(57)【要約】【課題】本発明は、コラーゲンおよび繊維芽細胞を含む真皮同等物の層を有する３次元培養皮膚モデルであって、更に構成細胞としてメラノサイトおよび表皮角化細胞を含む３次元培養皮膚モデルを提供すること、また、このモデルを使って紫外線照射の皮膚への影響や紫外線照射に対する薬剤の効果を調べる方法を提供することを目的とする。【解決手段】３次元培養皮膚モデルを作製する工程において、線維芽細胞およびコラーゲンを含む真皮同等物の上にメラノサイトを播種するに際し、メラノサイト単独では無く線維芽細胞または表皮角化細胞を同時に播種し共存させることによりメラノサイトが効率よく真皮層上に生着することを見出だし、紫外線に対してメラノサイトが良好に反応してメラニンを産生することが可能な極めてヒト皮膚に近似した人為的に作製された真皮層を有する３次元培養皮膚モデルを完成させるに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む３次元培養皮膚モデル。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層
（２）表皮角化細胞の層（表皮層）
（３）表皮基底層に存在し、かつ表皮層（ただし、表皮基底層を含み、角質層を含まない。）における一定断面積当たりの表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比が１．８％以上である、メラノサイト
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚モデルを使用して、美白剤の効果を調べる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射の皮膚に対する影響を調べる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射に対する薬剤の影響を調べる方法。
【請求項５】
真皮同等物層、表皮層およびメラノサイトを有する３次元培養皮膚モデルの製造方法であって、以下の（４）〜（６）に記載の工程を含むことを特徴とする製造方法。
（４）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養して、真皮同等物の層を作製する工程
（５）真皮同等物の層上に、メラノサイトを線維芽細胞または表皮角化細胞と共に播種する工程
（６）メラノサイトが生着した真皮同等物の層上に、表皮角化細胞を播種し、３次元培養する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトを含む新規な３次元培養皮膚モデル、およびこの３次元培養皮膚モデルを用いた美白剤の評価方法、更に紫外線照射の影響の評価方法、および紫外線照射に対する薬剤効果を調べる薬剤評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物愛護の観点から実験動物を使用せずに医薬品や化粧品原料の安全性評価等の試験を行う、いわゆる動物実験代替法が盛んに研究されている。その中のひとつとして、皮膚に関する毒性や皮膚科学研究を行うための３次元培養皮膚モデルが種々開発されている。このうち、美白剤研究に用いるため、皮膚モデルの構成細胞としてメラノサイトを含む３次元皮膚モデルも開発されている。
【０００３】
しかしながら、生体皮膚から分離作成した真皮層（ＤＥＤ；Ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  Ｄｅｒｍａｌ）の上に表皮角化細胞を重層化して作製した３次元培養皮膚モデルでは、紫外線に反応してメラニン産生が亢進するものは報告されているが（非特許文献１）、人為的に作製した真皮（以下、「真皮同等物」と表現することがある。）層を有する３次元培養皮膚モデルで、且つ、紫外線照射に充分反応する培養皮膚モデルはこれまでに報告が無い。
【０００４】
現在、商業的に作製されているメラノサイトを含む３次元皮膚モデルは、何れも真皮層は有さず、透過性膜上にメラノサイトを播種し、その上に表皮角化細胞を重層化させて表皮層を作製し３次元皮膚モデルとしている。この場合、メラノサイトは透過性膜を足場としてこれに接着しているためメラノサイトの機能をある程度発揮し、メラニン色素を作り出すことが可能である。しかし、これは生体の皮膚構造を再現したものとは言えず、このため、こうした皮膚モデルは特に紫外線照射に対する反応の再現性が悪いという問題があった。
【０００５】
このような背景から、正確に紫外線照射による影響を評価できる、ヒト生体皮膚に近似した３次元培養皮膚モデルの開発が真に望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  ２００３  ｖｏｌ．１２，  ６４−７０
【非特許文献２】「機能細胞の分離と培養」，１９８７年，丸善株式会社，三井洋司ら，ｐ８１−８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、コラーゲンおよび繊維芽細胞を含む真皮同等物の層を有する３次元培養皮膚モデルであって、更に構成細胞としてメラノサイトおよび表皮角化細胞を含む３次元培養皮膚モデルを提供すること、また、照射された紫外線に反応してメラノサイトにおけるメラニン色素産生能が亢進する特徴を利用し、このモデルを使って紫外線照射の皮膚への影響や紫外線照射に対する薬剤の効果を調べる方法、および美白剤の効果を調べる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、人為的に作製した真皮層を有する３次元培養皮膚モデルで、且つ紫外線照射に十分に反応する３次元培養皮膚モデルが作製できない大きな原因が、メラノサイトが真皮層と表皮層の境界、すなわち表皮基底層に容易には生着しないためであることを見いだした。即ち、コラーゲンと線維芽細胞を用いて人為的に作製した真皮層を有する３次元培養皮膚モデルを作製する場合、この真皮層上にメラノサイトを播種し、更に表皮角化細胞を播種して表皮層を形成させると、メラノサイトは表皮基底層に生着することなく表皮角化細胞の増殖による表皮の重層化に伴い表皮上層に押しやられてしまい、間も無くその機能を失ってしまう。
【０００９】
本発明者は上記のような課題を達成するために鋭意研究を行った結果、３次元培養皮膚モデルを作製する工程において、線維芽細胞およびコラーゲンを含む真皮同等物の上にメラノサイトを播種するに際し、メラノサイトをメラノサイト単独では無く線維芽細胞または表皮角化細胞と同時に播種し共存させることによりメラノサイトが効率よく真皮層上に生着することを見出した。我々はこの方法を用いて３次元培養皮膚モデルを作製することによりメラノサイトが表皮基底層に生着した３次元培養皮膚モデルを安定的に作製できることを可能にした。こうして作製した３次元培養皮膚モデルは、紫外線に対しても良好な反応性を有している。即ち、人為的に作製された真皮層を有する３次元培養皮膚モデルの表皮基底層にメラノサイトを安定的に生着させることに成功し、紫外線に対してメラノサイトが良好に反応してメラニンを産生することが可能な極めてヒト生体皮膚に近似した３次元培養皮膚モデルを完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本願発明の概要は以下の通りである。
［項１］
以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む３次元培養皮膚モデル。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層
（２）表皮角化細胞の層（表皮層）
（３）表皮基底層に存在し、かつ表皮層（ただし、表皮基底層を含み、角質層を含まない。）における一定断面積当たりの表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比が１．８％以上である、メラノサイト
［項２］
項１に記載の皮膚モデルを使用して、美白剤の効果を調べる方法。
［項３］
項１に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射の皮膚に対する影響を調べる方法。
［項４］
項１に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射に対する薬剤の影響を調べる方法。
［項５］
真皮同等物層、表皮層およびメラノサイトを有する３次元培養皮膚モデルの製造方法であって、以下の（４）〜（６）に記載の工程を含むことを特徴とする製造方法。
（４）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養して、真皮同等物の層を作製する工程
（５）真皮同等物の層上に、メラノサイトを線維芽細胞または表皮角化細胞と共に播種する工程
（６）メラノサイトが生着した真皮同等物の層上に、表皮角化細胞を播種し３次元培養する工程
【発明の効果】
【００１１】
メラノサイトは生体内では表皮基底層に存在しており、真皮同等物層の上にメラノサイトを播種し更に表皮角化細胞を播種する場合には、メラノサイトが生体内とは異なる環境に置かれることによりその機能を失い、生着率が低下すると推察される。しかしながら本発明により、メラノサイトを表皮角化細胞と共存させることによってメラノサイトの細胞環境を生体内の環境により近づけることにより、メラノサイトの生存率が格段に上昇し、生着率が向上したと考えられる。
【００１２】
上述のように本発明によって、真皮層（真皮同等物層）を有する３次元培養皮膚モデルであって、更にメラノサイトを含んでなる、極めてヒト生体皮膚に近似した３次元培養皮膚モデルを提供することが可能となった。さらに本発明によって、この３次元培養皮膚モデルを使用して、紫外線照射の影響を調べる評価方法、紫外線照射に対する薬剤効果を調べる薬剤評価方法を提供することが可能となった。
【００１３】
人為的に作製した真皮層を基に作られた３次元培養皮膚モデルで紫外線照射に充分反応するモデルはこれまでに報告が無く、本発明は紫外線照射による日焼けやシミ、皮膚の老化などのメカニズム解明やこうした症状を改善する薬剤の開発に有用な実験動物代替モデルとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明を用いた実施例１の空気培養暴露開始後７日目における、フォンタナ・マッソン染色像を示す組織切片（皮膚組織垂直断面）の写真である。
【図２】本発明を用いた実施例１の空気培養暴露開始後１４日目における、フォンタナ・マッソン染色像を示す組織切片（皮膚組織垂直断面）の写真である。
【図３】本発明を用いた比較例１の空気培養暴露開始後７日目における、フォンタナ・マッソン染色像を示す組織切片（皮膚組織垂直断面）の写真である。
【図４】本発明を用いた比較例１の空気培養暴露開始後１４日目における、フォンタナ・マッソン染色像を示す組織切片（皮膚組織垂直断面）の写真である。
【図５】本発明を用いた実施例２における、紫外線照射４日後の皮膚組織中メラニン量の比較を示すグラフである。
【図６】本発明を用いた比較例２における、紫外線照射４日後の皮膚組織中メラニン量の比較を示すグラフである。
【図７】本発明を用いた実施例３における、皮膚組織中メラニン量の比較を示すグラフである。
【図８】本発明を用いた実施例４における、紫外線照射７日後の皮膚組織中メラニン量の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明の具体的な実施の形態を説明する。
本発明の３次元培養皮膚モデルは、以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む、人為的に作製された真皮（真皮同等物）層を有する３次元培養皮膚モデルである。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層。
（２）表皮角化細胞の層。
（３）（１）の真皮同等物の層と（２）の表皮角化細胞の層との間（表皮基底層）に、生着したメラノサイトを含んでおり、該メラノサイトは真皮層上に表皮角化細胞または線維芽細胞と共に播種されたメラノサイト。
さらに本発明は、（３）において表皮層（ただし、表皮基底層を含み、角質層を含まない。）における一定断面積あたりの表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比が１．８％以上であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の実施におけるコラーゲンは特に限定されず、種々のコラーゲンが対象とされるが、Ｉ型コラーゲンを好適に利用できる。コラーゲン含有原料としては、コラーゲンを含有する原料であれば何れの材料も使用でき、哺乳類動物（例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ネズミ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器などが例示されるが、好ましくはウシ由来のものが例示される。
【００１７】
本発明の実施における繊維芽細胞は、哺乳類由来のものであれば特に限定されないが、ヒト由来の繊維芽細胞が好ましい。繊維芽細胞は皮膚繊維芽細胞を好適に用いることができる。繊維芽細胞は、胎児由来、新生児由来、成人由来などいずれの年齢由来のものも用いることができる。繊維芽細胞は単一ドナー由来のものでもよく、複数ドナー由来の混合であってもよい。また、初代培養細胞と継代培養細胞のいずれをも用いることができるが、第５代以下の継代培養細胞を用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の実施形態において、表皮角化細胞は哺乳類由来のものであれば特に限定されないが、ヒト由来の表皮角化細胞が好ましい。表皮角化細胞は、胎児由来、新生児由来、成人由来などいずれの年齢由来のものも用いることができる。表皮角化細胞は単一ドナー由来のものでもよく、複数ドナー由来の混合であってもよい。また、初代培養細胞と継代培養細胞のいずれをも用いることができるが、第５代以下の継代培養細胞を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明におけるメラノサイトは、ヒト表皮由来のものを好適に用いることができる。メラノサイトはいずれの年齢由来のものを使用することができるが、好ましくは新生児由来のメラノサイトを用いることができる。黒人由来、白人由来、黄色人種由来のいずれのドナー由来のものを用いることができる。メラノサイトは単一ドナー由来のものでもよく、複数ドナー由来の混合であってもよい。また、初代培養細胞と継代培養細胞のいずれをも用いることができるが、第５代以下の継代培養細胞を用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の３次元培養皮膚モデルは、例えば以下の方法により作製することが出来る。
まず線維芽細胞およびコラーゲンを含む真皮同等物をトランスウェルなどの支持膜体のある培養基の中に作製する。線維芽細胞は市販されている凍結ヒト線維芽細胞をフラスコで拡大培養し回収したものが好適に用いることができる。
【００２１】
コラーゲンと線維芽細胞を混合したものを一定期間培養すると、繊維芽細胞の働きによってコラーゲンが収縮し、真皮同等物が形成される。しかる後に、真皮同等層の上にメラノサイトを播種する。メラノサイトは、市販の凍結ヒトメラノサイトを好適に用いることができる。この場合、フラスコで拡大培養したメラノサイトをトリプシンで消化、分散させた後に回収し、培養液中に懸濁状態にして播種するのが好ましい。
【００２２】
本発明における実施態様では、メラノサイト播種を行う際、メラノサイトを真皮同等物上に効率よく接着そして生着させるため、メラノサイトだけではなく、同様に懸濁液状態にした繊維芽細胞あるいは表皮角化細胞を混合するなどして同時に播種することが好ましい。こうすることで、メラノサイトを単独で播種する場合に比べ格段にメラノサイトの生着効率が良くなる。
【００２３】
メラノサイト（MC）と線維芽細胞（FB）あるいは表皮角化細胞（KC）の細胞数の比は、MC：FBあるいはMC：KC＝１：１０〜１０：１、好ましくは１：２〜２：１の間が良いが、特に限定はされない。播種する細胞数は皮膚モデルの大きさ等により変化するが、メラノサイトあるいは繊維芽細胞や表皮角化細胞の播種数、液量は当業者であれば適宜選択できる。
【００２４】
メラノサイトと線維芽細胞あるいは表皮角化細胞は共存の効果があれば少し時間をずらして別々に播種しても構わず、必ずしも混合して播種する必要はない。
【００２５】
また、細胞が凝集塊を形成するのを防ぎ分散性を向上させ、また細胞接着性も向上させる目的で細胞懸濁液に少量のコラーゲンを添加しても構わない。
【００２６】
メラノサイトを真皮同等物上に播種した後、一定時間をかけて培養を行いメラノサイトを生着させる。この工程の培養時間はメラノサイトが接着されるに充分な時間であれば特に限定されないが、８時間以上が好ましく、さらには２４時間以上が好ましい。ただし培養時間が長すぎるとこの時点でメラノサイトの色素産生が亢進してしまうため、１２０時間を越えることは好ましくなく、可能であれば７２時間以下が好ましい。メラノサイトが接着したことを確認する方法は、特に限定されないが、例えば、作製した組織切片をフォンタナマッソン染色することによりメラノサイトが黒く染まることで確認できる。
【００２７】
メラノサイトを生着させた後、表皮層を形成させるために表皮角化細胞を播種し、更に培養する。表皮角化細胞は、市販の凍結ヒト表皮角化細胞をフラスコで拡大培養し回収したものを好適に用いることができる。ここから更に一定期間培養した後（４〜７日が好ましい）、上面を空気に暴露した状態にして更に培養を行い表皮重層化および角質形成をさせ（空気暴露培養）、本発明の３次元培養皮膚モデルを完成させる。
【００２８】
ヒト生体皮膚における表皮層に存在する表皮角化細胞（ケラチノサイト）数に対するメラノサイト数の比は約５％であり、本発明の３次元培養皮膚モデルにおけるメラノサイト数／ケラチノサイト数比は生体皮膚に極めて近似したものである。生体皮膚表皮層におけるメラノサイト存在比については、非特許文献２などに記載がある。
【００２９】
本発明の３次元培養皮膚モデルの実施態様における、表皮層（表皮基底層を含み、角質層を含まない）に存在する一定断面積当たりの表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比は、１．８％以上であり、好ましくは２．５％以上、より好ましくは３．５％以上であり、更に好ましくは４．５％以上である。空気培養暴露後１日目〜１４日目において、これらの数値以上の比を維持していることが好ましい。１．８％以下では皮膚モデルの着色が薄く、目視による黒色化の確認が難しい。一方、表皮層に存在する表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比が大きくなると、ヒト生体に比べてメラニンを多量に産生し、ヒト生体皮膚のモデルとして使用することがはばかられる。したがって、表皮層に存在する表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比は２０％以下が好ましく、さらに１０％以下であることが好ましい。
【００３０】
表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比は、一定断面積あたりのメラノサイトの細胞数を表皮角化細胞の細胞数で割ることにより算出される。一定断面積とは、３次元培養皮膚モデルの縦断面において、表皮層及び表皮基底層を含み、真皮層及び表皮角質層を含まない一定範囲の面積のことをいう。本発明の比の算出における一定断面積は、正方形または円形の２ｍｍ２であり、この範囲内で細胞数が計測される。
【００３１】
また、表皮層に存在する一定断面積当たりのケラチノサイト数に対するメラノサイト数の比を１０サンプル測定した場合に、その平均値が３．０％以上であることが好ましく、より好ましくは４．０％以上であり、更に好ましくは４．５％以上である。しかし、表皮層に存在する表皮角化細胞数に対するメラノサイト数の比が大きくなると、ヒト生体に比べてメラニンを多量に産生してしまうため、表皮層に存在するケラチノサイト数に対するメラノサイト数の比は２０％以下が好ましく、さらに１０％以下であることが好ましい。
【００３２】
本発明を実施する態様の一つは、上記の３次元培養皮膚モデルを用いて紫外線照射の皮膚に対する影響を調べることが出来る。皮膚の色素形成のメカニズムの解明や、日焼けやシミに関する生理学的試験を行うことができる。
【００３３】
また、これを応用して紫外線照射に対する薬剤の効果を調べ、薬剤評価を行うことが出来る。例えば一定期間、本発明の３次元培養皮膚モデルの上面への紫外線照射と薬剤の添加を繰り返し、その後、皮膚組織内のメラニン量を測定すること等により薬剤の評価を行うことが出来る。更なる薬剤の評価として、例えば薬剤の皮膚の透過性または吸収性、薬剤有効性や適合性、皮膚への毒性などの試験に利用することができる。本発明に係る３次元培養モデルはヒトの生体皮膚を再現したものであり、動物実験では完全に再現することのできなかったヒトの皮膚への影響をより正確に試験することができる点で特に有利である。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、日焼け止めや美白剤などの化粧品の開発や有効性、安全性等の試験のために３次元培養皮膚モデルを使用する方法である。日焼け止め化粧料には、ベンゾフェノン系化合物、パラアミノ安息香酸化合物、ケイ皮酸系化合物等の紫外線吸収剤や、酸化チタン、微粒子酸化チタン、酸化亜鉛、微粒子酸化亜鉛等の紫外線散乱剤が配合されている。美白剤としては、アルブチン、アスコルビン酸及びその誘導体、コウジ酸、ビタミンC誘導体などがよく用いられている。本発明に係る３次元培養皮膚モデルはヒトの生体皮膚に極めて近似するため、ヒト皮膚の自然な色素形成を再現でき、日焼け止め化粧料や美白剤のテストをするのに有利である。
【００３５】
本発明の別の側面は、前述した３次元培養皮膚モデルの製造方法に関する。
【００３６】
すなわち、下記の工程を含む。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養して、真皮同等物の層を作製する工程。コラーゲン溶液に繊維芽細胞懸濁液を混合し３〜１０日間、好ましくは５〜７日間培養することにより、ヒト皮膚の真皮層に近似した真皮同等物の層を作製する。
【００３７】
（２）真皮同等物の層にメラノサイトを繊維芽細胞または表皮角化細胞を共に播種する工程。メラノサイト（MC）と線維芽細胞（FB）あるいは表皮角化細胞（KC）の細胞数の比で、MC：FBあるいはMC：KC＝１：１０〜１０：１、好ましくは１：２〜２：１の割合で播種する。これらは混合して播種することが好ましいが、メラノサイトと繊維芽細胞あるいは表皮角化細胞は共存の効果があれば別々に播種しても良い。その後数時間〜５日間、好ましくは１〜３日間培養し、メラノサイトを真皮同等物層に生着させる工程を含めることが好ましい。
【００３８】
（３）メラノサイトが生着した真皮同等物の層上に表皮角化細胞を播種し、３次元培養する工程。メラノサイトの播種後、さらに表皮角化細胞懸濁液を添加する。添加後、表皮角化細胞を真皮同等物の層全体に進展し、さらに十分量まで増殖させるため、２〜７日間、好ましくは３〜５日間培養する工程を加えることが好ましい。その後、表皮角化細胞が空気中に晒されるように培地量を調整し、空気暴露培養を４〜７日間、さらにそれ以上行うことにより、表皮の重層化及び角質層を形成させ、３次元培養皮膚モデルが作製される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例および試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
（実施例１）
３次元培養皮膚モデルの作製
（１）培養皮膚支持体コラーゲンゲル（真皮同等物）の作製：
コラーゲンゲル作製方法はベルらの方法（Ｂｅｌｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  第７６巻、第１２７４項、１９７９）に準じて行った。オルガノジェネシス社から購入したヒト繊維芽細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛血清含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ＳＩＧＭＡ製）にて培養し、サブコンフルエントに達した後、同培地にて細胞を回収し、繊維芽細胞懸濁液を得た。４℃において、９容量のウシＩ型コラーゲン溶液に１容量の１０倍濃度のＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）培地（ギブコ社製）を加え、重曹をｐＨが中性付近になるまで攪拌しながら加えた。さらに１０％（ｖ／ｖ）量の牛血清を加えた後、上記繊維芽細胞懸濁液を最終細胞濃度が２．５×１０４  個／ｍｌになるようゆっくり加え、良く攪拌した。
【００４１】
上記のようにして得られた混合溶液を６ウェル細胞培養プレートに入ったトランスウェル（コースター社製、Ｃｏｄｅ：９１０３）の内側に３ｍｌずつ加え、室温（１８℃から２８℃の範囲の温度）にて１５分間静置してゲル化させた。上記コラーゲンゲルに１０％（ｖ／ｖ）牛血清含有ＤＭＥＭ培地を静かに添加して、３７℃、１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２  条件下で５〜７日間培養し、繊維芽細胞の作用によってコラーゲンゲルを収縮させた後、培養皮膚の支持体に供した。
【００４２】
（２）メラノサイト播種（共培養）：
メラノサイトはクラボウ社から購入したメラノサイト（Ｃｏｄｅ：ＮＨＥＭ−ＭＰ）を、メラノサイト増殖培地（クラボウ、Ｃｏｄｅ：ＫＭ−６３５０）で培養し、サブコンフルエントに達した時点でトリプシンで消化、分散させた後、同培地にて回収し、メラノサイト懸濁液を得た。同様に、オルガノジェネシス社から購入したヒト表皮角化細胞を、ＤＭＥＭ：ＨＡＭ  Ｆ１２＝３：１を基礎とする増殖培地で培養し、サブコンフルエントに達した時点でトリプシンで消化、充分に分散させた後、同培地にて回収し、表皮角化細胞懸濁液を得た。
【００４３】
このメラノサイト懸濁液と表皮角化細胞懸濁液を混合し、メラノサイトと表皮角化細胞
の最終細胞濃度がそれぞれ、１．２×１０５個／ｍｌ、２．４×１０５個／ｍｌになるように調製した。また、細胞の分散性を向上させるためコラーゲンを全懸濁液量に対し、１／６量（ｖ／ｖ）加え調製した。
【００４４】
（１）で作製した、収縮させたコラーゲンゲル（真皮同等物）の培地を抜き取った後に、このメラノサイトと表皮角化細胞の混合懸濁液を８０μｌ／ウェルづつ真皮同等物層の上に添加した。この後、再び１０％（ｖ／ｖ）牛血清含有ＤＭＥＭ培地とメラノサイト増殖培地の等量混合培地を１ウェルあたり９ｍｌ添加し、３日間培養しメラノサイトを真皮同等物層に生着させた。
【００４５】
（３）表皮角化細胞播種：
表皮角化細胞の播種、培養はベルらの方法（Ｐａｒｅｎｔｅａｕ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  第４５巻、第２４５項、１９９１）に従い行った。すなわち、オルガノジェネシス社から購入したヒト表皮角化細胞をＤＭＥＭ：ＨＡＭ  Ｆ１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ）＝３：１を基礎とする増殖培地で培養し、サブコンフルエントに達した時点でトリプシンで消化、充分に分散させた後、Ｅｐｉｄｅｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  用培地（東洋紡績製）に懸濁して細胞懸濁液を作製した。メラノサイト播種後、３日間培養したコラーゲンゲル（真皮同等物）の培地を抜き取った後に、真皮同等物上に同細胞懸濁液を細胞が０．５×１０５〜１×１０５  個／ｃｍ２  になるように添加した。次いで、前記培地を１ウェルあたり９ｍｌ静かに添加し、３７℃、１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２  条件下で５日間培養し、表皮角化細胞を充分伸展、増殖させた。次に、Ｃａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ  Ｆ１２＝１：１を基礎とするＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  用培地（東洋紡績製）を、真皮層が培養液下で、かつ表皮角化細胞が空気中に暴露するよう添加した（空気暴露培養）。この空気暴露培養を６日間行い、表皮層、角質層を形成させメラノサイト含有３次元培養皮膚モデルを作製した。
【００４６】
（４）フォンタナ・マッソン染色
前記方法にて作製した３次元培養皮膚モデルについて、それぞれ空気暴露培養開始後１日目、３日目、７日目、１０日目、および１４日目に皮膚組織をホルマリン固定、パラフィン包埋し、常法通りに組織切片を作製した。作製した組織切片についてヘマトキシリンエオジン染色およびフォンタナ・マッソン染色を施し、表皮形成過程におけるメラノサイトの所在を観察した。空気暴露培養開始後１日目、３日目、７日目、１０日目には更に、組織切片の一定断面積（約２ｍｍ２）の表皮層内に存在する表皮角化細胞（KC）およびメラノサイト（MC）数を数え、その存在比を求めた。
【００４７】
（比較例１）
比較例１では、実施例１における真皮同等物上へのメラノサイト播種の工程において、まずメラノサイトのみを播種し、その後３日後に表皮角化細胞を播種した。それ以外の工程は実施例１と同様に行い、３次元培養皮膚モデルを作製した。また、実施例１と同様、組織染色を行い、一定断面積（２ｍｍ２）の表皮層内に存在する表皮角化細胞（KC）およびメラノサイト（MC）数を数え、その存在比を求めた。
【００４８】
図１〜図４に示すとおり、空気暴露培養７日後のフォンタナ・マッソン染色の結果、実施例１ではメラノサイトが表皮基底層に生着しているのに対し、比較例１では基底層に生着しているメラノサイトの数が少なかった。一部メラノサイトが表皮層の上部に押し上げられている様子が観察された。基底層に生着する空気暴露培養１４日においても実施例１では、多数のメラノサイトが基底層に生着していた。本発明では、空気暴露培養後の表皮形成過程において終始メラノサイトは表皮基底層に存在しており、基底層への生着が確認できた。
【００４９】
また、表１に示すとおり、表皮層内に存在する表皮角化細胞（KC）およびメラノサイト（MC）数を数えてその存在比を求めた結果、実施例１においては、１、３、７、１０日目においてもメラノサイトの割合に有意な差はなく、生体皮膚に近似したメラノサイト数が表皮層に存在し、表皮基底層に生着していることが確認できた。
一方、比較例１においては空気暴露培養１日目のメラノサイトの割合は比較的高いものの、その後は急速に存在比が低下する傾向を示した。これは、表皮層の重層化に伴ってメラノサイトが表皮上層に押しやられてしまい、メラノサイトが基底層に生着できずに機能を失ったり死んでいくことを示していると思われた。
この結果から、本発明の３次元培養皮膚モデルが、ヒト皮膚に近似したモデルとして有用であることが明らかとなった。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
【表４】
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【００５４】
（実施例２）
紫外線照射
（１）紫外線照射
上記方法にて作製した３次元培養皮膚モデルに紫外線照射装置（ＤＮＡ−ＦＩＸ、アトー社）を使って、紫外線（ＵＶＢ）（波長３１２ｎｍ）を照射した。照射量は、５０ｍＪ／ｃｍ２とし、４日間連続で計４回を照射した。対照群は、紫外線は照射しないで照射群と同様の操作を行った。
【００５５】
（２）メラニン定量
４回目の紫外線照射から２４時間後、メラニン色素を含む中央部分の皮膚組織を直径１２ｍｍの大きさで切り取った。切り取った皮膚組織を３００μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中でホモジナイズし、３７℃で一晩インキュベートした後、メタノール：クロロホルム（１：２）の混合液を１００μｌ添加し激しく攪拌した。これを遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ社 CF 16RX 型）を用いて１１０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を９６ウェルプレートに１００μｌ分取し、４１５ｎｍの吸光度を測定した（吸光測定機：Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｌａｓｓｉｃ，ＴＥＣＡＮ社）。同様に処理したメラニン標準液についても測定し、検量線を描いてサンプルのメラニン量を求めた。
【００５６】
４日間のＵＶＢ照射により、肉眼観察において紫外線照射群は非照射群に対して強い黒色化が観察された。メラニン量を測定した結果、図５に示す通り、ＵＶＢ照射では、非照射群に対し、著明にメラニン量が多かった。即ち、本発明の３次元培養皮膚モデルは紫外線照射に対し、良好に反応しメラニン産生量が亢進した。
【００５７】
（比較例２）
比較例１と同じ方法にて作製した３次元培養皮膚モデルを用い、実施例２と同様の紫外線照射実験を実施した。
【００５８】
その結果、比較例２において、４日間のＵＶＢ照射により、メラニン量を測定した結果、図６に示す通り、ＵＶＢ照射群は非照射群に対しメラニン量が多い傾向を示すものの、統計学的な有意差は認められなかった。即ち、本発明の３次元培養皮膚モデルを用いれば紫外線照射の影響を鋭敏に捉えることが可能である。
【００５９】
（実施例３）
美白剤の評価
実施例１に記載の方法で作製したこの３次元培養皮膚モデルを用い美白剤の評価を実施した。
【００６０】
（１）美白剤の添加
実施例１に記載の方法で作製する３次元培養皮膚モデルにおいて、空気暴露培養を６日〜８日行い角質層を含む表皮層を形成させた後に、美白剤であるコウジ酸（１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳに溶解）を１日１回、皮膚組織上に５０μlづつ添加した（コウジ酸添加群）。対照群には、ＰＢＳを同様に５０μづつ毎日添加した。なお、美白剤添加を開始した日から、ＤＭＥＭ：ＨＡＭ  Ｆ１２＝１：１を基礎とするＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  用培地（東洋紡績製）に新生児子牛血清、インシュリン、トランスフェリン、ハイドロコルチゾン、およびαメラノサイト刺激ホルモン、ｂＦＧＦを添加した培地を使用し、光（紫外線を含む）不存在条件下で培養した。
【００６１】
（２）メラニン定量
コウジ酸添加開始から１４日後、メラニン色素を含む中央部分の皮膚組織を直径１２ｍｍの大きさで切り取った。切り取った皮膚組織を３００μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中でホモジナイズし、３７℃で一晩インキュベートした後、メタノール：クロロホルム（１：２）の混合液を１００μｌ添加し激しく攪拌した。これを遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ社 CF 16RX 型）を用いて１１０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を９６ウェルプレートに１００μｌ分取し、４１５ｎｍの吸光度を測定した（吸光度測定機：Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｌａｓｓｉｃ，ＴＥＣＡＮ社）。同様に処理したメラニン標準液についても測定し、検量線を描いてサンプルのメラニン量を算出した。
【００６２】
この結果、図７に示すとおり、コウジ酸添加群では対照群に比べ、皮膚組織中のメラニン量が著明に少なかった。すなわち本モデルの使用により、美白剤の効果を検出することが出来た。
【００６３】
（実施例４）
紫外線照射に対する美白剤の効果
（１）紫外線照射
実施例１記載の方法で作製した３次元培養皮膚モデルに紫外線照射装置（ＤＮＡ−ＦＩＸ、アトー社）を使って、紫外線（ＵＶＢ）（波長３１２ｎｍ）を照射した。照射量は、５０ｍＪ／ｃｍ２とし、７日間連続で計７回を照射した。
（２）美白剤の添加
（１）で紫外線照射を行った皮膚組織上に、美白剤であるコウジ酸（１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳに溶解）を１日１回、紫外線照射直後に５０μｌづつ添加した（コウジ酸添加群）。対照群には、同様に紫外線照射直後にＰＢＳを５０μｌづつ１日１回添加した。
（３）メラニン定量
７回目の紫外線照射から２４時間後、メラニン色素を含む中央部分の皮膚組織を直径１２ｍｍの大きさで切り取った。切り取った皮膚組織を３００μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中でホモジナイズし、３７℃で一晩インキュベートした後、メタノール：クロロホルム（１：２）の混合液を１００μｌ添加し激しく攪拌した。これを遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ社 CF 16RX 型）を用いて１１０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を９６ウェルプレートに１００μｌ分取し、４１５ｎｍの吸光度を測定した（吸光度測定器：Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｌａｓｓｉｃ，ＴＥＣＡＮ社）。同様に処理したメラニン標準液についても測定し、検量線を描いて各サンプルのメラニン量を求めた。
【００６４】
図８に示す通り、ＵＶＢ照射後にコウジ酸を添加した群では、ＵＢＶ照射後にＰＢＳを添加した群に対して、皮膚組織中のメラニン量が著明に少なかった。即ち、本発明の３次元皮膚モデルを用いることにより、紫外線を受けた皮膚に対する薬剤の効果を検出することが出来た。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、紫外線照射によるシミや皮膚の老化などのメカニズム解明やこうした症状を改善する薬剤の開発、皮膚科学研究に有用な動物代替モデルとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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