(57)【要約】      （修正有）【課題】現在利用可能なＤＮＡ配列決定技術に対して、並行オリゴヌクレオチド伸長によるＤＮＡ配列を決定する方法を提供する。【解決手段】１）ポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列を同定する方法であって、以下の工程：（ａ）開始オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドプローブと該開始オリゴヌクレオチドとを連結することによってポリヌクレオチドに沿って伸長させ、伸長した二重鎖を形成させる工程；（ｂ）該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；および（ｃ）ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、以下の工程：
（ａ）既知配列を有する結合領域及び未知配列を有する標的領域を含む第一のテンプレートポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）テンプレートに沿ったテンプレート依存方法で複数の開始オリゴヌクレオチドを伸長する工程であって、特定の開始オリゴヌクレオチドの伸長方法は、
工程（ａ）で提供される第一のテンプレートポリヌクレオチドと開始オリゴヌクレオチドの配列を含む第二のポリヌクレオチドとの間に二重鎖を形成する工程であって、開始オリゴヌクレオチドは第一のテンプレートポリヌクレオチドの結合領域の一部とハイブリダイズする工程
異なる配列を有する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程
異なるオリゴヌクレオチドプローブの一つを第二のポリヌクレオチドに連結することにより、第二のポリヌクレオチドを伸長し、より長い第二のポリヌクレオチドを作り出す工程であって、連結されたオリゴヌクレオチドプローブは第一のテンプレートポリヌクレオチドの配列に依存し、連結されたオリゴヌクレオチドプローブは提供されるオリゴヌクレオチドプローブ中の別のオリゴヌクレオチドプローブとはさらに連結される能力を有しない、工程
第二のポリヌクレオチドの伸長において連結されたオリゴヌクレオチドプローブに会合した標識を検出する工程であって、標識は連結されたオリゴヌクレオチドプローブの塩基に対応するが、連結されるオリゴヌクレオチドプローブの全配列には対応しない、工程
を含む工程；および
（ｃ）複数の開始オリゴヌクレオチドの伸長の検出の組み合わせに基づいて、未知配列の塩基の連続する配列を決定する工程；
を備える、方法。
【請求項２】
提供されるオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくともいくつかは、少なくとも一つのデオキシイノシン塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
提供されるオリゴヌクレオチドプローブは８ヌクレオチド、９ヌクレオチド及び１２ヌクレオチドから選択される所定の長さである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
連結したオリゴヌクレオチドプローブが連結した末端とは反対側の連結したプローブの末端ヌクレオチドに、標識が結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第一のポリヌクレオチドを増幅して、工程（ｂ）で使用する第一のポリヌクレオチドを作製する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
増幅した第一のポリヌクレオチドは、ビーズに担持された提供された第一のポリヌクレオチドの複数のコピーを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複数の異なる第一のポリヌクレオチドの伸長及び同定工程を並行して複数サイクル行うことに基づいて、異なるポリヌクレオチドの異なる未知配列の塩基の連続する配列を決定する工程をさらに備える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
複数の異なる第一のポリヌクレオチドは、お互いに共通の結合領域における既知配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異なる第一のポリヌクレオチドは、固相支持体に結合している、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定されるポリヌクレオチドにおける各ヌクレオシドの順序を決定することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
開始オリゴヌクレオチドは、少なくとも２０塩基の長さであり、かつ、結合領域は少なくとも２０塩基の長さである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第二のポリヌクレオチドの少なくともいくつかについて、第二のポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドプローブを開始オリゴヌクレオチドに連結することにより形成され、オリゴヌクレオチドプローブはさらなる伸長ができず、オリゴヌクレオチドプローブ上の伸長可能な末端を再生して、工程（ｂ）で提供されるプローブによってさらなる伸長が可能な伸長した二重鎖を形成する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
複数の開始オリゴヌクレオチドは同一の配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
開始オリゴヌクレオチドは、３’から５’方向又は５’から３’方向のいずれかに伸長され得る、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第二のポリヌクレオチドを伸長する工程は、第二のポリヌクレオチドを５’から３’の方向に伸長することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
異なる配列を有する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程は、５０−２５０の異なる配列のオリゴヌクレオチドプローブを同時に提供することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般にポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法に関し、さらに詳しくは、オリゴヌクレオチドブロックの連続的な連結により１つ以上のプライマーを段階的に伸長することによってテンプレートにおけるヌクレオチドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
現在利用可能な技術でのポリヌクレオチドの分析は、試験ポリヌクレオチドが標準または単離されたフラグメントと同一であるかまたは異なるかの確認から、試験ポリヌクレオチドの各ヌクレオチドの明白な同定および順序付けまでの範囲の情報を提供する。このような技術は、遺伝子の機能および制御を理解するのに、および分子生物学の基本的技術の多くを適用するのに非常に重要であるだけでなく、これらはまた、ゲノム解析および非常に多くの非研究的適用（例えば、遺伝的同定、法医学分析、遺伝学カウンセリング、医学診断など）における手段としてますます重要となった。これらの後者の適用において、部分的な配列情報を提供する技術（例えば、フィンガープリント法および配列比較）および完全な配列決定を提供する技術の両方が共に使用されてきた。例えば、Ｇｉｂｂｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：１９１９−１９２３（１９８９）；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：７６５２−７６５６（１９８８）；Ｃａｒｒａｎｏら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：１２９−１３６（１９８９）；Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３５：１５７−１６５（１９９２）；ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｉｖａｋ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：８９０２−８９０６（１９８９）；Ｇｒｅｅｎら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：７７−９０（１９９１）；およびＶｅｒｓａｌｏｖｉｃら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：６８２３−６８３１（１９９１）。
【０００３】
天然のＤＮＡは２つの線状ポリマー、またはヌクレオチドのストランドよりなる。各ストランドは、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオシドの鎖である。２つのストランドは、２つのストランドのヌクレオチドの相補的塩基の間の水素結合によって逆平行向きにまとまっている：デオキシアデノシン（Ａ）はチミジン（Ｔ）と対になり、そしてデオキシグアノシン（Ｇ）は、デオキシシチジン（Ｃ）と対になる。
【０００４】
現在、ＤＮＡ配列決定に対する以下の２つの基本的アプローチがある：ジデキオシチェーンターミネーション法（例えば、Ｓａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５４６３−５４６７（１９７７））；および化学的分解法（例えば、Ｍａｘａｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５６０−５６４（１９７７））。チェーンターミネーション法はいくつかの方法で改良されており、そして全ての現在利用可能な自動ＤＮＡ配列決定機のための基礎として供される。例えば、Ｓａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４３：１６１−１７８（１９８０）；Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２９：１６９−１７２（１９７９）；Ｓｍｉｔｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：２３９９−２４１２（１９８５）；Ｓｍｉｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：６７４−６７９（１９８７）；Ｐｒｏｂｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：３３６−３４１（１９８７）；Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：５１−３３４（１９８７）；Ｃｈｕｒｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１８５−１８８（１９８８）；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：５９−６７（１９９１）；Ｂｅｖａｎら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：２２２−２２８（１９９２）。
【０００５】
チェーンターミネーション法および化学的分解法は、両方とも、１組以上の標識ＤＮＡフラグメントの生成を必要とし、そして各々は共通の起源を有し、各々は既知の塩基で終結する。次いで、１組または複数組のフラグメントは、配列情報を得るために、サイズにより分離されなければならない。両方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によって分離され、この電気泳動は、わずか１ヌクレオチドだけサイズが異なる非常に大きなフラグメントを区別する能力を有しなければならない。残念ながら、この工程は一度に配列決定できるＤＮＡ鎖のサイズを厳しく制限する。これらの技術を用いる配列決定は、約４００〜４５０ヌクレオチドまでのＤＮＡ鎖に信頼性よく適応できる。Ｂａｎｋｉｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：５１−９３（１９８７）；およびＨａｗｋｉｎｓら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３：５５２−５５９（１９９２）。
【０００６】
いくつかの著しい技術的問題が、例えば、５００〜６００ヌクレオチドを超える長い標的ポリヌクレオチドの配列決定、または高容量の多くの標的ポリヌクレオチドの配列決定へのこのような技術の適用をひどく妨げてきた。このような問題としては、ｉ）大きな労働力を要するゲル電気泳動分離工程は、自動化が困難であり、そしてデータの解析に過剰の変動性（例えば、温度の影響によるバンドの広がり、ＤＮＡ配列決定フラグメントにおける二次構造による圧縮、分離ゲルにおける不均一性など）を導入する；ｉｉ）その特性（例えば、進化性、忠実度、重合速度、チェーンターミネーターの取り込み速度など）がしばしば配列依存性である核酸ポリメラーゼ；ｉｉｉ）ゲル中で空間的に重なるバンドに典型的にはｆｍｏｌ量で存在するＤＮＡ配列決定フラグメントの検出および分析；ｉｖ）標識部分が単一の均一相に濃縮されずに数百の空間的に分離されたバンドに分布することによる低シグナル；およびｖ）単一レーン蛍光検出の場合、適切な発光特性および吸収特性、量子収率、およびスペクトル分解性を持つ色素の利用可能性が挙げられる。例えば、Ｔｒａｉｎｏｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：４１８−４２６（１９９０）；Ｃｏｎｎｅｌｌら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５：３４２−３４８（１９８７）；Ｋａｒｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：４９５５−４９６２（１９９１）；Ｆｕｎｇら，米国特許第４，８５５，２２５号；およびＮｉｓｈｉｋａｗａら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１２：６２３−６３１（１９９１）。
【０００７】
もう１つの問題が、診断的配列決定の領域における現在の技術には存在する。常に拡大し続けている多数の障害、障害に対する感受性、疾患状態の予後などは、１つ以上の遺伝子座における、特定のＤＮＡ配列の存在、またはＤＮＡ配列における変化（または変異）の程度に関連付けられてきた。このような現象の例は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピング、膵嚢胞性線維症、腫瘍の進行および不均一性、ｐ５３プロトオンコジーン変異、ｒａｓプロトオンコジーン変異などを含む。例えば、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：９１−９８（１９９１）；Ｓａｎｔａｍａｒｉａら，国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１６７５号；Ｔｓｕｉら，国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ９０／００２６７号など。診断情報または予後情報を得るためのこのような病的状態に関連するＤＮＡ配列の決定における困難は、複数の亜集団のＤＮＡ（例えば、対立遺伝子変異体、多重突然変異体形態など）が頻繁に存在することにある。現在の配列決定技術を用いて複数配列の存在および同一性を区別することは、異なる種類のＤＮＡを単離し、そして恐らくはそれをクローン化するさらなる労力なくしては、実質的に不可能である。
【０００８】
ＤＮＡ配列決定に、ＤＮＡフラグメントの高分解能電気泳動分離を要しないで、より分析しやすいシグナルを生じ、そしてヘテロ接合遺伝子座由来のＤＮＡを容易に分析するための手段を提供する別のアプローチが利用可能になれば、配列決定技術において主要な進歩がなされ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、現在利用可能なＤＮＡ配列決定技術に対してこのような別のアプローチを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によって、以下が提供される：
１）ポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）開始オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドプローブと該開始オリゴヌクレオチドとを連結することによってポリヌクレオチドに沿って伸長させ、伸長した二重鎖を形成させる工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；および
（ｃ）ヌクレオチドの配列が決定されるまで工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
（２）前記オリゴヌクレオチドプローブが前記開始オリゴヌクレオチドに対して遠位の末端に鎖終結部分を有する、請求項１に記載の方法。
（３）前記同定の工程が、前記鎖終結部分を除去する工程、および１つ以上の標識した鎖終結ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼを用いて該オリゴヌクレオチドプローブを伸長させる工程を包含する、請求項２に記載の方法。
（４）前記伸長した二重鎖上に伸長可能な末端を再生する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
（５）前記オリゴヌクレオチドプローブが４つのリボヌクレオチドのサブ配列を包含し、そして前記再生の工程が該オリゴヌクレオチドプローブをＲＮａｓｅ  Ｈを用いて切断する工程を包含する、請求項４に記載の方法。
（６）前記鎖終結部分が３’ホスフェートである、請求項５に記載の方法。
（７）伸長した二重鎖または前記開始オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドプローブに連結できない場合は常に、該伸長した二重鎖または該開始オリゴヌクレオチドにキャップ形成させる工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
（８）前記伸長した二重鎖上に伸長可能な末端を再生する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
（９）前記再生の工程が、前記伸長した二重鎖において化学的に切断可能なヌクレオシド間結合を切断する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
（１０）前記化学的に切断可能なヌクレオシド間結合がホスホルアミデートである、請求項９に記載の方法。
（１１）前記再生の工程が、前記伸長した二重鎖においてヌクレオシド間結合を酵素的に切断する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
（１２）前記オリゴヌクレオチドプローブが４種のリボヌクレオチドのサブ配列を包含し、そして前記再生の工程が該オリゴヌクレオチドプローブをＲＮａｓｅ  Ｈを用いて切断する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
（１３）ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該ポリヌクレオチドを含むテンプレートを提供する工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチドに近接する該テンプレートと二重鎖を形成する開始オリゴヌクレオチドを提供する工程；
（ｃ）該開始オリゴヌクレオチドに近接する該テンプレートにオリゴヌクレオチドプローブをアニールする工程；
（ｄ）該オリゴヌクレオチドプローブを該開始オリゴヌクレオチドに連結させて、伸長した二重鎖を形成させる工程；
（ｅ）該連結されたオリゴヌクレオチドプローブ上の標識によって該ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；および
（ｆ）該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
（１４）前記オリゴヌクレオチドプローブが前記開始オリゴヌクレオチドに対して遠位の末端に鎖終結部分を有し、そして前記方法が該オリゴヌクレオチドプローブ上に伸長可能な末端を再生する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
（１５）前記オリゴヌクレオチドプローブに連結できない前記伸長した二重鎖または前記開始オリゴヌクレオチドにキャップ形成する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
（１６）前記同定の工程が前記ポリヌクレオチドの１つのヌクレオチドを同定することよりなる、請求項１４に記載の方法。
（１７）前記同定の工程が前記鎖終結部分を除去する工程、および１つ以上の標識された鎖終結ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼを用いて前記オリゴヌクレオチドプローブを伸長させる工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
（１８）オリゴヌクレオチドプローブであって、以下の式：
ＨＯ−（３’）（Ｂ）ｊ（５’）−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）ＮＨ−（Ｂ）ｋ−Ｂｔ＊
を有し、ここで：
Ｂはヌクレオシドまたはそのアナログであり；
ｊは１〜１２の範囲であり；
ｋはｊとｋとの合計が１２以下であるように、０〜１２の範囲であり；
Ｂｔ＊は標識された鎖終結部分である、
オリゴヌクレオチドプローブ。
（１９）以下からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブであって：
ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−（５’）（Ｂ）ｓＲＲＲＲ（Ｂ）ｗＢｔ＊、
ＨＯ−（３’）（Ｂ）ｓＲＲＲＲ（Ｂ）ｗＢｔ＊、および
ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−（５’）（Ｂ）ｓＲＲＲＲ（Ｂ）ｗ（３’）ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ
ここで：
Ｂはデオキシリボヌクレオチドまたはそのアナログであり；
Ｒはリボヌクレオチドであり；
ｓは１〜８の範囲であり；
ｗはｊとｋとの合計が８以下であるように０〜８の範囲であり；
Ｂｔ＊は標識された鎖終結部分である、
オリゴヌクレオチドプローブ。
【００１１】
発明の要旨
本発明は、一本鎖テンプレートに沿った二重鎖伸長の繰り返しサイクルに基づく核酸配列分析方法を提供する。好ましくは、このような伸長は、開始オリゴヌクレオチドとテンプレートとの間に形成される二重鎖から出発する。開始オリゴヌクレオチドを、最初の伸長サイクルにおいて、オリゴヌクレオチドプローブをその末端に連結することにより伸長し、伸長した二重鎖を形成させる。次いで、伸長した二重鎖を、その後の連結サイクルによって繰り返し伸長させる。各サイクルの間に、首尾よく連結されたオリゴヌクレオチドプローブ上、またはオリゴヌクレオチドプローブと会合した標識によって、テンプレート中の１つ以上ヌクレオチドの同一性を決定する。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、１回のサイクルで伸長した二重鎖の伸長が１回だけ起こるように、末端の位置にブロッキング部分（例えば、鎖終結ヌクレオチド）を有する。二重鎖を、次のサイクルでブロッキング部分を除去し、そして伸長可能な末端を再生することによってさらに伸長させる。
【００１２】
本発明の１つの局面において、複数の異なる開始オリゴヌクレオチドをテンプレートの別々の試料に提供する。各開始オリゴヌクレオチドは、伸長を受けつつある末端が、複数の他のそれぞれの開始オリゴヌクレオチドと、１つ以上のヌクレオチドと合致しない（ｏｕｔ  ｏｆ  ｒｅｇｉｓｔｅｒ）かまたは一致しないように、テンプレートと二重鎖を形成する。言い換えれば、伸長のための出発ヌクレオチドは、異なる開始オリゴヌクレオチドの各々につき、１つ以上のヌクレオチドにより異なる。このようにして、同一の長さのオリゴヌクレオチドプローブを用いる各伸長サイクルの後、同一の相対的相が異なるテンプレート上の開始オリゴヌクレオチドの末端間に存在する。従って、例えば、ｉ）開始オリゴヌクレオチドが１つのヌクレオチドにより一致しない、ｉｉ）９マーのオリゴヌクレオチドプローブを伸長工程で用いる、およびｉｉｉ）９つの異なる開始オリゴヌクレオチドを使用する好ましい実施態様においては、９つのテンプレートヌクレオチドが各伸長サイクルにおいて同時に同定される。
【００１３】
定義
ポリヌクレオチドに関して本明細書中で使用する「配列決定」、「ヌクレオチド配列の決定」、「配列決定」および同様の用語は、ポリヌクレオチドの部分配列および全長配列の情報の決定を含む。すなわち、この用語は、配列比較、フィンガープリント法、標識ポリヌクレオチドについての同様のレベルの情報、および試験ポリヌクレオチドの各ヌクレオシドの明確な同定および順序付けを含む。
【００１４】
プローブおよび標的ポリヌクレオチドの突出ストランドに関して「完全にマッチした二重鎖」とは、この突出ストランドが、二本鎖構造における各ヌクレオチドが反対のストランド上のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対合をするように、他のものと二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、プローブの縮重を減少させるために使用され得る、ヌクレオシドアナログ（デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対合を包含する。
【００１５】
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む、ヌクレオシドまたはそのアナログの線状オリゴマーを含む。通常、オリゴヌクレオチドは、数個のモノマー単位（例えば３〜４）から数百のモノマー単位までの範囲のサイズである。オリゴヌクレオチドを「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の配列によって表す場合は、常に、このヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であり、そして特記しない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。
【００１６】
本明細書中で使用する「ヌクレオシド」とは、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるように、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシル形態を含む、天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関して「アナログ」とは、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）によって一般的に記載されているように、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。このようなアナログは、結合特性の増強、縮重の減少、特異性の増大などのために設計された合成ヌクレオシドを含む。
【００１７】
本明細書で使用される「連結」とは、テンプレート駆動反応において、２つ以上の核酸（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド）の末端間で共有結合または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を形成することを意味する。結合（ｂｏｎｄ）または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）の性質は広範囲に変化し得るし、そして連結は酵素的または化学的に行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明による複数のテンプレートの並行伸長を模式的に示す。
【図２】図２は、酸不安定結合を使用する本発明の１つの実施態様を模式的に示す。
【図３Ａ】図３Ａは、３’→５’伸長でＲＮａｓｅ  Ｈ不安定オリゴヌクレオチドを使用する本発明の１つの実施態様を模式的に示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、５’→３’伸長でＲＮａｓｅ  Ｈ不安定オリゴヌクレオチドを使用する本発明の１つの実施態様を模式的に示す。
【図４】図４は、連結、その後のポリメラーゼ伸長および切断を使用する本発明の１つの実施態様を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、同様のサイズのＤＮＡフラグメントの電気泳動による分離を不要とし、そしてゲルまたは同様の媒体中のＤＮＡフラグメントの空間的に重なるバンドの検出および分析に関する困難をなくす核酸の配列決定方法を提供する。本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼを用いて長い一本鎖テンプレートからＤＮＡフラグメントを作製する必要もない。
【００２０】
本発明の１つの局面の一般的なスキームを図１に模式的に示す。以下により十分に記載するように、本発明は、この実施態様の特定の特徴によって限定されることを意図しない。配列未知のポリヌクレオチド（５０）および結合領域（４０）を含むテンプレート（２０）を固相支持体（１０）に付着させる。好ましくは、Ｎマーのプローブを使用する実施態様では、テンプレートをＮ個のアリコートに分け、そして各アリコートに、他の開始オリゴヌクレオチドの位置とは異なる結合領域（４０）中のある位置で完全にマッチした二重鎖を形成する異なる開始オリゴヌクレオチドｉｋを提供する。すなわち、開始オリゴヌクレオチドｉ１〜ｉＮは、未知配列に対して近い側の二重鎖の末端が未知配列のはじまりから０〜Ｎ−１ヌクレオチドであるように、結合領域（４０）においてテンプレートと二重鎖の組を形成する。従って、Ｎマーのプローブを用いる連結の第１サイクルにおいて、図１中のｉ１に連結したプローブ（３０）の末端ヌクレオチド（１６）は、結合領域（４０）のＮ−１ヌクレオチドに対して相補的である。同様に、図１中のｉ２に連結したプローブ（３０）の末端ヌクレオチド（１７）は、結合領域（４０）のＮ−２ヌクレオチドに対して相補的であり；図１中のｉ３に連結したプローブ（３０）の末端ヌクレオチド（１８）は、結合領域（４０）のＮ−３ヌクレオチドに対して相補的である。以下同様である。最後に、ｉｎに連結したプローブ（３０）の末端ヌクレオチド（１５）は、未知配列（５０）の最初のヌクレオチドに対して相補的である。連結の第２サイクルにおいて、プローブ（３１）の末端ヌクレオチド（１９）は、開始オリゴヌクレオチドｉ１で出発する二重鎖における未知配列（５０）の２番目のヌクレオチド（１９）に対して相補的である。同様に、開始オリゴヌクレオチドｉ２、ｉ３、ｉ４などで出発する二重鎖に連結したプローブの末端ヌクレオチドは、未知配列（５０）の３番目、４番目、および５番目のヌクレオチドに対して相補的である。
【００２１】
上記の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、伸長した二重鎖に隣接するヌクレオチドの同一性が標識から決定できるように標識される。
【００２２】
結合領域（４０）は既知配列を有するが、長さおよび組成は大いに変化し得る。結合領域は開始オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを適応させるために十分に長くなければならない。異なる結合領域を同一かまたは異なるかのいずれかの開始オリゴヌクレオチドとともに使用できるが、調製の便宜のためには、同一の結合領域および異なる開始オリゴヌクレオチドを提供するのが好ましい。従って、全てのテンプレートを同一に調製し、次いで、異なる開始オリゴヌクレオチドでの使用のためにアリコートに分ける。好ましくは、結合領域は、異なる開始オリゴヌクレオチドの組を適応させるのに十分な長さであるべきであって、各々はテンプレートにハイブリダイズしてその後の連結のための異なる出発点を生じる。最も好ましくは、結合領域は、約２０〜５０ヌクレオチドの間の長さである。
【００２３】
開始オリゴヌクレオチドは、伸長サイクルのいずれの洗浄工程の間にも無傷のままでいる結合領域との高度に安定な二重鎖を形成するように選択される。これは、都合よく、開始オリゴヌクレオチドの長さが、オリゴヌクレオチドプローブの長さよりもかなり長いように選択することによって、および／またはそれらがＧＣリッチとなるように選択することによって達成される。開始オリゴヌクレオチドはまた、種々の技術（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら，米国特許第４，１２３，６１０号）によってテンプレートストランドに架橋することもでき；または、それらは、その天然の対応物（例えば、ペプチド核酸）よりも安定性の大きな二重鎖を形成するヌクレオチドアナログよりなることもできる。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）；Ｈａｎｖｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１４８１−１４８５（１９９２）；およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２１９号および同第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０号。
【００２４】
好ましくは、開始オリゴヌクレオチドの長さは約２０〜３０ヌクレオチドであり、そしてその組成は、使用されるオリゴヌクレオチドプローブの融解温度を約１０〜５０℃だけ超える二重鎖融解温度を提供するために十分なパーセントのＧおよびＣを含む。より好ましくは、開始オリゴヌクレオチドの二重鎖融解温度は、オリゴヌクレオチドプローブの融解温度を約２０〜５０℃だけ超える。配列決定操作で使用される異なる開始オリゴヌクレオチドの数Ｎは、各サイクルで１つのヌクレオチドが同定される場合の１から、実際的に使用できるオリゴヌクレオチドプローブのサイズによってのみサイズが制限される多数まで変化し得る。オリゴヌクレオチドプローブのサイズを制限する因子は、妥当な速度でハイブリダイゼーション反応を駆動するために十分に高濃度の個々のプローブを有する混合物を調製する際の困難、二次構造の形成に対するより長いプローブの感受性、１塩基ミスマッチに対する感受性の低下などを含む。好ましくは、Ｎは１〜１６の範囲であり；より好ましくは、Ｎは１〜１２の範囲であり；そして最も好ましくは、Ｎは１〜８の範囲である。
【００２５】
広範囲の種々のオリゴヌクレオチドプローブを本発明で使用することができる。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、開始オリゴヌクレオチドまたは伸長した二重鎖に連結して、次の伸長サイクルの伸長した二重鎖を生じることができるべきである；連結は、プローブが連結の前にテンプレートと二重鎖を形成するべきであるのでテンプレートに駆動されるべきである；プローブは、１回の伸長サイクルにおいて同一のテンプレートに複数のプローブが連結するのを防ぐためにブロッキング部分を有すべきであり、プローブは連結後に伸長可能な末端を再生するために処理または修飾され得るべきであり、そしてプローブは成功した連結後にテンプレートに関連する配列情報の獲得を可能とするシグナリング部分を有すべきである。以下でより十分に記載するように、実施態様に応じて、伸長した二重鎖または開始オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブによって、５’→３’方向または３’→５’方向のいずれかに伸長され得る。一般に、オリゴヌクレオチドプローブはテンプレートと完全にマッチした二重鎖を形成する必要はないが、このような結合が通常は好ましい。テンプレート中の１つのヌクレオチドが各伸長サイクルで同定される好ましい実施態様において、完全な塩基対合は、その特定のヌクレオチドを同定するために必要とされるに過ぎない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを伸長した二重鎖に酵素的に連結する実施態様において、完全な塩基対合（すなわち、適切なワトソン−クリック塩基対合）が、連結されるプローブの末端ヌクレオチドとテンプレート中のその相補物との間で必要とされる。一般に、このような実施態様において、プローブの残りのヌクレオチドは、次の連結がテンプレートに沿って所定の部位または塩基数で起こることを確実とする「スペーサー」として働く。すなわち、それらの対合、またはその欠落は、さらなる配列情報を提供しない。同様に、塩基同定についてポリメラーゼ伸長に頼る実施態様において、プローブは主としてスペーサーとして働き、従って、テンプレートに対する特異的ハイブリダイゼーションは、望ましいとはいえ、重要ではない。
【００２６】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、所定の長さの全ての可能な配列のオリゴヌクレオチドを含む混合物としてテンプレートに適用される。このような混合物の複雑さは、例えば、Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：５１４９−５１５２；米国特許第５，００２，８６７号；Ｎｉｃｈｏｌｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：４９２−４９３（１９９４）によって教示されるデオキシイノシンなどのようないわゆる縮重低下アナログを用いることを含む多数の方法によって；またはオリゴヌクレオチドプローブの多数の混合物（例えば、一緒にすると所定の長さの全ての可能な配列を含むオリゴヌクレオチド配列の４つのばらばらのサブセットを含む４つの混合物）を別々に適用することによって低下させることができる。
【００２７】
本発明の開始オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドプローブは、都合よく、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）３９２型または３９４型のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機）で、例えば、以下の文献に開示されるホスホルアミダイト化学のような標準的な化学を用いて合成される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら，米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら，米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号など。例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートなどのような非天然の骨格基が得られる別の化学を使用することもできる。但し、得られたオリゴヌクレオチドは特定の実施態様の連結および他の試薬に適合するものとする。オリゴヌクレオチドプローブの混合物は、例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：７１８−７２５（１９９２）；Ｗｅｌｓｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５２７５−５２７９（１９９１）；Ｇｒｏｔｈｕｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１３２１−１３２２（１９９３）；Ｈａｒｔｌｅｙ，欧州特許出願第９０３０４４９６．４号などに開示されるような周知の技術を用いて容易に合成される。一般に、これらの技術は、縮重を導入することが望まれるカップリング工程の間の成長するオリゴヌクレオチドへの活性化モノマーの混合物の適用を必要とするだけである。
【００２８】
従来のリガーゼを本発明で使用する場合、以下でより十分に記載するように、いくつかの実施態様ではプローブの５’末端をリン酸化し得る。５’モノホスフェートを化学的または酵素的のいずれかでキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドに結合させることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。化学的リン酸化は、ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７：４７０５（１９８６）によって記載されており、そして開示されたプロトコルを実施するための試薬は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から５’Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＯＮＴＭとして市販されている。好ましくは、必要な場合、オリゴヌクレオチドプローブは化学的にリン酸化される。
【００２９】
本発明のプローブは、蛍光部分、発色部分などの直接的または間接的な結合を含む種々の方法で標識され得る。ＤＮＡを標識し、そしてＤＮＡプローブを構築するための方法論の多くの総合的な概説が、本発明のプローブを構築するために適用可能な手引きを提供する。このような概説は、Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１６９巻，１−２５頁（１９８８）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ，ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）；およびＥｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）などを含む。本発明に適用できる多くのより詳細な方法は、以下の文献の見本に開示される：Ｆｕｎｇら，米国特許第４，７５７，１４１号；Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．ら，米国特許第５，１５１，５０７号；Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ，米国特許第５，０９１，５１９号；（レポーター基の結合のための官能化されたオリゴヌクレオチドの合成）；Ｊａｂｌｏｎｓｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：６１１５−６１２８（１９８６）（酵素−オリゴヌクレオチドコンジュゲート）；およびＵｒｄｅａら，米国特許第５，１２４，２４６号（分岐ＤＮＡ）。
【００３０】
好ましくは、プローブは、例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎら，米国特許第５，１８８，９３４号；Ｂｅｇｏｔら，ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号によって開示されるような１つ以上の蛍光色素で標識される。
【００３１】
テンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブの適用のためのハイブリダイゼーション条件の選択における手引きは、多数の文献（例えば、Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）；ＤｏｖｅおよびＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：４６７−４７８（１９６２）；Ｈｕｔｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：３５３７−３５５５（１９７７）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：３７４６−３７５０（１９８６）；Ｉｎｎｉｓら編，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）など）に見い出すことができる。
【００３２】
一般に、オリゴヌクレオチドプローブを、伸長した二重鎖の末端に並列してテンプレートにアニールする場合、二重鎖とプローブとを連結する、すなわち、相互の共有結合を生じさせる。連結は酵素的または化学的のいずれかで達成され得る。化学的連結方法は当該分野で周知である。例えば、Ｆｅｒｒｉｓら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，８：４０７−４１４（１９８９）；Ｓｈａｂａｒｏｖａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：４２４７−４２５１（１９９１）など。好ましくは、酵素的連結は標準的プロトコルでリガーゼを用いて実施される。多くのリガーゼが知られており、そして本発明で使用するのに適切である。例えば、Ｌｅｈｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０−７９７（１９７４）；Ｅｎｇｌｅｒら，ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅｓ，３−３０頁，Ｂｏｙｅｒ編，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，第１５Ｂ巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）など。好ましいリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびＴｔｈリガーゼを含む。それらの使用についてのプロトコルは周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）；Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：５−１６（１９９１）；Ｍａｒｓｈら，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５：７３−７６（１９９２）など。一般に、リガーゼは、隣接するストランドの３＆ａｐｏｓ；ヒドロキシルへの連結のために５’リン酸基が存在することを必要とする。
【００３３】
標的ポリヌクレオチドの調製
好ましくは、標的ポリヌクレオチドを結合領域に連結してテンプレートを形成し、そしてテンプレートを複雑かつ時間を消費する精製工程を伴わない試薬の連続的適用を可能とする固相支持体（例えば、磁性粒子、ポリマーマイクロスフィア、フィルター物質など）に付着させる。標識ポリヌクレオチドの長さは広範囲に変化し得る；しかし、調製の便宜のためには、従来の配列決定で使用される長さが好ましい。例えば、数百塩基対（２００〜３００）から１〜２キロ塩基対までの範囲の長さが好ましい。
【００３４】
標的ポリヌクレオチドは、種々の常法によって調製され得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、従来のＤＮＡ配列決定で使用されるものを含む、従来の任意のクローニングベクターのインサートとして調製され得る。適切なクローニングベクターの選択および使用のための広範な手引きがＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）、および同様の文献で見い出される。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＩｎｎｉｓら編，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）もまた、標的ポリヌクレオチドを調製するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用について手引きを提供する。好ましくは、この方法で使用する他の試薬から標的ポリヌクレオチドを分離するのを容易にするために、磁性ビーズまたは他の固体支持体への付着を可能とするクローン化標的ポリヌクレオチドまたはＰＣＲ増幅標的ポリヌクレオチドを調製する。このような調製技術についてのプロトコルは、Ｗａｈｌｂｅｒｇら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３：５４７−５５１（１９９２）；Ｔｏｎｇら，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，６４；２６７２−２６７７（１９９２）；Ｈｕｌｔｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：４９３７−４９４６（１９８９）；Ｈｕｌｔｍａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０：８４−９３（１９９１）；Ｓｙｖａｎｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：１１３２７−１１３３８（１９８８）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら，米国特許第４，７３４，３６３号；Ｕｈｌｅｎ，ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００３０４号；および同様の文献に十分に記載される。キットもまた、このような方法を実施するために、例えば、Ｄｙｎａｌ  ＡＳ．（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）からＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭテンプレート調製キットとして市販される。
【００３５】
一般に、本発明の方法で使用する微粒子またはビーズのサイズおよび形状は重要ではない；しかし、直径数ｍ（例えば、１〜２ｍ）から直径数百ｍ（例えば、２００〜１０００ｍ）の範囲のサイズの微粒子が好ましい。なぜなら、それらは、例えば蛍光標識プローブからの容易に検出できるシグナルの生成を可能としつつ、試薬および試料の使用量を最小にするからである。
【００３６】
伸長可能な末端の連結、キャップ形成、および再生についてのスキーム
１つの局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブの連結および同定の繰り返し工程を必要とする。しかしながら、同一工程における同一の伸長した二重鎖に対する複数プローブの連結は、通常は同定の問題を誘引するであろうから、多重伸長を防止しそして伸長可能な末端を再生するのに有用である。さらに、もし連結工程が１００％効果的でなければ、それらがいずれのさらなる連結工程にも参画しないように、連結を受けない伸長二重鎖にキャップ形成するのが望ましいであろう。すなわち、キャップ形成工程は、好ましくは、ポリヌクレオチド合成のような他の合成化学プロセスから類推して、連結工程の後に起こる（例えば、Ａｎｄｒｕｓら、米国特許第４，８１６，５７１号）。これは、その後の同定工程で生じるシグナルから潜在的に有意なノイズの源を除去するであろう。
【００３７】
以下、本発明の連結、キャップ形成、再生および同定工程を実施するためのいくつかの例示的スキームを記載する。それらは、手引きの目的で提示するものであって、限定することを意図しない。
【００３８】
開始オリゴヌクレオチドまたは３’→５’方向に伸長した二重鎖を伸長するためのスキームは図２に示す。テンプレート（２０）をその５’末端により、固相支持体（１０）に付着させる。これは、常法技術を用い、ビオチンまたは同様の連結部分を介して、丁度都合よく達成され得る。５’リン酸基を有する開始オリゴヌクレオチド（２００）を、連結および同定の最初のサイクル前に、前記のようにテンプレート（２０）にアニールする。以下の形態のオリゴヌクレオチドプローブ（２０２）を使用する：
ＨＯ−（３’）ＢＢＢ．．．ＢＢＢ（５’）−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）ＮＨ−Ｂｔ＊
ここで、ＢＢＢ．．．ＢＢＢはオリゴヌクレオチドプローブ（２０２）のヌクレオチドの配列を表し、Ｂｔ＊はホスホルアミデート基、または光切断結合のような、他の不安定結合を介してオリゴヌクレオチドの５’炭素に連結した標識された鎖終結部分である。Ｂｔ＊の性質は広く変化し得る。それは連続的連結を防止する限り、標識されたヌクレオシド（例えば、５’Ｐ３’Ｎホスホルアミデートを介してカップリングしたもの）または他の部分であり得る。それは、ＡｇｒａｗａｌおよびＴａｎｇ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８３４７号に記載されるように、単にリンカーによって結合された標識であり得る。オリゴヌクレオチドプローブの重要な特徴は、アニーリングおよび連結（２０４）の後に、標識を除去でき、例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９４：２９２−２９３（１９７１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５：２８１０−２８１６（１９７６）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：３４０３−３４０９（１９９２）；および同様の文献によって教示されるように、ホスホルアミデート結合を酸で処理することによって、伸長可能な末端を再生できることである。例えば、ホスホルアミデートの加水分解は、室温における４０分間のジクロロメタン中の０．８％トリフルオロ酢酸での処理によって達成され得る。このようにして、Ｂｔ＊上の標識を介して連結したプローブをアニーリングし、連結し、そして同定した後、酸加水分解（２０６）により鎖終結部分を切断し、それによりリン結合を破壊し、連結したオリゴヌクレオチド上に５’モノホスフェートを残しておく。この工程は連続的サイクルで繰り返され得る（２０８）。この実施態様の１つの局面において、単一の開始オリゴヌクレオチドを、１つのヌクレオチドのみが各配列決定サイクルで同定されるように使用し得る。このような実施態様では、このプローブは好ましくは以下の形態を有する：
ＨＯ−（３’）Ｂ（５’）−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）ＮＨＢＢ．．．ＢＢＢ−Ｂｔ＊。
【００３９】
このようにして、各連結および酸切断工程の後、二重鎖は１ヌクレオチドだけ伸長される。
【００４０】
加水分解の前に、キャップ形成工程が導入され得る。例えば、プローブ（２０２）は以下の形態を有する：
ＨＯ−（３’）ＢＢ．．．Ｂｐ＾Ｂ．．．ＢＢ（５’）−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）ＮＨ−Ｂｔ＊
ここで、「ｐ＾」はホスホロチオエート、メチルホスホネートなどのようなエキソヌクレアーゼ耐性結合である。このような実施態様において、キャップ形成は、未連結伸長二重鎖を切断してエキソヌクレアーゼ耐性結合に戻すλエキソヌクレアーゼのようなエキソヌクレアーゼで伸長二重鎖を処理することによって達成され得る。次いで、伸長二重鎖の５’末端におけるこの結合の存在は、その後の連結にそれが関与することから防止する。明らかに、多くの他のキャップ形成方法、例えばアシル化、不活性オリゴヌクレオチドの連結などを使用し得る。遊離３’ヒドロキシルが関与する場合、キャップ形成は、鎖終結ヌクレオシド三リン酸、例えばジデオキシヌクレオシド三リン酸などの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼで二重鎖を伸長させることによって達成され得る。
【００４１】
前記したホスホルアミデート結合は、本明細書中では「化学的に切断可能なヌクレオシド間結合」と呼ばれるヌクレオシド間結合の一般的クラスの例である。これらは、酸化性環境、還元性環境、特徴的波長の光（光不安定性結合用）などのような特徴的な化学的または物理的条件でそれらを処理することによって切断され得るヌクレオシド間結合である。本発明に従い使用され得る化学的に切断可能なヌクレオシド間結合の他の例は、Ｕｒｄｅａ第５，３８０，８３３号；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１４０３−１４０８（１９９３）（ジスルフィド）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：２３６６−２３６９（１９９４）（ブロモアセチル）；Ｕｒｄｅａら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５２８７（光不安定性）；および同様の文献に記載されている。
【００４２】
本発明で使用され得るさらなる化学的に切断可能な結合は、伸長可能なヌクレオシドに化学的に変換され得る鎖終結ヌクレオチドを含む。このような化合物の例は以下の文献に記載されている：Ｃａｎａｒｄら、国際出願ＰＣＴ／ＦＲ９４／００３４５；Ａｎｓｏｒｇｅ，独国特許出願第ＤＥ  ４１４１１７８  Ａ１号；Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９−４２６７（１９９４）；Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ、米国特許第５，３０２，５０９号；Ｒｏｓｓら，国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６１７８号など。
【００４３】
開始オリゴヌクレオチドまたは伸長した二重鎖を５’→３’方向に伸長させるためのスキームが図３Ａに示される。テンプレート（２０）は、その３’末端によって固相支持体（１０）に結合させる。前記のように、これは、常法技術を用い、ビオチンまたは同様の連結部分を介して、丁度都合よく達成され得る。３’ヒドロキシル基を有する開始オリゴヌクレオチド（３００）は、連結および同定の最初のサイクル前に、前記のようにテンプレート（２０）にアニールされる。以下の形態のオリゴヌクレオチドプローブ（３０２）を使用する：
ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−（５’）ＢＢＢ．．．ＢＢＢＲＲＲＲＢｔ＊。
【００４４】
ここで、ＢＢＢ．．．ＢＢＢＲＲＲＲはオリゴヌクレオチドプローブ（３０２）の２’−デオキシヌクレオチドの配列を表し、「ＲＲＲＲ」はプローブ（３０２）の４つのリボヌクレオチドの配列を表し、そしてＢｔ＊は前記のように標識された鎖終結部分である。このような混合されたＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは通常の自動ＤＮＡ合成機を用いて容易に合成される（例えば、Ｄｕｃｋら、米国特許第５，０１１，７６９号）。ＲＮａｓｅ  Ｈは、４つのリボヌクレオチドセグメントの中心において特異的にプローブを切断し（Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：５５６１−５５６６（１９９０））、伸長した二重鎖上に３’ヒドロキシル（３１２）を残し、これはその後の連結工程に参加し得る。このようにして、本実施態様におけるサイクルは、テンプレート（２０）にプローブ（３０２）をアニールされそして、連結（３０４）させて、伸長した二重鎖（３０６）を形成することにより進行する。Ｂｔ＊を介する同定の後、伸長した二重鎖は、標識を切断し、伸長可能な末端を再生するために、ＲＮａｓｅ  Ｈで処理される。次いで、サイクルが繰り返される（３１４）。キャップ形成（３１０）は、ＲＮａｓｅ  Ｈ処理の前に、４つのジデオキシヌクレオシド三リン酸、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼで未連結末端を伸長させることによって実施され得る。
【００４５】
図３Ｂで説明したように、同様のスキームが３’５’伸長のために使用され得る。このような実施例において、開始オリゴヌクレオチドまたは伸長した二重鎖（３３０）は、５’一リン酸を有し、オリゴヌクレオチドプローブ（３３２）は以下の形態を有する：
ＨＯ−（３’）ＢＢＢ．．．ＢＢＢＲＲＲＲＢ．．ＢＢｔ＊。
【００４６】
前記のように、アニーリング、連結（３３４）、および同定（３３８）の後、伸長した二重鎖（３３６）は、この場合は伸長した二重鎖の末端で５’一リン酸（３４２）を残すＲＮａｓｅ  Ｈにより、切断される。再生した伸長可能な末端を用いて、サイクルは繰り返され得る（３４４）。キャップ形成工程は、ＲＮａｓｅ  Ｈ加水分解前に、未標識非ＲＮＡ含有プローブを連結することにより、またはホスファターゼでの処理による任意の残存する５’モノホスフェートを除去することのいずれかによって含まれ得る。
【００４７】
ヌクレオチドの同定は、連結後のポリメラーゼ伸長により達成され得る。図４に例示するように、この実施態様については、テンプレート（２０）を前記のように固相支持体（１０）に結合させ、３’ヒドロキシルを有する開始オリゴヌクレオチド（４００）を最初のサイクル前にテンプレートにアニールさせる。以下の形態を有するオリゴヌクレオチドプローブ（４０２）：
ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−（５’）ＢＢＢ．．．ＢＢＢＲＲＲＲＢ．．．Ｂ（３’）ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ
がテンプレート（２０）にアニールされ、そして連結（４０４）され、伸長した二重鎖（４０６）が形成される。同一サイクルにおいてプローブの連続的連結を防ぐ３’一リン酸がホスファターゼ（４０８）で除去され、遊離の３’ヒドロキシル（４１０）が露出される。明らかに、別のブロッキングアプローチも使用され得る。伸長した二重鎖（４０６）は、標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸（４１２）の存在下で、核酸ポリメラーゼによってさらに伸長し、それにより、取り込まれたジデオキシヌクレオシドの標識によってテンプレート（２０）のヌクレオチドの同定が可能となる。次いで、標識されたジデオキシヌクレオチドおよびプローブ（４０２）の一部は、伸長した二重鎖（４０６）上に伸長可能な末端を再生するために、例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ処理によって切断される（４１４）。次いで、サイクルが繰り返される（４１６）。
【００４８】
実施しなければならない別々のアニーリング反応の数を減少させるために、オリゴヌクレオチドプローブは、その相補的配列と完全にマッチした二重鎖が、同様の安定性または結合の自由エネルギーを有するプローブの混合物またはサブセットにグループ分けされ得る。同様の二重鎖安定性を有するオリゴヌクレオチドプローブのこのようなサブセットは、本明細書中ではオリゴヌクレオチドプローブの「ストリンジェンシークラス」といわれる。次いで、オリゴヌクレオチドプローブの混合物またはストリンジェンシークラスは、実質的に標的ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのみが二重鎖を形成するような条件下で、標的ポリヌクレオチドと別々に混ぜ合わされる。すなわち、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、実質的に完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのみが二重鎖を形成するように選択される。次いでこれらの完全にマッチした二重鎖が、連結され、伸長した二重鎖が形成される。所与のオリゴヌクレオチドプローブ長さにつき、各ストリンジェンシークラス内のオリゴヌクレオチドプローブの数は、広く変化し得る。オリゴヌクレオチドプローブの長さおよびストリンジェンシークラスサイズの選択は、標識配列の長さ、およびそれがどのように調製されるか、ハイブリダイゼーション反応が自動化され得る程度、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが制御され得る程度、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの存在または不存在などのようないくつかの因子に依存する。特定の実施態様のためのストリンジェンシークラスの適切なサイズを選択する手引きは、核酸ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応法についての一般的文献中に見い出され得る（例えば、Ｇｏｔｏｈ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６：１−５２（１９８３）；Ｗｅｔｍｅｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６：２２７−２５９（１９９１）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８３：３７４６−３７５０（１９８６）；Ｗｏｌｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：２９１１−２９２６（１９８７）；Ｉｎｎｉｓら編，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）；ＭｃＧｒａｗら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８：６７４−６７８（１９９０）など）。ストリンジェンシーは、温度、塩濃度、ホルムアミドのような特定の有機溶媒の濃度などを含むいくつかの変化するパラメーターによって制御され得る。好ましくは、用いられる種々のポリメラーゼまたはリガーゼの活性が、塩濃度または有機溶媒濃度がオリゴヌクレオチドプローブの特異的アニーリングを保証するために変えられ得る程度を制限するために、温度がストリンジェンシークラスを規定するために用いられる。
【００４９】
一般に、ストリンジェンシークラスが大きければ大きいほど、ハイブリダイズする混合物の複雑性が大きくなり、そして混合物におけるいずれかの特定のオリゴヌクレオチドプローブの濃度が低下する。標的ポリヌクレオチド上に相補的部位を有する、より低濃度のオリゴヌクレオチドプローブはハイブリダイズし連結されるオリゴヌクレオチドプローブの相対的公算（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を低下させる。これは、今度は、感受性の低下を導く。また、ストリンジェンシークラスが大きければ大きいほど、オリゴヌクレオチドプローブと相補的配列との間に形成される二重鎖の安定性に大きな変動を有する。他方、ストリンジェンシークラスが小さければ小さいほど、１セットの全てのオリゴヌクレオチドプローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを保証するために、より多数のハイブリダイゼーション反応を必要とする。
【００５０】
例えば、８マーのオリゴヌクレオチドプローブが使用される場合、ストリンジェンシークラスは、各々約５０から約５００の間のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。このようにして、数百〜数千のハイブリダイゼーション／連結反応が必要とされる。より大きなサイズのオリゴヌクレオチドプローブについては、より大きなストリンジェンシークラスが、ハイブリダイゼーション／伸長反応の数を実際的なもの（例えば、１０４〜１０５またはそれ以上）とするために必要とされる。
【００５１】
同一ストリンジェンシークラスのオリゴヌクレオチドプローブは、十分にランダムなオリゴヌクレオチドプローブが合成されるのと類似した様式で（例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：７１８−７２５（１９９２）；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５２７５−５２７９（１９９１）；Ｇｒｏｔｈｕｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｕｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１３２１−１３２２（１９９３）；Ｈａｒｔｌｅｙ，欧州特許出願９０３０４４９６．４などに開示されているように）、同時に合成され得る。差異は、各サイクルにおいて、モノマーの異なる混合物を、増殖するオリゴヌクレオチドプローブ鎖に適用することであり、ここで、混合物中の各モノマーの割合は、ストリンジェンシークラスにおけるオリゴヌクレオチドプローブの位置における各ヌクレオシドの割合によって指示される。ストリンジェンシークラスは、利用可能なアルゴリズム（例えば、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：３７４６−３７５０（１９８６）；Ｌｏｗｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：１７５７−１７６１（１９９０）など）により二重鎖形成の自由エネルギーを計算することによって容易に形成される。オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な反応条件下（例えば、標準的なバブルソート、Ｂａｓｅ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，１９７８））でのそれらの相補体への結合の自由エネルギーにより順序付けられる。例えば、以下のものは標準的なハイブリダイゼーション条件下での二重鎖形成の自由エネルギーによる最大安定性（頂部から底部にかけて）を有する、および二重鎖形成の自由エネルギーの最低安定性を持つ１０の６マーのリストである（自由エネルギーはＢｒｅｓｌａｕｅｒら（前出）により計算される）。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプローブ
ランキング配列（５’→３’）
１  ＧＣＧＣＧＣ
２  ＣＧＣＧＣＧ
３  ＣＣＣＧＣＧ
４  ＣＧＣＣＣＧ
５  ＣＧＣＧＣＣ
６  ＣＧＣＧＧＣ
７  ＣＧＧＣＧＣ
８  ＧＣＣＧＣＧ
９  ＧＣＧＣＣＧ
１０  ＧＣＧＣＧＧ
・  ・
・  ・
・  ・
４０８７  ＴＣＡＴＡＴ
４０８８  ＴＧＡＴＡＴ
４０８９  ＣＡＴＡＴＡ
４０９０  ＴＡＴＡＴＧ
４０９１  ＡＴＣＡＴＧ
４０９２  ＡＴＧＡＴＧ
４０９３  ＣＡＴＣＡＴ
４０９４  ＣＡＴＧＡＴ
４０９５  ＣＡＴＡＴＧ
４０９６  ＡＴＡＴＡＴ
このように、もしストリンジェンシークラスが最初の１０個の６マーからなるのであれば、最初の（最も３’側の）位置についての混合物モノマーは、０：４：６：０（Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔ）となるであろうし、第２の位置については、それは０：６：４：０となるであろう（以下、同様）。もしストリンジェンシークラスが最後の１０個の６マーからなるならば、最初の位置についてのモノマーの混合物は１：０：４：５となるであろうし、第２の位置については、それは５：０：０：５であろう（以下、同様）。次いで、得られた混合物は、加熱溶出によって所望のストリンジェンシークラスの配列につきさらに富化され得る（例えば、Ｍｉｙａｚａｗａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：２２３−２３７（１９６５））。
【００５３】
より便宜的には、数百〜数千のオリゴヌクレオチドを含むストリンジェンシークラスは、種々の並行合成アプローチによって直接的に合成され得る（例えば、Ｆｒａｎｋら、米国特許第４，６８９，４０５号；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４；１１０−１１６（１９９５）；Ｆｏｄｏｒら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５号；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：５０２２−５０２６（１９９４）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５：２１７−２２７（１９９４），Ｂｒｅｎｎａｎ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５８９６号など）。
【００５４】
いくつかの場合において、オリゴヌクレオチドプローブ−ダイマーを形成するのに感受性のサブセットまたはオリゴヌクレオチドプローブにおいて、他のオリゴヌクレオチドプローブに対する相補的配列を有する別々のサブセットのオリゴヌクレオチドプローブに配置することによって、オリゴヌクレオチドプローブのさらなるストリンジェンシークラスを形成することが所望され得る。
【００５５】
明らかに、当業者は、先に明示的に記載されていないが、本発明のなおさらなる実施態様を設計するために、前記の実施態様の特徴を組み合わせることができる。
【００５６】
また、本発明は、本発明の方法を自動的に実施するためのシステムおよび装置を含む。このようなシステムおよび装置は、ｉ）標的ポリヌクレオチドをつなぎ止めるために使用される固相支持体の性質、ｉｉ）所望の並行操作の程度、ｉｉｉ）使用される検出スキーム；ｉｖ）試薬を再使用するか捨てるかなどを含めたいくつかの設計製薬に依存して種々の形態をとり得る。一般に、装置は一連の試薬貯蔵器、好ましくは固相支持体（例えば、磁気ビーズ）に付着させた標的ポリヌクレオチドを含有する１つ以上の反応容器、１つ以上の検出ステーション、および試薬貯蔵器から反応容器へおよび反応容器から検出ステーションへ、予め決定した様式で試薬を移すためのコンピューター制御手段を含む。試薬を移し、温度を制御するためのコンピューター制御手段は、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８８−９７（１９９３）；Ｆｕｊｉｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：５８４−５９１（１９９０）；Ｗａｄａら、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ，５４：１５６９−１５７２（１９８３）などに開示されているもののような、種々の一般目的の実験室ロボットによって実行され得る。このような実験室ロボットはまた市販されている（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル８００Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））。
【００５７】
本発明の異なる実施態様を実施するために種々のキットが提供され得る。一般に、本発明のキットは、オリゴヌクレオチドプローブ、開始オリゴヌクレオチド、および検出システムを含む。キットはさらに、連結試薬および本発明の特別の実施態様を実施するための指示を含む。タンパク質リガーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、核酸ポリメラーゼ、または他の酵素を使用する実施態様においては、それらの各緩衝液が含ませられ得る。いくつかの場合においては、これらの緩衝液は同一であり得る。好ましくは、キットはまた、テンプレートをつなぎ止めるための固相支持体（例えば、磁気ビーズ）を含む。１つの好ましいキットにおいて、標的ポリヌクレオチドの異なる末端ヌクレオチドに対応するプローブが、明瞭なスペクトル的に分解できる蛍光色素を保持するように、蛍光的に標識されたオリゴヌクレオチドプローブが提供される。本明細書で用いられる「スペクトル的に分解可能な」とは、その色素が、操作条件下で、それらのスペクトル特性、特に蛍光放射波長に基づいて区別され得ることを意味する。このようにして、１つまたはそれ以上の末端ヌクレオチドの同一性は異なる色彩、またはおそらくは異なる波長における強度の比率に相関する。より好ましくは、４つのこのようなプローブは、標的ポリヌクレオチド上の４つのスペクトル的に分解可能な蛍光色素と４つの可能な末端ヌクレオチドの各々の間の一対一の対応を可能とするように提供される。スペクトル的に分解可能な色素のセットは、米国特許第４，８５５，２２５号および第５，１８８，９３４号：国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号；およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：２４７１−２４８３（１９９２）に開示されている。
【実施例】
【００５８】
実施例１
４つの開始オリゴヌクレオチドを用いてｐＵＣ１９から増幅された
標的ポリヌクレオチドの配列決定
本実施例においては、結合領域およびｐＵＣ１９プラスミドの一部を含むテンプレートをＰＣＲによって増幅し、そして磁気ビーズに付着させる。４つの開始オリゴヌクレオチドを、下記のように別々の反応で使用する。以下の式に示すように、４つの中央リボヌクレオチドならびに、両５’および３’一リン酸を有する８マーのオリゴヌクレオチドプローブを使用する：
ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−（５’）ＢＢＲＲＲＲＢＢ（３’）−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ。
【００５９】
アニーリングの後、プローブを開始オリゴヌクレオチドに酵素的に連結し、磁気ビーズ支持体を洗浄する。連結したプローブの３’リン酸をホスファターゼで除去し、その後、４つの標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸鎖終結剤の存在下で、プローブをＤＮＡポリメラーゼで伸長させる。伸長したヌクレオチドの洗浄および同定の後、連結されたプローブをＲＮａｓｅ  Ｈでリボヌクレオチド部分で切断して標識を除去し、そして伸長可能な末端を再生する。
【００６０】
３６マーの結合領域を含む以下の二本鎖のフラグメントをＳａｃＩ／ＸｍａＩ消化したｐＵＣ１９に連結する：
ＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣ
ＴＣＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＣＣ。
【００６１】
単離および増幅の後、改変されたｐＵＣ１９の４０２塩基対フラグメントを、テンプレートとして使用するために、ＰＣＲによって増幅する。該フラグメントは、４１位からポリリンカー領域中のＳａｃＩ部位に隣接して挿入された結合領域（未改変ｐＵＣ１９の４１３位）のｐＵＣ１９の領域にわたる（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１１９（１９８５））。配列５’−ＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣｘ−３’および５’−ＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴ−３’（ここで「ｘ」は製造業者のプロトコル付きの市販されている試薬（例えば、３’ビオチン−ＯＮ  ＣＰＧ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用い、合成の間に付着される３’ビオチン部分である）を有する２つの１８マーのオリゴヌクレオチドプローブを使用する。増幅されたテンプレートを単離し、Ｍ２８０−ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）とともに、製造業者のプロトコル（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用い、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に付着させる。約３００ｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０−ストレプトアビジンをロードするために十分な量のビオチニル化３１３塩基対フラグメントを提供する。
【００６２】
開始オリゴヌクレオチドとで形成される二重鎖が、二重鎖安定性を増強させるために、約６６％ＧＣの組成を有するように、結合領域配列を選択する。また、二次構造形成および結合領域内の１以上の位置への開始オリゴヌクレオチドの偶発的ハイブリダイゼーションを防ぐように配列を選択する。結合領域内の所与の開始オリゴヌクレオチドの位置のあらゆるシフティングも、有意数のミスマッチ塩基を生じる。
【００６３】
ローディングの後、テンプレートの非ビオチニル化ストランドを加熱変性によって除去し、その後、磁気ビーズを洗浄し、そして４つのアリコートに分ける。磁気ビーズに付着させたテンプレートは以下の配列を有する：
（磁気ビーズ）−（リンカー）−（３’）−ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣ−ＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧＴ．．．ＣＴＣＧＡＣＧ−（５’）。
【００６４】
以下の４つのオリゴヌクレオチドを、テンプレートの別々のアリコートの各々における開始オリゴヌクレオチドとして使用する：
５’−ＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧ
５’−ＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡ
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ
５’−ＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧ。
【００６５】
以下の反応および洗浄は、一般に、特記しない限り、使用する酵素のための５０Ｌ容量の製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の推奨する緩衝液中で実施する。また、標準的な緩衝液はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている。
【００６６】
４つのアリコートの各々用の８マーのプローブ全てを一緒に含む、９６ストリンジェンシークラスの６８４または６８２オリゴヌクレオチドプローブ各々（４８の異なるアニーリング温度の各々のための２のサブセット）を形成する。９６のクラスの各々のプローブを、同一成分を有する反応混合物中の標的オリゴヌクレオチドに別々にアニールするが、３７℃未満の温度でＳｅｑｕｅｎａｓｅおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼで行った伸長および連結、およびＴａｑ  Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメントおよび他の熱安定性リガーゼで行った伸長および連結は例外である。
【００６７】
４８のストリンジェンシー条件は、同一温度のサブセットの各グループが、次の最高および次の最低ストリンジェンシークラスを含むサブセットグループのそれと１℃だけアニーリング温度が異なるように、２２℃〜７０℃の範囲のアニーリング温度によって規定される。アニーリング温度の範囲（２２〜７０℃）は、各々、最も不安定なおよび最も安定な８マーが、標準的なＰＣＲ緩衝溶液中で、約５０パーセント最大アニーリングを有することが予想される温度より５〜１０℃低いの温度によっておおよそ境界を決める。
【００６８】
８０℃における５〜１０分間のインキュベーションの後、反応混合物を２０〜３０分間にかけて、それらの各アニーリング温度にもってゆく。連結、洗浄、およびホスファターゼでの処理の後、２単位のポリメラーゼおよび標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（０．０８ｍＭ最終反応濃度、およびＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＦＡＭ（フルオレセイン）、ＲＯＸ（ローダミンＸ）、およびＪＯＥ（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロフルオレセイン）で標識）を添加する。１５分後、ビーズをＨ２Ｏで洗浄し、そして各反応混合物を標準的な波長（例えば、Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ，モデル３７３ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を用いて照射することにより伸長したヌクレオチドの同一性を決定する。
【００６９】
同定後、反応混合物を製造業者の推奨のプロトコルを用いＲＮａｓｅ  Ｈで処理し、そして洗浄する。ＲＮａｓｅ  Ｈ処理した伸長二重鎖は、再生された３’ヒドロキシルを有し、次の連結／伸長／切断のサイクルの準備ができている。試験配列の全てのヌクレオチドが同定されるまでサイクルを実施する。
【００７０】
実施例２
ある開始オリゴヌクレオチドを用いるｐＵＣ１９から増幅された標的ポリヌクレオチドの配列決定
この実施例において伸長は５’→３’方向であるので、ビオチン部分を結合領域のＣＴリッチストランドにハイブリダイズするプライマーの５’末端に付着させる以外は、本実施例では、実施例１に従ってテンプレートを調製する。このようにして、本実施例では、一本鎖テンプレートの結合領域はＧＡリッチなセグメントである（本質的には、実施例１の結合領域の相補体）。配列５’−ｘＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧ−３’および５’−ＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣ−３’（ここで「ｘ」は製造業者のプロトコル付きの市販されている試薬（例えば、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋアミノアルキルホスホルアミダイト連結剤（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能なビオチン−Ｘ−ＮＨＳエステル）を用い、合成の間に付着される５’ビオチン部分である）を有する２つの１８マーのオリゴヌクレオチドプローブを使用する。
【００７１】
以下の配列を有する単一の１２マーの開始オリゴヌクレオチドを使用する：
５’−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−ＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣ−３’。
以下の式に示される、プローブの最も３’側と３’側から２番目のヌクレオシドとの間に酸不安定ホスホルアミデート結合を有する６マーのオリゴヌクレオチドプローブを使用する：
ＨＯ−（３’）Ｂ（５’）−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ−）ＮＨ−（３’）ＢＢＢＢＢｔ＊
ここで、標識は最も３’側の同一性に対応するように（従って、１６の異なる標識ジデオキシヌクレオシドをプローブの合成に使用する）、Ｂｔ＊はＪＯＥ−、ＦＡＭ−、ＴＡＭＲＡ−、またはＲＯＸ−標識ジデオキシヌクレオシドである。
【００７２】
前記のように、６マーのプローブを、各々４２または４３プローブを含む、９６ストリンジェンシークラス（４８の異なるアニーリング温度の各々につき２つのサブセット）に調製する。ハイブリダイゼーションおよび連結は、前記のように行う。連結および洗浄の後、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光シグナルによって標的ポリヌクレオチド中のヌクレオシドを同定する。次いで、室温にてジクロロメタン中の０．８％トリフルオロ酢酸で、伸長した二重鎖を４０分間処理することによって、酸切断を行い、伸長した二重鎖上で伸長可能な末端を再生する。標的ポリヌクレオチドの配列が決定されるまで該プロセスを継続する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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