(57)【要約】      （修正有）【課題】イネ科植物の単位面積当たりの年間収穫量を増加させるため、１作当たりの栽培期間を短縮するとともに通常栽培期間における収穫量を維持できる、イネ科植物の育成制御方法を提供する。【解決手段】外部光を遮蔽して人工光のみを植物に照射して、明期及び暗期の光周期で植物を育成する方法において、植物におけるＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日よりも１３〜３日前の間のいずれの日から、該転写量がピークに達する日からピークに達する日の７日後までの間のいずれの日までの１０〜１５日間エンド・オブ・デイ処理を行い、該エンド・オブ・デイ処理は明期の終了直後に遠赤色光を６０分間以内の照射時間で植物に照射することにより行う、イネ科植物の育成制御方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部光を遮蔽して人工光のみを植物に照射して、明期及び暗期の光周期で植物を育成する方法において、植物におけるＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日よりも１３〜３日前の間のいずれの日から、該転写量がピークに達する日からピークに達する日の７日後までの間のいずれの日までの１０〜１５日間エンド・オブ・デイ処理を行い、該エンド・オブ・デイ処理は明期の終了直後に遠赤色光を６０分間以内の照射時間で植物に照射することにより行う、イネ科植物の育成制御方法。
【請求項２】
エンド・オブ・デイ処理期間を決めるため、植物におけるＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写パターンをモニターしながら植物の育成を行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エンド・オブ・デイ処理をＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日又は減少に転じた直後に終了する、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、イネ科植物の育成制御方法、特に人工光のみを植物に照射する環境におけるイネ科植物の育成制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の一般水田におけるイネ栽培は基本的に１年に１回行う１期作であることから、１作当たりの収穫量を増やすことが重要である。しかし、光照射や温度などの栽培条件を制御できる完全閉鎖系環境でのイネ栽培は、１年に数回栽培を行う多期作が可能であるため、年間を通しての収穫量を増大させることが重要となってくる。そして年間収穫量を増大させる方法としては、１作当たりの栽培期間を短くすること、及び１作当たりの収穫量を増やすことが考えられる。
【０００３】
特許文献１には、完全制御型光植物工場における植物育成用の光照射手段において、特定の複数の光質照射時期を含むことを特徴とする植物育成光の照射方法及び照射装置が開示されており、これにより収穫時期を早めることができると記載されている。しかしながら、特許文献１に記載の発明は主に収穫量と無関係の草花の栽培期間を短縮するための方法であり、年間収穫量を増やすための方法ではない。
【０００４】
また、特許文献２には、人工光として青色光のみまたは青色光に加え遠赤色光を照射する光源手段を備えた、人工光を用いたイネ科植物の育苗装置が開示されており、これにより育苗時における定植後の花芽分化を促進し、育成期間を短縮することができると記載されている。しかしながら、特許文献２に記載の発明は主に品種改良における世代促進を実現するための方法であり、収穫量については記載されていない。
【０００５】
さらに、栽培光波長操作によるイネの収穫日数を短縮する技術として、エンド・オブ・デイ（Ｅｎｄ  ｏｆ  ｄａｙ；ＥＯＤ）処理が知られている。これは栽培期間を通じて明期終了直後に短時間の遠赤色光照射を行うものであり、これによりイネの出穂・収穫までの日数が短縮されると考えられている。しかしその一方で、ＥＯＤ処理によって、一穂当たりの籾数や分げつ数が減少することから、収穫量はかえって減少してしまうという欠点がある。
【０００６】
一方、イネＨｄ３ａ遺伝子は花芽形成に関連するとされており、Ｈｄ３ａ遺伝子の導入や発現制御により植物の開花時期を改変し得ることが知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−５７８１６号公報
【特許文献２】特開２００２−３４５３３７号公報
【特許文献３】特開２００２−１５３２８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、これまで１作当たりの栽培期間を短縮する方法はいくつか知られているが、いずれの方法によっても年間収穫量の増加には至らなかった。そこで本発明は、イネ科植物の単位面積当たりの年間収穫量を増加させるため、１作当たりの栽培期間を短縮するとともに通常栽培期間における１作当たりの収穫量を維持できる、イネ科植物の育成制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、意外なことに、エンド・オブ・デイ（ＥＯＤ）処理を、栽培の始めから終わりまでの通期ではなく、花芽形成関連遺伝子Ｈｄ３ａの転写パターンを指標にした特定の期間のみに行うことで、栽培期間を短縮するとともにコメ収穫量の低下を抑えられることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、外部光を遮蔽して人工光のみを植物に照射して、明期及び暗期の光周期で植物を育成する方法において、植物におけるＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日よりも１３〜３日前の間のいずれの日から、該転写量がピークに達する日からピークに達する日の７日後までの間のいずれの日までの１０〜１５日間エンド・オブ・デイ処理を行い、該エンド・オブ・デイ処理は明期の終了直後に遠赤色光を６０分間以内の照射時間で植物に照射することにより行う、イネ科植物の育成制御方法を提供する。本発明によれば、１作当たりの栽培期間を短縮するとともに通常栽培期間における１作当たりの収穫量を維持できることによって、単位面積当たりの年間収穫量を増加させることができる。
【００１１】
本発明は、また、エンド・オブ・デイ（ＥＯＤ）処理期間を決めるため、植物におけるＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写パターンをモニターしながら植物の育成を行う、上記イネ科植物の育成制御方法を提供する。栽培環境・条件が一定であれば、品種ごとに予めＨｄ３ａ又はその相同遺伝子の転写パターンを明らかにしておくことにより、それに基づいて品種ごとにＥＯＤ処理開始時期及び終了時期を決定することができる。また、予めモニターしたものについても、さらにＥＯＤ処理とともにＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量をモニターしながら栽培することで、該転写量ピークをより正確に把握することができ、より正確かつ効果的な終了時期の決定が可能となる。
【００１２】
本発明は、また、エンド・オブ・デイ（ＥＯＤ）処理をＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日又は減少に転じた直後に終了する、上記イネ科植物の育成制御方法を提供する。ＥＯＤ照射を終了する時期が転写ピークを過ぎれば過ぎるほど、栽培期間の短縮及び収穫量の減少抑制効果が弱まる傾向があるため、ＥＯＤ処理を転写ピークに達する日又は減少に転じた直後に終了することで、より効果的に１作当たりの栽培期間を短縮するとともに通常栽培期間における１作当たりの収穫量の減少を抑えることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、エンド・オブ・デイ（ＥＯＤ）処理を特定の期間のみに行うことで、栽培通期に渡ってＥＯＤ処理を行う場合に比べて、同程度に栽培期間を短縮できるだけでなく、１作当たりの収穫量の減少を抑え、その結果、単位面積当たりの年間収穫量を増加させることができる。また、ＥＯＤ処理にかかる電気代も節約でき、コストダウンにも貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】栽培開始時期の違いによるＨｄ３ａ転写パターンの変化をリアルタイムＰＣＲによって分析した結果を示す図であり、縦軸は８月屋外栽培の２３日目のＨｄ３ａ遺伝子転写量を１とした時の相対量である。
【図２】光植物工場栽培におけるイネのＨｄ３ａ遺伝子転写パターンを電気泳動及びＮＩＨイメージによって分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
（人工光によるイネ科植物の育成方法）
人工光による育成方法とは、外部光を遮蔽して人工光のみを植物に照射して、明期及び暗期の光周期で植物を育成する方法である。人工光による育成は、通常行われている方法であればよく、安定した栽培が可能である観点から、完全制御型光植物工場（例えば、特許文献３に記載の育苗装置）を用いて育成することが好ましい。完全制御型光植物工場であれば、栽培条件が一定であるため、後述のＨｄ３ａ又はその相同遺伝子の転写パターンのモニタリングは、一つの品種につき一回のみで足りるとの利点もある。
【００１７】
照射する人工光としては、光合成ができれば特に限定されないが、特に光合成に有効とされる赤色光と青色光との組合せであることが好ましい。赤色光は波長が６４０〜６９０ｎｍの光であり、例えば、波長ピークが６８０ｎｍである赤色レーザ（ＬＤ）光を使用することができる。青色光は波長が４２０〜４７０ｎｍの光であり、例えば、波長ピークが４５０ｎｍである青色ＬＥＤ光を使用することができる。照射光量は赤色光と青色光との合計で３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃ程度以上であればよく、好ましくは５００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃ以上である。
【００１８】
本発明の育成制御方法によって育成するイネ科植物は、特に限定されないが、産業上利用性の観点から、収穫量を増やす需要のあるイネが好ましく、イネとしては、例えば、コシヒカリ、ササニシキ、あきたこまち等の品種が挙げられる。また、本発明の育成制御方法はＨｄ３ａ又はその相同遺伝子を発現する他の短日植物にも応用できる。なお、温度・湿度、定植間隔、及び養液組成などの条件は、植物の種類によって当業者が適宜に選択することができる。
【００１９】
（Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写パターンの測定）
Ｈｄ３ａ遺伝子は、イネにおいて花芽形成を誘導するとされる遺伝子であり、そのｃＤＮＡの全長は、５４０ｂｐである（ＡＢ０５２９４４）。Ｈｄ３ａの相同遺伝子とは、イネ以外の植物由来の花芽形成誘導遺伝子であって、Ｈｄ３ａ遺伝子がコードするＨｄ３ａタンパク質と高い相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。イネにおいて、Ｈｄ３ａ遺伝子は特異的に葉で発現しているとの報告があるため、Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量は植物の葉を用いて測定することが好ましい。
【００２０】
ｍＲＮＡの転写量の測定は、全ＲＮＡの抽出、及びＨｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの定量によって行われる。全ＲＮＡの抽出は例えば市販の核酸抽出キットを用いて、Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの定量は例えばＲＴ−ＰＣＲ等の方法によって行われることができる。使用されるプライマーはＨｄ３ａ又はその相同遺伝子の配列に従って当業者が適宜に設計することができ、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件も配列の長さやプライマーによって当業者が適宜に決定することができる。定量に際して、内部標準として例えばユビキチン等が使用できる。
【００２１】
Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写パターンのモニタリングは、１〜７日に一回で葉の一部を採取して、分析することによって行う。そのうち、最も転写量の高い日を転写ピークに達する日とする。モニタリング期間は、植物の止め葉まで行えばよいが、転写ピークを判明した時点で終了してもよい。
【００２２】
初めて育成する品種については、Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量をモニターしながら育成を行い、これに基づいてエンド・オブ・デイ（ＥＯＤ）処理開始時期、終了時期、及び処理期間を決定する。同じ育成環境・条件であれば、決められたＥＯＤ処理条件に従って、育成制御することができる。すなわち、一つの品種につきモニタリングが一回のみで足りる。予めモニターした品種についても、さらにＥＯＤ処理とともに転写量をモニターしながら育成することがより好ましい。この場合、転写量ピークをより正確に把握することができ、より正確かつ効果的な終了時期の決定が可能となる。
【００２３】
（エンド・オブ・デイ処理）
本発明におけるエンド・オブ・デイ（ＥＯＤ）処理は、明期の終了直後に遠赤色光を６０分間以内の照射時間で植物に照射することにより行う。遠赤色（ＦＲ）光は波長が７００〜８００ｎｍの光であり、例えば波長が７３０ｎｍの遠赤色ＬＥＤ光を使用することができる。照射時間は６０分以内であればよく、３０分程度で十分である。照射強度は５０〜３００μＷであることが好ましい。なお、明期の終了直後とは、明期の終了後３０分以内をいう。
【００２４】
ＥＯＤ処理により短日植物は栽培期間短縮効果が得られるが、そのうち特に収穫量が重要なイネに関して、栽培期間を短縮できるとともに１作当たりの収穫量の減少を抑えられる観点から、栽培通期ではなく、Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日よりも１３〜３日前の間のいずれの日から、該転写量がピークに達する日からピークに達する日の７日後までの間のいずれの日までの１０〜１５日間エンド・オブ・デイ処理を行うことが好ましい。なお、転写量がピークに達する日よりも１３〜３日前とは、転写ピークに達する日を０日として、その−１３日〜−３日の間をいう。また、転写量がピークに達する日からピークに達する日の７日後までの間とは、転写ピークに達する日を０日として、その０日〜＋７日の間をいう。
【００２５】
ＥＯＤ処理は、Ｈｄ３ａ又はその相同遺伝子のｍＲＮＡの転写量がピークに達する日又は減少に転じた直後に終了することが特に好ましい。これによれば、より高い栽培期間の短縮効果及び収穫量の維持効果が得られる。なお、転写量が減少に転じた直後とは、転写量がピークに達する日から２日以内をいう。転写量がピークに達する日の翌日のＥＯＤ処理を最後に終了することが好ましく、転写量がピークに達する日のＥＯＤ処理を最後に終了することが最も好ましい。また、ＥＯＤ処理期間は１０〜１５日であればよく、好ましくは１０〜１４日間又は１１〜１４日間である。およそ１５日間を超えた期間に渡ってＥＯＤ処理を行うと、収穫量の減少抑制効果が弱まる傾向がある。また、転写量がピークに達する日からおよそ１週間後以降にもＥＯＤ処理を続けると、栽培期間の短縮の効果及び収穫量の減少抑制効果が弱まる傾向がある。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（栽培例１  光植物工場におけるイネの栽培方法）
イネ（コシヒカリ）の種を４日間吸水させ発芽を誘導した。その後、ウレタンに播種して暗黒下で３日間栽培した後、表１に記載の育苗期用養液を加えて、赤色レーザ（ＬＤ）光（４５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの光量）と青色ＬＥＤ光（５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの光量）の下に移し１週間栽培した。使用した赤色レーザ光の波長ピークは、６８０ｎｍであり、青色ＬＥＤ光の波長ピークは４５０ｎｍであった。その後１１日間栽培したあと、３０ｃｍ四方に１０株程度で、畝間約７ｃｍ、株間約１０ｃｍで定植し、外部光を遮蔽して人工光のみを植物に照射する光植物工場において栽培した。赤色レーザ光（４５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの光量）と青色ＬＥＤ光（５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの光量）の下で表１に記載の生育期用養液で栽培を行った。また、通期に渡って明期暗期の周期は１２ｈｒずつであった。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（栽培例２  屋外におけるイネの栽培方法）
定植までは上記光植物工場内におけるイネの栽培方法と同条件で栽培した。その後、ハウスに移して、３０ｃｍ四方に１０株程度で、畝間約７ｃｍ、株間約１０ｃｍで定植し、太陽光の下、生育期用養液で栽培を行った。
（実施例１  屋外栽培イネにおけるＨｄ３ａ遺伝子転写パターンの測定）
イネを栽培例２にしたがって栽培し、栽培期間中に葉の先端数ｃｍを切り取り液体窒素で凍結保存した。その後凍結葉をコーンラージで粉砕し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてメーカープロトコールにしたがって全ＲＮＡを抽出した。
【００２９】
その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲキット（タカラバイオ）でＨｄ３ａ  ＲＮＡを増幅した。Ｈｄ３ａの増幅には、以下のプライマーを使用した：
Ｈｄ３ａ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＴＣＡＣＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１）
Ｈｄ３ａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡ−３’ （配列番号２）
なお、増幅用プライマーの設計には、Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：３３２６−３３３６  （２００５）  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌｏｒａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｈｄ３ａ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｇｈｔ  ｂｒｅａｋ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｒｉｃｅを参考にした。
【００３０】
また、ユビキチンを内部標準とした。ユビキチンの増幅には、以下のプライマーを使用した：
Ｕｂｑ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡ−３’ （配列番号３）
Ｕｂｑ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＣＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡ−３’ （配列番号４）
ＲＴ−ＰＣＲはまず、５０℃、３０分で逆転写反応を行い、９４℃、２分で逆転写酵素の失活を行った。続いて、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを２６回繰り返すことにより、目的核酸の増幅を行った。得られた増幅産物は、４％のアガロースゲル電気泳動により分析し、ＮＩＨイメージを用いて定量を行った。または、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、リアルタイムＰＣＲによる定量を行った。
【００３１】
リアルタイムＰＣＲの結果を図１及び表２に示した。図１及び表２から、屋外でイネ栽培を行ったとき、異なる播種時期、すなわち、異なる日長・気温条件下においても、Ｈｄ３ａの転写ピークまでの日数と出穂までの日数との間に相関関係があることが判明した。転写ピークを示す時期に、イネの花芽形成に関する重要な働きが植物体内で起きていることが予想された。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
（実施例２  光植物工場栽培イネのＨｄ３ａ転写パターンの測定）
イネ（コシヒカリ）を栽培例１にしたがって栽培した。栽培期間中に葉の先端数ｃｍを切り取り液体窒素で凍結保存した。実施例１にしたがって、ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた増幅産物は、４％のアガロースゲル電気泳動により分析し、ＮＩＨイメージによってＨｄ３ａの転写パターンを測定した。結果は図２に示した。
（実施例３  光植物工場栽培イネのＥＯＤ処理時期と収穫量との相関）
実施例２と同じ品種のイネを実施例２と同じ条件で栽培し、明期終了直後３０分間に渡って、５０〜６０μＷの強さで遠赤色（ＦＲ）ＬＥＤ光（波長ピーク：７３０ｎｍ）を照射してＥＯＤ処理を行った。サンプル毎にＥＯＤ処理を行う時期を変化させた時のイネの出穂日数及び単位面積当たりの収穫量を測定した（表３）。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
表３から、ＥＯＤ処理を栽培通期に渡って行ったＥＯＤイネ（１）は、通常栽培イネ（ＥＯＤ処理無し）に比べて出穂日数を１３日も短縮できたが、収穫量が半分近くにまで減少してしまった。一方、ＥＯＤ処理を行う期間をＨｄ３ａの転写ピーク（播種後２８日目頃）付近の１１〜１４日間に限定することにより、出穂日数短縮と同時に収穫量の減少を抑えることが出来た（ＥＯＤイネ（２）、（３））。その結果、光植物工場のように１年を通して複数回のイネ栽培を行う場合において、単位面積当たりの年間収穫量が最大で約１７％増大する計算となる。
【００３６】
表３からは、また、照射の開始時期はＨｄ３ａ遺伝子の転写ピークの１３〜３日前が望ましく、終了時期は転写ピークに達する日から転写ピークに達する日から７日後までが望ましいことを判明した。また、ＥＯＤ照射を終了する時期が転写ピークを過ぎれば過ぎるほど、出穂日数の長期化及び収穫量の減少が見られた（ＥＯＤイネ（２）、（３）、（４））。このことから、遠赤色光の照射をＨｄ３ａ遺伝子の転写ピークに達する時点、又は減少に転じた直後に終了したほうがより望ましいと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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