(57)【要約】【課題】被測定粒子を蛍光色素で染色することなく、被測定粒子の大きさを測定することが可能な粒子径測定装置を提供する。【解決手段】粒子径測定装置１は、液体中において運動する被測定粒子３の大きさを測定する装置であって、光透過性を有する材料を用いて形成され、液体とともに被測定粒子３を保持する保持空間を有するサンプルホルダー５と、サンプルホルダー５内の被測定粒子３に照明光を照射する照明光学系１０と、照明光のうち被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面３１に入射させる結像光学系２０と、撮像面３１に入射した光の分布を画像として取得するイメージセンサー３０と、イメージセンサー３０により得られた画像を所定時間積算して積算画像を形成し、その積算画像に基づいて被測定粒子３の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて被測定粒子３の大きさを算出するコンピュータ５０とを備えて構成される。【選択図】図１
2011021948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中において運動する被測定粒子の大きさを測定する粒子径測定装置であって、
光透過性を有する材料を用いて形成され、液体とともに前記被測定粒子を保持する保持空間を有する保持部材と、
前記保持部材に保持された前記被測定粒子に照明光を照射する照明部と、
前記照明部により照射された照明光のうち前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面に入射させる結像部と、
前記結像部により前記撮像面に入射した光の分布を画像として取得する撮像部と、
前記撮像部により得られた画像を所定時間積算して積算画像を形成し、その積算画像に基づいて前記被測定粒子の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて前記被測定粒子の大きさを算出する演算処理部とを備えて構成されることを特徴とする粒子径測定装置。
【請求項２】
前記演算処理部は、算出した前記被測定粒子の大きさ基づいて前記測定粒子間の相互作用の程度を算出することを特徴とする請求項１に記載の粒子径測定装置。
【請求項３】
前記照明部は、光源部から射出された照明光を透過させて回折光を発生させる回折素子と、前記回折素子により生じた回折光を集光する第１集光レンズと、前記第１集光レンズにより集光された回折光のうち、少なくとも２つの所定次数の回折光のみを通過させる第１遮光部材と、前記第１遮光部材を通過した前記所定次数の回折光を前記保持部材の前記保持空間内において交差させる対物レンズとを有し、
前記結像部は、前記保持部材を透過した前記所定次数の回折光を集光する第２集光レンズと、前記第２集光レンズにより集光された前記所定次数の回折光のうち、前記被測定粒子によって射出方向が前記所定方向に変化した光のみを通過させる第２遮光部材と、前記第２遮光部材を通過した前記所定次数の回折光を前記撮像面に入射させる結像レンズとを有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の粒子径測定装置。
【請求項４】
前記第１遮光部材は、前記第１集光レンズにより集光された回折光のうち±１次回折光のみを通過させるように構成されることを特徴とする請求項３に記載の粒子径測定装置。
【請求項５】
前記第１遮光部材と前記第２遮光部材は、前記第１集光レンズおよび前記第２集光レンズを介して共役な位置に設けられ、
前記保持部材と前記撮像部は、前記第２集光レンズおよび前記結像レンズを介して共役な位置に設けられていることを特徴とする請求項３または請求項４に記載の粒子径測定装置。
【請求項６】
前記保持部材は、前記照明部から射出された前記照明光が透過する面に凹溝が所定周期で形成され、その凹溝内に前記液体とともに前記被測定粒子を保持するとともに、前記凹溝が形成された面を前記照明光を透過させて回折光を発生させるように構成され、
前記結像部は、前記保持部材により生じた回折光を集光する集光レンズと、前記集光レンズにより集光された前記回折光のうち、前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した光のみを通過させる遮光部材と、前記遮光部材を通過した前記回折光を前記撮像面に入射させる結像レンズとを有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の粒子径測定装置。
【請求項７】
液体中において運動する被測定粒子の大きさを測定する粒子径測定装置であって、
液体とともに前記被測定粒子を保持する保持空間を有する保持部材と、
前記保持部材に保持された前記被測定粒子に照明光を照射する照明部と、
前記照明部により照射された照明光のうち前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面に入射させる結像部と、
前記結像部により前記撮像面に入射した光の分布を画像として取得する撮像部と、
前記撮像部により得られた画像を所定時間積算して積算画像を形成し、その積算画像に基づいて前記被測定粒子の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて前記被測定粒子の大きさを算出する演算処理部とを備え、
前記保持部材は、前記照明部から射出された前記照明光が照射される面に凹溝が所定周期で形成され、その凹溝内に前記液体とともに前記被測定粒子を保持するとともに、前記凹溝が形成された面で前記照明光を反射させて回折光を発生させるように構成され、
前記結像部は、前記保持部材により生じた回折光を集光する集光レンズと、前記集光レンズにより集光された前記回折光うち、前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した回折光および０次回折光を通過させる遮光部材と、前記遮光部材を通過した前記回折光を前記撮像面に入射させる結像レンズとを有して構成されることを特徴とする粒子径測定装置。
【請求項８】
前記結像部は、前記保持部材で反射して生じた０次回折光を遮断する０次回折光遮断手段を有して構成されることを特徴とする請求項７に記載の粒子径測定装置。
【請求項９】
前記保持部材と前記撮像部は、前記集光レンズおよび前記結像レンズを介して共役な位置に設けられていることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の粒子径測定装置。
【請求項１０】
前記被測定粒子は蛋白質等の生体分子であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の粒子径測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中において運動する被測定粒子の大きさを測定する粒子径測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、このような測定装置として、蛍光相関分光法（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy:ＦＣＳ）を用いた装置が知られている（例えば、特許文献１を参照）。この蛍光相関分光法では、共焦点レーザーを用い、１フェムトリットルの領域までレーザー光の焦点を絞り、蛍光標識した分子が共焦点領域（測定領域）を通過したときに発する蛍光を検出する。このとき、溶液中の分子はブラウン運動により自由に移動しており、小さな分子は動きが速く、測定領域を速く通過するため蛍光の信号強度の変化が速くなり、大きな分子は動きが遅いため蛍光の信号強度の変化が遅くなる。そこで、この蛍光の信号強度の揺らぎの速さから分子の運動速度（並進拡散時間）を自己相関法により求めることで、分子の大きさや、測定領域あたりの分子数を測定（推測）することができる。また、分子間の相互作用により分子が繰り返し結合したり離れたりしていると、分子の実効的な大きさが大きくなるため、このような場合には分子の大きさの測定から相互作用の大小も測定（推測）でき、分子間の相互作用解析が可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４‐７７２９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記のような方法では、被測定粒子を蛍光色素で染色しなければならず、試料の準備に時間や手数がかかるだけでなく、蛍光色素が毒性をもっているため、被測定粒子が生体分子の場合には長時間生きたままの測定が困難であるという問題があった。
【０００５】
本発明はこのような課題に鑑みたものであり、被測定粒子を蛍光色素で染色することなく、被測定粒子の大きさを測定することが可能な粒子径測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的を達成するため、第１の本発明に係る粒子径測定装置は、液体中において運動する被測定粒子の大きさを測定する装置であって、光透過性を有する材料を用いて形成され、液体とともに前記被測定粒子を保持する保持空間を有する保持部材と、前記保持部材に保持された前記被測定粒子に照明光を照射する照明部と、前記照明部により照射された照明光のうち前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面に入射させる結像部と、前記結像部により前記撮像面に入射した光の分布を画像として取得する撮像部と、前記撮像部により得られた画像を所定時間積算して積算画像を形成し、その積算画像に基づいて前記被測定粒子の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて前記被測定粒子の大きさを算出する演算処理部とを備えて構成される。
【０００７】
また、上記のような目的を達成するため、第２の本発明に係る粒子径測定装置は、液体中において運動する被測定粒子の大きさを測定する装置であって、液体とともに前記被測定粒子を保持する保持空間を有する保持部材と、前記保持部材に保持された前記被測定粒子に照明光を照射する照明部と、前記照明部により照射された照明光のうち前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面に入射させる結像部と、前記結像部により前記撮像面に入射した光の分布を画像として取得する撮像部と、前記撮像部により得られた画像を所定時間積算して積算画像を形成し、その積算画像に基づいて前記被測定粒子の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて前記被測定粒子の大きさを算出する演算処理部とを備え、前記保持部材は、前記照明部から射出された前記照明光が照射される面に凹溝が所定周期で形成され、その凹溝内に前記液体とともに前記被測定粒子を保持するとともに、前記凹溝が形成された面で前記照明光を反射させて回折光を発生させるように構成され、前記結像部は、前記保持部材により生じた回折光を集光する集光レンズと、前記集光レンズにより集光された前記回折光うち、前記被測定粒子によって射出方向が所定方向に変化した回折光および０次回折光を通過させる遮光部材と、前記遮光部材を通過した前記回折光を前記撮像面に入射させる結像レンズとを有して構成される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、被測定粒子を蛍光色素で染色することなく、被測定粒子の大きさを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係る第１実施形態の粒子径測定装置の構成を示す図である。
【図２】積算画像（干渉縞）の信号強度分布とその自己相関を概略的に示した図であり、（ａ）は小さな粒子の場合であり、（ｂ）は大きな粒子の場合である。を概略的に示した図であり、
【図３】本発明に係る第２実施形態の粒子径測定装置の構成を示す図である。
【図４】本発明に係る第３実施形態の粒子径測定装置の構成を示す図である。
【図５】上記第３実施形態の粒子径測定装置の変形例の構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。第１実施形態に係る粒子径測定装置１は、図１に示すように、測定対象物である複数の被測定粒子３を保持するサンプルホルダー５と、サンプルホルダー５内の被測定粒子３に照明光を照射する照明光学系１０と、照明光のうち被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを所定の撮像面３１に入射させる結像光学系２０と、撮像面３１に入射した光の分布を画像として取得するイメージセンサー３０と、イメージセンサー３０からの画像データ（検出信号）に基づいて被測定粒子３の大きさを算出するコンピュータ５０とを有して構成される。
【００１１】
サンプルホルダー５は、光透過性を有する材料を用いて容器状に形成され、内部に水等の液体とともに複数の被測定粒子３を保持するように構成されている。サンプルホルダー５内に保持された被測定粒子３は、液体中を自由に移動しており、いわゆるブラウン運動を行っている。サンプルホルダー５は、ホルダー支持機構（図示せず）によって照明光学系１０から射出される照明光が入射する位置に支持されている。
【００１２】
照明光学系１０は、コヒーレント光である照明光を射出する光源１１と、光源１１から射出された照明光を所定径の平行光に変換するコリメータレンズ系１２と、コリメータレンズ系１２によって変換された平行光を透過させて回折光を発生させる位相回折素子１３と、位相回折素子１３により生じた回折光を集光する第１集光レンズ１４と、第１集光レンズ１４によって集光された回折光のうち±１次回折光以外の回折光を遮断する遮光板１５と、遮光板１５を通過した±１次回折光をサンプルホルダー５内において交差させる対物レンズ１６とを有して構成される。
【００１３】
位相回折素子１３は、光透過性を有する材料からなる平板の一面に直線状の凹凸パターンが所定周期で形成されており、このパターンが形成されている面（以下、回折面１３ａと称する）を透過した光を各次数の回折光に分割するように構成されている。なお、位相回折素子１３における回折面１３ａの反対側の面（裏面）には反射防止コートが施されており、この裏面に光源１１から射出された照明光が入射する。
【００１４】
遮光板１５は、第１集光レンズ１４および対物レンズ１６の間に配置され、位相回折素子１３により分割されて第１集光レンズ１４で集光された各次数の回折光のうち、±１次回折光のみ通過することが可能な通過孔１５ａ，１５ｂを有して構成されている。すなわち、遮光板１５は、位相回折素子１３によって分割された０次回折光、±２次回折光、・・・を遮断するように構成されている。
【００１５】
光源１１から射出された照明光（コヒーレント光）は、コリメータレンズ系１２を透過して所定径の平行光となり、位相回折素子１３に入射する。位相回折素子１３に入射した照明光は、回折面１３ａを透過して各次数の回折光に分割されて第１集光レンズ１４で集光され、各次数の回折光のうち±１次回折光以外の光が遮光板１５によって遮断される。遮光板１５の通過孔１５ａ，１５ｂを通過した±１次回折光は、対物レンズ１６により複数の被測定粒子３が保持されているサンプルホルダー５内において交差し、そこに干渉縞（回折素子１３のパターン形状）を形成する。そして、サンプルホルダー５を透過した±１次回折光は、結像光学系２０に入射する。
【００１６】
結像光学系２０は、サンプルホルダー５を透過した±１次回折光を集光する第２集光レンズ２１と、結像光学系２０の瞳面上に配置された絞り２２と、絞り２２を通過した光を撮像面３１に入射させる結像レンズ２３とを有して構成される。
【００１７】
絞り２２は、第２集光レンズ２１と結像レンズ２３の間に配置されており、サンプルホルダー５を透過して第２集光レンズ２１で集光された±１次回折光のうち、被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを通過させるように構成されている。すなわち、絞り２２は、サンプルホルダー５を透過した±１次回折光の射出方向が被測定粒子３によって上記所定方向以外に変化した光、およびサンプルホルダー５を透過する際に変化しなかった（被測定粒子３の影響を受けなかった）光を遮断するように構成されている。絞り２２と遮光板１５は、第１および第２集光レンズ１４，２１を介して共役な位置に設けられている。
【００１８】
サンプルホルダー５を透過した±１次回折光は、第２集光レンズ２１によって集光され、そのうちのホルダー５内の被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみが絞り２２を通過し、それ以外の光は絞り２２によって遮断される。絞り２２を通過した±１次回折光は、結像レンズ２３を透過してイメージセンサー３０の検出部に設けられた撮像面３１に入射する。
【００１９】
イメージセンサー３０は、結像光学系２０を介して撮像面３１に入射した光（以下、測定光と称する）を検出し、イメージセンサー３０の検出部、すなわち撮像面３１における測定光の分布を画像として取得するように構成され、その画像データ（検出信号）をコンピュータ（演算処理部）５０へ出力する。イメージセンサー３０の撮像面３１は、照明光学系１０によって干渉縞が形成されるサンプルホルダー５内の像面と結像光学系２０を介して共役な位置に設けられている。
【００２０】
コンピュータ５０は、イメージセンサー３０から出力された画像データを所定時間積算して積算画像（干渉縞）を形成し、その積算画像に基づいて被測定粒子３の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて被測定粒子３の大きさを算出する。また、算出した被測定粒子３の大きさに基づいて粒子間の相互作用を算出する。コンピュータ５０は、積算画像（干渉縞）や測定結果をモニター５１に表示することもできる。
【００２１】
以上において説明したように、粒子径測定装置１では、仮に複数の被測定粒子３を保持したサンプルホルダー５における屈折率分布が一様ならば、サンプルホルダー５を透過した±１次回折光は、絞り２２により遮断されてイメージセンサー３０（撮像面３１）に到達しないように構成されている。ところが、上述したようにサンプルホルダー５内の被測定粒子３は液体中を自由に移動している（ブラウン運動を行っている）ため、サンプルホルダー５における屈折率分布が時々刻々と変化し、そこに照射された±１次回折光の射出方向が時々刻々と変化する。そのため、サンプルホルダー５を透過した±１次回折光の一部は、絞り２２を通過して撮像面３１に到達するようになり、イメージセンサー３０によって検出される画像データも時々刻々と変化する。
【００２２】
コンピュータ５０では、イメージセンサー３０によって検出される画像データを十分な時間において積算すれば、サンプルホルダー５内に形成された干渉縞（回折素子１３のパターン形状）を得ることができる。しかし、積算時間が十分長くない場合には、干渉縞の完成度は低くなる。すなわち、積算時間をある一定時間に設定すれば、屈折率分布の時間変化が速いほど干渉縞の完成度が高くなる。図２に所定時間積算して得られる干渉縞（積算画像）の信号強度分布を概略的に示すように、小さな粒子の場合は、粒子の動きが速いため、より多くの屈折率分布による画像データ（信号パターン）が積算され、完成度の高い干渉縞が得られる。それに対し、大きな粒子の場合は、粒子の動きが遅いため、より少ない屈折率分布による画像データしか積算されないので、干渉縞の完成度は低くなる。
【００２３】
このように、イメージセンサー３０で検出された画像データを所定時間積算して得られる干渉縞（積算画像）の完成度は被測定粒子３の大きさに応じて異なる。したがって、コンピュータ５０は、この干渉縞から被測定粒子３の運動速度（並進拡散時間）を自己相関法等により求めることで、被測定粒子３の大きさを算出することができる。図２に示すように、得られた干渉縞の信号強度分布の自己相関をとると、小さな粒子の場合は各ピーク値の差が少ない波形となり、大きな粒子の場合は中心ｔ0（時間シフト量がゼロの場合）のピーク値だけが他のピーク値よりも大きい波形となる。このように、中心ｔ0のピーク値とその他のピーク値の関係（比等）と、粒子の大きさとが対応付けられるので、この対応付けから粒子の大きさを算出（推測）することができる。また、粒子間の相互作用により、粒子が繰り返し結合したり離れたりしていると、粒子の実効的な大きさが大きくなる。このような場合、粒子の大きさの算出から粒子間相互作用の大小も算出（推測）できる。
【００２４】
次に、第２実施形態に係る粒子径測定装置１００について図３を参照して説明する。なお、上述の粒子径測定装置１と共通する構成要素には同一符号を付してその説明を省略する。粒子径測定装置１００は、測定対象物である複数の被測定粒子３を保持するとともに透過光を各次数の回折光に分割するサンプルホルダー１０５と、サンプルホルダー１０５内の被測定粒子３に照明光を照射する照明光学系１１０と、照明光のうち被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面３１に入射させる結像光学系１２０と、イメージセンサー３０と、コンピュータ５０とを有して構成される。
【００２５】
照明光学系１１０は、光源１１と、コリメータレンズ系１２とを有して構成される。光源１１から射出された照明光（コヒーレント光）は、コリメータレンズ系１２によって所定径の平行光に変換され、サンプルホルダー１０５に入射する。
【００２６】
サンプルホルダー１０５は、光透過性を有する材料からなる平板の一面に直線状の凹溝が所定周期で形成され、その各凹溝に水等の液体とともに複数の被測定粒子３を保持するように構成されている。また、サンプルホルダー１０５は、上記凹溝が形成されている面（以下、回折面１０５ａと称する）を透過した光を各次数の回折光に分割するように構成されている。なお、サンプルホルダー１０５における回折面１０５ａの反対側の面（裏面）には反射防止コートが施されており、この裏面に光源１１から射出された照明光が入射する。サンプルホルダー１０５に入射した照明光は、回折面１０５ａを透過して各次数の回折光に分割されて結像光学系１２０に入射する。
【００２７】
結像光学系１２０は、サンプルホルダー１０５を透過して生じた回折光を集光する集光レンズ１２１と、結像光学系１２０の瞳面上に配置された絞り１２２と、絞り１２２を通過した光を撮像面３１に入射させる結像レンズ１２３とを有して構成される。絞り１２２は、集光レンズ１２１と結像レンズ１２３の間に配置されており、サンプルホルダー１０５を透過して生じた各次数の回折光のうち、被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを通過させるように構成されている。すなわち、絞り１２２は、サンプルホルダー１０５を透過して生じた回折光の射出方向が被測定粒子３によって上記所定方向以外に変化した光、およびサンプルホルダー１０５を透過する際に変化しなかった（被測定粒子３の影響を受けなかった）光を遮断するように構成されている。
【００２８】
サンプルホルダー１０５を透過して生じた各次数の回折光は、集光レンズ１２１によって集光され、そのうちのホルダー１０５内の被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみが絞り１２２を通過し、それ以外の光は絞り１２２によって遮断される。絞り１２２を通過した光は、結像レンズ１２３を透過してイメージセンサー３０の撮像面３１に入射する。
【００２９】
イメージセンサー３０は、結像光学系１２０を介して入射した測定光の撮像面３１における分布を画像として取得し、その画像データ（検出信号）をコンピュータ５０へ出力する。イメージセンサー３０の撮像面３１は、結像光学系１２０を介してサンプルホルダー１０５の回折面１０５ａと共役な位置に設けられている。コンピュータ５０は、イメージセンサー３０から出力された画像データを所定時間積算して積算画像（干渉縞）を形成し、その積算画像に基づいて被測定粒子３の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて被測定粒子３の大きさを算出（推測）する。また、算出した被測定粒子３の大きさに基づいて粒子間の相互作用を算出（推測）する。なお、この測定の過程は上述の実施形態に係る粒子径測定装置１の場合と同様である。
【００３０】
次に、第３実施形態に係る測定装置２００について図４を参照して説明する。なお、上述の粒子径測定装置１と共通する構成要素には同一符号を付してその説明を省略する。粒子径測定装置２００は、測定対象物である複数の被測定粒子３を保持するとともに反射光を各次数の回折光に分割するサンプルホルダー２０５と、サンプルホルダー２０５内の被測定粒子３に照明光を照射する照明光学系２１０と、照明光のうち被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面３１に入射させる結像光学系２２０と、イメージセンサー３０と、コンピュータ５０とを有して構成される。
【００３１】
照明光学系２１０は、光源１１と、コリメータレンズ系１２と、コリメータレンズ系１２によって変換された平行光を収束する収束レンズ２１４と、収束レンズ２１４によって収束された光が入射する位置に設けられたビームスプリッター２１５と、ビームスプリッター２１５で反射した光を平行光に変換してサンプルホルダー２０５に照射する集光レンズ２１６とを有して構成される。
【００３２】
光源１１から射出された照明光（コヒーレント光）は、コリメータレンズ系１２を透過して所定径の平行光となり、収束レンズ２１４によって収束されてビームスプリッター２１５に入射する。ビームスプリッター２１５で反射した照明光は、後述する絞り２２２を通過した後、集光レンズ２１６によって平行光に変換されてサンプルホルダー２０５に入射する。
【００３３】
サンプルホルダー２０５は、平板の一面に直線状の凹溝が所定周期で形成され、その各凹溝に水等の液体とともに複数の被測定粒子３を保持するように構成されている。また、サンプルホルダー２０５は、上記凹溝が形成されている面（以下、回折面２０５ａと称する）で反射した光を各次数の回折光に分割するように構成されている。サンプルホルダー２０５における回折面２０５ａには透過防止コートが施されており、この回折面２０５ａに光源１１から射出された照明光が入射する。回折面２０５ａは照明光の光軸に対して傾けて設けられており、これにより回折面２０５ａで反射して生じた０次回折光も後述する絞り２２２で遮断されるようになっている。サンプルホルダー２０５に入射した照明光は、回折面２０５ａで反射して各次数の回折光に分割され、集光レンズ２１６により集光されて結像光学系２２０に入射する。
【００３４】
結像光学系２２０は、サンプルホルダー２０５（回折面２０５ａ）で反射して生じ集光レンズ２１６で集光された各次数の回折光のうち、被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを通過させる絞り２２２と、絞り２２２を通過した光を撮像面３１に入射させる結像レンズ２２３とを有して構成される。絞り２２２は、照明光学系２１０におけるビームスプリッター２１５と集光レンズ２１６の間に配置されており、上述したように回折面２０５ａで反射して生じた各次数の回折光のうち被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを通過させるように構成される。すなわち、絞り２２２は、サンプルホルダー２０５で反射して生じた回折光の射出方向が被測定粒子３によって上記所定方向以外に変化した光、およびサンプルホルダー２０５で反射する際に変化しなかった（被測定粒子３の影響を受けなかった）光を遮断するように構成されている。
【００３５】
サンプルホルダー２０５で反射して生じた各次数の回折光は、集光レンズ２１６によって集光され、そのうちのホルダー２０５内の被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみが絞り２２２を通過し、それ以外の光は絞り２２２によって遮断される。絞り２２２を通過した光はビームスプリッター２１５に入射し、そのうちのビームスプリッター２１５を透過した光が、結像レンズ２２３を透過してイメージセンサー３０の撮像面３１に入射する。
【００３６】
イメージセンサー３０は、結像光学系２２０を介して入射した測定光の撮像面３１における分布を画像として取得し、その画像データ（検出信号）をコンピュータ５０へ出力する。イメージセンサー３０の撮像面３１は、集光レンズ２１６および結像レンズ２２３を介してサンプルホルダー２０５の回折面２０５ａと共役な位置に設けられている。コンピュータ５０は、イメージセンサー３０から出力された画像データを所定時間積算して積算画像（干渉縞）を形成し、その積算画像に基づいて被測定粒子３の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて被測定粒子３の大きさを算出（推測）する。また、算出した被測定粒子３に基づいて粒子間の相互作用を算出（推測）する。なお、この測定の過程は上述の実施形態に係る粒子径測定装置１の場合と同様である。
【００３７】
次に、上述の第３実施形態に係る測定装置２００の変形例について図５を参照して説明する。上述の測定装置２００では、回折面２０５ａを照明光の光軸に対して傾けることにより、回折面２０５ａで反射して生じた０次回折光も絞り２２２で遮断する構成であったが、この変形例に係る測定装置３００では、該０次回折光を遮断する遮蔽板２２６を備えて構成される。なお、上述の測定装置２００と共通する構成要素には同一符号を付してその説明を省略する。
【００３８】
測定装置３００は、サンプルホルダー２０５と、照明光学系２１０と、照明光学系２１０により照射された照明光のうち被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみを撮像面３１に入射させる結像光学系３２０と、イメージセンサー３０と、コンピュータ５０とを有して構成される。
【００３９】
照明光学系２１０において、光源１１から射出された照明光（コヒーレント光）は、コリメータレンズ系１２を透過して所定径の平行光となり、収束レンズ２１４によって収束されてビームスプリッター２１５に入射する。ビームスプリッター２１５で反射した照明光は、絞り２２２を通過した後、集光レンズ２１６によって平行光に変換されてサンプルホルダー２０５に入射する。本実施形態において、サンプルホルダー２０５の回折面２０５ａは、照明光の光軸に直交するように設けられている。サンプルホルダー２０５に入射した照明光は、回折面２０５ａで反射して各次数の回折光に分割され、集光レンズ２１６により集光されて結像光学系３２０に入射する。
【００４０】
結像光学系３２０は、サンプルホルダー２０５（回折面２０５ａ）で反射して生じ集光レンズ２１６で集光された各次数の回折光のうち、被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光および０次回折光を通過させる絞り２２２と、絞り２２２を通過した光を集光する結像レンズ２２３と、結像レンズ２２３を透過した光を撮像面３１に向けて反射させる反射ミラー３２４と、反射ミラー３２４で反射した光を撮像面３１に導く第１レンズ３２５ａおよび第２レンズ３２５ｂからなるリレーレンズ系３２５と、第１および第２レンズ３２５ａ，３２５ｂの間に配置され、回折面２０５ａで反射して生じた０次回折光を遮断する遮蔽板３２６とを有して構成される。
【００４１】
サンプルホルダー２０５で反射して生じた各次数の回折光は、対物レンズ２１６によって集光され、そのうちのホルダー２０５内の被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光および０次回折光が絞り２２２を通過し、それ以外の光は絞り２２２によって遮断される。絞り２２２を通過した光はビームスプリッター２１５に入射し、そのうちのビームスプリッター２１５を透過した光が、結像レンズ２２３を透過して反射ミラー３２４に入射する。反射ミラー３２４で反射した光は、リレーレンズ系３２５を介してイメージセンサー３０の撮像面３１に入射するが、このとき、絞り２２２を通過した０次回折光は遮蔽板３２６により遮断される。すなわち、サンプルホルダー２０５で反射して生じた各次数の回折光うち、結像光学系３２０を介して撮像面３１に入射する光は、ホルダー２０５内の被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみである。
【００４２】
イメージセンサー３０は、結像光学系３２０を介して入射した測定光の撮像面３１における分布を画像として取得し、その画像データ（検出信号）をコンピュータ５０へ出力する。イメージセンサー３０の撮像面３１は、集光レンズ２１６、結像レンズ２２３およびリレーレンズ系３２５を介してサンプルホルダー２０５の回折面２０５ａと共役な位置に設けられている。コンピュータ５０は、イメージセンサー３０から出力された画像データを所定時間積算して積算画像（干渉縞）を形成し、その積算画像に基づいて被測定粒子３の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて被測定粒子３の大きさを算出（推測）する。また、算出した被測定粒子３に基づいて粒子間の相互作用を算出（推測）する。なお、この測定の過程は上述の実施形態に係る粒子径測定装置１の場合と同様である。
【００４３】
以上のように本実施形態の粒子径測定装置によれば、サンプルホルダー内の被測定粒子３によって射出方向が所定方向に変化した光のみが絞りを通過してイメージセンサー３０の撮像面３１に入射するように構成され、イメージセンサー３０によって検出された画像データを所定時間積算して積算画像（干渉縞）を形成し、その積算画像に基づいて被測定粒子３の運動速度を算出し、その運動速度に基づいて被測定粒子３の大きさを算出（推測）することができる。また、算出した被測定粒子３の大きさに基づいて粒子間の相互作用も測定（推測）することができる。そのため、従来の蛍光相関分光法にように、被測定粒子を蛍光色素で染色する手間を省くことができ、また蛍光色素が有する毒性の影響を受けることなく、被測定粒子の大きさ及び粒子間の相互作用の程度を測定することができる。よって、被測定粒子が蛋白質等の生体分子の場合であっても、長時間生きたままの生体試料観察（測定）が可能となる。
【００４４】
なお、上述の実施形態では、位相回折素子およびサンプルホルダーにおいて、直線状の凹凸パターンまたは凹溝が所定周期で形成されているが、凹凸パターンおよび凹溝は、直線状でなくてもよく、透過光または反射光を回折光に変換するように形成されていればよい。
【符号の説明】
【００４５】
１，１００，２００，３００    粒子径測定装置
３    被測定粒子
５，１０５，２０５  サンプルホルダー（保持部材）
１０，１１０，２１０  照明光学系（照明部）
１３  位相回折素子（回折素子）
１４  第１集光レンズ
１５  遮光板（第１遮光部材）
１６  対物レンズ
２０，１２０，２２０，３２０  結像光学系（結像部）
２１  第２集光レンズ
２２  絞り（第２遮光部材）
２３  結像レンズ
３０  イメージセンサー（撮像部）
３１  撮像面
５０  コンピュータ（演算処理部）
１２１，２１６  集光レンズ
１２２，２２２  絞り（遮光部材）
１２３，２２３  結像レンズ
３２６  遮蔽板（０次回折光遮断手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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