(57)【要約】【課題】  試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の優勢型の効率的な判別方法を提供すること。【解決手段】ヒトパピローマウイルスのリアルタイムＰＣＲ法による検出に際して用いる、遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面において、熱サイクル数の範囲毎に分割された平面領域を５〜１０整数領域作成し、当該分割領域は、最小の熱サイクル数の範囲を示す領域と最大の熱サイクル数の範囲を示す領域に挟まれた平面領域が、３〜８整数領域に等分割されており、被験試料に異なる遺伝子型のヒトパピローマウイルスが存在する場合に、最小のＣｐ値を与える遺伝子型のヒトパピローマウイルスが属する前記５〜１０分割領域と、最大のＣｐ値を与える当該５〜１０分割領域同士が隣り合わない場合に、当該最小のＣｐ値が属する分割領域に属する１種以上の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを、他の遺伝子型のヒトパピローマウイルスに対して優勢型であると判定する、ヒトパピローマウイルスの相対定量方法、を提供することにより、上記の課題を解決することを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスのリアルタイムＰＣＲ法による検出に際して用いる、遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面において、熱サイクル数の範囲毎に分割された平面領域を５〜１０整数領域作成し、当該分割領域は、最小の熱サイクル数の範囲を示す領域と最大の熱サイクル数の範囲を示す領域に挟まれた平面領域が、３〜８整数領域に等分割されており、被験試料に異なる遺伝子型のヒトパピローマウイルスが存在する場合に、最小のＣｐ値を与える遺伝子型のヒトパピローマウイルスが属する前記５〜１０分割領域と、最大のＣｐ値を与える当該５〜１０分割領域同士が隣り合わない場合に、当該最小のＣｐ値が属する分割領域に属する１種以上の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを、他の遺伝子型のヒトパピローマウイルスに対して優勢型であると判定する、ヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項２】
等分割されている平面領域数は４〜６整数領域である、請求項１に記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項３】
等分割されている平面領域数は４領域である、請求項１に記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項４】
等分割されている隣り合わない領域に属するＣｐ値に相当するＨＰＶ遺伝子のコピー数の差の最低値は５倍以上である、請求項１〜３のいずれかに記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項５】
等分割されている隣り合わない領域に属するＣｐ値に相当するＨＰＶ遺伝子のコピー数の差の最低値は１０倍以上である、請求項２又は３に記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項６】
前記定量方法において、リアルタイムＰＣＲ法は、インベーダー・アッセイ法によるシグナルを指標としてＣｐ値が算出されるリアルタイムＰＣＲ法である、請求項１〜５のいずれかに記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項７】
前記定量方法において、リアルタイムＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面の各分割領域に対する、被験試料内のヒトパピローマウイルスの遺伝子型毎のＣｐ値の当てはめと、これにより決定された当てはめ値を基とした優勢型遺伝子の存在の判断、を行う手段が、アルゴリズム化されてなるソフトウエアにおいて行われる、請求項１〜６のいずれかに記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項８】
前記定量方法は、リアルタイムＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面の各分割領域に対する、被験試料内のヒトパピローマウイルスの遺伝子型毎のＣｐ値の当てはめと、これにより決定された当てはめ値を基とした優勢型遺伝子の存在の判断を行う手段、がアルゴリズム化されてなるソフトウエアを実行する処理装置によって行われる、請求項１〜６のいずれかに記載のヒトパピローマウイルスの相対定量方法。
【請求項９】
リアルタイムＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面の各分割領域に対する、被験試料内のヒトパピローマウイルスの遺伝子型毎のＣｐ値の当てはめと、これにより決定された当てはめ値を基とした優勢型遺伝子の存在の判断を行う手段、がアルゴリズム化されてなるソフトウエア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの検出方法、さらに詳細には、子宮頸部等由来の被験試料におけるヒトパピローマウイルスの優勢型を判定するための、当該ウイルスの相対定量方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸癌における最も重要な起因因子のひとつである。現在までに１００以上の遺伝子型が同定されており、少なくとも４０の遺伝子型が子宮頸部に感染する。ＨＰＶは子宮頸癌の進行との関連性から高リスク型と低リスク型に分類されており、少なくとも１４の遺伝子型（１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６７及び６８型）が高リスク型に分類されている。高リスク型ＨＰＶを早期に同定することはがん形成のリスクの軽減につながるとともに、治療方針に重要な情報をもたらす。これまでＨＰＶの検出にはコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ法や、ハイブリダイゼーションプローブを用いたハイブリッドキャプチャーアッセイなどが行われきた。ＰＣＲ法においては、３種類のコンセンサスプライマーが良く知られている（ＰＧＭＹ１１／０９、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋、Ｌ１Ｃ１／２）。また、ＨＰＶの遺伝子型は、制限酵素を用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、遺伝子型特異的プローブを使用したハイブリダイゼーション法、ラインプローブアッセイもしくはコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ産物のシーケンス解析法などにより判定されてきたが、いずれも多くの遺伝子型を判別できる反面、煩雑な工程と高額な試薬費が要求されるものであった。そのため、マルチプレックスＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法による簡便な新しい遺伝子型判定法も報告されはじめている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は複数の遺伝子型による重複感染率が高いが、高リスク型ＨＰＶの重複感染と子宮頸癌形成との関連性はいまだ明確になっていない。しかしながらこの関連性を明らかにするために重複感染しているそれぞれの遺伝子型のコピー数を定量することは容易ではなく、これまであまり報告されていない。この解析が困難とされている原因のひとつに定量に必要な検量線をそれぞれの遺伝子型について作成しなければならない点が挙げられる。測定対象となる遺伝子型が多ければ多いほど、それに伴ってコントロールの数も増加して行き、結果的に検査コストの高額化を招くこととなる。また、臨床的な子宮頸部擦過物において、ＨＰＶのコピー数を定量する場合には採取方法による影響、すなわち、採取サンプル毎の正常細胞の混入率の差を考慮しなければならなくなる。本発明は、このＨＰＶのコピー数の定量に伴う問題を解決することを課題とする発明である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ＨＰＶの重複感染例において有用な臨床診断は、ウイルスの絶対数よりも相対比から得られる情報を基として行うことが有利ではないかと考えた。その場合、ＨＰＶのリアルタイムＰＣＲ法による検出に際しては、遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面を、熱サイクル数によって分割された分割領域を設けて、当該分割領域のランク付けを行い、検体におけるリアルタイムＰＣＲによる遺伝子型別のＨＰＶ遺伝子の増幅曲線が、どのランクに属するかによって、ＨＰＶの重複感染の解析を行うことが、検査の効率上好ましいことに想到した。しかしながら、ＨＰＶの遺伝子型別の感染度合いの判断を行う場合、「どの遺伝子型が優勢か」、すなわち、「優勢型」を、どのように効率良く的確に判断するかが、子宮頸癌の発生頻度と関連して最も重要な要素の一つであり、実際にこの遺伝子検出操作を行う場合の鍵となる。
【０００５】
このさらなる課題に対し、本発明者らは、このリアルタイムＰＣＲ法における、上記の二次元チャート平面における、領域の分割形式と、当該形式に伴うＨＰＶの優勢型の判定方法を組み合わせることにより、検体におけるＨＰＶの優勢型の判断を、効率良く的確に行うことができることを見出して、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のリアルタイムＰＣＲ法による検出に際して用いる、遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面において、熱サイクル数の範囲毎に分割された平面領域を５〜１０整数領域、好適には、６〜８整数領域、最も好適には６整数領域、作成し、当該分割領域は、最小の熱サイクル数の範囲を示す領域と最大の熱サイクル数の範囲を示す領域に挟まれた平面領域が、３〜８整数領域、好適には４〜６整数領域、最も好適には４整数領域、に等分割されており、被験試料に異なる遺伝子型のＨＰＶが存在する場合に、最小のＣｐ値を与える遺伝子型のＨＰＶが属する前記５〜１０等の分割領域と、最大のＣｐ値を与える当該５〜１０等の分割領域同士が隣り合わない場合に、当該最小のＣｐ値が属する分割領域に属する１種以上の遺伝子型のＨＰＶを、他の遺伝子型のＨＰＶに対して優勢型であると判定する、ＨＰＶの相対定量方法、を提供する発明である。なお、本発明における上記の「等分割」とは、厳密に当該領域を等分割するのみならず、厳密な等分割により導き出される熱サイクル数の境界値の±５％のズレを含むものとする。
【０００７】
また、「優勢型」とは、他の遺伝子型のＨＰＶに対して、相対的に優勢な状態である、ＨＰＶの特定の遺伝子型を意味するものである。具体的には、特定のＨＰＶの遺伝子型が、他の遺伝子型よりも優勢であると判断を行う場合、当該優勢型ＨＰＶ遺伝子は、最低レベルの存在状態を示すＨＰＶ遺伝子に対して、５倍以上、好ましくは１０倍以上存在することを基準とすることが好適である。上記二次元チャートにおいて、熱サイクル数は遺伝子のコピー数を表すものであるから、異なる遺伝子型のＨＰＶのリアルタイムＰＣＲ解析を行った場合に、最小のＣｐ値のＨＰＶ遺伝子が属する領域と最大のＣｐ値のＨＰＶ遺伝子が属する領域同士が隣り合わない場合に、これらの領域に属する遺伝子のコピー数として、少なくとも５倍以上、好適には１０倍以上の差が認められるように、当該領域分割は行われる。
【０００８】
この本発明のＨＰＶの相対定量方法のあらましを解説した、実施例のデータに基づく概略図が図１（図１Ａと１Ｂ）である。図１Ａは、比較例として用いるべきリアルタイムＰＣＲ法を行うにあたって用いられる遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面である。当該二次元チャートにおいて、横軸は、熱サイクル数を示し、縦軸は、遺伝子増幅産物量を反映する蛍光強度（遺伝子増幅産物量が多いほど、蛍光量は大きい）を示している。また、ＮＣとは、ネガティブコントロールであり、検出モデルＤＮＡを含有しない試料を用いた遺伝子増幅産物の増幅曲線を反映する。また、１．０Ｅ＋０５とは、１０の５乗個の初発プラスミドの検出モデルＤＮＡを用いた「低ポジティブコントロール」の増幅曲線を反映する。１．０Ｅ＋０８とは、１０の８乗個の初発プラスミドの検出モデルＤＮＡを用いた「高ポジティブコントロール」の増幅曲線を反映する。図１Ａの二次元チャート平面は、熱サイクル数で区分けされる平面領域＋１〜＋４の整数で区分けされている。この図からわかるように、「低ポジティブコントロール」と「高ポジティブコントロール」の増幅曲線を主要に分ける平面領域は隣接しており、これらのポジティブコントロールの間に位置する検出曲線が反映する遺伝子型のＨＰＶの優勢型と非優勢型を明確に判別することは困難である。これに対して、図１Ｂに示した、本発明に関わる二次元チャート平面の例は、「低ポジティブコントロール」である１０の３乗個の初発プラスミドと、「高ポジティブコントロール」である１０の８乗個又は１０の７乗個の初発プラスミドの増幅曲線に挟まれる平面領域が＋２〜＋５の４領域に等分割されており、これらの等分割領域に１０の４乗〜８乗の増幅曲線が位置している。これは、一つの分割領域の横軸方向の幅は、遺伝子のコピー数として概ね１０倍に設定されていることを意味する。よって、これらのポジティブコントロールの間に位置する検出曲線が反映する遺伝子型のＨＰＶの優勢型と非優勢型の明確な判別は、隣り合う領域以遠の区分領域にＣｐ値を有する遺伝子型、すなわち、遺伝子のコピー数として１０倍以上離れているＨＰＶの遺伝子型が存在する場合に、最も少ないＣｐ値の属する領域のＨＰＶの遺伝子型を優勢型と判定し、その他の遺伝子型を非優勢型として判別することにより容易となる。なお、本例からすると、「高ポジティブコントロール」は、１０の７乗個の初発プラスミドで十分であることがわかる。
【０００９】
リアルタイムＰＣＲ法を用いた定量法としてＱ−Ｉｎｖａｄｅｒ法、サイバーグリーン法（文献Szuhai K, Sandhaus E, Kolkman-Uljee SM, Lemaitre M, Truffert JC, Dirks RW, Tanke HJ, Fleuren GJ, Schuuring E, Raap AK. A novel strategy for human papillomavirus detection and genotyping with SybrGreen and molecular beacon polymerase chain reaction. Am J Pathol. 2001 Nov;159(5):1651-60.）、スコーピオンプローブ法、モレキュラービーコンプローブ法（文献Takacs, T., Jeney, C., Kovacs, L., Mozes, J., Benczik, M., Sebe, A. 2008. Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5 low-risk HPV types. J. Virol. Methods. 149, 153-162.）等が挙げられる。ここに挙げたＱ−Ｉｎｖａｄｅｒ法は、好適な方法の一つである。また、これらの例示列挙した諸手法を適宜改変して、本発明を行うこともできる。Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法では、インベーダー・アッセイ法によるシグナルをモニタリングしてリアルタイムＰＣＲ法を行う定量法が開発されている。この方法の特徴は多くの異なるターゲットを共通の蛍光プローブで検出できることにあり、これにより簡便化と低コスト化が実現できる。本明細書の実施例では、Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法を用いて１４種類のＨＰＶ遺伝子型の相対定量解析を行っている。本発明の一態様では、Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法は、２波長の蛍光を用いて、異なるＨＰＶ遺伝子型を、２種類の型特異的プライマーとインベーダープローブを用いて同じウェルで検出するように設定されている。本方法には以下に示す３つの大きな特徴がある。図２に、Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法の測定原理を示す。
（１）２種類のＨＰＶ遺伝子型を１ウェルで検出するマルチプレックス反応を行うことができる。
（２）型特異的な蛍光プローブを必要としない。
（３）相対定量解析のためのコントロールは遺伝子型ごとに高／低濃度の２種類のみである。
【００１０】
このように、本発明においては、前記相対定量方法において行うリアルタイムＰＣＲ法は、インベーダー・アッセイ法によるシグナルを指標としてＣｐ値が算出されるリアルタイムＰＣＲ法（Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法）で、ＨＰＶの定量を行うことが好適である。
【００１１】
また、本発明においては、リアルタイムＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面の各分割領域に対する、被験試料内のヒトパピローマウイルスの遺伝子型毎のＣｐ値の当てはめと、これにより決定された当てはめ値を基とした優勢型遺伝子の存在の判断、を行う手段を、アルゴリズム化されたソフトウエアにおいて行うことが可能である。図３（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）に、当該ソフトウエアを構成するコンピュータプログラムのフローシートの一例を示す。図３Ａのフローシートは、Ｃｐ値のランク値（上記の分割された平面領域の個々に割り当てられた記号）への割り当てと、これを用いた優勢遺伝子型の判定の過程の全体を示すものである。図３Ｂのフローシートは、図３Ａのフローシートの一部をなすものであって、個々の遺伝子型のＨＰＶ（ｘは遺伝子型の番号）について、上記２次元グラフにおける領域分けの過程の一例を示すものである。図３Ｃのフローシートもまた、図３Ａのフローシートの一部をなすものであって、試料において、個々の遺伝子型のＨＰＶについて得られたＣｐについて対応が確定した上記分割領域をランク値としてとらえた場合に、試料中最大のランク値（Ｃｐ値により最も多く試料中に存在する遺伝子型のＨＰＶ）であったものと最小のランク値であったもの（Ｃｐ値により最も少なく試料中に存在する遺伝子型のＨＰＶ）の差が１より大きい場合、すなわち、該当する分割された平面領域が隣り合っていない場合に、最大のランク値を得た遺伝子型のＨＰＶが、被験試料における優勢型のＨＰＶであることを導き出すフローシートである。また、これらの図３に示されたフローシートは、上記の図１Ｂに示されるリアルタイムＰＣＲ法により得られる、分割された二次元チャートに準じて作成され得るコンピュータプログラムの基となるフローシートの具体例である。
【００１２】
＜図３Ａ＞
図３Ａに示されたフローシート０は、コンピュータプログラム全体の過程を示している。開始端子を示すステップ１は、フローシート０に従って行われるプログラムの開始を示している。当該ステップ１は、コンピュータハードウエアにおいて当該プログラムの開始機能を付与するものである。
【００１３】
データを示すステップ２は、フローシート０に従って実行されるコンピュータプログラムに対して、処理されるべきデータのエントリー段階を示している。この処理されるべきデータとは、リアルタイムＰＣＲ法の実行装置からの出力データ、すなわち、当該装置から得られる測定値を示している。ここで、「測定値」とは、本発明の定量方法の基礎となる、検出対象となるＨＰＶについて、遺伝子型別にリアルタイムＰＣＲ法を行うことにより得られたＣｐ値である。
【００１４】
定義済み処理を示すステップ３は、遺伝子型ｘのランク値（Ｓｒａｎｋ）への変換への一連の処理を示しており、その具体的な内容は図３Ｂに示すものであり、後述する。ここで、遺伝子型を示すｘは、通常は自然数であるが、ＨＰＶの遺伝子型の実際の番号とは限らない。むしろ、日本人において典型的なＨＰＶの遺伝子型を選択して、その飛び番号を連続番号に修正してｘ値とすることが好適である。本例では、１４種類ＨＰＶの遺伝子型（１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６７及び６８型）を選んで、それぞれを、１以上の連続した自然数として割り当てて「ｘ値」としている。「ランク値」は、このｘ値に対応する遺伝子型のＨＰＶについてリアルタイムＰＣＲ法を行って、検体から得られたＣｐ値が属する「リアルタイムＰＣＲ法の二次元チャート平面において、熱サイクル数の範囲毎に分割された平面領域に割り振られた番号」である。図１Ｂを参照すると、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５及び＋６、のそれぞれの番号がランク値に相当する。ただし、後述するように、本例の場合には＋の記号はランク値から、便宜上除いている。当該ステップ３に従い、コンピュータプログラムがコンピュータハードウエアにおいて実行されることにより、当該コンピュータに、遺伝子型ｘのランク値（Ｓｒａｎｋ）への変換機能が実現される。
【００１５】
定義済み処理を示すステップ４は、上記の定義済み処理３により得られた、遺伝子型ｘに対して決定されたランク値の内容から、検体における優勢型のＨＰＶ遺伝子型を判定する処理であり、その具体的な内容は図３Ｃに示すものであり、後述する。当該ステップ４に従い、コンピュータプログラムがコンピュータハードウエアにおいて実行されることにより、当該コンピュータに、検体における優勢型のＨＰＶ遺伝子型を判定する機能が実現される。
【００１６】
データを示すステップ５は、定義済み処理により得られた、検体から検出された遺伝子型とその優勢型の有無又は種類についての結果を出力する段階を示している。結果の出力は、コンピュータのモニタ画面上であっても、打ち出し紙上であってもよい。また、必ずしも逐次この出力処理を行う必要はなく、コンピュータのハードディスク等の適切な記憶媒体に保存しておき、所望する時に出力を行うこともできる。当該ステップ５に従い、コンピュータプログラムがコンピュータハードウエアにおいて実行されることにより、当該コンピュータに、検体から検出された遺伝子型とその優勢型の有無又は種類についての結果を出力する機能が実現される。
【００１７】
なお、この出力段階では、遺伝子型ｘは、本来のＨＰＶの遺伝子型を示す番号表現（遺伝子型名）に戻すことが好適である。よって、ステップ５の前段階のステップとして、遺伝子型ｘを、本来のＨＰＶの遺伝子型名に対応させて割り当てるステップを設けることが好適である。当該遺伝子型名への割り当てステップに従い、コンピュータプログラムがコンピュータハードウエアにおいて実行されることにより、当該コンピュータに、遺伝子型ｘから、本来のＨＰＶの遺伝子型名に割り当てる機能が実現される。
【００１８】
終了端子を示すステップ６は、フローシート０に従って行われるプログラムの終了を示している。当該ステップ６は、コンピュータハードウエアにおいて当該プログラムの終了機能を付与するものである。
【００１９】
＜図３Ｂ＞
図３Ｂにおいて、開始端子３１は、上記の定義済み処理３の開始を示している。処理３２は、ｘの初期値１、すなわち、最初に定義済み処理３を行うＨＰＶの遺伝子型を指定する処理である。
【００２０】
準備を示すステップ３３は、ランク値の算出に必要な要素を定義付けて割り当てる段階である。具体的には、Ｐ３ｃｐ＿Ｇｘは、遺伝子型ｘの１０３陽性コントロールのＣｐ値であり、Ｐ７ｃｐ＿Ｇｘは、遺伝子型ｘの１０７陽性コントロールのＣｐ値である。本例では、１０７陽性コントロールのＣｐ値を「ランク値（＋）６」の閾値として設定している。すなわち、図１Ｂからもわかるように、本例のＣｐ値を与える蛍光強度は、フル強度の２５％程度で設定されている。これは、Ｃｐ値を求める上で標準的かつ好適な設定である。また、１０３陽性コントロールのＣｐ値は「ランク値（＋）１」の閾値として設定されている。さらに、Ｐ３＿７ｃｐ＿Ｇｘは、Ｐ３ｃｐ＿ＧｘからＰ７ｃｐ＿Ｇｘを引いて得られる値であり、Ｓｃｐ＿Ｇｘは、検体におけるＨＰＶの遺伝子型ｘにおけるＣｐ測定値である。
【００２１】
判断を示すステップ３４は、上記の測定値であるＳｃｐ＿Ｇｘについて、これがどのランク値となるかを判断する処理である。「Ｓｃｐ＿Ｇｘ＝Null」が添えられている、ｘ値をｘ＋１とする処理を示すステップ３５に移行する判断を示す矢印３４０は、ｘ値に相当する遺伝子型のＨＰＶが検体中に認められなかった場合の判断を示すものであり、この場合は、当然、ｘ値におけるランク値の割り当ては行わずに、次のｘ＋１値におけるランク値の割り当てに移行することを示している。
【００２２】
「Ｓｃｐ＿Ｇｘ＜Ｐ７ｃｐ＿Ｇｘ」が添えられている矢印の先は、ランク値を６とする（Ｓｒａｎｋ＿Ｇｘ＝６）とする処理を示すステップ３４１であり、ここに移行する判断処理を示している。計測されたＣｐ値が１０７陽性コントロールのＣｐ値より小さい場合は、当該値は１０７陽性コントロールが示す閾値よりも小さいので、ランク値を最大の「６」とすることを意味する。
【００２３】
「Ｓｃｐ＿Ｇｘ＜Ｐ７ｃｐ＿Ｇｘ＋１／４＊Ｐ３＿７ｃｐ＿Ｇｘ」が添えられている矢印の先は、ランク値を５とする（Ｓｒａｎｋ＿Ｇｘ＝５）とする処理を示すステップ３４２であり、ここに移行する判断処理を示している。計測されたＣｐ値が、１０７陽性コントロールが示す閾値に、上述したＰ３ｃｐ＿ＧｘからＰ７ｃｐ＿Ｇｘの差の１／４（すなわち、上記の１０３と１０７陽性コントロールのＣｐ値の閾値に挟まれた、Ｃｐ値の絶対値の小さい方から数えて最初の４等分値）を加算した値よりも小さい場合は、当該Ｃｐ値は、上述したランク値６に属するＣｐ値以上（既に上記の処理を示すステップ３４１を行っているので、ランク値６をとる可能性は無くなっている）、かつ、ランク値６に属するＣｐ値に当該最初の４等分値を加算した値がとり得る最大のＣｐ値よりも小さい場合の範囲にあるので、ランク値を６より一つ少ない「５」とすることを意味する。
【００２４】
「Ｓｃｐ＿Ｇｘ＜Ｐ７ｃｐ＿Ｇｘ＋１／２＊Ｐ３＿７ｃｐ＿Ｇｘ」が添えられている矢印の先は、ランク値を４とする（Ｓｒａｎｋ＿Ｇｘ＝４）とする処理を示すステップ３４３であり、ここに移行する判断処理を示している。計測されたＣｐ値が、１０７陽性コントロールが示す閾値に、上述したＰ３ｃｐ＿ＧｘからＰ７ｃｐ＿Ｇｘの差の１／２（すなわち、上記の１０３と１０７陽性コントロールのＣｐ値の閾値に挟まれた、Ｃｐ値の絶対値の小さい方から数えて２つ目の４等分値）を加算した値よりも小さい場合は、当該Ｃｐ値は、上述したランク値６と５に属するＣｐ値以上（既に上記の処理を示すステップ３４１と３４２を行っているので、ランク値６と５をとる可能性は無くなっている）、かつ、ランク値６に属するＣｐ値に当該２つ目の４等分値を加算した値がとり得る最大のＣｐ値よりも小さい場合の範囲にあるので、ランク値を５より一つ少ない「４」とすることを意味する。
【００２５】
「Ｓｃｐ＿Ｇｘ＜Ｐ７ｃｐ＿Ｇｘ＋３／４＊Ｐ３＿７ｃｐ＿Ｇｘ」が添えられている矢印の先は、ランク値を３とする（Ｓｒａｎｋ＿Ｇｘ＝３）とする処理を示すステップ３４４であり、ここに移行する判断処理を示している。計測されたＣｐ値が、１０７陽性コントロールが示す閾値に、上述したＰ３ｃｐ＿ＧｘからＰ７ｃｐ＿Ｇｘの差の３／４（すなわち、上記の１０３と１０７陽性コントロールのＣｐ値の閾値に挟まれた、Ｃｐ値の絶対値の小さい方から数えて３つ目の４等分値）を加算した値よりも小さい場合は、当該Ｃｐ値は、上述したランク値６〜４に属するＣｐ値以上（既に上記の処理を示すステップ３４１と３４２と３４３を行っているので、ランク値６と５と４をとる可能性は無くなっている）、かつ、ランク値６に属するＣｐ値に当該３つ目の４等分値を加算した値がとり得る最大のＣｐ値よりも小さい場合の範囲にあるので、ランク値を４より一つ少ない「３」とすることを意味する。
【００２６】
「Ｓｃｐ＿Ｇｘ＜Ｐ３ｃｐ＿Ｇｘ」が添えられている矢印の先は、ランク値を２とする（Ｓｒａｎｋ＿Ｇｘ＝２）とする処理を示すステップ３４５であり、ここに移行する判断処理を示している。計測されたＣｐ値が、１０３陽性コントロールが示す閾値よりも小さい（すなわち、上記の１０３と１０７陽性コントロールのＣｐ値の閾値に挟まれた、Ｃｐ値の絶対値の小さい方から数えて４つ目の４等分値）を加算した値よりも小さい場合は、当該Ｃｐ値は、上述したランク値６〜３に属するＣｐ値以上（既に上記の処理を示すステップ３４１と３４２と３４３と３４４を行っているので、ランク値６と５と４と３をとる可能性は無くなっている）、かつ、ランク値６に属するＣｐ値に当該４つ目の４等分値を加算した値がとり得る最大のＣｐ値よりも小さい場合の範囲にあるので、ランク値を３より一つ少ない「２」とすることを意味する。
【００２７】
上記の処理を示すステップ３４１、３４２、３４３、３４４及び３４５以外の場合、すなわち、前記４等分値の範囲内（１０３陽性コントロールが示す閾値）よりもＣｐ値が大きい場合は、ランク値を１とする（Ｓｒａｎｋ＿Ｇｘ＝１）とする処理を示すステップ３４６がなされる。
【００２８】
これらの処理を示すステップ３４１〜３４６がなされて、ＨＰＶの遺伝子型ｘに与えられたランク値１〜６が当て嵌められ、次のステップ３５に移行する。
【００２９】
次いで、上記のｘ値をｘ＋１とする処理を示すステップ３５が行われる。判断を示すステップ３６は、ｘ値が１５より小さいか否かを判断する処理である。本例の場合、対象となるＨＰＶの遺伝子型の種類は１４種であるため、上記の判断を示すステップ３４〜処理を示すステップ３５の工程を行う回数は１４回となる。よって、ｘが１５より小さい（実質的には１４以下）の場合には、準備を示すステップ３３にループして戻り、ｘが１５より小さくない（１５以上）の場合には、定義済み処理を示すステップ３は終了する（終了端子を示すステップ３７）。
【００３０】
＜図３Ｃ＞
図３Ｃにおいて、開始端子を示すステップ４１は、上記の定義済み処理を示すステップ４の開始を示している。準備を示すステップ４２は、優勢型の有無又は優勢型に該当するＨＰＶの遺伝子型を判定するために必要な要素を定義付けて割り当てる段階である。定義済み処理を示すステップ３にて得られた各遺伝子型のランク値（Ｓｒａｎｋ）の最大値をＭａｘ＿ｒａｎｋ、同最小値をＭｉｎ＿ｒａｎｋとする。
【００３１】
判断を示すステップ４３は、Ｍａｘ＿ｒａｎｋとＭｉｎ＿ｒａｎｋとの差が１よりも大きいか否か（実質的には２以上か否か）をするための判断処理を表している。当該差が１よりも大きくない（実質的には１又は０）である場合には、「優性遺伝子型なし」とする確定処理を示すステップ４４がなされ、当該差が１よりも大きい（実質的には２以上）場合には、「ランク値がＭａｘ＿ｒａｎｋである１種以上のＨＰＶの遺伝子型」を「優勢型」と判定する確定処理を示すステップ４５に移行する。これらの確定処理を示すステップ４４と４５を経て、定義済み処理を示すステップ４は終了する（終了端子を示すステップ４６）。
【００３２】
このフローシート０のアルゴリズム、又は、これと実質的同一の内容を有するアルゴリズムに基づくコンピュータプログラムは、これを全体として、又は、さらに他のコンピュータプログラムの一部として、コンピュータハードウエアにおいて実行することにより、本発明の相対定量方法を行うことができる。「他のコンピュータプログラムの一部として」とは、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を行うためのプログラムに、上記のコンピュータプログラムの工程を付加する場合等が想定される。さらに具体的には、リアルタイムＰＣＲ法を行うことに伴い、リアルタイムＰＣＲ法を行うためのプログラムを実行することにより得られるＣｐ値を、検出対象としたＨＰＶの遺伝子型に割り当てるステップをコンピュータプログラムにおいて設け、当該割り当てステップを、上記の開始を示すステップ１又はデータを示すステップ２の上流に付加することにより、リアルタイムＰＣＲ法を行うためのコンピュータプログラムの一部として、上記の本発明に係わるコンピュータプログラムを含めることが可能となる。
【００３３】
上記の全ての本発明に係わるコンピュータプログラムは、一般的なコンピュータプログラム言語により、所望するアルゴリズムを構築して作出することができる。
【００３４】
コンピュータプログラム言語として、例えば、機械語、アセンブラ言語等の低水準言語；Ｆｏｒｔｒａｎ、ＡＬＧＯＬ、ＣＯＢＯＬ、Ｃ、ＢＡＳＩＣ、ＰＬ／Ｉ、Ｐａｓｃａｌ、ＬＩＳＰ、Ｐｒｏｌｏｇ、ＡＰＬ、Ａｄａ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）等の高水準言語；第４世代言語、エンドユーザー言語等を選択して用いることが可能である。また、必要に応じて、特殊問題向き言語を用いることもできる。
【００３５】
本発明は、上記のようなコンピュータプログラムを提供し、このコンピュータプログラムに基づく、本ソフトウエアが格納された電子媒体をも提供する。
【００３６】
本ソフトウエアを格納可能な電子媒体は、特に限定されず、例えば、磁気テープ、磁気ディスク、ＣＤ‐ＲＯＭ、ＣＤ‐Ｒ、ＣＤ‐ＲＷ、ＭＯ、ＤＶＤ‐Ｒ、ＤＶＤ＋Ｒ、ＤＶＤ‐ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ‐ＲＯＭ、ＵＳＢチップ等を用いることができる。
【００３７】
上記の本発明に係わるコンピュータプログラムは、処理装置において実行される。当該処理装置を、コンピュータを用いて構成する場合の一実施例を、図４としてここに示す。図４は、当該処理装置の構成のブロック図である。
【００３８】
処理装置７０は、コンピュータのハードウエアを構成する。８０は、基礎データの供給源であり、具体的には、リアルタイムＰＣＲ法の測定装置や、当該測定装置により蓄積された基礎データのデータベースが該当する。ここで基礎データとは、本発明に係わるコンピュータプログラムを実行するための基礎データであり、上記の「測定値」と同意義であり、検出対象となるＨＰＶについて、遺伝子型別にリアルタイムＰＣＲ法を行うことにより得られたＣｐ値と当該遺伝子型の組情報である。
【００３９】
処理装置７０の基本的な構成は、第１のインターフェース７１、演算処理部７２、一時記憶部７３、記録部７４、内部バス７５、第２のインターフェース７６、操作部７７、及び、表示部７８、となっている。第１のインターフェース７１、演算処理部７２、一時記憶部７３、記録部７４、及び、第２のインターフェース７６は、内部バス７５によりデータの交換が可能となっている。操作部７７は、演算処理部７２に対する指示やデータを入力するための手段であり、コンピュータ用のキーボード、マウス、タッチパネル等が例示される。表示部７８は、演算処理部７２による処理結果等を表示する手段であり、典型的にはコンピュータディスプレイが例示される。また、演算処理部７２はＣＰＵを、一時記憶部７３にはＲＡＭを、記録部７４にはハードディスクドライブを用いることができる。第１のインターフェース７１は、典型的には通信インターフェースであり、ＬＡＮ、イントラネット、インターネット等のネットワーク、あるいは、直接データ接続手段を介して、基礎データ供給源である８０からの基礎データのデータ交換を行う。また、第２のインターフェース７６は、入出力のインターフェースであり、操作部７７の種類に応じたシリアル若しくはパラレルインタフェースを用いることができる。また、第２のインターフェース７６は、ビデオメモリとＤＡ変換部を備えて、表示部７８のビデオ方式に応じたアナログ信号を出力することによって、表示部７８に情報を表示するための画像が表示される。また、表示部７８における表示に代えて、プリンタによる紙出力表示に変更することも可能である。
【００４０】
演算処理部７２は、操作部７７が操作されるに伴い、第１のインターフェース７１を介して、基礎データ供給源８０から基礎データを取得して、記録部７４に記録し、適宜記録部７４からデータを一時記憶部７３に読み出し、所定の処理、典型的には、図３（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）のフローシート０に基づくコンピュータプログラムによる処理を行った後、その結果を記録部７４に記録する。また、演算処理部７２は、操作部７７の操作を促す画面データや処理結果を表示する画面データを提供し、第２のインターフェース７６のビデオＲＡＭを介して、これらの画像を表示部７８に表示する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、被験試料における優勢型ＨＰＶを、簡便かつ正確に検出可能な、リアルタイムＰＣＲ法を用いた相対定量方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】リアルタイムＰＣＲ法を行うにあたって、遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す、比較例として用いるべき二次元チャート平面である。
【図１Ｂ】本発明にかかわる遺伝子増幅産物量と熱サイクル数の関係を示す二次元チャート平面である。
【図２】Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法の測定原理を示す図面である。
【図３Ａ】本発明にかかわるコンピュータプログラムのフローシートの一例（全体構成）である。
【図３Ｂ】本発明にかかわるコンピュータプログラムのフローシートの一部であって、ＨＰＶの遺伝子型の測定値をランク値とする定義済み処理を示している。
【図３Ｃ】本発明にかかわるコンピュータプログラムのフローシートの一部であって、優勢遺伝子型の判定を行う定義済み処理を示している。
【図４】本発明の処理装置の構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明のＨＰＶ遺伝子型判定における感度と効果を示すために、ＨＰＶ陽性検体を用いてシーケンス解析と比較試験を行った。
【００４４】
＜材料と方法＞
（１）コントロールＤＮＡ
ＨＰＶ  １６とＨＰＶ  １８のゲノムＤＮＡはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した。ＤＮＡ濃度はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。各コピー数はＤＮＡ濃度とゲノムサイズから算出した。ＨＰＶ−ＤＮＡは希釈し、測定の陽性コントロールとして使用した。
【００４５】
（２）臨床サンプル
１８２例の液状細胞診検体は茨城県衛生研究所より入手した。サンプリングにはＣｅｒｖｅｚ−Ｂｒｕｓｈ  （Ｒｏｖｅｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＯＳＳ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）  を使用した。検体の取り扱いは茨城県衛生研究所の倫理委員会規定に準じた。
【００４６】
（３）ＨＰＶ−ＤＮＡの抽出
５００μｌの液状細胞診検体からシリカメンブレン法（文献: Riemann K, Adamzik M, Frauenrath S, Egensperger R, Schmid KW, Brockmeyer NH, Siffert W. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J Clin Lab Anal. 2007;21(4):244-8.）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００４７】
（４）ＨＰＶ−ＤＮＡのクローニングによるコントロールプラスミドＤＮＡの作製
相対定量解析及び検出感度の検討のために液状細胞診検体から得た各遺伝子型ＨＰＶ−ＤＮＡをコンセンサスプライマーであるＬ１Ｃ１／Ｃ２プライマー（Ｌ１Ｃ１：５’−CGTAAACGTTTTCCCTATTTTTTT-３’（配列番号１）、 Ｌ１Ｃ２−１：５’−TACCCTAAATACTCTGTATTG-３’ （配列番号２）、 Ｌ１Ｃ２−２：５’−TACCCTAAATACCCTATATTG-３’ （配列番号３））を用いて増幅した。ＰＣＲ産物はｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジー社）を用いてクローニングし、３１３０  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてダイデオキシ法によりシーケンス解析を行った。各コントロールプラスミドの配列はＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ｄａｔａｂａｓｅのＢＬＡＳＴ検索により確認した。
【００４８】
（５）プライマー・インベーダープローブの設計
各遺伝子型の特異的プライマーはコントロールプラスミドに組み込んだ領域内にそれぞれ設計した。インベーダープローブはＩｎｖａｄｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃｒｅａｔｏｒを用いて増幅領域内に設計した（表１及び表２）。
【００４９】
【表１】
2011019512.tif 000002
【００５０】
上記表１に示したプライマーとインベーダープローブの塩基配列は、上から順に、配列番号４〜３１を割り当て、これを別添の配列表に示した。
【００５１】
【表２】
2011019512.tif 000003
【００５２】
上記表２に示したプライマーとインベーダープローブの塩基配列は、上から順に、配列番号３２〜５９を割り当て、これを別添の配列表に示した。
【００５３】
上記表１及び表２において、
「F-primer」は、Forward primerを意味するものであり、「R-primer」は、Reverse primerを意味するものであり、「P-probe」は、primary probeを意味するものであり、「I-oligo」は、Invader oligoを意味するものである。
【００５４】
また、下線を引いた配列は、プローブの５’フラップ配列(the 5' flap of probe)を示している。さらに、太文字の配列は、プライマリープローブの開裂部分(the cleavage site)を示している。全てのプライマリープローブの３’末端は、アミノ基により保護されている(Amino-blocked)。参考のために、各ＨＰＶのゲノムＤＮＡの配列のＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号を記載する。
【００５５】
HPV 16; GenBank accession no. NC_001526,
HPV 18; GenBank accession no. NC_001357,
HPV 31; GenBank accession no. J04353,
HPV 33; GenBank accession no. M12732,
HPV 35; GenBank accession no. M74117,
HPV 39; GenBank accession no. M62849,
HPV 45; GenBank accession no. X74479,
HPV 51; GenBank accession no. M62877,
HPV 52; GenBank accession no. X74481,
HPV 56; GenBank accession no. X74483,
HPV 58; GenBank accession no. D90400,
HPV 59; GenBank accession no. X77858,
HPV 67; GenBank accession no. D21208,
HPV 68; GenBank accession no. DQ080079
【００５６】
内在性コントロールとしてベータグロビンを検出するプライマーとインベーダープローブを、下記の内容で設計した。
forward primer: 5′- CAACTTCATCCACGTTCACC -3′（配列番号６０）
reverse primer: 5′- GAAGAGCCAAGGACAGGTAC -3′（配列番号６１）
primary probe: 5′- ACGGACGCGGAGGTGTTCACTAGCAACCT<amino> -3′（配列番号６２）
Invader oligo: 5′- CAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTC -3′（配列番号６３）
プライマリープローブの下線部はインベーダー反応におけるflapプローブを現している。
【００５７】
（６）Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法を用いた相対定量解析
１４のＨＰＶ遺伝子型の相対定量解析は改変したＱ−Ｉｎｖａｄｅｒ法を用いて行った。１反応２色の蛍光検出は２種類の共通蛍光プローブが含まれているＣｌｅａｖａｓｅ  ＸＩ  Ｉｎｖａｄｅｒ  ｃｏｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔを用いることで可能となる。最も効率よく測定を行えるよう、７ウェルで同時に１４の遺伝子型を測定した。遺伝子型の組み合わせは次のとおり：ウェル１：  ５１と１６、ウェル２：  ５６と３５、ウェル３：  １８と５８、ウェル４：  ３９と５９、ウェル５：  ４５と３１、ウェル６：  ５２と３７、ウェル７：６８と６７。
【００５８】
５−１００ｎｇのテンプレートＤＮＡを２種類の遺伝子型を増幅するためのプライマー、５０μＭ  のｄ−ＮＴＰ、７００ｎＭの各プライマリープローブ、７０−ｎＭの各インベーダーオリゴ、２Ｕ  のＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｇｏｌｄ）及びＣｌｅａｖａｓｅ  ＸＩ  Ｉｎｖａｄｅｒ  ｃｏｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔを含んだ１２μｌの反応試薬に加え、３８４ウェルのＰＣＲプレートを用いて反応させる。測定機器にはＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０を用い、反応条件は９５℃で１０分間熱処理した後、９５℃  ３０秒、６５℃  ６０秒、５０℃  ３０秒、７２℃  ３０秒の４−ステップＰＣＲを３５サイクル行った。ＦＡＭ  （ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）  （ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ／ｂａｎｄｗｉｄｔｈ：  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，  ４８５／２０  ｎｍ；  ｅｍｉｓｓｉｏｎ，  ５３０／２５  ｎｍ）と  ＲＥＤ  （ＲＥＤｍｏｎｄ  ＲＥＤ）  （ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，  ５６０／２０  ｎｍ；  ｅｍｉｓｓｉｏｎ，  ６２０／４０  ｎｍ）の２つの蛍光値は典型的なリアルタイムＰＣＲと同様に毎ＰＣＲサイクルの６５℃となるステップの最後に読み取った。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０ソフトウェアを用いてフィットポイント法により解析し、各遺伝子型のＣｐ値を求めた。
【００５９】
（７）Ｌ１Ｃ１／２プライマー及び型特異的プライマーを用いたシーケンス
Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法において単一遺伝子型のＨＰＶが検出された臨床検体についてはＬ１Ｃ１／２プライマーを用いたシーケンス解析により遺伝子型を確認した。一方、複数の遺伝子型が検出された検体についてはＬ１領域に設計した型特異的フォワードプライマーとＰＧＭＹ  ０９プライマーを用いたシーケンス解析により遺伝子型を確認した。
【００６０】
（８）検出感度及び再現性の検討
各遺伝子型のプラスミドを用いて本法の検出感度について検討した。検出下限については、各プラスミドを１０の３乗コピー〜１０の７乗コピーに調製し検討した。また、１０の３乗コピー及び１０の７乗コピーの各遺伝子型プラスミドをｎ＝５で３回測定し、再現性について検討した。重複感染における相対定量解析については異なる遺伝子型のプラスミドを混合して検討した。混合する際に相対比率の少ない遺伝子型のコピー数は５０００コピーとした。
【００６１】
＜結果＞
（１）検出感度と再現性
１０の３乗コピーから１０の７乗コピーまで濃度依存的な測定が可能であった。本測定系の測定感度は反応あたり１０００コピーであった。１０の３乗コピー及び１０の７乗コピーの各遺伝子型プラスミドの再現試験における平均Ｃｐ値と標準偏差は表３に示した。各Ｃｐ値のＣ．Ｖ．は０．７％−４．６％であった。
【００６２】
【表３】
2011019512.tif 000004
【００６３】
（２）相対定量解析
重複感染例における各遺伝子型の遺伝子型の相対比を求めるために相対定量解析を試みた。各遺伝子型について、高濃度及び低濃度コントロールのＣｐ値を基に相対定量値を６個のエリアに分割した（＋６；Ｃｐ値＞高濃度コントロール、＋５〜＋２；高濃度コントロール＞Ｃｐ値＞低濃度コントロール、＋１；低濃度コントロール＞Ｃｐ値）。＋５〜＋２は、Ｃｐ値基準で等分割を行った。Ｃｐ値の基準となる蛍光強度はフル強度の２５％値とした。
【００６４】
相対定量解析の検討は異なる遺伝子型のプラスミドを用いて行った。反応液中に異なる遺伝子型のプラスミドが等量含まれていた場合にも等しい相対定量値が得られた。しかしながら、異なる遺伝子型のプラスミドを１０倍以上の混合比で調製したテンプレートでは、混合比に比例した相対定量値の差が生じた。
【００６５】
（３）臨床検体におけるＨＰＶ遺伝子型の判定（１）
１８２例の子宮頸部擦過物を本系により測定した。１３１例にＨＰＶ陽性となり、このうち１０４例は単一遺伝子型、２７例からは複数の遺伝子型が検出された。同一検体中の遺伝子型の数は最も多いもので４であった。単一遺伝子型感染例については、Ｌ１Ｃ１／Ｃ２プライマーを用いたシーケンス解析により遺伝子型を確認した。本測定系とシーケンス解析の一致率は８１例（７７．９％）であった。残りの２３例についてはシーケンス解析において本系で判定できる１４遺伝子型以外の配列が現れるか、もしくは複数の遺伝子型の配列が重なり配列が読み取れないといったことから確認できなかった。そのため、確認できなかった２３例については遺伝子型特異的プライマーを用いて再度シーケンス解析を行い、本測定系の結果と一致することを確認した。複数の遺伝子型を含む２７例における本測定系の相対定量解析の結果は表４に示した。
【００６６】
【表４】
2011019512.tif 000005
【００６７】
表４によると、優勢型の存在が確認されたサンプルIDは、９５番（１６型が優勢型）、１２２番（１６型が優勢型）、１４８番（１６型が優勢型）、７１番（１８型が優勢型）、５５番（５２型が優勢型）、２７番（５２型が優勢型）、４９番（６７型が優勢型）、及び、１１８番（６８型が優勢型）、であった。
【００６８】
（４）臨床検体におけるＨＰＶ遺伝子型の判定（２）
上記判定試験（１）とは別個に、４２８例の子宮頸部擦過物について細胞診を行い、これと並行して、本系による測定を行った。本系による測定の結果、２３０例はＨＰＶ陽性と測定され、このうち１６４例は単一遺伝子型、６６例からは複数の遺伝子型が検出された。その詳細を、細胞診の結果と併せて表５に示す。なお、表５において、
「Normal」は、陰性を示し、炎症を限度とし、非腫瘍性所見を伴う事例を示す。異常なし（定期検査レベル）である。「ASC-US」は、意義不明な異型扁平上皮細胞が認められる事例であり、緩和された要精密検査レベルである。「ASC-H」は、高度扁平上皮内病変の疑いが認められる異型扁平上皮細胞が認められる事例を示す。厳格な要精密検査レベルである。「LSIL」は、軽度の扁平上皮内異形成が認められる事例を示す。厳格な要精密検査レベルである。「HSIL」は、高度扁平上皮内病変が認められる事例を示す。厳格な要精密検査レベルである。「SCC」は、扁平上皮癌が認められる事例を示す。厳格な要精密検査レベルである。「AGC」は、異型腺細胞が認められる事例であり、厳格な要精密検査レベルである。「Adenocarcinoma」は、浸潤腺癌が認められる事例であり、厳格な要精密検査レベルである。
【００６９】
【表５】
2011019512.tif 000006
【００７０】
表５により、ＨＰＶの感染率は、細胞診の評価がＡＳＣ−ＵＳの段階以上に細胞の異型化（悪性度）が進むと、急激に上がることが明らかとなった。また、ＨＰＶの複合感染は、特に、上皮細胞系の細胞異型に伴い認められることが明らかになった。
また、表６に、ＨＰＶ感染が陽性と認められた検体における、ＨＰＶの遺伝子型(ＨＰＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ)別の感染者数（（  ）内％）を、上記の細胞診の評価別に示した。
【００７１】
【表６】
2011019512.tif 000007
【００７２】
表６の結果より、特に、１６型と５２型は、細胞診の悪性度が上がると共に、陽性率が高くなっていることが認められた。
【００７３】
さらに、表７に、ＨＰＶの複合感染が認められた例の内訳を開示した。表中、グループ１は、Ｎｏｒｍａｌ，ＡＳＣ−ＵＳ及びＡＳＣ−Ｈからなる群であり、グループ２は、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ及びＳＣＣからなる群である。また、「Ｄ」とは、その複合感染の組み合わせにおいて、本系における「優勢型」として検出されたＨＰＶの遺伝子型を示している。例えば、ＡＳＣ−ＵＳの複合感染において、「３３Ｄ  ６７」とあるのは、「ＨＰＶの３３型と６７型の複合感染が認められ、かつ、３３型は本系による優勢型として検出された」ことを示している。
【００７４】
【表７】
2011019512.tif 000008
【００７５】
表７の内容から、それぞれの細胞診の悪性度について、全検体数当たりの「優勢型を伴う複合感染」の割合（％）を求めると、下記のようになる。
＜グループ１＞
（１）Ｎｏｒｍａｌ：  ０／１４７→０％
（２）ＡＳＣ−ＵＳ：  ５／８９→５．６％
（３）ＡＳＣ−Ｈ：  １／１６→６．３％
＜グループ２＞
（４）ＬＳＩＬ：  １８／７０→２５．７％
（５）ＨＳＩＬ：  １４／８１→１７．３％
（６）ＳＣＣ：  １／１０→１０％
【００７６】
この結果より、細胞診の悪性度が上がるにつれて、特に、ＬＳＩＬとＨＳＩＬにおける、優勢型を伴うＨＰＶの複合感染の頻度が高くなることがわかる。このように、本発明により優勢型を伴うか否かを検出することにより、疑い群の比率を下げて、より子宮頸癌のリスクが高い、グループ２（異形成進行群）であることを判定する効率を高めることができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
子宮頸癌のリスク診断において、ＨＰＶの迅速な検出及び遺伝子型判定は重要となっている。これまで迅速、正確、安価に重複感染例におけるハイリスクＨＰＶの各遺伝子型の相対比まで示すことは出来なかった。本発明の解析法では、ＨＰＶの重複感染例におけるハイリスクＨＰＶについての相対定量解析を可能とした。実施例では、各遺伝子型のＰＣＲプライマーとインベーダープローブはＬ１遺伝子領域に設定したところ、全ての遺伝子型について少なくとも１０の３乗コピーから１０の７乗コピーまで測定レンジを得る事が出来た。コントロールプラスミドを用いた再現性試験の結果は良好であった（ＣＶ値：０．７−４．６）。子宮頸部擦過物からＨＰＶ−ＤＮＡを抽出する場合、大量のヒト由来ＤＮＡが混入するので、ヒト由来ＤＮＡの影響を調べるために、コントロールプラスミドに１００ｎｇのヒト由来ＤＮＡを加えて検討したが、Ｃｐ値に変化は認められなかった。
【００７８】
ＨＰＶの重複感染は、子宮頸部で高頻度に認められる。それ故に、本発明においては、ＨＰＶの重複感染における各遺伝子型の相対比率を求めるために、相対定量法が提供される。相対定量値は各遺伝子型のＣｐ値より算出される。本発明の方法では、多くのコントロールを必要としないことを一つの特徴とする。各遺伝子型のプラスミドを用いた検討では、テンプレートＤＮＡの量に応じた相対定量値を得ることが可能であった。高リスク型ＨＰＶを含む１０４例の臨床検体を用いた検討では、Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法とコンセンサスおよび型特異的プライマーを用いたシーケンス解析により、ＨＰＶの遺伝子型を判定した。Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法とシーケンス解析の結果は全てのサンプルについて一致した。１０４例中の２７例ではハイリスク型ＨＰＶによる重複感染を確認した。重複している遺伝子型の数は２種類から４種類までと様々であったが、２種類が最も多く８１．５％であった。
【００７９】
また、実施例では、ハイリスク型ＨＰＶの様々な組み合わせにおける相対比を測定した。子宮頸部におけるＨＰＶの重複感染と細胞学的悪性度の関係は明らかとなっていない。しかしながら、重複感染における相対比率のモニタリングは、治療を進めるうえでＨＰＶの動態を理解するために重要と思われる。感染したＨＰＶの多くは一過性であり、免疫により自然に消失するが、ハイリスク型ＨＰＶが持続感染することで子宮頸癌が発生する。欧米では１６、１８、３１、３３及び４５型が子宮頸癌における典型的なハイリスク型であるが、本邦では、さらに、５２、５８型が高頻度に子宮頸癌で検出される。液状細胞診検体を用いたＨＰＶ遺伝子型判定は子宮頸癌の診断において一般的になってきている。将来、重複感染の研究がリスク診断において重要となってくると思われる。
【００８０】
さらに、実施例では、優勢型を伴う重複感染例では、より癌移行が疑われる「異形成進行群」を、本発明により的確にスクリーニングすることが可能であることが明らかとなった。
【００８１】
以上のように、本発明は、子宮頸癌に関連するＨＰＶの感染の深刻度を、より迅速、正確、安価に判定することが可能であり、産業上の有用性が明らかとなった。
【図１Ａ】
2011019512.tif 000009
【図１Ｂ】
2011019512.tif 000010
【図２】
2011019512.tif 000011
【図３Ａ】
2011019512.tif 000012
【図３Ｂ】
2011019512.tif 000013
【図３Ｃ】
2011019512.tif 000014
【図４】
2011019512.tif 000015
【配列表】
2011019512000001.app