(57)【要約】【課題】本発明は、皮膚の色素沈着を抑制する組成物を提供する。【解決手段】  該組成物は、キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）の茎部分から分離した２種の化合物、リンデラノリドＢ（ｌｉｎｄｅｒａｎｏｌｉｄｅ  Ｂ）およびスバモリドＡ（ｓｕｂａｍｏｌｉｄｅ  Ａ）を含む。この２種の化合物は抗チロシナーゼ作用を有し、細胞または個体のメラニン生成を抑制し、美白化粧品に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）の抽出物であって、以下の
有機溶剤により、キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）の茎を抽出する段階と、
前段階の産物を水に加えて、懸濁液を形成する段階と、
クロロホルム水溶液を該懸濁液に添加して、該懸濁液を分離させる段階と、
該分離液からクロロホルムの分離層を分離する段階と、
クロロホルムの分離層を液体カラムクロマトグラフィーによって、アルキル類およびエステル類の混合液を用いて、該抽出物を溶離する段階、
により得られることを特徴とする、抽出物。
【請求項２】
該アルキル類が、ノルマルヘキサンを、該エステル類が、酢酸エチルを含むことを特徴とする、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
飲料、化粧品または医薬品に添加されることを特徴とする、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
該飲料が各種ジュース、茶類、麺類、乳製品、または調味料を含み、該化粧品が化粧水、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、乳液、乳液状もしくはクリーム状のファンデーション、口紅、おしろい、洗顔フォーム、ヘアローションなどの液体、固体、ゾル体、またはその他周知の方法で製造される化粧品を含み、該医薬品が粉、カプセル、噴霧剤、ゲル、軟膏、タブレット、座薬、顆粒、パッチ、丸薬、トローチ、注射薬、点滴薬、懸濁剤、静脈内乳剤、徐放製剤、放出制御製剤、またはその他周知の方法で製造される医薬品を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１に記載の抽出物を、皮膚の色素沈着を抑制する薬物に調製する利用方法であって、該薬物が個体のチロシナーゼ活性を抑制して、メラニン生成を減少させ、該薬物の有効成分が、以下の化学構造（Ｉ）または（II）の化合物、
【化１】
2011178770.tif 000011
（Ｉ）リンデラノリドＢ
【化２】
2011178770.tif 000012
（II）スバモリドＡ
およびその塩類、エステル類、または溶媒和物を含むことを特徴とする、利用方法。
【請求項６】
該個体が、動物またはヒトを含むことを特徴とする、請求項５に記載の利用方法。
【請求項７】
色素沈着を抑制する組成物であって、以下の化学構造（Ｉ）または（II）の化合物、
【化３】
2011178770.tif 000013
（Ｉ）リンデラノリドＢ
【化４】
2011178770.tif 000014
（II）スバモリドＡ
およびその塩類、エステル類、または溶媒和物を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項８】
チロシナーゼ活性を抑制する作用を有することを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
飲料、化粧品または医薬品に添加されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
該飲料が各種ジュース、茶類、麺類、乳製品、または調味料を含み、該化粧品が化粧水、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、乳液、乳液状もしくはクリーム状のファンデーション、口紅、おしろい、洗顔フォーム、ヘアローションなど液体、固体、ゾル体、またはその他周知の方法で製造される化粧品を含み、該医薬品が粉、カプセル、噴霧剤、ゲル、軟膏、タブレット、座薬、顆粒、パッチ、丸薬、トローチ、注射薬、点滴薬、懸濁剤、静脈内乳剤、徐放製剤、放出制御製剤、またはその他周知の方法で製造される医薬品を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）抽出物およびその利用に関する。キナモムム・スバベニウム抽出物は、メラニン生成を抑制する美白効果を有する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のメラニンは、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）で生成され、表皮の基底層（ｓｔｒａｔｕｍ）に存在する。ヒトの皮膚は、通常ほぼ同じ濃度のメラニン細胞を有するが、異なる民族では、メラニンに関わる遺伝子の発現に違いがある。メラニンの分子構造は緊密で、不溶性高分子の重合体であり、常にタンパク質と結合している。構造によりユーメラニン（ｅｕｍｅｌａｎｉｎｓ）、フェオメラニン（ｐｈｅｏｍｅｌａｎｉｎｓ）、アロメラニン（ａｌｌｏｍｅｌａｎｉｎｓ）に分けられる。哺乳類のメラニンは、ユーメラニン（ｅｕｍｅｌａｎｉｎｓ）およびフェオメラニン（ｐｈｅｏｍｅｌａｎｉｎｓ）の２種の成分によって、異なる比率で構成される。この２種のメラニンの数および型は、４〜６個の遺伝子が不完全優性遺伝するものであり、遺伝子の複製はすべて父母双方からである。結合後、極めて種類の多い、異なる肌色を発現する。
【０００３】
メラニンの形成は、いくつかの酵素および分子が生化学反応に関与する必要があり、それぞれチロシン、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）および酸素分子である。チロシナーゼは、チロシンをジヒドロキシフェニルアラニン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に酸化した後、ドパクロム（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ）に変換する。さらにインドール（ｉｎｄｏｌｅｓ）を形成し、最後にメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）に変化する（Ｗｕｌｆ他、Ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、２００４年、Ｍｉｃｒｏｎ、３５、１８５〜１９１ページ）。チロシナーゼが、ジヒドロキシフェニルアラニンをドパクロムに変換するのを促進する段階は、律速段階である。ドパクロムは自動酸化反応によってメラニンを形成する。チロシナーゼは銅を含む金属酵素であり、メラニン細胞で合成され、メラニン生成の過程で非常に重要な役割を担う。チロシナーゼ活性が上昇すると、メラニンの生産量が増加し、チロシナーゼ活性が抑制されると、メラニン細胞のメラニン生成能力が、それに呼応して低下する。
【０００４】
メラニン沈着を引き起こす原因は多い。皮膚が紫外線照射を受けると、細胞内のチロシナーゼ活性が増強し、メラニン合成が促進される。他に、血液中の銅イオン濃度の上昇によってもチロシナーゼ活性が増強されることがある。したがって、チロシナーゼ活性の抑制は、メラニン生成を減少させる方法の１つとなる。
【０００５】
メラニン形成を抑制するメカニズムは以下の４種類に分類される。１、チロシナーゼ活性を減少させ、メラニン合成を抑制する。これはチロシナーゼ阻害剤によるものである。２、メラニン細胞の機能を低下させる。細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）を有する物質を使用して、メラニン細胞の増殖を低下させる。または、メラニン生成を阻害する。３、抗酸化剤などを用いて、ジヒドロキシフェニルアラニンの自動酸化を、抑制または予防する。４、皮膚の炎症反応、日焼け後に生じる炎症反応などを抑制する。したがって、皮膚の美白に関して、ＵＶ遮断、フリーラジカル除去、チロシナーゼ合成抑制、チロシナーゼ活性抑制、およびメラニン生成阻害またはその代謝促進など、いくつかの側面から着手する。
【０００６】
第１のメカニズムである、チロシナーゼ阻害剤に関する特許は比較的多い。以下に順を追って簡潔に述べる。米国特許第５７２３１０９号は、サリチル酸誘導体（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を利用して、チロシナーゼ阻害剤としており、米国特許第５７３０９６２号は、合成ベンゾフラン（ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）およびその誘導体も、チロシナーゼ活性抑制効果を有することを開示している。
【０００７】
他に、多くの天然植物または食物抽出物も、チロシナーゼ抑制効果を有する。米国特許第５８２４３２０号は、アフロイア（Ａｐｈｌｏｉａ）またはマンゴーの葉（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｌｅａｆ）の抽出物およびその誘導体が、チロシナーゼ活性の抑制およびコラゲナーゼ活性の抑制効果を有することを開示している。米国特許第５９６８４８７号は、合成コウジ酸誘導体［５−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−ピラン−２−イル］メチル−２−オキソチアゾリジン−４−カルボキシラート（［５−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−２−ｙｌｍｅｔｈｙｌ］２−ｏｘｏｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）が、皮膚美白剤としてヒトのメラニン合成を抑制することを開示している。米国特許第６７５０２２９号は、大豆から抽出した大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）およびボーマンバークプロテアーゼインヒビターを提供する。ボーマンバークプロテアーゼインヒビターは表皮上層で作用し、濃度の増加に伴って、メラニンの抑制は顕著になる。また、２種の抽出物をブタに作用させると、メラニンの抑制は４０％以上に達する。
【０００８】
以上に述べたように、複数種の薬物を美白剤とすることができるが、これらの美白剤を配合するだけの美白化粧原料の効果は非常に弱い。製剤の安定性または皮膚刺激に対する安全性の面でも不十分であり、市場のニーズを満たすことができない。アスコルビン酸の安定性は悪く、皮膚炎を誘発しやすいことがすでに知られている。コウジ酸およびその誘導体は、美白作用は強いが、光や熱によって容易に分解する。ハイドロキノンも美白作用は強いが不安定であり、いわゆるミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）および乳液の化粧品の製造方法において、脱色しやすい問題が生じる。低濃度であってもアレルギー性接触皮膚炎を誘発する問題もある。広東人参などの生薬は、それ自体が高価なため、廉価な美白剤を製造して、一般の消費者に提供する問題も有する。
【０００９】
以上を総合すると、市場では、低配合量で優れた美白効果を有する化合物、皮膚刺激が無いなど、安全性および安定性に優れた化合物、さらに該化合物を投与した摂取しやすい飲食物、香料、化粧品、医薬品が、依然として求められていることがわかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５７２３１０９号
【特許文献２】米国特許第５７３０９６２号
【特許文献３】米国特許第５８２４３２０号
【特許文献４】米国特許第５９６８４８７号
【特許文献５】米国特許第６７５０２２９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｕｌｆ他、Ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、２００４年、Ｍｉｃｒｏｎ、３５、１８５〜１９１ページ
【非特許文献２】Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．、Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８３年、１６、６５（１〜２）、５５〜６３ページ
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ他、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、２００１年、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．、２７  Ｓｕｐｐｌ１、Ｓ６８〜７５ページ
【非特許文献４】Ｌｉｎ他、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｏｓａｎ  ａｐｐｌｅ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、２００７年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６８巻、８号、１１８９〜１１９９ページ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）抽出物を提供する。以下の段階により得られる。
【００１３】
キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｕｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）抽出物は、以下の段階により得られる。
【００１４】
有機溶剤を用いて、キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）の茎を抽出する。
【００１５】
前段階の産物を水に加えて、懸濁液を形成する。
【００１６】
クロロホルム水溶液を懸濁液に添加して、懸濁液を分離させる。
【００１７】
該分離液からクロロホルムの分離層を分離する。
【００１８】
さらにクロロホルムの分離層を液体カラムクロマトグラフィーによって、アルキル類およびエステル類の混合液を用いて、抽出物を溶離する。本発明のアルキル類はノルマルヘキサンを、エステル類は酢酸エチルを含む。
【００１９】
また本発明は、該抽出物を、皮膚の色素沈着を抑制する薬物に調製する利用方法を提供する。該薬物は個体のチロシナーゼ活性を抑制し、メラニン生成をコントロールする。該薬物の有効成分は以下の化学構造（I）または（II）の化合物、
【００２０】
【化１】
2011178770.tif 000002
（I）リンデラノリドＢ
【００２１】
【化２】
2011178770.tif 000003
（II）スバモリドＡ
およびその塩類、エステル類、または溶媒和物を含む。個体は動物またはヒトを含む。
【００２２】
本発明は、他に皮膚の色素沈着を抑制する組成物を提供する。この組成物は以下の化学構造（I）または（II）の化合物、
【００２３】
【化３】
2011178770.tif 000004
（I）リンデラノリドＢ
【００２４】
【化４】
2011178770.tif 000005
（II）スバモリドＡ
およびその塩類、エステル類、または溶媒和物を含む。
【００２５】
該溶媒和物は、化合物が結晶化過程にあることを示す。溶媒分子を加えることで、結晶格子が変化し、得られた結晶が化合物の溶媒和物である。
【００２６】
２種の化合物は、ともにチロシナーゼ活性抑制作用を有する。
【００２７】
本発明の組成物または抽出物は、それぞれ飲料、化粧品または医薬品に添加される。
【００２８】
飲料は、例えばスポーツ飲料、炭酸飲料、果汁を含む各種ジュース、または紅茶飲料などの清涼飲料水である。ケーキ、ビスケット、パン、ゼリーもしくはアイスクリームなどの菓子類、うどん、麺、ラーメン、麺食、そばなどの麺類、味噌、醤油、酢、サラダ油、ゴマ油、バター、チーズ、豆乳または牛乳など、種類または形態に関わらず、すべて飲食物として摂取される。本発明の美白有効成分を飲食物に溶解、混合して製造することができる。
【００２９】
化粧品は、化粧水、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、乳液、乳液状またはクリーム状のファンデーション、口紅、おしろい、洗顔フォーム、ヘアローションなどの液体、固体、ゾル体、クリーム体であり、すべて外用に適している。口の中で崩れるソフトカプセル、または口中への噴霧器などもある。本発明は、美白有効成分を含む以外に、その他の材料を使用して、周知の方法により製造することができる。通常使用されるその他の材料は、油脂類（例えば蜜ロウおよびブラジルヤシロウなどの蝋、ホホバ油、ミンク油、カカオ脂、ヤシ油、パームオイル、ツバキ油、ゴマ油、ヒマシ油、オリーブオイルなど）、界面活性剤（例えばグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリグリセロール脂肪酸エステルなど）、低級または高級アルコール類（例えばセタノール、イソオクタデカノール、ラウリルアルコール、ヘキサデカノール、ベヘニルアルコール、オクチルドデシルアルコールなど）、脂肪酸類（例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ウンデシレン酸、オレイン酸など）、水溶性高分子（例えばカルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、セルロース、アルギン酸カルシウムなど）、多糖類（例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など）、ペプチド類（例えばコラーゲンなど）、防腐剤（例えば安息香酸およびその塩類、イソプロピルメチルフェノール、塩酸クロルヘキシジン（ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）、オルトフェニルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロメチルフェノール、クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎ）、クロロブタノール、ソルビン酸およびその塩類、デヒドロ酢酸およびその塩類、パラオキシエチレン安息香酸エステル（ｐａｒａｏｘｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｅｎｚｏａｔｅ  ｅｓｔｅｒ）、３−トリフルオロメチル−４，４−ジクロロカルバニリドなど）、増粘剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸カルシウム、多糖類など）、保湿剤（例えばグリセリン、キシリトール、ソルビトール、ジプロピレングリコール、ブタンジオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００〜６００、ポリオキシエチレンメチルグルコシド、マルチトール、マンニトールなど）、色素、香料、水、またはｐＨ調整剤などである。
【００３０】
医薬品は塗布薬、湿布薬、軟膏、ゾル状塗布薬などの外用品以外に、経口摂取の顆粒剤、細粒剤、錠剤、カプセル、シロップ、または液剤などを含む。本発明は美白有効成分を含む以外に、その他の材料を使用して、周知の方法により製造することができる。通常使用されるその他の材料は各種添加剤、例えば賦形剤（例えば乳糖、砂糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロースなど）、結合剤（例えばデンプン溶液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルボキシメチルセルロース液、アラビアガム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液など）、崩壊剤（例えばデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、炭酸カルシウムなど）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなど）、界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、または増粘剤（例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）などである。経口用医薬品の剤形は、咀嚼錠または口腔錠などを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、２つの化合物、リンデラノリドＢ（ｌｉｎｄｅｒａｎｏｌｉｄｅ  Ｂ）およびスバモリドＡ（ｓｕｂａｍｏｌｉｄｅ  Ａ）を、抽出および精製する工程を示す。
【図２Ａ】図２は、異なる濃度のリンデラノリドＢおよびスバモリドＡの、ヒトのメラニン細胞に対する試験結果を示す。他に、コウジ酸、Ｎ−フェニルチオ尿素、およびメラニン細胞刺激ホルモンを含む。図２Ａは、細胞毒性試験である。コントロール群を１００％とする。
【図２Ｂ】図２は、異なる濃度のリンデラノリドＢおよびスバモリドＡの、ヒトのメラニン細胞に対する試験結果を示す。他に、コウジ酸、Ｎ−フェニルチオ尿素、およびメラニン細胞刺激ホルモンを含む。図２Ｂは、チロシナーゼ酵素活性の実験結果である。コントロール群を１００％とする。
【図２Ｃ】図２は、異なる濃度のリンデラノリドＢおよびスバモリドＡの、ヒトのメラニン細胞に対する試験結果を示す。他に、コウジ酸、Ｎ−フェニルチオ尿素、およびメラニン細胞刺激ホルモンを含む。図２Ｃは、ヒト細胞のメラニン含量率である。コントロール群を１００％とする。
【図３】図３は、異なる濃度のリンデラノリドＢおよびスバモリドＡの、細胞成長に対する影響を示す。明視野顕微鏡で２００倍に拡大して観察した。矢印が示す部分は、双極（ｂｉｐｏｌａｒ）の外観を示す初代ヒト新生児メラニン形成細胞（ＨＥＭｎ−ＭＰ）である。
【図４】図４は、異なる濃度のリンデラノリドＢおよびスバモリドＡの、ゼブラフィッシュの色素含量に対する影響を示す。他にＮ−フェニルチオ尿素およびアルブチンの試験結果を含む。いずれもコントロール群を１００％とする。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）の抽出物によって、メラニン生成を抑制する。さらに、細胞実験およびゼブラフィッシュの生体システムを利用して、該抽出物が抗チロシナーゼ活性およびメラニン発現を低下させる機能を有することを証明する。図および以下の説明を参照されたい。その目的は、本発明を説明するための好適な実施例であり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００３３】
実験材料
キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）は、ニッケイ属（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ）に属し、台湾原生の常緑高木の１種である。主に海抜５００〜１５００メートルの間に分布している。その樹皮はニッケイの香りを有し、香料として使用される。葉から抽出した葉油は、食品、タバコの香料とされ、または殺菌剤として使用される。
【実施例２】
【００３４】
抽出および精製
キナモムム・スバベニウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｕｂａｖｅｎｉｕｍ）の茎から２種の化合物、リンデラノリドＢおよびスバモリドＡを分離した。以下化合物（I）および（II）と略す。
【００３５】
【化５】
2011178770.tif 000006
（I）リンデラノリドＢ
【００３６】
【化６】
2011178770.tif 000007
（II）スバモリドＡ
【００３７】
図１を参照されたい。キナモムム・スバベニウムの乾燥茎（８キログラム）を、メタノール（ＭｅＯＨ、８０リットル）を用いて、抽出を６回行った。室温、減圧条件下で、抽出物を合計２０２．５グラム回収した。抽出物を１リットルの水中に懸濁し、さらに５回に分けてクロロホルム（ＣＨＣｌ３、２リットル）を加えて、溶液を分離させた。分離後、クロロホルム層に溶解した抽出物は１２３．５グラム、水層に溶解したのは７４．１グラムであった。クロロホルム層の抽出物１２３．５グラムを、シリカゲル（８００グラム、７０〜２３０メッシュ（ｍｅｓｈ））を用いてクロマトグラフ分析を行った。ノルマルヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）およびメタノールを混合して溶離液とし、合計５組の溶出液を分離した。
【００３８】
第１次溶出液の一部の７．４６グラム（第１次の第１画分、１−１で表す）を、ノルマルヘキサン−酢酸エチル（３０：１）で溶離し、その後十分量の酢酸エチルを加えてクロマトグラフィーを行い、溶出液を合計１０画分（１−１〜１−１０）採取した。第１次の第３画分（４．０２グラム）を、ノルマルヘキサン−酢酸エチル（４０：１）で溶離し、続けて酢酸エチルを加えて、溶出液を３画分（１−３−１〜１−３−３）得た。１−３−２溶出液の重量は４．１１グラムであった。ノルマルヘキサン−酢酸エチル（４０：１）で溶離し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。さらに薄層クロマトグラフィー（ノルマルヘキサン−酢酸エチル（３０：１））を用いて調製し、第１次のクロマトグラフィー結果は、合計でイソリンデラノリドＢ（ｉｓｏｌｉｎｄｅｒａｎｏｌｉｄｅＢ）を２．３１グラム、およびリンデラノリドＢを１３４ミリグラム得た。
【００３９】
第２次溶出液（９．３１グラム）のシリカゲルクロマトグラフィーを行った。ノルマルヘキサン−酢酸エチル（１０：１）で溶離し、続けて酢酸エチルを加えて、溶出液を５画分（２−１〜２−５）得た。２−４溶出液の重量は１．３１グラムであった。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、ノルマルヘキサン−酢酸エチル（４０：１）で溶離し、続けて酢酸エチルを加えて、溶出液を４画分（２−４−１〜２−４−４）得た。溶出液２−４−２（１．０６グラム）を、ノルマルヘキサン−酢酸エチル（１０：１）で溶離し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。薄層クロマトグラフィー（ノルマルヘキサン−酢酸エチル（３０：１））で調製し、スバモリドＡ（ｓｕｂａｍｏｌｉｄｅＡ）３８ミリグラムを分離した。
【実施例３】
【００４０】
細胞実験
本実施例は、ヒトの皮膚のメラニン細胞を用いて、２つの化合物がチロシナーゼを抑制する効果を測定した。
【００４１】
細胞培養
初代ヒト新生児メラニン形成細胞（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｆｏｒｅｓｋｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、ＨＥＭｎ−ＭＰ）は、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（登録商標）から購入し、培地２５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（登録商標））で培養した。ヒトメラニン細胞増殖添加剤（ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＨＭＧＳ、ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−００２−５）を添加し、３７℃の湿潤環境（５％二酸化炭素）下、初代ヒト新生児メラニン形成細胞（ＨＥＭｎ−ＭＰ）を、２４ウェル培養プレートを用いて、細胞密度は１０５個／ウェルで培養した。
【００４２】
毒性試験
異なる濃度の化合物（I）および（II）（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭおよび１０μＭ）、コウジ酸（ｋｏｊｉｃ  ａｃｉｄ）１００μＭ、Ｎ−フェニルチオ尿素ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ（ＰＴＵ）１００μＭ、メラニン細胞刺激ホルモンα−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＳＨ）０．１μＭを細胞培養プレートに添加し、ＭＴＳアッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．、Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８３年、１６、６５（１〜２）、５５〜６３ページ）によって、細胞毒性試験を行った。コウジ酸およびＮ−フェニルチオ尿素が、メラニン阻害剤であることはすでに知られており、メラニン細胞刺激ホルモンはメラニン生成を刺激する。ここで同時に実験を行い、化合物（I）および（II）の効果との比較に用いた。実験結果は、表１および図２Ａに示すとおりである。コントロール群のデータを１００％とし、結果はすべて、３回以上の独立した実験によって得られた。
【００４３】
細胞活性
【００４４】
【表１】
2011178770.tif 000008
【００４５】
図２Ａを参照されたい。コントロール群のデータを１００％とした。細胞活性は、化合物（I）および（II）の濃度が上昇するにつれて低下した。Ｎ−フェニルチオ尿素およびコウジ酸の細胞活性に対する影響は、比較的小さかった。
【００４６】
チロシナーゼ活性試験
Ｙｏｓｈｉｍｕｒａが行った方法（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ他、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、２００１年、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．、２７  Ｓｕｐｐｌ１、Ｓ６８〜７５ページ）に基づき、ドパクロム（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ）生成速度を利用して、チロシナーゼ活性を測定した。ＨＥＭｎ−ＭＰ細胞（１０５個／ウェル）を２４ウェル培養プレートで培養し、すべてのウェルに５００μｌＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培養液を加え、実験する化合物（I）、（II）、コウジ酸、Ｎ−フェニルチオ尿素およびメラニン細胞刺激ホルモンをそれぞれ加えて、３日間培養した。
【００４７】
培養後、仔牛血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）で細胞を洗い、細胞を１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００／ＰＢＳに溶解した。細胞溶解物を回収し、Ｌ−ドーパ（Ｌ−Ｄｏｐａ）およびＬ−チロシン（Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）１０μｌ（１０ｍＭを０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に溶解した）を添加し、３７℃で３時間培養した。反応後、サンプルの４９０ナノメートルの吸光度を測定した。結果は表２および図２Ｂのとおりである。コントロール群のデータを１００％とし、結果はすべて３回以上の独立した実験により得られた。
【００４８】
図２Ｂを参照されたい。チロシナーゼ活性は、化合物（I）および（II）の濃度の上昇に伴い低下した。Ｎ−フェニルチオ尿素およびコウジ酸のチロシナーゼ活性に対する影響は、比較的小さかった。
【００４９】
チロシナーゼ活性
【００５０】
【表２】
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【００５１】
メラニンの定量分析
Ｌｉｎの方法によって、メラニンを測定した（Ｌｉｎ他、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｏｓａｎ  ａｐｐｌｅ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、２００７年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６８巻、８号、１１８９〜１１９９ページ）。細胞を１Ｎ水酸化ナトリウムおよびジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）に溶解し、１時間８０℃で加熱した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄液を吸光度４０５ナノメートルで測定した。結果は表３および図２Ｃのとおりである。コントロール群のデータを１００％とし、結果はすべて３回以上の独立した実験により得られた。化合物（I）および（II）濃度の増加に伴い、細胞のメラニン含量が低下した。コウジ酸およびＮ−フェニルチオ尿素も、メラニン含量を減少させる効果を示したが、メラニン細胞刺激ホルモンはメラニン含量を増加させた。
【００５２】
細胞メラニン濃度
【００５３】
【表３】
2011178770.tif 000010
【００５４】
図３は、異なる濃度のリンデラノリドＢおよびスバモリドＡの、ＨＥＭｎ−ＭＰ細胞の成長に対する影響を示す。明視野顕微鏡により、２００倍に拡大して観察すると、コントロール群と、低濃度の化合物（I）および（II）処理の細胞（図３Ａ、３Ｈ、３Ｉ、３Ｍおよび３Ｎ）は、細胞の配列が緊密で、かつ細長い双極（ｂｉｐｏｌａｒ）の外観を呈した。他に、α−ＭＳＨ処理の細胞（図３Ｂ）も同様の成長状態を示した。
【００５５】
Ｎ−フェニルチオ尿素、コウジ酸、比較的高濃度の化合物（I）および（II）処理の細胞は、比較的配列が乱れ、かつある細胞はすでに双極の特性を失っており、細胞の構造が破壊されたことを示した（図３Ｃ、３Ｄ、３Ｆ、３Ｇ、３Ｋおよび３Ｌ）。高濃度の化合物（I）および（II）処理では、細胞は不規則な配列を呈し、ある細胞の外観は変化し、化合物が細胞に対して部分的に有毒作用を引き起こすことを示した（図３Ｅおよび３Ｊ）。
【実施例４】
【００５６】
ゼブラフィッシュ動物実験
本実施例は、ゼブラフィッシュの生体試験を利用して、２つの化合物の美白効果を、またその投与量がゼブラフィッシュに対して有害性または致死性がないことを検査した。異なる濃度の２つの化合物（１μＭ、５μＭおよび１０μＭ）、Ｎ−フェニルチオ尿素１０μＭ、アルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ）５０μＭを、それぞれゼブラフィッシュ胎児の培養環境に加えた。すべての実験群は４〜９個の胎児を含む。図４からわかるように、１０μＭの２つの化合物はゼブラフィッシュの色素を２０％〜３０％減少させた。またゼブラフィッシュに対して毒性を示さなかったが、その効果は濃度が比較的高いＮ−フェニルチオ尿素およびアルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ）にわずかに劣った。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の技術は化粧品業界、バイオ医療技術業界などで応用することができる。発明の主な目的は、全世界で紫外線含量が非常に高く、皮膚を刺激することで、メラニン生成が加速され、それに伴う皮膚癌罹患率に対応することである。本発明は、抽出された化合物がチロシナーゼ活性を抑制することができ、良好なメラニン生成抑制効果を有し、なおかつ人体の正常な皮膚細胞に使用した研究プラットホームとすることを確認した。
【符号の説明】
【００５８】
１０  メタノールを加える
２０  クロロホルムおよび水の分離液に溶解する
３０  クロマトグラフ分析を行う。ノルマルヘキサン、酢酸エチルおよびメタノールを溶離液とする
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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