(57)【要約】【課題】細胞など生きた状態の生体試料を水平型光学顕微鏡で観察しながら任意の時点で固定することができる試料の固定装置を提供する。【解決手段】固定装置１は、水平型光学顕微鏡２と、試料固定部３とを備える。固定装置１は、観察者が水平型光学顕微鏡２で試料固定部３に保持された細胞試料の活動状態を水平型光学顕微鏡２で観察しながら、特定の現象の任意の時点で生体試料を固定し得るように構成されている。試料固定部３は、保持部１８と、落下機構１９と、凍結部２０とを備え、落下機構１９により、保持部１８で保持された生体試料を凍結部２０へ落下させ得るように構成されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中で起きる特定の現象の経時変化を観察対象として略水平方向から照明する照明光学系と、
前記生体試料から反射される反射光を、略水平方向を光軸とする対物レンズを介して受光して、前記生体試料の像を拡大する観察光学系と
を有する水平型光学顕微鏡と、
前記生体試料を前記対物レンズの焦点位置で略鉛直方向に立てて保持すると共に、任意の時点で前記生体試料を固定する試料固定部と
を備えることを特徴とする顕微鏡用細胞試料固定装置。
【請求項２】
前記照明光学系は、前記対物レンズを介して前記生体試料を照明する落射照明を行うことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。
【請求項３】
前記対物レンズは、液浸対物レンズであることを特徴とする請求項１または２記載の固定装置。
【請求項４】
前記対物レンズと前記生体試料との間に、前記浸液を貯留する液溜り部を設けたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。
【請求項５】
前記試料固定部は、カバーガラスの一側表面上に前記生体試料を載置して略鉛直方向に保持し、
前記カバーガラスは、前記試料を載置する載置部を除いて一側表面に疎水性膜が形成され、
表面張力によって前記載置部に形成された浸液による液溜り内に、前記生体試料を保持する
ことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。
【請求項６】
前記試料固定部は、
前記生体試料を保持する保持部と、
前記生体試料を凍結固定するための冷媒を収容した凍結槽と
を備え、
前記凍結槽は、前記保持部に保持された前記生体試料の下方に配置され、
前記保持部から前記生体試料を任意の時点で落下させ、前記冷媒に前記生体試料を浸漬させる落下機構を設けた
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。
【請求項７】
前記試料固定部は、前記生体試料に対し任意の時点で化学固定剤を添加する添加手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡用細胞試料固定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞など生きた状態の生体試料におけるさまざまな生命現象を高精度の光学顕微鏡で追尾し、その時系列画像を動画として連続的に記録しつつ、任意の時点で生体試料を固定して電子顕微鏡用生体試料として供し、特定の瞬間における同一部分の微細構造を高分解能で観察・記録するための顕微鏡用生体試料固定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生命活動はさまざまな構成分子間の相互作用により生じるが、各々の現象の顕微鏡観察により、分子複合体や細胞内小器官などの分子構築のさまざまな動きがしばしば検出される。それらの分子構築の動態と微細構造を解析、記録することは生命現象の分子機序を理解するための強力な手段である。観察のための顕微鏡として光学顕微鏡と電子顕微鏡が多用されるが、生きたままの状態で生体試料を観察できる光学顕微鏡では現象の時系列の連続的な追跡はできるが空間分解能が低く、一方、空間分解能に優れる透過型電子顕微鏡では試料を高真空中に配置する必要があるため、生きた生体試料中で起きる現象をそのまま観察することは不可能で、何らかの固定操作が必須である。従来、それらの観察はそれぞれの顕微鏡法に適した処理を施した試料について個別に行われてきたため、それらの観察で真に同一の現象を解析している保証はなく、その解析結果については常にそのような疑念が付きまとうものであった。そこで、類似の視野ではなく真に同一の対象を、光学・電子顕微鏡法により並行して観察できる手段や装置が望まれてきた。
【０００３】
これに対し、透過型電子顕微鏡を用いて生物試料を観察するための試料を作成するために、生物試料を液体ヘリウム温度に冷却した金属ブロックに短時間押し付けて急速凍結固定する急速凍結装置が開示されている（例えば、特許文献１）。これにより、特許文献１では、生のままの細胞・組織の微細構造を生体活動の動的な状態で凍結固定可能なものとすることができる、と記されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−１４２１２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１では、生体試料を予め観察することなく固定するが、活動中の生体試料においては時々刻々に状態が変化するため、その動的な構造変化に関する情報を得ることができない、という問題があった。
【０００６】
そこで本発明は、時間経過と共に変化する生体試料の状態を光学顕微鏡で経時的に観察・記録しながら任意の時点で電子顕微鏡用固定操作を行い、上記の観察領域と同一視野を電子顕微鏡観察に供することを可能とする顕微鏡用生体試料固定装置の作製を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の請求項１に係る発明は、生体試料中で起きる特定の現象の経時変化を観察対象として略水平方向から照明する照明光学系と、前記生体試料から反射される反射光を、略水平方向を光軸とする対物レンズを介して受光して、前記生体試料の像を拡大する観察光学系とを有する水平型光学顕微鏡と、前記生体試料を前記対物レンズの焦点位置で略鉛直方向に立てて保持すると共に、任意の時点で前記生体試料を固定する試料固定部とを備えることを特徴とする。
【０００８】
本発明の請求項２に係る発明は、前記照明光学系は、前記対物レンズを介して前記生体試料を照明する落射照明を行うことを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項３に係る発明は、前記対物レンズは、液浸対物レンズであることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項４に係る発明は、前記対物レンズと前記生体試料との間に、前記浸液を貯留する液溜り部を設けたことを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項５に係る発明は、前記試料固定部は、カバーガラスの一側表面上に前記生体試料を載置して略鉛直方向に保持し、前記カバーガラスは、前記試料を載置する載置部を除いて一側表面に疎水性膜が形成され、表面張力によって前記載置部に形成された浸液による液溜り内に、前記生体試料を保持することを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項６に係る発明は、前記試料固定部は、前記生体試料を保持する保持部と、前記生体試料を凍結固定するための冷媒を収容した凍結槽とを備え、前記凍結槽は、前記保持部に保持された前記生体試料の下方に配置され、前記保持部から前記生体試料を任意の時点で落下させ、前記冷媒に前記生体試料を浸漬させる落下機構を設けたことを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項７に係る発明は、前記試料固定部は、前記生体試料に対し任意の時点で化学固定剤を添加する添加手段を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、時間と共に変化する生体試料の活動状態を観察しながら、任意の時点で電子顕微鏡用固定操作を行い、上記の観察領域と同一視野を電子顕微鏡観察に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】固定装置の全体構成を模式的に示す概念図である。
【図２】試料固定部の使用状態を段階的に示す図であり、（Ａ）開口が閉塞されている状態、（Ｂ）開口が開放された状態、（Ｃ）生体試料が冷媒に浸漬された状態を示す図である。
【図３】標本面を撮影した画像であり、（Ａ）固定前の標本面を撮影した光学顕微鏡画像、（Ｂ）固定後、同じ標本面を撮影した電子顕微鏡画像である。
【図４】液浸対物レンズを用いた場合の例を示す部分拡大図であり、（Ａ）カバーガラスの表面側に生体試料を載置した場合、（Ｂ）カバーガラスの裏面側に生体試料を載置した場合を示す図である。
【図５】液溜り部の構成を示す斜視図であり、（Ａ）全体構成、（Ｂ）対物レンズに装着した状態、（Ｃ）使用状態を示す図である。
【図６】カバーガラスに疎水性膜を形成した例を示す断面図であり、（Ａ）全体構成、（Ｂ）使用状態を示す図である。
【図７】化学固定を行う場合の構成を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
１．第１実施形態
（１）全体構成
図1に示す顕微鏡用生体試料固定装置（以下、「固定装置」という）１は、水平型光学顕微鏡２と、試料固定部３とを備える。ここで試料とは、時間の経過と共に状態が変化する対象であって、種々のものが考えられるが、例えば、細胞からなる試料（以下、「生体試料」という）とすることができる。固定装置１は、全体として、観察者が水平型光学顕微鏡２で試料固定部３に保持された生体試料の活動状態を水平型光学顕微鏡２で観察しながら、任意の時点で前記生体試料を固定し得るように構成されている。
【００１７】
水平型光学顕微鏡２は、落射照明光学系４と、観察光学系５と、撮像部６とを備えている。この水平型光学顕微鏡２は、落射照明光学系４から出射された略水平方向の照明光により生体試料の表面（以下、「標本面」という）に対し照明を行い、生体試料を固定するために、観察光学系５を通じて当該標本面で反射した反射光を拡大して撮像部６で撮像して画像として出力し得るように構成されている。
【００１８】
落射照明光学系４は、光源７と、レンズ８と、開口絞り９と、視野絞り１０と、視野レンズ１１と、ハーフミラー１２と、対物レンズ１３とを有し、同軸落射照明で照明光を照射し得るように構成されている。このうち、光源７と、レンズ８と、開口絞り９と、視野絞り１０と、視野レンズ１１と、ハーフミラー１２は、同一軸上に配置されている。光源７は、例えば、ランプ光源を用いることができる。本実施形態の場合、落射照明光学系４は、標本面に対し同軸落射照明を行い得るように構成されている。
【００１９】
ハーフミラー１２は、入射した光の約半分を反射して、残りの約半分を透過する。このハーフミラー１２は、前記光軸Ｌに対し４５度の角度で配置されている。そして、ハーフミラー１２と対物レンズ１３とは、光軸Ｌ上に配置されている。
【００２０】
観察光学系５は、対物レンズ１３、ハーフミラー１２、およびフィールドレンズ１４が略水平方向に延びる光軸Ｌ上に順に配置されている。すなわち、対物レンズ１３およびハーフミラー１２は、落射照明光学系４と観察光学系５とにそれぞれ含まれており、共通の光学要素となる。対物レンズ１３は、落射照明光学系４において、コンデンサレンズとして機能する。
【００２１】
撮像部６は、図示しないが、受光面を有する画像センサを備え、図示しない表示部に前記画像センサで撮像された画像を表示し得るように構成されている。この撮像部６は、フィールドレンズ１４によって標本面の像が結像される位置に前記受光面を配置してなる。画像センサは、ＣＣＤ等の撮像素子で構成される。
【００２２】
試料固定部３は、前記生体試料を前記対物レンズ１３の焦点位置で略鉛直方向に立てて保持し、任意の時点で前記生体試料を固定し得るように構成されている。本実施形態の場合、試料固定部３は、保持部１８と、落下機構１９と、凍結部２０とを備える。この試料固定部３は、落下機構１９により、保持部１８で保持された生体試料を凍結部２０へ落下させ得るように構成されている。
【００２３】
保持部１８は、生体試料を載置したグリッドまたはカバーガラス（以下の説明では、主にグリッドとして説明する）２１を挟持するピンセット２２を保持し得るように構成されている。この保持部１８は、前記ピンセット２２を所定の高さ（上死点）で保持すると共に、落下機構１９によって落下したピンセット２２を下死点で保持する。
【００２４】
落下機構１９は、種々のものが考えられるが、例えば、図示しないが、前記ピンセット２２の基端側に貫通穴を形成し、当該貫通穴に挿入されるプランジャーを前記貫通穴に対し出入可能とする電磁アクチュエータにより構成することができる。
【００２５】
この落下機構１９は、貫通穴にプランジャーが挿入されることにより、上死点でピンセット２２が保持される。また、落下機構１９は、任意のタイミングで電磁アクチュエータが作動されることにより、プランジャーを退行方向へ移動させる。そうすると、貫通穴とプランジャーとの係合が解除されることにより、ピンセット２２は、自重により自由落下し、下死点で保持される。
【００２６】
凍結部２０は、生体試料を凍結固定し得るように構成されている。本実施形態の場合、凍結部２０は、上部に開口２５を有する凍結槽２３と、前記開口２５を開閉可能とする蓋部２４とを備える。
【００２７】
凍結槽２３は、保冷材（図示しない）が内部に充填されており、当該凍結槽２３内に冷媒２６が収容されている。この凍結槽２３は、前記ピンセット２２に保持された生体試料の下方に配置され、前記ピンセット２２が自由落下して下死点に到達した時点において、ピンセット２２の先端に挟持されたグリッド２１が冷媒２６に浸漬し得るように構成されている。
【００２８】
保冷材は、特に限定されるものではないが、本実施形態の場合、液体窒素が用いられる。また、冷媒２６は、種々のものが選択できるが、例えば、液化プロパンやエタンなどを用いることができる。このように構成された凍結槽２３は、保冷材により、冷媒２６を低温に保持し得るようになされている。
【００２９】
蓋部２４は、開口２５に対しスライド移動することにより、開口２５を開閉可能とし得るように設けられている。この蓋部２４は、前記電磁アクチュエータの作動に連動して、落下機構１９がピンセット２２を落下させるタイミングに先立って、開口２５を開放し得るように構成されている。
【００３０】
（２）作用および構成
次に、上記のように構成された固定装置１の作用および効果について説明する。なお、保持部１８は、先端にグリッド２１を挟持したピンセット２２を、上死点で保持している。ここで、ピンセット２２は、グリッド２１上に載置された生体試料を対物レンズ１３の焦点位置に配置した状態で保持されている。
【００３１】
水平型光学顕微鏡２の各部の作用から説明する。光源７から出射された照明光は、レンズ８により開口絞り９の位置に光源像を結ぶ。この光源像を２次光源として、照明光は、視野絞り１０および視野レンズ１１を経て、前記ハーフミラー１２に入射する。これにより、ハーフミラー１２は、入射した照明光の一部を９０度曲げる。
【００３２】
ハーフミラー１２によって９０度曲げられた照明光は、光軸Ｌ上を伝播し、対物レンズ１３の瞳位置に光源像を結ぶ。この光源像を３次光源として、対物レンズ１３がコンデンサとして機能し、照明光が光軸Ｌと平行とみなせるテレセントリックな照明が標本面に行われる。
【００３３】
標本面は、照明されたことによって反射光を反射する。当該反射光は、対物レンズ１３で屈折されてハーフミラー１２に入射する。ハーフミラー１２に入射した反射光の一部はハーフミラー１２を透過してフィールドレンズ１４に入射する。このフィールドレンズ１４は、当該反射光により、標本面の像を撮像部６の受光面に結像する。撮像部６は、図示しない表示部に撮像した標本面の画像を表示する。
【００３４】
これにより、観察者は、表示部において標本面の様子を観察することができる。この場合の生体試料と凍結部２０との位置関係を図2(A)に示す。観察者は、生体試料の活動状態を表示部で観察しながら、任意の時点で生体試料を固定するため図示しないスイッチを投入する。
【００３５】
そうすると、蓋部２４はスライド移動して開口２５を開放する図2(B)。次いで、落下機構１９は、電磁アクチュエータを作動してプランジャーを退行方向に移動させる。これにより、ピンセット２２の貫通穴とプランジャーとの係合が解除されることにより、ピンセット２２は自重によって自由落下する。
【００３６】
ピンセット２２が下死点に到達する前に、ピンセット２２の先端に挟持されたグリッド２１が冷媒２６に浸漬される図2(C)。同時に、グリッド２１上に載置された生体試料も冷媒２６に浸漬し、当該生体試料は凍結固定される。なお、実際には、落下させる前にろ紙やマイクロピペットなどにより生体試料の水分を除去する。
【００３７】
このようにして、凍結固定された生体試料は、目的に応じたさまざまな後処理を経た後に、図示しない電子顕微鏡により高分解能で観察され得る。図3は、本実施形態に係る固定装置１により観察した固定前の標本面を撮影した画像（同図(A)）と、固定後、電子顕微鏡で同じ標本面を撮影した画像（同図(B)）である。これらの画像は、当装置を用いることにより、任意の時点で確実に生体試料を固定できると共に、当該生体試料を固定して得られた固定生体試料を電子顕微鏡により高分解能で観察できることを示している。
【００３８】
固定装置１では、観察者が、時間と共に変化する生体試料の活動状態を観察しながら、生体試料を固定することができる構成とした。これにより、固定装置１は、生体試料を任意の時点で固定することができる。したがって、固定装置１は、生体試料を時系列で観察して、電子顕微鏡で観察し得る状態の固定生体試料を作製することができる。
【００３９】
また、固定装置１は、落射照明光学系４により同軸落射照明を行い得るように構成したことにより、生体試料を挟んで対物レンズ１３に対向する側の構成を省略してスペースを確保することができる。したがって、固定装置１は、透過型の照明を行う場合に比べ、生体試料を挟んで対物レンズ１３に対向する側に配置される凍結部２０の構成を選択する自由度が向上する。
【００４０】
また、固定装置１は、凍結槽２３に収容した冷媒２６内に生体試料を浸漬して、当該生体試料を凍結固定する構成としたことにより、簡単な構成でかつ、より確実に生体試料を固定することができる。
【００４１】
因みに、冷媒２６からの冷気で対物レンズ部分が冷却されると、レンズのみならず生体試料も予冷却されて生体試料に悪影響を及ぼし、生理的条件における当該生体試料を観察することが困難になる。本実施形態の場合、凍結槽２３の開口２５は、生体試料を固定する場合を除いて、開閉可能な蓋部２４で閉塞されていることにより、空気中の水分が冷媒２６に入り込むのを抑制することができる。また、生体試料Ｓや対物レンズ１３が冷気によって冷却されることを防ぐため、蓋部２４の上方に図示しない障壁（シュラウド）を設けることとしてもよい。
【００４２】
２．第２実施形態
（１）液浸対物レンズ
本実施形態に係る固定装置１は、対物レンズ１３に代えて、液浸対物レンズ３０を用いる点が上記第１実施形態と異なる。本実施形態の場合、図4(A)に示すように、液浸対物レンズ３０は、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間が、空気（屈折率：1.000、０℃）よりも屈折率の高い浸液３１で満たされている。これにより、固定装置１（本図には図示しない）は、開口数を大きくして、分解能を小さくすることができる。この場合、対物レンズ２９は、水浸、もしくは油浸対応の対物レンズである。
【００４３】
ここで、分解能は、レイリーの分解能の式より、開口数をN.A.、波長をλとすると、式（分解能＝0.61・λ／N.A.）で表すことができる。そうすると、開口数が大きいほど、分解能を小さくする（高分解能）ことができる。
【００４４】
また、開口数（N.A.）は、標本面と液浸対物レンズ３０間の媒質の屈折率をｎ、光軸Ｌと対物レンズ２９の最も外側に入る光線とがなす角度をθとすると、式（N.A.＝ｎ・ｓｉｎθ）で表される。したがって、理想的な状態では、媒質の屈折率が高いほど、分解能を上げる（高分解能）ことができる。
【００４５】
浸液３１としては、例えば、水（屈折率：1.333、２０℃）やオイル（屈折率：1.515、２３℃）を用いることができる。
【００４６】
また、固定装置１は、図4(B)に示すように、グリッド２１の裏面２１ａに生体試料Ｓを載置し、グリッド２１の表面２１ｂ側から生体試料Ｓを観察することとしてもよい。この場合、固定装置１は、グリッド２１と対物レンズ２９との間、および、生体試料Ｓを載置したグリッド２１の裏面２１ａの両方が浸液３１で満たされることが望ましい。
【００４７】
本実施形態では、液浸対物レンズ３０を用いることにより、生体試料の状態をより詳細に観察しながら、任意の時点で生体試料を固定することができるので、より所望の状態に近い固定生体試料を得ることができる。
【００４８】
（２）液溜り部
上記のように、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たす場合、図5(A)に示す液溜り部３５を水平型光学顕微鏡２に設けてもよい。液溜り部３５は、上部が開口してなる箱状の容器で構成され、一端の側壁３６には、切欠き３７が形成されている。当該切欠き３７は、グリッド２１の外形形状と同様に底辺が湾曲したＵ字状に形成されている。
【００４９】
この液溜り部３５は、一端の側壁３６が対物レンズ２９の先端２９ａに対向するように対物レンズ２９の下側に配置される（図5(B)）。そして、一端の側壁３６に形成された切欠き３７を閉塞するように上方からグリッド２１が切欠き３７に挿入される（図5(C)）。この状態で、液溜り部３５には、浸液３１が充填される。なお、ピンセット２２は、保持部１８（本図には図示しない）によって保持されている。
【００５０】
このようにして、液溜り部３５は、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を確実に浸液３１で満たすことができる。固定装置１は、液溜り部３５を備えることにより、作動距離が大きく浸液３１の表面張力だけでは対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たすことが困難な場合でも、より確実に対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たすことができる。ここで、作動距離とは、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの距離をいう。
【００５１】
この場合、落下機構１９（本図には図示しない）は、ピンセット２２を落下させる前に、グリッド２１とピンセット２２、および液溜り部３５が干渉しないように、例えば水平型光学顕微鏡２を生体試料Ｓから離れる方向、すなわち後方へスライド移動させる。なお、本実施形態の場合、蓋部２４の上部に、水平型光学顕微鏡２との一体構成として下からの冷気の浸入を防止する障壁（シュラウド）を設け、当該障壁（シュラウド）を光学顕微鏡２と一体的にスライド移動させることとしてもよい。
これにより、落下機構１９は、ピンセット２２を確実に落下させ、グリッド２１を冷媒２６（本図には図示しない）に浸漬させることができる。したがって、固定装置１は、液溜り部３５を備えた場合でも、より確実に任意の時点でグリッド２１を凍結槽２３に浸漬させて生体試料Ｓを凍結固定することができる。
【００５２】
（３）カバーガラス
固定装置１は、グリッド２１に代えて、図6に示すように、一側表面に生体試料Ｓを載置する箇所（以下、「載置部」という）４１を除いて疎水性膜４０が形成されたカバーガラス４２を用いることもできる。
【００５３】
この載置部４１には、生体試料Ｓが載置され、浸液３１がカバーガラス４２の一側表面に添加される。そうすると、カバーガラス４２の一側表面には、表面張力によって載置部４１のみに浸液３１による液溜りが形成される。この液溜りに対物レンズ２９（本図には図示しない）を当接することにより、固定装置１（本図には図示しない）は、対物レンズ２９と生体試料Ｓとの間を浸液３１で満たした状態で標本面を観察することができる。これにより、固定装置１は、浸液３１の表面張力で水滴を保持することで、上記液溜り部３５を用いずに、鉛直方向に保持された生体試料Ｓを浸液３１中に保持することができる。
【００５４】
このように、載置部４１を除いて疎水性膜４０を形成したカバーガラス４２を用いることにより、より容易に生体試料Ｓを浸液３１で覆うことができる。また、一つのカバーガラス４２に複数の載置部４１を形成してもよい。この場合、それぞれの載置部４１に生体試料Ｓを載置することにより、複数の生体試料Ｓの中から最適な生体試料Ｓを選択し、当該生体試料Ｓを任意の時点で固定することができる。
【００５５】
３．変形例
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することができる。例えば、上記実施形態の場合、凍結部２０は、凍結により生体試料を固定する場合について説明したが、本発明はこれに限らず、グルタールアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどの化学固定剤を生体試料に添加して化学固定してもよい。
【００５６】
この場合、図7に示すように、生体試料Ｓは、カバーガラス４５の裏面４５ａに生体試料Ｓを載置して、カバーガラス４５の表面４５ｂ側から対物レンズ１３で観察される。固定装置１（本図には図示しない）は、任意の時点で、カバーガラス４５の裏面４５ａ側から生体試料Ｓに対し、図示しない添加手段により化学固定剤（本図中、矢印）を添加して化学架橋により固定する。この場合、カバーガラス４５は、生体試料Ｓと対物レンズ１３との間に配置されるので、化学固定剤が対物レンズ１３へ飛散することを防止する。したがって、固定装置１は、化学固定剤が付着することによる対物レンズ１３の損傷を防ぐことができる。
【００５７】
上記実施形態の場合、落射照明光学系４において同軸落射照明により観察する場合（落射明視野観察）について説明したが、本発明はこれに限らず、落射暗視野観察、落射微分干渉観察、落射蛍光観察、または落射偏光観察を行うこととしてもよい。
【００５８】
落射暗視野観察は、生体試料に対し、対物レンズ１３の外縁側から、リング状の照明光が観察光学系５に直接入らないように斜めから照明し、散乱光、回折光を観察する。これにより、落射暗視野観察は、落射明視野観察に比べ、標本面の小さな凹凸を目立たせて観察することができる。
【００５９】
落射微分干渉観察には、対物レンズ１３の上方にノマルスキープリズムを配置し、照明光を横方向にずらした２つの光線に分離して、生体試料を照明し観察する。これにより、落射微分干渉観察は、微少な段差を立体的に観察することができる。
落射蛍光観察は、励起光で生体試料としての蛍光物質を照明し、当該蛍光物質から放出される蛍光を観察する。蛍光物質とは、励起光を吸収し、当該励起光により励起された状態からもとの基底状態に戻るときに蛍光としてエネルギーを放出する特性を有する物質をいう。この場合、固定装置１は、落射照明光学系４に励起フィルタが設置されていると共に、観察光学系５に吸収フィルタが設置されている。励起フィルタは、光源７としての例えば水銀ランプから蛍光物質を励起させるのに必要な波長の光を抽出し、当該光のみを対物レンズ１３へ入射させる。吸収フィルタは、蛍光物質から発せられた蛍光とその他の光を分離して、蛍光のみをフィールドレンズ１４へ入射させる。これにより、固定装置１は、蛍光部分だけを撮像することができる。
【００６０】
落射偏光観察は、落射照明光学系４と観察光学系５の二箇所に配置された２個の偏光板を、互いに直交方向となるように配置する。これにより、固定装置１は、生体試料の偏光特性を可視化し、観察し得る。
【００６１】
また、上記実施形態の場合、落下機構１９は、ピンセット２２の自重によりピンセット２２を自由落下させて生体試料を凍結液２６に浸漬させる場合について説明したが、本発明はこれに限らず、ピンセット２２を鉛直下方へ付勢する付勢手段を設け、強制的に落下させることとしてもよい。これにより、落下機構１９は、電磁アクチュエータによりプランジャーとピンセット２２の貫通穴との係合を解除すると、前記付勢手段がピンセット２２を鉛直下方へ押し下げることにより、より確実にピンセット２２を下死点に到達させることができる。
【００６２】
また、上記実施形態の場合、落下機構１９は、単一のスイッチ（図示しない）により、蓋部２４をスライド移動させると共に、電磁アクチュエータを作動することとしたが、本発明はこれに限らず、蓋部２４をスライド移動させるスイッチと、電磁アクチュエータを作動させるスイッチとを個別に設け、電磁アクチュエータを作動させるタイミングに先立って蓋部２４をスライド移動させることとしてもよい。
【符号の説明】
【００６３】
１    固定装置（顕微鏡用生体試料固定装置）
２    光学顕微鏡
３    試料固定部
１３    対物レンズ
１８    保持部
１９    落下機構
２０    凍結部
２３    凍結槽
２６    冷媒
２９    対物レンズ
３０    液浸対物レンズ
３１    浸液
３５    液溜り部
４０    疎水性膜
４１    載置部
４２    カバーガラス
４５    カバーガラス
Ｌ    光軸
Ｓ    生体試料
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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