(57)【要約】【課題】情動障害の治療薬の新たなスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。【解決手段】JLP遺伝子の破壊が情動障害を引き起こすことを見出し、さらにJLP遺伝子ノックアウトマウスが情動障害を起こしていることを確認して、該マウスを使用する情動障害の治療薬のスクリーニング方法を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質をJLP遺伝子の一部又は全部が改変又は欠損しているノックアウト非ヒト動物に投与する工程を含む情動障害の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
さらに、前記ノックアウト非ヒト動物の行動特性を評価する工程を含む請求項１のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ノックアウト非ヒト動物が、マウスである請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
情動障害の治療薬が、向精神薬又は抗不安作用薬である請求項１〜３のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
JLPタンパク質の発現を活性化又は促進する被検物質を評価する工程を含む情動障害の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、情動障害の治療剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、正常動物と比較して情動障害を示すJLP遺伝子欠損非ヒト動物を用いた情動障害の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
JLP｛c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK)-associated leucine zipper protein｝は、転写因子Maxの結合タンパク質として同定され、そしてJNK及びp38 MAPK シグナル伝達モジュールの足場タンパク質として機能すると考えられている（非特許文献１）。
また、JLPは、細胞表面タンパク質Cdoとの相互作用により、筋形成における重要な役割をすることも報告されている（非特許文献２）。
しかしながら、JLPのin vivoでの生体機能の多くは不明であった。
【０００３】
本発明者らは、成体マウスの精巣及び精巣上体におけるJLPの発現解析を行い、JLPの発現が精原細胞や精母細胞では発現が弱く、精子細胞で強い発現を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、マカクサルの精巣及び精巣上体を用いて免疫組織化学的解析及び生化学的解析を行ったところ、マウスと同様に、精巣上体精子では発現はなく、精子細胞で高い発現をすることを報告している。加えて、本発明らは、JLP遺伝子破壊（JLPKO）マウスの解析により、JLPKOマウスは一見正常な状態での出生が確認されたが、自然交配において膣栓形成後の雌の妊娠出産率が顕著に低く、雄性の不妊傾向があることを報告している（非特許文献３）。
しかしながら、JLP遺伝子の破壊が情動障害を引き起こすことについは何ら報告していない。
【０００４】
一方、各種の遺伝子を破壊した非ヒト動物を用いて抗不安薬、向精神薬等をスクリーニングすることが報告されている。
特開平10-127207（特許文献１）は、「アンジオテンシンII２型受容体をコードする遺伝子機能を染色体上で欠損させた非ヒト動物を使用して向精神薬活性を評価すること」を開示している。
特開2006-238762（特許文献２）は、「PKN1a遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損させた非ヒト動物を使用して向精神薬をスクリーニングすること」を開示している。
特開2008-237072（特許文献３）は、「motopsin遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損させた非ヒト動物を使用して向精神薬をスクリーニングすること」を開示している。
なお、上記文献では、JLP遺伝子についてはいっさいの開示又は示唆がない。
【０００５】
また、現代社会において、人々は様々なストレスを抱えている。該ストレスにより、精神的に疲弊し、不安や鬱状態を訴える患者が増加している。
従来、不安の治療にはベンゾジアゼピン系の抗不安薬が用いられている。しかし、これらの薬物には依存性などの副作用があり、その治療は専門医の厳重な管理下の元に行われている。また、鬱病の治療には、ノルアドレナリン、セロトニンの再取り込み阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬等の抗鬱薬の投与などが行われているが、これらの治療も不安の治療と同様に専門医により行われている。
また、これらの薬を長期間投与することにより、治療効果の低減、副作用の発生等が問題になっている。さらには、薬の効果には個人差があることも知られている。
【０００６】
以上の現状により、不安神経症や鬱病患者の増加に伴い、新たな情動障害の治療薬の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:14189-14194
【非特許文献２】J Cell Biol (2006) 175:383-388
【非特許文献３】Transgenic Res (2008) 17:1045-1058
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平10-127207
【特許文献２】特開2006-238762
【特許文献３】特開2008-237072
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した問題点を解決することを解決すべき課題とした。より詳しくは、本発明者らは、情動障害の治療薬の新たなスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、JLP遺伝子ノックアウトマウスを用いて精巣及び精巣上体におけるJLPの発現を解析する工程中に、新規に「JLP遺伝子の破壊が情動障害を引き起こすこと」を見出し、さらにJLP遺伝子ノックアウトマウスが情動障害を起こしていることを確認して、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．被検物質をJLP遺伝子の一部又は全部が改変又は欠損しているノックアウト非ヒト動物に投与する工程を含む情動障害の治療薬のスクリーニング方法。
２．さらに、前記ノックアウト非ヒト動物の行動特性を評価する工程を含む前項１のスクリーニング方法。
３．前記ノックアウト非ヒト動物が、マウスである前項１又は２に記載のスクリーニング方法。
４．情動障害の治療薬が、向精神薬又は抗不安作用薬である前項１〜３のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
５．JLPの発現を活性化又は促進する被検物質を評価する工程を含む情動障害の治療薬のスクリーニング方法。
６．情動障害が疑われる患者由来の試料中のJLP発現量を測定することにより、該患者がJLPの機能障害による情動障害であるかを検査する方法。」
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な知見「JLP遺伝子の破壊が情動障害を引き起こすこと」を基にして、新規な情動障害の治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】JLPノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法の説明
【図２】Jlp+/+ 、Jlp+/-、Jlp-/-マウスのサザンブロッティング分析結果
【図３】抗JLP 抗体によるウエスタンブロッティングの結果
【図４】高架式十字路迷路テストにおける各マウスの滞在秒数の結果
【図５】高架式十字路迷路テストにおける各マウスの進入回収の結果
【図６】テールサスペンションテストにおける各マウスの不動時間の結果
【図７】マウスの背側縫線核図（図中破線円で囲んだ箇所が背側縫線核）
【図８】JLPノックアウトマウスの背側縫線核の染色及び蛍光標識した図
【図９】野生型マウスの背側縫線核の染色及び蛍光標識した図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、下記実施例により、「JLP遺伝子の破壊が情動障害を引き起こすこと」を見出したことを利用している。
従って、被検査物質をJLP遺伝子ノックアウト非ヒト動物に投与し、さらに該ノックアウト非ヒト動物の行動特性の変化を確認することにより、情動障害の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００１５】
（情動障害）
本発明の「情動障害」とは、鬱病、全般性不安障害、社会不安障害、心的外傷後ストレス障害、強迫性障害、パニック障害、パニック発作、特定恐怖症、対人恐怖症または広場恐怖症を含む障害を意味する。
【００１６】
（情動障害の治療薬）
本発明の「情動障害の治療薬」とは、上記いずれかの障害を治療又は改善するための薬を意味する。例えば、不安状態の改善薬（抗不安作用薬）、向精神薬（抗自閉症薬、抗共依存症薬、対人行動改善薬、心的外傷改善剤、抗恐怖薬）等が例示される。
【００１７】
（被検物質）
本発明で用いる被検物質は、任意の物質を使用することができる。被検物質の種類は特に限定されず、低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。
あるいは、被検物質は、また化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーから選択してもよい。
【００１８】
なお、不安障害の治療には、ベンゾジアゼピン系抗不安薬、チェノジアゼピン系抗不安薬、ピペラジン系抗不安薬、セロトニン作動性抗不安薬等の抗不安薬が使用されている。また、抗不安薬は、不安障害以外にも、身体表現性障害（自律神経失調症）や統合失調症（精神分裂病）、鬱病、アルコール離脱（禁断）症状の予防等、不安状態を伴う病態にも、不安状態の解消のために使用されることがある。
また、鬱病の治療には、神経伝達物質の働きを高める薬剤が使用され、主なものとして、三環系抗鬱病薬、四環系抗欝薬、トリアゾロピリジン系抗鬱薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）が知られている。なお、ＳＳＲＩ及びＳＮＲＩは不安障害の治療に使用される場合がある。
よって、上記すでに情動障害の効果が知られている化合物の置換体、薬学的に許容できる塩等を候補被検物質とすることが好ましい。
【００１９】
（JLP）
JLPは、mitogen-activated protein kinase (MAPK)シグナル伝達経路の足場タンパク質であり、非ヒト動物に普遍的に存在する。また、JLPの塩基配列は、公知のデータベースより取得可能である。例えば、マウスのJLPのAccession Numberは、AF327451である。
【００２０】
「JLP遺伝子が破壊された（ノックアウトマウス）」とは、JLP遺伝子領域の配列が人為的に改変されたことによって、JLP遺伝子の正常な発現が阻害されていること、その結果、JLPの発現が抑制され、生体（特に脳）においてJLPが正常に機能していないことを意味する。
また、「JLP遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損している」における「全部」とは、JLPゲノムＤＮＡのエクソン１の５'端から最後のエクソンの３'端までの領域をいう。
また、「一部」とは、この領域の一部であって、JLP遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な長さの領域をいう。
さらに、「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【００２１】
本発明の「JLP遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損しているノックアウト動物」は、公知の方法で作製することができる。
例えば、下記実施例の記載のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において、JLP遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することにより、JLPの正常な発現を阻害できる。
また、本発明のスクリーニング方法に用いるノックアウト動物は、同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず、さらにその子孫をも含む。
【００２２】
（ノックアウト動物）
本発明のノックアウト動物の対象となる動物は、非ヒト動物であり、特に限定されない。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術を考慮するとマウス及びラットが、特に好ましい。
【００２３】
（ターゲッティングベクターの構築）
ターゲッティングベクター構築のため、対象となる動物のJLP遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからJLP遺伝子をスクリーニングする。
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく、JLP遺伝子を破壊し、そしてJLPの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。
また、ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、例えば市販のプラスミドをバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー及びネガティブセレクション用のマーカー（ＤＴ−Ａ遺伝子等）などの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる（参照：図１）。
【００２４】
（JLP遺伝子ノックアウト動物の作製）
上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて選択できる。
選別後、目的とする相同組換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。
【００２５】
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型JLP遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のJLP遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のJLP遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明のJLPノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。
【００２６】
（JLP遺伝子ノックアウト動物を用いた情動障害の治療薬のスクリーニング方法）
下記実施例に示すように、JLPノックアウトマウスは明瞭な形態異常を示さなかった。しかし、JLPノックアウトマウスは、高架式十字路迷路テストでは情動障害の一種である不安行動を示し、テールサスペンションテストでは情動障害の一種である鬱状態を示した。
これらの実施例結果から、情動障害はJLPの機能的抑制によって生じたものと考えられる。
つまり、被検物質（情動障害の治療候補化合物）を投与したJLPノックアウト非ヒト動物の行動特性を、正常の非ヒト動物の行動特性及び／又は該被検物質を投与していないJLPノックアウト非ヒト動物の行動特性と比較することにより向精神薬、抗不安作用薬などの向精神薬を含む情動障害の治療薬の選択をすることができる。
【００２７】
被検物質又はそれを含む混合物等は、それらの特性に応じて調製し、皮下あるいは腹腔内注射、静脈注射、経口投与等を適時選択して、JLPノックアウト非ヒト動物に投与する。
【００２８】
（行動特性の評価方法）
JLPノックアウト非ヒト動物の行動特性の評価方法は、自体公知の方法を利用することができる。例えば以下の方法を利用することができる。
不安症の確認には、高架式十字迷路テスト（Neurosci. Methods 14, 525-529, 1986）、明暗箱法(Psychopharmacology, 94, 392-396, 1988) を使用することができ、鬱症状の確認には強制水泳法 (Arch. int. Pharmacodyn. 229, 327-336, 1977)又はテールサスペンションテストを使用することができ、情動過多症状の確認にはオープンフィールド法（Life Sciences 58, 701-709, 1996）を使用することができる。また、Food Neophobia (Physiol. Behav., 51, 979-985, 1992) 、Vogel 型コンフリクトStaircase 試験（Psychopharmacol., 92, 106-109, 1987）又は学習性無力試験(Psychopharmacol., 90, 90-94, 1986) 等も使用することができる。
【００２９】
（高架式十字迷路テスト）
高架式十字迷路テストは、S.Pellowらの論文｛J. Neurosci. Methods, vol.14 (1985), p-149-167｝に記載された試験手順に準じて行うことができる。
試験装置としては、2つのオープンアーム（open arm）と、2つのクローズドアーム（closed arm）が、それぞれ、中心部分（common central platform）に同一線上に位置するように連結して構成される十字型の装置を用いることができ、これを床から一定の高さ（例えば30〜100cm、好ましくは40〜50cm）に設置する。オープンアームの周囲（幅方向の端部）には、一定の高さ（例えば0.1〜1.0cm、好ましくは0.3〜0.5cm）のリップ部分が設けられており、被験動物が容易に落下しないようにされている。
試験室の照度は適宜（例えば5〜200ルクス、好ましくは5〜20ルクス）設定しておく。被験動物は試験開始前（例えば1時間以上前、好ましくは3時間以上前）から試験開始時まで（投与時は除く）、別室で比較的明るい照度（例えば10〜1000ルクス、好ましくは20〜500ルクス）に慣らしておく。試験前に被検物質を投与を行う場合、当該投与は、例えば試験開始180分前までに、好ましくは15〜30分前に行う。
試験開始から一定時間、被験動物を自由に行動させ、その様子をビデオテープに録画する。
試験終了後に、各被験動物についてオープンアーム上に居た合計時間を測定し、結果を例えば「平均値+S.E.M.」で表記する。なお、被験動物の全肢がオープンアーム上にある時間を、被験動物がオープンアーム上に居た時間と定義して測定する。
【００３０】
当該試験で用いる被験動物は、試験直前まで比較的明るい照度に慣らしておいた動物であるため、その後の比較的暗い照度の試験条件下では、横に壁が無いオープンアーム上に居ることに対して不安感を持つと考えられる。従って、この高架式十字迷路テストでは、結果的にオープンアーム上により長い時間居た被験動物ほど、不安感が少ない動物、すなわち不安感が緩和若しくは除去された動物であると評価することができる。
また、被検物質投与濃度が異なる被験動物を複数準備し、そして試験を行うことにより、当該試験物質が情動障害を改善する（抗不安作用を有する）とすればどの程度の投与量（濃度）で効果が発揮されるか（有意差が認められるか）、あるいは投与量（濃度）依存性の傾向が認められるか等を解析及び評価することができる。
【００３１】
（明暗探査試験）
明暗探査試験は、暗コンパートメント（dark compartment）及び明コンパートメント（light compartment）の2つのコンパートメントから構成される試験装置を用いて行うことができる。暗コンパートメントは、プラスチック製等の黒い材質の部材で囲まれており、上に蓋を備えた構造をしており、明コンパートメントは、プラスチック製等の白い材質の部材で囲まれており、上が開いている構造をしている。明暗の両コンパートメントは、プラスチック製等の黒い材質のトンネルで連結されており、互いに行き来可能となっている。
試験室の照度は、適宜（例えば10〜1000ルクス、好ましくは150ルクス）に設定しておく。被験動物は試験開始前（例えば1時間以上前、好ましくは3時間以上前）から試験開始時まで（投与時は除く）、別室で比較的暗い照度（例えば50ルクス以下、好ましくは10ルクス）に慣らしておく。試験前に被検物質の投与を行う場合、当該投与は、例えば試験開始180分前までに、好ましくは15〜30分前に行う。
【００３２】
当該試験は、被験動物を暗コンパートメントに入れた状態で開始する。試験開始から一定時間（例えば5分以上、好ましくは5分）、被験動物を自由に行動させ、その様子をビデオテープに録画する。
試験終了後に、各被験動物について明コンパートメントに入っていた合計時間を測定し、結果を例えば「平均値+S.E.M.」で表記する。なお、被験動物の全肢が明コンパートメントに入っていた時間を、被験動物が明コンパートメントに入っていた時間と定義して測定する。
【００３３】
当該試験で用いる被験動物は、上記のように、試験直前まで比較的暗い照度に慣らしておいた動物であるため、その後の比較的明るい照度の領域に対して不安感を持つと考えられる。従って、この明暗探査試験では、明コンパートメントにより長い時間入っていた被験動物ほど、不安感が少ない動物、すなわち不安感が緩和若しくは除去された動物であると評価することができる。
【００３４】
（テールサスペンションテスト）
テールサスペンションテスト（TST）では、マウスの尾を固定してぶら下げる。ぶら下げられたマウスは、逃避しようとして暴れるが、しばらくすると逃避を放棄して無動状態になる。この無動状態に陥った時間（不動時間）がヒトにおける鬱状態の程度を反映すると考えられている。
よって、該不動時間の減少を指標として、候補情動障害の治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【００３５】
（JLP遺伝子の機能に着目した情動障害の治療薬のスクリーニング方法） 
下記実施例の結果により、JLPの機能阻害は、情動障害を生じさせることが明らかになった。そこで本発明は、JLPの発現を活性化又は促進する物質を評価する工程を含む情動障害の治療薬をスクリーニング方法も提供する。
すなわち、JLPの発現の抑制により情動障害を示す患者に、JLPの発現を活性化又は促進する物質を投与することにより、情動障害を改善又は完治することができると考えられる。
【００３６】
なお、上記評価方法は、自体公知の方法により行うことができる。
例えば、被検物質の投与により、JLPの機能活性又は促進が行われたかを確認する一つの指標として、in vitro又はin vivoにおけるJLP mRNA又はJLPの発現量を測定する。
また、JLPは、mitogen-activated protein kinase (MAPK)シグナル伝達経路の足場タンパク質である。足場タンパク質は、MAPKカスケードの関連のあるキナーゼ分子同士の複合体を形成させることで、連続したMAPKカスケードのリン酸化反応を効率よく進めることが出来るようにするタンパク質である。すなわち、JLPの機能活性又は促進が行われたかを確認する一つの指標として、MAPKカスケードのリン酸化を測定する。
【００３７】
上記スクリーニングで得られた行動障害の治療薬は、予防、改善又は治療等の目的に応じて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、液剤、注射剤（液剤、懸濁剤）または遺伝子療法に用いる形態などの各種の形態に、常法にしたがって調製することができる。本発明の治療剤は、通常は１種または複数の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００３８】
行動障害の治療剤の投与量または摂取量については、特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。本発明の医薬または食品は、１日１〜数回に分けて投与または摂取することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与または摂取してもよい。
【００３９】
（生体由来の試料中のJLP発現量に着目した情動障害の検査方法） 
下記実施例の結果により、JLPの機能阻害は、情動障害を生じさせることが明らかになった。そこで本発明は、生体由来の試料中のJLP発現量を測定する工程を含む情動障害の検査方法も提供する。
すなわち、情動障害が疑われる患者から試料を取得する。そして、該試料中のJLP発現量を、健常者由来の試料中のJLP発現量と比較することにより、JLPの機能障害による情動障害であるかを検査する。
【００４０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
（JLPノックアウトマウスの作製）
以下の方法により、JLPノックアウトマウスを作製した（参照：非特許文献３）。
なお、以下の操作は、文部科学省が定めた研究機関等における動物実験等の実施に関する基本方針及び米国国立衛生研究所が1985年に定めた実験動物の飼育管理および使用に関する指針に従って、行った。
【００４２】
図１は、本実施例のJLPノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。図中、上から順に、正常のJLP遺伝子（Wild type allele）、JLPノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting construct）、相同組換えを起こしたJLP遺伝子破壊（変異）アレル（Targeted allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。
【００４３】
マウスJLP遺伝子のエクソン１の上流4.5-kbからエクソン１の下流4.2-kb間の領域である8.7-kbの遺伝子領域をターゲッティングベクター構築のために使用した。
3.1-kb（エクソン１の上流4.5-kb〜1.4-kb）及び3.4-kb（エクソン１の下流0.8-kb〜4.2-kb）の遺伝子フラグメントをPCRにより増幅し、それぞれ、ターゲッティングベクターのレフトアーム及びライトアームに使用した。Neo耐性遺伝子を該レフトアームと該ライトアーム間に挿入して、JLＰ遺伝子のエクソン１を完全に欠失させた。DT-A遺伝子をネガティブ選抜のために導入した。
【００４４】
上記ターゲッティングベクターをNotIにより直鎖化後、129/Ola E14-1 ＥＳ細胞に導入した{参照：EMBO J (1997) 16:1850-1857、Neurosci Lett (2007) 429:43-48}。目的の相同組換えが起こったアレルを有するクローンは、5'-flanking probe及びneo probeを用いたPCR及びサザンブロッティングによって選抜した。
【００４５】
相同組換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを、公知の方法（参照：EMBO J 16:1850-1857）に従って、マウス胚に導入することにより、キメラマウスを得た。
さらに、このキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと３回戻し交配した。なお、下記実施例２で使用するJLPノックアウトマウス（Jlp-/-）は、ヘテロマウス（Jlp+/-）を交配して得た。
【００４６】
（JLPノックアウトマウスの確認）
サザンブロッティングによりJLP遺伝子のターゲッティングに成功したことを確認した（図２）。
また、ヘテロマウス（Jlp+/-）を交配して得られたホモマウス（Jlp-/-）は、予期したmendelian frequencyに従って生まれ、生存能力があり、かつ外見は正常であった。
加えて、抗JLP抗体を用いたウエスタンブロット解析を行ったところ、野生型マウスで検出されたJLPのバンドがホモマウスでは検出されなかった（図３）。
以上の結果により、JLPノックアウトマウスが作製できたことを確認できた。
【実施例２】
【００４７】
（JLPノックアウトマウスの情動行動の確認）
JLPノックアウトマウスの情動行動、特に不安行動を確認するために、高架式十字路迷路テストを行った。詳細は、以下の通りである。
【００４８】
高架式十字迷路（EP-3002，小原医科産業）および画像解析ソフト（Image J EP，小原医科産業製）を用いて，マウスの情動性を確認した。
装置は、壁のないオープンアーム（長さ50cm，幅5cm）、壁（15cm）があるクローズドアーム（長さ50cm，幅5cm）及び両走路の交差点であるプラットホームから構成されている。なお、該装置は、床上から高さ50cmの位置に設定した。
上記実施例１で作製したJLPノックアウトマウス（Jlp-/-, n=4）及びヘテロマウス（Jlp+/-, n=5）は、実験開始時にプラットホームに置き、以降10分間の移動経路を天井に取り付けたCCDカメラによって撮影した。
撮影した画像データを解析用ノートパソコンに取り込んだ後に，画像解析ソフトにより、各アームでの滞在時間、プラットホーム（中央区間）での滞在時間及び各アームへの進入回数を算出した。マウスの各アームへの選好性を指標として，オープンアームへの接近・滞在を「低情動」、クローズドアームへの接近・滞在を「高情動」として評価し、高情動である場合を不安傾向を持つ行動特性であると評価した。
【００４９】
（JLPノックアウトマウスの情動行動の確認結果）
JLPノックアウトマウスの10分間に滞在した秒数の測定において、中央区間、オープンアーム及びクローズドアームの滞在時間は、それぞれ、平均107.5秒、平均1.0秒及び（平均491.5秒であった（参照：図４）。
一方、ヘテロマウスの10分間に滞在した秒数の測定において、中央区間、オープンアーム及びクローズドアームの滞在時間は、それぞれ、平均82.5秒、平均37.0秒及び480.5秒であった（参照：図４）。
また、JLPノックアウトマウスの進入回数の測定において、オープンアーム及びクローズドアームの進入回数は、それぞれ、平均0.75回及び平均22.25回であった（参照：図５）。
一方、ヘテロマウスの進入回数の測定において、オープンアーム及びクローズドアームの進入回数は、それぞれ、平均4.0回及び平均25.4回であった（参照：図５）。
以上の結果から、JLPノックアウトマウスは明らかに不安行動を示した。
【実施例３】
【００５０】
（JLPノックアウトマウスの鬱状態の確認）
JLPノックアウトマウスの鬱状態を確認するために、テールサスペンションテストを行った。詳細は、以下の通りである。
【００５１】
上記実施例１で作製した７ヵ月齢のJLPノックアウトマウス（Jlp-/-）及びコントロールとしてのヘテロマウス（Jlp+/-）のそれぞれの尾先端をビニールテープで固定し、両マウスを懸垂状態にした。
両マウスを懸垂状態に固定後、三脚で固定したデジタルカメラ（Panasonic; DMC-FS25）を用いて、300秒の動画撮影をした。なお、タイマー（最小単位；秒）を用いて、手動でマウスの不動時間を計測した。不動時間は各マウスについて３回の測定を行った。
【００５２】
（JLPノックアウトマウスの鬱状態の確認結果）
JLPノックアウトマウスの300秒間中の不動時間は、平均220.7秒であった（参照：図６）。
一方、ヘテロマウスの300秒間中の不動時間は、平均87.3秒であった（参照：図６）。
明らかに、JLPノックアウトマウスは、ヘテロマウスと比較して、不動時間が長かった。
以上の結果から、JLPノックアウトマウスは明らかに鬱状態を示した。
【実施例４】
【００５３】
（JLPノックアウトマウスの背側縫線核でのセロトニン神経系の発現確認）
背側縫線核（図７）に起始核を持つセロトニン神経系は、前脳領域、特に海馬、扁桃体、視床下部などに投射し、セロトニンレセプターを賦活化することにより、不安や鬱等の情動性を抑制することが知られている。また、セロトニン神経系の不活性化は、不安、鬱等を惹起することが知られている。そして、現在、使用・開発されている抗不安薬、抗鬱薬においてはセロトニン神経系の賦活化を目的としたものが多数存在する。
そこで、実施例１で作製したJLPノックアウトマウスの背側縫線核でのセロトニン神経系の発現を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５４】
実施例１で作製したJLPノックアウトマウスの背側縫線核及び野生型マウスの背側縫線核をHoechstで染色すると同時に、抗セロトニン（Serotonin、別名 5-hydroxytryptamine, 5-HT）抗体を用いて蛍光標識した。
【００５５】
図８は、JLPノックアウトマウスの背側縫線核の染色及び蛍光標識した図であり、図９は、野生型マウスの背側縫線核の染色及び蛍光標識した図である。図８及び図９の結果から、ノックアウトマウスの背側縫線核でのセロトニン神経系の発現は、野生型マウスの背側縫線核でのセロトニン神経系の発現と比較して、減少していた。
以上の結果から、セロトニン神経系の不活性化がJLPノックアウトマウスの情動障害の一つの原因として考えられる。
【００５６】
（総論）
本実施例のJLPノックアウトマウスは、実施例２及び実施例３の結果より、不安・鬱様の行動特性を示した。加えて、該マウスは、実施例４の結果より、背側縫線核でのセロトニン神経の減少が観察された。
したがって，セロトニン神経系に作用する薬物をJLPノックアウトマウスに投与し、行動特性の変化を解析することで、セロトニン神経系に関わる抗不安薬、抗鬱薬の効果、作用機序を知ることができると共に、新たな薬物のスクリーニングを実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
JLPノックアウト非ヒト動物の行動特性を改善又は治療できる化合物又はJLPの発現を活性化又は促進する化合物は情動障害の治療薬となることができる。
【図１】
2011089982.tif 000002
【図２】
2011089982.tif 000003
【図３】
2011089982.tif 000004
【図４】
2011089982.tif 000005
【図５】
2011089982.tif 000006
【図６】
2011089982.tif 000007
【図７】
2011089982.tif 000008
【図８】
2011089982.tif 000009
【図９】
2011089982.tif 000010