(57)【要約】      （修正有）【課題】酸化ストレスを低減する剤の提供。【解決手段】一般式(I)2011032172.tif 000007[式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、アラルキル基、アラアリール基、フェニル基または水素原子を表す]で示されるピロロキノリンキノンまたはそのエステル若しくは塩を有効成分として含有する酸化ストレス低減剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2011032172.tif 000006
（式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、アラルキル基、アラアリール基、フェニル基または水素原子を表す。）で表される化合物、またはその塩を有効成分として含有する酸化ストレス低減剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノンもしくはそのエステル、またはその塩を有効成分として含有する酸化ストレス低減剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、酸素が化学的に活性化された化学種で、一般に非常に不安定で強い酸化力を示す。呼吸によって体内に取り込まれた酸素は様々な代謝経路を経て、エネルギー獲得に大きな役割を果たすが、この過程でより酸化力の強い活性酸素が生成される。活性酸素には細菌を分解するなどの有益な働きを示すことがあるものの、余剰となった活性酸素は、脂質、タンパク質、酵素あるいはDNAといった体の重要な構成成分を酸化損傷することが知られている。生体で発生した活性酸素の大部分は抗酸化防御システムにより消去されるが、ガン、糖尿病をはじめとする各種の生活習慣病を引き起こすとともに、老化を推進する大きな要因の一つになるとされている。従って、生活習慣病の予防、老化の抑制を目的として、原因となる酸化ストレスを抑えるために、ビタミンC、ビタミンE、ベータ・カロチン、ビタミンA、グルタチオン、還元型コエンザイムQなどが抗酸化物質の摂取が有効な手段の一つであると考えられている。
【０００３】
DNAは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの4種類の塩基から構成されている。DNAは活性酸素によって酸化損傷を受けることが知られており、グアニン塩基は酸化によって８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（８−OHｄG）に変化する。この８−OHｄGは遺伝子DNAの修復過程で遺伝子本体から切り出され、血液を経て尿中に排泄される。さらに８−OHｄGは比較的安定な物質で、生体内で代謝や分解されることなく尿中に速やかに排泄されることから、活性酸素による生体損傷を鋭敏に反映する優れたバイオマーカーであるとされている。酸化ストレスが高いとされているがん患者では健常人に比べ、尿中８−OHｄG値が高い。また、発がん因子として知られる喫煙、飲酒が８−OHｄG値を増加させ、ガン予防効果のある運動や果物、野菜の摂取は８−OHｄG値を低下させることも知られている。さらには、抗酸化物質であるビタミンＥ、ビタミンＣ、ベータ・カロチン、ルテイン、ベータ・クリプトキサンチン、クルクミン、緑茶、トマトソースなどの摂取により８−OHｄG値が低下することも報告されている。
【０００４】
また、脂質の過酸化により酸化ストレスを評価する方法も見出されている。ヘキサノイルリジン（HEL）は、脂質の過酸化反応の初期段階で生じるリノール酸ヒドロペルオキシドとリジン残基との反応によって生じる脂質-リジン付加体であり、脂質過酸化の初期段階を捉える酸化ストレスバイオマーカーとして利用されている。
【０００５】
ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱという）は、１９７９年メタノール資化性菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として見出された（例えば、非特許文献１および２参照）。細菌類以外にも、大豆、空豆、ピーマン、ジャガイモ、パセリ、ホウレンソウなどの食用植物や、酢、茶、ココア、納豆、豆腐等の加工食品からも検出されている（例えば、非特許文献３参照）。また、ヒトやラットの生体内にも存在すること（例えば、非特許文献４参照）が報告されている。２００３年にはアミノ酸、リジンの酸化を触媒する酵素（２-アミノアジピン酸 ６-セミアルデヒド脱水素酵素）の酸化還元補酵素として機能することが明らかとなり、新しいビタミンと位置付けられている化合物である（例えば、非特許文献５参照）。
【０００６】
ほ乳類におけるＰＱＱの栄養学的な研究は１９８０年代から進められてきており、ＰＱＱ欠乏餌を与えられたマウスは、発育不良、繁殖能力低下、皮膚障害などの欠乏症の症状を示すが、ＰＱＱを補給すると異常が改善されることから、ＰＱＱは重要な栄養素の一つであると考えられている（例えば、非特許文献６）。
【０００７】
栄養学的な側面だけでなく、ＰＱＱの薬理学的作用についても多くの報告がある。in vitroおよびin vivoで、ＰＱＱには強い活性酸素除去作用が認められることが報告されている（例えば、特許文献６参照）。また、細胞の増殖促進作用（例えば、特許文献７参照）、アルドース還元酵素阻害作用（例えば、特許文献８参照）、メラニン産生抑制および美白作用（例えば、特許文献９参照）、紫外線吸収作用（例えば、特許文献１０参照）などが知られている。また、ＰＱＱの神経系に対する作用としては、神経成長因子産生促進作用（例えば、特許文献１１参照）があるが、これはＰＱＱが神経成長因子を増強することにより、神経の再生を促進するというものであった。また、ラットを用いた検討から、経口摂取したＰＱＱが、学習能力などの認知機能の低下を防ぐ作用を発揮し、さらには、コエンザイムＱ１０との併用効果が認められることが報告されている（非特許文献７参照）。
ＰＱＱの抗酸化作用については、試験管内や動物でのデータは知られているが、ヒトでもその作用が認められるかについてはまったくデータがなかった（非特許文献８、９、１０参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００７−５０４２３４号公報
【特許文献２】特開２００６−２３２６７１号公報
【特許文献３】特表平１１−５１０５１３号公報
【特許文献４】特表２００２−５３７３８１号公報
【特許文献５】特開２００８−１３５５０号公報
【特許文献６】特開平５−０７８２４７号公報
【特許文献７】特開昭６１−５８５８４号公報
【特許文献８】特開平６−２５６１９１号公報
【特許文献９】特開平８−０２０５１２号公報
【特許文献１０】特許第３６２５４９３号公報
【特許文献１１】特開平０６−２１１６６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「ネイチャー（Nature）」、１９７９年、第２３０巻、ｐ．８４３−８４４
【非特許文献２】「フェブス  レター（FEBS  Letter）」、１９７９年、第１０８巻、ｐ．４４３−４４６
【非特許文献３】「バイオケミカル  ジャーナル（Biochem Journal）」、１９９５年、第３０７巻、ｐ．３３１−３３３
【非特許文献４】「バイオケミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）」、１９９２年、第１１５６巻、ｐ．６２−６６
【非特許文献５】「ネイチャー（Nature）」、２００３年、第４２２巻、ｐ．８３２
【非特許文献６】「サイエンス（Science）」、１９８９年、２４５巻、ｐ．８５０−８５２
【非特許文献７】「ジャーナル  オブ  クリニカル  バイオケミカル  ニュートリッション（J Clin Biochem Nutr）」、２００８年、第４２巻、ｐ．２９−３４
【非特許文献８】「バイオケミカル  ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）」、２００３年、第６５巻、ｐ．６７−７４
【非特許文献９】「ジャーナル  オブ  アグリカルチュラル  アンド  フード  ケミストリー（J Agric Food Chem）」、２００９年、第５７巻、ｐ．４５０−４５６
【非特許文献１０】「ブレイン  リサーチ（Brain Research）」、２００６年、第１０９４巻、ｐ．２００−２０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、酸化ストレスを低減する剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
様々な薬理学的作用を有する栄養素であるＰＱＱの酸化ストレス低減作用を鋭意検討した結果、ヒトで強い当該作用を見出し、本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は、下記の（１）に示すような酸化ストレス低減剤を提供するものである。
（１）  一般式（Ｉ）
【化１】
2011032172.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、アラルキル基、アラアリール基、フェニル基または水素原子を表す。）で表される化合物〔以下、化合物（Ｉ）という〕、またはその塩を有効成分として含有する酸化ストレス低減剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、酸化ストレス低減剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
化合物（Ｉ）の定義において、式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、アラルキル基、アラアリール（アルキルアリール）基、フェニル基または水素原子を表すが、これらの低級アルキル基、アラルキル基およびアラアリール基のアルキル基部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数１〜６のアルキル基が挙げられ、より具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、中でもメチル基またはエチル基が好ましい。
低級アルケニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルケニル基があげられ、より具体的にはビニル基、アリール基、１−プロペニルメタクリル基、クロチル基、１−ブテニル基、３―ブテニル基、２−ペンテニル基、４−ペンテニル基、２―ヘキセニル基、５−ヘキセニル基等が挙げられる。
低級アルキニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルキニル基が挙げられ、より具体的にはエチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられる。
アラルキル基としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル基が挙げられ、より具体的にはベンジル基、フェネチル基、ベンズヒドリル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。
アラアリール基のアリール基部分としては、例えば炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、より具体的にはフェニル基、ナフチル基、アントリル基等が挙げられる。従って、アラアリール基としては、メチルフェニル基、エチルフェニル基等が挙げられる。
【００１４】
上述の一般式（Ｉ）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３がいずれも水素原子である化合物は、有機化学的方法（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３、５５９９−５６００（１９８１））および発酵法、例えばメタノール資化性を有し、かつピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを含有し鉄化合物の濃度を制御した培養液中で培養することによりピロロキノリンキノンを生産する方法（特開平１−２１８５９７号公報）などにより製造することが可能である。
【００１５】
化合物（Ｉ）で示されるＰＱＱのエステル体の製造法は、ＰＱＱより常法のエステル化反応に従って合成することができる。
ＰＱＱのトリエステル体は、例えば、ＰＱＱまたはその塩を酸性条件下でアルコール類と反応させる方法（例えば、特開平３−１２３７８１号公報、特開平３−１４５４９２号公報）や、ＰＱＱまたはその塩を塩基の存在したでハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アラアリール等と反応させる方法などにより容易に合成することができる。また、上記方法によって得られるＰＱＱのトリエステル体を酸性あるいは塩基性条件下で部分加水分解することで、モノエステル体、ジエステル体を得ることができる。
【００１６】
このようにして得られる化合物（Ｉ）は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、および溶媒抽出法などの通常の方法により、反応液中から分離・精製することができる。また、化合物（Ｉ）の同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、質量分析などの各種手段が用いられる。
【００１７】
化合物（Ｉ）の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリエタノールアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩；リジン、アルギニン等の塩基性塩等が挙げられる。
【００１８】
本発明の酸化ストレス低減剤としては、化合物（Ｉ）またはその塩をそのまま投与することも可能であるが、通常各種の製剤として提供することが望ましい。
【００１９】
製剤は、有効成分として化合物（Ｉ）またはその塩を含有するが、さらに任意の他の治療のための有効成分を含有していてもよい。また、それら製剤は、有効成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００２０】
製剤の投与形態は、治療に際し最も効果的なものを使用することが望ましく、経口投与または、例えば静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与を挙げることができる。
投与する剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤として好適に用いられる。
経口剤として製剤化する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
【００２１】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して製剤化することができる。
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等の場合には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば食甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
【００２２】
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態のものであってもよい。また、神経再生作用を有する健康食品、機能性食品、栄養補助食品等の飲食品として用いてもよい。
【００２３】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張である化合物（Ｉ）またはその塩を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することができる。
【００２４】
本発明の酸化ストレス低減剤における化合物（Ｉ）またはその塩の濃度は、製剤の種類、該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、例えば経口剤の場合、化合物（Ｉ）またはその塩として、通常は０．１〜１００質量％、好ましくは０．５〜７０質量％、特に好ましくは１〜５０質量％である。
本発明の酸化ストレス低減剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、成人一日当たり、化合物（Ｉ）またはその塩として、通常は、０．５ｍｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５０００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。
投与期間は、特に限定されないが、通常は１週間〜１年間、好ましくは、２週間から３ヶ月間である。
【００２５】
なお、本発明の製剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物（以下、非ヒト動物と略す）に対しても使用することができる。非ヒト動物としては、ほ乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等、好ましくはほ乳類に属する非ヒト動物を挙げることができる。
本発明の酸化ストレス低減剤を非ヒト動物に投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、動物の年齢、種類等により異なるが、体重１ｋｇ１日当たり、化合物（Ｉ）またはその塩として、通常は０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜２０ｍｇとなるように一日一回ないし数回投与する。投与期間は、特に限定されないが、通常は１週間〜１年、好ましくは２週間から３ヶ月間である。  
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例にて本発明を説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。化合物（Ｉ）による酸化ストレス低減作用とその結果としての検査値の変化を調べたヒトでの試験例を示す。以下に実施例をあげて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
健常男女成人（年齢45〜65歳）を対象とした、プラセボ対照二重盲検並行群間比較試験を行った。試験群はＰＱＱ食品群（ＰＱＱ群）、プラセボ食品群の２群で構成した。ＰＱＱ群は  ２２例（年齢５２．９±７．０１歳、男女比９／１３、身長１６１．１±８．１６ｃｍ、摂取開始前の体重５７．３±１０．５４kg）、プラセボ群は２３例（年齢５１．７±７．３４歳、男女比８／１５、身長１６２．２±７．５９ｃｍ、摂取前の体重５８．２±１１．５８ｋｇ）であった。ＰＱＱ群ではＰＱＱ二ナトリウム塩（三菱ガス化学製）20mgを含有するハードカプセル1錠を毎朝食後にコップ1杯の水または白湯とともに、3ヶ月間摂取した。摂取前、４、８及び12週後の検査日の早朝尿を採取し、これを検体として、８−OHｄGを測定した。８−OHｄGは、８−OHｄGに特異的なモノクローナル抗体を用いたELISAキット（日研ザイル株式会社  日本老化制御研究所）で測定した。８−OHｄG濃度、体重、尿量及び蓄尿時間から８−OHｄGの生成速度（ng/kg/hr）を算出した。
表−１に各群での８−OHｄG生成速度検査値の平均値±標準偏差を示す。変化量は摂取前からの変化量の平均値±標準誤差を示す。プラセボでは検査値はほぼ横ばいで変わらなかったが、ＰＱＱ群では低下傾向であった。
【００２８】
【表１】
2011032172.tif 000003
【００２９】
同時に行った理学的検査、血液学的検査、血液生化学的検査では両群ともに異常は見出されず、医師の所見でも異常は認められなかったことから、摂取による安全上の問題はないものと考えられた。
【００３０】
（実施例２）
実施例１と同じ２群からの尿を検体として、ヘキサノイルリジン（HEL）を測定した。HELは、HELに特異的なモノクローナル抗体を用いたELISAキット（日研ザイル株式会社  日本老化制御研究所）で測定した。HEL濃度、体重、尿量及び蓄尿時間からHELの生成速度（pmol/kg/hr）を算出した。
表−２に各群でのHEL生成速度検査値の平均値±標準偏差を示す。変化量は摂取前からの変化量の平均値±標準誤差を示す。プラセボでは検査値はほぼ横ばいで変わらなかったが、ＰＱＱ群では低下傾向であった。
【００３１】
【表２】
2011032172.tif 000004
【００３２】
以上の実施例１及び２から、ＰＱＱ群では、酸化ストレスにより生成される核酸分解物８−ＯHｄＧ及び脂質過酸化物ＨＥＬの生成速度が低下傾向となることから、ＰＱＱには酸化ストレス低減作用があると考えられた。
【００３３】
（実施例３）
次に、本発明に係る組成物の配合例を示す実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、これらに限定されるものではない。
表−３記載の処方で常法により酸化ストレス低減剤（１カプセルあたり２５０ｍｇ）を製造した。
【００３４】
【表３】
2011032172.tif 000005