(57)【要約】【課題】本発明は、水質汚染の程度を評価するために、水中生物生体内で環境の汚染程度に対応して誘導されるストレス応答を速やかに確実に検出できる新たなバイオマーカーを確立し、当該バイオマーカーを用いた簡便な水質汚染の検出法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明においては、モータリンを水質汚染のバイオマーカーとして用いる。抗モータリン抗体、好ましくは細胞内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体を用いて、メダカ体内で発現したモータリンタンパク質量の増加の程度を検出することにより、水質汚染の程度を評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検水試料中で試験魚を飼育し、試験魚中のモータリン発現量を測定し、モータリン発現量の増加の程度により被検水試料中の汚染程度を評価する方法。
【請求項２】
モータリン発現量を抗モータリン抗体と反応するモータリンタンパク質の増加量を測定することにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗モータリン抗体が、細胞内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被検水試料中の汚染物質が重金属、過酸化物又はヒ素を含むものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗モータリン抗体を用いることを特徴とする、被検水試料中の汚染程度の評価用キット。
【請求項６】
抗モータリン抗体が細胞内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体である、請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水質汚染のバイオマーカーとしてのモータリンの使用に関し、抗モータリン抗体を利用した、水質汚染の鋭敏な検出法及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の世界は、工業によって常に環境は脅かされており、環境管理と環境保全は世界的な優先課題となっている。煙、化学物質、重金属などの工業上の副産物あるいは廃棄物は、近くの川や海に廃棄され、そこに住む水中生物の生理機能にすぐに影響を及ぼす。水中生物は、環境の変化に非常に敏感であり、とりわけ、水中生物のうちでもメダカは生態毒性試験の標準的な試験魚として国際的にも広く採用されている。特に、水中環境中に存在する化学物質のうち、生体内でホルモン類似作用又はホルモン阻害作用を示す内分泌攪乱化学物質（いわゆる「環境ホルモン」）に関する研究が盛んである（例えば、非特許文献１，２、特許文献１〜３）。また、水中生物体内では、汚染された環境において、内在タンパク質の生産の上昇といった形で、様々なストレス応答が誘導されるので、これらのタンパク質は、環境の質を検出するためのバイオマーカーとして用いることができる。そのような内在性タンパク質のうち最も汎用的なバイオマーカーはメタロチオネインである。メタロチオネインは、生体内で重金属が蓄積することに応答して生産される金属結合タンパク質で、重金属と結合することにより生体内で防御機構として働く。メタロチオネインは、汚染水中の重金属による、生体に対する毒性の検出に用いられてきた（非特許文献１，２）。
しかしながら、水質汚染の原因は重金属だけではなく、環境ホルモン以外にも様々な化学物質などが考えられるので、環境の質を正確に評価するためには、それら汚染物質全体を総合的に水質汚染の程度として確実に判定、評価できる方法である必要がある。そして、その評価方法は迅速でかつ鋭敏であって、しかも簡便に行える方法であることが望まれるが、そのためには、水中生物生体内で環境の汚染程度に対応して誘導されるストレス応答を速やかに確実に検出できる新たなバイオマーカーの確立が急務である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５-７３５１７号公報
【特許文献２】特開２００３−１９９５７１号公報
【特許文献３】特開２００１−２８１２３９号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００６／０２２３４４  Ａ１（特開２００６−８９４７１号公報）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Matsui, K. et al. (2002) Double evaluations of chemicals using a cocktail of fused recombinant receptors, Anal. Biochem., 307, 147-152.
【非特許文献２】Tamura, H., et al. (2001) Androgen Receptor Antagonism by the Organophosphate Insecticide Fenitrothion, Toxicol. Sci., 60, 56-62.
【非特許文献３】Chu, M. M., Guo, Z. Q., Muto, N., Itoh, N., Tanaka, K., and Ren, H. W. (2006) Front Biosci 11, 2113-2122
【非特許文献４】Mourgaud, Y., Martinez, E., Geffard, A., Andral, B., Stanisiere, J. Y., and Amiard, J. C. (2002) Biomarkers 7, 479-490
【非特許文献５】Zusman, I., and Ben-Hur, H. (2001) Int J Mol Med 7, 547-556
【非特許文献６】Wadhwa, R., Kaul, S. C., Ikawa, Y., and Sugimoto, Y. (1993) J Biol Chem 268, 6615-6621
【非特許文献７】Wadhwa, R., Kaul, S. C., Mitsui, Y., and Sugimoto, Y. (1993) Exp Cell Res 207, 442-448
【非特許文献８】Ran, Q., Wadhwa, R., Kawai, R., Kaul, S. C., Sifers, R. N., Bick, R. J., Smith, J. R., and Pereira-Smith, O. M. (2000) Biochem Biophys Res Commun 275, 174-179
【非特許文献９】Kaul, S. C., Deocaris, C. C., and Wadhwa, R. (2006) Exp Gerontol
【非特許文献１０】Wadhwa, R., Takano, S., Robert, M., Yoshida, A., Nomura, H., Reddel, R. R., Mitsui, Y., and Kaul, S. C. (1998) J Biol Chem 273, 29586-29591
【非特許文献１１】Kaul, S. C., Aida, S., Yaguchi, T., Kaur, K., and Wadhwa, R. (2005) J Biol Chem 280, 39373-39379
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、水質汚染の程度を評価するために、水中生物生体内で環境の汚染程度に対応して誘導されるストレス応答を速やかに確実に検出できる新たなバイオマーカーを確立し、当該バイオマーカーを用いた簡便な水質汚染の検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
生体内のストレス応答タンパク質（ヒートショックタンパク質）は、温度、食物、放射線を含む様々なストレス状況に対して応答して発現あるいは発現の上昇が見られることから、従来から疾患を含む生理学的な異常を検出するためのバイオマーカーとなることが知られている（非特許文献４）。
本発明者らは、以前からモータリンに関連した研究を続けてきたが、モータリンは、ストレス応答タンパク質のヒートショックプロテイン70（HSP70）ファミリーに属している。モータリンは、細胞内の様々な場所で、多機能に働いているタンパク質であり（非特許文献６−９）、ミトコンドリアの内外でのシャペロンとしての基本的な機能の他に、細胞質中の野生型p53タンパク質を不活性化するという機能を持つ（非特許文献１０，１１）。p53タンパク質は、ゲノムを保護する主要な癌抑制タンパク質で、その変異はヒトの腫瘍形成に関与する（非特許文献１０）ため、従来は主に癌との関連で研究されていた。
本発明者らは、これらの研究の過程で、モータリンが重金属イオンなどによる化学的ストレスに応答して増加する傾向を見出し、環境汚染の鋭敏なバイオマーカーとして用いることができるのではないかという仮説を立てた。
この仮説を検証するために、生態毒性試験の標準的な試験魚として広く採用されているメダカをモデル生物として用いた。コントロールとして水道水中で、水質汚染のモデルとしては、硫酸カドミウム、塩化ニッケル、三酸化砒素、過酸化水素など、様々な重金属イオンや過酸化物を含有する水を用いた。メダカの全抽出物を、処理後すぐに調製し、抗モータリン抗体（特許文献４）を用いてメダカ体内のモータリン量を測定すると、重金属あるいは酸化ストレスにさらされた際にモータリンタンパク質量が顕著に上昇することが確認された。
これらの知見により、モータリンが水質汚染のバイオマーカーとして用いることができることが実証され、抗モータリン抗体試薬などを用いてメダカ中のモータリンタンパク質発現量をモニターすることによる、水質汚染を検出するための鋭敏な方法に係る本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、具体的には以下の通りである。
［１］  被検水試料中で試験魚を飼育し、試験魚中のモータリン発現量を測定し、モータリン発現量の増加の程度により被検水試料中の汚染程度を評価する方法。
［２］  モータリン発現量を抗モータリン抗体と反応するモータリンタンパク質の増加量を測定することにより行う、前記［１］に記載の方法。
［３］  抗モータリン抗体が、細胞内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体である、前記［２］に記載の方法。
［４］  被検水試料中の汚染物質が重金属、過酸化物又はヒ素を含むものである、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  抗モータリン抗体を用いることを特徴とする、被検水試料中の汚染程度の評価用キット。
［６］  抗モータリン抗体が細胞内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体である、前記［５］に記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、抗モータリン抗体試薬、又はモータリン遺伝子検出用プライマーを用いて典型的な環境生物であるメダカの体内で発現するモータリンタンパク質の増加量を測定することで、環境内の重金属や過酸化物などの様々な水質汚染物質を鋭敏に検出することができる。このことにより、環境汚染の程度を、総合的に、迅速かつ鋭敏に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】メダカ全タンパク質抽出物（6匹分）に対し抗モータリン抗体を用いたウェスタンブロッティング。
【図２】過酸化水素に暴露されたメダカを用いたウェスタンブロッティング
【図３】三酸化砒素(Ar2O3)に暴露されたメダカを用いたウェスタンブロッティング
【図４】塩化ニッケル(NiCl2)に暴露されたメダカを用いたウェスタンブロッティング
【図５】硫酸カドミウム(CdSO4)に暴露されたメダカを用いたウェスタンブロッティング
【図６】ELISAによるメダカ中のモータリンの検出
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．本発明の実施例で用いた試薬、装置など
（１）試験魚について
メダカは、国際的にも広く生態毒性試験の標準的な試験魚として採用されているため、本発明においてもモデル生物として用いたが、試験魚としては、メダカに限らずゼブラフィッシュ等の小型魚類や淡水ガメなどの小動物でもよい。
メダカは、低価格で飼育や維持、実験を行いやすく、単純な体構造を持ち、ヒトの多くの疾患に対応している。本実施例で用いたメダカはペットショップで購入し、水道水中で、一般的な魚の餌を与えて飼育した。
【００１１】
（２）環境汚染物質
環境汚染物質としては、飲料用水、生活用水、農業用水などの水質を汚染する種々の汚染物質である、カドミウム、水銀、ニッケルなど種々の重金属類及びその有機化合物の他、ヒ素などの毒物、過酸化物、塩素化合物、ダイオキシン類などがあげられる。これらの物質は、メダカの体内において、ストレス応答を引き起こし、いずれもモータリンの発現量を増加させる。
本発明の実施例では、これらの環境汚染物質のうちでも典型的な重金属化合物モデルとして塩化ニッケル(NiCl2)、三酸化砒素(Ar2O3)、硫酸カドミウム(CdSO4)を、また過酸化物モデルとして過酸化水素(H2O2)を用い、これら化合物を一定の濃度になるように溶解した水槽中でメダカを飼育した。コントロールとしては、水道水中で飼育する。
【００１２】
２．本発明におけるモータリン発現量の測定方法
（１）モータリンタンパク質発現量の測定方法
典型的には、試験魚中のモータリンタンパク質自体の増加量を測定するが、モータリン遺伝子のmRNA転写量を、公知のRT-PCR法などでモニタリングすることもできる。
本発明での実施の態様としては、試験魚一匹あたりの全抽出タンパク質中でのモータリンタンパク質自体の増加量を、抗モータリン抗体を用いて測定する方法を用いた。この方法には限られないことは当業者には自明である。
【００１３】
（２）ストレスの誘導と全タンパク質の抽出
メダカなど試験魚を、汚染水中で１時間〜１週間、好ましくは２時間〜１日間飼育し、その後タンパク質の分解を防止しながら超音波破砕後遠心分離した上清液を用いる。
本発明での実施の態様は以下の通りであるが、この方法には限られない。
全てのメダカを、通常の魚用餌を与え、水道水中、室温で１日間以上順応させる。１回の実験あたり２匹以上、好ましくは３〜１０匹の順応させた魚を用い、水質汚染を検出する対象の被検水を入れた水槽に入れて、１時間以上、好ましくは２時間〜１昼夜飼育する。その後、メダカを凍結し（例えば−80℃で２時間から一晩置く）、細断後、氷温下で蛋白分解を避けながら（例えば、冷やしたチューブ内で、プロテアーゼ阻害剤カクテル入り冷緩衝液を加えた状態で）、超音波処理機を用いて破砕する。遠心処理で得られた上清を、繰り返し凍結融解を避けるために分注し、抽出物中のタンパク質量を定量する。
【００１４】
（３）モータリン発現量の検出
汚染物質によって試験魚（メダカ）体内で誘導されるストレスをモータリンの発現量で検出する。そのためには、試験魚を破砕した全タンパク質抽出液を用いて、発現しているモータリンの蛋白質量を測定する。
各種タンパク質混合液から抗原抗体反応を利用して標的タンパク質を検出する各種のアッセイ法を用いることができる。好ましくはウエスタンブロッティング法、及びＥＬＩＳＡ法である。
【００１５】
（４）ウェスタンブロッティング法
本発明者らが調製した抗モータリンモノクローナル抗体（特許文献４など）を用い、一般的なウェスタンブロッティング法により検出する。
例えば、下記の本実施例に記載の手法である、メダカの全タンパク質抽出物をSDSを加えたバッファーで展開し、PVDF膜に転写して免疫染色を行う手法が適用できる。
具体的には、上記（１）で得られた全タンパク質抽出物をSDS-PAGEによって分離し、フッ化ポリビニリデン（PVDF）膜上に、セミドライ法によってエレクトロブロッティングする。PVDF膜上のタンパク質を、抗モータリンモノクローナル抗体を用いて処理し、２次抗体上の標識（例えばECL化学発光)によって検出する。
抗モータリン抗体としては本発明者らの文献（特許文献４など）に記載の手法で得られる抗モータリンモノクローナル抗体、又は抗モータリン抗血清を用いることができる。特に、細胞内在化機能を有するモノクローナル抗体が好ましく、モノクローナル抗体３７−６が最も好ましい。モノクローナル抗体３７−６は、ハイブリドーマ３７番（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４０８）から得ることができる。
ウェスタンブロッティングのためには、抗モータリン抗体と共に、免疫グロブリンを認識する標識した二次抗体、例えば、HRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）を結合させた抗マウスあるいは抗ラビット二次抗体を用いることが好ましい。
【００１６】
（５）ＥＬＡＩＳＡ法（サンドイッチ法）
本発明者らが調製した抗モータリンモノクローナル抗体（特許文献４などによる）を用い、一般的なＥＬＡＩＳＡ法（サンドイッチアッセイ法）が適用できる。同様の原理に基づくラジオイムノアッセイ（RIA)法を用いてもよい。
例えば、下記の本実施例に記載の手法を適用できる。
ELISAを行うための抗体は、ウエスタンブロット法と同様に抗モータリン抗体、好ましくは細胞内在化機能を有するモノクローナル抗体が用いられ、２次抗体としては、AP（アルカリフォスファターゼ）を結合させたAP-ヤギ抗マウスIgG抗体を用いることができる。
【００１７】
（６）RT-PCR法
モータリン遺伝子は保存性の高い遺伝子であるため、被検試料中の試料魚（メダカ）のモータリンmRNA発現量は、マウス、ヒト、zebra fishなど公知のモータリン塩基配列（例えば、マウスモータリン遺伝子の場合、データベースにその塩基配列がアセッション番号：NM010481で登録されている。）に由来するプライマーセットを用いることで、その発現量の変化をモニターすることができ、環境ストレス量の変化を判定できる。
具体的には、試料魚（メダカ）中の全mRNAを抽出し、全mRNA中のモータリンmRNA量をRT-PCR法を用いて測定し、モータリン遺伝子の転写量の増加を測定すればよい。
その際のモータリン遺伝子はマウスモータリンのPCR用に用いた下記のプライマーセット及びプローブを用いることができる。
プライマー（forword)： 5’ cca tac ctg aca atg gat gct tca ggt 3’
プライマー(reverse) ： 5’ aac ctt gtt gtc tgt agc cat ctc 3’
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
なお、本発明で用いた細胞内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体３７−６は、ハイブリドーマ３７番（ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４０８）から得られ、細胞内に内在化しない抗モータリンモノクローナル抗体５２−３と同様に特許文献３に記載されている。
【実施例】
【００１８】
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
なお、本願明細書において引用した文献中の記載事項は、本願明細書中の記載として組み入れることとする。また、特に断りがない場合は、公知の方法、例えばMolecular Cloning  3rd edition  Sambrook J ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001年、細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」（秀潤社、2001年）などの記載に従って実施可能であり、市販の試薬やキット等の指示書に従って実施可能である。
【００１９】
（実施例１）アッセイに使用可能な抗モータリン抗体の選択
６匹のメダカを、通常の魚用餌を与え、水道水中、室温で１日間順応させた後、−80℃で２時間から一晩置き完全に凍結させた後に鋭い剃刀で小さく切り分けた。氷上で冷やしたチューブ内で、1 mlの冷NP-40緩衝液(10 mM Tris HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Nonidet P-40、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete Mini、Roche Diagnostics社製)）を加え、超音波処理機(Handy Sonic, Model UR-20P, Tomy Seiko, Ltd.社製)を用いて破砕した。全抽出物を15,000 rpmで10分間4℃で遠心し、得られた上清を、繰り返し凍結融解を避けるために分注した。
抗モータリン抗体を特許文献４の方法に従って、細胞内に内在化機能のあるモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体37-6、内在化機能のないモノクローナル抗体52-3及びポリクローナル抗体K（マウス抗血清 ）の３種類を調製した。また、ウエスタンブロッティングのために、HRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）を結合させた抗マウス二次抗体を調製した。
６匹のメダカの全タンパク質抽出物を、SDSを加えたバッファーで展開し、PVDF膜に転写して免疫染色を行った。具体的には、抽出物を10% SDS-PAGEによって分離し、PVDF膜(Millipore Corporation社製, US)上に、セミドライ法(Biorad社製, Japan)によってエレクトロブロッティングした。PVDF膜上のタンパク質を、上記３種類の抗モータリン抗体を用いて処理し、ECL化学発光 (Amersham Pharmacia Biotech社製)によって検出した。その結果、ポリクローナル抗体Kとモノクローナル抗体37-6はメダカ全抽出物中のモータリンを検出したが、モノクローナル抗体52-3はシグナルとして検出できなかった（図１）。そして、メダカモータリンタンパク質の大きさは、ヒト骨肉種細胞U2OSから検出されたヒトモータリンタンパク質と同じ大きさであった。
したがって、以下の実施例では、細胞に内在化できる性質を持つ抗モータリン抗体37-6を各アッセイに用いる。
抽出物中のタンパク質量を、Pierce Protein Assay Kit (Thermo scientific社製)を用いて定量し、10 ug をゲルにアプライーした。
【００２０】
（実施例２）過酸化水素に暴露されたメダカ中のモータリンタンパク質の検出（ウェスタンブロッティング法）
実施例１と同様に水道水に順応させた３匹のメダカを、過酸化水素を5ppmの濃度になるように調整した水槽内で２時間飼育し、３匹のメダカそれぞれの全タンパク質抽出物を個体毎に実施例１と同様の方法で抽出し、ＳＤＳで展開し、PVDF膜上に転写したタンパク質を、抗モータリンモノクローナル抗体37-6を用いて処理し、実施例１と同様のウエスタンブロッティング法でモータリンを検出した。コントロールとしては、水道水で同時間飼育した。
その結果、過酸化水素に暴露されたメダカでは高レベルのモータリンが生産されることが示された。具体的には、コントロールに比べて２倍から10倍程度のモータリン量であった。(図２，レーン3-5とレーン1-2を比較)。なお、図２中でのCoomassie brilliant blue R-250 (CBB)染色したゲルは、各個体中の全タンパク質量が同量であることを示している。
【００２１】
（実施例３）三酸化砒素(Ar2O3)に暴露されたメダカ中のモータリンタンパク質の検出（ウェスタンブロッティング法）
１２匹のメダカを用い、三酸化砒素(Ar2O3)を5mg/L、10mg/L及び50mg/Lの濃度になるように調整した水槽内でそれぞれ３匹ずつ２時間飼育し（コントロールも３匹用いた。）、実施例２と同様にウエタンブロッティング法を適用したところ、三酸化砒素(Ar2O3)に暴露されたメダカでは高レベルの2から10倍程度のモータリンが生産されることが示された(図３、レーン1-3(コントロール)と4-12(Ar2O3)を比較)。
【００２２】
（実施例４）塩化ニッケル(NiCl2)に暴露されたメダカ中のモータリンタンパク質の検出（ウェスタンブロッティング法）
４匹のメダカを用い、塩化ニッケル(NiCl2)を20mg/L及び40mg/Lの濃度になるように調整した水槽内でそれぞれ１匹ずつ２時間飼育し（コントロールは２匹用いた。）、実施例２と同様にウエタンブロッティング法を適用したところ、塩化ニッケル(NiCl2)に暴露されたメダカでは高レベルの2から10倍程度のモータリンが生産されることが示された(図４、レーン2-3(コントロール)と4-5(NiCl2)を比較)。
【００２３】
（実施例５）硫酸カドミウム(CdSO4)に暴露されたメダカ中のモータリンタンパク質の検出（ウェスタンブロッティング法）
４匹のメダカを用い、硫酸カドミウム(CdSO4)を50mg/Lの濃度になるように調整した水槽内２匹を２時間飼育し（コントロールも２匹用いた。）、実施例２と同様にウエタンブロッティング法を適用したところ、硫酸カドミウム(CdSO4)に暴露されたメダカでは高レベルのモータリンが生産されることが示された(図５、レーン1-2(コントロール)と3-4(CdSO4)を比較)。
【００２４】
（実施例６）ELISAによるメダカ中のモータリンの検出
ELISAによって、コントロールあるいは処理グループのメダカ中のモータリンを検出した。モータリンの量は、組み換えモータリンタンパク質によるELISA標準曲線を用いて計算した。図６に示すように、処理グループでは高レベルのモータリンが検出された。
具体的には、以下の通りである。
被検サンプルは、個々の魚の全抽出タンパク量が一定量（1-5 μg／100μl）になるようにcoating buffer (0.1 M Sodium bicarbonate、0.02% Sodium Azide (pH 9.6))によって希釈し、調整する。希釈した被検サンプルを、100 μlずつそれぞれのウェルに入れて2-4時間室温に置き、200μlのwashing buffer(PBS Tween (0.5%), pH 7.4)で5分間ずつ2回洗浄し、blocking buffer(1% Bovine Serum Albumin、0.02% Sodium Azide)により4℃で一晩、又は室温で2時間以上処理した。ELAISAプレートはNUNC-IMMUNO PLATE、Maxisorp (Cat.# nunc 4424004)を用いたが、当該プレートは、4℃で長期間保存可能である。Blocking bufferを捨てた後、抗モータリン抗体37-6（0.05-1.0 μg/ml  blocking buffer中）で1時間処理し、プレートを、washing bufferで3回洗浄後、100 μlの二次抗体(AP-ヤギ抗マウスIgG、blocking bufferで1:1000に希釈)で1時間処理した。プレートをwashing bufferで5回洗浄し、100μlのpNPP（p-Nitrophenyl phosphate）を含んだsubstrate buffer（50 mM NaHCO3、10 mM MgCl2 6H2O, pH 9.8）中で、室温で30分から1時間程度処理した。測定の吸光度を405 nmに設定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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