(57)【要約】      （修正有）【課題】テトラヒメナから得られ、商業的に価値ある多不飽和脂肪酸（いわゆるＰＵＦＡ：多不飽和脂肪酸）の生合成に関与する繊毛虫特異的Δ−６−デサチュラーゼをコードする、核酸（群）の提供。【解決手段】Δ−６−不飽和脂肪酸、特に、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）の産生増加を目的とした、繊毛虫、好ましくはテトラヒメナ、特にテトラヒメナ・サーモフィラでの過度に発現するための核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示したアミノ酸配列を有するテトラヒメナから得られるΔ−６−デサチュラーゼをコードする核酸。
【請求項２】
請求項１記載の核酸のΔ−６−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも８個のヌクレオチドを含む部分。
【請求項３】
繊毛虫から得られることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
テトラヒメナ・サーモフィラから得られることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡあることを特徴とする請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
３３位から１０９１位までの配列番号１に示した核酸配列を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
１つ以上の非コード配列を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
配列番号３に示した請求項１から８のいずれか一項に記載の単離核酸。
【請求項１０】
請求項９記載の核酸のΔ−６−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも８個のヌクレオチドを含む部分。
【請求項１１】
ベクターに含まれることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
ベクターが発現ベクターであることを特徴とする請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
核酸は、構成性および／または誘導性プロモーターと機能的に結合していることを特徴とする請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
核酸は、構成性および／または誘導性プロモーターおよび終結シグナルと機能的に結合していることを特徴とする請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
核酸を化学的に合成する、または核酸をプローブを使用して遺伝子ライブラリーから単離することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸の調製方法。
【請求項１６】
配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６記載のポリペプチドのΔ−６−デサチュラーゼ活性を有する少なくとも１２個のアミノ酸を含む部分。
【請求項１８】
適切な発現系または宿主生物において請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸を発現することを特徴とする請求項１６または１７に記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項１９】
配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドに対向する特異的抗体。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸を有する非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項２１】
配列番号１を含む請求項１に記載の核酸。
【請求項２２】
部分が少なくとも１５個のヌクレオチドを含む請求項２または１０に記載の核酸。
【請求項２３】
部分が少なくとも２０個のヌクレオチドを含む請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
部分が少なくとも１００個のヌクレオチドを含む請求項２３に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼ、それをコードする核酸およびその調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、真核生物において商業的に価値のある多不飽和脂肪酸（これは、ＰＵＦＡ、すなわちポリ不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ）と称する）の生合成に関与する、繊毛虫特異のΔ−６−デサチュラーゼをコードするテトラヒメナからの核酸に関する。これに関して、本発明による核酸、および、それから得ることのできるポリペプチドは、他の既知の天然デサチュラーゼと驚くべき程ほとんど配列同一性を示さない。本発明はさらに、脂肪酸構成（スペクトル）を特異的に修飾する目的で、特にＰＵＦＡの形成を増加する目的で、真核生物、特に繊毛虫、好ましくはテトラヒメナ、特に好ましくはテトラヒメナ・サーモフィラにおいて過度に発現するための核酸の使用に関する。
【０００３】
本発明による核酸は、繊毛虫から、好ましくはテトラヒメナから、特に好ましくはテトラヒメナ・サーモフィラ、非常に高含量のＧＬＡを有するＧＬＡ産生生物、から得ることができる。
【０００４】
図１は、真核生物における、ＰＵＦＡ生合成の一般的なスキーム、および関与する酵素を示す（Ｇｉｌｌ＆Ｖａｌｉｖｅｔｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、１５：４０１〜４０９（非特許文献１）に従って作成）。
ステアリン酸（１８：０）からオレイン酸（１８：１Δ９）への変換は、Δ−９−デサチュラーゼにより触媒される。オレイン酸は、Δ−１２−デサチュラーゼによりリノール酸（１８：２Δ９、１２；ＬＡと略称）に変換され、これは、次いで、Δ−６−デサチュラーゼにより、γ−リノレン酸（１８：３、Δ６、９、１２；ＧＬＡと略称）に、または、Δ−１５−デサチュラーゼによりα−リノレン酸（１８：３Δ９、１２、１５；ＡＬＡと略称）に変換される。
【０００５】
脂肪酸は、エロンガーゼの作用により伸長され、その結果、例えば、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３Δ８、１１、１５；ＤＧＬＡと略称）が、γ−リノレン酸から形成され、ジホモ−γ−リノレン酸は、次いで、Δ−５−デサチュラーゼによりアラキドン酸（２０：４Δ５、８、１１、１５；ＡＲＡと略称）に変換される。これは、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンおよびロイコトリエンなどの生理活性エイコサノイドの直接的な前駆体である。
【０００６】
ＬＡからＧＬＡへのΔ−６−デサチュラーゼによる変換は、ＧＬＡから得られるＰＵＦＡ（以下ではΔ−６−不飽和脂肪酸と称する）形成の律速段階であることが判明した（Ｈｕａｎｇ  ＹＳ＆Ｍｉｌｌｓ  ＤＥ（１９９６）γ−リノレン酸、代謝および栄養および医薬におけるその役割。イリノイ州シャンペイン所在ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６（非特許文献２））。
【０００７】
Δ−６−デサチュラーゼ活性を有する酵素は、テトラヒメナ・セトサおよびＴ．ピリフォルミスに存在することが知られているが（Ｐｅｎｇ，Ｙ．Ｍ．およびＥｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．（１９７１）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１０１、１１７７〜１１８４（非特許文献３））、繊毛虫から得られ、このような活性を有する均一タンパク質はこれまで入手できなかった（例えば、Ｋｏｌｌ，ＭおよびＥｒｗｉｎ，Ｊ．Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３７（３）２２９〜２３７（非特許文献４））。
【０００８】
脊椎動物は、脂肪酸に９位より後に二重結合を挿入できないので、ＬＡおよびＡＬＡなどの不飽和脂肪酸は、脊椎動物が合成できない必須栄養分であり、食事では、基本的に植物源から得られる（図１参照）。
【０００９】
哺乳類では、Δ−６−デサチュラーゼによってＬＡをＧＬＡに変換できる。このＧＬＡはＡＲＡの前駆体であり、この前駆体は大半のプロスタグランジンの必須前駆体である。ＥＰＡの前駆体のステアリドン酸（１８：４Δ６、９、１２、１５）のＡＬＡからの形成は、同様に、Δ−６−デサチュラーゼにより触媒される。従って、Δ−６−デサチュラーゼは、エイコサノイド生合成の最初の必須段階である（図１参照）。
【００１０】
哺乳類では、Δ−６−デサチュラーゼの活性は、アルコール消費、ストレス、栄養不足および加齢プロセスなどの因子により損なわれ得ることが分かった（Ｈｕａｎｇ＆Ｍｉｌｌｓ、１９９６；Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０）Ｒｅｖ．Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１：１〜４５；Ｂｏｌｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５１：６１９〜６２４；Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１９：８６７〜８７３（非特許文献５〜７））。そのため、ＧＬＡの供給が不十分となり、従って、すでに前記したように、ＬＡからのＧＬＡの形成はＰＵＦＡ合成の律速段階であるので、最終的にＧＬＡから得られる分子、例えば、ＡＲＡおよびそれから形成される生理的に重要なエイコサノイドが欠乏する（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＲＲ（１９７６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５〜１０１；Ｎａｋａｈａｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｊｐｎ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４２：２４２〜２５３；Ｃｈａｐｋｉｎ，ＲＳ（１９９８）必須脂肪酸の再評価、食物中の脂肪酸およびその健康との関連性、第２版（Ｃｈｏｗ  ＣＫ編）ＮＹ州ニューヨーク所在Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（非特許文献８〜１０））。
【００１１】
ＧＬＡの供給は、Δ−６−デサチュラーゼ脂肪酸の細胞内レベルの減少を補充し、かつ、これらの脂肪酸の要求の増加にも対応する（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０））。それ故、食事を介してＧＬＡを取込むことは、ＧＬＡから得られる分子の生合成に有利である（Ｆａｎ，ＹＹ＆Ｃｈａｐｋｉｎ，ＲＳ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８：１４１１〜１４１４（非特許文献１１））。
【００１２】
ＧＬＡがヒトの生体に多くの異なるプラスの影響を奏効するという知見は、これまで、多くの科学的研究により支持されている。従って、臨床試験により、例えばアトピー性湿疹（Ｓｈｉｍａｓａｋｉ，Ｈ：ＰＵＦＡ含量およびアトピー性湿疹に罹患した小児の血漿中のｎ−６、ｎ−３代謝物のプロフィルに対するγ−リノレン酸の豊富な油の食事による摂取の効果、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ（１９９５）１９（３）、１８３〜１９２）、慢性関節リウマチ（Ｚｕｒｉｅｒ  ＲＢ、Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  ＲＧ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＥＷ、ＤｅＭａｒｃｏ  ＤＭ、Ｌｉｕ  ＮＹ、Ｔｅｍｍｉｎｇ  ＪＥ、Ｗｈｉｔｅ  ＢＭ、Ｌａｐｏｓａｔａ  Ｍ（１９９６）慢性関節リウマチのγ−リノレン酸による処置：無作為プラセボ対照試験  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９（１１）１８０８〜１８１７）、アテローム性動脈硬化症（Ｌｅｎｇ  ＧＣ、Ｌｅｅ  ＡＪ、Ｆｏｗｋｅｓ  ＦＧＲ、Ｊｅｐｓｏｎ  ＲＧ、Ｌｏｗｅ  ＧＤＯ、Ｓｋｉｎｎｅｒ  ＥＲ、Ｍｏｗａｔ  ＢＦ、末梢動脈疾患におけるγ−リノレン酸およびエイコサペンタエン酸の無作為対照試験、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（１９９８）１７／６  ２６５〜２７１）、糖尿病性神経障害（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＭＡ、Ｓｃｈｕｍｅｒ  ＭＰ（１９９５）糖尿病性神経障害の臨床試験：過去、現在および未来、Ｄｉａｂｅｔｉｓ  ４４（１２）１３５５〜６１）、偏頭痛（Ｗａｇｎｅｒ  Ｗ、Ｎｏｏｔｂａａｒ−Ｗａｇｎｅｒ  Ｕ（１９９７）γ−リノレン酸およびα−リノレン酸による偏頭痛の予防的処置、Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  １７／２  １２７〜１３０）、精神分裂病（Ｖａｄｄａｄｉ，ＫＳ（１９８２）精神分裂病の処置におけるプロスタグランジンＥ１前駆体の使用に関する観察、Ｂｉｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ．Ａｄｄｉｃｔ．１８３〜９１．刊行者：英国チェスター所在Ｗｉｌｅｙ）および癌（Ｋａｉｒｅｍｏ  ＫＪＡ、Ｊｅｋｕｎｅｎ  ＡＰ、Ｋｏｒｐｐｉ−Ｔｏｍｍｏｌａ  ＥＴ、Ｐｙｒｈｏｎｅｎ  ＳＯ（１９９７）肝臓灌流および膵臓癌の組織に対するγ−リノレン酸リチウムの効果、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７／５  Ｂ  ３７２９〜３７３６（非特許文献１２〜１８））に対するＧＬＡのプラスの効果が実証された。これらの研究は、病気像において統計的にも臨床的にも有意な改善を達成した。これに関連して、ＧＬＡの効果は、特に、生合成においてＧＬＡが前駆分子となっているエイコサノイド（プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンおよびロイコトリエン）を形成することによる（図１）。
【００１３】
これらの正の特性のために、医薬産業、化粧品産業、動物食餌産業および食品産業において、ＧＬＡは広く応用される（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０）、Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．３１：１６３〜１９４；Ｃｈａｐｋｉｎ（１９９８）、Ｆａｎ＆Ｃｈａｐｋｉｎ（１９９８）（非特許文献１９））。
【００１４】
ヒトおよび動物に見出される大半のＰＵＦＡは、食事から直接得られるか、または、食事をとおして供給される必須脂肪酸のデサチュラーゼおよびエロンガーゼによる変換により形成される。この理由から、これらのＰＵＦＡが天然に存在する生物から得られるＰＵＦＡ生合成遺伝子は、商業的関心が高い。ＰＵＦＡの商業的製造は、生物または細胞で、特異的かつ機能的に系の中でこれらの遺伝子を発現することにより達成できる。この理由から、ＰＵＦＡ生合成に関与するデサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする遺伝子が求められ、そして、ＰＵＦＡおよびＰＵＦＡ油を商業的に確実かつ経済的方法により得る上でこれらの遺伝子の使用が必要となる。
【００１５】
どの商業的に使用される油料種子もＧＬＡを産生しない。これに対し、ＧＬＡは、一般のオオマツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｂｉｅｎｎｉｓ、約１０％のＧＬＡ）、ルリヂサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、約２３％）およびクロクサスグリの実（Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ、約１８％）などの種々の植物の種子から得られた油にしか存在しない。
【００１６】
これに加えて、真菌ＭｕｃｏｒおよびＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ（約２５％まで）、藍藻Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ（約１２〜１８％）、およびその他の種々の微生物が、ＧＬＡ源であることが知られている。テトラヒメナ（４７％まで；Ｈｉｌｌ，ＤＬ（１９７２）テトラヒメナの生化学および生理、第３章、４６〜７３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ロンドン；Ｅｒｗｉｎ，Ｊ＆Ｂｌｏｃｈ，Ｋ（１９６３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：１６１８〜１６２４（非特許文献２０〜２１））などの繊毛虫は、特に豊富なＧＬＡ源であると報告されている。Ｐｈｉｌｌｉｐｓ＆Ｈｕａｎｇは、ＧＬＡの天然源に関する良好な総説を提供している（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＣ、Ｈｕａｎｇ  ＹＳ（１９９６）γ−リノレン酸の天然源および生合成：総説、１〜１３：γ−リノレン酸、代謝および栄養および医薬におけるその役割、Ｈｕａｎｇ  ＹＳ、Ｍｉｌｌｓ  ＤＥ（編）イリノイ州シャンペイン所在ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６（非特許文献２２））。
【００１７】
しかし、これらの天然源からのＧＬＡの商業的単離は、いくつかの欠点を伴う。これらの生物から得られる油の品質および量の両方が変化し、場合によっては、油の組成は非常に不均一である。よって、ＧＬＡを濃縮するために面倒で費用のかかる精製段階の使用が必要となる。これに加えて、ＧＬＡ含有植物の栽培は、あまり経済的なプロセスではない（Ｈａｎｓｅｎ  ＣＥら（１９９１）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．５４：３０９〜３１２（非特許文献２３））。
【００１８】
ＧＬＡ含有油を得る空間的／時間的収量は、高等植物よりも、ＧＬＡ産生微生物の方が顕著に良好であることが判明した。この理由から、微生物を使用したＧＬＡの発酵による生産は、他のＧＬＡ源に向けての見込みある別法を提供する。多くの微生物の脂肪酸構成（スペクトル）は、しばしば、高等生物のそれよりもかなり単純である。これは、精製において大きな利点を提供する特徴である。また、発酵による生産は、気候、栄養分の供給等の外的因子に依存しない。さらに、このように調製したＰＵＦＡは、例えば、環境汚染の源となり得る汚染物質をあまり含まない。さらなる利点は、天然源から得られたＧＬＡとは対照的に、発酵プロセスにより単離したＧＬＡは、入手の点で変動を受けない。
【００１９】
発酵によりＧＬＡを単離するシステムを開発する試みがすでになされている（Ｒａｔｌｅｄｇｅ  Ｃ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２７８〜２８４；Ｒａｔｌｅｄｇｅ  Ｃ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１７：１１３９〜１１４１；Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１：４２３〜４２６（非特許文献２４〜２６）；（ＷＯ８６／０３５１８（特許文献１））。しかし、発酵によりＧＬＡを製造するのに微生物を商業的に使用する場合、ＰＵＦＡ産生微生物の発酵は、比較的面倒で費用がかかり、結果としてあまり経済的ではないために、ＧＬＡの含量を高くすることが望ましい（上記のＲａｔｌｅｄｇｅ１９９３参照）。テトラヒメナ・サーモフィラは、ＧＬＡが比較的高い含量であるため（上記参照）、発酵によりＧＬＡを得るのに特に適している。テトラヒメナは、発酵槽で容易に培養でき、高い細胞密度が達成できる（Ｋｉｙ，Ｔ．＆Ｔｉｅｄｔｋｅ（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７、５７６〜５７９；Ｋｉｙ，Ｔ．＆Ｔｉｅｄｔｋｅ，Ａ（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８、１４１〜１４６（非特許文献２７〜２８））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第８６／０３５１８号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌ＆Ｖａｌｉｖｅｔｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、１５：４０１〜４０９
【非特許文献２】Ｈｕａｎｇ  ＹＳ＆Ｍｉｌｌｓ  ＤＥ（１９９６）γ−リノレン酸、代謝および栄養および医薬におけるその役割。イリノイ州シャンペイン所在ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６
【非特許文献３】Ｐｅｎｇ，Ｙ．Ｍ．およびＥｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．（１９７１）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１０１、１１７７〜１１８４
【非特許文献４】Ｋｏｌｌ，ＭおよびＥｒｗｉｎ，Ｊ．Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３７（３）２２９〜２３７
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇ＆Ｍｉｌｌｓ、１９９６；Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０）Ｒｅｖ．Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１：１〜４５
【非特許文献６】Ｂｏｌｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５１：６１９〜６２４
【非特許文献７】Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１９：８６７〜８７３
【非特許文献８】Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＲＲ（１９７６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５〜１０１
【非特許文献９】Ｎａｋａｈａｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｊｐｎ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４２：２４２〜２５３
【非特許文献１０】Ｃｈａｐｋｉｎ，ＲＳ（１９９８）必須脂肪酸の再評価、食物中の脂肪酸およびその健康との関連性、第２版（Ｃｈｏｗ  ＣＫ編）ＮＹ州ニューヨーク所在Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ
【非特許文献１１】Ｆａｎ，ＹＹ＆Ｃｈａｐｋｉｎ，ＲＳ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８：１４１１〜１４１４
【非特許文献１２】Ｓｈｉｍａｓａｋｉ，Ｈ：ＰＵＦＡ含量およびアトピー性湿疹に罹患した小児の血漿中のｎ−６、ｎ−３代謝物のプロフィルに対するγ−リノレン酸の豊富な油の食事による摂取の効果、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ（１９９５）１９（３）、１８３〜１９２
【非特許文献１３】Ｚｕｒｉｅｒ  ＲＢ、Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  ＲＧ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＥＷ、ＤｅＭａｒｃｏ  ＤＭ、Ｌｉｕ  ＮＹ、Ｔｅｍｍｉｎｇ  ＪＥ、Ｗｈｉｔｅ  ＢＭ、Ｌａｐｏｓａｔａ  Ｍ（１９９６）慢性関節リウマチのγ−リノレン酸による処置：無作為プラセボ対照試験  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９（１１）１８０８〜１８１７
【非特許文献１４】Ｌｅｎｇ  ＧＣ、Ｌｅｅ  ＡＪ、Ｆｏｗｋｅｓ  ＦＧＲ、Ｊｅｐｓｏｎ  ＲＧ、Ｌｏｗｅ  ＧＤＯ、Ｓｋｉｎｎｅｒ  ＥＲ、Ｍｏｗａｔ  ＢＦ、末梢動脈疾患におけるγ−リノレン酸およびエイコサペンタエン酸の無作為対照試験、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（１９９８）１７／６  ２６５〜２７１
【非特許文献１５】Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＭＡ、Ｓｃｈｕｍｅｒ  ＭＰ（１９９５）糖尿病性神経障害の臨床試験：過去、現在および未来、Ｄｉａｂｅｔｉｓ  ４４（１２）１３５５〜６１
【非特許文献１６】Ｗａｇｎｅｒ  Ｗ、Ｎｏｏｔｂａａｒ−Ｗａｇｎｅｒ  Ｕ（１９９７）γ−リノレン酸およびα−リノレン酸による偏頭痛の予防的処置、Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  １７／２  １２７〜１３０
【非特許文献１７】Ｖａｄｄａｄｉ，ＫＳ（１９８２）精神分裂病の処置におけるプロスタグランジンＥ１前駆体の使用に関する観察、Ｂｉｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ．Ａｄｄｉｃｔ．１８３〜９１．刊行者：英国チェスター所在Ｗｉｌｅｙ
【非特許文献１８】Ｋａｉｒｅｍｏ  ＫＪＡ、Ｊｅｋｕｎｅｎ  ＡＰ、Ｋｏｒｐｐｉ−Ｔｏｍｍｏｌａ  ＥＴ、Ｐｙｒｈｏｎｅｎ  ＳＯ（１９９７）肝臓灌流および膵臓癌の組織に対するγ−リノレン酸リチウムの効果、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７／５  Ｂ  ３７２９〜３７３６
【００２２】
【非特許文献１９】Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０）、Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．３１：１６３〜１９４；Ｃｈａｐｋｉｎ（１９９８）、Ｆａｎ＆Ｃｈａｐｋｉｎ（１９９８）
【非特許文献２０】Ｈｉｌｌ，ＤＬ（１９７２）テトラヒメナの生化学および生理、第３章、４６〜７３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ロンドン
【非特許文献２１】Ｅｒｗｉｎ，Ｊ＆Ｂｌｏｃｈ，Ｋ（１９６３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：１６１８〜１６２４
【非特許文献２２】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＣ、Ｈｕａｎｇ  ＹＳ（１９９６）γ−リノレン酸の天然源および生合成：総説、１〜１３：γ−リノレン酸、代謝および栄養および医薬におけるその役割、Ｈｕａｎｇ  ＹＳ、Ｍｉｌｌｓ  ＤＥ（編）イリノイ州シャンペイン所在ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６
【非特許文献２３】Ｈａｎｓｅｎ  ＣＥら（１９９１）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．５４：３０９〜３１２
【非特許文献２４】Ｒａｔｌｅｄｇｅ  Ｃ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２７８〜２８４
【非特許文献２５】Ｒａｔｌｅｄｇｅ  Ｃ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１７：１１３９〜１１４１
【非特許文献２６】Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１：４２３〜４２６
【非特許文献２７】Ｋｉｙ，Ｔ．＆Ｔｉｅｄｔｋｅ（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７、５７６〜５７９
【非特許文献２８】Ｋｉｙ，Ｔ．＆Ｔｉｅｄｔｋｅ，Ａ（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８、１４１〜１４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
それ故、本発明の目的は、Δ−６−デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ＧＬＡおよび／またはΔ−６−不飽和脂肪酸の増大のために、宿主生物、好ましくはテトラヒメナに機能的に発現および過度に発現されるテトラヒメナからの核酸を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、それ故、配列番号１に示し、そして配列番号２に示したアミノ酸配列を有するΔ−６−デサチュラーゼをコードする核酸、またはその機能的変異体、および少なくとも８個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５または２０個のヌクレオチドを含み、特に少なくとも１００個のヌクレオチド、特に少なくとも３００個のヌクレオチドを含む、その一部に関する（以下で「本発明による核酸（群）」と称する）。本発明はさらに、同様に、配列番号３に示し、ゲノム配列を含み、Δ−６−デサチュラーゼをコードする配列に加えて、イントロン、プロモーターおよびフランキング配列などの非コード核酸配列も含む核酸に関する。
【００２５】
配列番号１に示した完全核酸は、３５２個のアミノ酸を含み、４１．８ｋＤａの理論的分子量を有するタンパク質をコードする。本発明による配列解析により、この核酸は、テトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼをコードする核酸であることが確認される。
【００２６】
相同性比較を使用して、核酸配列（配列番号１）から得られ、配列番号２に示した、タンパク質配列を、Δ−６−デサチュラーゼと同定した。ＢＬＡＳＴＰ機能（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）を、相同性比較に使用した。デサチュラーゼ、特にΔ−６−デサチュラーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１４．９９．２５；リノレオイル−ＣｏＡデサチュラーゼ）を、データベースから相同タンパク質であると同定した（図２及び図３参照）。
【００２７】
これに関連して、既知のΔ−６−デサチュラーゼは、本発明によるポリペプチド配列と最大２５％の同一性を示す（図４〜８参照）。
本発明によるポリペプチド配列を用いた種々の既知のΔ−６−デサチュラーゼのマルチプルアラインメントを図９に示す。
【００２８】
相同性は、特に、ヒスチジンボックスなどの保存ドメインに見出される（Ｌｏｓ＆Ｍｕｒａｔａ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３９４：３〜１５；Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２、６７４３〜６７４７）。これに加えて、チトクロムｂ５ドメインを他の真核Δ−６−デサチュラーゼのものと同じと同定することができた（Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｆ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７６、６７４〜６９２；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９、２７４（１）：４７１〜４７７）。
【００２９】
本発明によるポリペプチド配列は、Δ−６−デサチュラーゼと同定できるが、他のΔ−６−デサチュラーゼとはかなり異なる。３５２アミノ酸がある配列が、他の真核Δ−６−デサチュラーゼよりも約２０％短いことは特に驚きである。これに加えて、配列は、強く保存された領域で多くの独特の差異を示す。かくて、他のΔ−６−デサチュラーゼでは１００％保存されているＨＨＬＦＰモチーフは、ＨＨＦＦＰに変換している（図９参照）。これらの理由から、既知のデサチュラーゼと本発明によるポリペプチド配列の同一度は、驚くべき程に低い。
【００３０】
脂肪酸構成（スペクトル）は、例えば、テトラヒメナでデサチュラーゼを特に過度に発現することにより有意に修飾できる（表１および２参照）。これらの環境下で、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比は、有意により多くの不飽和脂肪酸の方向に転換する。ここで特に興味深いのは、このようにして達成できるＧＬＡの生産性の増加である。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは二本鎖ＤＮＡ、特に核酸配列を有するＤＮＡ、または３３位から１０９１位までの配列番号１に示したような核酸配列の機能的変異体である。本発明によると、２つの位置が、コード領域の開始および終結を決定する。
【００３２】
本発明によると、「機能的変異体」なる語は、テトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼに機能的に関連した核酸を意味すると理解される。関連核酸の例は、例えば、他の繊毛虫細胞由来の核酸、または対立遺伝子の変異体または同義性の変異体である。本発明は、同様に、本発明による核酸の機能的変異体を包含し、これは、異常なコドン使用度のために（Ｗｕｉｔｓｃｈｉｃｋ  ＪＤ、Ｋａｒｒｅｒ  ＫＭ（１９９９）テトラヒメナ・サーモフィラにおけるゲノムＧ＋Ｃ含量、コドン使用度、開始コドン内容および翻訳終結部位の解析、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  ４６（３）：２３９〜４７）、選択した発現系において本発明による核酸が適合することを必要とする。
【００３３】
一方、これは、繊毛虫でグルタミンをコードし、大半の他の発現系では終結コドンであるコドンＴＡＡおよびＴＡＧを、ＣＡＡおよびＣＡＧで置換することに関する。これに加えて、当業者は、本発明による核酸を、異なる発現系の、ある特定のコドン優先度（これをコドン使用度と称する）に最適に適合させることには慣れている。
核酸は、特異的に塩基を置換することにより既知の方法で修飾できるか、または必要な核酸を、人工的に調製したオリゴヌクレオチドから得ることができる。好ましい発現系における配列の適合は、例えば、既知のコドン使用度の表（例えば、インターネット：ＧｅｎＢａｎｋから作表したコドン使用度：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ．／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ＣＵＴＧ．ｈｔｍｌ）に基づいて、実施できる。本発明は、核酸の一部しか含まない核酸の変異体も包含する。
【００３４】
本発明によると、「変異体」なる語は、広義の意味において、相同性、特に約６０％、好ましくは約７５％、特に約９０％および特に約９５％の配列同一性を示す核酸を意味すると理解される。
【００３５】
本発明による核酸の断片部分は、例えば、他の機能的変異体の同定のためのプローブとして、またはアンチセンス核酸として個々のエピトープの調製に使用できる。例えば、少なくとも約８個のヌクレオチドを含む核酸は、アンチセンス核酸として使用するのに適し、一方、少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む核酸は、ＰＣＲ法でプライマーとして使用するのに適し、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含む核酸は、他の変異体の同定に適し、そして少なくとも約１００個のヌクレオチドを含む核酸は、プローブとしての使用に適する。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、本発明による核酸は、１つ以上の非コード配列（とりわけＵＴＲ）を含む。非コード配列は、例えば、Δ−６−デサチュラーゼコード遺伝子の制御発現のためのイントロン配列または、プロモーターまたはエンハンサー配列などの調節配列である。それ故、本発明は、配列番号３に示した本発明による核酸に関し、この核酸は、テトラヒメナ・サーモフィラから単離でき、イントロン、プロモーターおよびＵＴＲを含むΔ−６−デサチュラーゼのゲノム配列を示す。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明による核酸は、それ故、ベクター、好ましくは発現ベクターに含まれる。
【００３８】
発現ベクターは、例えば、原核または真核発現ベクターであり得る。大腸菌での発現用の原核発現ベクターの例は、Ｔ７発現ベクターｐＧＭ１０（Ｍａｒｔｉｎ、１９９６）であり、これは、Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグをコードし、また、その発現タンパク質が、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムにより有利に精製されることを可能にするものである。
【００３９】
サッカロミセス・セレビジアエでの発現に適した真核発現ベクターの例は、ベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、５７６７）であるが、昆虫細胞での発現に適した前記ベクターの例は、ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９またはＥＰ−Ｂ１−０５４９７２１に開示されたようなバキュロウイルスベクターであり、哺乳類細胞での発現に適したベクターの例は、一般に入手できるＳＶ４０ベクターである。
【００４０】
一般に、発現ベクターはまた、大腸菌での発現用のｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１５４１３３）、酵母での発現用のＡＤＨ−２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８、２６７４）、昆虫細胞での発現用のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９参照）、および、例えばＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ、２１４、２２８）から得られた初期ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーターなどの、宿主細胞に適した調節配列を含む。
【００４１】
例えば、Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：４６２〜４６５）またはＧａｅｒｔｉｇ＆Ｋａｐｌｅｒ（（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６２：４８５〜５００）によって記載されたベクターは、テトラヒメナの形質転換およびテトラヒメナにおける発現に適する。
【００４２】
本発明による核酸は、例えば、化学的に、例えばホスホトリエステル法に従って、配列番号１および３に開示した配列を使用して、または、配列番号２に開示したペプチド配列及び列挙した遺伝子コード（例えば、Ｕｈｌｍａｎ，Ｅ＆Ｐｅｙｍａｎ，Ａ（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０、５４３、Ｎｏ．４）を使用して合成できる。本発明による核酸を得る別の可能性は、適切なプローブを使用して、Δ−６−デサチュラーゼ活性を有する生物から調製した適切な遺伝子ライブラリーから前記核酸を単離することである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）分子クローニング：実験マニュアル第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。適切なプローブの例は、約１００から１０００ヌクレオチド長を有する、好ましくは約２００から５００ヌクレオチド長を有する、特に約３００から４００ヌクレオチド長を有する、一本鎖ＤＮＡ断片であり、その配列は、配列番号１または３に示した核酸配列から得ることができる。
【００４３】
この理由から、本発明は、また本発明による核酸を調製するプロセスに関し、前記核酸は、化学合成されるか、またはプローブを使用して遺伝子ライブラリーから単離される。
【００４４】
本発明はさらにまた、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド自体、またはその機能的変異体、および、少なくとも６個のアミノ酸を含む、好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸を含む、特に少なくとも６５個のアミノ酸を含む、特に少なくとも１５０個のアミノ酸を含む、その一部に関する（以下において「本発明によるポリペプチド」と称する）。例えば、約６〜１２アミノ酸長、好ましくは約８アミノ酸長のポリペプチドは、担体に結合した後に、特定のポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製に使用できる、エピトープを含むことができる（これに関しては、例えば、米国特許第５，６５６，４３５号参照）。少なくとも約６５個のアミノ酸長を有するポリペプチドは、担体を全く用いずに、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製に直接使用できる。
【００４５】
本発明の意味内で、「機能的変異体」なる語は、本発明によるペプチドに機能的に関連した、すなわちΔ−６−デサチュラーゼ活性を示すポリペプチドを意味すると理解される。
【００４６】
広義の意味において、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列相同性、特に約７０％、好ましくは約８０％、特に約９０％、特に約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを意味するとも理解される。
【００４７】
好ましいのは、保存されたヒスチジンボックス領域およびチトクロムｂ５ドメインを有するポリペプチドである。特に好ましいのは、ＨＨＦＦＰモチーフを含む本発明によるポリペプチドである。
【００４８】
「機能的変異体」なる語は、さらにまた、ポリペプチドにおける約１〜６０、好ましくは約１〜３０、特に約１〜１５、特に約１〜５個の範囲のアミノ酸の欠失を含む。例えば、最初のアミノ酸メチオニンを、ポリペプチドの機能を有意に変化させることなく欠失することができる。
「機能的変異体」なる語はまた、本発明による上記のポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質それ自体は、すでに、Δ−６−デサチュラーゼの機能を有しているか、または融合部分をとり除いた後にはじめて特異的機能を獲得できる。これらの融合タンパク質は、特に、約１〜２００、好ましくは約１〜１５０、特に約１〜１００、特に約１〜５０個のアミノ酸の非繊毛虫配列の構成部分を含む融合タンパク質を含む。
【００４９】
非繊毛虫ペプチド配列の例は、例えば大腸菌ガラクトシダーゼから得られる、または、ヒスチジンタグ、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグと称される、原核ペプチド配列である。ヒスチジンタグと称されるものを含む融合タンパク質は、金属イオン含有カラム、例えば、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを用いて、発現タンパク質を精製するのに特に適切である。「ＮＴＡ」は、キレート剤のニトリロトリ酢酸（キアゲンＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ）を意味する。
【００５０】
本発明によるポリペプチドの一部はエピトープを表し、例えば、このエピトープは、抗体により特異的に認識可能である。
本発明によるポリペプチドは、例えば、当業者に既知の方法に従って、本発明の核酸を、すでに上記したような適切な発現系で発現することにより調製できる。
適切な宿主細胞の例は、大腸菌株ＤＨ５、ＨＢ１０１またはＢＬ２１、酵母株サッカロミセス・セレビジアエ、昆虫細胞系、例えばスポドプテラ・フルジペルダから得られるレピドプテラン、または、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３およびＨｅＬａなどの動物細胞であり、その全てが一般的に入手できる。
【００５１】
特に、ポリペプチドの前記部分はまた、古典的ペプチド合成（メリーフィールド技術）により合成できる。それらは、特に、このようにして、本発明によるポリペプチドのさらなる機能的変異体を得るために、適切な遺伝子発現ライブラリーをスクリーニングすることに使用できる抗血清を得ることに適する。
本発明は、それ故また、本発明の核酸を適切な宿主細胞で発現し、適切な場合には単離する、本発明によるポリペプチドの調製法に関する。
【００５２】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドに特異的に反応する抗体に関し、ここで上記のポリペプチド部分それ自体は免疫原性であるか、またはウシ血清アルブミンなどの適切な担体に結合させることにより、免疫原性となることができる、またはその免疫原性を増加させることができる。
【００５３】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルである。同様に、本発明に関する調製は、例えば、哺乳動物、例えばウサギを、本発明によるポリペプチドまたは前記のその一部を用いて、適切な場合には例えばフロイントアジュバントおよび／水酸化アルミニウムゲルの存在下で免疫化することによる既知の方法に従って行なう（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１３４４）。次いで、既知の方法を使用して、免疫反応の結果として動物に形成されたポリクローナル抗体をすぐに血液から単離し、それらを、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製できる。Ｃ末端デサチュラーゼ断片が、例えば、ＮＨＳ活性化されたＨｉＴｒａｐカラムに結合している、抗体のアフィニティ精製が好ましい。
【００５４】
モノクローナル抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３）の既知の方法に従って調製できる。
【００５５】
Δ−６−デサチュラーゼは、すでに他の生物で記載されているが、テトラヒメナは組換え法により生産性の高い商業的に重要な株を作成する出発点として、および、ＰＵＦＡ生合成の遺伝子源としての両方の使用に適している。なぜなら、ＧＬＡを産生する場合に空間的／時間的収量が特に高いからである。従って、ＧＬＡ産生繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラから得られるΔ−６−デサチュラーゼおよびその使用を本発明に記載する。
【００５６】
脂肪酸構成（スペクトル）の組成を特異的に修飾するために組換え法を使用することは、Ｎａｐｉｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（１９９９）１２３〜１２７）、Ｍｕｒｐｈｙ＆Ｐｉｆｆａｎｅｌｌｉ（Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｅｍｉｎ．Ｓｅｒ．６７（植物脂質生合成）、（１９９８）９５〜１３０）およびＦａｃｃｉｏｔｔｉ＆Ｋｎａｕｆ（Ａｄｖ．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ．６：光合成における脂質：構造、機能および遺伝子学、Ｓｉｅｇｅｎｔｈａｌｅｒ＆Ｍｕｒａｔａ（編）Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ（１９９８）２２５〜２４８）に記載されている。
【００５７】
ＷＯ９８／４６７６３、ＷＯ９８／４６７６４およびＷＯ９８／４６７６５の文書は、真菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａから得られたデサチュラーゼおよびＰＵＦＡ産生における遺伝子の使用、およびまたデサチュラーゼのいくつかの部分的配列を記載する。第ＷＯ９３／０６７１２および第ＷＯ９６／２１０２２は、シアノバクテリウムからおよびルリヂサから得られたΔ６−デサチュラーゼ、および、シアノバクテリアおよび植物でのＰＵＦＡの産生におけるこれらの配列の使用をも記載する。第ＷＯ９９／２７１１１は、線虫から得られたデサチュラーゼおよびＰＵＦＡの産生におけるその使用を記載する。
【００５８】
Δ−６−デサチュラーゼは文献にも開示されている。しかし、これらのΔ−６−デサチュラーゼは、特に、植物（ルリヂサ（Ｓａｙａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７、９４：４２１１〜４２１６）、ヒメツリガネゴケ（Ｇｉｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）Ｐｌａｎｔ−Ｊ．１９９８  １５（１）：３９〜４８）、ヒマワリ（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５、２３２：７９８〜８０５））、真菌（モルチェレラ）、動物（マウス、ラット、カエノラブディティス（Ｎａｐｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０（２）、６１１〜６１４））、およびシアノバクテリウム（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９３、２９３〜３００）から得られたΔ−６−デサチュラーゼである。
【００５９】
一般に、目的は、栽培植物、特にセイヨウアブラナ、ヒマワリおよびその他などの油料種子における、これらの遺伝子の機能的で異種的な発現である。しかし、これまで刊行された全ての場合において、ＧＬＡ収量は非常に低い、および／またはΔ−６−デサチュラーゼ活性を有し、遺伝子工学により生産されたＧＬＡ産生生物は、商業的な重要性がない（Ｋｎｕｔｚｏｎ＆Ｋｎａｕｆ（１９９８）Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｅｍｉｎ．Ｓｅｒ．６７：２８７〜３０４）。
【００６０】
Ｍｕｒｐｈｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１０：１７５〜１８０）およびＫｎｕｔｚｏｎ＆Ｋｎａｕｆ（１９９８）は、例えば、トランスジェニック植物において脂肪酸スペクトルを特異的に修飾する上での問題および困難を記載している。
【００６１】
前述のテトラヒメナのＧＬＡの含量が高いということから、組換え法により、高度に生産的で商業的に重要な株を開発するために、この生物由来のＰＵＦＡ生合成遺伝子を使用することが有利である。テトラヒメナは大量培養で良好に、高い細胞密度で培養できる可能性があるということから、このように高度に生産的で商業的に興味ある株を、組換え法により作製するために、テトラヒメナそれ自体を使用することはさらに有利である。さらに、本発明の核酸を用いて、テトラヒメナ以外の他の生物を、ＧＬＡおよび他のΔ−６−不飽和脂肪酸の産生に使用することもできる。
【００６２】
テトラヒメナを発酵することによるＧＬＡの調製は、高等生物に比べて、脂肪酸構成（スペクトル）がかなり単純であるため、特に有利である。これに加えて、発酵的産生は、気候、栄養分供給等の外的因子に影響されない。さらに、このように得られた産物は、例えば、天然から得られる産物の場合にみられる環境汚染により生じ得る不純物をあまり含まない。
【００６３】
繊毛虫特異的テトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼをコードする本発明による核酸を使用して、ＧＬＡおよびΔ−６−不飽和脂肪酸を産生するか、または、前記脂肪酸の含量が実質的に野生型細胞（この場合、テトラヒメナ・サーモフィラ）と比べて増加している、トランスジェニック生物を産生できる（表１および２参照）。これらのトランスジェニック生物は、本発明による核酸配列を有するか、または、機能的にそれを発現する、好ましくは繊毛虫、特に好ましくはテトラヒメナである。このようなデサチュラーゼの発現により、Δ−６−不飽和脂肪酸またはそれから得られる二次産物が比較的増加する。この増加は、ＰＵＦＡ合成に関与する酵素および基質の濃度の変化に基づく。
【００６４】
本発明は、ＰＵＦＡ、特にＧＬＡおよびそれから得られるＰＵＦＡ、またはＧＬＡから得られる他の二次産物、またはΔ−６−不飽和脂肪酸の商業的生産に使用できる（図１参照：ＰＵＦＡ生合成）。ＧＬＡに加えて、このように、ＡＬＡを不飽和化することにより、例えば、産業で頻繁に使用される原材料であるステアリドン酸（１８：４Δ６、９、１２、１５）を調製できる。
【００６５】
特殊な実施形態では、本発明によるΔ−６−デサチュラーゼをコードする核酸を、適切な調節配列と機能的に組合せて使用することにより、酵素の発現を増加し、よってＧＬＡ産生生物でのＧＬＡ含量を増加するか、またはＬＡ産生生物でＧＬＡを産生できる。これに関連して、ヒマワリ、セイヨウアブラナおよび大豆などの油を産生する生物、および他の生物も同様に、特に関心をひく。これに加えて、例えばΔ−１２−デサチュラーゼ（例えば、Ｓａｋｕｒａｄａｎｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１：８１２〜８２０、Ｏｋｕｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９４）６（１）１４７〜５８）を同時に使用することにより、ＬＡを全く含まないか、ＬＡをほとんど含まない生物または細胞で、前記ＰＵＦＡを産生できる。同様に、ＧＬＡおよびΔ−６−不飽和脂肪酸の産生のために、ＧＬＡの生成に関与する３つのデサチュラーゼ、すなわちΔ６、Δ９およびΔ１２の組合せを使用できる。さらに、ＰＵＦＡ生合成（図１参照）に関与する他の遺伝子と合わせることは、本発明の別の好ましい実施形態を構成し、ＧＬＡおよびΔ−６−不飽和脂肪酸は、ＧＬＡが基質として作用する他の酵素により転換され、それにより、例えば、ＡＲＡ（２０：４）およびＧＬＡから得られる他の分子を調製することが可能である。
【００６６】
さらに、本発明は、新規ＧＬＡ含有栄養源、または、ＧＬＡまたは他のΔ６−不飽和脂肪酸から得ることのできる分子（特にＰＵＦＡ、例えばＡＲＡ）の豊富な栄養源の調製に使用できる。
【００６７】
さらに、本発明は、Δ−６−デサチュラーゼ遺伝子またはその一部を含む発現生成体、および異種調節配列とΔ−６−デサチュラーゼをコードする配列の機能的組合せも記載する。
【００６８】
本発明はさらに、記載のΔ−６−デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列および上記のΔ−６−デサチュラーゼ遺伝子の機能的生成体を使用することにより、ＧＬＡ含量の増加した（表１および２参照）、トランスジェニック生物の調製に関する。
【００６９】
ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを単離するための、および、ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを調製するための、多くの十分に確立された方法が知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）。
本発明に記載のデサチュラーゼまたはその一部を含む適切なベクターは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）分子生物学の現在のプロトコル、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｉｃｉａｔｅｓ、ニューヨーク）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されているような、当業者に既知の方法を使用して調製できる。
【００７０】
Δ−６−デサチュラーゼをコードする配列を含むベクターを、感染、トランスフェクション、電気穿孔法、粒子による撃ち込みおよび他の方法により細胞に導入できる。その場合、形質転換は、一般に、外来ＤＮＡの細胞への導入を意味すると理解される。その実施法は十分に確立され、当業者に既知の方法で実施できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２０５〜２２５、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｐ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：１３５〜１４１）。
【００７１】
ベクターも記載され、これらのベクターは、本発明のＤＮＡ配列または配列の一部を、宿主細胞の中で活性であるプロモーターまたは他の調節エレメントとの機能的組合せで含む。好ましい実施形態において、これらの調節エレメントは、繊毛虫、特にテトラヒメナで機能的に活性である核酸配列、例えばヒストンＨ４およびαおよびβ−チューブリンおよびその他のプロモーターである。
【００７２】
記載のΔ−６−デサチュラーゼをコードする配列を組換え発現する生物も、本発明に記載されている。それによって、これらの生物でΔ６−ＰＵＦＡを産生する可能性に加えて、例えば、組換えΔ６−デサチュラーゼまたはその一部を、標準的なタンパク質精製法（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５））を使用して単離する可能性もある。種々の生物でΔ−６−デサチュラーゼをコードする配列の発現に使用できるベクターは、当業者に既知の方法で調製できる。適切なベクターに関する詳細な情報は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｇｏｅｄｄｅｌ編（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓおよびＰｅｒｂａｌ（１９８８）分子クローニングの実践的なガイド、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社に見出し得る。
これらのベクターは、好ましくは、プロモーター、エンハンサーエレメント、上流活性化配列等の、発現に影響を及ぼす配列エレメント含む。誘導性および構成性プロモーター、または、例えば、組織特異的プロモーターは、発現の奏効に適する。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｒｅｓｔｒｅｐｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２  ９８７）、または、例えば、種子発達に関連して活性化されるプロモーターが、植物細胞での発現に適している。
【００７３】
使用するベクターは、好ましくはシャトルベクターである（Ｗｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１５６１〜１５６５、Ｂｕｓｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７５２５〜７５３３）。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明による核酸は、強力なプロモーター制御下でテトラヒメナにおいて発現する（例えばテトラヒメナβ−チューブリンプロモーター、Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。形質転換は、好ましくは、Ｇａｅｒｔｉｇら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：４６２〜４６５（または例えば、Ｇａｅｒｔｉｇ＆Ｇｏｒｏｖｓｋｙ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９１９６〜９２００）に記載の方法に従って行なうことができる。例えば、テトラヒメナ・サーモフィラα−またはβ−チューブリンプロモーターを、発現の調節エレメントとして使用できる。形質転換したテトラヒメナ細胞を選択培地で同定し、次いで、強化し培養する。細胞から脂質（リポイド）を単離するために標準的な方法を使用できる（例えば、Ｄａｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ６６、５４３）。脂肪酸のメチルエステルは、ガスクロマトグラフィーにより解析できる。
【００７５】
本発明による単離した核酸またはその一部はまた、他の生物から、特に例えば他の原生生物から、特に繊毛虫から関連遺伝子を単離するのに使用できる。本発明による核酸またはその一部は、相同遺伝子を単離するための、標識プローブとして使用できる。他の生物から単離しておいた核酸にプローブをハイブリダイズすることにより相同核酸配列を同定および単離できる。プローブは、当業者に既知の方法で標識できる（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記参照））。
放射性ヌクレオチド、または蛍光分子、ジゴキシゲニン、ビオチン、磁性分子または酵素などの検出可能な分子に連結したヌクレオチドが、例えば、プローブの標識に適する。相同ＤＮＡ配列は、異種ＤＮＡにプローブをハイブリダイズさせた後に標識を検出することにより、同定および単離する。ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーは、相同配列の探索に適している。これに加えて、サザンおよびノザンブロットが、相同配列の検出に適する。別に、標識プローブを選択的に保持すること（例えば磁気を使用して）により、標識プローブとハイブリダイズする相同ＤＮＡを単離できる。
【００７６】
交差ハイブリダイゼーションを使用した相同遺伝子の単離およびクローニングは、当業者に既知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５、分子生物学の現在のプロトコル、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、ニューヨーク）またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９、分子クローニング）に記載された方法により行なうことができる。
【００７７】
さらに、単離ＤＮＡ配列およびそれがコードするタンパク質配列に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による相同核酸配列の増幅に使用できる、オリゴヌクレオチドを設計できる。
【００７８】
相同タンパク質を単離する別の可能性は、それらを、本発明の配列によりコードされる、タンパク質またはその一部に対して指向された特定の抗体（例えばペプチド抗体）を使用して検出することにある。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＰＵＦＡ生合成の図である。
【図２】タンパク質データベースと、配列番号２に示したタンパク質配列を、ＢＬＡＳＴＰのデータベースで比較した結果を示す図である。
【図３】タンパク質データベースと、配列番号２に示したタンパク質配列を、ＢＬＡＳＴＰのデータベースで比較した結果を示す図である。
【図４】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したタンパク質配列のアラインメントの図である。
【図５】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したタンパク質配列のアラインメントの図である。
【図６】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したタンパク質配列のアラインメントの図である。
【図７】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したタンパク質配列のアラインメントの図である。
【図８】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したタンパク質配列のアラインメントの図である。
【図９】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したテトラヒメナ  ポリペプチド配列のマルチプルアラインメント。チトクロムｂ５ドメイン由来のヒスチジンボックスおよび保存ＨＰＧＧモチーフに下線を付してある。
【図１０】既知のデサチュラーゼと、配列番号２に示したテトラヒメナ  ポリペプチド配列のマルチプルアラインメント。チトクロムｂ５ドメイン由来のヒスチジンボックスおよび保存ＨＰＧＧモチーフに下線を付してある。
【図１１】配列番号１および３に示したテトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼ遺伝子の構造図である。
【図１２】ｐＢＤＥＳ６Δ−６−デサチュラーゼ発現生成体の調製を示す図である。
【図１３】ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏノックアウト生成体の調製を示す図である。
【図１４】テトラヒメナ野生型株（ＣＵ５２２）の脂肪酸構成（スペクトル）（主脂肪酸）と、テトラヒメナｐＢＤＥＳ６形質転換体（ＡＸ６０１およびＡＸ６０４）の脂肪酸のスペクトルの比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
最も重要な配列の説明
配列番号１：テトラヒメナ・サーモフィラΔ−６−デサチュラーゼのΔ−６−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
開始および終結コドンを強調している。
【００８１】
配列番号２：特殊な繊毛虫コドン使用度を考慮して、配列番号１から推定したテトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼのタンパク質配列（Ｗｕｉｔｓｃｈｉｃｋ  ＪＤ、Ｋａｒｒｅｒ  ＫＭ（１９９９）またはＣＵＴＧ（ＧｅｎＢａｎｋから作表したコドン使用度）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ．／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ＣＵＴＧ．ｈｔｍｌ）。
【００８２】
配列番号３：テトラヒメナ・サーモフィラΔ−６−デサチュラーゼのゲノムヌクレオチド配列。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明をこれらの実施例に制限されることなく説明するものである。
実施例１
生物および培養条件
テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｂ１８６８ＶＩＩ、Ｂ２０８６  ＩＩ、Ｂ＊ＶＩ、ＣＵ４２７、ＣＵ４２８およびＣＵ５２２株、米国ジョージア州アーセンズ所在ジョージア大学のＪ．Ｇａｅｒｔｉｇ博士より親切にも提供された）を、修飾ＳＰＰ培地（２％プロテオースペプトン、０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ（Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４５４９〜４５５３））またはスキムミルク培地（２％スキムミルク粉末、０．５％酵母抽出物、１％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）またはＭＹＧ培地（２％スキムミルク粉末、０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）中、抗生物質溶液（１００Ｕのペニシリン／ｍｌ、１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌおよび０．２５μｇのアムホテリシンＢ／ｍｌ（ＳＰＰＡ培地））を加えた存在下で、３０℃で、２５０ｍｌの三角フラスコ中５０ｍｌの容量で振盪（１５０ｒｐｍ）しながら培養した。
プラスミドおよびファージを、大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’、ＴＯＰ１０Ｆ’、またはＪＭ１０９で複製し、選び出した。細菌を、標準的な濃度の抗生物質を含む、ＬＢまたはＮＺＹ培地中で標準的な条件下で培養した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリング、ニューヨーク）。
【００８４】
実施例２
テトラヒメナ・サーモフィラｃＤＮＡライブラリーの調製
テトラヒメナ・サーモフィラ全ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート／フェノール／クロロホルム法を使用して単離した（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１：１５６〜１５９）。ｍＲＮＡを、オリゴテックス−ｄＴビーズ（キアゲン）を使用して全ＲＮＡから単離した。ｃＤＮＡを、ストラタジーンＺＡＰ発現ｃＤＮＡ合成法およびクローニングキットを使用して合成した。ＥｃｏＲＩアダプターをライゲートし、ＸｈｏＩで消化した後、ＤＮＡを、アガロースゲル上で分離し、サイズ分画した（Ｓ：５００〜１５００ｂｐ、Ｂ：１５００ｂｐより大きい）。ＤＮＡを、ゲル（クイアクイックゲル抽出キット、キアゲン）から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断しておいた、ＺＡＰ  発現ベクターにライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを、インビトロでファージにパッケージングし（ストラタジーン  ギガパックＩＩＩゴールド）、ファージを、大腸菌  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’中で複製した。ＳｃＤＮＡライブラリーは、平均挿入サイズが１．１ｋｂの約５×１０５個のクローンを含むが、ＢｃＤＮＡライブラリーは、平均挿入サイズが２ｋｂの約６×１０４個のクローンを含んでいる。
【００８５】
実施例３
Δ−６−デサチュラーゼ特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ
既知のデサチュラーゼの配列と比較することにより、保存領域を同定できた。特殊な繊毛虫コドン使用度ないしテトラヒメナコドン使用度を考慮に入れ、特に強く保存されたアミノ酸領域ＷＷＫＷＮＨＮＡＨＨ（配列番号４）およびＧＧＬＱＦＱＩＥＨＨＬＦＰ（配列番号５）のＰＣＲプライマーを設計することができた（Ｗｕｉｔｓｃｈｉｃｋ，ＪＤ、Ｋａｒｒｅｒ  ＫＭ（１９９９）テトラヒメナ・サーモフィラにおけるゲノムＧ＋Ｃ含量、コドン使用度、開始コドン内容および翻訳終結部位の解析、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（３）２３９〜４７；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ（１９８９）Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３６、１：２９〜３４、ＣＵＴＧ、（ＧｅｎＢａｎｋから作表したコドン使用度）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ．／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ＣＵＴＧ．ｈｔｍｌ）。
【００８６】
プライマー１（センス）：５’−ＴＧＧＴＧＧＡＡＲＴＧＧＡＭＮＣＡＹＡＡ−３’（配列番号６）
プライマー２（アンチセンス）：５’−ＣＧＤＧＧＲＡＡＮＡＲＲＴＧＲＴＧＴＴＣ−３’（配列番号７）
１００ｎｇの単離ｍＲＮＡを、ＡＭＶ逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム）を使用する第一鎖合成に使用した。反応は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２ｐｍｏｌのオリゴ−ＤＴアンカープライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴ（１６）Ｖ−３’；配列番号８）、２単位のＡＭＶ逆転写酵素、２０μｌの容量中６０分間５５℃、続いて１０分間６５℃で、製造業者のプロトコルに従って実施した。
この第一鎖反応の１／１０を、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲは、１×キアゲンＨｏｔＳｔａｒＴａｑＰＣＲ緩衝液（キアゲン）、ｐＨ８．７（２０℃）、１０ｐｍｏｌの各Δ−６−デサチュラーゼ特異的プライマー、各場合とも２００μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１単位のＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼ（キアゲン）を含む、２５μｌの容量中で実施した。
ＰＣＲは、以下の条件下で実施した：最初に９５℃で１５分間で変性、これに次いで、各場合とも９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる３５サイクル、最後に７２℃で１０分間。
ＰＣＲ断片をベクターｐＣＲ２．１に、Ｔ／Ａクローニング（インビトロゲン）によりライゲートし、大腸菌  ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロゲン）で複製した。プラスミドＤＮＡを、陽性クローンから単離し（Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ、キアゲン）配列決定した。
【００８７】
実施例４
完全Δ−６−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡの単離
このように決定した配列に基づいて、新規オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ用に設計した：
プライマーｄ６／１−Ｆ（センス）：５’−ＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号９）および
プライマーｄ６／１−Ｒ（アンチセンス）：５’−ＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１０）
完全Δ−６−デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、ｃＤＮＡライブラリーから、これらのプライマーをベクター特異的プライマー（Ｔ３およびＴ７）と組合せて使用して単離した。２μｌ（１０５ｐｆｕ／μｌ）のｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲに使用した（上記参照）。
上記の条件とは別に、ＰＣＲを、以下のプロトコルに従って実施した：９５℃で１５分間変性し、これに次いで、９４℃で２０秒間、５７℃で２０秒間および７２℃で１分間からなる３５サイクル、最後に７２℃で１０分間。
ＰＣＲ産生物を、ＰＣＲにも使用したプライマーを使用して配列決定した。このように得られた配列情報に基づいて、ｃＤＮＡ配列の５’末端に位置する新規プライマーを設計した：
プライマーｄ６−５’−Ｆ：ＡＧＴＡＡＧＣＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＣ（配列番号１１）
このプライマーを、ベクター特異的プライマーと組合せて使用して、ＰＣＲ（ＰＣＲ条件については上記参照）により完全ｃＤＮＡを増幅および単離することができた。プラスミドｐＤＥＳ６は、このＰＣＲ産生物をベクターｐＣＲ２．１にクローニングすることにより得た。
【００８８】
実施例５
テトラヒメナ・サーモフィラゲノムＤＮＡライブラリーの調製
ゲノムＤＮＡを、尿素法（Ｇａｅｒｔｉｇら、１９９４）により、テトラヒメナから単離し、ＥｃｏＲＩで切断した。切断ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで同様に切断しておいた、λベクター（Ｚａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ストラタジーン）にライゲートした。さらなる処理は、ｃＤＮＡライブラリーの場合に記載した手順に応じて行った。
【００８９】
実施例６
Δ−６−デサチュラーゼゲノム配列の単離
Δ−６−デサチュラーゼのゲノム配列を、ＰＣＲを用いて調べた。最初に、全コード配列およびイントロンを含む、約２２００ｂｐのサイズのＰＣＲ産生物を、ゲノムＤＮＡから、ｃＤＮＡの５’および３’末端からのプライマーを使用して作製した：
ｄ６−５’−Ｆ：ＡＧＴＡＡＧＣＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＣ（配列番号１２）
ｄ６−３’−Ｒ：ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＣＴＴＡＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＴＣ（配列番号１３）
ゲノムウォーカーシステム（クロンテック）を使用して、Δ−６−デサチュラーゼ遺伝子のフランキング配列を単離した。このシステムからの普遍的なプライマーおよび決定しておいたΔ−６−デサチュラーゼ配列に基づいた特異的プライマー、すなわち、
ｄ６−５’−Ｒ：ＣＴＴＡＡＧＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１４）
ｄ６−３’−Ｆ：ＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号１５）
を使用して、テトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼ遺伝子のフランキング領域を単離できた。ゲノム配列の完全構造を図１１に示す。
【００９０】
実施例７
ｐＢＤＥＳ６発現生成体の調製
ベクターｐＢＩＣＨ３（Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：４６２〜４６５）は、テトラヒメナ・サーモフィラＢＴＵ１遺伝子の非コード調節配列によりフランキングされる、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ  Ｉ抗原（Ｇ１）プレタンパク質をコードする配列を含む。開始点にＮｓｉＩ切断部位を含む、修飾プラスミド（ｐＢＩＣＨ３−Ｎｓｉ）（米国ＧＡ州アセンズ所在ジョージア大学のＪ．Ｇａｅｒｔｉｇ博士より親切にも提供された）を使用して、Δ−６−デサチュラーゼ発現生成体ｐＢＤＥＳ６を調製した。このために、ＰＣＲを使用して、テトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼをコードする配列の始点および終点にＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を挿入した。Δ−６−デサチュラーゼ（ｐＤＥＳ６）の完全ｃＤＮＡ配列を含む、単離プラスミドを、ＰＣＲの鋳型として使用した。
【００９１】
プライマー
Ｄ６−Ｎｓｉ−Ｆ：５’−ＧＣＡＴＴＡＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＧＡＣＴＴＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１６）
Ｄ６−Ｂａｍ−Ｒ：５’−ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＧ−３’（配列番号１７）
は、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ切断部位によりフランキングされる、Δ−６−デサチュラーゼをコードする完全配列を含む、ＰＣＲ産生物を作製した。ＰＣＲ産生物およびプラスミドｐＢＩＣＨ３−Ｎｓｉを、制限酵素ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル上で精製し、共にライゲートした（プラスミド作製図参照）。得られたｐＢＤＥＳ６発現生成体は、ＢＴＵ１遺伝子の調節配列の正しいリーディングフレーム内に挿入された、完全Δ−６−デサチュラーゼをコードする配列を含んでいる（図１２参照）。
テトラヒメナを形質転換するために、生成体を、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化することにより線形化した。形質転換が成功裡にできれば、ＢＴＵ１遺伝子を、相同的組換えにより、これらの生成体と交換し、よって、細胞はパクリタキセルに耐性となった。
【００９２】
実施例８
形質転換体の脂肪酸構成（スペクトル）の決定
脂肪酸構成（スペクトル）は、フレームイオン化検出器（米国ウィルミントン所在ヒューレットパッカード社）ガスクロマトグラフ（ＨＰ  ＧＣ  ６８９０）を使用して決定した。使用したカラムはＦＦＡＰ（遊離脂肪酸相）Ｐｅｒｍｂｏｎｄ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ、デューレン）であった。脂肪酸は、脂肪酸メチルエステル標準の保持時間との比較により同定した。既知濃度の標準に基づいて、試料中の脂肪酸の濃度を決定することができた。
脂肪酸スペクトルを決定するために、単離した形質転換体を、２４〜９６時間、ＭＹＧ培地中で３０℃で１５０ｒｐｍで培養した。５０ｍｌの培養液を、１５００Ｇで１５分間遠心分離し、その後、上澄を廃棄し、ペレットを−８０℃で凍結し、続いて凍結乾燥した。５０ｍｇの凍結乾燥試料を秤量し、１ｍｌの２０％メタノール性ＨＣｌおよび１ｍｌのメタノール性標準溶液（１ｍｇ／ｍｌ）で処理した。脂肪酸を遊離し、それらを脂肪酸メチルエステルにエステル交換するために、試料を、６０℃で２時間、封をした試験管の中で水浴中で撹拌し、次いで室温まで冷却した。次いで、１ｍｌの炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を加えて、注意深く混合しながら、試料を中和した。脂肪酸メチルエステルを、ｎ−ヘキサンを添加することにより抽出した。続いて、調製物を、激しく十分に混合し、４３００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより相分離を起こした。上の有機相の約２／３を取り出し、１μｌの試料を、ＧＣカラムに注入し、分析した。
【００９３】
【表１】
2011078425.tif 000002
【００９４】
【表２】
2011078425.tif 000003
【００９５】
これらの条件下で、形質転換体は、非形質転換株ＣＵ５２２と比べて２２〜３２％増加した、全脂肪酸スペクトル中のＧＬＡ含量を示している（表１）。ＧＬＡ含量の変動に加えて、高含量の不飽和脂肪酸への、脂肪酸スペクトルの顕著な変動も驚きである。形質転換体では、不飽和（主）脂肪酸と飽和（主）脂肪酸の比も、ほぼ２倍である（表２）。
【００９６】
実施例９
Δ−６−デサチュラーゼノックアウト生成体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの調製
ノックアウト生成体を調製するために、プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３（Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５３９１〜５３９８）からのｎｅｏカセットを、Δ−６−デサチュラーゼゲノム配列に挿入した。このｎｅｏカセットは、テトラヒメナヒストンＨ４プロモーターの制御下のネオマイシン耐性遺伝子およびＢＴＵ２遺伝子の３’−フランキング配列からなる。テトラヒメナでは、この生成体は、パロモマイシンに対する耐性を媒介する。プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３をＥｃｏ  ＲＶ／ＳｍａＩで切断し、約１．４ｋｂサイズのｎｅｏカセット断片を、ＥｃｏＲＶで切断しておいたプラスミドｐｇＤＥＳ６に含まれるテトラヒメナΔ−６−デサチュラーゼゲノム配列にライゲートした（図１４参照）。これにより、プラスミドｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏが得られる。形質転換が成功裡にできれば、Δ−６−デサチュラーゼをコードする遺伝子を、この生成体と、相同的組換えにより交換し、よって、細胞はパロモマイシンに耐性となった。
【００９７】
実施例１０
デサチュラーゼ発現生成体ｐＢＤＥＳ６を使用したテトラヒメナの巨核形質転換
５×１０６個のテトラヒメナ・サーモフィラ細胞（ＣＵ５２２）を、形質転換に使用した。細胞を、２５０ｍｌの三角フラスコ中５０ｍｌのＳＰＰＡ培地中、３０℃で１５０ｒｐｍで振盪しながら、細胞密度が約３〜５×１０５細胞／ｍｌに達するまで培養した。細胞を、５分間遠心分離（１２００Ｇ）することによりペレット化し、細胞ペレットを、５０ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前記のように遠心分離した。この洗浄段階を繰り返し、細胞を、細胞密度３×１０５細胞／ｍｌで、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、抗生物質も加える）に再懸濁し、その後、それらを２５０ｍｌの三角フラスコに移し、３０℃で１６〜２０時間振盪せずにインキュベートした（飢餓期）。飢餓期後、細胞数を、再度決定し、その後細胞を、上記のように遠心分離し、その後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で、５×１０６細胞／ｍｌの濃度まで調整した。１ｍｌの細胞を形質転換に使用した。形質転換は、微粒子撃ち込みにより行なった（下記参照）。
【００９８】
再生のために、細胞を、ＳＳＰＡ培地にとり、３０℃で三角フラスコ中で振盪せずにインキュベートした。３時間後、パクリタキセル（登録商標）を加えて、最終濃度を２０μＭとし、細胞を、１００μｌずつ、９６穴マイクロタイタープレートに移した。細胞を、３０℃で、湿気のある暗いボックス中でインキュベートした。２〜３日後、パクリタキセル耐性クローンを同定できた。陽性クローンを、２５μＭのパクリタキセルを含む新しい培地に接種することにより移した。完全「表現型組合せ」（Ｇａｅｒｔｉｇ＆Ｋａｐｌｅｒ（１９９９））は、細胞を、濃度をあげたパクリタキセル（８０μＭまで）中で培養することにより行なった。クローンを解析するために、約４ｍｌの培養液を、パクリタキセル含有ＳＰＰＡ中で増殖し、その後、ＤＮＡを単離し（Ｊａｃｅｋ  Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４５４９〜４５５３）、ＢＴＵ１座に組込んだＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。
使用したプライマーは、ＢＴＵ１特異的プライマーＢＴＵ１−５’Ｆ（ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣ、開始コドンの約５０ｂｐ上流、配列番号１８）およびＢＴＵ１−３’Ｒ（ＧＴＴＴＡＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＴＣ、終結コドンの３ｂｐ下流、配列番号１９）であった。
ＰＣＲ産生物を、非切断状態で、または、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＶ（ｐＢＤＥＳ６）またはＥｃｏＲＩ（ｐＢＤＥＳ９）で切断しておいて、１％アガロースゲル上で解析した。完全「表現型組合せ」は、ＢＴＵ１特異的プライマー（Ｇａｅｒｔｉｇ＆Ｋａｐｌｅｒ（１９９９））を使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【００９９】
実施例１１
ノックアウト生成体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏを使用した、テトラヒメナの微小核および巨核形質転換
異なる対を形成する型（ＣＵ４２８ＶＩＩおよびＢ２０８６ＩＩ）のテトラヒメナ株を、別々に、ＳＰＰＡ培地中で、３０℃で振盪（１５０ｒｐｍ）しながら、三角フラスコ中で培養した。細胞密度が３〜５×１０５細胞／ｍｌの時に、細胞を、５分間室温で遠心分離（１２００Ｇ）した。細胞を、３回、５０ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、最後に、５０ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、その後、抗生物質溶液を加えた。細胞を３０℃で振盪せずに三角フラスコ中でインキュベートした。約４時間後、２つの培養液を再度計測し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で３×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、その後、３０℃でさらに１６〜２０時間インキュベートした。この飢餓期後に、２つの培養液からの同じ（絶対）数の細胞を、２Ｌ三角フラスコ中で混合した。細胞を３０℃でインキュベートし（コンジュゲーションの開始）、コンジュゲーションの効率を、２時間後に決定した。形質転換を成功させるためには、約３０％の細胞が、この時点で対として存在すべきである。
微小核形質転換のために、各場合とも、１×１０７のコンジュゲート細胞（５×１０６対）を、コンジュゲート開始の３時間、３．５時間、４時間および４．５時間後に、１２００Ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを１ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
新規巨核原生生物の形質転換のために、細胞を、上記のように、コンジュゲート開始の１１時間後に遠心分離し、トリス−ＨＣｌに再懸濁した。形質転換は、微粒子撃ち込みにより行なった（上記参照）。Δ−６−デサチュラーゼノックアウト変異体を培養するために、２００μｇのルリヂサ油（２０〜２５％ＧＬＡ；シグマ）を培地に加えた。
【０１００】
パロモマイシン耐性を選抜することにより、形質転換した細胞を同定できた。微小核の形質転換の場合、パロモマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を、コンジュゲート開始の１１時間後に加え、細胞を、１００μｌずつ９６穴マイクロタイタープレートに分配した。細胞を、３０℃の加湿ボックス中でインキュベートした。２〜３日後に耐性クローンを同定できた。６−メチルプリンに対する巨核形質転換体の耐性に基づいて、真の微小核形質転換体を識別できた。
巨核を形質転換する場合、パロモマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を、形質転換の約４時間後に加え、細胞を、１００μｌずつ９６穴マイクロタイタープレートに分配した。細胞を３０℃の加湿ボックス中でインキュベートした。２〜３日後に耐性クローンを同定できた。陽性クローンを、１２０μｇのパロモマイシン／ｍｌを含む新しい培地に接種することにより移した。完全「表現型組合せ」（Ｇａｅｒｔｉｇ＆Ｋａｐｌｅｒ（１９９９））は、この高いパロモマイシン濃度中で細胞を培養することにより数世代後に達成された。Ｂ＊ＶＩ株と微小核形質転換体を交雑することにより、ホモ接合性ノックアウト変異体を作成することができた（Ｂｒｕｎｓ＆Ｃａｓｓｉｄｙ−Ｈａｎｌｅｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６２巻（１９９９）２２９〜２４０）。
【０１０１】
実施例１２
微粒子銃による形質転換（微粒子撃ち込み）
テトラヒメナ・サーモフィラを、Ｂｒｕｎｓ＆Ｃａｓｓｉｄｙ−ＨａｎｌｅｙＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６２巻（１９９９）５０１〜５０２）；Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：４６２〜４６５）またはＣａｓｓｉｄｙ−Ｈａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４６：１３５〜１４７）に記載のように、微粒子銃による形質転換により形質転換した。バイオリスティック（登録商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達系（バイオラッド）の操作は、添付マニュアルに詳述されている。形質転換のために、６ｍｇの金粒子（０．６μｍ；バイオラッド）に、１０μｇの線形化プラスミドＤＮＡ（Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３：３〜１６；Ｂｒｕｎｓ＆Ｃａｓｓｉｄｙ−Ｈａｎｌｅｙ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６２巻：５０１〜５１２）を装着する。
【０１０２】
金粒子の調製：
６０ｍｇの０．６μｍの金粒子（バイオラッド）を、１ｍｌのエタノールに再懸濁した。このために、粒子を、３回、各場合について１〜２分間、ボルテックスで激しく混合した。続いて、粒子を１分間遠心分離（１００００Ｇ）し、上澄をピペットを使用して注意して取り出した。金粒子を、１ｍｌの無菌水に再懸濁し、上記のように遠心分離した。この洗浄段階を、１回繰り返し、粒子を、１ｍｌの５０％グリセロールに再懸濁し、１００μｌずつ−２０℃で保存した。
形質転換体の調製：
マクロ担体ホールダー、マクロ担体およびストップスクリーンを、数時間、１００％エタノール中で保存し、一方、破裂ディスクはイソプロパノールに保存した。マクロ担体を、続いて、マクロ担体ホールダーに挿入し、風乾した。
【０１０３】
金粒子にＤＮＡを装着する：
全段階を、４℃で実施した。金粒子、調製したベクター、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２、１Ｍスペルミジンおよび７０％および１００％エタノールを、氷上で冷却した。１０μｌの線形ベクターＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を、１００μｌの調製した金粒子に加え、混合物を、注意して１０秒間ボルテックスにかけた。続いて、１００μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２を、最初に加え、その後、混合物を１０秒間ボルテックスにかけ、次いで、４０μｌの１Ｍスペルミジンを加え、混合物を注意して１０分間ボルテックスにかけた。２００μｌの７０％エタノールを添加した後、粒子を１分間ボルテックスにかけ、次いで１００００ｇで１分間遠心分離した。ペレットを、２０μｌの１００％エタノールに再懸濁し、遠心分離し、次いで３５μｌの１００％エタノールに再懸濁した。このように調製しておいた粒子をピペットを使用して、注意してマクロ担体の中心に加えた。続いて、マクロ担体を、形質転換が生じるまで、吸湿性シリカゲルを含むボックスに保存した。
【０１０４】
形質転換：
１ｍｌの調製細胞（上記参照）を、ペトリ皿中の、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で加湿しておいた丸いフィルターの中心に加え、バイオリスティック（登録商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム形質転換チャンバー中の最も低いスライドイン棚に挿入した。形質転換は、形質転換チャンバー中、９００ｐｓｉの圧力と（２つの４５０ｐｓｉの破裂ディスク）、２７インチＨｇの減圧下で、調製した金粒子を使用して実施した。次いで、細胞を、直ちに、５０ｍｌのＳＰＰＡ培地を含む三角フラスコに移し、振盪せずに３０℃でインキュベートした。
[配列表]
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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