(57)【要約】      （修正有）【課題】神経変性疾患の治療を必要とする患者を治療する方法の提供。【解決手段】トリグリセリドエステルとしてγ−リノレン酸残基およびリノレン酸残基の両方を含有するトリグリセリドオイルの治療上有効な用量を投与することを含んでなり、トリグリセリドのｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基のリノレン酸残基に対する比率が少なくとも０．８であり；ｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基の量が少なくとも１８％であり、該オイルが治療レベルで患者においてＴＧＦ−β１レベルを維持するかまたは上昇させるのに十分な用量で投与される、前記方法。好ましいオイルは、少なくとも３５％のｓｎ−２位脂肪酸残基をγ−リノレン酸として有するルリジサオイルまたは真菌オイルである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の治療を必要とする患者を治療する方法であって、トリグリセリドエステルとしてγ−リノレン酸残基およびリノレン酸残基の両方を含有するトリグリセリドオイルの治療上有効な用量をその患者に投与することを含んでなり、トリグリセリドのｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基のリノレン酸残基に対する比率が少なくとも０．８であり；ｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基の量が少なくとも１８％であり、ここで該オイルが治療レベルで患者においてＴＧＦ−β１レベルを維持するかまたは上昇するのに十分な用量で投与される、前記方法。
【請求項２】
１８か月の毎日の服用の後に、治療レベルが患者の血液中において少なくとも０．５のＴＧＦ−β１／ＴＮＦ−α比率を産生するような、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
比率が少なくとも０．７５である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
比率が少なくとも１である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
投与されるオイルの量が、１日当たり３から３０グラムの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
オイルが経口で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
用量が、オイルの他のγ−リノレン酸含量を除き、ｓｎ−２位における残基として、少なくとも１グラムのγ−リノレン酸残基を投与するために十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オイルの用量においてｓｎ−２位でのγ−リノレン酸の量が、少なくとも２グラムの前記ｓｎ−２  γ−リノレン酸を投与するために十分である、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
用量が８から２０グラムの間である、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
γ−リノレン酸脂肪酸残基およびリノレン酸脂肪酸残基に加えて、トリグリセリドが、非構造的であるエステル化脂肪酸を含む、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
トリグリセリドが、オレイン酸残基を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
オイルが、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）およびボラゴ（Ｂｏｒａｇｏ）属の種からなる群より選択される真菌または植物から得られるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
真菌または植物が、ムコール  ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）およびルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
オイルが、ｓｎ−２位でのエステル化γ−リノレン酸のパーセンテージが、その位での脂肪酸残基の少なくとも３５％である、ボラゴ属のオイルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ｓｎ−２位でのエステル化γ−リノレン酸のパーセンテージが、その位での脂肪酸残基の少なくとも３９％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｓｎ−２位でのエステル化γ−リノレン酸のパーセンテージが、その位での脂肪酸残基の少なくとも４５％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｓｎ−１位およびｓｎ−３位における脂肪酸残基が、リノレン酸残基、オレイン酸残基およびγ−リノレン酸残基を含む、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
トリグリセリドオイルが、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位の一方または両方において１２％を越えるオレイン酸含量を有する、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
オイルが、ケカビ属のオイルであり、そしてｓｎ−２位でのエステル化γ−リノレン酸残基の全パーセンテージが、その位での脂肪酸残基の少なくとも２０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
トリグリセリドオイルが、４５％を越えるｓｎ−２脂肪酸残基をオレイン酸残基として有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
トリグリセリドオイルが、５０％を越えるｓｎ−２脂肪酸をオレイン酸残基として有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
トリグリセリドオイルが、５％未満の単一不飽和（ｍｏｎｏｅｎｏｉｃ）脂肪酸残基を全脂肪酸残基％として含有する、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
トリグリセリドオイルが、全脂肪酸残基のパーセンテージとして、全体で５％未満のエルカ酸（２２：１ｎ−９）、２４：１ｎ−９（ネルボン酸）および２０：１ｎ−９（ガドレイン酸）を含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酸の量が、オイルにおける脂肪酸残基の１％から５％の間である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
オイルが追加のビタミンＥを有さない、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
ビタミンＥの量が０から０．１ｍｇ／ｇの間である、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
神経変性疾患を抑止し、または神経機能が回復する、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
治療が頭部外傷、脳梗塞および頭蓋内出血に関連する多発性硬化症または変性続発症のためである、前述の請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
治療が損傷を修復する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
治療が筋痙直および／または筋疼痛を緩和するために十分な用量を使用する、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項３１】
用量が認知機能を改善するために十分である、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項３２】
用量が再発を排除するために十分である、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項３３】
用量が１年の治療期間に渡る、少なくとも１ユニットによって、患者のＥＤＳＳスコアを改善するために十分である、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項３４】
用量が１年の治療期間に渡って、２．５より上のＥＤＳＳを有する患者のＥＤＳＳを、２よりも下に回復するために十分である、請求項１または２８に記載の方法。
【請求項３５】
神経変性疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし３４のいずれか１つに記載のオイルの使用。
【請求項３６】
神経変性疾患の治療のための医薬組成物であって、請求項１４ないし２６のいずれか１つに記載のボラゴ属またはケカビ属の種のトリグリセリドオイルを含んでなる、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、神経変性状態を治療するための方法、特にトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、特にＴＧＦ−β１、の増加が有益なものに関する。さらに特に、本発明は頭部外傷、脳梗塞および頭蓋内出血に関連する多発性硬化症および変性続発症のような状態の治療を提供し、それによりニューロンの機能は機能が損なわれた状態から改善しまたは回復する。さらに提供されるのは、そのような状態を有効に治療することができる、さらに特に神経学的機能の回復に関して、以前に達成されていないレベルの成功を達成することができる、医薬の製造のための不飽和脂肪酸部分を含んでなる公知のおよび新規の化合物の新規の使用である。
【０００２】
ｎ−３およびｎ−６の不飽和パターンの必須脂肪酸（ＥＦＡ）が、ヒトの多種多様な生理学的障害において有益な効果を有していることは、文献においてよく報告される。ＷＯ０２／０２１０５（Ｌａｘｄａｌｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、非常に広い範囲の疾患に対するそれらの有益な使用、および一般的栄養補給剤としての使用を記載する。Ｈａｒｂｉｇｅ（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔ．  Ｓｏｃ．  ５７，  ５５５−５６２は、自己免疫疾患状態におけるｎ−３およびｎ−６酸での食物の補給を概説し、そして特に臨床上重要なサインおよび関節リウマチの症状を減じる、ルリジサオイル（ｂｏｒａｇｅ  ｏｉｌ）のようなγ−リノレン酸（ＧＬＡ）および／またはリノレン酸（ＬＡ）に富んだオイルの利点の証拠に言及した。
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）患者に対する２つの研究が留意され、それは疾患の再発および重症度が、ｎ−６酸部分を含有するオイルでの治療により減じることが可能であるが（Ｍｉｌｌｅｒら（１９７３）、およびＢａｔｅｓら（１９７８））、さらなる研究がこの効果を確認できなかったこと（Ｐａｔｙら（１９７８））を示す。これらの論文は、およそ２０ｇ／日のリノレン酸（１８：２ｎ−６）でのヒト患者の補給が、対照と比べて再発がより低い頻度で、より低い重症度でそしてより短い期間であるような、多発性硬化症の再発の期間および重症度に影響したことを報告する。Ｂａｔｅは、リノレン酸およびγ−リノレン酸の混合物は、炎症および自己免疫疾患を治療することにおいてより有効である可能性が、１９５７年にさかのぼって示唆されたことに留意し、試験においてこのことを調査しようとした。しかしながら、この組み合わせを試験すると、３ｇ／日のオイル（Ｎａｕｄｉｃｅｌｌｅ  Ｅｖｅｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ  ｏｉｌ）で、再発を有する患者が、対照よりも試験オイルでより悪くなったことがわかった。
【０００４】
他の人達（Ｄｗｏｒｋｉｎら（１９８４））によるこれらのリノレン酸研究のメタ解析は、軽い多発性硬化症を有する患者において、疾患の長期間の進行の度合いの減少を有する、減じた再発率および重症度を実証した。後の多発性硬化症を有する患者の公開試験は、少ない脂肪の食物および／または食物のｎ−３およびｎ−６脂肪酸の操作が、有益であり得ることを示唆した（Ｓｗａｎｋ  ＆  Ｇｒｉｍｓｇａａｒｄ（１９８８）；Ｈａｒｂｉｇｅら（１９９０））。
【０００５】
ＭＳの原因論は未だに不明であるが、強力な証拠が該疾患の病因における自己免疫機構の存在を示唆する（Ｍａｒｔｉｎｏ  ＆  Ｈａｒｔｕｎｇ  １９９９）。ＭＳ患者が、例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のような非常に多くの神経抗原、並びに健康な対照と比較して増加した活性化状態である自己反応性Ｔ細胞を有することが、研究で示されている（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎら  １９９４、  Ｋｅｒｌｅｒｏ  ｄｅ  Ｒｏｓｂｏら  １９９３、  １９９７、
Ｃｈｏｕら  １９９２、  Ｏｔａら  １９９０、  Ｂｕｒｎｓら  １９９９、  Ｚｈａ
ｎｇら  １９９４、  Ｔｅｊａｄａ−Ｓｉｍｏｎら  ２００１）。ＭＳにおける、例えば慢性炎症、脱髄およびアストログリオーシス（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）のような軸索損傷の実際の過程は複雑であるが、白質炎症および脱髄が疾患の重症度を決定すると考えられ、一方、最近の研究が、ＭＳにおける軸索損傷が疾患の初期段階において始まり、そして能力障害に寄与することを示唆した（Ｄｅ  Ｓｔｅｆａｎｏら、２００１）。
【０００６】
実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳの免疫仲介効果の最も頻繁に使用される動物モデルである。モルモットにおける研究は、リノレン酸がＥＡＥの発生率および重症度を部分的に抑制することを示した（Ｍｅａｄｅら（１９７８））。真菌源または植物源からのγ−リノレン酸に富んだオイルを使用して、完全な防御がラットおよびマウスの両方で立証された（Ｈａｒｂｉｇｅら（１９９５）、１９９７ｂ）。これらの調査は、ＥＡＥの臨床的のおよび組織病理学的徴候に対する、リノレン酸およびγ−リノレン酸の疾患を緩和する効果を立証した。用量に依存して、γ−リノレン酸は急性なラットのＥＡＥにおいて十分に防御的であり、一方、リノレン酸は臨床的重症度に用量依存的作用を有したが、根絶はしなかった。
【０００７】
これらの実験的発見にもかかわらず、ヒトの疾患である多発性硬化症は非常に複雑であり、そしてＴ細胞および他の免疫反応因子の活性により逆に悪化しうるし改善しうることが認められる。ｎ−６脂肪酸は、リノレン酸のみで得られた結果に基づいて、自己免疫疾患および炎症性疾患を促進すると考えられる。ＴＧＦ−βおよびＰＧＥ２産生は、ｅｘ  ｖｉｖｏでγ−リノレン酸を与えられたマウスにおいて非特異的に増加したことが示されたが；ＴＧＦ−βは急性なそして再発するＥＡＥにおいて防御することが報告され（（Ｒａｃｋｅら（１９９３）；Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ（１９９３））、そしてしたがって、インドメタシン増強剤のようなＰＧ阻害剤は疾患を悪化する（Ｏｖａｄｉａ  ＆  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８２））。
【０００８】
疾患の再発期と一致するミエリン毒性（ｍｙｅｌｉｎｏｔｏｘｉｃ）炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γ）の増加を示す多くの研究とともに、サイトカインは、ＭＳの病因に関与する。反対に、抗炎症性および免疫抑制性サイトカイントランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）のレベルは、再発期の間は減じられ、患者が鎮静に入るにつれて増加するようである。したがって、生物学的に活性なＴＧＦ−β１と炎症性のＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γの間のバランスが、ＭＳの再発−鎮静の間は調節異常となっているようである。
【０００９】
ＥＡＥからの自然の回復期の間、ＴＧＦ−β分泌Ｔ細胞はＥＡＥエフェクター細胞を阻害し、ＴＧＦ−βはＣＮＳおいて発現し、そしてＥＡＥにおける経口寛容誘導防御においては、ＴＧＦ−βおよびＰＧＥ２は脳において発現する（Ｋａｒｐｕｓ  ＆  Ｓｗａｎｂｏｒｇ（１９９１）；Ｋｈｏｕｒｙら（１９９２））。Ｈａｒｂｉｇｅ（１９９８）は、ＥＡＥに対する食物のγ−リノレン酸の効果が、ＴＧＦ−βが関与するＴｈ３−様の機構を通じて、そしてスーパーオキシドジスムターゼ抗酸化活性をおそらく通じて仲介されると結論付けた。
【００１０】
とりわけ、多発性硬化症における免疫抑制を提供する手段として、γ−リノレン酸およびリノレン酸に富んだルリジサオイルの使用が示唆されている（ＵＳ  ４，０５８，５９４）。示唆された用量は、２．４グラム／日のオイルであり、そして現実の有効性の証拠は提供されていない。
【００１１】
ルリジサオイル（典型的には、１００％脂肪酸含量当たり、２３％のγ−リノレン酸および３７％のリノレン酸）が、活性化関節リウマチに関連した臨床上重要なサインおよび自己免疫疾患の症状を有意に減ずることが示された（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌら（１９９３）
）。ルリジサオイルおよび真菌オイル（図１を参照）は、ＭＳ候補を同定するためのＥＡＥ動物モデルの使用において有効であることが示されたが、ヒト疾患において有意に有効であることは示されていない。低レベルのγ−リノレン酸を含有する高レベルのリノレン酸に富んだオイル（ＥＰＯ：  リノレン酸：γ−リノレン酸  ７：１）は、ラットにおけるＥＡＥの発生率および重症度を部分的に抑制し（Ｍｅｒｔｉｎ  ＆  Ｓｔａｃｋｐｏｏｌｅ，１９７８）、一方、以上で言及したノーデセル（Ｎａｕｄｉｃｅｌｌｅ）の研究は、患者の悪化をもたらした。過去約３０年にわたる多発性硬化症患者による、ルリジサオイル並びに月見草オイル（Ｅｖｅｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ  ｏｉｌ）のような他のＧＬＡ／ＬＡ含有オイルの使用にもかかわらず、大多数の患者が疾患から回復することができず、有意な改善を示すことなく、進行し続け死に至る根底にある疾患を有した。
【００１２】
シクロホスファミドのようなＴ細胞消耗剤および変調剤を含む、他のより劇的な免疫抑制剤治療も、ＥＡＥモデルにおいて有効であることが示されたが、これらが採用された場合、ヒト多発性硬化症疾患症状は改善するが、根底にある疾患は進行し続ける。Ｔ細胞は、確かにヒトにおいてＴＧＦ−β１のような有益なサイトカイン、並びに有害なものを産生する。英国のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＮｅｕｒｏｌｏｇｙのＤａｖｉｄ  Ｂａｋｅｒは、２００４年５月１０日の英国ＭＳ学会の第１０回英国フロンティアミーティングで「Ｅｖｅｒｙｔｈｉｎｇ  ｓｔｏｐｓ  ＥＡＥ，  ｎｏｔｈｉｎｇ  ｓｔｏｐｓ  ＭＳ」と標題を付けた論文で、ＥＡＥにおいて有効なものとＭＳにおいて有効なものの間の格差を総括した。
【００１３】
免疫抑制単独では、ＭＳを治療できないことは明らかである。これはほぼ確実に、膜異常、サイトカイン異常調節、並びに続く免疫攻撃および損傷に至る、ＭＳ患者における基礎に横たわる代謝障害のためである。患者が再発−鎮静疾患における鎮静に入っても、根底にある脱髄は進行する。
【００１４】
ＭＳに対する「ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」治療は、β−Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびインターフェロン調製物でのような、インターフェロンが残る。このゴールドスタンダード治療は、患者のうちいくらか、例えば３０％の必要性を対処するのみであり、そしてこれらの症状の改善においてでさえも、再発の重症度を減ずることに限定される。患者のある割合において症状は軽減されうるが、根底にある退化のために、疾患はさらなる能力障害および死に進行しようとする。
【００１５】
本発明者らは今や驚くべきことに、適した付随の脂肪酸含量を伴うγ−リノレン酸を含有するトリグリセリドオイルでの「高用量」治療にしたがって、現在のゴールドスタンダード治療により提供されるものを上回る方法で、ＭＳのほとんど全ての症状の驚くべきレベルの改善が達成可能であることを確定した。そのような成功は、そのような有意な成功がない調製物を含有する他のγ−リノレン酸の従前の使用に照らして、特に驚くべきことである。
【００１６】
１８月の期間にわたり、高用量の選択されたルリジサオイルを摂取した患者は、ＥＤＳＳスコアの有意な（ｐ＜０．００１）および著しい改善、減じた再発率、筋痙直および有痛感覚症状の症状緩和、並びに認知機能の改善された客観的計測を示した。低用量ルリジサオイルは効果がなかった。
【００１７】
高用量ルリジサオイルを摂取した患者は、試験期間の間、ＴＧＦ−β１の末梢血単核細胞産生（ＰＢＭＣ）のレベルを維持し、炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βは有意にそして著しく（＜７０％）減じられ、そしてそれらはＰＢＭＣ膜長鎖オメガ−６脂肪酸ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＨＬＡ）およびアラキドン酸（ＡＡ）を、試験期間の
経過にわたってこれらの脂肪酸の欠失が実証された偽薬を摂取した患者と異なって、維持したかまたは増加した。
【００１８】
この免疫抑制が、活性的な損傷および神経変性を減ずることが予測されたが、本治療は外見上、そうしなければＭＳにおいて特異的に欠失する、重要な膜脂質成分の維持を標的とし、そうしなければ現在の治療によっては有効に治療されない代謝欠陥の修正を示唆する。低用量（５グラム／日）は、これに効果を有さなかった事実が、そのような決定を支持する。
【００１９】
特に、発明者らは、トリグリセリド分子内で特異的な位置的配置を有するγ−リノレン酸およびリノレン酸の両方のトリグリセリドを含んでなり、好ましくはオレイン酸と共の、トリグリセリドオイルが、何ヶ月および何年にもわたり多発性硬化症患者において有意に減少するＥＤＳＳスコアを提供することが可能であり、結果は、現在までに投与された治療のいずれでも達成されなかったものであったことを決定した。
【００２０】
γ−リノレン酸（１８：３ｎ−６、ＧＬＡ）は、インビボで急速に、より長い鎖のオメガ−６ポリ不飽和脂肪酸ジホモ−γ−リノレン酸およびアラキドン酸に変換されることが公知である（Ｐｈｙｌａｃｔｏｓら  １９９４、Ｈａｒｂｉｇｅら  １９９５、２０００）。したがって、ＭＳにおいて膜長鎖オメガ−６脂肪酸のレベルを増加させるために、発明者らは以下のいくつかのＧＬＡ含有オイルで得られた結果を、慢性再発性実験自己免疫脳脊髄炎（ＣＲＥＡＥ）として知られるＭＳのインビボ実験動物モデルにおけるＧＬＡ運搬システムとして、再調査した：真菌（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓより）および植物（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）の両方、月見草（Ｏｎｅｏｔｈｅｒａ属の種、またはクロフサスグリ（Ｂｌａｃｋｃｕｒｒａｎｔ）Ｒｉｂｅｓ属の種）並びに合成トリ−ＧＬＡオイル。
【００２１】
実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、脱髄を有するか有さず、げっ歯類および他の哺乳動物種で誘導できる、ＣＮＳの自己免疫炎症性疾患である。しかしながら、ラットにおけるＥＡＥの誘導（モルモット塩基性タンパク質を使用する）は、脱髄の組織学的特徴を生産しないが（Ｂｒｏｓｎａｎら  １９８８）、ＣＮＳ脱髄により特徴付けられそして臨床的に再発−鎮静であるＭＳとは異なる、急性で単相の疾患パターンを誘導した。したがって、脱髄および再発期により特徴付けられる慢性再発性および脱髄性ＥＡＥモデル（ＣＲＥＡＥ）は、現在のところＭＳ研究に最適の動物モデルである（Ｆａｚａｋｅｒｌｅｙ  １９９７）。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）がＭＳにおける重要な神経抗原標的であることの実証（Ｇｅｎａｉｎら  １９９９）、およびＭＳにおけるＭＢＰに比べて、この神経抗原に対する末梢血自己反応性リンパ球のさらに大きい反応の実証（Ｋｅｒｌｅｒｏ  ｄｅ  Ｒｏｓｂｏら  １９９３，１９９７）と共に、ＭＯＧ誘導ＣＲＥＡＥは、ＭＳにおいて観察されたものに近い類似の特徴を有する最適の動物モデルとなった（Ｆａｚａｋｅｒｅｌｙら  １９９７、Ｇｅｎａｉｎら  １９９９、Ａｍｏｒら  １９９４）。
【００２２】
これらの実験結果に基づいて、２つの重要な選択基準が、現在の目的を達成するための改善された脂質化合物の選択のために採用された。ＣＲＥＡＥおよびラットＥＡＥ摂食研究からの証拠は、富化されたクロフサスグリ種子オイル（７２％  ｗ／ｗ  １８：３ｎ−６、ＧＬＡ）が、ＥＡＥに対して防御しなかったことを示唆する（表３参照）。重要なことに、クロフサスグリ種子オイルは、ｓｎ−１およびｓｎ−３位においてＧＬＡのほとんどを持ち、低いｓｎ−２  ＧＬＡを有する（ＬａｗｓｏｎとＨｕｇｈｅｓ  １９８８）。さらに、３つのＧＬＡを含有する構造化されたトリアシルグリセロール（ＴＧ−ＧＬＡ）が、ＣＲＥＡＥにおいて使用されたルリジサオイルのそれに類似する防御効果を提供した（表２）。これは、ｓｎ−２  ＧＬＡが重要であることとも一致するであろう、すなわち
、外側のペアのｓｎ−１およびｓｎ−３ＧＬＡは、ｓｎ−２ＧＬＡのみを残して、インビボで酵素的に除去され、そしておそらく酸化をうける。この選択的加水分解は、インビボのｓｎ−２位の明白な防御を除いて、トリアシルグリセロール分子からｓｎ−１およびｓｎ−３脂肪酸を除去する特異的リパーゼの公知の能力より生じる（ＬａｗｓｏｎとＨｕｇｈｅｓ  １９９８、Ｋｙｌｅ  １９９０）。
【００２３】
このデータの本研究者らの再考はまた、リノレン酸（ＬＡ）残基のγ−リノレン酸（ＧＬＡ）残基に対する比率が、ＭＳのＣＲＥＡＥモデルにおける、ＬＡおよびＧＬＡ含有オイルの重要な有効性の特徴であり得ることも示唆する（表１）。表１は、真菌オイル、ルリジサオイル、月見草オイルおよび紅花オイルのＣＲＥＡＥにおける、組成分析および有効性を示す。ＣＲＥＡＥの発生率を減じる点の最も有効な治療は、０．８５のＬＡ：ＧＬＡ比率の真菌オイルであった。ルリジサオイルもまた、１．５のＬＡ：ＧＬＡ比率でとても有効であった。さらに、ｓｎ−１、ｓｎ−２およびｓｎ−３でＧＬＡを含有する構造化されたトリグリセリド（ＴＧ−ＧＬＡ）の実験は、ＧＬＡが活性な組成物になることを実証した。さらに、ＴＧ−ＧＬＡもまた、ルリジサオイルよりも低い用量レベルで有効であった（表２参照）。
【００２４】
抗酸化組成物のような他の因子もまた重要であり得る（未発表）が、例えば、ｓｎ−２
ＧＬＡ（３８−４６％の範囲）の我々の未発表の観察、並びにおそらくいくつかのルリジサオイルはＣＲＥＡＥにおける十分な防御効果を生産することができないことと一致して、１０％  ｓｎ−２  ＧＬＡ（Ｌｉｕら  ２０００）および４０％  ｓｎ−２（ＬａｗｓｏｎとＨｕｇｈｅｓ  １９８８）のように、異なったルリジサ種子オイルのものもまた、ｓｎ−２  ＧＬＡのレベルが多様であるようである。６０％程度のｓｎ−２  ＧＬＡを有するルリジサオイルが報告され（ＨｕａｎｇとＭｉｌｌｓ（１９９６）γ−リノレン酸：ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｅｉｎｅ：第６章）、そしてＧＬＡがリンパ液に入り込むのに効果的であることに留意された。
【００２５】
ＥＰ０５２０６２４（Ｅｆａｍｏｌ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）の表３は、月見草オイルおよびルリジサオイルのトリグリセリド含量を比較し、種々のＧＬＡに反応する障害に対して、後者よりも前者が、より治療的に有効であることが教示された。この文献は、ルリジサオイルは２７の異なったトリグリセリド成分を有し、そのうちの２０％のみがｓｎ−２  ＧＬＡを有することを示唆する。３ページ、４０−４２行目は、生物学試験が、異なったオイル源としてＧＬＡが供給されたときに、等量のＧＬＡが確かにとても異なった効果を有しうることを示したことに言及する。重大なことに、次いでそれは、月見草オイル（ＥＰＯ）に存在し、ルリジサオイルには存在しない、１つの特定の画分に読者の興味を向けさせ、それは前者のＰＧＥ１を上昇させる優れた効果、そしてしたがって抗炎症性効果の原因である（ＥＰ  ０５２０６２４  図表  ページ４および表２参照）：その画分は、ＥＰＯにおける全トリグリセリドの１８から１９％であると言われる、ジ−リノエオイル（ｌｉｎｏｅｏｙｌ）−モノ−ガンマ−リノレニル（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌ）−グリセロール（ＤＬＭＧ）である。６ページは、ｓｎ−１，２または３におけるＧＬＡの位置が、この効果に重要でないことを明確に教示する。
【００２６】
Ｄｉｎｅｓら（１９９４）、（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，アバディーンミーティング（１９９４年９月１４−１６日））は、ＥＰ０５２０６２４により主張された種類のγ−リノレン酸含有オイルを用いた糖尿病性神経障害神経損傷の治療研究を報告し、そして再び、ルリジサオイルが、この神経変性を治療する点で全く有効ではないが、月見草オイルは有効であったことに言及する。この論文は、ルリジサオイルがＧＬＡ活性を干渉する他の構成要素を含有すると結論付けている。
【００２７】
この先行技術に反して、本発明者らは、そのときに利用できた他の試料中のより少ない量と比較して、試験目的のために最も高いｓｎ−２  ＧＬＡで選択したルリジサオイル（＞４０％）を使用した。そのときに比較的大量に利用できたクロフサスグリ種子オイルは、その低いｓｎ−２  ＧＬＡ含量のため、最適とは考えられなかった。
【００２８】
さらなる選択基準は、全長鎖単一不飽和（ｍｏｎｏｅｎｏｉｃ）脂肪酸のレベルが５％より下に保たれることであった。異なった供給源からの異なったルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）種子オイル試料において、有意なレベルのエルカ酸（２２：１ｎ−９）、即ち全脂肪酸の１．４−２．３８％があり、そして有意なレベルの他の長鎖単一不飽和脂肪酸、即ち２４：１ｎ−９（ネルボン酸）および２０：１ｎ−９（ガドレイン酸）があった（表４）。
【００２９】
さらに、ビタミンＥの吸収、代謝および免疫機能に対する潜在的な影響のため（Ｈａｒｂｉｇｅ  １９９６、２００３）、試験オイルは、商業的ルリジサ種子オイルが日常的にそうであるように、さらなる追加のビタミンＥを有さず（例えば、１ｍｇ／ｇ）、天然レベルのビタミンＥ（０．０５ｍｇ／ｇ）のみを含有した。
【００３０】
そのような選択されたオイルは免疫抑制効果を有するが、その修復に必要な状態が作られている間、損傷への免疫攻撃を減じる点で利益を有する代謝補足効果もまた有意に有すると信じられている。これは、ＭＳのために以前に提供されたいずれの薬物で達成されなかったことである。
【００３１】
本発明の第一の側面において、神経変性疾患の治療を必要とする患者を治療する方法であって、その患者にトリグリセリドエステルとしてγ−リノレン酸残基およびリノレン酸残基の両方を含有するオイルの治療上有効な用量を投与することを含んでなり、トリグリセリドのｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基のリノレン酸残基に対する比率が少なくとも０．８であり；ｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基の量が少なくとも１８％であり、ここで該オイルが治療レベルで患者においてＴＧＦ−βレベルを維持するかまたは上昇させるのに十分な用量で投与される、前記方法が提供される。
【００３２】
治療レベルにより、健康な対象と少なくとも一致するレベルを意味する。好ましくは、用量は、１８か月の毎日の投与の後に患者の血液中において、０．４から３．０の、少なくとも０．５の、より好ましくは少なくとも０．７５の、そして最も好ましくは少なくとも１の、ＴＧＦ−β１／ＴＮＦ−α比率を産生するようなものである。好ましくは、用量は、１８か月の毎日の投与の後に患者の血液中において、少なくとも０．５の、より好ましくは少なくとも０．７５の、そして最も好ましくは少なくとも１の、ＴＧＦ−β１／ＩＬ−１β比率を産生するようなものである。好ましくは、前記レベルは、１２か月後に、そしてより好ましくは６か月後に産生される。
【００３３】
典型的には、毎日投与されるオイルの量は、３から３０グラムの間の経口投薬であり、さらにより好ましくは５から２０グラムの間であり、そして最も好ましくは７から１８グラムの間であり、典型的には１５グラムであろう。
【００３４】
最も好ましくは、γ−リノレン酸残基およびリノレン酸脂肪酸残基に加えて、オイルは非構造的であるエステル化脂肪酸を含み、即ち、それはオレイン酸残基のように代謝されてエネルギーを生産する。残基により、脂肪酸カルボキシル基がグリセロール分子のヒドロキシ基の１つとエステル化した後に、残る部分を意味する。
【００３５】
最も好ましくは、投与されたオイルは、ルリジサオイルまたは例えばムコール  ジャバ
ニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）からのような真菌オイルからのオイル源である。
【００３６】
典型的なルリジサオイルおよび真菌オイル組成物は、表１において説明され、ここで１８：２ｎ−６および１８：３ｎ−６は、それぞれパーセントによりリノレン酸残基およびγ−リノレン酸残基を表わす。
【００３７】
典型的には、ルリジサオイルは、オイル中の脂肪酸残基のパーセンテージとして、２０から２５％のγ−リノレン酸残基、および３５から４０％のリノレン酸残基を含有する。好ましいルリジサオイルは、ｓｎ−２位でのエステル化γ−リノレン酸の量がその位での脂肪酸残基の少なくとも３５％であり、より好ましくは３９％以上であり、そしてさらにより好ましくは４０％以上であるものである。最も好ましいオイルは、４２から４４％のｓｎ−２  ＧＬＡのように４１％を越え、一方、理想的には、それは４５％を越えるであろう。Ｈｕａｎｇらにより以上で述べられたように、６０％のｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイルが生産されており、そして選択のために使用できるはずである。ｓｎ−１およびｓｎ−３位残基は、好ましくはリノレン酸残基、オレイン酸残基およびγ−リノレン酸残基である。好ましいオイルは、ｓｎ−１およびｓｎ−３位のうち、両方ではないにしろ、少なくとも１つにおいて比較的高いオレイン酸含量（例えば、１２％を越え、より好ましくは１４％を越える）を有する。
【００３８】
本発明の使用における、使用に適した典型的なルリジサオイルは、以下のような脂肪酸配置を有する、
Ｓｎ−１：１４％  １８：１（オレイン酸）、５４％  １８：２ｎ−６（リノレン酸）および４％  １８：３ｎ−６（γ−リノレン酸）
Ｓｎ−２：１４％  １８：１（オレイン酸）、４２％  １８：２ｎ−６（リノレン酸）および４０％  １８：３ｎ−６（γ−リノレン酸）
Ｓｎ−３：１９％  １８：１（オレイン酸）、１８％  １８：２ｎ−６（リノレン酸）および３０％  １８：３ｎ−６（γ−リノレン酸）
ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）の種からのような真菌オイルが使用される場合、ｓｎ−２のγ−リノレン酸：リノレン酸の比率が少なくとも０．８、より好ましくは１以上である限りは、γ−リノレン酸残基の総量は、ルリジサオイルについてよりも低くともよい。これは、真菌オイルがリノレン酸残基よりも「代謝に」向いたオレイン酸残基を多く有する傾向があるからである。したがって、好ましい真菌オイルは、ｓｎ−２位でのエステル化γ−リノレン酸の量が、その位の脂肪酸残基の少なくとも１８％であり、より好ましくは少なくとも２０％であり、そして最も好ましくは少なくとも２２％であるものである。好ましい真菌オイルはｓｎ−２脂肪酸残基を、４５％を越え、より好ましくは５０％を越えて、オレイン酸残基として有する。
【００３９】
Ｓｎ−１：２５％  １８：１（オレイン酸）、５％  １８：２ｎ−６（リノレン酸）および１３％  １８：３ｎ−６（γ−リノレン酸）
Ｓｎ−２：５４％  １８：１（オレイン酸）、１９％  １８：２ｎ−６（リノレン酸）および２０％  １８：３ｎ−６（γ−リノレン酸）
Ｓｎ−３：４０％  １８：１（オレイン酸）、３％  １８：２ｎ−６（リノレン酸）および２０％  １８：３ｎ−６（γ−リノレン酸）
所与のオイルミックスにおいて、多くのトリグリセリドへの平均として、各位での前記脂肪酸のパーセンテージを試験することにより、そのようなオイルが出所を明らかにされる（ｓｏｕｒｃｅｄ）必要があるであろうことは、当業者により理解されるであろう。そのようなものは、例えば、Ｍｙｌｎｅｆｉｌｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
Ｌｔｄ，Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ，Ｍｙｌｎｅｆｉｌｅｄ，Ｉｎｖｅｒｇｈｏｗｒｉｅ，Ｄｕｎｄｅｅ  ＤＤ２，５ＤＡ，英国スコットランドのように、当業
者の全くの範囲内である。本出願人は、以上に述べられた基準に適合する多くのそのようなオイルの出所をなんとか明らかにし、およそ４６％という最も高いｓｎ−２の値が、例えば２００３年のニュージーランドを出所とするオイルにおいて発見された：これはもちろん年々変化しうる。しかしながら、低用量（５ｇ／日）のルリジサオイルでの反応の欠如を考慮して、回復への患者の努力は、毎日の必要な用量よりも少ないｓｎ−２％ＧＬＡルリジサオイルの提供による過少量との同等物により害されないことは重要である。
【００４０】
選択過程におけるそのようなオイルの解析のためのさらなるＮＭＲ法は、以下の方法の節において提供される。しかしながら、所与のティエム（ｔｉｅｍ）で利用できる全てのオイルは、３５％のｓｎ−２  ＧＬＡ値よりも下であるべきであり、そして好ましくは、もしそれが４０または４５％よりも下であるならば、合成トリグリセリドまたはトリグリセリドミックスでの補足が可能であろうことが理解されるであろう。多くの適した脂質が、当該技術分野で知られており、そして例えば、ＬＧＬ、ＯＧＯ、ＯＧＬ、ＬＧＯ若しくはルリジサオイルに存在することが知られている他の成分の混合物を単離するか、または組み合わせてもよい（ＥＰ０５２０６２４の表３参照）。合成ＧＬＡプールに、そしてしたがってＤＨＧＬＡプールに、そして次いでアラキドン酸プールにあふれ出すために過度の炎症性効果のリスクがあるので、本目的のためにｓｎ−１およびｓｎ−２位ＧＬＡレベルが高くなりすぎないようにするのが好ましいが、トリＧＬＡでさえも添加されうる（ＦＲ  ２，６１７，１６１（１９８８））。例えば、ＯＧＯの合成は、以下の文献に教示される：Ｙ．−Ｓ．Ｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｌｉｎ，Ｐ．Ｒ．ＲｅｄｄｅｎおよびＤ．Ｆ．Ｈｏｒｒｏｂｉｎ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ７２，  ６２５−６３１（１９９５）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｈｙｄｒｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ
Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  γ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ｂｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ、およびＫ．Ｏｓａｄａ，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．Ｈａｔａｎｏ  およびＭ．Ｈｏｓｏｋａｗａ，  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｕｉｓａｎ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ．，  ５７，  １１９−１２５（１９９１），Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．  １１５：２７８２９９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｉｃａｌｌｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ  Ｔｒｉｇｌｙｓｅｒｉｄｅｓ。
【００４１】
大量のこれらの高いＳｎ−２  ＧＬＡオイルのいずれかが投与される治療形態のために、エルカ酸（２２：１ｎ−９）および他の長鎖単一不飽和脂肪酸、即ち２４：１ｎ−９（ネルボン酸）および２０：１ｎ−９（ガドレイン酸）のような、潜在的に毒性の長鎖単一不飽和脂肪酸の量は、できるだけ低く、好ましくは脂肪酸残基の５％より低く、より好ましくは３％より低く、そしてより好ましくは２％より低いことが推奨される。
【００４２】
好ましいオイルのもう１つの特徴は、天然レベルのビタミンＥ（０．０５ｍｇ／ｇ）のみで提供されるような、低い添加またはゼロ添加のビタミンＥである。
本発明のさらなる側面は、神経変性疾患の治療のための医薬の製造のための、より具体的には根底にある神経変性の制止および神経機能の回復のための、以上に記載のようなトリグリセリドオイルの使用を提供する。特に、そのような医薬は、ニューロンの膜組成の正常化、健康なＴＧＦ−β１／ＴＮＦα比率および他のサイトカインとのＴＧＦ−β１比率の回復、多発性硬化症における神経変性の制止、並びに、例えば、ＭＲＩ若しくはＣＡＴスキャンにより、またはＥＤＳＳスコアにより測定されるような神経機能のうちの一部または完全な回復のためである。そのような使用は脳梗塞、頭部外傷および頭蓋内出血の後の、脳の機能的障害の治療を含むであろう。
【００４３】
また提供されるのは、多発性硬化症を治療することおよびインビボでのサイトカインの比率を有益な変化をもたらすことに、特に有効性を有する選択されたトリグリセリドオイルであり、これらのオイルは、以上に記載された方法に好ましいようなものである。
【００４４】
本発明の使用のためのオイルは、薬学で知られる慣用のビヒクルのいずれかにより投与され得る。最も慣用的には、そのようなオイルを含有するカプセルの形態、または経腸的なコートをされた形態で、そのままのオイルまたは食材との混合剤として投与されうる。他の形態は、配送技術が進歩するにつれて、当業者に思い浮かぶであろう。
【００４５】
他の有益な薬剤が、本発明における使用のために該オイルと組み合わされうることは、当業者に理解されるであろう。これらは、例えば、ナトリウムチャネルブロッカー、インターフェロン、Ｔ細胞消耗剤、ステロイドまたは他の緩和剤のような、イオンチャネルブロッカーであってよい。免疫および炎症性の反応が変調されている場合には、これらのシステムの複雑な性質を考慮して、そのような組み合わせは注意深く成される必要があるであろうことが、さらに理解されるであろう。しかしながら、本オイルに対する遅発性の反応を考慮すると、ＴＧＦ−β１レベルが正常化される前の治療の初期において、追加の治療がこの正常化過程を妨げない限りは、短期作用剤が有益であり得る。
【００４６】
本発明はこれから、以下の非限定的な表、実施例および図への言及のみによって、実施例を通じて記載されるであろう。本発明の範囲に含まれるさらなる態様は、これらに照らして当業者に思い浮かぶであろう。
【００４７】
表
表１：種々のトリグリセリドオイルの組成的％全脂肪酸含量、およびＥＡＥにおける防御的効果を示す。
表２：高いｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイル試験における、３つの治療群の変数を示す。
表３：ＥＡＥ発生率に対する多様な形態のＧＡＬの効果、およびＳＪＬマウスにおける臨床スコアを示す。
表４：高いＧＬＡであるが、低いｓｎ−２  ＧＬＡの植物オイルである富化されたクロフサスグリオイルは、ＥＡＥにおける真菌オイルおよびルリジサオイルへ匹敵できないことを示す。
表５：特にモノエンに関する試験ルリジサオイルの、４群の解析結果を示す。
表６：特にモノエンに関する非試験オイルの解析を示す。
【００４８】
方法
定量的−１３Ｃ−ＮＭＲによる、ルリジサオイル試料におけるガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）の位置解析
トリグリセロールにおける脂肪酸組成および位置配置の決定のための分析的方法論は、酵素または化学的過程によるトリアシルグリセロールの加水分解、およびそれに続くクロマトグラフィー技術によるモノ−およびジアシルグリセロールの解析を必要とする。これらの方法は破壊的であり、そして元の試料の回復はできない。加水分解手順は、通常いくつかのアシル移動を生じ、実質的に位置配置の誤りに帰着する。
【００４９】
１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）のいくつかの特性があり、それの適用は位置解析に有用である。第一に、化学シフトは分子構造に感度がよく、それによりそれぞれの核が特定の頻度でのピークにより同定されるスペクトルを生じる。それぞれの環境において、核の分析能は、線幅および近接ピーク間の化学シフト差異により決定される。第二に、全ての１３Ｃは、同じ吸収を示すので、各核から生じるピーク下の面積は、その環境における核の数に比例する。したがって、各ピークの化学シフトおよび積分面積は、各核の定性的および定量的測定の両方に使用可能である。第三に、本適用のための試料の調製は単純である。最後に、ＮＭＲは他の目的のために試料を回収することができる、非破壊的技術である。１３ＣＮＭＲ法は、普通はカルボニル炭素のシグナルの集団を解析することに基づく。ｓ
ｎ１，３−位および２−位における酸に対応して、２つの集団のシグナルが普通は観察される。２つの環境がおよそ０．４ｐｐｍの分離を生じるので、それらは通常、容易に区別される。これら２つの集団のシグナル内で、各酸または酸のグループの分離シグナルがなければならない。酸がカルボキシル基に近い、例えばｎ＝４，５または６の、炭素−炭素２重結合（すなわち、不飽和である）を有するとき、この基準は最も容易に満たされる。同じ２重結合グループ（例えば、ＥＰＡおよびＡＡ）の酸からのカルボニル炭素シグナルは、普通は区別しないであろう。そのような方法は、ＧＬＡ含有トリアシルグリセロールの解析に有用であるようであり、これがその事例であることが判明した。
【００５０】
参考文献：
【００５１】
【化１】
2011144195.tif 000002
【００５２】
実験
材料／試料−調製
モノ酸トリアシルグリセロールをＳＩｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌｓおよびＮｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ  Ｉｎｃから購入した：
トリパルミチン  （トリ−１６：０）
トリステアリン  （トリ−１８：０）
トリオレイン  （トリ−１８：１ｎ−９）
トリリノレイン  （トリ−１８：２ｎ−６）
トリガンマリノレイン  （トリ−１８：３ｎ−６）
トリエイコセノイン  （トリ−２０：１ｎ−９）
トリエルシン  （トリ−２２：１ｎ−９）
トリネルボニン  （トリ−２４：１ｎ−９）
７００μｌのジューテリオクロロホルム中のおよそ１８０ｍｇの脂質が、本研究にわたって使用された。
【００５３】
１３Ｃ−ＮＭＲ−データ
ＮＯＥを抑圧したプロトンデカップル１３ＣＮＭＲデータを、２１℃で、５ｍｍブロードバンドプローブにおいて、１２５．７２８ＭＨｚで動作するＪｅｏｌ  ５００ＭＨｚスペクトロメーターで収集した。Ｗａｌｔｚデカップリングはデカップリングの選択モードであり、そして１４．８９秒の獲得時間の間のみ開閉した。緩和猶予を３０秒にセットし、そしてパルス角は９０°であった。使用されたスペクトルウインドウは、１７０ｐｐｍオフセットで、およそ３５ｐｐｍであった（１７３．５から１７２．６ｐｐｍ）。スペクトルは、はじめ７７．０ｐｐｍでＣＤＣｌ３を参照した。典型的には、スキャンのおよその数を、混合物の複雑さに依存して、３００から１２００スキャンの幅で、適切なシグナルとノイズを収集した。実験の全獲得時間は、１−４時間の間の範囲であった（ルリジサオイル１２７２スキャン／４時間）。データ点６５，５３６。
【００５４】
計算
２−位および１，３−位でのＧＬＡカルボニルシグナルを、トリアシルグリセロールのスペクトルにおける全てに渡るカルボニルピークからよく分離した。これは、２−ＧＬＡ／１，３−ＧＬＡの比率を、全ての事例において信頼性および正確性をもって、決定することを可能にした。ルリジサオイルにおけるものと類似の比率であることが知られる、トリガンマリノレニンを含む８つのトリアシルグリセロールを含有する試験混合物を解析することにより、本方法の有効性が確認された。全組成は以前、ＧＬＣにより決定されてい
た。２つの計算方法を採用した。第一は、以下の２−ＧＬＡパーセンテージを計算する、内蔵（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）ＮＭＲ法であった。
【００５５】
ＧＬＡｘ３ｘ１００のｓｎ−２ピークの積分
ｓｎ−１，２および３全ての全積分
第二は、ＮＭＲおよび以下のようなＧＬＣにより決定された全ＧＬＡ組成から、２−ＧＬＡ／１，３ＧＬＡ積分を使用した。
【００５６】
ＧＬＡｘＧＣ解析ｘ３からの％ＧＬＡのｓｎ−２ピークの積分
ｓｎ−１，２および３でのＧＬＡの全積分
両演算からの結果は一致した。最も高い正確さで測定されうるそれぞれの方法からの変数を使用するので、本発明者らは、合成ＮＭＲ−ＧＬＣ法をより正確であるとみなす。ＧＬＡは、ルリジサオイルの主要成分であり、そしてしたがって結果に示すように、２−／１，３−ＧＬＡ比率は、正確にＮＭＲにより決定されうる。ＧＬＣは一般的に、少数の脂肪酸の組成を決定する点で、ＮＭＲよりも優れているが、位置情報は与えない。
【００５７】
要約
実験データの詳細は、表およびスペクトルに示される。以下に要約される。カプセルＤおよびＢは、以下で報告される臨床試験において提供される試料カプセルである。
【００５８】
【化２】
2011144195.tif 000003
【００５９】
これらのルリジサオイル試料において、ｓｎ−２位におけるＧＬＡ含量は、４１−４２％であり、すなわち全組成のおよそ２倍（１．９５ｘ）である。文献において報告された有望な典型的な試料は、全体で１．８倍の富化を示した。
【００６０】
ＮＭＲ法を使用して、ｓｎ−２位でのＧＬＡの信頼できる解析データを与えることが可能である。確かに、他の脂肪酸の存在の非干渉のため、ルリジサオイルは特に適している。興味深いことに、ＮＭＲ法からの結果が報告され、古い誘導−クロマトグラフィー法からのものと一致する。これら古い方法に由来する本発明者らの以前の試算（４０％）もまた、ＮＭＲの結果と一致する。
【００６１】
治療例
２８人の活動的な再発−鎮静（先行する１８月において２回の再発）の多発性硬化症患者（１８から６５歳の範囲の年齢）に、二重盲検偽薬対照試験を始め、１８か月に渡るカプセル化ルリジサオイルの臨床活性および研究室変数に対する効果を調査した。このオイルは、低いモノエン（ｍｏｎｅｎｅ）（例えば、エルカ酸（ｅｒｕｓｉｃ  ａｃｉｄ）含量を有する、高いＳｎ−２  γリノレン酸（ＧＬＡ）含量（＞４０％  Ｓｎ−２でのＧＬＡ）であり、公知の免疫変調剤であるビタミンＥが添加されていない。
【００６２】
患者を、市内の病院で神経外来から募集した；病院のインフォームドコンセントを、最初の来院時に得た。除外基準は、ステロイドまたは免疫抑制剤のいずれかの形態、妊娠、高脂血症、アスピリンまたは関連薬剤の常用、および前３か月以内のビタミンまたは脂肪酸補給を含む。
【００６３】
以下の基準の全てを満たした患者のみを試験において含んだ：（ａ）偏見なしにいつでもコンセントを撤回できるという完全な理解の下、治療の前にインフォームドコンセントを提供でき；（ｂ）男性または女性の１８歳から６０歳の年齢（１８歳および６０歳を含む）の外来患者で；（ｃ）臨床上明確な再発性ＭＳの診断が確認され；（ｄ）過去２年間において、少なくとも３回の記録された臨床的再発を有し；（ｅ）よく記録された再燃を有するという条件で、０．０−０．５（０．０および０．５を含む）の基準拡大能力障害スコアスケール（ｂａｓｅｌｉｎｅ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）（ＥＤＳＳ）を有し；そして、（ｆ）病歴、身体検査、並びに尿および血液学試験である臨床化学により確認された、ＭＳ関連症状以外は健康であること。
【００６４】
患者を、それぞれが１２人の患者を含有する３つのグループの１つに、院内薬局によりランダムに割り当てた。
・偽薬（５ｇのポリエチレングリコール４００）を受ける第一グループ（ｎ＝１２）
・低用量（５ｇ）の純化ルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）を受ける第二グループ（ｎ＝１２）
・高用量（１５ｇ）の純化ルリジサを受ける第三グループ（ｎ＝１２）
【００６５】
補給は、１８か月の期間、毎日１グラムのオイルカプセル（低用量は５／日、高用量は１５／日）の形態であった。ルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）オイルおよびオメガ−６ポリ不飽和脂肪酸は、一般にヒトに安全と認められる（ＧＲＡＳ）食品添加物である。ＥＣ規則下での分類または標識要件はない。臨床評価は、以下を含む：拡大能力障害スコアスケール（ＥＤＳＳ）および臨床再発記録。静脈血（５０ｍｌ）を、補給の１か月、３か月、６か月、１２か月、１５か月、１８か月で実験室の研究のために得た。
【００６６】
以下の生化学的および免疫学的変数を、治療前データとグループ間データを比較するために各患者で調査した。
・刺激および非刺激エクソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）末梢血単核細胞サイトカイン産生：ＴＧＦ−β１、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＦＮ−β、これら
は、ＭＳの病因に関わることが示唆されている。サイトカインおよび関連遺伝子発現。
・血清における可溶性接着分子、特にＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１。
・末梢血単核細胞膜脂肪酸組成および血漿リン脂質脂肪酸組成。
【００６７】
結果を、表１および２、並びに図１から５に示めす。
第一の結果の変数は、基準（０か月）と治療の終了（１８か月）の間の臨床再発の数であった。第二の結果の変数は以下を含んだ：はじめの臨床上の再発までの時間；ＥＤＳＳスコアおよびステロイド治療の使用により評価されるような再発の重症度；並びに、３ヶ月間持続するＥＤＳＳの少なくとも１．０ポイントの増加、または３ヶ月間持続する基準ＥＤＳＳからのＥＤＳＳの少なくとも１．５ポイントの増加として定義される、３，６，９，１２および１８か月での、基準と比較したＥＤＳＳの変化。この試験は外部資金を受けなかったので、磁気共鳴イメージングでＭＳ疾患活性を評価することは、財政上の理由からできなかった。１ｏｆ３。
【００６８】
１１人の患者が偽薬グループであり、７人の患者が低用量ルリジサオイルを摂取し、そして１０人の患者が高用量ルリジサオイルを摂取した。試験薬剤はよく許容され、そして１８か月の試験の間に深刻な不都合な出来事はなかった。
【００６９】
結果
２人の患者は下痢を進展させ、その両名とも後に高用量のルリジサオイルを摂取していたことが確認された。下痢は１人の患者においては緩やかであったが、第二の患者においては中程度に深刻であり、後に試験薬剤を継続できなかった。コードは壊されず、そして薬剤の継続をやめた後に下痢は止まったが、再チャレンジ時に再び現れた。したがって、この患者を、試験から離脱した。高用量のルリジサオイルで治療された残りの患者は、第一のおよび第二の結果基準で、すばらしい臨床上の改善を示した。例えば、治療の６か月後の、彼らの平均ＥＤＳＳスコアは、基準ＥＤＳＳから改善した（図１）。より重要なことに、偽薬グループにおける再発の数と比較したとき、治療の６か月後の臨床上の再発の平均数が有意に減じた（図２）。反対に、低用量ルリジサオイルを受けた患者は、偽薬グループと比較したとき、いずれの臨床上の改善も示さなかった。ＭＳ疾患活性に対する有益な効果に加えて、高用量のルリジサオイルは、筋痙直（凝り）および有痛感覚性症状の症状緩和を提供し、そして認知機能もまた改善する。
【００７０】
以下の図で見られるように、９，１２および１８か月後の再発率は、高用量グループで０まで下がった。１５か月で見られる増加は、このグループから抜け出した患者のためであった。
【００７１】
以下は、高用量高ｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイルの治療上の利点を説明するための、３つの短い事例歴である。はじめの２人は本試験からであり、一方３人目はＭＲＩ研究が得られた過去の試験患者である。
【００７２】
患者１（治療）：
第一の患者は４８歳の女性であり、臨床的に活性な再発鎮静ＭＳを９年間有した。彼女は、元々は地方の保健機関のフルタイムの行政官として勤務していたが、深刻なＭＳのために職務を遂行することができなかった。したがって、彼女は後にパートタイムの秘書として勤務したが、筋肉の凝りおよび感覚の混乱のため、それでも授動において困難を有した。彼女は、平均して９か月ごとに１回、深刻な臨床上の再発もまた経験していた。これらの再発の多くは、ステロイド療法のための入院という結果となった。彼女の活性ＭＳを考慮して、彼女をルリジサオイル試験に入れた。本研究に関する不利な出来事がなく、そして４か月の医薬品摂取の後で、彼女は歩行および感覚性症状において良い改善を経験した。
【００７３】
治療後およそ９か月で、彼女はフルタイム雇用を始めるに足りるほどであった。加えて、彼女は、臨床試験の１８か月の間、再発しないままであった。試験の終結の後、彼女は高用量のルリジサオイルを摂取したという試験コードが明らかとなった。
【００７４】
患者２（対照）：
第二の事例は４６歳の女性であり、臨床上活性な再発鎮静ＭＳを８年間もまた有した。彼女は、元々は店のアシスタントとして働いていたが、ＭＳと診断された後、失業した。
【００７５】
彼女の症状は、両足において授動の困難性および有痛感覚性症状を含んだ。彼女は、臨床試験に先行する２年間において、３度の臨床上の再発を経験し、そしてステロイド療法のために２回入院した。したがって、彼女はルリジサオイル試験に入れられたが、彼女の歩行は悪化し続けた。試験に入って６か月で、彼女は杖の使用を必要とし、そして低い四肢の痙直を減ずるために、Ｂａｌｃｌｏｆｅｎでの治療もまた受けた。ルリジサオイル試験の開始後およそ１０月で、彼女は深刻な臨床上の再発のために入院し、ステロイドで治療された。彼女は、後に膀胱障害を進展し、そして長い道のりで車いすを使用し始めた。治療コードは１８か月の試験の終結の後に壊され、そして彼女は偽薬を摂取していたことがわかった。それ以来、彼女は５０ヤードを越える道のりに歩行器を使用し始めた。
【００７６】
患者３：治療（試験の追加）
第三の事例は２６歳の男性であり、２００１年４月に明確なＭＳと診断された。彼の症状は１９９９年に始まり、そのときに彼は、体の種々の部分、特に胸部および腹部の左側に影響する広汎で処置しにくい疼痛を訴えた。これは、変動する脱力に関連した手および足の断続的しびれに続いた。また、頻尿および尿意切迫の形態で苦痛な膀胱の症状もあった。２００１年のＭＳの診断は再発鎮静症状に基づき、そしてポジティブ脳脊髄液解析および脳の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により確認され、それは両大脳半球における複数の白質異常を示した。症状は種々の医薬的療法に応答しなかった。
【００７７】
２００３年４月に、本高用量のルリジサオイルの経口補給を開始した。この経口補給の開始の３か月以内に、該患者は症状の劇的な改善を報告した。彼の有痛感覚性症状は完全に消失した。２００３年５月以来、彼はしびれまたは脱力を報告せず、そして膀胱の制御における有意な改善に気づいた。経口補給は不都合な出来事を引き起こさなかった。繰り返しの脳のＭＲＩが、Ｎ氏症状（Ｍｒ  Ｎ‘ｓ  ｓｙｍｐｔｏｍ）において報告された改善を実証することを保証した。繰り返しのＭＲＩは、白質異常のサイズおよび配置が減じたことを示した。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
【表２】
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【００８０】
【表３】
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【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】１８か月での、偽薬および試験オイルで処理されたヒトＭＳ患者における、末梢血単核細胞サイトカイン産生を示す。
【図２】棒グラフとして表わされた高用量（１５ｇ／日）と比較した、ヒトＭＳ患者のＥＤＳＳスコアに対する偽薬および低用量（５ｇ／日）高ｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイルの影響を示す。
【図３】グラフとして表わされた、ヒトＭＳ患者のＥＤＳＳに対する偽薬、低用量、および高用量の高ｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイルの影響を示す。
【図４】棒グラフとして、ヒトＭＳ患者の平均再発率（％）に対する偽薬、低用量、および高用量の高ｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイルの影響を示す。
【図５】グラフとして、ヒトＭＳ患者の平均再発率（％）に対する偽薬、低用量、および高用量の高ｓｎ−２  ＧＬＡルリジサオイルの影響を示す。
【図６】マウスＣＲＥＡＥに対する防御的効果と比較した、オイルのリノレン酸：γ−リノレン酸比率の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月11日(2011.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の治療を必要とする患者を治療する方法であって、トリグリセリドエステルとしてγ−リノレン酸残基およびリノレン酸残基の両方を含有するトリグリセリドオイルの治療上有効な用量をその患者に投与することを含んでなり、トリグリセリドのｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基のリノレン酸残基に対する比率が少なくとも０．８であり；ｓｎ−２位でのγ−リノレン酸残基の量が少なくとも１８％であり、ここで該オイルが治療レベルで患者においてＴＧＦ−β１レベルを維持するかまたは上昇するのに十分な用量で投与される、前記方法。