(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連する、新規のＩ−１ポリペプチドおよびＩ−２ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含む、単離された炎症性腸疾患関連Ｉ−２ポリペプチド。特定のアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドに選択的に結合する、実質的に精製された抗体物質。このＩＢＤ関連Ｉ−１抗原およびＩ−２抗原を使用して、炎症性腸疾患を診断する方法および炎症性腸疾患を処置する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された炎症性腸疾患関連Ｉ−２ポリペプチドであって、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＩ−２ポリペプチド。
【請求項３】
Ｉ−２ポリペプチドの単離された免疫反応性フラグメントであって、Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）の一部分と実質的に同じアミノ酸配列を含む、フラグメント。
【請求項４】
配列番号２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、請求項３に記載の単離された免疫反応性フラグメント。
【請求項５】
配列番号２を有するＩ−２ポリペプチドに選択的に結合する、実質的に精製された抗体物質。
【請求項６】
モノクローナル抗体物質である、請求項５に記載の実質的に精製された抗体物質。
【請求項７】
単離された核酸分子であって、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項８】
配列番号１の核酸配列を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を診断する方法であって、以下：
（ａ）該被験体からサンプルを得る工程；
（ｂ）Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントと、該Ｉ−２ポリペプチドに対する抗体との複合体を形成するに適切な条件下で、該サンプルを、該Ｉ−２ポリペプチドまたはその該免疫反応性フラグメントと接触させる工程；ならびに
（ｃ）該複合体の存在または不在を検出する工程、を包含し、ここで該複合体の存在は、該被験体がＩＢＤを有することを示す、方法。
【請求項１０】
前記複合体の存在または不在が、前記Ｉ−２ポリペプチドに対する前記抗体のクラス決定部分に対して特異性を有する検出可能な二次抗体で検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＢＤがクローン病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｉ−２ポリペプチドが、配列番号２の配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＢＤを有する患者において寛容を誘導する方法であって、ＩＢＤを有する該患者に、有効用量のＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記ＩＢＤがクローン病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｉ−２ポリペプチドが、配列番号２の配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
寛容化分子と組合せて、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチド、またはその寛容原性フラグメントを含む、組成物。
【請求項１７】
前記Ｉ−２ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
配列番号２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を有する寛容原性フラグメントを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する際に有用な薬剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）ＩＢＤを有する患者から腸内細菌の標本を得る工程；
（ｂ）該標本から、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む微生物種を単離する工程；
（ｃ）該微生物種を、薬剤と接触させる工程；および
（ｄ）該薬剤の不在下における該微生物種の増殖または生存率と比較した場合の、該微生物種の増殖または生存率の減少についてアッセイする工程、を包含し、ここで、該微生物種の増殖または生存率の該減少は、該薬剤が、ＩＢＤを処置する際に有用な薬剤であることを示す、方法。
【請求項２０】
前記ＩＢＤがクローン病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が抗生物質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する際に有用な薬剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）非ヒト動物にＩ−２ポリペプチドを投与する工程であって、これによって、ＩＢＤの１以上の症状が示される、工程；
（ｂ）該非ヒト動物に、薬剤を投与する工程；および
（ｃ）ＩＢＤに特徴的な１以上の該症状のレベルをアッセイする工程、を包含し、ここで、コントロールレベルと比較した場合の、１以上の該症状のレベルにおける減少は、該薬剤が、ＩＢＤを処置する際に有用であることを示す、方法。
【請求項２３】
前記ＩＢＤがクローン病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｉ−２ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記非ヒト動物が、Ｇαｉ２−／−マウス；ＴＣＲα−／−マウス、およびＩＬ−１０−／−マウスからなる群から選択されるマウスである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（謝辞）
本研究は、国立衛生研究所より授与された助成金番号ＤＫ４６７６３によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に、免疫学、微生物学、および炎症性腸疾患の分野に関し、そしてより詳細には、微生物抗原を使用する、炎症性腸疾患の診断および処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、病因が未知である２つの胃腸障害（クローン病（ＣＤ）および潰瘍性結腸炎（ＵＣ））を記載するために使用される、集合的な用語である。世界的に発生し、そして２００万人もの多くの人々に罹患したことが報告されているＩＢＤの経過および予後は、広範に変動する。ＩＢＤの発症は、主に若い成人においてであり、３つの最も一般的に現われる症状である下痢、腹痛、および発熱を伴なう。下痢は、軽度なものから重篤なものまで変動し得、そして貧血および体重減少が、ＩＢＤのさらなる一般的な症状である。ＩＢＤを有するすべての患者のうちの１０％〜１５％が、１０年間にわたって外科手術を必要とする。さらに、ＩＢＤを有する患者は、腸癌の発症の危険が増加する。心理学的問題（不安およびうつ病を含む）の発症の増加に関する報告は、これがしばしば壮年の盛りにある人々を襲う衰弱疾患であるので、おそらく驚くべき症状ではない。
【０００４】
不幸なことに、炎症性腸疾患について利用可能な治療はわずかであり、そして診断および処置の両方ともが、この疾患の病因に関する見識の欠如によって妨害されている。しかし、明らかなのは、遺伝的因子、外因性の誘因、および内因性の微生物叢の組合せが、炎症性腸疾患において見られる腸粘膜への免疫媒介性損傷に寄与し得るということである。クローン病では、細菌が、疾患の開始および進行に関与しており：クローン病における腸炎症は、その頻繁な抗生物質に対する応答性および細菌糞便流に対する感受性で有名である。一般的な腸の居住物（ｃｏｌｏｎｉｓｔ）および新規の病原体が、直接的な検出によってか、または疾患に関連した抗微生物免疫応答によって、クローン病に関連付けられている。さらに、慢性結腸炎の遺伝学的に感受性の多くのモデルにおいて、管腔微生物は、疾患に必須の補助因子であり；微生物のいない環境に閉じ込められた動物は、結腸炎を発症しない。しかし、クローン病における腸内微生物の役割についての多くの直接的証拠および間接的証拠にも関わらず、この疾患において見られる免疫調節不全に寄与する病原性生物および抗原は、同定されていない。
【０００５】
クローン病についての現在の診断用アッセイは、この疾患を有するすべての患者を検出し得ない。従って、クローン病に関連する新規の微生物抗原の同定は、現在の診断用アッセイの感度を増加させ得る試薬を提供する。さらに、このような微生物抗原は、疾患に関連したＴ細胞エピトープを保有し得、そしてこの疾患に関連する免疫応答の元々の誘発因子または一助的誘発因子として、炎症性腸疾患を処置するための有効な寛容原性抗原であり得る。ＩＢＤ関連微生物抗原の同定はまた、関与する微生物種の同定を容易にし、炎症性腸疾患を処置するための新規の抗生物質または薬物の発見を可能にし、このような薬物は、疾患の微生物性誘発因子を排除することによって、疾患を改善する。
【０００６】
従って、炎症性腸疾患に罹患している多くの個体を診断および処置するための、微生物性ＩＢＤ関連抗原の同定および単離についての必要性が存在する。本発明は、ＩＢＤ関連Ｉ−１微生物抗原およびＩ−２微生物抗原を提供することによって、この必要性を満たす。関連する利点も同様に提供される。
【発明の概要】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有する、単離された炎症性腸疾患関連Ｉ−２ポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号２の一部分と実質的に同じアミノ酸配列を有する、Ｉ−２ポリペプチドの単離された免疫反応性フラグメントを提供する。Ｉ−２ポリペプチドの単離された免疫反応性フラグメントは、例えば、配列番号２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を有し得る。
【０００８】
本発明によって、配列番号２を有するＩ−２ポリペプチドに選択的に結合する、実質的に精製された抗体物質もまた提供される。このような実質的に精製された抗体物質は、例えば、実質的に精製されたポリクローナル抗体物質またはモノクローナル抗体物質であり得る。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する。本発明の単離された核酸分子は、例えば、配列番号１の核酸配列を有し得る。
【００１０】
本発明によって、被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を診断する方法もまた提供される。この方法は、以下の工程：被験体からサンプルを得る工程；Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントと、Ｉ−２ポリペプチドに対する抗体との複合体を形成するに適切な条件下で、そのサンプルを、Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントと接触させる工程；ならびに、その複合体の存在または不在を検出する工程、を包含し、ここでその複合体の存在は、その被験体がＩＢＤを有することを示す。炎症性腸疾患を診断するための本発明の方法は、例えば、クローン病を診断するために有用であり得る。炎症性腸疾患を診断するための本発明の方法において、その複合体の存在または不在は、例えば、Ｉ−２ポリペプチドに対する抗体のクラス決定部分（ｃｌａｓｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）に対して特異性を有する検出可能な二次抗体で検出され得る。
【００１１】
本発明によって、ＩＢＤを有する該患者に、有効用量のＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）フラグメントを投与することによって、炎症性腸疾患を有する患者において寛容を誘導する方法がさらに提供される。本発明のこの方法は、クローン病を有する患者を処置するために特に有用であり得る。寛容を誘導するための本発明の方法において、投与されるＩ−２ポリペプチドは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。
【００１２】
本発明はまた、寛容化分子（ｔｏｌｅｒｏｇｉｚｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と組合せて、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチド、またはその寛容原性フラグメントを含む、組成物を提供する。本発明のこの組成物において、Ｉ−２ポリペプチドは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。本発明のこの組成物において有用な寛容原性フラグメントは、例えば、配列番号２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を有し得る。
【００１３】
本発明はまた、炎症性腸疾患を処置する際に有用な薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：炎症性腸疾患を有する患者から腸内細菌の標本を得る工程；この標本から、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む微生物種を単離する工程；この微生物種を、薬剤と接触させる工程；および、この薬剤の不在下におけるこの微生物種の増殖または生存率と比較した場合の、この微生物種の増殖または生存率の減少についてアッセイする工程、を包含し、ここで、この微生物種の増殖または生存率の減少は、この薬剤が、炎症性腸疾患を処置する際に有用な薬剤であることを示す。本発明の方法は、例えば、クローン病を処置するための薬剤を同定するために有用であり得る。本発明のこの方法は、抗生物質である薬剤をスクリーニングするために特に有用であり得る。
【００１４】
本発明はさらに、新規の動物モデルを使用して、炎症性腸疾患を処置する際に有用な薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：非ヒト動物にＩ−２ポリペプチドを投与する工程であって、これによって、ＩＢＤの１以上の症状が示される、工程；この非ヒト動物に、薬剤を投与する工程；および、ＩＢＤに特徴的な１以上の症状のレベルをアッセイする工程、を包含し、ここで、コントロールレベルと比較した場合の、１以上のこの症状のレベルにおける減少は、この薬剤が、ＩＢＤを処置する際に有用な薬剤であることを示す。本発明の方法は、例えば、クローン病を処置する際に有用な薬剤を同定するために適用され得る。投与されるＩ−２ポリペプチドは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。本発明の方法において特に有用な非ヒト動物は、例えば、Ｇαｉ２、ＴＣＲα、およびＩＬ−１０を欠損しているマウスであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１は、Ｉ−１およびＩ−２の核酸配列およびコードされるポリペプチドを示す。Ａ．Ｉ−２核酸配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）が示される。
【図１Ｂ】図１は、Ｉ−１およびＩ−２の核酸配列およびコードされるポリペプチドを示す。Ｂ．Ｉ−１核酸配列（配列番号３）およびＩ−１のオープンリーディングフレーム１（上部；配列番号４）およびオープンリーディングフレーム２（下部；配列番号５）が示される。
【図２】図２は、Ｉ−２アミノ酸配列（配列番号２）と、相同配列とのアラインメントを示す。配列を、非重複性（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）データベースに対して、ｔＢＬＡＳＴｘ検索によって同定した。アラインメントを、Ｇｅｎｅｄｏｃによる改変を伴なうＣＬＵＳＴＡＬＷによって作成した。「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来の推定タンパク質４（配列番号６；登録番号４８１５９１）であり；「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の推定タンパク質Ｒｖ３５５７ｃ（配列番号７；登録番号１８７７２８８）であり；そして、「Ａｑｕｉｆｅｘ」は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の転写制御因子（配列番号８；登録番号２９８４３６２）である。４つのポリペプチド間で同一または保存的に置換された残基を、黒色で示し；３つのポリペプチド間で同一または保存的に置換された残基を、濃灰色で示し；そして、２つのポリペプチド間で同一または保存的に置換された残基を、薄灰色で示す。コンセンサス残基を、アラインメントの真下に、保存されたアミノ酸を示す１文字コードで示し；「６」は、保存された非極性（疎水性）残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリンまたはメチオニン）を示し；そして、「５」は、保存された芳香族残基（フェニルアラニンまたはチロシン）を示す。
【図３】図３は、ＣＤ患者、ＵＣ患者およびコントロール個体由来のパラフィン包埋結腸サンプルを使用した、Ｉ−２（配列番号１）特異的プライマーでのＰＣＲ分析の結果を示す。「Ｎ」は、アッセイされたサンプルの数を示し、そして「Ｎ＋」は、陽性サンプルの数を示す。「Ｃａ」は、癌切除サンプルを示し；「Ｄｉｖｅｒｔｉｃ」は、憩室炎サンプルを示し；「ａｐｐｅｎｄ」は、虫垂炎サンプルを示し；そして、「Ｉ−ｃｏｌ」は、虚血性結腸炎を示す。
【図４Ａ】図４は、種々の集団におけるＩ−２ポリペプチド（配列番号２）に対するＩｇＧおよびＩｇＡ反応性を示す。Ａ．クローン病患者および正常個体由来の血清を、示される希釈率でＥＬＩＳＡによって、ＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチド（配列番号２）に対するＩｇＧ反応性についてアッセイした。吸光度の値は、ＧＳＴ単独に対する吸光度を差し引くことによって算出された。
【図４Ｂ】図４は、種々の集団におけるＩ−２ポリペプチド（配列番号２）に対するＩｇＧおよびＩｇＡ反応性を示す。Ｂ．クローン病、潰瘍性結腸炎、および正常な個体由来の血清を、ＥＬＩＳＡによって、ＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチド（配列番号２）に対するＩｇＡ反応性についてアッセイした。吸光度の値は、ＧＳＴ単独に対する吸光度を差し引くことによって算出された。カットオフ（破線）を、正常集団についての平均値を超える２つの標準偏差として設定した。
【図５】図５は、正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞を使用する、Ｔ細胞増殖アッセイを示す。Ｔ細胞を、示されるＧＳＴ−Ｉ−２融合タンパク質濃度（Ｙ軸上に示される）で刺激した。Ｘ軸は、取り込まれた［3Ｈ］−チミジンの計数を示す。ＳＥＢは、陽性コントロールであるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓエンテロトキシンＢによって刺激されたＴ細胞を示す。
【図６】図６は、ＧＳＴ−Ｉ−２融合タンパク質でのチャレンジに応答したＴ細胞サイトカイン発現を示す。
【図７】図７は、ＩＢＤ患者から単離された微生物を培養するための種々の条件を示す。
【図８】図８は、Ｉ−２刺激に際しての未処理ＣＤ４+Ｔ細胞の活性を示す。（Ａ）ネイティブＣＤ４+Ｔ細胞の［3Ｈ］−チミジン増殖アッセイ。（Ｂ）記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の［3Ｈ］−チミジン増殖アッセイ。
【図９】図９は、組換えＩ−２がスーパー抗原であることを示す。（Ａ）脾性Ｃ５７ ＢＬ／６Ｊ ＣＤ４+Ｔ細胞を、Ｉ−２−ＧＳＴを適用（ｐｕｌｓｅ）されたか、またはパラホルムアルデヒドで固定され、次いで、Ｉ−２−ＧＳＴを一晩適用された、Ｃ５７ ＢＬ／６由来の抗原提示細胞と共に培養した。（Ｂ）ハトのシトクロムＣ（ＰＰＣ）特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＰＰＣを適用されたか、またはパラホルムアルデヒドで固定され、次いで、ＰＰＣを一晩適用された、同系の抗原提示細胞と共に培養した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
炎症性腸疾患に関する病因は、理解が乏しいものの、究極的には、免疫媒介性組織損傷を含む。糖尿病および多発性硬化症のような自己免疫障害と類似して、炎症性腸疾患は、種々の免疫学的な異常に関連し、そして免疫調節不全のプロセスを示し得る。しかし、他の障害とは異なり、炎症性腸疾患は、腸の管腔と連係する粘膜部位において生じ、従って、炎症性腸疾患における主要な免疫標的は、慢性の微生物居住物のような外因性の因子であり得る。この場合、炎症性腸疾患に特徴的な粘膜損傷は、常在性の実質細胞に対する炎症性の傍観物（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）損傷の結果である。
【００１７】
本発明は、いくつかの微生物ＤＮＡ配列が、無関与の粘膜と比較した場合に、関与したクローン病（ＣＤ）粘膜において優先的に見出されるという興味深い発見に関する。本明細書中で開示されるように、感染した領域において優先的に見出されるＤＮＡ配列を同定するための、ＰＣＲ駆動性サブトラクティブクローニングアプローチである提示的差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）を使用して、巨視的に疾患を含まない領域と比較した場合に、潰瘍化を有する領域における固有層由来の単核細胞において示差的に存在した、クローン病患者由来のＤＮＡ配列を単離した（実施例Ｉを参照のこと）。本明細書中に開示されるように、２つのＩＢＤ関連配列は、微生物起源であった。Ｉ−１（配列番号３〜５）およびＩ−２（配列番号１および２）と称される、核酸配列およびアミノ酸配列を、図１に示す。本明細書中でさらに開示されるように、ＣＤ患者、ＵＣ患者、および非ＩＢＤ患者由来の結腸サンプルのＰＣＲ分析によって、Ｉ−２配列（配列番号１）は、ＵＣサンプルまたは非ＩＢＤサンプルにおいてよりも、関与したＣＤ組織においてより頻繁に見出されることが明らかになった（実施例Ｉおよび図３）。従って、炎症性腸疾患、特に、炎症性ＣＤ病変に関連した、新規の微生物配列が同定された。ＩＢＤと関連した微生物配列の単離は、ＩＢＤの病因における微生物を含意し、そして炎症性腸疾患を診断または改善するために有益な試薬を提供する。
【００１８】
従って、本発明は、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有する、単離された炎症性腸疾患関連Ｉ−２ポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号２の一部分と実質的に同じアミノ酸配列を有する、Ｉ−２ポリペプチドの単離された免疫反応性フラグメントを提供する。Ｉ−２ポリペプチドの単離された免疫反応性フラグメントは、例えば、配列番号２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を有し得る。
【００１９】
用語「単離された」は、ポリペプチドを参照して本明細書中で使用される場合、細胞においてそのポリペプチドに通常付随する、夾雑している脂質、ポリペプチド、核酸、または他の細胞性物質を比較的含まない形態にあるポリペプチドを意味する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｉ−２ポリペプチド」は、図１Ａに示される微生物性Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。微生物性Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）は、細菌の転写調節因子に対して幾分かの類似性を共有する（アミノ末端の３０個のアミノ酸において最も高い類似性を有する）、１００個のアミノ酸のポリペプチドである。図２で例示されるように、Ｉ−２ポリペプチドは、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来の推定タンパク質４（配列番号６）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲｖ３５５７ｃ（配列番号７）；およびＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の転写調節因子（配列番号８）と、弱い相同性を共有する。実施例Ｉで開示されるように、Ｉ−２コード核酸（配列番号１）は、巨視的に疾患を含まない粘膜と比較した場合に、関与したクローン病組織において示差的に存在する。
【００２１】
配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドは、天然に存在するＩ−２ポリペプチド（配列番号２）またはこの配列に対して実質的なアミノ酸配列類似性を有する関連のポリペプチドであり得る。このような関連のポリペプチドは、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ配列（配列番号６）に対してよりも配列番号２のＩ−２ポリペプチドに対してより高い配列類似性を示し、そしてこれには、図１Ａに示されるアミノ酸配列のアイソタイプ改変体またはホモログが含まれる。本明細書中で使用される場合、用語Ｉ−２ポリペプチドは、一般的に、配列番号２と、約５０％より高い同一性、好ましくは約６０％よりも高い同一性、より好ましくは約７０％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を一般的に有するポリペプチドを記載し、そして、配列番号２と、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％よりも高いアミノ酸同一性を有するポリペプチドであり得る。このアミノ酸配列同一性は、デフォルトパラメーターでＢＬＯＳＵＭ ６２行列（ｍａｔｒｉｘ）を使用するＣＬＵＳＴＡＬＷで決定される。Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍタンパク質４（配列番号６）は、配列番号２のＩ−２ポリペプチドと約２１％のアミノ酸同一性を有し、従って、本明細書中で規定されるようなＩ−２ポリペプチドではない。
【００２２】
Ｉ−１核酸配列（配列番号３）は、対立鎖において２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。図１Ｂにおいて示される上部の鎖のＩ−１ＯＲＦは、原核生物転写因子ｐｔｘＲとの相同性を有する１１５個のアミノ酸の推定ポリペプチド（配列番号４）をコードする。下部の鎖のＯＲＦは、１１４個のアミノ酸の推定ポリペプチド（配列番号５）をコードする。Ｉ−１コード核酸（配列番号３）はまた、関与したＣＤ粘膜において優先的に見出される配列として、ＲＤＡ分析によって単離された（実施例Ｉを参照のこと）。
【００２３】
Ｉ−１ポリペプチドは、配列番号４または配列番号５と実質的に同じアミノ酸配列を有し得る。このようなＩ−１ポリペプチドは、天然に存在するＩ−１ポリペプチド（配列番号４または５）または、関連のポリペプチド（例えば、これらの配列の１つに対して実質的なアミノ酸配列類似性を有する、アイソタイプ改変体または異なる細菌種由来のホモログ配列）であり得る。本明細書中で使用される場合、用語Ｉ−１ポリペプチドは、一般的に、配列番号４または５と、約５０％より高い同一性、好ましくは約６０％よりも高い同一性、より好ましくは約７０％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を一般的に有するポリペプチドを記載し、そして、配列番号４または５と、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％よりも高いアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり得る。このアミノ酸同一性は、デフォルトパラメーターでＢＬＯＳＵＭ ６２行列（ｍａｔｒｉｘ）を使用するＣＬＵＳＴＡＬＷで決定される。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じアミノ酸配列」は、Ｉ−１ポリペプチドまたはＩ−２ポリペプチドを参照して用いられる場合には、図１Ａもしくは図１Ｂに示されるような配列、または機能的に等価なアミノ酸配列であると当業者にみなされる、類似の非同一配列を意味することを意図する。例えば、Ｉ−１ポリペプチド（配列番号４または５）またはＩ−２ポリペプチド（配列番号２）と実質的に同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配列は、改変されたポリペプチドが、Ｉ−１またはＩ−２の実質的に少なくとも１つの生物学的活性（例えば、以下にさらに記載される、免疫反応性または寛容原性活性）を保持するという条件で、それぞれ、配列番号４もしくは５、または配列番号２のアミノ酸配列と比較して、１以上の改変（例えば、アミノ酸の付加、欠失、または置換）を有し得る。アミノ酸配列間の実質的な類似性についての比較は、通常、約６〜１００残基、好ましくは約１０〜１００残基、そしてより好ましくは約２５〜３５残基の配列で実施される。
【００２５】
従って、制限された改変が、以下にさらに記載されるように、その生物学的機能を破壊することなく、Ｉ−１もしくはＩ−２ポリペプチドに対して、またはその免疫反応性フラグメントもしくは寛容原性フラグメントに対してなされ得ることが理解される。免疫反応性を破壊しないＩ−１もしくはＩ−２ポリペプチドの改変体、または寛容原性活性を破壊しないＩ−１もしくはＩ−２ポリペプチドの改変体が、本明細書中で使用されるような、用語Ｉ−１ポリペプチドまたはＩ−２ポリペプチドの意味に包含される。改変は、例えば、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失、もしくは置換；アミノ酸の構造もしくは機能を模倣する化合物の置換；または、化学的部分（例えば、アミノ基またはアセチル基）の付加、であり得る。改変されたＩ−１もしくはＩ−２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントの活性は、例えば、本明細書中に開示される免疫反応性または寛容原性活性についてのアッセイの１つを使用して、アッセイされ得る（以下を参照のこと）。
【００２６】
本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントの特に有用な改変は、例えば、安定性の増加を付与する改変である。１以上のＤ−アミノ酸の組み込みは、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの安定性を増加させるに有用な改変である。同様に、リシンの欠失または置換は、分解に対して保護することによって、安定性を増加させ得る。例えば、このような置換は安定性を増加させ得、従って、本明細書中に開示されるポリペプチド抗原の１つのバイオアベイラビリティを増加させ得る。
【００２７】
Ｉ−２ポリペプチドおよびそのフラグメントは、Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）に選択的に結合する、実質的に精製された抗体物質を調製するために有用であり得る。抗体物質は、例えば、実質的に精製されたポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体物質であり得る。本発明の抗体物質は、例えば、罹患した患者の粘膜内におけるＩ−２ポリペプチドの存在または位置を決定するにおいて、および炎症性腸疾患を診断するにおいて、有用であり得る。本発明の実質的に精製された抗体物質は、例えば、クローン病を診断するためのＥＬＩＳＡまたは免疫組織病理学アッセイにおいて、有用であり得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体物質（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに少なくとも約１×１０5Ｍ-1のＩ−２ポリペプチドに対する選択的結合活性を保持する抗体のポリペプチドフラグメントを含むように、その最も広範な意味において使用される。当業者は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメントのような抗Ｉ−２抗体フラグメントが、Ｉ−２ポリペプチドに対する選択的結合活性を保持し得、従って、抗体の定義に含まれることを知る。さらに、用語抗体物質は、本明細書中で使用される場合、最少で１つのＶHドメインおよび１つのＬLドメインを含む、天然には存在しない抗体およびフラグメント（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）（Ｉ−２ポリペプチドに選択的に結合する））を含む。このような天然には存在しない抗体は、固相ペプチド合成によって構築され得るか、組換え的に生成され得るか、または例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、可変性重鎖および可変性軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって獲得され得る。
【００２９】
Ｉ−２ポリペプチド「に対して選択的な」抗体物質、またはＩ−２ポリペプチドに「選択的に結合する」抗体物質は、関連のないポリペプチドに対してよりもそのポリペプチドに対して、実質的により高い親和性で結合する。本発明の実質的に精製された抗体物質はまた、Ｉ−２ポリペプチドに対して特異的であり得、それにより、その結合親和性は、配列番号６〜８のような関連のポリペプチドに対してよりもＩ−２ポリペプチドに対して有意により高い。
【００３０】
抗Ｉ−２抗体物質は、免疫原として、例えば、Ｉ−２融合タンパク質またはＩ−２ポリペプチド（配列番号２）の一部分をコードする合成ペプチドを使用して、調製され得る。当業者は、組換え的に生成され得る、精製されたＩ−２ポリペプチドまたはＩ−２のフラグメント（合成ペプチドのような、Ｉ−２のペプチド部分を含む）が、免疫原として使用され得ることを知る。Ｉ−２の非免疫原性のフラグメントまたは合成ペプチドは、そのハプテンを、キャリア分子（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））とカップリングすることによって、免疫原性になされ得る。さらに、種々の他のキャリア分子、およびハプテンをキャリア分子とカップリングするための方法が、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、当該分野において周知である。
【００３１】
用語「実質的に精製された」は、抗体物質を参照して本明細書中で使用される場合、その抗体物質が、細胞においてその抗体に通常付随する、ポリペプチド、核酸、および他の細胞性物質を実質的に欠いていることを意味する。Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）に選択的に結合する、特許請求される抗体物質はさらに、関連のない特異性の（すなわち、Ｉ−２ポリペプチドに選択的に結合しない）抗体物質を実質的に欠く。本発明の抗体物質は、例えば、ポリクローナル抗Ｉ−２抗血清のＩ−２アフィニティー精製によってか、ファージに提示される抗体をＩ−２ポリペプチド（配列番号２）に対してスクリーニングすることによってか、またはハイブリドーマから調製されるモノクローナル抗体として、実質的に精製された形態で調製され得る。
【００３２】
本明細書中で開示されるように、Ｉ−２配列は、従来の条件下で飼育されたマウスにおいて存在し、そして用量依存性の増殖応答およびＩＬ−１０分泌を誘導する（実施例Ｖ）。本明細書中でさらに開示されるように、未処理および記憶ＣＤ４+Ｔ細胞集団の両方ともが、Ｉ−２に応答して、同時に増殖し、そしてＩＬ−１０を生成する（図８を参照のこと）。さらに、Ｉ−２応答は、ＭＨＣクラスＩＩ媒介性認識に依存性であるが、パラホルムアルデヒド固定細胞がＩ−２応答を誘導する能力によって示されるように、抗原のプロセシングを必要としない（図９を参照のこと）。これらの結果は、Ｉ−２が新規のスーパー抗原であることを実証し、そしてＩ−２スーパー抗原応答をブロックする方法が、クローン病を予防または改善し得ることを示す。
【００３３】
従って、本発明は、配列番号２を有するＩ−２ポリペプチドに選択的に結合する薬剤の有効用量をＩＢＤを有する患者に投与することによって、この患者を処置する方法を提供する。本発明の方法において、有用な薬剤は、例えば、実質的に精製された抗体物質（例えば、ポリクローナル抗体物質またはモノクローナル抗体物質）であり得、これは、配列番号２を有するＩ−２ポリペプチドに選択的に結合する。本発明の方法は、ＩＢＤを有する患者（例えば、クローン病を有する患者）の処置に有用である。
【００３４】
配列番号２を有するＩ−２ポリペプチドによって誘導されるスーパー抗原応答を阻害することによって、ＩＢＤを有する患者を処置する方法が、本発明によってさらに提供される。そのようなスーパー抗原応答は、例えば、Ｔ細胞増殖またはＩＬ−１０分泌であり得る。本発明の方法は、クローン病を有する患者のスーパー抗原応答の阻害に特に有用であり得る。
【００３５】
本明細書中に使用される場合、用語「スーパー抗原応答」は、Ｔ細胞のスーパー抗原に対する応答をいい、そして一般的に増殖応答である。とりわけ既知の最も強力なＴ細胞マイトジェンであるスーパー抗原は、Ｔ細胞レセプターのＶβドメイン中の残基および抗原結合裂溝の外側のクラスＩＩ ＭＨＣ分子中の残基に結合する。従って、スーパー抗原は、抗原独立な様式でＴ細胞とクラスＩＩ ＭＨＣ分子を架橋するように作用し得、そして特定のＶβドメインを有するＴ細胞レセプターを発現する全てのＴ細胞を活性化し得る。
【００３６】
用語、阻害（阻害する）は、本明細書中でスーパー抗原応答を参照して使用される場合、配列番号２を有するＩ−２スーパー抗原によって誘導される特異的応答の部分的または完全な減少をいう。本明細書中の実施例Ｖに開示されるように、Ｉ−２スーパー抗原は、増殖応答ならびにＩＬ−１０分泌を生じる。従って、増殖応答またはＩＬ−１０分泌における部分的または完全な減少は、本発明の方法において有用な薬剤を同定するために使用され得る。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する。本発明の単離された核酸分子は、例えば、配列番号１の核酸配列を有し得る。これらの核酸分子は、例えば、組換えポリペプチドを産生する際およびＩ−２ ｍＲＮＡ発現を検出するためのプローブとして有用である。配列番号１のヌクレオチド部分はまた、例えば、ＰＣＲ分析のためのプライマーとして有用である（実施例１を参照のこと）。
【００３８】
本発明の単離された核酸分子としては、例えば、Ｉ−２ポリペプチドホモログをコードする核酸分子、関連するが異なりかつ遺伝子暗号の縮重に起因して配列番号２のポリペプチドをコードする核酸分子、および関連するが異なりかつ免疫反応性または免疫寛容活性を示す配列番号２とは異なるＩ−２ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。
【００３９】
本発明の方法は、炎症性腸疾患（これは、クローン病および潰瘍性結腸炎の広範な分類を含む名称である）の診断および処置に関する。クローン病（限局性腸炎）は、胃腸管の任意の部分を含み得る慢性炎症の疾患である。通常、小腸（回腸）および盲腸の遠位部分が冒される。別の場合、この疾患は、小腸、結腸または肛門直腸領域に限定される。クローン病は、時々、十二指腸および胃、そしてより希に食道および口腔を含む。
【００４０】
クローン病の可変性臨床発現は一部、この疾患の変化する解剖学的局在の結果である。ＣＤの最も頻繁な症状は、腸の痛み、下痢および回帰熱である。例えば、ＣＤは通常、腸閉塞またはフィステル（これは、腸の疾患ループの間の異常な経路である）と関連する。クローン病はまた、目、関節および皮膚の炎症；肝臓疾患；腎臓結石またはアミロイド症のような合併症を含む。さらに、ＣＤは、腸癌の危険性の増加と関連する。
【００４１】
いくつかの特徴が、クローン病の病理に特徴的である。経壁炎症として公知のＣＤと関連する炎症は、腸壁の全ての層を含む。例えば、典型的には腸壁にわたってもまた表れる線維症を伴う、肥厚および水腫は、長期間の疾患にもまた存在する。ＣＤに特徴的な炎症はまた、炎症組織のセグメントにおいて不連続であり（「スキップ病巣」として公知）、これは明らかに正常な腸によって分離されている。さらに、直線潰瘍形成、水腫、および介在組織の炎症は、ＣＤの特徴である腸粘膜の敷石状概観を導く。
【００４２】
クローン病の特徴は、炎症細胞の離散性凝集（肉芽種として公知）の存在であり、これは、一般的に粘膜下組織で見出される。いくつかのクローン病の場合は、典型的な離散性肉芽腫を示すが、なかには散在性肉芽腫性反応または非特異的経壁炎症を示すものもある。結論として、離散性肉芽腫は、ＣＤの指標であるが、肉芽腫がないこともまたこの疾患と一致する。従って、肉芽腫の存在よりも、経壁炎症または不連続炎症が、クローン病の好ましい診断指標である（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｏｌｏｑｙ（第２版）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４）（これは、本明細書中に参考として援用される））。
【００４３】
潰瘍性結腸炎（ＵＣ）は、絞めつける腸の痛みを伴う慢性的な下痢、直腸出血、ならびに血液、膿および粘液のゆるい排泄によって特徴付けられる大腸の疾患である。潰瘍性結腸炎の発現は広く変化する。増悪および寛解のパターンは、ほとんどのＵＣ患者（７０％）の臨床コースを分類するが、寛解を伴わない連続した症状が、ＵＣを有するいくらかの患者に存在する。ＵＣの局所または全身性の合併症としては、関節炎、目の炎症（例えば、ブドウ膜炎）、皮膚潰瘍および肝疾患が挙げられる。さらに、潰瘍性結腸炎、そして特に、長期間の伸展した疾患は、結腸癌腫の危険性の増加と関連する。
【００４４】
いくつかの病理特徴は、他の炎症性腸疾患に対する識別においてＵＣを特徴付ける。潰瘍性結腸炎は、散在性疾患である。この疾患は、通常、直腸の最も遠位部分から可変性遠隔に近位に広がる。用語、左側結腸炎は、結腸の遠位部分を含む炎症を記載し、左結腸曲まで広がる。直腸回避または右側結腸（近位部分）の単独の関与は、潰瘍性結腸炎では珍しい。潰瘍性結腸炎の炎症プロセスは、結腸に限定され、例えば、小腸、胃または食道を含まない。さらに、潰瘍性結腸炎は、一般的に腸壁のより深い層を回避する粘膜の表面炎症によって識別される。変性した腸の陰窩が好中球で充填される陰窩膿瘍がまた、潰瘍性結腸炎の典型である（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ、前出、１９９４）。
【００４５】
直腸の頻繁な回避を伴う斑状疾患であるクローン病と比較して、潰瘍性結腸炎は、通常近位よりも遠位でより重篤である結腸の連続性炎症によって特徴付けられる。潰瘍性結腸炎における炎症は、通常粘膜層に対して制限されかつ好中球および陰窩膿瘍を伴う急性炎症性浸潤によって特徴付けられる点で、表層性である。対照的に、クローン病は、肉芽腫（いつもではないが、しばしば存在する）を伴う腸壁の全体の厚さを冒す。回盲弁で終わる疾患またはそれに対して遠位の結腸における疾患は、潰瘍性結腸炎の指標であるが、末端回腸の関与、栗石様の出現、離散性潰瘍またはフィステルは、クローン病を示唆する。クローン病の潰瘍性結腸炎からの識別に役立つ特徴を、表１に要約する（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ、前出、１９９４）。
【００４６】
【表１】
2011019515.tif 000002
【００４７】
特定の免疫媒介障害（全身性エリテマトーデス、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎を含む）は、自己抗体産生の異なるパターンと密接に関連する。疾患特異的マーカー抗体がまた、ＩＢＤ中で観察された。潰瘍性結腸炎の場合、核周囲染色パターン（ｐＡＮＣＡ）を生成する（例えば、アルコール固定好中球の間接的免疫蛍光顕微鏡観察の際）抗好中球細胞質抗体は、ＵＣ患者の６８〜８０％に上昇し、そして結腸の他の障害において低い頻度であった。クローン病において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ（ビール酵母）の細胞壁マンナン多糖類に対する血清反応性は、クローン病を有する個体の大多数に対する血液学マーカーである（Ｓｅｎｄｉｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２１９−２２６（１９９６）（これは、本明細書中に参考として援用される））。
【００４８】
本明細書中に開示されるように、ＥＬＩＳＡ分析によって、正常な個体と比較して、クローン病を有する患者においてＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチド（配列番号２）に対する増加したＩｇＧ血清反応性が示された（図４Ａを参照のこと）。図４Ｂに示されるように、クローン病患者の１０人のうち９人が、正常集団に関する平均値を超えた２つの標準偏差よりも、より大きいＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチドに対するＩｇＡ血清反応性を有した。対照的に、正常血清サンプルは、このカットオフを超えた抗Ｉ−２ ＩｇＡ反応性は含まなかった。抗Ｉ−２血清ＩｇＡ反応性はまた、潰瘍性結腸炎患者と比較して、クローン病患者からのサンプルにおいて平均して有意に高かった。これらの結果により、Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）に対する反応性が、クローン病の、正常な個体およびＵＣを有する個体からの区別に使用され得ることが示された。
【００４９】
上記の知見に基づいて、本発明は、被験体の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：サンプルを被験体から得る工程；このサンプルをＩ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントと、Ｉ−２ポリペプチドもしくはその免疫反応性フラグメントとＩ−２ポリペプチドに対する抗体との複合体形成に適した条件下で、接触させる工程；および、その複合体の存在または不在を検出する工程。ここで、複合体の存在は、被験体がＩＢＤを有していることを示す。炎症性腸疾患の診断のための本発明の方法は、例えば、クローン病の診断に有用であり得る。複合体の存在または不在は、例えば、Ｉ−２ポリペプチドに対する抗体のクラス決定部分に特異性を有する検出可能な二次抗体を用いて検出され得る。
【００５０】
本明細書中に使用される場合、用語「被験体」は、炎症性腸疾患を有し得る任意の動物（ヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラットまたはマウスを含み、特にヒト）を意味する。被験体は、一般的に、１つ以上の潰瘍性結腸炎またはクローン病の症状を有する。
【００５１】
本発明の方法に有用なサンプルは、抗体を有する任意の生物学的な液体（例えば、全血、血漿、唾液または他の体液もしくは組織などであり、好ましくは血清）から得られ得る。本発明の方法に従って評価されるサンプルは、任意のそのような被験体から得られ得る。
【００５２】
本明細書中に使用される場合、用語「複合体」は、「免疫複合体」と同意義であり、そして抗原（例えば、タンパク質またはペプチド）と抗体との間の特異的結合から生じる二つ以上の分子の凝集を意味する。本発明の方法において、複合体は、抗体に対するＩ−２ポリペプチドの特異的結合によって形成される。
【００５３】
本発明の方法において、複合体は、Ｉ−２ペプチドに対する抗体のクラス決定部分に特異性を有する、検出可能な二次抗体を用いて検出され得る。そのような二次抗体は、例えば、抗ＩｇＡ二次抗体、抗ＩｇＧ二次抗体または抗ＩｇＡ二次抗体および抗ＩｇＧ二次抗体の組合せであり得る。
【００５４】
本明細書中に使用される場合、用語「二次抗体」は、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に有するＩ−２ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合する、抗体または抗体の組合せを意味する。好ましくは、二次抗体がＩ−２抗原の一次抗体への結合と競合しないことを、当業者は理解する。二次抗体は、Ｉ−２ポリペプチドに特異的に結合する抗体の任意のエピトープに結合し得る。特に有用な二次抗体は、一次抗体のクラス決定部分に対する特異性を有する、抗ＩｇＡまたは抗ＩｇＧ抗体である。有用な二次抗体は、サンプルが得られた種に特異的である。例えば、ヒト血清が評価されるサンプルである場合、マウス抗ヒトＩｇＡまたはＩｇＧは、有用な二次抗体であり得る。本発明の方法に有用であり得る異なる抗体の組み合わせはまた、用語、二次抗体の意味の内に含まれる。但し、組合せのうちの少なくとも１つの抗体が、Ｉ−２ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合する。
【００５５】
本明細書中に使用される場合、用語「クラス決定部分」は、二次抗体に関して使用される際、アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を決定する抗体の重鎖定常領域配列を意味する。従って、例えば、ＩｇＡ分子のクラス決定部分に対する特異性を有する二次抗体は、他の抗体アイソタイプに優先してＩｇＡに結合する。
【００５６】
本発明で有用な二次抗体は、商業的にか、または当該分野で周知の技術によって入手され得る。このような抗体は、ポリクローナル、または好ましくはモノクローナル抗体であり得る。例えば、ＩｇＧ反応性ポリクローナル抗体は、本明細書中で参考として援用されるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）で記載されたように、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはげっ歯類のような動物の抗血清において、抗体の産生を刺激するために、ＩｇＧまたはＩｇＧのＦｃフラグメントを免疫原として使用して調製され得る。特定の抗原エピトープに結合し得るイディオトープの１つの種のみを含む抗体分子の集団であるモノクローナル二次抗体はまた、慣用的な方法（例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８を参照のこと）によって産生され得るか、または商業的に入手され得る。
【００５７】
「検出可能な二次抗体」という用語は、分析的方法によって検出または測定され得る、上記で定義したような二次抗体を意味する。従って、二次抗体という用語は、検出または測定され得る検出可能なマーカーで直接または間接的に標識され、そして酵素結合イムノソルベント検定法、ラジオイムノアッセイ、放射状免疫拡散アッセイ、またはウェスタンブロッティングアッセイのような簡便なアッセイで使用される抗体を含む。二次抗体は、例えば酵素、放射性同位元素、蛍光色素、または化学発光マーカーで標識され得る。さらに、検出可能なマーカーが二次抗体に結合するように、二次抗体を、ビオチン−アビジン結合を用いて検出可能にし得る。しかし、二次抗体の標識化は、二次抗体のＩ−２ポリペプチドへの結合を損なってはならない。所望される場合には、複数の抗体系を、上記で議論したような二次抗体として使用し得る。そのような系では、少なくとも１つの抗体が１次抗Ｉ−２抗体に結合し得、そして少なくとも１つの抗体が分析的方法によって容易に検出または測定され得る。
【００５８】
二次抗体を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、またはウレアーゼのような酵素で標識することによって検出可能にし得る。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば色素生産性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用され得、ＴＭＢは、過酸化水素の存在下で４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出可能な可溶性産物を産生する。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば色素生産性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートと共に使用され得、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって容易に検出可能な可溶性産物を産生する。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、色素生産性基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に使用され得、ＯＮＰＧは、４１０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出され得る可溶性産物を産生する。または、ウレアーゼ検出系は、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のような基質と共に使用され得る。二次抗体を、当該分野で周知の方法によって酵素に結合し得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）か、または多くの商業的供給源から入手され得る。例えば、ヤギＦ（ａｂ’）2抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入され得る、有用な検出可能な二次抗体である。
【００５９】
二次抗体をまた、蛍光色素で標識することによって検出可能にし得る。そのような蛍光色素は、光または他のエネルギー源による励起の後、紫外または可視波長の光を放射する。例えばＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、またはリサミンが、二次抗体に結合し得、そして複合体の存在または不在を検出するために使用され得る蛍光色素である。特に有用な蛍光色素は、フルオレセインまたはローダミンである。これらまたは他の適切な蛍光色素を結合体化および使用する方法は、例えば、Ｖａｎ ＶｕｎａｋｉｓおよびＬａｎｇｏｎｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第７４巻、パートＣ（１９９１）に記載されている（これは本明細書中で参考として援用される）。蛍光色素に結合した二次抗体も、商業的供給源から入手され得る。例えば、ヤギＦ（ａｂ’）2抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣは、Ｔａｇｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手可能である。
【００６０】
二次抗体はまた、化学発光マーカーで標識され得る。そのような化学発光二次抗体は、Ｉ−２ポリペプチドを含む複合体の、高感度の非放射活性検出のために都合良く、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）のような種々の供給源から商業的に入手され得る。
【００６１】
二次抗体をさらに、放射性同位元素で標識することによって検出可能にし得る。ヨウ素−１２５標識二次抗体は、特に有用な検出可能な二次抗体である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８を参照のこと）。
【００６２】
検出可能な二次抗体からのシグナルを、例えば色素生産性基質からの色を検出するための分光光度計；特定波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光計；またはヨウ素−１２５を検出するガンマカウンターのような、放射線を検出するための放射線カウンターを用いて分析し得る。酵素結合二次抗体の検出のために、例えばＥＭＡＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）のような分光光度計を、製造会社の指示に従って用いて、定量的分析を行い得る。所望される場合には、本発明のアッセイは、自動化され得るか、または自動装置（ｒｏｂｏｔｉｃａｌｌｙ）によって行い得、そして複数のサンプルからのシグナルを同時に検出し得る。
【００６３】
本発明のアッセイは、本明細書中で参考として援用される、Ｄａｖｉｄらに対して１９８３年３月８日に発行された米国特許第４，３７６，１１０号に記載されたように、順方向、逆方向、または同時であり得る。順方向アッセイでは、各試薬を連続的に本発明のＩ−２ポリペプチドに接触させる。所望される場合には、未結合試薬からの結合試薬の分離を、次の試薬を加える前に行い得る。逆方向アッセイでは、全ての試薬をＩ−２ポリペプチドと接触させる前に前もって混合する。改変逆方向アッセイが、本明細書中で参考として援用される、Ｅｌ Ｓｈａｍｉらに対して１９８８年１０月１８日に発行された米国特許第４，７７８，７５１号に記載されている。同時アッセイでは、全ての試薬を別々であるが同時期に本発明のＩ−２ポリペプチドと接触させる。試薬は、本発明のアッセイを実施するのに有用なあらゆる成分、例えばサンプル、Ｉ−２ポリペプチド、検出可能な二次抗体、洗浄緩衝液または他の溶液である。
【００６４】
複合体からの結合していない二次抗体の除去を含む、本明細書中で記載された種々のアッセイ形式の分離工程は、当該分野で公知の方法によって実施し得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）。例えば、適切な緩衝液による洗浄に続いて、ろ過、吸引、または磁気分離を行い得る。Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントが微小粒子のような粒状支持体に固定化されている場合、その粒子材料を遠心分離し得、所望される場合には続いて洗浄液の除去を行い得る。Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントが膜、フィルターまたはウェルに固定化されている場合、真空または液体吸着装置をその膜、フィルター、ウェルの反対側に適用して、複合体から洗浄液を除去し得る。
【００６５】
本発明はまた、サンプルを個体から得ること；サンプルをＩ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントと、Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントとＩ−２ポリペプチドに対する抗体との複合体を形成するに適切な条件下で接触させること；そして複合体の存在または不在を検出することによって、個体のＩＢＤに対する感受性を決定する方法を提供する。ここで、複合体の存在は、その個体がＩＢＤに感受性であることを示す。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、「個体」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラットまたはマウスを含む、炎症性腸疾患を有し得るあらゆる動物を意味するが、但しこの動物は、本明細書中で開示される臨床的、内視鏡的、および組織病理学的パラメーターで定義されるような炎症性腸疾患を有さない。本発明の方法によってアッセイされるサンプルは、そのようなあらゆる個体から入手され得る。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、Ｉ−２ポリペプチドとＩ−２ポリペプチドに対する抗体との複合体の存在によって示されるような、「ＩＢＤに対する感受性の増加した」という用語は、Ｉ−２ポリペプチドまたはその免疫反応性フラグメントと接触させた時に複合体を形成しないサンプルが得られる個体と比べて、ＩＢＤを引き起こす因子に対して抵抗する能力が減少していることを意味する。個体における増加したＩＢＤに対する感受性の増加は、必ずしもその個体がＩＢＤを発症することを意味しない。しかし、個体における増加したＩＢＤに対する感受性の増加は、将来ＩＢＤを有する可能性の増加と関連する。
【００６８】
Ｉ−２ポリペプチドを参照して使用する場合、「免疫反応性フラグメント」という用語は、抗Ｉ−２抗体陽性サンプルがＩ−２ポリペプチドと複合体を形成する能力によって定義されるような免疫反応性を有する、Ｉ−２ポリペプチドのペプチドまたはポリペプチド部分を意味する。従って、本明細書中で使用する場合、「Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメント」という用語は、配列番号２として提供されたアミノ酸配列の一部分と実質的に同じアミノ酸配列、およびクローン病患者由来のＩ−２反応性血清サンプルのような、抗Ｉ−２抗体陽性サンプルと複合体を形成する能力によって定義されるような免疫反応性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。一般的に、免疫反応性フラグメントは、Ｉ−２ポリペプチドの約３アミノ酸から全長までを有する。Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントは、例えば少なくとも５、８、１０、１２、１５、１８、２０、または２５アミノ酸を有し得る。例えば、Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントは、５〜５０アミノ酸、８〜５０アミノ酸、または１０〜５０アミノ酸であり得る。より好ましくは、免疫反応性フラグメントは、８〜２０アミノ酸または１０〜２０アミノ酸を有する。最も好ましくは、免疫反応性フラグメントは、１２〜２０アミノ酸または１５〜２０アミノ酸を有する。
【００６９】
Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントは、Ｉ−２反応性サンプル、例えばＩ−２反応性ＣＤ患者血清サンプルと複合体を形成する能力によって同定され得る。例えば、Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントは、Ｉ−２反応性ＣＤ血清と接触させた場合に複合体を形成する能力によって同定され得る。抗原と抗Ｉ−２血清サンプルとの間の複合体形成についてのアッセイは、本明細書中で開示される。ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントを同定するのに特に有用であり得る（実施例ＩＩＢを参照のこと）。
【００７０】
ＩＢＤと関連する微生物配列の同定は、ＩＢＤの病因における微生物を含意し、そして炎症性腸疾患を改善する有益な試薬を提供する。さらに、本明細書中で開示されるように、Ｉ−２ポリペプチドは、ＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチド（配列番号２）に反応したマウスＴ細胞の増殖によって示されるように、Ｔ細胞応答を誘発し得、Ｉ−２ポリペプチド抗原が炎症性腸疾患の病因に寄与し得ることを示す。ＩＢＤ関連Ｉ−２配列の同定および単離に基づいて、ＩＢＤを有する患者において寛容を誘導する方法、および健康な個体においてＩＢＤを予防する方法が提供される。
【００７１】
従って、本発明は、ＩＢＤを有する患者に、有効用量のＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントを投与することによって、炎症性腸疾患を有する患者において寛容を誘導する方法を提供する。本発明の方法は、クローン病を有する患者を治療するのに特に有用であり得る。寛容を誘導する本発明の方法において、投与されるＩ−２ポリペプチドは、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、「炎症性腸疾患を有する患者」という用語は、クローン病または潰瘍性結腸炎を有する患者を意味する。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、「有効用量」という用語は、ＩＢＤを有する患者において寛容を誘導するのに有用なＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントの量を意味する。経口的寛容の誘導のために、例えば複数の少ない経口用量が投与されても、または多い用量が投与されても良い。そのような用量は、例えば動物モデルにおける寛容の誘導から推定され得る（例えばＴｒｅｎｔｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１７２７−１７３０（１９９３）を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される）。
【００７４】
寛容を誘導のためのＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントの有効用量は、当該分野で周知の方法によって投与され得る。経口的寛容は、当該分野で自己免疫疾患を処置する方法として十分に認識されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５３−５８頁（９月１５日、１９９５）を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される）。例えば、経口投与された自己抗原は、いくつかの実験的自己免疫モデルを、疾患および抗原特異的な方法で抑制する。その疾患としては、実験的自己免疫脳脊髄炎、ブドウ膜炎、および筋無力症、コラーゲンおよびアジュバント誘発性関節炎、およびＮＯＤマウスにおける糖尿病が挙げられる（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：８０９−８３７（１９９４）を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される）。さらに、経口的寛容の臨床試験は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、およびブドウ膜炎の処置においてポジティブな結果を生じた。さらに、Ｉ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントの非経口投与を、寛容を誘導するために使用し得る。例えば、皮下注射を、Ｉ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントを、ＩＢＤ患者、例えばクローン病を有する患者に送達するために使用し得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３６（補遺）：Ｓ１１５−Ｓ１１７（１９９４）、これは本明細書中で参考として援用される）。
【００７５】
本発明のＩ−２ポリペプチドを参照して使用する場合、「寛容原性フラグメント」という用語は、単独または別の分子と組み合わせてかのいずれかで、減少した免疫学的応答を生じるその能力によって定義されるような寛容原性活性を有するポリペプチドのペプチドまたはポリペプチド部分を意味する。従って、Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、配列番号２の一部分と実質的に同じアミノ酸配列を有し、そして単独または別の分子と組み合わせてかのいずれかで、減少した免疫学的応答を生じるその能力によって定義されるような寛容原性活性を有する、ペプチドまたはポリペプチドである。Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、約３アミノ酸〜約９０アミノ酸を有し得る。Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、例えば少なくとも５、８、１０、１２、１５、１８、２０、または２５アミノ酸を有し得る。例えば、Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、５〜５０アミノ酸、８〜５０アミノ酸、または１０〜５０アミノ酸を有し得る。より好ましくは、寛容原性フラグメントは、８〜２０アミノ酸または１０〜２０アミノ酸を有する。最も好ましくは、寛容原性フラグメントは１２〜２０アミノ酸または１５〜２０アミノ酸を有する。
【００７６】
Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌アッセイのようなインビトロアッセイ、および炎症性腸疾患のマウスモデルにおける寛容の誘導のようなインビボアッセイを含む、種々のアッセイを用いて同定され得る。例えば、Ｔ細胞増殖アッセイは、寛容原性活性の予測として当該分野で十分に認識されている（例えばＭｉｙａｈａｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：１１０−１１５（１９９５）またはＬｕｎｄｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１８７−１９６（１９９３）を参照のこと、これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される）。Ｔ細胞増殖アッセイは、Ｔ細胞を、正常脾臓細胞のような照射した抗原提示細胞と、マイクロタイターウェル中で３日間、アッセイされる種々の濃度のＩ−２ポリペプチドのフラグメントと共に培養すること；3Ｈ−チミジンを添加すること；およびＤＮＡへの3Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによって行い得る。そのようなアッセイにおいて、Ｉ−２ポリペプチドのフラグメントを、例えば２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌの濃度で活性を試験し得る。
【００７７】
Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、当該分野で公知のＴ細胞サイトカイン分泌アッセイを用いて同定し得る。例えば、Ｔ細胞を、照射した抗原提示細胞と共に、種々の濃度の目的のフラグメントを有するマイクロタイターウェル中で培養し得、そして３日後にその培養上清を、本明細書中で参考として援用されるＣｚｅｒｉｎｓｋｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１９：５−２２（１９９１）で記載されたように、ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＦＮ−γに関してアッセイし得る。
【００７８】
Ｔ細胞増殖アッセイまたはサイトカイン分泌アッセイに使用する一次Ｔ細胞は、例えば固有層または末梢血から単離し得る。さらに、寛容原性活性に関するインビトロアッセイに使用するＴ細胞の簡便な供給源は、クローン病患者のようなＩＢＤ患者から、ＩＢＤのマウスモデルから、または本発明のＩ−２ポリペプチドで免疫した健康動物から確立したＴ細胞株であり得る。Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントを同定するのに使用する好ましいＴ細胞の供給源は、クローン病患者である。
【００７９】
Ｔ細胞株を、ＣＤまたはＵＣを有する患者から、例えばＴリンパ球を約１μｇ／ｍｌの組換えＩ−２ポリペプチドまたはＧＳＴ−Ｉ−２と、低濃度の増殖支持ＩＬ−２（約１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養することによって確立し得る。本明細書中で参考として援用される、Ｎａｎｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：２９７−３０２（１９９２）で記載されたように、Ｔ細胞株を、Ｔリンパ球を抗原提示細胞とともに培養すること、および細胞に４〜５日サイクルで交互にＩＬ−２およびＩ−２ポリペプチドまたはＩＬ−２単独のいずれかを供給することによって確立し得る。Ｉ−２ポリペプチドの存在に依存して、信頼性良く増殖する細胞株へと発達する細胞株は、Ｉ−２の寛容原性フラグメントを同定するのに特に有用である。小腸粘膜からのＴ細胞株の確立が、例えば、Ｌｕｎｄｉｎら、前出、１９９３に記載されている。Ｉ−２ポリペプチドの存在に依存し、そしてＩ−２寛容原性フラグメントを同定するのに有用なＴ細胞株を同様に調製し得る。
【００８０】
Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントをまた、減少した免疫学的応答で示されるような、インビボで寛容を誘導するその能力によって同定し得る。減少した免疫学的応答は、上記で記載したような減少した増殖応答またはサイトカイン分泌応答のような減少したＴ細胞応答、または抗原に対する減少した抗体力価であり得る。新生仔または成体のマウスを、例えばＩ−２ポリペプチドのフラグメントで寛容化し得、そしてＴ細胞応答または抗Ｉ−２ポリペプチド抗体力価を、免疫による抗原投与の後アッセイし得る。例えば、新生仔マウスを、誕生から４８時間以内に、不完全フロイントアジュバントで乳化した約１００μｇのＩ−２ポリペプチドフラグメントの腹腔内投与によって寛容化し、そして続いて約８週齢で、Ｉ−２ポリペプチドで免疫し得る（例えば、Ｍｉｙａｈａｒａ、前出、１９９５を参照のこと）。成体マウスを、約０．３３ｍｇのＩ−２ポリペプチドフラグメントを３日間毎日静脈内投与して寛容化（全用量１ｍｇ）し、そして１週間後Ｉ−２ポリペプチドで免疫し得る。寛容原性活性を示す、減少した増殖またはサイトカイン分泌のような減少したＴ細胞応答を、免疫から１０日後に採取したＴ細胞を用いて測定し得る。さらに、寛容原性活性をも示す減少した抗Ｉ−２ポリペプチド抗体力価を、免疫から４〜８週間後に採取した血液を用いてアッセイし得る。Ｔ細胞応答または抗Ｉ−２ポリペプチド抗体力価をアッセイする方法は、上記で記載され、そして当該分野で周知である。
【００８１】
Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントはまた、炎症性腸疾患のマウスモデルを用いて同定され得る。ＩＢＤ様疾患を有する新生仔または成体のマウスを、上記で記載したようにＩ−２ポリペプチドのフラグメントで寛容化し得、そしてＴ細胞応答または抗Ｉ−２ポリペプチド抗体力価をアッセイし得る。減少したＴ細胞応答または抗原に対する減少した抗体力価は、減少した免疫学的応答を示し、そして従って、Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントを同定するために役立つ。さらに、Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、ＩＢＤのマウスモデルにおいて結腸炎の頻度、発症の時間または重症度を低下させる能力によって同定され得る。
【００８２】
いくつかのよく受け入れられた炎症性腸疾患のマウスモデルが、本発明のＩ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントを同定するのに有用であり得る。例えば、Ｇタンパク質Ｇｉ２のαサブユニットをコードする遺伝子の標的破壊を有するマウスは、ヒト腸疾患の特徴を示す周知のモデルである（Ｈｏｒｎｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１０６８−１０７７（１９９７）；Ｒｕｄｏｌｐｈら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１４３−１５０（１９９５）（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。本明細書中で参考として援用されるＫｕｅｈｎら、Ｃｅｌｌ ７５：２６３−２７４（１９９３）で記載されたようなＩＬ−１０欠損マウス、および本明細書中で参考として援用されるＳａｄｌａｃｋら、Ｃｅｌｌ ７５：２５３−２６１（１９９３）で記載されたようなＩＬ−２欠損マウスもまた、結腸炎様の疾患を有し、そして本発明のＩ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントを同定するのに有用である。さらに、本明細書中で参考として援用されるＭｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｃｅｌｌ ７５：２７５−２８２（１９９３）で記載されたような、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）α、ＴＣＲβ、ＴＣＲβ×σ、またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）に変異を有するマウスは、炎症性腸疾患を発現し、そして従って、Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントを同定するのに有用である。同様に、本明細書中で参考として援用されるＰｏｗｒｉｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：５５３−５６２（１９９４）で記載されたような、炎症性腸疾患のよく受け入れられたモデルである、ＣＤ４５ＲＢ ＣＤ４+Ｔ細胞で再構成したＳＣＩＤマウスで、フラグメントを寛容原性活性に関してアッセイし得る。ＩＢＤのさらなる動物モデルもまた、当該分野で周知である（例えばＰｏｄｏｌｓｋｙ、Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｂｅｌｇ．６０：１６３−１６５（１９９７）；およびＢｒｅｇｅｎｈｏｌｔら、ＡＰＭＩＳ １０５：６５５−６６２（１９９７）を参照のこと（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。従って、Ｉ−２ポリペプチドの寛容原性フラグメントは、本明細書中で開示されるインビトロもしくはインビボでのアッセイによって、または当該分野で周知の別のアッセイによって容易に同定され得る。
【００８３】
Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントまたは寛容原性フラグメントは、目的のペプチドのまたはランダムペプチドの、大きなコレクションまたはライブラリーを、免疫反応性または寛容原性活性に関してスクリーニングすることによって同定し得る。例えば、Ｉ−２ポリペプチドの全配列にわたるペプチドのパネルを、上記で記載したように免疫反応性または寛容原性活性に関してスクリーニングし得る。そのようなパネルは、本明細書中で参考として援用されるＧｅｙｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１１８４（１９８７）で記載されたような、Ｍｉｍｏｔｏｐｅ切断可能ピン技術（Ｍｉｍｏｔｏｐｅ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いた、それぞれ３残基または５残基のずれで重複する、Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）の配列にわたる１５マーペプチドのパネルであり得る。続いて、パネルを、上記で記載したアッセイのうちの１つを用いて免疫反応性または寛容原性活性に関してスクリーニングする（例えば、Ｍｉｙａｈａｒａら、前出、１９９５を参照のこと（これは本明細書中で参考として援用される））。スクリーニングされるペプチドのライブラリーはまた、配列番号２のアミノ酸配列と関連するが、配列番号２とは異なる１つ以上のアミノ酸を有するペプチドの集団であり得る。
【００８４】
スクリーニングされるさらなるペプチドは、例えば、ペプチドおよびペプチド模倣物分子の、タグ化された化学的ライブラリーを含む。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ技術によって産生されたペプチドライブラリーを含む。ファージディスプレイ技術は、ファージ表面におけるペプチド分子の発現、ならびにタンパク質リガンドをそれをコードする核酸と結合しているか、またはそれと結合させ得る他の方法論を含む。発現されるペプチドの集団を多様化させるベクターおよび方法を含む、ファージディスプレイライブラリーの産生方法は、当該分野で周知である（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７（１９９３）；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０（１９９０）；およびＨｕｓｅ、第ＷＯ９１／０７１４１号および第ＷＯ９１／０７１４９号を参照のこと（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。これらまたは他の周知の方法を、免疫反応性または寛容原性活性に関して、例えば、開示されたアッセイのうちの１つでスクリーニングされ得る、ファージディスプレイライブラリーを産生するのに使用し得る。所望される場合には、ペプチドの集団を活性に関してひとまとめにアッセイし得る。例えば、Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントを同定するために、ペプチドの集団を、抗Ｉ−２ポリペプチド反応性を含むサンプルと複合体を形成する能力に関してアッセイし得る；活性な集団をさらに分けて、そして集団から免疫反応性フラグメントを単離するためにアッセイを繰り返す。
【００８５】
Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性フラグメントまたは寛容原性フラグメントはまた、例えば化学的切断またはタンパク質分解切断によって産生されたポリペプチドのフラグメントをスクリーニングすることによって同定され得る。化学的切断方法およびタンパク質分解切断方法、ならびに得られたタンパク質フラグメントの精製方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１８２巻、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照のこと（これは本明細書中で参考として援用される））。例えば、臭化シアンのような化学物質、またはトリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−ＣもしくはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎのようなプロテアーゼを、本明細書中で開示されたアッセイのうちの１つを用いて免疫反応性または寛容原性活性に関してスクリーニングされ得る、Ｉ−２ポリペプチドの簡便なフラグメントを産生するために使用し得る。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、「フラグメント」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、または天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸もしくは化学的に修飾したアミノ酸を含む化合物を意味する。Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性または寛容原性フラグメントはまた、ペプチド模倣物が本明細書中で定義されたような免疫反応性または寛容原性活性を保持するならば、ペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物は、アミノ酸配列を有するペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造物である。そのような模倣物は一般的に、そのペプチド対応物で見出されるものと同じ空間的配置で、大きさ、電荷、または疎水性のような同様の物理的特徴を示すものとして特徴付けられる。ペプチド模倣物の特定の例は、１つ以上のアミノ酸間のアミド結合が、例えば、炭素−炭素結合または当該分野で周知の他の結合で置換されている化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９５）を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される））。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、他に述べなければ、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を含む、天然に存在する２０個のアミノ酸のうちの１つをいう。アミノ酸という用語はまた、アミノ酸アナログ、ノルロイシンのような通常タンパク質には組み込まれない天然に存在するアミノ酸を含む化学的に修飾されたアミノ酸のような化合物、およびその化合物が免疫反応性または寛容原性活性を保持するようにペプチド中で置換され得るならば、アミノ酸に特有であると当該分野で公知である特性を有する化学的に合成された化合物のような化合物をいう。アミノ酸およびアミノ酸アナログの例は、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）に列挙されている。これは本明細書中で参考として援用される。アミノ酸はまた、アミノ酸模倣物であり得る。アミノ酸模倣物は、アミノ酸と実質的に同じ官能基の空間的配置を示すが、アミノ酸に特有のα−アミノ基およびα−カルボキシル基の両方を必ずしも有すわけではない構造物である。
【００８８】
Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性または寛容原性フラグメントを、当該分野で周知の方法を用いて産生または合成し得る。そのような方法は、組換えＤＮＡ方法およびペプチド産生のための化学的合成方法を含む。適切な宿主細胞におけるペプチドをコードする核酸配列の発現によってペプチドを産生する組換え方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１巻〜第３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）で記載されている。これは、本明細書中で参考として援用される。Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子の配列は、本明細書中で配列番号１として開示されている。
【００８９】
Ｉ−２ポリペプチドの免疫反応性または寛容原性フラグメントはまた、化学的合成、例えば本明細書中で参考として援用されるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６４）の固相ペプチド合成方法によって産生され得る。当該分野で周知の標準溶液方法も、本発明で有用な免疫反応性または寛容原性フラグメントを合成するために使用され得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４）およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）を参照のこと（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。新しく合成したペプチドを、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し得、そして例えば、質量分析法またはアミノ酸配列分析を用いて特徴付けし得る。
【００９０】
本発明はまた、Ｉ−２ポリペプチドを含み、そしてＩＢＤを有する患者で寛容を誘導するのに有用な寛容原性組成物を提供する。特に、本発明は、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有するＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントを、寛容化（ｔｏｌｅｒｏｇｉｚｉｎｇ）分子と組み合わせて含む組成物を提供する。本発明の組成物では、Ｉ−２ポリペプチドは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。本発明の組成物で有用な寛容原性フラグメントは、例えば、配列番号２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を有し得る。
【００９１】
種々の分子が、当該分野で寛容を引き起こす、促進する、または増強すると知られている。例えば、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，２６８，４５４号およびその中の引用を参照のこと。本明細書中で使用する場合、「寛容化分子」という用語は、本発明のＩ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントと組み合わせた場合に、寛容原性活性を引き起こす、促進する、または増強する、分子、化合物またはポリマーを意味する。寛容化分子は、例えば、Ｉ−２ポリペプチドに結合体化され得る。そのような寛容化分子は、例えばポリエチレングリコールを含み、そして当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，２６８，４５４号、前出を参照のこと）。
【００９２】
本発明はまた、有効用量のＩ−２ポリペプチドまたはその寛容原性フラグメントを個体に投与することによって、個体におけるＩＢＤを予防する方法を提供する。本発明の方法は、ＩＢＤに対する罹患しやすさが増大した個体において、ＩＢＤ、例えばクローン病を予防するのに特に有用である。そのような方法は、有効用量の抗原または寛容原性フラグメントが新生仔個体に投与される場合、ＩＢＤを予防するのに特に有用であり得る。
【００９３】
腸内細菌が、いくつかの疾患の病因において役割をはたしていることが示された。例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、消化性潰瘍疾患の病因に関わっており、そしてＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗生物質を、この疾患を有効に処置するために使用し得る（例えば、Ｓｏｎｔａｇ、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９２：１２５５−１２６１（１９９７）；およびＰｉｐｋｉｎら、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ ２：１５９−１７１（１９９７）を参照のこと（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。クローン病では、腸の炎症は、その抗生物質に対する頻繁な応答性、および細菌糞便流（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｅｃａｌ ｆｌｏｗ）へのなりやすさに関して注目に値する（Ｇｕｉら、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：３９３−４００（１９９７）；Ｐｒａｎｔｅｒａら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９１：３２８−３３２（１９９６）；およびＪａｎｏｗｉｔｚら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ．Ｄｉｓ．４：２９−３９（１９９８）（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。通常の腸居住物（ｃｏｌｏｎｉｓｔ）および新規病原体が、直接の検出によって、または疾患に関連した抗微生物免疫応答によって、ＣＤに関係していた（Ｂｌａｓｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８７：８８８−８９４（１９８４）；Ｅｌｓａｇｈｉｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：５０３−５０８（１９９２）；Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３：１０５−１１４（１９９８）；Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３１６：１６６（１９９８）（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される）；およびＳｅｎｄｉｄら、前出、１９９６）。さらに、慢性結腸炎のほとんどの動物モデルで、管腔の微生物は、疾患に必要な補助因子である。食物抗原もまた、ＩＢＤの病因に関係していた（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｇｕｔ ３１：１０３７−１０４０（１９９０）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１４７−１４８（１９７９）；およびＫｎｏｆｌａｃｈら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９２：４７９−４８５（１９８７）（これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される））。大規模な研究にも関わらず、病因となる生物は同定されないままである。
【００９４】
本明細書中で開示されるように、クローン病患者の炎症病巣に存在する結腸の微生物は、Ｉ−２ポリペプチド抗原（配列番号２）をコードする核酸配列を含む。この知見に基づいて、微生物を単離し、そしてこの生物の生存率または増殖を低下させる薬剤を発見するために使用して、それによってクローン病に寄与している免疫刺激を減少させ、そしてこの疾患の症状を改善し得る。
【００９５】
従って、本発明は、炎症性腸疾患を処置するのに有用な薬剤を同定する方法を提供する。その方法は、炎症性腸疾患を有する患者から腸内微生物の標本を得る工程；標本からＩ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含む微生物種を単離する工程；その微生物種を薬剤と接触させる工程；および薬剤の不在下での増殖または生存率と比較して、微生物種の低下した増殖または生存率に関してアッセイする工程を含む。ここで、微生物種の低下した増殖または生存率は、その薬剤が炎症性腸疾患を処置するのに有用な薬剤であることを示す。本発明の方法は、抗生物質である薬剤をスクリーニングするのに、そしてクローン病の処置のための治療する薬剤を同定するのに特に有用であり得る。当業者は、本発明の方法で薬剤と接触させる微生物種が、単一の微生物種、または２つ以上の微生物種の混合物であり得ることを理解する。ここで、少なくとも１つの種は、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００９６】
Ｉ−２ポリペプチドをコードしている核酸分子を有する微生物種は、実施例ＩＶで述べているように、そのＩ−２陽性微生物を、種々の培地を用いることや、好気的あるいは嫌気的条件下での培養によって単離できる。単離された微生物にＩ−２配列が存在するか否かを確かめるために、例えばＰＣＲ解析などを用いてさらにスクリーニングを行う。代表的な培養条件は図７で示すとおりである。
【００９７】
本明細書中で使用されているように、「薬剤」なる用語は、単体あるいは複合有機分子、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、またはオリゴヌクレオチドなどのような生物学的、化学的化合物を意味している。
【００９８】
本発明の本方法で同定された薬剤は、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を有する微生物種の生存率または増殖を低下させる。このように、ＩＢＤの治療に有用な薬剤は、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を有する微生物種を死滅させるか、または増殖スピードを抑制する機能を有する薬剤であり得る。ＩＢＤ治療に有用な薬剤は、微生物もしくは植物によって産生される分子、またはそのような分子の化学誘導体である、細菌に対する抗生物質などの静菌剤または殺菌剤で、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を有する微生物の増殖や生存率を抑制し得るものであり得る。当業者は、種々の機構によって、例えば、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を有する微生物のタンパク質合成阻害、ＤＮＡ合成阻害、細胞壁合成阻害、またはその微生物種に必要な基本的栄養素の合成の抑制によってＩＢＤ治療に有用な薬剤が機能し得ることを理解する。このような薬剤は、選択的にＩ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を有する特定の微生物種の生存率や増殖を抑制し得る。ＩＢＤ治療に有用な薬剤はまた、微生物に対する広い抗菌スペクトルを有し、その増殖または生存を抑制する活性を有し得る。当業者は、より好ましくは、ＩＢＤ治療に有効な薬剤が、哺乳動物細胞、特にヒト細胞に対して、その増殖や生存率に大きな変化を及ぼすことなく、Ｉ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を有する微生物種の増殖または生存率を抑制することを理解する。
【００９９】
本明細書中で使用されている場合、「ＩＢＤを処置する際に有用な薬剤」とは、炎症性腸疾患の１つ以上の症状の重症度、頻度、または発症時間を減少させる薬剤を意味している。
【０１００】
炎症性腸疾患の動物モデルが知られているにもかかわらず、これらの動物モデルはヒトＩＢＤと関連している抗原を含まない。ＩＢＤ関連Ｉ−２ポリペプチド抗原（配列番号２）の単離が開示されたこと、およびマウスＴ細胞がこの抗原に対して反応性があるという実証（実施例ＩＩＩを参照のこと）に基づいて、本発明は、新規のＩＢＤ動物モデルを提供する。この動物モデルの疾患はヒトの疾患と関連のある、Ｉ−２抗原によって開始される。従って、優れたＩＢＤ動物モデルは、抗生物質、抗炎症剤、および他の薬剤を含む新しいＩＢＤ治療法を同定するために提供される。
【０１０１】
特に、本発明は１つあるいは症候群としてＩＢＤの症状を示すヒト以外の動物に対してＩ−２ポリペプチドを投与すること、その非ヒト動物に薬剤を投与すること；ＩＢＤに特徴的な１つ以上の症状の重症度を分析し、コントロールのレベルと比較して１つ以上の症状のレベルが軽減していればその薬剤がＩＢＤを処置する際に有用な薬剤であることを示すことによって、炎症性腸疾患を処置する際に有用な薬剤を同定する方法を提供する。本発明の本方法を、例えばクローン病治療に有用な薬剤を同定するために使用し得る。投与されるＩ−２ポリペプチドは、例えばそのアミノ酸配列（配列番号２）を有し得る。本発明の本方法において特に有用な、ヒト以外の動物は、例えばＧαｉ２、ＴＣＲαまたはＩＬ−１０欠損マウスであり得る。
【０１０２】
先に示したように、「薬剤」なる用語は、単体あるいは複合有機分子、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、またはオリゴヌクレオチドなどのような生物学的、化学的化合物を意味している。薬剤は、例えば抗生物質や抗炎症剤であり得る。
【０１０３】
本発明の方法は、抗原性誘発因子に応答して炎症性腸疾患の１つ以上の症状を示し得る、ヒト以外の動物の使用、に依存している。ヒト以外の霊長類、ラットまたはマウスのＩＢＤモデルも含めて、ヒト以外のいかなる疾患動物モデルも本発明の本方法において有用であり得る。当該分野で周知の種々のＩＢＤマウスモデルが、本発明において特に有用であり得る（例として、Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，前出，１９９７；Ｂｒｅｇｅｎｈｏｌｔら、前出，１９９７を参照のこと）。このようなマウスモデルは本明細書で既に述べたモデル、例えばＧαｉ２欠損マウス（Ｇαｉ２−／−；Ｒｕｄｏｌｐｈら、前出，１９９５）、ＩＬ−１０欠損マウス（ＩＬ−１０−／−；Ｋｕｈｎら、前出，１９９５）、ＴＣＲα欠損マウス（ＴＣＲα−／−）；ＴＣＲβ欠損マウス（ＴＣＲβ−／−）、ｋｅｒａｔｉｎ８欠損マウス、ＩＬ−２欠損マウス（ＩＬ−２−／−；Ｓａｄｌａｃｋ，前出，１９９３）およびＣＤ４５ＲＢ ＣＤ４+Ｔ細胞を再構成されたＳＣＩＤマウス（Ｐｏｗｒｉｅら、前出，１９９４）を含んでいる。本発明の本方法に有用なヒト以外の動物モデルとしてはまた、ヒトＨＬＡ−２７遺伝子（β２−ミクログロブリン遺伝子と共に）の導入遺伝子を発現している動物、または機能的にＮ−カドヘリンをブロックするドミナントネガティブな構築物を発現している動物が挙げられる（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，前出，１９９７）。
【０１０４】
当業者は、ヒト以外の動物モデルにおいてＩＢＤの１つ以上の症状を引き起こすために、本発明のＩ−２ポリペプチドが種々の投与経路で投与され得るということを理解する。この疾患のヒト以外の動物モデルにおいてＩＢＤの１つ以上の症状を引き起こすために好ましいＩ−２ポリペプチド投与方法は、浣腸による投与またはＥ．ｃｏｌｉ．を用いてＩ−２ポリペプチドを発現している細胞成分を投与することである。
【０１０５】
遊離抗原の局所的な投与は、例えばＭａｈｌｅｒら（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：Ｇ５４４−Ｇ５５１（１９９８））が述べているように、浣腸によって達成され得る。Ｉ−２ポリペプチドはまた、マウス結腸に、抗原を保有する微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ．（Ｃａｈｉｌｌら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６５：３１２６−３１３１（１９９７））または別の細菌種（Ｋｕｌｌｂｅｒｇら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６６：５１５７−５１６６（１９９８）：Ｌｉら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６６：５４７７−５４８４（１９９８）；Ｃａｈｉｌｌ，前出，１９９７）をコロニーを形成させることにより投与され得る。ＩＢＤに対するヒト以外の動物モデルにおいて、ＩＢＤの１つ以上の症状はまた、細菌抗原と反応するＴ細胞株を用いて誘導され得る。ここで使用するＴ細胞は結腸炎感受性がある系統のマウスから由来するものである。このようなＴ細胞株は、例えば、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＢｉｒマウスで産生された、Ｅ．ｃｏｌｉ．と反応性のあるＴ細胞株であり得る（Ｃｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：８５５−８６４（１９９８））。Ｃ．Ｂ−１７Ｓｃｉｄ マウスにおいてはまた、自然にかまたは腸内感染のいずれかによって、抗原を保有する細菌のコロニー形成が可能である（Ｋｕｌｌｂｅｒｇら、前出，１９９８；Ｌｉら、前出，１９９８；Ｃｏｎｇら、前出，１９９８）。このようなマウスにＴ細胞株を移入することによって、強力な抗原特異的炎症性腸疾患モデルが得られる（Ｋｕｌｌｂｅｒｇら、前出，１９９８；Ｃｏｎｇら、前出，１９９８）。
【０１０６】
以下の実施例は本発明を例示するものであるが、本発明はこれに制限されるものではない。
【実施例】
【０１０７】
（実施例Ｉ）
（Ｉ−２およびＩ−１標的抗原の同定）
本実施例は、Ｉ−１およびＩ−２ポリペプチドをコードする新規微生物の核酸配列の単離について記述している。
【０１０８】
（Ａ．提示的差異分析（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ））
提示的差異分析（ＲＤＡ）は、感染領域にて特異的に検出されるＤＮＡ配列を同定するために、ＰＣＲを利用したサブストラクションクローニングを用いて行う分析であり、ＣＤ粘膜が関与する場合と関与しない場合とで異なっている配列を調べるために利用される。
【０１０９】
ＲＤＡは基本的に、本明細書中で参考として援用している Ｃｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１８６５−１８６９（１９９４）で記述されているように行った。簡潔に説明すると、クローン病患者の粘膜固有層の潰瘍を伴う部位（ｔｅｓｔｅｒ細胞：テスター細胞）と巨視的に疾患のない部位（ｄｒｉｖｅｒ細胞：ドライバー細胞）からそれぞれ単核細胞を採取、単離し、それぞれの細胞群からＤＮＡを精製した。ＲＤＡを用いて、疾患のない部位由来のＤＮＡ（ｄｒｉｖｅｒ ＤＮＡ）配列を潰瘍のある部位の細胞由来のＤＮＡ（ｔｅｓｔｅｒ ＤＮＡ）から差し引いて、炎症領域で特異的に検出される配列を残した。
【０１１０】
４つの配列が得られ、そのうち２つがヒトの配列であった。それぞれＩ−１とＩ−２と命名した残りの２配列は、ヒト遺伝子のどれとも意味のある相同性を示さなかった。Ｉ−２の核酸配列（配列番号１）およびコードされたポリペプチド（配列番号：２）を図１Ａで示している。Ｉ−１の核酸配列（配列番号３）およびコードされた二つのオープンリーディングフレーム（配列番号４および５）は図１Ｂで示している。
【０１１１】
（Ｂ．保存パラフィン包埋組織サンプルのＰＣＲ分析）
ＣＤ患者、ＵＣ患者、または非ＩＢＤコントロールからのパラフィン包埋組織サンプルに対して、ＰＣＲ分析を行った。簡潔に説明すると、Ｉ−２特異的プライマー ５’−ＣＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣＧ−３’（配列番号９）および５’−ＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＣＡＣＧ−３’（配列番号１０）を用いて、最終濃度４ｍＭ ＭｇＣｌ2を添加し標準的なＰＣＲ条件によってサンプルを増幅した。特に、本反応の組成は、２６．７５ｕｌ Ｈ2Ｏ、５．０μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液、５．０μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ 各ｄＮＴＰをそれぞれ１．０μｌずつ；配列番号：９および１０をそれぞれ１．０μｌずつ；ならびに０．２５μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５μｎｉｔｓ／ｕｌ）であった。反応系は９４℃で５分間インキュベートした後、９４oＣで３０秒、６５oＣで３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして３９サイクル繰り返した。その後、最後に７２℃で５分間、伸長反応を行った。反応系は２％アガロースゲルで、２８５ｂｐのフラグメントが予想されるＩ−２配列とともに分析した。
図３で示すように、Ｉ−２配列（配列番号１）は、ＵＣサンプルやＩＢＤ疾患を示さないサンプルと比較して、ＣＤサンプルにおいて有意により高頻度に存在した。これらの結果からＩ−２ポリペプチド抗原（配列番号２）が炎症性腸疾患、特にクローン病と関連があるということが示される。
【０１１２】
（実施例ＩＩ）
（Ｉ−２ポリペプチドに対するＩＢＤ患者血清および正常血清の異なる反応）
本実施例は、Ｉ−２ポリペプチドに対してクローン病患者の血清が、正常血清とは異なる反応性を示すということを説明している。
【０１１３】
（Ａ．ＧＳＴ−Ｉ−２融合タンパク質）
Ｉ−２の全長をコードしている核酸配列（配列番号１）をＧＳＴ発現ベクターであるｐＧＥＸにクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ．で発現させた後、そのタンパク質をＧＳＴカラムで精製した。精製したタンパク質は、銀染色により、予想される分子量であることが示され、またウエスタン分析において抗ＧＳＴ反応を有していた。
【０１１４】
（Ｂ．ＥＬＩＳＡ分析）
ＥＬＩＳＡ分析はＧＳＴ−Ｉ−２（配列番号２）融合ポリペプチドを用いて、希釈した患者または正常者の血清に対して行われた。反応性はＧＳＴ単独に対する反応性を差し引いて評価された。種々の希釈率のＣＤ血清および正常者からの血清について、ＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチドに対するＩｇＧの反応性を解析した。図４Ａで示されているように、１：１００から１：１０００の希釈率のサンプルで、正常血清と比較して有意に高い、ＣＤ血清の抗Ｉ−２ポリペプチド反応が観察された。これらの結果から、Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）が、クローン病血清に対して、正常血清とは異なる反応性を引き起こすということが示される。
【０１１５】
Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）に対するＵＣ、ＣＤおよび正常血清の血清ＩｇＡの反応性を下記に述べるような方法で解析した。図４Ｂに示すように、カットオフ値＝正常群の平均値＋２×標準偏差という基準を用いたところ、１０例のＣＤ測定値のうち９例が陽性であると判定された。その一方、正常血清サンプルで陽性と判定されたものは皆無だった。さらに、クローン病患者の血清１０例のうち７例でＯＤ450の吸光度測定値が０．３以上を示した。その一方、ＵＣ血清サンプルと正常血清サンプルでＯＤ450が０．３以上を示すものは皆無であった。これらの結果からＩ−２ポリペプチドに対する免疫反応性、特にＩｇＡの免疫反応性をクローン病の診断に使用し得るということが示される。
【０１１６】
基本的に次のような直接的ＥＬＩＳＡ分析によってＩ−２ポリペプチド（配列番号２）に結合するヒトＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を検出した。プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ３；ＤＹＮＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を１００μｌ／ウェルのＧＳＴ−Ｉ−２融合ポリペプチド（ホウ酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．５）で５μｇ／ｍｌに調製）によって一晩、４oＣでコートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗った後、プレートを０．５％ウシ胎児血清アルブミン／ＰＢＳ、ｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１５０μｌ／ウェルずつ添加し、３０分間、室温でブロッキングした。次いで、ブロッキング液を捨て、かわりに１００μｌ／ウェルずつ、１：１００に希釈したクローン病血清、潰瘍性結腸炎血清、または正常コントロール血清を加えた。次いで、プレートを２時間、室温でインキュベートし、前記と同様に洗浄した。アルカリホスファターゼ標識二次抗体［ヤギ 抗ヒト ＩｇＡ（α鎖特異的）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ］をＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈してＩｇＡプレートに添加した。ＩｇＧ反応性を解析するために、アルカリホスファターゼ標識二次抗体［ヤギ 抗ヒト ＩｇＧ（γ鎖特異的）、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ］を添加した。プレートを２時間、室温でインキュベートした後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、さらに３回、Ｔｒｉｓ緩衝化正常生理食塩水（ｐＨ７．５）で洗浄した。基質溶液（１．５ｍｇ／ｍｌリン酸Ｐ−ニトロフェノール二ナトリウム（Ａｒｅｓｃｏ；Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を含有する２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６）を１００μｌ／ウェルずつ添加し１時間、発色反応を進めた。次いで、プレートの各ウェルの４０５ｎｍ吸光度を測定した。
【０１１７】
（Ｃ．組織学的分析）
免疫原として精製ＧＳＴ−Ｉ−２融合タンパク質を用い、ウサギ 抗Ｉ−２抗体を調製する。アガロース支持体（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合しているＧＳＴに対する接着性を利用して、ＧＳＴ結合抗体を解離させ、ＥＬＩＳＡ分析によってウサギ血清の抗Ｉ−２免疫反応性を確認する。
【０１１８】
パラフィン包埋されたＣＤ、ＵＣおよび正常コントロール由来の生検標本からスライド標本を用意する。ヘマトキシリンーエオシンン染色を行い、次にＩ−２特異的抗血清と共にインキュベーションを行う。抗体の結合はペルオキシダ−ゼラベルされた抗ウサギ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出する。この解析はバックグラウンドに対するシグナルおよび、ＣＤ群とコントロール群の間の差異を最大にするように最適化される。
【０１１９】
（実施例ＩＩＩ）
（Ｉ−２ポリペプチドとの、ＣＤ４+Ｔ細胞の反応性）
本実施例は、正常マウス由来Ｔ細胞がＩ−２抗原（配列番号２）に対して反応して増殖することを実証する。
【０１２０】
ＣＤ４+Ｔ細胞を正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離し、以下のようにＩ−２抗原に対するＴ細胞の増殖反応性を解析した。ＣＤ４+Ｔ細胞を用意するために、８−１０週齢の雌性マウスから脾臓を摘出し、細胞懸濁液を調製した。ナイロンウールを用いて細胞集団からＢ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）を除き、さらに抗ＣＤ-８磁気ビーズを用いてＣＤ８+Ｔ細胞を除いた。フローサイトメトリーを用いてＣＤ４+Ｔ細胞懸濁液の純度を測定した。
【０１２１】
ＡＰＣを調製するために、８−１０週齢の雌性マウスから脾臓を摘出し、細胞懸濁液を調製した後、０、２、１０、または１５μｇ／ｍｌのＩ−２ポリペプチドを一晩適用（ｐｕｌｓｅ）した。Ｔ細胞培養に添加する前に、ＡＰＣに３，０００ｒａｄｓの放射線を照射した。抗原特異的なＴ細胞の増殖を解析するために、９６ウェル平底組織培養プレートで、３７oＣ、５％ＣＯ2、加湿空気中で、４×１０5のＣＤ４+Ｔ細胞／ウェルを４×１０5の抗原適用ＡＰＣ／ウェルとともにインキュベートした。種々のインキュベーション時間の後に、０．５μＣｉの［3Ｈ］−チミジンをそれぞれの培養液中に添加しさらに１８時間インキュベートした。細胞を回収し、細胞ＤＮＡに取り込まれた［3Ｈ］−チミジン量をシンチレーションカウンターを用いて測定し増殖を評価した。
【０１２２】
図５で示されているように、Ｉ−２ポリペプチド抗原（配列番号２）は５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの濃度で、Ｔ細胞増殖を刺激する。これらの結果は、ヒト炎症性腸疾患と関連しているＩ−２ポリペプチド（配列番号２）が、マウス細胞に対してＴ細胞反応を惹起し得ることを説明しており、またＩ−２ポリペプチドが炎症性腸疾患の病因解明の手がかりになり得ることを示している。
【０１２３】
（Ｂ．Ｉ−２ポリペプチドに対する応答におけるサイトカイン発現）
調節性Ｔ細胞についての役割はＣＤ４５ＲＢlow細胞、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＢlow細胞、およびＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＢlow細胞に関する研究によって裏付けられている。従って、サイトカイン発現を、Ｉ−２ポリペプチドに対する応答によって分析した。サイトカインアッセイのためにＴ細胞培養集団を使用した。Ｔ細胞増殖アッセイの４日目に、上清をＩＬ−１０およびインターフェロンーγの発現について解析した。図６で示しているように、インターフェロンーγ、つまりＴｈ１サイトカイン調節因子の発現がＧＳＴ−Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）によって誘導される。さらに、図６において、Ｔｈ１サイトカイン応答をダウンレギュレートするように作用し得るＩＬ−１０の発現が、ＣＤ４+Ｔ細胞を２μｇ／ｍｌ程度まで少ないＧＳＴ−Ｉ−２ポリペプチド（配列番号２）へ曝露することによって誘導されているということが示されている。これらの結果から、Ｉ−２ポリペプチド抗原（配列番号２）によって疾患が誘導されるＩＢＤの動物モデルはヒトにおける疾患の有益なモデルになり得るということが示される。
【０１２４】
（実施例ＩＶ）
（Ｉ−２配列を含む生物の単離および同定）
この実施例は、Ｉ−２配列を含む生物の単離および同定について記載する。
【０１２５】
ＣＤ患者からの組織標本は、嫌気的条件下でＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉより得られる。Ｑｉａｇｅｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて組織の小片からＤＮＡを抽出し、上記のＰＣＲアッセイを用いてＩ−２核酸配列（配列番号１）の存在を調べる。Ｉ−２核酸配列（配列番号１）の存在が確認された組織小片の細胞を種々の条件下（図７を参照のこと）で培養し、その単離物を分類する。
【０１２６】
標的ＤＮＡを増幅に利用できることを確認するために、上記の単離物を、１６Ｓ ＲＮＡについてＰＣＲによって分析した後、実施例Ｉに記載するように、Ｉ−２核酸配列（配列番号１）に対するＰＣＲによってその組織小片を分析する。その微生物を同定するために、基本的に本明細書中で参考として援用される、ＷｉｌｓｏｎおよびＢｌｉｔｃｈｉｎｇｔｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２２７３−２２７８（１９９６））において記載されている方法を用いて、Ｉ−２核酸を含む単離物の１６Ｓ ＲＮＡの配列決定を行う。
【０１２７】
（実施例Ｖ）
（Ｉ−２の、腸内、Ｔ細胞スーパー抗原活性の実証）
この実施例は、正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで存在しているＩ−２を含有する微生物がＣＤ４+Ｔ細胞応答の標的であるということを実証する。この実施例はさらに、Ｉ−２応答がＭＨＣクラスＩＩによって介在される認識に依存しているが、抗原プロセシングは必要としていないことを実証し、このことは、Ｉ−２がＴ細胞スーパー抗原の新しいクラスを表しているということを示す。
【０１２８】
（Ａ．Ｉ−２配列を有するマウス組織）
Ｉ−２配列が正常マウス組織において存在するか否かについて決定するために、正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの遠位の結腸、近位の結腸、盲腸、遠位の小腸、近位の小腸、および胃よりゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ分析によって、ヒトサンプルで見られるパターンと同一の、遠位の小腸、盲腸、近位の小腸から調製したＤＮＡにおいてＩ−２配列に特徴的な２８５ｂｐのフラグメントを検出した。この結果とは対照的に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの非病原性系統を含む、限定された微生物叢のみを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの同様の組織から抽出したゲノムＤＮＡからは検出可能なＩ−２フラグメントが増幅されなかった。これらの結果は、Ｉ−２発現微生物が通常の状態で飼育されているマウスに存在しているが、限定された微生物叢を有するマウスでは存在していないということを示す。
【０１２９】
マウスを次のような条件下で維持、飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）より購入した。８週齢以上の正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、他に示されない限り、通常の設備で飼育した。雌雄両方のマウスを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドと交配された、限定された微生物叢を含むＲａｇ−／−マウスは Ｄｒ．Ｗ．ＭｃＢｒｉｄｅのＵＣＬＡ繁殖コロニーより入手し、特異的な病原体不在下で飼育した。
【０１３０】
Ｉ−２およびマウス グリセルアルデヒド３−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のＰＣＲを次のように行った。マウスゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）により種々の組織より調製した。配列番号９および１０のプライマーを用いて増幅させた場合、ＰＣＲ応答によりネイティブのＩ−２からは２８５ｂｐの生成物が、陽性コントロールである模倣物Ｉ−２からは６０６ｂｐの生成物がそれぞれ生じた。陰性コントロールのＰＣＲ応答（緩衝液のみ）では、いかなるＰＣＲ産物も検出されなかった。ＰＣＲの条件は、合成Ｉ−２テンプレートから６０６ｂｐフラグメントの増幅から示されるように、Ｉ−２に特異的だった。それぞれのゲノムＤＮＡサンプルテンプレートからの３４０ｂｐマウスＧＡＰＤＨフラグメントの増幅によって示されるように、それぞれのサンプルに同量のＤＮＡが存在した。ＧＡＤＰＨプライマーは、５’−ＧＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴＧＡＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１１）および５’−ＧＡＡＴＣＣＡＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧ−３’、配列番号１２）を用いた。全ての応答は、９４oＣ、３０秒間を１サイクル、９４oＣで３０秒間、６５oＣで３０秒間、７２oＣで４０秒間を３９サイクル、その後、７２oＣで１０分間を１サイクル行った。
【０１３１】
（Ｂ．正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび１２９ＳｖマウスのＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｉ−２適用を受けた抗原提示細胞に応答して自発的に増殖しＩＬ−１０を産生する）
Ｉ−２抗原に対する本来の応答を、通常の状態で飼育された正常マウス系統において測定した。脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞を、非免疫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび１２９Ｓｖマウスより単離し、種々の濃度のＧＳＴ−Ｉ−２、ＧＳＴ単独、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ（ＳＥＢ）で前処理した同系の脾臓抗原提示細胞とともに培養した。［3Ｈ］−チミジン取り込みによって増殖を評価し、種々のサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−４）の分泌についてＥＬＩＳＡにより定量した。
【０１３２】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞はＧＳＴ−Ｉ−２に対する用量依存的な増殖応答を示した。ＧＳＴ単独に対する応答が最小であることから示されるように、この応答はＩ−２配列に対して特異的であった。Ｔ細胞増殖アッセイに対する陽性コントロールであるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ（ＳＥＢ）はＩ−２に対する最大の応答と同程度の応答の大きさを生じた。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＧＳＴ−Ｉ−２に応答してサイトカインＩＬ−１０を分泌したが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αなど、いくつかの他のサイトカインの分泌は検出されなかった。ＧＳＴ単独では、どのサイトカイン分泌も刺激されなかったことから、この応答がＩ−２抗原特異的であることが示された。これらの結果から、通常の条件で飼育されているＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＣＤ４-Ｔ細胞は、Ｉ−２で前処理された抗原提示細胞に対して応答し、自発的に増殖してＩＬ−１０を産生するということが示される。
【０１３３】
増殖およびサイトカイン分泌アッセイを以下のように行った。基本的に実施例ＩＩＩに記載した方法により、脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞を非免疫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび１２９Ｓｖマウスより単離した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび１２９Ｓｖマウスより摘出した脾臓から抗原提示細胞を単離し、細胞懸濁液を調製した。１５ｍｌのコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中で、４ｍｌあたり２×１０7個の有核脾臓細胞に対して種々の濃度のＧＳＴ−Ｉ−２、ＧＳＴ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎを添加して１２−１６時間、３７oＣで処理した。洗浄後、細胞を４×１０6個／ｍｌになるようにＰＲＭＩ １６４０、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、０．０５％ ２−メルカプトエタノール、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む完全培地で懸濁した。Ｔ細胞培養に添加する前に、抗原提示細胞を、３０００ｒａｄｓ（５６７．７ｃＧｙ／分 で５．５分間）で放射線照射した。
【０１３４】
同系抗原提示細胞（４×１０5個）を０、１、５μｇ／ｍｌのＧＳＴ単独またはＧＳＴ−Ｉ−２および１μｇ／ｍｌのＳＥＢ（ＳＩＧＭＡ）で抗原適用（ｐｕｌｓｅ）し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の４×１０5個の脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞とともに、マイクロタイターウェル中で培養した。ＧＳＴおよびＧＳＴ−Ｉ−２タンパク質を実施例ＩＩで記載したように産生させた。４８時間後に、培養上清を収集すること、および市販キットに添付されている製造業者の説明書（Ｒ&Ｄ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に従うＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γについてのＥＬＩＳＡ法によって、細胞のサイトカイン産生をアッセイした。値は、２連のサンプルの平均値である。７２時間後、基本的に実施例ＩＩＩで記載したように、［3Ｈ］−チミジンを用いる適用によって細胞の増殖をアッセイし、各３連の培養物について、取り込まれたｃｐｍ（平均値±標準偏差）を算出した。
【０１３５】
（Ｃ．限定された微生物叢を含むマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｉ−２に応答して自発的に増殖するが、ＩＬ−１０を産生しない）
正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの、ＧＳＴ−Ｉ―２に対する応答性を、限定された微生物叢を含み、そして特定の病原体不在下で飼育されているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較した。限定された微生物叢を含むＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離されたＣＤ４+Ｔ細胞は、ＧＳＴ−Ｉ−２タンパク質に対する増殖応答を示した。しかし、慣用的条件下で飼育されている通常のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで観察されるようなＧＳＴ−Ｉ−２に対する応答性とは対照的に、サイトカイン応答は検出されなかった。これらの細胞はＳＥＢ陽性コントロールで示されるように、増殖可能であり、さらに、ＧＳＴ単独に対する応答において、増殖性応答またはサイトカイン応答が観察されなかったことから、その応答はＩ−２特異的であった。
【０１３６】
ＧＳＴ−Ｉ−２に対する、限定された微生物叢を含むマウスの応答は、Ｉ−２抗原が、抗原によって前処理されていないＣＤ４+Ｔ細胞を刺激することができたということを示している。Ｉ−２配列が、限定された微生物叢を含むＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスには存在しないという実証と結びつけて考えると、これらの結果から、ＧＳＴ−Ｉ―２応答がスーパー抗原またはマイトジェンの結果であり得るということが示される。
【０１３７】
（Ｄ．正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの未処理ＣＤ４+Ｔ細胞集団と記憶ＣＤ４+Ｔ細胞集団の両方がＩ−２に応答して自発的に増殖し、ＩＬ−１０を産生する）
Ｉ−２に対する応答を未処理ＣＤ４+Ｔ細胞集団を用いて評価した。通常の方法で飼育されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞を、ＣＤ６２ＬhiＣＤ４４low未処理Ｔ細胞とＣＤ６２ＬlowＣＤ４４hi記憶Ｔ細胞に分画し、引き続いて、ＧＳＴ−Ｉ−２、ＧＳＴ単独、またはＳＥＢを適用した抗原提示細胞とともに培養した。未処理ＣＤ４+Ｔ細胞と記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の両方がＧＳＴ−Ｉ−２に対して強い増殖性応答とＩＬ−１０分泌性応答を有した（図８Ａおよび８Ｂ）。どちらの細胞集団も、ＧＳＴ単独に対しては応答性ではなく（図８Ａおよび８Ｂ）、そして両集団とも陽性コントロールであるＳＥＢを用いて示されるように増殖可能であったことから、その応答はＩ−２に対して特異的であった。これらの結果から、ＧＳＴ−Ｉ−２抗原が、通常のＭＨＣクラスＩＩの、プロセシングを受けた抗原ではなく、スーパー抗原またはマイトジェンであることが実証される。
【０１３８】
通常の方法で飼育されている正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣＤ４+Ｔ細胞の未処理Ｔ細胞サブ集団および記憶Ｔ細胞サブ集団を得て、以下のように分析した。未処理ＣＤ４+Ｔ細胞をＣＤ４+Ｔ細胞より得て、上記のＶＢ節に記載されるように単離し、そしてラット抗マウスＣＤ４４とともに３０分間、氷上でインキュベートした。記憶ＣＤ４+Ｔ細胞をＣＤ４+Ｔ細胞より得て、ラット抗マウスＣＤ４５ＲＢとラット抗マウスＣＤ６２Ｌとともに３０分間氷上にてインキュベートした。それらの細胞を洗浄し、ヒツジ抗ラットＩｇＧによってコートされたＤｙｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓで３０分間氷上にて処理した。枯渇後、未結合Ｔ細胞を陰性選択し、そして４×１０6個／ｍｌになるように、５％ＦＣＳを含む完全ＲＰＭＩ培地で再懸濁した。分画したＴ細胞の純度を、ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ４、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ６２Ｌ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いるフローサイトメトリーによって評価した。細胞集団は典型的に、８５％より多くが記憶ＣＤ４+Ｔ細胞または未処理ＣＤ４+Ｔ細胞であった。
【０１３９】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の分画した未処理ＣＤ４+Ｔ細胞および記憶ＣＤ４+Ｔ細胞（４×１０5）を、上記のようにマイクロタイターウェル中で、抗原（０、１、５μｇ／ｍｌ；ＧＳＴ；またはＧＳＴ−Ｉ−２）または１μｇ／ｍｌの陽性コントロールＳＥＢで予め抗原適用を行った４×１０5の同系抗原提示細胞とともに培養した。増殖およびサイトカイン産生を上記の方法でアッセイした。
【０１４０】
（Ｅ．Ｉ−２に対するＣＤ４+Ｔ細胞応答の、ＭＨＣクラスＩＩの制限）
Ｉ−２応答性を、ＭＨＣクラスＩＩプロセシングへの依存性に関して分析した。ＣＤ４+Ｔ細胞を、Ｉ−Ａ−bＭＨＣクラスＩＩ分子またはＩ−Ａ―dＭＨＣクラスＩＩ分子に対するモノクローナル抗体のいずれかの存在下でＩ−２適用した抗原提示細胞とともに培養した。抗Ｉ−Ａ−b抗体はＳＥＢおよびＧＳＴ−Ｉ−２両方に対するＴ細胞増殖応答をブロックしたが、一方、抗Ｉ−Ａ−d抗体はＳＥＢまたはＧＳＴ−Ｉ−２の増殖性応答に対して最小の効果を有した。これらの結果から、Ｉ−２応答性は、ＭＨＣクラスＩＩ媒介認識に依存しており、従って、この応答はマイトジェン応答ではないことが示される。
【０１４１】
ＭＨＣクラスＩＩの、Ｔ細胞増殖に対するブロッキングは以下のようにして行う。上記ＶＢ節において記載するように、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗Ｉ−Ａ−bまたは抗Ｉ−Ａ−d（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下または不在下で、ＣＤ４+Ｔ細胞（４×１０5）を、抗原適用を受けた４×１０5の抗原提示細胞とともにインキュベートした。インキュベーション開始４８時間後、０．５μＣｉ［3Ｈ］−チミジンをそれぞれの培養液中に添加し、１８時間さらに培養し、前記のように収集した。結果を、３連の培養物の例ずつの平均ＣＰＭ＋／−ＳＤとして表す。
【０１４２】
（Ｆ．Ｉ−２に対するＣＤ４+Ｔ細胞の応答において抗原プロセシングは必要ではない）
以前に明らかにされた結果から、Ｉ−２抗原はマイトジェンではないが、むしろ通常のＭＨＣクラスＩＩのプロセシングを受けた抗原か、または、抗原プロセシングを受けずに増殖性応答を刺激し得るものとして部分的に特徴づけられる抗原であるスーパー抗原のいずれかであることが示される。Ｉ−２応答性が抗原プロセシングを必要とするか否かを決定するために、正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の抗原提示細胞を、抗原プロセシングが起こらないようにパラホルムアルデヒドで固定し、次いでＧＳＴ―Ｉ―２またはＳＥＢを適用した。図９Ａに示されるように、ＣＤ４+Ｔ細胞は依然としてＧＳＴ−Ｉ―２およびＳＥＢに対して強く応答した。さらに、ＧＳＴ単独では増殖性応答が誘導されなかったことから、その応答はＩ−２に対して特異的であった。その結果とは対照的に、ハト チトクロムＣ（ＰＰＣ）で一晩適用した固定された抗原提示細胞によってＰＰＣ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖応答は誘導されなかった（図９Ｂ）。これらの結果から、ＧＳＴ−Ｉ−２増殖応答には抗原プロセシングが必要ではなく、従って、ＧＳＴ−Ｉ−２がスーパー抗原として働くということが実証される。
【０１４３】
パラホルムアルデヒド固定した抗原提示細胞を調製し、次のように分析した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の脾臓Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＧＳＴ−Ｉ−２を一晩適用した後さらに３０分間適用したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の抗原提示細胞、またはパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで３０分間インキュベートし、そして２回ＰＢＳで洗浄したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の抗原提示細胞とともに培養を行った。この固定した細胞を、１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌのＧＳＴ−Ｉ−２で一晩適用した。ＧＳＴおよびＳＥＢを、陰性コントロール抗原および陽性コントロール抗原としてそれぞれ使用した。固定実験のコントロールとして、ハト チトクロームＣ（ＰＰＣ）特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＰＰＣを一晩適用したか、または、パラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＰＣを一晩適用した同系抗原提示細胞とともに培養した。３日間の培養のうち、最後の１８時間は１μＣｉの［3Ｈ］ＴｄＲを各ウェルに添加した。結果を、３連の培養物の平均値ＣＰＭ±ＳＤとして表現する。
【０１４４】
（Ｇ．ＴＣＲ Ｖβ発現は、応答するＴ細胞集団応答において限定される）
大部分のスーパー抗原は特異的なＴＣＲ Ｖβによって特徴づけられる。ＧＳＴ−Ｉ−２注射後、１５のＶβのパネルから、Ｖβ９およびＶβ１７がＣＤ４-Ｔ細胞において拡大される。これらの結果により、ＧＳＴ−Ｉ−２がスーパー抗原であることが確証される。
【０１４５】
Ｖβの限定は以下のように特徴付けられた。ＧＳＴ−Ｉ−２タンパク質（５μｇ）を正常８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内注射した。投与１日後、脾臓を摘出し、細胞懸濁液を調製した。赤血球を溶解し、有核脾臓細胞を５％ＦＣＳを含む完全ＲＰＭＩ培地（５ｍｌ）で再懸濁した。細胞（２×１０6）をＰＥＲＣＰ結合体化抗ＣＤ４+（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および種々のＦＩＴＣ結合体化抗Ｖβ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で二重染色した。染色された細胞がＣＤ４+およびＶβ陽性であることについてフローサイトメトリーにより評価した。
【０１４６】
括弧内の、またはその他の、上記で提供された雑誌論文、参考文献、特許引用は全て、以前に言及されているか否かに関わらず、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１４７】
本発明は上記の実施例と関連して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変更がなされ得るということを理解されるべきである。従って、本発明は先に記載した特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１Ａ】
2011019515.tif 000003
【図１Ｂ】
2011019515.tif 000004
【図２】
2011019515.tif 000005
【図３】
2011019515.tif 000006
【図４Ａ】
2011019515.tif 000007
【図４Ｂ】
2011019515.tif 000008
【図５】
2011019515.tif 000009
【図６】
2011019515.tif 000010
【図７】
2011019515.tif 000011
【図８】
2011019515.tif 000012
【図９】
2011019515.tif 000013
【配列表】
2011019515000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月23日(2010.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された炎症性腸疾患関連Ｉ−２ポリペプチドであって、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。