(57)【要約】【課題】Ｌ−カルニチンに含まれる不純物を簡便な操作で除去すること。【解決手段】以下の工程を含む、Ｌ−カルニチンに含まれる不純物を除去する方法；（１）不純物を有するＬ−カルニチンのアルコール溶液を調製する工程（２）工程（１）で得られたＬ−カルニチンのアルコール溶液からＬ−カルニチンを晶析してスラリーを得る工程（３）工程（２）で得られたスラリーから、粒子径が１０μｍ未満の粒子を除去する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、Ｌ−カルニチンに含まれる不純物を除去する方法。
（１）不純物を有するＬ−カルニチンのアルコール溶液を調製する工程
（２）工程（１）で得られたＬ−カルニチンのアルコール溶液からＬ−カルニチンを晶析してスラリーを得る工程
（３）工程（２）で得られたスラリーから、粒子径が１０μｍ未満の粒子を除去する工程
【請求項２】
工程（２）における晶析が濃縮晶析である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（３）の前に、工程（２）で得られるスラリー溶液を冷却する工程を更に含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
アルコールが、１−ブタノール、イソブタノール、メタノール／１−ブタノール混合物、エタノール／１−ブタノール混合物、又はメタノール／イソブタノール混合物である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−カルニチンに含まれる不純物の除去方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患治療剤、過脂肪質血症治療剤、静脈疾患治療剤等として注目されているＬ−カルニチンは、ビタミンＢＴとも言われ、生体内で脂肪酸の代謝に関係している重要な化合物である。
Ｌ−カルニチンの製造法としては、Ｄ−マンニトールを原料として製造する方法（特許文献１参照）、γ−ハロアセト酢酸エステルを原料として酵素により不斉還元することを特徴とする方法（特許文献２参照）、リパーゼを用いて光学選択的に（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成することを特徴とする方法（特許文献３参照）、γ−ブチロベタイン又はクロトノベタインから微生物によってＬ−カルニチンを製造する方法（特許文献４参照）、カルニチンアミドハライドをｄ−樟脳酸により光学分割してＬ−カルニチンに導く方法（特許文献５参照）などが知られている。
本発明者は、上記従来の方法と比較して副反応を抑制できる製造方法として、１，３−ジクロロ−２−プロパノールを原料として、シアノ化反応、水和反応、４級アミノ化反応を経るカルニチンの製造方法を提供している（特許文献６参照）。この方法では、特に４級アミノ化反応時の副反応を大幅に抑制できる点で、他の製造方法よりも純度の高いカルニチンを得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５７−１６５３５２号公報
【特許文献２】特開昭５９−１１８０９３号公報
【特許文献３】特開平０２−２７９９５号公報
【特許文献４】特開昭６１−１９９７９３号公報
【特許文献５】特公昭４５−９１７２号公報
【特許文献６】国際公開２００８／０５６８２７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、Ｌ−カルニチンは医薬品、食品等に利用されるため、さらなる高純度の（不純物が低減された）ものが望まれている。
そこで、本発明の主な目的は、Ｌ−カルニチンに含まれる不純物を簡便な操作で除去することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、不純物を含むＬ−カルニチン混合物を特定のアルコール溶媒で晶析した後、特定の目開きを有する膜で濾過することにより、Ｌ−カルニチンから不純物が高度に除去できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の工程を含むＬ−カルニチンに含まれる不純物を除去する方法に関する。
（１）不純物を有するＬ−カルニチンのアルコール溶液を調製する工程
（２）工程（１）で得られたＬ−カルニチンのアルコール溶液からＬ−カルニチンを晶析してスラリーを得る工程。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、Ｌ−カルニチンに含まれる不純物を簡便な操作で十分に除去することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）不純物を有するＬ−カルニチンのアルコール溶液を調製する工程（工程（１））
本発明の工程（１）では、不純物を有するＬ−カルニチンのアルコール溶液を調製する。
（１−１）Ｌ−カルニチン
本発明で使用するＬ−カルニチンは、市販のものを使用することもできるし、公知又は新規な方法で製造したＬ−カルニチンを使用することもできる。
Ｌ−カルニチンとしては、例えば、以下の製造方法で調製されたものを使用することができる。
（ｉ）ジクロロプロパノールを酵素反応によりシアノ化及びアミド化した後、４級化し、加水分解等を行うことにより得られるＬ−カルニチン；
（ｉｉ）エピクロロヒドリンを順次、４級化、シアノ化、アミド化、光学分割等に供して得られるＬ−カルニチン；
（ｉｉｉ）ブチロラクトンを開環、４級化、微生物による反応等に供して得られるＬ−カルニチン；
（ｉv）クロロアセト酢酸エチルを不斉還元、４級化、加水分解等に供して得られるＬ−カルニチン。
これらのなかでも、（ｉ）で得られるＬ−カルニチンを好適に使用することができる（ＷＯ２００８／０５６８２７号パンフレット参照）。当該方法は、効率良くＬ−カルニチンを製造することができ、また、本発明の不純物の除去方法にも適しているからである。
また、当該Ｌ−カルニチンは結晶状のものも使用できるし、溶液に溶解しているものも使用することができる。合成直後のＬ−カルニチン水溶液だけでなく、当該溶液をイオン交換カラム、電気透析等の精製工程を経たものも使用することができる。
（１−２）不純物
本発明において除去される（Ｌ−カルニチンに含まれる）不純物は、Ｄ−カルニチン、クロトノベタイン、無機塩等が挙げられる。これらの不純物は１種単独で含まれていてもよいし、２種以上含まれていてもよい。
無機塩とは、塩酸、硫酸、燐酸、硝酸及びホウ酸からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む無機酸の、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である。より詳細には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、燐酸ナトリウム、燐酸水素ナトリウム、燐酸カリウム、燐酸水素カリウム、硝酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム等を例示することができる。本発明においては、これらの中でも特に硫酸ナトリウムを好適に除去することができる。
Ｌ−カルニチンに含まれる不純物の含有量は、本発明の方法において十分に除去することができる限り限定されない。例えば、効率良く不純物が除去できる範囲としては、Ｄ−カルニチン及びクロトノベタインの合計量が、Ｌ−カルニチンに対して０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．００１〜６質量％である。この範囲内であれば、本発明の方法において十分に除去することができるからである。
また、無機塩の含量は、Ｌ−カルニチンに対して０．００１〜１質量％程度が良く、より好ましくは０．００１〜０．１質量％の範囲である。この範囲内であれば、結晶性の悪化を防ぐことができ、また、本発明の方法において十分に除去することができるからである。
（１−３）溶媒（アルコール）
不純物を有するＬ−カルニチンのアルコール溶液を調製するためのアルコールの種類は、不純物が十分に除去できれば限定されないが、除去効率の点においてアルキルアルコールがより好ましい。
アルキルアルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、１−ヘキサノール及び２−ヘキサノールからなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。当該アルコールは、不純物が十分に除去できる範囲内で水を含んでいても良い。
当該アルコールは、１種単独で使用することもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。１種単独で使用する場合は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、１−ブタノール又はイソブタノールが好ましく用いられる。エタノール、１−ブタノール又はイソブタノールを用いれば、少ない溶媒で効果的に不純物を除去することができるのでより好ましい。さらに好ましくは、１−ブタノール又はイソブタノールである。
使用するアルコールの量は、不純物が十分に除去できれば限定されない。例えば、１種類のアルコールを単独で使用する場合は、L−カルニチンの質量に対して２〜２０倍量とすればよく、より好ましくは３〜１０倍量である。２倍量以上とするのは、L−カルニチンを十分に溶解することができるからであり、また、２０倍量以下とするのは、効率良く晶析することができるからである。
２種以上のアルコールを組み合わせて用いる場合には、不純物を効率良く除去することができれば、混合するアルコールの種類は限定されない。例えば、メタノールと１−ペンタノール、メタノールと１−ヘキサノール、イソプロパノールとメタノール、イソプロパノールとエタノール、１−ブタノールとメタノール、１−ブタノールとエタノール、イソブタノールとメタノール、イソブタノールとエタノール等の混合溶液が好適に用いられる。これらのなかでも、１−ブタノールとメタノール、１−ブタノールとエタノール、イソブタノールとメタノール、イソブタノールとエタノール等の組み合わせがより好ましい。これらの混合溶液を用いることにより、不純物の除去効率が上昇し、最終的に得られるカルニチンの純度が高くなるからである。
２種以上のアルコールを混合して用いる場合、不純物を効率良く除去することができれば、混合するアルコールの量及び混合比は限定されない。例えば、１−ブタノールとメタノール又はエタノールとの混合溶媒を用いる場合、メタノール又はエタノールは、１−ブタノール中０．１〜５０質量％程度の範囲とすればよく、１５〜４０質量％の範囲がより好ましい。このような範囲の混合溶媒を使用することにより、不純物の高い除去効果を得ることができる。当該混合溶媒の使用量も、上述したように、カルニチンの質量に対して１〜２０倍量、好ましくは１〜１０倍量とすればよい。
また、当該溶媒はアルコール以外の有機溶媒を含んでいてもよい。当該有機溶媒としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。有機溶媒の混合量は、不純物が効率良く除去できれば限定されず、当業者が適宜選択することができる。
（１−４）アルコール溶液の調製
本発明におけるアルコール溶液の調製方法は特に限定されるものではない。例えば、不純物を有するＬ−カルニチン水溶液にアルコールを添加したもの、不純物を有するＬ−カルニチン水溶液を溶媒置換によりアルコール溶液にしたもの、不純物を有するＬ−カルニチン水溶液を乾固してからアルコールを添加したもの、晶析等の操作によって得られた不純物を有するＬ−カルニチンの結晶にアルコールを添加したもの等を用いることができる。
ここで溶媒置換とは、Ｌ−カルニチン水溶液の溶媒（水）を当該溶媒とは異なる溶媒（例えば、アルコール）に置き換える操作を示す。本発明において、溶媒置換の方法は特に限定されないが、例えば、複数の溶媒の混合液から沸点の低い溶媒を濃縮により除去する方法、共沸組成のある溶媒を濃縮操作により除去し、一方の溶媒を残留させる方法、乾固しない範囲で充分濃縮した溶液に、当該溶媒と相互溶解度の有る溶媒を加えることでその加えた溶媒の溶液とする方法等が挙げられる。
本発明においては、例えば、Ｌ−カルニチン水溶液に水以外の単一あるいは複数のアルコール溶媒を添加した後、共沸操作により水を除去し、（晶析に用いる）アルコール等の他の溶媒に置き換えることが好ましい。例えば、Ｌ−カルニチン水溶液から１−ブタノールやイソブタノール等のアルコールを用いて、溶媒置換により水を除去させる方法が好ましい。
また、メタノール又はエタノール等のL−カルニチンを容易に溶解させる溶媒と１−ブタノールやイソブタノール等の沸点の異なる溶媒との混合溶液にＬ−カルニチンを含む混合物を溶解させたものから、溶媒置換してメタノール又はエタノールの大部分を留去する方法等もある。
不純物を有するＬ−カルニチンをアルコールに添加する際、アルコールの温度は、例えば１０〜８０℃、より好ましくは２０〜７０℃とすればよい。１０℃以上とすることにより、Ｌ−カルニチンを十分にアルコールに溶解させることができ、８０℃以下とするのは、不純物の生成を抑制することができ、また、少量の溶媒でＬ−カルニチンを十分に溶解することができるからである。
また、Ｌ−カルニチン溶液のｐＨは特に限定されないが、５〜１０、好ましくは６〜９とすればよい。ｐＨを５以上とするのは、カルニチンと無機酸の塩が生成することによる品質の低下を防ぐことができるからである。また、ｐＨを１０以下とするのは、Ｌ−カルニチンの分解を防ぐことができるからである。ｐＨの調整は、公知の方法でｐＨを調整することができる。
（２）工程（１）で得られたＬ−カルニチンのアルコール溶液からＬ−カルニチンを晶析してスラリーを得る工程（工程（２））
次に、上記工程（１）で調製されたアルコール溶液から、Ｌ−カルニチンを晶析する。晶析の方法は限定されず、公知の晶析方法を使用することができる。例えば、アルコール溶液を濃縮する方法、アルコール溶液を冷却する方法、アルコール溶液に有機溶媒を添加する方法等がある。
本発明においては、溶媒を濃縮することによって晶析させることが好ましい。濃縮晶析を行うことは、Ｌ−カルニチンのアルコール溶液から効率よく結晶が取得でき、また、効率良くＬ−カルニチンから不純物を除去することができるので好ましい。
濃縮を行う場合、常圧下で行うこともできるし減圧下に行うこともできる。減圧下に濃縮を行う際の減圧度は特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、０．１〜６６．７ｋＰａ程度とすればよく、濃縮速度の観点から０．１〜２６．７ｋＰａ程度の範囲が好ましい。
また、前記溶媒置換と同時に濃縮晶析を行うこともできる。例えば、Ｌ−カルニチン水溶液と共沸蒸留で水を除去できる最低限量のブタノールを混合し、溶媒置換しながら結晶を析出させる方法がより好ましい。当該方法により、Ｌ-カルニチンを含む混合物の水溶液から効率よく結晶を取得することができる。
【０００８】
晶析を行う場合の溶媒の温度は、例えば１０〜１５０℃程度である。カルニチンの収率低下又はカルニチン純度の低下を防ぐことができるので、１０〜８０℃程度が好ましい。また、２０〜７０℃程度の場合、熱履歴によるカルニチン結晶の品質の微細な変化を防ぐことができ、品質の低下がなく且つ効率的に晶析することができるので、より好ましい。
溶媒置換と同時に晶析させる場合、溶液の最終的な組成は特に制限がないが、例えば、水を含む溶媒を用いた場合は晶析終了時の水の量が１質量％以下となることが好ましい。水が多量に残留した場合に生じる、カルニチンの収率低下及びＤ−カルニチンの結晶への残留量増加を防ぐことができるからである。より好適には０．５％以下となるまで水を除くことでＤ−カルニチンを効率的に取り除くことができ好ましい。
なお、本発明において、晶析溶媒への置換操作の途中に一部Ｌ−カルニチンの結晶の析出が開始する場合があり、その場合、水の量は好ましい範囲を外れることがあるが、晶析終了時の水の量を好ましい範囲内に収めることで、効率よく精製することが可能である。
晶析後に得られるスラリー中のＬ−カルニチン含量は、当該スラリーが流動性を有する限り限定されない。例えば１〜７０質量％、好ましくは２０〜５０質量％とすればよい。この範囲内であると、流動性を確保しながら効率的に固液分離を行うことができるからである。
このようにして、Ｌ−カルニチンのスラリーを得ることができる。ここで、スラリーとは、晶析したＬ−カルニチン（及び不純物）の結晶が、晶析溶媒中で懸濁した状態のものを指す。結晶の濃度又は溶媒の濃度は限定されない。
【０００９】
更に、Ｌ−カルニチンから、不純物を高度に除去するために、得られたスラリーを冷却することが好ましい。冷却する温度は得られるＬ−カルニチンの品質が低下しなければ限定されず、適宜範囲することができる。例えば、晶析を行う際の温度より１〜７０℃低下させることができ、１０〜５０℃に低下させることが好ましい。この範囲であれば、Ｌ−カルニチンの収量が低下せず、十分に不純物が除去できるからである。
当該スラリーを冷却する方法は限定されない。自然冷却も可能であるし、公知の方法を用いて、スラリーの温度変化を見ながら徐々に温度を下げていくことも可能である。冷却する速度は、濾過の効率や得られるＬ−カルニチンの純度が低下しなければ限定されない。例えば、２．０℃／ｍｉｎ以下の速度が好ましく、０．０５〜１．０℃／ｍｉｎの速度がより好ましい。この冷却速度の範囲であれば、作業効率が悪化せず、且つ、急激な冷却によりＬ−カルニチンを多く含んだ結晶が大量に生じ、固液分離の際の濾過性悪化や収量低下を防ぐことができるからである。
（３）工程（２）で得られるスラリーから、粒子径が１０μｍ未満の粒子を除去する工程（工程（３））
次いで、上記工程（２）で得られたＬ−カルニチンのスラリーを固液分離する（工程（３））。本工程における固液分離は、粒子径が１０μｍ以上の粒子を捕集できる濾材を用いて行うことにより、上記スラリーから粒子径が１０μｍ未満の粒子を除去する。
本発明者らは、Ｄ−カルニチン、クロトノベタイン、無機塩等の不純物が、当該スラリー中の粒子径が１０μｍ未満の結晶中に集まる（高度に濃縮される）ことを見出した。従って、当該１０μｍ未満の結晶を除去することにより上記不純物が高度に除去され、高純度のＬ−カルニチンを得ることができる。
通常、濾材の種類によって保留粒子径（捕集できる粒子の粒子径）、通気量、濾過効率、目開きなど指標とする基準が異なるが、本発明においては、粒子径が１０μｍ未満の結晶が通過すれば（除去できれば）よい。すなわち、濾材の目開きが１０μｍ以上であれば使用する濾材は限定されず、適宜選択することができる。
好ましくは目開きが１０〜１００μｍの濾材である。これは、結晶のロス（Ｌ−カルニチンの収率の低下）を抑えながら、高度に不純物を除去することができるからである。より好ましくは目開きが１０〜６０μｍの濾材であり、この範囲とすることにより、結晶（Ｌ−カルニチン）をほとんどロスすることなく、高度に不純物を除去することができる。
ここで、濾材により捕集される粒子の粒子径は、ＪｉＳ  Ｐ  ３８０１〔ろ紙（化学分析用）〕で規定された、硫酸バリウムなどを自然濾過したときの漏洩粒子径により求めることができる。
また、濾材が濾布である場合は、通気量が０．３（ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃ）以上の濾布を用いることにより、粒子径が１０μｍ未満の粒子を除去することができる。ここで、通気量とは、単位時間当たりに濾布を通過する空気の量のことをいい、ＪｉＳ  Ｌ１０９６に規定された方法で測定することができる。
好ましくは、通気量が０．３〜３（ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃ）の濾布である。これは、結晶のロス（Ｌ−カルニチンの収率の低下）を抑えながら、高度に不純物を除去することができるからである。より好ましくは、通気量が０．３〜１．５（ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃ）である。これは、結晶（Ｌ−カルニチン）をほとんどロスすることなく、高度に不純物を除去することができるからである。
濾材の種類は限定されず、例えば、濾紙、メッシュクロス、金属メッシュ、ガラス繊維フィルター、メンブレンフィルター、カートリッジフィルター、濾布等を用いることにより、簡便に固液分離を行うことができる。これらの中でも、濾紙、メッシュクロス、カートリッジフィルター、濾布は、不純物を捕集しやすいので好ましい。
【００１０】
また、スラリーの溶媒として使用されているアルコールは、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、親水化ＰＴＦＥ等の素材を溶解させることがある。従って、濾材（濾過に使用される濾紙、濾布又はカートリッジフィルター）の素材は、コットン、セルロース繊維、ポリプロピレン、ポリエチレン、ステンレス、ポリエステル、硼珪酸塩ガラス繊維等を使用するのが好ましい。
固液分離の方法も限定されず、遠心濾過、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過等の公知の方法で行うことができる。これらの中でも、カルニチンの吸湿対策として遠心濾過や加圧濾過が好ましい。また、Ｌ−カルニチンの結晶は高い吸湿性を有するため、乾燥空気、乾燥窒素などの雰囲気下で実施することが好ましい。
このようにして得られたＬ−カルニチンは、高度に不純物が除去されており、非常に純度が高い。分離されたＬ−カルニチンの結晶は、必要に応じて洗浄（リンス、リパルプ、リスラリー）することができる。好ましくは、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール等のアルコール溶媒などを用いて洗浄することができる。さらに好ましくは、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール等、晶析溶媒と同一の溶媒を用いることで効率的に洗浄することができる。
得られた結晶は、必要に応じて乾燥することもできる。例えば、８０℃以下で加熱しながら、常圧又はアスピレーターや真空ポンプ等の減圧が可能な装置を用いて減圧して、残留する溶媒を効率良く除去することができる。
【実施例】
【００１１】
本発明において使用した各種定量分析方法について、分析方法詳細を以下に示す。
分析方法（ｉ）
・分析対象化合物
１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下「ＤＣＰ」と略す）
４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下「ＣＨＢＮ」と略す）
・試料調製方法：反応液を移動相に溶解
・カラム            ：ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-３Ｖ, ４．６ｍｍ 
ｉ.Ｄ.×２５０ｍｍ, 粒径５μｍ(ＧＬサイエンス製)
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相            ：水／アセトニトリル／リン酸=７０／３０／０．１（容積比）
１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器            ：示差屈折計（Ｒｉ）
・注入量            ：２０μＬ
・保持時間          ：ＤＣＰ        １５．７ｍｉｎ
：ＣＨＢＮ      ７．２ｍｉｎ。
分析方法（ｉｉ）
・分析対象化合物
４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下「ＣＨＢＮ」と略す）
４−クロロ−３−ヒドロキシブタンアミド（以下「ＣＨＢＡ」と略す）
・試料調製方法      ： 反応液を移動相に溶解
・カラム            ：ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-３Ｖ， 
４．６ｍｍ ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、 粒径５μｍ（ＧＬサイエンス製）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相            ：０．０５％  トリフルオロ酢酸水溶液、１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器            ：示差屈折計（日本分光製Ｒｉ-２０３１）
・注入量            ：２０μＬ
・保持時間          ：ＣＨＢＮ    １１．０ｍｉｎ
：ＣＨＢＡ    ６．７ｍｉｎ。
分析方法（ｉｉｉ）
・分析対象化合物
カルニチンアミドクロライド（以下「Ｃａｒ−アミド」と略す）
カルニチン（以下「Ｃａｒ」と略す）
ナトリウムイオン
・試料調製方法      ：反応液を移動相に溶解
・カラム            ：Ｓｈｏｄｅｘ  ｉＣ  ＹＫ−４２１， 
４．６ｍｍ ｉ．Ｄ．×１２５ｍｍ（ＧＬサイエンス製）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相            ：３ｍＭ  ＨＮＯ３ａｑ／ＡＴＮ＝４／６（容積比）、１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器            ：電気伝導度検出器（ＣＤ−５）  Ｓｈｏｄｅｘ製
・注入量            ：２０μＬ
・保持時間          ：Ｃａｒ−アミド    １０．２ｍｉｎ
：Ｃａｒ            ７．９ｍｉｎ
：ナトリウムイオン  ７．０ｍｉｎ。
分析方法（ｉｖ）
・分析対象化合物
硫酸イオン
・カラム            ：ｉ−５２４  ｓｈｏｄｅｘ社製  ４．６×２５０ｍｍ
・カラムオーブン温度  ：４０℃
・移動相              ：２．５ｍＭ  フタル酸＋２．３ｍＭ  トリス  １．０ｍＬ：ｍｉｎ
・検出              ：電気伝導度
・注入量            ：２０μＬ
・保持時間          ：硫酸イオン  ８．０  ｍｉｎ。
分析方法（ｖ）
・分析対象化合物
カルニチン（以下「Ｃａｒ」と略す）
クロトノベタイン（以下「ＣＢ」と略す）
・試料調製方法      ：反応液を移動相に溶解
・カラム            ：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５Ｎ（ＣＨ３）２， 
４．６ｍｍ ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ＧＬサイエンス製）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相            ：５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ＝４．７）ａｑ／ＡＴＮ＝３５／６５
（容積比）、１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器            ：ＵＶ検出器（２０５ｎｍ）  日本分光製ＵＶ−９３０
・注入量            ：５μＬ
・保持時間          ：Ｃａｒ    １０．８ｍｉｎ
：ＣＢ      １３．０ｍｉｎ。
分析方法（ｖｉ）
・水分含量
Ｌ−カルニチンのアルコール溶液中の水分量は三菱化成（株）製水分計（カールフィッシャー法）を用いて測定を行った
分析機器  ：カールフィッシャー水分量計
電極液    ：陽極液  アクアミクロンＡＸ
陰極液  アクアミクロンＣＸＵ。
分析方法（ｖｉｉ）：（Ｒ）−ＣＨＢＮ光学純度測定法
（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は、以下のようにして測定した。
（Ｒ）−ＣＨＢＮ１μＬにジクロロメタン２０μＬ、ピリジン２０μＬを加えた後、（Ｒ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（ＭＴＰＡ）２μＬを添加し、そのまま室温で５時間撹拌を行った。反応終了液にジイソプロピルエーテル３００μＬを添加し、続いて１Ｎ  ＨＣｌ水溶液３５０μＬを用いて洗浄、有機層を回収した。さらに有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３５０μＬで洗浄し、有機層を減圧乾燥、残渣をイソプロパノールに溶解させ、これをＨＰＬＣで分析を行った。
本分析に用いたＨＰＬＣシステムは以下の通りである。
・分析対象化合物
（Ｒ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル
（Ｓ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル
・カラム             ：Ｐａｒｔｉｓｉｌ−５（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）
：４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
・カラムオーブン温度 ：４０℃
・移動相             ：ヘキサン：イソプロパノール＝９９：１（容積比）、１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器             ：ＵＶ  ２５４ｎｍ
・保持時間                  ：（Ｒ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル：１１．９ｍｉｎ
：（Ｓ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル：１３．０ｍｉｎ。
分析方法（Vｉｉｉ）：Ｌ−カルニチンのＤ−カルニチンに対する過剰率（Ｌ体光学純度）（％ｅｅ）
Ｌ−カルニチンのＤ−カルニチンに対する過剰率（％ｅｅ）は、文献（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏ．Ａｎａｌ．，１４（１９９６）１５７９−１５８４）記載の方法を用いることで、高速液体クロマトグラフィ−による分析結果から算出することができる。
詳細には、下記式により求めることができる。
Ｌ−体過剰率（％ｅｅ）＝（Ｌ−カルニチン誘導体面積−Ｄ−カルニチン誘導体面積）÷（Ｌ−カルニチン誘導体面積＋Ｄ−カルニチン誘導体面積）×１００
・分析対象物質
Ｄ−カルニチン誘導体
Ｌ−カルニチン誘導体
・カラム    ：Ｕｌｔｒｏｎ  ＥＳ−ＯＶＭ，  信和化工社製、２×１５０  ｍｍ，  
・移動相    ：アセトニトリル：２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ４．５）＝１７：８３（容積比）、        ０．２  ｍＬ：ｍｉｎ
・検出     ：ＵＶ  ２５４ｎｍ
・保持時間  ：Ｄ−カルニチン誘導体    ６−６．５  ｍｉｎ
Ｌ−カルニチン誘導体    ７．５−８．５  ｍｉｎ。
ここで、上記分析条件から測定された溶液中又は結晶中の濃度は、いずれも質量％で記載する。
＜参考例１：４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（Ｒ−ＣＨＢＮ）の合成＞
ｉ）ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１（ＦＥＲＭ  Ｐ-１２０６５、特開平５−３１７０６６号参照）を、ＬＢ培地(１質量質量％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５質量％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ｉＰＴＧ、５０μｇ/ｍＬアンピシリン)が １００ｍＬずつ入れた５００ｍＬ容三角フラスコ、２０本それぞれに植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。２０本分の培養菌体を遠心分離により集菌し、集菌した菌体を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）を２０ｇになるように加え、懸濁した。
この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３-ジクロロ-２-プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１１ｍＭであった。  
なお、ｐＳＴ１１１は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｓｐ．Ｎ-１０７４のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ）を含むＢａｍＨｉ-Ｐｓｔｉ１．１Ｋｂ 断片をｐＵＣ１１８ に結合させたプラスミドである。また、ｐＳＴ１１１は、特開平５−３１７０６６公報に記載されており、ＪＭ１０９/ｐＳＴ１１１は、ＦＥＲＭ  Ｐ-１２０６５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東１-１-１中央第６)に平成３年３月１日付け寄託されている。
ｉｉ）１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
ｐＨ電極、ならびにｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した２Ｌ容フラスコに水６９３．０ｇ、ＨＣＮ２１．１ｇ、１，３−ジクロロ−２−プロパノール４９．７ｇを入れ均一に溶解するまで攪拌した。その後４８％ＮａＯＨ水溶液１．９ｇで、ｐＨ８．０に調整した。
次いで、ｉ）で調製したハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ菌体懸濁液１００．０ｇ（４０．０ｋＵ）を加え、２０℃、ｐＨ７．８〜７．９で反応を開始した。
２０℃で４８％ＮａＯＨ水溶液を逐次滴下し系内のｐＨを７．９〜８．０に維持しながら、反応開始直後より、１，３−ジクロロ−２−プロパノール５０．０ｇとＨＣＮ１２．４ｇを５時間かけて均等に滴下した。その後、２０℃で系内のｐＨを７．９〜８．０に維持しながら、１．５時間(反応開始から６時間)反応させた。反応終了時、反応液の全量は９０１．０ｇであった。このとき、反応系内の１，３−ジクロロ−２−プロパノールの濃度は０．７％（６．３ｇ）であり、ＣＨＢＮの濃度は９．０％（８１．２ｇ; 収率８８mol％）であった。また、このときのＣＨＢＮの光学純度は９２％ｅｅの（Ｒ）−体過剰であった。
この反応液を塩酸でｐＨ＝２．０に調節し、６０℃、１００ｔｏｒｒで減圧して１１時間ＨＣＮの除去を行い、反応系内のＨＣＮを硝酸銀で滴定、１ｐｐｍ以下であることを確認した。  反応液を濃縮して得られた溶液は４７５．３ｇあり、ＣＨＢＮを８０．８ｇ含んでいた。
【００１２】
＜参考例２：カルニチンアミドの合成＞
得られたＣＨＢＮ濃縮液４７５．３ｇに０．１％塩化コバルト（ｉｉ）水溶液２１．１ｇを入れ攪拌したのち、３０％ＮａＯＨにてｐＨ８．２に調整し、水を８０．７ｇ添加して反応液を希釈した後２０℃で１時間攪拌した。攪拌中、ｐＨは８．２のままであった。
上記処理液を２℃まで冷却し、ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）の菌体懸濁液（液活性８．６ｋＵ／ｇ）を４．０ｇ作用させた。反応中４％ＮａＯＨ水溶液を随時添加し、ｐＨを７．８〜８．２の間に維持した。反応開始から４時間後、ＨＰＬＣにてＣＨＢＮの消失と、ＣＨＢＡの生成を確認した。このとき、４-クロロ-３-ヒドロキシブタンアミド（以下ＣＨＢＡと称す）のＣＨＢＮからの収率は９９．９％であった。
得られた反応液に、３０％トリメチルアミン水溶液１５９．６ｇを加え、３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応開始から５時間後、ＨＰＬＣにて、ＣＨＢＡの消失と、カルニチンアミドの生成を確認した。このとき、カルニチンアミドのＣＨＢＡからの収率は９５％であった。
カルニチンアミド溶液を３６％ＨＣｌで中和しｐＨ７にした後、９６２．８ｇの水で希釈した。液中には１２６．２ｇのカルニチンアミドクロライドが含まれていた。
【００１３】
＜参考例３：カルニチンの合成＞
本実施例に用いた電気透析装置は、次の通りの仕様とした。
（１）電気透析装置：マイクロアシライザーＳ３型（株式会社アストム製）
（２）イオン交換膜：膜カートリッジ；ＡＣ−１１０（分画分子量１００、株式会社アストム製）
脱塩水側にｉｉｉで得られたカルニチンアミド水溶液を５００.０ｇ入れ、濃縮液側に純水を３３５.０ｇ入れて電圧をかけた。
３時間後に濃縮液を取得したところ、５０１．０ｇの濃縮液中にカルニチンアミドクロライドが３６．７ｇ含まれていた。同様に２回操作を繰り返し、合わせて１５０１．２ｇの濃縮液を取得し、カルニチンアミドクロライドは１１０．０ｇ得られた。
得られたカルニチンアミドクロライド溶液に９９．３ｇの４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、３０℃で反応を開始した。８時間後、カルニチンアミドクロライドの転化率が８０％に達した後４０℃に昇温して、さらに６時間反応をさせたところ、カルニチンアミドクロライドの転化率が１００％に達し、反応を終了した。反応後の溶液の重量は１２８０．４ｇであった。系内を２５％ＨＣｌで中和後、反応液中のカルニチンを定量すると、カルニチンが８９．２ｇ生成していることがわかった。
次に、得られたカルニチン水溶液全量を電気透析に処した。仕様は以下の通りとした。
（１）電気透析装置：マイクロアシライザーＳ３型（株式会社アストム製）
（２）イオン交換膜：膜カートリッジ；ＡＣ−２２０（分画分子量３００、株式会社アストム製）
脱塩水側にカルニチン水溶液を５００.０ｇ入れ、濃縮液側に純水を２５０.０ｇ入れて電圧をかけた。
３時間後に濃縮液を取得したところ、３４５．１ｇの脱塩液中にカルニチンが３０．３ｇ含まれていた。同様に２回操作を繰り返し、合わせて１００３．４ｇの濃縮液を取得し、カルニチンは８８．３ｇ得られた。この水溶液の一部を採取してＣａｒの光学純度を測定したところ、９２．２％ｅ．ｅ．であった。
カルニチン水溶液中の不純物をＨＰＬＣで分析したところ、Ｌ−カルニチンに対してＤ−カルニチン３．９％、クロトノベタイン０．３７％、硫酸ナトリウム０．０２％を含んでいた。当該水溶液を以下の実施例及び比較例に使用した。
＜実施例１＞
カルニチンを８８．０ｇ含む水溶液１０００．０ｇを、７０℃で加熱し、約３ｋＰａの減圧下でカルニチンが７７質量％となるまで濃縮した。
該濃縮液に１−ブタノールを３７８．４ｇ添加し、ジャケットを６０〜７０℃として内温が５０℃を下回らないように調製しながら７ｋＰａの減圧下で水を留去させて溶媒置換したところ、水分が３％を下回った時点で結晶が発生した。減圧度を徐々に４ｋＰａまで下げながら濃縮を続け、Ｌ−カルニチンのスラリー溶液の重量が２２８．８ｇとなったところで濃縮を終了した。この時の水分量は０．１０％であった。
ジャケットの温度を調製しながら液温が３０℃となるまで０．５℃／ｍｉｎの速度で冷却した。冷却後３０℃を１時間維持した。
Ｌ−カルニチンのスラリー溶液は通気量が０．３ｃｃ／ｃｍ２のポリプロピレン製の濾布を着けた遠心分離機で固液分離を行った。１０ｍｉｎかけて含液を充分振り落とした後、遠心機を回しながら１７．５ｇの１−ブタノールをかけ流して結晶をリンスした。リンス後さらに１０ｍｉｎかけて含液を振り落とした。
結晶を遠心分離機から取り出し重量を測定したところ、乾燥重量で７７．４ｇのＬ−カルニチン結晶を取得した。Ｌ−カルニチンの収率は８８％であった。結晶中に含まれる不純物は、Ｄ−カルニチンは０．７５％、クロトノベタインが０．０３％、硫酸ナトリウムは０．０１％以下（検出下限）であった。晶析条件と結晶収率は表１に示す。
一方、濾液に抜けた微細結晶は０．５ｇであり、その組成は、Ｌ−カルニチンが７８％、Ｄ−カルニチンが２２％、クロトノベタインが０．３６％、硫酸ナトリウムは０．２３％であった。この結果から、微細結晶中には不純物が多く含まれていたことが分かった（表２）。
＜実施例２及び３＞
実施例１と同様の方法でＬ−カルニチンを含む混合物溶液を調製し、カルニチンを８８．０ｇ含む水溶液１０００．０ｇを実施例１と同様の方法で濃縮し結晶を析出させた。
溶液を３０℃まで冷却後、Ｌ−カルニチンのスラリー溶液を目開きが１１μｍ（メッシュクロス；目開き＃１１）（実施例２）又は５４μｍ（メッシュクロス；目開き＃５４）のポリエチレンテレフタレート製のメッシュクロス（実施例３）を着けた加圧濾過機に供し、０．２ＭＰａの圧力をかけて固液分離を行った。１０ｍｉｎかけて含液を充分落とした後、１７．５ｇの１−ブタノールをかけ流して結晶をリンスした。リンス後さらに１０ｍｉｎかけて含液を落とした。
結晶を加圧濾過機から取り出し重量を測定した。また、Ｌ−カルニチン結晶中及び濾液に抜けた微細結晶の重量を測定し、そこに含まれる不純物を分析した。
実施例２の結果、乾燥重量で７７．５ｇのＬ−カルニチン結晶を取得した。Ｌ−カルニチンの収率は８８％であった。結晶中に含まれる不純物は、Ｄ−カルニチンは０．７７％、クロトノベタインが０．０３％、硫酸ナトリウムは０．０１％以下（検出下限）であった。晶析条件と結晶収率は表１に示す。一方、濾液に抜けた微細結晶は０．４ｇであり、その組成は、Ｌ−カルニチンが７６％、Ｄ−カルニチンが２３％、クロトノベタインが０．３７％、硫酸ナトリウムが０．２５％であった。この結果から、微細結晶中には不純物が多く含まれていたことが分かった（表２）。
実施例３の結果、乾燥重量で７７．４ｇのＬ−カルニチン結晶を取得した。Ｌ−カルニチンの収率は８８％であった。結晶中に含まれる不純物は、Ｄ−カルニチンは０．７２％、クロトノベタインが０．０３％、硫酸ナトリウムは０．０１％以下（検出下限）であった。晶析条件と結晶収率は表１に示す。一方、濾液に抜けた微細結晶は０．６ｇで、Ｌ−カルニチンが７８％、Ｄ−カルニチンは２２％、クロトノベタインが０．３６％、硫酸ナトリウムは０．２４％であった。この結果から、微細結晶中には不純物が多く含まれていたことが分かった（表２）。
＜実施例４＞
実施例１と同様の方法でＬ−カルニチンを含む混合物溶液を調製し、カルニチンを８８．０ｇ含む水溶液１０００．０ｇを８０℃で加熱し、約０．１ｋＰａの減圧下で乾固した。
乾固物に、メタノール１２３．２ｇと1−ブタノール３５２．0ｇを予め混合したものを添加し、６０℃で加熱しながら溶解させた。ジャケットの温度を６０〜７０℃として内温が５０℃を下回らないように調製しながら、１３ｋＰａの減圧下で溶媒を留去させた。減圧度を徐々に７ｋＰａまで下げながら濃縮を続け、Ｌ−カルニチンのスラリー溶液の重量が４１３．６ｇとなったところで濃縮を終了した。この時のメタノール濃度は３％、水分量は０．０２％であった。
ジャケットの温度を調製しながら液温が３０℃となるまで０．５℃／ｍｉｎの速度で冷却した。冷却後３０℃を１時間維持した。
Ｌ−カルニチンのスラリー溶液を目開きが３３μmのポリエチレンテレフタレート製のメッシュクロスを着けた加圧濾過機に供し、０．２Ｍｐａの圧力をかけて固液分離を行った。１０ｍｉｎかけて含液を充分落とした後、１４．２ｇの１−ブタノールをかけ流して結晶をリンスした。リンス後さらに１０ｍｉｎかけて含液を落とした。
その結果、乾燥重量で７１．８ｇのＬ−カルニチン結晶を取得した。Ｌ−カルニチンの収率は８８％であった。結晶中に含まれる不純物は、Ｄ−カルニチンは０．７９％、クロトノベタインが０．０３％、硫酸ナトリウムは０．０１％以下（検出下限）であった。晶析条件と結晶収率は表１に示す。
一方、濾液に抜けた微細結晶は０．３ｇであり、その組成は、Ｌ−カルニチンが７６％、Ｄ−カルニチンは２４％、クロトノベタインが０．３６％、硫酸ナトリウムは０．２５％であった。この結果から、微細結晶中には不純物が多く含まれていたことが分かった（表２）。
＜比較例１＞
実施例１と同様の方法でＬ−カルニチンを含む混合物溶液を調製し、カルニチンを８８．０ｇ含む水溶液１０００．０ｇを実施例１と同様の方法で濃縮し結晶を析出させた。
溶液を３０℃まで冷却後、Ｌ−カルニチンのスラリー溶液を保留粒子径が1μmの濾紙（アドバンテック  Ｎｏ．４Ａ）を着けた加圧濾過機に供し、０．２ＭＰａの圧力をかけて固液分離を行った。１０ｍｉｎかけて含液を充分落とした後、１７．５ｇの１−ブタノールをかけ流して結晶をリンスした。リンス後さらに１０ｍｉｎかけて含液を落とした。
その結果、乾燥重量で７８．６ｇのＬ−カルニチン結晶を取得した。Ｌ−カルニチンの収率は８９％であった。結晶中に含まれる不純物は、Ｄ−カルニチンは０．８８％、クロトノベタインが０．０３％、硫酸ナトリウムは０．０１％であった。濾液中に微細結晶は含まれていなかった。
【００１４】
【表１】
2011098934.tif 000002
【００１５】
【表２】
2011098934.tif 000003