(57)【要約】【課題】核酸の塩基配列中の複数の塩基を、１回のＰＣＲにより効率よく改変する方法の提供。【解決手段】核酸の塩基配列を改変する方法であって、標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された塩基配列を、改変塩基配列とし、前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基を改変部位塩基とし、前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の前記改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、かつ前記改変塩基配列とは異なる塩基配列を、部分改変塩基配列とし、前記部分改変塩基配列を有するプライマーを部分改変型プライマーとし、前記標的塩基配列を有する２本鎖核酸を鋳型とし、前記改変塩基配列を有する改変型プライマーと、１種以上の部分改変型プライマーとを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）を行う工程を有することを特徴とする塩基配列の改変方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の塩基配列を改変する方法であって、
標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された塩基配列を、改変塩基配列とし、
前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基を改変部位塩基とし、
前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の前記改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、かつ前記改変塩基配列とは異なる塩基配列を、部分改変塩基配列とし、
前記部分改変塩基配列を有するプライマーを部分改変型プライマーとし、
前記標的塩基配列を有する２本鎖核酸を鋳型とし、前記改変塩基配列を有する改変型プライマーと、１種以上の部分改変型プライマーとを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）を行う工程を有することを特徴とする塩基配列の改変方法。
【請求項２】
前記標的塩基配列と、前記改変塩基配列と、前記ＰＣＲにおいて用いられる全種類の部分改変型プライマーのそれぞれが有する部分改変塩基配列とからなる配列群において、当該配列群中の各塩基配列は、それぞれ、相違する塩基が２塩基以下である塩基配列を前記配列群中に少なくとも１種含んでいることを特徴とする請求項１記載の塩基配列の改変方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲにおいて、反応に用いる前記改変型プライマーの量が、用いられる全種類の部分改変型プライマーの総量よりも多いことを特徴とする請求項１又は２記載の塩基配列の改変方法。
【請求項４】
前記標的塩基配列は、遺伝子多型部位又は体細胞変異部位である多型部位を含まない塩基配列であり、
前記多型部位から１０塩基以内に含まれる２以上の塩基を改変することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の塩基配列の改変方法。
【請求項５】
請求項４記載の塩基配列の改変方法により塩基配列が改変された核酸を制限酵素処理することにより、前記多型部位の塩基種を解析することを特徴とする核酸の解析方法。
【請求項６】
請求項４記載の塩基配列の改変方法により塩基配列が改変された核酸を鋳型として核酸伸長反応を行うことにより、前記多型部位の塩基種を解析することを特徴とする核酸の解析方法。
【請求項７】
請求項４記載の塩基配列の改変方法により塩基配列が改変された核酸を鋳型とし、前記改変塩基配列を含む塩基配列からなるプローブを用いて、核酸連結反応を行うことにより、前記多型部位の塩基種を解析することを特徴とする核酸の解析方法。
【請求項８】
核酸の塩基配列を、標的塩基配列から、当該標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された改変塩基配列に改変するために用いられるキットであって、
前記改変塩基配列を有する改変型プライマーと、部分改変塩基配列を有する１種以上の部分改変型プライマーとを含み、
前記部分改変塩基配列は、前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、前記改変塩基配列とは異なる塩基配列であり、
前記改変部位塩基は、前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基であることを特徴とする塩基配列改変用キット。
【請求項９】
多型解析に用いられる核酸を改変するために用いられるものであり、
前記標的塩基配列が、解析対象である多型部位を含まず、かつ当該多型部位から１０塩基以内にある２以上の塩基を含む塩基配列であることを特徴とする請求項８記載の塩基配列改変用キット。
【請求項１０】
多型解析のために用いられるキットであって、
改変塩基配列を有する改変型プライマーと、部分改変塩基配列を有する１種以上の部分改変型プライマーと、多型検出用プライマーとを含み、
前記改変塩基配列は、標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された塩基配列であり、
前記標的塩基配列は、解析対象である多型部位を含まず、かつ当該多型部位から１０塩基以内にある２以上の塩基を含む塩基配列であり、
前記部分改変塩基配列は、前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、前記改変塩基配列とは異なる塩基配列であり、
前記改変部位塩基は、前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基であり、
前記多型検出用プライマーは、当該多型部位が特定の遺伝子型である核酸の前記標的塩基配列の領域が前記改変塩基配列に改変された核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする多型解析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、置換、欠失、又は挿入することにより、核酸の塩基配列中の２以上の塩基を改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、核酸分析による遺伝子検査は、医療、研究、産業への応用に広く用いられている。このような検査は試料中の標的塩基配列を有するＤＮＡの存在の検出を行うものであり、疾患の診断、治療だけでなく、食品検査等の様々な分野において応用されている。特に、ＳＮＰ（一塩基多型）等の遺伝子多型は、癌等の特定の疾患に対する罹り易さや、薬物代謝能等の個体差の主要な一因と考えられており、学術研究においてのみならず、実際の臨床検査においても、遺伝子多型解析が広く行われている。このため、高精度かつ迅速に遺伝子多型を検出し得る方法の開発が盛んである。
【０００３】
遺伝子多型を検出・識別する方法として、プローブやプライマー等の人工合成したポリヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。例えば、ＳＮＰ等の多型を含む領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅して検出する方法や、検出対象であるＳＮＰを３’末端に有するプローブと、該ＳＮＰの５’側の隣の塩基を５’末端に有するプローブを用いて、ライゲーション反応を行い、２つのプローブが結合された一のポリヌクレオチドが得られるか否かによりＳＮＰを検出する方法等のように、分子生物学的な酵素反応を用いて、解析対象であるＳＮＰ及びその近傍の塩基配列を解析する方法等がある。
【０００４】
特に、ＳＮＰ解析においては、特定の塩基配列やアレル等に特異的に結合し得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりＳＮＰを検出するＳＳＰ−ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ−ＰＣＲ）法やＡＳＰ−ＰＣＲ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ−ＰＣＲ）法が汎用されている。ＳＳＰ／ＡＳＰ−ＰＣＲ法による多型の検出は、塩基配列（遺伝子多型）の検出及び識別とシグナルの増幅を同時に行うことができるため、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に低い場合であってもＳＮＰを検出することができ、非常に利便性が高いためである。
【０００５】
プローブやプライマーを用いて多型解析を行う手法では、解析に用いるプローブやプライマーが反応に大きな影響を与える要素である。一方で、ＳＳＰ−ＰＣＲ法やＡＳＰ−ＰＣＲ法では、プライマーに用いる塩基配列は解析対象である多型部位の周囲に設計する必要がある。このように、プライマーの塩基配列の設計自由度が低いため、識別対象である遺伝子多型の塩基配列によっては、十分な感度が得られない、という問題がある。そこで、プローブやプライマーを様々に工夫することにより、ＳＳＰ−ＰＣＲ法やＡＳＰ−ＰＣＲ法を用いてＳＮＰ等の遺伝子多型を識別する場合の識別精度を向上させるために、様々な方法が開示されている。例えば、プライマーの塩基配列として、認識する（ハイブリダイズする）標的遺伝子の塩基配列の相補的な塩基配列中の１〜数塩基を置換、欠失、又は挿入したミスマッチを有する塩基配列を用いることにより、感度（ＳＮ）の改善を図る方法がある。その他、プライマーを構成する塩基として、ＬＮＡやＥＮＡ等のような人工的に認識能を高めた塩基を用いる方法もある。
【０００６】
プローブ等を用いずに多型解析を行う手法としては、制限酵素を利用して塩基配列を解析する制限酵素解析法ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）がある。ＲＦＬＰは、制限酵素処理後に得られる核酸断片の長さが多型の遺伝子型ごとに異なることを利用して、多型を解析する方法である（例えば、非特許文献１参照。）。一般的に、制限酵素の認識部位は制限酵素の種類により限定され、自由に選択することができない。そこで、多型周囲の配列を一部変更し認識配列に改変することにより、ＲＦＬＰをより容易に行うことができる。
【０００７】
核酸の塩基配列を改変する方法として、改変した塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う方法が広く用いられている。当該方法は、同一のストランド上に、所望の改変後の塩基配列を有する（つまり、ミスマッチを有する）１種類のプライマーと、対応するリバースプライマーとを配置し、これらを用いて核酸増幅することにより、標的塩基配列中の塩基を置換することが特徴である（例えば、非特許文献２参照。）。ＰＣＲ−ＲＦＬＰは、当該方法を利用して多型周囲の塩基配列の一部を制限酵素の認識配列に改変し、ＲＦＬＰを行う方法である（例えば、非特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】古川徹、「臨床検査」、医学書院発行、２００６年、第５０巻、第７号、第７２１〜７３０ページ。
【非特許文献２】エルリック（Henry A. Erlich）編、加藤郁之進監訳、「第２部第６章ＰＣＲを用いたＤＮＡエンジニアリング」、ＰＣＲテクノロジー（第２版）、宝酒造株式会社発行、１９９５年、第９０〜９２ページ。
【非特許文献３】レヴィ（Levi）、外６名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、１９９１年、第５１巻、第３４９７〜３５０２ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
実際の多型解析においては、塩基配列中の１塩基のみを変更することにより制限酵素の認識配列に改変できる場合は少なく、２塩基以上の塩基を変更することにより、有用な認識配列に改変できる場合が多い。しかしながら、非特許文献２に記載されているような所望の改変後の塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ法では、改変する塩基が２塩基以上となると、ＰＣＲの反応効率が低下する、という問題がある。プライマー中の改変された塩基は、鋳型とする改変前の核酸に対してミスマッチとなるため、改変する塩基が多くなると、プライマーと鋳型核酸との会合体形成が不安定化してしまうためである。特に、３塩基以上を改変する場合には、目的の改変された核酸が得られない場合が多い。
【００１０】
反応効率の低下を防止するため、１塩基のみを改変したプライマーを用いて、１回のＰＣＲで１塩基のみを改変し、この反応を繰り返し行うことにより、多数の塩基が改変された核酸を得ることはできる。しかしながら、塩基配列を改変する領域が広くなるほど反応段数が多くなり、作業効率及び収量が著しく低下してしまうという問題がある。
【００１１】
本発明は、核酸の塩基配列中の複数の塩基を、１回のＰＣＲにより効率よく改変する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、２以上の塩基を改変する場合に、所望の改変後の塩基配列を有するプライマーと、部分的に改変した塩基配列を有するプライマーとを併用してＰＣＲを行うことにより、所望の改変後の塩基配列を有する核酸を効率よく簡便に得ることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）    核酸の塩基配列を改変する方法であって、
標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された塩基配列を、改変塩基配列とし、
前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基を改変部位塩基とし、
前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の前記改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、かつ前記改変塩基配列とは異なる塩基配列を、部分改変塩基配列とし、
前記部分改変塩基配列を有するプライマーを部分改変型プライマーとし、
前記標的塩基配列を有する２本鎖核酸を鋳型とし、前記改変塩基配列を有する改変型プライマーと、１種以上の部分改変型プライマーとを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）を行う工程を有することを特徴とする塩基配列の改変方法、
（２）  前記標的塩基配列と、前記改変塩基配列と、前記ＰＣＲにおいて用いられる全種類の部分改変型プライマーのそれぞれが有する部分改変塩基配列とからなる配列群において、当該配列群中の各塩基配列は、それぞれ、相違する塩基が２塩基以下である塩基配列を前記配列群中に少なくとも１種含んでいることを特徴とする前記（１）記載の塩基配列の改変方法、
（３）  前記ＰＣＲにおいて、反応に用いる前記改変型プライマーの量が、用いられる全種類の部分改変型プライマーの総量よりも多いことを特徴とする前記（１）又は（２）記載の塩基配列の改変方法、
（４）  前記標的塩基配列は、遺伝子多型部位又は体細胞変異部位である多型部位を含まない塩基配列であり、
前記多型部位から１０塩基以内に含まれる２以上の塩基を改変することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の塩基配列の改変方法、
（５）  前記（４）記載の塩基配列の改変方法により塩基配列が改変された核酸を制限酵素処理することにより、前記多型部位の塩基種を解析することを特徴とする核酸の解析方法、
（６）  前記（４）記載の塩基配列の改変方法により塩基配列が改変された核酸を鋳型として核酸伸長反応を行うことにより、前記多型部位の塩基種を解析することを特徴とする核酸の解析方法、
（７）  前記（４）記載の塩基配列の改変方法により塩基配列が改変された核酸を鋳型とし、前記改変塩基配列を含む塩基配列からなるプローブを用いて、核酸連結反応を行うことにより、前記多型部位の塩基種を解析することを特徴とする核酸の解析方法、
（８）  核酸の塩基配列を、標的塩基配列から、当該標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された改変塩基配列に改変するために用いられるキットであって、
前記改変塩基配列を有する改変型プライマーと、部分改変塩基配列を有する１種以上の部分改変型プライマーとを含み、
前記部分改変塩基配列は、前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、前記改変塩基配列とは異なる塩基配列であり、
前記改変部位塩基は、前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基であることを特徴とする塩基配列改変用キット、
（９）  多型解析に用いられる核酸を改変するために用いられるものであり、
前記標的塩基配列が、解析対象である多型部位を含まず、かつ当該多型部位から１０塩基以内にある２以上の塩基を含む塩基配列であることを特徴とする前記（８）記載の塩基配列改変用キット、
（１０）  多型解析のために用いられるキットであって、
改変塩基配列を有する改変型プライマーと、部分改変塩基配列を有する１種以上の部分改変型プライマーと、多型検出用プライマーとを含み、
前記改変塩基配列は、標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された塩基配列であり、
前記標的塩基配列は、解析対象である多型部位を含まず、かつ当該多型部位から１０塩基以内にある２以上の塩基を含む塩基配列であり、
前記部分改変塩基配列は、前記標的塩基配列に対して、少なくとも１の改変部位塩基を、前記改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、前記改変塩基配列とは異なる塩基配列であり、
前記改変部位塩基は、前記標的塩基配列と前記改変塩基配列とにおいて相違する塩基であり、
前記多型検出用プライマーは、当該多型部位が特定の遺伝子型である核酸の前記標的塩基配列の領域が前記改変塩基配列に改変された核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする多型解析用キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の塩基配列の改変方法を用いることにより、改変前の塩基配列に対して２以上の塩基が置換された塩基配列に改変された核酸を、１回のＰＣＲにより効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の改変方法の一態様を模式的に示した図である。
【図２】ＥＧＦＲ遺伝子における８５８番目のロイシンをコードするコドンの周囲の塩基配列を示した図である。
【図３】実施例１において、ＰＣＲ産物の収量を、置換した塩基数ごとに示した図である。
【図４】実施例１において、表１の＃１、２、７、８、９、１０のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物に対してシーケンシングを行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の塩基配列の改変方法（以下、「本発明の改変方法」ということがある。）は、核酸の塩基配列を、改変後の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、２以上の塩基が置換された塩基配列へと改変する方法において、所望の改変部位の塩基を全て置換した塩基配列を有するプライマーと、複数の改変部位の一部を置換した塩基配列を有するプライマーとを併用することを特徴とする。
【００１７】
図１に、本発明の改変方法の一態様を模式的に示す。まず、図１（Ａ）に、塩基配列中の１の塩基が置換された核酸をＰＣＲにより調製する方法を示す。塩基配列中のある塩基Ｃ（シトシン）を置換する場合、当該Ｃに相当する塩基を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った場合には、鋳型とした核酸と同じ塩基配列を有する核酸が増幅される〔図１（Ａ）の左図〕。これに対して、当該Ｃに相当する塩基を、鋳型となる相補鎖上のＧ（グアニン）とは非相補的な塩基（ミスマッチ塩基）であるＡ（アデニン）としたプライマーを用いてＰＣＲを行った場合には、当該ＣがＡに置換された核酸を増幅産物として得ることができる。このように、鋳型となる核酸とミスマッチとなるミスマッチプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、塩基配列が改変された核酸を得ることができる。
【００１８】
しかしながら、複数の塩基を置換する場合には、所望の改変後の塩基配列を有するプライマー、すなわち、改変したい全ての塩基が置換されたプライマーを用いてＰＣＲを行ったとしても、所望の改変された核酸を得ることが非常に困難である。これは、置換する塩基数が多くなるほど、鋳型となる改変前の核酸とのミスマッチ領域が広くなり、プライマーと鋳型核酸との会合体が形成され難くなるためである。これに対して、本発明の改変方法では、部分的に置換されたプライマーを併用する。置換したい塩基を複数のプライマーに分散させて配置することにより、１回の反応で効率よく置換可能な塩基配列中の範囲を、非常に広くすることができる。ＰＣＲは、標的塩基配列と相補性が高いプライマーから段階的に反応するため、反応が進行するにつれて、置換された塩基が集積され、反応の終段階においては、改変したい全ての塩基が置換されている核酸（改変後の塩基配列を有する核酸）を得ることができる。
【００１９】
図１（Ｂ）は、塩基配列中の「ＡＴＣ」（Ｔはチミン）という３塩基を、「ＣＧＡ」の３塩基へと置換する場合を模式的に示した図である。左図が従来法を、右図が本発明の改変方法をそれぞれ用いた場合を示す。左図に示すように、ミスマッチ領域が広く、３塩基全てが置換されたプライマーと、鋳型となる改変前の核酸鎖との会合体の形成が不安定となり、ＰＣＲの反応効率が低下してしまう。これに対して、本発明の改変方法では、３塩基全てが置換されたプライマーに加えて、「Ａ」の１塩基のみが置換されたプライマーと、「ＧＡ」の２塩基のみが置換されたプライマーとを併用してＰＣＲを行う。これにより、おそらく、１塩基のみが置換されたプライマーと改変前の核酸とが会合体を形成して増幅されることにより、「Ａ」の１塩基のみが置換された２本鎖核酸が生成される。次いで、この１塩基が置換された２本鎖核酸を鋳型として、２塩基のみが置換されたプライマーにより増幅反応が起こり、「ＧＡ」の２塩基が置換された２本鎖核酸が生成される。さらに、この２塩基が置換された２本鎖核酸を鋳型として、３塩基全てが置換されたプライマーにより増幅反応が起こり、「ＣＧＡ」の３塩基全てが置換された所望の核酸を得ることができると推察される。
【００２０】
本発明において標的塩基配列とは、塩基配列を改変する対象となる塩基配列であって、遺伝子組換え技術等により増幅が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列であってもよく、ｍＲＮＡ等の生物のＲＮＡに存在する塩基配列であってもよい。
【００２１】
標的塩基配列の長さは、特に限定されるものではないが、ＰＣＲのプライマーとして使用可能な長さ以下の長さであることが好ましい。例えば、５０塩基以下であることが好ましく、２０〜４５塩基であることがさらに好ましい。
【００２２】
標的塩基配列は、置換して改変したい塩基が含まれるように、適宜設計することができる。また、改変後の核酸の利用の態様、例えば、改変後の核酸の解析方法等を考慮して設計することが好ましい。例えば、改変後の核酸を多型解析に用いる場合には、遺伝子多型部位や体細胞変異部位等の多型部位の塩基種に影響を与えることなく、当該多型部位近傍の塩基、例えば、多型部位から１０塩基以内に含まれる２以上の塩基を改変し得るように、標的塩基配列を設定することが好ましい。より具体的には、解析対象である多型部位を含まず、かつ当該多型部位から１０塩基以内（多型部位の上流側から１０塩基以内であってもよく、下流側 から１０塩基以内であってもよい。）にある２以上の塩基を含む塩基配列とすることが好ましい。
【００２３】
本発明において改変塩基配列とは、標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された塩基配列を意味し、改変型プライマーとは、改変塩基配列を有するプライマーをいう。例えば図１（Ｂ）においては、「ＣＧＡ」の３塩基全てが置換されたプライマーが、改変型プライマーに相当する。
【００２４】
また、標的塩基配列と改変塩基配列とにおいて相違する塩基を、改変部位塩基という。例えば、図１（Ｂ）において、鋳型とされる核酸鎖中の３塩基「ＧＡＴ」は、各塩基それぞれが改変部位塩基である。同じくプライマー中の「ＣＧＡ」は、各塩基それぞれが改変部位塩基である。
【００２５】
標的塩基配列中に存在する改変部位塩基の数は、２以上であれば特に限定されるものではないが、３塩基以上であることがより好ましく、３〜１０塩基であることがより好ましい。また、改変部位塩基は、標的塩基配列中に連続して存在していてもよく、２箇所以上に分散して存在していてもよい。改変後の核酸を多型解析に用いる場合には、改変部位塩基は、標的塩基配列の３’側よりに存在していることが好ましい。より具体的には、標的塩基配列の３’末端から２０塩基以内に存在していることが好ましく、１０塩基以内に存在していることがより好ましい。
【００２６】
本発明において部分改変塩基配列とは、標的塩基配列に対して、少なくとも１の改変部位塩基を、改変塩基配列と同じ塩基に置換された塩基配列であって、改変塩基配列とは異なる塩基配列をいう。また、部分改変型プライマーとは、部分改変塩基配列を有するプライマーをいう。例えば図１（Ｂ）においては、「Ａ」の１塩基のみが置換されたプライマーと「ＧＡ」の２塩基のみが置換されたプライマーとは、いずれも部分改変型プライマーに相当する。
【００２７】
本発明の改変方法は、具体的には、標的塩基配列を有する２本鎖核酸を鋳型とし、改変塩基配列を有する改変型プライマーと、１種以上の部分改変型プライマーとを用いてＰＣＲを行う工程を有する。
【００２８】
ＰＣＲに用いる部分改変型プライマーは、１種類以上であればよく、標的塩基配列の長さ、改変部位塩基の数、標的塩基配列中における改変部位塩基同士の位置関係等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、改変部位塩基が２個存在する場合には、標的塩基配列中のいずれか一方の改変部位塩基のみが、改変塩基配列と同じ塩基に置換された部分改変塩基配列を有する部分改変型プライマーのみを１種類用いればよいが、一の改変部位塩基が置換されている部分改変塩基配列を有する部分改変型プライマーと、他方の改変部位塩基が置換されている部分改変塩基配列を有する部分改変型プライマーとの、２種類の部分改変型プライマーを用いてもよい。
【００２９】
本発明においては、標的塩基配列と、改変塩基配列と、ＰＣＲにおいて用いられる全種類の部分改変型プライマーのそれぞれが有する部分改変塩基配列とからなる配列群において、各塩基配列は、それぞれ、当該配列群中の他の塩基配列と比較した場合に、互いに相違する塩基が２塩基以下である塩基配列、又は互いに相違する塩基が３塩基以上であり、かつ相違する塩基が連続して３塩基以上は存在していない塩基配列のいずれか一方を少なくも１種含んでいることが好ましい。中でも、当該配列群中の各塩基配列は、それぞれ、相違する塩基が２塩基以下である塩基配列を当該配列群中に少なくとも１種含んでいることがより好ましく、相違する塩基が２塩基以下である塩基配列を当該配列群中に少なくとも１種含んでいることがさらに好ましい。
【００３０】
一般的に、ＰＣＲにおいては、鋳型となる核酸とプライマーとの塩基配列が、連続する３塩基以上のミスマッチ塩基を有する場合には、両者の会合体の形成が不安定となり易い。そこで、ＰＣＲに用いる鋳型（標的塩基配列を有する２本鎖核酸）と、部分改変型プライマーと、改変型プライマーとにおいて、最も塩基配列の共通領域が多い（類似性が高い）塩基配列同士が、互いに相違する塩基を連続して２塩基以下しか存在しないように設計することにより、一の部分改変型プライマーから核酸鎖を伸長させて得られた核酸が、他の部分改変型プライマー又は改変型プライマーを用いた伸長反応の鋳型として効率よく機能することができる。
【００３１】
本発明においては、ＰＣＲの反応に用いる改変型プライマーの量が、各種の部分改変型プライマー量よりも多いことが好ましく、反応に用いられる全種類の部分改変型プライマーの総量よりも多いことがより好ましい。改変型プライマーが、部分改変型プライマーよりも多く存在する条件下でＰＣＲを行うことにより、反応の終段階においては、改変塩基配列を有する目的の核酸を主たる生成物とすることができる。本発明においては、特に、全種類の部分改変型プライマーの総量が、改変型プライマーの量の１／１０以下であることが好ましい。このように、部分改変型プライマーの使用量を改変型プライマーに比べて充分に少なくすることにより、ＰＣＲ産物の検出に一般的に用いられる手法により測定した場合に検出限界以下となる程度にまで、標的塩基配列が部分的に改変された核酸の生成量を抑制することができる。
【００３２】
本発明において用いられる標的塩基配列、改変塩基配列、及び部分改変塩基配列は、常法により設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データやＳＮＰデータと、汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースであるＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ. Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. ｈｔｍｌ）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。
【００３３】
このようにして設計した塩基配列を有するそれぞれのプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。
【００３４】
また、改変型プライマーや部分改変型プライマーは、改変塩基配列や部分改変塩基配列以外にも、標的核酸とハイブリダイズ可能な塩基配列を共通して有していてもよい。この場合には、改変塩基配列や部分改変塩基配列は、それぞれ、改変型プライマーや部分改変型プライマーの３’側に存在していることが好ましい。改変型プライマーや部分改変型プライマーは、さらに、本発明の効果を損なわない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
【００３５】
なお、本発明における標的塩基配列を有する２本鎖核酸（以下、標的核酸ということがある。）は、２本鎖核酸を構成するいずれか一方の核酸鎖が標的塩基配列を有しており、ＰＣＲにおける鋳型となり得る２本鎖核酸であれば、特に限定されるものではない。生体試料（検体）中に含有される核酸や、これらの生体試料等から抽出された核酸であってもよく、これらの核酸を鋳型として増幅された核酸であってもよい。また、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。本発明においては、特に、臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製した核酸であることが好ましい。ヒト由来の生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、又は大便等がある。
【００３６】
ＰＣＲの反応条件は、特に限定されるものではなく、使用するポリメラーゼの種類、第１型検出用プライマー、阻害用オリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮して、適宜決定することができる。
また、ＰＣＲに用いられるポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、通常核酸鎖伸長反応を行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。
【００３７】
本発明の改変方法により、従来の改変後の塩基配列を有する１種類のプライマーのみを用いた改変方法よりも塩基置換の反応効率が改善され、より広範囲の複数の塩基を、１回のＰＣＲで効率よく改変することができる。このため、多型解析等のような核酸の塩基配列を解析する際に、解析対象である塩基の周辺領域の塩基配列を、本発明の改変方法を用いて改変することにより、核酸解析の精度や作業性を向上させることができる。
【００３８】
例えば核酸解析においては、解析対象である領域の周辺領域の２次構造や熱力学的安定性が、解析に大きな影響を及ぼす場合がある。本発明の改変方法を用いて、解析対象領域の周辺領域の塩基配列を所望の塩基配列に改変することにより、当該周辺領域の２次構造や熱力学的安定性を広く制御することができ、解析対象領域の塩基配列を、より高精度かつ容易に解析することが可能になる。より具体的には、例えば、本発明の改変方法を用いることにより、解析対象配列の二次構造の解消すること、Ａ／ＴとＧ／Ｃの置換により熱力学的安定性を高め反応温度を高くしてＳＮを改善すること、制限酵素の認識配列への改変を組み込むことにより、改変前には適応できなかった制限酵素を用いて塩基配列を解析すること、ができるようになる。その他、解析対象の塩基の近傍の塩基配列を、核酸解析に用いるプライマーやプローブのＴｍ値を作業に都合の良い値に調整することができるように改変することもできる。
【００３９】
なお、改変型プライマーや部分改変型プライマーのＴｍ値は、塩基配列に基づいて、常法により算出することができる。また、ＶｉｓｕａｌＯＭＰ（ＤＮＡ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等の市販のシミュレーションソフトウェアを用いて算出することもできる。
【００４０】
本発明の改変方法により塩基配列が改変された核酸は、他の核酸と同様に、核酸解析に用いることができる。特に、多型解析に用いられることが好ましい。多型解析に用いられるプライマーやプローブは、設計位置が多型周囲に限定され、増幅を目的とした場合に比べて自由度が低いため、本発明の改変方法の効果がより効果的に発揮される。例えば、遺伝子多型部位や体細胞変異部位等の多型部位の近傍の塩基配列、例えば、多型部位から１〜１０塩基以内に含まれる２以上の塩基を、適宜改変することにより、当該多型部位を精度よく簡便に解析することができる。なお、多型部位の解析は、常法により行うことができる。
【００４１】
本発明において多型とは、ある生物種の個体間若しくは同一個体中の細胞間において、同じ遺伝子の塩基配列に相違部分があることを意味する。具体的には、同じ遺伝子において、一の細胞由来の特定の遺伝子の塩基配列に対して、同じ生物種の別個体由来の、又は同一個体の他の細胞由来の当該遺伝子の塩基配列が、１又は複数の塩基が置換、欠損、若しくは挿入されている場合に、当該遺伝子は多型であるといい、両者の塩基配列で相違する部位を多型部位という。なお、ゲノムＤＮＡ上における多型であってもよく、ミトコンドリアＤＮＡにおける多型であってもよい。また、先天的な多型であってもよく、腫瘍細胞等において多くみられる後天的な多型であってもよい。該多型として、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト、体細胞変異等がある。
【００４２】
本発明において多型部位とは、各多型において、遺伝子の塩基配列が異なる部位を意味する。例えば、ある多型において、一の遺伝子型（第１型）における塩基配列がｇｇｇａａａであり、第１型とは異なる遺伝子型（第２型）における塩基配列がｇｇｃａａａである場合に、第１型においてｇであり、第２型においてｃである５’側から３番目の塩基が多型部位である。また、本発明において、多型を解析するとは、ある核酸の多型部位の塩基種を判別する、若しくは、多型種の存在比率を定量することを意味する。
【００４３】
なお、改変された核酸を用いて多型解析を行うためには、改変された核酸中に、当該多型部位が含まれており、かつ、改変処理において当該多型部位の塩基が影響を受けない必要がある。このため、本発明の改変方法により改変する場合には、改変型プライマーや部分改変型プライマーは、鋳型となる核酸中の当該多型部位を含まない領域を認識するように設計する必要がある。さらに、ＰＣＲにより当該多型部位が含まれる領域の核酸が増幅されるように、改変型プライマーと対になるプライマーを設計する必要がある。
【００４４】
例えば、本発明の改変方法により、当該多型部位が一の遺伝子型（第１型）の場合には、当該多型部位を含む塩基配列が制限酵素の認識配列となり、他の遺伝子型（第２型）の場合には認識配列ではなくなるように、多型部位から１０塩基以内に含まれる２以上の塩基を改変し、この改変された核酸を制限酵素処理することにより、当該多型部位の塩基種を解析することができる。すなわち、改変された核酸が、制限酵素で切断された場合には、改変前の標的核酸の多型部位が第１型であり、制限酵素で切断されなかった場合には、標的核酸の多型部位は第２型であると解析することができる。
【００４５】
また、本発明の改変方法により改変された核酸を鋳型として、多型部位が特定の遺伝子型であるアレル等に特異的に結合し得る多型検出用プライマーを用いて核酸伸長反応を行うことによっても、多型部位の塩基種を解析することができる。本発明においては、多型検出用プライマーとは、多型部位が特定の遺伝子型である核酸の標的塩基配列の領域が改変塩基配列に改変された核酸と、当該多型部位を含む領域においてハイブリダイズするプライマーを意味する。このような多型検出用プライマーの設計及び合成は、改変型プライマー等と同様にして行うことができる。また、核酸伸長反応及び伸長産物の検出等は、公知の方法の中から適宜選択して行うことができる。
【００４６】
その他、本発明の改変方法により改変された核酸を鋳型とし、改変方法において用いた改変塩基配列を含む塩基配列からなるプローブを用いて、核酸連結反応を行うことにより、当該多型部位の塩基種を解析することができる。ここで、核酸連結反応とは、鋳型となる核酸鎖に、２つのプローブを両者が隣接するようにハイブリダイズさせた後、両プローブをライゲース等の酵素により連結させる反応である。核酸連結反応では、２つのプローブを、多型部位において連結されるように設計することにより、多型を解析することができる。例えば、鋳型が特定の遺伝子型である場合には、２つのプローブが隣接してハイブリダイズするため、両プローブが連結されるが、その他の遺伝子型である場合には、２つのプローブは隣接せず、両プローブは連結されない。このため、連結産物の有無を検出することにより、鋳型とした核酸の多型を解析することができる。
【００４７】
改変塩基配列を含むプローブは、改変された２本鎖核酸を構成する１本鎖核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、その３’末端の塩基が、改変された核酸の多型部位の塩基と塩基対を形成する塩基であってもよく、改変された核酸の多型部位の３’側隣の塩基と塩基対を形成する塩基であってもよい。なお、核酸連結反応及び連結産物の検出等は、公知の方法の中から適宜選択して行うことができる。
【００４８】
さらに、本発明の改変方法において用いられる改変型プライマーと１種以上の部分改変型プライマーとをキット化することも好ましい。当該キットには、その他に、ＰＣＲに用いられる酵素、反応溶液を調製するためのバッファー、ヌクレオチド等の試薬を含めてもよい。このようなキットを用いることにより、より簡便に、核酸の塩基配列を、標的塩基配列から、当該標的塩基配列中の２以上の塩基が置換された改変塩基配列に改変することができる。
【００４９】
本発明の改変方法において用いられる試薬等に加えて、さらに、改変された核酸を解析するために用いられる試薬等をもキット化することにより、塩基配列の改変から解析までの一連の操作をより簡便に行うことができる。特に、改変型プライマーと、１種以上の部分改変型プライマーと、多型検出用プライマーとをキット化することにより、多型解析をより簡便に行うことができる。
【実施例】
【００５０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
本発明の改変方法を用いて、体細胞変異部位の近傍の塩基配列を改変した。
具体的には、腫瘍細胞において高頻度に検出される多型であるＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子のＬ８５８Ｒ変異の近傍の塩基配列を改変した。
【００５２】
＜プライマーの設計＞
図２に、ＥＧＦＲ遺伝子における８５８番目のロイシンをコードするコドンの周囲の塩基配列を示す。図２（Ａ）が改変前の塩基配列であり、図２（Ｂ）が改変後の塩基配列である。図中、四角で囲まれた塩基が体細胞変異部位（多型部位）であり、実線が付されている配列がフォワードプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｗ）の配列であり、点線が付されている配列がリバースプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅ）の配列である。また、図２（Ａ）中の波線が付されている配列が標的塩基配列であり、図２（Ｂ）中の波線が付されている配列が、この標的塩基配列の全ての塩基が置換された塩基配列である。
【００５３】
標的塩基配列中の１〜６塩基がそれぞれ置換された核酸を調製するために、図２に示す塩基配列に基づき、表１に示すような改変型プライマーや部分改変型プライマーを設計した。表中の「備考欄」の「従来法」とは、ＰＣＲのフォワードプライマーとして改変型プライマーのみを用いた場合を示す。また、表中の各プライマーセットの欄（「＃Ｎ」）の最上段に記載されたプライマーが改変型プライマーに相当し、リバースプライマー（最下段）を除いたそれ以外のプライマーが部分改変型プライマーに相当する。なお、各プライマーは、株式会社ファスマックに合成を依頼した。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
＜ＰＣＲ＞
表１記載のプライマーセットごとに、図２（Ａ）に記載の塩基配列を有することが予め確認されているゲノムＤＮＡ（ＮｏｖａＧｅｎｅ社から購入、商品名：ＧｅｎｏｍｅＭｉｘ）を鋳型とし、ＰＣＲを行った。具体的には、プライマーセットのプライマーと、ＧｅｎｏｍｅＭｉｘとを添加した、１×Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）溶液を反応溶液とした。各プライマーは、それぞれ表１記載の濃度となるように添加した。各プライマーセットにおいて、改変型プライマーの添加量を５００ｎＭとし、部分改変型プライマーの総量が、改変型プライマー量の１／１０以下となるようにした。複数の部分改変型プライマーを用いる場合には、それぞれ等量ずつ添加した。該反応溶液を、９５℃で１５分間処理した後、９５℃で３０秒間、その後６８℃で１分間(サイクル毎に反応時間を５秒間延長)を５０サイクル行う工程からなる反応条件によりＰＣＲ増幅を行った。サーマルサイクラーはＰＴＣ−２００（ＭＪ社製）を用いた。
【００５６】
ＰＣＲ反応後の反応溶液中の核酸量を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（ＤＮＡ  １０００  ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて定量し、ＰＣＲによる収量について比較検討した。図３に、定量されたＰＣＲ産物の収量を、置換した塩基数ごとに示す。図３中、「置換なし」は標的塩基配列を有する天然型プライマー（Ｆｗ）を用いた場合を、「Ｎ塩基」は、Ｎ個の塩基を置換するためのプライマーセットを用いて得られた結果を、それぞれ示す。この結果、改変型プライマーのみを用いる従来法では、置換する塩基数が３塩基で大きく収量が低下し、４塩基や６塩基を置換した場合には、ＰＣＲ産物を確認することができなかった。一方で、置換する塩基を複数のプライマーに分散させて配置した本発明の改変方法では、３塩基を置換する場合においても、置換しなかった場合の９２％の収量が得られた。さらに、４塩基や６塩基を置換した場合においても、目的の改改変された核酸を、充分量得ることができた。
【００５７】
次に、表１の＃１、２、７、８、９、１０のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物に対してシーケンシングを行い、塩基配列を確認した。具体的には、まず、ＰＣＲ反応後の反応溶液から、プライマー及びｄＮＴＰを、市販のキット（ＡＢＩ社製、商品名：ＥｘｏＳａｐ−ＩＴ)を用いて除去した。次いで、シーケンシングプライマー（ＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣ）を用いて、ＢｉｇＤｙｅ  ｖ３．１キット（ＡＢＩ社製)を用いて、キット付属のプロトコルに従い、シーケンシング反応・精製を行った。シーケンシング反応物は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製)で解析し、塩基配列を決定した。なお、シーケンシングプライマーの合成は株式会社ファスマックに依頼した。
【００５８】
シーケンシングの結果を図４に示す。図中、「置換なし」がプライマーセット＃１を用いたＰＣＲ産物の結果を、「１塩基」がプライマーセット＃２を用いたＰＣＲ産物の結果を、「２塩基」がプライマーセット＃７を用いたＰＣＲ産物の結果を、「３塩基」がプライマーセット＃８を用いたＰＣＲ産物の結果を、「４塩基」がプライマーセット＃９を用いたＰＣＲ産物の結果を、「６塩基」がプライマーセット＃１０を用いたＰＣＲ産物の結果を、それぞれ示す。また、図中、四角で囲った配列が塩基を置換により改変した部位であり、●を付した塩基が体細胞変異部位である。この結果、各ＰＣＲ産物においては、目的通り塩基が置換されていることが確認された。
【００５９】
これらの結果から、置換する塩基を複数のプライマーに分散させて配置し、これらのプライマーを併用してＰＣＲを行うことにより、反応効率の低下を回避し、より広い範囲の塩基を精度よく置換できることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の塩基配列の改変方法を用いることにより、核酸の塩基配列中の複数の塩基を、１回のＰＣＲにより効率よく改変することができるため、核酸解析の分野、特にＳＮＰ識別等の遺伝子検査や腫瘍関連の体細胞変異解析等の臨床検査の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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