(57)【要約】      （修正有）【課題】標的分子相互作用物質の結合量が多く、標的分子との相互作用を効果的に行なうことができ、中性条件下でも全体的に均一な構造を有する標的分子相互作用物質固定化担体を提供。【解決手段】固相担体と、該固相担体に固定化された互いに結合してなる標的分子相互作用物質と水溶性重合体とを含む構造体、とを含む標的分子相互作用物質固定化担体。製造方法としては、（１）ホスホリルコリン類似基を有する所定のエチレン系不飽和重合性モノマーと、標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して結合している所定のエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成し、（２）該水溶性重合体と標的分子と相互作用する分子を混合し、（３）該混合物を、前記官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給して標的分子相互作用物質固定化担体を製造する。【選択図】図２
2011007785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体と、
該固相担体に固定化された互いに結合してなる標的分子相互作用物質と水溶性重合体とを含む構造体、
とを含む標的分子相互作用物質固定化担体であって、
前記水溶性重合体はスペーサーと重合性基を含む化合物の水溶性重合体であり、前記標的分子相互作用物質は該スペーサーを介して前記水溶性重合体に結合している、標的分子を捕捉・検出するための標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項２】
前記水溶性重合体は、標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して重合性基に結合してなる化合物の水溶性重合体であり、標的分子相互作用物質は前記官能基を介して水溶性重合体に結合している、請求項１に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項３】
スペーサーが下記式で表される、請求項１または２に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
-(Y)q-
ここで、Yは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示し、ｑは１〜２０の整数を示すが、ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【請求項４】
重合性基がアクリル基またはメタクリル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項５】
前記化合物が、下記一般式（II）で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーである、請求項４に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【化１】
2011007785.tif 000012
（式中Ｒ7は水素原子又はメチル基を示し、Ｗは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を示す。）
【請求項６】
前記水溶性重合体が、スペーサーと重合性基を含む化合物と、親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーとの共重合体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項７】
下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む方法により製造されることを特徴とする、請求項６に記載の標的分子相互作用物質固定化担体；
（１）親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーと、前記一般式（II）で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程
、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Wを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
【請求項８】
親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーが下記式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーである、請求項６または７に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【化２】
2011007785.tif 000013
（式中、Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。）
【請求項９】
水溶性重合体全体に対する、前記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来する構成単位の割合が、３０モル％以上であることを特徴とする、請求項８に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１０】
前記水溶性重合体が、さらに疎水性ユニットを有する不飽和重合性モノマーに由来する構成単位を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１１】
前記疎水性ユニットを有する不飽和重合性モノマーがｎ−ブチルメタクリレートである、請求項１０に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１２】
下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の標的分子相互作用物質固定化担体の製造方法；
（１）親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーと、前記一般式（II）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Ｗを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
【請求項１３】
下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む方法により製造されることを特徴とする、標的分子を捕捉・検出するための、標的分子相互作用物質固定化担体；
（１）下記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと、下記一般式（II）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、
【化３】
2011007785.tif 000014
（式中Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。）
【化４】
2011007785.tif 000015
（式中Ｒ7は水素原子又はメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示し、Ｗは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を示し、ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Ｗを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
【請求項１４】
前記（３）の工程により固相表面に供給された混合物を乾燥させる工程をさらに含む方法により製造される、請求項１３に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１５】
前記（１）の工程において、前記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、共重合に用いられる全モノマーの３０モル％以上であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１６】
前記（１）の工程において、さらに疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合させることにより製造される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１７】
前記疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマーがｎ−ブチルメタクリレートである請求項１６に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項１８】
下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に
記載の標的分子相互作用物質固定化担体の製造方法；
（１）下記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと、下記一般式（II）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、
【化５】
2011007785.tif 000016
（式中Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。）
【化６】
2011007785.tif 000017
（式中Ｒ7は水素原子又はメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示し、Ｗは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を示し、ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Ｗを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
【請求項１９】
標的分子が、標的分子相互作用物質を介して結合した、請求項１〜１１および１３〜１７のいずれか一項に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項２０】
標的分子が蛋白質、ペプチド、核酸および低分子化合物からなる群より選ばれる、請求項１９に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の標的分子相互作用物質固定化担体を含むバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的分子相互作用物質が固定化された担体及びその製造方法に関する。具体的には、センサーチップ、標的分子の分離精製用チップなどの標的分子相互作用物質が固定化されたバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
医療・診断、遺伝子解析、プロテオミクス、マイクロエレクトロニクス、膜分離等の分野においては、標的分子と当該標的分子と特異的に相互作用する物質との相互作用を用いて標的分子を検出することによる診断、検査、分析、精製等が行われている。このような標的分子の検出を適切に行なうために、これと相互作用する物質の固定化担体について、様々な技術が開発されている。
【０００３】
特に、標的分子相互作用物質（以下、これを単に「相互作用物質」と称することがある）の担持量や、相互作用物質を含有した微小空間（即ち、相互作用物質と標的分子との相互作用を効果的に行なうことのできる空間）の作製方法が検討されており、特許文献１には、相互作用物質とポリマーの混合溶液を基板に供給・濃縮して作製する、相互作用物質（タンパク質）とポリマーの凝集体が積層された状態で固定化されているチップが開示されている。このチップは、従来の方法と比べて相互作用物質の固定化量が増加し、その結果、標的分子と相互作用物質との間の相互作用を高感度に検出できるものであった。しかし、上記方法では、相互作用物質とポリマーの混合溶液を基板に供給・濃縮して作製する際に、供給した液滴の周囲の部分には厚い積層体が作製され、逆にスポット内部では積層構造が薄くなるという不均一性の問題が存在した。この現象は特に中性の条件下でチップを作製した際に顕著であった。この問題を解決するために、アルカリ性溶液を用いて該チップを作製する方法が提案されているが、アルカリ性で変性しやすいタンパク質を相互作用物質として用いる場合にはタンパク質の失活等が問題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO2006／038456号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、相互作用物質の結合量が多く、該相互作用物質を含有した微小空間が、相互作用物質と標的分子との相互作用を効果的に行なうことのできる空間であり、中性条件下でも全体的に均一な構造を有する構造体が固定化された担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、固相担体と、該固相担体に固定化された、互いに結合してなる標的分子相互作用物質と水溶性重合体とを含む構造体とを含み、前記水溶性重合体はスペーサーと重合性基を含む化合物の水溶性重合体であり、前記標的分子相互作用物質は該スペーサーを介して前記水溶性重合体に結合している標的分子相互作用物質固定化担体が上記課題を解決できることを見出した。より具体的には、（１）親水性又は両親媒性の官能基を有する所定の不飽和重合性モノマーと、相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して結合している所定の不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成し、（２）該水溶性重合体と相互作用物質を混合し、（３）該混合物を、相互作用物質又は水溶性重合体を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給することにより、上記課題を解決した標的分子相互作用物質固定化担体が製造できることを見出した。本発明は、これらの知見によるものである。
【０００７】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］固相担体と、
該固相担体に固定化された互いに結合してなる標的分子相互作用物質と水溶性重合体とを含む構造体、
とを含む標的分子相互作用物質固定化担体であって、
前記水溶性重合体はスペーサーと重合性基を含む化合物の水溶性重合体であり、前記標的分子相互作用物質は該スペーサーを介して前記水溶性重合体に結合している、標的分子を捕捉・検出するための標的分子相互作用物質固定化担体。
［２］前記水溶性重合体は、標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して重合性基に結合してなる化合物の水溶性重合体であり、標的分子相互作用物質は前記官能基を介して水溶性重合体に結合している、［１］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［３］スペーサーが下記式で表される、［１］または［２］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
-(Y)q-
ここで、Yは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示し、ｑは１〜２０の整数を示すが、ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
［４］重合性基がアクリル基またはメタクリル基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［５］前記化合物が、下記一般式（II）で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーである、［４］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【化１】
2011007785.tif 000003
（式中Ｒ7は水素原子又はメチル基を示し、Ｗは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を示す。）
［６］前記水溶性重合体が、スペーサーと重合性基を含む化合物と、親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーとの共重合体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［７］下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む方法により製造されることを特徴とする、［６］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体；
（１）親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーと、前記一般式（II）で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Wを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
［８］親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーが下記式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーである、［６］または［７］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
【化２】
2011007785.tif 000004
（式中、Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。）
［９］水溶性重合体全体に対する、前記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来する構成単位の割合が、３０モル％以上であることを特徴とする、［８］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１０］前記水溶性重合体が、さらに疎水性ユニットを有する不飽和重合性モノマーに由来する構成単位を含む、［６］〜［９］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１１］前記疎水性ユニットを有する不飽和重合性モノマーがｎ−ブチルメタクリレートである、［１０］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１２］下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む、［６］〜［１１］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体の製造方法；
（１）親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーと、前記一般式（II）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Ｗを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
［１３］  下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む方法により製造されることを特徴とする、標的分子を捕捉・検出するための、標的分子相互作用物質の標的分子相互作用物質固定化担体；
（１）下記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと、下記一般式（II）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、
【化３】
2011007785.tif 000005
（式中Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。）
【化４】
2011007785.tif 000006
（式中Ｒ7は水素原子又はメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示し、Ｗは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を示し、ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Ｗを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
［１４］  前記（３）の工程により固相表面に供給された混合物を乾燥させる工程をさらに含む方法により製造される、［１３］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１５］  前記（１）の工程において、前記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、共重合に用いられる全モノマーの３０モル％以上であることを特徴とする［１３］または［１４］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１６］前記（１）の工程において、さらに疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合させることにより製造される、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１７］前記疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマーがｎ−ブチルメタクリレートである［１６］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［１８］下記（１）〜（３）に示す工程を少なくとも含む、［１３］〜［１７］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体の製造方法；
（１）下記一般式（I）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーと、下記一般式（II）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、
【化５】
2011007785.tif 000007
（式中Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。）
【化６】
2011007785.tif 000008
（式中Ｒ7は水素原子又はメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示し、Ｗは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を示し、ｑは１〜２０の整数を示す。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）
（２）（１）の工程で得られた水溶性重合体と、標的分子相互作用物質とを混合する工程、
（３）（２）の工程で得られた混合物を、前記官能基Ｗを共有結合するための官能基又は標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程。
［１９］標的分子が、標的分子相互作用物質を介して結合した、［１］〜［１１］および［１３］〜［１７］のいずれかに記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［２０］標的分子が蛋白質、ペプチド、核酸および低分子化合物からなる群より選ばれる、［１９］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体。
［２１］［１９］または［２０］に記載の標的分子相互作用物質固定化担体を含むバイオチップ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る標的分子相互作用物質固定化担体は、従来の製造法で製造されたものと比べて、相互作用物質の担持量が多い。本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、相互作用物質を含有した微小空間が、相互作用物質と標的分子との相互作用を効果的に行なうことのできる空間である。本発明に係る標的分子相互作用物質固定化担体は、中性条件下でも均一な構造の構造体を有しているので、タンパク質などを相互作用物質として用いる場合に、特にその活性を保ったまま担持させることができる。本発明に係る標的分子相互作用物質固定化担体を用いることによりタンパク質等を相互作用物質とした診断、検査、分析、精製において、従来の標的分子相互作用物質固定化担体に比べて格段に標的分子との接触効率が高く、診断・検査・分析においては均一で再現性の高いシグナルを得られるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）〜（ｃ）はいずれも、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体の一例の表面近傍を拡大して示す模式図である。
【図２】ポリマーＡとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体が固定化されたウェルと、ポリマーＢとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体が固定化されたウェルと、ポリマーＣとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体が固定化されたウェルと、マウスＩｇＧのみが固定化されたウェルにおける、プロテインＡの捕捉量の比較データを示す図である。
【図３−１】ポリマーＡとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＢとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＣとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、マウスＩｇＧのみをスポットした金基板とにおける、スポットのイメージング像の比較データを示す図である。
【図３−２】ポリマーＡとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＢとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＣとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、マウスＩｇＧのみをスポットした金基板とにおける、相互作用物質構造体又はマウスＩｇＧの固定化量の比較データを示す図である。
【図３−３】ポリマーＡとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＢとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＣとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、マウスＩｇＧのみをスポットした金基板とにおける、プロテインＡの捕捉量の比較データを示す図である。
【図４】ポリマーＢとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＣとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、マウスＩｇＧのみをスポットした金基板（２Ｄ）とにおける、プロテインＡの捕捉量の比較データを示す図である。
【図５】ポリマーＢとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体のスポット、ポリマーＣとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体のスポット、およびマウスＩｇＧのみのスポットにおいて、結合した標的分子に由来するＣｙ５の蛍光画像を示す図である（写真）。
【図６】ポリマーＤとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板と、ポリマーＥとマウスＩｇＧが結合した相互作用物質構造体をスポットした金基板とにおける、プロテインＡの捕捉量の比較データを示す図と結合した標的分子に由来するＣｙ５の蛍光画像を示す図（写真）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［I  本発明の標的分子相互作用物質固定化担体］
本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、固相担体と、該固相担体に固定化された互いに結合してなる標的分子相互作用物質（以下、単に相互作用物質と呼ぶこともある）と水溶性重合体とを含む構造体、とを含む標的分子相互作用物質固定化担体であって、前記水溶性重合体はスペーサーと重合性基を含む化合物の水溶性重合体であり、前記標的分子相互作用物質は該スペーサーを介して前記水溶性重合体に結合している、標的分子を捕捉・検出するための標的分子相互作用物質固定化担体である。
ここで、水溶性重合体が標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して重合性基に結合してなる化合物の水溶性重合体であり、標的分子相互作用物質は前記官能基を介して水溶性重合体に結合していることが好ましい。
さらに好ましくは、水溶性重合体は標的分子相互作用物質がスペーサーを介して重合性基に結合してなる化合物と、親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーとの共重合体である。
本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、好ましくは、親水性または両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーと、相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して結合している所定の不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、該水溶性重合体と相互作用物質とを、所定の媒質中に共存させる工程（以下適宜、「混合工程」という）、混合工程で得られた混合物を、相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程を少なくとも含む方法により製造される。
本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、より好ましくは、ホスホリルコリン類似基を有する所定のエチレン系不飽和重合性モノマーと、相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して結合している所定のエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合させて水溶性重合体を合成する工程、該水溶性重合体と相互作用物質とを、所定の媒質中に共存させる工程、混合工程で得られた混合物を、相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相表面に供給する工程を少なくとも含む方法により製造される。
【００１１】
上記混合物が供給された固相表面上には、相互作用物質と、水溶性重合体とからなる鎖から構成される構造体（以下、相互作用物質構造体とよぶことがある）が形成されている。前記鎖は、特開２００６−１１３０５０号公報の［００８９］段落に記載されているもの等で、相互作用物質と水溶性重合体とが互いに結合してなるものである。水溶性重合体に相互作用物質がスペーサーを介して結合し、その構造の繰り返しによって鎖状及び／又は網目状の構造が形成される。
この鎖が、例えば集合したり結合したりすることによって、本発明における相互作用物質構造体のマトリックス構造（マトリックス）が構成されている。即ち、本発明における相互作用物質構造体は、図１（ａ）〜図１（ｃ）に模式的に示すように、相互作用物質と水溶性重合体とを含む構造体であり、その骨格は相互作用物質と水溶性重合体とが結合して構成された鎖により形成されている。これにより、本発明における相互作用物質構造体は、当該鎖が、鎖状及び／又は網目状に結合した構造を有するマトリックスとして構成されているのである。
なお、図１（ａ）〜図１（ｃ）は、本発明における相互作用物質構造体のマトリックス構造を説明するため、固相担体に固定化した本発明における相互作用物質構造体の一例の表面近傍を拡大して示す模式図である。また、図１（ａ）〜図１（ｃ）において、円形部分が相互作用物質を表わし、線状部分が水溶性重合体を表わす。また、線状部分のうち点線部分がスペーサーを表す。
【００１２】
以下、本発明における相互作用物質構造体の鎖及び当該鎖から構成されるマトリックス構造について説明する。
上述したように、本発明における相互作用物質構造体は、相互作用物質及び水溶性重合体からなる鎖を有する構造体である。また、本発明における相互作用物質構造体の鎖は、マトリックス構造の骨格を構成するもので、具体的には相互作用物質と水溶性重合体とが互いに結合してなるものである。詳しくは、水溶性重合体に相互作用物質がスペーサーを介して結合し、その構造の繰り返しによって鎖状及び／又は網目状の構造を形成したものである。
よって、本発明における相互作用物質構造体は、通常、下記式（Ａ）で表わされる部分構造を２以上有する。
Ｒ1−Ｒ2      （Ａ）
｛上記式（Ａ）において、Ｒ1は相互作用物質を表わし、Ｒ2は水溶性重合体を表わす。ただし、相互作用物質構造体が固相担体に結合している場合、Ｒ2は固相担体に直接結合していない水溶性重合体を表わす。また、各Ｒ1，Ｒ2はそれぞれ同じであっても異なっていても良い。｝
即ち、本発明における相互作用物質構造体は、上記式（Ａ）のように相互作用物質と水溶性重合体とが結合した部分構造が、直鎖状及び／又は網目状に結合した構造体であることが好ましい。具体的には、上記式（Ａ）のＲ1はそれぞれ独立に他の１又は２以上のＲ2に結合し、Ｒ2はそれぞれ独立に他の１又は２以上のＲ1に結合していることが好ましい。ただし、本発明における相互作用物質構造体は、例えば相互作用物質Ｒ1同士や水溶性重合体Ｒ2同士が結合した部分構造を含んでいてもかまわない。ここで、Ｒ1同士やＲ2同士の結合とは、分子間引力、疎液相互作用、電気的相互作用等の物理的相互作用による結合を示す。
したがって、本発明における相互作用物質構造体は、水溶性重合体同士の間には相互作用物質が存在し、また、相互作用物質同士の間には水溶性重合体が存在する橋架け構造を少なくとも一部に有していることが好ましい。そして、相互作用物質及び水溶性重合体の両方によって、マトリックス構造の鎖が構成されていることが好ましい。
【００１３】
相互作用物質構造体が相互作用物質と水溶性重合体とからなる鎖を有していることは、例えば、以下の方法により確認することができる。
本発明における相互作用物質構造体は、上述したような相互作用物質と水溶性重合体とからなる鎖を有しているため、その構成要素である相互作用物質の結合を分解することにより構造が崩壊する。これを利用し、相互作用物質構造体の相互作用物質のみを分解するようにすれば、相互作用物質と水溶性重合体とからなる鎖を確認することができる。例えば、水溶性重合体を分解しないようにしながら相互作用物質を分解した場合、本発明における相互作用物質構造体では、相互作用物質構造体が大きく崩壊する。さらに崩壊したものを調べることにより、相互作用物質構成要素以外の相互作用物質構造体を構成する化合物を特定することができる。さらに、水溶性重合体を分解しないようにしながら相互作用物質を分解した場合、本発明における相互作用物質構造体では、水溶性重合体のうち、固相担体に対して相互作用物質を介して固定化されていた部分は固相担体から脱離する。
【００１４】
したがって、具体的には、水溶性重合体が分解されず相互作用物質のみが分解を受ける酵素やその他の薬品により相互作用物質を分解し、この処理により固相担体から脱離した物質を調べること、又は、固相担体表面に残留している物質を調べることにより、相互作用物質構成要素以外の相互作用物質構造体を構成する化合物を特定できる。相互作用物質構造体が相互作用物質と水溶性重合体とからなる鎖を有していれば、脱離した物質または固相担体表面に残留している物質のなかに水溶性重合体が検出される。
【００１５】
上記の方法で用いる、相互作用物質を分解するための酵素や薬品は、用いた相互作用物質や水溶性重合体の種類に応じて任意のものを適当に用いればよい。その具体例を挙げると、相互作用物質が核酸である場合、例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等の核酸分解酵素などが挙げられる。
また、相互作用物質が蛋白質である場合、例えば、微生物プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、レンネット、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素、臭化シアン、２−ニトロ−５−チオシアン安息香酸、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム等のタンパク質分解能を有する化学物質などが挙げられる。
さらに、相互作用物質が脂質である場合、例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼＡ２等の脂質分解酵素などが挙げられる。
また、相互作用物質が糖である場合、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ等の糖分解酵素などが挙げられる。
なお、相互作用物質を分解するための酵素や薬品は、１種を単独で用いても良く、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用しても良い。
ただし、例示物の中でも、相互作用物質だけでなく水溶性重合体も分解する虞があるものは、上記の鎖の確認が正確に行なえなくなる虞があるため、使用は避けるべきである。
【００１６】
また、相互作用物質を分解し、分解後に固相担体上に残留している物質を確認する場合、その具体的な確認方法は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）、電子顕微鏡、エリプソメトリーなどによる測定によって確認することができる。
さらに、相互作用物質分解後に固相担体から脱離した物質の分析をする場合、その具体的な分析方法は任意であるが、例えば、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析（ＭＳ）、赤外分光法、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、吸光度測定、蛍光測定、元素分析、アミノ酸定量などが挙げられる。また、分析に際しては、各測定手法を単独で用いても良く、２種以上を任意に組み合わせて行なってもよい。
【００１７】
[I−１  水溶性重合体]
本発明における水溶性重合体とはスペーサーと重合性基を含む化合物の水溶性重合体であり、好ましくは標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して重合性基に結合してなる化合物をモノマー（以下、これを「スペーサー付きモノマー」あるいは「第１モノマー」と称することがある）に用いて重合反応を行うことにより得られる水溶性重合体である。ただし、相互作用物質が官能基と反応してスペーサーに結合すると官能基は水溶性重合体の構成要素ではなくなる。
ここで、スペーサーとしては下記式で表される構造が挙げられる。
-(Y)q-
【００１８】
ここで、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基又はアルキレン基を示す。ｑは１〜２０の整数を示すが、より好ましい標的分子捕捉効果が得られ、より効率よく水溶性重合体を合成できる範囲は２〜８である。ｑが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、又は異なるアルキレンオキシ基の連鎖であってもよい。スペーサーの好ましい構造としてはポリオキシエチレン等が挙げられる。特に、第１モノマー単独で重合させて水溶性重合体を得る場合にはスペーサーはポリアルキレンオキシ基である必要がある。
【００１９】
重合性基としては単独または他の重合性基と反応して重合反応できる基であればよいが、付加重合性基が好ましく、アクリル基、メタクリル基またはこれらを含む基がより好ましい。
【００２０】
標的分子相互作用物質を共有結合するための官能基がスペーサーを介して重合性基に結合してなる化合物として具体的には、下記一般式（ＩＩ）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーが挙げられる。
【化７】
2011007785.tif 000009
ここで、Ｒ7は水素原子又はメチル基を示す。
【００２１】
式（II）における-(Y)q-の定義および好ましい例は上述したとおりであるが、もし、スペーサーが無く（ｑが０の場合）、主鎖に直接活性エステルが結合しているモノマー（例えば、N- acryloyloxysuccinimide）を用いて水溶性重合体を合成したとしても、中性ｐ
Ｈ領域の媒質中において、相互作用物質を効率的に結合することができない。
これは、疎水性であるスクシンイミド基が水溶性重合体内部に埋もれてしまい、相互作用物質と接触、結合することが困難になるためである。特に、後述する第２モノマーとしてホスホリルコリン類似基を用いた水溶性重合体の場合には、ホスホリルコリン類似基が比較的バルキーであるために、さらにこの傾向が強い。
【００２２】
Ｗは標的分子相互作用物質と共有結合できる官能基を示す。官能基としては、上記の相互作用物質と共有結合可能なものであれば他に制限はなく、任意の官能基を用いることができる。通常は、相互作用物質の種類や本発明における相互作用物質が結合した水溶性重合体（以下、相互作用物質構造体とよぶことがある）の用途などに応じて適当なものを選択することが好ましい。なお、官能基は、１種を単独で用いても良く、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で用いても良い。
【００２３】
好ましい官能基としては、活性エステル基が挙げられる。活性エステル基の具体例としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、コハク酸イミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基等が挙げられる。相互作用物質がタンパク質である場合、通常は、タンパク質の表層に存在するアミノ基と、上記活性エステル基とが結合する。また、相互作用物質が核酸である場合も、通常は、核酸の末端に導入されるアミノ基と、上記活性エステル基とが結合する。さらに、相互作用物質が糖である場合も、通常は、糖の側鎖に存在するアミノ基と、上記活性エステル基とが結合する。
【００２４】
本発明における水溶性重合体は、前記第１モノマーと、親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマー（以下、これを「第２モノマー」と称することがある）との共重合により得られる水溶性重合体であることが好ましい。
【００２５】
水溶性重合体を構成する第２モノマーは、親水性の官能基を有する不飽和重合性モノマー又は両親媒性の不飽和重合性モノマーであれば特に限定されない。親水性又は両親媒性の官能基を有する不飽和重合性モノマーの具体例を挙げると、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、p-スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、（メタ）アクリロニトリル、Ｎ−（メタ）アクリロイルモルホリン、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−アセトアミド、ポリエチレングリコールモノ−（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸グリシジル、Ｎ-アクリロイルモルホリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等が挙げられる。
【００２６】
本発明における水溶性重合体の例としては、少なくとも、下記一般式（Ｉ）で表わされるホスホリルコリン類似基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び下記一般式（ＩＩ）で表わされるエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合体が挙げられる。
【化８】
2011007785.tif 000010
【化９】
2011007785.tif 000011
【００２７】
式中Ｒ1は炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を示し、Ｒ2は炭素数１〜４の２価の炭化水素基を示し、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、Ｒ6は水素原子又はメチル基を示す。ここで、Ｒ1として具体的には、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられるが、エチレン基であることが好ましい。Ｒ2として具体的には、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられるが、エチレン基であることが好ましい。Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5として具体的には、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられるが、メチル基であることが好ましい。
【００２８】
上記（Ｉ）で表わされる化合物として、具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、２−メタクロイルオキシアリルホスホリルコリン、２−メタクロイルオキシブテニルホスホリルコリン、２−メタクロイルオキシヘキセニルホスホリルコリン、２−メタクロイルオキシオクテニルホスホリルコリン、２−メタクロイルオキシデセニルホスホリルコリン等が挙げられるが、このうち２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましく用いられる。
【００２９】
上記式（Ｉ）、（II）で表わされる化合物は、市販のものを用いても良いし、当業者に周知の方法で調製したものを用いてもよい。
【００３０】
前記一般式（II）に示すスペーサーを有するエチレン系不飽和重合性モノマーを用いることで、親水性基又は両親媒性基よりも疎水性であるスクシンイミド基が水中に露出し、相互作用物質（タンパク質等）と接触しやすくなるなど、親水性基又は両親媒性基の立体障害を回避することができ、中性でも効率的に相互作用物質を結合することができる。特に、第２モノマーとしてホスホリルコリン類似基を用いる場合には、この傾向が顕著である。
【００３１】
前記水溶性重合体は、さらに疎水性ユニット（以下、これを「第３モノマー」と称することがある）を有することが好ましい。疎水性ユニットとは、疎水性ユニットを有する不飽和重合性モノマーに由来する構成単位を意味するが、具体的には疎水性基を有するメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、2−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香環（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等のポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体、メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体等が挙げられる。これらは単独若しくは２種以上の混合物として用いても良い。このうちｎ−ブチルメタクリレートが好ましく用いられる。疎水性ユニットは、造膜性を付与することと、疎水性である活性エステル基よりも、さらに疎水性の高いユニットが高分子鎖に導入されるため、活性エステルがより水中に露出しやすくなるため好ましい。
【００３２】
また、モノマー同士が結合しないように、過度の熱を加えることや、強力な紫外線を照射することを防ぐことも好ましい。
【００３３】
本発明における水溶性重合体は、上記モノマーを、それ自体既知の通常用いられる方法によって重合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、モノマーをラジカル重合させる場合、通常はラジカル重合開始剤を混合することにより重合を開始させる。用いるラジカル重合開始剤は、本発明の効果を著しく損なわない限り任意のものを用いることができる。使用できるラジカル系重合開始剤の例としては、２，２'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２'−アゾビス−（２−メチルプロパンニトリル）、２，２'−アゾビス−（２，４−ジメチルペンタンニトリル）、２，２'−アゾビス−（２−メチルブタンニトリル）、１，１'−アゾビス−（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２'−アゾビス−（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）、２，２'−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２'−アゾビス−（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド等のアゾ（アゾビスニトリル）タイプの開始剤、過酸化ベンゾイル、クメンヒドロペルオキシド、過酸化水素、過酸化アセチル、過酸化ラウロイル、過硫酸塩（例えば過硫酸アンモニウム）、過酸エステル（例えばｔ−ブチルペルオクテート、α−クミルペルオキシピバレート及びｔ−ブチルペルオクテート）等の過酸化物タイプの開始剤などが挙げられる。ラジカル重合開始剤の添加濃度は１〜１００ｍＭが好ましい。
【００３４】
さらにレドックス系開始剤を混合することにより重合を開始させてもよい。レドックス系開始剤も、本発明の効果を著しく損なわない限り任意のものを用いることができ、その例としては、アスコルビン酸／硫酸鉄（II）／ペルオキシ二硫酸ナトリウム、第三ブチルヒドロペルオキシド／二亜硫酸ナトリウム、第三ブチルヒドロペルオキシド／Ｎａヒドロキシメタンスルフィン酸が挙げられる。なお、個々の成分、例えば還元成分は、混合物、例えばヒドロキシメタンスルフィン酸のナトリウム塩と二亜硫酸ナトリウムとの混合物であってもよい。
【００３５】
本発明における水溶性重合体としては、上記第１モノマー単独、第１及び２モノマー、あるいは第１〜３モノマーを重合させた重合体のうち、水溶性であるのものをいう。ここで、水溶性とは重合体の少なくとも一部の量が水に溶解していればよく、残りは水に分散していてもよい。標的分子相互作用物質固定化担体の製造時に用いる媒質は任意であるが、通常は、溶媒や分散媒等の媒質として水を用いるためである。
【００３６】
前記重合体を水溶性とするには、具体的には、例えば、上記第２モノマーが、重合させるモノマー全体の３０モル％以上、好ましくは４０モル％以上、さらに好ましくは５０モル％以上に調製して上記共重合を行う方法が用いられる。共重合させる場合の溶媒としては、例えば、エタノール等のアルコール系溶媒が用いられ、反応条件は、用いる重合開始剤あるいはモノマーの種類によって適宜選択することができる。共重合反応に供するモノマーの量比としては、第１モノマーと第２モノマーとを共重合させて水溶性重合体を調製する場合においては、第２モノマーが３０〜９９モル％、好ましくは４０〜９９モル％、さらに好ましくは５０〜９９モル％、最も好ましくは６０〜９９モル％であり、第１モノマーが１〜７０モル％、好ましくは１〜６０モル％、さらに好ましくは１〜５０モル％、最も好ましくは１〜４０モル％（但し第１モノマーと第２モノマーの合計を１００モル％とする）である。
さらに第１モノマーと第２モノマーと第３モノマーとを共重合させて水溶性重合体を調製する場合においては、第２モノマーが３０〜９０モル％、好ましくは４０〜９０モル％、さらに好ましくは６０〜９０モル％であり、第１モノマーが１〜６０モル％、好ましくは１〜４０モル％、さらに好ましくは１〜２０モル％であり、第３モノマーが１０〜５０モル％、好ましくは２０〜３５モル％（但し第１モノマーと第２モノマーと第３モノマーの合計を１００モル％とする）である。具体的には、第２モノマーとして２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と称することがある）を用い、第１モノマーとして、Ｍｅｔｈａｃｒｙｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（以下、「ＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ」と称することがある）を用い、さらに第３モノマーとしてｎ−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と称することがある）を用いる場合には、例えばＭＰＣを３０〜９０モル％、好ましくは４０〜９０モル％、さらに好ましくは６０〜９０モル％、ＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳを１〜６０モル％、好ましくは１〜４０モル％、さらに好ましくは１〜２０モル％、ＢＭＡを１０〜５０モル％、好ましくは２０〜３５モル％（但しＭＰＣとＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＢＭＡの合計を１００モル％とする）とすることができる。
【００３７】
これらモノマーは、適当な溶媒に懸濁して重合開始剤を添加した後、５０〜８０℃で、２〜６時間静置することにより共重合反応を行う。溶媒としては、モノマー、開始剤、重合してできた重合体を溶解するものであれば特に制限なく用いることができるが、具体的には、例えば、エタノール等のアルコール系溶媒が好ましく用いられる。溶媒量としては、上記モノマーが十分に共重合できるような量を適宜選択することができるが、具体的にはモノマーの全体量に対して１〜２０倍程度を用いることが好ましい。
【００３８】
かくして得られる水溶性重合体は、それ自体既知の通常用いられる方法により精製することが好ましい。具体的には、クロロホルム−エーテル混合溶媒（２：８程度）により再沈殿を行い、沈殿物を回収して減圧乾燥する方法等が用いられる。
【００３９】
また、上記水溶性重合体は、無電荷であることが望ましい。水溶性重合体が相互作用物質と同じ電荷（同符号の電荷）を有していると、静電的反発力により、水溶性重合体と相互作用物質との結合が妨げられる可能性がある。一方、水溶性重合体が相互作用物質と反対の電荷（逆符号の電荷）を有していると、相互作用物質と水溶性重合体内の電荷を有する部分とが静電的引力により結合してしまい、水溶性重合体が有している活性エステル基に相互作用物質が効果的に結合することを妨げる可能性がある。また、水溶性重合体と相互作用物質との静電的引力による結合は、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体を分離精製に用いる場合、使用時に用いる溶液のｐＨや塩などの添加物により、容易に結合が壊れてしまうことがありえるものと予想される。
【００４０】
なお、水溶性重合体が無電荷であるとは、少なくとも構造式上、非イオン性もしくは両性イオン性（正及び負の両方の電荷を有しており、お互いの電荷が実質打ち消しあっているもの）であれば、当該水溶性重合体は無電荷である。ただし、本発明における相互作用物質構造体の製造過程において、活性エステル基の加水分解等により、水溶性重合体が電荷をもったとしても、本発明の効果を損なわない限り、このような水溶性重合体は好適に用いることができる。
【００４１】
水溶性重合体の分子量や構造等は特に制限は無く任意である。したがって、水溶性重合体として例えば低分子量の重合体（オリゴマー）を用いても良いが、その場合、固定化しようとする一つの相互作用物質内のみで架橋してしまい、効率的に鎖を形成できなくなって、本発明における相互作用物質構造体を形成できなくなる可能性がある。また、相互作用物質内で架橋すると、該相互作用物質の活性が保持されない可能性もある。これを防止する観点からは、水溶性重合体の重量平均分子量としては、通常１０００以上、好ましくは１００００以上、また、通常１００万以下、好ましくは５０万以下、さらに好ましくは２５万以下である。なお、分子量の測定には種種の方法が使える。尚、本明細書における分子量は、実施例に記載の方法で、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）により測定した分子量を意味する。
【００４２】
また、水溶性重合体の一部が媒質中に分散している場合において、水溶性重合体の大きさに制限は無く、本発明の効果を著しく損なわない限り任意である。ただし、効果的に相互作用物質と水溶性重合体とを結合させるためには、溶媒や分散媒などの液体（ここでは、媒質）中に混和した状態において、水溶性重合体の径は、通常１ｎｍ以上、好ましくは２ｎｍ以上、より好ましくは、３ｎｍ以上であることが望ましい。また、上限に特に制限は無いが、通常１μｍ以下である。
【００４３】
これらの水溶性重合体の大きさの測定には、種種の方法が使用できるが、静的光散乱測定法などにより調べることができる。
【００４４】
さらに、水溶性重合体が有する活性エステル基の量は、特に限定されず、また水溶性重合体の種類によって一概には規定できないが、例えば水溶性重合体として分子量１０００以上の高分子を用いた場合、水溶性重合体が相互作用物質と効率よく結合でき、かつ、溶媒や分散媒などに混和できるようにするため、水溶性重合体に対して、モル％で、０．０５％、好ましくは０．１％、より好ましくは０．５％以上、さらに好ましくは１％以上、かつ、４０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００４５】
［I−２  標的分子相互作用物質］
標的分子相互作用物質（相互作用物質）は、その目的に応じて、本発明の効果を著しく損なわない限り任意の物質を用いることができる。例えば、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体を標的分子の精製などの用途で用いる場合には、標的分子と結合する物質が用いられ、該結合作用を利用して、標的分子の分離精製を行なうようにする。
【００４６】
標的分子とは、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体により捕捉、検出する目的対象であれば何れのものでもよい。具体的には、蛋白質、ペプチド、核酸、酵素、抗体、低分子化合物等が挙げられる。ここで、「相互作用」とは、特に限定されるものではないが、通常は、共有結合、イオン結合、キレート結合、配位結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる物質間に働く力による作用を示す。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。標的分子は、既知のものでも未知のものでもよい。標的分子が未知の場合としては、例えば、これと相互作用する物質として医薬品化合物や医薬品候補化合物、基質が特定されていない受容体等を担持させ、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体を標的分子の特定（スクリーニング）に用いることができる。
【００４７】
標的分子と相互作用物質との組み合わせとしては、酵素と基質、抗体と抗原分子（エピトープ）、レクチンと糖、レセプターとリガンド、プロテインＡ、プロテインＧあるいはプロテインＡ／ＧとＦｃ、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質とビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオン、アルブミンとアルブミン結合化合物、マルトース結合タンパク質とマルトース、Ｇタンパク質とグアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチドとニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、ＤＮＡ結合タンパク質とＤＮＡ、抗体、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質とＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質とエストラジオールなどの各種受容体タンパク質とそのリガンド、細胞と細胞結合物質、アポ酵素と補酵素、核酸と該核酸に相補的な配列を有する核酸、等が挙げられる。
【００４８】
相互作用物質としてアルブミンを用いた場合は担体への非特異的吸着を抑制することができる。また、相互作用物質としてアビジンを用いれば、ビオチン化した別の相互作用物質又はその他の化合物を容易に且つ多量に固定化した担体を構成することができる。また、相互作用物質にプロテインＡを用いれば、抗体を容易に且つ多量に固定化した担体を構成することができる。
【００４９】
[I−３  混合工程］
混合工程では、所定の媒質中において、相互作用物質と、水溶性重合体とを共存させる。相互作用物質は、通常は、何らかの溶媒に相互作用物質を溶解もしくは分散させた溶液、又は分散液として用意する。この場合に相互作用物質を希釈する溶媒や分散媒は、相互作用物質の活性や構造の安定性等を考慮して調製することが好ましい。混合工程において、相互作用物質と、水溶性重合体とを、所定の媒質中に共存させることで、相互作用物質を水溶性重合体が有する官能基を介して結合させることができ、これにより相互作用物質構造体を得ることができる。なお、水溶性重合体が有する官能基は全て相互作用物質と反応する必要はなく、相互作用物質構造体において一部残存していてもよい。ただし、標的分子を相互作用させる際には残存していないことが望ましいので、一部残存している場合は標的分子を相互作用させる前に官能基を標的分子と反応しない基に変換することが好ましい。本明細書においては、相互作用物質と水溶性重合体とが結合する際の場を形成する物質を「媒質」と広義に呼ぶものとする。
【００５０】
混合工程においては、相互作用物質構造体に効率よく微小空間を形成させるために、さらに非結合物質を共存させてもよい。微小空間を形成させることにより、該微小空間中において、標的分子と相互作用物質の相互作用を効率的に行わせることが可能になる。
【００５１】
非結合物質は、相互作用物質及び水溶性重合体に結合しないことが好ましく、相互作用物質構造体に３００ｎｍ以上１００μｍ以下の径を有する微小空間を形成し得る物質を用いることが好ましい。非結合物質は、好ましくは水混和性物質が用いられ、中でも水溶性物質を使用することが好ましく、特に水溶性高分子化合物を用いることが好ましい。また、非結合物質は、無電荷であることが好ましい。なお、非結合物質が無電荷であるとは、少なくとも構造式上、非イオン性もしくは両性イオン性（正及び負の両方の電荷を有しており、お互いの電荷が実質打ち消しあっているもの）であれば、当該非結合物質は無電荷である。非結合物質は、合成高分子化合物でもよく、天然高分子化合物でもよい。非結合物質としては、例えばポリエチレングリコールが挙げられる。非結合物質については、特開２００７−２７９０２８号公報に詳細に記載されている。
【００５２】
混合工程の後、媒質を除去する濃縮工程や乾燥工程を行うこともできるし、非結合物質を除去する工程などを行なうこともできる。
【００５３】
本発明の標的分子相互作用物質固定化担体の製造工程においては、相互作用物質、水溶性重合体、非結合物質及び媒質、並びに、これらを混合した混合物などに対して、本発明の効果を著しく妨げない限り、任意の添加剤を共存させてもよい。添加剤の例としては、上記の塩の他、酸、塩基、バッファー、グリセリン、ポリエチレングリコール、糖類等の保湿剤、生体物質の安定剤としての亜鉛等の金属イオン、消泡剤、変性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤などを挙げることができる。
【００５４】
媒質としては、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体の製造が可能な限り任意のものを用いることができるが、通常は、相互作用物質と水溶性重合体とが混和しうるものを用いることが望ましい。さらに、非結合物質や添加剤が用いられる場合には、非結合物質や添加剤も混和しうるものを用いることが望ましい。この際、相互作用物質、水溶性重合体、非結合物質及び添加剤の混和状態は任意であり、溶解状態であっても分散状態であってもよいが、相互作用物質と水溶性重合体とを安定して結合させるためには、相互作用物質及び水溶性重合体が媒質中において溶解状態で存在していることが好ましい。
【００５５】
媒質としては、通常は液体を用いる。この際、媒質は、相互作用物質と水溶性重合体とが結合する場を形成することになり、相互作用物質や水溶性重合体等の活性や構造の安定性などに影響を与えることがあるため、その影響を考慮して選択することが好ましい。通常は、媒質として水や、各種緩衝液、例えば、炭酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファーなどが挙げられる。また、媒質としては水以外の液体を用いても良く、例えば、有機溶媒を用いることができる。さらに、有機溶媒の中でも、両親媒性溶媒、即ち、水に混和しうる有機溶媒が好ましい。水以外の媒質の具体例としては、メタノール、エタノール、１−ブタノールなどのアルコール系溶媒の他に、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＤＭＦ（Ｎ， Ｎ−ジメチルホルムアミド）、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）、ジオキサン、アセトニトリル、ピリジン、アセトン、グリセリンなどが挙げられる。
【００５６】
また、これらの媒質として液体を用いる際には、この媒質に塩を加えても良い。塩の種類は本発明の効果を著しく損なわない限り任意であるが、具体例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが挙げられる。また、用いる塩の量に制限は無く、用途に応じて任意の量の塩を用いることができる。なお、媒質は、１種を単独で用いても良く、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用しても良い。
【００５７】
混合工程における混合操作は任意で、また、これらを混合する順番も任意である。さらに、後述する固相担体に相互作用物質が結合した水溶性重合体を固定する目的で、固相担体上でこの混合物を調製することも可能である。
【００５８】
混合工程において使用する相互作用物質、水溶性重合体、非結合物質、媒質、添加剤等の混合比率は、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体を得ることができる限り任意である。ただし、「（相互作用物質の重量）／｛（相互作用物質の重量）＋（水溶性重合体の重量）｝」で表される混合比率の値は、通常０．１以上、好ましくは０．２以上、より好ましくは０．４以上、更に好ましくは０．５以上、特に好ましくは０．６以上が望ましい。また、上限に特に制限は無いが、通常０．９９９以下である。
【００５９】
また、媒質中における相互作用物質及び水溶性重合体の割合（濃度）も本発明の標的分子相互作用物質固定化担体を得ることができる限り任意であるが、相互作用物質及び水溶性重合体の合計濃度が、通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上とすることが望ましい。
【００６０】
さらに、「（非結合物質の重量）／｛（相互作用物質の重量）＋（水溶性重合体の重量）＋（非結合物質の重量）｝」で表される混合比率の値は、通常０．００１以上、好ましくは０．０１以上、より好ましくは０．１以上である。また、上限に特に制限は無いが、通常０．９５以下、好ましくは０．７以下、より好ましくは０．５以下である。
【００６１】
[I−４  固相担体]
固相担体は、表面に相互作用物質構造体が結合する基体となるものである。本発明で用いる固相担体に制限は無く、相互作用物質構造体が結合できるものであれば、任意の材質、形状、寸法のものを用いることができる。
【００６２】
固相担体の材質の例を挙げると、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、アクリル系樹脂等の各種樹脂材料、寒天、カラギーナン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、糊、アルギン酸、ポリビニルアルコール、デキストラン等のゲル状担体、ガラス、アルミナ、炭素、金属等の無機材料などが挙げられる。なお、固相担体の材質は１種を単独で用いたものでもよく、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用したものであっても良い。また、固相担体の形状は、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体の用途に応じて適宜選択することができる。
【００６３】
さらに、上記固相担体は、そのまま使用してもよいが、金属や金属酸化物などの被覆材料で表面を被覆してから相互作用物質構造体を結合させても良い。また、固相担体と相互作用物質構造体とを結合させるために、表面処理として、前記一般式（II）の官能基Ｗ又は相互作用物質を共有結合するための官能基を有する固相担体を用いる。該官能基として、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、ヒドラジド基、カルボニル基、エポキシ基、ビニル基、アミノ基、スクシンイミド基、ｐ−ニトロフェニル基等の、化学結合により固相担体と相互作用物質構造体とを結合させることができる官能基が挙げられる。
【００６４】
相互作用物質構造体と固相表面との結合は相互作用物質と固相表面の官能基の反応によるものであってもよいし、相互作用物質と未反応である水溶性重合体の官能基と固相表面の官能基の反応によるものであってもよいし、これらの両方であってもよい。
例えば、前記一般式（II）の官能基Ｗがスクシンイミド基であり、固相表面の官能基がアミノ基である場合には、相互作用物質構造体は、該スクシンイミド基と固相表面のアミノ基との間の共有結合を介して固相表面に結合することができる。また、相互作用物質がアミノ基を有する物質であり、固相表面の官能基がスクシンイミド基である場合には、相互作用物質構造体は、相互作用物質が有するアミノ基と固相表面のスクシンイミド基との間の共有結合を介して固相表面に結合することができる。
【００６５】
相互作用物質構造体を固相担体に供給する方法としては、前記混合工程における混合物を、固相担体に接触した状態にさせることができるものであれば何れの方法を用いてもよい。例えば、あらかじめ相互作用物質構造体の構成成分の混合物を用意して、該混合物を固相担体に接触させてもよいし、各成分を別々に用意し、固相担体上でそれらを混合させて混合物を調製しながら、固相担体に混合物を接触させるようにしてもよい。固相担体と混合物の好ましい接触方法としては、上記構成成分をそれぞれ別々に又は上記構成成分の混合物を固相表面上へ滴下する方法である。滴下量は、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体の用途や製造時の条件に応じて適宜選択することができるが、具体的には１ｐＬ〜１０μＬ程度が好ましい。
【００６６】
相互作用物質構造体を固相担体に結合させる際の条件は任意であるが、相互作用物質の変性等を避ける観点から、温度条件は、通常０〜３℃以上１０〜２５℃以下で行なう。さらに、相互作用物質構造体を固相担体に固定するには、混合物の供給後、所定の時間だけ固相担体を静置することが望ましい。静置の時間は任意であるが、通常１分〜１時間以上１２〜２４時間以下が望ましい。
【００６７】
また、固相担体に供給された相互作用物質構造体は、適宜、濃縮工程又は乾燥工程を行なうようにしてもよい。固相担体への固定後の混合物を乾燥、濃縮する場合、その際の圧力条件も任意であるが、通常は、常圧以下、自然乾燥が望ましい。
【００６８】
さらに、混合工程において非結合物質を添加した場合には、固相担体への混合物の供給後、除去工程を行なうことにより、相互作用物質構造体から非結合物質を除去することもできる。
【００６９】
非結合物質を除去する方法に制限は無く、例えば、非結合物質を含有する相互作用物質構造体を洗浄溶媒で洗浄し、非結合物質を除去しても良い。洗浄溶媒は、相互作用物質構造体を変質させないものが好ましい。洗浄溶媒の具体例を挙げると、水、エタノール、２−プロパノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等の水溶性有機溶媒などが挙げられる。中でも、水が好ましい。また、洗浄溶媒には、緩衝物質や界面活性剤などの物質を含有させてもよい。
【００７０】
かくして製造された相互作用物質構造体が結合した固相担体は、標的分子を検出するために使用することができるが、さらに固相表面上の活性エステル基等の未反応の官能基をブロッキングする目的で、エタノールアミン−ＨＣｌ水溶液やグリシン等を接触させることが好ましい。接触時間は１分〜５時間が好ましい。その後、さらにエタノールアミン等を除去する目的で脱塩水等を用いてよく洗浄し、室温で乾燥して、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体とすることが好ましい。
【００７１】
［II  本発明の標的分子相互作用物質固定化担体の用途］
本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、例えば、標的物質を検出するバイオセンサーとして好適に使用できる。上記のバイオセンサーは、例えば、いわゆるＤＮＡアレイ若しくはＤＮＡチップ、または、プロテインアレイ若しくはプロテインチップ等と呼ばれる、ＤＮＡまたは蛋白質等を固定化したセンサーチップ（バイオチップ）を用いて、相互作用を解析するものである。例えば、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、このセンサーチップに適用することができる。即ち、上述した方法によりセンサーチップ本体を固相にして、その表面に相互作用物質構造体を形成することでセンサーチップを製造することができる。
【００７２】
このようなセンサーチップは、蛍光法、ＥＬＩＳＡ法、化学発光法、ＲＩ法、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）法、ピエゾ方式カンチレバー法、レーザー方式カンチレバー法、質量分析法、電気化学的方法、電極法、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）法、カーボンナノチューブを利用したＦＥＴ及び／又は単一電子トランジスタ法に用いることができる。
【００７３】
さらに、本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、抗血栓性、細胞接着性、細胞増殖因子等のタンパク質の徐放性などを付与することができるため、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）のための薬剤の表面処理、再生医療担体の表面処理、人工臓器の表面処理、カテーテルなどの表面処理等に適用可能である。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、任意に変形して実施することができる。
【００７５】
[実施例１]
ポリマーＡ又はポリマーＢとマウスＩｇＧを用いて作製した９６ウェルプレート上の標的分子と相互作用する分子構造体
（１）水溶性重合体（ポリマーＡ）の合成
モノマーである２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と称する）を合成し、これを３．７重量部、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）（和光純薬社製）を０．９０重量部、スクシンモノマーである合成したＭｅｔｈａｃｒｙｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を０．６７重量部、開始剤ＡＩＢＮ（関東化学社製）を０．０４９重量部、溶媒であるエタノールを全量３０ｍｌとなるように添加し、アルゴン置換を行った。その後、６０℃で３時間、ラジカル重合によって合成を行った。クロロホルムーエーテル混合溶媒（２：８）を用いて再沈殿を行った。沈殿物を回収し、減圧乾燥することで、ポリマーＡを得た。
ここで、上記ＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳの合成は以下の方法で行った。
脱水アセトン３００ｍＬにＮ，Ｎ'−Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＳＣ）８．０１２１ｇ入れ攪拌した。そこへ脱水アセトン１００ｍＬにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｍｏｎｏｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ブレンマーＰＥ−９０：日油製）４．４０６２ｇ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）６．３４１１ｇを溶解後滴下し、室温で２４時間反応させた。反応後エバポレートで溶媒を除去した。その後クロロホルム３００ｍＬに溶解し、希塩酸（ｐＨ４）３００ｍＬを加え洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸マグネシウムを加え一昼夜脱水した。フィルターろ過後エバポレートで完全に溶媒を除去し、粘ちょうな液体を得た。収率は７４．７％（６．１４４２ｇ）であった。
【００７６】
得られたポリマーＡについて、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定を行なった結果、ポリマーＡのピークトップ分子量（Ｍｐ）が約７４４７０、重量平均分子量（Ｍｗ）が約６３９８９と見積もられた。
ここで、ＳＥＣの測定は、Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨ ｐａｋ ＳＢ−８０４ＨＱ（昭和電工製）を用い、メタノール：水＝７：３（１０ｍＭのＬｉＢｒを含む）を展開溶媒として行なった。また、分子量校正の標準試料としてはＰＥＧを用いた。
【００７７】
また、得られたポリマーＡに含まれるＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＢＭＡとＭＰＣとのモル比（ＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＭＡ／ＭＰＣ）は、1Ｈ−ＮＭＲ測定からＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＭＡ／ＭＰＣ＝３．３／３３／６３と見積もられた。
【００７８】
（２）水溶性重合体（ポリマーＢ）の合成
モノマーであるＭＰＣ（日油（株）社製）を３．７重量部、合成したＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳを２．７重量部、開始剤ＡＩＢＮ（関東化学社製）を０．０４９重量部、溶媒であるエタノールを全量３０ｍｌになるように添加し、アルゴン置換を行った。その後、６０℃で３時間、ラジカル重合によって合成を行った。クロロホルムーエーテル混合溶媒（２：８）を用いて再沈殿を行った。沈殿物を回収し、減圧乾燥することで、ポリマーＢを得た。
得られたポリマーＢについて、標準ポリエチレングリコールで校正されたＳＥＣ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定を行なった結果、ポリマーＢのピークトップ分子量（Ｍｐ）が約６３５０８、重量平均分子量（Ｍｗ）が約２８３１６７と見積もられた。
【００７９】
また、得られたポリマーＢに含まれるＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＭＰＣとのモル比（ＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ／ＭＰＣ）は、1Ｈ−ＮＭＲ測定からＭＡ−ＰＥＧ−ＮＡＳ／ＭＰＣ＝１１／８９と見積もられた。
【００８０】
（３）９６ウェルプレート表面への標的分子と相互作用する分子構造体の形成
（３−１）９６ウェルプレートの表面処理
０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬工業社製）水溶液１ｍＬと０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、同仁化学研究所製）水溶液１ｍＬとを混合し、さらに脱塩水１８ｇで希釈した溶液を、カルボキシル基が導入された９６ウェルプレート（スミロン（登録商標）ＥＬＩＳＡ製品・カルボタイプ、住友ベークライト社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１５分間反応させた。これは、ウェル内の表面に、ウェルと標的分子と相互作用する分子構造体とを結合させることができるスクシンイミド基を導入するためである。
【００８１】
（３−２）相互作用物質と水溶性重合体の混合物の調製及び滴下と乾燥処理
次に、相互作用物質として用いる１０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（ＬＡＭＰＩＲＥ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ製）のバッファーを１０ｍＭりん酸バッファー（ｐＨ７．４，ｐＨ８．０）又は１０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．４）に交換したものを用意した。この１０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含むバッファーとポリマーＡ又はポリマーＢの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を重量混合比１０：１（標的分子と相互作用する分子：水溶性重合体）で混合した混合物を、９６ウェルプレートのウェル内に１μＬスポッティングした。これを室温にて乾燥した後、未反応の活性エステル基をブロッキングする目的で、１ウェル内に１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ水溶液（ｐＨ８．５）３００μＬを室温して３０分浸漬した。これにより、プレートのウェル表面にマウスＩｇＧ及びポリマーＡもしくはポリマーＢを、それぞれ標的分子相互作用物質及び水溶性重合体とする、標的分子と相互作用する分子構造体が形成された。
【００８２】
その後、ウェル内を、エタノールアミンを除去する目的で脱塩水を用いてよく洗浄し、室温で乾燥して、表面に標的分子相互作用物質を担持したウェルを得た。
【００８３】
［比較例１］
ポリマーＣとマウスＩｇＧを用いて作製した９６ウェルプレート上の標的分子相互作用物質固定化担体の製造
（１）水溶性重合体（ポリマーＣ）の合成
モノマーであるＮ−アクリロイルモルホリン（ＮＡＭ、ＫＯＨＪＩＮ社製）２．８２重量部、及びＮ−アクリロイルオキシスクシンイミド（ＮＡＳ、ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ社製）０．８４重量部と、溶媒である脱水ジオキサン（和光純薬工業株式会社製）２０．８７重量部とをよく混合し、５０ｍＬの四つ口フラスコにそそぎ入れ、室温で３０分間窒素にて脱気を行ない、モノマー溶液を調製した。
【００８４】
このモノマー溶液をオイルバスにて７０℃に昇温し、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、キシダ化学株式会社製）０．０１２４重量部を脱水ジオキサン０．５０重量部に溶かした溶液を入れることにより、重合を開始した。重合は窒素雰囲気下、８時間行なった。
【００８５】
重合後、ポリマーが生成した溶液は、０．５Ｌのエタノール（純正化学株式会社製）に供給することにより再沈殿させた後、溶媒を除去することにより粉末化し、水溶性重合体ポリマーＣを得た。
【００８６】
得られたポリマーＣについて、標準ポリスチレンで校正されたＳＥＣ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定を行なった結果、ポリマーＣの重量平均分子量（Ｍｗ）が約５９５００と見積もられた。
ここで、ＳＥＣの測定は、下記の条件で行った。
溶媒 ：ＤＭＦ（50mMLiBr入）
流速 ： ０．５ml/min
温度 ： ８０℃
尚、今回は、以下の装置、検出器及びカラムを使って測定した。
装置 ：Ｔｏｓｏｈ  ＨＬＣ−８１２０ＧＰＣ
検出器：ＲＩ（装置内臓）
カラム ：ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫgel ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｍ（１５ｃｍ×２）
【００８７】
また、得られたポリマーＣに含まれるＮＡＳとＮＡＭとのモル比（ＮＡＳ／ＮＡＭ）は、1Ｈ−ＮＭＲ測定からＮＡＳ／ＮＡＭ＝２３／７７と見積もられた。
【００８８】
（２）９６ウェルプレート表面への相互作用物質構造体の形成
実施例１の「（３−１）９６ウェルプレートの表面処理」と同様にして、９６ウェルプレートのウェル内の表面にスクシンイミド基を導入した。
【００８９】
次に、ポリマーＡ水溶液またはポリマーＢ水溶液の代わりにポリマーＣ水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１の「（３−２）相互作用物質と水溶性重合体の混合物の調製及び滴下と乾燥処理」と同様の操作を行うことにより、プレートのウェル表面にマウスＩｇＧ及びポリマーＣをそれぞれ標的分子相互作用物質及び水溶性重合体とする相互作用物質構造体が形成された。
【００９０】
また、基板へのマウスＩｇＧの直接固定（２Ｄ）は、ポリマーを用いない点を除いては、上記方法と同様の方法にて行った。その後、ウェル内を、エタノールアミンを除去する目的で脱塩水を用いてよく洗浄し、室温で乾燥して、表面に相互作用物質構造体、もしくはマウスＩｇＧのみを担持したプレートを得た。
【００９１】
＜実施例１および比較例１で得られた標的分子相互作用物質固定化担体の蛍光強度法による評価＞
上記実施例１および比較例１で得られたサンプルの性能を蛍光強度法で分析した。上記の実施例１および比較例１で得られた相互作用物質構造体プレートを５重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μｌ／ウェルにて室温で１時間ブロッキングした。溶液を除去した後に水洗し、アナライトとして５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＥＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ,ＩＮＣ．製）を含むＰＢＳ（−）を１００μｌずつウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。溶液を除去した後、反応に関与しなかった余分なアナライトを除去することを目的として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）を用いて充分に洗浄を行なった。さらに水洗した後に、１ウェルあたりに１００μＬのＰＢＳを添加し、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＡＧＥＲ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を用いて励起波長４８８ｎｍ及び蛍光波長５３０ｎｍにて相互作用物質構造体全体部分のＦＩＴＣの蛍光強度測定を行なった。
【００９２】
結果を図２に示す。図２において、本実施例は、比較例１と比較して中性領域(Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０及びｐＨ７．４)で、より高い蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示した。このことから、ポリマーＡ、もしくはポリマーＢを用いることでより多くのアナライトを捕捉可能であることが示された。
【００９３】
［実施例２］マウスＩｇＧを用いた金チップ上の相互作用物質構造体
（１）金チップの表面処理
金で被覆されたチップを、１０ｍＭの１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＥＬＣＡＰＴＯＨＥＸＡＤＥＡＮＯＩＣ  ＡＣＩＤ：ＡＬＤＲＩＣＨ社製）エタノール溶液に浸漬させ、室温で１２時間反応させ、表面処理を行なった。反応終了後、金チップをエタノールで洗浄した。この表面処理は、金−硫黄結合を介して金チップの表面にカルボキシル基を導入するための処理である。
【００９４】
次に、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬工業社製）水溶液１ｍＬと０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、同仁化学研究所製）水溶液１ｍＬとを混合し、さらに脱塩水１８ｇで希釈した溶液に、上記のカルボキシル基を導入した基板（金チップ）を浸漬させ、１５分間反応させた。これは、基板表面に、基板と相互作用物質構造体とを結合させることができるスクシンイミド基を導入するためである。
【００９５】
（２）相互作用物質構造体の形成
次に１０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む水溶液（りん酸バッファー１０ｍＭ、ｐＨ７．4）とポリマーＡもしくはポリマーＢの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とを重量混合比１０： １（相互作用物質：水溶性重合体）で混合した混合物を、金チップの表面に１μＬ×４点スポッティングした。これを室温にて乾燥した後、未反応の活性エステル基をブロッキングする目的で、１Ｍのエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）３ｍＬに１５分間浸漬した。これにより、金チップの表面にマウスＩｇＧと、ポリマーＡもしくはポリマーＢとを、それぞれ相互作用物質及び水溶性重合体とする相互作用物質構造体が形成された。
【００９６】
その後、脱塩水を用いてよく洗浄し、室温で乾燥して、表面に相互作用物質構造体を担持した相互作用物質構造体金チップを得た。
【００９７】
［比較例２］マウスＩｇＧを用いた金チップ上の相互作用物質構造体
（１）金チップの表面処理
金チップへのスクシンイミド基の導入は、実施例２の「（１）金チップの表面処理」と同様にした。
【００９８】
（２）相互作用物質構造体の形成
次に、ポリマーＡ水溶液またはポリマーＢ水溶液の代わりにポリマーＣ水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いた以外は実施例２の「（２）相互作用物質構造体の形成」と同様の操作を行うことにより、金チップの表面にマウスＩｇＧとポリマーＣとをそれぞれ標的分子相互作用物質及び水溶性重合体とする相互作用物質構造体が形成された。また、基板へのマウスＩｇＧの直接固定（２Ｄ）は、ポリマーを用いない点を除いては、上記方法と同様の方法にて行った。
【００９９】
＜実施例２および比較例２で得られたマウスＩｇＧを用いた金チップ上の相互作用物質構造体のＳＰＲ測定による評価＞
実施例２および比較例２で得られた相互作用物質構造体金チップの測定をイメージングＳＰＲ装置にて行った。
【０１００】
ポリマーＡとＩｇＧ又はポリマーＢとＩｇＧからなる相互作用物質構造体が固定化された金チップをイメージングＳＰＲ装置ＦＬＥＸ  ＣＨＩＰ  TM  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＨＴＳ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）にセットし、バッファーを送液した後、スポットのイメージング像を観察した。また、比較例としては、比較例２で示したポリマーＣを用いて作製した相互作用物質構造体と、金基板に直接マウスＩｇＧを固定化したスポット（２Ｄ）を用いた。
結果を図３−１に示す。ポリマーＡを用いて作製した相互作用物質構造体はスポット全体が均一であった。ポリマーＢを用いて作製した相互作用物質構造体は、ところどころに斑点が見えるがスポット内部に相互作用物質構造体が形成されていることが確認された。しかし、ポリマーＣを用いて作製した相互作用物質構造体（比較例２）はスポット内部には相互作用物質構造体が形成されておらず、リング状にスポットの周囲にのみ相互作用物質構造体が形成されていた。さらに、金基板に直接マウスＩｇＧを固定化したもの（２Ｄ）においては、固定化量が少なく、スポットを確認することが難しかった。
【０１０１】
図３−２に、イメージング像（図３−１）のスポット内部の○で囲った部分に固定化された相互作用物質構造体もしくはマウスＩｇＧの固定化量をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）で測定した結果を示した。
尚、ＳＰＲ現象は、金属薄膜近傍の屈折率に依存するので、金属薄膜表面にタンパク質などが結合した場合には共鳴角が変化する。この結合量は共鳴角の変化量と一致するため、共鳴角の変化量を測定することで、タンパク質の固定化量、タンパク質−タンパク質間の相互作用量などを調べることができる。
固定化量は、ポリマーＡを用いた相互作用物質構造体、ポリマーＢを用いた相互作用物質構造体、ポリマーＣを用いた相互作用物質構造体、２Ｄの順に減少し、イメージング像と一致した。
【０１０２】
次に、アナライト（検体）として１μg／ｍＬのｐｒｏｔｅｉｎＡ(ＳＩＧＭＡ社)を用い、ＳＰＲ測定により相互作用物質構造体とｐｒｏｔｅｉｎＡとの相互作用を検出した。それぞれの相互作用物質構造体と相互作用したアナライト量を図３−３に示す。相互作用したアナライトは、固定化量と同様に、ポリマーＡを用いた相互作用物質構造体、ポリマーＢを用いた相互作用物質構造体、ポリマーＣを用いた相互作用物質構造体、２Ｄの順に減少した。
【０１０３】
［実施例３］ポリマーＢとマウスＩｇＧを用いて作製した、標的分子相互作用物質固定化担体
（１）水溶性重合体（ポリマーＢ）の合成
水溶性重合体であるポリマーＢの合成は、実施例１の「（２）水溶性重合体（ポリマーＢ）の合成」と同様にした。
【０１０４】
（２）金チップの表面処理
固相として金で被覆されたチップ（金チップ）を用いた。これらを、１０ｍＭの２−アミノタンチオール塩酸塩（和光純薬工業社製）水溶液に浸漬させ、室温で１２時間反応させ、表面処理を行なった。反応終了後、金チップを脱塩水で洗浄した。この表面処理は、金−硫黄結合を介して金チップの表面にアミノ基を導入するための処理である。
このようにして、水溶性重合体ポリマーＢに含まれるスクシンイミド基を共有結合するための官能基であるアミノ基を有する固相表面を得た。
【０１０５】
（３）アミノ基を有する固相表面上への相互作用物質構造体の形成
次に、１０ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧ溶液（ＬＡＭＰＩＲＥ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ製）のバッファーを１０ｍＭりん酸バッファー（ｐＨ７．４）に交換したものを用意した。この１０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む水溶液（りん酸バッファー１０ｍＭ、ｐＨ７．４）とポリマーＢの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とを重量混合比１０： １（相互作用物質：水溶性重合体）で混合した混合物を、上述のようにして作製したアミノ基を有する金チップの表面に１μＬ供給した。これを室温にて乾燥させた後、未反応のスクシンイミド基をブロッキングする目的で、１Ｍのエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）３ｍＬを前記金チップ表面全体を覆うように滴下し、３０分間放置した。これにより、金チップの表面にマウスＩｇＧと、ポリマーＢとを、それぞれ相互作用物質及び水溶性重合体とする相互作用物質構造体が作製された。
【０１０６】
その後、脱塩水を用いてよく洗浄し、室温で乾燥して、金チップ表面に相互作用物質構造体を得た。
【０１０７】
［比較例３］ポリマーＣとマウスＩｇＧを用いて作製した金チップ上の相互作用物質構造体
（１）水溶性重合体（ポリマーＣ）の合成
比較例１の「（１）水溶性重合体（ポリマーＣ）の合成」と同様にした。
【０１０８】
（２）金チップの表面処理
金チップへのアミノ基の導入は、実施例３の「（２）金チップの表面処理」と同様にした。
【０１０９】
（３）相互作用物質構造体の形成
水溶性重合体としてポリマーＣを用いたこと以外は、実施例３の「（３）アミノ基を有する固相表面上への相互作用物質構造体の形成」と同様にした。これにより、金チップの表面にマウスＩｇＧ及びポリマーＣとを、それぞれ相互作用物質及び水溶性重合体とする、相互作用物質構造体を得た。
【０１１０】
また、アミノ基を有する金チップ上へのマウスＩｇＧの直接固定（２Ｄ）は、ポリマーを用いない点を除いては、実施例３の「（３）アミノ基を有する固相表面上への相互作用物質構造体の形成」と同様にした。
【０１１１】
＜実施例３および比較例３で得られた相互作用物質構造体による標的分子の捕捉と検出＞
実施例３および比較例３で得られた相互作用物質構造体を表面に有する金チップの性能を蛍光強度法で分析した。上記の相互作用物質構造体を表面に有する金チップ上に３重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２ｍｌを滴下し、完全に金チップ表面を覆う状態で室温にて１時間ブロッキングした。溶液を除去した後に水洗し、標的分子として５０μｇ／ｍＬのＣｙ５標識ＰｒｏｔｅｉｎＡを含むＰＢＳ（−）1ｍｌを相互作用物質構造体が形成された金チップ上に添加し、室温で１時間インキュベートした。溶液を除去した後、反応に関与しなかった余分な標的分子を除去することを目的として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）を用いて充分に洗浄を行なった。さらに水洗した後に、圧空にて乾燥し、ＩｎｎｏＳｃａｎ７００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＩＮＮＯＰＳＹＳ製）を用いて励起波長６３５ｎｍにて相互作用物質構造体の中心付近のＣｙ５の蛍光強度測定を行なった。尚、解析ソフトウェアとしてＭＡＰＩＸ（ＩＮＮＯＰＳＹＳ社製）を用いた。
ここで、上記Ｃｙ５標識ＰｒｏｔｅｉｎＡの作製は以下の方法で行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ水溶液（RepliGen社製）のバッファーを１００ｍＭ炭酸バッファー（pH9.4）に交換し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ濃度が１ｍｇ/mlとなるように調製した。この１ｍｇ/mlＰｒｏｔｅｉｎＡ溶液１ｍｌをＣｙ５ Mono-Reactive Dye Pack（GE Healthcare製）１本に添加し、混合した。この混合溶液を室温にて３０分インキュベーションした。その後、ＰＤ−１０ Columns（GE Healthcare製）を用い、ＰＢＳ（−）を展開溶媒として使用し、前記混合液から未反応のＣｙ５を取り除き、Ｃｙ５標識ＰｒｏｔｅｉｎＡを得た。
【０１１２】
結果を図４に示す。図４において、本実施例は、ポリマーＣを用いて作製した相互作用物質構造体（比較例３）と比較して中性領域(Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４)で、より高い蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示した。このことから、ポリマーＢを用いることでより多くの標的分子を捕捉可能であることが示された。
【０１１３】
また、相互作用物質構造体に捕捉された標的分子に由来するＣｙ５の蛍光画像を図５に示す。ポリマーＢを用いて作製した相互作用物質構造体は、スポット（以下、相互作用物質と水溶性重合体の混合物を供給した領域のことを指す）内部にもＣｙ５の蛍光が確認され、相互作用物質構造体が均一に形成されたことがわかる。しかし、ポリマーＣを用いて作製した相互作用物質構造体（比較例３）はスポット内部には相互作用物質構造体が形成されておらず、リング状にスポットの周囲にのみＣｙ５の蛍光が確認され、相互作用物質構造体が不均一に形成されたことがわかる。
【０１１４】
［実施例４］ポリマーＤとマウスＩｇＧを用いて作製した金チップ上の相互作用物質構造体
（１）水溶性重合体（ポリマーＤ）の合成
モノマーであるＮ−アクリロイルモルホリン（ＮＡＭ、ＫＯＨＪＩＮ社製）０．８９４重量部、及びＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳを０．１０６重量部と、溶媒である脱水ジオキサン（和光純薬工業株式会社製）４．１７重量部とをよく混合し、３０ｍＬの四つ口フラスコにそそぎ入れ、室温で３０分間窒素にて脱気を行ない、モノマー溶液を調製した。
【０１１５】
このモノマー溶液をオイルバスにて８０℃に昇温し、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、キシダ化学株式会社製）０．００３重量部を脱水ジオキサン１．５重量部に溶かした溶液を入れることにより、重合を開始した。重合は窒素雰囲気下、６時間行なった。
【０１１６】
重合後、ポリマーが生成した溶液は、１５０ｍLのクロロホルム−ジエチルエーテル混合溶媒[クロロホルム/ジエチルエーテル＝３０/１２０ (v/v)]に供給することにより再沈殿させた後、溶媒を除去することにより粉末化し、水溶性重合体ポリマーＤを得た。
【０１１７】
得られたポリマーＤについて、標準ポリスチレンで校正されたＳＥＣ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定を行なった結果、ポリマーＤの重量平均分子量（Ｍｗ）が２３８９５４と見積もられた。
ここで、ＳＥＣの測定は、下記の条件で行った。
溶媒 ：DMF（50mMLiBr入）
流速 ： 1.0ml/min
温度 ： 50℃
尚、今回は、以下の装置、検出器及びカラムを使って測定した。
装置 ：日本ウォーターズ（株）製 Waters 2695
検出器：日本ウォーターズ（株）製 Waters 2410
カラム ：昭和電工株式会社製 Shodex AD-80M/S
【０１１８】
また、得られたポリマーＤに含まれるＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＮＡＭとのモル比（Ｍ−ＰＥＧ−ＮＡＳ／ＮＡＭ）は、1Ｈ−ＮＭＲ測定からＭＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳ／ＮＡＭ＝７/９３と見積もられた。
【０１１９】
（２）金チップの表面処理
固相として金で被覆されたチップを用いた。これを、５ｍＭの１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＥＬＣＡＰＴＯＨＥＸＺＤＥＣＡＮＯＩＣ  ＡＣＩＤ：ＡＬＤＲＩＣＨ社製）エタノール溶液に浸漬させ、室温で１２時間反応させ、表面処理を行なった。反応終了後、金チップをエタノールで洗浄した。この表面処理は、金−硫黄結合を介して金チップの表面にスクシンイミド基を導入するための処理である。
このようにして、相互作用物質であるマウスＩｇＧ中のアミノ基を共有結合するための官能基であるスクシンイミド基を有する固相表面を得た。
【０１２０】
（３）スクシンイミド基を有する固相表面上での相互作用物質構造体の形成
次に、１０ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧ溶液（ＬＡＭＰＩＲＥ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ製）のバッファーを１０ｍＭりん酸バッファー（ｐＨ７．４）に交換したものを用意した。この１０ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む水溶液（りん酸バッファー１０ｍＭ、ｐＨ７．4）とポリマーＤの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とを重量混合比１０： ２（相互作用物質：水溶性重合体）で混合した混合物を、上述のように作製したスクシンイミド基導入金チップの表面に１μＬ供給した。これを室温にて乾燥させた後、未反応のスクシンイミド基をブロッキングする目的で、１Ｍのエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）３ｍＬを金チップ表面全体を覆うように滴下し、３０分間放置した。これにより、金チップの表面にマウスＩｇＧ及びポリマーＤを、それぞれ相互作用物質及び水溶性重合体とする、相互作用物質構造体が形成された。
【０１２１】
その後、脱塩水を用いてよく洗浄し、室温で乾燥して、金チップ表面に相互作用物質構造体を得た。
【０１２２】
［比較例４］ポリマーＥとマウスＩｇＧを用いて作製した金チップ上の相互作用物質構造体
（１）水溶性重合体（ポリマーＥ）の合成
モノマーであるＮ−アクリロイルモルホリン（ＮＡＭ、ＫＯＨＪＩＮ社製）を５．６４重量部、及びＮ−アクリロイルオキシスクシンイミド（ＮＡＳ、ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ社製）を０．３６重量部と、溶媒である脱水ジオキサン（和光純薬株式会社製）３０重量部とをよく混合し、５０mlの四つ口フラスコに注ぎ入れ、室温で30分間窒素にて脱気を行い、モノマー溶液を調製した。
【０１２３】
このモノマー溶液をオイルバスにて８０℃に昇温し、重合開始剤アゾビスイソブチロニトリル（AIBN、キシダ化学株式会社製）０．０１８重量部を脱水ジオキサン４重量部に溶かした溶液を入れることにより、重合を開始した。重合は窒素雰囲気下、６時間行った。
【０１２４】
重合後、ポリマーが生成した溶液は、１５０ｍｌのクロロホルム−ジエチルエーテル混合溶媒[クロロホルム/ジエチルエーテル＝３０/１２０ (v/v)]に供給することにより再沈殿させた後、溶媒を除去することにより粉末化し、水溶性重合体ポリマーＤを得た。
ポリマーEを得た。
【０１２５】
得られたポリマーＥについて、標準ポリスチレンで校正されたＳＥＣ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定を行なった結果、ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）が１７０３２０と見積もられた。
ここで、ＳＥＣの測定は、実施例４の「（１）水溶性重合体（ポリマーＤ）の合成」に記載の方法と同様にした。
【０１２６】
また、得られたポリマーＥに含まれるＮＡＳとＮＡＭとのモル比（ＮＡＳ／ＮＡＭ）は、1Ｈ−ＮＭＲ測定からＮＡＳ／ＮＡＭ＝８．４／９１．６と見積もられた。
【０１２７】
（２）金チップの表面処理
固相として金チップを用いた。金チップのスクシンイミド基の導入は、実施例４の「（２）金チップの表面処理」と同様にした。
【０１２８】
（３）ポリマーＥを用いた相互作用物質構造体の形成
水溶性重合体としてポリマーＥを用いたこと以外は、実施例４の「（３）スクシンイミド基を有する固相表面上での相互作用物質構造体の形成」と同様にした。これにより、金チップの表面にマウスＩｇＧ及びポリマーＥとをそれぞれ相互作用物質及び水溶性重合体とする、相互作用物質構造体を得た。
【０１２９】
＜実施例４および比較例４で得られた相互作用物質構造体による標的分子の捕捉と検出＞
上記のように実施例４および比較例４で作製した相互作用物質構造体を表面に有する金チップの性能を蛍光強度法で分析した。上記の相互作用物質構造体金チップに３重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２ｍｌを表面を覆うように滴下し、室温にて１時間ブロッキングした。溶液を除去した後に水洗し、標的分子として５０μｇ／ｍＬのＣｙ５標識ＰｒｏｔｅｉｎＡを含むＰＢＳ（−）を1ｍｌを相互作用物質構造体が形成された金チップ上に表面を覆うように添加し、室温で１時間インキュベートした。溶液を除去した後、反応に関与しなかった余分な標的分子を除去することを目的として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）を用いて充分に洗浄を行なった。さらに水洗した後に、圧空にて乾燥し、ＩｎｎｏＳｃａｎ７００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＩＮＮＯＰＳＹＳ社製）を用いて励起波長６３５ｎｍにて相互作用物質構造体の中心付近のＣｙ５の蛍光強度測定を行なった。尚、解析ソフトウェアとしてＭＡＰＩＸ（ＩＮＮＯＰＳＹＳ社製）を用いた。
ここで、上記Ｃｙ５標識ＰｒｏｔｅｉｎＡの作製は以下の方法で行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ水溶液（RepliGen社製）のバッファーを１００ｍＭ炭酸バッファー（pH9.4）に交換し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ濃度が１ｍｇ/mlとなるように調製した。この１ｍｇ/mlＰｒｏｔｅｉｎＡ溶液１ｍｌをＣｙ５ Mono-Reactive Dye Pack（GE Healthcare製）１本に添加し、混合した。この混合溶液を室温にて３０分インキュベーションした。その後、ＰＤ−１０ Columns（GE Healthcare製）を用い、ＰＢＳ（−）を展開溶媒として使用し、前記混合液から未反応のＣｙ５を取り除き、Ｃｙ５標識ＰｒｏｔｅｉｎＡを得た。
【０１３０】
結果を図６に示す。図６において、本実施例は、比較例４と比較して中性領域(Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４)で、より高い蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示した。このことから、ポリマーＤを用いることでより多くの標的分子を捕捉可能であることが示された。
【０１３１】
また、標的分子相互作用物質固定化担体に捕捉された標的分子に由来するＣｙ５の蛍光画像を図６に示す。ポリマーＤを用いて作製した相互作用物質構造体は、スポット（以下、相互作用物質と水溶性重合体の混合物を供給した領域のことをいう）内部にもＣｙ５の蛍光が確認され、相互作用物質構造体が均一に形成されたことがわかる。しかし、ポリマーＥを用いて作製した相互作用物質構造体（比較例４）はスポット内部では蛍光強度が極めて低く、リング状にスポットの周囲にのみＣｙ５の蛍光が強く確認され、相互作用物質構造体が不均一に形成されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の標的分子相互作用物質固定化担体は、医療・診断、遺伝子解析、プロテオミクス、マイクロエレクトロニクス、膜分離等の分野において好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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