(57)【要約】 【課題】本発明は、異種抗体を作ることが出来るトランスジェニック非ヒト動物、及び実質的な親和性をもってヒト抗原に結合するヒト配列抗体を作る方法に関する。 【解決手段】免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部をコードする少なくとも１つの人工的遺伝子を含む細胞であって、該細胞は予め決められたヒト抗原を結合する免疫グロブリンの検出可能量を産生し、該免疫グロブリンポリペプチドは、トランスジェニックマウスから得られたハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンポリペプチドと実質的に同じ配列を有し、該マウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも一つのコピーを含み、ここで、該免疫グロブリンは、ヒト抗原に対する結合のために少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）でヒト抗原に結合する、細胞。 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）でヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＨＣ２トランスジーンから由来する重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＫＣｏ５トランスジーンから由来する軽鎖可変領域を含み、配列番号７または６１によって示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号８または６２によって示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域とを含む、単離された免疫グロブリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許出願No.08/544,404（1995年10月10日出願）の部分継続出願であり、これは、No.08/352,322（1994年12月７日出願）の部分継続出願であり、これは、No.08/209,741（1994年３月９日出願）の部分継続出願であり、これは、No.08/165,699(1993年12月10日出願)の部分継続出願であり、これは、No.08/161,739(1993年12月３日出願)の部分継続出願であり、これは、No.08/155,301（1993年11月18日出願）の部分継続出願であり、これは、No.08/096,762（1993年７月22日出願）の部分継続出願であり、これは、No.08/053,131（1993年４月26日出願）の部分継続出願であり、これは、No.07/990,860（1992年12月16日出願）の部分継続出願であり、これは、No.07/904,068（1992年６月23日出願）の部分継続出願であり、これは、No.07/853,408(1992年３月18日出願)の部分継続出願であり、これは、No.07/810,279(1991年12月17日出願)の部分継続出願であり、これは、No.07/575,962（1990年８月31日出願）（現在は放棄された）の部分継続出願であり、これは、No.07/574,748（1990年８月29日出願）（現在は放棄された）の部分継続出願である。本出願は、ＰＣＴ出願No.PCT/US91／06185（1992年２月５日に出願した米国特許出願No.07/834,539に対応する）およびＰＣＴ出願No.PCT/US92／10983に対して、米国法、セクション119の、タイトル35の下に、外国の優先権を主張している。
【０００２】
本発明は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物、そのようなトランスジェニック動物を産生するのに使うトランスジーン(transgene)、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えにおいて異種Ｄ遺伝子を機能的に再配列させることのできるトランスジーン、異種抗体を産生することのできる不死化Ｂ細抱、多数のイソタイプの異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジーン、内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を不活性化または抑制する方法およびそのためのトランスジーン、生殖細胞系列の再配列された可変領域配列に比較すると可変領域配列が体細胞変異を含んで成る異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジーン、ヒト一次配列を有する抗体を産生し且つヒト抗原に結合するトランスジェニック非ヒト動物、その様なトランスジュニック動物のＢ細胞から作られたハイブリドーマ、並びに該ハイブリドーマにより発現され６モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトにおけるモノクローナル抗体の生体内治療および診断用途の開発に直面する主な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの本質的免疫原性である。例えば、免疫寛容性のヒト患者に治療量の齧歯類モノクローナル抗体を役与すると、患者は齧歯類免疫グロブリン配列に対して抗体を産生し、それらのヒト抗マウス抗体（HAMA）は治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得る。よって、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗体と反応性であるヒト免疫グロブリンを作製することが望ましい。
【０００４】
モノクローナル抗体を作製するための現在の技術は、動物（通常はラットまたはマウス）を抗原に予備暴露するか、または抗原で感作せしめ、該動物からＢ細胞を収得し、そしてハイブリドーマクローンのライブラリーを作製することを伴う。ハイブリドーマ集団を抗原結合特異性（イディオタイプ）についてスクリーニングし、更に免疫グロブリンクラス（イソタイプ）についてもスクリーニングすることにより、所望の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することが可能である。
【０００５】
しかしながら、モノクローナル抗体を作製する現行法を、ヒト抗原に対して結合特異性を有するヒト抗体を産生せしめる目的に適用すると、ヒトは典型的には自己抗原に対しては免疫応答を生じないであろうから、ヒト免役グロブリンを産生するＢリンパ球を得ることは深刻な妨げになる。
【０００６】
よって、ヒト抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を作製する現行法は明らかに不十分である。ハイブリドーマを作製するためのＢ細胞源として非ヒト種を使用する場合にも、真の自己抗原に対するモノクローナル抗体を作製することに同じ制限が当てはまる。
【０００７】
機能的異種免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック動物の作製は、自己抗原と反応する抗体を産生させることができる方法である。
【０００８】
しかしながら、療法上有用な抗体の発現、またはそのような抗体を産生するハイブリド−マクローンを得るためには、トランスジェニック動物がＢリンパ球発生過程を経て成熟することのできるトランスジェニックＢ細胞を産生しなければならない。そのような成熟はトランスジェニックＢ細胞上の表面IgＭの存在を必要とするが、療法利用にはIgＭ以外のイソタイプが所望される。
【０００９】
よって、機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を受けて組換え多様性と接合多様性を生じることのできるトランスジーンおよびそのようなトランスジーンを有する動物が要求される。更に、そのようなトランスジーンとトランスジェニック動物は、好ましくは、Ｂ細胞成熟に必要とされる第一のイソタイプから優れた療法的効用を有する次なるイソタイプへのイソタイプ転換を促進するシス作用性配列を含有する。
【００１０】
多数の実験は、Ｉｇ遺伝子再配列に必要な特異的ＤＮＡ配列を決定するためのトランスフェクトされた細胞系の使用を報告している〔LewisおよびGellert(l989)，Cell，59.585-588〕。そのような報告は推定上の配列を同定し、そして再配列に使う組換え酵素へのそれらの配列の近づきやすさ(accesibility)が転写により変更されると結論づけている〔YancopoulosおよびAlt(1985)，Cell，40，271-281〕。Ｖ（Ｄ）Ｊ結合のための配列は、報告によれば、高度に保存されたほぼ回文式のヘプタマーと、12または23bpのいずれかのスペーサーにより隔てられたあまり保存されていない高ＡＴナノマーである〔Tonegawa(1983)，Nature，302，575-581,Hesseら(1989)，Genesin Oev.，3，1053-1061〕。効率的組換えは、伝えられるところによれば、異なる長さのスペーサー領域を有する組換えシグナル配列を含む部位の間でのみ起こる。
【００１１】
Ｉｇ遺伝子再配列は、組織培養細胞において研究されているが、トランスジェニックマウスでは詳しく研究されていない。マウス中に導入された再配列試験構成物を記載している少数の報告が発表されているに過ぎない〔Buchiniら、Nature，326:409-411(1987)（再配列されていないニワトリλトランスジーン）；Goodhartら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA84:4229-4233(1987)（再配列されていないウサギκ遺伝子）；およびBruggemannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA86:6709-6713(1989)（ハイブリッドマウス−ヒト重鎖）〕。
【００１２】
しかしながら、そのような実験の結果は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまたは最小の再配列を生じることがある。
【００１３】
更に、分子のＦｃ部分により抗体分子の多様な生物学的機能、例えばＦｃεを介したマスト細胞または好塩基球との相互作用、およびＦｃμまたはＦｃγによる補体の結合、が発揮され、イソタイプの変化により特定の特異性を有する機能的に多様な抗体を生成せしめることが更に望ましい。
【００１４】
異種抗体の１または複数の鎖をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック動物は作製されているけれども、好結果のイソタイプスイッチを受ける異種トランスジーンについての報告は全くない。イソタイプをスイッチすることのできないトランスジェニック動物は単一のイソタイプの異種抗体を産生するものに限定され、より詳しくは、Ｂ細胞成熟に不可欠であるイソタイプ、例えばIgＭとおそらくIgＤを産生するものに限定され、それらの抗体は療怯的効用が限定され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許出願No.08/544,404
【特許文献２】米国特許出願No.08/352,322
【特許文献３】米国特許出願No.08/209,741
【特許文献４】米国特許出願No.08/165,699
【特許文献５】米国特許出願No.08/161,73
【特許文献６】米国特許出願No.08/155,301
【特許文献７】米国特許出願No.08/096,762
【特許文献８】米国特許出願No.08/053,131
【特許文献９】米国特許出願No.07/990,860
【特許文献１０】米国特許出願No.07/904,068
【特許文献１１】米国特許出願No.07/853,408
【特許文献１２】米国特許出願No.07/810,279
【特許文献１３】米国特許出願No.07/575,962
【特許文献１４】米国特許出願No.07/574,748
【特許文献１５】ＰＣＴ出願No.PCT/US91／06185
【特許文献１６】米国特許出願No.07/834,539
【特許文献１７】ＰＣＴ出願No.PCT/US92／10983
【特許文献１８】米国特許出願
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】LewisおよびGellert(l989)，Cell，59.585-588
【非特許文献２】YancopoulosおよびAlt(1985)，Cell，40，271-281
【非特許文献３】Tonegawa(1983)，Nature，302，575-581,Hesseら(1989)，Genesin Oev.，3，1053-1061
【非特許文献４】Buchiniら、Nature，326:409-411(1987)
【非特許文献５】Goodhartら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA84:4229-4233(1987)
【非特許文献６】Bruggemannら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA86:6709-6713
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記に基づくと、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によってコードされる異種抗体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在することは明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢献するＤセグメントの全部または一部を含む機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子再配列を受けることができる異種免役グロブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。更に、（１）機能的なＢ細胞発達が起こり、そして（２）療法上有用な異種抗体が産生されるようにＶ−Ｄ−Ｊ組換えとイソタイプスイッチングを支えることができるトランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。抗体が設計される特定の種において療法または診断用のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができるＢ細胞源に対する要求も存在する。機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよび／またはイソタイプスイッチングを受けることができる異種免疫グロブリントランスジーンはそれらの要求を満たすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト抗体、を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提洪される。
【００１９】
更に、異種抗体を発現することができるそのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化されている前記Ｂ細胞を提供することが本発明の目的である。
【００２０】
この上記目的に従って、そのような異種モノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。
【００２１】
更にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に有用な再配列されていないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供することが本発明の目的である。
【００２２】
更にまた、トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供することが本発明の目的である。
【００２３】
更にまた、上述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する方法を提供することが本発明の目的である。
【００２４】
本発明の更なる目的は、本発明の１または複数のトランスジーンを作製するために使われる免疫グロブリン可変領域遣伝子セグメントレパートリーを作製する方法を提供することである。
【００２５】
上記の参考文献は、単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供される。本発明者らが先行発明によってそのような開示より以前は権利がないと認めることと解釈してはならない。
【発明の効果】
【００２６】
異種抗体、例えばヒト抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。そのような異種抗体は、IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAscc，IgDまたはIgEを含む様々なイソタイプのものであることができる。そのようなトランスジェニッグ非ヒト動物が免疫応答を行うには、Ｂ細胞の発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェニックＢ細胞および前Ｂ細胞が表面結合型免疫グロブリン、特にIgＭ（ことによるとIgＤ）イソタイプのものを産生することが必要である。そのようなIgＭ（またはIgＤ）表面結合型免疫グロブリンの発現はＢ細胞発達の抗原刺激成熟期の間にのみ要求され、一時期には一回スイッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟Ｂ細胞は他のイソタイプを産生し得る。
【００２７】
典型的には、Ｂ細胞系統の細胞は一時期に単一のイソタイプだけを産生するだろうが、μS（分泌型μ）およびμM（膜結合型μ）型、並びにμおよびδ免疫グロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはトランス二者択一ＲＮＡスプライシングは、単一細胞による複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従って、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なIgＧ，IgＡおよびIgＭイソタイプの異種抗体を産生せしめるためには、イソタイプスイッチングが起こることが必要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的クラススイッチであってもよく、または１もしくは複数の非古典的イソタイプスイッチ機構から生じてもよい。
【００２８】
本発明は、異種免疫グロブリントランスジーンおよびそのようなトランスジーンを有するトランスジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック動物はイソタイプスイッチを受けることにより複数のイソタイプの異種抗体を産生することができる。古典的イソタイプスイッチは、トランスジーン中の少なくとも１つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起こる。非古典的イソタイプスイッチは、例えば、ヒトσμ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換え（δ−関連欠失）により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例えば特にトランスジーン間および／または染色体間組換えは、イソタイプスイッチを果たすことができる。
【００２９】
そのようなトランスジーンおよびトランスジェニック動物は、抗原刺激型Ｂ細胞成熟に必要である第一の免疫グロブリンイソタイプを産生し、そして療怯的および／または診断的効用を有する１または複数の第二の異種イソタイプをコードし産生するようにスイッチすることができる。よって本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、一態様では、ヒト免疫グロブリン遣伝子配列によりコードされ且つ高親和力で特異的ヒト抗原に結合するIgＧ，IgＡおよび／またはIgＥ抗体を産生することができる。
【００３０】
本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を発現することのできるトランスジェニック動物からのＢ細胞にも関し、そのようなＢ細胞は、特定抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化される。そのようなＢ細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の１つの源として働くことができる。
【００３１】
本発明は、上述の非ヒトトランスジェニック動物中でまたはそのようなトランスジェニック動物から外植されたＢ細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイプスイッチを受けることができる、再配列されていないおよび再配列された異種免役グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供する。そのようなイソタイプスイッチは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物もしくは外植されたＢ細胞系統リンパ球をイソタイプスイッチ促進剤、例えばＴ細胞由来のリンホカイン（例えばIL-4およびIFNγ）で処理することによって誘導することができる。
【００３２】
更に、本発明は、上述のトランスジェニック非ヒト動物中での異種抗体産生を誘導する方法を包含し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのものであることができる。それらの方法は、異種抗体、特にスイッチされたイソタイプ（IgＧ．IgＡおよびIgＭ）の異種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒト動物において抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。
【００３３】
本発明は、トランスジェニック動物中で産生される異種免疫グロブリンおよび前記動物のＢ細胞から誘導されるモノクローナル抗I本クローンが多様なイソタイプのものであり得るように、トランスジーンがイソタイプスイッチを果たす配列を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細胞免疫グロブリン遣伝子座中で典型的に起こるよりもずっと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは異なる時間順序で起こるように、トランスジーンのイソタイプスイッチを促進する方法を提供する。スイッチ領域は、様々なＣH遺伝子から移植しそしてトランスジーン構成物中の別のＣH遺伝子に連結せしめることができる。そのような移植スイッチ配列は典型的には結合されたＣH遺伝子とは独立的に機能し、そのため、トランスジーン構成物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能であろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ一結合欠失配列が様々なＣH遺伝子に連結され、２つのδ−結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的スイッチを果たすことができる。よって、特定のＣH遺伝子が異なるスイッチ配列に連結され、それによって天然に結合されたスイッチ領域を使用した時に起こるよりも頻繁にスイッチされるトランスジーンを作製することができる。
【００３５】
本発明はまた、免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック動物においてトランスジーン配列のイソタイプスイッチが起こったかどうかを決定する方法を提供する。
【００３６】
本発明は、その内の幾つかは生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列（欠失を含んでもよい）のサブセットを含有する免疫グロブリントランスジーン構成物、および免疫グロブリントランスジーン構成物の作製方法を提供する。本発明は、免疫グロブリントランスジーンの容易なクローニングと作製のための特別な方法であって、２つのユニークNotl部位により隣接されたユニークXholおよびSalI制限部位を使用するベクターを必要とする方法を包含する。
【００３７】
本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに相当する。
【００３８】
本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトランスジーンは、トランスジェニック非ヒト動物が抗原に暴露されると、前記動物中での該遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）並びに生成した再配列された免役グロブリン重鎖および／または軽鎖の発現を可能にする。
【００３９】
本発明の一観点によれば、異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、再配列された異種ＤＮＡの比較的大きい断片を含んで成る。そのような断片は、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からのＣ，Ｊ（および重鎖の場合にはＤ）セグメントの実質的部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セダメントの実質的部分も含んで成る。
【００４０】
一態様では、そのようなトランスジーン構成物は、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種ＤＮＡから誘導された対応配列等を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を、本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列を有するトランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを組み合わせることができる。
【００４１】
本発明の方法では、生殖細胞再配列されていない軽鎖および重鎖免疫グロブリシトランスジーン−即ちＤ細胞分化中にＶＤＪ結合を受けるもの−を抗原と接触せしめ、二次レパートリーＢ細胞における異種抗体の産生を誘導する。
【００４２】
本発明に使われる非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベクターおよび方法も本発明に包含される。そのようなベクターおよび方法は、トランスジーン、好ましくはポジティブ−ネガティブ(positive-negative)選別ベクターを使用し、該ベクターは、それが本発明において使用する非ヒト動物にとって内因性である重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子セグメントのクラスの機能的破壊を標的するように構成される。そのような内因性遺伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および定常領域遺伝子セグメントが挙げられる。
【００４３】
本発明のこの観点によれば、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターを少なくとも１つの非ヒト動物の胎児性幹細胞と接触させた後、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物のゲノム中に組み込まれている細胞を選択する。移植後、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、該ベクターの相同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介の免疫応答を開始することが実質的に不可能である。そのような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の研究に使うことができ、または異種免役グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの受容体として使うことができる。
【００４４】
本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく、１または複数の種の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法および組成物を提供する。そのような方法は、トランスジーンによってコードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を許容しながら、トランスジーンによってコードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用である。内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発現の抑制は、破壊された内因性Ｉｇ遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック動物の確立に必要である時間のかかる飼育を必要としない。
【００４５】
内因性Ｉｇ遺伝子破壊法に比較した時の抑制法の追加の利点は、ある態様では、個体動物内で鎖抑制が可逆的であることである。例えば、Ｉｇ鎖抑制は、（１）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡをコードし発現するトランスジーン、（２）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスズリゴヌクレオチド、および（３）内因性Ｉｇ鎖ポリペプチドに特異的に結合する免疫グロブリン、を使って達成することができる。
【００４６】
本発明は、機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子の同型接合対、機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、及び非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピーを含み、ヒト抗原（例えばCO4）といった抗原での免疫化に続いて抗体応答を行なう、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明は同様に、前記機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子がＪH領域相同組換えノックアウトであり、前記機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子がＪk領域相同組換えノックアウトであり、前記非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンがHC1又はHC2ヒトミニ遺伝子トランスジーンであり、前記非相同軽鎖トランスジーンがKC2又はKCleヒトκトランスジーンであり、前記抗原がヒト抗原であるような、ヒト以外のトランスジェニック動物をも提供する。
【００４７】
本発明は同様に、内因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座を抑制、切除及び／又は機能的に分断するためのさまざまな実施態様をも提供している。
【００４８】
本発明は同様に、ヒト配列重鎖可変領域及びマウス配列重鎖恒常領域を含むキメラ重鎖及びヒト配列重鎖の両方を発現するトランスジェニックマウスをも提供する。このようなキメラ重鎖は一般に、機能的に再配置されたヒトトランスジーンと内因性マウス重鎖恒常領域（γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）の間でのトランススイッチにより産生される。標準的にはトランスジーンコードされたヒト配列軽鎖又は内因性マウス軽鎖と引合わされたこのようなキメラ重鎖を含む抗体は、予め定められた抗原での免疫化に応答して形成される。これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、第１の時点でヒト配列重鎖を産生（発現）し、第２（次に続く）時点でヒト可変領域及びマウス恒常領域（例えば、γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）から成るキメラ重鎖を産生（発現）するべくトランススイッチするＢ細胞を含むことができる；このようなヒト配列及びキメラ重鎖は軽鎖をもつ機能的抗体内に組込まれる：このような抗体は、かかるトランスジェニックマウスの血清中に存在する。
【００４９】
かくして換言すると、これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、ヒト配列重鎖を発現しその後、ヒト可変領域及び交互の恒常領域（例えばマウスγ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３：ヒトγ，α，ε）から成るキメラ又はアイソタイプスイッチを受けた重鎖を発現するべくスイッチ（トランススイッチ又はシススイッチによる）するＢ細胞を含むことができ；かかるヒト配列及びキメラ又はアイソタイプスイッチされた重鎖は軽鎖を伴う機能的抗体（ヒト又はマウス）の中に組込まれ；かかる抗体はかかるトランスジェニックマウスの血清内に存在する。
【００５０】
本発明はまた、大きなトランスジーンを生じる方法を提供し、該方法は、次のことを含む：哺乳動物の細胞に、少なくとも３つのポリヌクレオチド種を導入することであって；第１のポリヌクレオチド種は、第２のポリヌクレオチド種と共有された配列一致（sequence identity）の組換え遺伝子領域（recombinogenic region）を有し、第２のポリヌクレオチド種は、第１のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域および第３のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域を有し、かつ第３のポリヌクレオチド種は、第２のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域を有する。組換え遺伝子領域は、哺乳動物細胞（例えばＥＳ細胞）における、好ましくはまた非哺乳動物の真核細胞（例えばサッカロマイセスおよび他の酵母または菌の細胞）における、イン ビボでの相同組換えを生じるのに十分な実質的な配列一致の領域である。典型的には、組換え遺伝子領域は少なくとも50〜100,000ヌクレオチド長、好ましくは500ヌクレオチド〜10,000ヌクレオチド長で、たいてい80〜100％同一、しばしば95〜100％同一の、たいてい同質遺伝子である。
【００５１】
本明細書中に引用された参考文献は本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。先行発明によって本発明者らがそのような開示よりも先であるという権利を与えられることを認めるものと解釈してはならない。
【００５２】
（化２）及び（化３）はベクターpGPeの配列を示す。
【００５３】
（化４）及び（化５）は遺伝子ＶH49.8の配列を示す。
【００５４】
表１は本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトIgＭおよびIgＧの検出を示す。
【００５５】
（化６）及び（化７）はＶＤＪ接合の配列を示す。
【００５６】
表２は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＪセグメントに対する、pHC1トランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＪセグメントの分布を示す。
【００５７】
表３は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＤセグメントに対する、pHC1トランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＤセグメントの分布を示す。
【００５８】
（化８）及び（化９）は、pHC1トランスジェニックマウス中またはヒトＰＢＬ中のフレーム内ＶＤＪ接合を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さを示す。
【００５９】
表４は、pHC1トランスジェニックマウスから分析された30クローンのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。
【００６０】
表５は、指摘の実験において使用したライン112 のトランスジェニックマウスを示す；（＋）は各トランスジーンの存在を示し、（＋＋）は該動物がＪHＤ突出トランスジーンについてホモ接合性であることを示す。
【００６１】
表６は、複数の0011マウスの遺伝子型を示す。
【００６２】
表７は、トランスジェニックマウスにおけるHC2重鎖トランスジーン内の体細胞突然変異の発生を示す。
【００６３】
表８は、トランスジーンＶおよびＪセグメント使用を示す。
【００６４】
表11は、トランスジェニックマウスからのハイブリドーマにおけるヒト可変領域使用を示す。
【００６５】
表14は、YAC 4x17E1 でのヒト Vk セグメントの同定を示す。
【００６６】
表15、マウス系統KCo5−9272において発現したヒトVk遺伝子の同定。
【００６７】
表16、ヒトIgGk抗-nCD4モノクローナル抗体についての分泌レベル。
【００６８】
表17、ヒトCD4に結合するモノクローナル抗体についての速度および親和性（affinity）定数。
【００６９】
表18、ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の親和性（affinity）および速度定数。
【００７０】
表19、ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の結合力（avidity）および速度定数。
【００７１】
表20、抗CD4モノクローナル抗体について報告された結合力（avidity）および速度定数。
【００７２】
表21、フローサイトメトリーにより測定された、ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の親和性（avidity）定数。
【００７３】
表22、機能的転写のための部分ヌクレオチド配列。
【００７４】
表23、.ハイブリドーマ転写における生殖細胞系Ｖ(D)Ｊセグメント使用。
【００７５】
表24、ミニジーン構成において使用されるプライマー、ベクターおよび産物。
【００７６】
表25、末梢のチンパンジーのリンパ球でのヒト mAbs の効果。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロプリン重鎖遣伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４を表す。
【図２】ヒトλ鎖鎮遺伝子座を表す。
【図３】ヒトκ鎖遺伝子座を表す。
【図４】ヒト重鎖遺伝子座を表す。
【図５】ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５kb断片に次いでラット鎖３′エンハンザ−配列を含む７００bp断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。
【図６】生体内相同キ目同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。
【図７】ｐＧＰ１の作製を示す。
【図８】ｐＧＰ１中に含まれるポリリンカ−の構成を示す。
【図９】本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。
【図１０】ｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製を示す。
【図１１】ｏＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３′ ）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。
【図１２】ｐＨＩＧ３′およびｐＣＯＮの作製を示す。
【図１３】本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。
【図１４】ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。
【図１５】本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ 遺伝子セグメントを包含する断片を示す。
【図１６】ｐＥμの構造を示す。
【図１７】ｐＫａｐＨの作製を示す。
【図１８】マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図１９】マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２０】マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２１】マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２２】マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２３】マウスの内因性免役グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図２４】マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２５】κ軽鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２６】マウス重鎖標的用べクターの構造を示す。
【図２７】マウス重鎖標的用べクターの構造を示す。
【図２８】べクターｐＧＰｅの地図を示す。
【図２９】ベクターｐＪＭ２の構造を示す。
【図３０】ベクターｐＣＯＲ１の構造を示す。
【図３１】ｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す。
【図３２】ｐγｅ２の構造を示す。
【図３３】ｐＶＧＥ１の構造を示す。
【図３４】ｐＨＣ１トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。
【図３５】ｐＪＣＫ１の構造を示す。
【図３６】合成重鎖可変領域の作製を示す。
【図３７】重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＭ1，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。
【図３８】重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１．ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。
【図３９】機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。
【図４０】血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。
【図４１】８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図４２】プラスミドｐＢＣＥ１の略図である。
【図４３】ＫＬＨ−ＤＮＰ（４３Ａ）．ＫＬＨ（４３Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（４３Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。
【図４４】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４５】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４６】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１．ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４７】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定了ミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文宇で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４８】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４９】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラン スジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細抱トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５０】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５１】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定了ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５２】Ｖκ遺伝子セグメントを含有するvk65.3と命名されたヒトDNA断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５３】Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えングナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５４】Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５５】Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５６】同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換ええによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。
【図５７】抗原結合の特異性を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクロ−ナル抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図５８】ヒトＶＤＪ及びフウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図５９】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピトープを有する抗体を表わしている。
【図６０】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウス μについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６１】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウス κについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６２】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対的分布を示している。
【図６３】４つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒト κについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６４】免疫化されていない0011マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ 、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。
【図６５】さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示している。
【図６６】００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。
【図６７】ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗−ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗休力価を示す。
【図６８Ａ】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６８Ｂ】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６９】Storb et al．（1989）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。
【図７０】相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。
【図７１】「免疫グロブリン遺伝子」、Honjo，T，AIt，FW，及びRabbits TH（eds）Acad emic Press，NY（1989）p129 から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。
【図７２】マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図７３】マウス重鎖遺伝子座Ｊ4遺伝子内に２つのbpフレームソフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。
【図７４】高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ−軸）によって示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対するプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を描いている。
【図７５】クラススイッチ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えと一貫性をもつ。図７５は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃ１／Ｓｆｉ１消化されたＤＮＡのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ−５Ｈ１−５、ヒトγ１+／μ-；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１ +／μ-；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１-．μ+。３つのハイブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。プロットは、ヒトγ１スイッチ領域の３′半部分にまたがる２．３kbのＢｇIII／ＳｆｉＩ［ ＤＮＡフラグメントから誘導されたブローブでハイブリッド形成される。μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つのγ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２−２は、それぞれ、５．１kb及び５．３kbのＰａｃＩ／ＳｆｉＩ［フラグメントを結果としてもたらすスイッチ産物を含む。
【図７６】μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを決失するべく組換えできる４００bpの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。このメカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４kbι11,;bのＰａｃ１／ＳｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えによるクラススイッテは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、４kbと７kbの間のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッテ領域の間で組換えを受けていると思われる。
【図７７】トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ筋のＲＮＡの混合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。
【図７８−１】再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。抗原に対する一次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。ＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。
【図７８−２】再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。抗原に対する一次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。ＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。
【図７９−１】再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。抗原に対する二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。ＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８bp）。
【図７９−２】再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。抗原に対する二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。ＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８bp）。
【図８０】広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）である。
【図８１−１】広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８bp）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８１−２】広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８bp）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８２Ａ】ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントでの体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４bp）である。単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。
【図８２Ｂ】ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントでの体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４bp）である。単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。
【図８３】分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ÷／−，ＪＣκ÷／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ−軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍ ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０÷，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκｋ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒト μ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細抱のヒストグラム（対数螢光：Ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱に基づくｅ−パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示されている試料の各々におけるＢ２２０÷細胞の分画は、リンパ球光散乱ゲートの百分率として与えられている。
【図８４】２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。内因性重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ＫＣｏ４ ２重トランスＡジェニックマウスからのマウスγ及びλ及びヒトμ． γ 及びκ。マウス：（÷）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピー）；（〇）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個のＫＣｏ４コピ）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３（組込み一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７。
【図８５】ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免役化後（●）の血清について報告されている。
【図８６】ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。インヒボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／mlの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使用されたベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正万形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ 試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４：ＨＣ２系統２５５０．ＫＣｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。
【図８７】ヒトＣＤ８＋リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。
【図８８】トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４ＩｇＭ ａｎｆ ＩｇＧを示す。
【図８９】トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃｌｌ−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結合実験を示す。
【図９０】培養された２Ｃ１１−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示す。
【図９１】遺伝子、例えば重鎖定常領域遺伝子を欠失するための相同組換えターゲティングトランスジーンの構造を概略的に示す。
【図９２】HCo7トランスジーンを構成するプラスミド挿入部 （inserts）の重複する組を示す。
【図９３Ａ】pGP2bプラスミドベクターのヌクレオチド配列および制限酵素地図を示す。
【図９３Ｂ】pGP2bプラスミドベクターの制限酵素地図を示す。
【図９４】大きいトランスジーンを組み立てるためのクローニング法を示す。
【図９５】大きな挿入部が、高複写（high-copy）pUC誘導プラスミドにおいて不安定であることを示す。
【図９６】ファージP1クローンP1-570を示す。挿入部は、スウイッチ要素と共に、γ３およびγ１をカバーするヒト重鎖定常領域の部分に及ぶ。N、NotI；S、Sa lI、X、XhoI。
【図９７】HCo7トランスジェニック創立動物におけるヒトμおよびγ１の血清発現を示す。
【図９８】HCo7/KCo4二重トランスジェニック／二重欠失マウスにおけるヒト免疫グロブリンの血清発現を示す。
【図９９】HCo7トランスジェニックマウス脾臓RNAにおけるヒトγ１およびγ ３転写のRT PCR欠失を示す。
【図１００】インビトロでのLPSおよびIL−4によるヒトIqG1およびIgG3の誘導を示す。
【図１０１】YAC DNAの濃縮のためのアガロースゲル電気泳動装置。
【図１０２】HC2／KCo5／JHD／JKDおよびHC2／KCo4／JHD／JKDマウスからの骨髄細胞の二色FACS分析。B220+／CD43-、B220+／CD43+およびB220+／IgM+ゲートのそれぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。
【図１０３】HC2／KCo5／JHD／JKDおよびHC2／KCo4／JHD／JKDマウスからの脾臓細胞の二色FACS分析。B220明るい／IgM+およびB220曇っている／IgM+ゲートのそれぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。
【図１０４】IgGk抗-nCD4モノクローナル抗体のCD4＋ SupT1細胞への結合。
【図１０５】フローサイトメトリーによるIgG抗-nCD4モノクローナル抗体のエピトープ測定。SupT1細胞は、緩衝液（左のカラム）、2.5mg／ml RPA−T4（真中のカラム）または2.5 mg／ml Leu3a（右のカラム）で、次いで10のヒトIgGモノクローナル抗体（１：２に希釈した上清中）の１つまたはキメラLeu3aで、プレインキュベートされた。３つの典型的ヒトIgGモノクローナル抗体についての結果をこの図に示す。
【図１０６】ヒトIgGk抗-CD4モノクローナル抗体によるMLRの阻害。
【００７８】
本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイフリドーマを作製する。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
上述したように、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗原と反応するヒト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしながら、ヒト抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリンは問題がある。
【００８０】
第一に、Ｂ細胞源として働く免疫処置動物が、与えられた抗原に対して免疫応答を生じなければならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗原が外来でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性でなければならない。よって、例えばヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタンパク質に対する実質的な免疫応答を生じるのを妨げるだろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の唯一のエピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由来するもの（同種異系間エピトープ）であろうからである。
【００８１】
第二に、ハイブリドーマを形成させるためのＢ細胞の源として働く動物（一例ではヒト）が真正自己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物において深刻な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用のＢ細胞源としてヒトを使う場合には、そのような自己免疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見なされる。
【００８２】
かくして予め定められたヒト抗原に対する抗体応答を誘発できるヒト抗体分泌Ｂ細胞が必要とされることから、予め定められたヒト抗原と特異的反応性をもつヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを開発することには問題が多い。
【００８３】
ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るのに利用することができる１つの方法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジーン構成物を含有するトランスジェニックマウスの製造である。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジーン、またはヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の必須機能要素を含んで成る合成「小遺伝子座」（下記、並びに同時継続米国特許出願第08/352,322号(1994年12月７日出願)、第07/990,860号(1992年12月16日に出願)、第07/810,279号(1991年12月17日出願)、第07/904,068号(1992年６月23日に出願)；第07/853,408号(1992年３月18日に出願)、第07/574,748号(1990年８月29日に出願)、第07/575,962号（1990年８月31日に出願）およびPCT/US91/06185号（1991年８月28日に出願）に記載されている）を含有するトランスジーンを使ってトランスジェニック非ヒト動物を作製する。
【００８４】
そのようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する能力を有し、その上、ヒト抗原に対して免疫応答を生じることができるだろう。よって、そのようなトランスジェニック非ヒト動物は特定のヒト抗原と反応する免疫血清の源として働くことができ、そのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞をミエローマ細胞と融合せしめることにより、ヒト抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造することができる。
【００８５】
様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの製造は以前に報告されている。トランスジェニックマウスの製造には、再配列されたマウス免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子が使われている。加えて、μまたはγ１定常領域を含む機能的に再配列されたヒトＩｇ遺伝子がトランスジェニックマウス中で発現されている。しかしながら、トランスジーンが再配列されていない（再配列されないＶ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）免疫グロブリン遺伝子を含んで成る実験は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまたは最少の再配列を生じることがあった。しかし、トランスジーン中のＣH遺伝子間での好結果のイソタイプスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されていない免疫グロブリントランスジーンの例は１つも報告されていない。
【００８６】
本発明は同様に、基本的にヒト恒常領域配列に対するポリペプチド結合におけるヒトＶＤＪ配列から成るヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ候補を同定するための方法をも提供する。かかるハイブリドーマ候補は、（１）基本的にヒトＶＤＪ領域とヒト恒常領域から成る免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン、及び（２）基本的にヒトＶＤＪ領域及びマウス恒常領域から成るヘテロハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現するトランススイッチされたハイブリドーマを含むハイブリドーマクローンのプールから同定される。個々の又はプールされたハイブリドーマクローンの上清は、予め定められた抗原結合特異性をもつ抗体を選択するための結合条件下で、標準的には固定基質（例えばマイクロタイターウェル）上に吸着により不動化される抗原である予め定められた抗原と接触させられる。
【００８７】
ヒト恒常領域に特異的に結合する抗原も同様に、抗体が少なくとも１つのヒト恒常領域エピトープに選択的に結合するもののマウス恒常領域エピトープには結合しないような結合条件下で、ハイブリドーマ上清及び予め定められた抗原と接触させられ、かくして予め定められた抗原及び特異的にヒト恒常領域と結合する抗体に結合されたハイブリドーマ上清（トランスジェニックモノクローナル抗体）で基本的に構成されている複合体を形成する（そして、これは検出可能な標識又はリポーターで標識付け可能である）。このような複合体の形成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン又はプールを表わす）。
【００８８】
本発明の好ましい実施態様において、スクリーニングにおいて使用される抗ヒト定常領域免疫グロブリンは、非−μ、非−δイソタイプ、好ましくはαまたはε、より好ましくはγイソタイプ定常領域を特異的に認識する。γイソタイプのモノクローナル抗体が好ましい。というのは、(i)IgG免疫グロブリンの特性が、いくつかの治療的な適用について、IgM免疫グロブリンに対して好ましい（例えばIgMペンタマーに比べてIgGダイマーのより小さい大きさの故に）こと、および(ii)体細胞突然変異のプロセスが、μ定常領域から非μ（例えばγ）定常領域へのクラススウィッチに相関されることのためである。クラススウィッチを受けた免疫グロブリンの集団から選ばれた免疫グロブリン（例えばIgG）は、クラススウィッチを受けていない集団から選ばれた免疫グロブリン（例えばIgM）より高い親和性で抗体を結合する傾向にある。例えばロンベルグ(Lonberg)およびハスザー(Huszer)、Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995年)を見よ。
【００８９】
１つの実施態様において、候補者のハイブリドーマがまず、γイソタイプ定常領域についてスクリーニングされ、次に、IgG発現ハイブリドーマのプールが、予め決められた抗原への特異的結合についてスクリーニングされる。
【００９０】
かくして、この方法によれば、本発明のトランスジェニックマウスは、予め決められた抗原で免疫されて、免疫応答を引起す。Ｂ細胞がマウスから集められ、不死細胞に融合されてハイブリドーマを生じる。ハイブリドーマはまずスクリーニングされて、非μ、非δイソタイプのIg（例えばIgG）を分泌する個々のハイブリドーマを同定する。このハイブリドーマの組は次に、関心のある、予め決められた抗原への特異的結合についてスクリーニングされる。スクリーニングは、例えば、ハーロー(Harlow)およびレイン(Lane)、Antibodies:アラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー(A Laboratory Manua1，ColdSprinq Harbor)、ニューヨーク（1988年）に記載されたような標準的技術を用いて行われる。この方法を用いると、高親和性（例えば約107Ｍ-1より大きいKa）の免疫グロブリンを実用的に効率的に同定することが可能である。
【００９１】
定義 
本明細書中で使用する時、用語「抗体」は、少なくとも２本の同一の軽ポリペプチド鎖と２本の同一の重ポリペプチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重および軽ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域（通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重および軽ポリペプチド鎖は各々、ポリペプチド鎖の定常領域（通常はカルボキン末端部分）も含んで成り、その配列の一部は、免疫系の種々の細胞、或る種の食細胞および典型的補体系の第一成分（Clq）を含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する。
【００９２】
本明細書中で使用する時、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非ヒト動物から成らない生物において見つかるものに対応するアミノ酸配列を有するかまたはＤＮＡ配列をコードする抗体である。
【００９３】
本明細書中で使用する時、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物体起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合されたヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
【００９４】
本明細書中で使用する時、「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコ−ドされる抗体クラス（例えばIgＭまたはIgG1）を言う。
【００９５】
本明細書中で使用する時、「イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはイソタイプが或るＩｇクラスから別のＩｇクラスのうちの１つへ変化する現象を言う。
【００９６】
本明細書中で使用する時、「非スイッチイソタイプ」は、イソタイプスイッチが起こらなかった時に産生される重鎖のクラスを言う。非スイッチイソタイブをコードするＣH遺伝子は、典型的には磯能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の最初のＣH遺伝子である。
【００９７】
本明細書中で使用する時、用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えを招くそれらのＤＮＡ配列を言う。「スイッチ供与体」配列、典型的にはμスイッチ領域は、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の５′（即ち上流）にあるだろう。「スイッチ受容体」領域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領域（例えばγ，ε等）との間であろう。組換えが常に起こる特異部位は１つもないので、典型的には最終遺伝子配列は構成物から予想不可能であろう。
【００９８】
本明細書中で使用する時、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より詳しくは免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパターンとして定義される。当業者が異種抗体のグリコゾル化パターンをトランスジーンのＣH遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコシル化パターンに一層類似していると認識するような時には、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質上類似していると特徴付けることができる。
【００９９】
本明細書中で使用する時、「特異的結合」は、抗体が（１）予め決定された抗原に少なくとも１×107Ｍ-1の親和力で結合し、そして（２）予め決定された抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合親和力よりも少なくとも２倍大きい親和力で、予め決定された抗原に優先的に結合する性質を言う。
【０１００】
本明細書中で使用する時「天然に存在する」という用語は、対象物に用いた時に対象物が天然に見つけることができることを言う。例えば、天然源から単離することができ且つ人間によって実験室で故意に変更されていない、生物体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、「天然に存在する」ものである。
【０１０１】
本明細書中で使用する時「再配列された」という用語は、Ｖセグメントがそれぞれ本質的に完全なＶHまたはＶLドメインをコードする構造においてＤ−ＪまたはＪセグメントのすぐ近くに位置する重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を言う。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は生殖細胞ＤＮＡとの比較によって同定することができ；再配列された遺伝子座は少なくとも１つのヘプタマー／ナノマー相同性要素を有するだろう。
【０１０２】
Ｖセグメントに関して本明細書中で使用する時、「再配列されていない」または「生殖細胞配置」なる用語は、ＤまたはＪセグメントのすぐ近くになるようにＶセグメントが組換えられない配置を言う。
【０１０３】
核酸については、「実質的相同性」ともいうのは、最適な形で整列され比較された場合、２つの核酸又はその指定配列が、少なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なくとも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98〜99.5％のヌクレオチドにおいて適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って同一であることを表わす。代替的には、選択的ハイブリダイゼーション条件下でストランドの補体に対しセグメントがハイブリッド形成するときに実質的な相同性が存在する。核酸は、全細胞中に、細胞リゼイト中に、又は部分的に精製された形又は実質的に純粋な形で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣSClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野において周知のその他の技術を含む標準的技術により、例えばその他の細胞核酸又はタンパク質といったその他の細胞成分はその他の汚染物質から精製された時点で、「分離され」又は「実質的に純粋な状態にされ」ている。F．Ausubel，et．al.，ed．「分子生物学における現在のプロトコル」、Greene,Publishing and Wiley-Interscience、ニューヨーク（1987）参照。
【０１０４】
本発明の核酸組成物は、往々にして、ｃＤＮＡゲノミック又は混合物のいずれかからの未変性配列（修正された制限部位などを除く）にあるものの、標準的技術に従って遣伝子配列を提供するべくそこからの突然変異を受けることができる。コーディング配列については、これらの突然変異は望まれるとおりにアミノ酸配列に影響を及ぼしうる。特に、未変性にＤ．Ｊ．結合スイッチと実質的に相同な又はこれらから誘導されたＤＮＡ配列及び本書に記されているその他のこのような配列が考慮される（ここで「誘導された」というのは、１つの配列がもう１つの配列と同一であるか又はそれから修正されたものであることを表わす）。
【０１０５】
核酸は、他の核酸と機能的関係におかれたとき、それは「使用可能に連結される。」例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与えるとき、「作用可能に連結される。転写抑制配列に関し、作用可能に連結されるとは、連結されたＤＮＡ配列が隣接することを意味し、２つの蛋白質コード領域を連結するのに必要な場合、隣接しており、そしてリーディングフレーム内にある。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。
【０１０６】
異種抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物 
異種抗体レパートリーによる外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物のデザインは、トランスジェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブリントランスジーンがＢ細胞発達経路を通して正しく機能することを必要とする。好ましい態様では、異種重鎖トランスジーンの正しい機能がイソタイプスイッチを含む。従って、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの１つまたは複数をもたらすように本発明のトランスジーンが作製される：（１）高レベルで且つ細胞型特異的な発現、（２）機能的な遺伝子再配列、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル形質導入、（６）体細胞高度突然変異（hyper-mutation、および（７）免疫応答の間のトランスジーン抗体遺伝子座の優性化。
【０１０７】
下記開示から明らかなように、上記の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊されるそれらの態様では、トランスジーンは対立遺伝子排除を活性化する必要がない。更に、トランスジーンが機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含んで成る態様では、２番目の基準である機能的な遺伝子再配列は、少なくとも既に再配列されているトランスジーンには不要である。分子免疫学に関する背景につては、Fundamental Immunology，第２版(1989)，Paul William E.編，Raven Press，N.Y．を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１０８】
本発明の一観点では、トランジェニック動物の生殖細胞（ジャームライン）中に再配列された、再配列されていない、または再配列されたものと再配列されていないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを含有する、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジーンの各々は少なくとも１つのＣH遺伝子を含んで成る。加えて、重鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物のＢ細胞中で多数のＣH遺伝子をコードする異種トランスジーンのイソタイプスイッチを支持することができる機能的イソタイプスイッチ配列を含んでもよい。そのようなスイッチ配列は、トランスジーンＣ H遺伝子の源として働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然に存在するものであることができ、またはトランスジーン構成物を受け入れることになっている種（トランスジェニック動物）に存在するものから誘導することもできる。
【０１０９】
例えば、トランスジェニックマウスを製造するのに使われるヒトトランスジーン構成物は、それがマウス重鎖遺伝子座中に天然に存在するものに類似したスイッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプスイッチ現象をもたらすことができる。というのは、恐らくマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナーゼ酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイッチ配列は最適化されないだろうからである。スイッチ配列は、常用のクローニング法により単離しクローニングすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する発表された配列情報に基づいてデザインした重複合成オリゴヌクレオチドから初めから合成することができる（Mills ら、Nucl．Acids Res． 18.7305-7316（1991）;Siderrasら、Intl. Immunol. 1:631-642(1989)、これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１１０】
上記トランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、トランスジェニック動物の有意な率（少なくとも10パーセント）のＢ細胞中に検出される。
【０１１１】
本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに相当する。
【０１１２】
本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトランスジーンは、抗原に暴露されると、トランスジェニック非ヒト動物内でＶ，ＤおよびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）を支持し、そして好ましくは結果として得られる再配列された免疫グロブリン重鎖中へのＤ領域遺伝子セグメントの全部または部分の組み込みを支持する。
【０１１３】
本発明の別の観点によれば、該トランスジーンは、再配列された「小遺伝子座」を含んで成る。そのようなトランスジーンは、典型的にはＣ，ＤおよびＪセグメントの実質的部分並びにＶセグメントのサブセットを含んで成る。そのようなトランスジーン構成物では、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシング用のスプライス供与体およびスプライス受容体、組換えシグナル等は、異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含んで成る。
【０１１４】
あるいは、そのような調節配列を本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、トランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせることができる。あるいは、トランスジーン中に合成調節配列を組み込むこともでき、この場合、そのような合成調節配列は哺乳類のゲノム中に天然に存在することが知られている機能的ＤＮＡ配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則に従ってデザインされ、例えば、スプライス受容体部位またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容配列を特定するものである。
【０１１５】
例えば、ミニ遺伝子座は、天然に発生する生殖細胞系Ｉｇ遺伝子座と異なり、可欠ＤＮＡ部分（例えば介在配列；イントロン又はその一部分）の少なくとも１つの内部（すなわちこの部分の末端にはない）の欠失を有するゲノミック免疫グロブリン遺伝子座の一部分を含む。
【０１１６】
本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含有するトランスジェニック動物にも関し、ここで前記トランスジーンの一方は再配列された遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない遺伝子セグメントを含む。好ましい態様では、再配列されたトランスジーンが軽鎖免役グロブリントランスジーンであり、再配列されていないトランスジーンが重鎖免役グロブリントランスジーンである。
【０１１７】
抗体の構造および産生 
全ての免役グロブリンの基本構造は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドとから成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として知られる２つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれる２つの領域を含んで成る。
【０１１８】
重鎖または軽鎖の定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域遺伝子（ＣH）セグメントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメントの使用が免疫グロブリンのクラスを限定する。例えば、ヒトでは、μ定常領域遺伝子セグメントが抗体のIgＭクラスを限定し、一方でγ，γ２，γ３またはγ４定常領域遺伝子セグメントが抗体のIgＧクラス並びにIgＧのサブクラスIgＧ1〜IgＧ4を限定する。同様に、α1またはα2定常領域遺伝子セグメントの使用が抗体のIgＡクラス並びにIgＡ1およびIgＡ2サブクラスを限定する。δおよびε定常領域遺伝子セグメントがそれぞれIgＤおよびIgＥ抗体クラスを限定する。
【０１１９】
重鎖および軽鎖免疫グロブリンの可変領域は、一緒になって抗体の抗原結合領域を含む。広範囲の抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多様性が必要なため、初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、特定の可変領域遺伝子セグメントのファミリーに由来する多数の異なるＤＮＡセグメントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなファミリーは可変（Ｖ）遺伝子セグメントと連結（Ｊ）遺伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の初期可変領域は１つのＶ遺伝子セグメントと１つのＪ遺伝子セグメントによってコードされ、各セグメントはその生物のゲノムＤＮＡ中に含まれるＶおよびＪ遺伝子セグメントのファミリーから選ばれる。重鎖可変領域の場合、重鎖の初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、１つの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、１つの重鎖多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子てグメントを含んで成り、各セグメントはゲノムＤＮＡ中の適当な免疫グロブリン遺伝子セグメントのＶ，ＤおよびＪファミリーから選ばれる。
【０１２０】
抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎖トランスジーンが再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列中にＤ領域の全部または部分を組み込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を支持するシス作用性配列を含むことが好ましい。典型的には、発現されたトランスジーンによってコードされる重鎖（またはmRNA）の少なくとも約１％がＶ領域中に認識可能なＤ領域配列を含有する。好ましくは、トランスジーンによってコードされるＶ領域の少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約30％、最も好ましくは50％が認識可能なＤ領域配列を含有する。
【０１２１】
認識可能なＤ領域配列は一般に、重鎖トランスジーンのＤ領域遺伝子セグメント中に存在する配列に相当する少なくとも約８個の連続するヌクレオチドおよび／またはそのようなＤ領域ヌクレオテド配列によりコードされるアミノ酸配列である。例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52を含むならば、Ｖ遺伝子セグメント配列とＪ遺伝子セグメント配列の間のＶ領域中に配列5-TAACTGGG-3’を含有するトランスジーンによってコードされるmRNAは、Ｄ領域配列、特にDHQ52配列を含むものとして認識可能である。同様に、例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52を含むならば、Ｖ遺伝子セグメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグメントアミノ酸配列の間のＶ領域中に置かれたアミノ酸配列-DAF-を含有するトランスジーンによってコードされる重鎖ポリペプチドは、Ｄ領域配列、特にDHQ5 2配列を含むものとして認識可能である。
【０１２２】
しかしながら、Ｄ領域セグメントをさまざまな程度までのさまざまな読み取り枠内でのＶＤＪジョイニング内に取り込むことができることから、特定のＤセグメントの取込みを見極めるには、トランスジーン内に存在するＤ領域セグメントに対する重鎖可変領域のＤ領域部域の比較が必要である。その上、組換え中の潜在的エキソヌクレアーゼ消化は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え中の不精確なＶ−Ｄ及びＤ−Ｊ連結を漂く可能性がある。
【０１２３】
しかしながら、体細胞突然変異またはＮ領域付加のために、幾つかのＤ領域は、認識可能であるが連続するＤ領域配列と全く同一には一致しないことがある。例えば、ヌクレズテド配列5′-CTAAXTGGGG-3′（ここでＸはＡ，ＴまたはＧであり、該配列は重鎖Ｖ領域中にあり、Ｖ領域遺伝子配列とＪ領域遺伝子配列によって隣接されている）は、DH52配列５′-CTAACTGGG-３′に相当すると認識され得る。同様に、例えば、Ｖ領域中にありそしてアミノ末端側でトランスジーンＶ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されそしてカルボキン末端側でトランスジーンＪ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されているポリペプチド配列-DAFDI-，-DYFDY-または-GAFDI-は、Ｄ領域配列として認識され得る。
【０１２４】
従って、体細胞突然変異やＮ領域付加はトランスジーンＤ領域に由来する配列中に変異をもたらし得るので、認識可能なＤ領域配列の存在を決定するための指標として次の定義が与えられる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は次のような場合にＤ領域として認識可能である：（１）該配列がＶ領域中に存在し、一方の側がＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接されており、そして他方の側がＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接されており、且つ（２）該配列が既知のＤ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）と実質的に同じであるかまたは実質的に相同である場合。
【０１２５】
ここで使用する用語「実質的な同一」は、ポリペプチド配列が参照配列に比較して少なくとも50％の配列一致、しばしば少なくとも約80％の配列一致および、時には約90％より多い配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少なくとも70％の配列一致を有する、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の特徴を表す。配列一致の％は、参照配列の合計35％未満である小さな欠失または付加を除いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列はポリヌクレオチドの場合長さが少なくとも８ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが少なくとも３アミノ酸残基である。典型的には、参照配列は少なくとも８〜12ヌクレオチドまたは少なくとも３〜４アミノ酸であり、好ましくは12〜15ヌクレオチドもしくはそれ以上または少なくとも５アミノ酸である。
【０１２６】
ここで使用する用語「実質的な相同」は、ポリペプチド配列が参照配列に対して少なくとも80％の相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列相同性の％は、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸置換を相同であるとして数えることにより算出される。位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から生じ得るものである。単一ヌクレオチド置換により最初のアミノ酸のコドンと二番目のアミノ酸のコドンが異なり得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ酸と置き換えられる。例えば、配列-Lys-Glu-Arg-Val-は配列-Asn-Asp-Ser-Val-と実質的に相同である。何故なら、コドン配列-AAA-GAA-AGA-GUU-は、わずか３つの置換変異（２つの元のコドンのうちの３つに単一ヌクレオチド置換）を導入することによって-AAC-GAC-AGC-GUU-に変異せしめることができるからである。参照配列はより大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列は長さが少なくとも４アミノ酸残基である。典型的には参照配列は少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは６アミノ酸またはそれ以上である。
【０１２７】
一次レパートリー 
重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを作製する方法は、主としてＢ細胞を発達させることに存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの結合前、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、大部分、一次レパートリーＢ細胞の前駆体中にＶ，Ｄ，ＪおよびＣ遺伝子セグメントのクラスターとして見つかる。通常、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全てが単一の染色体上に比較的近くに密接して置かれている。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換え前のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中「再配列されていない」ゲノムＤＮＡと呼称される。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ，Ｄ，Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶとＪのみ）の適当なファミリーメンバーのいずれか１つの遺伝子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。
【０１２８】
そのような機能的再配列は、機能的な可変領域をコードするＤＮＡを形成する可変領域セグメントの再配列である。この遺伝子セグメント再配列過程は連続的であると思われる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ接合が作られ、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ接合と軽鎖Ｖ−Ｊ接合が作られる。軽鎖および／または重鎖中の機能的可変領域のこの初期形態をコードするＤＮ,へは、「機能的に再配列されたＤＮＡ」または「再配列されたＤＮＡ」と呼ばれる。重鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された重鎖ＤＮΛ」と呼はれ、そして軽鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された軽鎖ＤＮＡ」と呼ばれる。本発明のトランスジーンの機能的再配列を記述するためにも同様な用語が使われる。
【０１２９】
機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え応答能のあるＶ，ＤおよびＪセグメントに隣接する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）により媒介される。組換えを指令するのに必要且つ十分なＲＳＳは、二分子対称ヘプタマー、高ＡＴノナマー、および12塩基対または23塩基対のいずれかの中断スペーサー領域を含んで成る。それらのシグナルは、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行いそして機能的に相互交換可能である異なる遺伝子座および種の間で保存されている。Oettingeら(1990)，Science, 248,1517-1523およびその中に引用された参考文献を参照のこと。配列CACAGTGまたはその類似体を含んで成るヘプタマーの後に非保存性配列のスペーサー、次いで配列ACAAAAACCまたはその類似体を有するノナマーが存在する。それらの配列は、各ＶおよびＤ遺伝子セグメントのＪ側、即ち下流側上に見つかる。生殖細胞型たおよび遺伝子セグメントの直前に、再び２つの組換えシグナル配列があり、最初にノナマーそして非保存性配列により隔てられて次にヘプタマーがある。ＶL，ＶHまたはＤセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー配列は、それらが組み換わるＪL，ＤまたはＪHセグメントの前方のものと相補的である。ヘプタマーとノナマー配列との間のスペーサーは12塩基対の長さかまたは22〜24塩基対の長さかのいずれかである。
【０１３０】
Ｖ，ＤおよびＪセグメントの再配列に加えて、軽鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間および重鎖のＤセグメントとＪセグメントとの間の可変的祖換えによって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて更なる多様性が生まれる。そのような様々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確な場所の変位（ずれ）によって生成される。軽鎖におけるそのようなずれは、典型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンの内部およびＪセグメントの最初のコドンの内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎖染色体上ではＤセグメントとＪHセグメントとの間に起こり、10ヌクレオチドほどの多数に及ぶことがある。更に、ＤセグメントとＪHセグメントとの間およびＶHセグメントとＤセグメントとの間に、ゲノムＤＮＡによりコードされない幾つかのヌクレオチドが挿入されることがある。それらのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られている。
【０１３１】
ＶＪおよび／またはＶＤＪ再配列の後、再配列された可変領域遺伝子セグメントおよび再配列された可変領域の下流に置かれた１または複数の定常領域遺伝子セグメントの転写は、一次ＲＮＡ転写物を生成し、これが適当なＲＮＡスプライシングを受けると、全長の重鎖または軽鎖免疫グロブリンをコードするmRNAを生じる。そのような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞の経膜領域中への免役グロブリンの挿入および／またはＢ細胞からの分泌を行うリーダー配列を含む。このシグナル配列をコードするＤＮＡは、免役グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域を形成するのに使うＶセグメントの第一エクソンの内部に含まれる。コードされる免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチド（これは互いとの適切な会合によって抗体分子を形成する）を生成するmRNAの翻訳を調節するためにmRNA中に適当な調節配列も存在する。
【０１３２】
可変領域遺伝子セグメント中のそのような再配列およびそのような連結中に起こり得る可変的組換えの最終結果は、一次抗体レパートリーの生成である。一般に、この段階まで分化された各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリー抗体を産生する。この分化過程の間に、機能的に再配列されたIg遺伝子内に含まれるもの以外の遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が起こる。二倍体Ｂ細胞がそのような単一特異性を維持する過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。
【０１３３】
二次レパートリー 
一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫グロブリンを発現するＢ細胞クローンは、外来抗原に応答させるのにすぐに利用できる。単純なＶＪおよびＶＤＪ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる一次応答によって産生される抗体は比較的低い親和性のものである。２つの異なる型のＢ細胞がこの初期応答を作成する:一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパトリ−Ｂ細胞の前駆体〔Lintonら、Cell，59:1049-1059（1989）〕。最初の型のＢ細胞は或る種の抗原に応答してIgM分泌性形質細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ細胞依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴露に応答する。
【０１３４】
抗原により感作されたＢ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の抗体分子の構造が２つの経路で変化する。第一は、定常領域が非IgＭサブタイプにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単一アミノ酸置換により変更されて一層高い親和性の抗体分子を生成することができる。
【０１３５】
前に指摘したように、Ig重鎖または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む。二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸配列決定により、３つの相補性決定領域（CDR1，CDR2およびCDR3；これは超可変領域１，２または３とも呼ばれる）を含むＶ領域の至るところで起こることが決定されている〔Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest（1991）U.S．Department of Health and Human Services，Washington，DC；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。CDR1とCDR2は可変遺伝子セグメント内部に位置し、一方CDR3は大部分がＶ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間またはＶ，ＤおよびＪ遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。
【０１３６】
CDR1，2または3を構成しない可変領域の部分は、一般に、FR1，FR2，FR3およびFR4と名付けられたフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこと。高度突然変異の間に、再配列されたＤＮＡが変異されて異なるIg分子を有する新しいクローンを生じる。外来抗原に対して一層高い親和性を有するそれらのクローンがヘルパーＴ細胞によって選択的に増大されて、発現抗体の親和力成熟を引き起こす。クローン選択は、典型的にはCDR1，CDR2および／またはCDR3領域中に新規変異を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原結合領域の特異性および親和性に影響を及ぼすようなそれらの領域の外側の変異も起こる。
【０１３７】
異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 
本発明の１観点では、トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリントランスジーン（後述）を非ヒト動物の接合子または初期胚中に導入することにより製造される。本発明に有用である非ヒト動物は、一般に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列して一次抗体応答を生ぜしめることができる任意の哺乳類を包含する。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、および当業界で既知である他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が挙げられる。特に好ましい非ヒト動物はマウスまたは齧歯類の他のメンバーである。
【０１３８】
しかしなから、本発明はマウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を開始することができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができる。そのような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ウシ、ヒツジおよびブタの種、齧歯科の他のメンバー、例えはラット、並びにウサギおよびモルモットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラット、ウサギおよびモルモットであり、最も好ましくはマウスである。
【０１３９】
本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様々な遺伝子セグメントが再配列されていない形で重鎖および軽鎖トランスジーンに使われる。この態様では、そのようなトランスジーンがマウスに導入される。軽鎖および／または重鎖トランスジーンの再配列されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の円因性免疫グロブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に固有のＤＮＡ配列を有する。それらは生殖細胞やＢ細胞から成らない体細胞では再配列されていない形態でそしてＢ細胞では再配列された形態で容易に検出することができる。
【０１４０】
本発明の別の態様では、トランスジーンは、再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含んで成る。そのようなトランスジーンの機能的に再配列されたＶＤＪまたはＶＪセグメントに相当する特定セグメントは、マウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能である免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む。
【０１４１】
そういったＤＮＡ配列の相違は、マウスＢ細胞によりコードされるアミノ酸配列に比較するとそのようなヒト免疫グロブリントランスジーンによりコードされるアミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を検出することができる。
【０１４２】
ヒトまたは他の種由来の再配列されていないトランスジーンを含有するトランスジェニックＢ細胞は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機能的に再配列された軽鎖および重鎖可変領域を形成する。そのような再配列されたトランスジーンによりコードされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動物中で通常遭遇するものとは異種であるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を有することは容易に明らかであろう。
【０１４３】
再配列されていないトランスジーン 
本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン重鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。前記重鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。
【０１４４】
同様に、本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン軽鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。ここで、前記軽鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記軽鎖トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。
【０１４５】
本発明のこの観点でのそのような重鎖および軽鎖トランスジーンは、再配列されていない形態で上述の遺伝子セグメントを含有する。即ち、重鎖トランスジーン中のＶ，ＤおよびＪセグメントの間および軽鎖トランスジーン中のＶとＪセグメントの間には、適当な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）が置かれる。加えて、そのようなトランスジーンは、定常領域遺伝子セグメントをＶＪまたはＶＤＪ再配列された可変領域と結合するための適当なＲＮＡスプライシングシグナルも含む。
【０１４６】
複数のＣ領域遺伝子セグメント、例えばヒトゲノムからのＣμおよびＣγ１を含む重鎖トランスジーン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定常領域遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セグメントの下流に、免疫グロブリンクラススイッチ、例えばIgＭからIgＧへのクラススイッチを考慮した前記定常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するような「スイッチ」領域が組み込まれる。そのような重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、可変領域遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を含む転写調節配列（典型的にはTATAモチーフを含む）も含有する。
【０１４７】
プロモーター領域は、下流配列に作用可能に連結されると該下流配列の転写を指令することができるＤＮＡ配列として大体定義することができる。プロモーターは、効率的転写を指令するために連結された追加のシス作用性配列の存在を必要とすることがある。更に好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の配列が含まれる。繁殖不能性転写物の発現に関係する配列の例は、Rothmanら、Intl．Immunol. 2: 621-627（1990）；Reidら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA86: 840-844（1989）；Stavnezerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA85:7704-7708（1988）およびMillsら、Nucl．Acids Res. 18:7305-7316（1991）（この各々は参考として本明細書中に組み込まれる）を包含する、発表文献中に見つけることができる。
【０１４８】
それらの配列は、典型的にはスイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50bp、好ましくはスイッチ領域の上流の少なくとも約200bp、より好ましくはスイッチ領域の少なくとも約200〜1000bpまたはそれ以上を含む。適当な配列はヒトＳγ1,Ｓγ2,Ｓγ3,Ｓγ4,Ｓα1,Ｓα2およびＳεスイッチ領域のすぐ上流に存在するが、ヒトＳγ1およびＳγ3スイッチ領域のすぐ上流の配列が好ましい。それに代えて、又はそれと組合わせて、ネズミＩｇスイッチ配列を用いることができる。トランスジェニック非−ヒト動物と同じ種のＩｇスイッチ配列を用いるのが、しばしば有利である。特に、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性転写調節要素、例えばＩＦＮ誘導性エンハンサーがトランスジーンスイッチ配列のすぐ上流に含まれるのが好ましい。
【０１４９】
プロモーターに加えて、主にＢ系列細胞中で機能する他の調節配列が使われる。例えば、軽鎖トランスジーン上の好ましくはＪセグメントと定常領域遺伝子セグメントとの間に置かれた軽鎖エンハンサー配列は、トランスジーンの発現を増強し、それによって対立遺伝子排除を促進するために使われる。重鎖トランスジーンの場合、調節エンハンサーも使われる。そのような調節配列は、トランスジーンの転写および翻訳を最大にし、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較的高いレベルのトランスジーン発現を提供するために用いられる。
【０１５０】
上述のプロモーターおよびエンハンサー調節配列は包括的に記載されているけれども、そのような調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、異種トランスジーン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムＤＮＡから誘導することができる。あるいは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎖および軽鎖トランスジーンを含む、非ヒト動物または密接に関連した種のゲノム中の対応する調節配列から誘導される。
【０１５１】
好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒトから誘導される。そのような重鎖および軽鎖トランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのような動物に投与される特異抗原に対してIg介在型免疫応答を開始することができる。そのような動物中では異種ヒト抗体を産生することのできるＢ細胞が産生される。不死化後、および適当なモノクローナル抗体（Mab）、例えばハイブリドーマの選択後、治療用ヒトモノクローナル抗体の源が提供される。そういったヒトMabは、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免疫原性を有する。
【０１５２】
好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含む重鎖および軽鎖トランスジーンの作製を開示するけれども、本発明はそれに限定されない。この点に関しては、本明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子セグメントの使用に合わせて容易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の抗体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードされた療法的抗体を用いて獣医科学において使用するためのモノクローナル抗体を生成せしめることができる。
【０１５３】
再配列されたトランスジーン 
別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖細胞中に機能的に少なくとも１つの再配列された異種重鎖免疫グロブリントランスジーンを含有する。そのような動物は上述のような再配列された重鎖トランスジーンを発現する一次レパートリーＢ細胞を含有する。そのようなＢ細胞は、好ましくは、抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対して高い親和性を特異性を有する異種抗体を形成することができる。前記再配列されたトランスジーンは、少なくとも２つのＣH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を含むだろう。
【０１５４】
本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含み、前記トランスジーンのうちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方が再配列されていない遺伝子セグメントを含む、トランスジェニック動物にも関する。そのような動物では、重鎖トランスジーンが少なくとも２つのＣH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
【０１５５】
本発明は更に、本発明のトランスジーンにおいて使うことができる合成可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法にも関する。該方法は、免疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの集団を作製することを含んで成る。ここで前記ＶセグメントＤＮＡの各々は免疫グロブリンＶセグメントをコードし、そして各末端に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの前記集団は、その後、鎖状に連結されて合成免疫グロブリンＶセグメントレパートリーを形成する。そのような合成可変領域重鎖トランスジーンは、少なくとも２つのＣH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
【０１５６】
イソタイプスイッチ 
Ｂリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再配列されたＶHおよびＶL領域によって決定される結合特異性を有するIgＭを最初に産生する。続いて、各Ｂ細胞とその子孫の細胞が同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、それらはＨ鎖のイソタイプをスイッチすることができる。
【０１５７】
μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、IgＭおよびIgＤを単一細胞中で同時発現できるようにする、交互スプライシングによって決定される。その他の重鎖イソタイプ（γ，αおよびε）は、遺伝子再配列現象がＣμおよびＣδエクソンを欠失させた後で本質的にのみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイプスイッチと呼ばれ、典型的には各重鎖遺伝子（δを除く）のすぐ上流に置かれたいわゆるスイッチセグメントの間での組換えによって起こる。
【０１５８】
個々のスイッチセグメントは長さが2〜10kbであり、主として短い反復配列から成る。組換えの正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。cDNA由来のＣHプローブを用いるサザンブロット法または溶液ハイブリダイゼーション速度論を使った実験は、スイッチが細胞からのＣH配列の消失に関係し得ることを確証した。
【０１５９】
μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Ｓμは、コード配列の約１〜２kb５′側に位置し、そして（GAGCT）n（GGGGT）の形の配列の多数の縦列反復から成る。ここでｎは通常２〜５であるが、17ほどの大きさに及ぶことができる。〔T．Nikaidoら、Nature，292: 845-848(1981)を参照のこと。〕 
【０１６０】
他のＣH遺伝子の５′にも、数キロ塩基対に及ぶ同様な内部反復性スイッチ配列が見つかっている。Ｓα領域は配列決定されており、縦列に反復した80bpの相同性単位から成ることが判明した。一方、Ｓ2a，Ｓ2bおよびＳ3は全て、互いに非常に類似している反復した49bpの相同性単位を含む〔P．Szurekら、J.Immunol，135: 620-626（1985）およびT．Nikaidoら、J．Biol．Chem. 257:7322-7329（1982）を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。全ての配列決定されたＳ領域は、Ｓμ遺伝子の基本的反復配列であるペンタマーGAGCTおよびGGGGTの多数の存在を含む〔T．Nikaidoら、J．Biol．Chem. 257: 7322-7329（1982）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕；他のＳ領域では、それらのペンタマーはＳμのようには正確に縦列に反復されていないが代わりに大きな反復単位中に埋もれている。Ｓγ1領域は追加の高次構造を有し、即ち、２つの直接反復配列が49bpの縦列反復の２つのクラスターの各々に隣接する〔M.R.Mowattら、J ．Immunol. 136: 2674-2683（1986）を参照のこと；これは引用して不明細書中に組み込まれる〕。
【０１６１】
ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域はそれらのマウス同族体に非常に類似していることがわかっている。実際、ＣH遺伝子の５′側のヒトクローンとマウスクローンの間の類似性はＳ領域に限られることがわかっており、これは、それらの領域の生物学的重要性を確証する事実である。
【０１６２】
μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組換えは複合Ｓμ−Ｓα配列をもたらす。典型的には、組換えが常に起こるような特異部位はＳμ領域中にも他のＳ領域中にも存在しない。
【０１６３】
一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素的機構とは異なり、スイッチ機構は、明らかに生殖細胞Ｓ前駆体の反復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次いで該配列を異なる位置で一直線上に連結することができる。〔T.H. Rabbittsら、Nucleic Acids Res. 9: 4509-4524（1981）およびJ．Ravetchら、Proc．Natl．Acad. Sci. USA, 77:6734-6738（1980）を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる。〕 
【０１６４】
特定のイソタイプへのスイッチを選択的に活性化する機構の詳細は未知である。リンホカインやサイトカインのような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコンビナーゼを増加調節するかもしれないが、この酵素機構はあらゆるイソタイプへのスイッチを触媒し、そして特異性がこの酵素機構の標的を特定のスイッチ領域に向けることにある可能性もある。
【０１６５】
Ｔ細胞由来のリンホカインIL-4およびIFNγは、幾つかのイソタイプの発現を特異的に促進することが証明されている 
【０１６６】
IL-4はIgＭ，IgＧ2a，IgＧ2bおよびIgＧ3発現を減少させ、IgＥおよびIgＧ1発現を増加させる；IFNγはIgＧ2a発現を選択的に刺激し拮抗する一方、IgＥとIgＧ1発現の増加を誘導する〔Coffmanら、J．Immunol. 136: 949-954（1986）およびSnapperら、Science 236: 944-947(1987)；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【０１６７】
スイッチに関するＴ細胞作用に関係する実験のほとんどは、特定のスイッチ組換えを有する細胞において観察される増加が事前スイッチされた細胞または事前傾倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視することができなかった。しかし、最もありそうな説明はリンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するというものである。
【０１６８】
クラススイッチの誘導は、スイッチセグメントの上流で始まる繁殖不能転写物(stelile transcript)に関係があるらしい〔Lutzekerら、Mol. Cell Biol. 8:18 49（1988）；Stavnezer ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7704（1988）：EsserおよびRadbruch，EMBO J. 8: 483（1989）；Bertonら、Proc．Natl．Acad.Sci．USA 86:2829（1989）；Rothmanら、Int．Immunol．2:621（1990）；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。例えば、観察されるIL-4によるγ１繁殖不能転写物の誘導およびIFNγによる阻害は、IL-4がＢ細胞中でのγ１へのクラススイッチを促進し、IFNγがγ1発現を阻害するという観察結果と一致する。従って、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包含は、イソタイプスイッチの速度にも影響を及ぼし得る。例えば、特定の繁殖不能転写物の転写を増加せしめることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴うイソタイプスイッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。
【０１６９】
それらの理由により、トランスジーンがイソタイプに使用する予定の各スイッチ領域の約1〜2kb上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それらの転写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハンサー要素を含み、より好ましくはスイッチ領域と生来関連している（即ち生殖細胞配置で存在する）５′隣接（即ち上流）領域を含む。この５′隣接領域は、典型的には長さが少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500〜1000ヌクレオチドである。
【０１７０】
１つのスイッチ領域からの５′隣接配列をトランスジーン構成物用の別のスイッチ領域に作用可能に連結させることができる（例えば、ヒトＳγ１スイッチからの５′隣接配列をＳα1スイッチのすぐ上流に融合させることができ；ネズミＳγ１フランキング領域をヒトγ１スイッチ配列の隣りに移殖することができ；あるいはネズミＳγ１スイッチをヒトγ１コード領域に移植することができる）けれども、或る態様では、トランスジーン構成物中に含まれる各スイッチ領域が、天然に存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する５′隣接配列を有することが好ましい。
【０１７１】
モノクローナル抗体 
モノクローナル抗体は、当業者にとっては周知のさまざまな技術によって得ることができる。簡単に言うと、望ましい抗原で免疫化された動物からの脾細胞を、一般には骨髄腫細鉋との融合によって不死化させる。（Kchle及びMilstein，Eur．J．Immunol.，6 ; 511-519（1976）を参照のこと）。不死化の代替的方法としては、エプスタインーバーウイルス、オンコ遺伝子又はレトロウイルスでの形質転換、又はその他の当該技術分野において周知の方法が含まれる。
【０１７２】
単一の不死化された細胞から発生したコロニーは、抗原に対する望ましい特異性及び親和力を有する抗体の産生についてスクリーニングされ、かかる細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔内への注入を含むさまざまな技術によって増強できる。免疫グロブリンを産生するための動物の免疫化、モノクローナル抗体の産生；プローブとしての使用を目的とした免疫グロブリンの標識付け,イムノアフィニティ精製及び免疫学的検定法を含め、これらの技術分野で有効なさまざまな技法が、例えば、Harlow及びLane、抗体：その研究室マニュアル、Cold Spring Habor, New York（1988）の中で論述されている。
【０１７３】
トランスジェニック一次レパートリー 
【０１７４】
Ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座 
【０１７５】
トランスジーン機能のための重要な必要条件は、広範囲の抗原に対して二次免疫応答を開始させるのに十分な程度に多様である一次抗体レパートリーの作製である。再配列された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、可変領域エクソン、および各々が数個のエクソンによりコードされる多ドメイン定常領域の縦列整列領域から成る。定常領域遺伝子の各々は異なる免役グロブリンクラスの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、定常領域に近いＶ領域が欠失されて新規重鎖クラスの発現をもたらす。各重鎖クラスについては、ＲＮＡスプライシングの別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリンをもたらす。
【０１７６】
ヒト重鎖遺伝子座は、2Mbにわたる約200個のＶ遺伝子セグメント（今回のデーターは約50−100Ｖ遺伝子セグメントの存在を支持している。）、約40kbにわたる約30個のＤ遺伝子セグメント、3kbの範囲内に密集した６個のＪセグメント、および約300kbにわたる９個の定常領域遺伝子セグメントから成ると予想される。全遺伝子座は、染色体14の長い方の腕の遠位部分約2.5Mbに及ぶ（図４）。
【０１７７】
Ｂ．遺伝子断片トランスジーン
【０１７８】
1．重鎖トランスジーン 
好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンは、ヒト由来の再配列されていないゲノムＤＮＡを含んで成る。重鎖の場合、好ましいトランスジーンは670〜830kbの長さを有するNotI断片を含んで成る。この断片の長さは、３′制限部位が実際にマッピングされていないため、不明瞭である。しかしながら、α１とψα遺伝子セグメントとの間にあることが知られている。この断片は、６つの既知ＶHファミリーの全部のメンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、並びにμ，δ，γ３．γ１およびα１定常領域を含む。Bermanら、EMBOJ. 7:727-738(1988)。このトランスジーンを含有するトランスジェニックマウス系は、Ｂ細胞の発達に必要とされる重鎖クラス（IgＭ）を正しく発現し、そしてほとんどの抗原に対して二次応答を開始せしめのに十分な程多数のレパートリーと共に、少なくとも１つのスイッチされた重鎖クラス（IgＧ1）を発現する。
【０１７９】
2．軽鎖トランスジーン 
ヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を全て含有するゲノム断片を同様に作製することができる。そのような構成物は本実施例中に記載のようにして作製される。
【０１８０】
Ｃ．生体内組換えにより細胞内的に作製されるトランスジーン 
単一ＤＮＡ断片上の重鎖遺伝子座の全部または一部分を単離する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの670-830 kb Not I 断片は、トランスジーン形成(transgenesis)の間に非ヒト動物の生体内で形成させることができる。そのような生体内トランスジーン作製は、２以上の重複するＤＮＡ断片を非ヒト動物の胎児性核に導入することにより行われる。ＤＮＡ断片の重複部分は、実質的に相同であるＤＮＡ配列を有する。胎児性核内に含まれるレコンビナーゼに暴露されると、重複しているＤＮＡ断片が適切な方向において相同的に組み換わって670-830kbのNotl重鎖断片を形成する。
【０１８１】
生体内トランスジーン作製は、そのサイズのために現存の技術による作製またば操作が因難であるかまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジーンを形成せしめるのに使うことができると理解すべきである。例えば、生体内トランスジーン作製は、ＹＡＣベクター〔MurrayおよびSzostak, Nature 305:189-19 2 (1983)〕により繰作することができるＤＮＡ断片よりも大きい免疫グロブリントランスジーンを作製するのに有用である。そのような生体内トランスジーン作製は、トランスジェニック非ヒト動物から成らない種の実質的に完全な免疫グロブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入する場合にも使うことができる。
【０１８２】
ゲノム免疫グロブリントランスジーンを形成させることに加えて、実施例に記載の如く「小遣伝子座」トランスジーンを形成させるのにも生体内相同組換えを使うことかできる。
【０１８３】
生体内トランスジーン作製・を利用する好ましい態様では、各々の重複するＤＮＡ断片は、好ましくは第一のＤＮＡ断片の末端部分と第二のＤＮＡ断片の末端部分の間で重復する実質的に相同なＤＮＡ配列を有する。ＤＮＡ断片のそのような重復部分は、好ましくは約500bp-約2000bp、最も好ましくは1.0kb〜2.0kbを含む。生体円でトランスジーンを形成させるための重複ＤＮＡ断片の相同組換えは、1992年3月19日に公開された「哺乳類細胞における相同性組換え(homologous Recombination in Mammalian Cells)と称するPCT公開WO92/03917に更に詳しく記載されている。
【０１８４】
Ｄ．小遺伝子座トランスジーン
本明細書中で使用する時、「免疫グロブリン小遺伝子座」なる用語は、通常は約150kb未満、典型的には約25〜100kbのＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列が少なくとも１つの実質的不連続性（例えば、相同ゲノムＤＮＡ配列に関して、通常は少なくとも約2〜5kb、好ましくは10〜25kbミたはそれ以上の欠失）を有するような、次のものを各々少なくとも１つ含むＤＮＡ配列を言う：機能的可変（Ｖ）這伝子セグメント、機能的運結（Ｊ）領域セグメント、少すくとも１つの機能的定常（Ｃ）領域遣伝子セグメント、および重鎖小遺伝子座の場合には、機能的多様性（Ｄ）領域セグメント。軽鎖小遺伝子座トランスジーンは、長さが少なくとも25kb、典型的には50〜80kbであるだろう。重鎖トランスジーンは、スイッチ領域に作用可能に連結された２つの定常領域を有する、典型的には約70〜80kb、好ましくは少なくとも約60kbの長さであろう。更に、小遺伝子座の個々の要素は好ましくは生殖細胞（ジァームライン）配置にあり、そして小遺伝子座の該要素により完全にコードされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体分子を発現するように、トランスジェニック動物の前駆体Ｂ細胞において遺伝子再配列を受けることができる。更に、少なくとも２つのＣH遺伝子と必要なスイッチ配列とを含んで成る重鎖小遺伝子座は、典型的には、異なる免役グロブリンクラスの機能的抗体分子が生成されるように、イソタイプスイッチを受けることができる。そのようなイソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するＢ細胞中で生休内で起こるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から外植されたＢ細胞系列の培養細胞中で起こり得る。
【０１８５】
他の好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンはＶ-H , ＤおよびＪH遺伝子セグメントを各々１つまたは復数並びにＣH遺伝子を２つ以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも１つが小遺伝子座トランスジーンに組み込まれる。重鎖トランスジーンのＣHセグメントに関しては、トランスジーンが少なくとも１つのμ遣伝子セグメントと、少なくとも１つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遣伝子セグメント、最も好ましくはγ３またはγ１遺伝子セグメントとを含むことが好ましい。この優先性は、コードされる免疫グロブリンのIgＭ形とIgＧ形の間のクラススイッチおよび分泌形の高親和性非IgＭ免疫グロブリンの産生を考慮したものである。他の定常領域遺伝子セグメント、例えばIgＤ，IgＡおよびIgＥの産生をコードするものも使うことができる。
【０１８６】
当業者は、重鎖ＣH遺伝子の発生の順序が該ＣH遺伝子の供与体として働く種の生殖細胞において見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろうトランスジーンも作製するだろう。
【０１８７】
更に、当業者は、１つの種の複数の個体からＣH遺伝子を選択することができ（例えば、同種異系ＣH遺伝子）、そしてイソタイプスイッチを受けることができる過剰のＣH遣伝子として前記遣伝子をトランスジーン中に組み込むことができる。次いで、結果として生じたトランスジーン非ヒト勤動物は、或る態様では、トランスジーンＣH遺伝子を得た前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含する様々なクラスの抗体を生産することができる。
【０１８８】
更にまた、当業者は、異なる種からＣH遺伝子を選択してトランスジーン中に組み込むことかできる。各ＣH遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれるが、使用するスイッチ配列は必ずしもＣH遺伝子の隣に天然に存在するものである必要はない。種間のＣH遺伝子組み合わせは、様々な種からのＣH這伝子に相当する多様はクラスの抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物をもたらすだろう。腫間ＣHトランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、獣医学用のモノクローナルを産生するハイブリドーマを作製するためのＢ細胞の源として働くことができる。
【０１８９】
ヒトの重鎖ｊ領域セグメントは、３kbのＤＮＡ長さにおいて密集した６個の機能的Ｊセグメントこ３個の偽遺伝子を含んで成る。それが比較的小さいサイズであることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ遺伝子の５′部分と一緒に単一の23kb SFil／Soel断片として単離できること〔Sadoら、Biochem Biophys.Res.Commun. 154:246-271 (1988)；これは参考として本明細書甲に組み込まれるｊを仮定すれば、小遺伝子座構成物において全部のＪ領域遺伝子セグメントを使うことが好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の領域に広がるため、μ発現に必要とされるシス結合した３′調節要素の全部を含むことが適当である。
【０１９０】
更に、この断片は完全なＪ領域を含むため、重鎖エンハンサーとμスイッチ領域を含む〔Millsら、Nature 306:809(1983)；YancopoulosおよびAlt，AnnRev Immunol. 4:339-368(1986)；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。それは、ＶＤＪ結合を開始させて一次レパートリーＢ細胞を形成させる転写開始部位も含む〔YancopoulosおよびAlt，Cell 40:271-281 (1985);これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。あるいは、23kb SfiI/SpeI断片の代わりに、Ｄ領域の一部を含む36kb BssHII/SpeI断片を使うことができる。そのような断片の使用は、効率的Ｄ−ｊ結合を促進させる５′隣接配列の量を増加させる。
【０１９１】
ヒトＤ領域は、縦列に結合した４または５個の相同な9kbの亜領域から成る〔Siebenlistら、Nature 294:631-635(1981)〕。各亜領域は10個までの個々のＤセグメントを含む。それらのセグメントの一部はマッピングされており、それを図４に示す。２つの異なる方策を使って小遺伝子座Ｄ領域を作製する。第一の方策は、１つまたは２つの反復Ｄ亜領賊を含む短いＤＮＡの連続鎖の中に置かれたそれらのＤセグメントのみを使うものである。候補となるのは、12個の個々のＤセダメントを含む単一の15kb断片である。
【０１９２】
ＤＮＡのこの断片は２つの連続するEcoRI断片から成り、そして完全に配列決定されている〔Ichiharaら、EMBO J. 7:4141-4150(1988)〕。
【０１９３】
12のＤセグメントが一次レバートリーに十分であろう。しかしなから、Ｄ領域の分散性質があるとすれば、別の方策は、幾つかの不連続Ｄ断片含有断片を一緒に連結して、より多数のセグメントを有する一層小型のＤＮＡ断片を作製することである。例えば、特徴的な隣接ノナマーまたはヘブタマー配列（前傾）の存在により、および文献への参照により、追加のＤセグメント遺伝子を同定することができる。
【０１９４】
重鎖小遺伝子座トランスジーンを作製するのには、少なくとも１つ、好ましくは複数のＶ遺伝子セグメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグメントは、「異種性抗体を生産することができるトランスジェニック非−ヒト動物」（Transgenic Non-Human AnimalC apable of Producing Heterologous Artibodies）と称する。1992年3月19日に公開されたPCT公開WO1092/03918に記載の通りに単離することができる。
【０１９５】
隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグメント、Ｄセグメント、ＪセグメントおよびＣ遺伝子は、1992年3月19日に公開されたPCT公開WO1092/03918に記載の通りに単することができる。
【０１９６】
小遺伝子座軽鎖トランスジーンは、ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座から同様にして作製することができる。すなわち、例えば、複数のＤＮＡ断片、少なくとも２つ、３つまたは４つのＤＮＡ断片から、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常領域配列（各配列はヒト遺伝子配列に実質的に相同である）をコードする、例えば約75kbの、免疫グロブリン重鎖小遺伝子座トランスジーン構成物を形成せしめることができる。好ましくは、前記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そして再配列を受けることができる。２以上の適当に置かれた定常領域配列（例えばμおよびγ）およびスイッチ領域では、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽鎖トランスジーン構成物は、1990年8月29日出願の同時係属出願USS07/574,748に記載の通りに、ヒトＤＮＡに実質的に相同であり且つ再配列を受けることのできる複数のＤＮＡ断片から同様に形成せしめることができる。
【０１９７】
Ｅ．イソタイプスイッチを受けることができるトランスジーン構成物 
理想的には、クラススイッチを受けることになっているとランスジーン構成物は、繁殖不能転写物を調節するのに必要なシス作用性配列の全てを含むべきである。天然に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよび調節配列（例えばＩＦＮ誘導性要素）は、イソタイプスイッチを受けることかできるトランスジーン構成物中に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領域、好ましくはヒトγ１スイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50塩基対、好ましくは少なくとも約200塩基対、より好ましくは少なくとも500〜1000塩基対またはそれ以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγ１スイッチ配列に作用可能に連結されるだろう。更に、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天然には存在しないＣH遺伝子の上流に（且つ近隣に）連結せしめることができる。例えば、限定のつもりでないが、ヒトγ１スイッチ領域をヒトα２ＣH遺伝子の上流に連結してもよく、またはマウスγ１スイッチ領域をヒトＣH遺伝子に連結してもよい。
【０１９８】
トランスジェニックマウスにおいて非古典的イソタイプスイッチ（例えばδ−関連欠失）を得るための別法は、ヒトμ遺伝子に隣接する400bpの直接反復配列(σμおよびεμ)〔Yasuiら、Eur J. Immunol. 19:1399(1989)〕の包含を伴う。それらの二配列の間の相同組換えはIgＤ型のみのＢ細胞においてμ遺伝子を欠失せしめる。重鎖トランスジーンは、次の式によって表すことができる：
【０１９９】
(VH)x-(D)y-(JH)z-(SO)m-(CI)n-[(T)-(SA)P-(C2)]q
【０２００】
上式中、ＶHは重鎖可変領域遺伝子でセグメントであり、Ｄは重鎖Ｄ（多様性）領域遺伝子セグメントであり、ＪHは重鎖Ｊ（連結）領域遺伝子セグメントであり、ＳOはイソタイブスイッチが起こるようなＳd受容体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる供与体領域セグメントであり、ＣIはＢ細胞発達ににおいて使われるイソタイプ（例えばμまたはδ）をコート゛する重鎖定常領域遺伝子セグメントであり、Ｔは少なくともプロモーターを含有するシス作用性転写調節領域セグメントであり、Ｓ4はイソタイプスイッチが起こるような選択されたＳO供与体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる受容体領肢セグメントであり、Ｃ2はμ以外のイソタイプ（例えばγ1,γ2,γ3,γ4,α1,α2,ε）をコードする封鎖定常領域遺伝子セグメントであり、ｘ,ｙ,ｚ,ｍ,ｎ,ｐおよびｑは整数であり、ｘは１〜100、ｎは０〜10、ｙは１〜50、ｐは１〜10、ｚは１〜50、ｑは０〜50、ｍは０〜10である。典型的には、トランスジーンがイソタイプスイッチを受けることができる時、ｑは少なくとも１であり、ｍは少なくとも１であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｍはｎと等しいかまたはそれより大きくなければならない。
【０２０１】
ＶH, Ｄ, ＪH , ＳO , Ｃ1 , Ｔ, ＳA およびＣ2 セグメントは様々な種、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞ＤＮＡから選択することができる。
【０２０２】
ＶHセグメントは、ヒト生殖細胞中に天然に存在するＶHセグメント、例えばＶＨ251から選択することができる。典型的には、約２個のＶHセグメント、好ましくは約４個、より好ましくは少なくとも約10個のＶHセグメントが含まれる。
【０２０３】
典型的には少なくとも１個のＤセグメントか含まれるが、奸ましくは少なくとも10個のＤセグメントか含まれ、態様によっては、10個以上のＤセグメントが含まれる。幾つかの好ましい態様はヒトＤセグメントを含む。
【０２０４】
典型的には少なくとも１個のＪHセグメントがトランスジーンに含まれるが、約６個のＪHセグメントを含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約６個以上のＪHセグメントを含み、非ヒトＪHセグメントを１つも含まない。
【０２０５】
ＳOセグメントは該トランスジーンのＳAセグメントとの組換え現象に参加することかできる供与体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、ＳOおよびＳA領域はＳμ,Ｓγ1,Ｓγ2,Ｓγ3,Ｓγ4,Ｓα,Ｓα2およびＳEといったスイッチ領域である。好ましくは、スイッチ領或はマウスまたはヒトであり、より好ましくはＳOがヒトまたはマウスＳμであり、ＳAがヒトまたはマウスＳγ1である。非古典的イソタイプスイッチ（δ関連欠失）でが、ＳOおよびＳA領域は、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接する400塩基対の直接復配列である。
【０２０６】
Ｃ1セグメントは、典型的にはμまたはδ遺伝子であり、好ましくはμ遺伝子であり、より好ましくはヒトまたはマウスμ遺伝子である。
【０２０７】
Ｔセグメントは、典型的には天然に存在する（即ち生殖細胞）スイッチ領域に隣接する５′隣接配列を含む。Ｔセグメントは典型的には長さが少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも500〜1000ヌクレオチドである。好ましくはＴセグメントは、生殖細胞配置においてヒトまたはマウススイッチ領域のすぐ上流に存在する５′隣接配列である。前記Ｔセグメントが動物の生殖細胞に天然に存在しないシス作用性転写調節配列（例えばウイルスのエンハンサーおよひプロモーター、例えばSV40、アデノウイルス、および真核細胞に感染する他のウイルス中に見つかるもの）を含んでもよいことは当業者にとって明白である。
【０２０８】
Ｃ2セグメントは、典型的にはγ1,γ2,γ3,γ4,α1,α2またはεＣ11遺伝子であり、好ましくはそれらのイソタイプのヒトＣ11遺伝子であり、より好ましくはヒトγ1またはγ3遺云子である。様々な種からの下流（スイッチされる）イソタイプ遺伝子としてマウスγ24およびγ2bを使ってもよい。重鎖トランスジーンが免疫グロブリン重鎖小遺伝子座を含む場合、該トランスジーンの全長は典型的には150キロ塩基対未満であろう。
【０２０９】
一般に、該トランスジーンは、生来の重鎖Ｉｇ遺伝子座以外のものであるだろう。例えば、不必要な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換か存在するだろう。
【０２１０】
Ｆ.Ｉｇトランスジーン中の機能的.イソタイプスイッチを決定する方法 
トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチの発生は、当業界で公知である任意の方法によって同定することができる。好ましい態様としては次のものが挙げられ、それらば単独でまたは組み合わせて使用される。
【０２１１】
1. δ以外の少なくとも１つのトランスジーン下流ＣH遺伝子に相同である配列とトランスジーンＶH−ＤH−ＪH再配列された遺伝子に相同である隣接配列とを含有するmRNA転写物の検出；そのような検出はノーザンハイブリダイゼーション、Ｓ1 ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲ増幅、cDNAクローニングまたはその他の方法によることができる。
【０２１２】
2. トランスジェニック動物の血清中の、または該トランスジェニック動物のＢ細胞から作製したハイブリドーマ細胞の培養上清中の、下流ＣH 遺伝子によりコードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。ここで免疫化学的方法により、そのようなタンパク質が機能的可変領域を含んで成ることを証明することもできる。
【０２１３】
3. トランスジェニック動物のＢ細胞からのＤＮＡ中の、またはハイブリドーマ細胞からのゲノムＤＮＡ中の、該トランスジーン中のイソタイプスイッチの発生と一致するＤＮＡ再配列の検出。そのような検出はサザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成することができる。
【０２１４】
4. イソタイプスイッチの他の徴候、例えば繁殖不能転写物の産生、スイッチに関与する特徴的な酵素の産生（例えば「スイッチレコンビナーゼ」）、あるいは現行技術によって検出、測定または観察され得る他の徴候の同定。
【０２１５】
各々のトランスジェニック系列はトランスジーンの異なる組み込み部位とトランスジーン挿入断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランスジーンと隣接ＤＮＡ配列の各々の異なる配置は遺伝子発現に影響を与え得るため、高レべルのヒト免疫グロブリン、特にＩgＧイノタイプのものを発現し、且つ最少コピー数の該トランスジーンを含有するマウスの系統を同定しそれを使用することが好ましい。単一コピーのトランスジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺伝子発現の問題を最少にする。
【０２１６】
トランスジーンは典型的には宿主染色体ＤＮＡ中、最も普通には生殖細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、そしてその後の生殖細胞系列トランスジェニック飼育用動物の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者は、適宜および所望により、当業界において既知であるかまたは後に開発される他のベクターおよびトランスジェニック法に置換することができる。
【０２１７】
内因性非ヒト重鎖恒常領域遺伝子に対するトランススイッチが起こって、キメラ重鎖及びかかるキメラヒト／マウス重鎖を含む抗体を産生する可能性がある。かかるキメラ抗体は、本書で記述するいくつかの用途には望まれるかもしれないが、望ましくない場合もある。
【０２１８】
Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子鎖の機能的破壊 
好結果に再配列された免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑制することにより優性作用を有すると予想される。しかしながら、内因性抗体を欠く非ヒト動物を生成せしめる別の方注は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突然変異せしめることによるものである。胎児性幹細胞技術および相同組換えを使って、内因性免疫グロブリンレパ−トリ−を容易に排除することができる。下記はマウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊を説明する。しかしながら、開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用に合わぜて容易に改変することができる。
【０２１９】
簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織に分化することができる多分化能性細胞系における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免疫グロブリンの変更コピーを含むＤＮＡ構成物を胎児性幹細胞の核に導入する。その細胞の一部において、導入されたＤＮＡマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わり、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞を宿主マウス胚に注入し、それを受容体の雌に再移植する。それらの胚の一部が変異細胞系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、キメラマウスを交配することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規系列を獲得することが可能である〔Capecchi (1989) Science, 244, 1288-1292により概説されている〕。
【０２２０】
マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわずか５％に寄与するため、重鎖および／またはκ軽鎖遺伝子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々を破壊するのには３つの方法があり、Ｊ領域の欠失、Ｊ−Ｃイント０ンエンハンサーの欠失、および終結コドンの導入による定常領域コード配列の破壊である。ＤＮＡ構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡単である。μ遺伝子の排除はＢ細胞の成熟を破壊し、それによっていずれかの機能的重鎖セグメントにクラススイッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊（ノックアウト）する方策を下記に概説する。
【０２２１】
マウスμ-およびκ遺伝子を破壊するためには、Jaenischおよび共同研究者〔Zijlstraら(1989), Nature, 342, 435-433〕によりマウスβ２ミクログロブリン遺伝子の好結果の破壊に使われたデザインを基にした標的ベクターを用いる。プラスミドpnMClneoからネオマインン耐性遺伝子(neo)を標的遺伝子のコード領域中に挿入する。pMClneo挿入断片はneo発現を指令するのにハイブリッドワイルスプロモーター／エンハンサー配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞中で活性である。従って、破壊（ノックアウト）構成物の組込みのための選択マーカーとしてneoを使うことができる。ランダム挿入現象に対する陰性選択マーカーしてHSVチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を該構成物の末端に付加する（Zijlstraら、前掲）。
【０２２２】
重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい方策はＪ領域の削除である。この領或はマウスではかなり小さく、わずか1.３kbに及ぶ。遺伝子標的ベクタ−を作製するために、分泌されるＡ定常領域エクソンの全部含む15kbのKpnＩ断片をマウスゲノムライブラリ−から単離する。1.3kbのＪ領賊をpMCleoからの1.1kb挿入断片により置き換える。次いで該KpnＩ断片の５′末端にHSV tk遺伝子を付加する。相同組換えによるこの構成物の正しい組込みは、neo遺伝子によるマウスＪH領域の置換をもたらすだろう。neo遺伝子を基にしたプライマーとＤ頑域中のKpnＩ部位の５′のマウス配列に相同のプライマーとを使って、ＰＣＲにより組換え体をスクリーニングする。
【０２２３】
あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊することにより重鎖遺伝子座を破壊（ノックアウト）する。このアプローチは、上記のアプローチで使ったものと同じ15kbのKpnＩ断片を必要とする。pMIClneoからの1.1 kb挿入断片をエクソンII中のユニークBamHI部位のところに挿入し、そしてHSK tk遺伝子を３′KpnＩ末端に付加する。neo挿入断片の片側における二重交差（これはtk遺伝子を削除する）を選択する。それらは、選択されたクローンのプールからＰＣＲ増幅により検出される。ＰＣＲプライマーの一方はneo配列に由来し、そして他方は標的ベクターの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊は実施例に記載される。
【０２２４】
Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制 
内因性Iｇ遺伝子座の機能的破壊に加えて、内因性Ｉｇ遺伝子座の発現を防ぐ別の方法は抑制である。内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、１または複数の組み込まれたトランスジーンから産生されるアンチセンスＲＮＡにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および／または１または複数の内因性Ｉｇ鎖に特異的な抗血清の投与により達成することができる。
【０２２５】
アンチセンスポリヌクレオチド 
特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に破壊するためにアンチセンスＲＮＡトランスジーンを使うことができる〔Pepin ら(1991)Nature 355: 725 ; Hel ene．C．およびToulme. J. (1990) Bioch- mica Biophys. Acta 1049: 99 ; Sto ut, J. およびCaskey, T.(1990)Somat. Cell Mol. Genet. 1G: 369 ; Munirら (1990) Somat. Cell Mol. Genet. 16: 383 ; これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる］。
【０２２６】
「アンチセンスポリヌクレオチド」は、（１）参照配列、例えば内因性IgのＣHまたはＣL領域配列の全部または一部に相捕的であり、且つ（２）相捕的な標的配列、例えば染色体遺伝子座またはIg mRNAに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該ポリヌクレオチドの機能的性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付那加、欠失または転位を含んでもよい。
【０２２７】
相補的アンチセンスポリヌクレオチドとしては、個々のmRNA種に特異的にハイブリダイズしそして該mRNA種の転写および／またはＲＮＡプロセシングおよび／またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐことができる、可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる〔Chingら、Proc. Nati . Acad．Sci. USA 86.10006-10010 (1989)；Broderら、Ann. Int. Ned. 113:604-613 (1990)；Loreauら、FEBS Letters 274: 53-56(1990)；Holcenbergら、WO091/11535；U.S.S.N 07/530,165（「新規ヒトCRIPRO遺伝子」）;WO091/09865；WO91/04753；WO90/13641およびEP386563；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【０２２８】
アンテセンス配列は、長さが少なくとも約15の連続ヌクレオチド、より好ましくは長さが約30以上の連続ヌクレオチドの少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的であるポリヌクレオチド配列である。しかしながら、或る態様では、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として特異的ハイブリダイセーションが保持される限り、アンチセンス配列は,相補的免疫グロブリン遺伝子配列に比較して置換、付加または欠失を有することができる。一般的に、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮＡ再配列後に免疫グロブリン鎖をコードする潜在能力を有する内因性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子列に一致するセンス配列が特に転写を妨害することによっで発現を抑制する働きをすることがある。
【０２２９】
従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を阻害する。この点に関して、１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の転写および／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性Ｉｇ遺伝子座によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する非ヒト動物の能力および／または特異性を変更することができる。
【０２３０】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞中、例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成するのに使われるトランスジェニック多分化能性造血幹細胞中、あるいはトランスジェニック非ヒト動物中で異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生体内では循環系もしくは間質液中のいずれかの外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んで成ることができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞質に接近しそして特定のmRNA種の翻訳を阻害することが証明されている。
【０２３１】
ある態様では、アンチセンスポリヌクレオチドがメチルホスホネート成分を含んで成るか、あるいはホスホロチオネートまたはＯ−メチルリボヌクレオチドを使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用してもよい〔Oagｌeら(1990) Nucleic Acids Res. 18: 4751〕。ある用途には、アンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸を含んてもよい〔Nielsenら(1991)Science 25 4: 1497〕。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般法については、Antisense RNA and DNA (1988)，D.A. Helton編, Cold Spring Harbor Labo-ratory, Co ld Spring Harbor, NYを参照のこと。
【０２３２】
１または復数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを使って、転写、ＲＮＡプロセシング、および／または同起源のmRNA種の翻訳を阻害し、それによってコードされる各ポリペプチドの量を滅少させる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内で１または復数の内因性Ｉｇ遺伝子座の形成を阻害することにより治療機能を提供することができる。
【０２３３】
可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとしてまたはアンチセンストランスジーンから転写されたアンチセンスＲＮＡとしてのいずれにせよ、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態において内因性Ｉｇ配列に優先的にハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択されたアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トランスジーンによりコードされる異種Ｉｇ配列にそれほど多くはハイブリダイズしないだろう（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約25〜35％以上トランスジーンＩｇｆ発現を阻害しないであろう）。
【０２３４】
坑血清抑制 
内因性Iｇ鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウスに１または復数の内因性Ｉｇ鎖に対する抗血清を注入することにより達成することができる〔(Weissら(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:211；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。抗血清は、１または復数の内因性Ｉｇ鎖とは特異的に反応するが本発明のＩｇトランスジーンによりコードされる異種Ｉｇ鎖とは最少の反応性を有するかまたは全く反応性を持たないように選択される。よって、Weissら（前掲）のものにより代表されるようなスケジュールに従った選択抗血清の投与は、内因性Ｉｇ鎖発現を抑制するが本発明のトランスジーンによりコードされる１または複数の異積Ｉｇ鎖の発現を許容する。
【０２３５】
抗体適切な抗体共給源としては、以下のものが含まれる：（１）特異的にマウスμ,γ,κ又は入鎖に結合するものの本発明のヒトＩｇトランスジ−ンによりコ−ドされるヒト免疫グロブリン鎖と反応しない、モノクロ−ナル抗体といったようなモノクロ−ナル抗体、（２）混合物が、内因性Ｉｇ鎖の単一種上の多重エピトープと、多重内因住Ｉｇ鎖（例えばマウスμ及ひマウスγ）と、又は多重エピトープ及び多重の鎖又は内因性免疫グロブリンと結合するような、かかるモノクローナル抗体の混合物；（３）ポリクローナル抗血清又はその混合物。標準的には、かかる抗血清（単鎖）は、内因性Ｉｇ鎖の単一種（例えばマウスμ,マウスγ,マウスκ,マウスλ）又は内因性Ｉｇ鎖の多重種）に結合するため単一特異性のものであり、最も好ましくは、かかる抗結清は、本発明のトランスジーンによりコードされたヒト免疫グロブリン鎖に対して無視できる結合力しか有していない：及び／又は（４）内因性Ｉｇ鎖の単一又は多重種に対し結合し、最も好ましくは不発明のトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン領に対して無視できるほどの結合力しかもたないポリクローナル抗血清とモノクロ−ナル抗体の混合物。一般にポリクローナル抗体が好まれ、かかる実質的に単一特異性のポリクローナル抗体は、有利には、ヒト以外の動物種（例えばマウス）から誘導される抗体での予備吸着及び／又ば例えば不動化されたヒトＩｇを含む親和性樹脂上での抗血清又はその精製分画のアフィニティクロマトグラフィ（ここで結合された分画は抗血清中の望ましい抗ヒトＩｇについて冨化されており、この結合分画は標準的には低pH又はカオトロピック塩溶液という条件で溶離される）によりヒト免疫グロブリンに対して生成された抗血清から産生できる。
【０２３６】
内因性の（例えばマウスの）免疫グロブリン鎖を発現するリンパ球の抗体により誘導された細胞の枯渇を増強させるため、細胞分裂及び／又は補体固定を利用することができる。例えば、一実施態様においては、マウスＩｇを発現する外植された造血細胞及び／又はヒトＩｇトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスから得たＢ−系列のリンパ球の半ビボ枯渇のために抗体が利用される。かくして、造結細胞及び/又はＢ系列リンパ球が、ヒトＩｇトランスジーンを宿す（好ましくはヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンの両方を宿す）ヒト以外のトランスジェニック動物から外植され、外植された細胞は、（１）内因性免疫グロブリン（例えばマウスμ及び／又はκ）に結合し、（２）トランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対する実質的な結合力に欠ける抗体（単数又は複数）と共にインキュベートされる。
【０２３７】
このような抗体は、明確化を期して「抑制抗体」と呼ばれる。外植された細胞集団は、抑制抗体（単複）に結合する細胞を選択的に枯渇させられる，このような枯渇は、（１）末結合細胞から抑制抗体結合細胞を除去するための物理的分離（例えば、抑制抗体に結合している細胞を不動化し除去するため固体支持体又は磁気ビードに抑制抗体を結合させることができる）、（２）抑制抗体により結合された細胞の抗体依存型細胞死滅（例えば、ADCC、補体固定、又は抑制抗体に連関された毒素による）、及び（３）抑制抗体により誘発されたクローンアネルギー、などのさまざまな方法により達成できる。
【０２３８】
往々にして、内因住Ｉｇ鎖産生の抗体抑制のために用いられる抗体は、補体を固定することができる。ウサギ又はモルモットといったように半ビボ／インビトロ枯渇のための便利な補体源と充分反応するようにかかる抗体を選択できることが往々にして好ましい。インビボ枯渇については、一般に抑制抗体がヒト以外のトランスジェニック動物種においてエフェクター機能を有することが好ましい。かくして、トランスジェニックマウスでの使用のためには、一般に、マウスエフェクター機能（例えば、ADCC及び補体固定）を含む抑制抗体が好ましい。
【０２３９】
１変形実施態様においては、内因性免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ビボ/インビトロ枯渇のために、予め定められた内因性免疫グロブリン鎖に特異的に結合する抑制抗体が用いられる。ヒト免疫グロブリントランスジーンを宿すヒト以外のトランスジェニック動物からの細胞外植体（例えばリンパ球試料）は抑制抗体と接触させられ、抑制抗体に特異的に結合する細胞は枯渇させられ（例えば、不動化、補体固定などにより）、かくして内因性（非ヒト）免疫グロブリンを発現する細胞（例えばマウスＩｇを発現するリンパ球）内で枯渇された細胞副次集団を生成する。
【０２４０】
結果として得られた枯渇したリンパ球集団（Ｔ細胞、ヒトＩｇ−陽性Ｂ細胞など）は、内因性抗体を産生する能力が実質的に無い同じ種の免疫適合性ある（すなわちNHC適合性ある）ヒト以外の動物（例えばSCIOマウス、RAG-１又はRAG-２ノックアウトマウス）の体内へとトランスファさせることができる。再構成された動物（マウス）を次に抗原で免疫化させ（又は外稙体を提供したドナー動物を免疫化するのに使用した抗原を用いて再免疫化させる）、高親和性（親和性成熟した）抗体及びかかる抗体を産生するＢ細胞を得ることができる。かかるＢ細胞は、従来の細胞融合によりハイブリドーマを生成するのに使用でき、スクリーニングできる。抗体抑制はその他の内因性Ｉｇの失活／抑制方法（例えばＪHノックアウト、ＣHノックアウト、Ｄ−領域切除、アンチセンス抑制、補償されたフレームシフト失活）と組合わせて使用することもできる。
【０２４１】
完全な内因性Ｉｇ遺伝子座失活 
或る種の実施態様では、ヒト可変領域及び非ヒト（例えばマウス）恒常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないような形で（例えばトランスジーン及び内因性Ｉｇ配列の間のトランス切換えにより）、内因性Ｉｇ遺伝子座の完全な失活を行なうことが望ましい。ＪH領域においてのみ機能的に分断されている（原文with→whichの誤り）内因性重鎖対立遺伝子を支持するノックアウトマウスは、標準的にはトランスジーンによりコードされた再配置されたヒト可変領域（ＶＤＪ)が内因性マウス恒常領域に連鎖された融合タンパク質として発現されるトランススイッチを頻繁に示すが、その他のトランススイッチされた連結も可能である。
【０２４２】
この潜在的問題を克服するためには、一般に、制眼的な意味なく以下のものを含むさまざまな方法のうちのいずれかにより内因性重鎖遺伝子座を完全に失活することが望ましい：（１）少なくとも１つ、好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を、相同組換えによって機能的に分断及び／又は欠失させること、（２）少なくとも１つ好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を突然変異させて、終止コドン（又はフレームシフト）をコードし、切形又はフレームシフトされた産物（トランスススイッチされた場合）を産生すること、及び当業者にとっては明白なその他の方注及び戦略。重鎖恒常領域遺伝子及び／又はＤ−領域遺伝子の実質的部分又は全ての欠失は、特に「ヒット・エンド・ラン」タイプなどの相同組換えターゲティングベクターによる遂次欠失を含むさまざまな方法によって達成できる。同様にして、内因性軽鎖恒常領域遺伝子を切除するための少なくとも１つの内因性軽鎖遺伝子（例えばκ）の機能的分断及び／又は欠失が往々にして好ましい。
【０２４３】
頻繁に、非相同トランスジーンがＪセグメント（単複）内のフレームシフト及びトランスジーン恒常領域遺伝子のうちの単数又は複数のもの（好ましくは全て）の初期領域（すなわちアミノ末端コーディング部分）内の補償フレームシフト（例えば原読取り枠を再生させるため）を含んでいるようなフレームシフトされたトランスジーンを利用することが好ましい。内因性IgH遺伝子座恒常遺伝子（補償フレームシフトを含まないもの）に対するトランススイッチは、切形又はミスセンス産物を結果としてもたらすことになり、その結果、トランススイッチされたＢ細胞は欠失されるか又は選択されなくなり、かくしてトランススイッチされた表現型は抑制されることになる。
【０２４４】
内因性Ｉｇ遺伝子産物発現（例えば、マウス重鎖及び軽鎖配列）及び／又はトランススイッチされた抗体（例えばヒト可変／マウス恒常キメラ抗体）の実質的に完全な機能的失活を実施するためにはアンチセンス抑制及び抗体抑制も同様に使用することができる。
【０２４５】
内因性（例えばマウスの）Ｉｇ鎖発現の基本的に完全な抑制を行なうためには、失活及び抑制戦略のさまざまな組台せを使用することが可能である。
【０２４６】
（トランス−スイッチ） 
いくつかの変形態様においては、トランススイッチされた免疫グロブリンを産生することが望ましい場合がある。例えば、このようなトランススイッチされた重鎖は、キメラのものでありうる（すなわち非マウス（ヒト）可変領域及びマウス恒常領域）。このようなトランススイッチされたキメラ免疫グロブリンを含む抗体は、非ヒト（例えばマウス）恒常領域を有することか望まれるさまざまな利用分野（例えば、ヒト恒常領域を結合しない二次抗体の結合のためといったようなマウス免疫学的決定因子の存在について宿主内のエフェクター機能の保持のため）のために使用することができる。１例を挙げると、或る種の抗体に関して、マウス可変領域能力範囲（レパートリー）に比べて、ヒト可変領域能力範囲が有利である可能性がある。
【０２４７】
おそらくは、ヒトＶH,Ｄ,ＪH,ＶL及びＪL遺伝子は、進化の間に、或る種の進化上重要な抗原を結合する免疫グロブリンをコードするその能力のために選択されてきたのであろう：マウスの能力範囲のための進化上選択的な圧力を提供した抗原は、ヒトの能力範囲を形作るのに進化的圧力を提供した抗原と全く異なるものである可能性がある。マウス恒常領域（例えばトランススイッチされたマウスの）アイソタイプと組合わされたときヒト可変領域能力範囲を有利なものにするその他の能力範囲の利点も存在しうる。マウス恒常領或の存在は、ヒト恒常領域に比べ利点を提供する可能性がある。
【０２４８】
例えば、トランススイッチによりヒト可変領域に連鎖されたマウスγ恒常領域は、予め定められた抗原（例えばヒトIL−２レセプター）と反応性あるキメラ抗体（好ましくはモノクローナル）を、マウス内のＴリンパ球が機能的ヒトIL−２レセプターを発現する移植細胞対宿主病のマウスモデルといったマウス疾病モデルの中でテストできるように、マウスエフェクター機能（例えばAOCC、マウス補体固定）を有する抗体を提供しうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を（例えば供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニング又はPCR増復により）分離させ、望ましいヒト恒常領域をコードする配列にスプライシングして、免疫原性が好ましくは最小限にされているヒトの治療用途により適したものであるヒト配列抗体をコードすることが可能である。
【０２４９】
結果として得られる完全にヒトのコーディング配列（単復）を有するポリヌクレオチド（単複）を宿主内で発現させ（例えば哺乳動物細胞中の発現ベクターから）、医薬品のため精製することが可能である。いくつかの利用分野では、マウス恒常領域をヒト恒常領域と置換することなく直接キメラ抗体を使用することができる。トランススイッチされたキメラ抗体のその他の変形態様及び用途は、当事者にとって明白であろう。
【０２５０】
本発明は、一般にヒト重鎖トランスジーンと内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子の間のトランススイッチの結果として得られるキメラ抗体を発現するＢリンパ球を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。このようなキメラ抗体は、一般にマウスのスイッチされた（すなわち非μ、非δ）アイソタイプであるマウス恒常領域とヒト配列可変領域を含む。予め定められた抗原に対するキメラ抗体を作ることのできるヒト以外のトランスジェニック動物は、通常、ヒト可変及びヒト恒常領域遺伝子をコードするヒト重鎖及びヒト軽鎖トランスジーンの両方が組込まれた場合、完全にヒトの配列の抗体を作る能力もある。
【０２５１】
最も標準的には、機能的に分断された重鎖遺伝子座及び／又は軽鎖遺伝子座について同型接合であるが、トランススイッチできる単数又は複数の内因性重鎖恒常領域遺伝子（例えばγ,α,ε）を保持し、頻繁にシス連鎖したエンハンサーを保持する。このようなマウスは、通常アシュバントと組合わせた形で予め定められた抗原を用いて免疫化され、マウス恒常領域配列に連鎖されたヒト配列可変領域から成る重鎖を含む検出可能な量のキメラ抗体を含む免疫応答が生み出される。標準的には、かかる免疫化された動物の血清ば少なくとも約１μｇ／ml往々にして約10μg/ml以上、頻繁には30μg／ml以上、そして最高50〜100μｇ／ｍl以上の濃度でこのようなキメラ抗体を含みうる。
【０２５２】
キメラヒト可変／マウス恒常領域重鎖を含む抗体を含む抗血清は標準的に、ヒト可変／ヒト恒常領域（完全ヒト配列）重鎖を含む抗体をも含んでいる。トランススイッチされたキメラ抗体は通常、（１）ヒト可変領域とマウス恒常領域（標準的にはマウスガンマ）から成るキメラ重鎖及び（２）ヒトのトランスジーンコーディングを受けた軽鎖（標漂準的にはけカッパ）又はマウス軽鎖（標準的にはカッパノックアウトパックグラウンド内のラムダ）を含んでいる。
【０２５３】
かかるトランススイッチされたキメラ抗体は、一般に、約１×107 Ｍ-1以上、好ましくは５×１07 Ｍ-1以上、より好ましくは１×10n Ｍ-1〜１×102 Ｍ-1以上の親和力で予め定められた抗原（例えば免疫原）に結合する。頻繁には、予め定められた抗原は、ヒトタンパク質、例えばヒト細胞表面抗原（例えばCD４, CD８ ,IL−２レセプター、EGF レセプター、POGFレセプター）、その他のヒト生物学的巨大分子（例えばトロンボモジュリン、プロテインＣ、炭水化物抗原、シアリルールイス抗原、Ｌ−セレクチン）又は非ヒト疾病関連巨大分子（例えば細菌性 LPS 、ビリオン・カプシドタンパク質又は外被糖タンパク質）などである。
【０２５４】
本発明は、次のものを含むゲノムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を提供する：すなわち、（１）（例えば、機能的スイッチ組換え配列、標準的には機能的エンハンサーに対するシス連鎖における）トランススイッチすることのできる少なくとも１つのマウス恒常領域遺伝子を含む同型接合で機能的に分断された内因性重鎖遺伝子、（２）機能的ヒト重鎖可変領域をコードし発現するよう再配置することができかつトランススイッチすることのできる（例えばシス連鎖されたＲＳＳを有する）ヒト重鎖トランスジーン；さらに任意には（３）機能的ヒト軽鎖可変領域をコードするべく再配置しかつヒト配列軽鎖を発現することのできるヒト軽鎖（例えばカッパ）トランスジーン；さらに任意には、（４）同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座（κ、好ましくはκ及びλ）；そしてさらに任意に（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及ひ内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えばγ１,γ２ａ,γ２ｂ,γ３）によりコードされたマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清。
【０２５５】
かかるトランスジェニックマウスはさらに、約１×104 Ｍ-1以上、好ましくは約５×104 Ｍ-1以上、より好ましくは１×107 Ｍ-1〜１×102 Ｍ-1以上の親和力で、予め定められたヒト抗原（例えば、CD４,CD８,CBA）に結合するキメラ抗体を含む血清を含みうる。頻繁には、こうして産生されたモノクローナル抗体か少なくとも８×107 Ｍ-1の親和力をもつハイプリドーマを作ることかできる。往々にして非ヒト抗体に結合することができる、マウス恒常領域とヒト可変領域から成る重鎖を含むキメラ抗体が同様に血清中に、又はハイプリドーマから分泌された抗体として、存在しうる。
【０２５６】
いくつかの変形態様においては、無傷の重鎖恒常領域遺伝子を保持する失活した内因性マウス重鎖遺伝子座を有し、トランススイッチできるヒト重鎖トランスジーンを有し、任意には単数又は複数の失活した内因性マウス軽鎖遺伝子座を伴い、ヒト軽鎖トランスジーンをも有するトランスジェニックマウスを生成することが望ましい。かかるマウスは有利にも、トランススイッチにより、完全にヒトの重鎖を含む抗体及びキメラ（ヒト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を交互に発現することのできるＢ細胞を産生することができる。このマウスの血清には、完全にヒトの重鎖を含む抗体及び、好ましくは完全にヒトの軽鎖と組合わせた状態でキメラ（ヒト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を含む抗体が含まれる。ハイブリドーマは、このマウスのＢ細胞から生成されうる。
【０２５７】
一般にこのようなキメラ抗体はトランススイッチにより生成でき、ここで、インピボで産生能あるＶ−Ｄ−Ｊ再配置によりコードされるヒト可変領域及びヒト恒常領域、標準的にはヒトμをコードするヒトトランスジーンは、非トランスジーン免疫グロブリン恒常遺伝子スイッチ配列（ＲＳＳ）でのスイッチ組換えを受け、かくしで、標準的に内因性マウス免疫グロブリン重鎖恒常領域又は第２のトランスジーン上でコードされた非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域である、前記トランスジーンによりコードされていないヒト重鎖恒常領域とトランスジーンコーデイングを受けたヒト可変領域を作動的に連結させる。シスースイッチというのは、トランスジーン内のＲＳＳ要索の組換えによるアイソタイプスイッチのことであるが、トランススイッチには、往々にしてトランスジーンを宿す染色体とは異なる染色体上で、トランスジーンＲＳＳとこのトランスジーンの外側のＲＳＳ要その間での組換えが関与する。
【０２５８】
トランススイッチは、一般に、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子と、（非μアイソタイプ、標準的にはγの）内因性マウス恒常領域遺伝子のＲＳＳ又は往々にして別々の染色体上に組込まれている第２のトランスジーン上に含まれたヒト恒常領域遺伝子のＲＳＳのいずれか一方の間で起こる。
【０２５９】
トランススイッチが第１の、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子（例えばμ）のＲＳＳと、第２のトランスジーン上に含まれたヒト重鎖恒常領域遺伝子のＲＳＳの間で起こる場合、実質的に完全にヒトの配列をもつ非キメラ抗体が産生される。制眼的な意味のない例として、ヒト重鎖恒常領域（例えば、γ１）及び作動的に連鎖されたＲＳＳ（例えばγＩＲＳＳ）をコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンコーディングと受けたヒトμ鎖を含む抗体を発現するトランスジェニックマウスのＢ細胞（又はＢ細胞集団）から生成されたハイブリドーマ細胞の集団内に導入（例えばトランスフェクション）することができる。
【０２６０】
結果として得られたハイブリドーマ細胞を、導入されたポリヌクレオチドの存在について、及び／又は、ヒトμ鎖の可変領域（イディオタイプ／抗原反応性）を有しかつ導入されたポリヌクレオチド配列（例えば、ヒトγ１）によりコードされる恒常領域をもつ重鎖を含むトランススイッチされた抗体の発現について、選択することができる。トランスジーンにコードされたヒトμ鎖のＲＳＳと下流のアイソタイプ（例えばγ１）をコードする導入されたポリヌクレオチドのＲＳＳの間のトランススイッチ組換えは、かくしてトランススイッチされた抗体を生成することかできる。
【０２６１】
本発明はと同様に、（１）トランススイッチすることのできる少なくとも１つのマウス恒常領域遺伝子（例えばγ２ａ, γ２ｂ, γ１, γ３）を含む、同型接合で機能的に分離された内因性重鎖遺伝子座、（２）機能的ヒト重鎖可変領域をコードするべく再配置しヒト配列重鎖を発現することができ、かつアイソタイプスイッチ（及ビ／又はトランススイッチ）を受けることのできるヒト重鎖トランスジーン；さらに任意には（３）機能的ヒト軽（例えはカッパ）鎖可変領域をコードするべく再配置しヒト配列軽鎖を発現することができるヒト軽鎖（例えばカッパ）トランスジーン、そしてさらに任意には（４）同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座（標準的にはκ、好ましくはκとλの両方）、そしてさらに任意には（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えば、γ１, γ２ａ, γ２ｂ, γ３）によりコードされるマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清、を含むゲノムを含むトランスジェニックマウスを予め定められた抗原で免疫化する段階を含む、このようなトランススイッチされたキメラ抗体を産生するための方法も提供している。
【０２６２】
親和性標識：スイッチされたアイソタイプについての巽択 
有利なことに、体細胞突然変異のプロセスは、トランススイッチ（及びシススイッチ）と結びつけられる。体細胞突然変異は、Ｂ細胞のクローン後代によりコードされる抗体親和力の範囲を拡張する。例えば、スイッチ（トランス−又はシス−）を受けたハイブリドーマ細胞により産生された抗体は、スイッチを受けなかったハイブリドーマ細胞内に存在するよりも広い抗原結合親和力範囲を示す。従って、第１のヒト重鎖恒常領域（例えばμ）に対するポリペプチド結合において第１のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む第１の抗体を発現するハイブリドーマ細胞集団（標準的にはクローンの）を、第２の重鎖恒常領域（例えはヒトγ、 α又はε恒常領域）に対するポリペプチド結合において前記第１のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ細抱クローン変異株についてスクリーニングすることができる。
【０２６３】
かかるクローン変異株は、インビトロでシススイッチを生成する天然クローン変異によって、又はＴ細胞誘導されたリンホカイン（例えばIL−４及びＩＦＮ- γ）といったアイソタイプスイッチを促進する作用物質の投与を通してといったようなクラススイッチ（トランス−又はシス−）の誘発によって、又はトランススイッチのための基質として役立つべき非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域遺伝子及ひ機能的ＲＳＳを含むポリヌクレオチドの導入によって、又は上述のものの組合せなどによって、産生させることかできる。往々にして、作動的に連鎖されたＲＳＳを伴うヒト下流アイソタイプ恒常領域（例えばγ１, γ３など）を含むポリヌクレオチドが同様に、ハイブリドーマ細胞内に導入され、トランス・スイッチメカニズムを介してアイソタイプスイッヂを促進する。
【０２６４】
クラススイッチ及び親和性成熟は、本発明のトランスジェニック動物から誘導されたＢ細胞の同じ集団内で発生する。従って、クラススイッチされたＢ細胞（又はそれから誘導されたハイブリドーマ）の同定を、高親和力のモノクローナル抗体を得るための１つのスクリーニング段階として使用することができる。シス−スイッチ（トランスジーン内スイッチ）、トランススイッチ又はその両方といったクラススイッチ事象を容易にするため、さまざまなアプローチを利用することができる。例えば、付随するＲＳＳ要素及びスイッチ調節要素（例えば不稔写しプロモーター）を伴うμ及ひγの両方の恒常領域遺伝子を含む単一の連続ヒトゲノミックフラグメントを、トランスジーンとして使用することができる。
【０２６５】
しかしながら、望まれる単一の隣接するヒトゲノミックフラグメントの一部分は、例えばクローニング宿主などの中で複製されるときの不安定さの問題などにより、効果的にクローニングすることが困難でありうる：特にδとγ３の間の領域は、特にμ遺伝子、γ３遺伝子、Ｖ遺伝子、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントを含む隣接するフラグメントのように効率良くクローニングしにくいことが判明する可能性がある。
【０２６６】
同様に例として、ヒトμ遺伝子、ヒトγ３遺伝子、ヒトＶ遺伝子（単復）、ヒトＤ遺伝子セグメント及びヒトＪ遺伝子セグメントから成り、介入する（イントロンの）又はその他の形で可欠な配列（例えば単数又は復数のＶ、Ｄ、及び／又はＪセグメント及び／又は単数又は複数の非μ恒常領域遺伝子）の単数又は復数の欠失を伴う、不連続のヒトトランスジーン（ミニ遺伝子）、がある。このようなミニ遺伝子は、効率良い免疫グロブリンの発現及びスイッチのための必須要素の全てにまたがるゲノミックＤＮＡの単一の隣接セグメントを分離することに比べて、いくつかの利点を有する。
【０２６７】
例えば、このようなミニ遺伝子は、クローニングし難い配列（例えば、不安定配列、毒物配列など）を内含しうるＤＮＡの大きい断片を分離する必要性を無くする。さらに、シス−又はトランス−スイッチのためのアイソタイプスイッチのために必要な要素（例えば、ヒトγ不稔写しプロモータ）を含むミニ遺伝子座は、有利にもインビボで体細胞突然変異及びクラススイッチを受けることができる。多くの真核性ＤＮＡ配列がクローニングし難いものであることが立証されているため、可欠配列を削除することが有利であることが判明する。
【０２６８】
一変形態様においては、高い結合親和力（例えば１×107 Ｍ-1以上、好ましくは１×108 Ｍ-1以上、より好ましくは１×109 Ｍ-1以上）をもつ抗体を産生するハイブリドーマクローンは、産生力ある（枠内）Ｖ−Ｄ−Ｊ再配置を受けることができる内因性マウス重鎖遺伝子座が実質的に欠如しアイソタイプスイッチを行なうことのできる（以上参照）ヒト重鎖トランスジーンを宿すトランスジェニックマウスのＢ細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞のプールから、ヒト（又はマウス）非μ重鎖恒常領域に対するポリペプチド結合においてヒト配列重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマを選択することによって得られる。これらの抗体は、インビボ又は細胞培養中でのシス−スィッチ及び／又はトランス−スイッチの結果として産生される「スイッチされた重鎖」を含むことから、「スイッチされた抗体」と呼ばれる。
【０２６９】
スイッチされた抗体を産生するハイブリドーマは、一般に、体細胞突然変異プロセスを受けており、このハイブリドーマのブールは一般により広い抗原結合親和力範囲を有することになり、この中から高親和力の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することができる。標準的には、予め決定された抗原について実質的な結合親和力（１×107 Ｍ-1〜１×108 Ｍ-1以上）をもつヒト配列抗体を分泌し、このヒト配列抗体がヒト免疫グロブリン可変領域（単復）を含んでいるようなハイブリドーマを、２段階プロセスを含む方方により選択することかできる。１つの段階は、（例えば、スイッチされた重鎖に特異的に結合しスイッチされていないアイソタイプ、例えばμ、に対して実質的に結合しない不動化された免疫グロブリンに対しハイブリドーマ細胞を結合することにより）、スイッチされた重領を含む免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマ細胞を同定し分離することにある。
【０２７０】
もう１つの段階は、（例えばハイブリドーマクローン上清のELISA、標識づけされた抗原を用いたFACS分析などにより）実質的な結合親和力で予め定められた抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定することにある。標準的には、スイッチされた抗体を分泌するハイブリドーマの選択は，予め定められた抗原を結合するハイブリドーマ細胞を同定する前に行なわれる。予め定められた抗原に対する実質的な結合親和力をもつスイッチされた抗体を発現するハイブリドーマ細胞が分離され、標準的には個々の選択されたクローンとして当該技術分野において既知の適切な成長条件下で培養される。任意には、この方法には、モノクローナル抗体の発現に適した条件下で前記選択されたクローンを培養する段階が含まれる。このモノクローナル抗体を収集し、これを治療、予防及び／又は診断の目的で投与することができる。
【０２７１】
往々にして、選択されたハイブリドーマクローンは、予め定められた抗原に結合する（又はこれに対する結合力を付与する）免疫グロブリン（例えば可変領域）をコードする免疫グロブリン配列を分離するめたのＤＮＡ又はＲＮＡ原として役立ちうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を分離し（例えばPCR増幅又は供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニングによる）、好ましくは免疫原性が最小限にされるヒトの治療用途により適したヒト配列抗体をコードするべく望ましいヒト恒常領域をコードする配列に対しスプライシングする。結果として得られた完全にヒトのコーディング配列（単復）をもつポリヌクレオチド（単複）を宿主細胞（例えば哺乳細胞内の発現ベクターから）の中で発現させ、医薬品のために精製することが可能である。
【０２７２】
キセノ（異種）エンハンサー 
ヒト免疫グロブリン（例えば重鎖）をコードすることのできる非相同トランスジーンは、有利にも、マウスゲノムから誘導されていない、及び／又は非相同トランスジーンのエキソンとシスで自然に結びつけられていないシス−連鎖されたエンハンサーを含んでいる。例えば、ヒトκトランスジーン（例えばκミニ遺伝子座）は有利にも、ヒトＶK遺伝子、ヒトｊK遺伝子、ヒトＣK遺伝こ及びキセノエンハンサーを含んでいる可能性があり、標準的には、このキセノエンハンサーは、標準的にＪK遺伝子とＣK遺伝子の間にあるか又はＣK遺伝子の下流に位置づけされた、ヒト重鎖イントロンエンハンサー及び／又はマウス重鎖イントロンエンハンサーを含む。例えば、マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー(Banerjietal．(1983) Cell 33: 729)は、プラスミドpkVe2の0,9kbのkba １フラグメント上で分離されうる（下記参照）。
【０２７３】
ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー（Hayday et al. (1984) Nature 307 3 34）は、1.4kbのMlu I/Hind IIIフラグメントとして分離されうる（下記参照）。基本的にマウスＪ−μイントロンエンハンサーに対しシスで連鎖されたヒトＪ−μイントロンエンハンサーで構成されている組合されたきせノエンハンサーといった、トランスジーンに対する転写的に活性なキセノエンハンサーの付加は、特にこのトランスジーンかヒトκといった軽鎖をコードする場合、トランスジーンの高い発現レベルを付与することかできる。同様に、ラット３′エンハンサーを、ヒト重鎖とコードできるミニ遺伝子座構成体内に有利にも含み入れることかできる。
【０２７４】
核酸 
「実質的相同性」なる用語は、２つの核酸またはデザインしたその配列を最適に整列しそして比較した時に、少なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なくとも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98％〜99.5％のヌクレオチドが同一であることを指摘する。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする時、実質的相同性が存在する。核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純枠な形で、存在することかできる。
【０２７５】
核酸は、標準技術により、例えばアルカリ／SOS処理、CsClバンド沈降、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当業界で公知の他の方法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパク質から分離精製された時、「単離され」または「実質的に純粋にされ」る。F. Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingand Wiley-Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【０２７６】
本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って、しばしばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは混合物のいずれかからの生来の配列（修飾された制限部位等を除く）を変異せしめることができる。コード配列については、それらの変異は、所望であればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のＶ，Ｄ,Ｊ,定常,スイッチおよび他の本明細書中に記載のそのような配列に実質的に相同であるかまたはそれから誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「誘導される」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは変更されていることを指摘する）。
【０２７７】
核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」という。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に作用するならば、それらはコード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列については、作用可能に連桔されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続であって、そして２種のタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続であって且つ読み枠内であることを意味する。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。
【０２７８】
特定の好ましい態様 
本発明の好ましい態様は、実施例５,６,８または14に記載の軽鎖トランスジーンの単一のコピーを含有する動物と交配させた実施例12に記載のトランスジーン（例えばpHC1またはpHC2）の少なくとも１回のコピー、典型的には２〜10回のコピー、時には25〜50回以上のコピーを含有する動物、並びに実施例10に記載のＪH欠失動物から繁殖させた子孫である。動物はそれらの３つの特性について同型接合に交配される。
【０２７９】
そのような動物は次の遺伝子型を有する：再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座（実施例12に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、再配列されたヒトκ軽鎖構成物（実施例14に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、および機能的ＪHセグメントの全部を除去する各内因性マウス重鎖遺伝子座のところの欠失（実施例10に記載）。そのような動物は、ｊHセグメントの欠失について同型接合であるマウスと交配させる（実施例10）と、ＪH欠失について同型接合でありそしてヒト重鎖および軽鎖構成物については半接合である子孫を生産する。生じた動物に抗原を注入し、それらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生に使う。
【０２８０】
そのような動物がら単離されたＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一コピーのみを含むため、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それらはヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異性であろう。というのは、実施例９および12に記載のようにして導入されたｊH領域に広がる欠失によって、両万の内因性マウス重鎖遺伝子コピーが非機能的であるためである。更に、Ｂ細胞の実質的部分はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異性であろう。何故なら、再配列されたヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、Ｂ細胞の実質的部分における内因性マウスκおよびλ鎖遺伝子の再配列を対立的におよび同位的に排除するだろうからである。
【０２８１】
好ましい態様のトランスジェニックマウスは、理想的には生来のマウスのものと実質的に同じである、有意なレパートリーを有する免疫グロブリン産生を示すだろう。例えば、内因性Ig遺伝子が不活性化されている態様では、総免疫グロブリンレベルは約0.1〜10mg／ml血清、好ましくは0.５〜5mg／ml、理想的には少なくとも約1.O mg／mlの範囲であろう。IgMからIgGにスイッチすることができるトランスジーンをトランスジェニックマウスに導入した時、血清尾IgG対IgMの成熟マウス比は好ましくは約10：１である。もちろん、IgＧ対IgＭ比は、未成熟マウスではずっと低いだろう。一般に、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の約10％より多く、好ましくは40〜80％が、もっぱらヒトIgＧタンパク質のみを発現する。
【０２８２】
レパートリーは理想的にば非トランスジェニックマウス中にしめされるものとほぼ等しく、通常は少なくとも約10％ほど高く、好ましくは25〜50％またはそれ以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異なるＶ,ＪおよびＤ領域の数に主として依存して、通常少なくとも約1000種の異なる免疫グロブリン（理想的にはIgＧ）、好ましくは104〜106またはそれ以上の免疫グロブリンが産生されるだろう。それらの免疫グロブリンば、典型的には、高抗原性タンパク質の約半分またはそれ以上を認識するだろう。
【０２８３】
抗原性タンパク質としては、ハトチトクロームＣ、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウのマイトジェン(PWM)、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、インフルエンザ赤血球凝集素、スタフィロコッカスブロテインＡ、マッコウクジラミオグロビン、インフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサータンパク質が挙げられるがそれに限定されない。上記免疫グロブリンの幾つかは、予め選択された抗原に対して、少なくとも約107 Ｍ-1、好ましくは108 Ｍ-1〜 109 Ｍ-1またはそれ以上の親和性を示すだろう。
【０２８４】
いくつかの実施態様においては、予め定められた抗原タイプに対する抗対応答において表わされるＶ遺伝子の選択を制限する目的で、予め定められた能力範囲をもつマウスを生成することが好まれる可能性がある。予め定められた能力範囲をもつ重鎖トランスジーンは例ば、人間ににおける予め定められた抗原タイプに対する抗体応答で好んで用いられるヒトＶH 遺伝子を含みうる。代替的には、さまざまな範囲により（例えば、予め定められた抗原に対する高い親和力のＶ領域をコードする確率が低い；対細胞突然変異及び親和力激化を受ける傾向が弱い；又は一定の人間に対する免疫原性をもつ）、規定された能力範囲からいくつかのＶH 遺伝を除外することができる。
【０２８５】
様々な重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジーンの再配列の前に、それらの遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定により、トランスジェニック動物以外の生物種に由来するものであると容易に同定することができる。
【０２８６】
本発明のトランスジェニックマウスは、ヒトの抗体が望ましいところの、予め決められた抗原、例えば膜通過蛋白質、細胞表面巨大分子または他の適当な抗原（例えばTNF、LPS等）で免疫され得る。マウスは、トランスジーン内スウィッチ組換え（シスースウィッチ）を経てクラススウィッチを受け、予め決められた抗原と反応する免疫グロブリンを発現するＢ細胞を生成する。免疫グロブリンは、ヒト配列抗体であり得、ここで、重鎖および軽鎖ポリペプチドがヒトトランスジーン配列によってエンコードされ、これは体細胞突然変異によって誘導される配列およびＶ領域組換えジョイント、ならびに生殖細胞系エンコード配列を含み；これらのヒト配列免疫グロブリンは、ヒトVLまたはVH遺伝子セグメントおよびヒトJLまたはJLセグメントによってエンコードされたポリペプチド配列に実質的に同一であるとされ得る。たとえ他の非生殖細胞系配列が、体細胞突然変異および分化V-JおよびV-D-J組換えジョイントの結果として存在し得るとしても。そのようなヒト配列抗体に関して、各鎖の可変領域は、ヒト生殖細胞系V、Jおよび重鎖の場合にはＤ遺伝子セグメントによって、典型的には少なくとも80％エンコードされており；しばしば少なくとも85％の可変領域が、トランスジーンに存在するヒト生殖細胞系配列によってエンコードされており；時には90または95％またはそれ以上の可変領域配列がトランスジーンに存在するヒト生殖細胞系配列によってエンコードされている。しかしながら、非生殖細胞系配列は体細胞突然変異およびVJおよびVDJ結合によって導入されるので、ヒト配列抗体はしばしば、マウスの生殖細胞系におけるヒトトランスジーンに見出されるように、ヒトV、D、またはＪ遺伝子セグメントによってエンコードされるいくつかの可変領域配列(および、あまりしばしばではないが、定常領域配列),を有するであろう。典型的には、そのような非生殖細胞系配列（または個々のヌクレオチド配置）は、CRDの中もしくは近くに、または体細胞突然変異が集中する(cluster)ことが知られている領域に、集中するであろう。
【０２８７】
予め決められた抗原に結合するヒト配列抗体は、ヒト配列γ鎖（例えばγ1、 γ2a、γ2Bまたはγ3）およびヒト配列軽鎖（例えばκ）を含むヒト抗体が生成されるようなイソタイプスウィッチから、結果として生じ得る。そのようなイソタイプスウィッチされたヒト配列抗体はしばしば、典型的には可変領域に、特に二次的な（引き続く）抗原チャレンジに続く、抗原によるＢ細胞の親和性突然変異および選択の結果として、しばしば CDR の約10残基内で、１またはそれ以上の体細胞突然変異を含む。これらの高親和性ヒト配列抗体は、少なくとも１ｘ10 9 Ｍ-1、典型的には少なくとも５ｘ109Ｍ-1、しばしば1ｘ１010 Ｍ-1より上、時には５ｘ1010 Ｍ-1〜1ｘ1011 Ｍ-1またはそれ以上の結合親和性を有することができる。そのような高い親和性ヒト配列抗体は、ヒト抗原、例えばヒト CD4等のヒト巨大分子（例えばヒト膜通過または細胞表面蛋白質または他の細胞表面抗原）に対して高い結合親和性を有して、作られ得る。
【０２８８】
そのようなマウスからのＢ細胞は、ヒト蛋白質たとえば CD4 等を含む種々の抗原に対してモノクローナル高親和性（2ｘ109 Ｍ-1 より上）のヒト配列抗体を発現するハイブリドーマを生じるのに使用され得る。これらのハイブリドーマは、予め決められたヒト抗原への結合について、少なくとも２ｘ109Ｍ-1の親和性定数（Ka）を有する免疫グロブリンを含む組成物を生じるために使用され得る。ここで、前記免疫グロブリンは、つぎのものから成る： ヒト配列軽鎖であって、(１)ヒトVL遺伝予セグメントおよびヒトJLセグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域および(２)ヒトCL遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリぺプチド配列を含む軽鎖定常領域を含むヒト配列軽鎖：および ヒト配列重鎖であって、(１)ヒトVH遺伝子セグメント、任意的にはＤ領域、およびヒト JH セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域および(２)ヒト CH 遺伝子セグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。
しばしば、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンによって、それぞれ別々にエンコードされ、マウス細胞のゲノムに組込まれる。しかしながら、両方の鎖が単一のトランスジーン上にエンコードされ得るか、または一方もしくは両方の鎖が多重トランスジーン上にエンコードされ得る。多重トランスジーンは、例えば、マウス生殖細胞におけるヒト重鎖トランスジーンと同じ遺伝子座で、組込まれていないＶH配置を含む YA C からＶ遺伝子セグメントを誘導したヒト重鎖トランスジーン（例えばHC2）である。
【０２８９】
１つの実施態様において、組成物は、Ｋ定常領域を有するヒト配列軽鎖および γ定常領域を有するヒト配列重鎖を含む免疫グロブリンを含む。
【０２９０】
マウス（およびそれから誘導されたハイブリドーマ）は、予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも１ｘ1010 Ｍ-1の親和性定数（Ka）を有する免疫グロブリンのための供給源である。ここで、該免疫グロブリンは、次のものから成る： ヒト配列軽鎖であって、(１)ヒト VL遺伝子セグメントおよびヒトJL セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域および(２)ヒトＣL遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖定常領域を含むヒト配列軽鎖；および ヒト配列重鎖であって、(１)ヒトＶH遺伝子セグメント、任意的にはＤ領域、およびヒトJH七グメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域および(２)ヒトＣH遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。
【０２９１】
本発明は、次のものを含むトランスジーンマウスを提供する：機能的に分断された内因性の重鎖対立遺伝子のホモ接合の組、機能的に分断された内因性の軽鎖対立遺伝子のホモ接合の組、ヘテロガス免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１のコピー、およびヘテロガス免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１のコピー。ここで、該動物は、ヒト抗原との免疫に続いて抗体応答をし、抗体応答は、予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも２ｘ109 Ｍ-1の親和性定数 (Ka)を有する免疫グロブリンを含み、該免疫グロブリンは、次のものから成る： ヒト配列軽鎖であって、(１)ヒトＶL遺伝子セグメントおよびヒトＪLセグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域および(２)ヒトＣL遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖定常領域を含むヒト配列軽鎖；および ヒト配列重鎖であって、(１)ヒトＶH遺伝子セグメント、任意的にはＤ領域、およびヒトＪHセグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域および(２)ヒトＣH遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。
【０２９２】
そのようなトランスジェニックマウスは、ヒトの少なくとも１の体細胞系上に存在するヒトの表面もしくは膜通過蛋白質に結合するところのヒト配列免疫グロブリンを生成することができ、ここで、免疫グロブリンは、1.5ｘ10 Ｍ-1〜1.8 ｘ1010 Ｍ-1の親和性定数（Ka）で、該ヒトの表面もしくは膜通過蛋白質に結合する。そのようなヒトの表面もしくは膜通過蛋白質の１例はCD4であるが、他のものが所望の免疫原として使用され得る。
【０２９３】
予め決められた抗原に対する高親和性のヒト配列抗体の発生は、組込まれたヒト免疫グロブリントランスジーンを含むゲノムを有するトランスジエニックマウスにおいてヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを広げるための方法によって促進され、該方法は、該組込まれたヒト免疫グロブリントランスジーンに存在しないＶ領域遺伝子セグメントを含むｖ遺伝子トランスジーンをゲノムに導入することを含む。しばしば、このＶ領域トランスジーンは、ヒトゲノムに自然に生じ得るような、または組換え法によって別々にスプライスされ得るような、ヒトのＶHまたはＶL（ＶK）遺伝子セグメント配置の部分を含む、酵母の人工的な染色体であり、これは、適切でない（out- of-order）または省略されたＶ遺伝子セグメントを包含し得る。しばしば、少なくとも５またはそれ以上の機能的ｖ遺伝子セグメントがYACに含まれる。この変形において、Ｖレパートリー拡張法（V-repertoire expansion method)によって生成されたトランスジェニックマウスを作ることが可能であり、ここで、マウスは、Ｖ領域トランスジーンに存在するＶ領域遺伝子セグメントによってエンコードされた可変領域配列およびヒトIgトランスジーンにエンコードされたＣ領域を含む免疫グロブリン鎖を発現する。ｖレパートリー拡張法によって、少なくとも５の明瞭なＶ遺伝子を有するトランスジェニックマウスが生成されることができ、また、少なくとも約24のｖ遺伝子またはそれ以上を有するマウスが生成され得る。もちろん、いくつかのＶ遺伝子セグメントは非機能的であることができ（例えば偽遺伝子等)、これらのセグメントは保持されることができ、または所望なら当業者に入手可能な組換え法により削除されることができる。
【０２９４】
マウス生殖細胞系が、ＪおよびＣ遺伝子セグメントを含むヒトＩgトランスジーンにおいて実質的に存在しない、拡張されたＶセグメントレパートリーを有する機能的YACを含むように処理されたなら、形質は増殖され、他の遺伝子バックグラウンドへと繁殖され得る。他の遺伝子バックグラウンドは、拡張されたＶセグメントレパートリーを有する機能的YACが、異なるヒトＩｇトランスジーンを有するマウス生殖細胞系へと繁殖されるところのバックグラウンドを包含する。拡張されたＶセグメントレパートリーを有する多重の機能的YACは、生殖細胞系へと繁殖されて、ヒトＩｇトランスジーン（または多重ヒトＩｇトランスジーン）と共に働き得る。ここで、YACトランスジーンと称するけれども、ゲノムに組込まれたときそのようなトランスジーンは、酵母の配列を実質的に欠き得る。それは、例えば酵母での自律性の複製に必要とされる配列であり、そのような配列は、もはや必要ではない、酵母での複製後に（すなわち、マウスES細胞またはマウスプロザイゴート(prozygote)に導入されるに先立って)、遺伝子工学（例えば制限消化およびパルス場ゲル電気泳動（pulsed-field qel electrophoresis）または他の適当な方法）によって任意的に除去され得る。
【０２９５】
本発明はまた、ヒト配列免疫グロブリン発現の形質を増殖させる方法を提供し、この方法は、ヒトIgトランスジーンを有し、かつ拡張されたＶセグメントレパートリーを有する機能的YACを任意的にまた有するトランスジェニックマウスを繁殖させることを含む。ＶHおよびＶL遺伝子セグメントの両方が、YACの上に存在し得る。トランスジェニックマウスは、実行する人が所望する任意のバックグラウンドへと繁殖され得、このバックグラウンドは、ヒトIgトランスジーンおよび／または他のヒトリンパ球蛋白質をエンコードするトランスジーンを含む、他のヒトトランスジーンを収容するバックグラウンドを包含する。
【０２９６】
本発明はまた、拡張されたＶ領域レパートリーYACトランスジーンを有するトランスジェニックマウスにより生成された高親和性ヒト配列免疫グロブリンを提供する。
【０２９７】
上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を記戴したけれども、他の態様は本明細書の開示により、そしてより特定的には実施例に記載のトランスジーンにより定義される。トランスジェニック動物の４つのカテゴリーが定義され得る I ．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。
【０２９８】
II．再記列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。
【０２９９】
III. 再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない軽鎖免役グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。
【０３００】
IV．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫ダロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。
【０３０１】
トランスジェニック動物の上記カテゴリーの好ましい優先順序は、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともκ遺伝子）が相同組換え（または他の方法）により破壊されている場合にはII＞II＞III＞IVであり、そして内因性軽鎖遺伝子が破壊されておらず且つ対立遺伝子排除により優性になるに違いない場合には I＞II＞ III＞IVである。
【０３０２】
先に議論したように、本発明は、ヒトの疾病の処置において有用なヒト配列モノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体の治療上の使用は、例えばラリックおよびボーラ、Journal of BiologicalResponse Modifiers,５：379−393 において議論されている。ヒトモノクローナル抗体の使用は、自己免疫疾患、癌、感染症、移植組織の拒絶、血液障害例えば凝固障害、および他の疾病の処置を包含する。
【０３０３】
本発明の抗体は、蛋白質の送り出しについて医療分野で公知の任意の方法により、患者に投与され得る。抗体は、非経口投与（すなわち皮下、筋肉内、または静脈内投与）に特に適している。本発明の薬剤組成物は、代替的薬剤送り出しアプローチを用いた投与にまた適している（例えばランガー、サイエンス、249：1 527−1533(1990)）。
【０３０４】
非経口投与のための薬剤組成物は通常、受け入れ可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解されたモノクローナル抗体の溶液を含む。種々の水性担体が使用でき、例えば水、緩衝された水、0.4％塩水、0.3％グリシンなどである。これらの溶液は、無菌であり、一般に微粒子物質を含まない。これらの組成物は、慣用の公知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、適当な生理的条件に必要とされるような、薬剤的に受け入れ可能な補助的物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、緊張調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含むことができる。これらの処方における抗体の濃度は、広く変わり得る。すなわち、約 0.5 重量％より下から、通常0.1 重量％以上、1.5 または 2.0 重量％までであり、選択された投与の特定の様式にしたがって、第１に流体体積、粘度などに基づいて選択されるであろう。非経口投与可能な組成物を実際に調製する方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、より詳細には、例えばレミントンの薬学科学（Remington' s Pharmaceutical Scinences）、第１７版、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルバニア(1985)に記載されている。
【０３０５】
本発明の抗体またはその混合物を含む組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与されることができる。治療的施与において、組成物は、治療するのに十分な量、または感染およびその合併症を少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で患者に投与される。これを成し遂げるのに適切な量は、「治療的に有効な投与量」として定義される。この使用のために有効な量は一般に、約0.05 mg/kg体重〜約５mg／kg体重、好ましくは約0.2 mq/kq体重〜約1.5mg／kg体重の範囲である。
【０３０６】
いくつかの例においては、本発明の免疫グロブリン分子を変性してその生物学的活性を変化させることが望ましいであろう。例えば、免疫グロブリンは、直接または間接に、他の化学療法薬と一緒にすることができる。種々の化学療法薬が標的にするために一緒にされ得る。例えば、一緒にされ得る抗炎症剤は、免疫調節薬、血小板活性化因子（PAF）拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン拮抗剤を包含する。いくつかの好ましい部分は、シクロスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、FK−506、マイコフェノール酸等を含む。同様に、抗酸化剤例えばスーパーオキシドジスムターゼが、リパーヒュージョン障害（reperfudion injury）の処置において有用である。同様に、抗がん剤たとえばダウノマイシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ブレオマイシン等が標的にされ得る。
【０３０７】
本発明のモノクローナル抗体はまた、患者の部位に対して両親媒性のもの（例えばリポソーム）を標的にするのに使用され得る。これらの調製において、受け渡しされるべき薬剤が、ヒトモノクローナル抗体が埋め込まれるところのリポソームの部分として組込まれる。
【０３０８】
本発明のヒト配列モノクローナル抗体は、それらが向けられた、予め決められた抗原に特異的に結合するので、有用である。予め決められた抗原がヒト抗原（すなわち、ヒト蛋白質またはそのフラグメント）であるとき、本発明のヒト免疫グロブリンがまた非ヒト動物、特に薬剤試験（例えば生物学的活性、薬物動態学および安全の臨床前試験）のためによく使用される動物で見出されたコグネイト抗原に結合するなら、それは時には有利である。これらの動物は、マウス、ウサギ、ラット、イヌ、ブタ、および特に非ヒト霊長類例えばチンパンジー、無尾猿 (ape)および猿(monkey)（例えばレサスモンキー(Rhesus monkeyおよびシノモルガスモンキー(cynomolgus monkey)）を含む。実験動物において抗原を認識する能力は、免疫グロブリンの生物分布での特異的結合の効果を測定するのに特に有用である。コグネイト抗原は、（i）ヒト抗原と実質的に同様の構造（例えばアミノ酸配列）を有する（すなわち、動物のコグネイト蛋白質のアミノ酸配列は、典型的にはヒト蛋白質に少なくとも約50％同一、通常少なくとも約70％同一、およびしばしば少なくとも約80％またはそれ以上同一である）；（ii）ヒト抗原と実質的に同じ機能を有する；および(iii)ヒト抗原と同じ細胞区画にしばしば見出されるところの抗原である。ヒトおよび動物のコグネイト抗原は、典型的には（いつもではないが）同じ名前を有する。コグネイト抗原の例は、ヒトチューブリンおよびマウスチューブリン、ヒト CD4 およびレサス(Rhesus)CD4およびヒト IgG およびラット IgG を含む。
【０３０９】
別の観点では、本発明は、人工遺伝子によってエンコードされた少なくとも１のポリペプチドを有する抗原結合ヒトmABを提供する。人工遺伝子は、細胞誘導された鋳型核酸ストランド（例えば細菌性の細胞または免疫もしくはハイブリドーマ細胞から得られた核酸鋳型）および人工遺伝子の（複製を経た）子孫を必要としない化学的または酵素的方法によってイン ビボで合成された、ポリペプチドをエンコードする核酸セグメント、すなわち完全に合成された核酸を含む。
【０３１０】
短い核酸をプライマー、リンカー等として使用することは遺伝子工学においてルーチンであるが、化学的および／または酵素的手段によって、30、50またはそれ以上の塩基を長さに有する、完全に合成の蛋白質をエンコードする核酸を生成することがまた可能である。本発明の人工遺伝子は、合成核酸領域と細胞誘導核酸領域との両方を含み得る。人工遺伝子の合成核酸領域は一般に、少なくとも約 50塩基、しばしば少なくとも約100塩基、典型的には少なくとも約200塩基、よりたびたびには少なくとも約250塩基、通常300塩基または400塩基より多い塩基の長さがある。典型的には、合成核酸領域は、可変遺伝子セグメントまたはその部分例えば CDR領域をエンコードし、定常領域は、細胞誘導された核酸によってエンコードされる。免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖）は、ポリペプチドをエンコードする人工遺伝子を用いて簡便に発現され得る。通常、人工遺伝子は、転写プロモーター配列、例えば免疫グロブリン遺伝子からまたはウィルス（例えばSV40、CMV、HIV、RSV）またはハイブリッドプロモーターから誘導されたプロモーター配列に動作可能に結合される。人工遺伝子は、他の配列例えばポリアデニル化配列およびイントロンにもまた結合され得る。免疫グロブリンポリペプチドを発現するための１つの方法は、免疫グロブリンポリペプチドの１つの領域（例えば可変領域またはその部分）をエンコードする合成核酸を、残留するセグメントまたは免疫グロブリン鎖の部分（例えばμ、γ、γ2、γ3、γ4、δ、ε、α1、α2定常領域)、および任意的にプロモーター（例えば CMV（サイトメガロウィルス）プロモーター)、ポリアデニル化もしくは他の配列をエンコードするベクターへ挿入することを含む。そのようなベクターは、細胞に導入されると、ベクター配列の細胞性転写および翻訳が免疫グロブリンボリペプチドをもたらすように構成される。
【０３１１】
機能的ヒト配列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子およびポリペプチドは、人工遺伝子を用いて構成され、予め決められた抗原に特異的に結合するような所望の特異性を有する免疫グロブリンを生成するために使用され得る。これは、予め決められた抗原で免疫されたトランスジェニック動物からの細胞またはその動物から誘導されたハイブリドーマによって発現されたボリペプチドと実質的に同様の免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工遺伝子を構成することによって達成される。かくして、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工遺伝子および、人工遺伝子を用いてヒト配列免疫グロブリンを生成する方法を提供する。
【０３１２】
この方法に従って、トランスジェニック動物（例えば、機能的に分断された内因性の重鎖対立遺伝子のホモ接合の組、機能的に分断された内因性の軽鎖対立遺伝予のホモ接合の組、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、およびヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピーを有するトランスジェニックマウス）が、予め決められた抗原、例えばヒト蛋白質で免疫される。核酸、好ましくは mRNA は次に、集められまたは、免疫グロブリン遺伝子転位が起こるところの細胞または細胞集団から分離され、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖（特にＶセグメント）をエンコードする核酸又はその部分の配列が決定される。この配列情報は、人工遺伝子の配列のための基礎として使用される。
【０３１３】
配列の決定は一般に、興味ある遺伝子または cDNA の少なくとも部分、例えば転位されたヒトトランスジーンまたは免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする対応する cDNAの部分の分離を必要とする。通常、これは、ヒト免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする DNA、または好ましくはmDNA(すなわち cD NA）のクローニングを必要とする。クローニングは、標準の技術（例えばサムブルックら、（1989年)、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーガイド、第1 −3巻、コールド スプリングハーバープレスを見よ）を用いて行う。例えば、cD NA ライブラリーは、ポリA+ mRNA、好ましくは膜結合mRNA、および免疫グロブリンボリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングされたライブラリーの逆転写によって構成される。しかしながら、好ましい実施態様において、ポリメラーゼ鎖反応（pcR）が、興味のある免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば軽鎖可変セグメント）をエンコードする cDNA（または全長さの cDNA の部分）の増幅に使用される。ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子の配列は当業者に容易に入手可能なので、ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントを特異的にハイブリッド化するまたは増幅するプローブまたはPCRプライマーは容易に設計され得る。テイラーら、Nuc. Acids. Res., 2 0：6287（1992年）を見よ。さらに、トランスジェニックマウスのヒトトランスジーンの配列はしばしば、実施する人には公知であり、プライマー配列は、トランスジーンの適当な領域にハイブリッド化するように選択され得る。増幅された配列は、任意の適当なベクターたとえば発現ベクター、ミニジーンベクター、またはファージ表示ベクターへと、容易にクローン化され得る。興味のある免疫グロブリンポリペプチドのある部分の配列を決定することが可能である限りは、使用される特定のクローン化の方法は重要ではないことが正しく認識される。ここで使用されるように、クローン化され、増幅され、標識を付けられた、またはさもなければ、興味のある核酸の配列が決定され得るようにバックグラウンド核酸から区別された核酸は、分離されたと考えられる。
【０３１４】
クローニングおよび配列に使用されるRNAの１つの供給源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得、かつＢ細胞を不死細胞に融合することによって製造されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらが容易にスクリーニングされ、興味のあるヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマが選択されることである。あるいは、RNAが、免疫した動物のＢ細胞（または脾臓全部）から分離され得る。ハイブリドーマ以外の供給源が使用されるとき、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする配列についてスクリーンニングするのが好ましい。そのようなスクリーニングの方法の１つは、ファージ表示技術の使用である。ファージ表示は、例えばダウアーら、国際特許出願WO 91/17271、マックカファーティら、国際特許出願WO 92/01047、およびカトンおよびコプロウスキー、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、 87:6450-6454（199０年）に記載されている。ファージ表示技術を用いた１つの実施態様において、免疫されたトランスジェニックマウスからのcDNA（例えば全脾臓cDNA）が分離され、ポリメラーゼ鎖反応が、免疫グロブリンポリペプチドの部分、例えば CDR 領域をエンコードするcDNA 配列を増幅するのに使用され、かつ、増幅された配列は、ファージベクターに挿入される。興味のあるペプチド、例えば所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをエンコードするcDNAは、パニング(panning)のような標準の技術によって同定される。
【０３１５】
次に、増幅されたまたはクローン化された核酸の配列が決定される。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全部をエンコードする配列が決定されるが、しかし、時には可変領域の部分、例えばCDRをエンコードする部分のみを配列することが適当であろう。典型的には、配列された部分は、少なくとも30 塩基の長さであり、よりしばしば、可変領域の長さの少なくとも約３分の１または少なくとも約２分の１の長さについて基づいたコーディング（based coding）が配列されるであろう。
【０３１６】
配列は、cDNAライブラリーから分離されたクローン上で、またはPCRが使用されるときは、増幅された配列のサブクローニングの後で、または増幅されたセグメントの直接PCR配列によって、行われることができる。配列は標準技術（例えばサムブルックら、(1989年)、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーガイド、第１−３巻、コールド スプリング ハーバー プレスおよびサンガー、Ｆら、(1977年)、proc．Natl.Acad. Sci. USA 74:5463-5467を見よ）を用いて行われる。クローン化された核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの公開された配列と比べることにより、配列された領域に依存して、(i)ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のイソタイプを含む）の生殖細胞系セグメント使用(usage)および(ii)重鎖および軽鎖可変領域の配列（N-領域添加および体細胞突然変異のプロセスから生じた配列を含む）を、当業者は容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝予配列情報の１つの供給源は、ナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション、ナショナルライブラリーオブメディシン、ナショナル インスティテューツ オブ ヘルス、ベセスダ、エムディーである。
【０３１７】
代替的な実施態様においては、興味のある免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接蛋白質配列によって決定することができる。
【０３１８】
免疫グロブリン発現遺伝子（すなわち、転位トランスジーン）の少なくとも一部分に一致するかまたは実質的に同様の配列を有する人工遺伝子を構成することができる。同様に、人工遺伝子は、転位トランスジーンの配列された部分によりエンコードされたポリペプチドに一致するかまたは実質的に同様であるところのポリペプチドをエンコードすることができる。遺伝子コードの縮重は同じポリペプチドが多重核酸配列によってエンコードされるのを許す。時には核酸配列を変えて、例えば制限部位を誘導する、コドンの使用(usage)を変えて特定の発現系を反映する、またはグリコシル化部位を除去することが望ましい。さらに、ハイブリドーマ配列における変化は、免疫グロブリンの特性（例えば結合特性）を変えるために導入され得る。例えば、重鎖および軽鎖可変領域のCDR 領域において特に、予め決められた抗原にたいしての免疫グロブリンの親和性を増加するために、変化が導入される。
【０３１９】
合成核酸を構成するための方法はよく知られている。完全に化学的合成が可能であるが、一般に混合した化学的−酵素的合成が行われ、この方法では、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドがライゲーション反応および／またはポリメラーゼ鎖反応に使用されて、より長いポリヌクレオチドを作り上げる。もっとも好ましい実施態様において、ボリメラーゼ鎖反応は、増幅の結果が人工遺伝子のために望ましい配列を有するDNA であるように選ばれたオーバーラッププライマーを用いて行われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、固相または溶液中で合成され得る。一般に、固相合成が好ましい。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエステルおよびＨ-ホスホネート化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成についての工程の詳細な記載は、広く入手可能である。例えば、イタクラ、米国特許第4,401,79 6号明細書：カルサーズら、米国特許第4,458,066号明細書および第4,500,707号明細書；ビユーケイジら、Tetrahedron Lett.，22:1859−1862；マッチューチら、Ｊ．Amer.Chem．Soc.，103：3185−3191（1981年）；カルサーズら、GeneticE ngineering，4：1−17（1982年）；ジョーンズ、第２章、アトキンソンら、第３章、およびスプロートら、第４章、ガイト編、オリゴヌクレオチド合成：ア プラクティカル アプローチ、IRLプレス、ワシントンＤ．Ｃ.(1984年）；フレーラーら、Tetrahedron Lett.，27：469−472（1986年）；フレーラーら、Nucleic A cids Res.，14：5399−5407（1986年）；シンハら、Tetrahedron Lett.,24：584 3−5846（1983年）；シンハら、Nucleic Acids Res.，12：4539−4557（1984年）を見よ。
【０３２０】
人工遺伝子は細胞に導入され、発現されて、免疫グロブリンポリペプチドを生成することができる。発現のための細胞タイプの選択は、多くの要因（例えば所望される蛋白質グリコシル化のレベル）に依存するが、ヒト免疫グロブリンを分泌することができる細胞が好ましい。特に好ましい細胞は、CHO細胞およびミエローマ誘導細胞例えばSP20およびNSO細胞系を含む。標準の細胞培養はよく知られており、また、ニューマンら、Biotechnology，10：1455−1460（1992年）；ベビントンら、Biotechnology，10：169−175（1992年）；コケットら、Biotech nology,8:662−667(1990年);カーターら、Biotechnology,10：163−167（1992年）に記載されている。核酸例えば人工遺伝子の導入方法はよく知られており、トランスフェクション（例えばエレクトロポレーションによってまたはリポソームが媒介する）および形質転換を含む。導入された遺伝子の発現のためのシステムは、一般に、サムブルックらの上記の文献に記載されている。
【０３２１】
免疫グロブリン（例えば IgG分子）がイン ビボで生成されるように、同じ細胞中で２つの免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、重鎖および軽鎖）を発現することがしばしば望ましい。したがって、２つの人工遺伝子（すなわち、１つは重鎖をエンコードし、１つは軽鎖をエンコードする）を細胞に導入するのが時には望ましい。（この２つの人工遺伝子は単一のベクター上に導入され得る。）あるいは、１つの免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする１つの人工遺伝子が、遺伝子的に操作されて他の免疫グロブリンポリペプチドを発現する細胞に導入され得る。
【０３２２】
人工遺伝子がトランスフェクトされた細胞が増殖すると、人工遺伝子の合成核酸部分全部が、複製および転写のための鋳型としてふるまうことが明らかである。それにもかかわらず、子孫の遺伝子は、合成核酸由来であったであろう (すなわち、細胞誘導鋳型核酸ストランドを必要としない、化学的または酵素的方法によってインビトロで合成された、ポリペプチドをエンコードする核酸分子)。そして、ここで使用されているように、これはまた、人工遺伝子と考えられる。かくして、ハイブリドーマの、発現されたトランスジーンに対する人工遺伝子の合成部分の関係は、情報的結合（すなわち、配列情報）はあるが、直接物理的結合はないところのものである。
【０３２３】
本発明はまた、治療的および診断的な適用において、特にヒトの疾病の処置において有用な、抗 CD4 モノクローナル抗体を提供する。CD4は、胸腺細胞およびＴ細胞にまず発現される細胞表面蛋白質であり、これは、Ｔ細胞機能および抗原の MHC クラスII認識に含まれる。CD4 に向けられた抗体は、CD4 細胞の活性を減らすようにふるまい、かくして、望まない自己免疫反応、炎症性の応答および移植した器官の拒絶を減らす。
【０３２４】
実際に、抗 CD4 mAb の投与は、動物モデルにおいて、自己免疫疾患を防ぐ（ウォオフジーら、J．Exp．Med.，161：378−391 (1985年)）または逆転させる（ウォフジーら、J．Immunol.，138：3247−3253(1987年)、ワルダーら、サイエンス、227：415−417 (1985年)）ことが示された。ネズミまたはキメラの抗 CD4 m Ab の、リュウマチ様の関節炎患者への投与は、臨床的恩恵を示した（ノックスら、Blood, 77:20−30（19 91年）；ゴールドベリーら、Ｊ．Autoimmunity，4：617−630；ヘルツォグら、ランセット、ii：1461−1462；ホーネフら、Arthritis Rheum.,34:129−140;ライターら、Arthritis Rheum.,34：525−536；ウェンディングら、Ｊ．Rheum.，3 8：325−327；ファンデル ルツベら、ArthritisRheum.,38：1097−1106；ファン デル ルッベら、Arthritis Rheum.，36：1375−1379；モァランドら、Arthri tis Rheum.，36：307−318およびチョイら、Arthritis andRheumatism，39(1)： 52−56 (1996年))。さらに、上記したように、キメラ抗 CD4 mAbは、菌状息肉症の患者においていくらかの臨床的効力を示した（ノックスら、（1991年）Blood ，77：20)。抗 CD4 抗体はまた、ニューマンら、バイオテクノロジー、10：1455 −1460（1992年）において議論されている。
【実施例】
【０３２５】
方法および材料
トランスジェニックマススは、llogan ら、“Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory （これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って誘導される。
【０３２６】
胎児性幹細胞は、発表された方法に従って操作される〔Terato- carcinomas a nd embryonic stem cells ： a practical approach, E.J. Robertson編, IRL, Press，Washington, D.C., 1987 ; Zjilstraら、Nature 342: 435-438 (1889)およびSchwartzberg, P.ら、Science 246:799-803 (1939) ; この各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【０３２７】
ＤＮＡクローニング方法は、J．Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborator y Manual, 第２版, 1989, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Spri ng Harbor, N,Y,（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って実施される。
【０３２８】
オリゴヌクレオチドは、製造業者により与えられた規格書に従ってAppolied B iosystemsのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成される。
【０３２９】
ハイブリドーマ細胞および抗体は、“Antibodies: A Laboratory Manual”, H aralow およびDavid Lane編，Cold Spring Harbor Labo-ratory 1988)（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って操作される。
【０３３０】
[実施例１]
ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーン 
この実砲例は、マウスの接合子中にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングとマイクロインジェクションを記載する。
【０３３１】
Marzluff, W.Fら、“Transcription and Translation : A Pra-ctical Appro ach”, B.D. Hammes およびS.J. Higins編, 89-129頁, IRL Press，Oxford(1985 )により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗浄したヒト精母細胞）を低融点アガロース母材中に埋め込み、EDTAとプロティナーゼＫで溶解せしめで高分子量ＤＮＡを暴露させ、このＤＮＡを次いでM. FinneyによりCurrent Protocols in Moleculer Biology(F. Ausubeら編, John Wiley & Sons,増補４版，1938, 第2.5.1 章）中に記載された通りにアガロース中で制限酵素Not Iで消化する。
【０３３２】
次いでNot Ｉ消化さｎたＤＮＡを、Anand，R, ら、Nucl．Acids Res., 17:342 5-3433 (1989) により記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画する。Not ｉ断片に冨む画分をサザンブロットハイブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によりコードされる１または復数の配列を検出する。そのような配列ば、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、μおよびγ１定常領域と一緒に８種のＶH ファミリーの全部の代表物を含む〔この断片は、Bermanら (1988) 前掲によりHeLa細胞から87O kb断片として同定されているが、本発明者らはヒト胎盤および精子ＤＮＡからは830 kb断片としてであることを発見した〕。
【０３３３】
このNot I断片を含む画分（図４参照）をプールし、そして酵母細胞中のベクターpYACNNの Ｎot I部位にクロ−ニングする。プラスミドpYACNNは、pYAC-4 Ne o〔Cook，H.ら、Nucl．Acids Res． 16:11817（1988）］をEcoRIで消化しそしてオリゴヌクレオチド５′−AAT TGC GGC CGC−３′の存荘下で連結せしめることにより調製する。
【０３３４】
Brownsteinら(1989),Science, 244, 1348-1351およびGreen．E．ら、ProcNatl ．Acad．Sci．USA 87:1213-1217（1990）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、重鎮 Not Ｉ断片を含む YACクローンを単離する。M．Finncy．（前掲）により記載されたパルスフィールドゲル電気泳動により、高分子量酵母ＤＮＡからクローン化 Not Ｉ挿入断片を単離する。1Mmのスベルミンの添加によりこのＤＮＡを凝縮さぜ、上述の単細胞胚の核に直接マイクロインジュクトする。
【０３３５】
［実施例２］
生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン ヒトκ軽鎖の地図はLorenz．Wら、Nucl．Acids Res． 15;9667-9677（1987）に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０３３６】
全てのＣκ、３′エンハンサー、全てのＪセグメントおよび少なくとも５つの異なるＶセクメントを含む450 kbの XhoI−Not I断片を実施例１に記載の如く単離し、そして単一の細胞胚の核の中にマイクロインジェクトする。
【０３３７】
［実施例３］
生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン 前記成分の全部と少なくとも20個多いＶセグメントとを含む750 kp ＭluＩ−N ot I断片を実施例１に記載の如く単離し、そしてBssHIIで消化して約400 kbの断片を生戊せしめる。
【０３３８】
450 kb Xho I−Not I断片と約400 kb MIuI−BssHII断片は、Bss H II制限部位とXho I制限部位とにより眼定される配列重複を有する。マウス接合子のマイクロインジェクションによるそれらの２断片の相同組換えは、450 kb Xho I／Not I断片（実施例２）中に見つかるものよりも少なくとも15〜20個追加のＶセグメントを含むトランスジーンをもたらす。
【０３３９】
［実施例４］
重鎖小遺伝子座の作製 Ａ．pGP1およびpGP2の作製 pBR322をEcoRI とSFtyIで消化し、下記のオリゴヌクレオチドと連結せしめることにより、図８に記載の制限部位を有する147塩基対の挿入断片を含むpGP1を作製する。それらのオリゴの概括的重複は図９にも示される。
【０３４０】
オリゴヌクレオチドは下記のものである： オリゴ−１ ５′−CTT GAG CCC GCC TAA TAG GCG GGC TTT TTT TTG CAT ACT GCG GCC−３′ オリゴ−２ ５′−GCA ATG GCC TGG ATC CAT GGC GCG CTA GCA TCG ATA TCT AGA GCT CGA GCA−３′ オリゴ−３ ５′−TGC AGA TCT GAA TTC CCG GGT ACC AAG CTT ACG CGT ACT AGT GCG GCC GCT−３′ オリゴ−４ ５′−AAT TAG CGG CCG CAC TAG TAC GCG TAA GCT TGG TAC CCG GGA ATT−３′ オリゴ−５ ５′−CAG ATC TGC ATG CTC GAG CTC TAG ATA TCG ATG CTA GCG CGC CAT GGA TCC−３′ オリゴ−６ ５′−AGG CCA TTG CGC CCG CAG TAT GCA AAA AAA AGC CCG CTC ATT AGG CGG GCT−３′ このプラスミドは、マイクロインジェクション用のベクター配列から単離することができる大挿入断片を構築するための、稀少な切断性Not I部位により隣接された大きなポリリンカーを含む。このプラスミドは、pUC 系プラスミドに比べて比較的低コピー数であるpBR322に由来する（pGP1は複製開始点の近くにpBR322 コピー数調節領域を保持している）。低コピー数は挿入配列の潜在的毒性を減少させる。加えて、pGP1は、アンピシリン耐性遺伝子と前記ポリリンカーとの間に挿入された、trp由来の強力な転写ターミネーター配列〔Christie．G．E．ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 78:4180（1981）〕も含む。これは、アンピシリンプロモーターから起こる読み通し転写を防ぐことにより、或る腫の挿入断片に関係する毒性を減少させる。
【０３４１】
ブラスミドpPG2は、ポリリンカー中に追加の制限部位（Sfi I）を導入するようにpGP1から誘導される。pGP1をMIuIと SpeIで消化し、該プラスミドのポリリンカー邪分の中の認識配列を切除する。
【０３４２】
このように消化されたpGP1に次のアダプターオリゴヌクレオチドを連結せしめてpGP2を作製する。
【０３４３】
５′CGC GTG GCC GCA ATG GCC A ３′ ５′CTA GTG GCC ATT GCG GCC A ３′ pGP2は MIuI部位と Spe I部位の間に置かれた追加のSfiI部位を含むこと以外はpGP1と同じである。これは挿入断片をSfiIで並びにNot Iで完全に切除することを可能にする。Ｂ．pRE3（ラットエンハンサー３′）の作製 ラット定常領域の下流に置かれたエンハンサー配列を重鎮構成物中に導入する。
【０３４４】
Petterssonら、Nature 344:165-168（1990）により記載された重鎖領域３′ エンハンザーを単離し、クロ−ニングする。次のオリゴヌクレオチド５′CAG GAT CCA CAT ATC AGT ACC TGA AAC AGG GCT TGC ３′ ５′GAG CAT GCA CAG GAC CTG GAG CAC ACA CAG CCT TCC ３′ を使って、ラットIGH ３′エンハンサー配列をＰＣＲ増幅せしめる。
【０３４５】
こうして形成された３′エンハンサーをコードする二本鎖ＤＮＡをBamHIとSph Iで切断し、BamHI/SphIで切断されたpGP2中にクロ−ニングしてpRE3（ラットエンハンサ−３′）を得る。Ｃ．ヒトＪ−μ領域のクローニング この領域の実質的部分を、λファージ挿入断片から単離された２以上の断片を組み合わせることによりクロ−ニングする。図９を参照のこと。
【０３４６】
オリゴヌクレオチド GCA CTG TGT CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATGTCT GGG GCCA AG を使って、全部のヒトｊセグメントを含む6.３kbBamHI／HindIII 断片〔Mats uda ら、BMBO J． 7:1O47-1051（1988）：Ravetechら、Cell 27:583-591（198 1）、これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕をヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離する。
【０３４７】
オリゴヌクレオチド CAC CAA GTT GAC CAG CCT GGT CAC AGA CCTGAC CAC CTA TGAを使って、エンハンザー、スイッチおよび定常領域コードエクソンを含む隣接の10 kb HindIII／BamHI 断片〔Yasui ら、Eur．J．Immunol． 19:1399-1403 （1989）〕を同様にして単離する。
【０３４８】
プローブとしてクローンpMUM挿入断片（pMUMは、μ膜エクソン１オリゴヌクレオチド：CCT GTG GAC CAC CGC CTC CAC CTT CAT CGT CCT CTT CCT CCTを使ってヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離された4 kb EcoRI／HindIII断片である）を使って隣接の３′1.5 kbBamHI 断片を同様に単雌し、そしてpUCl9中にクロ−ニングする。
【０３４９】
pGP1をBamHIとBgl IIで消化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する。
【０３５０】
図９からの断片（ａ）および（ｂ）を前記消化pGP1中にクロ−ニングする。次いで５′BamHI部位が BamHI／Bgl II融合により破壊されるように置かれたクローンを単離する。それをpMU と命名する（図10参照）。
【０３５１】
pMU をBamHI で消化し、図９からの断片（ｃ）を挿入する。HindIII 消化により方向性を確認する。生じたプラスミドpHIG1（図10）は、およびＣμセグメントをコードする18 kb 挿入断片を含有する。Ｄ．Ｃμ領域のクロ−ニング pGP1をBamHI とHindIIIで消化し、次いで子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する（https://www.nri-cyberpatent.co.jp/patent/cache/meisaisho?kind=t&year=2000&no=502324&userid=sgac1041&session=1395155103&service=1 - fig14#fig14図14）。このように処理された図14の断片（ｂ）および図14の（ｃ）を、BamHI／HindIIIで切断したpGP1中にクローニングする。HindIII消化により断片（ｃ）の正しい方向を確認し、Ｃμ領域をコードする12 kb 挿入断片を含む pCONIを得る。
【０３５２】
PHIGIは、Not I部位により隣接されたポリリンカ−ー中にSfiI３′部位と S peI５′部位を有する18 kb挿入断片内にＪセグメント、スイッチおよびμ配列を含む故に、再配列されたＶＤＪセグメントに使われるだろう。pCONIはＪ領域を欠き12 kb 挿入断片のみを含むこと以外はpHIGIと同じである。再配列されたＶＤＪセグメントを含む断片の作製におけるpCONIの使用については後で記載する。Ｅ．γ−１定常領域のクローニング（oREG2） ヒトγ−１領域のクローニングは図16に描写される。
【０３５３】
Yamamuraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2152-2156（1986）は、組込み時に部分的に削除されたトランスジーン構成物からの膜結合ヒトγ−１の発現を報告している。彼らの結果は、３′BamHI 部位が、５kb未満のＶ−Ｃイントロンを有する経膜再配列されそしてスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭となることを指摘している。従って、再配列されていないスイッチされていない遺伝子では、最初のγ−１定常エクソンの５′末端から5 kb未満のところで始まる配列中にスイッチ領域全体が含まれる。
【０３５４】
従ってそれは５′5.3 kb Hind III 断片中に含まれる〔EIIison，J.W．ら、Nu cleic.Acids Res． 10:4071-4079（1982）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。Takahash1ら、Cell 29:671-679（1982）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）もまた、この断片がスイッチ配列を含むことを報告しており、この断片と7.7 kb Hind III−BamHI断片とを合わせると我々がトランスジーン構成物に必要とする配列の全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定遺伝子のイントロン中に存在する少なくとも15の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【０３５５】
γ−１の第三エクソン（ＣH３）に特異的である次のオリゴヌクレオチドを使って、γ−１領域を含むファージクローンを同定し単離する。
【０３５６】
５′TGA GCC ACG AAG ACC CTG AGG TCA AGT TCA ACT GGT ACG TGG ３′ 7.7kb Hind III -Bgl II断片（図11中の断片（ａ））をHindIII／Bgl IIで切断されたpRE3中にクロ−ニングしてpREG1を作製する。上流の5.3 kb Hind III 断片（図11中の断片（ｂ））をHindIII 消化されたpREG1中にクロ−ニングしてp REG2を作製する。BamHI／Spe I消化により正しい方向を確かめる。Ｆ．ＣγとＣμの結合 上述したプラスミドpHIG1はヒトｊセグメントとＣμ定常領域エクソンを含む。Ｃμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジーンを提供するために、pHIG エをSfi Iで消化した（図10）。プラスミドpREG2 もSfiIで消化し、ヒトＣγエクソンとラット３′エンハンザー配列を含む13.5 kb挿入断片を得た。それらの配列を連結し、31.5 kb挿入断片上にヒトＪセグメント、ヒトＣμ定常領域、ヒトＣγ１定常領域およびラット３′エンハンサー配列を含むプラスミドpH1G3′ を作製した（図12）。
【０３５７】
pCONI をSfiIで消化し、そしてpREG2 をSfi Iで消化して得られたヒトＣγ領域とラット３′エンハンサーとを含むSfiＩ断片と連結せしめることにより、ヒトＣμおよびヒトＣγ１をコードするがＪセグメントを含まない第二のプラスミドを作製する。得られたプラスミドpCON（図12）は、ヒトＣμ、ヒトγ１およびラット３′エンハンサー配列を有する20 kbの Not I／Spe I挿入断片を含有する。Ｇ．Ｄセグメントのクローニング ヒトＤセグメントをクローニングするための方策は図13に描写される。Ｄセグメントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージクローンを、多様性領域配列〔Y．Ichihara ら、EMBO J. 7:4141-4150（1988）〕に特異的なプローブを使って同定しそして単離する。次のオリゴヌクレオチドを使用する。
【０３５８】
OXP1： ５′−TGG TAT TAC TAT GGT TCG GGG AGT TAT TAT AAC CAC AGT GTC −３′ DXP4： ５′−GCC TGA AAT GGA GCC TCA GGG CAC AGT GGG CAC GGA CAC TGT −３′ DN4： ５′−GCA GGG AGG ACA TGT TTA GGA TCT GAG GCC GCA CCT GAC ACC −３′ オリゴ DXP1 を使って同定されたファージクローンから、DLR1，DXP1，DXP'1 およびUA1を含む5.2 kb XhoI断片（図13中の断片（ｂ））を単離する。
【０３５９】
オリゴ DXP4 を使って同定されたファージクローンから、DXR4,OA4およびOK4 を含む3.2 kb Xbe I断片（図13中の断片（ｃ））を単離する。
【０３６０】
図13中の断片（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を結合し、pGP1のXba I／Xho I部位中にクローニングして、10.6 kb挿入断片を含むpHIG2 を形成せしめる。
【０３６１】
このクロ−ニングは連続的に行われる。まず、図13の5.2 kb断片（ｂ）と図13 の2.2 kb断片（ｄ）を子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてXho I とXba Iで消化されたpGP1中にクロ−ニングする。生じたクローンを該5.2 kbおよび2.2 kb挿入断片を用いてスクリ−ニングする。5.2 kbおよひ2.2 kb挿入断片での試験に陽性であるそれらのクローンの半分が、BamHI 消化により確かめると正しい方向で5.2 kb挿入断片を有する。次いで図13の3.2 kb Xba I断片を、断片（ｂ）と（ｄ）を含むこの中間プラスミド中にクロ−ニングし、pHIG2 を形成せしめる。このプラスミドは、ユニーク５′Sfi I部位とユニーク３′Spe I部位を有するポリリンカー中にクローニングされた多様性セグメントを含む。完全なポリリンカーはNot I部位により隣接される。Ｈ．重鎖小遺伝子座の作製 下記は、１または複数のＶセグメンントを含むヒト重鎖小遺伝子座の作製を説明する。
【０３６２】
Newkirkら、J．Clin．Invest. 81:1511-1518（1988）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）のハイブリドーマ中に含まれるＶセグメントとして同定されたものに相当する再配列されていないＶセグメントを、次のオリゴヌクレオチド ５′−GAT CCT GGT TTA GTT AAA GAG GAT TTT ATT CAC CCC TGT GTC−３′ を使って単離する。
【０３６３】
再配列されていないＶセグメントの制限地図を調べて、消化すると３′および５′隣接配列と一緒に再配列されていないＶセグメントを含む約2 kbの長さを有するＤＮＡ断片を提供するユニーク制限部位を同定する。５′開始配列はプロモーターおよび他の調整配列を含み、一方３′隣接配列はＶ−ＤＪ結合に必要な組換え配列を提供するだろう。この約3.0 kbＶセグメント挿入断片をpGB2のポリリンカー中にクロ−ニングし、pVHIを形成せしめる。
【０３６４】
pVHIをSCiIで消化し、得られた断片をpHIG2のSfiI部位にクロ−ニングしてpHI G5′を作製する。pHIG2はＤセグメントのみを含むので、生成したpHIG5′プラスミドはＤセグメントと一緒に単一のＶセグメントを含む。pHIG5に含まれる挿入断片のサイズは、10.６ kb÷Ｖセグメント挿入断片のサイズである。
【０３６５】
Not IとSpeIでの消化によりpHIG5から挿入断片を切り出す。Ｊ．ＣμおよびＣ γ１セグメントを含むpHIG3′をSpeＩとNot Iで消化し、そして上記配列とラット３′エンハンサーとを含む3kb断片を単離する。それらの２断片を一緒にして、Not Iで消化されたpGP1中に連結せしめ、Ｖセグメント、９つのＤセグメント、６つの機能的なＪセグメント、Ｃμ、Ｃγおよびラット３′エンハンザーを含むPHIGを作製する。この挿入断片のサイズは約43 kb÷Ｖセグメント挿入断片のサイズである。Ｉ．相同組換えによる重鎖小遺伝子座の作製 前の章で指摘したように、pHIG挿入断片は単一のＶセグメントを使用すると約 43〜45 kbである。この挿入断片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクローニングすることかできる限界かまたはそれに近い。より多数のＶセグメントの使用に備えるために、接合子またはＥＳ細胞内での相同組換えによってラット３ ′エンハンサー配列、ヒトＣμ、ヒトＣγ１、ヒトＪセグメント、ヒトＤセグメントおよび多数のヒトＶセグメントを含むトランスジーンを形成する、重複ＤＮＡ断片の生体内相同組換えを下記に記載する。
【０３６６】
ヒトＪセグメントを含む6.3 kb BamHI／HindIII断片（図９中の断片（ａ）を参照のこと）を、次のアダブター： ５′GAT CCA AGC AGT ３′ ５′CTA GAC TGC TTG ３′ ５′CGC GTC GAA CTA ３′ ５′AGC TTA GTT CGA ３′ を使って、MIu I／SpeＩで消化されたpHIG5′中にクローニングする。
【０３６７】
生成したプラスミドをpHIG5’0（重複）と命名する。このプラスミド中に含まれる挿入断片はヒトＶ，ＤおよびＪセグメントを含む。pVH1からの単一Ｖセグメントが使われる時、この挿入断片のサイズは約17 kb÷2 kbである。この挿入断片を単離し、そしてヒトＪ，Ｃμ，γ１およびラット３′エンハンサー配列を含むpHIG3′からの挿入断片と組み合わせる。両挿入断片は、２つのＤＮＡ断片の間の約6.3 kbの重復部分に備えるヒトＪ配列を含む。これらをマウス接合子中に同時注入すると、生体内相同組換えが起こり、pHIG中に含まれる挿入断片と同等のトランスジーンを生成する。
【０３６８】
このアプローチは生体内で形成されるトランスジーン中への多数のＶセグメントの付加に備える。例えば、単一のＶセグメントをpBIG5′中に組み込む代わりに、（１）単離されたゲノムＤＮＡ、（２）ゲノムＤＮＡから誘導された連結ＤＮＡ、または（３）合成ＶセグメントレパートリーをコードするＤＮＡ、上に含まれる多数のＶセグメントをpHIG2のSfiI部位にクローニングしてpHIG5′VNを作製する。次いで図９のＪでグメント断片（ａ）をpHIG5′VN中にクローニングし、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、pHIG3′から単離した挿入断片上に含まれるＪセグメントと重複するＪセグメントと多数のＶセグメントを含むようになる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、相同組換えか起こり、多数のＶセグメントおよび多数のＪセグメント、多数のＤセグメント、Ｃμ領域、Ｃγ１領域（全てヒト由来）並びにラット３′エンハンサー配列をコードするトランスジーンを生成する。
【０３６９】
［実施例５］
軽鎖小遺伝子座の作製 Ａ．pEμlの作製 pEμlの作製は図16に描写される。オリゴ５′GAA TGG GAG TGA GGC TCT CTC ATA CCC TAT TCA CAA CTG ACT ３′ を使ってファージクローンから678 bpのXba I−EcoRI 断片〔J.Banerji ら、Ce li 33:729-740（1983）〕においてマウス重鎖エンハンサーを単離する。
【０３７０】
このＥμ断片を、EcoRI 部位の平滑末端フィルインにより、EcoRV／Xba I消化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpEμlと命名する。Ｂ．κ軽鎖小遺伝子座の作製 κ構成物は、少なくとも１つのヒトＶκセグメント、５つのヒトＪκセグメント全部、ヒトＪ−Ｃκエンハンサー、ヒトκ定常領域エクソン、および理想的にはヒト３′κエンハンサーを含む〔K．Meyerら、EMBO J. 8:1959-1964(1989)〕。マウスのκエンハンサーはＣκから9 kb下流である。しかしながら、ヒトではまだ同定されていない。加えて、該構成物はマウス重Ｊ−ＣμエンハンサーのＩコピーも含む。
【０３７１】
この小遺伝子座は次の４つの成分断片から作製される （ａ）マウス遺伝子座との類推によりヒトＣκエクソンと３′ヒトエンハンサーとを含む16 kb Sma I断片： （ｂ）５つのＪセグメント全部を含む５′隣接5 kb SmaＩ断片： （ｃ）ρεμ１から単離されたマウス重鎖イントロンエンハンサー（この配列は、Ｂ細胞発達のできるだけ初期に軽鎖構成物の発現を誘導するために含まれる。重鎖遣伝子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎮エンハンサーはおそらくイントロンκエンハンサーよりも早い段階で活性であろう。）；および （ｄ）１または複数のＶセグメントを含む断片。
【０３７２】
この構成物の調整は次の通りである。ヒト胎盤ＤＮＡをSmaIで消化し、電気泳動によりアガロース上で分画する。同様に、ヒト胎盤ＤＮＡを BamHIで消化し、電気泳動により分画する。SmaIで消化したゲルから16 kb画分を単離し、同様にB amHIで消化したＤＮＡを含むゲルから11 kb領域を単離する。
【０３７３】
16 kb Sma I画分を、Xho Iで消化されXho I制限消化生成物をフィルインするためにクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼで処理されているラムダFIX II（Stra tagene．La Jo11a，Ca1ifornia）中にクローニングする。
【０３７４】
16 kb Sma I画分の連結はSma I部位を破壊するがXho I部位はそのまま残す。
【０３７５】
11 kb BamHI 画分を、クローニング前にBamHIで消化したラムダFIX II（Strat agene．La Jolla．Callfornia）中にクローニングする。
【０３７６】
各ライブラリーからのクローンを、Ｃκ特異的オリゴ５′GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCA TCT TCC CGC CAT CTG ３′ を用いて探査する。
【０３７７】
ＣκかSma Iに隣接するように、16 kb Xho Ｉ挿入断片をXho Iで切断されたpE μl中にサブクローニングする。生じたブラスミドをpKap1と命名する。
【０３７８】
上記Ｃκ特異的オリゴヌクレオチドを用いてλ EML3/BamIIIライブラリーを探査し、11 kbクローンを同定する。５ kb Sma I断片（図25の断片（ｂ））をザブクローニングし、次いでSma Iで消化されたpKap1中に挿入する。正しい方向のＪセグメント、ＣκおよびＥμエンハンサーを含むそれらのプラスミドをpKap2と命名する。
【０３７９】
その後、１または複数のＶκセグメントをpKap2のMIuI中にサブクローニングし、ヒトＶκセグメント、ヒトＪκセグメント、ヒトＣκセグメントおよびヒトＥμエンハンサーをコードするプラスミドpKapHを生ぜしめる。pKapHを NotI 消化することによりこの挿入断片を切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により情製する。こうして精製された挿入断片を上述の如くマウス接合子の前核中にマイクロインジェクトする。Ｃ．生体内相同組換えによるκ軽鎖小遺伝子座の作製 11 kb BamHI断片を、その３′末端が Sfi I部位の方に向くように、BamHIで消化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpKAPintと命名する。p KAPint 中のBamHI 部位とSpe I部位との間のポリリンカー中に１または複数のＶ κセグメントを挿入してpKapHVを作製する。pkapHVの挿入断片をNot Iでの消化により切り出し、そして精製する。pKap2からの挿入断片をNot Iでの消化により切り出し、精製する。それらの２断片の各々は、pKapHVからの断片が、pK ap2がら得られる挿入断片中に含まれる5 kb SMa I断片と実質的に相同であるＪ κセグメントを含む 5 kbのＤＮＡ配列を含むという点で、相同性領域を含有する。それ故に、それらの挿入断片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトされると相同組換えして、Ｖκ，Ｊκ,およびＣκをコードするトランスジーンを形成することができる。
【０３８０】
［実施例６］
免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムク ローンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免役グロブリンκ軽鎖遺伝子のクローニングを記載する。そのような細胞は、与えられた免疫グロブリン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは４コピーのκ軽鎖遺伝子を含み、その２コピーは融合相手の細胞系からのものであり、２コピーは着目の免疫グロブリンを発現するもとのＢ細胞からのものである。それらの４コピーのうち、数個が再配列することかできるという事実にもかかわらず、ただ１つだけが着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載の手順は、κ軽鎖の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。Ａ．二本鎖cDNA ヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、または細胞表面形態もしくは分泌形態またはその両形態のκ軽鎖含有IgMを合成する他の細胞系を、ポリ_A- RNAの単離に使用する。次いで該RNAを、逆転写酵素を使ったオリゴdT開姑cDNAの合成に使用する。次で一本鎖cDNAを単離し、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼ酵素を使って３′末端にＧ残基を付加する。次いでＧ末端が付けられた一本鎖cDNAを精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド ５'−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG CCC CCC CCC CCC−３′ を使った第二鎖合成（ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触媒される）のための鋳型として用いる。
【０３８１】
二本鎮cDNAを単離し、発現される免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖をコードするmRNAの５′末端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次いで、それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現される軽鎖遺伝子のクロ−ニング方法は、下記のＢ部に要約される。Ｂ．軽鎖 Ａ部に記載された二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマ ５′−GAT CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AA G ACA GAT GGT GCA−３' を使った第３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。
【０３８２】
このプライマーは、κ軽鎖情報の定常部分に特異的な配列（TCA TCA GAT GGCG GG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー ５′−GAG CTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３′ ５′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG−３′ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
【０３８３】
ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド ５′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３′ を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。
【０３８４】
次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−カッパと称することにする。
【０３８５】
Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびSmaIを含む幾つか異なるの制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わぜて消化したＤＮＡのサザンブロットを、32Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−カッパを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセダメントの上流に同定される。
【０３８６】
次いでIg発現細胞系からのＤＮＡをSma Iおよび第二の酵素（Ｖセグメントの内側にSma I部位がある場合にはBamHI またはKpnI）で切断する。いずれかの生成した非平滑末端をT4 DNAポリメラーゼ酵素で処理し、平滑末端化ＤＮＡ分子を与える。次いで制限部位をコードするリンカー（断片中にどの部位が存在しないかに応じてBamHI，EcoRI（または Xho I）を付加し、そして対応するリンカー酵素で切断してBamHI，EcoRIまたはXho I末端を有するＤＮＡ断片を与える。次いで該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をラムダEMBL3またはラムダFIX (Stratage ne，La Jolla，Califortia中にクローニングする。ユニークプローブｏ−カッパを使って、Ｖセグメント含有クローンを単離する。陽性クローンからＤＮＡを単離し、そしてpKap1のポリリンカー中にサブクローニングする。生じたクローンをpRKLと命名する。
【０３８７】
［実施例７］
免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムロ ーンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリンン重鎖μ遺伝子のクローニングを記載する。この実施例に記載の手順は、μ重鎖遺伝子の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。
【０３８８】
上述した如く、二本鎖cDNAを調製し単離する。この二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマー ５′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG ACA GGA CAC GAG GGG CAA AAG GG T TGG GGC GGA TGC−３′ を使った３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。
【０３８９】
このプライマーは、μ重鎖情報の定常部分に特異的な配列（ACA GGA GAC GAGG GG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー： ５′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３ ′ ５′−GTA CTC CAT ATC AGC TGG ATG AAG−３ ′ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
【０３９０】
ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド ５′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３′ を使ったジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。
【０３９１】
次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−ミューと称することにする。
【０３９２】
Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびMIuI（MIuIは、Ｊセグメントとμ CHI との間を開裂する稀少切断性酵素である）を含む幾つかの異なる制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンプロットを、32Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−ミューを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。
【０３９３】
次いでIg発現細胞系からのＤＮＡをMIuIと第二の酵素で切断する。次でMIuIまたはSpeIアダプターリンカーを末端に連結せしめ、切断して上流部位をMIuIまたは SpeI変換する。次いで該ＤＮΛをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をプラスミドpGP1 中に直接クローニングする。ユニークプローブｏ−ミューを使ってＶセグメント含有クローンを単離し、その挿入断片をMIuIでまたはMIu I／Spe I で切断されたプラスミドpCON2中にサブクローニングする。生じたクローンをpRM GHと命名する。
【０３９４】
［実施例８］
ヒトκ小遺伝子座トランスジーンの作製 軽鎖小遺伝子座 κ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングし、Ｊκ−Ｃ領域に及ぶクローンを単離した。Ｊ κ1 を含む5.７ kb Cla I／Xho I断片をＪκ2-5とＣκを含む 13 kb XhoI断片と一緒にpGPlb中にクローニングし、そしてプラスミドpKcorを作製するのに使った。このプラスミドは、4.５ kbの５′隣接配列と９ kbの３′隣接配列と共に、Ｊ κ1-5、κインロトンエンハンサーおよびＣκを含有する。それはＶセグメントのクローニング用のユニークな５′Xho I部位と追加のシス作用性調節配列の挿入用のユニークな３′Sal I部位も有する。
【０３９５】
Ｖκ遺伝子 Ｖκ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングし、ヒトＶκセグメントを含むクローンを単離した。ＤＮＡ配列分析により機能的Ｖセグメントを同定した。それらのクローンは、TATAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12 bスペーサー−ノナマー配列を含有する。該クローンのうちの３つをマッピングし、配列決定した。該クローンのうちの２つ、65.5と65.8が機能的であり、それらがTA TAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12 bスペーサー−ノナマー配列を含有すると思われる。３つめのクローン65.4は、非規準的組換えヘプタマーを含むことからＶκＩ偽遺伝子をコードすると思われる。
【０３９６】
VkIIIファミリー遺伝子をコードする機能的クローンのうちの１つＶκ 65-8 を使って軽鎖小遺伝子座構成物を作製した。
【０３９７】
pkCI Ｖκ 65-8を含む7.5kb XhoI／Sa1 I断片を pKcorの５′Xho I部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC1（図38）を作製した。注入前にNotIでの消化により該トランスジーン挿入断片を単離した。
【０３９８】
精製した挿入断片を、受精した(C57BL/6×CBA)F2マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、次いでHogan ら(Methods of Manipulating the Mouse Embryo ，1986．Cold Spring Harbor Laboratory，New York)に記載の通りに、生存している胚を偽妊娠に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンプロット分折によりトランスジーン配列の存在について分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準に比較したバンド強度により、トランスジーンコピー数を評価した。それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよび Lane（Antibodies:A Laboratory Manual，1988．Cold Spring Harbor Laborator y，New York）により記載された通りに、トランスジーンによりコードされるヒトIgκタンパク質の存在についてELISAにより分析した。
【０３９９】
マイクロタイタープレートウエルをヒトIgκ（クローン 6E1，＃0173．AMAC I nc.，Westbrook，MEヒト.IgM（クローン AF6．＃0285．AMAC Inc., Westbrook ，ME）およびヒトIgGl（クローンJL512，＃0280,AMAC Inc.,WesLbrook，ME）に特異的なマウスモノクローナル抗体でコーティングした。血清試料を該ウエル中に系列希釈し、そしてマウス免疫グロブリンとの交差反応性を最少にするために予備吸着されているアフィニディー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg（多価）を使って特定の免疫グロブリンの存在を検出した。
【０４００】
図41は、８匹のマウス（I.D．=676．674，673，670．666，665．664 および49 ６）からの血清のELISAアッセイの結果を示す。それらのマウスの最初の７匹は ρKClトランスジーン挿入断片が注入された胚から発育し、そして８番目のマウスはphClトランスジーン（前記）のマイクロインジェクションにより生まれたマウスに由来する。pKC1注入胚からの７匹のマウスのうちの２匹（I.D．＃666と664 ）は、ＤＮＡサザンプロット分析により分析するとトランスジーン挿入断片を含んでおらず、５匹（I.D．＃676，674，673，670および665）は該トランスジーンを含んでいた。
【０４０１】
pKC1トランスジーン陽性動物の一匹を除く全てが検出可能なレベルのヒトIgκ タンパク質を発現し、残りの一匹の非発現性動物はＤＮＡサザンプロット分析に基づくと遺伝的モザイクであるらしい。pHCl陽性トランスジェニックマウスはヒトIgMとIgGlを発現するがIgκを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬の特異性を証明する。
【０４０２】
pkC2 Ｖκ65.5を含む８ kb XhoI／Sa1 Ｉ断片をpKC1の５′Xho I部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC2を作製した。２つのＶκセグメントを含む生成トランスジーン挿入断片をマイクロインジェクション前にNotIでの消化により単離した。
【０４０３】
pKVe2 この構成物は、Ｊκの５′に1.2 kbの追加配列を含みそしてＶκ65.8の３′の 4.5 kbの配列を欠いていること以外は、pKC1と同じである。該構成物は更に、マウス重鎖J−ｍイントロンエノハンサー〔Banrji ら、Cell 33:729-740（1982）〕を含む0.91 kb Xba I断片と、下流に挿入されたヒト重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサー〔Haydayら、Nature 307:334-340(1984)〕を含む゛1.4 kb MIuI−Hin dIII断片を含有する。この構成物を、対立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす軽鎖小遺伝子座の初期再配列を開始する可能性について試験する。異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３′κまたは重鎖エンハンサー〔Meyer およびNeuberger．EMBO J. 8:1959-1964（1989），Pettersonら、Nature 344:165-16 9（1990）：これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕を有する類似構成物を作製することができる。
【０４０４】
再配列された軽鎖トランスジーン ヒトＢ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するためにκ軽鎖発現カセットをデザインした。方策を図39に示す。ＰＣＲ増幅させた軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子65.5から単離した3.7 kbの５′隣接配列を含むベクターpK5nx中にクローニングする。次いで、Ｊκ2-4、Ｊκイントロンエンハンサー、Ｃκおよび9 kbの下流配列を含むベクターpK31sのユニークX hoI部位中に、５′転写調節配列に融合させたＶＪセグメントをクローニングする。生じたプラスミドは、再構成された機能的に再配列されたκ軽鎖トランスジーンを含有し、このトランスジーンは胚へのマイクロインジェクションのために Not Iで切り出すことができる。該プラスミドは追加のシス作用性調節配列の挿入のために３′末端にユニークSal I部位も含有する。
【０４０５】
ヒト脾臓ゲノムＤＮＡ由来の再配列されたκ軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに２つの合成オリゴヌクレオチド（o-130，o-131）を使った。オリゴヌクレオチドo- 130（gga ccc aga(g,c)ggg aac cat gga a(g,a)(g,a,T,c)）は、ＶκIII ファミリー軽鎖遺伝子の５′領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のＡＴＣと重複している。オリゴヌクレオチド o-131（gtg caa tca att ctc gag ttt ga c tac aga c）は、Ｊκ１の約150 bp ３′よりの配列に相補的であり、Xho I部位を含む。それらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｊκ１セグメントに連結された再配列されたＶκIII遺伝子に相当するヒト脾臓ＤＮＡからの0.７ kbのＤＮＡ断片を増幅する。
【０４０６】
ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをNcoIとXhoＩで消化し、個々のＰＣＲ生成物をプラスミドpNNO3中にクローニングした。５つのクローンのＤＮＡ配列を決定すると、機能的ＶＪ連結（転写解読枠）を有する２つのクローンが同定された。追加の機能的に再配列された軽鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクローンは上記軽鎖発現カセット（図39）中に個別にクローニングすることができる。再配列された軽鎖構成物を用いて生産されたトランスジェニックマウスを重鎖小遺伝子座トランスジェニックマウスと交配せしめることにより、一次レパートリーの多様性の全てが重鎖により与えられる完全にヒトの抗体のスペクトルを発現するマウス株を生産することができる。
【０４０７】
軽鎖多様性の１つの起源は体細胞突然変異からであることができる。全ての軽鎖が様々な異なる重鎖と結合する能力に関して同等であるわけではないので、各々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス抹を生成せしめ試験することができる。この方策の利点は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用とは反対に、容易に重鎖と対を作りすぐに重鎖ＶＤＪ連結が起こるような軽鎖を有することから生まれる軽鎖対立遺伝子およびイソタイプ排除の増加である。この組み合わせは、完全にヒトの抗体を発現するＢ細胞の頻度の増加をもたらし、かくしてヒトIg発現性ハイプリドーマの単離を容易にすることができる。
【０４０８】
プラスミドpIGM1，pHCl，pIGH1，pKC1およびpKC2のNot I挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製されたそれらの挿入断片を、受精した(C57BL/6×CBA)F2マウスの前核中にマイクロインジェクトし、そしてHogan らにより記載された通りに〔Hogan ら、Methods of Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory．New York(1986)〕、生存している胚を偽妊娠雌中に移した。
【０４０９】
［実施例９］
相同組換えによるマウスκ軽鎖遺伝子の不活性化 この実施例は、胎児性幹(ES)細胞中での相同組換えによるマウス内因性κ遺伝子座の不活性化に次いで、不活性化されたκ対立遺伝子を有する標的ES細胞を初期マウス胚（胚盤胞）中に注入することによるマウス生殖細抱系中への変異遺伝子の導入を記載する。
【０４１０】
方策は、Ｊκ遺伝子とＣκセグメントに及ぶ遺伝子座の4.5 kbセグメントが削除されそして選択マーカーneoにより置き換えられているマウスκ遺伝子座に相同なＤＮＡ配列を含むベクターを用いた相同組換えによりＪκ遺伝子とＣκ遺伝子を欠失せしめることである。
【０４１１】
κ標的ベクターの作製 プラスミドpGEM7(KJ1)（M.A．Rudnicki,Whitehead Institute）は、クローニンダベクタ−7Zf(÷)中のマウスホスホグリセレートキナーゼ(pgk)プロモータ−〔Xba I／TaqI断片；Adra，C.N.ら、Gene 60:65-74（1987）］の転写調節下に、トランスフェクトされたES細胞の薬剤選択に使うネオマイシン耐性遺伝子（neo ）を含む。このプラスミドは、マウスpgk 遺伝子の３′領域に由来する、neｏ遺伝子にとって異種のポリアデニル化部位〔Pvu II／HindIII 断片.Boer，PH.ら、 Biochem1cal Genetics 28:299-308（1990）〕も含む。このプラスミドをκ福的ベクターの作製のための出発点として使った。第一段階はneo発現カセットの３ ′のκ遺伝子座に相同な配列を挿入することであった。
【０４１２】
Ｃκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ５′−GGC TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG −３′ とＪκ遺伝子でグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ５′-CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGT AAG −３′ を使って、肝臓ＤＮＡから誘導されたゲノムファージライブラリーから、マウス κ鎖配列（図25a）を単離した。
【０４１３】
陽性ファーンクローンから２断片において、即ち1.2 kb BgIII／Sac I断片と6 .3 kb SacI断片として、マウスＣκセグメントの３′に及ぶ8 kb BgIII／SacI断片を単離し、それをBgIII／Sac Iで消化されたpGEM(KJ1)中にサブクローニングし、プラスミド pNEO-K3′を作製した（図25b）。
【０４１４】
Ｊκ領域の５′に及ぶ1.2 kb EcoRI／Sph I断片も陽性ファージクローンから単離した。この断片のSphI部位にSphI／Xba I／Bgl II／EcoRI アダプターを連結せしめ、生じたEcoRI 断片をneo遺伝子および下流の３′κ配列と同じ５′−３′方向で、EcoRIで消化された pNEO-K3′に連結せしめ、pNEO-K5′3′（図25 ｃ）を作製した。
【０４１５】
次いで、Mansourら、Nature 336:348-352（1988）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、相同組換え体を有するES クローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を含めた。プラスミドpGEM7(TK)からHSV TKカセットを得た。このカセットは、pGEM(KJ1)について上述したのと同様に、マウスpgk プロモーターとポリアデニル化配列とにより隣接されたHSV TK遺伝子の構造配列を含む。pGEM7(TK)のEcoRI部位をBamHI部位に変更し、そしてTKカセットをBamHI ／HindIII 断片として切り出し、pGP1b中にサブクローニングしてpGP1b-TKを作製した。このプラスミドをXho I部位のところで線状化し、Ｊκの５′からのゲノム配列とＣκの３′からのゲノム配列とにより隣接されたneo遺伝子を含む、p NEO-K5’3’由来の XhoI断片をpGP1b-TK中に挿入し、標的ベクターJ/C K1（図25 ｄ）を作製した。J/C K1を用いた相同組換え後のゲノムκ遺伝子座の推定構造を 図25eに示す。
【０４１６】
κ対立遺伝子の標的不活性化によるES細胞の作製および分析 使用したES細胞は、本質的には記載された通りに〔Robertson，E．J.，Terato carcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach，E.J.Robertson 編（Oxford:IRL Press）71-112頁(1987)〕、分裂上不活性なSNL76/7 支持細胞層〔McMahonおよびBradley，A Cell 62:1073-1085（1990）〕上で増殖させたAB-1 系であった。他の適当なES系としては、E14系〔Hooperら、Nature 326:292-295 (1987)〕、D3系〔Ｄoeｔschmanら、J.Embryol．Exp．Morph． 87:28-45(1985) 〕.、およびCCE 系〔Robertson ら、Neture 323:445:448(1986)〕が挙あげられるが、それらに限定されないい。特異的な標的変異を有するES細胞からマウス系統をうまく作製できるのは、ES細抱の多分化能性（即ち、宿主胚盤胞中に注入されれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の生殖細胞に貢献することができるそれらの能力）に依存している。
【０４１７】
任意の与えられたES細胞系の多分化能性は、培養時間およびそれに取り払った注意によって異なり得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイは、使用することになっているES細胞の特定集団がESゲノムの生殖細胞伝達を行うことができるキメラ体を生成することができるかどうかを決定することである。この理由により、遺伝子標的の前に、AB-I細胞の親集団の一部をC57O1/6J胚盤胞中に注入し、該細胞がキメラマウスを生成できるかどうか、およびそれらのキメラ体の大部分がESゲノムを子孫に伝達できるがどうかを確かめる。
【０４１８】
κ鎖不活性化ベクタ−J/C K1を NotIで消化し、そして記載された方法〔Hasty ，P.R．ら、Nature 350:243-246(1991)〕によりAB-1細胞中にエレクトロポレートぜしめた。エレクトロポレートされた細胞を100 mm皿上に２〜5×105細胞／皿の密度で塗抹した。24時間後、G418（200μg/mlの活性成分）およびFIAU（0.5μ Ｍ）を培地に添加し、10〜11日に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０４１９】
サザンブロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Laird，P.W.ら、Nucl．Acids Res． 19:4293 (1991)〕クローンからＤＮＡを単離し、XbaＩで消化し、そして標特的プローブとして図25ｅに指摘の800 bpE coRI／Xba Ｉ断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の3.7kb XbaＩ断片、および標的ベクターと相同組換えされた遺伝子座中の標徴的な1.8 k bバンドを検出した（図25ａおよびｅを参照のこと）。サザンブロット分析によりスクリーニングした 901個のG４18およびFIAU体制クローンのうち、７つのクローンがκ遺伝子のうちの１つへの相同組換えを示す1.8 kb XbaＩバンドを表した。それらの４つのクローンを更に BgIII．Sac IおよびPstＩ酵素で消化し、 κ遺伝子のうちの１つに該ベクターが相同的に組み込まれたことを確認した。標徴的800 bp EcoRI／Xba Ｉ断片（プローブＡ）を用いて探査すると、野生型ＤＮＡのBgIII．Sac ＩおよびPst Ｉ消化物がそれぞれ4.1，5.4，および7 kbの断片を生成し、一方標的されたκ対立遺伝子の存在はそれぞれ2.4，7.5および5.７ k bの断片により指摘された（図25ａおよびｅを参照のこと）。XbaＩ消化物により検出された７つの陽性クローンの全てが、κ軽鎖のところでの相同組換えに標徴的である期待の BgIII，Sac Ｉおよび Pst Ｉ制限断片を示した。
【０４２０】
不活性化されたκ鎖を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたESクローンのうちの５つを、記載の如く〔8radle y．A．，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E .J．Robertson 編 (Oxford: IRL Press)，113-151 頁(1987)〕C57B1/6J胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子官に移し、注入ES細胞から誘導された細胞と宿主の胚盤胞との混合物に由来するキメラマウスを作製丁る。黒いC57B1/6J背景上において、ES細抱系由来のアグーチ皮膜着色の量により、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、それらの大部分が皮膜着色への過剰のES細胞の貢献（70％以上）を示した。A81 ES細胞はXY 細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が、コロニー形成された雄ES細胞による雌胚の性転換のために雄であった。
【０４２１】
雄のキメラをC57BL/6Jと交配さぜ、ESゲノムの生殖細胞伝達の指標である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの２つからのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。κ遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローンに標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50％有した。尾部生検試料からのBgIII消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図25ｅ）を使って、標的遣伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50 ％が4.1 kbの野生型バンドに加えて2.4 kbのハイブリダイズするBgIIIバンドを示した。この結果は、標的されたκ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
【０４２２】
該変異に対して同型接合性のマウスを生成せしめるために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫のκ遣伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から３つの遺伝子型か誘導された：２コピーの正常κ遺伝子座を有する野生型マウス、１コピーの標的κ遺伝子と１つのＮＴκ遺伝子を有する異型接合体、およびκ変異に対して同型接合性であるマウス。それらの後者のマウスからのκ配列の欠失は、Ｊκに特異的なプローブ（ブローブＣ、図25ａ）を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。該Ｊκプローブのハイブリダイゼーションは異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料に観察されたが、一方で同型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかった。これは、標的変異の結果としての欠失によりκ遺伝子座の両方のコピーが不活性化されている新規マウス株の発生を証明する。
【０４２３】
［実施例１０］
相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活性化 この実施例は、胎児性幹(ES)細胞中での相同組換えによる内因性マウス免疫グロブリン重鎖遣伝子の活性化を記載する。方策は、ＪH領域が削除されそして選択マーカー遺伝子neoにより置き換えられている重鎖配列を含むベクターとの相同組換えにより内因性重鎖Ｊセグメントを欠失せしめることである。
【０４２４】
重鎖標的ベクターの作製 ＪH４特異的オリゴヌクレオチドプローブ ５′−ACT ATG CTA TGG ACT GGG GTC AAG GAA CCT CAG TCA CCG −３´ を使って、03 ES 細胞系〔Gossler ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:906 5-9069（1986）〕から誘導されたゲノムファージライブラリーから、ＪH領域を含むマウス重鎖配列（図26ａ）を単離した。
【０４２５】
ＪH領域に及ぶ3.5 kbのゲノムSac I／Stu I断片を陽性ファージクローンから単離し、それをSac.I／Sma Iで消化されたpUC18 中にサブクローニングした。生じたプラスミドをpuc18ＪHと命名した。トランスフェクトされたES細胞の薬剤選別に用いるネオマイシン耐性遺伝子(neo)は、プラスミド pGEM7 (KJI)の修復変形から誘導された。文献中の報告〔Yenofskiら、Proc．Natl．Acad．Sci.U.S. A．87: 3435-3439(1990)〕は、pGEM7（KJI）中に使用されるneo遺伝子の源として働いた pMClneo〔ThomasおよびCappechi．Cell 51: 503-512(1987)〕を含む幾つかの常用の発現ベクターの neoコード配列の点変異を証明している。
【０４２６】
この変異は neo遺伝子産物の活性を減少させるが、該変異を含む制限断片を野生型 neoクローンからの対応配列と置き換えることにより修復された。pGEM7（K Jl）中のHindlll部位を合成アダプターの付加によってSalＩ部位に変更し、そしてXba I／Sal Iでの消化によりneo 発現カセットを切り出した。次いで neo断片の両端をＤＮＡ polＩのクレノウ形での処理により平滑末端化し、pUC13 JHの Nae I部位中にサブクローニングし、プラスミドpUC18 ＪH -neo（図26ｂ）を作製した。
【０４２７】
標的ベクターの更なる作製は、プラスミドpGPlbの誘導体において行った。pGP lbを制限酵素 Not Iで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオチド 5′ −GGC CGC TCG ACG ATA GCC TCG AGG CTA TAA ATC TAG AAG AAT TCC AGC AAA GC T TTG GC- 3´ と連結せしめた。
【０４２８】
生じたプラスミド（pGETと命名）を使ってマウス免疫グロブリン重鎖標的構成物を構築した。
【０４２９】
Mansour ら、Nature 336: 348-352(1988)により記載されたようにして、相同組換え体を有するESクローンの冨化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を含めた。プラスミドpGEM(TK)からE coRIとHindIIIでの消化によりHSV TK遺伝子を得た。このTK DNA断片をpGMTのEco RI 部位とHindIII部位との間にサブクローニングし、プラスミドpGMT-TK（図26 ｃ）を作製した。
【０４３０】
標的配列に対する広範な相同性領域を提供するために、陽性ゲノムファージクローンから Xho IでのＤＮＡの限定消化および Xba Iでの部分消化により、ＪH 領域の５′に位置する5.9 kbのゲノムXba I／Xho I断片を誘導した。図26ａに示されるように、このXba I部位はゲノムＤＮＡ中には存在せず、むしろ陽性ファージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐに隣接するファージ配列から誘導される。この断片をXba I／Xho Iで消化されたpGMT-TK中にサブクローニングし、プラスミド pGMT-TK-JH 5′（図27ｄ）を作製した。
【０４３１】
作製の最終段階は、neo遺伝子および隣接するゲノム配列を含むpUC18 ＪH-neo からの2.8 kb EcoRI断片の切除を含んだ。この断片をクレノポリメラーゼにより平滑末端にし、同様に平滑末端化されたpGMT-TK-JH ５′のXhoＩ部位中にサブクローニングした。生じた構成物ＪH KOl（図27ｅ）は、ＪH遺伝子座を隣接する6. 9 kbのゲノム配列を含み、neo 遣伝子が中に挿入されているＪH 領域に及ぶ2.3 kbの欠失を有する。図27fは、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎖遺伝子の構造を示す。
【０４３２】
［実施例11］
標的されたES細胞の生産および分析 本質的には記載された通りに〔Robertson．E.J.(1987) Terato-carcinomas an d Embryonic Stem Cells:A Practical Approach， E.J.Robertson編 (Oxford: IRL Press)，71-112頁〕、分裂上不活性なSNL76/7 支持細胞層〔McMahon および Bradley，Cell 62: 1073-1085(1990)〕上でAB-1 ES細胞を増殖させた。前の実施例に記載した通り、標的指向性構成物ＪH KOl によるES細胞のエレクトロポレーションの前に、ESゲノムの生殖細胞伝達能力を有することが証明されたAB-1由来のキメラの作製により、ES細胞の多分化能力を決定した。
【０４３３】
重鎖不活性化ベクタ−ＪH.KOl をNot Iで消化し、そして記載された方法〔Has ty ら、Nature 350: 243-246 (1991)〕にこよりAB-1細胞中にエレクトロポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を100 mm皿上に1〜2×105細胞／皿の密度で塗抹した。24時間後、G418（200 mg／mlの活性成分）およびFIAU（0.5m M）を培地に添加し、８〜10日間に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０４３４】
サザンプロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Laird ら、Nucl．Acids Res． 19:4293 (1991)〕クローンからＤＮＡを単離し、Stu Iで消化し、そしてプローブＡとして図27ｆに示される500 bp EcoRI／S tu I断片を用いて探査した。このプローブは野生型遣伝子座中の 4.7 kb StuI断片を検出し、一方で3 kbバンドは標的指向ベクターと内因性配列の相同組換えに標徴的である（図26ａおよび27ｆを参照のこと）。サザンブロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした525 個のG418およびFITU二重耐性クローンのうち、12個が標的指向ベクターとの組換えに標徴的な3 kb断片を含むことがわかった。それらのクローンがＪH 遣伝子座のところに期待の標的現象（図27ｆに示されるような）示すことは、HindIII、Spe IおよびHpa Iでの更なる消化により確認された。
【０４３５】
Hindlll、Spe IおよびHpa Iで消化されたＤＮＡのサザンプロットへのプローブＡ、（図27ｆ参照）のハイブリダイゼーションは、野生型遣伝子座についてはそれぞれ2.3 kb、＞10 kbおよび＞10 kbのバンドをもたらし、一方標的された鎖遺伝子座についてはそれぞれ5.3 kb、3.8 kbおよび1.9 kbのバンドが予想される（図27ｆ参照）。Stu I消化物により検出された12個の陽性クローンの全てが、標的ＪH遺伝子に標徴的な推定HindIII、Spe IおよびHpa Iバンドを示した。加えて、neo-持異的プローブ（プローブＢ、図27ｆ）を使った12個のクローン全ての Stu I消化物のサザンプロット分析は3 kbの推定断片のみを生じ、それらのクローンが各々標的指向ベクターの単一コピーを含有することを証明した。
【０４３６】
ＪH 欠失を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたESクローンのうちの３つを解凍し、記載の如く- 〔Bradley，A．(1987)Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells: A Practica lApprocach，E．J．Robertson編 (Oxford: IRL Press)．113-151 頁(1987)〕C5 7B1/6J胚盤胞子中に注入し、そして偽妊娠雌の子官に移した。黒色C5781/6J背景上において、ES細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観的に同定する。２つの標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、３つ目の標的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらのキメラ体の大部分が皮膜着色へのES細胞のかなりの貢献度（70％以上）を示した。ABl ES細胞はXY細胞系であり、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄ES細胞により性転換されたために雄であった。雄キメラをC57BL/6J雌と交配させ、ESゲノムの生殖細胞伝達の標徴である優性のアグーテ皮膜色の存圧について子孫を観察する。
【０４３７】
それらのクローンのうちの両方からのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。重鎖遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローン中に標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50％有した。尾部生検試料からの Stu I消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図27ｆ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50％が4.7 kbの野生型バンドに加えて約3 kbのハイブリダイズする。Stu Iバンドを示した。この結果は、標的されたＪH 遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
【０４３８】
該変異に対して同型接合のマウスを作製するために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫の重鎖遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から３つの遣伝子型が誘導された：２コピーの正常ＪH 遺伝子座を有する野生型マウス、該遺伝子の１つの標的コピーと１つの正常コピーを有する異型接合体、およびＪH 変異に対して同型接合であるマウス。それらの後者のマウスからのＪH 配列の欠失は、ＪH に特異的なプローブ（プローブＣ、図26）を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料において4.7 kb断片へのＪH プローブのハイブリダイゼーションが観察されたが、一方でＪH 変異体同型接合体からの試料には全くシグナルが検出されなかった。これは、ＪH 配列の欠失により重鎖遺伝子の両方のコピーが変異されている新規マウス株の生成を証明する。
【０４３９】
［実施例12］
重鎖小遺伝子座トランジーン Ａ．大型ＤＮＡ配列をクローニングするためのプラスミドベクターの作製 1. pGPla プラスミドpBR322を EcoRIと StyＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリゴ−42 ５′-caa gag ccc gcc taa tga gcg ggc ttt ttt ttg cat act gcg gcc gct −３′ オリゴ−43 ５′−aat tag cgg ccg cag tat gca aaa aaa agc ccg ctc att ag g cgg gct −３′ と連結せしめた。
【０４４０】
生じたプラスミド pGPlaを、稀少切断性制限酵素 NotＩにより切除することができる非常に大型ＤＮＡ構成物をクローニングするために改変する。それは、tr pA遺伝子に由来する強力な転写終結シグナル〔Christieら、Proc．Natl．Acad.S ci．USA 78:4180 (1981)〕の下流に（アンピシリン耐性遺伝子AmpRに関して）N otＩ制限部位を含む。この終結シグナルは、AmpR遺伝子からの読み通し転写を排除することにより、NotＩ部位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下させる。加えて、このプラスミドは、pBR322コピー数調節領域を保持しているために pUCプラスミドに比較して低コピー数である。この低コピー数も挿入配列の潜在的毒性を更に低下させ、そしてＤＮＡ複製による大型挿入断片に対する選択を減少させる。ベクター pGPlb，pGPlc，pGPldおよびpGPlf はpGPla から誘導され、そして異なるポリリンカークローニング部位を含む。そのポリリンカー配列を下記に与える。
【０４４１】
【化１】
2011236257.tif 000002
【０４４２】
それらの各プラスミドは大型トランスジーン挿入断片の作製に利用することができ、該挿入断片は NotIで切り出すことができ、その結果トランスジーンＤＮＡをマイクロインジェクション前に、ベクター配列から精製することができる。
【０４４３】
2． pGPlb pGPlaを NotIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：オリゴ−47 ５′−ggc cgc aag ctt act gct gga tcc tta att aat cga tag tg a tct cga ggc−３′ オリゴ−43 ５′−ggc cgc ctc gag atc act gat taa tta agg atc cag cag ta a gct tgc −３′ と連結せしめた。
【０４４４】
生じたプラスミド pGPlbは、NotIにより隣接された短いポリリンカー領域を含む。これは、NotIにより切除することができる大型挿入断片の作製を容易にする。
【０４４５】
3．pGPe 次のオリゴヌクレオチドオリゴ−44 ５′−ctc cag gat cca gat atc agt acc tga aac agg gct tgc −３′ オリゴ−45 ５′−ctc gag cat gca cag gac ctg gag cac aca cag cct tcc −３′ を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓ＤＮＡ由来の免疫グロブリン重鎖３′エンハンサー〔S．Pettersonら、Nature344:165-168 (1990)〕を増幅せしめた。
【０４４６】
増幅生成物を BamHIとSph．Iで消化し、そして BamHI／Sph Iで消化されたpNN O3（pNNO3 は、記載順に次の制限部位：Not I，BamHI，Nco I，Cla I，EcoRV，X ba I，Sac I，Xho I，Sph I，Pst I，Bgl II，EcoRI，Sma I，Kpn I,HindIII および Not Iを有するポリリンカーを含む pUC由来のプラスミドである）中にクローニングした。生じたプラスミドpRE3を BamHIとHindIII で消化し、そしてラットＩg重鎖３′エンハンサーを含む挿入断片を、BamHI／HindIIIで消化されたpGP lb中にクローニングした。生じたプラスミドpGPe（図28および（化２）及び（化３））は、配列をクローニングすることができそして次いで Not I消化によって３′エンハンサーと一緒に切り出すことがかできる幾つかのユニーク制限部位を含有する。
【０４４７】
ベクターｐＧＰｅの配列
【０４４８】
【化２】
2011236257.tif 000003
【０４４９】
Ｂ．IgMを発現する小遺伝子座トランスジーンpIGMlの作製 
1. Ｊ−μ定常領域クローンの単離およびpJMlの作製 
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alt o，CA)中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−１ ５′−gga ctg tgt ccc tgt gtg atg ctt ttg atg tct ggg gcc aa g−３′ を用いてスクリーニングし、そしてファージクローンλ1.3を単離した。６つのＪセグメント全部並びにＤセグメントOHG52 および重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを含む、6 kbのHindIII／Kpn I断片をこのクローンから単離した。同じライブラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−２ ５′−cac caa gtt gac ctg cct ggt cac aga cct gac cac cta t ga −３′ を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ2.1を単離した。μスイッチ領域およびμ定常領域エクソンの全部を含む、10.5 kbのHindIII ／Xho I断片をこのクローンから単離した。それらの２断片を、Kpn I／Xho Iで消化されたpNNO3 と一緒に連結せしめ、プラスミドpJMIを得た。
【０４５０】
2． pJM2 
ファージクローンλ2.1から4 kbのXho I断片を単離した。該断片は、ある種の IgO発現Ｂ細胞中でのμ遺伝子のδ関連欠失に関与するいわゆるΣμ要素〔HYasu iら、Eur．J．Immunol 19:1399 (1989)；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を含む、pJMlの配列のすぐ下流の配列を含有する。この断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、そして Xho Iで切断されクレノウで処理されたpJMlと連結せしめる。生じたプラスミドpJM2（図29）は、内部の Xho I部位を失っているが、クレノウ酵素による不完全な反応の結果として３′Xh o Iを保持している。pJM2は完全なヒトＪ領域、重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッチ領域およびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ関連欠失に関与する２つの0.4 kbの直接反復σμおよびΣμを含有する。
【０４５１】
3． Ｄ領域クローンの単離およびpOH1の作製 
次のヒトＤ領域特異的オリゴヌクレオテドオリゴ−４ ５′−tgg tat tac tat ggt tcg ggg agt tat tat aac cac agt gt c −３′ を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをＤ領域クローンについてスクリーニングした。ファージクローンλ4.1とλ4.3を単離した。Ｄ要素ＤK1．ＤN1およびＤ M2〔Y．Ichihara ら、EMBO J．7: 4141 (1988)〕を含む5.5 kbの Xho I断片をファージクローンλ4.1から単離した。Ｄ要素ＤLR1，ＤXP1，ＤXP'1およびＤA1を含む上流の隣接5.2 kb Xho I断片をファージクローンλ4.3から単離した。それらのＤ領域 Xho I断片の各々をプラスミドベクターρSP72（Promega，Madison、 WI)のSal I部位中にクローニングし、２配列を結合する Xho I部位を破壊した。次いで上流断片を Xho IとSma Iで切り出し、下流断片を EcoRVと Xho Iで切り出した。得られた単離断片を Sal Iで消化されたpSP2と一緒に連結せしめ、プラスミドpOH1を与えた。pOH1は、少なくとも７つのＤセグメントを含みXho I（５ ′）およびEcoRV（３′）で切り出すことができる10.6kbの挿入断片を含有する。
【０４５２】
4. pCOR1 
プラスミドpJM2をAsp718（Kpn Iのアイソシゾマー）で消化し、そしてDNA-ポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて突出末端をフィルインした。次いで生じた DNA をCla Iで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断片をpOH1の XhoI／EcoR V 挿入断片および XhoI／Cla I消化pGPeと連結せしめ、pCOR1 を作製した（図30 ）。
【０４５３】
5． pVH251 
２つのヒト重鎖可変領域セグメントＶH 251 とＶH 105〔Humphrise ら、Hatur e 331:446（1988)〕を含む10.3 kbのゲノムHindIII断片をpSP72中にサブクローニングし、プラスミドpVH251を与えた。
【０４５４】
6. pIGM1 
プラスミドpCOR1 を XhoIで部分消化し、そしてpVH251の単離Xho I／Sal I挿入断片を上流の XhoI部位にクローニングし、プラスミド pIGM1（図31）を作製した。pIGM1 は、下記の配列要素の全邪が NotIでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離することができそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトすることができるように、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪH セグメント全部、ヒトμ エンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部およびヒトΣμ要素を、ラット重鎖３′エンハンサーと共に含有する。
【０４５５】
Ｃ．IgMとIgGを発現する小遺伝子座トランスジーンpHClの作製
【０４５６】
1. γ定常領域クローンの単離 
次のヒトIgG 定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドオリゴ−29 ５′−cag cag gtg cac acc caa tgc cca tga gcc cag aca ctg ga c −３′ を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。ファージクローンλ29 4とλ29.5を単離した。γスイッチ領域を含むファージクローンλ29.4の 4 kbHi ndIII断片を使って、ファージベクターラムダ FIXTMIII (Stratagene，La JoIIa ，CA)中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。ファージクローンλSgl.13を里離した。異なるγクローンのサブクラスを決定するために、鋳型として上記３つのファージクローンの各々のサブクローンを使ってそしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチドオリゴ−67 ５′−tga gcc cag aca ctg gac −３′ を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。
【０４５７】
ファージクローンλ29.５とλS γ1.13は両方ともγ1サブクラスであると決定された。
【０４５８】
2. oγel 
γ１コード領域を含むファージクローンλ29.5の7.8 kb Hind III 断片をpUC1 8中にクローニングした。生じたプラスミドpLT1を Xho Iで消化し、クレノウ断片で処理し、そして再連結せしめて内邪Xho I部位を破壊した。生じたクローンp LTlxkをHindIIIで消化し、挿入断片を単離し、pSP72 中にクローニングしてプラスミドクローンpLTlxks を作製した。ポリリンカーXho I部位とヒト配列由来のB amHI 部位のところでのpLTlxksの消化は、γ１定常領域コードエクソンを含む7. 6 kb断片を与えた。この7.6 kb Xho I／BamHI 断片を、ファージクローンλ29.5 からの隣接の下流4.5 kb BamHI断片と一緒に、Xho I／BamHI で消化されたpGPe 中にクローニングし、プラスミド pγe1を作製した。pγe1は、ラット重鎖３′ エンハンサーに連結された、5 kbの下流配列と共にγ１定常領域コードエクソンの全部を含有する。
【０４５９】
3. pγe2 
γ１スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物(sterile trans-cript)〔P．Si derasら、International Immunol. 1:631(1989)〕の第一エクソンとを含む5.3 k bのHindIII 断片をファージクローンλSγ1.13から単離し、そして挿入断片の５ ′末端の近隣にポリリンカー Xho I部位を有するpSP71 中にクローニングし、プラスミドクローンpSγlsを作製した。pSγlsの Xho I／Sal I挿入断片をXho Iで消化されたpγe1中にクローニングし、プラスミドクローンpγe2を作製した（図 32）。pγe2は、ラット重鎖３′エンハンサーに連結された、下流の5kb配列と共に、γ１定常領域コードエクソン全部並びに上流のスイッチ領域および緊殖不能転写物エクソンを含有する。
【０４６０】
4. pHC1 
プラスミドpIGM1 を Xho Iで消化し、43 kb 挿入断片を単離し、そして Xho I で消化されたpγe2中にクローニングし、プラスミドpHC1を作製した（図31）。
【０４６１】
pHC1は、下記の配列要素の全部が Not Iでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製することができるように、ラット重鎖３′エンハンサーと共に、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪHセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ 要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（関連のスイッチ領域および繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。
【０４６２】
Ｄ．IgM とIgG を発現する小遺伝子鎖トランスジーンpHC2の作製 
【０４６３】
１．ヒト重鎖Ｖ領域遺伝子 VH49.8 の単離 ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーラムダ FIXTM II(Stratagene，La Jolla,C A)を、次のヒトVH1 ファミリー特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−49 5'-gtt aaa gag gat ttt att cac ccc tgt gtc ctc tcc aca ggt g tc−3' を用いてスクリーニングした。
【０４６４】
ファージクローンλ49.8を単離し、そして可変セグメントVH49.8を含む6.1 kb Xba I断片をpNNO3 中にサブクローニングし（ポリリンカー Cla I部位がVH49.8 の下流にそしてポリリンカー Xho I部位が上流にくるように）、プラスミドpVH4 9.8を作製した。この挿入断片の800 bp領域を配列決定すると、VH49.8は転写解読枠並びに完全なスプライシングシグナルおよび組換えシグナルを有することがわかり、よって該遺伝子が機能的であることを指摘する（表２）。 
【０４６５】
ヒトＶHＩファミリー遺伝子ＶH49.8の配列 
【０４６６】
【化３】
2011236257.tif 000004
【０４６７】
2．pV2 
プラスミドｐUCl2中にサブクローニングされたヒトＶH IVファミリー遺伝子Ｖ H4-21〔I．Sanz ら、EMBO J．8: 3741 (1989)〕を含む4 kb Xba Iゲノム断片をS ma IとHindIII で切り出し、ポリメラーゼIのクレノウ断片で処理した。平滑末端化された断片を、Cla Iで消化されクレノウで処理されたpVH49.8 中にクローニングした。生じたプラスミド pV2は、挿入断片の３′末端のユニーク Sal I部位および５′末端のユニーク Xho I部位を使って、同じ方同でVH4-21[の上流に連結された、ヒト重鎖遺伝子VH49.8を含む。
【０４６８】
3．pSγ1-5' 
近隣の上流3.1 kb Xba I断片と一緒に0.7 kb Xba I／HindIII 断片（プラスミド pγe2中の 5.3 kb γ１スイッチ領域含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接した配列を表す）をファージクローンλSg1.13から単離し、そしてHindIII／XbaI で消化された pUCl8ベクター中にクローニングした。生じたプラスミドpSγ1-5' は、γ１イソタイプにスイッチする前のＢ細胞中に見つかる繁殖不能転写物(ste rile transcript)〔P. Siderasら、International Immunol.，1: 631 (1989)〕の開始部位の上流の配列を表す3.8 kb挿入断片を含む。該転写物はイソタイブスイッチの開始に関係があり、そして上流のシス作用性配列はしばしば転写調節に重要であるので、繁殖不能転写物の正しい発現および関連するスイッチ組換えを促進するためにそれらの配列がトランスジーン構成物中に含まれる。
【０４６９】
4．pVGEl 
pSγ1-5'挿入断片を Sma IとHindIII で切り出し、クレノウ酵素で処理し、そして次のオリゴヌクレオチドリンカー 5′−ccg gtc gac cgg − 3′ と連結せしめた。この連結生成物を Sal Iで消化し、Sal Iで消化されたpV2 に連結せしめた。
【０４７０】
生じたブラスミドpVP は、２つの機能的ヒト可変遺伝子セグメントVH49.8とVH 4-21（表２（化４）及び（化５）参照）の下流に連結された3.8 kbのγ１スイッチ５′隣接配列を含む。Sal Iでの部分消化および Xho Iでの完全消化の後、アガロースゲル上での15kb断片の精製により、pVP 挿入断片を単離する。次いで該挿入断片を pγe2の Xho I部位中にクローニングし、プラスミドクローンpVGE1 （図33）を作製する。pVGE1 は、ヒトγ１定常遺伝子および関連のスイッチ領域の上流に２つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含有する。可変領域と定常領域との間のユニークSal I部位を用いて、Ｄ，Ｊおよびμ遺伝子セグメントをクローニングすることができる。γ１遺伝子の３′末端にラット重鎖３′エンハンザーが連結され、そして挿入断片全体は Not I部位により隣接される。
【０４７１】
5．pHC2 
プラスミドクローンpVGE1をSal Iで消化し、pIGM1 のXho I挿入断片をその中にクローニングした。生じたクローンpHC2（図31）は、４つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのＤセグメント、６つのヒトＪHセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（繁殖不能転写物開始部位の上流の4 kb隣接配列と共に、関連のスイッチ領域と繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。
【０４７２】
それらのヒト配列は、前記配列要素全部を Not Iでの消化によりベクター配列を含まない単一鎖上に単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を生せしめることができるように、ラット重鎖３′エンハンサーに連結される。該挿入断片の５′末端のユニーク Xho I部位を使って、追加のヒト可変遺伝子セグメントをその中にクローニングし、この重鎖小遺伝子座の組換え多様性を更に増大させることができる。
【０４７３】
Ｅ．トランスジェニックマウス 
【０４７４】
プラスミドpIGM1 およびpHC1の Not I挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製された挿入断片を、受精した（C57BL/6×CBA ）F2マウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし、そして生存している胚を、Hogan らにより記載された通りに（B．Hogan，F．Costantini およびE．Lacy ，Methods of Manipulating the Mouse Embryo，1986，Cold Spring Harbor Lab oratory．New York）偽妊娠した雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンプロット分析によりトランスジーン配列の存在について分折した。既知量のクローン化ＤＮΛを含有する対照標準物に比較したバンド強度により、トランスジーンコピー数を評価した。
【０４７５】
３〜８週齢において、それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよびLa ne（E．Harlow およびD．Lane,Antibodies: A Laboratory Manual，1988，ColdS pring Harbor Laboratory, New York）により記載されたように、トランスジーンによりコードされるヒトIgＭおよびIgＧ１の存在について ELISAによりアッセイした。マイクロタイタープレートのウエルを、ヒトIgＭに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンAF6，＃0285，AMAC，Inc．Westbrook, ME）およびヒトIgＧに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンJL512，＃0280，AMAC，I nc.Westbrook, ME）によりコーティングした。該ウエル中に血清試料を連続的に希釈し、予備吸着させることによってマスウ免疫グロブリンとの交差反応性を最小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg （多価）を用いて、特異的免疫グロブリンの存在を検出した。
【０４７６】
表１と図34は、プラスミドpHC1のトランスジーン挿入断片を注入した胚から発育した２匹の動物の血清中のヒトIgＭおよびIgＧ１の存在についてのELISAアッセイの結果を示す。このアッセイにより試験した対照の非トランスジェニックマウスは全て、ヒトIgＭおよびIgＧの発現について陰性であった。pIGN1 Not I挿入断片を含有する２系統のマウス（系統＃6と15）はヒトIgＭを発現するがヒトI gＧ１を発現しない。我々はpHC1挿入断片を含む６つの系のマウスを試験した。その結果、４系統（系＃26，38，57および122）がヒトIgＭとヒトIgＧ１の両方を発現し、２系統のマウス（系統＃19および21）は検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。
【０４７７】
ヒト免疫グロブリンを発現しなかったpHC1トランスジェニックマウスは、マイクロインジェクトした胚から直接発育したものであり、該トランスジーンの存在についてモザイクであり得る、いわゆるＧ0マウスであった。サザンブロット分析は、それらのマウスの多くが細胞あたり該トランスジーンの１つまたは少数のコピーを含むことを示した。pIGM1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭ、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ１の検出は、トランスジーン配列がＶＤＪ連結、転写およびイソタイプスイッチを指令することにおいて正しく機能しているという証拠を提供する。１匹の動物(＃18)は、サザンブロット分折によりトランスジーンについて陰性であり、検出可能レベルのヒトIgＭまたはIgＧ１を全く示さなかった。２番目の動物(＃38)は、サザンブロッティングによりアッセイすると該トランスジーンの約５コピーを含んでおり、そして検出可能レベルのヒトIgＭとIgＧ１の両方を示した。トランスジーンを注入した胚から発育した11匹の動物についてのELISAアッセイの結果を下表（表１）に要約する。
【０４７８】
【表１】
2011236257.tif 000005
【０４７９】
表１は、組み込まれたトランスジーンＤＮＡの存在と血清中のトランスジーンによりコードされる免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。pHC1トランスジーンを含むことがわかった動物のうちの２匹は、検出可能なレベルのヒト免疫グロブリノを発現しなかった。それらは共に低コピー動物であり、該トランスジーンの完全なコピーが含まれていないか、または該動物が遺伝的モザイクを有している（動物＃21について評価された細胞あたり＜１コピーにより指摘される）ことがあり、そしてトランスジーン含有細胞が造血系統に移っていない場合がある。あるいは、トランスジーンがそれらの発現に至らないゲノム領域中に組み込まれている場合がある。pIGM1 トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭの検出、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ１の検出は、トランスジーン配列がＶＤＪ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で正しく機能することを指摘する。
【０４８０】
Ｆ．cDNAクローン 
【０４８１】
ＶＤＪ連結およびクラススイッチ、並びにＢ細胞発達および対立遺伝子排除におけるトランスジーンがコードするヒトＢ細胞レセプターの関与に関するpHC1トランスジーンの機能性を評価するために、トランスジェニックマウス脾臓mRNAから誘導した免疫グロブリンcDNAクローンの構造を調べた。ＤおよびＪセグメント用法、Ｎ領域の付加、CDR3の長さ分布、並びに機能的mRNA分子をもたらす接合部の頻度に焦点を合わせて、該トランスジーンによりコードされる重鎖の総合的多様性を調べた。VH105 とVH251 を組み込んだIgM およびIgＧをコードする転写物を調べた。
【０４８２】
第11週の雄第二世代57系列pHC1トランスジェニックマウスからポリアデニル化ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを使ってオリゴｄＴ開始−本鎖cDNAを合成した。次いで得られたcDNAを、次の４つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使った４つの各ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用した：VH251特異的オリゴ−149 ctagct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg（g,a,t,c）；VH105 特異的オリゴ−150 gtt gct cga gtg aaa ggt gtc cag tgt gag gtg ca g ctg（g,a,t,c）；ヒトγ１特異的オリゴ−151 ggc gct cga gtt cca cga cac cg t cac cgg ttc；およびヒトμ特異的オリゴ−152 cct gct cga ggc agc caa cgg cca cgc tgc tcg。反応１はプライマー o-149とo-151 を使って VH251−γ１転写物を増幅せしめ、反応２はプライマー o-149とo-152 を使って VH251−μ転写物を増幅せしめ、反応３はプライマー o-150とo-151 を使ってVH105−γ１転写物を増幅せしめ、そして反応３はプライマーo-150 とo-152 を使って、VH105− μ転写物を増幅せしめた。
【０４８３】
得られた0.５ kbのＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。対応するELISA データ（図40）と一致しで、μ転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であった。ＰＣＲ産物を Xho Iで消化し、プラスミドpNN03 中にクローニングした。４つのＰＣＲ増幅の各々からの９個のクローンのミニプレプから二本鎖プラスミドＤＮＡを単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を実施した。該クローンのうちの２つがＤまたはＪセグメントを含まない欠失体であることがわかった。それらは正常のＲＮＡスプライシング生成物からは誘導することができなかったので、おそらくＰＣＲ増幅中に導入された欠失から生じたのであろう。該ＤＮＡ試料のうちの１つは、２つの個々のクローンの混合物であることがわかり、そして他の３つのクローンは読み取り可能なＤＮＡ配列を生成しなかった（おそらくＤＮＡ試料か十分に純粋でなかったためであろう）。
【０４８４】
残りの30個のクローンからのＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を（化６）（及び化７）にまとめた。各配列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性でないこと、またはトランスジーン発現性Ｂ細胞の単一クローンが優性でないことを示す。どの２配列も類似していないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様性が２個のＶセグメント、10個のＤセグメントおよび６個のＪセグメントのみを含む小型の小遺伝子座から発現され得るという暗示でもある。該トランスジーン中に含まれるＶセグメントの両方、６個のＪセグメントの全部および10個のＤセグメントの７個がＶＤＪ接合部に使われる。
【０４８５】
加えて、両定常領域遺伝子（μとγ１）が転写物中に含まれる。VH105プライマーは実施した反応においてVH105に特異的であることがわかった。従って、反応３および４からのクローンの多くがVH251転写物を含んでいた。更に、連結反応３のＰＣＲ産物から単離されたクローンはIgＧよりもむしろIgＭをコードすることがわかった；しかしながら、これは、ＤＮＡを同一ゲル上で単離したため、反応４からのＰＣＲ産物による汚染を表すかもしれない。成人末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から免疫グロブリン重鎖配列を増幅せしめそしてＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を決定した同様な実験が、細菌Yamadaらにより報告された〔J．Exp．Med.17 3:395-407（1991）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。このヒトＰＢＬからのデータをpHC1トランスジェニックマウスからの我々のデータと比較した。
【０４８６】
【化４】
2011236257.tif 000006
【０４８７】
Ｇ．Ｊセグメント選択 
【０４８８】
表２は、成人ＰＢＬ免疫グロブリン転写物中に見つかるＪセグメントに対して、pHC1トランスジーンによりコードされる転写物中に取り込まれるＪセグメントの分布を比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似しており、両系ともＪ４セグメントが優性セグメントであり、次いでＪ６セグメントが優性である。Ｊ２はヒトＰＢＬ中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグメントである。
【０４８９】
【表２】
2011236257.tif 000007
【０４９０】
Ｈ．Ｄセグメント選択 
【０４９１】
Yamadaらにより分析されたクローンの49％（82のうち40）が、pHClトランスジーン中に含まれるＤセグメントを含んでいた。他の11クローンは、該著者らにより既知Ｄセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含んだ。それらの指定されなかった11個のクローンのうちの２つは、pHCl構成物中に含まれるDlR2セグメントの逆位から誘導されるようだ。lchiharaら〔EMBO J． 7: 4141 (1988)〕により予想されそしてSanz 〔J.lmmunol．147:1720-1729(1991)〕により観察されたこの機構を、Yamadaら〔J．Exp．Med. 171:395-407(1991)〕は考慮に入れなかった。表２は、pHClトランスジェニックマウスについてのＤセグメント分布と YamadaらによりヒトＰＢＬ転写物について観察されたものとの比較である。Yama daらのデータを、DlR2使用を包含しそしてpHClトランスジーン中にないＤセグメントを除外するように再編集した。
【０４９２】
表３は、Ｄセグメント組み込みの分布がトランスジェニックマウスとヒトＰＢＬとにおいて非常に類似していることを証明する。２つの優性なヒトＤてグメントOXP’１とDNlは、トランスジェニックマウス中にも高頻度で見つかる。２つの分布間の最も大きな相違点は、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのDH Q52の高頻度である。DHQ52の高頻度はヒト胎児肝臓中のＤセグメント分布を思い出させる。Sanzは重鎖転写物の14％がDHQ52配列を含んだことを報告している。p HCl中に見つからないＤセグメントを分析から除外すれば、Sanzにより分析された胎児転写物の31％がDHQ52を含んでいる。これは、不発明者らがpHClトランスジェニックマウス中に観察した27％と同等である。
【０４９３】
【表３】
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【０４９４】
Ｉ．ＶＤＪ接合部の機能性 
【０４９５】
表４は、pHClトランスジェニック動物から分析された30個のクローンからのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。翻訳配列は、30個の、ＶＤＪ接合部のうちの23個（77％）が可変セグメントとＪセグメントに関して枠内（in-frame）であることを示す。
【０４９６】
ＶＤＪ接合部の機能性 
【０４９７】
【化５】
2011236257.tif 000009
【０４９８】
Ｊ．C0R3の長さ分布 
表４は、pHClトランスジェニックマウス中の枠内ＶＤＪ接合部を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さをヒトＰＢＬ中のそれと比較したものである。ヒトＰＢＬデータは同じくYamadaらから得られたものである。両分布は類似しているが、トランスジェニックマウスの分布はヒトＰＢＬから観察されたものよりもわずかに小さいCOR3ペプチドの方に偏っていた。トランスジェニックマウスにおける COR3の平均長さは10.3アミノ酸である。これはSanz 〔J．Immunol．147;1720-17 29(1991)〕によりヒトCDR3ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に同じである。
【０４９９】
【表４】
2011236257.tif 000010
【０５００】
［実施例13］
再配列された重鎖トランスジーン 
【０５０１】
Ａ．再配列されたヒト重鎖ＶＤＪセグメントの単離 
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（C1onetech Laboralories，Inc.，Palo Alt o，CA)中にクローニングされた２種のヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを含むλl.３のl kb PacＩ／HindIII断片を用いてスクリーニングする。陽性クローンを、次のＶH特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−７ ５′−tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc ac ｃ−３′ オリゴ−８ ５′−tcc ctg aga ctc tcc tgt gca tct gga ttc acc ttc agt−３' の混合物とのハイブリダイゼーションについて試験する。
【０５０２】
ＶプローブとＪ−μプロ−ブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し、そして再配列されたＶＤＪセグメントのＤＮＡ配列を決定する。
【０５０３】
Ｂ．再配列されたヒト重鎖トランスジーンの作製 
【０５０４】
機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライスシグナル）を、プラスミト゛由来の XhoＩ部位が挿入断片配列の５′末端に隣接するように、プラスミドベクタ−pSP72中にサブクローニングする。機能的ＶＤＪセグメントを含むサブクローンをXholとPacI （PacIはＪ−μイントロンエンハンサ−近くの部位を認識する稀少な切断酵素である）で消化し、そして挿入断片をXhoI／Pa cIで消化されたpHC2中にクローニングし、機能的、ＶＤＪセグメント、Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッテ要索、μ定常領域コードエクソンおよひγ１定常領域（これは緊殖不能転写物関連配列、γ1スイッチおよびコードエクソンを含む）を有するトランスジーン構成物を作製する。上述したように、このトランスジーン構成物をNot Iで切り出し、そしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。
【０５０５】
［実施例14］
軽鎖トランスジーン 
【０５０６】
Ａ．プラスミドベクターの作製 
【０５０７】
１． プラスミドベクターpGPlc プラスミドベクターpGPlaをNo l消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリゴ−81 ５′−ggc ctc atc ccg gag ctc gag gac gac aag ctt tcg agg atｃcg c−３' オリコ゛−８２ ５′ ggc cgc tcc tg aaa gt tgt cga cc cga gac ccg g gａtgc−３' をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1cは、No l部位により隣接されたXmaI,Xhol,SalI,HindIIIおよびBamHI 制眼部位を有するポリリンンカ−を含む。
【０５０８】
2． プラスミドベクタ−pGP1d プラスミドベクタ−pGP1a Not I 消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリコ゛−８７ ５′ −ggc cgc tgt cga caａ gt tat cga tgg atc ctc g ag tgc−３′ オリコ゛−88 ５′ −gg cgc act cga gga tcc atc gat aag ctt gtc gac a gc−３′ をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1d は、Not Ｉ部位により隣接されたSa1I，Hindlll,Cla Ｉ,BamIIIよびXho I制限部位を有するポリリンンカーを含む。
【０５０９】
Ｂ．ＪκおよびＣκクローンの単離 
【０５１０】
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（C1onetech Laboratories，Inc.，Palo A lto，CA）中にクロ−ニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト κ軽鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：オリコ゛-36 ５'-cac ctt cgg cca agg gac acg act gga gat taa acg taa gcａ−３′を用いてスクリ−ニングし、そしてファージクローン136.2と136.5を単離する。136.2からＪκ１セグメントを含む7.4kb Xhol断片を単離し、プラスミドpNNO3 中にサブクロ−ニングしてプラスミドクローンp36.2を作製する。Ｃκ遺伝子セグメントと共にＪκセグメント２〜５を含む近隣の13 kb Xho I断片をファージクローン136.5から単離し、そしてプラスミドpNNO3中にサブクロ−ニングしてプラスミドクロ−ンp36.5を作製する。それら２つのクローンを一緒にすると、Ｊ κ1の7.2 kb上流で始まりＣκの9 kb下流で終わる領域に及ぶ。
【０５１１】
Ｃ．再配列された軽鎖トランスジーンの作製 
【０５１２】
1． 再配列された可変セグメントを発現さぜるためのＣκベクタ−pCK1 Ｃκ遺伝子を含むプラスミドクロ−ンp36.5の13 kb Xho I断片を、９ kbの下流配列と一緒に、該挿入断片の５′末端がプラスミドXho I部位に隣接した状態で、プラスミドベクタ−pGP1cのSal Ｉ部位中にクロ−ニングする。生じたクローンpCK1は、再配列された、ＶＪκセグメントを含むクロ−ン化断片をユニーク５′Xho Ｉ部位に収容することができる。次いで該トランスジーンをNot Iで切り出し、ゲル電気泳勤によってべクター配列から精製する。得られたトランスジ−ン構成物は、ヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーを含むであろうし、ヒト３ ′κエンハンサーを含むことができる。
【０５１３】
2． 再配列された可変セグメントを発現させるための重鎖エンハンサー含有Ｃ κベクターpCK2 
マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔J．Banerjiら、Cell33: 729-740( 1983)〕を含むマウスゲノムＤＮＡの0.9kb Xbal断片をpUCl8中にサブクローニングし、プラスミドpJH22.lを作製した。このプラスミドをSphtにより線状化し、クレノウ酵素を用いて末端をフィルインした。クレノウ処理されたＤＮＡを次いでトHindlll で消化し、そしてヒト重鎖μイントロンエンハンサー〔Haydayら、 Nature 307:334-340(1984)〕を含むファージクローンλ1.３ （前の実施例）の uI （クレノウ）／Hind1ll 断片をそれと連結した。
【０５１４】
生じたプラスミドpMHEl、両者が単一のBamHI／Hindlll 断片上に切除されるように、pUC18中に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μイントロンエンハンサーから成る。この2.3 kb断片を単離し、pGPlc中にクロ−ニングしてpMHE2を作製する。pMHE2 を Sallで消化し、p36.5の13 kb XhoＩ挿入断片をその中にクロ−ニングする。生じたプラスミドpCK2は、マウスとヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーがトランスジーン挿入断片の３′末端に融合していること以外は、pC Klと同一である。最終トランスジーンの発現を調節するために 異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３′κまたは重鎖エンハンサー〔Meyer および Neubrrger,EMBD Ｊ．8:1959-1964 (1989)；Pettersonら、Nature 344:165-168(1 990)〕を使って類似構成物を作製することができる。
【０５１５】
3．再配列されたκ軽鎖可変セグメントの単離 
ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories．Inc.．Palo Alt o，CA)中にクロ−ニングされた２つのヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、 p36.5の3.5 kb Xho I／Sma I 断片を含むヒトκ軽鎮Ｊ領域を用いてスクリーニングした。陽性クローンを、次のＶκ特異的オリゴヌクレオチドオリゴ−65 ５′ −agg ttc agt ggc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc ctc acｃatc agc−３′ とのハイブリダイゼーションについて試験した。ＶプロープとＪブローブの両方とハィブリダイズしたクローンを単離し、そして再配列されたＶＪκセグメントのＤＮＡ配列を決定する。
【０５１６】
4．再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジェニックマウスの作製 
機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライススグナル）をベクタ−pCK1およびpCK2の XhoＩ部位中にサブクロ−ニングし、再配列されたκ 軽鎖トランスジーンを作製する。Not lでの消化により該トランスジーン構成物をベクター配列から単離する。アガロースゲル上で精製した挿入断片をマウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製する。ヒトκ鎖を発現している動物を、重鎖小遺伝子を含有するトランスジェニック動物（実施例14）と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る。
【０５１７】
ＶＪκ組合せの全部か、広域スペクトルの種々の重鎖ＶＤＪ組合せと安定な重鎖ー軽鎖複合体を形成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列されたＶＪκクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランスジーン構成物を作製し、そして重鎖小遺伝子座トランスジーンを発現するマウスと交配させる。ニ重トランスジェニック（重鎖構成物と軽鎖構成物の両方）動物から、末梢血、脾臓およびリンパ節リンパ球を単離し、ヒトおよびマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリンに特異的な蛍光抗体(Pharmingen，San Diego，CA）で染色し、そしてFACScan 分析装置(Becton Dickinson，San Jose．CA）を使ってフローザイトメトリーにより分折する。最大数のＢ細胞の表面上に最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複合体を生じ且つ免疫細胞区分に悪影響を与えない（ＢおよびＴ細胞サブセット特異的抗体を用いたフローサイトメトリー分折によりアッセイした時）再配列された軽鎖トランスジーン構成物を、ヒトモノクローナル抗体の産生のために選択する。
【０５１８】
Ｄ．再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジーンの作製 
【０５１９】
1． 小遺伝子座トランスジーンを作製するためのＪκ，Ｃκ含有べクタ−pJCKl p36.5の13 kbのＣκ含有 Xhol挿入断片をクレノウ酵素で処理し、Hindlllで消化されクレノウ処理されたプラスミドpGP1d中にクロ−ニングする。挿入断片の５′末端がべクター由来のClaI部位に隣接するようなプラスミドクローンを選択する。生じたプラスミドp36.5-IdをClaIで消化し、クレノウで処理する。
【０５２０】
p36.2 のＪκl含有7.4 kb Xho I挿 入断片をクレノウで処理し、そしてClaIで消化されクレノウ処理されたp36.5-ld中にクロ−ニングする。p36.2挿入断片がp36.5挿入断片と同じ方向にあるクローンを選択する。このクローンpJCK1 （図35）は、7 .2kbの上流配列および9 kbの下流配列と一緒に、完全なヒトＪκ領域およびＣκ 領域を含む。
【０５２１】
該挿入断片はヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーも含み、ヒト3′κエンハンサーを含むこともある。該挿入断片は、追加の３′隣接配列、例えば重鎖または軽鎖エンハンザーをクロ−ニングする目的でユニーク３′ Sal I 部位により隣接される。ユニーク:Xho I 部位は、再配列されていないＶκ遺伝子セグメント中でクローニングする目的で該挿入断片の５′末端に置かれる。ユニークSal I およびXho I 部位は、最終のトランスジーン構成物をべクター配列から単離するために使われる Not I 部位により隣接される。
【０５２２】
2．再配列されていなＶκ遺伝子セグメントの単離およびヒトIｇ軽鎖タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製 
Ｖκ特異的オリゴヌクレメチテドであるオリゴ−65（上述）を使って、ファージベタターλEMBL3/SPG/T7 (Clonetech Laboratories,Inc.PaloAlto.CA)中にクロ−ニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡを探査する。生じたタローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、機能的と思われるクローンを選択する。機能性を判断するための基準は、転写解読格、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列を含むことである。
【０５２３】
選択された可変遺伝子セグメントを含むＤＮＡ断片をプラスミドpJCKlのユニークXhol部位にクロ−ニングし、小遺伝子座構成物を作製する得られたクローンをNotＩで消化し、挿入断片を単離し、そしてマウス胚の前.核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。それらの動物のトランスジーンは、Ｂ細胞発達の際にＶ−Ｊ結合を受けるであろう。ヒトκ鎮を発現丁る動物を、重鎮小遣伝子座を含有丁るトランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを得る。
【０５２４】
［実施例１５］
ゲノム重鎖ヒトIｇトランスジーン 
この実施例は、接合子中へのマイクロインジェクンョンまたはES細胞中への組み込みによりマウス生殖細胞中に導入される、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクロ−ニングを記裁する。
【０５２５】
Marzluff,W.F ら、(1985)Transcription and Translation:A Practrical Approa ch, B.D.Hammes およびS.J.Higgins偏,98-129頁，IRL Press,Oxord により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはPDSで洗浄したヒト精母細胞）を0.5％低融点アガロースブロック中に埋め込み、そして核については5OOmM EDTA．1％ SOS 中の1mg/mlのプロテイナーゼＫにより、精母細泡については5OOmM EDTA，1％ SOS．10mM DTT中の 1mg／mlのプロテイナーゼＫにより、50℃にて18時間溶解せしめる。該ブロックを40μg/mlのPM SF／TE中で50℃にて30分間インキュベートすることにより、プロテイナ−ゼＫを不活性化する。次いでM．FinneyによりCurrent Protocols in MolecularBiology (F.Ausubelら偏,John Miley & Sons,増補4, 1988,例えば第2.5.1章）中に記載されたように、アガロース中で該ＤＮＡを制限酵素 Not Iで消化する。
【０５２６】
Not I 消化したＤＮＡを、次いでAnandら、Nuc.Acids Rcs．17:3425-3433(1 989)により記載されたようにバルスフィールドゲル電気泳勤により分画する。NotＩ断片に冨む画分をサザンハイブリダイゼーションによりアッセイしの断片によってコードされる１または複数の配列を検出する。そのような配列は、重鎮Ｄセグメント、Ｊセグメントおよびγ1定常領域と共に６つのＶHファミリー全部の代表物を含む〔この断片は、Bermanら(1988)，前掲によればHeLa細鉋から67 0 kb断片として同定されているけれども、本発明者らはそれかヒト胎盤および精子ＤＮＡからのは330 kb断片であることを発見した〕。この Not I 断片を含む画分（図４参照）を記載の如く〔McCormickら、Tehnique 2:65-71（199O)〕べクタ−pYACNNの NotＩ部位中に連結せしめる。プラスミドpYACNNは、pYACneo(Clon tech)をEcoRIで消化しそしてオリコ゛ヌクレオチド5 ′-AAT TGC GGCCGC−３′ の存在下で連結せしめることにより、調製される。
【０５２７】
Traverら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5898-5902 (1989) により言己載された通りに、重鎖Not I 断片を含むYAC ベクターを単離する。クローン化されたNotＩ挿入断片を、M.Finney（前掲）により記截されたようなパルスフィールドゲル電気泳動により高分子量酵母ＤＮＡから単離する。ｌmMスペルミンの添加によりＤＮＡを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。あるいは、ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動により単離し、そしてリポフェクション〔Gnirkeら、EMBD J 10:1629-1634(1991)〕によりES細胞中に導入するか、またはYAC をスフェロプラスト融合によりES細胞甲に導入する。
【０５２８】
［実施例１６］
不連続ゲノム重鎖lgトランスジーン
ＶH６、Ｄセグメント、Ｊセグメント、μ定常領域および一部のγ定常領域を含むヒトゲノムＤＮＡの85 kb Spel断片は、不質的には実施例１に記裁した通りのYAC クロ−ニングによって単離された。生殖細胞型可変領域由来の断片、例えは多コピーのＶ1〜Ｖ5を含む上記の670-830kb Not I 断片の上流の570 kb N ot Ｉ断片、を含有するYACを上述の如く単離る。〔Bermanら(1988)，前掲は、各々が多数のＶセグメントを含有する２つの570 kb Not Ｉ断片を検出した。j この2 断片を実施例Iに記載の如くマウス単細胞胚の核中に同時注入する。
【０５２９】
典型的には、２つの異なるＤＮＡ断片の同時注入は、染色の体内の同一部位のところへの両断片の組込みをもたらす。従って、該２断片各々の少なくとも１コピーを含む生じたトランスジェニック動物の約50％が、定常領域含有断片の上流に挿入されたＶセグメント断片を有する。それらの動物のうち、85 kb SpeＩ断片の位置に関する570 kb NotＩ断片の方向性に依存して、約50％がＤＮＡ逆位によりＶ−ＤＪ結合を行い、そして約50％が欠失によりＶ−ＤＪ結合を行うだろう。生じたトランスジェニック勤物からＤＮＡを車離し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーソョンにより両方のトランスジーンを含んでいることが示された動物（詳しくは、多数のヒトＶセグメントとヒト定常領域遺伝子の両方を含む動物標準技術に従って、ヒト免疫グロブリンを発現する能力について試験する。
【０５３０】
［実施例１７］
トランスジェニックＢ細胞中の機能的に再配列された可変領域配列の同定 
着目の抗原を使って、次の遺伝的特性：ＪHの欠失（実施例10）については内因性所有鎮遺伝子座中の同型接合性；再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン（実施例5および14）の単コピーについては半接合性；および再配列されたヒトκ軽鎖トランスジーン（実施例６および14）の単一コピーにつては半接合性、を有するマウスを免疫化する〔HarlowおよびLane,Antibodies:A Labo ratory Manual,Cold Spring Harbor, New York (1988)を参照のこと〕。
【０５３１】
免役化スケジュールの後、脾臓を取り出し、脾細胞を使ってハイブリドーマを調整する。着目の抗原と反応性である抗体を分泌する個々のハイブリド−マクロ−ンからの細胞を使ってゲノムＤＮＡを調整する。ゲノムＤＮＡの試料を、ユニークな６塩基対配列を認識する幾つかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガロ−スゲル上で分固する。サザンブロットハイブリグイゼーションを凹って２〜10 kb範囲内の２つのＤＮＡ断片を同定する。該断片の一方は、再配列されたヒト重鎖ＶＤＪ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列されたヒト軽鎖ＶＪ配列の単一コピーを含む。それらの２断片をアガロースゲル上でサイズ分画し、pUCl8 中に直接クロ−ニングする。クローン化された挿入断片を、定常碩域配列を含む重鎮および軽鎮発現カセット中にそれぞれサブクロ−ニングする。
【０５３２】
プラスミドクローンpγe1（実施例12）を重鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＤＪ配列を Xhol部位中にクロ−ニングする。プラスミドクローンp CK1を軽鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＪ配列を XhoＩ部位中にクローニングする。生じたクローンを一緒に使ってSP。細胞をトランスフェクトせしめ、着目の抗原と反応する抗体を産生せしめる〔M.S．Coら、Proc．Natl.Ac ad.Scl USA 88:2869(1991)〕。
【０５３３】
あるいは、上述のクローン化ハイブリドーマ細胞からmRNAを単離し、cDNAを合成するのに使う。発現されるヒト重鎖および軽鎖ＶＤＪおよび、Ｖｊ配列を、次いでＰＣＲにより増幅し、クロ−ニングする〔J.W.Larrichら(1989)Bio1．Techn ologv.7:934-938〕。それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、そしてC.Queenら、Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 84:5454-5458 (1989)により記載されたようにして合成発現ベクターを作製する。
【０５３４】
複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化 
次の実験は、トランスジェニック動物がヒト赤皿球上の抗原のような複合抗原により好結果に免役化することができ、そして正常マウスにおいて観察される応答速度論に類似した速度論で応答することができることを証明する。
【０５３５】
血液細胞は一般に適当な免役原であり、赤皿球と白皿球の表面上には多数の異なる型の抗原を含んで成る。
【０５３６】
ヒト血液による免疫化 一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座（ＪHＤ）を有し且つヒト重鎖小遺伝子構成物(HCI)を含有するトランスジェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウスを系112と命名する。血液を洗浄し、50mlのハンクス溶液中に再懸濁し、1×106細胞／mlに希釈した。次いで23ゲージの針と！ccの注射器を使って0.2ml（2×107細胞）を腹腔内注射した。この免疫化プロトコールを６週間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼窩後方出血から採血し、血清を収集し、それを特異抗体について試験することにより、血清抗体価をモニタリングした。免疫前出血を対照として取った。まさしく最後の免疫化の時、血清またはハイブリドーマを得るためにそれらの動物を犠牲にする３日前に、ハイブリドーマの生産を増大させるために尾部静脈内への1 ×103細胞による免疫化を１回行った。
【０５３７】
動物
【０５３８】
【表５】
2011236257.tif 000011
【０５３９】
マウス# 2343と2348は所望の表現型を有する：重鎖破壊背景上のヒト重鎖小遣伝子トランスジェニック。
【０５４０】
ハイブリドーマの作製 
上述の通り免疫化された約16週齢のトランスジェニックマウス（表５）のマウス脾細胞を非分泌性ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞系X63 Ag8.653 から成る融合相手と融合せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマクローンを培養し、血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する免疫グロブリンを含有するハイブリドーマ上清を、例えばフロ−ザイトメトリーにより、同定した。
【０５４１】
フローサイトメトリー 
フロ−サイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上清を試験した。提供者からの赤血球をハンクス溶液中で４回洗浄し、50,000個の細胞を1.1 mlのポリプロピレン微小菅中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上清または抗血清と共に染色媒質〔フェノールレッドまたはビオチン(Irvlne Scientific)、３％新生ウシ血清、0.１％ナトリウムアジドを含まない1×RPMI培地〕中で氷上で30分間ィンキュベートした。対照は他の遺伝子型を有する同腰マウスから成った。次いで細胞をSorvall RT600B中で1000 rpmで５〜10分間4℃にて遠心することにより洗浄した。細胞を２回洗浄した後、蛍光生成試薬を使って細胞表面上の抗体を検出した。２種類のモノクローナル試薬を使って試験した。１つはFITCで標識されたマウス抗ヒトμ重鎖抗体（Pharmagen，San Diego，CA）であり、もう１つはPE で標識されたラット抗マワスκ軽鎖抗体（Becton-Dickenson，San Jose，CA)であった。それらの試薬は両方とも同様な結果を与えた。全血（赤血球と白血球）および白血球のみを標的細胞として使用した。両方の組が陽性結果を与えた。
【０５４２】
トランスジェニックマウスおよび同腹対照の血清を提供者からの赤血球または他の個体がらの白血球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒトIgM FITC 標識抗体により発色させ、フローサイトメーター中で分析した。結果は、ヒト小遺伝子座についてトランスジェニックであるマウス（マウス 2343 および2348）からの血清がヒトIgＭ反応性を示し、一方全ての同腹動物（2344,2 345．2346，2347）からの血清は該反応性を示さなかった。正常マウス血清（ＮＳ）とリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）を負の対照として使用した。赤血球は未濾過であり、白血球はリンパ球のみを含むように濾過された。比較を与えるためにｘ軸とｙ軸上に線が引かれている。融合体2348からの 100の上清に関してフローサイトメトリーを実施した。４つの上清が血球細胞抗原に対する陽性反応性を示した。
【０５４３】
［実施例１８］
アンチセンスＲＮＡによる内因性マウス免疫グロブリン発現の減少 
Ａ．アンチセンスＩｇ配列の発現用のベクター 
1． クローニングベクターpGPlh の作製
ベクターpGP1b（前の実施例に記載）をXho ＩとBamHIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド
５′- gat cct cga gac cag gta cca gat ctt gtg aat tcg −３′ 
５ - tcg acg aat tca caa gat ctg gta cct ggt ctc gag - ３′ 
と連結せしめてプラスミドpGPlhを作製した。このプラスミドは、次の制限部位：Not Ｉ，EcoRl，Bglll，Asp718，BamHI，Hind lll，Not Ｉを含むポリリンカーを含有する。
【０５４４】
2．pBCElの作製 
プロモーター−リーダー配列エクソン、第一イントロンおよびヒトＶH−Ｖファミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントの第二エクソンの一部を含む、pV H251（前の実施例に記載）の0.8 kb Xba Ｉ／Bgl 11断片を、Xba Ｉ／Bgl llで消化したベクターpXN03 中に挿入してプラスミドpVH251N を作製した。
【０５４５】
ヒト成長ホルモン遺伝子〔hGH ； Seeburg(1982)DNA l:239-249〕のコードエクソンを含む2.2 kb BamHI／EcoRI ＤＮＡ断片を、BamHI／EcoRI で消化したpGH 1h中にクローニングした。生じたプラスミドをBamHIで消化し、そしてpVH251N のBammHI／EcoRI 断片をhGH 遣伝子と同じ方向において挿入し、プラスミドpVhg h を作製した。
【０５４６】
マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Banerji ら（1983）Cell 33:729- 740〕を含むマウスゲノムＤＮＡのO.9 kb Xba Ｉ断片をpUC18 中にサブクローニングしてプラスミドpJH22.1 を作製した。このプラスミドをSph Ｉで直鎖状にし、末端をクレノウ酵素でフィルインした。次いでクレノウ処理したＤＮＡをHind lll で消化し、そしてヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Hayday ら（198 4）Nature 307:334-340〕を含むファージクローンλ1.3（上記実施例）の1.4kb Mlu Ｉ（クレノウ）／HIindlll断片をそれと運結せしめた。得られたプラスミド pMHE1は、単一の BamHI／Hindlll 断片において切り出すことができるようにpU Cl8中に一緒に連結されたマウスおよひヒトの重鎖」−μイントロンエンハンザーから成る。
【０５４７】
pMHE1 の BamHI／Hindlll断片を BamHI／Hindlll で切断されたpVhgh 中にクローニングし、Ｂ細胞発現ベクタ−pBCE1を作製した。このベクター（図42に描写）はユニーク Xho IおよびAsp718クローニング部位を含有し、その中にアンテセンスＤＮＡ断片をクロ−ニングすることができる。それらのアンチセンス配列の発現は、上流の重鎖プロモーター−エンハンサー組み合わせにより指令され、下流のhGH遺伝子配列はイントロン配列に加えてトランスジーン構成物の発現を促進するポリアデニル化配列を提洪する。pBCE1 から作製されたアンチセンストランスジーン構成物は Not Ｉでの消化によりベクター配列から分離することができる。Ｂ．IgM アンチセンストランスジーン構成物 下記オリゴヌクレオチド：
５′- cgc ggt acc gag agt cag tcc ttc cca aat gtc -３′
５′- cgc ctc gag aca gct gga atg ggc aca tgc aga -３′ 
を、基質としてマウス胛朦cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウス IgM定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られたO. 3 kbのＰＣＲ産物をAsp718と Xho Ｉで消化し、そしてAsp718／Xho Ｉで消化したpBCE1 中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物pMAS1 を作製した。pMAS1 の精製済 Not Ｉ挿入断片を、単独でまたは１もしくは復数の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgＭのmR NAとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってマウスIgＭタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。
【０５４８】
pMAS1 とpHCC1のようなヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座とを含有する二重トランスジェニックマウス（両構成物の同時注入によるかまたは一重トランスジェニックマウスの交配により作製される）は、ヒト重鎖小遺伝子座のみについてトランスジェニックであるマウスよりも高い比率のＢ細胞上に、ヒトトランスジーンによってコードされるIgレセプターを発現するだろう。ヒト対マウスIgレセプター発現細胞の比は、一部はＢ細胞の分化と発展を促進する因子および細胞に対する２集団間の競争のためである。IgレセプターはＢ細胞発達において重要な役割を果たすので、表面上に減少したレベルのIgＭを発現する（マウスIg特異的アンチセンスダウンレギュレーションのため）マウスIgレセプター発現Ｂ細胞も、ヒトレセプターを発現する細胞も競争しないだろう。
Ｃ．Igκアンチセンストランスジーン構成物
次の２つのオリゴヌクレオテド：
５′- cgc ggt acc gct gat gct gca cca act gta tcc -３′
５′- cgc ctc gag cta aca ctc att cct gtt gaa gct -３′ 
を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスIgκ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた0. 3 kbのＰＣＲ産物をAsp718とXho Ｉで消化し、そしてAsp718／Xho Ｉで消化した pBCE1 中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物 pKAS1を作製した。pMAS1 の精製済Not I挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgκ mRNA とハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってpMAS1 について上述したのと同様にマウスIgκタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。
【０５４９】
実施例19 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける好結果の免疫化と免疫応答を証明する。
【０５５０】
マウスの免疫化
１分子あたり 400以上のジニトロフェニル基と結合させたアオガイヘモシアニン（Calbiochem, La jotta, California) (KLH-ONP)を以前発表された方法(Practical Immunology，L．HudsonおよびF．C．Hay，B1ackwell Scientific出版，第９頁，1980年）に従ってミョウハン沈澱させた。ミョウバン沈殿させたKLH-DN P 400 μgを100μｌのリン酸塩緩術化塩溶液（ＰＢＳ）中の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム 100μgと一緒に各マウスに腹腔内注射した。６日後に眼窩後洞出血により血清試料を収集した。
【０５５１】
血清中のヒト抗体反応性の分析 
間接エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)を使って抗体の反応性および特異性を評価した。免疫原による抗体誘導を分析するために幾つかの標的抗原を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定にはアオガイヘモシアニン（Calbiochem）、ハブデンおよび／または修飾アミノ基に対する反応性の同定にはウシ血清アルブミン、そして全免疫原に対する反応性の同定にはKLH-DN P を・使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウス免疫グロブリンとの交差反応性を全く持たないIgＭおよびIgＧサブクラスに特異的な酵素接合（本により険出した。
【０５５２】
簡単に言えば、ＰＢＳ中５μg/mlのタンパク質を37℃にて一晩乾燥することによりマイクロタイタープレートを抗原コーティングした。ＰＢＳ、５％ニワトリ血清、O.５％ Tween-20中に希釈した血清試料をウエル中で室温にて１時間インキュベートし、次いで同希釈剤中の抗ヒトIgG FcおよびIgG F(ab')−西洋ワサヒペルオキシダーゼまたは抗ヒトIgM Fc−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベートした。室温で１時間後、ABTS基質（Sigma，St．Louis，Missouri）の添加により酵素活性を評価し、30分後に415-490 nmで読み取った。
【０５５３】
トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重鎖の関与
図43は、KLH-DNP による免疫化に対する３匹の同腹子マウスの応答を表す。第 1296号のマウスは再配列されていないヒトIgＭおよびIgＧトランスジーンを有し、マウスIg重鎖破壊について同型接合性であった。第1299号のマウスは無破壊の背景上にトランスジーンを有し、1301号のマウスはそれらの遺伝子組のいずれも遺伝しなかった。別の同腹子である第1297号のマウスはヒトトランスジーンを有し、マウス重鎖破壊に関して半接合性であった。それを非免疫化対照として実験に組み入れた。
【０５５４】
結果は、ヒトIgＧとIgＭ応答は両方ともタンパク質への接合という状況においてハプテンに対して発生したことを証明する。ヒトIgＭはKLH に対しても発生したが、この時点では有意なレベルのヒトIgＧは存在しなかった。同じマウスからの免疫前血清試料では、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意でなかった。
【０５５５】
［実施例２０］
この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による好結果の免疫化および免疫応答を証明し、そしてヒトトランスジーンの可変領域配列中に無作為でない体細胞変異が起こることを証明する。
【０５５６】
ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖を含んで成る抗体応答の証明
この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能的内因性（マウス）重鎖生産の欠失をもたらすＪ領域のところへのトランスジーンの導入（前掲）により作製された機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座について同型接合性であった。該トランスジェニックマウスは、少なくとも１つの完全な再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン（HC1、前掲）も含み、該トランスジーンは単一の機能的ＶH遺伝子（ＶH 251）、ヒトμ定常領域遺伝子、およびヒトｒ１定常領域遣伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリントランスジーン産物を発現することが示されたトランスジェニックマウス（前掲）をヒト抗原による免疫化のため選択し、トランスジェニックマウスがヒト抗原免疫化に対して免疫応答を生じる能力を有することを証明した。HC1-26系統のマウス３匹とHC 1-57系統のマウス３匹（前掲）にヒト抗原を注射した。
【０５５７】
ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）100 μg を不児全フロイントアジュバント中で０日目に注射し、次いで更に7．14．21および2 8日目に不完全フロイントアジュバント中のミョンバン沈澱ＣＥＡを毎週注射した。ＣＥＡの注射前の各日に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各グループ中の３匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプールした。
【０５５８】
マイクロタイタープレート上に固定化したヒトＣＥＡに結合したヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンをELISA アッセイにより測定した。ヒトμ鎖含有免段グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについての ELISAアッセイの結果をそれぞれ図44および45に示す。７日目までは両系統について有意なヒトμ鎖Ig抗体価が検出され、約21日目まで上昇が観察された。ヒトγ鎖Igについては、有意な抗体価は遅れ、前者がHC1-57系統で14日目そして後者はHC1-26系統で21日目に明らかになった。ヒトγ鎖Igの抗体価は、実験の間じゅう時間と共に増加を示し続けた。観察されたヒトμ鎖Ig応答は、平坦域に達した後、遅れて発生する上昇し続げるγ鎖応答と組み合わせると、親和性の成熟に伴って観察されるパターンに特徴的である。21日目の試料の分析は、無関係の抗原であるアオガイヘモシアニン(KLH)に対する反応性の欠失を示した。これは、抗体応答が特異的な形でＣＥＡに対して向けられたことを指摘する。
【０５５９】
それらのデータは、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニックである動物が、（１）ヒト抗原（例えばヒト糖タンパク質、ＣＥＡ）に対して応答でき、（２）観察されたμからγへのクラススイッチにより例示されるようなイソタイプスイッチ（クラススイッチ）を受けることができ、そして（３）それらの体液性免疫応答における親和性の成熟の特徴を表すことを示す。一般に、それらのデータは、（１）ヒトIgトランスジェニックマウスが異種抗体を誘導する能力を有すること、（２）単一のトランスジーン重鎖可変領域が限定抗原に対して応答する能力を有すること、（３）一次方よび二次応答形成に典型的は時期に渡る応答速度論、（４）IgM からIgG への、トランスジーンによってコードされる体液性免疫応答のクラススイッチ、および（５）トランスジェニック動物がヒト抗原に対してヒト配列抗体を産生する能力を有することを指摘する。
【０５６０】
ヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座における体細胞変異の証明 
HC1 トランスジーンの多重コピーを含有するHC1-57系統のトランスジェニックマウスを免役グロブリン重鎖欠失マウスと交配させ、HC1 トランスジーンを含み且つ内因性マウス重鎖の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た（前掲）。それらのマウスは、マウスκおよびλ軽鎖と共にヒトμおよびγ１重鎖を発現する（前掲）。それらのマウスのうちの１匹を、1.５カ月の期間に渡る反復腹腔内注射により、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化した。このマウスを犠牲にし、脾臓、鼠径部および腸間膜のリンパ節、並びにパイヤー斑からリンパ系細胞を単離した。該細胞を合わせ、全ＲＮＡを単離した。該ＲＮＡから第一鎖cDNAを合成し、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー
149 ５′- cta gtc cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg(g/a/t/c) -３
151 ５′- ggc gct cga gtt cca cga cac cgt cac cgg ttc -3’ 
を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
【０５６１】
それらのプライマーはVH25l/γ１ cDNA配列を特異的に増幅する。増幅された配列を Xho Ｉで消化し、ベクターpNN03 中にクローニングした。23個のランダムクローンの挿入断片のＤＮＡ配列を図46〜51に示す；生殖細胞配列からの配列変異が指摘され、ドットは配列が生殖細胞と同じであることを示す。VH251 トランスジーンの生殖細胞配列と該cDNA配列との比較は、クローンのうちの３個が完全に未変異であり、他の23個は体細胞変異を含むことを明らかにした。
【０５６２】
３個の未変異配列のうちの１つは枠外（ouｔ-of-frame）ＶＤＪ連結に由来する。特定の位置において観察された体細胞変異は、ヒトリンパ球において観察されたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターンで起こる〔Cai ら（1992）J．E xpMed．176:1073；これは参考として不明細書中に組み込まれる〕。体細胞変異の総体的頻度は約１％である；しかしアよがら、CORI同の頻度は約５％にまで及び、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重細配列の抗原指令型親和性成熟を証明する。
【０５６３】
［実施例２１］
この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖小遺伝子座トランスジーンを形成する２つの別々のボリヌクレオテドを同時導入することによる、好結果のトランスジーンの形成を証明する。
【０５６４】
２つの重複ＤＮＡ断片の同時注入による再配列されていない軽鎖小遺伝子座トラ ンスジーンの作製 
1．     再配列されていない機能的Ｖκ遺伝子セグメントvκ65.3．vκ65.8およびvk6 5.15の単離
Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ-65（5’- agg ttc agt ggc agtg gg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc -3')を使って、ファージベクターλBMBL3/SP6/T7 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。陽性ファージクローンからのVκセグメントを含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。
【０５６５】
得られたクローンからの可変遺伝子断片を配列決定し、機能的であると思われるクローンを選択した。機能性を判断する基準は次のものを含む：転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列。この方法により単離された４つの異なるるプラスミドクローンからの４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメント(vk65.3．vk65.5，vk65.8およびvk65.15)のＤＮＡ配列を 図52〜55に示す。４つのプラスミドクローン p65.3f，p65.5gl，p65.8およびp65 .15f) を下記に説明する。
【０５６６】
(1 a)p65.3f 
ファージクローンλ65.3の3 kb Xba I断片を、べクター由来のSal I部位が該挿入断片の３′末端に近位になり且つベクター由来の8amlll 部位が該挿入断片の5 ′末端に近位になるように pUC19中にサブクローニングした。このクローンの3 kb BamHl／Sal I挿入断片を pGPlf中にサブクローニングしてp65.3fを得た。
【０５６７】
(1 b)p65.5gl
ファージクローンλ65.5の6.8 kb EcoRI断片を、ベクター由来のXho i部位が該挿入断片の5 ′末端に近位になり且つベクター由来の Sall部位が該挿入断片の３'末端に近位になるようにpGPlf中にサブクローニングした。得られたプラスミドをp65.5glと命名した。
【０５６８】
(1 c)p65.8 
ファージクローンλ65.3の6.5 kb Hindlll 断片をpSP72 中にクローニングしてp65.8 を得た。
【０５６９】
(1 d)p65.15f 
ファージクローンλ65.16 の10 kb EcoRI 断片をpUCl8 中にサブクローニングしてプラスミドp65.15.3を作製した。該プラスミド挿入断片中のＶκ遺伝子セグメントを4.6 kb EcoRI／Hindlll 小断片にマッピングし、これをpGPlf 中にサブクローニングした。得られたクローン p65.15fは、挿入断片の５′および３′末端にそれぞれユニークXho I部位およびSal I部位が置かれている。
【０５７０】
2．     pkV4
p65.8 のXho I／Sal I挿入断片を p65.15fのXho I部位中にクローニングしてプラスミドpKV2を作製した。p65.5gl のXho I／Sal Ｉ挿入断片をpKV2の XhoI部位中にクローニングしてpKV3を作製した。pKV3のXho I／Sal I挿入断片をp65.3f の Xho I部位中にクローニングしてプラスミドpKV4を作製した。このプラスミドは、４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメントを含む単一の21 kb Xho I／Sal1挿入断片を含有する。Not Iを使って挿入断片全体を切り出すことができる。
【０５７１】
3．pKCIB 
(3 a)pKcor 
ヒトゲノムＤＮＡファージλクローンに由来する２つの Xho I 断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。第一の断片である13 kb のJκ２−ｊ κ５／Ｃκ含有断片をクレノウ酵素で処理し、そしてHndlll で消化されクレノウ処理されたプラスミドpGPld 中にクローニングした。挿入断片の５′末端がベクター由来のCla I部位に近いプラスミドクローン（pK-31）を選択した。第二の Xho I断片である、jκｌを含有する7.4 kbのＤＮＡ断片を、３′挿入断片XhoI部位がベクターSal I部位への連結により破壊されるように、Xho I／Sal Iで消化された pSP72中にクロ.ーニングした。
【０５７２】
得られたクローンp36.2sは、Jκlの4.5 kb上流に挿入断片由来のCla I部位、およびJκ1とJκ２の間に天然に存在するXho I部位の少し下流にポリリンカー由来の Cla I部位を含有する。このクローンをCla Iで消化して4.7 kb断片を遊離せしめ、該断片を正しい５′−３′方向においで、Cla Iで消化されたpK-31 中にクローニングし、全部で５個のヒトJκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、Ｃκ、4.５ kbの５′隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプラスミドpKcor は、挿入断片のそれぞれ５′および３′側にユニークな隣接Xho I部位およびSal I部位を含有する。
【０５７３】
(3 b) pKcorB 
ヒト３′κエンハンサーを含有する4 kb BamHI断片〔Judde，J.G．およびMax, E.E.，Mol.Cell Biol．12:5206(1992)；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を、５′末端がベクターのXho I部位に近位になるようにpGPlf 中にクローニングした。得られたブラスミド p24BfをXho Iで切断し、pKcor の17.7kb Xh o I／Sal I断片を該エンハンサー断片と同じ方向でその中にクローニングした。得られたブラスミドpKcorBは、該挿入断片の５′および３′末端にそれぞれユニークKho IおよびSa1 Ｉ部位を含有する。
【０５７４】
(3 c)pKC1B 
pKcorBの Xho I／Sal Ｉ挿入断片をp65.3fのSal Ｉ部位の中にクローニングして軽鎖小遺伝子座トランスジーンプラスミド pKCIBを作製した。このプラスミドは、５個のJκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒトＣκ、およびヒト３′κエンハンサーを含有する。この25 kb 挿入断片全体をNot I消化により単離することができる。
【０５７５】
4．Co4
プラスミドpKV4とpKClBからの２つの Not I挿入断片を各々2.5 μg/mlの濃度でマイクロインジェクション緩衝液中に混合し、そして上記実施例に記載のようにして半日マウス胚の前核中に同時注入した。生成したトランスジーン動物は、２断片が一緒に組み込まれたトランスジーン挿入断片（Co4 と命名、図56に示した組換えの生成物）を含有する。pKV4挿入断片の３′の3 kbとpKCIB挿入断片の５′の3 kbは全く同じである。幾つかの組み込み現象は3 kbの共通配列に渡って２断片の間で相同組換えが起こったことを表す。Co4 は遺伝子座はトランスジ- ェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリーの発現を指令するだろう。
【０５７６】
本発明の好ましい態様の今までの記載は、例示および説明のために与えられる。それらは排他的であるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限するつもりはない。上記教示に照らして多数の改良および変更が可能である。
【０５７７】
本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたかのように、参考として本明細書中に組み込まれる。
【０５７８】
［実施例２２］
この例は、ヒトＩｇトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖を含みかつ特異的免疫原と反応性をもつモノクローナル抗体を分泌するマウスのハイブリド−マクローンの産生の成功を実証している。
【０５７９】
ヒト重鎖トランスジーン産物を取込むモノクローナル抗体の生成 
１．ヒト重鎖トランスジーンを宿すマウスの免疫化 
内因性重鎖遺伝子（上記実施例２０を参照）のノックアウト（すなわち機能的分断）について同型接合でトランスジーンをコードするヒト重鎖を含むマウスを、精製されたヒトＣＥＡで免疫化し、その後適切な免疫応答期間の後に脾細胞を収穫した。従来の技術を用いて（Kohler及びMilstein，Eur.J.Immunol.，6：511 -519（1976），Harlow及びLane、「抗体：その研究所マニュアル、Cold SpringH arbor,New York（1988）参照）ハイブリドーマを生成するべく、マウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させた。免疫化のために用いられたマウスは、単一の機能的ＶH遺伝子（ＶH251）、ヒトＤ及びＪセグメント、ヒトμ恒常領域、及びヒトγｌ恒常領域遺伝子を含むヒトの再配置されていない重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンを内含していた。それが由来したトランスジェニック系統はＨＣｌ−５７（上記）と呼称された。
【０５８０】
ミョウバン上で不溶化させた精製ヒトガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（Cyrstal Ch em、シカゴ，IL又はScripps Labs，サンディエゴ，CA）を１００μｇ、完全フロイントアジュバントの中で、０日目に注入し、その後さらに７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈降したＣＥＡを週に一度注入した。さらに２０μｇの可溶性ＣＥＡを８３日目に静脈内で投与し、その後９２日目に、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのミョウバン沈降させたＣＥＡを注入した。骨髄腫細胞と脾細胞の融合に先立って血清試料中に、ＣＥＡに対するヒト重鎖応答を確認した。
【０５８１】
９５日目に動物を安楽死させ、脾臓を除去し、ポリエチレングリコールを用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ATCC CRC 1580，Americn Typ e Culture Collection，Rockville，MO）と融合させた。２週間後、ＥＬＩＳＡによりヒト重鎖μ又はγ恒常領域エピトープを含む、ＣＥＡと特異的に反応する抗体の存在について、融合ウエルからの上清をスクリーニングした。簡単に言うと、２．５μｇ／mlでＰＶＣマイクロタイタープレート上に精製されたヒトＣＥＡをコーティングさせ、これを、ＰＢＳ、０．５％のＴｗｅｅｎ、５％のニワトリ血清内で１：４又は１：５に希釈された培養上清と共にインキュベートした。
【０５８２】
プレートを洗浄し、その後ひきつづき、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対し特異的なホースラディッシュベルオキシダーゼで接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭ Ｆｃ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno Research．West Grove，PA）を付加した。さらに洗浄した後、ＡＢＴＳ基質の付加により、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を確認した。独立した２つの融合ウエルがＣＥＡに対する実質的な結合力をもつ抗体を含んでいることがわかった。クローニングの後、ＥＬＩＳＡにより、ヒトμ鎖及びマウスκ鎖の存在について、両方のハイブリドーマが陽性であることがわかった。類似の検定を用いて、いかなるマウスＩｇＧもＩｇＭも検出されなかった。
【０５８３】
２つの独立した親ハイブリドーマのサブクローニングの結果、９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２及び９２−０９Ａａ、−ＩＤ７−１−７−１と呼称される２つのクローンが得られた。両方の系統共、ブタぺスト条約に基づきＡＴＣＣ特許培養寄託所に寄託され、それぞれＡＴＣＣ呼称ＨＢ１１３０７及びＨＢ１１３０８を受けた。これらの細胞系統からの培養上清に関し、ＥＬＩＳＡを用いていくつかの精製された標的タンパク質に対する反応性についてテストすることによって、特異性を評価した。図５７に示されているように、さまざまな抗原に対するモノクローナル抗体の反応性を決定するためのＥＬＩＳＡ検定は、ＣＥＡ及びＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ−２のみが有意の反応性を示すことを立証したが、これは、ヘテロハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領域について制限された反応性の発達を表わしている。
【０５８４】
［実施例２３］
この例は、ヒトＩｇミニ遺伝子座トランスジーンによりコードされる再配置されたヒトＶＤＪ遺伝子を、キメラヒト／マウスＩｇ鎖をコードするべく例えばトランススイッチメカニズムによって、内因性Ｉｇ恒常領域遺伝子を含む写しとして転写させることができるということを立証している。
【０５８５】
キメラヒト−マウス重鎖をコードするトランス−スイッチ写しの同定 
内因性重鎖Ｊセグメント欠失について同型接合の高度免疫されたＨＣｌ系統５７のトランスジェニックマウスからＲＮＡを分離させた（上記）。本書に参考として内含されているTaylor et al.(1993)Nucleic Acids Res．20 ：6287に従ってｃＤＮＡを合成し、以下の２つのプライマを用いてＰＣＲにより増幅した ｏ−１４９（ヒトＶH251) ：
５′−CTA GCT CGA GTC CAA GGA GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG(G,A,T,C)−３′ 
ｏ−２４９（マウスガンマ）：
５′−GGC GCT CGA GCT GGA CAG GG(A／C) TCC A(G／T)A GTT CCA −３′ 
【０５８６】
オリゴヌクレオチドｏ−１４９は、ＨＣｌでコードされた可変遺伝子セグメントＶH251に特異的であり、一方ｏ−２４９は、次のような特異性順序でマウス及びヒトの両方のガンマ配列に対しハイブリッド形成する 
【０５８７】
マウスγ１＝マウスγ２ｂ＝マウスγ３＞マウスγ２ａ≫ヒトγ１ 
【０５８８】
ＰＣＲ産物から生成された無作為に選択した１０個のクローンからのＤＮＡ配列を決定し、これらを図５８に示す。２つのクローンが、ヒトＶＤＪ及びマウス γ１を含んでいた：４つのクローンがヒトＶＤＪ及びマウスγ２ｂを含んでいた。又４つのクローンがヒトＶＤＪとマウスγ３を含んでいた。これらの結果は、トランスジェニックＢ細胞の一分画の中で、トランスジーンでコードされたヒトＶＤＪが、クラススイッチ又は類似の組換えにより内因性マウス重鎖遺伝子座内に組換わったということを表している。
【０５８９】
［実施例２４］
この例は、ヒトＩｇ鎖をコードし発現するクローンから、キメラヒト／マウスＩｇ鎮をコードするクローンを弁別するためのハイブリドーマプールのスクリーニング方法について記述する。例えば、Ｊ領域で分断された内因性重鎖遺伝子座について同型接合でありヒトＩｇ重鎖トランスジーンを含むトランスジェニックマウスから作られたハイブリドーマクローンのプールの中で、トランススイッチされたヒトＶＤｊ−マウス恒常領域重鎖をコードするハイブリドーマクローンを、ヒトＶＤＪ−ヒト恒常領域重鎖を発現するハイブリドーマクローンから同定し分離することが可能である。
【０５９０】
キッメラＩｇ鎖を除去するためのハイブリドーマのスクリーニング 
スクリーニングプロセスには、単独で又は任意には組合わせた形で実施できる次の２つの段階が関与している：（１）予備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーン及び（２）ハイブリドーマ候補の二次的分子特徴づけ。好ましくは、ヒトＶＤＪ領域及びヒト恒常領域を発現するハイブリドーマ候補の初期同定のためには、予備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーンが用いられる。
【０５９１】
（例えば、トランスジェニックマウス内での抗体応答を惹起するのに用いられる免疫原などの）抗原との陽性の反応性を示すハイブリドーマを、マウスμ．γ ，κ及びλ及びヒトμ．γ及びκと特異的に反応するモノクローナル抗体のパネルを用いてテストした。ヒト重鎖及び軽鎖に対して陽性でありかつマウス鎖について陰性であるハイブリドーマだけが、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマ候補として同定される。かくして、ハイブリドーマ候補は、特定の抗原との反応性を有し、ヒト恒常領域の特徴であるエピトープを有することがわかる。
【０５９２】
ＲＮＡをハイブリドーマ候補から分離し、最初のストランドのｃＤＮＡを合成するのに使用する。この最初のストランドのｃＤＮＡを次に、（１本鎖ＤＮＡを連結する）ＲＮＡリガーゼを用いて、予め定められた配列の唯一の１本鎖オリゴヌクレオチドに連結する。連結されたｃＤＮＡを次に、２組のオリゴヌクレオチドプラマーを用いてＰＣＲにより２つの反応において増幅させる。セットＨ（重鎖）は、（ＥＬＩＳＡの結果に応じて）ヒトμ又はヒトγ１のいずれかへと特異的にアニールするオリゴ、及び、オリゴ−Ｘ配列へとアニールするオリゴを含む。こうして、ヒトミニ遺伝子座内へトランス再配置している可能性のあるマウスＶセグメントを含め、特別なＶセグメントの検出に対抗する偏が防止される。第２の組のプライマ、つまりセットＬ（軽鎖）は、ヒトκへと特異的にアニールするオリゴと、オリゴ−Ｘへと特異的にアニールするオリゴを含む。ＰＣＲ産物を分子クローニングし、ヒト及びマウスＩｇ配列に対する配列比較に基づいてハイブリドーマが唯一のヒト抗体を産生しているか否かを確かめるため、そのいくつかのＤＮＡ配列を決定する。
【０５９３】
実施例２５ 
この例は、ヒト軽鎖（κ）ミニ遺伝子座を宿すトランスジェニックマウスの産生を実証する。
【０５９４】
ヒトκミニ遺伝子座トランスジェニックスマウス
ＫＣＩ
（上記のようなκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによるヒトゲノミックＤＮＡファージライブラリから分離された）ファージクローンからの１３kbのＸｈｏＩ Ｊκ２−Ｋκを含むフラグメントをクレノウ酵素で処理し、ｐＫ−３１を産生するべくｐＧＰｌｄのクレノウ処理されたＨｉｎｄ lll 部位にクローニングさせた。これにより、インサートＸｈｏＩ部位が破壊され、唯一のポリリカー誘導されたＸｈｏＩ部位はＪκ２の隣り５′末端に位置つげされた。唯一のポリリカー誘導されたＣｌａＩ部位をこのＸｈｏＩ部位とインセット配列の間に位置設定し、一方唯一のポリリカー誘導されたＳａｌI部位をインサートの３′末端に位置設定する。
【０５９５】
ｊκｌ及び上流配列を含む７．５kbのＸｈｏＩフラグメントも同様に、（上述のようにκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによりヒトゲノミックＤＮＡファージライブラリーから分離された）ヒトゲノミックＤＮＡファージクローンから分離した。この７．５kbのＸｈｏＩフラグメントをｐＳＰ７２（Promega，Madison，Misconsin）のＳａｌｌ部位内にクローニングさせ、かくして両方のＸｈｏＩ部位を破壊し、Ｊκ１の３′にポリリンカーＣｌａＩ部位を位置づけた。結果として得られたクローンをＣｌａＩで消化させると、上流配列を４．５kbとＪκ１を含む４．７kbのフラグメントが放出された。
【０５９６】
この４．７kbのフラグメントをｐＫ−３１のＣｌａＩ部位内にクローニングさせ、ｐＫｃｏｒ「を作り出した。残りの唯一の５′ＸｈｏＩ部位をポリリンカー配列から誘導する。再配置されていないヒトＶκlll 遺伝子セグメント６５．８（プラスミドｐ６５．８、実施例２１）を含む６．５kbのＸｈｏＩ／Ｓａｌｌ ＤＮＡフラグメントをｐＫｃｏｒのＸｈｏＩ部位内にクローニングしてプラスミドｐＫＣ１を生成させた。ｐＫＣ１のＮｏｔＩインサートを１／２日目のマウス胎児内に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。２つの独立したｐＫＣ１誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣｌ−６７３及びＫＣ１−６７４は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンのおよそ１及び１０〜２０のコピーの組込みを含むものとして見積られた。
【０５９７】
ＫＣｌｅ
マウス及びヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを両方共含む２．３kbのインサートを切除するため、ＢａｍＨ［及びＨｉｎｄlllを用いてプラスミドｐＭＨＥｌ（実施１３及び１８）を消化した。このフラグメントをクレノウ処理し、Ｓａｌｌリンカー（New England Biolabs，Beverly.Massachusetts）に連結させ、ｐＫＣＩの唯一の３′Ｓａｌｌ部位の中にクローニングさせてプラスミドｐＫＣ１ｅを生成した。ｐＫＣｌｅのＮｏｔｌインサートを１／２日目のマウス胎児に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。４つの独立したｐＫＣｌｅ誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁殖させるのに使用した。これらの系統ＫＣｌｅ−１３９９．ＫＣｌｅ−１４０３．ＫＣｌｅ−１５２７及びＫＣｌｅ−１５３６は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約２０〜５０，５〜１０，１〜５及び３〜５のコピーの組込みを含むものであると見積られた。
【０５９８】
ｏＫＣ２
再配置されていないヒトＶκlll遺伝子セグメント６５．５（プラスミドｐ６５．５ｇｌ、実施例２１）を含む６．８kbのＸｈｏｌ／ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメントをｐＫＣｌの唯一の５′ＸｈｏＩ部位内にクローニングしてブラスミドｐＫＣ２を生成した。このミニ遺伝子座トランスジーンは、２つの異なる.機能的Ｖκlll遺伝子セグメントを含む。１／２日目のマウス胎児の中にｐＫＣ２のＮＯｔＩインサートを微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。５つの独立したｐＫＣ２誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座の両方を含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣ２−１５７３，ＫＣ２−１５７９，ＫＣ２−１５８８，ＫＣ２−１６０８及ひＫＣ２−１６１０は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約１〜５，１０〜５０，１〜５，５０〜１００及び５〜２０のコピーの組込みを含むものと見積られた。
【０５９９】
実施例２６ 
この例は、ヒトκトランスジーンを支持するトランスジェニックマウスが、機能的ヒトκ鎖を含む抗体を形成する抗原誘発された抗体応答を発生させることができるということを示している。
【０６００】
ヒトＩｇκ軽鎖と結びつけられた抗体応答
ＨＣｌ−５７ヒト重鎖及びＫＣｌｅヒトκトランスジーンを含むトランスジェニックマウスを精製されたヒト可溶性ＣＤ４（ヒト糖タンパク質抗原で免疫化した。ポリスチレンラテックス粒子（Polysciences．Marrington，PA）に対する接合（コンジュゲーション）により不溶化された精製ヒトＣＤ４（NEN Researchの製品、Westwood，MA）を２０μｇ、０日目にジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（Cal bio chem，San Diego，CA）を伴う食塩水中で腹腔内注射し、その後２０日目及び３４日目にさらに注射を行なった。
【０６０１】
２５日目と４０日目に眼窩後方出血をとり、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩｇＭ又はヒトＩｇＧ重鎖を含むＣＤ４に対する抗体の存在についてスクリーニングした。簡単に言うと、ＰＶＣのマイクロタイタープレート上に２．５μｇ／mlで精製されたヒトＣＤ４をコーティングし、ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％のニワトリ血清中で１：４／１：５に希釈された培養上清と共にインキュベートさせた。プレートを洗浄し、その後、ヒトＩｇＧ Ｆｃに特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭ Ｆｃ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno Research，Westr Grove，PA）を付与した ＡＢＴＳ基質の付加によるさらなる洗浄後に、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を見極めた。両方の出血において、抗原との反応性をもつヒトμを検出したが、γ反応性は基本的に検出不能であった。４０日目に、ヤギ抗ヒトκペルオキシダーゼ接合体（Sigma，St.Louis，MO）での同じ検定を用いて抗原反応性ヒトκ鎖についても試料をテストした。この時点でＣＤ４を結合するκ反応性が検出された。検定の結果は、図５９に示されている。
【０６０２】
実施例２７ 
この例は、機能的に分断されたマウス重鎖及び軽鎖遺伝子座（重鎖及びκ鎖遺伝子座）について同型接合であり、しかも、機能的ヒト重鎖及び機能的ヒト軽鎖をコードするべく産生的に再配置することのできるヒト軽鎖トランスジーンとヒト重鎖トランスジーンを並行して宿すマウスの生成の成功を示している。このようなマウスは「００１１」マウスと呼ばれ、ここで最初の２ケタの２つのゼロはこのマウスに機能的な重鎖及び軽鎖遺伝子座が欠如していることを表わし、次の２ケタの１は、このマウスがヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンについて半接合であることを表わしている。この例は、かかる００１１マウスに予め定められた抗原に対する特異的抗体応答を発生させる能力があること、又かかる抗体応答にアイソタイプスイッチが関与しうることを示している。
【０６０３】
００１１／００１２マウス：内因性Ｉｇノックアウト＋ヒトＩｇトランスジーン
上述のＨＣｌ−２６トランスジェニックマウス系統といったヒトＨＣｌトランスジーンも宿し、機能的ＪH領域が欠如した機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座（ＪＨＤ÷÷又はＪＨΔ÷÷と呼ばれる）について同型接合であったマウスを、機能的ＪH領域の欠如した機能的に分断された内因性カッパ鎖遺伝子座（ここではＪＫＤ÷÷又はＪＫ△÷÷と呼ばれる、図９参照）について同型接合のマウスと同系交配させて、ＪＨＤ÷÷／ＪＫＤ÷÷と呼ばれるＨＣｌトランスジーンを含む機能的に分断された重鎖及びカッパ鎖遺伝子座（重鎖／カッパ鎖ノックアウト）について同型接合のマウスを産生した。
【０６０４】
かかるマウスを、同系交配により産生させ、ゲノミックＤＮＡのサザンブロットにより評価されるとおりの遺伝子型に基づいて選択した。ＨＣｌ−２６÷／ＪＫＤ＋÷／ＪＨＤ＋＋マウスと呼ばれるこれらのマウスを、ヒトカッパ鎖トランスジーンを宿すマウス(系統ＫＣ２−１６１０，ＫＣｌｅ−１３９９及びＫＣｌｅ−１５２７；実施例２５参照).と同系交配させ、機能的に分断された重鎖及び軽鎖遺伝子座について同型接合でしかもＨＣｌトランスジーン及びＫＣ２又ＫＣｌｅトランスジーンについで半接合である子孫マウスを同定するのに、ゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析を用いた。
【０６０５】
このようなマウスは番号で呼称され、以下の略号を用いてその遺伝子型に関して同定された：すなわち、ＨＣｌ−２６÷はＨＣｌ−２６系統のヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン組込みに対する半接合を表わし；ＪＨＤ＋÷はＪHノックアウトに対する同型接合を表わし；ＪＫＤ÷÷はＪκノックアウトに対する同型接合を表わし；ＫＣ２−１６１０÷は、系統ＫＣ２−１６１０の場合と同じように組込まれたＫＣ２ヒトκトランスジーンについての半接合を麦わし：ＫＣｌｅ−１５２７÷は、系統ＫＣｌｅ−１５２７の場合と同じように組込まれたＫＣｌｅヒトκトランスジーンについての半接合を表わし；ＫＣｌｅ−１３９９÷は、系統ＫＣｌｅ−１３９９の場合と同じように組込まれたＫＣｌｅヒトκトランスジーンについての半接合を表わす。
【０６０６】
結果して得られた個々の子孫には各々数字で表わした呼称（例えば６２９５．６９０７など。）が与えられ、各々ＪHノックアウト対立遺伝子、Ｊκノックアウト対立遺伝子、ＨＣｌ−２６トランスジーン及びκトランスジーン（ＫＣ２又はＫＣｌｅ）の存在について評価され、各遺伝子座において半接合（÷）又は同型接合（÷÷）のいずれかであることが決定された。表１０は、子孫マウスのいくつかの番号呼称、性別及び遺伝子型を示している。
【０６０７】
【表６】
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我々は、生後６週間の雌マウスから脾臓をとり出した。サザンプロットハイブリダイゼーションにより、マウス＃７６５５は、ＨＣｌ（系統２６）及びＫＣ２（系統１６１０）トランスジーン取込みについて半接合であり、マウスμ及びκ Ｊ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲティングされ欠失について同型接合であることが見極められた。マウス＃７６５６は、サザンプロットハイブリダイゼーションにより、ＫＣ２（系統１６１０）トランスジーン組込みについて半接合でありマウスμ及びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲッティングされた欠失について同型接合であることが見極められた。マウス＃７７７７は、サザンプロットハイブリダイゼーションにより、マウスμ及びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲティングされた欠失について半接合であると見極められた。これらの欠失が劣性であることから、このマウスは表現型上野生型であるはずである。
【０６０８】
００１１マウスにおける内因性Ｉｇ鎖の発現
（１）野生型マウス（７７７７）、（２）重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン（７６５６）を宿す０００１マウス及び（３）重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン及びヒト重鎖トランスジーン（７６５５）を宿す００１１マウスから外植されたリンパ球を選別するため、ヒトμ、マウスμ、ヒトκ、マウスκ、又はマウスλのいずれかと反応性ある抗体のパネルを用いたＦＡＣＳ分析を使用した。
【０６０９】
我々は、Mishell 及びShiigi（Mishell，B.B．& Shiigi.S.M．（eds)細胞免疫 学における選択された方法。W.H.Freeman & Co.，New York，1980）により記述されているように、脾臓から単細胞懸濁液を調製し、ＮＨ4、Ｃlで赤血球を溶解させた。リンパ球を以下の試薬で染色するヨウ化プロピジウム（分子プローブ、 Eugene，OR）、ＦＩＴＣ接合された抗ヒトＩｇＭ（クローンＧ２０−１２７１Ph armingen.サンディエゴ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＭ（クローンＲ６−６０． ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）、フィコエリトリン接合された抗ヒトＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Cal Tag，サウスサンフランシスコ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６；Pharming en，サンディエゴ，CA)、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）、及びＣｙ−クロム接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）。我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩＳＩＩソフトウェア（Be ct on Dickinson，サンホゼ，CA）を用いて染色された細胞を分析した。
【０６１０】
マクロファ−ジ及び残留赤血球を、前方及び側方散乱をゲ−ト・オンすることにより排除する。死濁細胞は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞をゲート・アウトすることにより排除する。図６０及び図６１のフローサイトメトリーデータは、サザンブロットハイブリダイゼーションデータを確認し、マウス＃７６５５がヒト μ及びヒトκの両方を発現し、あったとしても比較的わずかなマウスμ又はマウスκを発現することを実証している。それでも、Ｂ細胞の有意な分画（約７０〜８０％）がヒト重鎖及びマウスλ軽鎖から成るハイブリッドＩｇレセプターを発現すると思われる。
【０６１１】
図６０は、細胞表面上でヒトμ又はマウスμを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はヒトμに対し陽性であるが、相対的にマウスμが欠如している；０００１マウス（７６５６）リンパ球は、多くのヒトμ又はマウスμを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウス μを発現するが、ヒトμが欠如している。
【０６１２】
図６１は、細胞表面上でヒトκ又はマウスκを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はヒトκについて陽性であるが、相対的マウスκが欠如している；０００１マウス（７６５６）リンパ球は多くのヒトκ又はマウスκを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスκ を発現するが、ヒトκか欠如している。
【０６１３】
図６２は、細胞表面上でマウスλを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はマウスλについて陽性である；０００１マウス（７６５６）リンパ球は、有意なマウスλを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスλを発現するが、００１１マウス（７６５５）に比べ相対的に低いレベルにある。
【０６１４】
図６３は、ヒトκ（トランスジーンでコードされたもの）に比べての内因性マウスλについて陽性のＢ細胞の相対的分布を示す。左上の図版は、機能的内因性重鎖及び軽鎖対立遺伝子を有しヒトトランスジーン（単複）が欠如している野生型マウスからの細胞の結果を示す；細胞はマウスラムダについて陽性である。右上の図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ÷÷）を有しＫＣｌｅ−１３９９系統のヒトκトランスジーンの組込みを宿すマウス（＃５８２２）からの細胞を示す;細胞は、おおまかに比例する量でヒトκ又はマウスλについて陽性である。
【０６１５】
左下図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ÷÷）を有しＫＣ２−１６１０系統のヒトκトランスジーン組込みを宿すマウス（＃７１３２）からの細胞を示すヒトκに対してよりマウスλに対してより多くの細胞が陽性であり、ＫＣ２−１６１０トランスジーン組込みがＫＣｌｅ−１３９９トランスジーン組込みほど効率が良くないということを表わしている可能性がある。右下図版は、ヒトκミニ遺伝子座トランスジーン（ＫＣｏ４）を宿し機能的内因性マウスκ対立遺伝子か欠如しているマウスからの細胞を示す。
【０６１６】
図６３に示されているデータは同様に、トランスジーン間の表現型の可変性をも実証している。かかる可変性は、組込まれたトランスジーンの結果もたらされる単数又は複数の表現型上の特徴（例えばアイソタイプスイッチ、高レベル発現、低マウスＩｇバックグラウンド）を発現する個々のトランスジーン及び／又はトランスジェニック系統について選択するのが望ましいことであるということを表わしている。−般に、（１）トランスジーン、（２）トランスジーン組込みの部位、及び／又は（３）遣伝的背景により異なっている多数の個別のトランスジェニック系統を形成するため、別々に単一又は多数のトランスジーン種（例えばｐＫＣｌｅ．ｐＫＣ２，ＫＣｏ４）が利用される。
【０６１７】
次のような望ましいパラメータについて個々のトランスジェニック系統を検査する：（１）予め定められた抗原に対する免疫応答を高める能力、（２）トランスジーンでコードされた恒常領域内のアイソタイプスイッチの頻度及び／又は内因性（例えばマウス）Ｉｇ恒常領域遣伝子に対するトランススイッチの頻度、（３）トランスジーンでコードされた免疫グロブリン鎖及び抗体の発現レベル、（４）内因性（例えばマウス）免疫グロブリン、免疫グロブリン配列の発現レベル、及び（５）産生的ＶＤＪ及びＶＪ再配置の頻度。標準的には、トランスジーンでコードされる（例えばヒト）免疫グロブリン鎖を最大濃度で産生するトランスジェニック系統が選択される；好ましくは、選択された系統は、トランスジェニック動物の血清中で少なくとも約４０μｇ／mlのトランスジーンコードされた重鎖（例えばヒトμ又はヒトγ）及び／又は少なくとも約１００μｇ／mlのトランスジーンコードされた軽鎖（例えばヒトκ）を産生する。
【０６１８】
マウスの免疫化を受けていない血清及び特異的抗原つまりヒトＣＤ４での免疫化の後の血清の中のヒト及びマウス免疫グロブリン鎖の発現について、マウスを検査した。図６４はさまざまな遺伝子型の別々の４匹の免疫化を受けていない００１１マウスの血清の中に存在するヒトμ、ヒトγ、マウスμ、マウスγ、ヒト κ、マウスκ及びマウスλ鎖の相対的発現を示している（ｎｔ＝テストせず）；ヒトκが最も豊富な軽鎖として優勢であり、ヒトμ及びマウスγ（推定上はトランススイッチの産物）が最も豊富な重鎖であるが、系統間で可変性が存在しており、このことは、ヒト鎖の発現を可能にしながらマウス鎖の発現を最小限にする有利な遺伝子型組合せを同定するための選択段階の有用性を表わしている。マウス＃６９０７及び７０８８は、ヒトμからヒトγへのアイソタイプスイッチ（トランスジーン内のシス・スイッチ）を示している。
【０６１９】
図６５は、さまざまな００１１遺伝子型のマウス内のヒトμ（ｈｕμ）、ヒト γ（ｈｕγ）、ヒトκ（ｈｕκ）、マウスμ（ｍｓμ）、マウスγ（ｍｓγ）、マウスκ（ｍｓκ）、及びマウスλ（ｍｓλ）についての血清免疫グロブリン鎖レベルを示している。
【０６２０】
００１１マウス内の特異的抗体応答
００１１マウス（＃６２９５）を、次の免疫化計画に従って免疫原性用量のヒトＣＤ４を用いて免疫化した：０日目、ＣＤ４マウス免疫血清１００μｌの腹腔内注入；１日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する；１５日目、１０μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する；２９日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤＡ（American Bio-Tech）を注入する；４３日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech ）を注入する。
【０６２１】
図６７は、抗ＣＤ４応答におけるヒトμ、ヒトκ及びヒトγ鎖の存在を立証する３週間目及び７週間目のＣＤ４免疫化に対する相対的抗体応答を示す。ヒトγ 鎖は、７週間目の血清中で著しく増大した発生量で存在し、野生型動物におけるァィソタイプスイッチのものと似た時間的関係で重鎖トランスジーン内でのシス−スイッチ（アイソタイプスイッチ）が発生していることを表わしている。
【０６２２】
図６８は、さまざまなヒト重鎖及び軽鎖トランスジーンの概略的寄せ集めを示す。
【０６２３】
実施例２８
この例は、マウスλ軽鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供する。
【０６２４】
マウスラムダ軽鎖遺伝子座のターゲティングされた失活
Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座とは異なり、マウスＶλＪλ及びＣλ遺伝子セグメントは、５′−３′アレイの形に配置された３つのグループにまとめられておらず、その代りに散在させられている。最も５′の部分は２つのＶセグメント（Ｖλ２及びＶλＸ）で構成されており、これら２つのセグメントの後には、３′方向に続行して各々独自のＪセグメント（Ｊλ２Ｃλ２及び遺伝子Ｊλ４Ｃλ４）と結びつけられた２つの恒常領域エキソンが続いている。次にくるのは最も広く用いられるＶセグメント （Ｖλ１）であり、このセグメントの後には恒常領域エキソンの第２のクラスター（Ｊλ３Ｃλ３及びＪλ１Ｃλ１）が続いている。全体として、遣伝子座は約２００kbにまたがり、２つのクラスター間の間隔は〜２０〜９０kbである。
【０６２５】
ラムダ遺伝子座の発現には、優越してＪλ２までのＶλ２又はＶλＸの再配置そして稀にのみＪλ３又はＪλ１に対してさらに３′の再配置が関与する。Ｖλ １はJλ３及びＪλ１の両方と組換え可能である。かくして、遺伝子座の組換え及び発現を充分に削除するため、ラムダ遺伝子座を突然変異させることが可能である。
【０６２６】
２つのラムダ遣伝子クラスターの間の距離は、マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を失活させる上で用いられたとおりに、単一のち密なターゲッティングされた欠失の生成を介して遺伝子座の発現を失活することを困難にする。その代り、発現ラムダ軽鎖を削除することになる小さい単一の欠失は、Ｊλ２Ｃλ２からＪλ１Ｃλ１までに広がる約１２０kbにまたがっている（図６９）。こうしてラムダ恒常領或エキソンの全てならびにＶλ１遺伝子セグメントが除去され、遺伝子座の失活が確保される。
【０６２７】
欠失された１２０1kbがＰＧＫ発現カセット内で選択可能な標識遣伝子ｎｅｏと置換されている、置換型ターゲティングベクター（Thomas及びCapecehi（1987 ）前掲書中）が構築される。このマーカーは、ラムダ遺伝子座に対する相同性を提供するため欠失にフランキングするゲノミックラムタダ配列内に埋め込まれており、同様に、ベクターを相同的に組込んだ細胞についての富化を可能にするため、相同性領域の１つの端部にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むこともできる。ターゲティングされている染色体ＤＮＡに対し同質遺伝子型のターゲティングベクターの使用が相同組換えの効率を増強することが報告されていることから、ラムダ遺伝子座ゲノミッククローン配列は、ターゲティングされているＥＳ系統と同質遺伝子型の系１２９／Ｓｖゲノミックファージライブラリのスクリーニングによって得られる。
【０６２８】
ラムダ遣伝子座に対する相同性の長さで相異のあるターゲティングベクターが構築される。第１のベクター（図７０中のベクター１）は、合計約８〜１２kb のラムダ遺伝子座配列によりフランキングされた標識遣伝子を含む。置換ベクターが数kbのＤＮＡの付加又は検出を媒介するターゲティング事象については、これは、充分以上の相同性範囲であることが実証されてきた（Hasty et al．（199 1）、前掲書Ｍ中；Thomas et al.（1992）前掲書中）。フランキングラムダ配列をさらに約４０〜６０kb伴うベクターも又構築される（図７０中のベクタ−２）。少なくとも８０kbのヒト１ｇミニ遣伝子座が日常的にクロ−ニングされ、プラスミドベクタ−ｐＧＰ１の中で増殖される（Taylor et al.（1993）前掲書中） ラムダ遣伝子座の失活のための代替的なアプローチでは、同じＥＳ細胞内において、例えば２つの恒常領域クラスタ一又は２つのＶ領域遺伝子座の突然変異といった２つの独立した突然変異が利用される。
【０６２９】
恒常領域が両方共各々ＤＮＡの〜６kb内に内含されているのに対しＶ遺伝子座の１つは〜１９kbにまたがっていることから、ターゲディングベクターは」λ２Ｃλ２／Ｊλ４Ｃλ４及びＪλ３Ｃλ３／Ｊλ１Ｃλ１遺伝子座を独立して欠失するように構築される。図１７０に示されているように、各々のベクターは、各欠失にフランキングする合計〜８〜１２kbのラムダ遺伝子座ゲノミックＤＮＡによりとり囲まれた、ＰＧＫ発現カセット内の選択可能なマーカー（例えばｎｅｏ又はｐａｃ）から成る。陽性−陰性選択による相同組換え事象のため富化するべく、ターゲディングベクターに対し、ＨＳＶ−ｔｋ遣伝子を付加することが可能である。
【０６３０】
恒常領域遺伝子のうちの１つの欠失を支持するクローンが生成されるように、ＥＳ細胞を２つのベクターで逐次的にターゲッティングさせる。次にこれらのクローンを２つのベクターで逐次的にターゲティングさせて、恒常領域遺伝子座の１つの欠失を支持するクローンが生成されるようにし、その後これらのクローンを残りの機能的恒常領域クラスターの欠失を生成するべくターゲティングさせる。両方のターゲティング事象がかくして同じ細胞に対し向けられていることから、２つのターゲティングのために異なる選択可能なマーカーを使用することが好ましい。図７０に示されている概略的な例においては、ベクターのうち一方はｎｅｏ遺伝子を含み、もう一方はｐａｃ（ピュロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいる。
【０６３１】
第３の潜在的に優性な選択可能マーカーは、ｈｙｇ（ハイグロマインンホスフォトランスフェラーゼ）遺伝子である。ｐａｃ及びｈｙｇ遣伝子は両方共、Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遣伝子座の中にｎｅｏ遺伝子座をターゲティングするためにうまく使用されるＰＧＫ発現構成体の中に挿入され得る。２つのラムダ恒常領域クラスターは密に連鎖されるされていることから、２つの突然変異が同じ染色体上にあることが重要である。好ましくは独立した２つのターゲティング事象により同じ対立遺伝子を突然変異させる確率は５０％あり、突然変異の連鎖は、２重にターゲティングされたＥＳ細胞から誘導されたキメラの繁殖（交配）中のその同時分離により確立される。
【０６３２】
実施例２９
この例は、マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供する。
【０６３３】
マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされた失活
ＥＳ細胞内での遺伝子ターゲティングによりマウス重鎖遣伝子座恒常領域遺伝子のうちの少なくとも１つ好ましくは実質的に全てを欠失するために、図９１に示された構造をもつ相同組換え遺伝子ターゲティングトランスジーンを使用する。図９１は、ターゲティングトランスジーンの全体的概要図を示す。セグメント（ａ）は、欠失されるべき恒常領域遺伝子（単複）の上流にある（すなわち遺伝子に近接する）クローニングされたゲノミックＤＮＡ配列である：セグメント（ｂ）は、ｐｇｋ−ｎｅｏといった正の選択マーカーを含みセグメント（ｃ）は欠失すべき恒常領域遺伝子（単複）の下流にある（すなわち恒常領域遺伝子（単複）及びＪH遺伝子に対し遠位にある）クローニングされたゲノミックＤＮＡ配列である；又任意のものであるセグメント（ｄ）は、負の選択マーカー遺伝子（例えばＨＳＶ−ｔｋ）を含む。図７１は、「免疫グロブリン遺伝子」、Honj ｏT．Alt，FW及びRabbits TH(eds)Academic Press，MY(1939)p129からとったマウス重鎖遣伝子座の地図を示す。
【０６３４】
ターゲティングトランスジーンは、図９１に従った構造を有し、ここで（１）（ａ）セグメントは、クローンＪＨ８．１の１１．５kbのインサート（Chen eta l.(1993)Int.Immunol. ５.647）又は、マウスＣμ遺伝子の上流にある少なくとも約１〜４kbの配列を含む同等の部分であり、（２）（ｂ）セグメントは上述のとおりのｐｇｋ−ｎｅｏであり、（３）（ｃ）セグメントは、５′−gtg ttg cg t gta tca gct gaa acc tag aaa cag ggt gac cag −３′という配列をもつ末端標識づけされたオリゴヌクレオチドでマウスゲノミッククローンライブラリをスクリーニングすることにより分離されたマウスＣα遺伝子のファージクローンから分離された４〜６kbのインサート又は図７２に示された１６７４bpの配列を含んでおり、（４）（ｄ）セグメントは上述のＨＳＶ−ｔｋ発現カセットを含んでいる。
【０６３５】
代替的には、第１のターゲティングが相同性領域すなわち恒常領域遺伝子（単複）、第１種の正の選択マーカー遺伝子（ｐｇｋ−ｎｅｏ）及びＨＳＶ−ｔｋ負の選択マーカーにフランキングする配列に相同なセグメント（ａ）及び（ｃ）を含んでいる、単数又は複数の重鎖恒常領域遺伝子の段階的欠失を実施する。かくして、（ａ）セグメントは、Ｃγ３の上流にある領域に相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ、（ｃ）セグメントはＣγ２ａの上流にある領域に対して相同な少くなくとも約１〜４kbの配列を含むことができる。
【０６３６】
このターゲティングトランスジーンはＣγ３，Ｃγ１．Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遺伝子を欠失させる。この第１のターゲティングトランスジーンはＥＳ細胞内に導入され、適正にターゲティングされた組換え体が選択され（例えばＧ４１８で）、適正にターゲティングされたＣ碩域欠失を生み出す。次にＨＳＶ−ｔｋカセットの喪失についての負の選択が行なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又はＦＩＡＵで）。結果として得られる適正にターゲティングされた第１図のＣ欠失組換え体は、Ｃγ３．Ｃγ１．Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遣伝子が欠如した重鎮遣伝子座を有する。
【０６３７】
第２のターゲティングトランスジーンは、相同性領域すなわち、恒常領域遣伝子（単複）、第１の種とは異なる第２種の正の選択マーカー遣伝子（例ｇｐｔ又はｐａｅ）及びＨＳＶ−ｔｋ負の選択マーカーにフランキングする配列と相同なセグメント（ａ）及び（ｃ）を含んでいる。かくして、（ａ）セグメントは、Ｃ εの上流にある領域に対し相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ、（ｃ）セグメントは、Ｃαの上流にある領域に相同で少なくとも約１〜４kbの配列を含むことかできる。このターゲティングトランスジーンはＣε及びＣα遣伝子を欠失させる。
【０６３８】
この第２のターゲティングトランスジーンは、第１のターゲティング事象から得られた適正にターゲティングされたＣ−領域組換え型ＥＳ細胞の中へ導入される。第２のノックアウト事象のために適正にターゲティングされている（すなわち第２のターゲティングトランスジーンでの相同組換えによる）細胞は、第２種の正の選択マー力ー遺伝子に特異的な選択薬剤（例えば、ｇｐｔについて選択するためのミコフェノール酸ｐａｃについて選択するためのピュロマイシン）を用いて選択される。その後、ＨＳＶ−ｔｋカセットの喪失についての負の選択が行なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又はＦＩＡＵを用いて）。結果として得られるこれらの適正にターゲティングされた第２回目のＣ領取組換え体は、Ｃ γ３．Ｃγ１．Ｃγ２ｂ．Ｃγ２ａ，Ｃε及びＣα遺伝子が欠如した重鎖遺伝子座を有する。
【０６３９】
単数又は複数のＣ領域遺伝子が欠如した適正にターゲティングされた第１回又は第２回目の組換え型ＥＳ細胞を、上述のとおり、胚盤胞注入のために使用し、キメラマウスを産生する。ターゲティングされた重鎖対立遺伝子の生殖細胞系伝播が樹立され、結果として得られた創立者マウスの繁殖（交配）を行なってＣ領域ノックアウトに対して同型接合のマウスを生成する。このようなＣ領域ノックアウトマウスは、ＪHノックアウトマウスに比べていくつかの利点を有する：−例を挙げると、Ｃ領域ノックアウトマウスは、ヒト重鎖トランスジーンと内因性重鎖遺伝子座恒常領域の間のトランススイッチを受ける能力が低下しており（又はこの能力が完全に欠如している）、かくしてトランスジェニックマウス内のキメラヒト／マウス重鎖の頻度を減少している。μ及びデルタも同様に頻繁に相同ターゲティングによって欠失させられているものの、マウスガンマ遣伝子のノックアウトが好まれる。
【０６４０】
内因性マウス重鎖遣伝子座内のその他のターゲティングされた病巣と合わせて、Ｃ領域ノックアウトを行なうことが可能である：中でも、マウス重鎮遺伝子座の産生的ＶＤＪ再配置を排除するため及びヒト重鎖トランスジーンとマウス重鎖遣伝子座の間のトランススイッチを排除又は削減するために、ＪHノックアウトとＣ領域欠失を組合わせることが可能である。いくつかの実施態様については、内因性重鎖遣伝子座の単数又は複数のＣ領域遺伝子が特定的に欠如しているもののその他のいくつかのＣ領域遺伝子を保持しているマウスを産生することが望ましい可能性がある。例えば、キメラヒト／マウスＩｇＡ、が有利な表現型を付与し実質的にマウスの望ましい有用性と干渉しない場合、このＩｇＡのトランススイッチによる産生を可能にするべくマウスＣα遺伝子を保持することが好ましい可能性がある。
【０６４１】
実施例３０
この例は、ヒトトランスジーンを宿トランスジェニックマウスから得られるリンパ球試料からの内因性（マウス）免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ピボ 枯渇を実証する。マウスＩｇを発現するリンパ球は、トランスジーン（単複）によりコードされるヒト免疫グロブリンに対する実質的結合力が欠如している抗マウス免疫グロブリン抗体に対する特異的結合により選択的に枯渇される。
【０６４２】
マウスＩｇ−発現Ｂ細胞の半ビボ枯渇
ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＨIＣ２）及びヒト軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＫＣｏ４）に対して同型接合のマウスをＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）同系繁殖マウスと繁殖（交配）させ、２２１１マウス（すなわち、機能的内因性マウス重鎖遺伝子座に対し同型接合で、機能的内因性マウス軽鎖遺伝子座に対し同型接合で、かつヒト重鎖トランスジーンの１つのコピーとヒト軽鎖トランスジーンの１つのコピーを有するマウス）を得る。かかる２２１１マウスば同様にＢ６主要及び非主要組織適合抗原をも発現する。これらのマウスを、免疫原性用量の抗原でプライミングさせ、約１週間後に脾細胞を分離させる。
【０６４３】
標準的方法（Wyso ckiet al.(1978). Proc.Natl.Acad.Sci．(U.S.A.)75；2844 ；MACS磁気細胞選別、Miltenyi Biotec Inc．Sunnyvale，CA）に従った固相連結されに抗体依存型細胞分離及び、それに続く、マウスＩｇに関し陽性の残留細胞を実質的に除去するための抗体依存型補体媒介の細胞溶解（「細胞免疫学におけ る選択された方法」、Mishell 88及びshiigi SM (eds)，W.M.Freeman and Compa ny，New York，1980，p211〜212）によって、マウスＩｇに関して陽性のＢ細胞を除去する。枯渇された試料中の残りの細胞（例えば、ヒトＩｇについて陽住なＢ細胞、Ｔ細胞）を、好ましくは発生するＢ細胞に対する付加的な抗マウスＩｇ抗体と合わせて、ＳＣＩＤ／Ｂ６又はＲＡＧ／Ｂ６マウスに静脈内注射する。再構成されたマウスを次に、さらに抗原に対し免疫化させ、ハイブリド−マクローンを産生するための抗体及び親和力の成熟した細胞を得る。
【０６４４】
実施例３１
体細胞キメラ内の完全にヒトの抗体の産生
体細胞キメラマウス内で完全にヒトの抗体を産生するための方法が記述される。これらのマウスは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖トランスジーンを有し、機能的マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子が欠如した胚幹（ＥＳ）細胞を、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２欠損マウスからの胚盤胞の中に導入することによって生成される。
【０６４５】
ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２欠損マウス（Mombaerts et al．(1992)Cell 68: 869；Shinkai et al．(1992)Cell 68：855）には、ＶＤＪ再配置を開始しＩｇｓをコードする遺伝子セグメント及びＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を組立てることができないため、マウスＢ及びＴ細胞が欠如している。Ｂ及びＴ細胞の産生におけるこの欠陥は、ＲＡＧ−２欠損動物から誘導された胚盤胞内への野生型ＥＳ細胞の注入によって補完できる。結果として得られたキメラマウスは、注入されたＥＳ細胞から完全に誘導された成熟したＢ及びＴ細胞を産生する（Chen et al(1 993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：4528）。
【０６４６】
キメラのＢ及び／又はＴ細胞全ての中に、規定の突然変異及び／又は外因性ＤＮＡ構成体を導入するために、注入されたＥＳ細胞の遺伝子操作を使用する。Ch en et al. (1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：4528−4532) ＲＡＧ胚盤胞内に注入された時点で、Ｂ細胞が無い状態でＴ細胞を作るキメラを産生した、Ｉｇ重鎖遺伝子座の同型接合失活を有する生成されたＥＳ細胞（原文不明瞭）。突然変異体ＥＳ細胞内への再配置されたマウス重鎖のトランスフェクションの結果、Ｂ細胞の発達が救われ、キメラ内でＢ細胞及びＴ細胞の両方が再生されることになる。
【０６４７】
マウスＩｇ重鎖又はカッパ軽鎖の合成が無い状態で完全にヒトの抗体を発現するキメラマウスを生成することが可能である。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の両方の失活について同型接合であるＥＳ細胞の中に、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖構成体を導入する。このときＥＳ細胞を、ＲＡＧ２欠損マウスから誘導された胚盤胞の中に注入する。結果として得られるキメラは、マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子を発現することはできないもののヒトＩｇ遺伝子は発現する注入されたＥＳ細胞から排他的に誘導されたＢ細胞を含んでいる。
【０６４８】
免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の失活について同型接合のＥＳ細胞の生成
それぞれ既知の手順に従った（Chen et al.(1993)EMBO J. 12：821；及びChen et al.(1993)Int.Immunol. 前掲書中）、ＥＳ細胞内でのＩｇＪH及びＪκ／Ｃ κ配列のターゲティングされた欠失により、失活されたＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を支持するマウスを生成した。２つの突然変異体系のマウスを合わせて繁殖させて、両方のＩｇ遺伝子座の失活について同型接合の系を生成した。この２重突然変異体の系を、ＥＳ細胞の誘導のために使用した。使用されたプロトコルは、基本的に、Robertson により記述されたものであった（１９８７、「奇形ガン腫及び胚幹細胞；１つの実践的アプローチ」中。
【０６４９】
p71〜112。E.J.Robertson 編、ＩＲＬプレス）。簡単に言うと、同系接合の２重突然変異体マウスの自然交配により、胚盤胞が生成された。受胎した雌を妊娠２．５日目に卵巣摘出し、妊娠７日目に子官から「遅延した」胚盤胞を洗い流し、支持細胞上で培養して、それらの未分化状態の維持を助けた。その形態で同定できる胚盤胞の内部細胞質量からの幹細胞をとり出し、解離させ、支持細胞上で継代させた。正常な核型をもつ細胞を同定し、雄細胞系統は、キメラを生成しマウスの生殖細胞に寄与するその能力についてテストされることになる。雄キメラははるかに多くの子孫を産生できることから、雌系統よりも雄ＥＳ細胞の方が好ましい。
【０６５０】
マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖欠損ＥＳ細胞内へのヒトＩｇ遺伝子の導入
ＨＣＳ及びＫＣ−ＣＯ４といったミニ遺伝子座構成体又はＪ１．３ＰといったＹＡＣクローンのいずれかとして、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を突然変異体ＥＳ細胞内に導入する。ヒトＩｇ ＤＮＡでのＥＳ細胞のトランスフェクションを、電気穿孔又は陽イオン脂質でのリポフェクションといった技術によって行なう。ヒトＤＮＡを取込んだＥＳ細胞の選択を可能にするため、選択可能マーカーを構成体に連結させるか又はＥＳ細胞へと構成体と同時トランスフェクションさせる。突然変異体ＥＳ細胞は、Ｉｇ遺伝子失活を生成した遺伝子ターゲティング事象の結果としてネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を含んでいることから、ヒトＩｇ遺伝子をＥＳ細胞内に導入するため、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）又はピュロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）といったさまざまな選択可能なマーカーが使用される。
【０６５１】
ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子は、異なる選択可能マーカーを用いて、突然変異体ＥＳ細胞内に同時に又は逐次的に導入することができる。トランスフェクションの後、適切な選択可能マーカーで細胞を選択し、ヒト遺伝子配列の組込みを確認し分析するべく凍結しＤＮＡ分析する目的で薬剤耐性コロニーを拡張させる。
【０６５２】
キメラの生成
記述されているとおり（Bradley，A．(1987)，「奇形ガン腫及び胚幹細胞：１つの実践的アプローチ」中、p113〜151，E.J.Robertson編、ＩＲＬプレス）ＲＡＧ−２胚盤胞内にヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子を含むＥＳクローンを注入し、偽妊娠の雌の子官内にトランスファさせる、血清試料のＥＬＩＳＡ険定により、ヒト抗体の存在について子孫をスクリーニングする。ヒトモノクローナル抗体の免疫化及び産生のために陽性動物を使用する。
【０６５３】
実施例３２
この例は、スイッチ組換えを受けるＢ細胞の欠失へと導くマウス重鎖遺伝子座内へのターゲティングされたフレームシフト突然変異の、ＥＳ細胞内の相同組換えを介しての導入について記述する。フレームシフトされたマウスは、ヒト配列免疫グロブリンをコードするマウス以外の（例えばヒトの）トランスジーンを宿すための適切な宿主である。
【０６５４】
新しいフレームシフトされたマウスは、なかでも、重鎖トランスジーン（単複）及び／又は軽鎖トランスジーンによりコードされる非マウス（例えばヒト）配列免疫グロブリンを発現させるため、及び導入されたトランスジーンからのクラススイッチされた親和力が成熟したヒト配列抗体を発現するハイブリドーマの分離のために使用可能である。４つのマウスＪＨ遺伝子セグメントのうちの１つの中、そしてマウスμ遺伝子の第１のエキソンの中に、フレームシフトを導入する。導入された２つのフレームシフト突然変異は、互いに補償し合い、かくして、機能的ＶＤＪ連結のためにＢ細胞がフレームシフトされたＪＨを使用するときの完全に機能的なマウスμ重鎖の発現を可能にする。残りのＪＨ遺伝子内で補償されないμ内のフレームシフトのため、その他の３つのＪＨセグメントのいずれも機能的ＶＤＪジョイニングに使用することができない。代替的には、多数のマウスＪＨ遺伝子の中に、補償するフレームシフトを工作することもできる。
【０６５５】
補償されフレームシフトされた免疫グロブリン重鎖対立遺伝子に対し同型接合のマウスは、ほぼ生理学的レベルの末梢Ｂ細胞及び、マウスとヒトのμを両方共含むほぼ生理学的レベルの血清ＩｇＭを有する。しかしながら胚中心内に動員されたＢ細胞は、頻繁に、非μアイソタイプへのクラススイッチを受ける。内因性マウスμ鎖を発現するＢ細胞内のこのようなクラススイッチは、残りの非μＣH 遺伝子が補償するフレームシフトを有していないことから、補償されていないフレームシフトｍＲＮＡの発現を導く。結果として得られるＢ細胞は、Ｂ細胞レセプタを発現せず、欠失される。従って、マウス重鎖を発現するＢ細胞はそれらがアイソタイプスイッチの起こる分化段階にひとたび達した時点で欠失される。しかしながら、アイソタイプスイッチの能力をもちかかるアイソタイプ制限フレームシフトを含まない、非マウス（例えばヒト）トランスジーンによりコードされる重鎖を発現するＢ細胞は、アイソタイプスイッチ及び／又は親和力成熟などを含むさらなる発達の能力をもつ。
【０６５６】
従って、フレームシフトを受けたマウスはマウス重鎖(μ)に関して二次応答が損なわれているが、トランスジーンコードされた重鎖に関しては有意な二次応答を有する。クラススイッチを受けることのできる重鎖トランスジーンがこの突然変異体バックグラウンド内に導入された場合、非−ＩｇＭ二次応答は、Ｂ細胞を発現するトランスジーンにより支配される。かくしてこれらのフレームシフトされたマウスからハイブリドーマを発現する親和力成熟したヒト配列免疫グロブリンを分離することが可能である。さらに、フレームシフトされたマウスは一般に、ヒト重鎖トランスジーンが可変領域の制限された能力能囲しかコードできない場合に有利でありうるマウスＩｇＭの免疫防御レベルを有する。
【０６５７】
ヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るために、トランスジェニック突然変異体マウスを免疫化し、その脾臓を骨髄細胞系統と融合させ、結果として得られたハイブリドーマを、トランスジーンでコードされたヒト非μアイソタイプの発現についてスクリーニングする。さらに、フレームシフトしたマウスは、シススイッチのための活性基質として役立つ転写されたＶＤＪに隣接した搬能的μスイッチ配列を含むことになり（Gu et al,(1993)Cell 73;11 55）、かくしてキメラヒト／マウス抗体を発現するトランススイッチされたＢ細胞レベルを低下させるため、ＪＨ欠失したマウスに比べ有利でありうる。
【０６５８】
フレームシフトベクターの構築
２つの別々のフレームシフトベクターを構築する。これらのベクターのうちの１つは、マウスＪ４遺伝子セグメントの３′末端で２つのヌクレオチドを導入するのに用いられ、もう１つのベクターは、マウスμ遺伝子のエキソン１の５′末端からこれらの同じ２つのヌクレオチドを欠失させるために用いられる。
１．    ＪＨベクター
ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータの制御下でヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター内に、マウス重鎖Ｊ領域及びμイントロンエンハンサーを網羅する３．４kbのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをサブクローニングする（ｔｋ／ｎｅｏカセット、Hasty et al. ,（1991）Nature 350：243）。次に以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて２つの異なるＰＣＲフラグメントを生成するための基質として、このクローンを使用する： 
o−A1 5′-cca cac tct gca tgc agc aga agc ttt tct gat-3′ 
o−A2 5′-ggt gac tga ggt acc ttg acc cca gta gtc cag-3′ 
o−A3 5′-ggt tac ctc agt cac cgt ctc ctc aga ggt aat aat ggc ctc -3′ 
o-A4 5′-agg ctc cac cag acc tct cta gac agc aac tac-3′
ＳｐｈＩ及びＫｐｏｎＩ消化される１．２kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドｏ−Ａ１及びｏ−Ａ２を使用する。ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化される０．６kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドｏ−Ａ３及びｏ−Ａ４を使用する。次にこれら２つの消化されたフラグメントを、ＳｐｈＩ／ＸｂａＩで消化されたプラスミドＡの中にクローニングし、プラスミドＢを生成する。
【０６５９】
プラスミドＢは、Ｊ４の末端に２ヌクレオチド挿入を含み、さらに挿入の上流に新しいＫｐｎＩ部位を含む。挿入のための診断マーカーとして、ＫｐｎＩ部位を使用する。
【０６６０】
相同組換え効率を増大させるため、プラスミドの５′ＸｈｏＩ部位及び３′ＥｃｏＲＩ部位の中に、付加的フランキング配列をクローニングすることができる。その後、ＳｐｈＩ又はインサート内に単一の部位をもつもう１つの制限酵素で、結果として得られたプラスミドを消化し、胚幹細胞へと電気穿孔させ、これらの細胞を次に、Hasty et al (1991)、前掲書中、により記述されているとおりに、Ｇ４１８で選択させる。サザンプロットハイブリダイゼーションにより相同組換え体を同定し、次にHasty et al により記述されているとおりにＦＩＡＵにより選択させて、２塩基対挿入とＪＨ４内の新たなＫｐｎＩ部位のみを含む欠失されたサブクローンを得る。これらを、ＫｐｎＩ消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定し、ＰＣＲ増幅されたＪＨ４ ＤＮＡのＤＮＡ配列分析により確認する。
【０６６１】
結果として得られたマウスは、突然変異されていない配列：すなわち
...TGGGGTCAAGGA ACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG gtaagaatggcctctcc.
TrpGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGlu
から突然変異体配列すなわち、 
...TGGGGTCAAGGTACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGgtaagaatggcctctcc... 
TrPGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGlu
へと変換されたＪＨ４セグメントを含む。
【０６６２】
μエキソンｌベクター
ＪＨｄ遺伝子セグメント内への２塩基対挿入を工作するべく上述したものと類似のインビトロ突然変異誘発を用いて、第１のμエキソンの５′末端で２塩基対欠失を含むベクターを作り出すため、ＰＣＲ産物及びゲノミックサブクローンを組立てる。さらに突然変異をマーキングするため、ＡをＧに変更することにより新しいＸｍｎＩ部位も下流に導入する。
【０６６３】
突然変異を受けていないμ遺伝子の配列は以下のとおりである： 
...ctggtcctcagAGAGTCAGTCCTTCCCA AATGTCTTCCCCCTCGTC. 
GluSerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal
突然変異を受げけたμ遺伝子の配列は以下のとおりである。
【０６６４】
XmnI
...ctggtcctcag＿AGTCAGTCCTTCCCGAATGTCTTCCCCCTCGTC... 
SerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal
突然変異体配列を含む相同組換えベクターを、ＪＨ４挿入を含むＥＳ細胞系統へと線形化させ電気穿孔させる。ネオマイシン耐性クローンから相同組換え体を同定する。ＪＨ挿入と同じ染色体上のフレームシフト挿入を含むこれらの相同組換え体を、ＫｏｎＩ／ＢａｍＨＩで消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。野生型１１．３kbから突然変異体９kbまでのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩを含むＪ−μイントロンのサイズを減少させる新しいＫｐｎＩ部位とＪＨ４挿入を結びつける。次に、ＦＩＡＵを用いて、挿入されたｔｋ／ｎｅｏカセットの欠失のために、結果として得られたクローンを選択する。突然変異体μエキソンを含むクローンを、ＸｍｎＩで消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。突然変異は、ＰＣＲ増幅されたμ エキソンｌＤＮＡのＤＮＡ配列分析により確認される。
【０６６５】
フレームシフトされたマウスの生成
次に、ＪＨ４内の２塩基対挿入及びμエソキン１内の２塩基対欠失の両方を含むＥＳ細胞系統を、キメラを生成するべく偽妊娠の雌の体内に挿入される胚盤胞段階の胚の中に導入する。キメラ動物を繁殖させて生殖細胞系列の伝播を得、結果として得られた動物を同型接合まで繁殖させて、補償されたフレームシフトされた重鎖遺伝子座に対し同型接合でかつマウス重鎖を発現するＢ細胞内の二次体液性免疫応答が損なわれている突然変異体動物を得る。
【０６６６】
例えばｐＨＣＩ又はｐＨＣ２といったヒト重鎖トランスジーンを、フレームシフトされたマウスＩｇＨ遺伝子座をもつマウスの中にかかるヒトトランスジーンを宿すマワスを交雑育種することによってマウス重鎖フレームシフトバックグラウンドへと繁殖させることができる。同系交配及び戻し交配を介して、μ補償されフレームシフトされたマウスＩｇＨ対立遺伝子に対してマウスＩｇＨ遺伝子座で同型接合で（すなわちマウスの非μ鎖ではなくμ鎖のみの補償された枠内発現をすることのできる）しかも機能的ヒト重鎖トランスジーン（例えばｐＨＣｌ又はｐＨＣ２）の少なくとも１つの組込みコピーを宿すマウスを産生させる。かかるマウスは任意には、上述のとおりの内因性マウスκ及び／又はλ遺伝子のノックアウトを内含していてよく、又任意には、ヒト又はその他の非マウス軽鎖トランスジーン（例、ｐＫＣ１ｅ，ｐＫＣ２ｔよど）を含む可能性がある。
【０６６７】
代替的には、トランスジーン恒常領域遺伝子（単複）内のフレームシフトにより補償されるフレームシフトがトランスジーンＪ遺伝子（単複）に含まれるように、ヒトトランスジーン（単複）（重鎖及び／又は軽鎖）にば補償フレームシャフトが含まれていてもよい、内因性恒常領域遺伝子に対するトランススイッチは、補償されす、切形の又はナンセンス産生を産生する；かかる補償されていないトランススイッチされた免疫グロブリンを発現するＢ細胞に対し選択を行ない、これを枯渇させる。
【０６６８】
実施例３３
Ｄ領域切除による内因性重鎖の失活
この例は、マウス生殖細胞系統免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を非機能的な再配置されたＶＤ」セグメントで置換するための正−負選択相同組換えベクターについて記述する。結果として得られる対立遺伝子は、対立遺伝子内重鎖クラススイッチを受けかくしてトランススイッチレベルを活性トランスジーン遺伝子座まで減少させている状態で、正常な非産生的対立遺伝子としてＢ細胞内で機能する。
【０６６９】
Ｄ領域ターゲティング構成体
マウスＤ領域の上流にある８〜１５kbのＤＮＡフラグメントを、Gen BankにリストアップされたＤＦＬ１６．１セグメントに対する公表済み配列の約５０の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マウス系１２９ファージライブラリから分離し、サブクローニングする。ＤＦＬ１６．１は、上流Ｄセダメント（すなわち、Ｖ領域遺伝子クラスターに近位で、恒常領域遺伝子クラスタに遠位のもの）である。
【０６７０】
同様に、ＪＨ３，ＪＨ４，Ｅμ，Ｓμ及びμ恒常領域の最初の２つのコーティングエキソンを含む９．５kbのＢａｍＨＩフラグメントを、マウス系１２９ゲノミックファージライブラリーから分離しサブクローニングする。
【０６７１】
次にマウスハイブリドーマ（あらゆる系）から５〜１０kbの再配置されたＶＤＪを分離し、停止コドンを含む合成リンカーをＪセグメント内に挿入する。Ｖ置換再配副が可能であるため、枠外ＶＤＪ連結よりもＪの内部の停止リンカーが好まれる。
【０６７２】
これら３つのフラグメントをＰＧＫｎｅｏ正の選択カセット及びＰＧＫＨＳＶｔｋ負の選択カセットと合わせて組立てて、相同組換えにより１２９−誘導ＥＳ細胞（例えばＡＢｌ）内のマウスＤ領域を削除するための正−負選択ベクターを形成する。ターゲティングベクターは、それ自体９．５kbのＢａｍＨＩフラグメントに連結される再配置された５〜１０kbの再配置済みＶＤＪにそれ自体連結されている正の選択カセット（例えばＰＧＫｎｅｏ）に８〜１５kbのＤＮＡフラグメントを連結させることによって形成される。次に、ターゲティング構成体のいずれかの端部で負の選択カセット（例えばＰＧＫＨＳＶｔｋ）を連結させる。かかるＤ領域ターゲティングベクターの構成は、図７３に概略的に示されている。
【０６７３】
Ｄ領域ターゲディング構成体を、ＡＢ１ ＥＳ細胞内にトランスファし、正及び負の選択を上述のとおりに行ない、適正にターゲディングされたＥＳ細胞をクローニングする。胚盤胞注入のために、適正にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを使用し、キメラマウスを産生する。Ｄ領域失活された重鎖対立遺伝子を宿す創立者マウスを産生するため、キメラマウスを繁殖させる。機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如した同型接合体を産生するため、子孫の同系交配を行なう。
【０６７４】
このような同型接合体を用いて、ヒトＩｇトランスジーン（例えばｐＨＣ１，ｐＨＣ２．ｐＫＣ２．ｐＫＣ１ｅ，ＫＣｏ４）を宿マウスまで交雑育種し、（さらに、機能的Ｄ領域が欠如した同型接合体までもどし交配することにより）、機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如しかつヒト重（鎖）トランスジーン（そして好ましくはヒト軽鎖トランスジーンも）を宿すマウスを生み出す。
【０６７５】
いくつかの機能的内因性軽鎖遺伝子座（例えばλ遺伝子座）が残る実施態様においては、一般に、トランスジーンがヒト軽鎖（例えばκ）ポリペプチドの高レベル発現を誘導する転写制御配列を含み、かくしてトランスジーンの遺伝子座が残りの同因性軽鎖（例えばλ）遺伝子座と有効に競合できるようにすることが好ましい。例えば、Ｃｏ４カッパ軽鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物内の内因性λ遺伝子座と有効に競合する能力に関してｐＫＣ１に比べ一般に好まれている。
【０６７６】
実施例３４
この例は、ヒトＶκ遺伝子座の一部分を含む酵母人工染色体とヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座の同時注入によるヒト軽鎖トランスジーンＶ遺伝子の能力範囲の拡張について記述する。
【０６７７】
Ｖκ含有ＹＡＣ ＤＮＡとκミニ遺伝子座の同時注入による機能的ヒト軽鎖Ｖセ グメントの導入
一般に入手可能なＩＣＲＦ ＹＡＣライブラリーのクローン４×１７Ｅ１から、増幅されていないＹＡＣ ＤＮＡとして、ヒトＶκ遺伝子座の一部を含む約４５０kbのＹＡＣクローンを得た（Larin et a1．(1991)Proc.Natl.Acad.Sci(U.SA ）88：4123；Imperial Cancer Research Fund、 ゲノム分析研究所、ロンドン． UK）。メーカーの仕様に従って標準的なパルフフィールドゲル電気泳動法により、予め増幅することなく、４５０kb]のＹＡＣクローンを分離した（ＣＨＥＦ ＤＲ−(I、電気泳動セル、Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)。臭化エチジウムを用いて６つの個別のバルスフィールドゲルを染色し、ＹＡＣクローンＤＮＡを含むゲル材料をゲルがら切除し、次に三角形のゲルトレイ内に流し込まれた新しい（標準ゲル緩衡液中の低融点アガロース）ゲル内にこれを埋込む。標準電気泳動緩衝液に加えて２ＭのＮａＯＡｃを伴う狭いアガロースゲルを用いて頂点において、結果として得られた三角形のゲル（６つの切除されたＹＡＣ含有ゲルブロックを内含する）を伸展させた。次にゲルを、標準ゲル緩衝液中に浸潰された電気泳動チャンバ内に入れた。
【０６７８】
Ｙ形状のゲルフォーマは、電流（流動？）が狭く高いソルトゲル部分までだけ流れるように、緩衝液の表面より上に立上っている。緩衝液内へのＮａＯＡｃの拡散を防ぐため、高ソルトゲル切片全体にわたり、アクリルのブロックを置いた。次に、ＹＡＣ ＤＮＡを切片化された（埋込まれた）もとの切除ゲルから狭い高ソルトゲル部分内へと電気泳動させた。低ソルトゲルから高ソルトゲルへの遷移の時点で、三角形のゲルの頂点でＤＮＡの移動を有効に停止させる抵抗の低下が存在する。
【０６７９】
電気泳動及び臭化エチジウムでの染色の後、濃縮したＹＡＣ ＤＮＡを残りのゲルから切り離し、アガロースをＧＥＬａｓｅ（Epi Centre Technologies，Ｍa dison，Wisconsin)で消化した。次に、結果として得られたＹＡＣ含有液体に塩化セシウムを付加し、１．68ｇ／mlの密度を得た。この溶液を３６時間３７０００rpmで遠心分離し、あらゆる汚染物質からＹＡＣ ＤＮＡを分離した。結果として得られた密度勾配の０．５ml分画を分離し、５mMのＴｒｉｓ（pH７．４）、５mMのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡに対してピークＤＮＡ分画を透析した。
【０６８０】
透析の後、結果として得られたＹＡＣ ＤＮＡの０．６５ml溶液の濃縮は、２ μｇ／mlのＤＮＡを含んでいることがわかった。このＹＡＣ ＤＮＡを、２０：１：１（マイクログラムＹＡＣ４×１７Ｅｌ：ＫＣｌＢ：ＫＶ４）の比率で、プラスミドｐＫＣｌＢ及ひｐＫＶ４からの精製されたＤＮＡインサートと混合した。半日のＢ６ＣＢＦ２の胚の前後の中に、結果として得られた２μｇ／mlの溶液を注入し、９５の存続する微量注入された胚を偽妊娠の雌の卵菅内に移送した。微量注入された胚から発達した１２匹のマウスが生まれた。
【０６８１】
実施例３５
この例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座に対して同型接合でありかつＨＣｌ又はＨＣ２重鎖トランスジーンを含む免疫化したトランスジェニックマウスの中でのクラススイッチ、体細胞突然変異及びＢ細胞発達について記述する ヒト配列生殖細胞系統配置ミニ遺伝子座が真正遺伝子座と置換できることを実証するために、我々は、ヒト生殖細胞系統−配置ＩｇＨトランスジーンを含む系を用いて、内因性ＩｇＨが欠如したマウス系を繁殖させた。２つのトランスジーンミニ遺伝子座ＨＣ１及びＨＣ２は、それぞれ１つ及び４つの機能可変（Ｖ）セグメント、１０及び１６の多様性（Ｄ）セグメント、６つのジョイニング（ＪＨ）セグメント全て、及び両方のμ及びγ１垣常領域でグメントを含む。ミニ遺伝子座は、コーディングでグメントに密に連鎖されている--ＪＨ−μイントロンエンハンサー及びμ及びγ１スイッチ配列といった--ヒトシス作用性調節配列を含む。
【０６８２】
これらは同様に、ラットＩｇＨ遺伝子座の３′末端から誘導された付加的なエンハンサー要累も含んでいる。我々は、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニックマウスを、記述のとおり（前出）ＪＨセグメント（ＪＨＤマウス）が欠如し従って機能的重鎖再配置を受けることのできない幹細胞由来の突然変異マウスと交配させた。結果として得られたトランスジェニック−ＪＨＤマウスは、導入された重鎖配列に依存するＢ細胞を含んでいる。
【０６８３】
免疫化及びハイブリドーマ
我々は、５０〜１００μｇの抗原の腹腔内注入によりマウスを免疫化した。抗原には、ヒトのガン胎児性抗原（ＣＥＡ；Crystal Chem，Chicago，IL）、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ；Picrce．Rockford，IL）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Pierce．Rockford，IL)が含まれていた。一次注入のために、我々は抗原を完全フロイントアジュバントと混合し、その後の注入については不完全フロイントアジュバント(Gibco BRL．Galthersburg，MD)を用いた。脾細胞を、非分泌性マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ATCC，CRL158 0）と融合させた。
【０６８４】
我々は、ＥＬＩＳＡにより、ヒト重鎖配列を含む特異的及び非特異的抗体の存在について血清試料及びハイブリドーマ上清を検定した。非特異的抗体の検出のために、我々は、ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗体（マウスＭＡｂαヒトＩｇＧｌ、クローンＨＰ６０６９、Cal bio chem，La Jolla，CA；マウスＭＡｂαヒトＩｇＭ、クローンＣＨ６、The Binding Site．Birmingham，UK）でマイクロタイターウエルをコーティングし、ペルオキシダーゼ接合抗血清（ポリクローナルヤギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）からのホースラディッシュベルオキシダーゼ接合の親和性精製されたｆａｂフラグメント、ｃａｔ ＃１０９−０３６−０９８；親和性精製されたホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたボリクローナルウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）．ｃａｔ ＃３０９−０３５−０９５。
【０６８５】
jackson Immuno Research，West Grove，PA）を用いて発達させた。抗原特異的抗体の検出のため、我々はマイクロタイターウエルを抗原でコーティングし、ペルオキシダーゼ接合されたヒト重鎖アイソタイプ特異血清を用いて発達させた。我々は、過酸化水素及び２，２′−アジノ−ピス−（３−エチルベンズテアソリン−ｂ−スルフォン酸、Sigma Chem．Co.，St.Louls，Mo）でのインキュベーションにより、結合ベルオキシダーゼを検出した。反応産物を４１５nmで吸収により測定し、４９０nmでの吸収について補正する。
【０６８６】
フローサイトメトリー
我々は、脾臓、骨髄及び腹腔から単細胞懸濁液を調製し、Mishell及びShiigi により記述されているとおりにＮＨ4Ｃｌで赤血球を溶解した。次の試薬でリンパ球を染色した：すなわち、フィコエリトリン接合された抗マウスＩｇκ（クロ−ンＸ３６；Becton Oickinson．San Joss．CA），ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＤ（クローンＳＢＡＩ．Southern Biotech．AL）．ＦＩＴＣ接合された抗マウスＣＤ５（クローン５３−７．３；Becton Dickinson，San Jose．CA），ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６）；Pharmingen，San Di ego，CA）及びＣｙ−クロム接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen，San Diego，CA）、我々はＦＡＣＳｃａｎクローン血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア(Becton Dickinson，San Jose．CA)を用いて染色した細胞を分析した。前方及び側方散乱器上でのゲーティングにより、大部分のマクロファージ、好中球及び残留赤血球を排除する。
【０６８７】
Ｂ細胞区画の救助
ＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤ動物の腹腔内では、ＣＤ5+Ｂ細胞の正常レベル及び従来のＣＤ5-Ｂ細胞の正常レベルの約４分の１が見られる。トランスジェニック腹腔ＣＤ5+Ｂ細胞は、正常な動物内での記述されたいわゆるＢ−１細胞に類似している：すなわち、これらは従来のＢ及びＴリンパ球よりも大きく、脾臓内で見られる従来のＢ細胞よりも低いレベルのＢ２２０を発現し、より高い割合のλ軽鎖発現細胞を含んでいる。脾臓Ｂ細胞の９０％以上がκを発現し、一方最高５０％の腹腔Ｂ細胞がλを発現する。かくして、従来のＢ細胞のレベルは全ての組織内で均等に減少している一方で、自己更新の能力がはるかに大きいものとして報告されているＢ−１のレベルは、ＨＣ１トランスジュニック−ＪＨＤ動物において正常であると思われる。
【０６８８】
クラススイッチ
トランスジェニッタ−ＪＨＤマウスにおいては、抗原に対して反復的に露呈することにより、ヒトｒ１抗体ならびにμ抗体が結果として産生される。我々は、一週間の間隔でトランスジェニック−ＪＨＤマウス内にヒトＣＥＡを注入し、４週間にわたり抗原特異的ＩｇＭ及びＩｇＧ１の血清レベルを監視した（図７４） 。１週間目に、検出可能なＩｇＭ応答があるがＩｇＧ１応答は全く無い。しかしながらＩｇＧ１応答は２週間後ＩｇＭ応答よりも大きく、ＩｇＭ応答が比較的恒常な状態にとどまっているのに対して増大し続けている。このパターン、すなわち初期のＩｇＭ応答とそれに続くＩｇＧ反応は、二次免免応答に典型的なものであり、これは、トランスジーン内に内含されているシス作用性配列が、クラススイッチを導くサイトカインに対し応答しているかもしれないということを示唆している。我々は、各々文献中で論述されてきた非μアイソタイプの発現について考えられる３つのメカニズムを考慮した。これらのメカニズムとはすなわち、μ 遺伝子の欠失が関与しない交互のスプライシング；フランキング反復配列間の相同組換えを介してのμ遺伝子の欠失が関与した「δ−型」スイッチ；そしてスイッチ領域間の非相同組換えである。以下で記述する我々の実験の結果はスイッチ領域組換えモデルを表わしている。
【０６８９】
アイソタイプシフトを説明するのに２つのタイプの非欠失性交互スプライシングメカニズムを喚起することができる。第１に、μ及びγ１の両方をカバーする単一の写しをトランスジーンから発現させることが可能である；この写しは抗原に対する露出により誘発されたサイトカインに応答して交互にスプライグさせることができた。代替的には、サイトカイン誘発されたγ１の上流で開始する不稔写しを、μ写しにトランススプライシングさセることができた。これらのメカニズムのうちのいずれかがヒトγ１配列の発現の原因であったならば、μ及びγ１の両方を発現するハイブリドーマを分離できるということを期侍したであろう。しかしながら、ヒトμ又はヒトγ１のいずれかを発現する数百のハイブリドーマをスクリーニングしてきたものの、かかる二重産生者（μ+，γ１+）ハイブリドーマは全く発見されなかった。このことは、γ１の発現にμ遺伝子の欠失が供っていることを表わしている。
【０６９０】
μ遺伝子の欠失は、μとγ１スイッチ領域の間の非相同組換えによって、又はＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている２つのフランキングする４００bpの直接反復（σμ及びΣμ）の間の.相同組換えによって媒介されうる。σ μ及ひΣμの間の欠失組換えは、いくつかのヒトＢ細胞のＩｇＤ+，ＩｇＭ-表現型の原因であることが報告されてきた。第１のメカニズムすなわち非相同スイッチ組換えは可変的な長さのスイッチ産物を産生するはずであるが、一方第２のメカニズムすなわちσμ／Σμ組換えはつねに同じ産物を生成するはずである。我々は、μを発現するもの１つとγ１を発現するもの２つの計３つのハイブリドーマ（図７５）から分離したゲノミックＤＮＡのサザンプロット分析を行なった。
【０６９１】
γ１スイッチ領域のうち２つの中にのみトランスジーンγ１の上流にゲノミック再配置が発見される（図７６）。さらに、観察した構造のうちいずれもσμと Σμの間の相同組換えと両立性がない。従って、我々の結果は、トランスジーンでコードされたμ及びγ１のスイッチ領域の間での欠失性非同組換えによって媒介されるγ１アイソタイプ発現のためのモデルと一貫性を有する。
【０６９２】
トランススイッチ
ヒトγ１に加えて、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニック−ＪＨＤマウスの血清中にマウスγが見い出される。これらの動物から、マウスγ発現ハイブリドーマも得られた。非トランスジェニック同型接合ＪＨＤ動物は、検出可能なレベルのマウス免疫グロブリンを発現しないことから、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニック−ＪＨＤ動物内のマウスγの発現は、トランススイッチ現象のせいであると思われる。我々が分析したトランスジェニック・ハィブリドーマの全ては、マウス又はヒトのいずれかの恒常領域配列を発現するものの両方を発現することはない。従ってトランススプライシングメカニズムが関与する可能性は低い。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンを分離するためのＰＣＲ増幅を用い、結果として得られるクローンのうちの１０個のヌクレオチド配列を決定した（図７ ７）。ＰＣＲ増幅中の５′オリゴヌクレオチドはトランスジーンコードされたＶＨ２５１に特異的であり、３′オリゴヌクレオテドはマウスγ１，γ２ｂ及びγ ３配列に特異的である。これら３つのマウス恒常領域の全てを取込んだトランススイッチ産物の例が見られる。
【０６９３】
体細胞突然変異
図７に示されているトランススイッチ産物の可変領域内のヌクレオチドの約１％が、生殖細胞系統コーディングを受けていない。これはおそらく、休細胞突然変異のせいであると思われる。突然変異を受けた配列は内因性遺伝子座にトランスロケートされていたため、これらの突然変異を導くシス作用性配列は、マウス γスイッチから３′のどこにでも位置設定することができた。しかしながら以下で論述するとおり、かかるトランスロケーションを受けなかったＶＤＪでセグメント内の体細胞突然変異も観察される。そしてこの結果は、重鎖体細胞突然変異が必要とする配列がトランスジーン内に内含されているということを表わしている。
【０６９４】
ＨＣ１及びＨＣ２構成体が、トランスジェニック−ＪＨＤマウス円で体細胞突然変異が起こるのに充分なシス作用性配列を含んでいるか否かを決定するため、我々は、２つの独立したＨＣ１トランスジェニック系統そして１つのＨＣ２系統から誘導されたｃＤＮＡクローンを分離し部分的に配列決定した。トランスジェニック−ＪＨＤマウスからのγ１写しのいくつかが、広範な体細胞突然変異を伴うＶ領域を含んでいることがわかる。これらの突然変異を受けた写しの頻度は、免疫化の反復に伴って増大するように思われる。図７８及び７９は、２組のｃＤＮＡ配列を示す：すなわち１組は、ＲＮＡを分離する５日前に抗原の一回の注入で免疫化したＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導体されている； 第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前から始めて異なる日に３回抗原を注入することによって高度免疫させたＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導されている；第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前から始めて異なる日に３回抗原を注入することによって高度免疫させたＨＣ１（系統２６）ソランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導されている（原文重複）。露呈後５日目から１３のＶ領域のうちわずか２つだけがいずれかの生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。これらのＶの各々は単一のヌクレオチド変更しか含まず、この試料について０．１％未満の全体的体細胞突然変異頻度を与えている。これとは対照的に、高度免疫された動物からの１３のＶ配列のいすれも完全に生殖細胞系統ではなく、全体的体細胞突然変異頻度は１６％である。
【０６９５】
単一の組織試料から分離されたμ及びγ１写しの比較は、体細胞突然変異の頻度がクラススイッチを受けたトランスジーンコピーの場合よりも高いということを示している。我々は高度免疫したＣＨ１系統５７トランスジェニック−ＪＨＤマウスからの４７の独立したμ及ひγ１ｃＤＮＡクローンを分離し、部分的に配列決定した（図８０及び８１）。μｃＤＮＡクローンのほとんどは、生殖細胞系統配列との関係において修正されておらず、一方γ１クローンの半数以上は、多数の生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。γ１発現細胞は、μ発現細胞とは全く異なり、２つのプロセスは必ずしも連関されていないものの、クラススイッチと体細胞突然変異は、Ｂ細胞の同じ副次集団内で起こっている。
【０６９６】
高度免疫を受けていないＣＨ１トランスジェニックマウス同にＶＨ２５１遺伝子の広範な体細胞突然変異は見られないが、特定の実験を受けていないＨＣ２トランスジェニックマウスにおいてはＶＨ５６ｐ１及びＶＨ５１ｐ１遺伝子の中で著しい体細胞突然変異が発見された。生後９週間の免疫化を受けていない雌のＨＣ２トランスジェニック動物から脾臓及びリンパ節ＲＮＡを分離した。我々は、Ｖ及びγ１特異的プライマを用いてＨＣ２トランスジーン内の４つのＶ領域の各々を取込むγ１写しを個別に増幅した。特異的ＰＣＲ産物の各々の相対的収量はＶＨ５６ｐ１≫ＶＨ５１ｐ１＞ＶＨ４．２１＞ＶＨ２５１であった。この技術は厳密に定量的ではないものの、ＨＣ２マウス同でのＶセグメントの使用における偏りを表わす可能性がある。
【０６９７】
図８２は、４つのＶ特異的プライマ全ての等モル混合物を用いたＰＣＲ増幅から誘導された、無作為にとり上げた２３個のγ１ｃＤＮＡ配列を示している。ここでも又、ＶＨ５６ｐ１（１９／２３クローン）向かっての偏りが見られる。さらに、ＶＨ５６ｐ１配列は、Ｖ遺伝子セグメント内で２．１％の全体的頻度で、著しい体細胞突然変異を示している。ＣＤＲ３配列を検査すると、１９のうち１７の個別のＶＨ５６ｐ１クローンが固有のものであるけれども、それらがわずか７つの異なるＶＤＪ組換え事象のみから誘導されている、ということかわかる。従って、特定の実験を受けていない動物において、恐らくは内因性病原体又は自己抗原によりＶＨ５６ｐ１発現Ｂ細胞が選択されるように思われる。この同じ遺伝子がヒトの胎児能力範囲内で過剰表示されることが適切である可能性がある。
【０６９８】
要約
上流シス作用性配列は、個々のスイッチ領域の機能性を規定し、クラススイッチには必要なものである。ＨＣ１トランスジーン内のクラススイッチが二次応答に関与する細胞に大幅に制限されており、全Ｂ細胞集団を横切って無作為に発生しないという我々の観察は、トランスジーンと共に内含される最低限の配列が充分なものであるということを示唆している。この構成体の中に内含されるγ配列は、γ１不稔写しの開始部位の上流わずか１１６個のヌクレオチドのところで始まっていることから、スイッチ調節領域はち密なものである。
【０６９９】
我々の結果から、これらの重要なシス作用性調節要素が個々のγ遺伝子に密に連鎖されているか又はＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている３′重鎖エンハンサーと結びつけられているかであるということが立証される。ＨＣ１及びＨＣ２インサートは、体細胞突然変異を受けている可能性の高い配列に対するマーカーとして役立ちうるトランスジーン自律性クラススイッチを受けていることから、我々は内因性遺伝子座へのトランスロケーションに由来したものでない高度に突然変異を受けた写しを容易に見い出すことができた。我々は、３つの独立したトランスジェニック系統（２つのＨＣ１系統及び１つのＨＣ２系統）の中に体細胞突然変異を受けたγ写しを見い出した。従って、トランスジーンの組込み部位にフランキングする配列がこのプロセスに影響を及ぼすという可能性は低い：その代り、トランスジーン配列は、体細胞突然変異を導くのに充分なものである。
【０７００】
実施例３６
この実施例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座について同型接合であり、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖をコードするトランスジーン配列を含むマウスからのハイブリドーマの生成について記述する。ここで記述されるハイブリドーマは、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖を含むモノクローナル抗体を分泌し、Ｔ細胞上で発現される予め定められた抗原に結合する。この実施例は同様に、ヒト由来の免役原ヒトＣＤ４に応えてヒト配列抗体を作るマウスの能力、及びヒト抗原と反応性あるヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るための供給源としてのかかるマウスの適性をも立証する。
Ａ．ヒトＣＤ４抗原で免疫化されたＨＣ１トランスジェニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成
機能的に分断されたＪH遺伝子座について同型接合でしかも、ヒト配列重鎖をコードするべく再配置可能なトランスジーン及びヒト配列軽鎖をコードするべく再配列可能なトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスを免疫化した。マウスの遺伝子型はＨＣ１−２６+ＫＣｌｅ−１５３６+ＪHＤ+/+ＪKＤ-であり、これはマウス重鎖失活に対する同型接合、及びＨＣ１ヒト配列重鎖トランスジーン及びＫＣｌｅヒト配列軽鎖トランスジーン生殖細胞系統コピーの存在を表わしていた。
【０７０１】
マウスを、安定した形でトランスフェクションされたポリヌクレオチドによりコードされたマウスーヒトハイブリッドＣＤ４分子を発現するＥＬ４細胞系統（ＡＴＣＣ）の変異体で免疫化した。発現されたＣＤ４分子は、実質的にヒト様のＣＤ４配列を含む。１００μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を伴う１００μｌのＰＢＳの中の約５×１０5の細胞を、０日目に１腹腔内注入を介してマウス体内に導入した。７日目、１４日目、２１日目、２８日目、６０日目及び７７日目に接種をくり返し行ない、１８日目、３５日目及び６７日目にテスト出血を行なった。８１日目に脾臓を除去し、標準的な方法（ＰＥＧ融合）により約１２×１０7の融合パートナ−細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３細胞系統：ＡＴＣＣ）に対して約７．２×１０7の脾細胞を融合させ、ＲＰＭＩ１６４０．１５％ＦＣＳ，４mMグルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウムにＨＡＴ及びＰＳＮ培地を加えたものの中で培養させた。多数の融合を実施した。
【０７０２】
ハイブリドーマを成長させ、ＣＨＯ細胞内で発現された精製組換え型可溶性ヒト配列ＣＤ４（Amcrican Bio-Technologics．Inc.(ABT)．Cambridge，MA）及び／又はNEW-DuPontから得られるＣＤ４といった市販の供給源に対する結合力について、ＥＬＩＳＡを用いて上清をテストした。ＡＢＴ試料は、ヒトＣＤ４のＶ1 〜Ｖ3ドメインから成る精製された５５kOのヒトＣＤ４分子を含んでいた。検定プレートに対して、組換え型ヒト配列ＣＤ４（ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で産生されたもの）を吸着させ、ハイブリドーマ上清からの抗体を捕獲するのに用い、次に捕獲した抗体を、ヒトμ、ヒトκ、ヒトγ、マウスμ又はマウスκのいずれかを結合する抗体のパネルに対する結合力について評価した。
【０７０３】
１つのハイブリドーマを、１Ｆ２と呼ばれるその培養プレートウエルからサブクローニングした。ＡＢＴ ＣＤ４調製物に対して結合された１Ｆ２抗体は、ヒトμ及ひヒトκについて陽性であり、ヒトγ、マウスγ及びマウスκについて陰性であった。
Ｂ．ヒトＣＤｄ及びヒトＩＥで免疫化されたＨＣ２トランスジェニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成
重鎖トランスジーンＨＣ２は図 ６８ に示され、上で記述したきた（実施例３４参照）。
【０７０４】
図６８に記されているヒト軽鎖トランスジーンＫＣｏ４は、マウスゲノム内の単一部位での２つの個別にクローニングされたＤＮＡフラグメントの同時組込みにより生成される。フラグメントは４つの機能的ＶKセグメント、５Ｊセグメント、ＣKエキソンそしてイントロン及び下流の両方のエンハンサー要素を含んでいる（実施例２１参照）（Meyer及びNeuberge (1989)，EM80 J．8 : 1959-1964: judde及びMax(1992)．Mol.Cell Biol. 12：5206-5216）。２つのフラグメントは共通の３Kb配列を共有していることから（図６７参照）、これらは、重複する配列の間の相同組換えの後、隣接する４３kbのトランスジーンとしてゲノミックＤＮＡの中に潜在的に組込まれうる。
【０７０５】
かかる組換え事象は、重複するＤＮＡフラグメントの微量注入の時点で頻繁に発生することが立証されてきた（Pieper et al．(1992)．Nucleic Aacids Res.2 0：1259-1264）。同時注入されたＤＮＡは同様に接合体内に同時組込みされる傾向をもち、個々にクローニングされたフラグメント内に含まれた配列は、その後Ｂ細胞の発達中ＤＮＡ再配置により連結されることになる。表８は、トランスジェニック系統のうち少なくとも２つからのトランスジーンインサートが機能的であることを示す。４つのトランスジーンコーディングを受けたＶセグメントの各々及び５Ｊセグメントの各々を取込んだＶＪ連結の例が、この３６クローンの組の中に表わされている。
【０７０６】
【表７】
2011236257.tif 000013
上記の表はＫＣｏ４トランスジェニックマウスにおけるヒト軽鎖Ｖ及びＪセグメントの使用を示す。この表は、示されたヒトカッパー配列を含有する、２つのトランスジェニック系に由来するｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲクローンの数を示す。ｗ個々のＫＣｏ４トランスジェニックマウス（マウス＃８４９０、３ｍｏ、雄性ＫＣｏ４系４４３７；マウス＃８８６７、２．５ｍｏ．、雌性、ＫＣｏｄ系４４３６）から単離された脾臓ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。Ｃｋ特異的オリゴヌクレオチド５・TAG AAG GAA TTC AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA ３′、並びに２つのＶｋ特異的オリゴヌクレオチド５′AGC TTC TCG AGCTCC TGC TGC TCT GTT TCC CAG GTG CC3′及び５′CAG CTT CTC GAG CTC CTG CTA CT C TGG CTC (C,A)CA GAT ACC ３′の１：３混合物を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そしてプラスミドベクター中にクローニングした。各動物からの無作為にとり上げた１８個のクローンにつき、ジデオキシチェンターミネージョン法により部分ヌクレオチド配列を決定した。各クローンの配列を未組換え（unrearranged）トランスジーンのジァームライン配列と比較した。
【０７０７】
２３の軽鎖ミニ遺伝子座陽性及び１８の重鎖陽性マウスが、注射した胚から発達した。機能的マウス重鎖及びκ軽鎖遺伝子座が無い状態でヒト重鎖及びκ軽鎖を含むマウスを得るため、内因性マウス重鎖（系ｊＨＤ）及びκ軽鎖遺伝子座（系ＪＣＫＤ）の中にターゲティングされた突然変異を含むマウスを用いて、これらのマウス及びその後代を繁殖させた。これらのマウスにおいて、あったとしても、マウスの軽鎖の寄与のみがマウスλ遺伝子座からのものである。
【０７０８】
表７は、体細胞突然変異がトランスジェニックマウスのトランスジーンコーディングを受けたヒト重鎖写しの可変領域の中で発生することを示している。ＨＣ２トランスジニニックマウスがらの２３のｃＤＮＡクローンを部分的に配列決定して可変領域内の生殖細胞系統コーディングされていないヌクレオチドの頻度を決定した。データには各クローンからのＶセグメントコドン１７〜９４の配列のみが含まれており、Ｎ領域は含まれていない。ＲＮＡは、マウス５２５０の脾臓及びリンパ節から分離した（ＨＣ２系統２５５０半接合、ＪＨＤ同型接合）、記述されているとわり（参考）一本鎖ｃＤＮＡを合成し、γ写しをＰＣＲで増幅した。増幅したｃＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、ジデオキシ読み終り方法により２３の無作為にとり上げたクローンを部分的に配列法定した。ＰＣＲ導入されたヌクレオチド変更の頻度は、恒常領域成配列から＜０．２％として見積られる。
【表８】
2011236257.tif 000014
フローサイトメトリー
我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア（Be cton Dickinson，San Jose．CA）を用いて染色した細胞を分析した。以下の試薬を用いて脾細胞を染色した；ヨウ化プロビシウム（分子プローブ、Eugene，OR）、フィコエリトリン接含されたα−ヒトＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Caltag ，S.San Francisco，CA ）、フィコエリトリン接合されたα−マウスＩｇκ（クローンＸ３６；Becton Dickinson，San Jose．CA）、ＦＩＴＣ接合されたα−マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６；Pharmingen，San diego，CA ）、ＦｉＴＣ接合されたα−マウスＩｇμ（クローンＲ６−６０ ２；Pharmingen，San dieg o，CA ）、ＦＩＴＣ接合されたα−ヒトＩｇμ（クローンＧ２０−１２７.Pharm ingen．San Dicgo，CA ）、及びＣｙ−クロム接合された抗−マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen．San Diego，CA ）。
【０７０９】
ヒトＩｇトランスジーンの発現
図８３は、ＪＨＤ及びＪＣＫＤの両方の突然変異について同型接合であるＫＣｏ４及びＨＣ２マウスからの脾細胞のフロー血球計算法による分析を示す。ヒト配列ＨＣ２トランスジーンはＪＨＤ突然変異バックグラウンド内でのＢ細胞の発達を救助し、脾臓内のＢ２２０+細胞の相対的数を野生型動物の約半分まで回復させた。これらのＢ細胞はトランスジーンコーディングを受けた重鎖を用いた細胞表面免疫グロブリンレセプタを発現した。ヒトＫＣｏ４トランスジーンは同様に機能的であり、無傷の内因性λ軽鎖遣伝子座をうまく競合した。重鎖及び軽鎖ヒトトランスジーンを両方共含む（２重トランスジェニック）ＪＨＤ／ＪＣＫＤ同型接合突然変異体マウスの中のＢ脾細胞のほぼ９５％が、完全にヒト細胞表面ＩｇＭκを発現した。
【０７１０】
血清Ｉｇレベルを以下のとおりＥＬＩＳＡによって決定した：ヒトμ：マウスＭａｂαヒトＩｇＭ（クローンＣＨ６、結合部位、Birmingham，UK）でコーティングされベルオキシダーゼ接合されたウサキαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３０９−０３５−０９５，Jackson Immuno Research．West Grove,PA ）で発達させられたマイクロタイターウエル。ヒトγ４：マウスＭＡｂαヒトＩｇＧｌ（クローンＨＰ６０６９，Calblochem，La Jolla，CA）でコーティングされ、ベルオキシダーゼ接合されたヤギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）（ｃａｔ＃１０９−０３６−０９８．Jackson Immuno Research，West Gvove，PA )で発達させられたマイクロタイターウエル。
【０７１１】
ヒトκ：マウスＭａｂαヒトＩｇκ（ｃａｔ＃０１７３．AMAC．Inc，Ｉｇκ （ｃａｔ＃Ａ７１６４，Sigma Chem．Co.，St Louis．NO ）でコーティングされマイクロタイターウエル。マウスγ：ヤギαマウスＩｇＧ（ｃａｔ＃１１５−００６−０７１．Jackson Immuno Research，West Grove，PA ）でコーティングされたマイクロタイターウエル。マウスλ：ラットＭＡｂαマウスＩｇλ（ｃａｔ＃０２１７１Ｄ．Pharmingen，San Diego，CA ）でコーティングされ、ペルオキシダーゼ接合されたウサギαマウスＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３０９−０３５−０９５，Jackson Immuno Research，West Grove,PA )で発達させられたマイクロタイターウエル。結合したペルオキシダーゼを、過酸化水素及び２，２′−アジノ−ビス−１３−エチルベンズチアゾリン−６−スルフォン酸、Sigma ChemCo ., St.Louis，MO ）を用いたインキュベーションにより検出する。反応産物を、４１５nmでの吸収により測定する。
【０７１２】
２重トランスジェニックマウスは、血清中で完全にヒトの抗体をも発現する。
【０７１３】
図８４は、いくつかの異なるトランスジェニック創立者動物から誘導された重及びカッパ軽鎖失活について同型接合である１８の個々の２重トランスジェニックマウスに関する免疫グロブリンタンパク質の測定された血清レベルを示す。我々は、検出可能なレベルのヒトμγ１及びκを発見した。我々は以上で、発現されたヒトγ１がトランスジーンμ及びγ１スイッチ領域の間のゲノミック組換えによる真正なクラススイッチの結果として得られるということを示した。その上、我々は、トランスジーン内邪のクラススイッチが重鎖可変領戚の体細胞突然変異により達成されることを発見した。
【０７１４】
ヒト免疫グロブリンに加えて、我々は血清内のマウスγ及びλをも発見した。内因性遺伝子座が完全に無傷であることからマウスλタンパク質の存在が予想される。我々は他の箇所で、マウスγ発現が、内因性重鎖遺伝子座内へのトランスジーンＶＤＪセグメントのトランススイッチ組換えの結果であるということを示した。当初野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪトランスジーンについて立証されていたこのトランススイッチ現象（Durdik et al.(1989)，Proc.Natl .Acad.Sci.USA 86：2346-2350；Gerstein et al.(1990)，細胞63：537-548）は、下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要累がなおも無傷であることから、突然変異体ＪＨＤバックグラウンド内で起こる。
【０７１５】
２重トランスジェニックマウス内のヒトＩｇＭκの血清濃度は約０．１mg／ml であり、動物間又ば系統間での偏差はほとんど無い。しかしながら、ヒトγ１、マウスγ及びマウスλレベルは０．１〜１０マイクログラム／mlの範囲に及んでいる。個々の動物間で見られたγレベルの変動は、γが誘発可能な恒常領域であるという事実の結果である可能性がある。発現はおそらく、動物の健康、抗原に対する露呈そして場合によってはＭＨＣタイプといった要因により左右されると思われる。マウスλ血清レベルは、個々のトランスジェニック系統と相関すると思われる唯一のパラメータである。
【０７１６】
１回の組込みあたりのトランスジーンのコピー数が最も少ない（約１〜２コピー）ＫＣｏ４系統４４３６マウスは、最高の内因性λレベルを有し、一方ＫＣｏ４系統の４４３７マウス（組込み一回あたり〜１０コピー）は最低のλレベルを有する。これは、κトランスジーンに続いて内因性λが再配置し、血清λレベルが選択されずその代りに前駆体Ｂ細胞プールの相対的サイズを反映しているような１つのモデルと一貫性をもつ。多数の軽鎖インサートを含むトランスジーン遺伝子座は、１つ以上のＶ〜Ｊへの組換え事象を受げる磯会を有する可能性があり、そのうちの１つが機能的なものとなる確率は増大する。かくして、高いコピー系統は、より小さい潜在的λ細胞プールを有することになる。
【０７１７】
ヒトＣＤ４及びＩｇＥでの免疫化
免疫応答に参加するトランスジェニックＢ細胞の能力をテストするために、我々はヒトタンパク質抗原で２重トランスジェニックマウスを免疫化し、ＥＬＩＳＡにより抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを測定した。腹腔内注入により完全フロイントアジュバント内のポリスチレン溶球（ｃａｔ＃０８２２６，Poly sciences Inc.，Warrington，PA ）に共役結合された５０μｇ(7)組換え型ｓＣＤ４（ｃａｔ，＃０１３１０１，American Bio-Technologies lnc.，Cambridge ，MA ）でマウスを免反化した。マウスの各々は、内因性μ及びκ遺云子座の分断について同型接合であり、ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２系統２５００及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４系統４４３７について半接合である。
【０７１８】
方法
血清試料を、組換え型ｓＣＤ４でコーティングされたマイクロタイターウエルへと希釈させた。ベルオキシダーゼ接合されたウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（Ja ckson Immuno Research，West Grove，PA ）又はベルオキシダーゼ接合されたヤギの抗ヒトＩｇκ（Sigma，St.Louis，MO)を用いて、ヒト抗体を検出した。
【０７１９】
図８５は、組換えヒト可溶性ＣＤ４で免疫化されたトランスジェニックマウスの一次応答を示す。
【０７２０】
免疫化された４匹の動物は全て、抗原特異的ヒトＩｇＭ応答を１週間目に示す。ＣＤ４特異的血清抗体は、ヒトμ重鎖及びヒトκ軽鎖の両方を含んでいる。
【０７２１】
ＨＣ２トランスジーンの二次応答に参加する能力を評価するため、我々は、抗原を反復的に注入することによりトランスジェニックマウスを高度免疫し、誘発された抗体の重鎖アイソタイプを監視した。ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４について同型接合であるマウスを、０日目に完全フロイントアジュバント内の２５μｇのヒトＩｇＥκ（The Binding Site,i rmingham，UK）で免疫化した。その後、約一週間おきで不完全フロイントアジュバント中でＩｇＥκをマウスに注入した。血清試料を１対１０の割合で希釈させ、ヒトＩｇＥ，λでコーティングされたプレート上で抗原特異的ＥＬＩＳＡを行なった。
【０７２２】
図８６は、これらの動物からの免疫応答の標準的時間的経過を示している。我々は、完全フロイントアジュバント中のヒトＩｇＥを２重トランスジェニックマウスに注入し、その後週一回、不完全フロイントアジュバント内のＩｇＥで追加免疫した。初期ヒト抗体応答はＩｇＭκであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧκ が現われた。これらのマウス内の誘発された血清抗体は、ヒトＩｇＭ又はＢＳＡに対していかなる反応反応性も示さなかった。ヒトＩｇＧの経時的発達、（原文抜け）。
【０７２３】
我々は、重鎖トランスジーンのインビトロでのクラススイッチを受ける能力もテストした：同じ重鎖構成体（ＨＣ２、系統２５５０）について半接合である脾臓Ｂ細胞が精製された形の動物は、ＬＰＳ及び組換え型マウスＩＬ−４の存在下で、ヒトＩｇＭからヒトＩｇＧ１へとスイッチする。しかしながら、インビトロスイッチは、ＬＰＳ及び組換え型マウスＩＬ−２又はＬＰＳ独自の存在下で起こらなかった。
【０７２４】
２重トランスジェニック／２重ノックアウト（００１１）マウスの脾臓、リンパ節、腹膜及び骨髄内にヒトＩｇＭ発現細胞が見られる。腹腔には正常な数のＢ細胞が含まれているものの、骨髄及び脾臓中のトランスジェニックＢ細胞の絶対数は、正常値の約１０〜５０％である。トランスジーン依存性のＢ細胞の発達における遅延の結果として、減少がもたらされる可能性がある。２重トランスジェニック／２重ノックアウト（００１１）マウスは同様に、これらのマウスにおけるヒトμ、γ１及びκのレベルが有意なものである状態で、血清中で完全にヒトの抗体を発現する。発現されたヒトγ１は、トランスジーンμとγ１のスイッチ領域の間でのゲノミック組換えによる真正のクラススイッチの結果として得られる。
【０７２５】
さらに、トランスジーン内のクラススイッチには、トランスジーンによりコードされた重鎖可変領域の体細胞突然変異が伴う。ヒト免疫グロブリンに加えて、これらのマウス内にはマウスμ及びマウスλが見られる。マウスμ発現は、トランスジーンＶＤＪ遺伝子が内因性マウス重鎖遺伝子座内に組込まれるトランススイッチ組換えの結果であると思われる。もともと野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪトランスジーンについて文献内に見られたトランススイッチは、マウス下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要素がなおも無傷であることから、我々のＪH-/-バックグラウンド内で起こる。
【０７２６】
トランスジェニックＢ細胞の免疫応答に参加する能力を実証するため、我々は、ヒトタンパク質抗原で００１１マウスを免疫化し、抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを監視した。初期ヒト抗体応答はＩｇＭであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧの発現が続く（図８６及び図８８）。ヒトＩｇＧ抗体が現われる前の遅延は、抗原に対する二次応答とクラススイッチの間の結びつきと一貫性をもつ ヒトＣＤ４で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいては、ＣＤ４抗原に対するヒトＩｇＧの反応性は、２×１０-2〜１．６Ｘ１０-4の範囲の血清濃度で検出可能であった。
【０７２７】
抗ヒト体ＣＤ４ハイブリドーマの同定
ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４について同型接合のトランスジェニックマウスを、０日目に完全フロイントアジュバント内の組換え休ヒトＣＤ４ ２０μｇで免疫化した。その後、約一週間の間隔をおいて不完全フロイントアジュバント中のＣＤ４をマウスに注入した。図８８ は、トランスジェニックマウスの血清中のヒトＣＤ４に対するヒト抗体応答を示す。血清試料を１：５０で希釈し、ヒトＣＤ４でコーティングされたプレート上で抗原特異性ＥＬＩＳＡを行なった。各々のラインは、個々の試料の測定値を表わす。黒丸はＩｇＭを、白丸はＩｇＧを表わす。
【０７２８】
我々は同様に、ヒトＣＤ４免疫化に応答したマウスの一匹からハイブリドーマ細胞系統も分離した。クローニングされたハイブリドーマのうちの５つは、組換え型ヒトＣＤ４に結合しその他の糖タンバク質抗原のパネルと交又反応しない（ＥＬＩＳＡにより測定される通り）ヒトＩｇＧκ（ヒトγ１／ヒトκ）抗体を分泌する。ＩｇＧκハイブリドーマ、４Ｅ４．２及び２Ｃ５．１の２つにより分泌されたモノクローナル抗体に対する免疫化用ヒトＣＤ４抗原の結びつき及び解離の速度を測定した。実験的に誘導された結合定数（Ｋａ）はそれぞれ抗体４Ｅ４２及び２Ｃ５．１について約９×１０7Ｍ-1及び８×１０-1であった。これらのＫａの値、その他の者による臨床的試験に万いて用いられてきた（Chenet al. (1993)Int.Immunol．６.647）マウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ４抗休の範囲内に入る。
【０７２９】
ライン＃７４９ｄ（００１２；ＨＣｌ−２６＋；；ＪＨＤ＋＋，ＪＫＤ＋＋；ＫＣ２−１６１０＋＋）のマウスを０日目、１３日目、２０日目、２８日目、３３日目及び４７日目にヒトＣＤ４で免疫化すると、ヒトκ及びヒトμ又はγから成る抗ヒトＣＤ４抗体を産生した。
【０７３０】
２８日目に、血清中にヒトμ及びヒトκが見られた。４７日目までに、ヒトＣＤ４に対する血清応答には、ヒトμ及びヒトγよらびにヒトκが含ミれていた。５０日目に、Ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞で脾細胞を融合させ、培養した。７００のウエルのうち４４（６．３％）がヒトγ及び／又はκ抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいた。これらのウエルのうち３つは、ヒト γ抗ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいることが確認されたが、ヒトκ鎖（おそらくはマウスλを発現する）が欠如していた。９つの１次ウエルは、完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでおり、さらなる特徴づけのため選択された。完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を発現する１つのこのようなハイブリドーマを２ＣＩＩ−８と呼称した。
【０７３１】
限界希釈法により一次ハイブリドーマをクローニングし、ＣＤ４に対して反応性あるヒトμ及びκモノクローナル抗体の分泌について評価した。９つのハイブリドーマのうち５つがＣＤ４ＥＬＩＳＡにおいて陽性にとどまった。ヒトＣＤ４についてのこれらのヒトＩｇＭκモノクローナル抗体の特異性は、オバルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘマシアニン及びガン胎児性抗原を含むその他の抗原との反応性が欠如していることによって実証された。
【０７３２】
これらのモノクローナル抗体が細胞表面上のＣＤ４（例えば未変性ＣＤ４）を認識できるか否かを見極めるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞系統、ＳｕｐＴ１との反応性について、これら５つのクローンの上清もテストした。５つのヒトＩｇＭκモノクローナル抗体のうち４つがこれらのＣＤ４＋細胞と反応した。これらのＩｇＭ κモノクローナル抗体の特異性をさらに確実にするため、これらの抗体で、分離されたばかりのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を染色した。５つの一次ハイブリッドのうちの４つから誘導されたクローンからの上清はＣＤ４＋リンパ球のみに結合し、ＣＤ８÷リンパ球には結合しなかった（図８７）。
【０７３３】
図８７は、ヒトＰＢＬとのＩｇＭκ抗ＣＤｄモノクローナル抗体の反応性を示す。ヒトＰＢＬを各クローンからの上清又はアイソタイプ整合された負の対照モノクローナル抗体及びそれに続くＰＥに接合されたマウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（上段）又はＦＩＴＣに接合されたマウス抗ヒトＣＤ８Ａｂ（下段）のいずれかを用いてインキュベートした。それぞれＦＩＴＣ又はＰＥに接合されたマウス抗ヒトμで、あらゆる結合したヒトＩｇＭκを検出した。クローンの１つ、２Ｃ１１−８(右側)及び対照ＩｇＭκ（左側）についての代表的結果が示されている。予想通り、負の対照ＩｇＭκはＴ細胞と反応せず、ヤギ抗ヒトμは、おそらくはヒトＢ細胞である約１０％のＰＢＬと反応した。
【０７３４】
ＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の産生のレベルの高さ及び優れた成長は、発達のためのクローナルハイブリドーマ細胞を選択する上で重要な要因である。ハイブリドーマのｌつ２Ｃ１１−８からのデータは、最高５pg／細胞／日が産生されうることを示している（図８９）。第２のクローンの場合にも類似の結果が見られた。−般に観察されるように、細胞が定常期成長に入るにつれて産生は劇的に増大する。図８９は、細胞の成長及び小規模培養におけるヒトＩｇＭκ 抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の分泌を示す。総量２mlの甲に１mlあたり２×１０5 細胞の割合で重複培養を播種した。その後４日間２４時間毎に、培養を収穫した。生存可能な細胞を計数することにより細胞の成長を決定し、全ヒトμ（上の図版）についてＥＬＩＳＡによりＩｇＭκ産生の量を計った。ＩｇＭκの量を細胞の数で除することにより、一日細胞一個あたりの産生を計算した（下の図版）。
【０７３５】
図９０は、ヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体のエピトープ地図作製を示す。ＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗休２Ｃ１１−８（ＨＢ １１６６８）により認識されるエピトープを位置設定するため競合結合フロー皿球計算実験を使用した。これらの研究のためには、ＣＤ４上の重復しないユニークエピトープに結合するマウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａ及びＲＰＡ−Ｔ４を用いた。減少する濃度のＲＰＡ−ＴＡ又はＬｅｕ−３ａのいずれかで予備インキュベートされその後ひきつづき２Ｃ１１−８で染色させたＣＤ４÷細抱のＰＥ螢光を、ＰＥ接合されたヤギ抗ヒトＩｇＭで検出した。Ｌｅｕ３ａによるヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体２Ｃ１１−８の結合については濃度依存性競合が存在したが、ＲＰＡ−Ｔ４によるその結合については存在しなかった。かくして、２Ｃ１１−８により認識されたエピトープは、モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａにより認識されたエピトープと類似していたか又は同一であったが、ＲＰＡ−Ｔ４により認識されたものとは全く異なっていた。
【０７３６】
要約すると、我々は、未変性ヒトＣＤ４と特異的に反応しヒトＰＢＬＳをＣＤ４+ 及びＣＤ４- 副次集団へと弁別するのに用いることのできるヒトＩｇＭκモノクローナル抗体を分泌する複数のハイブリドーマクローンを産生した。これらの抗体のうち少なくとも１つはモノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａにより構成されたエピトープに又はその近くに結合する。このエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体は、混合型の白血球応答を阻害するものであることが示されてきた（Engleman et al.,J.Eyp.Med (1981) 153：193）。モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａのキメラバージョンは、菌状患肉腫を患う患者においていくつかの臨床的効力を示した（Knox et al.(1991) Blood 77：20）。
【０７３７】
われわれは、３つの異なるハイブリドーマ細胞系（2C11.8、2C5.1および 4E4. 2）からcDNA クローンを分離し、これらの細胞系のそれぞれにおいて、発現された免疫グロブリン遺伝子のいくつかの部分的ヌクレオチド配列を決定した。
【０７３８】
配列の分析のために、全 RNAを約 5x106ハイブリドーマ細胞から分離した。オリゴdT での逆転写をプライミング（Priming）することにより、sscDNA を合成した。このsscDNA の部分を、二重 PCR 反応において使用した。この反応は、(i )HCl または HC2トランスジーン内に含まれる重鎖可変骨格領域および定常ヒトガンマ配列に特異的な単一の下流オリゴ、または(ii)KC2 またはKCo4 トランスジーン内に含まれる軽鎖可変骨格領域および定常ヒトカッパ配列に特異的な単一の下流オリゴについて特異性を有するオリゴのプールによってプライムされた。これらのPCR反応からの産物を適当な制限酵素によって消化し、ゲル精製し、そしてpNNO3 ベクターへと独立にクローン化した。DNAを分離し、手動のジデオキシおよび／または自動の蛍光配列化反応をdsDNAに行った。
【０７３９】
３つのハイブリドーマ2C11.8、2C5.1および4E4.2の特性を以下の表11に示す。
【０７４０】
【表９】
2011236257.tif 000015
nd.= 測定せず
２つのIgGkハイブリドーマ 2C5.1および 4E4.2からの発現された重鎖および軽鎖配列のヌクレオチド配列分析は、それらが、同じプロゲニターＢ細胞から誘導された同胞クローンであることを示す。正確なヌクレオチド配列は予定運命体細胞突然変異によって異なるが、２つのクローンからの重鎖および軽鎖Ｖ(D)J接合は一致する。重鎖 VDJ結合配列は、
【化６】
2011236257.tif 000016
である。軽鎖 VJ接合は、 
【化７】
2011236257.tif 000017
以下の非生殖細胞系エンコードコドンを同定した（予定運命体細胞突然変異）：
【表１０】
2011236257.tif 000018
これらの２つのガンマハイブリドーマは、規定された量の体細胞突然変異を受けたＢ細胞から誘導されたと推断する。このデータは、HC2トランスジェニック動物がVH5-51（aka VH251）Ｖセグメントを使用することを示す。VH4-34、VHI-6 9 および VH3-30.３がこれらのマウスによって発現されることを、われわれは予め示した。これらの結果の組合せは、HC2 トランスジェニックマウスは、ヒトVH 遺伝子をエンコードしたトランスジーンの４つすべてを発現することを証明する。
【０７４１】
ヒト免疫グロブリン発現Ｂ細胞は、発生を経験し、かつマウス免疫系の状況において抗原に応答することを我々は推断した。抗原応答性は、免疫グロブリン重鎖イソタイプスウィッチおよび可変領域体細胞突然変異に至る。われわれはまた、慣用のハイブリドーマ技術を、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を得るために使用することができることを証明した。したがって、これらのトランスジェニックマウスは、ヒトターゲット抗原に対するヒト抗体の供給源を意味する。
実施例37
この実施例は、不活化された内因性重鎖およびκ鎖遺伝子座についてホモ接合であり、かつ多重下流ヒトCH遺伝子にイソタイプスウィッチ可能なトランスジーンを収容する、トランスジェニックマウスの生成を記載する。この実施例はまた、重複する相同の配列結合（図92をみよ）を含む多重DNAフラグメント（断片）の共ミクロ注入によって、大きいトラスジーン（例えば160kb）を集めるためのクローニング方法を証明し、これは、イン ビボで集められるべきフラグメントの組の、例えばミクロ注入されたES細胞またはそのクローン子孫において、遠位端での複数の相同領域の相同の組換えによって、２より多い重複するフラグメント（断片）からの大きなトランスジーンの構成を許す。この実施例はまた、とりわけ、トランッスジェニック動物から分離されたリンパ球が、例えばIL-4 およびLPS を用いて、イン ビトロでのイソタイプスウィッチを受けるために導入され得ることを示す。
【０７４２】
５つの異なるプラスミドクローンの組を、プラスミド挿入部が分離され得、実質的にべタター配列がないように；かつ挿入部は共におよそ150kbの長さに及ぶ重複配列の単一の重なった組を形成するように構成した。この組は、ヒトV、D、 J、μ、γ3およびγ１コード配列ならびにマウス重鎖3′エンハンサー配列を含む。５つのクローンは、5′から3′順で、pH3V4D、pCOR1xa、p11-14、pP1-570 および pHP-3aである(図92)。このクローンの組を生成するために、いくつかの異なるクローニングベクターを使用した。ベクターのいくつかは、大きいトランスジーンを構築する目的で特異的に設計された。これらのベクター(pGP1a、pGP1 b、pGP1c、pGP1d、pGP1f、pGP2a、およびpGP2b)は、pUCベクターより細胞当たりのコピ-数が低く保持された pBR322に基づくプラスミドである（ヤニッシュ−ペロンら、（1985年）Gene33：103-119)。これらのベクターはまた、ポリリンカーとプラスミドβラクターゼ遺伝子の3′末端との間にtrpA転写終止シグナルを含む。ポリリンカーは、まれな切断（rare cutting）酵素 NotI についての制限部位によって隣接され；かくして胎児ミクロ注入に先立つベクター配列から挿入部を分離することを見込む。NotI 部位の内部で、ポリリンカーは、どちらの末端でも、ユニークＸhoI およびSalI 部位を含む。pGPl ベクターは、テイラーら、 (1992年)、NucleicAcids Res. 23：6287に記載されている。pGP2 ベクターを生成するために、pGPlfをまずAlwN I で消化し、合成オリゴヌクレオチドo-236 および o-237（o-236、5'-ggc gcg cct tgg cct aag agg cca−3'：o-237、5′-cct ctt agg cca agg cgc gcc tgg- 3′）でライゲート(ligate)した。得られたプラスミドは pGP2a と呼ばれる。プラスミド pGP2a は次に、KpnI および EcoRI で消化され、オリゴヌクレオチド o-288 および o-289 (o-288、5'-aat tca gta tcg atg tgg tac-3';o-289、5'-c ac atc gat act g-3'）でライゲートされて、pGP2b を作った（図 93A および 9 3B)。
【０７４３】
pGP プラスミドを用いてトランスジーンを構成するための一般的スキームは、図 94（パスＡおよびＢ）に略述されている。要素DNAフラグメントのすべてがまず、pGP ベクターにおいて同じ5'から3'定位方向で独立してクローン化される。挿入部 NotI、XhoI および SalI部位は、オリゴヌクレオチド突然変異生成によって、または可能なら、部分的消化、ポリメラーゼ充填および平滑末端連結反応によって壊される。これは、各挿入部の5'および3'末端に、ポリリンカー誘導 X hoIおよび SalI 部位のみを残す。個々の挿入部は次に、１つのクローンからXho I／salI フラグメントを分離し、かつ分離されたフラグメントを別のクローンの 5'XhoI または 3'SalI 部位に挿入する方法によって、段階的に結合されることができる(図 94、パス A)。形質転換体を次に、１以上の挿入部フラグメントを用いてフィルターハイブリッド化によってスクリーニングして、集められたクローンを得る。XhoI／SalI結合はいずれの酵素によっても裂くことができないので、得られた産物は、ユニーク 5'XhoI および 3'SalI部位を維持し、構成の段階で使用され得る。このスキームの変形は、ベクターpGP2a およびpGP2bを用いて行われる(図 94、パス B)。これらのプラスミドは、アンピシリン抵抗性遺伝子と複製のプラスミド源との間に SfiI部位を含む。SfiI およびXhoI またはSalI を用いての切断によって、薬剤抵抗性配列または複製の起源と共に、挿入部が分離され得る。合成の各段階において、１つのSfiI／XhoI フラグメントが、１つの SfiI／SalIフラグメントにライゲートされる。このスキームには、３つの利点がある：(i)アンピシリンの存在中で、両方のフラグメントからの配列がプラスミドの複製に必要とされるので、バックグラウンド形質転換体が減らされる；（ii）ライゲーションは単一の5'から3'定位方向でのみ起こり得る；および(iii) SfiI 末端が自己和合性でなく、SalIまたはXhoI と和合性でなく、かくして非生産的ライゲーションのレベルを下げる。このスキームの不都合は、挿入部SfiI 部位が NotI、XhoIおよび SalI と同様に除去されなければならないことである。これらの培地複写ベクターは、よく使われる pUC 誘導クローニングベクターより改良されている。これらのベクターの能力を比較して大きい DNA 挿入部を維持するために、ヒト JH/C μ領域を含む 43kb のXhoI フラグメントを、pSP72（プロメガ、マジソン、WI）、pUC1９（BRL、グランド アイラインド、ニューヨーク）およびpGP1f の SalI 部位にライゲートした。形質転換体クローンをニトロセルロースに移し、挿入部を含むクローンを放射能標識したプローブでのハイブリッド化により選択した。正のクローンを 3mlの培地で一晩育て、DNA を分離した：得られたDNA のEcoRI 消化は、すべてのpSP72およびpUC19 誘導クローーンが挿入部を欠失した（図95 ）が；18のpGP1f誘導クローンのうちの12が完全な挿入部を含んでいたことを示す。両方の定位方向が、これらの 12 のクローンにおいて示される。
【０７４４】
HCo7 トランスジーンを生成するために使用された５つのクローン（pH3V4D、p COR1xa、p11-14、pP1-570 および pHP-3a）の構成および分離を以下に略述する。
【０７４５】
pH3V4D
生殖細胞系配置重鎖可変遺伝子セグメントを、VH1 およびVH3 クラスについての合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ファージ１ゲノムDNA ライブラリーから分離した。VH1 クラスプローブは、o-49であった：
5'-gtt aaa gaggat ttt att cac ccc tgt gtc ctc tcc aca ggtgtc -3'
VH3 クラスプローブは、o-184 であった：
5'-gtt tgc agg tgt cca gtg t(c,g)ａggt gca gct g(g,t)t ggagtc (t,c)(g,c) g -3'
正にハイブリッド化されたクローンを分離し、部分的に制限地図を作成し、サブクローン化し、そして部分的に配列した。ヌクレオチド配列から、o-49プローブで分離されたVH1 クローンの１つが、hv1263遺伝子の公開された配列に含まれたものと一致するアミノ酸配列を含む、VH 遺伝子セグメント、49.8 をエンコードすることが決定された(チェンら、(1989年)、Arthritis Rheum. ３２：７２) 。0-184プローブで分離されたVH3遺伝子のうちの３つ、184.3、184.14、および1 84.17は、VH 遺伝予 DP-50、DP-54 および DP-45 について公開されたものに含まれるものに一致するアミノ酸配列をエンコードする配列を含んでいた（トムリンソンら、(1992年)、J.Mol.Biol. 227：776)。これら４つのVH遺伝子は、pH3V4 Dプラスミドを構築するために使用された。
【０７４６】
184.3 遺伝子は、3kbのBamHI エフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリンカーの XhoI 部位が遺伝子の５'であり、かつ SalI 部位が３'であるように、プラスミドベクターpGP1f へとサブクローン化された。得られたプラスミドはp184.3.36f と呼ばれる。184.14遺伝子は、4 .8kb の HindIIIフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、遺伝子がさらに、遺伝子のゲノムXhoI 部位 0.7kb上流でおよびポリリンカーが誘導した遺伝子のsalI 部位３'でのXhoI/salI 消化によって3.5kbのフラグメントとして分離され得るような定位方向で、プラスミドベクターpUC19 へとサブクローン化された。得られたプラスミドはp184.14.1 と呼ばれる。184. 17遺伝予は、5.7kbの HindIII フラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリンカー誘導XhoI およびSalI 部位がそれぞれ、遺伝子の5'および３'であるような定位方向で、プラスミドベクターpSP72（プロメガ、マジソン、WI）へとサブクローン化された。このプラスミドの挿入部は、XhoI での部分消化、クレノーフラグメント充填、および再ライゲーションによって除去された遺伝子の3'末端に XhoI 部位を含む。得られたプラスミドは p184.17SK と呼ばれる。49.8 遺伝子は、6.3kb の XbaI フラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリンカー誘導 XhoI および ClaI 部位がそれぞれ、遺伝子の 5'および３'であるような定位方向で、プラスミドベクターpNNO3 へとサブクローン化されて、プラスミドpVH49.8 を作った（テイラーら、(1994年)、Internat ional Immunol, 6：579)。pVH49.8のXhoI／ClaI 挿入部を次に、pGP1f へとサブクローン化して、プラスミドp49.8fを作り、これは、ユニークXhoI および SalI 部位をそれぞれ49.8遺伝子の5'および3'末端に含む。
【０７４７】
p184.14.1 の 3.5kb の XhoI／SaII フラグメントを、p184.3.36fのXhoI 部位にクローン化して、プラスミド pRMVH1 を生じ、これは184.14および 184.3 遺伝子の両方を同じ定位方向に含む。このプラスミドを XhoI で消化し、そして p 184.17SKの 5.7kbの XhoI／SalIフラグメントを挿人してプラスミドpRMVH2 を作り、これは 5'から 3'へ、３つのVH 遺伝子、184.17、184.14および 184.3 を、すべて同じ定位方向で含む。プラスミドpRMVH2 を次にXhoI で切断し、そしてp4 9.8fの 6.3kbの XhoI／SalI 挿入部を挿入してプラスミドpH3VH4を作り、これは 5'から3'へ、４つのVH 遺伝子、49.8、184.17、184.14および184.3 を、すべて同じ定位方向で含む。
【０７４８】
ヒトＤ領域クローンpDH1 の10.6kb の XhoI／EcoRV 挿入部（前述した；例えば実施例12において）を、XhoI／EcoRV 消化 pGPe プラスミドベクターへとタローン化して新しいプラスミドpDH1eを作った。次にこのプラスミドをEcoRVで消化し、そしてSaIl 部位を含む合成リンカーフラグメント（5'- ccg gtc gac ccg -3'）でライゲートした。得られたプラスミド、pDH1es は、XhoI 部位は5'末端にあり、Sa1l 部位は3'末端にあるように、XhoI およびSalI で除去され得る挿入部内にヒトD1 クラスターのほとんどを含む。この挿入部を分離し、pH3VH4 のSalI 部位にクローン化してプラスミド pH3VH4D を作り、これは４つの生殖細胞系配置ヒトVH 遺伝子セグメントおよび８つの生殖細胞系配置ヒトＤセグメントを含み、すべてが同じ 5'から 3' への定位方向にある。このクローンの挿入部は、NotI での消化によって、ベクター配列を実質的に含まず、分離されることができる。
【０７４９】
pCOR1xa
９つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪセグメント、Ｊμイントロン重鎖エンハンサー、μスウィッチ領域およびＣμコードエクソンを含む32kb の XhoI 挿入部を含むプラスミドpCUR1（前記）を、XhoI で部分的に消化し、クレノ一処理し、そして合成SalI リンカーライゲートして、新しいプラスミドpCOR1xa を生じ、これはユニークXhoI 部位を 5'末端に有し、ユニークSalI 部位を 3'末端に有する。pCOR1およびpCOR1xa の両方が 0.6kbのラット重鎖 3'エンハンサーフラグメントを 3'末端に含み、これは、プラスミドがXhoI または XhoI／salIの代わりにNotI で消化されるなら、挿入部に含まれる。
【０７５０】
pP1-570
ファージ P1 ライブラリー（Genome systems Inc.,セントルイス、ミズーリ州）を、次のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて PCRによってスクリーニングした：
5'- tca caa gcc cag caa cac caa ｇ -3'
5'- aaa agc cag aag acc ctc tcc ctg -3'
このプライマー対を、ヒトγ遺伝子鋳型を有する216 bp PCR 産物を生成するようにデザインした。同定されたP1 クローンの１つはヒトγ3およびγ1遺伝子の両方を 80kb の挿入部内に含むことが見出された。このクローンの挿人部（図９６に示す）は、NotIおよび Sa1Iでの消化によって、ベクター配列を実質的に含まず、分離することができる。
【０７５１】
p11-14
ヒトγ3／γ1 クローン P1−570 の制限酵素地図化は、挿入部の5'末端に近い 14kbのBamHエフラグメントを示した。この14kbのフラグメントを、ポリリンカー誘導SalI 部位が挿入部の 5'末端に隣接するように、プラスミドベクターpGP1f へサブクローン化した。得られたプラスミドはpB14 と呼ばれる。別に、プラスミドクローン pJ1NA（チョイら、（1993年）Nature Genetics 4：117）から誘導された、ヒトμ遺伝子の3'末端およびヒトδ遺伝子の5'末端をカバーする11kbの NdeI／SpeI ゲノムDNA フラグメントを、合成オリゴヌクレオチドアダプターを用いて、pBluescrlpt（Stratagene, LaJolla,CA）の SalI 部位へサブクローン化した。次に、得られたSalI挿入部を分離し、pJ1NA からのμフラグメントの5' から3'への相対的定位方向がP1−570からのγフラグメントと同じであるように、pB14のSalI 部位へクローン化した。得られたクローンはp11−14と呼ばれる。このクローンの挿入部は、NotI での消化によって、ベクター配列を実質的に含まず、分離することができる。
【０７５２】
pHP-3a
マウス重鎖3'エンハンサー（ダリアバッハら、（1991年） Eur.J.Immunol.21：1499；リーべルソンら、（1991年）Nucleic acids Res. 19：933）をbalb/ｃマウスゲノムDNA ファージλライブラリーからクローン化した。プローブを得るために、全balb/cマウス胸腺DNAを、以下の２つのオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅のための鋳型として使用した：
cck76：5'−caa tag ggg tca tgg acc c -3’
cck77：5'- tca ttc tgt gca gag ttg gc -3’
得られた220bpの増幅産物を、TAクローニング（商標）キット（Invitrogen、サンジエゴ、CA）を用いてクローン化し、挿入部を、マウスファージλライブラリーをスクリーニングするために使用した。得られたファージクローンの１つからの正にハイブリッド化された5.8kbの HindエエエフラグメントをpGP1f へサブクローン化した。このサブクローンの挿入部、pHC3'ENfa の定位方向は、ポリリンカーXhoI部位が挿入部の 5'末端に隣接し、SalI 部位が 3'末端に隣接するような方向である。このHindII フラグメントの部分のヌクレオチド配列分析は、それが 3'重鎖エンハンサーを含むことを確認した。pHC3'ENfaの挿入部はエンハンサー配列のコアで、ECoR1 部位の約 1.9kb 上流にXhoI 部位を含む。この Xho I 部位は、部分消化、クレノー充填および再ライゲーションによって除去されて、クローン pH3'Efxを 作り、これはユニークXhoI および SalI 部位をそれぞれ、挿入部の 5'および3'末端に含む。
【０７５３】
ヒトγ3／γ1クローンP1−570の 3'末端を次のようにしてサブクローン化した：P1−570 DNA をNotI で消化し、クレノー処理し、次いでXhoI で消化し；そして13kb の末端フラグメントを分離し、プラスミドベクターpGP2b（BamHI で消化し、クレノー処理し、次いでXhoIで消化されている）へライゲートした。得られたプラスミド、pPX−3は挿人部の5'末端でポリリンカーXhoI 部位に隣接するポリリンカーNotI 部位を失った；しかし、XhoI 部位はそのまま残り、挿入部はNo tIおよびXhoI または、SalI およびXhoI での消化により分離され得る。pH3'Efx のXhoI／SalI 挿入部を含む3'エンハンサーを分離し、そしてpPX−3 の3'SalI 部位へライゲートして、プラスミドpHP-3a を作った。pHP-3a挿人部内にフラグメントを含むエンハンサーは、P1−570 クローンの3'末端として逆の定位方向でライゲートされる。したがって、pHP-3a は内部SalI 部位を含み、挿入部はXhoI およびNotIの消化によって分離される。これはエンハンサー要素であるので、5 ' から 3'方向は一般に機能のために重要でない。
【０７５４】
HCo7.
前核ミクロ注入用のHCo7 DNA 混合物を調製するために、上記した５つのプラスミドのそれぞれからのDNA を制限酵素で消化し、アガロースゲル上で分離した。クローンpH3V4D を NotI で切断し；pCOR1xaをNotI で切断し；p11-14をNotI で切断し；pP1-570 をNotI およびSalI で切断し；そしてpHP-3a をNotI および XhoI で切断した。DNA 挿入部を電気溶出し(electroeluted)、さらにEtBr なしの平衡CsCl 勾配上で精製した。挿入部を注入緩衝液中へ透析し、次のように混合した：50マイクロリットルのpH3V4D 挿入部＠20.4ng／マイクロリットル；50 マイクロリットルのpCOR1xa 挿入部＠20.8ng／マイクロリットル；50マイクロリットルのp11−14 挿入部＠15.6ng／マイクロリットル；300マイクロリットルのp P1-570 挿人部＠8.8ng／マイクロリットル；60マイクロリットルのpHP-3a 挿人部＠10.8ng／マイクロリツトル；および1.49 ml の注入緩衝液。
【０７５５】
HCo7トランスジェニック動物
HCo7 DNA 混合物を、１/２日令の胚の前核にミクロ注入し、ホーガンらによって記載されている（マウスの胚の操作、コールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ、コールド スプリング ハーバー NY）ように、この胚を偽妊娠したメスの卵管に移した。
【０７５６】
テールチップDNA（tail tip DNA）を、ミクロ注入した胚から発生した202 の動物から分離した。ヒトμおよびDH 配列を含むプローブを用いた、このDNA のサザンブロット分析は、HCo7 トランスジーンの少なくとも一部を組込んだ22の創立動物を示した。図 97は、HCo7 DNAをミクロ注入された胚から発生した6 匹のGO 動物の血清におけるヒトμおよびヒトγ１の発現の分析を示す。ヒト免疫グロブリン蛋白質の血清濃度を、ロンバーグら、（1994年）nature 368：865 に記載されたELISA によって測定した。これら６匹のマウスのうちの４匹は、サザンブロット分析によるトランスジーンの組み込みの証拠を示し、これらのマウスのうちの３匹は、それらの血清中にヒトμおよびヒトγ１蛋白質の両方を発現した。ヒト免疫グロブリン蛋白質を発現しなかった１匹のトランスジェニックマウスが、サザンブロット分析により、トランスジーンの少数のコピーのみを含むことが決定され、全部のトランスジーンが組込まれなかったこと、またはこのマウスが遺伝モザイクであったことの可能性がある。創立HCo7 マウスのうちの２匹、＃119 52および＃11959は、ヒトκミニ遺伝子座（または小遺伝子座）(KCo4 系4436)トランスジェニックマウス（このマウスはまた、内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座（ロンバーグら、前述）の分裂についてホモ接合であった）を用いて繁殖されて、２つの内因性遺伝子座分裂についてホモ接合であり、かつ２つの誘導されたヒトミニ遺伝子座、KCo4 およびHCo7 についてヘミ接合であるマウスを生じた。これらのいわゆる二重トランスジェニック／二重欠失マウスのうちの５匹を、ヒト IgM、ヒトIgG1 およびヒトIgG3 の発現について分析した。対照として、３匹の HC2/KCo4 二重トランスジェニック／二重欠失マウスを分析に含めた。この実験を図 98に示す。この図におけるELISA データを、ロンバーグら（前述）におけるように（ただしヒトIgG3 の欠失を除く）集め、コーティング抗体はヒト IgG3 （cat.＃08041、ファーミンゲン、ラ ジョラ、CA）に対して向けられた特異的ｍ Ab であり；IgG3 アッセイの他の詳細はIgG1 について公開されたものと同一であつた。HC2/KCo4 マウスがヒトIgM およびヒトIgG1 のみを発現し、一方HC2/KC o4 マウスはまた、これら２つのイソタイプのほかにヒトIgG3 を発現する。HCo7 マウスにおけるヒトγ3およびχ1の発現はまた、トランスジェニックマウスの脾臓から分離されたRNA から合成されたcDNA のPCR 増幅によって検出された。図 99は、トランスジェニックマウスの３つの異なる系統からの脾臓cDNA を用いて合成されたPCR 増幅産物を示す：系2550 はHC2 トランスジェニック系であり、系11959 および11952 はHCo7 トランスジェニック系である。単一の残された(st randed)cDNA を、テイラーら、(1992年)、NucleicAcidRes.20:6287 に記載されたように、脾臓RNA から合成した。このcDNAを次に、以下の２つのオリゴヌクレオチドを用いて、PCR増幅した： o-382：5'- gtc cag aat tcg gt(c,g,t) cag ctg gtg (c,g)agtct gg -3' o-383：5'-ggt ttc tcg agg aag agg aag act qac ggt cc-3’ このプライマーの対は、ヒトγ転写のヒンジ領域に及ぶPCR 産物の合成を支配する。ヒトγ１およびγ３ヒンジ領域の構造の違いの故に、PCR 増幅は、これら２つの転写の間を区別する。ヒトγ１鋳型は752 bpPCR 産物の合成を支配し、一方、ヒトγ３は893 bp 産物の合成を支配する。ヒトγ１鋳型のみが、HC2 系255 0 およびHCo7 系11959 脾臓で検出可能であるが、γ１およびγ３転写の両方が、HCo7 系11952脾臓で検出可能である。このアッセイの非定量性の故に、かつ個々の動物の間のγ３発現における違い（図98においてELISAによって示した）の故に、図99におけるHCo7系11959脾臓にγ３を観察することの不能は、γ３がこの系に発現されないことを示さない。HCo7/KCo4マウスから分離された牌臓細胞はまた、LPS およびIL4 での刺激によりイン ビトロで、IgG1 およびIgG3 の両方を発現するように誘導され得る。この実験は、図 100に示される。７周令のオスの HCo7/KCo4二重トランスジェニック／二重欠失マウス（＃12496；系11959／ 4436）から分離された脾臓細胞を、単独で、および種々のサイトカインと結合して、胸腺非依存Ｂ細胞分裂促進因子、LPS に応答しての免疫グロブリン分泌について試験した。脾臓細胞は、Ｔ細胞による細胞障害性除去によって、Ｂ細胞が豊富にされた。B-豊富にされた細胞を、24のウェルプレート中で、RPMI-1640 中10 ％FCS ２ ml中、２ｘ106細胞／ウエルで、培養した。LPS を、10 マイクログラム／ml で、すべてのウェルに添加した。IL-2 を50 単位／ml で添加し、IL-4 を15 ng／mlで添加し、IL-6を15 ng／ml で添加し、γIFN を100 単位／ml で添加した。培養物を37℃、5％CO2 で10日間インキュベートした後、上清をELI SA によつてヒトIqG1 およびIgG3 について分析した。ELIZAのためのすべての試薬は、ジャクソン イム ノロジカルズ（ウエスト グローブ、PA）からのポリクローナル抗血清であったが、ただし、キャプチャー抗ヒト IqMは、ザバインディングサイト（バーミンガム、UK）からのモノクローナル抗体であった。
実施例38
この実施例は、ヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座および、多重ヒトVK セグメントを含む YAC クローンの共注入（co-injection）による、機能的ヒト軽鎖Ｖセグメントのマウスゲノムへの好結果の導入を説明する。この実施例は、YAC に含まれるVKセグメント遺伝子が、得られたマウスにおいてヒトκ鎖の発現されたレパートリーに寄与することを示す。この実施例は、トランスジーンエンコードヒト免疫グロブリン蛋白質のレパートリー拡張のための方法を証明し、詳細には、ヒト κ鎖可変領域レパートリーが、結合されていないポリヌクレオチド（ヒト免疫グロブリン可変領域セグメントを含む）の共導入(co-introduction）によってどのようにして拡張され得るかを示す。
【０７５７】
vK含有酵母人工染色体クローンDNAおよびκ軽鎖ミニ遺伝子座クローン DNA の共 注入による機能的ヒト軽鎖ｖセグメントの導入
I.      クローン化されたヒトVK 遺伝子セグメントを含む酵母株の分析
全ゲノムDNAを、ヒトVK 遺伝子座（ICRF YAC ライブラリー デザイネーシヨン 4x17E1)の部分を含む、450kb の酵母人工染色体(YAC)を含む酵母株から分離した。このYACクローンに含まれるVK 遺伝子セグメントのいくつかの同一性を決定するために、一連のVK ファミリー特異的PCR 増幅反応のための基質として、ゲノムDNA を使用した。４組の増幅において、４つの異なる5'プライマーを、単一のコンセンサス3'プライマーとそれぞれ対にした。この5'プライマーは：o-270 (5'-gac atc cag ctg acc cag tct cc-3')、o-271 (5'-gat attcag ctg act cag tct cc-3')、o-272（5'−gaa att cag ctg acgcag tct cc-3') および o-273 ( 5'-gaa acg cag ctg acg cag tctcc-3')であった。これらのプライマーは、マークスら（Eur．J.Immunol. 1991.21，985）により、ＶR ファミリー特異的プライマーとして使用される。３'プライマー、o-274（5'-gca agc ttc tgt cccaga cc c act gcc act gaa cc-3'）は、FR3 のためのコンセンサス配列に基づく。４組のプライマーのそれぞれが、YACクローン4x17E1を含む酵母ゲノムDNAからの期待された0.2kb のフラグメントの増幅を支配した。次に、異なる４組の増幅産物はゲル精製され、プラスミドベクターpSP72（プロメガ）の PvuII／HindIII 部位へクローン化された。11 の得られたクローンのヌクレオチド配列分析は、７つのはっきりとしたＶ遺伝子を同定した。これらの結果を以下の表14に示す。
【０７５８】
【表１１】
2011236257.tif 000019
* 遺伝子セグメントは、遠位のＶKクラスター内で地図を描いた（コックスら、E ur.Ｊ.Immunol. 1994．24，827；パージェントら、Eur.Ｊ.Immunol.1991．21、1 829；スカブル及びザツチュー、Biol．Chem．Hoppe-Seyler1993．374，1001)。
【０７５９】
YAC クローンから増幅された配列のすべてが、遠位のクラスターに地図を描かれるＶK遺伝子に明白に割り当てられるか、またはそれらは遠位の遺伝子配列と適合し得る。配列はどれも近位のＶ遺伝子に明白に割り当てられないので、YAC 4x17E1 は遠位のＶK領域からの配列を含むことが明白である。さらに、同定された配列のうちの１つ、クローン＃７（VkO2）は、遠位のクラスターのＪ近位末端の近くに地図を描き、一方、別の配列、クローン＃１および４（VkL22）は、遠位のクラスターのＪ遠位末端の近くに、300kb を超えて上流に地図を描く。かくして、450kb のYAC クローン4x17E1 が、対応するヒトゲノムフラグメントの非欠失コピーを示すなら、それは、少なくとも32の異なるＶKセグメントを含む。しかし、これらのうちのいくつかは、非機能偽遺伝子である。
２．    YAC 誘導ＶK遺伝子セグメントを含むトランスジェニックマウスの生成
胚の前核へのミクロ注入のための精製YAC DNA を得るために、全ゲノムDNA をアガロースゲル上で、サイズ分画（size fraction）をした。YAC 4x17E1を含む酵母細胞を、溶解に先立ってアガロース中に埋め込み、そしてYAC DNAを、標準パルスフィールドゲル電気泳動（製品明細：CHEF DR-II 電気泳動細胞、BIO-RAD ラボラトリーズ、リッチモンド CA）によって、酵母染色体DNA から分離した。６つの独立のパルスフィールドゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、YAC クローン含有ゲル物質をゲルの残部から切り離した。次に、YAC 含有ゲル片を，三角形のゲルトレー中の新たな（低い融点の）アガロースゲルキャスト(cast)中に埋め込んだ。得られた三角形のゲルを、標準ゲル緩衝液の他に２モル／リットルの酢酸ナトリウムを含む細いゲルを用いて、頂点で広げた(図 101)。次に、ゲルを、標準ゲル緩衝液に浸した電気泳動チャンバー中に置いた。電流が細い高塩ゲル片にだけ流れることができるように、Ｙ字形のゲル型を緩衝液の表面より上に上げた。プレキシグラスブロックを細い高塩ゲル片の上に置いて、NaOAcがゲル緩衝液へと拡散するのを防いだ。次に、YAC DNAを、元のゲル片から細い高塩ブロックへと電気泳動した。低塩ゲルから高塩ゲルへの移動の時点で、ゲルを通ったYA C DNAの移動を効果的に停止させる抵抗低下がある。これは、三角形のゲルの頂点でYAC DNAの濃縮に至る。電気泳動および染色に続いて、濃縮したYAC DNAをDN Aの残部から切り離し、アガロースをGELase（EPICENTRE Technologies）で消化した。次に、塩化セシウムをYAC DNA含有液体に添加して、1.68g／mlの密度を得た。この溶液を37,000 rpmで36時間遠心分離して、汚染物質からDNAを分離した。得られた密度勾配の0.5ml画分を分離し、ピークDNA含有画分を、５mMトリス（ pH7.4）／５mMNaCl／0.1M EDTAに対して透析した。透析後、YAC DNAの得られた0 .65ml溶液の濃度は、２マイクログラム／mlであることがわかった。このDNAを、プラスミドpKC1BおよびpKV4からの精製DNA挿入部（ロンバーグら、1994年、ネイチャー 368、856）と、20:１:１（マイクログラムYAC4x17E1：KC1B：KV4）で混合した。得られた２マイクログラム／ml溶液を、半日マウス胚の前核に注入し、 95の生き残ったミクロ注入した胚を、偽妊娠したメスの卵管に移した。ミクロ注入した胚から発生した、39のマウスが生まれた。これらマウスのうちの２匹、＃ 9269および＃9272を、トランスジェニック系を確立するために使用した。この系は、KCo5−9269およびKCo5−9272と称する。
【０７６０】
系KCo5−9269およびKCo5−9272マウスからのゲノムDNAのサザンブロット分析を行って、YAC 4x17E1誘導VKセグメントがそれらのゲノム中に組込まれたかどうかを決定した。遠位のVKクラスターの中央からのVK遺伝子セグメント、VkA10（アセッション＃：x12683；ストロービンガーら、1988、Biol．chem．Hoppe−Sey ler 369、601−607）を、サザンブロット分析のためのプローブとして選択した。クローン化したプローブを得るために、VkA1O遺伝子をまずPCRによって増幅した。２つのオリゴヌクレオチド、o-337(５'−cgg tta aca tag ccc tgg gac gag ac -３')およびo-338（５'−ggg tta act cattgc ctc caa agc ac -３')を、YAC 4x17E1から１kbフラグメントを増幅するためのプライマーとして使用した。増幅産物をゲル精製し、HincIIで消化し、そしてpUC18へクローン化して、プラスミドp17E1A10を得た。次に、このプラスミドの挿入部を、KCo5 −9269およびKCo5−9272 DNAのサザンブロットを調べるために使用した。ブロットは、KCo5−9272マウスDNAのみにおいて予想される制限フラグメントへのプローブのハイブリッド化を示した。このことは、VkA1O遺伝子が、KCo5−9272マウスのゲノムに組込まれ、KCo5−9269マウスには組込まれなかったことを示す。次に、系KCo5−9272マウスをHC2-2550/JHD/JKDマウスと交配して、内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の分断についてホモ接合であり、かつHC2およびKCo5トランスジーンについてヘミまたはホモ接合であるマウスを得た。内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の分断についてホモ接合で、ヒト重鎖およびκ軽鎖トランスジーンについてヘミまたはホモ接合である動物は、二重トランスジェニック／二重欠失マウスと称する。
【０７６１】
cDNAクローニング実験を行って、YAC誘導Vk遺伝子のいずれかがKCo5−9272系マウスに発現されるかどうかを決定した。二重トランスジェニック／二重欠失マウス＃12648（HC2-2550/KCo5−9272/JHD/JKD）を犠牲にし、全RNAを牌臓から分離した。１つのよられたcDNAをRNAから合成し、オリゴヌクレオチドo-270、o-27 1、o-272およびo-273を５'プライマーとして用い、かつCk特異的オリゴヌクレオチド、o-186（５'-tag aag gaa ttc agc agg cac acaaca gag gca gtt cca -３' ）を３'プライマーとして用いて、４つの別々のPCR反応における鋳型として使用した。増幅産物をpCRIITAクローニングベクター（インビトロゲン）へクローン化した。19の挿入部のヌクレオチド配列を決定した。配列分析の結果を以下の表 15にまとめる。
【０７６２】
【表１２】
2011236257.tif 000020
★ トランスジーンプラスミド配列によってエンコードされたVk遺伝子 
★★YAC誘導トランスジーン配列によっで唯一にエンコードされたVk遺伝子
これらの結果は、少なくとも３のYAC誘導Vk遺伝子セグメント、A10、L18およびL24が、KCo5−9272系マウスの発現されたヒトレパートリーに寄与することを示す。
【０７６３】
骨髄および脾臓での種々のB220+細胞集団のサイズにおけるこの増加したレパートリーの効果を決定するために、KCo5−9272系マウスにおいて、フローサイトメトリー分折を行った。この分析の一部が、図102および図103に示されている。２匹の二重トランスジェニック／二重欠失マウス（一匹はKCo5トランスジーンを含み、一匹はKCo4トランスジーンを含む）をこの実験において比較した。これら２つのトランスジーンは、同じ結合および定常領域配列、ならびに同じイントロンおよび３'エンハンサー配列を共にする。それらはまた、４つの異なるクローン化されたV遺伝子セグメントを共にするが；KCo5トランスジーンは、KCo4トランスジーンには含まれない、YAC 4x17E1から誘導された追加のVセグメントを含む。細胞を、マウス＃13534（HC2-2550/KCo5−9272/JHD/JKD）およびマウス＃13449（HC2-2550/KCo4−4436/JHD/JKD）から分離した。骨髄細胞を、抗マウスB22O（カルタグ、サウス サンフランシスコ、CA）、抗マウスCD43（ファーミンゲン、ラ ジョラ、CA）および抗ヒトIgM（ジャクソン イムノロジック、ウエストグローブ、PA）で染色した。脾臓細胞を抗マウスB220および抗ヒトIg Mで染色した。
【０７６４】
図102は、KCo5およびKCo4マウスの骨髄におけるＢ細胞およびＢ細胞前駆体集団の比較を示す。骨髄中のＢ細胞の画分（B220+、IgM+）は、KCo5マウスにおいて（6％）は、KCo4マウスにおける（２％）より、約３倍高い。プレＢ細胞集団（B220+、CD43-、IgM-）がまた、KCo5マウスにおいて、より高い（９％、KCo4の４％に比べて）。さらに、プロＢ区画(B220+、CD43+)がこれらのマウスにおいて上昇している(Kco5では11％、KCo4では５％)。これら３つの区画のそれぞれは、 KCo5マウスでは、KCo4マウスにおけるより大きいが、そのレベルはなお、野生型マウスにおいて見出された約半分である。骨髄Ｂ細胞の数の増加はたぶん、増加したレパートリーサイズの直接の結果である。これらのマウスのより大きい第１のレパートリーは、内因性の抗原についていくらかの最小の閾値親和性を膜Igに提供し得る。次に、レセプターライゲーションが反応性Igを発現するそれらＢ細胞の増殖を見込むことができた。しかしながら、プレＢおよびプロＢ細胞は軽鎖遺伝子を発現しないので、KCo5マウスにおけるこれら２つの区画の増加したサイズについての説明は直ぐに明らかではない。増加したＢ細胞の数は、これらの集団の拡張に、より助けとなる骨髄環境をつくるので、Ｂ細胞前駆体区画はKCo5マウスにおいてより大きくあり得る。この効果は、分泌された因子によって、またはＢ細胞と前駆細胞との間の細胞−細胞接触によって直接媒介されることができたか、または、さもなければ前駆細胞の生存または増殖を阻害するであろう因子または細胞の滴定によって、間接的に媒介されることができた。
【０７６５】
図103は、KCo5およびKCo4マウスにおける脾臓Ｂ細胞(B220+、IgM+)集団の比較を示す。これらの２匹のマウスの間の主な違いは、B220曇っているＢ細胞集団の相対的サイズである(Kco5マウスでは６％、かつKCo4マウスでは13％)。B220曇っ ている細胞は、B220明るいＢ細胞より大きく、それらのより高い画分は、１つの軽鎖を発現する。これらは、通常、野生型マウスでの末梢Ｂ細胞集団を支配する、いわゆるB1細胞集団の特性である。KCo4マウスの脾臓は、B220曇っている細胞の変則的に高い画分を含み、一方、KCo5マウスは、これらの細胞のより普通の分布を有する。しかしながら、両方の系統が、脾臓のＢ細胞の通常の数の約１/２〜１/３を含む。
実施例39
この実施例は、高親和性の抗原特異的なヒトIgGモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを分離するために、実施例38のKCo5トランスジェニックマウスの好結果の使用を説明する。
【０７６６】
免疫化
二重欠失／二重トランスジェニックマウス（KCo5−9272/HC2-2550/JHD/JKD、＃12657）を、８週間１週おきに、腹腔内に、４〜10ｘ106照射T4D3細胞、ヒトCD 4を発現するネズミＴ細胞系（ドクタージェインパーンズ、スタンフォード大学）で免疫し、次いで２週間後、不完全フロイントアジュバント（シグマ）中の20 mgの可溶な組換えヒトCD4（sCD4；イントラセル）を腹腔内に１回注入した。このマウスを、20 mgのsCD4と融合するに先立って３日間に１度、静脈内に追加した。
【０７６７】
ハイブリドーマ融合
免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、１/６の数のP3X63-A g8.653非分泌マウスミエローマ細胞(ATCC CRL 1580) に、50％PEG（シグマ）を用いて融合した。平底ミクロ滴定プレートに、約2x106 で、細胞を移植し、次いで、20％胎児クローン血清(HyClone)、18％「653」ならし培地、５％オリジエン(Origen)(IGEN)、４mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、５mM HEPES、0.055mM２-メルカプトエタノール、50単位／ml mMペニシリン、50mg／ml ストレプトマイシン、50mg／ml mMゲンタマイシンおよび１ xHAT（シグマ；融合の24時間後にHATを添加した）を含有する選択培地中で２週間インキュベートした。２週間後、HATをHTで置き換えた培地中で細胞を培養した。広範囲のハイブリドーマの成長または培地が使われたことが観察されたら、ウェルをELISAおよびフローサイトメトリーでスクリーニングした。
【０７６８】
ELISAによるハイブリドーマのスクリーニング
抗CD4 mAbを検出するために、ミクロ滴定プレート （ファルコン）を、PBS中 2.5mg／mlのsCD4 50mlで、４℃にて１晩被覆し、PBS中５％のチキン血清100 mL で１時間室温にてブロックし、次いで室温にて１時間インキュベートした。インキュベーションはそれぞれ、ハイブリドーマからの上清の希釈１:４、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRPO)結合ヤギ抗ヒトIgG（ジャクソン）のF(ab')2フラグメントの1,1000希釈または、HRPO結合ヤギ抗ヒトIgK抗体（シグマ）プラス１％通常のマウス血清の１：250希釈で行い、および最後に、0.0024％H2O2を有する、0.1Mのクエン酸燐酸緩衝液(pH4)中0.22mg／ml ABTSを用いて行った。最初以外はすべてのインキユベーション間で、プレートを洗浄緩衝液(PBS中0.5％Tween −20)で３〜６回洗浄した。希釈液（５％チキン血清を有する洗浄緩衝液）を使用して、上清およびHRPOコンジュゲートを希釈した。二重波長を用いて吸光度を測定した（490nmの参照波長でのODを415nmでのODから引いた）。
【０７６９】
マウスλ含有mAbを検出するために、以下のこと以外は、上記のELISAプロトコールを使用した。ミクロ滴定プレートのウェルを、100mlの１）1.25mg／mlヤギ抗マウスλ（ピアス）、２）1.25mg/ml ヤギ抗ヒトFcγ （ジャクソン）、または３）２.５mg／ml sCD4(ABT)で被覆した。検出段階について、ビオチンに結合した１:5000ヤギ抗マウス１(SBA)100ml を使用し、次いでHRPO（ジャクソン）に結合した１:1000ストレプトアビジン100 mlを使用した。ネズミおよびヒトのmAb標準を、示された濃度で使用した。関連のない抗原に対する交差反応性をさがすために、ウェルを、CEA（クリスタルケム）、KLH（カルバイオケム)、HSA（シグマ）、BSA（シグマ）またはOVA（シグマ；すべて２mg／ml、ただしCEAは2.5mg／mlであった）で被覆した。適当な抗体を滴定し、正の対照（ヒトIgM抗CEA（ジェンファーム）、ウサギ抗KL H（シグマ）、ヒツジ抗HSA（ザ バインディングサイト）、ヒツジ抗BSA（ザ バインディングサイト）およびヒツジ抗OVA（ザ バインデイングサイト)）として使用した。どの結合された抗体も、ヤギ抗ヒトIgM、ロバ抗ウサギIgGまたはロバ抗ヒツジIgG(すべて、１:1000に希釈され、ジャクソンから得た）のHRPOコンジュゲートで検出された。さもなければ、標準ELISAプロトコールは、以下のようであった。
【０７７０】
フローサイトメトリーアッセイによるハイブリドーマスクリーニング
自生種細胞の表面CD4と反応性のmAbをさらにスクリーニングするために、５ｘ 105のSupT1細胞（ATCC CRL 1942）を、融合プレートからの使われた上清の１:２希釈を用いて氷上で30分間インキュベートし、冷染色緩衝液（0.1％BSA、0.02％ NaN3、PBS中）で２回洗浄し、FITC結合ヤギ抗ヒトFcg(FITC−GaHuIgG;ジャクソン)のF(ab')2フラグメント1.5mg／mlで15分間インキュベートし、１回洗浄し、そしてFACScan（ベクトン−ディッキンソン）で直ちに分析した。
【０７７１】
CD4反応性ハイブリドーマ
上記したELISAおよびフローサイトメトリー技術を用いて、自生種ヒトCD4と特異的に反応するヒトIgGを分泌する12のハイブリドーマクローンを同定した。これら12のクローンのうちの10をさらにサブクローン化した。これらサブクローンのうちの８つをヒトIgG1k分泌ハイブリドーマとして同定した。他の２つは、マウスλ軽鎖を発現した。８つの完全なヒトクローンのためのペアレントウェルは、1E11、2E4、4D1 、6C1、6G5、7G2、10C5および1G1であった。完全なヒトIgGkサブクローンのうちの３つ（4D1.4、6G5.1および10C5.6）の結合のフローサイトメトリーアッセイを 図104に示す。
【０７７２】
図104は、IgGk抗nCD4モノクローナル抗体のnCD4+SupT1細胞への結合を示す。ログフェーズグロース培養（log phase growthculture）からの細胞を洗浄し、モノクローナル抗体なし、4E4.2(負の対照として)、キメラLeu3a（正の対照として）または10のヒトIgG抗nCD4モノクローナル抗体のうちの１つで染色した。どの結合したモノクローナル抗体も、FITC結合ヤギ抗ヒトFcγで検出された。10のモノクローナル抗体のすべてがSupT1細胞に結合した。ただし、そのうちの３つしか、データがここに示されていない。
【０７７３】
クローン化されたハイブリドーマによるヒト抗体分泌の分析
mAbの成長および分泌レベルを比べるために、サブクローンを複製培養物（2x1 05細胞／mlの初期密度で、24のウェルプレート中、HT培地中）に入れた。７日間毎日、各サブクローンについての複製培養物の１つを取り、細胞数、細胞生存度（トリパンブルー排除による）および上清中のmAbの量（全ヒトγについて定量的ELISAによる）を測定した。表16は、ハイブリドーマサブクローンのうちの７つによる抗体分泌についてのデータを示す。
【０７７４】
【表１３】
2011236257.tif 000021
★pg/細胞＝（mAbの最大量）／（生存細胞の最大数）
pg／細胞／d=（pg/細胞）／７日 
ヒトmAbの精製
個々のハイブリドーマクローンをHTおよびオリジェンなしの培地中で成長させ、FCSを徐々に減らして、最終１リットル培地中で約２〜３％までにした。ハイブリドーマの生存度が約30％より下に落ちたら、上清を取った。IgGk mAbを精製するために、使用した上清を遠心分離して細胞を除去し、超音波にて約50〜100m lに濃縮し、PBS、pH7.4で１:５に希釈し、そして５mlのプロテインＡ（ファルマシア）カラムに載せた。カラム体積の３〜５倍のPBSで洗浄した後、ヒトIgGk mA bを、0.1HCl、150 mM NaCl、pH2.8で溶出し、そして直ちに1Mトリス塩基で中和した。OD280＞0.2の物質を含むカラム画分を集め、PBSに透析した。次に、OD280 を測定し、1.4の吸収係数(absorbtivitycoefficient)を使用して、ヒトIgGの蛋白質濃度を計算した。流れの中にmAbは検出されず、％回収率は93〜100％の範囲であった。３〜６mgの各精製mAbが得られ、純度＞90％であった。
【０７７５】
クローン化されたハイブリドーマからのモノクローナル抗体の分析
mAbの結合の特異性を調べるために、ヒトPBMCをフィコール上で分離し、以下のように染色した。染色緩衝液中のヒトPBMC(106)を氷上で30分間インキュベートし、別々の反応において、サブクローン化したハイブリドーマの３つ（4D1.4 、6G5.1および10C5.6）のそれぞれからの同体積の上清を用いて、またはイソタイプが合った負の対照mAbを用いて行い、２回洗浄し、そして、フィコエリトリン(PE)に結合したマウス抗ヒトCD 4mAb(Leu3a;ベクトン−ディッキンソン)10ml、PEに結合したマウス抗ヒトCD8 mA b（Leu2a；ベクトン−ディッキンソン）10mlまたはPEに結合したマウス抗ヒトCD 19mAb(SJ25−C1；カルタグ）5mlと一緒に1mg/mlのFITC−GaHuIgGを用いて、20分間氷上でインキュベートした。次に、ゲートリンパ球(gatedlymphocyte)をFACSc anフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン、サン ジョゼ、CA)で分析した。３つの抗体すべてが、ヒトPBMCのCD4画分に特異的に結合することが見出された。
【０７７６】
これら３つのmAbによって認識されるエピトープの位置を近づけるために、５ｘ105 SupT1細胞を、緩衝液、2.5mg/ml RPA-T4、または染色緩衝液中の2.5mg／m l Leu3aを用いて氷上で20分間、次いで10のヒトIgG mAb（１:２に希釈した上清中）のうちの１つを用いて30分間、そして最後に0.5mg／ml FITC結合ヤギ抗ヒト Fcγを用いてプレインキュベートして、結合したヒトIgGをいずれも検出した。最後の段階の前に２回、その後に１回、細胞を染色緩衝液で洗浄した。このブロッキングアッセイの結果を図105に示す。３つの抗体のどれも、RPA−T4とエピトープを共にしないが、6G5.1および10C5.6は、Leu3aによって認識されたのと同じ（または隣接する）エピトープを認識するようである。
【０７７７】
速度および平衡定数の測定
ヒトsCD4(2500〜4200RU)を、製品の指示に従って、センサーチップ表面に、アミン基を介して共有結合によって固定した。抗体希釈物を、平衡に到達するまで、抗原結合センサーチップの上を流し、次いで緩衝液のみを流れるようにした。反応、結合および解離の各相について、結合した抗体の画分を時間に対してプロットした。結合曲線の導関数（dR／dt）を計算し、各濃度についての応答に対してプロットした。会合速度定数（k会合）を計算するために、それらの得られた線の勾配を、モノクローナル抗体の濃度に対してプロットした。このグラフからの線の勾配がｋ会合に対応した。解離速度定数（k解離）を、時間間隔に対しての応答（緩衝液の流れ相中）における低下の対数から、計算した。ｋ会合をｋ解 離で除して、Kaを誘導した。KCo5／HC2二重トランスジェニック／二重欠失マウスから誘導された５つの異なる精製モノクローナル抗体および、市販の供給源（ベクトンディッキンソン、サン ジョゼ、CA）から得られた１つの精製抗体について測定した速度および親和性定数データを表17に示す。
【０７７８】
【表１４】
2011236257.tif 000022
混合リンパ球反応(MLR)
KCo5トランスジェニックマウスから誘導されたヒトモノクローナル抗体10C5.6 のインビトロでの効力を、マウス抗体Leu3aと比較するために、MLRアッセイを行った。２人の関連のないドナーからのヒトPBMCをフィコール上で分離し、各ドナーからのCD4+PBLを、製品の指示に従って、CD4カラム（ヒトCD4セレクト、バイオテックス ラボラトリーズ、インク.、カナダ）を用いて精製した。両方のドナーからのPBMCを、培地（次のものを含むRPMI 1640：10％加熱−不活化ヒトAB血清(NA BIから)、ヘペス、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、pen／strep、およびb- メルカプトエタノール(すべて製品の推奨濃度で使用)）中の100mg／mlマイトマイシンｃ（アルドリッチ）を用いて、37℃で30分間処理した後、培地で３回洗浄することによって、不活化された刺激物細胞(stimulator cell)を得た。培地で希釈した種々の濃度のmAbまたは培地のみを、滅菌ろ過し、96ウェルの丸底プレートに、トリプル（triplicate）でウェル当たり100mlで加えた。次に、１人のドナーからの105CD4+PBL（培地中） 50mlおよび別のドナーからの105マイトマイシンＣ処理したPBMC（50mlの培地中）を、各ウェルに加えた。mAbのいかなる毒性または分裂促進因子効果についても対照するために、CD4＋PBL反応物(respo nder)のみプラスmAbを有する対照プレートをセットした。刺激物のみの対照および培地バックグラウンド対照をまた含めた。37℃、５％CO2加湿インキュベータにて７日間の後、各ウェルから上清100mlを除去し、2Omlの比色分析試薬（セルタイター96AQキット、プロメガコーポレーション、マジソン、WI）を加えた。４〜６時間発色させ、490nmにてプレートを読んだ。図106に示されたこの実験の結果は、ヒトIgG1k抗体10C5.6は、このアッセイにおいて、ヒトPBMC CD4細胞の機能を妨げることにおいて、少なくともLeu3aと同様に有効であることを示す。
実施例40
ヒトIgGカッパ抗CD4モノクローナル抗体の結合特性
この実施例は、ヒトCD4で免疫したHC2/KCo5/JHD/JCKDトランスジェニックマウスから得たハイブリドーマクローンから誘導されたヒトIgGkモノクローナル抗体の結合特性を提供する。このモノクローナル抗体は、組換えおよび天然ヒトCD4 に対して高い結合力および親和性(avidity and affinity)を有することが示された。
【０７７９】
ヒトCD4と反応性のヒトIgGカッパモノクローナル抗体(mAb)を分泌する、10の個々のハイブリドーマ細胞系（1E11、1G2、6G5、10C5、1G1、6C1、2E4、7G2、1F 8および4D1）からの細胞を、 JHD/JCKD/HC2/KCo5トランスジェニックマウスから誘導した。細胞系を培地で成長させ、抗体蛋白質を上清から分離した（フィッシュワイルドら、1996年、ネイチャーバイオテクノロジー14、845-851)。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製した抗体を結合定数を測定するために使用した。結果を表18 および19に示す。
【０７８０】
表18に示された速度および平衡定数は、センサーチップに結合されたヤギ抗ヒトIgG（Fc特異的）を使用し、飽和濃度のmAbを流して、次いで種々の抗原（rCD4 ）濃度で、BIAcore（ファルマシア バイオセンサー）を用いて測定された。これらの定数は、精製したmAbを用いた３つの実験から誘導された。
【０７８１】
【表１５】
2011236257.tif 000023
表19に示した速度および平衡定数は、センサーチップに結合した抗原（rCD4）を用い、次いでmAbを流して、BIAcoreにて測定した。これらの定数は、精製mAb を用いて、少なくとも３つの独立した実験から誘導された。
【０７８２】
【表１６】
2011236257.tif 000024
表20は、科学文献に示された抗CD4 mAbについての平衡定数を与える。
【０７８３】
【表１７】
2011236257.tif 000025
NR=報告なし、 
(１)J.Cell.Biol.15E:A179 
(２)J.Immunol.145:2839 
(３)Clin.Immunol.Immunopath.64:248 
(４)Biotechnology.10:1455 
(５)Mol.Immunol.30:1443 
(６)欧州特許出願#0626389A1
上記した結合力および親和性の測定は、組換えCD4（rCD4）を用いて行った。野生種CD4（nCD4）についてのヒトモノクローナル抗体の結合力を測定するために、変性されるべき抗体を必要としない、追加の結合アッセイを使用した。特異的に、抗体の連続希釈物を、SupT1細胞と共に、６時間氷上でインキュベートし、洗浄し、FITCヤギ抗ヒトFcγと結合したどの抗体をも検出した。Kaを、最大蛍光の１／２を与える抗体の濃度から測定した(４つのパラメータフィットを使用した)。その結果は、10のヒトモノクローナル抗体すべてが、Ka値＞109M-1 で、nCD4に非常によく結合したことを証明する(表21)。ほとんどの抗体（キメラ Leu3aを含む）が、rCD4よりもnCD4に、あまりよく結合しなかった。このことは、抗原の密度の差ならびに２つの抗原の間の差異に帰することができた。
【０７８４】
【表１８】
2011236257.tif 000026
★ヒトモノクローナル抗体は、SupT1細胞と共に、連続希釈物中で６時間インキュベートし、２回洗浄し、FITC結合ヤギ抗ヒトFcγ抗血清と共にインキュベートし、洗浄し、固定した。４つのパラメータフィットから測定したように、最大蛍光の１／２を与える抗体の濃度からKaを計算した。
実施例41
ヒトIgGκ抗CD4抗体をエンコードするヌクレオチド配列の同定 この実施例は、試験したハイブリドーマのそれぞれが１つの機能的重鎖または軽鎖RNA転写物のみを生成することを証明し、これは、適当な機能する対立遺伝子排除と一致する。さらに、重鎖および軽鎖CDRセグメントの配列分析は、免疫グロブリントランスジーンの体細胞突然変異が起こったことを示す。
【０７８５】
ヒトCD4と反応するヒトIgGκモノクローナル抗体を分泌し、 JHD/JCKD/HC2/KCo5トランスジェニックマウスから誘導された、５つの個々のハイブリドーマ細胞系(1E11、1G2、6G5、10C5および4D1)からの細胞が、個々の抗体のそれぞれをエンコードするRNAを分離するために使用された（フィッシュワイルドら、1996年、NatureBiotechnology 14、845-851)。RNAが、cDNAを合成するための基質として使用され、これは次に、ヒトVH、Vκ、Cγ、およびCκに特異的なプライマーを用いて、PCRによってヒトIgγおよびκ転写配列を増幅するために使用された（テイラーら、1992年、Nucleic AcidsRes.20、 6287-6295；ラリック、J.W.ら、(1989年)、 Bio/Technology 7．934-938；マークス、J.D.ら、(1991年)、Eur.J．Immunol.21 .985-991;テイラーら、1994年、Int.Immunol．6、579-591)。増幅されたIg重鎖およびκ軽鎖の配列を、細菌のプラスミドへクローン化し、ヌクレオチド配列を決定した。重鎖VDJおよび軽鎖VJ結合に広がる配列の分析は、５つのクローンのそれぞれについてフレーム内（in frame）重鎖および軽鎖転写を示し、いくつかの場合には、非機能的対立遺伝子を表している追加のフレーム外（out offrame ）無菌転写物を示す。適当な機能する対立遺伝子排除と一致して、個々のクローンのそれぞれについて同定された１より多いユニーク機能的重鎖または軽鎖転写物がある場合はない。10の機能的転写物のそれぞれについて、部分ヌクレオチド配列が、以下の配列I.D．番号に割り当てられ：1E11 γ[配列I.D.No.１]；1E11 κ[配列I.D.No.2]；1G2γ[配列I.D.No.３]；1G2κ[配列I.D.No.４]；6G5 γ[配列I.D.No.５]；6G5 κ[配列I.D.No.6]；10C5γ[配列I.D.NO.７]；10C5κ[ 配列I.D.No.８];4D1γ[配列I.D.No.９];4D1κ[配列I.D.No.10]、表22に示される。総ての配列が５'から３'への方向で示される。
【０７８６】
【表１９】
2011236257.tif 000027
【表２０】
2011236257.tif 000028
【表２１】
2011236257.tif 000029
これらのDNA配列の分折は、５つのハイブリドーマクローンが４つの個々のプライマリーＢ細胞の子孫を示すことを証明する。表23は、10のCDR3領域のそれぞれについて誘導されたアミノ酸配列およびこれらの転写物をエンコードする遺伝子のそれぞれに挿入された生殖細胞系遺伝子セグメントについての割り当てを示す。生殖細胞系の割り当ては、ナショナルセンターオブバイオテクノロジー インフォメーション(National Center for Biotechnology Information)、ナショナル ライブラリー オブ メディシン（National Library ofMedlcine)、ナショナル インスティテューツ オブ ヘルス(NationalInstitutes of Health)、Bethe sda、Md.から入手可能な公開された遺伝子配列に基づく。また、次をみよ：クックら、1994年、NatureGenet．7、162-168；トムリンソンら、1992年、J．Mol．B iol．227、776-798；マツダら、1993年、Nature Genet．3、88-94；スカブル＆ザッチュー、1993年、Biol．Chem．Hoppe-Seyler 374、1001-1022；コックスら、1994年、Eur.J.Immunol.24、827-836；ラベッチら、1981年、Cell 27、583-59 1；イチハラら、1988年、EMBO J．7、4141-4150；ヤマダら、1991年、J．Exp．M ed．173、395-407；サンツ、1991年、J．Immunol．147、1720-1729。
【０７８７】
【表２２】
2011236257.tif 000030
n.d.は、ヌクレオチド配列から決定することができなかった。
実施例42
トランスフェクトされた細胞系におけるヒトIgGκ抗CD4抗体の発現のためのミニ ジーンの構成
この実施例は、免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖または軽鎖）をエンコードする、完全に人工の遺伝子を作る方法を説明する。PC R増幅したV重鎖およびV軽鎖cDNA配列が完全な重鎖および軽鎖ミニジーンを再構成するために使用され得るように、プラスミドを構成した。
【０７８８】
κ軽鎖プラスミド、pCK7-96は、κ定常領域およびポリアデニル化部位[配列ID No.11]を含む。それは、イニシエーターメチオニンの上流のHindIII部位を含む５'プライマーで増幅されたκ配列が、HindIIIおよびBbsIで消化されることができ、かつHindIIIおよびBbsIで消化されたpCK7-96へクローン化されて、ポリアデニル化部位と共に配列をコードする完全な軽鎖を再構成するように行われる。このカセットは、HindIII／NotIフラグメントとして分離され、転写プロモータ配列にライゲートされて、細胞へのトランスフェクションのための機能的ミニジーンを作ることができる。
【０７８９】
γ１重鎖プラスミド、pCG7−96は、ヒトガンマ１定常領域およびポリアデニル化部位[配列ID No.12]を含む。それは、イニシエーターメチオニンの上流のHind III部位を含む５'プライマーで増幅されたγ配列が、HindIIIおよびAgeIで消化されることができ、かつHindIIIおよびAgeIで消化されたpCG7-96へクローン化されて、ポリアデニル化部位と共に配列をコードする完全なγ１重鎖を再構成するように行われる。このカセットは、HindIII／SalIフラグメントとして分離され、転写プロモータ配列にライゲートされて、細胞へのトランスフェクションのための機能的ミニジーンを作ることができる。
【０７９０】
以下の実施例は、ハイブリドーマからのヌクレオチド配列データがどのようにして、機能的Ｉｇ重鎖および軽鎖ミニジーンを再構成するために使用され得るかを説明する。ハイブリドーマ6G5および10C5からの重鎖および軽鎖転写物のヌクレオチド配列が、合成オリゴヌクレオチドの重複する組をデザインして、自然配列と一致するアミノ酸コードキャパシティーを有する合成V配列を作るために使用された。合成重鎖およびκ軽鎖配列（示されたHC6G5[配列I.D．No.61]およびL C6G5[配列I.D．No.62]は、３つの方法において自然配列と異なっていた：反復したヌクレオチド塩基の糸が中断されてオリゴヌクレオチド合成およびPRC増幅を促進する；最適翻訳開始部位がコザクの規則（Kozak、 1991年、J.Biol.Chem.266、19867−19870）に従って挿入された；およびHindIII 部位が翻訳開始部位の上流で操作された)。
Ａ.合成κ軽鎖
軽鎖PCR反応１
以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-548[配列ID No.13]、o-549[配列ID No.14]、o-550[配列ID No.15]、o-551[配列IDNo.16]、o-552[配列ID No.17]、o- 563[配列ID No.18]、o-564[配列ID No.19]、o-565[配列ID No.20]、o-566[配列I D No.21]、o-567[配列ID No.22]、以下の２つのプライマーで増幅した：o-527[ 配列ID No.23]およびo-562[配列ID No.24]。
軽鎖PCR反応２
以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-553[配列ID No.25]、o-554[配列ID No.26]、o-555[配列ID No.27]、o-556[配列IDNo.28]、o-557[配列ID No.29]、o- 558[配列ID No.20]、o-559[配列ID No.31]、o-560[配列ID No.32]、o-561[配列I D No.33]、o-562[配列ID No.24]、そして以下の２つのプライマーで増幅した：o -552[配列ID No.17]およびo-493[配列ID No.34]。
軽鎖PCR反応３
次に軽鎖PCR反応１および２の産物をまとめ、かつ次の２つのプライマーで増幅した：o-493[配列ID No.34］およびo-527[配列IDNo.23]。
【０７９１】
次に軽鎖PCR反応３の産物をHindIIIおよびBbsIで消化し、HindIII／BbsI消化p CK7−96[配列ID No.11]にクローン化して、pLC6G5[配列ID No.35]を生成した。
【０７９２】
Ｂ.合成γ重鎖
重鎖PCR反応１
以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-528[配列ID No.36]、 o-529[配列ID No.37]、o-530[配列ID No.38]、o-531[配例IDNo.39]、o-532[配列 ID No.40]、o-543[配列ID No.41]、o-544[配列ID No.42]、o-545[配列ID No.43] 、o-546[配列ID No.44]、o-547[配列ID No.45]、そして以下の２つのプライマーで増幅した：o-496[配列ID No.46]およびo-542[配列ID No.47]。
重鎖PCR反応２
以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-533[配列ID NO.48]、o-534[配列ID No.49]、o-535[配列ID No.50]、o-536[配列IDNo.51]、o-537[配列ID No.52]、o- 538[配列ID No.56]、o-539[配列ID No.53]、o-540[配列ID No.54]、o-541[配列I D No.55]、o-542[配列ID No.47]、ならびに、pCG7−96[配列ID No.12]の分離した439 bp BbsIフラグメント、そして以下の２つのプライマーで増幅した：o-490 [配列ID No.57]およびo-520[配列ID No.58]。
重鎖PCR反応３
次に重鎖反応１および２の産物をまとめ、かつ次の２つのプライマーで増幅した：o-520[配列ID No.58]およびo-521[配列ID No.59]。
【０７９３】
次に重鎖反応３の産物をHindIIIおよびAgeIで消化し、HindIII／AgeI消化pCG7 −96[配列ID No.12]にクローン化して、pHC6G5[配列ID No.60]を生成した。
【０７９４】
【表２３】
2011236257.tif 000031
【表２４】
2011236257.tif 000032
【表２５】
2011236257.tif 000033
【表２６】
2011236257.tif 000034
【表２７】
2011236257.tif 000035
【表２８】
2011236257.tif 000036
【表２９】
2011236257.tif 000037
【表３０】
2011236257.tif 000038
【表３１】
2011236257.tif 000039
【表３２】
2011236257.tif 000040
【表３３】
2011236257.tif 000041
【表３４】
2011236257.tif 000042
【表３５】
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【表３６】
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実施例43
ヒト抗CD4モノクローナル抗体の非ヒト霊長類リンパ球への結合
動物モデルにおいて、ヒト抗CD4モノクローナル抗体の前臨床的毒物学および薬物動力学的研究を行うことができるのは望ましい。いくつかの目的で、動物が、モノクローナル抗体でそれが認識されるように、ヒトCD4と交差反応性のエピトープを含むCD4を発現する非ヒト霊長類であることが更に望ましい。３匹の異なる非ヒト霊長類種、チンパンジー、アカゲザル（リーサスモンキー）(rhesus monkey)およびカニクイザル（シノモルガスモンキー）(cynomolgus monkey)を、ハイブリドーマ1E11、1G2、6G5、10C5および4D1からの５つの異なるヒト抗CD4モノクローナル抗体と交差反応性CD4エピトープについて試験した。チンパンジー、アカゲザルおよびカニクイザルの全血から末梢血リンパ球を分離した。分離した細胞を、これら５つのハイブリドーマのそれぞれからのヒト抗体（FITC-抗ヒトIgGで検出した）およびPE-抗CD8またはPE-抗CD4で二重染色した。染色した細胞を次に、フローサイトメトリーで分析して、ヒトモノクローナル抗体のそれぞれが、これら３種の非ヒト霊長類のそれぞれからのリンパ球の表面の内因性CD4 に結合したかどうか決定した。５つの抗体のうちの４つ、1E11、6G5、10C5および4D1が、チンパンジーのCD4細胞に結合することがわかった。さらに、５つの抗体のうちの４つ、1G2、6G5、10C5および4D1が、アカゲザルおよびカニクイザルの両方のCD4細胞に結合することがわかった。かくして、５つの抗体のうちの３つ、6G5、10C5および4D1が、試験した３種の非ヒト霊長類のそれぞれにおけるCD 4細胞に結合する。
実施例44
モノクローナル抗体(mAb)が患者において非欠乏または免疫抑制的であるかどうかを確実に予言することができる、インビボでのアッセイは知られていない。しかしながら、ヒトおよび非ヒト霊長類例えばチンパンジーおよびカニクイザルにおいて、３つの異なるmAbの、不足する（または不足しない）能力の間に相関関係が観察された（例えばM．ジョンカーら、Clin.Exp.Immunol.,93：301-307(1 993年）；およびJ.A.パウエルソンら、Transplantation、57:788-793(1994年)) 。したがって、非ヒト霊長類においてヒトmAbを用いて研究を行った。
【０７９５】
この研究にチンパンジーを使用した。というのは、抗CD4 mAbのうちの１つ、1 E11はチンパンジーにおいてのみCD4を認識し、アカゲザルまたはカニクイザルでは認識しないからである。第２のmAb、 6G5は、チンパンジー、アカゲザルおよびカニクイザルにおいてCD4を認識する。第３のmAb、1G2は、チンパンジーにおいてCD4を認識しないが、アカゲザルおよびカニクイザルにおいてCD4を認識する。そのmAbはすでに、カニクイザルにおいてインビボで非欠乏であることが示された。
【０７９６】
末梢血中でCD4+Ｔ細胞数におけるヒトmAbの効果を調べるだけでなく、イン ビボでのＴ細胞機能におけるmAb投与の効果をまた評価した。これを行うために最も受け入れられるやり方は、抗原例えばツベルクリンまたは破傷風トキソイドに前感作された、かつ皮膚に過敏性反応を固定する動物を使用することである。
【０７９７】
３匹のオスのチンパンジーをこの研究に登録した。-７、-３および１日に、ベースライン全血試料を得た。１日に血液を採取した後、１匹のチンパンジー毎に、2mg／kgにて、２つのヒトmAbのうちの１つ（1E11または6G5）を静脈内注入した。第３のチンパンジーは、等体積／kgの緩衝液のみを受け入れた。血液を、注入後30分、２時間、８時間、24時間および48時間に採取した。２日に、皮膚反応性試験を行った。
【０７９８】
以下の表25に示された結果は、1E11が末梢血リンパ球の一時的欠乏を引起し、ほとんどのCD4+Ｔ細胞が欠乏されていることを明らかに証明している。6G5はリンパ球またはCD4+Ｔ細胞の欠乏を引起さなかったが、mAbの両方が、対照チンパンジーに比べて、破傷風トキソイドへの過敏性応答を阻害することができた。かくして、ヒトmAbは両方、インビボで免疫抑制的であるのが明らかであり、この免疫抑制は、必ずしもＴ細胞欠乏を必要としない。
【０７９９】
【表３７】
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前述した本発明の好ましい実施態様は、説明し、記載する目的のために示されたものである。それらは、網羅されていること、または本発明を開示された通りの形に限定することを意図せず、上記の教示に照らして、多くの修正および変形が可能である。いくらかの変化および変形が請求の範囲内で行われ得ることが明らかである。
【０８００】
すべての公開物および特許出願は、各公開物または特許出願が詳細にかつ個々に示されたのと同じ程度に、参照することにより本明細書に組込まれている。一般に挙げられた出願USSN 08/544,404（1995 年10月10日出願)、USSN 08/352,322（1994年12月７日出願)、USSN 08/209,741(1 994年３月９日出願)、USSN 08/165,699(1993年12月10日出願）およびUSSN 08/16 1,739（1993年12月３日出願）（これは、08/155,301（1993年11月18日出願）の部分継続出願である)、国際特許出願WO92/03918、USSN 07/810,279(1991年12月1 7日出願)、USSN 07/853,408(1992年３月18日出願)、USSN 07/904,068(1992年６月23日出願)、USSN 07/990,860(1992年12月16日出願)、国際特許出願WO93/12227 およびUSSN08/053131（1993年４月26日出願）は、参照することにより本明細書に組込まれている。
【０８０１】
ここで、ヒト免疫グロブリンを発現するＢ細胞が発達を受け、マウス免疫系の情況の下で抗原に応答するという結論を下したい。抗原反応性は免疫グロブリン重鎖アイソタイプスイッチ及び可変領域体細胞突然変異を導く。我々は又、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を得るのに従来のハイブリドーマ技術を用いることができるということも実葵証してきた。従ってこれらのトランスジェニック抗体は、ヒト標的抗原に対するヒト抗体の供給源である。
【０８０２】
本発明の.トランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及ひＣから選択されたひト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。
【０８０３】
【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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上記表Ｂは不発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの分化のクラスター（cluste「of differentiation)（ＣＤ）の例のリストである。
【０８０４】
上記表Ｃは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの非−ＣＤ抗原の例のリストである。
【０８０５】
本発明のトランスジェニックマウスを表Ｄから選択されたヒト−病原体又は抗原により免疫する。トランスジェニックマウスば、ヒト病厘i本と結台する抗i本を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト病原体に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。
【０８０６】
【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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上記表Ｄは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生せしめるための、ヒト病原体及びその抗原の例のリストである。
【０８０７】
【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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上記の表Ｅは、不発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクロ−ナル抗体を生産するハイブリドーマを発生させるためのヒト病原体及びそれらの抗原の例のリストである。
【０８０８】
本発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記截してきたが、請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行えることは明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図８０】
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【図８１−１】
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【図８１−２】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３Ａ】
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【図９３Ｂ】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年10月3日(2011.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）を有する、ヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、ヒト重鎖ＨＣ２トランスジーン及びヒト軽鎖ＫＣｏ５トランスジーンを発現するトランスジェニックマウスから由来する重鎖及び軽鎖を含む、単離された免疫グロブリン。
【請求項２】
少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）を有する、ヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、ヒト重鎖ＨＣ２トランスジーンを発現するトランスジェニックマウスから由来する重鎖と、ヒト軽鎖ＫＣｏ５トランスジーンを発現するトランスジェニックマウスから由来する軽鎖とを含む、単離された免疫グロブリン。
【請求項３】
少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）を有する、ヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域ＣＤＲ３配列がアミノ酸配列ＶＩＮＷＦＤＰ（配列番号６５）を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列がアミノ酸配列ＱＱＡＮＳＦＰＹＴ（配列番号６９）を含む、単離された免疫グロブリン。
【請求項４】
少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）を有する、ヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むヒト軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号６１のヌクレオチド３６１−３８１または配列番号７のヌクレオチド３４９−３６９によってコードされるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号６２のヌクレオチド３３７−３６３または配列番号８のヌクレオチド３３１−３５７によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離された免疫グロブリン。
【請求項５】
重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号６１のヌクレオチド２１７−２６４または配列番号７のヌクレオチド２０５−２２５によってコードされるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号６２のヌクレオチド２２０−２４０または配列番号８のヌクレオチド２１４−２３４によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の免疫グロブリン。
【請求項６】
重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号６１のヌクレオチド１６０−１７４または配列番号７のヌクレオチド１４８−１６２によってコードされるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号６２のヌクレオチド１４２−１７４または配列番号８のヌクレオチド１３６−１６８によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の免疫グロブリン。
【請求項７】
少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）を有する、ヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、配列番号７または６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされた重鎖可変領域と、配列番号８または６２に示されたヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖可変領域とを含む、単離された免疫グロブリン。
【請求項８】
少なくとも１．１×１０９Ｍ−１の結合力定数（Ｋａ）を有する、ヒトＣＤ４に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、配列番号７または６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８または６２に示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された免疫グロブリン。
【請求項９】
重鎖がＨＣ２トランスジーンから由来する配列を含み、軽鎖がＫＣｏ５トランスジーンから由来する配列を含むヒト配列抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
【請求項１０】
結合力定数（Ｋａ）が１．１×１０９Ｍ−１から３．３×１０９Ｍ−１の間である、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンと、製薬学的に許容可能な担体とを含む、薬剤組成物。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンと、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗酸化剤、及び抗癌剤からなる群より選択される治療剤とを含む、薬剤組成物。
【請求項１３】
治療剤に連結した請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンを含む、薬剤組成物。
【請求項１４】
前記治療剤が放射能標識または毒素である、請求項１３に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少のための医薬の製造のための、請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンの使用。
【請求項１６】
自己免疫疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンの使用。
【請求項１７】
癌の治療のための医薬の製造のための、請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンの使用。
【請求項１８】
Ｔ細胞のリンパ腫の治療のための医薬の製造のための、請求項１、２、３、４、７または８に記載の免疫グロブリンの使用。
【請求項１９】
菌状息肉腫の治療のための医薬の製造のための、請求項１８に記載の免疫グロブリンの使用。