(57)【要約】【課題】チロシナーゼ阻害作用を有する剤（チロシナーゼ阻害剤）、メラニン生成抑制作用を有する剤（メラニン生成抑制剤）、ならびにこれらの作用に基づく美白剤及び美白外用剤を提供する。【解決手段】チロシナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤および美白剤の有効成分として、単離または精製されたグネチンＣまたはその塩を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離または精製されたグネチンＣまたはその塩を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
単離または精製されたグネチンＣまたはその塩を有効成分とする美白剤。
【請求項３】
請求項１に記載するチロシナーゼ阻害剤または請求項２に記載する美白剤を有効成分として含有する美白外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白外用剤の有効成分として有用なチロシナーゼ阻害剤および美白剤に関する。さらに、当該チロシナーゼ阻害剤または美白剤を有効成分とする美白外用剤、特に美白化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
シミ、ソバカスや日焼け後の皮膚色素沈着は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン産生が著しく亢進した結果として生ずるものであり、中高年齢層における肌の悩みの一つになっている。
【０００３】
一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素であるチロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、ついで５,６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成されるものとされている。従って、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・治療するためには、メラニン産生過程を阻害することが有効である。
【０００４】
このような考えに基づき、従来から種々の美白成分が提案されている。例えば、チロシナーゼ活性を阻害してメラニン産生を抑制するものとして、コロイド硫酸やグルタチオンに代表される硫黄化合物等、コウジ酸、アルブチン、ハイドロキノンなどが知られている。また各種の植物抽出物や植物成分にチロシナーゼ阻害作用があることも知られている（例えば、特許文献１や２等）。
【０００５】
また特許文献３には、グネツム科グネツム属植物（メリンジョ）の果実の微粉末を有効成分とする化粧料が記載されており、これに美白効果があることが記載されている。また非特許文献１及び２には、当該グネツム果実に含まれるレスベラトロールに、チロシナーゼ阻害活性があり、それに基づいてメラニン生成を抑制することが記載されている。
【０００６】
一方、グネチンＣ、グネモノシドＡ、グネモノシドＣ及びグネモノシドＤ等のレスベラトロールの二量体については、抗菌作用や抗酸化作用の報告はあるものの（特許文献４）、美白作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2002-201122号公報
【特許文献２】特開2008-214272号公報
【特許文献３】特開2008-100963号公報
【特許文献４】WO2006/030771
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Takako Yokozawa et al.,“Piceatannol Inhibits Melanogenesis by Its Antioxidative Actions,”Biol.Pharm.Bull. 30 (11) 2007-2011, 2007
【非特許文献２】Rishard A. Newton et al.,“Post-Transcriptional Regulation of Melanin Biosynthetic Enzymes by cAMP and Resveratrol in Human Melanocytes,” Journal of Investigative Dermatology, Volume 127 (9) 2216-27, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、グネチンＣについて新たに見出された生理活性に基づいて、これらの新規用途を提供することを目的とする。具体的には、グネチンＣまたはその塩について、チロシナーゼ阻害剤としての用途、及び美白剤としての用途を提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題の下、本発明者らが鋭意検討を重ねたところ、グネチンＣに、従来からチロシナーゼ阻害作用が知られているコウジ酸およびレスベラトロールに比して顕著に高いチロシナーゼ阻害活性を有し、シミやソバカスの原因となるメラニンの生成を抑制する作用があること、すなわち美白作用があることを見出し、当該グネチンＣが単独で美白剤の有効成分として使用できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の構成を有するものである。
【００１１】
（１）単離または精製されたグネチンＣまたはその塩を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
（２）単離または精製されたグネチンＣまたはその塩を有効成分とする美白剤。
（３）（１）に記載するチロシナーゼ阻害剤または（２）に記載する美白剤を配合してなる美白外用剤。
【発明の効果】
【００１２】
皮膚の着色の原因となるメラニン色素は、皮膚組織中の色素細胞（メラノサイト）で生成される。皮膚のシミやソバカス等の色素沈着は、日光からの紫外線暴露による刺激やホルモン異常、または遺伝的要因等が原因となって、色素細胞が活性化された結果、メラニン色素が異常沈着して発生するものと考えられている。通常、皮膚組織の代謝（ターンオーバー）によりメラニンは代謝されるが、加齢に伴う皮膚組織の代謝の低下なども、色素沈着の原因となる。
【００１３】
グネチンＣは、後述する実験例で示すように、メラニン合成に関わる酵素であるチロシナーゼに対して、チロシナーゼ阻害作用が知られているコウジ酸やレスベラトロールよりも優れた阻害活性を示し、メラニン生成を抑制する作用を有することから、美白（色素沈着やくすみの改善）作用を有する。このため、グネチンＣはチロシナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤または美白剤の有効成分として有用であるとともに、美白を効果とする皮膚外用剤（美白外用剤）の有効成分として有用である。
【００１４】
本発明のチロシナーゼ阻害剤または美白剤を含む美白外用剤は優れた美白作用を有し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス、紅斑等の淡色化、くすみを目立たなくさせるなど、美肌効果を有し、健康な肌を維持できるため、特に美白化粧料、美肌化粧料、スキンケア化粧料などとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験例１において、各被験試料（グネチンＣ、トランス−レスベラトロール、コウジ酸）についてチロシナーゼ阻害活性（％）を測定した結果を示す。
【図２】実験例２において、各被験試料（グネチンC(15μM)、コウジ酸(1000μM)）を用いた場合について細胞内でのメラニン生成量を測定した結果を示す。（ａ）は、チューブの底に集積したメラノーマ細胞の写真画像を示す。（ｂ）は、各被験試料（グネチンＣ、コウジ酸）を用いた場合について細胞内でのメラニン生成量を対比した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（Ｉ）チロシナーゼ阻害剤
前述するように、シミやソバカスは、色素細胞中の酵素であるチロシナーゼによってチロシンが酸化され、それに伴いメラニンが皮膚内に多量に生成され、異常沈着することにより発生する。すなわち、チロシナーゼはメラニン合成に重要な酵素であり、その活性を阻害することでメラニンの合成が阻止でき、その結果、美白効果を得ることができる。
【００１７】
本発明におけるチロシナーゼ阻害剤は、かかるチロシナーゼの活性を阻害する作用を有するものである。その結果、メラノサイト中のメラニン合成を阻害して、美白作用を発揮する。
【００１８】
かかる本発明のチロシナーゼ阻害剤は、グネチンＣを有効成分とすることを特徴とする。
【００１９】
ここでグネチンＣは、レスベラトロールの２量体で、下記式で示されるポリフェノールの一種である。
【００２０】
【化１】
2011032173.tif 000002
【００２１】
グネチンＣは、自家調製品または市販品を問わず用いることができる。ここでグネチンＣを自家調製する方法としては、特に制限されず、グネチンＣを含む植物から抽出し単離する方法、微生物に産生させて単離する方法（例えばAdil E Bala et al., “Antifungal activity of resveratrol oligomers from Cyphostemma crotalarioides", Pesticide Science, Vol.55, Issue 2, Pages 206-208など参照）、および化学的に合成する方法を挙げることができる。
【００２２】
グネチンＣを含む植物としては、特に制限されないが、好ましくはグネツム科に属する植物を挙げることができる（Ibrahim Iliya et al., "Stilbenoids from the stem of Gnetum latifolium(Gnetaceae)", Phytochemistry, 2002 Dec;61(8):959-61；Ibrahim Iliya et al., "Dimeric Stilbenes from Stem Lianas of Gnetum Africanum", VOL.57;NO.6;PAGE.1057-1062(2002),http://sciencelinks.jp/j-east/article/200213/000020021302A0470840.php)。
【００２３】
具体的には、グネツム科に属するGnetum latifolium、Gnetum AfricanumおよびGnetum gnemon（メリンジョ）を例示することができる。好ましくはメリンジョである。使用する植物の部位についてもグネチンＣを多く含む部位であれば、実（又は種子）、花及び葉など、部位に制限されないが、好ましくは実（または種子）、より好ましくは実の胚乳である。
【００２４】
ここでグネチンＣを植物から抽出する場合、その方法は特に制限されないが、極性溶媒を用いて抽出する方法や二酸化炭素等による超臨界抽出法を用いて抽出する方法が挙げられる。極性溶媒で抽出する場合、使用する抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール(メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、イソプロパノールなど)、ケトン類(アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトンなど)、エステル類(酢酸メチル、酢酸エチルなど)、グリコール類(エチレングリコール、プロピレングリコール)、グリセリン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸、プロピオン酸、アセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドを挙げることができる。
【００２５】
これらの抽出溶媒は１種で使用しても、また２種以上を任意に組み合わせて混合液として用いることもできる。好ましくは、水、低級アルコール（好ましくはエタノール）またはこれらの混合液（含水アルコール、好ましくは含水エタノール）である。なお、抽出溶媒として含水アルコール（好ましくは含水エタノール）を使用する場合、エタノール濃度としては、制限されないものの、２０〜９０容量％、特に４０〜８０容量％を好適に挙げることができる。
【００２６】
抽出は、溶媒に上記植物体の一部または全部を加え、０℃〜溶媒が沸騰する温度、通常100℃以下の温度で、30分から3日程度、浸漬静置または浸漬振盪抽出し、次いで不溶物を除去することなどにより、容易に行うことができる。斯くして得られた溶媒抽出物は、さらにグネチンＣの単離精製処理に供される。かかる単離精製処理は、慣用の方法を１または２種以上組み合わせて行うことができる。このような処理としては、例えば、析出法、液−液向流分配法、活性炭や樹脂などによる吸着処理、カラムクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製処理等が挙げられる。なお、グネチンＣの単離精製は、グネチンＣの分子量（454）および極大吸収波長（320nm）のほか、下記の挙動を指標として行うことができる。
【００２７】
＜薄層クロマトグラフィー（TLC）＞
下記条件で分析した際のRf値が0.61。
【００２８】
シリカゲル60F254、展開溶媒：20容量％メタノールを含むクロロホルム、検出波長：254 nm。
【００２９】
＜高速液体クロマトグラフィー（HPLC）＞
下記条件で分析した際の保持時間が33.5分。
カラム：東ソー製 TSKgel ODS-100V、5μm 4.6×150 mm、
移動層: Ａ液：1容量％酢酸含有水、Ｂ液：１容量％酢酸含有メタノール、
グラジェント条件：0分→10分：Ａ:Ｂ=65:35(v/v)→63:37(v/v)、10分→20分：Ａ:Ｂ=63:37(v/v)→56：44(v/v)、20分→40分：Ａ:Ｂ=48:52 (v/v)、
検出波長：320 nm、
流速: 0.8 ml/min。
【００３０】
なお、精製は純度１００％まで行う必要はない。本発明で使用するグネチンＣは、純度が通常５０％以上のものであればよく、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上のものを挙げることできる。
【００３１】
また、グネチンＣを、微生物を用いて産生する場合、また化学合成によって取得する場合も、上記と同様に精製処理を施すことが好ましい。
【００３２】
グネチンＣは、フリーの状態で使用してもよいし、また塩の状態で使用してもよい。ここで塩とは、グネチンＣが形成する塩であって外用医薬品として許容される塩であればよい。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。また、グネチンＣにはその水和物、医薬として許容される溶媒和や結晶多形なども含まれる。
【００３３】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、上記単離または精製されたグネチンＣまたはその塩だけからなるものであってもよい（グネチンＣまたはその塩100％）が、グネチンＣのチロシナーゼ阻害作用が妨げられない限り、他の成分（別添成分）としてチロシナーゼ阻害剤として公知の化合物（例えば、コウジ酸、アルブチン、ハイドロキノン）や植物抽出物などが配合されていてもよい。また、油脂類、炭化水素類、脂肪酸類、水、アルコール類またはエステル類等の担体（キャリヤー）や、酸化防止剤や殺菌・抗菌剤等の添加剤を含んでいても良い。かかる他の成分を含む場合のチロシナーゼ阻害剤中のグネチンＣの割合としては、グネチンＣがチロシナーゼ阻害活性を示す少なくとも３μＭの濃度であればよく（実験例１参照）、それを条件として例えば１〜９８重量％を例示することができる。
【００３４】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、その形態を特に問うものではなく、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状、カプセル状などの固形製剤形態を有していてもよいし、また液状、懸濁液状、乳液状などの液状製剤形態を有していてもよい。
【００３５】
本発明のチロシナーゼ阻害剤は、色素細胞中でチロシナーゼを阻害することでメラニンの産生を抑制する作用を有するため（実験例２参照）、美白（シミやくすみの予防および低減を含む）を効果とする皮膚外用剤（美白外用剤）、特に美白化粧料の有効成分として、好適に使用することができる。
【００３６】
（２）美白剤
本発明の美白剤は、前述するチロシナーゼ阻害剤として有効なグネチンＣを有効成分として含有することを特徴とする。
【００３７】
なお、グネチンＣは、フリーの状態で使用してもよいし、また塩の状態で使用してもよい。ここで塩とは、前述するように、グネチンＣが形成する塩であって医薬品として許容される塩であればよい。また、グネチンＣにはその水和物、医薬として許容される溶媒和や結晶多形なども含まれる。
【００３８】
本発明の美白剤は、上記単離または精製されたグネチンＣまたはその塩だけからなるものであってもよいが（グネチンＣまたはその塩100%）、グネチンＣのチロシナーゼ阻害作用またはそれによるメラニン生成抑制作用に基づく美白作用が妨げられない限り、他の成分（別添成分）として、美白剤として公知の化合物（例えば、アスコルビン酸またはその誘導体、イオウ、胎盤抽出物、エラグ酸またはその誘導体、コウジ酸またはその誘導体、グルコサミンまたはその誘導体、アゼラインまたはその誘導体、アルブチンまたはその誘導体、ヒドロキシケイヒ酸またはその誘導体、グルタチオンなど）、各種の植物抽出物（アルニカエキス、オウゴンエキス、オウゴンエキス、センキュウエキス、ソウハクヒエキス、サイコエキス、ボウフウエキス、ハマボウフウエキス、マンネンタケ菌糸体培養物またはその抽出物、ギムネマエキス、シナノキエキス、モモ葉エキス、エイジツエキス、クジンエキス、チユエキス、トウキエキス、ヨクイニンエキス、カキ葉エキス、ダイオウエキス、ボタンピエキス、ハマメリスエキス、マロニエエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス）および養蜂産品（例えばローヤルゼリー、プロポリス、花粉荷またはハチノコ等の加工品（例えば抽出エキスなど））などを含んでいてもよい。また、油脂類、炭化水素類、脂肪酸類、水、アルコール類またはエステル類等の担体（キャリヤー）や、酸化防止剤や殺菌・抗菌剤等の添加剤を含んでいても良い。かかる他の成分を含む場合、美白剤中のグネチンＣの割合としては、グネチンＣがチロシナーゼ阻害活性に基づく美白作用を示す少なくとも３μＭの濃度であればよく（実験例１参照）、それを条件として例えば、１〜９８重量％を例示することができる。
【００３９】
本発明の美白剤は、その形態を特に問うものではなく、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状、カプセル状などの固形製剤形態を有していてもよいし、また液状、懸濁液状、乳液状などの液状製剤形態を有していてもよい。
【００４０】
本発明の美白剤は、グネチンＣのチロシナーゼ阻害活性に基づいて、メラニンの産生を抑制する作用を有するため、美白（シミやくすみの予防および低減を含む）を効果とする皮膚外用剤（美白外用剤）、特に美白化粧料の有効成分として、好適に使用することができる。
【００４１】
（３）美白外用剤
本発明において美白外用剤とは、美白（シミやくすみの予防および低減を含む）を目的として使用される皮膚外用剤を意味する。当該皮膚外用剤には、外用の医薬品および化粧料が含まれる。好ましくは美白化粧料である。
【００４２】
本発明の美白外用剤は、グネチンＣを美白成分とする前述するチロシナーゼ阻害剤または美白剤を有効成分として含有することを特徴とする。
【００４３】
かかる美白外用剤は、前述するチロシナーゼ阻害剤または美白剤を、外用剤の基剤に配合し、定法に従って、任意の剤型に製剤化することによって調製することができる。ここで美白外用剤の剤型は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、および水−油−粉末３層系等、幅広い剤型を採ることができる。例えば、その形態として、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ジェル、フォーム、エッセンス、美容液、パック、マスク等を挙げることができる。
【００４４】
また外用剤の基剤としては、グネチンＣのチロシナーゼ阻害活性に基づくメラニン生成抑制作用を妨げないものであればよく、この限りにおいて、上記剤型や用途に応じて、慣用のものを使用することができる。例えば、外用剤の基剤として、下記の油脂類、炭化水素類、脂肪酸類、水、アルコール類またはエステル類等を挙げることができる：
油脂類：大豆油，アマニ油，キリ油，ゴマ油，ヌカ油，綿実油，菜種油，サフラワー油，トウモロコシ油，オリーブ油，椿油，アーモンド油，ヒマシ油，落花生油，カカオ油，モクロウ，ヤシ油，パーム核油，牛脂，ミンク油，卵黄油，ホホバ油，月見草油、馬油。
【００４５】
ロウ類：カルナウバロウ，キャンデリラロウ，蜜ロウ，サラシ蜜ロウ，鯨ロウ，セラックス，ラノリン類。
【００４６】
炭化水素類：流動パラフィン，ワセリン，マイクロクリスタリンワックス，セレシン，スクワラン，ポリエチレン末。
【００４７】
脂肪酸類：ステアリン酸，リノール酸，ラウリン酸，ミリスチン酸，パルミチン酸，ヘベニン酸，ラノリン酸，オレイン酸，ウンデシレン酸，イソステアリン酸。
【００４８】
アルコール類：ラウリルアルコール，セチルアルコール，ステアリルアルコール，ラノリンアルコール，水添ラノリンアルコール，オレイルアルコール，ヘキサデシルアルコール，２−オクチルドデカノール，グリセリン，ソルビトール，プロピレングリコール，１，３−ブチレングリコール，エチレングリコールおよびその重合体，ブドウ糖，白糖，コレステロール，フィトステロール，セトステアリルアルコール。
【００４９】
エステル類：オレイン酸デシル，ステアリン酸ブチル，ミリスチン酸ミリスチル，ラウリン酸ヘキシル，パルミチン酸イソプロピル，ミリスチン酸イソプロピル，ミリスチン酸オクチルドデシル，ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル，ジオレイン酸プロピレングリコール，フタル酸ジエチル，モノステアリン酸プロピレングリコール，モノステアリン酸エチレングリコール，モノステアリン酸グリセリン，トリミリスチン酸グリセリン，酢酸ラノリン，乳酸セチル。
【００５０】
また本発明の美白外用剤には、化粧料や外用剤に通常用いられる成分、例えば、保湿剤、収斂剤、細胞賦活剤、抗酸化・活性酸素消去剤、紫外線吸収剤、紫外線カット剤、界面活性剤、増粘剤、粉末成分、色材、殺菌・抗菌剤、消炎・抗アレルギー剤、各種皮膚栄養剤、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００５１】
本発明の美白外用剤中に含まれるチロシナーゼ阻害剤または美白剤の割合は、美白外用剤が美白効果を発揮する限り特に制限されないが、グネチンＣの量に換算して、美白外用剤中にグネチンＣが３μＭ以上の割合で配合されていることが好ましい。実験例１（図１）に示すように、グネチンＣは３μＭ以上でチロシナーゼ阻害活性を有し、その濃度が高くなるに従ってチロシナーゼ阻害活性も大きくなり、１０μＭ以上でほぼプラトーな状態になる。このことからわかるように、美白効果を発揮するという観点からは、グネチンＣの量の上限は特に制限されない。実用性からは、０.００３ｍＭ〜６６ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜４０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭ（約0.05〜0.5重量％）の濃度を挙げることができる。
【００５２】
また実験例１（図１）に示すように、グネチンＣは比較的低濃度、例えば３〜６０μＭ、好ましくは７．５〜３０μＭ、より好ましくは１５〜３０μＭの濃度で、従来公知のチロシナーゼ阻害作用と有意差をもって高いチロシナーゼ阻害活性を示す。このように、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、グネチンＣを上記低濃度の範囲で含む場合でも高いチロシナーゼ阻害活性を有することを特徴とする。
【００５３】
美白外用剤の形態は特に制限されず、例えば美白外用剤が基礎化粧品である場合、その形態として、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パック、マスク等が挙げられる。また、その他の形態として、洗顔料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、石けん等を挙げることもできる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実験例、および実施例により詳細に説明するが、これらの実施例等によって本発明は何ら限定されるものではない。
【００５５】
調製例１  グネチンＣの調製
以下の方法に従い、グネチンＣを単離した。
【００５６】
(i) 特開2009-013123号公報の段落[0024]の記載に従って、メリンジョの乾燥果実の破砕物を、室温下で含水エタノールに浸漬し、得られた抽出液を減圧濃縮して、固形分を63.2重量％含むメリンジョエキスペーストを得た。
【００５７】
(ii) 上記で得られたメリンジョエキスペースト2.5gをカラムクロマトグラフィー（ゲルの種類：Cosmosil 75C18-PREP（ナカライテスク製）、カラムサイズ：φ3×26.5 cm）に付し、溶離液としてメタノール含量が10容量％、25容量％、40容量％、80容量％および100容量％の含水メタノールを用いて順次ステップワイズ溶出した（各溶離液600 mLを流し、100 mLずつ分取）。得られた各成分を下記条件のＨＰＬＣで確認したところ、グネチンＣは、保持時間33.5分（１容量％酢酸および80容量％メタノールを含有する含水メタノール溶出フラクション）に溶出することが確認された。
【００５８】
＜HPLC条件＞
カラム：東ソー製 TSKgel ODS-100V、5μm 4.6×150 mm、
移動層: Ａ液：1容量％酢酸含有水、Ｂ液：１容量％酢酸含有メタノール、
グラジェント条件：０分→10分：Ａ:Ｂ=65:35(v/v)→63:37(v/v)、10分→20分：Ａ:Ｂ=63:37(v/v)→56：44(v/v)、20分→40分：Ａ:Ｂ=48:52 (v/v)
検出波長：320 nm、
流速: 0.8 ml/min。
【００５９】
(iii)上記フラクションを濃縮後、下記条件の中圧カラムクロマトグラフィーで順次溶出した。
【００６０】
＜中圧カラムクロマトグラフィー条件＞
ゲルの種類：シリカゲル、Daisogel IR-60-40/63-W、
カラムサイズ：φ2×7.48 cm、
検出波長：320 nm
移動層：Ａ液：メタノール、Ｂ液：クロロホルム、
グラジェント条件：０分→2分：Ａ:Ｂ=11:89(v/v)、2分→8分：Ａ:Ｂ=11:89(v/v)→18:82(v/v)、8分→12分：Ａ:Ｂ=18:82(v/v)、12分→14分：Ａ:Ｂ=21:79(v/v)、14分→20分：Ａ:Ｂ=21:79(v/v)→29:71(v/v)、20分→24分：Ａ:Ｂ=29:71(v/v)、24分→30分：Ａ:Ｂ=29:71(v/v)→36:64(v/v)、30分→34分：36:64(v/v)、
流速: 60 ml/min。
【００６１】
溶出液を60mLずつ分取し、検出波長：320 nmで吸収ピークを示した29番目から30番目のフラクションをエバポレーターで濃縮し、グネチンＣ(35.2 mg、純度97%)を得た。
【００６２】
実験例１  チロシナーゼ阻害活性の測定
（１）試験方法
チロシナーゼが有するドーパ酸化活性を測定することで、各被験試料（グネチンＣ、トランス−レスベラトロール、コウジ酸）のチロシナーゼ阻害活性を評価した。
具体的には、まず96ウェルプレートの各ウェルに、被験試料としてグネチンC（ホソダSHC社より入手）、トランス−レスベラトロール（Sigma社）、コウジ酸（Sigma社）、またはコントロールとしてDMSO（Sigma社）をそれぞれ加え、これに40U/mlに調製したマッシュルームに由来するチロシナーゼ液（50 mMリン酸緩衝液(pH6.8)で調製）を50μL加えて、1分間撹拌後、37℃で10分間インキュベートした。これに反応液（1.1 mM L-DOPA、6.7 mM MBTH[3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン] （Sigma社）、2.7% N, N-dimethylformamide（Sigma社）／17 mM リン酸緩衝液(pH 6.8)）を130μL加え、37℃で10分間インキュベートした後、515 nmの吸光度を測定し、これを測定値（被験試料測定値、コントロール測定値）とした。同時にチロシナーゼ液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.8)を加えた場合を測定し、これをバックグラウンド値とした。３ウェル分の平均値を１つのデータとし、３回の独立した試験を実施した。
【００６３】
チロシナーゼ阻害活性（％）を下記の計算式より導き、得られた阻害活性（％）から各被験試料のIC50を求めた。
【００６４】
【数１】
2011032173.tif 000003
【００６５】
（２）試験結果
図１に各被験試料のチロシナーゼ阻害活性（％）を、またそれから得られたIC50を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2011032173.tif 000004
【００６７】
これからわかるように、グネチンＣには、従来チロシナーゼ阻害活性が知られているレスベラトロールおよびコウジ酸よりも有意に強いチロシナーゼ阻害活性があることが判明した。また図１からわかるように、グネチンＣは特に少なくとも３μＭ程度の低い濃度で強いチロシナーゼ阻害活性を示すことが判明した。
【００６８】
実験例２  細胞のメラニン産生に対する抑制作用
（１）試験方法
96ウェルプレートの各ウェルのイーグルMEM培地（ニッスイ社）上に、マウスメラノーマB16細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社）を5×10４ cells／ウェルの割合で播種し、37℃、5%CO２の条件下で24時間インキュベートした。その後、テオフィリン（Sigma社）を終濃度500 μMになるよう加え、これに被験試料としてグネチンC（15μM）、コウジ酸（1000μM）、コントロールとして溶媒（DMSO）を加え、37℃、5%CO２の条件下で3日間培養した。培養後、培地を除去し、トリプシン-EDTA溶液（ギブコ社）を500μL加えて細胞を剥離させ、得られた細胞懸濁液をチューブに回収した。
【００６９】
なお、チューブに細胞を回収する際、細胞懸濁液を少量とり、CellTiter-GloTMキット（プロメガ社）を使用して、細胞数を測定した。細胞懸濁液を回収したチューブを15,000 rpmにて10分間遠心し、細胞をチューブの底に集積した後、上清を除き、写真撮影を行った（図２(a)）。撮影後、細胞数に対応する量の1N NaOHを加え、95℃で60分間インキュベートしてメラニンを抽出し、405 nmの吸光度を測定し、測定値（被験試料測定値、コントロール測定値）とした。同時に1N NaOHの吸光度を測定し、バックグラウンド値（被験試料ＢＧ値、コントロールＢＧ値）とした。
【００７０】
得られた測定値から、下式を用いて、各被験試料およびコントロールについてメラニン量を求めた。３回の独立した試験を行い、各試験で得られたコントロールのメラニン量を100として、被験試料のメラニン量を算出した。
【００７１】
【数２】
2011032173.tif 000005
【００７２】
（２）試験結果
チューブの底に集積した細胞の写真画像を図２(a)に、各被験試料（グネチンＣ、コウジ酸）およびコントロールについてメラニン量を対比した結果を図２(b)に示す。
【００７３】
実施例１においてグネチンＣにはチロシナーゼ阻害活性があることを示したが、図２の結果から、グネチンＣにはそのチロシナーゼ阻害活性に基づいて色素細胞内でのメラニン生成を抑制する作用があることが確認された。そしてその作用は、実施例１で示すように、コウジ酸よりも顕著に高いことが確認された。
【００７４】
処方例１：化粧水形態を有する美白剤
以下の表２に示される各成分を用い、常法に従い化粧水形態を有する美白外用剤を調製した。なお、ここでグネチンＣとして調製例１で調製した純度97％のものを使用する（処方例２及び３も同様）。
【００７５】
【表２】
2011032173.tif 000006
【００７６】
処方例２：美容液形態を有する美白剤
以下の表３に示される各成分を用い、常法に従い美容液形態を有する美白外用剤を製造した。
【００７７】
【表３】
2011032173.tif 000007
【００７８】
処方例３：乳液形態を有する美白剤
以下の表４に示される各成分（重量％）を用い、常法に従い乳液（美白外用剤）を製造した。
【００７９】
【表４】
2011032173.tif 000008
【図１】
2011032173.tif 000009
【図２】
2011032173.tif 000010