(57)【要約】【課題】蛍光染色された微生物に対して従来よりも早く焦点を合わせることを目的とする。【解決手段】微生物検出方法が、ろ過によりフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡を用いて前記フィルタから検出する微生物検出方法であって、蛍光を発する蛍光印を前記フィルタ上に配置する蛍光印配置工程を具備する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過によりフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡を用いて前記フィルタから検出する微生物検出方法であって、
蛍光を発する蛍光印を前記フィルタ上に配置する蛍光印配置工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記フィルタのろ過に使用された面（ろ過面）の外に前記蛍光印を配置することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記ろ過面は円形であり、ろ過面の外周に沿って３つ以上の前記蛍光印を配置することを特徴とする請求項２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記蛍光印は、蛍光ビーズから構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項５】
蛍光印配置穴が開いた蛍光印配置板を前記フィルタに重ね、蛍光印配置穴の中に蛍光印を作成することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項６】
ろ過により試料中の微生物を捕集するフィルタであって、
蛍光を発する蛍光印が配置されていることを特徴とするフィルタ。
【請求項７】
ろ過に使用される面（ろ過面）の外に前記蛍光印が配置されていることを特徴とする請求項６に記載のフィルタ。
【請求項８】
前記ろ過面は円形であり、ろ過面の外周に沿って３つ以上の前記蛍光印が配置されていることを特徴とする請求項７に記載のフィルタ。
【請求項９】
前記蛍光印は、蛍光ビーズから構成されていることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載のフィルタ。
【請求項１０】
中央にろ過用穴が開き、前記ろ過用穴の外周に沿って蛍光印配置穴が開いていることを特徴とする蛍光印配置板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出方法、フィルタ及び蛍光印配置板に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステージの平面移動と焦点合わせとが自動化された顕微鏡では、微生物を撮影する際に、ステージの移動により標本上の視野が切り替わる毎にオートフォーカスで焦点を合わす。しかし、標本内の全ての微生物を検出するためには、全ての視野においてオートフォーカスで焦点を合わせなければならないので、撮影に時間がかかるという問題があった。さらに、顕微鏡では、ステージの移動より残留振動が発生してしまうので、これが収束するまでオートフォーカスが行えずに撮影により時間がかかっていた。
そのため、残留振動によるオートフォーカスの遅れを解決する発明として、下記特許文献１には、振動数を計算して、振動が収束した時の焦点を推測することにより残留振動が収束する前にオートフォーカスを行うことができる顕微鏡が開示されている。
また、オートフォーカスを行うことで撮影に時間がかかるという問題を解決する発明として、下記特許文献２には、ＣＣＤカメラのビデオ信号から直接対象の焦点度を測定することで、リアルタイムに焦点を合わすことができる顕微鏡が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７‐１０１６２３号公報
【特許文献２】特表２００１‐５１１９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記特許文献１では、残留振動が収束する前にオートフォーカスを行うことで撮影時間の短縮を図っている。しかし、標本が暗い場合には露光のための時間が長くなるので、オートフォーカスに時間がかかってしまう。そのため、標本に含まれる微生物が蛍光染色されている場合には、オートフォーカス中に微生物の蛍光が退色してしまうので、当該微生物を検出することが困難になっていた。また、上記特許文献２でも、上記特許文献１と同様の理由で、微生物を検出することが困難になっていた。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、蛍光染色された微生物に対して従来よりも早く焦点を合わせることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、ろ過によりフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡を用いて前記フィルタから検出する微生物検出方法であって、
蛍光を発する蛍光印を前記フィルタ上に配置する蛍光印配置工程を具備するという手段を採用する。
【０００７】
本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記フィルタのろ過に使用された面（ろ過面）の外に前記蛍光印を配置するという手段を採用する。
【０００８】
本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記ろ過面は円形であり、ろ過面の外周に沿って３つ以上の前記蛍光印を配置するという手段を採用する。
【０００９】
本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１〜第３のいずれかの解決手段において、前記蛍光印は、蛍光ビーズから構成されているという手段を採用する。
【００１０】
本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第１〜第４のいずれかの解決手段において、蛍光印配置穴が開いた蛍光印配置板を前記フィルタに重ね、蛍光印配置穴の中に蛍光印を作成するという手段を採用する。
【００１１】
本発明では、フィルタに係る第１の解決手段として、ろ過により試料中の微生物を捕集するフィルタであって、蛍光を発する蛍光印が配置されているという手段を採用する。
【００１２】
本発明では、フィルタに係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、ろ過に使用される面（ろ過面）の外に前記蛍光印が配置されているという手段を採用する。
【００１３】
本発明では、フィルタに係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記ろ過面は円形であり、ろ過面の外周に沿って３つ以上の前記蛍光印が配置されているという手段を採用する。
【００１４】
本発明では、フィルタに係る第４の解決手段として、上記第１〜第３のいずれかの解決手段において、前記蛍光印は、蛍光ビーズから構成されているという手段を採用する。
【００１５】
本発明では、蛍光印配置板に係る第１の解決手段として、中央にろ過用穴が開き、前記ろ過用穴の外周に沿って蛍光印配置穴が開いているという手段を採用する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、蛍光印をフィルタに配置する。これにより、蛍光顕微鏡は、蛍光印を基準にオートフォーカスしておくことで、視野が移動したとしても蛍光染色された微生物に対して従来よりも早く焦点を合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法のフローチャートである。
【図２】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第２の工程（蛍光印配置工程）を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第３の工程を示す模式図である。
【図４】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第３の工程の結果を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
本実施形態に係るレジオネラ菌検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からレジオネラ菌を検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第１１の工程を有するものである。また、これら第１〜第１１の工程のうち、第２の工程は、本実施形態における蛍光印配置工程である。
【００１９】
レジオネラ菌検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、レジオネラ菌を含む液体試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することでレジオネラ菌の固定標本を作製する（ステップＳ１）。
【００２０】
〔第２の工程（蛍光印配置工程）〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、液体試料のろ過に用いるメンブレンフィルタ上に蛍光印を配置する（ステップＳ２）。ここで、上記第２の工程について、図２を参照して具体的に説明する。まず、メンブレフィルタＦｌの上に蛍光印配置板Ａｂを外周が一致するように重ねる（図２の（ａ）参照）。
【００２１】
上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。このメンブレンフィルタの中央部の直径１６ｍｍの円形領域（ろ過面Ｆｓ）が、ろ過に使用される。また、上記蛍光印配置板Ａｂは、薄いシリコン板であり、その中央にメンブレンフィルタＦｌのろ過面Ｆｓと同じ大きさの穴（ろ過用穴Ｆｈ）が開いている。さらに、蛍光印配置板Ａｂは、ろ過用穴Ｆｈの外周に沿って等間隔で４つの蛍光印配置穴Ａｈが開いている。なお、蛍光印配置板Ａｂの材質は、上述したシリコンでなくても、柔軟かつメンブレンフィルタＦｌに密着できるものであればよい。また、蛍光印配置穴Ａｈそれぞれは、ろ過用穴Ｆｈからの距離が例えば０．５ｍｍと一定であることが好ましい。
【００２２】
そして、電気泳動用ピペットで蛍光印配置穴Ａｈの中に蛍光ビーズ（Fluorebrite Polychromatic Red Microspheres，Polysciens,Inc）の懸濁液を滴下する。すると、図２の（ｂ）に示すように蛍光ビーズから構成される４つの蛍光印ＦｍがメンブレンフィルタＦｌ上に配置される。上記蛍光ビーズは、微生物等を画像解析によって抽出する際に、基準色及び基準サイズとして用いられるものであり、０．５μｍ程度の大きさである。そして、蛍光ビーズは、波長４９５ｎｍの青色の励起光が照射されると、波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発する。この蛍光ビーズの懸濁液は、３．６４×１０１１Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ/ｍｌを例えば１／１０〜１／２０、より望ましい限定的な濃度として１／１００〜１／２００、さらに望ましい限定的な濃度として１／１０００〜１／２０００に希釈したものである。そして、この懸濁液を１０μｌずつ蛍光印配置穴Ａｈの中のメンブレンフィルタＦｌ上にのせる。
【００２３】
〔第３の工程〕
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記液体試料をろ過装置によってろ過することで、レジオネラ菌の固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ３）。ここで、上記第３の工程について、図３及び図４を参照して具体的に説明する。ろ過装置１０は、図３に示すように、ろ過タワー１、蛍光印配置板Ａｂ、メンブレンフィルタＦｌ及びろ過びん２から構成されている。
【００２４】
ろ過タワー１はメンブレンフィルタＦｌに液体試料を導入するための筒形状の流路であり、蛍光印配置板Ａｂの上に取り付けられている。そして、ろ過タワー１の内周と蛍光印配置板Ａｂのろ過用穴Ｆｈは一致する。これにより、液体試料が、メンブレンズフィルタＦｌのろ過面Ｆｓに導かれる。蛍光印配置板Ａｂ及びメンブレンフィルタＦｌについては、上述しているので説明を省略する。ろ過びん２は、吸引ろ過器（図示略）に接続し、内部の空気が吸引ろ過器に吸引されることでメンブレンフィルタＦｌを通過した液体をためるびんである。
【００２５】
このようなろ過装置１０において液体試料をろ過する。そして、ろ過が完了すると、ろ過タワー１及びろ過びん２から蛍光印配置板Ａｂ及びメンブレンフィルタＦｌを取り外す。そして、メンブレンフィルタＦｌから蛍光印配置板Ａｂを取り外すと、図４に示すように、メンブレンフィルタＦｌの中央部のろ過面Ｆｓにはレジオネラ菌を含む標本Ｓｐが捕集されている。そして、４つの蛍光印Ｆｍが、ろ過面Ｆｓの外周に沿って配置されている。
【００２６】
〔第４の工程〕
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ４）。
〔第５の工程〕                          
上記第４の工程が終了すると、次に第５の工程において、上記メンブレンフィルタの全面にハイブリダイゼーションバッファを塗布する（ステップＳ５）。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。
【００２７】
〔第６の工程〕                          
上記第５の工程が終了すると、次に第６の工程において、上記メンブレンフィルタ上のレジオネラ菌にプローブを結合させる（ステップＳ６）。第５の工程を具体的に説明すると、まずレジオネラ菌用プローブ溶液の入ったシャーレのような内底面が平坦な容器に上記メンブレンフィルタを入れる。そして、インキュベータを使ってシャーレのような内底面が平坦な容器を４６℃の温度下で、約２時間インキュベートさせる。これにより、レジオネラ菌に対するプローブの結合が促進され、時間の経過とともにレジオネラ菌とプローブとが結合する。なお、プローブとは、標的微生物であるレジオネラ菌の核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチドに蛍光色素を共有結合したものである。
【００２８】
〔第７の工程〕
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、プローブ溶液から取り出したメンブレンフィルタをウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応のプローブを洗浄する（ステップＳ７）。
〔第８の工程〕
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ８）。
〔第９の工程〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、０．０５％寒天を加熱溶解後、４０℃程度で溶解を保持した寒天溶液中にメンブレンフィルタを浸した後に、標本捕集面を下にしてスライドガラス上に気泡を含まないように付着させ、乾燥させる（ステップＳ９）。メンブレンフィルタを載せる基板はスライドガラスでも良いが、より平面度を増すためには平行平面基板など平面度の高い物を用いたほうがよい。また、蛍光染色の場合には基板は透明である必要は無く、シリコンウェハーなども利用可能である。
【００２９】
〔第１０の工程〕
上記第９の工程が終了すると、次に第１０の工程において、スライドガラス上のメンブレンフィルタにベクターシールドを滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる（ステップＳ１０）。
【００３０】
〔第１１の工程〕
上記第１０の工程が終了すると、次に第１１の工程において、蛍光顕微鏡の対物レンズの焦点を蛍光印に基づいてオートフォーカスにより調整し、その後に蛍光顕微鏡でメンブレンフィルタ上のレジオネラ菌を検出する（ステップＳ１１）。つまり、蛍光顕微鏡にスライドガラスを取り付け、対物レンズをカバーガラスに接するように配置する。そして、蛍光顕微鏡に波長４９５ｎｍの青色の励起光を照射させた上で、対物レンズが蛍光印の真上に来るようにステージを移動させ、オートフォーカスにより対物レンズの焦点を蛍光印に合わせる。この際、蛍光印は、励起光により蛍光を発している。その後、蛍光印の高さとレジオネラ菌の高さの違いに基づいて対物レンズの焦点をレジオネラ菌に合うように調整する。そして、自動的にステージを移動させながら、メンブレンズフィルタのろ過面上の標本の撮影を実行させて、撮影した画像から蛍光を基にレジオネラ菌を検出する。
【００３１】
上述のように、レジオネラ菌に焦点が合うように調整されているので、蛍光顕微鏡の視野が移動しても、オートフォーカスによる焦点の再調整がほとんど行われることがない。そして、蛍光顕微鏡によって画像を撮影したところ、通常の方法では画像全体にフォーカスの合う写真は１０枚に１枚程度であったが、本実施形態に係る微生物検出方法を使うことで多数の画像において良好なフォーカスの画像が得られた。
【００３２】
以上のように、本実施形態では、蛍光印をメンブレンフィルタに配置する。これにより、蛍光顕微鏡は、蛍光印を基準にオートフォーカスしておくことで、視野が移動したとしても蛍光染色された微生物に対して従来よりも早く焦点を合わせることができる。
【００３３】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態は、ＦＩＳＨ法を用いたレジオネラ菌検出方法に本発明を適用したものであったが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法などのＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法でレジオネラ菌を検出するレジオネラ菌検出方法に、本発明を適用するようにしてもよい。
【００３４】
（２）上記実施形態では、メンブレンフィルタ上に４つの蛍光印を配置したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、メンブレンフィルタ上に蛍光印を３つ以上であればいくつ配置してもよい。すなわち、本発明の蛍光印は３つ以上であればよい。
【００３５】
（３）上記実施形態では、メンブレンフィルタのろ過面の外に蛍光印を配置したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ろ過面上に蛍光印を配置するようにしてもよい。
【００３６】
（４）上記実施形態では、蛍光印を蛍光ビーズで構成したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、蛍光インクで蛍光印を構成するようにしてもよい。すなわち、蛍光を発するものであれば、どのようなもので蛍光印を構成するようにしてもよい。
【００３７】
（５）上記実施形態では、蛍光印を基準にオートフォーカスしておくことで、視野が移動したとしても蛍光染色された微生物に対して従来よりも早く焦点を合わせが、本発明はこれに限定されない。
例えば、蛍光印が３点以上存在する場合には、蛍光印の空間座標から標本の面に近似する標本近似面を求め、当該標本近似面に基づいて標本の水平位置に応じた垂直位置を算出し、垂直位置を前記水平位置における合焦点とするようにしてもよい。
【００３８】
１…ろ過タワー、２…ろ過びん、１０…ろ過装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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