(57)【要約】      （修正有）【課題】筋変性疾患、特に筋ジストロフィーの病態モデル動物およびその製法、ならびに当該病態モデル動物を用いた筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】ジストロフィン遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされており、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）が高発現している、筋変性疾患の病態モデル動物の製造方法。該筋変性疾患の病態モデル動物を用いた、筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストロフィン遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされており、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）が高発現している筋変性疾患の病態モデル動物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）ジストロフィン遺伝子をノックダウンまたはノックアウトする工程；および／または
（ｂ）Ｈ−ＰＧＤＳを高発現させる工程
を含む製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られる筋変性疾患の病態モデル動物。
【請求項３】
下記工程：
（ａ）請求項２記載の動物に試験薬剤を投与する工程；
（ｂ）（ａ）で試験薬剤を投与した請求項２記載の動物における筋変性と、該薬剤を投与しなかった請求項２記載の動物における筋変性とを比較する工程；および
（ｃ）試験薬剤を投与した請求項２記載の動物における筋変性が該薬剤を投与しなかった請求項２記載の動物における筋変性よりも抑制されている場合に、該試験薬剤を筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤として同定する工程
を含む、筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
筋変性疾患が筋ジストロフィーである請求項１記載の方法、請求項２記載の動物、または請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋変性疾患、特に筋ジストロフィーの病態モデル動物およびその製法、ならびに当該病態モデル動物を用いた筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋障害あるいは筋壊死を伴う疾患群はミオパチーと呼ばれ、代表的な疾患として、筋ジストロフィー症、筋萎縮症等がある。筋ジストロフィーのうち最も患者数の多いデュシェンヌ型筋ジストロフィーは、点突然変異により１つのコドンがタンパク質の合成終了を意味するストップコドンに変化し、ジストロフィンタンパク質が合成されない病気である。性染色体劣性遺伝で男子だけに発症する疾患であり、人口１０万人あたり３〜５人、出生男児２０００〜３０００人あたり１人といわれている。通常、筋ジストロフィー患者は、３〜５歳頃に運動障害、すなわち、走れない、転びやすいなど歩行および起立に関する異常が発現し、１０歳前後に歩行不能となる。その後、脊柱の変形または関節拘縮が急速に進行し、多くの患者で呼吸不全、時に心不全または肺炎が起きる。筋ジストロフィー症に対する良好な治療手段は未だなく、治療法の開発が望まれている。
【０００３】
治療薬を開発する上では、ヒト病態を反映した筋ジストロフィーモデルが不可欠であり、ジストロフィン遺伝子を欠損したｍｄｘマウスや薬剤誘発筋壊死モデル動物（ラット、マウス）を用いて薬剤の治療効果が調べられている。
【０００４】
しかし、ｍｄｘマウスは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーと同様の遺伝子異常によって筋壊死病態を示すが、ヒト病態と異なり、筋肉の萎縮、呼吸不全および心不全といった重篤な症状を呈さない。さらに、健常成熟マウスの局所骨格筋でジストロフィン遺伝子をノックダウンして、ジストロフィンタンパク質の合成を阻害しても、顕著な筋壊死が誘導されないことが報告されている（非特許文献１）。また、薬剤誘発筋壊死モデル動物の筋壊死は一過性であり、長期の効果を評価することはできない。そのため、ヒトの病態を反映した齧歯類の筋ジストロフィーモデル動物の開発が望まれている。
【０００５】
また、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、Ｈ−ＰＧＤＳという）は、中枢ではマイクログリア、末梢では肥満細胞、Ｔｈ２リンパ球、および皮膚のランゲルハンス細胞等で発現している。また、Ｈ−ＰＧＤＳは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の壊死筋に発現すること、局所でＰＧＤ２を産生し、筋ジストロフィー病態の調節に強くかかわっていることが報告されている（非特許文献２）。さらに、Ｈ−ＰＧＤＳに特異的な阻害薬は、筋ジストロフィー病態の進行を著しく抑制することも報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hum Mol Genet. 17(17), 2622-32 (2008)
【非特許文献２】Acta Neuropathol. 104(4), 377-84 (2002)
【非特許文献３】Am J Pathol. 174(5), 1735-44 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑みて、ヒトの病態を反映した齧歯類の筋ジストロフィーモデル動物を開発するべく、鋭意研究を行ってきた。そして、骨格筋におけるジストロフィン遺伝子欠損（ノックダウンまたはノックアウト）によるジストロフィン蛋白質の合成阻害とＨ−ＰＧＤＳ遺伝子導入によるＨ−ＰＧＤＳタンパク質の高発現の組み合わせによって筋壊死病態が著しく亢進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に関するものである：
（１）ジストロフィン遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされており、造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｈ−ＰＧＤＳ）が高発現している筋変性疾患の病態モデル動物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）ジストロフィン遺伝子をノックダウンまたはノックアウトする工程；および／または
（ｂ）Ｈ−ＰＧＤＳを高発現させる工程
を含む製造方法；
（２）（１）記載の方法により得られる筋変性疾患の病態モデル動物；
（３）下記工程：
（ａ）（２）記載の動物に試験薬剤を投与する工程；
（ｂ）（ａ）で試験薬剤を投与した請求項２記載の動物における筋変性と、該薬剤を投与しなかった（２）記載の動物における筋変性とを比較する工程；および
（ｃ）試験薬剤を投与した（２）記載の動物における筋変性が該薬剤を投与しなかった請求項２記載の動物における筋変性よりも抑制されている場合に、該試験薬剤を筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤として同定する工程
を含む、筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤のスクリーニング方法；
（４）筋変性疾患が筋ジストロフィーである（１）記載の方法、（２）記載の動物、または（３）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来の病態モデル動物と比べて、より詳細に筋ジストロフィーに対する治療薬または予防薬の効果を判定することができる。さらに、本発明によって、筋変性疾患における病態発症と病態進展に係る分子を判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、AAV-shDmd4およびAAV-hHPGDSコンストラクトを筋肉内注射した9週間後の腓腹筋におけるGFPの発現を示す。
【図２】図２は、AAV-shDmd4 virus / salineコンストラクトを筋肉内注射した9週間後の腓腹筋におけるGFP の発現
【図３】図３は、AAV-shCTRL virus / AAV-hHPGDSコンストラクトを筋肉内注射した9週間後の腓腹筋におけるGFPの発現を示す。
【図４】図４は、AAV-shCTRLコンストラクトを筋肉内注射した9週間後の腓腹筋におけるGFPの発現を示す。
【図５】図５は、ＧＦＰ遺伝子発現量の比較（８週間後）を示す。
【図６】図６は、ヒトＨ−ＰＧＤＳ遺伝子発現量の比較（８週間後）を示す。
【図７】図７は、ジストロフィン遺伝子発現量の比較（４週間後）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
すなわち、本発明は、第１の態様において、ジストロフィン遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされており、Ｈ−ＰＧＤＳが高発現している筋変性疾患の病態モデル動物の製造方法に関する。本発明の動物は、齧歯類であってもよく、例えば、マウス、ラット、モルモット、フェレット、ハムスター、ウサギなどを用いて製造すればよい。また、上記筋変性疾患としては、例えば、筋ジストロフィーが挙げられ、筋ジストロフィーには、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、または眼筋型筋ジストロフィーなどが含まれる。
【００１２】
本発明において、ジストロフィン遺伝子の発現は、ノックダウンおよびノックアウトのいずれによって変更されてもよい。また、ジストロフィン遺伝子をノックダウンする場合、当該方法によって得ることができる動物において筋疾患変性疾患の病態が示されていればよく、ジストロフィン遺伝子の発現は、野生型の同種動物の発現レベルと比べて適宜低下していればよい。また、ジストロフィン遺伝子のノックダウンは、本発明の動物の全身、または骨格筋などの局所にて達成されていればよい。また、ジストロフィン遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするためには、公知の方法を使用すればよく、例えば、遺伝子の効率的な送達が可能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してもよい。
【００１３】
また、本発明において、Ｈ−ＰＧＤＳの高発現は公知の方法によって達成されてもよく、例えば、導入する動物にて使用し得る高発現用プロモーターに作動可能に連結したＨ−ＰＧＤＳ遺伝子を、公知の方法で細胞に導入することによって達成される。Ｈ−ＰＧＤＳの高発現は、当該方法によって得ることができる動物において筋疾患変性疾患の病態が示されていればよく、Ｈ−ＰＧＤＳの発現は、野生型の同種動物の発現レベルと比べて適宜上昇していればよい。Ｈ−ＰＧＤＳの高発現は、本発明の動物の全身、または骨格筋などの局所にて達成されていればよい。また、Ｈ−ＰＧＤＳ遺伝子の導入は、公知の方法、例えば、遺伝子の効率的な送達が可能なＡＡＶを使用する導入系を使用すればよい。
【００１４】
本発明の動物におけるジストロフィン遺伝子のノックダウンまたはノックアウト、およびＨ−ＰＧＤＳ遺伝子の高発現は、いずれか一方のみであってもよく、両方達成されていてもよい。さらに、本発明の動物において、ジストロフィンおよびＨ−ＰＧＤＳ以外にも特定の遺伝子の発現が、本発明の動物の全身または局所にて上昇または低下されていてもよい。
【００１５】
なお、上記筋疾患変性疾患の病態としては、例えば、骨格筋における細胞の再生速度低下が挙げられ、細胞の再生速度低下は筋壊死の亢進に起因してもよい。本発明において、筋疾患変性疾患の病態の有無および重症度は、動物の外観から判定してもよいが、分子生物学的、組織学的または病理学的手段など当業者に公知の方法によって判定してもよい。
【００１６】
また、本発明は、第２の態様において、第１の態様において製造された筋変性疾患の病態モデル動物に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、第３の態様において、上記筋変性疾患の病態モデル動物を用いた、筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、例えば、（ａ）第１の態様において製造された動物に試験薬剤を投与する工程；（ｂ）（ａ）で試験薬剤を投与した動物における筋変性と、第１の態様において製造され、該薬剤を投与しなかった動物における筋変性とを比較する工程；および（ｃ）試験薬剤を投与した動物における筋変性が該薬剤を投与しなかった動物における筋変性よりも抑制されている場合に、該試験薬剤を筋変性疾患の治療剤およびまたは予防剤として同定する工程を含んでもよい。
【００１８】
上記薬剤は、動物の状態、薬剤の種類、投与方法に応じて適宜投与されればよい。上記薬剤の投与経路は、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などのいずれであってもよい。本発明において、試験薬剤の効果の確認は、動物の外観から判定してもよいが、分子生物学的、組織学的または病理学的手段など当業者に公知の方法によって判定してもよい。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、上記スクリーニング方法により得ることのできる、筋変性疾患を治療または予防する物質に関するものである。また、このような物質を、任意の担体または賦形剤と組み合わせて、筋変性疾患を治療または予防する目的で使用してもよい。
【００２０】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例はあくまで例示説明であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
ＡＡＶ８−ｓｈＣＴＲＬ−ｈｒＧＦＰ、ＡＡＶ８−ｓｈＤｍｄ−ｈｒＧＦＰおよびＡＡＶ８−ＨＰＧＤＳコンストラクトの構築および精製
ｐＵＣベースのプラスミドであるｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ（ストラタジーン社製）のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの上流にＨ１プロモーターを配置し、その転写制御下に、ジストロフィンのノックダウンを目的としたショートヘアピン配列であるｓｈＤｍｄ、または陰性対照としてｓｈＣＴＲＬをそれぞれ配置し、ｐＡＡＶ−ｓｈＤｍｄ−ｈｒＧＦＰおよびｐＡＡＶ−ｓｈＣＴＲＬ−ｈｒＧＦＰを構築した。また、ｐＵＣベースのプラスミドであるｐＡＡＶ−ＭＣＳ（ストラタジーン製）のＣＭＶプロモーター制御下にヒトＨＰＧＤＳ遺伝子を配置することにより、ｐＡＡＶ−ＨＰＧＤＳを構築した。
【００２２】
組換えＡＡＶビリオンを、以下のように、ＡＡＶ２９３細胞（ストラタジーン社製）にて産生した。このＡＡＶ２９３細胞を、完全ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）（４．５ｇ／Ｌ グルコース、１０％  非動化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＧＩＢＣＯ社製）、および２ｍＭ  グルタミンを含む）中で培養した。サブコンフルエントなＡＡＶ２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿（例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＥＴ  ＡＬ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”,  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）により、ＡＡＶの発現カセットを有するｐＡＡＶ−ｓｈＣＴＲＬ−ｈｒＧＦＰ、ｐＡＡＶ−ｓｈＤｍｄ−ｈｒＧＦＰまたはｐＡＡＶ−Ｈ−ＰＧＤＳ、ｐＡＡＶ−２／８（ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む）ならびにｐＨｅｌｐｅｒ（Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ遺伝子を含む；ストラタジーン社製）の３種類のプラスミドを同時に形質移入した。６時間後、完全ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに３７℃、５％  ＣＯ２にて７２時間培養した。培養細胞を回収し、遠心分離した後で、ペレット化した細胞をＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）中で凍結／融解を４回繰り返した。そして、夾雑するゲノムＤＮＡを分解するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を最終濃度５０Ｕ／ｍｌで添加し、３７℃にて１時間反応させた。この溶解液を７，０００ｇで２０分間遠心分離して、上清を回収した。
【００２３】
それぞれの上清を、Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ(シグマアルドリッチ社製)を用いた密度勾配遠心分離に供し、４０％  Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ画分を回収した。溶媒をＩｏｄｉｘａｎｏｌからＰＢＳに交換するために、限外濾過膜（セントリコン１００Ｋ、ミリポア社製）を用いて、複数回の遠心分離を実施した。得られたウイルス溶液はそれぞれＡＡＶ８−ｓｈＣＴＲＬ−ｈｒＧＦＰ、ＡＡＶ８−ｓｈＤｍｄ−ｈｒＧＦＰおよびＡＡＶ８−Ｈ−ＰＧＤＳコンストラクトを含む（表１を参照のこと）。
【００２４】
【表１】
2011019446.tif 000002
これらのウイルス溶液をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理し、定量リアルタイムＰＣＲ法に供し、ベクター力価を決定した。
【実施例２】
【００２５】
各ベクターのインビボ投与による局所遺伝子ノックダウンおよび局所高発現
ウイルスベクターの効率的な送達により、ラット骨格筋に対するジストロフィン遺伝子のノックダウンおよびＨ−ＰＧＤＳ過剰発現の影響を調べた。
【００２６】
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（４週齢、日本エスエルシーより入手した）について、吸入麻酔（イソフルラン（１．５％）の存在下で、実施例１にて調製した各ＡＡＶコンストラクトをラットの後肢腓腹筋肉内に注射した。検討したコンストラクトの組み合わせを以下に示す。
【００２７】
【表２】
2011019446.tif 000003
ジストロフィン遺伝子のノックダウンあるいはヒトＨ−ＰＧＤＳ過剰発現による表現型を調べるために、各コンストラクトをラットの腓腹筋に注射の２週間、４週間、６週間および８週間後にサンプリングを行った。サンプリング方法は、以下の通りである。
【００２８】
ラットに過剰量のペントバルビタールを腹腔内投与（用量１００  ｍｇ／ｋｇ）して安楽死させ、ＰＢＳで全身を灌流し、腓腹筋を摘出した。摘出組織を、直ちに−７０℃程度まで冷却したイソペンタン中で凍結させた。凍結させた組織は、ＲＮＡ抽出、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学染色の検討まで−８０℃で凍結保存した。あるいは、過剰量のペントバルビタールを腹腔内投与（用量１００  ｍｇ／ｋｇ）して安楽死させ、ＰＢＳで全身を灌流し、続いて中性緩衝化１０％ホルマリン溶液（シグマアルドリッチ社製）で灌流固定後に組織を摘出し、２０％スクロースで平衡化し、これを４℃で保存した。
【００２９】
無固定凍結試料あるいはホルマリン固定後のサンプルを低温槽に配置し、５〜１０ミクロン（μｍ）の切片を収集した。サンプルの一部に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色、免疫組織化学染色、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を指標とした蛍光染色を行った。
【００３０】
ＰＣＲによる分析
生理食塩水を筋肉内注射したラットの組織を陰性対照として、腓腹筋組織中の遺伝子発現変動を定量ＰＣＲ法で調べた結果、ジストロフィン遺伝子について、ＡＡＶ投与（感染）の４週間後から有意な発現低下が検出された。一方で、ヒトＨ−ＰＧＤ合成酵素遺伝子の発現は、ＡＡＶ投与（感染）の２週間後から検出され、８週間後まで持続した。
【００３１】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を指標とした蛍光染色による分析
ＡＡＶ感染の指標としたＧＦＰ遺伝子は、ＡＡＶ投与（感染）の２週間後から検出され、８週間後まで持続した。
【００３２】
免疫組織化学染色法による分析
５〜１０μｍの薄切片をＰＢＳで洗浄し、０．３％Ｈ２Ｏ２で３０分間処理して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。ＰＢＳで再び洗浄し、続いてブロッキング溶液（ＰＢＳ中１０％ヤギ血清および０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中、室温で１時間インキュベートした。次にサンプルを、抗ジストロフィン−マウスモノクローナル抗体（ノボカストラ社製）（１：１００）、または抗ヒトＨ−ＰＧＤＳ−マウスモノクローナル抗体（１：５００００）と４℃で１晩インキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：２００）と室温で１時間インキュベートし、再度ＰＢＳで洗浄した。抗体結合を、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：３００）を用いて可視化した。
【００３３】
各コンストラクトを骨格筋に注射し、４週間後に免疫組織化学染色法により分析を行ったところ、グループ１、２および５では、腓腹筋細胞（筋繊維）でジストロフィンタンパク質が検出されなかったかあるいは減少していた。一方で、グループ３および４では、ＡＡＶ処理を行わなかった未処置群（グループ６）と同様に、腓腹筋細胞（筋繊維）でジストロフィンタンパク質が検出された。また、グループ１、３および４で、腓腹筋細胞（筋繊維）でヒトＨ−ＰＧＤＳタンパク質が検出された。しかし、グループ３および４では、ＡＡＶ処理を行わなかった未処置群（グループ６）と同様に、腓腹筋細胞（筋繊維）でヒトＨ−ＰＧＤＳタンパク質が検出されなかった。
【００３４】
以上の結果から、ＡＡＶコンストラクトを注射（感染させた）後、遅くとも４週間後には、ジストロフィン遺伝子のノックダウンおよびヒト−Ｈ−ＰＧＤＳ遺伝子の過剰発現が達成され、その効果は８週間以上持続することを確認した。
【００３５】
さらに、ＡＡＶコンストラクトを注射（感染させた）した９週間後の遺伝子発現をＧＦＰタンパク質の蛍光強度を指標として組織学的に調べたところ、ジストロフィン遺伝子ノックダウンおよびヒト−Ｈ−ＰＧＤＳ遺伝子高発現を目的としたコンストラクトを注射したグループ（グループ１）のみが、ＧＦＰタンパク質の発現が強かった。一方、他のグループでは、ＧＦＰタンパク質の発現が低下していた。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、従来の病態モデル動物と比べて、より詳細に筋ジストロフィーなどの筋変性疾患に対する治療薬または予防薬の効果を判定することができ、より効率的な治療薬および予防薬の開発が可能になる。さらに、本発明によって、筋変性疾患における病態発症と病態進展に係る分子を判別することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
SEQ ID NO:1；short hairpin sequence for dystrophin gene knockout
【図１】
2011019446.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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