(57)【要約】【課題】本発明は、プラズモン励起センサ表面上に存在する媒体として水より屈折率の小さい媒体を採用することにより測定装置の小型化を可能とするとともに、さらなる高感度な測定をも可能とする、ＳＰＦＳに基づくアッセイ法を提供することを目的とする。  【解決手段】本発明のアッセイ法は、工程（ａ）：透明誘電体基板と、金属薄膜と、リガント等とからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；工程（ｂ）：工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、リガンドと蛍光分子とからなるコンジュゲートを反応させる工程；工程（ｃ）：工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、屈折率が水より小さい媒体を流しつつ接触させた状態で、前記透明誘電体基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、工程（ｄ）：工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程を含む。【選択図】図1
2011169609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法：
工程（ａ）：透明誘電体基板と、該基板の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）と、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは反対側の表面に固定化された第１のリガンドとからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光分子とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程；
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、屈折率が水より小さい媒体を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明誘電体基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
【請求項２】
波長633nmの光に対する前記媒体の屈折率が１〜１．３３である請求項1に記載のアッセイ法。
【請求項３】
前記媒体が空気またはメタノールである請求項1に記載のアッセイ法。
【請求項４】
前記工程（ａ）に記載のプラズモン励起センサにおいて、誘電体からなるスペーサ層が前記金属薄膜と前記ＳＡＭとの間に配置されている請求項1〜3のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項５】
前記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含む請求項4に記載のアッセイ法。
【請求項６】
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である請求項1〜5のいずれかに記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のアナライトをプラズモン蛍光測定を用いて高感度に検出するとともに、測定系の小型化および低コスト化を可能とするアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
【０００３】
このＳＰＦＳに基づくバイオセンサまたはバイオチップについて、高感度化を図ろうとする研究など種々の研究が多くの研究者等により行われてきた。例えば、特開２００９−４２０９６号公報（特許文献1）では、プリズム表面に設けられた金属膜と試料保持部と
の間に、表面グラフト重合法により金属膜表面と結合した高分子化合物からなるバリア膜を設けることによって、金属消光が生じない距離に試料を保持するとともに該バリア膜の膜厚を均一なものとし、蛍光検出感度を高める試みがなされている。ここで、この特許文献１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムでは、環状ポリオレフィンなどの光学用樹脂から形成されるプリズムが基体として用いられており、その表面に金属膜等が形成されている。
【０００４】
しかし、これらの研究において、バイオセンサ等の表面上に存在する媒体として、いずれもバッファー溶液などの水系媒体が用いられている。前記特許文献1において、実施例
では、表面プラズモン増強蛍光測定用プリズムへの抗体等の導入はＰＢＳバッファー溶液の形でなされており、その後の蛍光測定の際に該プリズム表面上に存在する媒体として非水系媒体を用いる旨の記載はない。現在までのところ、このバイオセンサ等の表面上に存在する媒体の屈折率に着目した研究についての報告、特に、水系媒体に代えて、水よりも屈折率の低い溶液または気体を用いたＳＰＦＳ系によるバイオアッセイについての報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−４２０９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＰＦＳに基づくバイオアッセイ法においては、測定対象となる蛋白質、核酸、糖鎖などの生体分子を安定且つ自然に存在する状態に保つ目的でバイオセンサ等への検体の導入及び／または固定化をバッファー溶液等の水系溶液中で行うことから、測定時においても、バイオセンサ等の表面上に存在する媒体としてバッファー溶液等の水系溶液が用いられている。ここで、ＳＰＦＳを用いた測定は、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において行われる。
【０００７】
ここで、全反射減衰が起こるためには全反射が起こることが前提となるから、まず、全反射が生じる入射角について、図２を参照しつつ検討する。
【０００８】
まず、図２（Ａ）に示すように、屈折率ｎを有する媒質Ｘを通過する光が、屈折率ｎ'
を有する別の媒質Ｙに対して入射角θで進入するときの屈折角をθ'とすると、ｎ，ｎ'，θ，θ'はスネルの法則に従い、下記式（１）
ｎsinθ ＝ ｎ'sinθ'         （１）
を満たす関係にあることから、sinθ'は、下記式（２）
sinθ' ＝ (ｎ／ｎ') sinθ    （２）
の形で求められる。
【０００９】
ここで、媒質Ｙの屈折率ｎ'が媒質Ｘの屈折率ｎより小さい場合には、sinθ'＝１、す
なわち、屈折角θ'が９０°であるような入射角θが存在し、このときの入射角θを臨界
角θcという。図２（Ｂ）に示すように、θ＝θcのときには、屈折光が媒体Ｘと媒体Ｙとの界面に沿って進行する。この臨界角θcは、具体的には、下記式（３）
sinθc ＝ ｎ'／ｎ            （３）
あるいは、下記式（４）
θc ＝ Sin-1(ｎ'／ｎ)        （４）
の形で求められる。入射角θがこの臨界角θcより大きくなると、媒質Ｘを通過する光は
媒質Ｙに進入することができず、その全てが媒質Ｘと媒質Ｙとの界面で反射して再び媒質Ｘに戻る。このような現象を全反射という。
【００１０】
ＳＰＦＳなどプラズモン励起に基づく測定方法においては、金属薄膜を有するプリズム（あるいは、金属薄膜を有さないプリズムと金属薄膜を有する透明平面基板とからなる金属薄膜を有するプリズム系）と、その金属薄膜をはさんでそのプリズムの反対側にある媒体とが全反射条件となるような角度で光源の入射が行われる。このとき、上記プリズムおよび媒体は、それぞれ上記媒質ＸおよびＹとしての役割を果たすところ、プリズムの屈折率が高いほど、全反射が起こるために必要な光源の入射角を小さくすることができ、一方、プリズムの屈折率が低いほど、全反射が起こるために必要な光源の入射角が大きくなる。例えば、従来のＳＰＦＳ系について、屈折率が１．４７，１．５２，１．７２および１．９０であるプリズムを用いた場合における臨界角θcを上記式（４）を用いてそれぞれ
概算すると、前記媒体が水系媒体であることからその媒体の屈折率を１．３３として、それぞれ６５°，６１°，５１°および４４°と算出される。ここで、屈折率１．４７のプリズムについての値は、ＰＹＲＥＸ（登録商標）などのホウケイ酸ガラス（可視光では屈折率１．４７〜１．４８程度）をプリズムとして用いる場合の値に相当する。一方、屈折率１．５２，１．７２および１．９０のプリズムについての値は、光学ガラスをプリズムとして用いる場合の値に相当する。また、プリズムとして光学用樹脂が用いられている場合についてみると、例えば、特許文献1の実施例に記載の表面プラズモン増強蛍光測定用
プリズムに用いられる屈折率１．５０の光学用樹脂製プリズムでは、その臨界角θcは同
様に６２°と算出される。ただし、これらの数値は、あくまで臨界角θcであることから
、実際に全反射減衰（ＡＴＲ）条件を実現させるためには、さらに大きな入射角が必要となる。また、従来のＳＰＦＳシステムにおいては、媒体としてバッファー溶液が用いられていることから、そのバッファー溶液中の塩類によりその媒体の屈折率が上記試算に用いた値より大きくなる場合があり、それに伴いさらに大きな入射角が必要となる場合もある。しかし、実際のＳＰＦＳシステムにおいては、９０°に近い入射角をもって光源からの光をプリズムに導入することは困難であり、例えば、入射角が８０°以上の場合には、流路上への入射光の形状が歪むため、ＳＰＲを正確に測定することができず、また、ＳＰＦＳにおいても、測定エリアに対しての照射密度が落ちるため感度が低下するという問題点がある。これらの点を考慮すると、従来のＳＰＦＳシステムにおいては、ホウケイ酸ガラスなどの低屈折率材料をプリズムとして用いることは実際上困難であり、そのため、高屈折率の光学ガラスまたは光学用樹脂をプリズムとして用いる必要がある。
【００１１】
一方、ＳＰＦＳ装置の小型化を図るためには、光源の設置位置及びプリズムへの導光機
構を考慮すると、光源の入射角を小さくすることが好ましいが、従来のＳＰＦＳシステムにおいて光源の入射角を小さくするためには、より屈折率の高い光学ガラスをプリズムとして用いる必要がある。しかし、そのような屈折率の高い光学ガラスは一般に高価であることから、それに伴い、従来のＳＰＦＳシステムにはコストが上昇するという問題点もある。実際、従来のＳＰＦＳシステムにおいては、コストの面から、表面に直接金属薄膜を形成させたプリズムではなく、金属薄膜を有さないプリズムと、表面に金属薄膜を形成させた透明平面基板とを組み合わせたプリズム系が、金属薄膜を有するプリズムとして用いられている。
【００１２】
また、ＳＰＦＳ装置のさらなる小型化を行おうとすると、レーザ光を導光するための複雑なミラー機構などを導入する必要がさらに生じ、ＳＰＦＳシステムが複雑になる問題点もある。
【００１３】
本発明は、従来のＳＰＦＳシステムにおけるこのような問題点を克服するため、プラズモン励起センサ表面上に存在する媒体として水より屈折率の小さい媒体を採用することにより測定装置の小型化を可能とするとともに、さらなる高感度な測定をも可能とする、ＳＰＦＳに基づくアッセイ法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いてアナライトの検出を行うに当たり、プラズモン励起センサの金属薄膜表面上に存在する媒体として、水系媒体の代わりに水より屈折率の小さい媒体を用いると、光源の入射角を小さくすることができるとともに高い電場増強効果を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明のアッセイ法は、
工程（ａ）：透明誘電体基板と、該基板の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）と、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは反対側の表面に固定化された第１のリガンドとからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光分子とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程；
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、屈折率が水より小さい媒体を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明誘電体基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程
を含む。
【００１６】
本発明に係るアッセイ法において、波長633nmの光に対する前記媒体の屈折率が１〜１
．３３であることが望ましい。また、このような媒体は、具体的には、空気またはメタノールであることが望ましい。
【００１７】
また、本発明に係るアッセイ法において、前記工程（ａ）に記載のプラズモン励起センサにおいて、誘電体からなるスペーサ層が前記金属薄膜と前記ＳＡＭとの間に配置されていることが望ましく、この誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（Ｔ
ｉＯ2）を含むことが特に望ましい。
【００１８】
また、本発明に係るアッセイ法の対象となる典型的な検体は、血液、血清、血漿、尿、
鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、プラズモン励起センサの金属薄膜表面上に存在する媒体として、水より屈折率の小さい媒体を用いることによって光源の入射角を小さくすることができ、これによって、測定装置の小型化を可能とするとともに、得られる高い電場増強効果による高感度化をも可能とするアッセイ法を提供することができる。また、屈折率の低い基板を用いることができるので、より多種多様な基板をプラズモン励起センサに用いることができ、コストの低減をも図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本願発明に係るアッセイ法の模式図を示す。
【図２】屈折についての説明図を示す。
【図３】ＳＰＦＳモデルによるシミュレーションから試算された、金属表面に存在する媒体の屈折率と電場増強効果との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について、図１を参照しながら具体的に説明する。
【００２２】
〔アッセイ法〕
本発明の第１の態様は、
工程（ａ）：透明誘電体基板１１と、該基板１１の表面に形成された金属薄膜１２と、該金属薄膜１２の、該基板１１とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）１３と、該ＳＡＭ１３の、該金属薄膜１２とは反対側の表面に固定化された第１のリガンド２１とからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンド２３と蛍光分子２４とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程；
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、屈折率が水より小さい媒体を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明誘電体基板１１の、前記金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子２４から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライト２２の量を算出する工程
を含むことを特徴とするアッセイ法である。
【００２３】
すなわち、本発明においては、図１における媒体３１として、屈折率が水より小さい媒体が用いられることを最大の特徴とする。
【００２４】
＜工程（ａ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ａ）は、透明誘電体基板１１と、該基板１１の表面に形成された金属薄膜１２と、該金属薄膜１２の、該基板１１とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）１３と、該ＳＡＭ１３の、該金属薄膜１２とは反対側の表面に固定化された第１のリガンド２１とからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程である。
【００２５】
本発明の１態様において、金属薄膜１２とＳＡＭ１３との間に、誘電体からなるスペーサ層を設けることが望ましい。
【００２６】
透明誘電体基板
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する基板として透明誘電体基板１
１が用いられる。本発明において、平面基板として透明誘電体基板１１を用いるのは、後述する金属薄膜１２への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。
【００２７】
本発明で用いられる透明誘電体基板１１について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明誘電体基板１１が、ガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよい。
【００２８】
本発明で用いられる透明誘電体基板１１は、金属薄膜１２を形成するための表面として、少なくとも金属薄膜形成用平面を有する。このような透明誘電体基板１１の例として、透明平面基板が挙げられる。本発明では、透明誘電体基板として透明平面基板を用いて作成されるプラズモン励起センサは、金属薄膜形成用平面とは反対側の平面を、後述するプリズムと密着させた態様で用いられる。この透明平面基板において、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００２９】
また、透明誘電体基板１１は、金属薄膜形成用平面のほかにプリズム部など他の構成要素をさらに含んでいてもよく、例えば、金属薄膜形成用平面およびプリズム部を含むプリズム一体化基板であってもよい。ここで、このプリズム一体化基板において、金属薄膜形成用平面は、プリズム部における光反射面に位置する。本発明で透明誘電体基板１１としてプリズム一体化基板を用いる利点としては、金属薄膜形成用平面とプリズム部とが一体化された構造により金属薄膜形成用平面とプリズム部との界面における入射光の反射を抑制できる点などが挙げられる。なお、本発明で用いられるプリズム一体化基板では、金属薄膜形成用平面とプリズム部とが一体化されていることから大きさは特に限定されない。
【００３０】
ここで、本発明に係るアッセイ法のように、蛍光測定時に金属薄膜１２等をはさんで透明誘電体基板１１の反対側に存在する媒体（以下、単に「媒体」という場合がある。）３１として水よりも屈折率の小さい媒体を用いる場合における全反射について検討する。後述するように、水よりも屈折率の小さい媒体の例としては空気が挙げられることから、ここでは、空気をこのような媒体３１として用いた場合に検討する。この場合に、屈折率が１．４７，１．５２，１．７２および１．９０の透明誘電体基板における臨界角θcを計
算すると、空気の屈折率を１．００として、上記式（４）によりそれぞれ４３°，４１°，３５°および３２°と算出される。この計算結果は、従来のＳＰＦＳシステムで用いられているものと同様の高屈折率の光学ガラスを透明誘電体基板として用いた場合には、光源の入射角をより小さくすることができることを示している。これは、ＳＰＦＳ装置の小型化を図る上で有利な点である。一方、上記の計算結果はまた、ＰＹＲＥＸ（登録商標）に代表されるホウケイ酸ガラスのような低屈折率材料を透明誘電体基板として用いた場合には、光源の入射角を従来のＳＰＦＳシステムにおける入射角と同等の角度に抑えることができるので、ＳＰＦＳシステムのコストを引き下げることが可能となることも示している。
【００３１】
本発明で用いられる透明誘電体基板１１は、ＳＰＦＳ装置の小型化の観点からは、ｄ線（５８８ｎｍ）に対する屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．５〜２である。一方、コスト面
を重視する観点からは、透明誘電体基板１１の屈折率が前記範囲より低くてもよく、例えば、屈折率が水より小さい媒体として空気を用いる場合には、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が１．４〜２であってもよい。
【００３２】
ただ、ＳＰＦＳシステムにおいて検出する目的物質である蛍光の増強度の観点からは、波長６３３ｎｍの光に対する屈折率〔ｎ633〕によって規定する方がより適切である。そ
の場合、ＳＰＦＳ装置の小型化の観点からは、透明誘電体基板１１の屈折率として、〔ｎ
633〕が１．５〜２であることが望ましい。一方、コスト面を重視する観点からは、前記
〔ｎd〕によって規定する場合と同様、透明誘電体基板１１の屈折率が前記範囲より低く
てもよい。
【００３３】
透明誘電体基板１１としてガラス製の透明平面基板を用いる場合、ＳＰＦＳ装置の小型化の観点からは、従来のＳＰＦＳシステムで用いられるものと同様の光学ガラスを透明誘電体基板１１の材料として用いることができ、その市販品として、ＳＣＨＯＴＴ  ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎd〕１．５２，〔ｎ633〕１．５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎd〕 １．８５，〔ｎ633〕１．８４）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（
屈折率〔ｎd〕１．８４，〔ｎ633〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎd〕１
．８８，〔ｎ633〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎd〕１．９０，〔ｎ633〕１．９０）、並びに（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎd〕１．７２，〔ｎ633〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３４】
一方、コスト面を重視する観点からは、上記光学ガラスよりも屈折率の小さい材料を採用してもよく、例えば、屈折率が水より小さい媒体として空気を用いる場合には、コーニング社製のＰＹＲＥＸ(登録商標)７７４０（屈折率〔ｎd〕１．４７，〔ｎ633〕１．４７）などが好ましい。
【００３５】
一方、透明誘電体基板１１としてプリズム一体化基板を用いる場合、このプリズム一体化基板は、上述の透明平面基板に用いられるガラスを材料とするものであってもよく、また樹脂製であってもよい。ただ、価格、成形性、成形による光学特性低下の少なさなどの理由から、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの光学用樹脂製のものが好ましい。透明誘電体基板１１として用いられるプリズム一体化基板は、例えば、原料樹脂を射出成形することにより形成することができるし、日本ゼオン株式会社製  ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）  ３３０Ｒ（屈折率〔ｎd〕１．５０，〔ｎ633〕１．５０）などの市販品を使用することもできる。
【００３６】
透明誘電体基板１１は、その表面に金属薄膜１２を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００３７】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００３８】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００３９】
金属薄膜
本発明に係るアッセイ法では、前記透明誘電体基板１１の表面に金属薄膜１２を形成する。この金属薄膜１２は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光分子２４の発光をもたらす役割を有する。
【００４０】
上記透明誘電体基板１１の表面に形成された金属薄膜１２としては、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００４１】
なお、透明誘電体基板１１としてガラス製平面基板またはガラス製プリズム一体化基板
を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜１２とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を透明誘電体基板１１の表面に形成することが好ましい。
【００４２】
透明誘電体基板１１上に金属薄膜１２を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜１２を形成することが好ましい。
【００４３】
金属薄膜１２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００４４】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００４５】
金属薄膜１２の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００４６】
誘電体からなるスペーサ層
本発明に係るアッセイ法では、この金属薄膜１２による蛍光分子２４の金属消光を防止することを目的として、誘電体からなるスペーサ層を形成することが望ましい。このスペーサ層は、金属薄膜１２の、上記透明誘電体基板１１と接していないもう一方の表面に形成される。
【００４７】
このスペーサ層の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（Ｔ
ｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００４８】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。本発明のアッセイ法では、電場をより効果的に増強させる目的から、スペーサ層の厚さが１０〜１００ｎｍであることが望ましい。
【００４９】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００５０】
ＳＡＭ
自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）１３は、金属薄膜１２、あるいは必要により金属薄膜１２上に形成された前記スペーサ層の透明誘電体基板１１とは反対側の面に形成される。本発明のアッセイ法では、後述する検体及び蛍光ラベルを後述するリガンド２１および２３を介して金属薄膜１２（あるいは、その上に形成したスペーサ層）に固定した状態で、蛍光測定を行うが、このとき、リガ
ンド２１を、ＳＡＭ１３を介して金属薄膜１２等に固定する。すなわち、ＳＡＭ１３は、リガンド２１を金属薄膜１２等に固定する際の土台としての役割を有する。
【００５１】
本発明において、誘電体層からなるスペーサ層を有する場合では、ＳＡＭ１３がシランカップリング剤からなることが好ましく、このようなシランカップリング剤として、アミノ基またはカルボキシル基を有するシランカップリング剤であれば、特に限定せずに従来公知のものを用いることができる。このＳＡＭ１３が含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭ１３の光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００５２】
また、後述するようにＳＡＭ１３上にコーティング層を形成する場合には、ＳＡＭ１３が含む単分子として、炭素原子数４〜２０程度のアミノアルカンチオール、例えば１０−アミノ−１−デカンチオールを用いてもよい。このようにアミノ基を有する単分子をＳＡＭ１３に使用すると、該ＳＡＭ１３上に形成するコーティング層を構成する分子としてカルボキシル基を有する親水性高分子を用いることができる。
【００５３】
ＳＡＭ１３の形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜１２がその表面に形成された透明誘電体基板１１を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）あるいは１０−アミノ−１−デカンチオールを含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールあるいは１０−アミノ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭ１３を形成する。
【００５４】
コーティング層
本発明においては、リガンド２１を前記ＳＡＭ１３を形成後に得られるプラズモン励起センサに固定化しやすくすると共に、アナライトのプラズモン励起センサへの非特異的吸着を抑制することを目的として、上記ＳＡＭ１３上にカルボキシメチルデキストラン、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子からなるコーティング層を形成させてもよい。このコーティング層は、活性エステル化法などの従来公知の方法を用いて親水性高分子をＳＡＭ１３に結合させることによって形成することができる。
【００５５】
第１のリガンド
本発明では、前記ＳＡＭ１３を形成後に得られるプラズモン励起センサ前駆基板のうち、ＳＡＭ１３を形成した側の表面に第１のリガンド２１を結合させる。この第１のリガンド２１は、プラズモン励起センサに、検体中のアナライト２２を固定させる目的で用いられるものである。本発明において、工程（ａ）で用いられるリガンドを「第１のリガンド」２１と称するのは、後述する工程（ｂ）で用いられるリガンド（「第２のリガンド」）２３）と区別するためである。
【００５６】
本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライト２２を特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。
【００５７】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００５８】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
【００５９】
この第１のリガンド２１の固定化方法としては、例えば、上記ＳＡＭ１３を形成するシランカップリング剤などが有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。ＳＡＭ１３上に上記コーティング層を形成させている場合には、このコーティング層を介してリガンド２１をＳＡＭ１３に固定化させてもよい。例えば、ＳＡＭ１３上のコーティング層に、活性エステル化法などの従来公知の方法を用いてリガンド２１を結合させることによってリガンド２１をＳＡＭ１３に固定することができる。
【００６０】
なお、後述する検体等がプラズモン励起センサに非特異的に吸着することを防止するため、上記第１のリガンド２１を固定化させた後に、プラズモン励起センサの表面を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）およびエタノールアミン塩等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００６１】
検体
本発明において、「検体」とは、本発明のアッセイ法による測定対象となる種々の試料をいう。
【００６２】
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００６３】
接触
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのリガンド２１等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。ただし、蛍光測定を行う際には、この送液の代わりに屈折率が水より小さい媒体が導入される。したがって、この「接触」という語は、後述するようにプラズモン励起センサのリガンド２１等が固定化されている面を媒体３１中に浸漬されている状態にする意味で用いられる場合もある。工程（ａ）では、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【００６４】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。さらに、本発明のアッセイ法においては、後述するように、蛍光測定時に導入される、水よりも屈折率の小さい媒体もまた、この流路を通じてプラズモン励起センサに送達さ
れる。ここで、この流路の形状として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【００６５】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン(登録商標)、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。水よりも屈折率の小さい媒体としてメタノールなどの有機溶媒を用いる場合であっても、流路の材料として上記材料を用いることができる。
【００６６】
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜１２およびＳＡＭ１３が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【００６７】
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【００６８】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【００６９】
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、及びその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
【００７０】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
【００７１】
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるの
で好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサを併用してもよい。
【００７２】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するか或いは別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、ＳＡＭ層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【００７３】
本発明においては、送液等のほか、水よりも屈折率の小さい媒体もまた流路を通じてプラズモン励起センサ部に導入される。このとき、空気などの気体を媒体として用いる場合においても、水などの液体を媒体として用いる場合と同様に流路を通じてプラズモン励起センサ部に導入される。
【００７４】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００７５】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【００７６】
送液中の検体中に含有されるアナライト２２の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【００７７】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
【００７８】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎ
である。
【００７９】
洗浄工程
洗浄工程とは、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および後述する工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程（ｂ）の前後のうち少なくともいずれか一方に含まれることが好ましい。
【００８０】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
【００８１】
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００８２】
＜工程（ｂ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ｂ）は、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサ、好ましくは工程（ａ）の後に上記洗浄工程をさらに経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンド２３と蛍光分子２４とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程である。
【００８３】
蛍光分子
「蛍光分子」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する分子を意味し、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００８４】
本発明で蛍光分子２４として用いられる蛍光色素は、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００８５】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,
９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,
９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００８６】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
また、蛍光分子２４として用いられる蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光分子２４となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００８９】
本発明においては、例えば、金属薄膜１２として金を用いる場合には、最大蛍光波長が６００〜７００ｎｍの範囲にある蛍光色素を使用することが望ましい。このような蛍光色素として、例えば、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  ６４７などが挙げられ、特にＡｌｅｘａ  ６４７を使用することが望ましい。一方、金属薄膜１２として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００〜７００ｎｍの範囲にある蛍光色素を使用することが望ましい。
【００９０】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【００９１】
第２のリガンドと蛍光分子とからなるコンジュゲート
「第２のリガンドと蛍光分子からなるコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）２２を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。
【００９２】
本発明のアッセイ法において、第２のリガンド２３は、アナライト２２に蛍光分子２４による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、前記第１のリガンド２１と同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンド２１として用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンド２３として用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００９３】
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）２２と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
【００９４】
「第２のリガンドと蛍光分子とからなるコンジュゲート」の作製方法としては、第２の
リガンド２３として２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００９５】
このように作製された「第２のリガンドと蛍光分子とからなるコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬ
がより好ましい。
【００９６】
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
【００９７】
＜工程（ｃ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ｃ）は、工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、屈折率が水より小さい媒体を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明誘電体基板１１の、前記金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光分子２４から発光された蛍光量を測定する工程である。
【００９８】
屈折率が水より小さい媒体
本発明に係るアッセイ法においては、プラズモン励起センサの金属薄膜表面上に存在する媒体３１として、屈折率が水より小さい媒体が用いられる。具体的には、屈折率が水より小さい媒体を測定系内に導入し、工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに流しつつ接触させた状態で蛍光測定が行われる。本発明において、媒体３１として屈折率が水より小さい媒体を用いるのは、プラズモン励起センサの基板部分である透明誘電体基板１１と金属薄膜１２をはさんで透明誘電体基板１１の反対側に存在する媒体３１との間で全反射減衰（ＡＴＲ）を成立させたときに生じる電場増強効果が、媒体３１の屈折率が低いほど強く生じるからである。
【００９９】
このことを、本発明に係るアッセイ法における条件を模擬したＳＰＦＳモデルによるシミュレーションによって説明する。ここでは、屈折率１．７２の透明誘電体基板１１、厚さ５０ｎｍの金である金属薄膜１２、および屈折率１．４５かつ厚さ１ｎｍのＳＡＭ１３からなるモデルプラズモン励起センサと媒体３１とからなるＳＰＦＳシステムについて、波長６３３ｎｍの入射光を照射した場合における媒体３１の屈折率変化と電場増強効果との関係についてシミュレーションを行い、その結果を図３に示す。ここで、図３に記載されている「金属表面屈折率」は媒体３１の屈折率に対応する値であり、図３で「電場増強効果」として示してある値は、金属表面屈折率を固定しながら入射角を変化させたときの、電場増強効果の最大値を各金属表面屈折率について示している。具体的には、照射したフォトン量を基準としたときの電場増強効果によるフォトン増加量を、「電場増強効果」として示している。なお、各金属表面屈折率において、最大の電場増強効果を与える入射角を増強角という（増強角については、図示せず。）。
【０１００】
図３に示されるように、金属表面屈折率、すなわち媒体３１の屈折率が小さいほど金膜
表面における電場増強効果が大きい傾向にある。また、具体的な数値について言及すると、例えば、金属表面屈折率が１．３３５（これは、媒体３１が水である場合に相当する。）の場合には電場増強効果が１７．１倍であり、このときの増強角が５７．３°である。これに対して、金属表面屈折率が１．００（これは、媒体３１が空気である場合に相当する。）の場合には電場増強効果が２５．６倍であり、このときの増強角が３７．５５°である。
【０１０１】
このように、金属表面屈折率、すなわち媒体３１の屈折率が小さいほど、電場増強効果が大きくなり、かつ増強角が小さくなることが分かる。
【０１０２】
このように、媒体３１として屈折率が水よりも小さい媒体を用いると、媒体３１として水を用いた場合と比べて、より小さな入射角のもとで、より大きな電場増強効果を得ることができる。そのため、媒体３１として屈折率が水よりも小さい媒体を用いる本発明においては、向上した電場増強効果のもと、蛍光測定における蛍光シグナル強度が増大し、そのため高感度な測定が可能となる。
【０１０３】
この「屈折率が水より小さい媒体」は、本発明の目的が達成される限り、屈折率が水より低いどのような媒体であってもよく、液体、気体、および該当する場合には超臨界流体のいずれの形態を有していてもよい。ここで、本発明において「屈折率が水より低い」とは、測定を行う温度において、測定に用いる入射光の波長に対する屈折率が純水より低いことをいう。そのため、測定温度および光源として用いる入射光の波長によって「屈折率が水より低い」に該当する具体的な屈折率の範囲は変化しうる。
【０１０４】
まず、測定温度による変化をみると、水のｄ線（５８８ｎｍ）に対する屈折率〔ｎd〕
は、１５℃，２０℃および３５℃においてそれぞれ１．３３３８，１．３３３３および１．３３１６であり、測定温度が高くなるほど水の屈折率が低くなる傾向にある。ただ、本発明に係るアッセイ法は、多くのバイオアッセイ法と同様に通常常温で行われるものであり、大抵の場合２０℃付近で行われる。これらを考慮すると、「屈折率が水より小さい媒体」のｄ線（５８８ｎｍ）に対する屈折率〔ｎd〕は、１．３３未満が目安となる。
【０１０５】
一方、入射光の波長による変化をみると、２０℃における水の屈折率〔ｎ20〕は、波長４０５ｎｍ，４８６ｎｍおよび６５６ｎｍの入射光に対してそれぞれ１．３４２８，１．３３７１および１．３３１１であり、入射光の波長が大きくなるほど水の屈折率が低くなる傾向にある。ここで、約５００ｎｍ以上の波長領域では、波長の変化による水の屈折率の変化の度合いは比較的小さく、例えば、２０℃における水の波長６３３ｎｍの光に対する屈折率は、上記各入射光の波長に対する屈折率の数値を基にして１．３３２と見積もることができる。これを考慮すると、「屈折率が水より小さい媒体」の波長６３３ｎｍの光に対する屈折率〔ｎ633〕もまた、１．３３未満が目安となる。
【０１０６】
これらの点を考慮すると、本発明に係るアッセイ法で用いられる屈折率が水より小さい媒体が有する屈折率は、ｄ線（５８８ｎｍ）に対する屈折率〔ｎd〕として１．０以上か
つ１．３３未満の範囲にあり、また、波長６３３ｎｍの光に対する屈折率〔ｎ633〕とし
て１．０以上かつ１．３３未満の範囲にある。なお、前記屈折率に下限値が存在するのは、真空中での屈折率が１であることによる。
【０１０７】
このような屈折率が水より小さい媒体の例としては、上記空気（屈折率〔ｎd〕：１．
００，〔ｎ633〕：１．００）、酸素、二酸化炭素などの気体のほか、メタノール（屈折
率〔ｎd〕：１．３２，〔ｎ633〕：１．３２）などの屈折率が水より小さい液体も挙げられる。また、屈折率が水より小さい媒体が水蒸気であってもよい。このような屈折率が水より小さい媒体は、１種単独で用いてもよく、あるいは、２種以上を組み合わせて用いて
もよい。ここで、２種以上を組み合わせる場合においては、全体として単一の屈折率を有する透明な相をなす限り、混合媒体が、物質の三態として同じ状態にある媒体の組み合わせに限定されるものではない。例えば、気体が液体中に溶解した混合媒体、あるいは液体が気体中に凝集することなく分散した混合媒体であってもよい。
【０１０８】
上記「屈折率が水より小さい媒体」は、上記流路を通じてプラズモン励起センサに送達され、媒体３１としてプラズモン励起センサとの接触がなされる。工程（ｃ）では、「接触」という語は、プラズモン励起センサのリガンド２１等が固定化されている面を媒体３１中に浸漬されている状態にすることをいう。本発明によるアッセイ法においては、蛍光測定は、この屈折率が水より小さい媒体が媒体３１として、常に流動しながら、プラズモン励起センサと接触している状態で行われる。
【０１０９】
ここで、本発明においては、前記工程（ａ）における検体２２の接触、並びに前記工程（ｂ）における第２のリガンド２３と蛍光分子２４とからなるコンジュゲートの接触および反応をバッファー溶液等の水系溶液を用いて行うことから、「屈折率が水より小さい媒体」をプラズモン励起センサに接触させるためには、前記工程（ｂ）で用いた反応液または洗浄液などの水系溶液を除去するとともに、屈折率が水より小さい媒体を導入する必要がある。例えば、空気等の気体を「屈折率が水より小さい媒体」として用いる場合には、流路内に空気を送ることによって前記工程（ｂ）で用いた水系溶液を除去し、次いで、「屈折率が水より小さい媒体」を導入する。この場合、当該「屈折率が水より小さい媒体」を直接流路内に送ることによって、前記工程（ｂ）で用いた水系溶液を除去しても良い。一方、メタノール等の液体を「屈折率が水より小さい媒体」として用いる場合も同様に、流路内に空気を送ることによって前記工程（ｂ）で用いた水系溶液を除去し、次いで、「屈折率が水より小さい媒体」である所要の液体を導入し、必要により当該液体によるプラズモン励起センサ表面の洗浄を行う。
【０１１０】
本発明では、より小さな入射角のもとで、より大きな電場増強効果を得るという効果を最大限に得るためには、前記工程（ｂ）で用いた水系溶液の除去を完全に行うことにより、プラズモン励起センサ表面が直接、屈折率が水より小さい媒体上に接していることが望ましい。すなわち、図１に示すように、プラズモン励起センサ表面に形成されているＳＡＭ１３が、直接媒体３１である屈折率が水より小さい媒体に接していることが望ましい。
【０１１１】
ところが、屈折率が水より小さい媒体として空気等の気体を用いる場合には、水系溶液を除去しかつ屈折率が水より小さい媒体を導入するための上記操作を行っても、少量の水系溶液が、プラズモン励起センサ表面（特にＳＡＭ１３上、あるいはＳＡＭ１３表面に形成されたコーティング層上）に薄膜状に付着した状態で残存する場合がある。この場合には、空気を送液するか、あるいは、このプラズモン励起センサを一旦流路系から外し、エアガンなどによる水分除去の操作を行うことにより、薄膜状の水系溶液を除去または減少させることが望ましい。少量の水系溶液が、プラズモン励起センサ表面（特にＳＡＭ１３上）に薄膜状に付着していても、蛍光分子２４が、この薄膜状の水系溶液中ではなく屈折率が水より小さい媒体中に存在していれば、従来のＳＰＦＳシステムによるアッセイ法の場合と比べてより小さな入射角のもとで、より大きな電場増強効果を得るという効果を得ることができる。具体的には、ＳＡＭ１３上、あるいはＳＡＭ１３表面に形成されたコーティング層上に残存する少量の水系溶液による薄膜からの厚さが１０ｎｍ以下であれば、本発明による上記の効果を得ることができる。
【０１１２】
屈折率が水より小さい媒体の流速は、通常１０〜1000μＬ／ｍｉｎ、好ましくは１００〜1000μＬ／ｍｉｎである。
【０１１３】
光学系
本発明で用いる光源は、前記金属薄膜１２にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１１４】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜１２の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光分子２４を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明誘電体基板１１の屈折率、金属薄膜１２の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【０１１５】
蛍光分子２４は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１１６】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ（laser diode）レーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜１２に用いる金属種
によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１１７】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明誘電体基板１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。なお、プリズムは、プリズム一体化基板のプリズム部として上記透明誘電体基板１１に組み込まれていてもよい。
【０１１８】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１１９】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【０１２０】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１２１】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１２２】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能な
ＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１２３】
駆動装置
本発明において、上記光学系は「駆動装置」の形で統合されていてもよい。本発明の駆動装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明を実施するためのものである。
【０１２４】
「駆動装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１２５】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、３０〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１２６】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
【０１２７】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【０１２８】
＜工程（ｄ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ｄ）は、前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライト２２の量を算出する工程である。
【０１２９】
より具体的には、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１３０】
アナライト
アナライト２２としては、上記ＳＡＭ１３に固定化された第１のリガンド２１を特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【０１３１】
アッセイＳ／Ｎ比
さらに、工程（ｄ）においては、上記工程（ｃ）の前に測定した“ブランク蛍光シグナル”、上記工程（ｃ）で得られた“測定蛍光シグナル”、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式（５ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn        （５ａ）
（上記式（５ａ）において、Ｉaはアッセイ蛍光シグナル、Ｉoはブランク蛍光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
【０１３２】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（５ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライト２２の濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（５ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜        （５ｂ）
（上記式（５ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（５ａ）の場
合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【実施例】
【０１３３】
＜標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の調製＞
抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）を、市販のAlexa Fluor647ラベリングキット（Molecular Probes社製）により調製し、Alexa Fluor 647標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。
得られた抗体溶液はタンパク質、蛍光色素濃度を吸光度測定器により定量後、４℃で保存した。
【０１３４】
以下の実施例および比較例で用いた標識抗体は、すべて同様の方法により調製されたものである。
【０１３５】
［実施例１］
（工程１：金属薄膜の形成）
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「S-LAL 10」（(株)オハラ製。屈折率〔ｎd〕＝
１．７２）を、プラズマドライクリーナーでプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された基板表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
【０１３６】
（工程２：カルボキシメチルデキストランの結合）
前記工程１により得られた基板を、１０−アミノ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。この基板を、前記エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。得られたＳＡＭがパターニングされた金属基板をカルボキシメチルデキストラン（名糖産業（株）製、分子量５０万、置換度１．０８）５０ｍｇ／ｍｌ水溶液に浸漬した。更に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同人化学研究所製）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）をそれぞれ１００ｍＭになるように加え１時間室温で反応さ
せ、アミノ基末端のＳＡＭとデキストランのカルボキシル基とのアミドカップリングを行うことによりデキストランが固定化されたプラズモン励起センサ前駆基板を得た。
【０１３７】
（工程３：センサチップの構築）
工程２で得られたプラズモン励起センサ前駆基板のうちの金属薄膜およびＳＡＭが形成された側の面に、測定領域を形成するための、流路長１０ｍｍ、幅５ｍｍの穴のあいた厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを載せた。さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある。）。このＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が上記測定領域内に位置するように形成されたＰＭＭＡ製天板を載せた。これらセンサ基板
、ＰＤＭＳ製シート、およびＰＭＭＡ製天板の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、センサチップとした。
【０１３８】
（工程４：抗体の結合）
センサチップの送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下、特に記載しない限り、各種流体の送液および循環をすべてこのようなチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。
【０１３９】
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(
株)同人化学研究所製）４００ｍＭと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Thermo Scientific社製）１００ｍＭとを含む２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）  バッファー（ｐＨ５．０）混合液を、流速５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローして、センサチップに組み込まれた前駆基板の表面に固定されたカルボキシメチルデキストランを活性エステル化した。
【０１４０】
続いて、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所（株）製）を、当該抗体が２０μｇ／ｍＬとなるよう１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）にて希釈して得られた溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて３０分間フローして、当該抗体を前記カルボキシメチルデキストランに連結した。
【０１４１】
最後に、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製；ｐＨ８．５）水溶液を５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローすることによってブロッキング処理をし、表面プラズモン励起センサを完成させた。
【０１４２】
（工程５：シグナルの測定）
前記工程１〜４により作製された表面プラズモン励起センサに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッ
ファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。
【０１４３】
つづいて、前述のようにして調製した標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモ
ノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせた。
【０１４４】
その後、空気を流速５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローして乾燥させた状態にして、表面プラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイシグナル」とした。
【０１４５】
一方、前記工程１〜４により作製された別の表面プラズモン励起センサについて、上記最初のステップでＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「ブランクシグナル」とした。
【０１４６】
［実施例２］
工程５を下記のように変更した以外は実施例１と同様にして表面プラズモン励起センサを作製し、ブランクシグナルおよびアッセイシグナルを測定した。
【０１４７】
前記工程１〜４により作製された表面プラズモン励起センサに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッ
ファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。
【０１４８】
つづいて、前述のようにして調製した標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモ
ノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせた。
【０１４９】
その後、メタノールを流速５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローし、メタノールで流路を満たした状態で表面プラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイシグナル」とした。
【０１５０】
一方、前記工程１〜４により作製された別の表面プラズモン励起センサについて、上記最初のステップでＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「ブランクシグナル」とした。
【０１５１】
［比較例１］
工程５を下記のように変更した以外は実施例１と同様にして表面プラズモン励起センサを作製し、ブランクシグナルおよびアッセイシグナルを測定した。
【０１５２】
前記工程１〜４により作製された表面プラズモン励起センサに、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が０．１ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッ
ファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。
【０１５３】
つづいて、前述のようにして調製した標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモ
ノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせた。
【０１５４】
その後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を流速５００μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローし、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で流路を満たした状態にして、表面プラズモン励起センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値を「アッセイシグナル」とした。
【０１５５】
一方、前記工程１〜４により作製された別の表面プラズモン励起センサについて、上記最初のステップでＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「ブランクシグナル」とした。
以上の実施例および比較例それぞれについて、ブランクシグナルおよびアッセイシグナルから下記式によりＳ／Ｎ比を算出した。
【０１５６】
Ｓ／Ｎ比＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ブランクシグナル）｜
ここで、前記「アッセイシグナル」および「ブランクシグナル」は、それぞれ上記式（５ｂ）における「アッセイ蛍光シグナル」および「アッセイノイズシグナル」に相当する。
【０１５７】
また、実施例、比較例についてフォトダイオード、角度可変部（サーボモータ）によりで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求め、ＳＰＦＳアッセイに必要な共鳴角を求めた。
【０１５８】
【表２】
2011169609.tif 000004
【０１５９】
＜Ｓ／Ｎ比および共鳴角＞
以上の実施例および比較例それぞれのアッセイシグナル、ブランクシグナル、Ｓ／Ｎ比および共鳴角（比較例１のＳ／Ｎ比に対する比の値）は表２に示す通りである。本発明による実施例１、２の表面プラズモン励起センサは比較例１に示すような従来のＳＰＦＳセンサよりもＳ／Ｎ比が高く、ＳＰＦＳ測定の感度が改善されていることが分かる。また、共鳴角が低下していることから装置の小型化にも寄与できると言える。
【符号の説明】
【０１６０】
１１・・・透明誘電体基板
１２・・・金属薄膜
１３・・・ＳＡＭ
２１・・・第１のリガンド
２２・・・アナライト
２３・・・第２のリガンド
２４・・・蛍光分子
３１・・・媒体
【図１】
2011169609.tif 000005
【図２】
2011169609.tif 000006
【図３】
2011169609.tif 000007