(57)【要約】【課題】  本発明は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作でタンパク質を細胞内に輸送することのできる、汎用性の高いタンパク質輸送剤として有用なポリイオンデンドリマー、及びそれを用いたタンパク質の高効率な輸送方法を提供する【解決手段】  本発明は、表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー、それを用いたタンパク質輸送剤、及びタンパク質の輸送方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
【請求項２】
分岐鎖が、末端に１，４位で結合した１，２，３−トリアゾ−ル基を有していてもよい繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である請求項１に記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項３】
分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである請求項１又は２に記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項４】
ベンゾフェノン基を有する置換基が、次の一般式［２］又は［３］、
【化１５】
2011178756.tif 000016
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
【化１６】
2011178756.tif 000017
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基である請求項１〜３のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項５】
世代が、１〜５世代である請求項１〜４のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項６】
ポリイオンデンドリマーが、次の一般式［１］
【化１７】
2011178756.tif 000018
［式中、Ｘは次に示す一般式［２］又は［３］、
【化１８】
2011178756.tif 000019
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
【化１９】
2011178756.tif 000020
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基を示し、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｌは１〜６の整数を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは世代数を示し１〜５の整数を表す。なお、式中の分岐部分の３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミドは、３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドであってもよく、分岐鎖のエチレンオキシ鎖は、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖であってもよい。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜５のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項７】
ポリイオンデンドリマーが、次の一般式［４］
【化２０】
2011178756.tif 000021
［式中、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｍは０又は１を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜６のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項８】
ポリイオンデンドリマーが、次の式［５］
【化２１】
2011178756.tif 000022
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜７のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤。
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質輸送剤を用いることを特徴とするタンパク質の輸送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。本発明のポリイオンデンドリマーは、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作でタンパク質を細胞内に輸送できる、汎用性の高いタンパク質輸送剤として有用であり、本発明は、さらに本発明のポリイオンデンドリマーを用いたタンパク質輸送剤、及び生体細胞内へのタンパク質の輸送方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、その機能の特異性や生体適合性の高さから新しいタイプの薬剤として注目されている。一般にタンパク質のような高分子化合物は細胞膜透過性が極めて低いという問題があるために、効率的な細胞内導入を可能にするキャリアの使用が必要不可欠である。
タンパク質の細胞内取り込みを実現するアプローチの一つとして、アルギニンを多数含有する細胞内輸送ペプチドを連結させる方法が知られている (非特許文献１参照) 。しかしながら、この方法ではペプチドを共有結合で標的のタンパク質に連結させる必要があるため、タンパク質の変性や機能の損失を引き起こす可能性があるという問題があった。
【０００３】
もう一つのアプローチとして、カチオン性脂質を用いた非共有結合的方法が提案されている(非特許文献２参照)。この方法は、カチオン性脂質がタンパク質を内包するミセルを形成し、このミセルが細胞膜と融合することを利用して、標的タンパク質を細胞内に移行させる方法である。この方法では、前述の細胞内輸送ペプチドを用いる方法と異なり、共有結合形成を必要としないため、標的タンパク質の変性や失活を回避することができる。しかしながら、カチオン性脂質を用いたタンパク質輸送は１０μＭ以上の濃度の脂質分子を必要とするため、拡散の影響で希釈されてしまうin vivoでは十分な輸送効率を実現できていなかった。このため、in vivoで、タンパク質をそのまま効率よく細胞内に輸送できるキャリアの開発が待たれていた。
【０００４】
デンドリマーは、ギリシャ語の「dendri-」(樹木状)と「meros」(一部)を組み合わせて名づけられた、中心から規則的に分岐した構造を持つ樹状高分子で、構造が正確にコントロールされた樹木状のポリマーである。過去１０年間に５０００以上の論文が発表されてきているが、他の高分子と比べて合成が極めて困難であるため、実用化は難しいとされている。現在最もよく用いられているポリアミドアミン構造を持つＰＡＭＡＭデンドリマーなどは、既に市販されてきている。
デンドリマーは、コア (core) と呼ばれる中心分子と、デンドロン (dendron) と呼ばれる樹状の分岐構造部分、及び表面（surface）と呼ばれる末端基部分から構成され、デンドロン部分の分岐回数を世代 (generation) と言っている。一般に高分子はある程度の分子量分布を持つが、高世代のデンドリマーは、分子量数万に達するものでもほとんど単一分子量であるという、際立った特徴を持っている。
コア（core）はデンドリマー全体のサイズ・形・方向性・多様性を決定する部位であるとされており、デンドロン (dendron) は、枝状のセルが規則的に増えていく部分で、このセルが空間のタイプと大きさを決定し、枝状のセルの多重度は世代(generation)に対して指数関数的に増加する。表面（surface）は反応性・非反応性の末端基で構成され、末端基のタイプにより様々な機能を発現することができると共に、外部のゲスト分子の出入りをコントロールするゲートの役割も担っている。
【０００５】
デンドリマーの製造法はよく知られており、例えば、リジン単位の層に基づくデンドリマーの製造法（特許文献１参照）、ポリアミドアミンを含む他の単位に基づくデンドリマーやＰＡＭＡＭデンドリマーの製造法（特許文献２参照）などが報告されている。これらのデンドリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤又は油/水エマルジョン、製紙における湿潤紙力増強剤、及び塗料などの水性配合物での粘度調節剤などとしての使用に適するとされているが、医薬製造用の基剤としての使用（特許文献３参照）や、生物学的反応修飾物質になりうる担体物質と会合させるためのもの（特許文献４参照）なども既に報告されてきている。
また、表面の末端基としてグアニジン基のようなカチオン性の基を有するデンドリマー（樹状高分子化合物）も知られており、例えば、ポリアミドアミンデンドリマーやポリリジンデンドリマーやポリ(プロピレンイミン)デンドリマーなどの表面に４級アミノ含有部
分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分などのイオン性基を設けたデンドリマーを毒性物質による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献５参照）や、同じデンドリマーを細菌などの微生物又は寄生虫による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献６参照）、また、このようなイオン性末端基を有するデンドリマーをゲル形成剤として農薬や衛生用品の担体として使用するもの（特許文献７参照）などが報告されている。さらに、カチオン性の基を有するポリエチレンイミンデンドリマーなどのカチオン性物質をアニオン性の酵素活性蛍光基質と複合させて蛍光基質の膜輸送系を形成させる方法も報告されている（特許文献８参照）。
しかしながら、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合しているものは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５８７，３２９号明細書
【特許文献３】米国特許第４，４１０，６８８号明細書
【特許文献４】国際特許公開  ＷＯ９５／２４２２１号公報
【特許文献５】特表２００２−５２４５２３号公報
【特許文献６】特表２００２−５２４５２４号公報
【特許文献７】特表２００２−５３８１８６号公報
【特許文献８】特表２００６−５１７３８２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shiroh Futaki, Membrane-permeable arginine-rich peptides and the translocation mechanisms, Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 547-558
【非特許文献２】B.T.F. van der Gun et al, Serum insensitive, intranuclear protein delivery by the multipurpose cationic lipid SAINT-2, Journal of Controlled Release 123 (2007) 228-238
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明で解決しようとする課題は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作でタンパク質を細胞内に輸送することのできる、汎用性の高いタンパク質輸送剤として有用なポリイオンデンドリマーを提供すること、それを用いたタンパク質輸送剤、及びタンパク質の高効率な輸送方法を提供することにある。また、このようなタンパク質輸送剤の基本骨格となる分子の設計指針と合成手法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、複数のイオン種間で特に強い相互作用が働くことに着目し、分子表面にアルギニンの側鎖として知られるグアニジン基あるいはチオウレニウム基などを多数擁するポリカチオンデンドリマーの分子設計とその合成法を確立することによる、より高効率なタンパク質輸送剤の可能性の開拓に挑戦してきた。これらの化合物は、複数のイオン性官能基を表面に持つため、高い細胞膜透過性が期待できるとともに、標的タンパク質、核酸など複数のアニオン性官能基を持つ生体分子と強く結合する役割を果たすために、低濃度でのタンパク質・キャリア複合体形成が可能になることが期待できる。さらに、コア部に連結した疎水性のベンゾフェノン基は細胞膜内の疎水性の層に積極的に入り込むことで、上記のタンパク質・キャリア複合体を細胞膜上に集積・濃縮させる効果があることを見いだし、本発明に到達した。
【００１０】
即ち、本発明は、デンドリマーの表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。より詳細には、本発明は、下記の一般式［１］
【００１１】
【化１】
2011178756.tif 000002
【００１２】
［式中、Ｘは下記の一般式［２］又は［３］
【００１３】
【化２】
2011178756.tif 000003
【００１４】
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
【００１５】
【化３】
2011178756.tif 000004
【００１６】
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基を示し、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｌは１〜６の整数を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは世代数を示し１〜５の整数を表す。なお、一般式［１］中の分岐部分の３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミドは、３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドであってもよく、分岐鎖のエチレンオキシ鎖は、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖であってもよい。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
より詳細には、本発明は、下記の一般式［４］
【００１７】
【化４】
2011178756.tif 000005
【００１８】
［式中、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｍは０又は１を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
さらに詳細には本発明は、下記の式［５］で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
【００１９】
【化５】
2011178756.tif 000006
【００２０】
また、本発明は、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤又はタンパク質輸送剤用組成物に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤又はタンパク質輸送剤用組成物を用いて生体細胞膜内にタンパク質を輸送する方法に関する。
【００２１】
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）デンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
（２）分岐鎖が、末端に１，４位で結合した１，２，３−トリアゾ−ル基を有していてもよい繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である前記（１）に記載のポリイオンデンドリマー。
（３）分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである前記（１）又は（２）に記載のポリイオンデンドリマー。
（４）ベンゾフェノン基を有する置換基が、前記の一般式［２］又は［３］で表されるベンゾフェノン基を有する置換基である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（５）世代が、１〜５世代である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（６）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［１］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（７）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［４］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（８）ポリイオンデンドリマーが、前記した式［５］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（９）前記（１）〜（８）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤。
（１０）前記（９）に記載のタンパク質輸送剤を用いることを特徴とするタンパク質の輸送方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）は、共有結合を介さずに標的タンパク質と強い分子間相互作用によりタンパク質・キャリア複合体を形成することが可能であり、低濃度で、迅速に、かつタンパク質の活性を損なうことなく細胞内にタンパク質を輸送することができる。また、当該タンパク質輸送活性は血清存在下でも十分に高い効率が維持され、生体内においても十分な活性を示す。
さらに、本発明のタンパク質キャリア用のポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）は、実用的な１μＭの濃度でも細胞毒性を示さない。
【００２３】
以上のように、本発明のグアニジン等のカチオン性の基を多数有するポリカチオン型デンドリマーは、タンパク質と強く相互作用し、細胞へのタンパク質輸送剤として、従来のカチオン性脂質型タンパク質導入試薬SAINT-phDを遙かに上回る高効率なタンパク質の細胞内導入を実現することができるものである。そして、本発明のポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）は、従来の試薬と比較して、低濃度で迅速、かつ安全に使用できることから、従来のものでは困難であったin vivoへ応用が可能となる。
また、本発明は、表面部としてグアニジン基などのカチオン性の基、分岐鎖として親水性の高いポリエチレングリコール基、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基を有する樹状高分子を分子設計し、その製造法を確立した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、タンパク質として蛍光標識アクチンを用いた、本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰ（図１の右端）、Ａｒｇ９、Ｇ１−ＮＯＭｅ、Ｇ１−ＮＦＩＴＣ、及びSAINT-phDによるタンパク質取り込み活性を比較した結果を示すものである。図１の左端はコントロールであり、その右側はアクチンのみをを接触させた場合である。
【図２】図２は、本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰによるタンパク質取り込みを共焦点顕微鏡で観察した結果を示すものである。
【図３】図３は、本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰ、又はSAINT-phDによるタンパク質取り込み活性に対する血清の影響を解析した結果を示すものである。
【図４】図４は、本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰによるタンパク質取り込み活性についての接触時間及び濃度による影響を解析した結果を示すものである。
【図５】図５は、本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰにより取り込まれたタンパク質の活性が維持されているかどうかを共焦点顕微鏡で観察した結果を示すものである。
【図６】図６は、本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰの細胞毒性を解析した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第一にデンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有することである。このようなカチオン性の基としては、次の式［６］、［７］、及び［８］、
【００２６】
【化６】
2011178756.tif 000007
【００２７】
が挙げられる。これらの基の水素原子部分は炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基などで置換されていてもよい。
このようなカチオン性の基はデンドリマー表面部に１個以上あればよいが、好ましくは表面部の末端の全てがこれらのカチオン性の基を有するものが挙げられる。
また、デンドリマー表面部における、このようなカチオン性の基は、同一であっても異なっていてもよいが、製法の容易性からは全てが同一の場合が好ましい。
最近、グアニジン基を有するアミノ酸であるアルギニンの作用に注目が集まっている。特に、アルギニンを導入した化合物の細胞膜透過性が増すことが報告されており、この理由がグアニジン基のようなカチオン性の基にあるとされている。本発明のデンドリマー（樹状高分子）においても、本発明のデンドリマーが優れた細胞膜透過を有する一因が、グアニジン基のようなカチオン性の基を多数有していることと考えられる。
【００２８】
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第二に分岐鎖として親水性の高いポリアルキレンオキシ基を有していることである。本発明におけるアルキレン基としては、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基が挙げられる。好ましいアルキレンオキシ基としては、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基などが挙げられるが、入手のしやすさや親水性などの点からエチレンオキシ基が好ましい。また、これらのアルキレンオキシ基は、水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基などの親水性の基で置換されていてもよい。
分岐鎖におけるアルキレンオキシ基の繰り返し数としては、特に制限はないが、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは２〜４が挙げられる。また、デンドリマーの各世代において、これらの繰り返し数は同じであっても異なっていてもよい。これらの繰り返し数により、デンドリマーの内部のセル空間の広さが確保されることから、コア部に疎水性のベンゾフェノン基を有する大きな基を導入しようとする場合には、比較的大きな繰り返し数が必要となるし、疎水性のベンゾフェノン基を有する基が小さいものであれば、繰り返し数は比較的少なくてもよい。
本発明の一般式［１］においては、分岐鎖としてエチレンオキシ鎖が例示されているが、前記してきたように、本発明のポリイオンデンドリマーの分岐鎖としては、一般式［１］に例示されているエチレンオキシ鎖に限定されるものではなく、親水性の高いポリアルキレンオキシ鎖であれば炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖のいずれであってもよい。
【００２９】
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第三にコア部としてカルボキシル基を有し当該カルボキシル基にアルキレンオキシ基を介してベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることである。当該カルボキシル基は、遊離のカルボキシル基として存在することができるのであれば、分岐鎖を形成することができる基を有している限りにおいて、どのような化合物から誘導されるものであってもよいが、好ましくは本発明のデンドリマーにおける分岐部分を形成する分子と同じ化合物から誘導されるものが挙げられる。例えば、ポリヒドロキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸、トリカルボン酸や、テトラカルボン酸などが挙げられる。好ましい具体例としては、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド、３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸、又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドなどが挙げられる。
なお、一般式［１］、［４］、及び［５］においては、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミドが例示されているが、これに限定されるものではない。
また、当該カルボキシ基に結合するアルキレンオキシ基の繰り返し数としては、特に制限はないが、好ましくは２〜７、より好ましくは２〜５、さらに好ましくは３〜５が挙げられる。ベンゾフェノン基はカルボキシル基に結合しているアルキレンオキシ基に直接結合していてもよいし、たとえばチオウレア基を介して結合していてもよい。好ましい例としては、
【００３０】
【化７】
2011178756.tif 000008
【００３１】
式［９］及び式［１０］で示されるようにベンゾフェノンにカルボキシ基に共有結合させるための官能基を導入して、コア部のカルボキシ基とアミド結合させることができる。
コア部のカルボキシル基とベンゾフェノンを有する置換基との結合は、共有結合が可能であればどのような形態であってもよい。好ましい結合としては、アミド結合、エステル結合などが挙げられる。
ベンゾフェノン基を有する置換基におけるベンゾフェノンは、コア部のカルボキシ基に結合するための官能基、例えば、水酸基などの官能基のほかに、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基のような不活性な基で置換されていてもよい。また、コア部のカルボキシ基に結合するためのベンゾフェノンの官能基の位置は、特に制限はなく、２〜６位のいずれであってもよい。好ましい位置としては、４位が挙げられる。
【００３２】
本発明のポリイオンデンドリマーの分岐部分を形成する化合物としては、分岐可能なものであれば特に制限はないが、好ましくは前記したコア部の化合物と同種の化合物の使用が挙げられる。例えば、コア部におけるカルボキシ基を有する化合物として、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸用いた場合には、分岐部分においてもこれを用いることが製造の容易さの点からも好ましい。
分岐部分の化合物と、分岐鎖の結合も任意に選択することができる。例えば、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、イミノ（−Ｎ−）結合などの任意の結合を選択することができる。また、必要に応じてトリアゾリルメチル基を挿入することもできる。
【００３３】
本発明のポリイオンデンドリマーの製造方法としては、デンドリマーの公知の製造方法に準じた製造方法を適用することができる。例えば、コア部を形成して第一世代を製造する方法、又は第一世代を形成した状態でコア部を形成させる方法により、コア部と第一世代を製造し、次いで、必要に応じて第二世代、第三世代と成長させる方法が挙げられる。
そして、表面の末端部を形成させることにより製造することができる。
より具体的には、後記する実施例を参照されたい。
【００３４】
前記してきた一般式［１］で表される本発明のポリイオンデンドリマーは、分岐鎖がエチレンオキシ基であり、分岐部分が３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸で前の世代の分岐鎖とアミド結合で結合され、次の世代とエーテル結合で結合され、分岐鎖の繰り返し数がｌで世代がｎのものを表している。
また、前記した一般式［４］は、１世代の状態の本発明のポリイオンデンドリマーを表している。
これらはいずれも本発明の好ましいポリイオンデンドリマーの例であり、より具体的には、本発明の好ましいポリイオンデンドリマーとして、次式、
【００３５】
【化８】
2011178756.tif 000009
【００３６】
で表されるポリイオンデンドリマー（以下、この化合物をＧ１−ＢＰという。）が挙げられる。
【００３７】
本発明のポリイオンデンドリマーは、細胞膜透過性を有するだけでなくタンパク質と会合して、タンパク質・キャリア複合体を形成することができる。本発明のポリイオンデンドリマーはタンパク質と会合するだけであり、共有結合で結合されている訳ではないことからタンパク質の構造は何等変化することなくタンパク質の活性を維持したままで細胞膜内に目的のタンパク質を導入することができる。したがって、本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーとタンパク質とのタンパク質・キャリア複合体を提供するものである。
本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる細胞内へのタンパク質輸送剤を提供する。本発明のタンパク質輸送剤は、０．０１μＭ以上の濃度で、好ましくは０．０５〜５μＭの濃度で、迅速かつ安全に、しかも効率よく目的のタンパク質を細胞内へ輸送することができる。また、本発明のタンパク質輸送剤は、血清に対する影響を受けにくく、生体内においても使用することが可能である。また、本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる細胞内へのタンパク質輸送担体（キャリアー）を提供する。さらに、本発明は、本発明のポリイオンデンドリマー及びタンパク質輸送用溶媒を含有してなる細胞内へのタンパク質輸送用組成物を提供する。
本発明は、本発明のタンパク質輸送剤を用いることを特徴とするタンパク質の輸送方法を提供する。本発明の輸送方法は、目的とするタンパク質と本発明のタンパク質輸送剤を混合し、得られた混合物を緩衝液や培養液などにより適宜希釈し、これを標的の細胞に接触させることにより行うことができる。本発明の輸送方法によれば、目的のタンパク質を迅速かつ安全に、しかも効率よく標的とする細胞へ輸送することができる。
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。   
【実施例１】
【００３９】
Ｇ１−ＢＰの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰを製造した。
【００４０】
【化９】
2011178756.tif 000010
【００４１】
【化１０】
2011178756.tif 000011
【００４２】
（１）化合物３の製造
ｐ−トルエンスルホン酸２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル（化合物１）１．６６ｇ（５．０４ｍｍｏｌ）と４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物２）１．００ｇ（５．０４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５ｍｌに溶解させた。炭酸カリウム２．０９ｇ（１５．１ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で１８時間撹拌した。クロロホルムで希釈した後、ろ過により固体を除去し、減圧下、６０℃で溶媒を除去した。得られた固体を酢酸エチルに溶解させ、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、２回のカラムクロマトグラフィー（アルミナ、クロロホルム）、（シリカゲル、クロロホルム）で精製し、化合物３を薄黄色油状の透明液体として得た（１．６０ｇ；収率８９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ  （ｐｐｍ）
3.37 (t, 2H; ＣＨ２Ｎ３), 3.63-3.80 (m, 6H; ＯＣＨ２), 
3.90 (t, 2H; Ａｒ−ＯＣＨ２ＣＨ２), 4.21 (t, 2H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 
6.98 (d, 2H; 3,5-Ar-H), 7.41-7.61 (m, 3H; 3',4',5'-Ar-H), 
7.70-7.88 (m, 4H; 2,2',5,5'-Ar-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
50.6, 67.5, 69.5, 70.0, 70.6, 70.8, 113.9, 127.9, 
129.5, 130.0, 131.6, 132.2, 138.0, 162.2, 195.1.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ
計算値：  ３９４．２９，
実測値：  ［Ｍ＋Ｋ＋］    ３９４．１２，
計算値：  ３７８．３２，
実測値：  ［Ｍ＋Ｎａ＋］  ３７８．１４，
計算値：  ３５６．３５，
実測値：  ［Ｍ＋Ｈ＋］    ３５６．１６．
【００４３】
（２）化合物４の製造
１．４５ｇ（４．０８ｍｍｏｌ）の化合物３とパラジウム−炭素（Ｐｄ：１０％）１００ｍｇを混合し、エタノール１０ｍｌに懸濁させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで化合物４を黄色の固体として得た（１．２４ｇ；収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
3.15 (t, 2H; ＣＨ２ＮＨ２), 3.55-3.97 (m, 8H; ＯＣＨ２), 
4.22 (t, 2H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 5.39 (br, 2H; ＮＨ２), 
7.00 (d, 2H; 3,5-Ar-H), 7.41-7.61 (m, 3H; 3',4',5'-Ar-H), 
7.70-7.88 (m, 4H; 2,2’,5,5'-Ar-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
39.8, 67.5, 69.4, 70.0, 70.6, 70.8, 114.1, 128.1, 
129.6, 130.3, 131.9, 132.4, 138.0, 162.0, 195.5.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ
計算値：  ３７０．４６，
実測値：  ［Ｍ＋Ｋ＋］    ３６８．１３，
計算値：  ３５２．４１，
実測値：  ［Ｍ＋Ｎａ＋］  ３５２．１５，
計算値：  ３３０．４３，
実測値：  ［Ｍ＋Ｈ＋］    ３３０．１７．
【００４４】
（３）化合物６の製造
既知のトリアジドデンドロン（化合物５）５００ｍｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）と２５４ｍｇ（０．７７１ｍｍｏｌ）の化合物４及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）２００μｌを混合し、アセトニトリル／クロロホルム（１／１）１０ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１９２ｍｇ（０．８１８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、酢酸エチルに溶解させ、２Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。アルミナでろ過し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝４／１→１／０）で精製した。これをさらにリサイクルＧＰＣで精製し、化合物６を薄黄色油状の液体として得た（３７３ｍｇ；収率５１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
3.36 (m, 6H; ＣＨ２Ｎ３), 3.52-3.94 (m, 34H; ＯＣＨ２, ＮＨＣＨ２), 
4.18 (m, 8H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 6.84 (t, 1H; ＣＯＮＨＣＨ２), 
6.93 (d, 2H; 3,5-benzophenone-H), 7.08 (s, 2H; Ar-H), 
7.40-7.60 (m, 3H; 3',4',5'-benzophenone-H), 
7.67-7.83 (m, 4H; 2,2’,5,5’-benzophenone-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
39.8, 50.6, 67.5, 69.0, 69.4, 69.7, 69.8, 69.9, 70.1, 70.4, 
70.6, 70.7, 72.3, 106.9, 113.9, 128.0, 129.6, 130.1, 131.7, 
132.3, 137.9, 141.2, 152.2, 162.0, 166.7, 195.5.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ
計算値：  ９９１．８１，
実測値：  ［Ｍ＋Ｋ＋］    ９９１．３９，
計算値：  ９７５．８４，
実測値：  ［Ｍ＋Ｎａ＋］  ９７５．４２．
【００４５】
（４）化合物８の製造
既知のデンドロン（化合物７）１．１３ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）とプロパルギルアミン１０３ｍｇ（１．８７ｍｍｏｌ）を混合し、アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）２１５ｍｇ（０．９２０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、酢酸エチルに溶解させ、２Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これをアルミナでろ過し、減圧下で乾燥させることで化合物８を白色の固体として得た（６６１ｍｇ；収率５７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
1.46 (m, 57H; ＣＨ３), 3.48-3.86 (m, 31H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, CCH),
4.19 (m, 8H; Ａｒ−ＯＣＨ２, ＣＯＮＨＣＨ２), 7.12 (br, 1H; ＣＯＮＨＣＨ２),
7.25 (s, 2H; Ar-H), 8.58 (br, 3H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 
11.4 (br, 3H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
27.8, 28.0, 29.2, 40.3, 60.0, 68.6, 68.9, 69.5, 70.0, 
70.1, 70.4, 70.8, 71.9, 78.8, 79.6, 82.5, 82.6, 106.8, 
128.4, 140.9, 151.9, 152.4, 155.8, 162.9, 166.1.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ
計算値：  １３５０．１０，
実測値：  ［Ｍ＋Ｎａ＋］  １３４９．７１，
計算値：  １２７４．４８，
実測値：  ［Ｍ−Ｃ４Ｈ９＋Ｈ＋］  １２７１．６６，
計算値：  １２２９．５７，
実測値：  ［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ＋］  １２２７．６７，
計算値：  １１７７．３６，
実測値：  ［Ｍ−Ｂｏｃ−Ｃ４Ｈ９＋Ｈ＋］  １１７１．６１，
計算値：  １１２８．３８，
実測値：  ［Ｍ−２Ｂｏｃ＋Ｈ＋］  １１２７．６２，
計算値：  １０６４．４９，
実測値：  ［Ｍ−２Ｂｏｃ−Ｃ４Ｈ９＋Ｈ＋］  １０７１．５６，
計算値：  １０３１．０８，
実測値：  ［Ｍ−３Ｂｏｃ＋Ｈ＋］  １０２７．５７，
計算値：  ８２８．７３，
実測値：  ［Ｍ−５Ｂｏｃ＋Ｈ＋］  ８２７．４６，
計算値：  ７２７．２２，
実測値：  ［Ｍ−６Ｂｏｃ＋Ｈ＋］  ７２７．４１．
【００４６】
（５）化合物９の製造
１１９ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）の化合物６と５５５ｍｇ（０．４１８ｍｍｏｌ）の化合物８と硫酸銅五水和物１１ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム１６６ｍｇ（０．８３６ｍｍｏｌ）を混合し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／水（１／１）１０ｍｌに溶解させ、室温で１２時間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。セライトろ過により固体を除去し、減圧下で溶媒を除去した後、リサイクルＧＰＣで精製することにより化合物９を薄茶色の固体として得た（４２０ｍｇ；収率６８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.39 (m, 162H; ＣＨ３), 3.33-3.85 (m, 122H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine), 
3.93-4.18 (m, 26H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 4.38 (br, 6H; ＣＨ２ＣＨ２-triazol), 
4.53 (br, 6H; triazol-ＣＨ２-NHCO), 6.82 (m, 3H; triazol-H), 
7.08 (br, 6H; 3,5-benzophenone-H, CONH), 
7.29 (br, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H), 
7.33-7.53 (m, 3H; 3',4',5'-benzophenone-H), 
7.55-7.86 (m, 4H; 2,2',5,5'-benzophenone-H), 
8.52 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
27.9, 28.1, 35.2, 40.4, 49.9, 68.8, 69.0, 69.2, 69.5, 69.9, 
70.2, 70.4, 70.5, 72.1, 78.8, 82.6, 106.9, 113.8, 123.2, 127.8, 
128.8, 129.3, 129.5, 129.9, 131.5, 132.0, 137.8, 141.1, 152.1, 
152.6, 155.8, 161.9, 163.0, 166.4, 166.6, 194.8.
【００４７】
（６）Ｇ１−ＢＰの製造
４０５ｍｇ（０．０８２ｍｍｏｌ）の化合物９を４．０Ｍ塩化水素ジオキサン溶液５ｍｌに溶解させ、室温で６時間撹拌した後、減圧下で乾燥させてＧ１−ＢＰを薄茶色の固体として得た（２８２ｍｇ；収率＞９９％）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
3.28 (m, 18H; ＣＨ２-guanidine), 
3.37-4.23 (m, 106H; ＯＣＨ２, ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ), 
4.36 (m, 26H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 
4.59 (br, 12H; ＣＨ２ＣＨ２-triazol, triazol-ＣＨ２-NHC), 
6.65 (m, 3H; triazol-H), 6.94-7.15 (m, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H), 
7.19-7.56 (m, 7H; 3',4',5'-benzophenone-H, 2,2',5,5’-benzophenone-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
29.0, 40.52, 42.0, 51.4, 67.2, 69.0, 69.5, 69.6, 69.7, 70.1, 70.3, 70.4, 
70.7, 72.7, 106.6, 106.8, 114.7, 129.6, 130.2, 130.3, 133.2, 133.4, 
137.4, 140.2, 152.4, 152.6, 157.8, 162.9, 166.7, 167.5, 168.8, 198.0.
【実施例２】
【００４８】
Ｇ１−ＮＢＰの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ１−ＮＢＰを製造した。
【００４９】
【化１１】
2011178756.tif 000012
【００５０】
【化１２】
2011178756.tif 000013
【００５１】
（１）化合物１１の製造
アミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）で保護した、既知のトリエチレングリコール誘導体（化合物１０）３３０ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）、５００ｍｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）の化合物５、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１７１μｌを混合し、アセトニトリル６ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１９０ｍｇ（０．８１０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、２回のカラムクロマトグラフィー（アルミナ、酢酸エチル＋１０％メタノール）、（シリカゲル、酢酸エチル）で精製し、化合物１１を薄黄色油状の液体として得た（４６９ｍｇ；収率６６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
3.36 (m, 8H; ＣＨ２Ｎ３, ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｂｎ), 
3.51-3.88 (m, 34H; ＯＣＨ２, ＣＨ２ＮＨＣＯ), 4.18 (m, 6H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 
5.06 (s, 2H; ＰｈＣＨ２Ｏ), 7.04 (s, 2H; Ar-H), 7.31 (br, 5H; Ph-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
50.6, 61.7, 66.7, 69.0, 69.7, 69.9, 70.1, 70.4, 70.6, 70.7, 72.3, 
107.0, 127.9, 128.3, 129.6, 136.3, 141.1, 152.2, 156.2, 166.8.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ
計算値：  ９４４．１７，
実測値：  ［Ｍ＋Ｋ＋］    ９４４．３９，
計算値：  ９２８．１９，
実測値：  ［Ｍ＋Ｎａ＋］  ９２８．４１．
【００５２】
（２）化合物１２の製造
４１０ｍｇ（０．４５３ｍｍｏｌ）の化合物１１をＴＨＦ４ｍｌに溶解させ、０℃に冷却した。ここにトリフェニルホスフィン３９２ｍｇ（１．４９ｍｍｏｌ）を添加した後、徐々に室温まで昇温させ、その後室温で３時間撹拌した。水１ｍｌを添加した後、さらに５０℃で終夜撹拌した。室温に戻した後、水３ｍｌと１２Ｍ塩酸４５０μｌを添加した後、トルエンで３回洗浄した。これを減圧下で溶媒を除去することで化合物１２を茶色油状の液体として得た（４２３ｍｇ；収率＞９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
3.08 (m, 8H; ＣＨ２Ｎ３, ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｂｎ), 
3.35-3.88 (m, 34H; ＯＣＨ２, ＣＨ２ＮＨＣＯ), 
4.03-4.20 (m, 6H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 4.84 (s, 2H; ＰｈＣＨ２Ｏ), 
7.00 (s, 2H; Ar-H), 7.11-7.27 (m, 5H; Ph-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
40.2, 61.4, 67.4, 69.3, 69.9, 70.1, 70.5, 70.8, 71.0, 73.1, 
107.5, 128.3, 129.0, 129.5, 130.4, 137.3, 140.5, 152.6, 158.7, 169.7.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ
計算値：  ８６６．００，
実測値：  ［Ｍ＋Ｋ＋］    ８６６．４２，
計算値：  ８５０．０４，
実測値：  ［Ｍ＋Ｎａ＋］  ８５０．４４，
計算値：  ８２８．０７，
実測値：  ［Ｍ＋Ｈ＋］    ８２８．４６．
【００５３】
（３）化合物１３の製造
１．７１ｇ（１．３３ｍｍｏｌ）の化合物７、３７７ｍｇ（０．４０２ｍｍｏｌ）の化合物１２及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）２９２μｌを混合し、アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）３２４ｍｇ（１．３８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で４．５時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、酢酸エチルに溶解させてアルミナでろ過した。再度、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解させ、ヘキサン中で再沈殿させることにより化合物１３を薄黄色の固体として得た（１．１３ｇ；収率６０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.45 (m, 162H; ＣＨ３), 
3.42-3.86 (m, 132H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, ＣＨ２ＮＨＣＯ), 
3.86 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 7.07 (br, 8H; Ar-H), 7.22 (m, 5H; Ph-H), 
8.56 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
28.0, 28.3, 38.5, 39.8, 40.5, 43.4, 66.4, 68.9, 69.2, 69.6, 70.1, 
70.3, 70.5, 72.2, 79.1, 82.8, 106.9, 127.7, 127.8, 128.2, 
129.4, 129.5, 141.1, 152.2, 152.6, 155.9, 163.1, 166.8.
【００５４】
（４）化合物１４の製造
９３１ｍｇ（０．２００ｍｍｏｌ）の化合物１３とパラジウム−炭素（Ｐｄ：１０％）５０ｍｇを混合し、エタノール１０ｍｌに懸濁させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで白色の固体として得た（８５２ｍｇ；収率９４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.41 (m, 162H; ＣＨ３), 3.07 (br, 2H; ＣＨ２ＮＨ２), 
3.38-3.93 (m, 130H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, ＣＨ２ＮＨＣＯ), 
4.11 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 7.09 (m, 8H; Ar-H), 
8.27 (br, 2H; ＮＨ２), 8.56 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 
11.2 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
27.2, 27.4, 39.0, 41.3, 42.1, 53.8, 68.1, 68.5, 68.8, 68.9, 
69.6, 69.8, 71.6, 81.6, 84.2, 106.1, 126.9, 127.1, 127.6, 
128.8, 135.9, 139.7, 151.3, 154.4, 155.8, 157.9, 166.2.
【００５５】
（５）化合物１５の製造
４７６ｍｇ（０．１０６ｍｍｏｌ）の化合物１４、既知のベンゾフェノン−４−イソチオシアネート６３８ｍｇ（２．６７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン３６８μｌを混合し、ＤＭＦ５ｍｌに溶解させた後、室温で終夜撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、飽和食塩水、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。２回の再沈殿（クロロホルム→ヘキサン、クロロホルム→ジエチルエーテル）で精製することにより化合物１５を茶色の固体として得た（３７５ｍｇ；収率７５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.44 (m, 162H; ＣＨ３), 3.34-3.84 (m, 132H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, 
ＣＨ２ＮＨＣＯ, ＣＨ２ＮＨＣＳ), 4.22 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 
7.06 (m, 8H; Ar-H), 7.32-7.99 (m, 9H; benzophenone-H), 
8.57 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
28.1, 28.3, 39.9, 40.6, 68.5, 68.9, 69.3, 69.8, 70.3, 70.4, 
72.5, 79.2, 83.0, 102.8, 107.0, 117.7, 125.3, 128.1, 128.2, 
128.3, 129.7, 129.9, 131.5, 131.8, 138.0, 140.0, 152.3, 
152.7, 156.3, 162.1, 163.5, 195.5.
【００５６】
（６）Ｇ１−ＮＢＰの製造
３２５ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）の化合物１５を４．０Ｍ塩化水素ジオキサン溶液５ｍｌに溶解させ、室温で８．５時間撹拌した後、減圧下で乾燥させた。これをクロロホルムで洗浄することでＧ１−ＮＢＰを暗褐色の固体として得た（１５１ｍｇ；収率６７％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６ＤＭＳＯ；ｐｐｍ）：δ
2.85-3.15 (m, 18H; ＣＨ２-guanidine), 
3.17-3.81 (m, 108H;ＯＣＨ２, ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ), 
3.90-4.24 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 
6.92-7.20 (m, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H), 
7.32-7.85 (m, 7H; 3',4',5'-benzophenone-H, 2,2',5,5'-benzophenone-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
40.6, 42.3, 69.4, 69.9, 70.9, 73.2, 107.6, 119.1, 129.2, 130.6, 
131.6, 132.2, 133.3, 138.0, 141.1, 152.7, 158.2, 168.6, 196.6.
【実施例３】
【００５７】
タンパク質の細胞内取り込み
（１）標識タンパク質の調整
標的タンパク質として、蛍光標識されたアクチンを以下の方法で調整した。
アクチン（ウサギ骨格筋由来）１ｍｇを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ塩化カリウム含有、ｐＨ７．０）５００μｌに溶解させた。これにAlexa Fluor（登録商標）６３３  Ｃ５−マレイミド（１ｍＭ）ＨＥＰＥＳ緩衝溶液５０μｌを添加し、室温で４時間静置した。脱塩カラムＧ−２５で過剰の蛍光色素を除去した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で２００μｇ／ｍｌに希釈して分注し、−２０℃で保存した。
（２）タンパク質取り込み活性の評価
タンパク質の取り込み活性評価は以下の方法で行った。
６−ｗｅｌｌ培養ディッシュに１００，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を、仔ウシ血清（ＦＢＳ；１０％）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。下記に示す各種試薬とAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で下記に示す濃度に希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。再度ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡでディッシュから剥がしたものをフローサイトメトリーによって解析し、アクチンに結合させたAlexa Fluor（登録商標）６３３の蛍光強度を測定した。比較のため、蛍光標識アクチンのみを接触させた場合を測定した。図１に示す結果を得た。
【００５８】
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
（１）蛍光標識アクチン：５０ｎＭ（共通）
（２）蛍光標識アクチン  ＋  アルギニン九量体（Ａｒｇ９）：１μＭ
（３）蛍光標識アクチン  ＋  Ｇ１−ＮＯＭｅ：１μＭ
（４）蛍光標識アクチン  ＋  Ｇ１−ＮＦＩＴＣ：１μＭ
（５）蛍光標識アクチン  ＋  SAINT-phD：１５μＭ
（６）蛍光標識アクチン  ＋  Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
なお、比較例とした用いた（２）のアルギニン九量体（Ａｒｇ９）は細胞膜透過性ペプチドであり、（３）のＧ１−ＮＯＭｅは次の化学式、
【００５９】
【化１３】
2011178756.tif 000014
【００６０】
で示されるコア部にベンゾフェノン基を有していないポリイオンデンドリマーであり、（４）のＧ１−ＮＦＩＴＣは次の化学式、
【００６１】
【化１４】
2011178756.tif 000015
【００６２】
で示されるコア部にベンゾフェノン基ではなく９−フェニルキサンテン誘導体を有するポリイオンデンドリマーであり、（５）のSAINT-phDは市販のタンパク質導入剤である。
図１に示されるように、膜透過性ペプチドとして知られているＡｒｇ９は、アクチンのみを接触させた場合とほとんど違いは見られなかった。市販のタンパク質導入剤であるSAINT-phDを用いた場合は、Ａｒｇ９と比較しても有意に高い取り込み活性が見られた。
一方、本発明のＧ１−ＢＰを用いた場合では、SAINT-phDの１／１５の濃度であるにもかかわらず、３倍以上の高い取り込み活性を示した。
また、コア部にベンゾフェノン基を有していないポリイオンデンドリマーであるＧ１−ＮＯＭｅ及びＧ１−ＮＦＩＴＣは、いずれもアクチンのみを接触させた場合とほとんど違いは見られなかった。
この結果、本発明のコア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合しているポリイオンデンドリマーは、他のポリイオンデンドリマーに比べて顕著なタンパク質輸送作用を有していることが確認された。
【実施例４】
【００６３】
タンパク質取り込みの共焦点顕微鏡での観察による確認
また、本発明のＧ１−ＢＰによるAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンの細胞内への取り込みは、以下のようにしても確認した。
顕微鏡観察用のガラス底培養ディッシュに１０，０００個／枚となるようにＨｅＬａ細胞を培養した。Ｇ１−ＢＰとAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地を添加し、共焦点顕微鏡で観察し（励起波長６３３ｎｍ）、図２の結果を得た。
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
（１）蛍光標識アクチン：５０ｎＭ
（２）蛍光標識アクチン  ＋  Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
図２の左側は、本発明のＧ１−ＢＰを混合した場合を示し、右側は蛍光標識アクチンのみの場合を示す。図２の左側のように、本発明のＧ１−ＢＰを混合した場合には、細胞内部にAlexa Fluor（登録商標）６３３由来の蛍光が観察され、標識したアクチンがＨｅＬａ細胞内に取り込まれていることが確認できた。
【実施例５】
【００６４】
血清の影響
タンパク質取り込み活性に対する血清の影響を調べるために、同様の実験を、ＦＢＳを１０％含む培地を用いて行った。具体的な操作は以下の通りである。
６−ｗｅｌｌ培養ディッシュに１００，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を、仔ウシ血清（ＦＢＳ；１０％）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。下記に示す各種試薬とAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。再度ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡでディッシュから剥がしたものをフローサイトメトリーによって解析し、図３に示す結果を得た。図３の左側は、SAINT-phDを混合した場合を示し、右側は本発明のＧ１−ＢＰを混合した場合を示す。それぞれの、左側（青色）は血清がない場合を示し、右側（黄色）は血清がある場合を示す。
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
蛍光標識アクチン：５０ｎＭ（共通）
（１）蛍光標識アクチン  ＋  SAINT-phD：１５μＭ
（２）蛍光標識アクチン  ＋  Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
図３にSAINT-phDとＧ１−ＢＰの血清なし・血清ありのそれぞれの結果を示す。本発明のＧ１−ＢＰは血清の存在下においても十分に高いタンパク質取り込み活性を示し、依然としてSAINT-phDの２倍以上の活性を示す。
【実施例６】
【００６５】
濃度及び接触時間の影響
Ｇ１−ＢＰの接触濃度、接触時間がタンパク質取り込み量に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。
６−ｗｅｌｌ培養ディッシュに１００，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を、仔ウシ血清（ＦＢＳ；１０％）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。各種試薬とAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で、Ｇ１−ＢＰ（１μＭ）の条件で１〜４時間、あるいはＧ１−ＢＰ（０．０５，０．１，０．５，１μＭ）の条件で４時間接触させた。再度ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡでディッシュから剥がしたものをフローサイトメトリーによって解析し、図４（ａ）及び（ｂ）に示す結果を得た。図４の（ａ）［上側］は、本発明のＧ１−ＢＰ（１μＭ）の条件で１〜４時間接触させた時の結果を示し、図４（ｂ）［下側］は、本発明のＧ１−ＢＰの濃度が、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、又は１μＭの濃度で４時間接触させた時の結果を示す。
本発明のＧ１−ＢＰ  １μＭを使用した場合、接触時間が１時間でもSAINT-phD４時間接触時の活性を上回る性能を示した。SAINT-phDのプロトコルでは、細胞内導入のためのインキュベート時間が４時間であるのに対し、本発明のポリカチオン型デンドリマーを１μＭの濃度で使用した場合には１時間でこれを上回る迅速なタンパク質輸送が達成されることが明らかになった。また、４時間接触では、０．５μＭ（SAINT-phDの１／３０）という低濃度でも、市販のタンパク質導入試薬SAINT-phD（カチオン性脂質）を１５μＭの濃度で用いた場合の２．５倍以上のタンパク質輸送活性を示した。
【実施例７】
【００６６】
タンパク質の変性の有無
細胞内にＧ１−ＢＰによって取り込まれたタンパク質がその活性を維持しているかどうかを以下の実験により確認した。
顕微鏡観察用のガラス底培養ディッシュに１０，０００個／枚となるようにＨｅＬａ細胞を培養した。Ｇ１−ＢＰと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地を添加し、共焦点顕微鏡で観察し（励起波長４８８ｎｍ）、図５に示す結果を得た。図５の左側は、本発明のＧ１−ＢＰを混合したときの結果を示し、右側は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみのときの結果を示す。
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）：５ｎＭ
Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
細胞内に取り込まれたＧＦＰ由来の蛍光が確認できることから、取り込まれたタンパク質は変性や失活を引き起こさず、その機能を維持できたことがわかる。
【実施例８】
【００６７】
細胞毒性
Ｇ１−ＢＰの細胞毒性をCell Counting Kit-8（同仁化学）を用いて以下のように調べた。
９６−ｗｅｌｌ培養プレートに５，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を培養した。ＰＢＳで洗浄したこれらのＨｅＬａ細胞にＧ１−ＢＰを含むＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを含まない）を１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。ここに、Cell Counting Kit-8発色試薬を１０μＬずつ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で１時間静置下後、４５０ｎｍの吸光度測定によって毒性を評価し、図６に示す結果を得た。図６の縦軸は細胞生存率（比率）を示し、横軸はＧ１−ＢＰの濃度（μＭ）を示す。
図６のように、タンパク質取り込み活性が十分に発揮される１μＭの濃度でも細胞毒性は全く生じていない。以上のように、本発明のＧ１−ＢＰは標的の細胞に全く毒性を示さずに、既存のSAINT-phDを上回る高いタンパク質取り込み活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、目的とするタンパク質を、迅速かつ効率よく、しかもタンパク質の活性を損なうことなく安全に細胞内に輸送することができる、タンパク質キャリア用分子としての新規なポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）を提供するものであり、細胞内への効率的かつ迅速なタンパク質輸送剤として有用である。
【図１】
2011178756.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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