(57)【要約】【課題】  マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質の各種分野における利用を促進するために、マトリックスメタロプロテアーゼを阻害する新たな有効成分とその供給源を開発する。【解決手段】  ジメチルアリルカフェ酸エステルを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。該阻害剤を含有する飲食用または口腔用組成物として利用される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるジメチルアリルカフェ酸エステルを含有し、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＭＰ２阻害活性を有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【化１】
2011144202.tif 000004
【請求項２】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有することを特徴とする口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポプラ抽出物、ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物、またはそれらの含有成分を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix
metalloproteinase：以下、MMPと略記することがある）阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＭＰは細胞外マトリックスを分解する酵素群で、19種のヒトＭＭＰが報告されている〔岡田保典  産科と婦人科9（7）：1115−1124,2000（非特許文献１）〕。例えば、ゼラチナーゼであるＭＭＰ２は細胞外マトリックスの構成要素であるゼラチン、ラミニン、アグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する酵素であり、この酵素の働きを阻害することにより癌細胞の浸潤と転移が抑制されることが報告されている〔Imren S. 他、Cancer Res 56：2891-2895,1996（非特許文献２）〕。MMP２は特に乳がんの転移に深く関与している〔中島元夫  日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：２号  1998年（非特許文献３）〕。マトリライシンと呼ばれるＭＭＰ７は癌細胞特異的に産生され、ＭＭＰ２と同様にゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンを分解する。胃癌や大腸癌ではＭＭＰ７の発現と癌転移との相関が報告されている。また、細胞膜と結合するＭＴ１−ＭＭＰはプロテオグリカン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分解し、大腸癌細胞や乳癌細胞の遊走を引き起こすことが知られている〔Koshikawa N.他、J
Cell Biol 148：615-624,2000（非特許文献４）〕。
【０００３】
細胞外マトリックスは哺乳動物の組織において細胞間のすきまを埋めている生体高分子であるが、この細胞外マトリックスの代謝はこれらのＭＭＰとＭＭＰ阻害因子（ＴＩＭＰ: Tissue inhibitors of matrix metalloproteinase）とのバランスにより調節されている。細胞外マトリックス成分の構造異常や、合成・分解の代謝バランスの崩れは、腫瘍転移、アレルギー（例：関節炎疾患，慢性関節リウマチ）、骨吸収疾患（例：骨粗鬆症）、歯周病、角膜潰瘍，皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などの疾患の原因となる。よって、ＭＭＰ活性を阻害する物質は、これら６つの疾患に対する治療または予防薬として利用できる可能性がある。
【０００４】
これまでにＭＭＰ活性を阻害する物質が幾つか報告されている。例として、ヒドロキサム誘導体〔特開平08−81443（特許文献１）〕、フラボノイド類〔特開平8−104628（特許文献２）〕、特開2000−80035（特許文献３）〕、エスクレチン誘導体〔特開平08−183785（特許文献４）〕、スルホニルアミノ酸誘導体〔特開平09−309875（特許文献５）〕、テルペン類〔特開平11−139947（特許文献６）〕、タンニン類〔特開2000−344672（特許文献７）〕などが知られている。その他、有効成分は特定できていないが、ユーカリなどの植物エキスに、ＭＭＰの阻害作用があることも報告されている〔特開2001-64192（特許文献８）、特開2001−192316（特許文献９）〕。
【０００５】
ポプラは東アジアなどに生息する植物で、その芽は民間療法的に去痰薬として利用されている〔野呂征男ら  薬用植物学  ｐ106  1992年改訂第４版（非特許文献５）〕。その関与成分はサポニン、タンニン、精油とされる。しかしながら、ポプラの抽出物がＭＭＰ阻害活性を有しているという報告はない。また、ＭＭＰ阻害に関わる疾患である腫瘍転移、アレルギー、骨吸収疾患、歯周病、角膜潰瘍，皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などの緩和に効果があるとする報告もない。
【０００６】
一方、プロポリスはミツバチがアレクリン（Baccharis dracunculifolia）などの植物の葉、新芽、実などの樹脂や樹液と唾液を混合して構築する物質で〔田澤茂実ら  Natural Medicines 54(6)：306‐313，2000（非特許文献６）〕、抗菌性や抗酸化作用に優れ、特に癌治療・予防に民間療法的に利用されてきた。マウスを用いた動物試験においてプロポリス抽出物が直腸癌細胞の肺へ転移を抑制することが報告されている〔新井成之  ミツバチ科学15（4）：155−162，1994（非特許文献７）〕。しかしながら、そのメカニズムは十分に解明されておらず、プロポリス抽出物がマクロファージを主体とする免疫細胞の活性化したことによるものと推測されているにすぎない。
【０００７】
また、プロポリスには抗アレルギー作用、抗炎症作用、歯周病予防作用もあることが知られているが、その作用メカニズムは不明な点が多い。抗アレルギー作用および抗炎症作用についてはプロポリス抽出物のヒアルロニターゼ活性抑制作用〔八並一寿  フードリサーチ165：35−39，2000（非特許文献８）〕、歯周病予防についてはプロポリス抽出物の抗菌作用及び抗酸化作用によるものと考えられていた〔歯科学報：97（6）649−653，1997（非特許文献９）〕。よって、プロポリスエキスやその含有成分がＭＭＰ活性を顕著に阻害するであろうとは考えられていなかった。
【０００８】
また、これらの報告で実験材料として使用されたプロポリスはブラジル産（その起源植物は主にアレクリンでポプラは全く含まれない）であり、ポプラを起源植物とする中国産のプロポリスとは内容成分が本質的に異なる。実際、採取された国または地域によって、プロポリスに含まれる有効成分の種類と含有量に差がある。その理由はプロポリスの起源植物が異なるためであると考えられている〔熊澤茂則：ミツバチ科学，22(1)：1-8，2001（非特許文献１０）〕。
【特許文献１】特開平08−81443
【特許文献２】特開平8−104628
【特許文献３】特開2000−80035
【特許文献４】特開平08−183785
【特許文献５】特開平11−139947
【特許文献６】特開平11−139947
【特許文献７】特開2000−344672
【特許文献８】特開2001-64192
【特許文献９】特開2001−192316
【非特許文献１】岡田保典  産科と婦人科9（7）：1115−1124,2000
【非特許文献２】Imren S.他、Cancer Res56:2891-2895,1996
【非特許文献３】中島元夫  日本婦人科腫よう学会雑誌16巻：２号  1998年
【非特許文献４】Koshikawa N.他、J Cell Biol148:615-624,2000
【非特許文献５】野呂征男ら  薬用植物学  ｐ106  1992年改訂第４版
【非特許文献６】田澤茂実ら  Natural Medicines 54(6):306‐313，2000
【非特許文献７】新井成之  ミツバチ科学15（4）：155−162，1994
【非特許文献８】八並一寿  フードリサーチ 165：35−39，2000
【非特許文献９】歯科学報：97（6）649−653，1997
【非特許文献１０】熊澤茂則：ミツバチ科学，22(1)：1-8，2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＭＭＰ阻害物質の各種分野における利用を促進するために、ＭＭＰを阻害する新たな有効成分とその供給源を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者はポプラに着目し、ＭＭＰ活性の阻害の程度を調べた結果、ポプラ抽出物が優れたＭＭＰ阻害剤であることを発見し、また、ポプラを起源植物とするプロポリス、特に中国産のプロポリスにおいても同等のＭＭＰ阻害活性があることを発見した。さらに、その抽出物を精製することにより関与成分の同定および構造決定を行い、下記の式（Ｉ）で表されるカフェ酸エステルであることを見出し、実際に化学合成された標品を用いてこれらの関与成分がＭＭＰ阻害活性を有することをも証明した。
【００１１】
【化１】
2011144202.tif 000002
【００１２】
かくして、本発明は、ポプラ抽出物、または、ポプラを起源植物とするプロポリス（特に中国産プロポリス）の抽出物を含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤を提供するものである。さらに、本発明は、上記の構造式（Ｉ）で示される化合物であるジメチルアリルカフェ酸エステルを含有することを特徴とするＭＭＰ阻害剤も提供する。
また、本発明に従えば、上記のごとき本発明のＭＭＰ阻害剤の用途として該阻害剤を含有する飲食用または口腔用組成物が提供される
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、これまでに認識されていなかったポプラ抽出物、ポプラを起源植物とするプロポリス抽出物、およびジメチルアリルカフェ酸エステルから成る新しいタイプのＭＭＰ阻害剤とそれを含有する各種組成物を可能にするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤はポプラもしくはポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物、またはその成分物質を含む。プロポリスはブラジル、中国、オーストラリア、ヨーロッパなど世界各国で採取されているが、その地域に生育しているプロポリスの源となる植物が異なるため、プロポリスに含まれる成分の種類や量に差がある場合もある（既述の非特許文献１０）。本発明において使用するプロポリスは起源植物としてポプラを含むものに限定される。この種のプロポリスは主に中国で採取される。
【００１５】
本発明のＭＭＰ阻害剤を構成するポプラ抽出物またはプロポリス抽出物（ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物）を得るには、ポプラ（特にその新芽）またはプロポリスを抽出操作に供する。この抽出操作は、特に限定されるものではないが、一般に、エタノール、グリセロールなどのアルコールまたはアルコール水溶液（水とアルコールの混合物）または疎水性有機溶媒（例：へキサン）または超臨界状態（二酸化炭素の臨界温度及び臨界圧力を超えた状態）の二酸化炭素を抽出剤として用いることによって効率的に抽出される。なお、疎水性有機溶媒を用いて得られた抽出物からなる素材を医薬食品に用いる場合にその溶媒が残留していると安全衛生上問題があるので、精製して完全にその溶媒を除去する必要がある。
【００１６】
ポプラ抽出物は精製または濃縮または希釈して、あるいはそのままの状態で食品として用いることができる。界面活性剤を用いて水に乳化させて使用することもできるし、単独でまたは副原材料と混合してカプセルや錠剤に包含して製剤化することもできる。ポプラ抽出物を混合して得られた飲食組成物（例：菓子、パン、飴、ガム、飲料水など）は癌転移などの病気予防を目的として利用できる。また、ポプラ抽出物を歯磨き粉またはうがい液等に混合して得られた口腔組成物を歯周病予防のために利用することもできる。
【００１７】
ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物（特に中国産プロポリス）も同様の仕様・形状で利用できる。
【００１８】
ポプラ抽出物を歯磨き粉等に混合して得られた口腔組成物を歯周病予防のために利用する場合、歯磨き粉に対するポプラおよびプロポリス抽出物の含有率は特に限定しない。ただし、十分な効果を期待するためにはポプラ抽出物濃度は３％（W／W）以上が望ましい。
以下に本発明を実施例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
ポプラ抽出物のＭＭＰ阻害活性測定
２種のＭＭＰ〔膜結合型のＭＴ１−ＭＭＰ、およびゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）〕に対する阻害率を測定した。これらのＭＭＰの活性型タンパク質の調製は公知の方法（特許文献７：特開２０００−３４４６７２）に従って大略次のように行なった。
まず、これら２種のｃDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌に感染させ、その大腸菌内で大量発現させた。発現したタンパク質をアフィニティーカラムで精製し、再構成（リフォールディング）を行った。MT1−MMPはトリプシンと反応させて、活性型のタンパク質を調整した。一方、MMP−２についてはｐ‐ＡＭＰＡ（p-aminophenylmercuric
acetate：ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀）と反応させ、活性型のタンパク質を調整した。
【００２０】
ポプラ（Populus lassiocarpa）の新芽の乾燥物1グラムを粉砕し、木屑などのゴミを除去した後、3mlの95％濃度エタノールまたはエタノール水溶液と混合し、3日間室温で攪拌した。その混合物を絞り、フィルターろ過（６μｍメッシュ）して得られた上清をポプラ抽出物（1番絞り）とした。さらに、その絞り残渣にエタノールを加え、同様に抽出した（２番絞り）。最終的に、これらの抽出物を混合し、試験用のポプラ抽出物とした。
【００２１】
ポプラ抽出物原液を100％エタノールで50mg/mlに調製したものを、70μlをHPLC（カラム：CAPCELLPAKC18  10mm×250mm）に注入し、フラクション採取（溶出条件：70％アセトニトリル/30mn、UV280nm、Flow rate 3.0ml/min）を行った。分取したサンプルを凍結乾燥後、乾重量を測定し、50％エタノールで１mg/mlに調製した。
【００２２】
これらの各フラクションサンプルおよび適当に希釈したプロポリス抽出物（抽出物濃度：0.1〜10000μg/ml）の20μl、アッセイバッファー  20μl（Tris-HCl pH7.5  500mM、NaCl 1.5M、CaCl2 100mM、ZnSO4 500μM、NaN3 30mM、Brij35 0.05%）、MT1−MMPを加え、37℃で15分間プレインキュベーション後、MOCAc/DNPペプチド  120μl（4.16μM）を加えて、37℃に保ちながら蛍光マイクロプレートリーダー（検出条件：励起波長320nm、蛍光波長390nm）で15分ごとに、120分間経時的に測定を行った。測定後に20mM EDTA  20μlを加えて反応を停止させ、蛍光UV検出器付HPLCに5μl注入してペプチドの検出を行った（検出条件：70％アセトニトリル/0.1%TFA/30mn、UV280nm、Flow rate 1.0ml/min）。なお、阻害率の算出は以下の計算法に従った。
阻害率：  HPLCによる分析結果から算出した阻害率
阻害率（％）＝(A-B)/A×100
A=MT1のpeak height
B=各sampleのpeak height
【００２３】
さらに、MMP阻害活性の程度を定量的に比較評価するため、各サンプルの阻害率からIC50を算出し、評価指標として用いた。IC50とは「一定条件下でMMPの活性を50％阻害するために必要な検体の濃度」であり、この数値が小さいほど阻害活性が高いと言える。
【００２４】
ポプラ抽出物のMT1-MMPに対するIC50（mg/ml）を測定した結果、0.031であった。よって、ポプラ抽出物に高いMMP阻害活性があることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２５】
中国産プロポリス抽出物のＭＭＰ阻害活性測定
中国産プロポリスはミツバチがポプラ等の植物の葉、新芽、実などから構築する物質である。一方、ブラジル産プロポリスの主な起源植物はアレクリンである。そこで、それぞれのプロポリス1グラムに3ｍｌの８０％エタノールを加え、実施例１のポプラ抽出物の調整方法と同様にして、試験用のプロポリス抽出物とした。ＭＭＰ活性の阻害率を測定し、MT1-MMPに対するIC50（mg/ml）を算出した。その結果、中国産プロポリス抽出物のIC50（mg/ml）は0.034であった。中国産プロポリス抽出物はポプラとほぼ同程度のMMP阻害活性があることが明らかとなった。
【実施例３】
【００２６】
ジメチルアリルカフェ酸エステルのＭＭＰ阻害活性測定
ブラジル産プロポリスと比較して中国産プロポリスにはカフェ酸誘導体が多く含まれることから、その一つであるジメチルアリルカフェ酸エステルのMMP阻害活性を測定した。
なお、比較対照として試験するため、市販されているカフェ酸を購入した。一方、ジメチルアリルカフェ酸エステルは、次の手順により自社で合成した。1.8グラムの3,4−dihydroxycinnamic acidをピリジンに溶解し、2.2グラムの無水酢酸を滴下した。ピリジンを減圧下で留去し、酢酸エチル40mlに溶かし、0.1規定の塩酸で洗浄し、ピリジンを除去する。酢酸エチルを乾燥後、残渣をアセトンで再結晶し、3,4−diacetoxycinnamic acidを得た。
【００２７】
次に、1.32グラムの3,4−diacetoxycinnamic
acidをCH2Cl2に溶解し、1.53グラムの2−chloro−N−methylpyridinium
chlorideを加え、攪拌しながらEt３Nを滴下した。CH2Cl2を塩酸、10％炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄し、CH2Cl2層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで処理し、prenyl 3,4−diacetoxycinnamateを得た。これをCH2Cl2とメタノールの１：１混合液に溶解し、10％炭酸水素ナトリウムを加え、攪拌後、CH2Cl2を加え、CH2Cl2層を分離し、水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧留去してジメチルアリルカフェ酸エステルを得た。単離した化合物をNMRで分析し、構造を確認した。その結果を表１に示す。ポプラや中国産プロポリスに特異的に含まれるジメチルアリルカフェ酸エステルは２種のMMPに対してカフェ酸よりもそれぞれ高い阻害活性が確認された。
【００２８】
【表１】
2011144202.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明により、ポプラ抽出物、ポプラを起源植物とするプロポリスの抽出物またはジメチルアリルカフェ酸エステルを用いてマトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することが可能になった。これらの阻害剤を経口摂取または塗布することにより、腫瘍転移、アレルギー、骨吸収疾患、歯周病、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍化、糖尿病に付随するコラーゲン崩壊などのマトリックスメタロプロテアーゼ関連疾患を予防または治療することができる。