(57)【要約】      （修正有）【課題】土壌中の他の微生物との拮抗作用を考慮しつつも短時間で結果を得ることができる土壌の健全性の評価方法を提供する。【解決手段】（ｉ）評価対象の土壌の試料にペクチンを添加して培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定し；（ｉｉ）評価対象の土壌の試料にペクチンを添加せずに培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定し；（ｉｉｉ）（ｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性と（ｉｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性との差をとり、この差を評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性とし；及び（ｉｖ）評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性を、予め算出された健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性と比較し、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性より一定割合以上高い場合、評価対象の土壌は不健全であると判断。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌の健全性を評価する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（ｉ）評価対象の土壌の試料にペクチンを添加して培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定する工程；
（ｉｉ）評価対象の土壌の試料にペクチンを添加せずに培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性と工程（ｉｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性との差をとり、この差を評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性とする工程；及び
（ｉｖ）評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性を、予め算出された健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性と比較し、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性より一定割合以上高い場合、評価対象の土壌は不健全であると判断し、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性よりそうでない場合、評価対象の土壌は健全であると判断する工程。
【請求項２】
工程（ｉ）及び（ｉｉ）において、細菌の増殖を抑制する抗生物質の存在下で培養を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
土壌の健全性が、フザリウム属の糸状菌による土壌病害の発生しにくさであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価対象土壌のペクチン分解酵素誘導活性を健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性と比較することによって土壌の健全性（農作物病害の発生しにくさ）を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
土壌中には、糸状菌、放線菌、細菌、線虫などの様々な微生物が生棲している。これらの中には、農作物に病害を発生させるものも存在する。例えば、糸状菌の一種であるフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ｆ．ｓｐ．ラクツカエ（ｌａｃｔｕｃａｅ）は、レタスに根腐病を引き起こし、フザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．ラファニ（ｒａｐｈａｎｉ）は、ダイコンに萎黄病を引き起こす。従って、ある土壌で特定の農作物を栽培してもこのような病害が発生しにくいかどうか（つまり、土壌の健全性）を予め評価する方法が求められている。
【０００３】
かかる方法としては、土壌中の病原微生物の数を希釈平板法などによって定量し、その数に基づいて土壌の健全性を評価する方法が提案されている。この方法は、土壌を希釈して寒天培地で培養し、発生したコロニーがどの微生物のものであるかを形態学的特徴や生理学的特徴に基づいて特定する工程を含むため、かなりの時間がかかるという欠点を有する。また、土壌中では様々な微生物が拮抗作用を発揮しあっているため、たとえ病原微生物の数が多くても、この病原微生物に対して拮抗作用を有する他の微生物が土壌中に多ければ、農作物の病害は発生しないか又は発生してもその量は少なくなる。従って、土壌中の病原微生物の数は、実際の病害の発生しやすさと必ずしも相関しておらず、病原微生物の数に基づいて土壌の健全性を評価するこの方法は、正確さに欠ける。
【０００４】
土壌中の他の微生物との拮抗作用を考慮した評価方法としては、暗所栽培方法が提案されている（非特許文献１）。この方法は、評価対象土壌の試料に農作物の種子を播種し、暗所で栽培し、萎凋（自己消化）を起こすまでの日数を測定し、この日数が健全土壌の場合の日数と比較してどれくらい短縮されたかに基づいて土壌の健全性を評価するものである。この方法は、病原微生物を土壌から分離することなしに行われるため、病原微生物と土壌中の他の微生物との拮抗作用を考慮しており、土壌中の病原微生物の定量に基づく方法より正確さに優れるが、時間がかかる点では大差がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆ．ＳＥＫＥＲＡ：Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｅｒｎａｅｒ．Ｄｕｅｎｇ．Ｂｏｄｅｎｋ．７０（１１５）１９３（１９５５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、土壌中の他の微生物との拮抗作用を考慮しつつも短時間で結果を得ることができる土壌の健全性の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かかる目的を達成するにあたって、病原微生物が農作物に感染するために植物細胞壁の成分であるペクチンを分解する酵素を生産・分泌する能力を有することに着目した。そして、土壌のペクチン分解酵素活性は、病害の発生しやすさと強く相関すること、また、土壌のペクチン分解酵素活性は短時間で測定することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の構成（１）〜（３）を有する。
（１）  土壌の健全性を評価する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（ｉ）評価対象の土壌の試料にペクチンを添加して培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定する工程；
（ｉｉ）評価対象の土壌の試料にペクチンを添加せずに培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性と工程（ｉｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性との差をとり、この差を評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性とする工程；及び
（ｉｖ）評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性を、予め算出された健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性と比較し、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性より一定割合以上高い場合、評価対象の土壌は不健全であると判断し、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性よりそうでない場合、評価対象の土壌は健全であると判断する工程。
（２）  工程（ｉ）及び（ｉｉ）において、細菌の増殖を抑制する抗生物質の存在下で培養を行うことを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）  土壌の健全性が、フザリウム属の糸状菌による土壌病害の発生しにくさであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の土壌の健全性評価方法は、土壌のペクチン分解酵素活性という化学反応の測定に基づいているため、長期間の培養や栽培を行う必要がなく、短時間で結果を得ることができる。また、本発明の土壌の健全性評価方法は、土壌から病原微生物を分離せずに病原微生物が土壌に含まれた状態で測定を行うため、病原微生物と土壌中の他の微生物との拮抗作用を反映しており、評価精度が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例２の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、農地として使用する土壌の健全性（農作物病害の発生しにくさ）を評価する方法に関するものであり、病原微生物の生産するペクチン分解酵素に着目し、評価対象土壌のペクチン分解酵素誘導活性と健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性の比較に基づいて土壌の健全性を評価することを特徴とするものである。
【００１２】
本発明において、「土壌の健全性」は、その土壌で農作物を栽培したときに土壌中の病原微生物による農作物病害が発生しにくいかどうかを指す用語である。本発明で対象とする土壌中の病原微生物は、農作物への感染時にペクチン分解酵素を生産・分泌する能力を有するものである限り特に限定されないが、例えば、様々な農作物に種々の病害を引起すことが知られているフザリウム属の糸状菌であることができ、特に、レタスに根腐病を引き起こすフザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．ラクツカエや、ダイコンに萎黄病を引き起こすフザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．ラファニであることができる。
【００１３】
本発明の土壌の健全性評価方法では、まず、評価対象の土壌の試料にペクチンを添加して培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定する（工程（ｉ））。土壌試料をペクチンの存在下で培養すると、土壌試料中に含まれる病原微生物がペクチンを認識し、病原微生物の細胞中でペクチン分解酵素の生産が誘導される。工程（ｉ）では、このようにして誘導されたペクチン分解酵素の活性を測定する。
【００１４】
土壌試料へのペクチンの添加濃度や培養温度、培養時間は、土壌中の病原微生物によるペクチン分解酵素の生産を誘導するのに好適な条件である限り特に限定されないが、それぞれ以下のようなものであることができる。即ち、ペクチン添加濃度は、一般的に土壌試料１００ｇ当り５０〜１５０ｍｇ、好ましくは７０〜１３０ｍｇ、さらに好ましくは９０〜１１０ｍｇである。培養温度は、一般的に２０〜３０℃、好ましくは２２〜２８℃、さらに好ましくは２４〜２６℃である。培養時間は、一般的に１〜７日間、好ましくは２〜６日間、さらに好ましくは３〜５日間である。また、必要により、培養前に土壌試料に畑条件（最大容水量の６０％）になるように水を添加しておくことが好ましい。
【００１５】
培養終了後、土壌試料の病原微生物が生産したペクチン分解酵素の活性を測定する。活性の測定は常法に従って行えばよく、例えば阿江教治らの日本土壌肥料学雑誌、第４５巻、第４９７頁〜第５００頁（１９７７）に記載の方法を採用することができる。
【００１６】
次に、又は工程（ｉ）と平行して、評価対象の土壌の試料にペクチンを添加せずに培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定する（工程（ｉｉ））。土壌中の病原微生物は、ペクチンが存在しないか又はほとんど存在しない条件でもペクチン分解酵素をある程度恒常的に生産している。工程（ｉｉ）では、バックグランドをとるため、この恒常的に生産されているペクチン分解酵素の活性を測定する。正確に対比を行うためには、工程（ｉｉ）での培養温度及び培養時間は、工程（ｉ）での培養温度及び培養時間と一致させておくべきである。
【００１７】
次に、工程（ｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性と工程（ｉｉ）で測定されたペクチン分解酵素活性との差をとり、この差を評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性とする（工程（ｉｉｉ））。この工程（ｉｉｉ）において、ペクチン添加により誘導されるペクチン分解酵素の活性から、バックグランウンドとして恒常的に生産されているペクチン分解酵素の活性が除去され、土壌の健全性評価に適切なパラメータである評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が算出される。
【００１８】
次に、工程（ｉｉｉ）で得られた評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性を、予め算出された健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性と比較する（工程（ｉｖ））。
【００１９】
工程（ｉｖ）において、「健全土壌」は、加熱や薬剤添加によって病原微生物を死滅させた無菌土壌を指すのではなく、「病原微生物を含有するものの、病原微生物の数の少なさや土壌中の他の微生物との拮抗作用のため、農作物に病害が発生する程度でない土壌」を指す。
【００２０】
健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性は、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）と同様の方法で予め算出しておけばよく、具体的には、健全土壌の試料にペクチンを添加して培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定し、一方、健全土壌の試料にペクチンを添加せずに培養し、培養後の試料のペクチン分解酵素活性を測定し、両者の差をとり、この差を健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性とすればよい。正確に対比を行うためには、健全土壌試料へのペクチン添加濃度、培養温度、培養時間は、評価対象の土壌の試料の場合と一致させておくべきである。
【００２１】
工程（ｉｖ）において、比較の結果、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性より一定割合以上高い場合、評価対象の土壌は不健全である（つまり、この土壌で農作物を栽培すると土壌病害が発生しやすい）と判断する。この一定割合は、測定値のバラツキを考慮したものであり、一般に健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性の１．５倍、好ましくは１．３倍、さらに好ましくは１．１倍である。一方、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性が健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性よりそうでない場合、評価対象の土壌は健全である（つまり、この土壌で農作物を栽培しても土壌病害は発生しにくい）と判断する。
【００２２】
以上の工程（ｉ）〜（ｉｖ）により評価対象の土壌の健全性を評価することができるが、工程（ｉ）及び（ｉｉ）において、クロラムフェニコールなどの細菌の増殖を抑制する抗生物質の存在下で培養を行うと、評価対象の土壌が不健全である場合、この土壌のペクチン分解酵素誘導活性をさらに高めることができ、評価の精度を一層高めることができる。これは、抗生物質の存在により、土壌中の細菌の増殖が抑制され、糸状菌の増殖が促進されるためであると考えられる。抗生物質の添加濃度は特に限定されないが、一般的に５００〜２０００ｐｐｍ程度である。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
実施例１では、レタス根腐病に対する土壌の健全性を本発明の方法により評価した。
（１）材料
評価対象の土壌として、長野県伍賀農協のレタス連作耕作地の中でレタス根腐病の発生が確認されている区画の土壌を使用した。
健全土壌として、上記耕作地の中でレタス根腐病の発生が確認されていない区画の土壌を使用した。
【００２５】
（２）方法
（ｉ）評価対象の土壌から試料をとり、この試料に試料１００ｇ当り１００ｍｇの割合でペクチンを添加し、次に、畑条件（最大容水量の６０％）になるように水を添加した。次に、この試料を２５℃で３日間培養した。培養後の試料のペクチン分解酵素活性を、阿江教治ら、日本土壌肥料学雑誌、第４５巻、第４９７頁〜第５００頁（１９７７）に記載の方法に従って測定した。一方、評価対象の土壌から別の試料をとり、ペクチンを添加しなかったこと以外は第一の試料と同様にして培養し、ペクチン分解酵素活性を測定した。ペクチン添加時のペクチン分解酵素活性とペクチン無添加時のペクチン分解酵素活性との差をとり、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性を算出した。
（ｉｉ）また、健全土壌について評価対象の土壌と同様の手順によりペクチン添加時のペクチン分解酵素活性とペクチン無添加時のペクチン分解酵素活性との差をとり、健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性を算出した。
（ｉｉｉ）これらの結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１から明らかなように、評価対象の土壌（不健全土壌）のペクチン分解酵素誘導活性は、健全土壌のペクチン分解酵素誘導活性より約２．１倍高かった。このことから、本発明の方法によれば、評価対象土壌の健全性を評価することができることが明らかである。
【００２８】
実施例２
実施例１で本発明の土壌の健全性評価方法の有効性が明らかになったので、実施例２では、本発明の方法と土壌の健全性評価のための従来の暗所栽培方法との間にどの程度の相関関係があるかを調査した。
（１）材料
評価対象の土壌として、異なる農地からの５種類の土壌にそれぞれ、ダイコン萎黄病を引き起こすフザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．ラファニを添加して調製した５種類の不健全土壌を使用した。
【００２９】
（２）方法
（ｉ）評価対象の５種類の土壌からそれぞれ試料をとり、実施例１と同様にして、それぞれの評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性を算出した。
一方、評価対象の５種類の土壌からそれぞれ別の試料をとり、畑条件（最大容水量の６０％）になるように水を添加した。次に、この試料にダイコンの種子を播種し、暗所で栽培し、萎凋（自己消化）を起こすまでの日数を測定した。萎凋（自己消化）を起こすまでの日数は、平均で１４日であった。また、評価対象の５種類の土壌からそれぞれ別の試料をとり、試料１００ｇ当り１００ｍｇの割合でペクチンを添加したこと以外は第一の試料と同様にしてダイコンの種子を暗所で栽培し、萎凋（自己消化）を起こすまでの日数を測定した。これらの日数の差をとり、ペクチン添加による萎凋発現の短縮日数とした。
上で算出したペクチン分解酵素誘導活性とペクチン添加による萎凋発現の短縮日数との相関をとった。
（ｉｉ）また、評価対象の５種類の土壌からそれぞれ試料をとり、ペクチン添加時にペクチンに加えてクロラムフェニコール（細菌の増殖を抑制する抗生物質）を１０００ｐｐｍの濃度で添加したことを除いては（ｉ）と同様にして、ペクチン分解酵素誘導活性とペクチン添加による萎凋発現の短縮日数との相関をとった。
（ｉｉｉ）これらの結果を図１に示す。
【００３０】
図１から明らかなように、評価対象の土壌のペクチン分解酵素誘導活性とペクチン添加による萎凋発現の短縮日数との間には強い相関（Ｒ＝０．７５８）が認められた。このことから、ペクチン分解酵素活性に基づく本発明の土壌の健全性評価方法は、従来の暗所栽培方法より短時間で同程度の評価精度の結果を与えることができると言える。また、図１から明らかなように、細菌の増殖を抑制する抗生物質であるクロラムフェニコールを添加した群では、クロラムフェニコール無添加群と比較してペクチン分解酵素誘導活性が顕著に増大しており、土壌の健全性の評価精度が有意に向上されていると言える。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の土壌の健全性評価方法は、評価精度の高い結果を短時間で得ることができるため、農地で栽培する農作物の種類を決定するためや農地の消毒の時期を決定するために幅広く利用することができる。
【図１】
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