(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｉｇ（免疫グロブリン）Ｇに対して高度な親和性を有するＦｃ結合性タンパク質を改良することで、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質およびその製造方法の提供。【解決手段】野生型ヒトＦｃ受容体のうち、細胞外領域にある１つ以上の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、野生型ヒトＦｃ受容体と比較し熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質。当該Ｆｃ結合性タンパク質を固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィー用リガンド。【選択図】図３２
2011206046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質であって、以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含む、該Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号１の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号１の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号１の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号１の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号１の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号１の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号１の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号１の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号１の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号１の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号１の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号１の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニン、セリンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニン、バリンまたはセリンに置換
（１６７）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質であって、少なくとも以下の（４）、（１４）、（４１）および（７９）のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
【請求項３】
配列番号２、３、４、５、１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含む、請求項２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項４】
配列番号２、３、４、５、１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
宿主が大腸菌である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７または８に記載の形質転換体を用いた、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材。
【請求項１１】
（１）配列番号１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材に、抗体を含む溶液を添加して該吸着材に該抗体を吸着させる工程と、
（２）該吸着材に吸着した該抗体をｐＨ３．０から４．５の緩衝液を用いて溶出させる工程と、
を含む抗体精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質に関するものであり、より詳しくは、アフィニティークロマトグラフィー用の免疫グロブリン親和性リガンドとして用いるために熱安定性などの特性が改良されたＦｃ結合性タンパク質、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質を構成要素として用いた免疫グロブリンを吸着する吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧという）による免疫信号は、抗原捕捉後のＩｇＧが免疫細胞表面に存在するＦｃ受容体との結合によって伝達される。Ｆｃ受容体はＩｇＧのＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子であり、個々の分子種は免疫グロブリン・スーパーファミリーに属するＦｃ認識ドメインを有し、単一種の、または同じサブタイプに属する免疫グロブリンを認識する。これによって個々の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動員されるかが決定される（非特許文献１）。Ｆｃ受容体は、さらにサブタイプに分類することができ、ＩｇＧに対する受容体としてはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。
【０００３】
ＦｃγＲＩは、シグナルペプチド領域、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に大別され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後、両者の結合のシグナルが細胞質内へと伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜貫通領域と細胞外領域の境界にあるシステインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。ＦｃγＲＩのα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列は非特許文献３により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により大腸菌（特許文献１）または動物細胞を宿主細胞とした発現例が報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
前述した通りＦｃγＲＩの細胞外領域を構成するタンパク質（以下、Ｆｃ結合性タンパク質という）は、高度な親和性のもと、ヒト抗体に対する優れた識別機能を有している。この高度な親和性に基づいて、Ｆｃ結合性タンパク質は、診断試薬、抗体医薬品の研究用ツールまたはＩｇＧなどの抗体医薬品の製造工程で利用されるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして活用する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００５】
Ｆｃ結合性タンパク質は、ヒト生体内で機能するタンパク質を起源とするタンパク質であり、細菌の細胞表層などの生体外に存在するタンパク質に比べて、熱や極端なｐＨ変化などによりタンパク質変性が起こる傾向が強い。そのため、Ｆｃ結合性タンパク質をＩｇＧ製造のためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして使用する場合、該リガンドを固定化したゲルを用いてクロマト操作により吸着したＩｇＧを溶出させる際に、該リガンドがクエン酸緩衝液などの低いｐＨの溶液に晒されることがあるため、該Ｆｃ結合性タンパク質には酸に対する安定性が求められる。また、該ゲルを洗浄または再生する場合に該リガンドが水酸化ナトリウム溶液などの高いｐＨの溶液に晒されることがあるため、該Ｆｃ結合性タンパク質にはアルカリに対する安定性が求められる。さらに、該ゲルの長期間の保存を考慮すると、該Ｆｃ結合性タンパク質には熱に対する安定性も求められる。
【０００６】
タンパク質のような生体物質を工業的に利用するためには、該生体物質が有する天然の構造を改良することで、所定の条件下で安定な物質を改めて作製することが求められる場合もある。酵素タンパク質などでは、それをコードするポリヌクレオチドに人工的に変異を導入し、スクリーニング後、求める形質を獲得した変異体を取得した例が数多く報告されている。しかしながら、受容体タンパク質であるＦｃ結合性タンパク質に関しては、熱、酸またはアルカリに対して安定性が向上した改良体の報告例はなく、これまで工業的に利用された例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献４】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献５】タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＩｇＧに対して高度な親和性を有するＦｃ結合性タンパク質を改良することで、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質およびその製造方法を提供することにある。また本発明は、該タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして用い、Ｆｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を特異的に分離する方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質における構造安定性に関与したアミノ酸残基を特定し、該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が熱、酸および／またはアルカリに対する優れた安定性を有し、かつアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｋ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質であって、以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含む、該Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号１の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号１の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号１の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号１の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号１の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号１の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号１の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号１の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号１の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号１の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号１の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号１の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニン、セリンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニン、バリンまたはセリンに置換
（１６７）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質であって、少なくとも以下の（４）、（１４）、（４１）および（７９）のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む、（Ａ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（Ｃ）配列番号２、３、４、５、１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含む、（Ｂ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【００１２】
（Ｄ）配列番号２、３、４、５、１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、（Ｂ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【００１３】
（Ｅ）（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１４】
（Ｆ）（Ｅ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００１５】
（Ｇ）（Ｆ）に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【００１６】
（Ｈ）宿主が大腸菌である、（Ｇ）に記載の形質転換体。
【００１７】
（Ｉ）（Ｇ）または（Ｈ）に記載の形質転換体を用いた、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【００１８】
（Ｊ）（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材。
【００１９】
（Ｋ）（１）配列番号１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材に、抗体を含む溶液を添加して該吸着材に該抗体を吸着させる工程と、（２）該吸着材に吸着した該抗体をｐＨ３．０から４．５の緩衝液を用いて溶出させる工程と、を含む抗体精製法。
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１５番目までの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目から３１３番目までの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目から３７４番目までの領域）から構成される。
【００２２】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域を含んでいればよく、ＥＣ領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳＳ領域）の全てまたは一部が含まれていてもよいし、ＥＣ領域のＣ末端側にある膜貫通領域（図１のＴＭ領域）または細胞内領域（図１のＣ領域）を含んでいてもよい。さらに、ポリヒスチジンタグといった精製などを行なうためのタグペプチドがＮ末端側またはＣ末端側に付加されていても本発明のＦｃ結合性タンパク質に含まれる。
【００２３】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列中の細胞外領域（図１のＥＣ領域）の一部である１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域にあるアミノ酸残基のうち、少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されたポリペプチドであり、該置換により、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる野生型のヒトＦｃγＲＩと比較し、熱安定性、酸安定性および／またはアルカリ安定性が著しく向上し、かつアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして有用なことを見出している。具体的には本発明のＦｃ結合性タンパク質は、実施例で開示されているように、４３℃で１０分間加熱処理を行なったり、７０℃で２０分間加熱処理を行なったり、ｐＨ３．０の酸条件下で２４時間処理を行なったり、ｐＨ１０のアルカリ条件下で５３℃で２０分間処理を行なったりしても、アミノ酸置換を施していない野生型のヒトＦｃγＲＩ以上の抗体結合活性を保持している。
【００２４】
具体的には、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域のアミノ酸を含んでおり、かつ、Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ（この表記は、配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３８Ａｌａ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ａｒｇ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ａｌａ６２Ｖａｌ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｓｅｒ６９Ｐｈｅ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ａｓｐ９４Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１０Ａｓｎ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｐｒｏ、Ｔｒｐ１４９Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ｓｅｒ、Ａｓｎ２０６Ｌｙｓ、Ａｓｎ２０６Ｓｅｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２１８Ｖａｌ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２４８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ、
Ｖａｌ１７Ｇｌｙ、Ｖａｌ１７Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１９Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｔｈｒ２５Ａｒｇ、Ｇｌｎ２７Ｐｒｏ、Ｇｌｎ２７Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５Ｍｅｔ、Ｇｌｕ３５Ａｒｇ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４４Ａｓｐ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ａｓｎ、Ｌｅｕ４６Ａｓｐ、Ｌｅｕ４６Ｇｌｎ、Ｌｅｕ４６Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ４６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ４６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４７Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４７Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４７Ａｓｎ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｐｒｏ４９Ａｌａ、Ｇｌｙ５０Ａｒｇ、Ｇｌｙ５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５１Ｐｒｏ、Ｓｅｒ５１Ｖａｌ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ５３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５３Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５３Ｐｒｏ、Ｇｌｎ５５Ａｒｇ、Ｐｈｅ５７Ｔｙｒ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６１Ａｌａ、Ｔｈｒ６１Ｓｅｒ、Ａｌａ６２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ６３Ｌｅｕ、Ｔｈｒ６３Ｐｈｅ、Ｇｌｎ６４Ｐｒｏ、Ｇｌｎ６４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ６４Ｌｅｕ、Ｇｌｎ６４Ｌｙｓ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｔｈｒ６５Ｖａｌ、Ｓｅｒ６６Ｔｈｒ、Ｔｈｒ６７Ａｌａ、Ｔｈｒ６７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ６９Ａｌａ、Ｔｙｒ７０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｔｙｒ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｔｈｒ７３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ７４Ｐｈｅ、Ｓｅｒ７６Ａｓｎ、Ｖａｌ７７Ａｓｐ、Ｖａｌ７７Ｌｙｓ、Ａｓｎ７８Ｓｅｒ、Ａｓｎ７８Ｇｌｙ、Ｓｅｒ８０Ａｌａ、Ａｒｇ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｙ８８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ８９Ｇｌｎ、Ｌｅｕ８９Ｐｒｏ、Ｓｅｒ９０Ｇｌｙ、Ａｒｇ９２Ｃｙｓ、Ａｒｇ９２Ｌｅｕ、Ｉｌｅ９６Ｖａｌ、Ｉｌｅ９６Ｌｙｓ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｇｌｎ９７Ｌｙｓ、Ｈｉｓ１０１Ｌｅｕ、Ａｒｇ１０２Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ１０３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１０３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１１４Ｍｅｔ、Ｐｈｅ１１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ１１４Ｔｈｒ、Ｐｈｅ１１４Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１１５Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ａｌａ１２１Ｔｈｒ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｙｓ１２８Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３３Ａｒｇ、Ａｓｎ１３４Ｓｅｒ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ｔｙｒ１３８Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ａｓｎ１４０Ａｓｐ、Ｇｌｙ１４１Ａｓｐ、Ｇｌｙ１４１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１４２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４２Ａｒｇ、Ｐｈｅ１４４Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１４７Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４８Ａｒｇ、Ｈｉｓ１４８Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｉｌｅ、Ａｓｎ１５２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ１５４Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１５６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ａｓｎ１５９Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５９Ａｓｐ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ、Ｉｌｅ１６０Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１６１Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｍｅｔ１７１Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｈｉｓ１７４Ｇｌｎ、Ｔｈｒ１７７Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１８２Ｖａｌ、Ｓｅｒ１８２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ｐｒｏ１９０Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９３Ｌｅｕ、Ａｓｎ１９５Ａｌａ、Ａｌａ１９６Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９８Ｇｌｙ、Ｖａｌ１９８Ｍｅｔ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｓｅｒ２００Ｇｌｙ、Ｓｅｒ２００Ａｒｇ、Ｌｅｕ２０２Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２０３Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２０３Ｔｙｒ、Ｌｅｕ２０３Ａｒｇ、Ｌｅｕ２０３Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２０４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２０７Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２０７Ａｒｇ、Ｔｈｒ２０９Ａｌａ、Ｓｅｒ２１１Ａｒｇ、Ｓｅｒ２１１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｇｌｕ２１３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２１５Ａｒｇ、Ｌｙｓ２１５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２１７Ａｒｇ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｌｅｕ２１８Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２１８Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２１９Ｐｒｏ、Ｇｌｎ２１９Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２３Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２３Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２２３Ｍｅｔ、Ｇｌｎ２２４Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２５Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２２７Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２３１Ａｒｇ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｓｅｒ２３３Ａｓｎ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２４４Ｖａｌ、Ｔｙｒ２４５Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２４５Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４６Ａｒｇ、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２４８Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｔｈｒ２４９Ｓｅｒ、Ａｌａ２５０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５１Ｓｅｒ、Ａｒｇ２５２Ｈｉｓ、Ｇｌｕ２５３Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２５７Ａｒｇ、Ｌｅｕ２５７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌ、Ｇｌｕ２６１Ａｌａ、Ａｌａ２６２Ｖａｌ、Ａｌａ２６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２６４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２６５Ａｌａ、Ｇｌｕ２６５Ｇｌｙ、Ａｓｎ２６８Ｓｅｒ、Ａｓｎ２６８Ｉｌｅ、Ａｓｎ２６８Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２７０Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２７０Ａｒｇ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｙｓ２７１Ａｒｇ、Ａｒｇ２７２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２７７Ｖａｌ、Ｇｌｎ２７９Ａｒｇ、Ｇｌｎ２７９Ｈｉｓ、Ｇｌｙ２８２Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２８５Ａｒｇ、Ｌｅｕ２８５Ｈｉｓ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｎ、Ｐｒｏ２８６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２８６Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｕ、Ｔｈｒ２８７Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２８７Ａｌａ、Ｔｈｒ２８７Ｖａｌ、Ｔｈｒ２８７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８８Ａｌａ、Ｐｒｏ２８８Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８８Ｔｈｒ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、Ｖａｌ２８９Ｇｌｙ、Ｖａｌ２８９ＬｅｕおよびＶａｌ２８９Ｉｌｅのいずれかの置換を１つ以上含むポリペプチドである。また前記置換の中でも、Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎのいずれかの置換を１つ以上含んでいると、さらに熱安定性が向上するため好ましい。また前記置換の中でも、Ｌｅｕ４６Ａｒｇ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｌｅｕ４６Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ａｓｎ、Ｌｅｕ４６Ａｓｐ、Ｌｅｕ４６Ｇｌｎ、Ｌｅｕ４６Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ４６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ４６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１４Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１１４Ｍｅｔ、Ｐｈｅ１１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ１１４ＴｈｒおよびＰｈｅ１１４Ｖａｌのいずれかの置換を１つ以上含んでいると、Ｆｃ結合性タンパク質の熱、酸およびアルカリに対する安定性がさらに向上するため好ましい。
【００２５】
なお、アミノ酸置換により本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定のアミノ酸位置については、抗体結合活性を有する限り前述した置換以外のアミノ酸に置換してもよい。一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があり、保守的置換はＦｃ結合性タンパク質に限らず一般にタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、グルタミン酸とアラニン間があげられる（非特許文献５）。
【００２６】
本発明のＦｃ結合性タンパク質において、置換するアミノ酸の数に特に制限はなく、一例として、
（ａ）Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１１４ＬｅｕおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐからなる４重置換体（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｂ）Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４ＬｅｕおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐからなる６重置換体（配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｃ）Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３ＳｅｒおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐからなる８重置換体（配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｄ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる１９重置換体（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｅ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる３２重置換体（配列番号１１４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｆ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる３６重置換体（配列番号１１８に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｇ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる４４重置換体（配列番号１３０に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｈ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる４８重置換体（配列番号１３４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｉ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる５４重置換体（配列番号１４８に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｊ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる５６重置換体（配列番号１５４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｋ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎからなる５７重置換体（配列番号１６４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｌ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐからなる６０重置換体（配列番号１７４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｍ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐからなる６１重置換体（配列番号１７０に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｎ）Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐからなる６２重置換体（配列番号１７６に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸を含むＦｃ結合性タンパク質）、があげられる。特に前記（ｃ）から（ｎ）に示す置換体が熱、酸およびアルカリに対する安定性がさらに向上する点で好ましい。
【００２７】
本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとする）の作製方法としては、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
【００２８】
なお、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する場合は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００２９】
前記（ＩＩ）の方法で作製する場合、ＤＮＡ増幅法として、いわゆるエラープローンＰＣＲ法を用いることもできる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件はヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定されないが、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
【００３０】
さらに本発明のポリヌクレオチドの作製方法として、
（ＩＩＩ）ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射して、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法、
もあげられる。該薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル―Ｎ’―ニトロ―Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジンなど当業者が通常用いる変異原薬剤を用いればよい。
【００３１】
なお、前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（配列番号１８２）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特願２００９−２５６１８０号）。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミドなど）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターなどが例示できる。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータなどが例示できる。
【００３３】
前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株やＢＬ２１（ＤＥ３）株など）を選択する場合には、非特許文献６に記載の方法などにより形質転換すればよい。そのような方法で形質転換して得られた形質転換体から適切な方法でスクリーニングすることにより、熱、酸、アルカリに対する安定性が向上した本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を取得することができる。この形質転換体から、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを調製するには、アルカリ抽出法やＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体をスクリーニングするには、例えば発現するＦｃ結合性タンパク質に対する抗体の結合活性を測定することで行なうことができる。抗体の結合活性は、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥＬＩＳＡ法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することができる。このような測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１が特に好ましい。
【００３４】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主（形質転換体）を培養することで製造できる。該形質転換体の培養方法は、具体的には、該形質転換体を培養し、その培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出することを含む。本発明のＦｃ結合性タンパク質の製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入の有無によって形質転換体の増殖を選択的に可能とするために、培地に該発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらに、グリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。
【００３５】
培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドが良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３７】
本発明の形質転換体の培養液からＦｃ結合性タンパク質を抽出するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕して、Ｆｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。抽出タンパク質の中からＦｃ結合性タンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。
【００３８】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を分離精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして有用である。本発明のＦｃ結合性タンパク質を前記クロマトグラフィーに適用させるには、本発明のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化させたＦｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材（以下、単に本発明の吸着材という）の形態で用いるとよい。
【００３９】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を固定化させるための固相としては、親水性ビニルポリマー、シリカ、ガラス、セファロース（商品名）、アガロース、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリスチレンを含む物質などを例示することができる。なお固相の形態を、空孔が制御された形態、またはメンブランの形態とすると分離能がよくなる点で好ましい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化させるには、例えば、固相表面にエポキシ基、ホルミル基、アミノ基、カルボキシル基などの活性基を導入後、本発明のＦｃ結合性タンパク質表面に存在するアミノ酸残基と共有結合させればよい。
【００４０】
本発明の吸着材を用いて分離精製するＦｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質（以下、目的タンパク質という）の一例として、ＩｇＧの定常領域を含むタンパク質があげられ、その具体例としては、ＩｇＧや、ＩｇＧのＦｃ結合性タンパク質結合部位と他のタンパク質との融合タンパク質があげられる。なお、ここでいうＩｇＧの定常領域は、例えばパパイン等のプロテアーゼ処理によりＩｇＧから生じるヒンジやＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。本発明の吸着材を用いて分離精製する目的タンパク質の例として、ヒトＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ラクダＩｇＧなどがあげられ、特にヒトＩｇＧまたはヒト化ＩｇＧが好ましい。本発明の吸着材を用いて分離精製するヒトＩｇＧには、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３およびヒトＩｇＧ４があげられる。本発明の吸着材を用いて分離精製する目的タンパク質の別の例としては、モノクローナルＩｇＧ抗体、ポリクローナルＩｇＧ抗体、ＩｇＧ断片などがあげられる。
【００４１】
本発明の吸着材を用いて目的タンパク質を分離精製するには、
（１）本発明のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られるＦｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材に目的タンパク質を含む溶液を添加して、該吸着材に該目的タンパク質を吸着させる工程と、
（２）該吸着材に吸着した該目的タンパク質を適切な溶出液を用いて溶出させる工程、
を含む工程で行なえばよい。
【００４２】
本発明の吸着材を用いて分離精製する目的タンパク質は、例えば、遺伝子組換え技術を用いて、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）といった動物細胞、昆虫細胞、大腸菌やバチルス属細菌といった細菌、パン酵母やポンベ酵母といった酵母、または麹菌といった糸状菌などで発現させることにより生産できる。なお目的タンパク質を、その表面に糖鎖を必要とする形態で生産させたい場合は、真核細胞である動物細胞、昆虫細胞、酵母または糸状菌を選択すればよく、ＣＨＯ細胞を用いるとより好ましい。本発明の吸着材を用いて分離精製する目的タンパク質を含む溶液の一例としては、目的タンパク質を発現可能な宿主（動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、糸状菌など）の培養液、目的タンパク質を発現可能な植物の破砕液、ウシ等動物のミルクがあげられる。なお、これらの例のうち、培養液については、目的タンパク質を発現可能な宿主を含んでいてもよく、適切な前処理により該宿主を除いてもよい。ここでいう適切な前処理とは、遠心分離操作、精密ろ過膜や限外ろ過膜を例示することができ、当業者によって周知の方法を採用すればよい。
【００４３】
本発明の吸着材に目的タンパク質を吸着させる工程の一例として、本発明の吸着材を適切な容量の空カラムに充填することで分離精製用カラムを作製後、該カラムに適切な送液システム（例えば、液体クロマトグラフィーで用いられる高圧ポンプやペリスタリックポンプ）を用いて、目的タンパク質を含む溶液を、直接またはｐＨ調整した状態で添加して目的タンパク質を吸着させる工程があげられる。目的タンパク質を含む溶液をｐＨ調整する場合、目的タンパク質が変性しない条件であれば、調整するｐＨに特に限定はなく、中性でも酸性でもアルカリ性でもよい。ただし、通常の目的タンパク質の場合、ｐＨを３から１０の範囲で調整すると好ましく、ｐＨ４からｐＨ８の範囲に調整すると特に好ましい。
【００４４】
本発明の吸着材に吸着した目的タンパク質を溶出させる際に、前記吸着工程後、直ちに目的タンパク質を溶出させてもよいが、好ましくは溶出工程前に適切な洗浄液を用いて夾雑タンパク質を除去する洗浄工程を経てから溶出させるとよい。該洗浄液としては目的タンパク質が溶出しない条件のｐＨに調整した緩衝液であればよい。洗浄液として用いる緩衝液の構成要素の一例として、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、ホウ酸、アンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウムやコハク酸アンモニウム）、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）およびこれらの組み合わせがあげられる。洗浄液として用いる緩衝液のｐＨは目的タンパク質により異なるが、一般的にはｐＨが３から１０の範囲が好ましく、特にｐＨ４からｐＨ８の範囲が好ましい。なお、洗浄液として用いる緩衝液には、必要に応じて、添加剤を存在させてもよく、例えば、緩衝液イオン強度を調整するための、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウムなどの塩や、グリシン、ヒスチジン、アルギニンなどのアミノ酸、尿素などのカオトロピック試薬、エタノール、マンニトール、グリセロール、ベンジルアルコールなどのアルコール、スクロース、マルトース、トレハロース、フルクトースなどの糖などがあげられる。
【００４５】
本発明の吸着材に吸着した目的タンパク質を溶出させる工程では、適切な溶出液を用いて目的タンパク質を該吸着材から解離させ、適切な容器に回収する。該溶出液としては目的タンパク質が溶出し、かつ目的タンパク質が変性しない条件のｐＨに調整した緩衝液であればよい。溶出液として用いる緩衝液のｐＨは目的タンパク質により異なるが、一般的にはｐＨが２から１１の範囲が好ましく、特にｐＨ２．５からｐＨ６の範囲が好ましい。なお本発明の吸着材が、配列番号１１４、１１８、１３０、１３４、１４８、１５４、１６４、１７０、１７４および１７６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化させて得られた吸着材である場合、溶出液として用いる緩衝液のｐＨは３．０から４．５の範囲である。また、溶出液として用いる緩衝液には、必要に応じて、添加剤を存在させてもよく、例えば、目的タンパク質を安定化させるための界面活性剤や塩、糖などがあげられる。
【００４６】
本発明の吸着材を用いて分離精製された目的タンパク質は、カラムクロマトグラフィーに供することで、さらに高純度に精製することもできる。用いることができるクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが例示できる。
【発明の効果】
【００４７】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、野生型のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのうち、細胞外領域にある１つ以上の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したタンパク質であり、該タンパク質は野生型のヒトＦｃγＲＩと比較し、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして用いることで、ヒトＩｇＧといった抗体を安定的に精製することができる。
【００４８】
また、Ｆｃ結合性タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られた形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を製造する方法において、Ｆｃ結合性タンパク質として本発明のＦｃ結合性タンパク質を用いると、タンパク質生産性が向上する。そのため、本発明はＦｃ結合性タンパク質の工業的な製造においても有用である。
【００４９】
なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質は野生型のヒトＦｃγＲＩと比較し、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られるＦｃ結合性タンパク質結合部位を含むタンパク質を吸着する吸着材は、例えば、アルカリ処理（例えば、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液）による再生処理を行なっても、吸着性能はほとんど劣化しない。したがって本発明の吸着材は、ヒトＩｇＧといった抗体の大量精製用途に特に好ましいといえる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩの構造の概略を示す図である。
【図２】ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドｐＵＣＦｃＲの構造概略図である。
【図３】Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドｐＥＴＦｃＲ作製の概略図である。
【図４】プラスミドｐＥＴＭａｌＥの構造概略図である。
【図５】プラスミドｐＥＴＦｃＲの構造概略図である。
【図６】プラスミドｐＥＴＦｃＲ形質転換体で発現したＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を評価した図である。
【図７】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４、ＦｃＲｍ６、ＦｃＲｍ８、ＦｃＲｍ１９）の生産性を評価した図である。
【図８】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の生産性を評価した図である。
【図９】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のアルカリ安定性を評価した図である
【図１０】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）の生産性を評価した図である。
【図１１】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図１２】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）の生産性を評価した図である。
【図１３】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図１４】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）の生産性を評価した図である。
【図１５】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図１６】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）の生産性を評価した図である。
【図１７】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図１８】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）の生産性を評価した図である。
【図１９】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図２０】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）の生産性を評価した図である。
【図２１】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図２２】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６２）の生産性を評価した図である。
【図２３】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６２）のアルカリ安定性を評価した図である。
【図２４】Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性を評価した図である。
【図２５】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルの抗体溶出性を評価した図である。
【図２６】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）固定化ゲルの抗体溶出性を評価した図である。
【図２７】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）固定化ゲルの抗体溶出性を評価した図である。
【図２８】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）固定化ゲルの抗体溶出性を評価した図である。
【図２９】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルの抗体溶出性を評価した図である。
【図３０】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）固定化ゲルの抗体溶出性を評価した図である。
【図３１】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルのアルカリ安定性を評価した図である。
【図３２】Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルの繰り返し安定性を評価した図である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
実施例１  ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのクローニング
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を基に、細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域（１６番目から３７４番目までの領域）について大腸菌型のコドンを用いてヌクレオチド配列への変換を行なった。
（２）前記ヌクレオチド配列を基にして、ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを作製するための５２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドを配列番号１０から６１に示す。
（３）（２）で合成したオリゴヌクレオチドから、ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの全長を作製するために、下記に示す２段階のＰＣＲを行なった。
（３−１）１段階目のＰＣＲ反応を、表１に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００５３】
【表１】
2011206046.tif 000003
【００５４】
なお、表１に記載のＤＮＡミックスは、前記５２種類の５０ｐｍｏＬ／μＬの各合成オリゴヌクレオチドを同量ずつ採取し混合した溶液を指す。
（３−２）２段階目のＰＣＲ反応を、表２に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００５５】
【表２】
2011206046.tif 000004
【００５６】
なお、表２に示す組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲの反応液を用い、ＰＣＲプライマーは配列番号１０（５’−ＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴ−３’）および配列番号６１（５’−ＧＧＴＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＣＡＣ−３’）からなるオリゴヌクレオチドを用いた。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズ（約１．１ｋｂｐ）のＤＮＡバンドを確認することができた。
（４）前記ＤＮＡバンドを抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社製）し、抽出ＤＮＡの５’末端をリン酸化（ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ：タカラバイオ社製）後、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドベクターに挿入した。
（５）（４）で調製したプラスミドベクターと５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（６）定法に従い形質転換体からプラスミドを抽出し（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）、これをｐＵＣＦｃＲとした。構造の概略を図２に示す。
【００５７】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質の発現ベクター作製
Ｆｃ結合性タンパク質を大腸菌で発現させるために、ＭａｌＥシグナルペプチド（アミノ酸配列；ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ、配列番号１８２）を利用した系を構築した。作製工程の概略を図３に示す。
（１）ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製するために、配列番号６２（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）と、配列番号６３（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、配列番号６４（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、配列番号６５（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲ法を用いて連結した。ＰＣＲ反応は表３に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なった。
【００５８】
【表３】
2011206046.tif 000005
【００５９】
（２）前記ＰＣＲ産物を鋳型とし、ＰＣＲプライマーとして配列番号６２と配列番号６５からなる各オリゴヌクレオチドを用いて、表４に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲ反応をすることで、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
【００６０】
【表４】
2011206046.tif 000006
【００６１】
（３）（２）で作製したＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化した。これを制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をヒートショック法により形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＥＴＭａｌＥを調製した。構造の概略を図４に示す。
（５）実施例１で作製したｐＵＣＦｃＲ（図２）を鋳型とし、配列番号６６（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）と配列番号６７（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用い、表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲ反応により、Ｆｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（６）（５）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション後、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をヒートショック法により形質転換した。
（７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドｐＥＴＦｃＲを調製した。その構造概略を図５に示す。
【００６２】
実施例３  塩基配列の解析
実施例１で作製したｐＵＣＦｃＲ（図２）および実施例２で作製したｐＥＴＦｃＲ（図５）中に挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、配列番号６８（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）と配列番号６９（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００６３】
解析の結果、ｐＵＣＦｃＲおよびｐＥＴＦｃＲに挿入されたポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。ｐＵＣＦｃＲに挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号７０に、前記ポリヌクレオチドから翻訳したＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７１に示した。また、ｐＥＴＦｃＲに挿入されたポリヌクレオチドの配列を配列番号７２に、前記ポリヌクレオチドから翻訳したＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７３に示した。
【００６４】
実施例４  Ｆｃ結合性タンパク質の調製および抗体結合活性の測定
（１）ｐＥＴＦｃＲ（図５）により形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し（３７℃で１８時間）、さらに培養液を、再調製した５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地に接種した。
（２）培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）の値が０．５になったところで、培養温度を２０℃に切り替えて３０分培養後、ＩＰＴＧを０．０１ｍＭとなるように培養液に添加し培養した（２０℃で１８時間）。
（３）培養終了後、遠心分離操作により菌体を集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて菌体からタンパク質を調製した。
（４）得られた調製タンパク質の抗体結合活性を、以下の方法でＥＬＩＳＡ法により評価した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定し（４℃で１８時間）、固定化終了後、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、調製したタンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で２時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識の抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（４−４）３０℃で２時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６５】
測定結果を図６に示す。図中、Ｘ軸（横軸）はサンプルの希釈倍率を示し、Ｙ軸（縦軸）は、４５０ｎｍの吸光度（単位は任意）であり抗体結合活性を示す。図６に示すように、形質転換体から得られた可溶性タンパク質抽出液は、その濃度が高くなるほど（希釈倍率が小さいほど）吸光度の値が高くなった。すなわち、組み換えプラスミドであるｐＥＴＦｃＲ（図５）により大腸菌を形質転換した形質転換体が、Ｆｃ結合性タンパク質を発現することを確認できた。
【００６６】
実施例５  Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
（１）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表５に示す。
【００６７】
【表５】
2011206046.tif 000007
【００６８】
ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は０．１４％であった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同制限酵素で消化した実施例２で作製したｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養した（３７℃で１８時間）。
【００６９】
培養後プレート上には約５００００個のコロニーが形成された。これらのコロニーを混合した混合コロニーから、プラスミドＤＮＡを抽出しプラスミドライブラリーとした。
【００７０】
実施例６  安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例５で作製したプラスミドライブラリーを用いて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（２）前記形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（１６ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、５０μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（４）培養後、遠心操作により得られる培養上清を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈し、実施例４（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定した。また、前記培養上清を４３℃で１０分間熱処理後、同様にＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定した。約２５００株の形質転換体を評価し、前記形質転換体からｐＥＴＦｃＲで発現されるＦｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上した、Ｆｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得ることができた。
（５）熱安定性または発現量が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
【００７１】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３８Ａｌａ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ａｒｇ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ａｌａ６２Ｖａｌ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｓｅｒ６９Ｐｈｅ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ａｓｐ９４Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１０Ａｓｎ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｐｒｏ、Ｔｒｐ１４９Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ｓｅｒ、Ａｓｎ２０６Ｌｙｓ、Ａｓｎ２０６Ｓｅｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２１８Ｖａｌ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２４８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、またはＬｅｕ２８５Ｇｌｎ置換であった。熱処理後の抗体結合活性の残存率（残存活性）、アミノ酸置換の解析結果を表６に示す。表６に示すように、Ｆｃ結合性タンパク質に対しアミノ酸置換（変異）処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性が向上することが明らかとなった。
【００７２】
【表６】
2011206046.tif 000008
【００７３】
実施例７  アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質の作製
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の構造安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積して、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、ＰＣＲ法を主体に行ない、以下の４種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）４箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ４
（ｂ）ＦｃＲｍ４に２箇所のアミノ酸置換を追加し、合計６箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ６
（ｃ）ＦｃＲｍ６に２箇所のアミノ酸置換を追加し、合計８箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ８
（ｄ）ＦｃＲｍ８に１１箇所のアミノ酸置換を追加し、合計１９箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ１９
以下、各のＦｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
【００７４】
（ａ）ＦｃＲｍ４
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１１４ＬｅｕおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質（アミノ酸置換していないＦｃ結合性タンパク質）に集積したＦｃＲｍ４を作製した。Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１１４ＬｅｕおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐからなるアミノ酸置換の集積には、スクリーニングで取得した、各アミノ酸が置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体中のｐＥＴＦｃＲに挿入された、前記Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて行なった。
（ａ−１）スクリーニングで取得した、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｐＥＴＦｃＲプラスミドを鋳型とし、配列番号６８および配列番号７４（５’−ＡＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクルすることで行なった。
（ａ−２）スクリーニングで取得した、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｐＥＴＦｃＲプラスミドを鋳型とし、配列番号７５（５’−ＴＧＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＴＣＣＴ−３’）および配列番号７６（５’−ＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＴＣＧＧＡＴＣＧＣ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ａ−３）スクリーニングで取得した、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｐＥＴＦｃＲプラスミドを鋳型とし、配列番号７７（５’−ＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＣＧＡＴＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＴ−３’）および配列番号７８（５’−ＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＴＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＴＡＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ａ−４）スクリーニングで取得した、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｐＥＴＦｃＲプラスミドを鋳型とし、配列番号７９（５’−ＣＧＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＴＡＴＡＴＧＧＧＣＡ−３’）および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ａ−５）（ａ−１）から（ａ−４）までの４種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。
【００７５】
【表７】
2011206046.tif 000009
【００７６】
（ａ−６）（ａ−５）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これにより４箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ａ−７）（ａ−６）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−８）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４箇所アミノ酸置換処理したポリペプチドであるＦｃＲｍ４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４を得た。
（ａ−９）ｐＥＴＦｃＲｍ４のヌクレオチド配列の解析を、実施例３と同様の方法で行なった。
【００７７】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ４のアミノ酸配列を配列番号２に、前記ＦｃＲｍ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に示す。なお、配列番号２において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ４のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また配列番号２において、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目の位置にそれぞれある。
【００７８】
（ｂ）ＦｃＲｍ６
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４ＬｅｕおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲｍ６を作製した。前記作製したプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４を基に、配列番号８０（５’−ＴＧＣＡＡＣＧＴＣＡＣＧＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡ−３’）および配列番号８１（５’−ＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴＧＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＴｈｒ３８Ｓｅｒのアミノ酸置換を、配列番号８２（５’−ＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴ−３’）および配列番号８３（５’−ＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＩｌｅ１００Ｖａｌのアミノ酸置換を行ない、それをｐＥＴＦｃＲｍ４に集積した。
（ｂ−１）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４を鋳型とし、配列番号６８および配列番号８０からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。
（ｂ−２）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４を鋳型とし、配列番号８１および配列番号８２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｂ−１）と同様にＰＣＲ反応を実施した。
（ｂ−３）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４を鋳型とし、配列番号８３および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｂ−１）と同様にＰＣＲ反応を実施した。
（ｂ−４）（ｂ−１）から（ｂ−３）の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。
（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これにより６箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ６をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−６）（ｂ−５）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換処理したポリペプチドであるＦｃＲｍ６をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６を得た。
（ｂ−８）ｐＥＴＦｃＲｍ６の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【００７９】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ６のアミノ酸配列を配列番号３に、前記ＦｃＲｍ６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７に示す。なお、配列番号３において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ６のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また配列番号３において、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目の位置にそれぞれある。
【００８０】
（ｃ）ＦｃＲｍ８
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３ＳｅｒおよびＡｓｎ２４０Ａｓｐを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲｍ８を作製した。前記作製したプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６を基に、配列番号８４（５’−ＴＡＣＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡ−３’）および配列番号８５（５’−ＴＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＡＣＧＴＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＩｌｅ１６０ＭｅｔとＡｓｎ１６３Ｓｅｒの２つのアミノ酸置換を行ない、それをｐＥＴＦｃＲｍ６に集積した。
（ｃ−１）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６を鋳型とし、配列番号６８および配列番号８４からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。
（ｃ−２）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６を鋳型とし、配列番号８５および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｃ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これにより８箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ８をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して８箇所アミノ酸置換処理したポリペプチドであるＦｃＲｍ８をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を得た。
（ｃ−７）ｐＥＴＦｃＲｍ８の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【００８１】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ８のアミノ酸配列を配列番号４に、コードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号８に示す。なお、配列番号４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ８のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また配列番号４において、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔのメチオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目の位置にそれぞれある。
【００８２】
（ｄ）ＦｃＲｍ１９
実施例６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３ＨｉｓおよびＬｅｕ２８５Ｇｌｎを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲｍ１９を作製した。前記作製したプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を基に、配列番号８６（５’−ＴＧＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＴ−３’）および配列番号８７（５’−ＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＴｈｒ２０ＰｒｏとＴｈｒ２５Ｌｙｓの２つのアミノ酸置換を、配列番号８８（５’−ＣＧＣＴＣＧＣＧＧＡＧＧＴＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＧＴＣＧＧＧＧＴ−３’）および配列番号８９（５’−ＡＴＴＡＣＣＴＣＣＧＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＣＧＡＴＴＣＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＳｅｒ６９Ｔｈｒ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐの４つのアミノ酸置換を、配列番号９０（５’−ＴＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡ−３’）および配列番号９１（５’−ＡＣＡＡＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＡｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏの３つのアミノ酸置換を、配列番号９２（５’−ＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＡ−３’）および配列番号９３（５’−ＴＴＧＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＧＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いてＬｅｕ２８３ＨｉｓとＬｅｕ２８５Ｇｌｎの２つのアミノ酸置換を行ない、それをｐＥＴＦｃＲｍ８に集積した。
（ｄ−１）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を鋳型として、配列番号６８および配列番号８６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。
（ｄ−２）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を鋳型として、配列番号８７および配列番号８８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｄ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ｄ−３）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を鋳型として、配列番号８９および配列番号９０からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｄ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ｄ−４）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を鋳型として、配列番号９１および配列番号９２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｄ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ｄ−５）プラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を鋳型として、配列番号９３および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして（ｄ−１）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（ｄ−６）（ｄ−１）から（ｄ−５）の５種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。
（ｄ−７）（ｄ−６）で得られたＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これにより１９箇所アミノ酸置換処理したＦｃＲｍ１９をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｄ−８）（ｄ−７）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドＤＮＡであるｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ−９）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１９箇所アミノ酸処理したポリペプチドであるＦｃＲｍ１９をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ１９を得た。
（ｄ−１０）ｐＥＴＦｃＲｍ１９の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【００８３】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ１９のアミノ酸配列を配列番号５に、コードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号９に示す。なお、配列番号５において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ１９のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目までのヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また配列番号５において、Ｔｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔのメチオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【００８４】
実施例８  アミノ酸置換を集積させたＦｃ結合性タンパク質の生産性評価
（１）実施例２および実施例７で作製した形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養することで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で振とう培養した。培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に変更して、３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後の菌体から可溶性タンパク質を抽出し、実施例４に記載のＥＬＩＳＡ法にて既知濃度のヒトＦｃγＲＩを対照に、抽出したＦｃ結合性タンパク質のタンパク濃度を測定した。
【００８５】
実施例２および実施例７で作製した形質転換体により発現した、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した結果を図７に示す。なお、図７中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させたアミノ酸置換していない（野生型の）Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。このＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例７で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４、ＦｃＲｍ６、ＦｃＲｍ８、ＦｃＲｍ１９は、いずれも高い生産性が認められた。図７の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【００８６】
実施例９  Ｆｃ結合性タンパク質の調製
（１）実施例２と実施例７で作製した形質転換体を実施例８と同様な方法で前培養した。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で振とう培養した。
（３）培養液濁度（ＯＤ６００）が１．５から２．０になったところで、１５℃に冷却し、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加後、１５℃で一晩振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離操作により得られた各菌体を、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にそれぞれ懸濁し、６℃に冷却しながら超音波破砕した後、遠心分離操作を行ない、上清を回収した。
（５）回収した上清から下記に示す方法でＦｃ結合性タンパク質を精製した。
（５−１）回収した上清に終濃度で１０ｍＭとなるようイミダゾールを加え、あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したニッケルキレートカラム（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ：Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にアプライ後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、５００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸水素カリウム）（ｐＨ７．０）を用いて溶出した。
（５−２）前記溶出液をあらかじめＰＢＳ（ｐＨ７．０）で平衡化したＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で洗浄後、１５０ｍＭのＮａＣｌと１０％のグリセリンを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出の際は、あらかじめ溶出量の１／４量の濃度１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）が入っている容器に溶出させた。
【００８７】
実施例１０  Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性評価
各Ｆｃ結合性タンパク質の精製溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．０）で４℃にて透析し、ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）（示差走査熱量計）（ＶＰ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ、日本シイベルへグナー社製）を用いて、昇温速度６０℃／時間の条件で変性中点温度（Ｔｍ）の測定を行なった。その結果を表８に示す。
【００８８】
【表８】
2011206046.tif 000010
【００８９】
表８においてＦｃＲは、実施例２で作製した形質転換体により発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。このＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例７で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４、ＦｃＲｍ６、ＦｃＲｍ８、ＦｃＲｍ１９は、いずれもＴｍが上昇しており、熱安定性が向上していることを確認した。また、安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することにより、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性を向上させることができた。
【００９０】
実施例１１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ８）への変異導入およびライブラリーの作製
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例７（ｃ）で作製したＦｃＲｍ８をコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例７（ｃ）に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ８を、ＰＣＲプライマーとして配列番号６６および配列番号６７からなる各オリゴヌクレオチドを使用した。
【００９１】
【表９】
2011206046.tif 000011
【００９２】
ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養した（３７℃で１８時間）。培養後プレート上には約４０００個のコロニーが形成された。これらのコロニーを混合した混合コロニーから、プラスミドＤＮＡを抽出しＦｃＲｍ８のランダム変異プラスミドライブラリーとした。
（４）（３）で作製したプラスミドライブラリーを用いて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させた。これによりＦｃＲｍ８のランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【００９３】
実施例１２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ８）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例１１で作製したＦｃＲｍ８のランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水にて１０倍希釈後、０．１Ｍのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）と等量混合し、５３℃で２０分間熱処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。
（４）約３０００株の形質転換体より得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、以下の方法でＥＬＩＳＡ法により抗体結合活性を測定した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含んだ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）によりブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、調製したタンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識の抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（４−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）熱処理（５３℃で２０分間）したときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理しないときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（６）ＦｃＲｍ８と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ８と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【００９４】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ８に存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｔｈｒ２０Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｇｌｕ４４Ａｓｐ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｌｅｕ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６６Ｔｈｒ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０２Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１４２Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１４７Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４８Ａｒｇ、Ｈｉｓ１４８Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ａｓｎ１５２Ｉｌｅ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ、Ｉｌｅ１６０Ｌｅｕ、Ｍｅｔ１７１Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ａｓｎ２０６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｇｌｎ２１９Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２２５Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ａｒｇ２５１Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２５７Ａｒｇ、Ｌｅｕ２５７Ｇｌｎ、Ｇｌｙ２８２Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２８５Ａｒｇ、またはＶａｌ２９８Ａｓｐ置換であった。熱処理後の抗体結合活性の残存率（残存活性）、アミノ酸置換の解析結果を表１０に示す。表１０に示すように、ＦｃＲｍ８に対しさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【００９５】
【表１０】
2011206046.tif 000012
【００９６】
実施例１３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の作製
実施例１２で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２０７ＧｌｎおよびＭｅｔ２３１Ｌｙｓを選択し、それらの置換を実施例７（ｄ）に記載のＦｃＲｍ１９に対してさらに集積することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３２箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３２を作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、
（ｉ）Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのアミノ酸置換のために配列番号９４（５’−ＡＣＧＴＣＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡ−３’）および配列番号９５（５’−ＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＣＧＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉ）Ｖａｌ４５Ａｌａのアミノ酸置換のために配列番号９６（５’−ＡＧＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧＣＡＡ−３’）および配列番号９７（５’−ＴＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＴＣＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉｉ）Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのアミノ酸置換のために配列番号９８（５’−ＡＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴ−３’）および配列番号９９（５’−ＡＡＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＴＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｖ）Ｇｌｙ６０ＡｓｐおよびＴｈｒ６５Ａｌａのアミノ酸置換のために配列番号１００（５’−ＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡ−３’）および配列番号１０１（５’−ＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｖ）Ｔｙｒ１３３ＨｉｓおよびＡｒｇ１３９Ｈｉｓのアミノ酸置換のために配列番号１０２（５’−ＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＡＡＡＧＣＡＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴ−３’）および配列番号１０３（５’−ＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｖｉ）Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアミノ酸置換のために配列番号１０４（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡ−３’）および配列番号１０５（５’−ＴＴＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｖｉｉｉ）Ｌｅｕ１５６ＰｒｏおよびＩｌｅ１６０Ｔｈｒのアミノ酸置換のために配列番号１０６（５’−ＴＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＧＴＣＡ−３’）および配列番号１０７（５’−ＴＧＡＣＣＡＴＴＣＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＣＧＴＣＣＣＡＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｘ）Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアミノ酸置換のために配列番号１０８（５’−ＴＣＣＣＧＣＣＧＡＣＧＴＡＴＡＡＣＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴ−３’）からなるオリゴヌクレオチドを、
（ｘ）Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのアミノ酸置換のために配列番号１０９（５’−ＡＣＡＴＣＧＴＴＡＴＡＣＧＴＣＧＧＣＧＧＧＡＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡ−３’）からなるオリゴヌクレオチドを、
（ｘｉ）Ｌｅｕ２０３ＨｉｓおよびＬｅｕ２０７Ｇｌｎのアミノ酸置換のために配列番号１１０（５’−ＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＣＧＧ−３’）および配列番号１１１（５’−ＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＣＣＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｘｉｉ）Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのアミノ酸置換のために配列番号１１２（５’−ＣＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＴＡＧＡＡＣＧＡ−３’）および配列番号１１３（５’−ＴＣＧＴＴＣＴＡＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＣＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
（１）実施例７（ｄ）に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ１９を鋳型とし、配列番号６８と配列番号９４からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１とした。
（２）実施例７（ｄ）に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ１９を鋳型とし、配列番号９５と配列番号１０６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ２とした。
（３）実施例７（ｄ）に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ１９を鋳型とし、配列番号１０７と配列番号１１０からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ３とした。
（４）実施例７（ｄ）に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ１９を鋳型とし、配列番号１１１と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ４とした。
（５）前記のｍ３２ｐ１、ｍ３２ｐ２、ｍ３２ｐ３およびｍ３２ｐ４の４種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。
（６）（５）のＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ５とした。
（７）前記のｍ３２ｐ５を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号９８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ６とした。
（８）前記のｍ３２ｐ５を精製し、それを鋳型として、配列番号９９と配列番号１０４からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ７とした。
（９）前記のｍ３２ｐ５を精製し、それを鋳型として、配列番号１０５と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ８とした。
（１０）前記のｍ３２ｐ６、ｍ３２ｐ７およびｍ３２ｐ８の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ９とした。
（１１）前記のｍ３２ｐ９を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１００からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１０とした。
（１２）前記のｍ３２ｐ９を精製し、それを鋳型として、配列番号１０１と配列番号１０８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１１とした。
（１３）前記のｍ３２ｐ９を精製し、それを鋳型として、配列番号１０９と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１２とした。
（１４）前記のｍ３２ｐ１０、ｍ３２ｐ１１およびｍ３２ｐ１２の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１３とした。
（１５）前記のｍ３２ｐ１３を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号９６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１４とした。
（１６）前記のｍ３２ｐ１３を精製し、それを鋳型として、配列番号９７と配列番号１０２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１５とした。
（１７）前記のｍ３２ｐ１３を精製し、それを鋳型として、配列番号１０３と配列番号１１２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１６とした。
（１８）前記のｍ３２ｐ１３を精製し、それを鋳型として、配列番号１１３と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３２ｐ１７とした。
（１９）前記のｍ３２ｐ１４、ｍ３２ｐ１５、ｍ３２ｐ１６およびｍ３２ｐ１７の４種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。
（２０）（１９）のＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。（２１）（２０）で得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３２箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３２をコードするポリヌクレオチドを得た。
（２２）前記のＦｃＲｍ３２をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（２３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ３２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ３２を得た。
（２４）ｐＥＴＦｃＲｍ３２の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【００９７】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ３２のアミノ酸配列を配列番号１１４に、前記ＦｃＲｍ３２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１１５に示す。なお、配列番号１１４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ３２のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１１４において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｖａｌ４５Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【００９８】
実施例１４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）の生産性評価
（１）実施例１３で作製した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養することで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で振とう培養した。培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に変更して、３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養終了後、遠心分離操作により菌体を集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて菌体からタンパク質を調製した。
（４）得られた調製タンパク質の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法により評価することでＦｃ結合性タンパク質の生産性を測定した。Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した結果を図８に示す。なお、図８中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。またＦｃＲｍ１９は、実施例７（ｄ）の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例１３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３２は、いずれも高い生産性が認められた。図８の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【００９９】
実施例１５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９、ＦｃＲｍ３２）および、野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）濃度測定を行なったタンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で５分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法でアルカリ処理、未処理サンプルの抗体結合活性を測定した。
（４）測定されたアルカリ処理後の抗体結合活性を、アルカリ未処理時の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１００】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図９に示した。図９中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。またＦｃＲｍ１９は、実施例７（ｄ）の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例１３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３２は、ＦｃＲやＦｃＲｍ１９に比べアルカリに対する安定性が高いことが認められた。図９の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１０１】
実施例１６  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例１３で作製したＦｃＲｍ３２をコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例１３に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ３２を、ＰＣＲプライマーとして配列番号６６および配列番号６７からなる各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養した（３７℃で１８時間）。培養後プレート上には約１９０００個のコロニーが形成された。これらのコロニーを混合した混合コロニーから、プラスミドＤＮＡを抽出しＦｃＲｍ３２のランダム変異プラスミドライブラリーとした。
（４）（３）で作製したプラスミドライブラリーを用いて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させた。これによりＦｃＲｍ３２のランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１０２】
実施例１７  安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例１６で作製したＦｃＲｍ３２のランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で１０倍希釈し、０．１Ｍのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）と等量混合し、７０℃で２０分間熱処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、熱処理（７０℃で２０分間）した場合のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理しないときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ３２と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ３２と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１０３】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ３２に存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｇｌｎ２７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５１Ｐｒｏ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ５３Ｌｅｕ、Ｇｌｙ６０Ｇｌｙ、Ｔｈｒ６３Ｌｅｕ、Ｇｌｎ６４Ｐｒｏ、Ｔｈｒ７３Ｓｅｒ、Ｖａｌ７７Ａｓｐ、Ｓｅｒ８０Ａｌａ、Ｌｅｕ８９Ｇｌｎ、Ａｒｇ９２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ａｓｐ１２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｌｅｕ１３１Ｐｒｏ、Ｔｙｒ１３３Ａｒｇ、Ａｓｎ１３４Ｓｅｒ、Ｔｙｒ１３８Ｈｉｓ、Ｐｈｅ１４４Ｉｌｅ、Ｈｉｓ１４８Ａｒｇ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｓｅｒ１８２Ｔｈｒ、Ｖａｌ１９３Ｌｅｕ、Ｖａｌ１９８Ｇｌｙ、Ｓｅｒ２００Ｇｌｙ、Ｓｅｒ２００Ａｒｇ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２０７Ｈｉｓ、Ｓｅｒ２１１Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２３Ａｒｇ、Ａｓｎ２４０Ｇｌｙ、Ｇｌｎ２４６Ａｒｇ、Ａｌａ２５０Ｖａｌ、Ｔｈｒ２６４Ｓｅｒ、Ａｓｎ２６８Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２７７Ｖａｌ、またはＴｈｒ２８７Ｉｌｅの置換であった。なお前記置換のうち、表記したアミノ酸が変化していないもの（例えば、Ｇｌｙ６０Ｇｌｙ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している（以下、同様）。熱処理後の抗体結合活性の残存率（残存活性）、アミノ酸置換の解析結果を表１１に示す。表１１に示すように、ＦｃＲｍ３２に対しさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１０４】
【表１１】
2011206046.tif 000013
【０１０５】
実施例１８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）の作製
実施例１７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｓｅｒ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ１５２Ｔｈｒを選択し、それらの置換を実施例１３に記載のＦｃＲｍ３２に対してさらに集積することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３６箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３６ｂを作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４１ＭｅｔおよびＳｅｒ５２Ｇｌｙのアミノ酸置換のために配列番号１１６（５’−ＡＴＧＣＧＧＴＧＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡ−３’）および配列番号１１７（５’−ＧＡＣＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
（１）実施例１３に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ３２を鋳型として、配列番号６８と配列番号１１６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３６ｂｐ１とした。
（２）実施例１７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３２にさらに、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１１７と配列番号９２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３６ｂｐ２とした。
（３）実施例１３に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ３２を鋳型として、配列番号９３と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ３６ｂｐ３とした。
（４）前記のｍ３６ｂｐ１、ｍ３６ｂｐ２およびｍ３６ｂｐ３の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３６箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３６ｂをコードするポリヌクレオチドを得た。
（５）前記のＦｃＲｍ３６ｂをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ３６ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ３６ｂを得た。
（７）ｐＥＴＦｃＲｍ３６ｂの塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１０６】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ３６ｂのアミノ酸配列を配列番号１１８に、前記ＦｃＲｍ３６ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１１９に示す。なお、配列番号１１８において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ３６ｂのアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１１８において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｖａｌ４５Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【０１０７】
実施例１９  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）の生産性評価
実施例１８と実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１０８】
結果を図１０に示す。なお、図１０中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図１０中のＦｃＲｍ３２は、実施例１３の形質転換体を用いて発現した、Ｆｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例１８で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３６ｂは、高い生産性が認められた。図１０の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【０１０９】
実施例２０  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ）および野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）濃度測定を行なったタンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で５分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定した、アルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１１０】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図１１に示す。図１１中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図１１中のＦｃＲｍ３２は、実施例１３の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらＦｃＲやＦｃＲｍ３２に比べ、実施例１８で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ３６ｂは、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図１１の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１１１】
実施例２１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例１８で作製したＦｃＲｍ３６ｂをコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例１８に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ３６ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２０（５’−ＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’）および配列番号１２１（５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、ＦｃＲｍ３６ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１１２】
実施例２２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例２１で作製したＦｃＲｍ３６ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で５倍希釈し、４００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３０℃で６０分間アルカリ処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを中性領域に戻した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、（３）のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ３６ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ３６ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１１３】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ３６ｂに存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｇｌｎ３５Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５３Ｔｈｒ、Ｇｌｎ６４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ６７Ａｌａ、Ｔｈｒ６７Ｓｅｒ、Ｖａｌ７７Ｌｙｓ、Ｌｅｕ８９Ｐｒｏ、Ｓｅｒ９０Ｇｌｙ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｇｌｎ９７Ｌｙｓ、Ａｒｇ１０２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ１０３Ａｓｐ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ａｓｐ１２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１４２Ａｒｇ、Ａｓｎ１５２Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｓｅｒ１８２Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２０３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｙｓ２１５Ａｒｇ、Ｌｙｓ２１５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２２４Ａｒｇ、Ｔｙｒ２３０Ｈｉｓ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ｇｌｕ２４４Ｖａｌ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｔｈｒ２４９Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２５３Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌ、Ａｌａ２６２Ｖａｌ、Ａｌａ２６３Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２６５Ａｌａ、Ｇｌｕ２６５Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２７０Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２７１Ａｒｇ、Ｇｌｎ２７９Ａｒｇ、Ｇｌｎ２７９Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８３Ｐｒｏ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｎ、Ｔｈｒ２８７Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、またはＶａｌ２８９Ｇｌｙ置換であった。なお前記置換のうち、表記したアミノ酸が変化していないもの（例えば、Ｔｙｒ１３３Ｔｙｒ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している。アミノ酸置換の解析結果を表１２に示す。表１２に示すように、ＦｃＲｍ３６ｂに対しさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１１４】
【表１２】
2011206046.tif 000014
【０１１５】
実施例２３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）の作製  
実施例２２で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２４９ＡｌａおよびＧｌｕ２６１Ｖａｌを選択し、それらの置換を実施例１８に記載のＦｃＲｍ３６ｂに対してさらに集積して、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４４箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４４を作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、
（ｉ）Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアミノ酸置換のために配列番号１２２（５’−ＣＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＣＧＴＧＧＣＡＡ−３’）および配列番号１２３（５’−ＴＴＧＣＣＡＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉ）Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアミノ酸置換のために配列番号１２４（５’−ＡＣＧＴＧＴＴＣＧＴＣＣＴＣＧＧＡＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴ−３’）および配列番号１２５（５’−ＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＡＣＡＣＧＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ２１３ＶａｌおよびＬｅｕ２１８Ｉｌｅのアミノ酸置換のために配列番号１２６（５’−ＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＴＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡ−３’）および配列番号１２７（５’−ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＡＧＣＧＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｖ）Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアミノ酸置換のために配列番号１２８（５’−ＡＣＧＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＴ−３’）および配列番号１２９（５’−ＡＧＴＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＡＧＣＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
（１）実施例２２のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３６ｂにさらにＧｌｎ９７ＬｅｕおよびＧｌｕ２６１Ｖａｌ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１２２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ１とした。
（２）実施例２２のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３６ｂにさらにＧｌｎ９７ＬｅｕおよびＧｌｕ２６１Ｖａｌ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１２３と配列番号１２８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ２とした。
（３）実施例２２のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３６ｂにさらにＧｌｎ９７ＬｅｕおよびＧｌｕ２６１Ｖａｌ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１２９と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ３とした。
（４）前記のｍ４４ｐ１、ｍ４４ｐ２およびｍ４４ｐ３の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ４とした。
（５）前記のｍ４４ｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１２４からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ５とした。
（６）実施例２２のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３６ｂにさらにＳｅｒ１８２ＬｅｕおよびＧｌｕ２１３Ｖａｌ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１２５と配列番号１２６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ６とした。
（７）前記のｍ４４ｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号１２７と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４４ｐ７とした。
（８）前記のｍ４４ｐ５、ｍ４４ｐ６およびｍ４４ｐ７の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４４箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４４をコードするポリヌクレオチドを得た。
（９）前記のＦｃＲｍ４４をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（１０）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ４４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４４を得た。
（１１）ｐＥＴＦｃＲｍ４４の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１１６】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ４４のアミノ酸配列を配列番号１３０に、前記ＦｃＲｍ４４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３１に示す。なお、配列番号１３０において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ４４のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１３０において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｖａｌ４５Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌのバリンは２７９番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【０１１７】
実施例２４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）の生産性評価
実施例２３と実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１１８】
結果を図１２に示す。なお、図１２中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例２３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４４は、高い生産性が認められた。図１２の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
実施例２５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ４４）および野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で１０分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定した、アルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１１９】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図１３に示す。図１３中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図１３中のＦｃＲｍ３６ｂは、実施例１８の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例２３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４４は、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図１３の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１２０】
実施例２６  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例２３で作製したＦｃＲｍ４４をコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例２３に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４４を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２０および配列番号１２１の各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、ＦｃＲｍ４４のランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１２１】
実施例２７  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例２６で作製したＦｃＲｍ４４のランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で５倍希釈し、４００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３０℃で１２０分間アルカリ処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを中性領域に戻した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、（３）のアルカリ処理したときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ４４と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ４４と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１２２】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ４４に存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１７Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１９Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｔｈｒ２５Ａｒｇ、Ｇｌｎ３５Ｍｅｔ、Ｇｌｕ４４Ａｓｐ、Ｌｅｕ４６Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４７Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４７Ｌｅｕ、Ｐｒｏ４９Ａｌａ、Ｇｌｙ５０Ａｒｇ、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５１Ｐｒｏ、Ｇｌｎ５５Ａｒｇ、Ａｌａ６２Ｖａｌ、Ｇｌｎ６４Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６９Ａｌａ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ａｓｎ７８Ｇｌｙ、Ｓｅｒ８０Ａｌａ、Ｇｌｙ８８Ｓｅｒ、Ｓｅｒ９０Ｇｌｙ、Ｈｉｓ１０１Ｌｅｕ、Ｇｌｙ１０３Ｓｅｒ、Ａｌａ１２１Ｔｈｒ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ａｓｎ１３４Ｓｅｒ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５９Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ａｓｎ、Ａｓｎ１９５Ａｌａ、Ａｌａ１９６Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１９９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２０３Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２０４Ｖａｌ、Ｓｅｒ２１１Ｇｌｙ、Ｇｌｎ２１９Ａｒｇ、Ｇｌｎ２２４Ａｒｇ、Ｐｈｅ２２７Ｉｌｅ、Ｓｅｒ２３３Ａｓｎ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４６Ａｒｇ、Ｌｅｕ２４８Ｉｌｅ、Ａｒｇ２５２Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２５７Ｇｌｎ、Ａｓｎ２６８Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２７９Ａｒｇ、Ｇｌｙ２８２Ａｓｐ、Ｐｒｏ２８６Ａｒｇ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２８７Ａｌａ、Ｔｈｒ２８７Ｖａｌ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、またはＶａｌ２８９Ｌｅｕ置換であった。なお前記置換のうち、表記したアミノ酸が変化していないもの（例えば、Ａｓｎ１９５Ａｓｎ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している。アミノ酸置換の解析結果を表１３に示す。表１３に示すように、ＦｃＲｍ４４に対しさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１２３】
【表１３】
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【０１２４】
実施例２８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）の作製
実施例２７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３７ＰｈｅおよびＴｈｒ１８４Ｓｅｒを選択し、それらの置換を実施例２３に記載のＦｃＲｍ４４に対してさらに集積して、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４８箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４８を作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎのアミノ酸置換のために配列番号１３２（５’−ＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＣＧＴ−３’）および配列番号１３３（５’−ＡＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
（１）実施例２７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ４４にさらにＳｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｔｙｒ１３７ＰｈｅおよびＴｈｒ１８４Ｓｅｒ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１３２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４８ｐ１とした。
（２）実施例２７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ４４にさらにＳｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｔｙｒ１３７ＰｈｅおよびＴｈｒ１８４Ｓｅｒ置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１３３と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ４８ｐ２とした。
（３）前記のｍ４８ｐ１およびｍ４８ｐ２の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４８箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４８をコードするポリヌクレオチドを得た。
（４）前記のＦｃＲｍ４８をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ４８をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４８を得た。
（６）ｐＥＴＦｃＲｍ４８の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１２５】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ４８のアミノ酸配列を配列番号１３４に、前記ＦｃＲｍ４８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３５に示す。なお、配列番号１３４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ４８のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１３４において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｖａｌ４５Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒのスレオニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎのグルタミンは１４９番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌのバリンは２７９番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【０１２６】
実施例２９  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）の生産性評価
実施例２８と実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１２７】
結果を図１４に示す。なお、図１４中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例２８で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４８は、高い生産性が認められた。図１４の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
実施例３０  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４４、ＦｃＲｍ４８）および野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で５０分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定した、アルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１２８】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図１５に示す。図１５中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図１５中のＦｃＲｍ４４は、実施例２３の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例２８で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ４８は、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図１５の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１２９】
実施例３１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例２８で作製したＦｃＲｍ４８をコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例２８に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ４８を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２０および配列番号１２１からなる各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、ＦｃＲｍ４８のランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１３０】
実施例３２  安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例３１で作製したＦｃＲｍ４８のランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で５倍希釈し、６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３０℃で１２０分間アルカリ処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを中性領域に戻した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、（３）のアルカリ処理したときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ４８と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ４８と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１３１】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ４８に存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｇｌｎ３５Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｖａｌ４５Ｖａｌ、Ｈｉｓ４７Ａｓｎ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５３Ｐｒｏ、Ｇｌｎ６４Ｌｙｓ、Ａｒｇ７１Ｔｙｒ、Ｖａｌ７７Ｖａｌ、Ｉｌｅ９６Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５９Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２０７Ａｒｇ、Ｔｈｒ２０９Ａｌａ、Ｇｌｕ２１３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２１５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２２３Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２６１Ａｌａ、Ａｓｎ２６８Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２７０Ａｒｇ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ａｒｇ２７２Ｇｌｎ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｕ、Ｐｒｏ２８６Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｎ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２８７Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８８Ａｌａ、Ｐｒｏ２８８Ｓｅｒ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、またはＶａｌ２８９Ｇｌｙの置換であった。なお前記置換のうち、表記したアミノ酸が変化していないもの（例えば、Ｖａｌ７７Ｖａｌ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している。アミノ酸置換の解析結果を表１４に示す。表１４に示すように、ＦｃＲｍ４８に対しさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１３２】
【表１４】
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【０１３３】
実施例３３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）の作製
実施例３２で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｙｓ２３４ＧｌｕおよびＬｅｕ２７０Ｖａｌを、実施例２７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ａｌａ１２１Ｖａｌを、それぞれ選択し、それらの置換を実施例２８に記載のＦｃＲｍ４８に対してさらに集積し、さらにＶａｌ４５Ａｌａのアミノ酸置換をバリンに戻す置換を行なうことで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５４箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５４ｂを作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、
（ｉ）Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換のために配列番号１３６（５’−ＣＴＴＣＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧＡＴＴＣＴ−３’）および配列番号１３７（５’−ＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＧＡＡＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉ）Ｔｈｒ７３Ａｌａのアミノ酸置換のために配列番号１３８（５’−ＴＣＧＣＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＧＴ−３’）および配列番号１３９（５’−ＡＣＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＣＧＡＧＣＧＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉｉ）Ａｌａ１２１Ｖａｌのアミノ酸置換のために配列番号１４０（５’−ＴＧＧＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＴＣＧＣＣＴ−３’）および配列番号１４１（５’−ＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＧＴＴＧＣＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｖ）Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのアミノ酸置換のために配列番号１４２（５’−ＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡ−３’）および配列番号１４３（５’−ＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｖ）Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのアミノ酸置換のために配列番号１４４（５’−ＴＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＴＡ−３’）および配列番号１４５（５’−ＴＡＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｖｉ）Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのアミノ酸置換のために配列番号１４６（５’−ＴＧＧＧＣＴＣＣＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＡＴ−３’）および配列番号１４７（５’−ＡＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
（１）実施例３２のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ４８にさらにＳｅｒ５１ＡｌａおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換があり、かつＶａｌ４５Ａｌａのアミノ酸置換がバリンに戻っているＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１３８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ１とした。
（２）実施例３２のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ４８にさらにＳｅｒ５１ＡｌａおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換があり、かつＶａｌ４５Ａｌａのアミノ酸がバリンに戻っているＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１３９と配列番号１４０からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ２とした。
（３）実施例３２のスクリーニングで取得したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ４８にさらにＳｅｒ５１ＡｌａおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換があり、かつＶａｌ４５Ａｌａのアミノ酸置換がバリンに戻っているＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１４１と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ３とした。
（４）前記のｍ５４ｂｐ１、ｍ５４ｂｐ２およびｍ５４ｂｐ３の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ４とした。
（５）前記のｍ５４ｂｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１４２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ５とした。
（６）前記のｍ５４ｂｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号１４３と配列番号１４６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ６とした。
（７）前記のｍ５４ｂｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号１４７と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ７とした。
（８）前記のｍ５４ｂｐ５、ｍ５４ｂｐ６およびｍ５４ｂｐ７の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ８とした。
（９）前記のｍ５４ｂｐ８を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１３６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ９とした。
（１０）前記のｍ５４ｂｐ８を精製し、それを鋳型として、配列番号１３７と配列番号１４４からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ１０とした。
（１１）前記のｍ５４ｂｐ８を精製し、それを鋳型として、配列番号１４５と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５４ｂｐ１１とした。
（１２）前記のｍ５４ｂｐ９、ｍ５４ｂｐ１０およびｍ５４ｂｐ１１の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５４箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５４ｂをコードするポリヌクレオチドを得た。
（１３）前記のＦｃＲｍ５４ｂをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（１４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ５４ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ５４ｂを得た。
（１５）ｐＥＴＦｃＲｍ５４ｂの塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１３４】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ５４ｂのアミノ酸配列を配列番号１４８に、前記ＦｃＲｍ５４ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４９に示す。なお、配列番号１４８において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ５４ｂのアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１４８において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは６０番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは９１番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１３９番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎのグルタミンは１４９番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１６９番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは２１７番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２５２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌのバリンは２７９番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２８８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【０１３５】
実施例３４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）の生産性評価
実施例３３と実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１３６】
結果を図１６に示す。なお、図１６中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例３３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５４ｂは、高い生産性が認められた。図１６の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【０１３７】
実施例３５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８、ＦｃＲｍ５４ｂ）および野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で１２０分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定したアルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１３８】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図１７に示す。図１７中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図１７中のＦｃＲｍ４８は、実施例２８の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例３３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５４ｂは、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図１７の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１３９】
実施例３６  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例３３で作製したＦｃＲｍ５４ｂをコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例３３に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ５４ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２０および配列番号１２１からなる各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、ＦｃＲｍ５４ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１４０】
実施例３７  安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例３６で作製したＦｃＲｍ５４ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で５倍希釈し、７００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３０℃で１２０分間アルカリ処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを中性領域に戻した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、（３）のアルカリ処理したときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ５４ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ５４ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１４１】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ５４ｂに存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｇｌｎ３５Ｇｌｎ、Ｌｅｕ４１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４７Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４７Ａｓｎ、Ｓｅｒ５３Ｐｒｏ、Ｐｈｅ５７Ｔｙｒ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ａｌａ６２Ｇｌｕ、Ｔｙｒ７０Ｈｉｓ、Ａｒｇ９２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ｔｙｒ１３３Ｔｙｒ、Ｇｌｙ１４１Ａｓｐ、Ｇｌｙ１４１Ｖａｌ、Ｔｈｒ１５４Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１８２Ｖａｌ、Ｔｈｒ１８４Ｔｈｒ、Ｐｒｏ１９０Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２０２Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２０３Ｔｙｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２１７Ａｒｇ、Ｌｅｕ２１８Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２１８Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２１９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２３１Ａｒｇ、Ｇｌｕ２４４Ｖａｌ、Ｔｙｒ２４５Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２４８Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２６１Ｇｌｕ、Ａｌａ２６３Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｎ、Ｔｈｒ２８７Ａｌａ、Ｐｒｏ２８８Ｔｈｒ、Ｖａｌ２８９Ｇｌｙ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、またはＶａｌ２８９Ｌｅｕ置換であった。なお前記置換のうち、表記したアミノ酸が変化していないもの（例えば、Ｇｌｎ３５Ｇｌｎ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している。アミノ酸置換の解析結果を表１５に示す。表１５に示すように、ＦｃＲｍ５４ｂへさらにアミノ酸残基の置換（変異）が起こることで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１４２】
【表１５】
2011206046.tif 000017
【０１４３】
実施例３８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）の作製
実施例３７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｓｅｒ１１１ＡｌａおよびＴｈｒ１１５Ｉｌｅを選択し、それらの置換を実施例３３に記載のＦｃＲｍ５４ｂに対してさらに集積し、さらにＧｌｕ２６１Ｖａｌのアミノ酸置換をグルタミンに戻す置換を行なうことで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５６箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５６ｂを作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、
（ｉ）Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアミノ酸置換のために配列番号１５０（５’−ＡＡＡＣＧＣＧＧＧＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣＡ−３’）および配列番号１５１（５’−ＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＡＧＣＧＣＣＣＧＣＧＴＴＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉ）Ｇｌｕ２６１Ｖａｌのアミノ酸置換を元のグルタミン（Ｇｌｕ）に戻すために配列番号１５２（５’−ＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＡＣＡ−３’）および配列番号１５３（５’−ＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＴＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
（１）実施例３７のスクリーニングで取得したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５４ｂに、さらにＬｅｕ５８ＡｒｇおよびＴｈｒ１１５Ｉｌｅが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１５２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５６ｂｐ１とした。
（２）実施例３７のスクリーニングで取得したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５４ｂに、さらにＬｅｕ５８ＡｒｇおよびＴｈｒ１１５Ｉｌｅが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１５３と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５６ｂｐ２とした。
（３）前記のｍ５６ｂｐ１およびｍ５６ｂｐ２の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５６ｂｐ３とした。
（４）前記のｍ５６ｂｐ３を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１５０からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５６ｂｐ４とした。
（５）前記のｍ５６ｂｐ３を精製し、それを鋳型として、配列番号１５１と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５６ｂｐ５とした。
（６）前記のｍ５６ｂｐ４およびｍ５６ｂｐ５の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５６箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５６ｂをコードするポリヌクレオチドを得た。
（７）前記のＦｃＲｍ５６ｂをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（８）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ５６ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ５６ｂを得た。
（９）ｐＥＴＦｃＲｍ５６ｂの塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１４４】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ５６ｂのアミノ酸配列を配列番号１５４に、前記ＦｃＲｍ５６ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５５に示す。なお、配列番号１５４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ５６ｂのアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１５４において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは６０番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｌｅｕ５８Ａｒｇのアルギニンは７６番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは９１番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアラニンは１２９番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅのイソロイシンは１３３番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１３９番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎのグルタミンは１４９番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１６９番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは２１７番目、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓのヒスチジンは２２１番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎのグルタミンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２５２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２８８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【０１４５】
実施例３９  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）の生産性評価
実施例３８と実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１４６】
結果を図１８に示す。なお、図１８中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例３８で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５６ｂは、高い生産性が認められた。図１８の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【０１４７】
実施例４０  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５４ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ）および野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で１８０分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定したアルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１４８】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図１９に示した。図１９中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図１９中のＦｃＲｍ５４ｂは、実施例３３の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例３８で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５６ｂは、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図１９の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１４９】
実施例４１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例３８で作製したＦｃＲｍ５６ｂをコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例３８に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ５６ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２０および配列番号１２１からなる各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、ＦｃＲｍ５６ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１５０】
実施例４２  安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例４１で作製したＦｃＲｍ５６ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で５倍希釈し、８００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３０℃で１８０分間アルカリ処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを中性領域に戻した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、（３）のアルカリ処理したときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ５６ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ５６ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１５１】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ５６ｂに存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｔｈｒ１９Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３８Ａｌａ、Ｓｅｒ５３Ｔｈｒ、Ｔｈｒ６１Ａｌａ、Ｔｈｒ６３Ｐｈｅ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｓｎ７８Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１３１Ｌｅｕ、Ａｓｎ１４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ１５４Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６１Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１７７Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２０３Ａｒｇ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２１５Ａｒｇ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ａｓｎ２６８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２８３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ２８５Ｈｉｓ、Ａｓｎ２８６Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、Ｖａｌ２８９Ｌｅｕ、またはＶａｌ２８９Ｉｌｅ置換であった。なお前記置換のうち、表記したアミノ酸が変化していないもの（例えば、Ｔｈｒ２５Ｔｈｒ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している。アミノ酸置換の解析結果を表１６に示す。表１６に示すように、ＦｃＲｍ５６ｂへさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１５２】
【表１６】
2011206046.tif 000018
【０１５３】
実施例４３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）の作製
実施例４２で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｔｙｒ２３０ＰｈｅおよびＳｅｒ２３３Ｇｌｙを選択し、それらの置換を実施例３８に記載のＦｃＲｍ５６ｂに対してさらに集積し、さらにＬｅｕ１３１ＧｌｎおよびＬｅｕ２０３Ｈｉｓのアミノ酸置換をロイシンに戻す置換を行なうことで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５７箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５７ｂを作製した。なお、
（ｉ）Ｔｙｒ７０Ｐｈｅのアミノ酸置換のために配列番号１５６（５’−ＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＧＴＧＧＡ−３’）および配列番号１５７（５’−ＴＣＣＡＣＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉ）Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのアミノ酸置換のために配列番号１５８（５’−ＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡ−３’）および配列番号１５９（５’−ＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉｉ）Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅのアミノ酸置換のために配列番号１６０（５’−ＧＣＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＴ−３’）および配列番号１６１（５’−ＡＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＣ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｖ）Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙのアミノ酸置換のために配列番号１６２（５’−ＴＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＡ−３’）および配列番号１６３（５’−ＴＡＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
（１）実施例４２のスクリーニングで取得したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂのうち、Ｌｅｕ１３１ＧｌｎおよびＬｅｕ２０３Ｈｉｓのアミノ酸置換をそれぞれロイシンに戻したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１５６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ１とした。
（２）実施例４２のスクリーニングで取得したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂ内のＬｅｕ１３１ＧｌｎおよびＬｅｕ２０３Ｈｉｓのアミノ酸置換をそれぞれロイシンに戻したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１５７と配列番号１６２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ２とした。
（３）実施例４２のスクリーニングで取得したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂ内のＬｅｕ１３１ＧｌｎおよびＬｅｕ２０３Ｈｉｓのアミノ酸置換をそれぞれロイシンに戻したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１６３と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ３とした。
（４）前記のｍ５７ｂｐ１、ｍ５７ｂｐ２およびｍ５７ｂｐ３の３種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ４とした。
（５）前記のｍ５７ｂｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１５８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ５とした。
（６）前記のｍ５７ｂｐ４を精製し、それを鋳型として、配列番号１５９と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ６とした。
（７）前記のｍ５７ｂｐ５およびｍ５７ｂｐ６の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ７とした。
（８）前記のｍ５７ｂｐ７を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１６０からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ８とした。
（９）前記のｍ５７ｂｐ７を精製し、それを鋳型として、配列番号１６１と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ５７ｂｐ９とした。
（１０）前記のｍ５７ｂｐ８およびｍ５７ｂｐ９の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５７箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５７ｂをコードするポリヌクレオチドを得た。
（１１）前記のＦｃＲｍ５７ｂをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（１２）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ５７ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ５７ｂを得た。
（１３）ｐＥＴＦｃＲｍ５７ｂの塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１５４】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ５７ｂのアミノ酸配列を配列番号１６４に、前記ＦｃＲｍ５７ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６５に示す。なお、配列番号１６４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ５７ｂのアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１５４において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは６０番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｌｅｕ５８Ａｒｇのアルギニンは７６番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅのフェニルアラニンは８８番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは９１番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアラニンは１２９番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅのイソロイシンは１３３番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１３９番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１６９番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは２１７番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅのフェニルアラニンは２４８番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙのグリシンは２５１番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２５２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２８８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【０１５５】
実施例４４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）の生産性評価
実施例４３と実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１５６】
結果を図２０に示す。なお、図２０中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例４３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５７ｂは、高い生産性が認められた。図２０の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【０１５７】
実施例４５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ、ＦｃＲｍ５７ｂ）および、野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で１２０分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定したアルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１５８】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図２１に示す。図２１中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図２１中のＦｃＲｍ５６ｂは、実施例３８の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例４３で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ５７ｂは、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図２１の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１５９】
実施例４６  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）への変異導入およびライブラリーの作製  
（１）エラープローンＰＣＲにより、実施例４３で作製したＦｃＲｍ５７ｂをコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。エラープローンＰＣＲ反応における反応液組成を表９に示す。なお、鋳型ＤＮＡとして実施例４３に記載のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ５７ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２０および配列番号１２１の各オリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間熱処理後、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
（２）前記ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーション反応により挿入した。
（３）反応終了後、得られたライゲーション産物を用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株をエレクトロポレーション法により形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、ＦｃＲｍ５７ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを作製した。
【０１６０】
実施例４７  安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）ライブラリーのスクリーニング
（１）実施例４６で作製したＦｃＲｍ５７ｂのランダム変異形質転換体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を純水で５倍希釈し、１０００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３０℃で１８０分間アルカリ処理後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを中性領域に戻した。
（４）実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて約３０００株の形質転換体から得られたＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を測定し、（３）のアルカリ処理したときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（５）ＦｃＲｍ５７ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体よりプラスミドを調製し、前記プラスミドに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、実施例３に記載の方法にて解析し、ＦｃＲｍ５７ｂと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質に存在したアミノ酸の変異箇所を特定した。
【０１６１】
ヌクレオチド配列解析の結果、明らかとなったＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸の置換箇所（ただし、ＦｃＲｍ５７ｂに存在するものは除く）をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１７Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２７Ｌｙｓ、Ｌｅｕ４１Ｌｅｕ、Ｇｌｙ５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ５１Ｖａｌ、Ｓｅｒ５３Ｌｅｕ、Ｔｈｒ６１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ６５Ｖａｌ、Ｓｅｒ７４Ｐｈｅ、Ｓｅｒ７６Ａｓｎ、Ａｒｇ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｙ８８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ８９Ｐｒｏ、Ｉｌｅ９６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１１５Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ａｓｐ１２９Ｇｌｙ、Ｇｌｙ１４１Ａｓｐ、Ａｓｎ１５９Ａｓｐ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ｌｙｓ、Ｈｉｓ１７４Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１８２Ｇｌｕ、Ｖａｌ１９８Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２０２Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２０３Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｉｌｅ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２２３Ｍｅｔ、Ｔｙｒ２４５Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２４８Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２７９Ａｒｇ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｎ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２８７Ｓｅｒ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、またはＶａｌ２８９Ｇｌｙ置換であった。なお前記置換のうち、アミノ酸が変化していないもの（例えば、Ｌｅｕ４１Ｌｅｕ）は、一度置換（変異）したアミノ酸が野生型のアミノ酸に戻ったことを示している。アミノ酸置換の解析結果を表１７に示す。表１７に示すように、ＦｃＲｍ５７ｂへさらにアミノ酸置換処理することで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することが明らかとなった。
【０１６２】
【表１７】
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【０１６３】
実施例４８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６１）の作製
実施例４７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｇｌｎ２４６ＬｙｓおよびＶａｌ２８９Ａｓｐを選択し、それらの置換を実施例４３に記載のＦｃＲｍ５７ｂに対してさらに集積して、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６１箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６１を作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、
（ｉ）Ｇｌｕ１１８Ａｓｐのアミノ酸置換のために配列番号１６６（５’−ＴＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＡＡ−３’）および配列番号１６７（５’−ＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＴＡ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、
（ｉｉ）Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓのアミノ酸置換のために配列番号１６８（５’−ＧＧＣＴＡＡＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧ−３’）および配列番号１６９（５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＴＡＧＣＣ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた。
（１）実施例４７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５７ｂにさらにＴｈｒ１６５Ｍｅｔが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１６８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６１ｐ１とした。
（２）実施例４７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５７ｂにさらにＬｅｕ２１７ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１６９と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６１ｐ２とした。
（３）前記のｍ６１ｐ１およびｍ６１ｐ２の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６１ｐ３とした。
（４）前記のｍ６１ｐ３を精製し、それを鋳型として、配列番号６８と配列番号１６６からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６１ｐ４とした。
（５）前記のｍ６１ｐ３を精製し、それを鋳型として、配列番号１６７と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６１ｐ５とした。
（６）前記のｍ６１ｐ４およびｍ６１ｐ５の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６１箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６１をコードするポリヌクレオチドを得た。
（７）前記のＦｃＲｍ６１をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（８）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ６１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６１を得た。
（９）ｐＥＴＦｃＲｍ６１の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ６１のアミノ酸配列を配列番号１７０に、前記ＦｃＲｍ６１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７１に示す。なお、配列番号１７０において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ６１のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１７０において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは６０番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｌｅｕ５８Ａｒｇのアルギニンは７６番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅのフェニルアラニンは８８番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは９１番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアラニンは１２９番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅのイソロイシンは１３３番目、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐのアスパラギン酸は１３６番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１３９番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１６９番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔのメチオニンは１８３番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは２１７番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅのフェニルアラニンは２４８番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙのグリシンは２５１番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２５２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓのリジンは２６４番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２８８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目、Ｖａｌ２８９Ａｓｐのアスパラギン酸は３０７番目の位置にそれぞれある。
【０１６４】
実施例４９  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ）の作製
実施例４７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２１７ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐを選択し、それらの置換を実施例４３に記載のＦｃＲｍ５７ｂに対してさらに集積して、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６０箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６０ｃを作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔのアミノ酸置換のために配列番号１７２（５’−ＡＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡ−３’）および配列番号１７３（５’−ＴＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＡＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＣＴ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
（１）実施例４７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５７ｂにさらにＬｅｕ２１７ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号６８と配列番号１７２からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６０ｃｐ１とした。
（２）実施例４７のスクリーニングで取得した、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５７ｂにさらにＬｅｕ２１７ＧｌｎおよびＶａｌ２８９Ａｓｐが置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを鋳型として、配列番号１７３と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６０ｃｐ２とした。
（３）前記のｍ６０ｃｐ１およびｍ６０ｃｐ２の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６０箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６０ｃをコードするポリヌクレオチドを得た。
（４）前記のＦｃＲｍ６０ｃをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ６０ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃを得た。
（６）ｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃの塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１６５】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ６０ｃのアミノ酸配列を配列番号１７４に、前記ＦｃＲｍ６０ｃをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７５に示す。なお、配列番号１７４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ６０ｃのアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１７４において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは６０番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｌｅｕ５８Ａｒｇのアルギニンは７６番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅのフェニルアラニンは８８番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは９１番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアラニンは１２９番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅのイソロイシンは１３３番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１３９番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１６９番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔのメチオニンは１８３番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは２１７番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎのグルタミンは２３５番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅのフェニルアラニンは２４８番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙのグリシンは２５１番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２５２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２８８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目、Ｖａｌ２８９Ａｓｐのアスパラギン酸は３０７番目の位置にそれぞれある。
【０１６６】
実施例５０  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６２）の作製
実施例４７で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、安定性向上に関与するアミノ酸置換である、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｇｌｎ２４６ＬｙｓおよびＶａｌ２８９Ａｓｐを選択し、それらの置換を実施例４３に記載のＦｃＲｍ５７ｂに対してさらに集積して、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６２箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６２を作製し、さらなる安定性向上を図った。なお、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐのアミノ酸置換のために配列番号１６７からなるオリゴヌクレオチドを、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓのアミノ酸置換のために配列番号１６８からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
（１）実施例４９のプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃを鋳型として、配列番号１６７と配列番号１６８からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をｍ６２ｐ１とした。
（２）前記のｍ６２ｐ１のＰＣＲ産物を精製し、それを実施例４８のｍ６１ｐ４および実施例４８のｍ６１ｐ２の精製済みの各ＰＣＲ産物とともに混合後、表７に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表４に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物を精製し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６２箇所アミノ酸置換処理したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６２をコードするポリヌクレオチドを得た。
（３）前記のＦｃＲｍ６２をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出することで、ＦｃＲｍ６２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲｍ６２を得た。
（５）ｐＥＴＦｃＲｍ６２の塩基配列の解析を実施例３と同様の方法により行なった。
【０１６７】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲｍ６２のアミノ酸配列を配列番号１７６に、前記ＦｃＲｍ６２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７７に示す。なお、配列番号１７６において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃＲｍ６２のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号１７６において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは５３番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは５４番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは５９番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは６０番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは６９番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは７０番目、Ｌｅｕ５８Ａｒｇのアルギニンは７６番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は７８番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは８３番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅのフェニルアラニンは８８番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは９１番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは１１５番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアラニンは１２９番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅのイソロイシンは１３３番目、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐのアスパラギン酸は１３６番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１３９番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１４６番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１５１番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１５５番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１５７番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１６７番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１６９番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１７０番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１７４番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１７５番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔのメチオニンは１８３番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１９１番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１９９番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは２００番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは２０２番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは２１７番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２３１番目、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎのグルタミンは２３５番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２３６番目、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅのフェニルアラニンは２４８番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２４９番目、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙのグリシンは２５１番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２５２番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓのリジンは２６４番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２６７番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２８８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目、Ｖａｌ２８９Ａｓｐのアスパラギン酸は３０７番目の位置にそれぞれある。
【０１６８】
実施例５１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６２）の生産性評価
実施例４８から５０および実施例２で作製した形質転換体を実施例１４と同様の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定したＦｃ結合性タンパク質の生産性を、培養液濁度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ６００ｎｍ、ＯＤ６００）あたりの生産量（ｍｇ／Ｌ−培養液／ＯＤ６００）として比較した。
【０１６９】
結果を図２２に示す。なお、図２２中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例４８から５０で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６０ｃおよびＦｃＲｍ６２は高い生産性が認められた。図２２の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質の生産性が向上したことが明らかとなった。
【０１７０】
実施例５２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６２）のアルカリ安定性評価
（１）実施例１４に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６２）および、野生型Ｆｃ結合性タンパク質を調製し実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の６００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で１８０分間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）のアルカリ処理を行なった試料、および比較として（２）のアルカリ処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定したアルカリ処理後の試料の抗体結合活性を、アルカリ処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、アルカリ処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１７１】
アルカリに対する安定性を比較した結果を図２３に示す。図２３中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図２３中のＦｃＲｍ５７ｂは、実施例４３の形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であり、これらのＦｃ結合性タンパク質に比べ、実施例４８から５０で作製した形質転換体を用いて発現させたＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６０ｃおよびＦｃＲｍ６２は、アルカリに対する安定性が高いことが認められた。図２３の結果より、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積することによりＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上したことが明らかとなった。
【０１７２】
実施例５３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ４４、ＦｃＲｍ４８、ＦｃＲｍ５４ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ、ＦｃＲｍ５７ｂ）の熱安定性評価
実施例１３、１８、２３、２８、３３、３８および４３で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ４４、ＦｃＲｍ４８、ＦｃＲｍ５４ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ、ＦｃＲｍ５７ｂ）を実施例９に記載の方法で調製した。調製したＦｃ結合性タンパク質を実施例１０と同様の方法にて変性中点温度（Ｔｍ）の測定を行なった。その結果を表１８に示す。
【０１７３】
【表１８】
2011206046.tif 000020
【０１７４】
表１８においてＦｃＲは、実施例２で作製した形質転換体により発現させたアミノ酸置換をしていないＦｃ結合性タンパク質（Ｆｃ受容体）を示したものである。この野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ、実施例１３、１８、２３、２８、３３、３８および４３で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ４４、ＦｃＲｍ４８、ＦｃＲｍ５４ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ、ＦｃＲｍ５７ｂ）はいずれもＴｍが上昇しており、熱安定性が向上していることを確認した。
【０１７５】
実施例５４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９、ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ４４、ＦｃＲｍ４８、ＦｃＲｍ５４ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ、ＦｃＲｍ５７ｂ、ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６１、ＦｃＲｍ６２）の酸安定性評価
（１）実施例２、７（ｄ）、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、４８、４９および５０で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質または、Ｆｃ結合性タンパク質を実施例１４に記載の方法で調製し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて濃度測定を行なった。
（２）各Ｆｃ結合性タンパク質濃度を２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これに等量の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を加え、２５℃で２４時間放置した。
（３）放置後、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性領域に戻してから、（２）の酸処理を行なった試料、および比較として（２）の酸処理を行なわなかった試料の抗体結合活性を、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４）測定した酸処理後の試料の抗体結合活性を、酸処理しないときの試料の抗体結合活性で除することで、酸処理による各Ｆｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
【０１７６】
酸に対する安定性を比較した結果を図２４に示す。図２４中のＦｃＲは、実施例２の形質転換体を用いて発現させた野生型Ｆｃ結合性タンパク質を示したものである。また、図２４中のＦｃＲｍ１９、ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ４４、ＦｃＲｍ４８、ＦｃＲｍ５４ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ、ＦｃＲｍ５７ｂ、ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６１およびＦｃＲｍ６２は、それぞれ実施例７（ｄ）、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、４９、４８および５０で作製した形質転換体を用いて発現したＦｃ結合性タンパク質である。これらのＦｃ結合性タンパク質はいずれも野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比べ酸に対する安定性が高いことが認められた。
【０１７７】
実施例５５  Ｌｅｕ４６アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例５で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換のうち、配列番号１に記載のアミノ酸配列における４６番目のロイシン（Ｌｅｕ４６）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換することで熱安定性の向上が特に著しかった（表６）。そこで、４６番目のロイシンを置換することの有用性を再評価するため、４６番目のロイシンを他のアミノ酸で置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドと、その形質転換体を作製した。なお、４６番目のロイシンを任意のアミノ酸に置換するために配列番号１７８（５’−ＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＡＧＴＡＮＮＫＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧ−３’）および配列番号１７９（５’−ＡＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＭＮＮＴＡＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
（１）実施例２で作製した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲを鋳型として、配列番号６８と配列番号１７９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表１９に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をＬ４６ｐ１とした。
【０１７８】
【表１９】
2011206046.tif 000021
【０１７９】
（２）実施例２で作製した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲを鋳型として、配列番号１７８と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表１９に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をＬ４６ｐ２とした。
（３）前記のＬ４６ｐ１およびＬ４６ｐ２の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表２０に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表１９に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。こうして野生型Ｆｃ結合性タンパク質の４６番目のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたＰＣＲ産物をＬ４６ｐ３とした。
【０１８０】
【表２０】
2011206046.tif 000022
【０１８１】
（４）前記のＬ４６ｐ３を精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（図４）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出し、実施例３に記載の方法にて配列解析を行ない、４６番目のロイシン（Ｌｅｕ）がアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。
【０１８２】
実施例５６  Ｌｅｕ４６アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の活性評価
（１）前記形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５０μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定した。
【０１８３】
結果を表２１に示す。表２１より配列番号１に記載のアミノ酸配列における４６番目のロイシン（Ｌｅｕ）がＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｒｐに置換されることで活性が向上していることが確認された。好ましくはＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒへの置換であり、さらに好ましくはＰｒｏへの置換である。
【０１８４】
【表２１】
2011206046.tif 000023
【０１８５】
実施例５７  Ｐｈｅ１１４アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例５で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換のうち、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１１４番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ１１４）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換することで熱安定性の向上が特に著しかった（表６）。そこで、１１４番目のフェニルアラニンを置換することの有用性を再評価するため、１１４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸で置換した変異Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドと、その形質転換体を作製した。なお、１１４番目のフェニルアラニンを任意のアミノ酸に置換するために配列番号１８０（５’−ＣＡＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＣＧＣＧＴＴＮＮＫＡＣＣＧＡＡＧＧＣＧＡ−３’）および配列番号１８１（５’−ＡＡＧＣＧＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＭＮＮＡＡＣＧＣＧＧＧＡＧＣ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
（１）実施例２で作製した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲを鋳型として、配列番号６８と配列番号１８１からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表１９に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をＦ１１４ｐ１とした。
（２）実施例２で作製した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴＦｃＲを鋳型として、配列番号１８０と配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表１９に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ産物をＦ１１４ｐ２とした。
（３）前記のＦ１１４ｐ１およびＦ１１４ｐ２の２種類のＰＣＲ産物を精製し、それぞれを混合後、表２０に示す反応液組成で、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとするＰＣＲ反応を５サイクル行なうことでＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を連結した。このＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号６８および配列番号６９からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は表１９に示す反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。こうして野生型Ｆｃ結合性タンパク質の１１４番目のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたＰＣＲ産物をＦ１１４ｐ３とした。
（４）前記のＦ１１４ｐ３を精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２に記載の発現ベクターｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、菌体よりプラスミドを抽出し、実施例３に記載の方法にて配列解析を行ない。１１４番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）またはバリン（Ｖａｌ）に置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。
【０１８６】
実施例５８  Ｐｈｅ１１４アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の活性評価
（１）前記形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５０μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈し、実施例１２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定した。
【０１８７】
結果を表２２に示す。表２２より配列番号１に記載のアミノ酸配列における１１４番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置き換わることで活性が向上していることが確認された。好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌへの置換であり、さらに好ましくはＩｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌへの置換である。
【０１８８】
【表２２】
2011206046.tif 000024
【０１８９】
実施例５９  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）のゲルへの固定化
（１）実施例７（ｄ）で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ１９を調製した。
（２）得られた６．９ｍｇ／ｍＬのＦｃＲｍ１９溶液０．４ｍＬと０．１ｍＬのエポキシ基導入トヨパールゲル（東ソー社製）とを混合し、終濃度０．６Ｍとなるようにリン酸カリウム緩衝液を加え、２０℃で１４時間反応させた。
（３）反応後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルから反応残渣を除去し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄してＦｃＲｍ１９固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣のＦｃ結合性タンパク質量をブラッドフォード法にて定量し、仕込みＦｃ結合性タンパク質量にて除することにより固定化率を算出した。
【０１９０】
結果、固定化率が８３．３％、ゲル１ｍＬあたりのＦｃＲｍ１９固定化量は２３．０ｍｇであることが確認された。
【０１９１】
実施例６０  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルの抗体吸着性評価
（１）実施例５９で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲル０．１ｍＬに対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製、以下ＩｇＧと表記）を０．５ｍＬ添加し、１５℃で１時間振とうした。
（２）振とう後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、０．２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（３）最後に、０．２ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
【０１９２】
２８０ｎｍの吸光度測定（１０ｍｍセル、１％のＩｇＧ溶液の吸光度を１４として計算）で溶出させたＩｇＧを定量した結果、２．１０ｍｇであった。これにより、実施例５９で調製したＦｃＲｍ１９固定化ゲルのゲル１ｍＬあたりのＩｇＧ吸着量は２１．０ｍｇであることが確認された。
【０１９３】
実施例６１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルの抗体溶出性評価
（１）実施例５９で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲル０．１ｍＬをカラムに充填し、２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを添加してＩｇＧをゲルに吸着させた。
（２）カラムを２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて充分洗浄した後、ｐＨ３．０からｐＨ４．２の範囲にある任意のｐＨの１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流し、ＩｇＧを溶出させた（これを溶出液１とする）。
（３）最後にｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流してゲルに吸着したＩｇＧを完全に溶出させた（これを溶出液２とする）。
（４）溶出液１および２におけるＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、下記の式１にて各々のｐＨの溶出液におけるＩｇＧ溶出割合を求めた。
【０１９４】
ＩｇＧ溶出割合（％）＝
溶出液１のＩｇＧ量÷（溶出液１のＩｇＧ量＋溶出液２のＩｇＧ量）×１００
・・・・・・（式１）
結果、抗体溶出割合はｐＨ３．０のとき９９．１％、ｐＨ３．４のとき８７．４％、ｐＨ３．８のとき５１．３％、ｐＨ４．２のとき２２．０％であった。各ｐＨにおける抗体溶出割合をまとめたものを図２５に示す。
【０１９５】
実施例６２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）のゲルへの固定化
（１）実施例１３で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３２を調製した。
（２）得られた８．１ｍｇ／ｍＬのＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）溶液０．３ｍＬと０．１ｍＬのエポキシ基導入トヨパールゲル（東ソー社製）とを混合し、終濃度１．０Ｍとなるようにリン酸カリウム緩衝液を加え、２０℃で１４時間反応させた。
（３）反応後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルから反応残渣を除去し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄してＦｃＲｍ３２固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣のＦｃＲｍ３２量をブラッドフォード法にて定量し、仕込みＦｃ結合性タンパク質量にて除することにより固定化率を算出した。
【０１９６】
結果、固定化率が７９．３％、ゲル１ｍＬあたりのＦｃＲｍ３２固定化量は１９．３ｍｇであることが確認された。
【０１９７】
実施例６３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）固定化ゲルの抗体吸着性評価
（１）実施例６２で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）固定化ゲル０．１ｍＬに対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを０．５ｍＬ添加し、１５℃で１時間振とうした。
（２）振とう後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、０．２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（３）最後に、０．２ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
【０１９８】
溶出させたＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行なった結果、１．９８ｍｇであった。これにより、実施例６２で調製したＦｃＲｍ３２固定化ゲルのゲル１ｍＬあたりのＩｇＧ吸着量は１９．８ｍｇであることが確認された。
【０１９９】
実施例６４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）固定化ゲルの抗体溶出性評価
（１）実施例６２で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２）固定化ゲル０．１ｍＬをカラムに充填し、２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を通液してＩｇＧをゲルに吸着させた。
（２）カラムを２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて充分洗浄した後、ｐＨ３．０からｐＨ４．２の範囲にある任意のｐＨの１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流し、ＩｇＧを溶出させた（これを溶出液１とする）。
（３）最後にｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流してゲルに吸着したＩｇＧを完全に溶出させた（これを溶出液２とする）。
（４）溶出液１および２におけるＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、実施例６１に記載の式１にて各々のｐＨの溶出液におけるＩｇＧ溶出割合を求めた。
【０２００】
結果、抗体溶出割合はｐＨ３．０のとき９８．７％、ｐＨ３．４のとき９９．３％、ｐＨ３．８のとき９７．９％、ｐＨ４．２のとき８２．８％であった。実施例５９で行なったＦｃＲｍ１９固定化ゲルの抗体溶出性評価と比較すると、よりｐＨの高い（より中性側の）緩衝液におけるＩｇＧ溶出性が大きく向上していることが確認された。ＦｃＲｍ１９固定化ゲルと比較した、各ｐＨにおけるＦｃＲｍ３２固定化ゲルの抗体溶出割合をまとめたものを図２６に示す。
【０２０１】
実施例６５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）のゲルへの固定化
（１）実施例１８で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法にてＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３６ｂを調製した。
（２）得られた１５．５ｍｇ／ｍＬのＦｃＲｍ３６ｂ溶液０．１ｍＬと０．０５ｍＬのエポキシ基導入トヨパールゲル（東ソー社製）とを混合し、終濃度０．８Ｍとなるようにリン酸カリウム緩衝液を加え、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルから反応残渣を除去し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄してＦｃＲｍ３６ｂ固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣のＦｃ結合性タンパク質量をブラッドフォード法にて定量し、仕込みＦｃ結合性タンパク質量にて除することにより固定化率を算出した。
【０２０２】
結果、固定化率が６７．７％、ゲル１ｍＬあたりのＦｃＲｍ３６ｂ固定化量は２１．０ｍｇであることが確認された。
【０２０３】
実施例６６  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）固定化ゲルの抗体吸着性評価
（１）実施例６５で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）固定化ゲル０．０５ｍＬに対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを０．５ｍＬ添加し、１５℃で１時間振とうした。
（２）振とう後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、０．２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（３）最後に、０．２ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
【０２０４】
溶出させたＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行なった結果、１．４４ｍｇであった。これにより、実施例６５で調製したＦｃＲｍ３６ｂ固定化ゲルのゲル１ｍＬあたりのＩｇＧ吸着量は２８．８ｍｇであることが確認された。
【０２０５】
実施例６７  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）固定化ゲルの抗体溶出性評価
（１）実施例６５で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３６ｂ）固定化ゲル０．０５ｍＬをカラムに充填し、２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を通液してＩｇＧをゲルに吸着させた。
（２）カラムを２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて充分洗浄した後、ｐＨ３．０からｐＨ４．２の範囲にある任意のｐＨの１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流し、ＩｇＧを溶出させた（これを溶出液１とする）。
（３）最後にｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流してゲルに吸着したＩｇＧを完全に溶出させた（これを溶出液２とする）。
（４）溶出液１および２におけるＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、実施例６１に記載の式１にて各々のｐＨの溶出液におけるＩｇＧ溶出割合を求めた。
【０２０６】
結果、抗体溶出割合はｐＨ３．０のとき９９．５％、ｐＨ３．４のとき９９．４％、ｐＨ３．８のとき９２．２％、ｐＨ４．２のとき６４．０％であった。この結果、実施例５９で行なったＦｃＲｍ１９固定化ゲルの抗体溶出性評価と比較すると、よりｐＨの高い（より中性側の）緩衝液におけるＩｇＧ溶出性が大きく向上していることが確認された。ＦｃＲｍ１９固定化ゲルと比較した、各ｐＨにおけるＦｃＲｍ３６ｂ固定化ゲルの抗体溶出割合をまとめたものを図２７に示す。
【０２０７】
実施例６８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）のゲルへの固定化
（１）実施例２８で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ４８を調製した。
（２）得られた８．８ｍｇ／ｍＬのＦｃＲｍ４８溶液０．１ｍＬと０．０５ｍＬのエポキシ基導入トヨパールゲル（東ソー社製）とを混合し、終濃度０．８Ｍとなるようにリン酸カリウム緩衝液を加え、３５℃で５時間反応させた。
（３）その後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルから反応残渣を除去し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄してＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣のＦｃ結合性タンパク質量をブラッドフォード法にて定量し、仕込みＦｃ結合性タンパク質量にて除することにより固定化率を算出した。
【０２０８】
結果、固定化率が７７．３％、ゲル１ｍＬあたりのＦｃＲｍ４８固定化量は１３．６ｍｇであることが確認された。
【０２０９】
実施例６９  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）固定化ゲルの抗体吸着性評価
（１）実施例６８で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）固定化ゲル０．０５ｍＬに対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを０．５ｍＬ添加し、１５℃で１時間振とうした。
（２）その後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、０．２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（３）最後に、０．２ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
【０２１０】
溶出させたＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行なった結果、０．９４ｍｇであった。これにより、実施例６８で調製したＦｃＲｍ４８固定化ゲルのゲル１ｍＬあたりのＩｇＧ吸着量は１８．８ｍｇであることが確認された。
【０２１１】
実施例７０  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）固定化ゲルの抗体溶出性評価
（１）実施例６８で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ４８）固定化ゲル０．０５ｍＬをカラムに充填し、２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を通液してＩｇＧをゲルに吸着させた。
（２）カラムを２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて充分洗浄した後、ｐＨ３．０からｐＨ４．２の範囲にある任意のｐＨの１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流し、ＩｇＧを溶出させた（これを溶出液１とする）。
（３）最後にｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流してゲルに吸着したＩｇＧを完全に溶出させた（これを溶出液２とする）。
（４）溶出液１および２におけるＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、実施例６１に記載の式１にて各々のｐＨの溶出液におけるＩｇＧ溶出割合を求めた。
【０２１２】
結果、抗体溶出割合はｐＨ３．０のとき９９．２％、ｐＨ３．４のとき１００．０％、ｐＨ３．８のとき９８．２％、ｐＨ４．２のとき８１．９％であった。この結果、実施例５９で行なったＦｃＲｍ１９固定化ゲルの抗体溶出性評価と比較すると、よりｐＨの高い（より中性側の）緩衝液におけるＩｇＧ溶出性が大きく向上していることが確認された。ＦｃＲｍ１９固定化ゲルと比較した、各ｐＨにおけるＦｃＲｍ４８固定化ゲルの抗体溶出割合をまとめたものを図２８に示す。
【０２１３】
実施例７１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）のゲルへの固定化
（１）実施例３８で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５６ｂを調製した。
（２）得られた１３．２ｍｇ／ｍＬのＦｃＲｍ５６ｂ溶液１．０ｍＬと０．５ｍＬのエポキシ基導入トヨパールゲル（東ソー社製）とを混合し、終濃度０．８Ｍとなるようにリン酸カリウム緩衝液を加え、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルから反応残渣を除去し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄してＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣のＦｃ結合性タンパク質量をブラッドフォード法にて定量し、仕込みＦｃ結合性タンパク質量にて除することにより固定化率を算出した。
【０２１４】
結果、固定化率が７０．８％、ゲル１ｍＬあたりのＦｃＲｍ５６ｂ固定化量は１８．７ｍｇであることが確認された。
【０２１５】
実施例７２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルの抗体吸着性評価
（１）実施例７１で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲル０．５ｍＬに対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを３．０ｍＬ添加し、１５℃で１時間振とうした。
（２）振とう後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、１．０ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（３）最後に、１．０ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
【０２１６】
溶出させたＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行なった結果、１１．５ｍｇであった。これにより、実施例７１で調製したＦｃＲｍ５６ｂ固定化ゲルのゲル１ｍＬあたりのＩｇＧ吸着量は２３．０ｍｇであることが確認された。
【０２１７】
実施例７３  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルの抗体溶出性評価
（１）実施例７１で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲル０．１ｍＬをカラムに充填し、２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を通液してＩｇＧをゲルに吸着させた。
（２）カラムを２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて充分洗浄した後、ｐＨ３．０からｐＨ４．２の範囲にある任意のｐＨの１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流し、ＩｇＧを溶出させた（これを溶出液１とする）。
（３）最後にｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流してゲルに吸着したＩｇＧを完全に溶出させた（これを溶出液２とする）。
（４）溶出液１および２におけるＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、実施例６１に記載の式１にて各々のｐＨの溶出液におけるＩｇＧ溶出割合を求めた。
【０２１８】
結果、抗体溶出割合はｐＨ３．０のとき９９．７％、ｐＨ３．４のとき９９．５％、ｐＨ３．８のとき９４．５％、ｐＨ４．２のとき７３．０％であった。この結果、実施例５９で行なったＦｃＲｍ１９固定化ゲルの抗体溶出性評価と比較すると、よりｐＨの高い（より中性側の）緩衝液におけるＩｇＧ溶出性が大きく向上していることが確認された。ＦｃＲｍ１９固定化ゲルと比較した、各ｐＨにおけるＦｃＲｍ５６ｂ固定化ゲルの抗体溶出割合をまとめたものを図２９に示す。
【０２１９】
実施例７４  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）のゲルへの固定化
（１）実施例４３で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ５７ｂを調製した。
（２）得られた８．９ｍｇ／ｍＬのＦｃＲｍ５７ｂ溶液１．０ｍＬと０．４ｍＬのエポキシ基導入トヨパールゲル（東ソー社製）とを混合し、終濃度０．８Ｍとなるようにリン酸カリウム緩衝液を加え、３５℃で５時間反応させた。
（３）反応後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルから反応残渣を除去し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてゲルを洗浄してＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣のＦｃ結合性タンパク質量をブラッドフォード法にて定量し、仕込みＦｃ結合性タンパク質量にて除することにより固定化率を算出した。
【０２２０】
結果、固定化率が６４．０％、ゲル１ｍＬあたりのＦｃＲｍ５７ｂ固定化量は１４．２ｍｇであることが確認された。
【０２２１】
実施例７５  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）固定化ゲルの抗体吸着性評価
（１）実施例７４で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）固定化ゲル０．４ｍＬに対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを３．０ｍＬ添加し、１５℃で１時間振とうした。
（２）その後、フィルターろ過（ポアサイズ：１０μｍ）にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、１．０ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（３）最後に、１．０ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
【０２２２】
溶出させたＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行なった結果、６．６７ｍｇであった。これにより、実施例７４で調製したＦｃＲｍ５６ｂ固定化ゲルのゲル１ｍＬあたりのＩｇＧ吸着量は１６．７ｍｇであることが確認された。
【０２２３】
実施例７６  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）固定化ゲルの抗体溶出性評価
（１）実施例７４で調製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５７ｂ）固定化ゲル０．１ｍＬをカラムに充填し、２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を通液してＩｇＧをゲルに吸着させた。
（２）カラムを２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて充分洗浄した後、ｐＨ３．０からｐＨ４．２の範囲にある任意のｐＨの１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流し、ＩｇＧを溶出させた（これを溶出液１とする）。
（３）最後にｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸緩衝液を２ｍＬ流してゲルに吸着したＩｇＧを完全に溶出させた（これを溶出液２とする）。
（４）溶出液１および２におけるＩｇＧの定量を実施例６０に記載した２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、実施例６１に記載の式１にて各々のｐＨの溶出液におけるＩｇＧ溶出割合を求めた。
【０２２４】
結果、抗体溶出割合はｐＨ３．０のとき９９．３％、ｐＨ３．４のとき９９．６％、ｐＨ３．８のとき９０．２％、ｐＨ４．２のとき６６．２％であった。この結果、実施例５９で行なったＦｃＲｍ１９固定化ゲルの抗体溶出性評価と比較すると、よりｐＨの高い（より中性側の）緩衝液におけるＩｇＧ溶出性が大きく向上していることが確認された。ＦｃＲｍ１９固定化ゲルと比較した、各ｐＨにおけるＦｃＲｍ５７ｂ固定化ゲルの抗体溶出割合をまとめたものを図３０に示す。
【０２２５】
実施例７７  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ３２、ＦｃＲｍ３６ｂ、ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルのアルカリ安定性評価
（１）実施例６２、実施例６５および実施例７１で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にてそれぞれ２０％スラリーとし、フィルター付きスピンカラム（マイクロバイオスピンカラム、バイオラッド社製）４本に５０μＬずつ分注した。
（２）（１）で作製したカラムのうち３本について、フィルターろ過にてゲルスラリーからＰＢＳを除き、０．１５ｍＬの０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液にてゲルを１回洗浄した後、再度０．１５ｍＬの水酸化ナトリウム水溶液を添加した。
（３）前記３本のカラムを２０℃でそれぞれ１時間、３時間、２４時間放置した後、０．２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて３回洗浄した。
（４）得られたカラム（アルカリ処理時間：０時間、１時間、３時間、２４時間）に対し、２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を０．２ｍＬ添加後、１５℃で１時間振とうした。
（５）振とう後、フィルターろ過にてゲルからＩｇＧ溶液を除去し、０．２ｍＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）にて５回ゲルを洗浄した。
（６）最後に、０．１ｍＬの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を３回流してゲルに吸着したＩｇＧを溶出させた。
（７）溶出させたＩｇＧの定量を実施例６０に記載の２８０ｎｍの吸光度測定にて行ない、ゲルのＩｇＧ吸着量を算出した。
【０２２６】
結果、アルカリ未処理のゲルのＩｇＧ結合量を１００％活性とした場合、ＦｃＲｍ３２固定化ゲル（実施例６２）の場合は１時間処理で６３．６％、３時間処理で４１．８％、２４時間処理で１８．２％となった。ＦｃＲｍ３６ｂ固定化ゲル（実施例６５）の場合は１時間処理で８４．２％、３時間処理で６０．４％、２４時間処理で１６．８％となった。ＦｃＲｍ５６ｂ固定化ゲル（実施例７１）の場合は１時間処理で９６．８％、３時間処理で９２．１％、２４時間処理で６１．９％となった。このように、安定性向上に関与するアミノ酸置換（変異）を集積したＦｃ結合性タンパク質によってアルカリ安定性が向上していることを確認した。各Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルのアルカリ安定性をまとめたものを図３１に示す。
【０２２７】
実施例７８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲルの繰り返し安定性評価
実施例７１で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ５６ｂ）固定化ゲル０．２ｍＬをカラムに充填し、表２３に示すサイクルで緩衝液を繰り返し通液した。なお、１回目、３０回目、５０回目、７０回目、９０回目、１１０回目、１３０回目および１５０回目では、表２４に示すサイクルで緩衝液およびＩｇＧ溶液を通液し、カラムのＩｇＧ吸着量を算出した。
【０２２８】
【表２３】
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【０２２９】
【表２４】
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【０２３０】
１回目のＩｇＧ吸着量を１００％として経時的にカラムのＩｇＧ吸着量を測定した結果、３０回目で９８．９％、５０回目で９４．７％、７０回目で８９．０％、９０回目で８４．９％、１１０回目で８４．９％、１３０回目で８０．２％、１５０回目で８０．７％となった。
【０２３１】
一方、比較例として、実施例２で作製した形質転換体を用いて実施例９に記載の方法にて野生型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ）を調製し、実施例５９と同様な方法で０．２ｍＬのゲルにＦｃＲを固定化後、カラムに充填した。前記カラムに対して、表２４に示すサイクルで緩衝液およびＩｇＧを繰り返し通液し、カラムのＩｇＧ吸着量変化を確認した。１回目のＩｇＧ吸着量を１００％として経時的にカラムのＩｇＧ吸着量を測定した結果、２回目で６０．０％、３回目で４１．５％まで低下し、ＦｃＲ固定化ゲルではアルカリ洗浄によるゲルの再生が事実上困難であることが示された。各Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルのアルカリ洗浄に対する繰り返し安定性をまとめたものを図３２に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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