(57)【要約】      （修正有）【課題】中温〜高温、弱酸性〜弱アルカリ性、弱イオン強度〜高イオン強度といった幅広い条件で安定に存在し、活性を示すエンド−β−１，４−グルカナーゼ、それを含む酵素組成物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構造体、組換プラスミド、形質転換微生物、及びエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列によりコードされるポリペプチドからなり、ｐＨ５〜９．５、２８℃〜７０℃において活性を示すことを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列によりコードされるポリペプチドからなり、
ｐＨ５〜９．５、２８℃〜７０℃において活性を示すことを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
【請求項２】
Caldivirga maquilingensis JCM10307の内部で発現していることを特徴とする請求項１に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列から１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチドからなり、
ｐＨ５〜９．５、２８℃〜７０℃において活性を示すことを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
【請求項４】
酵素の精製が可能な条件下で培養された宿主細胞により生成されることを特徴とする請求項１または３に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼを含有することを特徴とする酵素組成物。
【請求項６】
配列番号１に示す塩基配列、または、配列番号１に示す塩基配列の縮重塩基配列、
のいずれかを含み、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列と９９％以上同一であるアミノ酸配列からなり、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド構造体。
【請求項９】
（ａ）請求項６または７に記載のポリペプチドと、
（ｂ）転写ターミネーターと、
を含むことを特徴とする組換プラスミド。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換プラスミドを保持することを特徴とする形質転換微生物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換微生物を培養し、得られた培養物からエンド−β−１，４−グルカナーゼを抽出することを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、酵素組成物、エンド−β−１，４−グルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構造体、組換プラスミド、形質転換微生物、及びエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは自然に最も多く存在するバイオマスのひとつであり酸によって分解することが可能である。しかし、酸による分解法は中和の際に発生する大量の石膏や分解時に生ずる黒液の処理等の問題がある。一方、酵素を用いた方法によればこのような処理問題を伴うことなく分解を行うことができる。
【０００３】
セルロース分解酵素としては、セルロースのβ−１，４−グルカン結合を加水分解するエンド−β−１，４−グルカナーゼが知られている。エンド−β−１，４−グルカナーゼは、材料・食品等の製造、並びに衣料用洗浄剤、古紙の漂白剤等として有用である。エンド−β−１，４−グルカナーゼは、カビや細菌などの多くの微生物により生産される。
【０００４】
所定の微生物により生産されたセルラーゼは、エキソセロビオヒドロラーゼ（EC3.2.1.91）（CBH）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（EC3.2.1.4）（EG）、β-グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）（BG）として同定されたものを含むいくつかの異なった酵素群からなる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
ところで、通常、酵素は３７℃前後、中性、低イオン強度といったマイルドな条件でその最適活性を示し、高温、酸性、高イオン強度といった条件では酵素が安定に存在できず、活性を示さない。このため、このような条件下で活性を示す酵素の探索が行われている。
【０００６】
例えば、特許文献１には、３０〜６０℃、ｐH３〜５において活性を示すβ−グルコシダーゼが記載されている。特許文献２には、３０〜３５℃、ｐH５〜７において活性を示すセルラーゼが記載されている。特許文献３には、７０℃、ｐH５．６〜８．５において活性を示すセルラーゼが記載されている。特許文献４には、５０〜９５℃、ｐH５．４〜６において活性を示すエンド−β−１，４−グルカナーゼが記載されている。特許文献５には、６０℃以下、ｐH５〜６において活性を示すセルラーゼが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２８９１２号公報
【特許文献２】特許第４０５００６０号
【特許文献３】特開２００８−１９３９９０号公報
【特許文献４】特許第４２５７９７９号
【特許文献５】特許第３０３０３４９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ウッド等著、Methods in Enzymology 160、25、234頁（1988）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、セルロースが有するグリコシド結合は非常に強固であり、マイルドな条件では十分な分解効率が得られず、時間、エネルギー的に非常に不利である。
【００１０】
本発明は以上のような技術的背景の下になされたものであり、中温〜高温、弱酸性〜弱アルカリ性、弱イオン強度〜高イオン強度といった幅広い条件で安定に存在し、活性を示すエンド−β−１，４−グルカナーゼ、それを含む酵素組成物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構造体、組換プラスミド、形質転換微生物、及びエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明の一の態様は、配列番号１に示す塩基配列によりコードされるポリペプチドからなり、ｐＨ５〜９．５、２８℃〜７０℃において活性を示すことを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼである。
【００１２】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、Caldivirga maquilingensis JCM10307の内部で発現していてもよい。
【００１３】
また、本発明の他の態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列から１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチドからなり、ｐＨ５〜９．５、２８℃〜７０℃において活性を示すことを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼである。
【００１４】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、酵素の精製が可能な条件下で培養された宿主細胞により生成することができる。
【００１５】
本発明の他の態様は、前記エンド−β−１，４−グルカナーゼを含有することを特徴とする酵素組成物である。
【００１６】
本発明の他の態様は、配列番号１に示す塩基配列、または、配列番号１に示す塩基配列の縮重塩基配列、のいずれかを含み、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチドである。
【００１７】
本発明の他の態様は、配列番号２のアミノ酸配列と９９％以上同一であるアミノ酸配列からなり、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチドである。
【００１８】
本発明の他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド構造体である。
【００１９】
本発明の他の態様は、（ａ）前記ポリペプチドと、（ｂ）転写ターミネーターと、を含むことを特徴とする組換プラスミドである。
【００２０】
本発明の他の態様は、前記組換プラスミドを保持することを特徴とする形質転換微生物である。
【００２１】
本発明の他の態様は、前記形質転換微生物を培養し、得られた培養物からエンド−β−１，４−グルカナーゼを抽出することを特徴とするエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、中温〜高温、弱酸性〜弱アルカリ性、弱イオン強度〜高イオン強度といった幅広い条件で安定に存在し、活性を示すエンド−β−１，４−グルカナーゼ、それを含む酵素組成物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構造体、組換プラスミド、形質転換微生物、及びエンド−β−１，４−グルカナーゼの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】反応温度と吸光度との関係を示すグラフである。
【図２】ｐＨと吸光度との関係を示すグラフである。
【図３】イオン強度と吸光度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、配列番号１に示す塩基配列（Cmaq_1621遺伝子）によりコードされ、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる。
【００２５】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、CMAQ_1621と命名されたタンパク質であり、セルロースのβ−１，４−グルカン結合の加水分解反応を触媒する活性を持つ。この酵素をコードするCmaq_1621遺伝子は好酸好熱菌Caldivirga maquilingensis JCM10307のゲノム中に含まれ、Caldivirga maquilingensis JCM10307の内部で発現している。Cmaq_1621遺伝子によってコードされる酵素を生産し活性を調べたところ、その酵素は幅広い条件で使用することが可能でより高効率なセロオリゴ糖の生産方法であることが見出された。
【００２６】
なお、配列番号１に示す塩基配列の縮重塩基配列も、配列番号１に示す塩基配列と同様に、エンド−β−１，４−グルカナーゼをコードする。配列番号１に示す塩基配列または配列番号１に示す塩基配列の縮重塩基配列を含むポリヌクレオチドはＤＮＡであり、原核生物、好ましくは古細菌のＤＮＡライブラリーから単離され、あるいはＤＮＡライブラリーに基づいて生成される。
【００２７】
また、配列番号２に記載のアミノ酸配列からセルロースのβ−１，４−グルカン結合の加水分解活性を失わせない程度に、１もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加といった変異を導入してもよい。このような変異は自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含む。例えば、His-Tag等を付加してもよい。人為的変異を生じさせる手段としては部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるがこれに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、前記した活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは５アミノ酸以内である。
【００２８】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、セルロース等、一般式（１）で表される化合物の分解処理に利用することができ、セロビオースやセロトリオースのようなセロオリゴ糖を効率的に生成することができる。
【００２９】
【化１】
2011109937.tif 000002
【００３０】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、例えば以下の方法により調整することができる。
まず、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを調整する。次に、これを転写ターミネーターを含むプラスミド等のベクターに挿入する。次に、ベクターを大腸菌、酵母、カビ等の微生物に導入し、形質転換する。その後、形質転換微生物を培養し、得られた培養液からエンド−β−１，４−グルカナーゼを抽出する。
このようにして得られたエンド−β−１，４−グルカナーゼは、中温〜高温、弱酸性〜弱アルカリ性、弱イオン強度〜高イオン強度といった幅広い条件で安定に存在し、活性を示すため、
【００３１】
なお、Caldivirga maquilingensis JCM10307を培養し、培養液をそのままエンド−β−１，４−グルカナーゼの用途に用いてもよい。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００３２】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを調整し、これを転写ターミネーターを含むプラスミドベクターpET28a（Novargen社製）に挿入し、これを用いてE.coli BL21株を形質転換した。
形質転換を行った菌をＬＢ培地とともに２００ｍｌ／５００ｍｌのバッフルフラスコに入れ、３７℃、２００ｒｐｍの往復振盪で３〜４時間培養した。
その後、Ｏ．Ｄ．６００＝０．８〜１．０にてＩＰＴＧによる発現誘導を行った。
その後、温度を１５℃に下げて同様に２４時間培養し、遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を超音波破砕し、遠心分離を行った上清より、Ni-affinity columnを用いて、目的となるセルロース分解酵素CMAQ_1621を含む純度９５％の精製溶液（酵素組成物）を得た。
上記粗精製溶液を用いて、温度、ｐＨ、イオン強度を変えてセルロース分解酵素の反応を計測した。
基質としてカルボキシメチルセルロースを用い、カルボキシメチルセルロースの分解により生じた還元糖の定量をSomogyi-Nelson法により行った（参考文献：福井作蔵著、「還元糖の定量法」、学会出版センター、ソモギ（Somogyi）・Ｍ著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、１９５巻、１９号）。すなわち、生成したモリブデンブルーによる６６０ｎｍの波長の吸光度を計測した。標準試料グルコースの濃度とSomogyi-Nelson法による吸光度との関係を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2011109937.tif 000003
【００３４】
〔温度依存性〕
（１）  粗精製溶液を以下の濃度となるように調整した。
・Tris-HCl（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ
・ＤＴＴ：２ｍＭ
・カルボキシメチルセルロース：１％
全体で５００μＬとした。
（２）  表１に示す各温度で１２時間反応させた後、還元糖の定量を行った。
結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2011109937.tif 000004
【００３６】
図１は反応温度と吸光度との関係を示すグラフである。CMAQ_1621の至適温度は６０℃以上であり、２８℃〜６８℃においても活性を示すことがわかる。 
【００３７】
〔ｐＨ依存性〕
（１）  ｐＨを２〜６．５の範囲で０．５ずつ変えた粗精製溶液を調整した。粗精製溶液は以下の濃度となるように調整した。
・クエン酸緩衝液（ｐＨ２〜６．５）：１００ｍＭ
・カルボキシメチルセルロース：１％
全体で５００μＬとした。
（２）  ３７℃で１２時間反応させた後、カルボキシメチルセルロースの分解により生じた還元糖の定量を行った。結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2011109937.tif 000005
【００３９】
図２はｐＨと吸光度との関係を示すグラフである。CMAQ_1621の至適ｐＨは５．５〜６であるが、ｐＨ４．５〜９．５においてもエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すことがわかった。
【００４０】
〔イオン強度依存性〕
（１）  ＫＣｌの濃度を０〜１Ｍの間で変えた粗精製溶液を調整した。粗精製溶液は以下の濃度となるように調整した。
・Tris-HCl（ｐＨ５．５またはｐＨ７．５）：１００ｍＭ
・ＤＴＴ：２ｍＭ
・カルボキシメチルセルロース：１％
・ＫＣｌ：０ｍＭ〜１Ｍ
全体で５００μＬとした。
また、コントロールとして、ＫＣｌ及び基質であるカルボキシメチルセルロースを含有しない粗精製溶液を調整した。
（２）  ３７℃、または５８℃で１２時間反応させた後、カルボキシメチルセルロースの分解により生じた還元糖の定量を行った。結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】
2011109937.tif 000006
【００４２】
図３はイオン強度と吸光度との関係を示すグラフである。CMAQ_1621の反応はイオン強度に依存しないことがわかる。 
【実施例２】
【００４３】
Caldivirga maquilingensis JCM10307をｐH３、６０℃で嫌気的に１６時間培養した。その後、Caldivirga maquilingensis JCM10307の培養液上清をｐH６．５の１％カルボキシメチルセルロースの溶液に入れ、５０℃で３時間反応させた後、カルボキシメチルセルロースの分解により生じた還元糖の定量を行った。
（結果）
【００４４】
【表５】
2011109937.tif 000007
【００４５】
エンド−β−１，４−グルカナーゼがCaldivirga maquilingensis JCM10307の内部で発現しており、それにより還元糖が生じていることがわかる。
【図１】
2011109937.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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