(57)【要約】【課題】認知症、特に老化に伴う認知症の改善及び／又は予防用組成物等の提供。【解決手段】ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する認知症、特に老化に伴う認知症の改善及び／又は予防用組成物、空間学習・記憶障害の改善剤、海馬神経細胞死の抑制剤等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する、認知症の改善及び／又は予防用組成物。
【請求項２】
認知症が、老化に伴う認知症である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
認知症の改善及び／又は予防が、空間学習・記憶障害の改善である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
認知症の改善及び／又は予防が、海馬神経細胞死を抑制することである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項５】
ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する、空間学習・記憶障害改善剤。
【請求項６】
空間学習・記憶障害が、老化に伴う空間学習・記憶障害である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する、海馬神経細胞死の抑制剤。
【請求項８】
海馬神経細胞死が、老化に伴う海馬神経細胞死である、請求項７記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症、特に老化に伴う認知症の改善及び／又は予防に有用な組成物に関する。本発明は、また、神経細胞死抑制剤ならびに学習・記憶障害の改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、認知症が世界的に医療上の大きな問題となっている。認知症は、学習・記憶障害及び判断力の低下を中心にした多種の症状を伴う疾患であるが、その原因となる病気によって症状及びその経過は異なる。しかし、いずれの場合も、患者の生活の質を著しく損なうという点で共通している。また、患者の家族をはじめとする介護者にも多大な労苦を強いるという事実を考えたとき、認知症は社会的にたいへん重大な問題であるといえる。寿命の長期化による高齢者人口の増加が、認知症患者の増加と関係しているため、日本では今後更に認知症患者が増加すると予測されている。また、認知症には分類されない老化に伴う認知障害を患う人も多い。
【０００３】
老化やアルツハイマー病等の神経変性疾患に伴う認知症は、脳萎縮を引き起こす脳神経細胞死（アポトーシス）が主な原因であり、特に、海馬が萎縮していく。脳神経細胞のアポトーシスは大きく２つの経路−酸化ストレスと小胞体ストレスによって誘導される。脳神経細胞死を抑制することができれば、認知症を改善することが可能となる。
【０００４】
認知症患者において、様々な生化学的病変が報告されている。アルツハイマー型認知症及びレビー小体型認知症などにおいて報告されているのが、脳内のアセチルコリン濃度の低下である。この事実に基づき、認知症、特にアルツハイマー型認知症の治療において、アセチルコリン分解酵素阻害剤の使用が、現在までに最も成功している方法である。日本において既に市販されている塩酸ドネペジル（商品名アリセプト）をはじめ、多種のアセチルコリン分解酵素阻害剤がこれまで開発されている。しかし、それらの薬剤は、認知症を根本的に治療するものではなく、症状の進行を遅らせる効果を有するものである。また、塩酸ドネペジルに関して、急性腎不全及び横紋筋融解症などの発症の危険性が報告されているなど、副作用の問題もある。これらの理由から、より安全で効果の高い認知症改善薬の開発が待ち望まれている。
認知症を改善し得る化合物が種々報告されている。リノール酸誘導体であるＤＣＰ−ＬＡは、アミロイド−βペプチドとスコポラミンで処理した動物モデル（非特許文献１）あるいは学習障害を有する老化促進マウスであるＳＡＭＰ８（Accelerated-senescence-prone mice 8）（非特許文献２）において記憶障害を改善することが報告されている。さらに１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンや１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが、スコポラミンによって誘導されたラット空間学習障害及び記憶障害、あるいはヒトにおける軽度の認知障害や痴呆を改善することが報告されている（非特許文献３、４）。
【０００５】
一方、ホスファチジルエタノールアミンは、生体膜の主要成分の１つであるリン脂質であり、ホスファチジルセリン等とともに健康食品として市販されている。ホスファチジルエタノールアミンの中でも、特に下記の構造：
【０００６】
【化１】
2011213700.tif 000002
【０００７】
を有するジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（脂肪酸として２つのリノール酸を含む）が、細胞死誘導抑制活性、特に小胞体ストレス抑制活性を有すること、当該活性により、ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンが医薬用途、特に神経変性疾患の予防および／または治療のために使用され得ることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンの海馬神経細胞、特に老化に伴う海馬神経細胞死への効果や老化に伴う空間学習・記憶障害への効果については何ら記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２４７７２８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nagata T, Yamamoto S, Yaguchi T, Iso H, Tanaka A, Nishizaki T.  The newly synthesized linoleic acid derivative DCP-LA ameliorates memory deficits in animal models treated with amyloid-beta peptide and scopolamine.  Psychogeriatrics 2005;5:122-6
【非特許文献２】Yaguchi T, Nagata T, Mukasa T, Fujikawa H, Yamamoto H, Yamamoto S, Iso H, Tanaka A, Nishizaki T.  Linoleic acid derivative DCP-LA improves learning impairment in SAMP8.  NeuroReport 2006;17:105-8
【非特許文献３】Yaguchi T, Nagata T, Nishizaki T.  Dilinoleoylphosphatidylcholine ameliorates scopolamine-induced impairment of spatial learning and memory by targeting alpha-7 nicotinic ACh receptors.  Life Sci 2009;84:263-6
【非特許文献４】Yaguchi T, Nagata T, Nishizaki T.  1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine improves cognitive decline by enhancing long-term depression.  Behav Brain Res 2009;204:129-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
認知症、特に老化に伴う認知症の改善及び／又は予防に有用な医薬組成物；学習・記憶障害、特に老化に伴う空間学習・記憶障害の改善剤；海馬神経細胞死、特に老化に伴う海馬神経細胞死の抑制剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ホスファチジルエタノールアミン、特にジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（以下、DLPhtEtnとも称する）に、海馬神経細胞死を抑制する作用があることを見出した。さらに、本発明者は、DLPhtEtnが、老化に伴う空間学習・記憶障害を改善する作用を有することを確認し、本発明を完成するに至った。これらの作用により、DLPhtEtnは老化に伴う認知症を改善及び／又は予防するのに有用である。
即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する、認知症の改善及び／又は予防用組成物。
［２］認知症が、老化に伴う認知症である、上記［１］記載の組成物。
［３］認知症の改善及び／又は予防が、空間学習・記憶障害の改善である、上記［１］又は［２］記載の組成物。
［４］認知症の改善及び／又は予防が、海馬神経細胞死を抑制することである、上記［１］又は［２］記載の組成物。
［５］ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する、空間学習・記憶障害改善剤。
［６］空間学習・記憶障害が、老化に伴う空間学習・記憶障害である、上記［５］記載の剤。
［７］ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する、海馬神経細胞死の抑制剤。
［８］海馬神経細胞死が、老化に伴う海馬神経細胞死である、上記［７］記載の剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の医薬組成物は、海馬神経細胞死を抑制することによって空間学習・記憶障害を改善し、従って認知症の改善及び／又は予防用組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、老化に伴う空間学習・記憶障害に対するDLPhtEtnの効果を示したグラフである。Ｎ＝５（ＰＥＧ投与ＳＡＭＲ１）、Ｎ＝１０（ＰＥＧ投与ＳＡＭＰ８）、Ｎ＝７（DLPhtEtn投与ＳＡＭＰ８）。Ｐ値、Fisher’s PLSD test
【図２】図２は、老化に伴う海馬萎縮に対するDLPhtEtnの効果を示したグラフである。各値は平均（±標準誤差）海馬面積を示す。Ｎ＝１０（ＰＥＧ投与ＳＡＭＰ８）、Ｎ＝７（DLPhtEtn投与ＳＡＭＰ８）。
【図３】図３は、老化に伴う海馬神経細胞の減少に対するDLPhtEtnの効果を示したグラフである。各値は平均（±標準誤差）神経細胞数を示す。Ｎ＝１０（ＰＥＧ投与ＳＡＭＰ８）、Ｎ＝７（DLPhtEtn投与ＳＡＭＰ８）。Ｐ値、unpaired t-test
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において有効成分として用いられるジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（DLPhtEtn）は下記の構造を有するリン脂質である。
【００１５】
【化２】
2011213700.tif 000003
【００１６】
DLPhtEtnは塩として用いることもできる。DLPhtEtnの塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００１７】
本発明に用いるDLPhtEtn又はその塩は、動物（卵黄等）、植物（大豆等）等から単離精製されたもの、化学的に合成・半合成されたもの等、特に制限はない。商業的に入手可能である。本発明に用いるDLPhtEtn又はその塩は、これを医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、特に制限無く用いることができる。
【００１８】
本明細書中で用いられる用語「認知症」とは、学習・記憶障害及び判断力の低下を中心にした多種の症状を伴う疾患を意味する。認知症の原因となる病気として、現在までに多数報告されており、例えばアルツハイマー病、レビー小体型認知症、ピック病等の神経変性疾患、あるいは多発性脳硬塞、びまん性白質梗塞等の脳血管性病変が挙げられる。さらに脳外科領域では慢性硬膜下血腫、正常圧水頭症等が認知症の原因となる。また、ヘルペス脳炎、アルコール・ビタミンＢ１欠乏に起因するウェルニッケ脳症、ビタミンＢ１２欠乏症、甲状腺機能低下症等も認知症を引き起こす。このような基礎疾患がなくても、老化に伴い脳が縮み（脳萎縮）、特に認知機能の中心的役割を担う海馬の萎縮が認知機能低下を引き起こす。本発明が対象とする認知症は、好適には、老化に伴う認知症である。
【００１９】
本明細書において、認知症の「改善」とは、認知症に伴う各種の症状の緩和及び進行の抑制を意味し、好ましくは日常生活に差し支えない程度にまで症状を緩和することを意味する。本明細書において、認知症の「予防」とは、認知症を発症しないようにすること、あるいは症状の進行を抑制することを意味する。
【００２０】
本発明において、DLPhtEtnを有効成分として含有する組成物は、認知症の改善及び／又は予防用の医薬組成物として提供することができる。
DLPhtEtnは、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して海馬神経細胞死を抑制し、それによって空間学習・記憶障害を改善し、ひいては認知機能を改善及び／又は予防することが可能となる。従ってDLPhtEtnを含有する組成物は、認知症、特に老化に伴う認知症の改善及び／又は予防に効果的である。
【００２１】
本発明において、「空間学習・記憶障害」とは、空間的な情報を学習・記憶する能力における障害を意味する。空間学習・記憶障害の有無は、例えば水迷路試験によって評価することができる。具体的には、濁った水をはった円形のプールに、マウスが這い上がって水から出られるプラットホームを水面下に作っておき、マウスをプールに入れプラットホームの場所を、プールの周りの空間的な物体の配置から学習させる。このトレーニングを１週間〜１０日間程行った後、プラットホームを取り除いた状態で、一定時間内にマウスがどれだけプラットホームが元あった場所を探すかどうか（滞納潜時）をテストし、空間学習・記憶機能を評価する。
【００２２】
例えば老化促進のモデルマウスとして、ＳＡＭＰ１，ＳＡＭＰ２，ＳＡＭＰ３，ＳＡＭＰ６，ＳＡＭＰ７，ＳＡＭＰ８及びＳＡＭＰ９等の老化促進マウス(Accelerated-senescence-prone mice (SAMP))が広く用いられている(Markowska AL, et al., Physiol Behav 1998; 64:15-26、 Takeda T, et al., J Am Geriati Soc 1991;39:911-9)が、これらのマウスでは、学習及び記憶障害が、老化に伴うコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の減少と並行して現れる（Maurice T, et al., Brain Res 1996;733:219-30、Nitta A et al., Behav Brain Res 1995;72:49-55、 Strong R, et al., Brain Res 2003;966:150-6)。水迷路試験では、ＳＡＭＰ８の滞納潜時は、ＳＡＭＲ１（老化促進に抵抗性を有するマウス(accelerated-senescence-resistant mice (SAMR))、正常な老化を示しＳＡＭＰのコントロールとして用いられている）のそれよりも延長していた。滞納潜時の延長は、老化に伴う空間学習・記憶障害を意味している。
【００２３】
本発明において、「海馬神経細胞死」とは海馬神経細胞のアポトーシスを意味する。海馬は、大脳辺縁系の一部であり、脳の空間学習・記憶能力に関与していることが知られている。老化により海馬神経細胞死が引き起こされ脳が委縮する。
海馬神経細胞死の有無は、海馬神経細胞のアポトーシスの有無を確認することによって評価することができる。具体的には、海馬領域の面積の測定や海馬神経細胞の数を測定することによって評価することができる。
【００２４】
本発明の認知症の改善及び／又は予防用組成物は、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
さらに、本発明の空間学習・記憶障害改善剤及び海馬神経細胞死の抑制剤も、上記した本発明の認知症の改善及び／又は予防用組成物と同様に、任意の添加物を含むことができる。尚、以下、本発明の認知症の改善及び／又は予防用医薬組成物に加え、組成物の態様である本発明の空間学習・記憶障害改善剤及び海馬神経細胞死の抑制剤を併せて「本発明の組成物」と称することがある。
【００２５】
一つの実施態様において、本発明の組成物は経口投与に好適な医薬製剤として処方され得る。経口投与に好適な医薬製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２６】
別の実施態様において、本発明の組成物は非経口的な投与に好適な医薬製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な医薬製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２７】
本発明の組成物を医薬として用いる場合の投与量は、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１回あたりの有効成分量は約５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１０〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１日１回〜３回投与する。
【００２８】
本発明の組成物は、食品として提供することができる。DLPhtEtnは、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して海馬神経細胞死を抑制し、それに伴い空間学習・記憶障害を改善することにより認知症、特に老化に伴う認知症の改善及び／又は予防に効果的である。従ってDLPhtEtnを含有する食品は、認知障害を伴う疾患や状態の予防や調節に効果的である。特に認知障害を伴う疾患や状態の予防や調節に効果的な機能性食品、及び空間学習・記憶障害の改善や海馬神経細胞死の抑制に効果的な機能性食品として提供することができる。ここで、「食品」とは、医薬品及び医薬部外品以外の全ての飲食物を意味する。例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、及びいわゆるサプリメントを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
食品である本発明の組成物は、有効成分としてDLPhtEtnを含有するが、その効能をより発揮するには、DLPhtEtnを好ましくは３０％以上、より好ましくは９０％以上含有する。食品中のDLPhtEtn以外の成分としては、上記した任意の添加物が挙げられる。
【００３０】
本発明の組成物を食品として用いる場合には、食品としては、例えば、一般食品（例えば、パン、乳製品（例、牛乳、ヨーグルト）、菓子、キャンデー、飴、チョコレート、ケーキ、プリン、ゼリー、清涼飲料水、麺類）、健康食品、ダイエタリーサプリメント、並びに厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品及び栄養機能食品が挙げられる。該食品は、液状物（水溶性、不溶性）、粉末、顆粒、錠剤、カプセル等の固形物、ゼリー状等の半固形物などの任意の形態であり得る。本発明の剤は水又は所定の水溶液に溶解して用いることができる。このような場合、本発明の剤は溶解補助物（例、リノール酸）、安定化剤を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の組成物を食品として用いる場合、その摂取量は、用いる形態（例、液状物、固形物、半固形物）、DLPhtEtn又はその塩の含有濃度等によって異なり一概に云えないが、通常、DLPhtEtn又はその塩の摂取量としては、１回あたり約５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１０〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、この量を１日１回〜３回摂取する。
【００３２】
本発明の組成物を医薬又は食品として用いる場合には、DLPhtEtn又はその塩の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいはDLPhtEtn又はその塩の多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。DLPhtEtn又はその塩の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された医薬又は食品としては、例えば、DLPhtEtn又はその塩の単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された医薬又は食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。DLPhtEtn又はその塩の多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬又は食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の医薬又は食品はまた、DLPhtEtn又はその塩の単位摂取量又はその分割量を、長期間（例えば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上）の摂取に十分な数で含み得る。
【００３３】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００３４】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００３５】
（材料と方法）
１．動物
動物に関する取扱いは、全て兵庫医科大学動物実験委員会の認可を受け、ＮＩＨ（国立衛生研究所）の実験動物の管理と使用に関する指針に準拠している。
老化促進マウスとしては雄性ＳＡＭＰ８を、老化促進に抵抗性を有するコントロールマウスとして雄性ＳＡＭＲ１を用いた。
雄性ＳＡＭＰ８及びＳＡＭＲ１（４週齢）は、武田薬品工業株式会社(Osaka, Japan)から入手した。マウスを２３±１℃、１２時間の明／暗−周期（午前７：００に点灯）で個別にケージ飼育し、餌（固形飼料）及び水ともに自由に摂取させた。DLPhtEtn (Avanti Polar Lipid, Inc., Alabaster, AL, USA)をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に溶解させたもの（最終容量０．１ｍＬ）又はＰＥＧ単独（最終容量０．１ｍＬ）をマウスに１週間に３回（月曜日，水曜日，及び金曜日）、実験前及び実験中の７ヶ月にわたって経口投与した。全ての試験は午前９：００〜午後５：００の間に行った。行動テストバッテリーは、以前から報告されているように（非特許文献２）、トレーニング歴による影響を最小限に抑えるために、低侵襲性から高侵襲性へと、オープンフィールドテスト(open field test)、水迷路試験(water maze test)及び受動回避テスト(passive avoidance test)の順に行った。
【００３６】
２．オープンフィールドテスト
オープンフィールドボックス（立方体のボックス、３０ｃｍ×３０ｃｍのプラスチック製プレート、光遮断用に木製の箱で覆う）をオープンフィールドテスト用に準備した。オープンフィールドアリーナには、箱の屋根に固定した白熱灯によって、１１０ルクスの光をあてた。外部からのノイズを避けるために、４５ｄＢのノイズをもたらすファンを箱の壁上に設置した。床上２ｃｍで、１０ｃｍの間隔をあけた２点から赤外線ビームを、床と並行に赤外線格子ができるように照射した。ビームが遮断された数を自発運動活性(locomotion activity)とみなした。一方、床上４．５ｃｍで２．５ｃｍの間隔をあけた１２点から赤外線ビームを照射した。ビームが遮断された数を立ち上がり活性(rearing activity)とみなした。マウスはオープンフィールド内を自由に動けるものとした。試験は、前半は点灯下で、後半は消灯下で行った。
【００３７】
３．水迷路試験
水迷路試験には、円形のプラスチック製の水槽（直径９０ｃｍ、深さ３６ｃｍ）を用いた。水槽の内側は全て黒色に塗り、底から２０ｃｍまで墨汁で濁った水を満たした（２２℃）。黒色に塗ったプラットホーム（直径１１ｃｍ）を水中に置き、水面下０．５ｃｍ水没するようにした。水槽は試験室に置き、マウスが水槽から見られる目印を幾つか設けた。試験を行っている間は、目印の位置は変えずにおいた。プラットホームを水槽の中央と端から等距離のところにある一定の位置、すなわち、４分円の一つの中心に設けた。無作為に選択した５箇所のうちの一つに水槽の壁に向き合わせてマウスを放し、プラットホーム上に退避するまでの時間を測定した。うまく退避できれば、マウスをそのままプラットホーム上で１０秒間滞在させた。９０秒以内にプラットホームを見つけることができなかったマウスは、試験を中止し、プラットホーム上に１０秒間滞在させた。１日に２回試験を行い、２回目の試験は最初の試験の後２分後に開始した。連続して８日間試験を行なった。７日後、プラットホームを除去し、プラットホームがあった場所に到達するまでの時間（滞納潜時：retention latency）を測定した。
【００３８】
４．受動的回避試験
受動回避装置には２つの部屋が設けられており、明るい前室（１０ｃｍ×１０ｃｍの床と高さ２０ｃｍの壁）と暗い後室（１０ｃｍ×１０ｃｍの床と高さ２０ｃｍの壁）を受動的回避試験に用いた。各部屋はギロチンドアで仕切られており、格子が両方の床に備え付けられている。マウスが暗室に入ると、ギロチンドアがロックされ、次いで０．３６ｍＡの電気刺激を３秒間、マウスの肢に与えた。その後、３０秒間マウスを室内に放した。最初、マウスを明るい部屋に置き、マウスが明るい部屋から暗い部屋へと移動する時間（移動潜時：acquisition latency）を測定した。２４時間後に同じ実験を行い、明るい部屋に滞在している時間（滞納潜時）を測定した。
【００３９】
５．体重及び脳重量の測定
ＳＡＭＲ１及びＳＡＭＰ８にＰＥＧ又はDLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した後、毎月これらのマウスの体重を測定した。行動学的な試験を行った後、マウスを犠殺して、脳を取り出し、その重量を測定した。
【００４０】
６．海馬領域の測定
行動学的な試験を行った後に取り出した脳を、パラホルムアルデヒドで固定し、粉末状ドライアイス中で凍結した。次いで脳の冠状断切片を厚さ１８μｍで、クライオスタット(LEICA CM 1800, Germany)を用いて調製した。海馬が検出される吻側部上から始まって、尾側部へと連続した８枚の切片を解析に用いた。海馬領域面積は、computer-based image analysis system (Image J, NIH, Bethesda, MD, USA)を用いて測定し、マウス１匹あたり８枚の切片からの領域面積を合計した。
【００４１】
７．海馬神経細胞数の計測
調製した８枚の冠状断切片を神経細胞のマーカーとなるＮｅｕＮに対するマウスモノクローナル抗体（１：５００）(CHEMICON, Billerica, MA, USA)と反応させ、次いでAlexa Fluor 488コンジュゲート２次抗体（１：５００）(Invitogen, Carlsbad, CA, USA)で反応させた。左側及び右側の両方ともで、海馬のＣＡ１領域における抗ＮｅｕＮ抗体に対して反応性のある神経細胞を、一定の選択した領域（１４２μｍ×１９２μｍ）中で計測した。マウス一匹あたり８枚の切片からの神経細胞数を合計した。
【００４２】
８．統計学的解析
統計学的解析は、Fisher’s Protected Least Significant Difference (PLSD)試験及びunpaired t-testを用いて行った。
【００４３】
実施例１：DLPhtEtnの老化促進マウスの過剰活動に及ぼす効果
オープンフィールドテストにおいて、光照射条件下で、ＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８の自発行動活性(locomotion activity)はＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１のそれと比べて増加していた(P=0.0007, Fisher’s PLSD test)。DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を７ヶ月間経口投与すると、DLPhtEtnを投与していないＳＡＭＰ８では増加した自発行動活性を、暗い条件下でも明るい条件下でも顕著に抑制した（ＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８に対する活性と比べて、明るい条件下でP=0.0011、暗い条件下でP<0.0001, Fisher’s PLSD test）。
PEG投与したＳＡＭＰ８の立ち上がり活性(Rearing activity)もまた、PEG投与したＳＡＭＲ１のそれに比べて増加していた（明るい条件下で、P<0.0001, Fisher’s PLSD test）。PEG投与したＳＡＭＰ８の立ち上がり活性の増加はDLPhtEtnで処置することにより顕著に弱まった（PEG投与したＳＡＭＰ８についての活性と比べて、明るい条件下でP=0.0010、暗い条件下でP<0.0001, Fisher’s PLSD test)。これらの結果を併せると、ＳＡＭＰ８の自発行動活性はＳＡＭＲ１のそれよりもより高く、そしてDLPhtEtnによってＳＡＭＰ８の過剰な活動が抑制されることがわかった。
【００４４】
実施例２：DLPhtEtnの老化促進マウスの空間学習・記憶障害に及ぼす効果
PEG投与したＳＡＭＰ８の滞納潜時はPEG投与したＳＡＭＲ１のそれに比べてより延長していた(P=0.0421, Fisher’s PLSD test)が、DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を７ヶ月間経口投与すると、DLPhtEtnを投与しなかったＳＡＭＰ８で観察された延長された滞納潜時をコントロールマウスであるＳＡＭＲ１と同程度にまで短縮した（PEG投与したＳＡＭＰ８についての活性と比べてP=0.0282, Fisher’s PLSD test）（図１）。このことは、DLPhtEtnが老化に伴う空間学習・記憶障害を改善し得ることを示している。
【００４５】
実施例３：DLPhtEtnの老化促進マウスの探索的行動や不安行動に及ぼす影響
受動的回避試験では、ＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１とＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８との間で移動潜時に顕著な違いは見られず、また、DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を７ヶ月間経口投与しても移動潜時には何の影響も与えなかった。
対照的に、ＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１の滞納潜時はＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８に比べて顕著に延長した(P=0.043, Fisher’s PLSD test)。この結果はＳＡＭＰ８では恐怖記憶が減少していることを示している。DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を７ヶ月間投与してもDLPhtEtnを投与していないＳＡＭＰ８で見られた恐怖記憶の減少には影響を与えなかった。このことは、DLPhtEtnは探索的行動や不安行動には影響を及ぼさないことを示している。
【００４６】
実施例４：DLPhtEtnの老化促進マウスにおける海馬神経細胞死に及ぼす効果
ＳＡＭＰ８及びＳＡＭＲ１において、ＰＥＧ又はDLPhtEtnを７ヶ月間投与することにより体重が次第に増加した。ＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８における体重増加はＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１における体重増加に比べて明らかに少なかった(P=00143, Fisher’s PLSD test)。DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を経口投与することにより、ＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１で体重が増加するのと同程度にＳＡＭＰ８の体重が増加した。
対照的に、脳重量においては、ＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１及びＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８の間で違いはなく、また、DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を経口投与してもＳＡＭＰ８の脳重量に何の影響も及ぼさなかった。
次に、ＳＡＭＰ８における海馬サイズを測定した（図２）。DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を経口投与したＳＡＭＰ８の海馬サイズは、DLPhtEtnを投与しなかったＳＡＭＰ８の海馬サイズよりも大きい傾向にあったが、有意な差ではなかった。
さらにＳＡＭＰ８について海馬神経細胞数を測定した（図３）。DLPhtEtn（１ｍｇ／ｋｇ）を経口投与したＳＡＭＰ８の海馬神経細胞数は、DLPhtEtnで処理していないＳＡＭＰ８のそれに比べて明らかに多かった(P=0.0002, unpaired t-test)（図３）。これらの結果より、DLPhtEtnが老化に伴う細胞死から海馬神経細胞を保護していることが示された。
海馬の萎縮度（海馬神経細胞死の程度）と認知障害には相関関係があることが報告されており（Sakamoto T, Ebisu Y, Ikeda A, Nakaya M, Nishizaki T. Hippocampal size may contribute to prospective diagnosis of age-related dementia. Psychogeriatrics 7: 76-80, 2007）、従って海馬神経細胞死を抑制することは海馬の萎縮を抑制することができ、認知症の予防に繋がる。
【００４７】
水迷路試験では、ＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８の滞納潜時は、ＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１に比べて顕著に延長した。このことは、ＳＡＭＰ８の空間学習・記憶の低下を反映している（すなわち、老化に伴う空間学習・記憶の低下）。DLPhtEtnを経口投与することによって、ＳＡＭＰ８で延長した滞納潜時が顕著に短縮され、コントロールマウスであるＳＡＭＲ１の潜時と同程度にまで短縮することができた。この結果は、DLPhtEtnが老化に伴う空間学習・記憶障害を改善し得ることを示唆している。
【００４８】
自発行動活性を評価するためのオープンフィールドテストではＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８では、ＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１に比べてより高い活性を示した。DLPhtEtnを経口投与することによりＳＡＭＰ８の過剰な活性を抑制した。この結果は、老化に伴う学習・記憶障害のDLPhtEtnによる改善が自発行動活性の増強によるものではないことを示唆している。
【００４９】
探索的行動及び不安行動を評価するための受動的回避試験では、ＰＥＧ投与したＳＡＭＰ８の滞納潜時はＰＥＧ投与したＳＡＭＲ１に比べて顕著に短かったが、習得潜時についてはＳＡＭＰ８とＳＡＭＲ１とには違いはなかった。この結果は、ＳＡＭＰ８の恐怖記憶が増強されたことを示唆している。DLPhtEtnを経口投与しても、ＳＡＭＰ８における習得潜時も滞納潜時もいずれにおいても影響を受けなかった。この結果は、DLPhtEtnが探索的行動及び不安行動とは独立して老化に伴う空間学習・記憶障害を改善している可能性を示唆している。
【００５０】
DLPhtEtnを投与したＳＡＭＰ８の海馬サイズはDLPhtEtnを投与していないＳＡＭＰ８の海馬サイズよりも大きい傾向にあるが、ＳＡＭＰ８の脳重量にはDLPhtEtnは何の影響も与えなかった。特に、DLPhtEtnで処理したＳＡＭＰ８の海馬神経細胞数は、DLPhtEtnを投与していないＳＡＭＰ８の数よりも明らかに多かった。これらの結果より、ＳＡＭＰ８において、老化に伴う海馬神経細胞のアポトーシスをDLPhtEtnが保護することにより老化に伴う空間学習・記憶障害が改善されている可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のDLPhtEtnを有効成分として含有する組成物は、海馬神経細胞死を抑制することによって空間学習・記憶障害を改善することができる。従って認知症の改善及び／又は予防用組成物、空間学習・記憶障害改善剤及び海馬神経細胞死の抑制剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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