(57)【要約】      （修正有）【課題】６ＰＧＬ活性を示す新規で有用なポリペプチドと、その製造手段と、その利用形態を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド。特定のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有し、６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチド。特定の塩基配列を有するポリヌクレオチド。このポリヌクレオチドを導入した形質転換体を利用するポリペプチドの製造方法。このポリペプチドを含有するリン酸化酵素測定用試薬。【選択図】図２
2011092113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有し、６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（１）及び（２）の一方又は双方に該当するポリヌクレオチド。
（１）請求項２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）請求項３に記載のポリヌクレオチドについての相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項７】
前記宿主が大腸菌（E.
coli）である請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載の形質転換体を培養して６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチドを取得するポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
クレアチンキナーゼ測定用試薬又はピルビン酸キナーゼ測定用試薬としての必須成分と共に、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチドを含有するリン酸化酵素測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチド及びその製造と利用に関する。更に詳しくは本発明は、３−カルボキシ−シス，シス−ムコ酸環化酵素（3-Carboxy-cis,cis-muconate cyclase：以下「３−ＣＭＣ」とも呼ぶ）のアミノ酸配列を有するにもかかわらず、機能的には６−ホスホグルコノラクトナーゼ（6-Phosphogluconolactonase：以下「６ＰＧＬ」とも呼ぶ）として作用する新規なポリペプチドと、このポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体による当該ポリペプチドの製造方法と、当該ポリペプチドの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
６ＰＧＬは、エステル結合に作用する加水分解酵素の一種である。より具体的には、国際生化学分子生物学連合（IUBMB）酵素委員会が定めるEC番号3.1.1.31の「6-Phosphogluconolactonase」に分類されるものであって、当該EC番号の定義によれば、６ＰＧＬは、６−ホスホ−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンが分子内加水分解によって６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸になる反応を双方向的に触媒する酵素である。
【０００３】
６ＰＧＬは、例えば、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の測定において非常に有用である。即ち、ＣＫやＰＫはヒト等の筋肉組織や脳に広範囲に存在し、それらの測定は各種の心疾患、筋疾患等の診断にルーチンに利用されている。そして、下記の特許文献１〜３に例示されるように、クレアチンキナーゼ測定用試薬やピルビン酸キナーゼ測定用試薬に６ＰＧＬを含ませると、高濃度にＣＫやＰＫを含む検体を希釈することなく、それらの測定が可能になるという利点が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２５７９０８２号公報  特許文献１は、「安定な６−ホスホグルコノラクトナーゼ、その製造方法および該酵素の使用」に関し、一定の特性を持った６ＰＧＬ（EC 3.1.1.31）の画分と、この画分を使用する、６ＰＧＬに酵素的に変換できる反応相手又はその反応に含まれる酵素の測定方法を開示している。
【０００５】
【特許文献２】特許第３０４５１９０号公報  特許文献２は、クレアチンリン酸、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類、ＳＨ試薬を主要成分とし、かつ６ＰＧＬが含有されているクレアチンキナーゼ測定用試薬を開示している。
【０００６】
【特許文献３】特許第３０４５１９１号公報  特許文献３は、ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類を主要成分とし、かつ６ＰＧＬが含有されているピルビン酸キナーゼ測定用試薬を開示している。  なお、上記した特許文献１〜３では、各発明に係る６ＰＧＬのアミノ酸配列を開示していない。６ＰＧＬのアミノ酸配列の公知例としては、Lactobacillus reuteri DSM20016由来の６ＰＧＬのアミノ酸配列が、「EC番号3.1.1.31」として、下記の周知のデータベースに開示されている。
【０００７】
〔データベース〕
NCBI、BLAST検索
上記のデータベースに開示された６ＰＧＬのアミノ酸配列を以下の「化１」に示す。この６ＰＧＬを構成するアミノ酸の数は３４２個である。
【０００８】
【化１】
2011092113.tif 000003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、６ＰＧＬは上記のように有益な用途を伴う酵素であるが、上記した特許文献１〜３やデータベースに示されたものも含め、市場に提供されている６ＰＧＬの種類の多様性、提供量の豊富さ等の点で、必ずしも十分であるとは言えない。
【００１０】
そこで本発明は、６ＰＧＬ活性を示す新規で有用なポリペプチドと、その製造手段と、その利用形態とを提供することを、解決すべき技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための第１発明の構成は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１２】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための第２発明の構成は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有し、６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチドである。
【００１３】
この第２発明も含めて、本願明細書で示すアミノ酸／塩基の配列相同性の数字（％）はＩｂｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の配列解析プログラム（名称：ＢｉｏＥｄｉｔ）の配列アライメントプログラムによって計算したものを言う。このプログラムの計算原理は、一般的にはClustalW multiple sequence alignment (interface internal, external
program by Des Higgins et. al.)と呼ばれる方法である。
【００１４】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための第３発明の構成は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドである。なお、配列表の配列番号１に示す塩基配列において、最初に小文字表記で示す「gaattc」の６塩基はEcoRIの認識部位を示し、最後に小文字表記で示す「ggatcc」の６塩基はBamHIの認識部位を示す。
【００１５】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための第４発明の構成は、以下の（１）及び（２）の一方又は双方に該当するポリヌクレオチドである。
【００１６】
（１）第２発明に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
（２）第３発明に記載のポリヌクレオチドについての相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１８】
この第４発明の（２）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、コロニーハイブリダイゼーション法，プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等の適宜なハイブリダイゼーション法において、以下の条件下で一方のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）又は該ポリヌクレオチドの断片に対し他方のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）がハイブリダイズできることを言う。即ち、フィルターに固定化された一方のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの断片に対して、０．７〜１ＭのＮａＣｌの存在下、所定温度（Ｘ°Ｃ）下で他方のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用いてＸ°Ｃの条件下でフィルターを洗浄した場合に、他方のポリヌクレオチドを同定できることを言う。そして上記の「Ｘ°Ｃ」とは、少なくとも５０°Ｃ以上であり、より好ましくは６０°Ｃ以上であり、更に好ましくは６５°Ｃ以上である。
【００１９】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための第５発明の構成は、第３発明又は第４発明に記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターである。
【００２０】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための第６発明の構成は、第５発明に記載の組み換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体である。
【００２１】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための第７発明の構成は、前記第６発明に係る宿主が大腸菌（E. coli）である形質転換体である。
【００２２】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための第８発明の構成は、第６発明又は第７発明に記載の形質転換体を培養して６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチドを取得するポリペプチドの製造方法である。
【００２３】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための第９発明の構成は、クレアチンキナーゼ測定用試薬又はピルビン酸キナーゼ測定用試薬としての必須成分と共に、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチドを含有する、リン酸化酵素測定用試薬である。
【００２４】
この第９発明において「リン酸化酵素測定用試薬」とは、リンを含む基を転移する酵素を測定する試薬であって、より具体的には、クレアチンキナーゼ測定用試薬又はピルビン酸キナーゼ測定用試薬を包含する概念である。又、クレアチンキナーゼ測定用試薬としての必須成分には、クレアチンリン酸、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類、ＳＨ試薬が挙げられる。又、ピルビン酸キナーゼ測定用試薬としての必須成分には、ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰ、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類が挙げられる。
【発明の効果】
【００２５】
第１発明のポリペプチド、即ち配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記「化１」に示す公知６ＰＧＬのアミノ酸配列とは著しく異なる。即ち両者のアミノ酸配列の相同性は約４７％という低い数値に止まる。
【００２６】
加えて第１発明のポリペプチドは、前記のデータベース中において「EC番号5.5.1.5」として開示された３−カルボキシ−シス，シス−ムコ酸環化酵素（3-Carboxy-cis,cis-muconate
cyclase：Leuconostoc citreum
KM20株由来）のアミノ酸配列と実質的に同一と認め得るアミノ酸配列を有している。上記データベースに開示された３ＣＭＣのアミノ酸配列を以下の「化２」に示すが、「化２」のアミノ酸配列と第１発明のポリペプチドのアミノ酸配列との相違点はなく、同一である。
【００２７】
【化２】
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なお、図１において、「Ａ」として６ＰＧＬが関与する触媒反応を示し、「Ｂ」として３ＣＭＣが関与する触媒反応を示す。これらは公知の事項である。
【００２８】
以上のように、第１発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列において公知の６ＰＧＬとは全く異なると共に公知の３ＣＭＣとは実質的に同一であるが、驚いたことに有効な６ＰＧＬ活性を示し、その半面、実施例では述べていないが、３ＣＭＣ活性は示さないことがわかった。即ち、第１発明によって、６ＰＧＬ活性を示す新規かつ有用なポリペプチドが提供される。
【００２９】
又、第２発明によれば、第１発明のポリペプチドと同等の機能を有する、新規かつ有用なポリペプチドが提供される。後述の実施例においては第２発明のポリペプチドの具体例を提示していないが、第１発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対して一部のアミノ酸が置換又は欠失されあるいは付加される変異を導入し、その結果として配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を示す６ＰＧＬ活性ポリペプチドを得ることは、当業者にとってはさして困難なことではない。
【００３０】
第３発明によれば第１発明のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが提供され、第４発明によれば第２発明のポリペプチドをコードする塩基配列あるいは第１発明のポリペプチドと機能同等のポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００３１】
これらのポリヌクレオチドは、例えば本発明のポリペプチドを効率的に生産するための、第５発明に係る組み換えベクターや、ひいては第６発明に係る形質転換体の作製に利用できる。形質転換体の宿主としては、特に大腸菌（E. coli）が好ましい。
【００３２】
第８発明によれば、本発明のポリペプチドを上記の形質転換体を利用して製造するという、新規で効率的なポリペプチド製造方法が提供される。
【００３３】
第９発明によれば、本発明の６ＰＧＬ活性を有するポリペプチドを含んで構成される新規なクレアチンキナーゼ測定用試薬又はピルビン酸キナーゼ測定用試薬であって、高い濃度にＣＫやＰＫを含む検体においても、それを希釈することなくＣＫやＰＫを正確に測定できるリン酸化酵素測定用試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】６ＰＧＬと３ＣＭＣが各々関与する触媒反応を示す。
【図２】実施例におけるプラスミドの構築図を示す。
【図３】実施例におけるＣＫ活性の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
次に、本発明の実施形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００３６】
〔ポリペプチド〕
本発明ポリペプチドの第１のカテゴリーは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このポリペプチドは、公知の６ＰＧＬのアミノ酸配列とは大きく異なり、公知の３ＣＭＣのアミノ酸配列とは実質的に同一のアミノ酸配列を有するにもかかわらず、有効な６ＰＧＬ活性を示し、一方、３ＣＭＣ活性は示さない。
【００３７】
本発明ポリペプチドの第２のカテゴリーは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有し、６ＰＧＬの機能を示すポリペプチドである。上記の配列相同性は、とりわけ８５％以上であることが好ましい。
【００３８】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明ポリヌクレオチドの第１のカテゴリーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、これは前記した第１のカテゴリーに係るポリペプチドをコードしている。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドの第２のカテゴリーは、以下の（１）及び（２）の一方又は双方に該当するポリヌクレオチドである。
【００４０】
（１）前記した第１のカテゴリーに係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００４１】
（２）上記の第１のカテゴリーに係るポリヌクレオチドについての相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、６ＰＧＬの機能を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００４２】
〔組み換えベクター、形質転換体、ポリペプチドの製造方法〕
本発明の組み換えベクターは、本発明に係る前記いずれかのポリヌクレオチド（遺伝子）を含有する。
【００４３】
本発明の形質転換体は、上記の組み換えベクターを宿主に導入してなるものである。宿主の種類は限定されず、バクテリア（Bacteria）、真菌（Eumycetes）、各種の酵母などの単細胞真核生物、又は動物あるいは植物の生細胞を任意に選択できるが、微生物が好ましく、特に大腸菌（E. coli）が好ましい。
【００４４】
本発明に係るポリペプチドの製造方法は、上記の形質転換体を培養して６−ホスホグルコノラクトナーゼの機能を示すポリペプチドを取得するという方法である。
【００４５】
一般的に形質転換体を利用する目的物の生産方法において認められることであるが、本発明のポリペプチドの製造方法においても、導入遺伝子の選択、導入すべき宿主の選択、発現ベクター等の導入手段とそれに適した DNA又はRNA の構築方法の選択、培地もしくはこれに対する添加物の種類や濃度の選択、形質転換体の培養条件あるいは生育条件の選択等の要因が、ポリペプチドの生産量に影響する場合がある。
【００４６】
形質転換体の培養により生産された本発明のポリペプチドは、通常行われる細胞破砕物からの抽出だけでなく、場合によっては適当な抽出溶媒を用いて培養液からも直接に抽出できる。利用する宿主の種類によっては、ポリペプチドの少なくとも一部が宿主細胞内あるいは細胞表面に止まる場合があるが、細胞膜もしくは細胞壁の破壊や、適宜な抽出溶媒による抽出等の公知の各種操作を経て、採取することができる。
【００４７】
本発明においては、少なくとも本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）が宿主細胞に導入される。ここにおいて、「遺伝子を導入する」とは、遺伝子の機能を有するポリヌクレオチドを組換え核酸として宿主細胞に導入する全ての場合を含む。又、「ポリヌクレオチド」とは、１本鎖、２本鎖又は３本鎖のＤＮＡ DNA及び／又はＲＮＡを言い、遺伝子の導入には、組み換えベクターによって導入する場合や、PCR フラグメント等で合成した核酸を用いて相同組換えによって導入する場合が含まれ得る。遺伝子は、より好ましくは、遺伝子の発現を強化する発現ベクターによって導入される。
【００４８】
発現ベクターは、導入しようとする遺伝子を、その発現を強化する種々のDNA 断片又はRNA 断片と融合させたものである。好ましくは、発現ベクターは、遺伝子を恒常的又は誘導的に発現させるための転写プロモーターや、転写ターミネーター、組換え体選抜用マーカー遺伝子、エンハンサーを含み得る。一般的な発現ベクターの構築方法として、例えば、PCR 法等で調製した遺伝子断片を、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方法で発現ベクターに組み込むことができる。大腸菌（E. coli）での発現用の転写プロモーターとして、trp，lac ，trc ，tac 等を用いることができる。
【００４９】
ベクターとしては、限定はされないが、大腸菌（E.
coli）を宿主とする場合に良く利用されるプラスミドpTRP、pSC101、pBR322、pHSG298、pVC18、pVC19、pTrc99A、pMal-c2、pGEX2T、pTV118N、pTV119N等を好ましく使用でき、その他にもS. cerevisiaeを宿主とする場合に良く利用されるpKG1、YEp13、YEp24、YCp50、pRS414、pRS415、pRS404、pAUR101等も利用でき、バシルス・ズブチリス（B. subtilis）を宿主とする場合に良く利用されるプラスミドpUB110、pC194等も利用できる。更に、pBI122、pBI1101その他の各種のものも限定なく使用できる。
【００５０】
遺伝子を宿主細胞に導入するに当たり、種々の態様で宿主に適合した組換え核酸を利用することができる。例えば、大腸菌への外来遺伝子の導入法は、ハナハンの方法等の確立された幾つかの方法を利用できる。酵母への外来遺伝子の導入法は、リチウム法等の確立された幾つかの方法を利用できる。
【００５１】
〔リン酸化酵素測定用試薬〕
本発明のリン酸化酵素測定用試薬は、具体的にはクレアチンキナーゼ（ＣＫ）測定用試薬又はピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）測定用試薬であって、ＣＫ測定用試薬又はＰＫ測定用試薬としての必須成分と共に、本発明に係る前記いずれかのポリペプチドを含有する測定用試薬である。リン酸化酵素測定用試薬には、上記の成分の他にも、緩衝液、賦活剤、防腐剤、安定剤等が含有され得る。
【００５２】
前記したように、ＣＫ測定用試薬としての必須成分には、クレアチンリン酸、ＡＤＰ、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類、ＳＨ試薬が含まれる。ＰＫ測定用試薬としての必須成分には、ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰ、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類が含まれる。
【００５３】
上記の成分の内、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、あるいはグルコース−６−リン酸脱水素酵素としては、それらの給源は限定されず、パン酵母その他の各種微生物由来のものや、動物由来のもの等を任意に選択して使用することができる。
【００５４】
マグネシウム塩類としては、例えば、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等を使用することができる。
【００５５】
ＳＨ試薬としては、ジチオスレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリコール酸、システイン等を使用することができる。
【００５６】
クレアチンリン酸、ＡＤＰ、グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ等は、既存のＣＫ測定用試薬やＰＫ測定用試薬に使用されているものを使用できる。
【００５７】
（ＣＫ測定用試薬の実施形態例）
ヘキソキナーゼ                  ：０．２〜２０ユニット／ｍｌ
グルコース−６−リン酸脱水素酵素：０．２〜２０ユニット／ｍｌ
本発明のポリペプチド            ：０．１〜１５ユニット／ｍｌ
クレアチンリン酸                ：５〜４０ｍＭ
ＡＤＰ                          ：０．２〜１０ｍＭ
ＮＡＤ又はＮＡＤＰ              ：０．２〜１０ｍＭ
グルコース                      ：２〜１００ｍＭ
マグネシウム塩類                ：２〜１５ｍＭ
ＳＨ試薬                        ：２〜５０μＭ
ＥＤＴＡ                        ：０．２〜１０ｍＭ
（ＰＫ測定用試薬の実施形態例）
ヘキソキナーゼ                  ：０．２〜２０ユニット／ｍｌ
グルコース−６−リン酸脱水素酵素：０．２〜２０ユニット／ｍｌ
本発明のポリペプチド            ：０．１〜１５ユニット／ｍｌ
ホスホエノールピルビン酸        ：５〜４０ｍＭ
ＡＤＰ                          ：０．２〜１０ｍＭ
ＮＡＤ又はＮＡＤＰ              ：０．１〜１０ｍＭ
グルコース                      ：２〜１００ｍＭ
マグネシウム塩類                ：２〜１５ｍＭ
ＳＨ試薬                        ：２〜５０μＭ
ＥＤＴＡ                        ：０．２〜１０ｍＭ
【実施例】
【００５８】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。実施例では、本発明に係るポリペプチドを、そのアミノ酸配列に鑑みて「本発明３−ＣＭＣ」と呼ぶ。
【００５９】
〔実施例１：本発明３−ＣＭＣ発現系の構築〕
まず、ロイコノストック・メセンテロイデス属菌由来の本発明３−ＣＭＣを大腸菌で発現させるためにプラスミドを構築し、本発明３−ＣＭＣの遺伝子配列を設計した。
【００６０】
本発明３−ＣＭＣを挿入したプラスミドｐＴＲＰ−３ＣＭＣを、図２に示す構築図にしたがって作製した。まず、ロイコノストック・メセンテロイデス属菌の染色体ＤＮＡを鋳型にして、５’末端側（センスプライマー）及び３’末端側（アンチセンスプライマー）にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を設けた下記に示すプライマーを用いてＰＣＲを行ない、アガロース電気泳動により約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を確認した。ＰＣＲ反応組成は、（５０μＬあたり）１Ｕ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）、１０ｐｇ 鋳型ＤＮＡ、０．３μＭ センスプライマー、０．３μＭ アンチセンスプライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１ｍＭ
ＭｇＳＯ４、１×バッファーにて行なった。ＰＣＲ反応は、９４℃／２分（変性）、５８℃／３０秒（アニーリング）、６８℃／１分３０秒（伸長）を３０サイクル繰り返した。
【００６１】
上記したセンスプライマー（３ＣＭＣ−ＥｃｏＲＩ−ＡＴＧ）の塩基配列を配列表の配列番号３に示し、アンチセンスプライマー（３ＣＭＣ−ＢａｍＨＩ−ＴＡＡ）の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
【００６２】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理を行ない、アガロース電気泳動後、ＧＦＸＴＭ
ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ
Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により回収した。本発明３−ＣＭＣ断片は、ＬｉｇａＦａｓｔＴＭ
Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、予め制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ（２．９ｋｂ）に導入した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、大腸菌組換え体ｐＴＲＰ−３ＣＭＣ／ＪＭ１０９を得た。このロイコノストック・メセンテロイデス属菌由来の本発明３−ＣＭＣの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示し、そのアミノ酸配列をあらためて配列表の配列番号２に示す。
【００６３】
〔実施例２：本発明３−ＣＭＣの大量培養〕
形質転換体の高密度培養によるロイコノストック・メセンテロイデス属菌由来の本発明３−CMCの大量生産（フェドバッチ培養による高密度培養）を以下の方法で実施した。
【００６４】
プラスミドｐＴＲＰ−３ＣＭＣを形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株について、１６Ｌ Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ＳＦ−１１６（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて高密度培養を行なった。温度（３７℃）、ｐＨ（７．２）、撹拌速度（５００ｒｐｍ）、通気量（１５ｍＬ／ｍｉｎ）の培養パラメーターは、ＭＬ−４１００（
Ｍｕｌｔｉ−ｌｏｏｐ ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ）によって制御した。ｐＨの調整は、１０％ アンモニア水を添加して行なった。
【００６５】
一晩前培養した培養液（１６０ｍＬ）を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（８Ｌ）へ植菌して２時間培養を行ない、その後１０時間目まで添加培地を連続的に合計２Ｌ加えながら培養を続けた。
【００６６】
添加培地の組成は以下に示す通りである。グルコース（１０％）、酵母エキス（１５％）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１％）、Ｌ−グルタミン酸（０．７５％）、Ｌ−スレオニン（０．７５％）、Ｌ−チロシン（０．０４％）、Ｌ−ヒスチジン（０．４％）、Ｌ−メチオニン（０．４％）、ｐＨ７．４。
【００６７】
培地の添加は、１００ｍＬ／ｈの速度で開始し、２時間ごとに２００ｍＬ／ｈ、３００ｍＬ／ｈ、４００ｍＬ／ｈの順で増加させて行なった。集菌は、１２時間目に遠心分離（１１，０００ｇ×２０ｍｉｎ）により行なった。菌体の増殖は、培養液の６００ｎｍでの吸光度を測定して調べた。その結果、プラスミドｐＴＲＰ−３ＣＭＣで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株の高密度培養菌体を得ることができた。
【００６８】
発現量を確認するため、得られた湿菌体５ｇを３ｍＬの抽出バッファー（２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ７．５）で懸濁し、超音波破砕後（ＭＩＳＯＮＩＸ社製 ａｓｔｒａｓｏｎ ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＯＴＲ ＸＬ）、遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃ ＢＥＣＫＭＡＮ社製 Ｍｏｄｅｌ Ｊ２−２１
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液中の本発明３−ＣＭＣ発現量は、約３２００Ｕ／ｍｇタンパクであった。
【００６９】
本発明３−ＣＭＣの活性測定は次のような方法で行なった。ＭＥＳバッファー （３０ｍＭ、ｐＨ６．５）、グルコース−６−リン酸（０．２６ｍＭ、ロシュ社製）、ＮＡＤ＋（０．２６ｍＭ、オリエンタル酵母工業社製）から構成される反応液にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（３０Ｕ、オリエンタル酵母工業社製）添加したのち、２５℃で３４０ｎｍの吸光度が変化しなくなるまで反応させる。その後、酵素溶液を添加したのち、３４０ｎｍの吸光度変化を測定し本発明３−ＣＭＣ活性を算出した。また、この反応条件における１分間あたりの１μｍｏｌのＮＡＤＨの生成量を１単位とし、上記酵素活性を本発明３−ＣＭＣ活性とした。
〔実施例３：本発明３−ＣＭＣの精製〕
大量精製を行なうため、得られた湿菌体１７０ｇを２０ｍＭリン酸カリウムバッファーに懸濁したのち、ＤＩＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｔｙｐ  ＫＤＬ）にて菌体破砕を行ない、得られた破砕画分を遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃
ＢＥＣＫＭＡＮ社製 Ｍｏｄｅｌ Ｊ２−２１
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液を用いて以下の方法で精製を行なった。
【００７０】
バッファーＡ（１０ｍＭ リン酸カリウムバッファー
ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−５００（生化学工業株式会社製）に通じ、バッファーＡで洗浄後、０−０．３Ｍ
ＮａＣｌのリニア・グラジエントで目的タンパク質を溶出させた。
【００７１】
活性画分に最終４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、１時間攪拌した後、バッファーＢ（１０ｍＭ
Ｋ−リン酸バッファー ｐＨ７．５、４０％飽和硫酸アンモニウム）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に通じ、バッファーＢで洗浄後、４０−０％ 硫酸アンモニウムのリニア・グラジエントで目的タンパク質を溶出させた。得られた目的画分をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に通じた。最終的に比活性６０００Ｕ／ｍｇタンパクである組換えタンパク質の精製標品を得た。この精製標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢＲ−２５０で染色した結果、約３８，０００のほぼ単一バンドを示した。
〔実施例４：クレアチンキナーゼ測定用試薬における応用評価〕
ＣＫ測定用試薬を以下の方法で調製した。まず、イミダゾールバッファー（ｐＨ  ６．６、１３４ｍＭ）、Ｇ６ＰＤＨ（オリエンタル酵母工業社製、１１８Ｕ／ｍＬ）、ＨＫ（オリエンタル酵母工業社製、２３７Ｕ／ｍＬ）、本発明３−ＣＭＣ（２１Ｕ／ｍＬ）、ＡＤＰ（２．６８ｍＭ）、ＮＡＤＰ（２．６８ｍＭ）、グルコース（２６．８ｍＭ）、酢酸マグネシウム（１３．４ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２．６８ｍＭ）、ＮＡＣ（２６．８ｍＭ）より構成されるＲ１試薬を調製した。さらに、イミダゾールバッファー（ｐＨ６．６、１０ｍＭ）、ＣＰ（１５４ｍＭ）からなるＲ２試薬を調製した（実施例）。また、別にＲ１試薬から本発明３−ＣＭＣを抜いた比較用Ｒ１試薬も調製し、比較例とすることとした。
【００７２】
別に、試料として、大腸菌で組み換えたヒト由来のクレアチンキナーゼである「組換えヒトＣＫ−ＭＭ（オリエンタル酵母工業社製）」を使用した。上記で調製したＲ１試薬、Ｒ２試薬及び比較用Ｒ１試薬を用いて日立自動分析装置７１７０形にてＣＫ活性を測定した。その結果、実施例では１分間当りの吸光度変化量が４，０００Ｕ／Ｌまで直線的に変化しているのに対して、本発明３−ＣＭＣ無添加（比較例）では１，６００Ｕ／Ｌまでしか直線的に変化していないことがわかった（図３参照）。このように、本発明３−ＣＭＣを添加することにより、測定範囲が広がることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により、６ＰＧＬ活性を示す新規で有用なポリペプチドと、その製造手段と、その利用形態とが提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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