(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｏ−マンノース型糖鎖を部分構造とする新規なＯ−マンノース型糖鎖プローブの提供。【解決手段】Ｏ−マンノース型糖鎖の還元末端に、オリゴエチレングリコール鎖を介して、末端にアミノ基、アミノ基の塩、アジド基、またはチオール基を有するアルキル鎖を結合してなるＯ−マンノース型糖鎖プローブ。より詳しくは、式（１）で示されるもの。2011178757.tif 000017また、これらの糖鎖プローブを支持体に固定化してなるＯ−マンノース型糖鎖提示素材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ−マンノース型糖鎖の還元末端に、オリゴエチレングリコール鎖を有し、末端にアミノ基、アミノ基の塩、アジド基、またはチオール基を有するアグリコンを結合してなるＯ−マンノース型糖鎖プローブ。
【請求項２】
Ｏ−マンノース型糖鎖の還元末端に、オリゴエチレングリコール鎖を介して、末端にアミノ基、アミノ基の塩、アジド基、またはチオール基を有するアルキル鎖を結合してなるＯ−マンノース型糖鎖プローブ。
【請求項３】
式（１）で示されるＯ−マンノース型糖鎖プローブ。
【化１５】
2011178757.tif 000016
（ただし、式中で、ｍは１から５までの整数を、ｎは２から２０までの整数を、Ｒはアミノ基、アミノ基の塩、アジド基、またはチオール基を表す。）
【請求項４】
請求項１、請求項２または請求項３に記載したＯ−マンノース型糖鎖プローブを支持体に固定化してなるＯ−マンノース型糖鎖提示素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−マンノース型糖鎖を部分構造とする新規なオリゴ糖誘導体である糖鎖プローブに関するものであり、その糖鎖プローブを支持体に固定化してなるＯ−マンノース型糖鎖提示素材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−マンノース型糖鎖（Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎ）は、哺乳類の脳、神経、筋細胞、そして酵母の細胞壁などにみられる糖タンパク質糖鎖の一種である。それらの中で、ウシ末梢神経のα―ジストログリカンに多く含まれているＯ−マンノース型糖鎖は、細胞外マトリックスであるラミニンのリガンドであることが報告された（非特許文献１参照）。すなわち、Ｏ−マンノース型糖鎖とラミニンが相互作用することによって、筋細胞骨格構造が維持されていると考えられている。また、Ｏ−マンノース型糖鎖の合成に関わる酵素の遺伝子不全が、先天性筋ジストロフィーなどの疾患要因であることが明らかになっている（非特許文献２参照）。先天性筋ジストロフィーは、筋肉の働きが徐々に弱まり失われてしまう遺伝子疾患であり、治療法が見出されていない難病である。この疾患には、福山型先天性筋ジストロフィー、Ｍｕｓｃｌｅ−ｅｙｅ−ｂｒａｉｎ病、Ｗａｌｋｅｒ−Ｗａｒｂｕｒｇ症候群などの亜型があるが、その全てにおいてＯ−マンノース型糖鎖の異常が示唆されている（非特許文献３参照）。したがって、筋ジストロフィー発生メカニズムの解明とその治療法開発には、Ｏ−マンノース型糖鎖の詳細な機能解明が必要となる。
【０００３】
糖鎖機能を解析する有効な手法として、表面プラズモン共鳴法が用いられており、すでに様々な糖鎖と生体成分との相互作用解析が報告されている（非特許文献４参照）。この方法を用いてＯ−マンノース型糖鎖の機能解析を行うためには、カルボン酸やアミノ基で修飾された支持体、または金基盤などの支持体に固定化できる糖鎖プローブが必要となる。
【０００４】
これまでに報告されているＯ−マンノース型糖鎖の調製法には、酵素化学的合成法や化学的合成法が報告されている（非特許文献５、６参照）。しかし、これらの手法で合成されたＯ−マンノース型糖鎖は、表面プラズモン共鳴法に用いるために開発されたものではなく、支持体への固定化については検討されていない。糖鎖と生体成分との相互作用解析を行う場合、生体成分中に含まれる評価対象物質以外の夾雑物質と、リンカー部分との非特異的相互作用がしばしば問題になる。したがって、表面プラズモン共鳴法を用いて糖鎖機能を解析するためには、非特異的相互作用を軽減できるリンカーの開発が求められる。一方、支持体へ固定化するためのリンカーを有するＯ−マンノース型糖鎖誘導体の調製法が報告されている（特許文献１参照）。この糖鎖誘導体は、Ｏ−マンノース型糖鎖を有する糖ペプチドにリンカーが結合したものである。しかし、その調製には化学合成だけでなく、入手の難しい糖転移酵素の使用や、固相合成反応が必要であり、量的な調製は困難と考えられる。以上のことから、量的な入手が可能であり、かつ生体成分中の評価対象以外の夾雑物質との非特異的相互作用を軽減することができるＯ−マンノース型糖鎖プローブの開発が強く求められている。
【０００５】
生体成分中に含まれる評価対象以外の夾雑物質と、リンカー部分との非特異的相互作用を抑制する方法として、オリゴエチレングリコール鎖、またはポリエチレングリコール鎖を介して、糖鎖を支持体へ固定化する方法が見出されている（特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２１５２０７号公報
【特許文献２】特開２００６−３３５６５２号公報
【特許文献３】特開２００８−０７４７２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａ．Ｃｈｉｂａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｈ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｉｎａｚｕ，Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｉ．Ｋａｎａｚａｗａ，Ａ．Ｋｏｂａｔａ，Ｔ．Ｅｎｄｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２巻、ｐ．２１５６−２１６２．
【非特許文献２】Ｈ．Ｍａｎｙａ，Ｋ．Ｓａｋａｉ，Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｋａｗａｋｉｔａ，Ｔ．Ｔｏｄａ，Ｔ．Ｅｎｄｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００３年、３０６巻、ｐ．９３−９７．
【非特許文献３】Ｈ．Ｋａｎｏ，Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｒ．Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｔａｃｈｉｋａｗａ，Ｈ．Ｍａｎｙａ，Ｉ．Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｎｏｎａｋａ，Ｖ．Ｓｔｒａｕｂ，Ｂ．Ｔａｌｉｍ，Ｔ．Ｖｏｉｔ，Ｈ．Ｔｏｐａｌｏｇｌｕ，Ｔ．Ｅｎｄｏ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．Ｔｏｄａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．、２００２年、２９１巻、ｐ．１２８３−１２８６．
【非特許文献４】Ｄ．Ｍ．Ｒａｔｎｅｒ，Ｅ．Ｗ．Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，Ｐ．Ｈ．Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．、２００４年、５巻、ｐ．１３７５−１３８３．
【非特許文献５】Ｉ．Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ．Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｋ．Ａｊｉｓａｋａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、４０巻、ｐ．５０４７−５０５０．
【非特許文献６】Ｊ．Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｔ．Ｏｇａｗａ，Ｓ．Ｋｕｒｏｎｏ，Ｙ．Ｉｔｏ、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．、２０００年、１７巻、ｐ．４０７−４２３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、量的調製が可能であり、生体成分中に含まれる評価対象以外の夾雑物質との非特異的相互作用を軽減できる、Ｏ−マンノース型糖鎖を部分構造に有する新規な糖鎖プローブを提供することであり、その糖鎖プローブを支持体に固定化してなるＯ−マンノース型糖鎖提示素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、Ｏ−マンノース型糖鎖の還元末端にオリゴエチレングリコール鎖を有するアグリコンを結合した糖鎖プローブを完成して、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、Ｏ−マンノース型糖鎖の還元末端に、オリゴエチレングリコール鎖を有し、末端にアミノ基、アミノ基の塩、またはチオール基を有するアグリコンを結合してなるＯ−マンノース型糖鎖プローブを提供するものであり、特に、Ｏ−マンノース型糖鎖の還元末端に、オリゴエチレングリコール鎖を介して、末端にアミノ基、アミノ基の塩、またはチオール基を有するアルキル鎖を結合してなるＯ−マンノース型糖鎖プローブ、より詳しくは、式（１）で示されるＯ−マンノース型糖鎖プローブを提供するものである。
【００１０】
【化１】
2011178757.tif 000002
（ただし、式中で、ｍは１から５までの整数を、ｎは２から２０までの整数を、Ｒはアミノ基、アミノ基の塩、アジド基、またはチオール基を表す。）
また、本発明は、これらのＯ−マンノース型糖鎖プローブを支持体に固定化してなるＯ−マンノース型糖鎖提示素材を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で提供される新規なＯ―マンノース型糖鎖プローブは、既存の方法に比べ量的調製が容易であり、かつ生体成分中に含まれる評価対象以外の夾雑物質との非特異的相互作用を少なくすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＯ−マンノース型糖鎖プローブの合成は如何なる方法によってもよい。具体的な合成方法の一例として、式（１）で示される化合物の合成法を示す。式（１）に示される化合物は、既知の合成法（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．、２０００年、１７巻、ｐ．４０７−４２３）や、実施例に示す方法に従って以下のように合成される。
【００１３】
式（１）において、ｍは１から１００までの整数が有効であるが、生体成分中に含まれる評価対象以外の夾雑物質との非特異的相互作用を軽減し、化合物の精製の容易さを考慮すると１から５の整数である。またｎは１から１００までの整数が有効であるが、化合物の調製に要する原料化合物の入手の容易さを考慮すると２から２０の整数である。
【００１４】
式（１）に示す化合物の糖鎖部分の調製は、如何なる方法を用いても構わない。例えば有機合成のみを用いて調製（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．、２０００年、１７巻、ｐ．４０７−４２３）することも可能であり、加水分解酵素の逆反応生成物から有機合成を用いて調製（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、４０巻、ｐ．５０４７−５０５０）することも可能である。
【００１５】
式（１）に示す化合物のＲがチオール基であるアグリコン部分の調製には、市販の化合物を用いることができる。また、式（１）に示す化合物のＲがアミノ基やアミノ基の塩であるアグリコン部分は、既知の化合物（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２００５年、４６巻、ｐ．４８１３−４８１６）の水酸基を周知の方法（例えば、社団法人日本化学会編、「実験化学講座、２０巻」（丸善株式会社、東京、１９９２年）参照）に従ってアジド化することによって調製できる。
【００１６】
式（１）で示される化合物は、上記の方法によって調製できる糖鎖部分とアグリコン部分を、通常用いられるグリコシル化（例えば、社団法人日本化学会編、「実験化学講座、２６巻」（丸善株式会社、東京、１９９２年）参照）によって結合させたのち、糖鎖部分の脱保護、チオール基の脱保護、アミノ基の脱保護、あるいはアジド基のアミノ基への変換を行うことによって調製することができる。また、糖鎖部分とアグリコン部分の調製、そしてグリコシル化の順序は、上述の順序に限定されない。例えば、糖鎖の還元末端であるマンノース誘導体を既知の方法（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、１０６巻、ｐ．２２８９−２２９３）で調製したのち、上述のグリコシル化によってアグリコン部分と結合させる。引き続き、文献既知の手法で調製できるＮ−アセチルグルコサミン誘導体（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００８年、６４巻、ｐ．１５２３−１５３５）とシアリルガラクトース誘導体（Ｇｌｙｃｏｃｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．、２００８年、２５巻、ｐ．２６９−２７８）を上述のグリコシル化によって順次結合させる。最後に糖鎖部分の脱保護、チオール基の脱保護、アミノ基の脱保護、あるいはアジド基のアミノ基への変換を行うことによって調製することができる。
【００１７】
以上の方法で用いられる糖鎖部分、チオール基、そしてアミノ基の保護基は、周知の糖誘導体、チオール基、アミノ基の保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｅｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ−Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９））を用いることができる。また、アジド基のアミノ基への変換方法は、周知の方法（例えば、社団法人日本化学会編、「実験化学講座、２０巻」（丸善株式会社、東京、１９９２年）参照）で行うことができる。
【００１８】
本発明のＯ−マンノース型糖鎖プローブの支持体への固定化は、既知の支持体、既知の方法を利用して行うことができる。例えば、式（１）に示す化合物でＲがチオール基の場合には、金基盤プレートなどの支持体への固定化法（特開２００８−１０５９７８）によって固定化できる。また、式（１）に示す化合物でＲがアミノ基やアミノ基の塩の場合には、カルボン酸を有する支持体への固定化法（特開２００３−２２６６９７）やアミノ基を有する支持体への固定化法（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００４年、１４巻、ｐ．４８５−４９０）によって固定化できる。また、式（１）に示す化合物でＲがアジド基の場合には、アルキン基を有する支持体への固定化法（特開２００８−２３１０１３）によって固定化できる。
【００１９】
本発明のＯ−マンノース型糖鎖プローブの支持体への固定化は、Ｏ−マンノース型糖鎖プローブを単独で固定化してもよいし、血清、スキムミルク、グリシン、ニコチンアミド、モノエタノールアミン、グルタミン酸ナトリウム、ポリエチレンイミンなどの既知のブロッキング剤、または上述のアグリコン部分との混合物を固定化してもよい。特に、上述のアグリコン部分との混合物は、生体成分中に含まれる評価対象物質以外の夾雑物質と支持体との非特異的吸着を効率的に軽減できる点で好ましい。
【００２０】
以下に記載する実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（Ｏ−マンノース型糖鎖プローブの合成）
アルゴン雰囲気化、式（２）で示されるアルコール誘導体（５８９．５ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２００５年、４６巻、ｐ．４８１３−４８１６）を脱水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液にアジ化ナトリウム（１２６．５ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で１８時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥したのち、ろ過、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、式（３）で示されるアルコール誘導体（５００．７ｍｇ、７４％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：３．７１−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．６５−３．７０（ｍ，６Ｈ），３．５６−３．６４（ｍ，４Ｈ），３．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），１．５４−１．６４（ｍ，４Ｈ），１．２３−１．４０（ｍ，１４Ｈ）． 
【００２２】
【化２】
2011178757.tif 000003
【化３】
2011178757.tif 000004
【００２３】
アルゴン雰囲気下、式（４）で示されるマンノース誘導体（８８０．１ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、１０６巻、ｐ．２２８９−２２９３）と式（３）で示されるアルコール誘導体（４８６．７ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、モレキュラーシーブス４Ａ（３．０４ｇ）を加え、０℃に冷却した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート（５０μｌ、２７６μｍｏｌ）を加え、４時間撹拌した。セライトろ過によりモレキュラーシーブス４Ａを除去し、ろ液をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥したのち、ろ過、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）により精製し、式（５）で示される化合物（１．０５９１ｇ、９１％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．２４−７．３７（ｍ，１３Ｈ），７．１３−７．１７（ｍ，２Ｈ），５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４，３．４Ｈｚ），４．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ），４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，９．６Ｈｚ），３．８９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．７６−３．８５（ｍ，３Ｈ），３．６７−３．７３（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．６５（ｍ，８Ｈ），３．５４−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．５３−１．６２（ｍ，４Ｈ），１．２３−１．３９（ｍ，１４Ｈ）．
【００２４】
【化４】
2011178757.tif 000005
【化５】
2011178757.tif 000006
【００２５】
式（５）で示されるマンノース誘導体（９９７．７ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（４０μｌ）を加えた。反応液を室温で５時間撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、式（６）で示されるマンノース誘導体（９４０．６ｍｇ、９９％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．２４−７．３８（ｍ，１３Ｈ），７．１４−７．２０（ｍ，２Ｈ），４．９３−４．９７（ｍ，１Ｈ），４．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．０６−４．１１（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，９．６Ｈｚ），３．８５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．７７−３．８３（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１１．０Ｈｚ），３．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１１．０Ｈｚ），３．５８−３．６７（ｍ，８Ｈ），３．５４−３．５７（ｍ，３Ｈ），３．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．４４−２．５１（ｍ，１Ｈ），１．５３−１．６３（ｍ，４Ｈ），１．２２−１．３９（ｍ，１４Ｈ）．
【００２６】
【化６】
2011178757.tif 000007
【００２７】
式（７）で示されるチオグリコシド誘導体（１．５５３ｇ、２．３９ｍｍｏｌ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００８年、６４巻、ｐ．１５２３−１５３５）をアルゴン雰囲気下に脱水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解した。モレキュラーシーブス４Ａ（７．０ｇ）を加え、室温で４．５時間撹拌した。−７８℃に冷却し、トリエチルシラン（１．２ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸（７００μｌ、７．９ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。反応液にメタノール（１ｍｌ）とトリエチルアミン（１．２ｍｌ、８．６ｍｍｏｌ）を加え、室温に戻した。セライトろ過、溶媒を留去したのちクロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、式（８）で示されるチオグリコシド誘導体（１．４３３３ｇ、９２％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．８０−７．８５（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．４６（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．３５（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．１６（ｍ，１Ｈ），６．９７−７．０２（ｍ，３Ｈ），６．８６−６．９５（ｍ，３Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），５．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９，１０．３Ｈｚ），４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），５．４９−５．５５（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１０．３Ｈｚ），４．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），３．７３−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６５（ｍ，２Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．９２（ｓ，３Ｈ），１．２１（ｓ，９Ｈ）．
【００２８】
【化７】
2011178757.tif 000008
【化８】
2011178757.tif 000009
【００２９】
式（８）で示されるチオグリコシド誘導体（８０６．１ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）をピリジン（４ｍｌ、４９ｍｍｏｌ）に溶解し、無水酢酸（２ｍｌ、ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間撹拌したのち、酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｍｏｌ塩酸水溶液、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、式（９）で示されるチオグリコシド誘導体（７４５．９ｍｇ、８７％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．８２−７．８６（ｍ，１Ｈ），７．６３−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．４５（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．３８（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．１６（ｍ，１Ｈ），６．９９−７．０９（ｍ，３Ｈ），６．９０−６．９８（ｍ，３Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），３．８０−３．９０（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１０．３Ｈｚ），３．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１０．３Ｈｚ），３．６２−３．６９（ｍ，１Ｈ），２．９０−２．９３（ｍ，１Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｓ，３Ｈ），１．２２（ｓ，９Ｈ）．
【００３０】
【化９】
2011178757.tif 000010
【００３１】
式（６）で示されるマンノース誘導体（２０２．７ｍｇ、２６１μｍｏｌ）と式（９）で示されるチオグリコシド誘導体（１７９．８ｍｇ、２５９μｍｏｌ；）をアルゴン雰囲気下に脱水ジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解した。モレキュラーシーブス（２７０ｍｇ）を加え、室温にて１５分間撹拌したのち０℃に冷却した。反応液にＮ―ヨードスクシンイミド（１２１．０ｍｇ、５３８μｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸（７μｌ、８０μｍｏｌ）を加え０℃で４時間撹拌した。セライトを用いてろ過し、ろ液をクロロホルムで抽出した。有機層をチオ硫酸ナトリウム溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち残渣を薄層シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：５）で精製し、式（１０）で示される二糖誘導体（２２２．０ｍｇ、６６％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．６０−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５１−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．２０−７．３７（ｍ，１６Ｈ），７．０７−７．１４（ｍ，４Ｈ），６．９９−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．８８−６．９６（ｍ，３Ｈ），５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．１３−５．１８（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．４９−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．３８−４．４８（ｍ，４Ｈ），４．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．１５−４．１８（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），４．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），３．７７−３．８３（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１１．０Ｈｚ），３．４５−３．６４（ｍ，１４Ｈ），３．４１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．３７−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１１．０Ｈｚ），１．９５（ｓ，３Ｈ），１．５３−１．６３（ｍ，４Ｈ），１．２２−１．３９（ｍ，１４Ｈ）．
【００３２】
【化１０】
2011178757.tif 000011
【００３３】
式（１０）で示される二糖誘導体（２２２．０ｍｇ、１７２μｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にエタノール（１０ｍｌ）に溶解した。エチレンジアミン（２ｍｌ）を加え、９０℃で５時間撹拌し、さらに室温で１７時間撹拌した。減圧下に反応液を濃縮し、ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）を加え濃縮した。残渣にピリジン（４ｍｌ、４９ｍｍｏｌ）、無水酢酸（２ｍｌ、２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を１Ｍｏｌ塩酸水溶液、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：４）で精製し、式（１１）で示される二糖誘導体（１８２．９ｍｇ、８８％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．３５−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．２０−７．３４（ｍ，２３Ｈ），５．６６（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），５．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），４．４４−４．６０（ｍ，９Ｈ），４．１８−４．２２（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９，９．６Ｈｚ），３．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，８．９Ｈｚ），３．７４−３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６５−３．７３（ｍ，２Ｈ），３．５１−３．６４（ｍ，１５Ｈ），３．４１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．００−３．０７（ｍ，１Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｓ，３Ｈ），１．５２−１．６４（ｍ，４Ｈ），１．２３−１．３８（ｍ，１４Ｈ）．
【００３４】
【化１１】
2011178757.tif 000012
【００３５】
式（１１）で示される二糖誘導体（１８２．９ｍｇ、１５２μｍｏｌ）をメタノール（１６ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（６０μｌ）を加えた。室温で１５時間撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣を薄層シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：７）で精製し、式（１２）で示される二糖誘導体（１５５．７ｍｇ、８８％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：７．２０−７．３９（ｍ，２５Ｈ），５．６４（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），５．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），４．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．５３−４．６０（ｍ，４Ｈ），４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），４．３３（ｄｄ，１Ｈ，８．２，９．６Ｈｚ），４．１５−４．１７（ｍ，１Ｈ），３．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９，９．６Ｈｚ），３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，８．９Ｈｚ），３．７３−３．７９（ｍ，３Ｈ），３．６８−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．５３−３．６７（ｍ，１５Ｈ），３．４１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．２４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．００−３．０７（ｍ，１Ｈ），２．６６−２．７０（ｍ，１Ｈ），１．７３（ｓ，３Ｈ），１．５２−１．６３（ｍ，４Ｈ），１．２１−１．３９（ｍ，１４Ｈ）．
【００３６】
【化１２】
2011178757.tif 000013
【００３７】
式（１２）で示される二糖誘導体（１５５．７ｍｇ、１３４μｍｏｌ）と式（１３）で示される二糖誘導体（２８０．７ｍｇ、２６８μｍｏｌ；Ｇｌｙｃｏｃｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．、２００８年、２５巻、ｐ．２６９−２７８）をアルゴン雰囲気下に脱水ジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解した。モレキュラーシーブス４Ａ（３２７ｍｇ）を加え、室温にて１５分撹拌したのち、０℃に冷却した。０℃で５時間撹拌したのち、反応液をセライトろ過し、ろ液をクロロホルムで抽出した。抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加え乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣を薄層シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１：７）で精製した。精製した化合物をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（４０μｌ）を加えた。４５℃で２３時間撹拌したのち、室温に戻し水（１．５ｍｌ）を加え４５℃で３時間撹拌した。陽イオン交換樹脂を用いて中和したのち、ろ過、溶媒を留去した。残渣をジオキサン―水（７：５）の混合溶液に溶解し、水酸化パラジウム（９６．３ｍｇ）、２Ｍｏｌ塩酸水溶液（３１μｌ）を加え、水素を充てんした。１７時間後セライトろ過し、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝２０：１０：０．５）、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（メタノール）で精製し、式（１４）で示される四糖誘導体（２２．２ｍｇ、３工程、１４％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：４．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４，９．６Ｈｚ），３．８９−３．９５（ｍ，３Ｈ），３．８０−３．８８（ｍ，５Ｈ），３．４１−３．７７（ｍ，２８Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），２．９１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，１２．４Ｈｚ），２．０１（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４），１．６１−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．５３−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．２７−１．４４（ｍ，１４Ｈ）．
【００３８】
【化１３】
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【化１４】
2011178757.tif 000015
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明であるＯ−マンノース型糖鎖プローブは、Ｏ−マンノース型糖鎖の機能解明に役立つことは確実である。とりわけ、従来は困難であったＯ−マンノース型糖鎖とラミニンとの相互作用解析を簡便にすることから、先天性筋ジストロフィーの治療薬開発など、産業的価値やその波及効果は極めて大きい。