(57)【要約】【課題】未知の修飾構造を有するタンパク質の構造を決定することのできる新規なタンパク質の同定方法を提供する。【解決手段】被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析ステップと、前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析ステップと、前記第２の質量分析ステップにより得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定ステップと、前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別ステップと、を有することを特徴とするタンパク質の同定方法である。【選択図】図３
2011215060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析手段と、
前記第１の質量分析手段により得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析手段と、
前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別手段と、を有することを特徴とする、タンパク質の同定装置。
【請求項２】
前記第２の質量分析手段により得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定手段を更に有することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の同定装置。
【請求項３】
前記ペプチド同定手段による前記ペプチドイオンの同定結果に基づいて前記親イオン（ＭＳ１）及びタンデムマス（ＭＳ２及びＭＳ３）の全てのデータを用いてスコアリングを行うスコアリング手段を更に有することを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質の同定装置。
【請求項４】
前記修飾ペプチド判別手段は、前記ペプチド同定手段によって同定されたペプチドの質量と前記第１の質量分析手段により得られた親イオン（ＭＳ１）の質量が一致しない場合に前記親イオンが修飾ペプチドであると判別することを特徴とする、請求項２又は３に記載のタンパク質の同定装置。
【請求項５】
前記第２の質量分析手段により得られたフラグメントに対して更に１回又は複数回の質量分析を行う第３の質量分析手段を更に有する、請求項１〜４の何れか１項に記載のタンパク質の同定装置。
【請求項６】
被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析ステップと、
前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析ステップと、
前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別ステップと、
を有することを特徴とする、タンパク質の同定方法。
【請求項７】
前記第２の質量分析ステップにより得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定ステップを更に有することを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項８】
前記ペプチド同定ステップによる前記ペプチドイオンの同定結果に基づいて前記親イオン（ＭＳ１）及びタンデムマス（ＭＳ２及びＭＳ３）の全てのデータを用いてスコアリングを行うスコアリングステップを更に有することを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項９】
前記修飾ペプチド判別ステップは、前記ペプチド同定ステップによって同定されたペプチドの質量と前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）の質量が一致しない場合に前記親イオンが修飾ペプチドであると判別することを特徴とする、請求項７又は８に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項１０】
前記第２の質量分析ステップにより得られたフラグメントに対して更に１回又は複数回の質量分析を行う第３の質量分析ステップを更に有する、請求項６〜８の何れか１項に記載のタンパク質の同定方法。
【請求項１１】
被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析ステップと、
前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析ステップと、
前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別ステップと、
をコンピュータに実行させることを特徴とするタンパク質の同定プログラム。
【請求項１２】
前記第２の質量分析ステップにより得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定ステップを更に有することを特徴とする、請求項１１に記載のタンパク質の同定プログラム。
【請求項１３】
前記ペプチド同定ステップによる前記ペプチドイオンの同定結果に基づいて前記親イオン（ＭＳ１）及びタンデムマス（ＭＳ２及びＭＳ３）の全てのデータを用いてスコアリングを行うスコアリングステップを更に有することを特徴とする、請求項１２に記載のタンパク質の同定プログラム。
【請求項１４】
前記修飾ペプチド判別ステップは、前記ペプチド同定ステップによって同定されたペプチドの質量と前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）の質量が一致しない場合に前記親イオンが修飾ペプチドであると判別することを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の記載のタンパク質の同定プログラム。
【請求項１５】
前記第２の質量分析ステップにより得られたフラグメントに対して更に１回又は複数回の質量分析を行う第３の質量分析ステップを更に有する、請求項１１〜１４の何れか１項に記載のタンパク質の同定プログラム。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質の同定プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いたタンパク質の同定方法に関する。詳しくは、未知の修飾構造を有するタンパク質の構造を決定することのできる新規なタンパク質の同定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の解析結果からデータベース検索を用いてタンパク質の構造決定を行う方法が知られている。かかるタンパク質配列決定方法では、親イオンとそのフラグメントのペプチドイオンの質量がデータベースに登録されているタンパク配列の部分配列質量と一致しているか否かによりタンパク配列が決定される。
【０００３】
例えば、親イオン（ＭＳ１）を利用するペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）の場合は、トリプシンなどの消化酵素で切断されたペプチド配列がフラグメントとして計測されるので、データベースに登録されているタンパク配列より切断後のペプチド配列を求め、求めた各ペプチド配列の質量とフラグメントイオンの質量との一致割合よりどのタンパクのペプチド配列であるかを決定する。また、親イオンのタンデムマス（ＭＳ２）を利用するＭＳ／ＭＳイオンサーチの場合は、切断後のペプチド配列から片端が削れた部分ペプチド配列がＭＳ２のフラグメントとして計測されるので、最初に親イオンの質量と一致する質量を持つ切断後のペプチド配列群を求め、次に切断後のペプチド配列よりＮ末端／Ｃ末端から１残基ずつ削れた部分ペプチド配列の質量を求め、求めた各部分ペプチド配列の質量とフラグメントイオンの質量との一致割合より切断後のペプチド配列を決定する（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
特許庁総務部企画調査課技術動向班、標準技術集、質量分析技術（マススペクトロメトリー）、３−６−２−１タンパク質同定、インターネット＜http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/mass/3-6-2.pdf#1-1＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のタンパク質配列決定方法では、親イオンやフラグメントの質量がデータベースに登録されているタンパク配列から求められる部分配列の質量と一致している必要があるため、親ペプチドに修飾が含まれている場合はその修飾情報を加えなければペプチド配列が決定できないという問題があった。従って、従来のタンパク質配列決定方法では未知の修飾構造には対応し難く、新たなタンパク質配列の解析手法の開発が強く望まれていた。
【０００６】
本発明は上記従来技術の有する問題点に鑑みなされたものであり、その目的とするところは、タンデム質量分析を用いたタンパク質の同定方法において、未知の修飾構造を有するタンパク質の構造を決定することのできる新規なタンパク質の同定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の上記目的は、下記の手段によって達成される。
【０００８】
（１）即ち、本発明は、被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析手段と、前記第１の質量分析手段により得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析手段と、前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別手段と、を有することを特徴とする、タンパク質の同定装置である。
【０００９】
（２）本発明はまた、前記第２の質量分析手段により得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定手段を更に有することを特徴とする、（１）に記載のタンパク質の同定装置である。
【００１０】
（３）本発明はまた、前記ペプチド同定手段による前記ペプチドイオンの同定結果に基づいて前記親イオン（ＭＳ１）及びタンデムマス（ＭＳ２及びＭＳ３）の全てのデータを用いてスコアリングを行うスコアリング手段を更に有することを特徴とする、（２）に記載のタンパク質の同定装置である。
【００１１】
（４）本発明はまた、前記修飾ペプチド判別手段は、前記ペプチド同定手段によって同定されたペプチドの質量と前記第１の質量分析手段により得られた親イオン（ＭＳ１）の質量が一致しない場合に前記親イオンが修飾ペプチドであると判別することを特徴とする、（２）又は（３）に記載のタンパク質の同定装置である。
【００１２】
（５）本発明はまた、前記第２の質量分析手段により得られたフラグメントに対して更に１回又は複数回の質量分析を行う第３の質量分析手段を更に有する、（１）〜（４）の何れか１項に記載のタンパク質の同定装置である。
【００１３】
（６）また、本発明は、被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析ステップと、前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析ステップと、前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別ステップと、を有することを特徴とする、タンパク質の同定方法である。
【００１４】
（７）本発明はまた、前記第２の質量分析ステップにより得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定ステップを更に有することを特徴とする、（６）に記載のタンパク質の同定方法である。
【００１５】
（８）本発明はまた、前記ペプチド同定ステップによる前記ペプチドイオンの同定結果に基づいて前記親イオン（ＭＳ１）及びタンデムマス（ＭＳ２及びＭＳ３）の全てのデータを用いてスコアリングを行うスコアリングステップを更に有することを特徴とする、（７）に記載のタンパク質の同定方法である。
【００１６】
（９）本発明はまた、前記修飾ペプチド判別ステップは、前記ペプチド同定ステップによって同定されたペプチドの質量と前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）の質量が一致しない場合に前記親イオンが修飾ペプチドであると判別することを特徴とする、（７）又は（８）に記載のタンパク質の同定方法である。
【００１７】
（１０）本発明はまた、前記第２の質量分析ステップにより得られたフラグメントに対して更に１回又は複数回の質量分析を行う第３の質量分析ステップを更に有する、（６）〜（８）の何れか１項に記載のタンパク質の同定方法である。
【００１８】
（１１）更に、本発明は、被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行う第１の質量分析ステップと、前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）のタンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに対して更に質量分析を行う第２の質量分析ステップと、前記タンデムマス（ＭＳ２）のフラグメントに修飾ペプチドが含まれるか否かを判別する修飾ペプチド判別ステップと、をコンピュータに実行させることを特徴とするタンパク質の同定プログラムである。
【００１９】
（１２）本発明はまた、前記第２の質量分析ステップにより得られたタンデムマス（ＭＳ３）のフラグメントのペプチドイオンの質量がタンパク配列データベースに記憶された既知のタンパク配列の部分配列質量の何れと一致するかを判別することにより前記ペプチドイオンを同定するペプチド同定ステップを更に有することを特徴とする、（１１）に記載のタンパク質の同定プログラムである。
【００２０】
（１３）本発明はまた、前記ペプチド同定ステップによる前記ペプチドイオンの同定結果に基づいて前記親イオン（ＭＳ１）及びタンデムマス（ＭＳ２及びＭＳ３）の全てのデータを用いてスコアリングを行うスコアリングステップを更に有することを特徴とする、（１２）に記載のタンパク質の同定プログラムである。
【００２１】
（１４）本発明はまた、前記修飾ペプチド判別ステップは、前記ペプチド同定ステップによって同定されたペプチドの質量と前記第１の質量分析ステップにより得られた親イオン（ＭＳ１）の質量が一致しない場合に前記親イオンが修飾ペプチドであると判別することを特徴とする、（１２）又は（１３）に記載のタンパク質の同定プログラムである。
【００２２】
（１５）本発明はまた、前記第２の質量分析ステップにより得られたフラグメントに対して更に１回又は複数回の質量分析を行う第３の質量分析ステップを更に有する、（１１）〜（１４）の何れか１項に記載のタンパク質の同定プログラムである。
【００２３】
（１６）更に、本発明は、（１１）〜（１５）のいずれか１項に記載のタンパク質の同定プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のタンパク質の同定方法によれば、被検タンパク質に対してタンデム質量分析を用いた多段階タンデムマスを行うことにより、既知のタンパク質配列のデータベースを利用して、従来法では為し得なかった未知の修飾構造を有するタンパク質の構造を容易に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のタンパク質の同定方法の基本概念を説明するための図である。
【図２】本発明のタンパク質の同定方法で得られる多段階タンデムマススペクトラムの一例を示す図である。
【図３】本発明のタンパク質の同定方法をコンピュータに処理させるためのプログラムのアルゴリズムの概略を説明するための図である。
【図４】本実施例で用いた被検タンパク質（ＥＳＳＸ及びＴＦＸ）の構造を示す図である。
【図５】本実施例で得られたＥＳＳＸのＭＳ３スペクトラムを示す図である。
【図６】本実施例で得られたＴＦＸのＭＳ３スペクトラムを示す図である。
【図７】本実施例で得られたＥＳＳＸ及びＴＦＸの配列、修飾部位及び修飾部の分子量の同定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照して詳細に説明する。
【００２７】
図１は、本発明のタンパク質の同定方法の基本概念を説明するための図である。本発明のタンパク質の同定方法では、被検タンパク質に対してタンデム質量分析を行い、親イオン（ＭＳ１）が修飾ペプチドである場合（図１（ａ））、親イオンのタンデムマス（ＭＳ２）フラグメント（図１（ｂ））の中で修飾されていないペプチドイオンに対してタンデムマス（ＭＳ３）を行って（図１（ｃ））、そのフラグメント情報から親イオンのペプチド配列を決定した後、ＭＳ１、ＭＳ２の情報を総合して修飾部位を決定し、修飾構造を推定する。即ち、従来のデータデース検索によるタンパク質配列決定方法では、親ペプチドに修飾が含まれている場合、その修飾情報を加えなければペプチド配列が決定できなかった。しかし、親ペプチドのタンデムマスの中には修飾の無いペプチド配列が現れる。そこで、本発明の方法では、この修飾のないペプチドに多段階タンデムマスを加え、その情報を利用して親ペプチドの配列を決定していくものである。
【００２８】
図２は、本発明のタンパク質の同定方法で利用される多段階タンデムマススペクトラムの一例を示す図である。図２（ａ）に示すＭＳ１のスペクトラムにおいて、５５１．９５ｍ／ｚのピークが修飾ペプチドである。このピークに対してタンデムマスを行うと、図２（ｂ）に示すＭＳ２のスペクトラムが得られる。このスペクトラムには５５１．９５ｍ／ｚや７６２．８９ｍ／ｚ等の修飾部位を含むペプチドピークも存在するが、同時に７０６．３８ｍ／ｚや６３５．３３ｍ／ｚ等の修飾の無いペプチドピークが存在する。この修飾の無いペプチドピーク（７０６．３８ｍ／ｚ）にさらなるタンデムマスを加えることで、図３（ｃ）に示すスペクトラム（ＭＳ３）が得られる。これにより、既知のタンパク配列のデータベースを用いてこれらのペプチド配列を決定するとともに、その情報を基にＭＳ２、ＭＳ１のスペクトラムを解析することにより、親ペプチドの配列、修飾部位、修飾部分の分子量を順次決定することができる。
【００２９】
図３は、本発明のタンパク質の同定方法をコンピュータに処理させるためのプログラムのアルゴリズムの概略を説明するための図である。図３に示すように、本発明のタンパク質の同定プログラムのアルゴリズムは、大別して次の３つのステップから構成される。
【００３０】
まず、ステップＳ１では、多段階タンデムマスにより得られるデータを用いてデータベース検索によるペプチド配列候補を決定する。即ち、まず、被検タンパク質に対して多段階タンデムマスを行う。この場合、トリプシン等の消化酵素で切断された後のペプチド配列から修飾を含む片端が削れた部分ペプチド配列が親イオンとして得られるので、このデータを用いて親ペプチドの配列候補を決定する。この際、部分ペプチド配列の片端が更に削れた部分アミノ酸配列がそのフラグメントとして計測されるので、最初に親イオンの質量と一致する質量を持つ切断後のペプチド配列から片端が削れた部分ペプチド配列群を求め、次に部分ペプチド配列よりＮ末端／Ｃ末端から１残基ずつ削れた部分アミノ酸配列の質量を求め、求めた各部分アミノ酸配列の質量とフラグメントイオンの質量との一致より部分ペプチド配列と切断後のペプチド配列の候補を決定する。この際、修飾を含む片端が削れた部分ペプチド配列由来の親イオンの種類が多く計測されるほど、候補が絞りやすくなる。また、疑陽性を防ぐために、親イオンの質量と一致する質量を持つ部分ペプチド配列として両端が削れたインターナル部分配列は最初は考慮せず、切断後のペプチド配列候補決定後に未決定の親イオンに関して考慮するようにする。
【００３１】
次に、ステップＳ２で、ステップＳ１で決定されたペプチド配列候補を用いて、タンパク修飾情報データベース検索により修飾部位と修飾構造候補を決定する。即ち、最初に修飾部分の分子量候補を、修飾を含む切断後のペプチド配列に相当するＭＳ２の親イオンの質量と決定された切断後のペプチド配列候補の質量差から求める。次に決定された部分ペプチド配列と切断後のペプチド配列より、切断後のペプチド配列の内部分ペプチド配列に含まれない部分を修飾部位候補とする。最後にタンパク修飾情報データベース（例えば、公共データベースのＵＮＩＭＯＤ等）より、修飾部位候補のアミノ酸残基と修飾部分の分子量とに一致する修飾情報を検索し、修飾部位と修飾構造候補を決定する。尚該当する修飾情報がない切断後のペプチド配列については、修飾部位と修飾構造未知の修飾分子量候補までを決定する。
【００３２】
そして、ステップＳ３では、ステップＳ２で決定されたペプチド配列、修飾部位、修飾構造候補と多段階タンデムマスのデータを比較して、各候補のスコアリングを行う。即ち、ステップＳ２まででも修飾部位と修飾構造を含むペプチド配列を決定することができるが、親イオンが修飾を含むアミノ酸配列由来の場合はペプチド配列決定に利用されないことになる。そこでステップＳ３では、より正確性を期するため多段階タンデムマスの全データを利用してスコアリングを行う。この場合、決定された切断後のペプチド配列、修飾部位、修飾構造候補について、修飾を含む切断後のペプチド配列から部分ペプチド配列、部分アミノ酸配列を求め、多段階タンデムマスの各親イオンとそのフラグメントの質量が、求めた部分ペプチド配列、部分アミノ酸配列の質量と一致するイオン強度をスコアリングとして利用し、最も一致する候補をペプチド配列とする。
【００３３】
尚、本発明のタンパク質の同定方法は、上記した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００３４】
例えば、上記した実施形態では、タンデム質量分析において３回のタンデムマスを行う場合を例にして説明したが、フラグメントのペプチドを同定するために必要であれば４回以上のタンデムマスを行うものであってもよい。
【００３５】
また、本発明のタンパク質の同定方法で利用されるタンデム質量分析装置としては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）等を用いたものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明によるタンパク質の同定方法は、単純方法として人が行う他、専用のハードウエア回路によっても、また、プログラムされたタンパク質の同定装置によっても実現することができる。プログラムされたタンパク質の同定装置によって本発明を実現する場合、タンパク質の同定装置を動作させるプログラムは、フロッピー（登録商標）ディスクやＣＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体によって提供されることができる。この場合、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されたプログラムは、通常、ＲＯＭやハードディスク等に転送され記憶される。また、このプログラムは、たとえば、単独のアプリケーションソフトとして提供されてもよいし、タンパク質の同定装置の一機能としてその装置のソフトウエアに組み込んでもよい。
【実施例１】
【００３７】
次に、本発明のタンパク質の同定方法を、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
１．被検タンパク質
【００３９】
図４に示すように、フィブリノゲンの２つのペプチド配列に対し１箇所のプロリンを４−ヒドロキシプロリンに置換した修飾ペプチドを合成し、被検タンパク質として用いた。上記被検タンパク質を０．１％ギ酸溶液で１００μＭに調整し、１回の測定で上記サンプル２μｌを用いてＬＣ−ＭＳ測定を行った。
【００４０】
２．装置
【００４１】
ＬＣＭＳシステムとして日立ハイテクノロジー社製ナノフロンティアーＬＤシステムを用い、以下の条件で測定を行った。
【００４２】
（１）ＮａｎｏＬＣ部：ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ  ｎＬＣ
流速：２００ｎＬ／ｍｉｎ
トラップカラム：０．１５ｍｍφ×５０ｍｍ（ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＨｉＱ  ｓｉｌ  Ｃ１８Ｗ−３）
分離カラム：０．２×５０ｍｍ（ＡＭＲ社製  Ｈａｌｏ  Ｃ１８  ＣＰ３／９１−１６０−００）
溶離液Ａ：０．１％ギ酸，１％アセトニトリル
溶離液Ｂ：０．１％ギ酸，９９％アセトニトリル
グラジエント［％Ｂ（Ｔｉｍｅ）］：２（０）→５０（６０ｍｉｎ）→１００（６０．１ｍｉｎ）→１００（７０ｍｉｎ）→２（７０．１ｍｉｎ）→２（８０ｍｉｎ）
【００４３】
（２）ＭＳ部：ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＤ
イオン化タイプ：Ｎａｎｏ−ＥＳＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）
機器設定：Ｔｒａｐ−Ｓｔａｎｄａｒｄ
スプレー電位：１７００Ｖ
カウンターガス流量：０．６Ｌ／ｍｉｎ
【００４４】
３．方法
【００４５】
１回目のＬＣ−ＭＳ測定においては、検出される親イオン（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎ）の質量電荷比（ｍ／ｚ）と溶出時間（ＲＴ）の情報を得て、かつそのイオンのＭＳ／ＭＳ分析から得られるフラグメントイオン（プロダクトイオン、ＭＳ２）のｍ／ｚ情報を得るため、通常のタンパク質同定で行われるようなＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。
【００４６】
２回目以降のＬＣ−ＭＳ測定においては、上記の測定で得られた親イオンが検出される時間を、抽出マスクロマトグラムにおけるピークトップのＲＴを把握した後、そのＲＴの前後１分間に、ＭＳ３を実行するように測定のメソッドを作成した。ＭＳ３を実行するターゲットとして、親イオンのＭＳ／ＭＳ分析から得られたフラグメントイオンのｍ／ｚ値を入力した。実行するメソッドは、ＭＳ１→ＭＳ２→ＭＳ３→ＭＳ２→ＭＳ３のように動作を指定し、１サイクルの分析データ上にＭＳ１、ＭＳ２及びＭＳ３の情報が蓄積されるように測定を行った。また、より多くのＭＳ３スペクトル情報得るために、イオン透過率やＣＩＤ電圧、ＣＩＤ時間を変更して複数回のデータ取得を行った。
【００４７】
４．結果
【００４８】
ＥＳＳＸでは５個の非修飾ペプチド由来のＭＳ３スペクトラム（３５９．２ｍ／ｚ、５０６．３  ｍ／ｚ、６３５．３ｍ／ｚ、６４７．  ｍ／ｚ及び７０６．４ｍ／ｚ）が、ＴＦＸでは８個の非修飾ペプチド由来のＭＳ３スペクトラム（３１８．１ｍ／ｚ、４６５．２ｍ／ｚ、６９５．３ｍ／ｚ、７０８．３ｍ／ｚ、８０７．４ｍ／ｚ、９５４．５ｍ／ｚ、１１４０．５ｍ／ｚ及び１４８１．７ｍ／ｚ）がそれぞれ得られた。ＥＳＳＸ及びＴＦＸのＭＳ３スペクトラムを図５及び図６にそれぞれ示した（何れも下線を付した部分が非修飾フラグメンとして同定された配列である）。
【００４９】
これにより、図７及び下記に示すとおり、ＥＳＳＸ及びＴＦＸの配列、修飾部位及び修飾部の分子量がそれぞれ同定できた。
【００５０】
（１）ＥＳＳＸ
配列ＥＳＳＳＨＨＰ＊ＧＩＡＥＦＰＳＲ
修飾部位  Ｐ＊
修飾部の分子量  １６Ｄａ
【００５１】
（２）ＴＦＸ
配列ＴＦＰ＊ＧＦＦＳＰＭＬＧＥＦＶＳＥＴＥＳＲ  
修飾部位  Ｐ＊
修飾部の分子量  １６Ｄａ
【産業上の利用可能性】
【００５２】
上述したように、本発明のタンパク質の同定方法は、被検タンパク質に対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた多段階タンデムマスを行うことにより、既知のタンパク質配列のデータベースを利用して、未知の修飾構造を有するタンパク質の構造を容易に決定することができる。
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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