(57)【要約】【課題】ホルモン置換療法の所望の効果を惹起する、新規の非ステロイド性ＳＥＲＭを提供すること。【解決手段】本開示は、新規のクラスの選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）に関する。この開示はまた、以前に知られていない膜結合エストロゲンレセプターの同定を包含する。この開示されたＳＥＲＭ（有用な組成物における開示された新規な化合物の薬学的処方物を含む）を作製するための方法および使用するための方法が開示される。本発明の新規の非ステロイド性ＳＥＲＭは、ホルモン置換療法の陰性の作用または公知の選択的エストロゲンレセプターモジュレーターの陰性の作用を誘導することなく、ホルモン置換療法の所望の効果を惹起する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の支援の認定）
本発明は、基金番号ＮＳ３５９４４、ＮＳ３８８０９、ＤＡ０５１５８、ＤＡ１０７０３、およびＤＫ５７５７４の下での政府の支援を用いてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の引用）
本願は、２００４年１０月２０日に出願された米国出願番号＿＿＿に対して優先権を主張し、この出願は、２００３年１０月２１日に出願された米国仮出願番号６０／５１３，２３５の利益を主張し、その開示は、その全体が本明細書中に援用される。
【０００３】
（分野）
本開示は、新規の化合物およびその使用方法（選択的エストロゲンレセプターモジュレーターおよびこのような選択的なエストロゲンレセプターモジュレーターを作製するための方法を包含する）に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
エストロゲンは、重要なクラスのステロイドホルモンであり、このステロイドホルモンは、ヒトにおける基礎的な性的特徴の発達および維持を刺激する。さらに、エストロゲンは、種々の多様な生物学的プロセスに影響することが示されている。エストロゲンの付随的な作用（骨密度の維持、中枢神経系の機能の維持および記憶の保持が挙げられる）の多くはポジティブである。しかし、エストロゲンはまた、深刻なネガティブな作用（乳癌および子宮内膜癌の発達を促進することが挙げられる）を有することが示されている。
【０００５】
米国において平均寿命がほぼ８０年であることに基づき、女性は、閉経後状態に人生の約３分の１を送ることを期待し得る。女性のエストロゲンレベルは、閉経の間に劇的に低下し、そして月経の閉止した女性は、しばしば、エストロゲン産生の減少に関連する、多くの副作用を経験する。これらの状態を処置するために、医師は、しばしば、ホルモン置換療法（これは、主として、プロゲスチンと組み合わせたエストロゲンの投与からなる）を処方する。
【０００６】
現在のホルモン置換療法に関連する、より深刻な副作用（虚血性の発作、心筋梗塞、血栓塞栓症、脳血管疾患、および子宮内膜腫の危険性の増大が挙げられる）に鑑み、有効な非ストロイド性のエストロゲンおよび抗エストロゲン性の化合物を同定するための、かなりの量の研究が実行されている。
【０００７】
最も効力のあるエストロゲンである、１７β−エストラジオールの作用を、模倣するかまたはブロックするかのいずれかをなす、多数の化合物が記載されている。エストロゲンレセプターに結合し、かつ１７β−エストラジオールと同一の生物学的作用の多くを刺激する化合物は、「エストラゲンレセプターアゴニスト」と呼ばれる。１７β−エストラジオールがエストロゲンレセプターに結合するのを阻害する化合物、またはエストロゲンレセプターに結合する１７β−エストラジオールの作用を妨害する化合物は、「エストロゲンレセプターアンタゴニスト」と呼ばれる。異なる効力で、異なるエストロゲンレセプターに影響する化合物は、代表的には、選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）と呼ばれる。ＳＥＲＭは、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し、１種以上のエストロゲンレセプターを選択的に調節し得る。特定のＳＥＲＭ化合物は、混合されたエストロゲン活性と抗エストロゲン活性とを有し、そしてある組織ではエストロゲンレセプターアゴニストとして作動し、そして他の組織では、エストロゲンレセプターアンタゴニストとして作動する。
【０００８】
エストロゲン（例えば、１７β−エストラジオール）は、２種の核内エストロゲンレセプター、（ＥＲ）αまたは（ＥＲ）β、の一方に結合することにより、その作用を発揮すると考えられている。（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）βは、さまざまな組織中で見出され、そしてさまざまな生物学的役割を有することが示されているので、研究者らは、（ＥＲ）αまたは（ＥＲ）βのいずれかに選択的に結合することにより応答を達成する、ＳＥＲＭの開発に焦点を当てている。
【０００９】
（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）βに対して異なる活性を示す非ステロイド性ＳＥＲＭの２つの例は、タモキシフェンおよびラロキシフェンである。タモキシフェンおよびラロキシフェンは、骨粗しょう症、心臓血管疾患および乳がんの処置および／または予防、さらには、種々の他の疾患状態の処置および／または予防のために開発されている。両化合物は、血漿コレステロールレベルに対する陽性の作用および特定の型の癌の発生数が大幅に低減したことと組み合わせて、骨鉱質密度に対する骨防御作用を示すことが示されている。不幸にも、タモキシフェンおよびラロキシフェンは、両方とも、副作用（例えば、顔面紅潮）を誘導し、そしてタモキシフェンは、生命を脅かす障害（例えば、子宮内膜癌）を促進する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、ホルモン置換療法の陰性の作用または公知の選択的エストロゲンレセプターモジュレーターの陰性の作用を誘導することなく、ホルモン置換療法の所望の効果を惹起する、新規の非ステロイド性ＳＥＲＭを包含する。
【００１１】
（要旨）
本開示は、新規の化合物、組成物、ならびに、上記化合物および組成物を作製および使用するための方法を包含する。一般的には、開示される化合物は、選択的なエストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）として機能する。一つの局面では、この化合物は、式Ｉを有し、そしてこれらの水和物、および薬学的に受容可能なプロドラッグおよび塩を包含する。さらに、開示された式の、キラル形態、ジアステレオマー形態、および幾何異性体形態のすべてが意図される。
【００１２】
【化２１】
2011098970.tif 000002
【００１３】
式１に関連して、Ｒは、Ｍに関してＥまたはＺであり得、そしてＲは、水素または低級脂肪族基を表し；Ｘは、オルト位、メタ位、またはパラ位の水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシ、アルコキシ、スルフヒドリル、チオエーテル、アミノ（−ＮＲ２Ｒ３、ここで、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素もしくは低級アルキルである）またはハロゲンであり；Ｍは、ケトン基、アミド基またはスルホンアミド基を含む。Ａｒは、芳香族基を表し、そして任意の芳香族基（フェニル、ビフェニル、１−ナフチル、２−ナフチルが挙げられるが、これらに限定されず、そして、ヘテロアリール基（例えば、例示の目的で、フラン基、チオフェン基、ピロール基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピリジン基、およびキノリン基）が挙げられる）であり得る。
Ｙは、Ｍに対して任意の位置（例えば、オルト位、メタ位、またはパラ位にて）にて結合され得る。一つの局面では、Ｙは、ヘテロ原子（例えば、窒素または酸素）である。式２に従う開示されたＳＥＲＭの特定の実施形態では、Ｙは、フェニル基を表す。
【００１４】
【化２２】
2011098970.tif 000003
【００１５】
式１および式２の参照を続けて、Ｇは、リンカー基（例えば、低級アルキル基、炭化水素鎖、オリゴエチレングリコール鎖など）を含む。Ｇが低級アルキル基を含む式２の一つの実施形態では、Ｇは、エチル基である。Ｚは、代表的には、ヘテロ原子を含む。特定の実施形態では、Ｚは、電荷を帯びた部分（例えば、アニオン性基（例えば、ボロン酸基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、またはカルボキシ基））を含む。Ｚがカチオン性の基を含む例では、このカチオン性の基は、アミノ基（例えば、ジメチルアミノ基またはピペリジノ基）であり得る。他の例では、Ｚは、ヒドロキシル基を包含し得る。式Ｙ−Ｇ−Ｚにより表される基の例としては、Ｙがヘテロ原子（例えば、酸素）であり、そして式−Ｇ−Ｚは、以下：
【００１６】
【化２３】
2011098970.tif 000004
【００１７】
のうちの一つ（これらに限定されない）を表すものが挙げられる。
【００１８】
図１および図２に関して、Ｍは、代表的には、アミドケトン基またはスルホンアミド基のうちの一つであり、そしてより代表的には、−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１−、または−ＳＯ２ＮＲ１−のうちの一つを表し、ここで、Ｒ１は、水素、低級アルキル基またはアラルキル基である。従って、このような化合物の例は、式３により表され得、ここで、Ｑは、代表的には、アミド結合またはスルホンアミド結合を形成する（Ｑは、−ＳＯ２−またはＣＯを表す）。
【００１９】
【化２４】
2011098970.tif 000005
【００２０】
従って、式３に従う化合物は、例えば、式４または式５を有し得る。式４および式５に関して、Ｒ、Ｘ、Ｒ１およびＹは、式１に関して上に規定されるとおりである。
【００２１】
【化２５】
2011098970.tif 000006
【００２２】
上の式に示されるように、上記開示された化合物としては、ビニルケトン誘導体、アクリルアミド誘導体およびビニルスルホンアミド誘導体が挙げられる。さらに、上の構造に例示されるように、ビニル基についての立体配置は、ＥまたはＺであり得る。
【００２３】
この開示の一つの局面は、新規の選択的エストロゲンレセプターモジュレーターを合成するための方法を包含する。別の実施形態では、この方法は、式６に従う開始物質を提供する工程を包含し、ここで、Ｇは、カルボキシ基、活性化カルボキシ基、スルホン酸基または活性化スルホン酸基である。活性化カルボンキシ基およびスルホン酸基としては、アミンまたはアミン等価物と反応し、式３または式４に従うアミドまたはスルホンアミドを形成し得る任意の基が挙げられる。代表的には、活性化カルボキシ基としては、ハロゲン化アシルおよび活性化エステルが挙げられる。特定の例では、Ｙは、求核試薬との反応のためにインサイチュで活性化されているカルボキシ基である。同様に、代表的な活性化スルホン酸基としては、スルホニルハライド（例えば、塩化スルホニル）が挙げられる。このような活性化スルホン酸基は、種々のアミン（一級アミンおよび二級アミン）をアシル化するために使用され得る。
【００２４】
【化２６】
2011098970.tif 000007
【００２５】
例えば、新規のエストロゲンレセプターモジュレーターを合成するための方法の一つの実施形態が、スキーム１に図示されている。スキーム１の式７に関して、可変物Ｙは、アニオンまたはアニオン等価物（例えば、ハロゲン）を示し、これらは、リチウム−ハロゲン交換条件に供され得、対応するカルボアニオンを与え得る。このカルボアニオンは、式８に図示されるようなカルボキシ基を導入するために使用され得る。このカルボキシ基は、例えば、保護されたカルボキシ等価物（例えば、保護されたクロロ蟻酸誘導体）として導入され得る。このような試薬の例の一つは、クロロ蟻酸アリルであり、これは、式８のカルボキシ基を導入するために使用され得る。式８に従う化合物は、多目的な合成中間体である。なぜなら、このような化合物は、任意の一級アミンまたは二級アミンとカップリングし、式９に従う化合物を提供し得るからである。従って、Ｒ１およびＲ２が、独立して、水素、脂肪族基、アリール基またはアラルキル基から選択される、式９に従う化合物は、式８に従う化合物と、式：Ｒ１Ｒ２ＮＨを有する、対応する一級アミンまたは二級アミンとを反応させることにより、調製され得る。代表的には、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも一方は、アリール基を含み、そしてアリール基を含む適切なアミンの例としては、Ｒ１およびＲ２のうち少なくとも一方がフェニル基またはフェニル誘導体であるものが挙げられる。
【００２６】
一般的に言えば、現在開示されている方法に従う、式８を有する化合物の式９を有する化合物への転換は、反応のためにカルボキシ基を活性化するカップリング試薬の使用を包含する。このようなカップリング試薬の例としては、カルボジイミド、ウロニウム塩、ホスホニウム塩などが挙げられるが、これらに限定されない。カルボジイミドの例としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、および１−（３−ジメチル−アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。ウロニウム塩の例としては、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＢＴＵ）が挙げられる。ホスホニウム塩の例としては、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）およびブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏｐ）が挙げられる。この転換はまた、必要に応じて、添加剤（例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）および／またはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））を使用し得る。一つの実施形態では、開示された合成、ＨＢＴＵは、ＤＭＡＰの存在下で使用され、式８を有する化合物にアミンをカップリングし得る。
【００２７】
【化２７】
2011098970.tif 000008
【００２８】
この方法の別の局面が、スキーム２に図示される。スキーム２に関して、この方法は、式１１に従う、ビニルスルホン酸を提供する工程、および１級アミンまたは２級アミン（Ｒ１Ｒ２ＮＨ）をカップリングし、式１２に従うスルホンアミドを提供する工程を包含する。このカップリング反応は、例えば、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣＩ、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＰｙＢｏｐまたはＰｙＢｒｏｐの存在下で達成され得る。この転換はまた、必要に応じて、添加剤（例えば、ＤＭＡＰおよび／またはＨＯＢｔ）を使用し得る。
【００２９】
【化２８】
2011098970.tif 000009
【００３０】
本開示に包含される特定の新規の化合物は、以前に同定されていない膜結合エストロゲンレセプターに結合する。さらに、これらの化合物の特定の例は、古典的な核内レセプターである（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）βに結合するよりも大きな親和性で、膜結合エストロゲンレセプターに選択的に結合する。従って、この開示の一つの局面は、膜結合エストロゲンレセプターの選択的アゴニストまたは選択的アンタゴニストを提供するための方法を包含する。
【００３１】
この開示はまた、種々の障害、特にエストロゲン欠乏により特徴付けられるもの（例えば、卵巣摘出、卵巣不全、または閉経に関連するもの）を処置するための方法および組成物を包含する。このような状態および障害としては、一般的に、自律神経機能障害、認知障害、運動機能障害、気分障害、摂食障害および心臓血管障害として記載されるもの、ならびに種々の型の障害が挙げられる。一つの局面では、開示された化合物は、特定の型の損傷に対して予防的効果を発揮する。例えば、この化合物は、神経保護薬（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として使用され得る。実際に、本明細書中で同定される膜結合エストロゲンレセプターをアゴナイズする化合物は、神経保護薬として作用し、虚血性発作に応答する神経細胞死を減少させ、再灌流障害を阻害する。
【００３２】
特定の組成物は、少なくとも１種の式Ｉに従う化合物、ならびに第２の治療上の化合物を含有する。第２の化合物はまた、エストロゲンレセプターに結合し得る。例えば、一つの実施形態において、第２の化合物は、ＳＥＲＭであり、そして別の実施形態では、第２の化合物は、エストロゲン（例えば、１７β−エストラジオール）、またはプロゲステロン（例えば、プロゲスチン）である。
【００３３】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
式：
【００３４】
【化１】
2011098970.tif 000010
【００３５】
に従う化合物であって、ここで、Ｒは、Ｈまたは低級脂肪族基であり；Ｍは、ケトン基、アミド基またはスルホンアミド基を含み；Ａｒは、芳香族基であり；Ｘは、ヒドロキシ、アルコキシ、またはハロゲンであり；Ｙは、ヘテロ原子を含み；Ｇは、リンカー基であり；そしてＺは、カルボキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基である、化合物。
（項目２）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００３６】
【化２】
2011098970.tif 000011
【００３７】
を有する、化合物。
（項目３）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００３８】
【化３】
2011098970.tif 000012
【００３９】
を有する、化合物。
（項目４）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ａｒが、フェニル基である、化合物。
（項目５）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００４０】
【化４】
2011098970.tif 000013
【００４１】
を有する、化合物。
（項目６）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００４２】
【化５】
2011098970.tif 000014
【００４３】
を有する、化合物。
（項目７）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｍが、アミド基を含む、化合物。
（項目８）
項目７に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００４４】
【化６】
2011098970.tif 000015
【００４５】
を有し、ここで、Ｒ１が、水素、低級アルキル基またはアラルキル基である、化合物。
（項目９）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｇが、低級アルキル基である、化合物。
（項目１０）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｚが、荷電した基を含む、化合物。  
（項目１１）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｚが、カチオン性の基を含む、化合物。  
（項目１２）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｚが、アミノ基を含む、化合物。
（項目１３）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｙが、酸素であり、そして−Ｇ−Ｚが、以下
【００４６】
【化７】
2011098970.tif 000016
【００４７】
からなる群より選択される式を有する、化合物。
（項目１４）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｒが、水素または低級アルキルである、化合物。
（項目１５）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｘが、ヒドロキシ基である、化合物。
（項目１６）
項目１に記載の化合物であって、ここで、Ｘが、水素である、化合物。
（項目１７）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００４８】
【化８】
2011098970.tif 000017
【００４９】
を有する、化合物。
（項目１８）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００５０】
【化９】
2011098970.tif 000018
【００５１】
を有する、化合物。
（項目１９）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００５２】
【化１０】
2011098970.tif 000019
【００５３】
を有する、化合物。
（項目２０）
項目１に記載の化合物であって、ここで、該化合物が、式
【００５４】
【化１１】
2011098970.tif 000020
【００５５】
を有する、化合物。
（項目２１）
式
【００５６】
【化１２】
2011098970.tif 000021
【００５７】
に従う、第１の化合物または該化合物の薬学的に受容可能な塩の薬学的に有効な量および薬学的キャリアを含有する組成物であって、ここで、Ｒが、Ｈまたは低級脂肪族基であり；Ｍが、ケトン基、アミド基またはスルホンアミド基を含み；Ａｒが、芳香族基であり；Ｘが、ヒドロキシ、アルコキシ、またはハロゲンであり；Ｙが、ヘテロ原子を含み；Ｇが、リンカー基であり；そしてＺが、カルボキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基である、組成物。
（項目２２）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、少なくとも１種の化合物が、式
【００５８】
【化１３】
2011098970.tif 000022
【００５９】
を有する、組成物。
（項目２３）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、前記化合物が、式
【００６０】
【化１４】
2011098970.tif 000023
【００６１】
を有する、組成物。
（項目２４）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、前記化合物が、式
【００６２】
【化１５】
2011098970.tif 000024
【００６３】
を有する、組成物。
（項目２５）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、前記化合物が、式
【００６４】
【化１６】
2011098970.tif 000025
【００６５】
を有する、組成物。
（項目２６）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、前記化合物が、式
【００６６】
【化１７】
2011098970.tif 000026
【００６７】
を有し、ここで、Ｒ１が、水素、低級アルキル基、またはアラルキル基である、組成物。
（項目２７）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、前記化合物が、式
【００６８】
【化１８】
2011098970.tif 000027
【００６９】
を有する、組成物。
（項目２８）
項目２１に記載の組成物であって、ここで、前記化合物が、式
【００７０】
【化１９】
2011098970.tif 000028
【００７１】
を有する、組成物。
（項目２９）
項目２１に記載の組成物であって、該組成物が、薬学的に有効な量の第２の化合物をさらに含有する、組成物。
（項目３０）
項目２９に記載の組成物であって、ここで、前記第２の化合物が、式
【００７２】
【化２０】
2011098970.tif 000029
【００７３】
を有し、ここで、Ｒが、Ｈまたは低級脂肪族基であり；Ｍが、ケトン基、アミド基、またはスルホンアミド基を含み；Ａｒが、芳香族基であり；Ｘが、ヒドロキシ、アルコキシ、またはハロゲンであり；Ｙが、ヘテロ原子を含み；Ｇが、リンカー基であり；そしてＺが、カルボキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基である、組成物。
（項目３１）
膜結合エストロゲンレセプターをアゴナイズまたはアンタゴナイズするための方法であって、該方法が、該レセプターと項目１の化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目３２）
被験体中のエストロゲン欠乏により特徴付けられる状態を処置するための方法であって、該方法は、有効量の項目１に記載の少なくとも第１の化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３３）
項目３２に記載の方法であって、ここで、前記エストロゲン欠乏により特徴付けられる状態が、卵巣不全である、方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法であって、ここで、前記エストロゲン欠乏により特徴付けられる状態が、閉経である、方法。
（項目３５）
項目３２に記載の方法であって、ここで、前記状態が、自律神経機能障害、睡眠周期分裂、認知障害、運動機能障害、気分障害、摂食障害または心臓血管障害を包含する、方法。
（項目３６）
項目３２に記載の方法であって、ここで、前記状態が、虚血誘導性神経死、頭部損傷、アルツハイマー病、顔面紅潮、パーキンソン病、遅発性ジスキネジー、鬱、精神分裂病、神経性食欲不振、神経性大食症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、長期ＱＴＬ症候群、ロマノ−ウォード症候群またはトルサード・ド・ポワント症候群、骨粗しょう症、慢性関節リューマチ、変形性関節症、骨折、多発性硬化症またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
（項目３７）
項目３２に記載の方法であって、該方法が、項目３２において投与される前記化合物とは異なる有効量の第２の化合物を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、そして前記第２の化合物が、項目３２において投与される化合物と組み合わせて治療上の効果を提供する、方法。
（項目３８）
項目３７に記載の方法であって、ここで、前記第２の化合物が、ステロイドホルモンである、方法。
（項目３９）
項目３７に記載の方法であって、ここで、前記第２の化合物が、選択的なエストロゲンレセプターモジュレーターである、方法。
（項目４０）
項目３２に記載の方法であって、ここで、前記第２の化合物が、項目１に記載の化合物の式を有する、方法。
（項目４１）
項目３２に記載の方法であって、ここで、該方法が、膜結合エストロゲンレセプターをアゴナイズまたはアンタゴナイズする工程を包含する、方法。
（項目４２）
項目４１に記載の方法であって、ここで、該方法が、前記膜結合エストロゲンレセプターをアゴナイズする工程を包含する、方法。
（項目４３）
ホルモン置換療法を提供するための方法であって、該方法が、有効量の、項目１に記載の少なくとも第１の化合物を前記被験体に投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、細胞全体のパッチ、電圧クランプ研究における、薬物投与のプロトコールを例示するための図である。
【図２】図２は、１３分間の細胞全体パッチクランプの記録の後のビオシチン標識の程度を例示する、ビオシチンで満たされたニューロンの例を示す画像である。
【図３】図３Ａは、バクロフェン（５μＭ）Ｉ／Ｖ前およびバクロフェン（５μＭ）Ｉ／Ｖ後のドパミンニューロンからの関係を例示するグラフである。図３Ｂは、バクロフェンＩ／Ｖ前の関係およびバクロフェンＩ／Ｖ後の関係のグラフであり、この関係は、別の細胞における１７β−エストラジオール処置に続き、バクロフェン応答について同一の逆電位を図示する。
【図４−１】図４Ａは、エストロゲンに応答した紡錘状弓状ドパミンニューロンのビオチン−ストレプトアビジン−Ｃｙ２標識を示す画像である。図４Ｂは、図４Ａに画像化されたニューロン中のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫細胞学的染色を示す画像である。図４Ｃは、小さな錐体状弓状ＰＯＭＣニューロンの、ビオシチン−ストレプトアビジン−Ｃｙ２標識を示す画像である。図４Ｄは、図４Ｃにおいて画像化されたニューロン中のβ−エンドルフィンの免疫細胞学的染色を示す画像である。
【図４−２】図４Ａは、エストロゲンに応答した紡錘状弓状ドパミンニューロンのビオチン−ストレプトアビジン−Ｃｙ２標識を示す画像である。図４Ｂは、図４Ａに画像化されたニューロン中のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫細胞学的染色を示す画像である。図４Ｃは、小さな錐体状弓状ＰＯＭＣニューロンの、ビオシチン−ストレプトアビジン−Ｃｙ２標識を示す画像である。図４Ｄは、図４Ｃにおいて画像化されたニューロン中のβ−エンドルフィンの免疫細胞学的染色を示す画像である。
【図５】図５は、ステロイド処置前およびステロイド処置後のＧＡＢＡＢ応答の代表的なトレースを含む。
【図６】図６は、バクロフェン応答に対する１７β−エストラジオールおよびＳＥＲＭの効果の概要を述べた棒グラフを含む。
【図７】図７Ａは、１７β−エストラジオール処理後の子宮の大きさと本明細書中で開示される例示的なＳＥＲＭを用いた処理後の子宮の大きさを比較し、そして１７β−エストラジオール処置マウスでは、油状物ビヒクル処置または本明細書中に開示される例示的なＳＥＲＭを用いた処理と比較すれば、安息香酸エストラジオール（ＥＢ）の後に、子宮の大きさが著しく増大したことを示す。図７Ｂは、油状物処置したマウスの子宮の重さおよびＳＥＲＭ処置したマウスの子宮の重さに対して、ＥＢ処置したマウスの子宮の重さを記録した棒グラフである（１群あたりｎ＝マウス３匹〜５匹）。
【図８】図８は、ＰＫＡ活性化剤またはＰＫＡインヒビターの存在下でのバクロフェン応答の代表的なトレースを含み、１７β−エストラジオールのＧＡＢＡＢ応答の減衰作用がプロテインキナーゼＡを必要とすることを示す。
【図９】図９は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）薬物のバクロフェン応答に対する効果の概要を述べた棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＰＫＣインヒビターの存在下でのバクロフェン応答の代表的なトレースを含む。
【図１１】図１１は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビターのバクロフェン応答に対する効果の概要を述べた棒グラフである。
【図１２】図１２は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およびＧαｑインヒビターの存在下でのバクロフェン応答の代表的なトレースを含む。
【図１３】図１３は、ＰＬＣおよびＧαｑインヒビターの効果の概要を述べた棒グラフである。
【図１４】図１４Ａは、単一の弓状ニューロンが、ＴＨ、ＧＡＤ，ＰＫＣδ、ＡＣ  ＶＩＩおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを発現することを例示する代表的なゲルである。図１４Ｂは、単一の弓状ニューロンが、ＰＯＭＣ、ＧＡＤ、ＰＫＣδ、ＡＣ  ＶＩＩおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを発現することを例示する代表的なゲルである。
【図１５】図１５は、視床下部ニューロンにおいて、速効型エストロゲンレセプター対遅効型エストロゲンレセプターが、神経伝達物質調節性の、Ｇタンパク質共役型レセプターのモジュレーションを、膜結合エストロゲンレセプターを介して媒介することを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
（発明の詳細な説明）
以下の用語および方法の説明が、本発明の化合物、組成物、および方法をより十分に記載するために提供され、そして本開示の実行において、当業者を導くために、提供される。本開示において使用される専門用語は、特定の実施形態および実施例を記載することのみを目的とするものであり、そして限定を意図しないこともまた理解される。
【００７６】
本明細書は、以下の略語および省略形を含む；
ＢＡＰＴＡ：１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
ＣＴＸ：コレラトキシン
ＤＡＧ：ジアシルグリセロール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ｄｄＨ２Ｏ：脱イオン蒸留水
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＧＴＡ：エチレングリコール四酢酸
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＥＲＫ：細胞外シグナル関連キナーゼ
ＧＩＲＫ：Ｇタンパク質共役型内向き整流性（ｉｎｗａｒｄｌｙ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ）Ｋ＋チャネル
Ｈｅｘ：ヘキサン
ＭＡＰＫまたはＭＡＰキナーゼ：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ
ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ
ＰＫＡ：プロテインキナーゼＡ
ＰＫＣ：プロテインキナーゼＣ
ＰＯＭＣ：プロオピオメラノコルチン
ＳＥＲＭ：選択的エストロゲンレセプターモジュレーター
ＴＴＸ：テトロドトキシン。
【００７７】
本明細書中では、範囲は、「約」一つの特定値から、および／または「約」別の特定値まで、として表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、上記一つの特定値から、および／または他の特定値まで、を含む。同様に、修飾語「約」の使用により、値が近似値として表現される場合、特定値が別の実施形態を形成することが理解される。他の終末点に関連してと、他の終末点とは独立して、との両方の意味で、上記範囲の各終末点が重要であることがさらに理解される。
【００７８】
開示された化合物は、キラル化合物（例えば、非対称な４置換炭素原子を含むもの）を包含する。このような化合物は、ラセミ形態で単離されるか、または光学活性な形態で単離され得る。光学活性な形態の化合物の合成の仕方が当業者に公知である。化合物のラセミ混合物の分割による、光学的に活性な化合物の調製の仕方もまた周知である。他に特に示されなければ、開示された構造のキラル形態、ジアステレオマー形態、および幾何異性体形態のすべてが意図される。
【００７９】
この明細書および添付の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると理解されるべき多くの用語が参照される：
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、後に記載された事象または環境が、生じ得るが、生じる必要はないこと、および上記記載が、上記事象または環境が生じる例および上記事象または環境が生じない例を含むことを意味する。
【００８０】
本開示を通じて使用される可変物（例えば、Ｒ、Ｇ、Ｍ、Ｑ、Ｘ、ＹおよびＺ）は、以前に定義されたのと同一の可変物である（逆に示唆された場合を除く）。
【００８１】
用語「エストロゲンレセプターアゴニスト」とは、エストロゲンレセプターに作用し、かつ、１７β−エストラジオールと同一の生物学的作用のうちの、少なくとも数種を有する化合物をいう。エストロゲンレセプターに作用し、１７β−エストラジオールの作用をブロックする化合物は、「エストロゲンレセプターアンタゴニスト」と呼ばれる。代表的には、本明細書中に開示される化合物は、部分アゴニストまたは部分アンタゴニストであり、このことは、本明細書中に開示される化合物が、１７β−エストラジオールの作用のいくつかを模倣するか、またはブロックすることもあれば、そうでないこともあることを意味する。いくつかの場合、この化合物は、混合されたアゴニスト／アンタゴニスト活性を示し、ここで、この化合物は、特定の組織では、エストロゲンレセプターアゴニストとして作用するが、他の組織では、エストロゲンレセプターアンタゴニストとして作用する。本明細書中に開示されるこのような化合物の例は、一種のエストロゲンレセプターに、他のエストロゲンレセプターより高い親和性で、選択的に結合することにより、部分アゴニスト活性を示す。このような選択性を示す化合物は、「選択的エストロゲンレセプターモジュレーター」、すなわち、「ＳＥＲＭ」と呼ばれる。
【００８２】
「ホルモン置換療法」とは、被験体中でのエストロゲンの産生が低減することまたは不十分であること（例えば、閉経において見られる）に応答して与えられる処置をいう。ホルモン置換療法は、しばしば、老化、卵巣摘出または早発性卵巣機能不全に応答して着手される。ホルモン置換療法は、しばしば、エストロゲン欠乏に関連する二次作用（例えば、骨粗しょう症、心疾患、顔面紅潮および気分障害）のうちの１種以上の処置を補助するために使用される。
【００８３】
「誘導体」とは、親化合物に由来する化合物もしくは化合物の一部、または親化合物に理論上由来し得る化合物もしくは化合物の一部をいう。
【００８４】
用語「アルキル基」とは、１炭素〜２４炭素の、分枝した飽和炭化水素基、または１炭素〜２４炭素の、分枝していない飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど）をいう。「低級アルキル」基は、１個〜１０個の炭素原子を有する、分枝した飽和炭化水素または分枝していない飽和炭化水素である。
【００８５】
用語「アルケニル基」とは、２個〜２４個の炭素原子の、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式の、炭化水素基をいう。
【００８６】
用語「アルキニル基」とは、２個〜２４個の炭素原子の、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式の、炭化水素基をいう。
【００８７】
用語「ハロゲン化アルキル基」とは、上に記載されたようなアルキル基の上に存在する１個以上の水素原子が、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されたアルキル基をいう。
【００８８】
用語「シクロアルキル基」とは、少なくとも３個の炭素原子で構成される非芳香族炭素ベースの環をいう。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルキル基」は、環の炭素原子のうち、少なくとも１個がヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄またはリンであるが、これらに限定されない）で置換されている、上で記載されるようなシクロアルキル基である。
【００８９】
用語「エチレングリコール鎖」または「オリゴエチレングリコール鎖」とは、反復エチレングリコール単位を有する基をいう。このエチレングリコール鎖は、任意の長さであり得るが、代表的には、２〜約１００のエチレングリコール単位、そしてより代表的には、２〜約７０のエチレングリコール単位を含む。最も代表的には、オリゴエチレングリコール鎖は、約２〜約２０のエチレングリコール単位を含む。
【００９０】
用語「脂肪族基」としては、上で記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン化アルキル基、およびシクロアルキル基が挙げられる。「低級脂肪族」基は、１個〜１０個の炭素原子を有する、分枝した構造または分枝していない構造である。
【００９１】
用語「アリール基」とは、任意の炭素ベースの芳香族基（ベンゼン、ナフタレンなどが挙げられるが、これらに限定されない）をいう。用語「芳香族」はまた、「ヘテロアリール基」を包含し、この「ヘテロアリール基」とは、芳香族基の環内に組み込まれた少なくとも１個のヘテロ原子を有する芳香族基をいう。このようなヘテロ原子の例としては、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、およびリンが挙げられるが、これらに限定されない。このアリール基は、１個以上の基（アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アリール基、ハライド基、ニトロ基、アミノ基、エステル基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドロキシ基、カルボン酸基、もしくはアルコキシ基が挙げられるが、これらに限定されない）で置換されていてもよいし、このアリール基は、置換されていなくてもよい。
【００９２】
用語「アラルキル」とは、上記アリール基に結合した、上で記載されたようなアルキル基を有するアリール基をいう。アラルキル基の例は、ベンジル基である。
【００９３】
用語「アルキルアミノ」は、少なくとも１個の水素原子が、アミノ基で置き換えられた、上に記載されたようなアルキル基を包含する。
【００９４】
用語「ヘテロ原子」とは、炭素原子以外の原子をいうことが、当業者により理解される。ヘテロ原子の例としては、ホウ素、窒素、酸素、リンおよび硫黄が挙げられる。
【００９５】
従って、本明細書中で用いられる場合、用語「炭化水素鎖」とは、代表的には、炭素原子の鎖をいい、代表的には、２個〜約２２個の炭素原子を含む。この鎖は、脂肪族基およびアリール基を含み得、そして直鎖、分枝鎖および／または環状の基を含み得る。
【００９６】
用語「ヒドロキシル基」は、式−ＯＨにより表される。用語「アルコキシ基」は、式−ＯＲにより表され、ここで、Ｒは、アルキル基であり得、必要に応じて、上述のように、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基で置換され得る。
【００９７】
用語「ヒドロキシアルキル基」とは、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキル基をいう。用語「アルコキシアルキル基」とは、少なくとも１個の水素原子が、上に記載されるようなアルコキシ基で置換されたアルキル基をいう。利用可能な場合には、ヒドロキシアルキル基またはアルコキシアルキル基のアルキル部分は、アリール、アラルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシを有し得る。
【００９８】
用語「アミン基」は、式−ＮＲＲ’により表され、ここで、ＲおよびＲ’は、独立して、水素または上に記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【００９９】
用語「アミド基」は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’により表され、ここで、ＲおよびＲ’は、独立して、水素、上に記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１００】
用語「エステル」は、式−ＯＣ（Ｏ）Ｒにより表され、ここで、Ｒは、上に記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１０１】
用語「カーボネート基」は、式−ＯＣ（Ｏ）ＯＲにより表され、ここで、Ｒは、上に記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１０２】
用語「カルボン酸」は、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨにより表される。
【０１０３】
用語「アルデヒド」は、式−Ｃ（Ｏ）Ｈにより表される。
【０１０４】
用語「ケト基」は、式−Ｃ（Ｏ）Ｒにより表され、ここで、Ｒは、上で記載されるような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１０５】
用語「カルボニル基」は、式Ｃ＝Ｏにより表される。
【０１０６】
「カチオン性基」または「カチオン性部分」とは、正に荷電した基または正に荷電し得る基をいう。例えば、カチオン性基は、生理学的に適切なｐＨにてプロトン化され得るアミンであり得る。カチオン性基の第２の例は、正に荷電した第４級アミンである。
【０１０７】
開示された化合物はまた、塩（いくつかの塩形成基が存在する場合、混合された塩および／または分子内塩を含む）を包含する。この塩は、一般的には薬学的に受容可能な、無毒性の塩である。塩を形成する酸性の基の例としては、カルボキシル基、リン酸基、ボロン酸基が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、適切な塩基と塩を形成し得る。これらの塩としては、例えば、元素の周期表のＩＡ族、ＩＢ族、ＩＩＡ族、およびＩＩＢ族の金属に由来する、無毒性の金属カチオンが挙げられ得る。一つの実施形態では、アルカリ金属カチオン（例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、もしくはカリウムイオン）、またはアルカリ土類金属カチオン（例えば、マグネシウムイオン、もしくはカルシウムイオン）が使用され得る。この塩はまた、亜鉛カチオンまたはアンモニウムカチオンであり得る。この塩はまた、適切な有機アミン（例えば、非置換の、もしくはヒドロキシル置換された、モノアルキルアミン、ジアルキルアミンもしくはトリアルキルアミン（特に、モノアルキルアミン、ジアルキルアミンもしくはトリアルキルアミン））あるいは４級アンモニウム化合物とともに（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、ビス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン（例えば、モノ−、ビス−、もしくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、もしくはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ−低級アルキル）アミン（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンもしくはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、もしくはＮ−メチル−Ｄ−グルカミン）、または４級アンモニウム化合物（例えば、テトラブチルアンモニウム塩）とともに）形成され得る。
【０１０８】
特定の化合物は、鉱酸と酸−塩基塩を形成し得る、少なくとも１個の塩基性の基を保有する。塩基性の基の例としては、アミノ基またはイミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。このような塩基性の基と塩を形成し得る無機酸の例としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。塩基性の基はまた、有機カルボン酸、有機スルホン酸、有機スルホ酸（ｓｕｌｆｏ  ａｃｉｄ）もしくは有機リン酸、またはＮ−置換スルファミン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボニック酸（ｅｍｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸と塩を形成し得るが、さらに、アミノ酸（例えば、α−アミノ酸）、およびメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシメタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、２−ホスホグリセリン酸もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸またはＮ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）または他の酸性有機化合物（例えば、アスコルビン酸）とも塩を形成し得る。
【０１０９】
用語「エーテル基」は、式Ｒ（Ｏ）Ｒ’により表され、ここでＲおよびＲ’は、独立して、上に記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１１０】
用語「ハライド」とは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩをいう。
【０１１１】
用語「ウレタン」およびカルバメートは、式ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ’により表され、ここで、ＲおよびＲ’は、独立して、水素、上に記載されたような、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、ヘテロシクロアルキル基であり得る。
【０１１２】
上に記載された基は、必要に応じて、１個以上の置換基で置換され得る。分子内の特定の位置での任意の置換基または可変物の定義は、この分子について他の場所での定義から独立している。適切な置換基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換されたアルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換されたアルカノイルアミノ、置換されたアリールアミノ、置換されたアラルカノイルアミノ、チオール、スルフィド、チオノ、スルホニル、スルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバミル、置換されたカルバミルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
用語「プロドラッグ」は、このプロドラッグが被験体に投与された場合に、本発明の活性な親薬物をインビボで放出する、共有結合された任意のキャリアを含有することが意図される。プロドラッグは、薬の特性（例えば、溶解度およびバイオアベイラビリティー）を増強することが公知であるので、本明細書中に開示される化合物は、プロドラッグの形態で送達され得る。従って、また企図されるのは、本願発明の化合物のプロドラッグ、プロドラッグを含有する組成物、およびこのようなプロドラッグを送達する方法である。開示された化合物のプロドラッグは、代表的には、慣用的な操作によって修飾が切断されるか、またはインビボで修飾が切断されるかのいずれかで、親化合物が得られる様式で、化合物中に存在する官能基を修飾する工程により調製される。プロドラッグとしては、ヒドロキシ基、アミノ基、またはスルフヒドリル基を有する化合物が挙げられ、上記ヒドロキシ基、アミノ基、スルフヒドリル基またはスルフヒドリル基は、切断されるとそれぞれ対応するヒドロキシル基、遊離アミノ基、または遊離スルフヒドリル基が得られる、任意の基で官能基化されている。プロドラッグの例としては、酢酸基、ギ酸基、および／または安息香酸基でアシル化された、ヒドロキシ基、アミノ基および／またはスルフヒドリル基を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
開示された化合物の保護された誘導体もまた、企図される。開示された化合物の使用が適切な種々の誘導体が、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；第３版；Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９において開示されている。
【０１１５】
本明細書中に記載されている化合物の置換基および置換パターンは、化学的に安定である化合物を提供し得るように、当業者により選択されること、ならびに当該分野で公知の技術およびさらに本開示において記載される方法によって容易に合成され得ることが、理解される。本発明の好ましい実施形態が、ここで詳細に参照される。
【０１１６】
（Ｉ．好ましい化合物の選択）
エストロゲンレセプターを調節するための好ましい化合物は、代表的には、１種以上のエストロゲンレセプターを、アゴナイズするか、またはアンタゴナイズする際の潜在能力および選択性に関して、選択される。代表的には、開示された化合物は、膜結合エストロゲンレセプターに選択的に結合し、そして（結合する場合には）核内エストロゲンレセプターである、（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）βに、より低い親和性で結合する。以下の方法および実施例の節に記載されているように、そして一般的に公知であるように、標的エストロゲンレセプターに対する特定の化合物の効力は、インビトロで決定され得、そして開示されたインビトロでの方法は、新規のＳＥＲＭをスクリーニングし、そして同定するために使用され得る。さらに、種々の状態および障害（閉経に関連する状態、もしくはエストロゲン欠乏により特徴付けられる他の状態（例えば、卵巣摘出、卵巣不全もしくは閉経））を処置するか、またはこれらに対して保護するための特定の化合物が提供される。このような状態の例としては、顔面紅潮、認知衰弱（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ）、骨粗しょう症、鬱、虚血性脳損傷およびアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
開示された化合物が顔面紅潮を阻害または改善する能力は、例えば、モルヒネ中毒のラットがナロキソンを用いて、モルヒネに対する急性の禁断症状を経験する場合に生じる、尾部の皮膚温度の上昇を、鈍化させる薬剤の能力を測定する標準的なアッセイにおいて決定され得る。Ｍｅｒｃｈｅｎｔｈａｌｅｒら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｏｔ  ｆｌｕｓｈ．Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  １９９８，３０，３０７−３１６を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される）。また、Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｉｂｏｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ
ｔａｉｌ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ
ｒａｔｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，４１９，４７−５４；およびＰａｎら、Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｍｉｃｒｏｎｉｚｅｄ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｗｉｔｈ  ｓｏｙ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ
ｔａｉｌ  ｓｋｉｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ．Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ  ２００１，８，１７１−１７４を参照のこと。Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎの刊行物およびＰａｎの刊行物の両方が、本明細書中に参考として援用される。
【０１１８】
特定の開示された化合物は、多発性硬化症の処置に対して有用である。多発性硬化症の症状を処置または抑制するための好ましい化合物は、Ｐｏｌａｎｃｚｙｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００３，１６３，１５９９−１６０５により記載される、実験的な自己免疫脳脊髄炎マウスモデルを使用することにより選択され得る。このＰｏｌａｎｃｚｙｋの刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【０１１９】
摂食障害（例えば、神経性食欲不振および／または神経性大食症）を処置するのに有用な、開示された化合物は、当業者に公知であるような、単純な栄養補給アッセイ（ｓｉｎｇｌｅ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を用いて同定され得る。
【０１２０】
学習および記憶に対する開示された化合物の効果は、Ｓｔａｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２２，１０１６３−１０１７１により記載されたプロトコールに従って、モリス水迷路および物体認識アッセイを用いて、評価され得る。Ｓｔａｃｋｍａｎらの刊行物が本明細書中に参考として援用される。
【０１２１】
開示された化合物の神経保護活性はまた、例えば、グルタミン酸塩チャレンジ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を用いた、標準的なインビトロでの薬理学的アッセイにおいて、評価され得る。Ｚａｕｌｙａｎｏｖら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，１９：７０５−７１８；およびＰｒｏｋａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，４４，１１０−１１４を参照のこと。Ｚａｕｌｙａｎｏｖら、およびＰｒｏｋａｉらの刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【０１２２】
開示された化合物はまた、全体的な大脳虚血に関連する損傷からニューロンを保護する能力に関して評価され得る。化合物は、Ｖｏｇｅｌら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  ２００３，９９，１１２−１２１により記載される、心停止および心肺蘇生術アッセイを用いて、このような損傷を低減する能力について評価され得る。一局面では、上記化合物は、蘇生後に投与された場合でさえ、ニューロンへの損傷を低減し得る。Ｖｏｇｅｌらの刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【０１２３】
神経保護はまた、マウスにおいて、Ｄｕｂａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１，９８，１９５２−１９５７；およびＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９，６３８５−６３９３により記載されるプロトコールに従って、中大脳動脈閉塞手順を用いて評価され得る。エストロゲン欠乏により特徴付けられる障害の異なるモデル中での開示された化合物を評価するためのさらなるアッセイが、以下の方法および実施例の節に記載されている。
【０１２４】
化合物の使用は、エストロゲン欠乏を伴う状態に必ずしも限定されない。このような状態および障害を処置または予防するための治療の効力を特徴付けるための技術およびアッセイは、周知であり、そして例えば、Ｍａｌａｍａｓら、およびＭｅｗｓｈａｗらにより、それぞれ米国特許出願公開第２００３／０１７１４１２号明細書および同第２００３／０１８１５１９号明細書に記載される。Ｍａｌａｍａｓら、およびＭｅｗｓｈａｗらの刊行物は両方とも、本明細書中に参考として援用される。
【０１２５】
（ＩＩ．薬学的組成物）
本開示の別の局面は、被験体への投与のために調製される薬学的組成物を包含し、そしてこの組成物は、現在開示されている１種以上の化合物の治療上有効な量を含有する。開示された化合物の治療上有効な量は、投与ルート、被験体である哺乳動物の型、および処置される被験体の身体的な特徴に依存する。考慮され得る特定の因子としては、疾患の重症度および段階、体重、食事ならびに併用薬（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。これらの因子と、開示された化合物の治療上有効な量を決定する工程との関係は、当業者に理解される。
【０１２６】
投与される化合物の治療上有効な量は、上に記述された所望の効果および因子に依存して変動し得る。代表的には、投薬量は、被験体の体重の、約０．０１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇとの間であり、そしてより代表的には、被験体の体重の、約０．０１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間である。一つの局面では、治療上有効な量は、インビトロで有効であると見出される濃度付近の被験体の標的組織中の治療用薬剤のインビボでの濃度を達成するように選択され得る。
【０１２７】
一つの実施形態では、開示されたＳＥＲＭは、本明細書中に開示されるさらなる化合物、および／または他の治療用薬剤（例えば、他のＳＥＲＭ、抗がん剤もしくは抗増殖剤）と組み合わせて使用される。例えば、開示された化合物は、化学療法剤（例えば、タモキシフェン、タキソール、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、メトトレキサートなど）とともに使用され得る。一つの局面では、開示されたＳＥＲＭは、ステロイドホルモン（例えば、エストロゲン（１７β−エストラジオールが挙げられる）、プロゲステロンなど）と組み合わせて使用される。このエストロゲンまたはプロゲステロンは、天然に存在し得るか、または合成エストロゲンもしくは合成プロゲステロンであり得る。異なる治療用薬剤が、組み合わせて使用される場合、治療用薬剤は、一緒に投与されてもよいし、別々に投与されてもよい。治療用薬剤は、単独で投与され得るが、より代表的には、選択された投与ルートおよび標準的な薬学的診療（ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を基本に選択される薬学的キャリアとともに投与される。
【０１２８】
本明細書中に記載される任意のＳＥＲＭは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされ得、薬学的組成物を形成する。薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も代表的には、ヒトに対する投与のための組成物の標準的なキャリア（溶剤（例えば、滅菌水、生理食塩水、または生理的なｐＨでの緩衝化溶液）が挙げられる）である。この組成物はまた、筋肉内投与されるか、経皮投与されるか、またはエアロゾルの形態で投与され得る。他の化合物は、当業者により使用される標準的な手順に従って投与される。
【０１２９】
薬学的送達が意図される分子は、薬学的組成物に処方され得る。薬学的組成物は、選択した分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤などを含有する。薬学的組成物はまた、１種以上のさらなる活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬など）を含有し得る。薬学的処方物は、さらなる成分（例えば、キャリア）を含有し得る。これらの処方物にとって有用な、薬学的に受容可能なキャリアは、従来のものである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５）は、本明細書中に開示される化合物の薬学的送達に適した組成物および処方物を記載する。
【０１３０】
一般的に、このキャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口処方物は、通常は、注射可能な流体（薬学的に受容可能でかつ生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなど）が挙げられる）をビヒクルとして含有する。固形組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）の、従来の無毒性の固体のキャリアとしては、例えば、薬学的等級の、マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき薬学的組成物は、少量の無毒性の補助剤（例えば、加湿剤、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムもしくはモノラウリン酸ソルビタン）を含有し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、開示されたＳＥＲＭの有効量を含有する薬学的調製物の徐放は、有益であり得る。緩徐な放出（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）の処方物は、当業者に公知である。例として、ポリマー（例えば、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸）またはレシチンの懸濁液が、徐放を提供するために使用され得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＳＥＲＭ送達が注射薬物蓄積および／またはインプラント薬物蓄積（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｐｏｔ）（例えば、多小胞リポソーム（例えば、Ｄｅｐｏ泡沫（ＳｋｙｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の多小胞リポソーム）を含む）を介することが具体的に企図される（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏ．１９９３，５０，２６１−２６４；Ｋａｔｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９８，８７，１３４１−１３４６；Ｙｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０００，６４，１５５−１６６；およびＨｏｗｅｌｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２００１，７，２１９−２２７を参照のこと）。
【０１３３】
（ＩＩＩ．開示された化合物を使用するための方法）
開示された化合物は、被験体中のエストロゲンレセプターを選択的に調節するために使用され得、それゆえ種々の障害（エストロゲン欠乏により特徴付けられるもの）を処置するのに有用である。さらに、開示された特定の化合物は、１種以上のエストロゲンレセプターに対して選択性を示すので、上記化合物は、状態（自律神経機能障害、認知衰弱、運動機能障害、気分障害、摂食障害および心臓血管障害ならびに異なる型の障害として記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために使用され得る。一般的に、上記化合物は、現在のホルモン置換療法において使用されるステロイドホルモン（例えば、エストロゲン、または合成エストロゲン）に関連する深刻な副作用と同一の副作用の発生を誘導せず、ホルモン置換療法にとって有用である。この開示された化合物はまた、副作用（例えば、現在公知のＳＥＲＭ（例えば、タモキシフェンもしくはラロキシフェン）を用いた処置において直面する副作用（例えば、顔面紅潮）を回避する。より具体的には、開示された化合物は、障害（例えば、虚血誘導性神経死、頭部損傷、アルツハイマー病、温度調節障害（例えば、顔面紅潮）、睡眠周期分裂（ｓｌｅｅｐ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、パーキンソン病、晩発性ジスキネジア、鬱、精神分裂病、神経性食欲不振、神経性大食症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、長期ＱＴＬ症候群（例えば、ロマノ−ウォード症候群またはトルサード・ド・ポワント症候群）、骨粗しょう症、慢性関節リューマチ、変形性関節症、骨折、および多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために使用され得る。一つの実施形態では、特定の化合物は、流体のバランスを調節することにより（例えば、ナトリウムまたはクロライドの上皮輸送をブロックすることにより）血管拡張を促進するために使用され得る。理論に限定されるわけではなく、この化合物は、マキシ−Ｋチャンネル（ｍａｘｉ−Ｋ  ｃｈａｎｎｅｌ）を活性化することにより機能すると考えられる。Ｖａｌｖｅｒｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８５，１９２９−１９３１を参照のこと。
【０１３４】
別の実施形態では、開示された化合物は、自己免疫疾患、特に男性よりも女性に頻繁に生ずる自己免疫疾患を処置するために使用され得る。このような疾患の例としては、多発性硬化症、慢性間接リューマチ、グレーヴス病、全身性エリテマトーデス、および重症筋無力症が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、開示された化合物は、被験体の免疫の能力を維持または増強するために機能する。さらに、開示された化合物は、特定の型の損傷に対して、予防的な効果を発揮する。例えば、上記化合物は、神経保護薬として使用され得る。実際に、本明細書中で同定される膜結合エストロゲンレセプターをアゴナイズする化合物は、虚血性発作に応答する神経保護薬として作用し、再灌流障害を阻害する。
【０１３５】
さらに、開示された化合物が１種以上の特定の型のエストロゲンレセプターを選択的に調節する能力のために、開示された化合物は、異なる生理学的効果を媒介する異なるエストロゲンレセプターの寄与を同定するために、使用され得る。開示された化合物はまた、これらの薬剤が作用する、特定のクラスの膜結合レセプターに結合し、かつ、これを調節するために使用され得る。実際、実用的な実施形態の開示された選択的エストロゲンレセプターモジュレーターは、膜結合レセプターに関しては、１７β−エストラジオールより１０倍高い効力を有し、そして核内エストロゲンレセプターである、（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）βに関しては、１７β−エストラジオールより１００万倍低い効力を有した。
【０１３６】
開示された化合物の別の適用は、アフィニティークロマトグラフィーである。現在開示されている化合物の例が、新規の、膜結合エストロゲンレセプターに結合するので、この化合物は、レセプターを精製するか、またはサンプルからこのレセプターを除去するために使用され得る。上記化合物を使用するために、上記化合物は、代表的には、当業者に公知の固形支持体に結合される。上記化合物は、直接的に結合されるか、またはリンカー分子を介して結合され得る。開示された化合物との使用が適切な、例示的なアフィニティークロマトグラフィー技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、編）に開示される。
【０１３７】
（ＩＶ．合成）
本明細書中に開示される化合物、およびこの開示を考慮すれば医化学分野の当業者に非常に明白になるこのような化合物のアナログが、当業者に周知の多くの方法で調製され得る。特定の化合物を作製するための例示的な方法は、以下に記載される。開示された試薬および反応に鑑み、上記分子の官能性を考慮すれば、これらの方法が、以下に明示的に記載されていない化合物の合成に対して一般化可能であることは、有機化学分野の当業者に理解される。開示された状態を考慮すれば、当業者は、本明細書中に開示される特定の状態に適合しない官能基を有し得る類似の化合物を調製するための代替の方法を認識する。
【０１３８】
所定の変換において存在する官能基に依存して、変換の間にその基をマスクするための、種々の基に対する保護基が好まれ得る。種々の官能性に対する適切な保護基は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；第３版；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。
【０１３９】
開示された化合物を合成するための方法の一つの実施形態が、以下のスキーム３に例示される。スキーム３に関して、この方法は、化合物２を提供する工程、および化合物２を化合物４へと転換する工程を包含する。化合物２は、Ｗｅａｔｈｅｒｍａｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１，８，４２７−４３６により報告されるプロトコールに従って調製された。実用的な実施例では、化合物２は、リチウム−ハロゲン交換条件に供され、続いて、クロロ蟻酸アリルと反応して、化合物４を与える。化合物６は、アリルエステル基のパラジウム−触媒切断を介して調製された。実用的な実施例では、触媒性Ｐｄ（ＰＰｈ３）４がＰｈＳｉＨ３と一緒に使用され、化合物６を生み出した。化合物６は、種々のＮ−置換アクリルアミド中間体を調製するために使用され得る多様な中間体である。例えば、任意の一級アミンまたは二級アミンが、化合物６とのアミド結合形成反応を介して組み込まれ得る。スキーム３において例示される方法は、Ｅ異性体およびＺ異性体（それぞれ化合物８および化合物９）の両方を生み出す。
【０１４０】
【化２９】
2011098970.tif 000030
【０１４１】
さらなるＳＥＲＭが、スキーム４に従って調製され得る。スキーム４に関して、化合物１０は、ジフェニルアセチレンから調製され得る。（エチルに加えて）種々のアルキル基が、種々の技術によりこの工程で導入され得る。化合物１０において導入されたヨード基は、カルボキシ基（例えば、カルボキシメチルエステル１２）を導入するために使用され得、このカルボキシ基は、対応するカルボン酸７へと容易に転換される。カルボン酸７は、種々の一級アミンおよび二級アミンと反応し得、対応するアミド（例えば、８および対応するＺ異性体９）が得られる。
【０１４２】
【化３０】
2011098970.tif 000031
【０１４３】
二置換アクリルアミド誘導体は、スキーム５に例示される方法に従って調製され得る。スキーム５に関して、１８のビス−アリル化で２０が生じる。２０とベンズアルデヒドとのアルドール反応で、２２が生じ、これが脱離を経て、Ｅ異性体およびＺ異性体の混合物としての２４が得られる。アリル保護基の切断で２６が生じ、続いて、アミド結合の形成が生じ、Ｅ異性体およびＺ異性体（それぞれ、２８および３０）を形成する。
【０１４４】
【化３１】
2011098970.tif 000032
【０１４５】
スキーム６は、ビニルケトン由来のＳＥＲＭを合成するための方法の実施形態を記載する。スキーム６に関して、化合物３２のアルキル化は、種々の基を導入するために使用され得る多様な反応である。例えば、Ｒとしては、ヒドロキシ基、保護されたヒドロキシ基、カルボキシ基、保護されたカルボキシ基、アミン、または保護されたアミノ基が挙げられ得るが、これらに限定されない。実用的な実施例では、Ｒは、ジメチルアミノ基またはピペリジノ基であった。中間体３４は、化合物２より調製される化合物のリチウムアニオンと反応し（スキーム３）、脱保護の後、Ｅ異性体およびＺ異性体（それぞれ３８および４０）が得られる。
【０１４６】
【化３２】
2011098970.tif 000033
【実施例】
【０１４７】
（Ｖ．方法および実施例） 
前述の開示は、以下の非限定的な実施例において、さらに説明される。
【０１４８】
（実施例１）
この実施例は、２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）−３−フェニルペンタ−２−エン酸アリルエステル（４）の合成を記載する。
【０１４９】
【化３３】
2011098970.tif 000034
【０１５０】
ｎ−ブチルリチウム（６．６８ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ；２．５Ｍ）を、−７８℃にまで冷却した無水ＴＨＦ（７５ｍＬ）中の臭化ビニル２（３．００ｇ、８．３５ｍｍｏｌ）溶液中に滴下した。１５分間攪拌した後、クロロ蟻酸アリル（４．４３ｍＬ、４１．８ｍｍｏｌ）をニートで滴下した。これを、−７８℃から室温にまで、４時間かけて攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウムを添加し、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮し、黄色の油状物を得た。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）で精製し、４を、収率５９％で淡黄色油状物（１．８０ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）として得た。Ｅ−異性体のＲｆ＝０．２０およびＺ−異性体のＲｆ＝０．１４（５％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）。
【０１５１】
【化３４】
2011098970.tif 000035
【０１５２】
（実施例２）
この実施例は、２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）−３−フェニルペンタ−２−エン酸（６）の合成を記載する。
【０１５３】
【化３５】
2011098970.tif 000036
【０１５４】
無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物４（０．１６ｇ、０．４３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰｈＳｉＨ３（０．１１ｍＬ、０．８７８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＰｄ（ＰＰｈ３）４（１０ｍｇ、８．７８μｍｏｌ）を添加した。この反応を室温で、アルゴン下で３０分間攪拌した。これを、ｄｄＨ２Ｏでクエンチし、１Ｍ  ＨＣｌを用いて、ｐＨを２にまで低下させ、ジクロロメタンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製黄色油状物を、カラムクロマトグラフィー（３５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）で精製し、収率９９％で、白色固形物（０．１４ｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）を得た。
Ｅ−異性体のＲｆ＝０．３３およびＺ−異性体のＲｆ＝０．４９（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０１５５】
【化３６】
2011098970.tif 000037
【０１５６】
（実施例３）
この実施例は、２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）−３−フェニルペンタ−２−エン酸［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニルアミド（７）の合成を記載する。
【０１５７】
【化３７】
2011098970.tif 000038
【０１５８】
ＨＢＴＵ（２５．７ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４ｍｇ、３．０９μｍｏｌ）を、予め０℃にまで冷却されたジクロロメタン（１ｍＬ）中の化合物３（２０．０ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この反応を、０℃にて３０分間攪拌させ、そして室温にてさらに３０分間攪拌した。次いで、０℃に再度冷却し、そしてアミン塩酸塩（１４．７ｍｇ、０．０６７９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．０４ｍＬ、０．２４７ｍｍｏｌ）を滴下した。この反応を、室温にて３０分間攪拌し、次いで、飽和塩化アンモニウムでクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウムで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、８４％の収率で、白色泡状物（２５．４ｍｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）を得た。Ｅ−異性体のＲｆ＝０．１５およびＺ−異性体のＲｆ＝０．３３（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０１５９】
【化３８】
2011098970.tif 000039
【０１６０】
（実施例４）
この実施例は、（Ｅ，Ｚ）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニルペンタ−２−エン酸［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）−フェニル］アミド（８および９）の合成を記載する。
【０１６１】
【化３９】
2011098970.tif 000040
【０１６２】
化合物７（２５．３ｍｇ，０．０５１４ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（０．４７ｍＬ）中に溶解し、０℃にまで冷却した。２，２，２−トリフルオロエタノール（０．３７ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（０．７４ｍＬ）を添加し、そして反応混合物を０℃から１０℃まで、１．５時間にわたって攪拌した。この時間の後、この溶液を１ＭのＨＣｌに注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そしてこの溶液を減圧下で除去した。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１５％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製し、９７％収率で、白色泡状物（２１．５ｍｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）を得た。Ｅ−異性体８のＲｆ＝０．１８およびＺ−異性体９のＲｆ＝０．２２（１５％
ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０１６３】
【化４０】
2011098970.tif 000041
【０１６４】
（実施例５）
この実施例は、１−ヨード−１，２−ジフェニルブタ−１−エン（１０）の合成を記載する。
【０１６５】
【化４１】
2011098970.tif 000042
【０１６６】
塩化ジエチルアルミニウム（９．７８ｇ、０．３９３ｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（２００ｍＬ）中の二塩化ビス（シクロペンタジエニル）チタニウム（２１．８ｍＬ、０．０３９３ｍｏｌ；１．８Ｍ）の溶液に添加し、そしてこの混合物をアルゴン雰囲気下で、室温で１０分間攪拌した。ジフェニルアセチレン（５．０ｇ、０．０２８１ｍｏｌ）を、ゆっくりと添加し、そして５時間攪拌した。この反応混合物を、−７８℃にまで冷却し、そしてジクロロメタン（７０ｍＬ）で希釈した。Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）（１４．５ｇ、０．０６４５ｍｏｌ）を、添加後の温度を−７８℃に保つようにゆっくりと添加し、そしてこの反応を一晩室温で攪拌した。翌日、これをヘキサン（１００ｍＬ）中に注ぎ、３Ｎ  ＮａＯＨ（２００ｍＬ）中の５％  Ｎａ２ＳＯ３を添加し、そして濾過した。濾過後、この２層を分離し、有機層を５％  Ｎａ２ＳＯ３（２００ｍＬ）で洗浄し、続いて３Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製生成物を、ヘキサン中でカラムクロマトグラフィーにより精製し、７６％の収率で、淡褐色油状物（７．１５ｇ、０．０２１４ｍｏｌ）として１０を得た。
【０１６７】
【化４２】
2011098970.tif 000043
【０１６８】
（実施例６）
この実施例は、２，３−ジフェニルペンタ−２−エン酸メチルエステル（１２）の合成を記載する。
【０１６９】
【化４３】
2011098970.tif 000044
【０１７０】
メタノール（５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、０．９８７ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（１０７ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ中に溶解したヨウ化ビニル１０（３００ｍｇ、０．８９８ｍｍｏｌ）に添加した。一酸化炭素で５分間泡立て、そして反応混合物を、８０℃で、ＣＯ雰囲気下で３日間攪拌した。この冷却した反応混合物を、酢酸エチルで希釈し、ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、この層を分離し、そして有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製生成物を、クロロホルム中でカラムクロマトグラフィーで精製し、８３％の収率で生成物（１９８ｍｇ、０．７４３ｍｍｏｌ）を得た。Ｅ−異性体のＲｆ＝０．４７およびＺ−異性体のＲｆ＝０．５３（ＣＨＣｌ３）。
【０１７１】
【化４４】
2011098970.tif 000045
【０１７２】
（実施例７）
この実施例は、２，３−ジフェニルペンタ−２−エン酸（１４）の合成を記載する。
【０１７３】
【化４５】
2011098970.tif 000046
【０１７４】
メタノール（４ｍＬ）およびＴＨＦ（９ｍＬ）中の化合物１２（５０ｍｇ，０．１８８ｍｍｏｌ）の溶液に、０．２ＭのＫＯＨ溶液（９．４ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）を滴下した。次いで、この反応を２日間加熱還流した。翌日、これを１ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）中に注ぎ、１０分間攪拌し、ＣＨＣｌ３で抽出し、硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（５％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、６８％収率で、白色固形物（３２ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を得た。Ｅ−異性体のＲｆ＝０．３３およびＺ−異性体のＲｆ＝０．４７（５％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０１７５】
【化４６】
2011098970.tif 000047
【０１７６】
（実施例８）
この実施例は、Ｅ−２，３−ジフェニルペンタ−２−エン酸［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）−フェニル］アミドおよびＺ−２，３−ジフェニルペンタ−２−エン酸［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）−フェニル］アミド（１６および１７）の合成を記載する。
【０１７７】
【化４７】
2011098970.tif 000048
【０１７８】
化合物１６および１７を、（Ｅ異性体およびＺ異性体の混合物としての）化合物１４（２９ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．７ｍｇ、５．７μｍｏｌ）、アミン塩酸塩（２７ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．０８ｍＬ、０．４５９ｍｍｏｌ）を用いて、化合物８および９（実施例４）について記載したように合成し、３２％の収率で、所望の生成物１７（１９ｍｇ、０．０４８８ｍｍｏｌ）を得、そして６０％の収率で、所望の生成物１６（２９ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を得た。Ｅ−異性体１６のＲｆ＝０．１５およびＺ−異性体１７のＲｆ＝０．１０（５％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０１７９】
【化４８】
2011098970.tif 000049
【０１８０】
（実施例９）
この実施例は、（４−アリルオキシフェニル）酢酸アリルエステル（２０）の合成を記載する。
【０１８１】
【化４９】
2011098970.tif 000050
【０１８２】
水素化ナトリウム（１．９０ｇ、０．０７８９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（７０ｍＬ）中に懸濁し、０℃にまで冷却した。４−ヒドロキシフェニル酢酸１８（５．００ｇ、０．３２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中に溶解し、冷却した水素化ナトリウム懸濁液に添加し、そして室温で２時間攪拌した。この時間の後、この反応物を０℃にまで再度冷却し、そして臭化アリル（１１．３ｍＬ、０．１３１ｍｍｏｌ）を添加した。４．５時間室温で攪拌した後、これを飽和ブライン中に注ぎ、エーテルで抽出し、１０％のＫＯＨ、次いでブラインで有機層を洗浄した。この有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３）により精製し、６５％の収率で油状物（４．９７ｇ、０．０２１４ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．６８（ＣＨＣｌ３）。
【０１８３】
【化５０】
2011098970.tif 000051
【０１８４】
（実施例１０）
この実施例は、２−（４−アリルオキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸アリルエステル（２２）の合成を記載する。
【０１８５】
【化５１】
2011098970.tif 000052
【０１８６】
ＬＨＭＤＳ（９．４７ｍＬ、９．４７ｍｍｏｌ）を、予め−７８℃に冷却した無水ＴＨＦ（１２０ｍＬ）中の２０（２．００ｇ、８．６１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。ベンズアルデヒド（０．８８ｍＬ、８．６１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中に溶解し、そして冷却混合物中に添加した。この反応を、−２０℃にまで暖め、そして一晩攪拌した。翌日、これを飽和塩化アンモニウムでクエンチし、ＥｔＯＡｃで水層を抽出し、有機層と合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１０％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）により精製し、６９％の収率で、化合物２２（２．０１ｇ、５．９４ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．１６（１０％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）。
【０１８７】
【化５２】
2011098970.tif 000053
【０１８８】
（実施例１１）
この実施例は、化合物２−（４−アリルオキシフェニル）−３−フェニルアクリル酸アリルエステル（２４）の合成を記載する。
【０１８９】
【化５３】
2011098970.tif 000054
【０１９０】
０℃に冷却したジクロロメタン（１０ｍＬ）中の２２（１．００ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１．２ｍＬ、８．８７ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、塩化メシル（ＭｓＣｌ）（０．４６ｍＬ、５．９１ｍｍｏｌ）を添加した。この反応を２時間攪拌し、次いで、エーテルで希釈し、セライトのプラグを通して濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製メシラートを、無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）中で希釈し、０℃にまで冷却し、そして１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）（１．３ｍＬ、８．８７ｍｍｏｌ）を添加した。室温にて２時間攪拌した後、１０％  ＨＣｌを添加し、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、およびブラインで洗浄し、次いで有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１５％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）により精製し、収率９５％で１０（０．９０ｇ，２．８１ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．５９（１５％  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）。
【０１９１】
【化５４】
2011098970.tif 000055
【０１９２】
（実施例１２）
この実施例は、２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニルアクリル酸（２６）の合成を記載する。
【０１９３】
【化５５】
2011098970.tif 000056
【０１９４】
ＰｈＳｉＨ３（０．７８ｍＬ、６．２４ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中の２４の溶液に添加し、続いて、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を室温で添加した。この反応を、アルゴン下で１５分間、室温で攪拌した。これを、ｄｄＨ２Ｏを添加することによりクエンチし、１Ｎ
ＨＣｌを添加し、このｐＨを２にまで低下させ、ジクロロメタンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製混合物を、カラムクロマトグラフィー（１：１のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）により精製し、収率７１％で、２６（２６６．９ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．３３（５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）。
【０１９５】
【化５６】
2011098970.tif 000057
【０１９６】
（実施例１３）
この実施例は、Ｅ−Ｎ−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−フェニル−アクリルアミド、およびＺ−Ｎ−［４−（２−ジメチルアミノ−エトキシ）−フェニル］−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−フェニル−アクリルアミド（それぞれ２８および３０）の合成を記載する。
【０１９７】
【化５７】
2011098970.tif 000058
【０１９８】
化合物２８および３０を、化合物２６（２６６ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４６２ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６．８ｍｇ、５５．４μｍｏｌ）、アミン塩酸塩（２６４ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．７７ｍＬ、４．４３ｍｍｏｌ）を用いて、化合物８および９（実施例４）について記載したように合成し、１６％の収率で、所望の生成物（７２ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．２７（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０１９９】
【化５８】
2011098970.tif 000059
【０２００】
（実施例１４）
この実施例は、４−（２−ジメチルアミノエトキシ）ベンゾエート（４２）の合成を記載する。
【０２０１】
【化５９】
2011098970.tif 000060
【０２０２】
ＴＨＦ（８０ｍＬ）中のメチル−４−ヒドロキシベンゾエート３２（３．００ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ジメチルアミノエチル（２．８４ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（３４．７８ｇ、９．８６ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（６５．５ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ）を添加し、そして一晩還流しつつ攪拌した。室温にまで冷却した後、ｄｄＨ２Ｏを添加し、クロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、７９％の収率で１２ａ（３．４７ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．３１（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２０３】
【化６０】
2011098970.tif 000061
【０２０４】
（実施例１５）
この実施例は、４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）ベンゾエート（４４）の合成を記載する。
【０２０５】
【化６１】
2011098970.tif 000062
【０２０６】
メチル−４−ヒドロキシベンゾエート（４．００ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、１−（２−クロロエチル）ピペリジン塩酸塩（４．７６ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１８．１６ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（４３．６ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１００ｍＬ）を用いる、化合物４２（実施例１４）と同一の手順。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（５％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、８０％の収率で、化合物４４（５．５４ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を得た。
【０２０７】
【化６２】
2011098970.tif 000063
【０２０８】
（実施例１６）
この実施例は、４−（２−ジメチルアミノエトキシ）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド（４６）の合成を記載する。
【０２０９】
【化６３】
2011098970.tif 000064
【０２１０】
化合物４４（２．６９ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）および塩酸メチルメトキシアミン（１．８２ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中に懸濁し、そして−２０℃にまで冷却した。塩化イソプロピルマグネシウム（１７．６ｍＬ）を滴下し、その間、温度を−１０℃未満に維持した。この反応を、室温にまで暖め、そして一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウムを添加し、エーテルで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、６７％の収率で、化合物４６（２．０４ｇ、８．０９ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．２６（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２１１】
【化６４】
2011098970.tif 000065
【０２１２】
（実施例１７）
この実施例は、Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）ベンズアミド（４８）の合成を記載する。
【０２１３】
【化６５】
2011098970.tif 000066
【０２１４】
従った手順は、化合物４６に関する手順と同一であり、化合物４４（２．００ｇ、７．６０ｍｍｏｌ）、塩酸メチルメトキシアミン（１．１５ｇ、１１．７７ｍｍｏｌ）、塩化イソプロピルマグネシウム（１１．３６ｍＬ、２．０Ｍ  ＴＨＦ）およびＴＨＦ（８０ｍＬ）を用いた。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、９１％の収率で、化合物４８（２．０１ｇ、６．８８ｍｍｏｌ）を得た。Ｒｆ０．４１（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２１５】
【化６６】
2011098970.tif 000067
【０２１６】
（実施例１８）
この実施例は、２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）−１−［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）−フェニル］−３−フェニルペンタ−２−エン−１−オン（５０）の合成を記載する。
【０２１７】
【化６７】
2011098970.tif 000068
【０２１８】
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の臭化ビニル２（２００ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃にまで冷却し、そしてｔ−ブチルリチウム（０．６９ｍＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加した。４５分間の攪拌後、化合物４６（１４０ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）を添加し、そして−７８℃から室温まで、３時間にわたって攪拌した。この反応を、飽和塩化アンモニウムでクエンチし、クロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして減圧下で濃縮した。この粗製混合物を、カラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、１０％の収率で、化合物５０（２２ｍｇ、０．０４６６ｍｍｏｌ）を異性体の混合物として得た。Ｒｆ０．４９（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２１９】
【化６８】
2011098970.tif 000069
【０２２０】
（実施例１９）
この実施例は、２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）−３−フェニル−１−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）−フェニル］ペンタ−２−エン−１−オン（５２）の合成を記載する。
【０２２１】
【化６９】
2011098970.tif 000070
【０２２２】
化合物５０を調製するために使用される手順に従い、臭化ビニル（２００ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）、ｔ−ブチルリチウム（０．６５ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）および化合物４８（１６３ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）を使用した。この粗製化合物を、カラムクロマトグラフィー（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製し、１０％の収率で、化合物５２を異性体混合物として得た。Ｒｆ０．４４（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２２３】
【化７０】
2011098970.tif 000071
【０２２４】
（実施例２０）
この実施例は、１−［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）−フェニル］−２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニルペンタ−２−エン−１−オン（５４）の合成を記載する。
【０２２５】
【化７１】
2011098970.tif 000072
【０２２６】
５０の脱保護について、８および９（実施例４）を調製するために使用したのと同一の手順を使用した。以下の量の試薬を使用した：５０（２２ｍｇ、０．０４６４ｍｍｏｌ）、トリフルオロエタノール（０．３４ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（０．６６ｍＬ）、およびジクロロメタン（０．６６ｍＬ）。この粗製生成物を、分取ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）を用いて精製し、収率５８％で、５４を異性体の混合物（１１ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）として得た。Ｒｆ０．２６（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２２７】
【化７２】
2011098970.tif 000073
【０２２８】
（実施例２１）
この実施例は、２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−３−フェニル−１−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−ペンタ−２−エン−１−オン（５６）の合成を記載する。
【０２２９】
【化７３】
2011098970.tif 000074
【０２３０】
５２の脱保護に関して、８および９（実施例４）を調製するために使用したのと同一の手順を使用した。以下の試薬の量を使用した：５２（２８ｍｇ、０．０５４７ｍｍｏｌ）、トリフルオロエタノール（０．４０ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（０．７８ｍＬ）、およびジクロロメタン（０．７８ｍＬ）。粗製生成物を、分取ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）を用いて精製し、収率５４％で、５６を異性体の混合物（１３ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）として得た。Ｒｆ０．１１（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）。
【０２３１】
【化７４】
2011098970.tif 000075
【０２３２】
（実施例２２）
この実施例は、以前にまだ同定されていない膜結合エストロゲンレセプターの同定および特性決定、ならびにＳＥＲＭの同定および評価のためのアッセイを記載する。
【０２３３】
（ＳＥＲＭのアッセイおよびスクリーニングのための一般的な方法）
雌性Ｔｏｐｅｋａモルモット（４００ｇ〜６００ｇ）（これらは、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの飼育施設で飼育された）および雌性の多彩なモルモット（４００ｇ〜５００ｇ、Ｅｌｍ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を使用した。このモルモットを、一定の温度（２６℃）および光の下に維持した（０６：３０〜２０：３０の間）。動物を個々に収容し、食物と水を無制限に提供した。実験の５日〜７日前に、ケタミン／キシラジン（それぞれ、３３ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇ；皮下）の麻酔薬の下でこの動物から卵巣を摘出し、そしてゴマ油のビヒクル（０．１ｍＬ、皮下）を実験の２４時間前に上記動物に与えた。血清エストロゲン濃度を、実験日に収集した体幹血液からラジオイムノアッセイにより決定し（Ｗａｇｎｅｒら、２００１）、そして血清エストロゲン濃度は、１０ｐｇ／ｍＬ未満であった。さらなる群の動物（ｎ＝６）を卵巣摘出し、そして１週間後に、屠殺の２４時間前に、油状物のビヒクル、安息香酸エストラジオール（油状物中に２５μｇ）または化合物８（実施例４、油状物中に２５μｇ）を注射した。
【０２３４】
これらの研究において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。すべての動物を、制御温度（２５℃）下で維持し、そして光周期の条件（１４時間の明期、１０時間の暗期；明期は、０７００〜２１００）で維持し、食物および水を無制限に提供した。成熟マウスを、イソフルラン麻酔の下で卵巣摘出し、そして１週間回復させた。この時点で、この動物に、２日間、油状物ビヒクル、安息香酸エストラジオール（ＥＢ；１μｇ）または化合物８（２μｇもしくは５μｇ）を注射し、麻酔をかけ、そして２４時間後に、断頭により殺した。後の組織学的分析のために、子宮を収集し、秤量し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した（データは示さず）。
【０２３５】
（市販薬物：）
薬物は、他に明記しなければ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。テトロドトキシン（ＴＴＸ；Ａｌｏｍｏｎｅ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、そして０．１％の酢酸でさらに希釈した（最終濃度１ｍＭ；ｐＨ４−５）。１７β−エストラジオール（１７β−エストラジオール）を、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ（Ｗｉｌｔｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）より購入し、再結晶して純度を確保し、そして１００％エタノール中に溶解して、ストックの濃度を１ｍＭにした。１７α−エストラジオール（１ｍＭ、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ）、抗エストロゲン：ＩＣＩ  １８２，７８０（１０ｍＭ，Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ）、および選択的エストロゲンレセプターモジュレーターである４−ＯＨ−タモキシフェン（１０ｍＭ、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ）、ラロキシフェン（１０ｍＭ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）ならびに化合物８（１０ｍＭ）をまた、１００％のエタノール中に溶解した。１７β−エストラジオール、１７−ヘミコハク酸：ＢＳＡ（１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１ｍＭ、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ）をＨ２Ｏ中に溶解した。プロテインキナーゼＡのインヒビター、Ｈ−８９二塩酸塩（１０ｍＭ）、プロテインキナーゼＡの活性化剤であるフォルスコリン（５０ｍＭ）、プロテインキナーゼＣのインヒビターである塩酸ビスインドリルマレイミドＩ（ＢＩＳ、１００μＭ）、Ｇｏｕ６９７６（２ｍＭ）、およびロッテリン（ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ）（１０ｍＭ）、ホスホリパーゼＣインヒビターであるＵ７３１２２（２０ｍＭ）、より活性の低いアナログＵ７３３４３（２０ｍＭ）およびＭＥＫ１インヒビターであるＰＤ９８０５９（５０ｍＭ）を、ＤＭＳＯ中に溶解した。プロテインキナーゼＡ抑制性ペプチドである６−２２  Ａｍｉｄｅ（１ｍＭ）、プロテインキナーゼＡインヒビター：Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ（５０ｍＭ）、およびコレラトキシンＡサブユニット（１μｇ／μＬ）を、Ｈ２Ｏ中に溶解した。ＧｑのαサブユニットのＣ末端を模倣するように設計されたＧｑ結合タンパク質、およびＧｓのαサブユニットのＣ末端を模倣するように設計されたＧｓのα結合タンパク質を、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）により合成した。Ｇｑペプチドのペプチド配列は、Ａｃ−ＬＧＬＮＬＫＥＹＮＬＶ−ＯＨであり、そしてＧｓペプチドのペプチド配列は、ＣＲＭＨＬＲＱＹＥＬＬであった。このペプチドはまた、Ｈ２Ｏ中に溶解した。ＢＡＰＴＡテトラナトリウム塩（１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）を、１０ｍＭの濃度にて、内液（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に溶解した。ストック溶液のアリコートを、必要とされるまで十分貯蔵した。
【０２３６】
（統計学的分析：）
一元分散分析（およびｐｏｓｔ  ｈｏｃ（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）対分析（ｐａｉｒｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ））を用いて、群間の比較のための統計的分析を行った。誤差の可能性が５％未満である場合、偏差を統計上有意であるとみなした。
【０２３７】
（組織の調製：）
実験日に、この動物を断頭し、この動物の脳を頭蓋から除去し、そして視床下部を解剖した。得られた視床下部のブロックを、プラスチックの切断プラットフォーム上に載せ、次いで、このプラスチックの切断プラットフォームを、氷冷し、酸素付加（９５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２）した人工脳脊髄液（ａＣＳＦ、ｍＭ単位：ＮａＣｌ、１２４；ＮａＨＣＯ３  ２６；デキストロース、１０；ＨＥＰＥＳ、１０；ＫＣｌ，５；ＮａＨ２ＰＯ４、２．６；ＭｇＳＯ４、２；ＣａＣｌ２，１）で十分に満たしたビブラトーム中に固定した。弓状物を通して、冠状の切片（３５０μｍ）４枚に切り取った。このスライスを、酸素付加したａＣＳＦを含有するマルチウェル補助的チャンバーに移し、そして約２時間後の電気生理学的記録まで、そこに維持した。
【０２３８】
（電気生理学：）
電圧クランプにおける細胞全体パッチ記録を、以前に記載されたように遂行した（Ｗａｇｎｅｒら、２００１）。手短に言えば、スライスを、暖め（３５℃）、酸素付加したａＣＳＦで灌流されたチャンバー中に維持し、この酸素付加したａＣＳＦは、同一の成分および各々の濃度（ＣａＣｌ２を除く。ＣａＣｌ２の濃度は、２ｍＭまで上昇した）を含有した。人工的なＣＳＦ（ａＣＳＦ）およびあらゆる薬物溶液を、１．５ｍＬ／分の速度で蠕動ポンプを介して灌流した。ａＣＳＦを含む十分なストック溶液で希釈することにより、薬物溶液を２０ｍＬのシリンジ中に調製し、そしてこの流れを、三方コックを介して制御した。
【０２３９】
細胞全体の記録のために、電極をホウケイ酸ガラスから組み立てた（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ；１．５ｍｍ  Ｏ．Ｄ．）。次いで、組み立てた電極を、内液（０．５％のビオシチンを含有し、以下（ｍＭ単位）：Ｋ＋、グルコン酸、１２８；ＮａＣｌ、１０；ＭｇＣｌ２、１；ＥＧＴＡ、１１；ＨＥＰＥＳ、１０；ＡＴＰ、１．２；ＧＴＰ、０．４からなり；ｐＨを、１ＮのＫＯＨで７．３−７．４に調節し；２７２〜３１５ｍＯｓｍ）で満たした。Ａｘｏｐａｔｃｈ  １Ｄ前置増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、電圧のパルスを増幅し、そして電極を通過させた。生じた電流の偏位を、デジタルオシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  ２２３０、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いてモニタリングした。電流の偏位（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）の減少の際に、ポリエチレンチューブにより電極に接続された５ｍＬのシリンジを介して陰圧を付与し、シール（＞１ＧΩ）を形成した。シールの形成に続いて、吸入、これに続いて、少なくとも４分間〜６分間の、１μＭ  ＴＴＸの灌流により、細胞内アクセスを達成し、自発発火（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｆｉｒｉｎｇ）およびシナプス性電位をブロックし、その後、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニストであるバクロフェンを適用した（図１）。バクロフェンに対するすべての応答を、外向き電流（Ｖ保持＝−６０ｍＶ）として電位クランプ中で測定し、そして記録中ずっとアクセス抵抗が１０％未満の変化を示した細胞（アクセス抵抗は、２０ＭΩ〜３０ＭΩの範囲であった）のみを本研究に包含した。膜電流は、ｐＣｌａｍｐ７．０（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に結合されたＤｉｇｉｄａｔａ  １２００インターフェースを介してアナログ−デジタル転換を経た。この電流の低パスフィルタリングを、２ＫＨｚの周波数で行った。液間の電位は、−１０ｍＶであり、そして後のデータ分析のために較正した。
【０２４０】
（視床下部弓状ニューロンのＰｏｓｔ−ｈｏｃ同定：）
電気的生理学的記録に続いて、このスライスを、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓリン酸化緩衝液（ｐＨ７．４）中で１２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓリン酸化緩衝液に溶解した２０％のスクロース中で一晩液浸し、次いで、Ｏ．Ｃ．Ｔ．包埋媒質中で凍結し、そして免疫細胞学に関して、前に記載されたように調製した（ＫｅｌｌｙおよびＲｏｎｎｅｋｌｅｉｖ、１９９４）。手短に言えば、冠状断面（２０μｍ）を低温槽上で刻み（Ｌｅｉｔｚ  Ｍｏｄｅｌ  １７２０Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｒｙｏｓｔａｔ）、そしてＦｉｓｈｅｒ  ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライドの上に載せた。断面を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で５分間洗浄し、次いで、ストレプトアビジン−Ｃｙ２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）（１：１０００）を２時間適用した。この反応を、緩衝液で洗浄することにより終了した。このスライスをＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８００蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、注射ニューロンについてスキャンした。ビオシチンで満たしたニューロンの位置確認の後、適切な断片を含むスライドを、蛍光免疫組織化学を用いて、以前に記載のようにチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）またはβ−エンドルフィンの存在について調査分析した（ＫｅｌｌｙおよびＲｏｎｎｅｋｌｅｉｖ、１９９４）。手短に言えば、ビオシチン同定ニューロン有する断面を、モノクローナルＴＨ抗体（１：１０，０００）（Ｄｉａｓｏｒｉｎ，Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，ＭＮ）またはポリクローナルβ−エンドルフィン抗体（１：５，０００）（Ｄａｖｅら、１９８５）と一緒に一晩インキュベートし、０．１Ｍのリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、それぞれヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３（１：５００）またはロバ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（１：５００）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ）とともにインキュベートした。断面を、リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、そして５％のＮ−プロピル没食子酸塩を含有するグリセロールグリシン緩衝液を使用して、カバーガラスをつけた。免疫染色した細胞を、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡を用いて撮影した。図２を参照のこと。
【０２４１】
（エストロゲンレセプター結合アッセイ：）
エストロゲンレセプター（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）βに対する化合物の相対的な結合親和性を、市販された全長形態の（ＥＲ）αおよび（ＥＲ）β（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）の両方と一緒に、スピンカラムアッセイを用いて決定した。溶液の最終濃度が１５ｎＭになるようにレセプターを４℃で添加した（この溶液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１０％  グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡならびに３ｎＭ［２，４，６，７，１６，１７−３Ｈ］エストラジオールを含有した）。この溶液の１００μＬを、エタノール中のリガンド（１μＬ）に添加し、ピペッティングにより穏やかに混和し、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、この混合物を、Ｇ−２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．）を含有するミクロスピンカラムへと適用し、このカラムを、製造業者の指示に従って、結合緩衝液（トリチウム化したエストラジオールは含まず）で平衡化した。結合されたエストラジオールを、２０００×ｇで４分間、室温でスピンすることにより、遊離リガンドから単離した。次いで、この濾液を、２．５ｍＬのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）に添加し、そして液体シンチレーションカウンターで計測した。結合曲線を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）統計分析ソフトウェアパックを用いた単結合部位競合モデルとフィットさせた。ＥＣ５０値から、標準偏差を、０．２ｌｏｇ単位未満であると決定した。次いで、相対的な結合親和性の百分率を、未標識のエストラジオールに対して決定されたＩＣ５０を、リガンドのＩＣ５０で除し、そして１００を乗じることにより、決定した。
【０２４２】
（分散した単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ：）
モルモットの３５０μｍの冠状視床下部スライスを、尾から吻にまで、ビブラトーム上で刻み、酸素付加したａＣＳＦを含有する補助的チャンバー中に置いた。このスライスを、分散の前にチャンバー中で１時間〜２時間回復させた。視床下部の弓状核を、顕微解剖し、そして２−３ｍＬのＨａｎｋ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ（ｍＭ単位）；１ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＸＩＶを含有するＤＥＰＣ−処理した水（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中の、ＣａＣｌ２、１．２６；ＭｇＳＯ４、１；ＫＣｌ，５．３７；ＫＨ２ＰＯ４、０．４４；ＮａＣｌ、１３６．８９；Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３４；Ｄ−グルコース、５．５５；Ｈｅｐｅｓ，１５）２−３ｍＬ中で、約１５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、この組織を１容積の低カルシウムａＣＳＦで４回洗浄し、そしてＨＢＳＳで２回洗浄した。この細胞を、火であぶって清潔にした（ｆｌａｍｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）パスツールピペットを用いたすりつぶし（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）により単離し、ディッシュ上に分散し、そして連続的にＨＢＳＳで１．５ｍＬ／ｎの速度で灌流した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡を用いて可視化し、そして個々のニューロンをパッチし、そして陰圧を付与することによりパッチピペット中に収集した。このピペットの中身を、シリコン化微小遠心用チューブへと発射し、このシリコン化微小遠心用チューブは、５μＬの以下の溶液：０．５μＬの１０×緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１５Ｕ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μＬ  １００ｍＭ  ＤＴＴおよびＤＥＰＣ−処置水を含有した。
【０２４３】
さらに、視床下部の組織を、ホモジェナイズし、そして全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出した。収集した細胞溶液および２５ｎｇの視床下部全ＲＮＡ（１μＬ）を、５分間６５℃で変性させ、５分間氷上で冷却し、次いで、５０Ｕ  ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、１．５μＬの１０×緩衝液、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２μＬのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１５ＵのＲＮａｓｉｎ、１０ｍＭのＤＴＴ、１００ｎｇのランダムヘキサマーおよびＤＥＰＣ処理水を最終容積が２０μＬになるように添加することにより、一本鎖ｃＤＮＡを細胞のＲＮＡから合成した。ネガティブなコントロールとして使用される細胞のＲＮＡおよび組織のＲＮＡを、上記のように処理したが、逆転写酵素はなしにした。この反応混合物を、４２℃で６０分間インキュベートし、９９℃で５分間変性させ、そして氷上で５分間冷却した。
【０２４４】
ＰＣＲを、各ＲＴ反応からのｃＤＮＡテンプレート（３μＬ）を用いて、ＰＣＲ反応容積を３０μＬにして実行し、このＰＣＲ反応容積（３０μＬ）は、３μＬの１０×緩衝液、２．４μＬのＭｇＣｌ２（ＴＨ、ＰＯＭＣ、ＧＡＢＡＢ−Ｒ２、ＰＫＣδ、アデニリルシクラーゼＶＩＩおよびＧＡＰＤＨのために、最終濃度２ｍＭ）、または３．６μＬのＭｇＣｌ２（ＧＡＤのために最終濃度３ｍＭ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．２μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ならびに０．２２μｇのＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙを合わせ、室温で５分間インキュベートし、反応内容物の残りをチューブに添加し、そして９４℃で２分間インキュベートした。次いで、各反応を、６０サイクル（ＧＡＰＤＨに関しては、３５サイクル）の増幅を、以下のプロトコール：９４℃、４５秒；５５℃（ＧＡＤ）、５７℃（ＰＫＣδ）、５８℃（ＧＡＢＡＢ−Ｒ２）、６０℃（ＴＨおよびアデニリルシクラーゼＶＩＩ）、６１℃（ＰＯＭＣ）、６３℃（ＧＡＰＤＨ）４５秒；７２℃、１分１０秒；最終７２℃で５分間伸張、に従って行った。１０マイクロリットルのＰＣＲ生成物を、エチジウムブロマイドを用いて、１．５％のアガロースゲル上で可視化した。
【０２４５】
プライマーはすべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により合成し、以下の通りであった；モルモットＧＡＤ６５；２０７ｂｐ生成物、フォワードプライマー
【０２４６】
【化７５】
2011098970.tif 000076
【０２４７】
リバースプライマー
【０２４８】
【化７６】
2011098970.tif 000077
【０２４９】
モルモットＴＨ；２２３ｂｐの生成物、フォワードプライマー
【０２５０】
【化７７】
2011098970.tif 000078
【０２５１】
リバースプライマー
【０２５２】
【化７８】
2011098970.tif 000079
【０２５３】
モルモットＧＡＢＡＢ−Ｒ２；２４１ｂｐの生成物、フォワードプライマー
【０２５４】
【化７９】
2011098970.tif 000080
【０２５５】
リバースプライマー
【０２５６】
【化８０】
2011098970.tif 000081
【０２５７】
モルモットＰＯＭＣ（登録番号Ｓ７８２６０）；３４４ｂｐの生成物、フォワードプライマー（塩基４０〜塩基６０）
【０２５８】
【化８１】
2011098970.tif 000082
【０２５９】
リバースプライマー（塩基３８３〜塩基３６３）
【０２６０】
【化８２】
2011098970.tif 000083
【０２６１】
モルモットＧＡＰＤＨ；２１２ｂｐの生成物（登録番号ＣＰＵ５１５７２）、フォワードプライマー
【０２６２】
【化８３】
2011098970.tif 000084
【０２６３】
リバースプライマー
【０２６４】
【化８４】
2011098970.tif 000085
【０２６５】
。ヒトのプロテインキナーゼＣδ；２５１ｂｐの生成物（登録番号Ｌ０７８６１）フォワードプライマー（塩基１１２７〜塩基１１４７）
【０２６６】
【化８５】
2011098970.tif 000086
【０２６７】
リバースプライマー（塩基１３７７〜塩基１３５７）
【０２６８】
【化８６】
2011098970.tif 000087
【０２６９】
。モルモットのアデニリルシクラーゼＶＩＩ；２３５ｂｐの生成物、フォワードプライマー
【０２７０】
【化８７】
2011098970.tif 000088
【０２７１】
リバースプライマー
【０２７２】
【化８８】
2011098970.tif 000089
【０２７３】
。
【０２７４】
（１７β−エストラジオールおよびＳＥＲＭは、視床下部ドパミンニューロンおよびプロ−オピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ニューロンにおいて、迅速にＧＡＢＡＢ応答を減衰する）
以下のデータは、１７β−エストラジオールおよびＳＥＲＭが、視床下部ニューロンにおいて、迅速にバクロフェン誘導型ＧＡＢＡＢ応答を減衰することを示し、これは、これらの化合物が、非転写性の事象を通して神経伝達に影響することを示す。細胞全体の記録を、卵巣摘出された雌性モルモットの弓状ニューロン（ｎ＝１９５）について作成した。図１は、細胞全体パッチ、電圧クランプ研究（Ｖ保持＝−６０Ｖ）における、薬物投与のプロトコールを例示するための図である。シールが形成され、そして細胞全体の立体配置が得られた後、スライスをＴＴＸ（１μＭ）で５分間灌流した。第１のＧＡＢＡＢレセプター媒介性応答を、（ＥＣ５０濃度５０μＭにて）ＧＡＢＡＢアゴニストのバクロフェンを灌流することにより生成し、ついに、安定状態の外向き電流を得た（第１の応答、Ｒ１）。バクロフェンの洗浄の後、この電流は、薬物投与前の静止レベルにまで回帰した。次いで、この細胞を、１７β−エストラジオールおよび／または他の薬物で１５分間処理し、そしてバクロフェン（５μＭ）で再度灌流し、そして第２の応答（Ｒ２）を測定した。１７β−エストラジオールおよび／または他の薬物のバクロフェン応答に対する効果を、Ｒ２／Ｒ１のパーセントとして表現する。これらのニューロンのサブグループ（ｎ＝５５）を、二重標識免疫細胞学を用いて同定した（データおよび画像は示さず）。これで、上記細胞の４１％がＴＨ−ポジティブ（すなわち、ドパミンニューロン）であり、そして３９％がβ−エンドルフィン−ポジティブ（すなわち、ＰＯＭＣニューロン）であることがわかった。さらに、ＧＡＤ６５の、二重免疫細胞学的染色およびインサイチュのハイブリダイゼーションに基づき、弓状ドパミンニューロンのサブグループは、ＧＡＢＡを共発現し（Ｒｏｎｎｅｋｌｅｉｖ、未公開の知見）、これは、ｓｃＲＴ−ＰＣＲのデータ（以下を参照）により立証した。電気生理学的分析のために、ＧΩのシールまたはよりよいシールを有する細胞のみをこの研究に含めた。平均的な静止膜電位が、０ｐＡの保持電流で、−５４．３±０．４ｍＶであり、そして平均的な入力抵抗は、１．９±０．３ＧΩであった。さらに、Ａ１２ドパミンニューロンの５０％は、Ｔ型のＣａ２＋電流および過分極活性化された、カチオン電流（Ｉｈ）（Ｌｏｏｓｅら、１９９０）を示した。ＰＯＭＣニューロンの７１％が、Ｉｈおよび一時的な外向きＫ＋電流（ＩＡ）（Ｋｅｌｌｙら、１９９０）を示した。従って、細胞全体のパッチの記録を用いて測定される受動的な膜の特性は、単一の電極電位クランプ記録を用いて得られる結果に類似する（Ｌｏｏｓｅら、１９９０；Ｋｅｌｌｙら、１９９０）。
【０２７５】
細胞全体の記録方法を使用して、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニストのバクロフェンによる、１７β−エストラジオールのＧタンパク質共役型内向き整流性Ｋ＋チャネル（ＧＩＲＫ）のコンダクタンスの活性化に対する迅速な効果を測定した。１７β−エストラジオールは、視床下部の弓状ニューロンにおいて、オピオイドレセプター媒介性の応答およびＧＡＢＡＢレセプター媒介性の応答の両方を迅速に減衰する（Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９９４；Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９９６；Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９９７）。従って、ＧＡＢＡＢ応答の１７β−エストラジオールのモジュレーションを測定するために、図１に記載のプロトコールに従って、バクロフェンのＥＣ５０濃度（５μＭ）を用いた。強固な外向き電流を、バクロフェンに対する応答（これは、洗い流し後に弱まる）において測定した（図５のグラフＡおよび図６）。バクロフェンの適用により、２０分後に、同一の強固な応答が生起し、これは、脱感作およびランダウンが５μＭのバクロフェンの連続的な適用に応答して生じないことを示した。しかし、１７β−エストラジオール（１００ｎＭ）を、暫定期間の間に（すなわち、第１のバクロフェンの適用の洗い流し後）適用した場合、バクロフェンの第２の適用に対する応答の、４１％の有意な減少があった（ｐ＜０．００５）（図５のグラフＢおよび図６）。１００ｎＭの１７β−エストラジオールの適用の前またはその間に生じた電流／電圧の関係は、このステロイドが、バクロフェン媒介性の応答についての逆の電位を変化させないことを示した：コントロールＥバクロフェン＝−８８．８±３．６ｍＶ、ｎ＝１３；これに対し、１００ｎＭの１７β−エストラジオールの適用の後のＥバクロフェン＝−８５．４±３．９ｍＶ、ｎ＝１２（図３Ａおよび図３Ｂ）。１７β−エストラジオールの作用は、立体特異的であったので、その結果、生物学的に不活性な立体異性体である１７β−エストラジオール（１００ｎＭ）は、バクロフェンの応答にまったく効果がなかった（図５のグラフＣおよび図６）。さらに、１７β−エストラジオールとともに灌流した場合、１７β−エストラジオールの作用を、抗エストロゲンＩＣＩ１８２，７８０によりブロックした（図６）。ＩＣＩ１８２，７８０のみを用いた処置では、バクロフェン応答にまったく効果がなかった（データは示さず）。
【０２７６】
この以前に同定されていなかったエストロゲンレセプターを、膜不透過性エストロゲン結合体である１７β−エストラジオール−ＢＳＡを用いることにより、膜結合していると決定した。１７β−エストラジオール−ＢＳＡ（１００ｎＭ）は、バクロフェン応答を阻害するのに十分に有効であって、これは、このエストロゲンレセプター媒介性の応答が原形質膜で開始されることを示唆する（図５のグラフＤおよび図６）。１７β−エストラジオール−ＢＳＡの調製の完全性を、このスライスの灌流液の１７β−エストラジオールのラジオイムノアッセイを行うことにより、立証した。未結合の１７β−エストラジオールは、この媒体中には検出されず（データは示さず）、これは、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ結合体が、遊離１７β−エストラジオール不純物を含まないことを示唆した。
【０２７７】
以前に同定されていない、膜結合エストロゲンレセプターを、いくつかのＳＥＲＭを用いることにより特徴付けた。タモキシフェン（１μＭ）は、不活性（コントロールとの比較においてｐ＞０．０５）であり、そしてＧＩＲＫのバクロフェン活性化の際に１７β−エストラジオールの効果を減衰しなかった（１７β−エストラジオールについてのＲ２／Ｒ１：５８．６±３．４％、ｎ＝１０；それに対して、タモキシフェン＋１７β−エストラジオール：６０．４±６．６％、ｎ＝５）。しかし、４−ＯＨタモキシフェン（１μＭ）は、バクロフェン応答を２５％だけブロックすることにより、１７β−エストラジオールの作用を部分的に模倣した（図６）。図６に関して、１７β−エストラジオール（１００ｎＭ）は、ＧＡＢＡＢレセプター媒介性外向き電流を４１％だけ減衰した。１７β−エストラジオールのバクロフェン応答に対する阻害的作用を、エストロゲンレセプターアンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０（１μＭ）によりブロックした。ウシ血清アルブミンに結合したエストロゲン（１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１００ｎＭ）、４−ＯＨタモキシフェン（１μＭ）、ラロキシフェン（１μＭ）、ＧＷ５６３８（１μＭ）および化合物８（１０ｎＭ）はまた、バクロフェン応答を阻害したが、１７α−エストラジオール（１μＭ）は、効果なしであった。バーは、群ごとに試験された４個〜１１個の細胞の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す（＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、これに対して、ビヒクル−コントロール群）。４−ＯＨタモキシフェンは、常にオレフィン異性体のＥ／Ｚ混合物として存在するので（Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎら、１９８５）、これらの異性体のうち一方のみが、この新規のエストロゲン応答を媒介するのに活性であり得る。ラロキシフェン（１μＭ）（ヒドロキシル化された芳香族環を有する別のＳＥＲＭ）は、バクロフェン応答を抑制する効力という観点で完全に１７β−エストラジオールの作用を模倣した（図６）。これに対して、ヒドロキシル化されていないＳＥＲＭであるＧＷ−５６３８（これは、構造的にタモキシフェンのトリフェニルエチレンのコア部分に類似する）は、バクロフェンによるＧＩＲＫチャンネルの活性化を阻害するのに１７β−エストラジオールよりも有意に効力があることを見出した（図６）。
【０２７８】
（化合物８は、迅速な応答を選択的に減衰させる核内ＥＲ活性を欠くＳＥＲＭである：）
上に言及される化合物のすべては、核内エストロゲンレセプターに対して、親和性の高いリガンドであり、これは、観察上の薬理学（ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）の解釈を複雑にし、核内エストロゲンレセプターについての役割をはっきりと排除することを困難にする。しかし、化合物８（実施例４）は、核内エストロゲンレセプター（ＥＲ）αまたはＥＲβについての結合親和性が、１７β−エストラジオールのそれに比して約１００万分の１に低下している（表１）。さらに、４−ＯＨタモキシフェンとは異なり、化合物８は、幾何的に（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）安定であり、そしてＥ／Ｚオレフィン異性体の混合物としては存在しない。さらに、化合物８は、１７β−エストラジオールの用量の５倍でも、対子宮作用がまったくなく（図６Ａおよび図６Ｂ）、８が、核内エストロゲンレセプターにより媒介される４−ＯＨタモキシフェン様エストロゲン活性を有さないことをインビボで確証づける。しかし、細胞全体の電気生理学的アッセイにおいて、１０ｎＭの８は、１００ｎＭの１７β−エストラジオールと同程度に、上記ＧＡＢＡＢ応答を減衰させるのに有効であった（図６）。
【０２７９】
【表１】
2011098970.tif 000090
【０２８０】
（１７β−エストラジオールのＧＡＢＡＢ応答に対する迅速な作用は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を必要とする：）
１７β−エストラジオール媒介性の、ＧＡＢＡＢの調節において、特定のシグナル伝達タンパク質の関与することを、異なる経路をブロックすることにより決定した。例えば、ＰＫＡ経路の活性化が必要とされるならば、１７β−エストラジオールのＧＡＢＡＢ応答に対する効果は、ＰＫＡの阻害によりブロックされるべきであり、ＰＫＡの刺激により模倣されるべきである。従って、選択的なＰＫＡインヒビターおよび選択的なＰＫＡ活性化剤を、ＰＫＡが関与していることを示すために使用した。例えば、図８のグラフＡおよび図９に示されるように、フォルスコリン（１０μＭ）は、１７β−エストラジオールの作用を模倣し、ＧＡＢＡＢの応答を減衰し得る。他方で、特定のＰＫＡインヒビターＨ８９（１０μＭ）は、１７β−エストラジオールが誘導する、ＧＡＢＡＢ応答の抑制をブロックした（図８のグラフＢおよび図９）。
【０２８１】
ＧＡＢＡＢ応答の１７β−エストラジオールのモジュレーションにおけるＰＫＡの関与を、ニューロン上でのＰＫＡの活性化をブロックする特定のＰＫＡ阻害性ペプチドＰＫＩ（プロテインキナーゼＡインヒビターである、６−２２アミド、２０μＭ）または加水分解不可能なｃＡＭＰアナログであるＲｐ−ｃＡＭＰ（２００μＭ）の作用によりさらに確証づけた。ＰＫＩまたはＲｐ−ｃＡＭＰを用いた透析の約１５分後に、１７β−エストラジオール誘導型のＧＡＢＡＢ応答の低減が台無しになった（図８のグラフＣおよび図９）。ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅにより分泌される細菌体外毒素であるコレラトキシン（ＣＴＸ）は、Ｇタンパク質ＧｓをＡＤＰ−リボシル化し、これにより明らかに不可逆的な様式でアデニリルシクラーゼの活性を刺激化することにより、種々の組織中での細胞内ｃＡＭＰレベルを高める。ＣＴＸの活性ユニットを用いた、個々の細胞への細胞内透析は、ＧＡＢＡＢ応答のエストロゲンによる迅速な阻害を遮断した（図８のグラフＤおよび図９）。これらの結果は、ＧＡＢＡＢ応答の１７β−エストラジオールによる抑制が、ＰＫＡの活性化を必要とすることを示唆する。図９は、試験されたＰＫＡ薬物の効果の概要を述べている。このＰＫＡ活性化剤のフォルスコリンは、１７β−エストラジオールの効果を模倣し得、特定のＰＫＡインヒビターである、Ｈ８９（１０μＭ）、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳおよびＰＫＡＩは、この作用をブロックし得る。ＣＴＸ−Ａは、１７β−エストラジオールによるバクロフェン応答の減衰を遮断し得るが、変性したＣＴＸ−Ａは、遮断し得ない。バーは、群ごとに試験された４個〜１１個の細胞の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す（＊＊＊ｐ＜０．００５、＊および＃ｐ＜０．０５、これに対し、ビヒクルのコントロール；ＣＴＸ−Ａ＋１７β−エストラジオール対変性したＣＴＸ−Ａ＋１７β−エストラジオール、ｐ＜０．０５）。
【０２８２】
（ＧＡＢＡＢ応答の減衰は、プロテインキナーゼＣδ（ＰＫＣδ）を必要とする：）
数個の選択的ＰＫＣインヒビターの効果により示されるように、ＰＫＣはまた、１７β−エストラジオールの、ＧＡＢＡＢ応答のモジュレーションに関与している。第１のインヒビター、ビスインドールマレイミド（ＢＩＳ）は、従来の形態のＰＫＣと、新規の形態のＰＫＣと、異常な形態のＰＫＣとの区別をしない、ＰＫＣの選択的インヒビターである。第２に、Ｇｏｕ６９７６は、従来のＰＫＣ異性体の選択的なインヒビターである（Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎら、１９９３；Ｗａｙら、２０００）。ＢＩＳを用いたニューロンの処置により、１７β−エストラジオールの効果がほぼ排除された（図１０のグラフＡおよび図１１）。対照的に、Ｇｏｕ６９７６の処置は、効果なしであった（図１１）。実際に、細胞内ＥＧＴＡを１０ｍＭの１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）（ＥＧＴＡと類似のＣａ２＋親和性を有するが速度がずっと速いカルシウム緩衝液）で置き換えた後でも、ＧＡＢＡＢ応答のエストロゲン阻害がさらに観察された（図１０のグラフＢおよび図１１）。ＰＫＣの従来の異性体は、このレベルのカルシウム緩衝液を用いれば、活性である可能性が低いので、これらの結果は、エストロゲンの作用を媒介する際の、Ｃａ２＋非依存性の新規のＰＫＣ異性体の役割をさらに支持する。最終的に、選択的ＰＫＣδインヒビターであるロッテリン（５μＭ）は、１７β−エストラジオールの、視床下部のニューロンにおいてＧＡＢＡＢ応答を阻害する能力を完全にブロックした（図１０、グラフＣおよび図１１）。図１１は、試験されたＰＫＣインヒビターの効果の概要を述べている。バーは、群ごとに試験された４個〜１１個の細胞の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す（＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、これに対して、ビヒクル−コントロール群）。
【０２８３】
（１７β−エストラジオールによるＧＡＢＡＢ応答の阻害は、Ｇαｑを必要とする：）
さらなる結果は、１７β−エストラジオールによるバクロフェン誘導型ＧＡＢＡＢ応答の阻害がメッセンジャータンパク質Ｇαｑを必要とすることを示している。特定のＰＫＣインヒビターであるＢＩＳは、１７β−エストラジオールの作用をブロックするが、フォルスコリン（１０μＭ）は、ＢＩＳ遮断の存在下でエストロゲンの効果を模倣することを見出した（図１０のグラフＤおよび図１１）。従って、ＰＫＣの作用は、ＰＫＡの活性の上流である。実際に、ＧＡＢＡＢ応答のエストロゲンレセプター媒介性阻害は、ＧαｑのＣ末端結合部位を模倣するペプチド（１１アミノ酸）で弓状ニューロンを処置することにより示されるように、Ｇαｑの活性化に依存する（Ａｋｈｔｅｒら、１９９８）。このペプチドは、Ｇタンパク質共役型レセプターとＧαｑタンパク質との相互作用をブロックする。このペプチド（２００μＭ）で透析した細胞（図１２のグラフＡおよび図１３）では、上記１７β−エストラジオール媒介性のＧＡＢＡＢ応答の低減が、ＧαｓのＣ末端ドメインを模倣するコントロールのペプチド（１１アミノ酸）で透析された細胞（図１２のグラフＢおよび図１３）と比較した場合、有意にブロックされた。従って、Ｇαｑは、１７β−エストラジオール媒介性の迅速な阻害に主要な役割を果たす。
【０２８４】
さらに、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性化（ホスホリパーゼＣは、周知のＧαｑエフェクターである）もまた、役割を果たす。実際に、ＰＬＣβの活性化は、広汎なスペクトルのＰＬＣインヒビターであるＵ７３１２２（１０μＭ）を用いたニューロンの処置により示されるように、ＧＡＢＡＢ応答のエストロゲン誘導型阻害に必要とされている。Ｕ７３１２２（１０μＭ）を、細胞外沐浴培地中で灌流した場合、エストロゲン媒介性ＧＡＢＡＢ応答の低減をブロックした（図１２のグラフＣおよび図１３）が、より活性の低いＰＬＣインヒビターであるＵ７３３４３は、同一濃度でまったく効果なしであった（図１２のグラフＤおよび図１３）。図１３に関して、バーは、群ごとに試験された４個〜１１個の細胞の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す（＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１、これに対して、ビヒクル−コントロール群；Ｕ７３１２２＋１７β−エストラジオール対Ｕ７３３４３＋１７βエストラジオール、ｐ＜０．０５；Ｇｑペプチド＋１７β−エストラジオール対Ｇｓペプチド＋１７β−エストラジオール、ｐ＜０．０５）。
【０２８５】
（ＧＡＢＡＢ応答の減衰は、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼを必要としない）
ＭＡＰキナーゼ活性の阻害は、バクロフェン応答のエストロゲンモジュレーションを妨害しない。最近の研究により、初代ニューロン性皮質培養物（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）において、そして器官型の大脳皮質外植片培養物において、１７β−エストラジオールが迅速にＭＡＰキナーゼ経路を活性化することがわかった（Ｗａｔｔｅｒら、１９９７；Ｓｉｎｇｈら、１９９９；Ｓｉｎｇｈら、２０００）。しかし、ＭＡＰキナーゼのインヒビターであるＰＤ９８０５９（１０μＭ，ピペット中）またはＵ０１２６（５μＭ）を用いた処理は、バクロフェン応答の１７β−エストラジオール阻害に影響しなかった（１７β−エストラジオールについてのＲ２／Ｒ１；５８．６±３．４％、ｎ＝１０；これに対して、ＰＤ９８０５９＋１７β−エストラジオール：６６．１±１１．８％、ｎ＝５）。
【０２８６】
（弓状（ＧＡＢＡ、ドパミン、およびＰＯＭＣ）ニューロンにおける、ＧＡＢＡＢレセプター、ＰＫＣδおよびアデニリルシクラーゼＶＩＩの転写物の発現）
弓状ニューロンにおける、ＧＡＢＡＢレセプター、ＰＫＣδおよびアデニリルシクラーゼＶＩＩの転写物の発現を、７５個の弓状に分散した弓状ニューロンから、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。結果により、このニューロンの９０％（ＴＨ発現ニューロンおよびＰＯＭＣ発現ニューロンを含む）が、ＧＡＤ６５転写物を発現することが判明した（データは示さず）。最も重要なことには、このニューロンの９２％が、ＧＡＢＡＢＲ２転写物を発現し、これがバクロフェンの応答速度の９０％に相関する。さらに、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲの結果により、ドパミンニューロンおよびＰＯＭＣニューロンが、ＰＫＣδ転写物およびアデニリルシクラーゼＶＩＩ転写物を発現することが判明している。一群の細胞（ｎ＝２２）では、ＰＫＣδおよびアデニリルシクラーゼＶＩＩの転写物は、大多数（７０％）のＴＨニューロンで発現された（ＧＡＤ６５を共発現するものを含む）（図１４Ａ）。ＴＨおよびＧＡＤは、この母集団のニューロンの６０％において共局在した。個々のニューロンに由来するｃＤＮＡの量に限りがあるために、ＰＯＭＣの発現を、別の群の細胞（ｎ＝２９）で決定し、これにより、ＰＫＣδおよびアデニリルシクラーゼのＶＩＩ転写物が、ＰＯＭＣニューロンの大多数（７５％）で発現した（ＧＡＤ６５を共発現するものを含む）ことがわかった（図１４Ｂ）。ＰＯＭＣおよびＧＡＤは、この母集団のニューロンの２８％において共局在した。従って、上記単一細胞のＲＴ−ＰＣＲのデータにより、ドパミンニューロンおよびＰＯＭＣニューロンが迅速なエストロゲンシグナル伝達のための重要な転写物を発現するという電気生理学的知見が確証される。ＧＡＰＤＨ転写物を、逆転写酵素（ＲＴ）反応に関して、内部コントロールと同一の細胞で分析した。一つの細胞は、ネガティブコントロール（−ＲＴ）として、ＲＴを含まなかった。基礎の視床下部組織（ｂａｓａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）（組織コントロール、＋）のＲＮＡはまた、ＲＴの存在下で逆転写された。ＲＴなし（−）の組織コントロールを、各試行に含めた。さらに、以下のコントロールを含めた；分散された細胞ミリューおよび水ブランクからのＨａｎｋ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（これらは、ＲＴ−ＰＣＲに従えば（データは示さず）、両方ともネガティブであった）。
【０２８７】
（独特の膜エストロゲンレセプターは、１７β−エストラジオールの迅速な効果を媒介する）
前述の結果は、膜エストロゲンレセプターが同定されたことを示している。例えば、エストロゲンは、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニストであるバクロフェンの作用を抑制し、ＧＡＢＡニューロン、ＰＯＭＣニューロンおよびドパミンニューロンにおけるＧＩＲＫチャンネルを活性化する。この１７β−エストラジオールの作用は迅速であり、１７β−エストラジオールの添加の数分以内に、測定可能な抑制が生ずる。この応答の動態は、古典的な核内エストロゲンレセプターである、（ＥＲ）αまたは（ＥＲ）βのうちの一つ（これらは、転写調節により作用する）ではなく、膜１７β−エストラジオールレセプターによる応答の仲介を示唆する。
【０２８８】
この迅速なエストロゲン応答について観察される薬理学は、新規の膜貫通エストロゲンレセプターの関与をさらに支持する。この膜不透過性の１７β−エストラジオール−ＢＳＡ結合体は、膜結合レセプター（このレセプターのホルモン結合部位は、原形質膜の細胞外表面からアクセス可能である）について期待されているように、遊離１７β−エストラジオールに対して同一の応答を与える。この１７β−エストラジオールの応答は、Ｄ−環のヒドロキシル基の立体配置に関して、立体特異的である；１７β−エストラジオールは、迅速な応答を惹起する一方で、１７α−エストラジオールは、不活性である。これは、注目に値する。なぜなら、１７α−エストラジオールは、１７β−エストラジオールと比較して効力がわずかに減少したにもかかわらず、核内エストロゲンレセプターのアゴニストとして機能するからである（Ｂａｒｋｈｅｍら、１９９８）。ＳＥＲＭ  ４−ＯＨタモキシフェン、ラロキシフェン、およびＧＷ−５６３８はすべて、この応答を媒介する際に、１７β−エストラジオールのように振舞う一方、上記ステロイド性抗エストロゲンＩＣＩ−１８２，７８０は、１７β−エストラジオール応答をアンタゴナイズする。最も重要なことに、核内エストロゲンレセプターに関して、エストロゲン活性を欠く（すなわち、抗エストロゲン活性の）新規のＳＥＲＭ８は、１７β−エストラジオールよりも強力な、この迅速な１７β−エストラジオール応答の活性化剤であり、１０分の１の濃度でも、１７β−エストラジオールよりも強力である。さらに、この膜ＥＲは、薬理学的（Ｓｃｈｉｌｄ）分析により示されるように、エストロゲンに対して、ナノモル濃度未満（ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ）の親和性を有する（Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９９７）。これらの結果は、この迅速な応答の薬理学が異なり、そして８の場合には、核内エストロゲンレセプターのものと分離可能であることを実証している（Ｒａｚａｎｄｉら、１９９９；Ｌｅｖｉｎ、２００１；ＣｈａｍｂｌｉｓｓおよびＳｈａｕｌ，２００２）。
【０２８９】
最近、Ｔｏｒａｎ−Ａｌｌｅｒａｎｄおよびその同僚（Ｔｏｒａｎ−Ａｌｌｅｒａｎｄら、２００２）が、高親和性の飽和可能なエストロゲンレセプター、「ＥＲＸ」を同定しており、このＥＲＸは、発達中の新皮質ニューロンにおけるキャベロア（ｃａｖｅｌｏａｒ）様の微小ドメインに結合する。この膜結合レセプターは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）１およびＥＲＫ２の活性化と共役しており、これらは、ニューロンの発達および生存にとって重要であると考えられる（Ｗａｔｔｅｒｓら、１９９７；Ｓｉｎｇｈら、１９９９；Ｓｉｎｇｈら、２０００；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋら、２００２）。ＥＲＸはまた、ＭＡＰキナーゼ経路を活性化するのに１７α−エストラジオールが１７β−エストラジオールと効力が等しいという点で、特有の薬理学を有する（Ｔｏｒａｎ−Ａｌｌｅｒａｎｄら、２００２；Ｗａｄｅら、２００１）。しかし、本明細書中に述べられているように、１７α−エストラジオールについては、ＧＡＢＡＢ応答に関しても、μ−オピオイド応答に関しても、効力が観察されなかった。このμ−オピオイド応答は、視床下部ニューロンにおいて、ＧＩＲＫのチャンネルの同一のファミリーに共役している（Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９９７）。同様に、ＧｕおよびＭｏｓｓ（ＧｕおよびＭｏｓｓ、１９９６）は、１７α−エストラジオールが、海馬のＣＡ１錐体状ニューロンにおいて、１７β−エストラジオールのグルタミン酸塩（カイニン酸塩）媒介性の電流を増強する作用を模倣しないことを発見した。同様に、Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎら（１９９６）は、１７α−エストラジオールが、１７β−エストラジオールよりも、新線条体ニューロンにおいてＬ型のカルシウム電流を低減する効力がずっと弱いことを発見した。従って、ＰＫＣ−ＰＫＡ経路を介して、ニューロンにおけるチャンネル活性を調節する膜エストロゲンレセプターは、増殖および生存を促進するＥＲＫ１／２の活性化に共役するレセプターとは薬理学的に異なる。
【０２９０】
（１７β−エストラジオールは、ＰＫＣδおよびＰＫＡを活性化し、視床下部ニューロンにおいて、ＧＰＣＲとＫ＋チャンネルとの共役を変化させる）
本明細書中に詳述したデータは、視床下部ニューロンにおいて、エストロゲンに対する迅速な応答のためのシグナル伝達経路が、図１５に記載されるものに従うことを示す。図１５に関して、事象の順序は；（１）１７β−エストラジオールは、新規の膜貫通エストロゲンレセプターに結合する；（２）リガンド結合により、Ｇαｑが活性化する；（３）活性化Ｇαｑが、今度はＰＬＣを活性化する；（４）活性化ＰＬＣが、ＤＡＧを遊離させる；（５）遊離ＤＡＧが、ＰＫＣδを刺激する；（６）ＰＫＣδアデニリルシクラーゼ（ＶＩＩ）を活性化する；（７）ｃＡＭＰレベルが上昇する；（８）ｃＡＭＰがＰＫＡを刺激する；（９）ＰＫＡが、Ｋ＋チャンネルの機能にとって重要な膜標的をリン酸化する、である。
【０２９１】
プロテインキナーゼの経路が、ＣＮＳニューロンにおいて、ＧＡＢＡＢレセプター媒介性シグナル伝達に影響するという、図１５に示される経路についてのさらなる証拠が発見されている。プロテインキナーゼＣの活性化は、海馬のＣＡ１錐体状ニューロン（ＤｕｔａｒおよびＮｉｃｏｌｌ、１９８８）において、ＧＩＲＫのチャンネルのＧＡＢＡＢレセプターの活性化を抑制し、そしてＧＡＢＡＢレセプター媒介性の、小脳スライスからのノルエピネフリン放出の阻害を減衰する（Ｔａｎｉｙａｍａら、１９９２）。
【０２９２】
現在、ＰＫＣファミリーの１２の公知のメンバーが存在する（Ｗａｙら、２０００）。このファミリーは、配列ホモロジーおよび生化学的調節に基づき、３群に分類される。クラスＡ、すなわち従来のＰＫＣ（ＰＫＣα、βＩ、βＩＩおよびγ）は、周知のＣａ２＋依存的なＰＫＣである。クラスＢ、すなわち新規のＰＫＣ（ＰＫＣδ、ε、θ、η）は、Ｃａ２＋非依存性である。最後に、クラスＣのＰＫＣ、すなわち異型のＰＫＣ（ＰＫＣζおよびτ／λ）は、最も発散したクラスである。異型のＰＫＣもまた、Ｃａ２＋非依存性であり、そしてジアシルグリセロールを活性化のために必要としない（Ｗａｙら、２０００）。エストロゲンの、視床下部ニューロンにおける迅速なＧＡＢＡＢ抑制性の作用は、広汎なスペクトルのＰＫＣインヒビターであるＢＩＳに感受性であるが、Ｇｏｕ６９７６には感受性でなく、従来のＰＫＣクラスに属しないＰＫＣの関与を暗示する。さらに、ＧＡＢＡＢ応答のエストロゲンの阻害は、細胞内記録パッチのピペットにおいて、１０ｍＭのＢＡＰＴＡの封入により変更されず、Ｃａ２＋依存性の、従来のＰＫＣが関与していないことを確証付けている。しかし、選択的なＰＫＣδインヒビターであるロッテリンは、１７β−エストラジオールの作用をブロックし、これは、この新規のクラスのＰＫＣが迅速な１７β−エストラジオール応答のメディエーターであることを示した。さらに、本明細書中に記載される弓状ニューロンにおけるＰＫＣδ転写物の発現に関するｓｃＲＴ−ＰＣＲのデータは、ＧＡＢＡＢ応答の１７β−エストラジオール媒介性阻害にＰＫＣδを関係付ける。同様に、ＰＫＣδは、エストロゲン媒介性のＫ＋チャンネルの阻害および雌性の遠位結腸上皮細胞における液体の保持に関与しているが、上流のシグナル伝達経路は、公知でない（Ｄｏｏｌａｎら、２０００）。
【０２９３】
（ＰＫＣ活性化は、ＰＫＡ活性化の上流である；）
１７β−エストラジオール媒介性のＧＡＢＡＢ阻害におけるＰＫＣ活性化は、ＰＫＡ活性化の上流である。例えば、ＢＩＳの内部灌流は、１７β−エストラジオールによるバクロフェン応答の阻害を完全にブロックしたが、バス灌流（ｂａｔｈ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）により適用されたフォルスコリンによるバクロフェン応答の阻害を減衰しなかった。ＰＫＣは、アデニリルシクラーゼを活性化することが公知であり（Ｊａｃｏｂｏｗｉｔｚら、１９９３；ＹｏｓｈｉｍｕｒａおよびＣｏｏｐｅｒ、１９９３；ＬｉｎおよびＣｈｅｎ，１９９８）；さらに、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）が、Ｇαｓでもフォルスコリンでもなく、ＰＫＣにより活性化される場合、アデニリルシクラーゼは、Ｇαｉによる阻害に抵抗性である（Ｐｉｅｒｏｎｉら、１９９３）。今日まで、９種のＡＣイソ酵素（ＡＣのＩ型〜ＩＸ型）がクローン化されている。注目すべきことに、ＡＣ  ＶＩＩは、他のアデニリルシクラーゼの配列には存在しない、ＰＫＣδの潜在的な結合部位（これは、ＰＫＣδが直接的にＡＣ  ＶＩＩをリン酸化するのを可能にする）を有する（Ｎｅｌｓｏｎら、２００３）。皮質、海馬、線条、および小脳におけるＧＡＢＡニューロンは、ＡＣ  ＶＩＩに対して免疫反応性であり（Ｍｏｎｓら、１９９８）、そして、本明細書中に開示されているように、視床下部のＧＡＢＡニューロン、ＴＨニューロン、およびＰＯＭＣニューロンは、ＡＣ  ＶＩＩ転写物を発現する。
【０２９４】
（Ｇαｑは、ＰＬＣを介して、１７β−エストラジオールによるＧＡＢＡＢ応答の阻害を媒介する：）
本明細書中に記載される結果により、膜ＥＲが、特異的に、メッセンジャーＧαｑと共役していること、およびこのメッセンジャータンパク質が、１７β−エストラジオールによるＧＡＢＡＢ応答の阻害に関与していることがわかる。この結論は、Ｇαｑのペプチドフラグメントを用いた細胞内透析が、Ｇタンパク質とのレセプター相互作用をブロックした場合に観察される結果により確証付けられる。このＧαｑペプチドは、皮質錐体状ニューロンにおけるＧαｑシグナル伝達経路（Ｃａｒｒら、２００２）をブロックするために使用されている。さらに、エストロゲン媒介性のＧＡＢＡＢ応答の低減は、より活性の低いインヒビターであるＵ７３３４３で灌流された細胞と比較して、ホスホリパーゼＣインヒビターであるＵ７３１２２により、有意に低減した。従って、メッセンジャーＧαｑは、１７β−エストラジオールによるＧＡＢＡＢ応答の阻害に関与している。
【０２９５】
ほとんどのＰＫＣは、ジアシルグリセロールにより活性化され、そしてＣａ２＋の存在を必要とするＰＫＣも存在する。従って、ＰＫＣは、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）−イノシトール三リン酸／ジアシルグリセロールシグナル伝達カスケードの下流である。異なる形態のＰＬＣが種々のメッセンジャー（Ｇαｑ、Ｇβγ（ＰＬＣβ）、およびチロシンキナーゼ（ＰＬＣγ）が挙げられる）により活性化され得るので、このＰＫＣファミリーは、多様な一続きのシグナル伝達カスケードに関与する（ＴａｎａｋａおよびＮｉｓｈｉｚｕｋａ，１９９４；Ｂａｔｔａｉｎｉ，２００１）。
【０２９６】
（実施例２３）
この実施例は、Ｓｃｈｉｌｄ分析を用いたエストロゲンレセプターアンタゴニストの同定およびアンタゴニストの効力の決定を記載する。この分析に対する一般的なプロトコールは、Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９９７に開示されている。蓄積的な濃度−応答曲線を、上述の細胞全体の電気生理的アッセイにおける、選択的エストロゲンレセプターアゴニストである化合物８の、濃度の増加を適用することにより生み出す。バクロフェン濃度の増加を、薬物誘導型の外向き電流が新規の定常レベルに到達するまで、適用する。バクロフェンおよび化合物８の両方のＥＣ５０値を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏｓｔａ  Ｍａｄｒｅ，ＣＡ）ソフトウェアを用いて算出し、ロジスティック方程式に最も適合する値を決定する。次いで、細胞を、潜在的なエストロゲンレセプターアンタゴニストの１ｎＭ溶液で洗い流す。次いで、（上記最初の濃度−応答曲線の生成において適用したように）化合物８の濃度の増加を適用し、第２の応答曲線を生成する。次いで、この細胞を、潜在的なアンタゴニスト溶液（２ｎｍ）で処置し、濃度応答曲線を繰り返す。このプロセスを、潜在的なアンタゴニストの濃度の増加とともに繰り返し、複数の濃度応答曲線を生成する。化合物８および提案されたアンタゴニストが、本明細書中に開示される、以前に同定されてない膜結合エストロゲンレセプターに結合する場合、このデータの線形回帰適合度（ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｉｔ）｛ｌｏｇ（用量比−１）対−ｌｏｇ［アンタゴニスト濃度］｝で、−１．０の傾きが得られる。
【０２９７】
（実施例２４）
この実施例は、開示された化合物の心臓保護活性の評価を記載し、そして新規の心臓保護用選択的エストロゲンレセプターモジュレーターを同定するための方法を提供する。生後４−７週間の、アポリポプロテインＥ−欠損Ｃ５７／Ｂ１Ｊ（ａｐｏ  Ｅ  ＫＯ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓより入手可能）の卵巣を摘出する。この動物を、体重により無作為化し、群に分ける（１群あたり、ｎ＝１２−１５のマウス）。プロトコール（ここで、消費量は、週単位で測定されており、それに従って、適用される用量は、動物の体重に基づく）を用いて、このマウスを、食餌中の開示された化合物または硫酸１７β−エストラジオール（１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置する。使用された食餌は、Ｐｕｒｉｎａにより調製され、０．５０％のコレステロール、２０％のラード、および２５ＩＵ／ＫＧのビタミンＥを含有する、Ｗｅｓｔｅｒｎ式食餌（５７Ｕ５）である。このマウスには、１２週間の期間、この方法論を用いて投薬する／餌を与える。コントロールの動物には、Ｗｅｓｔｅｒｎ式の食餌を与え、そして化合物は与えない。この研究期間の終わりに、この動物を安楽死させ、血漿サンプルを得る。まず、生理食塩水を用いて、次いで、中性緩衝化ホルマリン溶液（１０％）を用いて、心臓をインサイチュで灌流する。
【０２９８】
全コレステロールおよびトリグリセリドを、それぞれＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍおよびＷａｋｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されているキットを用いて、酵素的な方法を用いて決定する。血漿リポタンパク質の分離および定量を行い、そして各クロマトグラムのピークのそれぞれの相対的な百分率面積に全コレステロール値を乗ずることにより、各リポタンパク質画分を定量する。
【０２９９】
大動脈のアテローム性動脈硬化症を、注意深く大動脈を単離する工程および取り扱う前に注意深くこの血管をホルマリン固定液中に４８時間〜７２時間配置する工程により、定量する。アテローム性動脈硬化症の病巣を、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を用いて同定する。この血管を、短時間脱色し、次いで、イメージ化する。この病巣を定量し、そして血管についての評価、特に、腕頭幹の近位末端から左鎖骨下動脈までの大動脈弓内に含まれる領域に沿った正面についての評価を行う。大動脈アテローム性動脈硬化症のデータは、この規定された管腔領域内に、病巣関与の百分率として厳密に表現され得る。
【０３００】
（実施例２５）
この実施例は、酸素奪取／灌流に応答して、開示された化合物を用いる、予防的な神経保護の評価を記載し、そして新規の神経保護的な選択的エストロゲンレセプターモジュレーターを同定するための方法を提供する。気候馴化の後の、雌性Ｍｏｎｇｏｌｉａｎアレチネズミ（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＹから入手可能）を、イソフルランで麻酔し、そして卵巣を摘出する（第０日）。翌朝（第１日）、アレチネズミを、ビヒクル（１０％  ＥｔＯＨ／コーン油）、１７β−エストラジオール（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）または本明細書中に開示された化合物のいずれかで皮下処置する。第６日に先立ち、このアレチネズミに一晩絶食させ（一貫した虚血性損傷を促進し）、次いで、全身の虚血性外科手術に供する。この手術は、上記アレチネズミをイソフルランで麻酔し、正中頚部切開を介して共通の頚動脈を可視化し、そして同時に両動脈を微小動脈瘤クリップ（ｍｉｃｒｏ−ａｎｅｕｒｙｓｍ  ｃｌｉｐ）で５分間遮断することにより進行する。遮断の後に、このクリップを除去し、小脳の灌流を可能にし、そして頚部切開を創傷クリップで閉じる。第１２日に、アレチネズミを、致死量のＣＯ２に曝し、この脳をドライアイス上で凍結させ、−８０℃で貯蔵する。
【０３０１】
神経保護の程度を、ニューログラニン（ｎｅｕｒｏｇｒａｎｉｎ）のｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション分析により評価する。手短に言えば、ゼラチン被覆スライド上で２０μＭの冠状低温断面を回収し、乾燥させ、そして−８０℃で貯蔵する。処理の際に、この乾燥したスライドボックスを、室温にまで温め、このスライドを４％のパラホルムアルデヒドで固定した後、無水酢酸で処置し、次いで、クロロホルムおよびエタノールで脱脂質化および脱水する。次いで、加工した断面を載せたスライドを、５０％ホルムアルデヒドハイブリダイゼーションミックス中のＮｅｕｒｏｇｒａｎｉｎアンチセンスまたはセンス（コントロール）のリボプローブ（３５Ｓ−ＵＴＰ標識化ＮＧ−２４１；塩基９９−３４０）の２００μＬ（６×１０６ＤＰＭ／スライド）でハイブリダイズし、加湿したスライドチャンバー中で、カバースリップなしで５５℃で一晩インキュベートした。翌朝、このスライドをラック中に収集し、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ
クエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）／１０ｍＭ  ＤＴＴに液浸し、ＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）で処理し、そして６７℃で０．１×ＳＳＣで洗浄し（２×３０分）、非特異的な標識を除去する。脱水後、このスライドは、ＢｉｏＭａｘ（ＢＭＲ−１；Ｋｏｄａｋ）Ｘ線フィルムに一晩供する。
【０３０２】
損傷後のＣＡ１領域の神経損失の程度を定量的に評価し、そして１７β−エストラジオールおよび上記開示された化合物の効力を評価するために、ニューログラニンのハイブリダイゼーションのシグナルのレベルを使用する。ニューログラニンｍＲＮＡを、これらの研究のために選択する。なぜなら、ニューログラニンｍＲＮＡは、海馬ニューロン（ＣＡ１を含む）において高く発現されているが、この脳領域のグリア細胞および他の細胞型では存在しないからである。従って、存在するニューログラニンｍＲＮＡの量の測定は、生存ニューロンを示す。ニューログラニンハイブリダイゼーションシグナルの相対的な光学密度の測定は、コンピューターベースのイメージ分析システムを用いて、フィルムオートラジオグラムより得られる（Ｃ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ）。動物あたり６断面（４０μｍ、ばらばら）からの結果を平均化し、そして統計的に評価する。実数値を、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として報告する。一元分散分析を使用し、ニューログラニンｍＲＮＡのレベルにおける偏差を試験し、そして得られた断面に偏差がないことのすべての記載は、ｐ＞０．０５であることを示す。
【０３０３】
（実施例２６）
この実施例は、開示された化合物を使用して達成される認知増強（ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）の評価を記載する。卵巣摘出したラット（ｎ＝５０）を、各々５日間連続で１０分間、８アームのラジアルアーム（ｒａｄｉａｌ  ａｒｍ）迷路に慣らす。習慣形成（ｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎ）および試験に先立ち、動物から水奪取する。各アームの末端に設置した１００μＬのアリコートの水は、増強として役立つ。ラジアルアーム迷路における、獲得−移動（ｗｉｎ−ｓｈｉｆｔ）課題の獲得を、餌をつけた一つのアームにこの動物がアクセス可能にすることにより達成する。飲水後、この動物は、アームから出て、再度中心コンパ−トメントに入り、ここで、この動物は、以前に訪れたアームまたは新規のアームにアクセス可能である。この動物が新規のアームに入ることを選択する場合、正しい応答を記録する。各動物に、一日ごとに５回の試行を、３日間与える。最終の獲得試行後、上記動物を以下の４群のうちの１群に割り当てる；（１）ネガティブコントロ−ル：１０％のＤＭＳＯ／ゴマ油のビヒクルを、毎日１回、６日間（１μｇ／ｋｇ、皮下）注射する。（２）ポジティブコントロ−ル：安息香酸１７β−エストラジオールを、２日間注射し、そして第２の注射の後、４日間試験する（安息香酸１７β−エストラジオールを、ラットあたり、１０μｇ／０．１ｍＬ）。（３）１７β−エストラジオールを、６日間、毎日注射する（２０μｇ／ｋｇ、皮下）。（４）試験化合物：６日間毎日注射する（用量は変動し得る）。注射はすべて獲得の最終日の試験後に開始する。群１、３、および４の最終的な注射は、作業記憶を試験する２時間前に開始する。
【０３０４】
作業記憶についての試験は、１５秒、３０秒、または６０秒の遅れを利用するサンプル非適合課題（ＤＮＭＳ）である。この課題は、獲得課題のバリエーションであり、このバリエーションでは、ラットは、中心部の競技場に置かれ、前と同様に一つのアームに入ることが可能である。一度このラットが第１のアームの途中まで横断すれば、第２のアームを開け、そして再度このラットがこのアームを選択することが必要とされる。ラットがこの第２のアームを途中まで移動した場合、両側のドアが閉まり、そして遅れが開始する。一度この遅れが終了すれば、もとの２個のドア、および第３の新規のドアが同時に開く。この動物が、第３の、新規のアームを途中まで通過した場合、正しい応答を記録する。この動物が第１または第２のいずれかのアームを途中まで移動した場合、誤った応答を記録する。各動物に、３回の遅れ間隔の各々について、５回の試行を行い、被験体につき、各動物について全部で１５回の試行を行う。
【０３０５】
【化８９】
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【０３０６】
【化９０】
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【０３０７】
【化９１】
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【０３０８】
【化９２】
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【０３０９】
【化９３】
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【０３１０】
【化９４】
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【０３１１】
種々の変更およびバリエーションが、本開示の範囲および精神から逸脱せず、本発明の化合物、組成物、および方法に対してなされることは、当業者には明らかである。化合物、組成物および方法の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書中に開示された手順の実行から当業者に明らかである。本明細書および実施例が例示としてみなされるのみであり、本発明の真の範囲および精神が添付の特許請求の範囲に示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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