(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍に発現し、しかし正常成人造血細胞に発現しない、４０ｋＤａタンパク質に結合する抗体、生産の方法及びそのような抗体の使用を提供する。【解決手段】多様なタイプの腫瘍細胞の表面に発現される４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合することができるが、しかし成人正常造血細胞には結合しない、モノクローナル抗体。新規モノクロ−ナル抗体はそれが特異的に結合する腫瘍細胞の増殖を遮断し、そして、アポトーシスを誘導し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から成る群：
（ｉ）抗体ＤＭＦ１０．１６７．４の相補性決定領域を有するヒト化抗体；
（ｉｉ）抗体ＤＭＦ１０．６２．３の相補性決定領域を有するヒト化抗体；
（ｉｉｉ）抗体ＤＭＦ１０．３４．３６の相補性決定領域を有するヒト化抗体；
（ｉｖ）ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と抗体ＤＭＦ１０．１６７．４の軽鎖及び重鎖の可変領域とを有するキメラ抗体；
（ｖ）ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と抗体ＤＭＦ１０．６２．３の軽鎖及び重鎖の可変領域とを有するキメラ抗体；
（ｖｉ）ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と抗体ＤＭＦ１０．３４．３６の軽鎖及び重鎖の可変領域とを有するキメラ抗体；
（ｖｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．１６７．４；
（ｖｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．６２．３；及び
（ｉｘ）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．３４．３６、
より選択される、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が細胞に結合した場合に同型の細胞凝集を誘導する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
抗体又はその抗原結合断片が結合する細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項４】
抗体又はその抗原結合断片が、Ｅ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ、及びＣｏｓから成る群より選択される１種以上の腫瘍細胞株に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗体。
【請求項５】
抗体がＥ７１０．２．３細胞に特異的に結合する、請求項４に記載の単離抗体。
【請求項６】
検出可能な標識を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
検出可能な標識が、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質から成る群より選択される、請求項６に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
モノクローナル抗体ＤＭＦ１０．１６７．４、ＤＭＦ１０．６２．３、又はＤＭＦ１０．３４．３６によって結合されたエピトープに結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、及びＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４から成る群より選択される、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片を含む、腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片を含む、細胞においてアポトーシスを誘導するための医薬組成物。
【請求項１３】
細胞が、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び急性Ｔ細胞白血病から成る群より選択される腫瘍細胞である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片及びその使用説明書を含むキット。
【請求項１６】
胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、又は急性Ｔ細胞白血病から成る群より選択される腫瘍を検出するための、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
機能基に結合した請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む腫瘍細胞標的薬剤であって、機能基は、細胞毒、放射性核種、放射性同位体、化学療法剤、及び造影剤から成る群より選択される、前記薬剤。
【請求項１８】
被験者の腫瘍細胞に機能基を選択的に運搬するための、請求項１７に記載の腫瘍標的薬剤。
【請求項１９】
抗体タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下でタンパク質を含む試料を請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片に接触させること；
必要な場合は、試料から複合体を除去すること；及び
前記複合体からタンパク質を除去し、それによりタンパク質を単離すること、
を含む、タンパク質を単離するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、抗体、及び、それらが特異的に結合するタンパク質、及び、その生産方法及び腫瘍細胞に特異的に結合するそのような抗体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｅ７１０．２．３細胞株はクローン化されたマウスＣＤ４−ＣＤ８−胸腺Ｔリンパ腫細胞株であり、もとはＡＫＲ／Ｊマウスの胸腺腫瘍から単離された。単独で低密度で培養するとき、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激しなければ、Ｅ７１０．２．３は自発的には増殖しない。Ｅ７１０．２．３は、胸腺細胞あるいは脾細胞との接触により刺激され増殖し得る。しかしながら、Ｅ７１０．２．３はＰＭＡあるいは他の細胞がなくても、高密度で培養したときは自発的に増殖し得る。Ｅ７１０．２．３を同系マウスに注入すると、リンパ器官及び胸腺に悪性腫瘍として成長する。
【０００３】
発明の概要
本発明は、多様なタイプの腫瘍細胞の表面に発現される４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合することができるが、しかし成人正常造血細胞には結合しない、モノクローナル抗体の発見に基づいている。その新規モノクロ−ナル抗体はそれが特異的に結合する腫瘍細胞の増殖を遮断し、そして、アポトーシスを誘導し得る。
【０００４】
これらの発見に基づき、本発明はモノクローナル抗体、あるいは、その抗原結合断片を特徴とし、そのモノクローナル抗体は（ａ）胎児胸腺細胞に結合し、（ｂ）細胞への結合に基づいて細胞増殖を阻害し、及び（ｃ）成人胸腺細胞には結合しない。モノクローナル抗体はまた、細胞への結合に基づいて同型の凝集を誘導し、結合した細胞にアポトーシスを誘導することができ、及びＥ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ及びＣｏｓの群中の、１つ又はそれ以上の腫瘍細胞株と特異的に結合し得る。抗体は、例えば検出可能な標識で、標識され得る。
【０００５】
ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．６２．３、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５よって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．１６７．４、及び、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ 番号ＰＴＡ−４０４よって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．３４．３６はまた、本発明の範囲内である。
【０００６】
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、又はハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４によって生産されるモノクローナル抗体が結合するタンパク質と同様のタンパク質に結合する、モノクローナル抗体を特徴とする。モノクローナル抗体はヒト化し得る。
【０００７】
他の側面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５またはハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４により産生されるモノクローナル抗体が結合する４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体、あるいは、その抗原結合断片を特徴づける。
【０００８】
さらに他の側面では、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、又はハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４にって生産されるモノクローナル抗体が結合するタンパク質と同様のタンパク質に結合する、キメラモノクローナル抗体、あるいは、その抗原結合断片を特徴づけ、キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖の非ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む。
【０００９】
また他の側面では、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、又はハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４によって生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同様のエピトープに結合する、モノクローナル抗体、あるいは、その抗原結合断片を特徴とする。
【００１０】
本発明はまた、モノクローナル抗体、あるいは、その抗原結合断片を特徴とし、それは、（ｉ）分子量４０ｋＤａ、（ｉｉ）胎児胸腺細胞表面における発現、（ｉｉｉ）成人胸腺細胞表面には発現なし、 （ｉｖ）抗体の結合により細胞増殖を遮断する能力、及び、（ｖ）抗体の結合により同型凝集を誘導する能力、により特徴づけられるタンパク質に特異的に結合する。モノクローナル抗体は、（ｖｉ）抗体の結合に基づいて細胞にアポトーシスを誘導する能力、及び、（ｖｉｉ）Ｅ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ及びＣｏｓを含む腫瘍細胞株の群の表面における発現、によりさらに特徴づけられるタンパク質に特異的に結合する。
【００１１】
本発明はさらに、本明細書中に記載のモノクローナル抗体の抗原結合断片を特徴とする。抗原結合断片は、例えば検出可能な標識により標識され得る。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に記載のモノクローナル抗体を生産する、ハイブリドーマ細胞株を特徴とする。例えば、本発明はハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、あるいは、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４を特徴とする。
【００１３】
本発明はさらに、（ｉ）分子量４０ｋＤａ、（ｉｉ）胎児胸腺細胞表面における発現、（ｉｉｉ）成人胸腺細胞表面には発現なし、（ｉｖ）本明細書中に記載の抗体の結合に基づいて細胞増殖を遮断する能力、及び、（ｖ）本明細書中に記載の抗体の結合により同型凝集を誘導する能力、により特徴づけられる、実質的に純粋なタンパク質を特徴とする。タンパク質はさらに、（ｖｉ）Ｅ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ及びＣｏｓを含む腫瘍細胞株の群における発現、及び、（ｖｉｉ）本明細書中に記載の抗体の結合に基づいて細胞にアポトーシスを誘導する能力、によりさらに特徴づけられる。
【００１４】
他の側面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、又はハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４によって生産されるモノクローナル抗体が結合する、実質的に純粋なタンパク質を特徴とする。
【００１５】
本発明はまた、本明細書中に記載のモノクローナル抗体、及び、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を特徴とする。本発明はさらに被検体（ｓｕｂｊｅｃｔ）の腫瘍細胞を検出する方法を特徴づける。方法は、被検体からの細胞試料を、本明細書中に記載の１つ又はそれ以上のモノクローナル抗体との接触、及び、試料への抗体の結合を検出することを含み、ここで、結合は、被検体における腫瘍細胞の存在を示す。腫瘍細胞の例は、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び、急性Ｔ細胞白血病を含む。腫瘍細胞はまた、患者にも存在してもよい。腫瘍を検出するために使用するモノクローナル抗体は、標識され得る。
【００１６】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を特徴づける。方法は、腫瘍細胞と、本明細書中に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害するために十分な量のモノクローナル抗体との接触を含む。
【００１７】
他の態様において、本発明は細胞にアポトーシスを誘導する方法を特徴とする。方法は、細胞と、本明細書中に記載の細胞にアポトーシスを誘導するために十分な量の１つ又はそれ以上のモノクローナル抗体との接触を含む。細胞は、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び、急性Ｔ細胞白血病を含む群から選択された腫瘍細胞であり得る。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【００１８】
本発明はまた、本明細書中に記載の１つ又はそれ以上のモノクローナル抗体、及び、その使用のための説明書を含む、腫瘍診断のためのキットを含む。キットは、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び、急性Ｔ細胞白血病を含む群から選択される腫瘍細胞を含み得る。本発明はまた、本明細書中に記載の１つ又はそれ以上のモノクローナル抗体を含む、腫瘍細胞標的薬剤を含むことができ、それは腫瘍細胞に機能基（ｍｏｉｅｔｙ）を運ぶためにその機能基に結合され得る。Moietyの例は、抗腫瘍薬剤、細胞毒、サイトカインあるいはレポーターグループを含む。
【００１９】
本発明の他の態様は、機能基を哺乳動物の腫瘍細胞に選択的に運ぶ方法である。方法は本明細書中に記載の、機能基が結合した標的薬剤を哺乳動物に投与すること、及び、標的薬剤が腫瘍細胞に到達するために十分な時間を許容することを含み、標的薬剤中の抗体は腫瘍細胞に結合し、それにより哺乳動物において機能基を腫瘍細胞に選択的に運ぶ。機能基の例は、抗腫瘍薬剤、細胞毒、サイトカイン及びレポーターグループを含む。
【００２０】
本発明はさらに、本明細書中に記載の４０ｋＤａタンパク質を単離する方法を含む。方法は、タンパク質を含む試料を本明細書中に記載のモノクローナル抗体と、モノクローナル抗体／タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な時間および条件下で接触すること、もしある場合、その複合体の１つ又はそれ以上を試料から除くこと、及び、複合体からタンパク質を除くことを含み、それによりタンパク質を単離する。
【００２１】
“単離された核酸配列”とは、その中では自然に起こる、生物のゲノム中の核酸配列を挟む遺伝子から実質的にない核酸配列である。それゆえその用語は、ベクター、自己複製プラスミド若しくはウイルス、あるいは、原核生物または真核生物のゲノム核酸配列に組み込まれた、リコンビナント核酸配列を含む。それはまた、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作成される断片、あるいは、制限断片のような分離した分子を含む。
【００２２】
タンパク質に“特異的に結合する”抗体とは、タンパク質に結合するが、しかし、タンパク質、例えば４０ｋＤａタンパク質を自然に含む、試料、例えば生物学的な試料中の他の分子を認識および結合はしないものである。
【００２３】
“保存された”アミノ酸置換とは、一つのアミノ酸残基を同種の側鎖をもつ別のアミノ酸残基に置き換える置換である。同種の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をもつアミノ酸を含む。保存された置換においてはアミノ酸の任意のファミリーもそのファミリーの任意の他の構成員に置き換えるのに使われ得る。“ポリペプチド、ペプチド、及び、タンパク質”という用語は、本明細書中においては置き換え可能であるように使用され、アミノ酸残基の鎖に言及する。
【００２４】
抗体の“抗原結合断片”とは、抗体全体により結合される、抗原、例えば４０ｋＤａタンパク質のエピトープに結合可能な抗体の部分である。
【００２５】
“エピトープ”とは、抗原、例えばタンパク質の特定の領域であり、そこに抗体が結合し、免疫応答を引き出すことが可能である。
【００２６】
“実質的に純粋な”４０ｋＤａタンパク質とは、それが自然と付随するタンパク質及び自然に発生する有機分子が重量で少なくとも６０％ない４０ｋＤａのタンパク質である。好ましくは調製物は少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％重量の４０ｋＤａタンパク質である。実質的に純粋な４０ｋＤａタンパク質は、例えば、本明細書中に記載の抗体、あるいは、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、及び／または、物理的な精製技術により、得ることができる。
【００２７】
“単離された”抗体とは、実質的に自然と附随する他の自然に発生する有機分子がない抗体である。
【００２８】
細胞の増殖を遮断する抗体あるいは他の分子とは、細胞周期、分裂、あるいはその両方を阻害する、抗体あるいは分子である。
【００２９】
“同型の凝集”により、同じ型の細胞が互いに接着することで刺激される、生物学的に活性な過程を意味する。
【００３０】
“レポーターグループ”とは、適切な検出システムあるいは方法により容易に測定あるいは検出が可能である、発光、蛍光、酵素活性、電子密度、または、放射活性のような物理的あるいは化学的な特性をもつ分子あるいは化合物である。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的また科学的な用語は、本発明の属する分野の当業者により共通に理解されるのと同様の意味を持つ。本明細書中に記載のものと同様あるいは均等な方法および材料が、本発明の実施あるいはテストに用いられ得るが、適切な方法及び材料は以下に記載される。本明細書中で言及される全ての公開物、特許出願、特許、及び他の参照は、それら全てが参照として援用される。争議の場合、定義を含む本明細書は制御するだろう。さらに、材料、方法、及び例は、例証に過ぎず、限定を意図しない。本発明は、腫瘍細胞に発現する４０ｋＤａタンパク質を認識する抗体を特徴とする。抗体は、腫瘍細胞の増殖を阻害するため、および、それが特異的に結合する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するために使用され得る。モノクローナル抗体は、診断的に（例えば悪性細胞の存在を決定するために）使用することができ、あるいは、治療的には腫瘍細胞をそれ自身により治療するか、あるいは、それに抗腫瘍薬剤を結合させて運ぶことにより使用され得る。
【００３２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明により、及び、請求の範囲により、明らかになるだろう。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体を特徴とする。４０ｋＤａタンパク質は、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び、急性Ｔ細胞白血病を含む、並びにヒト、サル、及び、マウスを含む多様な異なる種における、腫瘍細胞の多様な型に発現する新規細胞表面タンパク質である。その抗体は正常成人造血細胞には反応性を示さない。本発明の抗体が４０ｋＤａタンパク質を発現する細胞に結合すると、細胞は増殖を停止し、及びアポトーシスを受ける。４０ｋＤａタンパク質は、モノクローナル抗体が細胞表面のこのタンパク質に結合したとき細胞がアポトーシスを受けることの観察に基づく、新規の死誘導タンパク質である。
【００３４】
４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産する、３つのハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣに受け入れ番号ＰＴＡ−３７７（ＤＭＦ１０．６２．３）、受け入れ番号ＰＴＡ−４０５（ＤＭＦ１０．１６７．４）、あるいは、受け入れ番号ＰＴＡ−４０４（ＤＭＦ１０．３４．３６）のもとで保管されている。
【００３５】
本明細書中に記載の抗体は、多様な使用を有する。その抗体は、哺乳動物、例えばヒトの組織における悪性細胞の存在を決定するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断アッセイに使用し得る。その抗体はまた、レポーターグループで標識した本明細書中に記載の単離された抗体を被検体に投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の局在にも使用され得る。その抗体はまた、治療的な応用をもつ。加えてその抗体は、腫瘍を治療すること、または、抗腫瘍薬剤を運搬することにも使用され得る。
【００３６】
抗体作成の方法
抗体とは、イムノグロブリン分子、及び、イムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分である。イムノグロブリン分子の断片の例は、４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合できる、抗体の断片、例えばＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）2部分を含む。断片はその抗体をペプシンのような酵素で処理することにより生産することができる。モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体組成物という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定のエピトープに免疫反応が可能である、ただ一つの抗原結合部位の種類を含む、抗体分子の集合をいう。モノクローナル抗体組成物はこのように、特異的に結合するタンパク質への単一の結合親和性を典型的に示す。
【００３７】
免疫法
４０ｋＤａタンパク質に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、適切な被検体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、あるいは他の哺乳動物）に、適切な免疫原を含む免疫原調製物を用いて、免疫することによって生じされ得る。免疫原は、新規４０ｋＤａタンパク質の発現を全て示した、不死化させた細胞株Ｅ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ及びＣｏｓ由来の細胞のような細胞を含む。
【００３８】
あるいは、免疫原は、精製または単離された４０ｋＤａタンパク質そのものであり得る。例えば、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ＰＴＡ−４０５、あるいは、ＰＴＡ−４０４として保管されるハイブリドーマ細胞株により生産されるモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、または、当該技術分野においてよく知られた他の技術を利用して、例えばＥ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ及びＣｏｓといった、タンパク質を生産し得る細胞から、そのタンパク質を単離するために使用することができる。
【００３９】
被検体によって生じた抗体は次に、その抗体が胎児胸線細胞に結合し、一方、成人胸線細胞には結合しないかどうかを決定するため、スクリーニングされ得る。このような抗体はさらに本明細書中に記載されるアッセイにおいてスクリーニングされ得る。例えば、これらの抗体はそれが結合する細胞の細胞増殖を阻害するか、細胞の同型凝集を誘導するか、及び／または、それらが結合する細胞にアポトーシスを誘導するかを決定する為に、アッセイされ得る。抗体が望ましい特性をもつことを同定する適切な方法が本明細書中に記載される。例えば、細胞に結合し細胞死を誘導する抗体の能力は、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）またはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から商業的に入手可能なキットを用いてアッセイされ得る。
【００４０】
免疫原（例えば、精製されたタンパク質、タンパク質を発現する腫瘍細胞、あるいは組換え体として発現した４０ｋＤａタンパク質）の単位投与量、及び、免疫方法は、免疫される被検体、その免疫状態、及び、被検体の体重に依存するだろう。被検体において免疫応答を増強するために、免疫原は、完全フロイントまたは不完全アジュバントのような、アジュバントとともに投与され得る。上に記載の免疫原による被検体の免疫は、ポリクローナル抗体の応答を誘導する。免疫された被検体における抗体力価は、固定化した抗原、例えば本明細書中に記載の４０ｋＤａタンパク質を使用するＥＬＩＳＡのような標準的な技術によって、経時的にモニターできる。
【００４１】
４０ｋＤａタンパク質に対する抗体を生じる他の方法は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用することを含む（Ｗｏｏｄら、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／００９０６；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１０７４１つ又はＬｏｎｂｅｒｇら、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０３９１８を参照）。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトの抗体産生細胞あるいは組織（例えば、ヒト骨髄細胞、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、ヒト胎児リンパ節組織、または、造血幹細胞）を移植した免疫欠失マウスに、抗原を導入することにより産生され得る。そのような方法はＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Ｄｕｃｈｏｓａｌら、 ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３/０５７９６、アメリカ合衆国特許番号５，４１１，７４９、または、ＭｃＣｕｎｅら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６３２−１６３９）参照）、あるいは、Ｒａｇ−１／Ｒａｇ−２欠損マウスで抗体を生じさせることを含む。ヒト抗体-免疫欠失マウスはまた商業的に入手できる。例えばＲａｇ−２欠損マウスはＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手できる。
【００４２】
ハイブリドーマ
モノクローナル抗体は、被検体を免疫原で免疫することにより生産され得る。免疫後適切な時間において、例えば、抗原力価が十分に高レベルであるときに、抗体産生細胞を免疫された動物から回収することができ、そして、標準的な技術を用いてモノクローナル抗体を調製するのために使用される。例えば、抗体産生細胞は、標準的な体細胞融合方法によって、骨髄腫細胞のような不死化された細胞と融合し、ハイブリドーマを得ることができる。このような技術は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより独自に開発されたハイブリドーマ技術（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及び、ヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）を含む。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作成する技術はよく知られている。
【００４３】
モノクローナル抗体はまた、抗体産生細胞、例えばヒトイムノグロブリンを発現しそして４０ｋＤａタンパク質を免疫されたトランスジェニックマウス由来の脾細胞を回収することにより、作成され得る。その脾細胞はヒト骨髄腫との融合により、あるいは、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）を用いた形質転換により、不死化され得る。これらのハイブリドーマは、専門分野において記載のヒトＢ細胞−あるいはＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を用いて作成され得る（例えば、Ｂｏｙｌｅら、欧州特許公開番号０ ６１４ ９８４）。
【００４４】
４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養上清のスクリーニングにより、例えば、固定化した４０ｋＤａタンパク質に特異的に結合する抗体を選択するスクリーニングによって、または、抗体が望ましい特性、例えば、細胞増殖の阻害能力を持つかを決定するための本明細書中に記載の抗体のテストによって、検出される。
【００４５】
本明細書中に記載のスクリーニングアッセイで試験陽性のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、栄養培地で、ハイブリドーマ細胞が培養培地にモノクローナル抗体を分泌するのに十分な条件及び時間で培養し、それにより抗体全体を生産することができる。ハイブリドーマ細胞に適する組織培養技術及び培養培地は専門分野において一般的に記載される（例えば、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）参照）。抗体を含む条件化ハイブリドーマ培養上清を、次に集めることができる。
【００４６】
組換え結合抗体ライブラリー
モノクローナル抗体は、組換え結合免疫グロブリンライブラリーの構築及び４０ｋＤａタンパク質を有するライブラリーのスクリーニングにより設計されうる。ファージディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）を生成及びスクリーニングするキットは商業的に入手可能である（例えば、ファルマシア組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；及びストラタジーンＳｕｒｆＺＡＰファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。簡単には、抗体ライブラリーをスクリーニングして、４０ｋＤａタンパク質と特異的に結合する抗体を発現するファージを同定して単離する。好ましい態様において、ライブラリーの一次スクリーニングは固定化４０ｋＤａタンパク質を用いたスクリーニングを含む。
【００４７】
スクリーニングの後、ディスプレイファージを単離して、選択した抗体をコードする核酸をディスプレイファージから（例えば、ファージゲノムから）回収して、よく知られる組換えＤＮＡ技術により他の発現ベクター中でサブクローン化を行うことができる。核酸はさらに操作（例えば、追加的な定常領域などの追加的な免疫グロブリンドメインをコードする核酸との結合）及び／又は宿主細胞において発現させることができる。
【００４８】
キメラ及びヒト化抗体
キメラ及びヒト化抗体などの抗体の組換え形態もまた、抗体に対するヒト患者の反応を最小にするために調製することができる。ヒトでない被検体で生産されるあるいはヒトでない抗体遺伝子の発現から誘導される抗体を治療的にヒトに使用するとき、それらは外来物として様々な程度で認識され、免疫反応が患者の中で生じうる。免疫反応を最小あるいは除去する１つのアプローチは、キメラ抗体誘導体、すなわちヒトでない動物の可変領域とヒトの定常領域を結合させた抗体分子を生産することである。そのような抗体はもとのモノクローナル抗体のエピトープ結合特異性を保持しているが、ヒトに投与するときはより免疫原性が小さく、従って患者はより寛容になりやすくなりうる。
【００４９】
キメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術により生産することができる。例えば、ヒトでない抗体分子の定常領域をコードする遺伝子はヒトの定常領域をコードする遺伝子と置換される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、 ＰＣＴ特許公報ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願１８４，１８４；あるいはＴａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．， 欧州特許出願１７１，４９６参照）。キメラ抗体はさらに、抗体結合に関係しない可変領域の部分をヒトの可変領域の均等な部分に換えることにより“ヒト化”されうる。“ヒト化”キメラ抗体の一般的な概説は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：１２０２−１２０７及びＯｉら，（１９８６）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４：２１４により提供される。そのような方法は単離、操作、及び少なくとも１つの重鎖あるいは軽鎖由来の免疫グロブリン可変領域の全てあるいは一部をコードする核酸配列の発現を含む。そして、ヒト化キメラ抗体、あるいはその断片をコードするｃＤＮＡは適切な発現ベクター中でクローン化できる。適した“ヒト化”抗体は相補性決定領域（ＣＤＲ）置換により代替的に生産できる（米国特許５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０）。
【００５０】
エピトープインプリンティング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）もまた、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、あるいはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４として寄託されるハイブリドーマにより生産される４０ｋＤａタンパク質に特異的なハムスター抗体の結合特異性を保持する“ヒト”抗体ポリペプチド二量体を生産するために使用されうる。簡単には、抗原に特異的に結合するヒトではない可変領域（ＶＨ）及びヒトの定常領域（ＣＨ１）をコードする遺伝子を大腸菌において発現させてヒトＶλＣλ遺伝子のファージライブラリーに感染させる。そして、ファージディスプレイ抗体断片を４０ｋＤａタンパク質への結合についてスクリーニングする。選択したヒトＶλ遺伝子をＶλＣλ鎖の発現のために再クローン化して、これらの鎖を有する大腸菌をヒトＶＨＣＨ１遺伝子のファージライブラリーに感染させて、ライブラリーは抗原コートチューブ（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏａｔｅｄ  ｔｕｂｅｓ）を用いたスクリーニングの球状物（ｒｏｕｎｄ）になりやすい。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９３／０６２１３参照。
【００５１】
抗体断片
本発明は、新規抗腫瘍抗体及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖ断片などの抗体の活性結合領域を含むそのあらゆる断片を含む。そのような断片は、当該技術分野でよく確立されている技術を使用して抗体から生産できる（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：６６３−６９  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片は抗体分子のペプシン消化により生産され、Ｆａｂ断片はＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成できる。
【００５２】
抗体の有用性
本明細書中に記載される抗体は様々な用途を有する。抗体はヒト組織中において悪性細胞の存在を決定する診断目的のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用できる。方法は４０ｋＤａタンパク質の存在について組織試料を検査することを含む。例えば、組織試料はハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、あるいはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４により生産されるモノクローナル抗体を接触させることができ、組織試料において細胞に特異的に結合する抗体の能力が決定される。結合によって腫瘍細胞の存在が示される。あるいは、抗体は放出抗原について血液試料をスクリーニングするためにも使用できる。
【００５３】
抗体は、検出可能シグナルを与えるレポーターグループ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）で標識される本発明の単離抗体を被検体に投与することにより、腫瘍の位置をｉｎ ｖｉｖｏで突きとめるためにも使用できる。そして、結合抗体は外部シンチグラフィー、放射トーモグラフィー、あるいは放射性核スクリーニングを使用して検出される。方法は疾病の程度に関して患者における癌のステージを明らかにするため、及び治療に応じた変化をモニターするために使用できる。
【００５４】
抗体はまた治療的な適用も有する。新規抗体は腫瘍を治療するために用いられるが、なぜなら腫瘍細胞に対する抗体の特異的な結合により細胞の増殖停止あるいは死が引き起こされるからである。
【００５５】
抗体は、例えば標的薬剤として、抗腫瘍剤を腫瘍へ運ぶために治療的にも使用できる。そのような抗腫瘍剤は化学療法剤、毒素、免疫学的反応媒介物、酵素、及び放射線同位体を含む。
【００５６】
検出可能標識
４０ｋＤａタンパク質と反応する抗体は、例えば被検体における腫瘍の存在を検出するために診断的に使用できる。検出は抗体を検出可能標識に結合させることにより容易になりうる。検出可能標識の例は、様々な酵素、配合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、電子密度標識、ＭＲＩの標識、及び放射性物質を含む。適する酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、あるいはアセチルコリンエステラーゼ；適する配合団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む；適する蛍光物質の例は、アンベリフェロン、フルオレシン、フルオレシンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレシン、ダンシルクロライドあるいはフィコエリスリンを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、並びに適する放射性物質の例は、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓあるいは3Ｈを含む。
【００５７】
標的薬剤としての抗体
本明細書中に記載される抗体及び抗体断片は機能基に結合することができ、抗体は４０ｋＤａタンパク質を発現する腫瘍細胞の部位に対する機能基を明らかにするために使用できる。機能基の例は、毒素、放射性核腫、あるいは腫瘍細胞を殺すために使用できる化学療法剤、あるいは４０ｋＤａタンパク質を発現する腫瘍を位置づけて寸法で分類するために使用できる造影剤を含む。ヒトにおける腫瘍に対する機能基を明らかにするために使用される抗体は好ましいモノクローナル抗体であり、例えばヒト化モノクローナル抗体である。
【００５８】
抗体は、機能基及びハイブリッドタンパク質分子をコードする融合遺伝子によりコードされる抗体によって、あるいは別々に生産される抗体と機能基を結合させるために使用される結合、例えば非ペプチド共有結合、例えば非アミド結合、のどちらかにによって機能基と融合できる。本明細書中に記載される抗体は、免疫細胞に特異的であり、腫瘍を殺す免疫細胞を刺激する他の抗体に融合させることもできる。
【００５９】
毒素
有用な毒素分子はペプチド毒素を含み、細胞間に存在するときには顕著な細胞障害性である。毒素の例は細胞毒素、酵素活性を崩壊させてその結果腫瘍細胞を殺す代謝崩壊物（阻害物及び活性化物）、及びエフェクター部分に限られた範囲内で全ての細胞を殺す放射性分子を含む。代謝崩壊物は細胞の代謝を変化させる分子、例えば酵素あるいはサイトカインであり、そのため通常の機能が変わる。広範には、毒素という用語は腫瘍細胞に死をもたらすあらゆるエフェクターを含む。
【００６０】
多くのペプチド毒素は、一般化された真核生物的受容体結合ドメインを有する；これらの例では、毒素は標的タンパク質を有していない細胞を殺すことを防ぐために（例えば、４０ｋＤａタンパク質は有していないが非修飾毒素のための受容体をもつ細胞の殺害を防ぐために）修飾されるに違いない。そのような修飾は、分子の細胞障害性機能を保存する様式で行われるに違いない。潜在的に有用な毒素は、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシン、０−志賀様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−ＩＩv）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、アロリン、サポニン、モデシン、及びゲラニンを含むがこれらには限定されない。その他の毒素は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）及びリンホトキシン（ＬＴ）を含む。抗腫瘍活性を有するもう一つの毒素は、カリーチアミシンガンマ１（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ  ｇａｍｍａ １）、腫瘍に対してかなりの有効性をもつ抗腫瘍抗性を含有するジネエン（ｄｉｙｎｅ−ｅｎｅ）、である（Ｚｅｉｎ， Ｎ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１１９８−２０１（１９８８））。
【００６１】
例として、ジフテリア毒素は本明細書中に記載される抗体と結合しうる。ジフテリア毒素は、配列が知られているＭｕｒｐｈｙ，米国特許番号４，６７５，３８２に詳細に記載されており、本明細書中で参照により援用される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅにより分泌される天然のジフテリア毒素分子は、特徴づけできるいくつかの機能的ドメインで構成されており、トランスロケーションドメイン及び一般化される細胞結合ドメイン（アミノ酸残基４７５から５３５）を含む、酵素的な活性フラグメントＡ（アミノ酸Ｇｌｙ１−Ａｒｇ１９３）及びフラグメントＢ（アミノ酸Ｓｅｒ１９４−Ｓｅｒ５３５）として、分子のアミノ末端で始まる。
【００６２】
抗体への毒素の結合
抗体と毒素機能基はいくつかの方法のいずれかで結合させることができる。もし化合物が融合遺伝子の発現により生産されるならば、ペプチド結合は細胞毒素及び抗体の間の結合として働く。あるいは、毒素及び抗体は別々に生産されて、後に非ペプチド共有結合により結合させることができる。例えば、共有結合はジスルフィド結合の形態をとりうる。この場合、この抗体をコードするＤＮＡは追加のシステインコドンを含有するために従来の方法で設計できる。
【００６３】
ジスルフィド結合の結合について、毒素分子はまた修飾抗体のシステインと反応するメルカプト基を用いて誘導される。ペプチド毒素の場合、この結合は毒素をコードするＤＮＡ配列にシステインコドンを挿入することにより達成できる。あるいは、メルカプト基はそれ自身あるいはシステイン残基の部分としてのどちらかにより、固層ポリペプチド技術を使用して導入できる。例えば、ペプチドへのメルカプト基の導入は、Ｈｉｓｋｅｙ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３：１３７（１９８１）により記載される。
【００６４】
誘導はまた、Ｂａｃｈａら，米国特許番号４，４６８，３８２のペプチドホルモン誘導について記載される方法に従って行うことができる。タンパク質へのメルカプト基の導入は、Ｍａａｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３４：３２（１９８３）に記載される。ひとたび要求されるメルカプト基が存在すると、細胞毒素及び抗体を精製する、両方の硫黄基を還元する、細胞毒素及び抗体を（約１：５から１：２０の割合で）混合して、ジスルフィド結合形成を室温で（一般に２０から３０分）完成に向かわせる。そして、混合物をリン酸緩衝塩水に対して透析して、反応しない抗体及び毒素分子を除去する。セファデックス（登録商標）クロマトグラフィーなどを使用して、大きさに基づいて毒素−毒素及び抗体−抗体結合物から所望する毒素−抗体結合化合物を分離する。
【００６５】
免疫反応モジュレーター
抗腫瘍機能基はまた、局所レベルにおける体の免疫系を活性あるいは阻害のどちらかをする免疫系のモジュレーターでもありうる。例えば、腫瘍に運搬されるサイトカイン、例えばＩＬ−２などのリンホカイン、は腫瘍の近隣において細胞障害性Ｔリンパ球あるいはナチュラルキラー細胞の増殖を引き起こすことができる。
【００６６】
放射性分子
機能基あるいはレポーターグループは、いわゆる“ホウ素中性子捕獲治療”（ＢＮＣＴ）における特異的な条件のもとで放射性となる、例えば低エネルギー中性子の光線に暴露されるときのホウ素、放射性分子、例えば放射性核腫、あるいはいわゆる感光剤、例えば前駆分子でもありうる（Ｂａｒｔｈら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９０：１００−１０７（１９９０））。そのような放射性エフェクター部分を有する化合物は、腫瘍細胞増殖を阻害するため及び画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）目的のために腫瘍細胞を標識するための両方に使用されうる。
【００６７】
放射性核腫はα、β、あるいはγ粒子のいずれかを放射しうる単一原子放射能分子である。アルファ粒子エミッターはβあるいはγ粒子エミッターよりも好ましく、なぜならそれらはより短い距離で相対的に非常に高いエネルギーを放出するため、それゆえ正常細胞に重大な貫通、及び損害、を与えずに効率的であるからである。適するα粒子放出放射性核腫は211Ａｔ、212Ｐｂ、及び212Ｂｉを含む。
【００６８】
放射性分子は直接にあるいは二機能性キレートにより抗体と密接に結合しなければならない。このキレートはｉｎ ｖｉｖｏで放射性分子の溶出及びそれゆえの早熟な放出をさせてはいけない（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７−６２（１９９１））。本発明にＢＮＣＴを適用するために、ホウ素の安定同位体、例えばホウ素１０を抗腫瘍機能基あるいは化合物のエフェクター部分として選択する。ホウ素は、腫瘍細胞に対する抗体の特異的な結合により腫瘍細胞に運ばれて腫瘍細胞内あるいは上で凝集する。蓄積するのに十分な量のホウ素を得られる時間の後、腫瘍は画像化（ｉｍａｇｅ）されて低エネルギー中性子の光線に照射され、約０．０２５  ｅＶのエネルギーを有する。この中性子照射それ自体は腫瘍の周囲の健常な組織、あるいは腫瘍自体のどちらかに対して少ししか障害を引き起こさないが（例えば、腫瘍細胞の表面上の）ホウ素１０は中性子を捕獲して、そこで安定同位体、ホウ素１１を形成する。ホウ素１１は直ちに分解して、リチウム７核及び約２．７９  ｍＥＶのエネルギーを有するα粒子を生み出す。これらの重粒子は高度に致死的であるが、非常に局所的で、放射の形態をとり、なぜなら粒子は約１細胞の直径（１０マイクロ）の経路長（ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｈｔ）しか有していないためである。
【００６９】
計算により、腫瘍細胞を破壊するためには、約１０億のホウ素原子が１平方センチメートル当たり１０12から１０13の熱中性子の流れに加えて要求され、このためα粒子により生成される放射線が窒素及び水素との中性子補獲反応により生成されるバックグランド放射線を上回るということが示されている。
【００７０】
画像化機能基
本明細書中に記載される抗体は４０ｋＤａタンパク質と特異的に結合し、従ってヒト腫瘍を検出するためにも有用である。１つのそのようなアプローチは、適した機能基あるいはレポーターグループ、例えば検出可能シグナルを生産する画像化試薬を用いて標識される抗体を使用する腫瘍画像化技術によりｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を検出することを含む。そのような試薬を用いて抗体を標識するための画像化試薬及び手順はよく知られている（例えば、Ｗｅｎｓｅｌ及びＭｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｃｏｌｃｈｅｒら， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：８０２−１６（１９８６）参照）。標識化抗体は放射性核スキャンニングなどの技術により検出できる（例えば、Ｂｒａｄｗｅｌｌら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｒｙ， Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．），ｐｐ．６５−８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）参照）。
【００７１】
投与
本明細書中に記載される抗体は、腫瘍を画像化するためあるいは治療するために被検体、例えば動物あるいはヒトに投与できる。抗体は単独、あるいは混合、例えば医薬的に許容可能な賦形剤あるいはキャリア（例えば、生理食塩水）の存在下、で投与できる。賦形剤あるいはキャリアは投与の様式及び経路に基づいて選択される。適した医薬的なキャリアはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｅ． Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）、当該技術分野でよく知られている参考文献、及びＵＳＰ／ＮＦ（米国薬局方及び国立処方集）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｌｙ）に記載されている。
【００７２】
医薬的組成物は投与の意図した経路と合うように製剤化される。投与経路の例は非経口的、例えば静脈内的、皮内的、皮下的、経口的（例えば吸入）、経皮的（局所的）、経粘膜的、及び直腸的な投与を含む。非経口的、皮内的、あるいは皮下的な適用に使用される溶液あるいは懸濁液は以下の成分を含みうる：注射のための水、塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールあるいはその他の合成溶剤などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールあるいはメチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｒａｂｅｎ）などの抗菌剤；アスコルビン酸あるいは重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤：酢酸、クエン酸あるいはリン酸などの緩衝液及び塩化ナトリウムあるいはデキストロースなどの張度の調節のための薬剤。ｐＨは塩酸あるいは水酸化ナトリウムなどの酸あるいは塩基を用いて調節できる。非経口的な調製物はアンプル、使い捨て注射器、あるいはガラスあるいはプラスチック製の複数用量バイアル内に封入できる。
【００７３】
本発明の組成物のための投与及び用量計画の最も効果的な様式は、疾病の重度及び経過、治療に対する患者の健康及び反応、及び治療医の判断に依存する。従って、組成物の投与量は個々の患者で適定すべきである。本発明の抗体組成物の効果的な用量は、約１μｇから約５０００  ｍｇ、好ましくは約１から約５００  ｍｇ、あるいは好ましくは約１００−２００  ｍｇの範囲内である。
【００７４】
診断的キット
本発明はまた、上で開示される方法を実行するための診断的キットを含む。診断的キットは、（ａ）本明細書中で記載されるモノクローナル抗体、及び（ｂ）抗体に特異的に結合するパートナー及び結合抗体を検出するための標識の結合物を含む。キットは緩衝剤及びタンパク質安定化剤など、例えば多糖類など、の補助的薬剤も含みうる。診断的キットはさらに、必要なところで、バックグランド干渉を減少させる薬剤、対照試薬、及び試験を行うための装置を含むシグナル産生系のその他の成分を含む。もう一つの態様において、診断的キットは本発明のモノクローナル抗体及び検出可能シグナルを産生できる標識の結合物を含む。上述されるような補助的薬剤も存在しうる。診断的キットの使い方の説明書もまた一般的に含む。
【００７５】
ポリペプチド
本明細書中に記載されるモノクローナル抗体は、結合する４０ｋＤａタンパク質を単離及び特徴づけするために使用できる。モノクローナル抗体に認識されるタンパク質は、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び急性Ｔ細胞白血病を含む様々な腫瘍細胞に見出される新規細胞表面タンパク質である。モノクローナル抗体がこのタンパク質と結合するとき、タンパク質が発現される細胞が死ぬという観察に基づき、そのタンパク質は死誘導分子である。
【００７６】
本発明のモノクローナル抗体に認識されるタンパク質は、タンパク質を発現する細胞（例えば、Ｅ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ、あるいはＣｏｓ）から単離できる。例えば、本明細書中に記載されるモノクローナル抗体は、タンパク質を免疫沈降するために使用できる。タンパク質の配列を決定するために、タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製でき、イモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上で電気ブロットできて、膜はクーマシーブリリアントブルーで染色できる。そして、染色したタンパク質バンド（Ｍｒ＝４０ｋＤａ）は、一連のアミノ末端配列解析のためにカミソリの刃で切り出すことができる。自動化エドマン分解などのアミノ末端配列解析は当該技術分野でよく知られている。
【００７７】
本発明はまた、非関連タンパク質と融合する４０ｋＤａタンパク質を含む融合タンパク質も特色とする。非関連タンパク質は、精製、検出、可溶化を容易にするため、あるいは幾つかの他の機能を提供するために選択されうる。融合タンパク質は合成的に生産できる、あるいはタンパク質は適するカップリング試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、を使用して非関連タンパク質に結合できる。あるいは、融合タンパク質は、適する発現ベクター内で融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列のクローン化によって組み換え的に生産できる。そして、組換え融合ポリペプチドは、培養培地あるいは細胞の融解物から精製できる。
【００７８】
４０ｋＤａタンパク質は、例えばある腫瘍に対して免役するためのワクチンとして有用である。ワクチンなどを調製する手順は当該技術分野で知られている（例えば、Ｅｓｔｉｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８５：１０５２（１９８８）参照）。簡単には、組換えウイルスをクローン化腫瘍関連タンパク質の発現のために構築する。組換えウイルスに感染した細胞は、細胞表面で宿主の組織適合抗原及び免疫原性ウイルスタンパク質と共にタンパク質を発現するであろう。これは腫瘍拒絶において鍵となる役割をする細胞性免疫の誘導を与える。本発明はまたモジュレーターを同定するための方法、すなわち４０ｋＤａタンパク質と結合するあるいは４０ｋＤａタンパク質の発現あるいは活性化に対して刺激的あるいは阻害的な効果を有する試験化合物あるいは薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子あるいは薬物）も提供する。例えば、４０ｋＤａタンパク質の拮抗物質は細胞内でアポトーシスを阻害するために有用であろう。この拮抗物質は被検体において誤った（ａｂｈｅｒｒａｎｔ）アポトーシスを阻害する役割をするかもしれない。
【００７９】
実施例
実施例１：抗腫瘍抗体の生成
リンパ腫の成長あるいは生存及び／又は正常な胸腺細胞機能に関係しうる新規機能分子を同定する試みにおいて、Ｅ７１０．２．３を注射したハムスター由来のハイブリドーマを以下のように生成した。アメリカンハムスターに１千万のＥ７１０．２．３を腹腔内注射して、融合前にブースターを７−１０回行った。融合は記載（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら （１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３４：１６０９）されるように融合パートナーＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３を使用して行った。ハイブリッドの上清は、最初に免疫蛍光及びフローサイトメトリーを使用してＥ７１０．２．３Ａへの結合能力についてスクリーニングした。本明細書中にＤＭＦ１０．６２．３として援用される１つの特定の抗体は、Ｅ７１０．２．３の表面を明るく染色した。
【００８０】
免疫蛍光解析により、ＤＭＦ１０．６２．３は多くのマウス細胞株に反応するが（表Ｉ）、その他には存在しないことが明らかになった（表ＩＩ）。陽性細胞株は、いくつかのＴ細胞株（例えば、ＲＭＡ−Ｓ）、いくつかのＢ細胞リンパ腫（例えば、Ａ２０及びＷＥＨＩ−２３１）、及びマクロファージ細胞株（Ｃ２．３）を含んだ。ＤＭＦ１０．６２．３はまた、非造血性起源のいくつかの不死化した細胞に特異的に結合して、間質細胞株（ＰＢＫ１０１Ａ２）、メラノーマ（Ｂ１６）、肉腫（ＭＣ５７）、及びポリオーマ形質転換線維芽細胞（ＷＯＰ−３０２７）を誘導した。いくつかのその他の未成熟（例えば、Ｇ５８．２）及び成人Ｔ細胞（例えば、ＥＬ４）、マクロファージ（例えば、Ａ３．１）、樹状細胞（ＤＣ２．４）、及び線維芽細胞株（ＬＡＤｐ３１）は、ＤＭＦ１０．６２．３に関して陰性であった。興味深いことに、ｍＡｂはまたいくつかのヒトの不死化した細胞株にも反応して、Ｊｕｒｋａｔ、２９３Ｔ及び１４３Ｂｔｋ−を誘導し、サルＳＶ４０−形質転換腎臓細胞株、Ｃｏｓ７にも反応した。ＤＭＦ１０．６２．３は、Ｂリンパ芽球様細胞、７２１、及び子宮頸癌細胞ＨｅＬａなどの特定のヒト細胞株には結合しなかった。代表的な細胞株の染色パターンは、ＤＭＦ１０．６２．３陽性細胞Ｅ７１０．２．３（Ｆｉｇ．１Ａ）、Ａ２０（Ｆｉｇ．１Ｂ）及びＪｕｒｋａｔ（Ｆｉｇ．１Ｃ）及びＤＭＦ１０．６２．３陰性細胞、ＲＦ３３．７０（Ｆｉｇ．１Ｄ）についてＦｉｇ．１に示す。
【００８１】
【表１】
2011219477.tif 000002
【００８２】
上のデータは、新規抗体が多くのしかし全てではない不死化した細胞株に特異的に結合し、結合は種あるいは細胞系に限定されないことを示した。
【００８３】
【表２】
2011219477.tif 000003
【００８４】
実施例２：ＤＭＦ１０．６２．３に認識される分子の発現
ＤＭＦ１０．６２．３に認識される分子の発現を、以下のように胎児胸腺細胞において調べた。Ｃ５７Ｂ１／１０マウスの調整された（ｔｉｍｅｄ）妊娠により胎生１４日目で屠殺された胚を作り出した。胎児胸腺はエッペンドルフチューブガラスプランジャーを使用してＰＢＳに回収した。単一細胞懸濁液は、Ｆｃレセプターをブロックするために抗ＦｃガンマレセプターＩＩ／ＩＩ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に２０分間氷中にてインキベートした。続いて、細胞をＤＭＦ１０．６２．３あるいはハムスターＩｇＧのどちらかと共に３０分間染色した後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ハムスター、さらにアロフィコヤニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｙａｎｉｎ）（ＡＰＣ）結合抗Ｔｈｙ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加えた。いくつかの実験においては、ＰＥ結合抗ＣＤ２５及びＣｙ−Ｃｈｒｏｍｅ結合抗ＣＤ４４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）も含んだ。染色細胞は１%パラホルムアルデヒド中で一晩固定して、続いてフローサイトメトリーにより解析した。
【００８５】
結果から、ＤＭＦ１０．６２．３で染色した１４日目胎児胸腺細胞は４０ｋＤａタンパク質に関して陽性であることが明らかになり、タンパク質はＴｈｙ１．２陽性細胞上に存在することが見出された（Ｆｉｇ．２Ａ）。興味深いことに、タンパク質はＣＤ２５+ＣＤ４４+胎児胸腺細胞ならびにＣＤ４４+ＣＤ２５-胎児胸腺細胞の両方に存在した。しかし、成人胸腺（Ｆｉｇ．２Ｃ）、成人脾臓（Ｆｉｇ．２Ｂ）及び成人骨髄細胞（Ｆｉｇ．２Ｄ）の染色により、ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質は、これらのいかなる細胞においても対照のハムスターＩｇＧで認められた以上のレベルでは存在しないことが示された。さらに、タンパク質は、複数パラメータ解析においてＣＤ４-ＣＤ８-細胞上で同期（ｇａｔｅ）した後、ＲＡＧ−／−マウス由来のこの集団のフローサイトメトリーあるいは解析により、成人ＣＤ４-ＣＤ８-胸腺細胞上では検出できなかった。１４日目胎児肝臓細胞もＤＭＦ１０．６２．３には反応しなかった。
【００８６】
ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質が正常な、活性化された細胞に存在するかどうかを決定するために、以下のように脾臓Ｔ細胞をＴ細胞有糸分裂促進物質ＣｏｎＡで活性化して、ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質の発現について染色した。脾臓、胸腺、及び骨髄細胞は成人（４−６月齢）Ｂａｌｂ／ｃあるいはＣ５７Ｂ１／６マウスから調製した。赤血球はトリス塩化アンモニウムリーシスを使用して脾臓細胞懸濁液から除去した。すぐに非刺激細胞を染色した。リンパ芽球は培養において１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡあるいは１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。培養１−３日後、細胞をＤＭＦ１０．６２．３の発現について染色した。バックグランド以上の顕著な染色は、非刺激細胞（Ｆｉｇ．３Ａ）あるいは活性化２４（Ｆｉｇ．３Ｂ）、４８（Ｆｉｇ．３Ｃ）、７２（Ｆｉｇ．３Ｄ）時間後にＣｏｎＡで刺激した細胞では認められなかった（ＦＡＣプロファイルではシフトしていない）。陽性対照として、ＣｏｎＡ刺激細胞をＣＤ２５で染色した。期待されるように、ＣｏｎＡ処理により非刺激細胞と比較するとこれらの細胞上のＣＤ２５発現は顕著に増加した（細胞へのＣＤ２５の結合はＦＡＣプロファイルのシフトを引き起こす）。同様に、脾臓Ｂ細胞をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したとき、ＤＭＦ１０．６２．３の染色は２４（Ｆｉｇ．３Ｅ）、４８（Ｆｉｇ．３Ｆ）、７２（Ｆｉｇ．３Ｇ）時間では認められなかったが（ＦＡＣプロファイルではシフトしていない）、しかし、これらの細胞はＣＤ２５を強く発現した（ＦＡＣプロファイルではシフトした）。ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質は成人骨髄細胞上には存在していない（Ｆｉｇ．２Ｄ）。これらのデータは、ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質はいくつかの胎児胸腺細胞上に存在しているが、成熟した動物の造血起源の正常の静止あるいは活性化細胞上には存在していないことを示す。
【００８７】
実施例３：ＤＭＦ１０．６２．３は腫瘍細胞の増殖を阻害する
Ｅ１７０．２．３細胞を低密度で成長させて、ＰＭＡの非存在下で維持すると、細胞はゆっくり増殖するかあるいは全く増殖しない。しかし、それらは胸腺細胞と共培養すると増殖する。 ＤＭＦ１０．６２．３は当初、この胸腺細胞誘導増殖をブロックする能力により同定された。表ＩＩＩで示すように、ＤＭＦ１０．６２．３は完全にこの反応を阻害する（Ｆｉｇ．４Ａ）。増殖アッセイは以下のように行った。Ｅ１０．２．３細胞を洗浄してＰＭＡを除去して、低細胞濃度（＜１０5／ｍｌ）で４８時間コンプリートＲＰＭＩ中にて培養して、バックグランドの増殖を減少させた。続いて、５ ｘ １０3細胞を７２時間平底マイクロタイタープレートにて２５  ｎｇ／ｍｌのＰＭＡあるいは５ ｘ １０5の胸腺細胞と共に抗体の存在下あるいは非存在下で培養した。細胞の自発的な増殖に対する抗体の効果を調べる実験では、Ｅ７１０．２．３（高密度での成長＞１０5／ｍｌ）あるいはＲＭＡ−Ｓ細胞を様々な濃度の抗体の存在下あるいは非存在下で３６時間培養した。3Ｈ−チミジン（１  ＴＣｉ／ウェル）を最後の５時間加えて、ＤＮＡ内への標識の取り込みをＪ−シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にて測定した。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
その他の刺激に対するＥ７１０．２．３の反応を阻害するＤＭＦ１０．６２．３の能力も調べた。表ＩＩＩに示すように、抗体はＥ７１０．２．３のＰＭＡ誘導増殖もブロックした。さらに、Ｅ７１０．２．３は高密度で成長させたときには自発的に増殖して、ＤＭＦ１０．６２．３はこの反応を阻害した（Ｆｉｇ．４Ａ）。増殖は３μｇ／ｍｌで顕著に阻害されて、１２．５μｇ／ｍｌで完全な阻害が観察される。対して、ハムスターＩｇＧは、これらのあらゆる刺激に対するＥ７１０．２．３の反応には効果を持たなかった。同様に、もとの融合由来の多くのｍＡｂはＥ７１０．２．３に結合したが、その増殖は阻害しなかった（例えば、ＤＭＦ１０．１３２）（表ＩＩＩ）。従って、ＤＭＦ１０．６２．３は増殖を誘導するために使用される刺激に関わらず、Ｅ７１０．２．３の増殖を特異的に阻害した。
【００９０】
ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質は、多くのその他の細胞株に存在する。従って、抗体がそれらの自発的な増殖に同様な効果を持つかどうかを決定することは興味深い。ＤＭＦ１０．６２．３はＲＡＭ−Ｓ（Ｆｉｇ．４Ｂ）ならびに試験した多くのその他の細胞株の増殖を阻害した。対して、抗体はＤＭＦ１０．６２．３タンパク質の存在が陰性であるＲＦ３３．７０の自発的な増殖には効果を持たなかった（Ｆｉｇ．４Ｃ）。
【００９１】
実施例４：ＤＭＦ１０．６２．３はアポトーシスによる細胞死を誘導する
アポトーシスはＲ&Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及びＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのキットを使用してアッセイした。簡単には、２ ｘ １０5の細胞を様々な濃度の抗体と共に２００ ｉｌ培地でインキベートした。インキベーションの終わりに、細胞をＰＢＳにて２回（Ｘ）洗浄して、１５分間ＰＩ及びＦＩＴＣアネキシンで処理して、そしてフローサイトメトリーで解析した。ＤＮＡ断片は、Ｓｃｈａｔｔｎｅｒら（（１９９５）Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１５５７）に記載されるように、２%アガロースゲル上でのアガロースゲル電気泳動によりアッセイした。
【００９２】
抗体ＤＭＦ１０．６２．３で処理した細胞の培養は視覚化して点検して、インタクトな細胞の数の減少を書き留めた。加えて、細胞はもはや生体染色トリパンブルーを排出しなかった。この観察ならびに増殖阻害は、抗体が細胞に対して細胞障害的であることを示唆した。従って、研究はＤＭＦ１０．６２．３が細胞死を誘導する機序を決定するために行われた。
【００９３】
細胞はアポトーシスあるいは壊死により死にうる。アポトーシスが起こりつつある細胞に見られる早期の変化の１つは、細胞質膜上のホスファチジルセリンの外面化であり、これはＦＩＴＣアネキシンで染色することにより検出できる。過程における早期では、アポトーシス細胞はヨウ化プロピジンなどの生体染色を排出することができ、従ってＦＩＴＣアネキシン陽性及びＰＩ陰性として同定できる。アポトーシス過程の後期では、膜の完全性が失われてＦＩＴＣアネキシン陽性細胞がＰＩ陽性になる。対して、壊死の間、細胞は膜の完全性を失い、ＦＩＴＣアネキシン陽性及びＰＩ陰性がなく同時にＰＩ陽性及びＦＩＴＣアネキシン陽性となる。
【００９４】
Ｆｉｇ．５Ａから５ＩのＦＡＣプロファイルにおいて、左の下方の象限にある細胞は生細胞であり、下方の右の象限にある細胞はアポトーシスを起こしつつあり（ＦＩＴＣアネキシン陽性）、上方の右の事象にある細胞はアポトーシスあるいは壊死により死んでいる細胞である（ＰＩ陽性及びＦＩＴＣアネキシン陽性）。各々の事象にある細胞のパーセンテージも示す。本研究では、あるパーセンテージのＥ７１０．２．３細胞は培養において自発的なアポトーシスを起こした（１０．９から１５%でアネキシン+、ＰＩ−）。しかし、１μｇ／ｍｌ程度のＤＭＦ１０．６２．３は１時間でアポトーシスの顕著な増加を引き起こし（２８．９%でアネキシン+、ＰＩ−；Ｆｉｇ．５Ａ）、このアポトーシスは時間にわたり増加した（３時間までに４８．６%でアネキシン+、ＰＩ陽性）（Ｆｉｇ． ５Ｃ）。より高濃度のＤＭＦ１０．６２．３（１５μｇ／ｍｌ）は、時間においてより急速に（１時間までに３７．１%でアネキシン+、ＰＩ陽性）及びより多くの細胞で（Ｆｉｇ．５Ｅ−Ｇ）アポトーシスを刺激した。対して、同量のハムスターＩｇＧでの処理は、培地のみより顕著な効果は持たなかった（Ｆｉｇｓ．５Ｄ， ５Ｈ，５Ｉ）。アポトーシスはまた、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の視覚化により証明された。
【００９５】
ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質はその他の細胞上で発現し、この抗体は（試験したところでは）それらの増殖を阻害したため、ＤＭＦ１０．６２．３はまたそれらを刺激してアポトーシスを起こすかどうかをさらに調べた。ＤＭＦ１０．６２．３はマウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ２７．４及びＡ２０及びヒト細胞株Ｊｕｒｋａｔ及び１４３ＢＴＫ−の顕著なアポトーシスを引き起こした（表ＩＶ）。アポトーシスは１５μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３を使用して誘導され、より高濃度の抗体で増加した。対して、ＤＭＦ１０．６２．３はタンパク質が陰性であるＲＦ３３．７０ではアポトーシスを引き起こさなかった。ＤＭＦ１０．６２．３により誘導されるアポトーシスのレベルは、種々の細胞株間で変化しており、表面発現のレベルさらにはタンパク質を発現する集団内での細胞のパーセンテージに依存している可能性がある（表ＩＶ）。例えば、大半のＥ７１０．２．３及びＲＭＡ−Ｓ細胞は高レベルでタンパク質を発現しており、ＤＭＦ１０．６２．３はこれらの細胞株の両方で高レベルのアポトーシスを誘導した。対して、ほんの少数のＡ２０及びＬＢ２７．４細胞は低レベルで４０ｋＤａタンパク質を発現しており、ＤＭＦ１０．６２．３はこれらの細胞においてより低レベルのアポトーシスを誘導した（表ＩＶ）。Ｅ７１０．２．３及びＲＡＭ−Ｓ細胞はｆａｓを発現していないため、ＤＭＦ１０．６２．３によるアポトーシスの刺激はｆａｓ依存性である可能性がある（表ＩＶ）。
【００９６】
【表４】
2011219477.tif 000005
【００９７】
実施例５：ＤＭＦ１０．６２．３はＥ７１０．２．３及びその他の細胞株において同型的凝集（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を引き起こす
同型的凝集（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）は生物学的な活性過程であり、それにより細胞は刺激されて互いに接着する。凝集アッセイは以下のように設定した。１０5の細胞を２００ ｉｌコンプリートＲＰＭＩ中で様々な濃度のＤＭＦ１０．６２．３あるいはハムスターＩｇＧと共にあるいは抗体を用いずにインキベートした。阻害剤の効果を試験するために、１０5の細胞を阻害剤と共に３０分間プレインキベートして、そしてＤＭＦ１０．６２．３ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を６時間阻害剤の継続的な存在下で加えた。凝集に対するパラホルムアルデヒドの効果を試験するために、細胞を１０分間１%パラホルムアルデヒド中で固定して、洗浄して、そしてＤＭＦ１０．６２．３を６時間加えた。凝集は視覚的に点数をつけた。顕微鏡写真は熱電気的冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）を使用して６時間の時点で撮影した。ＤＭＦ１０．６２．３は培養においてＥ７１０．２．３の同型的凝集を誘導することが見出された。６時間の時点で、顕著な凝集が５μｇ／ｍｌあるいはそれ以上の抗体で処理した細胞で観察された。対して、ハムスターＩｇＧあるいは培地で処理した培養物には凝集は観察されなかった。この凝集は、アクチン微小フィラメントを破壊するサイトカラシンＢ、カルモジュリン依存性過程を阻害するトリフルオペラジン、ＡＴＰ合成を阻害するＮａアジド+２デオキシグルコース、及びＣａ２+及びＭｇ２+をキレートするＥＤＴＡを含む様々な濃度の薬剤で処理することによりブロックされた。対して、凝集は微小管形成を阻害するコルヒチンには影響されなかった。凝集は４℃でのインキベーション及びパラホルムアルデヒドでの処理によっても阻害された（表Ｖ）。これらの結果から、凝集は活動的な過程であり単一の凝集ではないことが示される。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
ＤＭＦ１０．６２．３は、ＤＭＦ１０．６２．３結合タンパク質を発現するいくつかの他の細胞株（例えば、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ）の同型的凝集も引き起こした。しかし、バックグランド以上の凝集は、いくつかの他のＤＭＦ１０．６２．３陽性細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＬＢ２７．４、Ａ２０、１４３Ｂｔｋ−）に関してはほとんど見られなかった。ＤＭＦ１０．６２．３が結合しないＲＦ３３．７０では凝集は見られなかった。
【０１００】
凝集アッセイは、新規抗体が本発明の新規抗腫瘍抗体の１つであるかどうかを決定するのを助けるために使用できる。
【０１０１】
実施例６：ＤＭＦ１０．６２．３はＧＰＩ結合性でない４０ｋＤａタンパク質を免疫沈降する
ＤＭＦ１０．６２．３により結合されるタンパク質を特徴づけるために、以下のように35Ｓ標識化及び免疫沈降を行った。５ ｘ １０6のＥ７１０．２．３細胞をメチオニン除去培地にて１時間欠乏（ｓｔａｒｖｅ）させて、そして０．５ ｍＣｉ／ｍｌの35Ｓ メチオニンと共に２時間インキベートした。標識化細胞は、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：２２３５）により記載されるように免疫沈降緩衝液中で融解した。不純物を除いた融解物はハムスターＩｇＧで事前浄化し（ｐｒｅｃｌｅａｒ）、プロテインＡセファロース結合ＤＭＦ１０．６２．３を用いて免疫沈降して、１４%ゲルでのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。ＤＭＦ１０．６２．３結合タンパク質の分子量を決定するために、Ｅ７１０．２．３細胞を35Ｓ メチオニンと共に２時間標識化した。標識化細胞由来の免疫沈降物は、還元状態のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【０１０２】
ｍＡｂ ＤＭＦ１０．６２．３は、還元状態のもとでＥ７１０．２．３由来の約４０ｋＤａタンパク質を免疫沈降した。このタンパク質の電気泳動移動度は、非還元状態のもとでも変わらなかった。このバンドは正常ハムスターＩｇＧを用いた免疫沈降物、あるいは抗ＭＨＣクラスＩ抗体、Ｙ−３を用いた免疫沈降物には見られなかった。４０ｋＤａタンパク質は、表面標識化Ｅ７１０．２．３及びＲＭＡ−Ｓ細胞の融解物中でも同定された。
Ｔｈｙ−１及びＬｙ−６ Ａ／Ｅなどのいくつかの細胞表面分子は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞表面に結合する。この表面結合はＰＩ−ＰＬＣでの処理に感受性がある。ＤＭＦ１０．６２．３に認識されるタンパク質がＧＰＩ結合性かどうかを決定するために、細胞表面にタンパク質を発現するＲＭＡ−Ｓ細胞をＰＩ−ＰＬＣで処理した。ＰＩ−ＰＬＣ処理によりＤＭＦ１０．６２．３染色は衰えなかったが、ＧＰＩ結合分子Ｔｈｙ−１に関する染色は減少した；ＤＭＦ１０．６２．３に認識される４０ｋＤａタンパク質は、ＧＰＩにより細胞表面に繋がれているのではないことが示唆される。
【０１０３】
実施例７：ＤＭＦ６２．３抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ＡＫＲマウスに５ ｘ １０6の同系のＥ７１０．２．３腫瘍細胞をＩＶあるいはＩＰで注射して、塩水あるいは０．５  ｍｇの対照あるいはＤＭＦ６２．３抗体のＩＰ注射を初日及び再度１０日後に与えた。動物の生存は５０日間追跡した（表ＶＩ）。
【０１０４】
【表６】
2011219477.tif 000007
【０１０５】
寄託申告（Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）
モノクローナル抗体ＤＭＦ１０．６２．３を生産するハイブリドーマ細胞株は、１９９９年７月２０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）， １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡにより受理され（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３０７）、モノクローナル抗体ＤＭＦ１０．１６７．４及びＤＭＦ１０．３４．３６を生産するハイブリドーマ細胞株は、１９９９年７月２２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）， １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡにより受理された（それぞれＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５及びＰＴＡ−４０４）。ハイブリドーマは、３７  ＣＦＲ  １．１４及び３５ ＵＳＣ １２２のもとでそれに対して権利を与えるために、特許及び商標委員によって決定されるものにそれらを開示する特許出願が未決の間は、ハイブリドーマへの接触が有効であることを保証する、という条件の下で寄託されている。寄託は、主題の出願の対照、あるいはその所産が提出される国において、外国の特許法により要求されるときに有効である。しかし、寄託の有効性は、政府の決定により認められる特許権利の減損において主題の発明を実行するための許可は継続しないことを理解されるべきである。
【０１０６】
さらに、主題の培養の寄託は、微生物の寄託についてのブタペスト条約の規定に合わせて、保存されて公共に利用できる、すなわち、それらは寄託の試料の供給の最も最近の要求の後少なくとも５年間、及びいかなる場合でも、寄託した日の後少なくとも３０年間、あるいは培養を開示することを発するいかなる特許の実施可能な生命にとって、寄託からの試料の最後の要求の後さらに５年間、それらを生存させてコンタミをしないようにし続けるために必要なあらゆる配慮をもって保存されるであろう。寄託者は、受託者が試料を要求したとき寄託の状態のために試料が供給できない寄託は戻さなければならないという義務を承認する。社会に対する主題の培養寄託の有効性におけるあらゆる制限は、それらを開示する特許の承認の上変更できないよう除去されるであろう
その他の態様
本発明はその詳細な記述に関連して記載されているが、先の記述は説明を意図して折り本発明の範囲を限定するものではなく、それは添付の請求項の範囲により定義される。その他の観点、利点、及び修飾は次の請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１Ａ−Ｄは、ＤＭＦ１０．６２．３により検出される、Ｅ７１０．２．３（図１Ａ）、Ａ２０（図１Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ（図１C）、及び、ＲＦ３３．７０（図１Ｄ）における、４０ｋＤａ蛋白の発現を示す４つのフローサイトメトリーのグラフである。
【図２】図２Ａ−Ｄは、ＤＭＦ１０．６２．３により検出される、14日の胎児胸腺（図２Ａ）、総成人脾臓（図２Ｂ）, 総成人胸腺（図２Ｃ）、及び総成人骨髄（図２Ｄ）における、４０ｋＤａ蛋白の発現を示す４つのフローサイトメトリーのグラフである。
【図３】図３Ａ−Ｇは、ＤＭＦ１０．６２．３により検出される、未刺激でフレッシュに回収されたＴ及びＢ細胞（図３Ａ）、２４時間活性化されたＴ細胞（図３Ｂ）、４８時間活性化されたT細胞（図３Ｃ）、７２時間活性化されたＴ細胞（図３Ｄ）、２４時間活性化された脾臓Ｂ細胞（図３Ｅ）、４８時間活性化された脾臓Ｂ細胞（図３Ｆ）、及び７２時間活性化された脾臓Ｂ細胞（図３Ｇ）における、４０ｋＤａ蛋白の発現を示す７つのフローサイトメトリーのグラフである。
【図４】図４Ａ−Ｃは、モノクロ−ナル抗体ＤＭＦ１０．６２．３による、Ｅ７１０．２．３細胞（図４Ａ）、ＲＭＡ−Ｓ細胞（図４Ｂ）、または、ＲＦ３３．７０細胞（図４Ｃ）の、自発的な増殖の阻害を示す３つの線グラフである。
【図５】図５Ａ−Ｉは、１μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３で1時間（図５A）、１μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３で２時間（図５Ｂ）、１μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３で３時間（図５C）、ハムスターＩｇＧで３時間（図５D）、１５μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３で１時間（図５Ｅ）、１５μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３で２時間（図５F）、１５μｇ／ｍｌのＤＭＦ１０．６２．３で３時間（図５Ｇ）、ハムスターＩｇＧで３時間（図５Ｈ）、及び、抗体なしで（図５Ｉ）処理したＥ７１０．２．３細胞における、アポトーシスの誘導を示す９つのフローサイトメトリーのグラフである。
【図１】
2011219477.tif 000008
【図２】
2011219477.tif 000009
【図３】
2011219477.tif 000010
【図４】
2011219477.tif 000011
【図５】
2011219477.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月6日(2011.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から成る群：
（ｉ）抗体ＤＭＦ１０．１６７．４の相補性決定領域を有するヒト化抗体；
（ｉｉ）抗体ＤＭＦ１０．６２．３の相補性決定領域を有するヒト化抗体；
（ｉｉｉ）抗体ＤＭＦ１０．３４．３６の相補性決定領域を有するヒト化抗体；
（ｉｖ）ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と抗体ＤＭＦ１０．１６７．４の軽鎖及び重鎖の可変領域とを有するキメラ抗体；
（ｖ）ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と抗体ＤＭＦ１０．６２．３の軽鎖及び重鎖の可変領域とを有するキメラ抗体；
（ｖｉ）ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と抗体ＤＭＦ１０．３４．３６の軽鎖及び重鎖の可変領域とを有するキメラ抗体；
（ｖｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．１６７．４；
（ｖｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．６２．３；及び
（ｉｘ）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４によって生産されるモノクローナル抗体ＤＭＦ１０．３４．３６、
より選択される、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が細胞に結合した場合に同型の細胞凝集を誘導する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
抗体又はその抗原結合断片が結合する細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項４】
抗体又はその抗原結合断片が、Ｅ７１０．２．３、ＲＭＡ−Ｓ、ＣＴＬＬ、ＬＢ１７．４、Ａ２０、ＷＥＨＩ−２３１、ＰＢＫ１０１Ａ２、Ｃ２．３、Ｂ１６、ＭＣ５７、ＷＯＰ−３０２７、２９３Ｔ、１４３Ｂｔｋ、Ｊｕｒｋａｔ、及びＣｏｓから成る群より選択される１種以上の腫瘍細胞株に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗体。
【請求項５】
抗体がＥ７１０．２．３細胞に特異的に結合する、請求項４に記載の単離抗体。
【請求項６】
検出可能な標識を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
検出可能な標識が、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質から成る群より選択される、請求項６に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
細胞株ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０５、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７、及びＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４０４から成る群より選択される、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片を含む、腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片を含む、細胞においてアポトーシスを誘導するための医薬組成物。
【請求項１２】
細胞が、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、及び急性Ｔ細胞白血病から成る群より選択される腫瘍細胞である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片及びその使用説明書を含むキット。
【請求項１５】
胸腺リンパ腫、Ｔ細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ、骨肉腫、又は急性Ｔ細胞白血病から成る群より選択される腫瘍を検出するための、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
機能基に結合した請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む腫瘍細胞標的薬剤であって、機能基は、細胞毒、放射性核種、放射性同位体、化学療法剤、及び造影剤から成る群より選択される、前記薬剤。
【請求項１７】
被験者の腫瘍細胞に機能基を選択的に運搬するための、請求項１６に記載の腫瘍標的薬剤。