(57)【要約】【課題】本発明は、タンパク質を結晶化する際に用いる結晶化試薬の選択にかかる時間、労力等を軽減させることを主な目的とする。さらに、タンパク質の立体構造情報を用いて医薬品等の開発をするに当り、貴重な生体高分子や医薬品候補化合物を有効に活用することも目的とする。【解決手段】本願発明者は、上記の課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、各タンパク質が機能を発揮する環境に近似するイオン組成を有する緩衝液中にて結晶化することに成功した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内タンパク質を、
（Ａ）１３．８６〜１４．１４ｍＭの酢酸ナトリウム、
（Ｂ）３．９６〜４．０４ｍＭの塩化カリウム、
（Ｃ）５５．９４〜５７．０７ｍＭのリン酸水素二カリウム、及び
（Ｄ）１２．８７〜１３．１３ｍＭの酢酸マグネシウム
を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中にて結晶化する方法。
【請求項２】
前記ＨＥＰＥＳ緩衝液が４９．５〜５０．５ｍＭの濃度であり、ｐＨが６．７〜６．９である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞内タンパク質が、グルコースイソメラーゼである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞外タンパク質を、
（Ａ）１１５．８３〜１１８．１７ｍＭの塩化ナトリウム、
（Ｂ）０．９９〜１．０１ｍＭのリン酸水素二カリウム、
（Ｃ）１．４９〜１．５２ｍＭの酢酸マグネシウム、
（Ｄ）２．４８〜２．５３ｍＭの酢酸カルシウム、及び
（Ｅ）１．９８〜２．０２ｍＭの酢酸カリウム
を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中にて結晶化する方法。
【請求項５】
前記ＨＥＰＥＳ緩衝液が、４９．５〜５０．５ｍＭの濃度でありｐＨが７．３〜７．４である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外タンパク質が、アミラーゼ又はリゾチームである請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を結晶化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体機能の大部分を生体高分子であるタンパク質が担っているので、その立体構造情報がそれらの機能を理解するには不可欠となっている。タンパク質の立体構造を解析するには様々な手法が存在するが、精度や応用範囲の広さから結晶構造解析がもっとも有効であると認められ、タンパク質の立体構造を網羅的に解析する研究計画が実行された。
【０００３】
例えば、アミラーゼを結晶化する際に用いる結晶化溶液として、５ｍＭ−ＣａＣｌ２、０．１Ｍ−ＨＥＰＥＳ、１８％ＰＥＧ５０００が用いられ、水素イオン濃度ｐＨ７．５で結晶化された。空間群はＰ２１２１２１、分解能１．９８Åで結晶構造解析されている。（非特許文献１）グルコースイソメラーゼを結晶化する際に用いる結晶化溶液としてＭｇＣｌ２，Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ，ＭＰＤが用いられ、水素イオン濃度ｐＨ７．５、温度２９５Ｋで結晶化された。空間群はＩ２２２、分解能０．９９Åで結晶構造解析されている。（非特許文献２）リゾチームを結晶化する際に用いる結晶化溶液として、ｐＨ４．５で加える陰イオンはＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（ＮＯ３）−、ＳＣＮ−などが用いられ、空間群がＰ４３２１２、Ｐ２１、Ｐ１などの結晶が得られた。分解能０．９Å以下の結晶構造解析が成されている。（非特許文献３）この解析法を用いるにはタンパク質の結晶化が必須である。しかし、それらの結晶化の理論的解明はされておらず、多くの結晶化試薬の効果をスクリーニングにより確かめる方法が広く採用され、その為の効率的スクリーニングや自動結晶化方法が特許申請されている（特許文献１、２）。さらに、スクリーニングを短時間に行う結晶化ロボット（キット）が開発されている（特許文献３）。
【０００４】
溶液からの結晶化方法は、過飽和の溶液から結晶を析出させるバッチ法や溶液の物理学的状態変化（沈澱剤添加による溶解度の変化）などにより結晶を析出させる方法（蒸気拡散法、液−液拡散法など）が広く試みられている。これらの方法を用いて試行錯誤により多くの結晶化条件をスクリーニングするには大量の生体高分子試料や試薬の浪費を少なくする必要があり、そのために極小量の試料を使って結晶化を確認する方法が開発された。
【０００５】
さらに、Ｘ線結晶構造解析に用いる良質の結晶を得るために結晶化の際に電圧を印加しながらタンパク質を結晶化させる方法が開発されている（特許文献４）。
【０００６】
また、結晶化条件を検討する上で、結晶化に用いる緩衝液の塩の濃度を、水素イオン濃度における生体高分子上の解離基の電離度合いの計算を基に調整することによりタンパク質の結晶化条件を限定することが有用である知見が示されている（非特許文献４）。
【０００７】
しかしながら、依然としてタンパク質の結晶化条件を検討するには、個々のタンパク質に対して様々な条件の検討が必要であり、精製タンパク質試料や試薬に係る費用と費やす時間の問題は解決されておらず、検討すべき条件の多さを軽減する画期的な方法は見出せていない。
【０００８】
さらに、タンパク質の立体構造情報を用いて医薬品等の開発をするに当り、タンパク質の結晶構造解析から得られる情報が、生体内で存在する実際の立体構造情報と異なるために、貴重な生体高分子や医薬品候補化合物を有効に活用できない問題点を有しており、このような問題は、タンパク質の結晶を得ることにのみ注力した結果、生体内にてタンパク質が機能する環境とは、かけ離れた条件下でタンパク質が結晶化されることによって生じる問題と考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１９４６４７号公報
【特許文献２】特許２７２１３２３号公報
【特許文献３】特開２００７−１６１５９３号公報
【特許文献４】特開２００８−１３７９６１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】A. M. Brzozowski and G. J. Davies, “Structure of the Aspergillus Oryzae alpha-amylase complexed with the inhibitor at 2.0 A resolution”, Biochemistry, (1997) 36, 10837
【非特許文献２】Timothy D. Fenn, Dagmar Ringe, and Gregory A. Petsko, “Xylose Isomerase in Substrate and Inhibitor Michaelis States: Atomic Resolution Studies of a Metal-Mediated Hydride Shift”, Biochemistry, (2004), 43 (21), 6464-6474
【非特許文献３】M.C. Vaney, I. Broutin, P. Retailleau, A. Douangamath, S. Lafont, C. Hamiaux, T. Prange, A. Ducruix and M. Ries-Kautt, “Structural effect of monovalent anions on polymorphic lysozyme crystals”, Acta Cryst. Section D, (2001), D57, 929-940
【非特許文献４】第７回日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集２P-113
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、タンパク質を結晶化する際に標的とするタンパク質が機能する環境のイオン濃度に実質的に同一の条件で結晶化させることを主な目的とする。さらに、タンパク質の立体構造情報を用いて医薬品等の開発をするに当り、貴重な生体高分子や医薬品候補化合物を有効に活用し、用いる結晶化試薬の選択に時間や労力を軽減させることをすることも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者は、上記の課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、各タンパク質が機能を発揮する環境と実質的に同一のイオン組成を有する緩衝液中にて結晶化することに成功した。得られたタンパク質の結晶から解析される立体構造は、従前の方法によって作製されるタンパク質と結合するイオンや包含する分子との相互作用が異なる構造を有することも判明した。従って、本発明は下記の態様の発明を包含するものである。
【００１３】
項１  細胞内タンパク質を、
（Ａ）１３．８６〜１４．１４ｍＭの酢酸ナトリウム、
（Ｂ）３．９６〜４．０４ｍＭの塩化カリウム、
（Ｃ）５５．９４〜５７．０７ｍＭのリン酸水素二カリウム、及び
（Ｄ）１２．８７〜１３．１３ｍＭの酢酸マグネシウム
を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中にて結晶化する方法。
【００１４】
項２  前記ＨＥＰＥＳ緩衝液中に、さらに３９．４〜１０５０ｍＭの酢酸カリウムを含む上記項１に記載の方法。
【００１５】
項３  前記ＨＥＰＥＳ緩衝液が４９．５〜５０．５ｍＭの濃度であり、ｐＨが６．７〜６．９である上記項１又は２に記載の方法。
【００１６】
項４  前記細胞内タンパク質が、異性化酵素である上記項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
項５  前記細胞内タンパク質が、グルコースイソメラーゼである上記項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
項６  細胞外タンパク質を、
（Ａ）１１５．８３〜１１８．１７ｍＭの塩化ナトリウム、
（Ｂ）０．９９〜１．０１ｍＭのリン酸水素二カリウム、
（Ｃ）１．４９〜１．５２ｍＭの酢酸マグネシウム、
（Ｄ）２．４８〜２．５３ｍＭの酢酸カルシウム、及び
（Ｅ）１．９８〜２．０２ｍＭの酢酸カリウム
を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中にて結晶化する方法。
【００１９】
項７  前記ＨＥＰＥＳ緩衝液中に、さらに２５．７４〜１０５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む上記項６に記載の方法。
【００２０】
項８  前記ＨＥＰＥＳ緩衝液が、４９．５〜５０．５ｍＭの濃度でありｐＨが７．３〜７．４である上記項６又は７に記載の方法。
【００２１】
項９  前記細胞外タンパク質が、加水分解酵素である上記項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【００２２】
項１０  前記細胞外タンパク質が、アミラーゼ又はリゾチームである上記項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の方法によると、タンパク質を結晶化するにあたり用いる結晶化溶液を、膨大なバリエーションからスクリーニングして決定する労力を軽減することができる。また本発明の方法によって結晶化したタンパク質から得られる該タンパク質の立体構造情報は、生体中において各タンパク質が機能を発揮する環境と同じイオン組成の結晶化溶液を用いて結晶化することから、タンパク質そのものの機能を反映させた、より正しい立体情報を得ることができる。従って、タンパク質の機能をターゲットとした薬剤のスクリーニングを効率的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】細菌由来アミラーゼ結晶の写真。右下のスケールは、１目盛０．０２５ｍｍを表す。
【図２】細菌由来グルコースイソメラーゼ結晶の写真。右下のスケールは、１目盛０．０２５ｍｍを表す。
【図３】ニワトリ卵白リゾチーム結晶の写真。右下のスケールは、１目盛０．１ｍｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
〔本発明のタンパク質〕
本発明の方法は、結晶化を所望するタンパク質が機能を発揮する環境と実質的に同一のｐＨを有するＨＥＰＥＳ緩衝液中であれば結晶化することができ、当該タンパク質は細胞内にて機能を発揮する細胞内タンパク質であっても、細胞外にて機能を発揮する細胞外タンパク質であってもよい。
【００２６】
上述した、『タンパク質が機能を発揮する』とは、該タンパク質が単に存在しているのみではなく、生体内の他の分子に変化をもたらすことを意味する。例えば、タンパク質が酵素である場合は、酵素が特異的に結合する他の生体分子異なる形態に変化させる触媒作用が機能を発揮することに当る。
【００２７】
他の例として、タンパク質が細胞増殖因子である場合は、細胞表面上に存在する特異的なレセプター分子に結合し、細胞内の細胞分裂に関与する生体分子に対して刺激を与えることが、機能を発揮することに当る。さらに、タンパク質が転写因子である場合は、細胞の核内に存在するＤＮＡ分子の特定の配列に対して結合し、ＤＮＡの転写開始を促すことが、機能を発揮することに当る。
【００２８】
上述の細胞内タンパク質は、特には限定されないが、例えば酵素を挙げることができ、中でも異性化酵素が好ましい。上述の異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼ、ホスホムターゼ等を挙げることができ、グルコースイソメラーゼが最もこのましい。
【００２９】
上述のグルコースイソメラーゼとは、酵素番号において、ＥＣ５．３．１．５に属するものであり、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、ホスホヘキソムターゼ、オキソイソメラーゼなどの別名も有する酵素である。上述のグルコースイソメラーゼとは、細胞内における糖新生系、解糖系、ペントースリン酸回路への代謝系にて機能し、具体的にはグルコースをフルクトースに変換させる可逆反応を触媒する。上述のグルコースイソメラーゼの由来は特に限定されることは無いが、具体的にはヒト、植物、微生物由来のものをあげることができる。最も好ましいものは、Streptmyces rubiginousus由来のグルコースイソメラーゼである。
【００３０】
上述の細胞外タンパク質は、特には限定されないが、例えば、酵素を挙げることができ、中でも加水分解酵素であることが好ましい。上述の加水分解酵素としては、アミラーゼ、リゾチーム、トリプシン等を挙げることができ、最も好ましくはアミラーゼ、又はリゾチームである。
【００３１】
上述のアミラーゼとは、多糖類のα１→４グルコシド結合またはβ１→４グルコシド結合を加水分解する機能を有する酵素であり、結合部位の切断様式としてエンド型であっても、エキソ形であってもよい。具体的には、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、エキソマルトテトラオヒドラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）、エキソイソマルトトリオヒドラーゼ（ＥＣ３．２．１．９５）、エキソイソマルトヘキサオヒドラーゼ（ＥＣ３．２．１．９８）などがあげられる。最も好ましいものは、α-アミラーゼである。上述のアミラーゼの由来は特に限定されることは無いが、具体的にはヒト、植物、微生物由来のものをあげることができる。最も好ましいものは、Aspergillus oryzae由来のアミラーゼである。
【００３２】
上述のリゾチームとは、国際生化学連合によって規定される酵素番号（Enzyme Commission numbers）において、ＥＣ３．２．１．１７に属するものであり、ムラミダーゼ、ムコペプチドグリコヒドロダーゼなどという別名も有する酵素である。上述のリゾチームは、細胞外において真性細菌などの細胞壁に含まれる多糖類などを基質とし、Ｎ-アセチルムラミン酸とＮ-アセチルグルコサミンの間のβ１→４グリコシド結合を加水分解する機能を有する酵素である。また、本発明のリゾチームの由来は特に限定されることは無いが、具体的には哺乳類由来、鳥類由来、バクテリオファージ由来のリゾチームをあげることができる。最も好ましいものはニワトリ由来のリゾチームである。
【００３３】
本発明の方法にて用いるタンパク質は、野生型のものでも変異型のものでもよい。また、生体から抽出した後に精製されたものであっても、大腸菌や酵母などの菌体、昆虫細胞、鳥類の卵、哺乳類細胞など宿主細胞として用いた発現系によって作製される組み換えタンパク質、またはイネやコムギなどの無細胞発現系によって作製される組み換えタンパク質であってもよい。
【００３４】
本発明の方法にて用いる細胞内又は細胞外タンパク質は、タンパク質が生体内において機能を発揮する際に、他の物質と複合体を形成しているもの、または相互作用しているタンパク質でもよい。例えば、タンパク質が酵素である場合は、その酵素の基質となる物質と結合した複合体の状態のタンパク質を結晶化することが可能となる。また、二種類以上のタンパク質によって多量体を形成している複合体の状態のタンパク質を結晶化することが可能であり、各々のタンパク質は同一のものであっても異なるものであってもよい。
【００３５】
また、本発明の方法によって結晶化することができる細胞内又は細胞外タンパク質は、核酸と複合体を形成しているものでもよい。このようなタンパク質の例として、転写因子、転写共益因子、ヒストン、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リコンビナーゼ、ヒストンアセチラーゼ、エキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼなどの制限酵素、リガーゼ、アルカリフォスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ、テロメラーゼなど、があげられる。
【００３６】
上述の核酸とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルを塩基として構成される高分子化合物であり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などがあげられる。ここで、ＤＮＡやＲＮＡの塩基長は特に限定されることなく、利用することが可能である。また、上記核酸は二本鎖のものであっても一本鎖のものであってもよい。
【００３７】
本発明の方法によって結晶化することができるタンパク質は、ＤＮＡ配列を基に生体内にて生合成されるアミノ酸のみを有するタンパク質ではなく、翻訳後修飾を受けているものも含まれる。翻訳後修飾とは、特定のアミノ酸残基に対して、アシル化、アルキル化、グルコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ化、硫酸化、ミリストイル化、リン酸化、酸化などの化学基による修飾があげられる。その他、タンパク質が有するアミノ酸残基同士での修飾であってもよく、システイン残基の側鎖が有するチオール基が会合するＳ−Ｓ結合による修飾や、特定の化学結合が生じることによるヘム化修飾、チロシン残基やトリプトファン残基の側鎖が反応することによって分子内で架橋を形成する修飾などがあげられる。
【００３８】
本発明の方法によって結晶化する細胞内又は細胞外タンパク質は、各種のクロマトグラフィー等を用いた公知の方法によって、一定の精製度を有していればよく、通常は８０〜９５％程度の精製度であればよい。精製度を判定する方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理のあとに、ＣＢＢ染色、銀染色、またはＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビーなどの蛍光色素を用いた公知の方法によってタンパク質を染色し、さらに画像処理技術を用いて見積もることができる。
【００３９】
上述の精製したタンパク質は、通常は、５〜１５０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度で、緩衝液に含有させることができる。上記の濃度よりも薄いタンパク質を入手した場合は、公知の方法を用いることによって濃縮することができ、濃いタンパク質であれば、下記に示す溶媒にて希釈すればよい。
【００４０】
上述のタンパク質の溶媒としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液を挙げることができ、通常は６．８〜７．５程度の範囲のｐＨで、２０〜１００ｍＭ程度の濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液とすることができる。より好ましい濃度は、４９．５〜５０．５ｍＭ程度である。このようなタンパク質溶液は、下記に示す細胞内タンパク質又は細胞外タンパク質のそれぞれの方法を用いることによって結晶化することができる。
【００４１】
〔細胞内タンパク質の結晶化〕
本発明の細胞内タンパク質を結晶化する方法は、上述した細胞内タンパク質を、
（Ａ）１３．８６〜１４．１４ｍＭの酢酸ナトリウム（好ましくは１４ｍＭの酢酸ナトリウム）、
（Ｂ）３．９６〜４．０４ｍＭの塩化カリウム（好ましくは４ｍＭの塩化カリウム）、
（Ｃ）５５．９４〜５７．０７ｍＭのリン酸水素二カリウム（好ましくは５６．５ｍＭのリン酸水素二カリウム）、及び
（Ｄ）１２．８７〜１３．１３ｍＭの酢酸マグネシウム（好ましくは１３ｍＭの酢酸マグネシウム）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中にて結晶化する方法である。
【００４２】
上記のＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は、通常は４９．５〜５０．５ｍＭ程度とすることができ、上記のＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨは、通常は６．７５〜６．９５程度とすることができる。上述のｐＨに調整するために、通常は、酢酸を用いて調整することができる。
【００４３】
上述のＨＥＰＥＳ緩衝液には、結晶が形成しにくいタンパク質に対しては、さらに酢酸カリウムを含有させて用いることも可能である。ここで、酢酸カリウムの含有量は、通常は３９．４〜１０５０ｍＭ程度の終濃度とすることができ、より好ましくは３９．４〜５０５．０ｍＭ程度である。
【００４４】
上記のＨＥＰＥＳ緩衝液には沈殿剤が含まれていても良く、例えば、ジメチルペンタジオール、平均分子量が通常２００〜２０，０００程度のポリエチレングリコール等を挙げることができる。中でも、ポリエチレングリコールを用いることが好ましく、特に平均分子量が４０００のポリエチレングリコールが好ましい。沈殿剤の含有量は、通常１０〜３０重量％程度とすることができる。また、上記のＨＥＰＥＳ緩衝液には、結晶の核を結成させるために、公知の成分が含まれていてもよい。
【００４５】
上述した終濃度の（Ａ）〜（Ｄ）等の成分を含む緩衝液中にて、所望の細胞内タンパク質を結晶化することができるので、上記のＨＥＰＥＳ緩衝液に含まれる各種成分の濃度をそれぞれ通常０．５〜３倍量程度、好ましくは１〜２倍程度とした結晶化ＨＥＰＥＳ緩衝液を予め作製し、上述の結晶化を所望するタンパク質を含む溶液と等量ずつ混合した後に、公知の方法を用いて結晶化に供することが可能である。（Ａ）〜（Ｄ）等の成分の終濃度が上述の範囲よりも濃くなった場合は、タンパク質溶液の量を増やして適宜調節することができる。
【００４６】
逆に低くなった場合は、混合するタンパク質溶液の量を減らして適宜調整することもできるが、タンパク質溶液に含まれるタンパク質に影響を及ぼす程度に濃い濃度の溶液となるために、その混合量が制限されたとしても、混合後のタンパク質を含む結晶化ＨＥＰＥＳ緩衝液中の水分が蒸発し、（Ａ）〜（Ｄ）等の各種成分の濃度が上述の範囲になることでタンパク質が結晶化するので問題は無い。
【００４７】
上述の公知の結晶化方法として、具体的にはハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法等に代表される蒸気拡散法、微量透析法、ゲルを用いた拡散法等を用いて結晶化することができ、特に限定はされないが、蒸気圧拡散法を用いることがこのましい。蒸気圧拡散法を用いて結晶化する場合は、リザーバーとしては（Ａ）〜（Ｄ）等の各成分を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液を用いることが可能である。
【００４８】
〔細胞外で機能を発揮するタンパク質の結晶化〕
本発明の細胞外で機能を発揮するタンパク質を結晶化する方法は、
（Ａ）１１５．８３〜１１８．１７ｍＭの塩化ナトリウム（好ましくは、１１７ｍＭの塩化ナトリウム）、
（Ｂ）０．９９〜１．０１ｍＭのリン酸水素二カリウム（好ましくは、１ｍＭのリン酸水素二カリウム）、
（Ｃ）１．４９〜１．５２ｍＭの酢酸マグネシウム（好ましくは、１．５ｍＭの酢酸マグネシウム）、
（Ｄ）２．４８〜２．５３ｍＭの酢酸カルシウム（好ましくは、２．５ｍＭの酢酸カルシウム）、及び
（Ｅ）１．９８〜２．０２ｍＭの酢酸カリウム（好ましくは、２ｍＭの酢酸カリウム）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中にて結晶化する方法である。
【００４９】
上記のＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は、通常は４９．５〜５０．５ｍＭ程度とすることができ、上記のＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨは、通常は７．３５〜７．４５程度とすることができる。上述のｐＨに調整するために、通常は、酢酸を用いて調整することができる。
【００５０】
上述のＨＥＰＥＳ緩衝液には、結晶が形成しにくいタンパク質に対しては、さらに酢酸ナトリウムを含有させて用いることも可能である。酢酸ナトリウムの含有量は、通常は２５．７４〜１０５０ｍＭ程度の終濃度とすることができ、より好ましくは２５．７４〜７５７．５ｍＭである。
【００５１】
上記の結晶化用ＨＥＰＥＳ緩衝液には、上述した細胞内で機能を発揮するタンパク質の結晶化と同様に、沈殿剤が含まれていても良い。また、上記の結晶化用ＨＥＰＥＳ緩衝液には、結晶の核を結成させるために、公知の成分が含まれていてもよい。
【００５２】
本発明において、細胞外で機能を発揮するタンパク質を結晶化するためには、上述の細胞内で機能を発揮するタンパク質を結晶化する方法と同様にすることができる。具体的には、上述のＨＥＰＥＳ緩衝液に含まれる各成分をそれぞれ通常０．５〜３倍量程度、好ましくは１〜２倍程度の濃度とした結晶化ＨＥＰＥＳ緩衝液を予め作製し、上述の結晶化を所望するタンパク質を含む所定量の溶液と混合した後に、公知の方法を用いて結晶化に供することで、タンパク質の結晶を得ることができる。
【実施例】
【００５３】
以下に本発明について詳細に説明する。但し本発明が以下の実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００５４】
本発明の実施例における細胞内で機能するタンパク質の結晶化溶液（以下、細胞内結晶化イオン溶液とする。）、細胞外で機能するタンパク質の結晶化溶液（以下、細胞外結晶化イオン溶液とする。）の組成について表１に示す。細胞内結晶化イオン溶液は５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ水溶液に対して、表１に記載の最終濃度になるようにそれぞれの化合物を添加し、所定のｐＨになるよう酢酸を用いて緩衝液を調整した。細胞外結晶化イオン溶液は５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ水溶液に対して、表１に記載の最終濃度になるようにそれぞれの化合物を添加し、所定のｐＨになるよう酢酸を用いて調整した。
【００５５】
【表１】
2011200185.tif 000002
【００５６】
実施例１
細胞外で機能を発揮する細菌由来アミラーゼ（ＡＭＹＬ）の結晶化
４７８アミノ酸からなるＡＭＹＬタンパク質（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）を新日本化学社より入手し、さらに陰イオン交換カラムクロマトグラフィを用いて精製した。精製ＡＭＹＬタンパク質は、約５２ｋＤａのタンパク質であり、その等電点は４．４８であった。得られた精製ＡＭＹＬタンパク質に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて２５ｍｇ／ｍＬ濃度に調節したＡＭＹＬタンパク質溶液を作製した。続いて、表１に記載された０．７ｍＬの細胞内結晶化イオン溶液に、終濃度が２０重量％となるようにポリエチレングリコール４０００を溶解し、終濃度がさらに７５０ｍＭの酢酸ナトリウムを混合させて細胞外タンパク質結晶化溶液とした。
【００５７】
ＡＭＹＬタンパク質溶液５μＬと細胞外タンパク質結晶化溶液５μＬを混合し、蒸気拡散結晶化容器内にて密閉して４℃で保った。なお蒸気拡散結晶化容器内には、混合溶液とは隔離してリザーバー溶液を準備した。リザーバー溶液は細胞内タンパク質結晶化溶液をそのまま用いた。密閉から７日後に偏光顕微鏡を用いて蒸気拡散結晶化溶液内のＡＭＹＬタンパク質の結晶を観察した。晶出したＡＭＹＬタンパク質結晶の顕微鏡写真を図１に示す。
【００５８】
実施例２
細胞内で機能を発揮する細菌由来グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）の結晶化
３８８アミノ酸からなるＧＩタンパク質（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｕｓｕｓ由来）をＨａｍｏｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社より入手し、さらに陰イオン交換カラムクロマトグラフィを用いて精製した。精製ＧＩタンパク質は、約４３ｋＤａのタンパク質であり、その等電点は４．９５であった。得られた精製ＧＩタンパク質に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて２５ｍｇ／ｍＬ濃度に調節したＧＩタンパク質溶液を作製した。続いて、表１に記載された０．７ｍＬの細胞内結晶化イオン溶液に、終濃度が２０重量％となるようにポリエチレングリコール４０００を溶解して細胞内タンパク質結晶化溶液とした。
【００５９】
ＧＩタンパク質溶液５μＬと細胞内タンパク質結晶化溶液５μＬを混合し、蒸気拡散結晶化容器内にて密閉して４℃で保った。なお蒸気拡散結晶化容器内には、混合溶液とは隔離してリザーバー溶液を準備した。リザーバー溶液は細胞内タンパク質結晶化溶液をそのまま用いた。密閉から７日後に偏光顕微鏡を用いて蒸気拡散結晶化溶液内のＧＩタンパク質の結晶を観察した。晶出したＧＩタンパク質結晶の顕微鏡写真を図２に示す。
【００６０】
実施例３
細胞外で機能を発揮するニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）の結晶化
１２９アミノ酸からなるＨＥＷＬタンパク質（ニワトリ卵白由来）を生化学工業社より入手し、さらに陽イオン交換カラムクロマトグラフィを用いて精製した。精製ＨＥＷＬタンパク質は、約１４ｋＤａのタンパク質であり、その等電点は９．３２であった。得られた精製ＨＥＷＬタンパク質に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて２５ｍｇ／ｍＬ濃度に調節したＨＥＷＬタンパク質溶液を作製した。続いて、表１に記載された０．７ｍＬの細胞外結晶化イオン溶液に、終濃度が２０重量％となるようにポリエチレングリコール４０００を溶解して終濃度がさらに５００ｍＭの酢酸ナトリウムを混合させ細胞外タンパク質結晶化溶液とした。
【００６１】
ＨＥＷＬタンパク質溶液５μＬと細胞外タンパク質結晶化溶液５μＬを混合し、蒸気拡散結晶化容器内にて密閉して２０℃で保った。なお蒸気拡散結晶化容器内には、混合溶液とは隔離してリザーバー溶液を準備した。リザーバー溶液は細胞内タンパク質結晶化溶液をそのまま用いた。密閉から７日後に偏光顕微鏡を用いて蒸気拡散結晶化溶液内のＨＥＷＬタンパク質の結晶を観察した。晶出したＨＥＷＬタンパク質結晶の顕微鏡写真を図３に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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