(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニック鳥類を創出するための方法として、鳥類始原生殖細胞に対して、高効率に外来遺伝子を導入し、安定発現株を樹立する方法を提供する。【解決手段】下記の工程１及び２を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法：（１）鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程１、（２）工程１によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程２。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程１及び２を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法：
（１）鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程１、
（２）工程１によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程２。
【請求項２】
ゾルが、ポリビニルピロリドンの被膜を有するシリカ粒子を分散質として含有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、工程１にてゾルを２０〜２５質量％の含む密度勾配液と、ゾルを４５〜５５質量％の含む密度勾配液を用いた密度勾配遠心法によって分画した後、工程２にてゾルを２０〜２５質量％含む密度勾配液と、ゾルを４５〜５５質量％含む密度勾配液の界面に集積する細胞を回収して得られたものである請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類始原生殖細胞に対して高効率に外来遺伝子を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥類を用いたトランスジェニック技術は、鳥類の品種改良を目的とするものや、鳥類由来卵をバイオリアクターとしての利用の目的のために、近年、盛んに研究が行われている。そこで、鳥類のトランスジェニック動物を創出するための方法として、従来は、主にレトロウイルスベクターを用いて、鳥類の初期胚の細胞に遺伝子導入する方法がとられてきた。しかしながら、初期胚の細胞に導入することができる遺伝子の大きさには、１０ｋｂｐ程度以下に限られており、そのトランスジェニック動物の用途が限られてしまう点で問題が生じている。
【０００３】
また、近年では様々な細胞に分化する鳥類のＥＳ細胞も単離する技術も開発され、鳥類由来のＥＳ細胞には１０ｋｂをも超える、大型の遺伝子が導入することが可能であるが、鳥類由来のＥＳ細胞は生殖細胞に分化することが無いとされており、鳥類由来のＥＳ細胞に対して大型の遺伝子が導入することができたとしても、トランスジェニック個体を作製することが出来ないために、上記問題の解決には至らない。
【０００４】
一方、ニワトリの始原生殖細胞を用いた研究から、新たなトランスジェニック個体の作製法が開発された。その方法とは、ニワトリ由来の始原生殖細胞を長期間培養し、ここにプラスミドをはじめとする各種遺伝子を導入し、トランスジェニック個体を創出しようとするものである（非特許文献１）。このような方法には、プラスミド等の外来遺伝子が導入された始原生殖細胞の安定発現株を取得することが必要となり、安定発現株の取得のために高効率に外来遺伝子を導入する技術が望まれている。特に鳥類由来の始原生殖細胞の培養全般に係る作業は、他の一般的な細胞に比べて著しく煩雑で、さらにコストがかかるものであり、多くの鳥類由来の始原生殖細胞を調整することは困難であるために、効率のよい安定発現株を取得方法が切望されている。
【０００５】
また、上記非特許文献１に記載された方法では、６ｋｂｐ程度の外来遺伝子を導入する程度に留まっており、外来遺伝子が導入された安定発現株を、様々な用途に利用することに鑑みると、より大きなサイズの遺伝子を導入する技術の開発も望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Robert J. Etches et al., Nature, Vol.441, pp.766-769 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、トランスジェニック鳥類を創出するための方法として、鳥類始原生殖細胞に対して、高効率に外来遺伝子を導入し、安定発現株を樹立することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、鳥類由来の始原生殖細胞に対して所定の処理を施した後に遺伝子を導入すると、その導入効率を顕著に亢進させることを見出した。また、導入された遺伝子を安定的に発現する株を樹立することができる事も見出した。すなわち、本発明は以下の方法を含むものである。
【０００９】
項１  下記の工程１及び２を含む鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法：
（１）鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いた密度勾配遠心法によって分画する工程１、
（２）工程１によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程２。
【００１０】
項２  ゾルが、ポリビニルピロリドンの被膜を有するシリカ粒子を分散質として含有する上記項１に記載の方法。
【００１１】
項３  ゾル１ｍＬ当り、シリカ粒子を１．１２５〜１．１３５ｇ含有する上記項２に記載の方法。
【００１２】
項４  シリカ粒子の粒径が、１５〜３０ｎｍである上記項２又は３に記載の方法。
【００１３】
項５  ゾルが、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）である、上記項１に記載の方法。
【００１４】
項６  細胞が、工程１にてゾルを２０〜２５質量％の含む密度勾配液と、ゾルを４５〜５５質量％の含む密度勾配液を用いた密度勾配遠心法によって分画した後、ゾルを２０〜２５質量％含む密度勾配液と、ゾルを４５〜５５質量％含む密度勾配液の界面に集積する細胞を回収して得られたものである上記項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００１５】
本発明の方法によって遺伝子導入した細胞において、一過性に発現するタンパク質の量は、従来の方法によって遺伝子導入した細胞と比較して、遺伝子導入効率が７倍程度にも上昇する。また、本発明の方法を用いることによって、これまでに得ることのできなかった、鳥類由来の始原生殖細胞の安定発現株を得ることができる。
【００１６】
以下に本発明について詳述する。
【００１７】
本発明の鳥類由来の始原生殖細胞に遺伝子を導入する方法は、下記の工程１及び工程２を含むものである。
工程１
鳥類由来の始原生殖細胞を、密度勾配液として培地、及びゾルを用いて密度勾配遠心法によって分画する工程。
工程２
工程１によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程。
【００１８】
工程１について
工程１にて用いる鳥類始原生殖細胞は、浮遊性で生殖細胞系列への分化能を有する細胞であり、非特許文献１に記載された方法を用いることによって採取、培養することができる。具体的には、発生初期胚（ニワトリの場合約３日目のＨＨステージ１４−１７）の血液を採取し、ＢＲＬ細胞など適当なフィーダー細胞上にて培養、増殖する細胞を採取すればよい。採取した細胞は、下記に詳述する工程１にて用いる培地に懸濁した状態にして調製すればよい。その懸濁液中の細胞の量は、通常は０．２〜２．０×１０５細胞／ｍＬ程度とすればよい。
【００１９】
工程１にて用いる密度勾配遠心法とは、特定の容器内に密度が異なる密度勾配液の層を、段階的に重層することで形成させ、最上層にさらに分離対象となる混合物を重層した後に、該容器を遠心分離工程に供することで、層間の界面にその密度よりも小さい粒子が集まることを利用した分離法である。この方法を、鳥類由来の始原生殖細胞に対して適用することにより、層間の界面に各々異なる特性を有する鳥類由来の始原生殖細胞の群に分画することできる。
【００２０】
本発明においては、密度勾配液として培地、及びゾルを用いることができる。具体的には、本発明の密度勾配液とは培地に対して所定量のゾルを混合させて作製されるものである。上記の密度勾配遠心法を用いるには、その原理に鑑みて、異なる密度の密度勾配溶液を作製する必要があるが、本発明では、培地とゾルを用いて密度勾配液とした際の、密度勾配液全体に対するゾルの質量％によって密度の違いを規定すればよい。このとき、質量％の数値が大きいほど、密度勾配液の密度も大きくなる。
【００２１】
工程１にて用いる密度勾配液は、高い効率で外来遺伝子を導入することのできる、鳥類由来の始原生殖細胞の群を分画できるものであれば特に限定されないが、２種類以上の異なる密度の密度勾配液を用いればよく、好ましくは３種類の異なる密度勾配液を用いればよい。
【００２２】
具体的には、密度勾配液全体に対して１０〜１５質量％（より好ましくは１２〜１３質量％）、２０〜３０質量％（より好ましくは２４〜２６質量％）、及び４５〜５０質量％（より好ましくは４８〜５２質量％）程度ゾルを含む、３種類の異なる密度を有する密度勾配液を用いる方法が挙げられる。
【００２３】
培地とは、通常、鳥類由来の始原生殖細胞に障害を与えないものであれば、特に限定はされないが、例えばＤＭＥＭ培地、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地などを挙げることができ、通常の細胞培養時との共通性の観点から、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地を用いることが好ましい。なお、上記の培地には、鳥類由来の始原生殖細胞を維持するために、血清が含まれていても良い。
【００２４】
血清の濃度は、通常１〜２０％であればよく、より好ましくは５〜１５％である。また、血清の種類は、特に限定はされないが、ウシ胎仔由来の血清であるＦＢＳ、ＦＣＳ、ニワトリ由来の血清などを挙げることができ、通常の細胞培養時との共通性の観点から、ＦＣＳとニワトリ由来血清の混合物を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明のゾルとは、鳥類由来の始原生殖細胞に対して毒性を与えることなく十分な生体適合性を有し、密度勾配遠心法による高効率な遺伝子導入が可能となる細胞群を分画する際の、密度勾配液として用いることのできるゾルであればよく、例えば、ポリビニルピロリドンの被膜を有するシリカ粒子を分散質として含有するゾルが挙げられる。
【００２６】
上記のシリカ粒子は、密度勾配遠心法によって高効率に遺伝子導入される鳥類由来の始原生殖細胞を分画するために、本発明のゾル１ｍＬ当り通常１．１２５〜１．１３５ｇ程度の割合で、分散質として含まれていればよく、さらに好ましくは１．１３ｇ程度である。
【００２７】
上記のシリカ粒子の粒径は、密度勾配遠心法によって分画する鳥類由来の始原生殖細胞に障害を与えないために、通常１５〜３０ｎｍ程度であればよい。
【００２８】
上述したゾルのうち、本発明の方法において最も好ましく用いられるものはＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）である。
【００２９】
工程１では、上述のように調製した２種類以上の異なる密度を有する密度勾配液を、密度の大きい液から順に重層し、最上層に上述した鳥類由来の始原生殖細胞の懸濁液を重層して、遠心分離機に設置して遠心分離工程に供すればよい。遠心分離工程は、通常１０００〜１５００ｇ程度の遠心力で、１５〜２５℃程度の条件下にて、１５〜３０分程度行えばよい。このような遠心分離工程によって、層間の界面に鳥類由来の始原生殖細胞を集積
させ、分画することができる。
【００３０】
工程２について
工程２は、工程１によって分画した細胞を回収し、該細胞に遺伝子を導入する工程である。
【００３１】
工程２における細胞の回収方法は、上記の工程１にて、どのような質量％で上述のゾルを含有する密度勾配液を用いたか、何種類の異なる密度の密度勾配液を用いたか等の条件によって異なるが、密度勾配液の全体に対して通常４５〜５５質量％程度のゾルを含む密度勾配液の層と、それよりも一段階小さい密度の密度勾配液（すなわち、一段階少ない質量％で上記のゾルを含む密度勾配液）との界面に集積し、分画された鳥類由来の始原生殖細胞を回収すればよい。
【００３２】
具体的には、ゾルを２０〜２５質量％含む密度勾配液と、ゾルを４５〜５５質量％含む密度勾配液の界面に集積し、分画された細胞を回収することを挙げることができる。
【００３３】
工程２にて用いる細胞への遺伝子導入方法は、公知の遺伝子導入方法であれば、特に限定されること無く用いることができ、導入する鳥類由来の始原生殖細胞の種類、一過性発現か又は安定的発現かといった発現方法などのように、導入する遺伝子の発現形態、導入する遺伝子の大きさ、遺伝子を導入する細胞の強さ、達成されるべき所望の遺伝子導入効率の程度などを勘案して、適宜選択することが可能である。
【００３４】
具体的には、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、燐酸カルシウム法、塩化カルシウム法、アデノウイルスやセンダイウイルスなどのウイルス感染機構を利用するウイルス法、カチオン性リポソームを用いるリポフェクション法などを挙げることができる。本発明においては、高い遺伝子導入効率を達成するために、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。
【００３５】
エレクトロポレーション法を用いたキットとして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｎｅｏｎ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｏｎｚａ社のＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ等の購入可能なキット付随するシステムを用いてもよい。これらのキット等を用いる際には、販売元より入手可能なプロトコルに沿って、遺伝子導入を実施すればよい。例えば、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いる際には、遺伝子導入試薬としてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｖを用い、Ａ−２７プロトコルを用いて遺伝子導入することができる。ここで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｖとは、血球系細胞、結合組織細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞への遺伝子導入に適した試薬であり、Ａ−２７プロトコルとは、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて遺伝子導入する際に最適化された条件の一つである。
【００３６】
工程２において導入する遺伝子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良く、それぞれ種類に限定されることは無い。また導入する遺伝子の大きさは、通常２０ｋｂｐ程度までの大きさのものを用いることができ、より好ましくは８〜２０ｋｂｐ程度である。
【００３７】
遺伝子導入後の鳥類由来の始原生殖細胞は、通常の方法を用いて培養・維持すればよく、特に限定される方法は必要とされない。上記工程１及び工程２の方法を用いて遺伝子を導入した鳥類始原生殖細胞は、高効率に外来遺伝子を導入することができるので、安定発現株の樹立に好適に用いることができる。
【００３８】
安定発現株の樹立は、公知の方法を用いることができ、上述の方法によって遺伝子を導入した後に、適当な薬剤を用いて発現株を選択することができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の方法を用いることによって、鳥類由来の始原生殖細胞に対して、高い効率で外来遺伝子を導入することが可能となる。とりわけ、２０ｋｂｐ程度のもの大きさの外来遺伝子を導入できる点において、優位な効果を有している。
【００４０】
また、本発明の方法によって導入された遺伝子を、安定的に発現する鳥類由来の始原生殖細胞株を樹立することが可能となる。鳥類由来の始原生殖細胞の遺伝子安定発現株は、従来の方法では樹立することができなかったので、本発明の方法によって得られる、非常に大きな効果である。
【００４１】
さらに、鳥類由来の始原生殖細胞を用いることによって、トランスジェニック鳥類を創出することが可能となるために、トランスジェニック鳥類をバイオリアクターとして用いることにより、様々なタンパク質や生体分子を生合成させることが可能となる
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】導入遺伝子の模式図
【図２】一過的遺伝子導入後の始原生殖細胞像（左：対照群、右：パーコール密度勾配遠心処理群）
【図３】一過的遺伝子導入実験における蛍光陽性細胞数
【図４】安定的に遺伝子が導入されたと認められるクローンを含む培養皿の数
【図５】安定的に遺伝子が導入された始原生殖細胞の蛍光像
【実施例】
【００４３】
一過的遺伝子導入による検討
５０、２５、及び１２．５質量％のパーコール（GE healthcareBioscience co., Japan）を含むＤＭＥＭ培地（５質量％ＦＣＳを含む）を遠心勾配液として調製し、１５ｍｌの遠沈管に３ｍｌずつ、５０、２５、１２．５質量％の順に下から重層して、密度勾配遠心溶液とした。
【００４４】
非特許文献１に記載された方法に従って、ニワトリ由来の始原生殖細胞８×１０４採取し２分割した。片方は対照実験用として、何ら操作を加えずに保存し、もう片方を遠心して回収し、その後３ｍｌの５質量％ＦＣＳを含むＫＯ−ＤＭＥＭ培地に懸濁して準備した。既に作製した上述の密度勾配遠心溶液の上部に重層し、１１６０ｇの強さで、２０分間遠心した。遠心の後、５０質量％のパーコールを含むＤＭＥＭ培地と、２５質量％のパーコールを含むＤＭＥＭ培地の境界面に集積する細胞を回収した。回収した細胞に、新たな５質量％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて懸濁し、その後遠心した。同時に対照実験用のニワトリ由来の始原生殖細胞も遠心した。それぞれの細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、８００ｇで１分間遠心後、ＰＢＳを除いた細胞をトランスフェクションに用いた。
【００４５】
トランスフェクションは、ｎｅｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。図１に示す１４ｋｂのプラスミドを１μｇ、及び１０μｌのＲ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ用いてトランスフェクションを行なった。１３００Ｖ、１０ｍｓの条件下で３回パルスによって行った。
【００４６】
細胞を、非特許文献１に記載された抗生物質を含まない始原生殖細胞用の培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ、７．５％ＦＣＳ、２．５％ｃｈｉｃｋｅｎ  ｓｅｒｕｍ）に懸濁しＢＲＬ  ｆｅｅｄｅｒ細胞上で２４時間培養後、蛍光顕微鏡を用いて観察を行なった（図２）。また、定量的解析の為に培養皿中心部３箇所の重ならない領域で赤色蛍光陽性の細胞数を計測した。その結果対照群２８±１３個に対し、密度勾配遠心したものでは２００±８０個で
あり（図３）、密度勾配遠心による遺伝子導入効率の顕著な向上が認められた。
【００４７】
安定的遺伝子導入における検討
次に、始原生殖細胞株への安定的遺伝子導入における本研究の有用性について検討した。採取したニワトリ由来の始原生殖細胞の数を１．５×１０５とした以外は、上述した一過的遺伝子導入による検討と同様にして、始原生殖細胞株を処理した。また、同時に未処理のニワトリ由来の始原生殖細胞も調整した。
【００４８】
処理後の始原生殖細胞及び対照実験用として調整した未処理の始原生殖細胞のそれぞれを、１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、８００ｇで１分間遠心後、ＰＢＳを除き、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ)を用いて遺伝子導入を行なった。図１の模式図にて示す１４ｋｂのプラスミド３μｇと、始原生殖細胞を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｖ中で混合し、その後Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ａ−２７を用いて始原生殖細胞に導入した。遺伝子導入後の細胞を、抗生物質を含まない始原生殖細胞用の培地に懸濁し１２分割し、ＢＲＬ  ｆｅｅｄｅｒ細胞上で３日間培養後培地にネオマイシン（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を終濃度３００μｇ／ｍｌとなるように加え、適宜培地交換を行ないながら３週間培養した。そののちネオマイシン耐性のクローンの存在する培養皿を計数した。その結果を図４に示す。
【００４９】
パーコールを用いた密度勾配遠心を行なった群では４つの培養皿でネオマイシン耐性クローンが認められたのに対し対照群では０であった。また、得られたクローンの細胞は全て赤色蛍光を安定的に発現していた（図５）。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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