(57)【要約】      （修正有）【課題】ピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩を含むリポソーム組成物、および該リポソームを含有する溶液の製造方法の提供。【解決手段】下記式で表されるピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩を含むリポソーム組成物、およびピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩とリポソームとをｐＨが１〜８で、６０〜１９０℃で加温する工程を含む該リポソームを含有する溶液の製造方法。該リポソームは、リン脂質及び／又は糖脂質を用いて調製された溶液であり、該リン脂質としては、レシチンであることが好ましい。2011219397.tif 000005【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）；
【化１】
2011219397.tif 000004
で表されるピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩を含むリポソーム組成物。
【請求項２】
請求項１記載のリポソーム組成物を含み、ピロロキノリンキノンの濃度が０．０００１〜２重量％であり、pHが８以下である溶液。
【請求項３】
リポソームがリン脂質及び／又は糖脂質を用いて調製されたものである請求項２記載の溶液。
【請求項４】
リン脂質がレシチンである請求項３記載の溶液。
【請求項５】
レシチンが大豆レシチンまたは卵黄レシチンである請求項４記載の溶液。
【請求項６】
リポソームの大きさが０．０５から１００μmであることを特徴とする請求項２から５のいずれかに記載の溶液。
【請求項７】
ピロロキノリンキノンの重量濃度が０．０１から１重量％であり、pHが２から６である請求項１記載のレシチンからできたリポソーム組成物を含む溶液。
【請求項８】
請求項２から７のいずれかに記載の溶液を乾燥した粉末。
【請求項９】
ピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩とリポソームとをpHが１から８で、６０℃から１９０℃で加温する工程を含むことを特徴とする溶液の製造方法。
【請求項１０】
ホモジナイザーを使用して分散させる工程を含むことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明で取り扱うピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱと記す）は式１で表される構造の物質で、このフリー体又は塩を含むリポソームの技術に関する。
【化１】
2011219397.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱは新しいビタミンの可能性があることが提案されており（例えば、非特許文献１参照）、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。さらには細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。
【０００３】
このＰＱＱは、有機化学的合成法（非特許文献２）または発酵法（特許文献１）などの方法により得たＰＱＱをクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、晶析により結晶化し（特許文献２）、乾燥して得ることができる。
【０００４】
このＰＱＱは栄養機能を強化した食品として使用することが期待されるが、酸性条件下では化学的に安定であるが、アルカリ条件下では分解しやすい。また、カルボニル化合物との反応性も有している。さらには強酸性では析出しやすい。そのため、pHの変化等に対応できる方法が求められている。また、吸収性を上げ、ピロロキノリンキノンの機能を向上させる方法も求められている。
【０００５】
リポソームとは通常はリン脂質からなる脂質の膜でできたカプセル構造のことをいい、中に水相が閉じこめられている。リン脂質の分子は松葉のような形をしていて、頭の部分が親水性、葉のように見える部分が疎水性という２つの性質を併せ持っているので、水に放たれると親水性の部分が水と引きつけあい、リポソームを形成する。リポソームは、水溶性の成分をその親水性の部分に、油溶性の成分をその疎水性の部分に閉じこめることができる。リポソームは、薬剤を投与する方法として主に医学の分野で注目されており、吸収性の向上や分散性の向上、安定性の向上の利点が一般的に知られ、経口、皮膚に塗布する用途で広く使用されている。そのためＰＱＱを含むリポソームが求められている。
【０００６】
さらにはＰＱＱは脳機能改善が期待されているが、同様の機能を有するポスファチジルコリンやポスファチジルセリン（非特許文献４）との同時摂取が期待されており、リン脂質成分としてこれらはリポソーム原料に含まれることから、ピロロキノリンキノンのフリー体又は塩を含有するリポソームの提供とそれにより機能性が向上した組成物、その製造方法が求められている。
【０００７】
これまで、ＰＱＱを電子メディエーターとして使用し、酵素をリポソームとして固定する燃料電池は開発されている（特許文献３）。また、S-ニトロシル化化合物を哺乳類に投与するための組成物として提案されているが、具体的な例はなく、製造方法についても記載がない（特許文献４）。リン脂質はそのままでは粘度が高く、リポソームにするにはクロロホルムのような溶剤に溶かし、フラスコ内部に液膜を形成して超音波で分散する方法が一般的であるが、この方法は生産性が低く、また、溶剤が残留する危険性がある。このように、具体的な溶液として提供する方法やそのための製造方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１−２１８５９７号公報
【特許文献２】特許第２０７２２８４号公報
【特許文献３】特表２００６−５０８５１９号公報
【特許文献４】特表２００１−５１８０９６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】nature,vol422, 24April,2003, p832
【非特許文献２】JACS、第103巻、第5599〜5600頁（1981）
【非特許文献３】JACS、第111巻、第6822〜6828頁（1989）
【非特許文献４】ファインケミカル、第３４巻、No.11, 第30-41頁（2005）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩を含むリポソームを提供することと効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ピロロキノリンキノンの性質とリポソーム化の条件を鋭意検討した結果以下の方法により解決できることを見出した。
（１） 下記式（１）；
【化２】
2011219397.tif 000003
で表されるピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩を含むリポソーム組成物。
（２）ピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩とリポソームとをpHが１から８で、６０℃から１９０℃で加温する工程を含むことを特徴とするリポソーム組成物を含む溶液の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ピロロキノリンキノンのフリー体及び／又は塩を含む安定性の高いリポソームを効率的に製造することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】リポソーム粒子径
【図２】透析後のリポソーム粒子径
【図３】糖を添加したリポソームの粒子径
【図４】凍結融解処理した後のリポソーム粒子径
【図５】水素添加大豆リン脂質を用いた場合のリポソーム粒子径
【図６】吸収性試験の結果
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で使用するＰＱＱはフリー体、アルカリ金属塩であればよく特に限定されない。特に入手しやすい、フリー体、ジナトリム体、ジカリウム体が使用しやすい。
【００１５】
本発明に用いるリポソームは、リン脂質又は糖脂質を単独または混合して用いて調製される。生体に含まれるリン脂質の主成分にホスファチジルコリンがあり、レシチンとも呼ばれ、卵黄レシチン、大豆レシチン、精製大豆レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールアミン、カルジオリピン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、およびこれらの混合物等の物質が使用できる。本発明には市販のホスファチジルコリンを用いることができる。例えば、日油製COATSOME NC-21（水素添加大豆リン脂質、ＰＣ含量９０％以上）、日光ケミカルズ製NIKKOL レシノール S-10EX（水素添加大豆リン脂質、ＰＣ含量９５％以上）を用いることができる。
【００１６】
糖脂質としてはジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エルテル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドＧ７、ガングリオシドＧ６、ガングリオシドＧ４、ジガラクトシルセラミド、およびこれらの混合物を用いることができる。
【００１７】
基剤にステロールを添加してもよい。添加量は、リン脂質あるいは糖脂質に対して１／５重量が好ましい量の上限であり、１／１０重量が更に好ましい。ステロールとしては、コレステロールが最も好ましいが、その他のステロールを使用してもよい。
【００１８】
リポソーム組成物は、一般的な定法により製造することが可能であり、例えば、レシチンを有機溶剤、例えば、クロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、フラスコの壁面に付着した脂質のフィルムにＰＱＱ溶液を加えて製造することができる。しかし、この方法では操作が複雑で、毒性のある有機溶媒が残留する危険性があるうえに、そのための分析も必要になるために費用がかかるため、最適とは言えない。
【００１９】
より好ましくはＰＱＱを０．０００１〜２重量％に最終濃度になるように溶解した水溶液に、必要に応じステロール、多価アルコール、ｐＨ調整剤を加え、６０〜１９０℃に加温し、ホモジナイザーにより分散することにより製造できる。ホモジナイザーを使用することで高い生産性で作ることが可能である。ここでＰＱＱの上限濃度は溶解度の限度であり、これより高いと析出しやすく、下限濃度より低いとピロロキノリンキノンの機能が期待できない。
【００２０】
ＰＱＱはアルカリ性では安定性が低いため、ｐＨは８以下が好ましく、より好ましくは２から６である。８よりpHが高い場合はＰＱＱが分解する。酸性にするのは安定性の面では問題がないが、溶解性が下がるために高含有にするのが困難になる。
【００２１】
本発明のリポソームの大きさは０．０５から１００μmであることを特徴とする。リポソームの大きさはその機能性に応じて使い分けることができる。より好ましくはレシチンを使用し、ＰＱＱの重量濃度が０．０１から１重量％であり、pHが２から６であり、大きさが０．０５から１００μmのリポソーム溶液である。ＰＱＱの重量濃度がこれより低い場合は適切な効果を出せず、また、濃度が高い場合は温度を上げても溶解できないため、均一な溶液を作ることができない。また、ｐＨがアルカリ性になるとＰＱＱの分解が生じやすくなる。また、強酸性化ではＰＱＱの溶解度が低く、リポソーム内の水層に維持できる濃度が低くなる。リポソームの大きさは容易に形成できる範囲である。０．０５μmより小さいリポソームの形成は難しく、また、１００μmよりも大きなリポソームも形成困難である。また、大きなリポソームは吸収性等の面では効果が小さいことが予想できる。
【００２２】
高圧乳化機も使用することができる。高圧乳化機としてはプライミクス製 薄膜旋回型高速ホモミキサー（Ｔ．Ｋフィルミックス）、マイクロフルイディックス製 超高圧ホモジナイザー（マイクロフルイダイザー）、エム・テクニック製 内部せん断力型ミキサー（クレアミックス）、吉田機械興業製 湿式メディアレス微粒化装置（ナノマイザー）等を用いることができる。
【００２３】
リポソームを形成した後に、透析、凍結融解、フィルター濾過、凍結乾燥、遠心分離等の処理を施すことでリポソームの精製やサイズのコントロールを行うことができる。
【００２４】
次にこれらの操作について説明する。透析処理はリポソームが大きな分子集合体であるため限外濾過膜を通過できないことを利用する方法で、リポソーム内の水層だけを利用する溶液を作ることができる。ＰＱＱの場合、低分子であるため使用する限外濾過膜も低分子量を通す膜であればよく、一般的な膜であればよい。浸透圧をできるだけ合わせた溶液で透析することが望ましいが、浸透圧が異なる液を使用して積極的にこの効果を利用してサイズを変えることもできる。
【００２５】
凍結融解はリポソーム溶液を冷却して凍らせ、次に溶解することでリポソーム外部にある物質の取り込み、この相変化に伴うサイズの変更を行う。この時にはポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、ショ糖等を加えることでリポソーム脂質の分離を起こさず、操作を行うことができる。フィルター濾過は滅菌やサイズを一定にするために行う。凍結乾燥は粉体化やリポソームへの取り込みのために行う操作で、凍結に耐えうる組成にしなければならない。遠心分離は比重差を利用するもので濃縮等に使用できる。
【００２６】
本発明のリポソーム組成物を調製する際に、本発明の効果を損なわない範囲で他のステロール、ポリオキシエチレンステロールエーテル、多価アルコール、ｐＨ調整剤、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、油剤、保湿剤、水溶性高分子、抗酸化剤、紫外線吸収剤、キレート剤、防腐剤、抗菌剤、着色剤、香料等を配合することができる。また、コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール、アラキドン酸、DHA、レチノール誘導体等のビタミン類やイチョウエキス、カンカエキス等の植物抽出液等を配合したリポソームにすることもできる。
【００２７】
本発明のリポソーム組成物は、リポソームが分散した水溶液、水中油型乳化組成物、油中水型乳化組成物、多重乳化組成物、多層状剤のいずれでもよい。こうして調製される溶液には、更に、薬剤学的に許容されている他の製剤素材を常法により適宜添加混合してもよい。添加しうる製剤素材としては特に限定されず、例えば、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、矯臭剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤などが挙げられる。
【００２８】
本発明による溶液組成物の保存方法としては、特に限定されず、低温保存、密閉容器による嫌気的保存、遮光保存などを用いることができる。こうして調製される本発明の溶液は、冷蔵あるいは室温で保存した際に、析出物なく安定に保存できる。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例及び調製例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および調製例のみに限定されるものではない。大豆レシチンはＪＵＮＳＥＩ、ピロロキノリンキノンジナトリウム(ＰＱＱ―Ｎａ２)は三菱ガス化学、その他はWAKOの試薬を使用した。
【００３０】
実施例１
リポソーム溶液の作製
３g/L ＰＱＱ―Ｎａ２水溶液１００ｇに大豆レシチン３．０g加えた。この時のpＨは３．５であった。約８０℃に加温しながら、NISSEI AM-３ホモジナイザーで３０分７０００回転、室温に下げ１０分処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。均一な溶液で３週間以上安定であった。
【００３１】
ＰＱＱ濃度測定
上記のリポソーム溶液を等量のジメチルスルホキシドを加え、下記の溶離液で希釈してＰＱＱ濃度を測定した。測定は島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、LC-20Aで、カラムはYMC-Pack ODS-TMS(5μm)、150x4.6mm I.D.を４０℃で溶離液100mM CH3COOH/100mM CH3COONH4(30/70, pH5.1)を1.5mL/minで２６０ｎｍ検出した。その結果、ＰＱＱの濃度変化は観測されず、本発明の条件で作ることが出来たＰＱＱ含有リポソームは、濃度低下は起きなかった。
【００３２】
リポソーム粒子径測定
リポソーム粒子径は細胞や生体への吸収性、安定性において重要な因子である。そこで作成した粒子径を測定した。
ＳＥＩＳＨＩＮ  ＬＭＳ−３５０を使用して、水に分散して粒度分布を求めた。この装置では０．１μｍが検出下限である。図１に結果を示す。縦軸は体積換算での割合を示す。体積換算で正規分布５０％  ０．６μｍで粒子径を累積したグラフの百分率での９０％の粒子径であるｘ９０が２．０μｍであった。ＰＱＱの濃度を維持した安定なリポソームを製造することができた。
【００３３】
実施例２
リポソーム溶液の透析
実施例１のリポソーム溶液では、リポソーム内部の水溶液と外側の水溶液にＰＱＱが存在する。そこで内部だけに存在させるために透析を行った。
透析キットSlide-A-Lyzer Dialysis Cassetes (Thermo)に約３ml加え、水で透析をおこなった。3日間室温で行った後、溶液を回収すると６mlに増加していた。溶液は赤から黄色の濁った液に変化した。これをＤＭＳＯでリポソームを壊しＰＱＱ濃度を実施例１と同様に分析した結果、０．２３g/LのＰＱＱになっていた。元の溶液から８５％が透析されていた。残りが内部であると考えられる。さらにリポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。図２に結果を示す。浸透圧差があるために粒子径が大きくなっていた。
【００３４】
実施例３
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇにソルビトール５ｇ、大豆レシチン３．４g加えた。この時のpHは３．５であった。約８０℃に加温しながら、NISSEI AM-３ホモジナイザーで３０分７０００回転、室温に下げ１０分処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。均一な溶液で３週間以上安定であった。リポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。結果を図３に示す。正規分布５０％  ０．６μｍでｘ９０が２．０μｍであった。
【００３５】
実施例４
凍結融解処理
実施例３で得られたリポソーム溶液を−２０℃に冷却して凍結し、それを室温で融解した。この操作を３回繰り返した。リポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。結果を図４に示す。正規分布５０％  ２．８μｍでｘ９０が４．５μｍであった。凍結融解によりリポソームの粒子径が大きくなった。
【００３６】
実施例５
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇにCOATSOME NC-21（水素添加大豆リン脂質）３．０g加えた。この時のpHは３．５であった。約８０℃に加温しながら、NISSEI AM-３ホモジナイザーで３０分７０００回転、室温に下げ１０分処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。リポソームの粒子径を実施例1と同様に測定した。結果を図５に示す。正規分布５０％  3.8μｍでｘ９０が6.8μｍであった。レシチンの種類を変えることで大きさを変えることができた。
【００３７】
実施例６
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇに卵黄レシチン３．０g加えた。この時のpHは３．５であった。約８０℃に加温しながら、NISSEI AM-3ホモジナイザーで３０分７０００回転、室温に下げ１０分処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。リポソーム溶液を作成することができた。
【００３８】
実施例７
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇに大豆レシチン３．０g加え、コエンザイムＱ１０（三菱ガス化学）を０．０６ｇ加えた。この時のpHは３．５であった。約８０℃に加温しながら、NISSEI AM-３ホモジナイザーで３０分７０００回転、室温に下げ１０分処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。リポソーム溶液を作成することができた。
【００３９】
実施例８
実施例３で作製した溶液１０ｍｌをステンレス製バットに加え、−８０℃で凍結した。これを凍結乾燥器で乾燥を１晩行い、粉末を得た。
【００４０】
実施例９  混合試験
日油製ＰＳ５０−ホスファチジルセリン５０重量％含有粉末（澱粉含有）１．２ｇと実施例１の溶液２gを混合した。粉末は均一な分散であった。
【００４１】
比較例１
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇに大豆レシチン３．０g加えた。この時のpHは３．５であった。室温でNISSEI AM-3ホモジナイザーで３０分７０００回転処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。全体に均一にならず沈殿物が存在した。
【００４２】
比較例２
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇに水酸化カリウム溶液を加えpHを１０以上にした。３０℃で一晩放置した後、ＰＱＱは６０%になっており、リポソーム形成前に分解した。
【００４３】
比較例３
水１００ｇに大豆レシチン３．０g加え約８０℃に加温しながら、NISSEI AM-３ホモジナイザーで３０分７０００回転、室温に下げ１０分処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。ＰＱＱを含まないリポソームを作成した。
【００４４】
比較例４
３g／L ＰＱＱ−Ｎａ２水溶液１００ｇに濃塩酸を加えpHを０．８にした。ＰＱＱは析出し、溶液は透明になった。ＰＱＱは溶解していないため、リポソーム形成してもリポソーム内に取り込めない。
【００４５】
吸収性試験
ＰＱＱは培養動物細胞に対して非常に高濃度にすると細胞の増殖を抑える。これを利用してリポソーム化により動物細胞を使用して細胞吸収がどのように変化するかを試験した。
実施例１０
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-DHFR)をα‐MEM+10%牛胎児血清の培地で５％CO2, ３７℃で培養してした。イワキ製９６穴プレート使用し、１個の穴に６５００個の細胞になるように１００μlの培地とともに加え、一晩培養した。培養液を抜き、所定の試験濃度の培地を加えた。1日培養後、培地を入れ替え同仁化学  WSTアッセイキットを使用して1時間反応させ、４５０nmの吸光度を測定した。この時の吸光度は細胞数に比例する。
【００４６】
試験サンプルは、ＰＱＱジナトリウム、大豆レシチン-ＰＱＱリポソーム(実施例１)と、大豆レシチンリポソーム（比較例３）を用いた。これらのサンプルを培地で希釈して試験した。各サンプル２回行い平均化した。
試験濃度は500, 250, 125, 62, 31, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 0μMで行った。
全細胞数が無添加と比較して１０％少なくなる添加量はＰＱＱジナトリウムでは５００μM, 実施例１のリポソーム溶液では３１μMであった。比較例３のリポソーム単独の場合は、細胞濃度の急激な低下はなかった。リポソーム化により１６倍吸収性が上がっていると考えられる。図６にＰＱＱを添加しない時の細胞濃度の平均を１００とした各条件での濃度をグラフに示す。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の溶液は、医療用、化粧用、食品用、園芸用、酪農用など広い範囲で使用できる。より具体的な形態としては、注射剤、輸液、液剤、点眼剤、内服用液剤、ローション剤、ヘヤートニック、化粧用乳液、スプレー液、エアロゾル、ドリンク液、液体肥料、保存用溶液などが挙げられる。
【図１】
2011219397.tif 000006
【図２】
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【図３】
2011219397.tif 000008
【図４】
2011219397.tif 000009
【図５】
2011219397.tif 000010
【図６】
2011219397.tif 000011