(57)【要約】【課題】実際の生体内の状態により近い状態で、リガンドの分析ができるようにする。【解決手段】ステップＳ１０４で、抗体固定化基板の観察領域にリガンド候補混合膜画分を配置した試料基板を作製する。ステップＳ１０５で、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇプロテイン）を試料基板の観察領域に供給し、ＧＰＣＲに結合したＧプロテインの量の時間変化を測定する。この後、ステップＳ１０６で、測定した結果より膜画分におけるＧタンパク質共役受容体に対してリガンドとなるリガンド候補の物質を分析する。【選択図】  図１
2011252888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象の動物細胞を破砕して前記動物細胞の膜画分を分取する第１ステップと、
前記膜画分にリガンド候補の物質を加えたリガンド候補混合膜画分を作製する第２ステップと、
目的のＧタンパク質共役受容体に対する抗体を基板の観察領域に固定して抗体固定化基板を作製する第３ステップと、
前記抗体固定化基板の観察領域に前記リガンド候補混合膜画分を配置した試料基板を作製する第４ステップと、
リガンドと反応している目的の前記Ｇタンパク質共役受容体に結合するＧＴＰ結合タンパク質を前記試料基板の観察領域に供給し、前記Ｇタンパク質共役受容体に結合した前記ＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化を測定する第５ステップと、
測定した結果より膜画分における前記Ｇタンパク質共役受容体に対してリガンドとなる前記リガンド候補の物質を分析する第６ステップと
を少なくとも備えることを特徴とするリガンド分析方法。
【請求項２】
請求項１のリガンド分析方法において、
前記第６ステップでは、前記Ｇタンパク質共役受容体に結合した前記ＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化により、前記Ｇタンパク質共役受容体に対するリガンドの特性を分析する
ことを特徴とするリガンド分析方法。
【請求項３】
請求項１または２記載のリガンド分析方法において、
前記第５ステップでは、前記ＧＴＰ結合タンパク質の供給による前記観察領域における屈折率の変化により、前記Ｇタンパク質共役受容体に結合した前記ＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化を測定する
ことを特徴とするリガンド分析方法。
【請求項４】
請求項３記載のリガンド測定方法において、
前記第５ステップでは、表面プラズモン共鳴測定により、前記観察領域における屈折率の変化を測定することを特徴とするリガンド分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体と作用するリガンドとなるリガンド候補物質を分析するリガンド分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レセプタ（受容体）は、生体内の調節に関わる重要なタンパク質であり、現在、市場に出回る薬剤の約半数は、レセプタを作用対象としている。このようなレセプタを作用対象とする新薬開発や種々の疾患原因の追究のためは、レセプタに特異的に作用する物質であるリガンドの分析が重要となる。このリガンドの分析では、一般には、候補物質とレセプタとの作用の有無を確認（検出）することが行われている。このため、リガンドの候補となる多くの物質の分析を行うためには、多くのレセプタが必要となる。レセプタを大量に採取できる方法としては、細胞に遺伝子を導入し、レセプタを強制的に発現する手法が一般的となっている。
【０００３】
また、レセプタに対するリガンドの作用の状態の観測は、まず、レセプタを発現する遺伝子にカルシウムイオンに対する蛍光応答に対応する遺伝子を付帯させ、これらを所定の細胞内に導入する。このように作製した観察用細胞において、レセプタのリガンドとの結合により蛍光発光が得られるので、この発光を観測することで分析が行える。ただし、リガンドとレセプタとの結合反応から蛍光発光までには、数段階の細胞内反応が関与するため、これらの反応が正確に発現されるような観察用の細胞を作製するためには、高度が技術が必要とされる。
【０００４】
上述した細胞内での反応の観察に対し、レセプタとリガンドの結合をより直接的に分析するために、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）結合タンパク質（Ｇプロテイン）類の吸着と置換反応を利用した分析手法がある。Ｇプロテインは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合して働く物質であるが、ＧＰＣＲにリガンドが結合するとレセプタの構造変化が起こり、Ｇプロテイン類の吸着定数も変化する。この吸着定数の変化によるＧプロテイン類の吸着に関連したグアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸の交換反応を利用し、ＧＰＣＲのリガンド結合の定性・定量が行われている。このような分析では、標識として同位体元素や蛍光物質が用いられている（非特許参考文献１）。
【０００５】
また、表面プラズモン共鳴測定原理を使い、ＧＰＣＲとリガンドとの相互作用を評価する報告がある（非特許参考文献２，３）。この報告では、測定基板上に脂質膜を形成し、ここに目的のレセプタを強制発現させた細胞から精製したレセプタを埋めこんで測定している。リガンドと結合したレセプタが、Ｇプロテインのサブユニットと吸着する様子を屈折率変化として観察することで、原理的にはリガンドの分析が可能になる。
【０００６】
上記のように表面プラズモン共鳴測定法も含まれる全反射光学系を用いた表面分析装置を用いる手法には、ＧＰＣＲとリガンドとの相互作用により生じる屈折率変化を直接的かつリアルタイムにモニタ（観測）できる利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３３５６２１２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】W.Thomsen, J.Frazer, D.Unett, "Functional assays for screening GPCR targets", Current Opinion in Biotechnology, VOL.16, pp.655-665, 2005.
【非特許文献２】D.Alve, Z.Salomon, E.Verga, H.I.Yamamura, G.Tollin, V.J.Hruby, "Direct Observation of G-protein Binding of the Human delta-Opioid Receptor Using Plasmon-Waveguide Resonance Spectroscopy", The Journal of Biological Chemistry, vol.278, no.49, pp.48890-48897, 2003.
【非特許文献３】Stenlund,G.J.Babcock, J.Sodroski, D.G.Myszka, "Capture and reconstitution of G protein-coupled receptors on a biosensor surface", Analytical Biochemistry, vol.316, pp.243-250, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、細胞で強制発現させたレセプタを用いたリガンドの分析では、実際の生物細胞と同様に機能しているかという点が問題となる場合がある。例えば、新薬を探索する場合、強制発現させた細胞と実際の生物細胞との間で、リガンドとレセプタとの反応系に違いがあった場合、このリガンドは薬剤としては副反応が存在することになる。また、強制発現させたレセプタを精製し、このレセプタを基板上の脂質膜中に再構築して分析に用いる場合、レセプタ構造の安定性やレセプタの本来の応答を促す細胞内物質やその他の環境が、本来の生物細胞内での構造とは異なっている恐れもある。
【００１０】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、実際の生体内の状態により近い状態で、リガンドの分析ができるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るリガンド分析方法は、分析対象の動物細胞を破砕して動物細胞の膜画分を分取する第１ステップと、膜画分にリガンド候補の物質を加えたリガンド候補混合膜画分を作製する第２ステップと、目的のＧタンパク質共役受容体に対する抗体を基板の観察領域に固定して抗体固定化基板を作製する第３ステップと、抗体固定化基板の観察領域にリガンド候補混合膜画分を配置した試料基板を作製する第４ステップと、リガンドと反応している目的のＧタンパク質共役受容体に結合するＧＴＰ結合タンパク質を試料基板の観察領域に供給し、Ｇタンパク質共役受容体に結合したＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化を測定する第５ステップと、測定した結果より膜画分におけるＧタンパク質共役受容体に対してリガンドとなるリガンド候補の物質を分析する第６ステップとを少なくとも備える。
【００１２】
上記リガンド分析方法において、第６ステップでは、Ｇタンパク質共役受容体に結合したＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化により、Ｇタンパク質共役受容体に対するリガンドの特性を分析するようにすればよい。また、第５ステップでは、ＧＴＰ結合タンパク質の供給による観察領域における屈折率の変化により、Ｇタンパク質共役受容体に結合したＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化を測定してもよい。また、第５ステップでは、表面プラズモン共鳴測定により、観察領域における屈折率の変化を測定すればよい。
【発明の効果】
【００１３】
以上説明したように、本発明によれば、Ｇタンパク質共役受容体に結合したＧＴＰ結合タンパク質の量の時間変化を測定するようにしたので、実際の生体内の状態により近い状態で、リガンドの分析ができるようになるという優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施の形態におけるリガンド分析方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】図２は、抗体固定化基板の構成を示す平面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、抗体固定化基板の作製工程を説明する工程図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、抗体固定化基板の作製工程を説明する工程図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、抗体固定化基板の作製工程を説明する工程図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、抗体固定化基板の作製工程を説明する工程図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、抗体固定化基板の作製工程を説明する工程図である。
【図４Ａ】図４Ａは、抗体固定化基板の構成を示す断面である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、表面プラズモン共鳴測定を行う装置の構成を示す構成図である。
【図５】図５は、表面プラズモン共鳴測定により吸着による屈折率（ＳＰＲ角度）の変化を観測した結果を示す特性図である。
【図６】図６は、表面プラズモン共鳴測定により吸着による屈折率（ＳＰＲ角度）の変化を観測した結果を示す特性図である。
【図７】図７は、表面プラズモン共鳴測定により吸着による屈折率（ＳＰＲ角度）の変化を観測した結果を示す特性図である。
【図８】図８は、表面プラズモン共鳴測定により吸着による屈折率（ＳＰＲ角度）の変化を観測した結果を示す特性図である。
【図９】図９は、表面プラズモン共鳴測定により吸着による屈折率（ＳＰＲ角度）の変化を観測した結果を示す特性図である。
【図１０】図１０は、実験に用いる基板の構成例を示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態におけるリガンド分析方法を説明するためのフローチャートである。このリガンド分析方法は、まず、ステップＳ１０１で、分析対象の動物細胞を破砕して動物細胞の膜画分を分取する。例えば、ポッター型のホモジナイザーを用いてホモジナイズすることで、細胞より膜画分を得ることができる。次に、ステップＳ１０２で、得られた膜画分にリガンド候補の物質を加えた（混合した）リガンド候補混合膜画分を作製する。
【００１６】
次に、ステップＳ１０３で、目的のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対する抗体を基板の観察領域に固定して抗体固定化基板を作製する。例えば、得られた膜画分に含まれているＧＰＣＲを予め特定しておき、特定したＧＰＣＲの抗体を基板の観察領域に固定する。次に、ステップＳ１０４で、抗体固定化基板の観察領域にリガンド候補混合膜画分を配置した試料基板を作製する。例えば、観察領域にリガンド候補膜画分を滴下すればよい。
【００１７】
次に、ステップＳ１０５で、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇプロテイン）を試料基板の観察領域に供給し、ＧＰＣＲに結合したＧプロテインの量の時間変化を測定する。この後、ステップＳ１０６で、測定した結果より膜画分におけるＧタンパク質共役受容体に対してリガンドとなるリガンド候補の物質を分析する。
【００１８】
Ｇプロテインは、リガンドと反応（結合）しているＧＰＣＲに結合する。例えば、Ｇプロテインのαサブユニットを含む溶液を流し、Ｇプロテインのαサブユニットが、リガンドと反応しているＧＰＣＲに結合する。従って、測定領域のＧＰＣＲに結合するＧプロテインが観察（検出）されれば、観察領域に配置されているリガンド候補混合膜画分には、リガンドが結合しているＧＰＣＲが存在していることになる。また、リガンドとＧＰＣＲの結合の状態が、ＧＰＣＲに結合するＧプロテインの量に対応している。
【００１９】
ここで、このようにＧＰＣＲに結合するＧプロテインは、例えば、分取した膜画分中に存在する様々な物質の影響を受け、ＧＰＣＲより分離する場合もある。従って、上述したようなＧＰＣＲに対するＧプロテインの結合量は、特定の時間経過の後に測定しても、正確な結果を得られない。これに対し、ＧＰＣＲに結合したＧプロテインの量の時間変化を測定することで、ＧＰＣＲに対するＧプロテインの結合状態を分析することが可能となる。また、ＧＰＣＲに対するＧプロテインの結合状態により、ＧＰＣＲに対するリガンドの特性を分析することができる。
【００２０】
このＧＰＣＲに結合したＧプロテインの量の時間変化は、観察領域における屈折率の経時的な変化を測定することで得ることができる。このような屈折率変化の測定は、例えば、よく知られた表面プラズモン共鳴測定により行うことができる（特許文献１参照）。
【００２１】
以上に説明したように、本実施の形態によれば、動物細胞を破砕して得られた膜画分を用いるので、実際の生体内の状態により近い状態での分析となる。また、膜画分中のＧＰＣＲに結合したＧプロテインの量の時間変化を測定するようにしたので、ＧＰＣＲに対するリガンドの特性が分析できるようになる。また、異なるリガンド候補物質と同一膜画分とを混合して得られた複数のリガンド候補混合膜画分を、同じ基板の上に配列固定し、これら各々とＧプロテインとの結合状態を測定することで、リガンド種類により、レセプタとの結合後にレセプタに与える構造変化の違いの度合いを評価することができる。
【００２２】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。以下では、ＧＰＣＲに結合したＧプロテインを、表面プラズモン共鳴法による屈折率の変化により測定する場合について説明する。
【００２３】
［膜画分作製方法］
ラットから摘出した脳の細胞を、ポッター型のホモジナイザーを用いて粉砕する。次に、粉砕した試料より、遠心分離を行って膜画分を取り出し、さらに、プロテアーゼ・インヒビターを含む溶解緩衝溶液に溶出した後、さらに遠心分離をかける。次に、緩衝剤と界面活性剤を加えて膜画分サンプルとした。次に、所定の基板上に膜画分サンプルより、レセプタ抗体(anti-δOpioid Receptor；Anti-OpiR)を用いてレセプタの存在を確認する。Anti-OpiRにより「δOpioid Receptor」の存在が確認されたサンプルを、膜画分Ａとする。なお、この膜画分Ａには、「δOpioid Receptor」以外の様々なレセプタおよび細胞膜を構成する脂質膜が混在し、また、Ｇプロテインが含まれている場合もある。
【００２４】
［抗体固定化基板作製方法］
図２の平面図に示すように、膜厚５０ｎｍの金薄膜２０２を形成した透明基板２０１を用意する。透明基板２０１は、例えば、ガラスあるいは透明なプラスチックから構成されていればよい。また、透明基板２０１は、板厚１ｍｍ程度とすればよい。次に、図３Ａに示すように、紫外線を照射することによるＵＶオゾン処理により、金薄膜２０２を洗浄する。次に、図２および図３Ｂに示すように、金薄膜２０２の上に、所定の間隔でブロック部２０３を形成する。例えば、よく知られたスポッター装置を用いてブロッキング剤をスポットすることで、ブロック部２０３を形成する。このブロック部２０３の間を、観察領域２０４として用いればよい。
【００２５】
次に、観察領域２０４にプロテインＡ溶液を塗布し、１０分静置して水洗浄することで、図３Ｃに示すように、観察領域２０４にプロテインＡ３０２を配置する。この後、ＧＰＣＲに対する抗体の溶液を塗布し、図３Ｄに示すように、プロテインＡ３０２に抗体３０３を固定する。プロテインＡ３０２は、黄色ブドウ球菌由来のタンパク質である。このプロテインＡ３０２は、抗体３０３が「ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ」の場合、「ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ」のＦｃ部分３０４に選択的に結合する。
【００２６】
また、「ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ」は、図３Ｄに示すように、Ｆｃ部分３０４および抗体３０３の抗原認識サイトであるＦａｂ部分３０５を備える。このため、Ｆｃ部分３０４をプロテインＡ３０２に固定（吸着）した抗体３０３は、金薄膜２０２を下側として、Ｆａｂ部分３０５を上側に配置する状態で固定化されるものと考えられる。この抗体固定化は、一般的に用いられる手法の一つである。
【００２７】
以上のように抗体の溶液を塗布して２０分静置して抗体３０３を固定化し、これを水洗浄した後、透明基板２０１（金薄膜２０２）の上の観察領域２０４に、膜画分Ａを滴下すれば、図３Ｅに示すように、抗体３０３にＧタンパク質共役受容体３０６が固定化される。膜画分Ａを滴下してから２０分静置して水洗し、この後、乾燥しないように緩衝剤に浸漬しておく。なお、膜画分Ａに含まれている脂質膜３０７などが、Ｇタンパク質共役受容体３０６に付帯している場合もある。
【００２８】
［表面プラズモン共鳴測定について］
まず、測定では、図４Ａに示すように、透明基板２０１の上に流路シート４０１を挟んでカバー４０２を配置する。流路シート４０１には流路４０３が形成されており、カバー４０２の試料導入口４０４より導入した試料溶液は、金薄膜２０２に配置される流路４０３を流れて試料排出口４０５より排出される。
【００２９】
次に、表面プラズモン共鳴測定では、図４Ｂに示すような測定装置４１１を用いる。測定装置４１１は、発光ダイオードなどから構成されている光源４１２，プリズム４１３，光検出部４１４，およびフィルタ４１５を備える。透明基板２０１は、金薄膜２０２が形成されていない裏面側を、マッチングオイルなどを介してプリズム４１３の測定面に配置する。
【００３０】
この測定装置４１１では、光源４１２から特定の入射角でプリズム４１３に入射させ、入射させた光を金薄膜２０２に照射する。これにより金薄膜２０２で反射した光を、プリズム４１３を通し、フィルタ４１５を通して光検出部４１４で検出する。金薄膜２０２に入射した光は、金薄膜２０２の反射面でエバネッセント波となり、反射面では、金薄膜２０２の上に配置される試料の屈折率の関数で表される表面プラズモン波が生じる。このエバネッセント波と表面プラズモン波の波数とが一致する入射角で光源４１２からの光が入射したとき、エバネッセント波は、表面プラズモンの励起に使われ、光検出部４１４が検出する反射光の光量が減少する。
【００３１】
上記光の入射角は、表面プラズモン波を発生させる物質の屈折率に固有のものとなる。従って、光検出部４１４から出力される光電変換信号を情報処理部４２１で処理することで、金薄膜２０２の上に配置される試料における上記物質の存在を測定（定量）することができる。
【００３２】
［抗体に対する対象のＧＰＣＲの選択的な固定化とＧプロテインとの応答］
次に、固定化のために用いた抗体に対して、目的のＧＰＣＲが選択的に固定化されている状態、およびこのような固定化におけるＧプロテインとの応答（反応）について調査した結果について説明する。
【００３３】
この調査では、レセプタを構成する糖鎖に吸着するレクチンを利用し、レクチンおよび抗体に吸着する物質を測定する。レクチンは、様々な糖鎖を持つレセプタを吸着する物質であり、以下では、ＷＧＡ（Wheat germ agglutinin）を用いる。前述したように作製した抗体固定化基板の一部のブロック部２０３の間に、ＷＧＡを塗布したテスト基板Ａを作製する。テスト基板Ａでは、Anti-OpiRに加えてＷＧＡも存在する状態となる。
【００３４】
このテスト基板Ａに、既知のリガンドを添加した膜画分Ａを緩衝剤で希釈した試料液を流し、上述した表面プラズモン共鳴測定により吸着による屈折率（ＳＰＲ角度）の変化を観測する。図５は、この観測の結果を示す特性図であり、（ａ）は、Anti-OpiRの部分、（ｂ）は、ＷＧＡの部分の結果である。図５に示すように、両者に屈折率の変化が発生しており、両者に吸着が生じていることが観察される。しかしながら、Anti-OpiRにおける吸着量が、ＷＧＡにおける吸着量より小さいことがわかる。
【００３５】
前述したように、ＷＧＡの部分には、「δOpioid Receptor」以外の他のレセプタも吸着するが、Anti-OpiRの部分には、「δOpioid Receptor」が選択的に吸着する。このため、Anti-OpiRの部分への吸着量は、ＷＧＡの部分への吸着量より少なくなることになる。上述した測定結果は、これに対応しており、テスト基板Ａにおいては、Anti-OpiRの部分に、膜画分Ａ中の「δOpioid Receptor」が選択的に吸着していることを示している。
【００３６】
さらに、「δOpioid Receptor」がリガンドと反応している状態である場合に、「δOpioid Receptor」の末端のカルボニル基（Ｃ末）に吸着するＧプロテインであるＧｉα（Calbiochem社製、ウシ脳由来）との反応性を評価する。この評価では、上記テスト基板ＡにＧｉαを含む緩衝溶液を供給し、屈折率の変化を観測することで行う。図６は、この観測の結果を示す特性図であり、（ａ）は、Anti-OpiRの部分、（ｂ）は、ＷＧＡの部分の結果である。
【００３７】
図６の（ａ）に示すように、Ｇｉαを供給すると、Anti-OpiRの部分では、吸着量の増加が観測され、Ｇｉαの吸着が確認される。これに対し、図６の（ｂ）に示すように、Ｇｉαを供給しても、ＷＧＡの部分では、吸着量の減少が確認され、Ｇｉαの吸着は確認できない。ＷＧＡの部分にも「δOpioid Receptor」が存在しているものと考えられるが、「δOpioid Receptor」の周囲に存在してＧｉαと親和性のあるグアノシン類などが、ＷＧＡによる固定化部分によって失われる反応が優先して発生しているためと考えられる。
【００３８】
また、この結果から、膜画分として取り出してきたままの材料中には、Ｇｉαと親和性のあるコンフォメーションをとっている「δOpioid Receptor」が存在していることが判断できる。従って、目的とする「δOpioid Receptor」とリガンドとの反応性を評価するためには、「δOpioid Receptor」の状態を、リセットするプロセスが必要になるものと考えられる。
【００３９】
「他の抗体による膜画分からの固定化」
Anti-OpiRおよびアドレナリン・レセプタ抗体(anti-beta 2 Adrenergic Receptor;anti-b2AdR)を固定化した基板に、各々、膜画分Ａを滴下して固定化したテスト基板Ｂを作製する。このテスト基板Ｂを用いてＧｉαとの反応性を観測する。総Ｇプロテイン濃度は２μｇ／ｍＬに調整してある。図７は、この観測の結果を示す特性図であり、（ａ）は、Anti-OpiRの部分、（ｂ）は、anti-b2AdRの部分の結果である。図７の（ａ）に示すように、Anti-OpiRを介して「δOpioid Receptor」を含む膜部分を固定化した領域においては、Ｇｉαの供給により吸着量の増加が観測され、Ｇｉαの吸着が確認できる。これに対し、図７の（ｂ）に示すように、anti-b2AdRを固定化した領域においては、Ｇｉαの供給により反対に吸着量の減少が観測される。
【００４０】
上述したテスト基板Ｂには、膜画分Ａ内のアドレナリン・レセプタ（b2AdR）が吸着している部分があるが、b2AdRはＧプロテインのなかのＧｓαと吸着することが知られるレセプタである。よって、anti-b2AdRを固定化した部分にb2AdRを含む部分が優先的に吸着されていれば、Ｇｉαとの吸着はおこらないはずである。図７に示す結果は、この予想と一致したものであり、従って、基板側の抗体の選択性により、膜画分に含まれる測定対象とするレセプタが、周辺の脂質およびグアノシン類とともに固定化できることが確認できた。
【００４１】
なお、anti-b2AdRを固定化した部分においては、図６で示した結果と同様に、Ｇｉαと親和性のあるグアノシン類が吸着し、基板表面よりＧｉαが失われていったと考えられる。さらに、同一のテスト基板Ｂを用い、「δOpioid Receptor」とこれに対するアゴニストとしてのエンドルフィンとの吸着を確認した。この確認では、図８の（ａ）に示すように、Anti-OpiRの部分にはアゴニストの吸着が観測されたが、図の（ｂ）に示すように、anti-b2AdRの部分ではアゴニストが吸着が観測されない。このことからも、抗体を用いた固定化により、レセプタとリガンドとの反応が阻害されることはなく、かつ、リガンド選択性を表すＧプロテイン類の吸着も問題なく観測できることが確認される。
【００４２】
［リガンド特性の評価］
次に、リガンドの特性評価について説明する。まず、膜画分Ａに「δOpioid Receptor」のアゴニストであるエンケファリンを混合した膜画分Ａ１を作製する。また、膜画分Ａに「δOpioid Receptor」のアンタゴニストであるナルトインドールを混合した膜画分Ａ２を作製する。「δOpioid Receptor」は、エンケファリンとの結合によりＧｉαを吸着するコンフォメーションを取る。これに対し、「δOpioid Receptor」は、ナルトインドールと結合するとＧｉα吸着には向かないコンフォメーションを取ることが知られている。このように、レセプタはアンタゴニストとの結合（反応）により、レセプタとしての活動が抑制されるようになる。
【００４３】
次に、２箇所にAnti-OpiRを固定化したテスト基板Ｃを作製する。このテスト基板Ｃの、Anti-OpiRを固定化した２つの領域Ａおよび領域Ｂの各々に、膜画分Ａ１および膜画分Ａ２を固定化する。このテスト基板Ｃにおける、Ｇｉαとの応答を観測する。図９は、この観測の結果を示す特性図であり、（ａ）は、領域Ａの部分、（ｂ）は、領域Ｂの部分の結果である。図９の（ａ）に示すように、膜画分Ａ１から固定化した領域ＡにおけるＧｉαの吸着量の時間変化（時間変化量）は、膜画分Ａ２から固定化した領域ＢにおけるＧｉαの吸着量の時間変化（時間変化量）より大きい。各々の時間変化の傾きを比較すると、領域Ａは、領域Ｂに比較して、Ｇｉαに対する吸着量が６０倍の能力を持つことが確認される。
【００４４】
以上のことより、アゴニストとの結合によりＧｉαを吸着するコンフォメーションを取った領域Ａと、アンタゴニストと結合したためＧｉα吸着には向かないコンフォメーションとなった領域Ｂのレセプタで、明らかにＧｉαの吸着能力に差が生じたことを直接的に観察できたことになる。この試験においては、Ｇｉα以外の物質を測定系に添加していない。「δOpioid Receptor」がＧｉαと結合するためには、脂質膜中にとらわれた状態で、かつＧβおよびＧγも同時に吸着するヘテロ３量体である必要がある。ＧβおよびＧγは、脂質膜との親和性が高く、脂質成分から除去し難い物質である。従って、上述した膜画分Ａを抗体により基板に固定した状態では、レセプタ（δOpioid Receptor）がＧｉαと結合するために必要な脂質に加え、ＧβおよびＧγも含まれた状態であるといえる。
【００４５】
また、Anti-OpiRと「Anti-Adrenergic Receptor」を、各々１箇所ずつ固定化した基板において、Anti-OpiRを固定化した領域に膜画分Ａ１を滴下し、「Anti-Adrenergic Receptor」を固定化した領域に、アドレナリン・レセプタを強制発現させた膜のホモジナイズ品（市販品：膜画分Ｂ）を滴下し、各々固定化させた実験を実施した。この状態を図１０に示す。領域２０４ａが、Anti-OpiR３０３ａを固定化した領域であり、領域２０４ｂが「Anti-Adrenergic Receptor」３０３ｂを固定化した領域である。
【００４６】
この実験の結果、膜画分Ａ１固定化部分のみＧｉαの吸着が確認できた。異なる種類の膜画分を用いても、レセプタの特異性に対応したＧプロテイン吸着反応が観測できると考えられる。これより、膜画分と混合した物質（リガンド候補物質）のリガンドとしての性能を、分析できることが示された。
【００４７】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形が実施可能であることは明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１０】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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