されたことがわかる。
【００３４】
グリセリンは、菌体の冷凍保存に使用されているように殺菌性は低く、食品・医薬品へ使用されているように生分解性に優れていることから環境負荷が低く、さらに起泡性も少ないため気泡の発生による測定阻害も発生しにくい。これらの点から染色促進剤として従来から知られている界面活性剤やＥＤＴＡより優れていると言える。
【００３５】
（Ｂ）二重染色を用いた色素粒子の影響除去
図４（Ａ），（Ｂ）は、二重染色による生菌と蛍光色素の色素粒子の判別の原理を示す説明図である。
【００３６】
図４（Ａ）は、膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する第一の蛍光色素で生菌を染色したときに、生菌２０１と、第一の蛍光色素の分子２０３の凝集物がそれぞれ発する蛍光の様子を示す。生菌を含む液体と第一の蛍光色素を混合すると、第一の蛍光色素の分子２０３は膜透過性であるため、第一の蛍光色素の分子２０３の一部は生菌２０１の細胞膜を透過し生菌２０１のＤＮＡ２０２に結合する。また、ＤＮＡに結合しなかった第一の蛍光色素の分子２０３の一部は凝集し粒子化する。この状態で第一の蛍光色素を励起する励起光２０４を照射すると、生菌２０１は第一の蛍光色素の蛍光２０５を発し、第一の蛍光色素の分子２０３の凝集物も蛍光２０６を発する。蛍光２０５と蛍光２０６はともに第一の蛍光色素の蛍光であるため、生菌２０１と第一の蛍光色素の分子２０３の粒子を波長の情報だけでは区別することができない。仮に蛍光強度に大きな差があれば、強度差から二つを判別することは可能であるが、生菌の蛍光強度分布と色素粒子の蛍光強度分布は重なっていることが多く、生菌２０１と第一の蛍光色素の分子２０３の凝集物を判別することは難しい。
【００３７】
図４（Ｂ）は、膜透過性で核酸結合により蛍光量が増幅する二種類の蛍光色素（第一の蛍光色素と第二の蛍光色素）で生菌を染色したときに、生菌２０１と、第一の蛍光色素の分子２０３の凝集物と、第二の蛍光色素の分子２０７の凝集物がそれぞれ発する蛍光の様子を示す。生菌を含む液体と第一の蛍光色素と第二の蛍光色素を混合すると、第一の蛍光色素の分子２０３と第二の蛍光色素の分子２０７は膜透過性であるため、第一の蛍光色素の分子２０３の一部と第二の蛍光色素の分子２０７の一部は、それぞれ生菌２０１の細胞膜を透過し生菌２０１のＤＮＡ２０２に結合する。また、ＤＮＡに結合しなかった第一の蛍光色素の分子２０３の一部と第二の蛍光色素の分子２０７の一部は凝集し粒子化する。この状態で第一の蛍光色素と第二の蛍光色素を励起する励起光２０４を照射すると、生菌２０１は蛍光２０８を発し、第一の蛍光色素の分子２０３の凝集物は蛍光２０６を発し、第二の蛍光色素の分子２０７の凝集物は蛍光２０９を発する。蛍光２０８は第一の蛍光色素と第二の蛍光色素の蛍光が合わさった蛍光であるが、蛍光２０６は第一の蛍光色素の蛍光であり、蛍光２０９は第二の蛍光色素の蛍光であるため、生菌２０１と第一の蛍光色素の分子２０３の凝集物および第二の蛍光色素の分子２０７の凝集物を、波長の情報だけで区別することができる。
【００３８】
この方法で全菌（生菌と死菌）を二種類（第一及び第二）の蛍光色素で染色したときに、全菌並びに第一及び第二の蛍光色素の粒子から発する蛍光の種類を図５に示す。全菌は第一の蛍光色素および第二の蛍光色素に染色されているため、二種類の蛍光色素の蛍光を発するが、第一の蛍光色素の粒子は第一の蛍光色素の蛍光を、第二の蛍光色素の粒子は第二の蛍光色素の蛍光しか発しない。
【００３９】
この方法によれば、波長の情報だけで全菌などの目的粒子と色素粒子の判別が可能になるため、蛍光の情報から目的粒子数の計測を行う蛍光サイトメトリー（ＩＣＭ，ＦＣＭ）に有用な方法である。特に後述の微生物検査チップを用いた蛍光フローサイトメトリー法のように計測の事前に夾雑物を遠心分離などの精製により除去できない場合に効果が大きい。これにより、誤検出の要因であった色素粒子の排除が容易になるため、計測精度と計測下限を向上することができる。
【００４０】
図６は、二重染色による色素粒子の影響除去の効果をフローサイトメーターで実証した結果を示す図である。大腸菌（菌種：ＮＴ９００１，菌終濃度：１０2〜１０5個／ml）を含む液体に、共に膜浸透性かつ核酸結合性の蛍光色素であるＬＤＳ７５１（終濃度：１μｇ／ml）とシアニン系赤蛍光色素（終濃度：０.４μＭ）を追加した後、染色した菌数をフローサイトメーターで測定し、その測定数と培養法で得られた菌数を比較したものである。図６には、（１）液体中の菌数を変えた時のＬＤＳ７５１の蛍光が検出された粒子の計測数、（２）ＬＤＳ７５１とシアニン系赤蛍光色素の蛍光が同時検出された粒子の計測数を記載している。特にＬＤＳ７５１は色素粒子数が非常に多い蛍光色素で、おおよそ１０4〜１０5個／mlの色素粒子が含まれている。そのため菌濃度がＬＤＳ７５１の色素粒子数に対し圧倒的に少ない場合、ＬＤＳ７５１の蛍光のみでは正確な菌数を求めることは困難になる。検体に含まれる色素粒子数の上限が菌数の検出下限とすると、ＬＤＳ７５１のみ使用した場合の菌数の検出下限は１０5個／mlとなる。一方、ＬＤＳ７５１とシアニン系赤蛍光色素を両方使用した場合、両方の蛍光色素の蛍光が同時検出された粒子を菌体として検出し、ＬＤＳ７５１とシアニン系赤蛍光色素の色素粒子の影響は取り除かれるため、高精度に菌数を計測することができる。同時染色を行った場合は菌数の検出下限が１０2個／mlまで下げられることを確認している。
【００４１】
菌体は複数の蛍光色素に染色されるため、使用する蛍光色素の種類が多いほど、色素粒子と菌体の選別率は向上する。しかし、蛍光色素の蛍光はスペクトルをもっているため、蛍光の分離を正確に行うためには、蛍光スペクトルのピークが最低でも５０ｎｍは離れている蛍光色素を使用することが好ましい。
【００４２】
また、染色促進剤として菌体の染色時にグリセリンを検体に追加すると、グリセリンを追加しないときに比べ、色素粒子数が数倍増えることがある。しかし、二重染色により色素粒子を計測対象から除去することで、色素粒子数が増加しても正確に菌数を計測することができ、グリセリンによる蛍光強度の増加の効果と相俟って検出精度を向上させることができる。
【００４３】
また、本実施の形態では全菌用色素を二種類使用し全菌数を計測したが、死菌用の色素を二種類使用することで、検体液中の死菌数を高精度に計測することが可能になる。死菌数は培養法でも計測することができないため、本方法は死菌数の計測に非常に有効な手段となる。
【００４４】
（Ｃ）多重染色における波長域の設定
図７は、自家蛍光を発する葉緑体および色素体を含む野菜を波長５３２ｎｍの励起光で励起したときの蛍光スペクトルを示す図である。ほうれん草は緑色の色素であるクロロフィルを含む葉緑体を多く保持し、じゃがいもはでんぷんを貯蔵するアミロプラストを保持し、南瓜は黄色の色素であるカロテノイドを含む色素体を多く保持し、葡萄の皮は紫色の色素であるアントシアニンを含む色素体を多く保持している。これらの野菜は黄色〜赤の波長域である５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の波長域で蛍光を発する。従って、これらの自家蛍光を発する粒子による検出精度の低下を避けるために、蛍光サイトメトリー（ＩＣＭ，ＦＣＭ）で食品中の細菌を検出する際には、全菌（生菌と死菌）を染色する色素の波長域は、５５０ｎｍ〜６８０ｎｍの波長域以外の、青色か近赤外の波長域の色素を選択することが好ましい。また、ミトコンドリアなどの、計測からの排除対象を染色するための色素の波長域は５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の範囲内でも問題はない。また、死菌のみを染色するための色素の波長域も５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満の範囲内で問題はない。
【００４５】
図８（Ａ），（Ｂ）は、蛍光サイトメーターで生菌を計測するために使用する蛍光色素の波長域の例である。本実施の形態では、計測からの排除対象である死菌を染色する蛍光色素には膜不浸透性の核酸結合性の蛍光色素である死菌用シアニン系橙蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：５７０ｎｍ）、同じく計測からの排除対象であるミトコンドリアを染色する色素にはミトコンドリア用赤蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：６４０ｎｍ）を、全菌（生菌と死菌）を染色する色素には膜浸透性の核酸結合性の蛍光色素である全菌用シアニン系青蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：４５０ｎｍ）と膜浸透性の核酸結合性の蛍光色素であるシアニン系橙蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：５５０ｎｍ）か（図８（Ａ））、全菌用シアニン系青蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：４５０ｎｍ）とＬＤＳ７５１（蛍光スペクトルのピーク波長：７２０ｎｍ）を（図８（Ｂ））選択している。この方法では、死菌、ミトコンドリア、野菜の色素体や葉緑体を区別することはできないが、これらの物質は計測からの排除対象であるため、互いの蛍光スペクトルが重なっても生菌の計測には問題はない。全菌（生菌と死菌）を染色する色素の他の候補としては、ＤＡＰＩ（４′，６−ヂアミジン−２′−フェニルインドール，蛍光スペクトルのピーク波長：４６０ｎｍ），ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８（蛍光スペクトルのピーク波長：４６０ｎｍ），ＨＯＥＣＨＳＴ３４５８０（蛍光スペクトルのピーク波長：５００ｎｍ），全菌用シアニン系赤蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：６７０ｎｍ付近）があげられる。死菌を染色する色素の他の候補としては、ＰＩ（プロピディウムイオダイド，蛍光スペクトルのピーク波長：６３０ｎｍ），ＥＢ（エチジウムイオダイド、蛍光スペクトルのピーク波長：６０５ｎｍ）があげられる。ミトコンドリアを染色する色素の他の候補としては、例えばミトコンドリア用橙蛍光色素（蛍光スペクトルのピーク波長：５７６ｎｍ）がある。
【００４６】
計測からの排除対象の蛍光の波長域を５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満に、全菌（生菌と死菌）を染色する色素の波長域をそれ以外にまとめ、生菌かそれ以外かの判断に特化することで蛍光サイトメーターの解析回路を単純化することが可能になり、また排除対象の波長（５５０ｎｍ以上６８０ｎｍ未満）の光はまとめて１〜２個の検出器で検出しても問題がないため、製造コストを大きく低減することができる。
【００４７】
図９は、食品由来の検体に全菌を染色する蛍光色素として、全菌用シアニン系青蛍光色素（青色の蛍光）とＬＤＳ７５１（近赤外の蛍光）、死菌のみを染色する蛍光色素として死菌用シアニン系橙蛍光色素（橙色の蛍光）、ミトコンドリアを染色する蛍光色素としてミトコンドリア用赤蛍光色素（赤色の蛍光）を使用したときの生菌，死菌，食品由来の物質（ミトコンドリア，葉緑体，色素体，でんぷん，グリコーゲン，セルロース），各色素粒子の蛍光の種類を示すものである。蛍光サイトメーターで食品由来の検体を測定する際、図９をもとに粒子を下記のように特定することができる。
（１）生菌は全菌を染色する蛍光色素のみ染色されるため、青色と近赤外の蛍光を発する。
（２）死菌は、死菌のみを染色する蛍光色素にも染色されるため、青色，橙，近赤外の蛍光を発する。
（３）葉緑体や色素体は内部にＤＮＡを持っているが、その長さは１５０kbpと菌体のＤＮＡ（数Ｍｂｐ）に比べ短いため、全菌を染色する蛍光色素に染色してもその蛍光は微弱なものになる。これらの物質は橙もしくは赤の自家蛍光を発するため、生菌と区別することが可能である。
（４）ミトコンドリアは動物細胞由来と植物細胞由来の二種類存在する。動物細胞のミトコンドリアのＤＮＡの長さは１０kbpと非常に短いが、植物細胞のミトコンドリアのＤＮＡの長さは菌体に近い長さを持っているという報告もあることから、全菌を染色する蛍光色素に染色した場合、菌体に近い蛍光を発するミトコンドリアも存在する。しかしミトコンドリアはミトコンドリア用の蛍光色素に染色され、赤色の蛍光を発するため生菌との区別が可能になる。
（５）でんぷん，グリコーゲン，セルロースなどの物質は核酸を持っていないが、蛍光色素が非特異的に吸着することで各種蛍光色素の蛍光を発する。
【００４８】
以上より、生菌以外の物質は橙色もしくは赤色の蛍光を発するため、生菌との区別が可能になる。
（６）各蛍光色素の粒子は構成する蛍光色素の蛍光しか出さないため、一種類の蛍光しかを発しない。そのため、生菌との区別が可能になる。
【００４９】
上述のように、本実施の形態によれば、検出対象の生菌の蛍光のみを選別して検出し、死菌，葉緑体，ミトコンドリアなどの排除対象の蛍光を選別せず検出することができるため、解析回路を簡素化することができる。
【００５０】
（Ｄ）微生物検査装置の全体構成例
図１０に、本発明の実施の形態に係る微生物検査装置１の構成図を示す。微生物検査装置１は、検体や試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備えた微生物検査チップ１０と、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査チップ１０と連結したチップ連結管１４４１〜１４４３を介して微生物検査チップ１０内に高圧気体を供給し、微生物検査チップ１０内の検体や試薬の搬送を制御するための圧力供給装置１４と、微生物検査チップ１０を保持し、微生物検査チップ１０の位置を調整するＸ−Ｙ可動ステージ１２５と、微生物検査チップ１０内の微生物に励起光を照射し、微生物からの散乱光及び蛍光を電気信号に変換する検出装置１１で構成されている。微生物検査装置１に連結したシステム装置１８は、圧力供給装置１４に対する制御信号の出力と、検出装置１１から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。なお、電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置１８に接続された出力装置１９に表示される。
【００５１】
圧力供給装置１４は、圧力調節装置付のボンベ１４１を有する。ボンベ１４１には高圧の空気，不活性気体等が封入されている。ボンベ１４１と微生物検査チップ１０の各通気口１５９１〜１５９３（図１３を参照）は、チップ連結管１４４１〜１４４３によって接続されている。チップ連結管１４４１〜１４４３には、バルブ１４２１〜１４２３がそれぞれ設けられている。バルブ１４２１〜１４２３を開閉することにより、微生物検査チップ１０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査チップ１０の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査チップ１０内における検体や試薬の搬送を実現する。このような微生物検査装置は、本発明者等が先に出願した特開２００８−１５７８２９号公報や特開２００９−１７８０７８号公報などにも詳しく説明されている。
【００５２】
微生物検査チップ１０は、図１０及び図１３に示すように、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、検体中の微生物の染色するための染色液（試薬液）１５２１を保持し、検体と染色液を混合、反応させる微生物染色液容器（反応容器）１５２と、励起光源１１１からの励起光１１３が照射され、微生物を観測するための微生物検出用流路１７３を内部に備えた微生物検出部１７と、微生物検出用流路１７３を通過した検体１５１１と染色液１５２１の混合液を廃棄するための検出液廃棄容器１５６と、検体容器１５１，微生物染色液容器１５２，微生物検出用流路１７３を連結し、検体１５１１や混合液が流動するための溶液用流路１５７１〜１５７３（図１３）と、圧力供給装置１４から検体１５１１や混合液を流動させるための高圧気体が供給される通気口１５９１〜１５９２（図１３）と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８２（図１３）とで構成されている。この明細書においては、検体液の流れに沿って検体容器１５１の側を上流側、微生物検出用流路１７３の側を下流側と定義する。
【００５３】
また、検体液と蛍光色素を混合する前後または同時にグリセリンを検体液に追加する工程を設ける場合には、例えば、微生物染色液容器１５２の下流に、グリセリンを保持する容器を設ける（図示省略）。
【００５４】
検出装置１１の概要を図１０に基づき説明する。検出装置１１は、励起光源１１１と、散乱光検出部と、蛍光検出部とで構成される。このうち、散乱光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの散乱光１２４を検出するための散乱光検出器１２３と、励起光源１１１からの励起光１１３が散乱光検出器１２３に直接入射することを防ぐための遮光板１２２とから構成される。一方、蛍光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの蛍光１２１を集光し、平行光にする対物レンズ１１４と、励起光１１３を微生物検出部１７の方向に反射する一方で蛍光１２１は透過するダイクロイックミラー１１２と、蛍光１２１を通過するバンドパスフィルタ１１７と、平行光を集光させるための集光レンズ１１８と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール１１９と、バンドパスフィルタ１１７を通過した光を検出する光検出器１２０とで構成される。なお、照射部及び検出部は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には微生物検出用流路１７３を焦点の位置に調整できるように構成されている。
【００５５】
検出装置１１は、励起光源１１１から出力された励起光１１３を微生物検出用流路１７３に照射し、微生物検出用流路１７３から生じる散乱光の光量と微生物検出部１７から生じる蛍光の光量をそれぞれ検出することにより、Ｘ−Ｙ可動ステージ１２５の可動位置と各光量との関係をプロファイルとして取得する。また、検出装置１１は、取得されたプロファイルに基づいてＸ−Ｙ可動ステージ１２５を可動制御し、微生物検査チップ１０（具体的には、微生物検出用流路１７３）を検出に適した位置に合わせる。
【００５６】
（Ｅ）微生物検査チップの構造例
図１１（Ａ）及び図１１（Ｂ）を用い、微生物検査チップ１０のうち微生物検査部１７の構造を説明する。図１１（Ａ）は、微生物検査チップ１０の本体１５と微生物検出部１７の接合部の断面図を示す。なお、本体１５と微生物検出部１７はそれぞれ別工程で作製されている。図１１（Ｂ）は、微生物検出部１７の分解斜視図を示す。
【００５７】
まず、微生物検出部１７の製造方法を説明する。微生物検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材１７２には溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には貫通孔１７４１，１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。この貼り合わせにより微生物検出部１７が形成される。流路部材１７２の溝１７３１とカバー部材１７１によって微生物検出用流路１７３が構成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１，１７５１によって、微生物検出用流路入口１７４と微生物検出用流路出口１７５が構成される。
【００５８】
一方、本体１５に形成された微生物染色液容器−微生物検出用流路間の溶液用流路１５７２は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。同様に、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間の溶液用流路１５７３は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。溶液用流路１５７２の開口は、微生物検出用流路入口１７４に接続され、溶液用流路１５７３の開口は、微生物検出用流路出口１７５に接続されている。
【００５９】
本体１５には検出用窓枠部１６１が形成されている。検出用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検出用窓枠部１６１は、溶液用流路１５７２の開口と溶液用流路１５７３の開口の間に形成されている。作製された微生物検出部１７は、前述したように、本体１５に接合され装着される。図１１（Ａ）に示すように、本体１５の検出用窓枠部１６１の上に微生物検出用流路１７３が配置されるように、微生物検出部１７を装着する。
【００６０】
本実施の形態の場合、微生物検出用流路１７３の背後に、本体１５の貫通孔又は貫通溝である検出用窓枠部１６１が設けられる。従って、励起光１１３は、微生物検出部１７のみを照射し、本体１５を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体１５からの反射光や自家蛍光は発生しない。微生物検出用流路１７３を通過した励起光１１３が、本体１５に照射されないためには、検出用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１１３の放射方向に沿って増加することが好ましい。
【００６１】
カバー部材１７１の厚さは、例えば０.０１μｍ〜１mmとする。流路部材１７２の厚さは、例えば０.０１μｍ〜１mmとする。微生物検出用流路１７３の断面形状は、例えば正方形，長方形，台形に形成する。微生物検出用流路１７３の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。微生物検出用流路１７３の断面の一辺は、例えば１μｍ〜１mmが好ましく、長さは例えば０.０１mm〜１０mmが好ましい。微生物検出用流路１７３に照射する励起光１１３の光軸は、微生物検出用流路１７３の方向ベクトルに対して垂直になる。
【００６２】
また、微生物検査チップ１０は、ディスポーザブルタイプであるので安価な材料で構成され、また、蛍光計測に好適なように、自家蛍光が低く、光透過性，面精度，屈折率などに優れている材料で構成されている。例えば、カバー部材１７１はガラス又は石英などによって構成し、流路部材１７２は微細加工を考慮して、ポリメタクリル酸メチルエステル，ポリジメチルシロキサン，シクロオレフィンポリマー，ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトなどによって構成する。流路部材１７２をポリジメチルシロキサンによって構成した場合、カバー部材１７１と流路部材１７２の接合は、ポリジメチルシロキサンの自己接着性を利用する。また、カバー部材１７１及び流路部材１７２を、シクロオレフィンポリマー，ポリメタクリル酸メチルエステル，ポリエチレンテレフタラート、又は、ポリカーボネイトによって製造してもよい。この場合、ガラス、又は、石英によってカバー部材１７１を製造し、ポリジメチルシロキサンによって流路部材１７２を製造する場合より、単位体積あたりの自家蛍光量が約３倍以上増加するため、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さは０.０１mm以上０.３mm以下が好ましい。また、本体１５は、内部に複雑な構造を有するので、微細加工が容易で、且つ、加工費が安価な材料によって形成され、処理前の検体や染色液を内部に保持するので、耐薬品性の材料によって形成される。例えば、本体１５は、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタラート，ポリカーボネイト，ポリスチレン，アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂，ポリメタクリル酸メチルエステル等で構成される。また、流路部材１７２は、本体１５と同一の材料によって形成するのが好ましい。
【００６３】
（Ｆ）生菌数計測の工程例
以下、本実施の形態に係る微生物検査装置１を用いて、食品由来の検体中の生菌数を計測する場合の実施例を説明する。図１２に、微生物検査チップ１０を用いた生菌数計測の工程をフローチャートで示す。
【００６４】
最初に微生物検査チップ１０の構成を、図１３を用いて改めて説明する。微生物検査チップ１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、検体中の微生物の染色するための染色液（試薬液）１５２１を保持するための微生物染色液容器１５２と、検体中に含まれる食品残渣を取り除くためのフィルタである食品残渣除去部１６０と、外部光源からの励起光を照射して発生する微生物の蛍光を観測するための微生物検出用流路１７３と、微生物検出用流路１７３を通過した検体１５１１と微生物染色液１５２１の混合液を廃棄するための検出液廃棄容器１５６と、検体容器１５１，食品残渣除去部１６０，微生物染色液容器１５２，微生物検出用流路１７３を連結し、検体１５１１や混合液を流動させるための溶液用流路１５７１〜１５７３と、各容器内の検体１５１１や混合液を流動させるために高圧気体が供給されたり大気開放される通気口１５９１〜１５９３と、通気口１５９１〜１５９３と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８３とを備える。
【００６５】
溶液用流路１５７１〜１５７３，通気口１５９１〜１５９３及び通気用流路１５８１〜１５８３は、以下の説明では、纏めて表記する場合を除いて、連結する容器の名称から、検体容器−微生物染色液容器間流路１５７１，微生物染色液容器−微生物検出用流路間流路１５７２，微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７３，検体容器通気口１５９１，微生物染色液容器通気口１５９２，検出液廃棄容器通気口１５９３，検体容器通気流路１５８１，微生物染色液容器通気流路１５８２，検出液廃棄容器通気流路１５８３とする。
【００６６】
検体容器１５１１と、食品残渣除去部１６０と、微生物染色液容器１５２と、微生物検出用流路１７３と、検出液廃棄容器１５６は、溶液用流路１５７１〜１５７３により直列に連結されている。
【００６７】
図１３の場合、溶液用流路１５７１〜１５７３の深さ及び流路幅は例えば１０μｍ〜１mm、通気用流路１５８１〜１５８３の深さ及び流路幅は例えば１０μｍ〜１mmの範囲で形成され、溶液用流路１５７１〜１５７３の断面積は通気用流路１５８１〜１５８３の断面積より大きくなるように形成されている。
【００６８】
微生物染色液１５２１は、微生物検査チップ１０内に前もって封入されている。検体１５１１は、検査前に通気口１５９１から検体容器１５１に注入する（Ｓ９０１）。
【００６９】
検体容器１５１の体積は、検体１５１１の体積より大きい。微生物染色液保持容器１５２の体積は、検体１５１１と微生物染色液１５２１の合計体積より大きい。また、検体容器−微生物染色液容器間流路１５７１の最高点は、検体容器１５１中の検体１５１１の水位より高くなるように形成されている。これと同様に、微生物染色液容器−微生物検出用流路間流路１５７２の最高点は、検体１５１１と微生物染色色素１５２１の混合液の水位より高くなるように形成されている。
【００７０】
ここで使用した検体１５１１は、検査する食品に対し質量比１０倍の生理食塩水を加え、ストマッキング処理を行った後、終濃度が１０％になるようグリセリンを追加したものである。
【００７１】
微生物染色液は、死菌を染色するための死菌染色液一種と全菌を染色するための全菌染色液二種とミトコンドリアを染色するためのミトコンドリア染色液の混合液であり、死菌染色液には、例えば、死菌用シアニン系橙蛍光色素（終濃度：０.０１μＭ〜１０μＭ）を使用し、全菌染色液には、全菌用シアニン系青蛍光色素（終濃度：０.０１μＭ〜１０μＭ）とＬＤＳ７５１（終濃度：０.１μｇ／ml〜１mg／ml）を使用し、ミトコンドリア染色液にはミトコンドリア用赤蛍光色素（終濃度：０.０１μＭ〜１０μＭ）を使用する。
【００７２】
微生物検査チップ１０を用いた生菌数測定は、図１２に示すように、微生物検査チップ１０を微生物検査装置（分析装置）１にセットした状態で開始される（Ｓ９０２）。この測定工程は、微生物検査チップ１０の位置合わせを行う位置合わせ工程（Ｓ９０５）と、検体から食品残渣を取り除いて検体中の微生物を染色する前処理工程（Ｓ９０３〜Ｓ９０４）と、生菌数を実際に測定する計測工程（Ｓ９０６）とで構成される。
【００７３】
位置合わせ工程（Ｓ９０５）と前処理工程（Ｓ９０３〜Ｓ９０４）は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程（Ｓ９０６）を行う。
【００７４】
位置合わせ工程（Ｓ９０５）は、位置合わせとして一般的な手法である、標識となる蛍光微粒子を含む位置合わせ用試薬を微生物検出用流路１７３に流し、蛍光微粒子が発する蛍光を目印として行うようにしても良いし、本願出願人が先に出願した特願２００９−１０９１５３号に記載の方法を用いるようにしても良い。前者の場合、微生物検査チップ１０に位置合わせ用試薬を保持する容器が設けられる（図示省略）。後者の場合、励起光源１１１から出力された励起光１１３を微生物検出用流路１７３に照射し、微生物検出用流路１７３から生じる散乱光の光量と微生物検出部１７から生じる蛍光の光量をそれぞれ検出することにより、Ｘ−Ｙステージ１２５の可動位置と各光量との関係をプロファイルとして取得する。また、検出装置１１は、取得されたプロファイルに基づいてＸ−Ｙ可動ステージ１２５を可動制御し、微生物検査チップ１０（具体的には、微生物検出用流路１７３）を検出に適した位置に合わせる。具体的には、微生物検出用流路からの散乱光の強度変化でＸ方向の位置合わせを行い、微生物検出部から生じる蛍光の光量の強度変化でＹ方向の位置合わせを行う。先ず、Ｘ方向の位置合わせを行い、その後Ｙ方向の位置合わせが行われる。Ｘ方向の位置合わせでは、検出装置１１は、Ｘ方向の変位と検出される散乱光の光量のプロファイルをシステム装置１８でストックし、散乱光の光量が最大となる位置に微生物検出用流路１７３の中心を移動する。Ｙ方向の位置合わせでは、検査装置１１は、Ｙ方向の変位と検出される蛍光の光量のプロファイルをシステム装置１８でストックし、蛍光の光量が最大となる位置に微生物検出用流路１７３の中心を移動する。このときの微生物検出用流路１７３の中心と励起光１１３の焦点の距離をＡとすると、検査装置１１は、微生物検出用流路１７３の中心と励起光１１３の焦点をより正確にあわせるためには距離Ａだけ補正した位置に微生物検出用流路１７３を動かす。
【００７５】
続いて、各工程における各液体の移動について説明する。前処理工程では、まず、検体１５１１を微生物染色液容器１５２に移動させる（Ｓ９０３）。この前処理工程では、通気口１５９１を介して検体容器１５１に対して圧力供給装置１４からの圧力を加える。これにより、検体容器１５１内の気圧を上げる。同時に、微生物染色液容器通気口１５９２を介して微生物染色液容器１５２の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体１５１１は、微生物染色液容器１５２に入り、微生物染色液１５２１と混合される。
【００７６】
混合には、バブリングを使用する（Ｓ９０４）。バブリングは通気口１５９３に対して圧力供給装置１４からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで検出液廃液容器１５６の気圧を上げる。同時に通気口１５９１と通気口１５９２を介し、検体容器１５１と微生物染色液容器１５２を大気開放する。空気は検出液廃液容器１５６から微生物検出用流路１７３を経て微生物染色液容器１５２に流入する。空気は気泡となり、混合液の下から上まで上昇する際に、混合液を攪拌し混合を促進する。
【００７７】
検体１５１１中の死菌は、死菌染色液（ここでは死菌用シアニン系橙蛍光色素（ピーク波長５７０ｎｍ）を使用する。）と全菌染色液（ここでは全菌用シアニン系青蛍光色素（ピーク波長４５０ｎｍ）とＬＤＳ７５１（ピーク波長７１０ｎｍ）を使用する。）により染色され、一方、検体１５１１中の生菌は全菌染色液のみにより染色される。
【００７８】
二液の混合液の水位は、微生物染色液容器１５２と微生物検出用流路１７３連結する微生物染色液容器−微生物検出用流路間流路１５７２の最高点を越えず、さらに微生物染色液容器１５２中に入っている空気は、微生物染色液容器通気口１５９２を介して外部に放出される。微生物染色液容器１５２の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は微生物検出用流路１７３に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、微生物染色液容器１５２に保持することができる。
【００７９】
このとき、微生物検出用流路１７３への流入を防ぐ目的で、通気口１５９３に対して圧力供給装置１４からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで検出液廃液容器１５６の気圧を上げても良い。
【００８０】
なお、染色中は、微生物検査チップ１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。
【００８１】
また、検体１５１１が食品残渣除去部１６０を経て、微生物染色液保持容器１５２へ流動する際に、検体１５１１中の食品残渣は、食品残渣除去部１６０により検体１５１１から取り除かれる。
【００８２】
以上で、前処理工程が終了する。また、この前処理工程と並行して、微生物検査チップ１０の位置合わせが実行される。
【００８３】
以上の動作が終了すると、検体１５１１と微生物染色液１５２１の混合液を微生物検出用流路１７３に移動させ、検体中の生菌を計測する（Ｓ９０６）。この工程では、通気口１５９１を介して検体容器１５１に対して圧力供給装置１４からの圧力を加える。これにより、検体容器１５１内の気圧を上げる。同時に、微生物染色液容器通気口１５９２を介して微生物染色液容器１５２の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体１５１１は、微生物染色液容器１５２に入り、微生物染色液１５２１と混合される。通気口１５９２を介し、圧力供給装置１４からの圧力を加え、微生物染色液容器１５２内の気圧をあげる。同時に通気口１５９３を介し、検出液廃棄容器１５６を大気開放する。その他の通気口１５９１は閉じる。気圧差により、混合液は、微生物染色液容器１５２から微生物検出用流路１７３を経由し検出液廃棄容器１５６まで流動する。
【００８４】
混合液中の菌体は、微生物検出用流路１７３を通過するときに計測される。微生物検出用流路１７３における菌体の計測は、蛍光フローサイトメトリー法を用いて行われる。図１３の場合、紙面垂直方向より、励起光１１３が照射される。このため、微生物からは微生物を染色した色素からの蛍光と、微生物による散乱光が生じ、葉緑体や色素体など食品由来の粒子からは、食品由来の粒子に吸着した色素からの蛍光や食品由来の物質がもつ自家蛍光と、粒子からの散乱光が生じる。蛍光の詳細は図８に示したとおりであり、これにより生菌，死菌，食品由来の物質の判別が可能になる。また、散乱光の光量は菌体や粒子の大きさにより変わるため、菌体や粒子の大きさの判別も可能になる。
【００８５】
（Ｇ）検出装置の構成例
次に、微生物検査装置１を構成する検出装置１１の構成例を、図１４を参照しながら説明する。本実施の形態の検出装置１１は、食品由来の検体中の生菌数を計測するのに好適である。すなわち、検出装置１１を用いれば、生菌数と死菌数を判別することができる。検出装置の光学系は、蛍光色素の励起スペクトルと蛍光スペクトルによって異なる場合もある。ここでは、死菌染色液として死菌用シアニン系橙蛍光色素（ピーク波長５７０ｎｍ）を使用し、全菌染色液として全菌用シアニン系青蛍光色素（ピーク波長４５０ｎｍ）とＬＤＳ７５１（ピーク波長７２０ｎｍ）、ミトコンドリア用染色液としてミトコンドリア用赤蛍光色素（ピーク波長６４０ｎｍ）を使用する場合について説明する。
【００８６】
図１４における検出装置１１の光学系は、４種類の蛍光色素を使用する場合に好適なように構成されている。勿論、５種類以上の蛍光色素を使用する場合には、各色素に応じて光学系を用意する。
【００８７】
検出装置１１の励起光源１１１は、励起用青色光源１１１１（波長４０５ｎｍ），励起用緑色光源１１１２（波長５３２ｎｍ）及び励起用青色光源１１１１と励起用緑色光源１１１２を合成するため光源合成用ダイクロイックミラー１１１３を有する。また検査装置１１は、散乱光を検出するために、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの散乱光１２４を検出するための散乱光検出器１２３と、励起光源１１１からの励起光１１３が散乱光検出器１２３に直接入射することを防ぐための遮光板１２２を有する。また、検査装置は、蛍光を検出するために、励起光１１３を反射し、微生物の蛍光を透過する励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２と、微生物検出用流路１７３を通過する微生物や食材由来の粒子からの蛍光を集光し、平行光にする対物レンズ１１４と、平行光を集光させるための集光レンズ１１８１と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール１１９と、再び平行光に戻すためのレンズ１１８２と、波長４８０ｎｍ以下の光を反射し、波長４８０ｎｍ以上の光を通過させる青蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５１と、波長４５０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる青蛍光用バンドパスフィルタ１１７１と、波長６００ｎｍ以上の光を通過させる橙蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５２と、波長５７０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる橙蛍光用バンドパスフィルタ１１７２と、波長６８０ｎｍ以上の光を通過させる赤蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５３と、波長６４０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる赤蛍光用バンドパスフィルタ１１７１と、波長７２０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる近赤外蛍光用バンドパスフィルタ１１７４、青蛍光用バンドパスフィルタ１１７１を通過した蛍光を検出する青蛍光用光検出器１２０１と、橙蛍光用バンドパスフィルタ１１７２を通過した蛍光を検出する橙蛍光用光検出器１２０２と、赤蛍光用バンドパスフィルタ１１７３を通過した蛍光を検出する赤蛍光用光検出器１２０３と、近赤外蛍光用バンドパスフィルタ１１７４を通過した蛍光を検出する近赤外蛍光用光検出器１２０４を有する。
【００８８】
なお、励起用青色光源１１１１と励起用緑色光源１１１２にはレーザー光源を使用し、散乱光用光検出器にはフォトダイオードを使用し、青蛍光用光検出器１２０１，橙蛍光用光検出器１２０２，赤蛍光用光検出器１２０３，近赤外蛍光用光検出器１２０４にはフォトマルチプライヤ（ＰＭＴ：Photomultiplier）を使用している。上述したように、微生物検査チップ１０の微生物検出用流路１７３の位置合わせは完了している。すなわち、対物レンズ１１４の焦点の位置に、微生物検査チップ１０の微生物検出用流路１７３が配置されている。
【００８９】
励起用青色光源１１１１と励起用緑色光源１１１２から出力された励起光（波長４０５ｎｍ，波長５３２ｎｍ）は、励起光−蛍光分離用ダイクロイックミラー１１２で反射されて進行方向を変更し、微生物検出用流路１７３を照射する。この照射により微生物検出用流路１７３を流れる微生物を染色した死菌用シアニン系橙蛍光色素，全菌用シアニン系青蛍光色素，ＬＤＳ７５１，ミトコンドリアを染色したミトコンドリア用赤蛍光色素，葉緑体，色素体は励起される。死菌用シアニン系橙蛍光色素からの蛍光（ピーク波長５７０ｎｍ）と全菌用シアニン系青蛍光色素（ピーク波長４５０ｎｍ），ＬＤＳ７５１からの蛍光（ピーク波長７２０ｎｍ），ミトコンドリア用赤蛍光色素（ピーク波長６４０ｎｍ）と、葉緑体や色素体の自家蛍光（５６０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲）は、いずれも対物レンズ１１４に入射する。
【００９０】
全菌用シアニン系青蛍光色素からの蛍光は青蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５１で反射され、青蛍光用バンドパスフィルタ１１７１を通過後、青蛍光用光検出器１２０１に入射する。死菌用シアニン系橙蛍光色素からの蛍光と色素体の自家蛍光の一部は橙蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５２で反射され、橙蛍光用バンドパスフィルタ１１７２を通過後、橙蛍光用光検出器１２０２に入射する。ミトコンドリア用赤蛍光色素からの蛍光，葉緑体の自家蛍光，色素体の自家蛍光の一部は赤蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５３で反射され、赤蛍光用バンドパスフィルタ１１７３を通過後、赤蛍光用光検出器１２０３に入射する。全菌染色液ＬＤＳ７５１からの蛍光は赤蛍光分離用ダイクロイックミラー１１５３、近赤外蛍光用バンドパスフィルタ１１７４を通過後、近赤外蛍光用光検出器１２０４に入射する。こうして、４つの色素由来の蛍光は波長の違いにより分離できる。
【００９１】
また、励起用青色光源１１１１と励起用緑色光源１１１２から出力された励起光が微生物検出用流路１７３を流れる微生物に当たることにより散乱光１２４が生じる。散乱光の光量は微粒子の大きさによって変わるため、微粒子の大きさを計測することができる。微粒子の大きさについて測定情報が得られれば、微生物と食品残渣等のゴミとを判別の精度がさらに向上する。
【００９２】
青蛍光用光検出器１２０１と橙蛍光用光検出器１２０２，赤蛍光用光検出器１２０３，近赤外蛍光用光検出器１２０４で検出された蛍光と、散乱光用光検出器１２３で検出された散乱光はそれぞれ電気信号に変換された後、システム装置１８（図１０）に送られる。システム装置１８は、短波長用光検出器である青蛍光用光検出器１２０１，長波長用光検出器である橙蛍光用光検出器１２０２及び散乱光用光検出器１２３から送られた電気信号を処理し、微生物数の情報を検査結果として出力装置１９（図１０）に出力する。
【００９３】
ところで、微生物検出部１７の表面では、励起用青色光源１１１１と励起用緑色光源１１１２からの励起光１１３の一部が反射し、検出装置１１に戻る可能性がある。この反射を防止するためには、微生物検出部１７の法線ベクトルと励起光１１３の光軸は平行でないことが好ましい。すなわち、微生物検出部１７の法線ベクトルと励起光１１３の光軸の間の角度αは、α＝１０〜２０°であることが好ましい。図１４では、このような取り付け例を表している。
【００９４】
図１４では、微生物検出部１７の表面と励起光１１３の光軸の成す角をθとして表している。θ＋α＝９０°である。θは９０度未満であるが、励起光１１３が、微生物検出部１７の表面で全反射しないように設定する。θは８０〜７０°であっても良い。なお、微生物検出部１７の法線ベクトルと励起光１１３の光軸が平行とならないように、微生物検出部１７を傾斜させるが、励起光は微生物検出用流路１７３に対して垂直方向より照射する。
【符号の説明】
【００９５】
１  微生物検査装置
１０  微生物検査チップ
１１  検出装置
１４  圧力供給装置
１７  微生物検出部
１８  システム装置
１９  出力装置
１１１  励起光源
１１３  励起光
１１４  対物レンズ
１１９  ピンホール
１２１  蛍光
１２４  散乱光
１２５  Ｘ−Ｙ可動ステージ
１５１  検体容器
１５２  微生物染色液容器
１５６  検出液廃棄容器
１６１  検出用窓部
１７３  微生物検出用流路
１１７１  青蛍光用バンドパスフィルタ
１１７２  橙蛍光用バンドパスフィルタ
１１７３  赤蛍光用バンドパスフィルタ
１１７４  近赤外蛍光用バンドパスフィルタ
１１８１，１１８２  集光レンズ
１２０１  青蛍光用光検出器
１２０２  橙蛍光用光検出器
１２０３  赤蛍光用光検出器
１２０４  近赤外蛍光用光検出器
１５７１〜１５７３  溶液用流路
１５８１〜１５８３  通気用流路
１５９１〜１５９３  通気口
【図１】
2011092104.tif 000003
【図２（Ａ）】
2011092104.tif 000004
【図２（Ｂ）】
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【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５】
2011092104.tif 000009
【図６】
2011092104.tif 000010
【図７】
2011092104.tif 000011
【図８（Ａ）】
2011092104.tif 000012
【図８（Ｂ）】
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【図９】
2011092104.tif 000014
【図１０】
2011092104.tif 000015
【図１１（Ａ）】
2011092104.tif 000016
【図１１（Ｂ）】
2011092104.tif 000017
【図１２】
2011092104.tif 000018
【図１３】
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【図１４】
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