(57)【要約】【課題】被検試料における核酸の分離および精製などの前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子の検出方法を提供する。また特定遺伝子がＲＮＡである場合、核酸合成に対する阻害物質の作用を抑制して、生体試料中のＲＮＡを効率よく増幅させ得る特定遺伝子の検出方法を提供する。【解決手段】特定遺伝子の検出を目的とする固形被検試料を採取する工程と、プレート状またはチューブ状の担体上で、前記固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、前記特定遺伝子を増幅する工程と、前記特定遺伝子の増幅量を検出する工程と、を備える特定遺伝子を検出する方法。【選択図】図１
2011019505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定遺伝子の検出を目的とする固形被検試料を採取する工程と、
プレート状またはチューブ状の担体上で、前記固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および前記特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、前記特定遺伝子を増幅する工程と、
前記特定遺伝子の増幅量を検出する工程と、
を備える特定遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
前記固形被検試料を採取する工程では、
毛根、口腔粘膜、細胞組織、皮膚、乾性耳垢および固形食品から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、
または、
鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、精液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで前記固形被検試料を採取する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固形被検試料を採取する工程では、糞便を植物繊維体に塗布し、前記植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉して１時間以上保持することで前記固形被検試料を採取する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固形被検試料を採取する工程では、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、または、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物を溶解させた後乾燥させることで前記固形被検試料を採取する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記担体は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体であり、かつ、表面に前記特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるプローブＤＮＡを固定化されてなる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記担体は、複数種の前記プローブＤＮＡを固定化されてなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、および前記プローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法のいずれかの方法で前記特定遺伝子の増幅量を検出する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記特定遺伝子を増幅する工程では、前記プローブＤＮＡで、前記固形被検試料の前記特定遺伝子としてのＲＮＡをハイブリダイゼーションで捕捉し、ＲＴ−ＰＣＲ法にて特定遺伝子を増幅する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記特定遺伝子を増幅する工程では、前記担体上の液相で前記特定遺伝子を増幅し、
前記特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、同時に複数種の前記プローブＤＮＡで前記特定遺伝子を捕捉する請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記固形被検試料が細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を含むものであり、検出する特定遺伝子がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液が、融解温度調整剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定遺伝子を検出する方法に関する。より詳細には、生体試料、臨床試料中に特定遺伝子が含まれるか、および、生体試料、食品や臨床試料中に微生物、ウイルスが含まれているか、を特異的に検出できる特定遺伝子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の個体間では、野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ）が存在する。この遺伝子多型は、個体の基礎代謝、性質、疾患などの差異を生じさせることが知られている。したがって、個体のＤＮＡの特定遺伝子において変異が生じているか否かを検査することについて、ＰＣＲ法などを利用した様々な研究が進められている（たとえば特開２００５−２４５２７２号公報（特許文献１）を参照）。生物における遺伝子多型を検査することは、将来生じうる疾患などを予測することが臨床的にも重要視されている。しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などの操作が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。
【０００３】
また生体から少量の血液などを採取し、その血液を直接利用して特定遺伝子を増幅して検出するための簡便なＰＣＲ法などが開発されている（たとえば特表２００８−５３１０３９号公報（特許文献２）を参照）。しかし、特許文献２に記載の方法においては、血液を採取する際に痛みが伴い、血液を輸送する際には低温に保持する必要があり、さらに、ＰＣＲ法などに使われなかった余った血液などの生体試料の保存および処分には細心の留意を払う必要がある。
【０００４】
また、ＰＣＲ法などを利用した特開２００６−１８７２７０号公報（特許文献３）、特開２００６−３２２７３９号公報（特許文献４）およびＫｉｎｏｓｈｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５：ｅ３  （２００７）（非特許文献１）には、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面にＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体に検出対象遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、該ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせ、溶液中の遺伝子断片の含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法が開示されている。しかしながら、特許文献３、４などに記載の方法においても、同様にＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などの操作が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。
【０００５】
生体試料、食品や臨床試料、または環境中などの特定微生物の有無を調べる場合には、従来、被検試料中の微生物を分離培養し、コロニーについて視覚的観察（コロニーの色素反応、コロニー形態など）、顕微鏡観察、グラム染色、生化学的性状の検査などを行っていた。特定微生物の有無が判明するまでに少なくとも２日間を要する。したがって、この方法は、微生物が検出されたとしてとしてもそれに対する対応が遅くなることから、食品メーカーによる食品出荷前の自主検査には採用し難い。そこで、食品衛生検査や臨床検査領域においては、微生物の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各微生物の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各微生物の存在の有無を判別および定量する試みがなされている。
【０００６】
また、ウイルス病の診断を確実に行うこと、また、未知の流行病を新しいウイルス病として同定することは、当該ウイルス病の地域分布と流行時期を知り、当該疾患に対する予防と治療対策を立てる上で重要なことであることから、簡便に早急に診断することについて研究が進められている。したがって、生体試料から、生体に潜在しているウイルス核酸やｍＲＮＡの特定遺伝子としての存在を証明して診断する方法が開発されている。当該方法によると、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５））やＲＴ−ＰＣＲ法を利用することによって生体試料中に微量存在するウイルス遺伝子でも高感度に検出できる。しかし、この場合、検査結果の取得に１日以上要する。
【０００７】
また、近年、臨床での応用が期待される薬物代謝関連酵素遺伝子のＳＮＰも多く見出されており、多くの薬物代謝に関与するチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）のファミリーや抗結核薬イソニアジドの代謝に関与するＮ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２（ＮＡＴ−２）、経口抗凝固剤ワルファリンの効果の強さに大きく影響するＣＹＰ２Ｃ９とＶＫＯＲＣ１などがそれである。これらの遺伝子にその酵素活性を低下させるようなＳＮＰがあると、薬剤の血中濃度が長時間に渡って高く保たれた結果、効果が強く発現したり、有毒な中間代謝産物が蓄積されたりする副作用がある。また、代謝速度の高い遺伝子多型が見出されたならば、薬剤の血中濃度を維持するために投薬量を増やすなどの処置が必要となる。そこで、投薬前にこのような遺伝子のＳＮＰを検査し、その遺伝子の型から判断して適切な薬剤の投薬量を決定するなどして、副作用を回避し、効率的な治療効果を得ようとする医療、すなわち、「テーラーメイド医療」、「オーダメイド医療」、あるいは「個別化医療」と呼ばれている患者個々の体質に応じたより適切な医療の実現が可能となり、無用な副作用への対処や不適切な投薬を減らすことによって医療費削減への効果も期待できる。このように、ＳＮＰを利用した診断の実用化と普及が大いに期待されている。
【０００８】
また、ヒトの大腸内には５００〜１０００種以上、糞便１ｇ当たり１０12個近い多種多様な細菌が棲息している。これらの細菌がヒトの栄養、薬効、生理機能、老化、発ガン、免疫、感染などに極めて大きな影響を及ぼすことが培養法により明らかにされてきた。しかしながら、大腸内の環境は複雑な栄養成分および嫌気性であるが故に分離、同定できる菌種に限りがあり、大腸内常在菌の約７０〜８０％が難分離、難培養性細菌で占められている。そのため、大腸内菌叢の全体像は明らかにされていなかった。１９９０年代になって分子生物学的手法より環境中の微生物菌叢の解析が行われるようになった。その結果、多数の難分離、難培養性細菌が存在することが系統学的に明らかにされ始めた。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ライブラリーによりヒト大腸内菌叢の解析を行い、今までに検出されていない細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を検出し、多くの難分離、難培養性細菌の存在を明らかにした。しかしながら、現在行われている遺伝子の分離・精製法では煩雑であり、大腸内常在菌の全体像を理解するには不十分である。さらにどの様な大腸内常在菌が難分離、難培養性であるのか不明瞭であるなどの課題が残されていた。
【０００９】
また現在、核酸の増幅方法は、微量なＲＮＡの検出方法としても活発に利用されている。ＲＮＡの検出方法として通常使用されるＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後に、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する方法で、微量のＲＮＡでも定量的に解析できるため、今日最も検出感度の高い解析法の１つとして、ＲＮＡを遺伝子として保有しているウイルスの検出、ｍＲＮＡの定量的検出や塩基配列決定による発現遺伝子の解析、さらにはｃＤＮＡのクローニングによる発現産物の解析および生産などには欠かせないものになっている。
【００１０】
ＲＴ−ＰＣＲ法をはじめとしたＲＮＡ増幅法は全て酵素反応をベースとしているため、生体試料中に存在する色素、タンパク質、糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が強く阻害されることが広く知られている。そこで、ＲＮＡ増幅に先立って、被験物から細胞、真菌、細菌、ウイルスなどのＲＮＡを包含する試料を分離後、当該試料よりＲＮＡを抽出する過程が必要となる。その方法として、従来、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などにより生体試料を処理し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルムなどを用いて、ＲＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。最近ではＲＮＡ抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬などが使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−２４５２７２号公報
【特許文献２】特表２００８−５３１０３９号公報
【特許文献３】特開２００６−１８７２７０号公報
【特許文献４】特開２００６−３２２７３９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５：ｅ３  （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、生体試料、臨床試料中に特定遺伝子が含まれるか、および、生体試料、食品や臨床試料中に微生物、ウイルスが含まれているか、を特異的に検出できる特定遺伝子の検出において、さまざまな問題が未だ解決されていない。
【００１４】
そしてさらに、患者から採取した生体試料を対象として、該生体試料中に含まれるウイルス遺伝子の検出を目的としてハイブリダイゼーションが広く行われてきているが、１個の不溶性担体内でウイルス遺伝子を捕捉し、洗浄後、分離した遺伝子を増幅してウイルスを検出する方法は知られていなかった。
【００１５】
また、試料中の微量の核酸を増幅するためにはＰＣＲ法が広く普及している。しかしながら、ＰＣＲ法では試料中に含まれる夾雑物により遺伝子の増幅反応を阻害してしまう場合があるため、上述のように増幅反応の前に分離および精製等の煩雑な前処理を行う必要がある。
【００１６】
特に、上述したようにＲＮＡを増幅させる場合、試料中のＲＮＡの精製を行っても、夾雑物の完全な除去は困難であり、かつ試料中のＲＮＡの回収量が一定しない場合も多く、このため引き続くＲＮＡ増幅が、とりわけ試料中の目的とするＲＮＡの含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、ＲＮＡの精製は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。
【００１７】
さらに、ＲＮＡは全ての生体試料中に普遍的に存在するＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常に曝されており、精製の際に迅速なＲＮａｓｅ不活性化の処理を行うべきことはもちろんのこと、精製過程においても、精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないような厳重な操作や管理が要求される。
【００１８】
このような背景から、本発明者は、固形被検試料を採取し、直接固形被検試料に含まれる特定遺伝子を増幅し、簡便かつ短時間に検出できる検査法の開発を行ってきた。また、本発明者は、食品や臨床試料中に含まれる特定の複数の微生物などを選択的、簡単かつ迅速に検出する方法の開発を行ってきた。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、被検試料における核酸の分離および精製などの前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子の検出方法を提供することである。
【００２０】
また本発明は特定遺伝子がＲＮＡである場合、核酸合成に対する阻害物質の作用を抑制して、生体試料中のＲＮＡを効率よく増幅させ得る特定遺伝子の検出方法を提供することもその目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、上述した課題の解決を目的として種々検討していたところ、生体試料からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する前処理などを行うことなく、より簡便に生体試料中の特定遺伝子の検出を行う方法を開発した。本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。
【００２２】
つまり、本発明は、特定遺伝子の検出を目的とする固形被検試料を採取する工程と、プレート状またはチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、前記特定遺伝子を増幅する工程と、特定遺伝子の増幅量を検出する工程とを備える特定遺伝子を検出する方法に関する。
【００２３】
また、本発明の方法において、固形被検試料を採取する工程では、毛根、口腔粘膜、細胞組織、皮膚、乾性耳垢および固形食品から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、または、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、精液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで前記固形被検試料を採取することが好ましい。
【００２４】
本発明の方法において、前記固形被検試料を採取する工程では、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物から直接前記固形被検試料を採取する、または、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物を溶解させた後乾燥させることで前記固形被検試料を採取することが好ましい。
【００２５】
また、本発明の方法において、固形被検試料を採取する工程では、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉して１時間以上保持することで固形被検試料を採取することが好ましい。
【００２６】
また、本発明の方法において、ＲＮＡを捕捉して逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅して網羅的に特異的ＤＮＡを検出する場合、担体は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆された不溶性担体であり、かつ、表面に特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるプローブＤＮＡを固定化されてなることが好ましい。
【００２７】
また、本発明の方法において、担体は、複数種のプローブＤＮＡを固定化されてなることが好ましい。
【００２８】
また、本発明の方法において、特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法のいずれかの方法で特定遺伝子の増幅量を検出することが好ましい。
【００２９】
また、本発明の方法において、特定遺伝子を増幅する工程では、プローブＤＮＡで、固形被検試料の特定遺伝子としてのＲＮＡをハイブリダイゼーションで捕捉し、ＲＴ−ＰＣＲ法にて特定遺伝子を増幅することが好ましい。
【００３０】
また、本発明の方法において、特定遺伝子を増幅する工程では、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、特定遺伝子の増幅量を検出する工程では、同時に複数種のプローブＤＮＡで特定遺伝子を捕捉することが好ましい。
【００３１】
また、本発明の方法において、固形被検試料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一つを有する生体試料（ウイルスを含む）から得られるものであれば特に限定はされない。
【００３２】
また、本発明においては、プライマーＤＮＡは、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列または１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅するために選択されることが好ましい。
【００３３】
本発明の方法において、前記固形被検試料は、細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を含むものであり、検出する特定遺伝子がＲＮＡであってもよい。この場合、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液が、融解温度調整剤をさらに含むことが、より好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の方法によると、被検試料における核酸の分離および精製等の前処理を必要とせず、簡易に高感度で検出し得る特定遺伝子の検出をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１の各工程を示す模式図である。
【図２】実施例１において、ＰＣＲ反応液［Ｇ］に対して毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図３】実施例１において、ＰＣＲ反応液［Ａ］に対して毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図４】実施例２において、ＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ［Ａ］に対して、乾燥ろ紙血および毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図５】担体のプローブＤＮＡの点着部分をＣＣＤカメラで取り込んだ写真である。
【図６】図５における各スポットの位置を簡単に示した模式図ものである。
【図７】実施例４においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図８】実施例５においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図９】実施例５においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１０】実施例６においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１１】実施例６においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１２】実施例７においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１３】実施例７においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１４】実施例７においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１５】実施例８においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１６】実施例９においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１７】実施例１１において合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡを添加したものについてＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１８】実施例１１において合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加したものについてＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図１９】実施例１３においてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【図２０】実施例１４においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の特定遺伝子を検出する方法は、特定遺伝子の検出を目的とする固形被検試料を採取する工程と、プレート状またはチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施して、特定遺伝子を増幅する工程と、特定遺伝子の増幅量を測定する工程とを備える。
【００３７】
以下、各工程について詳細に説明する。
＜固形被検試料を採取する工程＞
本工程では、直接固形被検試料を採取する、または、液状物を乾燥することで固形被検試料を採取する。
【００３８】
まず、直接固形被検試料を採取する場合とは、毛根、口腔粘膜、細胞組織、皮膚、乾性耳垢および固形食品から選ばれる固形物を直接以下の工程で用いることを意味する。なお毛根は、毛髪、眉毛、鼻毛、ひげ、陰毛、腋毛を含む全ての体毛由来のものであれば特に限定されない。毛根は、根元から毛を抜くことで得られるため、比較的痛みをともなわない採取が可能であり、口腔粘膜は口中に皮膚を綿棒等で軽くこすることで痛みをともなわず採取することが可能である。また、口腔粘膜は、採取後そのまま室温に置くことで乾燥させた固形状態のものであってもよい。細胞組織、皮膚、乾性耳垢、固形食品については、そのまま用いられる程度に乾燥していることが好ましく、水分含有量は０％以上５０％未満であることが特に好ましい。また、細胞組織、固形食品については、細かく粉砕されることが好ましい。本発明方法の対象となる食品は、特に制限されず、麺製品、食肉、魚介類、野菜、穀類、乳製品およびこれらの加工物等の広い範囲の食品を対象にすることができる。細胞組織とは、動物の細胞のほか、植物組織も含むものとする。
【００３９】
次に、液状物を乾燥されることで固形被検試料を採取する場合とは、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、精液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を乾燥させることで得られる固形物を以下の工程で用いることを意味する。ここで、液状物に含まれる食品および細胞組織は、水分含有量が５０％以上のものを示すものとする。なお、上述した口腔粘膜も、適宜乾燥させた後に用いてもよい。
【００４０】
ここで、液状物を乾燥させる方法としては、ろ紙に該液体状の試料をしみこませ、水分を蒸発させる方法や、自然乾燥または凍結乾燥など、公知の乾燥方法を選ぶことができる。ただし、糞便由来の固形被検試料を得るためには、糞便を植物繊維体に塗布し、植物繊維体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉し１時間以上保持することが好ましい。植物繊維体とは、紙、綿などの植物性の繊維体をいうものとする。
【００４１】
液状物を乾燥させて固形被検試料とすることで、液状物にもともと含まれるプロテアーゼ、アミラーゼおよびヌクレアーゼなどの酵素活性を阻害することができ、生体組織細胞、微生物およびウイルスを完全に死滅させることなく生命活動を休止させることができる。したがって、固形被検試料の輸送、保存等は室温で行うことができ、より簡便となる利点がある。
【００４２】
本発明における固形被検試料は、植物から採取されたものであってもよい。この場合、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物から直接、または、植物の葉、茎、根、果実から選ばれる固形物を溶解させた後乾燥させることで、固形被検試料を採取する。
【００４３】
特定遺伝子とは、固形被検試料の遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）に含まれる生物種に特異的配列またはその遺伝子多型（ＳＮＰ）、微生物のユニバーサル領域、またはウイルス由来遺伝子における特異的配列である。特異的配列は、たとえば生物種ごとに公開されている遺伝子配列データベースを検索することで固形被検試料ごとに決定することができる。
【００４４】
特定遺伝子の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５０〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、特定遺伝子は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これは、広汎な微生物に応用して使用することができるためである。また、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を応用して使用してもよい。
【００４５】
また、上述のように固形被検試料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一つを有する生体試料（ウイルスを含む）から得られるものであれば特に限定はされない。
【００４６】
本発明の方法において、前記固形被検試料は、細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を含むものであり、検出する特定遺伝子がＲＮＡであってもよい。この場合、本発明においては、前記試料を反応液に直接添加してＲＮＡ増幅反応を行うことにより、当該試料中に存在するＲＮＡを直に増幅させることを特徴の１つとするものである。ここで、「直接添加」とは、「ＲＮＡ増幅に先立って、試料から細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を分離後、このＲＮＡを包含する試料からＲＮＡを抽出する過程が不要」という意味である。ＲＮＡを試料を含む試料が液状である場合には、上述したようにろ紙などに塗布して乾燥後、その一部（パンチ片）を直接反応液に添加すればよい。この場合、試料を反応液に添加しても、反応液を試料に添加してもよく、特に添加の順序は特に制限されるものではない。
【００４７】
＜特定遺伝子を増幅する工程＞
本工程においては、プレート状またはチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させて、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification：ループ介在等温増幅）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＳＤＡ（Reverse Transcription Strand Displacement Amplification：逆転写鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification：逆転写ループ介在等温増幅）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification：核酸配列に基づいた増幅）法、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification：転写介在増幅）法、ＲＣＡ（Rolling Cycle Amplification：ローリングサイクル増幅）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：等温遺伝子増幅）法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction：リガーゼ連鎖反応）法、ＬＤＲ（Ligase Detection Reaction：リガーゼ検出反応）法、ＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法、ＳＭＡＰ２（Smart Amplification Process Version 2）法から選ばれる方法を施して、特定遺伝子を増幅する。これらの遺伝子増幅方法は、それ自体公知の方法である。
【００４８】
まず、プレート状またはチューブ状の担体上に試薬を置く。チューブ状の担体である場合には、その内部に試薬を投入し、プレート状の担体である場合には、その表面に試薬を置く。この試薬は、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液とプライマーＤＮＡとを含有する。そして試薬と固形被検試料とが直接接触するように担体上に固形被検試料を配置し、公知の方法によってポリメラーゼ連鎖反応、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法から選ばれる方法で遺伝子を増幅する。なお、担体上に固形被検試料を置き、その後に担体上に試薬を置いてもよい。
【００４９】
本工程において用いられるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼに代表される、プライマー付加による核酸を合成する耐熱性に優れたポリメラーゼであれば特に制限なく用いることができる。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、たとえばThermus aquaticus由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus由来のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕあるいはＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは上述したＤＮＡポリメラーゼの少なくともいずれかの混合物などを挙げることができ、中でもＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。なお、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよびCarboxydothermus hydrogenoformans 由来のＣ.ｔｈｅｒｍ  DNAポリメラーゼはＲＴ活性も有しているため、後述するようにＲＴ−ＰＣＲをOne tube−One stepで行うときに、１種類の酵素で賄うことができるという特徴を有している。
【００５０】
バッファーは固形被検試料中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質存在下でもＤＮＡ増幅可能なものであれば、特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（（株）島津製作所製）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）、ＫＯＤ  ＦＸバッファー（東洋紡績（株）製）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）などを用いることが好ましく、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ用に開発されたＫＯＤ  ＦＸバッファー（東洋紡績（株）製）を用いることが特に好ましい。たとえば実施例で用いられたＰＣＲ酵素キットＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）には、試料中のＰＣＲ阻害成分の反応阻害を除去する効果を有する、１〜２Ｍのベタインが含まれる。なお、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）には、ベタインが含まれていることが記載されており、ＫＯＤ  ＦＸバッファーと同等の効果が期待できる。
【００５１】
以下、特定遺伝子がＲＮＡである場合に好適な遺伝子増幅方法として用いられるＲＴ−ＰＣＲ法を行う場合を例に挙げて、具体的に説明する。
【００５２】
逆転写（ＲＴ）反応に用いる反応液（ＲＴ反応液）は、通常、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌなどの塩類、ジチオスレトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅインヒビター、逆転写酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。ＲＴ反応液はまた、通常、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク、界面活性剤を含む。
【００５３】
本発明において、特定遺伝子がＲＮＡである場合、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液が、融解温度調整剤をさらに含むことが、より好ましい。融解温度調整剤は、ＤＮＡポリメラーゼ反応時のプライマーと鋳型ＤＮＡとの融解温度（Ｔｍ）を調整するためのものであり、このような融解温度調整剤としてベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、プロリン、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと省略する）、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩などが一般に利用される。融解温度調整剤を利用することで、オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。さらに、ベタインやトラアルキルアンモニウム塩を融解温度調整剤として用いた場合には、そのisostabilize作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。
【００５４】
融解温度調整剤としてたとえばベタインを用いる場合、反応液中０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍの範囲内の添加によって、本発明による核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシー（stringency）と反応性を与える条件を適宜設定することができる。
【００５５】
ＲＴ反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写出来る酵素を意味する。逆転写酵素としては、Rous associated viru（ＲＡＶ）やAvian myeloblastosis virus（ＡＭＶ）などのトリのレトロウイルス由来の逆転写酵素、Moloney murine leukemiavirus（ＭＭＬＶ）などのマウスのレトロウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、Thermus thermophilus由来のTth DNAポリメラーゼあるいはCarboxydothermus hydrogenoformans由来のC.therm DNAポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
ＲＴ−ＰＣＲはＲＴ反応の産物の一部をＰＣＲ反応液に添加して実行すること（Two tube−Two step）、ＲＴ反応の産物にＰＣＲ用試薬類を添加して実行すること（One tube−Two step）、あるいは予めＲＴ−ＰＣＲに必要な全ての試薬を準備しておき、ＲＴ反応とＰＣＲを連続して実行すること（One tube−One step）も可能である。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＴ反応に引き続き行われるＰＣＲの反応液は、通常、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤、さらに上述した融解温度調整剤であるジメチルスルホキシド、ベタインなどが添加される場合がある。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲにおいて、添加剤として、たとえば、１ｍＬ中に２．７Ｍ  ベタイン、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、６．７％  ＤＭＳＯ、５５μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する溶液を調整し、適宜、濃度調整して添加するようにしてもよい。また、上述した市販品であるＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ  ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加しても同等の効果を得ることができる。
【００５９】
本発明における特定遺伝子を増幅する工程に用いられるＤＮＡプライマーは、特定遺伝子を決定した時点で、適宜公知の方法で設計することができる。またたとえば、検出対象の微生物に特異的な特定遺伝子に対応するプライマーセットと、広汎なウイルスまたは微生物のＤＮＡに対応するプライマーセットを用いることができる。具体的には、特定遺伝子は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。
【００６０】
本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、前記特定遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。検出対象が微生物である場合に、具体的には、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号１、２および３に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２  １０４８−１０５７（２００４））が挙げられる。また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号４および５に示すプライマー（ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００）セット、配列番号６および７に示すプライマーセット（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３２：３３５−３５１（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３：３３９０−３３３９７（２００５）、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，７：５７５５８１−３３３９７（２００５））、および配列番号８および９に示すプライマーセット（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３０：５８７−５９１（２００５））が挙げられる。
・配列番号１：５’−ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣ−３’（４３ａ２）
・配列番号２：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧ−３’（６９ａｒ２）
・配列番号３：５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣ−３’（６９ａｒｒｈ）
・配列番号４：５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（１６Ｓ−９Ｆ）
・配列番号５：５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’（１６Ｓ−５３６Ｒ）
・配列番号６：５’−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＹ−３’（ＲＷ０１＆ＲＤＲ０８０、１１７０−１１８９）
・配列番号７：５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’（ＤＧ７４、１５２２−１５４０）
・配列番号８：５’−ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’（Ｐｂａ１、３５８-３７８）
・配列番号９：５’−ＴＣＡＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’（Ｐｂａ２、１４４４-１４２５）
また、担体は、不溶性であって、少なくとも内側を高分子物質で被覆して、その上にプローブＤＮＡを固定化させたものが好ましい。プローブＤＮＡとは、特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるＤＮＡである。「高分子物質」は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含み、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーを示す。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプローブＤＮＡを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プローブＤＮＡは、このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該不溶性担体の表面に固定化される。具体的には、住友ベークライト株式会社の開発した表面処理（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を施したＰＣＲチューブを例として挙げることができる。なお、プローブＤＮＡ固定化をされた担体の作製方法については、特表２００３−５３０１１８号公報に記載の方法を適宜選択することができる。なお、ホスホリルコリン基またはアルキレングリコール基等の生体適合性の高い官能基を有する高分子物質については、特開２００８−１２８８５４号公報に記載されているものを挙げることができる。プローブＤＮＡには、塩基数が１００以下より好ましくは８０以下のＤＮＡ鎖を用いることが好ましい。これは、プローブＤＮＡの長さが１００以下である場合には、合成が容易であり、また、後述する増幅を安定して行うことができるためである。また、プローブＤＮＡには、修飾されたオリゴＤＮＡを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴＤＮＡを用いても固定化が可能である。さらには、プローブＤＮＡがアミノ基が導入されたオリゴＤＮＡである場合には、固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、プローブＤＮＡとして、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、該プローブＤＮＡは、効率よくかつ強固に該高分子物質上にプローブＤＮＡを固定化することができる。
【００６１】
次に、本発明における「不溶性担体」は、プラスチック、ガラス等からなるチューブのほか、９６穴ウェル等を挙げることができる。チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。
【００６２】
また、担体に複数種のプローブＤＮＡを固定すると、後述する特定遺伝子の増幅によって、１つの被検試料における複数の特定遺伝子の有無を検出することで、短時間に多数のデータを得ることも可能である。
【００６３】
上述のように、担体表面にはプローブＤＮＡが固定化されていることが特に好ましい。これは、固形被検試料中のＲＮＡの特定遺伝子をチューブ状の担体に固定したオリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を介してハイブリダイゼーションで捕捉して、ＲＴ−ＰＣＲ法にて遺伝子増幅ができ、または、担体上の液相で特定遺伝子を増幅し、同時に、プレート状担体に固定した複数種のプローブＤＮＡで多種の生物の特異的遺伝子を検出したり、遺伝子多型（ＳＮＰ）を網羅的に検出できるという利点があるためである。
【００６４】
そして、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法によって前記特定遺伝子が増幅される。
【００６５】
＜特定遺伝子の増幅量を検出する工程＞
本工程では、増幅したＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を検量して、被検試料中の特定遺伝子の存在の有無を判定する。
【００６６】
本工程における解析法は、増幅された特定遺伝子の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ法、およびプローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法から選ばれるいずれかの方法が挙げられる。ゲル電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲの特定遺伝子に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００６７】
また、複数種の微生物に共通するプライマーＤＮＡを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の微生物に特異的なプライマーＤＮＡを用いると、被検試料中の特定の菌種を検出することができる。
【００６８】
ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理にのっとった特異的な増幅が起こる限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【００６９】
＜各用語＞
本発明においては、「ウイルス」という用語は、たとえば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ノロウイルス、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）およびアフリカ豚コレラウイルスよりなる群から選択される。
【００７０】
本発明においては、「微生物」という用語は、原核生物、細菌、真菌、寄生生物、または原生動物を意味するのに使用する。「微生物」としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌のいずれもが含まれ、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））のスタフィロコッカス属細菌、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等のバチラス属細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、マイコバクテリウム属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカスゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロコッカスデュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスアガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）などが挙げられる。
【００７１】
また、検出対象の微生物が病原性微生物である場合には、特定遺伝子としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン遺伝子やｉｎｖＡ遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のＭＭＳ遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
【００７２】
［応用］
本発明の特定遺伝子の検出方法を用いることによって、ヒトの３０億塩基対あるゲノム遺伝子配列上の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することが可能であり、ＳＮＰタイピングから遺伝的背景を調べることができる他、原因遺伝子のわかっている遺伝病については、将来的な危険率も診断することができる。例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）をＳＮＰタイピングすることにより、アルコールに対する強さなどの遺伝的な要因を調べることができる。
【００７３】
また、上述の人の体質を診断する一塩基多型（ＳＮＰ）以外に、動植物（肉、米、生薬など）の種別判別、加工食品中のアレルゲン物質（そば、小麦、落花生、えび、かになど）および遺伝子操作作物（略；ＧＭＯ、大豆、とうもろこしなど）の有無、血液・糞便など生体試料中の細菌・ウイルスなどの微生物検査などに応用することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７５】
＜実施例１＞
図１は、本実施例の各工程を示す模式図である。以下、図１に基づいて説明する。
【００７６】
≪固形被検試料を採取する工程≫
まず、毛根２を含む頭髪１を注意深く２本引き抜き、固形被検試料として採取した。つまり、本実施例においては、毛根２を直接固形被検試料とした。なお、毛根１は、後述するＡＤＨ２およびＡＬＤＨ２共にヘテロ型（［Ｇ］／［Ａ］）の遺伝子を有することをあらかじめＤＮＡシーケンス法で確認したサンプルを用いた。
【００７７】
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
チューブ状の担体３の内部に表１および表２に示すＰＣＲ反応液４を投入した。そして、２つの担体３にそれぞれ頭髪１を１本ずつ投入した。ＰＣＲ反応液は、東洋紡績（株）製ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸを使用して、添付のプロトコールに従って以下の試薬を含む２５μＬ反応液を２種類（ＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ反応液［Ａ］）調整した。なお、以下［Ｇ］は野生型、［Ａ］は変異型を示すものとする。
【００７８】
【表１】
2011019505.tif 000003
【００７９】
【表２】
2011019505.tif 000004
【００８０】
本実施例においては、特定遺伝子としてヒトゲノム配列のアルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７  Ｇ→Ａ）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７  Ｇ→Ａ）として知られている配列部分を選択した。
【００８１】
したがって、プライマーＤＮＡ−１〜３はＡＤＨ２遺伝子の４７番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドであり、プライマーＤＮＡ−４〜６はＡＬＤＨ２遺伝子の４８７番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドとなるように設計した。
・配列番号１０：５’−ＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＡ−３’（プライマーＤＮＡ−１）
・配列番号１１：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＧ−３’（プライマーＤＮＡ−２）
・配列番号１２：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧ−３’（プライマーＤＮＡ−３）
・配列番号１３：５’−ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ−３’（プライマーＤＮＡ−４）
・配列番号１４：５’−ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡ−３’（プライマーＤＮＡ−５）
・配列番号１５：５’−ＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’（プライマーＤＮＡ−６）
プライマーＤＮＡ−２および５は野生型［Ｇ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に野生型［Ｇ］のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有し、プライマーＤＮＡ−３と６は変異型［Ａ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に変異型［Ａ］のヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有するものとした。プライマーＤＮＡ−２、３がアンチセンス鎖であり、プライマーＤＮＡ−１と組み合わせてアルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７  Ｇ→Ａ）の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用されるものとした。
【００８２】
本ＰＣＲの増幅反応産物（増幅される特定遺伝子）の大きさは、Ａｌｌｅｌｅ１［Ｇ］／Ａｌｌｅｌｅ２［Ａ］＝２２８ｂｐ／２２８ｂｐとなるよう設計した。プローブＤＮＡ−５、６がアンチセンス鎖であり、プローブＤＮＡ−４と組み合わせてアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７Ｇ→Ａ）の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。本ＰＣＲの増幅反応産物の大きさは、Ａｌｌｅｌｅ１［Ｇ］／Ａｌｌｅｌｅ２［Ａ］＝１３５ｂｐ／１３７ｂｐとなるよう設計した。以上のようにしてチューブ状の担体上で、固形被検試料をバッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液、および特定遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡに直接接触させた状態とした。
【００８３】
そして、チューブ状の担体３に蓋５をして、表３に示す増幅条件で、ＰＣＲ反応をし、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７  Ｇ→Ａ）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７  Ｇ→Ａ）の増幅を行った。
【００８４】
また、比較用にＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ反応液［Ａ］それぞれに対して、
（１）毛髪を投入しない
（２）毛髪の代わりにＡＤＨ２［Ｇ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６１Ｐに含まれる）を投入
（３）毛髪の代わりにＡＤＨ２［Ａ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６１Ｐに含まれる）を投入
（４）毛髪の代わりにＡＬＤＨ２［Ｇ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６２Ｐに含まれる）を投入
（５）毛髪の代わりにＡＬＤＨ２［Ａ］（東洋紡績（株）製ポジティブコントロールセットＳＴＫ−１６２Ｐに含まれる）を投入
（６）ＰＣＲ反応液の代わりに滅菌水のみを投入
の６種類のサンプルも準備して、同様に表３に示す増幅条件で、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２、４７  Ｇ→Ａ）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７  Ｇ→Ａ）が増幅するかどうか検討した。
【００８５】
【表３】
2011019505.tif 000005
【００８６】
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ反応液［Ａ］５μＬをアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
【００８７】
図２は、ＰＣＲ反応液［Ｇ］に対して毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。なお、ＰＣＲ反応液［Ｇ］に対する前記（１）〜（６）のサンプルのＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した結果も示される。
【００８８】
図３は、ＰＣＲ反応液［Ａ］に対して毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。なお、ＰＣＲ反応液［Ａ］に対する前記（１）〜（６）のサンプルのＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した結果も示される。
【００８９】
以下、図２および３に基づいて説明する。
図２において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ヒト毛髪
・レーン２；サンプル（１）（ネガティブコントロール）
・レーン３；サンプル（２）（ポジティブコントロール）
・レーン４；サンプル（３）
・レーン５；サンプル（４）（ポジティブコントロール）
・レーン６；サンプル（５）
・レーン７；サンプル（６）（ネガティブコントロール）
また図３において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ヒト毛髪
・レーン２；サンプル（１）（ネガティブコントロール）
・レーン３；サンプル（２）
・レーン４；サンプル（３）（ポジティブコントロール）
・レーン５；サンプル（４）
・レーン６；サンプル（５）（ポジティブコントロール）
・レーン７；サンプル（６）（ネガティブコントロール）
［考察］
ＡＤＨ２およびＡＬＤＨ２共にヘテロ型（［Ｇ］／［Ａ］）の遺伝子を有するヒトの毛髪を使用したレーン１では、図２および図３双方で明確なバンドが確認された。また、ＰＣＲ反応液にポジティブならびにネガティブコントロールサンプルを添加したレーン２〜７においても矛盾無くその増幅された特定遺伝子が所定の分子サイズで検出された。
【００９０】
＜実施例２：毛髪の保存安定性および乾燥ろ紙血の比較＞
≪固形被検試料を採取する工程≫
採血針を用いて親指から採血した血液（全血）をろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）にしみこませ、自然乾燥させて、固形被検試料としたの乾燥ろ紙血を採取した。
【００９１】
また、固形被検試料として脱毛直後の毛根と、脱毛してから室温（２０℃）で１週間保存した毛根と２種類採取した。
【００９２】
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
実施例１における表１および表２に記載したＰＣＲ反応液に乾燥ろ紙血の直径１ｍｍのパンチ片を添加して実施例１と同様にＰＣＲ反応を行った。
【００９３】
実施例１における表１および表２に記載したＰＣＲ反応液に脱毛直後の毛根と、１週間保存した毛根とをそれぞれ添加して実施例１と同様にＰＣＲ反応を行った。
【００９４】
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
実施例１における表３に記載した条件と同様にしてＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液［Ｇ］５μＬをアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
【００９５】
図４は、ＰＣＲ反応液［Ｇ］およびＰＣＲ［Ａ］に対して、乾燥ろ紙血および毛根を接触させてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【００９６】
図４において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；乾燥ろ紙血をＰＣＲ反応液［Ｇ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；脱毛直後の毛根をＰＣＲ反応液［Ｇ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；１週間室温保存後の毛根をＰＣＲ反応液［Ｇ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；乾燥ろ紙血をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；脱毛直後の毛根をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン６；１週間室温保存後の毛根をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入してＰＣＲ反応
・レーン７；毛根をＰＣＲ反応液［Ａ］に投入せずにＰＣＲ反応（ネガティブコントロール）
［考察］
乾燥ろ紙血を使用したと毛根の場合の差は全く見られなく、脱毛後、１週間室温にて保存した毛根サンプルとの有意差も観察されなかった。したがって、サンプルから核酸を精製するという作業を備えずに毛根をダイレクトに使用したＰＣＲ反応の有用性が証明された。
【００９７】
＜実施例３＞
≪固形被検試料を採取する工程≫
毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪を固形被検試料として採取した。
【００９８】
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
本実施例において、担体は、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質で被覆されたプレート状の不溶性材料を選択した。プレート状の担体は１０ｍｍ×１０ｍｍ×深さ０．５ｍｍのウェルを２個有するものとした。そして、その表面に特定遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列からなるプローブＤＮＡを固定化されてなるものを用いた。
【００９９】
具体的に担体の製造方法について説明する。まず、アルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２、４８７  Ｇ→Ａ）のＡｌｌｅｌｅ１［Ｇ］／Ａｌｌｅｌｅ２［Ａ］を検出する５’末端がアミノ基修飾した合成プローブＤＮＡ−１および２を５Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ  ９．０）に溶解し、０．１μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。プローブＤＮＡ溶液１μＬを特許文献３および４に記載の表面処理された１０ｍｍ×１０ｍｍ×深さ０．５ｍｍウェル成型したプレート状の担体（Ｓ−ＢＩＯ  ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ；住友ベークライト（株）製）の表面にスポットし、室温で１時間静置してプローブＤＮＡを固定化させた。その後、担体を０．１Ｎ  ＮａＯＨでブロッキング処理を施し、ＲＮａｓｅ  フリー水で２回洗浄したものを以下の実験に使用した。
【０１００】
このときのプローブＤＮＡの配列は、
・配列番号１６：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＧ−３’（プローブＤＮＡ−１（野生型［Ｇ］検出用プローブＤＮＡ））
・配列番号１７：５’−ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧ−３’（プローブＤＮＡ−２（野生型［Ａ］検出用プローブＤＮＡ））
・配列番号１８：５’−ＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ−３’（プローブＤＮＡ−３：ポジティブスポット）
・配列番号１９：３’−ＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣ−５’（プローブＤＮＡ−４：ネガティブスポット）
とし、配列番号１６〜１８においては、５’側をＮＨ2−Ｃ６（アルキル基）−で修飾し、配列番号１９においては、３’側をＮＨ2−Ｃ６（アルキル基）−で修飾した。
【０１０１】
本実施例は、東洋紡績（株）製ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸを使用して、添付のプロトコールに従って以下の試薬を含む７５μＬのＰＣＲ反応液を調整した。プライマーＤＮＡ−７および８は、アルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）の特異的配列の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。本ＰＣＲの増幅反応産物の大きさは、７７０ｂｐとして設計した。
・配列番号２０：５’−ＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＧＡ−３’（プライマーＤＮＡ−７）
・配列番号２１：５’−ＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣ−３’（プライマーＤＮＡ−８）
下記のＰＣＲ反応液をプレート状担体のウェル内に装填し、毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪を反応液に直接添加してプレートシールで密封後、住友ベークライト（株）製のＰＣＲ装置に装着して、下記条件によりＡＬＤＨ２遺伝子多型を解析した。
【０１０２】
【表４】
2011019505.tif 000006
【０１０３】
【表５】
2011019505.tif 000007
【０１０４】
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
前記反応条件にて、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）化した核酸（ｂｉｏｔｉｎ−１１−ｄＵＴＰ）を使用してプローブＤＮＡを伸張反応終了後、界面活性剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０など）を含んだトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で十分に洗浄した。ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼ溶液を担体表面に供給し、３７℃で３０分放置後、アルカリフォスファターゼ溶液を除去後、基板の洗浄を行い、続いてニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）溶液を供給し、３７℃で３０分放置後、基板を洗浄した。担体のプローブＤＮＡの点着部分の着色は肉眼で観察できた。
【０１０５】
図５は、担体のプローブＤＮＡの点着部分をＣＣＤカメラで取り込んだ写真であり、図６は、図５における各スポットをイラスト化したものである。図６における符号１０は、プローブＤＮＡ−１（野生型［Ｇ］検出用プローブＤＮＡ）が固定されていた部分であり、符号１５は、プローブＤＮＡ−２（変異型［Ａ］検出用プローブＤＮＡ）が固定されていた部分であり、符号２０はポジティブコントロール（配列番号１８に記載の配列を固定）、符号２５はネガティブコントロール（配列番号１９に記載の配列を固定）の位置を示す。
【０１０６】
［考察］
プローブＤＮＡで表面処理した担体においては、担体上でのＰＣＲ反応によって特定遺伝子が増幅され、同時に、担体に固定したプローブＤＮＡ−１およびプローブＤＮＡ−２がＤＮＡポリメラーゼにより鎖伸長し、事前に予測されたヘテロ型のスポットシグナル（［Ｇ］／［Ａ］のシグナル）が検出された。以上の結果から、担体に複数種のプローブＤＮＡを固定し、毛根、乾燥ろ紙血など固形被検試料をウェル内に配置して、複数種の特定遺伝子を同時に増幅するマルプレックスＰＣＲ反応を行えば、網羅的に特異的配列を検出できることが証明された。
【０１０７】
＜実施例４＞
糞便の中にはＤＮＡ分解酵素が存在しＤＮＡの分解が徐々に進行するため、従来は採取後速やかに液体窒素による凍結保存を要した。本発明においてはＤＮＡ分解酵素の活性が乾燥状態では極めて低下することに着目した。
【０１０８】
≪固形被検試料を採取する工程≫
まず、市販の綿棒を糞便に接触させ、綿棒に付着した糞便を、植物繊維体であるろ紙に塗布し水分の除去を促し、一昼夜自然乾燥した。そして、そのまま該ろ紙を乾燥剤（シリカゲル）入りのプラスチック袋に封入して１時間以上保持した後の該ろ紙を固形被検試料として用いた。本工程は、糞便中のＤＮＡの安定化を図るとともに、糞便の取扱いおよび輸送、保管を簡便かつ衛生的に行うことができる。また、シリカゲルと該ろ紙とをともに密閉して保存することで、該ろ紙の臭いを軽減することができる。
【０１０９】
≪特定遺伝子を増幅する工程≫
固形被検試料としての該ろ紙を約５ｍｍ角に切り取り、担体としての５００μＬチューブに投入し、さらに、該チューブに溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），１Ｍ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μＬを添加し、ボルテックスで良く攪拌後、チューブを９５℃１０分間加熱した。上清３μＬを使用して、以下のＰＣＲ反応による細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅実験を実施した。
【０１１０】
本実施例は、東洋紡績（株）製ＰＣＲキットＫＯＤ  ＦＸを使用して、添付のプロトコールに従って以下の試薬を含む２５μＬのＰＣＲ反応液を調整した。配列番号４および５は、細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（特定遺伝子）のＰＣＲプライマーＤＮＡとして使用される。本ＰＣＲによって増幅される特定遺伝子の大きさは、約５３０ｂｐとなるよう設計した。
【０１１１】
【表６】
2011019505.tif 000008
【０１１２】
【表７】
2011019505.tif 000009
【０１１３】
≪特定遺伝子の増幅量を検出する工程≫
ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液３μＬをアガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子を確認した。
【０１１４】
図７は、実施例４においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１１５】
図７において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；大腸菌をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；滅菌水をＰＣＲ反応（ネガティブコントロール）
・レーン３；実施例４における糞便をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
［考察］
図７の電気泳動から、乾燥（糞便）ろ紙からの抽出液を使用して増幅反応を行ったレーン３では、約５３０ｂｐ付近に明確なバンドが確認された。また、反応液に大腸菌液を添加したレーン１においても矛盾無く所定の分子サイズの増幅産物が検出された。
【０１１６】
この結果から、実施例３と同様に担体に細菌またはウイルス特異的な配列を固定して、配列番号１〜９のプライマーＤＮＡを用いて、担体上でＰＣＲ反応をすることにより、網羅的な遺伝子分類につなげることができることが分かった。
【０１１７】
＜実施例５＞
毛根、湿性耳垢、鼻腔ぬぐい液、唾液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液、糞便、喀痰について、特定遺伝子の検出を行った。毛根については、毛根部分を含む約５ｍｍの頭髪１本を固形被検試料として、実施例１と同様にして直接ＰＣＲ反応に供した。液性の粘液状物である湿性耳垢、鼻腔ぬぐい液、唾液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液については、綿棒、歯間ブラシまたは紙縒りなどを使用して採取し、ろ紙上に塗布し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
【０１１８】
糞便は、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。得られた溶解液０．５μＬ、１．０μＬをそれぞれＰＣＲ反応に供した。溶解液を簡易遠心機で分離した上清１０μＬを未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙から２箇所、ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
【０１１９】
喀痰については、ＰＣＲ反応を阻害する生体成分を多く含み、ろ紙上に展開し、乾燥したサンプルを直接遺伝子増幅することは困難であるため、糞便の場合と同様の前処理を行った。まず、採取した喀痰を未使用のろ紙上に塗布し、自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清１０μＬを未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙からハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した（図９のレーン２）。また、喀痰を直接ＰＣＲ反応に供した場合も行った（図１０のレーン１）。
【０１２０】
表８に示す組成のＰＣＲ反応液を用い、表９に示す条件でＰＣＲ反応を行った。プライマーとしては、上述したプライマー１６Ｓ−９Ｆ（配列番号４）およびプライマー１６Ｓ−５３６Ｒ（配列番号５）を用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子を確認した。
【０１２１】
【表８】
2011019505.tif 000010
【０１２２】
【表９】
2011019505.tif 000011
【０１２３】
図８、９は、実施例５においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１２４】
図８において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；毛根１本をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙湿性耳垢をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；乾燥ろ紙鼻腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；乾燥ろ紙唾液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；乾燥ろ紙口腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン６；乾燥ろ紙歯間ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン７；乾燥ろ紙糞便溶解液０．５μＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン８；乾燥ろ紙糞便溶解液１μＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン９；乾燥ろ紙糞便溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１０；乾燥ろ紙糞便溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１１；乾燥ろ紙膣腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１２；大腸菌をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
また図９において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；乾燥ろ紙喀痰をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙喀痰溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；大腸菌をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；蒸留水（ＤＷ）をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
＜実施例６＞
毛根、皮膚、血液、唾液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液、糞便、喀痰、精液について、特定遺伝子の検出を行った。毛根、皮膚片については、実施例１と同様にして直接ＰＣＲ反応に供した。また、毛根１本を０．２ｍＬＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間の加熱処理を行った。得られた毛根溶解液を１μＬ、ＰＣＲ反応に供した。また、溶解液を簡易遠心機で分離した上清を未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて前記前処理を行った乾燥ろ紙から打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を実施した。
【０１２５】
液性の粘液状物である血液、唾液、口腔ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、膣腔ぬぐい液については、綿棒、歯間ブラシまたは紙縒りなどを使用して採取し、ろ紙上に塗布し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
【０１２６】
糞便は、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清を未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙からハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
【０１２７】
喀痰および精液については、ＰＣＲ反応を阻害する生体成分を多く含むため、ろ紙上に展開し、乾燥したサンプルを直接遺伝子増幅することは困難であるため、糞便の場合と同様の前処理を行った。まず、採取した喀痰、精液を未使用のろ紙上に塗布し、自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、前記乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片２個を０．２ｍＬのチューブ状の担体に取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清２０μＬを未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。前記前処理を行ったろ紙からハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した（図１１のレーン２、４）。また、喀痰、精液を直接ＰＣＲ反応に供した場合も行った（図１１のレーン１、３）。
【０１２８】
ＰＣＲ反応液、ＰＣＲ反応の条件は、実施例５と同様にした。プライマーとしては、上述したアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）の特異的配列の増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用されるプライマーＤＮＡ−７、８（配列番号２０、２１）を用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子を確認した。
【０１２９】
図１０、１１は、実施例６においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１３０】
図１０において、各レーンは以下を示している。
・レーン１；毛根１本をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙毛根溶解液１ｍＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；乾燥ろ紙毛根溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；皮膚片をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；乾燥ろ紙毛根溶解液１ｍＬをＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン６；乾燥ろ紙毛根溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン７；乾燥ろ紙血液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン８；乾燥ろ紙唾液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン９；乾燥ろ紙口腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１０；乾燥ろ紙鼻腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１１；乾燥ろ紙歯間ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１２；乾燥ろ紙膣腔ぬぐい液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１３；乾燥ろ紙糞便溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン１４；蒸留水（ＤＷ）をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
また図１１において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；乾燥ろ紙喀痰をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン２；乾燥ろ紙喀痰溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン３；乾燥ろ紙精液をＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン４；乾燥ろ紙精液溶解液再乾燥ろ紙をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
・レーン５；蒸留水（ＤＷ）をＰＣＲ反応液に投入してＰＣＲ反応
＜実施例７＞
サクラの葉、タマネギの葉、アサガオの葉、アボガドの葉、クローバの葉、楮（コウゾ）の葉、バナナの果実、キウイの果実、アボガドの果実、スイカの果実、イネの果実（米）、ブロッコリーの茎について、特定遺伝子の検出を行った。サクラの葉、タマネギの葉、アサガオの葉、アボガドの葉、クローバの葉、楮（コウゾ）の葉、ブロッコリーの茎については、二つ折りにしたろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）で挟み、ペンチで挟み（プレス）、葉の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した。その後、ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬのチューブ状の担体に入れ、ＰＣＲ反応に供した。
【０１３１】
また、サクラの葉、アボガドの葉。サクラの葉、クローバの葉、楮の葉については、次のように抽出したものもＰＣＲ反応に供した。葉片（４ｍｍ角）を０．５ｍＬ  ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を５０μＬ入れ、９５℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液を簡易遠心機で分離した上清を未使用のろ紙上に滴下後、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて前記前処理を行ったろ紙から打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。
【０１３２】
バナナの果実、キウイの果実、アボガドの果実、スイカの果実については、ろ紙上に置き、薬用さじまたはヘラなどを使用して押しつぶし、果実の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径１．２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。
【０１３３】
米については、炊飯した米１粒をろ紙上に置き、薬用さじまたはヘラなどを使用して押しつぶし、果実の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した。ハリスユニコアパンチ（直径１．２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。
【０１３４】
表１０に示す組成のＰＣＲ反応液を用い、表１１に示す条件でＰＣＲ反応を行った。プライマーとしては、厚生労働省からの通知法（アレルギー物質を含む食品の検査方法について：食安発第１０１１００２号）で用いられている下記の塩基配列の植物検出用プライマー対（ＣＰ０３−５’、ＣＰ０３−３’）を用いて確認した。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
・配列番号２２：５’−ＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＴ−３’（プライマーＣＰ０３−５’）
・配列番号２３：５’−ＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡ−３’（プライマーＣＰ０３−３’）
【０１３５】
【表１０】
2011019505.tif 000012
【０１３６】
【表１１】
2011019505.tif 000013
【０１３７】
図１２〜１４は、実施例７においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１３８】
図１２において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；サクラ葉（プレス）
・レーン２；サクラ葉（抽出）
・レーン３；バナナ果実
・レーン４；ブロッコリー茎
・レーン５；キウイ果実 
・レーン６；アボガド果実
・レーン７；タマネギ葉
・レーン８；蒸留水（ＤＷ）
また図１３において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；アサガオ葉
・レーン２；アボガド葉
・レーン３；クローバ葉
・レーン４；楮葉 
・レーン５；サクラ葉
・レーン６；サクラ葉＋アボガド葉
・レーン７；スイカ果実
・レーン８；米
また図１４において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；アボガド果実
・レーン２；アボガド葉
・レーン３；アボガド葉（抽出）
・レーン４；サクラ葉
・レーン５；サクラ葉（抽出）
・レーン６；クローバ葉（抽出）
・レーン７；楮葉（抽出）
・レーン８；蒸留水（ＤＷ）
＜実施例８＞
サクラの葉、さくらんぼについて、特定遺伝子の検出を行った。サクラの葉は、実施例７と同様に、プレス、抽出の２通り行った。さくらんぼについては、ろ紙上に置き、薬用さじまたはヘラなどを使用して押しつぶし、果実の細胞組織をろ紙に固定し、室温にて自然乾燥した後、ハリスユニコアパンチ（直径１．２ｍｍ）を用いて乾燥ろ紙サンプルから打ち抜いたパンチ片１個を直接０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。また、比較のために、サクラの葉より常法により抽出・精製したＤＮＡを標品として用いた。
【０１３９】
実施例７と同じ組成のＰＣＲ反応液、プライマーを用い、同じ条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
【０１４０】
図１５は、実施例８においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１４１】
図１５において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；サクラ葉（プレス）
・レーン２；サクラ葉（抽出）
・レーン３；さくらんぼ
・レーン４；サクラＤＮＡ（標品） 
＜実施例９＞
排便後、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記の乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２５ｍＬ入れ、９０℃、１０分間加熱処理を行った。得られた溶解液を試料として、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加し、ＲＴ−ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した。コントロールとして、乾燥ろ紙血を上記溶解バッファーで処理した溶解液、または、ＲＮａｓｅフリー水（ＤＷ）を試料の代わりに用い、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加して、ＲＴ−ＰＣＲ反応ならびにＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した。
【０１４２】
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＲＴ−２０１、ＱＲＴ−２０１Ｔ、東洋紡績（株）製）
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎアッセイ用）
またＲＴ−ＬＡＭＰキットとしては以下のものを用いた。
・ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）
合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡは、国立感染症研究所  感染症情報センター第六室より、下記塩基配列のノロウイルスＧＩＩ  ｃＤＮＡの分与を受け、そのプラスミドＤＮＡを利用してプラスミドＤＮＡをリコンストラクトし、インビトロで合成した。
・配列番号２４：５’−ＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＣＴＡＧＡＣＣＣＡＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＮＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＮＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＣＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’（ノロウイルスＧＩＩ  ｃＤＮＡ）
表１２に示す組成の反応液を用い、表１３に示す条件で反応を行った。プライマーとしては、下記の塩基配列のプライマーＣＯＧ２Ｆ、Ｇ２ＳＫＲを用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
・配列番号２５：５’−ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（プライマーＣＯＧ２Ｆ）
・配列番号２６：５’−ＣＣＲＣＣＮＧＣＡＴＲＨＣＣＲＴＴＲＴＡＣＡＴ−３’（プライマーＧ２ＳＫＲ）
【０１４３】
【表１２】
2011019505.tif 000014
【０１４４】
【表１３】
2011019505.tif 000015
【０１４５】
図１６は、実施例９においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１４６】
図１６において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０6コピー
・レーン２；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０5コピー
・レーン３；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０4コピー
・レーン４；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０3コピー
・レーン５；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０6コピー
・レーン６；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０5コピー
・レーン７；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０4コピー
・レーン８；血液、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０3コピー
・レーン９；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０6コピー
・レーン１０；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０5コピー
・レーン１１；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０4コピー
・レーン１２；ＤＷ、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０3コピー
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ  ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加し、糞便中に添加した１０5コピーの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。また、乾燥ろ紙血パンチ片から上記溶解液を使用して得た溶液に添加したノロウイルスＲＮＡの検出が可能であることが実証できたので、血液感染症のエイズウイルスなどの検出も可能であること推察された。
【０１４７】
＜実施例１０＞
表１４に示す組成の反応液を用い、実施例９と同様にして調製した乾燥ろ紙糞便溶解液（試料）またはＤＷ（コントロール）について、１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加し、ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを用い、試料、ＤＷそれぞれについて２通り実施した。
【０１４８】
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）
プライマーとしては上述したプライマーＣＯＧ２Ｆ（配列番号２５）と下記塩基配列のプライマーＣＯＧ２Ｒを組み合わせて用い、また、プローブとして下記塩基配列のプローブＲＩＮＧ２−ＴＰを用いた。
・配列番号２７：５'−ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡ−３'（プライマーＣＯＧ２Ｒ）
・配列番号２８：５'−ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴ−３'（プローブＲＩＮＧ２−ＴＰ）
【０１４９】
【表１４】
2011019505.tif 000016
【０１５０】
反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、リアルタイムＲｔ−ＰＣＲプログラム（９０℃、３０秒→５５℃、２０分→９５℃、１分→〔９４℃、１５秒→５６℃、１分〕（４０サイクル）という条件で行った。反応後、Ｃｔ（増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ））、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｃｔ（Ｃｔ値の平均）、ＳｔｄＤｅｖ  Ｃｔ（複数回ＲＴ−ＰＣＲを行って測定したときのＣｔ値の平均）の数値をそれぞれ測定した。結果を表１５に示す。
【０１５１】
【表１５】
2011019505.tif 000017
【０１５２】
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ  ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｒｎｔｒｅ社製）を添加し、糞便中に添加した１０2コピーの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。
【０１５３】
＜実施例１１＞
表１６に示す組成の反応液を用い、実施例９と同様にして調製した乾燥ろ紙糞便溶解液（試料）１０2コピー、１０3コピー、１０4コピーの合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡまたは１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピーまたは１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加し、表１７に示す条件でＲＴ−ＬＡＭＰ法を実施した。また、合成ノロウイルスＲＮＡを添加していないＤＷをコントロールとした。
【０１５４】
またＲＴ−ＬＡＭＰキットとしては、それぞれ以下のものを用いた。
・ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）
・ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）
合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡは、国立感染症研究所  感染症情報センター第六室より、下記塩基配列のノロウイルスＧＩ  ｃＤＮＡの分与を受け、そのプラスミドＤＮＡを利用してプラスミドＤＮＡをリコンストラクトし、インビトロで合成した。また合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡは、実施例９、１０と同様のものを用いた。
・配列番号２９：５’−ＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＧＧＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣ−３’（ノロウイルスＧＩ  ｃＤＮＡ）
合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡ検出用のプライマー、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ検出用のプライマーとしては、上述したキットに予め含まれているものを用いた。
【０１５５】
反応後の反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
【０１５６】
【表１６】
2011019505.tif 000018
【０１５７】
なお、表１６中、２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘは、以下の組成を有するものである。
（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ組成）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ
・ＫＣｌ：２０ｍＭ
・ＭｇＳＯ4：１６ｍＭ
・（ＮＨ4）2ＳＯ4：２０ｍＭ
・Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％
・ベタイン：１．６Ｍ
・ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ
また、表１６中、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘは、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼとＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅをミックスしたものである。
【０１５８】
【表１７】
2011019505.tif 000019
【０１５９】
図１７は、実施例１１において合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡを添加したものについてＲＴ−ＬＡＭＰを行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１６０】
図１７において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ＤＷ
・レーン２；糞便、合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡ１０2コピー
・レーン３；糞便、合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡ１０3コピー
・レーン４；糞便、合成ノロウイルスＧＩ  ＲＮＡ１０4コピー
また図１８は、実施例１１において合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加したものについてＲＴ−ＬＡＭＰを行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１６１】
また図１８において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ＤＷ
・レーン２；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０2コピー
・レーン３；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０3コピー
・レーン４；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０4コピー
・レーン５；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０5コピー
・レーン６；糞便、合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡ１０6コピー
［考察］
本実施例では、ＬｏｏｐａｍｐノロウイルスＧＩまたはＧＩＩ検出試薬キット（栄研化学（株）製）を使用してノロウイルスの検出を行った。上述したように、当該キットは０．８Ｍのベタインを含有する試薬であり、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ  ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）など生体試料中の阻害物を緩和する試薬は使用していない。本実施例では、糞便中に添加した１０3コピーレベルの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。
【０１６２】
＜実施例１２＞
末梢血採集用のランセットを用いて採取した血液をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記の乾燥ろ紙血から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２５ｍＬ入れ、９０℃、１０分間の加熱処理を行った。溶解液（試料）に１０コピー、１０3コピーまたは１０5コピーの合成エイズウイルスＲＮＡを添加し、表１８に示す組成の反応液を用い、表１９に示す条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。コントロールとして、ＤＷに１０コピー、１０3コピーまたは１０5コピーの合成エイズウイルスＲＮＡを添加して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。また、試料、ＤＷに合成エイズウイルスを添加しなかった場合もコントロールとした。
【０１６３】
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）
合成ウイルスＲＮＡは、コントロールＨＩＶ  ＬＡＩ株から抽出したＲＮＡを用いて、定法により合成ＲＮＡを調整した。合成エイズウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの塩基配列は以下のとおりである。
・配列番号３０：５’−ＣＴＧＮＮＧＡＮＧＣＧＴＴＡＣＧＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＮＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＮＧＡＡ−３’（合成エイズウイルス  ｃＤＮＡ）
プライマーとして下記塩基配列のプライマーＳＫ１４５、ＳＫＣＣ１Ｂを用い、また、プローブとして下記塩基配列のプローブＳＫ１０２を用いた。
・配列番号３１：５'−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ−３'（プライマーＳＫ１４５）
・配列番号３２：５'−ＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣ−３'（プライマーＳＫＣＣ１Ｂ）
・配列番号３３：５'−ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ−３'（プローブＳＫ１０２）
【０１６４】
【表１８】
2011019505.tif 000020
【０１６５】
【表１９】
2011019505.tif 000021
【０１６６】
反応後、Ｃｔ、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｃｔ、ＳｔｄＤｅｖ  Ｃｔの数値をそれぞれ測定した。結果を表２０に示す。
【０１６７】
【表２０】
2011019505.tif 000022
【０１６８】
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ・プローブアッセイ用）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ  ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加し、血液中に添加した１０3コピーレベルの合成エイズウイルスＲＮＡを検出できた。
【０１６９】
＜実施例１３＞
飲用茶「伊右衛門」（登録商標）（サントリー（株）製）をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記飲用茶の成分を固定した乾燥ろ紙茶から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を１００ｍＬ入れ、９０℃、１０分間加熱処理を行った。溶解液（５倍希釈）（試料）に０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬまたは１ｎｇ／ｍＬの１６Ｓ  ｒＲＮＡを添加して、表２１に示す反応液を用いて、表２２に示す条件でＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲ後の反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
【０１７０】
ＲＴ−ＰＣＲキットとしては以下のものを用いた。
・ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎアッセイ用）
１６Ｓ  ｒＲＮＡとしては、市販品であるＥ.ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００由来  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）（ロシュ社製）を用いた。またプライマーとしては、プライマーＭｉｃｒｏＳｅｑ  ５００（１６Ｓ−９Ｆ９）（配列番号４）、プライマーＭｉｃｒｏＳｅｑ  ５００（１６Ｓ−５３６Ｒ）（配列番号５）を用いた。
【０１７１】
【表２１】
2011019505.tif 000023
【０１７２】
【表２２】
2011019505.tif 000024
【０１７３】
図１９は、実施例１３においてＲＴ−ＰＣＲを行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１７４】
図１９において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；溶解液、１ｎｇ／μＬ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ
・レーン２；溶解液、０．１ｎｇ／μＬ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ
・レーン３；溶解液、０．０１ｎｇ／μＬ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ
・レーン４；ＤＷ
［考察］
ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）にＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ  ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加し、ポリフェノールなどＰＣＲ反応を阻害する夾雑物を多く含む飲用茶をろ紙に固定・乾燥した試料を作成した。そのサンプルを弱アルカリ性のバッファーで加熱処理した溶液に１６Ｓ  ｒＲＮＡを添加したところ、０．０１ｎｇレベルまで検出できた。
【０１７５】
＜実施例１４＞
排便後、肛門より直接または便器にティッシュを敷き採便した糞便より、綿棒を用いて採取した一部糞便をろ紙上に塗布し、室温にて約２時間自然乾燥した後、シリカゲル入りのプラスチック袋に内装して保存した。ハリスユニコアパンチ（直径２ｍｍ）を用いて、上記の乾燥ろ紙糞便から打ち抜いたパンチ片１個を０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに取り、溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を２５ｍＬ入れ、９０℃、１０分間加熱処理を行った。得られた溶解液を試料として、１０6コピーの合成ノロウイルスＧＩＩ  ＲＮＡを添加し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
【０１７６】
表２３または表２４に示す組成の反応液を用い、表２５に示す条件で反応を行った。
【０１７７】
【表２３】
2011019505.tif 000025
【０１７８】
【表２４】
2011019505.tif 000026
【０１７９】
【表２５】
2011019505.tif 000027
【０１８０】
なお、表２３および表２４中、ＡＭＶは市販の逆転写酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）であり、ＫＯＤ  ＦＸ、ｒＴｔｈは、共に市販のＤＮＡポリメラーゼ（どちらも東洋紡績（株）製）である。また、表２３および表２４中、２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘは、以下の組成を有するものである。
（２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ組成）
・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）：４０ｍＭ
・ＫＣｌ：２０ｍＭ
・ＭｇＳＯ4：１６ｍＭ
・（ＮＨ4）2ＳＯ4：２０ｍＭ
・Ｔｗｅｅｎ２０：０．２％
・ベタイン：１．６Ｍ
・ｄＮＴＰｓ：各２．８ｍＭ
プライマーとしては、上述したプライマーＣＯＧ２Ｆ（配列番号２５）、Ｇ２ＳＫＲ（配列番号２６）を用いた。ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０μＬを３％アガロースゲルにアプライし、電気泳動にて増幅された特定遺伝子の確認した。
・配列番号２５：５’−ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（プライマーＣＯＧ２Ｆ）
・配列番号２６：５’−ＣＣＲＣＣＮＧＣＡＴＲＨＣＣＲＴＴＲＴＡＣＡＴ−３’（プライマーＧ２ＳＫＲ）
図２０は、実施例１４においてＰＣＲ反応を行った後の増幅された特定遺伝子を確認した電気泳動の写真である。
【０１８１】
図２０において、各レーンは以下を示している。
・Ｍ；ＤＮＡサイズマーカー
・レーン１；ＡＭＶおよびＫＯＤ  ＦＸの組み合わせ
・レーン２；ＡＭＶおよびｒＴｔｈの組み合わせ
［考察］
発明者が作製したＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘに、市販の逆転写酵素ＡＭＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）と、市販のＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績（株）製）またはｒＴｔｈ（東洋紡績（株）製）とを組み合わせて用いることで、定法のＲＴ−ＰＣＲ条件下、糞便中に添加した１０6コピーの合成ノロウイルスＲＮＡを検出できた。
【０１８２】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【０１８３】
１  頭髪、２  毛根、３  担体、４  ＰＣＲ反応液、５  蓋、１０  プローブＤＮＡ−１を固定した位置、１５  プローブＤＮＡ−２を固定した位置、２０  ポジティブコントロールの位置、２５  ネガティブコントロールの位置。
【図１】
2011019505.tif 000028
【図６】
2011019505.tif 000029
【図２】
2011019505.tif 000030
【図３】
2011019505.tif 000031
【図４】
2011019505.tif 000032
【図５】
2011019505.tif 000033
【図７】
2011019505.tif 000034
【図８】
2011019505.tif 000035
【図９】
2011019505.tif 000036
【図１０】
2011019505.tif 000037
【図１１】
2011019505.tif 000038
【図１２】
2011019505.tif 000039
【図１３】
2011019505.tif 000040
【図１４】
2011019505.tif 000041
【図１５】
2011019505.tif 000042
【図１６】
2011019505.tif 000043
【図１７】
2011019505.tif 000044
【図１８】
2011019505.tif 000045
【図１９】
2011019505.tif 000046
【図２０】
2011019505.tif 000047
【配列表】
2011019505000001.app