(57)【要約】【課題】  イムノクロマトグラフィーによる被測定物質の定量測定において、試験片を透過した測定光を光学的に検出し、被測定物質の濃度を定量的かつ再現性良く測定するための具体的な装置である試験片ハウジングおよび濃度測定用イムノクロマトデバイスを提供すること。【解決手段】  第一カバー１１と第二カバー１２との間にイムノクロマトグラフィー用の薄板状の試験片２を収容する試験片ハウジング１であって、前記第一カバー１１に測定光が透過して前記試験片２の被測定部を照射する第一観察窓部１３を備え、前記第二カバー１２に前記被測定部に照射された前記測定光が透過する第二観察窓部１４を備える試験片ハウジングおよび濃度測定用イムノクロマトデバイス。【選択図】  図２
2011089917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一カバーと第二カバーとの間にイムノクロマトグラフィー用の薄板状の試験片を収容する試験片ハウジングであって、
前記第一カバーに測定光が透過して前記試験片の被測定部を照射する第一観察窓部を備え、前記第二カバーに前記被測定部に照射された前記測定光が透過する第二観察窓部を備えることを特徴とする試験片ハウジング。
【請求項２】
前記第一観察窓部および前記第二観察窓部は、前記第一カバーと前記第二カバーの対向する位置に貫通孔を設けることにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の試験片ハウジング。
【請求項３】
前記試験片は、被測定物質の濃度を示す呈色物質が呈色する呈色部を有するメンブレン部と、前記メンブレン部を保持する基部と、を備え、前記基部の全部または一部が測定光を透過する樹脂であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の試験片ハウジング。
【請求項４】
被測定物質の濃度を示す呈色物質が呈色する呈色部を有するメンブレン部と、前記メンブレン部を保持する基部と、を備えた試験片の内部で生じる抗原抗体反応によって前記被測定物質の濃度を測定するために用いられる濃度測定用イムノクロマトデバイスであって、
測定光が透過する第一観察窓部を備えた第一カバーと、前記第一観察窓部および前記呈色部を透過した測定光を透過する第二観察窓部を備えた第二カバーと、を備えた試験片ハウジングと、
光源部と、前記試験片ハウジングを保持する試験片ハウジング保持部と、前記光源部から出て前記試験片ハウジングの前記第一観察窓部、前記呈色部および前記第二観察窓部を通過した透過光の強度または吸光度を測定する測定部と、を備え、前記呈色部における透過光の強度または吸光度に基づいて前記被測定物質の濃度を測定する測定装置と、
を備えることを特徴とする濃度測定用イムノクロマトデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験片ハウジングおよび濃度測定用イムノクロマトデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イムノクロマトグラフィーにより定量分析を行う方法として、被検査溶液を展開する展開層と、前記展開層の一部に前記被検査溶液中の測定対象物に対する試薬を固定化することにより形成された試薬固定化部と、前記展開層の他の一部に前記被検査溶液の展開により溶出可能な標識試薬を保持することにより形成された標識試薬保持部と、前記展開層から前記試薬固定化部、及び前記標識試薬保持部を除いた部分である生地部とを備えたクロマトグラフィー試験片に、光源から出射された光ビームを照射し、前記クロマトグラフィー試験片からの透過光もしくは反射光を利用して光学的な信号検出を行い、前記信号から定量的に前記被検査溶液中に含まれる分析対象物の濃度を測定するクロマトグラフィー定量測定装置が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
また、イムノクロマトグラフィーにより液体試料中の被検物質の濃度を測定する方法として、標識として蛍光物質を用いる場合には、試験片に励起光を照射し、励起光をフィルタでカットしながら照射する面と反対の面から試験片上で発せられた蛍光を透過光として検出する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−４７４３号公報
【特許文献２】特開２００３−８３９７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１および特許文献２には、試験片に光を照射し、試験片を透過した光を光学的に検出し、被測定物質の濃度を定量的に測定する旨が記載されているが、具体的な装置構成については記載されていない。即ち、特許文献１および特許文献２では、発明の実施の形態において、測定を反射光学系測定装置で行う場合のみが記載されており、透過光学系測定装置については言及されていない。特に、特許文献２では、標識として蛍光物質を用いるが、例えば微粒子（ナノコロイド等）などの光を吸収する呈色物質の吸光度に基づいて被測定物質の濃度を測定することについては述べられていない。
【０００６】
このように、試験片を透過した測定光を光学的に検出し、被測定物質の濃度を定量的に測定する装置構成について、知られていない。反射光学系測定装置で測定する場合、試験片の表面のみの反射光を測定していることになる。しかしながら、通常試験片は膜厚１００〜２００μｍであり、試験片の試薬固定化部に抗体などの蛋白質を固定した場合、抗体は試験片の表面だけでなく内部にも固定される。また浸透による反応液の流れは試験片内部での流れであり、正確に測定するためには試験片の内部も測定する必要がある。特に、微粒子（ナノコロイド等）などの光を吸収する呈色物質の吸光度に基づいて被測定物質の濃度を測定する場合には、呈色物質と抗体との結合物が試験片の内部にも存在している。そのため、試験片の表面で反射した測定光を検出しただけでは正確な濃度を測定するのは困難であり、定量性・再現性が不十分であった。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、イムノクロマトグラフィーによる被測定物質の定量測定において、試験片を透過した測定光を光学的に検出し、被測定物質の濃度を定量的かつ再現性良く測定するための具体的な装置である試験片ハウジングおよび濃度測定用イムノクロマトデバイスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の課題を解決するために講じた第１の課題解決手段は、第一カバーと第二カバーとの間にイムノクロマトグラフィー用の薄板状の試験片を収容する試験片ハウジングであって、前記第一カバーに測定光が透過して前記試験片の被測定部を照射する第一観察窓部を備え、前記第二カバーに前記被測定部に照射された前記測定光が透過する第二観察窓部を備えることを特徴とする試験片ハウジングである。
【０００９】
また、第２の課題解決手段は、前記第一観察窓部および前記第二観察窓部は、前記第一カバーと前記第二カバーの対向する位置に貫通孔を設けることにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の試験片ハウジングである。
【００１０】
また、第３の課題解決手段は、前記試験片は、被測定物質の濃度を示す呈色物質が呈色する呈色部を有するメンブレン部と、前記メンブレン部を保持する基部と、を備え、前記基部の全部または一部が測定光を透過する樹脂であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の試験片ハウジングである。
【００１１】
また、第４の課題解決手段は、被測定物質の濃度を示す呈色物質が呈色する呈色部を有するメンブレン部と、前記メンブレン部を保持する基部と、を備えた試験片の内部で生じる抗原抗体反応によって前記被測定物質の濃度を測定するために用いられる濃度測定用イムノクロマトデバイスであって、測定光が透過する第一観察窓部を備えた第一カバーと、前記第一観察窓部および前記呈色部を透過した測定光を透過する第二観察窓部を備えた第二カバーと、を備えた試験片ハウジングと、光源部と、前記試験片ハウジングを保持する試験片保持部と、前記光源部から出て前記試験片ハウジングの前記第一観察窓部、前記呈色部および前記第二観察窓部を通過した透過光の強度または吸光度を測定する測定部と、を備え、前記呈色部における透過光の強度または吸光度に基づいて前記被測定物質の濃度を測定する測定装置と、を備えることを特徴とする濃度測定用イムノクロマトデバイスである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、第一カバーと第二カバーに試験片の被測定部に照射される測定光が透過する第一観察窓部および第二観察窓部を備えるため、試験片ハウジングに収容されたイムノクロマトグラフィー用の薄板状の試験片内を測定光が透過する。試験片の内部に存在する物質による光吸収は試験片の厚み方向に累積される。従って、第一観察窓部、試験片、および第二観察窓部を透過した測定光を光学的に検出すれば、試験片の表面だけでなく内部に存在する物質の量を検出可能となる。より多くの物質による光吸収を検出できれば、光散乱およびノイズによる測定値のばらつきを抑制でき、イムノクロマトグラフィーにおいて被測定物質の濃度を定量的かつ再現性良く測定するための具体的な装置である試験片ハウジングを提供できる。
【００１３】
また、第一カバーと第二カバーに貫通孔を設けることにより第一観察窓部および第二観察窓部を形成するため、試験片の被測定部を透過する測定光のロスを抑制できる。
【００１４】
また、試験片の基部の全部または一部が測定光を透過する樹脂であるため、基部による測定光の散乱を抑制できる。
【００１５】
また、光源部から出て試験片ハウジングの第一観察窓部、呈色部および第二観察窓部を通過した透過光の強度または吸光度に基づいて被測定物質の濃度を測定するため、試験片の表面だけでなく内部に存在する呈色物質の量を検出可能となる。より多くの呈色物質による光吸収を検出できれば、光散乱およびノイズによる測定値のばらつきを抑制でき、イムノクロマトグラフィーにおいて被測定物質の濃度を定量的かつ再現性良く測定するための具体的な装置である試験片ハウジングおよび測定装置を提供できる。また、光源を発し、試験片の呈色部を透過して測定部に至る光路を一直線上に構成することが可能となり、簡単な構造で設計自由度に優れたイムノクロマトデバイスとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試験片ハウジングの分解斜視図である。
【図２】試験片ハウジングの断面図である。
【図３】濃度測定用イムノクロマトデバイスの要部であって、測定光学系を示す説明図である。
【図４】実施例に使用した試験片の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明の実施の形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。
【００１８】
図１は、本発明の一実施形態であるイムノクロマトグラフィー用試験片ハウジング１と、その内部に収容される試験片２を示す分解斜視図である。
【００１９】
試験片ハウジング１は、片側面を陥没させた上部開口平板状に形成して試験片２を載置する第一カバー１１と、第一カバー１１の上部開口部を覆う第二カバー１２とから構成される。第一カバー１１は、測定光が透過して試験片２の被測定部を照射する貫通孔である第一観察窓部１３を備えている。また、第二カバー１２は、試験片２の被測定部に照射された測定光が透過する貫通孔である第二観察窓部１４を備えている。
【００２０】
図２は、試験片ハウジング１の断面図である。第一観察窓部１３および第二観察窓部１４には、試験片ハウジング１の外側に近づくほど幅広になるテーパーが形成されている。そして、第一観察窓部１３および第二観察窓部１４は、第一カバー１１および第二カバー１２上であって対向する位置に設けられている。第一カバー１１の内側には、試験片２がずれないように係止するための突部１５が立設されている。第二カバー１２には、試験片３に試料溶液を滴下する試料滴下孔１６が穿設されている。試料滴下孔１６は、試験片ハウジング１の外側に近づくほど幅広になるテーパー形状となっている。
【００２１】
第一カバー１１に載置される試験片２の長さ方向両端には、少なくとも２つの係止穴部１７が配設されている。一方、第二カバー１２の係止穴部１７と対向する位置に係止穴部１７に挿入可能な係止突部１８が配設されている。そして、係止穴部１７と係止突部１８とを係合させ、第一カバー１１と第二カバー１２とを位置合わせしながら組み合わせることにより試験片ハウジング１が形成される。
【００２２】
試験片２は、被測定物質の濃度を示す呈色物質が呈色する呈色部を有するメンブレン部２１と、メンブレン部２１を保持する基部２２と、を備えている。試験片２のメンブレン部２１としては、例えばニトロセルロースが使用される。ニトロセルロースは多孔質であるため、乾燥時はニトロセルロースと気孔中の空気との屈折率の差により表面で光を散乱して白色であるが、試料溶液で濡れると空気より屈折率の差が小さい試料溶液で置換されて透明になる。基部２２は、測定光を透過する透明な熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂であり、例えば硬質透明塩化ビニル樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ナイロン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリカーボネート樹脂、エポキシ樹脂等が使用される。
【００２３】
尚、被測定物質、呈色物質、および抗体としては、イムノクロマトグラフィーにおいて一般的なものが使用され、特に限定されない。そのため詳細については説明を省略するが、例えば、呈色物質として金コロイドや発色色素が使用可能である。本実施形態は、いわゆるサンドイッチ抗体反応によるイムノクロマトグラフィーでも、競合反応によるイムノクロマトグラフィーでも適用可能である。
【００２４】
図３は、本発明の一実施形態である濃度測定用イムノクロマトデバイスの要部であって、測定装置３の測定光学系を示す説明図である。測定装置３は、試験片ハウジング１を保持する試験片保持部３１と、光源部３２と、光源部３２から出射された光を平行光に変換するコリメートレンズ３３と、光源部３２から出射されて試験片ハウジング１の第一観察窓部１３、試験片２の呈色部、および第二観察窓部１４を通過した透過光の強度を測定する測定部３４と、透過光の強度に基づいて被測定物質の濃度を算出する演算部３５と、両端で測定部３４および演算部３５に接続された信号線３６と、を備えている。
【００２５】
試験片ハウジング保持部３１は、光源部３２と測定部３４との間の光路Ｌ上の所定位置に試験片ハウジング１を保持する。図３では試験片ハウジング１を上下で挟持する円柱状の試験片保持部３１を用いているが、これに限定されず、試験片ハウジング１を載置する板状の試験片保持部３１としてもよい。
【００２６】
光源部３２は、測定光を出射する発光部品であり、例えば、電球、蛍光管、発光ダイオード、レーザー等が使用される。測定光の波長は、呈色物質により光吸収が生じる波長であればよく、特に、呈色物質の吸光スペクトルで吸光度が極大となる波長が望ましい。また、測定光の波長は、メンブレン部２１および基部２２により吸収されない波長であることが望ましい。
【００２７】
測定部３４は、試験片２の呈色部を通過した透過光の強度に応じて電気信号を生成するセンサであり、例えば、フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣｄＳセル、ＣＣＤ等が使用される。
【００２８】
演算部３５は、信号線３６を経由して接続された測定部３４から入力される電気信号に基づいて被測定物質の濃度を算出する。
【００２９】
次に、測定装置３を使用した試験片２の測定方法について説明する。
【００３０】
まず、試験片ハウジング１の試料滴下孔１６から試料溶液を滴下した試験片ハウジング１を試験片ハウジング保持部３１にセットする。次に、光源部３２を発光させ、試験片２の呈色部に光を照射する。このとき、光は試験片ハウジング１の第一観察窓部１３を通過し、試験片２の基部２２を透過してメンブレン部２１に照射される。メンブレン部２１は試料溶液が浸透することにより透明になるため、メンブレン部２１内を透過する際に、光はメンブレン部２１の内部に予め固定された抗体と結合した呈色物質により吸収される。
【００３１】
メンブレン部２１を透過した透過光は、試験片ハウジング１の第二観察窓部１４を通過して、測定部３４に捕捉される。測定部３４は、試験片２の呈色部を通過した透過光の強度に応じて電気信号を生成し、演算部３５は、信号線３６を経由して接続された測定部３４から入力される電気信号に基づいて被測定物質の濃度を算出する。
【００３２】
測定の際、光路Ｌを試験片２の長さ方向に走査して透過光強度の変化を測定する。走査の方法としては、試験片ハウジング保持部３１で試験片２を長さ方向に移動させる方法でもよいし、光路Ｌを走査する光学系を使用する方法でもよい。また、測定部３４が試験片２の呈色部を二次元画像として取得し、画像処理により試験片２上の位置による透過光強度の変化を測定する方法でもよい。
【００３３】
従って、本実施形態にかかる試験片ハウジング１は、第一カバー１１と第二カバー１２に試験片２の被測定部に照射される測定光が透過する第一観察窓部１３および第二観察窓部１４を備えるため、試験片ハウジング１に収容されたイムノクロマトグラフィー用の薄板状の試験片２内を測定光の光路Ｌが透過する。測定する際、試験片２のメンブレン部２１に存在する呈色物質による光吸収は試験片の厚み方向に累積される。従って、第一観察窓部１３、試験片２、および第二観察窓部１４を透過した測定光を光学的に検出すれば、試験片２のメンブレン部２１の表面だけでなく内部に存在する呈色物質の量を検出可能となる。より多くの呈色物質による光吸収を検出できれば、光散乱およびノイズによる測定値のばらつきを抑制でき、イムノクロマトグラフィーにおいて被測定物質の濃度を定量的かつ再現性良く測定するための具体的な装置である試験片ハウジング１を提供できる。
【００３４】
また、第一カバー１１と第二カバー１２に貫通孔を設けることにより第一観察窓部１３および第二観察窓部１４を形成するため、試験片２の被測定部を透過する測定光のロスを抑制できる。第一観察窓部１３および第二観察窓部１４にはテーパーが形成されているため、光路Ｌへの散乱光の混入を防止できる。
【００３５】
また、試験片２の基部２２が測定光を透過する樹脂であるため、基部２２による測定光の散乱を抑制できる。
【００３６】
また、測定装置３により、光源部３２から出射されて試験片ハウジング１の第一観察窓部１３と、被測定物質の濃度を示す呈色物質が呈色する呈色部を有するメンブレン部２１と、第二観察窓部１４と、を通過した透過光の強度または吸光度に基づいて被測定物質の濃度を測定するため、試験片２の表面だけでなく内部に存在する呈色物質の量を検出可能となる。また、光源３２を発し、試験片２の呈色部を透過して測定部３４に至る光路Ｌを一直線上に構成することが可能となり、簡単な構造で設計自由度に優れたイムノクロマトデバイスとなる。
【実施例】
【００３７】
上記実施形態に基づいて、免疫反応として競合反応を用い、また酵素基質反応によって呈色物質を生成させる方法に用いる濃度測定用イムノクロマトデバイスを作製し濃度測定を行った。
【００３８】
図４は、本実施例に使用した試験片２の概略図である。透明なポリ塩化ビニルからなるシート状の基部２２（厚み０．５ｍｍ）の上に、ニトロセルロース（日本ミリポア社製、ＨＦ１３５）からなるメンブレン部２１（厚み１００μｍ）を貼付した。ここで、メンブレン部２１の第一呈色部２１ａには、抗ヒトｈＣＧ抗体１ｍｇ/ ｍＬ（メディクスバイオケミカ社製）溶液が予め塗布および乾燥固定され、第二呈色部２１ｂには、抗マウスＩｇＧ抗体１ｍｇ/ ｍＬ（ニップンテクノクラスタ社製）溶液が予め塗布および乾燥固定されている。
【００３９】
メンブレン部２１の第一呈色部２１ａ側端部には、一部重なるようにコンジュゲートパッド２３（厚み０．５ｍｍ）をアクリル系接着剤で接着した。コンジュゲートパッド２３は、抗ヒトＬＨ抗体（メディクスバイオケミカ社製）に金コロイド（Ｂ．Ｂ．Ｉ社製）を吸着結合反応させたものを予め塗布および乾燥固定したグラスウール（日本ミリポア社製、ＧＦＣＰ１０３０００）からなる。コンジュゲートパッド２３の前記メンブレン部２１に接着した側と反対側の端部には、一部重なるように試料添加マット２４（厚み０．５ｍｍ）をアクリル系接着剤で接着した。試料添加パッド２４は、グラスウール（日本ミリポア社製、ＧＦＣＰ１０３０００）により構成される。メンブレン部２１の第二呈色部２１ｂ側端部には、一部重なるように吸収パッド２５（厚み０．５ｍｍ）をアクリル系接着剤で接着した。吸収パッド２５は、セルロース（日本ミリポア社製、ＧＦＳＰ２２３０００）により構成される。
【００４０】
上記試験片２を５つ作成し、それぞれを試験片ハウジング１に収容した。試験片ハウジング１の試料滴下孔１６に、リコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）１００ｐｇ／ｍＬに５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液で希釈した被測定物質を１００μＬ滴下し、メンブレン部２１上の浸透により第一呈色部２１ａと第二呈色部２１ｂに金コロイドの凝集したものが目視できるまで室温下２５℃で５分間反応した。反応終了後、第一呈色部２１ａおよび第二呈色部２１ｂにおける吸光度（ピーク値）を、イムノメジャー（アイシン精機社製）の下部にＬＥＤ光源を装着した図３のような透過光学系装置を使用して、透過光学系にて測定した。さらに、従来技術である反射光学系によるイムノクロマトグラフィーの比較例として、イムノメジャー（アイシン精機社製）を使用して反射光学系にて測定し、測定結果を表１にまとめた。
【表１】
2011089917.tif 000003
【００４１】
ここで、第一呈色部２１ａにおける測定強度をＴ１で表し、第二呈色部２１ｂにおける測定強度をＴ２で表す。競合反応によるイムノクロマトグラフィーにおいて、被測定物質の濃度はＴ１／Ｔ２に相関する。透過光学系測定装置を使用した場合には、Ｔ１／Ｔ２の平均値は０．３４７、標準偏差は０．００７、変動係数（ＣＶ）は、２．１％であった。一方、反射光学系測定装置を使用した場合には、Ｔ１／Ｔ２の平均値は０．４２７、標準偏差は０．０１１、変動係数（ＣＶ）は、２．６％であった。
【００４２】
変動係数（coefficient of variation）とは、試験データの相対的な分散を表す指標である。標準偏差は測定データの値と同スケールであるため、測定データの平均値が異なる複数のデータ群を相互に比較できないが、変動係数は標準偏差からスケールの影響を排除しているため、平均値が異なる複数のデータ群でも分散の度合いを相互に比較できる。繰り返し測定時の測定値の変動が正規分布をとると仮定した場合、（変動係数）＝（標準偏差）／（平均値）×１００［％］により変動係数を算出できる。
【００４３】
従って、透過光学系では、測定結果のばらつきを示す変動係数が反射光学系の場合より小さくなっていることが確認された。このことは、本実施形態の試験片ハウジング１および測定装置３を使用したイムノクロマトシステムにおいて測定安定性が向上したことを示す。
【符号の説明】
【００４４】
１      試験片ハウジング
２      試験片
３      測定装置
１１    第一カバー
１２    第二カバー
１３    第一観察窓部
１４    第二観察窓部
２１    メンブレン部
２１ａ  第一呈色部（呈色部）
２１ｂ  第二呈色部（呈色部）
２２    基部
３１    試験片ハウジング保持部
３２    光源部
３４    測定部
【図１】
2011089917.tif 000004
【図２】
2011089917.tif 000005
【図３】
2011089917.tif 000006
【図４】
2011089917.tif 000007