(57)【要約】      （修正有）【課題】医療用デバイスのための表面被覆剤としての、ヘパリン結合成長因子の新たなペプチド類似体、特に、アゴニストとして機能する合成ペプチドアゴニスト、及び医療用デバイスの提供。【解決手段】ペプチド鎖または複数の鎖が、ヘパリン結合成長因子レセプターを結合し、そして特に、疎水性リンカーでありうるリンカーによって、ヘパリン結合ドメインを含む非シグナル発生ペプチドに共有結合で結合されるものである、少なくとも１個のペプチド鎖、好ましくは２つの三官能アミノ酸残基から構成されるジペプチド分岐部位から分岐した２個のペプチド鎖を有する合成ヘパリン結合成長因子類似体及び合成ヘパリン結合成長因子類似体を表面被覆剤とした医療用デバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2011078806.tif 000016
式Ｉ
Ｒ3およびＲ5は、各々独立に、ＮＨ2；Ｎ末端ＮＨ2、ＮＨ3+、ＮＨ基あるいは対応するアシル化誘導体を含む、直鎖または分岐Ｃ1からＣ17までのアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニルまたはアラルキル鎖を有するアシル基であるか、またはＮ末端ＮＨ2、ＮＨ3+、ＮＨ基あるいは対応するアシル化誘導体を有するアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドである；
Ｒ4は、−ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ−Ｒ6であるか、またはＣ末端−ＯＨ、ＮＨ2、またはＮＨ−Ｒ6を有するアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドである；
Ｒ6は、脂肪族Ｃ1からＣ17までの鎖である；
各Ｘは、配列番号６〜２２から選択され；
Ｊ1およびＪ2は、各々独立に、三官能性アルファアミノ酸残基であり、各Ｘは、Ｊ1およびＪ2の側鎖を通して共有結合で結合される；
Ｙは、３個のアミノヘキサン酸残基の鎖からなるリンカーある；
Ｚは、配列番号２、ヘパリン結合ドメインからなる非シグナルペプチド、
ｎは、０または１であり、ｎ＝１の場合、合成ペプチド鎖Ｘは同一である、
式IIで表されるヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）類似体を、その表面に、非共有結合を介して、被覆した医療用デバイスを供し、そして哺乳類の表面上に医療用デバイスを乗せるか、またはその中に医療用デバイスを移植することを包含する、活性ヘパリン結合成長因子類似体を哺乳類に送出するデバイス。
【請求項２】
医療用デバイスは、縫合糸、移植片材料、外傷被覆材、神経ガイド、骨ワックス、動脈瘤コイル、塞栓形成粒子、微細ビーズ、ステント、歯科移植片、または骨プロテーゼ、組織足場、または徐放性薬剤送出デバイスである請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
非共有結合は、合成ヘパリン結合成長因子類似体のヘパリン結合ドメインと、医療用デバイスの表面に結合したヘパリン含有化合物の間の結合である請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
ヘパリン含有化合物は、ベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイル−ヘパリンである請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
医療用デバイスの表面は、ステンレス鋼、チタン、プラチナ、タングステン、セラミックス、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、伸縮ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリシロキサン、天然ゴム、人工ゴム、ブロック重合体またはブロック重合体の共重合体である請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
ポリシロキサンが、２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサンである請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
Ｘ及びＺは合成ペプチド鎖である請求項１に記載の合成ヘパリン結合成長因子類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン結合成長因子の合成ペプチドおよび類似体、特に、非成長因子ヘパリン結合領域と都合によりリンカーをさらに有し、そのリンカーは、疎水性でありうる類似体の分野に関する。本発明は、さらに、可溶性薬剤として、そして医療用デバイスのための被覆剤としてこのような類似体の医療用途に関する。
【０００２】
関連出願に対する関連文献
本出願は、２００２年８月２０日に提出された「合成ヘパリン結合成長因子類似体」と題される米国特許出願番号第１０／２２４，２６８号の一部継続出願であり、そしてそれに対して優先権を主張し、そしてその明細書は、ここに参照して組み込まれる。
【０００３】
連邦に支援される研究または開発に関する供述
本発明は、米国エネルギー省により授与される契約番号ＤＥ−ＡＣ０２−９８CH１０８８６号の下に米国連邦政府支援を伴い発明された。米国連邦政府が本発明のあらゆる権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
以下の検討は、著者（ら）による多くの出版物および出版物の年度に関すること、そして最近の出版物の日付により、所定の出版物は、本発明に対する先行技術として評価されないことに注目すること。ここでのこのような出版物の検討は、さらに完全な背景について示され、そしてこのような出版物が、特許性決定の目的のための先行技術であると認めると解釈されるべきでない。
【０００５】
ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）は、現在までに同定された２３の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ１−２３）、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進剤）、ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合成長関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合成長関連分子）、ＴＧＦ−α（形質転換成長因子−α）、ＴＧＦ−β（形質転換成長因子−β）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＥＧＦ（表皮成長因子）、ＶＥＧＦ（脈管内皮成長因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）、ＩＧＦ−２（インスリン様成長因子−２）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−２（インターロイキン−２）、ＩＦＮ−α（インターフェロン−α）、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）、ＳＤＧＦ（神経鞘腫由来成長因子）および多くの他の成長因子を含む多数のクラスの成長因子、ヘパリンに親和性を示すサイトカイン、リンホカインおよびキモカインから構成される。
【０００６】
ヘパリン結合成長因子レセプターを結合する天然のＨＢＧＦから得られるペプチドが、同定されてきた。例えば、Ｒａｙらによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４巻：７０４７−７０５２頁（１９９７年）を参照。これらの著者らは、ＦＧＦ−２から得られる２つのアミノ酸配列が、神経性先祖細胞上のＦＧＦ−２の有糸分裂活性を遮断するのに十分であることを示した。第一のペプチドは、アミノ酸６５−７４から得られる１０個のアミノ酸配列であり、第二のペプチドは、アミノ酸１１５−１２９から伸長する。
【０００７】
代替的アプローチでは、ヘパリン結合成長因子レセプターを結合する人工ペプチドは、ファージディスプレイ方法により同定された。ＢａｌｌｉｎｇｅｒらによるＮａｔｕｒｅ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７巻：１１９９−１２０４頁（１９９９年）では、Ｃ１９と呼ばれる２８個のアミノ酸ペプチドを単離し、ＦＧＦ−２レセプターを結合する技術を使用しているが、しかしそれ単独では、生物学的活性を刺激できない。ペプチドは、あらゆる既知ＦＧＦとアミノ酸配列同一性を有しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
広範な疾患および障害の防止または治療に有用なＨＢＧＦは、天然源から精製されるか、または組換えＤＮＡ法によって産生されうるが、しかし、このような調製は、高価であり、そして一般に調製することが困難である。
【０００９】
ヘパリン結合成長因子類似体を発生するある程度の努力がなされた。例えば、天然のＰＤＧＦは、頭部から頭部（ＡＡまたはＢＢ）ホモ二量体、または（ＡＢまたはＢＡ）ヘテロ二量体に配列されたＡ鎖およびＢ鎖として生じる。したがって、Ｊｅｈａｎｌｉらに対する米国特許第６，３５０，７３１号は、２つの合成ＰＤＧＦレセプター結合ドメインが、ポリグリシンまたはＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシルメチル）−マレイミド（ＳＭＣＣ）鎖を通して共有結合で連結されて、天然の活性ポリペプチド二量体を擬態するＰＤＧＦ類似体を開示する。
【００１０】
Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎに対する米国特許第６，２３５，７１６号は、脈管形成因子の類似体を開示する。その類似体は、多リンカー骨格により連結された２個またはそれ以上の脈管形成相同領域を含む分岐した多価リガンドである。
【００１１】
Ｇｏｄｏｗｓｋｉに対する米国特許第５，７７０，７０４号（’７０４号特許）は、レセプターチロシンキナーゼ、サイトカインレセプターおよび神経成長因子レセプタースーパーファミリーの構成要素を活性化する接合体を開示する。接合体は、同族レセプターに結合する能力のある少なくとも２つのリガンドを含み、その結果、個々のリガンドの結合は、これらのレセプターのオリゴマー化を誘発する。’７０４号特許に開示されるリガンドは、種々の非タンパク質様高分子、特にポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンのような親水性高分子、およびポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含めたポリビニルアルケンエーテルへの共有結合付着によって連結される。リガンドは、各々ＨＧＦレセプターを結合し、それによりレセプターに、ＨＧＦレセプター二量体の生物学的活性の二量体化および活性化を引起させる肝細胞成長因子（ＨＧＦ）ペプチド変異体を含む。
【００１２】
Ｃａｌｄｗｅｌｌらに対する米国特許第６，２８４，５０３号（’５０３号特許）は、細胞付着、細胞成長、細胞分級および生物学的アッセイのための疎水性表面および疎水性被覆表面への細胞および生物分子の付着を調節する組成物および方法を開示する。組成物は、反応性末端基活性化高分子に接合した生体分子である。末端基活性化高分子は、ブロック共重合体界面活性剤骨格および活性化または反応性基を含む。ブロック共重合体は、疎水性表面に吸着する能力のある疎水性領域、および疎水性領域が、疎水性表面に吸着されるときに、表面から離れて伸長する親水性領域を有するあらゆる界面活性剤でありうる。’５０３号特許は、末端基活性化高分子に接合しうる生体分子が、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＨおよびＧＨＲＦのような天然または組換え成長因子、並びに多ＣＳＦ（ＩＩ−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＭ−ＣＳＦを含むことを開示する。
【００１３】
他の研究者らは、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の相同体および類似体を含む組成物を記述した。例えば、ＬａｐｐｉおよびＢａｉｒｄに対する米国特許第５，６７９，６７３号；Ｄｅｌｓｈｅｒらに対する米国特許第５，９８９，８６６号、およびＦｉｄｄｅｓらに対する米国特許第６，２９４，３５９号を参照。これらの開示は、毒性部分に接合され、そしてＦＧＦレセプター担持細胞に標的にされるか、またはＦＧＦ相同体または類似体による結合により、ＦＧＦレセプターに伝達されるシグナルを通して生物学的経路を調節する相同体または類似体であるかのいずれかであるＦＧＦ相同体または類似体に関する。
【００１４】
Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒらに対する一連の特許出願は、合成キモカインおよび造血刺激タンパク質を含めた高分子修飾タンパク質を開示する。例えば、国際公開番号０２／０４１０５号、０２／１９９６３号、および０２／２００３３号を参照。これらは、ポリペプチド鎖が、タンパク質上の１つまたはそれ以上のグリコシル化部位に付着した水溶性高分子と一緒に生じるように、合成造血タンパク質のポリペプチド鎖の化学的に連結したペプチドセグメントを含む。これらの出願は、修飾高分子でもあり、そしてアンタゴニストと主張される合成キモカインも開示する。しかし、ヘパリン結合ドメインは開示されていない。Ｗｒｉｇｈｔｏｎらに対する米国特許第５，７７３，５６９号および第５，８３０，８５１号に開示されるもののような他のエリスロポイエチン擬態が知られている。
【００１５】
ＢａｌｌｉｎｇｅｒおよびＫａｖａｎａｕｇｈに対する国際公開番号００／１８９２１号は、直接、または連結基を通してのいずれかで、「オリゴマー化ドメイン」に連動してＦＧＦレセプター親和性を示す融合タンパク質から構成される組成物を開示する。オリゴマー化ドメインは、長さ約２０から３００残基までの範囲にあり、そして転写因子、ＩｇＧのＦｃ部分、ロイシンジッパーなどのような構築物を含む。開示されるオリゴマー化ドメインは、単一ＦＧＦレセプター親和性融合タンパク質が、ロイシンジッパーのような単一ドメインに連結され、次に、各々単一ＦＧＦレセプター親和性融合タンパク質を有する２つの平行のロイシンジッパーが、ジスルフィド結合の手段により架橋されているように、ロイシンジッパーのアミノおよびカルボキシ末端の両方でシステイン残基の手段により、類似の分子に連結されているホモ二量体ドメインである。融合タンパク質が、ヘパリン結合ドメインであることを明らかに示す、多量体化ドメインとしてのｊｕｎの使用のようなヘパリン結合ドメインを含みうることも開示されている。したがって、ＢａｌｉｎｇｅｒおよびＫａｖａｎａｕｇｈによって開示される組成物は、全て、オリゴマー化ドメインに共有結合で付着され、それにより各々単一レセプター結合配列を有する２つまたはそれ以上の類似のオリゴマー化ドメインが、オリゴマー化ドメインにより供給された結合の手段により結合されるか、または代わりに、個別の成分の共有結合を供給するために化学的に架橋されるかのいずれかである単一レセプター結合配列から構成される。
【００１６】
上述の相同体、類似体、接合体またはリガンドは、各々、レセプター結合ドメインを含む。しかし、開示された組成物の内で、さらに、ジペプチド配列に２つのレセプター結合ドメインの連結を供するリンカーを含み、そしてさらにヘパリン結合ドメインを含有する単一非シグナル発生ペプチドを供することの両方をするものはない。さらに、これらまたは他の既知ヘパリン結合成長因子類似体の内で、ここに後述される利点を供するものはない。ＨＢＧＦの新たなペプチド類似体の、特に、アゴニストとして機能するものの必要性がなおある。特に、ヘパリン結合成長因子レセプターの費用効率の高い合成ペプチドアゴニスト、特に、医療用デバイスの被覆に、そして可溶性生物製剤として有益な合成ヘパリン結合成長因子アゴニストの必要性がなおある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
１つの実施態様では、本発明は、式Ｉで表されるＨＢＧＦ類似体を提供する。
【００１８】
【化１】
2011078806.tif 000002
式Ｉ
各Ｘは、（ｉ）最小３個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最大約５０個のアミノ酸残基を有し、そして（ｉｉｉ）ヘパリン結合成長因子レセプター（ＨＢＧＦＲ）を結合するペプチド鎖である；Ｒ1は、アミノ酸残基であり、Ｘは、Ｒ1のＮ末端を通して、またはＲ1の側鎖を通して共有結合で結合されている；Ｒ2は、三官能性アルファアミノ酸残基であり、Ｘは、Ｒ2の側鎖を通して共有結合で結合されている；Ｙは、ｎ＝０の場合、Ｒ1およびＺに、またはｎ＝１の場合、Ｒ2およびＺに共有結合で結合された０個から約５０個の原子までの鎖を包含するリンカーである；Ｚは、ヘパリン結合ドメインを包含する非シグナル発生ペプチド鎖であり、そして（ｉ）最小１個のヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最大約１０個のヘパリン結合モチーフ、および（ｉｉｉ）最大約３０個のアミノ酸を包含するアミノ酸配列を包含する；そしてｎは、０または１であり、ｎ＝１の場合、ペプチド鎖Ｘは同一である。
【００１９】
式Ｉで表されるＨＢＧＦ類似体では、Ｙは、さらに、（ｉ）疎水性であり、（ｉｉ）最小約９個、そして最大約５０個の原子の鎖を包含し、そして（ｉｉｉ）Ｘが結合するＨＢＧＦＲの天然リガンドに見られないリンカーを含みうる。式Ｉの１つの実施態様では、Ｒ1は、Ｘが、Ｒ1の側鎖を通して共有結合で結合されている三官能性アミノ酸残基である。
【００２０】
式Ｉの１つの実施態様では、式ＩのＨＢＧＦ類似体は、それが、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中でヘパリンを結合するが、１Ｍ  ＮａＣｌによって溶出されるようにヘパリンについての結合活性を示すことで特徴づけられる。
【００２１】
別の実施態様では、本発明は、式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体を提供する。
【００２２】
【化２】
2011078806.tif 000003
式ＩＩ
Ｒ3およびＲ5は、独立に、ＮＨ2；Ｎ末端ＮＨ2、ＮＨ3+、またはＮＨ基あるいは対応のアシル化誘導体を含む、線状または分岐Ｃ1からＣ17までのアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニルまたはアラルキル鎖を有するアシル基であるか、またはＮ末端ＮＨ2、ＮＨ3+、ＮＨ基あるいは対応のアシル化誘導体を有するアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドである；Ｒ4は、−ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ−Ｒ6であるか、またはＣ末端−ＯＨ、ＮＨ2、またはＮＨ−Ｒ6を有するアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドである；Ｒ6は、脂肪族Ｃ1からＣ17までの鎖である；各Ｘは、（ｉ）最小３個のアミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最大約５０個のアミノ酸残基を有し、そして（ｉｉｉ）ＨＢＧＦＲを結合するペプチド鎖である；Ｊ1およびＪ2は、各々独立に、各Ｘが、Ｊ1およびＪ2の側鎖を通して共有結合で結合される三官能性アルファアミノ酸残基である；Ｙは、ｎ＝０である場合、Ｊ1およびＺに、あるいはｎ＝１である場合、Ｊ2およびＺに共有結合で結合された０から約５０個までの原子の鎖を包含するリンカーである；Ｚは、ヘパリン結合ドメインを包含する非シグナル発生ペプチドであり、そして（ｉ）最小１個のヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最大約１０個のヘパリン結合モチーフ、および（ｉｉｉ）最大約３０個のアミノ酸を包含するアミノ酸配列を包含する；そしてｎは、０または１であり、ｎ＝１の場合、合成ペプチド鎖Ｘは同一である。
【００２３】
式ＩＩで表されるＨＧＢＦ類似体では、Ｙは、さらに、（ｉ）疎水性であり、（ｉｉ）最小約９個および最大約５０個の原子の鎖を包含し、そして（ｉｉｉ）Ｘが結合するＨＢＧＦＲの天然のリガンドには見られないリンカーを含む。
【００２４】
１つの実施態様では、式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体は、それが、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中でヘパリンを結合するが、１Ｍ  ＮａＣｌによって溶出されるようにヘパリンについての結合活性を示すことで特徴づけられる。
【００２５】
式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体は、さらに、ＨＢＧＦＲへのその結合が、ＨＢＧＦＲによりシグナルを発生させること、あるいは代わりに、それが、ＨＢＧＦＲによりシグナル発生を阻止することを特徴としうる。
【００２６】
式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体の１つの実施態様では、Ｊ1および、ｎ＝１の場合には、Ｊ2は、ジアミンアミノ酸残基である。このようなジアミンアミノ酸残基は、２，３ジアミノプロピオニルアミノ酸残基、リシル残基またはオルニチニル残基でありうる。式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体の代替的実施態様では、Ｊ1および、ｎ＝１の場合には、Ｊ2の側鎖は、反応性カルボキシル基を含む。
【００２７】
式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体の１つの実施態様では、ＸとＪ1または、ｎ＝１の場合には、Ｊ2との間の共有結合は、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、二級アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾンまたはオキシム結合を包含する。好ましい実施態様では、結合は、アミド結合である。
【００２８】
そのような式ＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体は、さらに、ｍは、１から約１０までである、式ＩＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体を含む。
【００２９】
【化３】
2011078806.tif 000004
式ＩＩＩ
そのような式ＩＩＩで表されるＨＢＧＦ類似体は、さらに、ｐは、１から約１０までであり、そしてｑは、１から約２０までである、式ＩＶで表されるＨＢＧＦ類似体を含む。
【００３０】
【化４】
2011078806.tif 000005
式ＩＶ
１つの特に好ましい実施態様では、ｐは、５であり、そしてｑは、３である。
【００３１】
１つの実施態様では、ｎ＝１である式ＩまたはＩＩで表されるか、または式ＩＩＩまたはＩＶで表されるいずれかのＨＢＧＦ類似体では、ペプチド鎖Ｘは、架橋または環状化されている。このような架橋または環状化は、少なくとも１つのジスルフィド、ペプチド、アミドまたはチオエーテル結合を含めた共有結合を通しての可能性がある。
【００３２】
別の実施態様では、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩで表されるいずれかのＨＢＧＦ類似体で、Ｙは、１と約３３個の間のエチレングリコール（オキシエチレン）単位を含む。代わりに、Ｙは、１個と約２０個の間の炭素原子の分岐または未分岐、飽和または不飽和アルキル鎖を含みうる。特に好ましい実施態様では、Ｙは、ｐは、１から約１０までであり、そしてｑは、１から約２０までである［ＮＨ2−（ＣＨ2）pＣＯ］qである。別の実施態様では、Ｙは、ペプチド配列を含み、そして好ましい実施態様では、１から約１６個のＧｌｙ残基を伴う。
【００３３】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれかのＨＢＧＦ類似体の別の実施態様では、Ｚの各ヘパリン結合モチーフは、ＢｘＢＢ、またはＢＢＢｘｘＢであり、各Ｂは、独立に、リシン、アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンを表し、そしてｘは、天然に生じるアミノ酸を表す。好ましい実施態様では、Ｚは、少なくとも２個のヘパリン結合モチーフを含み、さらに好ましくは、少なくとも５個のヘパリン結合モチーフを含む。
【００３４】
本発明は、さらに、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれかのＨＢＧＦ類似体を含む医薬組成物、またはその医薬上許容しうる塩、および医薬上の担体を含む。
【００３５】
本発明は、さらになお、有害用量の放射線または化学療法剤にさらされた哺乳類を処置する方法、哺乳類に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれかの有効用量のＨＢＧＦ類似体を投与することを包含する方法を提供する。特に好ましくは、Ｘが、ＦＧＦ  ＨＢＧＦＲを結合するＨＢＧＦであり、さらに好ましくはＦＧＦ−７レセプターである。その方法は、哺乳類に、有効用量の合成ヘパリン結合成長因子類似体を投与して、粘膜炎、胃腸症候群、または放射線壊死を含みうる放射線または化学療法剤の有害な影響を改善することを含む。
【００３６】
本発明は、活性ペプチドを哺乳類、特にヒトに送出する方法も提供する。その方法は、その表面に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれかのＨＢＧＦ類似体との非共有結合を介して被覆した医療用デバイスを供し、そして哺乳類の表面上に医療用デバイスを載せるか、またはその上に医療用デバイスを移植することを含む。
【００３７】
本発明の他の目的、利点および新規特性、およびさらなる範囲の適用性は、付随の図面と共に、続く詳細な説明で部分的に説明され、そして部分的に、以下のものの検査により、当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって習得されうる。本発明の目的および利点は、装置および付随の請求項で特に指摘される組合わせの手段により認識および保持されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の各合成ＨＢＧＦ類似体は、特定のＨＢＧＦにより結合された１個またはそれ以上のレセプターに結合する特定のＨＢＧＦの類似体である。合成ＨＢＧＦ類似体は、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、キモカインまたはインターロイキンの類似体でありうる。
【００３９】
１つの態様では、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つの分子である。ＨＢＧＦは、ヘパリンに選択的に結合するあらゆる成長因子を含む。例えば、ＨＢＧＦは、既知ＦＧＦ（ＦＧＦ−１からＦＧＦ−２３まで）、ＨＢＢＭ（ヘパリン結合脳分裂促進剤）、ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合成長関連因子）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）、ＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合成長関連分子；プレイオトロフィン、ＰＴＮ、ＨＡＲＰとしても知られる）、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング成長因子−α）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子−β）、ＶＥＧＦ（脈管内皮成長因子）、ＥＧＦ（表皮成長因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）、ＩＧＦ−２（インスリン様成長因子−２）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、分泌フリーズルド関連タンパク質−１（ＳＦＲＰ−１）、小型誘導性サイトカインＡ３（ＳＣＹＡ３）、誘導性サイトカイン・サブファミリーＡメンバー２０（ＳＣＹＡ２０）、誘導性サイトカイン・サブファミリーＢメンバー１４（ＳＣＹＢ１４）、誘導性サイトカイン・サブファミリーＤメンバー１（ＳＣＹＤ１）、支質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、トロンボスポンジン１、２、３および４（ＴＨＢＳ１−４）、血小板因子４（ＰＦ４）、水晶体上皮由来成長因子（ＬＥＤＧＦ）、ミディカイン（ｍｉｄｉｋｉｎｅ）（ＭＫ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、モエシン（ＭＳＮ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ；ＳＦとも称される）、胎盤成長因子、ＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−２（インターロイキン−２）、ＩＬ−３（インターロイキン−３）、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、ＩＬ−７（インターロイキン−７）、ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）、ＩＬ−１２（インターロイキン−１２）、ＩＦＮ−α（インターフェロン−α）、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）、ＳＤＧＦ（神経鞘腫由来成長因子）、神経成長因子、軸索成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）、ニューロトロフィン、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質２）、ＯＰ−１（骨形成タンパク質１；ＢＭＰ−７とも称される）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターフェロン−γ誘導性タンパク質−２０、ＲＡＮＴＥＳ、およびＨＩＶ−ｔａｔ−相互作用因子、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、脈管関連移行細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）、アンギオスタチン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、システイン富脈管形成インデューサー６１（ＣＹＣＲ６１）、エンドスタチン、フラクタルカイン／ニューロアクチン、または神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＲＯ２、肝癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、およびヘパリンに親和性を示す多くの成長因子、サイトカイン、インターロイキンおよびキモカインのいずれかでありうる。
【００４０】
これらおよび他のＨＢＧＦの多くのアミノ酸配列は、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚで、医薬タンパク質データベースの国立図書館から入手可能である。前述のインターネットサイト上のこれらのＨＢＧＦアミノ酸配列は、参照してここに組み込まれる。これらおよび他のＨＢＧＦから得られるレセプター結合ドメインのアミノ酸配列を組み込む合成ＨＢＧＦ類似体の使用は、本発明で特に熟考される。
【００４１】
本発明の特定の実施態様では、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、基本的に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つの分子から構成され、すなわち、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つの分子は、合成ＨＢＧＦ類似体組成物中の主要な活性成分である。
【００４２】
他の特定の実施態様では、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、全体的に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つの分子から構成され、すなわち、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つの分子は、合成ＨＢＧＦ類似体組成物中の唯一の成分である。
式ＩからＩＶまでのヘパリン結合成長因子
式ＩからＩＶまでの合成ＨＢＧＦ類似体の領域ＸおよびＺは、アミノ酸残基を含み、そして都合により領域Ｙは、アミノ酸残基を含む。アミノ酸残基は、Ｒが水素またはあらゆる有機基でありうる−ＮＨＲＣＯ−として定義される。アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸でありうる。さらに、アミノ酸は、アミノ酸の炭素鎖の長さによって、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、またはδ−アミノ酸などでありうる。
【００４３】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ、ＹおよびＺ成分領域のアミノ酸は、タンパク質中で天然に見られる２０種のアミノ酸、すなわち、アラニン（ａｌａ、A）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Aｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、W）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）のいずれかを含むことができる。
【００４４】
さらに、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ、ＹおよびＺ成分領域のアミノ酸は、タンパク質では天然に見られない天然に生じるアミノ酸、例えば、β−アラニン、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）、ホモセリン、ホモシステイン、γ−アミノ酪酸、オルニチン、およびシトルリンのいずれかを含みうる。
【００４５】
さらに、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ、ＹおよびＺ成分領域のアミノ酸は、非生物学的アミノ酸のいずれか、すなわち、例えば、自然界で見られない直鎖アミノカルボン酸のような生物系で通常は見られないものを含みうる。自然界で見られない直鎖アミノカルボン酸の例は、６−アミノヘキサン酸、および７−アミノヘプタン酸、９−アミノノナン酸などを含む。
【００４６】
ｎが０である場合、式ＩまたはＩＩでは、本発明の分子は、単一Ｘ領域を含む。ｎが０である場合、式Ｉの分子は、その分子が、線状鎖または分岐されたもの（Ｘは、Ｒ1がジアミンアミノ酸残基であるアミド結合を通してのように、Ｒ1の側鎖を通してＲ1に共有結合で結合される）であるように、線状（Ｘは、ペプチド結合を通すように、Ｒ1のＮ末端を通してＲ1に共有結合で結合される）でありうる。式ＩまたはＩＩ中で、ｎが１である場合、その分子は、アミノ酸配列で同一である２つのＸ領域を含む。したがって、ｎが１である場合、その分子は、下に記述されるとおり２つのＸ領域の間の架橋によっても制約されうる分岐鎖であるか、または下に記述されるとおり環状化されうる。本実施態様では、本発明の各ＨＢＧＦ類似体は、２つのＨＢＧＦＲを結合し、そしてレセプター二量体化を誘導できる。有利にも、二量体化は、すぐに、ＨＢＧＦＲの増強されたレセプター・シグナル発生活性を増強する。
【００４７】
式Ｉ中、ｎが０である場合、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、アミノ酸Ｒ1を通して、領域Ｙに共有結合で連結される。Ｙは、都合により、疎水性領域でありうる。同様に、式ＩＩ中、ｎが０である場合、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、アミノ酸Ｊ1を通して、領域Ｙに共有結合で連結されるが、ただしＸが、Ｊ1の反応性側鎖を通して連結され、したがって、Ｊ1は、ジアミンアミノ酸のような三官能性アミノ酸残基を構築する。ここでも、Ｙは、都合により疎水性領域でありうる。
【００４８】
式Ｉ中、ｎが１である場合、１つのＸ領域は、アミノ酸Ｒ1を通して、領域Ｙに共有結合で連結され、そしてそれは、次に、三官能性アルファアミノ酸、そして好ましくはジアミンアミノ酸である第二のアミノ酸Ｒ2に共有結合で連結される。Ｒ1は、Ｒ2の１つのアミノ基に連結される。第二のＸ領域は、ジアミンアミノ酸の第二のアミノ基のようなＲ2の第二の反応性基通して、Ｒ2に共有結合で連結される。その後、Ｒ2は、それのカルボキシ末端を通して、合成ＨＢＧＦ類似体のＹ領域に共有結合で連結される。同様に、式ＩＩ中、ｎが１である場合、１つのＸ領域は、アミノ酸Ｊ1の反応性側鎖を通して、共有結合で連結され、そして、次に、第二のアミノ酸Ｊ2に共有結合で連結される。Ｊ1およびＪ2の両方が、三官能性アミノ酸、好ましくはジアミンアミノ酸を構築する。第二のＸ領域は、ジアミンアミノ酸の第二のアミノ基のようなＪ2の第二の反応性基を通して、Ｊ2に共有結合で連結される。その後、Ｒ2は、それのカルボキシ末端を通して、合成ＨＢＧＦ類似体のＹ領域に共有結合で連結される。
【００４９】
式Ｉで表されるアミノ酸Ｒ1は、上に記述されるアミノ酸のいずれかでありうる。式Ｉで表されるＲ2、および式ＩＩで表されるＪ1およびＪ2は、あらゆる三官能性アミノ酸残基、好ましくは三官能性アルファアミノ酸残基でありうる。好ましい実施態様では、三官能性アミノ酸残基は、例えば、リシンまたはオルニチン、または２個のアミノ基を有する他のあらゆるアミノ酸のようなジアミンアミノ酸である。
【００５０】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体の式ＩからＩＶまでで表される領域Ｘは、ＨＢＧＦＲを結合する合成ペプチド鎖である。例えば、領域Ｘは、ＨＢＧＦＲを結合するあらゆるアミノ酸配列を有し、そしてＨＢＧＦのアミノ酸配列の部分と同一であるアミノ酸配列を含みうる。代わりに、Ｘは、ＨＢＧＦのアミノ酸配列と同一なものよりむしろ相同なアミノ酸配列を有する。本発明の合成ＨＢＧＦ類似体によって結合される特定のＨＢＧＦＲは、当初のＨＢＧＦの同族レセプターであっても、なくてもよく、すなわち、合成ＨＢＧＦ類似体は、異なるＨＢＧＦのレセプターに追加的に、または唯一結合しうる。
【００５１】
ここで使用される場合、用語「相同性の」は、配列が配置されるときに、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置にあるアミノ酸配列で異なるペプチドに該当する。例えば、２つの相同なペプチドのアミノ酸配列は、５から１０個までのアミノ酸の配列されたアミノ酸配列内の１つのアミノ酸残基によってのみ異なる可能性がある。代わりに、１０から１５個までのアミノ酸の２個の相同なペプチドは、配列された場合、２個以下のアミノ酸残基によって異なる可能性がある。別の代替物では、１５から２０個まで、もしくはそれ以上のアミノ酸の２個の相同なペプチドは、配列された場合、３個までのアミノ酸残基により異なる可能性がある。長いペプチドについては、相同なペプチドは、２個のペプチド相同体のアミノ酸配列が配列される場合、およそ５％、１０％、２０％または２５％までのアミノ酸残基により異なる可能性がある。
【００５２】
式ＩからＩＶまでのＸ領域として特に有用なアミノ酸配列は、わずか１個または２個あるいは非常に少数の位置にある天然の成長因子のアミノ酸配列と異なる天然に生じるＨＢＧＦのフラグメントの相同体を含む。このような配列は、好ましくは、当初のアミノ酸が、周知原則；例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンを伴うアラニンのような非極性アミノ酸の置換、または他の同じ酸性または塩基性特徴を有する１つの酸性または塩基性アミノ酸の置換により類似の特徴のアミノ酸と置換される、控えめな変化を含む。
【００５３】
別の代替例では、合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、あらゆるＨＢＧＦのアミノ酸配列に対して検出可能な相同性を示さないアミノ酸配列を含みうる。同族の成長因子とほとんどアミノ酸配列相同性を示さないか、またはまったく示さず、そして、なおＨＢＧＦＲを結合する本発明の合成類似体のＸ領域の成分として有用なペプチドまたは、成長因子類似体は、例えば、ファージ表示による選択を含めた広範な範囲の方法のいずれかにより得ることができる。例として、Ｓｉｄｈｕら、「新規結合ペプチドの選択のためのファージ・ディスプレイ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８巻：３３３−６３頁（２０００年）を参照。ＨＢＧＦＲを結合するこのようなペプチドが、あらゆる既知ＨＢＧＦに相同性をまだ示さない例は、実施例１で後述されるＣ１９ペプチド配列である。
【００５４】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、ＨＢＧＦＲを有効に結合するアミノ酸配列を含むあらゆる長さを示す。好ましくは、合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ３個のアミノ酸残基の最小の長さを示す。さらに好ましくは、合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ６個のアミノ酸残基の最小の長さを示す。最も好ましくは、合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、少なくともおよそ１０個のアミノ酸残基の最小の長さを示す。本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＸ領域は、好ましくは、およそ５０個までのアミノ酸残基の最大の長さ、さらに好ましくは、およそ４０個までのアミノ酸残基の最大の長さを示し、そして最も好ましくは、およそ３０個までのアミノ酸残基の最大の長さを示す。
【００５５】
２個のＸ領域を含む合成ＨＢＧＦ類似体の１つの実施態様では、Ｘ領域は、共有結合で架橋される。適切な架橋は、２個のＸ領域を連結するシステインのＳ−Ｓ架橋により形成されうる。代わりに、架橋は、ランチオニン（チオ−ジアラニン）残基を組み込んで、チオエーテル結合により一緒に共有結合で結合されるアラニン残基で、２つの同一のＸ鎖を連結させることによって、Ｘ領域アミノ酸鎖の同時および並行のペプチド合成の間に都合よく形成されうる。別の方法では、２個のＸ領域アミノ酸鎖は、ジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤を導入し、それにより遊離アミノ、ヒドロキシまたはチオール基を有する２個の同一のＸ領域の間の炭化水素架橋を導入することによって架橋されうる。架橋Ｘ領域は、Xの末端アミノ酸が、反応性側鎖または末端基を通して、都合により架橋または他の連結で架橋される場合のような環状ペプチドを構成しうる。
【００５６】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体では、１つの好ましい実施態様で、式ＩからＩＶまでのＹ領域は、ＨＢＧＦ類似体を、ポリスチレンまたはポリカプロラクトン表面などに非共有結合で結合させるのに十分に疎水性であるリンカーである。さらに、Ｙ領域は、他の疎水性表面、特に医療用デバイスで使用される材料から形成される疎水性表面に結合しうる。このような表面は、一般的には疎水性表面である。適切な表面の例には、それに限定されないが、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、伸縮ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリエチルビニルアセテート、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコライドおよび前述のいずれか２つまたはそれより多くの共重合体のような疎水性重合体；２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサンのようなシロキサン；天然および人工ゴム；ガラス；およびステンレス鋼、チタン、プラチナ、およびニチノールを含めた金属が挙げられる。好ましくは、疎水性表面へのＨＢＧＦ類似体の結合は、酵素連結免疫アッセイまたは生物学的アッセイのような分析法により検出されるのに十分な量のものである。
【００５７】
式ＩからＩＶまでのＹ領域は、原子の鎖または鎖を形成する原子の組合わせを含みうる。通常、その鎖は、例えばアミノ酸（例えば、上に列挙されるとおりタンパク質に見られるアミノ酸；オルニチンおよびシトルリンのようなタンパク質中に見られない天然に生じるアミノ酸；またはアミノヘキサン酸のような非天然アミノ酸；または前述のアミノ酸のいずれかの組合わせ）から形成される原子の鎖のような、都合により、酸素、窒素または硫黄原子を含みうる炭素原子の鎖である。
【００５８】
式ＩのＹ領域の原子の鎖は、Ｒ1またはＲ2に、そしてペプチドＺに共有結合で付着される。同様に、式ＩＩのＹ領域の原子の鎖は、Ｊ1またはＪ2に、そしてペプチドＺに共有結合で付着される。共有結合は、例えば、ペプチド、アミドまたはエステル結合でありうる。好ましくは、Ｙ領域は、最小約９個の原子の鎖を含む。さらに好ましくは、Ｙ領域は、最小約１２個の原子の鎖を含む。最も好ましくは、Ｙ領域は、最小約１５個の原子の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個のアミノ酸の鎖から形成されうる。代わりに、Ｙ領域は、少なくとも１個、少なくとも２個、または少なくとも３個のアミノヘキサン酸残基の鎖から形成されうる。
【００５９】
好ましくは、Ｙ領域は、最大約５０個の原子の鎖を含む。さらに好ましくは、Ｙ領域は、最大約４５個の原子の鎖を含む。最も好ましくは、Ｙ領域は、最大約３５個の原子の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、約１２個まで、約１５個まで、または約１７個までのアミノ酸の鎖から形成されうる。
【００６０】
式ＩまたはＩＩのＹ領域のアミノ酸配列は、好ましくは、人工配列であり、すなわち、ＨＢＧＦの天然のリガンドに見られる４個またはそれ以上のアミノ酸残基のアミノ酸配列をなんら含まない。
【００６１】
特定の実施態様では、Ｙ領域は、疎水性アミノ酸残基、または疎水性アミノ酸残基の鎖を含む。例えば、Ｙ領域は、１個、２個、３個またはそれ以上のアミノヘキサン酸残基のような１個またはそれ以上のアミノヘキサン酸残基を含みうる。
【００６２】
別の特定の実施態様では、式ＩまたはＩＩの分子のＹ領域は、１個と約２０個の炭素原子の間にある分岐または未分岐の飽和または不飽和アルキル鎖を含みうる。さらに別の実施態様では、Ｙ領域は、例えば、エチレングリコール残基のような疎水性残基の鎖を含むことができる。例えば、Ｙ領域は、少なくとも約３個、または少なくとも約４個、または少なくとも約５個のエチレングリコール残基を含みうる。代わりに、Ｙ領域は、約１２個まで、約１５個まで、または約１７個までのエチレングリコール残基を含みうる。別の代替的実施態様では、Ｙ領域は、アミノ酸疎水性残基の組合わせを含みうる。
【００６３】
式ＩまたはＩＩの分子のＺ領域は、ヘパリン結合領域であり、そしてＶｅｒｒｅｃｃｈｉｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５巻：７７０１頁（２０００年）に記述されるとおり１つまたはそれ以上のヘパリン結合モチーフＢＢｘＢまたはＢＢＢｘｘＢを含みうる。代わりに、Ｚ領域は、ＢＢｘＢおよびＢＢＢｘｘＢモチーフ（Ｂは、リシン、アルギニン、またはヒスチジンを表し、そしてｘは、天然に生じるか、または天然に生じないアミノ酸を表す）の両方を含みうる。例えば、ヘパリン結合モチーフは、リシンまたはアルギニンから各々独立に選択されるとおり最初の３個のアミノ酸、続いてあらゆる２個のアミノ酸およびリシンまたはアルギニンである６番目のアミノ酸を明記する配列［ＫＲ］［ＫＲ］［ＫＲ］Ｘ（２）［ＫＲ］（配列番号：１）によって示されうる。
【００６４】
ヘパリン結合モチーフの数は、重要ではない。例えば、Ｚ領域は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも５個のヘパリン結合モチーフを含みうる。代わりに、Ｚ領域は、最大約１０個までのヘパリン結合モチーフを含みうる。別の代替的実施態様では、Ｚ領域は、少なくとも４個、少なくとも６個または少なくとも８個のアミノ酸残基を含む。さらに、Ｚ領域は、約２０個まで、約２５個まで、または約３０個までのアミノ酸残基を含みうる。部分的に、ヘパリンに関するＺ領域の結合活性は、選択される特定のヘパリン結合モチーフ、およびＺにおけるこのようなモチーフの数によって決定される。したがって、特定の用途について、このようなモチーフの選択および数の両方は、Ｚ領域の最適なヘパリン結合を提供するために変化されうる。
【００６５】
好ましい実施態様では、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ（配列番号：２）である。別の実施態様では、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＧＲＩＡＲ（配列番号：３）である。さらに別の実施態様では、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＷＲＡＲＡ（配列番号：４）である。さらに別の実施態様では、Ｚ領域のアミノ酸配列は、ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲＣ（配列番号：５）である。末端システイン残基の存在は、都合により、Ｚ領域に、フルオロクロム、ラジオアイソトープおよび他の検出可能なマーカーのような検出試薬を含めた他の分子を連結させる機会、並びに毒素、免疫原などを連結する機会をもたらす。
【００６６】
既知ヘパリン結合ドメインにほとんど、またはまったく配列相同性を保持しないヘパリン結合ドメインも、本発明で達成される。ここで使用される場合、用語「ヘパリン結合」は、−ＮＨＳＯ3-およびスルフェート修飾多糖、ヘパリンに対する結合、および関連修飾多糖、ヘパランに対する結合をも意味する。
【００６７】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体のＺ領域は、低塩濃度、約０．１５ＭまでのＮａＣｌ、都合により約０．４８ＭまでのＮａＣｌでのヘパリンに対する結合の特性を付与して、ヘパリンと、因子類似体のＺ領域の間の複合体を形成する。複合体を、１Ｍ  ＮａＣｌ中に解離させて、ヘパリン複合体から合成ＨＢＧＦ類似体を放出することができる。
【００６８】
Ｚ領域は、非シグナル発生ペプチドである。したがって、単独で使用される場合、Ｚ領域は、ＨＢＧＦのレセプターに結合されうるヘパリンに結合するが、しかしＺ領域ペプチド単独の結合は、レセプターによるシグナル発生を開始、あるいは阻止しない。
【００６９】
Ｚ領域のＣ末端は、封鎖されるか、または遊離型でありうる。例えば、Ｚ領域のＣ末端は、末端アミノ酸の遊離カルキシル基でありうるか、または代わりに、Ｚ領域のＣ末端は、例えば、アミド基のような封鎖カルボキシル基でありうる。好ましい実施態様では、Ｚ領域のＣ末端は、図１および２で示されるとおりアミド化アルギニンである。
【００７０】
ここにおよび他の場所で使用される場合、以下の用語は、示された意味を示す。
【００７１】
用語「アルケン」は、１つまたはそれ以上の炭素―炭素結合を含有する不飽和炭化水素を含む。このようなアルケン基の例は、エチレン、プロペンなどを含む。
【００７２】
用語「アルケニル」は、２から６個までの炭素原子の線状一価炭化水素ラジカル、または少なくとも１個の二重結合を含有する３から６個までの炭素原子の分岐一価炭化水素残基を含む。その例は、エチニル、２−プロペニルなどを含む。
【００７３】
ここで特定される「アルキル」基は、直鎖または分岐形態のいずれかにある指示された長さのアルキルラジカルのものを含む。このようなアルキルラジカルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ターシャリー−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどを含む。
【００７４】
用語「アリール」は、６から１２個までの環原子の、そして都合によりアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキチオ、ハロ、ニトロ、アシル、シアノ、アミノ、モノ置換アミノ、二置換アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはアルコキシ−カルボニルから選択される１個またはそれ以上の置換基で独立に置換された一価または二環芳香族炭化水素ラジカルを含む。アリール基の例は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、１−ナフチル、および２−ナフチル、それらの誘導体などを含む。
【００７５】
用語「アラルキル」は、ラジカル−ＲaＲb（Ｒaは、アルキレン（二価アルキル）基であり、そしてＲbは、上に定義されるとおりのアリール基である）を含む。アラルキル基の例は、ベンジル、フェニルエチル、３−（３−クロロフェニル）−２−メチルペンチルなどを含む。用語「脂肪族」は、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、およびそれらの誘導体のような炭化水素鎖を有する化合物を含む。
【００７６】
用語「アシル」は、基ＲＣＯ−（Ｒは、有機基である）を含む。例は、アセチル基ＣＨ3ＣＯ−である。
【００７７】
ペプチドまたは脂肪族部分は、上に定義されるとおりのアルキルまたは置換アルキル基が、１個またはそれ以上のカルボニル｛−（Ｃ＝Ｏ）−｝基を通して結合される場合、「アシル化」される。最も通常には、ペプチドは、Ｎ末端でアシル化される。
【００７８】
「アミド」は、カルボニル基（−ＣＯ．ＮＨ2）に付着した三価窒素を有する化合物を含む。
【００７９】
「アミン」は、アミノ基（−ＮＨ2）を含有する化合物を含む。
ＦＧＦ合成類似体
別の特定の態様では、本発明は、合成ＦＧＦペプチド類似体を提供する。Ｘが、ＦＧＦ類似体である、式ＩからＩＶまでのいずれかによって表される合成ＦＧＦ類似体は、２３のＦＧＦ−１からＦＧＦ−２３まですべてを含めた既知ＦＧＦのいずれかのようなすべてのＦＧＦでありうるＦＧＦの類似体である。
【００８０】
式ＩからＩＶまでの分子のＸ領域は、例えばＦＧＦ−２またはＦＧＦ−７のようなＦＧＦに見られるアミノ酸配列を含みうる。代わりに、Ｘ領域は、分子で結合されるＦＧＦＲの天然リガンドに見られない配列を含みうる。
【００８１】
式ＩからＩＶまでのいずれかの合成ＦＧＦペプチド類似体のＹ領域は、必ずしも疎水性でなく、したがって、存在する場合、極性、塩基性、酸性、親水性または疎水性でありうる。したがって、合成ＦＧＦペプチド類似体のＹ領域のアミノ酸残基は、あらゆるアミノ酸、または極性、イオン性、疎水性、または親水性基を含みうる。
【００８２】
合成ＦＧＦペプチド類似体のＸ領域は、繊維芽細胞成長因子に見られるアミノ酸配列に１００％同一であるアミノ酸配列か、または繊維芽細胞成長因子のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含みうる。例えば、Ｘ領域は、繊維芽細胞成長因子から得られるアミノ酸配列に少なくとも約５０％、少なくとも７５％、または少なくとも約９０％の相同性であるアミノ酸配列を含みうる。繊維芽細胞成長因子は、既知、またはまだ同定されていない繊維芽細胞成長因子の全てを含めたあらゆる繊維芽成長因子でありうる。
【００８３】
特定の実施態様では、本発明の合成ＦＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合される場合、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによりシグナルを始める。
【００８４】
別の特定の実施態様では、本発明の合成ＦＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアンタゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合される場合、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによりシグナル発生を阻止する。
【００８５】
本発明の別の特定の実施態様では、合成ＦＧＦ類似体は、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ、またはｂＦＧＦとしても知られている）の類似体である。本発明の別の特定の実施態様では、ＦＧＦレセプターに対する合成ＦＧＦ類似体の結合は、ＦＧＦレセプターによりシグナルを始める。別の特定の実施態様では、ＦＧＦレセプターに対する合成ＦＧＦ類似体の結合は、ＦＧＦレセプターによりシグナル発生を阻止する。
【００８６】
さらに別の特定の実施態様では、本発明は、ＦＧＦレセプター結合ドメインがヘパリン結合ドメインに疎水性リンカーを通して結合されるものであるＦＧＦ−２の合成ＦＧＦ類似体を提供する。別の特定の実施態様では、本発明は、Ｘ領域のアミノ酸配列がＦＧＦ−２から得られるＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号：６）であるＦＧＦ−２の合成ＦＧＦ類似体を提供する。さらに別の特定の実施態様では、本発明は、Ｘ領域のアミノ酸配列がＮＲＦＨＳＷＤＣＩＫＴＷＡＳＤＴＦＶＬＶＣＹＤＤＧＳＥＡ（配列番号：７）である合成ＦＧＦ類似体を提供する。
【００８７】
さらに別の特定の実施態様では、本発明は、Ｘ領域がＹＩＳＫＫＨＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫ（配列番号：８）であるＦＧＦ−１の合成ＦＧＦ類似体を提供する。この配列は、ＦＧＦ−１のベータ９およびベータ１０ループを繋げるアミノ酸から誘導される。さらに別の特定の実施態様では、Ｘ領域が、ＨＩＱＬＱＬＳＡＳＥＶＧＥＶＹ（配列番号：９）であり、そしてＦＧＦ−１のβ−４およびβ−５領域から誘導されるアミノ酸に対応するＦＧＦ−１類似体を提供する。
【００８８】
さらに別の特定の実施態様では、本発明は、Ｘ領域がＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱＫ（配列番号：１０）であるＦＧＦ−７の合成ＦＧＦ類似体を提供する。ＦＧＦ−７の合成ＦＧＦ類似体のさらに別の実施態様では、Ｘ領域は、アミノ酸配列ＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡ（配列番号：１１）である。
【００８９】
下の表１は、本発明の２つの合成ＦＧＦ類似体Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４の作用を、組換えＦＧＦ−２のものと比較する。成長研究では、使用された特異的セルラインは、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２繊維芽細胞、Ａ７Ｒ５マウス平滑筋細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）、ラット微細血管内皮細胞（ＲＭＥＣ）、およびＣＧ４神経膠腫細胞を含む。平滑筋アクチンおよびＴＧＦ−βＲＩＩ（成長因子−ベータをトランスフォーミングするレセプター）における変化を、免疫化学により監視した。フルオロゲンとして２，４−ジアミノフルオレッセンを使用した蛍光顕微鏡法により、一酸化窒素（ＮＯ）生成を監視した。ラット筋肉における被覆縫合糸の導入に続いて、脈管形成を監視した。唾液生成を監視することによって、唾液腺刺激を測定した。ラット皮膚の全厚みの外傷で、外傷治癒を監視した。表１および以降で、「Ｎ．Ｄ．」は、測定されないことを意味する。
【００９０】
【表１】
2011078806.tif 000006
【００９１】
ＶＥＧＦ合成類似体
別の特定の態様では、本発明は、合成ＶＥＧＦペプチド類似体を提供する。示される合成ＶＥＧＦ類似体は、１つの実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶ（配列番号：１２）であるＶＥＧＦ類似体を含む。別の実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＧＡＴＷＬＰＰＮＰＴＫ（配列番号：１３）である合成ＶＥＧＦペプチド類似体を提供する。さらに別の実施態様では、Ｘ領域のアミノ酸配列がＮＦＬＬＳＷＶＨＷＳＬＡＬＬＬＹＬＨＨＡ（配列番号：１４）である合成ＶＥＧＦペプチド類似体を提供する。
【００９２】
下の表２は、本発明の２つの合成ＶＥＧＦペプチド類似体ＶＡ０１およびＶＡ０２の作用を、組換えＶＥＧＦのものと比較する。ＭＡＰキナーゼについては、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞を、３０または６０分間、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、ＶＡ０１またはＶＡ０２で刺激した。モノクローナル抗ホスホ４４／４２ＭＡＰキナーゼ抗体（Ｔｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４）を用いたウエスタン・ブロッティングにより、細胞溶解液を分析し、そしてＶＥＧＦ、ＶＡ０１またはＶＡ０２を用いた刺激に続いて、対照に比べてＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２のリン酸化が増大したことを検出した。成長については、ＶＥＧＦ、ＶＡ０１またはＶＡ０２を用いた刺激に続いて、ＢＡＥ細胞の相対的細胞数における増加が見出されたのに対して、平滑筋セルラインＡ７Ｒ５では、類似体の作用に特異性を示す成長刺激は見られなかった。
【００９３】
【表２】
2011078806.tif 000007
【００９４】
ＢＭＰ合成類似体
別の特定の態様では、本発明は、合成ＢＭＰペプチド類似体を提供する。合成骨形成タンパク質類似体は、Ｘ領域がアミノ酸配列ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷ（配列番号：１５）、ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号：１６）、ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号：１７）、ＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧ（配列番号：１８）、ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号：１９）、ＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬ（配列番号：２０）、またはＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶ（配列番号：２１）である実施態様を含む。
【００９５】
下の表３は、１つのＢＭＰ類似体Ｂ２Ａ２の生化学的相互作用、およびＣ２Ｃ１２細胞を使用して調節を監視したアルカリ性ホスファターゼの調節を要約する。
【００９６】
【表３】
2011078806.tif 000008
【００９７】
ヘパリン結合成長因子類似体を合成する方法
本発明の類似体の合成は、当業界で周知である多様な化学的方法のいずれかにより達成されうる。このような方法は、ベンチスケールの固相合成および市販で入手可能な多くのペプチド合成機のいずれか１つでの自動ペプチド合成を含む。好ましくは、合成機は、９９パーセントより大きな周期当たりのカップリング効率を示す。
【００９８】
段階合成によるか、または類似の周知技術により結合されうる一連のフラグメントの合成により、本発明の類似体を生成しうる。例えば、Ｎｙｆｅｌｅｒ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｖｉａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５巻：３０３−１６（１９９４年）；およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、「Ｃｏｎｃｅｐｔ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２８９巻：３−１３頁（１９９７年）を参照。これらの方法は、個別のペプチドの調製のために日常的に使用される。そのＸ、ＹおよびＺ成分を構築するペプチドのような成分部で本発明の類似体を構築し、そしてその後、このような成分部を繋げて、類似体を構築することは可能である。例えば、ＤａｗｓｏｎおよびＫｅｎｔ、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９巻：９２３−９６０頁（２０００年）；およびＥｏｍら、「Ｔａｎｄｅｍ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５巻：７３−８２頁（２００３年）を参照。
【００９９】
有利には、本発明の式ＩからＩＶまでの類似体が２つの同一のＸ領域アミノ酸配列を含む場合には、これらの同一のＸ領域ペプチドの合成は、平行に行われうる。この方法により、添加の各々のサイクルは、Ｘ領域ペプチドの両方にアミノ酸を加え、そしてこれらの分岐分子の合成を大いに促進する。
【０１００】
これらの方法の順化により、ＨＢＧＦＲに対する結合のような所望の特性についてスクリーニングするために使用されうるペプチドライブラリーを作製しうる。例えば、Ｆｏｘ、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３巻：２４９−５８頁（１９９５年）；およびＷａｄａおよびＴｒｅｇｅａｒ、「Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｕｓｔｒａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３巻：３３２−６頁（１９９３年）を参照。
【０１０１】
特定の実施態様では、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合される場合、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによりシグナルを始める。
【０１０２】
別の特定の実施態様では、本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲのアンタゴニストである。ＨＢＧＦＲに結合される場合、合成ＨＢＧＦ類似体は、ＨＢＧＦＲによりシグナル発生を阻止する。
【０１０３】
特定の態様では、本発明は、細胞を、式ＩからＩＶまでによる合成ＨＢＧＦ類似体の有効量と接触させることによって、細胞中での成長因子レセプターシグナル発生を刺激する方法を提供する。有効量は、当業者によって容易に決定されうる。シグナル発生は、細胞からのサイトカイン放出、細胞の増殖または分化の刺激または阻害、細胞の化学走性、哺乳類の免疫系の刺激または阻害を生じうる。
【０１０４】
本発明のＨＢＧＦの使用の方法
本発明のＨＢＧＦ類似体は、例えば、種々の疾患の予防または治療のための溶解性薬剤としての投与のように、溶解性予防薬または治療用医薬製剤としてを含めて、例えば癌療法および放射線防御での使用を含めて、多くの点で有用である生物学的に活性な分子の費用効率の高い、そして潜在的に制限のない源を提供する。
【０１０５】
本発明の合成ＨＢＧＦ類似体は、例えば細胞の成長および増殖、または外傷の治癒を刺激するために、または例えば縫合糸、移植片および生物学上の応答を促進する医療機器のような医療用デバイスの被覆剤のための生物学的活性剤としても有用である。
【０１０６】
１つの態様では、本発明は、有害線量の放射線にさらされた哺乳類を処置する方法を提供する。その方法は、ＦＧＦ類似体である本発明の合成ＨＢＧＦ類似体の有効量を、哺乳類に投与することを含む。その処置は、粘膜炎、胃腸症候群、または放射線の照射から生じる可能性のあるような放射線壊死の防止または処置に特に有用である。ＨＢＧＦ類似体は、非経口で、経口で、または局所に投与されうる。代わりに、ＨＢＧＦ類似体は、例えば類似体被覆医療用デバイスで運動領域に送出されうる。関連の実施態様では、本発明は、哺乳類に化学療法剤の毒性を改善するために、１用量の化学療法剤を投与された哺乳類を処置する方法を提供する。上述の方法の特定の実施態様では、哺乳類は、ヒトである。本発明の別の特定の実施態様では、ＨＢＧＦ類似体は、ＦＧＦ−２類似体またはＦＧＦ−７類似体である。
【０１０７】
ここに使用される場合、用語「医療用デバイス」は、生物、好ましくは哺乳類、特にヒトでの臓器、組織、血液または他の体液との接触で、１つまたはそれ以上の表面を有するデバイスを意味する。医療用デバイスは、例えば血中酸素発生装置、血液ポンプ、血液センサー、血液を運ぶために使用される管、および患者に戻される血液に接触するようなもののような手術で使用するための体外デバイスを含む。その用語は、血管移植片、ステント、ペースメーカーリード、心臓弁、および血管に、または心臓に移植されるようなもののような、ヒトまたは動物の体での血液接触で移植される内部プロテーゼ（内部人工器官）をも含みうる。その用語は、さらに、監視または修復の目的のための血管または心臓に入れられるカテーテル、ガイド線のような、一過性血管内用途のためのデバイスを含みうる。その用語は、さらに、神経電極、筋肉電極、移植可能なパルス波発生装置、移植可能な薬剤ポンプ、および除細動器を含みうる。さらに、用語の医療用デバイスは、縫合糸、移植片材料、外傷被覆材、神経ガイド、骨ワックス、動脈瘤コイル、塞栓形成粒子、微細ビーズ、歯科移植片、骨プロテーゼ、組織足場、人工関節または徐放性薬剤送出デバイスを含みうる。
【０１０８】
医療用デバイスの表面は、例えば、ステンレス鋼、チタン、プラチナ、タングステン、セラミックス、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、伸縮ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリシロキサン（２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサンのような）、天然ゴム、または人工ゴム、またはブロック重合体または共重合体のような、医療用デバイスに使用するのに適切な一般に使用される材料のいずれかから形成されうる。
【０１０９】
医療用デバイスの表面上に生体分子を被覆する方法が知られている。例えば、Ｈｅｎｄｒｉｋｓらに対する米国特許第５，８６６，１１３号を参照し、その明細書は、参照してここに組み込まれる。Ｔｓａｎｇらは、米国特許第５，９５５，５８８号で、非トロンボゲン形成被覆剤組成物、およびそれを医療用デバイスに使用する方法を教示し、そして参照してここに組み込まれる。Ｚａｍｏｒａらは、米国特許第６，３４２，５９１号で、細胞接着組成物を調節する医療用デバイスのための両親媒性被覆剤を教示し、そして参照してここに組み込まれる。
【０１１０】
最新の発明から離れて教示する他の被覆剤発明は、以下のものを含む：Ｏｔｔｅｒｓｂａｃｈらは、米国特許第６，２４８，８１１号で、支持体の表面上に被覆剤を共有結合で固定する生物活性被覆剤を教示し、したがって、最新の発明から離れて教示する。Ｒａｇｈｅｂらは、米国特許第６，２９９，６０４号で、生物活性材料が、被覆層の少なくとも一部に据えられ、そして多孔性層を通して拡散する構造物の一方の表面に据えられる被覆層を記述する。同様に、Ｃｈｕｄｚｉｋらは、米国特許第６，３４４，０３５号で、高分子成分の混合物と組合せて生物活性剤を含む生物活性剤放出被覆剤を記述する。Ｓｐｒａｇｕｅは、米国特許第６，１４０，１２７号で、内皮細胞接着剤５アミノ酸ペプチドで、血管内ステントを被覆する方法を記述する。この被覆剤は、好ましくは、プラズマグロー放電を使用して血管内ステントを活性化させ、別の層を塗布し、ピリジンおよびトレシルクロリドを含有するトレシル化溶液を塗布し、そして配列グリシン−アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリンを有する５個のアミノ酸ペプチドを塗布して、その表面にペプチドの化学的接合を生じることによって行われる。Ｓｔｅｂｅｒらは、米国特許第５，８０１，１４１号で、コア混合物の総重量の重量ベースで、約２０％から約８０％までの成長因子、生物学上活性なフラグメントまたは誘導体；約１０％から約７５％までの脂質、ワックスまたはそれの混合物；０％から約２５％までの緩衝液、塩、糖またはその混合物；および０％から約１５％までのフィラーを包含する均質なコア混合物の１から３つまでの層を含有する小型化され、ぎざぎざを刻まれ、そして部分的に被覆された組成物を包含する必然的に均一で、そして継続量の生物学上活性なタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの非経口投与のための移植片を教示する。
【０１１１】
１つの実施態様では、本発明は、（ｉ）式ＩからＩＶまでの合成ＨＢＧＦ類似体でその表面に被覆された医療用デバイスを供し、その合成ＨＢＧＦ類似体は、非共有結合により医療用デバイスの表面に結合され；そして（ｉｉ）哺乳類の表面上に医療用デバイスを置くか、またはそれに医療用デバイスを移植することを含む、哺乳類に活性ペプチドを送出方法を提供する。
【０１１２】
上の方法の特別の実施態様では、非共有結合は、合成ＨＢＧＦ類似体のヘパリン結合ドメインと、医療用デバイスの表面に結合したヘパリン含有化合物との間の結合である。医療用デバイスの表面に結合したヘパリン含有化合物は、例えばベンジル−ビス（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイルヘパリンのようなあらゆるヘパリン含有化合物でありうる。
【０１１３】
上の方法の別の特定の実施態様では、医療用デバイスは、式ＩからＩＶまでの合成ＨＢＧＦ類似体で被覆される前に、ヘパリン含有化合物で予め被覆されない。
【０１１４】
ヘパリン結合成長因子
繊維芽細胞成長因子ＦＧＦは、間葉、上皮、および神経外胚葉の細胞型の正常な成長および分化を制御する関連タンパク質のファミリーを構築する。相同体は、広範で多様な種で見られた。ＦＧＦは、ヘパリンに非常に高い親和性を示し、したがって、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）とも称される。ここで使用される場合、用語「ＨＢＧＦ」は、全てのＦＧＦを含む。
【０１１５】
２つの主要な型のＦＧＦが知られている。第一の型のＦＧＦは、当初、脳組織から単離された。それは、３Ｔ３細胞のようなマウス繊維芽細胞についてのその増殖−増強活性により同定された。それの塩基性ｐｌにより、その因子は、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、またはＨＢＧＦ−２、ヘパリン結合成長因子−２）と名づけられ、そして現在、一般に、ＦＧＦ−２と称される。これは、ＦＧＦファミリーのプロトタイプである。
【０１１６】
当初脳組織から単離された別の型のＦＧＦも、酸性ＦＧＦ（ＨＢＧＦ−１としても知られるａＦＧＦ、ヘパリン結合成長因子−１またはＨＢＧＦ−α、ヘパリン結合成長因子−α）であり、現在、一般に、ＦＧＦ−１と称される。それは、筋芽細胞についてのそれの増殖−増強活性により同定された。
【０１１７】
同じファミリーに属する他の繊維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ−３（またはＨＢＧＦ−３、当初はｉｎｔ−２と称されたヘパリン結合成長因子−３；Ｆｅｋｅｔｅ、「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｌ．」２３巻：３３２頁（２０００年）を参照）、ＦＧＦ−４（ＨＢＧＦ−４、当初は癌遺伝子ｈｓｔの産物として識別されたヘパリン結合成長因子−４；Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１巻：１２３６８−７２）、およびＦＧＦ−５（当初はＨＢＧＦ−５と称された、Ｂａｔｅｓら、「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ５」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１１巻１８４０−１８４５頁（１９９１年））；ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ、「Ｔｈｅ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８巻：５７５−６０６頁（１９８９年）；およびＺｈａｎら、「Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−５  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．８巻：３４８７−３４９５頁（１９８８年）を参照）を含む。
【０１１８】
ＦＧＦ−６は、ＨＢＧＦ−６としても知られており、そしてしばしば、ｈｓｔ−２または癌遺伝子ｈｓｔ−１関連成長因子と称され、Ｉｉｄａら、「Ｈｕｍａｎ  ｈｓｔ−２（ＦＧＦ−６）  ｏｎｃｏｇｅｎｅ：ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７巻：３０３−９頁（１９９２年）；およびＭａｒｉｃｓら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＳＴ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＦＧＦ−６  ｇｅｎｅ，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４巻：３３５−４０頁（１９８９年）を参照。
【０１１９】
ＦＧＦ−７またはＫ−ＦＧＦは、ＫＧＦあるいはケラチノサイト成長因子（Ａａｒｏｎｓｏｎら、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．「Ａ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｗｉｔｈ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８巻：６２−７７頁（１９９１年）；Ｆｉｎｃｈら、「Ｈｕｍａｎ  ＫＧＦ  ｉｓ  ＦＧＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５巻：７５２−５頁（１９８９年）；Ｍａｒｃｈｅｓｅら、「Ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ＫＧＦ  ｆｒｏｍ  ＥＧＦ  ｆａｍｉｌｙ」，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４４巻：３２６−３２頁（１９９０年）を参照）としても知られている。
【０１２０】
ＦＧＦ−８は、アンドロゲン誘発成長因子ＡＩＧＦと同一であると見なされ、そして十分に研究されている（Ｂｌｕｎｔら、「Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＦＧＦ−８  ｌｉｇａｎｔｓ．」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：３７３３−８頁（１９９７年）；Ｄｕｂｒｕｌｌｅら、「ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｓｏｍｉｔｅ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｌｏｃｋ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｈｏｘ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．」、Ｃｅｌｌ  １０６巻：２１９−２３２頁（２００１年）；Ｇｅｍｅｌら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ８．」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５巻：２５３−２５７頁（１９９６年）；Ｔａｎａｋａら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ８  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｄｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．」、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４６巻：１０１６−２１頁（２００１年）を参照）。
【０１２１】
ＦＧＦ−９は、当初、神経膠活性化因子、またはＨＢＧＦ−９と称された。Ｍｉｙａｍｏｔｏら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｉｎｔｈ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ，  ｗｈｉｃｈ  ｈａｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ．」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３巻：４２５１−９頁（１９９３年）；およびＮａｒｕｏら、「Ｎｏｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ（ｇｌｉａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻：２８５７−６４頁（１９９３年）を参照。
【０１２２】
ＦＧＦ−１０は、ＫＧＦ−２、ケラチノサイト成長因子−２とも称される（Ｋｏｋら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５６巻：７１７−７２１頁（１９９９年）を参照）。
【０１２３】
数種のＦＧＦ関連因子は、繊維芽細胞成長因子相同体因子（ＦＨＦ）と見なされてきて、そしてＦＧＦ−１１（ＦＨＦ−３）、ＦＧＦ−１２（ＦＨＦ−１）、ＦＧＦ−１３（ＦＧＦ−２、Ｇｒｅｅｎｅら、「ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０巻：１９１１−１９２５頁（１９９８年））、およびＦＧＦ−１４（ＦＨＦ−４）とも称される。
【０１２４】
ＦＧＦ−１５は、開発中の神経系で発現され、そして転写因子Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１により調節される遺伝子と同定された。ＭｃＷｈｉｒｔｅｒら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｓ  ａ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ２Ａ−Ｐｂｘ１」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４巻：３２２１−３２３２頁（１９９７年）。
【０１２５】
ＦＧＦ−１６は、２０７アミノ酸のＦＧＦを発現する相同性基本のポリメラーゼ連鎖反応によりラット心臓からｃＤＮＡクローンとして単離された。ＦＧＦ−１６は、ＦＧＦ−９に７３％同一である。Ｍｉｙａｋｅら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ，  ＦＧＦ−１６，  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４３巻：１４８−１５２頁（１９８８年）。
【０１２６】
ＦＧＦ−１７をコード化するｃＤＮＡを、ラット胚から単離した。そしてそれは、２１６アミノ酸のタンパク質をコード化する。３Ｔ３繊維芽細胞中で発現されたとき、マウスＦＧＦ−１７は、トランスフォーミングである。胚形成の間、ＦＧＦ−１７は、前頭での、中脳−菱脳接合部、発達中の骨格、および発達中の動脈での特異的部位で発現される。Ｈｏｓｈｉｋａｗａら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ−１７，ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｂｒａｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４４巻：１８７−１９１頁（１９９８年）；およびＸｕら、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍａｐｐｉｎｇ，ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １７」、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ８３巻：１６５−１７８頁（１９９９年）を参照。
【０１２７】
ＦＧＦ−１８をコード化するｃＤＮＡを、２０７アミノ酸のタンパク質をコード化するラット胚から単離した。ＦＧＦ−１８は、グリコシル化タンパク質であり、そしてＦＧＦ−８およびＦＧＦ−１７に最も類似する。組換え体マウスＦＧＦ−１８の注入は、上皮および間葉器官の両方の組織で、特に肝臓および小腸で増殖を誘発することが示された。組換え体ラットＦＧＦ−１８は、ＰＣ１２細胞での軸索生長を誘発する。組換え体マウスＦＧＦ−１８タンパク質は、硫酸ヘパリン依存性手段でのインビトロでＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中での増殖を刺激する。全般的情報として、Ｈｕら、「ＦＧＦ−１８，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ，ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｅｐａｒｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８巻：６０６３−６０７４頁（１９９８年）；およびＯｈｂａｙａｓｈｉら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ−１８」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻：１８１６１−１８１６４頁（１９９８年）を参照。
【０１２８】
ＦＧＦ−１９は、遠く離れてＦＧＦファミリーの他のメンバーと関連している。ＦＧＦ−１９ｍＲＮＡは、胎児の軟骨、皮膚および網膜、並びに成体の胆嚢を含む数種の組織で発現される。それは、結腸腺癌セルラインで過剰発現される。ＦＧＦ−１９は、ＦＧＦ−４レセプターについての高い親和性のあるヘパリン依存性リガンドである。Ｘｉｅら、「ＦＧＦ−１９，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＦＧＦＲ４」、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １１巻：７２９−７３５頁（１９９９年）を参照。
【０１２９】
ＦＧＦ−２０は、正常な脳、特に小脳で、そしてある種の癌セルラインで発現される。ＦＧＦ−２０ｍＲＮＡは、黒質部緻密層で優先的に発現される。組換え体ＦＧＦ−２０タンパク質は、多様な細胞型でのＤＮＡ合成を誘発し、そして複数ＦＧＦレセプターにより認識される。ＦＧＦ−２０は、癌遺伝子のように機能し、そして３Ｔ３繊維芽細胞セルラインで発現される場合、形質転換された表現型を引き起こす。これらの形質転換された細胞は、ヌードマウスで腫瘍形成性である。Ｊｅｆｆｅｒｓら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１巻：３１３１−８頁（２００１年）；およびＯｈｍａｃｈｉら、「ＦＧＦ−２０，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ｐｒｅｆｅｒａｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ  ｐａｒｓ  ｃｏｍｐａｃｔａ  ｏｆ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７巻：３５５−６０頁（２０００年）を参照。
【０１３０】
ＦＧＦ−２１を、マウス胚から単離させた。ＦＧＦ−２１ｍＲＮＡは、肝臓で最も豊富で、そして胸腺中で低濃度である。ＦＧＦ−２１は、ヒトＦＧＦ−１９に最も類似している。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＦＧＦ、ＦＧＦ−２１、ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４９２巻：２０３−６頁（２０００年）を参照。
【０１３１】
ＦＧＦ−２２をコード化するｃＤＮＡ（１７０アミノ酸）を、ヒト胎盤から単離した。ＦＧＦ−２２は、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−７に最も類似している。マウスＦＧＦ−２２ｍＲＮＡは、皮膚で優先的に発現される。皮膚中のＦＧＦ−２２ｍＲＮＡは、毛包の内毛根鞘で優先的に見られる。Ｎａｋａｔａｋｅら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ−２２，ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１５１７巻：４６０−３頁（２００１年）を参照。
【０１３２】
ＦＧＦ−２３は、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−１９に最も類似している。ヒトＦＧＦ−２３遺伝子は、ヒトＦＧＦ−６遺伝子に連結した染色体１２ｐ１３に位置づけられる。ＦＧＦ−２３ｍＲＮＡは、主に脳（優先的に、外側腹側核で）で、そして低濃度で胸腺で発現される。ＦＧＦ−２３遺伝子でのミスセンス突然変異は、常染色体優性低ホスファターゼ血症性くる病を示す患者で見られた。ＦＧＦ２３の過剰産生は、腫瘍誘導骨軟化症、腎性リン酸塩るいそうにより引起される低リン酸塩血症によって特徴づけられる腫瘍随伴性疾患を引起す。Ｙａｍａｓｈｉｔａら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ−２３，ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ  ｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７巻：４９４−８頁（２０００年）；およびＳｈｉｍａｄａら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＧＦ２３  ａｓ  ａ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９８巻：６５００−５頁（２００１年）を参照。
【０１３３】
ＨＢＢＦ（ヘパリン結合脳分裂促進剤）は、当初、数種の脳組織からヘパリン結合タンパク質として単離され、そしてヘパリン結合軸索促進因子と同一である。Ｈｕｂｅｒら、「Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｖｉｎｅ，ｒａｔ，ａｎｄ  ｃｈｉｃｋ  ｂｒａｉｎ：  ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ」、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．  １５巻：４３５−４３９頁（１９９０年）を参照。
【０１３４】
ＨＢ−ＧＡＦ（ヘパリン結合成長関連因子）は、ＨＢＮＦ（ヘパリン結合軸索促進因子）と同一の神経作用性および有糸分裂性因子である。Ｋｕｏら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８２巻：１８８−１９４頁（１９９２年）を参照。
【０１３５】
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様因子）は、セルラインＵ９３７の調整培地中に見られ、そしてマクロファージおよびヒト血管の平滑筋細胞によっても合成される。ＨＢ−ＥＧＦは、８６アミノ酸の単量体ヘパリン結合Ｏ−グリコシル化タンパク質であり、そして２０８アミノ酸の前駆体から加工される。数種の切断形態のＨＢ−ＥＦＧは、記述されている。ＨＢ−ＥＧＦは、内皮細胞についてではなく、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ケラチノサイトおよび平滑筋細胞についての有望な分裂促進剤である。平滑筋細胞における有糸分裂活性は、ＥＧＦについてよりいっそう強力であり、そして細胞表面ヘパランサルフェートプロテオグリカンとの相互作用に関与するように見える。ＨＢ−ＥＧＦは、外傷体液の主要な成長因子成分であり、そして外傷治癒で重要な役割を果たしうる。Ａｂｒａｈａｍら、「Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ，  ａｎｄ  ｔｒａｓｃｒｉｐｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９０巻：１２５−１３３頁（１９９３年）；Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら、「Ａ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＥＧＦ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１巻：９３６−９頁（１９９１年）；およびＭａｒｉｋｏｖｓｋｙら、「Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｆｌｕｉｄ  ａｓ  ａ  ｒｅｓｐｏｎｅｓｅ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０巻：３８８９−９３頁を参照。
【０１３６】
ＨＢＮＦ（ヘパリン結合軸索促進因子）とも称されるＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合成長関連分子）は、いくつかの種の脳組織からヘパリン結合タンパク質として単離された１５．３ｋＤａのタンパク質である。ＨＢ−ＧＡＭは、軟質寒天でのＳＷ−１３細胞の成長を促進する。Ｃｏｕｒｔｙら、「Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８０巻：１４５−１５１頁（１９９１年）；およびＨａｍｐｔｏｎら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．３巻：８５−９３頁（１９９２年）。
【０１３７】
ＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−αに関連しない既知ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５の少なくとも５つの異型中に存在する。それらのアミノ酸配列は、およそ７０−８０パーセントの相同性を表示する。ＴＧＦ−β１は、優勢な型であり、そしてほとんど偏在的に見られる一方で、他の異型は、さらに限定された特性の細胞および組織で発現される。
【０１３８】
ＴＧＦ−ベータは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーとして知られるタンパク質のファミリーのプロトタイプである。このファミリーは、インヒビン、アクチビンＡ、ＭＩＳ（ミュラー管活性化物質）およびＢＭＰ（骨形成タンパク質）を含む。Ｂｕｒｔ、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８４巻：５９０−５頁（１９９２年）。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
明細書に組み込まれ、その一部を形成する付随の図面は、本発明の１つまたはそれ以上の実施態様を示し、そして説明と一緒に、本発明の原則を説明する役割を果たす。図面は、１つまたはそれ以上の本発明の好ましい実施態様を示す目的のためのみであり、本発明を限定すると見なされるべきでない。
【図１】合成ペプチド類似体Ｆ２Ａ３の配列を描く。
【図２】合成ペプチド類似体Ｆ２Ａ４の配列を描く。
【図３】ヘパリン親和性カラムからのＦ２Ａ３の溶出のプロットである。
【図４Ａ】ＨＵＶＥＣ上でのＦＧＦＲへのＦ２Ａ３の特異的結合を描くグラムである。
【図４Ｂ】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２繊維芽細胞上でのＦＧＦＲへのＦ２Ａ３およびＦ２Ａ４の特異的結合を描くグラムである。
【図５】ＭＡＰキナーゼ燐酸化および活性化における生来、組換えＦＧＦ−２に対するＦＧＦ−２類似体Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４の平衡を示すブロットである。
【図６】繊維芽細胞培養物での生物増殖の刺激のグラフであり、そしてＦＧＦ−２に対するＦ２Ａ３およびＦ２Ａ４の有糸分裂の用量反応を示す。
【図７Ａ】Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４が、インビトロでの細胞付着についてＦＧＦ−２を擬態することを示し、２時間後、シリル−ヘパリン単独で、またはシリル−ヘパリンとＦＧＦ−２またはＦ２Ａ３で被覆されたポリスチレンに対するＣＨ３１０Ｔ１／２マウス繊維芽細胞の付着を示すプロットである。「*」は、０．０５未満のｐを示す。
【図７Ｂ】Ｆ２Ａ３の被覆剤を用いた（左側パネル）および用いなかった（右側パネル）ポリカプロラクトン上で育成されたウシ大動脈内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図８Ａ】２週目のラット筋肉中の被覆ポリアクチド縫合糸を利用する毛細管／フィールドの比較を示し、被覆剤なしを、シリルヘパリンとＦ２Ａ３で被覆された縫合糸との比較を示すプロットである。
【図８Ｂ】２週目のラット筋肉中の被覆ポリアクチド縫合糸の顕微鏡写真であり、パネルＡは、被覆剤なしであり、パネルＢは、シリルヘパリン被覆剤であり、パネルＣは、Ｆ２Ａ３被覆剤であり、そしてパネルＤは、シリルヘパリンおよびＦ２Ａ３被覆剤である。
【図９】５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２またはＦ２Ａ３によって減じられる８Ｇｙ  ｘ線照射により誘導されるアポトーシスを用いた内皮細胞培養物中での放射線保護を示すプロットである。
【図１０】対照としてＦＧＦ−２と共に、Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４を利用した、インビボでの胃腸症候群からの放射線保護を示すプロットである。
【図１１】Ｂ２Ａ２を用いて、または用いずに、異なる濃度のＢＭＰ−２で、マウスＣ２Ｃ１２細胞でのアルカリ性ホスファターゼの誘導を示すプロットである。
【図１２】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス細胞でのＢ２Ａ２によるＢＭＰ−２の正の調節を示すプロットであり、そしてリン酸アルカリンによる検出を用いて、未被覆細胞を、Ｂ２Ａ２被覆細胞を比較する。
【図１３】ＶＡＯ１、ＶＡＯ２または組換えＶＥＧＦの添加の結果としてのウシ大動脈内皮細胞で誘発される新芽のプロットである。
【図１４】ＶＡＯ１、ＶＡＯ２およびＶＥＧＦを用いたウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞の成長の刺激のプロットである。
【実施例１】
【０１４０】
その構造が図１に示される合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ２Ａ３を、標準固相ペプチド合成法により合成した。Ｆ２Ａ３は、Ｘ領域のアミノ酸配列、ＮＲＦＨＳＷＤＣＩＫＴＷＡＳＤＴＦＶＬＶＣＹＤＤＧＳＥＡ（配列番号：７）が、Ｂａｉｌｉｎｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７巻：１１９９頁（１９９９年））により同定されたＣ１９ペプチド配列に対応するものである式ＩＩによる構造を有する。配列番号：７の２つのＸ領域ペプチドの各々は、リシン残基にアミド結合により共有結合で連結され、そしてそのリシン残基は、Ｊ1およびＪ2に対応する。Ｊ2Ｌｙｓは、３つのアミノヘキサン酸残基から形成されるトリペプチドの一方の末端に結合した共有結合ペプチドの手段により結合され、そしてリンカーＹに対応し、１８個のアルキル炭素原子の疎水性種を提供する。アミノヘキサン酸トリペプチドの対峙末端は、領域Ｚに対応するヘパリン結合ペプチドＲＫＲＫＬＥＲＡＩＲ（配列番号：２）に結合したペプチドによって共有結合で結合される。
【０１４１】
反復性サイクルでのアミノ基の一過性保護のためにＦｍｏｃ化学を使用して、置換ベンズヒドリルアミン樹脂上での固相合成により、ペプチドを、段階的に構築した。鎖の分岐は、連続リシル残基の側鎖アミノ基からの同一鎖の段階的成長によって達成された。完成したペプチド鎖を、酸加水分解によりＣ末端アミドから切断し、そしてそれは、酸不安定側鎖保護基も除去した。
【０１４２】
ヘパリン親和性クロマトグラフィーによって、最初に、粗ペプチド製剤を精製した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中で粗製剤を溶解化させ、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）ヘパリンＨＰカラム（アメシャム・ファルマシ・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、米国ニュージャージー州ピスケートウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ））にかけ、そして１０カラム量の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で洗浄した。その後、そのペプチドを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中の２Ｍ  ＮａＣｌで溶出させ、２８０ｎｍ吸光度により監視した。ペプチドフラクションを、脱塩し、そしてＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、米国マサチューセッツ州（ＭＡ）、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ））にかけることによって濃縮し、１０カラム容量の水で洗浄し、そしてその後、８０％アセトニトリルで溶出した。溶出されたフラクションを、凍結乾燥させ、水中に再溶解させ、そして参照としてウシ血清アルブミンを使用したＢＣＡ（登録商標）プロテインアッセイキット（ピールス・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）、米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ））によって、濃度を測定した。
【実施例２】
【０１４３】
標準固相ペプチド合成法によって、図２に示されるとおり合成ＨＢＧＦ類似体Ｆ２Ａ４を、合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＦ２Ａ４のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものに一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号：６）は、Ｒａｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻：７０４７−７０５２頁、１９９７年）により同定されたＦＧＦ−２のアミノ酸１１５−１２９に対応する。
【０１４４】
実施例１で上に記述したとおり、粗製剤を精製した。
【実施例３】
【０１４５】
図３は、ヘパリン親和性カラムからのＦ２Ａ３の溶出プロファイルを示す。０．５ｍＬヘパリン−アガロースを用いて、ミニカラムを作製し、そして水で集約的に洗浄した。Ｆ２Ａ３を、カラムにかけ、そして水で洗浄した。示されるとおりＮａＣｌの濃度を段階的に増大することにより、Ｆ２Ａ３を、カラムから溶出させた。
【実施例４】
【０１４６】
図４Ａは、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）に対するＦ２Ａ３の特異的結合を示す。125Ｉ−ｂＦＧＦを、非標識Ｆ２Ａ３の存在下で、無傷のＨＵＶＥＣとインキュベートした。緊縮洗浄の後、４℃でのこの結合した125Ｉ−ｂＦＧＦフラクションを、可溶化ＨＵＶＥＣ膜から回収し、そしてガンマー計数計で定量化した。Ｆ２Ａ３は、ＨＵＶＥＣのＦＧＦレセプターに結合した125Ｉ−ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）を置換した一方で、非関連ヘパリン結合サイトカインＶＥＧＦは置換しなかった。図４Ｂは、Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４が、125Ｉ−ｂＦＧＦ結合を、ＦＧＦレセプターを含有する第二の一連の細胞に競合的に置換した一方で、非関連ヘパリン結合サイトカインＶＥＧＦは置換しなかった。125Ｉ−ｂＦＧＦを、氷上で２０分間、冷Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４の存在下で、培養Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２繊維芽細胞とインキュベートした。緊縮洗浄の後、４℃で結合した125Ｉ−ｂＦＧＦフラクションを、可溶化細胞膜から回収し、そしてガンマー計数計で定量化した。
【実施例５】
【０１４７】
図５は、ＭＡＰキナーゼ・リン酸化および活性化での生来、組換え体ＦＧＦ−２に対するＦＧＦ−２類似体Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４の平衡を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１０、３０または６０分間、３ｎＭのＦＧＦ−２、Ｆ２Ａ３またはＦ２Ａ４で刺激し、そして溶解させた。細胞溶解液から得られる活性ＭＡＰキナーゼを、モノクローナル抗ホスホプ−４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４）で免疫沈降させた。生じた免疫沈降物を、ＡＴＰの存在下で、Ｅｌｋ−１融合タンパク質とインキュベートした。Ｓｅｒ３８３でのリン酸化Ｅｌｋ−１を、リン光体−Ｅｌｋ−１（Ｓｅｒ３８３）抗体を用いたウエスタンブロティングにより可視化した。ＭＡＰキナーゼのリン酸化を示すために、モノクローナル抗ホスホプ−４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４）抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、細胞溶解液を分析した。結果は、Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４の両方が、ＦＧＦ−２がそうするように、１０分でこれらのサンプルに存在し、そして未処理対照から不在であるリン酸化Ｓｅｒ３８３残基によって示されるおとり、Ｅｌｋ−１を活性化することを示す。リン酸化Ｓｅｒ３８３の濃度は、１０分から３０分に、そしてさらに６０分でさえ、継続的に減少した。対照的に、リン光体−ＥＲＫ−１およびリン光体−ＥＲＫ−２の濃度は、１０分、３０分および６０分で、Ｆ２Ａ３、Ｆ２Ａ４およびＦＧＦ−２処置サンプルで一貫して高かったのに対して、対照未処理サンプルは、リン光体−ＥＲＫ−１およびリン光体−ＥＲＫ−２の各々の際立って低い濃度を示した。これらの観察は、ＨＢＧＦ類似体Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４が、これらのアッセイでＦＧＦ−２類似体として生物学的に活性であることを示す。
【実施例６】
【０１４８】
図６は、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）と比較した場合、Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４による分裂についてのアッセイの結果を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清）で補足したＤＭＥＭ培地で育成した。アッセイの２日前に、細胞培養培地を、低血清培地（０．１％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）に交換した。アッセイの開始時に、細胞を、トリプシン処理し、そして単一細胞懸濁液を、１，０００細胞／ウエルで、９６穴培養プレート上に蒔いた。合成サイトカイン類似体ペプチドまたは組換え体ヒトＦＧＦ−２を、三部構成のウエルに添加し（１００μ／ウエル最終容量）、そして培養プレートを、３７℃インキュベーターに戻した。３日後、製造業者の指示によりＸＴＴ細胞増殖キットＩＩ（ロッシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ））により、細胞増殖を定量化した。
【０１４９】
類似体Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４は、このアッセイの結果によって示されるとおり、ＦＧＦ−２より低濃度で、高い特異的活性を供する。
【実施例７】
【０１５０】
図７は、Ｆ２Ａ３によるインビトロでの付着の増強を示す。所定の濃度で、シリル−ヘパリン単独で、またはシリル−ヘパリンとｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）またはシリル−ヘパリンとＦ２Ａ３で被覆したポリスチレン９６穴組織培養プレートのウエルへのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス繊維芽細胞の付着を、２時間後、５９５ｎｍでの吸光度により測定した。
【０１５１】
Ｆ２Ａ３の被覆剤を用いて、または用いずにポリカプロラクトン上で育成されたウシ大動脈内皮細胞（ＢＥＡＣ）の顕微鏡写真を得た。細胞を、結晶バイオレットで染色し、そして１００×倍率で顕微鏡撮影した。Ｆ２Ａ３被覆試験片上の付着細胞の実質的に高い細胞密度を観察した。
【実施例８】
【０１５２】
図８は、生物分解性縫合糸上のＦ２Ａ３の運動領域送出により外傷治癒の促進を示した。シリル−ヘパリンおよびＦ２Ａ３組合せで、飽和するまで被覆した、そしていかなる被覆剤なしに生物吸着性ビクリル（登録商標）ポリグリコライド／ラクチド縫合糸（エチコン・ジョンソン・アンド・ジョンソン（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、米国ニュージャージー州ソマービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ））を、成体ラットの大腿部筋に導入した。２週後、移植領域を除去し、そして日常の方法により組織学の処理をした。１００×の倍率で、毛細血管を定量化し、そしてデータは、フィールド当たりの平均として表された。図８に示されるとおり、Ｙ軸は、フィールド当たりの毛細血管の数を描写する。エイチ・アンド・イー染色組織学断面を利用して、増大した造粒および脈管形成も観察した。顕微鏡試験は、未被覆縫合糸が導入されたラット筋肉組織の２週間後に中程度の量の造粒を示した。シリル−ヘパリン被覆縫合糸とＦ２Ａ３被覆縫合糸の両方を用いて、低から中程度までの造粒を見出した。シリル−ヘパリンおよびＦ２Ａ３で被覆した縫合糸を用いて、ＰＧＬＡ繊維が網目状になったことは、断面で明らかであり、横紋筋組織のフィールド内で、可変の厚みの造粒組織の環に囲まれた。シリル−ヘパリン単独、およびＦ２Ａ３単独の両方の被覆剤は、対照と比べて、細胞質を減じた。しかし、シリル−ヘパリンおよびＦ２Ａ３の組合せは、網目状になった縫合糸を囲み、そして浸透しながら、際立った繊維芽細胞増殖を引起し、そして造粒組織内の内皮細胞を増大させた。
【実施例９】
【０１５３】
図９は、培養物中の内皮細胞に照射し、そして未処理対照に比べた場合、ＦＧＦ−２またはＦ２Ａ３を用いた処理の後に、アポトーシス細胞率を測定した放射線保護実験の結果を示す。８Ｇｙ  ｘ線照射により、アポトーシスが誘発され、そして処理には、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２またはＦ２Ａ３を用いた。
【実施例１０】
【０１５４】
図１０は、ＤｉｎｇおよびＯｋｕｎｉｅｆｆ（Ｏｋｕｎｉｅｆｆら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｓｕｐｐｌ．２７巻：Ｓ１０５−８頁（１９９６年））によって開発されたモデルであるマウスモデルでのｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）に比べた、Ｆ２Ａ３およびＦ２Ａ４による胃腸症候群死からのインビボ放射線防御を示す。全体照射の直前に、成体Ｃ５７ＢＬｘＤＢＡマウスに、腹腔内キシラジン／ケタミン注射により麻酔をかけた。１５μｇ／マウスのＦＧＦ−２（アール・アンド・ディー・システムズ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国ミネソタ州ミネアポリス（Minneapolis,MN,USA））、５μｇ／マウスのF２A３、５μｇ／マウスＦ２Ａ４、または対照ベヒクル溶液（０．９％ＮａＣｌ中の１００μLの０．２％ゼラチン）のいずれかを、静脈レトロ−眼窩注射により対象に投与し、その後、137Ｃｓ源（線量速度０．９３Ｇｙ／分）による１４Ｇｙガンマ照射にかけた。３０日間、毎日２回、動物を監視し、そしてカプラン−マイヤーの方法により、生存データの統計的解析を行った。
【実施例１１】
【０１５５】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ１Ａ１を合成した。式ＩＩの領域YおよびＺに対応するＦ１Ａ１のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域配列のＦＧＦレセプター結合アミノ酸配列は、ＹＩＳＫＫＨＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫ（配列番号：８）である。この配列は、ＦＧＦ−１のベータ９およびベータ１０ループを架橋するアミノ酸から誘導される。
【０１５６】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。生じた類似体は、以下の構造を示した。
【０１５７】
【化５】
2011078806.tif 000009
【実施例１２】
【０１５８】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ１Ａ２を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＦ１Ａ２のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域配列のアミノ酸配列ＨＩＱＬＱＬＳＡＳＥＶＧＥＶＹ（配列番号：９）は、ＦＧＦ−１のベータ−４およびベータ−５領域から誘導されるアミノ酸に対応する。この全般的領域は、ＦＧＦ−１の結合にかかわりを示す（Ｓａｎｚら、「Ｈｉｎｔｓ  ｏｆ  ｎｏｎｈｉｅｒａｒｃｈｉａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１９２３−１９３３頁（２００２年））。
【０１５９】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。生じた類似体は、以下の構造を示した。
【０１６０】
【化６】
2011078806.tif 000010
【実施例１３】
【０１６１】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ７Ａ１を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＦ７Ａ１のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭＦＶＡＬＮＱＫ（配列番号：１０）は、ＦＧＦ−７のベータ９およびベータ１０ループから誘導されるアミノ酸に対応する。ＦＧＦ−７のこのセグメントに含まれる残基９１−１１０は、ＫｉｍらのＦＧＦＲ２ＩＩｂについての特異性を決定するのに重要であると見なされてきた（Ｋｉｍら、「Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７巻：８８５３−８８６２頁（１９９８年））。
【０１６２】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。生じた類似体は、以下の構造を示した。
【０１６３】
【化７】
2011078806.tif 000011
【実施例１４】
【０１６４】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ７Ａ２を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＦ７Ａ２のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡ（配列番号：１１）は、ＦＧＦ−７のβ−４およびβ−５領域から誘導されるアミノ酸に対応する。ＦＧＦ−７のβ４−β５鎖に繋がるループは、高い親和性レセプター結合に寄与し、そしてドメイン交換および部位指向性突然変異誘発実験（Ｓｈｅｒら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｂｏｔｈ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−７」、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５巻：３４８８１−３４８８６頁（２０００年））で測定される場合、ＫＧＦＲ識別に重要である。
【０１６５】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。生じた類似体は、以下の構造を示した。
【０１６６】
【化８】
2011078806.tif 000012
【実施例１５】
【０１６７】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、ＶＡ０１を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＶＡ０１のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶ（配列番号：１２）は、Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅら（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＶＥＧＦ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｅｍｂｏ．Ｊ．１９巻：１５２５−１５３３頁（２０００年））により記述されるＶＥＧＦ配列の最初の２０アミノ酸から誘導される。
【０１６８】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。生じた類似体は、以下の構造を示した。
【０１６９】
【化９】
2011078806.tif 000013
【実施例１６】
【０１７０】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、ＶＡ０２を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＶＡ０２のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＧＡＴＷＬＰＰＮＰＴＫ（配列番号：１３）は、科学文献で明確に記述または特徴付けされなかったが、しかし、むしろＢｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＶＥＧＦ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｅｍｂｏ．Ｊ．１９巻：１５２５−１５３３頁（２０００年））によって記述される短い配列から誘導される。
【０１７１】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。生じた類似体は、以下の構造：
【０１７２】
【化１０】
2011078806.tif 000014
を示した。
【実施例１７】
【０１７３】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、ＶＥＧＦ１−２０を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＶＥＧＦ１−２０のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致し、そしてＸアミノ酸配列ＮＦＬＬＳＷＶＨＷＳＬＡＬＬＬＹＬＨＨＡ（配列番号：１４）は、脈管内皮成長因子配列を形成する。
【０１７４】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例１８】
【０１７５】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ１を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ１のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷ（配列番号：１５）は、ＢＭＰ−２のアミノ酸３０１−３１３に対応する。
【０１７６】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例１９】
【０１７７】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ２を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ２のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号：１６）は、ＢＭＰ−２中の鎖ベータ７およびベータ８のアミノ酸９１−１０５に対応する。この領域は、ＢＭＰＲ−ＩＩの結合に関与するＢＭＰ−２のエピトープ２の一部であると考えられる。
【０１７８】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２０】
【０１７９】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ２−１．２を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ２−１．２のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号：１７）は、ＢＭＰ−２のベータ７およびベータ８領域に見られるアミノ酸に対応する。
【０１８０】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２１】
【０１８１】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ２−１．４Ｅを合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ２−１．４Ｅのアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧ（配列番号：１８）は、ＢＭＰ−２のベータ８領域に見られるアミノ酸に対応する。
【０１８２】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２２】
【０１８３】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ３を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ３のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号：１９）は、ＢＭＰ−２のベータ８領域に見られるアミノ酸に対応する。
【０１８４】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２３】
【０１８５】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ４−１．１を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ４−１．１のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬ（配列番号：２０）は、ＢＭＰ−２のベータ４およびベータ５領域に見られるアミノ酸に対応する。
【０１８６】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２４】
【０１８７】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｂ２Ａ４−１．３を合成した。式ＩＩの領域ＹおよびＺに対応するＢ２Ａ４−１．３のアミノ酸配列は、実施例１で記述されるＦ２Ａ３のものと一致する。２つのＸ領域ペプチドのアミノ酸配列ＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶ（配列番号：２１）は、ＢＭＰ−２のベータ５およびベータ５ａ領域に見られるアミノ酸に対応する。
【０１８８】
実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２５】
【０１８９】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ２Ａ４−Ｌｉｎを合成した。この類似体は、ｎ＝０、Ｔは、Ｒ1であり、Ｘは、ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号：６）であり、そしてＺは、配列番号：２であり、そしてＸおよびＺは、ペプチド結合により共有結合で結合される、式Ｉのペプチドであるアミノ酸配列ＮＨ2−ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴ−ＨｅｘＨｅｘＨｅｘ−ＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ−アミド（配列番号：２２）の線状ペプチドであった。実施例１で上に記述されるとおり、粗製剤を精製した。
【実施例２６】
【０１９０】
標準固相ペプチド合成法により、合成ＨＢＧＦ類似体、Ｆ２Ａ４−Ｓｉｎを合成した。この類似体は、ｎ＝０、Ｊ1は、Ｌｙｓであり、Ｘは、配列番号：６であり、Ｚは、配列番号：２であり、そしてＹは、Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘであり、そしてＸは、以下の構造のＪ1の側鎖にアミド結合によって共有結合で結合される、式ＩＩの単一鎖で分岐されたペプチドである。
【０１９１】
【化１１】
2011078806.tif 000015
【実施例２７】
【０１９２】
本実施例は、マウスＣ２Ｃ１２細胞でのアルカリ性ホスファターゼの誘導においてＢ２Ａ２の正の調節を示す。細胞を、９６穴プレート上に１０4細胞／ウエルで蒔き、１０％新生仔ウシ血清を含有する培地中で１日間インキュベートし、組換え体ＢＭＰ−２（大腸菌）を用いた２％血清、またはそうでないものを含有する培地に交換し、そしてさらに３日間インキュベートした。使用される場合、Ｂ２Ａ２を、１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。１％緩衝ホルマリン中の１０分間の固定、０．３％トリトンＸ１００でのインキュベーション、そして市販で入手可能なパラニトロフェノール（ＰＮＰＰ）キットを用いた６０分間の色素原展開に続いて、アルカリ性ホスファターゼを測定した。図１１で示されるとおりデータは、平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）（式中、ｎ＝５）として表された。アルカリ性ホスファターゼの誘発は、ＢＭＰ−２の生物学的活性についての特徴である。
【実施例２８】
【０１９３】
本実施例は、被覆剤として使用される場合の、Ｂ２Ａ２によるＢＭＰ−２活性の正の調節を示す。９６穴プレートのウエルを、０．２５％シリル−ヘパリン［ベンジル−テトラ（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイル−ヘパリン］を含有する６０％水性イソプロパノールを使用して予備被覆し、続いて水中で洗浄して、未結合材料を除去した。その後、ウエルを、水（対照）で、または１０μｇ／ｍＬのＢ２Ａ２を含有する水性溶液で処理した。処理溶液の除去の後、適量の２×１０4Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス細胞を、１００μＬの容量で添加し、続いて５μＬでの１０ｎｇの組換え体ＢＭＰ−２（大腸菌）の添加を行った。数日後、培養物を、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性について、そして総タンパク質の量について評価した。図１２に示されるとおりデータは、ｍｇでのタンパク質の量による、ＡＬＰアッセイから得られる平均光学密度として表された。
【実施例２９】
【０１９４】
本実施例は、脈管形成のインビトロモデルでのＶＥＧＦ擬態ペプチドの効果を表す。ウシ大動脈内皮細胞を、コラーゲンゲルの層を含有する９６穴プレートの個々のウエルに蒔いた。細胞を、ゲルに付着させ、そして続いて、未結合細胞を除去した。付着細胞を、添加なし（対照）か、または２５ｎｇ／ｍＬのＶＡＯ１、ＶＡＯ２、または組換え体ＶＥＧＦのいずれかを含有するコラーゲンゲルの第二の層で覆った。第二の層のゲルが硬化した後、培養物を、上で特定された濃度で試験材料を含有する１００μＬの培地で上に積層した。数日後、培養物を位相差顕微鏡法により実験し、そしてゲルに進出する芽の数を記録した。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）で表された。結果は、図１３に示される。発芽を刺激する薬剤の能力は、インビボ脈管形成の許容された推定モデルである。
【実施例３０】
【０１９５】
本実施例は、培地に添加した４８時間目でのＶＡＯ１およびＶＡＯ２によるウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞の成長の刺激を表す。適量の１０3ＢＡＥ細胞を９６穴プレートのウエルに蒔き、そして２４時間支持体に付着させた。その後、培地を、添加なし（対照）か、または上に指示される濃度で、ＶＡＯ１、ＶＡＯ２、または組換え体ＶＥＧＦのいずれかを含有する２％新生仔ウシ血清を含有するものに交換した。４８時間後、実施例６でのように市販で入手可能なＸＴＴキットを使用して、細胞を解析した。吸光度は、対照値の百分率として表された。ＶＥＧＦは、限定された濃度範囲より成長における適度の増大を発生した一方で、ＶＡＯ１およびＶＡＯ２は、図１４に示されるとおり広範な濃度範囲より成長刺激をさらに言明された。点線は、対照値を示す。
【０１９６】
先行する実施例は、反応体を包括的に、または特異的に脱着し、および／または先行する実施例で使用されるものについての本発明の状態を観察することによって類似の成果で繰り返されうる。
【０１９７】
本発明は、これらの好ましい実施態様で特定の資料で詳細に記述されたが、他の実施態様でも同じ結果を達成しうる。本発明の変動および修飾は、当業者に明らかであり、そしてそれは、全てのこのような修飾および等価物を、付随の請求項で網羅すると意図される。上に引用される全ての資料、出願、特許および公報の全開示は、参照してここに組み込まれる。
【図１】
2011078806.tif 000017
【図２】
2011078806.tif 000018
【図３】
2011078806.tif 000019
【図４Ａ】
2011078806.tif 000020
【図４Ｂ】
2011078806.tif 000021
【図５】
2011078806.tif 000022
【図６】
2011078806.tif 000023
【図７Ａ】
2011078806.tif 000024
【図７Ｂ】
2011078806.tif 000025
【図８Ａ】
2011078806.tif 000026
【図８Ｂ】
2011078806.tif 000027
【図９】
2011078806.tif 000028
【図１０】
2011078806.tif 000029
【図１１】
2011078806.tif 000030
【図１２】
2011078806.tif 000031
【図１３】
2011078806.tif 000032
【図１４】
2011078806.tif 000033
【配列表】
2011078806000001.app