(57)【要約】【課題】所定成分の分取効率の向上が容易にできるクロマトグラフィーによる分取方法および所定成分の製造方法を提供する。【解決手段】試料に含まれている複数の成分（5'-IMP・5'-GMP・5'-XMP）の中から所定成分（5'-GMP）をクロマトグラフィーにて分取する際に、溶離液のｐＨを調整して、所定成分と所定成分以外の成分（5'-IMP）とのピークのリテンションタイムの順序を逆転させることにより、所定成分の分離精製度を向上でき、所定成分の分取効率を容易に向上できる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の成分の中から所定成分をクロマトグラフィーにて分取する分取方法であって、
前記所定成分の分離精製度が向上するように、所定条件で前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の前記所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの前記成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させて前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取する
ことを特徴とする分取方法。
【請求項２】
複数の成分の中から溶離液を用いたクロマトグラフィーにて所定成分を分取する分取方法であって、
所定条件で前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の前記所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの前記成分のピークのリテンションタイムの順序が逆転するように溶離液を調整した状態で、前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取する
ことを特徴とする分取方法。
【請求項３】
クロマトグラフィーは、複数の成分に溶離液を送って分画し、
前記溶離液の少なくともｐＨを変化させて、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムとの順序を逆転させる
ことを特徴とする請求項１または２記載の分取方法。
【請求項４】
クロマトグラフィーは、複数の成分に溶離液を送って分画し、
前記溶離液のｐＨのみを変化させて、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外の成分のピークのリテンションタイムとの順序を逆転させる
ことを特徴とする請求項１または２記載の分取方法。
【請求項５】
複数の成分の中から所定成分をクロマトグラフィーにて分離精製する成分の製造方法であって、
前記所定成分の分離精製度が向上するように、所定条件で前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の前記所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの前記成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させて前記所定成分をクロマトグラフィーにて分離精製する
ことを特徴とする成分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の成分の中から、例えば呈味物質等の所定成分をクロマトグラフィーにて分取する分取方法および、その所定成分の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の呈味物質等の所定成分をクロマトグラフィーにて分取する分取方法としては、例えば、下記特許文献１および特許文献２に記載のように、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：ＨＰＬＣ）を行う際の、試料中の分取目的である所定成分のピークのリテンションタイムを長くして、この所定成分の分離度（Resolution：Ｒｓ）を向上させる濃度勾配制御を用いたグラジエント溶離法や、所定成分のピークと不純物のピークとの間隔を広くするために分取を繰り返すリサイクルクロマトグラフィーなどといった分取方法が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３２７８４７号公報
【特許文献２】特開２００３−１５６４８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記特許文献１および特許文献２にかかる従来技術によれば、所定成分が含まれている試料中に混在している他の成分のピークについても所定成分と同時に同じ方向に移動してしまい、不要な混合物の除去が容易ではないため、所定成分の分取効率の向上が容易ではない。
【０００５】
そこで本発明は、従来技術における上記問題を解決し、所定成分の分取効率の向上が容易にできる新規な分取方法および、その所定成分の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この課題を解決するため、請求項１にかかる本発明は、複数の成分の中から所定成分をクロマトグラフィーにて分取する分取方法であって、前記所定成分の分離精製度が向上するように、所定条件で前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の前記所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの前記成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させて前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取することを特徴とする分取方法である。
【０００７】
請求項２は、複数の成分の中から溶離液を用いたクロマトグラフィーにて所定成分を分取する分取方法であって、所定条件で前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の前記所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの前記成分のピークのリテンションタイムの順序が逆転するように溶離液を調整した状態で、前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取することを特徴とする分取方法である。
【０００８】
請求項３は、請求項１または２の分取方法において、クロマトグラフィーは、複数の成分に溶離液を送って分画し、前記溶離液の少なくともｐＨを変化させて、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムとの順序を逆転させることを特徴とする。
【０００９】
請求項４は、請求項１または２の分取方法において、クロマトグラフィーは、複数の成分に溶離液を送って分画し、前記溶離液のｐＨのみを変化させて、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外の成分のピークのリテンションタイムとの順序を逆転させることを特徴とする。
【００１０】
請求項５は、複数の成分の中から所定成分をクロマトグラフィーにて分離精製する成分の製造方法であって、前記所定成分の分離精製度が向上するように、所定条件で前記所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の前記所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの前記成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させて前記所定成分をクロマトグラフィーにて分離精製することを特徴とする成分の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させて所定成分をクロマトグラフィーにて分取することにより、所定成分の分離精製度を向上でき、この所定成分の分取効率を容易に向上できる。
【００１２】
さらに、所定条件で所定成分をクロマトグラフィーにて分取した場合の所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムの順序が逆転するように溶離液を調整した状態で、所定成分をクロマトグラフィーにて分取することによって、所定成分の分離精製度を容易に向上でき、この所定成分の分取効率を容易に向上できる。
【００１３】
また、複数の成分に送られて分画される溶離液の少なくともｐＨを変化させることによって、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムとの順序を逆転できるため、これら所定成分のピークとこの所定成分以外のいずれかの成分のピークとのリテンションタイムの順序の逆転を容易にできる。
【００１４】
さらに、複数の成分に送られて分画される溶離液のｐＨのみを変化させるだけで、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムとの順序を逆転できるため、これら所定成分のピークとこの所定成分以外のいずれかの成分のピークとのリテンションタイムの順序の逆転をより容易にでき、所定成分の分取に用いる装置を簡略化できるとともに、所定成分を分取する際のランニングコストを少なくできる。
【００１５】
そして、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させて所定成分をクロマトグラフィーにて分離精製することにより、所定成分の分離精製度を向上でき、この所定成分の分取効率を容易に向上できるため、この所定成分を効率良く製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施の形態に係る分取方法のための分取装置を示す概略構成図である。
【図２】本発明の実施例１に係る呈味ヌクレオチドのクロマトグラム（ｐＨ２．２）である。
【図３】上記実施例１に係る呈味ヌクレオチドのクロマトグラム（ｐＨ２．７）である。
【図４】上記実施例１に係る呈味ヌクレオチドのクロマトグラム（ｐＨ３．２）である。
【図５】本発明の実施例２に係る天然調味料のクロマトグラム（ｐＨ２．２）である。
【図６】上記実施例２に係る天然調味料のクロマトグラム（ｐＨ３．２）である。
【図７】上記実施例２に係る天然調味料の分取部のクロマトグラム（Ｒｔ＝４０．１ｍｉｎ）である。
【図８】上記実施例２に係る天然調味料の分取部のクロマトグラム（Ｒｔ＝１８．９ｍｉｎ）である。
【図９】本発明の実施例３に係る家庭用調味料のクロマトグラム（ｐＨ２．７）である。
【図１０】上記実施例３に係る家庭用調味料のクロマトグラム（ｐＨ３．２）である。
【図１１】上記実施例３に係る家庭用調味料の分取部のクロマトグラム（Ｒｔ＝２４．４ｍｉｎ）である。
【図１２】上記実施例３に係る家庭用調味料の分取部のクロマトグラム（Ｒｔ＝３７．８ｍｉｎ）である。
【図１３】本発明の実施例４に係る酵母エキスのクロマトグラム（ｐＨ４．０）である。
【図１４】上記実施例４に係る酵母エキスのクロマトグラム（ｐＨ７．０）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の一実施の形態に係る分取方法について図１を参照して説明する。
【００１８】
この分取方法は、クロマトグラフィーを用いた成分の製造方法である分離精製方法であって、同一のカラム１で溶離液Ａの性質（例えばｐＨ：水素イオン濃度）を変化させることによって、該溶離液Ａに加えられる試料Ｂ中の複数の成分（例えば、核酸系呈味物質：5'-IMP、5'-GMP、5'-XMP）のうちの少なくとも２つの成分（例えば、5'-IMP、5'-GMP）のピークのリテンションタイム（Retension time：Ｒｔ）の順序を逆転させるなどの調整をし、目的成分である所定成分（例えば、5'-GMP）の分離精製度を向上させるものである。ここで、リテンションタイムとは、少なくとも所定成分が含まれている試料Ｂをカラム１へ注入した時点から、このカラム１内で分離された該所定成分がカラム１を通過するピークを示す時点までの保持時間をいう。
【００１９】
次に、上記分取方法を用いるための分取装置としてのクロマトグラフ１０は、軸方向を上下方向に向けて設置された円筒状のカラム１を備えており、このカラム１の一端である上流側には、吸着力が強い物質や不可逆的に結合する物質などによるカラム１の劣化や微粒子の詰まりを防止するためのカラムガード２が接続されている。このカラムガード２の上流にポンプ３が接続されており、このポンプ３の上流側には、試料Ｂが充填された試料タンク４と、溶離液Ａが充填された溶離液タンク５と、該溶離液Ａの性質を変化させるための調整液Ｃ（例えば、ｐＨ調整液など）が充填された調整液タンク６とのそれぞれが接続されている。
【００２０】
調整液タンク６と溶離液タンク５との間に三方バルブである調整用バルブ７が取り付けられており、この調整用バルブ７によって、溶離液Ａに対する調整液Ｃの混合比・流量・流速等が調整できるように構成されている。また、この三方バルブ７と試料タンク４との間にも他の三方バルブである試料用バルブ８が取り付けられており、この試料用バルブ８によって、調整液Ｃにて調整された溶離液Ａに対する試料Ｂの混合比・流量・流速等が調整できるように構成されている。
【００２１】
一方、カラム１の他端である下流側には、例えば紫外線検出器などの検出器９が接続され、カラム１を通過した成分を検出できるように構成されている。ここで、この検出器９には、該検出器９にて検出されるグラフ、すなわちクロマトグラムＤが出力可能なレコーダー１１が取り付けられている。さらに、検出器９の下流側には、該検出器９にて検出したクロマトグラムＤに基づいて、カラム１から分取した成分を分離するためのフラクションコレクター１２が接続されている。このフラクションコレクター１２には、分取した成分（例えば、5'-GMP）を供給して貯留させるための複数、例えば３つの分取用タンク１３と、分取した成分が取り除かれた廃液Ｅが供給されて貯留される廃液タンク１４とが接続されている。
【００２２】
具体的には、溶離液タンク５と調整液タンク６との間の調整用バルブ７を調整して、溶離液Ａへの調整液Ｃの混合比・流量等を調整するとともに、この調整用バルブ７と試料タンク４との間の試料用バルブ８を調整して溶離液Ａおよび調整液Ｃに対する試料Ｂの混合比・流量等を調整し、該試料Ｂ中の各成分を溶離液Ａに分画させてからポンプ３を駆動させて、これら調整液Ｃおよび試料Ｂが混合された溶離液Ｃをカラム１へ供給して充填させていく。そして、このカラム１内においては、例えば高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーが行われる。
【００２３】
このとき、試料Ｂに含まれている各成分は、これら各成分のリテンションタイムが短い順にカラム１を通過していき、検出器９と送られてリアルタイムにクロマトグラムＤがレコーダー１１に記録されていく。さらに、検出器９を通過した各成分は、フラクションコネクター１２へと送られ、このフラクションコネクター１２による制御によって各成分毎に分けられていずれかの分取用タンク１３へ送られて貯留されて分取される。また、各成分が分取されて分取用タンク１３へ送られる前後および間の廃液Ｅは、フラクションコレクター１２による制御によって廃液タンク１４へと送られて貯留される。
【００２４】
このとき、カラム１内での少なくとも２つの成分（例えば、5'-IMP、5'-GMP）のピークのリテンションタイムの順序が逆転するように調整させる。具体的には、調整用バルブ７を再度調整して、溶離液Ａに対する調整液Ｂの混合比・流量等を調整することによって、溶離液Ａの性質（例えばｐＨ）を変化させるとともに、試料用バルブ８を再度調整して溶離液Ａおよび調整液Ｃに対する試料Ｂの混合比・流量等を調整してからポンプ３を駆動させて、これら調整液Ａおよび試料Ｂが混合された溶離液Ａをカラム１へ供給して充填させていく。
【００２５】
このとき、試料Ｂに含まれている各成分は、これら各成分のリテンションタイムが短い順にカラム１を通過していくが、溶離液Ａの性質を変化させたことによって、少なくとも２つの成分（例えば、5'-IMP、5'-GMP）のピークのリテンションタイムの順序が調整されて逆転した順にカラム１を通過して検出器９へと送られていく。その後、クロマトグラムＤがレコーダー１１に記録されてフラクションコネクター１２へと送られた各成分は、このフラクションコネクター１２による制御によっていずれかの分取用タンクへ１３と分けられて分取される。
【００２６】
すなわち、予め定められた初期条件（所定条件）において、所定成分（例えば、5'-GMP）をクロマトグラフィーして分取した場合に、分取目的以外の不要物が多く含まれている等の理由によって、分離精製度が良くない場合には、前述のように、同一のカラム１で溶離液ＡのｐＨを変化させて、所定成分（例えば、5'-GMP）のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分（例えば、5'-IMP）のピークのリテンションタイムとの順序を逆転させて調整することによって、主としてこれら所定成分（例えば、5'-GMP）と、この所定成分以外のいずれかの成分（例えば、5'-IMP）とのピークのリテンションタイムの順序が逆転し、これら所定成分（例えば、5'-GMP）およびこの所定成分以外のいずれかの成分（例えば、5'-IMP）以外の不純物のピークのリテンションタイムも移動するため、この状態で所定成分をクロマトグラフィーにて分取することによって、他の成分（例えば、5'-IMP）と隣接するピークを有する所定成分（例えば、5'-GMP）のピークの分離精製度を向上できる。したがって、この所定成分の分取効率を容易に向上できるから、この所定成分を試料Ｂ中からより効率よく製造できる。
【００２７】
特に、溶離液ＡのｐＨのみを変化させるだけで、所定成分のピークのリテンションタイムと、この所定成分以外のいずれかの成分のピークのリテンションタイムとの順序を調整でき逆転できるため、これら所定成分のピークと他の成分のピークとのリテンションタイムの順序の調整を容易にできる。よって、所定成分の分取に用いられる、例えばグラジエント溶離法やリサイクルクロマトグラフィーなどの他の分離モードや、リサイクルクロマトグラムなどの他の装置を使用せずに同一のカラム１で所定成分を分取できるから、クロマトグラフ１０を簡略化でき、所定成分を分取する際に必要なランニングコストを少なくできる。
【００２８】
なお、上記一実施の形態の分取方法では、溶離液Ａの性質を変化させる方法として、溶離液ＡのｐＨのみを変化させているが、溶離液ＡのｐＨを変化させる他に、アルコール濃度（例えば、メタノール濃度）を変化させても、試料Ｂ中の隣接するピークを有する成分間のリテンションタイムの順序を調整して逆転することができる。
【００２９】
また、上記分取方法では、複雑な分取行程を使用せずに、１本のカラム１を用いたｐＨ調整のみで効率良く所定成分を分取できるため、核酸系呈味物質（5'-IMP、5'-GMP、5'-XMP）の他、酵母エキスなどの他の天然物の有効成分の工業的精製にも用いることが可能である。
【実施例１】
【００３０】
上記分取方法の実施例１として、イオン交換クロマトグラフィーによる核酸系呈味物質の分取方法の実験例を説明する。
【００３１】
（実験方法）
まず、試料に添加する成分として、旨味調味料の主成分である呈味ヌクレオチド5'-IMP（Inosinic acid：イノシン酸）、5'-GMP（Guanylic acid：グアニル酸）、および5'-XMP（Xanthylic acid：キサンチル酸）の和光純薬工業株式会社製の特級（純品）の試薬を用いた。
【００３２】
溶離液として、０．０５ｍｏｌリン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４：ｐＨ２．２〜ｐＨ３．２）５％メタノール（ＣＨ３ＯＨ）を用い、調整液として、リン酸（Ｈ２ＰＯ４）と水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶離液のｐＨ調整を行った。
【００３３】
また、クロマトグラフとして、株式会社島津製作所製のＨＰＬＣ装置（型番：ＳＣＬ−１０Ａ）を用い、検出器として、日本分光株式会社製の波長２６０ｎｍの紫外線（ＵＶ）を用いた紫外線検出器（型番：ＵＶ−２０７５）を用い、レコーダーとして、株式会社日立製作所製のデータ処理機（型番：Ｄ２５００、Ｃ−Ｒ７Ａｐｌｕｓ付属）を用いた。
【００３４】
さらに、カラムとして、東ソー株式会社製の内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍの弱陰イオン交換カラム（型番：ＤＥＡＥ−５ＳＷ）を用いた。ここで、弱陰イオン交換カラムは、シリカゲルを支持体（担体）としイオン交換体であるＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル：Diethylaminoethyl）を弱陰イオン交換体官能基として導入したものであり、イオン交換性にｐＨの変化が顕著に現れるカラムである。
【００３５】
そして、5'-IMP、5'-GMPおよび5'-XMPの標準試薬濃度を４ｍｍｏｌとした試料２．５ｍｌに溶離液２．５ｍｌを加えて良く混合させてから、ザルトリウス社（ドイツ）製の孔径０．４５μｍのメンブレンフィルター（品名：ザルトフロルＬＧ）（図示せず）を通したものをカラムへ供給した。このときの液体クロマトグラフィーの条件を表１に示す。さらに、このカラムを通過させた5'-IMP、5'-GMPおよび5'-XMPについては、フラクションコレクターを用いて成分毎に分離した。
【表１】
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【００３６】
まず、初期条件（所定条件）として、調整液を加えてｐＨ２．７に調整した溶離液を用いて実験した。この結果、図３に示すクロマトグラムとなった。図３に示すように、各成分のピークのリテンションタイムが大きく、5'-IMP、5'-GMPおよび5'-XMPのそれぞれのピークのリテンションタイムがはっきりと分離した状態となっている。
【００３７】
ここで、これら5'-IMP、5'-GMPおよび5'-XMPは、核酸の旨味成分であって、プリン塩基を骨格としており、その分子構造の５´の位置にのみ相違を有するにすぎない。具体的に、これら5'-IMP、5'-GMPおよび5'-XMPは、５´の位置に、5'-GMPにおいてはアミノ基（ＮＨ２）、5'-IMPにおいては水素基（Ｈ）、5'-XMPにおいては水酸基（ＯＨ）が結合しており、その他のリン酸基については同じ構造である。
【００３８】
そこで、これら３種の基(Ｈ，ＮＨ２，ＯＨ)を識別して、5'-IMP、5'-GMPおよび5'-XMPの３成分のピークのリテンションタイムの順序を調整して逆転させることが重要であると考えられた。すなわち、リテンションタイムを長くするだけでは、各成分の混濁物も同様に、これら成分とともに移動するに過ぎないからである。そして、溶離液のｐＨを変化させることによって、カラムのイオン交換性に相違が生じ、各成分のピークのリテンションタイムの順序を調整して逆転させることができると考えられた。また、ピークのリテンションタイムの順序を調整して逆転させることによって、混濁物についても異なるイオン交換性を有することとなり、これら混濁物のピークのリテンションタイムも同様に変化すると考えられるからである。
【００３９】
そこで、調整液として薄い水酸化ナトリウムを加えてｐＨ３．２に上げた溶離液を用いて実験した。なお、この溶離液については、ｐＨ２．７の場合の溶離液と同様に塩濃度を５０ｍｍｏｌとした。そして、同一のカラムでクロマトグラフィーしたところ、図４に示すクロマトグラムとなった。図４に示すように、5'-IMPのピークのリテンションタイムの順序は変化していないが、5'-GMPと5'-IMPとの間のピークのリテンションタイムの順序が調整されて逆転している。この理由としては、溶離液の水酸化物イオン（ＯＨ−）の濃度が上昇して、5'-XMPの水酸化物イオン（ＯＨ−）によるイオン交換性が向上して、この5'-XMPのピークのリテンションタイムが大きくなったものと考えられる。
【００４０】
さらに、図３に示すクロマトグラムにおいては、5'-IMPの分離精製度が増加せず同程度であるが、5'-GMPおよび5'-XMPのピークにおける分離精製度が向上すると考えられる。
【００４１】
そこで、調整液としてリン酸溶液を加えてｐＨ２．２に下げた溶離液を用い、同一のカラムでクロマトグラフィーしたところ、図２に示すクロマトグラムとなった。図２に示すように、5'-XMPのピークのリテンションタイムの順序は変化していないが、5'-GMPと5'-IMPとのピークのリテンションタイムの順序が調整されて逆転している。この理由としては、溶離液中の水素イオン（Ｈ＋）の濃度が上昇し、5'-IMPの水素イオンとのイオン交換性が増加して、この5'-IMPのピークのリテンションタイムが大きくなったものと考えられる。このとき、5'-GMPのピークのリテンションタイムについては、5'-IMPの場合とは逆に、リテンションタイムが短くなっている。
【実施例２】
【００４２】
分離精製度の向上を確認するための実施例として、天然調味料（きのこエキス）を用いた実験例を説明する。
【００４３】
（実験方法）
上記実施例１と同様の実験条件（ただし、ｐＨ２．２，イオン強度（Ionis strength）５０ｍｍＭ）下で、白平茸（Pleurotus pulmonaris）を天然調味料として用い、この白平茸エキスの分離精製を行った。
【００４４】
（試料の調製）
まず、日本産の白平茸１０ｇを５０ｍｌの温水に入れてエキスを抽出させてから、このエキスを抽出した溶液をアドバンテック東洋株式会社製のろ紙（Ｎｏ．６：JIS P 3801 ６種）にてろ過して試料液とした。次いで、この試料液２．５ｍｌに溶離液２．５ｍｌを加えて良く混合させた後、ザルトリウス社（ドイツ）製の孔径０．４５μｍのメンブレンフィルター（品名：ザルトフロルＬＧ）（図示せず）を通して白平茸エキス（試料）とした。この白平茸エキスは、ヌクレオチドである5'-GMPを多く含んでいることから旨味があり、この5'-GMPとともに他のヌクレオチドが混在している。
【００４５】
本実施例２では、白平茸エキス中の5'-GMPを主目的の分取物とし、上記実施例１で用いた呈味ヌクレオチドと同じ成分のピークのリテンションタイムについてｐＨを変化させて逆転させることとした。
【００４６】
まず、初期条件（所定条件）として、溶離液をｐＨ２．２として上記実施例１と同様にクロマトグラフィーした結果、図５に示すクロマトグラムとなった。図５に示すように、Ｒｔ＝１５．４ｍｉｎおよびＲｔ＝１６．０ｍｉｎにおいて、２つのピークが重なって現われている。そして、これらピークについて、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークのリテンションタイムで確認したところ、Ｒｔ＝１５．４のピークは5'-GMPであり、Ｒｔ＝１６．０のピークは不純物であった。
【００４７】
次いで、上記ｐＨ２．２の場合のＲｔ＝１５．０ｍｉｎからＲｔ＝１６．０ｍｉｎまでの区間を分取し、この分取した分取部について、上記と同じカラムを用い、調整液として水酸化ナトリウムを加えてｐＨ３．２にした溶離液を用いてクロマトグラフィーした。なお、他の条件については、図５に示すクロマトグラムの場合と同様にした。この結果、図６に示すクロマトグラムとなった。
【００４８】
ここで、図６中のＲｔ＝４２．１ｍｉｎおよびＲｔ＝１８．９ｍｉｎのピークの成分を判定する方法として、弱陰イオン交換クロマトグラフィーとは異なる分離原理の逆相分配クロマトグラフィー（ＯＤＳカラム）を用いた。このときの逆相分配クロマトグラフィーの条件を表２に示す。ここで、ＯＤＳカラムは、オクタデシルシリル基（OctaDecylSilyl：ODS基）をシリカゲル担体に化学結合させた充填剤が詰められたカラムであって、ナカライテスク株式会社製のカラム（製品名：Cosmosil（登録商標）Ｃ１８−ＰＡＱ）を用いた。
【表２】
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【００４９】
この結果、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークのリテンションタイムと比べて確認したところ、図７に示すように、図６中のＲｔ＝４２．１ｍｉｎについては、図５中のＲｔ＝１５．４ｍｉｎに相当していることから、5'-GMPであることが分かった。また、図８に示すように、図６中のＲｔ＝１８．９ｍｉｎについては、図５中のＲｔ＝１６．０ｍｉｎに相当していることから不純物であることが分かった。
【００５０】
以上のことから、上記弱陰イオン交換カラムを用いて5'-ヌクレオチドを分離精製する際に、ｐＨをシフトアップ、すなわちｐＨ２．２からｐＨ３．２へ変化させることによって、5'-GMPと何らかの不純物とを、２つの分離精製度の高いピークとして切り離すことができた。
【００５１】
さらに、図６に示すクロマトグラムでは、5'-GMPのピークのリテンションタイムと、不純物のピークのリテンションタイムとが逆転している。また、図７および図８に示すクロマトグラムでは、２つのシャープなピークが現れず、5'-GMP（図６中のＲｔ＝４２．１ｍｉｎ）のピークに比べて混合物（図６中のＲｔ＝１８．９ｍｉｎ）のピークが少なくなっているため、これら5'-GMPと混合物（不純物）とを分離できないことが分かる。
【００５２】
したがって、弱陰イオン交換カラムにて溶離液のｐＨを２．２から３．２まで変化させることによって5'-GMPの精製度を向上できることが分かった。
【００５３】
また、上記実施例１の標準ヌクレオチド成分についての図２ないし図４で得られたリテンションタイムがｐＨのシフトアップにて逆転されることに加え、本実施例２では天然調味料（白平茸）について、ｐＨを変化させて5'-GMPのリテンションタイムを逆転させることによって、ｐＨ２．２の溶離液での分取ピークよりもｐＨ３．２の溶離液で再度クロマトグラフィーした場合の分取ピークでの精製度が明らかに向上していることから、5'-GMPの分離精製度を向上できることが分かった。
【実施例３】
【００５４】
分離精製度の向上を確認するための実施例として、家庭用調味料を用いた実施例３について説明する。
【００５５】
（実験方法）
上記実施例１と同様の実験条件（ただし、ｐＨ２．７）下で、一般に家庭で使用されている家庭用調味料中の5'-IMPと5'-XMPとの分離精製を行った。
【００５６】
（試料の調製）
まず、ヤマキ株式会社製の家庭用調味料（商品名：めんつゆ）を、１０倍〜２０倍に希釈してからアドバンテック東洋株式会社製のろ紙（Ｎｏ．６：JIS P 3801 ６種）にてろ過して試料液とした。次いで、この試料液２．５ｍｌに溶離液２．５ｍｌを加えて良く混合させた後、ザルトリウス社（ドイツ）製の孔径０．４５μｍのメンブレンフィルター（品名：ザルトフロルＬＧ）（図示せず）を通したものを試料とした。
【００５７】
そして、初期条件（所定条件）として、溶離液をｐＨ２．７とし上記実施例１と同様にクロマトグラフィーした結果、図９に示すクトマログラムとなった。図９に示すように、Ｒｔ＝１７．５８ｍｉｎと１９．８６ｍｉｎの２つのピークは、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークのリテンションタイムと比べて確認したところ、5'-IMPおよび5'-XMPのリテンションタイム（Ｒｔ）と同じであることが分かった。そして、これら２つの大きなピークの付近にわずかな他のピークが混在している。
【００５８】
そこで、この混在しているピークを分離することを目的として、図９に示すクロマトグラム上のＲｔ＝１６．０ｍｉｎからＲｔ＝２０．０ｍｉｎまでを分取した分取部について、溶離液をｐＨ２．７から０．５シフトアップさせてｐＨ３．２としてクロマトグラフィーした。この結果、図１０に示すクロマトグラムとなった。図１０に示すように、図９におけるＲｔ＝１６．０ｍｉｎ〜２０．０ｍｉｎ中の２つの大きなピークがＲｔ＝２４．４ｍｉｎとＲｔ＝３７．８ｍｉｎとなり、はっきりと明確に分離できていることが分かる。溶離液をｐＨ３．２とした条件においては、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークと比べて確認したところ、Ｒｔ＝２４．４ｍｉｎでのピークが5'-IMPであり、Ｒｔ＝３７．８ｍｍのピークが5'-XMPであった。
【００５９】
次に、これらＲｔ＝２４．４ｍｉｎおよびＲｔ＝３７．８ｍｉｎのピークの精製度を確認することを目的とし、図１０に示すクロマトグラム中のＲｔ＝２４．４ｍｉｎおよびＲｔ＝３７．８ｍｉｎの部分の成分を分取した。そして、これら２つの分取したピークの成分を判定する方法として、上記実施例２にて用いた逆相分配クロマトグラフィー（ＯＤＳカラム）にて分析した。
【００６０】
この結果、Ｒｔ＝２４．４のピークについては、図１１に示すクロマトグラムとなった。図１１に示すように、Ｒｔ＝６．６およびＲｔ＝７．４において２つのピークが生じていることが分かる。これらピークは、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークと比べて確認したところ、Ｒｔ＝６．６ｍｉｎの部分が5'-IMPであり、Ｒｔ＝７．４ｍｉｎの部分が5'-IMPでない混在ピークであった。
【００６１】
以上から、弱陰イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィーにおいて、ｐＨを２．７から３．２に０．５シフトアップさせて溶離液の性質を変化させたとしても、5'-IMP中の異なる成分を分離できない。すなわち、上記実施例１での呈味ヌクレオチド（5'-GMP，5'-IMP，5'-XMP）の純品試薬を用いて溶離液をｐＨ２．７からｐＨ３．２へ変化させた図３および図４に示すクロマトグラムにおいては、5'-IMPは共に最初に溶出される成分であって、他のヌクレオチドである5'-GMPと5'-XMPとのピークのリテンションタイムの順序が逆転する現象は生じていない。したがって、類似するヌクレオチド成分への精製度の向上には至っていない。
【００６２】
しかしながら、ピークのリテンションタイムの順序が逆転する現象が生じている5'-XMPでは、Ｒｔ＝３７．８ｍｉｎのピークについて逆相分配クロマトグラフィーした図１２に示すクロマトグラムのように、5'-XMPとは異なる他の大きなピークが見当たらないことから、溶離液のｐＨの変化によって5'-XMPがより効率良く分離精製されていることが分かる。この結果、明らかに5'-XMPの分離精製において溶離液のｐＨの変化が貢献していることが分かる。Ｈ２．７の溶離液での5'-XMPの分取ピークに比べ、ｐＨ３．２の溶離液で再度クトマログラフィーした場合の5'-XMPの分取ピークでの分離精製度が明らかに向上していることが分かった。
【実施例４】
【００６３】
分離精製度の向上を確認するための実施例として、様々な食品加工メーカーにおいて調味料として使用されている酵母エキスを用いた実験例を説明する。
【００６４】
（試料の調製）
まず、酵母エキスとして、麒麟麦酒株式会社製の酵母エキス（商品名：ＦＲ）を用いた。この酵母エキスには、呈味ヌクレオチドとして5'-UMP（Uridylic acid ：ウリジル酸）、5'-IMP、5'-GMP、および5'-XMPが含まれているものの、旨味閾値が比較的低い5'-IMPおよび5'-GMPの含有量を基準として製造されているが、旨味閾値が比較的高い5'-UMPが多く含有されている。
【００６５】
そこで、本実施例では、上記酵母エキスからの5'-GMPおよび5'-XMPの分離精製度を向上させることを目的とし、これら成分のピークのリテンションタイムの順序を逆転させることを試みた。
【００６６】
まず、初期条件（所定条件）として、溶離液をｐＨ４．０とし、表３に示す条件下でクロマトグラフィーを行ったところ、図１３に示すクロマトグラムとなった。このとき、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークのリテンションタイムと比べて確認したところ、図１３に示すように、ピークのリテンションタイムの順序が、5'-UMP、5'-IMP、5'-XMP、および5'-GMPとなった。
【００６７】
次いで、この表３に示す条件において、5'-GMPのアミノ基の陽イオン性を上げるために溶離液のｐＨを７．０に上げるとともに、5'-XMPの疎水性を下げるために溶離液中のメタノール（ＣＨ３ＯＨ）濃度を３０％上げた表４に示す条件下でクロマトグラフィーしたところ、図１４に示すクロマトグラムとなった。この場合は、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークのリテンションタイムと比べて確認したところ、図１４に示すように、ピークのリテンションタイムの順序が、5'-UMP、5'-IMP、5'-GMP、および5'-XMPとなった。
【表３】
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【表４】
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【００６８】
すなわち、上記実施例１で用いた純品の試薬を同様の条件でクロマトグラフィーした場合のピークのリテンションタイムと比べて確認したところ、溶離液をｐＨ４．０とした表３に示す条件下では、図１３に示すように、5'-XMPのピークがＲｔ＝１４．７０ｍｉｎで5'-GMPのピークがＲｔ＝１６．４７ｍｉｎであった。
【００６９】
これに対し、溶離液をｐＨ７．０としメタノール濃度を３０％上げた表４に示す条件下では、図１４に示すように、5'-GMPのピークがＲｔ＝１９．２０ｍｉｎとなっており、この表４に示す条件下での5'-XMPのピークがＲｔ＝２５．５５ｍｉｎであることから、この5'-XMPのピークのリテンションタイムが遅れていることが分かる。
【００７０】
さらに、表３に示す条件下において、5'-XMPは、Ｒｔ＝１４．７０ｍｉｎであることから、5'-GMP（Ｒｔ＝１６．４７ｍｉｎ）よりリテンションタイムが短いが、表４に示す条件下において、5'-XMP（Ｒｔ＝２５．５５ｍｉｎ）は、5'-GMP（Ｒｔ＝１９．２０ｍｉｎ）よりリテンションタイムが長くなっている。
【００７１】
この結果、酵素エキスに含まれている旨味成分である5'-UMPおよび5'-IMPのピークのリテンションタイムの順序を維持しつつ、5'-GMPおよび5'-XMPのピークのリテンションタイムの順序を調整して逆転することによって、酵母エキスからの5'-GMPおよび5'-XMPの分離精製度を向上できることが分かった。
【００７２】
なお、上記実施例２および４で得られた陰イオン交換クロマトグラフィーのｐＨ調整による分離および精製の効率化について、天然調味料（白平茸、酵母エキス）中のヌクレオチドの分離精製を取り上げて説明したが、天然調味料以外の他の天然物についても、その天然物中の有効成分を分離精製する際に有効である。
【符号の説明】
【００７３】
１  カラム
２  カラムガード
３  ポンプ
４  試料タンク
５  溶離液タンク
６  調整液タンク
７  調整用バルブ
８  試料用バルブ
９  検出器
１０  クロマトグラフ
１１  レコーダー
１２  フラクションコレクター
１３  分取用タンク
１４  廃液タンク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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