(57)【要約】      （修正有）【課題】二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法の提供。【解決手段】１．選択した複数の形質について、形質ごとにＤＮＡプール（第一段階プール）を作成し、２．これを試料として形質ごとに特異的なＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成し、３．高速シークエンサーによってＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後に、塩基配列の類似性に基づき、その由来するＤＮＡプール（第一段階プール）とターゲット塩基配列を特定する二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の１）〜６）の工程を含む、二段階プール法による形質関連塩基配列の性質を探索する方法、
１）形質ごとに関連する候補遺伝子リストを作成する工程、
２）上記１）の候補遺伝子リストに挙げられた候補遺伝子について、形質ごとに特異的な排他的ＰＣＲプライマーペアセットを作成する工程、
３）同一形質・同一表現型を有する複数の個体由来のＤＮＡからなるＤＮＡプール（第一段階プール）を作成する工程、
４）上記３）で作成したＤＮＡプールを試料として、上記２）で作成した排他的ＰＣＲプライマーペアセットを用いてＰＣＲを行い、候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅して得たＤＮＡ断片を、同一形質の異なった表現型に由来するＤＮＡ断片を混合しないというルールに従って混合し、ＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成する工程、
５）上記４）において作成したＤＮＡ断片プールを試料として、高速シークエンサーにかけ、塩基配列決定を行う工程、
６）上記５）において決定された塩基配列について、上記２）で作成した排他的ＰＣＲプライマーペアセットによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅして、決定された塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを調べ、各形質における形質関連塩基配列の性質を探索する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法に関する。さらに詳しくは、１．選択した複数の形質について一つの形質の一つの表現型ごとにＤＮＡプール（第一段階プール）を作成し、２．これを試料としてＰＣＲにより、形質ごとに特異的なＤＮＡ断片を得た上で、複数の形質の表現型に由来するＤＮＡ断片を混合したＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成し、３．高速シークエンサーによってＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後に、塩基配列の類似性に基づき、その由来するＤＮＡプール（第一段階プール）とターゲット塩基配列を特定することによる二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの塩基配列は約３ギガあることが知られており、この全塩基配列の決定のために、従来、年単位での解析事業が行われてきた。しかし、近年、高速シークエンサー（次世代シークエンサー、高速並列シークエンサー、ギガシークエンサーなどとも呼ばれる）の開発が進み、高速シークエンサーであれば、１週間以内にヒトゲノムの全塩基配列決定が可能となる等、以前より高速にＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となってきた。高速シークエンサーについての技術革新は日進月歩で行われており、塩基配列決定速度はさらに速くなることが期待されており、１週間に１テラ（１０の１２乗）の塩基配列決定も夢ではないといわれている。
【０００３】
しかし、これらの塩基配列決定機の用途には課題が多く、少数の人間の全ゲノムを決定しても、それだけでは有用な遺伝子が見出される可能性は低い。それは、約千塩基に一つのＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が見られる等、個人間のゲノムの塩基配列は極めて多様であり、この違いが表現型の違いに関連しているか否かを決めることが難しいためである。例えば、３ギガのゲノムの塩基配列の中に約３００万個の塩基配列の違いがあるとき、そのどれが表現型と関連するかを決定することは困難を極めた作業になる。
従って、ゲノムの塩基配列から特定の形質に関連する遺伝子を特定するためには多数の患者と対照者（コントロール）のゲノムの塩基配列を比較する必要があるが、この多数の個人の全ゲノム塩基配列を決定するためには、現在のシステムでは膨大な時間と資金が必要であるという問題がある。そこで、より効率的に表現型に関連する関連遺伝子の塩基配列の性質が探索できる方法の提供が望まれている。
【０００４】
表現型に関する関連遺伝子の塩基配列の性質を探索できる方法として、化学物質等で変異を加えたトマトについて、ＤＮＡプールを作成し、これを試料として標的配列を増幅させ、増幅産物のライブラリーを作成した後、シークエンシングを使用してヌクレオチド配列を決定することで、変異させた集団における標的配列中の変異を検出する方法が開発されている。しかし、この方法は、変異を加えるという点から、ヒト以外を対象とするものであり、また、複数の変異を形質として、各ＤＮＡプールから増幅されたＤＮＡ断片を混合して異なった形質を含むＤＮＡ断片プールを作成するという発想はなく、効率的に表現型に関連する関連遺伝子の塩基配列の性質が探索できる方法であるとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５０９５２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、１．選択した複数の形質について、一つの形質の一つの表現型ごとにＤＮＡプール（第一段階プール）を作成し、２．これを試料としてＰＣＲにより、形質ごとに特異的なＤＮＡ断片を得た上で、複数の形質の表現型に由来するＤＮＡ断片を混合しＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成し、３．高速シークエンサーによってＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後に、決定した塩基配列の類似性に基づき、その由来するＤＮＡプール（第一段階プール）とターゲット塩基配列を特定することにより、効率的に表現型に関連する関連遺伝子の塩基配列が探索できることを見出し、本発明を完成するに至った。表現型に関連する関連遺伝子や、その塩基配列は複数存在するため、それぞれの塩基配列をまとめることで、本発明の方法により、形質関連塩基配列の性質を探索することができる。
【０００８】
本発明の探索法は、第一に、ＤＮＡプール（第一段階プール）の作成によって、同一形質の同一表現型を持った複数の個体のＤＮＡを混合する。第二に、混合したＤＮＡプール（第一段階プール）を試料として、この形質に特異的な複数のＰＣＲプライマーペアを用いてＰＣＲを行うことで、この形質に特異的な複数のＤＮＡ断片を作成し、さらにそれとは異なる様々な形質についても特異的な複数のＤＮＡ断片を作成し、これらのＤＮＡ断片を一定のルールの下に混合することで、ＤＮＡ断片のプール（第二段階プール）を作成する。そして、このＤＮＡ断片プールについて、高速シークエンサーを用いＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後に、決定した塩基配列の類似性に基づき、その由来するＤＮＡプールとターゲット塩基配列を特定することで、迅速に特定のＤＮＡプールに由来するターゲット塩基配列を決定することを可能にする方法である。
ＤＮＡ断片プール（第二段階プール）は、同一形質の異なった表現型のＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を混合しないという条件に従えば、複数の形質の表現型のＤＮＡプールから、形質ごとに特異的なＰＣＲプライマーペアを用いてＰＣＲを行い、形質ごとに増幅されたＤＮＡ断片を混合した、形質混合ＤＮＡ断片プールとすることもできる。そして、この形質混合ＤＮＡ断片プールを用いることにより、さらに各形質の、各ＤＮＡプールとターゲット塩基配列に特有な塩基配列の特定を迅速化することができる。
【０００９】
すなわち、本発明は次の二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法に関する。
（１）次の１）〜６）の工程を含む、二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法、
１）形質ごとに関連する候補遺伝子リストを作成する工程、
２）上記１）の候補遺伝子リストに挙げられた候補遺伝子について、形質ごとに特異的な排他的ＰＣＲプライマーペアセットを作成する工程、
３）同一形質・同一表現型を有する複数の個体由来のＤＮＡからなるＤＮＡプール（第一段階プール）を作成する工程、
４）上記３）で作成したＤＮＡプールを試料として、上記２）で作成した排他的ＰＣＲプライマーペアセットを用いてＰＣＲを行い、候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅し、同一形質の異なった表現型に由来するＤＮＡ断片を混合しないというルールに従ってＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成する工程、
５）上記４）において作成したＤＮＡ断片プールを試料として、高速シークエンサーにかけ、塩基配列決定を行う工程、
６）上記５）において決定された塩基配列について、上記２）で作成した排他的ＰＣＲプライマーペアセットによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、決定された塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを調べ、さらに高速シークエンサーにかけて得られた、同一形質の複数の表現型由来の塩基配列を比較することにより、各形質における形質関連塩基配列の性質を探索する工程。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法により、複数の形質において、各形質に関連する塩基配列や、その由来するＤＮＡプールを迅速に特定することができることから、遺伝的関連研究の効率化に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法および試験例の概要を示した図である（実施例、試験例）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法」とは、例えば、肺癌、肝臓癌、大腸癌、糖尿病、高血圧、薬物Ａに対する反応性などの様々な形質の異なった表現型間で異なる遺伝子の塩基配列を「形質関連塩基配列」として１つ以上見出し、その性質を探索することをいう。
【００１３】
本発明の「二段階プール法」とは、ある形質において、同一形質・同一表現型を有する複数の個体由来のＤＮＡからなるＤＮＡプールを第一段階プールとして作成し、さらに、このＤＮＡプールを試料として、候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅し、得られた複数の形質に由来するＤＮＡ断片を混合したＤＮＡ断片プールを第二段階プールとして作成する方法のことをいう。
第一段階のＤＮＡプールでは、同一形質・同一表現型の複数の個人のＤＮＡのみを混合してＤＮＡプールを作成する。また、第二段階のＤＮＡ断片プールでは、「同一形質の異なった表現型に由来するＤＮＡ断片を混合しない」というルールに従いさえすれば、複数のＤＮＡプールに由来するＤＮＡ断片を混合して作成することもできる。
【００１４】
本発明の「二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法」において、対象とする「形質」には、上記のような様々な疾患や、薬物に対する反応性等が挙げられる。
一つの「形質」は複数の互いに排他の「表現型」の集合である。「表現型」とは、個体の特徴のことをいい、「特定の疾患（例えば、糖尿病）の有無」という形質においては、「疾患（例えば、糖尿病）で有る」、「疾患（例えば、糖尿病）で無い」という個体の特徴が、「表現型」としてそれぞれ挙げられる。血液型が「Ａ型である」、「Ｂ型である」、「ＡＢ型である」、または「Ｏ型である」などの場合や「Ｄという薬が効く」、「効かない」、「副作用が出る」、「出ない」、なども「表現型」のひとつとして挙げられる。即ち、複数で有限数のカテゴリーに、個体をその特徴により分類できる場合、一つのカテゴリーを表現型とする。
本発明においては、量的形質ではなく、質的形質を取り扱うことが好ましく、また量的表現型より、質的表現型を取り扱うことが好ましい。
【００１５】
本発明の「二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法」は、本発明の二段階プール法を用い、形質または形質と表現型の組み合わせにおける形質関連塩基配列の性質が探索できる方法であればいずれの方法を用いても良いが、例えば、次のような工程１〜６を経ることで行うことができる。
工程１：形質ごとに関連する候補遺伝子リストを作成する工程、
工程２：候補遺伝子リストに挙げられた候補遺伝子について、形質ごとに特異的な排他的ＰＣＲプライマーペアセットを作成する工程、
工程３：同一形質・同一表現型を有する複数の個体由来のＤＮＡからなるＤＮＡプール（第一段階プール）を作成する工程、
工程４：ＤＮＡプールを試料として、排他的ＰＣＲプライマーペアセットを用いてＰＣＲを行い、候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅し、同一形質の異なった表現型に由来するＤＮＡ断片を混合しないというルールに従ってＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成する工程、
工程５：ＤＮＡ断片プールを試料として、高速シークエンサーにかけ、塩基配列決定を行う工程、
工程６：決定された塩基配列について、排他的ＰＣＲプライマーペアセットによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、決定された塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを調べ、各形質における形質関連塩基配列の性質を探索する工程。
【００１６】
この「二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法」の各工程には、さらに、工程６において、決定された塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを調べた後、さらに、同様に得られた同一形質の複数の表現型由来の塩基配列を比較することにより、各形質における形質関連塩基配列の性質を探索してもよい。
【００１７】
このうち、工程１は「工程１．候補遺伝子リストの作成」として、例えば、肺癌、糖尿病、高血圧、薬物Ａに対する反応性などの様々な形質のうち、複数の形質を選択し、形質ごとに関連する候補遺伝子をリストアップして、候補遺伝子リストを作成することをいう。
【００１８】
工程２は、「工程２．プライマーペアセットの作成」として、工程１で選択した複数の形質のうち、ある形質のある候補遺伝子について、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ｅｘｏｎ−ｉｎｔｒｏｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ｅｘｏｎ、３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎなど、塩基配列の変化が形質に直接関連する可能性がある塩基配列を増幅するＰＣＲのプライマーペアを設定することをいう。
プライマーペアセットの作成ルールとしては、１）ある形質について、工程１で作成した候補遺伝子リストに挙げられているすべての候補遺伝子について、ＰＣＲのプライマーペアを作成し、これらを全て含む集合を、その形質のＰＣＲプライマーペアセットとし、２）異なった形質のＰＣＲプライマーペアセットは互いに排他となるように作成する（排他的ＰＣＲプライマーペアセット）。これによって、形質ごとにプライマーペアにより増幅される領域が異なり、塩基配列が異なることになる。
さらに、プライマーペアセットの作成ルールとして、３）上記１）、２）に加え、排他的ＰＣＲプライマーペアセットをいくつかのサブセットに分割してもよい。これは、プライマーペアによってＰＣＲの温度条件などが異なる場合において、同一条件のプライマーペアを同じサブセットに入れることで、ＰＣＲ効率をあげることが可能となるためである。
【００１９】
工程３は「工程３．ＤＮＡプールの作成」として、工程１で選択した複数の形質のうち、形質ごとに、同一形質・同一表現型の複数の個体のＤＮＡを集め、ＤＮＡプール（第一段階プール）を作成することをいう。
このＤＮＡプールの作成においては、各個人のＤＮＡの濃度を測定した後に、ＤＮＡが同じ量等になるように混合することが好ましいが、混合比は必ずしも１：１に限定されない。また、同一形質・同一表現型については、それに属する全ての個体のＤＮＡを混合することもあるが、いくつかのサブセットに分割して混合してもよい。
【００２０】
工程４は「工程４．ＤＮＡ断片プールの作成」として、工程３で作成したＤＮＡプールを試料として、工程２で作成した排他的ＰＣＲプライマーペアを用いてＰＣＲを行い、増幅した候補遺伝子のＤＮＡ断片について、ＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成することをいう。
ＤＮＡ断片プールの作成にあたっては、同一形質の異なる表現型のＤＮＡプールに由来するＤＮＡ断片を混合しないことが重要である。同一形質の異なった表現型のＤＮＡプールに由来するＤＮＡ断片を混合した場合、ゲノム塩基配列がどのＤＮＡプールに由来するかを特定することが不可能になるからである。
一方で、異なった形質のＤＮＡプールに由来するＤＮＡ断片は混合しても良い。これは、形質ごとに排他的ＰＣＲプライマーペアセットによって増幅される候補遺伝子のターゲット塩基配列が異なるため、形質ごとに異なったＤＮＡ断片が得られることになり、これらのＤＮＡ断片を混合したところで、由来する個体の形質について混同する可能性がないためである。
このＤＮＡ断片プールの作成においては、増幅されたＤＮＡ断片の混合比率は特に限定されないが、一個人由来のＤＮＡ断片すべてが等モル濃度になるように混合することが好ましい。
【００２１】
このＤＮＡ断片プールの作成において、候補遺伝子のターゲット塩基配列の増幅のために行うＰＣＲは、一つのプライマーペアセットごとに行う以外に、それぞれのＰＣＲプライマーペアごとに別々に行った後に生成されたＤＮＡ断片を混合しても良い。この混合する前に何らかの方法でＤＮＡ断片を精製することも可能である。一つのプライマーペアセットは複数のプライマーペアを含むのでこれを用いてＰＣＲを同じ溶液で行えば複数の断片を同じ溶液の中で同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲということになる。ＰＣＲによって増幅された候補遺伝子のターゲット塩基配列は、増幅されたか否かを電気泳動などで確認することができる。
【００２２】
工程５は「工程５．シークエンス」として、工程４において作成したＤＮＡ断片プールを試料として高速シークエンサーにかけ、塩基配列決定を行うことをいう。
このシークエンスには、ロッシュ社製の４５４、ＡＢＩ社製のＳｏｌｉｄ、イルミナ社製のＧｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｚｅｒなどを使用することができるが、これに限定されない。シークエンサーによる塩基配列決定の前に、高速シークエンサーのシステムに合わせてＤＮＡ断片を精製したり、ＤＮＡ断片をさらに断片化したり、アダプター配列やｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを結合したりすることが好ましい。
【００２３】
工程６は「工程６．形質関連塩基配列の性質の探索」として、工程５において決定された塩基配列（決定塩基配列）について、工程２において設定した排他的プライマーペアセットによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、塩基配列の類似性により、由来するＤＮＡプール、ひいてはそれに関連する形質を特定することをいう。
そして、さらに同様の工程によって得られた同一形質の複数の表現型由来の塩基配列を比較することにより、同一の形質における各表現型に特徴的な塩基配列の性質をそれぞれ特定することをいう。
【００２４】
本発明の「二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法」は、コンピュータを用いて行うことができ、コンピュータ上でのシミュレートによっても行うことができる。
この場合、工程１には、選択した複数の形質に対し、形質ごとに関連する候補遺伝子自体や、その遺伝子の染色体の位置、塩基配列等の情報を入力する工程や、入力した情報をリスト化する工程も含むことができる。
工程２には、工程１で選択した複数の形質のうち、ある形質のある候補遺伝子について、その候補遺伝子の塩基配列の情報から、塩基配列の変化が形質に直接関連する可能性がある塩基配列を増幅するＰＣＲのプライマーペアをＰｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎ  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ  （Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  および  ハワード・ヒューズ医学研究所）等のソフトウェエアを用いてコンピュータ上で設定する工程も含むことができる。
工程３には、工程１で選択した複数の形質のうち、形質ごとに集めた同一形質・同一表現型の複数の個体のＤＮＡの情報をコンピュータに入力し、ＤＮＡプール（第一段階プール）としてプール化する工程も含むことができる。
【００２５】
工程５には、工程４において作成したＤＮＡ断片プールを高速シークエンサーにかけた場合に、シークエンサーから得られる塩基配列の情報をコンピュータ上で予測する工程も含むことができる。シークエンサーから得られる塩基配列のほとんどは、設定されたプライマーペアによって増幅される塩基配列であると考えられるが、プライマーペアの塩基配列情報を用いてホモロギー検索により全ゲノムから探すことも可能である。
さらに、工程６には、工程５において予測された塩基配列について、工程２において設定した排他的プライマーペアセットによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、決定された塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを調べ、これらの塩基配列が対応する形質塩基配列の類似性により、由来するＤＮＡプール、ひいてはそれに関連する形質をコンピュータ上で特定する工程も含むことができる。
【００２６】
このような工程を経て行われる、本発明の「二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法」の原理は次のようなものである。
即ち、
１．高速シークエンサーは一分子のＤＮＡ塩基配列を読むことから、複数の形質について形質関連塩基配列を混合しても一つ一つ塩基配列を読む、
２．各形質に互いに排他のプライマリーペアセットを用いることにより、塩基配列が由来したＤＮＡプールに関係する形質を特定できる、
３．極めて低頻度で存在するプライマーペアセットのターゲットとなっていない望まない塩基配列についても最終的にＤＮＡ断片プールの中に存在すると思われるが、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡに比較すると無視できるほど少ないと考えられる、  
従って、
４．「同一形質の異なった表現型に由来するＤＮＡ断片を混合しない」というルールを守りさえすれば、同一形質における表現型の異なる個体由来の塩基配列を混同することはない。  
【００２７】
本発明のこの原理によって、次の様な利点が生じると考えられる。即ち、高速シークエンサーは膨大な塩基配列情報を同時に読むことができるので、数多くの形質の注目する塩基配列の解析を速く、低価格で行うことができる。
また、増幅されたＤＮＡ断片の濃度にはばらつきがあるが、試料となるＤＮＡプール（第一段階プール）を作成するときに同一の割合で混合されるように注意すれば、最終的に得られた塩基配列が特定の個体に由来する確率は、同じＤＮＡプールの個体の間でほぼ同一と考えられる等である。
【００２８】
以下、試験例、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
＜二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法＞
本発明の二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法は、次の１．〜６．の工程によって行うことができる。これらの工程によって、同一形質の異なった表現型について形質関連塩基配列を得て、表現型ごとの形質関連塩基配列を比較することにより、各表現型に特徴的な形質関連塩基配列の性質を特定することができる。
【００３０】
工程１．候補遺伝子リストの作成
複数の形質を選択し、それぞれの形質に関連する候補遺伝子をリストアップして、候補遺伝子リストを作成する。
【００３１】
工程２．プライマーペアセットの作成
工程１で選択した複数の形質のうち、ある形質のある候補遺伝子について、塩基配列の変化が形質に直接関連する可能性がある塩基配列を増幅する、排他的なＰＣＲのプライマーペアを設定する。
【００３２】
＜プライマーペアセットの作成ルール＞
１）ある形質について、工程１で作成した候補遺伝子リストに挙げられているすべての候補遺伝子について、ＰＣＲのプライマーペアを作成し、これらを全て含む集合を、その形質のＰＣＲプライマーペアセットとする。
２）ＰＣＲプライマーペアセットは形質とは異なる他の形質のＰＣＲプライマーペアセットとは排他となるように作成する（排他的ＰＣＲプライマーペアセット）。これによって、形質ごとにプライマーペアにより増幅される領域が異なり、同じ塩基配列を持たないことになる。
３）さらに、上記１）、２）に加え、排他的ＰＣＲプライマーペアセットをいくつかのサブセットに分割してもよい。サブセットは一つのプライマーペアしか含まなくても良い。
【００３３】
工程３．ＤＮＡプールの作成
工程１で選択した複数の形質のうち、同一形質の同一表現型（例：形質（Ａ）の表現型（ａ））の複数の個体のＤＮＡを集め、ＤＮＡプール（第一段階プール）を作成する。
【００３４】
工程４．ＤＮＡ断片プールの作成
工程３で作成したＤＮＡプールを試料として、工程２で作成した排他的ＰＣＲプライマーペアを用いてＰＣＲを行い、候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅する。
ＰＣＲが終了した後、目的とするＤＮＡ断片の精製を行い、ＤＮＡ濃度を測定する。増幅・精製されたＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＡ断片プール（第二段階プール）を作成する。ＤＮＡ断片が等モル濃度になるように混合することが望ましい。
【００３５】
＜ＤＮＡ断片プールの作成ルール＞
「同一形質の異なった表現型に由来するＤＮＡ断片を混合してはならない。」このルールが満足される限り、異なった形質のＤＮＡプールに由来するどのようなＤＮＡ断片、あるいはＤＮＡ断片のプールを混合しても良い。
【００３６】
工程５．シークエンス
工程４において作成したＤＮＡ断片プールを試料として高速シークエンサーにかけ、塩基配列決定を行う。
【００３７】
工程６．形質関連塩基配列の性質の探索
工程５において決定された塩基配列について、設定したプライマーペアによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、決定された塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを調べる。類似塩基配列の定義は、塩基配列が９０％以上一致しているなどの基準を定めることができるが、この基準にはとらわれない。
一つのターゲット塩基配列は特定の形質に対応するため、そのターゲット塩基配列と照合することにより、決定された塩基配列に由来する形質が特定できる。これによって、一つの形質の一つの表現型を保有する個体のＤＮＡプールに由来する塩基配列を得ることができる。
【００３８】
さらに、同一の形質において異なった表現型（例：形質（Ａ）の表現型（ｂ））がある場合には、工程４〜６を繰り返すことで、同一の形質の異なった表現型について形質関連塩基配列を得ることができる。これらの各表現型の形質関連塩基配列を比較することにより、同一の形質における各表現型に特徴的な形質関連塩基配列の性質をそれぞれ特定することができる。
本発明の二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法および試験例の概要を図１に示した。
【００３９】
［試験例］
以下の工程について、コンピュータシミュレーションと公知の事実を用い、本発明の実現性の検証を行った。
工程１．候補遺伝子リストの作成
３つの異なった疾患（疾患Ａ：肺癌、疾患Ｂ：大腸癌、疾患Ｃ：肝癌）をそれぞれ形質として選択した。この場合、例えば「肺癌」が一つの形質となり、「肺癌である」と、「肺癌でない」がこの形質の２つの表現型ということになる。次に、それぞれの形質ごとに候補遺伝子をリストアップして、候補遺伝子リストを作成した。これらの３つの形質の候補遺伝子は重なりがないという必要条件を満たしていた。選択した形質および候補遺伝子を表１に示した。
【００４０】
【表１】
2011092053.tif 000002
【００４１】
工程２．プライマーペアセットの作成
実施例１のプライマーペアセットの作成ルールに従い、各形質の各候補遺伝子に対し、ＰＣＲのプライマーペアセットを作成した。表２〜４に各候補遺伝子の情報および該遺伝子に関するプライマーペアセットを示した。各候補遺伝子のターゲット塩基配列はＵｎｉＳＴＳ（ユニークなｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｔｅｓ  （ＳＴＳｓ））の各ＩＤ（ＵｎｉＳＴＳ＿ＩＤ）によって示され、インターネットのＮＣＢＩサイト、ＮＣＢＩ  ｆｔｐサイト内にある、ｈｕｍａｎ．ｓｔｓ  というファイル内の塩基配列の情報より得ることができる（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ＵｎｉＳＴＳ／ ）。
表２〜４における「開始位置」および「終止位置」は染色体上の位置を示している。この情報は、ＮＣＢＩ  ｆｔｐサイト内にある、ｓｅｑ＿ｓｔｓ．ｍｄというファイル内より情報を得ることができる（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｍａｐｖｉｅｗ ）。また、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｙｍｂｏｌはＵｎｉＳＴＳを増幅するためのプライマーペアの名称を示し、同じインターネットサイトより得られる。
疾患Ａ（肺癌）の候補遺伝子（３１個）に関するプライマーペアセットの配列番号を表２に、疾患Ｂ（大腸癌）の候補遺伝子（３９個）に関するプライマーペアセットの配列番号を表３（表３−１、３−２）に、疾患Ｃ（肝癌）の候補遺伝子（６０個）に関するプライマーペアセットの配列番号を表４（表４−１、４−２）に示した。
【００４２】
【表２】
2011092053.tif 000003
【００４３】
【表３−１】
2011092053.tif 000004
【表３−２】
2011092053.tif 000005
【００４４】
【表４−１】
2011092053.tif 000006
【表４−２】
2011092053.tif 000007
【００４５】
工程３．ＤＮＡプールの作成
疾患Ａ（肺癌）、疾患Ｂ（大腸癌）、疾患Ｃ（肝癌）について、それぞれ、患者（３０人）のＤＮＡの塩基配列の、それぞれ疾患Ａ、Ｂ、Ｃに対応するプライマーペアセットで増幅される部分を、ＨａｐＭａｐ日本人のＳＮＰ情報にあるアレル頻度情報を閾値として使用し、乱数を発生させて閾値を‘越えた／越えていない’とすることで  ＳＮＰ  の塩基を決定してシミュレートし、疾患Ａ、Ｂ、ＣのそれぞれについてＤＮＡプールを作成した。
【００４６】
工程４．ＤＮＡ断片プールの作成
工程３で作成した各疾患の患者のＤＮＡプール（３０人分）を試料として、工程２で作成した各疾患のＰＣＲプライマーペアを用いてＰＣＲ反応を行い、疾患Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれについて候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、疾患Ａ、Ｂ、Ｃの患者について増幅したＤＮＡ断片をすべて混合し、患者のＤＮＡ断片プールを作成する。
シミュレーションではＤＮＡ断片の塩基配列をプールし、ＤＮＡ断片プールを作成した。
【００４７】
工程５．シークエンス
工程４において作成した患者のＤＮＡ断片プールを試料として高速シークエンサーにかけ、塩基配列決定を行うことにより患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列を得る。
シミュレーションではタイピングのエラーを１０−５して患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列をシミュレートした。その結果の一例を表５に示した。表５のＥＸ＿ＩＤとは、患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列として、高速シークエンサーが出力する約５０塩基の塩基配列のＩＤをそれぞれ示したものである。全結果をファイルし、約５６ギガｂｐ（プリントすると３万７０００ページになる）のデータを得たが、全結果の塩基配列を示すのは困難なので、以下にその最初の一部を示した。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
工程６．形質関連塩基配列の性質の探索
工程５においてシミュレートされた患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列について、表２〜５において設定したプライマーペアによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、各決定塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを、ＢＬＡＳＴソフトウェア（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いたホモロジー検索により調べた。
表６（表６−１〜６−３）にｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）した各候補遺伝子のターゲット塩基配列の配列番号（具体的な塩基配列は配列表に示した）およびこの候補遺伝子に関連する形質を示した。
【００５０】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【００５１】
工程５においてシミュレートされた患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列と、各候補遺伝子のターゲット塩基配列とのホモロジー検索の結果と、表６の各候補遺伝子に関連する疾患の情報を照合し、患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列が由来する各ＤＮＡプールに対応する形質（肺癌：ｌｕｎｇ、肝癌：ｌｉｖｅｒまたは大腸癌：ｃｏｌｏｎ）を記載したファイルを得た。
その結果の一部を表７に示した。（全結果はプリントすると８万７千ページとなり、全表示は不可能であった）。表７の「ＥＸ＿ＩＤ」は、表５で示されたそれぞれの患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列のＩＤを示したものであり、表７の「ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」とは、表６で示された各候補遺伝子のターゲット塩基配列のＵｎｉＳＴＳ  ＩＤを示したものである。「塩基番号」は、各候補遺伝子のターゲット塩基配列のうち、ホモロジー検索を行う開始塩基番号と終了塩基番号を示したものである。
この結果より、例えば、患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列であるＥＸ＿ＩＤ１は候補遺伝子のターゲット塩基配列であるＵｎｉＳＴＳ：１５６２８１、ＵｎｉＳＴＳ：１５６９６７およびＵｎｉＳＴＳ：１５７２６３と９８％の類似率を示したことから、形質として肝癌（ｌｉｖｅｒ）に関連することが示唆された。
なお、一つのＥＸ＿ＩＤが複数の候補遺伝子のターゲット塩基配列に対応するのは、候補遺伝子のターゲット塩基配列が重なっていることによるものであり、問題はない。
【００５２】
【表７】
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【００５３】
工程７．同一の形質の異なった表現型の個体群間の塩基配列の比較
比較のために、疾患Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれに対するコントロール（非患者）の個体（３０人）から得たＤＮＡを集め、３つのＤＮＡプールを作成するシミュレーションを行い、作成したＤＮＡプール（３０人分）の塩基配列をもとに、工程２で作成した、それぞれの形質に特異なＰＣＲプライマーペアを用いてＰＣＲを行い、疾患Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれの候補遺伝子のターゲット塩基配列を増幅する。
このように作成した、疾患Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれのコントロール（非患者）ついてのＤＮＡ断片をすべて混合し、コントロールのＤＮＡ断片プールを作成し、これを試料として高速シークエンサーにかけ、塩基配列を決定し、コントロールのＤＮＡ断片の決定塩基配列を得る。
シミュレーションではタイピングのエラーを１０−５としてコントロールのＤＮＡ断片の決定塩基配列をシミュレートした。
引き続き、このように決定されたコントロールのＤＮＡ断片の決定塩基配列について、表２〜５において設定したプライマーペアによって増幅される可能性のある、すべての候補遺伝子のターゲット塩基配列をｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参照）して、各決定塩基配列がどの候補遺伝子のターゲット塩基配列に類似しているかを、ホモロジー検索により調べた。
コントロールのＤＮＡ断片の決定塩基配列と、各候補遺伝子のターゲット塩基配列とのホモロジー検索の結果と、各候補遺伝子に関連する疾患の情報を照合し、疾患Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれのコントロールに由来する決定塩基配列とした。
しかる後に、このようにして得られた、疾患Ａ，Ｂ，ＣそれぞれのコントロールＤＮＡ断片の決定塩基配列を、工程６で得られた疾患Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれの患者のＤＮＡ断片の決定塩基配列と比較し、その違いの特徴を検索した。
【００５４】
以上の試験では、高速シークエンサーを２回用いて、ＤＮＡ断片試料の塩基配列決定を行っている。しかし、従来の方法では、３つの形質（肺癌、大腸癌、肝癌）に特徴的なゲノムの塩基配列の性質を調べるために、高速シークエンサーを６回用いてＤＮＡ断片試料の塩基配列決定を行う必要がある。即ち、疾患Ａの試料、疾患Ａのコントロールの試料、疾患Ｂの試料、疾患Ｂのコントロールの試料、疾患Ｃの試料、疾患Ｃのコントロールの試料の計６回である。
本発明の方法により、高速シークエンサーの使用回数を従来の方法の３分の１とすることができた。高速シークエンサーの使用は１回につき極めて高価なので大幅に検査費用を節約できたことになる。また、高速シークエンサーの１回の検査には時間もかかるので（約１週間）、本発明の方法により時間も３分の１に節約できることになる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の二段階プール法による形質関連塩基配列の性質の探索法により、複数の形質において、各形質に特異的な形質関連塩基配列や、各形質の各表現型に特異的な形質関連塩基配列を迅速に特定することが可能となることから、数多くの形質において注目する塩基配列の解析を迅速かつ低価格で提供することが可能となる。  
【図１】
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【配列表】
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