(57)【要約】【課題】検体の測定可能レンジを従来よりも大幅に広げることによって低濃度域及び高濃度域での測定を可能となるようなイムノクロマトグラフ方法を提供すること。【解決手段】被検物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した第一の標識物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した第二の標識物質とを混合させた状態で不溶性担体上に展開し、該被検物質に対する第二の結合物質、または被検物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被検物質と該第一の標識物質及び／又は第二の標識物質を捕捉して該被検物質を検出するイムノクロマトグラフ方法であって、上記第一の標識物質が増幅反応を発生させる標識物質であり、上記第二の標識物質が増幅反応に実質的に影響を与えない標識物質である、上記イムノクロマトグラフ方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した第一の標識物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した第二の標識物質とを混合させた状態で不溶性担体上に展開し、該被検物質に対する第二の結合物質、または被検物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被検物質と該第一の標識物質及び／又は第二の標識物質を捕捉して該被検物質を検出するイムノクロマトグラフ方法であって、上記第一の標識物質が増幅反応を発生させる標識物質であり、上記第二の標識物質が増幅反応に実質的に影響を与えない標識物質である、イムノクロマトグラフ方法。
【請求項２】
第一の標識物質が、銀イオンと銀イオンのための還元剤と反応して金属銀を生じる性質を有する物質であり、第二の標識物質が銀イオンと銀イオンのための還元剤とは実質的に反応性を有しない物質である、請求項１に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項３】
銀イオンと、銀イオンのための還元剤を用いた増幅反応により金属銀を生じさせる、請求項２に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項４】
第一の標識物質が金属コロイドである、請求項１から３の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項５】
不溶性担体に含まれる金属コロイドの粒子数が１×１０5個以上１×１０8個以下である、請求項４に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項６】
金属コロイドが金、銀、または白金を含む、請求項４又は５に記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項７】
第一の標識物質が酵素であり、かつ増幅反応が酵素反応である、請求項１から６の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項８】
第二の標識物質が着色粒子である、請求項１から７の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
【請求項９】
第二の標識物質が着色ラテックスである、請求項１から８の何れかに記載のイムノクロマトグラフ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフ方法を用いた測定方法およびイムノクロマトグラフ方法を用いた検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。しかし、９６穴プレ−トを用いた酵素免疫測定法やラテックス凝集法のような従来の免疫学的測定法は、必ずしも測定の迅速簡便性又は検出感度を満たすものではなかった。
【０００３】
また他のニーズとして、現在スワブ液や血液と言った比較的侵襲的な検体を用いている検査において、高感度化が達成されることで、鼻水やうがい液、尿、といった比較的低侵襲的な検体中にごく少量含まれる被検試料を検出することができるようになることで、患者の負担の少ない検査方法が可能となることも期待できる。
【０００４】
近年、特に迅速な診断が求められる感染症の検査に、イムノクロマトグラフ方法（イムノクロマトグラフ法、またはイムノクロマト方法と称することもある。）を用いた検査キット（以後の説明において、イムノクロマトグラフキットと記す。）が多く使用されるようになってきている。これらキットの普及により、患者の感染を迅速・簡便な方法で特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことが可能となってきている。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ方法では、分析対象物（例えば、抗原）に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、分析対象物と特異的に結合する標識化第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、分析対象物を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
【０００５】
イムノクロマトグラフ方法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約５分〜１５分間静置するだけで測定結果が得られる。イムノクロマトグラフ方法は、迅速に測定結果が得られるので、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
【０００６】
また、天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質、更にはウイルス感染症の感染初期の検体は、従来の一般的イムノクロマトグラフ方法では検出できない極微量で作用する物質が多く、それらの迅速、簡便、且つ高感度なイムノクロマトグラフ法の開発が求められている。
【０００７】
また、一方でイムノクロマトグラフ方法の原理を利用し、その検出部位の光学濃度を光学測定するリーダーを用いることで、被検物質が存在することを定性的に確認したり、被検物質の定量を行ったりすることもできる。ロシュ・ダイアグノスティックス社のコバスh232シリーズのように、イムノクロマトグラフ方法を用いで定量することで、心筋マーカーと呼ばれるようなタンパク質の血中濃度を、１５分程度と迅速に測定している例もある。
【０００８】
しかしながら、従来、金コロイドや着色ラテックス等を標識として用いるイムノクロマト法での測定可能レンジは、金コロイドや着色ラテックス１個当りの吸光度の限界に起因して被検物質の低濃度域に限界を持っていた。また、その問題を解決する為に金コロイドのシグナルを例えば銀イオンで増幅すると、低濃度域の問題は改善されるが、銀量が増えても遮蔽面積としてはあまり変わらなくなってくるために、高濃度域の吸光度が飽和してくるという問題と、低濃度域の測定レンジを確保する為に、金コロイドを多く用いると、例えばシグナルの増幅とともに、非特異吸着した金コロイド標識により、偽陽性の問題が生じるケースが多かった（特許文献１）。そのために、標識物の量を偽陽性が出なくなるまで低減すると、いわゆるプロゾーン現象により抗原の超高濃度域での陰性化現象が見られるころがある。
【０００９】
従来から酵素法や銀増幅法による高感度化法は知られている（特許文献２及び３）。しかしながら、いずれの系においても、低濃度域から高濃度域に至る広範囲の十分な測定レンジを確保できているものは無かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−０９８１３９号公報
【特許文献２】特許３３０９９７７号公報
【特許文献３】特開２００２−２０２３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の通り、従来の標識を用いたイムノクロマトグラフ方法において、測定可能レンジが狭いという問題があった。また、低濃度の測定を可能にするために、増幅後のシグナルを測定するだけでは、高濃度の検体の場合はその測定が困難であった。
【００１２】
即ち、本発明は、検体の測定可能レンジを従来よりも大幅に広げることによって低濃度域及び高濃度域での測定を可能となるようなイムノクロマトグラフ方法を提供することを解決すべき課題とした。また、増幅システムでは、基質や試薬を用いて増幅反応を起こす必要があり、試料を滴下して毛細管現象による展開を一旦行った後に、一定時間をおいてからこれらの基質や試薬を再度展開する必要があった。一般的にノイズを少なくするためにも増幅前の感度は低く設定せざるを得ず、そのため目視判定はできないレベルとなり、結果的に試料中の被検物質の濃度にかかわらず一定の時間を必ず待たざるを得なかった。さらに、ノイズを少なくするために標識物などを少なくすると、プロゾーン現象により超高濃度域における偽陰性化の問題も発生した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、２種の異なる標識を用い、例えば、１種の標識を用いて、目視もしくは適当な機器等を用いて測定した後、もう１種の標識の増幅を行い、再度測定するという増幅前と増幅後の２回測定を行うことで、低濃度域及び高濃度域での測定が可能となり、検体の測定可能レンジを従来よりも大幅に広げることができた。
【００１４】
このことにより、感染症等の診断においては、高濃度域の検体では、増幅前でも目視などにより短時間でシグナルを確認することが可能となるため、増幅処理前の早い時間に陽性判定を行うことができ、必要に応じて測定を終了することが可能となる。一方、被検物質が非常に少ない低濃度域、もしくはプロゾーン現象が発生するような超高濃度域においても偽陰性の問題なく結果の判断が可能にすることができる。また、定量測定が必要な診断項目においては、非常に広いレンジで測定することが可能になった。
【００１５】
即ち、本発明によれば、被検物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した第一の標識物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した第二の標識物質とを混合させた状態で不溶性担体上に展開し、該被検物質に対する第二の結合物質、または被検物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被検物質と該第一の標識物質及び／又は第二の標識物質を捕捉して該被検物質を検出するイムノクロマトグラフ方法であって、上記第一の標識物質が増幅反応を発生させる標識物質であり、上記第二の標識物質が増幅反応に実質的に影響を与えない標識物質である、上記イムノクロマトグラフ方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、第一の標識物質は、銀イオンと銀イオンのための還元剤と反応して金属銀を生じる性質を有する物質であり、第二の標識物質は銀イオンと銀イオンのための還元剤とは実質的に反応性を有しない物質である。
【００１７】
好ましくは、銀イオンと、銀イオンのための還元剤を用いた増幅反応により金属銀を生じさせる。
好ましくは、第一の標識物質は金属コロイドである。
好ましくは、不溶性担体に含まれる金属コロイドの粒子数は１×１０5個以上１×１０8個以下である。
好ましくは、金属コロイドは金、銀、または白金を含む。
【００１８】
好ましくは、第一の標識物質が酵素であり、かつ増幅反応が酵素反応である。
好ましくは、第二の標識物質が着色粒子である。
好ましくは、第二の標識物質が着色ラテックスである。
【００１９】
好ましくは、第一の標識物質は測定時の標識物質の平均粒子サイズが1μｍ以上20μｍ以下のサイズのイムノクロマト方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のクロマトグラフ方法によれば、検体の測定可能レンジが従来の２桁程度広げることが可能になり、低濃度域から高濃度域までの測定が可能となる。また、標識物を低減させた増幅用の標識物質の系にて発生する超高濃度域のプロゾーン現象に対しても、第二の標識物を添加することで偽陰性を発生させることなく検出可能となる。
【００２１】
さらに、増幅システムを用いた際の判定時間が固定されているのに対して、目視で判定できる領域の高濃度試料の際には、増幅を伴わない標識物質による判定が可能となり、短時間の判定を可能とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明で用いることができるイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。１はバック粘着シート、２は標識抗体保持パッド、３は抗体固定化メンブレン、３ａは捕捉部位、３１は検出部、３２はコントロール部、４は吸収パッド（吸液部）、５は試料添加パッド（滴下部）を示す。
【図２】本発明で用いることができるイムノクロマトグラフキットに洗浄用パットをつけた状態で上から見た模式的な平面図である。２は標識抗体保持パッド、３は抗体固定化メンブレン、３１は検出部、３２はコントロール部、４は吸収パッド、５は試料添加パッド、６は洗浄液添加用パット、７は洗浄液吸水用パットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を実施するための形態としては、被検物質と、被検物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質を混合させた状態で不溶性担体上において展開し、該被検物質に対する第二の結合物質、または被検物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被検物質と該標識物質を捕捉して該被検物質を検出するイムノクロマトグラフ方法であって、増幅反応を発生させる第一の標識物質と増幅反応に実質的に影響を与えない第二の標識物質少なくとも2種類の標識物質を有するイムノクロマト方法を用いることで実施できる。
【００２４】
実施に当たっては、（ａ）第一の標識物質として銀イオンと銀イオンの為の還元剤と反応して金属銀を生じる性質を有する物質、及び（ｂ）第二の標識物質として銀イオンと銀イオンのための還元剤とは反応性を有さない、または非常に低い反応性しか有しない性質を持つ物質の異なる少なくとも２種の標識物質を使用することが好ましい。
【００２５】
本発明で用いる、銀イオンと、銀イオンの為の還元剤により金属銀を生じさせる標識としては、金、銀、または白金を含む金属コロイドを用いることができる。また、本発明の実施にあたっては第一の標識物質として１テストストリップ中に含まれる金属コロイドの粒子数が１×１０5個以上１×１０8個以下にすることが好ましい。
【００２６】
銀イオンと銀イオンのための還元剤とは反応性を有さない第二の標識物質としては、金属コロイドではない着色粒子を用いることができる。着色粒子は、特に限定されないが着色ラテックスが好ましい。
【００２７】
本発明の増幅反応では、検査開始前と、検査終了時の標識のサイズが異なっていても構わない。例えば第一の標識物質として金属コロイドを用い、銀イオンと、銀イオンの為の還元剤により金属銀を生じさせる場合には、増幅前のコロイド粒子のサイズは一般的に0.01μｍ以上0.10μｍ以下程度であるのに対し、検査終了時の増幅後の標識物質の平均粒子サイズは1μｍ以上20μｍ以下であることが好ましい。
【００２８】
１．クロマトグラフ
一般に、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された標識物質が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と標識物質とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と標識物質の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に標識物質が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００２９】
本発明におけるクロマトグラフ方法を行うキットや装置は、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と標識物質の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。
【００３０】
２．被検試料
本発明のクロマトグラフ方法で分析することのできる被検試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
【００３１】
３．被検試料の前処理
本発明のクロマトグラフ方法では、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００３２】
４．構成
本発明のクロマトグラフ方法において使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図１は、本発明のクロマトグラフ用ストリップの一例の断面図を模式的に示す。
【００３３】
図１を用いて説明をする。本発明のクロマトグラフ用ストリップは、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド５、標識化物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）２、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シート１上に配置されている。
【００３４】
前記クロマトグラフ担体３は、捕捉部位３ａを有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾーン（検出部と記載することもある）３１を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール部と記載することもある）３２を更に有する。
【００３５】
前記標識化物質保持パッド２は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
【００３６】
前記試料添加パッド５としては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。
【００３７】
４−１．標識物質
本発明では、標識物質を少なくとも２種用いることが特徴である。第一の標識物質は、増幅反応を発生させることができる標識物である。例えば、酵素とその基質（色素増幅液）により連続的に色素を形成するように酵素標識を行ったり、銀イオンの存在下において還元反応によって銀粒子を形成するように金属コロイド粒子標識を行ったりできる。
【００３８】
一方、第二の標識物質は、増幅反応に実質的に影響を与えない物質である。例えば免疫凝集反応や免疫染色に用いられている着色粒子を使用することができる。具体的には高分子ポリマー微粒子である着色ラテックス粒子、色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等を用いることができる。これらは直接に可視領域にて強いシグナルを持ち、上述した増幅反応には実質的に大きな影響を与えないものが望ましく、いずれもイムノクロマト方法において被検物質に対して特異的な免疫反応を生成する成分、特に抗体などと結合させて用いられる。
【００３９】
特に望ましい標識物質としては0.2〜0.5μｍ程度の粒径を持つポリスチレン製の着色ラテックス粒子である。また、第一の標識物質として酵素標識を用いた場合は、第二の標識物質として金属コロイド粒子標識も用いることができる。
【００４０】
本発明によれば、標識物質として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマー粒子標識を用いるイムノクロマトグラフ方法において、前記金属の標識を増幅させることができる。
【００４１】
具体的には、前記分析対象物と標識物質の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物の分析を高感度に実施することができる。
【００４２】
従って、本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された標識を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ方法をそのまま適用することができる。
【００４３】
本発明のクロマトグラフ方法では、分析対象物（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。
【００４４】
前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のクロマトグラフ方法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができる。また、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。
【００４５】
４−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被検物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被検物質（抗原）に対する抗体、該被検物質（抗体）に対する抗原、該被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被検物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。
【００４６】
本発明では、多孔性担体は、（ａ）被検物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）第一の結合物質への結合性を有する物質を有している。 該被検物質に対する第二の結合物質とは、例えば該被検物質（抗原）に対する抗体、該被検物質（抗体）に対する抗原、該被検物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被検物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。被検物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被検物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被検物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。
【００４７】
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／または第二の結合物質が抗体である。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
【００４８】
４−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
【００４９】
通常、クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾーンを作製する。検出用物質は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００５０】
４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
【００５１】
４−５．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した標識物質を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００５２】
４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
【００５３】
５．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法について説明する。
【００５４】
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被検物質の分析を実施することができる。まず、被検物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第2抗体を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、被検物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被検物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被検試料中に被検物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被検物質（抗原）と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００５５】
サンドイッチ法では、固定化第2抗体と被検物質（抗原）と第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、第一の不溶性担体における固定化第2抗体を固定した領域について第一の光学濃度測定を行うことによって標識物を定量し、被検試料中の被検物質の量を測定することができる。次いで、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標
識からの信号を増幅した後に、第二の光学濃度測定を行うことによって、増幅後の標識物質を定量し、被検試料中の被検物質の量を測定することができる。
【００５６】
６．洗浄
本発明では、捕捉した少なくとも1種の標識物質を測定するための工程と、それとは異なる標識物質を測定する為の工程がある。それらの工程間に、標識を増幅させることを行うことができるが、その場合はそれらの工程間に、洗浄液を展開させることにより洗浄を行うことができる。
【００５７】
（洗浄液）
前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去するための洗浄液は、洗浄の機能があればどんなものでもよい。
【００５８】
洗浄液は特異的な結合反応以外でクロマトグラフ担体内に残存している、つまり非特異的に残存している標識物質を洗浄するための液体であれば特に限定されるものではなく、単なる水やエタノールなどの溶剤単独でも良いし、例えば１％BSA入りのPBSバッファーや界面活性剤等の溶液等を用いることができる。また、洗浄液として、後述する銀イオンを含む液体、銀イオンの還元剤を含む液体を用いることもできる。なお、洗浄液は展開途中に非特異的に残存した標識物質を洗浄しながら展開するので標識物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識物質を含んでいない液を用いる。なお、洗浄効果を上げる為にそのpHを調整したり、界面活性剤成分やBSAなどのタンパク質、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物を加えたりした洗浄液を用いてもよい。
【００５９】
（洗浄液の展開、その方向）
洗浄液は、検体液を展開した後に、クロマトグラフ用ストリップに添加しクロマトグラフ用ストリップに残存する抗原抗体反応で結合した以外の標識物を洗浄する。洗浄液の送液方法としては、検体液を展開した後にそのまま試料滴下部に添加する方法や、予めストリップに洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットを付着させておき、その洗浄液添加パットに添加し吸水パット方向へ送液する方法、予めストリップに洗浄液の添加部位を備えておき、検体液の展開後にその洗浄液の添加部位に洗浄液を添加する方法、などがあるが、より好ましくは、検体液をストリップに展開した後に洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットをストリップに付着させ、洗浄液添加パットに洗浄液を供給し、洗浄液を展開させる方法である。洗浄液添加パットに洗浄液を供給する方法としては、洗浄液の入ったポットに洗浄液添加パットを挿入してもいいし、洗浄液添加パットに洗浄液を滴下しても良い。
【００６０】
本明細書中では、該被検物質の液の展開方向とは、試料添加パッドと吸収パッドとを結ぶ方向と定義し、洗浄液の展開方向とは、洗浄液送液の為の洗浄液添加パットと吸水パットとを結ぶ方向と定義する。
【００６１】
被検物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度の場合、洗浄
効果が大きくなる。さらに、該被検験物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角は、好ましくは60度から170度、さらに好ましくは60度から150度である。
【００６２】
洗浄液添加パット（第二の不溶性担体とも標記する）は、洗浄液を添加できればなんでもよく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。
吸水パットは、吸水することができる物質ならばなんでもよく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
【００６３】
７．増幅液
増幅溶液は、含まれる薬剤が標識物質や被検物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液である。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。
【００６４】
詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅溶液として用いることができる。
【００６５】
増幅液の具体例としては、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いることができる。以下、銀を含む化合物と銀イオンのための還元剤等について説明する。
【００６６】
（銀（イオン）を含む化合物）
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
【００６７】
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル／ｍ2〜0.2モル／ｍ2、好ましくは0.01モル／ｍ2〜0.05モル／ｍ2含有されることが好ましい。
【００６８】
（銀イオンのための還元剤）
銀イオンのための還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
【００６９】
なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。
【００７０】
還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
【００７１】
８．色素増幅液
色素増幅液は、「臨床検査  Vol.41  no.9  1020  H2O2-POD系を利用した染色」に記載されているような、西洋わさびペルオキシダーゼ検出の発色基質などを、好適に用いることができる。
【００７２】
９．検出溶液
検出溶液とは、含まれる薬剤が標識物質や被検物質などと反応し、変色、着色した化合物の生成、発光等の変化が生じる溶液を意味例えば、被検物質であるカルシウムイオンと錯体化することで呈色するオルソクレゾールフタレインコンプレキソンや、被検物質であるタンパク質と反応し変色する銅イオン溶液などが挙げられる。また、被検物質に対して特異的に結合する標識化された複合体の溶液もこれに含まれる。例えば、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡやＲＮＡを検出する標識化ＤＮＡや標識化ＲＮＡ、抗原を検出する抗体感作粒子や抗体標識化酵素などが挙げられる。
【００７３】
１０．その他の助剤
増幅溶液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈである。
【００７４】
１１．検出時の平均粒子サイズの算出方法
検出時（増幅後）、テストライン部を切り出し、試料裏面をカーボンペーストで試料台に取り付けた後、断面を切り、カーボン蒸着し、走査型電子顕微鏡にて、形状と大きさを観察する。例えば、日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ  Ｓ-5500で、加速電圧10ＫＶで反射電子による試料表面の観察をＳＥＭで行う事ができる。その後、シグナル粒子を100粒子選び、粒子の投影面積の円相当直径を測定し、平均値を算出し、検出時の平均粒子サイズとする。
【００７５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
（インフルエンザ抗原検出）
（標識成分の調製）
標識成分である0.3μm着色ラテックス（バングス・ラボラトリーズ社製：DC02B）および0.06μｍ金コロイド（ブリティッシュバイオセルインターナショナル社製：GC60）に、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Bios Pacific社製、クローンナンバー：A60010044P）を結合させた。結合の要領は、常法によった。
【００７７】
（標識抗体保持パッド２の調製）
抗インフルエンザA型モノクローナル抗体結合着色ラテックスおよび抗インフルエンザA型モノクローナル抗体結合金コロイドを任意のＯＤ濃度で含む調製液を、ガラス繊維パッドに塗布し、乾燥させ、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体標識成分塗布パッド（標識抗体保持パッド２）を調製した。
【００７８】
（検出部３１の調製）
抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Fitzgerald社製：クローンナンバー：M2110169）を、多孔質坦体である抗体固定化メンブレン３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））の所定位置に、テスト当たり０．５μｌでライン状に塗布し検出部３１を形成した。また、検出部３１の下流側に、抗マウス抗体を同様にテスト当たり０．５μｌで塗布し、反応確認のためのコントロール部３２を形成した。塗布後、自然乾燥させて固定化し、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体固相化メンブレン（検出部３１の配置された抗体固定化メンブレン３）を調製した。
【００７９】
（検出装置の作製）
試薬添加パッド（滴下部）５としての濾紙、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体標識成分塗布パッド２、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体固相化メンブレン３、吸収パッド（吸液部）４としての濾紙とを、それぞれの端部が約３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂（バック粘着シート１）上に貼付してインフルエンザA型の検出装置を作製した。
【００８０】
（反応性試験）
（増幅前判定）
５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓバッファーにインフルエンザウイルスＡ型抗原を溶解し、各濃度の試験用インフルエンザウイルスＡ型溶液を作製した。その１４０μlを滴下部５へ滴下し、１０分後までに検出部３１に現れる、標識成分由来のライン着色（金コロイド粒子由来色、着色ラテックス粒子由来色またはその混合色）を目視判定した。判定は、濃い着色がある「＋＋」、着色がある「＋」、薄い着色がある「＋ｗ」、着色が無い「−」、で判別した。また、抗原溶液滴下後にライン発色が認められる場合、その着色強度が＋ｗとなった時間を、判定可能時間として計測した。
【００８１】
（増幅後判定）
（銀増幅液の作製）
（増幅液A-1の作製）
水325gに、硝酸鉄（III）九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作製した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸（和光純薬、038-06925）10.5g、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  0.44gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%,）を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
【００８２】
（増幅液A-2の作製）
硝酸銀溶液10ｍＬ（10ｇの硝酸銀を含む）に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2（10重量%硝酸銀水溶液）を作製した。
【００８３】
（増幅液Ａの作製）
増幅液A-1 40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Ａとした。
【００８４】
（洗浄液の作製）
PBSバッファー（和光純薬）に１重量％のBSA（シグマ社）を溶解した１％BSA入りPBSバッファーを洗浄液とした。
【００８５】
（評価）
（洗浄）
滴下10分後、検出部３１にて判定した試験用イムノクロマトグラフキットのメンブレンに対して、洗浄液展開の上流端となる端に洗浄液添加用パット６（12 mm×10mmに切ったガラス繊維ろ紙（ＧＥヘルスケア社製 (GF/F））、下流端となる端に洗浄液吸水用パット７（12 mm×15mmに切ったガラス繊維ろ紙（ＧＥヘルスケア社製（GF/F）））をそれぞれ12ｍｍ端側がメンブレンの洗浄液上流、下流側になるように約２ｍｍ重なるように押し当てた。洗浄液展開方向と被検物質の展開方向とのなす角は90度となるようにした。洗浄液150μＬを毛細管現象により展開させ３分間洗浄した。
【００８６】
本実験において、洗浄時の洗浄液入れ物の形状に依存する液面の高さ、及びイムノクロマトグラフキットの試料添加パッドの形状・材質、実験環境（温度、湿度）、吸収パットの材質・厚み、吸収パットとニトロセルロースメンブレンとの接合、などは洗浄液の吸水スピード・量を変化させる要因であり、実験において、一定に保つことが必要である。この洗浄液の吸水スピード・量は、最終的な洗浄の効果（金微粒子の残存量の減少）を左右する要因である。今回の実験は、気温22±3℃、湿度50±15%にて行った。
【００８７】
（増幅液によるシグナル増幅）
洗浄に続いて増幅液A100μLをメンブレンの検出ゾーン、コントロールゾーンが満たされるように添加して１分間増幅反応を行った。
【００８８】
増幅反応終了後、メンブレンを取り出し、１分間よく水洗を行った。このとき検出部３１の着色度合いを目視判定した。判定は、濃い着色がある「＋＋」、着色がある「＋」、薄い着色がある「＋ｗ」、着色が無い「−」、で判別した。
【００８９】
（実施例１、比較例１〜４）
上記作製法により着色ラテックスの量と、金コロイドの量を変化させたキットを作製し評価した（表１）。実施例１では、抗インフルエンザA型モノクローナル抗体標識成分を波長520nmの吸光度にてOD=0.050（目視キットにおける通常濃度の1/30量、1キットあたり４×１０7の金コロイド量に相当）及び抗インフルエンザA型モノクローナル抗体結合着色ラテックスを波長850nmの吸光度にてOD=0.4の相当量を用いて作製した。これに対して比較例１〜３では、着色ラテックスなしで金コロイド量を波長520nmにおいてOD=1.5（目視キットにおける通常濃度、１キットあたり1.3×109の金コロイド量に相当）、0.15、0.050として試作した。また、比較例４では、金コロイドなしで着色ラテックスのみを波長850nmの吸光度にてOD=0.4の相当量を用いて試作した。
【００９０】
（結果）
表１に示した結果から、銀増幅後における偽陽性発生（抗原ゼロ濃度におけるライン着色）を抑制するために金コロイド量を減らすと銀増幅前の感度は著しく低下するが（比較例１、２、３）、銀増幅活性の低い標識粒子（比較例４）を混合することによって、銀増幅前の感度低下を補うことができた（実施例１）。また、表２に示した結果より、銀増幅反応を待たずにライン判定が可能な抗原濃度範囲が生じ、より短時間での判定が可能となる。なお、Ｎ．Ｔ．とは実験を行わなかった事を示す。
【００９１】
【表１】
2011117906.tif 000002
【００９２】
【表２】
2011117906.tif 000003
【００９３】
（実施例２）
（ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）抗原検出）
（標識成分の調製）
標識成分である0.3μm着色ラテックス（バングス・ラボラトリーズ社製：DC02B）および0.06μｍ金コロイド（ブリティッシュバイオセルインターナショナル社製：GC60）に、抗hCGモノクローナル抗体（特異性Intact-ｈCG）を結合させた。結合の要領は、常法によった。
【００９４】
（標識部２の調製）
抗hCGモノクローナル抗体結合着色ラテックスおよび抗hCGモノクローナル抗体結合金コロイドを任意のＯＤ濃度で含む調製液を、ガラス繊維パッドに塗布し、乾燥させ、抗hCGモノクローナル抗体標識成分塗布パッド２（標識部２）を調製した。
【００９５】
（検出部３１の調製）
抗hCGモノクローナル抗体（特異性β-ｈCG）を、多孔質坦体であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））の所定位置に、テスト当たり０．５μｌでライン状に塗布し検出部３１を形成した。また、検出部３１の下流側に、抗マウス抗体を同様にテスト当たり０．５μｌで塗布し、反応確認のためのコントロール部３２を形成した。塗布後、自然乾燥させて固定化し、抗hCGモノクローナル抗体固相化メンブレン３（検出部３１の配置された多孔質担体）を調製した。
【００９６】
（検出装置の作製）
滴下部５としての濾紙、抗hCGモノクローナル抗体標識成分塗布パッド２、抗hCGモノクローナル抗体固相化メンブレン３、吸液部４としての濾紙とを、それぞれの端部が約３ｍｍずつ重なるように、粘着剤付の樹脂上に貼付してｈＣＧ抗原の検出装置を作製した。
【００９７】
（反応性試験）
（増幅前判定）
０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにｈＣＧを溶解し、各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を作製した。その１４０μlを滴下部５へ滴下し、１０分後までに検出部３１に現れる、標識成分由来のライン着色（金コロイド粒子由来色、着色ラテックス粒子由来色またはその混合色）を目視判定した。判定は、濃い着色がある「＋＋」、着色がある「＋」、薄い着色がある「＋ｗ」、着色が無い「−」、で判別した。また、抗原溶液滴下後にライン発色が認められる場合、その着色強度が＋ｗとなった時間を、判定可能時間として計測した。
【００９８】
（増幅後判定）
（銀増幅液の作製）
（増幅液A-1の作製）
水325gに、硝酸鉄（III）九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作製した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸（和光純薬、038-06925）10.5g、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  0.44gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%,）を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
【００９９】
（増幅液A-2の作製）
硝酸銀溶液10ｍＬ（10ｇの硝酸銀を含む）に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2（10重量%硝酸銀水溶液）を作製した。
【０１００】
（増幅液Ａの作製）
増幅液A-1 40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Ａとした。
【０１０１】
（評価）
（洗浄）
滴下10分後、検出部３１にて判定した試験用イムノクロマトグラフキットのメンブレンに対して、洗浄液展開の上流端となる端に洗浄液添加用パット６（12 mm×10mmに切ったガラス繊維ろ紙（ＧＥヘルスケア社製（GF/F））、下流端となる端に洗浄液吸水用パット７（12 mm×15mmに切ったガラス繊維ろ紙（ＧＥヘルスケア社製（GF/F）））をそれぞれ12ｍｍ端側がメンブレンの洗浄液上流、下流側になるように約２ｍｍ重なるように押し当てた。洗浄液展開方向と被検物質の展開方向とのなす角は90度となるようにした。洗浄液150μＬを毛細管現象により展開させ３分間洗浄した。
【０１０２】
本実験において、洗浄時の洗浄液入れ物の形状に依存する液面の高さ、及びイムノクロマトグラフキットの試料添加パッドの形状・材質、実験環境（温度、湿度）、吸収パットの材質・厚み、吸収パットとニトロセルロースメンブレンとの接合、などは洗浄液の吸水スピード・量を変化させる要因であり、実験において、一定に保つことが必要である。この洗浄液の吸水スピード・量は、最終的な洗浄の効果（金微粒子の残存量の減少）を左右する要因である。今回の実験は、気温22±3℃、湿度50±15%にて行った。
【０１０３】
（増幅液によるシグナル増幅）
洗浄に続いて増幅液A100μLをメンブレンの検出ゾーン、コントロールゾーンが満たされるように添加して１分間増幅反応を行った。
【０１０４】
増幅反応終了後、メンブレンを取り出し、１分間よく水洗を行った。このとき検出部３１の着色度合いを目視判定した。判定は、濃い着色がある「＋＋」、着色がある「＋」、薄い着色がある「＋ｗ」、着色が無い「−」、で判別した。
【０１０５】
（実施例２、比較例５〜９）
上記作製法により着色ラテックスの量と、金コロイドの量を変化させたキットを作製し評価した（表３）。実施例２では、抗hCGモノクローナル抗体標識成分を波長520nmの吸光度にてOD=0.010（目視キットにおける通常濃度の1/250量、１キットあたり1.0×107の金コロイド量に相当）及び抗ｈCGモノクローナル抗体結合着色ラテックスを波長850nmの吸光度にてOD=0.7の相当量を用いて作製した。比較例５〜８では、着色ラテックスなしで金コロイド量を波長520nmにおいてOD=2.5（目視キットにおける通常濃度、１キットあたり2.5×109の金コロイド量に相当）、0.25、0.125、0.010として試作した。また、比較例９では、金コロイドなしで着色ラテックスのみを波長850nmの吸光度にてOD=0.7の相当量を用いて試作した。
【０１０６】
（結果）
表３に示した結果から、銀増幅後における偽陽性発生（抗原ゼロ濃度におけるライン着色）を抑制するために金コロイド量を減らすと銀増幅前の感度は著しく低下した（比較例５、６、７、８）。また、高濃度抗原検体においてプロゾーン現象発生する（比較例８）が、銀増幅活性の低い標識粒子（比較例９）を混合することによって、銀増幅前の感度低下を補うことができ、またプロゾーン現象も回避できた（実施例２）。さらに、表４に示した結果より、銀増幅反応を待たずにライン判定が可能な抗原濃度範囲が生じ、より短時間での判定が可能となる。
【０１０７】
【表３】
2011117906.tif 000004
【０１０８】
【表４】
2011117906.tif 000005
【図１】
2011117906.tif 000006
【図２】
2011117906.tif 000007