(57)【要約】【課題】キク科植物であるデイジー（ヒナギク、チョウメイギク）の花部、その抽出液もしくは抽出エキス、又は前記抽出液もしくは抽出エキスを分離、精製することにより得ることができる特定の化合物を含有し、コラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤を提供する。【解決手段】  デイジー花部、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物等によりデイジー花部を抽出して得られる抽出液、もしくは前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は前記抽出液もしくは抽出エキスから分離、精製して得られる特定の化合物を含むことを特徴とするコラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デイジー花部、デイジー花部を、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを、有効成分として、含むことを特徴とするコラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤。
【請求項２】
下記構造式（１）〜（２０）のいずれかで示される化合物からなる群より選ばれる１種以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【化１】
2011213699.tif 000024
【化２】
2011213699.tif 000025
【化３】
2011213699.tif 000026
【化４】
2011213699.tif 000027
【化５】
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【化６】
2011213699.tif 000029
【化７】
2011213699.tif 000030
【化８】
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【化９】
2011213699.tif 000032
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
2011213699.tif 000039
【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
2011213699.tif 000043
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）植物であるデイジーの花部、その抽出液もしくは抽出エキス、又はこれらから分離・精製して得られるコラーゲン産生促進作用を有する化合物を含有する皮膚外用剤及び皮膚化粧料に関する。ここで、皮膚化粧料とは、化粧料の形態で用いられる皮膚外用剤である。従って、「皮膚外用剤」との用語は「皮膚化粧料」も含む意味である。
【背景技術】
【０００２】
デイジー（学名：Ｂｅｌｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ  Ｌ．）は、和名をヒナギク（雛菊）、エンメイギク（延命菊）及びチョウメイギク（長命菊）等とも称される多年生植物である。西洋諸国では古くから、デイジーの若葉、蕾や花部等をサラダに加えて食用として用いている。又、デイジーの根部は、薬用としてリウマチや傷の治療、去痰薬等としても用いられていた（非特許文献１）。さらに、非特許文献１等では、デイジーの根部の含有成分として数種のサポニン成分等が報告されている。
【０００３】
デイジー花部については、詳細な含有成分の探索やその生物活性評価等の科学的研究はあまり実施されていなかった。しかし、特許文献１では、デイジー花部より得られる中性脂質吸収抑制剤、及びそれを含有し中性脂質吸収抑制作用を有する医薬や健康食品が開示されている。特許文献１では、さらに、デイジー花部から得られる新規サポニン化合物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２３４９６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉ  Ｗ．，  Ａｓａｄａ  Ｙ．，  Ｋｏｉｋｅ  Ｋ．，  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｔ．，  Ｆｕｒｕｙａ  Ｔ．，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｔ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  Ｖｏｌ．６１，  ｐｐ．２９２１−２９２９（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、デイジー花部及びその抽出物等の皮膚外用剤としての用途を提供するものであり、デイジー花部、その抽出液もしくは抽出エキス、又はそれらに含まれる特定の化合物を含有し、コラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
皮膚を構成する真皮は、主に線維芽細胞及びマトリックス成分からなっている。線維芽細胞は、コラーゲン等のタンパク質及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンを産生して、結合組織を形成し、皮膚において重要な役割を果たしている。そのため、コラーゲンやヒアルロン酸等が減少すると、結合組織が崩壊することにより皮膚が老化し、シワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等が起こることになる。
【０００８】
このようなコラーゲンやヒアルロン酸の機能に着目して、従来は、ニワトリのトサカ等に含まれるヒアルロン酸が化粧料に配合されている。しかし、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを配合した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題があった。そこで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の合成を促進させることができる作用（コラーゲン産生促進作用）を有する皮膚外用剤が、これまで模索されてきた。
【０００９】
デイジー花部については、これまでそのコラーゲン産生促進作用は知られていなかった。そこで、本発明者らは、上記背景に鑑み、デイジー花部、その抽出液もしくは抽出エキス、又はそれらに含まれる化合物のコラーゲン産生促進作用について検討した。具体的には、デイジー花部、デイジー花部を水や低級脂肪族アルコール等により抽出して得られた抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は前記抽出液や抽出エキスより分離、精製して得られる化合物のコラーゲン産生促進作用について、繊維芽細胞におけるコラーゲン産生促進活性を活性評価の指標として検討した。
【００１０】
そして、これまでに行ったデイジー花部に関する詳細な含有成分の探索に基づき、鋭意検討を継続した結果、デイジー花部、デイジー花部の抽出液や抽出エキスが、コラーゲン産生促進作用を示すことを見出した。さらに、抽出液や抽出エキスより分離、精製して得られる化合物の中に、コラーゲン産生促進作用を示す化合物が含まれていることを見出した。従って、これらは、コラーゲン産生促進剤として用いられるものであり、さらに、これらを有効成分として含有させることにより、コラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤が得られる。以下に示す態様の本発明は、これらの結果に基づいて完成されたものである。
【００１１】
本発明は、その第１の態様として、デイジー花部、デイジー花部を、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを、有効成分として、含むことを特徴とするコラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤を提供する（請求項１）。
【００１２】
本発明者は、さらに、前記の抽出液又は抽出エキスの分離、精製を行い、分離、精製された化合物のコラーゲン産生促進作用を検討した結果、以下に示す構造式（１）〜（２０）で示される化合物が、コラーゲン産生促進作用を有することを見いだした。請求項２に記載の発明は、下記構造式（１）〜（２０）のいずれかで示される化合物からなる群より選ばれる１種以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする皮膚外用剤である。なお、構造式（１）〜（１３）、（１６）、（１７）及び（１９）から選ばれる１の構造式で示される化合物は、特許文献１で開示されている化合物である。又、構造式（１４）、（１５）、（１８）及び（２０）から選ばれる１の構造式で示される化合物については、その製造方法（分離方法）を後述の実施例３〜５に示す。構造式（１）〜（２０）のそれぞれで表わされる化合物の命名を、以下の各構造式の後に記載する。
【００１３】
【化１】
2011213699.tif 000002
［ペレニソシドＩＩＩ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓｏｓｉｄｅ  ＩＩＩ）］
【００１４】
【化２】
2011213699.tif 000003
［ペレニソシドＶＩＩＩ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓｏｓｉｄｅ  ＶＩＩＩ）］
【００１５】
【化３】
2011213699.tif 000004
［ペレニソシドＩＸ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓｏｓｉｄｅ  ＩＸ）］
【００１６】
【化４】
2011213699.tif 000005
［ペレニソシドＸＶＩ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓｏｓｉｄｅ  ＸＶＩ）］
【００１７】
【化５】
2011213699.tif 000006
［ペレニソシドＸＶＩＩ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓｏｓｉｄｅ  ＸＶＩＩ）］
【００１８】
【化６】
2011213699.tif 000007
［ペレニソシドＸＩＸ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓｏｓｉｄｅ  ＸＩＸ）］
【００１９】
【化７】
2011213699.tif 000008
［ペレニサポニンＦ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓａｐｏｎｉｎ  Ｆ）］
【００２０】
【化８】
2011213699.tif 000009
［ペレニサポニンＨ  （ｐｅｒｅｎｎｉｓａｐｏｎｉｎ  Ｈ）］
【００２１】
【化９】
2011213699.tif 000010
［ベリソシドＥ  （ｂｅｌｌｉｓｏｓｉｄｅ  Ｅ）］
【００２２】
【化１０】
2011213699.tif 000011
［アステルバタノシドＤ  （ａｓｔｅｒｂａｔａｎｏｓｉｄｅ  Ｄ）］
【００２３】
【化１１】
2011213699.tif 000012
［ベリサポニンＢＳ６  （ｂｅｌｌｉｓｓａｐｏｎｉｎ  ＢＳ６）］
【００２４】
【化１２】
2011213699.tif 000013
［アピゲニン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノサイド  （ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００２５】
【化１３】
2011213699.tif 000014
［アピゲニン７−Ｏ−β−Ｄ−グルクロノピラノシド  （ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００２６】
【化１４】
2011213699.tif 000015
［ケンフェロール３-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド  （ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ  ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００２７】
【化１５】
2011213699.tif 000016
［ケルセチン３-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド  （ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００２８】
【化１６】
2011213699.tif 000017
［イソラムネチン３-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド  （ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ  ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００２９】
【化１７】
2011213699.tif 000018
［イソラムネチン３-Ｏ-β-Ｄ-グルクロノピラノシド  （ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ  ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００３０】
【化１８】
2011213699.tif 000019
［イソラムネチン３-Ｏ-α-Ｌ-ラムノピラノシド  （ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ  ３−Ｏ−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００３１】
【化１９】
2011213699.tif 000020
［メチルシリンゲート４-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド  （ｍｅｔｈｙｌ  ｓｙｒｉｎｇａｔｅ  ４−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）］
【００３２】
【化２０】
2011213699.tif 000021
［クロロゲン酸  （ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ］）
【発明の効果】
【００３３】
本発明の皮膚外用剤は、デイジー花部由来のもので、コラーゲン産生促進作用を有する。従って、本発明の皮膚外用剤を用いることにより、真皮を構成している線維芽細胞を活性化させ、細胞によるコラーゲンの合成を促進させることで、老化に伴うシワ、しみ、くすみ、きめの消失及び弾力の低下等を予防、改善できる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
次に、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の第１の態様の皮膚外用剤としては、
１）デイジー花部を（抽出等の処理を行わずに）有効成分として含むもの、
２）デイジー花部を、水、低級脂肪族アルコ−ルもしくは低級脂肪族アルコ−ルの含水物等により抽出して得られる抽出液を有効成分として含むもの、及び
３）前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含むもの、
を挙げることができる。
【００３６】
デイジー花部を（抽出等の処理を行わずに）、コラーゲン産生促進作用を示す有効成分として、含む皮膚外用剤の場合は、デイジー花部をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの、もしくは、乾燥等の調製をしたものを用いることもできる。
【００３７】
デイジー花部を、抽出して得られる抽出液を有効成分として含む皮膚外用剤の場合、抽出液は、水、低級脂肪族アルコール及び低級脂肪族アルコールの含水物より選ばれる抽出溶媒によりデイジー花部をそのまま抽出して得ることもできる。しかし、デイジー花部を、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを用いて抽出する方法が、抽出効率の面では望ましい。
【００３８】
抽出溶媒として用いられるアルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液が挙げられる。抽出溶媒としては、好ましくはこれらのアルコール、又はこれらのアルコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールが用いられる。前記のアルコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。
【００３９】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が好ましい。抽出は、振盪下もしくは非振盪下又は還流下に、前記の抽出材料、即ち、デイジー花部そのもの、又はそれを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
【００４０】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００４１】
前記の抽出工程により得られた抽出液にはデイジー花部に含有されている成分が溶出されている。本発明の皮膚外用剤には、このようにして得られた抽出液をそのまま加えてもよいが、前記抽出液を濃縮して抽出エキスにして加えてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。なお、濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。抽出エキスは、濃縮したままの状態で、皮膚外用剤に加えてもよい。また、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は、当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００４２】
このようにして得られる抽出液又は抽出エキスを、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。前記構造式（１）〜（２０）で示される化合物は、この分離により得ることができる。そして、これらの化合物を加えることによりコラーゲン産生促進作用を有する本発明の皮膚外用剤が得られる（本発明の第２の態様）。
【００４３】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【００４４】
デイジー花部からの抽出液及び抽出エキスの製造方法、並びに、精製処理により構造式（１）〜（１３）、（１６）、（１７）及び（１９）から選ばれる１の構造式で示される化合物を得る方法や、これらの方法を実施するための具体的条件等は、（本発明者と同一発明者の発明に係る）特許文献１に記載されている。又、構造式（１４）、（１５）、（１８）及び（２０）から選ばれる１の構造式で示される化合物を得る方法（製造方法、分離方法）やこれらの方法を実施するための具体的条件等は後述の実施例３〜５に示されている。
【００４５】
後述の実施例の結果が示すように又はその結果から自明なように、デイジー花部そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりデイジー花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、抽出液又は抽出エキスを精製処理に付して得られた構造式（１）〜（２０）で示される化合物は、コラーゲン産生促進作用の活性評価の指標として実施した、ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）を用いたコラーゲン産生促進剤活性試験において、活性が見出された。従って、これらは、本発明の、コラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤の有効成分として用いられる。
【００４６】
本発明の皮膚外用剤は、前記デイジー花部、その抽出液もしくは抽出エキス、又は抽出液もしくは抽出エキスに含まれる前記構造式（１）〜（２０）で示される化合物から選択される少なくとも１つを有効成分として配合することで製造される。デイジー花部抽出液及び抽出エキスに含まれる化合物は、それ自体でコラーゲン産生促進作用を有するのでデイジー花部抽出液又は抽出エキスを単独で皮膚外用剤として使用することもできるが、たとえば、外用剤の基剤として通常用いられる油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、エステル類、水溶性高分子、界面活性剤、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、防腐剤、防カビ剤、香料、顔料、賦形剤、酸化防止剤、美容成分、化粧料安定化剤等を含有させてもよい。また、本発明の皮膚外用剤には、前記の、コラーゲン産生促進作用を有する成分以外にも、さらにその他の細胞賦活剤、抗老化防止剤、コラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤等を配合することができる。
【００４７】
本発明のコラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤としては、たとえば、シワ予防改善用外用剤、皮膚老化防止用化粧料、日焼け止め化粧料、皮膚保護用化粧料、美白化粧料、ファンデーションやその他の医薬部外品等があげられる。本発明のコラーゲン産生促進作用を有する皮膚外用剤は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、ゾル剤、クリーム、軟膏、パウダー、スプレー等の種々の形態とすることができる。また、本発明の皮膚外用剤を化粧料の形態で用いる場合（即ち、皮膚化粧料の場合）は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック剤、洗顔料等の皮膚用化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、リキッドファンデーション、口紅等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、ボディソープ、石鹸等の身体用化粧料、シャンプー、リンス、養毛剤等の頭髪用化粧料とすることができる。
【実施例】
【００４８】
つぎに、実施例にもとづいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００４９】
実施例１
［デイジー花部メタノ−ル抽出エキスの調製］
特許文献１の実施例１に記載の方法と、同じ方法、条件にてデイジー花部メタノ−ル抽出エキスを調製した。
【００５０】
実施例２
［メタノ−ル抽出エキスの分離及び精製］
特許文献１の実施例２〜６及び参考例１〜５に記載の方法と、同じ方法、条件にて、メタノ−ル抽出エキスの分離及び精製を行い、構造式（１）〜（１３）、（１６）、（１７）及び（１９）から選ばれる１の構造式で示される化合物を得た。なお、構造式（１）〜（１３）、（１６）、（１７）及び（１９）から選ばれる１の構造式で示される化合物は、特許文献１では異なった化合物番号が付されているのでその対応関係を以下に示す。
【００５１】
構造式（１）の化合物＝特許文献１の構造式（３）の化合物
構造式（２）の化合物＝特許文献１の構造式（８）の化合物
構造式（３）の化合物＝特許文献１の構造式（９）の化合物
構造式（４）の化合物＝特許文献１の構造式（１６）の化合物
構造式（５）の化合物＝特許文献１の構造式（１７）の化合物
構造式（６）の化合物＝特許文献１の構造式（１９）の化合物
構造式（７）の化合物＝特許文献１の構造式（２５）の化合物
構造式（８）の化合物＝特許文献１の構造式（２７）の化合物
構造式（９）の化合物＝特許文献１の構造式（４２）の化合物
構造式（１０）の化合物＝特許文献１の構造式（４５）の化合物
構造式（１１）の化合物＝特許文献１の構造式（４７）の化合物
構造式（１２）の化合物＝特許文献１の構造式（４９）の化合物
構造式（１３）の化合物＝特許文献１の構造式（５０）の化合物
構造式（１６）の化合物＝特許文献１の構造式（５３）の化合物
構造式（１７）の化合物＝特許文献１の構造式（５４）の化合物
構造式（１９）の化合物＝特許文献１の構造式（５７）の化合物
【００５２】
以下の実施例３〜５では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。また、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００５３】
［溶媒］
メタノール：ナカライテスク社製、一級
ＨＰＬＣ用メタノールおよびアセトニトリル：関東化学社製、特級
【００５４】
［濾紙］  アドバンテック社製：Ｎｏ．２
【００５５】
［クロマトグラフィー用担体］
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、ＢＷ−２００、１５０〜３００メッシュ
逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ１０２０Ｔ、１００〜２００メッシュ
【００５６】
［ＨＰＬＣカラム］
ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ（実施例中カラムＡと略記）
【００５７】
実施例３    デイジー花部抽出エキスの調製及び含有成分の単離
アルバニア産デイジー（Ｂｅｌｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ）の乾燥花３．０ｋｇを５Ｌのメタノールで３時間還流下抽出し、その後抽出液を濾取し、メタノール抽出液を得た。濾過残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行い、それぞれメタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を合わせた後、減圧下溶媒留去しメタノール抽出エキス（７７５ｇ、植物からの収率２５．８％）を得た。
【００５８】
実施例４  デイジー花部抽出エキスの分離及び精製
実施例３で得られたメタノール抽出エキス（７２０ｇ）を、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）と水で分配抽出した。得られたＡｃＯＥｔ移行部を減圧下溶媒留去し、ＡｃＯＥｔ可溶部（１８７．１ｇ、植物からの収率６．７％）を得た。
【００５９】
実施例５  ＡｃＯＥｔ可溶部の精製
ＡｃＯＥｔ可溶部（１５０．０ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［３．０ｋｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝（４０：１→２０：１→１０：１→５：１→２：１→１：１）→クロロホルム：メタノール：水（１０：３：１→７：３：１）→メタノール］で順次溶出し、溶出画分Ｅ１（１．８５ｇ）、Ｅ２（１５．２９ｇ）、Ｅ３（６．８９ｇ）、Ｅ４（１０．５４ｇ）、Ｅ５（１３．６４ｇ）、Ｅ６（９．２５ｇ）、Ｅ７（８．２６ｇ）、Ｅ８（７．９５ｇ）、Ｅ９（２８．５５ｇ）、Ｅ１０（２０．１１ｇ）及びＥ１１（１３．４７ｇ）を得た。
【００６０】
溶出画分Ｅ９（２８．５５ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［６００ｇ、メタノール：水＝（３０：７０→４０：６０→５０：５０→７０：３０→８０：２０）→メタノール］にて画分し、溶出画分Ｅ９−１（１０６５．５ｍｇ）、Ｅ９−２（４６７０．４ｍｇ）、Ｅ9−３（３９５．２ｍｇ）、Ｅ9−４（５８９．７ｍｇ）、Ｅ９−５（６０３．０ｍｇ）Ｅ９−６（１４９７．６ｍｇ）、Ｅ９−７（１３８３．１ｍｇ）、Ｅ９−８（３９３．７ｍｇ）、Ｅ９−９（７６５１．１ｍｇ）、Ｅ９−１０（２６５３．１ｍｇ）、Ｅ９−１１（１３１２．５ｍｇ）、Ｅ９−１２（４２７．１ｍｇ）及びＥ９−１３（９１５．７ｍｇ）を得た。
【００６１】
画分Ｅ９−９（１５０．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［移動相  アセトニトリル：ＭｅＯＨ：水＝２８：１６：５６］を用いて分離精製し、化合物Ａ（３４．８ｍｇ，０．０７９１％（植物からの化合物の単離収率。以下同様））、化合物Ｂ（１６．８ｍｇ、０．０８０３％）を単離した。
【００６２】
溶出画分Ｅ１０（２０．１１ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［６００ｇ、メタノール：水＝（４０：６０→５０：５０→７０：３０→８０：２０）→メタノール］にて画分し、溶出画分Ｅ１０−１（８０９．０ｍｇ）、Ｅ１０−２（１２４７．９ｍｇ）、Ｅ１０−３（３３１５．８ｍｇ）、Ｅ１０−４（１０５１．０ｍｇ）、Ｅ１０−５（３９８．０ｍｇ）、Ｅ１０−６（８０２．５ｍｇ）、Ｅ１０−７（１４９７．７ｍｇ）、Ｅ１０−８（４５２５．２ｍｇ）およびＥ１０−９（１８３９．９ｍｇ）を得た。
【００６３】
画分Ｅ１０−２（６００ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［移動相  ＭｅＯＨ：水＝４０：６０］を用いて分離精製し、化合物Ｃ（３９．８ｍｇ、０．０１２４％）および化合物Ｄ（２１．８ｍｇ，０．００２０％）、を単離した。
【００６４】
実施例３〜５で得られた化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｄについて［α］Ｄ、ＭＳ、ＲＩ、ＵＶ、ＩＲ及び１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等の測定を、特許文献１記載の測定条件と同じ条件で行った。それらの測定値と、公知文献記載の物理化学的データの数値との比較から、化合物Ａは、前記の構造式（１８）で表わされるイソラムネチン３-Ｏ-α-Ｌ-ラムノピラノシド、化合物Ｂは、前記の構造式（１４）で表わされるケンフェロール３-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド、化合物Ｃは、前記の構造式（１５）で表わされるケルセチン３-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド、化合物Ｄは、前記の構造式（２０）で表わされるクロロゲン酸であることが確認された。
【００６５】
実施例６
［コラーゲン産生促進作用試験］
このコラーゲン産生促進剤活性試験においては、デイジー花部から得られる抽出エキス、及び構造式（１）〜（２０）で表される化合物を、ＮＨＤＦ細胞に対して共存下培養することで、当該細胞の培養液中に遊離されるコラーゲンを、市販キットを使用して定量した。以下、その具体的手順を示す。
【００６６】
（ａ）ＮＨＤＦ細胞の培養
倉敷紡績社より購入した新生児包皮由来の正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＮＨＤＦ）（ＮＢ）を培養して実験に供した。培地は、ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ｆａｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，Ｒｏｃｈｅ社）、及び、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ、１００μｇ／ｍＬのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン）を添加して使用した。細胞の培養は、７５ｃｍ２培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で行い、５％ＣＯ２下、３７℃にて行った。
【００６７】
（ｂ）コラーゲン産生促進試験
ＮＨＤＦ細胞を２．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で９６穴培養プレート（住友ベークライト社）に播種して実験を行った。培養２４時間後、培地を、被験物質を添加したＤＭＥＭに交換してさらに４８時間培養した。尚、被験物質は０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ溶液として培地に添加した。
【００６８】
（ｃ）コラーゲン産生量の測定
前記において、被験物質の共存下培養した細胞の培養上清中の遊離コラーゲン量は、市販キットＳｉｒｃｏｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を用いて測定を行った。即ち、培養期間終了後、各ｗｅｌｌから培養上清１０μＬを１．５ｍＬチューブ（ＷＡＴＳＯＮ）に採取し、キットに添付のＤｙｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ９０μＬを添加した。１時間の攪拌により反応を行った後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により赤色沈殿を得た。この沈殿にキットに添付のＡｌｋａｌｉ  ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ加えて沈殿を溶解させ、９６穴マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）に色素溶解液を分取（９０μＬ／ｗｅｌｌ）し、マイクロプレートリーダー（ｍｏｄｅｌ  ６８０ＸＲ，Ｂｉｏ-ｒａｄ社）にて測定した（波長：５７０ｎｍ，参照波長：６５５ｎｍ）。
【００６９】
結果はいずれも平均値と標準誤差（Ｎ＝４）で表し、対照群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。試験結果を、表１及び表２に示す。なお、表１及び表２中、濃度とは、培養液中の被験物質の濃度であり単位はμｇ／ｍＬである。
【００７０】
【表１】
2011213699.tif 000022
【００７１】
【表２】
2011213699.tif 000023
【００７２】
前記表１及び２中、試験結果の数値の末尾の符号「＊」及び「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５及び０．０１未満であったことを表す。
【００７３】
表１及び表２に示した結果により、本発明のデイジー花部抽出エキス及び構造式（１）〜（２０）で表される化合物は、高いコラーゲン産生促進作用を有することが確認できた。実施例で行ったコラーゲン産生促進作用試験により、コラーゲン産生の促進が観察される物質は、前記のように老化に伴う皮膚のコラーゲン量の低下に基づく皮膚の形質的変化、即ち皮膚のしわやたるみ等の変化を予防・改善することが期待できる。従って、デイジー花部そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物によりデイジー花部を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）〜（２０）で表される化合物は、コラーゲン産生促進作用と有する皮膚外用剤の有効成分として用いることができる。
【００７４】
以下、本発明の皮膚外用剤の処方例を示す。なお、含有量は重量％である。
【００７５】
＜処方例１：クリーム＞
デイジー花部抽出エキス                                ０．０２
ヒアルロン酸ナトリウム                                ０．０１
グリセリルモノステアレート                            ３．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート  ３．０
セタノール                                            ２．０
スクワラン                                            ３．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                        １０．０
グリセリン                                            ７．０
エチルパラベン                                        ０．１
残部：精製水    合計  １００
【００７６】
＜処方例２：クリーム＞
デイジー花部抽出エキス                                ０．０１
ステアリン酸                                          １０．０
セタノール                                            ２．０
ラノリン                                              １．０
ミリスチン酸イソプロピル                              ３．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール                １．５
トリエタノールアミン                                  ０．８
ソルビトール（７０％）                                ４．０
メチルパラベン                                        ０．１
香料                                                  ０．０１
残部：精製水    合計  １００
【００７７】
＜処方例３：リキッドファンデーション＞
デイジー花部抽出エキス                                ０．０１
ヒアルロン酸                                          ０．０１
グリセリルモノステアレート                            ２．０
ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム  ０．５
ステアリン酸                                          ５．０
ベヘニルアルコール                                    １．０
ラノリン                                              ２．０
スクワラン                                            ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                        ４．０
顔料                                                  １０．０
プロピレングリコール                                  ７．０
トリエタノールアミン                                  １．０
エチルパラベン                                        ０．１
残部：精製水    合計  １００
【００７８】
＜処方例４：リキッドファンデーション＞
デイジー花部抽出エキス                                ０．０５
ラノリン                                              ２．０
流動パラフィン                                        ５．０
ステアリン酸                                          ２．０
セタノール                                            １．０
グリセリン                                            ２．０
スクワラン                                            ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                        ４．０
顔料                                                  １０．０
プロピレングリコール                                  ７．０
トリエタノールアミン                                  １．０
エチルパラベン                                        ０．１
香料                                                  ０．０１
残部：精製水    合計  １００
【００７９】
＜処方例５：乳液＞
デイジー花部抽出エキス                              ０．０２
ヒアルロン酸                                        ０．０１
ステアリン酸                                        ２．０
エタノール                                          ０．５
流動パラフィン                                      １０．０
ラノリン脂肪酸イソプロピル                          ３．０
ラノリン                                            ４．０
スクワラン                                          ５．０
セスキイソステアリン酸ソルビタン                    １．０
プロピレングリコール                                ５．０
トリエタノールアミン                                ０．６
エチルパラベン                                      ０．１
香料                                                ０．０１
残部：精製水    合計  １００
【００８０】
＜処方例６：乳液＞
デイジー花部抽出エキス                              ０．０１
ステアリン酸                                        ３．５
エタノール                                          ０．５
流動パラフィン                                      ３．０
ラノリン                                            ０．５
スクワラン                                          ２．０
プロピレングリコール                                ３．０
トリエタノールアミン                                ０．８
エチルパラベン                                      ０．１
カルボキシビニルポリマー１％液（アルカリ中和）      ８．０
香料                                                ０．０１
残部：精製水    合計  １００
【００８１】
＜処方例７：化粧水＞
デイジー花部抽出エキス                              ０．０２
ヒアルロン酸ナトリウム                              ０．０１
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン  １．０
１，３−ブチレングリコール                          ３．０
ソルビトール（７０％）                              ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液                    ３．０
エタノール                                          １５．０
アスコルビン酸                                      ０．１
メチルパラベン                                      ０．１
香料                                                ０．０１
残部：精製水    合計  １００
【００８２】
＜処方例８：化粧水＞
デイジー花部抽出エキス                              ０．０５
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン  １．０
１，３−ブチレングリコール                          ５．０
ソルビトール（７０％）                              ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液                    ３．０
エタノール                                          １５．０
アスコルビン酸                                      ０．１
メチルパラベン                                      ０．１
色素                                                ０．０１
香料                                                ０．０１
残部：精製水    合計  １００