(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光標識試薬として有用な新規な芳香族置換キサンテン色素及び、それを用いる混合物中の複数の空間的に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮＡ配列決定法の検出法等、を提供する。【解決手段】蛍光色素として有用な芳香族置換キサンテン化合物のクラスが開示されており、この化合物は、一般構造（Ｉ）を有し、2011178999.tif 000036ここで、Ｙ１およびＹ２は、別々に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、連結基およびアミンからなる群から選択されるか、またはＹ１は、Ｒ２と一緒になって、環状イミンであるか、またはＹ２は、Ｒ３と一緒になって、環状アミンである；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、別々に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニルおよび連結基からなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の属する技術分野］
本発明は、一般に、分子プローブとして有用な蛍光色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用な芳香族置換キサンテン色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
［従来の技術］
蛍光色素を利用する生物学的分析物の非放射性検出は、現在の分析バイオテクノロジーにおいて、重要な技術である。放射性標識の必要性をなくすことにより、安全性が高まり、試薬廃棄物の環境上の影響が著しく低下する。このような蛍光検出方法を使用する方法の例には、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ鎖反応生成物の検出、イムノアッセイなどが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多くの重要な用途では、混合物中の複数の空間的に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮＡ配列決定法などが必要である。複数座のＤＮＡプローブアッセイの場合には、分光的に識別可能な蛍光標識を用いることにより、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの製造が容易になる。自動化したＤＮＡ配列決定の場合には、多色蛍光標識化により、単一レーンの複数の塩基の分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力が増え、レーン間の電気泳動の移動度の変化に付随した不確実性が減少する。
【０００４】
多色蛍光検出では、特に、単一励起光源、電気泳動分離および／または酵素での処置が必要な適用（例えば、自動化蛍光ベースＤＮＡ配列決定）に対して、色素標識の選択について、５つの厳しい制約が課せられている。第１に、色素の発光スペクトルが分光的に分解される一連の色素を見出すことが困難である。なぜならば、有機蛍光色素の典型的な発光バンドの半値幅は、約４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源により制限されるからである。第２に、たとえ、非重複発光スペクトルを有する色素を見出しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、そのセットは、依然として、適切ではないかもしれない。第３に、数個の蛍光色素を同時に使用するとき、これらの色素の吸収バンドが広範囲に分離するために、同時励起が困難となる。第４に、これらの色素の電荷、分子サイズおよび立体配座は、その分析物の電気泳動移動度に悪影響を与えてはならない。第五に、これらの蛍光色素は、これらの分析物を生成するかまたは処置するのに使用する化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合性でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの局面において、本発明は、次式を有する芳香族置換キサンテン色素化合物であって：
【０００６】
【化１３】
2011178999.tif 000002
【０００７】
ここで：
Ｙ１およびＹ２は、別々に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、連結基およびアミンからなる群から選択されるか、またはＹ１は、Ｒ２と一緒になって、環状アミンであるか、またはＹ２は、Ｒ３と一緒になって、環状イミンである；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、別々に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニルおよび連結基からなる群から選択される；
Ｒ１は、別々に、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族および電子リッチ複素環からなる群から選択されるか、またはＲ７と一緒になるとき、電子リッチ複素環およびインデンからなる群から選択される；
Ｒ４は、別々に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニル、連結基、アミン、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環からなる群から選択されるか、またはＲ５と一緒になるとき、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環からなる群から選択される；そして
Ｒ６は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、置換フェニル、複素環芳香族およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、上記置換フェニルは、以下の構造を有する：
【０００８】
【化１４】
2011178999.tif 000003
【０００９】
ここで：
Ｘ１〜Ｘ５は、別々に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨまたは連結基である、
芳香族置換キサンテン色素化合物を提供する。
【００１０】
好ましい実施形態において、上記Ｒ１は、Ｒ７と一緒になって、２位および３位が上記キサンテン環に縮合したベンゾフランであり得る。
【００１１】
好ましい実施形態において、上記Ｒ４は、Ｒ５と一緒になって、２位および３位が上記キサンテン環に縮合したベンゾフランであり得る。
【００１２】
好ましい実施形態において、上記Ｒ２およびＲ３は、水素であり得る。
【００１３】
好ましい実施形態において、上記Ｒ４は、クロロであり、そしてＲ２およびＲ３が、水素であり得る。
【００１４】
好ましい実施形態において、上記Ｒ１およびＲ４は、フェニルおよび置換フェニルからなる群から選択され得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、上記Ｒ２およびＲ３は、水素であり、そしてＲ６は、置換フェニルであり、ここで、Ｘ２およびＸ５は、クロロであり、そしてＸ１は、カルボン酸であり得る。
【００１６】
好ましい実施形態において、上記Ｒ１は、ナフチルおよび置換ナフチルからなる群から選択され得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、上記Ｒ４は、ナフチルおよび置換ナフチルからなる群から選択され得る。
【００１８】
好ましい実施形態において、上記Ｒ６は、置換フェニルであり、ここで、Ｘ２およびＸ５は、クロロであり、そしてＸ１は、カルボン酸であり得る。
【００１９】
好ましい実施形態において、上記Ｒ２およびＲ３は、Ｈであり得る。
【００２０】
好ましい実施形態において、上記Ｒ２およびＲ３は、フルオロであり得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、上記Ｒ４は、Ｒ５と一緒になって、フェニルまたは多環式芳香族であり得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、上記Ｒ６は、置換フェニルであり、ここで、Ｘ２およびＸ５は、クロロであり、そしてＸ１は、カルボン酸であり得る。
【００２３】
好ましい実施形態において、上記Ｒ１は、Ｒ７と一緒になって、２位および３位が上記キサンテン環に縮合したベンゾフランであり得る。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記Ｒ２は、Ｈであり、そしてＲ３は、フッ素であり得る。
【００２５】
好ましい実施形態において、上記Ｒ１は、ナフチルであり得る。
【００２６】
好ましい実施形態において、上記Ｒ７は、Ｈであり、そしてＲ２およびＲ３は、フッ素であり得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、上記Ｒ１は、フェニルであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｃｌであり、そしてＲ６は、置換フェニルであり、ここで、Ｘ２およびＸ５は、クロロであり、そしてＸ１は、カルボン酸であり得る。
【００２８】
別の局面において、本発明は、以下を包含するエネルギー移動色素であって：
供与体色素であって、上記供与体色素は、第一波長で光を吸収し、それに応答して、励起エネルギーを放射できる、色素；
受容体色素であって、上記受容体色素は、上記供与体色素により放射された上記励起エネルギーを吸収して、それに応じて、第二波長で蛍光を発することができる、色素；および
上記供与体色素および上記受容体色素を連結するためのリンカーであって、上記リンカーは、上記供与体色素および上記受容体色素間のエネルギーの効率的な移動を促進するように働く、リンカー；
ここで、上記供与体色素および上記受容体色素の少なくとも１個は、上に記載の芳香族置換キサンテン色素である、
エネルギー移動色素を提供する。
【００２９】
好ましい実施形態において、上記リンカーは、以下の構造を有し、
【００３０】
【化１５】
2011178999.tif 000004
【００３１】
ここで、
Ｚ１は、ＮＨ、イオウおよび酸素からなる群から選択される；
Ｒ２１は、上記供与体色素に結合した低級アルキルである；
Ｒ２２は、アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも１個の不飽和結合を有する５員環および６員環、ならびに上記カルボニル炭素に結合した縮合環構造からなる群から選択される、置換基である；そして
Ｒ２８は、上記リンカーを上記受容体色素に結合する官能基を含有し得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、上記Ｒ２２が、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレンからなる群から選択される５員環または６員環であり得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、上記リンカーは、以下の構造を有し、
【００３４】
【化１６】
2011178999.tif 000005
【００３５】
ここで、
Ｚ２は、ＮＨ、イオウおよび酸素からなる群から選択される；そして
Ｒ２９は、低級アルキルであり得る。
【００３６】
好ましい実施形態において、上記リンカーが、以下の構造
【００３７】
【化１７】
2011178999.tif 000006
【００３８】
を有し得る。
【００３９】
別の局面において、本発明は、次式を有する標識化ヌクレオシド／ヌクレオチドであって：
ＮＵＣ−ＤＹＥ
ここで、
ＮＵＣは、ヌクレオシド／ヌクレオチドまたはヌクレオシド／ヌクレオチドアナログである；
ＤＹＥは、上に記載の芳香族置換キサンテン色素化合物であって、ＮＵＣおよびＤＹＥは、連結により接続される；
ここで、上記連結は、Ｒ１〜Ｒ６位の１個にて、ＤＹＥに結合される；そして
ここで、ＮＵＣがプリン塩基を含有する場合、上記連結は、上記プリンの８位に結合され、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含有する場合、上記連結は、７−デアザプリンの７位に結合され、そしてＮＵＣがピリミジン塩基を含有する場合、上記連結は上記ピリミジンの５位に結合される、
標識化ヌクレオシド／ヌクレオチドを提供する。
【００４０】
好ましい実施形態において、上記ＮＵＣは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００４１】
好ましい実施形態において、上記連結は、以下
【００４２】
【化１８】
2011178999.tif 000007
【００４３】
であり得る。
【００４４】
別の局面において、本発明は、次式を有するホスホロアミダイト化合物であって：
【００４５】
【化１９】
2011178999.tif 000008
【００４６】
ここで：
Ｘは、スペーサーアームである；
Ｙは、連結である；
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基である；
Ｂ２およびＢ３は、別々に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択される；そして
Ｄは、上に記載の色素化合物である；
ここで、ＹおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ６位のうちの１個でＤに結合した連結により、連結される、
ホスホロアミダイト化合物を提供する。
【００４７】
好ましい実施形態において、上記Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、その主鎖に５個までの炭素原子、および全体で１０個までの炭素原子を含有するアルケン鎖を形成し、上記鎖の両末端原子価結合は、上記窒素原子に結合している；またはＢ２およびＢ３は、上記窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し、上記飽和窒素複素環は、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、上記Ｂ１は、メチル、β−シアノエチルまたは４−ニトロフェニルエチルからなる群から選択され、
Ｂ２およびＢ３は、別々に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチルおよびｓｅｃ−ブチルからなる群から選択され、そして
Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノであり得る。
【００４９】
好ましい実施形態において、上記ＸおよびＹが、一緒になって、以下であり、
【００５０】
【化２０】
2011178999.tif 000009
【００５１】
ここで、ｎは、２〜１０であり得る。
【００５２】
好ましい実施形態において、上記ＸおよびＹが、一緒になって、以下であり、
【００５３】
【化２１】
2011178999.tif 000010
【００５４】
ここで、ｎは、２〜１０であり得る。
【００５５】
別の局面において、本発明は、次式を有するホスホロアミダイト化合物であって：
【００５６】
【化２２】
2011178999.tif 000011
【００５７】
ここで：
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基である；
Ｂ２およびＢ３は、別々に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択される；
Ｂ５は、酸開裂可能ヒドロキシル保護基である；
Ｂは、ヌクレオチド塩基である；そして
Ｄは、上に記載の色素化合物である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、上記糖部分は、上記プリンまたは７−デアザプリンのＮ９位で結合されており、そしてＢがピリミジンである場合、上記糖部分は、上記ピリミジンのＮ１位で結合されている；
ここで、ＢおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位のうちの１個でＤに結合された連結を介して連結されている；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、上記連結は、上記プリンの８位に結合されており、Ｂが７−デアザプリンである場合、上記連結は、上記７−デアザプリンの７位に結合されており、そしてＢがピリミジンである場合、上記連結は、上記ピリミジンの５位に結合されている、
ホスホロアミダイト化合物を提供する。
【００５８】
好ましい実施形態において、上記Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００５９】
別の局面において、本発明は、ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、上記方法は、以下の工程：
以下のようにして、第一、第二、第三および第四のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程：
上記第一のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、そして第一色素で標識されている；
上記第二のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、そして第二色素で標識されている；
上記第三のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、そして第三色素で標識されている；
上記第四のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、そして第四色素で標識されている；
ここで、上記第一、第二、第三または第四の色素のうちの１個は、上に記載の芳香族置換キサンテン色素である；
上記色素の他のものは、上記非対称ベンゾキサンテン色素から、および互いから、スペクトル的に分解可能である；
上記ポリヌクレオチドを電気泳動によって分離して、それにより、類似の大きさのポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；
上記バンドを、上記色素に蛍光を生じさせることができる照射ビームで照射する工程；および
上記色素の上記蛍光スペクトルにより、上記バンド内の上記ポリヌクレオチドのクラスを同定する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００６０】
別の局面において、本発明は、フラグメント分析の方法であって、上記方法は、以下の工程：
標識化ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、上記フラグメントは、上に記載の芳香族置換キサンテン色素で標識されている、工程；
上記標識化ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスにかける工程；および
上記分離プロセスに引き続いて、上記標識化ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００６１】
好ましい実施形態において、上記サイズ依存性分離プロセスが、電気泳動であり、そして上記標識化ポリヌクレオチドフラグメントが、蛍光により検出され得る。
【００６２】
（要旨）
本発明は、多色蛍光検出のために有用な分光的に分離できる蛍光標識のセットの生成のために適合している芳香族置換キサンテン色素のクラスの発見に関する。本発明は、特別な局面および用いられた実施態様に依存する以下の一つ以上の目的を達成する。
【００６３】
本発明の目的は、レッドシフトした発光スペクトルを有する（例えば、約５４０ｎｍより大きい波長で発光最大の）芳香族置換キサンテン色素化合物のクラスを提供することにある。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、単独励起光源、電気泳動分離、および／または酵素による処置を用いる多色蛍光検出を必要とする適用（例えば、自動化蛍光ベースＤＮＡ配列決定）に適合する芳香族置換キサンテン色素化合物のクラスを提供することにある。
【００６５】
本発明の別の目的は、色素の発光スペクトルが、使用された芳香族置換基のタイプにおける小さな変化により調整され得る芳香族置換キサンテン色素のクラスを提供することにある。
【００６６】
本発明のさらに別の目的は、非芳香族キサンテン色素より実質的に明るい芳香族置換キサンテン色素化合物のクラスを提供することにある。
【００６７】
第一の局面において、本発明の上述の目的および他の目的は、次式を有する芳香族−置換キサンテン色素化合物により達成される。
【００６８】
【化２３】
2011178999.tif 000012
【００６９】
ここで、組成物の変化し得る置換基は以下の通りである。Ｙ１およびＹ２は、別個にヒドロキシル、酸素、イミニウム、連結基およびアミンから成る群から選択され、またはＹ１はＲ２と一緒になって環状アミンであり、またはＹ２はＲ３と一緒になって環状イミンである。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニルおよび連結基から成る群から選択される。Ｒ１は、別個にフェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、連結基、および電子リッチ複素環から成る群から選択され、またはＲ７と一緒になった場合には、電子リッチ複素環およびインデンから成る群から選択される。Ｒ４は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニル、連結基、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環から成る群から選択され、またはＲ５と一緒になった場合には、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環から成る群から選択される。上記構造において、Ｒ４およびＲ１の少なくともひとつは連結基ではない。Ｒ６は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、複素環式芳香族、および下記構造
【００７０】
【化２４】
2011178999.tif 000013
【００７１】
を有する置換フェニルから成る群から選択される；
ここで、Ｘ１〜Ｘ５は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ，または連結基である。
【００７２】
第２の局面において、本発明は、供与体色素および受容体色素、ならびに供与体および受容体色素を連結するリンカーを含有するエネルギー移動色素を包含する。供与体色素は、第１の波長の光を吸収し、それに応答して励起エネルギーを放射する能力を有する。そして受容体色素は、供与体色素から放射された励起エネルギーを吸収し、それに応答して第２の波長で蛍光を発する能力を有する。リンカーは、供与体色素および受容体色素の間の効率的なエネルギー移動を促進するのに役立っている。本発明に従って、供与体色素および受容体色素の少なくともひとつは、上述した構造を有する芳香族−置換キサンテン色素である。
【００７３】
第３の局面において、本発明は下記構造を有する標識ヌクレオシド／ヌクレオチドを包含する；
ＮＵＣ−ＤＹＥ
ここで、ＮＵＣは、ヌクレオシド／ヌクレオチドまたはヌクレオシド／ヌクレオチドアナログであり、そしてＤＹＥは、上述した構造を有する芳香族−置換キサンテン色素化合物である。本発明に従って、ＮＵＣおよびＤＹＥは、連結によって結合し、ここで、連結はＲ１〜Ｒ６位置のひとつでＤＹＥと結合し、そしてＮＵＣがプリン塩基を含有する場合、連結はプリンの８位に結合し、ＮＵＣが７−−デアザプリン塩基を含有する場合、連結は７−デアザプリンの７位に結合し、そしてＮＵＣがピリミジン塩基を含有する場合、連結はピリミジンの５位に結合する。
【００７４】
第４の局面において、本発明は、下記構造を有するホスホロアミダイト化合物を包含する：
【００７５】
【化２５】
2011178999.tif 000014
【００７６】
ここで、Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ  ａｒｍ）であり；Ｙは、連結であり；Ｂ１は、亜リン酸エステルの保護基であり；Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルから成る群から選択され；そしてＤは、上述の構造を有する色素である。ＹおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ６位置のひとつでＤに結合した連結を介して結合する。
【００７７】
第５の局面において、本発明は、下記の式を有するホスホロアミダイト化合物を包含する；
【００７８】
【化２６】
2011178999.tif 000015
【００７９】
ここで、変化し得る置換基は、以下のように定義された。Ｂ１は、亜リン酸エステルの保護基であり；Ｂ２およびＢ３は、別個に低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルから成る群から選択され；Ｂ５は、酸切断可能なヒドロキシルの保護基であり；Ｂは、ヌクレオシド／ヌクレオチド塩基であり、そしてＤは、上述の構造を有する色素化合物である。本発明に従って、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたは７−デアザプリンのＮ９位で結合し、そしてＢがピリミジンである場合、糖部分はピリミジンのＮ１位で結合する。ＢおよびＤはＲ１〜Ｒ６位置のひとつでＤに結合する連結を介して結合する。Ｂがプリンである場合、連結はプリンの８位に結合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、連結は７−デアザプリンの７位に結合し、そしてＢがピリミジンである場合、連結はピリミジンの５位に結合する。
【００８０】
第６の局面において、本発明は、上述の構造を有する芳香族−置換キサンテン色素で標識された標識ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動）に標識ポリヌクレオチドフラグメントを供する工程、および分離プロセスに引き続いて標識ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程を含有するフラグメント分析の方法を包含する。
【００８１】
本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および利点は、以下の記載、図面、および添付の特許請求の範囲を参照すると、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の芳香族−置換キサンテン色素の合成で使用されるいくつかの中間体の構造、および例示的な芳香族−置換キサンテン色素化合物を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の芳香族−置換キサンテン色素の合成で使用されるいくつかの中間体の構造、および例示的な芳香族−置換キサンテン色素化合物を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の芳香族−置換キサンテン色素の合成で使用されるいくつかの中間体の構造、および例示的な芳香族−置換キサンテン色素化合物を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の芳香族−置換キサンテン色素の合成で使用されるいくつかの中間体の構造、および例示的な芳香族−置換キサンテン色素化合物を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の好ましい一般的な合成スキームを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の好ましい一般的な合成スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
［発明の実施の形態］
本発明の好ましい実施態様を、ここで詳細に言及し、その実施例を添付の図面で例示する。本発明は好ましい実施態様に関連して記述されているものの、それらは本発明をこれらの実施態様に限定する意図はないと理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲で定義した本発明の範囲内に含まれ得る代替、改良および等価物を含むことを意図している。
【００８４】
一般に、本発明は、蛍光色素として有用な新規なクラスの芳香族−置換キサンテン色素化合物、そのような色素を合成するための方法および中間体、分子標識としてそのような色素を採用する試薬、ならびにそのような色素および試薬を分析生物工学の領域で利用する方法を包含する。本発明の化合物は、蛍光核酸分析の領域（例えば、自動化蛍光ベースＤＮＡ配列決定およびフラグメント分析、ハイブリダイゼーションアレイおけるプローブハイブリダイゼーションの検出など）において特定の用途が見出されている。
【００８５】
（Ｉ．定義）
他で述べない限り、本明細書で使用される以下の用語および言いまわしは、以下の意味を有すると意図される：
一組の色素に関する「スペクトルの分解能」とは、色素の蛍光発光帯が十分に区別（例えば、十分に重ならない）されることを意味し、それぞれの色素が結合する試薬（例えば、ポリヌクレオチド）は、標準光検出システム（例えば、バンドパスフィルターのシステムおよび光電子増倍管、電荷結合装置およびスペクトログラフなどが用いられ、米国特許第４，２３０，５５８号、同４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐ２１〜７６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）に記載されたシステムで例示される）を使用して、それぞれの色素により生成する蛍光シグナルに基づいて区別され得る。
【００８６】
「連結基」とは、試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーに結合する「相補的官能性」を持って反応し得る部分を意味し、このような反応は、色素が試薬またはエネルギー移動色素対のメンバーに連結する「結合」を形成する。
好ましい連結基は、相補的官能性がアミンである場合は常に、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、または他の反応性カルボキシレートを含む。好ましい連結基は、相補的官能性がスルフヒドリルである場合は常に、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特に好ましい実施態様では、連結基は、相補的官能性アミンと反応する活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、ここで活性化ＮＨＳエステルを形成するため、カルボキシレート連結基を含有する本発明の色素は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応してＮＨＳエステルを形成する。
【００８７】
本明細書で使用される「置換」とは、１個以上の水素原子が水素以外の原子または部分で置き換えられた官能基または部分のことを言う。例示的な置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホ、アミド、ニトリルなどを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
「多環式芳香族」とは、ビアリールおよび縮合ベンゼノイド炭化水素を含む多環構造を有する芳香族炭化水素を意味する。ビアリールとは、２個以上の環が、単一の結合で共に連結されたベンゼノイド化合物である。このクラスの親系統（ｐａｒｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）は、ビフェニルである。縮合ベンゼノイド化合物は、環の各対が２個の炭素を共有するように、２個以上のベンゼン環がオルト位で共に縮合されることを特徴とする。この基の最も単純なメンバーは、２個の環を有するナフタレン、ならびにそれぞれ３個の環を有するアントラセンおよびフェナントレンである。
【００８９】
「電子リッチ複素環」とは、１個以上の環原子が炭素でなく（すなわち、ヘテロ原子である）、そしてヘテロ原子が６π電子系に寄与する不対電子を有する環状化合物を意味する。例示的な電子リッチ複素環は、ピロール、インドール、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェンおよび他の類似構造体を含むがこれらに限定されない。
【００９０】
「低級アルキル」とは、１〜８個の炭素原子を含有する直鎖状および分岐状炭化水素部分を意味する（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなど）。「低級ハロアルキル」とは、１個以上のハロゲン原子置換基、通常はフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを有する低級置換アルキルを意味する。
【００９１】
「低級アルケン」とは、１個以上の炭素−炭素結合が二重結合である、１〜８個の炭素原子を含有する炭化水素を意味する。
【００９２】
「低級アルキン」とは、１個以上の炭素が三重結合で結合された、１〜８個の炭素原子を含有する炭化水素を意味する。
【００９３】
「ヌクレオシド」とは、プリン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）から成る化合物のことを言い、１’位でペントースに結合する。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザアプリンのＮ９位で結合し、そしてヌクレオシド塩基がピリミジンである場合、糖部分はピリミジンのＮ１位で結合する（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）。本明細書中で使用される「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）のことを言い、ここで、エステル化される最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合している水酸基である。本明細書中で使用される「ヌクレオシド／ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を含有する一組の化合物のことを言う。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「アナログ」は、修飾塩基部分、修飾糖部分および／または修飾リン酸部分を有する合成アナログ（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）により一般的に記述される）を含む。リン酸アナログは、リン原子が＋５の酸化状態でありそして１個以上の酸素原子が酸素でない部分で置換された、リン酸アナログを包含する。例示的なアノログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートなどを含有し、会合した対イオンが存在する場合、例えば、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなどの対イオンを含む。例示的な塩基アナログは、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンおよび他の類似のアナログなどを含むが、これらに限定されない。例示的な糖アナログは、２’位が水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよびフェノキシ）、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモである、２’−修飾体を含むがこれらに限定されない。「標識ヌクレオシド／ヌクレオチド」という用語は、式Ｉの色素化合物に連結を介して共有結合したヌクレオシド／ヌクレオチドのことを言う。
【００９４】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、天然のヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの直線状ポリマーを意味し、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドそれらのα−アノマー形などを含む。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合により連結されており、本明細書中で使用する「ホスホジエステル結合」という用語は、ホスホジエステル結合またはそれらのリン酸アナログを含む結合のことを言い、会合した対イオンが存在する場合、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなどの対イオンを含む。このポリヌクレオチドの大きさは、代表的には数個（例えば、８個〜４０個）のモノマー単位から、数千個のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字列で表わされる場合は、常に、このヌクレオチドは、他に記載がなければ、５’→３’の順序で左から右にあり、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表わし、「Ｃ」は、デオキシシチジンを表わし、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表わし、そして「Ｔ」は、チミジンを表わすと理解されるべきである。
【００９５】
「キサンテン色素」は、下記一般式
【００９６】
【化２７】
2011178999.tif 000016
【００９７】
を含む色素のことを言い、それらの任意のおよび全ての置換基のバージョンを含む（ここで、Ｙ１およびＹ２が、別個にヒドロキシル、酸素、イミニウム、連結基およびアミンから成る群から選択される）。
【００９８】
（ＩＩ．芳香族−置換キサンテン色素化合物）
（Ａ．構造）
第１の局面において、本発明は、下記式Ｉで示された一般構造を有する新規なクラスの芳香族−置換キサンテン色素化合物を包含する（本明細書中で提供される任意の分子構造は、提示された正確な電子構造を含むのみならず、その全ての共鳴構造およびプロトン化状態を含むと意図される）。
【００９９】
【化２８】
2011178999.tif 000017
【０１００】
式Ｉに関連して、Ｙ１およびＹ２は、独立してヒドロキシル、酸素、アミン、イミニウム、または連結基のいずれかである。Ｙ１がヒドロキシルでありそしてＹ２が酸素である場合、その化合物はフルオレセインに類似し、一方、Ｙ１がアミンでありそしてＹ２がイミニウムである場合、その化合物はローダミンに類似する。好ましくは、Ｙ１はヒドロキシルであり、そしてＹ２は酸素である。
【０１０１】
Ｒ１〜Ｒ６部分は、この分子の基底および励起状態の電子構造を改変することにより、色素の種々の特性を調節するために用いられる置換基である。特に、Ｒ１〜Ｒ６部分を変えることは、化合物のスペクトル特性、化学的安定性、および光安定性に影響する。例えば、Ｒ６が置換フェニルである場合、特定の置換基Ｘ２およびＸ５を塩素にすると、より狭い発光帯となることが観察される（置換基Ｘ２およびＸ５の定義に関しては下記を参照のこと）。本発明の明細書中で特に重要な置換基は、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７であり（特に、Ｒ１およびＲ４）、ここでそのような置換基とは、芳香族または置換芳香族基である。
【０１０２】
好ましくは、置換基Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、アリール、低級アルコキシ、または連結基である。本発明の好ましい実施態様では、Ｒ２および／またはＲ３は、水素、塩素またはフッ素である。
【０１０３】
置換基Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７の性質は、最も適切な芳香族置換がなされるのがこれらの置換位置であるので、本発明では特に重要である。特に、置換基Ｒ１は、別個にフェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、および電子リッチ複素環であり得る。あるいは、Ｒ７と一緒になった場合、Ｒ１／Ｒ７の組み合わせは、電子リッチ複素環またはインデンであり得る。置換基Ｒ４は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニル、連結基、アミン、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環から成る群から選択され、またはＲ５と一緒になった場合、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環から成る群から選択される。
【０１０４】
置換基Ｒ６は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、複素環式芳香族、または以下の構造を有する置換フェニルであり得る：
【０１０５】
【化２９】
2011178999.tif 000018
【０１０６】
ここで、Ｘ１からＸ５は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、または連結基である。
【０１０７】
色素の発光スペクトルが他の置換色素よりも実質的により狭い本発明の特に好ましい実施様態では、Ｒ６は、置換フェニル（例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号）である。好ましくは、置換フェニルは、Ｘ１がカルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ２ＯＨであり；Ｘ２およびＸ５が別個に水素、塩素、フッ素または低級アルキルであり；ならびにＸ３およびＸ４が別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸または連結基であるように置換される。さらに好ましくは、Ｘ２およびＸ５は、塩素である。さらなる好ましい実施態様では、Ｘ３またはＸ４のひとつは、連結基である。好ましくは、Ｘ１は、カルボン酸である。本発明の色素化合物を含有するホスホロアミダイト化合物を形成するのに特に適したさらなる好ましい実施態様では、Ｘ１またはＸ５のひとつは、環状エステルまたは環状エーテルを形成し得る部分であり、例えば、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、またはスピロ環系を形成する任意の他の基（すなわち、二つの環に共通のひとつの炭素原子を有する二環式化合物（例えば、スピロ［４．５］デカン））である。
【０１０８】
いくつかの例示的な芳香族−置換キサンテン色素構造を図１に示す。化合物２６では、Ｒ１およびＲ４はフェニルであり；化合物２８では、Ｒ１はＲ７と一緒になって電子リッチ複素環であり、そしてＲ４はＲ５と一緒になって電子リッチ複素環であり、より詳細には両方の組み合わせは、２および３位がキサンテン環に縮合したベンゾフランであり；化合物２９では、Ｒ１およびＲ４は別個にそれぞれ多環式芳香族であり、より詳細にはナフタレンであり；化合物２５では、Ｒ１およびＲ４は別個にそれぞれナフタレン、そしてＲ２およびＲ３は別個にフッ素であり；そして化合物３５では、Ｒ１はＲ７と一緒になって２および３位がキサンテン環に縮合したベンゾフランであり、Ｒ３はフッ素であり、そしてＲ４はＲ５と一緒になってフェニルである。
【０１０９】
（Ｂ．合成法）
一般に、本発明の芳香族−置換キサンテン色素は以下のように調製される。
図２Ａ〜Ｂを参照のこと。
【０１１０】
第一に、ハロゲン化フェニル前駆体１を、例えば、アルキルリチウム塩を用いてメタル化して、メタル化された中間体２を形成することにより、１個以上の官能化されたフェノール中間体が調製される。メタル化された中間体は、次いでホウ酸トリメチルと反応させ、続いて加水分解することによりホウ酸３を生成する。ホウ酸３は、次いでブロモフェノールメチルエーテル４とパラジウム触媒のカップリングを起こしてメチル化された置換フェノールエーテルを生成し、これは、続いて三臭化ホウ素を用いて脱メチル化して置換フェノール５を生成する。あるいは、化合物４は、メタル化し、そしてそのホウ酸に変換し、続いてパラジウム触媒により１とカップリングさせて、最終的に５を生成し得る。またブロミド中間体は、パラジウム触媒によりブロミドまたはヨージドと反応する他の中間体に変換し得る（例えば、ホウ酸をアルキルスズ誘導体で置換し得る）。
【０１１１】
非対称色素は、第一の官能基化フェノール中間体５を、酸クロリドのような活性化した酸を含む試薬６と第一に縮合させることにより最も容易に調製される。この縮合は、塩化アルミニウムのようなＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ触媒を用いて実施され、そして芳香族ケトン７を生成し得る。芳香族ケトン７は、次いで高い温度（例えば、８０℃以上）で、強酸（例えば、硫酸）の存在下、第二の官能基化フェノール８と縮合させ、非対称芳香族−置換キサンテン色素９を生成する。
【０１１２】
対称芳香族−置換キサンテン色素は、高い温度（例えば、８０℃以上）で、強酸（例えば、硫酸）の存在下、２当量の置換フェノール中間体５を、活性化された酸（例えば、酸クロリドまたは無水物）を含む１当量の試薬６と縮合させることにより最も容易に調製される。
【０１１３】
（ＩＩ．色素化合物を組み込んだエネルギー移動色素）
別の局面において、本発明は、式Ｉの芳香族−置換キサンテン色素化合物を組み込んだエネルギー移動色素化合物を包含する。一般に、本発明のエネルギー移動色素は、第１の波長の光を吸収し、そしてそれに応答して励起エネルギーを放射する供与体色素、供与体色素により放射された励起エネルギーを吸収し、そしてそれに応答して第２の波長で蛍光を発し得る受容体色素、および供与体色素を受容体色素に結合するリンカーを包含する。このリンカーは供与体色素と受容体色素の間の効率的なエネルギー移動を促進するのに効果的である。そのようなエネルギー移動色素の構造、合成および使用に関する一貫した議論が、Ｌｅｅらの米国特許出願番号第０８／７２６，４６２号、およびＭａｔｈｉｅｓらの米国特許第５，６５４，４１９号により提供される。
【０１１４】
エネルギー移動蛍光色素において、供与体色素を受容体色素に連結するための本発明のひとつのリンカーは、下記一般式を有する；
【０１１５】
【化３０】
2011178999.tif 000019
【０１１６】
ここで、Ｒ２１は供与体色素に結合した低級アルキルであり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素のいずれかであり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくともひとつの不飽和結合を有する５および６員環、またはカルボニル炭素が結合している縮合環構造を含む置換基であり、そしてＲ２８はリンカーを受容体色素に結合する官能基を含む。
【０１１７】
このリンカーのひとつの実施態様（下記に例示）では、リンカーは一般構造
【０１１８】
【化３１】
2011178999.tif 000020
【０１１９】
を有する；
ここで、Ｒ２１およびＲ２２は上記に詳述した通りであり、Ｚ１およびＺ２は独立してそれぞれＮＨ，硫黄または酸素のいずれかであり、Ｒ２９は低級アルキルであり、そして末端カルボニル基は受容体色素の環構造に結合する。Ｚ２が窒素に変わった場合、Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２サブユニットは、アミノ酸サブユニットを形成する。リンカーにおいて、Ｒ２２として使用し得る５または６員環の特定の例は、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジンおよびオキサジンを含むが、これらに限定されない。縮合環構造の例は、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレンを含むが、これらに限定されない。このリンカーの好ましい実施態様は、Ｒ２１およびＲ２９がメチレンである場合、Ｚ１およびＺ２はＮＨであり、そしてＲ２２はベンゼンであり、下記で示される。
【０１２０】
【化３２】
2011178999.tif 000021
【０１２１】
本発明のエネルギー移動色素の局面の別の好ましい実施態様では、リンカーは、置換基Ｒ３の位置でエネルギー移動色素の芳香族−置換キサンテン色素成分に結合する。代替の他の好ましい実施態様では、エネルギー移動色素の芳香族−置換キサンテン色素成分のＲ６は置換フェニルであり、そしてリンカーは置換基Ｘ３またはＸ４の位置のひとつで芳香族−置換キサンテン色素に結合する。
【０１２２】
本発明のエネルギー移動色素の局面のさらに別の好ましい実施態様では、色素対の第一のメンバーは芳香族−置換キサンテンであり、そして色素対の第二のメンバーは、シアニン、フタロシアニン、スクアレイン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、または第一のメンバー以外の異なる置換基を有する芳香族−置換キサンテンである。
【０１２３】
（ＩＩＩ．色素化合物を組込んだ試薬）
別の局面では、本発明は、式Ｉの芳香族置換キサンテン色素化合物で標識された試薬を含む。本発明の試薬は、実質的に、本発明の色素が結合され得る任意のものであり得る。好ましくは、この色素は、試薬に共有結合的に結合する。試薬は、タンパク質、ポリペプチド、ポリサッカライド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機ポリマー、ならびにそれらの組み合わせおよび集合物（例えば、染色体、核、生きた細胞（例えば、細菌、または他の微生物）、哺乳動物細胞、組織など）を含み得るがこれに限定されない。
【０１２４】
（Ａ．ヌクレオシド／ヌクレオチド試薬）
標識試薬の好ましいクラスは、本発明の芳香族置換キサンテン色素を組込むヌクレオシド／ヌクレオチドを含む。このようなヌクレオシド／ヌクレオチド試薬は、酵素的な合成により形成される標識ポリヌクレオチド形成の状況（例えば、ＰＣＲ増幅法、サンガー型ポリヌクレオチド配列決定およびニックトランスレーション反応の状況において用いられるヌクレオチド三リン酸）において特に有用である。
【０１２５】
一般に、標識ヌクレオシド／ヌクレオチド試薬の構造は、
ＮＵＣ−ＤＹＥ
式ＩＩ
であり、ここで、ＮＵＣはヌクレオシド／ヌクレオチドまたはヌクレオシド／ヌクレオチドアナログであり、そしてＤＹＥは、式Ｉの芳香族置換色素化合物である。
【０１２６】
ヌクレオシド／ヌクレオチドと色素を連結する結合は、Ｒ１〜Ｒ７位のいずれか１つで色素へ結合され得る。好ましくは、色素およびヌクレオチドは、色素のＲ６位を介して結合する。本発明の色素がトリメリト酸無水物（ｔｒｉｍｅｌｌｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）から合成される場合、Ｒ６は好ましくは、置換フェニルであり、連結は、置換フェニル（他の位置は水素原子である）のＸ３またはＸ４位の一つで色素に結合される。
【０１２７】
ＮＵＣが、プリン塩基を含む場合、ＮＵＣとＤＹＥとの間の結合は、プリンのＮ８位に結合しており、ＮＵＣが、７−デアザプリン塩基を含む場合、この結合は、７−デアザプリンのＮ７位に結合しており、ＮＵＣが、ピリミジン塩基を含む場合、結合は、ピリミジンのＮ５位に結合している。
【０１２８】
ヌクレオシド標識化は、公知の結合、連結基および関連する相補的官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を用いる多くの公知のヌクレオシド／ヌクレオチド標識化技術の任意の一つを用いて成し遂げられ得る。一般に、色素とヌクレオシドを連結する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であるべきで、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害すべきでなく、（ｉｉｉ）関連の酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼなどと互換性であるべきで、そして（ｉｖ）色素の蛍光特性に不利な影響を与えないべきである。本発明と関係して用いるのに適した例示的な塩基の標識化手順は、以下を含む：Ｇｉｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：６４５５−６４６７（１９８７）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４５１３−４５３５（１９８７）；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４８５６−４８７６（１９８７）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、５（３）：２３３−２４１（１９８６）；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら、ＪＡＣＳ、１１１：３７４−３７５（１９８９）；米国特許第４，８５５，２２５号、同第５，２３１，１９１号、および同第５，４４９，７６７号。
【０１２９】
好ましくは、結合は、アセチレンアミド結合またはアルケンアミド結合であり、色素とヌクレオシド／ヌクレオチド塩基との間の結合は、色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとヌクレオシド／ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルキニルアミノ誘導体化塩基との反応により形成されている。より好ましくは、得られた結合は、以下の構造を有する３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピン−イルである
【０１３０】
【化３３】
2011178999.tif 000022
【０１３１】
代替的な好ましい結合は、以下の構造を有する置換されたプロパルギルエトキシアミド結合を含み、
【０１３２】
【化３４】
2011178999.tif 000023
【０１３３】
ここで、Ｘは、以下の式からなる群から選択される：
【０１３４】
【化３５】
2011178999.tif 000024
【０１３５】
（ここでｎは１〜５の範囲である）
【０１３６】
【化３６】
2011178999.tif 000025
【０１３７】
（ここでｎは１〜５の範囲である）
【０１３８】
【化３７】
2011178999.tif 000026
【０１３９】
および
【０１４０】
【化３８】
2011178999.tif 000027
【０１４１】
；Ｒ１は、−Ｈ、低級アルキルおよび保護基からなる群から選択される；そしてＲ３は−Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される。Ｋｈａｎら、１９９７年４月１０日出願、米国特許出願番号第０８／８３３，８５４を参照のこと。
【０１４２】
アルキルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、Ｈｏｂｂｓらにより、欧州特許出願番号第８７３０５８４４．０およびＨｏｂｂｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０（１９８９）に教示されている。簡潔に言えば、アルキルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適切なハロジデオキシヌクレオシド（通常、Ｈｏｂｂｓら（上記）により教示されるように５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコ内に入れ、空気を除くためにアルゴンでフラッシュし、乾燥ＤＭＦを加え、その後アルキニルアミン、トリエチレンアミンおよびＰｄ（０）を添加することにより形成される。この反応混合物を数時間または薄相クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌する。非保護のアルキニルアミンが用いられる場合、アルキニルアミノ−ヌクレオシドは、反応混合物を濃縮する工程、およびカップリング反応において生成するハロゲン酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｄｅ）を中和するために水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけることにより単離され得る。保護アルキルアミンが用いられる場合、メタノール／メチレンクロリドは、反応混合物に添加され得、その後、炭酸水素形態の強塩基性陰イオン交換樹脂にかけられる。次いで、このスラリーは、約４５分間撹拌され、濾過され、そして、さらなるメタノール／メチレンクロリドで樹脂が洗浄され得る。合わせらた濾過物は、濃縮され、そしてメタノール−メチレンクロリド勾配を用いてシリカゲル上でフラッシュ−クロマトグラフィーにより精製され得る。この三リン酸エステルは標準的技術により得られる。
【０１４３】
本発明の特に好ましいヌクレオシド／ヌクレオチドは、以下、式ＩＶに示される：
【０１４４】
【化３９】
2011178999.tif 000028
【０１４５】
Ｂは、ヌクレオチド塩基、例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニンまたはデアザグアノシンである；Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＯＨまたはテンプレート指向性ポリマー化を介してポリメラーゼをブロックし得る基（例えば、Ｈ、フッ素など）である；Ｗ３は、ＯＨまたは一、ニもしくは三リン酸またはリン酸アナログである；そしてＤは、式Ｉの色素化合物である。一つの特に好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＶ．１に示される構造（もし存在するなら、会合対イオンを含む）を有するジデオキシヌクレオチド三リン酸である。
【０１４６】
【化４０】
2011178999.tif 000029
【０１４７】
式ＩＶ．１に示したもののような標識ジデオキシヌクレオチドは、蛍光検出を利用するサンガー型ＤＮＡ配列決定法において、鎖停止剤として、特定の用途が見出されている。第二の特に好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＶ．２に示した構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオンを含む）。
【０１４８】
【化４１】
2011178999.tif 000030
【０１４９】
式ＩＶ．２に示したもののような標識デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはニックトランスレーションにおいて、ポリメラーゼ伸長産物を標識する手段として、特定の用途が見出されている。
【０１５０】
（Ｃ．ホスホロアミダイト試薬）
別の好ましいクラスの試薬は、本発明の芳香族置換キサンテン色素を組込むホスホロアミダイト化合物を包含する。このようなホスホロアミダイト試薬は、本発明の芳香族置換キサンテン色素で標識したポリヌクレオチドの自動化化学合成に、特に有用である。このようなホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの５’−水酸基と反応して、亜リン酸エステル結合を形成し、これは、次に、酸化されて、リン酸エステル結合が得られる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，４１５，７３２号）。
【０１５１】
（１．非ヌクレオチドホスホロアミダイト試薬）：一般に、１つの局面において、本発明のホスホロアミダイト試薬は、すぐ下の式Ｖの構造を有する：
【０１５２】
【化４２】
2011178999.tif 000031
【０１５３】
ここで、Ｘは、スペーサーアームである；Ｄは、式Ｉの芳香族置換キサンテン色素またはそれらの保護誘導体である；Ｙは、この色素上の連結基を用いて形成した結合である；Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり、そしてＢ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アラルキル、または１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルである。
【０１５４】
スペーサーＸおよび結合Ｙは、種々の形態をとり得るが、しかしながら、構造Ｘ−Ｙは、（ｉ）ＤＮＡ合成条件に対して安定であり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを実質的に妨害せず、そして（ｉｉｉ）それが結合する色素の蛍光を消失させてはならない（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号、同第５，２５８，５３８号、および同第４，７５７，１４１号および同第５，２１２，３０４号）。
【０１５５】
好ましくは、Ｘは、直鎖または環状の低級アルキル、直鎖または環状の置換低級アルキル、ポリエチレンオキシド、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、ペプチド、またはポリエーテルである。好ましくは、結合Ｙは、アミド、スルホンアミド、ウレア、ウレタンまたはチオウレア（ｔｈｏｕｒｅａ）である。特に好ましい実施態様では、結合Ｙはアミドであり、そしてスペーサーＸは式Ｖ．１の以下に示される構造を有する直鎖アルキルである：
【０１５６】
【化４３】
2011178999.tif 000032
【０１５７】
ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より好ましくは、２〜６の範囲である。第二の特に好ましい実施態様では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸは、式Ｖ．２で以下に示す構造を有する直鎖ポリエチレンオキシドである：
【０１５８】
【化４４】
2011178999.tif 000033
【０１５９】
ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より好ましくは、２〜６である。
【０１６０】
好ましくは、Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、その主鎖に５個までの炭素原子および全体で１０個までの炭素原子を含有するアルキル鎖を形成し、この鎖の両方の末端原子価結合は、窒素原子に結合されている。他方、Ｂ２およびＢ３は、窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し、これは、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有する。好ましくは、Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルであり、そしてＢ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノである。
【０１６１】
Ｂ１は、ホスホロアミダイトが結合したポリヌクレオチドの所望されない伸長を防止する亜リン酸エステル保護基である。Ｂ１は、ポリヌクレオチド合成条件に対して安定であるが、このポリヌクレオチドまたは色素の完全性に悪影響を及ぼさない試薬を用いて、このポリヌクレオチド生成物から除去され得る。好ましくは、Ｂ１は、メチル、β−シアノエチルまたは４−ニトロフェニルエチルである。
【０１６２】
ＹとＤを連結する結合は、Ｒ１〜Ｒ７位の１つで、Ｄに結合している。
本発明の色素が、トリメリト酸無水物から合成される場合、Ｒ６は、好ましくは、置換フェニルであり、そして結合は、この置換フェニルのＸ３またはＸ４位の１つで、この色素に結合している。
【０１６３】
このようなホスホロアミダイト化合物は、公知の種々の方法により合成され得る。一般に、合成は、以下のように進行する。この色素のフェノール性ヒドロキシルは、ＤＮＡ合成脱保護剤（例えば、アンモニア、エタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：２：１）混合物）で除去され得る色素保護基で保護される。例えば、米国特許第５，２３１，１９１号を参照のこと。そのように保護された色素は、本明細書においてこの色素の「保護誘導体」という。好ましい保護基には、安息香酸またはピバル酸のエステルが挙げられる。この保護色素の連結基（例えば、カルボン酸）は、次いで、例えば、カルボジイミドで活性化され、そしてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または別の類似の非プロトン性溶媒中にて、アルコールリンカー誘導体（例えば、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン、ヘキサノールアミンなど））と反応させて、遊離アルコール官能性基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）（例えば、アルコール−アミド誘導体）を有する保護色素が生じる。この遊離アルコールは、次いで、触媒量のテトラゾールジイソプロピルアミンを含有するアセトニトリル中にて、標準操作を用いて、ホスフィチル化剤（例えば、ジ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン）と反応させて、ホスホロアミダイトを生じる（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号）。
【０１６４】
式Ｖに示されるような非ヌクレオチド性ホスホロアミダイトは、ヌクレオチドの糖部分を介して化学的に合成されたポリヌクレオチドの５’−末端の標識化に特によく適している。
【０１６５】
（２．ヌクレオチド性ホスホルアミダイト試薬）：好ましい、第二の局面では、本発明のホスホルアミダイト試薬は、すぐ下の式ＶＩの構造を有する：
【０１６６】
【化４５】
2011178999.tif 000034
【０１６７】
ここで、Ｂ１〜Ｂ３は、上で記述のものと同じである。Ｂ５は、水素またはヒドロキシル保護基であり、Ｂは、ヌクレオチド塩基であり、そしてＤは、式Ｉの芳香族置換キサンテン色素またはそれらの保護誘導体である。
【０１６８】
Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位にて結合している。他方、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位にて結合している。ＢおよびＤは、上で詳細に記述される連結基およびその相補官能性の反応により形成した結合により結合される。Ｂがプリンなら、その結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンなら、その結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合している。Ｂがピリミジンなら、その結合は、このピリミジンの５−位にて結合している。
【０１６９】
Ｂ５は、一般に、水素または酸切断可能なヒドロキシル保護基を表わす。好ましくは、Ｂ５は、トリフェニルメチル基およびその電子供与性置換型誘導体であり、この場合、本明細書中で使用する「電子供与性」との用語は、それが一部をなす分子内において、近接原子に原子価電子を放出するという置換基の傾向を表わし、すなわち、それは、近接原子に関して、電子的に正である。好ましくは、電子供与性置換基には、アミノ、低級アルキル、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、低級アルコキシなどが挙げられる。さらに好ましくは、この電子供与性置換基は、メトキシである。代表的なトリチルには、４，４’−ジメトキシトリチル、すなわち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチルなどが挙げられる。これらのトリチルおよび他のトリチルの結合条件および切断条件は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）に見出され得る。
【０１７０】
一般に、本発明のヌクレオチドホスホルアミダイトは、以下のようにして合成され得る。その５’−ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基およびその塩基上に保護相補的官能基を有するヌクレオシドは、この相補的官能基だけを暴露するように、選択的に脱保護される。次に、（上記のようにして）保護した色素は、連結基をその反応形状に転化することにより、活性化される。この色素の活性化連結基は、次いで、このヌクレオシドの相補的官能性と反応されて、この色素の５’−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する色素標識ヌクレオシドが形成される。この色素標識ヌクレオシドは、次いで、上記のホスフィチル化剤と反応されて、このヌクレオチドホスホルアミダイトが生成される。
【０１７１】
その相補的官能基がアミンでありかつ連結基がカルボキシルである好ましい方法では、この合成は、以下のようにして進行する。その５’−ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基（例えば、トリチル基）を有し、そしてその塩基上に保護アミノ−窒素相補的官能基を有する保護ヌクレオシドは、そのアミンを暴露するように選択的に脱保護され、このような選択的脱保護は、その保護５’−ヒドロキシル部分を脱保護することなく、そのアミノ官能性のみを脱保護するように働く。（上記のように）保護した色素は、カルボキシ連結基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、そのＮＨＳエステルに転化することにより、活性化される。このＮＨＳエステルは、このヌクレオシドのアミノ基と反応されて、この色素の５’−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する色素標識ヌクレオシドが形成される。次いで、この色素標識ヌクレオシドは、上記のホスフィチル化剤と反応される。
【０１７２】
式ＶＩに示されるような標識化ヌクレオチドホスホルアミダイトは、化学的に合成されたポリヌクレオチドの内部標識に特によく適している。
【０１７３】
（Ｄ．ポリヌクレオチド試薬）
本発明のさらに別の好ましいクラスの試薬には、本発明の芳香族置換キサンテン色素で標識したポリヌクレオチドが包含される。このような標識ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチドライゲーションプローブなどを含めた多くの重要な状況で、有用である。
【０１７４】
一つの好ましい実施態様において、本発明の標識されたポリヌクレオチドは、蛍光エネルギー移動が供与体色素と受容体色素との間で生じるように配置された複数の色素を含む。このような多重色素エネルギー移動ポリヌクレオチドは、分光的に整調可能（ｔｕｎａｂｌｅ）配列決定プライマーとして適用を見出す（例えば、Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４３４７−４３５１（１９９５）、およびハイブリダイゼーションプローブとして（例えばＬｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：３７６１−３７６６（１９９３））。
【０１７５】
標識ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを用いて、酵素的に合成するか（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２４章、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９８１））または例えば、ホスホルアミダイト法、亜リン酸トリエステル法などによる化学合成によるか（例えば、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０））のいずれかにより、合成され得る。標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使用して、酵素合成中に導入され得るか、または上記の標識非ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホルアミダイトを用いて、化学合成中に導入され得、あるいは合成に引き続いて導入され得る。
【０１７６】
一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵素合成を用いて製造されるなら、以下の手順が使用され得る。テンプレートＤＮＡが変性され、そしてこのテンプレートＤＮＡに、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールされる。この混合物に、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含み、ここでこのデオキシヌクレオチドの少なくとも１個の画分は、上記の本発明の色素化合物で標識される）の混合物が添加される。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下にて、ポリメラーゼ酵素が添加される。ポリメラーゼ媒介鎖合成中の、この標識デオキシヌクレオチドの組込みにより、標識ポリヌクレオチドが形成される。代替の酵素的合成法では、１個のプライマーの代わりに２個のプライマーが使用され、１方のプライマーは、この標的の＋鎖に相補的であり、他方は、この標的の−鎖に相補的であり、このポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼであり、そしてその反応温度は、変性温度と伸長温度の間で循環され、それにより、ＰＣＲによって、標識相補体が標的配列へと指数関数的に合成される（例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ  （１９９０））。
【０１７７】
標識ポリヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法を用いて、化学的に合成され得る。このホスホルアミダイト法によりポリヌクレオチドを形成するのに使用される化学の詳細な説明は、他のところに、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号および４，４１５，７３２号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４：１−１７（１９８２）；Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ３９２  ａｎｄ  ３９４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ、６−１〜６−２２頁、Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｒｔ    Ｎｏ．９０１２３７（１９９１）に提供されている。
【０１７８】
ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その効率および急速なカップリングおよび出発物質の安定性のために、好ましい方法である。この合成は、固体支持体に結合した伸長するポリヌクレオチド鎖を用いて行われ、その結果、液相にある過剰な試薬は、濾過により容易に除去され得、それにより、合成サイクル間の精製工程の必要性がなくなる。
【０１７９】
以下は、このホスホルアミダイト法を用いる、典型的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記述する。まず、保護ヌクレオチドモノマーを含む固体支持体は、酸（例えば、トリクロロ酢酸）で処理されて、５’−ヒドロキシル保護基が除去され、このヒドロキシルは、引き続くカップリング反応のために、遊離される。次いで、この反応系に、保護ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーおよび弱酸（例えば、テトラゾール）を同時に添加することにより、活性化中間体が形成される。この弱酸は、このホスホルアミダイトの窒素にプロトンを付加して、反応性中間体を形成する。ヌクレオシド付加は、３０秒以内に完結する。次に、ヌクレオシド付加を受けなかったいずれかのポリヌクレオチド鎖を停止するキャップ化工程が行なわれる。キャップ化は、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて行われる。このヌクレオチド間結合は、次いで、好ましい酸化剤としてヨウ素および酸素供与体としての水を用いる酸化により、この亜リン酸エステルから、より安定なホスホトリエステルに転化される。酸化後、このヒドロキシル保護基は、プロトン酸（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）で除去され、このサイクルは、鎖の伸長が完了するまで、繰り返される。合成後、このポリヌクレオチド鎖は、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミン）を用いて、この支持体から切断される。この切断反応はまた、いずれのリン酸保護基（例えば、シアノエチル）をも除去する。最後に、この塩基の環外アミン上の保護基およびこの色素上のヒドロキシル保護基は、塩基中にて、このポリヌクレオチド溶液を高温（例えば、５５℃）で処理することにより、除去される。
【０１８０】
このホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーのいずれかは、上記の色素標識したホスホルアミダイトであり得る。このヌクレオチドの５’−末端位置が標識される場合、この最終縮合工程中に、本発明の標識した非ヌクレオチドホスホルアミダイトが使用され得る。このオリゴヌクレオチドの内部位置が標識される場合、いずれかの縮合工程中に、本発明の標識ヌクレオチドホスホルアミダイトが使用され得る。
【０１８１】
合成に引き続いて、このポリヌクレオチドは、非常に多くの位置で標識でき、これらの位置には、５’−末端（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、第８章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）およびＯｒｇｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１（１８）：６５１３（１９８３）；米国特許第５，１１８，８００号）；ホスホジエステル骨格（例えば、同書、第９章）；または３’−末端（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（２３）：６２５３−６２５９、および米国特許第５，４０１，８３７号および第５，１４１，８１３号）が含まれる。オリゴヌクレオチド標識手順の総説については、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ  ｉｎ  Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｓｔｅｉｎｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  （１９８３）を参照のこと。
【０１８２】
１つの好ましい合成後化学標識化法では、オリゴヌクレオチドは、以下のようにして標識化される。カルボキシ連結基を含む色素は、無水酢酸エチル中にて、室温で３時間にわたり、およそ１当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびおよそ３当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転化される。この反応混合物は、５％  ＨＣｌで洗浄され、硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、そして固形物になるまで濃縮され、この固形物は、ＤＭＳＯに再懸濁される。このＤＭＳＯ色素ストックは、次いで、過剰で（１０〜２０倍）、ｐＨ  ９．４にて、０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加され、そして６時間反応される（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。この色素標識したオリゴヌクレオチドは、緩衝液（例えば、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸塩（ＴＥＡＡ））で溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、未反応色素から分離される。この粗標識オリゴヌクレオチドを含有する画分は、勾配溶出を使用する逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製される。
【０１８３】
（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）
本発明の色素および試薬は、蛍光検出を使用するいずれかの方法（特に、複数の空間的に重複した分析物の同時検出を必要とする方法）によく適合される。本発明の色素および試薬は、生化学分離手順（例えば、電気泳動）に供されるポリヌクレオチドのクラスを同定、または空間的にアドレス可能なハイブリダイゼーションアレイにおける位置を区別するのに、特によく適合される。
【０１８４】
本明細書において「フラグメント分析」法または「遺伝分析」法と称される好ましいカテゴリーの方法では、標識化ポリヌクレオチドフラグメントは、標識プライマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート指向性酵素的合成（例えば、ライゲーションまたはポリメラーゼ指向性プライマー伸長による）を介して、生じる；これらのフラグメントは、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され、そして分離したフラグメントは、この分離に引き続いて、例えば、レーザー励起蛍光により、検出される。特に好ましい実施態様では、複数のクラスのポリヌクレオチドが同時に分離され、異なるクラスのものは、分光学的に分離可能な標識により、識別される。
【０１８５】
このようなフラグメント分析の１方法は、増幅フラグメント長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として知られているが、ＰＣＲにより増幅した増幅フラグメント長多型性（すなわち、制限フラグメント長多型性）に基づいている。種々のサイズのこれらの増幅フラグメントは、系統による次の突然変異遺伝子のための連鎖マーカーとして役立つ。増幅フラグメントが染色体上の突然変異遺伝子に近づくほど、この結合の相関が高くなる。多くの遺伝的疾患に対する遺伝子は、同定されていないので、これらの結合マーカーは、疾患のリスクまたは起源の評価を助けるのに役立つ。このＡｍｐＦＬＰ技術では、このポリヌクレオチドは、標識ポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いることにより、またはＰＣＲ中の標識ヌクレオチド三リン酸を使用することにより、標識され得る。
【０１８６】
ニック（ｎｉｃｋ）トランスレーションとして知られているような別のフラグメント分析では、二本鎖ＤＮＡ分子内の未標識ヌクレオシド三リン酸を標識したものに置き換えるために、反応が使用される。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）処理により生じる「ニック」によって、未標識ＤＮＡ内に、遊離の３’−水酸基が作られる。ＤＮＡポリメラーゼＩは、次いで、このニックの３’−ヒドロキシル末端への標識ヌクレオチドの付加を触媒する。同時に、この酵素の５’〜３’−エクソヌクレアーゼ活性は、このニックの５’−ホスホリル末端からこのヌクレオチド単位を取り除く。最初に取り除かれたヌクレオチドの位置に、遊離の３’−ＯＨを有する新しいヌクレオチドが取り込まれ、そしてこのニックは、３’方向に沿って、１ヌクレオチド単位だけシフトする。この３’シフトの結果、存在する未標識ヌクレオチドの除去を伴って、新しく標識したヌクレオチドのＤＮＡへの連続付加が生じる。このニックトランスレーションされたポリヌクレオチドは、次いで、分離プロセス（例えば、電気泳動）を用いて分析される。
【０１８７】
別の例示的なフラグメント分析法は、可変数のタンデム反復、すなわち、ＶＮＴＲに基づいている。ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接した複数コピーを含有する二本鎖ＤＮＡの領域であり、繰り返し単位の数は、可変である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例には、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８およびＡｐｏ  Ｂがある。ＶＮＴＲ法のサブセットは、マイクロサテライト反復または短タンデム反復（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２個〜４個の塩基）反復配列により特徴付けられるＤＮＡのタンデム反復の検出に基づいている。ヒトにおいて最も豊富に点在した反復型のＤＮＡファミリーの１つには、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド反復ファミリー（これはまた、（ＣＡ）ｎジヌクレオチド反復ファミリーとも呼ばれる）である。ヒトゲノムには、５０，０００個〜１００，０００個程度の（ＣＡ）ｎ反復領域があると考えられ、代表的には、１ブロックあたり、１５個〜３０個の反復を有する。これらの反復領域の多くは、長さが多型性であり、従って、有用な遺伝子マーカーとして供され得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法では、色素標識ＰＣＲプライマーを用いることにより、ポリヌクレオチドフラグメントに標識が導入される。
【０１８８】
特に好ましいフラグメント分析法において、本発明に従って同定されたクラスのものは、４個の可能な末端塩基と分光学的に分離可能な色素のセットのメンバーとの間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチドの点で規定される。このようなセットは、市販の分光光度計を用いて、発光および吸収バンド幅を測定することにより、本発明の色素から容易に組み立てられる。さらに好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的または鎖停止法の状況にて、クラスが生じ、そして最も好ましくは、この鎖停止法、すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定またはサンガー配列決定の状況において、クラスが生じる。
【０１８９】
サンガー型の配列決定は、配列が決定されるべき一本鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートを用いた、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を包含する。合成は、このテンプレートにオリゴヌクレオチドプライマーがアニールする、規定された位置で開始される。この合成反応は、連続的なＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの取りこみにより、停止される。例示的な鎖停止ヌクレオチドアナログには、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が挙げられ、これは、３’から５’へのＤＮＡ鎖の伸長に必要な３’−ＯＨ基を欠失する。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸）および４個のｄｄＮＴＰの１個が使用される場合、酵素触媒した重合は、このｄｄＮＴＰが取り込まれる各部位で、鎖集団の画分において、停止される。各反応に対して、標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰが使用される場合、この配列情報は、高分解能電気泳動による分離後、蛍光により検出され得る。この鎖停止法では、本発明の色素は、配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合され得る。色素は、例えば、Ｆｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号での教示に従って、このプライマーの５’末端にて；プライマーの塩基にて；または例えば、Ｈｏｂｂｓら（前述）によって開示されるアルキニルアミノ連結基を介して、ジデオキシヌクレオチドの塩基にて、相補的官能基と連結され得る。
【０１９０】
上記フラグメント分析法のそれぞれでは、標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動手順により、分離される（例えば、ＧｏｕｌｄおよびＭａｔｔｈｅｗｓ、上記；ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８１；Ｏｓｔｅｒｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１巻  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４；または米国特許第５，３７４，５２７号、５，６２４，８００号、および／または５，５５２，０２８号）。好ましくは、電気泳動マトリックスの型は、約２〜２０重量％の間の濃度（重量対容量）を有する連結または非連結ポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、このポリアクリルアミド濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、特にＤＮＡ配列決定の状況では、この電気泳動マトリックスは、変性剤（例えば、ウレア、ホルムアミドなど）を含有する。このようなマトリックスを構築する詳細な手順は、「Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ
Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ９８％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ｏｒ  ７Ｍ  Ｕｒｅａ」Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：２９９−３０５（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｃｈａｉｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｄｏｕｂｌｅ−  ａｎｄ
Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４：３７８７−３７９４（１９７５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７９−１８５頁（１９８２）；およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｒｅｖ．Ａ、Ｊａｎｕａｒｙ  １９９５、第２章（ｐ／ｎ９０３４３３、Ｔｈｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により与えられる。特別な分離に使用される最適な電気泳動の条件、例えば、ポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度は、多くの因子に依存し、これらには、分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖か二本鎖か、およびその情報が電気泳動により追究されるクラスの性質が含まれる。従って、本発明の適用には、特定の分離のための条件を最適化する標準予備試験が必要とされ得る。
【０１９１】
電気泳動分離に引き続いて、色素−ポリヌクレオチド結合体は、この色素標識ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することにより、検出される。このような検出を行うために、この標識ポリヌクレオチドは、標準的な手段、例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなどにより照射される。好ましくは、この照射手段は、４８８ｎｍと５５０ｎｍの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。さらに好ましくは、この色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー（特に、４８８ｎｍおよび５１４  ｎｍの発光系列のアルゴンイオンレーザー）、または５３２ｎｍの発光系列のネオジム固相ＹＡＧレーザーにより発生したレーザー光によって、照射される。いくつかのアルゴンイオンレーザーが市販されており、これらは、これらの系列で、同時にレーザーとして使える（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ、Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）のＭｏｄｅｌ  ２００１など）。次いで、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電連結デバイスなど）により、その蛍光が検出される。例示的な電気泳動検出システムは、他の例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；５，２７４，２４０号；４，８７９，０１２号；５，０９１，６５２号および４，８１１，２１８号に記載されている。
【実施例】
【０１９２】
（Ｖ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確にされ、これらの実施例は、純粋に、本発明に例示であることを意図しており、いずれの様式でも、その範囲を限定することを意図していない。特定の化合物を示す参照番号は、図１Ａ〜Ｄで提供した構造を意味する。
【０１９３】
（実施例１）
１−フルオロナフト−２−イルボロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（１１）の合成
１−フルオロナフタレン（１４．６１ｇ、１００ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、そして−７８℃まで冷却した。次いで、この混合物に、５分間にわたって、ｓｅｃ−ブチルリチウム溶液（ヘキサン中で１．３Ｍ、１００ｍＬ）を添加した。この混合物を、−７８℃で２０分間撹拌し、次いで、ホウ酸トリメチル（１５ｍＬ、１３２ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加した。−７８℃で１５分間攪拌を継続し、続いて、室温で、３０分間攪拌した。この反応を、ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏの３：１混合物１００ｍＬを添加することによりクエンチし、そして室温で一晩攪拌した。次に、酢酸エチルおよび水の１：１混合物５００ｍＬを添加した。その有機層を１０％  ＨＣｌ（２００ｍＬ×１）、水（２００ｍＬ×２）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、白色固形物１８グラムを得た。この物質をシリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３５０グラム、酢酸エチル−ヘキサン１：１移動相）により精製して、表題化合物１６．３ｇ（８６％）を得た。
【０１９４】
（実施例２）
１，３−ジメトキシ−４−ブロモ−２−フルオロベンゼン（１２）の合成
２−フルオロレゾルシノール（これは、Ｐａｔｒｉｃｋ，  Ｔ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ（１９８６），５１，３２４２−４に従って、調製した）（１２．８ｇ、１００ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４２ｇ、０．３ｍｏｌ）およびヨウ化メチル（２５ｍｌ、０．４ｍｏｌ）をアセトン（３００ｍＬ）と混合し、そして６時間還流した。この反応物を氷水（５００ｍＬ）に注ぎ、そして酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出した。この酢酸エチルを水（２００ｍＬ×２）およびブライン（２００ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、１，３−ジメトキシ−２−フルオロベンゼン１４．２グラム（９１％）を得た。このフルオロ−ベンゼン中間体（２３．１９ｇ、１４８．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２６．５２ｇ、１４９ｍｍｏｌ）および７０％過塩素酸水溶液３００μＬ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、３．４ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（１００ｍＬ）中で混合し、そして室温で１時間攪拌した。この混合物を濾過し、その溶媒を除去して、黄色のオイルを得た。このオイルをシリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン移動相）にかけて、黄色のオイルとして、１，３−ジメトキシ−４−ブロモ−２−フルオロベンゼン１２化合物３３．２８グラム（９５％）を得た。
【０１９５】
（実施例３）
４−（ナフト−２−イル）−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン（１４）の合成
２−ナフチルボロン酸１３（これは、Ｌ．Ｊ．Ｄｉｏｒａｚｉｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８，１９９２，８０７３に従って、調製した）（１ｇ、５．８ｍｍｏｌ）、実施例２から得た１，３−ジメトキシ−４−ブロモ−２−フルオロベンゼン１２（１．３７ｇ、５．８ｍｍｏｌ）、無水グリム（５ｍＬ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６７５ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を１５分間攪拌し、続いて、炭酸カリウム（水７ｍＬ中で１．６ｇ）を添加した。２４時間還流した後、この反応混合物を、１：１の１０％  ＨＣｌおよび酢酸エチル２００ｍＬに注いだ。その有機層を水（１００ｍＬ×２）およびブライン（１００ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、そのジメチルエーテル中間体１．１５グラム（７１％）を得た。この中間体（２８２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、そしてアルゴン雰囲気下にて、−７８℃まで冷却した。ジクロロメタン中の１Ｍ三臭化ホウ素（５ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を添加した後、この溶液を−７８℃で３０分間攪拌し、次いで、４℃で１６時間攪拌した。この反応混合物を氷水１００ｍＬに注ぎ、そして酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。その有機層を水（１００ｍＬ×２）およびブライン（１００ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン移動相中の１０％ＣＨＣｌ３）により精製して、固形生成物２２０ｍｇ（８６％）を得た。
【０１９６】
（実施例４）
４−（ナフト−２−イル）−１，３−ジヒドロキシベンゼン（１６）の合成
この化合物は、実施例３で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、１，３−ジメトキシ−４−ブロモ−２−フルオロベンゼン１２に代えて、１，３−ジメトキシ−４−ブロモベンゼン１５を使用した点が相違している。
【０１９７】
（実施例５）
４−フェニル−１，３−ジヒドロキシベンゼン（１８）の合成
この化合物は、実施例３で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、２−ナフチルボロン酸１３に代えて、フェニルボロン酸１７（Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用し、そして１，３−ジメトキシ−４−ブロモ−２−フルオロベンゼン１２に代えて、１，３−ジメトキシ−４−ブロモベンゼン１５を使用した点が相違している。
【０１９８】
（実施例６）
４−（フルオロナフト−２−イル）−１，３−ジヒドロキシ（Ｄｉｈｙｄｒｏｘ）−２−フルオロベンゼン（ｆｌｕｏｒｏｙｂｅｎｚｅｎｅ）（１９）の合成
この化合物は、実施例３で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、２−ナフチルボロン酸１３に代えて、実施例１から得た１−フルオロナフト−２−イルボロン酸１１を使用した点が相違している。
【０１９９】
（実施例７）
４−（ジベンゾフラン−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン（２２）の合成
この化合物は、実施例３で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、２−ナフチルボロン酸１３に代えて、２−ブロモジベンゾフランの２−ボロン酸（２−ブロモジベンゾフランは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入し、そしてＬ．Ｊ．Ｄｉｏｒａｚｉｏら（上記）の方法に従って、そのボロン酸２１に転化した）を使用した点が相違している。
【０２００】
（実施例８）
ナフチル−フルオロ−レゾルシノールケトン（２４）の合成
実施例３から得た４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４（７６０ｍｇ、２．９８８ｍｍｏｌ）、無水２，５−ジクロロトリメリト酸２３（７８０ｍｇ、２．９８８ｍｍｏｌ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ（ＡＢ）部品番号３６１８９２）、ニトロベンゼン（５ｍＬ）、およびニトロベンゼン中の塩化アルミニウム（１５ｍＬ、１Ｍ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、室温で、１６時間攪拌した。この反応混合物を、氷水（１００ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）の磁気攪拌した混合物に注ぎ、続いて、１０％ＨＣｌ（１００ｍＬ）を添加して、このアルミニウム塩を溶解した。その有機層を水（１００ｍＬ×２）およびブライン（１００ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、異性体混合物として、その生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン移動相中の１０％メタノール）により分離して、所望の緩慢移動異性体（Ｓｌｏｗｅｒ  ｍｏｖｉｎｇ  ｉｓｏｍｅｒ）３４０ｍｇ（２２％）を得た。
【０２０１】
（実施例９）
芳香族置換キサンテン色素（２５）の合成
実施例３から得た４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、無水２，５−ジクロロトリメリト酸２３（５２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、ＡＢ部品番号＃３６１８９２）、およびメタンスルホン酸（５ｍＬ）を、１２０〜１３０℃で、２時間攪拌した。この溶液を、冷却し、そして氷水（５０ｍＬ）と混合し、沈殿物を形成させた。この沈殿した色素を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、その抽出物を水（５０ｍＬ×２）およびブライン（５０ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、２個の異性体として、その粗色素を得た。これらの異性体を、分離用厚層クロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン：メタノール：酢酸１００：１０：２（容量）の移動相）により分離して、所望の緩慢移動異性体６０ｍｇ（４１％）を得た。
【０２０２】
（実施例１０）
芳香族置換キサンテン色素（２６）の合成
この化合物は、実施例９で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４に代えて、実施例５から得た４−フェニル−１，３−ジヒドロキシベンゼン１８を使用した点が相違している。
【０２０３】
（実施例１１）
芳香族置換キサンテン色素（２８）の合成
この化合物は、実施例９で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４に代えて、１，３−ジヒドロキシベンゾフラン２７（これは、Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１，１６０５，（１９８４）に従って、調製した）を使用した点が相違している。
【０２０４】
（実施例１２）
芳香族置換キサンテン色素（２９）の合成
この化合物は、実施例９で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４に代えて、実施例４から得た４−ナフチル−１，３−ジヒドロキシベンゼン１６を使用した点が相違している。
【０２０５】
（実施例１３）
芳香族置換キサンテン色素（３０）の合成
この化合物は、実施例９で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４に代えて、実施例６から得た４−フルオロナフチル−１，３−ジヒドロキシベンゼン１９を使用した点が相違している。
【０２０６】
（実施例１４）
芳香族置換キサンテン色素（３１）の合成
この化合物は、実施例９で用いた手順と本質的に同じ手順を用いて調製したが、４−（ナフト−２−イル）−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン１４に代えて、実施例７から得た４−ジベンゾフラン−２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシベンゼン２２を使用した点が相違している。
【０２０７】
（実施例１５）
芳香族置換キサンテン色素（３３）の合成
実施例５から得た４−フェニル−１，３−ジヒドロキシベンゼン１８（１８２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ケトン３２（４０５ｍｇ、１ｍｍｏｌ、ＡＢ部品番号＃３６１８９３）およびメタンスルホン酸（１０ｍＬ）を混合し、そして１３０〜１３５℃で２時間攪拌した。この反応混合物を冷却し、そして氷水（５０ｍＬ）と混合した。沈殿した色素を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、その有機層を水（５０ｍＬ×２）およびブライン（５０ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、その粗色素を得た。これらの色素をクロロホルムから結晶化して、純粋色素４５０ｍｇ（８１％）を得た。
【０２０８】
（実施例１６）
芳香族置換キサンテン色素（３５）の合成
ジベンゾフラン−１，３−ジオール（これは、Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｃ．Ｆ．ら（上記）に従って、調製した）（２００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、２−フルオロナフタレン−１，３−ジオール３４（１７８ｍｇ、１ｍｍｏｌ、ＡＢ部品番号３６１８２８）および無水２，５−ジクロロトリメリト酸（２６０ｍｇ、１ｍｍｏｌ、ＡＢ部品番号３６１８９２）を、メタンスルホン酸（１０ｍＬ）中で混合し、そして１３０〜１３５℃で２時間攪拌した。この反応混合物を冷却し、そして氷水（１００ｍＬ）と混合した。沈殿した色素を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、その有機層を水（５０ｍＬ×２）およびブライン（５０ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、異性体混合物として、その粗色素を得た。これらの異性体を分離用薄層クロマトグラフィーにより分離して、色素８０ｍｇ（１３％）を得た。
【０２０９】
（実施例１７）
芳香族置換キサンテン色素（３６）の合成
実施例８から得たナフチル−フルオロ−レゾルシノールケトン２４（２０６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、および２−フルオロナフタレン−１，３−ジオール３４（７２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、ＡＢ部品番号３６１８２８）をメタンスルホン酸（４ｍＬ）と混合し、そして１２０〜１３０℃で２時間攪拌した。この溶液を室温まで冷却し、次いで、氷水（１００ｍＬ）に注いだ。沈殿した色素を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、その有機層を水（５０ｍＬ×２）およびブライン（５０ｍＬ×１）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を除去して、その粗色素を得、これを、クロロホルムからの結晶化によりさらに精製して、純粋色素１２０ｍｇ（４５％）を得た。
【０２１０】
（実施例１８）
芳香族置換キサンテン色素（３３）で標識したＰＣＲプライマーの合成
実施例１５から得た芳香族置換キサンテン色素（３３）を、室温で、３時間にわたって、無水ＤＭＦ中にて、１．２当量の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩および１．５当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに転化した。この反応混合物を５％ＨＣｌと混合し、そして酢酸エチル中で抽出した。この抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして固形物にまで濃縮した。この固形物をＤＭＳＯ（６ｍｇ／６６ｍＬ  ＤＭＳＯ）に溶解して、色素ストック溶液を形成した。このＤＭＳＯ色素ストック（５〜６ｍＬ）を、０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中のアミノヘキシル
誘導体化オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー（１×１０−３）に過剰に（１０〜２０倍）添加して、１時間反応させたが、この場合、このアミノヘキシル誘導体化プライマーは、自動化ＤＮＡ合成機を用いて調製し、この場合、その最後の合成サイクルにて、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ−２試薬を使用した（ＡＢ  ｐ／ｎ  ４００８０８）。この色素標識化オリゴヌクレオチドは、０．１モルトリエチルアミン酢酸塩で溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５サイズ排除カラムに通すことにより、未反応色素から分離した。この粗標識化オリゴヌクレオチドを含有する画分を、ＲＰ−１８クロマトグラフィーカラムを用いて、２５分間にわたって、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ中の８％アセトニトリルから２５％までの勾配溶出液を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。この純粋色素標識化オリゴヌクレオチドを凍結乾燥して、固形物にした。この色素標識化オリゴヌクレオチドの濃度は、２６０ｎｍでのＵＶ吸収により、測定した。
【０２１１】
（実施例１９）
ＨＥＸおよびＪＥＢ標識化ＰＣＲプライマーの相対蛍光強度の評価
実施例１８に従って芳香族置換キサンテン色素（３３）（ＪＥＢ）で標識したＰＣＲプライマーＤ１９Ｓ２２１およびＤ２２Ｓ４２３を、ＣＥＰＨファミリー８８４（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ１５）（ＡＭ２００）に由来のＤＮＡを用いて、ＨＥＸ色素で標識した同じプライマーと比較した。その標的ＤＮＡは、Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｔ用の標準プロトコル（これは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭＬｉｎｋａｇｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｔ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｎｕａｌ（ＡＢ  ｐ／ｎ  ９０３４７７）で公開されている）に従って増幅し、そして推奨手順に従って、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて、相対蛍光強度について評価した。これらの結果を、表１で以下に要約する。
【０２１２】
【表１】
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【０２１３】
全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参考として援用されることが示されるのと同じ程度まで、本明細書中で参考として援用されている。
【０２１４】
少数の実施態様のみを上で詳細に記述したものの、化学技術分野の当業者は、その教示から逸脱することなく、その好ましい実施態様において、多くの改良が可能であることを、明らかに理解する。このような改良の全ては、以下の請求の範囲内に包含されることを意図している。
【０２１５】
蛍光色素として有用な芳香族置換キサンテン化合物のクラスが開示されており、この化合物は、一般構造（Ｉ）を有し、ここで、Ｙ１およびＹ２は、別々に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、連結基およびアミンからなる群から選択されるか、またはＹ１は、Ｒ２と一緒になって、環状イミンであるか、またはＹ２は、Ｒ３と一緒になって、環状アミンである；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ７は、別々に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェニルおよび連結基からなる群から選択される；Ｒ１は、別々に、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、連結基、および電子リッチ複素環からなる群から選択されるか、またはＲ７と一緒になるとき、電子リッチ複素環およびインデンからなる群から選択される；Ｒ４は、別々に、アミノ、アミド、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデン、連結基、および電子リッチ複素環からなる群から選択されるか、またはＲ５と一緒になるとき、フェニル、置換フェニル、多環式芳香族、置換多環式芳香族、インデンおよび電子リッチ複素環からなる群から選択される；そしてＲ６は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、置換フェニル、および複素環式芳香族からなる群から選択される。他の局面では、本発明は、上記色素化合物および中間体を合成する方法を包含する。さらに他の局面では、本発明は、この非対称ベンゾキサンテン色素化合物で標識した試薬（デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、ホスホロアミダイトおよびポリヌクレオチドを含む）を包含する。さらなる局面では、本発明は、このような色素化合物および試薬を使用する方法（ジデオキシポリヌクレオチド配列決定およびフラグメント分析方法を含む）を包含する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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