(57)【要約】      （修正有）【課題】癌、とりわけ腎癌の免疫療法、ならびに免疫療法で使用するための分子および細胞の提供。【解決手段】ペプチドがＨＬＡ−ＤＲに結合する場合に、結合した該ペプチドが、特定な配列からなるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を誘導可能である、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの分子のＨＬＡ−ＤＲ４に結合する能力を有する腫瘍関連ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２７３に記載の連続したアミノ酸配列を含む、１５〜３０アミノ酸長の腫瘍関連ペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号２７３のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項３】
ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの分子のＨＬＡ−ＤＲ４に結合する能力を有する、請求項１または２に記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項４】
ペプチドがＨＬＡ−ＤＲに結合する場合に、結合した該ペプチドが、配列番号２７３に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を誘導可能である、請求項３に記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項５】
該ペプチドが非ペプチド結合を包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項６】
該ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連インバリアント鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載ペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ若しくはそれらの組合せである、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項７または８に記載の核酸を発現することが可能な発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の核酸または請求項９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
組換えＡｗｅｌｌｓ細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の腫瘍関連ペプチドの製造方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を培養すること、および該ペプチドを宿主細胞若しくはその培地から単離することを含んでなる、製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の腫瘍関連ペプチド、および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１４】
医薬品での使用のための、請求項１〜６のいずれか１つに記載の腫瘍関連ペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の腫瘍関連ペプチドを含んでなる癌ワクチン。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに示されるところのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤であって、有効量患者に投与されることにより抗標的細胞免疫応答を誘導する請求項１〜６のいずれか１つに記載のペプチドを含む、標的細胞の死滅剤。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれかに示されるところのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１つに記載の腫瘍関連ペプチドの使用。
【請求項１８】
活性化型細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏの製造方法であって、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間、適する抗原提示細胞の表面上に発現された抗原を負荷したヒトクラスＩＩ  ＭＨＣ分子とＣＴＬをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含んでなり、該抗原が請求項１〜６のいずれか１つに記載のペプチドである、製造方法。
【請求項１９】
該抗原が、十分な量の該抗原を抗原提示細胞と接触させることにより、適する抗原提示細胞の表面上で発現されたクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に負荷される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗原提示細胞が請求項９に記載の発現ベクターを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
クラスＩＩ  ＭＨＣ分子がＨＬＡ−ＤＲ４である、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、請求項１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により製造された活性化型細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、該ＴＣＲが、請求項２１若しくは２２の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）から得られるか、または該ＴＣＲと機能上同等な分子である、ＴＣＲ。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸。
【請求項２５】
請求項２２または２３に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現することが可能な発現ベクター。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤であって、有効量患者に投与される請求項２２若しくは２３に定義されるところの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む、標的細胞の死滅剤。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤であって、請求項２２若しくは２３に定義されるところのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または当該ＴＣＲと機能上同等な分子をコードする核酸が導入された、患者から得られた細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む、標的細胞の死滅剤。
【請求項２８】
標的細胞が癌細胞である、請求項１６、２６および２７のいずれか１つに記載の患者における標的細胞の死滅剤。
【請求項２９】
癌が、請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する腎癌である、請求項２８に記載の患者における標的細胞の死滅剤。
【請求項３０】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤の製造における、請求項２２または２３に定義されるところの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の方法、ならびに免疫療法の方法での使用のための分子および細胞に関する。とりわけ、本発明は癌、とりわけ腎癌の免疫療法に関する。本発明はさらに、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬学的有効成分としてはたらく、単独の若しくは他の腫瘍関連ペプチドと組合せの腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープに関する。とりわけ、本発明は、抗腫瘍免疫応答を導き出すためのワクチン組成物で使用し得る、ヒト腫瘍細胞株のＨＬＡクラスＩＩ分子由来の３３８種の新規ペプチド配列に関する。
本発明の目的上、本明細書に引用されるところの全部の参考文献は、そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系により外来として認識される抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、今や、腫瘍増殖に介入するため宿主の免疫系を使用する可能性を生じた。免疫系の体液性および細胞性双方の部門の利用の多様な機構が、現在、癌免疫療法のため探求されている。
【０００３】
細胞性免疫応答の特定の要素が、腫瘍細胞を特異的に認識かつ破壊することが可能である。腫瘍浸潤細胞集団若しくは末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、こうした細胞が癌に対する自然免疫防御において重要な役割を演じていることを示唆する（非特許文献１）。サイトゾル中に位置するタンパク質由来の通常８ないし１０残基の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子をもつペプチドを認識する、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＴＣＤ８＋）はとりわけ、この応答で重要な役割を演じている。ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも命名されている。
【０００４】
ＭＨＣ分子には２つのクラスがある：ＭＨＣ−Ｉ分子は、内因性タンパク質およびより大きなペプチドのタンパク質分解性切断から生じるペプチドを提示し、核を有するほとんどの細胞上で見出し得る。ＭＨＣ−ＩＩ分子は、専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのみ見出し得、そしてエンドサイトーシスの経過中にＡＰＣにより取り込まれ、そして消化される外因性タンパク質のペプチドを提示する。ペプチドとＭＨＣ−Ｉの複合体はＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球により認識され、ペプチドとＭＨＣ−ＩＩ分子の複合体はＣＤ４＋−ヘルパーＴ細胞により認識される。
【０００５】
ペプチドが細胞性免疫応答を誘発する（導き出す）ためには、ＭＨＣ分子に結合しなければならない。この過程はＭＨＣ分子のアリルおよびペプチドのアミノ酸配列の特定の多型に依存する。ＭＨＣクラスＩに結合するペプチドは、長さが通常８〜１０残基であり、そして、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用する、それらの配列中の２個の保存された残基（「アンカー」）を含有する。
【０００６】
現在、腫瘍細胞を特異的に認識しかつ養子移入後にいくつかの場合には完全寛解を誘導する治療活性を有する、マウスおよびヒト双方のＴＣＤ８＋の多数の例が存在する。しかしながら、腫瘍を根絶するＴ細胞の潜在能力にもかかわらず、多くの腫瘍がｉｎ  ｖｉｖｏでＴＣＤ８＋による認識を逃れることが、大部分の癌の進行性増殖からみても明らかである。多様な腫瘍が免疫原性であることが見出されているとは言え、効果的な抗腫瘍免疫応答の刺激は立証することが困難であった。
【０００７】
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球により認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などのような全部のタンパク質分類由来の分子であり得る。さらに、例えば、腫瘍関連抗原はまた、例えば変異した遺伝子の産物として腫瘍細胞中のみに存在し得る。腫瘍関連抗原の別の重要な分類は、多様な種類の腫瘍および健康な精巣組織で発現されるＣＴ（「癌精巣」）抗原のような組織特異的構造である。
【０００８】
多様な腫瘍関連抗原が同定されている。さらに、多くの研究の労力が付加的な腫瘍関連抗原を同定するために費やされている。腫瘍特異的抗原ともまた当該技術分野で称される、いくつかの群の腫瘍関連抗原は組織特異的である。例として、これに限定されるものでないが、黒色腫のチロシナーゼ、前立腺癌のＰＳＡおよびＰＳＭＡ、ならびにリンパ腫におけるｂｃｒ／ａｂｌのような染色体交差が含まれる。しかしながら、同定された多くの腫瘍関連抗原は複数の腫瘍型に存在し、そして、形質転換を実際に引き起こす癌タンパク質および／若しくは腫瘍抑制遺伝子（腫瘍抑制遺伝子は、例えば腎癌について非特許文献２に総説されている）のような数種は、ほぼ全腫瘍型に存在する。例えば、ｐ５３（腫瘍抑制遺伝子の一例である）、ｒａｓ、ｃ−ｍｅｔ、ｍｙｃ、ｐＲＢ、ＶＨＬおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕのような、細胞の増殖および分化を制御する正常細胞タンパク質は、これらの遺伝子産物の発現の上方制御をもたらす突然変異を蓄積してそれによりそれらを発癌性にし得る（非特許文献３；非特許文献４）。これらの変異体タンパク質は、複数の型の癌での腫瘍特異的免疫応答の標的となり得る。
【０００９】
腫瘍抑制遺伝子は、多細胞生物体の細胞が腫瘍細胞に変わることができる確率を低下させる遺伝子である。こうした遺伝子の突然変異若しくは欠失は腫瘍の確率を増大させることになる。その点で腫瘍抑制遺伝子は癌遺伝子に類似している。腫瘍抑制遺伝子、若しくはより正確にはそれらがコードするタンパク質は、細胞周期の調節を弱くする又は抑制する効果を有する。これは、基本的に、腫瘍抑制遺伝子／タンパク質により３つの方法により行われる：１．細胞周期の継続に不可欠である遺伝子の抑制。これらの遺伝子が発現されない場合、細胞周期は継続することができず、細胞分裂を効果的に阻害する。２．細胞周期のＤＮＡ損傷への結合。細胞中に損傷を受けたＤＮＡが存在する限り、分裂しないはずである。該損傷が修復され得る場合に細胞周期が継続し得る。３．損傷が修復され得ない場合、該細胞はアポトーシスすなわちプログラムされた細胞死を開始して、該生物体のより大きな利益に対してそれが与える脅威を除去するはずである。発見された最初の腫瘍抑制タンパク質はヒト網膜芽種におけるｐＲｂタンパク質であった。重要な腫瘍抑制因子はｐ５３遺伝子（上を参照されたい）である。
【００１０】
ＨＰＶ由来のＥ６およびＥ７、若しくはエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＥＢＮＡ１のような腫瘍ウイルス由来のトランスフォーミングタンパク質もまた、多くの腫瘍型に存在し、かつ、複数の型の癌で腫瘍特異的免疫応答の標的となり得る（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ＭＡＧＥおよびＭＵＣファミリーのような非腫瘍性宿主タンパク質もまた広範に分布している。とりわけ、ＭＡＧＥファミリーの抗原は、乳癌、肺癌、食道癌、肝癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、胃癌、多発性骨髄腫および黒色腫を包含する多くの多様な癌で見出されている（非特許文献９）。ＭＵＣファミリーの抗原は、卵巣および子宮内膜癌、乳癌、多発性骨髄腫、膵癌ならびに結腸および直腸癌と関連づけられている（非特許文献１０）。
【００１１】
さらに、大部分の癌は１種以上の抗原が関連する。１種以上の腫瘍抗原を発現する腫瘍の例は、これに限定されるものでないが、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、ｐ５３、Ｔ／ＴｎおよびＣＥＡに関連することが示されている乳癌、ＭＵＣ−２およびＭＵＣ−４、ＣＥＡ、ｐ５３ならびにＭＡＧＥファミリーに関連することが示されている結腸癌、ＭＡＧＥファミリーのメンバー、ＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００に関連することが示されている黒色腫、ならびにＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖（ｈＣＧβ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡと関連づけられている前立腺癌を含む。事実、腫瘍の抗原欠失バリアントが免疫系の機能下で増殖し得るという事実を代償するために、一連の抗原が、癌に対する免疫療法での使用に提案された（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【００１２】
タンパク質が腫瘍特異的抗原として細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されるために、また、治療で使用されるために、特定の前提条件が満たされなければならない。抗原は主として腫瘍細胞により発現され、そして正常の健康な組織により発現されないか若しくは少量で発現するはずである。それぞれの抗原が１つの型の腫瘍にのみならず、高濃度（例えば、細胞あたりのコピー数）でも存在することがさらに望ましい。腫瘍関連抗原由来であるこうしたペプチド（「免疫原性ペプチド」）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏのＴ細胞応答につながるはずであるため、抗原のアミノ酸配列中のエピトープの存在が必須である。
【００１３】
現在まで、クラスＩＩのプロセシング経路中の抗原を標的とするための多数の戦略が記述された。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、取り込まれかつプロセシングされるために目的の抗原とインキュベートすることが可能である（非特許文献１３）。他の戦略はリソソーム標的配列を含有する融合タンパク質を使用する。ＡＰＣ中で発現され、こうした融合タンパク質は、抗原をクラスＩＩのプロセシング区画に向かうことになる（非特許文献１４；非特許文献１５）。
【００１４】
ヘルパーＴ細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能の統合において重要な役割を演じている。Ｔｈ１型のヘルパーＴ細胞応答を誘発するヘルパーＴ細胞エピトープは、それらの細胞表面上に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を表示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能を包含するＣＤ８＋キラーＴ細胞のエフェクター機能を支援する。こうして、腫瘍関連ヘルパーＴ細胞ペプチドエピトープは、単独で若しくは他の腫瘍関連ペプチドとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬学的有効成分としてはたらき得る。
【００１５】
腫瘍ワクチンの開発における主要な責務は、従って、ＣＤ４＋＋  ＣＴＬにより認識され得る新規腫瘍関連抗原およびそれ由来の免疫原性Ｔヘルパーエピトープの同定および特徴付けである。従って、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの分子に結合する能力を有するこうしたペプチドの新規アミノ酸配列を提供することが、本発明の一目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第４，４４０，８５９号
【特許文献２】米国特許第４，５３０，９０１号
【特許文献３】米国特許第４，５８２，８００号
【特許文献４】米国特許第４，６７７，０６３号
【特許文献５】米国特許第４，６７８，７５１号
【特許文献６】米国特許第４，７０４，３６２号
【特許文献７】米国特許第４，７１０，４６３号
【特許文献８】米国特許第４，７５７，００６号
【特許文献９】米国特許第４，７６６，０７５号
【特許文献１０】米国特許第４，８１０，６４８号
【特許文献１１】ＷＯ  ９５／１８１４５号
【特許文献１２】ＷＯ  ９６／０３１４４号
【特許文献１３】ＷＯ  ９７／２６３２８号
【特許文献１４】ＷＯ  ９３／１７０９５号
【特許文献１５】米国特許第４，８４４，８９３号
【特許文献１６】米国特許第４，６９０，９１５号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９３  ６９０：１０１−１１２
【非特許文献２】Ｌｉｎｅｈａｎ  ＷＭ、Ｗａｌｔｈｅｒ  ＭＭ、Ｚｂａｒ  Ｂ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ．Ｊ  Ｕｒｏｌ．２００３  Ｄｅｃ；１７０（６  Ｐｔ  １）：２１６３−７２
【非特許文献３】ＭｃＣａｒｔｅｙら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８  １５：５８  ２６０１−５
【非特許文献４】Ｄｉｓｉｓら  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．１９９４  １８７：１９８−２１１
【非特許文献５】ＭｃＫａｉｇら  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  １９９８  ２０（３）：２５０−６５
【非特許文献６】Ｐｕｎｗａｎｅｙら  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  １９９９  ２１（１）：２１−９
【非特許文献７】Ｓｅｒｔｈら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９  １５：５９（４）：８２３−５
【非特許文献８】Ｐａｇａｎｏ，Ｊ．Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  １９９９  １１１（６）：５７３−８０
【非特許文献９】Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ａ．Ｍ．とＣｏｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．１９９９  ２５（４）：２１９−２７
【非特許文献１０】Ｓｅｇａｌ−Ｅｉｒａｓ，Ａ．とＣｒｏｃｅ，Ｍ．Ｖ．Ａｌｌｅｒｇｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９９７  ２５（４）：１７６−８１
【非特許文献１１】Ｚｈａｎｇら  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８  ４：２６６９
【非特許文献１２】Ｋａｗａｓｈｉｍａら  Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  ５９：１
【非特許文献１３】Ｃｈａｕｘ，Ｐ．、Ｖａｎｔｏｍｍｅ，Ｖ．、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ，Ｖ．、Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ，Ｋ．、Ｃｏｒｔｈａｌｓ，Ｊ．、Ｌｕｉｔｅｎ，Ｒ．、Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂｏｏｎ，Ｔ．とｖａｎ  ｄｅｒ，Ｂ．Ｐ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９、７６７−７７８
【非特許文献１４】Ｍａｒｋｓ，Ｍ．Ｓ．、Ｒｏｃｈｅ，Ｐ．Ａ．、ｖａｎ  Ｄｏｎｓｅｌａａｒ，Ｅ．、Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．とＢｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３１、３５１−３６９
【非特許文献１５】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｆ．、Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｓ．、Ｒｅｄｗｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．、ｄｅ  Ｐｅｒｅｄａ，Ｊ．Ｍ．とＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５、１０４２１−１０４３０
【非特許文献１６】Ｓｔｒｕｂｉｎ，Ｍ．、Ｍａｃｈ，ＢとＬｏｎｇ，Ｅ．Ｏ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＨＬＡ−ＤＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ＥＭＢＯ  Ｊ．３（４）、８６９−８７２（１９８４）
【非特許文献１７】Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ、Ｂａｃｈｍａｎｎ  Ｊ、Ｅｍｍｅｒｉｃｈ  ＮＰ、Ｂａｃｈｏｒ  ＯＡ、Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ  Ｓ．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄｅｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９  Ｎｏｖ；５０（３−４）：２１３−９．総説
【非特許文献１８】Ｋｏｖａｔｓら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  Ａｐｒ；２７（４）：１０１４−２１
【非特許文献１９】Ｅｎｄｌら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７  Ｍａｙ  １５；９９（１０）：２４０５−１５
【非特許文献２０】ｔｅｎ  Ｂｏｓｃｈら  Ｂｌｏｏｄ．１９９６  Ｎｏｖ；８８（９）：３５２２−７
【非特許文献２１】Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；７１（８）：６０１１−９
【非特許文献２２】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｊａｎ  １；１６２（１）：１５２−６０
【非特許文献２３】Ｆｒｉｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９６  Ｊｕｎ  ７；１３１６（２）：８５−１０１
【非特許文献２４】Ｓｅｅｔｅら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  Ｓｅｐ  １５；１５１（６）：３１６３−７０．
【非特許文献２５】Ｈａｍｍｅｒら  Ｃｅｌｌ．１９９３  Ｊｕｌ  １６；７４（１）：１９７−２０３．
【非特許文献２６】Ｈａｍｍｅｒら  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９５  Ｍａｙ  １；１８１（５）：１８４７−５５
【非特許文献２７】Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、３２３０−３２３７
【非特許文献２８】Ｌｕら（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６、３４３３
【非特許文献２９】Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、４８７−４９１
【非特許文献３０】Ｃｏｈｅｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９、２１１０
【非特許文献３１】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー
【非特許文献３２】Ｓｈｅｒｍａｎら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー
【非特許文献３３】Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５、１０４−１０９
【非特許文献３４】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３
【非特許文献３５】Ｂｅｒｅｎｔら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８
【非特許文献３６】Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら（１９９３）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０、２７６−２９１
【非特許文献３７】Ｚｈｏｕら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６、３２９５−３３０１
【非特許文献３８】Ｒｏｔｈら（１９９６）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４３、６４６−６５１
【非特許文献３９】Ｃｏｎｒｙら（１９９６）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３、１３５−１４７
【非特許文献４０】Ｃｏｎｄｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２、１１２２−１１２７
【非特許文献４１】Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３、５５８−５６１
【非特許文献４２】Ｚｈａｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６、７００−７１０
【非特許文献４３】Ｇｒａｈａｍら（１９９６）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５、６６４−６７０
【非特許文献４４】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃａｌｖｏら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ中、Ｂｕｒｃｈｅｌｌら（１９９６）ｐｐ  ３０９−３１３
【非特許文献４５】ＫａｒｒｅとＬｊｕｎｇｇｒｅｎ（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２、１７４５
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【非特許文献４９】Ｐｌｅｂａｎｓｋｉら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５、１７８３−１７８７
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【非特許文献５３】Ｐｏｒｔａら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２、４４９−９５５
【非特許文献５４】Ｃｈｕｎｇら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、１２６５４−１２６５８
【非特許文献５５】Ｆｉｎｅｒら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３、４３
【非特許文献５６】Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４、２８７８−２８８９
【非特許文献５７】Ｍｏｒｉｔｚら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、４３１８−４３２２
【非特許文献５８】Ｅｓｈｈａｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、７２０−７２４
【非特許文献５９】Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８、３６１−３６６
【非特許文献６０】Ｍｕｒｐｈｙら（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９、３７１−３８０
【非特許文献６１】Ｔｊｕａら（１９９７）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３２、２７２−２７８
【非特許文献６２】Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４、１０２３−１０３８
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【非特許文献６４】Ｓｐｅｃｈｔら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、１２１３−１２２１
【非特許文献６５】Ｓｚａｂｏｌｃｓら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ
【非特許文献６６】Ｔｕｔｉｎｇら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、２７０２−２７０７
【非特許文献６７】Ａｓｈｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、１１７７  １１８２
【非特許文献６８】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）、１２１、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
【非特許文献６９】Ａ．Ｋｉｂｂｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、２０００、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｓｓ
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【非特許文献７３】Ｖａｓｅｆ，Ｍ．Ａ．、Ｂｒｙｎｅｓ，Ｒ．Ｋ．、Ｓｔｕｒｍ、Ｍ．、Ｂｒｏｍｌｅｙ，Ｃ．とＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９９９）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１２、４１２−４１６
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【非特許文献７９】Ｍａｌｃｈｅｒｅｋ，Ｇ．、Ｗｉｒｂｌｉｃｈ，Ｃ．、Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｎ．、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．とＭｅｌｍｓ，Ａ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、１５２４−１５３３
【非特許文献８０】Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｓ．、ｄｅＲｏｏｓ，Ｐ．、Ｈｏｎｅｙ，Ｋ．、Ｂｅｅｒｓ，Ｃ．とＲｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８、２６１８−２６２５
【非特許文献８１】Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．、Ｗｉｌｍ，Ｍ．、Ｖｏｒｍ，Ｏ．とＭａｎｎ，Ｍ．（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８、８５０−８５８
【非特許文献８２】Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｗ．、Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．、Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ，Ｃ．、Ｄｕｍｒｅｓｅ，Ｔ．、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｄ．、Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．とＲａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０、２２１６−２２２５
【非特許文献８３】Ｓｅｅｇｅｒ，Ｆ．Ｈ．、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｗ．、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．とＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９、９９６−９９９
【非特許文献８４】Ｂｅｎｄｅｒ，Ａ．、Ｓａｐｐ，Ｍ．、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．とＢｈａｒｄｗａｊ，Ｎ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９６、１２１−１３５
【非特許文献８５】Ｗａｒｍｅｒｄａｍ，Ｐ．Ａ．、Ｌｏｎｇ，Ｅ．Ｏ．とＲｏｃｈｅ，Ｐ．Ａ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３３、２８１−２９１
【非特許文献８６】Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．とＫｅｏｇｈ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２４、９２５−９３２
【非特許文献８７】Ｔｉｅｔｚｅ，Ｃ．、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｐ．とＳｔａｈｌ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９２、４１７−４２４
【非特許文献８８】Ｓｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｏ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６：７３７−６４．、７３７−７６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明により、この目的は、添付された配列表の配列番号１ないし配列番号３３８のいずれかの少なくとも１の配列を含んでなるペプチドの群から選択される腫瘍関連ペプチドを提供することにより解決されるものであって、該ペプチドはヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの分子に結合する能力を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明はさらに、抗腫瘍免疫応答を導き出すためのワクチン組成物で使用し得る、ヒト腫瘍細胞株、とりわけ腎癌細胞株のＨＬＡクラスＩＩ分子由来の３３８種の新規ペプチド配列に関する。該新規ペプチド配列は、定義された（例えば腫瘍関連）抗原の未知の天然にプロセシングされたＨＬＡクラスＩＩリガンドの同定のための新たなかつ一般に応用可能な組合せアプローチにより同定された。従って、ペプチドに基づく免疫療法の新たなかつ有望な候補が、著しく興味深い腫瘍抗原の選択およびそれに由来するペプチド配列の慎重な決定を包含する様式で同定された。
【００２０】
本発明の第一の局面は、配列番号１ないし配列番号３３８若しくはそれらのバリアントのいずれかのアミノ酸配列を含んでなるペプチドを提供するが、但し、該ペプチドは、該アミノ酸配列が由来する無傷のヒトポリペプチド（すなわち遺伝子座連関ＩＤ（受入番号、下の付属の表を参照されたい）に列挙されるところの完全長配列の１つ）でない。
【００２１】
下に本明細書に下述されるとおり、本発明の基礎を形成するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩをもつ細胞（Ａｗｅｌｌｓ細胞）により提示されるとして全部が同定された。従って、これらの特定のペプチド、ならびに該配列を含有する他のペプチド（すなわち派生ペプチド）は、こうした応答が誘導されるであろう程度が個々のペプチドごとに変動するかもしれないが、おそらく全部が特異的Ｔ細胞応答を導き出すであろう。差異は、例えば前記ペプチド中の突然変異により引き起こされ得る（下を参照されたい）。当業者は、とりわけ本明細書の実施例およびそれぞれの文献を参照して、個々のペプチドにより応答が誘導される程度を決定するために適用し得る方法を知っている。
好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号１ないし配列番号３３８若しくはそれらのバリアントのいずれかのアミノ酸配列より本質的になる。
【００２２】
「より本質的になること」は、本発明のペプチドが、配列番号１ないし配列番号３３８若しくはそれらのバリアントのいずれかの配列に加えて、結合モチーフを含んでなるペプチドのコア配列および免疫原性Ｔヘルパーエピトープとして機能する、ペプチドの形成部分で必須ではないアミノ酸の付加的なＮおよび／若しくはＣ末端に位置するひと配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含有することを意味している。
【００２３】
にもかかわらず、これらのひと配列は、本発明のペプチドの細胞中への効率的な導入を提供するために重要であり得る。本発明の一態様において、本発明のペプチドは、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７（Ｓｔｒｕｂｉｎ，Ｍ．、Ｍａｃｈ，ＢとＬｏｎｇ，Ｅ．Ｏ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＨＬＡ−ＤＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ＥＭＢＯ  Ｊ．３（４）、８６９−８７２（１９８４））に由来するところのＨＬＡ−ＤＲ抗原関連インバリアント鎖（ｐ３３、以下で「Ｉｉ」）の８０のＮ末端アミノ酸を含んでなる。
【００２４】
所定のアミノ酸配列の「バリアント」により、われわれは、ペプチドが、該所定のアミノ酸配列よりなるペプチドと実質的に同じ方法でＨＬＡ分子に結合することがなお可能であるような、アミノ酸残基の例えば１若しくは２個の側鎖が（例えばそれらを別の天然に存在するアミノ酸残基の側鎖若しくは何らかの他の側鎖で置換することにより）変えられることを意味している。例えば、ペプチドは、それが、ＨＬＡ−ＤＲのような適するＭＨＣ分子と相互作用しかつそれを結合する能力を改良しない場合は少なくとも維持するように、また、それが、本発明の局面で定義されるところのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを異常に発現する細胞を認識かつ死滅させ得る活性化型ＣＴＬを生成させる能力を改良しない場合は少なくとも維持するように、改変しうる。以下で記述されるところのデータベースに由来し得るとおり、ＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドのある位置は、典型的に、ＨＬＡの結合溝の結合モチーフに嵌るコア配列を形成するアンカー残基である。これらおよびＨＬＡ−ＤＲの結合に関与する他の残基の改変は、ＣＴＬ認識を変えることなく結合を高めうる。
【００２５】
Ｔ細胞受容体と相互作用するのに不可欠でないアミノ酸残基は、その組み込みがＴ細胞反応性を実質的に遂げずかつ関連するＭＨＣへの結合を除外しない別のアミノ酸での置換により改変し得る。従って、与えられる条件から離れて、本発明のペプチドは、与えられるところのアミノ酸配列またはそれらの一部分若しくはバリアントを包含するいかなるペプチド（その用語によりオリゴペプチド若しくはポリペプチドを包含する）でもありうる。
【００２６】
これらのペプチドが、ある種のＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフ、ならびに場合によってはコア配列の機能を妨害しない（すなわちペプチドおよびＴ細胞の相互作用にとって不適切と思われない）Ｎおよび／若しくはＣ末端の延長を有する「コア配列」から構成されることが、ＭＨＣクラスＩＩで提示されるペプチドについてさらに既知である。該Ｎおよび／若しくはＣ末端の延長は、それぞれ長さが１ないし１０アミノ酸の間であり得る。従って、本発明の好ましいペプチドは、９と３０アミノ酸の間の全体長さを表す。これらのペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩ分子を添加するために直接使用し得るか、若しくは、該配列を下の記述によるベクターに該配列をクローン化し得るかのいずれかである。これらのペプチドは、細胞内でより長いペプチドのプロセシングの最終産物を形成するため、より長いペプチドを同様に使用し得る。本発明のペプチドはいかなる大きさのものであってもよいが、しかし、典型的にはそれらは分子量が１０００００未満、好ましくは５００００未満、より好ましくは１００００未満、および典型的には約５０００でありうる。アミノ酸残基の数に関して、本発明のペプチドは、１０００残基未満、好ましくは５００残基未満、より好ましくは１００残基未満を有しうる。
【００２７】
約１２アミノ酸残基より大きいペプチドを使用してＭＨＣ分子に直接結合する場合は、コアＨＬＡ結合領域に隣接する残基が、ＭＨＣ分子の結合溝に特異的に結合するか若しくはＣＴＬにペプチドを提示する該ペプチドの能力に実質的に影響を及ぼさないものであることが好ましい。しかしながら、これらのより大きいペプチドは抗原提示細胞により断片化されうるため、上で既に示したとおり、とりわけポリヌクレオチドによりコードされる場合は、より大きいペプチドを使用しうることが認識されるであろう。
【００２８】
ＭＨＣリガンド、モチーフ、バリアントのペプチドの例、ならびにＮおよび／若しくはＣ末端の延長のある種の例は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のデータベースＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ、Ｂａｃｈｍａｎｎ  Ｊ、Ｅｍｍｅｒｉｃｈ  ＮＰ、Ｂａｃｈｏｒ  ＯＡ、Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ  Ｓ．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄｅｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９  Ｎｏｖ；５０（３−４）：２１３−９．総説）、および本明細書に引用されるところの参考文献由来であり得る。
【００２９】
制限しない例として、該データベース中のＨＬＡ−ＤＲのある種のペプチドは、Ｉｇ  κ鎖の１８８−２０３由来のＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳ（Ｋｏｖａｔｓら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  Ａｐｒ；２７（４）：１０１４−２１）；Ｉｇ  κ鎖の１４５−１５９由来のＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ（Ｋｏｖａｔｓら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  Ａｐｒ；２７（４）：１０１４−２１）、ＧＡＤ６５の２７０−２８３由来のＬＰＲＬＩＡＦＴＳＥＨＳＨＦ（Ｅｎｄｌら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７  Ｍａｙ  １５；９９（１０）：２４０５−１５）、若しくはＧＡＤ６５の５５６−５７５由来のＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴＨＱＤＩＤＦＬＩ（Ｅｎｄｌら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７  Ｍａｙ  １５；９９（１０）：２４０５−１５）である。加えて、ペプチドは、ｂｃｒ−ａｂｌの２１０ｋＤの融合タンパク質由来のＡＴＧＦＫＱＳＳＫＡＬＱＲＰＶＡＳ（ｔｅｎ  Ｂｏｓｃｈら  Ｂｌｏｏｄ．１９９６  Ｎｏｖ；８８（９）：３５２２−７）、ＨＣＶ−１  Ｎ３３の２８−４１  Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；７１（８）：６０１１−９由来のＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ、若しくはＨＩＶ−１（ＨＸＢ２）ＲＴの３２６−３４５由来のＦＲＫＱＮＰＤＩＶＩＱＹＭＤＤＬＹＶＧ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｊａｎ  １；１６２（１）：１５２−６０）の場合でのような、抗原の変異された配列にもまた由来し得る。全部の「アンカー」アミノ酸（Ｆｒｉｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９６  Ｊｕｎ  ７；１３１６（２）：８５−１０１；Ｓｅｅｔｅら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  Ｓｅｐ  １５；１５１（６）：３１６３−７０．；Ｈａｍｍｅｒら  Ｃｅｌｌ．１９９３  Ｊｕｌ  １６；７４（１）：１９７−２０３．、およびＨａｍｍｅｒら  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９５  Ｍａｙ  １；１８１（５）：１８４７−５５を参照されたい。ＨＬＡ−ＤＲ４の例として）を太字で示し、推定のコア配列に下線を付けている。
【００３０】
全部の上述されたペプチドは、所定のアミノ酸配列の「バリアント」という用語により包含される。
【００３１】
「ペプチド」により、われわれは、アミノ酸がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合により結合されている分子のみならず、しかしまたペプチド結合が反転されている分子も包含する。こうしたｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏペプチド模倣物は、例えばＭｅｚｉｅｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、３２３０−３２３７（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるもののような当該技術分野で既知の方法を使用して作成しうる。このアプローチは、バックボーンを伴いかつ側鎖の指向を伴わない変更を含有する擬似ペプチドを作成することを必要とする。Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）は、少なくともＭＨＣクラスＩＩおよびＴヘルパー細胞応答にこれらの擬似ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｓｏペプチドは、タンパク質分解に対しはるかにより抵抗性である。
【００３２】
典型的には、本発明のペプチドは、抗原提示細胞中で発現される場合に、適切なＭＨＣ分子に結合することが可能でありそして適する細胞により提示されかつ適するＴ細胞応答を導き出しうるフラグメントが生じられるように、プロセシングされうるものである。該ペプチドから生じられるフラグメントもまた本発明のペプチドでありうることが認識されるであろう。便宜的に、本発明のペプチドは、所定のアミノ酸配列またはそれらの一部分若しくはバリアントを包含する一部分、および何らかの所望の特性を賦与するさらなる一部分を含有する。例えば、さらなる部分は、さらなるＴ細胞エピトープ（第一のＴ細胞エピトープ含有部分と同一のポリペプチド由来であろうとそうでなかろうと）を包含しうるか、または、それは担体タンパク質若しくはペプチドを包含しうる。従って、一態様において、本発明のペプチドは、切断型のヒトタンパク質、または、タンパク質フラグメントおよび別のポリペプチド部分の融合タンパク質であるが、但し、ヒト部分は１種もしくはそれ以上の発明のアミノ酸配列を包含する。
【００３３】
とりわけ好ましい一態様において、本発明のペプチドは、本発明のアミノ酸配列、および最低１個のさらなるＴ細胞エピトープを包含し、該さらなるＴ細胞エピトープは、腫瘍関連抗原を異常に発現する腫瘍の型に向けられたＴ細胞応答の産生を助長することが可能である。従って、本発明のペプチドは、ワクチンとしてもまた使用し得るいわゆる「数珠状構造（ｂｅａｄｓ  ｏｎ  ａ  ｓｔｒｉｎｇ）」ポリペプチドを包含する。
【００３４】
いくつかの応用において、本発明のペプチドを直接使用しうる（すなわち、それらは患者の細胞若しくは患者に与えられる細胞中でのポリヌクレオチドの発現により産生されない）ことが以下から認識されるであろう。こうした応用において、ペプチドが１００残基未満を有することが好ましい。
【００３５】
本発明のペプチドがＨＬＡ−ＤＲに結合することが可能である場合が好ましい。ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ４に選択的に結合する場合がとりわけ好ましい。
【００３６】
本発明のペプチドは、本発明の本ペプチドの基礎を形成するポリペプチドを異常に発現する細胞を標的としかつ死滅させるための免疫療法の方法でとりわけ有用である。所定のアミノ酸配列よりなるこれらの特定のペプチドはＨＬＡ−ＤＲに結合するため、本発明のペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲに結合し、かつ、そのように結合された場合に、ＨＬＡ−ＤＲ−ペプチド複合体が、適する抗原提示細胞の表面上に存在する場合に所定のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するＣＴＬの産生を導き出すことが可能であることが好ましい。
【００３７】
本発明の一態様において、本発明のペプチドは、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来するところのＨＬＡ−ＤＲ抗原関連インバリアント鎖（ｐ３３、以下で「Ｉｉ」）の８０のＮ末端アミノ酸を含んでなる。
【００３８】
「異常に発現される」により、われわれは、該ポリペプチドが正常な発現レベルに比較して過剰発現されている、若しくは、腫瘍が由来する組織中で該遺伝子がサイレントであるがしかし腫瘍中でそれが発現されるという意味を包含する。「過剰発現される」により、われわれは、該ポリペプチドが正常組織中に存在するレベルの最低１．２倍；好ましくは正常組織中に存在するレベルの最低２倍、およびより好ましくは最低５若しくは１０倍のレベルで存在することを意味している。
【００３９】
ペプチド（少なくともアミノ酸残基間のペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕら（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６、３４３３およびその中の参考文献により開示されたところの固相ペプチド合成のＦｍｏｃ−ポリアミドモードにより合成しうる。一時的なＮアミノ基保護は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基により提供される。この高度に塩基不安定性の保護基の反復切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンを使用して遂げられる。側鎖の官能性は、それらのブチルエーテル（セリン、トレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リシンおよびのヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）ならびに４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護しうる。グルタミン若しくはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖のアミド官能性の保護に４，４'−ジメトキシベンズヒドリル基が利用される。固相支持体は、３種の単量体、ジメチルアクリルアミド（バックボーン単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能性化剤）から構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマーに基づく。使用されるペプチドから樹脂の切断可能な結合剤は、酸不安定性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。全部のアミノ酸誘導体は、アスパラギンおよびグルタミン（反転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾールに媒介されるカップリング手順を使用して付加される）を除き、それらの予め形成された対称性の無水物誘導体として付加される。全部のカップリングおよび脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸若しくはイソチン試験手順を使用してモニターする。合成の完了に際し、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理による側鎖保護基の同時の除去で、樹脂支持体からペプチドを切断する。一般に使用されるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であり、正確な選択は合成されているペプチドの構成アミノ酸に依存する。
【００４０】
トリフルオロ酢酸は、ジエチルエーテルとのその後の摩砕を用いる真空中での蒸発により除去されて、粗ペプチドを提供する。存在するいかなるスカベンジャーも、水相の凍結乾燥に際してスカベンジャーを含まない粗ペプチドを提供する単純な抽出手順により除去される。ペプチド合成のための試薬は、一般に、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ．、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＮＧ７  ２ＱＪ、ＵＫから入手可能である。
【００４１】
精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および（通常は）逆相高速液体クロマトグラフィーのようないずれか１つの技術若しくはそれらの組合せにより遂げることができる。
【００４２】
ペプチドの分析は、酸加水分解後の薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アミノ酸分析を使用して、ならびに、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析により実施しうる。
【００４３】
本発明のさらなる一局面は、本発明のペプチドをコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ若しくはそれらの組合せであることができ、また、それは、それが該ペプチドをコードする限りはイントロンを含有しても若しくはしなくてもよい。もちろん、それは、ポリヌクレオチドによりコード可能である、天然に存在するペプチド結合により結合された天然に存在するアミノ酸を含有するペプチドのみである。本発明のなおさらなる一局面は、本発明のポリペプチドを発現することが可能な発現ベクターを提供する。
【００４４】
例えば相補的付着端を介してベクターにポリヌクレオチド、とりわけＤＮＡを作動可能に連結するための多様な方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマー領域を、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加し得る。ベクターおよびＤＮＡセグメントをその後、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合により結合して組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００４５】
１個若しくはそれ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ベクターへのＤＮＡセグメントの一代替結合方法を提供する。前に記述されたところのエンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントを、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩで処理し、これらの酵素は突出している３'一本鎖末端をそれらの３'−５'−エキソヌクレアーゼ活性で除去し、そしてそれらのポリメラーゼ活性でくぼんだ３'端を埋める。
【００４６】
これらの活性の組合せは従って平滑端のＤＮＡセグメントを生成する。該平滑端セグメントをその後、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼのような平滑端ＤＮＡ分子の核酸連結を触媒することが可能である酵素の存在下で、モル濃度大過剰のリンカー分子とともにインキュベートする。従って、該反応の生成物はそれらの端にポリマーリンカー配列を運搬するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントをその後、適切な制限酵素で切断し、そして、該ＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を生じる酵素で切断した発現ベクターに連結する。
【００４７】
多様な制限酵素部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、米国コネチカット州ニューヘイブンを包含する多数の供給源から商業的に入手可能である。
【００４８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの望ましい一改変方法は、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、４８７−４９１により開示されたところのポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法は、例えば適する制限部位で設計することにより、適するベクターにＤＮＡを導入するのに使用しうるか、若しくは、それを使用して、当該技術分野で既知であるところの他の有用な方法でＤＮＡを改変しうる。この方法において、酵素で増幅されるべきＤＮＡは、該増幅されたＤＮＡにそれら自身が組み込まれる２種の特異的プライマーにより隣接される。前記特異的プライマーは、当該技術分野で既知の方法を使用して発現ベクターにクローン化するのに使用し得る、制限酵素認識部位を含有しうる。
【００４９】
ＤＮＡ（若しくはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）がその後、適する宿主中で発現されて、本発明の化合物を含んでなるポリペプチドを産生する。従って、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡを、本明細書に含有される教示を鑑みて適切に改変された既知技術に従って使用して発現ベクターを構築することができ、この発現ベクターをその後、本発明のポリペプチドの発現および産生のため適切な宿主細胞を形質転換するのに使用する。こうした技術は、Ｒｕｔｔｅｒらに１９８４年４月３日に発行された米国特許第４，４４０，８５９号、Ｗｅｉｓｓｍａｎに１９８５年７月２３日に発行された同第４，５３０，９０１号、Ｃｒｏｗｌに１９８６年４月１５日に発行された同第４，５８２，８００号、Ｍａｒｋらに１９８７年６月３０日に発行された同第４，６７７，０６３号、Ｇｏｅｄｄｅｌに１９８７年７月７日に発行された同第４，６７８，７５１号、Ｉｔａｋｕｒａらに１９８７年１１月３日に発行された同第４，７０４，３６２号、Ｍｕｒｒａｙに１９８７年１２月１日に発行された同第４，７１０，４６３号、Ｔｏｏｌｅ，Ｊｒ．らに１９８８年７月１２日に発行された同第４，７５７，００６号、Ｇｏｅｄｄｅｌらに１９８８年８月２３日に発行された同第４，７６６，０７５号、およびＳｔａｌｋｅｒに１９８９年３月７日に発行された同第４，８１０，６４８号明細書（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるものを包含する。
【００５０】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ（若しくはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために多様な他のＤＮＡ配列に結合しうる。伴（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）ＤＮＡは、宿主の性質、宿主細胞への該ＤＮＡの導入の様式、およびエピソーム維持が望ましいか若しくは組込みが望ましいかに依存することができる。
【００５１】
一般に、ＤＮＡは、プラスミドのような発現ベクターに、発現のための適正な向きおよび正しい読み枠で挿入する。必要な場合は、ＤＮＡは所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節性の制御ヌクレオチド配列に連結しうるが、こうした制御配列は発現ベクターで一般に利用可能である。ベクターをその後、標準的技術により宿主に導入する。一般に、宿主の全部がベクターにより形質転換されるわけではない。従って、形質転換された宿主細胞を選択することが必要となる。一選択技術は、抗生物質耐性のような、形質転換された細胞中の選択可能な特質をコードするいずれかの必要な調節領域とともに、ＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込むことを伴う。
あるいは、こうした選択可能な特質の遺伝子は、所望の宿主細胞を共形質転換するのに使用する別のベクター上にあってよい。
【００５２】
本発明の組換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞をその後、ポリペプチドの発現を可能にするための本明細書に開示される教示を鑑み、十分な時間、および当業者に既知の適切な条件下で培養し、ポリペプチドをその後回収してよい。
【００５３】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、）酵母（例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を包含する多くの発現系が既知である。好ましくは、該系はＡｗｅｌｌｓ細胞であってよい。
【００５４】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こさせる、ＤＮＡ配列により形成される発現調節領域である。模範的な細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列は、典型的に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクター中に提供されている。典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ、（米国カリフォルニア州リッチモンド）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【００５５】
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化した遺伝子の発現を駆動するのにＳＶ４０後期プロモーターを使用し、最高レベルの発現はＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原産生細胞で見出される。誘導可能な哺乳動物発現ベクターの一例は、またＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＭＳＧである。このベクターは、クローン化した遺伝子の発現を駆動するために、マウス乳癌ウイルス末端反復配列のグルココルチコイドで誘導可能なプロモーターを使用する。有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、そして一般にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐ）であり、そして酵母の選択可能なマーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐ）である。多様な宿主細胞との使用のための他のベクターおよび発現系が当該技術分野で公知である。
【００５６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換された宿主細胞にも関する。該宿主細胞は原核生物若しくは真核生物のいずれかであり得る。細菌細胞はいくつかの環境で好ましい原核生物宿主細胞であることができ、そして、典型的には、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ベセスダから入手可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５、および米国メリーランド州ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能なＲＲ１（Ｎｏ  ＡＴＣＣ  ３１３４３）のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株である。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル若しくはヒト線維芽および腎細胞株からのもののような脊椎動物細胞を包含する。酵母宿主細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、米国から一般に入手可能であるＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１を包含する。好ましい哺乳動物宿主細胞は、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ  １６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＲＬ  １６５０としてＡＴＣＣから入手可能なサル腎由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎臓細胞である２９３細胞を包含する。好ましい昆虫細胞はバキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトし得るＳｆ９細胞である。
【００５７】
本発明のＤＮＡ構築物での適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターの型に典型的に依存する公知の方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９、２１１０およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記述されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５、１０４−１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、こうした細胞のトランスフェクションにおいて有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン若しくはリポソーム製剤が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、若しくはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ２０８７７、米国から入手可能である。電気穿孔法もまた細胞を形質転換および／若しくはトランスフェクトするのに有用であり、また、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換するために当該技術分野で公知である。
【００５８】
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞は、公知の技術により同定し得る。例えば、本発明の発現構築物の導入から生じる細胞を、本発明のポリペプチドを産生させるために増殖させ得る。細胞を収集かつ溶解し得、そしてそれらのＤＮＡ内容物を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３若しくはＢｅｒｅｎｔら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８により記述されたもののような方法を使用して、該ＤＮＡの存在について検査し得る。あるいは、上清中の外タンパク質の存在を、下述されるところの抗体を使用して検出し得る。
【００５９】
組換えＤＮＡの存在について直接アッセイすることに加え、成功裏の形質転換は、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指図することが可能である場合に、公知の免疫学的方法により確認し得る。例えば、発現ベクターで成功裏に形質転換された細胞は、適切な抗原性を表すタンパク質を産生する。形質転換されていることが疑われる細胞のサンプルを収集し、そして、適する抗体を使用してタンパク質についてアッセイする。従って、形質転換された宿主細胞それら自身に加え、本発明はまた、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、若しくはモノクローナル培養物由来の培養物も企図している。
【００６０】
本発明のある種の宿主細胞、例えば細菌、酵母および昆虫細胞が、本発明のペプチドの製造で有用であることが認識されるであろう。しかしながら、他の宿主細胞がある種の治療方法で有用でありうる。例えば、樹状細胞のような抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子に負荷されうるような本発明のペプチドを発現させるために有用に使用しうる。
【００６１】
本発明のさらなる一局面は、静脈内（ｉ．ｖ．）注入、皮下（ｓ．ｃ．）注入、皮内（ｉ，ｄ．）注入、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入、筋肉内（ｉ．ｍ．）注入のためのペプチドの製造方法を提供する。好ましいペプチド注入方法はｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．である。好ましいＤＮＡ注入方法は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．である。１から５００ｍｇのペプチド若しくはＤＮＡの用量を与えうる。
【００６２】
本発明のさらなる一局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法を提供し、該方法は、有効量の本発明のペプチド、または有効量の前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは発現ベクターを患者に投与することを含んでなり、前記ペプチドの該量または前記ポリヌクレオチド若しくは発現ベクターの量は、前記患者で抗標的細胞免疫応答を惹起するのに有効である。標的細胞は、典型的に腫瘍若しくは癌細胞である。
【００６３】
ペプチド若しくはペプチドをコードする核酸は腫瘍若しくは癌ワクチンを構成する。それは患者に、冒された器官に直接投与しうるか、またはその後患者に投与される該患者由来の細胞若しくはヒト細胞株にｅｘ  ｖｉｖｏで適用しうるか、または、その後患者に再投与される該患者由来の免疫細胞からの亜集団を選択するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用しうる。核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に投与する場合、インターロイキン−２のような免疫刺激サイトカインを共発現するようにトランスフェクトすることが細胞に有用でありうる。該ペプチドは、実質的に純粋であっても、若しくはＤｅｔｏｘのような免疫刺激アジュバントと組合せても、若しくは免疫刺激サイトカインとともに使用しても、若しくは適する送達系、例えばリポソームを用いて投与してもよい。該ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）若しくはマンナンのような適する担体にも複合しうる（ＷＯ  ９５／１８１４５号、およびＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら（１９９３）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０、２７６−２９１を参照されたい）。該ペプチドはまた、標識しても、若しくは融合タンパク質であっても、若しくはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明で示されるペプチドが発現されてＣＤ４  ＣＴＬを刺激する。しかしながら、刺激は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞により提供される援助の存在下でより効率的である。従って、ハイブリッド分子の融合パートナー若しくは区分は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。ＣＤ４＋を刺激するエピトープは当該技術分野で公知であり、そして破傷風トキソイド中で同定されたものを包含する。該ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であっても、または適するベクター若しくは送達系に含有されてもよい。
【００６４】
適するベクターおよび送達系は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、若しくは１種以上のウイルスの要素を含有するハイブリッドに基づく系のようなウイルスを包含する。ウイルス以外の送達系は、ＤＮＡ送達の技術分野で公知であるところの陽イオン性脂質および陽イオン性ポリマーを包含する。「遺伝子銃」を介するような物理的送達もまた使用しうる。該ペプチド、若しくは該核酸によりコードされるペプチドは、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激する破傷風トキソイドからのエピトープをもつ融合タンパク質でありうる。
【００６５】
癌ワクチンでの使用のためのペプチドはいかなる適するペプチドでもありうる。とりわけ、それは適する９ｍｅｒペプチド、あるいは適する７ｍｅｒ若しくは８ｍｅｒ若しくは１０ｍｅｒ若しくは１１ｍｅｒペプチドまたは１２ｍｅｒでありうる。より長いペプチドもまた適しうるが、しかし付属の表１に記述されるところの９ｍｅｒ若しくは１０ｍｅｒペプチドが好ましい。
【００６６】
適切には、患者に投与されるいかなる核酸も無菌でありかつ発熱性物質を含まない。裸のＤＮＡは筋肉内若しくは皮内若しくは皮下に与えうる。ペプチドは筋肉内、皮内若しくは皮下に与えうる。
【００６７】
ワクチン接種は専門の抗原提示細胞により刺激されるＣＴＬ応答をもたらし、ＣＴＬが一旦刺激されれば、腫瘍細胞中でのＭＨＣ発現の増強において一利点が存在しうる。
【００６８】
注入の部位、ターゲッティングベクターおよび送達系の使用、または患者からのこうした細胞集団の選択的精製およびペプチド若しくは核酸のｅｘ  ｖｉｖｏ投与のいずれかにより、ワクチンの標的を特定の細胞集団、例えば抗原提示細胞に向けることもまた有用でありうる（例えば、樹状細胞を、Ｚｈｏｕら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６、３２９５−３３０１；Ｒｏｔｈら（１９９６）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４３、６４６−６５１に記述されるとおり選別しうる）。例えば、ターゲッティングベクターは、適する場所での抗原の発現を指図する組織若しくは腫瘍特異的プロモーターを含みうる。
【００６９】
本発明のさらなる一局面は、従って、有効量の本発明のペプチドを含んでなるか若しくはこうしたペプチドをコードする核酸を含んでなる、癌、または癌若しくは腫瘍細胞に対し有効なワクチンを提供する。ワクチンが核酸ワクチンである場合がとりわけ好ましい。ポリペプチドをコードするＤＮＡワクチンのような核酸ワクチンでの接種がＴ細胞応答につながることが既知である。
【００７０】
便宜上、核酸ワクチンは、いかなる適する核酸送達手段も含みうる。核酸、好ましくはＤＮＡは裸でありうる（すなわち投与されるべき他の成分を実質的に含まない）か、または、それはリポソーム中で若しくはウイルスベクター送達系の一部として送達されうる。
【００７１】
樹状細胞による核酸の取り込みおよびコードされるポリペプチドの発現が、免疫応答のプライミングの機構でありうると考えられるが、しかしながら、樹状細胞はトランスフェクトされなくてもよいがしかしなお重要である。それらは、トランスフェクトされた細胞からの発現されたペプチドを組織中に取り込みうるからである。
【００７２】
ＤＮＡワクチンのようなワクチンが筋中に投与される場合が好ましい。ワクチンが皮膚に投与される場合もまた好ましい。核酸ワクチンはアジュバントを伴わずに投与してもよい。核酸ワクチンはまた、ＢＣＧ若しくは明礬のようなアジュバントとともにも投与しうる。他の適するアジュバントは、サポニン由来であるＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロン（ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国マサチューセッツ州ウースター）、ミコバクテリウム抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、ならびにＲｉｂｉのＤｅｔｏｘのような特許のアジュバントを包含する。別のサポニン由来アジュバント、Ｑｕｉｌ  Ａもまた使用しうる（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク）。核酸ワクチンがアジュバントを伴わずに投与される場合が好ましい。フロイントのアジュバントのような他のアジュバントもまた有用でありうる。キーボールリンペットヘモシアニンに、好ましくはまたアジュバントと複合させたペプチドを与えることもまた有用でありうる。
【００７３】
癌のペプチドヌクレオチド媒介性の免疫療法は、Ｃｏｎｒｙら（１９９６）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３、１３５−１４７；Ｃｏｎｄｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２、１１２２−１１２７；Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３、５５８−５６１；Ｚｈａｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６、７００−７１０；Ｇｒａｈａｍら（１９９６）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５、６６４−６７０；およびＢｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃａｌｖｏら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ中、Ｂｕｒｃｈｅｌｌら（１９９６）ｐｐ  ３０９−３１３（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００７４】
本発明のなおさらなる一局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞を死滅させるための医薬品の製造における、本発明のペプチド、またはこうしたペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは発現ベクターの使用を提供する。
【００７５】
本発明のさらなる一局面は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化型細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の製造方法を提供し、該方法は、ＣＴＬを、適する抗原提示細胞の表面上に発現された、抗原負荷ヒトクラスＩＩＭＨＣ分子と、前記ＣＴＬを抗原（該抗原は本発明のペプチドである）特異的様式で活性化するのに十分な時間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含んでなる。
【００７６】
適しては、ＣＴＬは、好ましくはＴＨ１型のＣＤ４＋ヘルパー細胞である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、いかなる適する細胞の表面上に発現されてもよく、また、細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を天然に発現しない（その場合、該細胞はこうした分子を発現するようトランスフェクトされる）か、またはそれが発現する場合はそれが抗原プロセシング若しくは抗原提示経路に欠陥があるものである場合が好ましい。こうして、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞が、ＣＴＬを活性化する前に選ばれたペプチド抗原で実質的に完全に予備刺激されることが可能である。
【００７７】
抗原提示細胞（若しくは刺激体（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）細胞）は、典型的にその表面上に１個のＭＨＣクラスＩＩ分子を有し、そして、好ましくは、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に選択された抗原をそれ自身負荷することが実質的に不可能である。より詳細に下述されるとおり、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、選択された抗原をｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に負荷されうる。
【００７８】
好ましくは、該哺乳動物細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体を欠くか、若しくはその低下されたレベルを有するか、若しくはその低下された機能を有する。ＴＡＰペプチド輸送体を欠く適する細胞は、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓおよびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を包含する。ＴＡＰは、抗原プロセシングに関与する輸送体（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）である。
【００７９】
ヒトペプチド負荷欠損細胞株（ｈｕｍａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）Ｔ２は、カタログ番号ＣＲＬ  １９９２で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２、ＵＳＡから入手可能であり；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ株２は、カタログ番号ＣＲＬ  １９８６３でＡＴＣＣから入手可能であり；マウスＲＭＡ−Ｓ細胞株は、ＫａｒｒｅとＬｊｕｎｇｇｒｅｎ（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２、１７４５（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００８０】
便宜上、前記宿主細胞は、トランスフェクション前にＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激体細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ３のいずれかのようなＴ細胞共刺激に重要な分子を発現する場合もまた好ましい。
【００８１】
多数のＭＨＣクラスＩＩ分子および共刺激体分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。
【００８２】
さらなる一態様において、ＨＬＡ分子の組合せもまた使用しうる。
【００８３】
複数のＣＤ８＋  ＣＴＬエピトープの送達のための組換え多エピトープワクチンの使用は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、８２２−８２６およびＷＯ  ９６／０３１４４号（それらの双方は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。本発明に関して、単一のワクチン中に１種のペプチド（若しくは１種のペプチドをコードする核酸）を包含することが望ましいことができ、該ペプチドは、本発明のアミノ酸配列およびＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激するエピトープ（破傷風トキソイドのような）をいずれかの順序で包含する。こうしたワクチンは、癌を処置するのにとりわけ有用であるとみられる。こうした「数珠状構造」ワクチンは、典型的にはＤＮＡワクチンである。
【００８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＴＬを生成するのに多数の他の方法を使用しうる。例えば、Ｐｅｏｐｌｅｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２、４３２−４３６およびＫａｗａｋａｍｉら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、６３８６４３に記述される方法は、ＣＴＬの生成で自己の腫瘍浸潤リンパ球を使用する。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５、１７８３−１７８７は、ＣＴＬの製造で自己の末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用する。Ｊｏｃｈｍｕｓら（１９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８、１６８９−１６９５は、ペプチド若しくはポリペプチドで樹状細胞をパルスすることを使用することによるか、または組換えウイルスへの感染を介する、自己ＣＴＬの製造を記述する。Ｈｉｌｌら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１、２２２１−２２２８およびＪｅｒｏｍｅら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１、１６５４−１６６２は、自己ＣＴＬの製造でＢ細胞を利用する。加えて、ペプチド若しくはポリペプチドでパルスしたか、または組換えウイルスに感染させたマクロファージを、自己ＣＴＬの製造で使用しうる。
【００８５】
同種異系細胞もまたＣＴＬの製造に使用することができ、そして、この方法はＷＯ  ９７／２６３２８号（引用することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記述されている。例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞およびＴ２細胞に加え、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニアに感染させた標的細胞のような他の細胞を使用して抗原を提示しうる。加えて、植物ウイルスを使用しうる（例えば、外来ペプチドの提示のための多収性の系としてのササゲモザイクウイルスの開発を記述するＰｏｒｔａら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２、４４９−９５５を参照されたい）。
【００８６】
本発明のペプチドに向けられる活性化型ＣＴＬは治療で有用である。従って、本発明のさらなる一局面は、本発明の前述の方法により得ることができる活性化型ＣＴＬを提供する。
【００８７】
本発明のなおさらなる一態様は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する活性化型ＣＴＬを提供する。好ましくは、該ＣＴＬはＨＬＡ／ペプチド複合体と相互作用（例えば結合）することにより前記細胞を認識する。該ＣＴＬは、有効な数の活性化型ＣＴＬを患者に投与する、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法で有用である。患者に投与されるＣＴＬは、患者由来でありかつ上述されたとおり活性化しうる（すなわちそれらは自己ＣＴＬである）。あるいは、該ＣＴＬは患者からでないが、しかし別の個体からである。もちろん、該個体が健康な個体である場合が好ましい。「健康な個体」により、われわれは、個体が全般として良好な健康状態にある、好ましくは適確な免疫系を有する、およびより好ましくは、容易に試験かつ検出され得るいかなる疾患にも罹っていないことを意味している。
【００８８】
活性化型ＣＴＬは、異常なポリペプチドを発現する細胞の認識に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＣＲをコードするｃＤＮＡが活性化型ＣＴＬからクローン化されかつ発現のためさらなるＣＴＬに移入される場合が有用である。
【００８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、本発明のＣＤ４＋  ＣＴＬの標的細胞は、腫瘍の細胞（ときにＭＨＣクラスＩＩを発現する）および／若しくは腫瘍（腫瘍細胞）を取り囲む間質細胞（ときにまたＭＨＣクラスＩＩを発現する）であり得る。
【００９０】
本発明のペプチドに特異的な本発明のＣＴＬクローンのＴＣＲをクローン化する。ＣＴＬクローンでのＴＣＲの使用は、（ｉ）ＴＣＲ可変領域特異的モノクローナル抗体、ならびに（ｉｉ）ＶａおよびＶｐ遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを用いるＲＴ  ＰＣＲを使用して決定する。ＣＴＬクローンから抽出したポリＡ  ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する。ＴＣＲ  ａおよびＰ鎖のＣ末端部分、ならびに同定されたＶａおよびＰセグメントのＮ末端部分に特異的なプライマーを使用する。ＴＣＲ  ａおよび鎖の完全なｃＤＮＡを高忠実度ＤＮＡポリメラーゼで増幅し、そして、増幅された産物を適するクローニングベクターにクローン化する。クローン化されたａおよびＰ鎖遺伝子を、Ｃｈｕｎｇら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、１２６５４−１２６５８により記述されるところの方法により、一本鎖ＴＣＲに集成しうる。この一本鎖構築物中で、ＶａＪセグメントにＶ  ＤＪセグメントが続き、次いでＣｐセグメント、次いでＣＤ３鎖の膜貫通および細胞質セグメントが続く。この一本鎖ＴＣＲをその後レトロウイルス発現ベクターに挿入する（一団のベクターを、成熟ヒトＣＤ８＋  Ｔリンパ球を感染させかつ遺伝子発現を媒介するそれらの能力に基づいて使用しうる。すなわち、レトロウイルスベクター系Ｋａｔが１つの好ましい可能性である（Ｆｉｎｅｒら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３、４３を参照されたい）。高力価の両指向性レトロウイルスを使用して、腫瘍患者の末梢血から単離した、精製したＣＤ８＋若しくはＣＤ４＋  Ｔリンパ球を（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４、２８７８−２８８９（引用することにより本明細書に組み込まれる）により公表されたプロトコルに従って）感染させる。抗ＣＤ３抗体を使用して、精製したＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を誘発し、それは一本鎖ＴＣＲのレトロウイルス組込みおよび安定な発現を助長する。レトロウイルス形質導入の効率は、一本鎖ＴＣＲに特異的な抗体での感染させたＣＤ８＋  Ｔ細胞の染色により決定する。形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、該ＴＣＲ鎖が最初にクローン化された同種拘束性（ａｌｌｏ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＣＴＬクローンで見られると同一の腫瘍特異的死滅をそれらが表すことを確立する。期待された特異性をもつ形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団を、腫瘍患者の養子免疫療法に使用しうる。患者は、１０８ないし１０１１の間の自己の形質導入されたＣＴＬで処置しうる。ＣＤ８＋と同様に、関連する構築物を運搬する形質導入されたＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を生成させ得る。
【００９１】
遺伝子をＣＴＬに導入するための他の適する系は、Ｍｏｒｉｔｚら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、４３１８−４３２２（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。Ｅｓｈｈａｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、７２０−７２４、およびＨｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８、３６１−３６６もまた、ＣＴＬのトランスフェクションを記述している。従って、本発明のさらなる局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するＴＣＲを提供し、該ＴＣＲは活性化型ＣＴＬから得ることができる。
【００９２】
ＴＣＲだけでなく、ＴＣＲに機能上同等な分子が本発明に包含される。これらは、ＴＣＲと同一の機能を演じ得る、ＴＣＲに機能上同等であるいかなる分子も包含する。とりわけ、こうした分子は、Ｃｈｕｎｇら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、１２６５４−１２６５８（引用することにより本明細書に組み込まれかつ上に言及された）により記述されかつ上に引用される方法により作成されるところの、遺伝子的に操作された３ドメインの一本鎖ＴＣＲを包含する。本発明はまた、ＴＣＲ若しくは機能上同等な分子をコードするポリヌクレオチド、および該ＴＣＲ若しくはその機能上同等な分子をコードする発現ベクターも包含する。本発明のＴＣＲを発現するのに適する発現ベクターは、本発明のペプチドの発現に関して上述されたものを包含する。
【００９３】
しかしながら、発現ベクターがトランスフェクション後にＣＴＬ中でＴＣＲを発現することが可能であるものであることが好ましい。
【００９４】
本発明のなおさらなる一局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法を提供し、該方法は、（１）患者からＣＴＬを得る段階；（２）ＴＣＲ若しくは上で定義されたところの機能上同等な分子をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する段階；および（３）段階（２）で製造した細胞を患者に導入する段階を含んでなる。
【００９５】
本発明のなおさらなる一局面は、本発明の第一若しくは第二若しくは第三の局面で定義されるところのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法を提供し、該方法は、（１）前記患者から樹状細胞のような抗原提示細胞を得る段階；（２）前記抗原提示細胞を、本発明の第一若しくは第二若しくは第三の局面で定義されるところのペプチド、またはこうしたペプチドをコードするポリヌクレオチドとｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる段階；および（３）そのように処理した抗原提示細胞を患者に再導入する段階を含んでなる。
【００９６】
好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。適切には、樹状細胞は、抗原ペプチドでパルスされている自己の樹状細胞である。抗原ペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じさせるいかなる適する抗原ペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原からのペプチドでパルスした自己の樹状細胞を使用するＴ細胞療法は、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９、３７１−３８０およびＴｊｕａら（１９９７）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３２、２７２−２７８に開示されている。
【００９７】
さらなる一態様において、樹状細胞のような抗原提示細胞を、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。該ポリヌクレオチドはいかなる適するポリヌクレオチドであってもよく、そして、それが樹状細胞を形質導入し、従ってペプチドの提示および免疫の誘導をもたらすことが可能であることが好ましい。
【００９８】
便宜上、ポリヌクレオチドはウイルスポリヌクレオチド若しくはウイルスに含まれうる。例えば、アデノウイルスで形質導入した樹状細胞は、ＭＵＣ１に関して抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導することが示された（Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４、１０２３−１０３８を参照されたい）。同様に、アデノウイルスに基づく系を使用することができ（例えば、Ｗａｎら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８、１３５５−１３６３を参照されたい）；レトロウイスル系を使用することができ（Ｓｐｅｃｈｔら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、１２１３−１２２１、およびＳｚａｂｏｌｃｓら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ）、樹状細胞への粒子媒介性移入もまた使用することができ（Ｔｕｔｉｎｇら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、２７０２−２７０７）；そしてＲＮＡもまた使用しうる（Ａｓｈｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、１１７７  １１８２）。
【００９９】
患者における標的細胞の死滅方法に関して、標的細胞が癌細胞、より好ましくは腎癌細胞であることがとりわけ好ましいことが認識されるであろう。
【０１００】
本発明の方法により処置される患者がＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを有する場合がとりわけ好ましい。従って、好ましい一態様において、患者のＨＬＡハプロタイプを処置の前に決定する。ＨＬＡハプロタイピングは、いずれの適する方法を使用して実施してもよく、こうした方法は当該技術分野で公知である。
【０１０１】
本発明は、とりわけ、活性のｉｎ  ｖｉｖｏワクチン接種のため；ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの自己の樹状細胞の操作、次いでＣＴＬ応答を活性化するためのそのように操作した樹状細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの導入のため；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自己ＣＴＬを活性化し、次いで養子療法のため（すなわちそのように操作したＣＴＬを患者に導入する）；および健康なドナー（ＭＨＣマッチ若しくはミスマッチの）からのＣＴＬをｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、次いで養子療法のための、本発明のペプチド（若しくはそれらをコードするポリヌクレオチド）の使用を包含する。
【０１０２】
好ましい一態様において、本発明のワクチンは、腫瘍の形成を阻害若しくは抑制するために、単独で、若しくは別の癌治療との組合せのいずれかで宿主に投与する。
【０１０３】
ペプチドワクチンはアジュバントを伴わずに投与しうる。ペプチドワクチンはまた、ＢＣＧ若しくは明礬のようなアジュバントとともに投与してもよい。他の適するアジュバントは、サポニン由来であるＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロン（ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国マサチューセッツ州ウースター）、ミコバクテリウム抽出物、および合成の細菌細胞壁模倣物、ならびにＲｉｂｉのＤｅｔｏｘのような特許のアジュバントを包含する。別のサポニン由来アジュバント、Ｑｕｉｌ  Ａもまた使用しうる（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク）。フロイントのアジュバント若しくはＧＭＣＳＦのような他のアジュバントもまた有用でありうる。好ましくはまたアジュバントとともにのキーホールリンペットヘモシアニンに複合させたペプチドを与えることもまた有用でありうる。
【０１０４】
本発明のペプチドはまた診断試薬としても使用し得る。該ペプチドを使用して、ＣＴＬ集団中に、ペプチドに特異的に向けられているＣＴＬが存在するかどうか、若しくはＣＴＬが治療により誘導されるかどうかを分析し得る。さらに、前駆Ｔ細胞の増大を、規定されたペプチドに対する反応性を有するペプチドを用いて試験し得る。さらに、該ペプチドを、該ペプチドが由来する前記抗原を発現する腫瘍の疾患の進行をモニターするためのマーカーとして使用し得る。
【０１０５】
付属の表１に、同定されたところのペプチドを列挙する。加えて、該表に、ペプチドが由来するタンパク質、およびそれぞれのタンパク質中のペプチドのそれぞれの位置を指定する。さらに、国立衛生研究所の「国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」のＧｅｎｂａｎｋに関するそれぞれの受入番号を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１０６】
別の好ましい態様において、該ペプチドを白血球、とりわけＴリンパ球の染色に使用する。この使用は、ＣＴＬ集団中に、ペプチドに向けられている特異的ＣＴＬが存在するかどうかが証明されるはずである場合にとりわけ有利である。さらに、該ペプチドを、腫瘍性疾患若しくは障害における治療の進行を決定するためのマーカーとして使用し得る。
【０１０７】
別の好ましい態様において、該ペプチドを抗体の製造に使用する。ポリクローナル抗体は、該ペプチドの注入を介する動物の免疫化、および免疫グロブリンのその後の精製により、標準的様式で得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）、１２１、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに記述されるような標準的プロトコルに従って製造し得る。
【０１０８】
本発明は、さらなる一局面において、本発明の前記ペプチドの１種若しくはそれ以上を含有する医薬組成物に関する。本組成物は、皮下、皮内、筋肉内のような非経口投与若しくは経口投与に使用する。このため、ペプチドを、薬学的に許容される、好ましくは水性の担体に溶解若しくは懸濁する。加えて、組成物は、緩衝剤、結合剤、膨潤剤、希釈剤、着香料、滑沢剤などのような賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインのような免疫刺激物質と一緒になっても投与し得る。こうした組成物中で使用し得る賦形剤の広範囲の一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、２０００、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｓｓから採用し得る。組成物は、腫瘍性疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）および／若しくは治療に使用し得る。
【０１０９】
配列番号１ないし配列番号３８８のいずれかを含んでなる本発明のペプチドの最低１種を含有する医薬組成物を、それぞれのペプチド若しくは抗原と関連づけられる腫瘍性疾患に罹っている患者に投与する。これにより、ＣＴＬ特異的免疫応答を誘発し得る。
【０１１０】
本発明の別の局面において、２種若しくはそれ以上の本発明のペプチドの組合せを、直接の組合せで若しくは同一処置レジメン内でのいずれかでワクチンとして使用し得る。さらに、他のペプチド、例えばＭＨＣクラスＩ特異的ペプチドとの組合せを使用し得る。当業者は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の生成、ならびに、それらの効率および全体的な存在、ある種のペプチドに対するある種のＴ細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、親和性および増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、ならびに例えばＩＦＮ−γ産生を分析することによるＴ細胞の機能性を試験することにより、免疫原性ペプチドの好ましい組合せを選択することが可能であろう（下の実施例もまた参照されたい）。通常、最も効率的なペプチドをその後、上述されたところの目的上、ワクチンとして組み合わせる。
【０１１１】
適するワクチンは、２、３、４、５、６、７、８若しくは１０種の異なるペプチド、好ましくは４、５、６若しくは７種の異なるペプチド、および最も好ましくは６種の異なるペプチドを含有することができる。
【０１１２】
最後に、ワクチンは、処置されるべき患者が罹っている癌の特定の型、ならびに、疾患の状態、以前の処置レジメン、患者の免疫状態、およびもちろん該患者のＨＬＡハプロタイプに依存し得る。
【０１１３】
Ｉｉの８０のＮ末端アミノ酸が、タンパク質をクラスＩＩプロセシング経路に向けるのに十分であることが示された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．、Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ，Ｋ．とＳｈａｓｔｒｉ，Ｎ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９２、７２１７−７２２１、Ｗａｎｇ、Ｒ．Ｆ．、Ｗａｎｇ，Ｘ．、Ａｔｗｏｏｄ，Ａ．Ｃ．、Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．とＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、１３５１−１３５４）。本発明の概念の例示的一証明を提供するため、発明者は、Ｉｉの８０のＮ末端アミノ酸および多様な悪性度と関連する例示的１抗原、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）よりなる融合タンパク質を生成した。
【０１１４】
サイクリンＤ１は、サイクリン依存性キナーゼとの相互作用によりＧ１−Ｓ移行に関与する細胞周期調節物質である。さらに、サイクリンＤ１は癌原遺伝子であり、かつ、数種の腫瘍型で過剰発現されることが示された（Ｈｅｄｂｅｒｇ，Ｙ．、Ｄａｖｏｏｄｉ，Ｅ．、Ｒｏｏｓ，Ｇ．、Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ，Ｂ．とＬａｎｄｂｅｒｇ，Ｇ．（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８４、２６８−２７２、Ｖａｓｅｆ，Ｍ．Ａ．、Ｂｒｙｎｅｓ，Ｒ．Ｋ．、Ｓｔｕｒｍ、Ｍ．、Ｂｒｏｍｌｅｙ，Ｃ．とＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９９９）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１２、４１２−４１６、−Ｔｒｏｕｓｓａｒｄ，Ｘ．、Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏ，Ｍ．、Ｍｅｌｌｅｒｉｎ，Ｍ．Ｐ．、Ｍａｌｅｔ，Ｍ．、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．とＳｏｌａ，Ｂ．（２０００）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｊ．１、１８１−１８５）一方、それは、肝および高位腹部大動脈平滑筋を除くいかなる特定の分布も伴わず、大きな一団の健康な器官および組織中で低レベルで発現される（Ｗｅｉｎｓｃｈｅｎｋ，Ｔ．、Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ，Ｃ．、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｏｂｅｒｍａｙｒ，Ｆ．、Ｗａｌｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｃｈｏｏｒ，Ｏ．、Ｋｕｒｅｋ，Ｒ．、Ｌｏｅｓｅｒ，Ｗ．、Ｂｉｃｈｌｅｒ，Ｋ．Ｈ．、Ｗｅｒｎｅｔ，Ｄ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２、５８１８−５８２７）。示差的質量分析のアプローチにおいて、発明者は、トランスフェクトしたおよびトランスフェクトしていない細胞からの精製したＨＬＡペプチドの質量スペクトルを比較し、そして、これらのＨＬＡクラスＩＩリガンドの免疫原性の特徴を証明するために、目的の生じるペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞プライミング実験で使用した。
【０１１５】
腫瘍関連抗原のＴヘルパー細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫療法における重要な責務のままである。ここに、われわれは、腫瘍関連抗原の天然にプロセシングかつ提示されるＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定するための、ＭＳによる示差的ペプチド分析から派生した、新しくかつ一般に応用可能な方法およびペプチドを報告する。このアプローチは、Ｉｉ鎖と目的のＡｇの間の融合タンパク質をコードするベクターでのＡＰＣのトランスフェクション段階、ＨＬＡに結合したペプチドの溶出、および、トランスフェクトされない細胞との比較による、トランスフェクタントにより提示されるＡｇ由来ペプチドのＭＳ同定を初めて組合せる。さらに、われわれは、同定されたペプチドに対し誘導されたＴ細胞が、同族のＡｇを過剰発現するトランスフェクタントを特異的に認識することを示すことにより、該方法を検証し得た。同定されたペプチドはなお、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれらの免疫原性について試験されなければならないが、われわれのアプローチは、天然にプロセシングされるＭＨＣクラスＩＩリガンドの正確な特徴付けに至る。従って、発明者は、腫瘍関連抗原の合成の重なるペプチド、若しくはクラスＩエプトープ予測に比較して精度の低いエピトープ予測により選択された広範なペプチドのいずれかを試験することを回避する。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化を誘導することが不可能な潜在性Ｔ細胞エピトープの同定につながりうる困難なＴ細胞アッセイ（Ａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｖｉｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．、Ｍａｔｈａｒｕ，Ｐ．、Ｌｏｗｒｅｙ，Ｐ．Ａ．とＷｒａｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、１７５−１８１）と対照的に、該研究は、提示されることが見出されている数種のペプチドに集中し得る。さらに、この方法を使用すれば、該ペプチドが天然にプロセシングされることを証明するために組換えＡｇを産生するか若しくはＡｇを発現する腫瘍細胞株を有することが必要でない。
【０１１６】
発明者は、ＥＢＶで形質転換したＢ細胞のクラスＩＩプロセシング区画中に腫瘍関連抗原を向けるためにＩｉのＮ末端を使用した。これを達成するため、われわれは、いかなる抗原もＩｉとの融合タンパク質として発現し得かつウエスタンブロット分析によりトランスフェクトされた細胞中のタンパク質の発現レベルを測定するためにわれわれを補助する、融通のきくベクターを構築した。ＩｉのＮ末端が、タンパク質の標的をクラスＩＩプロセシング区画中に定めるのに十分であることが既に示されている。しかし、今日まで、これは、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡライブラリーを使用して未知のＡｇを同定するため（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．、Ｗａｎｇ，Ｘ．、Ａｔｗｏｏｄ，Ａ．Ｃ．、Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．とＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、１３５１−１３５４）、若しくは既知のＴ細胞クローンの特異性を確認するため（Ｃｈａｕｘ，Ｐ．、Ｖａｎｔｏｍｍｅ，Ｖ．、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ，Ｖ．、Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ，Ｋ．、Ｃｏｒｔｈａｌｓ，Ｊ．、Ｌｕｉｔｅｎ，Ｒ．、Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂｏｏｎ，Ｔ．とｖａｎ  ｄｅｒ，Ｂ．Ｐ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９、７６７−７７８）に、卵アルブミンを使用したモデルでのみ記述された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．、Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ，Ｋ．とＳｈａｓｔｒｉ，Ｎ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９２、７２１７−７２２１）。われわれの知る限り、この方法は、既知の腫瘍関連抗原の天然に提示されたＭＨＣクラスＩＩに結合したペプチドを同定するために以前に使用されていなかった。ＭＡＬＤＩ−ＭＡＳによるトランスフェクトされたおよびトランスフェクトされていない細胞のクラスＩＩリガンドの示差的分析、ならびにＥＳＩ−ＭＳによる差次的に発現されたペプチドのさらなる特徴付けは、目的の抗原のクラスＩＩリガンドの簡単な同定方法をもたらす。ケラチン１８融合タンパク質での細胞のトランスフェクションは、われわれの方法が目的の抗原に一般に応用可能であることを証明し、再度、われわれはまた、モデル導入遺伝子ケラチン１８からのＨＬＡ−ＤＲに提示されるペプチドを記述することも可能であった。
【０１１７】
発明者は、配列ＮＰＰＳＭＶＡＡＧＳＶＶＡＡＶ（配列番号１）を有する免疫原性のＨＬＡ−ＤＲ４に提示されるサイクリンＤ１ペプチド抗原、ならびにトランスフェクトしたヒト腫瘍細胞株から溶出された３３７種の他のＨＬＡクラスＩＩ関連ペプチドを同定した。サイクリンＤ１ペプチド、およびヒト腫瘍細胞株から同定した他のペプチドは、ヒト癌の処置のための治療的ワクチンの臨床開発のための可能な候補である（Ｗｅｉｎｓｃｈｅｎｋ，Ｔ．、Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ，Ｃ．、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｏｂｅｒｍａｙｒ，Ｆ．、Ｗａｌｔｅｒ，Ｓ．、Ｓｃｈｏｏｒ，Ｏ．、Ｋｕｒｅｋ，Ｒ．、Ｌｏｅｓｅｒ，Ｗ．、Ｂｉｃｈｌｅｒ，Ｋ．Ｈ．、Ｗｅｒｎｅｔ，Ｄ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２、５８１８−５８２７）。
【０１１８】
本明細書に開示かつ記述されるところの本発明の特徴が、示されるところのそれぞれの組合せでのみならず、しかしまた、本発明の意図される範囲から離れることなく単独の様式でも使用し得ることが、理解されるべきである。
本発明は今や、以下の図面、配列表および実施例を参照してより詳細に記述されることができる。以下の実施例は、具体的説明の目的上のみ提供され、そして本発明を制限することを意図していない。
配列番号１ないし配列番号３３８は、本発明の、ＭＨＣクラスＩＩにより提示されるペプチドを含有するＴ細胞エピトープのペプチド配列を示す。
配列番号３３９ないし配列番号３５０は、実施例で使用されるところのプライマーの配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】実験の経過中に作製した融合タンパク質の第一のウエスタンブロット分析を示す。
【図２】実験の経過中に作製した融合タンパク質の第二のウエスタンブロット分析を示す。
【図３】トランスフェクトされない細胞株およびＡｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−サイクリンＤ１クローンのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】際立つ個々のシグナルを有する好ましい画分の質量分析を示す。
【図５】際立つ個々のシグナルを有する好ましい画分の質量分析を示す。
【図６】ペプチドＮＰＰＳＭＶＡＡＧＳＶＶＡＡＶ（配列番号１）（サイクリンＤ１１９８−２１２）の同定を示す。
【図７】サイクリンＤ１ペプチドによるＴ細胞の特異的刺激（上図）、および該ペプチドに応答してのＴ細胞のサイトカイン産生（下図）を示す。
【図８】ＨＬＡ−ＤＲ４／サイクリンＤ１１９８−２１２に特異的なＴ細胞受容体でのＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞の結果として起こりうる非特異的活性化の陰性対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
本開示および本実施例に際して当業者に明らかであろうように、本発明はまた、免疫原性のＨＬＡ−ＤＲ４に提示された、配列ＮＰＰＳＭＶＡＡＧＳＶＶＡＡＶ（配列番号１）を有するサイクリンＤ１ペプチド抗原およびケラチン１８に関する以下の実施例で特異的に使用されるところの腫瘍関連抗原の他のエピトープにも関する。該実施例は、本発明を完全に可能にするために本発明の腫瘍関連抗原の全エピトープ（すなわち配列番号１ないし配列番号３３８の配列のいずれかを含んでなる）に当業者により容易に適用され得る、一般的例および概要として見られるべきである。
【０１２１】
本出願を通じて使用される略語：
Ａｂ：抗体
Ａｇ：抗原
ＡＰＣ：抗原提示細胞
ＣＤ：表面抗原分類
ｃｐｍ：１分あたりカウント
ＤＣ：樹状細胞
ＥＢＶ：エプスタイン−バーウイルス
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＦＮ：インターフェロン
Ｉｉ：インバリアント鎖（ＣＤ７４）
ＩＬ：インターロイキン
ＭＡＬＤＩ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化
ＭＨＣ：主要組織適合遺伝子複合体
ＭＳ：質量分析法
ＯＤ４５０：４５０ｎｍの波長での光学密度
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｓ．Ｉ．：刺激指数
ＴＯＦ：飛行時間
【実施例】
【０１２２】
細胞および抗体
ヒトＢリンパ芽球様細胞株Ａｗｅｌｌｓ（ＩＨＷ−Ｎｏ．９０９０；ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４*０１０１）を、１０％ＦＣＳ（Ｐａｎ、独国アイデンバッハ）を含有しかつ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ベルギー・ヴェルヴィエ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ．Ｃ．Ｐｒｏ、独国ノイシュタット）培地中で維持した。トランスフェクトした細胞クローンに関しては０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリア・リンツ）を添加した。安定形質転換体をＡｗｅｌｌｓ細胞の電気穿孔（２８０Ｖ、９７５μＦ；Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ、Ｂｉｏｒａｄ、独国ミュンヘン）により作製し、次いで制限希釈法を使用してクローン化した。抗体Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）（Ｌａｍｐｓｏｎ，Ｌ．ＡとＬｅｖｙ，Ｒ．（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５、２９３−２９９）およびＷ６／３２（抗ＨＬＡクラスＩ）（Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｆ．Ｍ．とＰａｒｈａｍ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８、１２９−１３５）を、プロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）を使用してハイブリドーマ培養上清から精製した。Ｔｈ細胞株は、１０％ヒトＡＢ血清（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＬＬＣ、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）を含有しかつ１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンならびに５０μＭ  β−メルカプトエタノールを補充したＩＭＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で誘導かつ培養した。フローサイトメトリー分析で使用した抗体はＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）からであった。
【０１２３】
プラスミドＤＮＡ構築物
Ｉｉの８０のＮ末端アミノ酸を含有するｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７）を、Ａ．Ｍｅｌｍｓ（Ｍａｌｃｈｅｒｅｋ，Ｇ．、Ｗｉｒｂｌｉｃｈ，Ｃ．、Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｎ．、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．とＭｅｌｍｓ，Ａ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、１５２４−１５３３）から得たベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）４１−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、独国ハイデルベルク）からＰＣＲ反応で増幅し、そして、５'プライマーＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号３３９）および３'プライマーＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号３４０）を使用して、ｐｃＤＮＡ３のＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位にサブクローニングした（ｐｃＤＮＡ３−Ｉｉ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、独国カールスルーエ）。目的の遺伝子は、それぞれ、ケラチン１８（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１２８８１）について５'プライマーＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＧＣＴＣＣ（配列番号３４１）および３'プライマーＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴ（配列番号３４２）、ならびにサイクリンＤ１（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋＸ５９７９８）について５'プライマーＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣ（配列番号３４３）および３'プライマーＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＴＣＣＡＣＧＴＣＣＣＧＣＡＣ（配列番号３４４）を使用して、悪性腎組織からのｃＤＮＡからＰＣＲ反応で増幅した。得られたｃＤＮＡを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、独国カールスルーエ）を使用してサブクローニングし、そして最後に、Ｉｉ配列とインフレームでｐｃＤＮＡ３−ＩｉのＥｃｏＲ  １およびＮｏｔ  Ｉ部位に挿入した。
【０１２４】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
細胞からのＲＮＡを、製造元の推奨に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、独国カールスルーエ）を使用して単離した。ｃＤＮＡを１μｇの全ＲＮＡから合成した。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、独国ダルムシュタット）を使用して実施した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＣＲ増幅およびＰＣＲ産物のリアルタイム検出に使用した。プライマー配列は後に続くとおりである：１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５'プライマーＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号３４５）および３'プライマーＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ（配列番号３４６）；ケラチン１８、５'プライマーＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＣ（配列番号３４７）および３'プライマーＴＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＣ（配列番号３４８）；サイクリンＤ１、５'プライマーＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＣＣ（配列番号３４９）および３'プライマーＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣ（配列番号３５０）。ＰＣＲ反応は３００ｎＭの各プライマーを含む２０μｌ中で実施した（１８Ｓリバースプライマー：５０ｎＭのみ）。全部のサンプルを二検体ずつ増幅した。多様な遺伝子についてのトランスフェクトした細胞と野性型細胞の間の発現の差違を、比較閾値周期（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（ＣＴ）法（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３０３８５９．ｐｄｆで読み出し可能）を使用する相対定量により、ＰＣＲ増幅曲線から計算した。１８ＳリボソームＲＮＡを標準化のための参照遺伝子として選んだ。
【０１２５】
融合タンパク質の検出
融合タンパク質は、Ｉｉのアミノ酸残基１２−２８に結合するｍＡｂ  ＰＩＮ．１（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｂｉｏｍｏｌ、独国ハンブルク）を使用するウエスタンブロット分析により検出した。簡潔には、細胞を記述された（Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｓ．、ｄｅＲｏｏｓ，Ｐ．、Ｈｏｎｅｙ，Ｋ．、Ｂｅｅｒｓ，Ｃ．とＲｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８、２６１８−２６２５）とおり溶解し、ライセートをＬａｅｍｍｌｉ添加液中で沸騰させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてニトロセルロースメンブレンに転写した。ＢＳＡでの飽和段階後に、メンブレンをｍＡｂ  ＰＩＮ．１（１μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、独国フライブルク）を使用して可視化した。いくつかの場合には、トランスフェクトした細胞を、融合タンパク質のエンドソーム／リソソームターゲッティングを検討するために、１０〜１００μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ、独国シュタインハイム）の存在下で培養した。細胞をその後溶解し、そしてタンパク質を上述されたとおりウエスタンブロットにより検出した。
【０１２６】
Ｉｉ−ケラチン１８もまた、免疫沈降、およびトリプシンでのその後のｉｎ  ｓｉｔｕ消化、次いで質量分析により検出した。簡潔には、細胞を記述された（Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｓ．、ｄｅＲｏｏｓ，Ｐ．、Ｈｏｎｅｙ，Ｋ．、Ｂｅｅｒｓ，Ｃ．とＲｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８、２６１８−２６２５）とおり溶解し、そして、ｍＡｂ  ＰＩＮ．１およびプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）とともにインキュベートした。セファロースペレットを洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ添加液中で沸騰させ、そして１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。タンパク質のスポットをゲルから切り出し、そして、本質的には記述された（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．、Ｗｉｌｍ，Ｍ．、Ｖｏｒｍ，Ｏ．とＭａｎｎ，Ｍ．（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８、８５０−８５８）とおり、トリプシンでｉｎ  ｓｉｔｕで消化した。その後分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ、独国ブレーメン）で実施した。タンパク質の同一性を、ハイブリッド四重極直交加速型飛行時間タンデム質量分析計（ＱＳｔａｒ  Ｐｕｌｓａｒ  ｉ  Ｑｑｏａ  Ｔｏｆ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、独国ヴァイターシュタット）に記録したタンデムＭＳスペクトルにより確認した。
【０１２７】
ＭＨＣクラスＩＩに結合したペプチドの溶出
凍結細胞ペレット（３．５ないし５×１０１０細胞）を、以前に記述された（Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｗ．、Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．、Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ，Ｃ．、Ｄｕｍｒｅｓｅ，Ｔ．、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｄ．、Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．とＲａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０、２２１６−２２２５）とおり処理し、そして、ペプチドを、標準的プロトコル（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｆ．Ｈ．、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｗ．、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．とＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９、９９６−９９９）に従い、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂ  Ｌ２４３（Ｌａｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ａ．とＬｅｖｙ，Ｒ．（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５、２９３−２９９）を使用して単離した。
【０１２８】
ＤＲ溶出したペプチドの分子分析
ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＳＭＡＲＴ装置、μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ  ２．１／１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国フライブルク）により分離し、そして、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）により画分を分析した。差次的に提示されたペプチドを、記述された（Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｗ．、Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．、Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ，Ｃ．、Ｄｕｍｒｅｓｅ，Ｔ．、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｄ．、Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．とＲａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０、２２１６−２２２５）ところのハイブリッド四重極直交加速型飛行時間タンデム質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ；Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国マンチェスター）でのナノＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）タンデムＭＳによりさらに分析した。
【０１２９】
ペプチドの合成および分析
ペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーに従って、自動ペプチド合成機ＥＰＳ２２１（Ａｂｉｍｅｄ、独国ランゲンフェルト）で合成した。ＴＦＡ／フェノール／エタンジチオール／チオアニソール／水（容量で９０／３．７５／１．２５／２．５／２．５）での１時間若しくは３時間（アルギニン含有ペプチド）の処理による樹脂の除去後に、ペプチドをメチル−ターシャリブチルエーテル（ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｒｔ．  ｂｕｔｙｌ  ｅｔｈｅｒ）から沈殿し、メチル−ターシャリブチルエーテルで１回およびジエチルエーテルで２回洗浄し、そして凍結乾燥前に水に再懸濁した。合成産物をＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  ｓｔａｒ、Ｚｉｎｓｓｅｒ  ａｎａｌｙｔｉｃｓ、独国ミュンヘン）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ｆｕｔｕｒｅ、ＧＳＧ、独国ブルフザール）により分析した。８０％未満の純度のペプチドを分取用ＨＰＬＣ（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ）により精製した。
【０１３０】
単球由来樹状細胞
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、古典的手順に従い、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３*０２０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ４*０１陽性ドナーから調製した。樹状細胞（ＤＣ）は、使用した培地が血清を含まないＸ−ＶＩＶＯ  １５（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）であったことを除き、以前に記述された（Ｂｅｎｄｅｒ，Ａ．、Ｓａｐｐ，Ｍ．、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．とＢｈａｒｄｗａｊ，Ｎ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９６、１２１−１３５）とおり、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６日間培養したプラスチック付着性ＰＢＭＣから得た。第６日に、未熟ＤＣを、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ならびにＨＬＡ−ＤＲの細胞表面発現について、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを伴うＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）でのフローサイトメトリーにより分析した。ＤＣをその後、５０μｇ／ｍｌポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩ／Ｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の存在下で更に２日間成熟させ、そして、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の細胞表面発現についてフローサイトメトリーにより再度分析した。成熟ＤＣは、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６分子の明瞭な上方制御を示した。
【０１３１】
ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞の生成
３×１０５の成熟ＤＣに、１０μＭのペプチドＮＰＰＳＭＶＡＡＧＳＶＶＡＡＶを２４ウェルプレート中で２時間添加し、そして十分に洗浄した。その後、４×１０６の新鮮自己ＰＢＭＣを、Ｔｈ−１発生に有利であるために１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２ｐ７０の存在下でＤＣに添加した。ＰＢＭＣを、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、ペプチドを負荷した照射した自己ＰＢＭＣで毎週再刺激した。３および５回の再刺激後にＴ細胞を合わせ、そしてペプチドの存在下で自己ＰＢＭＣに対し試験した。Ｔヘルパー細胞株をその後、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ、２５〜５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下に、照射した同種ＰＢＭＣで１〜２週ごとに増幅し、そしてその後、トランスフェクトした細胞株の認識について試験した。３ないし４週ごとに、Ｔヘルパー細胞株を、１０μＭのペプチド、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下に、照射した自己ＰＢＭＣで再刺激した。
【０１３２】
Ｔヘルパー細胞株の機能アッセイおよび特徴付け
Ｔヘルパー細胞活性化は、チミジン取り込みならびにサイトカイン分泌により推定されるところの細胞増殖により試験した。簡潔には、２×１０５細胞を、１０μＭのペプチド若しくは３μｇ／ｍｌのＰＨＡの存在若しくは非存在下に３検体ずつ９６ウェルプレート中で２×１０５の照射した自己ＰＢＭＣとともにインキュベートした。２４時間後に２部分の５０μｌの上清を収集かつ凍結し、そして５０μｌの新鮮培地を細胞に添加した。５４時間後に、５０μｌのトリチウム化チミジン含有培地（０．０７４ＭＢｑ／ウェル、Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、独国ブラウンシュヴァイク）を添加し、そして、チミジンの取り込みを、シンチレーションカウンター（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ、Ｗａｌｌａｃ、独国フライブルク）を使用して７２時間に測定した。細胞増殖は、比：（刺激したＴ細胞のｃｐｍの平均）／（未刺激のＴ細胞のｃｐｍの平均）に対応する刺激指数（Ｓ．Ｉ．）として表す。ＩＬ−２分泌は、ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞株を使用して測定した。簡潔には、１０４細胞を上清の存在下に２０〜２４時間インキュベートした。その後、チミジン含有培地（０．０５５ＭＢｑ／ウェル）を追加の７〜８時間添加し、そしてチミジンの取り込みを上述したとおり測定した。結果はまたＳ．Ｉ．として表す。
【０１３３】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−６分泌は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎからの抗体対およびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを使用しかつ製造元の推奨に従ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。われわれは基質としてＳｕｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、独国ドライゼンホーフェン）を使用し、また、反応は２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を使用して停止した。ＯＤ４５０をその後測定し、そして結果は標準に従いｐｇ／ｍｌで表した。
【０１３４】
ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞株によるサイクリンＤ１でトランスフェクトした細胞の認識
トランスフェクタントに対するＴ細胞の検出可能な非自己反応の非存在を、多様な細胞数の照射したトランスフェクタントの存在下で該Ｔヘルパー株を生成させるのに使用したドナーからの新鮮ＰＢＭＣを共培養することにより立証した。細胞増殖ならびにＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ分泌を上述したとおり測定し、そして、さらなる実験で使用されるべきエフェクター／標的比をかように決定した。
【０１３５】
サイクリンＤ１由来の天然にプロセシングされたペプチドの認識は、サイクリンＤ１若しくは陰性対照としてのケラチン１８のいずれかをコードするプラスミドでトランスフェクトした照射したＡｗｅｌｌｓ（４×１０４細胞）の存在下で、かつ、上で決定された細胞比に従って、ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞株（２×１０５細胞）を共培養することにより試験した。１０μＭのペプチド若しくは３μｇ／ｍｌのＰＨＡの存在下の照射した自己ＰＢＭＣが陽性対照としてはたらいた。細胞増殖ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を上述したとおり測定した。いくつかの実験では、細胞を２０μｇ／ｍｌの精製したＬ２４３抗体の存在下で培養した。
【０１３６】
結果
融合タンパク質を発現する細胞クローンの生成
われわれは、挿入物の３'端の後に一般的クローニング部位（ＧＣＳ）が続いたような方法で、ベクターｐｃＤＮＡ３中にＩｉの８０のＮ末端アミノ酸をコードするｃＤＮＡをクローン化した。これは、われわれに、Ｉｉおよび目的の遺伝子の融合タンパク質を発現するための融通の利くベクターを与えた。Ｉｉとインフレームで、われわれは、サイクリンＤ１のｃＤＮＡ、ならびに対照としてのケラチン１８をクローン化した。
【０１３７】
Ａｗｅｌｌｓ細胞株を、電気穿孔法を使用して該２種の融合タンパク質をコードするベクターで安定にトランスフェクトした。その後、単細胞クローンを生成し、そして、それらの抗原発現についてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで試験した。野性型（トランスフェクトされていない細胞株）に比較して、最良のＩｉ−ケラチン１８クローンは、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析により測定されたとおり、５，７００倍より多いケラチン１８を発現し、また、最良のＩｉ−サイクリンＤ１クローンは１，２００倍より多いサイクリンＤ１を発現した。該データは１８ＳリボソームＲＮＡで標準化した。
【０１３８】
ウエスタンブロット分析において、ＰＩＮ．１抗体を使用してＩｉ融合タンパク質を検出した。Ｉｉの２種のアイソフォームに対応する２本のバンドのみが検出された野性型（Ｗａｒｍｅｒｄａｍ，Ｐ．Ａ．、Ｌｏｎｇ，Ｅ．Ｏ．とＲｏｃｈｅ，Ｐ．Ａ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３３、２８１−２９１）と比較して、期待された分子量を伴うＩｉ−ケラチン１８若しくはＩｉ−サイクリンＤ１融合タンパク質を表す２個の付加的なバンドを各クローンで観察し得た（図１）。クローンＡｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−ケラチン１８の場合には、融合タンパク質が、免疫沈降、次いでトリプシンでのｉｎ  ｓｉｔｕ消化およびその後のＭＳ／ＭＳ分析を介してもまた同定された。
【０１３９】
該クローンはまた、トランスフェクションおよびクローニング手順がそれを妨害したかどうかを決定するため、フローサイトメトリーによりそれらのＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ細胞表面発現レベルについても試験した。双方のクローンは、トランスフェクトされていない細胞株と比較して、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子の正常な発現レベルを示した。
【０１４０】
融合タンパク質のエンドソーム／リソソームターゲティング
ＩｉのＮ末端が、タンパク質の標的をＭＨＣクラスＩＩ経路に向けるのに十分であることが既に記述されている（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．、Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ，Ｋ．とＳｈａｓｔｒｉ，Ｎ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９２、７２１７−７２２１、Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．、Ｗａｎｇ，Ｘ．、Ａｔｗｏｏｄ，Ａ．Ｃ．、Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．とＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、１３５１−１３５４、Ｍａｌｃｈｅｒｅｋ，Ｇ．、Ｗｉｒｂｌｉｃｈ，Ｃ．、Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｎ．、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．とＭｅｌｍｓ，Ａ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、１５２４−１５３３）。われわれの構築物がＡｇプロセシングのその経路に実際に従ったかどうかを試験するため、われわれは、トランスフェクタントを、増大する量のクロロキン（リソソームのｐＨを上げることによりタンパク質のリソソーム分解を阻害する細胞傷害性の薬物）（Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．とＫｅｏｇｈ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２４、９２５−９３２、Ｔｉｅｔｚｅ，Ｃ．、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｐ．とＳｔａｈｌ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９２、４１７−４２４、Ｓｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｏ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６：７３７−６４．、７３７−７６４）とともに４時間インキュベートした。細胞をその後溶解し、そして融合タンパク質をウエスタンブロットにより検出した。図２は、タンパク質バンドが、クロロキンの量を増大させるにつれてますます強くなることを示し、融合タンパク質の量がクロロキン濃度とともに増大することを示し、そして従って融合タンパク質がＭＨＣクラスＩＩのタンパク質分解経路に従うことを提供する。
【０１４１】
ＨＬＡ−ＤＲに結合したペプチドの示差的質量分析
各クローンおよびトランスフェクトされていない細胞株からの３．５ないし５×１０１０細胞を増殖させ、そして、ＨＬＡ−ＤＲに結合したペプチドを、以前に記述された（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｆ．Ｈ．、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．、Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｗ．、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．Ｇ．とＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９、９９６−９９９）とおりにＨＰＬＣを介して単離かつ分離した。トランスフェクトされていない細胞株およびＡｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−サイクリンＤ１クローンのＨＰＬＣクロマトグラムを比較した（図３）。ＨＬＡ−ＤＲで提示されるペプチドレパートリーの小さなほとんど定量的な差違は、図３に示されるところのわずかに異なるＵＶ痕跡になった。われわれの実験から期待されたとおり、明瞭なＵＶシグナルは、トランスフェクタントにより独占的に提示されるペプチドに割り当て得なかった。Ａｗｅｌｌｓとトランスフェクトした株の間のＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチド提示のただわずかな差違は、ＨＰＬＣ画分の大部分が同一のパターンを含有したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によってもまた可視的になった。図４は、ケラチン１８でトランスフェクトした株から溶出されたペプチド混合物中にのみ存在しかつケラチン１８由来ペプチドを表した顕著な個別のシグナル（ｍ／ｚ：１７３２．９６）を含む唯一の画分の質量分析を示す。図５では、１３７０．１のｍ／ｚシグナルは、サイクリンＤ１トランスフェクタントからの独占的に提示される１ペプチドを示す。双方のペプチドをナノフローＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ（タンデムＭＳ）によりより詳細に分析した。発明者は、それぞれ２種のトランスフェクトされた融合タンパク質由来のペプチドＮＰＰＳＭＶＡＡＧＳＶＶＡＡＶ（配列番号１）（サイクリンＤ１１９８−２１２）（図６）およびＳＨＹＦＫＩＩＥＤＬＲＡＱＩ（配列番号２）（ケラチン１８１２６−１３９）を同定することが可能であった。該配列を、対応する合成ペプチドの質量スペクトルにより確認した。
【０１４２】
ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞株の生成および特徴付け
新規のＨＬＡクラスＩＩ由来の腫瘍関連および推定で免疫原性のペプチドの同定のための概念の証明を確立するために、同定されたサイクリンＤ１ペプチドに特異的なＴ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ４＋樹状細胞に負荷した対応する合成ペプチドでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激により誘導した。それぞれ第３および５回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ（再）刺激後に、Ｔヘルパー細胞株の特異性を試験した。Ｔ細胞を、図７（上図）に示されるとおりサイクリンＤ１ペプチドにより特異的に刺激した。Ｔ細胞は、サイクリンＤ１ペプチドを負荷した自己ＰＢＭＣに応答して増殖した（Ｓ．Ｉ．＝５．４）。陽性対照として、ＰＨＡは強いＴ細胞増殖を誘導した（Ｓ．Ｉ．＝３３０）。発明者は次に、どの型のＴヘルパー細胞（Ｔｈ１対Ｔｈ２）がペプチドに応答して刺激されたかを、サイトカインプロファイルを検査することにより分析した。図７（下図）に示されるとおり、Ｔ細胞はペプチドに応答して低い程度までとは言えＩＬ−２を産生した一方、それらはＰＨＡ刺激に対しなお感受性であった。対照的に、ペプチドで誘導したＴ細胞刺激は、強いＩＦＮ−γ分泌（３２５０ｐｇ／ｍｌ、図７Ｃ）をもたらしたが、しかしＩＬ−４若しくはＩＬ−６分泌をもたらさなかった。とは言え、Ｔ細胞はなお、ＰＨＡで誘導されるサイトカイン分泌に対しそれぞれ高度におよび中程度に感受性であった。ＨＬＡ−ＤＲ４／サイクリンＤ１１９８−２１２に特異的なＴ細胞受容体でのＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞の最終的な非特異的活性化についての陰性対照としての無関係のペプチドでの刺激を表８に提示する。結論として、確立されたＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞株は、サイクリンＤ１１９８−２１２ペプチドに特異的でありかつＴｈ１型のものである。この型は、腫瘍細胞の排除における特異的ＣＤ８＋キラーＴ細胞の援助においてとりわけ重要である。
【０１４３】
ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞株は、サイクリンＤ１でトランスフェクトした細胞もまた認識する
Ａｗｅｌｌｓ細胞およびＴ細胞株は完全にＨＬＡが適合しているわけではないため、われわれは最初に、双方を共培養することによりいずれかの非自己反応が生じ得るかどうかを試験した。簡潔には、多様な細胞数の照射したＡｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−ケラチン１８若しくはＡｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−サイクリンＤ１トランスフェクタントを、Ｔ細胞ドナーからの固定した数のＰＢＭＣの存在下で共培養し、そして、細胞増殖ならびにＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ分泌を測定した。中程度のＴ細胞増殖が高細胞数の双方のトランスフェクタントにより誘導されたが、しかし、サイトカイン分泌は観察されなかった（データは示されない）。従って、われわれは、サイトカイン分泌の非存在下でわずかなＴ細胞増殖のみが観察された５／１という（エフェクターＴ細胞）／（標的細胞）比を使用することを決定した。結果として、サイトカイン分泌をもたらすＴ細胞活性化は、トランスフェクタントにより提示される同族の抗原によってのみ特異的に誘導され得た。
【０１４４】
サイクリンＤ１ペプチドに特異的なＴヘルパー細胞株は、サイクリンＤ１タンパク質を過剰発現しそして該サイクリンＤ１ペプチドを天然にプロセシングしかつＨＬＡ−ＤＲ分子と共同して提示する、トランスフェクトされた細胞を認識することが可能であった。図８に示されるとおり、照射したＡｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−サイクリンＤ１トランスフェクタントは、ＩＬ−２分泌により観察されたとおり、Ｔヘルパー細胞株を特異的に活性化することが可能であった（Ｓ．Ｉ．＝４．０）。対照的に、Ａｗｅｌｌｓ−Ｉｉ−ケラチン１８トランスフェクタント（Ｔ細胞刺激の陰性対照として使用され、かつ、ＨＬＡ−ＤＲと共同して無関係のケラチン１８ペプチド１２６−１３９を提示することが知られている）はＴ細胞活性化を誘導せず、ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞株が同族の抗原を特異的に認識することを示した。さらに、これらの結果は、本発明で使用されるサイクリンＤ１ペプチドが、Ｔ細胞エピトープを含有する天然にプロセシングされたペプチドであることを証明する。この活性化は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的なブロッキングＬ２４３Ａｂの存在により阻害され得た（７１．２％）。
【０１４５】
クラスＩＩ分子およびペプチド抗原サイクリンＤ１１９８−２１２を使用する活性化型細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の製造ならびにそれらの投与
活性化型細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ＨＬＡ−ＤＲクラスＩＩ分子、およびサイクリンＤ１１９８−２１２（配列番号１）からのペプチドを使用して製造する。
一般に、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９３／１７０９５号に記述される方法を使用してＣＴＬを製造する。Ａｗｅｌｌｓ細胞を使用してペプチド抗原をＣＴＬに提示する。ＨＬＡ−ＤＲ分子はＡｗｅｌｌｓ細胞により発現される。試験されるべきペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの合成機、ＡＢＩ  ４３１Ａ（米国カリフォルニア州フォスターシティ）で合成し、そしてその後ＨＰＬＣにより精製する。ＷＯ  ９３／１７０９５号に詳細に記述されるとおり、特異的細胞傷害性Ｔ細胞の生成のためｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件を最適化するために、刺激体細胞の培養物を適切な培地中で維持する。刺激体細胞は、好ましくは無血清培地（例えばＥｘｃｅｌｌ  ４００）中で維持されるＡｗｅｌｌｓ細胞である。
【０１４６】
活性化されるべき細胞、例えば前駆体ＣＤ４＋細胞との刺激体細胞のインキュベーション前に、ある量の抗原ペプチドを十分な量の刺激体細胞培養物に添加し、刺激体細胞の表面上で発現されるべきヒトクラスＩＩ分子に負荷されたようにする。十分な量のペプチドは、約２００、および好ましくは２００若しくはそれ以上のペプチドを負荷したヒトクラスＩＩＭＨＣ分子が、各刺激体細胞の表面上で発現されることを可能にする量である。刺激体細胞は、典型的に、２０ｐｇ／ｍｌ超のペプチドとともにインキュベートする。
【０１４７】
休止期若しくは前駆体ＣＤ４＋細胞をその後、適切な刺激体細胞を含む培養物中で、ＣＤ４＋細胞を活性化するのに十分な時間インキュベートする。ＣＤ４＋細胞はかように抗原特異的様式で活性化される。刺激体細胞に対する休止期若しくは前駆体ＣＤ４＋（エフェクター）細胞の比は個体ごとに異なることがあり、また、個体のリンパ球の培養条件への従順さのような変数にさらに依存しうる。リンパ球：刺激体細胞（Ａｗｅｌｌｓ細胞）の比は、典型的に約３０：１ないし３００：１の範囲にある。例えば、３×１０１のヒトＰＢＬおよび１×１０６の生存Ａｗｅｌｌｓ細胞を混合し、そして２０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持する。
【０１４８】
エフェクター／刺激体の培養物は、治療上使用可能な若しくは有効な数のＣＤ４＋細胞を刺激するのに必要であるだけの時間維持する。最適な時間は典型的に約１と５日の間であり、「プラトー」すなわち「最大の」特異的ＣＤ４＋活性化レベルは一般に５日の培養後に観察される。ＣＤ４＋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化は、典型的に、細胞株のトランスフェクション後短時間内に検出される。ＣＤ４＋細胞を活性化することが可能な、トランスフェクトされた細胞株での一過性発現は、トランスフェクション４８時間以内に検出可能である。これは、ヒトクラスＩＩＭＨＣ分子を発現する形質転換細胞の安定若しくは一過性培養物のいずれも、ＣＤ４＋細胞の活性化において有効であることを明確に示す。
【０１４９】
活性化型ＣＤ４＋細胞は、それらの適切な相補リガンドに結合させるため、刺激体（Ａｗｅｌｌｓ）細胞、刺激体細胞に負荷したペプチド、またはＣＤ４＋細胞（若しくはそのセグメント）に特異的なモノクローナル抗体を使用して、刺激体細胞から効果的に単離しうる。抗体標識した分子をその後、免疫沈降若しくはイムノアッセイ法を介して、刺激体とエフェクター細胞の混合状態から抽出する。
【０１５０】
活性化型ＣＤ４＋細胞の有効な細胞傷害性の量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの使用の間で、ならびにこれらのキラー細胞の最終的標的である細胞の量および型で変動し得、約１×１０６と１×１０１２の間の活性化型ＣＴＬを成人のヒトに使用する。
活性化型ＣＤ４＋細胞は、処置されている個体への該ＣＤ４＋細胞の投与前に、Ａｗｅｌｌｓ細胞培養物から収集する。
Ｈｏｎｓｉｋへの米国特許第４，８４４，８９３号明細書およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇへの米国特許第４，６９０，９１５号明細書に例示されるもののような細胞成分の再導入方法を使用する。例えば、静脈内注入を介する活性化型ＣＤ８細胞の投与が適切である。
【０１５１】
表１：本発明で同定されたところの腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープ
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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