(57)【要約】【課題】抗体モノマーの精製において、凝集体を含む夾雑物を有効にかつ迅速に除去することのできる、多孔膜を提供すること。【解決手段】多孔質基材の基材骨格内部及び細孔内部に固定されたグラフト鎖を有する多孔膜であって、全てのグラフト鎖の２０重量％以上は基材骨格内部に存在し、グラフト鎖は電荷を有するイオン、分子、及び粒子状物質を吸着する性質を持つ官能基を側鎖に有しており、全ての官能基に対する細孔内部に存在する官能基のモル比率が、全てのグラフト鎖を形成するモノマーに対する細孔内部に存在するグラフト鎖を形成するモノマーのモル比率より大である多孔膜を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質基材の基材骨格内部及び細孔内部に固定されたグラフト鎖を有する多孔膜であって、
全ての前記グラフト鎖の２０重量％以上は前記基材骨格内部に存在し、
前記グラフト鎖は電荷を有するイオン、分子、及び粒子状物質を吸着する性質を持つ官能基を側鎖に有しており、
全ての前記官能基に対する前記細孔内部に存在する前記官能基のモル比率が、全ての前記グラフト鎖を形成するモノマーに対する前記細孔内部に存在する前記グラフト鎖を形成するモノマーのモル比率より大である、多孔膜。
【請求項２】
前記官能基が、アニオン交換基及びカチオン交換機より選ばれる、請求項１に記載の多孔膜。
【請求項３】
前記アニオン交換基が、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基より選ばれる、請求項２に記載の多孔膜。
【請求項４】
前記アニオン交換基が、アルキル基が結合したアミノ基であって、トリメチルアミノ基、トリエチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、プロピルアミノ基、及びイソプロピルアミノ基からなる群より選ばれる、請求項２又は３に記載の多孔膜。
【請求項５】
前記多孔質基材がポリエチレン、ポリプロピレン又はポリフッ化ビニリデンを含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の多孔膜。
【請求項６】
前記グラフト鎖が、グリシジルメタクリレートの重合体を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多孔膜。
【請求項７】
アニオン交換基を多孔質基材に固定されたグラフト鎖に導入する反応を含む多孔膜の製造方法において、
前記反応が、アルカリ金属水酸化物を含む水溶液雰囲気下でなされる、多孔膜の製造方法。
【請求項８】
多孔質基材と、前記多孔質基材に固定されたグラフト鎖と、前記グラフト鎖の側鎖に結合しているアミノ基であって、アルキル基が結合しているアミノ基と、を備える請求項１乃至６いずれか１項に記載の多孔膜を用いて、タンパク質を含む溶液から夾雑物を除去するタンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記タンパク質が抗体モノマーであり、前記夾雑物が宿主細胞由来タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシン、及び抗体モノマーの２量体を含む凝集体からなる群より選ばれる少なくとも一つ以上である、請求項８に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質基材に固定されたグラフト鎖に結合している官能基を有する多孔膜、及びその製造方法、並びに該多孔膜を用いたタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び医療分野において、有用なタンパク質を効率的に精製する方法が強く求められている。また近年、バイオテクノロジー産業においては、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に医薬の分野において、抗体医薬の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を産生及び精製可能な技術の確立が強く望まれている。
【０００３】
一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施し、目的タンパク質を含む無菌溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、代表的にはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーを初めとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、目的タンパク質の凝集体、エンドトキシン、ウィルス、カラムから脱離したプロテインＡ、並びにプロテインＡ及び抗体の凝集体等の夾雑物を、この無菌溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。
【０００４】
以上説明した従来のタンパク質の精製方法の対象となる細胞培養液中の目的タンパク質の濃度は、現状では通常１ｇ／Ｌ程度である。また、夾雑物の濃度も、目的タンパク質の濃度とほぼ同程度又はそれ以下であると考えられる。１ｇ／Ｌ程度の濃度においては、上記のハーベスト工程及びダウンストリーム工程を含む従来のタンパク質の精製方法でも有効でありうる。
【０００５】
しかしながら、抗体医薬の需要が急速に拡大し、抗体医薬に用いられるタンパク質の大量生産が指向されたため、近年では細胞培養液中のタンパク質濃度を高める細胞培養技術が急速に発達している。そのため、細胞培養液中の目的タンパク質の濃度が１０ｇ／Ｌ又はそれ以上に達することもある。同時に、細胞培養液中の夾雑物の濃度も同様に増加し、従来のタンパク質の精製方法では、目的タンパク質の精製が困難になりつつある。
【０００６】
また、細胞培養液中の目的とする抗体タンパク質の濃度の増大に伴い、そのモノマーの凝集体、例えば２量体、３量体などの多量体の濃度も顕著に増加する傾向にある。凝集体は、生体内への投与時に、補体の活性又はアナフィラキシーをもたらしうる。そのため、凝集体が抗体医薬の安全性に有害な影響を及ぼしうるとの指摘がされており、その有効な除去方法が近年希求されている。これに対し、凝集体を含む各種の夾雑物を有効に除去し、抗体医薬品として使われる抗体タンパク質、すなわちモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び免疫グロブリンなどを精製することを目的としたクロマトグラフィー工程が多数報告されている。
【０００７】
イオン交換クロマトグラフィーは、抗体と夾雑物との等電点の相違を利用して、これらを分離する方法である。特にアニオン交換クロマトグラフィーは、一般に等電点の値が抗体タンパク質より小さいＨＣＰ、ＤＮＡ、及びウィルスなどの夾雑物の除去に多用されている。
【０００８】
近年では、多孔質膜にイオン交換基を導入して、タンパク質吸着能力を付与したタンパク質吸着膜が開発され（例えば特許文献１及び２参照）、購入も可能である。また、タンパク質吸着膜の使用例として、特許文献３には、アニオン交換基を導入したセルロース多孔膜とカチオン交換基を導入したセルロース多孔膜との２種類のタンパク質吸着膜を用いて、リンパ液からアルブミンを分離する方法が開示されている。さらに、特許文献４には、アニオン交換基を導入したセルロース多孔膜を用いて、核酸とエンドトキシンとを分離する方法が開示されている。特許文献５及び６には、カチオン交換基及びアニオン交換基をそれぞれポリエーテルスルホン多孔膜に導入したタンパク質吸着膜が開示されている。また特許文献７並びに非特許文献１及び２には、多孔質中空糸膜にグラフト鎖を導入し、さらにグラフト鎖にアニオン交換基を付与した、吸着性の高いタンパク質吸着膜が開示されている。
【０００９】
加えて、細胞培養液やカチオン交換クロマトグラフィー工程の溶出液のような、比較的塩濃度が高い、即ち、電気伝導度の高い状態の溶液から不純物を除去し、抗体モノマーを精製することに適した多孔膜として、特許文献８には１級アミンをアニオン交換基として固定した膨潤ゲル層を有する多孔膜が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，５４７，５７５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７３９，３１６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，００１，９７４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２３５，８９２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７８３，９３７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，７８０，３２７号明細書
【特許文献７】特開平２−１３２１３２号公報
【特許文献８】特開２００９−５３１９１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ラヂエーション・フィジックス・アンド・ケミストリ（Radiation Physics and Chemistry）、エルゼビア、１９９５年、第４６巻、第２号、ｐ．２３９−２４５
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・メンブレン・サイエンス（Journal of Membrane Science）、エルゼビア、１９９６年、第１１７巻、ｐ．１３５−１４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜は、細孔径が１μｍ以上であるため、濁質不純物である細胞デブリを除去する能力が乏しい。また溶存タンパク質の吸着容量が小さいため、大量のタンパク質を吸着できない。さらに細胞培養液には、通常、塩が含まれているが、細胞培養液に０．１ｍｏｌ／Ｌ以上の塩が含まれていると、特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜のタンパク質の吸着量は著しく少なくなる。したがって、特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜を用いて、細胞培養液から不純物タンパク質を除去することは、実用的ではない。
【００１３】
特許文献７並びに非特許文献１及び２に開示されたグラフト鎖を有する中空糸状のタンパク質吸着膜は、細孔径が小さく、タンパク質の吸着容量が高い。特に非特許文献１及び２に開示されたタンパク質吸着膜は、細孔径が０．３μｍと小さいため、濁質成分の除去も可能である。このように、特許文献７並びに非特許文献１及び２に開示されたタンパク質吸着膜は、特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜と比較して、タンパク質の吸着容量及び濁質の除去性において、優れた性質を有しているが形状安定性が低く、塩を含む溶液を通液すると膨潤するため、モジュールに成型して実用に用いることが困難である。
【００１４】
また特許文献７に開示されたタンパク質吸着膜は、塩を含む溶液を通液した後に、純水や塩を含まない緩衝液を通液すると、通液圧が著しく上昇するという課題がある。これは、細孔内部ではなく基材を形成する基材骨格内部に存在するグラフト鎖に固定されたアニオン交換基に塩のカウンターイオンである塩素イオンのような負イオンが吸着し、そのため純水通液時に水分子が浸透圧によって基材骨格内に侵入することにより膨張し、細孔を閉塞するためと推定される。
【００１５】
特許文献８に開示された多孔膜は、塩を含む溶液からの優れた不純物除去性を示すものの、吸着した不純物を洗浄溶出することが出来ないため、繰返し使用することが出来ないという実用上の課題を有する。
【００１６】
かかる状況に鑑み、本発明の解決しようとする課題は、高濃度の抗体モノマー等のタンパク質及び高濃度の夾雑物を含む溶液から、簡便で高速処理が可能であり、かつプロセスウィンドウが広い方法で、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン及び凝集体などの夾雑物を有効かつ迅速に除去することが可能であり、さらに形状安定性に優れ、膨張などによる通液圧の上昇が抑制されると共に、適切な洗浄により吸着した不純物を速やかに洗浄し、再生可能な多孔膜、その製造方法、並びに該多孔膜を用いたタンパク質の精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、多孔質基材の基材骨格内部及び細孔内部に固定したグラフト鎖が存在し、該グラフト鎖の側鎖に官能基が固定されていて、さらに官能基のグラフト鎖への固定が、細孔内部以外に存在するグラフト鎖より細孔内部に存在するグラフト鎖が多くなるよう、不均一になされた、形状安定性の高い多孔膜を用いることが、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、ウィルス及び２量体を含む凝集体をはじめとするこれまで除去することが困難であった夾雑物の除去に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１８】
すなわち、本発明の態様は、多孔質基材の基材骨格内部及び細孔内部に固定されたグラフト鎖を有する多孔膜であって、全てのグラフト鎖の２０重量％以上は基材骨格内部に存在し、グラフト鎖は電荷を有するイオン、分子、及び粒子状物質を吸着する性質を持つ官能基を側鎖に有しており、全ての官能基に対する細孔内部に存在する官能基のモル比率が、全てのグラフト鎖を形成するモノマーに対する細孔内部に存在するグラフト鎖を形成するモノマーのモル比率より大である、多孔膜であることを要旨とする。
【００１９】
また、本発明の態様は、上記の官能基分布の結果として生じる、形状安定性が高く、塩溶液通液後の通液圧上昇を抑制する多孔膜を与える、アルカリ金属水酸化物を含む水溶液を用いる、多孔膜の製造方法であることを要旨とする。
【００２０】
さらに、本発明の他の態様は、上記の製造方法によって得られた、多孔質基材と、多孔質基材に固定されたグラフト鎖と、グラフト鎖の側鎖に結合しているアミノ基であってアルキル基が結合しているアミノ基と、を備える多孔膜を用いて、タンパク質を含む溶液から夾雑物を除去するタンパク質の精製方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の多孔膜は、形状安定性に優れ、膨張などによる通液圧の上昇を抑制可能であり、また、適切な洗浄により吸着した不純物を速やかに洗浄し、再生可能であり、さらに、本発明の多孔膜及び該多孔膜を用いたタンパク質の精製方法によれば、高濃度の抗体モノマー等のタンパク質及び高濃度の夾雑物を含む溶液から、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン及び凝集体などの夾雑物を簡便かつ高速に除去可能であり、抗体モノマー等のタンパク質の精製を有効かつ迅速に実施することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００２３】
本実施の形態に係る多孔膜は、多孔質基材と、多孔質基材の基材骨格内部及び細孔内部に固定されたグラフト鎖と、を有する多孔膜であって、全てのグラフト鎖の２０重量％以上は基材骨格内部に存在し、グラフト鎖は電荷を有するイオン、分子、及び粒子状物質を吸着する性質を持つ官能基を側鎖に有しており、全ての官能基に対する細孔内部に存在する官能基のモル比率が、全てのグラフト鎖を形成するモノマーに対する細孔内部に存在するグラフト鎖を形成するモノマーのモル比率より大である多孔膜である。したがって、官能基は、細孔内部により多く存在するように不均一にグラフト鎖の側鎖に結合している。官能基は、例えばアミノ基であって、アルキル基が結合しているアミノ基である。また、本実施の形態は、多孔膜の製造方法、及び多孔膜を用いて、抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液のろ過を行い、混合液中の夾雑物及び／又は抗体モノマーを該多孔膜に吸着させる工程を含む、抗体モノマーの精製方法に関する。
【００２４】
本実施の形態における「抗体」とは、生体内に侵入した抗原と抗原抗体反応を起こし、抗原に対する免疫性を生体に与えるタンパク質の総称であり、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び免疫グロブリンなどを指す。特に本実施の形態における精製方法が、抗体医薬の製造工程で用い得る方法であるという観点からは、上記の抗体のうち、抗体医薬となり得る抗体が好ましい場合もある。本実施の形態における「抗体モノマー」とは、上記の抗体のうち、単量体で存在するものを指す。
【００２５】
本実施の形態における「夾雑物」とは、抗体モノマーを精製しようとする対象溶液（混合液）中に含まれる、抗体モノマー以外の不純物を指し、例えば、抗体を細胞培養により産生させる際に培養槽内で産生される目的抗体モノマー以外の不純物が挙げられる。より具体的には、ＨＣＰ、エンドトキシン、ＤＮＡ、プロテアーゼ、遊離プロテインＡ、ウィルス、バクテリア及び抗体モノマーの凝集体、誤って折りたたまれた抗体タンパクの種、などが挙げられる。
【００２６】
本実施の形態における「凝集体」（「抗体モノマーの凝集体」ということもある）とは、１種若しくは複数種の抗体モノマー同士の複合体、又は抗体モノマーと他のタンパク質等の化合物との複合体を指し、例えば、抗体モノマーの２量体又は３量体などの多量体、遊離したプロテインＡと抗体との複合体などを含む。
【００２７】
本実施の形態における「抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液」は、上記の抗体モノマー及び夾雑物を含有する溶液（又は含有する可能性のある溶液）であれば特に制限されず、本実施の形態の抗体モノマーの精製方法によりそこから抗体モノマーを精製しようとする対象溶液である。例えば、抗体の産生において用いられる細胞培養液又はその除濁液、あるいはそれらのダウンストリーム工程でのクロマトグラフィー工程中又は工程後の部分精製液等が挙げられる。これらの中でも、ダウンストリーム工程における、代表的にはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィー工程前の除濁液、又はアフィニティクロマトグラフィー工程後の部分的に精製された溶液が、溶液が澄明であること、また夾雑物が部分的に除去されていることで後段の精製工程における負荷がより低減されることから、特に好適である。混合液中の抗体モノマー及び夾雑物の濃度は、特に限定されない。しかし、本実施の形態における抗体モノマーの精製方法が、特に高濃度の抗体モノマー及び夾雑物を含有する混合液に対しても効率よく実施することができるという観点からは、例えば、混合液は、抗体モノマー及び夾雑物を合わせて２ｇ／L含んでいてもよく、抗体モノマーを５ｇ／Ｌ以上、夾雑物を１ｇ／Ｌ以上それぞれ含んでいてもよい。
【００２８】
本実施の形態において用いられる「アミノ基とアルキル基とが固定された多孔膜」とは、例えば多孔質基材の主表面及び多孔質基材の内部の細孔の側壁に、グラフト鎖が固定され、該グラフト鎖がその側鎖に水酸基及びそれに隣接するアミノ基を有し、該アミノ基にアルキル基が結合している多孔膜である。特に多孔膜への抗体モノマー及び／又は夾雑物の吸着性を高めるという観点からは、アニオン交換基が多孔質基材の細孔の側壁に固定された多孔膜であることが好ましい。なお、以下において、多孔質基材の内部の細孔の側壁を含む多孔質基材の総ての表面を単に「表面」といい、多孔質基材の内部の細孔の側壁を含まない表面を「主表面」という。
【００２９】
多孔質基材の材料は、特に限定はされないが、多孔質基材が疎水性であれば、タンパク質と多孔質基材との間に付加的な疎水性相互作用が生じ得るという観点、及び機械的性質を保持するという観点から、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体の例としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、前記オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種若しくは２種以上の前記オレフィンとパーハロゲン化オレフィンとの共重合体などが挙げられる。また、これらの重合体の２種以上の混合物であってもよい。パーハロゲン化オレフィンの例としては、テトラフルオロエチレン及びクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
【００３０】
これらの中でも、疎水性と機械的強度に特に優れ、かつ高い吸着容量が得られる素材であるという観点から、多孔質基材の材料として、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００３１】
本実施の形態において、アミノ基は、２級アミノ基（−ＮＨ−Ｒ）、３級アミノ基（−Ｎ−Ｒ2）、及び４級アミノ基（−Ｎ+−Ｒ3）より選ばれる。ここでＲはアルキル基である。なお、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基は、それぞれ、モノアルキル置換アミノ基、ジアルキル置換アミノ基、及びトリアルキル置換アミノ基ともいう。
【００３２】
本実施の形態において、アルキル基は、メチル基（−ＣＨ3）、エチル基（−ＣＨ2ＣＨ3）、プロピル基（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、イソプロピル基（−ＣＨ（ＣＨ3）2）、及びブチル基（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）より選ばれる。
【００３３】
アミノ基とアルキル基との組み合わせにより、タンパク質によって吸着性能及び精製条件に相違が生じる。そのため、目的に応じてアミノ基とアルキル基との組み合わせを選択することにより、プロセスウィンドウの広い、タンパク質精製のための多孔膜を得ることが可能となる。特に抗体モノマーの精製の目的のためには、２級アミノ基としては、プロピルアミノ基（−Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、イソプロピルアミノ基（−Ｎ−ＣＨ（ＣＨ3）2）、３級アミノ基としては、ジエチルアミノ基（−Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ3）2）、ジプロピルアミノ基（−Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）2）、ジイソプロピルアミノ基（−Ｎ−（ＣＨ（ＣＨ3）2）2）、４級アミノ基としては、トリメチルアミノ基（−Ｎ+−（ＣＨ3）3）、トリエチルアミノ基（−Ｎ+−（ＣＨ2ＣＨ3）3）が好ましい。
【００３４】
アルキル化されたアミノ基の多孔質基材への固定の方法は、特に制限されないが、一般に、エポキシのような反応性の高い官能基を多孔質基材の表面に導入し、その後、該官能基に有機アミン化合物を結合させる方法によって行うことができる。本実施の形態においては特にエポキシ基を有するグラフト鎖を予め多孔質基材の表面に固定しておき、所望のアミノ基とアルキル基との組み合わせからなる有機アミン化合物をエポキシ基に反応させることにより、多孔質基材の主表面及び多孔質基材に設けられた細孔の側壁に有機アミン化合物を固定する。
【００３５】
本実施の形態において、「グラフト鎖」とは、多孔質基材の主表面及び多孔質基材に設けられた細孔の側壁に結合した、多孔質基材の材料と同種又は異種の分子鎖であり、基材を形成する基材骨格内部および多孔質部分を形成する細孔内部の両方に存在する。グラフト鎖としては、例えば、グリシジルメタクリレート、酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルアセテート又はこれらのいずれか２種以上の重合体を含む分子鎖が挙げられるが、アミノ基を導入しやすいことから、グリシジルメタクリレート又は酢酸ビニルの重合体が好ましく、グリシジルメタクリレートの重合体がより好ましい。多孔質基材に対するグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、例えば後述の実施例等に記載の手法を用いて測定することができ、より高い吸着容量及び力学的に安定な強度をともに確保するという観点から、好ましくは２０％〜２００％、より好ましくは２０％〜１５０％、更に好ましくは３０％〜１００％である。
【００３６】
グラフト鎖の多くはその起点を基材骨格内部に有し、基材骨格内部から細孔空間に伸びた形状をしている。即ち、グラフト鎖は多孔質基材の基材骨格内部及び細孔空間の両方に存在しており、このため、細孔の表面にのみ固定されている場合に比べて、グラフト鎖はより強固に多孔質基材に固定されている。グラフト鎖の全重量の内で基材骨格内部に存在するグラフト鎖の重量の比率は、グラフト鎖の基材への固定強度を確保するという観点から、好ましくは２０重量％〜９０重量％、より好ましくは３０重量％〜９０重量％、更に好ましくは４０重量％〜９０重量％である。
【００３７】
多孔質基材の主表面及び細孔の側壁に、グラフト鎖を導入し、さらに、アルキル化されたアミノ基をグラフト鎖に固定する従来の方法としては、以下に限定されるものではないが、例えば特開平２−１３２１３２号公報に開示される方法が挙げられる。この方法では、気相反応に従うために、アミン化合物は、反応環境下において気相として存在し、エポキシ基と反応しうるものに限定される。液相反応によってアミン化合物をグラフト鎖に固定されたエポキシ基と反応させ固定する従来の方法としては、例えばJournal of Chromatography A, 689(1995) 211-218に記載されている方法がある。ただし、当該文献には、ジエチルアミンを反応させる方法のみが開示されている。これらのアミノ基をグラフト鎖に固定する従来の方法においては、アミノ基はグラフト鎖が基材骨格内にあるか、あるいは細孔内にあるかによらず、ほぼ均一にグラフト鎖に固定される。即ち、全官能基に対する細孔内部に存在する官能基のモル比率は、全グラフト鎖に対する細孔内部に存在するグラフト鎖のモル比率とほぼ等しくなる。
【００３８】
基材骨格内にグラフト鎖が導入されることにより、またさらにグラフト鎖のエポキシ基にアミノ基が固定されることにより、多孔質基材は体積が増加する。また、アミノ基は水分子と水和構造を作りやすい性質があるため、得られた多孔膜に水溶液あるいは純水を通液すると、水分子が基材内部に浸透し、多孔質基材が膨張する場合がある。更に基材骨格が膨張することにより、細孔が閉塞され、通液圧が増大する原因になる。純水を通液した際の通液圧の増大は、塩を含む溶液を通液した後に純水を通液した際に、特に顕著に見られる。これは塩溶液中のＣｌ-などの陰イオンが基材骨格内のアミノ基に吸着し、純水を通液した際に、浸透圧の効果により水分子が基材骨格内に吸収され、より細孔の閉塞が顕著になることが原因と推測される。
【００３９】
これに対し、本実施の形態において、全官能基に対する細孔内部に存在する官能基のモル比率が、全グラフト鎖に対する細孔内部に存在するグラフト鎖のモル比率より大となるように、アミノ基を導入する反応においては、液相反応による方法を用いる。この際、アミン化合物の反応液にアルカリ金属の水酸化物水溶液を添加すると、特に基材骨格内に存在するグラフト鎖のエポキシ基は、アミン化合物ではなく、水酸基とより優先的に反応し、基材骨格内に固定されるアミノ基は基材骨格内に存在するグラフト鎖の割合に比べて少なくなる。これは基材骨格内へは、アミノ基よりもサイズの小さな水酸基が優先的に浸透することによると考えられる。本実施の形態に用いられるアルカリ金属の水酸化物は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムより選ばれるが、これらの中でも水酸化ナトリウムが最も安価で汎用的であることから好適である。
【００４０】
本実施の形態に係る反応方法により得られた、アミノ基がグラフト鎖に固定された多孔膜は、反応の前後での体積増加が少ない。更に塩溶液の後に純水を通液した際の基材の膨張、並びに通液圧の増大が著しく抑制される。任意のアミン化合物をエポキシ基と反応させて固定する方法は、使用するアミン化合物によって適切に選択される必要があり、例えば後述の実施例等に記載の方法を用いて行う。
【００４１】
本実施の形態の多孔膜は、多孔質基材と、多孔質基材の主表面及び多孔質基材に設けられた細孔の側壁に固定されたグラフト鎖と、グラフト鎖が有する側鎖に結合しているアミノ基及びアルキル基と、を備える。このような多孔膜は、多孔質基材に固定された各グラフト鎖が１以上の側鎖を有し、その側鎖にアミノ基及びアルキル基がそれぞれ１以上固定された構造を有するため、アミノ基及びアルキル基が細孔空間内に立体的に分布する。そのため、電荷点を有するタンパク質などに対してアミノ基の吸着点の数が多く、吸着量が増加するとともに、相互作用の小さなタンパク質などの吸着性も高くなる。さらに、電荷相互作用以外に、アルキル基が存在することによる効果により、より高度に選択的なタンパク質の吸着が実現され、特に抗体モノマーなどの、電荷相互作用のみでは精製が困難なタンパク質を、有効に夾雑物から分離することに有効である。
【００４２】
多孔膜の最大細孔径は、溶液中の抗体モノマー及び／又は夾雑物を有効に吸着し、かつ高い透過流速を得るために、上記のアニオン交換基の固定及びグラフト鎖の導入前の状態で、好ましくは０．０１μｍ〜５．０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ〜３．０μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１．０μｍである。
【００４３】
多孔膜中の細孔の占める体積である空孔率は、多孔膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、好ましくは５％〜９９％であり、より好ましくは１０％〜９５％であり、さらに好ましくは３０％〜９０％である。
【００４４】
上記細孔径及び空孔率の測定は、Ｍａｒｃｅｌ  Ｍｕｌｄｅｒ著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができる。例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、透過率法などの測定方法が挙げられる。例えば最大細孔径の測定は、後述の実施例等に記載のバブルポイント法を適切に用いることができる。
【００４５】
多孔質基材の形態は、溶液を通液することが可能な形態であれば特に限定されず、例えば、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、又はキャピラリーなどが挙げられる。これらの形態の中でも、製造のし易さ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などの観点からは、中空糸膜が好ましい。また、多孔質基材の形状は、例えば円板又は円筒状であってもよいが、これに限定されない。
【００４６】
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と外層とが貫通孔である細孔によって連通しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体又は気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。中空糸の外径及び内径は、物理的に多孔膜が形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
【００４７】
上記の本実施の形態の多孔膜に、抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液を通液し、夾雑物及び／又は抗体モノマーを多孔膜に吸着させる工程を、以下に説明する。
【００４８】
本実施の形態による典型的な抗体モノマーの精製方法の例としては、特に限定するものではないが、抗体モノマーと夾雑物とを含む混合液を本実施の形態に係る多孔膜に通液し、混合液中の夾雑物を多孔膜に吸着させることより夾雑物を混合液から除去し、透過液を抗体モノマーの精製液として回収する方法が、最も簡便であり速やかに精製を実施することができることから好ましい。
【００４９】
抗体モノマーの等電点（ｐＩ）は通常、６．５〜８．５の範囲である。一方、ＨＣＰ、ＤＮＡ、及びウィルスなどの夾雑物の多くのｐＩは７以下にある。そのため、上記の多孔膜に通液する溶液のｐＨ範囲及び塩濃度(電気伝導度)を好適に制御することによって、夾雑物の多くを多孔膜の正に帯電したアミノ基に吸着させ、透過液を抗体モノマーの精製液として回収することが可能となる。夾雑物のうち、凝集体のｐＩは抗体モノマーに近いかほぼ等しい。しかし、抗体モノマーと凝集体との相違点は、凝集体は抗体モノマーの複合体であるため、ｐＩが抗体モノマーと同程度であっても、凝集体の方が全体として有する電荷点の数が多い点である。このため、凝集体は、正に帯電したアミノ基を有する多孔膜に抗体モノマーよりも僅かながら吸着しやすい性質を有する。そのため、溶液のｐＨ及び塩濃度を適切に調整することにより、凝集体を多孔膜のアミノ基に吸着させ、透過液を抗体モノマーの精製液として回収することが可能となる。
【００５０】
特に、多孔質基材にグラフト鎖を介してアミノ基が固定された多孔膜（好ましくは各グラフト鎖が１以上の側鎖を有し、各側鎖がアミノ基を有する多孔膜）を用いる場合、多孔膜においてアミノ基が立体的に固定されていることになる。その結果、凝集体などのタンパク質は、電荷点において複数のアミノ基によって立体的に固定される。そのため、凝集体は抗体モノマーよりも、より強固に多孔膜に吸着され、抗体モノマーの精製を容易に行うことができる。
【００５１】
また、タンパク質は本質的に疎水性相互作用の性質も有する。そのため、疎水性の性質を有する多孔膜を用いると、抗体モノマーの精製をより容易に行うことができると考えられる。抗体モノマーの凝集体は抗体モノマーとは疎水性の性質が異なる。したがって、グラフト鎖がアルキル基を有することにより、より選択的に凝集体を吸着除去することが可能になる。
【００５２】
混合液中の夾雑物を多孔膜に吸着させ、吸着により夾雑物を混合液から除去し、透過液を抗体モノマーの精製液として回収する場合、夾雑物の多孔膜への吸着性が抗体モノマーよりも顕著になる条件に混合液のｐＨ及び塩濃度を調整する。具体的には、ｐＨ５〜９及び塩濃度が０ｍｏｌ／Ｌ〜０．３ｍｏｌ／Ｌの範囲に混合液を調整する。
【００５３】
塩濃度の調整に用いる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの他、クエン酸、リン酸又はグリシンの金属塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ｐＨの調整は通常、簡便には塩酸又は水酸化ナトリウムの添加によって行うことができるが、これに限定されず、当業者に公知のｐＨ調整方法を適宜用いることができる。溶液のｐＨ及び塩濃度の測定は、例えば市販の測定機器を用いて、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。
【００５４】
上記のｐＨ及び塩濃度の混合液を、本実施の形態における多孔膜に通液することにより、凝集体、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、及びウィルスなどのｐＩが７以下の夾雑物が多孔膜に吸着される。混合液のｐＨ及び塩濃度を、精製対象とする抗体モノマーのｐＩに応じて調整することにより、夾雑物（特に凝集体）がより選択的に多孔膜に吸着され、抗体モノマーの精製を、より有効に行うことができる。一般的な抗体モノマーのｐＩは８近辺にあるという観点からは、混合液のｐＨ及び塩濃度は、好ましくはｐＨ６〜９及び塩濃度が０ｍｏｌ／Ｌ〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくはｐＨ７〜８．５及び塩濃度が０ｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくはｐＨ７．５〜８．５及び塩濃度が０ｍｏｌ／Ｌ〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。具体的には、精製対象とする抗体モノマーによって異なるが、抗体モノマーの等電点が７．５以上、例えば７．５〜８．５の範囲にある場合、混合液のｐＨ及び塩濃度を上記の範囲とすれば、抗体モノマーの精製を有効に行い得る。なお、上記の混合液と同じｐＨ及び塩濃度を有する洗浄液で、混合液通液後の多孔膜を洗浄することで、抗体モノマーをより高収率で精製することが可能となる。
【００５５】
このように、夾雑物を含む混合液のｐＨ及び塩濃度を調整し、本実施の形態に係る多孔膜に通液することによって、凝集体を含む夾雑物を容易に除去し、抗体モノマーの精製を簡便に行うことが可能となる。この際、通液する溶液と、多孔膜に固定されたアミノ基及びアルキル基との接触は強制対流によってなされるため、カラムクロマトグラフィーの場合と比べて極めて早い通液流速、例えば、１０００Ｖ／ｈ又はそれ以上の流速でも抗体モノマーの精製を行うことができる。
【００５６】
本実施の形態に係る方法及び多孔膜を用い、本明細書の記載を参照することにより、高濃度の抗体モノマー及び高濃度の夾雑物を含む溶液から、凝集体を含む夾雑物の除去を簡便で高速処理が可能でプロセスウィンドウが広い方法で行うことが可能となり、有効かつ迅速に抗体モノマーを精製することが可能となる。したがって、精製された抗体モノマーを工業的に効率的に得ることが可能となる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例及び比較例（本明細書中において、単に「実施例等」ともいう。）に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【００５８】
［製造例１］  アニオン交換基が表面に固定された多孔膜モジュールの作製
（ｉ）中空糸状の多孔質基材へのグラフト鎖の導入
外径３．１ｍｍ、内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、空孔率７０％、重量０．１３５ｇ、後述するバブルポイント法で測定した最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン製で中空糸状の多孔質基材（旭化成ケミカルズ製、ポリエチレンＢ膜）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン製で中空糸状の多孔基材をガラス反応管に入れて、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）２．５体積部、メタノール９７．５体積部からなる反応液を、中空糸状の多孔質基材の２０質量部に注入した後、１２時間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、グラフト鎖が導入された中空糸多孔膜を得た。なお、ＧＭＡ及びメタノールからなる反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
【００５９】
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を捨てた。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて中空糸多孔膜を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマー及び中空糸多孔膜に固定されなかったグラフト鎖を除去した。洗浄液を捨てた後、さらにジメチルスルホキシドを入れて２回洗浄を行った。次いでメタノールを用いて同様にして洗浄を３回行った。洗浄後の中空糸多孔膜を乾燥し、重量を測定したところ、中空糸多孔膜の重量はグラフト鎖導入前の１５５％の０．２０９ｇであり、グラフト鎖導入前の多孔膜基材の重量に対するグラフト鎖の重量の比として定義されるグラフト率は５５％であった。また反応後の中空糸は外径３．３５ｍｍ、内径２．１５ｍｍ、長さ１０８ｍｍ、空孔率７０％であった。反応前後において空孔率に変化が無いことから、グラフト鎖が基材骨格内部に形成されることによる体積増加は、空孔構造に変化を及ぼさない、形状を保持したままの相似的な膨張であることが示される。
【００６０】
したがって、基材骨格内に存在するグラフト鎖の、全グラフト鎖に対する重量比率ｗMSは、基材骨格内におけるグラフト鎖の密度が骨格密度に等しいとすると、重量増加率に対する膜体積増加率の比であり、以下の式によって表される。
ｗMS＝（（Ｖ1−Ｖ0）／Ｖ0）／（（Ｗ1−Ｗ0）／Ｗ0）・・・（１）
ここで、Ｖ0及びＶ1はそれぞれグラフト導入反応前及び後での中空糸多孔膜体積であり、いずれも外径、内径及び長さから容易に算出される。また、Ｗ0及びＷ1はそれぞれ反応前及び後での中空糸の重量である。また、ｗMSは基材骨格内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖モノマーに対するモル比率ｍMSに等しい。
【００６１】
式（１）より、中空糸多孔膜の細孔内に存在するグラフト鎖の、全グラフト鎖に対する重量比率ｗMPは式（２）によって与えられ、３２％と得られた。
ｗMP＝１−ｗMS・・・（２）
ここで、ｗMPは細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖モノマーに対するモル比率ｍMPに等しい。
【００６２】
（ｉｉ）グラフト鎖へのアミノ基及びアルキル基の固定
グラフト鎖を導入した後乾燥させた中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。次に、アミノ基とアルキル基とを有するアミン化合物として、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンを用意し、実施例にて後述する、それぞれのアミン化合物に適した反応条件により、グラフト鎖が有するエポキシ基を開環反応でアミン化合物に置換し、グラフト鎖にアミノ基とアルキル基とを固定した。置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ0のうち、アミン化合物に置換されたモル数をＮ1として下記式（３）を用いて算出した。
Ｔ＝１００×Ｎ1／Ｎ0
＝１００×｛（Ｗ2−Ｗ1）／Ｍ1｝／｛Ｗ1（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ2｝・・・（３）
式（３）中、Ｍ1はアミン化合物の分子量、Ｗ1はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、Ｗ2はアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ2はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００６３】
基材骨格内に存在するアミノ基の、全アミノ基に対するモル比率ｍLSは、基材骨格内におけるアミノ基の密度をρとすると、重量増加率に対する膜体積増加率の比であり、以下の式によって表される。
ｍLS＝（（Ｖ2−Ｖ1）ρ／Ｖ1）／（（Ｗ2−Ｗ1）／Ｗ1）・・・（４）
ここで、Ｖ2及びＷ2はそれぞれ、アミノ基導入反応後での中空糸多孔膜の体積及び重量である。
【００６４】
式（４）より、中空糸多孔膜の細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率ｍLPは次式（５）によって与えられる。
ｍLP＝１−ｍLS・・・（５）
【００６５】
（ｉｉｉ）アミノ基とアルキル基とが固定された中空糸多孔膜モジュールの作製
（ｉｉ）で得られた、アミノ基とアルキル基とがグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜１本の長手方向の両末端を、中空糸多孔膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で、内径０．５ｃｍ、有効長９．２ｃｍのポリスルホン酸製モジュールケースに固定して、中空糸多孔膜モジュールを作製した。これを、以下の実施例等において、評価モジュールとして用いた。
【００６６】
［評価方法例１］バブルポイント法
中空糸多孔膜の最大細孔径は、バブルポイント法を用いて測定した。長さ８ｃｍの中空糸多孔膜の一方の末端を閉塞し、他方の末端に圧力計を介して窒素ガス供給ラインを接続した。この状態で窒素ガスを供給してライン内部を窒素に置換した後、中空糸多孔膜をエタノールに浸漬した。この時、エタノールがライン内に逆流しないように極僅かに窒素で圧力をかけた状態で、中空糸多孔膜を浸漬した。中空糸多孔膜を浸漬した状態で、窒素ガスの圧力をゆっくりと増加させ、中空糸多孔膜から窒素ガスの泡が安定して出始めた圧力Ｐを記録した。これより、最大細孔径をｄ、表面張力をγとして、下記式（６）に従って、中空糸多孔膜の最大細孔径を算出した。
ｄ＝Ｃ1γ／Ｐ・・・（６）
式（６）中、Ｃ1は定数である。エタノールを浸漬液としたときのＣ1γ＝０．６３２（ｋｇ／ｃｍ）であり、上式にＰ（ｋｇ／ｃｍ2）を代入することにより、最大細孔径ｄ（μｍ）を求めた。
【００６７】
［評価方法例２］中空糸多孔膜のタンパク質動的吸着容量の測定
２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に１ｇ／Ｌの濃度でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を溶解したＢＳＡ溶液を用い、破過が開始するまで（ｉｉｉ）で作成した中空糸多孔膜モジュールにＢＳＡ溶液を透過させた。溶液は評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって流速３ｍＬ／ｍｉｎにて通液した。評価はＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００を用いて実施し、同装置において得られる、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度が供給液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度（１５０ｍＡＵ）の１／１０（１５ｍＡＵ）となった時点を破過点とし、その時点までに供給したＢＳＡ溶液の体積から、動的吸着容量を産出した。ここで、ＢＳＡ溶液の濃度Ｑ、評価モジュールが破過した時までに透過させたＢＳＡ溶液の体積ＶB、及び評価モジュール内の実施例に係る中空糸多孔膜の体積ＶMから、下記式（７）に基づいて動的吸着容量Ａを算出した。
Ａ＝Ｑ×ＶB／ＶM  ・・・（７）
【００６８】
中空糸多孔膜の体積とは、中空部分を除いた体積である。また破過とは、透過液中のＢＳＡ濃度が、供給されたＢＳＡ溶液の濃度の１０％である０．１ｇ／Ｌを超えた時点のことをいう。
【００６９】
［評価方法例３］  抗体モノマーと凝集体との比率の測定
抗体モノマーと凝集体との比率は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製クロマトグラフＬＣ−１０Ａシステムにゲルろ過カラムとして東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬを取り付け、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸及び０．２ｍｏｌ／Ｌのアルギニン（ｐＨ６．８）を含むバッファーを用いて、２５℃において流速０．８ｍL／ｍｉｎでカラムに通液し、ここに評価サンプルを２０μＬ添加した。カラム透過後に抗体モノマーと凝集体はそれぞれ分離した溶出ピークを示し、得られた抗体モノマーと凝集体のピーク面積比から、溶液中でのそれぞれの存在比率を算出した。
【００７０】
［製造例２］  抗体モノマーと凝集体とを含む混合液の調整
１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン、１０ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓからなる水溶液を作製し、ここにｐＨ８．３となるように１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を滴下しながら添加して、緩衝液を作製した。ここに、抗体タンパク質としてｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（田辺三菱製薬製、ヴェノグロブリンＩＨ）を２ｇ／Ｌとなるように添加し、夾雑物として２量体を含む抗体モノマーの混合液を作製した。ｐＨは市販のｐＨメーター（東亜ディーケーケー（株）、ＨＭ−３０Ｓ）を用いて測定した。得られた混合液中の全抗体タンパク質中の凝集体比率を評価方法例２の方法により測定したところ、２量体の比率が４．０６％であり、残りは全てモノマーであった。またこの混合液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度は７２０ｍＡＵであった。
【００７１】
［評価方法例４］  抗体モノマー精製評価
上記の製造例２で作製した抗体モノマーと凝集体との混合液５０ｍＬを、製造例１で作製した評価モジュールに透過させた。その際、事前に評価モジュールには抗体モノマーと凝集体とを含まない同じｐＨと塩濃度の緩衝液を２０ｍＬ通液し、評価モジュールを平衡化しておいた。また、混合液の透過後、平衡化に用いたものと同じ緩衝液１０ｍＬをモジュール内に残存する抗体モノマーの洗浄液として通液し、これも透過液に加えて６０ｍＬの透過液を回収した。回収した透過液を用いて、評価方法例２の方法により、抗体モノマーと凝集体との比率を測定し、評価モジュールに通液する前の比率と比較した。溶液は評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって流速３ｍＬ／ｍｉｎにて通液した。評価はＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００を用い、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定し、下記式（８）に従って、ＵＶ吸光度から精製後の抗体モノマーの回収率を評価した。
回収率（％）＝（２０×Ｉ1）／（１０×Ｉ0）×１００・・・（８）
式（８）中、Ｉ0及びＩ1はそれぞれモジュール透過前の混合液及び回収した透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度である。
【００７２】
［実施例１］
グラフト鎖へのトリメチルアミノ基（４級アミノ基とメチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、トリメチルアミン塩酸塩１．９１ｇに０．７ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液を全体積が４０ｍＬとなるまで攪拌しながら添加し、アルカリ金属水酸化物（ＮａＯＨ）を含む反応液を作製した。得られた反応液は、トリメチルアミン塩酸塩０．５ｍｏｌ／Ｌ、ＮａＯＨ０．７ｍｏｌ／Ｌよりなる水溶液である。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト反応後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部である反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、調整した反応液に純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、７時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリメチルアミノ基に置換し、４級アミノ基とメチル基とがグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．５１ｍｍ、内径２．１８ｍｍであり、式（３）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の７９％がトリメチルアミノ基によって置換されていた。また、式（５）により、細孔内に存在するアミノ基の全アミノ基に対するモル比率は、６３％と得られ、細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率３２％の約２倍と有意に大であった。
【００７３】
トリメチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５５ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．３ｃｍ2であった。得られたモジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６９ｍｇ／ｍＬであった。また、ＢＳＡ吸着後、１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬをモジュールに通液し、その後、純水を通液したところ、通液圧は０．０３３ＭＰａであった。ここで通液速度は塩溶液、純水ともに３ｍＬ／ｍｉｎであり、通液後の外径変化は見られなかった。
さらにこの１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液したモジュールを用いて、再度評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６９ｍｇ／ｍＬと同じ値が得られた。即ち、本モジュールは塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができた。
【００７４】
［比較例１］
トリメチルアミン塩酸塩に加えるＮａＯＨ水溶液の濃度が、トリメチルアミン塩酸塩の塩酸成分を中和する等量に当たる０．５ｍｏｌ／Ｌである以外は、実施例１と同様にして、トリメチルアミノ基をグラフト鎖に固定した中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸は外形３．７ｍｍ、内径２．２５ｍｍであり、式（３）により、グラフト鎖が有する全エポキシ基の８４％がトリメチルアミノ基によって置換されていた。また、式（５）により、細孔内に存在するアミノ基の全アミノ基に対するモル比率は、２９％と得られ、細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率３２％とほぼ等しかった。得られた中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製し、実施例１と同様にしてＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６８ｍｇ／ｍＬであった。更に実施例１と同様にして、塩溶液通液後に純水を３ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液した際の通液圧は、０．１３ＭＰａと極めて高く、通液後に外径は３．９５ｍと膨張した。
さらにこの１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液したモジュールを用いて、再度評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６８ｍｇ／ｍＬと同じ値が得られた。即ち、本モジュールは塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができた。
【００７５】
実施例１と比較例１より、反応溶液中のアルカリ金属水酸化物であるＮａＯＨの濃度がトリメチルアミン塩酸塩濃度より高い状態で反応することにより、同程度の置換率であっても、得られた中空糸多孔膜の外形は小さくなる。即ち、実施例１の反応方法を用いることにより、トリメチルアミノ基は基材骨格部分には少なく分布し、細孔部分により多く分布していることが示された。また実施例１の評価モジュールを用いることにより、通液圧、特に塩溶液後に純水を通液した際の通液圧の上昇が顕著に抑制され、形状安定性が保たれることが示された。
【００７６】
［実施例２］
グラフト鎖へのジエチルアミノ基（３級アミノ基とエチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、ジエチルアミン２０ｍＬと０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ水溶液２０ｍＬとを混合し、アルカリ金属水酸化物（ＮａＯＨ）を含む反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト反応後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部である反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、調整した反応液に純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２４時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジエチルアミノ基に置換し、３級アミノ基とエチル基とがグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４８ｍｍ、内径２．１７ｍｍであり、式（３）により、グラフト鎖が有する全エポキシ基の８６％がジエチルアミノ基によって置換されていた。また、式（５）により、細孔内に存在するアミノ基の全アミノ基に対するモル比率は、６２％と得られ、細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率３２％の約２倍と有意に大であった。
【００７７】
ジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．３ｃｍ2であった。得られたモジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６２ｍｇ／ｍＬであった。また、ＢＳＡ吸着後、１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬをモジュールに通液し、その後、純水を通液したところ、通液圧は０．０４６ＭＰａであった。ここで通液速度は塩溶液、純水ともに３ｍＬ／ｍｉｎであり、通液後の外径変化は見られなかった。
さらにこの１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液したモジュールを用いて、再度評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６１ｍｇ／ｍＬと、ほぼ同じ値が得られた。即ち、本モジュールは塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができた。
【００７８】
［比較例２］
ジエチルアミンと混合するＮａＯＨ水溶液の濃度が０ｍｏｌ／Ｌ、即ちアルカリ金属水酸化物（ＮａＯＨ）を含まない純水である以外は、実施例２と同様にして、ジエチルアミノ基をグラフト鎖に固定した中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸は外形３．６３ｍｍ、内径２．２３ｍｍであり、式（３）により、グラフト鎖が有する全エポキシ基の９２％がジエチルアミノ基によって置換されていた。また、式（５）により、細孔内に存在するアミノ基の全アミノ基に対するモル比率は、３０％と得られ、細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率３２％とほぼ等しかった。得られた中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製し、実施例２と同様にしてＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６０ｍｇ／ｍＬであった。更に実施例２と同様にして、塩溶液通液後に純水を３ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液した際の通液圧は、０．１４ＭＰａと極めて高く、通液後の外径は３．９３ｍｍと膨張した。
さらにこの１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液したモジュールを用いて、再度評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６１ｍｇ／ｍＬと、ほぼ同じ値が得られた。即ち、本モジュールは塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができた。
【００７９】
実施例２と比較例２より、反応溶液中にＮａＯＨ水溶液が存在することにより、同程度の置換率であっても、得られた中空糸多孔膜の外形は小さくなる。即ち、実施例２の反応方法を用いることにより、ジエチルアミノ基は基材骨格部分には少なく分布し、細孔部分により多く分布していることが示された。また実施例２の評価モジュールを用いることにより、通液圧、特に塩溶液後に純水を通液した際の通液圧の上昇が顕著に抑制され、形状安定性が保たれることが示された。
【００８０】
［実施例３］
グラフト鎖へのトリエチルアミノ基（４級アミノ基とエチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、トリエチルアミン塩酸塩２．７５ｇと０．６ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液２０ｍLを混合し、ここに全体積が４０ｍＬとなるまでメタノール攪拌しながら添加して、アルカリ金属水酸化物（ＮａＯＨ）を含む反応液を作製した。得られた反応液は、トリエチルアミン塩酸塩０．５ｍｏｌ／Ｌ、ＮａＯＨ０．６ｍｏｌ／Ｌよりなる水溶液である。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト反応後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部である反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、調整した反応液に純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２０時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリエチルアミノ基に置換し、４級アミノ基とエチル基とがグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．５３ｍｍ、内径２．１９ｍｍであり、式（３）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の７７％がトリメチルアミノ基によって置換されていた。また、式（５）により、細孔内に存在するアミノ基の全アミノ基に対するモル比率は、７０％と得られ、細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率３２％の２倍以上と有意に大であった。
【００８１】
トリエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５５ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．３ｃｍ2であった。得られたモジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６７ｍｇ／ｍＬであった。また、ＢＳＡ吸着後、１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬをモジュールに通液し、その後、純水を通液したところ、通液圧は０．０３１ＭＰａであった。ここで通液速度は塩溶液、純水ともに３ｍＬ／ｍｉｎであり、通液後の外径変化は見られなかった。
さらにこの１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液したモジュールを用いて、再度評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６８ｍｇ／ｍＬと、ほぼ同じ値が得られた。即ち、本モジュールは塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができる。
［比較例３］
トリエチルアミン塩酸塩に加えるＮａＯＨ水溶液の濃度が、トリメチルアミン塩酸塩の塩酸成分を中和する等量に当たる０．５ｍｏｌ／Ｌである以外は、実施例３と同様にして、トリエチルアミノ基をグラフト鎖に固定した中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸は外形３．７７ｍｍ、内径２．２２ｍｍであり、式（３）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の８６％がトリエチルアミノ基によって置換されていた。また、式（５）により、細孔内に存在するアミノ基の全アミノ基に対するモル比率は、３６％と得られ、細孔内に存在するグラフト鎖モノマーの、全グラフト鎖に対するモル比率３２％と僅かに大なだけであった。得られた中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製し、実施例１と同様にしてＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６８ｍｇ／ｍＬであった。更に実施例１と同様にして、塩溶液通液後に純水を３ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液した際の通液圧は、０．１２ＭＰａと極めて高く、通液後の外径は３．９８ｍｍと膨張した。
さらにこの１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液したモジュールを用いて、再度評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、６７ｍｇ／ｍＬと、ほぼ同じ値が得られた。即ち、本モジュールは塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができる。
【００８２】
実施例３と比較例３より、反応溶液中のアルカリ金属水酸化物であるＮａＯＨの濃度がトリエチルアミン塩酸塩濃度より高い状態で反応することにより、同程度の置換率であっても、得られた中空糸多孔膜の外形は小さくなる。即ち、実施例３の反応方法を用いることにより、トリエチルアミノ基は基材骨格部分には少なく分布し、細孔部分により多く分布していることが示された。また実施例１の評価モジュールを用いることにより、通液圧、特に塩溶液後に純水を通液した際の通液圧の上昇が顕著に抑制され、形状安定性が保たれることが示された。
【００８３】
［実施例４］
評価方法例４に従い、実施例１で作製したトリメチルアミノ基を有する中空糸多孔膜モジュールに、製造例２で得られた抗体モノマー混合液を５０ｍＬ通液し、洗浄液も含めて６０ｍＬを透過液として回収した。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を評価方法例３の方法により測定した。その結果、透過前は４．０６％であった２量体比率が、多孔膜に通液した後は１．６％に低下した。また、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度は３３６ｍＡＵであり、全抗体モノマーの回収率は９３％であった。よって、トリメチルアミノ基を有する中空糸多孔膜モジュールを用いることにより、凝集体が除去された抗体モノマーを高い回収率で得られることが示された。
【００８４】
［実施例５］
評価方法例４に従い、実施例２で作製したジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜モジュールに、製造例２で得られた抗体モノマー混合液を５０ｍＬ通液し、洗浄液も含めて６０ｍＬを透過液として回収した。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を評価方法例３の方法により測定した。その結果、透過前は４．０６％であった２量体比率が、多孔膜に通液した後は１．３％に低下した。また、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度は３４１ｍＡＵであり、全抗体モノマーの回収率は９１％であった。よって、ジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜モジュールを用いることにより、凝集体が除去された抗体モノマーを高い回収率で得られることが示された。
【００８５】
［実施例６］
評価方法例４に従い、実施例３で作製したトリエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜モジュールに、製造例２で得られた抗体モノマー混合液を５０ｍＬ通液し、洗浄液も含めて６０ｍＬを透過液として回収した。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を評価方法例３の方法により測定した。その結果、透過前は４．０６％であった２量体比率が、多孔膜に通液した後は０．３％に低下した。また、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度は３３６ｍＡＵであり、全抗体モノマーの回収率は８９％であった。よって、トリエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜モジュールを用いることにより、凝集体が除去された抗体モノマーを高い回収率で得られることが示された。
【００８６】
以上により、アルカリ金属水酸化物水溶液が存在する条件において、アミノ基をグラフト鎖に導入することにより、多孔質基材の基材骨格内のグラフト鎖にアミノ基が導入されることが抑制され、その結果体積膨張並びに通液圧の増大が抑制されることが示された。また、多孔質基材と、多孔質基材表面に固定されたグラフト鎖と、グラフト鎖の側鎖に結合しているアミノ基及びアルキル基と、を備える多孔膜とその製造方法が示され、さらにその多孔膜を用いることにより、抗体モノマーの精製が、高速でかつ簡便になされることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
多孔質基材と、多孔質基材表面に結合しているグラフト鎖と、グラフト鎖の側鎖に結合しているアルキル化されたアミノ基と、を備える多孔膜であって、アミノ基が細孔空間内に存在するグラフト鎖により高濃度なるよう不均一に固定された多孔膜に、抗体モノマーと夾雑物を含む混合液を通液することによって、抗体モノマーの凝集体を含む夾雑物を容易に除去することが可能となり、精製された抗体モノマーを得ることが可能となる。この方法は、従来のカラムクロマトグラフィーを用いる方法に比べて、より高い凝集体除去能を有し、抗体モノマー及び夾雑物を高い濃度で含む混合液であっても、高速で処理が可能であり、スケールアップも容易である。このことから、工業レベルで医薬品を製造する際の抗体モノマーの精製に適するという産業上の利用可能性を有する。