(57)【要約】【課題】ビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンについて、ビタミンＢ２の光励起に起因する活性酸素及び抽出時のｐＨ条件によるビオチンの分解を抑制することにより、ビオチンのバイオアッセイ方法における分析の正確さを向上させる。【解決手段】遮光することのできる器具を使用し、ビオチン及びビタミンＢ２を含有する試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整してビオチンを抽出することを特徴とするビオチンのバイオアッセイ方法及びこの方法で測定するためのバイオアッセイキット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遮光器具を用いて、試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することを特徴とするビオチンのバイオアッセイ方法。
【請求項２】
測定対象がビタミンＢ２を含有する試料であることを特徴とする請求項１記載のビオチンのバイオアッセイ方法。
【請求項３】
遮光器具を用いて、試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することを特徴とするビオチンのバイオアッセイキット。
【請求項４】
測定対象がビタミンＢ２を含有する試料であることを特徴とする請求項３記載のビオチンのバイオアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンのバイオアッセイ方法及びそれを用いたバイオアッセイキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチンは、食品中に広く分布し、ビタミンＨとも称される補酵素の１種であって、人体に対し生体内の４種のカルボキシラーゼの必須補酵素として作用することが知られている（非特許文献１参照）。ビオチンの定量分析法には、乳酸菌を用いたバイオアッセイ方法と液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣ法とする）を用いた理化学定量法がある。ＨＰＬＣ法は、夾雑物の影響を受けやすく、測定条件の設定が難しいため、食品中のビオチンの測定は、一般的にバイオアッセイ方法が採用されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
また、ビタミンＢ２は、人体に対し細胞の再生や成長を助けたり、蛋白質、炭水化物、脂質の代謝を促進するといった効果を有することが知られている。しかしながら、ビタミンＢ２は紫外線波長領域の光によって励起し、基底状態に戻るときにエネルギーを放出し、この放出エネルギーが溶液中の溶存酸素や含酸素化合物の三重項酸素を活性酸素に変化させてしまうことが知られている（非特許文献３及び非特許文献４参照）。
【０００４】
一方、ビオチンは、活性酸素によって酸化分解されることが知られており（非特許文献５参照）、特開平７−９７３２２号公報（特許文献１）では、ビオチンを用いた一重項酸素消去剤が開示されている。また、特開２００６−８９４３０号公報（特許文献２）では、トシシ抽出物を含有して、ビオチンの光安定性を向上させた水性液剤組成物が開示されている。
【０００５】
しかしながら、公知のビオチンのバイオアッセイ方法には、光励起に起因する活性酸素によるビオチンの分解に関する記述はない（非特許文献２参照）。また、特開２００６−８９４３０号公報（特許文献２）には、「バイオアッセイ方法ではビオチンの分解物（生体中ではビオチンと同等の活性を有さない）もビオチンと同等の活性を示してしまう」という旨の記載があるものの、ビタミンＢ２の光励起に起因する活性酸素によって生成したビオチン分解物が、バイオアッセイ方法によるビオチンの定量結果に及ぼす影響については、詳細には調べられていない。
【０００６】
一方、ビオチンの水溶液の安定性に関しては、ｐＨ９以下で安定であり、６Ｎ硫酸中で１２０℃、１時間の加熱に対しても安定とされている（非特許文献６参照）。また、食品中のビオチンのバイオアッセイ方法では、試料の抽出方法については、「一般的な食品を対象とする場合は試料を硫酸で処理して抽出する。また、ビオチン含量の高い食品を対象とする場合は、試料に水を加えて抽出する。抽出後に１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ６．８に調整する。」旨が記述されている（非特許文献２参照）。しかし、上記の酸分解は結合型のビオチンを遊離型にして活性化するためや、アルカリによるｐＨ調整は乳酸菌の培養に適切な状態を整えるためであり、これらのｐＨ調整はビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンについて、光及びｐＨ安定性を考慮されたものではない。さらに、内服液剤やドリンク剤は服用感を向上するとの観点から、ｐＨは２〜５に調整されるが、ビオチン及びビタミンＢ２を含有し、酸性を示す試料の場合も公知のバイオアッセイ方法では光及びｐＨ安定性に関する対策は講じられてこなかった。
【０００７】
従って、ビタミンＢ２を含有する試料の場合、従来技術のビオチンのバイオアッセイ方法には光及びｐＨによるビオチンの安定性に関する技術情報はなく、試料の抽出段階におけるビオチンの安定性を保持するための対策は行われていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−９７３２２号公報
【特許文献２】特開２００６−８９４３０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】日本ビタミン学会編「ビタミンハンドブック２  水溶性ビタミン」、（株）化学同人、ｐ１１５〜ｐ１２６、１９８９年発行
【非特許文献２】（財）日本食品分析センター編「栄養表示のための成分分析のポイント」、中央法規（株）、ｐ１７７〜ｐ１８２、２００７年発行
【非特許文献３】豊崎俊幸著、Ｎｅｗ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、ｖｏｌ．３４、Ｎｏ．１、ｐ７０〜ｐ７６、１９９２年発行
【非特許文献４】ＰＣＪｏｓｈｉ著、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、Ｖｏｌ．２６、ｐ１８６〜ｐ１８９、１９８９年６月発行
【非特許文献５】小畑清隆、ビタミン、ｖｏｌ．７１、Ｎｏ．４、ｐ１８０、１９９７年発行
【非特許文献６】日本ビタミン学会編「ビタミン学ＩＩ」、（株）東京化学同人、ｐ４３９、１９８０年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明においては、ビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンについて、光励起に起因する活性酸素及び抽出時のｐＨ条件によるビオチンの分解を抑制することにより、ビオチンのバイオアッセイ方法における分析の正確さを向上させることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、遮光器具を用いて、ビオチン及びビタミンＢ２を含有する試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することにより、ビオチンの安定性を保持し、ビオチンのバイオアッセイ方法における分析の正確さを向上させる効果を持つことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、遮光器具を用いて、ビタミンＢ２を含有する試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することを特徴とするバイオアッセイ方法及びそれを用いたバイオアッセイキットである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、遮光器具を用いて、ビオチン及びビタミンＢ２を含有する試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することにより、光励起に起因する活性酸素及び抽出時のｐＨ条件によるビオチンの分解を抑制し、ビオチン定量の分析の正確さを向上させるバイオアッセイ方法及びそれを用いたバイオアッセイキットを提供するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のビオチンのバイオアッセイ方法及びそれを用いたバイオアッセイキットは、遮光器具を用いて、ビオチン及びビタミンＢ２を含有する試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することを特徴とするものである。
【００１５】
本発明で用いられる遮光器具は特に限定されず、ビオチンのバイオアッセイ方法で用いられ、遮光されている器具であれば良く、例えば、アルミシートなどの金属膜やフィルムを被覆した器具や、塗料を塗布した器具や、ガラス表面を茶色に着色した器具であっても良い。
【００１６】
上記遮光器具としては、例えば、茶色遮光されたビーカー、メスフラスコ、メジューム瓶、ホールピペット、フィンピペットまたは試験管など、ビオチンのバイオアッセイ方法において試験溶液の調製と乳酸菌接種後の培養に用いられる器具が挙げられる。また、マイクロプレートの場合には、アルミプレートなど遮光性のシートが貼られており、濁度測定時にアルミプレートが剥がせる構造になっている形態が良い。
【００１７】
本発明で用いられるｐＨ５〜９の緩衝液は特に限定されず、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸―クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。ｐＨ５未満ではビタミンＢ２が共存下、光が照射されるとビオチンの分解が促進されて、バイオアッセイ方法における分析の正確さが低下する傾向があり、また、ｐＨ９を超えるとビオチンの安定性が低下する傾向がある。また、緩衝液濃度としては、バイオアッセイ方法の試料抽出時に、１〜１００ｍＭとなるように調整されることが好ましい。１ｍＭ未満では緩衝効果が期待しにくい傾向があり、１００ｍＭを超えても緩衝効果が増大しにくい傾向がある。ｐＨ５〜９の緩衝液は予め遮光器具に保持されていてもよく、濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行った乾燥物としてや、増粘剤や多孔質材とともに混合することによりゲル状物として、マイクロプレートなどの遮光器具に乳酸菌株とともに固相化されていても良い。
【００１８】
本発明のビオチンのバイオアッセイ方法及びそれを用いたバイオアッセイキットは、医薬品、食品、化粧品のいずれの試料にも用いることができる。また、その剤型としては、例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などを含む）、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、錠菓、飲料、化粧水、クリーム、乳液等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いられるビタミンＢ２（リボフラビン）は、リン酸エステル及び酪酸エステル等のような各種誘導体等も含むことができる。
【実施例】
【００２０】
次に本発明を詳細に説明するため、予備試験、実施例として本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。予備試験、実施例に示す配合量は重量％を示す。
【００２１】
（予備試験１：遮光器具とｐＨ緩衝液によるビオチン安定化効果）
ビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンについて、遮光器具の使用及びｐＨ条件によるビオチンの安定性を調べるため、表１に示した成分を混合、溶解して、ビタミンＢ２の有無、ｐＨの異なる溶液１〜１０を調製した。なお、ビタミンＢ２としてリン酸リボフラビンナトリウムを用い、ｐＨ緩衝液として５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液を用い、器具は茶色遮光のビーカー及び試験管を用いた。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
［ビオチンの光及びｐＨ安定性］
前記溶液１〜１０について、ビオチンの光及びｐＨ安定性を測定した。すなわち、溶液１〜１０を茶色遮光試験管、または無色透明試験管に２０ｍＬとり、室温で１５００Ｌｕｘ（白色蛍光灯を使用）の光を連続照射し、１時間後（１５００Ｌｕｘ・ｈｒ）、３時間後（４５００Ｌｕｘ・ｈｒ）及び６時間後（９０００Ｌｕｘ・ｈｒ）に各溶液のサンプリングを行い、溶液のｐＨと、ＨＰＬＣ法でビオチンの残存率を測定した。得られた結果を表２、図１及び図２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
表２及び図１に示したように、茶色遮光器具を用い、ビオチン及びビタミンＢ２を含有し、ｐＨ５〜９の緩衝液が加えられた溶液２〜４は、各々ｐＨ４．９、７．２、９．１を示し、光照射量９０００Ｌｕｘ・ｈｒの時点でもビオチン残存率は９５％以上を保つことが確認された。また、ｐＨ３の緩衝液が加えられた溶液１（ｐＨ３．２）及びｐＨ緩衝液を加えなかった溶液５（ｐＨ４．３）の同時点でのビオチン残存率は各々９２％、９３％であり、若干の減少が見られた。一方、表２及び図２に示したように、無色透明器具を使用すると、ビオチン及びビタミンＢ２を含有する溶液１〜５は、光照射量の増加に伴って、ビオチンが分解され、特に溶液１（ｐＨ３．２）は光照射量１５００Ｌｕｘ・ｈｒの時点でビオチン残存率が５０％未満に減少し、また、ｐＨ緩衝液を加えなかった溶液５（ｐＨ４．３）もビオチン残存率が６０％未満に減少することが確認された。なお、ビタミンＢ２を含有しない溶液６〜１０のビオチンの残存率は変化しなかった。
【００２６】
（予備試験２：ビオチンの分解物がバイオアッセイ方法によるビオチン定量に及ぼす影響）
ビオチン及びビタミンＢ２を含有する試料の場合、光及び抽出時のｐＨ条件によって生成したビオチンの分解物が、バイオアッセイ方法によるビオチンの定量結果に及ぼす影響を調べるため、予備試験１でサンプリングした各溶液のうち、無色透明試験管に入れ、光を連続照射した溶液５（ｐＨ４．３）を試料として、ビオチンの残存率をバイオアッセイ方法で測定した。
【００２７】
［バイオアッセイ方法とＨＰＬＣ法の相関性］
茶色遮光器具を用い、各試料に１００倍量のｐＨ６．８緩衝液を加えて抽出して試料溶液を調製した後、さらに精製水で１００倍に希釈して試験溶液として、バイオアッセイ方法でビオチンを測定した。得られた結果を予備試験１のＨＰＬＣ法の結果とともに表３及び図３に示す。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
表３及び図３に示したように、光照射及び抽出時のｐＨ条件によってビオチンが減少した試料を、バイオアッセイ方法及びＨＰＬＣ法で測定した結果は良好な相関性を示した。つまり、ビタミンＢ２共存下で光照射及び抽出時のｐＨ条件によって生成したビオチンの分解物は、バイオアッセイ方法において、ビオチンと同等の活性は示さないことが確認された。よって、ビオチンのバイオアッセイ方法において試料の抽出、試験溶液の調製時や乳酸菌接種時に、室内やクリーンベンチ内の蛍光灯などの光照射によって試験溶液中のビオチンが減少して測定結果の誤差が生じ、分析の正確さが低下することが危惧された。
【００３０】
（実施例１〜５及び比較例１〜１１：遮光器具とｐＨ緩衝液によるビオチン安定化効果）
ビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンについて、遮光器具を用いて、試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出した場合のバイオアッセイ方法におけるビオチンの光及びｐＨ安定性を調べるため、使用する器具の遮光性や加える緩衝液のｐＨを段階的に振って、抽出方法による定量結果の差異を比較できるように、表４に示す実施例１〜５（バイオアッセイ１〜５）及び比較例１〜１１（バイオアッセイＡ〜Ｋ）の各バイオアッセイ方法を設定した。
【００３１】
［バイオアッセイ方法によるビオチンの光及びｐＨ安定性］
表４に示す実施例１〜５及び比較例１〜１１の各バイオアッセイ方法について、ビオチン０．０２％及びリン酸リボフラビンナトリウム０．０５％含有のカプセル剤内容物（内容物１ｇを精製水１００ｍＬに溶解し、濾過した濾液のｐＨは４．１であった）を試料として、ビオチンの定量を行った。器具は茶色遮光器具または無色透明器具のメジューム瓶、ホールピペット及び試験管を用い、ｐＨ緩衝液は５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液をもとに、ｐＨ４、５、６、７、８、９または１０の緩衝液を調製して用いた。実施例１〜５（バイオアッセイ１〜５）、比較例１（バイオアッセイＡ）及び比較例２（バイオアッセイＢ）は茶色遮光器具を使用し、試料に１００倍量の各ｐＨ緩衝液を加えて抽出して試料溶液を調製した後、リン酸または０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ６．８に調整し、さらに精製水で１００倍に希釈して試験溶液とした。比較例３（バイオアッセイＣ）は、試料に１００倍量の精製水を加えて抽出した以外は、実施例１と同様にして試験溶液を調製した。また、比較例４〜１０（バイオアッセイＤ〜Ｊ）は、無色透明器具を使用して、各ｐＨ緩衝液を加えて抽出した以外は実施例１と同様にして試験溶液を調製した。比較例１１（バイオアッセイＫ）は無色透明器具を使用した以外は、比較例３と同様に抽出して試験溶液を調製した。なお、試料の抽出、試験溶液の調製及び乳酸菌接種はクリーンルームに設置されたクリーンベンチ内（蛍光灯点灯）で行い、作業時の光照射量は約３０００Ｌｕｘ・ｈｒであり、オートクレーブ処理及びインキュベーター時は装置内に設置されていたため遮光されていた。ビオチンの各定量値を、ビオチン０．０２％含有のカプセル剤内容物（リン酸リボフラビンナトリウムは含有しない）を試料として比較例３と同様にして得られた測定値で除した値をビオチンの残存率として算出した。得られた結果を表４及び図４に示す。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
表４及び図４に示したように、茶色遮光器具を使用し、ｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを４．９〜９.１に調整して抽出した実施例１〜５（バイオアッセイ１〜５）は、ビオチンの残存率は９５％以上を示し、遮光器具を用いて、ビオチン及びビタミンＢ２を含有する試料にｐＨ緩衝液を加えて試料溶液のｐＨを５〜９に調整して抽出することにより、試験溶液の調製時に室内やクリーンベンチ内の蛍光灯などの光照射による試験溶液中のビオチンの減少が少なく、分析の正確さが高いことが確認された。また、茶色遮光器具を使用しても、ｐＨ４の緩衝液を添加して抽出した比較例１（バイオアッセイＡ）、ｐＨ１０の緩衝液を添加して抽出した比較例２（バイオアッセイＢ）またはｐＨ緩衝液を添加せず抽出した比較例３（バイオアッセイＣ）の試料溶液のｐＨは各々３．９、１０．１、４．１を示し、ビオチンの残存率が９０％未満に減少することが明らかとなった。さらに、比較例４〜１１（バイオアッセイＤ〜Ｋ）のように無色透明器具を使用した場合は、いずれもビオチンの残存率は９０％未満に減少することが明らかとなった。
【００３４】
（実施例６）
ビオチン０．０１％及びリン酸リボフラビンナトリウム０．０２％含有の内服液剤（ｐＨ３．５）を試料として、ｐＨ７の緩衝液を予め入れた茶色遮光メジューム瓶を用いて抽出し（ｐＨ６．９）、遮光器具（ホールピペット、試験管）を用いて希釈して、実施例３と同様に、バイオアッセイ方法でビオチンの定量を行った。得られたビオチン残存率は９７％と、分析の正確さは高いものであった。
【００３５】
（実施例７）
ビオチン０．０２％及びリボフラビン０．００５％含有の化粧水（ｐＨ６．０）を試料として、ｐＨ６のリン酸緩衝液を予め入れ、シート状のアルミプレートを貼って遮光したマイクロプレートに添加して（ｐＨ５．８）、遮光器具（ビーカー、メスフラスコ、フィンピペット）を用いて、バイオアッセイ方法でビオチンの定量を行った。得られたビオチン残存率は９８％と、分析の正確さは高いものであった。
【００３６】
（実施例８）
ビオチン０．０１％及びリン酸リボフラビンナトリウム０．０５％含有の錠剤（１ｇを精製水１００ｍＬに溶解し、濾過した濾液のｐＨは４．４であった）を試料として、遮光器具（メジューム瓶、ホールピペット、試験管）及びｐＨ８のトリス緩衝液を用いて抽出し（ｐＨ７．９）、実施例４と同様に、バイオアッセイ方法でビオチンの定量を行った。得られたビオチン残存率は９７％と、分析の正確さは高いものであった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、ビタミンＢ２を含有する試料中のビオチンを定量する分析の正確さを高めた技術であり、血中のビオチンの定量などの健康医学分野や、果実などの植物、農作物中や環境中のビオチン定量にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】予備試験１で得られた溶液１〜１０を茶色遮光試験管にとり、光を連続照射した時の光照射量（Ｌｕｘ・ｈｒ）と各溶液のビオチンの残存率（％）との関係を示すグラフである。
【図２】予備試験１で得られた溶液１〜１０を無色透明試験管にとり、光を連続照射した時の光照射量（Ｌｕｘ・ｈｒ）と各溶液のビオチンの残存率（％）との関係を示すグラフである。
【図３】予備試験１でサンプリングした各溶液のうち、無色透明試験管に入れ光を連続照射した溶液５を試料として、バイオアッセイ方法及びＨＰＬＣ法で測定したビオチンの残存率（％）を示すグラフである。
【図４】実施例１〜５（バイオアッセイ１〜５）及び比較例１〜１１（バイオアッセイＡ〜Ｋ）の各バイオアッセイ方法で測定したビオチンの残存率（％）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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