(57)【要約】      （修正有）【課題】蛋白質の生体膜透過性を調べる方法、及び、蛋白質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法の提供。【解決手段】ターゲット蛋白質と発光又は蛍光蛋白質のC末端フラグメントとの融合蛋白質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光蛋白質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出する、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法。前記C末端フラグメントとＮ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。発光又は蛍光蛋白質のN末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲット蛋白質と発光又は蛍光蛋白質のC末端フラグメントとの融合蛋白質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲット蛋白質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとＮ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
【請求項２】
さらに、発光基質を添加することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
発光タンパク質がルシフェラーゼであり、発光基質がルシフェリンである請求項２記載の方法。
【請求項４】
ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである請求項３記載の方法。
【請求項５】
ホタルルシフェラーゼが北米産ホタル天然ルシフェラーゼである請求項４記載の方法。
【請求項６】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼが配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項５記載の方法。
【請求項７】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びＮ末端フラグメントが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びＮ末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記Ｎ末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである請求項６記載の方法。
【請求項８】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである（７）記載の方法。
【請求項９】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目若しくは１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目若しくは１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端からら１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目若しくは１〜１４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目若しくは１〜１３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目若しくは１〜１２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目若しくは１〜１１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目若しくは１〜１０番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜８番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目若しくは１〜９番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜９番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目若しくは１〜８番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１０番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目若しくは１〜７番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目若しくは１〜６番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目若しくは１〜５番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目若しくは１〜４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目若しくは１〜３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目又は１〜２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ホタルルシフェラーゼが配列番号７のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである請求項４記載の方法。
【請求項１１】
変異型ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びＮ末端フラグメントが、それぞれ、配列番号７のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びＮ末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記Ｎ末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目若しくは１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目若しくは１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目若しくは１〜１４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目若しくは１〜１３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目若しくは１〜１２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目若しくは１〜１１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目若しくは１〜１０番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜８番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目若しくは１〜９番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜９番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目若しくは１〜８番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１０番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目若しくは１〜７番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目若しくは１〜６番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目若しくは１〜５番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目若しくは１〜４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目若しくは１〜３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目若しくは１〜２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記Ｎ末端フラグメントとＣ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
【請求項１５】
発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記Ｎ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
【請求項１６】
さらに、発光基質を含む、請求項１５記載の試薬。
【請求項１７】
さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ及び還元剤からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１５又は１６記載の試薬。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキット。
【請求項１９】
さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記Ｃ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
【請求項２１】
さらに、発光基質を含む、請求項２０記載の試薬。
【請求項２２】
さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ及び還元剤からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項２０又は２１記載の試薬。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれかに記載の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキット。
【請求項２４】
さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含む、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号３又は９のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号３又は９のアミノ酸配列のＮ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチド。
【請求項２６】
請求項２５記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２７】
請求項２６記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項２８】
請求項２６記載のＤＮＡの上流又は下流に制限酵素部位を含有する請求項２７記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２７又は２８記載のベクターで形質転換した細胞。
【請求項３０】
請求項２５記載のペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物から請求項２５記載のペプチドを採取することを含む、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントであるペプチドの製造方法。
【請求項３１】
発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号５又は１１のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号５又は１１のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチド。
【請求項３２】
請求項３１記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３３】
請求項３２記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項３４】
請求項３２記載のＤＮＡの上流又は下流に制限酵素部位を含有する請求項３２記載のベクター。
【請求項３５】
請求項３３又は３４記載のベクターで形質転換した細胞。
【請求項３６】
請求項３１記載のペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物から請求項３１記載のペプチドを採取することを含む、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントであるペプチドの製造方法。
【請求項３７】
発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記Ｎ末端フラグメントとＣ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
【請求項３８】
発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとＮ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
【請求項３９】
ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記Ｃ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
【請求項４０】
請求項３９記載の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキット。
【請求項４１】
ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記Ｎ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
【請求項４２】
請求項４１記載の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分割レポータータンパク質による標的タンパク質の検出方法、より詳細には、分割レポータータンパク質を用いて、標的タンパク質の生体膜透過性や標的タンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面に存在する細胞膜タンパク質は、細胞膜（膜厚が約４ナノメートル）を構成しているタンパク質である。その存在形態は、膜表面に結合していたり、片側に埋まっていたり、膜を貫通していたりする。膜タンパク質には、トランスポーター、イオンチャンネル、受容体、酵素および構造タンパク質、制御タンパク質ならびにその役割が未解明なものも数多く存在する。また、宿主・病原体の細胞構成成分として構成的に発現する膜タンパク質もある。多細胞生物においては、細胞内外環境の恒常性維持が細胞の生存にとって本質的意味を持つ。これを達成するために、生物は膜タンパク質を通じて外部環境と物質の交換や情報の受信を行うことにより、細胞内外の環境を一定に保っている。例えばイオントランスポーターは、原則的に脂質二重層膜は不透過である無機イオンや生体代謝に関与する多くの水溶性有機物質をATPのエネルギーを使うことによる能動輸送を行う機能を有している。
【０００３】
多くの分泌タンパク質は細胞増殖、細胞分化、および種々の特定の細胞応答を調節するうえで極めて重要な役割を果たしている。成長ホルモンや各種のインターロイキンなどの医学的に有用なタンパク質は分泌タンパク質である。
【０００４】
膜タンパク質・分泌タンパク質が生理的に機能するためには多様な活性制御機構を集積しながら細胞膜上の特定の場所に局在する必要があり、細胞膜上特定部位への組み込み、集積、局在維持は、ほぼ全ての膜輸送の研究で考察されている。この輸送効率は細胞表面の発現量に直接関係している。  膜タンパク質の機能発現には生合成後の細胞表面までの細胞内輸送が必須であり、細胞表面の発現量変化は細胞のシグナル伝達に大きな影響を与えるため、膜タンパク質の細胞内輸送に変化を及ぼす分子のプロファイリングが重要となる。  チャネル、トランスポーターの分子自身の遺伝子同定、生理的機能解析、病態との関連分析が近年急速に進展してきた過程で、創薬分野において、膜タンパク質の細胞内輸送の阻害・促進をプロファイルすること、膜タンパク質が正常に細胞膜まで輸送され、機能していることを測定するニーズが高まっている。例として、多くの抗不整脈薬、抗ヒスタミン剤、向精神薬、抗生物質がhERG（human ether-a-go-go related gene product）の膜表面への発現を阻害し、QT延長症候群を惹起することが判明し、すべての候補薬に対してhERGチャンネルに対する安全性を確認することが推奨されている。
【０００５】
また、イオンチャネル・トランスポーターの機能解析では、膜電位固定法やパッチクランプ法によりチャネル電流を、膜小胞による輸送実験によってトランスポーター活性を調べることにより、輸送タンパク質の機能特性の解析が行われている。さらに最近、創薬でのイオンチャンネル・トランスポーターの正常な発現をモニターするニーズの高まりから、パッチクランプ法（分）を自動化した装置や原子吸光法（分）を適用した方法、蛍光色素を利用してイオンチャンネルを測定する方法（分）等が開発されている。しかしながら、パッチクランプ法では精密なデータは得ることができるが、自動化されているとはいえ、一日で処理できる検体はせいぜい3,000個程度が限界である。原子吸光法は、ハイスループット解析に適用しやすい反面、生体に本来存在しない、ルビジウムイオンを細胞内に導入することになり、細胞内プロテオームを攪乱する可能性がある。また、蛍光色素を用いた方法も前記と同様の問題が生じる。従って、これらの点を改善した迅速で大規模なスクリーニングを可能とする膜タンパク質の細胞内輸送を測定するアッセイ系の開発が望まれている。創薬においては、主薬効として治療のために細胞内輸送を改善させる物質を発見することも、副作用として細胞内輸送を阻害するか否かを確認することも重要である。しかしながら、上記記載のように、現状では膜タンパク質のトラフィッキングに対するスループット性の高い系がなく、効率的にプロファイリングができていない。
【０００６】
分泌タンパク質の発現解析については、古典的に放射性元素を用いてpulse-chase実験により解析することが行われている。分泌タンパク質が酵素である場合では、確立された酵素活性測定法によりその分泌量が見積もられている。また、分泌タンパク質自体の抗体を作製し、ウエスタンブロッティングにより細胞外でのタンパク質の存在を確認する場合もある。しかしながら、いずれの手法も多大な設備や煩雑な操作を要する。適用できるタンパク質に制限が伴うのが実情である。そこで、操作が簡便で解析手法が確立しており、高感度である蛍光・発光タンパク質を、細胞内輸送系をモニタリングや細胞外分泌を確認できるシステムに適用することが望まれていた。
【０００７】
レポータータンパク質を上記の目的として採用するためには、蛍光タンパク質それ自体が検出されるべき部位以外で蛍光を発することがあってはならない。また、発光タンパク質の場合では、発光基質が低分子化合物であり、細胞膜を容易に透過して細胞内に導入され発光反応が進行することを防止しなければならない。この理由は、仮にある薬剤を細胞に処理をした後、細胞内輸送系に異常があった場合でも、輸送途中のレポータータンパク質も発光活性を持つ可能性があるためである。これにより実際の細胞内輸送系の阻害率・促進率を誤って解釈してしまう危険性がある（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Thompson, E.M., Nagata,S. and Tsuji, F.I. (1990) 96. 257-262. Gene
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、タンパク質の生体膜透過性を調べる方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、タンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
生体膜はリン脂質二重膜で構成されており、高分子の物質は不透過である。すなわち、生体膜で隔てられた領域間をまたいでの蛍光・発光反応が生ずる可能性は生体膜が機能している場合は特殊な場合を除き皆無である。この性質を利用して、レポータータンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質が生体膜を透過した場合にのみ蛍光、発光、薬剤耐性等の酵素活性を生じさせその活性を測定することにより目的タンパク質の局在を簡便に検出することが可能となる。
【００１２】
そこで分割酵素アッセイを利用し、細胞を生かしたまま、かつ分泌が完了したタンパク質や細胞膜に発現したタンパク質のみを定量するシステムを考案する。分割酵素アッセイは、Rossiらにより報告された方法（Rossi, F., Charlton, C. A. and Blau, H. M. (1997) 94. 8405-8410. Proc. natl. Acad. Sci. USA）であって、元来、酵母two hybrid法（Chien, C. T., Bartel, P. L., Sternglanz, R. and Fields, S. (1991) 88. 9578-9582. Proc. natl. Acad. Sci. USA）の代替として開発された技術である。すなわち、あるタンパク質とあるタンパク質の結合能力を予め分割したレポーター遺伝子の融合遺伝子を構築して細胞に導入し、あるタンパク質同士が結合した場合のみにおいて、そのレポーター遺伝子も結合してその活性が表現型、例えば蛍光や発光が現れ、それを測定するものである。例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いたもの（Ozawa, T., Nogami, S., Sato, M., Ohya, Y. and Umezawa, Y. (2000) 72. 5151-5157.  Anal. Chem.）、発光タンパク質はホタルルシフェラーゼを用いたもの（特許第3772193号）、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼを用いたもの（Kim, S. B., Ozawa, T., Watanabe, S. and Umezawa, Y. (2004) 101. 11542-11547. Proc. Natl. Sci. USA.）、ヒカリコメツキルシフェラーゼを用いたもの（Kim, S. ., Otani, Y., Umezawa, Y, and Tao, H. (2007) 79. 4820-4826. Anal. Chem.）がある。
【００１３】
本方法は、タンパク質同士の結合能を定量的に解析する手法であって、レポータータンパク質の結合し酵素活性の発揮があるタンパク質の結合が生じていない場合にあってはならない。しかしながら本発明においては、分割酵素アッセイにおける分割部位を勘案することにより、分割されたレポータータンパク質が自発的に結合することを利用してターゲットタンパク質の局在を検出することを目的としている。
【００１４】
本出願の発明は、以上の事情を鑑みてなされたものであり、分割されたタンパク質が会合した場合にのみ発光・蛍光を生ずるため、従来の問題点を解消して膜タンパク質・分泌タンパク質の正確な発現定量解析を実現し、新薬候補のスクリーニングや開発初期段階での副作用等の予見に利用することを課題としている。
【００１５】
本発明者らは、まず、ホタルルシフェラーゼのＣ末端フラグメントとＮ末端フラグメントを用意し、両者が相互作用したときに発光が生じることを確認した（後述の実施例１）。次に、Gaussiaルシフェラーゼ（ターゲットタンパク質）とホタルルシフェラーゼのＣ末端フラグメントとの融合タンパク質をHEK293細胞に発現させ、この細胞にホタルルシフェラーゼのＮ末端フラグメントを添加した後、ルシフェリン（発光基質）を添加したところ、発光が確認された。この結果は、Gaussiaルシフェラーゼが生体膜透過性を有することを示している（後述の実施例２）。このことから、分割レポータータンパク質を用いて、標的タンパク質の生体膜透過性を調べられることがわかる。このアッセイの原理を図１に模式的に示す。すなわち、相互作用したときに発光が生じるような発光タンパク質のC末端フラグメント（C末端ルシフェラーゼ）とN末端フラグメント（N末端ルシフェラーゼ）を用意し、ターゲットタンパク質と前記C末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、前記N末端フラグメントを添加し、発光基質（ルシフェリン）を加えて、発光の有無又は発光波長の変化を検出する。ターゲットタンパク質が生体膜透過性を有する場合には、発光又は発光波長の変化が認められ（図１）、ターゲットタンパク質が生体膜透過性を有さない場合には、発光又は発光波長の変化が認められない。発光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントの代わりに蛍光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントを利用してもよい。蛍光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントを利用する場合には、発光基質を加える必要はない。
【００１６】
また、この原理を応用すれば、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性も調べることができる。このアッセイの原理を図２に模式的に示す。すなわち、発光タンパク質のN末端フラグメント（N末端ルシフェラーゼ）を細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光タンパク質のC末端フラグメント（C末端ルシフェラーゼ）との融合タンパク質を添加し、発光基質（ルシフェリン）を加えて、発光の有無又は発光波長の変化を検出する。ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる場合には、発光又は発光波長の変化が認められ（図２）、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれない場合には、発光又は発光波長の変化が認められない。発光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントの代わりに蛍光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントを利用してもよい。蛍光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントを利用する場合には、発光基質を加える必要はない。
【００１７】
図１及び２のアッセイにおいて、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントとＮ末端フラグメントの役割を入れ替えてもよい。すなわち、細胞に発現させるタンパク質を発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントとし、この細胞にターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出してもよい。
【００１８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとＮ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
（２）さらに、発光基質を添加することを含む（１）記載の方法。
（３）発光タンパク質がルシフェラーゼであり、発光基質がルシフェリンである（２）記載の方法。
（４）ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである（３）記載の方法。
（５）ホタルルシフェラーゼが北米産ホタル天然ルシフェラーゼである（４）記載の方法。
（６）北米産ホタル天然ルシフェラーゼが配列番号１のアミノ酸配列からなる（５）記載の方法。
（７）北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びＮ末端フラグメントが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びＮ末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記Ｎ末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである（６）記載の方法。
（８）北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである（７）記載の方法。
（９）北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目若しくは１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目若しくは１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端からら１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目若しくは１〜１４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目若しくは１〜１３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目若しくは１〜１２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目若しくは１〜１１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目若しくは１〜１０番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜８番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目若しくは１〜９番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜９番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目若しくは１〜８番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１０番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目若しくは１〜７番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目若しくは１〜６番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目若しくは１〜５番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目若しくは１〜４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目若しくは１〜３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目又は１〜２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドである（８）記載の方法。
（１０）ホタルルシフェラーゼが配列番号７のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである（４）記載の方法。
（１１）変異型ルシフェラーゼのC末端フラグメント及びＮ末端フラグメントが、それぞれ、配列番号７のアミノ酸配列のC末端のアミノ酸及びＮ末端のアミノ酸を含み、かつ前記C末端フラグメントと前記Ｎ末端フラグメントが相互作用したときに発光が生じるものである（１０）記載の方法。
（１２）ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドである（１１）記載の方法。
（１３）ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目若しくは１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目若しくは１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目若しくは１〜１４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目若しくは１〜１３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目若しくは１〜１２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目若しくは１〜１１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目若しくは１〜１０番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜８番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目若しくは１〜９番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜９番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目若しくは１〜８番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１０番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目若しくは１〜７番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目若しくは１〜６番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目若しくは１〜５番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目若しくは１〜４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目若しくは１〜３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目若しくは１〜２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであり、
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドである（１２）記載の方法。
（１４）ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記Ｎ末端フラグメントとＣ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
（１５）発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記Ｎ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
（１６）さらに、発光基質を含む、（１５）記載の試薬。
（１７）さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ及び還元剤からなる群より選択される少なくとも１つを含む、（１５）又は（１６）記載の試薬。
（１８）（１５）〜（１７）のいずれかに記載の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキット。
（１９）さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含む、（１８）記載のキット。
（２０）発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記Ｃ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
（２１）さらに、発光基質を含む、（２０）記載の試薬。
（２２）さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ及び還元剤からなる群より選択される少なくとも１つを含む、（２０）又は（２１）記載の試薬。
（２３）（２０）〜（２２）のいずれかに記載の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキット。
（２４）さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含む、（２３）記載のキット。
（２５）発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号３又は９のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号３又は９のアミノ酸配列のＮ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチド。
（２６）（２５）記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
（２７）（２６）記載のＤＮＡを含有するベクター。
（２８）（２６）記載のＤＮＡの上流又は下流に制限酵素部位を含有する（２７）記載のベクター。
（２９）（２７）又は（２８）記載のベクターで形質転換した細胞。
（３０）（２５）記載のペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物から（２５）記載のペプチドを採取することを含む、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントであるペプチドの製造方法。
（３１）発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号５又は１１のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号５又は１１のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチド。
（３２）（３１）記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
（３３）（３２）記載のＤＮＡを含有するベクター。
（３４）（３２）記載のＤＮＡの上流又は下流に制限酵素部位を含有する（３２）記載のベクター。
（３５）（３３）又は（３４）記載のベクターで形質転換した細胞。
（３６）（３１）記載のペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物から（３１）記載のペプチドを採取することを含む、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントであるペプチドの製造方法。
（３７）発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記Ｎ末端フラグメントとＣ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
（３８）発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとＮ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法。
（３９）ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記Ｃ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
（４０）（３９）記載の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキット。
（４１）ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記Ｎ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬。
（４２）（４１）記載の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、生細胞における、ターゲットタンパク質の局在確認（細胞膜内・外）、発現量の変化の測定、細胞内輸送時間の測定、in vivoイメージングなどが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のアッセイ（ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法）の概念図を示す。  ターゲットタンパク質（Ｇ）とＣ末端ルシフェラーゼ（Ｃ）の融合タンパク質を発現する遺伝子を構築して細胞（楕円で示す）にトランスフェクションする。細胞を培養し、融合タンパク質が発現する。ターゲットタンパク質が細胞膜を透過する分泌タンパク質の場合、Ｃ末端ルシフェラーゼとの融合タンパク質が培地中に放出される。次に、N末端ルシフェラーゼ（Ｎ）、ルシフェリンを含む試薬(Reagent)を培地に投入し一定時間インキュベートする。この時点よりN末端ルシフェラーゼとC末端ルシフェラーゼの自発的な会合が開始される。Ｎ末端・Ｃ末端が会合したルシフェラーゼはルシフェリンを酸化する能力によりルシフェリンールシフェラーゼ反応が進行し、その際に光が生成される。この光量が細胞外に分泌された融合タンパク質の量に比例している。また、低分子化合物であるルシフェリンは細胞膜を透過して細胞内に導入されるが、細胞内にNC末端を有する完全なルシフェラーゼは存在しないため、発光は生じない。すなわち、発光は細胞外に存在するＮＣが会合したルシフェラーゼ由来であると断定できる。
【図２】本発明の別のアッセイ（ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法）の概念図を示す。  Ｎ末端ルシフェラーゼを発現する遺伝子を構築して細胞（楕円で示す）にトランスフェクションする。細胞を培養し、Ｎ末端ルシフェラーゼを発現させる。次に、Ｃ末端ルシフェラーゼ（Ｃ）とターゲットタンパク質（α）の融合タンパク質、ルシフェリンおよびその他反応に必要な物質や増感剤を含む試薬(Reagent)を培地に投入し一定時間インキュベートする。細胞にタンパク質をとりこむ反応（食作用）があれば、融合タンパク質が細胞内に存在することになる。すでに細胞内で発現させているＮ末端ルシフェラーゼと融合タンパク質との自発的な会合が開始される。また、Ｎ末端・Ｃ末端が会合したルシフェラーゼはルシフェリンを酸化する能力によりルシフェリンールシフェラーゼ反応が進行し、その際に光が生成される。この光量が細胞内に取り込まれた融合タンパク質の量に比例している。また、低分子化合物であるルシフェリンは細胞膜を透過して細胞内に導入されるが、細胞内にＮＣ末端を有する完全なルシフェラーゼは存在しないため、発光は生じない。すなわち、発光は細胞外に存在するＮ末端及びＣ末端が会合したルシフェラーゼ由来であると断定できる。
【図３】実施例１で用いたＣ末端側ベクター（p3xFLAG-CMV-9-CLuc（細胞外に分泌する）、p3xFLAG-CMV-10-CLuc（非分泌））とＮ末端側ベクター（pTri6-NLuc）の構成の一部を示す。CLucは天然ルシフェラーゼの399〜550番目のアミノ酸を含む。NLucは天然ルシフェラーゼの1〜416番目のアミノ酸を含む。  天然ルシフェラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。  CLucのアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に示す。  NLucのアミノ酸配列を配列番号５に、塩基配列を配列番号６に示す。  CMV：サイトメガロウイルスプロモーター、  FLAG：タンパク質タグ、His：Hisタグ、PPT LS：Preprotrypsin leadersequence（細胞外へタンパク質を分泌させるシグナル）
【図４−１】実施例１及び２で用いたCLucとNLucのアミノ酸配列を示す。CLucとNLucの重複部分をグレーのボックスで囲った。
【図４−２】実施例２で用いたCLuc（非耐熱）、CLuc530（耐熱）、NLuc-TS（耐熱）とNLuc（非耐熱）のアミノ酸配列を示す。変異部位をグレーのボックスで囲った。
【図５】実施例２で用いたＣ末端側ベクター（(1)pTri-CLuc（ネガティブコントロール・非耐熱）、(2)pTri-GL-CLuc（分泌・非耐熱）、(3)pTri-CLuc530（ネガティブコントロール・耐熱）、(4)pTri-GL-Cluc530（分泌・耐熱））とＮ末端側ベクター（pTri6-NLucTS）の構成の一部を示す。CLucは天然ルシフェラーゼの399〜550番目のアミノ酸を含む。CLuc530は、変異型ホタルルシフェラーゼの399〜550番目のアミノ酸を含む。NLuc-TSは、変異型ホタルルシフェラーゼの1〜416番目のアミノ酸を含む。  天然ルシフェラーゼ（非耐熱）のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。  CLuc（非耐熱）のアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に示す。  NLuc（非耐熱）のアミノ酸配列を配列番号５に、塩基配列を配列番号６に示す。  変異型ホタルルシフェラーゼ（耐熱）のアミノ酸配列を配列番号７に、塩基配列を配列番号８に示す。  変異型ホタルルシフェラーゼ（耐熱）は、天然ルシフェラーゼ（非耐熱）のアミノ酸配列のうち、215番目のアミノ酸がAからLに、232番目のアミノ酸がIからAに、295番目のアミノ酸がFからLに、354番目のアミノ酸がEからKに、533番目のアミノ酸がLからRに置換している。  CLuc530（耐熱）のアミノ酸配列を配列番号９に、塩基配列を配列番号１０に示す。  NLuc-TS（耐熱）のアミノ酸配列を配列番号１１に、塩基配列を配列番号１２に示す。  CMV：サイトメガロウイルスプロモーター、His：Hisタグ、GL：Gaussiaルシフェラーゼ
【図６】実施例２の(1)〜(4)のベクターを導入した細胞(HEK293)の培地の発光量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００２２】
本発明は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法であって、前記C末端フラグメントとＮ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法を提供する。
【００２３】
本発明の方法において、ターゲットタンパク質はいかなるタンパク質であってもよく、例えば、分泌タンパク質としては、インターロイキン、インターフェロン、細胞応答因子、エリトロポエチン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン、成長ホルモン、織プラスミノーゲンアクチベーター等が挙げられる。膜タンパク質としては、イオンチャンネル、トランスポーター、Gタンパク質、イオンチャンネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、Gタンパク質共役型受容体、細胞接着分子などを挙げることができる。
【００２４】
発光タンパク質としては、発光生物由来の発光酵素、例えば、ルシフェラーゼなどを例示することができる。発光タンパク質は、天然由来のものであっても、変異型のものであってもよい。
【００２５】
ルシフェラーゼの例としては、ホタル天然ルシフェラーゼ（具体的には、北米産ホタル天然ルシフェラーゼ、ヘイケボタル由来ルシフェラーゼ、ゲンジボタル由来ルシフェラーゼ、ヒメボタル由来ルシフェラーゼ、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ、鉄道虫由来ルシフェラーゼ、ツチボタル由来ルシフェラーゼ、ウミボタル由来ルシフェラーゼ、ウミサボテン由来ルシフェラーゼ）、ホタルルシフェラーゼ以外の天然ルシフェラーゼ（具体的には、渦鞭毛藻（虫）由来ルシフェラーゼ、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、キヨタケ由来ルシフェラーゼ、発光バクテリア由来ルシフェラーゼ、ラチア由来ルシフェラーゼ、発光ゴカイ由来ルシフェラーゼ）などの天然ルシフェラーゼ、それらの変異体などを挙げることができる。
【００２６】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのアミノ酸配列の一例を配列番号１に示す。
【００２７】
また、北米産ホタル天然ルシフェラーゼの変異体のアミノ酸配列の一例を配列番号７に示す。
【００２８】
蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein, GFP）、及び同様の性質を示すタンパク質であるTurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescent Proten, BFP ）、その類縁タンパク質であるEBFP、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescent Protein, CFP）、及び同様の性質を示すECFP、TagCFP、AmCyan、MidoriishiCyan、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescent Protein, RFP）、及び同様の性質を示すタンパク質であるTurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescent Protein, YFP）及び同様の性質を示すTagYFP、EYFP、Venus、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、橙色蛍光タンパク質であるKusabiraOrange、mOrange、赤外光の蛍光を発する蛍光タンパク質であるTurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed  mRasberry、mPlumなどを例示することができる。蛍光タンパク質は、天然由来のものであっても、変異型のものであってもよい。
【００２９】
発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントは、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントと相互作用したときに、発光又は蛍光が生じるものであればよい。発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントの例としては、ある発光又は蛍光タンパク質のC末端のアミノ酸を含むものを挙げることができ、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントの例としては、同じ発光又は蛍光タンパク質のＮ末端のアミノ酸を含むものを挙げることができる。発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとＮ末端フラグメントは、重複するアミノ酸配列を含んでもよい。重複するアミノ酸の数は、１〜200個が好ましく、5〜30個がより好ましい。
【００３０】
例えば、発光タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなる北米産ホタル天然ルシフェラーゼである場合、そのC末端フラグメントとしては、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３１】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３２】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目若しくは１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３３】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目若しくは１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３４】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端からら１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目若しくは１〜１４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３５】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目若しくは１〜１３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３６】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目若しくは１〜１２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３７】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目若しくは１〜１１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３８】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目若しくは１〜１０番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００３９】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜８番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目若しくは１〜９番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４０】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜９番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目若しくは１〜８番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４１】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１０番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目若しくは１〜７番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４２】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目若しくは１〜６番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４３】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目若しくは１〜５番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４４】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目若しくは１〜４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４５】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目若しくは１〜３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４６】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目又は１〜２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４７】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号５のアミノ酸配列のN末端から１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４８】
北米産ホタル天然ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、北米産ホタル天然ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００４９】
また、例えば、ホタルルシフェラーゼが配列番号７のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである場合、そのC末端フラグメントとしては、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５０】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５１】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目若しくは１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５２】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目若しくは１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５３】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目若しくは１〜１４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５４】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目若しくは１〜１３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５５】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目若しくは１〜１２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５６】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目若しくは１〜１１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５７】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目若しくは１〜１０番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５８】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜８番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目若しくは１〜９番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００５９】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜９番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目若しくは１〜８番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６０】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１０番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目若しくは１〜７番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６１】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１１番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目若しくは１〜６番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６２】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１２番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目若しくは１〜５番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６３】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１３番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目若しくは１〜４番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６４】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１４番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目、１〜２番目若しくは１〜３番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６５】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１５番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目若しくは１〜２番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６６】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１６番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド又は配列番号１１のアミノ酸配列のN末端から１番目が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６７】
ルシフェラーゼのC末端フラグメントが、配列番号９のアミノ酸配列のＣ末端から１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるペプチドであるとき、ルシフェラーゼのN末端フラグメントとしては、配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドを例示することができる。
【００６８】
本発明の方法において、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させる。例えば、ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な細胞に導入し、適当な時間培養することにより、融合タンパク質を細胞に発現させることができる。ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡ及び発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡは、PCR等を用いる公知の方法で調製することができる。発現ベクターとしては、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば真核性のものではp3XFLAG-CMV-9、p3XFLAG-CMV-10、pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40、細菌性のものではpQE70、pQE60、pQE-9、
pBluescriptII KS、pTrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T、pET-11a等がある。ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡは、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡの上流又は下流のいずれに組み込んでもよい。また、ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡとの間には、１〜50個のヌクレオチドからなるリンカー配列を挿入してもよい。
【００６９】
融合タンパク質を発現させる細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などの細胞を例示することができる。
【００７０】
ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを宿主に導入するには、リン酸カルシウム法によるもののほか、Lipofectamine、Lipofectamine2000（いずれもインビトロジェン）、GeneJuice（メルク）、Xfect（クロンテック）、FuGENE 6 （ロシュ・アプライド）、HilyMax（同仁化学研究所）などの市販の遺伝子導入試薬を用いればよい。
【００７１】
発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントは、例えば、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントをコードするＤＮＡを組み込んだベクターをタンパク質発現用宿主（例えば、大腸菌）に導入し、適当な時間培養した後、培養物から目的のタンパク質（発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメント）を採取することができる。目的のタンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地から目的のタンパク質を分離し、精製すればよい。目的のタンパク質が宿主の細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物から目的のタンパク質を分離し、精製すればよい。
【００７２】
融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出する。例えば、融合タンパク質を発現する細胞の培養液に発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントを添加し、適当な時間静置した後、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出するとよい。ターゲットタンパク質と発光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光タンパク質のN末端フラグメントを添加する場合には、発光基質を加えてから、発光の有無又は発光波長の変化を検出するとよい。発光基質は、発光タンパク質の種類により、適宜、選択するとよい。例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼの場合は、発光基質としてルシフェリンを選択するとよい。発光タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなる北米産ホタル天然ルシフェラーゼ又は配列番号７のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである場合、発光基質ルシフェリンであるとよい。また、発光タンパク質と発光基質のモル比は、発光タンパク質と発光基質の種類等により、当業者であれば、適宜決定することができるであろう。
【００７３】
発光波長は、発光タンパク質の種類により、適宜選択すればよいが、発光タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなる北米産ホタル天然ルシフェラーゼ又は配列番号７のアミノ酸配列からなる変異型ルシフェラーゼである場合、発光波長は562ｎｍが適当である。
【００７４】
蛍光波長は、励起波長とともに、蛍光タンパク質の種類により、適宜選択すればよいが、例えば、以下のような励起波長と蛍光波長を選択するとよい。
【００７５】
青色蛍光タンパク質であるEBFPの場合は、励起波長380 nm−蛍光波長 440 nm、  シアン色蛍光タンパク質であるCFPの場合は励起波長433 nm−蛍光波長475 nm、緑色蛍光タンパク質であるEGFPの場合は励起波長488 nm−蛍光波長509 nm、黄色蛍光タンパク質であるYFPの場合は励起波長514 nm−蛍光波長527 nm、赤色蛍光タンパク質であるDsRed2の場合は励起波長563 nm−蛍光波長582 nm、赤外光蛍光タンパク質であるmPlumの場合は励起波長590 nm−蛍光波長649 nmをそれぞれ選択する。
【００７６】
発光又は蛍光の検出は、市販の装置を用いて行なうことができる。
【００７７】
ターゲットタンパク質が生体膜透過性を有する場合には、融合タンパク質が細胞の外に分泌され、添加した発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと結合し、（発光タンパク質の場合は、発光基質の添加により）、発光若しくは発光波長の変化又は蛍光の若しくは蛍光波長の変化が観察される。
【００７８】
ターゲットタンパク質が生体膜透過性を有さない場合には、融合タンパク質が細胞の外に分泌されないので、添加した発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと結合できず、発光若しくは発光波長の変化又は蛍光の若しくは蛍光波長の変化は観察されない。
【００７９】
本発明の方法は、細胞破砕液や細胞抽出液を調製することなく、生細胞のままで、発光又は蛍光を測定することができる。
【００８０】
また、反応が一段階のため、新たに発光基質等の添加の必要がないという利点もある。
【００８１】
本発明により、生細胞における、ターゲットタンパク質の局在確認（細胞膜内・外）、発現量の変化の測定、細胞内輸送時間の測定、in vivoイメージングなどが可能となる。
【００８２】
本発明の方法により、生細胞におけるターゲットタンパク質の局在（細胞膜内・外）を確認するには、以下のようにするとよい。
【００８３】
細胞外への分泌有無を確認したいタンパク質（ターゲットタンパク質）と発光または蛍光タンパク質のＣ末端との融合タンパク質を発現する遺伝子を構築し、培養細胞にトランスフェクションする。一定時間インキュベートし、培地に発光または蛍光タンパク質のＮ末端を含む試薬を投入し、発光・蛍光強度を測定する。
【００８４】
ターゲットタンパク質の細胞内への取り込みを調べる場合は、予め培養細胞の細胞質で発光または蛍光タンパク質のＮ末端のみを発現させておく。ターゲットタンパク質とＣ末端との融合タンパク質を含む試薬を培地に投入して一定時間インキュベートする。その後、発光または蛍光強度を測定する。光強度がターゲットタンパク質の細胞への取り込み、すなわち細胞膜透過性を反映している。
【００８５】
本発明の方法により、生細胞におけるターゲットタンパク質の細胞内輸送時間を測定するには、以下のようにするとよい。
【００８６】
細胞膜表面に発現することが判明しているタンパク質をターゲットタンパク質とする。このたーガットタンパク質と発光または蛍光タンパク質のＣ末端の融合タンパク質を発現するベクターを構築し、細胞にトランスフェクトする。一定時間培養し、細胞をＰＢＳバッファーで洗浄して細胞数をカウントして細胞数を調製した懸濁液を得る。細胞懸濁液に細胞膜表面に発現しているタンパク質を不活性化する化合物（例えばSulfo-NHS）を添加する。これにより、細胞膜表面に発現しているタンパク質の活性が一度失われる。その後、細胞内輸送を阻害する試薬、例えばBrefeldin
A（BFA）を細胞懸濁液に添加したサンプル（処理区）、無添加のサンプル（無処理区）を設定する。それぞれの実験区に発光または蛍光タンパク質のＮ末端を含む試薬を添加して一定時間インキュベートして蛍光・発光強度を測定する。処理区・無処理区の強度を比較することにより細胞内輸送阻害の有無を判定する。
【００８７】
本発明の方法により、ターゲットタンパク質のin vivoイメージングを行なうには、以下のようにするとよい。
【００８８】
ターゲットタンパク質の細胞外への分泌有無を確認したい場合、ターゲットタンパク質の細胞への取り込みを調べる場合とに分けられるがターゲットタンパク質の調製や実験操作における強度の測定までは上記と同様である。光強度の測定と細胞・組織観察を行うため、発光・蛍光強度を検出できる顕微鏡、例えば共焦点レザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）や光電子増倍管を搭載した微弱な発光を検出できる生物発光顕微鏡を使用して組織・細胞の観察を行う。
【００８９】
本発明の方法において、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントは役割を入れ替えてもよい。すなわち、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出してもよい。
【００９０】
また、本発明は、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記Ｎ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬を提供する。このような試薬は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法に用いることができる。
【００９１】
本発明の試薬は、さらに、発光基質を含んでもよい。発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとＣ末端フラグメント、発光基質は上述の通りである。本発明の試薬は、さらに、増感剤（例えば、ベンゾフェノン、ローズベンガルなど）、Mgイオン、コエンザイムＡ、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、アスコルビン酸、有機イオウ系還元剤など）などを含んでもよい。
【００９２】
例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼである場合、本発明の試薬において、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメント、発光基質、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ、還元剤のモル比は、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメント：発光基質：増感剤：Mgイオン：コエンザイムＡ：還元剤＝１：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000であるとよい。
【００９３】
本発明は、上記の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキットも提供する。
【００９４】
本発明のキットの構成要素であるベクターは、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有する。ベクターは、さらに、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン、タグなどが付加されていてもよい。
【００９５】
本発明のキットは、さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含んでもよい。このような細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００９６】
また、本発明は、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるための試薬であって、前記Ｃ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬を提供する。このような試薬は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法に用いることができる。
【００９７】
本発明の試薬は、さらに、発光基質を含んでもよい。本発明の試薬は、さらに、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ、還元剤などを含んでもよい。発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとＣ末端フラグメント、発光基質、増感剤、還元剤は上述の通りである。例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼである場合、本発明の試薬において、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメント、発光基質、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ、還元剤のモル比は、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメント：発光基質：増感剤：Mgイオン：コエンザイムＡ：還元剤＝１：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000であるとよい。
【００９８】
本発明は、上記の試薬、及び発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有するベクターを含む、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べるためのキットも提供する。
【００９９】
本発明のキットの構成要素であるベクターは、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントをコードするDNAとその上流又は下流に制限酵素部位とを含有する。ベクターは、さらに、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン、タグなどが付加されていてもよい。
【０１００】
本発明のキットは、さらに、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を発現させる細胞を含んでもよい。このような細胞としては、宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【０１０１】
本発明は、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号３又は９のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号３又は９のアミノ酸配列のＮ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチドを提供する。
【０１０２】
また、本発明は、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントであるペプチドであって、配列番号５又は１１のアミノ酸配列からなる前記ペプチド又は配列番号５又は１１のアミノ酸配列のＣ末端から１番目、１〜２番目、１〜３番目、１〜４番目、１〜５番目、１〜６番目、１〜７番目、１〜８番目、１〜９番目、１〜１０番目、１〜１１番目、１〜１２番目、１〜１３番目、１〜１４番目、１〜１５番目、１〜１６番目若しくは１〜１７番目のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなる前記ペプチドを提供する。
【０１０３】
本発明のペプチドは、公知の方法によって製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、組換え蛋白質として生産させることにより、本発明のペプチドを製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１０４】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、PCR等を用いる公知の方法で調製することができる。
【０１０５】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターは、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの上流又は下流に制限酵素部位を含有してもよい。ベクターの制限酵素部位にターゲットタンパク質をコードするＤＮＡを組み込み、このベクターを細胞に導入することにより、この細胞にターゲットタンパク質と本発明のペプチドとの融合タンパク質を発現させ、ターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べたり、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べることができる。
【０１０６】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３， pGACAG）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【０１０７】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【０１０８】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、p3XFLAG-CMV-9、p3XFLAG-CMV-10、pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40、細菌性のものではpQE70、pQE60、pQE-9、pBluescriptII KS、pTrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T、pET-11aなどを例示することができる。
【０１０９】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
【０１１０】
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【０１１１】
組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【０１１２】
形質転換体を培地で培養し、培養物から本発明のペプチドを採取することができる。ペプチドが培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からペプチドを分離し、精製すればよい。ペプチドが形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からペプチドを分離し、精製すればよい。
【０１１３】
本発明のペプチドは、上記のようなターゲットタンパク質の生体膜透過性を調べる方法に利用することができる。
【０１１４】
さらに、本発明は、発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出することを含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べる方法であって、前記Ｎ末端フラグメントとＣ末端フラグメントが相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記方法を提供する。上記の方法において、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとN末端フラグメントは役割を入れ替えてもよい。すなわち、発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントを細胞に発現させた後、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化又は蛍光の有無若しくは蛍光波長の変化を検出してもよい。
【０１１５】
本発明は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記Ｃ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬も提供する。この試薬は、さらに、発光基質、増感剤、Mgイオン、コエンザイムA、還元剤などを含んでもよい。これらの成分は上述した通りである。例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼである場合、本発明の試薬において、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質、発光基質、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ、還元剤のモル比は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のC末端フラグメントとの融合タンパク質：発光基質：増感剤：Mgイオン：コエンザイムＡ：還元剤＝１：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000であるとよい。
【０１１６】
また、本発明は、上記の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキットも提供する。このキットは、さらに、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントをコードするＤＮＡを含有するベクター、発光又は蛍光タンパク質のＮ末端フラグメントを発現させる細胞を含んでもよい。ベクターや細胞は上述した通りである。
【０１１７】
本発明は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるための試薬であって、前記Ｎ末端フラグメントは発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントと相互作用したときに発光又は蛍光が生じる前記試薬も提供する。この試薬は、さらに、発光基質、増感剤、Mgイオン、コエンザイムA、還元剤などを含んでもよい。これらの成分は上述した通りである。例えば、発光タンパク質がルシフェラーゼである場合、本発明の試薬において、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質、発光基質、増感剤、Mgイオン、コエンザイムＡ、還元剤のモル比は、ターゲットタンパク質と発光又は蛍光タンパク質のN末端フラグメントとの融合タンパク質：発光基質：増感剤：Mgイオン：コエンザイムＡ：還元剤＝１：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000：10,000〜10,000,000であるとよい。
【０１１８】
また、本発明は、上記の試薬を含む、ターゲットタンパク質が細胞に取り込まれる活性を調べるためのキットも提供する。このキットは、さらに、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡを含有するベクター、発光又は蛍光タンパク質のＣ末端フラグメントを発現させる細胞を含んでもよい。ベクターや細胞は上述した通りである。
【実施例】
【０１１９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２０】
〔実施例１〕
I．実験方法
１．ベクターの作製
検体細胞にトランスフェクションするためのベクターとしては、シグマ・アルドリッジ社製の市販品p3XFLAG-CMV-9又はp3XFLAG-CMV-10に検出したいタンパク質と融合される小断片を組み込んだもの（C末端側ベクター：p3xFLAG-CMV-9-CLuc（細胞外に分泌する）、p3xFLAG-CMV-10-CLuc（非分泌）を作製した（図３）。CLucは天然ルシフェラーゼの399〜550番目のアミノ酸を含んでいる（図４−１）。CLucのDNA断片はPCRにより増幅することにより得た。すなわち、天然ルシフェラーゼの399〜407番目のアミノ酸配列に対応したDNA配列を持ち、かつ制限酵素によるクローニングを容易にするため5'末端側にHindIIIの認識配列を持つプライマー（センスプライマー）、及び天然ルシフェラーゼの543〜550番目のアミノ酸配列に対応したDNA塩基配列と3'末端側にXbaIの認識配列を持つプライマー（アンチセンスプライマー）を合成した。これらのプライマーを使用し、天然ルシフェラーゼのDNA配列を持つ市販のベクター（PGV-C2 東洋インキ社製）を鋳型としてPCRを行った。増幅したDNA断片をアガロースゲルに電気泳動を行い、目的の断片を切り出して、p3XFLAG-CMV-9又はp3XFLAG-CMV-10のHind III-XbaIサイトにライゲーションにより挿入した。
【０１２１】
検出試薬側に加える大断片（N末端）の精製タンパク質を得るため、大腸菌にN末端タンパク質を大量発現するためのベクター（pTri6-NLuc）を作製した（図３）NLucは天然ルシフェラーゼの1〜416番目のアミノ酸を含む（図４−１）。NLucのDNA断片もCLucと同様にPCRにより増幅することにより得た。天然ルシフェラーゼの1〜7番目のアミノ酸配列に対応したDNA塩基配列と5'末端にKpnIの認識配列を持つプライマー（センスプライマー）、及び天然ルシフェラーゼの409-416番目のアミノ酸配列に対応したDNA塩基配列と3'末端にBamHIの認識配列を持つプライマー（アンチセンスプライマー）を合成し、上記と同様の方法でDNA断片を得て、pTriEX-6（メルク社製）のKpnI-BamHIサイトにライゲーションした。
【０１２２】
p3XFLAG-CMV-9またはp3XFLAG-CMV-10を大腸菌JM109株に導入し、プラスミドを保持した菌株を得た。この菌株をLB培地で37℃、16時間培養した。次に、Plasmid
Maxi Kit（キアゲン社製）を用い、製品取扱説明書の手順に従いプラスミドDNAの抽出・精製を行った。
【０１２３】
２．N末端側タンパク質の単離・精製
pTri6-NLucをタンパク質発現用大腸菌（BL21(DE3)；メルク社製）に導入し、Overnight Express Instant LB
Medium（メルク社製）で１６時間、NLucタンパク質の発現を誘導しつつ培養した。菌体を溶解してタンパク質を抽出してHis-tagカラムを用いてNLucを回収した。
【０１２４】
３．C末端側タンパク質の動物細胞への導入
p3xFLAG-CMV-9-CLuc、p3xFLAG-CMV-10-CLucそれぞれを遺伝子導入試薬（Lipofectamine 2000試薬；インビトロジェン社製）を用いてHEK293細胞にトランスフェクションして24時間培養した。
【０１２５】
４．発光測定
トランスフェクションした細胞を培養しているウェルから培地  100 mlを抜き取り、そこにHis-tag精製したNLuc  50mlを添加した。室温に30分静置した後、ピッカジーン（東洋ビーネット）100 mlを添加して5秒間の発光量を測定した。
【０１２６】
また、CLucを発現している細胞株から細胞溶解剤を用いて細胞ライセートを得た。細胞ライセートには発現させたClucが含まれている。細胞ライセート100mlに対しNLuc 50 mlを添加した後、ピッカジーン100 mlを添加して5秒間の発光量を測定した（ベルトールド社製  LB9607）。
【０１２７】
II．結果および考察
１．発光量測定結果
実験方法４での測定結果を下表に示す。
【０１２８】
【表１】
2011200146.tif 000003
２．考察
分泌型ベクターを使用した場合、培地中にCLucが含まれているため、NLucを添加することによりN-C複合体が形成されて発光反応が生じると考えられる。非分泌型ベクターの結果より、細胞中にCLucは存在するが培地中には存在しないこと、およびCLucの漏出は発生していないことが示唆される。さらに、非分泌ベクター導入細胞の培地と細胞ライセートの発光量の比較から、NLucは細胞内には浸入していないと考えられる。
【０１２９】
〔実施例２〕
検出されるタンパク質（ターゲットタンパク質）にGaussiaルシフェラーゼを使用した。Gaussiaルシフェラーゼは、Gaussia princeps（カイアシ）よりクローン化された公知のルシフェラーゼである（Ballou et al. 11th Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Asilomar, Carifornia(2000), Verhaegent et al. Anal. Chem. 74 4378-85(2002), Tannous, et al. Mol Ther, 11:435-43, Siouxsie Wiles, et al. Appl. Envir. Microbiol. 71:3427-3432(2005), Svetlana J. Biol. (2004)279:3212-3217)。本ルシフェラーゼは185アミノ酸から構成され、分子サイズが19.9kDaである。また、ウミシイタケルシフェラーゼと同様にセレンテラジンを酸化する能力を有する。そのため、480 nmをピークとする光を放射する。さらに、Gaussiaルシフェラーゼは細胞外に容易に分泌されるタンパク質であることが判明している。Gaussiaルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列をDNA（図５）、NLuc、CLuc共に耐熱性を持たせるため変異を入れ（CLuc530、NLuc-TS）（図４−２）、C末端側ベクター（(1) pTri-CLuc（ネガティブコントロール・非耐熱）、(2) pTri-GL-CLuc（分泌・非耐熱）、(3) pTri-CLuc530（ネガティブコントロール・耐熱）、(4) pTri-GL-Cluc530（分泌・耐熱））とＮ末端側ベクター（pTri6-NLucTS）を作製し、実施例１と同様の実験を行なった。但し、ベクターとしては、実施例１のシグマ・アルドリッジ社製の市販品p3XFLAG-CMV-9又はp3XFLAG-CMV-10の代わりに、pTriEX-3（メルク社製）を用いた。
【０１３０】
II．結果および考察
１．発光量測定結果
結果を図６に示す。
【０１３１】
２．考察
(1)〜(4)のベクターを導入した細胞（HEK293）の培地の発光量を測定した。分泌ターゲットタンパク質であるGaussiaルシフェラーゼを融合させたベクターを導入した場合に発光が確認された。また、耐熱性ルシフェラーゼを使用した場合は非耐熱性ルシフェラーゼより約3.8倍の発光が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、生細胞における、ターゲットタンパク質の局在確認（細胞膜内・外）、発現量の変化の測定、細胞内輸送時間の測定、in vivoイメージングなどに利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３３】
＜配列番号１＞
配列番号１は、天然ホタルルシフェラーゼ（非耐熱）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、天然ホタルルシフェラーゼ（非耐熱）の塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、CLuc（非耐熱）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、CLuc（非耐熱）の塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、NLuc（非耐熱）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、NLuc（非耐熱）の塩基配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、変異型ホタルルシフェラーゼ（耐熱）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、変異型ホタルルシフェラーゼ（耐熱）の塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、CLuc530（耐熱）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、CLuc530（耐熱）の塩基配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、NLuc-TS（耐熱）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、NLuc-TS（耐熱）の塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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