(57)【要約】【課題】改良されたフィターゼを提供すること。【解決手段】広範な局面において、本発明は、細菌由来のフィターゼおよびその改変型（修飾型）に関する。詳細には、本発明は、細菌であるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．由来の野性型フィターゼに、そして野性型（親）酵素に比較して改善された特徴について選択されるか、および／または操作されたそれらの改変体型／修飾型に関する。本発明は、新規なフィターゼであって、飼料用酵素として特に有用にかつ効果的にする特性を有するフィターゼを提供するので有利である。詳細には、本発明は、本明細書に記載のような単離されるか、および／もしくは精製された新規なフィターゼポリペプチド、またはその機能的なフラグメントもしくは改変体型もしくは修飾型に関する。本発明はまた、このようなフィターゼをコードする核酸配列を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィターゼ、フィターゼのヌクレオチド配列、フィターゼの産生方法、およびそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、飼料への添加のための酵素の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、食物および動物の飼料におけるリン酸塩消化を増強するために用いられ得るフィターゼに関する。
【背景技術】
【０００３】
（技術的な背景および先行技術）
フィチン酸は、穀類およびマメ類におけるリンの主要な貯蔵形態である。しかし、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物は、フィチン酸（またはフィチン酸）を代謝も吸収もできず、従ってこれは排出されて、集中的な家畜生産の地方ではリン汚染がもたらされる。さらに、フィチン酸はまた、カルシウム、銅および亜鉛のような金属因子をキレートすることによって、単胃動物における抗栄養剤として機能する。
【０００４】
これらの動物の成長および健康のために十分なリン酸塩を提供するためには、無機リン酸塩がそれらの食餌に添加される。このような添加は、費用がかさみ、そして汚染の問題をさらに拡大し得る。
【０００５】
フィターゼの作用を通じて、フィチン酸塩は一般に加水分解されて、低級なイノシトール−リン酸塩および無機リン酸塩が得られる。フィターゼは動物の食餌への添加物として有用であり、ここでそれらはその動物に対する有機リンのアベイラビリティーを改善し、環境のリン酸塩汚染を低減する（非特許文献１）。
【０００６】
真菌起源の（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）および細菌起源の（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）多数のフィターゼが文献に記載されている。
しかし、現在までのところ、これらのフィターゼで、動物飼料の補充物としての有効な使用のために必要な特性を示すものはない。詳細には、真菌のフィターゼは、タンパク質分解性に不安定である傾向であり（Ｉｇｂａｓａｎ  Ｆ．Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ａｎｉｍ．Ｎｕｔｒ．５３，３５３〜３７３（２０００））、従って、変性の影響を受け易いが、ほとんどの細菌のフィターゼは、フィチン酸塩のみに狭い基質特異性を有し、そして中間程度のリン酸化というように劣ったイノシトールリン酸塩の分解である（非特許文献５；非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ  ＲＪ，Ｕｌｌａｈ  ＡＨ．Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６年，第４２巻，ｐ．２６３〜３０２
【非特許文献２】Ｗｙｓｓ  Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第６５年，第２号，ｐ．３６７〜３７３
【非特許文献３】Ｂｅｒｋａ  Ｒ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８年，第６４年，第１１号，ｐ．４４２３〜４４２７
【非特許文献４】Ｌａｓｓｅｎ  Ｓ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１年，第６７年，第１０号，ｐ．４７０１〜４７０７
【非特許文献５】Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９３年，第３０３年，第１号，ｐ．１０７〜１１３
【非特許文献６】Ｋｅｒｏｖｕｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８年，第６４年，第６号，ｐ．２７０９〜２０８５
【非特許文献７】Ｋｉｍ  Ｈ．Ｗ．らＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第２５巻，ｐ．１２３１〜１２３４
【非特許文献８】Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９７年，第３４１年，第２号，ｐ．２０１〜２０６
【非特許文献９】Ｙｏｏｎ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６年，第１８巻，ｐ．４４９〜４５４
【非特許文献１０】Ｚｉｎｉｎ  Ｎ．Ｖ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００４年，第２３６巻，ｐ．２８３〜２９０
【非特許文献１１】Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０００年，第３５２巻，ｐ．６２３〜６２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、改良されたフィターゼが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
広範な局面において、本発明は、細菌由来のフィターゼおよびその改変型（修飾型）に関する。詳細には、本発明は、細菌であるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．由来の野性型フィターゼに、そして野性型（親）酵素に比較して改善された特徴について選択されるか、および／または操作されたそれらの改変体型／修飾型に関する。
【００１０】
本発明は、新規なフィターゼであって、飼料用酵素として特に有用にかつ効果的にする特性を有するフィターゼを提供するので有利である。詳細には、本発明は、本明細書に記載のような単離されるか、および／もしくは精製された新規なフィターゼポリペプチド、またはその機能的なフラグメントもしくは改変体型もしくは修飾型に関する。本発明はまた、このようなフィターゼをコードする核酸配列を提供する。
【００１１】
食物および動物の飼料に対する酵素添加物として有効であるためには、フィターゼは多数の異なる特性を組み合わせなければならない。動物の胃の酸性環境においてフィチン酸を分解できるためには、これは低いｐＨにおいて、好ましくは広範なｐＨの値にまたがって活性でなければらない。さらに、好ましくは飼料ペレットのような飼料の調製に通常使用される高温に対してタンパク質が耐え得るように高い比活性および高い熱安定性を有さなければならない。
【００１２】
酵素が広範な基質特異性を有しており、フィチン酸を加水分解するだけでなく、イノシトール五リン酸、四リン酸および三リン酸のようなフィチン酸分解の中間産物も分解することを可能にすることがまた重要である。ブタでのフィチン酸分解の研究によって、これらのイノシトール五リン酸は、そうでなければ小腸および大腸においてかなり不溶性のままであり、従って、動物および腸のミクロフローラによって生成されるアルカリホスファターゼに対して近づきがたいことが示される（Ｓｃｈｌｅｍｍｅｒ  Ｕら、Ａｒｃｈ．Ａｎｉｍ．Ｎｕｔｒ．５５，２５５〜２８０（２００１））。異なる酵素の基質特異性プロフィールにおける変動は同定されている。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のフィターゼによって生成されたイノシトール−三リン酸は、この酵素によるさらなる加水分解に対して本質的に耐性である（Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５２，６２３〜６２８（２０００））。
【００１３】
本発明の別の局面では、本明細書に記載される新規なフィターゼまたはその改変型を含むプラスミド、またはベクター系、または形質転換された生物体もしくはトランスジェニック生物体が提供される。
【００１４】
別の局面では、本発明は、本明細書に記載されるような新規なフィターゼまたはその改変型を発現するように改変され、従って、フィターゼを産生し得るトランスジェニック生物体に関する。本発明はさらに、フィターゼの生物技術学的な産生および食餌補充物としてのそれらの使用のための手段および方法を提供する。
【００１５】
本発明の局面は、特許請求の範囲に、そして以下の注釈に提示されている。
【００１６】
参照を容易にするために、本発明のこれらおよびさらなる局面をここで、適切な見出しのもとで考察する。しかし、各々のセクションにおける教示は必ずしも、各々の特定のセクションには限定されない。
【００１７】
本発明に対する言及として用いる場合、「生成する、産生する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」、「生成すること、産生すること（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「生成された、産生された（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）」、「生成可能な、産生可能な（ｐｒｏｄｕｃｅａｂｌｅ）」、「生成、産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、それぞれの用語「調製する（ｐｒｅｐａｒｅ）」、「調製すること、調製する工程（ｐｒｅｐａｒｉｎｇ）」、「調製された（ｐｒｅｐａｒｅｄ）」、「調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、「生成された（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）」、「生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」および「調製可能な（ｐｒｅｐａｒａｂｌｅ）」と同義である。
【００１８】
本発明の言及で用いる場合、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」、「ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ（発現された）」、および「発現可能な（ｅｘｐｒｅｓｓａｂｌｅ）」という用語は、それぞれ「転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」、「転写する（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｓ）」、「転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）」および「転写可能な（ｔｒａｎｓｃｒｉｂａｂｌｅ）」という用語と同義である。
【００１９】
本発明に対する言及で用いる場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、宿主、宿主細胞、組織または器官への核酸配列の導入の方法をいう。
【００２０】
本発明において用いられ得るヌクレオチド配列に関与する他の局面は以下を含む：本発明の配列を含む構築物；本発明における使用のための配列を含むベクター；本発明における使用のための配列を含むプラスミド；本発明における使用のための配列を含む形質転換された細胞；本発明における使用のための配列を含む形質転換された組織；本発明における使用のための配列を含む形質転換された器官；本発明における使用のための配列を含む形質転換された宿主；本発明における使用のための配列を含む形質転換された生物体。本発明はまた、宿主細胞における発現のような、本発明における使用のためのヌクレオチド配列を発現する方法であって、これらを用いる方法を包含する；これには、これらを移入するための方法を包含する。本発明は、宿主細胞からの単離のような、ヌクレオチド配列を単離する方法をさらに包含する。
【００２１】
本発明における使用のためのアミノ酸配列に関する他の局面は以下を包含する：本発明における使用のためのアミノ酸配列をコードする構築物；本発明における使用のためのアミノ酸配列をコードするベクター；本発明における使用のためのアミノ酸配列をコードするプラスミド；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された細胞；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された組織；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された器官；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された宿主；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された生物体。本発明はまた、宿主細胞における発現のように、本発明における使用のためのアミノ酸配列を、これらを用いて精製する方法を包含し、この方法は、これらを移入し、次いでこの配列を精製する方法を包含する。
【００２２】
配列番号１は、細菌株の同定のために得た配列を列挙する。
【００２３】
配列番号２は、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来のフィターゼ遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を列挙する。
【００２４】
配列番号３は、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来のフィターゼ遺伝子のアミノ酸配列を列挙する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼ、またはその改変型、相同なポリペプチド、改変体、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（項目２）
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性（相同性）を有する配列、もしくはその機能的なフラグメントを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
単離および／または精製されている、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
フィターゼ活性を示す、項目１〜３に記載のポリペプチド。
（項目５）
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株から得ることが可能であり、好ましくはその株由来であるという点で特徴付けられる、項目１〜４に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記フィターゼが少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも３００Ｕ／ｍｇという比活性を有するという点で特徴付けられ、該比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で３７℃の温度で該フィターゼをインキュベートすることによって決定される、項目４または５に記載のポリペプチド、またはその機能的な等価物。
（項目７）
前記フィターゼが約ｐＨ３〜６、好ましくは約ｐＨ４〜５、最も好ましくは約ｐＨ４．５において最大活性を有するという点で特徴付けられ、該活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該フィターゼを３７℃の温度でインキュベートすることによって決定される、項目４〜６に記載のポリペプチド、またはその機能的な等価物。
（項目８）
以下：５９、７０、１２２、１２５、１６７、１９３、１９７、２０４、２０９、２１１、２２１、２２３、２２５、２４０、２４２、２４４、２６８、２８１、２８９、２９４、３０３、３３６または３５１の位置（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）の少なくとも１つにおいて変異を含む、項目１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目９）
前記フィターゼが、以下：
【化１−１】
2011239793.tif 000002
【化１−２】
2011239793.tif 000003
の変異のうちの１つ以上を含む、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
以下：Ｋ５９Ｅ；Ｔ１６７Ｖ；Ｋ２４０Ｔ；Ｔ１６７Ｉ；Ｋ２４０Ｅ；Ｄ２４４Ｃ；Ｑ２８９Ｙ；Ｔ２０９ＫまたはＦ１９７Ｓからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、項目８または項目９に記載のポリペプチド／フィターゼ酵素。
（項目１１）
以下：
【化２】
2011239793.tif 000004
からなる群より選択される変異の組み合わせを含む、項目８〜１０に記載のポリペプチド／フィターゼ酵素。
（項目１２）
前記単離されたポリペプチドまたはフィターゼ酵素が、親のフィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
から選択される改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体である、項目８〜１１のいずれかに記載のポリペプチド／フィターゼ酵素。
（項目１３）
単離された核酸分子であって、
ｉ）項目１〜１２のいずれかに記載のフィターゼをコードする単離された核酸分子、
ｉｉ）配列番号３に記載のポリペプチド、またはそのホモログをコードする核酸に対して、中度にストリンジェンシーな条件、好ましくは高度または極めて高度のストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする、核酸、
ｉｉｉ）配列番号２に示される配列またはそのホモログを含む単離された核酸分子、
ｉｖ）配列番号２またはその相補体に対して、中度にストリンジェンシーな条件、好ましくは高度または極めて高度のストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする、核酸、から選択される単離された核酸分子。
（項目１４）
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性（相同性）を有する配列、またはその有効なフラグメントを含む、ポリペプチドをコードする、項目１３に記載の単離された核酸分子。
（項目１５）
ヌクレオチド配列を含む項目１３または１４に記載の単離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号２の任意の配列と同じであるか、もしくはそれに相補的であるか、もしくは配列番号２の任意の配列の任意の適切なコドン置換を含むか、または配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有する配列を含む、単離された核酸分子。
（項目１６）
項目８〜１２に記載のポリペプチドをコードする、項目１３〜１５に記載の単離された核酸分子。
（項目１７）
項目１３〜１６に記載のヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター系。
（項目１８）
前記プラスミドもしくはベクター系が、項目１〜１２に記載の任意の酵素を発現するための発現ベクターであるか、および／または、微生物中において、項目１３〜１６に記載のポリヌクレオチドを含む、項目１７に記載のプラスミドまたはベクター系。
（項目１９）
項目１７または１８のいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系を用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
（項目２０）
フィターゼを含む項目１９に記載の宿主細胞であって、該フィターゼが、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも７５％相同である相同なポリペプチド配列を含む、宿主細胞。
（項目２１）
前記宿主細胞が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌を含む微生物、および、Ｈ．ｐｏｌｙｍｐｒｐｈａ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母を含む真菌、ならびにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、例えば、Ａ．ｏｒｙｚａｅのような糸状菌由来である、項目１９または２０に記載の宿主細胞。
（項目２２）
前記微生物が原核生物細菌細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉである項目２１に記載の宿主細胞。
（項目２３）
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託された、細菌細胞Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株。
（項目２４）
ポリペプチドを産生する方法であって、宿主細胞中において、項目１〜１２に記載のアミノ酸配列を発現する工程と、および／または項目１３〜１６に記載のポリヌクレオチドを発現する工程と、該宿主細胞培養培地から該フィターゼを分離する工程とを包含する、方法。
（項目２５）
項目１〜１２のいずれかに記載されるポリペプチドを、食物または動物飼料に対して液体形態で噴霧する工程を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
（項目２６）
項目１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを乾燥生成物として、食物または動物飼料と混合する工程を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
（項目２７）
食物または動物飼料における項目１〜１２のいずれかに記載のフィターゼの使用。
（項目２８）
ｉ）項目１〜１２のいずれかに記載のフィターゼ、および／または項目２５もしくは２６に記載の方法によって生成された動物飼料、のいずれかを含む、食物または動物飼料組成物。
（項目２９）
フィターゼ酵素改変体を調製するための方法であって以下の連続的工程：
ａ）少なくとも１つの親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、該少なくとも１つの親のフィターゼ酵素が、ｉ）項目１〜１２に記載のポリペプチド、および／またはｉｉ）少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体、から選択される工程と、
ｂ）該親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換またはその組み合わせである、該親のフィターゼ酵素の少なくとも１つの変更を導入することによって、少なくとも１つのフィターゼ改変体を作製して、少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）該少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体をスクリーニングして、該親のフィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
から選択される改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体を同定する工程と、
ｄ）該改良されたフィターゼ酵素改変体を調製して、好ましくは、単離されたおよび／または精製されたフィターゼ酵素改変体を生成する工程と、
を包含する、方法。
（項目３０）
工程ｂ）の間にフィターゼ酵素改変体の集団が生成され、かつ工程ｃ）において、フィターゼ酵素改変体の該集団の少なくとも一部がスクリーニングされる、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
工程ａ）が、親のフィターゼ酵素をコードする項目１１〜１３に記載のヌクレオチド配列を突然変異誘発に供する工程を包含し、かつ工程ｂ）が、宿主細胞において工程（ａ）で得られた該変異されたヌクレオチド配列を発現する工程を包含し、かつ工程ｃ）が、宿主細胞またはその抽出物を、前記改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体についてスクリーニングする工程を包含する、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
工程ｃ）および必要に応じてｄ）の後に、反復工程ａ）〜ｃ）および必要に応じてｄ）の少なくとも１回の引き続くラウンドをさらに含み、好ましくは該引き続くラウンド（単数または複数）において、工程ａ）の少なくとも１つの親のフィターゼ酵素が、項目２９〜３１に記載の方法に従って調製された、前記少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体および／または改良されたフィターゼ改変体から選択される、項目２９〜３１に記載の方法。
（項目３３）
工程ｃ）が、ｉ）前記親のフィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかに比較して、少なくとも２．５という熱安定性の相違を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、項目２９〜３２に記載の方法。
（項目３４）
工程ｃ）が、ｉ）前記親のフィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかに比較して、少なくとも３０というペプシン安定性を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、項目２９〜３３に記載の方法。
（項目３５）
工程ｃ）が、ｉ）前記親のフィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかに比較して、配列番号３によってコードされるフィターゼに比較した場合少なくとも１１０という比活性を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、項目２９〜３４に記載の方法。
（項目３６）
項目２９〜３５に記載の方法に従って調製された、改良されたフィターゼ改変体。
（項目３７）
ポリ核酸構築物であって、好ましくは項目１６または項目３６のいずれかに記載の改良されたフィターゼ酵素改変体をコードするポリ核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
（項目３８）
項目３７に記載のポリ核酸構築物を含む、組換え発現ベクター。
（項目３９）
項目３７に記載のＤＮＡポリ核酸および／または項目３８に記載のベクターを用いて形質転換される宿主細胞。
（項目４０）
項目３９に記載の宿主細胞を、前記改良されたフィターゼ酵素改変体の発現を可能にする条件下で培養する工程を包含する、改良されたフィターゼ酵素改変体の生成のための方法。
（項目４１）
項目２５または項目２６に記載の方法に従って調製される食物または飼料組成物であって、項目８〜１２もしくは３６のいずれかに記載の少なくとも１つの改良されたフィターゼ酵素改変体、または項目３８に記載の宿主細胞を含む、飼料または食物組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって精製したＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来の組換えフィターゼのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。この図は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼのサンプルを含むレーンのデジタル写真画像の走査トレースを示す
【図２】図２は、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来のフィターゼのｐＨプロフィールを示す。
【図３】図３は、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来の精製された組換えフィターゼと、種々の程度のリン酸化およびモデル基質のイノシトールリン酸塩画分との基質特異性を示す。略号：ＩＰ６−フィチン酸、ＩＰ５、ＩＰ４およびＩＰ３−それぞれ、異性体のイノシトール５−、４−および３−リン酸塩の混合物。Ｆｒｕ  Ｐ２−フルクトース１，６−二リン酸塩、Ｆｒｕ  Ｐ１−フルクトース６−リン酸塩。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な開示）
本発明は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼまたはその改変型（修飾型）、ホモログ、改変体、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含む酵素を特徴とする。
「フィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）」という用語は、フィチン酸塩を含むリン酸のエステルの加水分解を触媒し得、かつ無機のリン酸塩を遊離し得るタンパク質またはポリペプチドを意味する。いくつかのフィターゼは、フィチン酸塩に加えて、中程度のリン酸化の少なくともいくつかのイノシトールリン酸塩を加水分解し得る。
【００２７】
「Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼに相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．  ｐｈｙｔａｓｅ）」という用語は、この酵素がＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．の供給源から得られている必要はないことを意味する。そうではなく、この酵素は好ましくは、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼのものと同じ機能的な特徴または配列を有さなければならない。例えば、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼは、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．由来であって、ただしＢｕｔｔｉａｕｘａｌｌａ種に天然には存在しない改変体であってもよい。
【００２８】
Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．としては、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ａｇｒｅｓｔｉｓ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｂｒｅｎｎｅｒａｅ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ
ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｅ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｇａｖｉｎｉａｅ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｉｚａｒｄｉｉ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｎｏａｃｋｉａｅ、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅが挙げられる。Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ種の染色液は、ＤＳＭＺ、ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌから入手可能である。フィターゼは好ましくは、本明細書に記載の方法、例えば、配列番号２に対するハイブリダイゼーションによって、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐから同定される。本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを単離するために好ましいＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．株は、実施例に挙げる。
【００２９】
本発明に従う、「野性型フィターゼ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｐｈｙｔａｓｅ）」または「野性型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」という用語は、天然に見出されるアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素を表す。
【００３０】
本発明に従う「フィターゼ酵素改変体（ｐｈｙｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」または「フィターゼ改変体（ｐｈｙｔａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、親のフィターゼのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有するが、まとめて「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」と呼ばれる、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失によって異なっているフィターゼ酵素を表す。フィターゼ酵素改変体はまた、分子進化のようなフィターゼ改変体を調製する方法のさらなるラウンドのための親のフィターゼ酵素であってもよいことが想定される。
【００３１】
本発明による「相同なポリペプチド（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ｓ））という用語はまた、本明細書において「ホモログ、相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」として記載され、第一のポリペプチド／フィターゼ／酵素のアミノ酸配列に比較して７５％より大きい配列同一性を有する、好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するポリペプチド、好ましくはフィターゼ酵素（すなわち、「相同なフィターゼ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｈｙｔａｓｅ）」または「相同な酵素（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅｓ）」）を表す。
【００３２】
「その機能的な等価物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｔｈｒｅｏｆ）」という用語は、この酵素がＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼのものと同じ機能的な特徴を有さなければならないことを意味する。「改変型、修飾型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｏｒｍ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、この酵素が、そのもとの形態から改変されているが、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼのものと同じ酵素的な機能の特徴を保持していることを意味する。詳細には、「改変体」または「修飾型、改変型」という用語は、親／野性型のフィターゼのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有し、かつ、まとめて変異と呼ばれる、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を有するフィターゼ酵素を包含する。改変型または改変体は、親の酵素と比較して変更された酵素特徴を示し得る。好ましくは、改変型または改変体は、以下の向上した表現型のうちの１つ以上を有する：向上した熱安定性、および／または；タンパク質分解性（例えば、ペプシン）安定性の増大および／または；非活性の増大、および／または；より広範な基質特異性、および／または；より広いｐＨ範囲にまたがる活性。「機能的な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」または「有効な（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」フラグメントという用語は、同じ酵素の機能または効果を保持するＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ
ｓｐ．フィターゼのフラグメントまたは部分を意味する。
【００３３】
好ましくは本発明のこの局面のフィターゼ酵素は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼのものと同じ配列または少なくとも７５％同一（相同）である配列を有する。
【００３４】
適切には、この酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％同一性（相同性）を有する配列、またはその機能的なフラグメントを含む、好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％同一性（相同性）を有する配列、またはその有効なフラグメントを有する、単離および／または精製されたポリペプチドを提供する。配列番号３、および配列番号３を含むポリペプチドについて言及する場合、これはまた、発現の間に同時にまたは翻訳後に、例えば、シグナルペプチドの切断によって、プロセシングされるポリペプチドをいうことが想定される。翻訳後の切断はＣ末端でも生じ得る。従って好ましい実施形態では、その有効なフラグメント（またはその機能的なフラグメントとも呼ばれる）は、天然の宿主または適切な適当な発現宿主によって生成される成熟ポリペプチドである。
【００３５】
別の実施形態では、このフィターゼは、受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株由来であるという点で特徴付けられる。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の第一の局面の任意の実施形態によるフィターゼであって、以下の位置（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）において１つ以上の変異を含む、フィターゼに関する：５９、７０、１２２、１２５、１６７、１９３、１９７、２０４、２０９、２１１、２２１、２２３、２２５、２４０、２４２、２４４、２６８、２８１、２８９、２９４、３０３、３３６、３５１。
【００３７】
これらの位置は、これらの位置での酵素の突然変異誘発が、所望の酵素特徴における改善をもたらすという点で特徴付けられる。
【００３８】
以下の置換が好ましい改変体であり得る。
【００３９】
【化３】
2011239793.tif 000005
「保存的変異（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」とは、示されたアミノ酸残基に比べてアミノ酸の特徴に関して保存的であるアミノ酸残基に対する変異を意味する。アミノ酸の特徴としては、当該分野で公知である、残基のサイズ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値、および他のアミノ酸特徴が挙げられる。好ましい保存的置換は、保存的置換として下に列挙する。
【００４０】
特に好ましい実施形態では、この変異は、以下の位置の１つ以上である：Ｋ５９；Ｔ１６７；Ｋ２４０；Ｔ１６７；Ｋ２４０；Ｄ２４４；Ｑ２８９；Ｔ２０９およびＦ１９７。
【００４１】
これらの特定の位置における好ましい変異は上記しており、さらに好ましい変異としては以下が挙げられる：Ｋ５９Ｅ；Ｔ１６７Ｖ；Ｋ２４０Ｔ；Ｔ１６７Ｉ；Ｋ２４０Ｅ；Ｄ２４４Ｃ；Ｑ２８９Ｙ；Ｔ２０９ＫおよびＦ１９７Ｓ。
【００４２】
さらに好ましい実施形態では、以下からなる群より選択される変異の組み合わせを含む、フィターゼが提供される。
【００４３】
【化４】
2011239793.tif 000006
従って、本発明に従う好ましいフィターゼは、配列番号３として列挙されたアミノ酸配列またはその有効なフラグメント（またはそのホモログ、好ましくはこのフィターゼは、受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されるＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株、またはそのホモログ由来であるという点で特徴付けられる）を含み、ただし上記に列挙されたアミノ酸変異の１つ以上または上記に列挙された変異の組み合わせのうちの１つを有する、改変体である。
【００４４】
これらの実施形態では、この命名法は、配列番号３におけるアミノ酸の位置を参照することによって示される変異を有する、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むフィターゼを示す。この命名法は、下に詳細に記載される。
【００４５】
適切には、これらの改変体は、以下の任意の１つに関して改善された特徴を示す：温度安定性、ｐＨ範囲、ペプシン安定性、比活性、基質特異性、およびより広い基質特異性。これらの特徴を決定するための適切な方法は本明細書に開示される。
【００４６】
詳細には、フィターゼの特徴における改善は、飼料補充物としての使用に特に適切である改善された改変体を作製する、食物および飼料の処理条件下での酵素安定性に、胃の通過の間の酵素安定性に、そしてヒトまたは動物の胃および／または腸管における酵素活性および安定性に関する。従って、このような改善は、パラメーターのなかでもとりわけ、上昇した温度、好ましくは６５℃を上回る温度での安定性の増大、タンパク質分解性の消化、好ましくはペプシンのような消化管のプロテアーゼに対する安定性の増大、低いｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満での触媒活性の増大、およびフィチン酸からのリン酸塩遊離、そして好ましくはさらにイノシトールリン酸塩の遊離の一般的な効率を含む。
【００４７】
（命名法）
本明細書および特許請求の範囲においては、アミノ酸残基についての従来の１文字および３文字コードを用いる。参照の容易さのために、酵素改変体における変異は、以下の命名法の使用によって記載する：親の酵素におけるアミノ酸残基；位置；置換アミノ酸残基（単数または複数）。この命名法に従って、例えば、２０位置でのアラニン残基のグリシン残基での置換は、Ａｌａ２０ＧｌｙまたはＡ２０Ｇと示される。同じ位置でのアラニンの欠失は、Ａｌａ２０＊またはＡ２０＊として示される。さらなるアミノ酸残基（例えば、グリシン）の挿入は、Ａｌａ２０ＡｌａＧｌｙまたはＡ２０ＡＧとして示される。アミノ酸残基の連続的ストレッチの欠失（例えば、位置２０のアラニンと位置２１のグリシンとの間）は、Δ（Ａｌａ２０−Ｇｌｙ２１）またはΔ（Ａ２０−Ｇ２１）と示される。親の酵素配列が、ナンバリングに用いられる酵素配列に比べて欠失を含む場合、このような位置での挿入（例えば、欠失位置２０でのアラニン）は、＊２０Ａｌａまたは＊２０Ａとして示される。複数の変異はプラスの記号またはスラッシュによって隔てられる。例えば、アラニンおよびグルタミン酸をグリシンおよびセリンで置換する位置２０および２１における２つの変異は、それぞれ、Ａ２０Ｇ＋Ｅ２１ＳまたはＡ２０Ｇ／Ｅ２１Ｓとして示される。所定の位置のアミノ酸残基が、２つ以上の別のアミノ酸残基で置換される場合、これらの残基は、コンマまたはスラッシュで隔てられる。例えば、グリシンまたはグルタミン酸のいずれかでの位置３０のアラニンの置換は、Ａ２０Ｇ，ＥまたはＡ２０Ｇ／Ｅ、またはＡ２０Ｇ、Ａ２０Ｅとして示される。改変に適切な位置が、示唆されている任意の特定の改変なしに本明細書において同定される場合、任意のアミノ酸残基が、この位置に存在するアミノ酸残基で置換され得ることが理解されるべきである。従って、例えば、位置２０におけるアラニンの改変に言及するが特定はされない場合、アラニンは、欠失されても、または任意の他のアミノ酸残基（すなわち、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つ）で置換されてもよいことが理解されるべきである。
【００４８】
適切には、本発明のフィターゼまたは機能的な等価物は、このフィターゼが少なくとも１００Ｕ／ｍｇまたは２００Ｕ／ｍｇ、好ましくは少なくとも３００Ｕ／ｍｇの比活性を有し、この比活性が、実施例１に詳細であるように、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる。本発明のフィターゼまたはその機能的な等価物はまた適切には、このフィターゼが約ｐＨ４〜４．５で最大活性を有し、この活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられ得る。本発明のフィターゼはまた適切には、このフィターゼがｐＨ２．５〜５．５で観察される最大活性の４０％以上を有し、ｐＨ２．５での活性は塩酸グリシン緩衝液を用いて決定するという点で特徴付けられ得る。
【００４９】
適切には、一実施形態では、本発明のフィターゼまたは機能的な等価物は、このフィターゼが３３０Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、この比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる。別の実施形態では、本発明のフィターゼまたはその機能的な等価物はまた適切には、このフィターゼが約ｐＨ３およびｐＨ４〜４．５で２つの最大活性を有し、この活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられ得る。
【００５０】
別の局面では、本発明は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼ、またはそのホモログに相当するアミノ酸配列を含む酵素をコードする単離および／または精製された核酸分子またはヌクレオチド配列を提供する。適切には、この単離および／または精製された核酸分子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列またはその有効なフラグメントを含むポリペプチドをコードする。一実施形態では、この核酸分子は、配列番号３を含み、かつ本明細書に列挙される好ましい位置で変異を、または本明細書に列挙される任意の特定の変異または変異の組み合わせを含むポリペプチドをコードする。別の実施形態では、本発明は、配列番号２の任意の配列と同じであるか、もしくはそれに相補的であるか、もしくは配列番号２の任意の配列の任意の適切なコドン置換を含むヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列相同性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列を含む、単離されるかおよび／または精製された核酸分子を提供する。
【００５１】
なおさらなる局面では、本発明は、以下のように示されるヌクレオチド配列に、そしてヌクレオチド配列の使用に関する：
（ａ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントであるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの相補体であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列の相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列。
【００５２】
あるヌクレオチドは、上記のヌクレオチド（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）の１つに対して、中度のストリンジェンシー、さらに好ましくは高度なストリンジェンシー、それよりさらに好ましくは極めて高度なストリンジェンシー条件のもとでハイブリダイズし得る場合、それに対してハイブリダイズするとみなされる。
【００５３】
ハイブリダイゼーションブロットを調製するために、ブロッティングのためのの標準の分子生物学的プロトコールを用いてもよい（例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションのためのサザンブロッティング）。標的ＤＮＡの量は、標的配列の相対的な量に依存する。純粋な標的配列が用いられるべき場合、１キロベースのポリヌクレオチドあたり１〜５ピコグラムのＤＮＡが好ましい。代表的には、検出限界は、１０９ｄｐｍ／ｍｇという比活性を有する放射性プローブについて約０．５ｐｇのＤＮＡであり、これは、複雑なゲノム（例えば、ヒト）の３．３ｍｇのゲノムＤＮＡにおける単一コピーの遺伝子５００ｂｐ長と等価である。実際に、当業者は、本発明のフィターゼコードポリヌクレオチドを含む微生物のような生物体について例えばスクリーニングするために、約１０ｍｇのゲノムＤＮＡを用いる。標的ＤＮＡが細菌であるかまたは例えばプラスミドである場合、プラスミドは、過剰な曝露を回避するために適宜ＤＮＡを希釈しなければならない。標的ＤＮＡは、例えば、ドットブロッティングによって、または電気泳動ゲルからのブロッティングを介してブロットされる。好ましい条件は、「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ，ＵＫ．−ＰＩ／１６２／８５／１）に記載される。Ｈｕｂｏｎｄ  Ｎ＋正荷電ナイロン膜が好ましくは用いられる（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。このプローブを好ましくは、ＰｈａｒｍａｃｉａのＲｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ＤＮＡＴＭ標識キットに従って調製して、１×１０９ｄｐｍ／マイクログラムより多いプローブを調製する。このプローブを１ミリリットルのハイブリダイゼーション緩衝液あたり１×１０６ｄｐｍの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液中において用いる。ブロットを好ましくはハイブリダイゼーション緩衝液（６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液および０．５％ＳＤＳ、および変性サケ精子ＤＮＡ〜１００ｍｇ／ｍｌ緩衝液）中で６５℃において１時間、プレハイブリダイゼーションして、続いて振盪しながら、変性標識プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中において６５℃で１２時間ハイブリダイゼーションする。次いで、ブロット（単数または複数）を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の適切な容積の洗浄緩衝液（代表的には５０ｍｌ）を用いて６５℃で３０分間洗浄し、続いて、中度のストリンジェンシーの洗浄については同じ洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、または０．１％×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１０分間６５℃（高ストリンジェンシー）のいずれかで、適切な容積の洗浄緩衝液（代表的には５０ｍｌ）中での第二の洗浄を行い、この第二の洗浄は、極めて高ストリンジェンシーの洗浄については７０℃で反復してもよい。
【００５４】
本発明のヌクレオチド配列は、配列番号３またはその有効なフラグメントまたはその改変体、改変型（修飾型）、ホモログもしくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。
【００５５】
詳細には、本発明は、本明細書に記載されるようなフィターゼ、またはそのホモログもしくは誘導体を含むプラスミドまたはベクター系を提供する。好ましくはこのプラスミドまたはベクター系は、配列番号２に示される核酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％相同性である配列もしくはその有効なフラグメントを含む。適切には、このプラスミドまたはベクター系は、配列番号２のいずれかに示される核酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％相同性（同一）である配列によってコードされる任意の酵素の微生物中での発現のための発現ベクターである。適切な発現ベクターは本明細書において記載される。さらに、本発明は、本明細書に記載される任意の改変された酵素または改変体または機能的なフラグメントの発現のためのプラスミドまたはベクター系を提供する。適切な発現ベクターは本明細書に記載される。
【００５６】
（フィターゼ改変体）
本発明は、親のフィターゼのアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基の改変による親のフィターゼの特徴の改善を記載する。
【００５７】
本発明による親の酵素として用いられるフィターゼ酵素としては、細菌由来の野性型フィターゼ、詳細には、好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくはその有効なフラグメント、または配列番号３と７５％より多く、好ましくは８０％より多く、さらに好ましくは９０％より多く、それよりさらに好ましくは９５％、９５％、９７％、９８％より多く、好ましくは９９％より多くが同一であるアミノ酸配列（すなわち相同なポリペプチド）もしくはその有効なフラグメントを有する、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．から得ることができるかまたはそれに由来するフィターゼが挙げられる。
【００５８】
本発明の改良されたフィターゼ酵素改変体は好ましくは、配列番号３またはその有効なフラグメントに対して７５％より多く、好ましくは８０％より多く、さらに好ましくは９０％より多く、それよりさらに好ましくは９５％、９５％、９７％、９８％より多く、好ましくは９９％より多く同一性を有する。しかし、改変体は配列番号３に対して異種（すなわち、相同でない）であってもよいことがまた想定される。例えば、エキソ−媒介性組換え（ｅｘｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはファミリー・シャッフリング（ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）のような組換え技術によって生成された改変体は改変体を生じ得、これは本発明に従う親のフィターゼを用いて調製されるが、７５％未満の相同性であってもよい。
【００５９】
配列アラインメントおよび配列同一性の決定は適切には、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰのような当該分野で公知のコンピュータープログラムの方法によって行われてもよい（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，ｐ４４３〜４５３）。ＧＡＰは、ポリペプチド配列比較のために以下の設定で用いられ得る：ＧＡＰ作製ペナルティーが３．０およびＧＡＰ伸長ペナルティーが０．１。配列アラインメントを用いて、例えば、相同なポリペプチドにおける対応する位置を決定する。
【００６０】
フィタータゼ酵素は、以下の発現宿主の１つ以上での異種発現後に特徴付けられた：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。他の発現宿主を用いてもよい。
【００６１】
本発明によるフィターゼ特徴の改善は、食物および飼料の処理における使用に、そして食物および飼料製品への添加物としての使用に関する。詳細には、改善は、食物および飼料の処理条件下での安定性に、胃の通過の間の安定性に、そしてヒトまたは動物の胃および／または腸管における活性および安定性に関する。このような改善は、パラメーターのなかでもとりわけ、上昇した温度、好ましくは６５℃を上回る温度での安定性の増大、タンパク質分解性の消化、好ましくは消化管のプロテアーゼに対する安定性の増大、低いｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満での触媒活性の増大、およびフィチン酸からのリン酸塩遊離の一般的な効率を含む。
【００６２】
上昇した温度での安定性の増大は、酵素の不活性化温度によって定量される。不活性化温度とは、特定の期間のインキュベーションおよび室温への引き続く冷却後のフィターゼ酵素の残留活性が、室温で同じ条件下で同じ期間にわたってインキュベートされた同じフィターゼ酵素の残留活性の５０％である温度として規定される。熱安定性の相違は、２つの酵素の不活性温度の間の相違の℃である。
【００６３】
改良された特徴を得るように変異される位置および／または領域は、野性型フィターゼの配列および構造の分析によって、そして親の酵素の突然変異誘発によって、詳細には、配列番号３に示される野性型アミノ酸配列への変異の導入および、改良された特徴を有する酵素改変体をスクリーニングすることによって、見出された。これによって親の酵素内の特定の領域および位置が、フィターゼ酵素の特徴を改善するために重要であることが同定された。
【００６４】
従って、本発明は、以下の位置（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）：
：５９、７０、１２２、１２５、１６７、１９３、１９７、２０４、２０９、２１１、２２１、２２３、２２５、２４０、２４２、２４４、２６８、２８１、２８９、２９４、３０３、３３６、３５１の１つ以上において、および／または配列番号３のアミノ酸配列に示されるフィターゼに相同なフィターゼにおける対応する位置において変異を含む、親のフィターゼに比較した場合、改善された特徴を有するフィターゼ改変体に関する。これらの位置は、これらの位置の突然変異誘発が、酵素特徴における改善をもたらすという点で特徴付けられる。
【００６５】
Ｋ５９Ｅ；Ｔ１６７Ｖ；Ｋ２４０Ｔ；Ｔ１６７Ｉ；Ｋ２４０Ｅ；Ｄ２４４Ｃ；Ｑ２８９Ｙ；Ｔ２０９ＫおよびＦ１９７Ｓ。
または各々の位置での保存的変異。
【００６６】
変異のうち特に好ましい組み合わせとしては以下が挙げられる。
【００６７】
【化５】
2011239793.tif 000007
（フィターゼ改変体を調製する方法）
広範な実施形態において、本発明は、フィターゼ酵素改変体（単数または複数）を調製する方法を提供する。
【００６８】
好ましい実施形態では、フィターゼ酵素改変体を調製する方法は以下の連続的な工程を含む：
ａ）少なくとも１つの親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この少なくとも１つの親のフィターゼ酵素が、ｉ）本明細書に記載されるようなＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ
ｓｐ．フィターゼに相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変型、相同なポリペプチド、改変体、機能的等価物もしくは有効なフラグメント、あるいはｉｉ）本明細書に記載されるような少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体、から選択される工程と、
ｂ）この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換またはその組み合わせである、親のフィターゼ酵素の少なくとも１つの変更を導入することによって、少なくとも１つのフィターゼ改変体を作製して、少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）この少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体をスクリーニングして、この親のフィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または    ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
から選択される改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体を同定する工程と、
ｄ）この改良されたフィターゼ酵素改変体を調製して、好ましくは、単離されたおよび／または精製されたフィターゼ酵素改変体を生成する工程と。
【００６９】
好ましい実施形態では、工程ｂ）の間に、フィターゼ酵素改変体の集団が生成され、かつ工程ｃ）において、フィターゼ酵素改変体のこの集団の少なくとも一部がスクリーニングされる。
【００７０】
好ましい実施形態では、工程ａ）は、親のフィターゼ酵素をコードする請求項１１〜１３に記載のヌクレオチド配列を突然変異誘発に供する工程を包含し、かつ工程ｂ）が、宿主細胞において工程（ａ）で得られた変異されたヌクレオチド配列を発現する工程を包含し、かつ工程ｃ）が、宿主細胞またはその抽出物を、前記改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体についてスクリーニングする工程を包含する。
【００７１】
さらなる実施形態では、工程ｃ）および必要に応じてｄ）の後に、反復工程ａ）〜ｃ）および必要に応じてｄ）の少なくとも１回の引き続くラウンドをさらに含み、好ましくはこの引き続くラウンド（単数または複数）において、工程ａ）の少なくとも１つの親のフィターゼ酵素が、この方法に従って調製された、上記少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体および／または改良されたフィターゼ改変体から選択される。
【００７２】
さらに好ましい実施形態では、工程ｃ）は、ｉ）前記親のフィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのその機能的なフラグメントのいずれかに比較して、少なくとも２．５という熱安定性の相違を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する。
【００７３】
さらなる実施形態では、工程ｃ）は、ｉ）前記親のフィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのその機能的なフラグメントのいずれかに比較して、少なくとも３０というペプシン安定性を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する。
【００７４】
さらなる実施形態では、工程ｃ）は、ｉ）前記親のフィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかに比較して、少なくとも１１０という配列番号３によってコードされるフィターゼに比較した場合の比活性を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する。
【００７５】
本発明はまた、フィターゼ酵素改変体を調製する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
ａ）親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この親のフィターゼ酵素が：
ｉ．配列番号３またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
ｉｉｉ．少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体
から選択される工程と、
ｂ）この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも１つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
のうちの１つ以上から好ましくは選択される、本明細書に記載のような改善された特徴を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と
ｄ）フィターゼ酵素改変体を調製する工程と。
【００７６】
必要に応じて、少なくとも工程ａ）〜ｃ）は、１つ以上の引き続く（反復性）のラウンドで繰り返されてもよい。従って、親のフィターゼ酵素とは、上記の方法ａ）〜ｃ）の以前のラウンドによって調製されたフィターゼ酵素改変体であることが想定される。
【００７７】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ改変体を調製する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
（ａ）親のフィターゼ酵素であって、
（ｉ）配列番号３またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素、
（ｉｉ）Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体
から選択される、親のフィターゼ酵素を提供する工程と、
（ｂ）この親のフィターゼ酵素の変更によってフィターゼ改変体の集団を生成する工程であって、好ましくはこの変更（単数または複数）が親のフィターゼにおける少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換、またはその任意の組み合わせを通じて得られる工程と、
（ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
（ｉ）より高い熱安定性および／または
（ｉｉ）より高い比活性および／または
（ｉｉｉ）より高いタンパク質分解安定性
のうちの１つ以上から好ましくは選択される、本明細書に記載のような改善された特徴を有するフィターゼ酵素改変体についてこの集団をスクリーニングする工程と、
（ｄ）フィターゼのこの集団から１つ以上のフィターゼ酵素改変体を選択する工程と、
（ｅ）必要に応じて、工程（ａ）〜（ｃ）を循環的に繰り返す工程であって、好ましくは１つのサイクルで選択されたフィターゼ改変体が次のサイクルで第一のフィターゼとして用いられる工程と。
【００７８】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を調製する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
ａ）親のフィターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を突然変異誘発に供する工程であって、この親のフィターゼ酵素が
ｉ．配列番号３またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
ｉｖ．少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体
から選択される工程と、
ｂ）工程（ａ）において得られた変異されたヌクレオチド配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．より高い比活性および／または
ｉｉｉ．より高いタンパク質分解安定性
のうちの１つ以上のから好ましくは選択される、本明細書に記載されるような、改善された特徴を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、および／または
ｄ）この宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と。
【００７９】
必要に応じて、工程（ａ）〜（ｃ）は、必要に応じてｄ）を含んで、１回以上の連続的な（反復性）ラウンドで繰り返されてもよい。
【００８０】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ改変体を調製する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）親のフィターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を突然変異誘発に供して変更されたヌクレオチド改変体の集団を生成する工程であって、好ましくはこの変更（単数または複数）が、親のフィターゼにおける少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換、またはその任意の組み合わせを通じて得られ、この親のフィターゼ酵素が、
（ｉ）配列番号３またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
（ｉｉ）Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
（ｉｉｉ）少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体
から選択される工程と、
（ｂ）工程（ａ）において得られたヌクレオチド改変体の集団を、対応する宿主細胞の集団中で発現させる工程と、
（ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．より高い比活性および／または
ｉｉｉ．より高いタンパク質分解安定性
のうちの１つ以上から好ましくは選択される、本明細書に記載されるような、改善された特徴を有するフィターゼ改変体の集団をスクリーニングする工程と、
（ｄ）このフィターゼの集団から１つ以上のフィターゼ改変体を選択する工程と。
（ｅ）必要に応じて、工程（ａ）〜（ｃ）を循環的に反復する工程であって、好ましくは１つのサイクルで選択されたフィターゼ改変体が次のサイクルで第一のフィターゼとして用いられる工程と。
【００８１】
必要に応じて、フィターゼ酵素改変体を調製する上記の方法では、上記のヌクレオチド配列は好ましくはＤＮＡ配列である。
【００８２】
このヌクレオチド配列は好ましくは、本明細書に記載されるような、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼに相当するアミノ酸配列、またはそのホモログを含む酵素をコードする、単離されるかおよび／または精製された核酸分子またはヌクレオチド配列である。
【００８３】
親のフィターゼは好ましくは、本明細書に記載されるように、配列番号３またはその機能的なフラグメントまたは配列番号３に開示されるようなＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐのフィターゼのホモログから選択される。
【００８４】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する、本発明の上記の実施形態では、親のフィターゼの酵素／ヌクレオチドコードする親のフィターゼ酵素／ヌクレオチドは好ましくは野性型フィターゼである。
【００８５】
しかし、別の方法では、親は、突然変異誘発の以前のラウンドで調製された改変体であってもよい。すなわち、一実施形態では、フィターゼ酵素改変体を調製する方法は、反復性であり、工程ａ）〜ｃ）（必要に応じて工程ｄ）を含む）は、少なくとも２回以上繰り返される。このような実施形態では、突然変異誘発の初回に用いられる突然変異誘発法は好ましくは、エラー・プローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、より好ましくはエラー限界値（ｅｒｒｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）ＰＣＲである。その後のラウンドはまた、エラー・プローンＰＣＲ、より好ましくはエラー限界値ＰＣＲであってもよいが、あるいは、組換えに基づく突然変異誘発であってもよく、少なくとも２つの独立して改良された改変体の群は突然変異誘発の初回には同一であり、組換え突然変異誘発の２回目またはその後のラウンドの間に、少なくとも１つの組換え改変体が得られる（例えば、ファミリーシャッフリングまたはリコンビナーゼ連鎖反応法を用いて）。
【００８６】
ラショナール・デザイン（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）、サイト・スキャニング突然変異誘発（ｓｉｔｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）または化学的／放射線誘導突然変異誘発を含む、別の突然変異誘発方法も用いられてもよいことが当業者には理解される。
【００８７】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する本発明の上記の実施形態では、このフィターゼ酵素改変体は好ましくは、より高い熱安定性についてスクリーニングされる。
【００８８】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する本発明の上記の実施形態では、このフィターゼ酵素改変体は好ましくは、より高い熱安定性、より高いタンパク質分解安定性またはより高い比活性、最も好ましくはより高い熱安定性から好ましくは選択される、少なくとも単一のパラメーターについてスクリーニングされる。
【００８９】
好ましくは、この第一のパラメーターについてのスクリーニングは、少なくとも工程ａ）〜ｃ）からなる突然変異誘発の少なくとも初回に行われ、ここでｃ）がこの第一のパラメーターについての少なくともスクリーニングを含む。次いで、この初回の突然変異誘発には、工程ａ）〜ｃ）（必要に応じてｄ）を含む）を含む、さらなる（反復性）ラウンドの突然変異誘発および選択が続いてもよく、ここでこのさらなるラウンドにおける選択は、この初回の工程ｃ）において用いられるのと同じ選択パラメーター、あるいは異なるパラメーターから選択されてもよい。
【００９０】
フィターゼ酵素改変体を調製する上記の方法の反復性のラウンドの間に、好ましくはこの第一のパラメーターは、より高い熱安定性、より高いタンパク質分解安定性またはより高い比活性、最も好ましくはより高い熱安定性から選択される。好ましくは、突然変異誘発の初回が、より高い熱安定性を有する改変体を選択するために行われている場合、工程ａ）〜ｃ）を含む突然変異誘発の引き続く（反復性）のラウンド（単数または複数）の間、このパラメーターは、より高い熱安定性、より高いタンパク質分解安定性またはより高い比活性、最も好ましくはより高いタンパク質分解安定性またはより高い比活性から選択される。
【００９１】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する本発明の上記の実施形態では、このフィターゼ酵素改変体は好ましくは、少なくとも１回の突然変異誘発（工程ａ〜ｃ）、好ましくは２回以上の、すなわち反復性のラウンドの選択において、より高い熱安定性、およびより高いタンパク質分解安定性、およびより高い比活性についてスクリーニングされる。
【００９２】
親のフィターゼ酵素は好ましくは、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  Ｐ１−２９由来である。
【００９３】
親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を突然変異誘発に供する工程を含む、フィターゼ酵素改変体を調製する方法では、親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列は好ましくは、ランダム変異導入法（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、より好ましくはエラープローンＰＣＲ、さらにより好ましくはエラー限界値ＰＣＲに供される。
【００９４】
親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の突然変異誘発の好ましい方法は、エラープローンＰＣＲ、より好ましくはエラー限界値ＰＣＲであり、突然変異誘発の他の方法が、エラープローン／限界値ＰＣＲの代わりに、またはエラープローン／限界値ＰＣＲと組み合わせてのいずれかで用いられてもよい。適切なエラープローンＰＣＲおよびエラー限界値ＰＣＲ方法についての参照を提供する実施例１２を参照のこと。変異導入（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）ＰＣＲのための別の適切な方法は、ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３（１９９４），１３６〜１４９）に開示される。
【００９５】
「フィターゼ酵素改変体を調製する方法」を指す、この実施形態の文脈で用いられる場合、「宿主細胞での発現」という用語は、好ましくは、本明細書に規定されるような生きている生物体、器官または細胞におけるフィターゼ酵素改変体の産生として規定される。好ましい宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。本明細書に詳細なフィターゼ酵素は、以下の発現宿主のうちの１つ以上における異種発現後に特徴付けられる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【００９６】
しかし、本明細書に記載されるようなフィターゼ酵素改変体の選択の目的のためには、このような方法を、フィターゼ酵素改変体の発現のインビトロ方法において、好ましくは１つ以上の生存している生物体またはウイルスから単離された１つ以上の細胞から単離された転写物および翻訳機構を利用する、上記の方法の工程（ｃ）における使用のために使用してもよいとみなされる。本発明の改変体フィターゼのこのようなインビトロ産生はまた、好ましい改変体フィターゼを選択するために用いられ得る。インビトロ発現は適切には、標準的な技術を用いて行われてもよい。参照については、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃから入手可能な「インビトロ発現ガイド（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ）」を参照のこと（Ｐａｒｔ＃ＢＲ０５３）。
【００９７】
（改変体の表現型の定義）
より高い熱安定性（熱安定性相違）を有する改変体は好ましくは、実施例１２に開示される方法を用いて決定される。
【００９８】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法によって調製される改変体フィターゼ酵素は好ましくは、少なくとも１．５、より好ましくは２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、最も好ましくは少なくとも２０という熱安定性の相違（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（Ｔ．Ｄ）を有する。
【００９９】
より高いタンパク質分解安定性を有する改変体は好ましくは、実施例１２に開示される方法によって決定される。
【０１００】
好ましくは、本発明のフィターゼ酵素改変体は、少なくとも４５％、好ましくは５０％、５５％、より好ましくは、少なくとも６０％または６５％、最も好ましくは少なくとも７０％のタンパク質分解性の安定性（残留活性）を有する。
【０１０１】
好ましくは、本発明のフィターゼ酵素改変体は、ｐＨ４．０で重量の１００％より大きい活性、好ましくは１０５％、１１０％、さらに好ましくは１１４％より大きいという比活性を有する。
【０１０２】
（さらなる改変体実施形態）
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料の調製のための方法を提供し、この方法は、ｉ）フィターゼ酵素改変体を調製する上記の方法の１つ以上を行う工程と、ｉｉ）動物飼料に対してこの調製されたフィターゼ酵素改変体を添加する工程と、という連続する工程を包含する。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料の調製のための方法を提供し、この方法は、
ａ）親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この親のフィターゼ酵素が、
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素またはその機能的フラグメント、
ｉｉ．Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．、好ましくはＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  Ｐ１−２９由来の親のフィターゼ酵素、および／または
ｉｉｉ．少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体；
から選択される工程と、
ｂ）この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも１つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
のうちの１つ以上から好ましくは選択される、本明細書に記載のような改善された特徴を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、
ｄ）フィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
ｅ）調製されたこのフィターゼ酵素改変体を動物飼料に添加する工程と、
を包含する。
【０１０４】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料の調製のための方法を提供する。
ａ）親のフィターゼ酵素をコードするヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）配列を、突然変異誘発に供する工程であって、この親のヌクレオチドが
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素またはその機能的フラグメント、および／または
ｉｉ．Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．、好ましくはＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  Ｐ１−２９由来の親のフィターゼ酵素、
をコードするヌクレオチドから選択される工程と、
ｂ）工程（ａ）において得られた変異されたヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．より高い比活性および／または
ｉｉｉ．より高いタンパク質分解安定性
のうちの１つ以上から好ましくは選択される、本明細書に記載のような改善された特徴を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
ｄ）この宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
ｆ）この調製されたフィターゼ酵素改変体を動物飼料に添加する工程。
【０１０５】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法の記載された実施形態および好ましい局面はまた、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料を調製する上記の方法にあてはまる。
【０１０６】
本発明の別の局面では、本明細書において記載されるようなフィターゼをコードする核酸を用いて形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【０１０７】
適切には、本発明のこの局面に従う宿主細胞は、フィターゼを含み、このフィターゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも７５％相同である配列を含む。
【０１０８】
好ましい実施形態では、この宿主細胞は、フィターゼを生成する。
【０１０９】
本発明の更なる局面では、本発明に従うフィターゼをコードする核酸を用いて形質転換されるか、またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。好ましくは、このフィターゼは、本明細書において記載されるようなＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼ、またはそのホモログもしくは誘導体である。適切には、このフィターゼ酵素は、配列番号３のいずれかに示されるアミノ酸配列またはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも７５％相同（同一）である配列を含む。好ましくは、この宿主細胞は、フィターゼを生成する。
【０１１０】
一実施形態では、本発明において用いられ得るヌクレオチド配列は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．から得ることができる（ただし実際にそれから得られる必要は無い）が、等価な株から単離されるか、および／または精製された酵素が等しく用いられ得ることが理解される。
【０１１１】
適切には、宿主細胞は、細菌を含む微生物および酵母を含む真菌由来である。特に好ましい実施形態では、この宿主細胞は、原核生物細菌細胞である。適切な細菌宿主細胞としては、プロテオバクテリアを含む種々の原核生物分類群由来の細菌が挙げられ、これには、α、β、γ、δ、およびεの亜門のグラム陽性の細菌のメンバー、例えば、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、フィルミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）および関連のもの、フラボバクテリウム、シアノバクテリア、緑色イオウ細菌、緑色非イオウ細菌および古細菌が挙げられる。特に好ましいのは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、γ亜門に属するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉプロテオバクテリア、および低ＧＣ−グラム陽性細菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓである。
【０１１２】
適切な真菌宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含む子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを含むアナモルフィックな（ａｎａｍｏｒｐｈｉｃ）子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）からなる群より選択される酵母が挙げられる。
【０１１３】
他の適切な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞、例えばＳＦ９、ＳＦ２１、ＴｒｙｃｈｐｌｕｓｉａｎｉおよびＭ１２１細胞が挙げられる。例えば、本発明によるポリペプチドは、昆虫細胞系において有利に発現され得る。培養中での昆虫細胞における発現と同様に、フィターゼ遺伝子は、昆虫の生物体丸ごとにおいて発現され得る。バキュロウイルスのようなウイルスベクターは、昆虫全体へ感染し得る。大型の昆虫、例えば、カイコは、高い収率の異種タンパク質を供給する。このタンパク質は、従来の抽出技術に従って昆虫から抽出され得る。本発明における使用のために適切な発現ベクターとしては、昆虫細胞株において外来のタンパク質を発現可能である全てのベクターが挙げられる。
【０１１４】
他の宿主細胞としては、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、胚珠、接合子などからなる群より選択された植物細胞が挙げられる。本発明はまた、形質転換されておりかつ本発明の組換えＤＮＡを含む植物丸ごとを提供する。
【０１１５】
「植物（ｐｌａｎｔ）」という用語は一般に、真核性藻類、有胚植物を含み、これには、コケ植物、シダ植物および種子植物、例えば、裸子植物および被子植物が挙げられる。
【０１１６】
好ましくは、このような宿主細胞は微生物である。好ましい微生物としては、原核生物の細菌細胞、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ属の他の種、酵母、好ましくは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅが挙げられる。
【０１１７】
本発明の別の局面では、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｓｏｋｅｒｉｔｅｈｔａａｎｔｉｅ  ２０，ＦＩＮ−０２４６０  Ｋａｎｔｖｉｋ、Ｆｉｎｌａｎｄに受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８として２００４年の９月２２日に寄託された細菌細胞の株Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９が提供される。このような細胞は、飼料に直接組み込まれてもよい。
【０１１８】
別の局面では、本発明に従う発現ベクターまたはプラスミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトする工程と、この宿主細胞をフィターゼの発現のための条件下で培養する工程と、このフィターゼを宿主細胞培養培地から抽出する工程とを包含する、フィターゼの産生のための方法が提供される。
【０１１９】
適切には、この方法は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の相同性を有する配列、またはその有効なフラグメントを宿主細胞中で発現する工程と、この宿主細胞培養培地から、分泌されたタンパク質を抽出する工程とを包含する、フィターゼの産生のための方法である。
【０１２０】
本発明の別の局面は、本発明に従うフィターゼを含む飼料組成物を提供する。好ましくは、この飼料組成物は、飼料１ｋｇあたり１０〜１００００Ｕ、好ましくは２００〜２０００Ｕ、さらに好ましくは５００〜１０００Ｕの濃度でフィターゼを含む。
【０１２１】
一実施形態では、この飼料組成物は、本発明に従う宿主細胞を含む。
【０１２２】
さらなる局面では、食料または動物飼料における本発明に従うフィターゼの使用が提供される。
【０１２３】
（好ましい局面）
好ましい局面は、添付の特許請求の範囲に、そして以下の詳細な説明および実施例のセクションに示される。
【０１２４】
（さらなる利点）
本発明は、動物飼料に対する添加物としてフィターゼを特に有用にさせる、多数の特性を有するフィターゼを提供するので有利である。
【０１２５】
詳細には、本発明のフィターゼは、低いｐＨで、そして好ましくは、ｐＨ２〜５．５の範囲で活性であり、ｐＨ４〜４．５の周囲で活性が最大である。適切には、本発明のフィターゼは、胃の環境の低いｐＨで活性である（ｐＨ２．５における最大活性の約４０％を保持している）。
【０１２６】
さらに、本発明のフィターゼは、天然の宿主において、そして異種発現の間に効率的に分泌され、これによって、飼料への添加のための、より効率的な産生および単離がもたらされる。
【０１２７】
さらに、本発明のフィターゼは好ましくは、五−、四−、三−、および二−リン酸塩基質を含む、広範な基質特異性を有し、それによって動物による吸収に利用可能な総リン酸塩（利用可能なリン酸塩）が増大する。本発明のフィターゼはまた、好ましくは、３００Ｕ／ｍｇ＋／−約１０％、好ましくは少なくとも３００Ｕ／ｍｇという領域で高い非活性を有する。
【０１２８】
本発明の生成物は、食料および飼料に対する添加物／補充物として用いられ得る。この生成物はまた、種々のイノシトール−リン酸塩の商業的な産生において有用であり得る。
【０１２９】
（フィチン酸塩／フィチン酸／フィターゼ）
フィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸エステル）は、穀類、マメ科植物および脂肪種子の作物における重要な構成物である。塩型であるフィチン酸塩は、これらの植物におけるリンの主要な貯蔵形態である。
【０１３０】
フィターゼは、フィチン酸のリン酸モノエステル加水分解を触媒し、段階的な形態のｍｙｏ−イノシトールの五−、四−、三−、二−および一リン酸エステルの形成、ならびに無機リン酸塩の遊離を生じる。
【０１３１】
本発明において用いられる場合、「野性型フィターゼ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｐｈｙｔａｓｅ）」または「野性型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」という用語は、天然に見出されるアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素をいう。
【０１３２】
「フィターゼ改変体（ｐｈｙｔａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「改変型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｏｒｍ）」という用語は、まとめて「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」と呼ばれる、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する親のフィターゼのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素を指す。
【０１３３】
「親のフィターゼ（ｐａｒｅｎｔ  ｐｈｙｔａｓｅ）」または「親の酵素（ｐａｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、フィターゼ改変体が由来するフィターゼ酵素をいう。親のフィターゼは、野性型フィターゼまたは別のフィターゼ改変体であってもよい。詳細には、本発明においては、「親のフィターゼ」は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．由来であってもよい。適切には、「親のフィターゼ」は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を好ましくは有する、本明細書に記載のようなＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９株由来である。
【０１３４】
（単離された）
一局面では、好ましくはヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、単離型である。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、この配列が天然に通常会合している、そして天然に見出されるような、少なくとも１つの他の成分をこの配列が少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０１３５】
（精製された）
一局面では、好ましくはヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、精製型である。「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は、この配列が比較的純粋な状態、少なくとも１％、５％純粋、または１０％純粋、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％純粋であることを意味する。好ましい実施形態では、ポリペプチドについて言及する場合、上記のような純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって他のポリペプチドから精製されることに関して決定される。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドについて言及する場合、上記のような純度は、他のポリヌクレオチドから精製されることに関して決定される。
【０１３６】
（ヌクレオチド配列）
本発明の範囲は、本明細書に記載のような特定の特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【０１３７】
本明細書において用いる場合、用語「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、オリゴヌクレオチド配列、核酸またはポリヌクレオチド配列、ならびにその改変体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体（例えば、その一部）をいう。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来または合成由来または組換え由来であってもよく、これはセンス鎖を示そうとまたはアンチセンス鎖を示そうと、二本鎖であっても、または一本鎖であってもよい。
【０１３８】
「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、本発明に関しては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。好ましくは、これは、本発明をコードするＤＮＡを、より好ましくはｃＤＮＡ配列意味する。
【０１３９】
好ましい実施形態では、このヌクレオチド配列は、本発明の範囲に関連する場合、そして本発明の範囲自体によって包含される場合、本発明に従う天然のヌクレオチド配列を、その天然の環境にある場合、そして天然に関連する配列（単数または複数）であってその天然の環境にある配列に関連する場合は、含まない。言及を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施形態を、「天然でないヌクレオチド配列（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ぶものとする。これに関しては、この「天然のヌクレオチド配列（ｎａｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、その天然の環境にあり、そして天然に関連するプロモーター全体に作動可能に連結され、このプロモーターがまたその天然の環境にある場合、ヌクレオチド配列全体を意味する。しかし、本発明の範囲によって包含されるアミノ酸配列は、その天然の生物体におけるヌクレオチド配列の発現後に単離および／または精製され得る。しかし、好ましくは、本発明の範囲によって包含されるアミノ酸配列は、その天然の生物体におけるヌクレオチド配列であって、ただしその生物体が天然に関連しているプロモーターの制御下ではないヌクレオチド配列によって発現されてもよい。
【０１４０】
（ヌクレオチド配列の調製）
代表的には、本発明の範囲によって包含されるヌクレオチド配列または本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかし、本発明の別の実施形態では、このヌクレオチド配列は、当該分野で周知の化学的方法を用いて、全体としてまたは部分的に合成されてもよい（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨら（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３およびＨｏｒｎ  Ｔら（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２を参照のこと）。
【０１４１】
本明細書に規定されるような特異的な特性を有する酵素、または改変に適切である酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、このような酵素を産生する任意の細胞または生物体から同定および／または単離および／または精製してもよい。ヌクレオチド配列の同定および／または単離および／または精製のためには、種々の方法が当該分野で周知である。例えば、より多くの配列を調製するためにＰＣＲ増幅技術を一旦用いて、適切な配列を同定および／または単離および／または精製してもよい。
【０１４２】
さらなる例としては、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーが、この酵素を産生する生物体から、染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いて構築され得る。酵素のアミノ酸配列または酵素のアミノ酸配列の一部が既知である場合、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、用いて、この生物体から調製されたゲノムライブラリーから酵素をコードするクローンを同定してもよい。あるいは、別の公知の酵素遺伝子と相同な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、酵素コードクローンを同定してもよい。後者の場合、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いる。
【０１４３】
あるいは、酵素をコードするクローンは、プラスミドのような発現ベクターにゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入すること、得られたゲノムＤＮＡライブラリーで酵素陰性の細菌を形質転換すること、次いでこの形質転換された細菌をこの酵素の基質（例えば、ガラクトシダーゼ（マルターゼ）産生酵素についてはマルトース）を含む寒天プレート上にプレートすることによって同定されてもよく、これによってこの酵素を発現するクローンを同定することが可能になる。
【０１４４】
なおさらなる別の方法では、この酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，ｐ１８５９〜１８６９によって記載されるホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，ｐ８０１〜８０５によって記載される方法によって合成的に調製されてもよい。ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザー中で合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターにクローニングされる。
【０１４５】
ヌクレオチド配列は、混合されたゲノム由来および合成由来の配列であっても、混合された合成由来およびｃＤＮＡ由来であっても、または混合されたゲノム由来およびｃＤＮＡ由来であってもよく、標準的な技術に従って合成、ゲノムもしくはｃＤＮＡ由来（必要に応じて）のフラグメントを連結することによって調製されてもよい。各々の連結されたフラグメントは、全体的なヌクレオチド配列の種々の部分に相当する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に、またはＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７〜４９１）に記載のような、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製されてもよい。
【０１４６】
遺伝子コードの縮重に起因して、ヌクレオチド配列であって、ここでは、もとのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸のいくつかまたは全てについて三つ組みのコドン用法が変化されており、それによって、もとのヌクレオチド配列に対しては相同性が低いが、もとのヌクレオチド配列によってコードされるのと同じ、または改変体、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、容易に生成され得る。例えば、ほとんどのアミノ酸について、遺伝子コードの縮重性は三つ組みコドンにおける三番目の位置（ゆらぎ位置（ｗｏｂｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ））であり（参照については、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌｕｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−７１６７−１９２０−７を参照のこと）、従って、全ての三つ組みのコドンが三番目の位置で「ゆらいでいる（ｗｏｂｂｌｅｄ）」ヌクレオチド配列は、もとのヌクレオチド配列に対しては約６６％の同一性であるが、変更されたヌクレオチド配列は、もとのヌクレオチド配列と同じ、または改変体の一次アミノ酸配列をコードする。
【０１４７】
従って、本発明はさらに、三つ組みコドンをコードする少なくとも１つのアミノ酸の別の三つ組みコドン用法を有するが、もとのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列と同じ、または改変体、ポリペプチド配列をコードする、任意のヌクレオチド配列に関する。
【０１４８】
さらに、特定の生物体は代表的には、三つ組みコドンがアミノ酸をコードするために用いられるのに応じてバイアスを有する。好ましいコドン用法の表が、広範に利用可能であり、そしてコドン最適化遺伝子を調製するために用いられ得る。このようなコドン最適化技術は、異種の宿主における導入遺伝子の発現を最適化するために慣用的に用いられる。
【０１４９】
（分子進化）
一旦、酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されるか、および／もしくは精製されるか、または推定の酵素コードヌクレオチド配列が同定されれば、選択されたヌクレオチド配列を改変することが所望され得る。例えば、配列を変異させて、本発明に従う改善された安定特徴を有する酵素を調製することが所望され得る。
【０１５０】
変異は、合成のオリゴヌクレオチドを用いて導入されてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６〜６４９）に開示される。酵素コードヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）、１８０、ｐ１４７〜１５１）に記載される。
【０１５２】
部位特異的突然変異誘発の代わりに、上記のように、例えば、市販のキット、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ突然変異誘発キット、またはＣｌｏｎｔｅｃｈのＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲランダム変異突然変異誘発キットを用いて、変異をランダムに導入してもよい。
【０１５３】
新規な配列を得るための第三の方法は、多数の制限酵素（単数または複数）、例えば、Ｄｎａｓｅ  Ｉを用いることによって、同一でないヌクレオチド配列を断片化すること、および機能的なタンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再構築することである。あるいは、１つまたは複数の同一でないヌクレオチド配列を用いて、この全長ヌクレオチド配列の再構築の間に、変異を導入してもよい。
【０１５４】
これによって、ヌクレオチド配列に多数の部位特異的なまたはランダムな変異を、インビボまたはインビトロのいずれかで、生成すること、そして種々の手段によってこのコードされたポリペプチドの機能の改善について引き続きスクリーニングすることが可能である。
【０１５５】
非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異体または天然の改変体を、野性型または他の変異体または天然の改変体と組換えて、新規な改変体を生成してもよい。このような新規な改変体はまた、コードされたポリペプチドの改善された機能についてスクリーニングされ得る。新規な好ましい改変体の生成は、当該分野で十分確立された種々の方法、例えば、エラー限界値突然変異誘発（Ｅｒｒｏｒ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＷＯ９２／１８６４５）、オリゴヌクレオチド媒介性ランダム突然変異誘発（米国特許第５，７２３，３２３号）、ＤＮＡシャッフリング（米国特許第５，６０５，７９３号）、エキソ媒介性遺伝子アセンブリ（ｅｘｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）（ＷＯ００５８５１７）によって達成され得る。他の適切な方法は、例えば、ＷＯ０１３４８３５、ＷＯ０２／０９７１３０、ＷＯ０３／０１２１００、ＷＯ０３／０５７２４７、ＷＯ２００４／０１８６７４、米国特許第６，３０３，３４４号および米国特許第６，１３２，９７０号に記載される。
【０１５６】
上述の適用および類似の分子進化方法によって、タンパク質の構造または機能の先行技術の知識なしに、好ましい特徴を有する、本発明の酵素の改変体の同定および選択が可能になり、そして予測不能だが有益な変異または改変体の生成が可能になる。酵素活性の最適化または変更のためには当該分野において分子進化の適用の多数の例があり、このような例としては、限定はしないが、以下の１つ以上が挙げられる：宿主細胞における、またはインビトロにおける、最適化発現および／または活性、酵素活性の増大、基質および／または生成物特異性の変更、酵素のまたは構造の安定性の増大または減少、好ましい環境条件、例えば、温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変更。
【０１５７】
上記の分子進化方法は、本明細書に記載のようなフィターゼ酵素改変体を調製する方法において用いられ得る。
【０１５８】
（アミノ酸配列）
本発明の範囲はまた、本明細書に規定されるような特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列を包含する。
【０１５９】
本明細書において用いる場合、「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、「ポリペプチド」という用語および／または「タンパク質」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、「酵素（ｅｎｚｙｍｅ）」と同義である。
【０１６０】
アミノ酸配列は、適切な供給源から調製／単離されてもよいし、または合成的に作製されてもよいし、または組換えＤＮＡ技術の使用によって調製されてもよい。
【０１６１】
本発明に包含される酵素は、他の酵素と組み合わせて用いられてもよい。従って、本発明はまた、酵素の組み合わせを包含し、この組み合わせは本発明の酵素および本発明に従う別の酵素であってもよい別の酵素を含む。この局面は後ろのセクションで考察される。
【０１６２】
好ましくは、本発明の範囲に関連している場合、および本発明の範囲自体によって包含される場合、このアミノ酸配列は、天然の酵素ではない。この点で、「天然の酵素（ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、その天然の環境にあり、かつその天然のヌクレオチド配列によって発現されている場合、酵素全体を意味する。
【０１６３】
（改変体／ホモログ／誘導体）
本発明はまた、酵素の任意のアミノ酸配列の、またはこのような酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の改変体、ホモログおよび誘導体の使用を包含する。
【０１６４】
ここで、「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」という用語は、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と同等であり得る。適切には、「ホモログ」とは、この状況では、下にさらに詳細に記載されるとおり、アラインメントアルゴリズムを用いてそれらの配列を整列させた後の２つの酵素の間の配列同一性の割合をいう。
【０１６５】
本発明の状況では、相同なアミノ酸配列は、この配列に対して少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むものとする。代表的には、ホモログは、例えば、本発明のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮してもよいが、本発明の状況では、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１６６】
「機能的なフラグメント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、そのポリペプチドの特徴的な特性を保持するポリペプチドのフラグメントを意味する。本発明の状況では、フィターゼ酵素の機能的なフラグメントとは、タンパク質丸ごとのカロテノイド切断能力を保持するフラグメントである。
【０１６７】
本発明の状況では、相同なヌクレオチド配列とは、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列（本発明の配列）に対して少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％同一である、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むものとする。代表的には、ホモログは、活性部位をコードする、本発明の配列と同じ配列などを含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮してもよいが、本発明の状況では、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１６８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列については、相同性比較は、肉眼で、またはさらに一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの補助によって行われてもよい。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列の間の相同性％を計算し得る。
【０１６９】
相同性％は、連続的な配列にまたがって算出され得、すなわち、１つの配列が他の配列と整列され、そして１つの配列における各々のアミノ酸が直接、他の配列における対応するアミノ酸、１残基とある時点で比較される。これは、「非ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。代表的には、このような非ギャップアラインメントは、比較的短い数の残基にまたがってのみ行われる。
【０１７０】
これは極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一対の配列において、１つの挿入または欠失は、次のアミノ酸残基がアラインメントから出されるようにさせ、これによって、可能性としては、全体的なアラインメントが行われる場合に相同性％の大きな低下を生じ得るということを考慮できない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に損なうことなく、可能な挿入および欠失を考慮する最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所相同性を最大化するように試みるために配列アラインメントにおいて「ギャップ（ｇａｐｓ）」を挿入することによって達成される。
【０１７１】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントを生じる各々のギャップに対して「ギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当て、その結果、同数の同一のアミノ酸について、できるだけギャップの少ない配列アラインメント（２つの比較配列の間の関連性がより高いことを反映する）は、多くのギャップで１よりも高いスコアを達成する。ギャップの存在について比較的高いコストおよびギャップにおける各々の引き続く残基についてより小さいペナルティーをチャージする、「アフィンギャップコスト（ａｆｉｉｎｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ）」が代表的には用いられる。これが、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながら、よりギャップの少ない最適化アラインメントを生じる。ほとんどのアラインメントプログラムによって、ギャップペナルティーが改変されることが可能になる。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォールト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列についてのデフォールトギャップペナルティは、ギャップについて−１２、そして各々のエクステンションについて−４である。
【０１７２】
従って、最大相同性％の算出は最初に、ギャップペナルティーを考慮する最適アラインメントの生成を要する。このようなアラインメントを行う適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）。配列比較を行ない得る他のソフトウェアの例としては、限定はしないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方とも、オフラインおよびオンラインの検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。
【０１７３】
しかし、いくつかの適用については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる新規なツールもまた、タンパク質およびヌクレオチドの配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０１７４】
最終の相同性％は、同一性に関して測定され得るが、アラインメントプロセス自体は代表的には、オール・オア・ナッシングの対の比較には基づかない。代わりに、化学的な類似性または進化距離に基づいて各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、計測された類似性スコアマトリックスが一般に用いられる。一般に用いられるこのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（プログラムのＢＬＡＳＴスイーツ（ｓｕｉｔｅ）についてのデフォールトマトリックス）。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般に、供給された場合、公的なデフォールト値またはカスタム記号比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。いくつかの適用については、ＧＣＧパッケージについての公的なデフォールト値を、または他のソフトウェアの場合には、デフォールトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を用いることが好ましい。
【０１７５】
あるいは、相同性パーセントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７〜２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において複数のアラインメント特徴を用いて算出されてもよい。
【０１７６】
一旦ソフトウェアが最適アラインメントを生成すれば、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することが可能である。このソフトウェアは代表的には、これを配列比較の一部として行い、計算結果を得る。
【０１７７】
本発明の好ましい局面では、配列の相同性／同一性の割合を算出するために以下のソフトウェアおよび設定を用いる。アミノ酸配列については、同一性（相同性）または「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）」の割合は、アミノ酸配列の各々の可能性のある対についてＡｌｉｇｎＸ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．由来のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ９．１）によって算出する。設定はデフォールトパラメーター（Ｇａｐオープニングペナルティー−１０，Ｇａｐエクステンションペナルティー０．１）である。
【０１７８】
核酸配列については、同一性（相同性）または「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）」の割合は、核酸配列の各々の可能性のある対について、Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラムによって算出する。設定はＤＮＡについてデフォールト設定であり、Ｇａｐオープニングペナルティー：１５そしてＧａｐエクステンションペナルティー：６．６６である（複数のアラインメントについて同じ設定）。
【０１７９】
好ましくはアミノ酸同一性（相同性）は、全長のアミノ酸配列配列にまたがって、または核酸については、代表的な全長アミノ酸配列をコードする対応するポリヌクレオチドに対して算出される。
【０１８０】
この配列はまた、サイレント変化を生じ、かつ機能的に等価な物質を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有してもよい。意図的なアミノ酸置換は、アミノ酸特性（例えば、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質）の類似性に基づいてなされ得、従って、官能基においてアミノ酸をまとめてグループ分けするために有用である。アミノ酸は、それらの側鎖単独の特性に基づいて、まとめてグループ分けされてもよい。しかし、同様に変異データを含むことがさらに有用である。このように誘導されたアミノ酸のセットは、構造的な理由のために保存的であると考えられる。これらのセットは、Ｖｅｎｎダイアグラムの形態で記載され得る（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ
Ｃ．Ｄ．およびＢａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５〜７５６（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５〜２１８）。保存的置換基は、例えば、アミノ酸の一般に受容されるＶｅｎｎダイアグラムグループ分けを記載する以下の表に従って行われてもよい。
【０１８１】
【化６】
2011239793.tif 000008
本発明はまた、相同な置換基を包含し（置換および置き換えは両方とも、既存のアミノ酸残基の別の残基での交換を意味するとして本明細書において用いられる）これは、すなわち、同種対同種の置換、例えば、塩基と塩基、酸と酸、極性と極性などを生じ得る。非保存的置換が生じてもよく、すなわち、１クラスの残基から、別のあるいは天然ではないアミノ酸、例えば、オルニチン（本明細書において以降ではＺと呼ばれる）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書において以降ではＢと呼ばれる）、ノルロイシンオルニチン（本明細書において以降ではＯと呼ばれる）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンへの置換を含む。
【０１８２】
置き換えはまた、天然ではないアミノ酸によって行われてもよい。
【０１８３】
改変体アミノ酸配列は、グリシンまたはβアラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチルまたはプロピル基のようなアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基を含んでもよい。変動のさらなる形態は、１つ以上のアミノ酸残基のペプトイド型での存在に関与し、当業者によって十分に理解される。疑いを避けるために、「ペプトイド型（ｐｅｐｔｏｉｄ  ｆｏｒｍ）」とは、改変体アミノ酸残基をいうために用いられるものであり、このα炭素置換基は、α炭素ではなく残基の窒素原子上にある。ペプトイド型でペプチドを調製するためのプロセスは、当該分野で公知である。例えば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪら、ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０）、９３６７〜９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２〜１３４。
【０１８４】
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、それらの中に合成または改変されたヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらとしては、メチルホスホン酸塩およびホスホロチオエート骨格および／またはその分子の３’および／または５’末端の位置でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的については、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、当該分野で利用可能な任意の方法によって改変されてもよいことが理解されるべきである。このような改変は、本発明のヌクレオチド配列のインビボの活性または寿命を増強するために、行われ得る。
【０１８５】
本発明はまた、本明細書に示される配列に相補的であるヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、フラグメントもしくは誘導体の使用を包含する。この配列が、そのフラグメントに相補的であるならば、その配列は、他の生物体などにおいて類似のコード配列を同定するためのプローブとして用いられ得る。
【０１８６】
本発明の配列に対して１００％相同ではないが本発明の範囲内におさまるポリヌクレオチドは、多数の方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の改変体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、種々の集団由来の個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のホモログ（相同体）を得ることが可能であり、そしてこのようなそのホモログおよびそのフラグメントは、一般に、本明細書に列挙される配列に示される配列に対して選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他の種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の種由来のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすること、そしてこのようなライブラリーを、中度〜高いストリンジェンシーの条件下で添付の配列表における任意の１つの配列の全てまたは一部を含むプローブを用いてプローブすることによって、得ることができる。同様の考慮が、得られた種ホモログおよび本発明のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体にあてはまる。
【０１８７】
改変体および株／種ホモログ（相同体）はまた縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを用いて得られてもよく、このＰＣＲは、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の配列を標的するように設計されたプライマーを用いる。保存された配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログ由来のアミノ酸配列を整列させることによって、予測され得る。配列アラインメントは、当該分野で公知のコンピューターソフトウェアを用いて行われてもよい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広範に用いられる。
【０１８８】
縮重（ｄｅｇｅｎｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲにおいて用いられるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして公知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために用いられる条件よりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。
【０１８９】
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列の部位特異的な突然変異誘発によって得ることができる。このことは、例えば、このポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞についてコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が必要である場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するためには、または、このポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変更するためには、他の配列変化が所望され得る。
【０１９０】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、別の増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性標識もしくは非放射性標識を用いる従来の手段によって顕在化標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）で標識されたプローブを生成するために用いられてもよく、またはこのポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされてもよい。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０もしくは４０ヌクレオチド長であり、そしてまた本明細書において用いられる場合、本発明のポリヌクレオチドという用語によって包含される。
【０１９１】
本発明によるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブは、組換え的に、合成的にまたは当業者に利用可能な任意の方法によって生成されてもよい。それらはまた、標準的な技術によってクローニングされてもよい。
【０１９２】
一般には、プライマーは、合成方法によって生成される。この手段は、ある時点での１ヌクレオチドでの所望の核酸配列の段階的な製造を包含する。自動的な技術を用いてこれを達成するための技術は、当該分野で容易に利用可能である。
【０１９３】
より長いポリヌクレオチドは一般に、組換え方法を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成される。このプライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローニングされ得るように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
【０１９４】
（生物学的に活性）
好ましくは、この改変体配列などは、本明細書に提示される配列と少なくとも同じ程度に生物学的に活性である。
【０１９５】
本明細書において用いる場合、「生物学的に活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」とは、天然に存在する配列の類似の構造的機能（ただし同じ程度である必要はない）、および／または類似の調節機能（ただし、同じ程度である必要はない）、および／または類似の生物学的機能（ただし、同じ程度である必要はない）を有する配列をいう。
【０１９６】
詳細には、改変体配列またはその改変型（修飾型）は、本明細書において同定されたフィターゼのプロフィールに類似の酵素的なプロフィールを有する。このプロフィールとしては、分泌タンパク質であること、ｐＨ２〜５．５、好ましくは４．０〜４．５の範囲でｐＨ最適条件を有すること、ｐＨ範囲２．０〜５．５にまたがって最大活性の少なくとも５０％を保持すること、および／または３００Ｕ／ｍｇを超える比活性を有することなどの特徴が挙げられる。
【０１９７】
（ハイブリダイゼーション）
本発明はまた、本発明の核酸配列に対して相補的である配列、または本発明の配列に対してもしくはそれに対して相補的である配列のいずれかに対してハイブリダイズし得る配列を包含する。
【０１９８】
本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）」という用語は、「核酸の鎖が塩基対を通じて、相補的な鎖と結合するプロセス」、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われるような増幅のプロセスを包含する。
【０１９９】
本発明はまた、本明細書に提示される配列に対して相補的である配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、フラグメントもしくは誘導体の使用を包含する。
【０２００】
「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語はまた、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得る配列に相補的である配列を包含する。
【０２０１】
好ましくは、「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸・Ｎａ３  ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に対して相補的である配列を包含する。
【０２０２】
さらに好ましくは、「改変体」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対して高ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸・Ｎａ３  ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に対して相補的である配列を包含する。
【０２０３】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるヌクレオチド配列の相補的な配列を含む）に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列に関する。
【０２０４】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるヌクレオチド配列の相補的な配列を含む）に対してハイブリダイズし得る配列に対して相補的であるヌクレオチド配列に関する
また、中度から最大のストリンジェンシーの条件下で、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０２０５】
好ましい局面では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ）下で、本発明のヌクレオチド配列、またはその相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。
【０２０６】
さらに好ましい局面では、本発明は、高ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ）下で、本発明のヌクレオチド配列、またはその相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。
【０２０７】
（部位特異的な突然変異誘発）
一旦、酵素コードヌクレオチド配列が単離および／もしくは精製されるか、または推定の酵素コードヌクレオチド配列が同定されれば、本発明の酵素を調製するためにこの配列を変異させることが所望されるかもしれない。
【０２０８】
変異は、合成のオリゴヌクレオチドを用いて導入されてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０２０９】
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａｒａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６〜６４９）に開示される。酵素コードヌクレオチド配列へ変異を導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０、ｐ１４７〜１５１）に記載される。さらなる方法は、ＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９０），８、ｐ４０４〜４０７−「Ｔｈｅ  ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」）に記載される。
【０２１０】
（組換え体）
一局面では、本発明における使用のための配列は、組換え配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されている配列）である。
【０２１１】
これらの組換えＤＮＡ技術は、当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｂｏｏｋｓ１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに説明される。
【０２１２】
（合成）
一局面では、本発明における使用のための配列は、合成配列−すなわち、インビトロの化学的または酵素的な合成によって調製されている配列−である。これには、限定はしないが、宿主生物体−例えば、メチロトローフ酵母ＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａについて最適コドン用法で作製された配列が挙げられる。
【０２１３】
（酵素の発現）
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、組換え複製可能ベクターに組み込まれてもよい。ベクターは、ヌクレオチド配列を酵素の形態で、適合性の宿主細胞においておよび／またはその宿主細胞から、複製および発現するために用いられ得る。
【０２１４】
発現は、制御配列、例えば、調節性配列を用いて制御され得る。
【０２１５】
ヌクレオチド配列の発現により宿主組換え細胞によって生成される酵素は、分泌されてもよいし、または用いられる配列および／もしくはベクターに依存して細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核生物または真核生物の細胞膜を通じて物質コード配列の直接分泌を増強するシグナル配列で設計され得る。
【０２１６】
有利には、本発明の酵素は分泌される。
【０２１７】
（発現ベクター）
「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」、「ベクター系（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）」または「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、インビボまたはインビトロで発現し得る構築物を意味する。本発明の状況では、これらの構築物は、宿主細胞へ酵素をコードする遺伝子を導入するために用いられ得る。適切には、発現が誘導される遺伝子は、「発現可能導入遺伝子（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）」と呼ばれてもよい。
【０２１８】
好ましくは、この発現ベクターは、適切な宿主生物体のゲノムに導入される。「組み込まれた（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」という用語は好ましくは、ゲノムへの適切な組み込みを包含する。
【０２１９】
本発明のヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、ベクターに存在してもよく、このベクターでは、このヌクレオチド配列は、適切な宿主生物体によってヌクレオチド配列の発現を提供し得る制御配列（調節性配列）に対して作動可能に連結される。
【０２２０】
本発明における使用のためのベクターは、本発明のポリペプチドの発現を提供するために、下に記載されるような適切な宿主細胞中に形質転換されてもよい。
【０２２１】
ベクター、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージベクターの選択はしばしば、導入されるべき宿主細胞に依存する。
【０２２２】
本発明における使用のためのベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子−例えば、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラマイシン耐性を付与する遺伝子を含んでもよい。あるいは、選択は、同時形質転換によって達成されてもよい（ＷＯ９１／１７２４３に記載されるとおり）。
【０２２３】
ベクターは、インビトロで、例えば、ＲＮＡの産生のために用いられてもよく、または宿主細胞をトランスフェクト、形質転換、形質導入または感染させるために用いられてもよい。
【０２２４】
従って、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製ベクターへ導入すること、このベクターを適切な宿主細胞へ導入すること、およびベクターの複製をもたらす条件下でこの宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０２２５】
ベクターはさらに、該当の宿主細胞中でベクターを複製させ得るヌクレオチド配列を含んでもよい。このような配列の例は、プラスミドであるｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＪＩ１０１、ｐＴＺ１２およびｐＥＴ１１の複製起点である。
【０２２６】
（制御配列（調節性配列））
いくつかの適用では、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、選り抜きの宿主細胞などによる、ヌクレオチド配列の発現を提供し得る、制御配列（調節性配列）（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して作動可能に連結される。一例として、本発明は、このような制御配列（調節性配列）に対して作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち、発現ベクターであるベクターを包含する。
【０２２７】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、近接であって、記載された成分がその意図される方式で機能することを可能にさせる関係にある近接を意味する。コード配列に対して「作動可能に連結された」制御配列（調節性配列）とは、このコード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方式で連結される。
【０２２８】
「制御配列、調節性配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」という用語は、プロモーター、およびエンハンサー、および他の発現調節シグナルを包含する。
【０２２９】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）」という用語は、当該分野の正常な意味で用いられる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０２３０】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の増強された発現はまた、異種の調節性領域、例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター領域の選択によって達成され得る。
【０２３１】
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともあるプロモーターに対して作動可能に連結される。
【０２３２】
細菌、真菌または酵母宿主におけるヌクレオチド配列の転写を指向するために適切なプロモーターの例は、当該分野で周知である。
【０２３３】
（構築物）
「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」という用語は、「結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」および「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」などの用語と同義であって、プロモーターに対して直接または間接的に結合された本発明による使用のためのヌクレオチド配列を包含する。
【０２３４】
間接的な結合の例は、本発明のプロモーターおよびヌクレオチド配列を仲介する、適切なスペーサー基、例えば、イントロン配列、例えば、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンの供給である。同じことは、直接または間接的な結合を含む、本発明に関する「融合された（ｆｕｓｅｄ）」という用語にあてはまる。ある場合には、この用語は、野性型遺伝子プロモーターと通常会合している、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらが両方ともその天然の環境にある場合、包含しない。
【０２３５】
この構築物は、その遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含んでもよいし、発現してもよい。
【０２３６】
いくつかの適用については、好ましくは本発明の構築物は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の少なくともヌクレオチド配列を含む。
【０２３７】
（宿主細胞）
「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」という用語は、本発明に関しては、上記のようなヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞であって、本明細書に規定されるような特定の特性を有する酵素の組換え産生において、または本発明の方法において用いられる任意の細胞を包含する。
【０２３８】
従って、本発明のさらなる実施形態は、本発明に記載される酵素を発現するヌクレオチド配列で形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。この細胞は、このベクターと適合するように選択され、そして例えば、原核生物（例えば、細菌）、真菌、酵母または植物細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞ではない。
【０２３９】
適切な細菌宿主生物体の例は、グラム陽性またはグラム陰性の細菌種である。
【０２４０】
好ましい実施形態では、宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。なぜなら、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  Ｐ１−２９フィターゼはＥ．ｃｏｌｉで効率的に分泌されることが観察されているからである。改変体を含むフィターゼ酵素は、以下の発現宿主のうちの１つ以上における異種発現後に特徴付けられた：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。従って、これらの宿主も好ましい。
【０２４１】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質および／または発現されたタンパク質のさらなる処理についての望ましさに依存して、真核生物宿主、例えば、酵母または他の真菌が好ましいかもしれない。一般には、酵母細胞は、真菌細胞よりも好ましい。なぜなら、酵母細胞は、操作することがより容易であるからである。しかし、いくつかのタンパク質は、酵母細胞からはあまり分泌されないか、またはある場合には、適切にはプロセシングされない（例えば、酵母では高グリコシル化）。これらの場合には、異なる真菌宿主生物体が選択されなければならない。
【０２４２】
適切な宿主細胞（例えば、酵母、真菌および植物宿主細胞）の使用によって、翻訳後改変（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を、本発明の組換え発現産物に対して最適の生物学的活性を付与するために必要であり得る場合、提供してもよい。
【０２４３】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損であっても、またはプロテアーゼマイナス株であってもよい。
【０２４４】
宿主細胞の遺伝子型は、発現を改善するために改変され得る。
【０２４５】
宿主細胞改変の例としては、プロテアーゼ欠損、まれなｔＲＮＡの補充、およびジスルフィド結合形成を増強するための細胞質における還元電位の改変が挙げられる。
【０２４６】
例えば、宿主細胞Ｅ．ｃｏｌｉは、まれなｔＲＮＡを過剰発現して、Ｋａｎｅに例示／記載されたように（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５），６，４９４〜５００「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｎ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ」）、異種タンパク質の発現を改善し得る。宿主細胞は、多数の還元酵素が欠失されてもよく、これによって、Ｂｅｓｓｅｔｔｅに例示／記載されたように（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９９），９６，１３７０３〜１３７０８「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」）適切なジスルフィド結合の形成を支持する。
【０２４７】
一実施形態では、本発明の状況における宿主細胞としては、動物飼料に直接添加され得る細胞が挙げられる。
【０２４８】
（生物体）
「生物体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、本発明に関しては、本発明に記載されるような酵素をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られる産物、および／または本発明によるヌクレオチド配列の発現をこの生物体に存在する場合に可能にし得るプロモーターを含む、任意の生物体を包含する。
【０２４９】
適切な生物体としては、原核生物、真菌、酵母または植物を挙げることができる。
【０２５０】
「トランスジェニック生物体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、本発明に関しては、本発明に記載されるような酵素をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られる産物、および／または本発明によるヌクレオチド配列の発現をこの生物体内で可能にし得るプロモーターを含む任意の生物体を包含する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、この生物体のゲノムに組み込まれる。
【０２５１】
「トランスジェニック生物体」という用語は、それらの天然の環境において天然のヌクレオチドコード配列を、これもその天然の環境にあるそれらの天然のプロモーターの制御下である場合は、包含しない。
【０２５２】
従って、本発明のトランスジェニック生物体は、本発明に記載される酵素をコードするヌクレオチド配列、本発明による構築物、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、またはそれらの生成物のうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む生物体を包含する。
【０２５３】
例えば、トランスジェニック生物体はまた、異種プロモーターの制御下で本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０２５４】
（宿主細胞／生物体の形質転換）
以前に示されるとおり、宿主生物体は、原核生物または真核生物生物体であってもよい。適切な原核生物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。
【０２５５】
原核生物宿主の形質転換に対する教示は、当該分野でよく実証されている、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。他の適切な方法は、本明細書における実施例に示される。原核生物宿主を用いるならば、ヌクレオチド配列は、イントロンの除去などによって、形質転換の前に適切に改変される必要があるかもしれない。
【０２５６】
糸状の真菌細胞は、当該分野で公知の種々の方法、例えば、プロロプラスト形成およびプロトプラストの形質転換に続く、公知の方式における細胞壁の再生を含むプロセスを用いて形質転換され得る。宿主微生物としてのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの使用は、欧州特許０２３８０２３に記載される。
【０２５７】
別の宿主生物体は植物であり得る。植物を形質転換するために用いられる一般的技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５〜２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏｎ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７〜２７）による文献に見出され得る。植物の形質転換に対するさらなる技術は、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出され得る。
【０２５８】
真菌、酵母および植物の形質転換に対する一般的な技術は、以下の節に示される。
【０２５９】
（形質転換された真菌）
宿主生物体は、真菌、例えば、糸状の真菌であってもよい。適切なこのような宿主の例としては、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、パンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの属に属する任意のメンバーが挙げられる。
【０２６０】
糸状の真菌の形質転換に対する教示は、米国特許第５７４１６６５号に概説されており、これは、糸状真菌の形質転換および真菌の培養についての標準的な技術が当該分野で周知であるということを述べている。Ｎ．Ｃｒａｓｓａに適用されるような技術の広範な概説は、例えば、Ｄａｖｉｓおよびｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９〜１４３に見出される。
【０２６１】
糸状の真菌を形質転換するさらなる教示は、米国特許第５６７４７０７号に概説される。
【０２６２】
一局面では、宿主生物体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒであってもよい。
【０２６３】
本発明によるトランスジェニックのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓはまた、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  Ｊ．Ｒ．（編者）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  ２９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９９４．ｐｐ．６４１〜６６６）の教示に従って調製されてもよい。
【０２６４】
糸状真菌における遺伝子発現は、Ｐｕｎｔら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ｍａｙ；２０（５）：２００〜６，Ａｒｃｈｅｒ  ＆  Ｐｅｂｅｒｄｙ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１７（４）：２７３〜３０６に概説されている。
【０２６５】
（形質転換された酵母）
別の実施形態では、トランスジェニックの生物体は酵母であってもよい。
【０２６６】
酵母における異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９５），４９：３４１〜５４、およびＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）Ｏｃｔ；８（５）５５４〜６０に提供される。
【０２６７】
これに関して、酵母、例えば、種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（２０００
２４（１）：４５〜６６を参照のこと）が、異種遺伝子発現のビヒクルとして用いられ得る。
【０２６８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の原理の概説は、Ｅ  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ  Ｋｅｎｎｙ（１９９３，「Ｙｅａｓｔ  ａｓ  ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ」、Ｙｅａｓｔｓ，第５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｈ  ＲｏｓｅおよびＪ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）によって与えられる。
【０２６９】
酵母の形質転換については、いくつかの形質転換のプロトコールが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｈｉｎｎｅｎらの教示（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ  Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈら（１９８３，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３，１６３〜１６８）に従って調製されてもよい。
【０２７０】
この形質転換された酵母細胞は、種々の選択性マーカー、例えば、栄養要求性のマーカー優性な抗生物質耐性マーカーを用いて選択されてもよい。
【０２７１】
（形質転換された植物／植物細胞）
本発明に適切な宿主生物体は植物であってもよい。一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５〜２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７〜２７）による文献に見出され得る。
【０２７２】
（培養および生成）
本発明のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされた酵素の産生をもたらし、そして細胞および／または培養培地からの酵素の回収を容易にする条件下で培養され得る。
【０２７３】
細胞を培養するために用いられる培地は、該当の宿主細胞を増殖すること、およびこの酵素の発現を得ることのために適切な任意の従来の培地であってもよい。
【０２７４】
組換え細胞によって生成されるタンパク質は、細胞の表面上に提示され得る。
【０２７５】
この酵素は、宿主細胞から分泌されてもよく、そして周知の手順を用いて培養培地から都合よく回収されてもよい。
【０２７６】
（分泌）
発現宿主から培養培地へ酵素が分泌されて、それから酵素がより容易に回収され得ることが所望され得る。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択され得る。ハイブリッドシグナル配列も、本発明の状況で用いられてもよい。
【０２７７】
異種分泌リーダー配列の代表的な例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−両方とも、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の１８および２４アミノ酸のバージョン）、α因子遺伝子（酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）またはαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来する配列である。
【０２７８】
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質の分泌は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：１３２〜４３に概説される。
【０２７９】
（検出）
アミノ酸配列の発現を検出および測定するための種々のプロトコールは当該分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０２８０】
広範な種々の標識および結合技術が、当業者に公知であり、そして種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて用いられ得る。
【０２８１】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のような多数の会社が、これらの手順のための市販のキットおよびプロトコールを供給している。
【０２８２】
適切なレポーター分子または標識としては、それらの放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色素生産剤、ならびに基質、補因子、インヒビター、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９９３９，３５０号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，２７７，４３７号；米国特許第４，２７５，１４９号および米国特許第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０２８３】
また、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に示されるように生成されてもよい。
【０２８４】
フィターゼ活性を検出するための他の適切なアッセイは、当該分野で公知であり、かつ本明細書に例示される。
【０２８５】
（融合タンパク質）
本発明に従う使用のためのアミノ酸配列は、例えば、抽出および精製を補助するための融合タンパク質として生成されてもよい。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）および（β−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。融合タンパク質のパートナーと目的のタンパク質の配列との間にタンパク質分解性の切断部位を含んで、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも好都合であり得る。
【０２８６】
好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を邪魔しない。
【０２８７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子融合発現系は、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５）６（５）：５０１〜６に概説されている。
【０２８８】
本発明の別の実施形態では、アミノ酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、物質の活性に影響し得る因子のペプチドライブラリーをスクリーニングするためには、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用であり得る。
【０２８９】
（さらなる配列）
本発明による使用のための配列はまた、１つ以上のさらなる目的のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）または目的のヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＮＯＩ）と組み合わせて用いられ得る。
【０２９０】
ＰＯＩの非限定的な例としては以下が挙げられる：キシラナーゼ（Ｘｙｌａｎａｓｅ）、リパーゼ、酸性ホスファターゼおよび／またはその他。これらとしては、例えば、飼料の粘度を調節する酵素が挙げられる。ＮＯＩは、任意のこれらの配列についてのアンチセンス配列であってさえよい。
【０２９１】
ＰＯＩは、例えば、抽出および精製を補助するか、またはインビボのフィチン酸塩代謝を増強する、融合タンパク質であってさえもよい。
【０２９２】
ＰＯＩは、分泌配列に融合されてさえよい。
【０２９３】
他の配列はまた、分泌を容易にするか、または分泌されたＰＯＩの収率を増大させ得る。このような配列は、例えば、英国特許出願９８２１１９８．０に記載のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｃｙｐ  Ｂ遺伝子の生成のようにシャペロンタンパク質をコードしてもよい。
【０２９４】
ＰＯＩをコードするＮＯＩは、限定はしないが、その発現産物のプロセシングおよび／または発現を改変する変更を含む、多数の理由のためにその活性を変更するように操作されてもよい。さらなる例としては、ＮＯＩはまた、特定の宿主細胞において発現を最適化するように改変されてもよい。制限酵素認識部位を導入するために他の配列変化が所望され得る。
【０２９５】
ＰＯＩをコードするＮＯＩはその中に、メチルホスホン酸塩およびホスホロチオエート骨格のような合成または改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
【０２９６】
ＰＯＩをコードするＮＯＩは、細胞内の安定性および半減期を増大するように改変されてもよい。可能性のある改変としては、限定はしないが、その分子の５’および／もしくは３’末端の隣接配列の付加、またはこの分子の骨格内のホスホジエステラーゼ結合以外のホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
【０２９７】
（抗体）
本発明の一局面は、配列番号３のアミノ酸と免疫学的に反応性であるアミノ酸に関する。
【０２９８】
抗体は、標準的な技術によって、例えば、本発明の物質での免疫によって、またはファージディスプレイライブラリーを用いることによって、生成され得る。
【０２９９】
本発明の目的に関しては、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、反対に特定しない限り、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成したフラグメント、ならびにその模倣物を包含する。このようなフラグメントとしては、標的物質についてのその結合活性を保持する抗体全体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および他の合成タンパク質であって、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質が挙げられる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、ヒト化抗体であってもよい。中和抗体、すなわち、物質としてのポリペプチドの生物学的活性を阻害する抗体が、特に診断および治療のために好ましい。
【０３００】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、本発明の配列（またはその免疫学的なエピトープを含む配列）で免疫される。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大してもよい。
【０３０１】
免疫された動物由来の血清を収集して、公知の手順に従って処理する。本発明の配列（またはその免疫学的エピトープを含む配列）に対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合、このポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生および処理するための技術は当該分野で公知である。このような抗体が作製され得るためには、本発明はまた、動物またはヒトにおける免疫原としての使用のために、本発明のポリペプチドまたは別のポリペプチドに対してハプテン化されたそのフラグメントを提供する。
【０３０２】
本発明の配列に関するモノクローナル抗体（またはその免疫学的なエピトープを含む配列）はまた、当業者によって容易に生成され得、これには限定はしないが、ハイブリドーマ技術（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  １９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ８０：２０２６〜２０３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒｉｃｋｍａｎ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，ｐｐ７７〜９６）が挙げられる。
【０３０３】
さらに、ヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングによって、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るという、「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」の産生のために開発された技術が用いられてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４）。
【０３０４】
あるいは、単鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７９号）が、物質特異的な単鎖抗体を生成するために適合されてもよい。
【０３０５】
この物質に特定の結合部位を含む抗体フラグメントも生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、限定はしないが、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元させることによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするように構築されてもよい（Ｈｕｓｅ  ＷＤら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５〜１２８１）。
【０３０６】
（大規模適用）
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のフィターゼをコードするアミノ酸配列または本発明の方法を大規模な適用のために用いる。詳細には、本発明の方法は、食料または飼料の組成物への添加物／補充物としての産業上の用途のためのフィターゼの大規模生成に用いられ得る。
【０３０７】
好ましくは、このアミノ酸配列は、宿主生物体の培養後、総細胞培養容積１リットルあたり５ｇ〜約１０ｇの量で生成される。
【０３０８】
好ましくは、このアミノ酸配列は、宿主生物体の培養後、総細胞培養容積１リットルあたり１００ｍｇ〜約９０ｍｇの量で生成される。
【０３０９】
好ましくは、このアミノ酸配列は、宿主生物体の培養後、総細胞培養容積１リットルあたり２５０ｍｇ〜約５００ｍｇの量で生成される。
【０３１０】
（フィターゼの使用）
上記で述べるとおり、本発明はまた、本明細書に記載のようなフィターゼの生成に関する。
【０３１１】
詳細には、本発明はまた、有機および無機のリン酸化合物の生成において本明細書に開示されるようなアミノ酸配列の使用に関する。
【０３１２】
従って、本発明はさらに、フィターゼの発現のための発現ベクターまたは発現系を生成するのにおける、フィターゼをコードするヌクレオチド配列の使用に関する。
【０３１３】
さらに、本発明はフィターゼを発現する宿主細胞の生成におけるこのような発現ベクターまたは発現系の使用に関する。
【０３１４】
本発明はさらに、有機および無機のリン酸化合物の前駆体の生成における、または特定の有機リン酸塩化合物の生成における、改変宿主細胞の使用に関する。
【０３１５】
適切な有機および無機のリン酸塩化合物としては、ミオ−イノシトール五リン酸塩、四リン酸塩、三リン酸塩、二リン酸塩および一リン酸塩が挙げられる。
【０３１６】
従って、適切には、本発明は、有機リン酸化合物を生成する方法を提供し、この方法は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．由来のフィターゼを用いてフィチン酸塩を処理する工程を包含する。好ましくは、この方法は、酵素が配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列またはその有効なフラグメント、または改変型を含むという点で特徴付けられる。適切には、有機リン酸塩は、ｍｙｏ−イノシトール二リン酸、三リン酸、四リン酸および五リン酸のフィチン酸塩または全ての可能な立体異性体である。他の適切な有機リン酸塩としては、イノシトール−四リン酸塩およびイノシトールオリゴリン酸塩が挙げられる。好ましい実施形態では、この方法はインビボのバイオテクノロジープロセスである。
【０３１７】
有機リン酸化合物を生成するためのこのような方法は適切には以下の工程を包含し得る：
ａ）Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼを含む発現可能な導入遺伝子を含む宿主細胞を提供する工程と；
ｂ）導入遺伝子の発現のために適切な条件下でトランスジェニック生物体を培養する工程と；
ｃ）培養物から有機リン酸化合物を回収する工程と；
この化合物は、フィターゼの特徴付けのためのアッセイを含む多数の適用のために用いられ得る。いくつかのイノシトールリン酸塩は、細胞内の調節におけるシグナル分子として含まれており、研究の化合物として用いられ得る。
【０３１８】
別の局面では、食品または動物の飼料の産生のための方法が提供される。動物飼料は代表的には、飼料粉砕機において生成され、ここでは原料が最初に適切な粒子サイズに挽かれ、ついで適切な添加物と混合される。次いでこの飼料は、マッシュまたはペレットとして生成されてもよい；後者は代表的には、温度が標的レベルまで上昇され、次いで飼料が金型を通過されて特定のサイズのペレットが生じる方法を包含する。引き続き、液体添加物、例えば、脂肪および酵素を添加してもよい。このペレットは輸送の前に冷却される。動物飼料の生成はまた、ペレット化の前に押し出し成形または膨張を含むさらなる工程を包含してもよい。
【０３１９】
従って、本発明はさらに、食物または飼料生成物の製造における使用のためのフィターゼを生成するための、フィターゼをコードするアミノ酸配列またはフィターゼを発現する宿主細胞の使用を提供する。一局面では、食物または飼料生成物の製造における本明細書に記載のようなアミノ酸配列の使用が提供される。別の局面では、食物または飼料生成物の製造における本発明に従う、宿主細胞の使用が提供される。別の局面では、食物または飼料生成物の製造における本発明に従う発現ベクターまたは発現システムの使用が提供される。
【０３２０】
本発明はまた、動物に対して送達するための他の成分と組み合わせた飼料の成分として酵素を用いる工程を包含する。
【０３２１】
（他の成分との組み合わせ）
本発明の酵素は、他の成分またはキャリアと組み合わせて用いられてもよい。
【０３２２】
飼料酵素のために適切なキャリアとしては、コムギ（荒挽き）が挙げられる。さらに、植物ゴムなどを添加している、脂肪／ワックス被膜に基づくカプセル化技術を含む、多数のカプセル化技術がある。
【０３２３】
他の成分の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤（ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、甘味料（人工甘味料を含む）、流動性調整剤（ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、安定剤、抗酸化剤、色素、酵素、キャリア、ビヒクル、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、香味料、着色物、懸濁剤、崩壊剤、顆粒結合剤など。これらの他の成分は天然であってもよい。これらの他の成分は、化学的および／または酵素的な技術の使用によって調製され得る。
【０３２４】
本明細書において用いる場合、「増粘剤またはゲル化剤（ｔｈｉｃｋｎｅｒ  ｏｒ  ｇｅｌｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」という用語は本明細書において、粒子、不混和性の液体の液滴、空気または不溶性の固体の移動を遅らせるかまたは防止することによって分離を妨げる生成物をいう。
【０３２５】
本明細書において用いる場合、「安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｓｅｒ）」とは、経時的な変化から生成物（例えば、食品）を保持する成分または成分の組み合わせとして規定される。
【０３２６】
本明細書において用いる場合、「乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）」という用語は、エマルジョンの分離を妨げる成分（例えば、食物成分）をいう。
【０３２７】
本明細書において用いる場合、「結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）」という用語は、物理的または化学的な反応を通じて生成物を一緒に結合させる成分（例えば、食品成分）をいう。
【０３２８】
本明細書において用いる場合、「結晶調節剤（ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）」という用語は、脂肪または水の結晶化に影響する成分（例えば、食品成分）をいう。
【０３２９】
「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒｓ）」または「ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）」とは、化合物投与のために適切な物質を意味し、そして、非毒性であり、かつ有害な様式でその組成物の任意の成分と相互作用しない、当該分野で公知の任意のこのような物質、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などが挙げられる。
【０３３０】
栄養的に受容可能なキャリアの例としては、例えば、穀物、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油などが挙げられる。
【０３３１】
賦形剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：微結晶性セルロースおよび他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖および高分子量ポリエチレングリコール。
【０３３２】
崩壊剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：デンプン（好ましくは、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはタピオカデンプン）、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複雑なケイ酸塩。
【０３３３】
顆粒結合剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチンおよびアカシア。
【０３３４】
潤滑剤の例としては以下の１つ以上が挙げられる：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリル・ベヘネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈｅｎａｔｅ）および滑石。
【０３３５】
希釈剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、およびそれらの組み合わせ。
【０３３６】
他の成分は、同時に用いられても（例えば、それらが一緒に混合される場合、またはそれらが異なる経路によって送達される場合でさえ）、または連続して用いられてもよい（例えば、それらは、種々の経路によって送達され得る）。
【０３３７】
本明細書において用いる場合、「動物またはヒトの消費に適切な成分」という用語は、栄養面での恩恵であり得る、補充物としての本発明の組成物であるか、またはそれに添加され得る化合物、線維代用物、または消費者に一般に有益な効果を有する化合物を意味する。
【０３３８】
一例として、この成分は、プレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、例えば、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ラクトスクロース、ダイズオリゴ糖、パラチノーゼ、イソマルト−オリゴ糖、グルコ−オリゴ糖およびキシロ−オリゴ糖であってもよい。
【０３３９】
（食物または飼料物質）
この化合物は、食品または飼料物質として、またはその調製において用いられ得る。ここで、「食物（ｆｏｏｄ）」という用語は、広義に用いられ、そしてヒトのための食物および食品を、そして動物用の食品（すなわち、飼料）を包含する。「飼料（ｆｅｅｄ）」という用語を用いて、家畜の飼育において動物に給餌される生成物をいう。好ましい局面ではこの食物または飼料は、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物による消費のためである。
【０３４０】
この食物または飼料は、適用の用途および／もしくは方式、ならびに／または投与の様式に依存して、溶液の形態で用いられても、または固体として用いられてもよい。
【０３４１】
（食物および飼料成分および補充物）
この化合物は、食物または飼料成分として用いられ得る。
【０３４２】
本明細書において用いる場合、「食物または飼料成分（ｆｏｏｄ  ｏｒ  ｆｅｅｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、処方物を含み、これは、食物または食料品であってもそれに添加されてもよく、そして広範な種々の生成物に低レベルで用いられ得る処方物を含む。
【０３４３】
食品成分は、適用の用途および／または様式、ならびに投与の方式次第で、溶液の形態であってもまたは固体であってもよい。
【０３４４】
この化合物は、食物補充物であっても、または食物補充物に添加されてもよい。
【０３４５】
（食物および飼料組成物）
単胃動物のための飼料組成物は代表的には、フィチン酸塩を含む植物生成物を含む組成物を含む。このような組成物としては、コーンミール、ダイズミール、菜種かす、綿実粕、トウモロコシ、コムギ、オオムギおよびソルガムベースの飼料が挙げられる。
【０３４６】
本明細書に記載されるフィターゼは、食物または飼料物および組成物であっても、またはそれに添加されてもよい。
【０３４７】
本発明はまた、食物または飼料成分または補充物を調製する方法を提供し、この方法は、本発明のプロセスによって生成されるフィターゼまたは本発明に従う組成物と別の食物成分とを混合させる工程を包含する。調製方法または食物成分はまた、本発明の別の局面である。動物飼料を調製するための方法は、上記されている。この酵素は、固体処方物の形態で添加されてもよいし、または事前混合物のような飼料添加物として添加されてもよい。固体型は代表的には、混合工程の前または間に添加される；そして液体型は代表的には、ペレット化工程の後に添加される。
【０３４８】
（薬剤）
本発明のフィターゼはまた、いくつかの薬学的な効果を得るために、薬学的調製物においてまたは食品への組み合わせのために用いられ得る。例えば、欧州特許第１，３８９，９１５号は、ヒトの食品または飲料のカルシウム、鉄および／または亜鉛のアベイラビリティーを増大するための食物または飲料におけるフィターゼの使用を記載している。
【０３４９】
さらに、欧州特許第１，３９２，３５３号は、生体元素、例えば、カルシウムおよび鉄のバイオアベイラビリティを増大させるため、ならびに欠乏性の疾患と戦うために有用である、フィターゼを含む医薬または栄養補充物を記載している。
【０３５０】
ここでは、「薬剤の（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」という用語は、広義の意味で用いられる−そして、ヒトの薬剤および／または栄養補助剤、ならびに動物のための薬剤および／または栄養補助剤（すなわち、獣医の適用）を包含する。好ましい局面では、薬剤はヒトの使用のため、および／または畜産業のためである。
【０３５１】
薬剤は、治療目的のためであってもよく、これは実際には、治療的であっても、または緩和（対症）的であっても、または予防的であってもよい。薬剤は、診断目的であってさえよい。
【０３５２】
薬剤として、または薬剤の調製において用いる場合、本発明の生成物および／または化合物は、以下の１つ以上と組み合わせて用いられ得る：薬学的に受容可能なキャリア、薬学的に受容可能な希釈剤、薬学的に受容可能な賦形剤、薬学的に受容可能なアジュバント、薬学的に活性な成分。
【０３５３】
薬剤は、適用の用途および／もしくは方式、ならびに／または投与の様式に依存して、溶液の形態であっても、または固体であってもよい。
【０３５４】
（薬学的な成分）
本発明の生成物および／または化合物は、薬学的成分として用いられ得る。ここで本発明の生成物および／または組成物は、単独の活性成分であってもよいし、または活性成分の少なくとも１つのメンバー（すなわち、２つ以上）であってもよい。
【０３５５】
薬学的な成分は、適用の用途および／もしくは方式、ならびに／または投与の方式に依存して、溶液の形態であっても、または固体であってもよい。
【０３５６】
薬学的な成分は、薬剤の溶解特性を改善するために発泡性生成物の形態であってもよい。
【０３５７】
（形態）
本発明の生成物および／または化合物は、単独の場合であろうと、組成物中に存在する場合であろうと、任意の適切な形態で用いられ得る。同様に、本発明に従って生成されたフィターゼ（すなわち、成分−例えば、食物成分、機能的食品成分、または薬学的な成分）は、任意の適切な形態で用いられてもよい。
【０３５８】
形態の適切な例としては、即時放出、遅延放出、改変放出、持続放出、パルス放出または制御放出の適用のための、以下：錠剤、丸剤、カプセル、坐薬（ｏｖｕｌｅｓ）、溶液または懸濁液の１つ以上が挙げられ、これは、香味料または着色剤を含んでもよい。
【０３５９】
一例として、生成物および／または組成物が、機能的な成分としての使用のためなどの錠剤型で用いられる場合、この錠剤は、以下：賦形剤、崩壊剤、顆粒結合剤または潤滑剤のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０３６０】
この形態を調製するのにおける使用のための栄養的に受容可能なキャリアの例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコン、ワックス、ワセリンなどが挙げられる。
【０３６１】
この形態のための好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３６２】
水性の懸濁液および／またはエリキシルについては、カロチノイド切断化合物を、種々の甘味料または香味量、着色料または色素と、乳化剤および／または懸濁剤と、そして希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにそれらの組み合わせと合わせてもよい。
【０３６３】
この形態はまた、ゼラチンカプセル；ファイバーカプセル、ファイバー錠剤などを含んでもよい。
【０３６４】
（一般的な組換えＤＮＡ方法の技術）
本発明は、他に示さない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、この文献に例示される。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｂｏｏｋｓ１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５）および定期補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９、１３および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々が本明細書において参照によって援用される。
【実施例】
【０３６５】
本発明はここで、以下の非限定的な実施例においてさらに例示される。
【０３６６】
（実施例１．フィターゼ活性アッセイ）
マイクロ−リットル（ｍｉｃｒｏ−ｌ）＝マイクロリットル
フィターゼアッセイは、マイクロタイタープレートで行った。反応混合物（１００μｌ）は以下を含んだ：２ｍＭのフィチン酸塩および０．８ｍＭのＣａＣｌ２が含有される２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５。この反応は、３７℃で１時間進行させて、その後に、放出されたリン酸塩を公知の手順の改良型によって測定した（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ  Ｊ．Ｋ．，Ｌａｈｔｉ  Ｒ．Ｊ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３（２），３１３〜３１７（１９８１））。要するに、２００マイクロリットルの新鮮に調製したＡＭＭ溶液（７．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、１５ｍＭのモリブデン酸アンモニウムおよびアセトン  −  １：１：２）を、各々のマイクロタイタープレートウェル中で１００マイクロリットルの反応混合物に添加した。３９０ｎｍでの吸光度は、ＡＭＭ試薬の添加後、１０分より後でかつ３０分より前に測定した。リン酸塩の量は、濃度が既知のリン酸塩溶液を用いて検量線を作製することによって決定した。異なるｐＨ値でフィターゼ活性を評価するためには、以下の緩衝液（全てが２００ｍＭ）を用いた：グリシン／ＨＣｌｐＨ２．０〜３．０、酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ３．５〜５．５、Ｔｒｉｓ／マレイン酸ｐＨ６．０〜７．５。
【０３６７】
（実施例２．フィターゼ産生株Ｐ１−２９）
細菌株Ｐ１−２９はもともと、フィンランド南部の森林において水溜りの底から採集された腐敗している植物の塊から単離された。この株は多くの単純な培養培地、例えばＬＢ（１％ペプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）または低リン酸塩培地ＰＰ１（１％ペプトン、１％ウシ抽出物、０．５％、酵母抽出物、ＣａＣｌ２−０．２Ｍ）上において、３０℃で好気的に培養され得る。この培地は、ＮａＯＨを用いてｐＨを約１１に調製して、１０分間煮沸することによって調製する。この沈殿物を、濾過によって除去し、ｐＨを、５．５に再調節して、その培地は１２１℃で１５分間のオートクレーブによって滅菌する。
【０３６８】
液体ＰＰ１培地中での増殖後、その株は、ｐＨ３．５および５．５の両方でフィターゼ活性を示すことが見出された（実施例１に記載のようにアッセイした）。３．５および５．５での活性の比は約１．３であった。その活性はまた、Ｐ３−４２の細胞および細胞上清中で別々に測定した。これらの測定によれば、全てのフィターゼ活性のうちほとんどが細胞に結合しており、培養培地の上清中では１０〜２０％の活性を有した。
【０３６９】
この株は、受託番号４１２４８としてＮＣＩＭＢに寄託された。
【０３７０】
（実施例３．株Ｐ１−２９からの染色体ＤＮＡの単離）
染色体ＤＮＡは本質的に、標準的な手順によって調製した（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。ＬＢ培地中において３０℃で一晩増殖した２５０ｍｌの培養物を、１０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離して、２０ｍｌの５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８中で洗浄し、そして１０ｍｌの冷ＴＥＳ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％グルコースｐＨ８）中に再懸濁した。リゾチームを１０ｍｇ／ｍｌに添加して、その細胞懸濁液を、溶解が生じるまで３７℃で３０〜６０分間インキュベートして、１００μｌの反応混合物の１ｍｌの０．１％ＳＤＳへの希釈および「ネバネバの（ｓｌｉｍｙ）」流動性についてチェックすることによって確認した。この時点で、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を、それぞれ１％および０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。この反応混合物を、５６℃で３０分間インキュベートし、続いて２ｍＭの５Ｍ  ＮａＣｌの添加および１．４ｍｌの１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ）の添加を行った。このインキュベーションは、６５℃で１５分間継続した。その溶液をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を用いて１回、フェノール／クロロホルムを用いて１回抽出した。抽出後、その水相を０．６容積のイソプロパノールと混合して、ＤＮＡ沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）によって収集し、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥して、２ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、５μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅに再懸濁した。
【０３７１】
（実施例４．細菌株Ｐ１−２９の分類学的同定）
株Ｐ１−２９の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のフラグメントを、プライマー；５３６ｆ（ＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＷＣ）および１３９２ｒ（ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ）（Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｊ．Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，Ｓｔａｃｋｂｒａｎｄｔ，Ｅ、およびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ１１５〜１１７（１９９１））を用いて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。以下のプログラムを用いた：１）９５℃５分の初回ＤＮＡ変性工程；２）９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分の３０サイクル；３）７０℃の最終伸長工程１０分間。約９００塩基対のサイズのＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル中における電気泳動によって精製し、製造業者の指示に従ってＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから抽出した。精製されたＰＣＲ生成物は、Ｍｅｄｐｒｏｂｅ（Ｎｏｒｗａｙ）によって商業的に配列決定した。この配列決定された領域を配列番号１に列挙する。この配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）におけるＤＮＡ配列と比較した。最高のマッチング（６９１ヌクレオチドのうち６８８〜６８９、９９．６〜９９．７％）が、Ｂ．ｉｚａｒｄｉｉ  ＤＳＭ９３９７、Ｂ．ｇａｖｉｎｉａｅ  ＤＳＭ  ９３９３およびＢ．ｎｏａｃｋｉａｅＡＴＣＣ５１６０ＴのようないくつかのＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ株由来の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の配列と見出された。従って、株Ｐ１−２９は分類学的に、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．として分類され得る。
【０３７２】
（実施例５．Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９由来のフィターゼ遺伝子のクローニング）
Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９由来の染色体ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで部分的に消化して、その消化物を１％のアガロースゲル上で分画した。３〜５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから単離して、ＢａｍＨＩ消化した脱リン酸化λ―ＺＡＰアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と連結させた。ライブラリー構築のための引き続く工程は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ／Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔの指示に従った。ライブラリーのファージ型は、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって記載されたとおりの「マス切除（ｍａｓｓ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）」手順によってプラスミド型に変換された。プラスミドライブラリーのスクリーニングは、ペトリプレートでのフィターゼ活性の検出のための初期の公開された方法と類似の方法によって行った（ＨｏｗｓｏｎおよびＤａｖｉｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５，３７７〜３８２（１９８３）；Ｃｈｅｎ  Ｊ．Ｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（１０）７５１〜７６１（１９９８）；Ｒｉｃｃｉｏ  Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８２，１７７〜１８５（１９９７））。いくつかのフィターゼ陽性クローンを単離して、サブクローニングによって精製した。これらの単離物は、液体培養物（ＬＢ培地で３０℃かつ２００ｒｐｍで約２４時間）中で増殖させて、そしてフィターゼ活性を、得られた細胞懸濁液中で測定した（実施例１）。最高のフィターゼ活性を有した１つのクローン（約１．２Ｕ／ｍｌ、ｐＨ３．５）を引き続く特徴づけのために選択した。プラスミドＤＮＡは、ｐＢＫ（Ｐ１−２９）と命名されたこのクローンから単離して、挿入ＤＮＡの部分的ＤＮＡ配列決定によって特徴付けた（配列決定サービスは、Ｍｅｄｐｒｏｂｅ（Ｎｏｒｗａｙ）から得た）。フィターゼ遺伝子を含むこの配列は、配列番号２として列挙する。Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ｐ１−２９のフィターゼの、この推定配列は、配列番号３として列挙される。ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）によって提供されるＢＬＡＳＴサービスを用いるＧｅｎＢａｎｋにおける配列との配列番号３の比較によって、Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｔｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ９０４１９）由来のフィターゼは、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９のフィターゼの最も近い公知のホモログとして同定される。しかし、相同性レベルは低く、両方のタンパク質で同一であるのはアミノ酸残基のほぼ７４％しかない。
【０３７３】
（実施例６．Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９由来のフィターゼ遺伝子の増幅および発現）
フィターゼ遺伝子は、ＰＣＲによって増幅された。Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のＰ１−２９株の染色体ＤＮＡを、テンプレートとして、そしてオリゴヌクレオチドｏ２９−５（ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＴＣＴＣＴＧＣＧＴＴＴＡＡＣ）およびｏ２９−３（ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡ−ＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧ）をプライマーとして用いた。その増幅は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。以下のプログラムを用いた：１）９４℃で３分間の初回のＤＮＡ変性；２）９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、６８℃で１分、７２℃で１分、７４℃で１分の３５サイクル；３）７２℃で１０分の最終伸長工程。得られたＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル中での電気泳動、その後のＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるゲルからのＤＮＡ抽出によって精製した。この精製されたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化して、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって反応混合物から単離した。ベクタープラスミドｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、エビのアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて脱リン酸して、０．８％アガロースゲル中における電気泳動によって精製した。この直線化したプラスミドＤＮＡのバンドをゲルから切り出して、Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。この２つの精製されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて連結した。この連結反応物を７０％エタノールで沈殿させて、エタノールで洗浄し、そして５０μｌのエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞中に直接再懸濁した。この懸濁物を０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移して、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）セットを用いて、１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで電気泳動させた。電気泳動の直後に、１ｍｌのＬＢ培地を添加して、細胞懸濁液を１５ｍｌのプラスチックチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移して、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上にプレートして、３７℃で一晩インキュベートした。２４個の形質転換体を液体培地中で増殖させて、その培養物を、フィターゼ活性をアッセイすること、およびプラスミドＤＮＡの単離のために用いた。最高のフィターゼ活性を生成し、かつプラスミドＤＮＡの予想される認識パターンを生成する１クローンを選択した。ｐＥＴ１１（Ｐ１−２９）と命名されたこのクローンによって含まれるプラスミドを用いて、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。この形質転換された細胞懸濁物を、２％グルコースを含有するＬＢ中において３７℃で１時間振盪し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびグルコース（２％）を含有する５０ｍｌのＬＢに接種して、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させた。得られた培養物のＯＤは、６００ｎｍで測定して、その培養物を用いて、０．０４のＯＤ６００になるまで１ｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に接種した。増殖は、３０℃で一晩継続した。このような培養物におけるフィターゼ活性は代表的には、８〜１２Ｕ／ｍｌであった。フィターゼ活性のうち約４０％が、培養培地に分泌され、そして残りは細胞に伴ったままであった。これらの観察によって、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９のフィターゼは、その天然の宿主よりもいくらか効率的にＥ．ｃｏｌｉで分泌されることが示される。同じ条件下で増殖されたｐＥＴ１１で形質転換されたコントロールの株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの培養物における活性は０．０５Ｕ／ｍｌ未満であった。
【０３７４】
（実施例７．ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９からの組換えフィターゼの精製）
ｐＥＴ１１（Ｐ１−２９）で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの培養物を遠心分離して、細菌細胞を除去して、ロータリーエバポレーターを用いて約１／１０のもとの容積まで濃縮して、溶液の伝導率が２５０μＳ／ｃｍ未満に低下するまで水に対して透析した。溶液のｐＨは、ｔｒｉｓ塩基を用いて８．０に調節し、そしてこれを、２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｒｏｃｈｅ）のカラム（３×２０ｃｍ）に加えた。そのカラムを、平衡化緩衝液を３ｍｌ／分の流速で３０分間用いて洗浄し、続いて、３つの連続的勾配のＮａＣｌが含有される２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０：０〜５０ｍＭ、５０〜１５０ｍＭおよび１５０〜５００ｍＭを用いて、溶出した。各々の３つの勾配は、３ｍｌ／分の一定流速を用いて１時間プログラムした。９ｍｌの画分を収集して、フィターゼ活性についてアッセイした。活性の１つの強力なピークが検出された。ピーク画分中のタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮して、１２％のゲルおよび標準的なＬａｅｍｍｌｉ緩衝液システムを用いてＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。この分析の結果、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって得られた組換えＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９フィターゼの調製物が単一の突出したタンパク質成分を含むことが示された。ゲルのデジタル画像を走査することに基づく半定量的な分析（図１）によって約６５％という純度が示される。
【０３７５】
（実施例８．ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来の組換え体フィターゼのｐＨプロフィール）
（実施例７に従って精製された）ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９フィターゼの活性のｐＨに対する依存性を、緩衝液中において、そして実施例１に記載の条件下で研究した。この酵素は、広範なｐＨ領域（２〜５．５）で活性であり、ほぼｐＨ４．５で最大、そしてほぼｐＨ３で曲線の強力な「肩部分（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）」を有していた（図２）。
【０３７６】
（実施例９．ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来の組換えフィターゼの基質特異性）
１つのイノシトール残基あたり３、４または５つのリン酸基を含むイノシトールリン酸塩の画分を、真菌フィターゼ（Ｎａｔｕｐｈｏｓ）で処理したフィチン酸の部分的加水分解物からイオン交換クロマトグラフィーによって単離した。これらの調製物の産生および精製は、ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，Ｒｕｓｓｉａ）の商業的サービスであった。種々の程度のリン酸化を有するイノシトール−リン酸塩による各々の画分の混入は、ＨＰＬＣによって５％未満であると判定された（Ｓａｎｄｂｅｒｇ  Ａ．Ｓ．，Ａｈｄｅｒｉｎｎｅ  Ｒ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．５１（３），５４７〜５５０）。市販のフルクトース１，６−二リン酸塩およびフルクトース６−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）を、二および一リン酸塩基質に向かうＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９フィターゼの特異性を評価するために用いたモデル基質として用いた。異なる基質での実施例７によって精製されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａフィターゼの活性を、最終反応混合物中において２ｍＭ濃度の基質を用いて、ｐＨ３．５で標準的なアッセイ（実施例１）によって測定した。この結果（図３）によって、この酵素は、広範な基質特異性を有することが示される。五リン酸塩、四リン酸塩および三リン酸塩でのその活性は基質としてのフィチン酸での活性と本質的に等しいかまたはいくぶん高かった。ほとんどのフィターゼについて基質として劣る１，６−フルクトース二リン酸塩は、Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．のフィターゼ（詳細にはＰ１−２９由来のフィターゼ）によってさらに効率的に加水分解された。フルクトース６−リン酸塩の加水分解も検出可能であったが、試験された他の基質の加水分解よりも効率がかなり劣っていた。
【０３７７】
（実施例１０．ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来の組換えフィターゼの比活性）
ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９のフィターゼの比活性は、実施例７に従って精製された調製物を用いて評価した。フィターゼ活性は、実施例１に従ってｐＨ３．５で測定した。フィターゼ濃度は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて総タンパク質濃度を測定すること、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって評価されるフィターゼ含量（実施例７）によってこれを補正することによって算出した。これらの測定によれば、ＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａのＰ１−２９由来の組換えフィターゼの比活性は３７℃で約３００Ｕ／ｍｇである。
【０３７８】
（実施例１１．フィターゼ改変体の生成および特徴づけ）
フィターゼ改変体は、上記で列挙されるような突然変異誘発方法、例えば、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６〜６４９）に、またはＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）、１８０、ｐ１４７〜１５１）に開示される方法、またはＷＯ９２／１８６４５に記載のエラー限界値突然変異誘発（Ｅｒｒｏｒ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）プロトコールを用いて、ヌクレオチド配列番号２の突然変異誘発によって構築した。変異導入（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）ＰＣＲについての別の適切な方法は、ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３（１９９４），１３６〜１４０）に開示される。
【０３７９】
フィターゼ酵素改変体は、以下の発現宿主の１つ以上における異種発現後に特徴付けられた：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【０３８０】
２位置、３位置、４位置、５位置、６位置、７位置、８位置、９位置、１０位置、１１位置、１２位置を含む、配列番号３由来の１つ以上のアミノ酸位置において異なるフィターゼ改変体が誘導された。必要に応じて、突然変異誘発の反復回を本明細書に記載のように行った。
【０３８１】
（フィターゼ改変体の特徴づけ）
（１．熱安定性）
このような改変体の熱安定性は、酵素の不活性化温度によって特徴付けた。この不活性化温度は、種々の温度での１０分間のインキュベーションおよび引き続く室温への冷却後、フィターゼ酵素の残留活性を測定することによって決定した。この不活性化温度とは、この残留活性が、室温で同じ条件下で同じ期間にわたるインキュベーション後の残留活性に比較して５０％である温度である。必要に応じて、５０％残留活性に相当する温度を決定するために、測定された活性データからの補間および外挿を行う。熱安定性の相違の℃は、２つの酵素の不活性温度をお互いから差引きすることによって計算した。
【０３８２】
表１は、種々の改変体についての熱安定性の相違を列挙する：
表１：配列番号３に示される親のフィターゼ由来の改変体についての熱安定性の相違（ＴＤ）
【０３８３】
【化７】
2011239793.tif 000009
（２．他の特徴）
他の特徴も改善された。
【０３８４】
選択された改変体の熱安定性、比活性およびペプシン安定性を、上記のようなアッセイを用いて比較した。このような改変体のペプシン安定性は、コントロール条件と比較して、ペプシンインキュベーション後、ｐＨ３．５、３７℃で測定した残留活性によって特徴付けられた（残留活性＝ペプシンインキュベーション後の活性／コントロール条件下でのインキュベーション後の活性）。ペプシンインキュベーションは、３７℃で、ｐＨ２．０、０．２５ｍｇ／ｍｌ、ペプシン、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで２時間行った。コントロールの条件はｐＨ５．０で１ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡで３７℃で２時間であった。
【０３８５】
表２は、選択された改変体の特性を示す（配列番号３に従うフィターゼから、そしてフィターゼ重量に比較して）
表２：
配列番号３に示される親のフィターゼ由来の改変体についてのペプシン安定性
【０３８６】
【化８】
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表３：
配列番号３に示される親のフィターゼ由来の改変体についての比活性
【０３８７】
【化９】
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上記の明細書に言及された全ての刊行物、およびこのような刊行物に引用された参考文献は、参照によって本明細書に援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変形は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者に明白である。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連の領域における当業者に明白である、本発明を行うための記載された方式の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内であるものとする。
【０３８８】
【化１０】
2011239793.tif 000012
【０３８９】
【化１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2011239793000001.app
【外国語明細書】
2011239793000001.pdf