(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な花成制御遺伝子およびこの花成制御遺伝子を利用した花成制御方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を含むＤＮＡ。前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花成制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。特定のアミノ酸配列を含むタンパク質。前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ花成制御活性を有するタンパク質。上記のＤＮＡの発現を植物体内において制御する花成制御方法。【選択図】図１
2011019474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１，３，５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花成制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２，４，６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ花成制御活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２，４，６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ花成制御活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項１または２記載のＤＮＡの発現を植物体内において制御することによる花成制御方法。
【請求項５】
請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換植物。
【請求項７】
請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転換を行うことによる形質転換植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な花成制御遺伝子およびこの花成制御遺伝子を利用した花成制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シロイヌナズナは、高等植物のモデル植物として各種の研究が古くから行われてきていることは周知の通りであり、その花成を制御する経路の一つとして知られる光周性経路は、ＧＩＧＡＮＴＥＡ（ＧＩ）、ＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ（ＦＴ）からなる遺伝子カスケードによって制御され、日長感受的な開花促進に寄与することが明らかにされている。また、本カスケードにおいて、ＦＴ遺伝子の発現はＣＯ遺伝子により、ＣＯ遺伝子の発現はＧＩ遺伝子により、それぞれ誘導されるが、これらの遺伝子やそのタンパク質は、ＰｈｙＢを介した赤色光シグナル経路やＣＲＹ２を介した青色光シグナル経路などの種々の機構によって遺伝子レベルやタンパク質レベルで調節を受けることが判明している。植物の花成を掌握し、花成を自在に制御するシステムは、農業の発展に大きく貢献することが期待されることから、これまでにも盛んに研究が行われており、今日、本カスケードを介して花成を制御する種々の因子が単離・同定されるに至っている（例えば特許文献１）。しかしながら、その全容は未だ明らかではなく、本カスケードに関与する数多くの未同定因子が存在することは想像に難くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−９８７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、新規な花成制御遺伝子およびこの花成制御遺伝子を利用した花成制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、シロイヌナズナの伴細胞で特異的に発現する遺伝子の中から、ＦＴ遺伝子の発現を介して花成を促進する新規な遺伝子を見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１，３，５のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花成制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
また、本発明は、請求項２記載の通り、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡである。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２，４，６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ花成制御活性を有するタンパク質
また、本発明は、請求項３記載の通り、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２，４，６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ花成制御活性を有するタンパク質
また、本発明は、請求項４記載の通り、請求項１または２記載のＤＮＡの発現を植物体内において制御することによる花成制御方法である。
また、本発明は、請求項５記載の通り、請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換えベクターである。
また、本発明は、請求項６記載の通り、請求項５記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換植物である。
また、本発明は、請求項７記載の通り、請求項１または２記載のＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転換を行うことによる形質転換植物の作出方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新規な花成制御遺伝子およびこの花成制御遺伝子を利用した花成制御方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例４における発芽処理終了から４０日目のＴＲＴ１ｏｘ−２、ＷＴ、ｔｒｔ１、ｔｒｔ３のそれぞれの系統の個体の外観を示す写真である。
【図２】同、ＷＴ、ｔｒｔ１、ｔｒｔ３、ＴＲＴ１ｏｘ−２〜ＴＲＴ１ｏｘ−４のそれぞれの系統の個体の花成開始時の本葉の枚数を示すグラフである。
【図３】同、ＷＴ、ＴＲＴ１ｏｘ−２、ｔｒｔ３のそれぞれの系統の個体のＦＴ遺伝子の発現変動を示すグラフである。
【図４】同、ＷＴ、ＴＲＴ１ｏｘ−２、ｔｒｔ３のそれぞれの系統の個体のＣＯ遺伝子の発現変動を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らによって単離・同定されたシロイヌナズナ由来の新規な花成制御遺伝子（ＴＲＴ１：ＴＲＡＶＥＬＩＮＧ  ＴＩＮＴＥＲ  １）は、ＦＴ遺伝子の発現を介して花成を促進するものであって、そのコード領域のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１に記載の通りであり、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる９１個のアミノ酸残基で構成されるタンパク質をコードしている。また、ＴＲＴ１遺伝子の相同遺伝子であるＴＲＴ２遺伝子も、ＴＲＴ１遺伝子と同様の花成促進機能を有する遺伝子である。そのコード領域のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号３に記載の通りであり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる８８個のアミノ酸残基で構成されるタンパク質をコードしている。さらに、ＴＲＴ１遺伝子の相同遺伝子であるＴＲＴ３遺伝子も、ＴＲＴ１遺伝子と同様の花成促進機能を有する遺伝子である。そのコード領域のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号５に記載の通りであり、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる９５個のアミノ酸残基で構成されるタンパク質をコードしている。本発明には、以上のＴＲＴ１遺伝子、ＴＲＴ２遺伝子、ＴＲＴ３遺伝子のそれぞれのコード領域のｃＤＮＡを含むＤＮＡの他、それぞれの遺伝子のコード領域のｃＤＮＡからなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花成制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、それぞれの遺伝子がコードするタンパク質をコードするＤＮＡ、それぞれの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ花成制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が包含される。なお、ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士（例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士）がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を意味し、具体的には、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００１０】
ＴＲＴ１遺伝子のコード領域のｃＤＮＡのクローニングは、例えば、シロイヌナズナのゲノム情報から公知の配列番号７に記載の塩基配列からなるＴＲＴ１遺伝子のコード領域を含むｃＤＮＡ（コード領域は塩基配列の１１４番目〜３８９番目）から設計されるプライマーを用いて、シロイヌナズナの組織（例えば高い発現量を示す花蕾など）由来のｍＲＮＡから行うことができる。プライマーの具体例としては、フォワードプライマーとしてＴＣＴＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧ（配列番号８）、リバースプライマーとしてＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＡＴ（配列番号９）が挙げられる。ＴＲＴ２遺伝子とＴＲＴ３遺伝子のコード領域のｃＤＮＡのクローニングも同様の方法で行うことができる。
【００１１】
植物内でのＴＲＴ１遺伝子、ＴＲＴ２遺伝子、ＴＲＴ３遺伝子の発現量を人為的に制御することで、花成時期の制御を行うことができる。具体的には、これらの遺伝子の発現量を過剰にすることで花成を早くすることができ、発現量を抑制することで花成を遅くすることができる。これらの遺伝子の発現量を過剰にする方法としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ）などの植物細胞内で転写機能を有するプロモータとこれらの遺伝子のコード領域のｃＤＮＡを含む発現カセット（必要に応じてターミネータなどをさらに含んでいてもよい）をクローニングしたバイナリーベクター（組換えベクター）をアグロバクテリウム属菌に導入した後、これを植物に感染させることにより植物の形質転換を行う方法が挙げられる。これらの遺伝子の発現量を抑制する方法としては、例えば、これらの遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡやアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉが植物内で発現するように植物の形質転換を行う方法が挙げられる。
【００１２】
上記の方法によって形質転換が行われる植物（形質転換植物）には、植物体そのものや種子の他、植物を構成する細胞、組織、器官、また、カルスやプロトプラストなどが包含される。形質転換の対象となる植物としては、ライムギ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、イネなどの穀類、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、ウメなどの果実類、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコンニンジン、カボチャ、ジャガイモ、キュウリ、メロン、パセリなどの野菜類、ラン、キク、ユリ、サフランなどの観賞植物の他、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、ユーカリ、アカシヤ、ポプラ、スギ、ヒノキ、マツ、トウヒ、タケ、イチイなどが挙げられる。
【００１３】
なお、本発明の花成制御遺伝子は、シロイヌナズナ以外の植物由来であってもよい。他の植物由来のＴＲＴ１遺伝子、ＴＲＴ２遺伝子、ＴＲＴ３遺伝子に対する相同遺伝子は、例えば、ゲノム情報が公知の場合にはデータベースを用いた相同性検索により、そうでない場合には公知の方法で調製されるＤＮＡライブラリーを用いたスクリーニングによりクローニングすることができる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１５】
実施例１：ＴＲＴ１遺伝子の単離・同定
ＮＡＳＣ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ）から分譲されているｍＧＦＰ−ＥＲ遺伝子をマーカーとしたシロイヌナズナのエンハンサートラップ系統Ｎ９１８７（篩部組織特異的なＧＦＰシグナルを示す系統：Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．２００５  Ｓｅｐ；５６（４１９）：２４３３−４２）のマーカー遺伝子のゲノム上における挿入位置をＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により確認したところ、機能未知の遺伝子であるＡｔ５ｇ０２５８０遺伝子（ＡＧＩ  ｃｏｄｅ，シロイヌナズナの全遺伝子に付けられた記号）の下流５００ｂｐに存在していた。このＡｔ５ｇ０２５８０遺伝子のプロモータ解析をＧＵＳ遺伝子を用いて行ったところ、ＧＵＳ遺伝子はマーカー遺伝子と同様に伴細胞に特異的な発現を示した。そこで、Ａｔ５ｇ０２５８０遺伝子の機能解析を行った結果、この遺伝子は植物の緑色化や花成を制御することが判明したことから、この遺伝子を花成制御遺伝子としてＴＲＴ１（ＴＲＡＶＥＬＩＮＧ  ＴＩＮＴＥＲ  １）と命名した。そのコード領域のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、この遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１６】
実施例２：ＴＲＴ２遺伝子およびＴＲＴ３遺伝子のクローニング
ＴＲＴ１遺伝子に対するｂｌａｓｔ  ｘ  プログラムによる相同性検索により、最も相同性が高い遺伝子（７９％）としてＴＲＴ２遺伝子を、次に相同性が高い遺伝子（７８％）としてＴＲＴ３遺伝子を特定し、クローニングした。ＴＲＴ２遺伝子のコード領域のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、この遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＴＲＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質との相同性：６０％）を配列番号４に示す。また、ＴＲＴ３遺伝子のコード領域のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、この遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＴＲＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質との相同性：５８％）を配列番号６に示す。
【００１７】
実施例３：ＴＲＴ１遺伝子のコード領域のｃＤＮＡのシロイヌナズナへの導入によるＴＲＴ１遺伝子の過剰発現系統の作出
シロイヌナズナの花蕾からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりＴＲＴ１遺伝子のコード領域のｃＤＮＡを増幅した。プライマーは、フォワードプライマーとしてＴＣＴＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧ（配列番号８）、リバースプライマーとしてＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＡＴ（配列番号９）を用いた。次に、ＴＲＴ１遺伝子のコード領域のｃＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにクローニングし、クローニング断片を制限酵素処理によって切り出し、ｐＩＧ１２１Ｈｍ（ＣａＭＶ３５ＳプロモータにＧＵＳ遺伝子が結合されたバイナリーベクター）のＧＵＳ遺伝子と置換した。こうして作製した組換えベクターをエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５に導入し、フローラルディップ法によってシロイヌナズナの形質転換を行った。形質転換個体から得られた種子はカナマイシンを５０ｍｇ／Ｌ含んだＭＳ培地上で選抜し、選抜個体の自殖次代をＴＲＴ１遺伝子の機能解析実験に供した。
【００１８】
実施例４：ＴＲＴ１遺伝子の機能解析実験
以下の系統の個体を用いて実験を行った。
・  シロイヌナズナ野生型（ＷＴ：Ｃｏｌ−０）
・  ｔｒｔ１（Ａｔ５ｇ０２５８０遺伝子即ちＴＲＴ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された系統。ＮＡＳＣから入手。登録名：ＳＡＩＬ ５７４ Ｈ０３）
・  ｔｒｔ３（ＴＲＴ３遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された系統。ＮＡＳＣから入手。登録名：ＧＡＢＩ ７６０ Ｅ０９）
・  ＴＲＴ１ｏｘ−２〜ＴＲＴ１ｏｘ−４（実施例３において作出された３種類のＴＲＴ１遺伝子の過剰発現系統）
それぞれの系統の個体の種子を、バーミキュライトを詰めたプラスチックポットに播種した後、４℃で４日間の発芽促進処理を施した。その後、２２℃、１６／８時間日長（明期／暗期）の環境制御室にて育成した。
発芽処理終了から４０日目のＴＲＴ１ｏｘ−２、ＷＴ、ｔｒｔ１、ｔｒｔ３のそれぞれの系統の個体の外観を図１に示す。図１から明らかなように、ＴＲＴ１ｏｘ−２ではＷＴに比較して著しい花成の促進が認められた（花芽が抽だいした時点で花成開始とみなす。以下同じ）。一方、ｔｒｔ３ではＷＴに比較して著しい花成の遅延が認められた。
また、ＷＴ、ｔｒｔ１、ｔｒｔ３、ＴＲＴ１ｏｘ−２〜ＴＲＴ１ｏｘ−４のそれぞれの系統の１０個体を用い、花成開始時の本葉の枚数を調べた結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＷＴでは花成開始時の本葉の枚数は１５枚程度であるのに対し、ＴＲＴ１ｏｘ−２〜ＴＲＴ１ｏｘ−４では１０枚程度である一方、ｔｒｔ３では２３枚程度であり、この実験によってもＴＲＴ１遺伝子の過剰発現系統の花成促進とｔｒｔ３の花成遅延が確認できた。
さらに、ＷＴ、ＴＲＴ１ｏｘ−２、ｔｒｔ３のそれぞれの系統について、発芽処理終了から５〜６週間の個体より本葉を４時間おきに６回採集し、Ｍｉｃｒｏ−Ｆａｓｔｔｒａｃｋ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡを回収し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡをテンプレートにしてＦＴ遺伝子とＣＯ遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。解析は、テンプレートよりＡＣＴＩＮ遺伝子を増幅して定量することでｃＤＮＡ間の濃度差を補正し、ＡＣＴＩＮ遺伝子の発現量に対するＦＴ遺伝子とＣＯ遺伝子のそれぞれの発現量を比較することで行った。解析にはＣｈｒｏｍｏ４検出システムを搭載したＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）とｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を利用した。なお、各サンプルの定量は３反復実施し、その平均値をデータとして採用した。ＦＴ遺伝子の解析結果とＣＯ遺伝子の解析結果をそれぞれ図３と図４に示す（グラフ上部の白色部分は明期を意味し黒色部分は暗期を意味する）。図３と図４から明らかなように、ＦＴ遺伝子は日長周期的な発現変動を示し、明期から暗期への転換期に発現極大となるが、その発現量はｔｒｔ３ではＷＴに比較して減少するのに対し、ＴＲＴ１ｏｘ−２ではＷＴに比較してほぼ２倍に増加することがわかった。一方、ＣＯ遺伝子はＷＴとＴＲＴ１ｏｘ−２では明期から暗期への転換期の４時間前に発現極大となり、その発現量は両者で同等であったが、ｔｒｔ３ではこれらとは全く異なる発現変動と発現量を示すことがわかった。
以上の結果から、ＴＲＴ１遺伝子は、ＣＯ遺伝子によるＦＴ遺伝子の発現誘導とは異なるカスケードによってＦＴ遺伝子の発現誘導に関与し、花成の促進をもたらすことが推測された。
【００１９】
実施例５：ＴＲＴ２遺伝子およびＴＲＴ３遺伝子の機能
別途の実験により、これらの遺伝子はＴＲＴ１遺伝子と同様の花成誘導機能を保有することが確認もしくは推測され、ＴＲＴ３遺伝子についてはＴ−ＤＮＡ挿入によって遺伝子破壊されたｔｒｔ３が花成の遅延をもたらすことから（実施例４）、これらの遺伝子もまた花成制御遺伝子であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明は、新規な花成制御遺伝子およびこの花成制御遺伝子を利用した花成制御方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2011019474.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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