(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子保存容器および粒子の保存方法を提供することにある。【解決手段】  生物由来物質を固定化するための複数の粒子と、前記複数粒子を覆う樹脂材料の被覆体とを有することを特徴とする粒子複合体と、先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有する容器本体と、粒子複合体を保持する格子状の受け具から形成されることを特徴とする粒子複合体、および先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に格子状の受け具を挿入する工程と、粒子複合体を容器本体の内部に挿入し、格子状の受け具の上面に設置する充填工程を有することを特徴とする工程からなる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来物質を固定化するための複数の粒子と、前記複数粒子を覆う樹脂材料の被覆体とを有することを特徴とする粒子複合体。
【請求項２】
前記複数の粒子は、分散液に分散した状態で、前記被覆体で覆われているものである請求項１に記載の粒子複合体。
【請求項３】
前記被覆体は、先端の鋭利なものにより開裂することが可能なものである請求項１または２に記載の粒子複合体。
【請求項４】
前記被覆体は、厚さ２００μｍ以下のプラスチックフィルム、半透膜、ゴムで構成されているものである請求項１ないし３のいずれかに記載の粒子複合体。
【請求項５】
平均粒子径が０．１〜１０ｍｍである請求項１ないし４のいずれかに記載の粒子複合体。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の粒子複合体が充填されていることを特徴とする保存容器。
【請求項７】
先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有する容器本体で構成される請求項６に記載の保存容器。
【請求項８】
前記容器本体の内部に、前記粒子複合体を保持する保持手段が設けられている請求項７に記載の保存容器。
【請求項９】
前記保持手段は、前記粒子複合体を通過しないサイズの格子を有する格子状の受け具である請求項８に記載の保存容器。
【請求項１０】
保存容器に粒子複合体を充填する工程と、
前記粒子複合体を開裂して粒子を取り出す工程とを有することを特徴とする粒子複合体の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の粒子を覆う樹脂材料の被覆体からなる粒子粒子複合体、粒子複合体保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズなど表面を活性化させた粒子が多数市販されている（非特許文献１）。しかし、それらの大半は水溶液あるいは有機溶媒の分散液として保存し、使用時に必要量分取するという使用方法である（特許文献２）。しかし、粒子のような固体を液体中に均一に分散させるのは困難であり、使用毎に分取量が変化してしまう。また、処理する検体数が多い場合、分散液を反応容器に移すのに手間がかかるという欠点があった。
【０００３】
この様な背景から、あらかじめ一定量の粒子が反応容器に保存された状態での提供が求められる。カラムにあらかじめ粒子が封入された状態で販売されている例もあるが、分散液での保存、乾燥状態での保存ともに容器の表面等に付着してしまうことで一部の粒子を損失してしまう場合があった。また、粒子を封入している容器から他の別の容器に移したい場合、粒子を完全に回収するのに手間がかかる上、一部の粒子を損失する場合があった。特に、少量の粒子を反応に用いるような系の場合、そのことが原因で結果にばらつきが生じやすくなってしまう。
【０００４】
そこで、粒子の損失を低減し、且つ、表面の活性基を失活させることなく保存する方法が必要とされる。また、保存した粒子を容易に他の反応容器に持ち込むことが可能な方法が必要である。さらに、ハイスループット処理を可能にするためには、多検体処理に向いている使用法であったり、自動化に対応可能な使用法であったりすることが必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献２】特表２００８−５３６８２１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ナノアフィニティビーズのすべて  半田宏、川口春馬  著  中山書店
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子複合体、粒子複合体の保存容器および粒子複合体の保存方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的は、下記（１）〜（１０）に記載の本発明により達成される。
（１）生物由来物質を固定化するための複数の粒子と、前記複数粒子を覆う樹脂材料の被覆体と、を有することを特徴とする粒子複合体。
（２）前記複数の粒子は、分散液に分散した状態で、前記被覆体で覆われているものである（１）に記載の粒子複合体。
（３）前記被覆体は、先端の鋭利なものにより開裂することが可能なものである（１）または（２）に記載の粒子複合体。
（４）前記被覆体は、厚さ２００μｍ以下のプラスチックフィルム、半透膜、ゴムで構成されているものである（１）ないし（３）のいずれかに記載の粒子複合体。
（５）平均粒子径が０．１〜１０ｍｍである（１）ないし（４）のいずれかに記載の粒子複合体。
（６）（１）ないし（５）のいずれかに記載の粒子複合体が充填されていることを特徴とする保存容器。
（７）先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有する容器本体で構成される（６）に記載の保存容器。
（８）前記容器本体の内部に、前記粒子複合体を保持する保持手段が設けられている（７）に記載の保存容器。
（９）前記保持手段は、前記粒子複合体を通過しないサイズの格子を有する格子状の受け具である（８）に記載の保存容器。
（１０）保存容器に粒子複合体を充填する工程と、前記粒子複合体を開裂して粒子を取り出す工程とを有することを特徴とする粒子複合体の保存方法。  
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、粒子の損失を低減し、かつ表面の活性基の失活を低減することができる粒子複合体保存容器および粒子の保存方法を得ることができる。
また、本発明によれば、上述の保存容器を用いた効率の良い生化学試料の検査方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】保存容器の外観図
【図２】保存容器１の外観図
【図３】格子状の受け具の平面図
【図４】マルチウェルプレート形状の保存容器の外観図
【図５】保存容器の使用方法概略図
【図６】粒子複合体１のウシＩｇＧ由来糖鎖（２ＡＢラベル）のＨＰＬＣチャート
【図７】粒子複合体２のウシＩｇＧ由来糖鎖（２ＡＢラベル）のＨＰＬＣチャート
【図８】保存容器による保存を行っていない粒子を使用して検出したウシＩｇＧ由来糖鎖（２ＡＢラベル）のＨＰＬＣチャート
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の粒子保存容器、粒子保存方法および生化学試料の検査方法について説明する。
本発明の粒子保存容器は、先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、粒子分散液を保持した袋状のものと、格子状の受け具を有することを特徴する。
また、本発明の粒子の保存方法は、先端が開口し、先細り形状をなす突出部および基端が開口した基端開口部を有し、内部に格子状の受け部を有する容器に、粒子分散液を袋状の被覆体に封入したものを挿入する工程とを有することを特徴とする。
また、本発明の生化学試料の検査方法は、上記に記載の粒子保存容器を用いることを特徴とする。
【００１２】
（粒子封入体）
＜実施形態＞
【００１３】
粒子分散液を封入する被覆体の物質の材質は、粒子分散液を封入した状態で安定な材質からなるものであれば特に限定するものではないが、容易に開裂できるものであることが必要であるので、プラスチック製、半透膜製、または薄膜ゴム製であることが好ましい。また、全面が同一素材である必要もなく、複数種の材質からなるものでも構わない。例えば、材質の異なる２枚のフィルムを張り合わせて袋状にしても良い。
またその形状は、中に液体を封入できれば良く、前述のように袋状のものが好ましい。液体を封入する工程は特に限定するものでないが、円筒状のチューブの一端を接着、溶着または結束により封じ、液体を入れた後、もう一方の端を接着または溶着する方法。徳利型に成形した後、液体を内部に入れ、口を接着、溶着または結束して閉じる方法などが採用できる。
【００１４】
開裂の方法は特に限定するものでないが、先端の鋭利なもので封入体を突き刺し開裂させる方法が簡便である。先端の鋭利なものとしては、１８〜２４Ｇの注射針などが使用できるが、分注用のピペットの先端やディスペンサーチップの先端部なども使用可能である。
ピペットやディスペンサーチップは、本体内に洗浄液を溜めた状態で使用することも可能であり、封入体を破って内容物を漏出させた後、直ちに洗浄液で洗浄することも可能で効率的である。
また、薄膜ゴム製の被覆体は、伸縮性のある材質を用いることで、開裂時に被覆体が収縮し容易に内容物を漏出させることが可能となり簡便である。
【００１５】
次に、粒子保存容器について、図１〜５に示す好適な実施形態に基づいて詳細に説明する。
図１に示すように粒子保存容器１００は、筒状の容器本体１と、粒子分散液を保持した袋状の物質２と、格子状の受け具３とで構成されている。
図２に示すように、筒状の容器本体１は、に先端が開口した突出開口部１１１を有する先細り形状をなす突出部１１と、基端が開口した基端開口部１２とを有している。さらに、図３に示す、格子状の受け具を基端開口部１２より入れ先細りをなす手前に装着することで、これにより、粒子分散液を保持した袋状の物質粒子を基端開口部１２から入れ容器本体中に保持することが可能となる。
【００１６】
容器本体１の形状は、図１に示す実施形態では円筒状であるが、これに限定されず角筒状でも良いが、円筒状（より具体的にはチューブ状）であることが好ましい。このような容器本体１の幅は、特に限定されないが、幅０．５ｍｍ〜５０ｍｍが好ましく、より好ましくは１ｍｍ〜２０ｍｍであり、さらに好ましくは１．５ｍｍ〜１０ｍｍである。
また、長さ（突出部１１を含む全体の長さ）は２．５ｍｍ〜２００ｍｍが好ましく、より好ましくは５ｍｍ〜１００ｍｍであり、さらに好ましくは１０ｍｍ〜５０ｍｍである。容器本体１のサイズが前記範囲内であると、特に生体試料由来のサンプルのように少量のサンプルを扱う際サンプル損失を最小限に抑えることができるという点で優れる。
【００１７】
突出開口部１１１の内径は、保存する粒子の大きさに依存して特に限定されないが、０．１〜２０ｍｍが好ましく、特に０．２〜５ｍｍが好ましく、最も０．５〜３ｍｍが好ましい。突出開口部１１１の内径が前記範囲内であると、特に粒子の排出を効率良く実施することができる。
また、突出部１１の長さも特に限定されないが、１〜５０ｍｍが好ましく、特に２〜２５ｍｍが好ましく、最も３〜１５ｍｍが好ましい。突出部１１の長さが前記範囲内であると、微粒子の損失を最小限に抑えられる点に優れる。
【００１８】
本容器は１本でもその用を果たすが、ハイスループットスクリーニング等で効率を上げるために、本容器を並べて、マルチウェルプレートの形状にすることも可能である。例えば、図４に示したような８ｘ１２列に同じ容器を並べた９６ウェルプレート対応のものを作ることにより、９６ウェルプレートを用いたハイスループットスクリーニングに用いることが可能である。
【００１９】
容器本体を構成する材料としては、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等が挙げられる。これらの中でもポリプロピレンが好ましい。これにより、溶剤耐性を向上することができる。
【００２０】
容器本体１は、透明、半透明、不透明でも構わないが、透明または半透明であることが好ましい。これにより、容器本体内の内容物の状態を確認することができる。
このような容器本体１１は、例えば射出成形法やプレス成形により得ることができる。
【００２１】
図４に示すように９６ウェルプレート形状の容器本体も、前述と同じ樹脂、同じ成形方法により得ることができるが、自動分注装置または、自動測定装置に装着する必要から寸法精度を高めることが重要であり、そのことから９６ウェルプレート形状の容器は射出成形法で成形することが望ましい。
また、９６ウェルプレート形状の一体成形品でも、個々の部品、例えば、プレート部と個別容器部分など、をそれぞれ成形し、接着や溶着により一体化させ組み立てることも可能である。
【００２２】
９６ウェルプレート形状の容器本体は、ウェルの中心間の距離が９ｍｍであることが好ましく、これは市販されている９６ウェルのマイクロプレートとの形状の整合性を取るためには重要である。また、ウェルの中心間の距離を９ｍｍに保つためにはウェルの内径を５ｍｍ〜７ｍｍにすることが好ましく、さらに６ｍｍ〜７ｍｍであることが好ましい。
【００２３】
格子状の受け具２は、容器本体１に粒子分散液を封入した袋状のものから粒子分散液を回収する場合において、開裂させた後の残渣が吐出開口部への流入を防止するためのものであり、本受け具が無い場合には、吐出開口部に開裂した後の残渣が詰まり、粒子分散液の回収の妨げになる場合が生じる。
【００２４】
格子状の受け具の材質は、溶液に侵されないものであれば特に限定するものではないが、樹脂成形品、金属、または樹脂線維を編んだものが好ましい。
格子の孔のサイズは、特に限定されないが、粒子複合体を受け具の上に保持し、かつ開裂後粒子が通過できることが必要であり、具体的には一辺５〜０．５ｍｍが好ましく、特に２〜１ｍｍであることが好ましい。また、その形状も、特に限定するものではないが、図３に示すように編み目状になったもの（図３−ａ）、放射状になったもの（図３−ｂ）などが好ましい。
【００２５】
以下に実施例を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
【００２６】
以下は粒子を効率良く容器内に保存し、必要時に容易に回収可能な方法に関するものである。
本発明は、小分けにした粒子を容器内で保存する従来法の問題点を解決するためになされたもので、その目的とするところは微粒子を失ったり表面の活性基を失活したりすることなく、微粒子を効率よく容器内に保存する方法、およびハイスループット処理が可能な形で保存する方法を提供することにある。
本発明の微粒子保存方法によれば、一定量の微粒子を反応容器に容易に導入することが可能となる。この際、従来問題となっていた微粒子の減少を最小限に抑えることが可能である。また、微粒子を封入する部分を複数個連結させることで、作業の効率化も図れる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
＜実施例１＞
（１）粒子保存容器の作製  
縦幅３８ｍｍ、横幅８．２ｍｍ、下部開口部の形状は円形で直径２．２ｍｍ、突出部が２０ｍｍである容器本体を原材料としてポリプロピレン樹脂（株式会社プライムポリマー製、Ｊ２３５Ｔ）を用いて射出成形にて作製した。格子状の受け具も、ポリプロピレン樹脂（株式会社プライムポリマー製、Ｊ２３５Ｔ）を用いて射出成形にて作製し、容器本体に挿入した。
【００２９】
（２）粒子複合体１の作製
透析チューブ（セロファン透析チューブ［Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｔｕｂｅ、三光純薬：分画分子量12,000〜14,000］）を２ｃｍの長さに切断し超純水に浸した後、一方の端から０．５ｃｍの箇所を木綿糸で縛って袋状にする。
ヒドラジド基含有ビーズ分散液（ポリマー粒子、球状、０．１ｍｇ／ｕＬ、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）５０μＬを透析チューブの袋の中に分注した後、もう一方の開口部を同じように木綿糸で縛って袋状にし粒子複合体を作製した。
作製した粒子複合体を実施例１に記載した容器に入れ、粒子複合体を有す容器を完成させた。
【００３０】
（３）粒子複合体２の作製
シリコーンゴムを用いて、全長が１８ｍｍ、内径が４ｍｍ、外径が４．２ｍｍである一端が封止され、もう一端が開放されたＵ字形上のバルーンを成形した。
ヒドラジド基含有ビーズ分散液（ポリマー粒子、球状、０．１ｍｇ／ｕＬ、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）５０μＬを透析チューブの袋の中に分注した後、開口部を針金で結束して袋状の粒子複合体を作製した。
作製した粒子複合体を実施例１に記載した容器に入れ、粒子複合体を有す容器を完成させた。
（４）微粒子の回収
続いて行う微粒子の反応に使用する新たな反応容器（フィルターカラム、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）を準備した。保存容器の下部開口部の真下にフィルターカラムが来るように設置した。（１）で作製した透析膜からなる粒子複合体は、保存容器上部から、ディスペンサーを用いて、チップ先端で粒子複合体を突き刺して内容物を漏出させ、さらに超純水２００μL加え、フィルターカラムに排出した。また、（２）で作製したシリコーンゴムからなる粒子複合体は、保存容器上部から、注射針を用いて、先端で粒子複合体を突き刺して内容物を漏出させ、さらに超純水２００μL加え、フィルターカラムに排出した。
目視観察しながらさらに容器内に超純水２００μLを加え、容器内に残っている粒子をすべてフィルターカラムに排出させた。
最後に、フィルターカラムを遠心させフィルターカラム内に溜まった水を完全に排出させた。
（５）微粒子の性能確認
（Ａ）試料の作製
ウシ免疫グロブリンＧ（ウシＩｇＧ）１ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
【００３１】
（Ｂ）微粒子と生体試料の反応
予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させビーズ上のヒドラジド基に糖を固定させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にてビーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にてビーズを洗浄した。
ビーズの入ったディスポカラムに超純水２０μLおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１時間反応させビーズ上の糖鎖を切り出した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発しビーズが乾固した状態であることを目視で確認した。
【００３２】
（Ｃ）標識化工程
ビーズの入ったディスポカラムに、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μLを添加し、６０℃で２時間反応させた。
【００３３】
（Ｄ）余剰試薬除去工程
反応溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、付属のクリーンアップカラムに吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
【００３４】
（Ｅ）標識化糖鎖の検出
得られた標識糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミドカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ａｍｉｄｅ−８０  ４．６＊２５０）を用いて励起波長３３０ ｎｍ、蛍光波長４２０ ｎｍにて測定した。溶媒Ａは５０ｍＭギ酸、２５％アンモニア水にてｐＨ４．４に調整したものを使用し、溶媒Ｂとしてアセトニトリルを使用し、溶媒Ａ液２０％  （０ｍｉｎ）→Ａ液５８％（１５８ｍｉｎ）で送液した。カラム温度は３０℃で流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００３５】
＜参考例＞
実施例１で用いたヒドラジドビーズを、上述した粒子保存容器内で保存することなく、直ぐに標識化糖鎖の検出を行った。得られた結果を、図８に示す。実線は、ウシＩｇＧ糖鎖由来ピークである。
参考例の結果で得られたウシＩｇＧ糖鎖由来ピークと、粒子複合体１、２を用いた検討で得られたウシＩｇＧ糖鎖由来ピークに大きな相違は無かった。
これより、本発明の粒子保存容器を用いて粒子を保存しても粒子表面の活性基の失活及び（微）粒子の損失がほとんどないことが分かった。
【符号の説明】
【００３６】
１      容器本体
１１    突出部
１２    基端開口部
１１１  突出部開口部
１００  粒子保存容器
２      粒子複合体
３      格子状受け具
４      ディスペンサーチップ
５      開裂後の粒子複合体残渣
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の粒子複合体は、抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズ等の微粒子を一定量任意の容器に保存するのに使用できる。また、他の反応容器に微粒子を移し替えも容易に可能であり、例えば、９６穴型マイクロプレートに対応した保存容器形状とすることで、ハイスループットに微粒子の移し替えが可能となる。保存容器から微粒子を排出させる方法が単純なため、ロボットによる自動処理にも対抗が可能である。また、一連の操作により微粒子の有する活性基等を破壊することもない。使用毎に量り取る手間や、ロスを心配することなく微粒子保存するのに適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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