(57)【要約】      （修正有）【課題】長鎖リン脂質と短鎖リン脂質の溶解物から特定温度領域で形成される円盤状のミセル集合体（バイセル(Bicelle)）の磁場配向領域（磁場配向性のバイセルが形成される条件）を拡大するように調製されたバイセルを提供する。【解決手段】長鎖リン脂質と短鎖リン脂質とからなるバイセル用組成に、配向増強剤として極性頭部にイノシトール骨格を持つ特異的構造のリン脂質を加えることにより、円盤状のミセル集合体（バイセル)を形成する磁場配向領域が拡大される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式
【化１】
2011089946.tif 000012
で表わされるリン脂質Ａ（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、ぞれぞれ独立して、炭素数が４〜６である直鎖飽和炭素鎖である。）、
下式
【化２】
2011089946.tif 000013
で表わされるリン脂質Ｂ（式中、Ｒ２１及びＲ２２は、ぞれぞれ独立して、炭素数が１１〜１５である直鎖飽和炭素鎖である。）、
下式
【化３】
2011089946.tif 000014
で表わされるリン脂質Ｃ（式中、Ｒ３１は、水素原子又は−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は炭素数が１〜２１である直鎖炭素鎖を表す。）を表し、Ｒ３２は、炭素数が７〜２１である直鎖炭素鎖を表し、Ｒ３３、Ｒ３４及びＲ３５は、ぞれぞれ独立して、水素原子又はリン酸基（−ＯＰＯ３Ｈ２）を表す。）
及び下式
【化４】
2011089946.tif 000015
で表わされるリン脂質Ｄ（式中、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、炭素数が１１〜２１である直鎖炭素鎖である。）から成るリン脂質混合物であって、リン脂質Ａ〜Ｄの合計に対する、リン脂質Ａ、リン脂質Ｂ、リン脂質Ｃ及びリン脂質Ｄのモル比をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとした場合、Ａ＞０、Ｂ＞０、Ｃ＞０、Ｄ≧０であって、（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）／Ａ＝２．５〜６．０、及びＣ／（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）≦０．５を満たし、更にリン脂質Ｂ、Ｃ及びＤのうち、（不飽和結合を含まないリン脂質のモル数の合計）／（不飽和結合を含むリン脂質のモル数の合計）の比が１以上であるリン脂質混合物。
【請求項２】
（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）／Ａ＝３．０〜４．０である請求項１に記載のリン脂質混合物。
【請求項３】
Ｄ＝０である請求項１又は２に記載のリン脂質混合物。
【請求項４】
Ｄ＞０である請求項１又は２に記載のリン脂質混合物。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のリン脂質混合物を、水和率（＝水（又は緩衝液）／（リン脂質混合物＋水（又は緩衝液）））が６０〜８５重量％となるように、水又は緩衝液に溶解してなり、Ｄ＝０の場合、３０〜４０℃の温度下に置かれ、又はＤ＞０の場合、１５〜４０℃の温度下に置かれ、形態が円盤状のミセル集合体である、４Ｔ（テスラ）以上の磁場で自発配向するバイセル。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のリン脂質混合物を、水和率（＝水（又は緩衝液）／（リン脂質混合物＋水（又は緩衝液）））が６０〜８５重量％となるように、水又は緩衝液に溶解し、Ｄ＝０の場合、３０〜４０℃の温度下に置き、又はＤ＞０の場合、１５〜４０℃の温度下に置くことから成る、形態が円盤状のミセル集合体であるバイセルの形成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、磁場中で自発配向する、長鎖リン脂質及び短鎖リン脂質から構成されたバイセルに関し、より詳細には、配向増強剤を添加して磁場配向領域が拡大されたバイセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
長鎖リン脂質と短鎖リン脂質（又は界面活性剤）から特定温度領域で形成される円盤状のミセル集合体である脂質膜（図１Ａ、通常"バイセル(Bicelle)"と呼ばれる。）は、磁場存在下で自発的に配向する（非特許文献１）。飽和アシル鎖を持つ長鎖リン脂質と短鎖リン脂質のみから調製される一般のバイセルは、自発磁場配向が長鎖リン脂質の液晶−ゲル相転移点以上で成立し、その温度範囲は３０〜４０℃である。また、液晶−ゲル相転移点が飽和脂質より低い不飽和アシル鎖を持つ脂質を適切な割合で添加することにより、より低温で自発磁場配向するバイセルが開発されている（非特許文献２）。
このような自発磁場配向するバイセルに、膜タンパク質のような分子を、結合させ又は挿入して、その状態で機能を発現させて、溶液及び固体核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いて非破壊で分子内部の構造や運動性に関する情報を取得することができる。そのため、バイセルは、様々な生体分子の溶液ＮＭＲによる構造解析（非特許文献３）や固体ＮＭＲによる構造解析（非特許文献４）に利用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Prog. NMR Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
【非特許文献２】Biophys. J. 91, 1357-1367(2006)
【非特許文献３】Prog. NMR Spectrosc. 40, 175-197 (2002).
【非特許文献４】Boichemistry vol.45, Num.28, 8453-8465(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
最近開発されたより低温で自発磁場配向するバイセル（非特許文献２）について、本発明者らは、文献に従ってリン脂質混合物を調製し、温度を変えてＮＭＲ測定を行ったところ、１６〜１７℃という比較的低温で形成されたバイセルが自発的に磁場配向することを確認したが、２℃以内という極めて狭い温度範囲でのみ十分な磁場配向が達成されることが判明した（後記の比較例１）。しかし、実際の使用において常にこの温度範囲内にバイセルを保つことは困難であり、このバイセルは実用性がないことが判明した。
そこで、本発明は、従来技術の問題点を解消し、磁場配向領域が安定な実用的なレベルにあるように調製されたバイセルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、長鎖リン脂質と短鎖リン脂質とからなる一般的バイセル組成に、配向増強剤として極性頭部にイノシトール骨格を持つ特異的構造のリン脂質を特定の比率で加えることにより、円盤状のミセル集合体（バイセル)を形成する磁場配向領域が拡大され、その領域が安定な実用的なレベルにあることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
即ち、本願発明は、下式
【化１】
2011089946.tif 000002
で表わされるリン脂質Ａ（式中、Ｒ１１及びＲ１２は、ぞれぞれ独立して、炭素数が４〜６である直鎖飽和炭素鎖である。）、
下式
【化２】
2011089946.tif 000003
で表わされるリン脂質Ｂ（式中、Ｒ２１及びＲ２２は、ぞれぞれ独立して、炭素数が１１〜１５である直鎖飽和炭素鎖である。）、
下式
【化３】
2011089946.tif 000004
で表わされるリン脂質Ｃ（式中、Ｒ３１は、水素原子又は−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は炭素数が１〜２１である直鎖炭素鎖を表す。）を表し、Ｒ３２は、炭素数が７〜２１である直鎖炭素鎖を表し、Ｒ３３、Ｒ３４及びＲ３５は、ぞれぞれ独立して、水素原子又はリン酸基（−ＯＰＯ３Ｈ２）を表す。）
及び下式
【化４】
2011089946.tif 000005
で表わされるリン脂質Ｄ（式中、Ｒ４１及びＲ４２は、それぞれ独立して、炭素数が１１〜２１である直鎖炭素鎖である。）から成るリン脂質混合物であって、リン脂質Ａ〜Ｄの合計に対する、リン脂質Ａ、リン脂質Ｂ、リン脂質Ｃ及びリン脂質Ｄのモル比をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとした場合、Ａ＞０、Ｂ＞０、Ｃ＞０、Ｄ≧０であって、（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）／Ａ＝２．５〜６．０、及びＣ／（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）≦０．５を満たし、更にリン脂質Ｂ、Ｃ及びＤのうち、（不飽和結合を含まないリン脂質のモル数の合計）／（不飽和結合を含むリン脂質のモル数の合計）の比が１以上であるリン脂質混合物である。
【０００６】
また本発明は、このリン脂質混合物を、水和率が６０〜８５重量％となるように、水又は緩衝液に溶解してなり、Ｄ＝０の場合、３０〜４０℃の温度下に置かれ、又はＤ＞０の場合、１５〜４０℃の温度下に置かれ、形態が円盤状のミセル集合体である、４Ｔ（テスラ）以上の磁場で配向するバイセルである。
更に本発明は、このリン脂質混合物を、水和率が６０〜８５重量％となるように、水又は緩衝液に溶解し、Ｄ＝０の場合、３０〜４０℃の温度下に置き、又はＤ＞０の場合、１５〜４０℃の温度下に置くことから成る、形態が円盤状のミセル集合体であるバイセルの形成法である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】リン脂質混合物から形成される円盤状のミセル集合体である脂質膜（又はバイセル）とマルチラメラベシクル(MLV)の模式図とその断面を示す図である。Ａは、バイセルを示し、Ｂはマルチラメラベシクル(MLV)を示す。
【図２】本発明のリン脂質混合物の31P-NMRスペクトルの温度変化を示す図である。（ａ）は実施例１のリン脂質混合物、（ｂ）は比較例１のリン脂質混合物、（ｃ）は比較例２のリン脂質混合物を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本願発明のバイセルを形成するためのリン脂質混合物は、下記のリン脂質から成る。
（１）下式で表わされるリン脂質Ａ
【化１】
2011089946.tif 000006
式中、Ｒ１１及びＲ１２は、ぞれぞれ独立して、炭素数が４〜６、好ましくは５〜６である直鎖飽和炭素鎖である。ここで直鎖とは、炭素原子を含む側鎖のないことをいう（以下同様）。
このリン脂質Ａは、バイセルを構成する短鎖リン脂質に相当し、必須成分である。
この短鎖リン脂質は、バイセルを構成するに際し、長鎖リン脂質により形成される脂質二重膜部エッジのアシル鎖領域で、水相と接する部位が全て極性部になるように二重膜部位の表裏の極性部を繋げるように連続的に覆うことにより、バイセルが円盤状の形状を保つ役割をすると考えられる。
【０００９】
（２）下式で表わされるリン脂質Ｂ
【化２】
2011089946.tif 000007
式中、Ｒ２１及びＲ２２は、ぞれぞれ独立して、炭素数が１１〜１５、好ましくは１２〜１４である直鎖飽和炭素鎖である。
このリン脂質Ｂは、バイセルを構成する長鎖リン脂質に相当し、必須成分である。
この長鎖リン脂質は、バイセルを構成するに際し、バイセルの脂質二重膜部位を形成し、磁場配向を促す役割をすると考えられる。
【００１０】
（３）下式で表わされるリン脂質Ｃ
【化３】
2011089946.tif 000008
式中、Ｒ３１は、水素原子又は−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は炭素数が１〜２１、好ましくは７〜２１である直鎖炭素鎖を表す。）を表す。
Ｒ３２は、炭素数が７〜２１である直鎖炭素鎖を表す。
Ｒ３２及びＲ３６は、それぞれ、二重結合を１〜６個含んでもよいが、不飽和脂質を含むと配向を低下させるため、好ましくは直鎖飽和炭素鎖である。
Ｒ３３、Ｒ３４及びＲ３５は、ぞれぞれ独立して、水素原子又はリン酸基（−ＯＰＯ３Ｈ２）を表す。）を有する。
この中で、Ｒ３４及びＲ３５が共にリン酸基であり、Ｒ３１が−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は上記と同様に定義される。）である組み合わせが好ましい。
このイノシトール骨格の極性頭部とアシル鎖を持つ特異的構造のリン脂質Ｃは、配向増強剤として機能し、必須成分である。
この配向増強剤は、磁場配向性のバイセルが形成される条件（磁場配向領域）を拡大する役割を持つと考えられる。
なお、比較例２で示すように、このリン脂質Ｃが配向増強剤として機能するために、イノシトール骨格の極性頭部が必須である。そのため、イノシトール骨格の極性頭部以外の部分の構造は比較的自由度が高いと考えられる。
【００１１】
（４）下式で表わされるリン脂質Ｄ
【化４】
2011089946.tif 000009
式中、Ｒ４１は炭素数が１１〜２１、好ましくは１７〜２１、より好ましくは１７〜１９であって、二重結合を０〜４、好ましくは１〜２個含む直鎖炭素鎖である。
Ｒ４２は炭素数が１１〜２１、好ましくは１５〜１９、より好ましくは１５〜１７であって、二重結合を０〜４、好ましくは０個含む直鎖炭素鎖である。
このリン脂質Ｄは、任意成分であり、バイセルを構成するに際し、自発磁場配向温度を低下させる役割をすると考えられる。しかし、不飽和脂質は配向を低下させる要因として働くため、その構成モル比は後に示すような範囲になければならない。
【００１２】
上記リン脂質の混合物がバイセル（円盤状のミセル集合体）を形成するためには、各リン脂質の成分比が下記条件を満たす必要がある。
即ち、リン脂質Ａ〜Ｄの合計に対する、リン脂質Ａ、リン脂質Ｂ、リン脂質Ｃ及びリン脂質Ｄのモル比をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとした場合（ただし、Ａ＞０、Ｂ＞０、Ｃ＞０、及びＤ≧０である。）、
（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）／Ａ＝２．５〜６．０、好ましくは３．０〜４．０、及びＣ／（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）≦０．５、好ましくは０．３の条件を満たす必要がある。
この脂質組成条件である（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）／Ａは、ｑ値と定義される。このｑ値は、モル比（長鎖リン脂質／短鎖リン脂質）を意味し、２．５以下では、バイセルの直径が小さくなり、バイセルが配向しにくく、６．０以上の場合、バイセル直径が著しく大きくなるため、ＭＬＶ（図１Ｂ）が形成されやすい。
【００１３】
更に長鎖リン脂質（アシル鎖が炭素数が７以上の直鎖炭化水素基を含むリン脂質。即ち、リン脂質Ｂ、Ｃ及びＤ）について、これらのリン脂質混合物中の、(i)アシル鎖が不飽和結合（二重結合）を有しない（即ち、飽和である）リン脂質のモル数に対して、(ii)アシル鎖が不飽和結合（二重結合）を有するリン脂質のモル数が同じ又は少ない条件下で、バイセルの磁場配向が実現される。言い換えると、更にリン脂質Ｂ、Ｃ及びＤのうち、（不飽和結合を含まないリン脂質のモル数の合計）／（不飽和結合を含むリン脂質のモル数の合計）の比が１以上である必要がある。アシル鎖が炭素数が６以下の直鎖炭化水素基を含むリン脂質（即ち、リン脂質Ａ）は配向温度には影響を与えない。
【００１４】
即ち、Ｂ、Ｃ及びＤは以下の条件を満たす必要がある。
リン脂質Ｄが不飽和アシル鎖を有する場合、即ち、Ｒ４１又はＲ４２が二重結合を含み、かつリン脂質Ｃが不飽和アシル鎖を有する場合、即ち、(a)Ｒ３２又は(b)Ｒ３１が−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は上記と同様に定義される。）で表わされた場合のＲ３６が、不飽和結合（即ち、二重結合）を含む場合は、
Ｂ／（Ｃ＋Ｄ）≧１．０、
リン脂質Ｄが不飽和アシル鎖を有する場合、即ち、Ｒ４１又はＲ４２が二重結合を含み、かつリン脂質Ｃが飽和アシル鎖を有する場合、即ち、(a)Ｒ３２及び(b)Ｒ３１が−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は上記と同様に定義される。）で表わされた場合のＲ３６が、飽和炭化水素鎖である場合（Ｒ３１が水素原子である場合は、Ｒ３２が飽和炭化水素鎖である場合）は、
(Ｂ＋Ｃ)／Ｄ≧１．０、
リン脂質Ｄが飽和アシル鎖を有する場合、即ち、Ｒ４１又はＲ４２が二重結合を含まず、かつリン脂質Ｃが不飽和アシル鎖を有する場合、即ち、(a)Ｒ３２又は(b)Ｒ３１が−ＣＯＲ３６（式中、Ｒ３６は上記と同様に定義される。）で表わされた場合のＲ３６が、不飽和結合（即ち、二重結合）を含む場合は、
（Ｂ＋Ｄ）／Ｃ≧１．０、
の条件を満たす必要がある。
【００１５】
上記リン脂質の混合物を溶媒に溶解させると、特定温度条件でバイセル（形態が円盤状のミセル集合体）を形成する。
この温度（配向温度）は、リン脂質混合物中の不飽和結合（二重結合）を含むリン脂質の構造とモル数に依存する。
リン脂質の混合物がリン脂質Ａ、Ｂ及びＣから成る場合（即ち、Ｄ＝０の場合）、バイセルは３０〜４０℃の温度雰囲気で形成される。
一方、リン脂質の混合物がリン脂質Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから成る場合（即ち、Ｄ＞０の場合）、かつリン脂質Ｃ及びＤのどちらか、または双方が不飽和アシル鎖を有する場合、バイセルの配向温度範囲はＣ及びＤのモル比に応じて変化する。即ち、上記条件を満たす最大モル比の条件（リン脂質ＣおよびＤが共に不飽和アシル鎖を有する場合、Ｂ／（Ｃ＋Ｄ）＝１．０、リン脂質Ｃが飽和アシル鎖を有し、リン脂質Ｄが不飽和アシル鎖を有する場合、（Ｂ＋Ｃ）／Ｄ＝１．０）では、１５〜２１℃の温度範囲で形成される。このモル比が小さくなるにつれ、この温度範囲は上記温度範囲（３０〜４０℃）に近づく。
【００１６】
バイセル形成のために用いる溶媒は水、又は水に弱酸及びその塩等を適宜加えた様々な緩衝液である。
ｐＨは、対象となる脂質と相互作用する生体分子種にも依存するが、通常５〜８、好ましくは６〜７．５である。ｐＨ５以下では脂質が長期安定ではなく、生理条件より高いｐＨではバイセルは配向しにくい。
また、水（又は緩衝液）／（リン脂質の混合物＋水（又は緩衝液））を水和率（重量％）と定義する。この水和率は通常６０〜８５％であり、配向能の高いバイセルを形成するためには７０〜７５％が好ましい。水和率がこの上限以上の場合は、臨界ミセル濃度に近づくため、バイセルが形成されず、水和率が上記範囲未満の場合、試料の粘性が増加し、温度上昇時の脂質の再配向が困難となるため、バイセルの形成を阻害する。
【００１７】
上記のように形成したバイセルは磁場存在下で自発的に配向する。
この磁場は、４Ｔ（テスラ）以上、好ましくは４．７Ｔ以上である。バイセルが磁場で配向するために磁場は高ければよいと考えられるが、上限は５０Ｔ程度である。
また、このバイセルは、熱振動によるランダムな分子運動が磁場配向を促す力を打ち消すような温度以上では融合して、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）を形成する。ＭＬＶは、図１Ｂに示すように、脂質二重膜が水層を介して幾重にも重なった球状の脂質膜であり、特定方向に配向するものではない。
また磁場配向温度以下の温度では、上記リン脂質混合物は小さいミセル状構造をとる。
【００１８】
本発明のリン脂質混合物は、生体中と同様の水和率条件下において、特定温度領域で円盤状の平面脂質二重膜（バイセル）を形成するため、脂質結合型生体分子のような脂質膜と相互作用する様々な分子の立体構造の解析や機能発現機構の解明に用いることができる。
例えば、膜貫通型タンパク質のような疎水性の高い分子を、バイセル調製の際に脂質分子に同時に添加することにより、バイセルの二重膜部位に挿入された状態のバイセルを調製することができる。一方、脂質膜表面と弱く相互作用する比較的小さい生体分子については、バイセルを含む緩衝液に当該分子を添加することにより、同様に脂質二重膜表面に結合したバイセルを調製することができる。また、脂質膜表面に結合するような膜表在性タンパク質でも、実施例１に示すように、一度長鎖リン脂質のみからなるＭＬＶを調製し、そのＭＬＶを短鎖リン脂質へ添加するバイセルの調製法を用いることにより、当該タンパク質を変性させることなく、脂質二重膜上に結合させたバイセルを調製することができる。
【００１９】
上記のような手法で調製したバイセルは、当該生体分子が本来機能しうる十分に水和された生体中の細胞膜上に結合した状態に近い試料条件下にあるため、当該分子の立体構造及び機能を解析することができる。このような試料条件下で本発明のバイセル（脂質）と相互作用する生体分子の構造解析は、当該分子に対する分子レベルでの機能発現、及びその機構解明の手がかりを与え、医薬、創薬の基礎研究に大きな寄与を与えると考えられる。また、このような脂質膜に当該分子が結合した状態でバイオ素子として機能させることができる。
【００２０】
更に、上記のように調製したバイセルは、以下のように使用できる。
１．モデル生体脂質として、特に脂質と相互作用する生体分子を対象とした研究に用いることができる。特に、ＭＬＶ、ＳＵＶ、ミセルとは異なり平面脂質膜を持つため、脂質膜面の曲率に敏感な生体分子の構造や機能を解析することができる。
２．自発的に磁場配向するために、光や電磁場等の方向性を持つ外部摂動に対して、脂質膜及び分子を特定の相対方向へ設置することができる。
３．脂質膜と相互作用する生体分子の研究、特に固体ＮＭＲを用いた脂質膜中及び表面に結合した当該分子の構造や機能を解析することができる。
４．水溶性分子を部分配向させるための配向溶媒として用いることができる。
【００２１】
一方、本発明のバイセルは、固体ＮＭＲの分野において、膜タンパク質の立体構造解析の手段として用いることができる。本発明のバイセルに、膜タンパク質を結合させ又は挿入して、配向条件下で様々な核種に対して化学シフト異方性、磁気双極子双極子相互作用、核四極子相互作用などの異方的相互作用を選択的に観測することにより、静磁場に対する各異方的相互作用の主軸の相対方向を決定することができる。特定部位に関するこれらの複数の配向情報を組み合わせることにより、可能な局所配向を規定し、静磁場に対する分子の配向及び立体構造を決定することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
１．原料調製
短鎖リン脂質として1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (sigma aldrich社、以下「リン脂質ａ」という。)、長鎖リン脂質として1,2-dimyristoyl-sn- glycero-3-phosphocholine (和光純薬工業、以下「リン脂質ｂ」という。)、配向増強剤としてhosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (Avati Polar Lipids社、以下「リン脂質ｃ」という。)及び1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- phosphocholin (和光純薬工業、以下「リン脂質ｄ」という。)を用いた。
【００２３】
各リン脂質の化学式を以下に示す。
【化５】
2011089946.tif 000010
【００２４】
後に作製するバイセルにおける構成成分の混合比を正確にするため、各リン脂質の重量を正確に計量した。吸湿性が高い粉末状のリン脂質ｄを、窒素ガス雰囲気下のグローブボックス中で精密天秤（メトラー社 AB104S）を用いて計量し、計量した脂質をクロロホルムに溶解してクロロホルム溶液を調製した。リン脂質ａとリン脂質ｃはクロロホルム溶液として提供されるため、これらをクロロホルムで正確に希釈した。これらの溶液における、リン脂質ａ、リン脂質ｃ及びリン脂質ｄの濃度は、それぞれ、16、1.25及び30 mg/mlであった。
【００２５】
２．バイセルの調製
水和率25%(w/w)のq値3.0のバイセルを以下のように調製した。各分子のモル比（リン脂質ａ:リン脂質ｂ:リン脂質ｃ:リン脂質ｄ）を20:30:3:27とした。
100mlナスフラスコにリン脂質ｂ 15.4mgの粉末、及びリン脂質ｃ 2.5mgとリン脂質ｄ 15.6mgを含有するクロロホルム溶液を混合し、さらにクロロホルムを1ml加え、全量を約5mlにした。ロータリーエバポレーターを用いて40℃でクロロホルムを吸引乾燥させ、脂質フィルムを得た。この脂質フィルムを、一晩5 Pa以上の真空度で乾燥させて残留クロロホルムを完全に除去した。
0.025%(w/v) NaN3, 1mM dithiothreitol(DTT)を含有したpH 7.4、20mM 3-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS)緩衝液を用意し、この緩衝液500μLを用いて上記で得た脂質フィルムを水和した。この際、作業はボルテックスを用いて全脂質の液晶−ゲル相転移点以上の温度である30-40℃の範囲で行った。その後、凍結融解を３度行い、マルチラメラベシクル(MLV、図１Ｂ)を調製した。
さらに1mLの追加の上記緩衝液を用いて上記MLVを完全回収し、超遠心器（日立工機社製himac CS100GXL 及びS100AT4ローター）を用いて4℃、541000×gの条件で6 時間適用し、MLVを遠心沈降させた。
【００２６】
一方、6.9mgのリン脂質ａを含有したクロロホルム溶液を5mLのガラス試験管中で窒素ガスを当てて乾燥させてフィルムを作成し、同様に一晩5 Pa以上の真空度で乾燥させて残留クロロホルムを完全除去した。
得られたフィルムを30μLの同緩衝液で水和し、ミセル溶液を調製する。このミセル溶液に上記で得たMLVを少量ずつ添加してボルテックスで攪拌、及び氷冷、30℃の湯浴の温度条件下に交互に数回繰り返し行い、MLVを完全に溶解させた。この状態ではMLVの含水量は最適な水和率より高い状態にあった。そこで、分画分子量3000のセルロース製フィルタ（ミリポア社製Microcon YM3）を用いて4℃、14000×g 条件で1時間程度、卓上遠心器（クボタ社製：テーブルトップ冷却遠心器2800）を用いて濃縮し、水和率が25%(w/w)になるように濃縮し、バイセルを調製した。
得られたバイセルを固体NMRで測定するため、得られた各々のバイセル90μLを自作のダイフロンスペーサーを用いて6 mm o.d.ジルコニアMASローター中央5 mmの領域に封入し、水和率が変化しないように両端をエポキシ接着材で完全に密閉した。その後4℃で一晩熟成させ、試料を均一な状態にした。
【００２７】
３．固体NMRによる検証
磁場配向能を脂質極性基のリン核を観測する31P-NMRで検証した。NMR測定は9.4Tの超伝導マグネットとINOVA400分光器を用いて、検出には、日本電子社製6 mmナローボアH-X二重共鳴MASプローブを静止条件で用いた。試料温度を磁場中で一度-2℃程度に下げ、その後、４℃から２℃毎に温度を増加させた。配向が観測される条件付近でのみ１℃ずつ温度を増加させ、31P-NMRスペクトルを測定した。結果を図２（ａ）に示す。
8℃以下の温度ではミセルが形成されているため、等方信号のみが観測された。温度の上昇とともに、幅広の信号が現れ、徐々に配向信号に近い２つの信号が観測された。
12℃以上で、温度上昇と共に、31P-NMRスペクトルのピークは徐々に先鋭になり、15℃以上で極めて先鋭なピークを与える。ここに２つのピークが見られるが、-3 ppm付近のピークは短鎖由来、-11 ppm付近のピークは長鎖由来の信号である。これらのピークが観察されたことは、リン脂質の再配向が生じ、バイセル形成されていることを意味する。
【００２８】
一方、22℃以上では、-15.5ppm付近の信号が観察される。このことは、バイセルが融合してMLV（図１Ｂ）が形成されたことを示す。MLVは特定の方向に配向しないため、31P化学シフト異方性の軸対象粉末線形を示す。この粉末線形のエッジに相当するδ⊥値周辺が-15.5ppm付近の信号である。３つのピーク（-3 ppm付近、-11 ppm付近、-15.5ppm付近）が観察される22℃では、バイセル平面膜とMLVが共存している状態であると考えられる。
以上から、15-21℃の比較的広い温度範囲で均一なバイセルが安定的に形成され、磁場配向していることが分かる。後述の比較例１（配向増強剤（リン脂質ｃ）を含まない）において、この安定的にベシクルが形成される温度範囲が16-17℃と狭い範囲であることと比べると、適切な量の配向増強剤（リン脂質ｃ）の添加が磁場配向能を向上させたことを意味する。
【００２９】
比較例１
この比較例では、配向増強剤（リン脂質ｃ）の影響を調べるため、実施例１のリン脂質混合物からこの配向増強剤を除いて、実施例１と同様の測定を行った。
水和率25%(w/w)のq値3.0のバイセルを実施例1と同様にして調製した。各分子のモル比（リン脂質ａ:リン脂質ｂ:リン脂質ｄ）を2:3:3とした。
ただし、このバイセルは、リン脂質ａ 10.4mg、リン脂質ｂ23.4mg、リン脂質ｄ 26.2mgを用いて実施例１のバイセルと同様にリン脂質ｂ及びリン脂質ｄ混合脂質からなるMLVをまず調製し、その後MLVをリン脂質ａのミセル溶液に加え、バイセルを調製した。リン脂質ａに関し調製は同様に行うが、水和には60μLの緩衝液を用いた。
一連の調製において、実施例１のバイセルと同様の工程によりバイセルを調製したが、最後の水和率の調製では回収するMLVの含水量が少ないため、濃縮せずに緩衝液を追加して最終水和率を25%(w/w)に調製した。
測定した31P-NMRスペクトルを図２（ｂ）に示す。
２つのピーク（-3 ppm付近、-11 ppm付近）が16℃からシャープになり、-15.5ppm付近の信号が18℃から観測される。
以上から、ベシクルが安定的に形成される配向温度範囲が16-17℃であることが分かる。
【００３０】
比較例２
配向増強剤として用いたhosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (リン脂質ｃ)の代わりに、1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SAPC、下式)を用いて、実施例１と同様の試験を行った。各分子のモル比（リン脂質ａ:リン脂質ｂ:SAPC:リン脂質ｄ）は20:30:3:27とした。
【化６】
2011089946.tif 000011
測定した31P-NMRスペクトルを図２（ｃ）に示す。
14℃のスペクトルですでにMLVの信号（-15.5ppm付近）が観測され、それ以上の温度領域でもMLVが共存している。すなわち、リン脂質ｃの代わりにSAPCを用いた場合は、配向能が低下した。
この結果は、実施例1において配向増強剤（リン脂質ｃ）の添加により磁場配向領域が拡大したことが、リン脂質ｃのアシル鎖に起因するものではなく、極性頭部のイノシトール環に起因するものであることを示している。
【図１】
2011089946.tif 000016
【図２】
2011089946.tif 000017