(57)【要約】      （修正有）【課題】化学発光分子の検出の鋭敏な検出感度を共鳴エネルギー転移リガンド結合方法と結び付けるために使用することができる分子の提供。【解決手段】互いに相補的である末端、及び標的配列に相補的である１５から３０塩基の配列を含む中央部分を有する４０以下の塩基を含む核酸プローブに関し、この核酸プローブは、５’末端において一般式（Ｉ）：2011219489.tif 000028の化学発光アクリジニウムエステル標識化化合物で標識化され、そして、この核酸プローブは、３’末端において、クエンチャで標識化されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに相補的である末端、及び標的配列に相補的である１５から３０塩基の配列を含む中央部分を含む４０以下の塩基を有する核酸プローブであって、該核酸プローブは、５’末端において一般式（Ｉ）
【化１】
2011219489.tif 000027
［式中、［Ｒ１がスクシンイミジルカルボニルであり、
Ｌ１が３〜１０のメチレン単位であり、及び
Ｒ２が水素である］、
［Ｌ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、該−Ｃ（＝Ｏ）がアクリジン環の９位に結合され、Ｒ５がＣ１〜Ｃ８アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ又はＣ１〜Ｃ８アシルである］、
［Ｒ３がニトロ、フッ素、塩素、臭素又はトリフルオロメチル基と２位及び６位でそれぞれ置換されるフェニル基であり、該置換基は、Ｒ３及びＬ２基の−Ｏ−から形成されるフェノキシ離脱基のｐＫａが≦約９．５となるように電子求引性である］、及び
［Ｘ−がヨウ化物、フルオロスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩又はトリフルオロ酢酸塩である］］
の化学発光アクリジニウムエステル標識化化合物で標識化され、そして、該核酸プローブは、３’末端において、クエンチャで標識化されており、該核酸プローブの相補的末端の二本鎖が、該核酸プローブの該中央部分の、該標的配列へのハイブリダイゼーションのような、化学手段又は物理手段によって実質的に非完全のままであるときではなく、該相補的末端の二本鎖が実質的に完全であるときに、該アクリジニウムエステルからの化学発光放出の減衰が存在する、核酸プローブ。
【請求項２】
前記式（Ｉ）のアクリジニウムエステル標識化化合物が、以下：
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、及び
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩
からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項３】
前記クエンチャがメチルレッドであることを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
標的核酸配列を検出する方法であって、該方法は、
該標的配列を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸プローブと合わせる工程、
ｐＨを６〜１０に維持しながら媒体に過酸化水素を添加する工程、及び
前記アクリジニウムエステルからの化学発光放射の放出を検出する工程
を含む、方法。
【請求項５】
前記化学発光放射の放出を検出する工程がｐＨ９で実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、及び
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩
からなるグループから選択される、アクリジニウムエステル標識化化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種リガンド結合法で化学発光標識として有用である化合物、これらの化合物を用いる分析方法及びそれらを含むキットに関する。特に、特定のアクリジニウム誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学発光は化学反応が光の放出をもたらす現象である。これが生じるのは、反応生成物が電子的な励起状態で形成され、その結果、その基底状態に戻るために電磁放射（可視スペクトルでよく起こる）を発するためである。
【０００３】
分析試薬の標識化のために化学発光エネルギー転移系を使用することについてこれまで説明されてきた。このような標識化系では、発光ドナー−アクセプター対が提供され、それらの相対的な距離がリガンド結合事象の有無に依存している。例えば、リガンドと反リガンドが結合複合体として存在するときに、化学発光放出がアクセプターの近接近によって変調されるように、リガンドは化学発光エミッターに結合し、対応する反リガンドはエネルギーアクセプターに結合する。このような変調は、アクセプター分子の性質にしたがって、化学発光強度全体の損失として、又は放出の波長の変化として現れる。
【０００４】
免疫学的検定や核酸ハイブリダイゼーション分析などのリガンド結合法での標識化分子として、化学発光アクリジニウム塩が広く用いられてきた。このような分析方法は、直接的に共有結合によって、又は標識化分子がストレプトアビジンに結合するビオチン−ストレプトアビジン結合によって例証される二次的リガンド結合によって、これらの分子をリガンド又は反リガンドに結合することに関する。
【０００５】
化学発光アクリジニウム標識化分子として作用可能である分子に必要な特徴としては、単純に、１）（例えば標識化）リガンドに前述のリガンドの反応性に影響を及ぼさないで結合可能であること、及び２）標識化化合物がその化学発光の活性を実質的に維持することである。これらの特徴をなす特定の分子構造であれば標識化化合物として作用することができ、実際に多くのそのような構造が説明されてきた。
【０００６】
例えば、ＥＰ−Ａ−００８２６３６は式
【０００７】
【化１】
2011219489.tif 000002
【０００８】
［式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜Ｃ１０の任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールを表し、
Ｒ２及びＲ３は水素、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、アルコキシル、ニトロ又はハロであり、
Ｒ４は任意に置換されたフェノキシ部分である。］
【０００９】
の化学反応標識としてのアクリジニウム化合物に関する。
【００１０】
アクリジニウム系を酸化し、ジオキセタノン中間体を経由してＣ−９位置でケトン基の形成を引き起こす過酸化水素の処理で、このタイプのアクリジニウム化合物は化学発光放射を発する。この生成物は励起状態で形成され、この励起状態は引き続いて電磁放射の放出でその対応する基底状態に緩和する。
【００１１】
しかしながら、ＥＰ−Ａ−００８２６３６に記載された化合物はフェノキシ部分Ｒ４の置換を経由してリガンドに結合し、これによって、過酸化水素の処理後にアクリドン環系を放出する放射はもはやリガンドに結合しない。化学発光放射がリガンドによって非特異的にクエンチされることがないという点で、これは特定の効果があるかもしれない。しかし、一方で、このタイプの化合物を使用すると、特定のクエンチングが必要である化学発光エネルギー転移系で最適でないかもしれない。
【００１２】
この潜在的な問題は、PatelとCampbellによってClin. Chem., 29(9), 1604-1608(1983)で検討された。この文献は、化学発光化合物のアミノブチルエチル−イソルミノールとそのイソチオシン酸塩誘導体を用いた化学発光エネルギー転移分析方法に関する。別の化学発光ドナーを用いたエネルギー転移の大きさを改善する試みは失敗したと、著者は述べている。特に、「アクリジニウム標識ＩｇＧの間ではいかなるエネルギー転移もいまだ検出されていない…」と述べている。これは、化学発光反応の間に、励起したＮ−メチルアクリドンが抗原から切断されるためであるはずと推測している。アクリジニウムの励起反応は、抗体−抗原複合体を分離させる高ｐＨで最適な触媒作用があるということも著者は指摘している。
【００１３】
ＥＰ−Ａ−０３２４２０２は式
【００１４】
【化２】
2011219489.tif 000003
【００１５】
［式中、Ａは二価の有機部分であり、
ＸはＣ−９のアクリジニウム原子と過酸化水素とともにジオキセタンを形成することができる置換基であり、
Ｙは対イオンであり、
Ｚは官能基であり、
ベンゼン環は低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンなどのような一以上の置換基を担持することができる。］
【００１６】
の化学発光アクリジニウム化合物に関する。
【００１７】
これらの化合物とＥＰ−Ａ−００８２６３６のものとの間には、それらがＺ基を経由してリガンドに結合するという違いがあるといわれている。したがって、過酸化水素との反応に続いて、化学発光エミッターはリガンドに付着したままである。
【００１８】
しかしながら、この技術に関する問題が以前認められたものより複雑であることと、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２の提案に反して、それに関するほとんどの化合物が化学発光エネルギー転移系での使用に適していないこととについて、本発明者らは理解するようになる。
【００１９】
実際に、それは化学発光エネルギー転移系での問題になっており、これは、蛍光放出標識を用いるエネルギー転移系が広く使用される一方で、それらの化学発光に対応するものでは商業的な用途が見つからなかった。これは、化学発光が従来の蛍光よりはるかに大きい感度で検出されることができ、したがって分析的な終点としてはるかにより望ましくなるという事実にかかわらずである。
【００２０】
共鳴エネルギー転移系での蛍光系の成功と、それらの化学発光の対応するものの成功の不足との１つの理由としては、蛍光の開始が物理的で非侵入のプロセスであることである。一方、化学発光の開始は化学状態での変化を必要とする。この化学状態はアクセプターの光学的特性を変換し、それがモニターするように設計されているまさにリガンド／反リガンドの相互作用を分離するかもしれない。
【００２１】
ＥＰ−Ａ−０３２４２０２に記載されたアクリジニウム化合物はエネルギー転移分析方法に役立つことを意図しているが、ほとんどのこれらの化合物は、評価される結合複合体の整合性を維持する間、開始される化学発光反応を可能にすることができないということを本発明者らは理解するようになる。これは、Ｘ基がフェノキシカルボニル基である化合物を標識化するアクリジニウムエステルの唯一の例として確かに真実である（実施例２１及び２５参照）。
【００２２】
例証した唯一のアクリジニウムエステル化合物を含むＥＰ−Ａ−０３２４２０２のほとんどの化合物は、かなりのアルカリ状態を除いて役立つ化学発光放出をもたらさないため、問題が起こる。唯一の例で説明したように、化学発光はｐＨ≧１２で開始する。しかしながら、ほとんどの結合複合体は、標識化分子の化学発光反応を開始するために必要なかなりのアルカリ性のｐＨで解離する。化学発光標識としてのＥＰ−Ａ−０３２４２０２の多くのアクリジニウム化合物の使用では、信号測定時に維持されるように結合複合体の完全性を普遍的に必要とする化学発光共鳴エネルギー転移系でそれらを実行可能に使用することができないため、その使用が非常に制限されるということをこれは意味する。文献ではこの考慮を述べていないためＥＰ−Ａ−０３２４２０２の著者によって正しく理解されていないことは明らかであった。したがって、意図されるように化合物が実際に実施可能であるというＥＰ−Ａ−０３２４２０２の提案からは、立証する方法がない。
【００２３】
先行技術の化合物で必要とされる高ｐＨ値の他の問題としては、一般的に使用される多くのクエンチャ分子の吸収スペクトルがｐＨ依存性であり、従来のアクリジニウム標識から化学発光の開始のために必要とされる高いｐＨによってそのようなクエンチャが役立たなくなる。また、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２の著者によってこの問題は正しく評価されておらず、実際に、この文献では、説明している化合物との組合せで使用されるはずであるクエンチャについていずれも示唆していない。
【００２４】
アクリジニウム化合物は１２〜１４より低いｐＨ値で化学発光反応に耐えることが可能であると説明されているが（ＥＰ−Ａ−０６８２２５４）、これらの化合物は酵素基質として使用され、リガンドと結合するための標識化化合物でない。ＥＰ−Ａ−０６８２２５４によれば、適切な分子をＥＰ−Ａ−０３２４２０２のような文献で述べられる方法を使用して調製することができると提案するが、特に、生物学的興味の物質に共有結合するために必要な反応基がそこで示唆されている化合物の特徴ではないと述べている。したがって、これらの先に述べた化合物は本発明の化合物とは構造的に完全に別であり、それらは標識化化合物としての用途に適していない。カップリング基を含むＥＰ−Ａ−０６８２２５４の分子に適応して化学発光の開始に対するｐＨについての影響、及び生物学的興味の物質にそのように適用した分子のカップリングについての影響を予測することはできない。
【００２５】
化学発光エネルギー転移反応での他の問題としては、化学発光標識化分子に加えて、それらが標識化分子の放出スペクトルで少なくとも部分的にであるが好ましくは完全に重複する吸収スペクトルを有する適切なクエンチャを必要とすることである。多数のクエンチャがわかっていると仮定すると問題となるようにみえないかもしれないが、実際は、標識化分子とクエンチャ両方のスペクトル範囲がそれらの環境のｐＨでかなり変化することができるため単純なことではない。
【００２６】
したがって、化学発光転移系が必要とする化学発光標識化分子としては、結合複合体の解離を回避するために十分に低いｐＨで化学発光放射を放出するものであり、適切なクエンチャのスペクトルと重複するスペクトルを有するｐＨで化学発光放射を放出するものでもある。
【００２７】
このように、化学発光分子の検出の鋭敏な検出感度を共鳴エネルギー転移リガンド結合方法と結び付けるために使用することができる分子が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明の第１の構成では、一般式（Ｉ）
【００２９】
【化３】
2011219489.tif 000004
【００３０】
［式中、［Ｒ１はアミノ又はチオール部分と反応可能である反応基であり、
Ｌ１はヒドロキシ、ハロ、ニトロ又はＣ１〜Ｃ４アルコキシと任意に置換される２〜１２の炭素原子を有する炭化水素結合部分であり、及び
Ｒ２は水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アリール、縮合アリール、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アシル、ハロゲン化物、ヒドロキシ又はニトロである、又は
Ｒ１−Ｌ１−の組合せは、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ又はＣ１〜Ｃ４アルコキシで任意に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキル基を有し、及び
Ｒ２は、Ｒ４−Ｌ１−基を有し、Ｒ４はアミン又はチオール部分と反応可能である反応基であり、Ｌ１は上記で定義したとおりである］、
［Ｌ２は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＳＯ２Ｒ５）−であり、いずれにおいても−Ｃ（＝Ｏ）は環状炭素原子に結合し、Ｒ５はＣ１〜Ｃ８アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ又はＣ１〜Ｃ８アシルである］、
［Ｒ３は、置換Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル又はアリール基であり、前述の置換のうち少なくとも１つは、Ｒ３から形成される離脱基とＬ２基の−Ｏ、−Ｓ又はーＮ（ＳＯ２Ｒ５）との共役酸のｐＫａが≦約９．５であるように電子求引性である］、及び
［Ｘ−が分子の合成及び処理の結果として形成されるアニオンである］］の化合物であり、
この化合物は、一方又は両方の外環に１以上のさらなるＲ２部分を、前述のＲ２部分のうち１つのみがＲ４−Ｌ１−基を有することができるという条件で含む化合物を提供する。
【００３１】
Ｒ３基の置換基は、Ｒ３によって形成される離脱基とＬ２基の−Ｏ、−Ｓ又は−Ｎ（ＳＯ２Ｒ５）の共役酸が≦約９．５となるように選択される。これは、実際に、Ｒ３の置換基の少なくとも１つが電子求引性であることを意味する。分子がｐＨ８以下で有効な化学発光であるため、これは特に重要な特徴である。これによって、本発明の化合物は、先行技術の化合物、特にＥＰ−Ａ−０３２４２０２で例証される化合物に対して重要な利点を有する。ＥＰ−Ａ−０３２４２０２（実施例２１及び２５）で例証されるエステル化合物のみではｐＨ８で有効な化学発光放出を生成しないで、実際には、使用可能な化学発光放出のために少なくとも１２のｐＨを必要とする。
【００３２】
先行技術の化合物に対して、本発明の最適化されたアクリジニウム標識の化学発光放出は、一般的に使用されるクエンチャ及びリガンド結合複合体の安定した必要要件に適合したｐＨ値で開始することができる。
【００３３】
このように、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２では化学発光標識として役立つ化合物に関連することを意図しているが、上述したように概説される問題を特定していない。さらに、エネルギー転移分析方法にはいかなる化合物の使用について例がなく、実際、文献で述べられる一般式はそのような分析方法で完全に使用できない多数の化合物を包含する。この文献には、クエンチャを化合物との組合せで使用することができるかもしれないことについても提案がされていない。ＥＰ−Ａ−０３２４２０２での化学発光のアクリジニウムエステルの唯一の例では、本発明のＲ３に等価の位置にフェノキシ置換基を有し、化学発光放出の間、１２を上回るｐＨで反応が起こる。このｐＨでは、いかなる結合複合体も解離してしまうし、多くのクエンチャの効果がなくなってしまう。
【００３４】
ＥＰ−Ａ−０３２４２０２は実施例１から８で中間体のエステル化合物を開示する。このように、多数の化合物がＥＰ−Ａ−０３２４２０２に包含されるが、この文献の著者はエネルギー転移分析方法での目的でその化合物の構造が重要であるという認識を示していない。実際に、電子吸引性の化合物のみがエネルギー転移分析方法で使用可能であるということを本発明者らが見つけたときに、非置換の化合物、電子求引性の化合物及び電子供与性の化合物を同量で与える。ＥＰ−Ａ−０３２４２０２に記載される唯一の測定条件はｐＨ≧１２であり、結果としてエネルギー転移を不可能とするリガンド結合複合体の解離となる。置換基のタイプが有効であること、及び化学発光の最終生成物に変換される唯一のアクリジニウムエステルの前駆体が実施例１の化合物であり、これは非置換のフェニルエステルであることについて、文献には提案又は認識すらない。実施例２５の実例によれば、この化合物は基本的な過酸化水素で処理するときに化学発光性であるが、化学発光化合物のリガンドへの結合又は化学発光エネルギー転移分析方法の例はない。実際に、すでに述べたように、例証された特定の化合物はこの分析で使用することができないはずである。したがって、この先行技術の文献から、特定の化合物が化学発光エネルギー転移分析方法で役立つかについて確認することは完全に不可能である。しかしながら、本発明のいくつかの実施の形態では、Ｒ３が４−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、４−アセチルフェニル又は１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピルである化合物が一般式（Ｉ）の定義から状況次第で除外される。
【００３５】
本発明との関係では、「リガンド」という用語は、複合体を形成する「反リガンド」として称される第２部分に特に結合することができる任意の部分に関する。リガンドと反リガンドの例は、抗体と抗原又は抗原決定基、核酸配列、酵素と酵素基質、及びレセプターとレセプター結合分子を含む。
【００３６】
「標識化分子」は、リガンド又は反リガンドと化学的に結合することができ、及びリガンド又は反リガンドを検出することを可能にする検出可能な信号を放出する分子に関する。本発明の標識化分子は化学発光標識化分子であり、これは適切な化学反応の開始で化学発光放射を放出することができる。
【００３７】
「クエンチャ」は、リガンド又は反リガンドと化学的に結合することができる分子に関し、また、クエンチャを標識化分子と近接近（一般的に１０ｎｍ未満）させるときに化学発光又は蛍光放出スペクトルが変調されるように、標識化分子の化学発光又は蛍光放出スペクトルと完全に又は部分的に重複する吸収スペクトルを有する分子に関する。
【００３８】
「Ｃ１〜Ｃ８アルキル」は、８以下の炭素原子を有する直鎖又は分岐飽和炭化水素鎖に関連する。例としては、メチル、エチル、プロピル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチルが含まれる。「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、同様の意味であるが１から４までの炭素原子を有する。
【００３９】
「Ｃ１〜Ｃ８アルケニル」は、２から８までの炭素原子を有し少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素鎖に関する。エテニル、２−プロペニル及び３−ヘキセニルが例として含まれる。
【００４０】
「Ｃ２〜Ｃ８アルキニル」は、２から８までの炭素原子を有し少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素鎖に関する。エチニル、２−プロピニル及び３−ヘキシニルが例として含まれる。
【００４１】
「ハロアルキル」は、クロロ、フルロ、ブロモ及びヨードからなるグループから選択される１以上の置換基を有するアルキル基に関する。
【００４２】
「アリール」は、例えば窒素、酸素又は硫黄などの１以上のヘテロ原子を含むことができる５から１０員環の単一又は縮合芳香族環系に関する。フェニル、ピリジル、フラニル及びナフタレニルが例として含まれる。
【００４３】
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードに関連し、「ハロゲン化物」はフッ化物、塩化物、臭化物及びヨウ化物に関連する。
【００４４】
標識化分子を生物学的に重要な分子に結合させる手段は十分に確立しており、本発明を実施することができるＲ１およびＬ１の多くの変形例があることはいうまでもない。しかしながら、Ｌ１が２から１０の炭素原子を含むときに良好な結果に達することがわかってきた。より好ましくは、Ｌ１がメチレン単位からなる完全飽和鎖である。
【００４５】
化合物を生物学的に重要な分子と結合するときに特に役立つことがわかってきたＲ１とＲ４基は、スクシンイミジルエステル及びイミダートエステルのような活性エステルと、クロロカルボニル、ブロモカルボニル、ヨードカルボニル、クロロスルホニル及びフルオロジニトロフェニルのような活性ハロゲン化物とを含む。
【００４６】
同様に、化学発光の活性化を保持させ、化学発光標識の放出波長を変換するために使用することができるＲ２によって表すことができる多数の置換があることが十分に確立されている。これは分析方法で使用されるクエンチャの選択に影響する。しかしながら、本発明者らは、最も役立つ化合物はＲ２が水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル、特にメチル又はエチルであるものを含むことをみつけた。これらがアクセプターメチルレッドとの組合せの用途に適しているからである。Ｒ２が水素である化合物が特に好ましい。
【００４７】
本発明の好ましい化合物では、Ｌ２は−Ｃ（＝Ｏ）−である。
【００４８】
すでに上述したように、Ｒ３は、Ｒ３によって形成される離脱基と−Ｏ、−Ｓ又は−Ｎ（ＳＯ２Ｒ５）との共役酸のｐＫａが≦約９．５となるように選択されなければならず、これは少なくとも１つの電子求引基を含むことを意味する。
【００４９】
しかしながら、Ｒ３部分が反応しすぎる離脱基を形成するならば、これは化合物が標識化化合物として役立つために必ずしも十分に安定していないことを意味する。化学発光転移分析方法のための標識化化合物としての最適効率のために、従って、Ｒ３で形成される離脱基とＬ２基の−Ｏ、−Ｓ又は−Ｎ（ＳＯ２Ｒ５）との共役酸のｐＫａは≧３であることが好ましい。
【００５０】
したがって、電子求引基に加えて、Ｒ３置換基は、電子求引性でない基を含むことができ、存在する電子求引基の効果が優性であるならば電子供与性であってもよい。Ｒ３の構造は、化学発光反応の結果である離脱基のｐＫａ値の計算によって直ちに予測可能であり、従って、そのような基の範囲は当業者によって認識されることができる。
【００５１】
しかしながら、例えば、有用なＲ３基は、１以上のハロゲン化物又はハロゲン化アルキルと置換したアルキル又はアリール基を含む。特に好ましい化合物は、Ｒ３がそのような基と、特にニトロ、フッ素、塩素、臭素又はトリフルオロメチルと２及び６位置でそれぞれ置換されるフェニル基であるものを含む。このような基の例としては、２，６−ジブロモフェニル、２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェニル及び２，６−ジニトロフェニルを含む。
【００５２】
Ｘ−は、多くの適切なアニオンのうちの任意の１つであってもよいが、ヨウ化物、フルオロ硫酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩又はトリフルオロ酢酸のようなハロゲン化物又はハロゲン化物含有アニオンが好ましい。
【００５３】
Ｒ２が水素又は低級アルキルである化合物がエネルギーアクセプターとしてのメチルレッドとの使用で特に適当である。これらの化合物は、これらの化学発光放出のスペクトルがｐＨ９でのクエンチャのメチルレッドの吸収スペクトルの完全な範囲内であるという特有の利点を有するからである。リガンドと反リガンドの間の反応の範囲及び速度、したがって前述の反応に影響する物質又は事象の存在の定量測定をするために、上述した好ましい化合物の１つがエミッターとして使用され、メチルレッドがアクセプターである化学発光エネルギー転移系を使用することができることを意味する。化学発光シグナルの変化の範囲を測定することで、これを簡単にすることができる。
【００５４】
すでに述べたように、特定の化学発光エミッターで使用するために適しているクエンチャを選択することは簡単ではない。エミッターとクエンチャ両方のスペクトル範囲がその環境のｐＨで変わるからであり、これらの式（Ｉ）の化合物のメリルレッドとのスペクトルの重なりは特に望ましい。
【００５５】
本発明の特に好ましい化合物は次のものを含む。
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、及び、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、及び、
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩。
【００５６】
本発明の化合物は周知の方法により調製することができる。例えば、一般式（Ｉ）の化合物は一般式（ＩＩ）
【００５７】
【化４】
2011219489.tif 000005
【００５８】
［式中、Ｒ２、Ｌ２及びＲ３は一般式（Ｉ）で定義されたとおりである。］
【００５９】
の化合物を一般式（ＩＩＩ）
【００６０】
【化５】
2011219489.tif 000006
【００６１】
［式中、Ｌ１、Ｒ１及びＸは一般式（Ｉ）で定義されていたとおりであり、Ｘはトリフレート又はヨウ化物のような離脱基であることが好ましい。］
【００６２】
の化合物と処理することによって調製することができる。
【００６３】
一般的に、ニトロベンゼンのような極性有機溶媒で、約８０から１５０℃の高温で反応を行う。
【００６４】
一般式（ＩＩＩ）の化合物はよく知られており、簡単に入手することができ、又は、既知の方法によって簡単に入手可能な材料から調製することができる。例えば、一般式（ＩＩＩ）のＲ１部分がスクシンイミジルエステルの場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの対応するカルボキシル酸との反応によって調製することができる。
【００６５】
一般式（ＩＩ）の化合物は、一般式（ＩＶ）
【００６６】
【化６】
2011219489.tif 000007
【００６７】
［式中、Ｒ２は一般式（Ｉ）で定義された通りであり、Ｌは離脱基である］
【００６８】
の化合物を一般式（Ｖ）
【００６９】
【化７】
2011219489.tif 000008
【００７０】
［式中、Ｒ３は一般式（Ｉ）で定義された通りであり、ＺはＯ又はＳである］
【００７１】
の化合物と反応させることで調製することができる。
【００７２】
ピリジンのような極性有機溶媒で、好ましくは１０から５０℃の温度、一般的には室温で、反応を実行することができる。
【００７３】
一般式（ＩＶ）の化合物はこの技術でよく知られており、簡単に入手することができる化合物から標準的な方法によって調製することができる。例えば、アクリジン−９−カルボキシル塩化物はアクリジン−９−カルボン酸から調製することができる。式（Ｖ）の化合物も簡単に入手することができる。
【００７４】
上述したように、式（Ｉ）の化合物は、先行技術で知られている化合物よりもとても低いｐＨで化学発光を放出し、これによって、それらが多くの分析方法で特に役立つようになる。
【００７５】
分子種の会合又は解離をモニターするために化学発光クエンチングを使用する分析方法において、一般式（Ｉ）の化合物は特に役立つ。例えば、クエンチングの損失で活性酵素の存在を測定するように、切断位置の両側に、それぞれ一般式（Ｉ）の化合物とクエンチャを組み込むことで、酵素基質の切断をモニターすることができる。このような方法は、任意の酵素の阻害剤又はプロモーターを同定するために役立つ。
【００７６】
同様に、免疫学的検定、タンパク質結合、レセプター結合、核酸ハイブリダイゼーションなどによって例証されるような非共有結合プロセスを研究するときに、一般式（Ｉ）の化合物を組み込んでいる化学発光のエミッター／クエンチャ対が役立つ。したがって、そのようなプロセスに影響を与え、又はそのようなプロセスの一部となる物質を同定及び／又は定量するために、このような方法を用いることができる。このような測定の基本は十分に確立しており、本発明で開示する提案とともに使用することができ、１つの結合パートナーを一般式（Ｉ）の化合物で標識化し、さらにそれぞれの結合パートナーをクエンチャで標識化し又はそれ自体をクエンチャとするという知見によって改良した分析方法を提供する。特定の環境では、以下に例証するように結合パートナーがエミッターとクエンチャをともに組み込んでもよい。
【００７７】
したがって、本発明の他の構成では、媒体中の第１及び第２結合パートナーの会合又は解離を検出又はモニターする方法であって、第１及び第２結合パートナーが会合するときに一般式（Ｉ）の化合物の化学発光シグナルが変調されるように、第１結合パートナーを一般式（Ｉ）の化合物で標識化し、第２結合パートナーをクエンチャで標識化し、又はそれ自体をクエンチャにし、この方法は、ｐＨを約６〜１０に維持しながら媒体に過酸化水素を添加すること、及び化学発光放射の放出を検出することを含むことを特徴とする方法が提供される。
【００７８】
第１及び第２結合パートナーは、例えば酵素によって触媒作用を及ぼすことができる共有反応を経由して会合又は解離する分子種とすることができる。又は、第１及び第２結合パートーは、リガンドと反リガンド、例えば相補的核酸、抗体と抗原又は抗原決定基、又はレセプターとレセプター結合分子とすることができる。
【００７９】
上述した方法は媒体中の検体の検出に適用することもできる。検体と結合パートナーは、例えば酵素によって触媒作用を及ぼすことができる共有反応を介して会合又は解離する分子種とすることができる。又は、それらをリガンドと反リガンド、例えば相補的核酸、抗体と抗原又は抗原決定基、又はレセプターとレセプター結合分子とすることができる。
【００８０】
一般式（Ｉ）の化合物に対しクエンチャを有する検体の媒体中の有無を検出する方法であって、
ａ）検体が存在するならば特定結合複合体を形成するように、一般式（Ｉ）の化合物で標識化される検体に対し特定結合パートナーを媒体中に添加すること、
ｂ）ｐＨを約６〜１０に維持しながら媒体に過酸化水素を添加すること、
ｃ）化学発光放射の放出を検出し、一般式（Ｉ）の化合物の変調信号が検体の存在を示すことを含む方法も提供される。
【００８１】
検体が一般式（Ｉ）の化合物に対しクエンチャでない場合に、本発明では、媒体中の検体を検出する方法であって、
ａ）検体が存在するならば特定結合複合体を形成するように、一般式（Ｉ）の化合物、又は一般式（Ｉ）の化合物に対しクエンチャで標識化された検体に対し、特定結合パートナーを媒体に添加すること、
ｂ）媒体に、二次的結合試薬を同時に又は連続して添加すること、
ｃ）ｐＨを約６〜１０に維持しながら媒体に過酸化水素を添加するステップを有する化学発光方法によって特定結合複合体の存在を検出し、化学発光放射の放出を検出し、一般式（Ｉ）の化合物の変調信号が検体の存在を示すことを含む方法が提供される。
【００８２】
上述した方法では、競合的結合測定方法又は「サンドイッチ」測定方法によって、前述の第１特定結合パートナーと結合する検体の存在を決定及び／又は定量することができる。前者の測定方法では、二次的結合試薬が、標識付けした第１標識特定結合パートナーに適合するように、クエンチャ又は一般式（Ｉ）の化合物で標識化された検体類似物である。後者の測定方法では、第２結合試薬が、第１標識特定結合パートナーに適合するように、クエンチャ又は一般式（Ｉ）の化合物で標識化された第２特定結合パートナーである。本発明で開示されるように改善された化合物及び関連する化学発光クエンチング系の特定の必要性に関連して本発明の特定の提案に付随することを別として、競合的及び非競合的結合測定方法の一般的な設計は当業者に良く知られており、確率された原理を本発明に適応させることができる。
【００８３】
本発明の構成の分析方法の他の例では、検体が核酸であり、分析方法ではオリゴヌクレオチドプローブを特定結合パートナーとして用いる。これは、２つの末端（約４〜８塩基）が互いに相補的であり、中央部分が検体の標的配列の全部又は一部に対し相補的である約１５から３０の配列を有する約４０以下の塩基を有する一本鎖核酸である。一方端で一般式（Ｉ）の化合物で、他方でクエンチャで、オリゴヌクレオチドプローブを標識化することができる。検体がない場合では、一般式（Ｉ）の分子が放出する任意の化学発光シグナルがクエンチャで変調されるように、オリゴヌクレオチドプローブの互いに相補的な末端が、分子の２つの末端を互いに接触させるように結合する。しかしながら、検体がある場合では、分子の中央部分が、分子の２つの末端の結合よりもより強固に検体に結合する。したがって、検体が存在する場合では、化学発光放射のクエンチングが全く起こらないように、クエンチャが一般式（Ｉ）の化合物から分離される。
【００８４】
他の変形例では、結合プロセスの阻害剤又はプロモーターの存在を検出するためにこの方法を適用することができる。この方法では、一般式（Ｉ）の化合物及びクエンチャでそれぞれ標識化した第１及び第２特定結合パートナーを混合し、ｐＨを約６〜１０に維持しながら媒体に過酸化水素を添加し、化学発光放射の放出を検出することを含み、一般式（Ｉ）の化合物の化学発光シグナルの変調が結合プロセスの促進を示し、無変調信号の存在が結合プロセスの阻害を示す。
【００８５】
上述したように、一例としては、酵素基質の切断をモニターする方法の使用であり、この場合では、第１及び第２結合パートナーが互いに共有結合している分子種（ペプチド）であり、基質の切断をクエンチングがないことで決定するように、切断部位の両側のそれぞれの部位で、一般式（Ｉ）の化合物及びクエンチャで標識化される。
【００８６】
他の変形例では、核酸の２つの相補鎖のそれぞれを一般式（Ｉ）の化合物及びクエンチャでそれぞれ標識化する。相補鎖を二本鎖で結合するときにエミッターとクエンチャが互いに相互作用するように有効な近接近状態であるように、相対的な標識化位置を選択しなければならない。したがって、例えば、酵素活性、温度変化、非標識オリゴヌクレオチドとの結合に対する競合、カオトロピック剤などのプロセスによって、鎖が実質的に分離したときに化学発光が観察されるのみである。
【００８７】
この分析方法での使用で一般式（Ｉ）の好ましい化合物は、第１の構成で上述したとおりである。
【００８８】
一般式（Ｉ）の化合物が好ましい化合物の１つである場合、クエンチャとしてのメチルレッドとの組合せで使用することができる。好ましい化合物の化学発光放出スペクトルがｐＨ６〜１０でメチルレッドの吸収スペクトルの範囲内に完全に入るからである。
【００８９】
上述した分析方法は、蛍光検出方法を用いた対応する分析方法よりも高感度である。したがって、化学発光検出方法のさらなる利点としては、核酸増幅のようなステップの必要性を除去することができる。この核酸増幅は、分析方法の検出限界の範囲内とするために、有効に存在する検体の量を簡単に増加するように、蛍光検出方法とともにしばしば使用される。
【００９０】
本発明の分析方法は簡単に実行して、広い範囲の検体の検出に適している。
【００９１】
本発明の他の構成では、一般式（Ｉ）の化合物で標識化されたリガンド又は反リガンドを有する試薬が提供される。リガンド又は反リガンドを標識核酸、又はペプチド又はタンパク質とすることができ、例えば抗体、抗原、抗原決定基、酵素、酵素基質、レセプター又はレセプター結合分子である。試薬は、上述した分析方法での用途に適している。
【００９２】
一部の例では、リガンド又は反リガンドをクエンチャでさらに標識化することができる。例えば、試薬が、末端が互いに相補的であり、中央部分が標的配列に対し相補的である約１５から３０の塩基配列を含む約４０以下の塩基を有する核酸分子を有し、この分子が一方端で一般式（Ｉ）の化合物で、他方端でクエンチャで標識化されている。
【００９３】
又は、リガンド又は反リガンドが核酸二本鎖を有し、化学又は物理手段によって二本鎖が実質的に非完全のままであるときでなく、二本鎖が実質的に完全であるときに、光放出の減衰があるように、そのそれぞれの鎖が一般式（Ｉ）の化合物とクエンチャでそれぞれ標識化される。
【００９４】
そのような試薬の他の例としては、基質の切断がクエンチングがないことで決定されるように、切断部位の両側のそれぞれの部位で、一般式（Ｉ）の化合物とクエンチャで標識化される酵素基質を有する。
【００９５】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物としては、上述したとおりであり、これらの好ましい化合物のうち１つを使用するときに、クエンチャをメチルレッドとすることができる。
【００９６】
試薬はキットの一部を形成することができ、したがって、本発明でさらに提供されるキットとしては、上述した試薬、過酸化水素溶液、及び検体含有媒体のｐＨをｐＨ６〜１０に、好ましくは約ｐＨ９に調製するように合わせる緩衝剤を有する。
【００９７】
上述したように、試薬としては、例えば、リガンド又は反リガンドが核酸分子又は酵素基質であるときに、一般式（Ｉ）の化合物に加えてクエンチャを有してもよい。
【００９８】
又は、試薬は、検体に対し特定結合パートナー又は二次的結合パートナーを有してもよく、また、キットは、クエンチャで標識化される二次的試薬をさらに有してもよい。このように、試薬が検体に対し特定結合パートナーを有するならば、第２試薬としては二次的結合パートナーを有することになる。逆の場合も同様である。
【００９９】
キットを競合結合測定方法用に適合するときに、標識付けした第１標識特定結合パートナーに応じて、二次的結合試薬がクエンチャ又は一般式（Ｉ）の化合物で標識化された検体類似物を有する。サンドイッチ測定方法では、第１標識特定結合パートナーに応じて、二次的結合試薬がクエンチャ又は一般式（Ｉ）の化合物で標識化された第２特定結合パートナーを有する。
【０１００】
試薬と第２試薬を混合物又はキットの分離構成物として提供してもよい。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
一般式（Ｉ）
【化１】
2011219489.tif 000009
［式中、［Ｒ１がアミン又はチオール部分と反応可能である反応基であり、
Ｌ１がヒドロキシ、ハロ、ニトロ又はＣ１〜Ｃ４アルコキシと任意に置換される２〜１２の炭素原子を有する炭化水素結合部分であり、及び
Ｒ２が水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ハロアルキル、アリール、縮合アリール、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アシル、ハロゲン化物、ヒドロキシ又はニトロである、又は
組み合せのＲ１−Ｌ１−がヒドロキシ、ハロ、ニトロ又はＣ１〜Ｃ４アルコキシと任意に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキル基を有し、及び
Ｒ２がＲ４−Ｌ１−基を有し、Ｒ４がアミン又はチオール部分と反応可能である反応基であり、Ｌ１が上記定義されたとおりである］、
［Ｌ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＳＯ２Ｒ５）−であり、それぞれの場合で、前記−Ｃ（＝Ｏ）が環状炭素原子に結合され、Ｒ５がＣ１〜Ｃ８アルキル、アリール、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ又はＣ１〜Ｃ８アシルである］、
［Ｒ３が置換Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル又はアリール基であり、前記置換のうち少なくとも１つは、Ｒ３から形成される離脱基とＬ２基の−Ｏ、−Ｓ又は−Ｎ（ＳＯ２Ｒ５）との共役酸のｐＫａが≦約９．５となるように、電子求引性である］、及び
［Ｘ−が分子の合成及び処理の結果として形成されるアニオンである］］の化合物であり、
前記化合物は、一方又は両方の外環に１以上のさらなるＲ２部分を、前記Ｒ２部分のうち１つのみがＲ４−Ｌ１−基を有することができるという条件で含むことができることを特徴とする化合物。
（項目２）
Ｒ１が活性エステル、イミダート又は活性ハロゲン化物であること、
Ｌ１が３から１０の炭素原子を有すること、
Ｒ２が水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであること、
Ｌ２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であること、及び
Ｘ−がハロゲン化物又はハロゲン化物含有アニオンであることのそれぞれ又はいずれかの組み合せであることを特徴とする項目１に記載された化合物。
（項目３）
Ｒ１がスクシンイミジルエステル、イミダートエステル、マレイミド、クロロカルボニル、ブロモカルボニル、ヨードカルボニル、クロロスルホニル又はフルオロジニトロフェニル部分であること、
Ｌ１が３から１０のメチレン単位を有すること、
Ｒ２が水素であること、及び
Ｘ−がヨウ化物、フルオロスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩又はトリフルオロ酢酸塩であることのそれぞれ又はいずれかの組み合わせであることを特徴とする項目２に記載された化合物。
（項目４）
Ｌ２−Ｒ３離脱基の共役酸のｐＫａが≧３となるようにＲ３を選択することを特徴とする項目１から３のいずれか１項に記載された化合物。
（項目５）
Ｒ３が１以上のハロゲン化物又はハロゲン化アルキルと置換されるアルキル又はアリールであることを特徴とする項目１から４のいずれか１項に記載された化合物。
（項目６）
Ｒ３が、ニトロ、フッ素、塩素、臭素又はトリフルオロメチル基と２及び６位置でそれぞれ置換されるフェニル基であることを特徴とする項目５に記載された化合物。
（項目７）
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、又は
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩を含むことを特徴とする項目１から６のいずれか１項に記載された化合物。
（項目８）
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物の調製のためのプロセスであって、一般式（ＩＩ）
【化２】
2011219489.tif 000010
［式中、Ｒ２、Ｌ２及びＲ３が、一般式（Ｉ）で定義されたとおりである］の化合物を、一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2011219489.tif 000011
［式中、Ｌ１及びＲ２が一般式（Ｉ）で定義されたとおりであり、Ｘが離脱基である］
の化合物と処理することを含むことを特徴とするプロセス。
（項目９）
媒体中で第１及び第２結合パートナーの会合又は解離を検出又はモニターする方法であって、前記第１及び第２結合パートナーが会合するときに、項目１から７のいずれか１項に記載された化合物の化学発光シグナルが変調されるように、前記第１結合パートナーが項目１から７のいずれか１項に記載された化合物で標識化され、前記第２結合パートナーがクエンチャで標識化され、又はそれ自体をクエンチャとし、前記方法は、ｐＨを約６〜１０に維持しながら媒体に過酸化水素水を添加すること、及び化学発光放射の放出を検出することを含むことを特徴とする方法。
（項目１０）
前記第１及び第２結合パートナーは、共有結合を経由して会合又は解離する分子種であることを特徴とする項目９に記載された方法。
（項目１１）
前記第１及び第２結合パートナーはリガンド及び反リガンドであることを特徴とする項目９に記載された方法。
（項目１２）
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物に対しクエンチャを有する検体の媒体中の有無を検出する方法であって、
ａ）前記媒体に前記検体に対して特定結合パートナーを添加することであり、検体が存在するならば特定結合複合体を形成するように、前記特定結合パートナーが項目１から７のいずれか１項に記載された化合物で標識化されていること、
ｂ）ｐＨを約６〜１０に維持しながら前記媒体に過酸化水素を添加すること、及び
ｃ）化学発光放射の放出を検出することであり、項目１から７のいずれか１項に記載された化合物の変調信号が前記検体の存在を示すこと、を含むことを特徴とする方法。
（項目１３）
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物に対しクエンチャでない検体の媒体中の有無を検出する方法であって、
ａ）前記媒体に前記検体に対し特定結合パートナーを添加することであり、検体が存在するならば特定結合複合体を形成するように、前記特定結合パートナーが項目１から７のいずれか１項に記載された化合物、又は項目１から７のいずれか１項に記載された化合物に対しクエンチャで標識化されていること、
ｂ）前記媒体に、ステップ（ａ）で使用される項目１から７のいずれか１項に記載された化合物に対するクエンチャ、又はステップ（ａ）でクエンチャを使用するならば項目１から７のいずれか１項に記載された化合物で標識化された二次的結合試薬を同時に又は連続して添加すること、及び
ｃ）ｐＨを約６〜１０に維持しながら前記媒体に過酸化水素を添加するステップを含む化学発光方法によって特定結合複合体の存在を検出し、化学発光放射の放出を検出し、項目１から７のいずれか１項に記載された化合物の変調信号が前記検体の存在を示すこと、を含むことを特徴とする方法。
（項目１４）
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物に対しクエンチャでない検体の媒体中の有無を検出する方法であって、
ａ）検体が存在するならば特定結合複合体を形成するように、項目１から７のいずれか１項に記載された化合物、又は項目１から７のいずれか１項に記載された化合物に対するクエンチャで標識化された検体に対し、特定結合パートナーを前記媒体に添加すること、
ｂ）前記媒体に、前記第１標識特定結合パートナーに応じて適切に、クエンチャ又は項目１から７のいずれか１項に記載された化合物で標識化された第２特定結合パートナーを同時又は連続して添加すること、及び
ｃ）ｐＨを６〜１０に維持しながら前記媒体に過酸化水素を添加するステップを含む化学発光方法によって特定結合複合体の存在を検出し、化学発光放射の放出を検出し、項目１から７のいずれか１項に記載された化合物の変調信号が前記検体の存在を示すこと、
を含むことを特徴とする方法。
（項目１５）
結合プロセスの阻害剤又はプロモーターの存在を検出する方法であって、
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物とクエンチャでそれぞれ標識化された第１及び第２特定結合パートナーを混合すること、
ｐＨを６〜１０に維持しながら前記媒体に過酸化水素を添加すること、及び
化学発光放射の放出を検出することを含み、
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物の化学発光シグナルの変調が結合プロセスの促進を示し、無変調信号の存在が結合プロセスの阻害を示すことを特徴とする方法。
（項目１６）
酵素基質の切断又は相補的核酸のハイブリダイゼーションをモニターするための項目１５に記載された方法。
（項目１７）
前記クエンチャがメチルレッドであることを特徴とする項目９から１６のいずれか１項に記載された方法。
（項目１８）
項目１から７のいずれか１項に記載された化合物で標識化されたリガンド又は反リガンドを有することを特徴とする試薬。
（項目１９）
前記リガンド又は反リガンドが核酸、ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする項目１８に記載された試薬。
（項目２０）
前記リガンド又は反リガンドがさらにクエンチャで標識化されることを特徴とする項目１９に記載された試薬。
（項目２１）
互いに相補的である末端、及び標的配列に相補的である約１５から３０塩基の配列を含む中央部分を有する約４０以下の塩基を有し、一方端で項目１から７のいずれか１項に記載された化合物で、他方端でクエンチャで標識化されることを特徴とする項目２０に記載された試薬。
（項目２２）
核酸二本鎖を有し、化学又は物理手段によって前記二本鎖が実質的に非完全のままであるときではなく、前記二本鎖が実質的に完全であるときに光放出の減衰が存在するように、前記核酸二本鎖のそれぞれの鎖が項目１から７のいずれか１項に記載の化合物及びクエンチャでそれぞれ標識化されることを特徴とする項目２０に記載された試薬。
（項目２３）
切断部位の両側のそれぞれの部位で、項目１から７のいずれか１項に記載された化合物とクエンチャで標識化された酵素基質を有することを特徴とする項目２０に記載された試薬。
（項目２４）
前記クエンチャがメチルレッドであることを特徴とする項目２１から２３のいずれか１項に記載された試薬。
（項目２５）
項目１９から２４のいずれか１項に記載された試薬、過酸化水素溶液、及び媒体を含む検体のｐＨをｐＨ６〜１０に維持するように合わせる緩衝剤を有することを特徴とするキット。
（項目２６）
クエンチャで標識化された第２試薬をさらに有することを特徴とする項目２５に記載されたキット。
（項目２７）
前記第１試薬が検体に対し特定結合パートナーであり、前記第２試薬が二次的結合パートナーであること、又は、前記第１試薬が二次的結合パートナーであり、前記第２試薬が検体に対し特定結合パートナーであることを特徴とする項目２６に記載されたキット。
（項目２８）
前記クエンチャがメチルレッドであることを特徴とする項目２６又は２７に記載されたことを特徴とするキット。
（項目２９）
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩、及び
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩からなるグループから選択することを特徴とする化合物。
【０１０１】
以下、次の限定されない実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【０１０２】
プロットでは、ｐＨ９でのクエンチャDabcylとメチルレッドの吸収スペクトルがこのｐＨでのアクリジニウムエステルの放出スペクトルとして同じ軸にプロットされ、アクリジニウムエステルの放出スペクトルがメチルレッドのものと完全に重複している。
【０１０３】
テスト溶液の標的配列の量を、一般式（Ｉ）の化合物及びメチルレッドでそれぞれ標識化した相補的末端配列を有する核酸プローブから得た化学発光強度に対しプロットすると、溶液中の標的配列の量が増加するにつれて、プローブの２つの末端配列の互いのハイブリダイゼーションが減少し、したがって化学発光シグナルのクエンチングの量も減少する。
【０１０４】
次の実施例では、合成されテストされた化合物が全て、Ｒ１がアミン又はチオール部分と反応可能である反応基であり、Ｌ１が結合部分である化合物である。しかしながら、Ｒ２部分を経由してリガンドに結合することができる化合物（例えばＲ２がＲ４−Ｌ１である化合物）もまた本発明で有用である。このタイプの化学発光化合物を外環置換基（一般式（Ｉ）のＲ２）を経由してリガンドに結合する原理としては、先行技術、例えばＵＳ５２８３３３４（ＭａＣａｐｒａ）でよく知られ、そのような化合物が化学発光することが実証されてきた。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩
【０１０６】
ａ．１１−ヨードウンデカン酸［８，９］
【０１０７】
【化８】
2011219489.tif 000012
【０１０８】
５０ｍｌのフラスコに、１１−ブロモウンデカン酸（２．１９２ｇ、８．２７ｍｍｏｌ）とＮａＩ（３．０３７０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をオイルポンプで１時間乾燥した。アセトン（２０ｍｌ）を添加し、混合物を２０時間攪拌した。得られた混合物を水（２０ｍｌ）に注ぎ、ジエチルエーテル（２５ｍｌ×４）で抽出し、次に、組み合せた有機抽出液を飽和ＮａＳＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発させ、粗淡赤色固体生成物（２．３６０９ｇ、９１．５％の収率）を得た。固体をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン＋エーテル＋ギ酸、１００：１００：０．１）で精製した。Ｒｆ＝０．４９の画分を集め、乾燥のため蒸発させ、白色固体（２．２３０ｇ、８３％、ｍ．ｐ．６３〜６４℃［８］）を生成した。
【０１０９】
1HNMR, (CDCl3, δ, ppm), 3.12 (2H, t, J=7Hz), 2.28 (2H, t, J=7Hz), 1.75 (2H, quintet, J=7Hz), 1.56 (2H, quintet, J=7Hz), 1.24-1.18 (12H, m) ; 13CNMR (CDCl3, δ, ppm), 179.9 (C=O), 34.3, 33.9, 30.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 28.9, 25.0, 7.5 (10 x CH2); IR (ν, cm-1) 1693 (C=O); MS (EI) 313 (M + H+, 3%), (CI) 330 (M + NH4+,100%).
【０１１０】
ｂ．スクシンイミジル１１−ウンデカノアート［１０］
【０１１１】
【化９】
2011219489.tif 000013
【０１１２】
５０ｍｌのフラスコに、１１−ヨードウンデカン酸（５５６ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４４０ｍｇ、３．８３ｍｍｏｌ）及び乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）を添加し、この系を窒素で洗い流した。混合物をアイスバスで１０分間冷却し、次にＴＨＦ（１０ｍｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、７７０ｍｇ、３．７６ｍｍｏｌ）を導入した。混合物を０℃で３時間、次に室温で一晩維持した。得られた混合物をろ過し、副生成物のジシクロヘキル尿素（ＤＣＵ）をほとんど取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し、次に残渣をクロマトグラフィーのシリカゲルカラムに導入した。トルエン＋酢酸エチル（４：１）でカラムを溶出し、Ｒｆ＝０．５９の画分を組み合せ蒸発し、白色固体（６３９ｍｇ、ｍｐ８３℃）を得た。６５℃でヘキサン＋ＥｔＯＡｃから結晶化によって不純物を取り除き、純粋生成物（３８７ｍｇ、５３％）を生成した。
【０１１３】
1HNMR, (CDCl3, δ, ppm), 3.16 (2H, t, J=7Hz), 2.81 (4H, s), 2.57 (2H, t, J=7Hz), 1.79, (2H, quintet, J=7Hz), 1.71 (2H, quintet, J=7Hz), 1.41-1.22 (12H, m); 13CNMR (CDCl3, δ, ppm) 169.6, 169.1 (2 x C=O), 34.0, 31.3, 30.9, 29.7, 29.6, 29.4, 29.1, 28.9, 26.0, 25.0, 7.7 (12 x CH2); IR (ν, cm-1) 1725; MS (CI) 427 (M+NH4+, 15%), 301 (15%), 225 (16%), 149 (30%), 132 (100%).
【０１１４】
ｃ．スクシンイミジル１１−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）ウンデカノアート［１１〜１３］
【０１１５】
【化１０】
2011219489.tif 000014
【０１１６】
５ｍｌのフラスコに、スクシンイミジル１１−ウンデカノアート（１８８ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）及び銀トリフレート（２１４ｍｇ、０．８３６ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをＮ２で５分間洗い流した。ベンゼン（１．５ｍｌ）をシリンジに導入し、そこに若干の黄色固体がすぐに現れた。混合物を１８時間、室温で攪拌し、次に短いクロマトグラフィーカラム（シリカゲル、２ｇ）に導入し、それをジクロロメタン（ＤＣＭ）で溶出した。Ｒｆ＝０．４８の画分を組み合わせ蒸発し、白色固体（１３３ｍｇ、収率、６７％）を得た。
【０１１７】
1HNMR (CDCl3, δ, ppm), 4.44 (2H, t, J=6Hz) 2.75 (4H, s), 2.51 (2H t, J=7Hz), 1.73 (2H, m), 1.63 (2H, quintet, J=7Hz), 1.37-1.17, (12H, m); 19FNMR (CDCl3, δ, ppm), -74.8; 13CNMR (CDCl3, δ, ppm), 169.6, 169.0 (C=O), 119.0 (quartet, CF3SO3), 78.1, 31.3, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 26.0, 25.4, 24.9 (12 x CH2); IR (ν, cm-1), 1725.
【０１１８】
ｄ．２，６−ジブロモフェニル  アクリジン−９−カルボン酸塩［３〜５］
【０１１９】
【化１１】
2011219489.tif 000015
【０１２０】
ＣａＣｌ２乾燥管とマグネチックスターラーバーを備えた丸底フラスコ（５０ｍｌ）で、ピリジン中のアクリジニウム−９−カルボン酸塩化物（２．０３６ｇ、８．４２ｍｍｏｌ）を（７０℃）まで加熱した。固体が完全に溶解した後、溶液を室温まで冷却し、２，６−ジブロモフェノール（２．３２５ｇ、９．２３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をしっかり一晩攪拌した。得られた混合物から茶色固体を残してピリジンを取り除いた。ＤＣＭ（１０ｍｌ）を使用して生成物を抽出し、抽出物をカラムクロマトグラフィーにさらし、トルエン＋ＥｔＯＡｃ（４：１）で溶出した。Ｒｆ０．５１での画分を集め蒸発し、淡黄色固体を得た。固体をＤＣＭ（４０ｍｌ）に再溶解し、希ＮａＯＨ（５×４０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過及び蒸発し、淡黄色粉体（２．０８０ｇ、５４％の収率）、ｍｐ１５９〜１６０℃を得た。
【０１２１】
ｅ．９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩［６，７］
【０１２２】
【化１２】
2011219489.tif 000016
【０１２３】
５ｍｌのフラスコに、２，６−ジブロモフェニル  アクリジン−９−カルボン酸塩（９３．２ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）、スクシンイミジル１１−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）ウンデカノアート（９４．１ｍｇ、０．２１８ｍｍｏｌ）、及びスターラーバーを添加し、次にフラスコに空気冷却機を備え、Ｎ２で洗い流す。テトラクロロエタン（１．５ｍｌ）をシリンジで導入し、そこで混合物が明るい黄色に変わった。フラスコをオイルバス（１４０℃）に４時間置き、その間、混合物が徐々にオレンジ色に変わり、最終的に黄褐色溶液を得た。混合物全体から溶媒を取り除き、次にＤＣＭで抽出し、ＥｔＯＥｔで沈殿させた。ＴＬＣが出発原料の存在を示さなくなるまで、繰り返し沈殿物をＤＣＭで再溶解し、沈殿させる。黄色固体（２８ｍｇ、１５％の収率、ｍｐ１６５〜１６６℃）を得て、特性を示した。
【０１２４】
1HNMR, (CDCl3, δ, ppm), 8.84 (2H, d, J=8Hz), 8.66 (2H, d, J=9Hz), 8.39 (2H, dd, J=8, 7Hz), 7.89 (2H, dd, J=9, 7Hz), 7.58 (2H, d, J=8Hz), 7.06 (1H,t,J=8Hz), 5.47 (2H,t,J=8Hz), 2.65 (4H, s), 2.41 (2H,t,J=7Hz), 2.03 (2H, m), 1.64-1.49 (4H, m), 1.31-1.07 (10H, m); 19FNMR (CDCｌ3, δ, ppm), -78.2; 13CNMR (CDCl3, δ, ppm), 169.7, 169.1, 161.5 (3 x C=O), 147.1, 145.8, 141.7, 140.8, 133.8, 130.3, 129.9, 129.3, 123.9, 119.8, 117.7, 52.9, 31.3, 30.1, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.0, 26.9, 26.0, 24.9; IR (ν, cm-1) 1774, 1728 (C=O); MS (ES-), 149 (100%, CF3SO3); (ES+), 739 (80%, M-CF3SO3), 519 (100%).
【０１２５】
（実施例２）
９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩の調製
【０１２６】
ａ．スクシンイミジル４−ヨードブタノアート
【０１２７】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、５ｍｌ）中の４−ヨード酪酸（１１５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を０℃まで冷却する。この溶液に、ＴＦＴ（１ｍｌ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）とＴＦＴ（２ｍｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（１２５ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）をそれぞれ添加する。混合物を０℃で３時間、次に室温で一晩攪拌する。得られた懸濁液をろ過する。ろ液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル（Ｔｏｌ−ＥｔＯＡｃ）、４：１）で精製する。所望の生成物（１３２ｍｇ）を淡黄色固体、ｍｐ８６〜８７℃として得た。
【０１２８】
ｂ．９−（２，６−ジブロモフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニル）プロピル）アクリジニウム  ヨウ化物
【０１２９】
ガラス管内でニトロベンゼン（２ｍｌ）中にある、実施例１ｄのように合成した２，６−ジブロモフェニル  アクリジン−９−カルボン酸塩（４３ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）とスクシンイミジル４−ヨードブタノアート（５０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をオイルバス中で１２０℃、２時間加熱した。得られた茶色溶液を石油エーテル（４０〜６０）（５×２ｍｌ）で洗浄し、茶色固体（約２ｍｇ）を得た。洗浄液を組み合わせ、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に２時間真空化に置き、オレンジ色溶液を得た。混合物を再利用した。実施例１ｅで説明した条件で実験を行った。
【０１３０】
（実施例３）
９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩の調製
【０１３１】
ａ．２−トリフルオロメチル−６−ヨードフェノール［１、２］
【０１３２】
【化１３】
2011219489.tif 000017
【０１３３】
５０ｍｌのフラスコに、２−トリフルオロメチルフェノール（１．００ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロピラン（２ｍｌ）を添加し、次にトルエンスルホン酸一水塩（ＴｓＯＨ．Ｈ２Ｏ）の数個の結晶を添加した。エーテル（２５ｍｌ）を導入した後、フラスコをオイルバスに置いて１９時間還流した。得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍｌ）中に注ぎ、水層をジエチルエーテル（２５ｍｌ×２）で抽出し、組み合せた抽出物を飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を取り除き、無色油分、２−（トリフルオロメチル）フェノール  テトラヒドロピラニル  エーテル（１．３５ｇ、５．５０ｍｍｏｌ、８９％の収率）を得た。
【０１３４】
1HNMR (CDCl3, δ, ppm), 7.50 (1H, d, J=8Hz), 7.38 (1H, t, J=8Hz), 7.18 (1H, d, J=8Hz), 6.94 (1H, t, J=8Hz), 5.48 (1H, approx. t, J=3Hz), 3.77 (1H, dt, J=3, 11Hz), 3.55 (1H, m), 1.96 (1H, m), 1.89-1.73 (2H, m), 1.71-1.46 (3H, m).
【０１３５】
油分をＴＨＦ（８．５ｍｌ）に溶解し、ＢｕＬｉ（２．５Ｍの３ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ）で処理し、−７８℃で３０分間攪拌した後、反応混合物をＴＨＦ（８．５ｍｌ）中のヨウ化物（２．２０１３ｇ、８．６７ｍｍｏｌ）の溶液で処理し、１０分間攪拌し、次に室温まで暖めた。混合物を２０％Ｎａ２ＳＯ３に注ぎ、しっかりと振動させた。水層をジエチルエーテルで抽出し、組み合せた抽出物を飽和ＮａＣｌで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を取り除いた後、黄褐色の油分を得た。
【０１３６】
1HNMR (CDCl3, δ, ppm), 7.88 (1H, dd, J =8, 1Hz), 7.46 (1H, dd, J=8, 1Hz), 6.80 (1H,t, J=8Hz), 5.25 (1H, dd, J=5, 2Hz), 4.04 (1H, m), 3.43 (1H, m), 2.01 (1H, m), 1.91-1.79 (2H, m), 1.58-1.42 (3H, m).
【０１３７】
これより油分が２−（トリフルオロメチル）−６−ヨードフェノール  テトラヒドロピラニル  エーテルであることを示した。油分を短経路の蒸留にさらし、その間、テトラヒドロピラニルエーテルの分解が生じ、２−（トリフルオロメチル）−６−ヨードフェノール（１．６６ｇ、収率、純粋であると仮定するならば収率９４％であるが、実際には約１５％のジヒドロピラン水和物で汚染されている）の生成物を得た。
【０１３８】
1HNMR (CDCl3, δ, ppm), 7.88(1H, d, J=8Hz), 7.47 (1H, d, J=8Hz), 6.79 (1H, t, J=8Hz), 5.85 (1H, s).
【０１３９】
ｂ．２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノール［１，２］
【０１４０】
【化１４】
2011219489.tif 000018
【０１４１】
スターラーバーを備えた５０ｍｌのフラスコに、Ｃｄ粉体（３．０５７ｇ、２７．２ｍｍｏｌ）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０ｍｌ）と添加した。フラスコをＮ２で洗い流し、次にアイスバスで０℃まで冷却した。ＣＢｒ２Ｆ２（１ｍｌ＋１ｍｌ＋０．５ｍｌ、全体で２７．１７ｍｍｏｌ）をシリンジでゆっくりと添加し、次に混合物を室温まで温め、さらに３０分間攪拌する。混合物をヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ、１０ｍｌ）で希釈し、０℃まで冷却し、ＣｕＢｒ（１．８０３６ｇ、１２．５７ｍｍｏｌ）を添加し、全体を１０分間攪拌した。結果としてのＦ３ＣＣｕを含む混合物に２−トリフルオロメチル−６−ヨードフェノール（９３７．１ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をオイルバス（６５℃）で２時間攪拌しながら加熱した。混合物全体を３ＭのＨＣｌ（３０ｍｌ）とエーテル（３０ｍｌ）の混合物に注ぎ、ろ過によって固体を混合物から取り除き、２層の液層を分離した。水層をさらにエーテル（２５ｍｌ×５）で抽出し、組み合せた抽出物を飽和ＮａＣｌで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥した。ロータリーエバポレーターで溶媒を取り除き、残渣を短経路の蒸留にさらした。ｂｐ７０℃（１ｍｂａｒ）での画分を集めた。収率２８３．４ｍｇで３８％である。
【０１４２】
1HNMR (CDCｌ3, δ, ppm), 7.70 (2H, d, J=8Hz), 7.06 (1H, t, J=8Hz); 13CNMR (CDCｌ3, δ, ppm), 153.0, 131.0, 123.8 (３Ｆ核に結合するためのｑ), 120.3, 120.0. EI-MS, mJz, 230 (M+, 18%), 213 (28%), 179 (23%) , 163 (30%), 135 (100%).
【０１４３】
ｃ．２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェニル  アクリジン−９−カルボン酸塩［３〜５］
【０１４４】
【化１５】
2011219489.tif 000019
【０１４５】
スターラーバー、冷却機、及びＣａＣｌ２乾燥管を備えた５ｍｌのフラスコ中で、アクリジン−９−カルボン酸塩化物（１３１．６ｍｇ、０．５４４ｍｍｏｌ）、２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノール（１３０ｍｇ、０．５６５ｍｍｏｌ）及びピリジン（３ｍｌ）を混合し、４０℃で１日しっかりと攪拌した。溶媒を混合物から蒸発させ、残渣の固体をカラムクロマトグラフィー（シリカ、トルエン：ＥｔＯＡｃ４：１）にさらした。Ｒｆ＝０．４９での画分を集め蒸発させ、オレンジ色固体（１３７．５ｍｇ、５８％の収率）、ｍｐ１７１℃を得た。
【０１４６】
1HNMR (CDCｌ3, δ, ppm), 8.51 (2H, d, J=9Hz), 8.32 (2H, d, J=9Hz), 7.96 (2H, d, J=8Hz), 7.79 (2H, dd, J=9. 7Hz), 7.61 (2H, dd, J=9, 7Hz), 7.56 (1H, t, J=8Hz); 13CNMR (CDCｌ3, δ, ppm), 164.6 (C=O), 148.6, 146.3, 131.9, 131.0, 130.0, 128.5, 127.8, 126.5, 126. 2, 125.8, 123.8, 122.8 (３Ｆ核に結合するためのｑ); IR (ν, cm-1), 1758 (C=O); MS: (EI), m/z, 435 (M+, 10%), 206 (82%) , 178 (100%); (CI), m/z, 436 (M+H+, 39%), 180 (100%).
【０１４７】
ｄ．９−（２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩［６，７］
【０１４８】
【化１６】
2011219489.tif 000020
【０１４９】
窒素であらかじめ洗い流した５ｍｌのフラスコに、２，６−ビス（トリフルオロメチル）フェニルアクリジニウム−９−カルボン酸塩（７４．９ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）とスクシンイミジル１１−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）ウンデカノアート（実施例１ｃに従って調製、７４．８ｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをＮ２で再度洗い流し、次に乾燥ジクロロエタン（１．６ｍｌ）をシリンジで導入した。混合物を８０℃で２０時間維持し、その後、ロータリーエバポレーターで溶媒を取り除いた。混合物をジクロロメタン（１ｍｌ）で抽出し、次に抽出物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにさらし、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／ＣＨ３ＣＮ（３：１）で溶出した。Ｒｆ＝０．１９での成分を集め蒸発させ、黄色固体（１５．９ｍｇ、１０．７％の収率）、ｍｐ１６４〜１６５℃を得た。
【０１５０】
1HNMR (CDCl3, δ, ppm) 8.88 (2H, d, J=9Hz), 8.77 (2H, d, J=9Hz), 8.58 (2H, dd, J=9, 7Hz), 8.15 (2H, d, J=8Hz), 8.07 (2H, dd, 9, 7 Hz), 7. 81, (1H, t, J=8Hz), 5.69 (2H, t, J=8Hz), 2.85 (4H, s), 2.60 (2H, t, J=7Hz), 2.29-2.18 (2H, m), 1.84-1.69 (4H, m), 1.51-1.26 (10H, m); 13CNMR (CDCｌ3, δ, ppm), 169.7, 169.1, 161.8, 144.9, 141.7, 140.6, 132.4, 130.0, 129.0, 128.5, 126.0, 125.7, 124.3, 119.8, 53.3, 31.3, 30.1, 29.6, 29.5 (2シグナル), 29.3, 29.0, 26.9, 26.0, 24.9 (CF3シグナルはノイズ比に対するシグナルが低すぎたため見られなかった。); MS (ES+) 717 (C37H35F6N2O6+, 25%), (ES-) 149 (CF3SO3-, 100%).
【０１５１】
９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（１０−スクシンイミジルオキシカルボニルデシル）アクリジニウム  トリフルオロメタンスルホン酸塩と９−（２，６−ジニトロフェノキシカルボニル）−１０−（３−スクシンイミジルオキシカルボニルプロピル）アクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩を調製するために、実施例１から３と同様の方法を用いてきた。
【０１５２】
（実施例４）
化学発光での各種のＸ基の効果
本実施例では、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２で提案されるようなＸ基を有する化合物全てが適度なｐＨで化学発光反応を起こすことができるわけではないことを示す。次の一般式の化合物を確立された方法に従って合成した。
【０１５３】
【化１７】
2011219489.tif 000021
【０１５４】
［式中、化合物（ａ）では、Ｒ１はメチル、Ｒ２はフェニルであり、
化合物（ｂ）では、Ｒ１はメチル、Ｒ２は３−メチルフェニルであり、
化合物（ｃ）では、Ｒ１はメチル、Ｒ２は２，６−ジフルオロフェニルであり、
化合物（ｄ）では、Ｒ１は（スクシンイミジルオキシカルボニル）プロピル、Ｒ２は２，６−ジブロモフェニルである。］
【０１５５】
ｐＨ９又はｐＨ１２の緩衝過酸化水素の注入（２００μｌ）によって反応の機内の開始に続いて、ルミノメーター（LuminoTM、Stratec Electronik GmbH、Pfortzheim、ドイツ）を使用して、これらの化合物からの化学発光を測定した。二ナトリウム水素オルトリン酸塩（０．０２Ｍ／ｌ）を用いてｐＨ９が達成され、１００μｌの５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液と２０μｌの３０％過酸化水素水溶液を２０ｍｌの水に希釈することでＥＰ−Ａ−０３２４２０２で説明されるようにｐＨ１２が達成される。どちらの場合も、３０％の過酸化水素水を使用した。
【０１５６】
測定時間を５秒とし、その時間の間、光子係数を積分し、すぐに試薬を注入し始めた。それぞれの化合物がｐＨ１２と同等のピーク高さを示すように、使用するそれぞれの化合物の量とルミノメーターの係数要素を選択した。通常、１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度では、最初に１ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリルに溶解し、次に、ｍＭ／ｌの塩酸にさらに希釈した純粋化合物とともに使用した。発光測定では１０μｌの体積を使用した。
【０１５７】
【表１】
2011219489.tif 000022
【０１５８】
表１には、ｐＨ９での化学発光放出強度を、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２で設定された従来の反応条件（ｐＨ１２）を用いて得られたものの百分率で示す。４つの化合物全てがＥＰ−Ａ−０３２４２０２の範囲内となっているＸ基を備えているが、化合物（ｃ）と（ｄ）のみが適度なｐＨで有効な化学発光を放出することができる。これらの２つの化合物は、本発明で必要とされる電子求引基を備えるフェニル部分を有する。
【０１５９】
（実施例５）
結合複合体の安定性についてのｐＨの効果
それぞれの末端修飾がメチルレッド（ＭＲ）と１級アミン結合部分を備える次の配列のステムループオリゴヌクレオチドを必要に応じて合成し、商業的に購入した（Oswel Research Products, Romsey, イギリス）。
【０１６０】
ＮＨ２−５’−ＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＧＧＴ−ＭＲ
【０１６１】
確立された方法によって、スクシンイミジルエステルの化学反応を用いて、実施例２のアクリジニウムエステル化合物（ｄ）で１級アミンを標識化した。（Nelson他, Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, pp. 391-428, Academic Press, 1995）明らかに、化合物（ａ）も化合物（ｂ）も標識として使用することができなかった。上述した表１に示すように、それらはｐＨ９で有効な化学発光を放出しないからである。しかしながら、化合物（ｄ）は、ｐＨが９まで減少したときに、ｐＨ１２の放出強度の１００％を維持する特性を有する。
【０１６２】
実施例２で設定された方法を用いて、化合物（ｄ）で標識化されたオリゴヌクレオチドが放出した化学発光をｐＨ９とｐＨ１２で測定した。結果を表２に示す。
【０１６３】
【表２】
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【０１６４】
表２では、化合物（ｄ）が放出する化学発光シグナルをメチルレッドによって９８％クエンチするが、ｐＨ１２ではクエンチングは２％しかない。
【０１６５】
化合物（ｄ）で標識化されたオリゴヌクレオチドは、構造（Ａ）の安定な分子間結合複合体の形成のため、自由溶液中に穏和な条件（ｐＨ９）下でステムループ構造として存在する。
【０１６６】
【化１８】
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【０１６７】
このように、ｐＨ９で、クエンチャ、メチルレッドの近接近から、エミッター、化合物（ｄ）まで生じる化学発光クエンチングのため、最小の背景化学発光放射が見られる。
【０１６８】
一方、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２で設定されたようにｐＨ１２で化学発光を開始するときに、有効な化学発光放出を観察する。これは、ｐＨ１２では、オリゴヌクレオチドの５’と３’の末端での相補的な核酸の間のハイブリダイゼーションが分裂し、したがって標識化オリゴヌクレオチドが構造（Ｂ）を選択するからである。
【０１６９】
【化１９】
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【０１７０】
構造（Ｂ）では、放出化合物（ｄ）は、クエンチングを生じさせるために、クエンチャ、メチルレッドに十分に接近していない。
【０１７１】
この実験の結果から、結合複合体がこれらの条件下で非特定で分離するため、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２で提案される条件下で分析系の基礎として、化学発光クエンチングを使用することができないことは明らかである。核酸系以外の系、例えば抗体−抗原結合に基づくものもまた同じである。
【０１７２】
一方、結合複合体はｐＨ９で完全なままであり、クエンチングを発生させることができる。このように、均一系のエネルギー転移結合分析の基礎として、本発明で開示するように、適度のｐＨで化学発光反応を起こすアクリジニウム標識のみを使用することができる。
【０１７３】
（実施例６）
式（Ｉ）の化合物との使用でのクエンチャの選択
ドナーのそれから異なる波長で吸収エネルギーを再放出するフルオレセインとLucifer  Yellowのようなエネルギー転移アクセプターをＥＰ−Ａ−０３２４２０２では示唆し、したがって、そのようなアクセプターをクエンチャとして使用することができない。特許請求の範囲の化合物としてその他の役立つクエンチャについて文献には全く示されていない。しかしながら、蛍光クエンチャが記載されており、一般的に使用される蛍光クエンチャを使用することができると予想しているのかもしれない。本実施例では、十分に確立されたクエンチャDabcylTMを全ての環境下でアクリジニウムエミッタからの放出をクエンチするために、予想されてきたもののように、使用することができないことを実証する。これは、化学発光反応をもたらすために必要であるｐＨでクエンチャの吸収スペクトルがアクリジニウム標識の放出スペクトルと比較してシフトするからである。
【０１７４】
アクリジニウムエステル化学発光（Ｎ−メチルアクリドン）の第一放出の放出スペクトルは十分に確立されている。メチルレッドとDabcylTMの吸収スペクトルを蛍光分光計で測定した。複合スペクトルを生成するために、Ｎ−メチルアクリドンの放出スペクトルのものとこれらのスペクトルを重ねた。ｐＨ９でＮ−メチルアクリドンの放出スペクトルとDabcylTMの吸収スペクトルの間で１つの緩やかな重複のみがあった。有効な共鳴エネルギー転移クエンチングは最大のスペクトルの重複を必要とするため、好ましいアクリジニウムエステルの化学発光反応を開始するために必要なｐＨで、このようなDabcylTMクエンチングは有効でないことがわかる。一方、本発明の好ましい化合物は、ｐＨ９でメチルレッドクエンチャと１００％のスペクトルの重複を示す。このように、従来使用されるDabcylTMではなく、メチルレッドクエンチャのみが、ｐＨ９で化学発光反応を引き起こすことができるアクリジニウムエステルの有効なクエンチャである。DabcylTMが多くのエネルギー転移分析で役立つクエンチャであると述べられているため、これは多少予想外である。
【０１７５】
（実施例７）
式（Ｉ）の化合物の化学発光特性
本実施例では、均一系のエネルギー転移クエンチング結合分析の基礎として、本発明の化合物を使用することができることについて、このような化合物が適度なｐＨで化学発光を示すことができ、慎重に選択されたクエンチャ、例えばメチルレッドなどとともに効果的なクエンチング系の部分として作用することができるからであることを実証する。本実施例では、一方で、ＥＰ−Ａ−０３２４２０２の範囲内にある多数の化合物と同様に、このような目的のために、化学発光を引き起こす高いｐＨを必要とするアクリジニウムエステルを使用することができないことも実証する。
【０１７６】
１０μｌのハイブリダイゼーション緩衝剤（０．１Ｍ／ｌリチウムコハク酸塩、ｐＨ５．１、８．５％  ｗ／ｖ  リチウムラウリル硫酸、０．１２５Ｍ／ｌリチウム水酸化物、１．５ｍＭ／ｌＥＤＴＡ及び１．５ｍＭ／ｌＥＧＴＡ）中の実施例３で説明された標識ステムループオリゴヌクレオチド（１〜１０ｆＭ）を、ハイブリダイゼーション緩衝剤（１０μｌ）中の部分的に相補的なオリゴヌクレオチド標的配列（ｇｃｃｃｇｔｔａｃｔｇｔｃｇｔｔｔｔｔｇｔｃｃ）を０、１、１０、５０、１００、５００及び１０００ｐＭ含む溶液とそれぞれ混合する。混合物を６０℃で６０分間インキュベートし、適当なｐＨ開始溶液を用いて発光測定の前に室温と平衡にする。ループ領域のその標的への相補的な結合が、ドナーとアクセプター部分が分離するようになることを引き起こして、ステム結合を分離するように、これらの相互作用の原理はよく知られている。したがって、標的がないと、結果としての混合物は、ｐＨ９で構造Ａからなり、ｐＨ１２で構造Ｂからなるものであった（参照、実施例３）。標的の濃度が増加すると、構造Ｃの量が増加するように形成される結果となり、これはクエンチングがないことに基づいて構造Ａと区別される。
【０１７７】
【化２０】
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【０１７８】
したがって、ｐＨ９で、化学発光の強度は標的配列の濃度に比例する。一方、結合複合体の分離のため、ｐＨ１２で化学発光強度と標的濃度の間には関係がない。これによって、適度なｐＨで化学発光を生成することができるアクリジニウムエステルのみをそのような分析で使用することができることが確認される。
【０１７９】
（参照）
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【外国語明細書】
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