(57)【要約】【課題】標識タンパク質を取得することを課題とする。特に標識タンパク質と標識されていない該タンパク質を分離することを課題とする。【解決手段】標識タンパク質であって、標的タンパク質と、少なくとも１つ以上の、アフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、少なくとも１つ以上の標識サイトを有する、被標識タンパク質と、さらに前記標識サイトの少なくとも１つに結合した標識試薬からなり、標識タンパク質と被標識タンパク質の、アフィニティーキャリアとの親和性が異なることを特徴とする標識タンパク質を提供する。【選択図】図１
2011032264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識タンパク質であって、
標的タンパク質と、少なくとも１つ以上の、アフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、少なくとも１つ以上の標識サイトを有する、被標識タンパク質と、
さらに前記標識サイトの少なくとも１つに結合した標識試薬からなり、
標識タンパク質と被標識タンパク質の、アフィニティーキャリアとの親和性が異なることを特徴とする標識タンパク質。
【請求項２】
下記の一般式（１）で表されることを特徴とする標識タンパク質。
Ｚ−（Ｌ）ａ−Ｘ−Ｙ      ・・・（１）
（ただし、上記の式においてＺは標的タンパク質、Ｌはリンカーを構成するアミノ酸、Ｘはアフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトとからなるポリペプチド、Ｙは前記標識サイトに結合した標識試薬であり、ａは０または１である。ただし、上記一般式（１）からＹを欠失した状態のタンパク質（被標識タンパク質）と上記一般式（１）で表される標識タンパク質では、アフィニティーキャリアとの親和性が異なる。）
【請求項３】
前記被標識タンパク質が、アフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトを含む配列として、以下の配列番号１から５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の標識タンパク質。
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１）
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号４）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号５）。
【請求項４】
前記被標識タンパク質が、アフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトを含む配列として、以下の配列番号６から１４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号６）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号７）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号８）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号９）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１０）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１１）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１２）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１３）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１４）
【請求項５】
前記標識タンパク質の、前記アフィニティーキャリアとの会合速度定数が、前記被標識タンパク質の、前記アフィニティーキャリアとの会合速度定数と比較して１０分の１以下であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
【請求項６】
前記標的タンパク質が、一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
【請求項７】
前記標的タンパク質が、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３８）
【請求項８】
前記標識試薬が、蛍光色素からなることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
【請求項９】
前記標識試薬が、酸化鉄微粒子からなることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
【請求項１０】
前記標識試薬が、リン脂質からなることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
【請求項１１】
前記標識試薬が、ポリエチレングリコール−リン脂質複合体からなることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の標識タンパク質。
【請求項１２】
標識タンパク質を取得する方法であって、
ｉ）  標的タンパク質とアフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを有する被標識タンパク質を得る工程
ｉｉ）  前記被標識タンパク質の標識サイトに標識試薬を結合し、標識試薬が結合した標識タンパク質を得る工程、
ｉｉｉ）  標識タンパク質と標識試薬を有さない被標識タンパク質の混合物を上記アフィニティー相互作用ドメインに特異的に結合できるアフィニティーキャリアに接触させる工程、
ｉｖ）  前記アフィニティーキャリアへの親和性の差異により、標識タンパク質を選択する工程、
を具備する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標識タンパク質を高純度で取得するための、標識タンパク質、ならびにその取得方法に関する。特には、診断用途において有用な標識抗体、ならびにその精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標識抗体をはじめとする標識タンパク質は癌などの病変の診断に用いられる。標識タンパク質は病変部位で特異的に存在している分子と結合するタンパク質、および標識物としての生体外からの検出を可能とする信号発信部や、そのタンパク質の物理化学的性質を改変する化学修飾剤からなる。標識物が信号発信部の場合、病変部の検出、画像化病変部位の造影などに用いられる。すなわち、標識タンパク質が特異的分子に結合し、その標識物が信号を発するため、その信号を検出する事で、特異的分子の在否、量、ならびにその位置情報を得る事が可能になる。また、タンパク質の機能を改変、制御する目的で、標識物として化学修飾剤が用いられる。
【０００３】
標識タンパク質を診断剤や造影剤として使用する際、未標識タンパク質の混在は、競合阻害を引き起こし、検出感度を低下させる原因となる。したがって、標識タンパク質の分離精製法が望まれる。
【０００４】
しかし、標識後の標識タンパク質と未標識タンパク質の分離は困難であり、特に標識試薬として蛍光色素や水溶性オリゴエチレングルコールなどの低分子化合物を使用する場合は、いっそう分離が困難となる。なぜなら、低分子化合物で標識する場合、標識前後で標識体の物理化学的な性質（分子サイズ・新疎水性・電荷など）が大きく変わらないためである。
【０００５】
標識タンパク質の分離には、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなどを用いることができる。しかし、低分子量化合物を標識した標識タンパク質と未標識タンパク質を分離することはこれらを用いても簡単ではなく、詳細な条件検討が必要になる。その他の分離法として、標識試薬に対する抗体、例えば抗蛍光色素抗体を用いることで標識タンパク質を分離可能であるが、必ずしも抗体が入手できるわけではなく、汎用的ではない。
【０００６】
標識タンパク質の精製方法として、標識タンパク質を未標識タンパク質から分離するための疎水性クロマトグラフィーを用いる方法（特許文献１）、ヒドロキシアパタイトカラムによる分離精製方法（特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−３２５１４２号公報
【特許文献２】特開平２−２９３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記の疎水性クロマトグラフィーを用いる方法は、精製する対象となるタンパク質が変性してしまうおそれがある。
また、ヒドロキシアパタイトカラムによる分離精製方法は、対象となるタンパク質と、ヒドロキシアパタイトのイオン交換や、静電相互作用を利用する。この性質上、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた精製は次の（ｉ）から（ｉｉｉ）のような課題がある。
（ｉ）精製条件がサンプルに依存し、分離溶媒のｐＨや塩濃度、流速などのパラメーターを最適化しないといけないので、手間がかかる。
（ｉｉ）対象となるタンパク質の種類によっては、アパタイト表面への吸着をきっかけにして、変性してしまうおそれがある。
（ｉｉｉ）同じような分子表面（例えば、表面電位、親疎水性）を持つ物質は、同じように吸着・遊離すると考えられるため、分離が困難である。
本発明は、標識タンパク質を取得することを課題とする。特に標識タンパク質と標識されていない該タンパク質を分離することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題を達成するための、標識タンパク質の取得方法について鋭意検討を行い、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第一は、標識タンパク質であって、標的タンパク質と、少なくとも１つ以上の、アフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、少なくとも１つ以上の標識サイトを有する、被標識タンパク質と、さらに前記標識サイトの少なくとも１つに結合した標識試薬からなり、標識タンパク質と被標識タンパク質の、アフィニティーキャリアとの親和性が異なることを特徴とする標識タンパク質を提供する。
【００１１】
また、本発明の第二は、下記の一般式（１）で表されることを特徴とする標識タンパク質を提供する。
Ｚ−（Ｌ）ａ−Ｘ−Ｙ      ・・・（１）
（ただし、上記の式においてＺは標的タンパク質、Ｌはリンカーを構成するアミノ酸、Ｘはアフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトとからなるポリペプチド、Ｙは前記標識サイトに結合した標識試薬であり、ａは０または１である。ただし、上記一般式（１）からＹを欠失した状態のタンパク質と上記一般式（１）で表される標識タンパク質では、アフィニティーキャリアとの親和性が異なる。）
この形態においては、一般式（１）からＹを欠損した状態のタンパク質が被標識タンパク質に相当する。
【００１２】
また、本発明の第三は、標識タンパク質を取得する方法であって、ｉ）標的タンパク質とアフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを有する被標識タンパク質を得る工程ｉｉ）前記被標識タンパク質の標識サイトに標識試薬を結合し、標識試薬が結合した標識タンパク質を得る工程、ｉｉｉ）標識タンパク質と標識試薬を有さない被標識タンパク質の混合物を上記アフィニティー相互作用ドメインに特異的に結合できるアフィニティーキャリアに接触させる工程、ｉｖ）前記アフィニティーキャリアへの親和性の差異により、標識タンパク質を選択する工程、を具備する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の標識タンパク質は、アフィニティー精製によって、未標識の該タンパク質と分離することが可能になり、標識タンパク質を簡便に精製することができる。
また、本発明の標識タンパクの取得方法は、従来のカラムを利用した精製工程は２つの工程（サンプルを吸着させる工程と溶出する工程）であるのに対し、条件によっては、１つの工程（サンプルを流して、分離されなかったものを回収する工程のみ）で行うことも可能であり、優れている。
また、本発明の標識タンパク質は、抗体結合部位の外に標識物質が存在し、これが固定相に吸着するため、タンパク質の変性が極力抑えられる。
また、標識物質の有無を特異的に識別するため、同じような分子表面であっても分離が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係る標識タンパク質を示す模式図を示す
【図２】金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによるｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖタンパクの精製前後における、還元下のゲル電気泳動の結果を示す。
【図３】アフィニティー相互作用ドメイン及び標識サイトを含む配列と一本鎖抗体からなる標識タンパク質の模式図を示す。
【図４】本実施例で作製したＰＥＧ化抗体とＰＥＧ化前の抗体の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【図５】本発明実施形態に係る方法の概略を示す
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態に係る標識タンパク質について以下にその詳細を説明する。
【００１６】
本発明は、被標識タンパク質と標識試薬とからなる標識タンパク質である。この被標識タンパク質は、標的タンパク質と、少なくとも１つ以上の、アフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、少なくとも１つ以上の標識サイトを有する。なお、前記標識試薬は、前記標識サイトの少なくとも１つに結合している。そして、前記標識タンパク質と前記被標識タンパク質の、アフィニティーキャリアとの親和性が異なる。
【００１７】
本発明に係る標識タンパク質の一例として、下記の一般式（１）で表されることを特徴とする標識タンパク質が挙げられる。
Ｚ−（Ｌ）ａ−Ｘ−Ｙ      ・・・（１）
（ただし、上記の式においてＺは標的タンパク質、Ｌはリンカーを構成するアミノ酸、Ｘはアフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトとからなるポリペプチド、Ｙは前記標識サイトに結合した標識試薬であり、ａは０または１である。ただし、上記一般式（１）からＹを欠失した状態のタンパク質と上記一般式（１）で表される標識タンパク質では、アフィニティーキャリアとの親和性が異なる。）
このうち、一般式（１）からＹを欠失した状態のタンパク質（被標識タンパク質）が、上記被標識タンパク質である。
【００１８】
本発明においては、標識タンパク質と被標識タンパク質の、アフィニティーキャリアとの親和性が異なるため、標識タンパク質と被標識タンパク質とを分離、精製することができる。
【００１９】
本発明の実施形態に係る標識タンパク質を、図１（ａ）から（ｄ）に示す。図１（ａ）は標識試薬として色素を、（b）は微粒子を、（ｃ）はＰＥＧを、（ｄ）はＰＥＧ化リン脂質を用いた例である。なお、図中１は標的タンパク質、２はリンカーアミノ酸、３はアフィニティー相互作用ドメイン、４は標識サイト、５は色素、６は微粒子、７はＰＥＧ、８はＰＥＧ化リン脂質を示す。
【００２０】
（標的タンパク質）
本実施形態において、標的タンパク質とは、標識されることを目的とするタンパク質をいう。標的タンパク質は、特に限定されることはなく、その例として、酵素、抗体、抗体フラグメント、受容体、サイトカイン、ホルモン、血清タンパク等が挙げられ、特に好適な例として抗体または抗体フラグメントが挙げられる。抗体とは、特定の抗原又は物質に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリンファミリーのタンパク質の総称であり、特定の分子を認識し、結合することが可能である。抗体又は抗体フラグメントは、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、鳥、等、由来は問わず、さらにはキメラ体であってもよい。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体フラグメントとは、標的分子結合能を維持したまま低分子化した抗体の誘導体を指す。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン単独、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン、または抗体の相補正決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド等がある。これらのうち、特に好ましくはペプチドリンカーで重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結した一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、更には、ヒト化一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が特に好ましい。抗体フラグメントは、抗体に比べ、分子サイズが小さくなる結果、高い組織浸透性や早いクリアランス速度を有する事から診断剤あるいは造影剤としての応用が期待される。これらの抗体あるいは抗体フラグメントは、特に病変部位で発現の高い分子と結合するものが望ましい。病変部位で発現の高い分子の例として、例えば、受容体型チロシンキナーゼＨＥＲ２やガン胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）を挙げることができる。ＨＥＲ２遺伝子はがん関連遺伝子であり、多くの種類のがんでその遺伝子増幅がみられる。ＣＥＡは、糖タンパク質であり、内胚葉由来の消化系上皮腺癌、および乳癌や非小細胞肺癌などにおいて強く発現している。
【００２１】
上記標的タンパク質として、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３８）
【００２２】
（アフィニティー相互作用ドメイン）
本実施形態において、アフィニティー相互作用ドメインとは、互いに特異的な親和性（アフィニティー）を有する２以上の物質において、その一方の物質あるいは物質の部分構造を含むドメインのことをいう。互いに特異的な親和性を示す２以上の物質の例として、抗原と抗体、酵素と酵素基質、受容体とホルモンなどのリガンド、キレートされた金属イオンとその捕捉体、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）とその相補結合、ビオチンとアビジンなどが知られている。アフィニティーキャリアとは、アフィニティー相互作用ドメインと特異的な親和性を有し、アフィニティー相互作用ドメインを含む分子の固定や精製に用いるための担体をいう。アフィニティーキャリアの例として、上記互いに特異的な親和性を有する２以上の物質のうちの一方を、デキストランやアガロースなどに固定化したものを挙げることができる。アフィニティーキャリアは、キャリア上に分離すべき物質の溶液を展開することで、アフィニティー相互作用ドメインを有する物質を分離精製するアフィニティー精製に用いることができる。
【００２３】
本実施形態において、アフィニティー相互作用ドメインは相互作用可能な物質であれば特に制限されない。アフィニティー相互作用ドメインの例を挙げると、少なくとも４個以上のオリゴヒスチジンペプチド、マルトース結合ペプチド（ＭＢＰ）、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）、ビオチンを含むペプチドを挙げることができる。アフィニティーキャリアの例として、アフィニティー相互作用ドメインがマルトース結合ペプチド（ＭＢＰ）であれば、マルトースあるいは抗ＭＢＰ抗体、少なくとも４個以上の連続したヒスチジンペプチドであれば、ニトリロ三酢酸に結合したニッケル錯体化合物（Ｎｉ−ＮＴＡ）あるいは抗オリゴヒスチジン抗体、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）であれば、アルブミンあるいは抗アルブミン抗体、ビオチンを含むペプチドであれば、アビジン、アビジン誘導体、あるいは抗ビオチン抗体を用いる事が出来る。
【００２４】
アフィニティー相互作用ドメイン自体のサイズが小さく、標的タンパクの機能を阻害しない点においては、アフィニティー相互作用ドメインはオリゴヒスチジンペプチド、特にヘキサペプチドＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓが好ましい。オリゴヒスチジンは、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋などの２価金属イオン、特にＮｉ２＋イオンと結合する。これらの金属をキレートしたアフィニティーキャリア（例えば、ニトリロ三酢酸−キレート化Ｎｉ２＋またはイミノ二酢酸−キレート化Ｎｉ２＋）を用いて、オリゴヒスチジンペプチドをアフィニティー精製することができることが知られている。
【００２５】
（標識サイト）
本実施形態において、標識サイトとは、標識試薬を連結するための部位のことをいう。標識サイトはアフィニティー相互作用ドメインあるいは標的タンパク質に含まれていてもよい。標識サイトとして、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、マレイミド基、ヒドロキシスクシンイミド基、アルデヒド基、イソチオシアネート基、グリシジル基を有するアミノ酸残基を挙げることができる。これらの官能基はアミノ酸残基がもともと有するものであってもよいし、アミノ酸残基に化学反応などにより付加してもよい。
【００２６】
標識サイトとして、より好適には、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、チロシンを用いることができる。反応特異性、標識サイト導入の容易性からは、標識サイトとしては、側鎖チオール基を有するシステインあるいは、側鎖εアミノ基を有するリジンがさらに好適に用いられ、その場合、側鎖チオールあるいは側鎖εアミノ基を介して標識試薬を結合することができる。
【００２７】
（被標識タンパク質）
本実施形態で、被標識タンパク質とは、標的タンパク質と、少なくとも１つ以上の、アフィニティーキャリアに結合するアフィニティー相互作用ドメインと、少なくとも１つ以上の標識サイトを有するタンパク質をいう。本明細書中では、被標識タンパク質を、特に標識されていない状態のものを指すことがある。被標識タンパク質において、標識サイトはアフィニティー相互作用ドメインに含まれてもよく、本実施形態に係る被標識タンパク質は、アフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトの両者を含む配列として、例えば以下の配列を有することができる。
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１）
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号４）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号５）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号６）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号７）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号８）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号９）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１０）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１１）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１２）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１３）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１４）
【００２８】
これらの配列は標的タンパク質の機能を損なわない限りにおいてＮ末端Ｃ末端のいずれに結合してもよく、また、標的タンパク質とこれらの配列の間には適宜アミノ酸残基を加えてもよい。標的タンパク質が一本鎖抗体である場合には、そのＮ末端側の配列が抗原認識に深く関わっているため、上記の配列はＣ末端側に付加されることが望ましい。
【００２９】
（リンカーアミノ酸）
なお、本実施形態に係る被標識タンパク質は、図４で示すように、標的タンパク質、アフィニティー相互作用ドメイン、標識サイト、のそれぞれの間にリンカーアミノ酸を有してもよい。リンカーアミノ酸は、アフィニティー相互作用ドメインあるいは標識サイトと標的タンパク質を空間的に互いに分離する役割があり、それらの機能性に相互に悪影響を及ぼさない形であることが必要である。それらの空間配置的が重ならないように、該リンカーアミノ酸はフレキシブルであることが特に必要である。該アミノ酸の例を挙げると、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、リジン、セリン及びチロシンなどがある。柔軟性を有し、水溶性を著しく低下させないのであれば、その組成や残基数は特に制限されないが、好ましくは１〜３０アミノ酸の長さであり、特に好ましくは、１〜１５アミノ酸からなるリンカーアミノ酸である。例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１５）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１６）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１７）が、柔軟性の観点から好適に用いる事が出来る。いうまでもなく、リンカーアミノ酸はなくともよい。
【００３０】
そして、上記被標識タンパク質の好適な例として、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げる事ができる。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号２１）
上記配列中、リンカーアミノ酸はＡＡＡＬＥ（配列番号１７）、アフィニティー相互作用ドメインと標識サイトはＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号１）である。
【００３１】
本実施形態において、被標識タンパク質は、遺伝子工学による組換えＤＮＡ技術を利用し、融合タンパク質として細菌や細胞により生産することで行うことができる。実施例で後述するように、標的タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に、標識サイト、あるいは、アフィニティー相互作用ドメインのアミノ酸配列をコードする遺伝子ｃＤＮＡを目的タンパク質をコードするｃＤＮＡと連結し、融合した形で発現させることができる。
【００３２】
あるいは、被標識タンパク質は、標的タンパク質とアフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトを化学反応により結合することによって作製してもよい。その際、標的タンパク質とアフィニティー相互作用ドメインと、標識サイトの互いの間にリンカーアミノ酸を含んで結合させてもよい。いずれにおいても、アフィニティー相互作用ドメイン、標識サイト及び標的タンパク質の機能が相互に悪影響を及ぼさない条件で行われるべきである。化学反応により結合する場合、標的タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、又はリジン残基、又はシステイン残基との結合、好ましくは、標的タンパク質のカルボキシ末端との反応を介してアフィニティー相互作用ドメインや標識サイトを導入することができる。
【００３３】
さらには、被標識タンパク質は、遺伝子組換えと化学反応の両方を組み合わせて作製してもよい。例えば、アフィニティー相互作用ドメイン、標識サイト、標的タンパク質をそれぞれ別個に遺伝子組換えにより作製してから、それらを化学反応により結合させてもよい。または、遺伝子組換えにより作製した標的タンパク質に、化学合成により作製したアフィニティー相互作用ドメインあるいは標識サイトを化学反応により結合してもよい。
【００３４】
遺伝子組換えにより、被標識タンパク質、標的タンパク質、アフィニティー相互作用ドメイン、標識サイトなどを作製する場合は、宿主を介して、あるいはインビトロ翻訳法を介してタグ分子あるいは融合タンパク質を発現させて得ることができる。ベクターは、目的タンパク質を発現できるものであれば特に限定はされないが、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルスベクターなどが利用できる。ベクターを作製するには、例えば、被標識タンパク質の発現であれば、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを公知の方法に従って合成し、適当なベクターに挿入することができる。アフィニティー相互作用ドメインとして用いることのできる、オリゴヒスチジン部位をコードするベクター（例えばＮｏｖａｇｅｎ社、ｐＥＴシリーズ）は商業的に入手可能である。宿主は、前記ベクターがペプチドやタンパク質を発現することができるものであれば特に限定されない。例えば、動物細胞、昆虫細胞、大腸菌、酵母などであり、公知の形質転換方法によって宿主に導入し、宿主を適当に培養することで目的タンパク質を取得できる。また、インビトロ翻訳法においてタグ分子あるいはタンパク質を合成可能であり、市販のキット（例えばＲｏｃｈｅ社ＲＴＳシステム）を用いることができる。なお、遺伝子組換えに関する一連の操作は、上記に限定されるわけではなく、当業者であればＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ）等に示されている公知の技術に基づいて容易に実施することができる。
【００３５】
化学合成については、特に限定されるものではなく、例えば、市販のペプチド合成用樹脂を用いることができ、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させることができる。また、天然のアミノ酸はない新たな官能基を導入する場合、予め官能基を挿入したアミノ酸誘導体を原料とするペプチド合成、あるいはペプチド合成後に所定の化合物を反応させて官能基を導入することができる。
【００３６】
（標識試薬）
本実施形態において、標識試薬は特に限定はないが、例として色素、微粒子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン脂質、ポリエチレングリコール−リン脂質複合体を用いることができる。
【００３７】
色素の特に好ましい例としては、蛍光色素を挙げることができ、とりわけ、近赤外蛍光色素、例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、Ｖｉｖｏｔａｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社商標）６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社商標）６８０、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ７５０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社商標）６８０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ７５０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｙ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ社商標）５．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）などが挙げられる。
【００３８】
近赤外に吸収波長と蛍光波長を有するシアニン色素は特に好ましく、インドシアニングリーンあるいはその誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０が特に好ましい。
【００３９】
また、微粒子の好ましい例としては、酸化鉄や金の金属微粒子、高分子微粒子、タンパク質微粒子などが挙げられ、診断用途としては、酸化鉄微粒子を特に好適に用いる事ができる。体内診断における酸化鉄微粒子は、酸化鉄磁気共鳴イメージングの造影剤として既に臨床で用いられており、その平均直径は５０〜１００ｎｍ程度である。毛細血管径が２マイクロメートル程度であることから、粒子のサイズは大きくても１マイクロメートル以下、組織への浸透性を考慮すれば、５〜５００ナノメートルのサイズが好ましい。
【００４０】
さらに、ＰＥＧやリン脂質もタンパク質の機能制御用の標識試薬として有効である。ＰＥＧは生体に対する毒性が低く、生体内に投与する物質をＰＥＧ標識することで、その血中半減期を延長させる事が知られている。ＰＥＧは非イオン性の水溶性の高い高分子であり、大きな体積排除効果を有する。ＰＥＧの十分な体積排除効果を発揮するためには、その平均分子量が２ｋ以上であることが望ましく、標識されるタンパク質の機能阻害を抑制するためには、その平均分子量が４０ｋ以下であることが望ましい。したがって、ＰＥＧの平均分子量は２ｋから４０ｋであることが、特に好ましい。なお、本明細書において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧの誘導体も含む。
【００４１】
酸化鉄粒子やＰＥＧでは、蛍光色素と比較して、分子サイズがかなり大きいため（数〜数十ナノメートル）、アフィニティー相互作用ドメインに対して、大きな立体障害となる。その結果、標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのアフィニティーは被標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのアフィニティーと比較して顕著に低下する。
【００４２】
本実施形態において、リン脂質とは、天然リン脂質および合成リン脂質、ならびにそれらの誘導体のいずれでもよい。例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシルグリセロホスホエタノールアミン、ジステアロイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオリルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ポリエチレングリコール−リン脂質複合体、卵リン脂質などが挙げられる。また、前記リン脂質はリガンドと共有結合する官能基を含んでいてもよく、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、マレイミド基、カルボキシル基、およびビオチン基などが挙げられる。タンパク質に安定に疎水性を導入する目的で、特に、ポリエチレングリコール−リン脂質複合体（本明細書において、ＰＥＧ化リン脂質ということがある）が利用できる。
【００４３】
本実施形態に係る精製方法においては、上記の標識試薬により、より効果的に標識タンパク質を濃縮精製することが可能になる。
【００４４】
また、標識試薬は上記の標識試薬に、さらに標識サイトと結合するための官能基が付されていてもよい。そのような官能基として、たとえば、ＮＨＳエステル、イソシアナート、マレイミド、ヒドラジド（アルデヒド反応性）、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基などが利用できる。
【００４５】
標識サイトと標識試薬の結合は、共有結合、イオン結合、配位結合など、特に限定されないが、特に好ましくは共有結合である。また、標識サイトに、標識試薬が結合する際には、４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステルなどの二官能性架橋試薬を介して結合してもよい。例えば、４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステルは標識サイトのシステイン側鎖のチオール基を修飾することで、ヒドロキシスクシンイミド基を介して標識試薬のアミノ基と結合できるようになる。
【００４６】
本実施形態に係る標識タンパク質は、標識を有しない状態の被標識タンパク質と比較して、アフィニティーキャリアとの親和性が、大きく変化することを特徴する。アフィニティー相互作用ドメイン自体のアフィニティーキャリアとの親和性は、標識前後で変化はないが、標識タンパク質全体としては、アフィニティーキャリアとの親和性は標識前後で変化する。親和性は、その解離定数ＫＤによって評価することが一般的である。しかし、標識タンパク質と被標識タンパク質とを分離するという本発明の目的に照らし合わせると、標識されていない被標識タンパク質がアフィニティーキャリアに強く結合することが重要であり、解離定数ＫＤよりも、会合速度定数ＫＯＮが重要である。
【００４７】
親和性の差は会合速度定数Ｋｏｎが１０倍異なることが好ましく、すなわち、標識タンパク質とアフィニティーキャリア間、被標識タンパク質とアフィニティーキャリア間の会合速度定数Ｋｏｎが１０倍異なることが好ましい。特に、標識後に親和性が低下することが好ましく、標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのＫｏｎが被標識タンパク質とアフィニティーキャリアとの会合速度定数と比較して１０分の１以下であることが好ましい。例えば、被標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのＫｏｎが１０４Ｍ−１ｓ−１（Ｋｏｆｆ＝１０−４ｓ−１，ＫＤ＝１０−８Ｍ）であり、標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのＫｏｎが１０３Ｍ−１ｓ−１（Ｋｏｆｆ＝１０−４ｓ−１，ＫＤ＝１０−７Ｍ）である系を考える。系中の標識タンパク質あるいは被標識タンパク質のアフィニティー相互作用ドメインの全濃度を１μＭ、それと相互作用するアフィニティーキャリアの全濃度を１μＭとする。単純化するために、アフィニティー相互作用ドメインとアフィニティーキャリアは１：１で相互作用すると仮定する。この条件下で、それぞれのアフィニティー相互作用ドメインとアフィニティーキャリアの結合の経時変化をシミュレーションすると、１０分間のインキュベーション後では、被標識タンパク質（Ｋｏｎ＝１０４Ｍ−１ｓ−１）は８３％がアフィニティーキャリアと結合している。一方、標識タンパク質（Ｋｏｎ＝１０３Ｍ−１ｓ−１）は３６％がアフィニティーキャリアと結合している。従って、標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのＫｏｎと被標識タンパク質とアフィニティーキャリアとのＫｏｎにおける１０倍の差は、標識タンパク質と被標識タンパク質をアフィニティ−精製で分離精製するに十分な親和性の差である。実施例で後述するように、本実施形態に係る被標識タンパク質は、標識されることにより、標識試薬の空間的な阻害効果により、アフィニティーキャリアとの親和性が大きく低下する。これを利用する事で、標識体と未標識体を簡便に分離することが可能になる。
【００４８】
標識タンパク質の親和性は、アフィニティー相互作用ドメインと標識試薬の、分子サイズ、空間的な位置、数、荷電状態などに依存する。以下は、アフィニティー相互作用ドメインがヘキサヒスチジンの場合を例に説明する。ペプチド結合単位の平均距離は、約０．３８ｎｍであり、ヘキサヒスチジンの分子長は約２．３ｎｍである。ヘキサヒスチジン配列から０〜５残基の距離内に位置する標識サイト、例えばシステインに標識試薬が結合する場合、標識試薬のサイズが約２〜６ｎｍ以上であれば、立体障害を発揮させると考えられ、好適に用いる事ができる。シアニン蛍光色素の一般的なサイズは、約２ｎｍであり、これらの色素をヘキサヒスチジン近傍に標識する場合は、可能な限り近接させて、具体的にはアミノ酸残基数で少なくとも５残基以内の位置に、標識させることが好ましい。分子サイズや距離のみならず、分子の荷電状態も親和性には影響する。例えば、アフィニティー相互作用ドメインがカチオン電荷を有する場合、標識試薬がマイナス電荷を有すれば、適切な距離に位置する場合、両者に静電相互作用が生じるため、標識タンパク質のアフィニティーキャリアとの親和性を効果的に低下する事が可能である。
【００４９】
本実施形態に係る標識タンパク質を取得する方法について、図５を用いて、以下に詳細に説明する。
ｉ）標的タンパク質とアフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを有する被標識タンパク質を得る工程
上述の被標識タンパク質の項等に従って、標的タンパク質とアフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを有する被標識タンパク質を得ることができる。
【００５０】
ｉｉ）前記被標識タンパク質の標識サイトに標識試薬を結合し、標識試薬が結合した標識タンパク質を得る工程
上述の標識試薬の項等に従って被標識タンパク質の標識サイトに標識標識を結合し、標識タンパク質を得ることができる。
【００５１】
ｉｉｉ）標識タンパク質と標識試薬を有さない被標識タンパク質の混合物を上記アフィニティー相互作用ドメインに特異的に結合できるアフィニティーキャリアに接触させる工程
上述のとおり、本実施形態に係る標識タンパク質は、標識試薬で標識することで、アフィニティーキャリアとの親和性が、被標識タンパク質と比較して変化する。この親和性の差を用いて、標識タンパク質を分離するための工程がこれらの工程である。上記ｉｉｉ）の工程は、具体的には、標識タンパク質と被標識タンパク質の混合物を、アフィニティー相互作用ドメインに特異的に結合するアフィニティーキャリアに接触させることである。例えば、前記アフィニティーキャリアを充填したカラムに流し込むことによって行われる。
【００５２】
ｉｖ）アフィニティーキャリアへの親和性の差異により、標識タンパク質を選択する工程
アフィニティーキャリアへの親和性の差異が十分に大きく、被標識タンパク質のみがアフィニティーキャリアに結合し、標識タンパク質はアフィニティーキャリアに結合しない場合は、カラムを素通りした画分を回収することで標識タンパク質を選択することができる。図５では、この例を示している。さらに、必要であれば、この操作を繰り返す事で、さらに純度の高い標識タンパク質を得ることができる。
【００５３】
一方、アフィニティーキャリアへの親和性の差異が上記ほどは大きくなく、標識タンパク質が前記アフィニティーキャリアに弱く結合する場合は、次のようにして、標識タンパク質を選択することができる。すなわち、標識タンパク質を溶出するが、被標識タンパク質を溶出しないような溶出液、溶出時間などの各条件を選択して溶出することで、標識タンパク質のみを選択的に溶出することができる。溶出液はたとえば、前記アフィニティーキャリアに特異的な親和性を有する物質を含むものを用いることができ、使用するアフィニティーキャリアに対応し、適時選択することができる。例えば、アフィニティー相互作用ドメインがオリゴヒスチジンであれば、イミダゾールまたはその誘導体を含む溶液を溶出液として利用できる。本工程はその他周知のアフィニティー精製方法に従って実施することができる。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例では具体的な試薬や反応条件を挙げるが、種々の変更が可能であり、それらもまた本発明の範囲に包摂される。以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００５５】
（実施例１  アフィニティー相互作用ドメイン及び標識サイトを含む抗体ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５’末端には制限酵素ＮｃｏＩ−を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す（制限酵素の認識サイトを下線で示す）。
【００５６】
５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’  （配列番号１８）
【００５７】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩ−とＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。
【００５８】
その後、アフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを含む配列を挿入する。具体例として、上記遺伝子産物のカルボキシ末端に、標識サイトとしてシステイン残基、及びアフィニティー精製のためのヒスチジンが６残基連続した６×Ｈｉｓタグを有するタグ配列（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号６））について説明する。まず、上記のプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化処理する。以下に示す塩基配列の合成ＤＮＡ（配列番号１９及び配列番号２０）をアニ−リングによって２本鎖ＤＮＡとし、これを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化処理後、先のプラスミドへライゲーションさせる。この結果、ＨＥＲ２へ結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＣ末端に本実施例にかかるアフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを含む配列が融合したタンパク質の発現用プラスミドが調製された。  
【００５９】
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１９）
【００６０】
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号２０）
【００６１】
このプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２×ＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧを添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００×ｇ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ／５００ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。結果を図２に示す。図２において、レーン１は分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇスタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、レーン２は精製前のタンパク溶液、レーン３は精製後のタンパク質溶液（２８ｋＤａ）をそれぞれロードした。アフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを含む配列を含む発現させたタンパク質（一本鎖抗体）の模式図を図３に示した。図３においては、抗体のＶＬとＶＨドメイン、これらを連結するペプチドリンカー、さらにアフィニティー相互作用ドメイン及び標識サイトを含む配列がカルボキシ末端に連結されている。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す（リンカー配列、アフィニティー相互作用ドメイン、ならびに標識サイトを含む配列を下線で示す。）。
【００６２】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号２１）
以下、得られた精製タンパク質を抗体と略す。
【００６３】
（実施例２  抗体の色素を用いた標識）
上記で調製した抗体を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）にバッファー置換後、２０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で２時間、還元処理した。この還元処理した抗体を、２５℃で２〜４時間、１０倍モル量の蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０―マレイミド、と反応させた。１時間の反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００  ＧＬ１０／３００カラム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）７５０―マレイミドを除去し、標識抗体を得た（以下、色素標識抗体と略す）。抗体に対する色素の標識率（モル比）は、吸光度測定より０．４〜０．６であった。
【００６４】
（実施例３  抗体のＰＥＧを用いた標識）
上記で調製した抗体を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）にバッファー置換後、２０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で２〜４ｈ、還元処理した。この還元処理した抗体を、２５℃で２〜４時間、１０倍モル量の２０ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミド（日油株式会社）と反応させた。反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００ＧＬ１０／３００カラム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応の２０ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドを除去し、ＰＥＧ化抗体を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＰＥＧ化前の抗体と分子量を比較することで、ＰＥＧ化抗体の調製が確認できる。本実施例で作製したＰＥＧ化抗体とＰＥＧ化前の抗体の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示す。
【００６５】
（実施例４  抗体への微粒子を用いた標識）
上記で調製した抗体を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）にバッファー置換後、２０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で２〜４時間、還元処理した。この還元処理した抗体を、２５℃で２〜４時間、市販酸化鉄粒子ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ＳＰＩＯ（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ修飾されたもの、平均直径２０ｎｍ、コアフロント株式会社）と反応させる。反応後、ＢＣＡアッセイ等により粒子に固定化された抗体量を定量することで粒子への抗体の固定化を確認できる。
【００６６】
（実施例５  標識前後の抗体とアフィニティキャリアの親和性評価）
上記で作製した標識抗体とアフィニティキャリアであるＮｉ−ＮＴＡとの相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いて測定した。センサーチップは、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を予め固定化したカルボキシルメチルデキストランチップ（ＧＥヘルスケア株式会社）を用い、Ｎｉ塩水溶液を添加し、表面にニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）とニッケルの錯体を形成させた。約８０  ＲＵであった。ランニングバッファーとしてはＰＢＳ−Ｔ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）を用いて、１００  ｎＭの標識抗体または未標識抗体（コントロール）を流速３０μｌ／分の条件下でインジェクトし結合能を評価した。測定時間は、注入時間（結合）１２０秒、注入停止後経過時間（解離）１２０秒であり、フローセル表面の洗浄は１サンプル測定毎にＥＤＴＡ水溶液を用いてセンサーグラムがベースラインに戻るまで適量注入した。結合速度論解析実験においては、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０．２ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いてセンサーグラムを分析した。標識抗体のセンサー表面への吸着量（レゾナンスユニット：ＲＵ）は、コントロールに対して、約１０倍低下した。この結果から、色素標識により、オリゴヒスチジンとＮＴＡニッケル錯体との親和性が低下することがわかった。
【００６７】
（実施例６  アフィニティー精製による標識タンパク質の濃縮精製）
アフィニティキャリアとして金属キレートカラム担体であるＨｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いる。カラム調製やサンプル負荷、及び洗浄工程は、前記業者の推奨方法に準拠し、室温（２０℃）にて行うが、必要に応じて条件を最適化することができる。
【００６８】
まず、上記実施例２〜４で調製された標識タンパク質を、ＮｉをローディングしたＨｉｓ−Ｂｉｎｄカラムに添加する。展開溶媒はＴｒｉｓ緩衝溶液を用いる。カラムを素通りしてくる溶液は全て回収する。目的の標識タンパク質はこの溶液に含まれる。標識されていないタンパク質はカラム内に強く保持される。目的である標識タンパク質が遊離しない場合は、低濃度のイミダゾール溶液、例えば５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、をカラムに添加することで、目的の標識タンパク質を回収する事ができる。一方、カラムに保持された未標識タンパク質は１００ｍＭ〜１Ｍイミダゾール溶液にて溶出させ、回収することができる。回収された液の紫外・可視吸収スペクトル、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、標識タンパク質の精製を確認できる。必要に応じ、上記の精製操作を繰り返す事により、精製度を上げることができる。
【００６９】
（実施例７  アフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを含む配列を融合タンパク質として調製するためのオリゴＤＮＡ）
本実施例に係るアフィニティー相互作用ドメインと標識サイトを含む配列を融合タンパク質として調製するためのオリゴＤＮＡを以下に示す。実施例１に従い、ライゲーション反応により抗体遺伝子への連結が行われる。
【００７０】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号７）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２２）
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号２３）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７１】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号８）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２４）
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号２５）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７２】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号９）に対しては、５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’  （配列番号２６）
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＡＧＴＧＣ−３’  （配列番号２７）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７３】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１０）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’  （配列番号２８）
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＡＧＴＧＣＧＧＣ−３’  （配列番号２９）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７４】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１１）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’  （配列番号３０）
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣ−３’  （配列番号３１）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７５】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１２）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＣ−３’  （配列番号３２）
５’−ＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣ−３’  （配列番号３３）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７６】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１３）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＣ−３’  （配列番号３４）
５’−ＴＣＧＡＧＡＣＡＴＧＣ−３’  （配列番号３５）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７７】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１４）に対しては、
５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’  （配列番号３６）
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣ−３’  （配列番号３７）
を、アニ−リングすることで２本鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いたカセットライゲーションにより発現コンストラクトを調製できる。
【００７８】
（実施例８  抗体のポリエチレングリコール−リン脂質複合体を用いた標識）
上記で調製した抗体を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）にバッファー置換後、２０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で２ｈ、還元処理した。この還元処理した抗体を、２５℃で４ｈ、４倍モル量の［Ｎ−［（３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ］
ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）］（製品名ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ，  日油株式会社）と反応させた。反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＧＬ  １０／３００カラム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、ポリエチレングリコール−リン脂質複合体を標識した抗体の粗精製物を得た。
【００７９】
（実施例９  アフィニティー精製による色素標識抗体の濃縮精製）
サンプルとして、抗体に対する色素の標識率（モル比）が０．４３の色素標識抗体を用いた。色素標識抗体の溶液１ｍＬを、予めＮｉをローディングしたＨｉｓ−Ｂｉｎｄカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に添加した（担体のベッドボリューム：１ｍＬ）。次いで、展開溶媒としてのＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）を３ｍＬ添加し、カラムを通過した溶液（カラム通過分と略す）を全て回収した。目的の色素標識抗体はこの溶液に含まれる。色素標識されていない未標識抗体はカラム内に強く保持された。カラム通過分の紫外・可視吸収スペクトルにより、標識抗体の標識率を算出した結果、０．５８であった。一方、カラムに保持された未標識抗体を３００ｍＭイミダゾール溶液にて溶出させ、回収した。回収された溶液の紫外・可視吸収スペクトルにより、本回収溶液中の抗体は色素標識されていないことが確認された。以上の結果より、本実施例にかかる精製方法において、標識抗体から未標識抗体を簡便に除去できる事が示された。
【符号の説明】
【００８０】
１  タンパク質
２  リンカーアミノ酸
３  アフィニティー相互作用ドメイン
４  標識サイト
５  蛍光色素
６  微粒子
７  ＰＥＧ
８  ＰＥＧ化リン脂質
【図１】
2011032264.tif 000003
【図３】
2011032264.tif 000004
【図５】
2011032264.tif 000005
【図２】
2011032264.tif 000006
【図４】
2011032264.tif 000007
【配列表】
2011032264000001.app