(57)【要約】【課題】  遺伝子組み換え技術によって、目的とするタンパク質遺伝子を効率よくクローニングできるように最適化したマルチクローニングサイトを含む発現ベクターであって、該発現ベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターを動物細胞に導入し、組換えタンパク質の高い生産性を示す細胞を効率よく樹立するための発現ベクターに関する。【解決手段】  目的タンパク質、特に抗体遺伝子に出現頻度の低い制限酵素認識配列を含むマルチクローニングサイト、ｍＲＮＡ不安定化配列を有する薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、及び少なくとも１つの遺伝子発現安定化配列を有する発現ベクター。【選択図】  図５５
2011019509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列、
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の群より選択される１以上の制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト。
（ｉ) ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の群からそれぞれ１以上選択される制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト
（ｉｉ）ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ
（ｉｉｉ） ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ
【請求項３】
遺伝子発現安定化配列が、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
遺伝子発現安定化配列が以下のいずれかである、請求項１または２に記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列
（ＩＩ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列から、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列
【請求項５】
遺伝子発現安定化配列を２つ以上含む、請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項６】
薬剤選択マーカー遺伝子が、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、請求項１〜５のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項７】
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が挿入された、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１０】
目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
宿主細胞を、請求項１〜１０のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換して得られる形質転換細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が動物細胞である、請求項１１に記載の形質転換細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が哺乳類動物細胞である、請求項１２に記載の形質転換細胞、
【請求項１４】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、請求項１３に記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（Ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子を挿入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を（Ｉ）で作製した発現ベクターで形質転換する工程
（ＩＩＩ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ＩＶ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換え技術によって、目的とするタンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターを動物細胞、特に哺乳類動物細胞に導入し、組換えタンパク質を高発現する細胞を効率よく樹立するための発現ベクター、及び形質転換された高生産性細胞に関する。本発明の発現ベクターは、遺伝子工学的手法により、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核生物、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属など）および哺乳類細胞を含む真核細胞の両者が用いられている。これらの中で、動物細胞、特に哺乳類細胞における発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳類動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与し、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞発現システムを利用した方が、研究用及び治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。
【０００３】
組換えタンパク質を産生する細胞を樹立する方法としては、一般に、目的タンパク質遺伝子を発現する遺伝子構築物を宿主細胞へ遺伝子導入し、目的タンパク質を発現する遺伝子構築物が宿主細胞のゲノム上に安定導入された細胞を選別する。この際、前記遺伝子構築物に薬剤選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を目的タンパク質と同一プロモーター下あるいは別個のプロモーター下で発現するように挿入しておき、薬剤選択によって生存する細胞を目的遺伝子が安定導入された細胞として選別する。しかしながら、組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は、通常不可能である。従って、遺伝子導入しても大半の細胞は組換えタンパク質を発現していないか、発現量が低く、目的タンパク質の高い生産性を示す細胞のスクリーニングに膨大な労力を要する。
【０００４】
従来、高生産性を示す細胞を取得するため、数ヶ月〜1年の期間を要していた。１０００〜数千の細胞サンプルから１〜２個の細胞株を選別する作業を繰り返し行う必要があり、膨大な労力と時間を費やす必要があった。
【０００５】
そこで、比較的高いレベルで目的タンパク質を発現する形質転換細胞を効率よく選別するため、薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する手法が開発されてきた。
【０００６】
１つの方法としては、薬剤選択マーカーの発現に用いるプロモーターとして、転写活性の弱いプロモーターであるＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターを利用した手法（非特許文献１）や、野生型の転写活性レベルよりも減弱された変異型プロモーターを用いて薬剤選択マーカーの発現を抑える手法（特許文献１、２）が挙げられる。しかしながら、いずれの方法も薬剤選択マーカーの発現を減弱するという面で効果がほとんど見られなかった。このことから、本技術を用いて比較的高いレベルで目的タンパク質を発現する細胞株を効率よく選別するということは難しい。
【０００７】
別の方法としては、薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列に変異を導入して薬剤選択マーカーの機能を弱める手法で、主にネオマイシンホスホトランスフェラーゼを対象に実施されている（特許文献３、４）。本方法を用いることにより薬剤選択マーカーの機能を多少減弱させることができ、薬剤選択の結果として少量の発現量の向上した細胞株を取得することができる。しかしながら、高レベルの生産性を示す細胞株を選別する点での効率は良くなく、本方法による顕著な効果は見られなかった。
【０００８】
高生産性細胞の樹立には細胞選択技術の改良の他に、目的遺伝子の発現を安定的に維持するため、宿主細胞ゲノム上の目的遺伝子導入部位の周囲のゲノム環境からの影響を排除する工夫が必要である。組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は通常、不可能である。従って、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも培養を継続していくうちに次第に発現が低下してしまうこともある。このような位置効果を克服するため、導入遺伝子への隣接する染色体や調節エレメントの影響を緩和する染色体エレメント（シス作用性ＤＮＡエレメント）が組換えタンパク質の製造に利用されつつある。このような機能を持った核酸配列の１つがインスレーターと呼ばれる配列で、ニワトリのβ−グロビンＬＣＲの１．２ｋｂ長のＤＮａｓｅＩ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ部位（ｃＨＳ４）などがよく機能解析され、組換えタンパク質の発現に利用されているが（非特許文献２）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現の増加はそれほど大きなものではないとされている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ５，６２７，０３３
【特許文献２】ＷＯ２００５／０２４０１５
【特許文献３】ＷＯ２００１／０３２９０１
【特許文献４】ＷＯ２００４／０５０８８４
【特許文献５】特開２００１−３７４７８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎｉｗａ  Ｈ、Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ．（１９９１）  Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００
【非特許文献２】Ｐｉｋａａｒｔ  ＭＪ，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ  Ｆ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：２８５２−６２
【非特許文献３】Ｉｚｕｍｉ  Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＭ．（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７６：２８０−２８９
【非特許文献４】Ｂａｋｈｅｅｔ  Ｔ，Ｆｒｅｖｅｌ  Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｂ．Ｒ．Ｇ、  Ｇｒｅｅｒ  Ｗ，Ｋｈａｂａｒ  Ｋ．Ｓ．Ａ．（２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：２４６−２５４
【非特許文献５】Ｌａｇｎａｄｏ  Ｃ．Ａ，Ｂｒｏｗｎ  Ｃ．Ｌ，Ｇｏｏｄａｌｌ  Ｇ．Ｊ．（１９９４）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：７９８４−７９９５
【非特許文献６】Ｚｕｂｉａｇａ  Ａ．Ｍ，Ｂｅｌａｓｃｏ  Ｊ．Ｇ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｅ．（１９９５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：２２１９−２２３０
【非特許文献７】Ｖｏｏｎ  Ｄ．Ｃ，Ｓｕｂｒａｔａ  Ｌ．Ｓ，Ｂａｌｔｉｃ  Ｓ，Ｌｅｕ  Ｍ．Ｐ，Ｗｈｉｔｅｗａｙ  Ｊ．Ｍ，Ｗｏｎｇ  Ａ，Ｋｎｉｇｈｔ  Ｓ．Ａ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｆ．Ｔ，Ｄａｌｙ  Ｊ．Ｍ．（２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：ｅ２７
【非特許文献８】Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡ（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ８：２９９−３０９
【非特許文献９】Ｇｏｎｚａｌｏ  Ｓ，Ｊａｃｏ  Ｉ，Ｆｒａｇａ  ＭＦ，Ｃｈｅｎ  Ｔ，Ｌｉ  Ｅ，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡ（２００６）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４１６−４２４
【非特許文献１０】Ｐｅｒｒｏｄ  Ｓ，Ｇａｓｓｅｒ  ＳＭ（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０：２３０３−２３１８
【非特許文献１１】Ｗａｋｉｍｏｔｏ  ＢＴ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９３：３２１−３２４
【非特許文献１２】Ｂａｏ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｃｕｉ  Ｙ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，Ｄ８３−Ｄ８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において、組換えタンパク質の生産性の高い細胞を迅速、かつ効率よく樹立するのに効果的な発現ベクター、及び高生産性細胞を提供することにある。
【００１２】
発現ベクターには、多くの場合、目的タンパク質遺伝子を挿入するためにマルチクローニングサイトが備えられている。そして制限酵素を用いて、所望のタンパク質遺伝子をマルチクローニングサイト中に連結し、発現ベクターに挿入する。しかしながら、従来のマルチクローニングサイトに存在する制限酵素認識配列（切断部位）は、目的タンパク質遺伝子のコード配列中にも存在する場合が多く、その場合、目的タンパク質遺伝子を部分分解し、発現ベクターに挿入する必要があり、不便であった。それゆえ、マルチクローニングサイトには適切な制限酵素認識配列を選ぶ必要があったが、どの制限酵素を用いるかの条件設定に当たっては、極めて煩雑な過程を要していた。
【００１３】
すなわち、制限酵素を利用するに当たり、目的とするタンパク質遺伝子の配列に特有な制限酵素による切断部位の分布図（すなわち、制限酵素マップ）を作成する必要があり、そのための知識またはソフトウェアが必要であった。そのため、制限酵素マップの作成の必要がなく、目的タンパク質の遺伝子を有する発現ベクターを簡便かつ効率的に構築するためのマルチクローニングサイトを有するベクターが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するため、ｍＲＮＡ不安定化因子を導入した薬剤選択マーカー発現カセット、及び遺伝子発現安定化エレメントを発明した。ｍＲＮＡ不安定化因子を有する種々の薬剤選択マーカー発現カセットと遺伝子発現安定化エレメントを具備した導入遺伝子の発現ベクターを構築し、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞の遺伝子発現を詳しく解析したところ、目的タンパク質の高生産性細胞の割合が有意に上昇することを見出し、本発明を完成させるに到った。
【００１５】
本発明者らはさらに様々な組換えタンパク質、とりわけ抗体分子の発現ベクターを効率よく構築するためのマルチクローニングサイトを具備し、さらに薬剤選択マーカー発現カセット、遺伝子発現安定化配列等の各要素の機能を損なうことなく、目的タンパク質のクローニングを効率よく行うために各要素の配列を最適化した発現ベクターを見出し、本発明を完成させるに到った。
【００１６】
すなわち、本発明によれば、以下が提供される：
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列、
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の群より選択される１以上の制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト。
（ｉ) ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（若しくは、Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ、ともいう。），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（若しくは、ＲｓｒＩＩ、ともいう。），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（若しくは、ＳｎａＢＩ、ともいう。），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）の配列要素を有する発現ベクター。
（ａ）遺伝子発現安定化配列
（ｂ）薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列
（ｃ）以下の（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の群からそれぞれ１以上選択される制限酵素の認識配列からなるマルチクローニングサイト
（ｉｉ）ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ,ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ
（ｉｉｉ） ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩ
（３）遺伝子発現安定化配列が、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、（１）または（２）に記載の発現ベクター。
（４）遺伝子発現安定化配列が以下のいずれかである、（１）または（２）に記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列
（ＩＩ）配列番号２６の４１６０１〜４２７００番目の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列から、（ｉ)〜（ｉｉｉ)の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列
（５）遺伝子発現安定化配列を２つ以上含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の発現ベクター。
（６）薬剤選択マーカー遺伝子が、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の群より選択される少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である、（１）〜（５）のいずれかに記載の発現ベクター。
（７）薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、（６）に記載の発現ベクター。
（８）薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、（７）に記載の発現ベクター。
（９）マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が挿入された、（１）〜（８）のいずれかに記載の発現ベクター。
（１０）目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、（９）に記載の発現ベクター。
（１１）宿主細胞を、（１）〜（１０）のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換して得られる形質転換細胞。
（１２）宿主細胞が動物細胞である、（１１）に記載の形質転換細胞。
（１３）宿主細胞が哺乳類動物細胞である、（１２）に記載の形質転換細胞、
（１４）宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、（１３）に記載の形質転換細胞。
（１５）以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（Ｉ）（１）〜（８）のいずれかに記載の発現ベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子を挿入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を（Ｉ）で作製した発現ベクターで形質転換する工程
（ＩＩＩ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ＩＶ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の薬剤選択マーカーは、野生型に比べｍＲＮＡが不安定化されて薬剤選択マーカーの発現が減弱されるため、薬剤選択マーカー発現カセットが発現しやすいゲノム領域に組み込まれないと、薬剤存在下で生存が困難となる。このため、本発明において薬剤選択によって生き残った細胞では、この薬剤選択マーカーと隣接したゲノム上の部位に目的遺伝子の発現カセットを保持し、その結果として目的遺伝子を効率よく発現するものが多く、高発現株の取得を容易にすることができる。
【００１８】
また本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、細胞ゲノムにおける組換えタンパク質遺伝子に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて組換えタンパク質遺伝子の遺伝子発現を安定化し、高発現を長期間維持することができる。そこで、本発明の弱化された薬剤選択マーカー発現カセットと遺伝子発現安定化エレメントを併用することにより、その相乗効果によって、薬剤選択によって選択された細胞において目的遺伝子を非常に高度に発現する細胞を濃縮し、かつそれらの高発現細胞における発現の安定的な維持ができる。本発明により、それら非常に高いレベルのタンパク質生産性を示す高生産細胞株を迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。
【００１９】
さらに、本発明のマルチクローニングサイトには、目的タンパク質遺伝子、特に抗体遺伝子の中で出現頻度の低い制限酵素認識配列を選択することによって、抗体遺伝子などの目的タンパク質のクローニングを効率よく行うことができる。さらに、薬剤選択マーカー遺伝子内や遺伝子発現安定化エレメント内の前記制限酵素認識配列を変異導入によって破壊することによって、各要素の機能を維持したままに特に抗体遺伝子における高効率クローニングベクター（発現ベクター）が構築された。
【００２０】
すなわち、本発明の発現ベクターにおける、マルチクローニングサイトに含まれる制限酵素認識部位を認識する制限酵素を用いることにより、目的タンパク質とりわけ抗体分子を、そのコード配列を切断することなくクローニングすることができる。更に薬剤選択マーカー遺伝子や遺伝子発現安定化エレメントの内部切断による機能低下を生じさせることもない。したがって、目的タンパク質、とりわけ抗体分子の制限酵素マップに関する知識や作成を必要とすることなく、簡便かつ効率的に目的タンパク質遺伝子を有する発現ベクターを構築することができ、高生産細胞株の樹立の迅速化、容易化、効率性向上により一層の効果を示すものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２の構築を示す図である。
【図２】ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築を示す図である。以下、図中、Ｐｕｒとは、ピューロマイシン耐性遺伝子のことである。また、図中、ｉＰＣＲとは、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲのことである。
【図３】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ，ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図４】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図５】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図６】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団を薬剤選択した際の明視野像である。
【図７】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒのコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。
【図８】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４のコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。
【図９】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｎｅｏとは、ネオマイシン耐性遺伝子のことである。
【図１０】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築を示す図である。
【図１１】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１２】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図１３】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｈｙｇとは、ハイグロマイシン耐性遺伝子のことである。
【図１４】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１５】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１６】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図１７】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１８】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１９】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図２０】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の構築を示す図である。
【図２１】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図２２】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図２３】配列番号２６の配列とＣＴＣＦの結合配列の予測部位を示す図である。
【図２４】核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍの構築を示す図である。
【図２５】配列番号２６の配列、ＣＴＣＦＢＳ、被験配列の核酸断片の位置関係を示す図である。
【図２６】各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析して得られたＳＮＡＰｍ発現強度と細胞数の分布を示すグラフである。
【図２７】各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析によって、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。
【図２８】ＣＨＯ５のデリーションコンストラクト構築と配列番号２６の当該被験配列の位置関係を示す図である。
【図２９】ＣＨＯ５、及びＣＨＯ５デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。
【図３０】ＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクト構築のためのＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法に用いたプライマーの位置関係とデリーションによって得られた被験挿入配列を示す図である。
【図３１】ＣＨＯ５Δ３、及びＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。
【図３２】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図３３】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図３４】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３５】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図３６】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図３７】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３８】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図３９】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図４０】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図４１】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図４２】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図４３】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図４４】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図４５】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図４６】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図４７】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図４８】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図４９】遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図５０】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、および、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、および、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。
【図５１】遺伝子安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を付加し、高い抗体生産性が認められたもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、９６ウェルプレートにおける２週間培養での抗体生産性の度数分布をプロットしたグラフである。
【図５２】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図５３】２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図５４】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。
【図５５】ｐＥＨＸのベクターマップを示す図である。
【図５６】ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）の構築を示す図である。
【図５７】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図５８】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図５９】ｐＥＬＸのベクターマップを示す図である。
【図６０】ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図６１】制限酵素認識配列を未削除の遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ）、遺伝子発現安定化配列から４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ−ΔＲＥ）、について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図６２】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。制限酵素認識配列を未削除の遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ）、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ−ΔＲＥ）、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２３】
タンパク質の機能解析や有用タンパク質の生産のために、遺伝子組み換え技術を用いて、細胞、特に動物細胞に目的とするタンパク質の遺伝子を導入し、組換えタンパク質として発現させる方法が広く用いられている。具体的には、プラスミドベクターに代表されるベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入し、細胞にベクターを取り込ませた後、組換えにより目的タンパク質遺伝子を細胞ゲノムに組み込み、細胞を形質転換させる方法がよく用いられている。
【００２４】
細胞のゲノムは染色体上に存在するが、染色体はヒストンのアセチル化や高度な凝集（ヘテロクロマチン）等により遺伝子の発現が制御されており、挿入される染色体の場所によって遺伝子の発現量は大きく異なる。ベクターを用いて細胞を形質転換する方法においては、細胞ゲノムのどの場所に目的タンパク質遺伝子が導入されるかを制御することはできず、そのため細胞の目的タンパク質の発現量ないし生産量は細胞によって大きく異なることになる。
【００２５】
また、遺伝子組み換えがうまくいかず、目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれていない細胞も多く存在する。
【００２６】
そこで、従前、予め発現ベクターに薬剤耐性遺伝子を挿入しておき、細胞に前記ベクターを遺伝子導入した後、培地中に薬剤を投与して（薬剤選択）、形質転換が成功した細胞を選択する。その後、生じた細胞群から高い発現を示す細胞株を繰り返し選別する作業が行われてきた。しかしながら、多数の細胞を用意する必要があり、また長期間の培養を必要とする動物細胞の選別作業を繰り返し行うため、多大の労力と時間を要してきた。加えて、薬剤耐性遺伝子は多くの場合、少量の発現でも薬剤に対する耐性を示すため、生存した細胞であっても発現量が大きく異なる細胞が混在しており、更に労力と時間に拍車をかけてきた。
【００２７】
しかしながら、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも、培養を継続していくうちに次第に発現が低下するものが少なからず見られる。これは、遺伝子サイレンシングにより発現が抑制されるためであると考えられる。目的とするタンパク質遺伝子のゲノム導入位置の制御が通常不可能であるため、遺伝子サイレンシングの効果による発現量低下を予測することは極めて困難である。そこで、このような位置効果を緩和し、発現を高レベルで安定的に維持する技術が必要とされてきた。
【００２８】
そこで、本発明はこれらの問題を解決するため、薬剤選択を利用して高発現を示す細胞を取得できるようにし、かつ遺伝子発現安定化エレメントによって、遺伝子の導入部位に左右されることなく高い発現のレベルを維持できるようにするものであり、迅速・簡便かつ効率的に目的タンパク質生産性の高い細胞株を取得できる点で極めて顕著な効果を有するものである。
【００２９】
また、本発明による遺伝子発現安定化配列は、目的タンパク質の発現の安定的維持のみならず、薬剤耐性遺伝子に効果を示す場合には、薬剤耐性遺伝子の発現に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させ、薬剤耐性遺伝子本来の機能を発揮する助けとなり、薬剤選択との相乗効果を示すものともなる。
【００３０】
そこで、本発明は、遺伝発現安定化配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列、並びに、特に抗体遺伝子の中で出現頻度の低い制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを有するベクターを提供する。更には、薬剤選択マーカー遺伝子やｍＲＮＡ不安定化配列、及び遺伝子発現安定化配列の機能を維持したまま、それらの内部にあるマルチクローニングサイトを構成する制限酵素認識配列を変異導入により破壊した発現ベクターを提供する。加えて、前記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び前記形質転換細胞を培養して目的とするタンパク質、特に抗体を生産する方法を提供するものである。
【００３１】
（薬剤選択マーカー遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列）
本発明らは、ｍＲＮＡ不安定化配列が極めて効果的に薬剤耐性遺伝子を弱化可能であることを見出した。本発明のｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー発現カセットを搭載した発現ベクターを哺乳類細胞へ遺伝子導入した場合、ｍＲＮＡ不安定化配列を含まない発現ベクターを遺伝子導入した場合にくらべ、薬剤選択後の生存細胞数、あるいはそのコロニーは１／１０〜１／１００に減少する。これはｍＲＮＡ不安定因子により薬剤選択マーカーのｍＲＮＡが不安定化し、薬剤選択マーカーの発現量が下がるため、宿主細胞のゲノム中で転写活性の高い領域に当該発現カセットが組み込まれた細胞でなければ薬剤選択下での生存が困難になるためと考えられる。
【００３２】
「ｍＲＮＡ不安定化配列」とは、ｍＲＮＡの細胞内半減期を低減させるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味する。また、「ｍＲＮＡ不安定化因子」とは、ｍＲＮＡ不安定化配列を含み、これに限らず該配列からの派生物や該配列に結合ないしは相互作用するものも含む、ｍＲＮＡを不安定化する機能を果たす概念を有する広範なものを表す。本発明を特定の作用様式に何ら限定するものではないが、該因子はｍＲＮＡを直接的又は間接的に標的化してこれを分解することが考えられる。
【００３３】
ｍＲＮＡ不安定化因子は、いくつかの遺伝子ではコード配列中、あるいは５’ＵＴＲ（非翻訳領域）に存在するものもあるが、多くは３’ＵＴＲに存在する。３’ＵＴＲに存在するｍＲＮＡ不安定化因子としては、ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）、ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍＲＮＡ  ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ、ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＲＥ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ｌｏｎｇ  ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐなどが知られている。その内ＡＲＥは、恒常的にｍＲＮＡを不安定化できることから、本発明に用いるｍＲＮＡ不安定化因子として好ましい。
【００３４】
ＡＲＥとは、ｍＲＮＡにおける「ＡＵが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を高い割合で含む配列もしくは領域を意味する。またＡＲＥとは、前記エレメントをコードするＤＮＡにおける「ＡＴが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を高い割合で含む配列もしくは領域を指すためにも用いられる。
【００３５】
ＡＲＥは、造血細胞増殖因子、成長因子、インターロイキン、インターフェロン等のサイトカイン、及びいくつかの癌原遺伝子（プロトオンコジーン）などに見られ（非特許文献４）、当該領域核酸配列をそのまま利用してもよいが、モチーフ配列として知られるＵＡＵＵＵＡＵ（非特許文献５）やＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（非特許文献６）などを利用する方が、不要な制限酵素認識配列を発現ベクターに挿入してしまうことを避けることができ、利便性が高い。
【００３６】
ＡＲＥを持つ遺伝子の例としては、造血細胞成長因子としてはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｉｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキンとしてはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−1β、２，３、４、６、８、１０、１１、インターフェロンの例としてはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、癌原遺伝子の例としてはｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，Ｐｉｍ−１などが例示される。このほかにもＴｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ２など多くの遺伝子がＡＲＥを持つことが知られており、例示された遺伝子に限定されない。
【００３７】
本発明の実施態様におけるｍＲＮＡ不安定化因子としては、下記のものが例示される。
【００３８】
ＡＵＵＵの１ないし２以上の繰り返し配列。
【００３９】
ＡＵＵＵＡの１ないし２以上の繰り返し配列。
【００４０】
ＵＡＵＵＵＡＵの１ないし２以上の繰り返し配列。
【００４１】
ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）の１ないし２以上の繰り返し配列。（Ｕ／Ａ）はＵまたはＡのいずれかである。
【００４２】
これらの配列は、１ないし数塩基の置換／挿入／欠失を含んでもよく、ＤＮＡの複製の誤りや突然変異などの自然変異によるもの、人為的な変異導入によるもの等が想定される。また、繰り返し配列間には１〜１００塩基程度のスペーサー配列またはリンカー配列を含んでもよい。加えて、モチーフ配列の逆位を含むものであってもよい。
【００４３】
これら配列の２回以上の繰り返し配列は、１単位の配列に比べ、ｍＲＮＡの不安定化効果が高いことが報告されている（非特許文献６、７）。本発明者らは、特に２回以上の繰り返し配列、より好ましくは４回以上の繰り返し配列を薬剤選択発現カセットに導入した場合において、その選択効率が顕著に増大することを見出した。
【００４４】
本発明における好ましい実施態様は、ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）の１ないし２以上の繰り返し配列であり、繰り返しの回数としては、好ましくは２以上、より好ましくは４以上である。上限は特に限定されないが、細胞へのベクターの取り込みの観点から、発現ベクターが最大１０ｋｂｐ〜２０ｋｂｐとなることが望ましい。ただし、繰り返し配列数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの不安定化の効果は飽和に向かい、一定の繰り返し数を超えるとそれ以上の顕著な効果を望めなくなる。上限値を定めるものではないが、１０以上の繰り返し配列は実用上意味がない。
【００４５】
本発明のｍＲＮＡ不安定化配列は、主として、薬剤選択マーカーコード配列とターミネーター配列の間に配置される。
【００４６】
本発明における薬剤選択マーカー遺伝子は薬剤選択マーカー発現カセットの形で実施される。発現カセットとは、プロモーターから遺伝子コード配列、ターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）までの遺伝子発現の単位をいう。加えて、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を含むこともある。したがって、「薬剤選択マーカー発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列であるものをいう。
【００４７】
本発明における薬剤選択に使用される薬剤としては、タンパク質合成阻害系抗生物質としてブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ；Ｈｙｇ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；Ｐｕｒ）が例示される。その他の選択用薬剤としてメトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ；ＭＴＸ）、ＭＳＸ (ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ)などが例示される。
【００４８】
本発明に使用される薬剤選択マーカーとして、薬剤選択に使用される薬剤に対する耐性を示す遺伝子が好適に用いられる。タンパク質合成阻害系抗生物質を薬剤として用いる場合には、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子を用いることが好ましい。特に限定されるものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子（ジェネティシン耐性遺伝子としての機能も有する）として、Ｔｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ハイグロマイシン‐Ｂ-ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ、実施例および図面ではＨｙｇと記載）、ピューロマイシン耐性遺伝子として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ、実施例および図面ではＰｕｒと記載）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ）などが例示される。本発明の薬剤選択マーカーの好ましい実施態様は、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼであり、より好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼであり、さらに好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。
【００４９】
本発明の薬剤選択マーカー発現カセットにおけるプロモーターとしては、動物細胞、特に哺乳類細胞で発現可能なプロモーターであれば特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒトヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーター、などのウイルスに由来するものや、マウスｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ−ｋｉｎａｓｅ１ 遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーターのハイブリッドが挙げられる。ここで、プロモーターは、プロモーターのコア領域に限るものではなく、エンハンサー領域を含む場合もある。薬剤選択マーカーの発現を減弱するため、転写活性が低いものがより好ましい。転写活性の低いプロモーターとして変異型のプロモーターなどを利用してもよいし、コザック配列を置換してもよい。さらに、ｍＲＮＡ不安定化因子の繰り返し配列の回数を少なくし、転写活性の弱いプロモーターと併用するのも１つの想定される実施態様である。
【００５０】
本発明で利用されるターミネーター配列としては、ＳＶ４０ウイルス由来ｌａｔｅ  ｐｏｌｙＡシグナル、ｅａｒｌｙ  ｐｏｌｙＡシグナル、ＨＳＶ−ｔｋ由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長因子遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナルなどが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００５１】
（遺伝子発現安定化配列）
本発明における「遺伝子発現安定化配列」とは、目的タンパク質の生産性を高めるために、目的遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。なお、「遺伝子発現安定化エレメント」ということもある。
【００５２】
遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列としては、インスレーター、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、遍在作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などが利用できる。
【００５３】
インスレーターとしては、ニワトリβ-グロビンＬＣＲに由来する１．２ｋｂ  ＤＮａｓｅＩ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ（ｃＨＳ４），バフンウニ由来ＵＲ１などが例示される。Ｓ／ＭＡＲとしては、ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲエレメント、ヒトβ−グロビンＭＡＲエレメントやヒトインターフェロンβＳＡＲエレメントなどが例示される。
【００５４】
本発明の実施態様によれば、少なくとも一つの遺伝子発現安定化配列が配置される。これら遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列を目的タンパク質の発現カセットの上流若しくは下流、あるいは上流及び下流に配置することによって、遺伝子発現の安定的維持、及び目的タンパク質の生産性を向上させることが可能である。
【００５５】
目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物として、プラスミドベクターが一般に用いられるが、プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２０ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましい。好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ程度である。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様における遺伝子発現安定化配列は、特許文献５に記載のＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）から本発明者らによって同定された核酸分子である。当該株は、外来遺伝子としてヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現ベクターに導入し、このベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＧ４４株に導入し、導入株をＩＭＤＭ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得、この形質転換体を、次いでＩＭＤＭ培地（核酸不含）、１０％透析牛胎児血清を添加した培地で選択し、さらに５０ｎＭ、１００ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含み、核酸を含まないＩＭＤＭ培地を用いて１０から１００倍程度に増加するまで培養し、ＭＴＸ濃度を上昇させることにより得られたテロメアタイプのクローン細胞である。
【００５７】
真核細胞のゲノムは、真正染色質と異質染色質の２つのクラスの染色質に分けられる。セントロメアとテロメアの配列は、構成的な異質染色質の主要な部分である。特に、テロメアは、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列とサブテロメア領域からなり、際立った異質染色質の立体構造をとる、遺伝子の乏しい領域である（非特許文献８，９）。テロメアは、ゲノムの安定性に対するその寄与や保護的な役割に加え、テロメア位置効果として知られる現象によって、近くに導入された遺伝子の発現にも影響を与える（非特許文献１０，１１）。
【００５８】
ところが、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株は、テロメアタイプのクローン細胞であるにもかかわらず、導入された外来遺伝子は導入部位付近の異質染色体からの不活性化の影響を受けることなく、長期間の培養において、安定したｈＧＭ−ＣＳＦの高い産生を維持した。これは、外来遺伝子の導入された部位の近傍に、不活性化の進行を強力に遮断するような境界エレメントが存在し、遺伝子発現を安定化していることを示唆する。
【００５９】
本発明者らは、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株において外来遺伝子導入部位の近傍の配列を分析した結果、配列表の配列番号２６で示す約９１ｋｂｐの配列からなるＤＮＡが遺伝子発現の安定化に関与していることを見出した。
【００６０】
本発明における実施態様の１つの側面は遺伝子安定化配列を有する発現ベクターであり、遺伝子発現安定化配列の長さは短い方が好ましい。そこで、より小さいサイズでも遺伝子発現安定化機能を有する領域を絞り込むため、発明者らは更なる研究を行った。
【００６１】
配列番号２６に示す約９１ｋｂｐの配列を更に分析するにあたり、通常、ショットガン法による約３ｋｂｐ程度の断片のライブラリを作成し、各断片を１つずつアッセイする方法が取られる。しかしながら、各断片が遺伝子安定化機能を有するかどうかを解析する際に、細胞の形質転換や培養に時間がかかるため、１アッセイ当たり数週間から数ヶ月の期間を要する。従って、全アッセイを行うためには膨大な時間と労力を要することになる。
【００６２】
そこで、本発明者らは、配列番号２６の配列中、遺伝子発現配列の境界エレメントが存在することが期待される部位を中心に解析する方法を見出した。そして、配列番号２６からなるＤＮＡのうち４２ｋｂｐ、４５ｋｂｐ、及び９１ｋｂｐ付近の領域が遺伝子発現安定化機能を有することを見出すに至った。
【００６３】
この配列をさらに詳細に分析したところ、この配列の中でも、（ｉ）４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域、（ｉｉ）４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域、（ｉｉｉ）４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域、及び（ｉｖ）９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の４つの領域が、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフに相当することを見出した。従って、これらの４つの領域の少なくともいずれかを含む、これらの領域の近傍が特に遺伝子発現の安定化に関与していると考えられた。
【００６４】
本発明における実施態様では、遺伝子発現安定化配列として、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又はその組み合わせが使用できる。
（ａ）配列番号２６で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。
【００６５】
これらのエレメントは、ＣＨＯゲノムから単離同定されたものであるが、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化配列として使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。
【００６６】
また、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡも当然、遺伝子発現安定化配列として使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化配列は、これらの（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。さらに、（ｈ）前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡも、遺伝子発現安定化機能を有し、遺伝子発現安定化配列として使用することができるため、本発明に含まれる。
【００６７】
ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中４０〜５０℃または０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中５５〜６５℃の条件下ハイブリダイズする塩基配列である。さらにストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ値）に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、「６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約１５〜３０℃低い温度」程度の条件をあげることができる。より高いストリンジェントな条件としては「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度、更に高いストリンジェントな条件としては「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度の洗浄条件をあげることができる。更に高いストリンジェントな条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度の洗浄条件が例示される。
【００６８】
本発明の遺伝子発現安定化配列の好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又は配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域である。また、これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列も含まれる。本発明の遺伝子発現安定化配列のさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又は配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域であり、又はこれらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列である。
【００６９】
本発明の遺伝子発現安定化配列がその発現安定化効果を奏するためには、該配列が宿主細胞ゲノム中で外来遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化配列と外来遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。
【００７０】
このような近接配置は、本発明の配列を含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化配列、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。
【００７１】
（マルチクローニングサイト）
様々な目的タンパク質遺伝子を発現ベクターに効率よく挿入するために、発現ベクターにはマルチクローニングサイトを具備する。バイオ医薬品製造において、近年特に供給が望まれるのは抗体分子である。抗体遺伝子のクローニングには抗体遺伝子内に認識配列が存在しない制限酵素を用いることが好ましい。医薬品用抗体としてはＩｇＧが大半を占めることから、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  γ１遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＡＫ０５７７５４），γ２遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＣ０６２３３５），γ３遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＸ５３８１２６），γ４遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＸ６４０８２４），Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  κ遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＡＹ８９４９９１），λ1遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＣ００７７８２），λ２遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｘ５７８０９）、及び発現ベクター構築のベースに用いられるｐＵＣ１８ベクター（マルチクローニングサイトを除く）の塩基配列を解析し、いずれの遺伝子配列にも認識配列が存在せず、突出末端を生成する制限酵素を抽出したところ、ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩといった制限酵素が挙げられた。また、１ないし２つの遺伝子を切断してしまうが、遺伝子組換えに比較的利用しやすい酵素として、ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩが挙げられる。
【００７２】
一方、平滑末端を生成するような制限酵素は、目的タンパク質遺伝子の末端を平滑化しておくことによって、配列を問わず、連結することが可能であるので、マルチクローニングサイトに含まれる１つの認識配列として好ましい。このような平滑末端を生成するような制限酵素としては、ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩが挙げられる。
【００７３】
マルチクローニングサイトには前記制限酵素認識配列のうち、発現ベクター内のプロモーター、ｐｏｌｙＡシグナル、薬剤選択マーカー遺伝子、遺伝子発現安定化配列の中に認識配列を持たない制限酵素認識配列を用いることが好ましい。そこで、これらの機能を損ねないように当該配列中の制限酵素認識配列を削除することによって、当該配列をマルチクローニングサイトに利用することが可能になる。
【００７４】
例えば、遺伝子発現安定化配列（配列番号２６の４１６０１番目から４２７００番目までの配列）の４２３１４位のＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、４２５９５位のＳｍａＩ認識配列は遺伝子発現安定化の機能に影響なく、認識配列を削除するように塩基置換することが可能であると確認され、マルチクローニングサイトの認識配列として利用可能であった。さらに、４２６４９位のＢａｍＨＩ認識配列や４２１３７位のＳａｃＩ認識配列も遺伝子発現安定化の機能に影響なく、認識配列を削除するように塩基置換することが可能であることを確認した。
【００７５】
ＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列は、例えば、薬剤選択マーカーとしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を採用した際にコーディング領域内に出現してしまうが、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のコドンユーセージを変更することによって、アミノ酸配列を置換することなく、遺伝子中のＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列を破壊することができ、マルチクローニングサイトの認識配列として利用可能である。
【００７６】
マルチクローニングサイトに含まれる制限酵素認識配列として特に好ましい例としてＢｓｉＷＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＸｂａＩが挙げられるが、これに限られるものではない。さらに少なくとも１つの平滑末端生成酵素認識配列を含んでおくことがより好ましい。
【００７７】
本発明の実施態様においては、マルチクローニングサイトの上流にプロモーター、下流にターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）が配置され、マルチクローニングサイトに挿入された組換えタンパク質遺伝子を発現させるための発現カセットが構成される。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはＣＨＯ由来のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １（ＥＦ１α）遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター／エンハンサーのハイブリッド、例えばＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。
【００７８】
本発明の実施態様において、マルチクローニングサイトに挿入される目的タンパク質遺伝子はいずれのタンパク質遺伝子でもよいが、好ましくは抗体の重鎖及び／又は軽鎖のポリペプチド遺伝子である発現ベクターである。
【００７９】
目的のタンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、マルチクローニングサイト及びそれに伴う発現カセットを複数配置し、各マルチクローニングサイトにそれぞれのポリペプチド遺伝子を配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子を内在性リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ、ＩＲＥＳ）でつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形でもよい。
【００８０】
（発現ベクター）
本発明におけるベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターであり、本発明の実施態様の１つはプラスミドベクターである。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。
【００８１】
本発明における発現ベクターの実施態様の１つは、マルチクローニングサイトに挿入された目的タンパク質遺伝子を発現させるためのカセット（以下、目的タンパク質遺伝子発現カセット、という。）と薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流若しくは下流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。好ましくは、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。この場合、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットのどちらが上流であってもよいが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されたものである。
【００８２】
本発明における別の実施態様は、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間に遺伝子安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流であって薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流、若しくは薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの下流であって目的タンパク質遺伝子発現カセットの上流のいずれの態様も考えられるが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流であって薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。
【００８３】
本発明における発現ベクターの好ましい実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流及び下流に、それらの発現カセットを挟むように遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの順序は問わないが、目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されていることが好ましい。また、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットそれぞれの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されていてもよい。
【００８４】
本発明における好ましい別の実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセットの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置され、さらにその下流に薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが配置されたベクターである。
【００８５】
更には、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの下流に目的タンパク質の遺伝子発現カセットが配置され、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間及び目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されている発現ベクターも実施しうる。
【００８６】
遺伝子発現安定化エレメントと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット若しくは目的タンパク質の遺伝子発現カセットとの間は、隣接していてもよいし、スペーサー配列等が挿入されていてもよい。
【００８７】
また、前記薬剤遺伝子発現カセットと目的タンパク質遺伝子発現カセットが１つのベクター上に配置される場合、隣接してもよいし、スペーサー配列が挿入されていてもよい。隣接して挿入される際には、所望のタンパク質の発現カセットが上流になるように配置される方が好ましい。さらに、スペーサー配列として、隣接する発現カセットの転写干渉を抑制するためのインスレーター配列が挿入されていてもよい
【００８８】
薬剤選択マーカー発現カセットは、１つのベクターに２つ以上含まれていても良い。この場合、同一の薬剤選択マーカーが選ばれる場合もあるし、それぞれ異なる薬剤選択マーカーが選ばれる場合もある。また、各薬剤選択マーカーは隣接して配置されても良いし、離れて配置されることもある。
【００８９】
目的のタンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、マルチクローニングサイト及び発現カセットを複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットを含む発現ベクターの形でもよい。
【００９０】
また、複数のベクターのそれぞれにマルチクローニングサイトを準備しておき、各々にポリペプチド遺伝子を挿入して構築したベクターを１つの宿主細胞へ導入して形質転換細胞を作製し、目的タンパク質を生産することができる。この場合、各ベクターに薬剤選択マーカー発現カセットを配置することができ、それぞれ同一の薬剤選択マーカーを用いることもできるが、異なる薬剤選択マーカーを用いる方が、各ポリペプチドが全て高発現を示す細胞を効率よく取得する点で有利であり、好ましい。
【００９１】
本発明の１つの実施態様は、まずｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー発現カセット、及び少なくとも１つの遺伝子発現安定化配列を有し、並びにマルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が挿入されたベクターを用意し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。そして形質転換された細胞に薬剤選択を行い、薬剤選択後も生存する細胞群を選別し、必要に応じて細胞を単離して、更に高い発現レベルを示す細胞株を取得するものである。こうして取得された細胞群または細胞株も本発明に含まれる。
【００９２】
本発明に用いられる宿主細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、これに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞なども導入対象とすることができる。また、大腸菌などの細菌細胞や酵母、昆虫細胞などを用いたタンパク質生産システムにも応用しうる。
【００９３】
一般にバイオ医薬品などの工業生産には、ウイルスなどの有害成分の混入を排除するため、動物成分を含まない培地、より好ましくは化学的に組成の明らかな（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ）な培地で生産細胞を培養することが求められる。このため、一般的に使用されるウシ胎児血清などを含有した培地で高生産細胞をスクリーニングした後、１〜２ヶ月程度かけて動物成分非含有培地やＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄとされる培地へ細胞を適応させること（無血清馴化）が必要とされる。しかしながら、せっかく取得した高生産性細胞も上手く馴化できないケースもある。そこで、あらかじめ無血清馴化された細胞に遺伝子導入することは、無血清馴化工程を省略して生産細胞の樹立時間を短縮でき、非常に有効である。このような課題達成のため、本発明に用いられる宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞等における無血清馴化済み細胞がさらに例示される。
【００９４】
細胞へのベクターの導入方法は当業者であれば適宜選択しうるが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション等が挙げられる。
【００９５】
薬剤の濃度としては、一般に使用される濃度の範囲で高発現細胞の濃縮が可能であるが、少し高めの濃度が好ましい。最適な濃度は、宿主細胞や用いる培地の種類によって変化する。これらの濃度は当業者にとっては公知であり、適宜設定しうる。例えば、産業用の生産細胞として用いられるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ‘ｓ  Ｆ１２培地で培養した場合、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＰｕｒｏｍｙｃｉｎの濃度としては５μg／ｍｌ以上、より好ましくは７．５μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上である。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂの濃度としては、２００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは６００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上である。Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＧ４１８の濃度としては、好ましくは４００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１，０００μｇ／ｍｌ以上である。
【００９６】
本発明による薬剤選択により、ｍＲＮＡの不安定化を伴わない薬剤選択を行った細胞群に比べて、発現量の高い値を示す細胞の割合が有意に高くなる。本発明を用いれば、薬剤選択後も生存する細胞群（ポリクローン）のうち、発現量の高い割合を示す細胞群から細胞を単離し、培養することにより、容易に高発現を示す細胞株（モノクローン）を取得することができる。従前膨大なサンプルから細胞株を選別する作業を繰り返し行わなければならなかったが、本発明によれば、薬剤選択マーカーのｍＲＮＡ不安定化を含む薬剤選択を経て、選別の候補となるサンプル数を大幅に絞ることができるからである。実施態様の一例として、４．０×１０５個の細胞に本発明の薬剤選択マーカー発現カセットが挿入されたベクターを遺伝子導入後、薬剤選択を行って生じた細胞群から１００の細胞株をランダムに選択して、個々の細胞株の発現量を調べることにより目的タンパク質の高発株を取得することができる。
【００９７】
細胞の発現レベルはレポーター遺伝子の発現量により調べることができるが、一例として、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子（Ｃｏｖａｌｙｓ社）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子を含む発現カセットを本発明の発現ベクターに導入し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）等のフローサイトメーターを用いて蛍光強度の解析や細胞の選別を行うことができる。別の例として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを本発明による発現ベクターに導入後、細胞溶解液にＤ−ルシフェリンを添加してルミノメーターで発光量を測定することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子に限らず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を利用することで抗体等の目的タンパク質の発現を調べることもできる。
【００９８】
本発明により、細胞選抜の工程及び日数を大幅に短縮することができると共に、高発現を示す細胞の割合が上昇することにより、短時間、高効率に組換えタンパク質生産細胞を取得することができ、従来技術と比べて極めて顕著な効果を示す。
【００９９】
例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）により、蛍光強度ＦＬ１にてＳＮＡＰ２６ｍの発現量を測定した場合、ＦＬ１が２００以上若しくは１０００以上を示す細胞の割合は、薬剤選択マーカー発現カセットを有さない細胞に比べて、本発明による細胞では１．１倍以上、また多くの場合１．５倍から２倍以上大きくなる効果が認められた。また、ＦＬ１が２００以上を示す細胞の割合の増加率よりもＦＬ１が１０００以上を示す細胞の割合の増加率の方が高い傾向が見られており、本発明により作製される細胞群が、薬剤選択マーカー発現カセットを有さない細胞に比べて高い発現を示すという効果を裏付けている。
【０１００】
さらに、本発明におけるｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子安定化配列を有する発現ベクターにより形質転換された細胞では、ｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子安定化配列を有さない発現ベクターを使用した場合に比べ、高生産性を示す細胞の割合が７〜８倍向上する。遺伝子発現安定化配列のみを有する発現ベクターにより形質転換された細胞では、高生産性を示す細胞の割合が２倍程度向上し優れた効果を有しているが、本発明はｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子発現安定化配列の相乗効果によって更に顕著な効果を有する。
【０１０１】
本発明が実施されることによる態様の一つは、前記マルチクローニングサイトに有用遺伝子を挿入した発現ベクター、その発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び前記細胞を培養してオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ジアミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質を生産する方法である。
【０１０２】
本発明の好ましい実施態様は、マルチクローニングサイトに抗体重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチド遺伝子が挿入された発現ベクター、前記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、及び前記細胞を用いて、抗体もしくは抗体医薬を製造する方法である。抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子が同一のベクターに挿入されていても良いし、それぞれ異なるベクターに挿入されていても良い。
【０１０３】
抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子をそれぞれ異なるベクターに挿入して発現させ、抗体を生産した場合と、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させ、抗体を生産した場合の比較において、抗体の生産性はどちらも変わらないか、もしくは抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させたほうがより高い生産性を示す。したがって、いずれの方法を用いても高い生産性を示す細胞株を取得することができるが、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させたほうが好ましい。
【０１０４】
本発明のより好ましい実施態様の１つは、抗体重鎖遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイトを具備したプラスミドベクター、軽鎖遺伝子をクローニングするためのマルチクローニングサイトを具備したプラスミドベクターを備え、抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を各プラスミドベクターにクローニングした後、それぞれの発現プラスミドを制限酵素で処理して混合し、連結反応によって１つの発現プラスミドベクターを構築する方法、及び当該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び前記細胞を用いて、抗体もしくは抗体医薬を製造する方法である。
【０１０５】
哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、二次元電気泳動等により測定することができる。
【０１０６】
本発明の発現ベクターにより形質転換された細胞により生産された抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にて公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。
【０１０７】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、好ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１０８】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１０９】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０１１０】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１１１】
また本発明の更なる実施態様においては、本発明による発現ベクターのマルチクローニングサイトにワクチンとなるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挿入されており、その発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を用いて、ワクチンを製造する方法である。
【０１１２】
ワクチンとしては、病原体のエピトープのアミノ酸配列からなるタンパク質をワクチンとして使用することができる。また、ウイルス体の構成タンパク質すべてを生産するのみならず、エンベロープタンパク等を生産し、ワクチンとして使用することができる。
【０１１３】
ワクチンは任意の経路の投与のための製剤とすることができる。粘膜型投与、例えば、経口経路、経鼻経路、経気道経路、経膣経路、経直腸経路の他、非粘膜経路による投与、例えば皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のためのワクチン製剤が挙げられる。
【実施例】
【０１１４】
以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。なお以下において用いられる「遺伝子発現安定化エレメント」は、「遺伝子発現安定化配列」と同義である。
【実施例１】
【０１１５】
ピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築
図１に示すスキームに従って、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。即ち、まずＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃベクター（ｐＥＬｕｃ−ｔｅｓｔ）（東洋紡績社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイトにＣＭＶプロモーター（配列番号１）が導入されたｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃ（ＥＬｕｃ）遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍ（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）からＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶを構築した。続いて、ｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを配列番号４，５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。
【０１１６】
続いて、図２に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ（クロンテック社製）のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子のコード配列の３‘末端に、配列番号６、７のプライマーとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの４回繰り返し配列（Ｎ４）を挿入してｐＰＵＲ・Ｎ４を構築した。
【０１１７】
つづいて、ｐＰＵＲ，ｐＰＵＲ・Ｎ４を鋳型として、配列番号８、９のプライマーとＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ｖｅｒ．２（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲによって、ＳＶ４０  プロモーター−Ｐｕｒ−ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０プロモーター−Ｐｕｒ・Ｎ４−ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡの薬剤発現カセット断片を増幅した。ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２と前記増幅断片をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩで部分消化して連結し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ-Ｐｕｒ，ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ-Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した（図３）。
【実施例２】
【０１１８】
（２）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入（１）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研バイオリソースセンター、Ｎｏ．ＲＣＢ０２８５）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（日水製薬社製）を使用した。
【０１１９】
トランスフェクションは、３μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、１μｇのプラスミドとしてｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−ＰｕｒあるいはｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４にこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、6μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。3週間の選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に２μＭ  ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１２０】
図４は、薬剤選択後のｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。横軸が蛍光強度（ＦＬ１）、縦軸がカウント数である。また、図５に蛍光強度ＦＬ１がそれぞれ２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【実施例３】
【０１２１】
細胞株でのピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入（２）
つづいて、実施例２同様に遺伝子導入を行い、９μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。ここで形成されたコロニーを顕微鏡下でピペットの先でｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒについては４８クローン、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については２０クローンをかきとり、１２ウェルプレートに播種した。増殖が認められた、それぞれ３６クローン、１０クローンについて、実施例２と同様にＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５で標識処理をし、ＦＡＣＳ解析を実施した。
【０１２２】
図６に、薬剤選択後の細胞の明視野像を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒに比べ、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については生存細胞数、コロニー数が顕著に減少し、選択効果が高いことが示唆される。
【０１２３】
図７にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。図８にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒでは高発現クローンは３６クローン中１クローン（２．８％）しか認められなかった。しかしながら、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４は取得されたクローンは少ないものの、ＳＮＡＰｍ高発現クローンのヒット率が４０％（１０クローン中４クローン）と非常に選択効果が高いことが確認された。また、この結果から、実施例２で認められたように、薬剤選択後の細胞集団をＦＡＣＳ解析することによって高発現細胞の割合の上昇していることと、高発現クローンの取得が効率化されていることに相関が確認されたことから、以後の解析は細胞集団のＦＡＣＳ解析によって効果の確認を実施した。
【実施例４】
【０１２４】
ＥＦ１αプロモーター使用下でのピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置換した場合も、上述と同様の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。本実験では、図９に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置換したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加した構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２である。
【０１２５】
このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を用いて、図１０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を構築した。本プラスミドから制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩでネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＰＵＲ・Ｎ４から下流にＮ４配列を付加したＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を配列番号１４，１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１６、１７のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流のＮ４配列を削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。
【実施例５】
【０１２６】
（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）でリニアライズ（直鎖状化）した。トランスフェクションは、３μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、前記のリニア化したプラスミド１μｇを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、５、７．５、あるいは１０μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎをそれぞれ含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１２７】
図１１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度に関わらず、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【実施例６】
【０１２８】
ハイグロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ‐ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築
ハイグロマシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化因子の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。この構築には、図１３に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミドの制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２である。
【０１２９】
このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２をＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社製）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号１８、１９のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２の制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、図１４に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号３，２０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２２のプライマーを使ってＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。
【実施例７】
【０１３０】
（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌハイグロマイシン  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１３１】
図１５は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１６に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【実施例８】
【０１３２】
ネオマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築
ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化因子の効果が認められるか検討するため、図１７に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を構築した。即ち、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２３のプライマーを使ってネオマイシン耐性遺伝子下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を構築した。
【実施例９】
【０１３３】
（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１３４】
図１８は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１９に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【実施例１０】
【０１３５】
ＡＲＥ配列モチーフの繰り返し配列数の検討
図２０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１６、２４のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ２配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの２回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２を構築した。また、同様の方法で、配列番号７、２４のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ６配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの６回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６を構築し、配列番号７、２５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ８配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの８回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。
【０１３６】
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、７．５μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１３７】
図２１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、繰り返し配列数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６あるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換したとき、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４と比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、高発現細胞の選択効率が高いとの結果であった。
【実施例１１】
【０１３８】
核酸配列の決定
ＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）より作成されたＢＡＣライブラリーのうち、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含むクローンＣｇ００３１Ｎ１４を単離した。このクローンＣｇ００３１Ｎ１４に由来するＢＡＣより作成したショットガンクローンの５’，３’ワンパスシーケンスを実施し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄによる配列情報のアッセンブルを行い、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットが導入されたＣＨＯ細胞の近傍のゲノム配列約９１ｋｂｐの配列を決定した。この配列を、配列表の配列番号２６に示す。
【実施例１２】
【０１３９】
核酸配列の解析
前記決定された核酸配列中にインスレーター配列が存在するかどうかを、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフを検索することによって調査した。解析ツールとしてＩｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＣＴＣＦＢＳ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／）（非特許文献１２）を使用した。前記ツールで抽出されたモチーフ配列を表１及び図２３に示す。
【０１４０】
【表１】
2011019509.tif 000003
【実施例１３】
【０１４１】
導入遺伝子発現の安定化効果の確認
実施例１の途中で構築されたｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを配列番号２７，２８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍを構築した（図２４）。
【０１４２】
次に、実施例１１で作成したショットガンライブラリーのクローンうち、４１８２０位、４５１８２位のＣＴＣＦの結合配列モチーフの付近のＣＨＯゲノム配列を含むクローンを抽出し、ＣＨＯゲノムに由来する導入配列（図２５参照）をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍの制限酵素ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩまたはＸｈｏＩ、ＣｌａＩサイトに導入した。ショットガンライブラリークローンと、当該導入配列が組み込まれたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトの対応関係を表２に示す。なお、表２中のＳＮＡＰｍ発現コンストラクトの欄の（−）は、ＣＨＯのゲノム配列が導入されていないｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍである。
【０１４３】
【表２】
2011019509.tif 000004
【０１４４】
これらのＳＮＡＰｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。
【０１４５】
一方、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＣＨＯ−Ｋ１細胞を１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を使用した。
【０１４６】
トランスフェクションは、３μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈し、前記の混合プラスミド１μｇにこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に２μＭ  ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰｍの発現強度を解析した。
【０１４７】
図２６は、被検配列ＣＨＯ１〜ＣＨＯ６がそれぞれ導入されたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２７は、未処理のＣＨＯ細胞（図２６左上の（−））の解析結果から１０以上のシグナル（図２６中のＭ２）を示す細胞をＳＮＡＰｍの発現細胞とし、その細胞の割合をプロットしたグラフである。図２６、２７から明らかな通り、ＣＨＯ細胞ゲノムの一部を導入したコンストラクト、特に配列番号２６の４１６０１〜４６７４６位を導入したＣＨＯ４及び５において、有意な発現の上昇が認められた。ＣＨＯ４とＣＨＯ５の差異はサンプル間のバラツキの範囲内と考えられるが、念のため、以後の最適領域の絞り込みはＣＨＯ５に基づいて実施した。
【実施例１４】
【０１４８】
遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（１）
前記で発現の上昇が最も高かったコンストラクトＣＨＯ５をもとに、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号３９、４０のプライマーを使って被験配列４１６０１−４２９０２位をデリーションしたＣＨＯ５Δ５を、配列番号４１，４２のプライマーを使って４２９０３−４４２００位をデリーションしたＣＨＯ５ΔＭを、配列番号４３、４４のプライマーを使って４４２０１−４６７４６位をデリーションしたＣＨＯ５Δ３を構築した（図２８）。
【０１４９】
これらのＳＮＡＰｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。
【０１５０】
前記の混合プラスミド１μｇを前日１２ウェルプレートに播種したＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ・ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェルあたり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に２μＭ  ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰｍの発現強度を解析した。
【０１５１】
図２９は、被検配列ＣＨＯ５Δ５、ΔＭ、Δ３がそれぞれ導入されたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図２９から明らかな通り、ＣＨＯ５Δ３についてはデリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰｍの発現強度が認められたのに対し、ＣＨＯΔＭ、Δ３では発現上昇の効果が明らかに低減した。このことから、発現の安定化には配列番号２６の配列の４１６０１〜４６７４６位のうちの５’側〜前半部分が主に寄与していると考えられる。
【実施例１５】
【０１５２】
遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（２）
配列番号４４〜４９のプライマーを使用し、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、ＣＨＯ５Δ３の被験配列の３’がさらにデリーションされたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを構築した（図３０及び表３）。
【０１５３】
【表３】
2011019509.tif 000005
【０１５４】
これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを実施例１４と同様に処理し、ＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１５５】
図３１は、被検配列ＣＨＯ５Δ３、ＣＨＯ５Δ３−１〜５のＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図３１から明らかな通り、配列番号２６の配列の４１６０１〜４２７００位を含むＣＨＯ５Δ３−１からＣＨＯ５Δ３−３までについては、サンプル間のバラツキはあるものの、デリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰｍの発現強度が認められたのに対し、かかる領域の３’側が欠失したＣＨＯ５Δ３−４及びＣＨＯ５Δ３−５では発現の上昇効果が明らかに低減した。
【実施例１６】
【０１５６】
ピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ピューロマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、プラスミドを構築した。本実験では図３２に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋを利用した。即ち、まず、実施例４の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに配列番号５０、５１のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３（以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号５２、５３のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋである。
【０１５７】
一方、実施例４で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号５４、５５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２を構築した。
【０１５８】
続いて、図３３に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例１７】
【０１５９】
（２）ピューロマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４および１６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、それぞれ５、７．５、１０μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１６０】
図３４は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図３５に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３の有無に関わらず、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度が高いほど、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことが分かる。しかしながら、ＣＨＯ５Δ３−３あるいはＮ４配列を用いることでＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が増大し、さらにこれらを併用することによって、その相乗効果により高発現細胞の割合は最大値となることが分かる。
【実施例１８】
【０１６１】
ハイグロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ハイグロマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、図３６に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｈｙｇ・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｈｙｇ−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例１９】
【０１６２】
（２）ハイグロマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例６および１８で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌ  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１６３】
図３７は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図３８に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４配列と遺伝子発現安定化効果を有するＣＨＯ５Δ３−３を組み合わせることで、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３を単独で用いた場合と比較してＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に増大しており、高生産性細胞の選択効率が向上することが分かる。
【実施例２０】
【０１６４】
ネオマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ネオマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、図３９に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｎｅｏ・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｎｅｏ−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例２１】
【０１６５】
（２）ネオマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例８および２０で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン  Ｇ４１８を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１６６】
図４０は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図４１に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４配列と遺伝子発現安定化効果を有するＣＨＯ５Δ３−３を組み合わせることで、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３を単独で用いた場合と比較してＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に増大しており、高生産性細胞の選択効率が向上することが分かる。
【実施例２２】
【０１６７】
ＣＨＯ５Δ３−３存在下でのＡＲＥ配列モチーフの繰り返し配列数の検討
図４２に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋおよびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。まず、実施例１０で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号５４、５５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ８を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ８から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ２−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ６−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ８−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【０１６８】
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋの各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１６９】
図４３は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。なお、実施例１９までの条件でＦＡＣＳ解析に供したところ、細胞の蛍光強度ＦＬ１が強すぎて、高発現細胞の割合を正確に算出することができなかった。そのため、フローサイトメーターの蛍光感度を下げて再検討した結果を図４３に示している。また、図４４に蛍光強度ＦＬ１が１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ＣＨＯ５Δ３−３で発現カセットを挟んだ場合でも、繰り返し配列数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋあるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換したとき、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの場合と比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、高生産性細胞の選択効率が飛躍的に向上することが確認された。
【実施例２３】
【０１７０】
抗体生産系におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、ｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められた遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４５に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。抗体遺伝子は、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５６）から得られる抗体（抗ＫＯＤ抗体）の遺伝子を用いた。
【０１７１】
即ち、実施例２０に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例２４】
【０１７２】
（２）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４６に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、まず、実施例６の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに配列番号５０、５１のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３（以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号５２、５３のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を挿入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例２５】
【０１７３】
（３）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４７に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、実施例１８に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例２６】
【０１７４】
（４）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４８に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例２７】
【０１７５】
（５）抗ＫＯＤ抗体発現系での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果のポリクローンにおける検討
抗ＫＯＤ抗体の重鎖（ＨＣ）発現コンストラクトである、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２（以下、−／Ｎｅｏと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｎｅｏと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４と記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と記載）、および、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖（ＬＣ）発現コンストラクトである、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（以下、−／Ｈｙｇと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｈｙｇと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４と記載）をそれぞれ制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズ（直鎖状化）した。そして、重鎖および軽鎖発現コンストラクトを、
・  遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏと−／Ｈｙｇ）、
・  遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏと１．１ｋ／Ｈｙｇ）、
・  遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｎｅｏ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、
・  遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）
のそれぞれについて、抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が１：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。
【０１７６】
前記の混合プラスミド２μｇを、前日に６ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、ジェネティシン  Ｇ４１８およびＨｙｇｒｏＧｏｌｄ、あるいは、ＰｕｒｏｍｙｃｉｎおよびＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、および、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）では、６００μｇ／ｍｌジェネティシン  Ｇ４１８・４００μｇ／ｍｌ  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて、選択培養をした。遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では、４００μｇ／ｍｌジェネティシン  Ｇ４１８・２００μｇ／ｍｌ  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて選択培養をした。遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では、７．５μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ・４００μｇ／ｍｌ  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて選択培養をした。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡ（パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを固相化したもの）で測定した。
【０１７７】
具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ社製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名    ；ＳＰＥＣＴＲＡ ＣＬＡＳＳＩＣ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｃｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。
【０１７８】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５６）から得られた抗体を用いた。結果を図４９に示す。図４９から明らかな通り、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と比較して、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）では抗体生産量が２倍程度上昇したが、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では抗体生産量が更に上昇し、約３倍に増加した。また、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもので、重鎖発現コンストラクトの薬剤耐性遺伝子をＮｅｏからＰｕｒに変更したとき、抗体生産量が顕著に増加し、遺伝子発現安定化エレメント及びｍＲＮＡ不安定化配列を有さない発現コンストラクトに比べて、約５倍の抗体生産量を示した。
【実施例２８】
【０１７９】
（６）抗ＫＯＤ抗体発現系での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果のモノクローンにおける検討
続いて、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
【０１８０】
具体的には、実施例２７のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）のそれぞれについて、発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１８１】
標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図５０に示す。その結果、ポリクローンでの生産性を比較した場合と同様、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と比較して、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）で抗体生産量が上昇したが、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）で抗体生産量が更に上昇していた。また、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したものでは、重鎖発現コンストラクトの薬剤耐性遺伝子をＮｅｏ・Ｎ４からＰｕｒ・Ｎ４に変更したとき、各細胞の抗体生産量が著しく増加し、高い抗体生産性を示すクローンの割合が顕著に大きくなった。この結果から抗体生産系における高生産性細胞の選択効率が飛躍的に向上することが確認された。
【０１８２】
さらに、効果を確認するため、遺伝子発現安定化エレメントもｍＲＮＡ不安定化配列も含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と、高い抗体生産量を示した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を含み、さらに薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、前記９６ウェルプレートにおける２週間培養後のＥＬＩＳＡ測定によって算出されたＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を再度解析し、度数分布としてプロットした結果を図５１に示す。この結果、ＫＯＤ３Ｇ８生産量に対するクローンの分布は、１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４において有意に高生産側へシフトしており、極めて高い抗体生産性を有する細胞の割合が顕著に増大している。遺伝子発現安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの利用が、その相乗効果により、高生産細胞株取得に極めて大きく寄与していることが確認された。
【実施例２９】
【０１８３】
抗ＫＯＤ抗体発現系での、２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
（１）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合でも高生産細胞を取得可能か検討するため、図５２に示すスキームに従ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【０１８４】
なお、Ｈ鎖（重鎖）発現カセットとＬ鎖（軽鎖）発現カセットとをそれぞれ別々のベクターに配置した場合を「２コンストラクト抗体発現系」もしくは単に「２コンストラクト」といい、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合を「シングルベクター抗体発現系」もしくは単に「シングルベクター」という。
【０１８５】
まず、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋにＬ鎖発現カセット挿入用の制限酵素サイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−Ｓを構築した。即ち、実施例２６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩで処理し、ＥＦ−１αプロモーターを切り出した。一方、実施例１６の途中で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋから配列番号５８、５９のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩで処理して調製したＥＦ−１αプロモーターを、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋのＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩサイトに導入して、ＥＦ−１αプロモーター上流にＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−Ｓを構築した。
【０１８６】
続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−ＳをＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩで処理した。一方、実施例６の途中で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２から配列番号６０、６１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体のＬ鎖発現カセットを、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−ＳのＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに導入して、シングルベクターｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【実施例３０】
【０１８７】
（２）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおける２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
シングルベクター抗体発現系でも、２コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能か検討した。２コンストラクト抗体発現系として、実施例２７および２８で最も良好な結果が得られた、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が１：１となるように混合したプラスミド（制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズ済）をトランスフェクションに用いた。また、シングルベクター抗体発現系として、実施例２９で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズし、トランスフェクションに用いた。各々のプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、２コンストラクト発現系では７．５μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ・４００μｇ／ｍｌ  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、シングルベクター系では１０μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１８８】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図５３に示す。その結果、２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系間で、抗体生産量に差異はほとんど見られないとの結果であった。
【実施例３１】
【０１８９】
（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおける２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
続いて、２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
【０１９０】
具体的には、実施例３０のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１９１】
標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図５４に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、シングルベクター抗体発現系と２コンストラクト抗体発現系間で、抗体発現量はほとんど変わらないとの結果であった。このことから、シングルベクター抗体発現系でも、２コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能であることがわかった。
【実施例３２】
【０１９２】
発現ベクターにおける各配列要素からの制限酵素認識配列削除の効果の確認
（１）ＣＨＯ５Δ３−３からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号６２、６３のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳａｃＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号６４、６５のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号６６、６７のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＢａｍＨＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を構築した。最後に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号６８、６９のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を構築した。
【実施例３３】
【０１９３】
（２）ｐＥＨＸの構築
マルチクローニングサイトと、実施例３２で作成した４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流に配する図５５に記載のｐＥＨＸを構築した。具体的には、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号７０、７１のプライマーを使ってＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号７２、７３のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳａｌＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号７４、７５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号７６、７７のプライマーを使ってｆ１  ｏｒｉを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号７８、７９のプライマーを使って制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号８０、８１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号８２、８３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号８４、８５のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１��１ｋを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５２、８６のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸを構築した。
【実施例３４】
【０１９４】
（３）ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）およびｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）の構築
次に、エレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、図５６に示すスキームに従って、ｐＥＨＸのマルチクローニングサイトにＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入した。具体的には、ｐＥＨＸのＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、配列番号３，２０のプライマーセットを使ってｐＳＮＡＰｍを鋳型に増幅したＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）を構築した。同様に、ｐＥＨＸのＢｓｉＷＩ、ＮｏｔＩサイトに、配列番号３，８７のプライマーセットを使ってｐＳＮＡＰｍを鋳型に増幅したＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）を構築した。
【実施例３５】
【０１９５】
（４）ＳＮＡＰ２６ｍ発現系での、ＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例１６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、および実施例３４で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、それぞれ７．５、１０μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【０１９６】
図５７は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図５８に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度に関わらず、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を用いたプラスミドを用いたほうがＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことが分かる。また、ｐＥＨＸにＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入した場合、クローニングに使用した制限酵素サイトに関わらず、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことも分かる。
【実施例３６】
【０１９７】
抗体生産性における発現ベクターの各配列要素からの制限酵素認識配列削除の効果の確認
（１）ｐＥＬＸの構築
マルチクローニングサイトを含む図５９に記載のｐＥＬＸを構築した。具体的には、実施例６の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号８８、８９のプライマーを使って制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号９０、９１のプライマーを使って、ｆ１  ｏｒｉとハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを削除し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号８０、８１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４を構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号８２、８３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＬＸを構築した。
【実施例３７】
【０１９８】
（２）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系でエレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１９９】
まず、ｐＥＨＸおよびｐＥＬＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、それぞれ抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）、およびｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。同様に、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＬＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０２００】
そして、図６０に示すスキームに従って、ｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【実施例３８】
【０２０１】
（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおけるＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を削除した効果を抗ＫＯＤ抗体発現系で検討した。制限酵素認識配列を未削除の遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例２９で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（１．１ｋ）を用いた。また、遺伝子発現安定化配列から４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例３７で構築したｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いた。制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０２０２】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図６１に示す。その結果、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いたほうが、抗体生産量が高いとの結果であった。
【実施例３９】
【０２０３】
（４）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおけるＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
続いて、ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を未削除のもの、削除したもののそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
【０２０４】
具体的には、実施例３８のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を未削除のもの、削除したもののそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０２０５】
標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図６２に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いたほうが、抗体生産量が高いとの結果であった。この結果から、発現ベクターの各配列要素から制限酵素サイトを削除し最適化することで、抗体発現系においてもクローニングから目的タンパク質の高発現株構築まで簡便かつ効率的に実施することが可能になったと言える。
【産業上の利用可能性】
【０２０６】
本発明の、少なくとも１つの遺伝子発現安定化配列、ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、目的タンパク質、特に抗体遺伝子に出現頻度の低い制限酵素認識配列を含むマルチクローニングサイト、を有する発現ベクターは、目的タンパク質遺伝子のクローニングから組換えタンパク質の生産性の高い細胞を樹立するに至るまでを、迅速、かつ効率よく行うために大いに効果を発揮する。従って、本発明の発現ベクターを使用した細胞発現システムは、種々の動物細胞、特に哺乳類動物細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【配列表】
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