(57)【要約】      （修正有）【課題】インンターロイキン、腫瘍壊死因子−αなどの炎症促進性マーカーを下方調節するための組成物の提供。【解決手段】インディアン・フランキンセンスなどのボスウェリア種のガム樹脂から得られる、β−ボスウェリア酸や１１−ケト−β−ボスウェリア酸などを含むボスウェリア酸画分及びアラビノース、Ｄ−グルクロン酸などを含む多糖類画分を、濃度約６０％のボスウェリア酸画分及び濃度約４０％の多糖類画分の量で含む相乗的組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
濃度約６０％のボスウェリア酸画分を及び濃度約４０％の多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む相乗的組成物。
【請求項２】
該ボスウェリア酸画分及び該多糖類画分は、ボスウェリア種から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該ボスウェリア酸画分は、β−ボスウェリア酸、アセチル−β−ボスウェリア酸、１１−ケト−β−ボスウェリア酸及びアセチル−１１−ケト−β−ボスウェリア酸を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該多糖類画分は、ガラクトース、アラビノース、Ｄ−グルクロン酸及び４−Ｏ−メチル−グルクロノアラビノ−ガラクタンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
該薬学上許容可能な腑形剤は、滑沢剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、増量剤及び希釈剤、芳香剤、着色剤、流動促進剤、潤滑剤、防腐剤、収着剤、甘味剤並びにこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
組成物は、液体、トローチ、ロゼンジ、粉体、顆粒、カプセル、タブレット、膏薬、ゲル、エマルション、クリーム、ローション、歯磨き剤、ドロップ、懸濁液、シロップ、エリキシル剤、フィトシューティカル及びニュートラシューティカルを含む群から選択される剤形に処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
濃度約６０％のボスウェリア酸画分を及び濃度約４０％の多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む相乗的組成物を調製する方法であって、
ボスウェリア種からボスウェリア酸画分及び多糖類画分を得、
濃度約６０％ボスウェリア酸画分、及び、濃度約４０％多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに混合する工程を含む前記方法。  
【請求項８】
該ボスウェリア酸画分は、β−ボスウェリア酸、アセチル−β−ボスウェリア酸、１１−ケト−β−ボスウェリア酸及びアセチル−１１−ケト−β−ボスウェリア酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該多糖類画分は、ガラクトース、アラビノース、Ｄ−グルクロン酸及び４−Ｏ−メチル−グルクロノアラビノ−ガラクタンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
炎症促進性マーカーを下方調節／抑制するための方法であって、濃度約６０％のボスウェリア酸画分を及び濃度約４０％の多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む前記方法。
【請求項１１】
ボスウェリア酸画分及び多糖類画分は、ボスウェリア種から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象は、ヒトを含む動物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該炎症促進性マーカーは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＦＮ−γ、酸化窒素及びＬＴＢ４を含む群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＧＥ２を下方調節／抑制するための方法であって、多糖類単独、又は、ボスウェリア酸画分との組み合わせを適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む前記方法。
【請求項１５】
該ボスウェリア酸画分及び多糖類画分は、ボスウェリア種から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象は、ヒトを含む動物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１及び／又は１４に記載の組成物を含有する栄養補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年３月２日に出願された米国仮出願第６１／３０９４８１の正規の出願である。
本発明は、ボスウェリア種（ｓｐｅｃｉｅｓ）から得られるボスウェリア酸画分及び多糖類画分を含む組成物に関する。この組成物は、高められた生物活性、特に炎症促進性マーカーの下方調節を示すことにおいて相乗的である。
【０００２】
本発明は、また、ＰＧＥ２の抑制のために多糖類画分単独、又はボスウェリア酸画分との組合せの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫システムの正確な調節無くして生存は不可能である。炎症促進性サイトカインの産生は、成長、組織再生、ヒーリング、損傷又は感染の間に免疫及び代謝応答を組織化するために、そして、われわれの体を出血、虚血、癌及び敗血症から守るために重要な生理学的プロセスである。インンターロイキン（ＩＬ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−a）などの炎症促進性サイトカインの制御された産生は、感染及び組織障害を閉じこめるための局所凝集を促進する有益な炎症促進性応答をトリガーする（Ｕｌｌｏａ及びＴｒａｃｅｙ，２００５）。しかし、これらのサイトカインの無制限の産生は、もとの障害よりも危険であり、ヒトの罹病率及び死亡率の主要な要因の一つである。このプロセスの最も劇的な例の一つは、集中治療室での死亡の主要な原因であり、そして、先進社会での死亡の主要な原因である「重篤な敗血症」である（Ｍａｒｔｉｎ等，２００３）。重篤な敗血症は、組織の炎症、心臓血管機能障害及び致死性多重臓器不良を引き起こす炎症促進性サイトカインの圧倒的な産生によって特徴づけられる（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ及びＬｏｗｒｙ，１９９５；Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ及びＫａｒｌ，２００３；Ｒｉｃｅ及びＢｅｒｎａｒｄ，２００５）。この効果は、中和炎症促進性サイトカイン（モノクローナル抗ＴＮＦ抗体及びＩＬ−１レセプターアンタゴニスト）が関節リュウマチ、クローン病、強直性脊椎症、乾癬等の炎症促進性状態の上首尾であると証明されたことを示す研究によって説明される（Ｆｅｌｄｍａｎｎ，２００２；Ｕｌｌｏａ及びＴｒａｃｅｙ，２００５；Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ等，２００６；Ｕｌｌｏａ及びＭｅｓｓｍｅｒ，２００６）。
【０００４】
サイトカインに加えて、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ブラジキニン等の他のメディエーターもまた、炎症において役割を演じる。したがって、これらは、マーカーとして働き、そして、疾病状態、特に現在高いレベルにある疾病状態を診断するのに有用である。したがって、免疫システムを正確に制御するためのマーカーを調節することは必須である。
【０００５】
「Ｄｈｕｐ」、インディアン・フランキンセンス又はインディアン・オリバナムとして知られるボスウェリアセラータ（Ｎ．Ｏ．Ｂｕｒｓｅｒａｃｅａｅ）のガム樹脂は、宗教的儀式や香料用途での長い使用の歴史を有する。アーユルヴェーダの伝統で長く知られるインディアン・フランキンセンスの健康用途は、過去３０年以上、西側社会に焦点が置かれており、ガム樹脂浸出液の標準化抽出物の幅広い用途を生じている。そのような抽出物は、健康的な老化をサポートするために栄養補助食品や化粧品の原料として使用される。栄養補助食品の最も人気のある用途は、正常な関節機能や機動性をサポートするために関節の健康をサポートする製品においてである。
【０００６】
最近の科学的証拠は、ボスウェリアセラータの健康に良い効果をますます支持する。典型的には、ボスウェリアセラータのガム含油樹脂浸出液は、セスキテルペノイド・エッセンシャルオイル（８〜１２％ｗ／ｗ）、多糖類（４５〜６０％ｗ／ｗ）及び高級テルペノイド（２５〜３５％ｗ／ｗ）を含有することが報告される。このガム樹脂の抽出物中のバイオマーカー構成物質は、ボスウェリア酸として知られる一群の五環トリテルペン化合物である。
【０００７】
ボスウェリア酸は、５−リポキシゲナーゼ酵素を抑制することが示され、この酵素は、アラキドン酸から炎症促進性ロイコトリエンの生成を触媒する。この機構に加えて、ボスウェリア酸は、また、酵素、ヒトの白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）の活性を減少させる。この二つの作用は、ボスウェリア酸に特有である（Ｓａｆａｙｈｉ，Ｈ等，１９９７）。数多くの炎症及び過敏症に基づくヒトの疾病においてロイコトリエン生成及びＨＬＥ放出が好中球刺激によって同時に増大するので、ボスウェリア酸による二つの炎症促進性酵素の報告された遮断と補体タンパク質及びマスト細胞安定化活性の有益な効果が、多くの前臨床及び臨床研究で実証化されている、ボスウェリア抽出物の健康によい効果の理屈であると一般に信じられている。ボスウェリアセラータガム樹脂の抽出物は、一般に、天然には樹脂質であり、バイオマーカーのボスウェリア酸（親油性化合物）は、水に不溶である。
【０００８】
米国特許公開２００３／０１８６９３２は、ボスウェリアセラータのガム樹脂浸出液から抽出された水溶性生物活性画分を記載する。それは、さらに、この画分とボスウェリア酸との等比（１：１）での組み合わせは、抗関節炎活性について相加効果を示し、相乗効果でないことを開示する。
【０００９】
米国特許第７５８２３１４は、ボスウェリア酸及びセレン元素を含む組成物を投与することにより、乾癬に冒された個人を治療する方法を記載する。
【００１０】
米国特許公開２００８／０２７５１１７は、ボスウェリア酸及び／又はそのアセテートを６５％超の量含む組成物の使用により関節炎を治療する方法を記載する。組成物は、また、さらに多糖類、及びｎ−オクチルアセテート、インセンソール、インセンソールアセテート、リナロール、ボルネオール、カンフェン、エレメン（ｅｌｅｍｅｎｅ）、カリオフィレン、インセンソールオキサイド、インセンソールオキサイドアセテート又はこれらの組み合わせを含むと言われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ボスウェリア種から得られるボスウェリア酸画分及び多糖類画分を含み、炎症促進性マーカーの下方調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）／抑制に増強作用を示す組成物を成就する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、酸化窒素、ＩＦＮ−γ及びＬＴＢ４のような炎症促進性マーカーの下方調節のためにボスウェリア種から得られるボスウェリア酸画分及び多糖類画分を含む組成物に関する。ボスウェリア酸画分は、濃度約６０％存在し、そして多糖類画分は、濃度約４０％存在する。
【００１３】
ボスウェリア酸画分及び多糖類画分を含む該組成物は、個々の画分と対比して活性の増強作用を示す。
【００１４】
本発明は、さらに、ＰＧＥ２の抑制のための多糖類画分単独又はボスウェリア酸画分との組み合わせの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ボスウェリア種から得られるボスウェリア酸画分の多回投与の処置ｂａｌｂ／ｃマウスから取った血清における細胞外ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＴＮＦ−a及びＩＬ−１β評価の効果。
【００１６】
【図２】ボスウェリア種から得られる多糖類画分の多回投与の処置ｂａｌｂ／ｃマウスから取った血清における細胞外ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＴＮＦ−a及びＩＬ−１β評価の効果。
【００１７】
【図３】本組成物の多回投与の処置ｂａｌｂ／ｃマウスから取った血清における細胞外ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＴＮＦ−a及びＩＬ−１β評価の効果。
【００１８】
【図４】ボスウェリア種から得られるボスウェリア酸画分の多回投与の処置ｂａｌｂ／ｃマウスから取った血清における細胞外ｉｎ  ｖｉｖｏＮＯ評価の効果。
【００１９】
【図５】ボスウェリア種から得られる多糖類画分の多回投与の処置ｂａｌｂ／ｃマウスから取った血清における細胞外ｉｎ  ｖｉｖｏＮＯ評価の効果。
【００２０】
【図６】本組成物の多回投与の処置ｂａｌｂ／ｃマウスから取った血清における細胞外ｉｎ  ｖｉｖｏＮＯ評価の効果。
【００２１】
【図７】ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物の、ラット（前足に注射した）のマイコバクテリウムツベルクリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｌｉ）誘発炎症促進性関節炎における抗関節炎活性（予防）の比較。
【００２２】
【図８】ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物を段階的用量レベルで処置したラットのマイコバクテリウムツベルクリ誘発炎症促進性関節炎の関節炎の前足組織ホモジネートから取った上澄におけるＴＮＦ−αの発現。
【００２３】
【図９】ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物を段階的用量レベルで処置したラットのマイコバクテリウムツベルクリ誘発炎症促進性関節炎の関節炎の前足組織ホモジネートから取った上澄におけるＰＧＥ２の発現。
【００２４】
【図１０】ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物を段階的用量レベルで処置したラットのマイコバクテリウムツベルクリ誘発炎症促進性関節炎の関節炎の前足組織ホモジネートから取った上澄におけるＬＴＢ４の発現。
【００２５】
【図１１】マイコバクテリウムツベルクリ誘発炎症促進性関節炎の動物の脾臓胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）のフローサイトメトリーによる、ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物の細胞内ＩＦＮ−γ発現の効果。
【００２６】
【図１２】ラット（前足に注射した）のマイコバクテリウムツベルクリ誘発発症炎症促進性関節炎における、ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物（効果用量）の抗関節炎活性（治療）。
【００２７】
【図１３】ボスウェリア酸画分及び本発明の組成物の水溶解性の比較を示す。
【００２８】
【図１４】本発明の組成物の調製工程を示すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、濃度約６０％のボスウェリア酸画分を及び濃度約４０％の多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む相乗的組成物に関する。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、ボスウェリア酸画分及び多糖類画分は、ボスウェリア種から得られる。
【００３１】
本発明のさらに別の実施態様では、ボスウェリア酸画分は、β−ボスウェリア酸、アセチル−β−ボスウェリア酸、１１−ケト−β−ボスウェリア酸及びアセチル−１１−ケト−β−ボスウェリア酸を含む。
【００３２】
本発明のさらに別の実施態様では、多糖類画分は、ガラクトース、アラビノース、Ｄ−グルクロン酸及び４−Ｏ−メチル−グルクロノアラビノ−ガラクタンを含む。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様では、薬学上許容可能な腑形剤は、滑沢剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、増量剤及び希釈剤、芳香剤、着色剤、流動促進剤、潤滑剤、防腐剤、収着剤、甘味剤並びにこれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００３４】
本発明のさらに別の実施態様では、本組成物は、液体、トローチ、ロゼンジ、粉体、顆粒、カプセル、タブレット、膏薬、ゲル、エマルション、クリーム、ローション、歯磨き剤、ドロップ、懸濁液、シロップ、エリキシル剤、フィトシューティカル及びニュートラシューティカル（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む群から選択される剤形に処方される。
【００３５】
本発明は、また、濃度約６０％のボスウェリア酸画分を及び濃度約４０％の多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む相乗的組成物を調製する方法であって、
ボスウェリア種からボスウェリア酸画分及び多糖類画分を得、
濃度約６０％ボスウェリア酸画分、及び、濃度約４０％多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに混合する工程を含む前記方法に関する。
【００３６】
本発明のさらに別の実施態様では、ボスウェリア酸画分は、β−ボスウェリア酸、アセチル−β−ボスウェリア酸、１１−ケト−β−ボスウェリア酸及びアセチル−１１−ケト−β−ボスウェリア酸を含む。
【００３７】
本発明のさらに別の実施態様では、多糖類画分は、ガラクトース、アラビノース、Ｄ−グルクロン酸及び４−Ｏ−メチル−グルクロノアラビノ−ガラクタンを含む。
【００３８】
本発明は、炎症促進性マーカーを下方調節／抑制するための方法であって、濃度約６０％のボスウェリア酸画分を及び濃度約４０％の多糖類画分を適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む前記方法に関する。
【００３９】
本発明のさらに別の実施態様では、ボスウェリア酸画分及び多糖類画分は、ボスウェリア種から得られる。
【００４０】
本発明の別の実施態様では、対象は、ヒトを含む動物である。
【００４１】
本発明の別の実施態様では、炎症促進性マーカーは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＦＮ−γ、酸化窒素及びＬＴＢ４を含む群から選択される。
【００４２】
本発明は、ＰＧＥ２を下方調節／抑制するための方法であって、多糖類単独、又は、ボスウェリア酸画分との組み合わせを適宜の薬学上許容可能な腑形剤とともに含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む前記方法に関する。
【００４３】
本発明のさらに別の実施態様では、ボスウェリア酸画分及び多糖類画分は、ボスウェリア種から得られる。
【００４４】
本発明の別の実施態様では、対象は、ヒトを含む動物である。
【００４５】
本発明は、また、上記組成物を単独に又は組み合わせて含有する栄養補助食品に関する。
【００４６】
本発明は、より水溶性のバージョンを関節の健康をサポートする高められた可能性（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｊｏｉｎｔ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をもって製造者に提供する既存の汎用のボスウェリア抽出物よりも改善を示す。この組成物は、有効成分について特異的な放出プロファイルを与える。ボスウェリア酸（ボスウェリア抽出物が従来標準化されている活性の基本）に加えて、ボスウェリアセラータのガム樹脂から取った多糖類画分は、また、生物活性を有し、そして水溶性である。多糖類画分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験で明らかにされるように、抽出物中のボスウェリア酸の健康によい役割を、単に加算される予想を超えたレベルで強化する。
【００４７】
ボスウェリア種から得られるボスウェリア酸画分及び多糖類画分を含む本組成物は、炎症促進性マーカーの下方調節を示す。本組成物は、組成物の個々の画分と対比して炎症促進性サイトカイン又はメディエーターの下方調節で強化された活性を示し、したがって、性質が相乗的である。ボスウェリア種の多糖類画分は、水溶性が活性であり、したがって、  ボスウェリア酸の溶解性を増し（図１３）、高濃度にてボスウェリア酸の毒性を下げ、そして、抗炎症促進性作用の持続を可能にする。
【００４８】
ボスウェリアガムは、エタノールで抽出され、このエタノール抽出物は、酸塩基で処理され、続いて、水洗してボスウェリア酸画分を得る。この工程で得られたへキサン残留物（オイル画分）は廃棄される。エタノールを用いたボスウェリアガムの抽出後に残存する搾りかすは、蒸留水で抽出され、そして、アルコールで沈殿させて、多糖類画分を得る。ボスウェリア酸画分及び多糖類画分を、それぞれ濃度約６０％及び４０％で混合して、本発明の組成物に到達する（図１４）。
【００４９】
ボスウェリア酸画分は、β−ボスウェリア酸、アセチル−β−ボスウェリア酸、１１−ケト−β−ボスウェリア酸及びアセチル−１１−ケト−β−ボスウェリア酸を含む。多糖類画分は、ガラクトース、アラビノース、Ｄ−グルクロン酸及び４−Ｏ−メチル−グルクロノアラビノ−ガラクタンを含む。
【００５０】
本組成物は、適宜、滑沢剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、増量剤及び希釈剤、芳香剤、着色剤、流動促進剤、潤滑剤、防腐剤、収着剤、甘味剤並びにこれらの組み合わせを含む群から選択される薬学上許容可能な腑形剤を含有してもよい。
【００５１】
本発明の組成物は、液体、トローチ、ロゼンジ、粉体、顆粒、カプセル、タブレット、膏薬、ゲル、エマルション、クリーム、ローション、歯磨き剤、ドロップ、懸濁液、シロップ、エリキシル剤、フィトシューティカル及びニュートラシューティカルを含む群から選択される剤形に処方される。
【００５２】
組成物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−β、酸化窒素、ＩＦＮ−γ、ＰＧＥ２、ＬＴＢ４等の炎症促進性マーカーのレベルを抑制する／下方調節する／減少させる潜在能力が試験された。
【００５３】
ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）は、組織の炎症に関与するサイトカインであり、急性相応答を刺激する。ＴＮＦ産生の調節は、癌をはじめとするさまざまなヒトの疾病に関係している。それは、ＬＰＳによって誘発される敗血症ショックの発病学に重要な役割を演ずる。
【００５４】
ＩＬ−１βは、生理学的免疫応答、及び、さまざまな免疫病理学的障害の発展の両方に関与する最も影響力の強い炎症促進性サイトカインである。ＩＬ−１βレベルをチェックすることは、炎症促進性、免疫学的及び骨の疾病を含むさまざまな疾病の管理及び診断に有用である。
【００５５】
酸化窒素：酸化窒素産生の適当なレベルは、肝臓等の臓器を虚血性障害から守るのに重要である。しかし、ＮＯ産生の持続レベルは、直接の組織毒性を生じ、敗血症ショックを伴う血管虚脱に寄与する。ＮＯの慢性の発現は、さまざまな癌腫、並びに若年性糖尿病、多発性硬化症、関節炎及び潰瘍性大腸炎を含む炎症促進性状態を伴う。
【００５６】
サイトカインや他のメディエーターを下方調節／減少させることにより、組成物は、関節炎、潰瘍性大腸炎、炎症促進性腸症候群（ＩＢＤ）、喘息（呼吸障害）のような高いレベルを示すさまざまな疾病／障害の管理に潜在的な用途を見出す。
【実施例】
【００５７】
さらに、以下の実施例の助けを借りて本発明を詳述する。しかし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと捉えてはならない。
実施例１：生物活性評価
急性安全性試験：
【００５８】
急性経口毒性試験をマウスで以下のＯＥＣＤガイドラインＮｏ．４２３［経済協力開発機構、化合物を試験するためのＯＥＣＤガイドライン、ガイドライン４２３、急性経口毒性−急性毒性クラス法、採択、１９９６年３月２２日（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＯＥＣＤ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ４２３，  ａｃｕｔｅ  ｏｒａｌ  ｔｏｘｉｔｙ−ａｃｕｔｅ  ｔｏｘｉｃ  ｃｌａｓｓ  ｍｅｔｈｏｄ，ａｄｏｐｔｅｄ，Ｍａｒｃｈ  ２２，１９９６）］にしたがって行った。動物を個々に、最初の２４時間は定期的に、最初の４時間は特別な注意をはらって観察し、その後は、毎日、全１４日間同時に観察した。１回量２０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．の本組成物を、雌性マウスの各群に経口投与したが、これらの試験動物の総全体挙動に変化はなかった。１回量５０００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．もまた評価した。実験動物のビヒクルコントロール群と比較した際、死亡率や正常挙動のいかなる変化もこの高い経口用量で観察されなかった。
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験：
実施例１：  マウスの好中球における細胞内Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−a評価：
【００５９】
テスト材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に供し、ここでは、フローサイトメトリー試験を行って、ヒストパック勾配によって全血から分離したマウスの好中球における細胞内ＴＮＦ−aサイトカイン発現のボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本発明の組成物の多回投与の効果を測定した。
【００６０】
細胞をＬＰＳで刺激し、段階濃度（μｇ／ｍｌ）を持つテスト材料とともに３時間ＣＯ２インキュベータ内でインキュベートした。透過性溶液を細胞に添加し、その後、これらを１０分間インキュベートした。細胞をその後、共役型抗マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体で標識化し、さらに３０分間のインキュベーションを暗所で行った。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、試料を直接、ＢＤ−ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，米国）上に重ねた。蛍光トリガーを好中球集団ゲートのＦＬ１パラメーターの上にセットし（１０，０００イベント）、そして、蛍光補正、データ分析及びデータ表示をＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  ソフトウエアを用いて行った。［Ｃｌａｒａ，Ｂ．，Ｒ．Ｃ．  Ａｒａｎｃｈａ，Ｇ．Ｍ．  Ａｎｄｒｅ´ｓ，Ｐ．Ａｔａｎａｓｉｏ，Ａ．Ｊｕｌｉａ，及びＯ．Ａｌｂｅｒｔｏ．２００３．直接免疫蛍光表面膜染色を用いるＴＮＦ−α−分泌細胞ｌを検出するための新規な方法（Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＴＮＦ−α−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇｓ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６４：７７−８７．］［Ｋｈｕｒｓｈｉｄ  Ａ．Ｂｈａｔ，Ｂｈａｈｗａｌ  Ａ．Ｓｈａｈ，Ｋｕｌｄｅｅｐ  Ｋ．Ｇｕｐｔａ，Ａｎｊａｌｉ  Ｐａｎｄｅｙ，Ｓａｒａｎｇ  Ｂａｎｉ，Ｓｕｂｈａｓｈ  Ｃ．Ｔａｎｅｊａ、ヒト好中球におけるＴＮＦ−ａサイトカイン発現の潜在的抑制としてのピニトールの半合成類似体（Ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｐｉｎｉｔｏｌ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．）、Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９  ２００９，  １９３９−１９４３］。表１、２及び３（フローサイトメトリー試験）に挙げられた結果から、本組成物は、ボスウェリア酸画分及び多糖類画分単独と比較したとき、ＬＰＳ刺激剤に応答したマウスの分離した好中球中へのＴＮＦ−aサイトカイン分泌抑制効果が最大を示したことが明らかである。２５、５０、１００、２００、４００及び８００μｇ／ｍｌ濃度ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物でｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した好中球は、２００μｇ／ｍｌの用量レベルにてそれぞれ、３０．５２％、２９．３１％及び５９．８３％のＴＮＦ−a抑制を示した。このデータから、個々の画分と対比して同じ用量の本組成物がＴＮＦ−aを抑制する高められた活性を示したことが明白である。
【表１】
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【表２】
2011178773.tif 000004
【表３】
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Ｉｎ−ｖｉｖｏ  試験：
実施例２：  処置マウスから取った血清における細胞外Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＴＮＦ−a、ＩＬ−１β  及び酸化窒素（ＮＯ）の評価
【００６１】
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスを２２±２℃で１２／１２ｈ明暗サイクルに保持した。マウスは、１００、２００、４００  ｍｇ／ｋｇの異なるテスト材料（ｗ／ｖ）すなわちボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本発明の組成物を６日間経口処置で受け付け、続いて、Ｂｒｉｅｖａ等，２００１によって記載された方法にしたがって１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを静脈内注射された。［Ｂｒｉｅｖａ  Ａ，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  Ａ，Ａｌｏｎｓｏ−Ｌｅｂｒｅｒｏ  ＪＬ及びＰｉｖｅｌ  ＪＰ．２００１．イムノフェロン、天然由来の複合糖質は、ＬＰＳ誘発ＴＮＦ−ａ産生及び炎症性応答を抑制する（Ｉｎｍｕｎｏｆｅｒｏｎ，ａ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｏｒｉｇｉｎ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＮＦ−ａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １．１９７９−１９８７］。各群に６匹のマウスを採用し、実験を３通り行った。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及び酸化窒素産生を、ＬＰＳ注射９０分後の各実験群の処置マウスから取った血清で、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）により評価した。３０  ｍｇ／ｋｇのロリプラムを標準薬として使用した。血清採集及び測定により、血清ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＮＯのレベルの有意な低下が明らかになり、これは、ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物について、炎症促進性応答の制御に関する広い種非依存性ｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示唆する。ともに、これらのデータは、血液中のＬＰＳ濃度の増大の応答する際の組成物の制御作用は、ＴＮＦ−a産生レベルにおいてだけではなく、さらに、ＬＰＳ刺激マウスのＩＬ−１β、別の炎症促進性サイトカイン及びＮＯのレベルの減少によっても確認され、ボスウェリア酸画分及び多糖類画分単独について観測されたよりも顕著であった（図１〜６）ことを示唆する。３０ｍｇ／ｋｇ用量レベルのロリプラムを標準薬として使用して、実験デザインの確実性及び再現性を観察した。
【００６２】
本組成物が疾病状態で働くことを示すために、以下の試験を行った。試験のために選択した疾病状態は、関節炎である。
実施例３：アジュバント誘発進行中炎症促進性関節炎：
【００６３】
６群の１２〜１４週齢、体重１４０〜１６０ｇのウイスターラットを試験に採用した。すべての動物を２２±２℃のプラスチックケージ内で、１２ｈ明暗サイクルで保持し、ペレットフード及び水をフリーアクセスとした。テスト材料を、実験期間中、１日１回経口投与した。すべての実験で、コントロール群を保持し（ビヒクル投与）、一方、他の群は、比較及び試験の確実性／信憑性のために、１日１回投与された標準薬のアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）を受け付けた。すべての試験は、実験動物倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）からの承認の後に行い、そして、実験で使用したすべての動物は、ヒトの世話を受けた。各群の中項（ｔｈｅ  ｍｅａｎ）の平均及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を計算し、その結果を、コントロール群に対する抑制％として表した。有意さを、スチューデントｔ検定を適用することにより統計的に測定した。
【００６４】
アジュバント関節炎は、液体パラフィン中蒸気殺傷されたマイコバクテリウムツベルクリの新規調製懸濁液（５．０ｍｇ／ｍｌ）の０．０５ｍｌを足底下部（ｓｕｂ−ｐｌａｎｔａｒ）注射することによって誘発した。［Ｎｅｗｂｏｕｌｄ  ＢＢ．マイコバクテリアアジュバントによりラットに誘発された関節炎の化学療法（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９６３；２１：１２７−３６］。注射した前足の容積を、事前及びアジュバント注射１４日目に定量化し、容積変化測定装置モデルＬＥ  ７５００Ｎ，Ｐａｎｌａｂ，スペインにより測定した。
【００６５】
ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物は、経口２００ｍｇ／ｋｇの用量レベルにて、浮腫の抑制に依存する用量を示した（図７及び表４）。本組成物は、コントロールと比較して、ラットのマイコバクテリウムツベルクリ誘発炎症促進性関節炎の浮腫の抑制４８％という高く有意な活性を示した。
【表４】
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実施例４：  １４日目の前足組織の進行中炎症促進性関節炎の均質化
【００６６】
各アッセイの均質化の前に、骨組織を含有する凍らせた前足の重量を計り、ドライアイス上で粉々に破砕した。１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のリン酸緩衝生理食塩水を含有する４ｍｌ／ｇの組織抽出バッファーに前足組織を添加した。組織を氷上でポリトロンで均質化し、ホモジネートを５０００ｇで１５分間遠心分離した。上澄を分析するまで−８０℃で保存した［Ａｎｊａｌｉ  Ｐａｎｄｅｙ，Ｓａｒａｎｇ  Ｂａｎｉ，Ｐｒａｂｈｕ  Ｄｕｔｔ，Ｋｒｉｓｈｎａ  Ａｖｔａｒ  Ｓｕｒｉ．アジュバント誘発関節炎組織におけるヒドロキシカビコールによるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン及び炎症性メディエーターの調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｖｉｃｏｌ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４９  （２０１０）  １１４−１２１］。
組織ホモジネートから取った上澄中のＴＮＦ−α、ＰＧＥ２及びＬＴＢ４の定量化：
【００６７】
動物の異なる群から取った１４日目の試料を、上記したサイトカインメディエーターの分析用に用意した。ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２及びＬＴＢ４を、サンドイッチ及び競合ＥＬＩＳＡ技術に基づく市場で手に入るキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，米国）を製造者インストラクションにしたがって用いて推定した。すべてのサイトカイン濃度は、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ，米国）上での４５０ｎｍの測色測定を用いて標準曲線からの内挿により行った。［Ａｎｊａｌｉ  Ｐａｎｄｅｙ，Ｓａｒａｎｇ  Ｂａｎｉ，Ｐｒａｂｈｕ  Ｄｕｔｔ，Ｋｒｉｓｈｎａ  Ａｖｔａｒ  Ｓｕｒｉ．アジュバント誘発関節炎組織におけるヒドロキシカビコールによるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン及び炎症性メディエーターの調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｖｉｃｏｌ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４９  （２０１０）  １１４−１２１］。［Ｍａｇａｒｉ  Ｋ，Ｍｉｙａｔａ  Ｓ，Ｏｈｋｕｂｏ  Ｙ，Ｍｕｔｏｈ  Ｓ．ラットコラーゲン誘発関節炎の進行中の前足組織中の炎症性サイトカインレベル、ＦＫ５０６の効果、Ｔ細胞活性化のインヒビター（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｐａｗ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ, ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＦＫ５０６，  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ  ２００４；  ５３：４６９−７４］。ボスウェリア酸画分は、関節炎にかかった動物のＴＮＦ−α及びＬＴＢ４の有意な減少を示したが、ＰＧＥ２には効果がなかった。多糖類画分は、ＴＮＦ−α及びＰＧＥ２レベルの中庸の減少を示したが、ＬＴＢ４に有意な抑制を示さなかった。一方、本組成物は、経口用量２００ｍｇ／ｋｇ用量で最大の抑制を示す用量依存したやり方でＴＮＦ−α、ＰＧＥ２及びＬＴＢ４レベルを有意に減少させた（図８、９及び１０）。
【００６８】
多糖類画分がＰＧＥ２の抑制効果を示したという発見は、本発明の驚くべき発見であり、したがって、新規である。多糖類画分単独、又は、ボスウェリア酸との組み合わせは、高レベルのＰＧＥ２抑制のせいで副作用を有する当業技術で知られている他の薬と違って中庸レベルにてＰＧＥ２を抑制するのに有用であることは、本試験から明らかである。
実施例５：フローサイトメトリーによる脾細胞中の細胞内ＩＦＮ−γ検出：
【００６９】
関節炎の原因論的な理由は、明白に評価されていないが、累積する証拠は、Ｔ細胞−媒介自己免疫応答が発病学に重要な役割を演じることを示唆する。［Ｐａｎａｙｉ  ＧＳ．関節リュウマチにおけるＴ細胞−依存性パスウエイ（Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｔｉｔｉｓ）、Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９７７；９：２３６−４０］。関節炎の治療の特殊特異性を増すために、サイトカインをターゲットにすることに重点が移行している。ＩＦＮ−産生Ｔｈ１細胞は、ヒト及びモデル動物の両方で関節炎の進行に重要なようである。［Ｇａｒｒａ  Ｏ．サイトカインは、機能的に不均質なＴヘルパー細胞亜集団の発達を誘発する（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ）。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９８；８：２７５−８３］。したがって、最近の治療戦略は、Ｔｈ１細胞の応答を調節することに焦点が置かれている。薬力学的試験は、多くの疾病状態のサイトカイン治療のための作用のありえる機構としてＴｈ１／Ｔｈ２調節を指摘する。［Ｌｉｓｓｏｎｉ  Ｐ，Ｍａｌｕｇａｎｉ  Ｆ，Ｍａｌｙｓｈｅｖａ  Ｏ．皮下低用量のインターロイキン−2、メラトニン及びナルトレキソンを用いた処置不能な転移性固型癌の神経免疫療法、オピオイドシステムをブロックすることによるインターロイキン−２誘発抗腫瘍免疫の調節（Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｕｎｔｒｅａｔａｂｌｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ，  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｎａｌｔｒｅｘｏｎｅ，  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｐｏｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２００２；２３：  ３４１−４．］、［Ｔａｂａｔａ  Ｎ，Ｔａｇａｍｉ  Ｈ，Ｔｅｒｕｉ  Ｔ．デヒドロエピアンドロステロンは、アトピー性皮膚炎においてサイトカイン産生のレギュレーターの一つである（Ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｍａｙ  ｂｅ  ｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  １９９７；２８９：  ４１０−４．］。細胞媒介免疫応答は、関節炎の進行の間の重要な役割を演じ［Ｗａｋｓｍａｎ  ＢＨ，Ｐｅａｒｓｏｎ  ＣＭ，Ｓｈａｒｐ  ＪＴ．  マイコバクテリアアジュバント−ＩＩの注射によりラットに誘発された関節炎及びもう一つの障害の研究：疾病は、外因性抗原に対するは種性免疫応答であるという証拠（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ−ＩＩ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｄｉｓｓｅｍｉｎ��ｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９６０；８５：４０３−１７］、そして、この応答の抑制、特にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されるＩＦＮ−γの抑制は、抗関節炎の活性を有する組成物と強い相関を示す。本組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により産生されるＩＦＮ−γの用量に関連する抑制を作った。
【００７０】
すべての試験群の動物から脾臓を無菌状態下でハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ，Ｓｉｇｍａ）内に採取し、均質な細胞懸濁液を得、そして、赤血球をＦＡＣＳ溶血用試薬（Ｌｙｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で溶解した。遠心分離（３８０ｇ、４℃、１０分間）後、ペレット化した細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、そして、完全培地［１２ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．１）、０．０５ｍＭの２−メルカプトメタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００ｌｇ／ｍｌのスプレプトマイシン及び１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０］に再懸濁した。細胞数を、トリパンブルー色素排除試験法により血球数計算器でカウントした。細胞の生存度は９５％を越えた。詳細には、脾細胞を９６ウエル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に２Ｘ１０６細胞／ｍｌシードした。３日後、脾臓のリンパ球を、５μｌのＰＥ結合抗マウスＩＦＮ−γ抗体で染色し、１μｌのＦＡＣＳ透過化溶液の存在下、４℃で３０分インキュベートした。分析をＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエアを使用したフローサイトメーター（ＢＤ，ＬＳＲ）で行った。［Ａｎｊａｌｉ  Ｐａｎｄｅｙ，Ｓａｒａｎｇ  Ｂａｎｉ，Ｐｒａｂｈｕ  Ｄｕｔｔ，Ｋｒｉｓｈｎａ  Ａｖｔａｒ  Ｓｕｒｉ．アジュバント誘発関節炎組織におけるヒドロキシカビコールによるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン及び炎症性メディエーターの調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｖｉｃｏｌ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４９  （２０１０）  １１４−１２１］。細胞内サイトカイン含量を査定するため、蛍光色素とともに脾細胞を培養した。予想どおり、コントロール群の関節炎には、ＩＦＮγ発現２６．７４％という高いパーセンテージを記録した。サイトカイン−産生リンパ球サブセットに関連したＩＦＮγの特徴を明確にするために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の中でもＩＦＮγ産生細胞を試験した。ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本組成物処理した脾細胞からは、段階的用量にて、かなり低いレベルの細胞内ＩＦＮγを記録した。最大の抑制は、２００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．用量での本組成物処置群で観察された（図１１）。
実施例６：アジュバント誘発の発症した炎症促進性関節炎：
【００７１】
関節炎は、上記したように、死んだマイコバクテリウムツベルクリの油を左後足の足底下部に注射することによって誘発される。疾病は、最初の１４日間で進行する。この期間は、薬を与えない。１５日目から、薬を２８日目まで動物に経口投与する。これは、発症した関節炎で試験材料の治療能力を示す試験である。［Ｎｅｗｂｏｕｌｄ，Ｂ．Ｂ．，１９６９．フェンクロジン酸、２−（−４−クロロフェニル）テラゾール−４−イラクティック酸の薬理学（Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｅｎｃｌｏｚｉｃ  ａｃｉｄ  ２−（−４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｅａｚｏｌ−４−ｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）：Ｉ．Ｃ．Ｉ．５４，４５０；Ｍｙａｌｅｘ：抗炎症性、鎮痛及び解熱作用をもった新規化合物（ａ  ｎｅｗ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ａｎａｌｇｅｓｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｐｙｒｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ３５，１８９−１９７］。絶対浮腫抑制を、ボスウェリア酸画分、多糖類画分及び本発明の組成物で処置した動物に観察された。しかし、本組成物が、発症した関節炎のラットにおいて最も優位な効果（絶対浮腫の抑制）を示した。
【００７２】
したがって、全体の結果は、本発明の組成物は、ボスウェリア酸画分及び多糖類画分よりもターゲットの有意な抑制を示すことを示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの最大効果は、１００及び２００μｇ／ｍｌであり、ｉｎ  ｖｉｖｏの最大効果は、実験動物において１００及び２００ｍｇ／ｋｇ動物体重／ｐ．ｏ．／日処置の用量であった。
【００７３】
本組成物は、それを必要とする個人に対して１日に２〜３回、最高５００ｍｇまでの投薬が提案される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【外国語明細書】
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