(57)【要約】【課題】溶液中の粒子および分子の電気泳動移動度の測定のための方法および装置を提供する。【解決手段】粒子によって散乱された光は、散乱されていないビームとともにセルを出るときに集められて平行化される。このビームは、自由空間中で、位相変調された参照ビームと結合される。その干渉は、周波数変調されたスペックルパターンを形成し、それは光検出器アレイによって検出される。各アレイ素子は、十分に定義された散乱角の狭い範囲を集める。各々からの信号は、復調されて、散乱する粒子の電気泳動移動度の第１原理測定を与える光学位相の情報を抽出する。各検出素子は同時に独立の測定を与える。この特有の並列化は所定時間において利用可能な情報量を劇的に増加させる。その結果の増大した感度は１ナノメートル未満の粒子への移動度の測定へと拡張し、従来の方法と比較して必要な濃度および電場を低減させる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの溶液の一定分量中の粒子の電気泳動移動度を測定するための装置であって、
（Ａ）コヒーレントで単色の光のビームを生成するための手段と、
（Ｂ）前記コヒーレントで単色の光のビームを、
１．前記サンプルを通過するであろうサンプルビームと、
２．参照ビーム
とに分割するための光学手段と、
（Ｃ）  非導電性のサンプルセルとを備え、前記セルは、
１．前記サンプルの一定分量を保持するためのチャンバと、
２．その間において、電圧が、その中に含まれる前記サンプルの一定分量に印加され得る電極と、
３．前記チャンバの中の光学窓とを備え、前記光学窓を通じて、
（ａ）前記サンプルビームが、前記チャンバに入り得て、その中に含まれている前記一定分量中の粒子から散乱され得るとともに、
（ｂ）前記サンプルビームと前記サンプルの一定分量中の前記粒子から散乱された光の一部とが、前記サンプルセルを離れ得、
前記装置は、さらに、
（Ｄ）散乱されずに前記サンプルセルを離れる前記サンプルビームと、前記粒子から散乱されて前記サンプルセルを離れる前記サンプルビーム光の前記一部とを集めるとともに平行化するための光学手段と、
（Ｅ）前記サンプルビームの光学位相と相対的に前記参照ビームの光学位相を変調するための手段と、
（Ｆ）前記参照ビームを、前記粒子から散乱された光の前記平行化された一部と結合させて、それにより第３のコヒーレントビームを形成するための、自由空間中の光学手段と、
（Ｇ）前記第３のコヒーレントビームが入射し、各検出素子が時間的に変化する信号をそこから生成する、光検出素子のアレイと、
（Ｈ）前記光検出素子の各々から受信した前記時間的に変化する信号を処理するための電子手段とをさらに備え、前記電子手段は、前記信号をデジタル形式に変換して、前記結果としてのデジタル信号をコンピュータ手段に転送して、そこから前記電気泳動移動度を算出する、装置。
【請求項２】
前記参照ビームの光学位相を変調するための前記手段は、逆反射手段を駆動する圧電アクチュエータを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記逆反射手段は、直角プリズムである、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記逆反射手段は、その反射面が互いに垂直である、２つのミラーを備える、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記直角プリズムの斜辺側の表面は、反射防止コーティングされる、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記光検出素子は、フォトダイオードである、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光検出素子のアレイは、１次元である、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記光検出素子のアレイは、２次元である、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記サンプルセルのチャンバは、入力および出力流れ手段を含み、それによって、前記サンプルの一定分量が前記チャンバに注入され得るとともに前記チャンバから排出され得る、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記サンプルセルは、交換可能なユニットである、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記交換可能なサンプルセルユニットは、使い捨てである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記サンプルビームとの再結合に先立って前記参照ビームを平行化するための手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記参照ビームを平行化するための前記手段は、発散レンズおよび収束レンズを備える、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記サンプルビームを集めるとともに平行化するための前記手段は、収束レンズを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記単色でコヒーレントな光のビームは、レーザによって生成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記サンプルビームは、前記サンプルセルの中央において焦点を合わせられる、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記サンプルビームの散乱されない部分は、減光フィルタによって減衰される、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記サンプルビームの前記減衰された非散乱部分は、前記光検出素子アレイの単一の素子に入射し、当該単一の素子は、それによりサンプルビームモニタを提供する、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記電極と接触した、前記サンプルセルの温度制御を可能にする手段をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
前記コヒーレントで単色の光ビームを、前記参照ビームと前記サンプルビームとに分割するための前記光学手段は、ビームスプリッタを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
前記参照ビームを、前記粒子から散乱した光の前記平行化された一部と結合するための前記自由空間中の光学手段は、ビームスプリッタを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
散乱されずに前記サンプルセルを離れる前記サンプルビームと、前記粒子から散乱されて前記サンプルセルを離れる前記サンプルビーム光の前記一部とを集めるとともに平行化するための前記光学手段は、非球面レンズを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
前記サンプルビームとの再結合に先立って前記参照ビームを整形して、前記光検出素子アレイの最適な利用を可能にするための光学手段をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項２４】
前記ビームスプリッタによって反射された前記第３のコヒーレントビームの部分が入射する、第２の光検出素子のアレイをさらに備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２５】
サンプルの溶液中の粒子の電気泳動移動度を測定する方法であって、
（Ａ）サンプルセルを前記サンプルの溶液の一定分量で満たすステップを備え、前記サンプルセルは、
（ａ）前記サンプルの一定分量を保持するためのチャンバと、
（ｂ）その間において、電圧が、その中に含まれる前記サンプルの一定分量に印加され得る電極と、
（ｃ）光ビームが通り得る、前記チャンバの中の光学窓
とを備え、
前記方法は、
（Ｂ）コヒーレントで単色の光のビームを生成するための手段を設けるステップと、
（Ｃ）前記コヒーレントで単色の光のビームを、
（ａ）前記サンプルセルを通過するであろうサンプルビームと、
（ｂ）参照ビーム
とに分割するための光学手段を設けるステップと、
（Ｄ）前記サンプルビームの光学位相と相対的に前記参照ビームの光学位相を変調するための手段を設けるステップと、
（Ｅ）散乱されずに前記サンプルセルを離れる前記サンプルビームと、前記サンプルセル中の前記サンプルの一定分量から散乱された前記サンプルビーム光の前記一部とを集めるとともに平行化するための光学手段を設けるステップと、
（Ｆ）前記参照ビームを、前記サンプルの一定分量から散乱された光の前記平行化された一部と結合させて、それにより第３のビームを形成するための手段を設けるステップと、
（Ｇ）前記第３のビームの経路に配置された複数の光検出素子の各々において前記第３のビームの光の強度値を測定するための手段を設けるステップと、
（Ｈ）各光検出素子において測定された前記光の強度値をデジタル形式に変換するための手段を設けるステップと、
（Ｉ）前記結果としてのデジタル信号をコンピュータ手段に転送するための手段を設けるステップと、
（Ｊ）前記デジタル信号を処理して、そこから前記溶液中の前記粒子の前記電気泳動移動度を得るための手段を設けるステップと、
をさらに備える、方法。
【請求項２６】
前記参照ビームの光学位相を変調するための前記手段は、逆反射手段を駆動する圧電アクチュエータを備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記逆反射手段は、直角プリズムである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記逆反射手段は、その反射面が互いに垂直である、２つのミラーを備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記直角プリズムの斜辺側の表面は、反射防止コーティングされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記光検出素子は、フォトダイオードである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の光検出素子は、１次元のアレイに配列される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の光検出素子は、２次元のアレイに配列される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルセルは取り外し可能であるとともに、前記コヒーレントで単色の光のビームの経路に配置するに先立って満たされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記交換可能なサンプルセルユニットは、使い捨てである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルビームとの再結合に先立って前記参照ビームを平行化するための手段を設けるステップをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記参照ビームを平行化するための前記手段は、発散レンズおよび収束レンズを備える、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルビームを集めるとともに平行化するための前記手段は、収束レンズを備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記単色でコヒーレントな光のビームは、レーザによって生成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルビームを、前記サンプルセルの中央において焦点を合わすための手段を設けるステップをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
減光フィルタによって前記サンプルビームの散乱されない部分を減衰させるための手段を設けるステップをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルビームの前記減衰された非散乱部分は、前記複数の光検出素子の単一の素子に入射し、当該単一の素子が、それによって、サンプルビームをモニタする手段を提供する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記電極と接触した、前記サンプルセルの温度制御を可能にする温度制御手段を設けるステップをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
前記コヒーレントで単色の光ビームを、前記参照ビームと前記サンプルビームとに分割するための前記手段は、ビームスプリッタを備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４４】
前記参照ビームを、前記サンプルの一定分量から散乱した光の前記平行化された一部と結合するための前記手段は、ビームスプリッタを備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４５】
散乱されずに前記サンプルセルを離れる前記サンプルビームと、前記サンプルセル中の前記サンプルの一定分量から散乱された前記サンプルビーム光の前記一部とを集めるとともに平行化するための前記光学手段は、非球面レンズを備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルビームとの再結合に先立って前記参照ビームを整形して、前記複数の光検出素子の最適な利用を可能にするための光学手段を設けるステップをさらに備える、請求項２５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ビームスプリッタによって反射された前記第３のコヒーレントビームの部分が入射する、第２の複数の光検出素子を設けるステップをさらに備える、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、与えられた電場を受ける、溶液中の荷電粒子の動きを測定することが可能な革新的な方法および装置を開示する。本発明は、その明細書の多くの部分を通じて高分子について言及するが、本発明は、より一般的には、そのサイズが０．５ナノメートルから数千ナノメートルまでの間にある、エマルション、ウイルス、ナノ粒子、リポソーム、マクロイオンおよび他の溶液構成物質を含むすべての分類での微小粒子を含むものである。すなわち「分子」、「高分子」または「マクロイオン」という用語が用いられるときは、それらが溶液に留まる上記の物質のすべてを含むものであると理解されるべきである。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動移動度は、直接的に測定可能であるとともに、そのような溶液中における分子（あるいは、さらに言えば存在する他の粒子）の電荷を特徴付けるために最も広く用いられる量である。一旦測定されれば、電気泳動移動度は、そのような分子によって担持される有効電荷Ｚｅだけでなく、いわゆるゼータ電位ζを決定するために順に用いられることができる。イオン群の間の界面は粒子に強固に結合され、粒子と一緒に動かない周囲の溶液は、流体力学のせん断面を定義する。ゼータ電位は、このせん断面において存在する静電ポテンシャルを示す。本発明の基本的な目的は、溶液中の分子および粒子の電気泳動移動度、有効電荷およびゼータ電位が測定可能である、改善された手段を提供することである。
【０００３】
電気泳動は、電場の影響下でのマクロイオンの移動である。定常状態における電気泳動速度ｖeは、移動するマクロイオンによって得られるが、印加された電場に線形的に比例する。電場が印加されたときには、分子の速度は、本質的には常に平衡状態にある。比例定数（この場合には電気泳動移動度）は、電気泳動速度を測定して印加された電場で割ることによって測定できる。本発明の目的は、これまでに可能であったよりも、より正確に溶液中の粒子の電気泳動速度を測定することを可能にする、改良された装置を提供することである。
【０００４】
いくつかの技術が開発されてきており、移動度を測定するために利用可能である。これらの技術の中に、移動境界法、顕微鏡電気泳動、および、たとえばヘテロダイン動的光散乱（ＤＬＳ）、レーザドップラー電気泳動（ＬＤＥ）および位相解析光散乱（ＰＡＬＳ）といった光散乱法がある。移動境界法は、特殊なセルを用いて高分子溶液とバッファとの間の２つのはっきりとした境界を確立する。電場の印加による境界の移動は、移動度を決定するための定量的手段を提供する。顕微鏡電気泳動は、個々の粒子の電気泳動的な動きを、拡大光学系によって直接的に観察することに基づく。しかしながら、顕微鏡電気泳動は、半径が約１００ｎｍよりもずっと大きい粒子の移動度の測定に制限される。光散乱技術は、また電気泳動の測定のために開発されてきた。移動する粒子から散乱された光は、そのような動きに関する情報を担持し、それから粒子の電気泳動移動度を決定することができる。
【０００５】
さて、電気泳動移動度の測定のためのこれらの測定技術のうち、最も重要であるＰＡＬＳについて考える。単色光のビーム（通常はレーザ光源から）は、与えられた電場の影響を受ける、液体に留まる粒子のサンプルを照射する。粒子が散乱する光のいくつかは集められて、入射非散乱光の一部と結合される。すなわち、散乱信号は入射光とコヒーレントに結合されてヘテロダイン信号を生成する。２つのビームのそのような結合は、一般的には、それら２つのビームの間で良好なアライメントを保証するシングルモードファイバを用いて達成される。この技術は、縞を高いコントラストで生成するが、結果として、比較的低い強度の結合ビームをもたらす。その理由は、各構成ビームのエネルギの大部分がファイバによってサポートされていないモードへと失われていくためである。本発明の別の目的は、そのようなビームを自由空間で結合して極めて大きなエネルギをもつ結合されたコヒーレントビームと、それに応じて単純化された検出システムとを作り出すことである。
【０００６】
結合されたビームの変動を測定して散乱粒子の電気泳動移動度の測定をそこから導き出すために、結合されたビームのうちの１つが、まず、振動する鏡から反射するように向けられる。このことは、電気泳動的な動きがないときでも、検出された縞に、強度変調をもたらす。印加された場の適用によってもたらされる電気泳動的な動きは、周波数シフトの許容、それによる移動度の兆候の明確な決定を生み出す。しかしながら、現実的な条件は、Robert G. W. Brownによって、“Homodyne Optical Fiber Dynamic Light Scattering,”Appl.Opt.40,4004-4010（2001）において議論されるように、２つの結合されたビームの相対的強度を調整する必要があり、それら２つの比が約３０未満であることを要求する。本発明の別の目的は、ビームの相対強度を調整する必要なくして、それらの比を、コヒーレント増幅として知られる効果の利点が得られるように１００：１よりも大きくすることを可能にすることであり、このことは「発明の詳細な説明」の欄においてより詳細に説明される。
【０００７】
これまでのＰＡＬＳ測定における結合されたビームの強度比は比較的小さな範囲に制限されているので、それにより生成される信号の検出は、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）の使用を必要とする。そのような検出器は高価であるとともに、周囲の室内灯または他の外部光源に不注意に晒されることによって深刻な損傷を受けたりあるいは破壊される可能性がある。本発明の他の重要な目的は、これらの高価な構成要素をなくしつつ、同時に、外部光源によって損傷を受ける可能性のない検出手段を提供することである。ＰＭＴデバイスおよびＡＰＤデバイスは、非常に制限されたダイナミックレンジを有するため、検出器がその線形的範囲内に保たれるように、光の強度および２つのビームの比は絶えず調整されなければならない。あるいは、非線形の効果を補正しなければならない。本発明の目的は、広い線形応答性を有する検出手段を導入して、そのような調整とモデリングとを不要にすることである。
【０００８】
本発明の他の目的は、分子種の移動度を、すばやく、そして測定される分子への損傷なくして測定することである。本発明のさらなる、そして特に重要な目的は、約５ｎｍというＰＡＬＳの限界よりも十分小さい有効サイズを有する分子の移動度を測定することである。本発明のさらに他の目的は、測定の線形的範囲を増大して、より低い濃度とより小さいサイズへの展開を可能にすることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の簡単な説明
ＰＡＬＳ技術のこの革新的な実施は、従来と同じように、レーザ光のコヒーレントビームを分割して２つのビーム、すなわち参照ビームとサンプルビームとを生成することから始まる。参照ビームは、参照ビームに時間変化の位相変調を与える変調器に向けられる。このビームは次に拡張および整形されて、検出器アレイを十分に照射する。サンプルビームは、液体サンプルを含むセル内に焦点を合わせられてそのセルを通され、液体サンプルは、移動度が測定されるべき分子の懸濁液を有する。セル内の電極は、照射されたサンプルに、時間的に変化する電場を与える。伝達されたサンプルビームは、サンプルによって散乱された光の部分に沿うものであり、今は分子の動きについての情報を含んでいるが、レンズによって平行にされる。このサンプルビームは、参照ビームと結合されて、検出器アレイ上に干渉スペックルパターンを形成する。アレイは、各素子が、スペックルパターンの１以上のコヒーレント領域に及ぶとともに、平行レンズの焦点距離によって決定される散乱角の狭い範囲に及ぶように選ばれる。参照ビームは位相変調されているので、各検出素子は、位相変調器によって設定される周波数を有する、時間的に変化する信号を記録する。各検出素子からの電気的信号は増幅されてバンドパスフィルタによってこの周波数付近で通される。アレイ上の１つの素子であるフォワードモニタは、散乱されていないサンプルビームと参照ビームとの干渉を検出する。フォワードモニタは、参照ビームで与えられた正確な位相変調を測定する。この信号は、次に、異なる散乱角に対応する信号を復調するために用いられる。フォワードモニタと各検出器との間の位相差は、累積した光学的位相を決定し、それによりサンプルの移動度を決定する。この測定技術によって与えられる最も重要な利点は、各検出素子が、独立で同時の測定を提供するということである。移動度の決定の正確性は、用いられる検出器の数を改善し、多数の素子を有するアレイが好ましい。それゆえに、この技術は、大規模並列移動解析光散乱（ＭＰ−ＰＡＬＳ）と呼ばれる。多数の素子を平均することによって、特定の正確性を達成するために必要な時間が、素子の数に反比例して減少し、タンパク質のような非常に小さな粒子の測定を可能にする。さらに、ＭＰ−ＰＡＬＳに関連する減少した測定時間が、電極の電気化学的な劣化を最小化する一方で、壊れやすい生物学的サンプルに対する損傷を低減する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】光散乱のための位相図である。ｘ軸に沿った電場Ｅは、電気泳動を駆動するために印加される。
【図２ａ】粒子の拡散のみによる、測定された光学位相を示す図である。
【図２ｂ】電気泳動および拡散による、測定された光学位相を示す図である。
【図２ｃ】印加された電場の複数サイクルに及び平均化された電気泳動および拡散による、測定された光学位相を示す図であり、電気泳動成分が支配的である一方で拡散成分が無視できることを示している。サンプルは、電気泳動移動度のためのＮＩＳＴ標準の参照材料（ＳＲＭ  １９８０）である。
【図３】電流−電圧変換のためのフィードバックループにおいて抵抗ＲFを有するトランスインピーダンス増幅器と、アナログ結合のためにそれに続く、ωpに中心を有するバンドパスフィルタを示す図である。
【図４】自由空間光学系および光検出器アレイによって実現されるＭＰ−ＰＡＬＳ配置を示す図である。
【図５】改良されたＰＡＬＳシステムの１つの実施形態の測定セルの詳細図である。
【図６】図４に示された本発明のＭＰ−ＰＡＬＳ配置の代替的な実施を示す図であり、２つの光検出器アレイが用いられた実施を示す図である。
【図７ａ】粒子の拡散のみによる、測定された光学位相を示す図である。
【図７ｂ】電気泳動および拡散による、測定された光学位相を示す図である。
【図７ｃ】印加された電場の複数サイクルに及び平均化された電気泳動および拡散による、測定された光学位相を示す図であり、電気泳動成分が支配的である一方で拡散成分が無視できることを示している。サンプルは、リン酸でｐＨ３．４に滴定された１ｍＭリン酸バッファ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ中の１．０ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンであり、MenonおよびZydneyによって、“Measurement of Protein Charge and Ion Binding Using Capillary Electrophoresis,”（Anal. Chem., V70, pp1581-1584（1998））において報告されるように、毛細管電気泳動によって測定された値とよい一致を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
電気泳動は、電場の影響下におけるマクロイオンの移動である。約２００Ｖ／ｃｍ未満の場の強度では、移動するマクロイオンに対して与えられる、定常状態における電気泳動速度ｖeは、印加される電場Ｅに線形的に比例し、すなわち
【００１２】
【数１】
2011180584.tif 000003
【００１３】
と表される。ここで、μは、電気泳動移動度または単位電場あたりの速度を表す。定常状態での電気泳動速度に到達するための時間スケールは、大まかにはｍ／ｆであり、ｍはマクロイオンの質量であり、関連する摩擦力ｆは６πηｒhであり、ηは、溶媒の動的粘性係数であり、ｒhは、マクロイオンの流体力学半径である。たとえば、水溶液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の分子は、およそ０．２ｎｓｅｃのｍ／ｆを有する。すなわち電場が印加されたときに、分子速度は、効果的に、常に平衡状態となる。そして、電気泳動速度を測定して印加された電場で割ることによって、電気泳動移動度を測定することができる。
【００１４】
μ，Ｚｅおよびζを関連付けるいくつかの関係が導かれてきたが、それらのいずれも、すべての環境において十分に適用可能なほど厳密ではない。さまざまな近似および、デバイ長、溶液イオン強度、誘電定数、粘度、粒子サイズ、マクロイオン表面伝導度といったパラメータのすべてが複雑さをもたらす。さらに、理想的ではないことは、μとζとの間の正確な解析的表現を得ることが、不可能でなければ厄介な仕事であることを示唆している。１つのそのような非理想的なことは、C. Tanfordにより、Physical Chemistry of Macromoleculesにおいて説明された「電気泳動効果」と呼ばれ、それによればマクロイオン／粒子は、かならず低モル質量の対イオン（counter-ion）および同符号イオン（co-ions）により取囲まれ、通常では、電解液によって与えられるというものである。過剰の対イオンは、マクロイオン／粒子の各々の近くに存在する。マクロイオンを動かす電場は、また、これらの対イオンに逆方向に作用するであろう。動き、溶媒和された（solvated）対イオンは、それらとともに溶媒を引きずり、溶媒は同様にマクロイオンに作用する。正味の影響は、マクロイオンの動きを妨害する２次的な力である。他の重要な非理想的なことは、「イオン緩和」であり、マクロイオンの周囲の同符号イオンおよび対イオンの分布の平衡状態からの摂動が、マクロイオンの動きをもたらすまさにその電場から生じる。
【００１５】
移動度を測定するためのさまざまな技術が開発されてきた。そのうちの最も初期のものの１つは、J. Chem. Educ., 25,426,619（1948）での“An Introduction to Electrophoresis,”においてR. A. Albertyにより記述された「移動境界法」である。それは、高分子溶液と適切なバッファとの間の２つの明確な境界を確立するために、Ｕ型のティセリウスセルを用いる。高分子溶液は、通常は、測定に先立ってバッファに対して透析される。電場の適用下での（拡散で広がった）境界の移動は、移動度を決定するための定量的手段を提供する。移動境界法の実施は、タンパク質およびコロイド懸濁液の知識に多くの貢献をもたらしたが、ジュール熱、電気浸透、非類似の上行脚および下行脚といった、実験での多くの難しさ、およびｐＨおよびマクロイオン移動度の変化に繋がる境界間にまたがるバッファイオン濃度の不可避の変化と関連する。これはV. P. Dole によって、J. Am. Chem. Soc., 67,1119（1945）において議論されている。
【００１６】
非常に大きな粒子のために特に開発された他の技術は、「顕微鏡電気泳動」であり、これは適切な拡大光学系によって、個々の粒子の電気泳動的な動きを直接的に観察することに基づく。これは、A. V. Delgado他によって、その論文J. Colloid Interface Sci., 309,203（2007）の“Measurement and Interpretation of Electrokinetic Phenomena”に記載されている。それにも関わらず、この技術は、その光学的分解能によって制限されて、半径が１００ｎｍよりもずっと小さい粒子の移動度を測定することはできない。他の不利な点は、制限された数の粒子のみが測定されるので、その技術が、低い統計的な正確性に見舞われることである。加えて、どのようにして粒子が特定され、追跡されるかということに基づく選択の偏りが存在する。測定は、通常では完了するのに何分もあるいは何時間も要する。その結果として、ジュール熱、サンプルの劣化および電気浸透の重大な課題が存在し得る。
【００１７】
１９７０年代の初期から、電気泳動測定のためのさまざまな光散乱技術が開発されてきた。動く粒子から散乱された光はドップラーシフトして、その動きについての情報を担持する。図１は、光散乱の位相図を示しており、入射光が散乱体積１内の粒子によって散乱されて散乱角θSで新しい方向へと散乱される。散乱ベクトルは、ｑS＝ｋS−ｋ0として定義され、これは散乱光の波数ベクトルと入射光の波数ベクトルとの間の差を表す。その方向は図１において示されており、その強度は、｜ｑS｜＝４πｎｓｉｎ（θS／２）／λである。ここでｎは溶液の屈折率であり、λは真空中の光の波長である。ｘ軸に沿った電場Ｅは、結果的に電気泳動速度ｖe＝μＥをもたらす。散乱光の光学位相φSは、散乱する粒子の位置と関連する。電気泳動的な動きのみを考慮すると、時間０とΔｔ後との間の光学的な位相差はΔφS＝ｑS・ｖeΔｔであり、ｖeΔｔは、電気泳動による粒子の変位である。いくつかの直接的な代数演算によって、ドップラーシフトωS＝ｄφS／ｄｔ＝μ・２πｎ・ｓｉｎ（θS）Ｅ／λを得ることができる。一般的に、粒子の動きは集合的（流体の流れ、電気泳動などによる）および拡散的（ブラウン運動による）であり得る。拡散成分は、本質的に確率的なものであるが、時間的に平均すれば０であり、拡散成分を０に平均化するために十分な測定の情報が利用できるならば、集合的成分を明らかにすることができる。もし、印加された電場による、単位時間あたりの平均的な光学的位相シフト
【００１８】
【数２】
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【００１９】
を測定したならば、電気泳動移動度μを決定することができる。
図２は、粒子の拡散と関連する光学位相がどのようにして、所定の十分な測定時間で０に平均化されるかを示す。図２ａは、粒子拡散のみによる測定された光学位相を示す。位相測定は、２ミリ秒ごとに得られるとともにｓｉｎθSで規格化される。サンプルは、国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）によって保証された、電気泳動移動度標準の参照材料（ＳＲＭ  １９８０）である。それは、電子顕微鏡から決定されるように、６０ｎｍ×２０ｎｍの平均寸法を有する針状の粒子からなる。示されるように、この拡散成分は実際にランダムであり、粒子の拡散によってさまざまに変化する対応の位相は、数秒のオーダで０に平均化される。ストークス−アインシュタイン方程式に従うと、拡散係数は、流体力学半径に反比例し、したがって粒子が小さいほど、拡散成分を平均化するための時間が長くなる。図２ｂは、１０Ｈｚの強度１８Ｖ／ｃｍを有する方形波の電場が電気泳動を駆動するために印加された場合に測定された光学位相を示すグラフである。視覚的参照のために、光学位相の下には、縮尺されてオフセットを有する電場が記されている。ここで、光学位相は、電気泳動成分と拡散成分とからなる。明らかに見られるように、電気泳動成分は、電場が極性を切り替えるときにはいつでもその方向を反転させるのに対し、拡散成分は、電場とは独立のままであり、ランダムに推移する。図２ｃにおいて、単位電場あたりの光学位相変化が電場の複数のサイクルにわたり平均化されて、電場の正の領域および負の領域の両方に対して直線で適合されている。拡散成分は数秒内で平均化されるので、電気泳動移動度は、直ちに適合された直線の傾きから得られる。ＳＲＭ  １９８０の移動度は、＋２．５７μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓｅｃと計算され、ＮＩＳＴの保証値（２．５３±０．１２μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓｅｃ）の不確実性の中に十分に入っている。移動度は、３秒未満で正確に決定される。この測定は６６０ｎｍで動作するレーザで実施されたが、任意の波長が使用され得る。
【００２０】
一般に、ＤＬＳ測定は、２つの異なる方式、ホモダインおよびヘテロダインでなされ得る。ホモダインおよびヘテロダインとの用語は、しばしば文献において一貫性なく用いられる。明細書での開示のため、それらは次のように定義される：ｉ）「ホモダイン」モードでは、粒子自身から散乱された光のみが混合され、ii）「ヘテロダイン」モードでは、粒子から散乱された光は、しばしば局所発振器と呼ばれる、散乱されていない光と混合される。これら２つのモードの間の区別を理解するために、検出器で生成された光電流ｉ（ｔ）を考慮することにする。
【００２１】
【数３】
2011180584.tif 000005
【００２２】
Ｒは、検出器の応答性であり、ωはレーザの各周波数であり、ＰLOは局部発振器パワーであり、Ｐ0は散乱体積中のＮ個の粒子の各々から散乱された光のパワーであり、φj（ｔ）は、ｊ番目の粒子によって散乱された光の位相である。一般化の損失がなければ、すべての粒子が等しい効率、すなわちそれらが同じ分極率を有すると仮定する。位相φj（ｔ）は、粒子ｊの位置ｘj（ｔ）と、φj（ｔ）＝ｑS・ｘj（ｔ）によって関連付けられる。拡散的な動きと電気泳動的な動きの両方がｘj（ｔ）に寄与するので、結果として以下の関係となる。
【００２３】
【数４】
2011180584.tif 000006
【００２４】
ｘjD（ｔ）およびφjD（ｔ）＝ｑS・ｘjD（ｔ）は、ｊ番目の粒子のブラウン運動と関連する変位成分および位相成分であり、φC（ｔ）＝ｑS・ｖCtは、集合的速度ｖCによる位相成分であり、その集合的速度はすべての粒子に共通である。なお、ｘjD（０）は、ｊ番目の粒子の初期位置を示す。ｉ（ｔ）を展開すると、
【００２５】
【数５】
2011180584.tif 000007
【００２６】
が得られる。ホモダインモードでは、局部発振器がなく、したがってＰLO＝０であるので、最終的に
【００２７】
【数６】
2011180584.tif 000008
【００２８】
となる。なお、ホモダイン検出の場合には、集合的位相成分φC（ｔ）のすべてがｉ（ｔ）において相殺される。すべての時間ｔにおいて得られる測定値は、情報を担持する項φjD（ｔ）−φkD（ｔ）＝ｑS・［ｘjD（ｔ）−ｘkD（ｔ）］を有する。今、動的光散乱（ＤＬＳ）は、ホモダインモードでは集合的な粒子の動きに対して無反応であることが明らかであるが、これは、拡散的な情報のみが利用可能であるためである。すなわちホモダインＤＬＳは、流れが存在するときであっても流体力学半径を測定するのに適しているが、電気泳動移動度を測定するために用いられることができない。
【００２９】
一方、ヘテロダインＤＬＳから得られる信号は、ｃｏｓ［φjD（ｔ）＋φC（ｔ）］の項を含み、集合成分および拡散成分の両方の位相の情報を担持する。したがって、R. Ware and W. H. Flygareによって、Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics（John Wiley & Sons Inc. 79[1976]）では、ヘテロダインモードにおけるＤＬＳが、４ｍＭ  ＮａＣｌ溶液中における５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン分子の移動度の測定にどのように用いられたかを示しているが、そこに記述されるように、光散乱で電気泳動を測定するために、光学ヘテロダインが必須である。
【００３０】
他の方法、レーザドップラー電気泳動（ＬＤＥ）は、E. E. UzgirisによってProg. Surf. Sci. 10,53（1981）に記載されている。ＬＤＥは、動かない縞状のパターン内で移動するマクロイオンから散乱された光を検出することを含む。ＬＤＥにおいて、与えられる電場の方向は、ほぼ常に、縞の位相の領域に対して垂直である。縞状パターンは、よいコントラスト比を確保するために、同じレーザから由来する２つの光ビームの干渉によって生成される。近接する明るい縞と暗い縞との間の距離は、干渉するレーザビームの間の交差の角度からわかる。電場が印加されたマクロイオンが明るい縞および暗い縞を横断するに従い、光検出器は散乱光からの正弦波信号を拾い、その正弦波信号の周波数から電気泳動速度が測定され得るとともに移動度が取得される。
【００３１】
ＬＤＥは、それ以前の技術に対して重要な利点を有する。それは、移動度の測定のために要求されるサンプルの体積をミリリットルまたはそれ以下に大きく低減するが、その理由は、１−２ｍｍしか離れていない電極間の距離内に、縞状のパターンを生成することができるためである。電場は電極間の電圧差を電極間の距離で割ったものであるので、低減された電極の間隔は、観測可能な電気泳動を生成するために印加されなければならない電圧の強度を低減させる。加えて、非常に多数のマクロイオンが検出された信号に寄与するとともにこれが統計的に妥当な測定値を生成する。電極の分極（電極近くにイオンが集まって、印加された電場からバルクを遮蔽する）を避けるために、直流の電場よりも振動する交流電場が好ましい。電場の反転の周波数は、ドップラー周波数よりもずっと低くされるべきであるとともに、電気振動が発達するために要する時間の逆数よりもずっと高くされるべきである。電気振動の発達の特徴的な時間はｄ2／ｖであり、ｄは関連する１次元の寸法であり、ｖは溶液の動的粘性係数である。２０℃での水溶液の場合、ｖ≒１．０ｍｍ2／ｓｅｃであり、電気振動が発達するために要する時間は１ｍｍの電極間距離では約１秒である。しかしながら、低い移動度の種を測定する場合、約０．１−０．５μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓｅｃよりも小さい移動度である場合には、ＬＤＥは、過剰に高い電圧を印加して大量の電気分解と流体の滞留といった問題にぶつからなければ、それらの条件の両方を満たすことができない。ＬＤＥの他の限界は、正の電場および負の電場の両方が同じ光信号を生成して移動度の符号が決定できないことである。
【００３２】
ＬＤＥの限界に対処するため、位相解析光散乱（ＰＡＬＳ）が１９８０年代の後半において、J. F. Miller, K. SchatzelおよびB. Vincentにより、その論文“The Determination of Very Small Electrophoretic Mobilities in Polar and Nonpolar Colloidal Dispersions Using Phase Analysis Light Scattering,”(J. Colloid Interface Sci. 143,532-554[1991]）において開発された。ＰＡＬＳは、ＬＤＥに由来し、それらの技術の間の主な違いは、ＰＡＬＳにおいては、動かない代わりに走査する縞状パターンが散乱体積において確立されることである。そのような縞状パターンは、干渉するレーザビームの位相変調する一方または両方によって生成され得る。位相復調方式および検出された光信号のバンドパスフィルタリングの採用は、電子ノイズの排除に大きな役割を果たす。走査する縞状パターンは、マクロイオンが単一の電場の期間の間にいくつかの明るい縞と暗い縞とを横切らなければならないという必然性を取り除くだけでなく、移動度の符号の決定をも可能にする。ゼロ移動度、そしてそれゆえに動かない粒子は、その走査する縞の周波数と等価なドップラー周波数を生じさせ、その走査する縞と同じまたは反対の方向に移動するマクロイオンは、走査する縞の周波数よりも低くあるいは高いドップラー周波数を生成する。
【００３３】
ＰＡＬＳの他の変形において、散乱体積において干渉する２つのレーザビームの代わりに、第２のレーザビーム（局部発振器）が検出器において、マクロイオンから散乱された光と直接的に混合／ヘテロダインされて、光増幅器として機能するとともに電気泳動速度の測定に必須の位相基準として機能する。局部発振器は、上記のように説明されるのと同じ理由によって位相変調される。この構成において、ＰＡＬＳは、実際には干渉計測法であり、干渉計測法において、一方のアームは変調された局部発振器であり、他方は散乱された光である。入射レーザビームがサンプルを通り直進するので、サンプルの体積はさらに減少され得る。この構成の他の利点は、ヘテロダイン測定およびホモダイン測定が同時に可能なことである、なぜなら、ホモダイン信号は散乱された光が局部発振器と混合される前に測定可能であり、ヘテロダインはその混合の後に測定されるためである。
【００３４】
次に、局部発振器によって与えられる光増幅と、システムの信号−ノイズ比（ＳＮＲ）に対するその関係を考察する。これまでに説明されるように、検出器で生成される光電流は、吸収される光パワーに比例し、
【００３５】
【数７】
2011180584.tif 000009
【００３６】
と表される。Δωは局部発振器の位相変調による周波数シフトである。散乱体積中のすべての粒子から散乱される光は合計されて、最終項が得られ、ＰSは、散乱光のパワーを表し、φS（t）は、粒子の動きの情報を担持する光学位相である。ｉ（ｔ）を展開すると、
【００３７】
【数８】
2011180584.tif 000010
【００３８】
が得られる。ヘテロダインの利点は、交差項
【００３９】
【数９】
2011180584.tif 000011
【００４０】
において明らかに見られる。ここで、関連する信号のパワーは、局部発振器によって「コヒーレントに増幅される」。関連するショットノイズ電流の平均二乗は、
【００４１】
【数１０】
2011180584.tif 000012
【００４２】
である。ここで、ｅは電子の電荷であり、ｉdは検出器の暗電流の平均を表し、ΔＢは、電子回路によって決定されるシステムの帯域である。応答性Ｒは、ηeｅ／ｈνと表すことができ、ηeは、検出器の量子効率（７００ｎｍ付近の波長において、シリコンフォトダイオードとＡＰＤの両方で〜７０％）であり、ｈはプランク定数であり、νは光の周波数である。検出された信号電流の平均二乗は、
【００４３】
【数１１】
2011180584.tif 000013
【００４４】
となる。信号−ノイズ比は、したがって、
【００４５】
【数１２】
2011180584.tif 000014
【００４６】
で与えられる。分母の最終項は、検出の過程に関連する抵抗成分に由来するジョンソンノイズを表し、図３に示されるように、たとえばトランスインピーダンス増幅器のフィードバックループにおける抵抗ＲFである。増幅器に続くバンドパスフィルタは、システムの帯域ΔＢを制限してノイズ項を最小化する。通過帯域の中心ωpは、最適な動作での局部発振器の変調周波数Δωと等しく設定される。
【００４７】
ヘテロダイン検出の利点は、ここで明らかとなる。局部発振器によって生成されるショットノイズ項が完全に他のノイズ項を小さくするまで、局部発振器パワーＰLOが大きくなるに従ってＳＮＲが増大する。この限界において、
【００４８】
【数１３】
2011180584.tif 000015
【００４９】
が得られる。最小の検出可能な信号は、出力ＳＮＲを１にする信号入力パワーとして定義されるが、
【００５０】
【数１４】
2011180584.tif 000016
【００５１】
となる。これが光検出の量子的限界である。ηe＝１の場合、このパワーは（ΔＢ-1）秒あたりの１個のフォトンのレートでのフォトンの流れに対応する。すなわち、A. YarivによってOptical Electronics in Modern Communications, pages 423 et seq. Oxford University Press (1997)に説明されるように、システムの時間分解能あたりの１個のフォトンである。
【００５２】
ＬＤＥと比較すると、ＰＡＬＳは、測定を行なうために要求される時間をより少なくするとともに、より高い感度を有する。ＰＡＬＳは、また、極性のない溶媒中のサンプルおよび、等電点に近接するマクロイオンのような移動度の低い種の測定により適している。現在市場にある数多くの計測器が、高分子の移動度を測定するためのＰＡＬＳ技術を実現する。ＰＭＴおよびＡＰＤといった量子的高感度の検出器が用いられて、約５ｎｍまでサイズが小さくなったマクロイオンの移動度が特別な条件下で測定可能である。マクロイオンの最小の測定可能なサイズは、マクロイオンモル質量、濃度および測定の期間といったいくつかの他のパラメータにも依存する。このことは、ＰＡＬＳをより大きな粒子の測定に適したものにさせるが、タンパク質のような生体分子に適したものにさせない。というのも、これらの分子の大部分は５ｎｍよりも小さいためである。本発明の目的の１つは、このサイズの限界を克服し、これまでに議論された方法によって測定可能な粒子よりもさらに小さい粒子の正確な測定を可能にすることである。
【００５３】
ＰＡＬＳのように技術が改良されているが、市場で入手可能な現在の実現手段は限界を有する。これらの計測器において、単一フォトンをカウントするＡＰＤは、その感度と高い量子効率によって検出器の好ましい選択となる。しかしながらＡＰＤは本質的には広い帯域の「デジタル」検出器であるので、ＡＰＤの使用は、ＰＡＬＳによって与えられるノイズ除去のためのアナログフィルタリングの利点を犠牲にする。電気泳動を測定するために、散乱された局部発振器の光がファイバレンズモジュールによって集められて、混合された信号が光検出のためにＡＰＤへと導かれる。一般的に認められている経験則では、局部発振器は、たとえばC. J. Oliverによって、Photon Correlation and Light Beating Spectroscopy, pp.151-223, H. Z. Cummins and E. R. Pike, eds., Plenum, New York 1974における「Correlation techniques」とタイトルがつけられた章において報告されているように、無視できる線幅のひずみのために散乱された光信号よりもおよそ３０倍強くなければならない。ＡＰＤは制限されたダイナミックレンジを有するとともにカウントレート＞２ＭＨｚにおいて非線形になるので、局部発振器と散乱された光との間の強度比は、最適な感度を維持するために一定に調整される必要がある。もしその比率が低すぎるならば、ホモダイン信号は測定値に紛れ込む。もしその比率が高すぎるならば、ＡＰＤは、その非線形形態へと追い込まれるか、あるいは飽和する。さらに、ＡＰＤはシリコンＰＩＮフォトダイオードよりも、少なくとも１桁の大きさで高価であり、関連する商業的な計測器は、移動度の測定のために散乱光のごくわずかな部分のみを利用する、単一検出器チャネルに制限される。
【００５４】
この制限は、ｒh＜５ｎｍでの小さな分子の移動度の測定にとっては、それと関連するより顕著なブラウン運動により、扱いにくいものであることを証明する。数分あるいは数１０分の測定時間が、拡散位相成分を平均化するために要求される。すなわち、これらの計測器が電気泳動移動度のための最小の測定可能なサイズを５ｎｍに特定する主な理由は、より小さな分子の拡散成分を平均化するためには、長期の測定時間が要求されるということである。これらの長い測定の全く不便なことおよび非効率であることを凌駕しても、特に壊れやすいサンプルが含まれているときには、長期間の測定が、しばしば適していないことがある。
【００５５】
バイオテクノロジーにおける進歩は、この分野へのさらなる試みを作り出してきた。製剤化学者は、保存サンプル、たとえば組換治療タンパク質の安定性の学習に関心を有する。タンパク質の移動度は、安定性のきわめて重要な指標である。一般に、移動度が高くなるほど、タンパク質はより表面的に帯電され、静電的斥力は、集合する傾向を減少させる。最も関心があり、最も研究されたタンパク質は、モル質量が〜２００ｋＤ未満であり、半径がしばしば５ｎｍよりもずっと小さいものである。たとえば、ＩgＧ分子は、〜１５０ｋＤのモル質量および〜４．６ｎｍの流体力学半径を有する。これらの分子の移動度の測定は、本発明の時点において利用可能ないかなる計測器でも手ごわい仕事である。電極近くのタンパク質は、一貫性のある測定値が得られる前に損傷を受ける。分子サイズおよび／または移動度がより小さくなるときには状況はさらに悪化する。このサイズの範囲では、高分子は極めて少ない光を散乱し、より活発な粒子の拡散が、測定された変位の不確実性に寄与する。J. F. Miller, K. Schatzel，B. Vincentによって、その論文“The Determination of Very Small Electrophoretic Mobilities in Polar and Nonpolar Colloidal Dispersions Using Phase Analysis Light Scattering,”(J. Colloid Interface Sci. 143,532-554[1991]）において議論されるように、粒子の拡散による、関連のある信号−ノイズ比ＳＮＲDは、ＳＮＲD∝μＥ（Ｔ／Ｄ）0.5として表すことができる。Ｔは全体の測定時間であり、Ｄは粒子の移動拡散係数である。所定のサンプルに対するＳＮＲDを増加させるために、与えられる電場を増大させるか、または、より長い期間にわたる測定を行なうことのいずれかが必要である。不幸なことに、いずれの選択肢も、測定された高分子に対する有害な効果を有するとともに、通常は、サンプルの劣化と電極へのめっきをもたらす。このことは、抗体のような「細心の注意が必要」であり壊れやすいタンパク質の場合には特に真実となる。満足のいく方式でこの測定を達成するために、測定時間をできるだけ短く保つことが必須である。
【００５６】
本明細書に開示されたＭＰ−ＰＡＬＳの発明に関する実施は、検出器のアレイで多重の同時測定を実行することによって、このジレンマを解決する。B. J. BerneおよびR. Pecoraによって、以前に引用された文書において議論されるように、散乱された光がスクリーンに衝突するときに、拡散／スペックルパターンが生成され、そのパターンは、他のものとの間で、散乱体積の範囲に依存する。すなわち、強度の最大値および最小値は、散乱体積の大きさに依存する。スクリーン上の任意の点Ｐにおいて、その範囲内のすべての点における信号がＰにおける信号と部分的にコヒーレントであるように、点Ｐの近くの領域を定義することができる。この領域は、コヒーレンス領域と呼ばれる。光散乱のためのコヒーレンス領域の実用的な見積もりは、Ａcoh＝λ2／Ωであり、Ωは検出器における散乱体積によって定められる立体角である。Ωが小さくなるにつれて、Ａcohは、より大きくなる。本発明の実施では、各検出器チャネルは独立の測定を行なうので、Ｎチャネルは測定時間をＮ倍減少するであろう。各検出素子の有効領域が散乱光のコヒーレンス領域以上である限り、異なる検出素子から集められた信号は全く独立である。この並列化は、干渉するビームの自由空間多重化を可能にする革新的な光学デザインによって可能になる。そのような並列化の力は、図７において明確に示される。
【００５７】
図７において、小さなタンパク質（ｒh＝３．５ｎｍ）からのデータが示される。そのタンパク質は、リン酸でｐＨ３．４に滴定された１ｍＭリン酸バッファ中に溶解された１０ｍＭ  ＮａＣｌ中の１．０ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。図７ａは、拡散のみによる位相の累積を示す。図２ａに示された大きな粒子と比較すると、拡散による位相の変動はより大きくなる。図７ｂは、振動する電場が与えられた場合の位相の累積を示す。小さな粒子の場合には、動きが拡散によって隠されて、図７ａおよび図７ｂに示されたデータは本質的に同じに見える。しかしながら、図７ｃに示されたＭＰ−ＰＡＬＳの大規模並列化は、この小さな分子の移動度の正確な測定を可能にする。そのような測定は、本発明のＭＰ−ＰＡＬＳより先には可能となってはいなかった。このことは、既存のＰＡＬＳ計測器に対して少なくとも１桁の感度の改善を示している。
【００５８】
マクロイオンまたは分散粒子の電気泳動移動度を定量的に測定するすべての計測器は、対象の粒子に、予めわかっている大きさの電場を印加する必要があるとともに、この電場の印加から、その電場の方向に移動する影響を受けた粒子の速度を決定する。図１およびこれまでの議論を参照すると、光散乱に基づく計測器の場合、コヒーレント干渉のいくつかの形態が常に必要となる。散乱体積１を含む干渉パターンを成立させて、移動する高分子から散乱される光の強度を測定することができる。その代わりに、散乱体積１において移動する高分子で散乱された光が、検出器においてコヒーレントな局部発振器と混合されて、情報を担持する光学位相が抽出される。この発明では後者の選択肢を実現するが、その理由は、電場を生成する電極間の間隔をより狭くすることを可能にするだけでなく、利用可能な光の強度をより効率的に用いることも提供するためである。
【００５９】
図４は、電気泳動移動度を測定するＰＡＬＳに基づく計測器の本発明の実施を示す。ビームスプリッタ２は、レーザビーム３を２つのビームに分割する。サンプルビーム４は、レンズ５によって、サンプルセル６の中央において焦点を結ばれ、参照ビーム７は、プリズム８へと向けられる。
【００６０】
サンプルセル６は、２つの電極９を含むチャンバを備えるとともに、サンプルビーム４が通る経路を可能にする入射窓１０および出射窓２６によって封じられる。チャンバは、通常はサンプル溶液によって完全に満たされている。自由な表面がないことが、流体の対流の発達を防ぐとともに、用いられ得るサンプルのイオン強度の範囲を拡張する。より高いイオン強度を有するサンプルの場合、より多くの電流が電極間の流体で満たされた空間を流れると予想され、ジュール熱による流体の対流が最終的に発達し得る。定常状態の流体の対流による効果がデータ解析において計上され得るが、その理由は、印加された電場が極性を反転させるときにはいつでも電気泳動的な動きは方向を反転させるが、その一方で、対流成分は電場の極性とは独立であるためである。しかしながら、問題は、もしセルが温度的に安定化していないならば、セルの内部に放出された熱がずっと対流を発生させて、測定の間は定常状態に達しないことである。温度の変化による流体の粘性の変化は、また、移動度の測定を複雑にし得る。本発明の１つの実施例では、セルの底を冷却して上部を加熱して対立する温度勾配を生成し、対流に対してシステムを安定化させることによって、この問題を軽減する。
【００６１】
ビルトイン電極９は、次の３つの目的を与える。すなわち、セル／サンプル温度の安定化、サンプルの伝導度σの測定および電気泳動を駆動するための電場Ｅの印加である。セルの本体は電気的に絶縁される必要があり、一般的な電気絶縁体（たとえばプラスチック）はまた典型的な断熱体であり、したがって、セルの温度の安定化には適していない。したがって、熱伝導性を有する電極が、温度的に安定化しなければならない。このことは、熱電素子を付着して、含まれるサンプルを加熱または冷却するとともに、導電性サンプルにおいて電力が消費される間、セル／サンプル温度を安定化させることによって達成され得る。移動度の測定の場合には、一旦サンプルが所望の温度に到達すれば、対象の溶液の伝導度σは、予めわかっている大きさの電圧パルスを電極間に印加して、その結果の電流を測定することによって決定される。その伝導度は、次に、たとえば塩化カリウム（ＫＣｌ）といった、伝導度の基準と比較される。電気泳動移動度の測定の間、電流源および電圧源のある組合せが電極間に印加されて、電気泳動を駆動する電場Ｅを生成する。その電場はＥ＝Ｊ／σとの関係によって決定され得る。ここでＪは測定された電流密度である。
【００６２】
なお、Ｊは実時間において測定され、σは予め決定される。電極は、ステンレス鋼、金、白金またはパラジウムのようなさまざまな導電性材料からなるのでもよいし、または、そのような導電性材料で覆われていてもよい。選択材料は、その表面抵抗および対象のサンプルとの化学的な互換性に基づいて選択され得る。
【００６３】
導電性サンプルの場合、単位体積あたりの消費パワーは、Ｅ・Ｊまたはσ｜Ｅ｜2である。高い伝導度のサンプルの場合、相当高い電流が、つりあった電場を生成するために必要である。したがってジュール熱はサンプルの導電度に比例する。たとえば、１０ｍｓ／ｃｍサンプル中の一定の電場２０Ｖ／ｃｍ（〜５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）は、水溶液中において１℃／秒のオーダのジュール熱を引起す。σが増加するにつれ、測定は流体の対流および温度の上昇による変化する粘性に対してより一層弱くなる。さらに、高い電流は、電極だけでなく測定される分子に対してもさまざまな有害となる効果を生成する。これらの困難を克服することの鍵は、より短い測定時間と、対流電流の発達を妨げる十分に設計されたセルに依存する。導電性を有さないサンプルの場合には、電極の間に電流が流れず、印加された電場は、単純に電圧差を電極の間隔で割ったものである。セルの中ではパワーは消費されず、何らかの熱的な効果に対する懸念は存在しない。
【００６４】
焦点を合わせられたサンプルビームがサンプルセル６を通過すると、光の一部が電気泳動を受けている粒子から散乱する。散乱されていないサンプルビーム１７に沿って出射窓１０を通りサンプルセルを離れ得る散乱光１２の一部は、次に、コンデンサレンズ１１によって平行にされて、結合された平行サンプルビームを形成する。その結合された平行サンプルビームは、非散乱成分１７を有し、その非散乱成分１７は、ミラー手段１３から反射する、集められた散乱部分と結合される前に、減衰手段１８によって減衰され得る。これらの反射成分は、次にビームスプリッタ手段１４からさらに反射して、検出器アレイ１５に向かう。ミラー１３およびビームスプリッタ１４は、非散乱成分を有する、平行にされた散乱サンプルビームと検出器アレイ１５における最適な光学混合／ヘテロダインのための参照ビーム１６との間の共線性を達成する。各アレイ素子は、散乱光の立体角および対応する散乱ベクトルの範囲を妨げるが、散乱ベクトルは、コンデンサレンズ１１の焦点距離およびアレイ素子の位置および寸法によって決定される。ここで平行にされたサンプルビーム１７の非散乱部分は、ビームスプリッタ１４においてその一部を反射する前に望まれるように減衰されて、サンプルビームモニタとしての役割を果たすであろう特定のアレイ素子１９に入射する。
【００６５】
本発明の好ましい実施例において、サンプルセル６の内部領域は、図５に示されるように、入口部２０および出口部２１を通り流れる流体に対して接近可能である。すなわち、セルを取り除くことの必要なく、その中に含まれるサンプルが変わることを可能にする。
【００６６】
図４を再び参照して、ビームスプリッタ２から反射したレーザビームの一部は、直角プリズム８によって、引続き逆反射する。プリズム８は逆反射器として用いられるので、その斜辺側の表面は、光の伝達を最大にするために反射防止コーティングされる。プリズム８は圧電アクチュエータ２２によって連続的に駆動され、アクチュエータは、測定された電気泳動移動度の符号の決定および電子ノイズの除去を容易にするために、ビームに対して並列的に位相変調を与える。プリズム８は、２つのさらなる目的を与える。
【００６７】
１．プリズムからの逆反射は、圧電アクチュエータ２２による移動を二重にして、所定の圧電駆動電圧に対する位相変調の量を増加させる。同じ効果は、プリズム８を、その反射面が互いに垂直である２つのミラーに置換えることによっても達成し得る。これは背面反射をなくすであろう。
【００６８】
２．単一の４５°ミラーの単純な反射と比較して、逆反射は横方向のビームの移動をなくすとともに、検出器１５によって受信したかもしれない関連する振幅変調を防止する。
【００６９】
逆反射の後、ビームはミラー２３によって再度向きを変え、そして適切な光学系によって整形されて参照ビーム１６としての役割を果たす。参照ビーム１６は、次にビームスプリッタ１４を通過して伝達し、検出器アレイ１５に向けられる。検出器アレイ１５では、参照ビーム１６は、反射された散乱サンプルビーム部分１２と同一直線上で再結合する。
【００７０】
図４において、ビームスプリッタ１４を通って伝達した参照ビームと、ビームスプリッタ１４によって反射したサンプルビームとは検出器アレイ１５によって測定される。代わりの実施例は、図６に示されているが、第２の光検出器アレイ１５′を含み、その検出器アレイは、ビームスプリッタ１４によって反射された参照ビームとビームスプリッタ１４によって伝達されたサンプルビームとを集める。位置１５および１５′における検出器アレイは、改善された平均化のために同時に用いられ得る。
【００７１】
より一般的に、２次元の検出器アレイが、検出のために、１次元アレイ１５に代えて用いられ得る。そして参照ビーム１６の形状が、光検出器アレイ１５を効果的に照射するために調整されるであろう。たとえば、ガリレイ望遠鏡（適切な倍率を有する）が、それによって、逆に円盤の形状を有する参照ビームを得るために用いられることができ、その参照ビームは、次に、同じく円盤の形状を有するサンプルビーム散乱部分と混合される。
【００７２】
本発明の好ましい実施例において、１次元検出器アレイ１５が用いられ、ビーム整形が１対のシリンドリカルレンズ２４および２５により実現されて、引伸ばされた参照ビーム１６が得られる。直線的に配置された素子を適切に覆うために、そのような引伸ばされた参照ビームは、利用可能な光パワーの最も効率的な利用を行なう。
【００７３】
なお、１次元アレイ検出器１５の場合、平行化されたサンプル散乱部分と参照ビームとは、ともに時間的および空間的にコヒーレントでなければならず、それにより干渉計に基づく移動度の測定が十分に実現可能である。時間および空間の両方において実現されるコヒーレンスについて以下に説明する。
【００７４】
時間でのコヒーレンスを得るために、光源のコヒーレンス長は、サンプルビームおよび参照ビームの間の経路の長さの差よりも十分に長くなければならない。このことは、さまざまなコヒーレント光源、たとえば、ガスレーザ、固体レーザおよび周波数の安定した半導体レーザによって容易に達成される。具体的なコヒーレント光源の選択は、光源に照射されるサンプル、たとえば吸収および／または発光を示すサンプル、他の要因のうちのコスト面での考慮によって決定される。
【００７５】
この発明でのＰＡＬＳ実施において、シリコンフォトダイオードアレイと結合した自由空間光学系が検出のために用いられる。空間でのコヒーレンス（または波面位相整合）は、ミラー１３とビームスプリッタ１４との適切な配置および向きによって達成されて、平行化されたサンプルビームおよび参照ビームの同一直線での伝搬を確保する。２つのビームの間の最大に可能な角度偏差θDは、λ／２πｗに等しく、ｗはアレイ素子の寸法であり、λは真空中の光の波長である。これは、光学システムの注意深い配置を要求する。今日市場で利用可能なすべてのＰＡＬＳ計測器は、それぞれに空間コヒーレンスを達成する。それらは、光を集めるために光ファイバを用いる。そのようなファイバは、光を、個々の「モード」で伝達する。散乱光と局部発振器とが一旦ファイバに結合されると、それらから伝達モードが取り出されて、したがって相互の空間コヒーレンスが得られる。このことは、Robert G. W. Brownによって、その論文“Homodyne Optical Fiber Dynamic Light Scattering,”Appl. Opt. 40, 4004-4010 (2001) において説明されている。これは非効率的プロセスである、というのも、非伝達モードは、ファイバのクラッドを通じて失われるためである。一方、配置が容易であることは利点である、というのも局部発振器ビームおよび散乱光は、正確に平行である必要がないためである。不幸なことに、低い検出効率を補うためには、厳密な線形性とダイナミックレンジとを有するＡＰＤまたはＰＭＴのような量子的な感度の検出器が要求される。
【００７６】
移動度の測定のためのより高い情報スループットのみの考慮から、自由空間光学系とシリコンフォトダイオードアレイとの結合が、光ファイバとＡＰＤまたはＰＭＴとの使用に対してはるかに優れている。より挑戦的な光学配置が、十分に構築された光学システムを用いて首尾一貫して達成され得るとともに、一旦配置されれば、さらなる利点が実現される。
【００７７】
１．複数のアレイ素子に入射する散乱光はヘテロダインであり、同時に検出される。各アレイ素子は独立の測定を行ない、拡散成分を平均化するために要求される測定時間は劇的に減少する。その理由は、平均化が、時間だけでなく空間においても行なわれるためである。並べられたフォトダイオードは、そのような大規模な並列化に、それら自身を容易に役立たせる。さらに、複数のＡＰＤおよび光ファイバを用いた多重チャネル測定は、非常に高価となるであろう。
【００７８】
２．この並列化は、計測器における最小の測定可能な粒子サイズの減少を示す。その理由は、付随する拡散成分が、より容易になくなるためである。最小の測定可能な粒子サイズは１ｎｍ以下に拡張される。
【００７９】
３．短縮された測定時間は、サンプル分子が電流を受けなければならない期間を減少させ、それによりサンプルだけでなくシステム電極の完全性を保存することに役立つ。このことは、特にタンパク質が見本の種類である、貴重で壊れやすいサンプルにとって重要である。
【００８０】
４．ＡＰＤおよびＰＭＴとは対照的に、フォトダイオードアレイは、優れた線形性と非常に大きなダイナミックレンジ（１０11の倍数まで）を有する。非常に大きなダイナミックレンジの利点を持つことにより、ＡＰＤを用いるシステムと比較して局部発振器に対する散乱光の非常に高い強度比を用いることができる。このことは、２つのビームの間の強度比を調整する必要性をなくし、ショットノイズで制限された実行を可能にする。さらに、局部発振器／参照ビームの位相を変調することにより、ほとんど制限のないさまざまな可能性から選ばれた変調周波数を有する信号を検出することができる。このことは、ＤＣに基づく測定から対象の測定を遠ざけるとともに、アナログカップリングの使用を可能にする。この方式において、変調周波数について信号をバンドパスフィルタすることによって、ノイズ帯域は大きく減少する。ＤＣから遠ざけることは、また、アナログ検出器において特有である１／ｆノイズを減少することに役立つ。
【００８１】
５．要素のコストは大きく低減される。ＡＰＤはフォトダイオードアレイ全体よりも１桁の大きさで高価である。ＰＡＬＳの本発明の変形における単位コストあたりの情報スループットは、光ファイバおよびＡＰＤまたはＰＭＴを用いるシステム／計測器のそれよりも大きく上回る。
【００８２】
光散乱、高分子評価および電気泳動移動度測定の分野の当業者にとっては明らかであるように、本発明の方法および装置の多くの明らかな変形があり、それらは、その実施のために挙げた基本的な要素と変わらない。すべてのそのような変形は、以上説明した本発明の明らかな実現であり、以下に続くクレームを参照することにより含まれる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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