(57)【要約】【課題】遺伝子検査を検体試料調整から検査まで連続的に、かつ利便性よく行うことができ、検体試料からの目的遺伝子の検知をより容易に行うことのできる装置及び方法を提供することを目的とする。【解決手段】核酸塩基配列を検査するための装置であって、少なくとも、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器と、検体試料溶液及び薬液を前記極微小容器内に導入するための導入手段と、廃液を排出するための排出手段と、検体試料を観察して塩基配列を測定するための装置とを具備するものであることを特徴とする核酸塩基配列検査装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸塩基配列を検査するための装置であって、少なくとも、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器と、検体試料溶液及び薬液を前記極微小容器内に導入するための導入手段と、廃液を排出するための排出手段と、検体試料を観察して塩基配列を測定するための装置とを具備するものであることを特徴とする核酸塩基配列検査装置。
【請求項２】
前記極微小容器の室は、検体試料導入口と該検体試料導入口の対面に排出口を持ち、該排出口の開口部は、検体試料より小さいものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸塩基配列検査装置。
【請求項３】
更に、前記極微小容器を加熱するための加熱機構を具備するものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸塩基配列検査装置。
【請求項４】
前記検体試料から核酸を得るための検体試料破壊機構を具備するものであることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の核酸塩基配列検査装置。
【請求項５】
核酸塩基配列の検査方法であって、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器に、検体試料を入れ、前記極微小容器の室内で核酸増幅反応を行わせることにより、核酸塩基配列の検査を行うことを特徴とする核酸塩基配列検査方法。
【請求項６】
前記検体試料から核酸を得るための検体試料の破壊を、前記極微小容器の室内にて行うことを特徴とする請求項５に記載の核酸塩基配列検査方法。
【請求項７】
前記核酸増幅反応が、等温増幅法によって行われることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の核酸塩基配列検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を用いた検査技術、特に塩基配列解析、遺伝子診断など、特定遺伝子の配列の検出と言った検査技術に関し、それらの分析に用いる核酸塩基配列検査装置及び核酸塩基配列検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の進展に伴い、より正確に、より容易に標的とする核酸を増幅することが可能になっている（例えば特許文献１参照）。
そして、それら核酸増幅技術を用いて、増幅された核酸の検出手段を改善し、より簡便に結果を得る為の手法が報告されている（例えば特許文献２参照）。しかしながら、この方法は検出に至る為の手段であって、その前工程（サンプル調整、核酸増幅）は含まれていない。また、この報告例では、指向している技術がマイクロアレイの延長である為に、その操作の自動化を可能にするものの、マイクロアレイ技術の置き換えであって、核酸増幅技術をより普遍的な形態とするようにはなっていない。
【０００３】
また、核酸増幅の為のサンプル調整も、必ずしも容易なものではない。
血球の分離は、例えば、遠心分離操作によって行われ、さらに分離の効率・精度を上げるために比重液を用いる比重遠心分離が行われるが、簡便ではなく、誰でもすぐに行えるわけではない。
【０００４】
核酸増幅法の特性を考慮に入れて、遺伝子検査をサンプル調整から検査までを連続的に行える装置を得る事は、遺伝子検査をより身近なものとし、遺伝子と関連する疾病の予防、早期発見・早期治療やオーダーメード医療を可能とし、ＱＯＬの向上に貢献するものと期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許３９４２６２７号
【特許文献２】特開２００４−１２５７７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、遺伝子検査を検体試料調整から検査まで連続的に、かつ利便性よく行うことができ、検体試料からの目的遺伝子の検知をより容易に行うことのできる装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は、核酸塩基配列を検査するための装置であって、少なくとも、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器と、検体試料溶液及び薬液を前記極微小容器内に導入するための導入手段と、廃液を排出するための排出手段と、検体試料を観察して塩基配列を測定するための装置とを具備するものであることを特徴とする核酸塩基配列検査装置を提供する。
【０００８】
このような構成からなる装置であれば、遺伝子検査をサンプル調整から検査まで連続的に、かつ利便性よく行うことができ、検体試料からの目的遺伝子の検知をより容易に行うこともできる。
【０００９】
また、前記極微小容器の室は、検体試料導入口と該検体試料導入口の対面に排出口を持ち、該排出口の開口部は、検体試料より小さいものであることが好ましい。
【００１０】
このように、極微小容器の室が検体試料導入口と、その対面に開口部が検体試料より小さい排出口を持つものであれば、不要な溶液のみを容易に排出することができる。
【００１１】
この場合、更に、前記極微小容器を加熱するための加熱機構を具備するものであることが好ましい。
このような加熱機構を具備するものであれば、検体試料に対し様々な反応を行わせることが容易となる。
【００１２】
また、前記検体試料から核酸を得るための検体試料破壊機構を具備するものであることが好ましい。
このような検体試料破壊機構を具備するものであれば、検体試料から核酸を容易に得ることができる。
【００１３】
また、本発明は、核酸塩基配列の検査方法であって、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器に、検体試料を入れ、前記極微小容器の室内で核酸増幅反応を行わせることにより、核酸塩基配列の検査を行うことを特徴とする核酸塩基配列検査方法を提供する。
【００１４】
このような方法を用いれば、遺伝子検査を検体試料調整から検査まで連続的に、かつ利便性よく行うことができ、検体試料からの目的遺伝子の検知をより容易に行うことができる。
【００１５】
また、前記検体試料から核酸を得るための検体試料の破壊を、前記極微小容器の室内にて行うことができる。
このように、検体試料から核酸を得るための検体試料の破壊を、極微小容器の室内で行うことで、検体試料の調整が容易に行えると共に、その後の検査を連続的に行うことが可能となる。
【００１６】
また、前記核酸増幅反応が、等温増幅法によって行われることが好ましい。
このように、等温増幅法により核酸増幅反応を行えば、反応温度を変調させるための装置を別に設ける必要がなく、反応温度を変化させる際のその応答にかかっていた時間を短縮することができる。
【発明の効果】
【００１７】
以上説明したように、本発明の核酸塩基配列検査装置及び方法によって、遺伝子検査を検体試料調整から検査まで連続的に、かつ利便性よく行うことができ、検体試料からの目的遺伝子の検知をより容易なものにできる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の核酸塩基配列検査装置の一例を示す概略図である。
【図２】本発明の核酸塩基配列検査装置の他の一例を示す概略図である。
【図３】本発明に用いられる極微小容器の一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
上述のように、遺伝子検査をより身近なものとし、遺伝子と関連する疾病の予防、早期発見・早期治療やオーダーメード医療を可能とし、ＱＯＬの向上に貢献するものとの観点から、核酸増幅法の特性を考慮に入れて、遺伝子検査をサンプル調整から検査までを連続的に行える装置及び方法の早期開発が望まれていた。
【００２０】
本発明者らは、上記事情を鑑み、鋭意検討を行った結果、検体試料を入れるための容器を、特に一つの細胞や細胞核のサイズにまで微細なものとすれば、検体試料の調整も容易に行え、検出に至るまでの増殖回数が少なくて済み、それにより検体試料調整から検出までを利便性よく行えることに想到し、本発明をなすに至った。
【００２１】
即ち、本発明の核酸塩基配列検査装置は、核酸塩基配列を検査するための装置であって、少なくとも、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器と、検体試料溶液及び薬液を前記極微小容器内に導入するための導入手段と、廃液を排出するための排出手段と、検体試料を観察して塩基配列を測定するための装置とを具備するものであることを特徴とするものである。
【００２２】
以下、本発明について、図面を参照して説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
図１は本発明の核酸塩基配列検査装置の一例を示す概略図である。
図１の核酸塩基配列検査装置は、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室１を有する極微小容器２と（図３参照）、検体試料溶液及び薬液を極微小容器２内に導入するための導入手段３と廃液を排出するための排出手段として吸引用シリンジ４１を具備し、極微小容器２はサンプル容器１３に保持されており、極微小容器２を配した面と対となる面には、検体試料を観察して塩基配列を測定するための装置５を具備している。その測定の際に蛍光や濁度を用いる場合には、極微小容器２の室１内に光源６より光を導入する。また、極微小容器２の底面には、加熱のための加熱機構７を、側面には検体試料から核酸を得るための検体試料破壊機構８を具備している。さらに、等温増幅を行うための恒温装置９を具備している。
【００２３】
このように、極微小容器の室１を、特に一つの細胞や細胞核のサイズにまで微細なものとすれば、これまでの血液一滴、１０μｌと言ったサイズと比べ、格段に小さい容積とすることができる。
【００２４】
核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の検出を、核酸の増幅の有無で見分ける方法、ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）を始め、等温増幅法であるランプ法（ＬＡＭＰ法、栄研化学）やＳＭＡＰ法（ダナフォーム）、ＳＤＡ法（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＩＣＡＮ法（タカラバイオ）と言った方法ではいずれも、その開始点と終点との間を複製し続ける方法であって、下記式に示すように、その増殖産物の量は、サンプル中の目的核酸の数に２の増殖回数分累乗を掛けた分になる。
（増殖産物の量）＝（サンプル中の目的核酸の数）×２＾（増殖回数）
識別可能な検出強度は、検出・測定系が容器のサイズに合わせられるものであれば、増殖産物の濃度に依存することから、室のサイズが極微細であるほど増殖回数が少なくて済み、増殖に掛かる時間が短縮できる。
例えば、極微細な立方体容器の１辺が１０μｍであった場合、その体積は１．０ｘ１０−６ｍｍ３であり、１０μｌ＝１０ｍｍ３であることから、その差は１０の７乗ある。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
始め１対の核酸が１分当り１回の増殖をする場合で、１０μｌのサンプルが約２４分で検知可能な数に達したとすると、本発明に用いられる極微小容器では約１分で検知可能な濃度に達することとなる。ただし、実際上は、どの場合も化学反応の初期速度は低濃度では遅く、また、周囲とのコントラストを得られることが識別に必要であることから、現実的な検知可能な数の下限が決まると考えられ、例えばそのおおよそ１０倍とみると、約４分を検知時間と見ることもできる。その場合でも４分の１に検出時間が短縮される。
【００２７】
ここで例示したのは増殖した核酸の数であるが、検出に用いるマーカーが、その核酸の増殖に合わせて増えることを利用しているのであって、そのマーカーの増加が核酸の増加と相関している必要があるが、その増加の程度は、核酸の増加に対して線形の関係か、非線形の関係かの区別を示しているわけではない。
【００２８】
この場合のマーカーは、例えば核酸そのものや蛍光物質、ピロリン酸など、利用可能な物質が挙げられるが、その物質に制限を加えるものではない。
しかしながら、本発明による方法では、増幅後に極微小容器へさらなる試薬の添加をすることなく、検出に至ることが可能である。
【００２９】
実用上、この極微小容器を利用可能なものとするための、方法について提示する。
核酸を含む単位、例えば血液であれば白血球、組織片であればその構成する細胞、また、それら細胞膜を破壊した後の細胞核が挙げられ、その核酸を含む単位を極微小容器２に導入、極微小容器の室内に留めるようにする。そのために、この極微小容器の室１には、検体試料１０導入口１１と排出口１２が備えられることが好ましい（図３参照）。検体試料導入口の大きさは、核酸を含む単位の大きさより大きいことが望ましく、一方、排出口の開口部は核酸を含む単位の大きさより小さいことが必要になる。
また、極微小容器の室中で増幅反応させたあと検出する為には、その極微小容器の室は最表層にあることがより好ましい。
【００３０】
合わせて、極微小容器中に白血球や細胞、細胞核を導入する為にはその流量・流速を確保する為に、導入する液量と勘案して、極微小容器２が多数の室１を有することが望ましい。同時に、極微小容器の室は、測定に要する最低限の個数以上あってもよく、さらに、極微小容器の室が白血球や細胞、細胞核によってすべて占められてしまった際の、残りの液の排出用に、極微小容器の室の開口部に対して大きい開口部を有する排出口を設けても良い。
【００３１】
このような構造の極微小容器を用いれば、検出に蛍光や濁度と言った光学的測定系を用いることができ、室の位置が特定可能で、配置の再現性も高いものとなる。
これは、多数設けられた極微小容器の室に白血球や細胞、細胞核を導入した後、各種核酸増殖法、ＰＣＲ、ランプ法、ＳＭＡＰ法と言った方法により、目的の塩基配列を有する白血球や細胞、細胞核の入った極微小容器の室内のみ核酸が増殖され、蛍光や透過・反射光の低下が見られることから、極微小容器の室の位置が判別しやすいものであれば、経過時間に伴う蛍光や透過・反射光の低下のモニタリングを容易なものとできる。
【００３２】
サンプルの導入および排出の為の駆動力は、例えばシリンジによる加圧・陰圧や圧縮空気、毛細管現象を利用した吸水シート４２の配置（図２参照）と言ったもので良い。但し、核酸増幅時には、その駆動を止めることが可能なものが好ましく、必要に応じて、排出口を閉ざす機構を設けても良い。
【００３３】
排出口を閉ざす機構としては、例えばシリンジを用いた場合には、その陰圧を止める、又はシリンジを切り離す（抜き取る）ことによっても排出を止めることができ、吸水シートを用いた場合には、切り離しや、９８℃用のホットプレート上に押し込むかたちで排除することにより、排出を止めることが可能である。
【００３４】
加熱のための装置は、極微小容器内に導入された白血球や細胞などの膜を消化する反応や、核酸増幅の反応に必要なものであって、電熱線やランプ加熱、電磁誘導、ペルチェ素子やＰＴＣヒーターなどを用いる事ができ、その内でもペルチェ素子は加熱と冷却の制御、ＰＴＣヒーターは自律的な温度調整が可能となるため、より好ましい。
【００３５】
観察・測定のための装置として、例えば、蛍光や濁度の測定にＣＣＤやＣＭＯＳセンサなどの撮像素子と、必要に応じてレンズ、そのオートフォーカス機構やピンホールレンズを配する。レーザーとフォトダイオードとの組み合わせと言った方法でも良い。これらは、検出の為のマーカーに合わせた形で測定光の波長と、検出の為のデバイスの受光特性とを上手く組み合わせられれば良い。そのうちでも、撮像素子を用いた方法は、その画像解析で全面の同時測定を行うことが可能で、その画像処理から多様な結果を得られることから好ましい。
【００３６】
試料中の白血球や細胞、細胞核を極微小容器の室に導入した後、その中の核酸を得るために検体試料を破壊する機構としては、例えば、凍結、低圧の浸透圧、界面活性剤による溶解、超音波やエレクトロポレーション法の利用による物理的破壊と言ったものが挙げられる。
この時、核酸増幅の試薬と共存できるものがより望ましい。
【００３７】
本発明の装置を用いて核酸塩基配列の検査等を行う場合、必ずしも全ての極微小容器の室中に白血球や細胞、細胞核を導入する必要はないが、それら導入の有無を判別しておくことが有益であれば、あらかじめ、もしくは反応の終了後に、光学的に像として、もしくは染色と言った方法を用いて判別しておくことができる。但し、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして染色するもので、転写・複製を阻害するタイプの染色剤の内、次に来るＤＮＡ増幅に悪影響を与えるものは好ましくない。
【００３８】
極微小容器が室を複数有する場合、どの室に白血球や細胞、細胞核が入っているかを判別することは、例えば、遺伝子の変異の程度を検討する際に有益であり、白血球や細胞、細胞核の導入された極微小容器の室に対して、核酸増幅のあった極微小容器の室との比率を求めることが可能となる。
【００３９】
そのため、例えば、血液サンプルは成分の凝集を防ぐ必要があり、組織片は細胞毎に分離する必要がある。もしくは、細胞膜や細胞壁を消化させて、細胞核のみとしても良い。例えば、血流を確保する為のデキストランの添加は血液を扱う場で広く用いられており、有効な手段である。抗凝血剤のヘパリン液の添加もある。クエン酸塩やＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）やその塩、と言った抗凝固剤を用いても良い。
【００４０】
組織片からの細胞への分離は、コラゲナーゼなどによる酵素消化が挙げられる。
さらに、血液サンプルの場合、赤血球をあらかじめ除去するか、溶血させておく事は、実施上有利である。
これら前処理は、極微小容器の室内で行っても良い。
【００４１】
このような極微小容器は、例えば、以下のような工程により製造することができる。
基板上にレジスト等の構造材料を用いて構造材料層を形成した後、該構造材料層にパターンを形成する。該パターンの間を犠牲材料により埋め込み犠牲材料層を形成して、該犠牲材料層を構造材料層の高さまで減らした後、さらに構造材料層を積層してパターンを積層し、室の深さが目的とする深さとなるまで、この工程を繰り返す。そして、積層を全て終えた後に犠牲材料層を除去すれば、目的深さの室を１又は複数有する極微小容器を得ることができる。
【００４２】
また、本発明は、核酸塩基配列の検査方法であって、検体試料がそれぞれ１個入る大きさの室を１又は複数有する極微小容器に、検体試料を入れ、前記極微小容器の室内で核酸増幅反応を行わせることにより、核酸塩基配列の検査を行うことを特徴とする核酸塩基配列検査方法を提供する。
【００４３】
この場合、検体試料から核酸を得るための検体試料の破壊を、極微小容器の室内にて行うことができ、これにより、検体試料の調整から検査までを連続的に行うことが可能となる。
【００４４】
また、核酸増幅方法は、等温増幅法が好ましく、これは、等温にて連続的に増幅されることから、検査時間が短縮でき、また、温度を変調するための装置を設置する必要がないため、装置構成の点からも好ましい。
【００４５】
本発明の核酸塩基配列検査方法のフローの一例を提示する。
はじめに検体試料を、極微小容器の室内に導入する。必要に応じて前処理の試薬を添加して、さらに必要に応じて加熱の処理を行っても良い。検体試料はその全量を、極微小容器の室が開口している面を通過させる。より好ましくは、極微小容器の室内から液を排出する。さらには等張の生理食塩水などで洗浄しても良い。次いで、核酸増幅の為の試薬を極微小容器に導入し、各極微小容器の室を満たす。この後、細胞膜の消化を利する加熱の工程を加えても良い。続けて核酸増幅の為の加熱工程を行う。同時平行して連続的に、もしくは特定の経過時間に合わせて、蛍光や濁度と言った変化を観察・測定する。これにより、標的の遺伝子を検体試料が有するか、検出が可能となる。
このような一連の検査方法は、前記核酸塩基配列検査装置を用いて行うことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
（極微小容器を持つプレートの作成）
レジスト材料は、特許３７６７６７６号による方法により調整し、ウエーハ上に成膜後ｉ線露光（３６５ｎｍ光）を用いてパターンを形成した。パターンはそれぞれ露光エリア内に繰り返しで生じさせ、また、ウエーハ上のショットは５ｍｍ角とした。
極微小容器をシリコンウエーハ上に作製するに当り、最初にレジスト材料による１０μｍの膜を形成（全面露光、加熱、現像）し、続いて膜厚５μｍ、５μｍ幅の溝となるレジストパターンをその上に形成した。その後、レジストパターンを犠牲材料により埋め込み犠牲材料層を形成した後、レジストと同じ高さまで犠牲材料層を減らし、更にその上にレジスト材料による膜を形成した後、先のパターン上に、１０μｍ（膜厚８μｍ）の穴となるパターンを配した。さらに、そのレジストパターンを犠牲材料により埋め込み犠牲材料層を形成した後、レジストと同じ高さまで犠牲材料層を減らし、更にその上にレジスト材料による膜を形成した後、１０μｍの穴となるパターン上に７μｍの穴（膜厚５μｍ）による開口部を形成し、最終的に犠牲材料を除去して、検体試料を入れるための室を複数形成した。
そして、シリコンウエーハをダイシングにより切り出し、複数の室を有する極微小容器を製造した。そのプレート表面に、直径５ｍｍの樹脂製のＯリング（ＩＳＯ規格Ａ００３１Ｇ）を載せた。
プレートの切り出した断面、それも５μｍ幅の溝の開口部と合うように吸水シートを接触させた。
【００４７】
（遺伝子検査）
上記のように製造した、複数の室を有する極微小容器上に血液１滴分（約１０μｌ）のサンプルの赤血球を溶血処理した血液を落とし、全量を吸収させた。続いて、生理食塩水を一滴落とし、カバーガラスを掛けた。次いで、ＳＭＡＰ試薬（ＡＬＤＨ２タイピングキット）を滴下、プレート上の液滴が少し減ったところで吸水シートをはずし、電極を液滴中に挿入、高電圧パルスを発生させエレクトロポレーションを細胞膜破壊に利用した。電極をはずしてからカバーガラスを掛け、６０℃のホットプレート上に載せ、光学顕微鏡で極微小容器を観察、反応を画像を連続的に保存することで確認することができた。
【００４８】
このように、本発明の装置を用いた場合、検体試料の調整から検査まで、連続的に行うことができ、また、検出までにかかった時間も、従来約２０分かかっていたところ、６分にまで、飛躍的に短縮することができた。
また、検体試料を納める容器自体が小さいものであるので、装置全体の小型化も実現できた。
【００４９】
尚、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【符号の説明】
【００５０】
１…室、  ２…極微小容器、  ３…検体試料及び薬液導入手段、
４１、４２…廃液排出手段、  ５…観察・測定装置、  ６…光源、７…加熱機構、
８…検体試料破壊機構、  ９…恒温装置、  １０…検体試料、  １１…導入口、
１２…排出口、  １３…サンプル容器。
【図１】
2011109917.tif 000004
【図２】
2011109917.tif 000005
【図３】
2011109917.tif 000006