(57)【要約】      （修正有）【課題】マイコプラズマ・ニューモニエから単離される新規な抗原物質、該物質に特異的に結合する抗体、及び該抗体を含有するマイコプラズマ・ニューモニエ感染の診断用組成物の提供。【解決手段】下式で表されるマイコプラズマ・ニューモニエから単離されるグリセロ型糖脂質の抗原物質、該物質に特異的に結合する抗体、及び該抗体を含有するマイコプラズマ・ニューモニエ感染の診断用組成物。2011079830.tif 000011【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で表される化合物：
2011079830.tif 000009
（式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、かつ、Ｒ３は飽和、不飽和を問わない任意の炭化水素基から独立して選択可能であるか、または
Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨであり、かつ、Ｒ３は飽和炭化水素基である。）
または、その塩。
【請求項２】
マイコプラズマ・ニューモニエ由来の単離された天然化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
合成化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３が、―（ＣＨ２）ｎＣＨ３（但し、ｎは、１２、１４、１６、または１８である）である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、―（ＣＨ２）ｎＣＨ３（但し、ｎは、１４または１６である）である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
以下の化合物：
３−Ｏ−［（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、
３−Ｏ−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、または
これらの塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物を含有する組成物。
【請求項８】
下記一般式で表される化合物に特異的に結合する抗体：
2011079830.tif 000010
（式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、かつ、Ｒ３は飽和、不飽和を問わない任意の炭化水素基から独立して選択可能であるか、または
Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨであり、かつ、Ｒ３は飽和炭化水素基である。）
または、その塩。
【請求項９】
Ｒ３が、―（ＣＨ２）ｎＣＨ３（但し、ｎは、１２、１４、１６、または１８である）である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
Ｒ３が、―（ＣＨ２）ｎＣＨ３（但し、ｎは、１４または１６である）である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
以下の化合物：
３−Ｏ−［（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、
３−Ｏ−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、または
これらの塩、
に特異的に結合する抗体である、請求項８〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体である、請求項８〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載の抗体を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離された新規構造であるグリセロ型糖脂質抗原物質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマは、細胞壁を持たず、最も単純かつ小さい微生物群である。その一種であるマイコプラズマ・ニューモニエは、マイコプラズマ肺炎の原因微生物である。マイコプラズマ肺炎は、特に小児の肺炎において肺炎双球菌やクラミジア感染によるものとの区別がつきにくく、それらに対する抗生物質はマイコプラズマには無効である。この診断を誤り、間違った抗生物質の使用により、重篤な症状に陥ることもまれではない。よって、正確な感染の判断および病気の診断を行うことが求められている。
【０００３】
しかしながら、現行のマイコプラズマ・ニューモニエ検出法は、マイコプラズマ・ニューモニエの抽出混合物を抗原として利用したものであり、特異性が低いこと、および抽出物のロット間の差異により再現性が維持されないこと等の問題がある。
【０００４】
また、マイコプラズマ・ニューモニエは、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患の原因物質としても報告されている。しかしながら、その疾患発症のメカニズムは未だ解明されていない（特開２００５−１１０５４５号公報；ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，３０，４，３７１−３７５．；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００４，１５，２−３，１５７−１６８．；Ｂｒａｉｎａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００５，２７，６，４３１−４３３．）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１１０５４５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，３０，４，３７１−３７５．
【非特許文献２】Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ ＦａｃｔｏｒＲｅｖｉｅｗｓ，２００４，１５，２−３，１５７−１６８．
【非特許文献３】Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００５，２７，６，４３１−４３３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような状況下で、マイコプラズマ・ニューモニエの感染の正確な判断方法およびこの微生物に関連する疾患の正確な診断方法が確立されることが望まれている。特に、特異性の高いマイコプラズマ・ニューモニエ検出法が望まれている。
【０００８】
本発明者らは、マイコプラズマ・ニューモニエの病原性の解明をするために、マイコプラズマ・ニューモニエの膜脂質画分から抗原性を有する糖脂質を分離、精製し、構造解析を試みた。その結果、重要な生理活性を有する可能性のある新規な糖脂質を分離することに成功し、その絶対構造を決定した。さらに、本発明の糖脂質抗原に対する抗体が、神経疾患の患者に見出されることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、以下の化合物（本発明のグリセロ型糖脂質）、それを含有する組成物、診断剤、またはキット、およびこれらを用いたマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断方法を提供する。
（１）下記一般式で表される化合物：
2011079830.tif 000002
（式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨである。Ｒ３は飽和、不飽和を問わない任意の炭化水素基から独立して選択可能である。）
または、その塩。
（２）Ｒ３が、―（ＣＨ２）ｎＣＨ３（但し、ｎは、１２、１４、１６、または１８である）である、上記（１）に記載の化合物。
（３）以下の化合物：
３−Ｏ−［（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、
３−Ｏ−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、またはその塩である、上記（１）に記載の化合物。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を含有する組成物。
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を含有する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤。
（６）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（５）に記載の診断剤。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物または上記（４）に記載の組成物を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断用キット。
（８）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（７）に記載の診断用キット。
（９）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物または上記（４）に記載の組成物を、被験者由来の試料と接触させる工程、および
上記試料中の上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物に対する抗体を免疫学的に検出または測定する工程、
を包含する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断方法。
（１０）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（９）に記載の診断方法。
（１１）ガラクトースを非還元末端に有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を利用した上記（５）〜（１０）のいずれかに記載の診断剤、診断キット、または診断方法。
（１２）グルコースを非還元末端に有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を利用した上記（５）〜（１０）のいずれかに記載の診断剤、診断キット、または診断方法。
（１３）下記一般式で表される化合物に対する抗体：
2011079830.tif 000003
（式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨである。Ｒ３は飽和、不飽和を問わない任意の炭化水素基から独立して選択可能である。）
または、その塩。
（１４）Ｒ３が、―（ＣＨ２）ｎＣＨ３（但し、ｎは、１２、１４、１６、または１８である）である、上記（１３）に記載の抗体。
（１５）以下の化合物に対する抗体：
３−Ｏ−［（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、
３−Ｏ−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール、またはその塩、
である、上記（１３）に記載の抗体。
（１６）モノクローナル抗体である、上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の抗体。
（１７）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体を含有する組成物。
（１８）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体を含有する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤。
（１９）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（１８）に記載の診断剤。
（２０）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体または上記（１７）に記載の組成物を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ検出用キット。
（２１）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体または上記（１７）に記載の組成物を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断用キット。
（２２）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（２１）に記載のキット。
（２３）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体または上記（１７）に記載の組成物を、試料と接触させる工程、および
上記試料中の抗原物質と上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体との結合を免疫学的に検出または測定する工程、
を包含する、マイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出するための方法。
（２４）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体または上記（１７）に記載の組成物を、被験者由来の試料と接触させる工程、および
上記試料中の抗原物質と上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体との結合を免疫学的に検出または測定する工程、
を包含する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断方法。
（２５）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（２４）に記載の方法。
【００１０】
本発明はまた、以下のマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤の製造方法を提供する。
（２６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物または上記（４）に記載の組成物を、適切な支持体または担体と結合させる工程を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤の製造方法。
（２７）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（２６）に記載の製造方法。
（２８）上記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の抗体または上記（１６）に記載の組成物を、適切な支持体または担体と結合させる工程を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤の製造方法。
（２９）上記疾患が、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患である、上記（２８）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のグリセロ型糖脂質は、マイコプラズマ・ニューモニエの主要な抗原であるため、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度・正確に検出するための分子基盤となりうる。よって、この糖脂質を利用してマイコプラズマ・ニューモニエが原因である病気の正確な診断法、診断剤および診断キットの開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の３−Ｏ−［（β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１，６）−（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）］−１，２−ｄｉａｃｙｌ−Ｏ−ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（１）、および３−Ｏ−［（β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１，６）−（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）］−１，２−ｄｉａｃｙｌ−Ｏ−ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（２）の構造を示す図である。
【図２】実施例１において抽出した脂質試料について、薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により脂質試料を展開し、オルシノール試薬にて染色した図である。
【図３】実施例１において得られた脂質画分について、ＤＭＳＯ−ｄ６１００％中で測定したＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図である。
【図４】実施例１において得られた脂質画分について、ＥＳＩ−ＭＳ測定による分析により得られたスペクトルチャートである。
【図５】マイコプラズマ・ニューモニエの脂質画分をＴＬＣ展開し、（ａ）：オリシノール試薬にて染色した結果、および（ｂ）：ギランバレー症候群の患者血清との反応をＴＬＣ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法にて検出した結果を示す図である。（ｂ）に示すように、糖脂質抗原のスポットが発色しており、これは、ギランバレー症候群の患者が糖脂質抗原に対する抗体を保持していることを示す。
【図６】実施例３において、Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用したＥＬＩＳＡ法によって調査した疾患群と非疾患群とのスコア値の分布を示す図である。
【図７】実施例３において、Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用したＥＬＩＳＡ法による実験結果を、感度対偽陽性率の値で表したＲＯＣ曲線（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｃｕｒｖｅ）である。
【図８】ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図を示す。図中の符号は、それぞれ以下を表す。１ 粘着シート；２ 含浸部材；３ 膜担体；３１ 捕捉部位；４吸収用部材；５ 試料添加用部材。
【図９】マイコプラズマ・ニューモニエ菌体から抽出した脂質混合物、および化学合成により作製したＧａｌβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧをＨＴＬＣプレートに展開して、得られたヤギ血清を反応させた結果を示す写真である。右図は、得られたヤギ血清を使用して免疫染色した結果である。左図は、化合物を展開したＨＴＬＣプレートをオリシノール染色した結果である。
【図１０】Ｇａｌβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを抗原と硫安分画により精製したモノクローナル抗体との反応性を示すＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。モノクローナル抗体が、ＧａｌＧＬおよびＧｕｌＧＬのいずれとも反応した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、マイコプラズマ・ニューモニエの抗原物質の中から、特に抗原性が強い主要な化合物の単離・精製、に成功した。またその構造解析を行い、新規グリセロ型糖脂質を同定した。
【００１４】
１．本発明のグリセロ型糖脂質
１つの実施形態において、本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエの抗原物質から新たに単離され、構造決定されたグリセロ型糖脂質を提供する。
【００１５】
本発明により提供されるグリセロ型糖脂質は、マイコプラズマ・ニューモニエが生成する、以下の構造式で表されるグリセロ型糖脂質：
2011079830.tif 000004
（式中、Ｒ１＝ＯＨのとき、Ｒ２＝Ｈであり、Ｒ１＝Ｈのとき、Ｒ２＝ＯＨである。Ｒ３は飽和、不飽和を問わない任意の炭化水素基から独立して選択可能である。）
または、その塩である。好ましくは、Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは１２、１４，１６、または１８である）で表される飽和炭化水素である。
【００１６】
特に好ましくは、本発明により提供されるグリセロ型糖脂質は、下記の構造式：
2011079830.tif 000005
で表されるグリセロ型糖脂質、またはその塩である。
【００１７】
上記構造式において、（１）の場合は、３−Ｏ−［（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール（３−Ｏ−［（β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１，６）−（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（本明細書中、「Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧ」と略すことがある。）であり、（２）の場合は、３−Ｏ−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，６）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−アシル−ｓｎ−グリセロール（３−Ｏ−［（β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−（１，６）−（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）］−１，２−ｄｉ−Ｏ−ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（本明細書中、「Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧ」と略すことがある。）である。但し、アシル（ａｃｙｌ）基は、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｒｙｌ）基もしくはステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）基である。
【００１８】
本明細書中、「本発明のグリセロ型糖脂質」という場合、上記構造式で表されるグリセロ型糖脂質およびその塩を指すものとする。塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが含まれる。
【００１９】
本発明のグリセロ型糖脂質は、マイコプラズマ・ニューモニエが産生する糖脂質であり、マイコプラズマ・ニューモニエの検出、またはマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断のためのマーカーとして有用である。例えば、本発明のグリセロ型糖脂質に対して特異的に結合する抗体を用いることにより、免疫学的手法を用いてマイコプラズマ・ニューモニエの検出、またはマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断を行うことができる。
【００２０】
２．本発明のグリセロ型糖脂質に対する自己抗体を検出することによる、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断方法
本発明の１つの実施形態によれば、被験者由来の試料中の抗グリセロ型糖脂質抗体の存在により特徴づけられるマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断方法が提供される。この方法は、本発明のグリセロ型糖脂質を被験者由来の試料と接触させる工程を包含する。
【００２１】
本発明の方法において使用する、抗グリセロ型糖脂質抗体の測定方法としては、被験者由来の試料中の抗グリセロ型糖脂質抗体の測定を可能とするものであれば特に限定されない。典型的には、抗原抗体反応に基づく免疫学的測定法が挙げられる。本発明において使用する免疫学的測定法は、被験者由来の試料と本発明のグリセロ型糖脂質とを接触させる工程、および被験者由来の試料中の抗グリセロ型糖脂質抗体と本発明のグリセロ型糖脂質との免疫複合体の存在を検出する工程を包含する。
【００２２】
本明細書中、「マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患」とは、マイコプラズマ・ニューモニエの感染によって引き起こされる疾患を意味する。マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患は、典型的には、本発明のグリセロ型糖脂質またはこれらの塩、あるいは本発明のグリセロ型糖脂質に対する自己抗体が、当該疾患の患者由来の生体試料中で検出されることによって特徴づけられる。マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の例としては、マイコプラズマ肺炎、喘息、神経疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中、「被験者」とは、マイコプラズマ・ニューモニエに感染しているおそれのある哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス等を含む）を意味するが、好ましくは、ヒトであり、最も好ましくは、マイコプラズマ・ニューモニエに感染しているヒト、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患を罹患しているおそれのあるヒト、またはマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患を罹患しているヒトを意味するものとする。
【００２４】
本明細書中、「試料」または「生体試料」とは、被験者から採取された体液、例えば、全血、血漿、血清、関節液、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液、滑液など、および組織、細胞などを含むものとする。
【００２５】
本発明の、被験者に由来する試料中の自己抗体の検出に基づく、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断および予知方法は、このような疾患を有する被験者および疾患のないコントロールからの生体試料の使用により確認される。自己抗体を含有する可能性のある生体試料、たとえば血清は、特定の疾患の存在が疑われる被験者または疾患を発症する素因が疑われる被験者から得られる。同じ体液が、疾患を有さないコントロールから得られる。
【００２６】
本発明によれば、本発明のグリセロ型糖脂質抗原に対して反応性の自己抗体の測定を、疾患、例えば、マイコプラズマ肺炎の初期診断に使用することができる。さらに、自己抗体レベルのモニタリングは疾患の進行を予知的に明らかにするために使用することができる。
【００２７】
３．抗グリセロ型糖脂質抗体の測定方法
試料、例えば、被験者由来の血清試料中の本発明のグリセロ型糖脂質に対する自己抗体の検出は任意の多くの方法で実行することができる。このような方法にはイムノアッセイがあり、これにはそれらに限定するものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ等が包含される。
【００２８】
このようなイムノアッセイは、被験者由来の試料を、本発明のグリセロ型糖脂質抗原またはそれを含有する組成物と特異的な抗原−抗体結合が起こる条件下に接触させ、自己抗体による免疫特異的結合を検出またはその量を測定することからなる方法によって実施される。特定の態様においては、組織切片によるこのような自己抗体の結合を、たとえば自己抗体の存在を検出するために使用することが可能であり、この場合、自己抗体の検出は疾患状態であることを示す。血清試料中における自己抗体のレベルを、疾患を有しない被験者からの同種の血清試料中に存在するレベルと比較する。
【００２９】
イムノアッセイは様々な方法で実施することができる。たとえば、このようなアッセイを実施するための一つの方法は、本発明のグリセロ型糖脂質の固体支持体上への繋留およびそれに特異的に結合する抗グリセロ型糖脂質抗体の検出を含む。
【００３０】
試料中の抗グリセロ型糖脂質抗体の測定方法は、より具体的には、例えば、以下のような工程を包含する：
（１）固相に固定化した本発明のグリセロ型糖脂質と生体試料中の抗グリセロ型糖脂質抗体とを反応させ、免疫複合体を形成させる工程（一次反応）、
（２）（１）の工程で生成した免疫複合体と標識化抗ヒトイムノグロブリン抗体とを反応させ、免疫複合体を形成させる工程（２次反応）、
（３）免疫複合体を形成しない標識化抗ヒトイムノグロブリン抗体を固相から分離する工程、
（４）固相に生成した免疫複合体中の標識量または標識活性を測定する工程、
（５）予め既知濃度の抗グリセロ型糖脂質抗体を用いて作成した検量線と、（４）の測定で得られた測定値とを比較する工程。
【００３１】
上記の（１）の工程と（２）の工程との間に、必要に応じて、一次反応後の固相を洗浄する工程を追加してもよい。また、（１）および（２）の工程を同時に行ってもよい。また、本発明の生体試料中の抗グリセロ型糖脂質抗体の測定においては、二次反応でビオチン化抗ヒトイムノグロブリン抗体などと反応させてもよい。この場合、二次反応により生成した免疫複合体（本発明のグリセロ型糖脂質、抗グリセロ型糖脂質抗体、およびビオチン化抗ヒトイムノグロブリン抗体を含有する複合体）と（ストレプト）アビジン標識化抗体と反応させ、生成した免疫複合体中のアビジン標識化抗体量を測定すればよい。また、二次反応において、（標識化）抗ヒトイムノグロブリン抗体の代わりに、抗グリセロ型糖脂質抗体と反応する（標識化）アプタマーを用いることもできる。
【００３２】
一次反応は、水性媒体中（例えば、ウェル内の液相中）で行われても乾式媒体中（例えば、固相支持体上）で行われてもよい。本発明のグリセロ型糖脂質が固定化される固相としては、例えば、マイクロタイタープレートなどのポリスチレンプレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製または合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜などの各種メンブレン、合成樹脂製の試験管、シリカゲルプレートなどが挙げられる。二次反応についても、水性媒体中で行われても乾式媒体中で行われてもよい。二次反応により固相上に生成した免疫複合体中の標識の量または活性を測定する方法としては、例えば、吸光度法（比色法）、蛍光法、発光法、放射活性法などが挙げられる。標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、免疫複合体中の酵素活性を測定することができる。酵素の基質と当該酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。
【００３３】
上記の方法によりマイコプラズマ・ニューモニエに感染していると判定またはマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患に罹患していると診断された被験者は、適切な処置または治療を受けることができる。
【００３４】
４．本発明のグリセロ型糖脂質を含有する組成物、診断剤、および診断用キット
本発明は、１つの実施形態において、本発明のグリセロ型糖脂質を含有する組成物を提供する。本発明はまた、別の実施形態において、本発明のグリセロ型糖脂質を含有する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤を提供する。本発明はさらに別の実施形態において、本発明のグリセロ型糖脂質または本発明の上記組成物を含有する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断用キットを提供する。
【００３５】
本発明のグリセロ型糖脂質を含有する組成物は、適切な担体、賦形剤、緩衝剤、希釈剤等を含み得る。本発明の組成物は、例えば、本発明のグリセロ型糖脂質に対する抗体を作製する目的でマウス、ラット、ウサギなどの動物に投与するために使用することができる。あるいは、本発明の組成物は、試料中の本発明のグリセロ型糖脂質に対する抗体（例えば、抗Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧ抗体または抗Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧ抗体）を検出するために使用することができる。あるいは、本発明の組成物は、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤として使用され得る。本発明の組成物はまた、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断用のキットに含めることができる。
【００３６】
本発明のグリセロ型糖脂質を含有する上記本発明の診断剤およびキットは、上記で説明した抗グリセロ型糖脂質抗体の測定方法に従って使用される。本発明のキットは、上記で説明した二次反応のためのビオチンなどで標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体などをさらに含有し得る。本発明のキットにおいて、本発明のグリセロ型糖脂質は、例えば、マイクロタイタープレートなどのポリスチレンプレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製または合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜などの各種メンブレン、合成樹脂製の試験管、シリカゲルプレートなどの固相支持体に固定化されていてもよい。本発明のキットはまた、反応を行うための液相として使用するための緩衝液などを含んでいてもよい。さらに、本発明のキットには、製造業者による取扱説明書などが含まれていてもよい。
【００３７】
本発明はまた、１つの実施形態において、本発明のグリセロ型糖脂質または本発明のグリセロ型糖脂質を含有する組成物を適切な支持体または担体に結合させる工程を包含する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤の製造方法を提供する。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどを用いることができる。
【００３８】
５．本発明のグリセロ型糖脂質に対する抗体およびその使用
本発明は、１つの実施形態において、本発明のグリセロ型糖脂質に対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエ固有のグリセロ型糖脂質（本発明のグリセロ型糖脂質）に対して反応特異性を有するので、これを用いて検体中のグリセロ型糖脂質を免疫学的に測定することができる。本発明の抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断に使用することができる。
【００３９】
（Ｉ）本発明の抗体の調製
本発明の抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエ由来の本発明のグリセロ型糖脂質を抗原として動物を免疫し、その動物から血清を分離するか、あるいはその動物の抗体産生細胞を採取し、永続的に培養可能とし、その培養物から回収することによって得られる。以下に、本発明の抗体の調製法を例示するが、これに限定されるものではなく、本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのグリセロ型糖脂質を抗原に用いるならば、その他の方法によって調製してもよい。
【００４０】
（１）ポリクローナル抗体の調製
例えば、後述の実施例に記載されるようにして得られたマイコプラズマ・ニューモニエの脂質抽出物に、モノフォスフェートリピド、フロイント完全アジュバント、及びミネラルオイルを加えて混合し、さらに０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加えて乳化する。
【００４１】
次に、得られた乳化物をマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ等の動物の皮下または腹腔内に投与する。初回免疫後、２〜３週間目に常法によって追加免疫を行うと、力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、硫酸アンモニウムによる塩析、イオン交換クロマトグラフィー等の通常の抗体の精製と同様の方法によってイムノグロブリン画分を取得する。尚、最終免疫の後に、酵素免疫測定法等により血中抗体価の上昇を確認しておくことが望ましい。
【００４２】
上記のようにして得られる抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのグリセロ型糖脂質に対して特異的に結合する。本明細書中、抗体が、ある抗原（例えば、本発明のグリセロ型糖脂質）に対して「特異的に結合する」とは、その抗体が他の物質（例えば、本発明のグリセロ型糖脂質以外の他のグリセロ型糖脂質）に対するその親和性よりも、その抗原に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定の抗原から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００４３】
マイコプラズマ・ニューモニエの脂質抽出物の代わりに、精製した本発明のグリセロ型糖脂質を用いれば、本発明のグリセロ型糖脂質に対して反応特異性を有するポリクローナル抗体が得られる。
【００４４】
（２）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，４９５〜４９２頁、１９７５年）によって得られる。すなわち、グリセロ型糖脂質に対する抗体を産生する哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫（ミエローマ）細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、目的の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、このハイブリドーマを培養することによって培養液中にモノクローナル抗体が得られる。以下、工程ごとに分説する。
【００４５】
（ｉ）動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
グリセロ型糖脂質に対する抗体を産生する細胞は、グリセロ型糖脂質でマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどの動物を免疫し、その動物から脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血液等を調製することにより得られる。上記動物をグリセロ型糖脂質で免疫するには、（１）と同様に行えばよい。
【００４６】
本発明のグリセロ型糖脂質に対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を得るには、精製した本発明のグリセロ型糖脂質で動物を免疫してもよいが、グリセロ型糖脂質混合物で免疫した動物の抗体産生細胞を用いてハイブリドーマを調製し、得られたハイブリドーマから本発明のグリセロ型糖脂質に対して反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生する株を選択してもよい。この方法によれば、動物の免疫に必要な量の本発明のグリセロ型糖脂質を得る必要がなく、酵素免疫法による検出が可能な程度の微量の本発明のグリセロ型糖脂質があればよい。
【００４７】
（ｉｉ）ハイブリドーマの作製
グリセロ型糖脂質で免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、骨髄腫細胞との細胞融合を行う。細胞融合に使用する骨髄腫細胞には種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが好ましい。また、骨髄腫細胞株は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合の骨髄腫細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、８−アザグアニン耐性株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損しており、核酸合成はｄｅｎｏｖｏ合成経路に依存している。このような骨髄腫細胞と正常抗体産生細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）では、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）中で、アミノプテリンによりｄｅｎｏｖｏ合成経路が阻害されても、チミジン、ヒポキサンチンが存在しているので、リンパ球由来のサルベージ回路により核酸合成できるので、増殖が可能である。これに対し、８−アザグアニン耐性の骨髄腫細胞は、アミノプテリンによりｄｅｎｏｖｏ合成経路も阻害されるため、核酸合成できずに死滅し、また正常細胞である抗体産生細胞も長期培養はできない。したがって、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によって生成したハイブリドーマのみがＨＡＴ培地で増殖できるので、非融合細胞から融合細胞を選択することができる（サイエンス第１４５巻７０９頁、１９６４年）。また、骨髄腫細胞として、固有のイムノグロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点で好ましい。
【００４８】
ハイブリドーマを得るための細胞融合は、例えば以下のようにして行う。免疫動物から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して細胞浮遊液を調製する。この脾細胞と、対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞、例えばＳＰ２／０細胞（アザグアニン耐性、ＩｇＧ非分泌：ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１）とを、脾細胞とミエローマ細胞が１０：１〜１：１程度となるように混合し、遠沈後、沈渣に平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコールを、最終濃度が３０〜５０％となるように加えて細胞を融合させる。ポリエチレングリコールを加える代わりに、細胞混合液に電気パルスを印加することによって融合させてもよい。
【００４９】
融合処理を行った細胞は、例えば１０％（ｖ／ｖ）仔ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地などで培養後、ＨＡＴ培地などの選択培地に浮遊させ９６ウェルのマイクロタイタープレートなどに分注して培養を行いハイブリドーマのみを生育させる。
【００５０】
（ｉｉｉ）グリセロ型糖脂質に対して反応特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマの検索
上記のようにして得られたハイブリドーマは、複数の抗原あるいは抗原決定部位に対する各々のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの混合物であるので、これらの中から本発明のグリセロ型糖脂質に対して反応特異性を有するモノクローナル抗体（例えば、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧまたはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧに対して反応特異性を有するモノクローナル抗体）を産生する株を選択する。また、本発明のグリセロ型糖脂質に結合するモノクローナル抗体のうち、抗原性の強い抗原決定部位に対するモノクローナル抗体を産生する株を選択することが好ましい。
【００５１】
グリセロ型糖脂質に対するモノクローナル抗体を産生する株は、これらを抗原として用いる酵素免疫法によって選択できる。このような方法としてＥＬＩＳＡ法、すなわち、抗原をマイクロタイタープレート等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養液を加え、さらに酵素、ケイ光物質、発光物質などで標識した二次抗体を加えてインキュベートし、結合した標識物質によって抗体を検出する方法が挙げられる。その際、抗体を固相化し、これに抗原、標識二次抗体を順次加えてインキュベートしてもよい。尚、ＥＬＩＳＡ法については後に詳述する。
【００５２】
精製された本発明のグリセロ型糖脂質が得られていない場合には、マイコプラズマ・ニューモニエの脂質画分を高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）プレートを用いて分離し、このプレートにハイブリドーマの培養液、標識２次抗体を順次加えてインキュベートし、標識物質が結合する位置を検出する。この位置が本発明のグリセロ型糖脂質（例えば、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧまたはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧ）がＨＰＴＬＣによって展開される位置と同じであれば、そのハイブリドーマはその本発明のグリセロ型糖脂質に対するモノクローナル抗体を産生すると認められる。本発明のグリセロ型糖脂質に対するモノクローナル抗体が得られれば、これを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって、脂質画分から本発明のグリセロ型糖脂質を精製することもできる。
【００５３】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを含むことが確認されたら、そのハイブリドーマが含まれていたウェルの細胞から限界希釈法などによりクローニングを行う。
【００５４】
（ｉｖ）モノクローナル抗体の調製
上記のようにして得られたハイブリドーマを適当な培地中で培養すれば、その培養上清中に本発明のモノクローナル抗体が得られる。さらに常法により、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、あるいは抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィーなどによってモノクローナル抗体を精製することができる。
【００５５】
こうして得られる本発明のグリセロ型糖脂質に対するモノクローナル抗体は、本発明のグリセロ型糖脂質に対して特異的に結合する。したがって、望ましくは、そのようなモノクローナル抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエに感染していない健常人の血清中に存在するシアル酸含有糖脂質（ガングリオシド）、血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセチルグリセロ−３−ホスホコリン）もしくはその部分脱アシル化物、ホスファチジルコリンもしくはその部分脱アシル化物、またはスフィンゴミエリン等の糖脂質及びリン脂質とは交差反応を示さない。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、そのまま使用することもできるが、フラグメント化したものを使用することもできる。抗体のフラグメント化の際、抗体の抗原結合部位（Ｆａｂ）が保存されていることが抗原と抗体との結合に必須であるので、抗原結合部位を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン）で抗体を処理して得られる抗原結合部位（Ｆａｂ）を含むフラグメントは使用することができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲなどが挙げられる。また、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）なども本発明において使用することができる。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮すると、より好ましくはＩｇＧである。
【００５７】
また、本発明のモノクローナル抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に抗原結合部位（Ｆａｂ）を含むフラグメントを作製することが可能である。
【００５８】
６．本発明の抗グリセロ型糖脂質抗体を含有する組成物、診断剤、および診断用キット
本発明は、１つの実施形態において、本発明のグリセロ型糖脂質に対する抗体を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、適切な担体、賦形剤、緩衝剤、希釈剤等を含み得る。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどを用いることができる。
【００５９】
本発明の組成物は、試料中の本発明のグリセロ型糖脂質を検出するために使用することができる。あるいは、本発明の組成物は、生体試料中の本発明のグリセロ型糖脂質を検出することによる、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断に使用することができる。
【００６０】
したがって、本発明はまた、被験者由来の試料中の本発明のグリセロ型糖脂質の存在により特徴づけられるマイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患を診断するための薬剤またはキットを提供し、この薬剤またはキットは、本発明の抗グリセロ型糖脂質抗体を含むか、または該抗体を含有する組成物を含む。
【００６１】
したがって、本発明はまた、本発明の抗体または本発明の抗体を含む組成物を、適切な支持体または担体に結合させる工程を包含する、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断剤の製造方法を提供する。
【００６２】
本発明のキットは、免疫測定法に従って使用される。本発明のキットは、必要に応じて、免疫学的方法により被検体中のグリセロ型糖脂質またはマイコプラズマ・ニューモニエを検出する際に、本発明のグリセロ型糖脂質に対して反応特異性を有する抗体と、この抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した上記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体とを含んでいてもよい。
【００６３】
具体的なキットの一例として、マイクロタイタープレート、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のブロッキング試薬、本発明のグリセロ型糖脂質（標準物質）、本発明の抗体、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体、過酸化水素水、ＯＰＤ、洗浄用緩衝液からなるキットが挙げられる。抗体類、マイコプラズマ・ニューモニエのグリセロ型糖脂質等は、凍結乾燥品として、またはこれらを安定して保存できる溶媒に溶解しておくことが好ましい。本発明のキットは、さらに製造業者による取扱説明書を含んでいてもよい。
【００６４】
（測定法）
本発明において用いられる免疫学的な測定法としては、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等、抗体を用いる通常の免疫学的方法が挙げられる。例えば、抗グリセロ型糖脂質抗体が結合した固相に検体液を接触させて検体液中に含まれるグリセロ型糖脂質を前記抗体に結合させ、非吸着成分を固相から分離除去し、次いで、標識物質で標識化したマイコプラズマ・ニューモニエのグリセロ型糖脂質を前記固相に接触させ、前記検体液中に含まれるグリセロ型糖脂質と標識化したグリセロ型糖脂質とを競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出することにより、検体液中のグリセロ型糖脂質を測定することができる。
【００６５】
また、抗グリセロ型糖脂質抗体が結合した固相に、検体液と、標識物質で標識化したグリセロ型糖脂質とを接触させ、前記検体液中に含まれるグリセロ型糖脂質と標識化したグリセロ型糖脂質とを前記抗体に対して競合反応させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出することにより検体中のグリセロ型糖脂質を測定することができる。この際、標識化したグリセロ型糖脂質の代わりに無標識の標準グリセロ型糖脂質を用い、検体中のグリセロ型糖脂質と標準グリセロ型糖脂質との競合反応を行った後、さらに標識物質で標識化した抗グリセロ型糖脂質抗体を固相に接触させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。この場合も、さらに標識化した二次抗体を用いてもよい。
【００６６】
さらに、検体液中のグリセロ型糖脂質を固相に結合し、これに標識化した抗グリセロ型糖脂質抗体を接触させ、固相に結合した標識物質または固相に結合しない標識物質のいずれかを検出してもよい。
【００６７】
その他、免疫学的測定法には種々の態様が知られているが、いずれの方法も本発明に適用することができる。また、上記のような固相を用いる方法以外に、ハプテン、抗原の免疫測定に使用される方法、例えば、前記抗体に対して検体中のグリセロ型糖脂質と標識化したグリセロ型糖脂質を競合反応させ、抗体と結合した抗原と遊離の抗原を、例えばポリエチレングリコール、デキストラン、二次抗体等を用いて分離し、遊離の標識抗原の標識物質を検出する液相法を採用してもよい。
【００６８】
上記固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロン等のマイクロタイタープレートのウェル等の通常の材料及び形態（粒子、微粒子、試験管、マイクロタイタープレート、ストリップ等）のものが挙げられる。固相に抗体またはグリセロ型糖脂質を結合させた後に、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やゼラチンなどを用いてブロッキングを行うことが好ましい。また、標識物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等、酵素反応により色素の発色が可能な酵素；放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光色素などが挙げられる。
【００６９】
色素は、ペルオキシダーゼに対しては４−クロロ−１−ナフトール、Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）もしくは３，３’−ジアミノベンチジン等、アルカリフォスファターゼに対してはｐ−ニトロフェニルフォスフェート等を使用する。
【００７０】
また、本発明に係るグリセロ型糖脂質は、マイコプラズマ・ニューモニエに固有であるので、前記の方法により検体中のグリセロ型糖脂質を測定し、グリセロ型糖脂質の存否またはその存在量と検体中のマイコプラズマ・ニューモニエの存否またはその存在量とを関連づけることによって、マイコプラズマ・ニューモニエを検出することもできる。
【００７１】
上記グリセロ型糖脂質の測定法またはマイコプラズマ・ニューモニエの検出法において、検体としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、関節液または細胞培養液（上清）等が挙げられる。
【００７２】
上記方法の他に、生体組織または細胞を、そのまま又はグリセロ型糖脂質の固定処理を施した後、標識物質で標識化した抗グリセロ型糖脂質抗体と反応させ、マイコプラズマ・ニューモニエが感染した生体組織または細胞に標識化抗体を結合させ、標識物質を測定することにより、マイコプラズマ・ニューモニエを検出することもできる。固定処理の方法としては、例えばホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド等を用いる方法が挙げられる。また、標識物質で標識化した抗グリセロ型糖脂質抗体の代わりに、無標識の抗グリセロ型糖脂質抗体を固定処理した生体組織または細胞と反応させ、同時またはその後に、前記抗体の調製に用いた免疫動物以外の動物を用いて調製した前記免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した二次抗体を反応させ、マイコプラズマ・ニューモニエが感染した生体組織または細胞に標識化二次抗体を結合させ、標識物質を測定してもよい。
【００７３】
本発明の抗体を用いて試料中のグリセロ型糖脂質を免疫学的に測定する際、例えば、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧの両方に対して反応特異性を有する抗体を用いれば、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを測定することができ、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧまたはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧに対して反応特異性を有する抗体を用いれば、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧまたはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを選択的に測定することができる。Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧまたはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧの測定に際しては、実施例記載のようにして得られるＧａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧまたはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを標準物質として使用することができる。
【００７４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
１．糖脂質の分離・精製
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍａｃ ｓｔｒａｉｎ）のＰＰＬＯ培地での培養を以下のとおり行った。ＰＰＬＯ液体基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に１０％牛血清、１０％ペニシリン、０．０００２％フェノールレッド及び１％グルコースを加えた液体培地にて３７℃で培養した。培地のｐＨ変化により微生物の増殖を確認した後、１６，０００×ｇで１時間遠心分離した。この操作をもう一度繰り返し脂質抽出用の試料とした。２００Ｌ（湿潤状態の容量）の微生物試料に対し、クロロホルムとメタノールの混合溶媒で脂質画分を抽出した。
【００７６】
２．脂質の抽出
試料をメタノールに浮遊させて４時間なじませた。そこに倍量のクロロホルムを加え、超音波で菌体を破砕し、さらに４時間放置した。３０００ｒｐｍで遠心し、上清を回収して濃縮し、脂質画分試料とした。
【００７７】
この脂質試料を、シリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィーによりクロロホルムとメタノールを使用して分離・精製した。第一段階として、クロロホルム：メタノールの混合比を９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９、０：１０とした溶媒で１０のフラクションに分画した。さらにそれぞれのフラクションに対し、第２、第３段階として同様のカラムクロマトグラフィーを行いさらに分離を行った。第一段階では、それぞれ３３ｍｇ、７９ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、４ｍｇ、２ｍｇ、６ｍｇ、０ｍｇ（何も回収されなかった）の化合物を含む１０のフラクションを得た。このうちの一つの画分７９ｍｇを第２段階でさらに６つのフラクションに分画し、その中で２番目に得られたフラクションをさらに第３段階で６つのフラクションに分画し、４番目に得られたフラクションとして糖脂質１および２を得た。収量は１５ｍｇであった。
【００７８】
図２は、薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により脂質試料を展開し、オルシノール試薬にて染色した図である。レーン１は精製する前の菌体より抽出した脂質画分、レーン２〜１０は最初のカラムクロマトグラフィーにより分離したそれぞれのフラクション、レーン１１は３段階の精製を行って得た目的糖脂質画分である。
【００７９】
３．ＮＭＲ分析
得られた糖脂質画分をＤＭＳＯ−ｄ６：Ｄ２Ｏ＝９８：２溶液に溶解して、６０℃にて１Ｈ−ＮＭＲを測定した。スフィンゴシンのシグナルは観察されず、グリセロール部分のプロトンが明快に観測されたことから、グリセロ型の脂質であることを決定した。脂肪酸は２本でほとんど飽和であり、ごくわずかに不飽和を含んでいた。よって、脂質部分はジアシルグリセロール（ＤＡＧと表記する）と決定した。糖部分は、１つのグルコースと３つのガラクトースのいずれもβ型のアノメリックプロトンが観察された。グルコースは非還元末端、ガラクトースの２つは６位に置換基を持っているように思われた。これらの情報から、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧとＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧの骨格が混合していると考えた。この骨格の検証として、還元末端のガラクトースの６位に非還元末端の糖が結合しているかどうかを、Ｇａｌ−ＤＡＧを評品として、６位のケミカルシフトを比較した。さらに、Ｄ２Ｏを含まないＤＭＳＯ−ｄ６１００％中で測定し、−ＯＨのプロトンの同定を行ったところ、還元末端のガラクトースの２，３，４位の−ＯＨシグナルは観察されるものの、６位の−ＯＨシグナルは観察されなかった。これらにより６位に非還元末端の糖が結合していることを決定した。
【００８０】
図３はＤＭＳＯ−ｄ６１００％中で測定したＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルであり、−ＯＨのプロトンの帰属を記載している。また、表１は、ＤＭＳＯ−ｄ６：Ｄ２Ｏ＝９８：２、６０℃で測定した各プロトンの帰属データである。
【表１】
2011079830.tif 000006
【００８１】
４．質量分析
得られた脂質画分に対し、ＥＳＩ−ＭＳ測定による分析を行った。そのスペクトルチャートを図４に示す。ポジティブモードはナトリウム添加条件で測定し、分子イオンに相当するピークｍ／ｚ９１５（Ｍ＋２３）と９４３（Ｍ’＋２３）が観察された。これらは脂肪酸の組成の違いによるものであり、前者がＣ１６：０／１６：０（１００％）、後者がＣ１６：０／１８：０（３０％）であると予想された。これらの分子フラグメントに対しＭＳ／ＭＳを行ったところ、ヘキソース−ヘキソース−ジアシルグリセロールの骨格から脂肪酸、糖部位、グリセロール部位が脱離したフラグメントが観察され、この骨格に矛盾しない結果が得られた。またネガティブモードでも分子イオンピークｍ／ｚ８９１（Ｍ−１）と９１９（Ｍ’−１）が観察され、これらに対するＭＳ／ＭＳ測定でも同様の矛盾しない結果が得られた。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ解析および質量分析の結果を合わせて、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧとＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧの構造であることが決定できた。
【００８３】
５．化学合成品とのデータ比較による構造の確定
構造を確定するため、化学合成により立体選択的かつ位置選択的にそれぞれの骨格を合成した。１Ｈ−ＮＭＲ測定を天然物と同様のＤＭＳＯ−ｄ６：Ｄ２Ｏ＝９８：２、６０℃の条件において行い、そのスペクトルを解析し比較した。その結果、合成品のスペクトルは天然物のそれと一致したことから、絶対構造を確定することができた。
【００８４】
表２は天然物（ｎａｔｕｒａｌ）および合成品（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）の各プロトンの帰属データである。スペクトルのｐｐｍ値、カップリング定数（ＪＨｚ）は一致し、また形も同じであった。
【表２】
2011079830.tif 000007
グリセロ型糖脂質は、植物バクテリアなどで多数見つかっているものの、β型の糖結合であり２糖が１−６結合である構造は今までに報告がない。構造式１，２で示される糖脂質は新規構造である。
【００８５】
（実施例２）
（神経疾患患者由来の試料中の本発明の糖脂質抗原に対する抗体）
構造式１および２で表される糖脂質抗原を含有するマイコプラズマ・ニューモニエの脂質画分に対し、ギランバレー症候群の患者の血清を反応させる実験を、ＴＬＣ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法によって検討した。マイコプラズマ・ニューモニエから抽出した脂質画分をＴＬＣプレート上に展開し、ギランバレー症候群の患者血清を反応させた。反応の検出をペルオキシダーゼ標識のａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡの混合物により行い、化学発色によって可視化した。図５は、マイコプラズマ・ニューモニエの脂質画分をＴＬＣ展開し、（ａ）：オリシノール試薬にて染色した結果、および（ｂ）：ギランバレー症候群の患者血清との反応をＴＬＣ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ法にて検出した結果を示す図である。
【００８６】
図５（ｂ）に示すように構造式１および２で表される糖脂質抗原のスポットに対し発光が認められたため、ギランバレー症候群の患者がこれら糖脂質抗原に対する抗体を保持していることが証明できた。
【００８７】
この実験結果は、構造式１および２で示す糖脂質抗原およびその抗体が、マイコプラズマ・ニューモニエ感染が原因である疾患の診断マーカーとなることを示すものである。
【００８８】
（実施例３）
合成によって作製したＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧについて、それぞれを使用した２種類のＥＬＩＳＡキットを作製し、ヒト検体中のこれら抗原に対するＩｇＭ抗体価を調べた。検体として、マイコプラズマ肺炎患者のペア血清を４０検体測定し、このＥＬＩＳＡ法がマイコプラズマ肺炎の診断法として有用な方法であるかを検討した。比較として健常人の血清も４０検体測定し、スコア値を比較した。
【００８９】
抗原プレートの作製：Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを５μｇ／ｍＬ（メタノール：アセトニトリル溶液）になるよう調製し、この溶液をＥＬＩＳＡ用イムノプレート（平底）に５０μＬずつ撒き、溶媒を除去することによって、Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを固相化したプレートを作製した。Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧについても同様の手法によりプレートを作製した。
【００９０】
ＥＬＩＳＡ法のプロトコール：測定ウェルにブロッキング液を１００μＬずつ展開して１時間室温でインキュベーションさせた後、洗浄して、測定する検体溶液を１００μＬずつ撒いて２時間室温でインキュベーションさせた（測定は２重で行なった）。その後洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識したＩｇＭ抗体溶液を１００μＬずつ撒いて２時間室温でインキュベーションさせた。その後洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を発色基質として加え１５分間反応させた後、反応を１Ｎ硫酸水溶液にて停止し、吸光度を測定した。
【００９１】
測定結果：コントロールをおき標準曲線から吸光度を任意にスコア化して検体の抗体価を比較検討した。ＧｌＣβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用したＥＬＩＳＡ測定の結果、健常人のサンプルのスコアはすべて２．５以下、半数は１未満であったのに対し、マイコプラズマ肺炎患者の血清ではスコアがすべて１以上で、２．５以下は２８％、それ以上のものが７２％であった。この結果を、感度対擬陽性率の値で描くＲＯＣ曲線に表したところ、曲線下面積が０．９５となり、この測定は疾患の識別に能力がかなり高いと評価できた。
【００９２】
一方、Ｇａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用したＥＬＩＳＡ測定の結果では、疾患の識別能があまりなく、健常人でも高いスコア値が検出された。
【００９３】
図６はＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用したＥＬＩＳＡ測定の結果であり、疾患群と非疾患群（健常人）のスコア分布を示す。図７はこの測定結果を感度対偽陽性率の値で表したＲＯＣ曲線である。
【００９４】
この実験結果は、Ｇｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧａｌβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用した抗体測定によって、マイコプラズマ・ニューモニエの感染によって発症するマイコプラズマ肺炎の疾患識別が可能であることを示すものである。加えて、２種類の抗原糖脂質には能力に差があり、それぞれ単独で使用することによって別の結果になる可能性がある。マイコプラズマ肺炎の疾患診断にはＧｌｃβ−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを使用することが望ましいと考えられる。
【００９５】
（実施例４）イムノクロマトグラフィー
（１）金コロイド溶液の調製
金コロイドは、４０ｎｍの粒子サイズのＢｉｏｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｕ．Ｋ．）の市販品の溶液をそのままの濃度で用いた。
【００９６】
（２）金コロイド標識糖脂質抗原溶液の調製
金コロイド標識を作製するためにマイコプラズマ・ニューモニエの糖脂質抗原ＧｌｃＧＬを用いた。この１０μｇ／ｍｌのＧｌｃＧＬ抗原１ｍｌと上記（１）の金コロイド溶液１ｍｌとを混合し室温で３０分間静置してこの抗原を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液の最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と記す）溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をブロックして、金コロイド標識抗原（以下、「金コロイド標識抗原」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（８０００×Ｇ、１０分間）して金コロイド標識抗原を沈殿せしめ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、上清液を除いて金コロイド標識抗原を得た。この金コロイド標識抗原を１％サッカロース・０．５％ＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
【００９７】
（３）抗マイコプラズマ・ニューモニエ特異的抗体測定用イムノクロマト法テストストリップの作製
図８に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作製した。
【００９８】
（３−１）抗マイコプラズマ・ニューモニエ特異的抗体と金コロイド標識抗原との複合体の捕捉部位
幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。
【００９９】
抗ヒトＩｇＭ抗体２ｍｇ／ｍｌが含有されてなる溶液４μｌを、このクロマト展開用膜担体３におけるクロマト展開開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で３日間、乾燥し、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体と金コロイド標識抗原との複合体の捕捉部位３１とした。
【０１００】
（３−２）金コロイド標識抗体含浸部材
５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗原溶液４０μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材２とした。
【０１０１】
（３−３）イムノクロマト法テストストリップの作製
上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図８に示すようなクロマト法テストストリップを作製した。
【０１０２】
（４）試験
肺炎患者血清を検体希釈液で希釈して、各濃度に調製し、被験試料とした。そして、被験試料４０μｌを上記（３）で得られたテストストリップの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１０分放置後、上記捕捉部位３１で捕捉された抗マイコプラズマ・ニューモニエ特異抗体と金コロイド標識抗原との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）の４段階に区分して判定した。その結果を表３に示した。
【表３】
2011079830.tif 000008
【０１０３】
（実施例５）抗マイコプラズマ・ニューモニエ糖脂質ポリクローナル抗体の作製
ヤギ２０％血清で培養したマイコプラズマ・ニューモニエ菌体１ｍｌを１０倍の１０ｍｌに希釈し、これにフロイント完全アジュバントを１０ｍｌ加え、これを４００ｒｐｍでグラインドしてエマルジョンを得た。上記の方法で調製したエマルジョンを、ヤギ皮下に１匹あたり１０ｍｌ皮下免疫し、１ヵ月後に１０ｍｌ追加免疫した。さらに、１カ月おきにヤギ２０％血清で培養したマイコプラズマ・ニューモニエ菌体で免疫を追加した。上記のようにして免疫したヤギの血液から、常法によって血清を分離した。この血清を用いてＴＬＣ免疫染色実験を行い、特異抗原糖脂質との反応性を確認した。
ＴＬＣ免疫染色実験：
【０１０４】
実験操作は一般法に従った。マイコプラズマ・ニューモニエ菌体から抽出した脂質混合物、および化学合成により作製したＧａｌβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧをＨＴＬＣプレートに展開して、得られたヤギ血清を反応させた。反応の検出をペルオキシダーゼ標識したａｎｔｉ−ＧｏａｔＩｇＧで行い、コニカイムノステインキットを使用してペルオキシダーゼによる反応を可視化して検出した。その結果を図９に示す。右図が得られたヤギ血清を使用して免疫染色した結果である。また左図は化合物を展開したＨＴＬＣプレートをオリシノール染色した結果である。
【０１０５】
図９に示すようにＧａｌβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧに相当するスポットに対し発色が認められたため、作製したヤギ血清はこれらに対する反応性を有することを確認した。
【０１０６】
（実施例６）抗ＧＧＬモノクローナル抗体の作製
（１）ハイブリドーマの作製
マイコプラズマ・ニューモニエ菌体を含むエマルジョンを、７週令のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１匹あたり０．５ｍｌ注射した。初回免疫後２週間目と３週間目に、上記の方法で調製したエマルジョンを１匹あたり０．５ｍｌを皮下と腹腔内に注射した。
【０１０７】
最終免疫の４日後にマウスから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて細胞浮遊液を調製した。この２×１０８個の脾細胞と対数増殖期にあるマウスミエローマＳＰ２／０細胞（２×１０７個）と混合し、遠沈後、沈渣に４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００（和光純薬（株）製）１ｍｌを１分間かけて緩やかに振盪しながら加え、その後３７℃下で、振盪しながら２分間インキュベートした。これに、ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間かけて加え、更に、８ｍｌを３分間かけて加えた。
【０１０８】
上記細胞混合液を遠沈後、細胞を１０％仔牛胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地５０ｍｌに浮遊させ、９６穴マイクロプレート４枚に、１ウェルあたり１００μｌずつ分注し、炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス、３７℃）中で培養した。２４時間後、培地をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ培地）に交換し、引き続き炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス、３７℃）で培養した。４日目に、新しいＨＡＴ培地を１ウェルあたり１００μｌ追加した。７日目にＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）に交換し、その翌日に１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に交換した後、コロニー形成の有無をチェックした。
【０１０９】
（２）抗体産生ハイブリドーマの選択
抗体を産生するハイブリドーマについて限界希釈法によってクローニングを繰り返し、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体を抗原に用いたＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行い、反応するハイブリドーマＧ１Ｅ６およびＭ２Ｆ８株を得た。
【０１１０】
（３）モノクローナル抗体の獲得
続いて、Ｇ１Ｅ６およびＭ２Ｆ８株を、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、その培養上清を回収することにより、モノクローナル抗体を含む培養液を得た。硫安分画により精製したモノクローナル抗体を、Ｇａｌβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧを抗原としたＥＬＩＳＡ（下記）を行って、モノクローナル抗体が、ＧａｌＧＬおよびＧｕｌＧＬのいずれとも反応した。その結果を図１０に示す。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡ法：
合成したＧａｌβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧおよびＧｌｃβ１−６Ｇａｌβ−３ＤＡＧそれぞれ５μｇ／ｍｌをメタノール：アセトニトリル＝２：１の溶媒で調製し、この溶液を９６穴マイクロプレートの１ウェルあたり５０μｌずつ加え、ケミカルフード内で風乾した後１５時間真空処理して、抗原糖脂質を貼り付けたＥＬＩＳＡプレートをそれぞれ作製した。ＥＬＩＳＡ測定プロトコールは一般法に従った。まず３５０μｌのブロッキング液（ナカライテスク社製ブロッキングワンを水で５倍希釈したもの）を各ｗｅｌｌに分注し、３０℃で１時間静置したのち、３５０μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳで５回洗浄した。その後、５倍希釈済の１３７Ｃ培養上清（希釈液としてブロッキングワンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳで２０倍希釈したものを使用）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注し、３０℃で２時間静置した。その後、３５０μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次に５０００倍希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ［ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ．＃８１−６５２０］、または、Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ＩｇＭ［ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ．＃６１−６８２０］溶液（希釈液としてブロッキングワンを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳで２０倍希釈したものを使用）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注し、３０℃で１時間静置した。その後３５０μｌ／ｗｅｌｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳで５回洗浄し、発色基質（ＴＭＢ溶液；）を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ分注し、３０℃で３０分間静置した後、１ＮＨ２ＳＯ４を各ｗｅｌｌに５０μｌずつ分注して混和し発色を止め、吸光度（４５０ｎｍ／６２０ｎｍ）を測定した。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のグリセロ型糖脂質は、マイコプラズマ・ニューモニエの主要な抗原であるため、この微生物を高感度かつ正確に検出するための分子基盤となる。よって、この糖脂質を利用してマイコプラズマ・ニューモニエが原因である病気の正確な診断法の開発が可能である。本発明のグリセロ型糖脂質は、マイコプラズマ・ニューモニエを病原とする疾患の診断用のマーカーとして使用し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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