(57)【要約】【課題】ＱβレプリカーゼによるＲＮＡ複製の障害となっているｓｐＲＮＡの発生を抑制する、新規のＲＮＡ複製法を提供することを本発明の課題とする。【解決手段】エマルジョンを用いてＲＮＡ増幅溶液を微小区画化し、さらに、ｓｐＲＮＡを含む画分を大きなＲＮＡを増幅する画分と隔離して、ＱβレプリカーゼによるＲＮＡ増幅反応を行うことによって、上記課題を解決した。本発明においては、効率的に高分子量のＲＮＡ複製を行うことが可能である。さらに、本発明においては、プライマーも固相支持体も不要である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）Ｑβレプリカーゼ；
（ｂ）反応緩衝液；および、
（ｃ）鋳型核酸；
を含有する水相成分、ならびに、油相成分を含む、核酸増幅のための油中水型エマルジョン。
【請求項２】
請求項１に記載の油中水型エマルジョンであって、
（ｉ）プライマー；および
（ｉｉ）固相支持体、
のいずれも含有しない、油中水型エマルジョン。
【請求項３】
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼが：
（ｃ１）
（ｃ１−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ１−２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ１−３）配列番号１に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
（ｃ２）
（ｃ２−１）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ２−２）配列番号９に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ２−３）配列番号８に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；ならびに、
（ｃ３）
（ｃ３−１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ３−２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ３−３）配列番号１０に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
を含む、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項４】
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼがさらに、
（ｃ４）
（ｃ４−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ４−２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド、および、
（ｃ４−３）配列番号１２に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド
を含む、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項５】
前記（ｂ）反応緩衝液が、緩衝剤、塩、リボヌクレオチド、還元剤、および、タンパク質を含む水溶液である、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項６】
前記（ｃ）鋳型核酸が３’末端に核酸配列「ＣＣＣ」を有する、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項７】
前記（ｃ）鋳型核酸が、３００塩基以上の長さである、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項８】
請求項１に記載の油中水型エマルジョンであって、直径が５μｍ以上２０μｍ以下のポアサイズを有するメンブレンを用いて製造されるか、または、ボルテックスの攪拌によって製造される、油中水型エマルジョン。
【請求項９】
さらに、（ｄ）Ｈｆｑタンパク質を含む、請求項１に記載の油中水型エマルジョンであって、ここで、該Ｈｆｑタンパク質が、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｄ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；および、
（ｄ３）配列番号３に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、ポリペプチドである、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項１０】
さらに、（ｅ）乳化剤を含む、請求項１に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項１１】
前記（ｅ）乳化剤が、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および、セチルジメチコンコポリオールからなる群から選択される、請求項１０に記載の油中水型エマルジョン。
【請求項１２】
請求項１に記載の油中水型エマルジョンを含有する、ＲＮＡ複製のための組成物。
【請求項１３】
核酸増幅反応のための油中水型エマルジョンの製造方法であって、以下の工程：
（１）  （ａ）Ｑβレプリカーゼ、
（ｂ）反応緩衝液、
（ｃ）鋳型核酸、および、
（ｆ）油相成分、
を含有する混合物を調製する工程；ならびに、
（２）  上記工程（１）の混合物を、メンブレンを通過させる工程、または、ボルテックスによって攪拌する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法であって、
前記工程（１）の混合物が、
（ｉ）プライマー；および
（ｉｉ）固相支持体、
のいずれも含有しない、方法。
【請求項１５】
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼが、
（ｃ１）
（ｃ１−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ１−２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ１−３）配列番号１に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
（ｃ２）
（ｃ２−１）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ２−２）配列番号９に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ２−３）配列番号８に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；ならびに、
（ｃ３）
（ｃ３−１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ３−２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ３−３）配列番号１０に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
を含む、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項１６】
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼがさらに、
（ｃ４）
（ｃ４−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ４−２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド、および、
（ｃ４−３）配列番号１２に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド
を含む、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項１７】
前記（ｂ）反応緩衝液が、緩衝剤、塩、リボヌクレオチド、還元剤、および、タンパク質を含む水溶液である、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項１８】
前記（ｃ）鋳型核酸が３’末端に核酸配列「ＣＣＣ」を有する核酸である、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項１９】
前記（ｃ）鋳型核酸が、３００塩基以上の長さである、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項２０】
前記メンブレンのポアサイズの直径が５μｍ以上２０μｍ以下である、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項２１】
前記工程（１）の混合物がさらに（ｄ）Ｈｆｑタンパク質を含む、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法であって、ここで、該Ｈｆｑタンパク質が、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｄ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；および、
（ｄ３）配列番号３に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、ポリペプチドである、油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項２２】
前記工程（１）の混合物がさらに（ｅ）乳化剤を含む、請求項１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【請求項２３】
前記（ｅ）乳化剤が、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および、セチルジメチコンコポリオールからなる群から選択される、請求項２２に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の技術分野に属する。より詳細には、本発明は、ＲＮＡ増幅の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ増幅法は、遺伝子操作や分子生物学の実験において重要であるのみならず、診断などにおいても重要な技術である。ＲＮＡ増幅を担う酵素として、Ｑβレプリカーゼが周知である。
【０００３】
Ｑβレプリカーゼは、大腸菌ファージＱβ（非特許文献１）のゲノムＲＮＡ（４２１７塩基長）を複製する、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製酵素である（非特許文献２〜３）。Ｑβレプリカーゼは４量体で働くことが知られており、その構成は、ファージ由来のβサブユニットと宿主由来のＲｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１、伸張因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）およびＴｓ（ＥＦ−Ｔｓ）からなる（非特許文献４）。これらのうちで、活性に必須のサブユニットは、βサブユニット、ＥＦ−Ｔｕサブユニット、および、ＥＦ−Ｔｓサブユニットである。Ｓ１サブユニットは、特定の鋳型ＲＮＡ（例えば、ゲノムＲＮＡ）の複製に必須である。
【０００４】
Ｑβレプリカーゼは鋳型となるゲノムＲＮＡのプラス鎖から相補鎖のマイナス鎖を合成し、さらにそのマイナス鎖からプラス鎖を合成するといったサイクルで働き、その特徴から、鋳型ＲＮＡを指数的に増幅することが可能な酵素である（非特許文献５）。また、宿主因子であるＨｆｑによってその反応が促進されることが知られている（非特許文献６）。
【０００５】
しかしながら、試験管内でＱβレプリカーゼによるゲノムＲＮＡ複製反応を行った場合、ゲノムＲＮＡのような大きなＲＮＡはあまり複製されず、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって短いＲＮＡ（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ＲＮＡ（ｓｐＲＮＡ））が現れることが知られており、これが、ゲノムＲＮＡ複製反応の解析に大きな障害となっている。このｄｅ  ｎｏｖｏ合成ＲＮＡの由来には様々な意見があり、例えば、反応液中のＮＴＰからの合成（非特許文献７〜８）、複製過程におけるＲＮＡの組み換えや（非特許文献９〜１１）、鋳型ＲＮＡの分解産物などが提唱されている。また、空気中からの混入なども挙げられており（非特許文献１２）、完全な除去や混入防止は不可能だと言われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Calendar, R. The bacteriophages, Edn. 2nd. (Oxford University Press,Oxford ; New York; 2006)
【非特許文献２】Haruna, I. & Spiegelman, S. Specific template requirements ofRNA replicases. Proc Natl Acad Sci U S A 54, 579-587 (1965)
【非特許文献３】Chetverin, A.B. & Spirin, A.S. Replicable RNA vectors: prospectsfor cell-free gene amplification, expression, and cloning. Prog Nucleic AcidRes Mol Biol 51, 225-270 (1995)
【非特許文献４】Brown, D. & Gold, L. RNA replication by Q beta replicase: a workingmodel. Proc NatlAcad Sci U S A 93, 11558-11562 (1996)
【非特許文献５】Biebricher, C.K., Eigen, M. & Luce, R. Kinetic analysis oftemplate-instructed and de novo RNA synthesis by Q beta replicase. J Mol Biol148, 391-410 (1981)
【非特許文献６】Franze de Fernandez, M. T., Eoyang, L.. & August, J. T. Factorfraction required for the synthesis of bacteriophage Qβ RNA. Nature 219,588-590
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
大きなＲＮＡの高効率複製のために、ＲＮＡ複製の障害となっているｓｐＲＮＡの発生を抑制する、新規のＲＮＡ複製法が求められている。本発明では、ＲＮＡ複製の障害となっているｓｐＲＮＡの発生を抑制する、新規のＲＮＡ複製法を提供することを、その課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明においては、エマルジョンを用いてＲＮＡ増幅溶液を微小区画化し、ｓｐＲＮＡを含む画分を大きなＲＮＡを増幅する画分と隔離し、その結果、従来法ではＱβレプリカーゼによって増幅することが不可能であった大きなＲＮＡの増幅が可能になったことを予想外に見出すことにより、上記課題を解決した。
【０００９】
従って、本発明は例えば以下を提供する。
（項目１）
以下：
（ａ）Ｑβレプリカーゼ；
（ｂ）反応緩衝液；および、
（ｃ）鋳型核酸；
を含有する水相成分、ならびに、油相成分を含む、核酸増幅のための油中水型エマルジョン。
（項目２）
項目１に記載の油中水型エマルジョンであって、
（ｉ）プライマー；および
（ｉｉ）固相支持体、
のいずれも含有しない、油中水型エマルジョン。
（項目３）
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼが：
（ｃ１）
（ｃ１−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ１−２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ１−３）配列番号１に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
（ｃ２）
（ｃ２−１）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ２−２）配列番号９に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ２−３）配列番号８に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；ならびに、
（ｃ３）
（ｃ３−１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ３−２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ３−３）配列番号１０に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
を含む、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目４）
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼがさらに、
（ｃ４）
（ｃ４−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ４−２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド、および、
（ｃ４−３）配列番号１２に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド
を含む、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目５）
前記（ｂ）反応緩衝液が、緩衝剤、塩、リボヌクレオチド、還元剤、および、タンパク質を含む水溶液である、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目６）
前記（ｃ）鋳型核酸が３’末端に核酸配列「ＣＣＣ」を有する、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目７）
前記（ｃ）鋳型核酸が、３００塩基以上の長さである、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目８）
項目１に記載の油中水型エマルジョンであって、直径が５μｍ以上２０μｍ以下のポアサイズを有するメンブレンを用いて製造されるか、または、ボルテックスの攪拌によって製造される、油中水型エマルジョン。
（項目９）
さらに、（ｄ）Ｈｆｑタンパク質を含む、項目１に記載の油中水型エマルジョンであって、ここで、該Ｈｆｑタンパク質が、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｄ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；および、
（ｄ３）配列番号３に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、ポリペプチドである、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目１０）
さらに、（ｅ）乳化剤を含む、項目１に記載の油中水型エマルジョン。
（項目１１）
前記（ｅ）乳化剤が、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および、セチルジメチコンコポリオールからなる群から選択される、項目１０に記載の油中水型エマルジョン。
（項目１２）
項目１に記載の油中水型エマルジョンを含有する、ＲＮＡ複製のための組成物。
（項目１３）
核酸増幅反応のための油中水型エマルジョンの製造方法であって、以下の工程：
（１）  （ａ）Ｑβレプリカーゼ、
（ｂ）反応緩衝液、
（ｃ）鋳型核酸、および、
（ｆ）油相成分、
を含有する混合物を調製する工程；ならびに、
（２）  上記工程（１）の混合物を、メンブレンを通過させる工程、または、ボルテックスによって攪拌する工程、
を包含する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法であって、
前記工程（１）の混合物が、
（ｉ）プライマー；および
（ｉｉ）固相支持体、
のいずれも含有しない、方法。
（項目１５）
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼが、
（ｃ１）
（ｃ１−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ１−２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ１−３）配列番号１に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
（ｃ２）
（ｃ２−１）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ２−２）配列番号９に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ２−３）配列番号８に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；ならびに、
（ｃ３）
（ｃ３−１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ３−２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、および、
（ｃ３−３）配列番号１０に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にＲＮＡ複製活性を有する、ポリペプチド、
からなる群から選択される、ポリペプチド；
を含む、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目１６）
前記（ａ）Ｑβレプリカーゼがさらに、
（ｃ４）
（ｃ４−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
（ｃ４−２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド、および、
（ｃ４−３）配列番号１２に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合に、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせよりも高いＲＮＡ複製活性を示す、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド
を含む、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目１７）
前記（ｂ）反応緩衝液が、緩衝剤、塩、リボヌクレオチド、還元剤、および、タンパク質を含む水溶液である、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目１８）
前記（ｃ）鋳型核酸が３’末端に核酸配列「ＣＣＣ」を有する核酸である、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目１９）
前記（ｃ）鋳型核酸が、３００塩基以上の長さである、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目２０）
前記メンブレンのポアサイズの直径が５μｍ以上２０μｍ以下である、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目２１）
前記工程（１）の混合物がさらに（ｄ）Ｈｆｑタンパク質を含む、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法であって、ここで、該Ｈｆｑタンパク質が、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｄ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；および、
（ｄ３）配列番号３に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド；
からなる群から選択される、ポリペプチドである、油中水型エマルジョン製造方法。
（項目２２）
前記工程（１）の混合物がさらに（ｅ）乳化剤を含む、項目１３に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
（項目２３）
前記（ｅ）乳化剤が、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および、セチルジメチコンコポリオールからなる群から選択される、項目２２に記載の油中水型エマルジョン製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、従来法ではＱβレプリカーゼによって増幅不可能であるような大きなＲＮＡの増幅を可能にするという効果を奏する。さらに、本発明においては、Ｑβレプリカーゼ活性がｓｐＲＮＡの阻害を受けないため、従来法では不可能であったＱβレプリカーゼの速度論的解析が可能になるという効果もまた、奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｓ２２２  ＲＮＡを、試験管内（◆）、ボルテックスを用いて調製した油中水型エマルジョン（「Ｗ／Ｏエマルジョン」ともいう）内（○）、および、メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン（●）を用いて増幅した結果を示す。
【図２】図２は、ＲＮＡ増幅反応液を調製した試験管内のβサブユニット量（「試験管」）、親水性メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン内のβサブユニット量（「親水性」）、疎水性メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン内のβサブユニット量（「疎水性」）、および、ボルテックスを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン内のβサブユニット量（「ボルテックス」）を、試料の調製に用いたβサブユニット（「コントロール」）の相対値として示したグラフである。調製時にＤＴＴを用いた場合は、（「＋」）を記載し、ＤＴＴを用いなかった場合は、（「−」）を記載した。
【図３】図３は、試験管内の反応（「試験管」）、親水性メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン内のＲＮＡ増幅反応（「親水性」）、疎水性メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン内のＲＮＡ増幅反応（「疎水性」）、および、ボルテックスを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン内のＲＮＡ増幅反応（「ボルテックス」）を比較したグラフである。調製時にＤＴＴを用いた場合は、（「＋」）を記載し、ＤＴＴを用いなかった場合は、（「−」）を記載した。
【図４】図４は、種々の濃度のＨｆｑを用いた場合のＲＮＡ複製反応の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｑβレプリカーゼ２によるＲＮＡ増幅反応の指数期における経時的変化を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｑβレプリカーゼ２によるＲＮＡ増幅反応の線形期における経時的変化を示すグラフである。
【図７】図７は、Ｑβレプリカーゼ２によって増幅されたＲＮＡ中の＋鎖と−鎖を、経時的に測定した結果である。
【図８】図８は、アニーリング実験の結果の電気泳動写真である。
【図９】図９は、指数増幅条件（●）および線形増幅条件（○）における各時点での２本鎖率を算出した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念も含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１３】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１４】
本発明において使用する場合、用語「Ｑβレプリカーゼ」とは、ＱβファージのＲＮＡ複製酵素およびその改変体をいう。ＲＮＡ複製活性を保持する限り、あらゆる改変体が、本発明の「Ｑβレプリカーゼ」に包含される。例えば、本発明のＱβレプリカーゼとしては、（１）βサブユニット（例えば、配列番号１の核酸配列によってコードされる配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド）、または、Ｑβレプリカーゼにアセンブルした場合にＲＮＡ複製活性を保持するβサブユニットの改変体、（２）ＥＦ−Ｔｕサブユニット（例えば、配列番号１０の核酸配列によってコードされる配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチド）、または、Ｑβレプリカーゼにアセンブルした場合にＲＮＡ複製活性を保持するＥＦ−Ｔｕサブユニットの改変体、（３）ＥＦ−Ｔｓサブユニット（例えば、配列番号８の核酸配列によってコードされる配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド）、または、Ｑβレプリカーゼにアセンブルした場合にＲＮＡ複製活性を保持するＥＦ−Ｔｓサブユニットの改変体を含むタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。また、必要に応じて、Ｑβレプリカーゼは、（４）Ｓ１サブユニット（例えば、配列番号１２の核酸配列によってコードされる配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド）、または、Ｑβレプリカーゼにアセンブルした場合にＲＮＡ複製活性を促進するＳ１サブユニットの改変体を含んでもよい。サブユニットの改変体としては、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含みむポリペプチド、および、野生型ポリペプチドをコードする核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明において使用する場合、用語「反応緩衝液」とは、本来ＲＮＡ複製活性を有する本発明のＱβレプリカーゼが、そのＲＮＡ複製活性を発揮することができる環境を提供する溶液をいう。反応緩衝液は、緩衝剤、塩、および、リボヌクレオチドを含む水溶液であるが、プライマーや固相支持体は含まない。好ましくは、反応緩衝液は、還元剤、および、タンパク質を含む。緩衝剤としては、当該分野において周知の緩衝剤であってＱβレプリカーゼの活性を阻害しない緩衝剤を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ、および、Ｈｅｐｅｓが挙げられるが、これに限定されない。塩としては、当該分野において周知の塩であってＱβレプリカーゼの活性を阻害しない塩を用いることができる。塩としては、例えば、ＭｇＣｌ２、および、酢酸マグネシウムが挙げられるが、これに限定されない。使用する塩濃度は、５〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭであるが、これらに限定されない。リボヌクレオチドは、Ｑβレプリカーゼの基質である。リボヌクレオチドとしては、代表的には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、および、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）が挙げられるが、これに限定されない。これらリボヌクレオチドの修飾物であって、Ｑβレプリカーゼの基質となるリボヌクレオチドもまた、本発明のリボヌクレオチドに包含される。タンパク質としては、当該分野において周知のタンパク質であってＱβレプリカーゼの活性を阻害しないタンパク質を、Ｑβレプリカーゼの安定化のために用いることができる。タンパク質としては、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）が挙げられるが、これに限定されない。還元剤としては、当該分野において周知の還元剤であってＱβレプリカーゼの活性を阻害しない還元剤を用いることができる。還元剤としては、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、および、βメルカプトエタノールが挙げられるが、これに限定されない。
【００１６】
本発明において使用する場合、用語「プライマー」とは、数塩基長〜数百塩基長の核酸をいう。
【００１７】
本発明において使用する場合、用語「固相支持体」とは、水性溶媒に不溶性の固体をいう。
【００１８】
本発明において使用する場合、用語「鋳型核酸」とは、本発明の方法によって増幅されるＲＮＡをいう。鋳型核酸は、好ましくは３００塩基以上、より好ましくは６００塩基以上、さらにより好ましくは１２００塩基以上、最も好ましくは４０００塩基以上であるがこれらに限定されない。本発明の鋳型核酸は、Ｑβレプリカーゼの基質となるために、好ましくは、３’末端に核酸配列「ＣＣＣ」を有する。
【００１９】
本発明において使用する場合、用語「エマルジョン」とは、水相成分と油相成分という極性の異なる成分を混合した分散系溶液をいう。油相成分としては、例えば、ミネラルオイル、デカン、および、流動パラフィンが挙げられるが、これに限定されない。本発明のエマルジョンは、好ましくは、油中水型エマルジョン（「Ｗ／Ｏエマルジョン」ともいう）であり、また、好ましくは、乳化剤を含む。
【００２０】
本発明において使用する場合、用語「乳化剤」とは、両親媒性の物質であり、本発明のエマルジョンを安定化する物質をいう。本発明の乳化剤としては、例えば、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および、セチルジメチコンコポリオールが挙げられるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明において使用する場合、用語「Ｈｆｑタンパク質」とは、Ｑβファージの宿主細胞（例えば、Escherichia coli）のタンパク質であって、ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進するタンパク質をいう。例えば、本発明のＨｆｑタンパク質としては、（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、（ｄ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に、１または数個の欠失、付加、または、置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進する、ポリペプチド、および、（ｄ３）配列番号３に示される核酸配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、前記ＱβレプリカーゼのＲＮＡ複製活性を促進するポリペプチド、からなる群から選択される、ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
（エマルジョンの調製）
本発明のエマルジョン（油中水エマルジョン）は、好ましくは乳化剤を含む。例えば、本発明のエマルジョンは、乳化剤を適当濃度加えた油相成分に少量の水相成分を加え攪拌することにより調製することができる。本発明のエマルジョンでは、好ましくは、油相成分中の水相成分は均一な球形になる。エマルジョンの調製方法としては、種々の方法が周知である。ボルテックスのせん断力による拡散法では、例えば、油相成分４８０μＬに対して水相成分２０μＬを添加し、４℃  ３２００ｒｐｍ（例えば、VORTEX-GENIE2（Scientific Industries）の場合、機械目盛り８）で３０秒間攪拌することによりエマルジョンを調製するが、この方法に限定されることはなく、当業者は、種々の周知の方法を用いることができる。メンブレンを用いる場合、例えば、油相成分９６０μＬに対して水相成分４０μＬを添加し、４℃でメンブレンを２０往復通過させるという方法を用いることができるが、この方法に限定されることなく、当業者は、種々の周知の方法を用いることができる。また、本発明において使用するメンブレンのポアサイズは、５μｍ以上２０μｍ以下であり、好ましくは２０μｍであるが、これらに限定されない。マイクロ流路を用いる場合、例えば、十字型の流路を用い、上から水層、左右から油層を流すことにより、下の流路からエマルションを回収できるが、この方法に限定されることなく、当業者は、種々の周知の方法を用いることができる。ソニケーションを用いる場合、例えば、プローブ型のソニケーターの場合、プローブを油層と水層の混じった溶液中に挿入し、出力するという方法を用いることができるが、この方法に限定されることなく、当業者は、種々の周知の方法を用いることができる。
【００２３】
（核酸増幅のための油中水型エマルジョンの調製）
本発明の一つの局面において、（ａ）Ｑβレプリカーゼ、（ｂ）反応緩衝液、および、（ｃ）鋳型核酸を含有する水相成分、ならびに、油相成分を含む、核酸増幅のための油中水型エマルジョンが提供される。本発明の油中水型エマルジョンは、好ましくは、プライマーも固相支持体も含有しない。鋳型核酸は、好ましくは、ＲＮＡである。このＲＮＡを鋳型とし、反応緩衝液中のヌクレオチドを基質として、Ｑβレプリカーゼは、ＲＮＡの増幅反応を行う。
【００２４】
本発明の別の局面において、核酸増幅反応のための油中水型エマルジョンの製造方法であって、以下の工程：
（１）  （ａ）Ｑβレプリカーゼ、
（ｂ）反応緩衝液、
（ｃ）鋳型核酸、および、
（ｆ）油相成分、
を含有する混合物を調製する工程；ならびに、
（２）  上記工程（１）の混合物から油中水型エマルジョンを調製する工程、
を包含する方法が提供される。本発明の油中水型エマルジョンは、好ましくは、プライマーも固相支持体も含有しない。鋳型核酸は、好ましくは、ＲＮＡである。上記方法において製造された油中水型エマルジョンでは、このＲＮＡを鋳型とし、反応緩衝液中のヌクレオチドを基質として、Ｑβレプリカーゼが、ＲＮＡの増幅反応を行う。
【実施例】
【００２５】
（材料および方法）
１．鋳型ＲＮＡの調製
１．１．インビボ抽出ゲノムの調整（インビボＲＮＡ）の調製
鋳型ゲノムＲＮＡとして、Ａ２タンパク、コートタンパク、βサブユニットをコードする約４２１７塩基長のＲＮＡを用いた。大腸菌Ａ／λを５ｍＬ  ＬＢ培地で３７℃  １２０ｒｐｍでオーバーナイト前培養し、その５０μＬを５ｍＬ  ＬＢ培地でＯＤ（６００ｎｍ）が０．１〜０．２になるまで培養した（大腸菌Ａ／λ：１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）。次に１Ｍ  ＣａＣｌ２を終濃度１０ｍＭになるように添加し、ファージタイターが１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍＬになるようにＱβファージを加え、ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１になるまで約５時間振とう培養した。次にクロロホルム１２５ｕｌ加え２〜３分間振とう培養し、５０００ｇで２０分間遠心分離を行い、上清を回収した（４回）。回収溶液をポアサイズ０．２２μｍのフィルターで濾過を行った。次に等量のフェノール／クロロホルムを素早く混和し、２５℃  １００００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収した（３回）。回収溶液に３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を４０μＬ加え、さらにイソプロパノールを４４０μＬ加え素早く混和し、−８０℃で１５分間静置した。次に、その溶液を４℃  １４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清をピペッティング除去し、７０％エタノールを４００μＬ加え、さらに４℃  １４０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清をピペッティング除去した。残存エタノールをデシケーションした後に、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを  ４００μＬ加え穏やかに混和、さらに５Ｍ  ＬｉＣｌを４００μＬ加え穏やかに混和した。４℃で２時間静置後、４℃  １２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上清をピペッティング除去した。さらにもう一度、７０％エタノールを４００μＬ加え、４℃  １４０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清をピペッティング除去した後、残存エタノールをデシケーションし、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを３０μＬ加えた。産物をＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｅｌｕｔｅで精製し目的のゲノムＲＮＡを得た。
【００２６】
１．２．インビトロ転写ゲノムＲＮＡ（インビトロＲＮＡ）の調製
鋳型ゲノムＲＮＡとして、Ａ２タンパク、コートタンパク、βサブユニットをコードする約４２１７塩基長のＲＮＡを用いた。ゲノムＲＮＡの調整はＳＫＱβプラスミドを用いたインビトロ転写により合成した。最初にＳＫＱβプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで３７℃１時間、制限酵素処理し、産物をＱｕｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎで精製し、アガロースゲル電気泳動（１％アガロースゲル  ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ）で産物を確認した。次に、５’末端にＱβ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｉｍｅｒ＋３（配列番号６：TCTCTCTAATACGACTCACTATAGGGGGACCCCCTTTAGG）、３’末端にＱβ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｉｍｅｒ−３（配列番号７：CAAACCCGGGAGGAGAGAGGGCAAAGC）を結合させ、９４℃  ５分間後、９８度１０秒、６５℃３０秒、７２℃５分３０秒を３５サイクルでＰＣＲを行った。産物をＱｕｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎで精製し、アガロース電気泳動で確認後、ＳｍａＩで３７℃オーバーナイト制限酵素処理を行った。産物をＱｕｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎで精製し、ＲＮＡ合成を行った。反応条件は３７℃約５時間インキュベートし、その後、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ）  ２ｕｌ加えさらに３７℃  １０〜２０分間インキュベートした。産物をＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｅｌｕｔｅで精製し目的のゲノムＲＮＡを得た。
【００２７】
１．３．Ｓ２２２  ＲＮＡの調製
鋳型ＲＮＡよりも短いＲＮＡとして、Ｓ２２２  ＲＮＡを調製した。Ｓ２２２  ＲＮＡは自然発生したＲＮＡをクローン化した２２２塩基長ＲＮＡである。Ｓ２２２  ＲＮＡの調整にはｐＵＣ１９＿ｓ２２２Ａプラスミドを用いたインビトロ転写で合成した。最初にｐＵＣ１９ｋｈ  Ｆ  ｐｒｉｍｅｒとｐＵＣ１９ｋｈ  Ｒ２  ｐｒｉｍｅｒを用い、９４℃５分後、９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクルでＰＣＲを行った。Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎで精製後、アガロース電気泳動（１％アガロースゲル  ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ）で産物を確認後、ＡｌｗＩで３７℃５時間制限酵素処理した。Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎで精製し、産物をテンプレートとして、３７℃オーバーナイトでＲＮＡ合成を行った。その後、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ）  ２ｕｌ加えさらに３７℃１０〜２０分間インキュベートした。産物をＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｅｌｕｔｅで精製し目的のＳ２２２  ＲＮＡを得た。
【００２８】
２．油中水型エマルジョンの調製
２．１．油相成分の調製
エマルションの調整に用いた油相組成は、９５％  ミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ  Ｍ５９０４−５００ＭＬ）、４．５％  ソルビタンモノオレエート（Ｗａｋｏ  １９１−０８４８５）、０．５％  ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｗａｋｏ  １６１−２１６２１）。最初にソルビタンモノオレエートは粘度が高いので、誤差を小さくする目的で密度０．９８６ｇ／ｍＬを利用して質量から体積に換算し、その値を油相調整量の４．５％としてミネラルオイルを９５％相当加えＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で約１分間混和した。次に０，５％相当のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを加えＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２で約３０秒間混和した。反応液と同じ組成の飽和用バッファー（１２５ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  ＢＳＡ  ＆  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ）を油相１ｍＬに対して１５０μＬ加え、ボルテックスで約１０秒間攪拌し、３７℃で約２０分間インキュベートした。インキュベート後１５０００ｒｐｍで約２０分間遠心分離を行い、油相を回収した。得られた油相を油中水型エマルション作製用の油相成分とした。
【００２９】
２．２．水相成分の調製
内封する反応液の組成は、１２５ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  ＢＳＡ、１．２５ｍＭ  各ＮＴＰｓである。希釈は全てＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒで行った。さらにゲノムＲＮＡやＱβレプリカーゼ（β−サブユニット、ＥＦ−ＴＵ、ＥＦ−ＴＳ）、Ｓ１タンパク、Ｈｆｑタンパクはそれぞれの実験に応じて加えた。
【００３０】
２．３．油中水型エマルジョンの調製
油中水型エマルションの作製は１．５ｍＬエッペンチューブで行った。上記で調整した油相成分４８０μＬに対して、水相成分２０μＬを添加し、ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２で約３０秒間攪拌した。攪拌の際、目視で均一に混ざっていることを確認した。また、攪拌強度は機械目盛り８で統一した。また、メンブレンを使った油中水型エマルションの作製も行った。上記で調整した油相９６０μＬ  に対して、反応液（水相）４０μＬ加え、攪拌は２０往復で統一し作製した。油中水型エマルションの作製は全て４℃条件下で行った。
【００３１】
２．４．油中水型エマルジョンからの水相成分の回収
最初にエマルション溶液に複製反応を停止させる目的で１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｗａｋｏ）を２μｌ加え、その上からジエチルエーテル（Ｗａｋｏ）を油相の１／２量加え混和した。この際、１／２量より多くジエチルエーテルを加えると、界面活性剤が析出してしまい水相の回収が困難になるので注意が必要である。混和後、１７０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離操作を行い、上層のエーテルと油相の混和物を除去した。さらに油相と等量のジエチルエーテルを加え混和し、１００００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心分離操作後、上層のエーテルと残存油相の混和物を除去した。この際、回収産物の濃度を正確に定量するためにエーテルは極力取り除くことが望ましい。さらに残存エーテルを完全に除去するため、氷上で約１５分間揮発させ、下層の水相を回収した。
【００３２】
３．反応産物の測定
電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真からの酵素、ＲＮＡ濃度計算は、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊで行った。まず編集項目で画像データの色を反転させ、測定範囲をなるべくバンドの大きさに合わせ、強度を測定した。その後ブランクとして同じ測定範囲でバンドと同レーンのゲル部分を測定した。データとしては、面積と平均強度の数値が得られるので、その積を算出、ブランクを差し引いた値を定量用の数値とした。
【００３３】
４．ｑＲＴ−ＰＣＲ
エマルジョンから回収した反応産物内のゲノムＲＮＡ＋鎖、−鎖の定量を行った。逆転写反応が阻害されないＳＤＳ量が０．０００５％以下ということが報告されているので、それに準拠して試薬の調整を行った。まず２本鎖をほどく目的で、サンプルを１ｍＭ  ＥＤＴＡで１０００倍希釈しＳＤＳを０．０００５％になるように加え、９５℃  ５分間熱処理を行った。その後、１サンプルを２本に分注し、それぞれ＋鎖検出用プライマー（１ｓｔ  ＲＴ  ａｎｎｅａｌ  Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ）と−鎖検出用プライマー（１ｓｔ  ＲＴ  ａｎｎｅａｌ  Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ）を結合させ、５０℃  ３０分間、７０℃  １５分間で逆転写した。反応後のサンプルを１００倍希釈し、＋鎖検出には２ｎｄ  ＴＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒとＭＢＴＦ  ｐｒｉｍｅｒ、−鎖検出には２ｎｄ  ＴＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒとＭＢＴＲ  ｐｒｉｍｅｒを使ってＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｖｅによる定量ＰＣＲをＭｘ  ３００５Ｐ（ＳＴＲＡＴＡ  ＧＥＮＥ）で行った（９５℃  １０分後、９５℃  １５秒／６０℃  １分／５０サイクル）。
【００３４】
５．２本鎖率の測定
ゲノムＲＮＡ複製反応を行い、電気泳動で産物を確認した際、目的産物ｓｓＲＮＡの上方に常にもう１本バンドが現れる。これは２本鎖だといわれているが、過去の論文に従ってそのことを確認した。まずサンプルをＴＥバッファーで９５℃  ５分間熱処理し、アニーリングバッファーを加え、６５℃で１時間アニーリングを行った。サンプル４ｕｌに対して、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  ２ｕｌ、１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）  １ｕｌ加え希釈し、６ｕｌを１％ＴＡＥアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ−ＨＧＳ：ｎａｋａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、泳動ｂｕｆｆｅｒ  ＴＡＥで１００Ｖ約３０分間電気泳動した。電気泳動後、１ｘ  ＳＹＢＥＲ−ＧｒｅｅｎＩＩ  ＲＮＡ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎｓ（ＴａＫａＲａ）で約３０分間振とうさせながら染色後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９２１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光を測定した。バンド強度を画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊで測定し、その値からｄｓＲＮＡ／（ｓｓＲＮＡ＋ｄｓＲＮＡ）を算出し、２本鎖率を測定した。
【００３５】
（実施例１：油中水型エマルジョン内でのゲノムＲＮＡの複製）
（１）油中水型エマルジョン調製時の飽和バッファーの必要性
油中水型エマルジョン内で反応を行う際、内封反応液（水相）の外相（油相）へのもれ込みが生じ、内部反応が阻害されることが予想されたので、これを防ぐために内封反応液と同じ組成のバッファーで油相を飽和させるといった操作を行うことにした。結果、飽和操作ありだと、目的産物であるssRNAの増幅が確認できたが、飽和操作なしでは全体的にバンド強度が弱く反応が進んでいないことがわかった。
【００３６】
（２）メンブレンとボルテックスで作製した油中水型エマルションのサイズ
メンブレンとボルテックスで油中水型エマルションを作製することで、そのサイズがどのよう異なるか確認した。油中水型エマルションの油相、水相組成、及び調整法は上記と同じように作製した。それぞれのエマルション溶液を顕微鏡で観察し、ランダムで画像を10枚撮影、それを画像解析ソフトNI visionで個数を数え、サイズ分布を算出した。結果、メンブレンは3種類とも分散が小さく、均一な油中水型エマルションができていることがわかった。またポアサイズ20μmでは直径約1μm、ポアサイズ15μmでは直径約1.5μm、ポアサイズ5μmでは直径約2μmの油中水型エマルションが大部分を占めていることがわかった。ボルテックスを用いた場合、分散が大きく、直径が約10μmの油中水型エマルションが大部分を占めていることがわかった。
【００３７】
（３）メンブレンとボルテックスの比較
メンブレン、ボルテックスで作製した油中水型エマルション内でQβレプリカーゼ１によるゲノムRNA複製反応が進行するかどうかを確認した。3回行った結果、ゲノムRNA複製量はボルテックス＞ポアサイズ20μmのメンブレン＞ポアサイズ10μmのメンブレン＞ポアサイズ5μmのメンブレン＞試験管内の順であった。またspRNAの複製量は、ポアサイズ20μmのメンブレン＜ポアサイズ10μmのメンブレン≒ポアサイズ5μmのメンブレン＜ボルテックス＜試験管内の順であった。メンブレンを使った場合、ポアサイズ10μmのメンブレン、ポアサイズ5μmのメンブレンを用いた場合、RNAの分解と思われるバンドのスメアが見られた。また油中水型エマルションのサイズが小さいほどspRNAが抑えられると予想していたが、それに反してポアサイズ10μmのメンブレンおよびポアサイズ5μmのメンブレンにおいてspRNAの増加が確認された。
【００３８】
（４）S222 RNAを使ったW/Oエマルション内RNA複製反応の経時変化
過去の研究においてRNA複製反応の速度論解析は試験管内反応の結果から算出されてきた。しかし、本研究では反応場はW/Oエマルション内であり、試験管内とは異なる環境であるため、そのことによる酵素反応への影響を確認する必要がある。そこで、W/Oエマルション内でも試験管内反応と同様にRNA複製反応が起こるかどうかをS222 RNAを使って確認した。S222 RNAはspRNAを単離しクローン化したRNAであるため、複製反応過程でのspRNAによる反応阻害は起こらない。試験管内でのQβレプリカーゼ１によるS222 RNA (spRNA)複製量とW/Oエマルション内でのRNAの複製量を比較することで、W/Oエマルション内と試験管内とで複製反応の進行が異なるのかどうかを確認した。メンブレン、ヴォルテックス双方で作製したW/OエマルションでS222 RNA複製反応を行い、それぞれ0分、5分、10分、20分、30分のRNA複製量を比較した。その結果、試験管内反応とヴォルテックスで作製したW/Oエマルション内反応ではRNA複製量に差が見られなかった。このことからヴォルテックスで作製したW/Oエマルションは酵素に影響せず、試験管反応時と同等に進行していることがわかった。逆にメンブレンで作製したW/Oエマルション内反応ではRNA複製量が他2つにくらべて約1/2になった。メンブレンで作製したW/Oエマルションでは酵素反応が十分に進行しないことが示された。
【００３９】
結果を図１に示す。図１は、Ｓ２２２  ＲＮＡを、試験管内（◆）、ボルテックスを用いて調製した油中水型エマルジョン（「Ｗ／Ｏエマルジョン」ともいう）内（○）、および、メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョン（●）を用いて増幅した結果を示す。実験条件は、以下のとおりである：所期Ｓ２２２  ＲＮＡ濃度  １０ｎＭ；Ｑβレプリカーゼ１濃度  １００ｎＭ；Ｓ１タンパク  ２００ｎＭ；Ｈｆｑタンパク  ６００ｎＭ；油相量  メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョンの場合９６０μＬ、ヴォルテックスを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョンの場合４８０μＬ；水相量  メンブレンを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョンの場合  ４０μＬ、ヴォルテックスを用いて調製したＷ／Ｏエマルジョンの場合２０μＬ；検出系  電気泳動（１０％  ポリアクリルアミドゲル）；反応条件  ３７℃  ３０分間。
【００４０】
（５）メンブレン使用時にＲＮＡ複製量が低くなる理由の解明
メンブレンでＷ／Ｏエマルションを作製し、その内部でＲＮＡ複製反応を行うと反応速度と複製量が低下するといった結果が得られた。Ｗ／Ｏエマルション内ゲノムＲＮＡ複製反応の速度論解析を行う上で試験管内反応と進行具合が異なることは過去の研究結果等と比較する上で問題であり、実験の信憑性に関わる問題となり得る。よってその原因の解明と改善を試みた。まずその低下の原因はｉ）酵素の失活、ｉｉ）実験操作による有効酵素濃度の低下の２仮説が考えられた。この２項目を確認するために、反応後の酵素量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。酵素量に差が見られなければ仮説ｉ）が原因であり、差があれば仮説ｉｉ）が原因であると考えた。
【００４１】
結果、メンブレンで作製したW/Oエマルション内では酵素濃度が低下していた。このことからｉｉ）実験操作による有効酵素濃度の低下が示唆された。それはメンブレン孔に酵素が凝集し詰まっていることが原因だと考えられたので、このことを確認するために、（ａ）反応液中にＤＴＴを加えることにより、酵素の凝集が回避され、メンブレン孔に詰まらなくなるか否かを、検討した。また、（ｂ）従来の材質が親水性であることから、疎水性メンブレンを用いることによりレプリカーゼの吸着量が減少するか否かについても、検討した。Ｗ／Ｏエマルション内でＳ２２２  ＲＮＡ複製反応を行った場合の複製量もまた、検討した。
【００４２】
結果、ＤＴＴを加えることで、メンブレン使用時のβサブユニット回収量が試験管、ヴォルテックスの場合で、ほぼ同等となった。メンブレンを疎水性メンブレンに交換しても、βサブユニット回収量は増えなかった。結果を図２に示す。ＲＮＡ複製結果を図３に示す。
【００４３】
ＤＴＴを加えることでβサブユニット回収量は大幅に上がったが、メンブレンを用いた場合は、ＲＮＡ複製量は試験管、ヴォルテックスと比較して、これらの約１／２程度だった。また疎水性メンブレンではＲＮＡ複製量の増加は見られなかった（図２）。以上をふまえて、酵素のメンブレン孔への吸着、凝集以外にもなんらかのメンブレン特有の反応阻害があることが示唆された。原因の解明はできなかったが、ヴォルテックスで作製したＷ／Ｏエマルション内ＲＮＡ複製反応は試験管内反応と同等の結果を示したことから、以後ヴォルテックスでＷ／Ｏエマルションを作製し実験を進めることにした。
【００４４】
（６）ゲノムＲＮＡの決定
Ｑβファージから抽出したＲＮＡ（インビボＲＮＡ）には鋳型となるＲＮＡの他に、もう２種類のＲＮＡが存在することが電気泳動により確認されている。この目的外のＲＮＡが反応に何かしら影響を及ぼすのではないか、また反応産物の正確な定量ができないことが予想されたので、この２種類のＲＮＡが存在しないＲＮＡ（インビトロＲＮＡ）を作製し、このＲＮＡで複製反応が起こるかどうかを確認した。その結果、インビトロＲＮＡを用いた場合には、ＲＮＡが問題なく増幅したので、以後このインビトロＲＮＡを使いた。
【００４５】
（７）Ｑβレプリカーゼの決定
Ｑβレプリカーゼ１とＱβレプリカーゼ２とを、ＲＮＡ増幅能について比較した。結果、ｓｓＲＮＡの増幅量は双方変わらなかったが、Ｑβレプリカーゼ１ではＱβレプリカーゼ２に比べてｓｐＲＮＡが多く出たので、以後の実験ではＱβレプリカーゼ２を使いた。
【００４６】
（８）反応液中の希釈緩衝液量比の決定
希釈緩衝液はＱβレプリカーゼやＳ１タンパク、Ｈｆｑタンパクを保存するためのバッファーでグリセロールが含まれている。ＲＮＡ複製反応においてグリセロールは反応を阻害することが知られているので極力少なくしたほうがよいとされており、過去の報告によれば、全体量の１／２０が理想とされている。しかし、ピペッティング誤差を小さくするためには反応液２０μＬに対して２μＬが適当だと考えられたので、全体量の１／１０にすることによる反応阻害の度合いを確認した。また同時に、あらかじめ活性の低い酵素を完全に失活させるプレインキュベーション操作（反応液の調整時に３７℃３０分間インキュベート）を行えば、より正確なＲＮＡ複製反応の様子を確認できると考えられたため、プレインキュベーション操作のありなしでＲＮＡ複製反応にどう影響するかを確認した。結果、希釈緩衝液量を２μＬにすることによる反応への悪影響はなく、従来どおりプレインキュベーションも行うことにした。
【００４７】
（９）Ｓ１タンパク最適濃度の決定
Ｑβレプリカーゼは、前述したようにβサブユニットとＥＦ−ＴＵ、ＥＦ−ＴＳの３量体に外部因子のＳ１タンパクが作用して４量体で働く。そこで、よりゲノムＲＮＡが増幅されるＳ１タンパクの最適濃度を決定した。３量体濃度を２４０ｎＭ、Ｈｆｑ濃度を６００ｎＭに固定し、Ｓ１濃度を０、２５、５０、１００、２００ｎＭとしてＷ／Ｏエマルションを調製し、各々について、ＲＮＡ複製反応を測定した。３回行った結果、Ｓ１タンパク濃度に依存してゲノムＲＮＡ複製量が増加することが示された。よってＱβレプリカーゼに対して十分量にあたる２００ｎＭを最適濃度とした。
【００４８】
（１０）Ｈｆｑタンパク最適濃度の決定
Ｈｆｑタンパクは６量体タンパクでゲノムＲＮＡ複製反応を促進する働きがあることは知られているが、その詳細はまだ良くわかっていない。そこで、よりゲノムＲＮＡが増幅されるＨｆｑタンパクの最適濃度を決定した。３量体濃度を２４０ｎＭ、Ｓ１濃度を２００ｎＭに固定し、Ｈｆｑ濃度を０、６０、１５０、３００、６００、１２００ｎＭとして、各々についてＷ／Ｏエマルションを調製し、ＲＮＡ複製反応を測定した。３回行った結果、Ｈｆｑタンパクは少なくても、多すぎてもゲノムＲＮＡが増えにくくなることが示された。また３００〜６００ｎＭが最適濃度であることがわかった。よって３００ｎＭを本実験での最適濃度とした。結果を図４に示す。反応条件は、以下のとおりである：所期インビトロＲＮＡ濃度  １０ｎＭ；Ｑβレプリカーゼ２濃度  ２４ｎＭ；Ｓ１タンパク質濃度  ２００ｎＭ；エマルジョンの作製  ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２を用いた；反応時間  ３７℃  ４０分間；検出系  電気泳動（１％  ＴＥＡ  アガロース）。
【００４９】
（実施例２：Ｗ／Ｏエマルション内でＱβレプリカーゼによるゲノムＲＮＡ複製反応の速度論解析）
（１）指数期の解析
酵素がＲＮＡの対して過剰に存在する場合、全てのＲＮＡに酵素が結合していると仮定されるため、ＲＮＡは指数的に増幅するはずである。そこでゲノムＲＮＡ（インビトロＲＮＡ）２ｎＭに対してＱβレプリカーゼ２  ２４０ｎＭ（ただし、約１０％が活性を保持し、約９０％は失活していた）の条件化で、Ｗ／Ｏエマルション内で反応させ、その経時変化を観察した。サンプリングタイムは０、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０分の点で行った。結果を図５に示す。図５Ｂは、図５Ａの縦軸を、指数表記したものである。反応条件は、以下のとおりである：所期インビトロＲＮＡ濃度  １０ｎＭ；Ｑβレプリカーゼ２濃度  ２４ｎＭ；Ｓ１タンパク質  ２００ｎＭ；Ｈｆｑタンパク質  ３００ｎＭ；エマルジョンの作製  ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２を用いた；検出系  電気泳動（１％  ＴＥＡ  アガロース）。
【００５０】
この結果について下記のモデル
【００５１】
【数１】
2011019461.tif 000002
に従いｋｃａｔを算出すると、ｋｃａｔ＝０．２４±０．０３であった。
【００５２】
（２）線形期の解析
ＲＮＡが酵素に対して過剰に存在する場合、全ての酵素にＲＮＡが結合していると仮定されるため、ＲＮＡは線形的に増幅する。そこでゲノムＲＮＡ（インビトロＲＮＡ）  ５０ｎＭに対してＱβレプリカーゼ２  ２４０ｎＭ（ただし、約１０％が活性を保持し、約９０％は失活していた）の条件化で、Ｗ／Ｏエマルション内で反応させ、その経時変化を観察した。サンプリングタイムは０、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０分の点で行った。結果を図６に示す。反応条件は、以下のとおりである：所期インビトロＲＮＡ濃度  １０ｎＭ；Ｑβレプリカーゼ２濃度  ２４ｎＭ；Ｓ１タンパク質  ２００ｎＭ；Ｈｆｑタンパク質  ３００ｎＭ；エマルジョンの作製  ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２を用いた；検出系  電気泳動（１％  ＴＥＡ  アガロース）。
【００５３】
この結果について下記のモデル
【００５４】
【数２】
2011019461.tif 000003
に従いｋｃａｔを算出すると、ｋｃａｔ＝０．１０３±０．０１２であった。
【００５５】
（３）ｑＲＴ−ＰＣＲによる＋鎖、−鎖の定量
Ｗ／Ｏエマルション内ゲノムＲＮＡ複製反応で回収したサンプルについて、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、＋鎖、−鎖の定量を行った。全てのサンプルは電気泳動で定量した濃度から５ｎＭになるように希釈して使った。スタンダード濃度を５０、５、０．５ｎＭとした。結果、＋鎖、−鎖の合計は電気泳動からの定量結果と大きくずれたが、全体的な傾向としては、＋鎖より−鎖の方が少ないといった結果が得られた。指数期サンプルを用いた結果を図７Ａに、線形期サンプルを用いた結果を図７Ｂに示す。電気泳動での測定値を（■）、ｑＲＴ−ＰＣＲの＋鎖と−鎖の合計を（□）、ｑＲＴ−ＰＣＲの＋鎖を（●）、ｑＲＴ−ＰＣＲの−鎖を（○）で示した。
【００５６】
（４）二本鎖率の測定
ゲノムＲＮＡ複製産物を電気泳動で確認した際に目的ｓｓＲＮＡの上にもう１本バンドが出る。このバンドがｄｓＲＮＡであることを過去の論文に従って確認した。＋鎖のみ５０ｎＭ、−鎖のみ５０ｎＭをアニーリングしたもの、＋鎖−鎖を１：１で混ぜて合計で５０ｎＭにしてアニーリングしたもの、それぞれ熱処理ありなしで電気泳動した。＋鎖−鎖のみのサンプルでバンドが出れば、その産物は２量体だと決定でき、混ぜたもので出れば、２本鎖（ｄｓＲＮＡ）であると決定した。次に経時変化サンプルの電気泳動写真から２本鎖率を算出した。結果、電気泳動写真から＋鎖−鎖を１：１で混ぜてアニーリングしたサンプルで、もう１本のバンドが現れたので、このバンドはｄｓＲＮＡであることが確認できた。結果を図８に示す。各実験条件は、以下のとおりである：（ｉ）＋鎖ＲＮＡ  ５０ｎＭ、（ｉｉ）−鎖ＲＮＡ  ５０ｎＭ、（ｉｉｉ）＋鎖および−鎖ＲＮＡｎ総量  ５０ｎＭ、（ｉｖ）反応によって生じた産物；なお、熱ショックは、９５℃  ５分間行った。
【００５７】
次に、タイムコースサンプルの電気泳動結果から、各時点での２本鎖率を算出した。結果、指数増幅条件（●）と線形増幅条件（○）で異なる傾向を示した。指数増幅条件では最初２本鎖が２６％と大きな値をとり、徐々に下がって最終的は１５％程度に落ち着くような結果だった。線形増幅条件では、初めから常に一定の１０％前後を示した。結果を図９に示す。ただし、２本鎖率の算出の際、初期濃度込みで計算した。
【００５８】
また、本発明では、Ｈｆｑの添加により、ＲＮＡ増幅効率が促進されることも、明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によって、核酸（特にＲＮＡ）増幅反応のための油中水型エマルジョンが提供される。また、本発明によって、核酸（特にＲＮＡ）増幅反応のための油中水型エマルジョンを製造する方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号１    Ｑβレプリカーゼβサブユニットの核酸配列
配列番号２    Ｑβレプリカーゼβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号３    Ｈｆｑタンパク質の核酸配列
配列番号４    Ｈｆｑタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５    Ｓ２２２  ＲＮＡの配列
配列番号６    Ｑβ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｉｍｅｒ＋３の配列
配列番号７    Ｑβ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｉｍｅｒ−３の配列
配列番号８    ＱβレプリカーゼＥＦ−Ｔｓサブユニットの核酸配列
配列番号９    ＱβレプリカーゼＥＦ−Ｔｓサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１０  ＱβレプリカーゼＥＦ−Ｔｕサブユニットの核酸配列
配列番号１１  ＱβレプリカーゼＥＦ−Ｔｕサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１２  ＱβレプリカーゼＳ１サブユニットの核酸配列
配列番号１３  ＱβレプリカーゼＳ１サブユニットのアミノ酸配列
【図１】
2011019461.tif 000004
【図２】
2011019461.tif 000005
【図３】
2011019461.tif 000006
【図４】
2011019461.tif 000007
【図５】
2011019461.tif 000008
【図６】
2011019461.tif 000009
【図７】
2011019461.tif 000010
【図８】
2011019461.tif 000011
【図９】
2011019461.tif 000012
【配列表】
2011019461000001.app