(57)【要約】      （修正有）【課題】アマノリ属のスサビノリ、アサクサノリも含めたヒトエアマノリ亜属１６種及び外国産のダンシサイやP.vietonamensisの簡便なアマノリ類の種判別方法及びそれに用いるプライマーを提供する。【解決手段】被検試料中のＤＮＡを鋳型として、特定の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅処理し、得られる増幅産物を制限酵素Taq Iで処理した切断片パターン、及び／又は特定の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅処理し、得られる増幅産物を制限酵素SspI、AciI、Cfr13I及びAluIから選択されるいずれか１種以上で処理した切断片パターンにより判別するアマノリ類の品種判別方法及びそれに用いるプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号１及び２の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅処理し、得られる増幅産物を制限酵素Taq Iで処理した切断片パターン、及び／又は配列番号３及び４の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅処理し、得られる増幅産物を制限酵素Ssp I、Aci I、Cfr13 I及びAlu Iから選択されるいずれか１種以上で処理した切断片パターンにより判別するアマノリ類の品種判別方法。
【請求項２】
配列番号３または４で示される塩基配列もしくはこれらに対応する相補的な塩基配列を有するプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマノリ類の種判別方法及びこれに用いるプライマー関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国に生息するアマノリ類（Porphyra属）は、表１に示すような３亜属２８種と言われている。
【０００３】
【表１】
2011092060.tif 000002
【０００４】
このうちフタツボシアマノリ亜属３種とフタエアマノリ亜属３種は、いずれも生息域が北海道や東北地方に限られており、生息量が少ないことと外部形態で亜属レベルでの判別が可能（フタツボシアマノリ亜属は１細胞に葉緑体が２個、フタエアマノリ亜属は細胞が２層）である。それに対して、ヒトエアマノリ亜属２２種は、いずれも外部形態からでは種判別が困難な上、生息環境によって外部形態の変異が大きいため、形態による種判別は不可能である。そのうち、コスジノリは絶滅種、アナアマノリ、エリモアマノリ、アツバアマノリ、ムロネアマノリ、クロノリの５種は近年の採集報告が全くない準絶滅種であるため、１６種が現存する。
【０００５】
一方、これまでノリ養殖はスサビノリ、アサクサノリの２種のみで行われ、他種はほとんど利用されてこなかった。しかし、近年の温暖化による生産量の減少・不安定化や外国からのノリ製品輸入の増大により、新たな形質を持つ新品種の開発や新たな付加価値をつけたノリ製品の考案によるノリ養殖業の活性化が叫ばれるようになってきた。
しかし、これまで用いられてきたスサビノリやアサクサノリの養殖品種は、限られた少数の株からの選抜によって派生したため、遺伝的多様性に乏しく、新たな有用形質を保持している可能性は低い。そこで、新品種作出のための株として、スサビノリ、アサクサノリ以外の野生種が注目されてきており、これら野生種を用いて、野生種単独での選抜や野生種と養殖種との交雑等による新品種開発が進められている。
【０００６】
以上のような背景により、スサビノリ、アサクサノリも含めたヒトエアマノリ亜属１６種の簡便な種判別技術の開発が求められていた。また、外国産であるダンシサイ（P. haitanensis）やP. vietonamensis等の高温に強い種は、今後温暖化対策のための新品種作出に向けて、比較検討すべき種であることから、これら外国産２種も国内産１６種との判別技術開発が求められていた。
ところで、ＤＮＡの塩基配列比較やＰＣＲ‐ＲＦＬＰ分析などの分子生物学的手法の進歩により、スサビノリ種とアサクサノリ種の判別が容易となってきた(非特許文献１〜５)。また、しかしながら、これらの方法では、ＤＮＡシーケェンサー等、大掛かりな装置を用いる必要があり、また種レベルでの判別はできていなかった。
また、アオノリ属の海藻であるか否かを決定する方法も提案されているが（特許文献１）、アマノリ属はアオノリ属とは判別に使用できるＤＮＡが全く異なり、またこの方法も種レベルでの判別方法までは提案していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３０４６０４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kunimoto et al. J. Appl. Phycol.，11，203‐209（1999）
【非特許文献２】Kunimoto et al. J. Appl. Phycol.，15，337‐343（2003）
【非特許文献３】Niwa et al. J. Phycol.，41，294‐304（2005）
【非特許文献４】Niwa et al. Phycol. Res.，53，296‐302（2005）
【非特許文献５】Niwa et al. Aquaculture，274，126‐131（2008）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、アマノリ属のスサビノリ、アサクサノリも含めたヒトエアマノリ亜属１６種及び外国産のダンシサイ（P. haitanensis）やP. vietonamensisの簡便な種判別方法及びそれに用いるプライマーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、次のとおりである。
（１）被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号１及び２の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅処理し、得られる増幅産物を制限酵素Taq Iで処理した切断片パターン、及び／又は配列番号３及び４の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅処理し、得られる増幅産物を制限酵素Ssp I、Aci I、Cfr13 I及びAlu Iから選択されるいずれか１種以上で処理した切断片パターンにより判別するアマノリ類の品種判別方法。
（２）配列番号３または４で示される塩基配列もしくはこれらに対応する相補的な塩基配列を有するプライマー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、培養して形態や細胞生物学的観察を行うことなしに、アマノリ類１８種の種名を簡便に判別できるという効果を奏する。これにより、スサビノリ、アサクサノリ以外の野生種を用いて、より付加価値の高いノリ新品種の作出において、元株の種名を明らかにでき、新品種作出の効率化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】領域１のＰＣＲ増産産物の電気泳動パターンの写真である。
【図２】領域１のＰＣＲ増産産物を制限酵素Taq Iで処理した後の切断片の電気泳動パターンの写真である。
【図３】領域２のＰＣＲ増産産物の電気泳動パターンの写真である。
【図４】領域２のＰＣＲ増産産物を制限酵素Ssp Iで処理した後の切断片の電気泳動パターンの写真である。
【図５】領域２のＰＣＲ増産産物を制限酵素Aci Iで処理した後の切断片の電気泳動パターンの写真である。
【図６】領域２のＰＣＲ増産産物を制限酵素Cfr13 Iで処理した後の切断片の電気泳動パターンの写真である。
【図７】領域２のＰＣＲ増産産物を制限酵素Alu Iで処理した後の切断片の電気泳動パターンの写真である。
【図８】紫外線照射下における切断片の電気泳動パターンの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の被検試料は、アマノリ属に属するノリであれば、養殖ノリ、野生ノリのいずれでもよい。本発明では、まず、被検試料からＤＮＡを抽出する。このＤＮＡは、胞子、糸状体、葉状体のいずれから抽出してもよいが、一般には保存が糸状体でなされているので、この糸状体から抽出することが好ましい。この抽出は、分子生物学の分野で慣用されている手法にしたがって行い、必要に応じて精製し、供試試料として調製すればよい。たとえば、市販の植物などからＤＮＡを抽出するキット、ISOPLANT II（NIPPON GENE Co. Ltd.）などを用いると簡便である。
【００１４】
次に、この抽出されたＤＮＡを鋳型として、プライマーを用いて増幅処理を行うが、この場合、プライマーとしては、表２に示した塩基配列又はそれに対応する相補的な塩基配列を有するものが用いられる。この場合、配列番号１のフォワード側の塩基配列と配列番号２のリバース側の塩基配列、又は配列番号３のフォワード側の塩基配列と配列番号４のリバース側の塩基配列、或いはこれらの相補的な塩基配列を各々１組のプライマーセットとして用いる。このプライマーセットは、国内産アマノリ類１６種及び外国産アマノリ類２種の合計１８種間において、ミトコンドリアＤＮＡ中の遺伝的多様性を有する２つの領域を増幅することができる。
【００１５】
【表２】
2011092060.tif 000003
【００１６】
配列番号１及び２のプライマーセットを用いたアマノリ類のＤＮＡ増幅産物は、そのまま電気泳動を行っても、図１に示したように、そのパターンからは、種の判別はできない。しかし、このＤＮＡ増幅産物を制限酵素Taq Iで処理した後に、電気泳動を行うと図２に示したように、切断片パターンの違いから、[6]イチマツノリ、 [7]マルバアマノリ、[8]オニアマノリ、[9]ヤブレアマノリ、[10]ソメワケアマノリ、[12]ベンテンアマノリ、 [14]カヤベノリ、 [15]タネガシマアマノリ、[16]ツクシアマノリ、[17]ダンシサイ、[18] P. vietnamensisの１１種が判別可能となる。
なお、残った７種は、上記制限酵素Taq Iの切断片パターンから、次のようにグループ化できる。
グループI：[1]スサビノリ、[5]ウタスツノリ
グループII：[2]アサクサノリ、[4]カイガラアマノリ、[11]マルバアサクサノリ
グループIII：[3]ウップルイノリ、[13]チシマクロノリ
【００１７】
同様に、配列番号３及び４のプライマーセットを用いたアマノリ類のＤＮＡ増幅産物は、そのまま電気泳動を行っても、図３に示したように、そのパターンからは、種の判別はできない。このＤＮＡ増幅産物を制限酵素Ssp Iで処理した後に、電気泳動を行うと図４に示したように、切断パターンの違いから、上記グループIの２種、すなわち、[1]スサビノリ、[5]ウタスツノリについて判別可能となる。
一方、この配列番号３及び４のプライマーセットを用いたアマノリ類のＤＮＡ増幅産物を制限酵素Aci Iで処理した後に、電気泳動を行うと図５に示したように、切断片パターンの違いから、上記グループIIの１種、すなわち、[11]マルバアサクサノリが判別可能となる。
また、このＤＮＡ増幅産物を制限酵素Cfr13 Iで処理した後に、電気泳動を行うと図６に示したように、切断片パターンの違いから、上記グループIIの２種、すなわち、 [2]アサクサノリと[4]カイガラアマノリが判別可能となる。
さらに、このＤＮＡ増幅産物を制限酵素Alu Iで処理した後に、電気泳動を行うと図７に示したように、切断片パターンの違いから、上記グループIIIの２種、すなわち、[3]ウップルイノリ、[13]チシマクロノリが判別可能となる。
【００１８】
以上のように、本発明の方法は、２組のプライマーセットのいずれか、又は両方を用いて得られたＤＮＡ増幅産物を、上述したような制限酵素で処理し、その切断片のパターンを対比することにより、被検試料のアマノリが現存する国内産１６種と外国産２種の合計１８種のいずれの種に該当するかを判別する。
なお、本発明の方法では、被検試料のアマノリがどの種に該当するかを判別できればよいので、上述した方法をすべて行う必要はなく、例えば、配列番号１及び２のプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅し、その増幅産物を制限酵素Taq Iで処理して、その切断片パターンと図２のパターンと比較して１１種のどれかに該当することが判別すれば、それで判別は終了する。また、被検試料の種が、例えば、[13]チシマクロノリと予測され、その確認を行うのであれば、配列番号３及び４のプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅し、その増幅産物を制限酵素Alu Iで処理して、その切断片パターンと図７のパターンと対比してどれに該当することが判別すればよいことになる。
もちろん、配列番号１及び２並びに配列番号３及び４の２組のプライマーセットを一緒に用いて、被検試料のＤＮＡを増幅し、次いで、上述の各制限酵素で各々処理して、切断片パターンを対比、判別することもできる。
【００１９】
なお、上記プライマーを用いたＤＮＡの増幅は、公知のＤＮＡ増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）などを用いることができる。また、この増幅を行う際の反応液の組成やサイクリングの条件は、プライマーのTm値、サーマルサイクラーの仕様などに合わせて適宜選定するとよい。一方、切断片の増幅産物は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等の慣用の電気泳動法により分離し、そのパターンを対比、判別すると良い。
また、本発明に用いる制限酵素は市販のものを用いることができ、各制限酵素の切断部位は表３に示すとおりである。
【００２０】
【表３】
2011092060.tif 000004
【実施例１】
【００２１】
次に実施例に基いて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
元株保有機関から分与された起源の明らかな表１に示した、絶滅種又は準絶滅種を除く日本産アマノリ類１６種（[1]スサビノリ、[2]アサクサノリ、[3]ウップルイノリ、[4]カイガラアマノリ、[5]ウタスツノリ、[6]イチマツノリ、[7]マルバアマノリ、[8]オニアマノリ、[9]ヤブレアマノリ、[10]ソメワケアマノリ、[11]マルバアサクサノリ、[12]ベンテンアマノリ、[13]チシマクロノリ、[14]カヤベノリ、[15]タネガシマアマノリ、[16]ツクシアマノリ）及び外国産アマノリ類２種〔[17]ダンシサイ（P. haitanensis）、[18] P. vietnamensis〕の合計１８種のノリを単藻化し、表４に示す条件で室内培養を行い、種判別用の基準株とした。
【００２２】
【表４】
2011092060.tif 000005
【００２３】
この培養により得られたフリー糸状体を液体窒素で凍結して粉砕後、ISOPLANTII（NIPPON GENE Co. Ltd.）を用いて、プロトコールにしたがって、ＤＮＡを抽出し、精製した。
次に、配列番号１及び２に示した塩基配列を有するプライマーセットを用い、上記により得られたＤＮＡをi-Cyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）により、表５に示した条件でＰＣＲ法で増幅した（なお、この増幅領域を「領域１」という）。
【００２４】
【表５】
2011092060.tif 000006
【００２５】
領域１の増幅産物を、２％アガロースゲルで、１×TAEバッファーを用いて電気泳動を行い、泳動後に、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外線下で得られた電気泳動パターン写真を図１として示した。なお、図中の各パターンの上部に付した番号は、上記のアマノリ類の各種の先頭に付した番号の種名と対応している（以下、同じ）。この結果からは、種の判別ができないことが分かる。
【００２６】
一方、領域１の増幅後のＰＣＲ反応液について、制限酵素Taq Iを用いて、表６に示した条件で処理し、処理後の切断片について、上記と同様の方法で電気泳動を行い、図２に示した電気泳動パターン写真を得た。また、領域１の種ごとのＰＣＲ増幅産物サイズと制限酵素Taq I処理後の切断片サイズを表７に示した。
この切断片パターンの違いから、[6]イチマツノリ、 [7]マルバアマノリ、[8]オニアマノリ、[9]ヤブレアマノリ、[10]ソメワケアマノリ、[12]ベンテンアマノリ、 [14]カヤベノリ、 [15]タネガシマアマノリ、[16]ツクシアマノリ、[17]ダンシサイ、[18] P. vietnamensisの１１種が判別可能であることが分かる。
【００２７】
【表６】
2011092060.tif 000007
【００２８】
【表７】
2011092060.tif 000008
【００２９】
上述の方法で抽出、精製された１８品種のＤＮＡについて、配列番号３及び４に示した塩基配列を有するプライマーセットを用い、上記と同様の条件、方法により、ＰＣＲ法で増幅（この増幅領域を「領域２」という）、電気泳動を行い、図３に示した電気泳動パターンの写真を得た。この結果からは、種の判別ができないことが分かる。
次に、領域２の増幅後のＰＣＲ反応液について、制限酵素Ssp Iを用いて、表８に示した条件と同じ条件で処理し、処理後の切断片について、上記と同様の方法で電気泳動を行い、図４に示した電気泳動パターンの写真を得た。この結果、切断片パターンの違いから、[1]スサビノリ、[5]ウタスツノリの２種が判別可能であることが分かる。
【００３０】
また、領域２の増幅後のＰＣＲ反応液について、制限酵素Aci Iを用いて、表８に示した条件と同じ条件で処理し、処理後の切断片について、上記と同様の方法で電気泳動を行い、図５に示した電気泳動パターンの写真を得た。この結果、切断片パターンの違いから、[11]マルバアサクサノリが判別可能であることが分かる。
【００３１】
さらに、領域２の増幅後のＰＣＲ反応液について、制限酵素Cfr13 Iを用いて、表９に示した条件と同じ条件で処理し、同様にして、電気泳動を行い、図６に示した電気泳動パターンの写真を得た。この結果、切断片パターンの違いから、[2]アサクサノリと[4]カイガラアマノリの２品種が判別可能であることが分かる。
【００３２】
またさらに、領域２の増幅後のＰＣＲ反応液について、制限酵素Alu Iを用いて、表８に示した条件と同じ条件で処理し、同様にして、電気泳動を行い、図７に示した電気泳動パターンの写真を得た。この結果、切断片パターンの違いから、[3]ウップルイノリ、[13]チシマクロノリがの２品種が判別可能であることが分かる。
以上により、現存する日本産アマノリ類の１６品種と外国産アマノリ類の２品種の合計１８品種の判別ができることが分かる。
また、領域２の種ごとのＰＣＲ増幅産物サイズと上記各制限酵素で処理した後の切断片サイズを表１０に示した。
【００３３】
【表８】
2011092060.tif 000009
【００３４】
【表９】
2011092060.tif 000010
【００３５】
【表１０】
2011092060.tif 000011
【実施例２】
【００３６】
判別を依頼されたノリを表４の条件で室内培養し、得られたフリー糸状体を液体窒素で凍結・粉砕し、ISOPLANTIIを用いて、プロトコールにしたがって、ＤＮＡを抽出し、精製した。
次に、配列番号１及び２並びに配列番号３及び４の塩基配列を有する２組のプライマーセットを用いて、上記により得られたＤＮＡをi-Cyclerサーマルサイクラーを用いて、表５に示した条件でＰＣＲ法により増幅した。増幅後のＰＣＲ反応液を５分割し、それぞれを、制限酵素Taq Iにより表６に示した条件で、制限酵素Ssp I、Aci I、Alu Iにより表８に示した条件で、Cfr13 Iにより表９に示した条件で処理し、処理後の切断片について、２％アガロースゲルで、１×TAEバッファーを用いて電気泳動し、泳動後に、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外線照射下に図８に示した切断片パターン写真を得、これを図２及び図４〜７の写真と対比した。図８中、Lane1：領域１における制限酵素Taq I、Lane2：領域２における制限酵素Ssp I、Lane3：領域２における制限酵素Aci I
、Lane4：領域２における制限酵素Cfr13 I、Lane5：領域２における制限酵素Alu Iの
切断結果である。この結果、このノリは、ウップルイノリであることが判別された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、スサビノリ、アサクサノリ以外の野生種を用いてより付加価値の高いノリ新品種の作出を検討する際に、新品種作出時の元株の種名を明らかにする必要が生じたときなどに利用できる。また、本発明はそのまま判別に用いることもできるが、本発明を元にアマノリ類１８種を判別可能な検査キットを作成する場合にも利用できる。
【図１】
2011092060.tif 000012
【図２】
2011092060.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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