(57)【要約】      （修正有）【課題】医師による処置や薬剤投与を必要としないＵＣＰ1発現誘導方法の提供。【解決手段】局所又は全身への温熱刺激を付与することによって、ＵＣＰ１の発現増加を引き起こし、熱産生能を向上させることを特徴とするＵＣＰ1発現誘導方法。このような熱によるエネルギー消費は、余剰な脂肪や糖の燃焼を促進することから、生体における脂肪蓄積を抑制し、肥満や脂肪蓄積を起因とする様々な病態・疾患の予防・改善につながる。温熱刺激としては、ヒト又は動物のＵＣＰ１の発現増加を望む部位（臓器・器官・組織）、もしくは全身に外部から温熱負荷を与えるのが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＵＣＰ１発現誘導方法。
【請求項２】
局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織における熱産生促進方法。
【請求項３】
局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織における脂肪燃焼促進方法。
【請求項４】
温熱刺激が、４０〜４３℃で３０〜６０分の温熱負荷である請求項１〜２の何れか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪の燃焼および熱産生に関与するＵＣＰ１(Uncoupling Protein1)の発現誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱共役タンパク質 (Uncoupling Protein：ＵＣＰ)は、小型の冬眠哺乳動物の褐色脂肪組織に存在するタンパク質 (ＵＣＰ１)として古くから知られていたが、１９９７年にそのホモログ分子ＵＣＰ２がヒトで発見された（非特許文献１）。その後、ＵＣＰ３、ＵＣＰ４が相次いでクローニングされ（非特許文献２及び３）、さらにアメーバやカビなどにも相同なタンパク質が存在することが示された（非特許文献４及び５）。ＵＣＰはいずれもミトコンドリアに局在し、その機能は名前の通り、酸化的リン酸化の脱共役である（非特許文献６）。すなわち、ミトコンドリアでの電子伝達系とＡＴＰ合成は、内膜を介するプロトン濃度勾配によって密に共役している。ＵＣＰはこのプロトン濃度勾配を短絡・解消する６回膜貫通型のチャネルであり、これが活性化されると酸化基質の化学エネルギーはＡＴＰ合成に利用されず、熱へと変換される。このような機能を持つことからＵＣＰは熱産生タンパク質とも呼ばれ、体温調節やエネルギー代謝に関与すると考えられている。
【０００３】
生体内でエネルギー蓄積を担うのは主に脂肪であるが、これを行っているのは、白色脂肪組織（ＷＡＴ：White Adipose Tissue）と呼ばれる部分である。逆に、熱としてエネルギーを消費させる脂肪も生体内には存在しており、これは褐色脂肪組織（ＢＡＴ：Brown Adipose Tissue）と呼ばれている。
【０００４】
脂肪組織には、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３が発現しているが、この中のＵＣＰ1はＢＡＴに特徴的に発現しており、ＢＡＴにおける熱エネルギー産生の中心分子であることが知られている。ラットなどゲッ歯類の動物に、寒冷刺激（４℃）を与えると、ＢＡＴを中心とした非震え熱産生が起こるが、これは寒冷刺激により強力に発現誘導されたＵＣＰ１によるものである。つまり、低温条件下では、ＵＣＰ１による熱エネルギー産生が亢進し、ＢＡＴが生体の加温装置として働くことと考えられており、実際にＵＣＰ１ノックアウトマウスでは低温条件下での体温維持ができないことが明らかになっている（非特許文献７及び８）。
【０００５】
また、過食時に発現が増加し、食事性熱産生を引き起こすことから、ＵＣＰ1は熱としてのエネルギー消費への関与も示唆されている。実際に、ＵＣＰ１の発現が低下したマウスを作製したところ、寒冷曝露時の熱産生能が低下するとともに、平常時酸素消費量（エネルギー消費量）の低下も認められ、さらに体脂肪量が２倍以上になることが報告されており、これらの結果から、ＵＣＰ１は、熱産生によって余剰エネルギーを消費する役割も担っていると考えられている（非特許文献９）。また、逆に脂肪細胞特異的にＵＣＰ１を過剰発現させたトランスジェニックマウスでは脂肪量が減少しており、この原因はＵＣＰ１によるエネルギー消費が亢進したためであると考えられている。（非特許文献１０）。さらに、in vitro試験でもＵＣＰ１が熱産生によってエネルギー消費を増大させていることが示唆されている。本来、ＵＣＰ1の発現が非常に低い肝臓細胞に、ＵＣＰ１を過剰発現させると、ＡＴＰ産生が低下するという結果が得られており、これ原因は、ＵＣＰ１の増加にともない、肝臓細胞内の酸化的リン酸化反応の一部が、熱産生経路に移行したためであることが報告されている（非特許文献１１）。以上のことから、ＵＣＰ１の遺伝子発現量を増加させることは、熱産生を促進することになり、その結果として余剰エネルギーの消費を増大させ、脂肪蓄積や肥満を抑制することにつながると考えられる。
【０００６】
また、このようなＵＣＰ１によるエネルギー消費には、主に中性脂肪（トリグリセリド）から切り出された遊離脂肪酸が利用されており、これが熱エネルギーへと変換されている。したがって、ＵＣＰ１の増加は、生体内において脂肪燃焼の促進につながると考えられている（非特許文献１２）。
【０００７】
ＵＣＰ２は、脂肪や骨格筋、肺、心臓など、全身に広く発現しており、最近では、活性酸素の発生を抑え、生体内の酸化ダメージを防ぐことが役割の１つであると考えられている（非特許文献１２）。熱としてのエネルギー消費への寄与度は、はっきりしない部分も多いが、ヒトでの解析結果から、脂肪組織におけるＵＣＰ２の遺伝子発現は脂肪量に反比例していることや（非特許文献１３）、肥満者の骨格筋におけるＵＣＰ２量は体脂肪率と有意な相関があることが報告されており（非特許文献１４）、これらの結果は、ＵＣＰ２が肥満に関与していることを示唆している。
【０００８】
ＵＣＰ３は骨格筋において発現が高く、他に心筋や褐色脂肪においても発現しており、ＵＣＰ２同様、最近では、生体内への酸化ダメージを防ぐ役割も担っていると考えられている（非特許文献１２）。ＵＣＰ３の肥満への関与については、ＵＣＰ３を高発現するトランスジェニックマウスの研究から、コントロールマウスと比較して痩せていることや、糖代謝が改善していることが報告されている（非特許文献１５）。また、ピマインディアンを対象とした研究では、ＵＣＰ３の発現レベルとＢＭＩには負の相関が、安静時代謝率には正の相関が認められることが報告されており（非特許文献１６）、これらの事実は、ＵＣＰ３がエネルギー消費や代謝の一部に関与していることを示唆している。
【０００９】
以上のようにＵＣＰは、肥満やエネルギー代謝に関与していると考えられている。すなわちＵＣＰの増加や活性化は、エネルギー代謝を向上させることになり、肥満や脂肪蓄積を起因とする様々な病態・疾患（インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、虚血性心疾患、等）の予防・改善につながると考えられる。
【００１０】
実際に、ワカメなど海草に多く含まれるフコキサンチンが、脂肪細胞のＵＣＰ１を活性化し脂肪燃焼を促進することが報告されるとともに（非特許文献１７）、抗肥満活性剤としてフコキサンチン有効であることが報告されている（特許文献１）。また、共役異性化された高度不飽和脂肪酸類もＵＣＰを活性化することにより、抗肥満・内臓蓄積脂肪低減化機能を発揮することが報告されている（特許文献２）。
【００１１】
また経口摂取だけでなく皮膚に塗布することによりＵＣＰを活性化させる痩身用皮膚外用剤や（特許文献３）、におい刺激によりＵＣＰが活性化させる、香料のダイエット組成物も報告されている（特許文献４）。
【００１２】
ＵＣＰは、脂肪燃焼作用があることから、肥満だけでなく他の脂質代謝関連疾患にも関与している。実際に、抗肥満作用があることで知られるダルマギク抽出物は、ＵＣＰを活性化するため、高脂血症や心循環系疾患の予防・改善に有効であることが示されている（特許文献５）。
【００１３】
以上のことから、ＵＣＰを増加または活性化することは、肥満や内臓脂肪症候群、またそれらを起因とする生活習慣病をはじめ、高脂血症や糖尿病の予防改善に有用であることが推測される。また、このような症状の改善・予防方法として、薬剤などを使うことなく、簡易且つ安全に、ＵＣＰを制御する方法の確立が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００８−２８０２８１公報
【特許文献２】特開２０００―１４４１７０公報
【特許文献３】特開２００３―６３９７７公報
【特許文献４】特開２００９−２３９６４公報
【特許文献５】特表２００８−５３３１９６公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Fleury C, et al. (1997) Nat Genet. 15 : 269-272
【非特許文献２】Boss O, et al. (1997) FEBS Lett. 408 : 39-42
【非特許文献３】Mao W, et al. (1999) FEBS Lett. 443 : 326-330
【非特許文献４】Jarmuszkiewicz W, et al. (1999) J Biol Chem. 274 : 23198 -23202
【非特許文献５】Jarmuszkiewicz W, et al. (2000) FEBS Lett. 467 : 145-149
【非特許文献６】Ricquier D, Bouillaud F. (1997) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 56 : 83-108
【非特許文献７】Lowell BB, Spiegelman BM. (2000) Nature. 404 : 652-660
【非特許文献８】Enerback S, et al. (1997) Nature. 387 : 90-94
【非特許文献９】Lowell BB, et al. (1993) Nature. 366 : 740-742.
【非特許文献１０】Kopecky J, et al. (1995) J Clin Invest. 96 : 2914-2923.
【非特許文献１１】Gonzalez-Muniesa P, et al. (2005) J Physiol Biochem. 61 : 389-393
【非特許文献１２】斉藤正之,佐々木典康 (1996) 実験医学.14: 222-227
【非特許文献１３】Kogure A, et al. (1998) Diabetologia. 41 : 1399
【非特許文献１４】Echtay KS. (2007) Free Radic Biol Med. 43 : 1351-1371.
【非特許文献１５】Pinkney JH, et al. (2000) J Clin Endocrinol Metab. 85 : 2312-2317.
【非特許文献１６】Simoneau JA, et al. (1999) Int J Obes Relat Metab Disord. 23 :S68- S71
【非特許文献１７】Clapham JC, et al. (2000) Nature. 406 : 415-418
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、簡便・安全で、且つ効果的にＵＣＰ１を誘導し、熱産生および脂肪燃焼を促進させる方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、生体への負荷が小さく、容易に実施できるＵＣＰ１発現制御方法について検討したところ、生体に安全な温度で温熱刺激を与えることにより、ＵＣＰ１の発現を誘導できることを見出した。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の１）〜４）の発明に係るものである。
１）局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とするＵＣＰ1発現誘導方法。
２）局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織における熱産生促進方法。
３）局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織における脂肪燃焼促進方法。
４）温熱刺激が、４０〜４３℃で３０〜６０分の温熱負荷である上記１）〜３）の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法は、生体への負荷が小さく、医師による処置や薬剤投与を必要とせず、一般市民やエステティシャン等が容易に実施できる。従って、本発明によれば、簡易且つ安全に、局所もしくは全身の脂肪組織におけるＵＣＰ１の発現を誘導することができる。
また、ＵＣＰ1発現増加による熱産生を通して、余剰エネルギーの消費を促すことができ、皮下脂肪など局所の脂肪や全身性の脂肪の減少を図ることができ、さらに脂肪蓄積に起因して発症する病態の予防・改善を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】温熱刺激を付加した場合のＢＡＴにおけるＵＣＰ１の経時的発現量を示す図
【図２】温熱刺激を付加した場合のＷＡＴにおけるＵＣＰ１の経時的発現量を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のＵＣＰ１発現誘導方法は、熱産生によるエネルギー消費の増大を通して、局所的な皮下脂肪の減少や、脂肪蓄積に起因して引き起こされる症状の予防・改善を図るものであり、医療目的以外の目的、主に美容・ダイエットを目的として行われるものであって、いわゆる医療行為を含むものではない。
【００２２】
後記実施例に示すとおり、マウスに温熱刺激を与えることにより、ＢＡＴおよびＷＡＴのＵＣＰ１の遺伝子発現が増加する。従って、温熱刺激により生体内の脂肪組織における熱産生の促進、すなわち脂肪燃焼促進を図ることできる。
【００２３】
本発明に用いる温熱刺激としては、ヒト又は動物の局所、すなわちＵＣＰ１の発現増加を望む部位（臓器・器官・組織）、もしくは全身に外部から温熱負荷を与えるのが好ましい。人の場合、少なくとも３８℃以上の温熱負荷を３０分以上、好ましくは４０〜４３℃の温熱負荷を３０〜６０分与えるのがよい。
【００２４】
温熱刺激は、最低1週間に1回、好ましくは３日に1回、更に好ましくは毎日とし、この温熱刺激を1回もしくは複数回繰り返すことにより行うことができる。
【００２５】
温熱刺激は、ＵＣＰ１の発現誘導が可能な温熱負荷手段を用いて行えばよいが、好適には、既存の温熱負荷装置又は器具を用いて、上記の温熱負荷を与えるのがよい。
【００２６】
熱負荷装置・器具は、ヒト又は動物の局所又は全身に温熱刺激を加えることができ、その熱量、温度が制御可能であれば、どのような熱負荷装置又は器具を用いてもよい。
【００２７】
温熱負荷装置・器具の熱源は、通常ガス、電気等であり、熱源で作られた熱の搬送手段は、パイプ、電線等が挙げられる。これらの熱をヒト、動物等に伝える媒体としては、気体、液体、伝熱性のある固体等が挙げられる。例えば、温熱負荷装置として、電源を必要とするエアーインキュベーターである場合、電気により発生させた熱を、電線やパイプで搬送し、気体を媒体として生体に熱を伝えればよい。また、超音波振動や、マイクロ波による温熱負荷等も、本発明の温熱負荷法として用いることができる。
また、熱を発生する市販の温熱カイロ類や温熱貼布剤、蒸気温熱貼布剤等を用いることもできる。
【実施例】
【００２８】
試験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢  ♂）（日本クレア）を用いた。試験開始前の１週間、室温２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間の明暗サイクル（明期；ＡＭ７：００〜ＰＭ７：００）下で予備飼育した。尚、飼育期間中、すべてのマウスに、ＣＥ−２固形食（日本クレア）を自由摂食させるとともに、水道水を自由飲水させた。
【００２９】
１週間の予備飼育後、平均体重が等しくなるように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを非加温群と加温群の２群に分けた。加温群のマウスは、４１℃のヒートチャンバーに１時間入れることで温熱刺激を与え、その刺激から１２、２４、３６、４８時間後に解剖を行い(Ｎ＝６)、肩甲骨間白色脂肪(WAT)と、肩甲骨間褐色脂肪(BAT) を採取した。非加温群はコントロールとし、温熱刺激を与えず、０、１２、２４、３６、４８時間後に解剖を行い(Ｎ＝６)、ＷＡＴとＢＡＴを採取した。温熱刺激による脱水症状を避けるため、加温群のマウスは、ヒートチャンバー内で４１℃の水を自由摂取できるようにした。採取した脂肪組織は、1mlのISOGEN(ニッポンジーン)内でホモジナイズ後、ただちに液体窒素に入れ、凍結保存した。
【００３０】
凍結した組織からのＲＮＡの調製は、ＩＳＯＧＥＮのマニュアルに従った。
調製したＲＮＡは濃度をそろえ、６５℃、１０分間の熱処理を行い、急冷後に使用した。逆転写には、１２５ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、２０μｌの反応液（１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  II（Roche）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Roche）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Takara），２．５ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）１８  ｍＲＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（New England Biolabs）、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Takara））を調製した。反応は４２℃，６０分→５２℃、３０分→９９℃、５分→４℃で行い、得られたｃＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。また、定量的ＰＣＲのスタンダード用として、５００ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、同様の反応系で逆転写を行った。
【００３１】
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７５００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）にて定量的ＰＣＲを行った。スタンダード用ｃＤＮＡを７段階希釈したものをスタンダードとして、作成した標準曲線に基づき、定量を行った。得られた解析結果は３６Ｂ４の発現量を内部標準として補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として表した。反応液は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）  ２５μｌ、１００μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２２μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、となるように調製した。定量的ＰＣＲの温度条件は５０℃２分、９５℃１０秒の後、９５℃１５秒と６０℃１分の反応を４０  サイクル繰り返した。
以下に、定量的ＰＣＲで用いたプライマーの配列を示す。
【００３２】
【表１】
2011019615.tif 000003
【００３３】
試験結果は、温熱刺激から０、１２、２４、３６、４８時間後の各点の非加温群の遺伝子発現量を１とした相対平均を求め、平均値±標準偏差(Average(Ave)±standard deviation(SD))で表した。また、有意差検定は各時点の非加温群と加温群の間でｔ−ｔｅｓｔを行い、ｐ値が０．０５未満のものを統計学的有意差があるとした。
【００３４】
マウスに温熱刺激を与えると、刺激から１２時間後にはＢＡＴのＵＣＰ１の遺伝子発現が増加しはじめ、２４時間後には有意な発現増加が認められた（図１）。さらに、ＵＣＰ１の発現の高い状態は、温熱刺激から４８時間後でも維持されていた。このことから、温熱刺激はＢＡＴにおけるＵＣＰ１の発現を増加させることが明らかになった。したがって、温熱刺激は、熱エネルギーの産生亢進に有効であると考えられる。
【００３５】
また、温熱刺激はＷＡＴにおいてもＵＣＰ１の遺伝子発現を増加させた（図２）。温熱刺激から１２時間後にはＵＣＰ１遺伝子の有意な増加が認められ、この有意な増加状態は、４８時間後も観察された。このことから、温熱刺激はＷＡＴにおいても、ＵＣＰ１の発現増加を促し、熱エネルギーの産生を亢進させることが示された。
【００３６】
以上のことから、温熱刺激は、ＵＣＰ１の発現増加を引き起こし、熱産生能を向上させることが示された。このような熱によるエネルギー消費は、余剰な脂肪や糖の燃焼を促進することから、生体における脂肪蓄積を抑制することにつながる。従って、ＵＣＰ１の発現誘導を促す温熱刺激は、肥満や生活習慣病の制御に有効であると考えられる。
【図１】
2011019615.tif 000004
【図２】
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【配列表】
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