(57)【要約】      （修正有）【課題】テンの個体識別が可能になるＰＣＲプライマーセット及びテンの個体識別方法を提供する。【解決手段】テンの個体識別に用いられる特定の塩基配列と８０％以上の相同性を有する７組のＰＣＲプライマーセットである。これら少なくとも７組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてテンから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとする少なくとも７種類のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、マイクロサテライト法により個体識別を行うテンの個体識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンの個体識別に用いられるＰＣＲプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＡと、配列番号２の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＢとからなる第１プライマーセット、
配列番号３の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＣと、配列番号４の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＤとからなる第２プライマーセット、
配列番号５の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＥと、配列番号６の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＦとからなる第３プライマーセット、
配列番号７の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＧと、配列番号８の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＨとからなる第４プライマーセット、
配列番号９の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＩと、配列番号１０の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＪとからなる第５プライマーセット、
配列番号１１の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＫと、配列番号１２の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＬとからなる第６プライマーセット、及び
配列番号１３の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＭと、配列番号１４の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＮとからなる第７プライマーセットからなることを特徴とするＰＣＲプライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のＰＣＲプライマーセットにおいて、上記第１プライマーセットとしては、上記配列番号１の塩基配列を有するプライマーＡと上記配列番号２の塩基配列を有するプライマーＢとを有し、
上記第２プライマーセットとしては、上記配列番号３の塩基配列を有するプライマーＣと、上記配列番号４の塩基配列を有するプライマーＤとを有し、
上記第３プライマーセットとしては、上記配列番号５の塩基配列を有するプライマーＥと、上記配列番号６の塩基配列を有するプライマーＦとを有し、
上記第４プライマーセットとしては、上記配列番号７の塩基配列を有するプライマーＧと、上記配列番号８の塩基配列を有するプライマーＨとを有し、
上記第５プライマーセットとしては、上記配列番号９の塩基配列を有するプライマーＩと、上記配列番号１０の塩基配列を有するプライマーＪとを有し、
上記第６プライマーセットとしては、上記配列番号１１の塩基配列を有するプライマーＫと、上記配列番号１２の塩基配列を有するプライマーＬとを有し、
上記第７プライマーセットとしては、上記配列番号１３の塩基配列を有するプライマーＭと、上記配列番号１４の塩基配列を有するプライマーＮとを有することを特徴とするＰＣＲプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＰＣＲプライマーセットおいて、マルテス・メランプス（Martes melampus）の個体識別に適用することを特徴とするＰＣＲプライマーセット。
【請求項４】
少なくとも７組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてテンから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとする少なくとも７種類のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、マイクロサテライト法により個体識別を行うテンの個体識別方法において、
上記ＰＣＲプライマーセットとしては、請求項１〜３のいずれか一項に記載のものを採用することを特徴とするテンの個体識別方法。
【請求項５】
請求項４に記載の個体識別方法において、上記ＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の長さを比較することにより個体識別を行うことを特徴とするテンの個体識別方法。
【請求項６】
請求項４に記載の個体識別方法において、上記ＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の塩基配列を決定し該塩基配列を比較することにより個体識別を行うことを特徴とするテンの個体識別方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の個体識別方法において、上記ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング温度Ｔａを４５℃〜６５℃とすることを特徴とするテンの個体識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テンの個体識別方法及びこれに用いるＰＣＲプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国においては１９９９年の環境影響評価法施行以来、環境に著しい影響を及ぼすおそれのある事業の実施に際して、事業者が環境への影響について事前に調査、予測評価を行い、環境保全策を講じることが求められている。
例えば事業が生態系へ与える影響を評価する際には、事業予定地に生息する動物の中から上位性、典型性、及び特殊性を考慮した指標種を選定し、その指標種を対象とした現地調査が行われる。
【０００３】
食肉目イタチ科に属するテン（マルテス・メランプス（Martes melampus））は、森林を主な生息地とし、かつ、食物連鎖の上位に位置する動物であることから、猛禽類と並んで森林生態系における上位性の指標種に取り上げられることが多い。日本国内には、本州・四国・九州に分布するテンのほか、対馬に分布する亜種ツシマテン（マルテス・メランプス・ツエンシス（Martes melampus tsuensis））北海道に分布するクロテン（マルテス・ジベリナ（Martes zibellina））の３種のテン属が生息する。
【０００４】
調査対象エリア内の生息個体数は、個体群の健全度評価や将来的な変動予測を行う上で、最も基本的な情報である。これまでの中型陸上哺乳類を対象とした調査では、フィールドサイン法や捕獲法等により個体数の推定が行われてきた。糞や体毛、足跡などの痕跡を利用するフィールドサイン法では、比較的現場から情報を集めやすいという利点があるものの、種同定の不確かさや痕跡が複数存在した場合にそれらが同一個体のものか否かを判断することはほぼ不可能であるという問題がある。一方、トラップにより個体を直接捕獲する捕獲法では、種同定及び個体の識別は確実に行えるが、捕獲自体の困難性や調査費用の高コスト化、捕獲時に個体に与えるダメージの影響などの問題がある。
そこで、より正確でより適切な生息個体数の推定法の開発が求められていた。
【０００５】
ところで、近年の分子遺伝学的手法の発展により、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いたゲノムＤＮＡの多型の判別により個体を識別する方法が確立されている。
具体的には、イネゲノムを識別する方法やユーカリ属の樹脂を判別する方法が開発されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２４８６３５号公報
【特許文献２】特開２０００−３２５０８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、テンについては、そのゲノムＤＮＡの多型に基づいた個体判別の方法は未だ確率されていなかった。そのため、個体を直接捕獲して識別を行う方法しか選択の余地がなかったが、テンは非常に機敏で木に登ることも多いため、捕獲自体が困難であった。したがって、上述のごとく森林生態系における指標種に取り上げられるテンではあるが、その個体識別を行うことは非常に困難であった。
【０００８】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、テンの個体識別が可能になるＰＣＲプライマーセット及びテンの個体識別方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の発明は、テンの個体識別に用いられるＰＣＲプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＡと、配列番号２の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＢとからなる第１プライマーセット、
配列番号３の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＣと、配列番号４の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＤとからなる第２プライマーセット、
配列番号５の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＥと、配列番号６の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＦとからなる第３プライマーセット、
配列番号７の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＧと、配列番号８の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＨとからなる第４プライマーセット、
配列番号９の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＩと、配列番号１０の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＪとからなる第５プライマーセット、
配列番号１１の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＫと、配列番号１２の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＬとからなる第６プライマーセット、及び
配列番号１３の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＭと、配列番号１４の塩基配列と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを有するプライマーＮとからなる第７プライマーセットからなることを特徴とするＰＣＲプライマーセットにある（請求項１）。
【００１０】
第２の発明は、少なくとも７組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてテンから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとする少なくとも７種類のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、マイクロサテライト法により個体識別を行うテンの個体識別方法において、
上記ＰＣＲプライマーセットとしては、上記第１の発明のものを採用することを特徴とするテンの個体識別方法にある（請求項４）。
【発明の効果】
【００１１】
第１の発明のＰＣＲプライマーセットは、上記特定配列の７種類のプライマーセット（上記第１〜第７プライマーセット）を有する。
即ち、上記特定配列の７種類のプライマーセットの組合せを採用することができる。これらのプライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行うことにより、テンに対する精度の優れた個体識別が可能になる。
テンの個体識別は、第２の発明のようにして行うことができる。
【００１２】
即ち、上記第１の発明のＰＣＲプライマーセットを用いて、テンから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとする少なくとも７種類のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。これにより、マイクロサテライト法によるテンの個体識別を行うことができる。
具体的には、ゲノムＤＮＡ中に存在するＣＡリピート等の数塩基の反復配列（マイクロサテライト）をＰＣＲにより増幅して、その反復配列の繰り返しの数に基づいてゲノムＤＮＡの多形性を識別し、個体識別を行うことができる。
【００１３】
本発明においては、ＰＣＲに少なくとも７種類の上記特定の組合せのプライマーセットをそれぞれ用いている。そのため、非常に精度の高い識別が可能になる。
また、上記ＰＣＲプライマーセットを用いると、テンの糞等の排泄物から採取したＤＮＡに対しても反復配列の増幅が可能になる。そのため、個体自体には、直接接触することなく、例えば一定エリア内に存在する個体の識別が可能になる。即ち、個体に対してフィジカルな影響をほとんど与えることなく個体識別が可能になる。
【００１４】
また、上記ＰＣＲプライマーセットを用いると、テン（マルテス・メランパス（Martes melampus））、ツシマテン（マルテス・メランパス・ツエンシス（Martes melampus tsuensis））、クロテン（マルテス・ジベリナ（Martes zibellina））などの日本に生息するテン属の哺乳類に対しても精度よく個体識別を行うことが可能になる。
【００１５】
このように、本発明によれば、テンの個体識別が可能になるＰＣＲプライマーセット及びテンの個体識別方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、上記プライマーＡ〜上記プライマーＮとしては、それぞれ上記配列番号１〜１４の塩基配列と８０％以上の相同性を有する。
具体的には、上記プライマーＡは、上記第１プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＡ（配列番号１）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＢは、上記第１プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡＴＣ（配列番号２）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＣは、上記第２プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＣＡＴＣＣＴＣＡＡＡＴＧＴＧＴＡＧＧＧＴ（配列番号３）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＤは、上記第２プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＣＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＴＴＡＣＴＣ（配列番号４）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＥは、上記第３プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号５）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＦは、上記第３プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＣＡＴＡＡＴＧＣＣＣＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＧは、上記第４プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＡＴＴＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＡ（配列番号７）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＨは、上記第４プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＴＴＡＴＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＡ（配列番号８）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＩは、上記第５プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＡＣＣＣＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号９）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＪは、上記第５プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＡＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴ（配列番号１０）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＫは、上記第６プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＴＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣ（配列番号１１）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＬは、上記第６プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＡＧＴＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＣＡＡ（配列番号１２）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＭは、上記第７プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＧＴＴＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＣＧＴＧＴＧ（配列番号１３）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
上記プライマーＮは、上記第７プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡ（配列番号１４）と８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
【００１７】
相同性が８０％未満の場合には、ＰＣＲにおいて、反復配列を増幅することが困難になり、個体識別が困難になるおそれがある。好ましくは、相同性は８５％以上、より好ましくは９０％以上がよい。
【００１８】
また、好ましくは、上記プライマーＡ〜上記プライマーＮは、少なくともその３’末端から１０塩基対の塩基配列がそれぞれ上記配列番号１〜１４の塩基配列の３’末端から１０塩基対の塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有することがよい。
この場合には、ＰＣＲにおいて、反復配列の増幅をより精度よく増幅することができる。それ故、個体識別の精度をより向上させることができる。
【００１９】
また、好ましくは、上記第１プライマーセットとしては、上記配列番号１の塩基配列を有するプライマーＡと上記配列番号２の塩基配列を有するプライマーＢとを有し、上記第２プライマーセットとしては、上記配列番号３の塩基配列を有するプライマーＣと、上記配列番号４の塩基配列を有するプライマーＤとを有し、上記第３プライマーセットとしては、上記配列番号５の塩基配列を有するプライマーＥと、上記配列番号６の塩基配列を有するプライマーＦとを有し、上記第４プライマーセットとしては、上記配列番号７の塩基配列を有するプライマーＧと、上記配列番号８の塩基配列を有するプライマーＨとを有し、上記第５プライマーセットとしては、上記配列番号９の塩基配列を有するプライマーＩと、上記配列番号１０の塩基配列を有するプライマーＪとを有し、上記第６プライマーセットとしては、上記配列番号１１の塩基配列を有するプライマーＫと、上記配列番号１２の塩基配列を有するプライマーＬとを有し、上記第７プライマーセットとしては、上記配列番号１３の塩基配列を有するプライマーＭと、上記配列番号１４の塩基配列を有するプライマーＮとを有することがよい（請求項２）。
この場合には、個体識別の精度をより一層向上させることができる。
上記配列番号１〜１４の塩基配列を有するプライマー及びこれらと相同性を有するプライマーは、例えば市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。
【００２０】
上記ＰＣＲプライマーセットは、マルテス・メランプス（Martes melampus）の個体識別に適用することが好ましい（請求項３）。
マルテス・メランプス、即ち日本に生息するテンについては、従来その個体識別が困難であったが、上記ＰＣＲプライマーセットを用いると精度よくその個体識別が可能になる。
【００２１】
また、上記ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲは、テンから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして行うことができる。
ゲノムＤＮＡは、テンの組織、体毛、体液、糞等から抽出することができる。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、本出願までに公知の方法を採用することができる。
【００２２】
また、テンの個体識別は、上記ＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の長さを比較することにより行うことができる（請求項５）。
この場合には、比較的簡単な操作で個体識別を行うことができる。
上記ポリメラーゼ連鎖反応物（ＰＣＲ産物）の長さは、アガロース、アクリルアミド等のゲル中での電気泳動により測定することができる。ゲルとしては、例えばアプライド・バイオシステムズ社製のＰＯＰ−７TMポリマーなどの市販のものを利用することもできる。
【００２３】
また、上記ＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の塩基配列を決定し該塩基配列を比較することにより個体識別を行うことができる（請求項６）。
この場合には、より正確な個体識別が可能になる。
塩基配列の決定は、市販のシークエンサーを用いて行うことができる。
【００２４】
上記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は次のようにして行うことができる。
即ち、まず、ＰＣＲ反応用緩衝液中で、テンから抽出したゲノムＤＮＡと、上記第１〜第７プライマーセットのうち１つのプライマーセットと、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ）と、ＤＮＡポリメラーゼとを混合する。次いで、混合物を適当な温度サイクルで反応させることにより、ポリメーラーゼ連鎖反応を行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ反応用緩衝液は、市販のものを採用することができる。
また、ポリメラーゼ連鎖反応は、上記第１〜第７プライマーセットのうちの一組（フォワード側プライマー及びリバース側プライマー）のプライマーセットを用いて行う。本発明においては、上記第１〜第７プライマーセットをそれぞれ用いて少なくとも７回のポリメラーゼ連鎖反応を行う。
【００２５】
ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は、目的の反応物が増幅するように、適宜調整することができる。
例えば、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液１〜１０μｌ、ゲノムＤＮＡ１０〜５００ｎｇ、フォワード側の各プライマー０．２〜１．０μＭ、リバース側の各プライマー０．２〜１．０μＭ、ｄＮＴＰ２．０〜３．０ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ０．２５〜２．５Ｕを混合し、全液量が１０〜１００μｌとなるように希釈した混合物を用いることができる。
【００２６】
また、ポリメラーゼ連鎖反応における温度条件（サイクル条件）は、例えば次のようにして行うことができる。
ステップ１（１サイクル）：９４〜９６℃（約１〜５分）
ステップ２（３０〜４５サイクル）：９４〜９６℃（約１０〜６０秒）→４５〜６５℃（アニーリング温度Ｔａ、約１０〜６０秒）→６８〜７２℃（約１０〜６０秒）
ステップ３（１サイクル）：６８〜７２℃（約１〜１０分）
【００２７】
また、上記ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング温度Ｔａは４５℃〜６５℃にすることが好ましい（請求項７）。
アニーリング温度Ｔａが４５℃未満の場合には、上記の反復配列以外の領域が増幅され、識別が困難になるおそれがある。一方、６５℃を超える場合には、上記ＰＣＲプライマーセットがゲノムＤＮＡに結合することが困難になり、上記反復配列が増幅され難くなる。この場合にも識別が困難になる。より好ましくは、アニーリング温度Ｔａは５０℃〜６０℃がよい。
【００２８】
また、上記プライマーセット１〜７においては、フォワード側及びリバース側の少なくとも一方のいずれかの末端に、本出願時までに公知の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。この場合には、ＰＣＲ反応後の検出を容易にすることができる。
蛍光物質としては、例えば４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等を用いることができる。
【実施例】
【００２９】
（実験例）
本例においては、テンの反復配列（マイクロサテライト）のＤＮＡプライマーの設計を行う。
まず、テンの筋肉片から反復配列の単離を行った。反復配列の単離は、ハミルトン・エム・ビー（Hamilton M.B.）等著、ユニバーサル・リンカー・アンド・ライゲーション・プロシージャーズ・フォー・コンストラクション・オブ・ゲノミック・ディーエヌエー・ライブラリィズ・エンリッチド・フォー・マイクロサテライツ（Universal linker and ligation procedures for construction of genomic DNA libraries enriched for microsatellites）、「バイオ・テクニックス（Bio Techniques）」、（米国）、１９９９年、第２７巻、ｐ．５００−５０７に記載の方法に準じて行った。
【００３０】
具体的には、まず、テンの筋肉片からゲノムＤＮＡを抽出した。
筋肉片からゲノムＤＮＡの抽出は、キアゲン（Qiagen）（株）製のディーエヌイージー・ティシュー・キット（DNeasy Tissue Kit）を用いて行った。
【００３１】
次いで、ゲノムＤＮＡを、ＡｌｕＩ（タカラバイオ株式会社製）、ＲｓａＩ（タカラバイオ株式会社製）、ＨａｅIII（タカラバイオ株式会社製）、及びＮｈｅＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）の４種類の制限酵素で消化した。各制限酵素による消化は、制限酵素に添付のマニュアルに記載の条件に従って行った。次いで、濃度２％のアガロースゲルで電気泳動（緩衝液：０．５×のＴＡＥバッファー（０．４Ｍ
Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ 酢酸、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ））を行い、サイズマーカーとの比較によりサイズ４００ｂｐ−１０００ｂｐに相当するＤＮＡ断片をアガロースゲルごと切り出し、これを市販の核酸精製キット（キアゲン製のキアクイック・ゲル・エクストラクション・キット（QIAquick Gel Extraction Kit））を用いて精製し、ＤＮＡ断片を回収した。ＤＮＡ断片の回収は、添付のマニュアルに従って行った。
【００３２】
回収したＤＮＡ断片は、マング・ビーン・ヌクレアーゼ（mung bean nuclease,タカラバイオ（株）製）による突出末端の平滑化、及びカーフ・インテストナル・アルカリン・フォスファターゼ（Calf Intestinal Alkaline Phosphatase、タカラバイオ（株）製）による５’末端の脱リン酸化を行った後、（株）キアゲン（QIAGEN）製のキアクイック・ピーシーアール・ピュアリフィケイション・キット（QIAquick PCR Purification Kit）により精製した。突出末端の平滑化、５’末端の脱リン酸化、及び精製は、それぞれ添付のマニュアルに従って行った。
【００３３】
次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）を用いて、精製したＤＮＡ断片の両端にＳＮＸリンカー配列を付加した（ライゲーション反応）。
ここで、ＳＮＸリンカー配列とは、制限酵素ＳｔｕＩ、ＮｈｅＩ、及びＸｍｎＩによって消化される配列を含むリンカーであり、上述のハミルトン・エム・ビー等著の「ユニバーサル・リンカー・アンド・ライゲーション・プロシージャーズ・フォー・コンストラクション・オブ・ゲノミック・ディーエヌエー・ライブラリィズ・エンリッチド・フォー・マイクロサテライツ」で用いられているものである。
ライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに添付のマニュアルに従って行った。
【００３４】
次いで、ＳＮＸリンカーを付加したＤＮＡ断片のうち、反復配列を含む断片の濃度を高めるために、ＤＮＡ断片の５’末端をビオチンで修飾したオリゴプローブとハイブリダイズさせた後、表面にストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ（（株）ベリタス製の「ダイナビーズ  Ｍ−２８０  ストレプトアビジン（Dynabeads M-280  Streptavidin）」と反応させた。
【００３５】
具体的には、ＳＮＸリンカーを付加したＤＮＡ断片溶液６μｌに、ハイブリダイゼーションバッファー（１０×ＳＳＣバッファー（１．５ＭＮａＣｌと０．１５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物の水溶液）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液）５０μｌ、ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブ０．０２μＭを混合し、全液量が１００μｌとなるように滅菌水を加えた。得られた混合液をサーマルサイクラーで温度９５℃、１５分間加熱してＤＮＡを変性させた後、温度６０℃で５時間以上インキュベーションすることによりＤＮＡ断片とビオチン化オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせた。本例においては、ハイブリダイズさせるオリゴプローブとして、(ＣＡ)15又は（ＧＴ）15オリゴプローブをそれぞれ用いた。
その後、添付のマニュアルにしたがって洗浄した上述の磁気ビーズの懸濁液３０μｌと、ハイブリダイズさせたＤＮＡ断片溶液とを混合し、旋回式振とう器で撹拌しながら温度４３℃で１時間インキュベーションした。
【００３６】
次に、ＤＮＡ断片と結合した磁気ビーズを専用の磁石により回収し、洗浄バッファー(１×ＳＳＣバッファー（０．１５ＭＮａＣｌと０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物の水溶液）、０．１％
ＳＤＳ)で数回洗浄した。その後、Ｔ−ｄｏｔ−Ｅバッファー(１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ)中で磁気ビーズをインキュベーションすることにより磁気ビーズから再びＤＮＡ断片のみを回収した。
【００３７】
磁気ビーズから回収したＤＮＡ断片は一本鎖の状態であるため、タカラバイオ（株）製の「TAKARA Taq（登録商標）」を用いたＰＣＲ反応により二本鎖化した。
具体的には、磁気ビーズから回収したＤＮＡ断片（一本鎖）溶液１０μｌに、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液５μｌ、プライマー０．３μＭ、ｄＮＴＰ２．５ｍＭ、及び「TAKARA Taq（登録商標）」１．２５Ｕを混合し、全液量が５０μｌとなるように滅菌水で希釈した。１０×ＰＣＲ反応用緩衝液及びｄＮＴＰは、「TAKARA Taq（登録商標）」に添付のものを用いた。また、プライマーとしては、配列ＣＴＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣ（配列番号１５）を採用した。
【００３８】
ＰＣＲにおける加熱サイクルは、次の条件で行った。
ステップ１（１サイクル）：９６℃（２分）
ステップ２（３０サイクル）：９６℃（３０秒）→６５℃（３０秒）→７２℃（１分）
【００３９】
そして、ＰＣＲ産物である二本鎖化したＤＮＡ断片は、キアクイック・ピーシーアール・ピュアフィリケイション・キット（QIAquick PCR Purification Kit、（株）キアゲン製）で精製した。精製は添付のマニュアルに従って行った。
【００４０】
次に、予め、制限酵素ＸｂａＩ(タカラバイオ（株）製)による切断と脱リン酸化を行ったプラスミドｐＢＳIIＳＫ（＋）(ストラタジーン社製)へ精製済みＤＮＡ断片を挿入した。具体的には、まず、ｐＢＳIIＳＫ（＋）を制限酵素ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化した。制限酵素による消化は、添付のマニュアルに従って行った。次に、このｐＢＳIIＳＫ（＋）にＤＮＡ断片を挿入した（ライゲーション反応）。ライゲーション反応は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）を用い、これに添付のマニュアルにしたがって行った。
【００４１】
次いで、ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド（ｐＢＳIIＳＫ（＋））を、コンピテントセル（ストラタジーン社製の「XL2-Blue MRF’ Competent Cells」）に導入した。コンピテントセルへの導入は、添付のマニュアルに従って行った。
その後、コンピテントセルをＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ、及びアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で培養し、青白判定により挿入断片を含むコロニーを得た。青白判定用のＬＢ寒天培地は、日本製薬（株）製のＬＢ寒天培地「ダイゴ」に５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、プラスチック製シャーレで冷やして固めた培地表面に１００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液（５０μｌ）及び２．５ｗｔ％Ｘ−ｇａｌ溶液を塗布することによって作製した。
【００４２】
次に、青白判定により、挿入断片を含むことが確認されたコロニーについて、挿入断片の長さを確認するために、コロニーＰＣＲを行った。
具体的には、滅菌済み楊枝を用いてピックアップしたコロニーをマイクロチューブに入れたＴ−ｄｏｔ−Ｅバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に懸濁し、温度９６℃で１０分間インキュベートして、バッファー中にプラスミドを放出させた。次いで、得られたプラスミド溶液を鋳型とし、ストラタジーン社製の「Ｍ１３フォワードプライマー」（配列番号１６）及びストラタジーン社社製の「Ｍ１３リバースプライマー」（配列番号１７）を用いてＰＣＲを行った。
【００４３】
ＰＣＲは、プラスミド溶液に、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液２．５μｌ、各Ｍ１３プライマー０．２μＭ、ｄＮＴＰ２．５ｍＭ、及びＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製のＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑ）０．６２５Ｕを混合し、全液量が２５μｌとなるように希釈した混合物を用いた。１０×ＰＣＲ反応用緩衝液及びｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼに添付のものを用いた。
【００４４】
ＰＣＲにおける加熱サイクルは、次の条件で行った。
ステップ１（１サイクル）：９６℃（２分）
ステップ２（３０サイクル）：９６℃（３０秒）→６０℃（２０秒）→７２℃（１分）
ステップ３（１サイクル）：７２℃（５分）
【００４５】
そして、ＰＣＲ産物を濃度２％のアガロースゲルで電気泳動（緩衝液：０．５×のＴＡＥバッファー（０．４Ｍ Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ 酢酸、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ））を行い、サイズマーカーとの比較により、インサートＤＮＡ断片のおおよそのサイズを確認した。
【００４６】
４００ｂｐ以上のＤＮＡ断片の挿入が確認されたコロニーを滅菌済み楊枝を用いてピックアップし、ＬＢ培地（日本製薬（株）製のＬＢ培地「ダイゴ」に５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したもの）を１５０μｌずつ分注した９６穴型マイクロプレート中で３７℃で約１８時間振盪培養した。
次いで、市販のプラスミド抽出キット（キアゲン社製のキアプレップ・スピン・ミニプレップ・キット（QIAprep Spin Miniprep Kit））を用いて、ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出した。
【００４７】
次に、シークエンスキット（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製の「ビッグダイ・ターミネーター・ブイ３．１・サイクル・シーケンシング・キット（BigDye Terminator V.3.1 Cycle Sequencing Kit）」）及びシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社製の「３１３０・ジェネティック・アナライザー（3130 Genetic Analyzer）」）により、挿入断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、添付のマニュアルに従って行った。
【００４８】
以上のようにして、約２００個の陽性クローンのうち２４クローンの塩基配列を決定した。いずれのクローンもマイクロサテライト配列を含んでいた。ほとんどのクローンにおいては、マイクロサテライト領域に隣接する配列が極端に短く、プライマーを設計することができなかったが、５つのクローンについてはプライマーの設計が可能であった。
【００４９】
次に、マイクロサテライトを含む挿入断片の塩基配列を基に、マイクロサテライト領域を挟むＰＣＲプライマーを設計した。設計には、プライマー解析ソフトフェア（モレキュラー・インサイツ社（Molecular Biology Insights）製の「OLIGO Ver.6.67」を用いた。
このようにして、５組のプライマーセットを設計し、合成した。
【００５０】
これらのプライマーセットは、それぞれ遺伝子座Ｍｍｅ−１、Ｍｍｅ−２、Ｍｍｅ−３、Ｍｍｅ−４、及びＭｍｅ−５のマイクロサテライトに対するプライマーセットである。各プライマーセットはそれぞれフォワード側及びリバース側のプライマーからなる。
また、各プライマーの合成にあたっては、フォワード側のプラーマーの５’末端を蛍光物質で標識した。
各プライマーを標識する蛍光物質としては、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）のいずれかを採用した。
【００５１】
次に、各プライマーセットのマイクロサテライトマーカーとしての有効性を確認するために、各プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、テンの筋肉片４８検体から抽出したＤＮＡについて対立遺伝子の検出を行った。
【００５２】
テンの筋肉片（４８検体）は、２００４年〜２００５年に熊本県内で回収されたテンの個体から採取した。筋肉片からゲノムＤＮＡの抽出は、上述のようにキアゲン（株）製の「ディーエヌエージー・ティシュー・キット」を用いて行った。
【００５３】
次に、テンの筋肉片から抽出した鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ)１．０μＬ、蛍光標識したフォワードプライマー(５０μＭ)及び未標識のリバースプライマー(５０μＭ)各０．１μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製の「TAKARA EX Taq（登録商標） ＨＳ」(５ｕｎｉｔｓ／μＬ)０．０５μＬ、酵素添付品の１０×ＰＣＲバッファー１．０μＬ、及びｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ) ０．８μＬの混合物を滅菌ｍｉｌｌｉ-Ｑ水で希釈して総量を１０μＬとした。
【００５４】
この混合液を以下のＰＣＲサイクル条件で反応させた。
ステップ１（１サイクル）：９５℃（２分）
ステップ２（３０サイクル）：９５℃（３０秒）→各プライマーセットのアニーリング温度Ｔａ（２０秒）→７２℃（２０秒）
【００５５】
次に、ＰＣＲ産物を、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）製の「3130 Genetic Analyzer」及びアプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）製の「The GeneScanTM 500 ROXTM Size Standard」を用いて検出し、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）製の「GeneMapper（登録商標） Software v4.0」により断片サイズを決定した。各操作は、添付のマニュアルに従って行った。
【００５６】
また、アメリカテン（M.americana）で報告（デービス・シー・エス・アンド・ストロベック・シー（Davis C.S. & Strobeck C.）著、アイソレイション・バライアビリティ・アンド・クロス−スピーシーズ・アンプリフィケイション・オブ・ポリモルフィック・マイクロサテライト・ロウサイ・イン・ザ・ファミリー・ムステリダエ（Isolation, variability, and cross-species amplification of polymorphic microsatellite loci in the family Mustelidae.）、「モレキュラー・エコロジー（Molecular Ecology）」、（米国）、１９９８年、第７巻、ｐ．１７７１−１７８８）された１４種類のマイクロサテライトマーカー（Ｍａ−１、Ｍａ−２、Ｍａ−３、Ｍａ−４、Ｍａ−５、Ｍａ−７、Ｍａ−８、Ｍａ９、Ｍａ−１０、Ｍａ−１１、Ｍａ−１４、Ｍａ−１５、Ｍａ−１８、Ｍａ−１９）についても、上述のプライマーセットと同様に、テンの筋肉片から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のシークエンスを行った。
【００５７】
その結果、テンから作製した５種類のプライマーセットのうち、遺伝子座Ｍｍｅ−２、Ｍｍｅ−３、及びＭｍｅ−５のマイクロサテライトのプライマーセット、並びにアメリカテンで報告されたもののうち、遺伝子座Ｍａ−１、Ｍａ−２、Ｍａ−５、及びＭａ−８のマイクロサテライトのプライマーセットの合計７つのプライマーセットについてＰＣＲ産物が確認された。これらのプライマーセットをそれぞれ第１〜第７プライマーセットとする。
【００５８】
第１プライマーセットは、遺伝子座Ｍｍｅ−２のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＡ（フォワードプライマー）及びプライマーＢ（リバースプライマー）からなる。プライマーＡの配列を配列番号１に示し、プライマーＢの配列を配列番号２に示す。
第２プライマーセットは、遺伝子座Ｍｍｅ−３のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＣ（フォワードプライマー）及びプライマーＤ（リバースプライマー）からなる。プライマーＣの配列を配列番号３に示し、プライマーＤの配列を配列番号４に示す。
第３プライマーセットは、遺伝子座Ｍｍｅ−５のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＥ（フォワードプライマー）及びプライマーＦ（リバースプライマー）からなる。プライマーＥの配列を配列番号５に示し、プライマーＦの配列を配列番号６に示す。
【００５９】
第４プライマーセットは、遺伝子座Ｍａ−１のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＧ（フォワードプライマー）及びプライマーＨ（リバースプライマー）からなる。プライマーＧの配列を配列番号７に示し、プライマーＨの配列を配列番号８に示す。
第５プライマーセットは、遺伝子座Ｍａ−２のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＩ（フォワードプライマー）及びプライマーＪ（リバースプライマー）からなる。プライマーＩの配列を配列番号９に示し、プライマーＪの配列を配列番号１０に示す。
【００６０】
第６プライマーセットは、遺伝子座Ｍａ−５のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＫ（フォワードプライマー）及びプライマーＬ（リバースプライマー）からなる。プライマーＫの配列を配列番号１１に示し、プライマーＬの配列を配列番号１２に示す。
第７プライマーセットは、遺伝子座Ｍａ−８のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＭ（フォワードプライマー）及びプライマーＮ（リバースプライマー）からなる。プライマーＭの配列を配列番号１３に示し、プライマーＮの配列を配列番号１４に示す。
【００６１】
第１〜第７の各プライマーセットのアニーリング温度、増幅されるマイクロサテライトの長さ及び反復配列を後述の表１に示す。
【００６２】
また、各プライマーセットの対立遺伝子数を表１に示す。
具体的には、上述の各プライマーセットを用いたＰＣＲを行って検出されるＰＣＲ産物の長さのバリエーション数を計測し、これを対立遺伝子数とした。
【００６３】
また、ヘテロ接合体率の観察値ＨO（オブザーブド・ヘテロザイゴシティ（observed heterozygosity））及びヘテロ接合体率の期待値ＨE（エクスペクティッド・ヘテロザイゴシティ（expected heterozygosity））を表１に示す。
ヘテロ接合体率の観察値ＨOは、あるマーカー座におけるヘテロ接合している個体の割合を示す。
ヘテロ接合体率の期待値ＨEは、下記の数式（１）で計算される。なお、数式（１）において、Ｐi：ｉ番目の対立遺伝子のサンプル頻度、Ｋ：対立遺伝子数である。
【００６４】
【数１】
2011109952.tif 000002
【００６５】
また、テンの個体識別に対する各プライマーセットの有効性を判断するために、コンピュータソフトウェア「GIMLET version 1.3.3」(ナタニエル・ヴァリエール（Nathaniel Valiere）作 2002)を用いて個体判別確率(プロバビリティ・オブ・アイデンティティ（Probability of identity)）を計算した。
個体判別確率には、非血縁個体間の個体判別確率ＰＩtheoric（プロバビリティ・オブ・アイデンティティ・ビトウィーン・アンリレイティッド・インディビジュアルズ（probability of identity between unrelated individuals））と同胞個体間の個体判別確率ＰＩsibsプロバビリティ・オブ・アイデンティティ・ビトウィーン・シブリングス（probability of identity between siblings）がある。
【００６６】
非血縁個体間の個体判別確率（ＰＩtheoric）は、パートコー・ディ・アンド・ストロベック・シー（Paetkau D. & Strobeck C）著、マイクロサテライト・アナリシス・オブ・ジェネティック・バリエイション・イン・ブラック・ベア・ポピュレイションズ（Microsatellite analysis of genetic variation in black bear populations.）、「モレキュラー・エコロジー（Molecular Ecology）」、（米国）、１９９４年、第３巻、ｐ４８９−４９５の記載に従って計算した。
同胞個体間の個体判別確率（ＰＩsibs）は、タバーレット・ピー・アンド・ルイカート・ジー（Taberlet P. & Luikart G）著、ノンインベイシブ・ジェネティック・サンプリング・アンド・インディイジュアル・アイデンティフィケイション・データ（Non-invasive genetic sampling and individual identification.）、「バイオロジカル・ジャーナル・オブ・ザ・リンネン・ソサイティ（Biological Journal of the Linnean Society）」、（英国）、１９９９年、第６８巻、ｐ４１−５５の記載に従って計算した。
その結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2011109952.tif 000003
【００６８】
表１より知られるごとく、プライマーＡ〜プライマーＮよりなる第１〜第７プライマーセットにおいては、これら７つのプライマーセットを合わせた非血縁個体間の個体判別確率（ＰＩtheoric）が１．５４９×１０-7であり、同胞個体間の個体判別確率（ＰＩsibs）が２．２８３×１０-3であった。即ち、別個体でありながら同じ対立遺伝子型を持つものが出現する確率は、非血縁集団を想定した場合において１／６４５５５３１個体、同胞集団を想定した場合においても１／４３８個体と推定される。したがって、第１〜第７プライマーセットは、これらを組み合わせることにより十分な個体識別能を有していることがわかる。
なお、７つのプライマーセットを合わせたＰＩtheoric及びＰＩsibsは、各プライマーセットのＰＩtheoric及びＰＩsibsの値の積から算出した。
【００６９】
（実施例）
次に、野外サンプルによる実証実験を行う。
本例においては、野外の様々な場所で採取したテンの糞サンプルからＤＮＡを抽出し、第１〜第７プライマーセットを組み合わせて用いて個体識別を行う例である。
【００７０】
まず、テンが生息する熊本県内の森林に設定した任意の５つのルート（収集場所Ａ〜Ｅ）において、野生のテンの糞を５日間にわたり採取した。採取した糞は１００％エタノール中に保存した。
このようにして、１４５個のテンの糞の検体（試料Ｓ１〜試料Ｓ１４５）を得た。これらの検体は、実験に使用するまで、−２５℃のフリーザーで冷凍保存した。
【００７１】
次いで、キアゲン社製の「キアアンプ・ディーエヌエー・ストゥール・ミニ・キット（QIAamp DNA Stool Mini Kit）」を用いて、糞からＤＮＡを抽出した。抽出は添付のマニュアルに従って行った。
また、フォワード側プライマーを蛍光標識した各プライマーセット（第１プライマーセット〜第７プライマーセット）を合成した。
【００７２】
具体的には、第１プライマーセット（マーカー座：Ｍｍｅ−２）のフォワード側プライマー（プライマーＡ）、第２プライマーセット（マーカー座：Ｍｍｅ−３）のフォワード側プライマー（プライマーＣ）、及び第３プライマーセット（マーカー座：Ｍｍｅ−５）のフォワード側プライマー（プライマーＥ）には、５’末端側に、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）からなる蛍光標識物質を結合させた。
また、第４プライマーセット（マーカー座：Ｍａ−１）のフォワード側プライマー（プライマーＧ）には、５’末端側に、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）からなる蛍光標識物質を結合させた。
また、第５プライマーセット（マーカー座：Ｍａ−２）のフォワード側プライマー（プライマーＩ）、第６プライマーセット（マーカー座：Ｍａ−５）のフォワード側プライマー（プライマーＫ）、及び第７プライマーセット（マーカー座：Ｍａ−８）のフォワード側プライマー（プライマーＭ）には、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）からなる蛍光標識物質を結合させた。
【００７３】
次に、テンの糞から抽出した鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ)１．０μＬ、蛍光標識したフォワードプライマー(５０μＭ)及び未標識のリバースプライマー(５０μＭ)各０．１μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製の「TAKARA EX Taq（登録商標） ＨＳ (５ｕｎｉｔｓ／μＬ)」０．０５μＬ、酵素添付品の１０×ＰＣＲバッファー１．０μＬ、及びｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ) ０．８μＬの混合物を滅菌ｍｉｌｌｉ-Ｑ水で希釈して総量を１０μＬとした。
この混合液を以下のＰＣＲサイクル条件で反応させた。
ステップ１（１サイクル）：９５℃（２分）
ステップ２（３５サイクル）：９５℃（３０秒）→各プライマーセットのアニーリング温度Ｔａ（表１参照）（２０秒）→７２℃（２０秒）
【００７４】
次に、ＰＣＲ産物を、実験例と同様に、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）製の「3130 Genetic Analyzer」及びアプライド・バイオシステムズ社製の「The GeneScanTM 500 ROXTM Size Standard」を用いて検出し、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）製の「GeneMapper（登録商標） Software v4.0」により断片サイズを決定した。各操作は、添付のマニュアルに従って行った。
【００７５】
糞から抽出したＤＮＡはアレリック・ドロップアウト（allelic dropout）やフォールス・アレル（false allele）による判定エラーを引き起こしやすいことが知られている。そのため、ＰＣＲ増幅及び断片サイズの決定は、１検体あたり全ての座位について最低２回ずつ繰り返して行った。そして、２回とも同一の対立遺伝子型を示したものをその座位の対立遺伝子型とした。１回目と２回目の結果が異なる場合には、最高で５回目まで分析を繰り返し、２回以上同一の対立遺伝子型を示したものをその座位の対立遺伝子型とした。個体識別は、すべてのマーカー座について対立遺伝子型が決定できたサンプルのみを対象とし、コンピュータソフトウェア「サーバス・バージョン２．０（Cervus version２．０）」を用いて判定した。かかる判定は、マーシャル・ティ．シー（Marshall T.C.）、スレイト・ジェイ（Slate J.）、クルーク・エル（Kruuk L.）、ペンバートン・ジェイ・エム（Pemberton J.M.）著、スタティスティカル・コンフィデンス・フォー・ライクリフッド−ベースド・パターナティ・インフェレンス・イン・ナチュラル・ポピュレイションズ（Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations.）、「モレキュラー・エコロジー（Molecular Ecology）」、（米国）、１９９８年、第７巻、ｐ．６３９−６５５に記載に従って行った。
【００７６】
【表２】
2011109952.tif 000004
【００７７】
【表３】
2011109952.tif 000005
【００７８】
【表４】
2011109952.tif 000006
【００７９】
【表５】
2011109952.tif 000007
【００８０】
表２〜表５より知られるごとく、野外から採取したテンの糞サンプルによる実証実験では、全体の４９％にあたる７１検体において全てのマーカー座の対立遺伝子が決定できた。残りの７４検体のうち、６２検体では１つ以上のマーカー座で対立遺伝子が検出できたが、全体の８．３％にあたる１２検体ではいずれのマーカー座でも対立遺伝子が検出できなかった。これらの７４検体については、表２〜表５への記載を省略してある。
全てのマーカー座について対立遺伝子が決定できた７１検体について個体識別判定を行った結果、３５個体（個体Ｘ１〜Ｘ３５）について識別ができた（表２〜表５参照）。
これらの３５個体のうち、２７個体（個体Ｘ９〜個体Ｘ３５）は検出回数が１回のみであったが、残りの８個体（個体Ｘ１〜個体Ｘ８）は複数回にわたって検出できた。
【００８１】
また、個体Ｘ１〜個体Ｘ７については、複数日にまたがって糞が確認されており、少なくとも３日以上調査ルートに滞在していたことが明らかとなった。
以上のように、第１〜第７プライマーセットは、テンの生息個体数の推定及び行動権の把握に有用であることがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号：１はテン（マルテス・メランパス）の遺伝子座Ｍｍｅ−２のフォワード側プライマー（プライマーＡ）の塩基配列を示す。
配列番号：２はテン（マルテス・メランパス）の遺伝子座Ｍｍｅ−２のリバース側プライマー（プライマーＢ）の塩基配列を示す。
配列番号：３はテン（マルテス・メランパス）の遺伝子座Ｍｍｅ−３のフォワード側プライマー（プライマーＣ）の塩基配列を示す。
配列番号：４はテン（マルテス・メランパス）の遺伝子座Ｍｍｅ−３のリバース側プライマー（プライマーＤ）の塩基配列を示す。
配列番号：５はテン（マルテス・メランパス）の遺伝子座Ｍｍｅ−５のフォワード側プライマー（プライマーＥ）の塩基配列を示す。
配列番号：６はテン（マルテス・メランパス）の遺伝子座Ｍｍｅ−５のリバース側プライマー（プライマーＦ）の塩基配列を示す。
配列番号：７はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−１のフォワード側プライマー（プライマーＧ）の塩基配列を示す。
配列番号：８はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−１のリバース側プライマー（プライマーＨ）の塩基配列を示す。
配列番号：９はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−２のフォワード側プライマー（プライマーＩ）の塩基配列を示す。
配列番号：１０はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−２のリバース側プライマー（プライマーＪ）の塩基配列を示す。
配列番号：１１はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−５のフォワード側プライマー（プライマーＫ）の塩基配列を示す。
配列番号：１２はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−５のリバース側プライマー（プライマーＬ）の塩基配列を示す。
配列番号：１３はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−８のフォワード側プライマー（プライマーＭ）の塩基配列を示す。
配列番号：１４はテン（マルテス・アメリカーナ）の遺伝子座Ｍａ−８のリバース側プライマー（プライマーＮ）の塩基配列を示す。
配列番号：１５はプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１６はフォワード側プライマー（Ｍ１３プライマー）の塩基配列を示す。
配列番号：１７はリバース側プライマー（Ｍ１３プライマー）の塩基配列を示す。
【配列表】
2011109952000001.app