(57)【要約】【課題】中枢神経の損傷を効果的に治療することができる、中枢神経損傷治療剤を提供すること。【解決手段】中枢神経損傷治療剤は、抗TGF-β1抗体のようなTGF-β1阻害剤を有効成分として含有する。【効果】中枢神経損傷治療剤は、中枢神経の損傷を効果的に治療することができる。本発明の治療剤によれば、脊髄の機械的な挫傷により失われた運動機能が、有意に改善する。従って、本発明の治療剤は、事故や疾病による中枢神経の損傷の治療に大いに寄与するものと考えられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGF-β1阻害剤を有効成分として含有する中枢神経損傷治療剤。
【請求項２】
前記TGF-β1阻害剤が、抗TGF-β1抗体又はその抗原結合性断片である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
前記TGF-β1阻害剤が、抗TGF-β1中和抗体である請求項1又は２記載の治療剤。
【請求項４】
前記中枢神経が脊髄である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
抗ＴＧＦ-β１中和抗体を有効成分として含有する脊髄損傷治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経損傷治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄の傷害により、ニューロン及びグリアの双方に損傷を与える、一連の細胞性及び生化学的プロセスが開始される。損傷部位において細胞及び軸索の消滅が起き、この障害が隣接領域に広がっていく。脊髄軸索は自発的に再生しないので、内発性の神経解剖学的修復及び機能回復を促進する戦略が必要である。免疫細胞の活性化及び炎症プロセスが、損傷後の続発症において重要な役割を果たすと信じられている。いくつかの炎症プロセスは、中枢神経系の修復を促進するので、有益であるという数種類の知見がある。活性化マクロファージを脊髄内移植することにより解剖学的及び機能的修復が改善されたことが報告されている（非特許文献１) 。このことは、いくつかの活性化炎症細胞が、損傷された中枢神経系(CNS)にとって有益であるかもしれないことを示唆している。活性化マクロファージの投与は、損傷部位から破片を清掃し、種々のサイトカインを生産することにより軸索の成長を促進すると報告されている。炎症により誘導されるサイトカイン及び局所的に放出される成長因子が、CNS炎症におけるこれらの２つの作用に寄与しているかもしれない。対照的に、CNSの損傷後、免疫応答を過度に増強することはニューロンに有害である。従って、免疫系は、CNSの損傷後の防御及び維持において役割を果たしているかもしれず、免疫応答は、よく制御されるならば、ニューロンに有益かもしれない（非特許文献２)。
【０００３】
TGF-β1は、創傷修復に密接に関与する多面的なサイトカインである。TGF-β1は数種類のCNS病理モデルにおいて発現し、神経変性プロセスにおいけるその重要な役割は認められつつある（非特許文献３) 。TGF-β1は、単球及びリンパ球の活性を刺激することにより炎症応答を高める。TGF-β1は、哺乳動物における組織損傷に応答してアップレギュレートされる。このアイソフォームは、組織修復において最も一般的に関与している。TGF-β1は、新たなマトリックスタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチン及びプロテオグリカン）の生産を同時に刺激することにより細胞外マトリックスの沈着を誘導し、炎症応答に関与する。
【０００４】
成熟哺乳動物のCNSでは、損傷した軸索の再生能力は極めて限られているということは既によく確立されている。適切な軸索再生がないので、成体の脳及び脊髄への外傷による損傷は、しばしば終身的な神経欠損を引き起こす。CNS損傷後、損傷部位の周囲には、種々の神経突起成長阻害物質が存在する。これらは、損傷により誘導される乏しい軸索再生及び機能欠損の少なくとも部分的な原因であると考えられている。ミエリン中の軸索成長阻害物質は重要な役割を果たすと考えられているが、CNSの損傷部位の周囲に発生するグリア性瘢痕中に発現する、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPGs)のような細胞外マトリックス分子は、顕著な阻害剤である。TGF-β1の投与により、グリア性瘢痕が増加し（非特許文献４、非特許文献５)、グリア性瘢痕は軸索再生に対する物理的及び化学的障壁を作り出す（非特許文献６、非特許文献７) 。
【０００５】
【非特許文献１】Rapalino O, Lazarov-Spiegler O, Agranov E, Velan GJ, Yoles E, Fraidakis M, Solomon A, Gepstein R, Katz A, Belkin M, Hadani M, Schwartz M (1998) Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats. Nat Med 4: 814-821.
【非特許文献２】Moalem G, Leibowitz-Amit R, Yoles E, Mor F, Cohen IR, Schwartz M (1999) Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy. Nat Med 5: 49-55.
【非特許文献３】Finch CE, Laping NJ, Morgan TE, Nichols NR, Pasinetti GM (1993) TGF-beta 1 is an organizer of responses to neurodegeneration. J Cell Biochem 53: 314322.
【非特許文献４】Laping NJ, Morgan TE, Nichols NR, Rozovsky I, Young-Chan CS, Zarow C, Finch CE (1994) Transforming growth factor-beta 1 induces neuronal and astrocyte genes: tubulin alpha 1, glial fibrillary acidic protein and clusterin. Neuroscience 58: 563-572.
【非特許文献５】Morgan TE, Laping NJ, Rozovsky I, Oda T, Hogan TH, Finch CE, Pasinetti GM (1995) Clusterin expression by astrocytes is influenced by transforming growth factor beta 1 and heterotypic cell interactions. J Neuroimmunol 58: 101-110.
【非特許文献６】Qiu J, Cai D, Filbin MT (2000) Glial inhibition of nerve regeneration in the mature mammalian CNS. Glia 29: 166-174.
【非特許文献７】Yiu G, He Z (2006) Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci 7: 617-627.
【非特許文献８】Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC (1995) A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12: 1-21
【非特許文献９】Yamashita T, Fujitani M, Yamagishi S, Hata K, Mimura F (2005) Multiple signals regulate axon regeneration through the Nogo receptor complex. Mol Neurobiol 32: 105-111
【非特許文献１０】Tang X, Davies JE, Davies SJ (2003) Changes in distribution, cell associations, and protein expression levels of NG2, neurocan, phosphacan, brevican, versican V2, and tenascin-C during acute to chronic maturation of spinal cord scar tissue. J Neurosci Res 71: 427-444
【非特許文献１１】Pratt BM, McPherson JM (1997) TGF-beta in the central nervous system: potential roles in ischemic injury and neurodegenerative diseases. Cytokine Growth Factor Rev 8: 267-292.
【非特許文献１２】Uehata M, Ishizaki T, Satoh H, Ono T, Kawahara T, Morishita T, Tamakawa H, Yamagami K, Inui J, Maekawa M, Narumiya S (1997) Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature 389: 990-994.
【非特許文献１３】Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA (1999) Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton. EMBO J 18: 578-585.
【非特許文献１４】Bareyre FM, Kerschensteiner M, Raineteau O, Mettenleiter TC, Weinmann O, Schwab ME (2004) The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci 7: 269-277.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、損傷された中枢神経の再生を促進する方法も提案されているが、その効果は必ずしも十分ではなく、中枢神経損傷の実用的な治療方法は未だ存在しない。
【０００７】
従って、本発明の目的は、中枢神経の損傷を効果的に治療することができる、中枢神経損傷治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、TGF-β1の阻害剤を中枢神経の損傷部位に投与することにより、損傷部位における軸索の伸長が促進され、運動機能の回復が促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の通りである。
(1)  TGF-β1阻害剤を有効成分として含有する中枢神経損傷治療剤。
(2)  前記TGF-β1阻害剤が、抗TGF-β1抗体又はその抗原結合性断片である上記(1)記載の治療剤。
(3)  前記TGF-β1阻害剤が、抗TGF-β1中和抗体である上記(1)又は(2)記載の治療剤。
(4)  前記中枢神経が脊髄である上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の治療剤。
(5)  抗ＴＧＦ-β１中和抗体を有効成分として含有する脊髄損傷治療剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、中枢神経の損傷を効果的に治療することができる、中枢神経損傷治療剤が提供された。下記実施例において具体的に記載するように、本発明の治療剤によれば、脊髄の機械的な挫傷により失われた運動機能が、有意に改善する。従って、本発明の治療剤は、事故や疾病による中枢神経の損傷の治療に大いに寄与するものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記の通り、本発明の中枢神経損傷治療剤は、TGF-β1阻害剤を有効成分として含有する。TGF-βは、細胞増殖・分化を制御し、細胞死を促すことが知られているサイトカインであり、TGF-β1はTGF-βファミリーに包含される１つのアイソフォームである。TGF-β1自体は周知であり、よく研究されている。
【００１２】
本発明において用いられるTGF-β1阻害剤とは、TGF-β1の作用を阻害（喪失又は低減）させる物質を意味し、好ましい例として抗TGF-β1抗体を挙げることができる。TGF-β1の作用を阻害（中和）する抗TGF-β1抗体は、TGF-β1の研究用として広く用いられており、市販されている。本発明においてはこのような市販の抗TGF-β1抗体を好ましく用いることができる。TGF-β1の作用は、TGF-β1受容体と結合することにより発揮されることが知られており、市販の抗TGF-β1抗体は、TGF-β1とTGF-β1受容体との結合を阻害することが確認されている。また、TGF-β1と抗原抗体反応により結合してその作用を阻害する抗体であれば、必ずしもTGF-β1を免疫原として作製された抗体でなくてもよく、交差反応的にTGF-β1と抗原抗体反応してその作用を阻害する抗体であってもよい。もっとも、投与対象となる動物が持っている天然のTGF-β1を対応抗原とする抗体が好ましく、従って、治療対象がヒトであれば、ヒトのTGF-β1を対応抗原とする抗体が好ましい。
【００１３】
一般に、抗体の抗原結合性断片、すなわち、抗体の可変領域を含むFab断片やF(ab')2断片等は、抗体の対応抗原に結合し、抗体と同様な作用を発揮することが多いことも知られている。従って、本発明においては、TGF-β1の作用を阻害する抗体の抗原結合性断片を有効成分として用いることもできる。また、抗体医薬としては、投与された抗体医薬を異物として認識する免疫応答をできるだけ抑制するために、定常領域をその動物の定常領域に変えたキメラ抗体（ヒトに投与する抗体医薬であれば、ヒトの定常領域を持つ）抗体や、さらにはCDR領域もヒト由来領域に変えたヒト化抗体、ヒト抗体を産生するトランスジェニック動物に抗原を免疫して作成したヒト抗体も抗体医薬として広く用いられており、このようなキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体も好ましく用いることができる。これらの抗体の作製技術は既に抗体医薬の分野において確立されている。さらに、遺伝子工学的に生産された抗体でもよい。さらに、ScFvのような一本鎖抗体も抗原結合性断片に含めて解釈する。また、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
【００１４】
本発明において用いられるTGF-β1阻害剤は、抗TGF-β1抗体又はその抗原結合性断片が代表的であるが、TGF-β1は、TGF-β1受容体に結合することによりその生理活性を発揮することが知られているので、TGF-β1とTGF-β1受容体との結合を阻害すればTGF-β1の作用を阻害することができる。本発明において、「TGF-β1阻害剤」としては、TGF-β1とTGF-β1受容体との結合を阻害する物質も包含される。代表的なものとして、TGF-β1との結合を阻害する抗TGF-β1受容体抗体及びその抗原結合性断片を例示することができる。TGF-β1との結合を阻害する抗TGF-β1受容体抗体も市販されており、このような市販品を好ましく用いることができる。
【００１５】
さらに、上記した抗体やその抗原結合性断片を生体内で生産させることができる、該抗体やその抗原結合性断片の遺伝子を組み込んだ組換えベクターも本発明でいう「TGF-β1阻害剤」に包含される。抗体を遺伝子工学的に作製する技術は既に広く用いられており、抗体遺伝子を組み込んだ組換えベクターは容易に作製可能である。一方、所望のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターを生体に投与し、生体内でその遺伝子を発現させることにより結果的にそのタンパク質を生体に投与する手法は、遺伝子治療、特に、遺伝子ワクチンの分野において広く知られており、本発明で用いる抗体をこのような遺伝子治療的手法により投与することも可能である。
【００１６】
本発明の治療剤による治療対象は、中枢神経の損傷である。中枢神経は脊髄が好ましい。また、損傷は、交通事故、スポーツ事故、転倒等の事故による外傷の他、脊髄腫瘍やヘルニア等の疾病に起因する損傷も含まれる。好ましくは外傷に起因する損傷である。
【００１７】
投与経路は、損傷部への局所投与が好ましい。投与は、注射により断続的に行うことも可能であるが、下記実施例に記載されるように、ミニポンプとこれに接続したカテーテル等を駆使して持続的に損傷部に投与することが好ましい。投与は、損傷後、可能な限り速やかに開始することが好ましく、投与は損傷から少なくとも１週間、さらに好ましくは少なくとも２週間続けることが好ましい。もっとも、損傷後、長期間経過後は治療効果が低くなるので、投与は最長２ヶ月程度、さらに好ましくは最長１ヶ月程度とすることが経済面及び患者の負担の観点から好ましい。
【００１８】
抗TGF-β1抗体を用いる場合、その投与量は、損傷の程度や患者の状態等により適宜設定できるが、成人の場合、通常、１日当たり0.01mg〜2000mg程度、好ましくは0.5mg〜100mg程度である。また、製剤は、常法に従い、注射剤として製剤したものを用いることができ、例えば、生理食塩液中に抗体を溶解した抗体溶液等を用いることができる。注射剤には、製剤分野で常用される緩衝剤、pH調節剤、浸透圧調節剤等を添加することができる。また、本発明の効果が阻害されないならば、他の薬剤、例えば、外傷の治療や悪化防止に用いられる殺菌剤、抗生物質等や、栄養剤等を併用することも可能である。
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
材料及び方法
外科的処置
麻酔（ペントバルビタールナトリウム、40mg/kg)した雌Sprague-Dawleyラット(200〜250g)を          脊椎レベルT9/T10で椎弓切除して脊髄を露出させた。無限水平衝撃器(infinite horizon impactor (IH impactor; Precision System Instrumentation社製）を用いて脊髄を挫傷した。動物モデルでの中和抗体アッセイのために、脊髄損傷(SCI)の直後に、対照ウサギIgG（13匹）又は抗TGF-β1抗体（13匹）を充填した浸透ミニポンプ(200μL溶液、0.5μL/h, 14日間送達、Alzet pump model 2002（商品名））を各ラットに埋め込んだ。ミニポンプは、動物の背中の皮下に置き、ミニポンプの出口に接続されたシリコーンゴムチューブをSCI部位の硬膜の下に置いた。次に、筋肉層と皮膚層を縫合した。偽手術したラット（３匹）は、脊椎レベルT9/T10で椎弓切除して脊髄を露出させた。次に、筋肉層と皮膚層を縫合した。
【００２１】
免疫組織化学
深い麻酔を誘導した後、0.1Mリン酸緩衝液(PB)中4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を心臓灌流した。脊髄を切り取り、上記固定液で後固定し、30%ショ糖含有PBS中で一夜低温保存した。損傷部位より頭側10mm及び尾側10mmを、Tissue Tek OCT（商品名）に包埋した。各ブロックを横断面に沿って薄切りした(50μm)。矢状切片(50μm)を、損傷部位より頭側10mm及び尾側10mmから集めた。PBSで３回洗浄後、5%ウシ血清及び0.1% Triton X-100（商品名）を含むPBSで、室温(RT)下、１時間、全ての切片をブロックした。切片を一次抗体と４℃で一夜インキュベートし、PBSで３回洗浄し、フルオレッセイン結合二次抗体(1:1000, Invitrogen社製）と室温下、１時間インキュベートした。モノクローナル抗グリア性線維性酸性タンパク質(GFAP)抗体(1:1000, Chemicon社製）、モノクローナル抗コンドロイチン硫酸抗体(1:200, Sigma社製）、抗タイプIVコラーゲン抗体(1:200,LSL社製）、抗Iba1抗体(1:500,和光社製）、モノクローナル抗ED1抗体(1:100, Serotec社製）及びポリクローナル抗セロトニン抗体(5HT)(1:1000, Immunostar社製）を一次抗体として用いた。
【００２２】
皮質脊髄路(CST)の順行性標識
５匹の対照IgG投与SCIラット及び５匹の抗TGF-β1抗体投与SCIラットにおいて、下行性CST線維をビオチン化デキストランアミン(BDA、食塩液中10%、皮質当り4.0μL、分子量10000, Invitrogen社製）で標識した。BDAは、損傷１０週間後に、麻酔下、左右の運動皮質（座標：ブレグマの2mm前、ブレグマの2mm横、深さ1.5mm)に注入した。各注入では、マイクロリットルシリンジ(ITO社製）に接続された内径15〜20μmのガラスキャピラリーを介して４μLのBDAを、８分間かけて注入した。BDA注入１４日後、PBS、次に4%パラホルムアルデヒドを潅流することにより動物を殺した。脊髄を切り取り、上記固定液で一夜後固定し、30%ショ糖含有PBS中で一夜低温保存した。損傷部位より頭側40mm、頭側10mm及び尾側10mmの脊髄をTissue Tek OCT中に包埋した。各ブロックを横断面に沿って薄切りした(50μm)。切片を、0.5%BSA含有PBSで１時間ブロックし、0.15%BSA含有PBS中Alexa Fluor 488-結合ストレプトアビジン（商品名、1:400, Invitrogen社製）と１時間インキュベートした。
【００２３】
定量
各マーカーの免疫反応密度の定量は、顕微鏡を用いて行った。長さ10mm(GFAP、Iba1及びED1について)長さ4mm(CSPG及びコラーゲンについて）の切片中の免疫反応性を、Scion Image software (商品名、米国メリーランド州FrederickのScion Corporation社製）を用いて測定した。免疫標識した領域のピクセル数は、全領域のピクセル数に対する百分率として算出した。
【００２４】
損傷部位の中心から10mm頭側の切片及び10mm尾側の切片を用いてセロトニン陽性線維を測定した。セロトニン陽性線維のピクセル数は、同じ切片中の前角のピクセル数に対する百分率として算出した。
【００２５】
損傷部位から40mm頭側の横断面切片中のBDA-陽性線維のピクセル数を計数した。灰白質中のBDA-標識線維のピクセル数は、同一の切片の後柱の前角中に観察された該線維のピクセル数に対する百分率として算出した。
【００２６】
神経突起成長アッセイ
出生後のラット(P7-9)からトリプシン処理（PBS中0.25%トリプシンで37℃、15分間処理）により小脳顆粒神経細胞(cerebellar granule neurons(CGNs))を切り取り、10%ウシ胎児結成を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)中に再懸濁し、すりつぶし、血清含有DMEMで３回洗浄した。B27添加無血清DMEM中でニューロンを培養し、ポリ-L-リジン(PLL)でコートしたチャンバースライド (LabTek II（商品名）、デンマーク国RoskildeのNunc社製）上にプレートした。プレートしたニューロンを組換えヒトTGF-β1(10ng/ml; R&D Systems社製）又は対照としての溶媒(PBS)と共に24時間インキュベートした。細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、モノクローナル抗体TuJ1(1:1000、Covance社製）で染色した。各TuJ1陽性ニューロンで最も長い神経突起の長さを測定した。
【００２７】
GTP-RhoAのアフィニティ沈殿
1% Triton X-100（商品名）、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、500mM NaCl及び10mM MgCl2並びに各10μg/mLのロイペプチン及びアプロチニンを含む50mM Tris, pH7.5中に溶解した。細胞溶解物を13,000gで４℃、１０分間遠心して清澄化し、上清を、20μgのRhotekinビーズ（商品名）のGST-Rho結合ドメインと共に４℃で４５分間インキュベートした。ビーズを３回、洗浄バッファー(1% Triton X-100（商品名）、0.1% SDS、150mM NaCl及び10mM MgCl2並びに各10μg/mLのロイペプチン及びアプロチニンを含む50mM Tris, pH7.5)で洗浄した。抗RhoA抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.社製）を用いたウェスタンブロットによりRhoAの検出を行った。
【００２８】
行動試験
損傷後、１２週間にわたり、オープンフィールド内で、行動の回復を、Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)運動評価尺度(locomotor rating scale)(非特許文献８)で評価した。損傷されていない偽手術ラット（n=3)は、満点であった。定量は盲検的に行った。
【００２９】
結果
TGF-β1の中和はSCI後の運動回復を促進する
内発性TGF-β1の阻害が、SCI後の機能回復に寄与するか否かを調べた。本実施例では、抗TGF-β1中和抗体（入手先：R&D Systems社製）を用いた。また、本実施例では、臨床の状態をより良く模するために、ラットの脊髄挫傷モデルを用いた。脊椎レベルTh9/T10の部位で、無限水平衝撃器(商品名IH impactor)を用いて脊髄を挫傷させた。抗TGF-β1中和抗体又は対照IgGは、損傷部位の上部の髄腔内に置いたカテーテルを用いて２週間にわたり、浸透圧ミニポンプにより送達した。動物の運動能力は、損傷後１２週間に亘り監視した。偽手術ラット（図１）は、後足の運動を評価するBasso-Beattie-Bresnahan (BBB)運動評価尺度で満点であった。全てのSCIラットは、損傷後１〜７日間は、ほぼ完全に麻痺状態であった。BBBスコアに示されるように、これらの動物は、徐々に運動行動の部分的な回復を示した（図１）。損傷後５〜１２週間の間、抗TGF-β1抗体を投与したラットの運動能力は、対照IgGを投与したラットに比べて良い傾向を示した。損傷１２週間後、対照IgGを投与したラットは、BBBスコアが平均で10.1であったが、抗TGF-β1抗体を投与したラットは、BBBスコアが平均で14.4と有意に高かった（図１）。このように、本実施例のデータは、抗TGF-β1抗体の投与により、ラットにおける脊髄損傷後の運動回復が有意に改善されることを示している。
【００３０】
TGF-β1の阻害はSCI後の瘢痕を減少させる
グリア性瘢痕が、中枢神経系(CNS)損傷後の軸索成長の阻害の重要なソースであることはよく確立されている（非特許文献９)。損傷に対するグリア性応答により、ミクログリア、乏突起膠細胞前駆体、髄膜細胞及び星状細胞が損傷部位に集まる。損傷部分における多数の星状細胞がしばしば肥大性になり、反応性の表現型を呈し、CSPGsとして知られる、阻害的細胞外マトリックス分子になる。先の研究により、TGF-β1を投与することによりグリア性瘢痕が増大することが報告されている（非特許文献４、非特許文献５)。そこで、損傷したラット脊髄中の反応性星状細胞の増加を定量分析し、TGF-β1の阻害がグリア性瘢痕の形成に影響するかどうかを調べた。反応性星状細胞の数を見積もるために、抗GFAP抗体を用いて、対照及び抗TGF-β1抗体投与ラットから得た損傷脊髄の矢状切片を、免疫染色した。対照SCIラットでは、SCIの２週間後、損傷部位の周辺においてGFAPに対する強い免疫反応性が観察されたが、抗TGF-β1抗体投与SCIラットでは、GFAPに対する免疫反応性の顕著な低減が見られた。SCIの１週間後、２週間後及び１２週間後に、損傷部位の中心周辺の、GFAPに対する免疫反応性の全面積を測定して星状細胞の増加を見積もった。SCIの１週間後においては、抗TGF-β1抗体投与ラットと対照抗体投与ラットの間でグリア性瘢痕形成についての有意差はなかった。しかしながら、SCIの２週間後では、TGF-β1の阻害により、グリア性瘢痕の形成が明らかに低減された。この差異は、SCIの１２週間後には消えた（図2i)。
【００３１】
バーシカン、ブレビカン及びニューロカンを包含するほとんどのCSPGsが、SCIの６ヶ月後までアップレギュレートされることが報告されており(非特許文献１０)、これらの細胞外マトリックス分子が軸索の成長を阻害すると考えられている。従って、次に、CSPGsの発現を調べた。反応性の星状細胞の増加と符合して、抗TGF-β1抗体投与ラット（図2j)では、対照IgG投与ラット（図2j)と比較して、SCIの２週間後にCSPGsの発現が有意に低減したが、SCIの１週間後では有意に低減しなかった。
【００３２】
さらに、SCI後のコラーゲン形成を調べた。抗TGF-β1抗体投与に起因するコラーゲンの発現低下の傾向がある程度見られたが（図2k)、抗TGF-β1抗体投与ラットと対照IgG投与ラットの間で、SCIの１週間後、２週間後及び１２週間後のいずれにおいても有意差は見られなかった。
【００３３】
TGF-β1阻害はミクログリア／マクロファージの蓄積及び活性化を促進する
TGF-β1は、活性化されたミクログリア／マクロファージの種々の機能を抑制することができる抗炎症剤としての役割を演じることが知られている（非特許文献１１)。このため、SCI後のミクログリア／マクロファージの蓄積を調べた。損傷１週間後及び２週間後に、Iba-1についての免疫組織化学を行いミクログリア／マクロファージを特徴付けた。SCI１週間後および２週間後に、損傷部位内において、多数のIba-1陽性ミクログリア／マクロファージが認められた。予想された通り、これらのIba-1陽性ミクログリア／マクロファージの数は、抗TGF-β1抗体投与により増加するように思われた。ミクログリア／マクロファージの蓄積の程度を定量的に分析するために、損傷部位の周囲（損傷部位中心の周囲10mmの長さ）のIba-1陽性細胞により占められた面積を測定した。その結果、抗TGF-β1抗体投与により、SCIの２週間後に、Iba-1陽性細胞の蓄積が有意に高められた（図3i)。次に、抗ED-1抗体を用いてミクログリア／マクロファージの活性化を見積もった。なお、ED-1は、活性化マクロファージのマーカーである。抗TGF-β1抗体投与ラットでは、対照IgG投与ラットに比べて、損傷部位の周囲のより広い範囲においてED-1陽性ミクログリア／マクロファージが広がっていた。抗TGF-β1抗体投与により、SCI２週間後のED-1陽性細胞に占められる面積が増大したことが統計学的処理により示された（図3j)。従って、これらの知見は、SCI後の損傷部位の周りのミクログリア／マクロファージの蓄積及び活性化が抗TGF-β1抗体投与により高められたことを示している。
【００３４】
TGF-β1は、RhoA/Rho-キナーゼ経路の活性化に依存する機構により神経突起の成長を阻害する
上記データにより、TGF-β1の阻害がSCI後の運動の回復を促進することが示されたので、TGF-β1阻害により、損傷された神経回路が回復することが示唆された。TGF-β1阻害により誘導される、グリア性瘢痕の減少及びミクログリア／マクロファージの活性化／蓄積の増大が、機能回復を支持しているように思われるが、TGF-β1がまた、損傷ニューロンの軸索成長を直接阻害する役割を果たしている可能性もある。TGF-β1が、インビトロにおいて、哺乳動物のCNS神経突起成長の阻害に寄与しているという仮説を検証するために、小脳顆粒神経細胞(CGNs)を用いた。出生後のラット(P7-9)から得たCGNsを、10ng/mLの組換えTGF-β1(rTGF-β1)の存在下又は非存在下で２４時間培養し、神経突起の長さを調べた。CGNsをrTGF-β1で処理した際に神経突起の成長が有意に阻害された（図4b)。神経突起の成長阻害にかかわるシグナル伝達機構を利用するために、TGF-β1のニューロンに対する効果が、低分子量GTPase RhoA又はその下流のエフェクターであるRho-関連セリン／スレオニンキナーゼ(Rho-kinase)に依存するか否かを調べた。10μMの、Rho-キナーゼの特異的阻害剤であるY27632（非特許文献１２)の存在下又は非存在下でニューロンを２４時間培養したところ、TGF-β1の阻害活性がY27632により低減することが観察された（図4b)。TGF-β1のシグナル伝達にRhoAが関与するか否かを直接調べるために、エフェクタータンパク質であるRhotekin(非特許文献１３) のRhoA結合ドメインを用いた。この試験により、TGF-β1の添加後１０分間以内に、細胞抽出物中のGTP-RhoA量が、対照細胞に比較して増大していた。これらの結果は、TGF-β1が、RhoA/Rhoキナーゼの活性化に依存する機構により神経突起の成長を阻害することを示している。
【００３５】
TGF-β1の中和はセロトニン作動性軸索の成長及び／又は保存を誘導する
神経突起成長アッセイの結果は、TGF-β1が生体内においても軸索成長を抑制している可能性を示している。そこで、TGF-β1の阻害により、損傷したニューロンの軸索成長が促進されるか否かを調べた。数種類の下行性経路が、SCI後の運動機能の回復に寄与している。免疫組織化学分析により、抗IgG投与SCIラットにおける下行性セロトニン作動性縫線脊髄路軸索を調べた。損傷１２週間後、対照SCIラットの損傷部位の尾側10mmにある前角では、損傷部位の頭側10mmの切片と比較して、5-ヒドロキシトリプタミン(5-HT)陽性線維の密度が40%減少していた（図4f)。抗TGF-β1抗体を投与した損傷ラットから得られた試料では、損傷部位の頭側10mmにおける前角中の5-HT陽性線維の密度は、頭側切片中の対照値とほぼ同じであることがわかった（図4f)。しかしながら、損傷部位から尾側10mmの前角中の5-HT陽性線維の密度は、尾側切片中の対照値と比較して有意に増大していた（図4f）。このように、抗TGF-β1抗体投与により、損傷部位の尾側の縫線脊髄軸索の成長及び／又は保存が促進される。5-HT陽性線維の成長は、尾側部における側枝の発芽及び／又は切断されたセロトニン含有軸索からの遠距離軸索成長の組合せに起因するかもしれない。
【００３６】
次に、両側の感覚運動皮質にビオチン化デキストランアミン(BDA)を注入することにより、下行性皮質脊髄路(CST)の完全性を調べた。しかしながら、抗TGF-β1抗体投与SCIラットにおいても対照のIgG投与ラットにおいても、損傷部位の中心よりも尾側では標識線維は検出されなかった（データ示さず）。次に、損傷部位の中心から40mm頭側で得られた脊髄の遠頭側切片を調べた。なぜなら、この領域におけるCSTからの側枝発芽が、運動回復にとって重要であることが示されているからである（非特許文献１４)。SCIラットでは、灰白質、特に後柱に隣接する灰白質においてBDA陽性線維の発芽が検出された。BDA陽性線維の発芽は、抗TGF-β1抗体投与SCIラットにおける灰白質においても検出された。しかしながら、抗TGF-β1抗体投与SCIラットと対照のIgG投与SCIラットの間には、灰白質中のBDA陽性線維の数に有意差はなかった（図4k)。このように、上記データは、抗TGF-β1抗体投与によって、SCI後の損傷CSTの発芽又は再成長が促進されるということを否定している。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】脊髄損傷後、本発明の治療剤を投与したラットの運動能力の回復を、脊髄損傷後、本発明の治療剤を投与しなかったラット及び脊髄を損傷していないラットと比較して示す図である。抗TGF-β1抗体投与ラット（１群13匹）、対照IgG投与ラット（１群13匹）及び偽手術ラット（１群３匹）のそれぞれについて、SCI後、図示の時点でBBBスコアを測定した。各群の平均±標準偏差で示す。抗TGF-β1抗体投与群は、SCI後の図示の日において、対照IgG投与群と統計学的に異なっていた。*: 対照群と比較してP<0.05
【図２】iはグリア性瘢痕形成の定量結果を示す図である。Scion Image Software（商品名）を用い、５匹の対照抗IgG投与ラット（白抜きバー）及び６匹の抗TGF-β1抗体投与ラットから得た矢状切片を分析した。GFAP免疫反応性が陽性の面積を、各切片の全面積（損傷部位の中心の周囲10mmの長さ）に対する百分率として算出した。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差で示す。SCI２週間後において、２つの群の間で有意差が見られた。*: 対照群と比較してP<0.05  jは抗TGF-β1抗体投与ラット及び対照IgG投与ラットにおけるSCIの１週間後及び２週間後におけるCSPG発現を測定した結果を示す図である。SCI後のCSPG発現の誘導は、抗TGF-β1抗体投与により抑制された。CSPG免疫反応性が陽性の面積を、各切片の全面積（損傷部位の中心の周囲4mmの長さ）に対する百分率として算出した。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差で示す。*: 対照群と比較してP<0.05  kはSCIの１週間後、２週間後及び１２週間後における挫傷脊髄中のコラーゲンを測定した結果を示す図である。コラーゲン免疫反応性が陽性の面積を、各切片の全面積（損傷部位の中心の周囲4mmの長さ）に対する百分率として算出した。いずれの時点においても２つの群の間に有意差は見られなかった。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差で示す。
【図３】活性化ミクログリア／マクロファージの定量結果を示す図である。Scion Image Software（商品名）を用い、５匹の対照抗IgG投与ラット（白抜きバー）及び６匹の抗TGF-β1抗体投与ラットから得た、SCIの１週間後及び２週間後の矢状切片を分析した。Iba-1免疫反応性(i)又はED-1免疫反応性(k)が陽性の面積を、各切片の全面積（損傷部位の中心の周囲4mmの長さ）に対する百分率として算出した。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差で示す。SCIの２週間後、２群の間で有意差が見られた。*: 対照群と比較してP<0.05
【図４】TGF-β1により軸索の成長が阻害されることを示す図である。CGNsを、ポリ-L-リジン(PLL) でコートしたチャンバースライド上で、10μMのY27632の存在下又は非存在下でTGF-β1(10ng/mL)の存在下又は非存在下で、コンディションド培地中で２４時間培養した。  bは、ニューロン当たりの神経突起の平均長さを示す。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差で示す。*: 対照群と比較してP<0.01（Studentのt検定）  fは、SCIの１２週間後の対照IgG投与ラット及び抗TGF-β1抗体投与ラットにおける、5-HT陽性線維の定量結果を示す。損傷部位の中心から10mm頭側の切片及び10mm尾側の切片を用いてセロトニン作動性の線維を測定した。損傷部位の中心から10mm尾側において、２群の間で有意差が見られた。白抜きバー：対照群、黒塗りバー：抗TGF-β1抗体投与群。*: 対照群と比較してP<0.05  kは、SCIの１２週間後の対照IgG投与ラット及び抗TGF-β1抗体投与ラットにおける、損傷部位の中心から40mm頭側の切片における、灰白質中のBDA-標識CST線維の数と、正常な脊髄の同切片における数との比を示す図である。対照IgG投与群と抗TGF-β1抗体投与群との間に有意差はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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