(57)【要約】      （修正有）【課題】血管の狭窄または再狭窄を予防するための被験哺乳類の治療法の提供。【解決手段】血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）および／または血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）遺伝子またはタンパク質を用いた血管の狭窄または再狭窄を予防する材料および方法。【選択図】図３
2011173874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管の狭窄または再狭窄を予防するための被験哺乳類の治療法であって、血管の狭窄または再狭窄を予防するための治療を必要とする被験哺乳類に、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物を投与する工程を含んでなり、それによって血管の狭窄または再狭窄を予防する方法。
【請求項２】
被験哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が哺乳類ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組成物がヒトＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドが、配列番号２の連続部分を含んでなるアミノ酸配列を含んでなり、その連続部分がそのアミノ末端として配列番号２の３０〜１３１位からなる群から選択されるアミノ酸を有しかつそのカルボキシル末端として配列番号２の２１１〜４１９位からなる群から選択されるアミノ酸を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をも含んでなり、分泌シグナルペプチドをコードする配列がＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする配列とインフレームで結合している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが配列番号２のアミノ酸２２８〜４１９をコードするヌクレオチド配列を欠いている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが配列番号２のアミノ酸３２〜１０２をコードするヌクレオチド配列を欠いている、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが分泌シグナル配列およびＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする配列に作動可能に結合したプロモーター配列を更に含んでなり、このプロモーター配列が被験哺乳類の細胞の分泌シグナル配列およびＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする配列の転写を促進する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする配列に作動可能に結合したポリアデニル化配列を更に含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が遺伝子治療ベクターを含んでなり、その遺伝子治療ベクターが前記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ベクターが複製欠損アデノウイルスを含んでなり、そのアデノウイルスがプロモーターに作動可能に結合したポリヌクレオチドを含んでなりかつアデノウイルスポリヌクレオチド配列が隣接している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が薬学上許容可能なキャリヤーを更に含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
投与が、組成物の少なくとも１回血管内投与することを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
投与が、組成物の被験哺乳類の血管へのカテーテルを介する導入を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
カテーテルを介する遺伝子の導入が、被験哺乳類の冠状動脈へカテーテルを導入し、冠動脈へ組成物を放出することを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与を、ヒトにおいて経皮的経管的冠動脈形成と同時に行う、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、血管の狭窄または再狭窄の予防に有効な量のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
投与が、被験哺乳類に血管内ステントを移植することを含んでなり、そのステントが組成物をコーティングまたは含浸させている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複製欠損アデノウイルスベクターを血管に送達することを含んでなる、ヒトの血管の狭窄または再狭窄を予防するための治療であって、、そのベクターがＶＥＧＦ−ＣポリペプチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドから選択されるポリペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、および血管の細胞で少なくとも一種類のポリペプチドの発現を促進するためのプロモーター配列を更に含んでなり、これにより血管の狭窄または再狭窄を予防することを含んでなる、治療。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドがＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血管の狭窄を治療するための手術中に血管の表面に接触するように設計された医療装置であって、再狭窄の予防に有効な組成物であって、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物を装置に組込んでなる改良を特徴とする、装置。
【請求項２３】
装置が、血管内ステント、血管内カテーテル、血管外カラー、血管内ステントまたはカテーテルの表面を被覆するのに適したエラストマー膜、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の医療装置。
【請求項２４】
血管の表面に接触するための外部表面を有する血管内ステントと、その表面上の組成物であって、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物とを含んでなる、請求項２２に記載の医療装置。
【請求項２５】
血管の表面に接触するための外部表面を有するカテーテルと、その表面上の組成物であって、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の部材を含んでなる組成物とを含んでなる、請求項２２に記載の医療装置。
【請求項２６】
治療薬を血管の内部に送達する目的で保持するためのボイドを有するバルーンカテーテル、およびボイドに含まれる組成物であって、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物を含んでなる、請求項２２に記載の医療装置。
【請求項２７】
ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を保持する容器と、容器に取り付けられまたは容器と一緒に包装されたラベルであって、血管の再狭窄を予防するための化合物の使用を記載したラベルを含んでなる、再狭窄治療用キット。
【請求項２８】
血管内ステント、血管内カテーテル、血管外カラー、および血管内ステントまたはカテーテルの表面を被覆するのに適した膜からなる群から選択される医療装置を更に含んでなる、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
血管の狭窄または再狭窄の治療または予防用の医薬を製造するための組成物の使用であって、その組成物が血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種類の再狭窄防止薬を含んでなる、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血管の狭窄および再狭窄を予防する材料および方法に関し、一般的には循環器薬の分野に関する。
【０００２】
冠動脈疾患は、世界中、特に米国および欧州での罹病率および死亡率の主要な原因となっている。経皮的経管的冠動脈形成（例えば、冠動脈内ステンティングを行うまたは行わないバルーン血管形成）はこのような疾患に最もよく用いられかつ成功率の高い治療法であり、米国だけでも年に数十万回行われている。しかしながら、このような血管再生法の１／３〜１／２程度で、再狭窄が起こる。再狭窄の経済コストは、米国だけでも年に２０億ドルと計算されている[Feldman et al., Cardiovascular Research, 32: 194-207 (1996); この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される]。剖検およびアテレクトミー研究により、再狭窄損傷の主要な組織学的成分として脈管内膜過形成が確認されている[Cerek et al., Am. J. Cardiol., 68: 24C-33C (1991)]。
【０００３】
再狭窄は、末梢血管で行われる血管形成においても関心を集めている。同様に、狭窄は、心臓バイパス療法、または末梢血管虚血や間欠跛行の治療のための血管（例えば、移植したおよび移植した人工血管）移植後の臨床的関心事である（例えば、膝上大腿膝窩動脈バイパス移植片）。
【０００４】
Mazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21: 104-111 (1994)には、再狭窄は主として経皮冠動脈形成によって引起される損傷に対する動脈の応答であり、内皮細胞およびその下の中膜の平滑筋細胞の脈管内膜層を崩壊させることが述べられている。この著者は、血小板、内皮細胞、マクロファージおよび平滑筋細胞によって分泌される複数の増殖因子が再狭窄過程に機械的に関与しており、平滑筋細胞の増殖が決定的な病因であることを述べている。著者らによれば、この平滑筋細胞の増殖は機械的および薬物療法に抗療性であることが明らかになった。更に最近、他の研究者らは、平滑筋細胞の増殖が再狭窄に極めて重要である(of penultimate importance)かどうかに異議を唱えている。Libby, Circ. Res., 82: 404-406 (1998)を参照されたい。
【０００５】
Nairns et al., Circulation, 97: 1298-1305 (1998)は、再狭窄の予防における冠動脈内ステントの使用およびそれらの利点と限界について概説している。Debbas et al., American Heart Journal, 133: 460-468 (1997)は、ステント内でステンティングを行い、ステント内再狭窄を治療することを記載している。
【０００６】
Chang & Leiden, Semin. Intervent. Cardiol., 1: 185-193 (1996)（この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）は、再狭窄を治療するための体腔遺伝子療法を概説している。Chang & Leidenは、複製欠損アデノウイルスが再狭窄の予防を目的とする遺伝子療法の有望かつ安全なベクター系であることを教示しているが、このウイルスは血管平滑筋など広汎な種類の細胞型に効率的に感染することができ、このウイルスは高力価で産生することができ（例えば、１０１０〜１０１２プラーク形成単位／ml）、このウイルスは大きさが例えば、７〜９キロ塩基（kb）のトランスジーンを収容することができ、このウイルスは標準的なカテーテルにより経皮的に送達することができ、かつこのウイルスは宿主ゲノムに組込まれないからである。Chang & LeidenおよびFeldman et al.（上記引用）は共に、再狭窄の特徴である新内膜形成に関与すると考えられている増殖する血管平滑筋細胞を殺しまたは阻止するようにデザインされている細胞毒性および細胞増殖抑制遺伝子療法も概説している。
【０００７】
Riessen & Isner, J. Am. Coll. cardiol., 23: 1234-1244 (1994)（この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）には、血管内薬剤送達の装置および血管内遺伝子療法のベクターが概説されている。
【０００８】
Cerek et al., Am. J. Cardiol., 68: 24C-33C (1991)には、動脈損傷の増殖因子による治癒を抑制することによる再狭窄の予防が示唆されている。血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボスポンジン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）およびβ（ＴＧＦ−β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の潜在的役割が記載されている。
【０００９】
Isner & Asaharaの国際特許公表ＷＯ９８／１９７１２号明細書（この特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）では、患者の内皮前駆細胞を単離し、この細胞を患者に再投与することによって損傷した血管を治療し、血管形成後の再内皮形成を促進することが示唆されている。この著者は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）または塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような新脈管形成促進増殖因子を用いることの有効性は、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦがその効果を発揮する内皮細胞を欠いているため限定されることがあることを示唆している。
【００１０】
Martin et al.の国際特許公表ＷＯ９８／２００２７号明細書には、ＶＥＧＦ遺伝子またはタンパク質を用いて血管の狭窄または再狭窄を治療または予防することが示唆されている。著者らは、ＶＥＧＦの好ましい効果が、内皮が損傷していた場合の再内皮形成の刺激に関するＶＥＧＦの活性の基礎となっている機構以外の異なる作用機構から生じることを示唆している。
【００１１】
Callow et al., Growth Factors, 10: 223-228 (1994)には、血管透過因子（ＶＥＧＦとしても知られている）をバルーン血管形成によって誘発された内皮露出を行ったウサギに静脈内投与すると、対照と比較して内皮の再生が増加したことが記載されている。著者らは、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が再内皮形成の促進に友好であるが、この再内皮形成は新内膜損傷の大きさの増加を伴うことも述べている。
【００１２】
Asahara et al., Circulation, 94: 3291-3302 (December 15, 1996)は、ＣＭＶ−ヒト−ＶＥＧＦ１６５トランスジーンの局部経皮カテーテル送達によりバルーンにより損傷したウサギにおける再内皮形成が促進され、内膜の肥厚化が少なくなったことを述べている。著者の関連グループの報告であるVan Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol., 29: 1371-1379 (May, 1997)は、ステント内皮形成がＣＭＶ−ヒト−ＶＥＧＦ１６５トランスジーンの送達によって促進されかつ内膜の肥厚化もみられたことを述べている。
【００１３】
Morishita et al., J. Atherosclerosis and Thrombosis, 4(3): 128-134 (1998)は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）はＶＥＧＦより強いヒト内皮細胞に対する分裂促進作用を有することを述べており、ＨＧＦ遺伝子療法が血管形成後の再狭窄のような循環器疾患の治療に潜在的な治療価値を有する可能性があるという仮説を立てた。Morishita et al.は、内皮細胞のみを刺激し、血管平滑筋細胞は刺激しない増殖因子についてはほとんど知られていないことも述べている。
【００１４】
DeYoung & Dichek, Circ. Res., 82: 306-313 (1998)は、ＶＥＧＦ遺伝子送達は現在のところヒトの冠動脈再狭窄に用いられる予定になっているとは思われず、かつ２つの独立した研究はＶＥＧＦ送達が動脈の内膜過形成を実際に悪化させることがあることを示唆していることを述べている。
【００１５】
Brown et al.の米国特許第５，７９５，８９８号明細書は、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦシグナル形成の阻害剤を用いて血管形成後の冠状血管または他の動脈の再狭窄に関与するアテローム発生の促進を抑制することを提案している。
【００１６】
上記の論文は、血管形成材料および／または方法の改良、および／または補助療法を行って再狭窄の事例を減少させるための久しく感じていた要望が存在し続けていることを示している。
【００１７】
発明の概要
本発明は、哺乳類の血管における狭窄または再狭窄を予防するための材料および方法を提供することにより医薬の分野で久しく感じられてきた要望を解決する。
【００１８】
例えば、本発明は、被験哺乳類を治療して血管の狭窄または再狭窄を予防する方法であって、血管の狭窄または再狭窄を予防するための治療を必要とする被験哺乳類に、ポリヌクレオチドを含んでなる組成物であって、ポリヌクレオチドが血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるものである組成物を投与する工程を含んでなる方法を提供する。好ましい態様では、被験動物はヒト被験者である。
【００１９】
ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは狭窄を予防する目的で純粋に予防治療として投与することができると考えられるが、好ましい態様では、経皮経腔冠動脈形成法の直前および／または同時および／または直後に被験者の血管の再狭窄を予防する目的でポリヌクレオチドを投与することが考えられる。もう一つの好ましい態様では、ポリヌクレオチドをバイパス処置（例えば、冠状動脈バイパス法）の前、中および／または直後に投与し、移植血管中または付近での狭窄または再狭窄、特に移植片自身の場所における狭窄を予防する。更に好ましい態様では、ポリヌクレオチドを、末梢虚血または間欠性跛行を治療する目的で行った末梢血管での血管移植の前、中または後に投与する。狭窄または再狭窄の予防とは、外科処置で頻繁にみられる狭窄または再狭窄の量／激しさを減少させ、および／または実質的に除去するための予防的治療を意味する。ポリヌクレオチドは、被験哺乳類の血管においてＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの発現を促進するのに有効な量および形態で組成物に含まれ、これにより血管の狭窄または再狭窄が予防される。
【００２０】
好ましい態様では、被験哺乳類は、ヒト被験者である。例えば、被験者は、（血管内ステントを挿入したまたは挿入しない）治療的バルーン血管形成法または冠動脈バイパス法により快復の可能性がある候補者として心臓専門医によって確認されている冠動脈疾患に罹っているヒトである。他の被験哺乳類、特にヒトでの治療効果を示すためのモデルとして一般に用いられている哺乳類（例えば、霊長類、ブタ、イヌまたはウサギ）における本発明の方法の実施も考えられる。
【００２１】
本発明の方法の実施について、「ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド」という用語は、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｃ類似体アミノ酸配列（本明細書の他の箇所で更に詳細に定義する）を有しかつヒトＶＥＧＦ−Ｃのイン・ビボでの再狭窄減少作用を有する任意のポリペプチド含むことを意図するものであり、この作用は本明細書ではウサギモデルでの例によって示される。「ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド」という用語は、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる任意のポリヌクレオチド（例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むことを意図するものである。遺伝子コードの周知の縮重により、任意の選択されたＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする複数のＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド配列がある。
【００２２】
ヒトの治療には、ヒトＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドが特に好ましく、ヒトＶＥＧＦ−ＣｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドが特に好ましい。「ヒトＶＥＧＦ−Ｃ」とは、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子の任意の対立遺伝子によってコードされる天然に存在するタンパク質（プレプロタンパク質、部分プロセス型タンパク質(partially-processed protein)、または完全プロセス型成熟タンパク質(fully-processed mature protein)）に相当するポリペプチド、または天然に存在する成熟タンパク質の生物活性断片を含んでなるポリペプチドを意味する。例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ｃは、ポリペプチドに結合させ、ＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３レセプターを発現する細胞中でこれらのレセプターのホスホリル化を刺激するのに十分な配列番号２に記載のアミノ酸配列の連続部分を含んでなる。配列番号２のアミノ酸１３１〜２１１を含んでなるポリペプチドが、特に考えられる。例えば、配列番号２の連続部分を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、連続部分がそのアミノ末端として配列番号２の３０〜１３１位からなる群から選択されるアミノ酸を有し、かつそのカルボキシル末端として配列番号２の２１１〜４１９位からなる群から選択されるアミノ酸を有するものが考えられる。本明細書の他の箇所で更に詳細に説明するように、ＶＥＧＦ−Ｃ生物活性、特にＶＥＧＦＲ−２を介して伝達されるものは、アミノ末端およびカルボキシル末端のプロペプチドのプロセッシングによって増加する。従って、配列番号２の１０２〜１３１位からなる群から選択されるアミノ末端が好ましく、配列番号２の１０３〜１１３位からなる群から選択されるアミノ末端が特に好ましい。同様に、配列番号２の２１１〜２２７位からなる群から選択されるカルボキシル末端が好ましい。上記のように、「ヒトＶＥＧＦ−Ｃ」という用語は、配列番号１および２に記載の配列を特徴とするヒトＶＥＧＦ−Ｃの対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドを包含しようとするものでもある。
【００２３】
更に、治療用ＶＥＧＦ−Ｃは組換えＶＥＧＦ−Ｃとしてまたは体性遺伝子療法により間接的に投与されるものであるので、１個以上のアミノ酸を加え、欠失し、または他のアミノ酸、特に保存的置換で置換しかつ抗再狭窄生物活性を保持しているヒトＶＥＧＦ−Ｃの類似体（およびこのような類似体をコードするポリヌクレオチド）を作成し、使用することは当該技術分野の技術の範囲内にある。抗再狭窄ＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持している類似体は、本発明で用いられるＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドと考えられる。好ましい態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の改質を有し、抗再狭窄ＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持している類似体は、本発明で用いられるＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドと考えられる。このような類似体をコードするポリヌクレオチドは、通常のＰＣＲ、位置指定突然変異誘発、および化学合成の手法を用いて生成させる。
【００２４】
非ヒト哺乳類またはトリＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドおよびポリヌクレオチドも、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドと考えられる。「哺乳類ＶＥＧＦ−Ｃ」とは、任意の方法にのＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子の任意の対立遺伝子によってコードされる天然に存在するタンパク質（プレプロタンパク質、部分プロセス型タンパク質(partially-processed protein)、または完全プロセス型成熟タンパク質(fully-processed mature protein)）に相当するポリペプチド、または成熟タンパク質の生物活性断片を含んでなるポリペプチドを意味する。「哺乳類ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド」という用語は、哺乳類ＶＥＧＦ−Ｃのイン・ビボでの再狭窄減少作用を有する哺乳類ＶＥＧＦ−Ｃの類似体を含むことを意図するものである。トランスジーンコードヒトＶＥＧＦ−Ｃを用いる遺伝子療法がウサギモデルで再狭窄を予防するのに有効であるという事実は、ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質の種間治療効力があることの証拠である。
【００２５】
どのＶＥＧＦ−Ｃが選択されるかについては関係なく、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、好ましくはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド配列とインフレームで融合した分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。分泌シグナルペプチドはポリヌクレオチドを発現する細胞によってＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの分泌を指示し、分泌されたＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド由来の細胞によって開裂する。例えば、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは配列番号２に記載の完全なプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃ配列をコードすることができ、または完全プロセス型ＶＥＧＦ−Ｃ（例えば、配列番号２のアミノ酸１０３〜２２７）またはＶＥＧＦ−Ｃ類似体をコードする配列にインフレームで融合したＶＥＧＦ−Ｃシグナルペプチドをコードすることができた。更に、シグナルペプチドをＶＥＧＦ−Ｃから誘導する必要はない。シグナルペプチド配列は、別の分泌されたタンパク質のものであることができ、または被験哺乳類の細胞で分泌を指示するのに有効な完全に合成のシグナル配列であることができる。
【００２６】
一つの態様では、本発明のＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、２０mM  ＮａＰＯ４，ｐＨ６．８中４２℃でハイブリダイゼーション、および１ＸＳＳＣ中で５５℃にて３０分間洗浄の典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に記載のヒトＶＥＧＦｃＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつヒトＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３に結合して、刺激するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。これらの典型的な条件での変動は、ハイブリダイゼーションを行う配列の長さおよびＧＣヌクレオチド含量に基づいて起こることが理解される。当該技術分野における標準的な式は、適当なハイブリダイゼーション条件を決定するのに適当である。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual （第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、9.47-9.51節を参照されたい。
【００２７】
好ましい態様では、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子療法を促進するために追加の配列をも含んでなる。一つの態様では、「裸の」ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーン（すなわち、トランスフェクションを促進するためのウイルス、リポソームまたは他のベクターを持たないトランスジーン）を遺伝子療法に用いる。この態様では、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、好ましくは標的哺乳類細胞で発現するための適当なプロモーターおよび／またはエンハンサー配列（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー[Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502 (1991); Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)]; ラウス肉腫ウイルスプロモーター[Davis et al., Hum. Gene Ther., 4: 151 (1993)];タイプロモーター(Tie promoter)[Korhonen et al., Blood, 86(5): 1828-1835 (1995)];またはサルウイルス４０プロモーター）であって、プロモーターがＶＥＧＦ−Ｃコード配列の上流（すなわち、５′）に適切に結合しているものを含んでなる。ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドはまた、好ましくはＶＥＧＦ−Ｃコード配列の下流（すなわち、３′）に作動可能に結合した適当なポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化配列）をも含む。ポリヌクレオチドは、場合によっては、唯一の意図した機能が例えば複製の細菌起源のような、細菌におけるベクターの大規模酸性を促進することである配列、および選択可能なマーカーをコードする配列も含んでなることができる。しかしながら、好ましい態様では、このような異種配列は、本発明の方法によってヒトに投与する前に少なくとも部分的に開裂している。他のトランスジーンについての文献に記載されている手順を用いて良好な遺伝子療法を行うために、このようなポリヌクレオチドを製造して、投与することができる。例えば、Isner et al., Circulation, 91: 2687-2692 (1995);Isner et al., Human Gene Therapy, 7: 989-1011 (
1996)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００２８】
任意の適当なベクターを用いて、ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンを宿主に導入することができる。文献に記載されている典型的なベクターとしては、レンチウイルスベクター[Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816 (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46]; アデノ随伴ウイルスベクター[Gnatenko et al., J. Investig. Med., 45: 87-98 (1997)]; アデノウイルスベクター［例えば、米国特許第５，７９２，４５３号明細書; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992); およびRosenfeld et al., Cell, 68: 143-155 (1992)]; リポフェクチン依存性遺伝子導入（ＢＲＬ）; リポソームベクター［例えば、米国特許第５，６３１，２３７号明細書（センダイウイルスタンパク質を含んでなるリポソーム）］；およびそれらの組合せなどの複製欠損レトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。上記文献の総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。複製欠損アデノウイルスベクターは、好ましい態様を構成する。
【００２９】
ウイルスベクターを用いる態様では、好ましいポリヌクレオチドは、更に上記のような適当なプロモーターおよびポリアデニル化配列が挙げられる。更に、これらの態様では、ポリヌクレオチドはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする配列に作動可能に結合したベクターポリヌクレオチド配列（例えば、アデノウイルスポリヌクレオチド配列）も挙げられる。
【００３０】
従って、一つの態様では、投与を行う組成物は、ベクターであって、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる。好ましい態様では、ベクターはアデノウイルスベクターである。極めて好ましい態様では、アデノウイルスベクターは複製欠損であり、すなわちアデノウイルスゲノムから本質的なウイルス複製配列が欠失しているため被験哺乳類では複製することができない。例えば、本発明者らは、ベクターが複製欠損アデノウイルスであって、プロモーターに作動可能に結合しかついずれかの末にアデノウイルスポリヌクレオチド配列によって隣接したＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドを含んでなるアデノウイルスを含んでなる方法を考慮している。
【００３１】
本発明の方法によって投与を行う組成物は、好ましくは（ポリヌクレオチドまたはベクターの他に）治療薬を血管内送達するのに一般に用いられる水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、グルコースまたは他のキャリヤーのような薬学上許容可能なキャリヤー溶液を含んでなる。多重遺伝子療法であって、組成物が場合によってはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド／ベクターおよび再狭窄を予防する目的で選択された別のポリヌクレオチド／ベクターを両方とも含んでなるものも考えられる。ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンを用いるコトランスフェクションのための典型的な候補遺伝子／ベクターは上記文献に記載されており、細胞毒性因子、細胞増殖抑制因子、内皮増殖因子、および平滑筋細胞増殖／マイグレーションインヒビターをコードする遺伝子が挙げられる。以下において更に詳細に説明するように、ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンとの同時投与の好ましい候補である。ＶＥＧＦトランスジーンの同時投与も、具体的に考慮される。
【００３２】
本発明の方法によって行われる「投与」は、治療薬を被験哺乳類の血管に直接または間接的に導入するための任意の医学上許容された手段を用いて行うことができ、注射、経口摂取、経鼻または局所投与などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドを含んでなる組成物の投与は、静脈内、動脈内、または冠動脈内注射のように血管内に行われる。
【００３３】
極めて好ましい態様では、組成物は、局所、例えば血管形成の部位またはバイパスに投与される。例えば、投与は、被験哺乳類の血管、特に被験哺乳類の冠動脈へのトランスジーンを含む組成物のカテーテルによる導入である。局所送達のための典型的な材料および方法は、Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994)およびWilensky et al., Trends Cardiovasc. Med., 3: 163-170 (1993)に概説されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。例えば、組成物は、冠動脈内への薬剤輸液の文献に記載されているものなど輸液−灌流バルーンカテーテル（好ましくは、多孔性バルーンカテーテル）を用いて投与される。例えば、米国特許第５，７１３，８６０号明細書（輸液アレイを有する血管内カテーテル）；米国特許第５，０８７，２４４号明細書；米国特許第５，６５３，６８９号明細書；およびWolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 475-481 (1990)（ウォリンスキー輸液カテーテル）；およびLambert et al., Coron. Artery Dis., 4: 469-475 (1993)を参照されたい。上記の総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。位置指定体細胞遺伝子療法へのこれらのカテーテルの使用は、例えばMazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21: 104-111 (1994)に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンをアデノウイルスベクターに投与する態様では、このベクターは、好ましくは１０７〜１０１３のウイルス粒子の力価で、更に好ましくは１０９〜１０１１ウイルス粒子の力価で薬学上許容可能なキャリヤー中で投与される。アデノウイルスベクター組成物は、好ましくは１５秒〜３０分間、更に好ましくは１〜１０分間輸液する。
【００３４】
例えば、冠動脈の単一または複数の損傷による狭心症の患者であって、冠動脈血管造影の一次所見に基づいてＰＴＣＡが処方された患者では、典型的プロトコールは大腿部法を用いる標準的臨床実施による７Ｆガイドカテーテルを介するＰＴＣＡを行うことを含む。ＰＴＣＡ単独では最適結果が得られない場合には、血管内ステントも移植する。（最適でない結果は、目視評価、およびＢおよびＣ型切開による管腔直径の＞３０％の残存狭窄として定義される。）バルーン拡張の部位における動脈遺伝子導入は、血管形成の直後でステント移植の前に、輸液−灌流バルーンカテーテルを用いて複製欠損アデノウイルスＶＥＧＦ−Ｃベクターで行う。カテーテルの大きさは、血管造影図から測定した動脈の直径に合うように選択され、例えば、３．０〜３．５Ｆの直径となる。バルーンを最適圧力まで膨張させ、ウイルス力価１．１５×１０１０で０．５ml／分の速度で１０分間の輸液中に行う。
【００３５】
もう一つの態様では、他のトランスジーンを導入するために文献に記載されているように、ゲルをコーティングしたカテーテルを用いる血管内投与が考えられる。例えば、米国特許第５，６７４，１９２号明細書（強靱に付着した膨張性ヒドロゲルポリマーをコーティングしたカテーテル）；Riessen et al., Human Gene Therapy, 4: 749-758 (1993); およびSteg et al., Circulation, 96: 408-411 (1997)および90: 1648-1656 (1994)を参照されたい。これらの総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。簡単に説明すれば、ＤＮＡの溶液（例えば、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド）をヒドロゲルポリマーをコーティングした膨張した血管形成カテーテルバルーンの表面にエクス・ビボで１回以上塗布する（例えば、ヒドロプラスを有するスライダー(Slider with Hydroplus), Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA)。ヒドロプラスコーティングは、親水性のポリアクリル酸ポリマーであって、バルーンに架橋して、バルーンにしっかりと付着した高分子量ヒドロゲルを形成する。ＤＮＡで被覆されたヒドロゲルを乾燥した後、バルーンをすぼませる。血管形成法の際にバルーンを血管内で再膨張させることにより、ＤＮＡが血管壁に導入される。
【００３６】
更にもう一つの態様では、バルーン血管形成カテーテルまたはステントに配置されたまたはこれと一体的な膨張性の弾性膜または同様の構造を用いて、ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンを送達する。例えば、米国特許第５，７０７，３８５号、第５，６９７，９６７号、第５，７００，２８６号、第５，８００，５０７号および第５，７７６，１８４号明細書を参照されたい。上記の総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００３７】
もう一つの態様では、ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンを含む組成物を、例えば血管の一部を取り囲みまたはカプセル化する装置を用いて血管外に投与する。例えば、（バイパス処置の際などに）動脈の外側に置き、プラスミドまたはリポソームベクターを介して動脈壁にトランスジーンを送達するカラーが記載されている国際特許公表ＷＯ９８／２００２７号明細書（この特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）を参照されたい。
【００３８】
更にもう一つの態様では、内皮細胞または内皮前駆細胞をＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンでエクス・ビボでトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を被験哺乳類に投与する。血管移植片に遺伝子修飾した内皮細胞を播種するための典型的手順は、米国特許第５，７８５，９６５号明細書に記載されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００３９】
被験哺乳類が血管移植片を受け入れているときには、ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンを含む組成物を単離した血管断片に直接適用した後、イン・ビボで移植することができる。
【００４０】
もう一つの態様では、本発明は、血管の狭窄または再狭窄を予防するための被験哺乳類の治療法であって、血管の狭窄または再狭窄を予防するための治療を必要とする被験哺乳類に、血管の狭窄または再狭窄を予防するための有効量のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを含んでなる組成物を投与する段階を含んでなる方法を提供する。好ましい態様では、投与は、血管内ステントを被験哺乳類に移植することを含んでなり、このステントは組成物をコーティングまたは含浸させている。薬剤をコーティングしたまたは薬剤を含浸したステントを構築するための典型的な材料は上記文献に記載されており、Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994)に概説されている。もう一つの好ましい態様では、組成物は、ＰＧＬＡ、非分解性ポリマー、または生物学的ポリマー（例えば、澱粉）のような生物分解性ポリマーからなる微粒子であって、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドでカプセル化または含浸されているものを含んでなる。このような粒子は、輸液血管形成カテーテルなどを用いて血管壁に送達される。局部的に持続した薬剤送達を行うための他の手法は、Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med., 3: 163-170 (1993)に概説されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００４１】
血管形成またはバイパス処置の後に１回以上の静脈内注射による投与も考えられる。処置の部位へのＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの局在化は、増殖する内皮細胞上でのＶＥＧＦ−Ｃレセプターの発現によって起こる。局在化は、（例えば、Shih et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990)に記載のアポリポタンパク質Ｂ−１００オリゴペプチドに融合した）融合ポリペプチドとしてＶＥＧＦ−Ｃを組み換え発現することによっても促進される。ＶＥＧＦ−ＣポリヌクレオチドとＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの同時投与も考えられる。
【００４２】
更にもう一つの態様では、本発明は、血管の狭窄または再狭窄の治療または予防用の医薬を製造するためのＶＥＧＦ−ＣポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの使用を提供する。
【００４３】
更にもう一つの態様では、本発明は、血管の狭窄または再狭窄を予防するための被験哺乳類の治療法であって、血管の狭窄または再狭窄を予防するための治療を必要とする被験哺乳類にポリヌクレオチドを含んでなる組成物であって、ポリヌクレオチドが血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるものを投与する段階を含んでなる方法を提供する。このような方法は、ＶＥＧＦ−Ｄをコードするポリヌクレオチドを用いること以外はＶＥＧＦ−Ｃをコードするポリヌクレオチドに関して本明細書に本質的に記載されている方法で実施される。ヒトＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子およびタンパク質の詳細な説明は、Achen, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95(2): 548-553 (1998); １９９８年２月２６日公表の国際特許公表ＷＯ９８／０７８３２号明細書、およびGenbank受入番号ＡＪ０００１８５号に記載されており、上記の総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。プレプロ−ＶＥＧＦ−ＤについてのｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、本明細書の配列番号３および４に記載されている。周知のように遺伝子コードが縮重しているため、多重ＶＥＧＦ−Ｄコードポリヌクレオチド配列があり、それらのいずれを本明細書に記載の方法によって用いることができることは当然である。
【００４４】
ＶＥＧＦ−Ｃに関して本明細書で詳細に説明したように、ＶＥＧＦ−Ｄ断片、ＶＥＧＦ−Ｄ類似体、ＶＥＧＦ−Ｄ対立遺伝子および種間変異体をコードするポリヌクレオチド、およびヒトＶＥＧＦ−Ｄのイン・ビボで再狭窄防止作用を有するものの使用が、総て本発明に包含されるものとして考えられる。
【００４５】
更にもう一つの態様では、本発明は、血管の狭窄または再狭窄を予防するための被験哺乳類の治療法であって、血管の狭窄または再狭窄を予防するための治療を必要とする被験哺乳類にＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを血管の狭窄または再狭窄を予防するのに有効な量で含んでなる組成物を投与する段階を含んでなる方法を提供する。このような方法は、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドに関して本明細書に本質的に記載されている方法で実施される。
【００４６】
関連態様では、本発明は、上記方法の実施のための材料および装置を提供する。
【００４７】
例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、組成物、および本発明の組成物での用途について記載したものは、それ自体が本発明の態様と考えられる。
【００４８】
同様に、本発明は、血管内（血管中）ステント、バルーンカテーテル、輸液−灌流カテーテル、血管外カラー、弾性膜などの循環器障害の治療に用いられる外科装置であって、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを含んでなる組成物をコーティングし、含浸し、これに付着し、または装置内にカプセル化することによって改良した装置も提供する。
【００４９】
例えば、一つの態様では、本発明は、血管内ステントであって、このステントがＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物をコーティングまたは含浸している改良を特徴とするステントを提供する。この方法で改良することができる典型的ステントは、米国特許第５，８００，５０７号および第５，６９７，９６７号明細書(Medtronic, Inc., フィブリンおよび再狭窄の治療法を提供することができる溶出可能な薬剤を含んでなる管腔内ステントを記載）、米国特許第５，７７６，１８４号明細書（Medtronic, Inc., ポリマーおよび固形物または固形物／溶液中に治療物質をポリマーと共に含んでなる多孔性コーティングを有するステントを記載）、米国特許第５，７９９，３８４号明細書（Medtronic, Inc., 体管腔に接触するための生物適合性ポリマー表面を有する柔軟な円筒形の金属ステントを記載）、米国特許第５，８２４，０４８号および第５，６７９，４００号明細書、および米国特許第５，７７９，７２９号明細書に記載され、描写されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。一般的な血管形成法の際にこのようなステントを移植すると、通常のステントの移植よりも再狭窄が少なくなる。この意味において、ステントの生物適合性は改良されている。
【００５０】
もう一つの態様では、本発明は、血管に治療薬を送達するための血管外カラーであって、このカラーがＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物をコーティングまたは含浸しまたはカプセル化している改良を特徴とするカラーを提供する。この方法で改良される典型的なカラーは、国際特許公表ＷＯ９８／２００２７号明細書（Eurogene, Ltd., 血管周囲をシールし、再狭窄防止医薬処方物を保持する溜めを画定するために採用された本体を含んでなるカラー）に記載され、描写されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００５１】
更にもう一つの態様では、本発明は、ステントを包むためのポリマーフィルムであって、フィルムがＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類の再狭窄防止薬を含んでなる組成物をコーティングまたは含浸している改良を特徴とするフィルムを提供する。この方法で改良される典型的なカラーは、米国特許第５，７００，２８６号および第５，７０７，３８５号明細書（Advanced Cardiovascular Systems, Inc., 再狭窄防止治療薬をコーティングまたは含浸し、血管内ステントに結合可能な生物吸収性ポリマー材料の鞘）に記載され、描写されている。
【００５２】
同様に、本発明は、本発明の方法を実施するためその使用を促進する方法で包装された本発明の化合物または組成物を含んでなるキットを含む。最も単純な態様では、このようなキットは、密封ボトルまたは器のような容器に、容器に添付されまたは包装に含まれている本発明の方法を実施するための化合物または組成物の使用を記載しているラベルと共に包装された本発明の実施に用いられることが本明細書に記載されている化合物または組成物（例えば、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を含む。好ましくは、化合物または組成物は、単位投与形態で包装される。もう一つの態様では、本発明のキットは、ステント、カテーテル、血管外カラー、ポリマーフィルムなどの本発明の方法の実施に有用な物理装置と共に包装されているＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドまたはポリペプチド組成物を含む。もう一つの態様では、本発明のキットは、ヒドロゲルポリマーまたは微粒子ポリマー、またはＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−Ｄを患者に送達するのに有用であることが本明細書に記載されている他のキャリヤーと共に包装されているＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
【００５３】
本発明の他の特徴および変更は、本願明細書の内容から当業者に明らかになるであろうし、これらの総ての特徴は、本発明の態様と考えられるものである。
【００５４】
同様に、本明細書に記載された本発明の特徴を、特徴の組合わせが本発明の側面または態様として上記に具体的に述べられているかどうかには関係なく、本発明の側面とも考えられる追加の態様と再度組み合わせることができる。また、本発明にとって決定的なものとして本明細書に記載される限定のみをそのまま記載すべきであり、本明細書に決定的なものとして記載されなかった限定を欠く本発明の変更は、本発明の側面と考えようとするものである。
【００５５】
上記に加えて、本発明は、上記で具体的に述べた変更よりいずれにせよ範囲が狭い本発明の総ての態様を追加の側面として含む。本出願人（ら）はここに追加された請求項の全範囲を発明したが、ここに追加した請求項は、その範囲内に第三者の従来技術による研究成果を包含しようとするものではない。従って、請求項の範囲内の法定従来技術が特許庁または他の団体または個人によって出願人が考慮させられる場合には、出願人（ら）は出願可能な特許法下で補正の権利を実施し、請求項の主題を再定義し、このような請求の範囲から法定上の従来技術または明白な法定上の従来技術の変更を具体的に除外する権利を留保する。このような補正した請求の範囲によって定義される発明の変更も、本発明の側面として考えられる。
【００５６】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）を一般的なバルーン血管形成法の際に起こることがある外傷のような血管外傷を受けた哺乳類に投与すると、損傷した血管の再狭窄が減少しまたはなくなることを見出したことに基づいている。再狭窄を予防するためのＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンの効果を示すイン・ビボで制御した実験を、例１で詳細に説明する。例２は、ＶＥＧＦ−Ｃの再狭窄防止作用が類似の方法で投与したＶＥＧＦの再狭窄防止作用より優れていると思われることを示す同時行った比較研究を提供する。
【００５７】
血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）と呼ばれる増殖因子、並びにＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ変異体および類似体をコードする天然のヒト、非ヒト哺乳類およびトリのポリヌクレオチド配列は、１９９８年２月２日に出願され１９９８年８月６日に国際公表ＷＯ９８／３３９１７号として公表された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号明細書、Joukov et al., J. Biol. Chem., 273(12): 6599-6602 (1998); およびJoukov et al., EMBO J., 16(13): 3898-3911 (1997)に詳細に記載されており、上記の総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。そこで詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｃは最初は４１９アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドとしてヒト細胞に産生する。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−ＣについてのｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に記載されており、ヒトＶＥＧＦ−ＣをコードするｃＤＮＡは、ブダペスト条約の規定に準じてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），10801 University Blvd., Manassa, VA 20110-2209 (USA)に寄託されている（寄託日１９９５年７月２４日、およびＡＴＣＣ受入番号９７２３１）。他の種からのＶＥＧＦ−Ｃ配列も報告されている。例えば、Genbank 受入番号ＭＭＵ７３６２０(Mus musculus)およびＣＣＹ１５８３７(Coturnix coturnix)を参照されたい。上記配列の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００５８】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは多段階で処理され、約２１〜２３ｋＤ（還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価）の成熟し極めて活性の高いＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを産生する。このような処理としては、シグナルペプチドの開裂（配列番号２，残基１〜３１）、カルボキシル末端ペプチドの開裂により（配列番号２のアミノ酸２２８〜４１９に近似的に相当し、バルビアニ環３タンパク質（ＢＲ３Ｐ）配列を暗示する間隔を置いたシステイン残基のパターンを有する{Dignam et al., Gene, 88: 133-40 (1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211: 331-49 (1990)]）約２９ｋＤの部分処理形態を産生すること、およびアミノ末端ペプチド（配列番号２のアミノ酸３２〜１０３に近似的に相当する）の開裂（明らかに細胞外）により約２１〜２３ｋＤの完全に処理された成熟形態を産生することが挙げられる。実験的証拠は、ＶＥＧＦ−Ｃの部分処理形態（例えば、２９ｋＤ形態）はＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）レセプターに結合することができ、砒素の完全処理形態ではＶＥＧＦＲ−２への高親和性結合だけが起こる。ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、天然では非ジスルフィド結合二量体として会合していると思われる。
【００５９】
更に、配列番号２のアミノ酸１０３〜２２７は、ＶＥＧＦ−Ｃ機能の保持に総てが決定的という訳ではないことが示されている。配列番号２のアミノ酸１１３〜２１３からなり（かつ残基１０３〜１１２および２１４〜２２７を欠く）ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｃレセプターに結合して、刺激する能力を保持しており、約残基１３１から約残基２１１までの範囲のポリペプチドはＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持することが予想される。１５６位のシステイン残基は、ＶＥＧＦＲ−２結合能にとって重要であることが示されている。しかしながら、ＶＥＧＦ−ＣΔＣ１５６ポリペプチド（すなわち、欠失または置換によりこのシステインを欠く類似体）は、ＶＥＧＦＲ−３の強力な活性剤のままである。ＶＥＧＦ−Ｃの再狭窄防止作用がＶＥＧＦＲ−３を介して伝達されると、ＶＥＧＦ−ＣΔＣ１５６ポリペプチド（およびそれらをコードするポリヌクレオチド）の使用は、再狭窄防止効果を提供し、ＶＥＧＦＲ−２依存性の副作用を最小限にすることが予想される。配列番号２の１６５位のシステインは、いずれかのレセプターへの結合にとって本質的であり、８３または１３７位のシステインを欠く類似体は両レセプターとの結合について本来のＶＥＧＦ−Ｃと競合誌、両レセプターを刺激する。
【００６０】
ヒトＶＥＧＦ−Ｃを他の種由来のＶＥＧＦ−Ｃと整列（任意の一般に認められている整列アルゴリズムを用いて行った）は、ＶＥＧＦ−Ｃの生物活性を破壊することなく修飾を導入することができる（例えば、挿入、置換、および／または欠失）追加の残基を示唆する。整列した２個以上の種のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドが異なるアミノ酸、特に異なる化学的特徴の側鎖を有する異なるアミノ酸を有する任意の位置は、同時に機能が除去されることなく修飾を受けやすい適当な位置である。ヒト、ネズミおよびウズラのＶＥＧＦ−Ｃの典型的な整列は、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３の図５に記載されている。
【００６１】
上記の考察は別として、無数の保存的アミノ酸置換を行って特にこの置換の数が小さければＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を保持するポリペプチドを生じると思われる野生型ＶＥＧＦ−Ｃ配列とすることができることが理解されるであろう。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸を同様の化学的特性の側鎖を有するアミノ酸で置換することを意味する。保存的置換行うための同様なアミノ酸としては、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リシン、ヒスチジン）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性の脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、小さな側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）、または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）を有するものが挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を破壊することのない１または数個の内部アミノ酸の付加または欠失も、考えられる。
【００６２】
特定の理論に限定しようとするものではないが、再狭窄の予防におけるＶＥＧＦ−Ｃの効果を支持する機構は、血管中の平滑筋の増殖を有意に同時に刺激することなく損傷した血管（および／または血管内ステント）の再内皮形成を刺激するＶＥＧＦ−Ｃの能力に関するものと思われる。ＶＥＧＦ−Ｃは、平滑筋細胞増殖を抑制することもできる。従って、候補のＶＥＧＦ−Ｃ類似体ポリペプチドを、最初に既知のＶＥＧＦ−Ｃレセプター（ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）に結合し、自動ホスホリル化を刺激する目的で速やかにスクリーニングすることができる。一方または両方の既知レセプターを刺激するポリペプチドを、培養した毛細血管または動脈内皮細胞（例えば、ＷＯ９８／３３９１７号明細書に記載）に対するマイトジェンおよび／または走化性活性についてイン・ビトロで速やかに再スクリーニングする。次に、マイトジェンおよび／または走化性活性を有するポリペプチドを、再狭窄を予防する能力について本明細書に記載の方法でイン・ビボでスクリーニングする。この方法で、天然に存在するＶＥＧＦ−Ｃタンパク質の変異体（類似体）を速やかにスクリーニングし、この変異体が本発明で使用するための「ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド」を構成するのに必要な生物活性を有するかどうかを決定する。
【００６３】
血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）と呼ばれる増殖因子、並びにＶＥＧＦ−Ｄをコードするヒト配列、およびＶＥＧＦ−Ｄ変異体および類似体は、１９９７年８月２１日に出願され、１９９８年２月２６日に国際公表ＷＯ９８／０７８３２号として公表された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６号明細書、およびAchen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95(2): 548-553 (1998)に詳細に記載されており、両文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。そこに詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｄは最初はヒト細胞で３５４アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドとして産生される。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−ＤについてのｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および４に記載されている。他の種由来のＶＥＧＦ−Ｄ配列も報告されている。例えば、Genbank 受入番号Ｄ８９６２８(Mus musculus)およびＡＦ０１４８２７(Rattus norvegicus)を参照されたい。上記配列の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００６４】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは２１アミノ酸の推定シグナルペプチドを有し、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃの処理と類似の方法で明らかにタンパク質分解的に処理される。配列番号４の残基１〜９２および２０２〜３５４を欠く「組換え成熟した」ＶＥＧＦ−Ｄは、レセプターＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３を活性化する能力を保持しており、非共有結合した二量体として会合していると思われる。従って、好ましいＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドとしては、配列番号４のアミノ酸９３〜２０１をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。機能を保護する修飾をＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドに導入するための上記に提供したガイダンスも、機能を保護する修飾をＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドに導入するのに適している。
【００６５】
本発明によって提供される再狭窄の治療的または予防的治療は、ヒトなどの被験哺乳類にＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはそれらの組合せを含んでなる組成物（時には、本明細書では総称的に「ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療薬」と呼ばれる）を投与することを含む。
【００６６】
「投与」は、治療薬を被験哺乳類の血管に直接または間接的に導入する任意の医学的に認められた手段を用いて行うことができ、注射、経口摂取、経鼻または局所投与などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドまたはポリペプチド組成物を含んでなる組成物の投与は、静脈内、動脈内、または冠動脈内注射によるなど血管内で行う。
【００６７】
極めて好ましい態様では、組成物は、局所的に、例えば血管形成またはバイパスの部位に投与される。例えば、投与は、治療組成物を被験哺乳類の血管、特に被験哺乳類の冠動脈にカテーテルを介して導入することを含んでなる。局所送達の典型的な材料および方法は、Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994)、およびWilensky et al., Trends Cardiovasc. Med., 3: 163-170 (1993)に概説されており、これらの文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。例えば、組成物は、冠動脈薬剤輸液についての文献に記載されているような輸液−灌流バルーンカテーテル（好ましくは、微孔性バルーンカテーテル）を用いて投与される。例えば、米国特許第５，７１３，８６０号明細書（輸液アレイを有する血管内カテーテル）；米国特許第５，０８７，２４４号明細書；米国特許第５，６５３，６８９号明細書；およびWolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 475-481 (1990)（ウォリンスキー輸液カテーテル）；およびLambert et al., Coron. Artery Dis., 4: 469-475 (1993)を参照されたい。上記の総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。位置指定体細胞遺伝子療法へのこれらのカテーテルの使用は、例えばMazur et al., Texas Heart Institute Journal, 21: 104-111 (1994)に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００６８】
例えば、冠動脈の単一または複数の損傷による狭心症の患者であって、冠動脈血管造影の一次所見に基づいてＰＴＣＡが処方された患者では、典型的プロトコールは大腿部法を用いる標準的臨床実施による７Ｆガイドカテーテルを介するＰＴＣＡを行うことを含む。ＰＴＣＡ単独では最適結果が得られない場合には、血管内ステントも移植する。（最適でない結果は、目視評価、およびＢおよびＣ型切開による管腔直径の＞３０％の残存狭窄として定義される。）バルーン拡張の部位における動脈遺伝子導入は、血管形成の直後でステント移植の前に、輸液−灌流バルーンカテーテルを用いて複製欠損アデノウイルスＶＥＧＦ−Ｃベクターで行う。カテーテルの大きさは、血管造影図から測定した動脈の直径に合うように選択され、例えば、３．０〜３．５Ｆの直径となる。バルーンを最適圧力まで膨張させ、ウイルス力価１．１５×１０１０で０．５ml／分の速度で１０分間の輸液中に行う。
【００６９】
もう一つの態様では、他のトランスジーンを導入するために文献に記載されているように、ゲルをコーティングしたカテーテルを用いる血管内投与が考えられる。例えば、米国特許第５，６７４，１９２号明細書（強靱に付着した膨張性ヒドロゲルポリマーをコーティングしたカテーテル）；Riessen et al., Human Gene Therapy, 4: 749-758 (1993); およびSteg et al., Circulation, 96: 408-411 (1997)および90: 1648-1656 (1994)を参照されたい。これらの総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。図１に示されるように、膨張性バルーン12が遠位末端に取り付けられているカテーテル10が提供される。バルーンは、治療用のＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療薬を含んでなる溶液を吸収することができる膨潤性のヒドロゲルポリマーコーティング14を含む。簡単に説明すれば、ＤＮＡの溶液（例えば、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド）をヒドロゲルポリマーをコーティングした膨張した血管形成カテーテルバルーンの表面にエクス・ビボで１回以上塗布する（例えば、ヒドロプラスを有するスライダー(Slider with Hydroplus), Mansfield Boston Scientific Corp., Watertown, MA)。ヒドロプラスコーティングは、親水性のポリアクリル酸ポリマーであって、バルーンに架橋して、バルーンにしっかりと付着した高分子量ヒドロゲルを形成する。ＤＮＡで被覆されたヒドロゲルを乾燥した後、バルーンをすぼませる。血管形成法の際にバルーンを血管内で再膨張させることにより、ＤＮＡが血管壁に導入される。従って、また図１について説明すれば、取り付けてコーティングしたバルーンを、保護鞘20によって被覆して、閉塞部位22に置かれる前にコーティングしたバルーンが血液に露出するのを最小限にしながら、血管18の管腔16に挿入する。装置が治療領域に配置されたならば、保護鞘を引き戻し、またはカテーテルを前方に移動させてバルーンを露出させ、これを膨張させてバルーン（従って、コーティング）を血管壁に与圧して、圧縮したスポンジから液体を絞り出しまたは湿潤塗料を接触によって表面に導入するのと類似の方法でＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療薬を組織に導入する。
【００７０】
更にもう一つの態様では、バルーン血管形成カテーテルまたはステントに配置されたまたはこれと一体的な膨張性の弾性膜、フィルムまたは同様の構造を用いて、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療薬を送達する。例えば、米国特許第５，７０７，３８５号、第５，６９７，９６７号、第５，７００，２８６号、第５，８００，５０７号および第５，７７６，１８４号明細書を参照されたい。上記の総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。図２Ａ〜２Ｂに示されるように、弾性膜材料（図２Ａ）の単層30または多層30，32シートを、シート（同士）の対向末端をまとめて、例えば重複または接触関係で接着することによって管状構造34（図２Ｂ）に成形する。この方法で、弾性材料をカテーテルバルーンまたはステントの回りに巻き付けることができる。治療用のＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ組成物を、射出成形、コーティング、拡散、および吸収法などの任意の適当な手段を用いて膜と合わせる。図に示した多層態様では、二層の両端を結合させて、液密シールを形成することができる。好ましい態様では、材料の一方の層を最初に材料を伸張し、複数の微小孔またはスリット36を導入することによって加工する。層同士が互いに結合した後、シートを伸張し、孔またはスリットの一方を介して治療用ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ組成物を注入して層の間にある空隙を満たすことができる。次に、シートを弛緩させ、孔を閉じて、シートを再度伸張するときまで層の間に治療組成物をシールする。これは、例えばシートによって被覆された血管内ステントまたはバルーンが狭窄した血管の管腔内で膨張するときに起こる。膨張ステントまたはバルーンは、管状シートカバーの内部表面38に対して放射状外側にプレスし、シートを伸張し、孔を開き、治療薬を血管壁に送達する。
【００７１】
もう一つの態様では、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療薬を含む組成物を、例えば血管の一部を取り囲みまたはカプセル化する装置を用いて血管外に投与する。例えば、（バイパス処置の際などに）動脈の外側に置き、プラスミドまたはリポソームベクターを介して動脈壁にトランスジーンを送達するカラーが記載されている国際特許公表ＷＯ９８／２００２７号明細書（この特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）を参照されたい。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、血管外カラーは、例えば生物分解性または生物適合性材料で形成された壁44によって画定されるボイドスペース42を含む。カラーは、カラーの外側末端で血管48の外壁46に触れている。血液52は、血管の管腔を流れる。柔軟なカラーの縦方向スリット54により、カラーを変形させ、血管の回りに置き、トロンビン接着剤のような通常の組織接着剤を用いてシールする。
【００７２】
更にもう一つの態様では、内皮細胞または内皮前駆細胞をＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄトランスジーンでエクス・ビボでトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を被験哺乳類に投与する。血管移植片に遺伝子修飾した内皮細胞を播種するための典型的手順は、米国特許第５，７８５，９６５号明細書に記載されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００７３】
被験哺乳類が血管移植片を受け入れているときには、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療組成物を単離した血管断片に直接適用した後、イン・ビボで移植することができる。
【００７４】
もう一つの態様では、投与は、被験哺乳類に血管内ステントを移植することを含んでなり、ステントは治療用ＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ遺伝子／タンパク質組成物でコーティングまたは含浸されている。薬剤をコーティングしたまたは薬剤を含浸したステントを構築するための典型的な材料は上記文献に記載されており、Lincoff et al., Circulation, 90: 2070-2084 (1994)に概説されている。図４Ａおよび４Ｂに示されるように、ステントを形成するための金属またはポリマーワイヤー70を、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ治療組成物を含浸させた（または浸漬し、あるいは使用直前に容易にコーティングすることができる）多孔性の生物適合性ポリマーまたはゲルのような組成物でコーティングする。ワイヤーをコイルに巻き取り、織り、あるいは血管内血管形成カテーテル法のような通常の材料および手法を用いて血管の管腔に移植するのに適するステント74に成形する。この方法で改良することができる典型的ステントは、米国特許第５，８００，５０７号および第５，６９７，９６７号明細書(Medtronic, Inc., フィブリンおよび再狭窄の治療法を提供することができる溶出可能な薬剤を含んでなる管腔内ステントを記載）、米国特許第５，７７６，１８４号明細書（Medtronic, Inc., ポリマーおよび固形物または固形物／溶液中に治療物質をポリマーと共に含んでなる多孔性コーティングを有するステントを記載）、米国特許第５，７９９，３８４号明細書（Medtronic, Inc., 体管腔に接触するための生物適合性ポリマー表面を有する柔軟な円筒形の金属ステントを記載）、米国特許第５，８２４，０４８号および第５，６７９，４００号明細書、および米国特許第５，７７９，７２９号明細書に記載され、描写されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。一般的な血管形成法の際にこのようなステントを移植すると、通常のステントの移植よりも再狭窄が少なくなる。この意味において、ステントの生物適合性は改良されている。
【００７５】
もう一つの好ましい態様では、組成物は、ＰＧＬＡ、非分解性ポリマー、または生物学的ポリマー（例えば、澱粉）のような生物分解性ポリマーからなる微粒子であって、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド／ポリヌクレオチドでカプセル化または含浸されているものを含んでなる。このような粒子は、輸液血管形成カテーテルなどを用いて血管壁に送達される。局部的に持続した薬剤送達を行うための他の手法は、Wilensky et al., Trends Cardiovasc. Med., 3: 163-170 (1993)に概説されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【００７６】
血管形成またはバイパス処置の後に１回以上の静脈内注射による投与も考えられる。処置の部位へのＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの局在化は、増殖する内皮細胞上でのＶＥＧＦ−Ｃレセプターの発現によって起こる。局在化は、（例えば、Shih et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87: 1436-1440 (1990)に記載のアポリポタンパク質Ｂ−１００オリゴペプチドに融合した）融合ポリペプチドとしてＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄを組み換え発現することによっても促進される。
【００７７】
血管の狭窄または再狭窄を予防するためのＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの医薬効果を、イン・ビボで、例えば幾つかは余弦的なものである下記の例に記載されるような手順を用いて示す。例により、本発明の説明が更に容易になるが、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００７８】
例１
再狭窄を予防するためのアデノウイルス依存性ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入の使用
ウサギの再狭窄モデルで行った下記の実験は、血管形成後の再狭窄を予防するためのアデノウイルス依存性の血管内ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入の効果を示す。
【００７９】
Ａ．材料および方法
１．アデノウイルス構築物
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列に作動可能に結合した完全なヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−ＣオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを含むアデノウイルスプラスミドは、下記の方法で構築した。ＣＭＶプロモーター配列を含んでなるＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター(Invitrogen)をＳａｌＩで消化し、５′オーバーハングにクレノウ酵素を充填することによって調製した。ＣＭＶプロモーター（ヌクレオチド５４３１〜９１１）を、ベクターからＨｉｎｄIIIで摘出して、単離した。配列番号１に記載した１９９７bpの配列（並びに追加の非コードおよびポリリンカー配列の５０塩基未満）を含む完全長のヒトＶＥＧＦ−ＣｃＤＮＡを、［ＷＯ９８／３３９１７号明細書に記載の］ＶＥＧＦ−ＣｐＲＥＰ７発現ベクターからＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩで摘出し、単離した。ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（約８６０bp）を、αＭＨＣベクターからＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで摘出した。ＣＭＶプロモーター、ＶＥＧＦ−ＣｃＤＮＡおよびｈＧＨポリアデニル化シグナル断片を同時にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐＣＲIIベクターに連結した。連結したＣＭＶプロモーターおよびＶＥＧＦ−ＣｃＤＮＡは、配列番号１７に示されている。生成する構築物をＢｇｌIIで開き、ＢａｍＨＩで部分消化した。完全転写単位をＢｇｌIIで開いたｐＡｄＢｇｌIIベクターに連結した。次に、この構築物［ｐＡｄＢｇｌIIＶＥＧＦ−Ｃと命名］を用いて、標準的相同組換え法を用いてＣＭＶ−ＶＥＧＦ−Ｃ−ｈＧＨ転写単位を含む組換えアデノウイルスを作成した[Barr et al., Gene Ther., 1: 51-58 (1994)]。組換え欠損Ｅ１〜Ｅ３欠失アデノウイルスを２９３個の細胞で産生させ、文献で知られている手法を用いる超遠心によって濃縮した［例えば、Barr et al. (1994)を参照されたい］。同じプロモーターに操作可能に連結したｌａｃＺ遺伝子を含んでなるコントロールプラスミドも用いた[Laitinen M. et al., Hum. Gene Ther., 9: 1481-1486 (1998)]。ｌａｃＺアデノウイルスは核標的設定シグナルを有し、核に対するβ−ガラクトシダーゼ発現を指定した。複製欠損Ｅ１〜Ｅ３欠失アデノウイルスを２９３個の細胞で産生させ(Barr et al., 1994)。アデノウイルス製剤をヘルパーウイルスおよび細菌学的汚染物が含まれないことについて分析した。
【００８０】
２．動物モデル
ニュージーランドシロウサギを用いて、遺伝子導入研究を行った。第一群のウサギには０．２５％コレステロール食を２週間与えた後、大動脈のバルーン露出を行った後、３日後にアデノウイルス依存性遺伝子導入を行った。第二群のウサギには、遺伝子導入だけを行った。動物を、遺伝子導入から２または４週後に屠殺した。両研究群における実験（ＶＥＧＦ−Ｃ）およびコントロール（ｌａｃＺ）動物の数は６であった。
【００８１】
第一群のウサギでは、４．０Ｆ動脈塞栓摘出カテーテル(Sorin Biomedical, Irvine, CA)を用いて大動脈弓の先端から初めて大動脈全体を露出させた。カテーテルを右腸骨動脈を介して大動脈弓まで導入し、膨張させ、大動脈を二回露出させた。
【００８２】
３．遺伝子導入
遺伝子導入は、３．０Ｆチャンネルバルーン局所薬送達カテーテル(Boston Scientific Corp., Maple Grove, MA)を用いて行った。Ｘ線透視装置制御を用いて、バルーンカテーテルを左腎動脈尾部の側肢のない部分に右頸動脈中の５Ｆ経皮インデューサー鞘(Arrow International, Reading, PA)を介して配置し、コントラスト媒体および食塩水の混合物で６ＡＴＭまで膨張させた。バルーンカテーテルの解剖学上の位置を、左腎動脈の大動脈開口からの距離を測定することによって決定した。１．１５×１０１０プラーク形成単位（pfu）のウイルス力価をそれぞれの動物に最終容積２ml（０．９％ＮａＣｌ）で投与し、遺伝子導入を６ＡＴＭで１０分間（０．２ml／分）行った。第二の研究群では、動物に遺伝子導入のみを行い、遺伝子導入から２週後に屠殺した。それぞれの研究群（０．９％ＮａＣｌのみ、ｌａｃＺ遺伝子導入、およびＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入）における動物数は３であった。総ての検討は、フィンランドのクオピオ大学の実験動物委員会によって承認された。
【００８３】
４．組織学
屠殺の３時間前に、動物にＢｒｄＵ  ５０mgを４０％エタノールに溶解したものを静脈内投与した。屠殺後、遺伝子導入を行った大動脈切片を取り出し、食塩水で静かに洗い流し、５個の均等な切片に分けた。基部切片を液体窒素で瞬間凍結し、−７０℃で保管した。次の切片を、４％パラホルムアルデヒド／１５％スクロース（ｐＨ７．４）中で４時間浸漬固定し、１５％スクロース（ｐＨ７．４）で一晩洗浄し、パラフィンに埋設した。中膜切片は、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で１０分間浸漬固定し、ＰＢＳで２時間洗浄し、ＯＣＴ化合物(Miles)に埋設し、−７０℃で保管した。第四の切片は７０％エタノールで浸漬固定し、パラフィンに埋設した。先端切片は、Ｘ−ＧＡＬ染色与中で＋３７℃で１６時間β−ガラクトシダーゼ活性について直接染色し、４％パラホルムアルデヒド／１５％スクロース（ｐＨ７．４）中で４時間浸漬固定し、１５％スクロース（ｐＨ７．４）で一晩洗浄し、パラフィンに埋設した。パラフィン切片は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、マクロファージおよび内皮の免疫細胞化学的検出に用いた。遺伝子導入効率を、ＯＣＴ埋設組織のＸ−ＧＡＬ染色を用いて評価した。ＢｒｄＵ陽性細胞を、製造業者の指示に準じて検出した。形態計測は、イメージ分析ソフトウェアを用い、ヘマトキシリン−エオシン染色パラフィン切片を用いて行った。測定は、切片の起源について知識のない複数の切片から２名の観察者が独立して行った。内膜／中膜（Ｉ／Ｍ）比を、内膜の肥厚化のパラメーターとして用いた。
【００８４】
Ｂ．結果
バルーンによって露出したマウスの組織学的分析により、ｌａｃＺをトランスフェクションしたコントロール群のＩ／Ｍ比は、遺伝子導入の２週間後では０．６１であり、これはＶＥＧＦ−Ｃをトランスフェクションした群（Ｉ／Ｍ比は０．４０）とは統計的に有意さがあることを表していた。ＶＥＧＦ−Ｃ群が小さめのＩ／Ｍ比を有する傾向は、遺伝子導入から４週後の時点でも持続した。
【００８５】
（内皮露出なしで）血管壁への遺伝子導入を施しただけのウサギの第二の群では、ｌａｃＺ群のＩ／Ｍ比は０．３であり、一方ＶＥＧＦ−Ｃ群については０．１５であった。この差も、ＶＥＧＦ−Ｃ群での新内膜形成の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）阻害を表していた。
【００８６】
ＢｒｄＵ標識により、ＶＥＧＦ−Ｃトランスフェクション対コントロール（ｌａｃＺ）動物における平滑筋細胞増殖の分析を行うことができる。ＳＭＣ増殖は、ＶＥＧＦ−Ｃトランスフェクション個体では減少することが予想される。
【００８７】
上記データーは、大動脈露出およびバルーン露出なしでの遺伝子導入カテーテルによって引起された血管壁損傷から２週後の時点では、ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入により内膜肥厚化が有意に減少することを示している。これらのデーターは、血管形成後再狭窄の予防を目的とするＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子の治療上の有用性を示している。
【００８８】
例２
ＶＥＧＦ−Ｃの再狭窄作用がＶＥＧＦの作用より優れていることを示す比較例
下記の実験は、血管形成後再狭窄の予防を目的とするアデノウイルス依存性血管内ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入の効果を示しており、ＶＥＧＦ−ＣがＶＥＧＦと比較して優れた治療効果を提供すると思われることを示している。  Ａ．  材料および方法
１．  アデノウイルス構築物
ＶＥＧＦ（ネズミＶＥＧＦ−Ａ１６４；配列番号１８）アデノウイルスをＶＥＧＦ−Ｃ構築物と同じプロモーターを用い、例１に記載したのと同様な手順に従って構築した。ＶＥＧＦ−Ａ１６４アデノウイルス構築物を２９３Ｔ細胞で産生し、本質的に例１に記載の方法で濃縮し、ヘルパーウイルス、リポ多糖類および細菌性混入物が含まれていないことを分析した。
【００８９】
２．  動物モデル
６３匹のニュージーランドシロウサギを、０．２５％コレステロール食餌を２週間与え、遺伝子導入の前に大動脈のバルーン露出を行った第一群と、遺伝子導入のみを行った第二群の二つの主要な群に分割した。遺伝子導入は、第一群のウサギでは露出の３日後に行い、遺伝子導入の２または４週間後に屠殺した。両時点におけるそれぞれの検討群（ｌａｃＺ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｃ）のウサギの数は６匹であった。第二の検討群では、ウサギは遺伝子導入のみを行い、コレステロール食餌またはバルーン露出は行わず、遺伝子導入の２または４週間後に屠殺した。それぞれの検討群（０．９％食塩水、ｌａｃＺ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｃ）のウサギの数は３匹であった。
【００９０】
３．  遺伝子導入
遺伝子導入は、例１に記載の手順に従って行った。
【００９１】
４．  組織学
組織学は、本質的に例１に記載の方法で、ＳＭＣはHHF35 (DAKO, １：５０希釈）を用いて検出し、マクロファージはRAM-11 (DAKO, １：５０希釈）を用いて検出し、内皮はCD31 (DAKO, １：５０希釈）を用いて検出し、Ｔ細胞はMCA805 (DAKO, １：１００希釈）を用いて検出した改質を加えて行った。免疫染色のコントロールは、クラスおよび種にマッチした免疫グロブリンを有するインキュベーション、および一次抗体を省いたインキュベーションを含んだ。形態計測およびイメージ分析は、Image-Pro Plus（商品名）ソフトウェアおよびOlympus AX70顕微鏡（Olympus Optical, 日本）を用いて行った。統計分析は，ＡＮＯＶＡおよび改良ｔ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えた。
【００９２】
Ｂ．  結果
バルーン露出したウサギの組織学的分析では、内膜肥厚化およびＳＭＣ増殖を示している。遺伝子導入の２週間後には、ｌａｃＺコントロール群はＩ／Ｍ比が最高となり（０．５７±０．０４）、一方ＶＥＧＦ−Ｃ（０．３８±０．０２）およびＶＥＧＦ（０．４９±０．１７）群では内膜肥厚化の減少を示した。ｌａｃＺおよびＶＥＧＦ−Ｃ群のＩ／Ｍ比の差は有意であったが（Ｐ＜０．０５）、ｌａｃＺとＶＥＧＦ群の間の差は２週間後の時点では統計上有意ではなかった。ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｃのいずれの群でもＩ／Ｍ比がより小さいという傾向は、４週間後の時点では継続しており、Ｉ／Ｍ比はｌａｃＺ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦについてそれぞれ０．７３±０．１６、０．４４±０．１４および０．６３±０．２１であった。トランスフェクションした動脈のヘマトキシリン−エオシンおよび免疫染色は、総ての動脈における内膜の肥厚化は大部分がＳＭＣからなることを示している。
【００９３】
アデノウイルスベクターを用いることによって、免疫および炎症性応答を生じることができるが、一部は高力価アデノウイルスがＮＦκＢの発現を誘発し、ＣＴＬ応答を活性化するからである。しかしながら、マクロファージおよびＴ細胞免疫染色によって判定したところ、炎症または泡沫細胞の蓄積の徴候は全く検出されなかった。また、ヒトの臨床的遺伝子療法級のウイルスをトランスフェクションした動脈で短い露出時間で用い、これによりこの反応では過酷な炎症反応がみられないことを説明することもできる。
【００９４】
増殖細胞の割合を、ＢｒｄＵ標識を用いて分析した。ＶＥＧＦ−Ｃ群は増殖速度は低くなりがちであったが、有意差は見られず、ＶＥＧＦ−Ｃを形質導入した動脈はいずれの時点でもＩ／Ｍ比が小さいという観察と一致した。バルーン露出から２週間後には、増殖細胞の割合は、ｌａｃＺ、ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦ−Ｃ群についてそれぞれ１．８±０．４、２．２±０．７、および１．２±０．０であり、４週間後には、増殖細胞の割合は、ｌａｃＺ、ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦ−Ｃ群についてそれぞれ０．３±０．１、１．２±０．５、および０．３±０．１であった。内皮再成長を、組織学的切片から完全な内皮の長さを測定することによって分析した。これらの検討群の間には、有意差は見られなかった。
【００９５】
アデノウイルスが血管壁および新内膜形成に損傷を引起す可能性を、ウサギの完全な腹部大動脈にバルーン−露出なしで高力価アデノウイルス遺伝子導入を行うことによって試験した。コントロールウサギには、同じ方法で０．９％食塩水を投与した。処置の後に、遺伝子導入カテーテルの設置により、幾らかの内部弾性管腔の損傷と新内膜形成の中程度の誘導を引起した。２週間後の時点では、ｌａｃＺ群でのＩ／Ｍ比は０．２４±０．０６であり、コントロール群では０．２８±０．０５であり、ＶＥＧＦ−Ｃ群では０．１８±０．０７であり、ＶＥＧＦ群では０．１５±０．０３であった。４週間後の時点では、ｌａｃＺ群はＩ／Ｍ比が０．２２±０．１３であり、ＶＥＧＦ−Ｃ群は０．１３±０．０３であり、ＶＥＧＦ群は０．２３±０．１１であった。
【００９６】
この検討は、バルーン損傷後の血管壁に対する血管内アデノウイルス依存性ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入の治療効果が有益であることを示し、また新内膜形成の予防のためのＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦアデノウイルス依存性遺伝子導入を比較する。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦの異なるレセプター結合プロフィールは血管壁において異なる生物学的効果を生じる可能性があるが、いずれのＶＥＧＦも遺伝子導入から２週間後には内膜肥厚化が減少した。従って、いずれのＶＥＧＦも虚血性のアテローム性疾患の血管遺伝子療法の潜在的な候補である。しかしながら、この実験によれば、このモデル系ではＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦより効果的に再狭窄を防止すると思われる。ＶＥＧＦと比較して、再狭窄を防止するＶＥＧＦ−Ｃの優れた能力は、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−ＤのレセプターではあるがＶＥＧＦのレセプターではないＶＥＧＦＲ−３の発現または活性によると思われた。あるいは、明らかな優越性は、ＶＥＧＦＲ−１を介して伝達される再狭窄促進作用によるか、または血管平滑筋細胞で発現するといわれている共通レセプターＶＥＧＦＲ−２を介して伝達される示差リガンド効果（ＶＥＧＦ−Ｃ対ＶＥＧＦ）によることができる［Grosskreutz et al., Microvasc. Res., 58(2): 128-136（１９９９年９月）を参照されたい］ 。
【００９７】
例３
大動脈壁におけるトランスフェクションしたＶＥＧＦの発現
例２に記載した同じ実験動物からの大動脈切片を用いて、ｌａｃＺ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ（ネズミＶＥＧＦ−Ａ１６４）のｍＲＮＡ発現を、遺伝子導入後の大動脈組織において分析した。総ＲＮＡを、Triazol Reagent (Gibco-BRL)を用いてトランスフェクションした大動脈切片から抽出し、ＲＮＡ２μgを用いてｃＤＮＡを合成した。ｌａｃＺ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦについてのプライマーをデザインして、ＣＭＶプロモーター由来の５′プライマーとコード領域由来の３′プライマーを選択することによって内在性および形質導入遺伝子を識別した。
【００９８】
ｌａｃＺ増幅については、プライマーは、５′プライマーが5'-TTGGAGGCCTAGGCTTTTGC-3'（配列番号５）であり、３′プライマーが5'-ATACTGTCGTCGTCCCCTCA-3'（配列番号６）であった。第一のＰＣＲサイクルは９６℃で４分間の初期インキュベーションに続いて８０℃で３分間のインキュベーションであり、この間にＤＮＡポリメラーゼを加えた。この後に３０サイクル行い、それぞれ９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で５０秒間からなり、続いて７２℃で５分間の最終伸張を行った。第一のＰＣＲ生成物５μlは、５′プライマー5'-GGTAGAAGACCCCAAGGACTTT-3'（配列番号７）および３′プライマー5'-CGCCATTCGCCATTCAG-3'（配列番号８）と共に第二のＰＣＲについて用いた。第一のＰＣＲサイクルは、９６℃で３分間の初期インキュベーションに続いて８０℃で３分間のインキュベーションであり、これに続いて３２サイクル行い、それぞれ９４℃で６０秒間、５８℃で１５秒間、および７２℃で９０秒間からなり、続いて７２℃で５分間の最終伸張を行った。
【００９９】
ＶＥＧＦ−Ｃ増殖については、プライマーは、５′プライマーが5'-CTGCTTACTGGCTTATCG-3' （配列番号９）であり、３′プライマーが5'-CCTGTTCTCTGTTATGTTGC-3' （配列番号１０）である。第一のＰＣＲサイクルは９６℃で４分間の初期インキュベーションに続いて８０℃で３分間のインキュベーションであり、この間にＤＮＡポリメラーゼを加えた。この後に３９サイクル行い、それぞれ９４℃で３０秒間、５６℃で４０秒間、および７２℃で９０秒間からなり、続いて７２℃で５分間の最終伸張を行った。第一のＰＣＲ生成物５μlは、５′プライマー5'-TCTCCAAAAAGCTACACCG-3'（配列番号１１）および３′プライマー5'-CAAGTGCATGGTGGAAGG-3'（配列番号１２）と共に第二のＰＣＲについて用いた。第一のＰＣＲサイクルは、９６℃で３分間の初期インキュベーションに続いて８０℃で３分間のインキュベーションであり、これに続いて３９サイクル行い、それぞれ９４℃で６０秒間、５７℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間からなり、続いて７２℃で５分間の最終伸張を行った。
【０１００】
ＶＥＧＦ増幅については、プライマーは、５′プライマーが5'-TCGATCCATGAACTTTCTGC-3' （配列番号１３）であり、３′プライマーが5'-TTCGTTTAACTCAAGCTGCC-3' （配列番号１４）である。第一のＰＣＲサイクルは９６℃で４分間の初期インキュベーションに続いて８０℃で３分間のインキュベーションであり、この後に３９サイクル行い、それぞれ９４℃で３０秒間、５３℃で４０秒間、および７２℃で９０秒間からなり、続いて７２℃で５分間の最終伸張を行った。第一のＰＣＲ生成物５μlは、５′プライマー5'-GACCCTGGCTTTACTGCTG-3'（配列番号１５）および３′プライマー5'-GGAACATTTACACGTCTGCG-3'（配列番号１６）と共に第二のＰＣＲについて用いた。第一のＰＣＲサイクルは、９６℃で３分間の初期インキュベーションに続いて８０℃で３分間のインキュベーションであり、これに続いて３９サイクル行い、それぞれ９４℃で６０秒間、５４℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間からなり、続いて７２℃で５分間の最終伸張を行った。
【０１０１】
遺伝子導入から４週間後までに、ｌａｃＺ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡを大動脈壁組織に検出した。
【０１０２】
遺伝子導入効率を、ＯＣＴ埋設組織切片でβ−ガラクトシダーゼ活性についてのＸ−Ｇａｌ染色によって分析したｌａｃＺ発現を検討することによって評価した。トランスフェクション効率は、血管内カテーテル依存性遺伝子導入からそれぞれ２および４週間後では、１．１％±０．５および０．３％±０．１であった。
【０１０３】
例４
大動脈壁におけるＶＥＧＦレセプターの発現
例２に記載の実験動物を用いて、大動脈壁でのＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の発現を免疫染色およびインシテューハイブリダイゼーションによって分析した。免疫組織化学は、ＶＥＧＦＲ−１の検出にはクローンｓｃ−３１６(Santa Cruz Biotechnology, １：５０希釈）、ＶＥＧＦＲ−２の検出にはクローンｓｃ−６２５１(Santa Cruz Biotechnology, １：５０希釈）、およびＶＥＧＦＲ−３の検出にはクローンｓｃ−６３７(Santa Cruz Biotechnology, １：３００希釈）を用いて行った。免疫染色のコントロールは、クラスおよび種にマッチした免疫グロブリンを有するインキュベーション、および一次抗体を省いたインキュベーションを含んだ。ＶＥＧＦレセプターｍＲＮＡのインシテューハイブリダイゼーションは、３３Ｐ−ＵＴＰを標識したリボプローブを用いて行った。総てのレセプターの発現は、内皮に局在化した。ＶＥＧＦＲ−２は、新内膜ＳＭＣでも発現した。
【０１０４】
例５
再狭窄の予防のための露出ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーン療法の使用
下記の改質を行ったことを除き、例１および２に記載の手順を繰返した。ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンの送達のためにアデノウイルスベクターを用いる代わりに、哺乳類発現ベクターを構築して、（露出プラスミドＤＮＡの）直接遺伝子導入を行う。ＶＥＧＦ−Ｃコード配列はＣＭＶプロモーターのような適当なプロモーターに作動可能に結合し、好ましくはヒト成長ホルモンポリアデニル化配列のような適当なポリアデニル化配列に結合した。典型的なＶＥＧＦ−Ｃベクターは、他の増殖因子のベクターを含まない遺伝子導入を行うために文献に記載されたベクターから、ＶＥＧＦコード配列の代わりにＶＥＧＦ−Ｃコード配列を用いることによって設計することができる。［例えば、Isner et al., Circulation, 91: 2687-2692 (1995); およびIsner et al., Human Gene Therapy, 7: 989-1011 (1996)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。］ベクター。ｌａｃＺ遺伝子を含んでなる同様な構築物は、コントロールとして用いられる。
【０１０５】
ヒドロゲルでコーティングしたバルーンカテーテル(Boston Scientific)を、Asahara et al., Circulation, 94: 3291-3302 （１９９６年１２月１５日）に本質的に記載されたＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンの送達に用い、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。簡単に説明すれば、血管形成バルーンは、テフロン保護鞘(Boston Scientific)中を完全にすぼめたバルーンを前進させることによってエクス・ビボで調製する。バルーンを膨張させ、通常のピペットを用いて、トランスジーン構築物（例えば、５０〜５０００μgのトランスジーンＤＮＡの食塩溶液）を膨張させたバルーンの外部表面をコーティングしているヒドロゲルポリマーに塗布する。トランスジーン溶液が乾燥した後、バルーンをすぼませて保護鞘中に引き入れ、バルーンが標的動脈中で適正に配置されるまでバルーン表面を通る血流を最小限にする。
【０１０６】
内膜／中膜（Ｉ／Ｍ）比を、内膜の肥厚化のパラメーターとして用いた。ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンをコーティングしたバルーンカテーテルで処理した動物でのＩ／Ｍ比の減少は、治療効果を示していると考えられる。例２に記載しているように、ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入の治療効果のＶＥＧＦ遺伝子導入のような他の治療法との比較を、平行して行うこともできる。
【０１０７】
例６
ステントを用いる血管形成の後の再狭窄を予防するためのＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子療法の使用
初期のバルーン血管形成と同時に通常の手順を用いて冠動脈ステントの移植を行うことの改質を除き、上記の例に記載した手順を繰返す。ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンを、上記の例に本質的に記載したステントの移植と同時にまたは直前または直後に送達する。Van Belle et al., J. Am. Coll. Cardiol., 29: 1371-1379 （１９９７年５月）に記載されているように、（ステントなしの血管形成と比較して）トランスジーンの量を増加（例えば、２倍〜１０倍）させ、トランスフェクション時間を増加させることが望ましいことがある。上記の文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子で処理した動物体マーカー遺伝子で処理したコントロール動物での新内膜肥厚化の減少および／または血栓性閉塞の減少は、ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子療法の効果を示しているものと考えられる。
【０１０８】
例７
血管狭窄を減少させるための血管外カラーの使用
国際特許公表ＷＯ９８／２００２７号明細書に記載のような不活性シリコーンカラーを、ニュージーランドシロウサギの頸動脈周囲に外科的に移植するカラーは内膜肥厚化を誘発する刺激物質として作用し、ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンまたはタンパク質医薬処方物の局部送達に適する溜めを含む。例１に記載したＶＥＧＦ−Ｃアデノウイルス構築物または混合物と構築物を用いる遺伝子導入を、５日後に１０８〜１０１１pfuをカラーに注入することによって開始する。動物を１４または２８日後に屠殺し、組織学的検討を例１に記載したのと同様にして行う。内膜／中膜厚み比[Yla-Herttuala et al., Arteriosclerosis, 6: 230-236 (1986)]を、狭窄の指標として用いる。ｌａｃＺコントロールウサギと比較して、ＶＥＧＦ−ＣトランスフェクションウサギでのＩ／Ｍ比が減少することは、動脈狭窄の予防のためのＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子導入の治療効果を示している。
【０１０９】
例８
再狭窄を減少させまたは防止するためのＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの使用
試験動物をＶＥＧＦ−ＣトランスジーンまたはｌａｃＺコントロールを含むアデノウイルスで処理する代わりに、動物に薬学上許容可能なキャリヤー中にＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド（例えば、血清アルブミンを含む等張食塩水）またはコントロールとしてキャリヤー溶液のみを投与することを除き、例１に記載の手順を繰返す。試験動物には、例えば例１に記載されているように、動脈内輸液によりＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド１０、１００、２５０、５００、１０００、または５０００μgを投与する。第二群の動物には、７日後にＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの注射を更に行う。動物を、例１に記載した方法で屠殺し、組織学的検討を行った。コントロール動物と比較して、ＶＥＧＦ−Ｃを投与した動物でＩ／Ｍ比が減少することは、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド治療の治療効果を示している。様々な持続放出ＶＥＧＦ−Ｃ処方物および上記の材料を用いて実験を繰返すと、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの治療効果が更に向上することが予想される。更に、ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質（標的血管に即時に治療を行うための）ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質と（数日または週間持続治療を行うための）ＶＥＧＦ−Ｃトランスジーンとの同時投与を含んでなる治療法は、本発明の一変法と特に考えられている。
【０１１０】
例９
ＶＥＧＦ−Ｄの狭窄防止／再狭窄防止活性
上記の例に記載された手順を、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド／ポリペプチドの代わりにＶＥＧＦ−ＤポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−Ｄを含んでなる組成物を用いて繰返し、血管の狭窄または再狭窄を予防するためのＶＥＧＦ−Ｄの能力を示す。
【０１１１】
本発明を特定の態様について説明してきたが、変更および改質は当業者に起こるであろうし、これらは総て本発明の側面としようとするものであることが理解される。従って、請求の範囲に見られる制限のみが、本発明に適用されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】保護鞘を含む薬剤送達バルーンカテーテルを挿入した血管の断面であり、保護鞘は挿入および位置設定の際にバルーンを被覆する働きをする。
【図２Ａ】両端を互いに合わせる前の間隔を置いて離れている二層を有する膨張性膜の斜視図。
【図２Ｂ】丸めてチューブ状にし、対向端を隣接させた図２Ａの膜の斜視図。
【図３】血管の一部を取り巻いている血管外カラーの斜視（図３Ａ）および縦断面（図３Ｂ）略図。
【図４Ａ】治療組成物を含む（例えば、含浸させる）ことができるポリマーまたはゲルをコーティングしたワイヤーの断面図。
【図４Ｂ】図４Ａのワイヤーから形成された血管内ステントの斜視図。
【符号の説明】
【０１１３】
10  カテーテル
12  膨張性バルーン
14  膨潤性ヒドロゲルポリマーコーティング
16  管腔
18  血管
20  保護鞘
22  閉塞部位
30，32  弾性膜材料の層
34  管状構造
36  孔またはスリット
38  内部表面
40  血管外カラー
42  ボイドスペース
44  壁
46  外壁
48  血管
50  カラーの外部先端
52  血液
54  縦方向スリット
70  ワイヤー
72  組成物
74  ステント
【図１】
2011173874.tif 000003
【図２Ａ】
2011173874.tif 000004
【図２Ｂ】
2011173874.tif 000005
【図３】
2011173874.tif 000006
【図４Ａ】
2011173874.tif 000007
【図４Ｂ】
2011173874.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月28日(2011.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチド）を含んでなる、血管の狭窄の予防に用いるための医薬組成物。
【請求項２】
血管の狭窄を治療または予防するための手術中に血管の表面に接触するように設計された血管内ステントである装置であって、ステントが血管の表面に接触するための外部表面とその表面上の組成物とを含んでなり、その組成物が、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドを含んでなる、装置。
【請求項３】
血管の狭窄を治療または予防するための手術中に血管の表面に接触するように設計された血管外カラーである装置であって、カラーが血管の外部表面を取り巻くような形状の外壁を含んでなり、この壁が、ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドを含んでなる組成物を含む間隙を取り囲むことを特徴とする、装置。
【請求項４】
ＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドを含んでなる組成物を保持する容器と、容器に取り付けられた、または容器と一緒に包装されたラベルであって、血管の狭窄を予防するための化合物の使用を記載したラベルとを含んでなる、狭窄予防用キット。
【請求項５】
血管内ステント、血管内カテーテル、血管外カラー、および血管内ステントまたはカテーテルの表面を被覆するのに適した膜からなる群から選択される医療装置を更に含んでなる、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
血管の管腔壁に薬剤を送達するためのキャリヤー物質を更に含んでなる、請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
キャリヤーが、ヒドロゲルポリマーおよび微粒子ポリマーからなる群から選択される、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
容器中に包装されたＶＥＧＦ−Ｄポリヌクレオチドを含んでなる組成物を含んでなる血管の狭窄を予防するための単位投与処方物であって、容器が、狭窄を予防するために処方物を使用するための指示を含むラベルを含んでいることを特徴とする、単位投与処方物。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、哺乳類ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、ヒトＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１１】
コードされたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが、配列番号４の連続部分を含んでなるアミノ酸配列を含んでなり、その連続部分が配列番号４の９３〜２０１位を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸１〜９２をコードするヌクレオチド配列を欠いている、請求項１１に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸２０２〜３５４をコードするヌクレオチド配列を欠いている、請求項１１または１２に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１４】
ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ６．８中４２℃でハイブリダイゼーション、および１ＸＳＳＣ中で５５℃にて３０分間洗浄の典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３で特定されたヒトＶＥＧＦ−Ｄ配列に相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、かつヒトＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に結合して、それらのリン酸化を刺激するＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドが、分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含んでなり、分泌シグナルペプチドをコードする配列がＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードする配列とインフレームで結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１６】
分泌シグナルペプチドが、異種シグナルペプチドである、請求項１５に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが、分泌シグナル配列およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター配列を更に含んでなり、プロモーター配列が哺乳類細胞において分泌シグナル配列およびＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードする配列の転写を促進する、請求項１５または１６に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結したポリアデニル化配列を更に含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項１９】
組成物が、遺伝子療法ベクターを含んでなり、その遺伝子療法ベクターが前記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項２０】
ベクターが、複製欠損アデノウイルスを含んでなり、そのアデノウイルスが、プロモーターに作動可能に連結し、かつ、アデノウイルスポリヌクレオチド配列が隣接しているポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１９に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項２１】
ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４の９３〜２０１位を含んでなる配列番号４の連続部分；および
（ｂ）１〜数個のアミノ酸が付加、欠失または他のアミノ酸に置換された（ａ）の類似体であって、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に結合し、それらのリン酸化を刺激する類似体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項２２】
組成物が、薬学上許容可能なキャリヤーを更に含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【請求項２３】
血管が、移植血管である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物、装置、キット、または単位投与処方物。
【外国語明細書】
2011173874000001.pdf