(57)【要約】【課題】哺乳動物における免疫応答を、単純かつ有効に増強する方法を提供すること。【解決手段】本発明の一つの局面は、特定の植物レクチンが、粘膜アジュバントとして働いて、種々の免疫原に対する免疫応答を増強すること（増加された抗体力価ヲ含む）により、単純で、非毒性で、かつ安価なワクチンまたは免疫原性組成物が調製されることを可能にすることである。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、植物レクチンおよび免疫源を含む混合物である。そのような混合物は、哺乳動物（ヒトを含む）に対する粘膜送達に特に適切であり、そして従って獣医学およびヒトの医学目的のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９９年１０月２６日に出願した、仮出願番号６０／１６１，３７
１号に対する利益を主張する。これは、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、哺乳動物において免疫応答を増強することに関する。より詳細には
、本発明は、植物レクチンをアジュバントとして使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほとんどの病原体は、粘膜表面において宿主にコロニー形成しそして侵入する
ことから、この部位での免疫誘発は、本発明にとって合理的かつ魅力的なアプロ
ーチである（１）。ワクチンのための粘膜経路は、非侵襲的であり、従って投与
は比較的単純かつ安価である。さらに、ある範囲の粘膜を誘発する能力および粘
膜ワクチン送達後の全身性免疫応答により、多くの疾患に対して有効な免疫の可
能性が可能になる。例えば、特定のＩｇＡのみがインフルエンザでの鼻内感染（
２）から、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅでの腸感染から（３）マウス
を保護し得る。しかし、非複製性免疫原の粘膜送達は、代表的に、強力な免疫応
答は刺激しない。応答が誘導される場合、複数の高用量の送達がしばしば必要で
ある（４）。さらに、免疫源の粘膜送達は、しばしば、全身性の不応答性を生じ
る（１）。
【０００４】
多数の戦略を使用して、粘膜に送達されるワクチンに対する応答が増強され得
る。生の細菌およびウイルスのベクターであって、粘膜にコロニー形成するもの
を使用して、免疫原が送達され得る（５）。生分解性の微粒子（６）またはリポ
ソーム（７）を付随させて免疫原に微細特性を付与することもまた、粘膜免疫原
性を増強し得る。
【０００５】
別のアプローチは、アジュバント特性を伴うレクチン様分子を使用することで
ある。これまでに同定された最も強力な粘膜アジュバントは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ（ＣＴ）によって産生されるコレラ毒素、およびＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ  ｃｏｌｉの腸毒素産生性株からの熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ
）である（８，９）。ＣＴおよびＬＴは、十分に特徴づけられた粘膜免疫原およ
び共存タンパク質にとってのアジュバントである。コレラの毒素は、別個のＡサ
ブユニットおよびＢサブユニットを含む（それぞれＣＴＡおよびＣＴＢと呼ばれ
る）。Ｂサブユニットは、細胞表面レセプターに対する結合を媒介する（２０）
。ＧＭ１ガングリオシドは、ＣＴにとっての主要なレセプターと考えられている
（２１）が、ＣＴＢは、ＧＭ１以外の細胞表面レセプターに結合し得る（２２）
。Ｂサブユニットの結合後、Ａサブユニットは、細胞質ゾルに達し、そしてアデ
ニルシクラーゼを活性化し、［ｃＡＭＰ］iの大幅な上昇を生じる（１０，１１
）。ＬＴは、構造的および機能的に、ＣＴに類似し、そして全身性または粘膜性
のアジュバントとしてＣＴに匹敵する（２３，２４）。マウスにおいて、ＣＴは
、粘膜ＩｇＡ産生および細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機能を含む、体液性およ
び細胞媒介性の免疫応答を強力に刺激する（１０）。毒素特異的な局所および全
身性の応答の刺激ならびに共投与された免疫原に対する応答は、これらの分子を
、粘膜された場合にあまり免疫原性ではないほとんろの可溶性タンパク質と識別
する（１０，１１）。しかし、これらの分子の毒性により、臨床適用が妨げられ
ている。
【０００６】
特定の植物レクチンが粘膜上皮に対する分子の特定の標的化のための因子とし
て調査されてきている。植物レクチンは、少なくとも１つの非触媒性ドメインを
含み、このドメインは、モノサッカリドまたはオリゴサッカリドに特異的かつ可
逆的に結合する（１３）。例えば、Ｇｉａｎｎａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１４）
は、誘導をともなう鼻内免疫が特定のＩｇＧ抗体のレクチン免疫原結合体刺激し
たが、他方、免疫原単独またはレクチンとの混合物は刺激しなかったことを開示
する。米国特許第４，４７０，９６７号は、糖タンパク質免疫原とレクチンとの
複合体が免疫原に対する免疫応答を増強するアジュバントとして作用し得ること
を開示する。同様に、ＷＯ８６／０６６３５は、哺乳動物を含む脊椎動物におけ
る免疫応答を惹起するために使用され得る、化学的に改変された免疫原レクチン
複合体を開示する。しかし、これらの各々において、レクチンは物理的に免疫源
に結合していた。このことは、すくなくとも１つの余計な調製工程が必要であり
、実際に、免疫応答が所望される、免疫原のエピトープ（例えば、中和免疫が指
向されるエピトープ）を変更し得る。
【０００７】
従って、別の分子との免疫原の複合体化する必要もなく、所望のエピトープの
マスクしたり変更したりすることもなく、哺乳動物において、免疫応答、特に粘
膜投与後のを増強する、単純で有効でかつ非毒性の方法に対する当該分野におけ
る必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供する。この方法は
、免疫原と植物レクチンとを含む混合物を哺乳動物に投与することによる。それ
により、哺乳動物は、植物レクチンの非存在下で生じる免疫応答に比較して増加
した免疫応答を生じる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  哺乳動物において免疫原に対する免疫応答を産生するための
医薬の製造における、該免疫原および植物レクチンを含む混合物の使用であって
、該免疫応答は、該植物レクチンの存在しない場合に該免疫原に対して惹起され
る免疫応答よりも大きい、使用。
（項目２）  前記混合物が粘膜に投与される、項目１に記載の使用。
（項目３）  前記混合物が鼻腔内投与される、項目２に記載の使用。
（項目４）  前記植物レクチンが、ＭＬ−１、ＭＬ−ＩＩ、ＭＬ−ＩＩＩ
、ＷＧＡ、およびＵＥＡ−１からなる群より選択される、項目１に記載の使用。
（項目５）  前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトからなる群より選択される、項目１に記載の使用。
（項目６）  前記免疫応答がＴ細胞応答である、項目１に記載の使用。
（項目７）  前記Ｔ細胞応答がＴｈ２応答である、項目６に記載の使用。
（項目８）  前記Ｔ細胞応答がＴ細胞の増殖である、項目６に記載の使用。
（項目９）  前記免疫応答が抗体応答である、項目１に記載の使用。
（項目１０）  前記哺乳動物が、ＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体からなる群
より選択される抗体を産生する、項目９に記載の使用。
（項目１１）  前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂからなる群より選択される、項目１０に記載の使用。
（項目１２）  前記抗体が血清中に検出可能である、項目１０に記載の使用。
（項目１３）  前記抗体が粘膜分泌物中に検出可能である、項目１０に記載の使用。
（項目１４）  前記粘膜分泌物が、腸粘膜、膣粘膜、口腔粘膜、および鼻
粘膜からなる群より選択される粘膜より得られる、項目１３に記載の使用。
（項目１５）  前記混合物が２以上のレクチンを含む、項目１に記載の使用。
（項目１６）  前記混合物が２以上の免疫原を含む、項目１に記載の使用。
（項目１７）  前記免疫原がタンパク質の感染因子である、項目１に記載の使用。
（項目１８）  前記感染因子がウイルスである、項目２０に記載の使用。
（項目１９）  前記免疫原が、２型単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパ
ク質Ｄ２タンパク質である、項目２１に記載の使用。
（項目２０）  前記混合物が粘膜スプレーを使用して投与される、項目３に記載の使用。
（項目２１）  前記混合物を含む液体が数滴投与される、項目３に記載の使用。
（項目２２）  少なくとも２用量の前記混合物が投与される、項目１に記載の使用。
（項目２３）  前記混合物が、免疫原および植物レクチンを少なくとも約
１：１の比で含む、項目１に記載の使用。
（項目２４）  前記比が少なくとも約１０：１である、項目２６に記載の使用。
（項目２５）  抗体力価がＥＬＩＳＡを使用して測定される、項目９に記載の使用。
（項目２６）  項目１に記載の使用であって、ここで、前記混合物は、
経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、皮下注射、筋肉内注射、経皮注
射（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、および経皮注射（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕ
ｓ）からなる群より選択される方法によって投与される、使用。
（項目２７）  前記植物レクチンが、２型リボソーム不活性化タンパク質
である、項目１に記載の使用。
（項目２８）  項目３０に記載の使用であって、ここで、前記２型リボ
ソーム不活性化タンパク質が、ニグリンｂ、塩基性ニグリンｂ、エブリン１、エ
ブリンｒ１、エブリンｒ、エブリンｆ、ニグリンｆ、ＳＮＡ１、ＳＮＡ１、ＳＮ
ＡＶ、ＳＮＡＶＩ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ＳＮＬＲＰ１、Ｓａｍｂｕ
ｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ＳＮＬＲＰ２、リシン、トウゴマ属レクチン、Ｐｏｌｙｇ
ｏｎａｔｕｍ  ＲＩＰ、Ｓｉｅｂｏｌｄｉｎ−６、アブリン、アブリン１１、モ
デシン、ボルケンシン、ＳＳＡ、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Ｅｖａｎ
ｔｈｉｓ  ｈｙｅｍａｌｉｓ、ＲＩＰ、虹彩アグルチニン、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−Ｉ
Ｉ、およびＭＬ−ＩＩＩからなる群より選択される、使用。
（項目２９）  前記混合物が微粒子キャリアを使用して投与される、請求
項１に記載の使用。
（項目３０）  前記混合物が生物接着性ポリマーと組合わせて投与される
、項目１に記載の使用。
（項目３１）  前記混合物が腸処方物にある、項目１に記載の使用。
【０００９】
従って、本発明は、哺乳動物における免疫応答を、単純かつ有効に増強する方
法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、４回の免疫原の鼻内投与の後のマウスの鼻気管洗浄液において測定された総ＩｇＡレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２】図２Ａ−Ｄは、植物レクチンのアジュバント効果を示すプロットである。鼻内免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ抗体力価。図２Ａ、１回の投与の後の血清ＩｇＧ力価（１３日目）。図２Ｂ、２回の投与の後の血清ＩｇＧ力価（２７日目）。図２Ｃ、３回投与の後の血清ＩｇＧ力価（４１日目）。図２Ｄ、最後の投与の後の血清ＩｇＧ力価（５６日目）。
【図３】図３は、鼻内免疫したマウスにおいて測定したＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ１抗体力価を示すプロットである。
【図４】図４Ａ−Ｄは、鼻内免疫したマウスの分泌物において測定されたＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体力価を示すプロットである。図４Ａ、唾液；図４Ｂ、膣洗浄液；図４Ｃ、鼻気管洗浄液；図４Ｄ、腸洗浄液。
【図５】図５Ａ−Ｆは、鼻内免疫したマウスにおいて測定したＣＴ／植物レクチン特異的血清ＩｇＧ抗体力価である。図５、ＣＴ；図５Ｂ、ＬＥＡ；図５Ｄ、ＰＨＡ；図５Ｅ、ＷＧＡ；図５Ｆ、ＵＥＡ−Ｉ。
【図６】図６Ａ−Ｄは、鼻内免疫したまうすからのｇＤ２特異的血清ＩｇＧ抗体力価を示すプロットである。図６Ａ、１４日目；図６Ｂ、２８日目；図６Ｃ、４１日目；図６Ｄ、５５日目。
【図７】図７Ａ−Ｄは、ｇＤ２特異的血清ＩｇＧサブクラス抗体力価を示すプロットである。図７Ａ，ＩｇＧ１；図７Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図７Ｃ、ＩｇＧ２ｂ；図７Ｄ、ＩｇＧ３。
【図８】図８Ａ−Ｄは、分泌物において測定したｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を示すプロットである。図８Ａ、唾液；図８Ｂ、膣洗浄液；図８Ｃ、鼻気管洗浄液；図８Ｄ、腸洗浄液。
【図９】図９は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ５（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−Ｉ、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒ１、ＳＮＡＩＩまたはＳＥＬｆｄとともに用いて鼻内免疫したマウスからのｇＤ２特異的総血清ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの力価である。図９Ａ，ＩｇＧ；図９Ｂ、ＩｇＧ１；図９Ｃ、ＩｇＧ２ａ；図９Ｄ、ＩｇＧ２ｂ。
【図１０】図１０は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ５（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−Ｉ、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒ１、ＳＮＡＩＩまたはＳＥＬｆｄとともに用いて鼻内免疫したマウスからのｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価である。図１０Ａ、唾液；図１０Ｂ、膣洗浄液；図１０Ｃ、鼻気管洗浄液；図１０Ｄ、腸洗浄液。
【図１１】図１１は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ２（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−ＩまたはＵＥＡ−１とともに用いて鼻内免疫したマウスにおいて測定されるｇＤ２特異的血清ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体力価である。図１１Ａ、血清ＩｇＡ；図１１Ｂ、血清ＩｇＧ。
【図１２】図１２は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ２（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−ＩまたはＵＥＡ−１とともに用いて鼻内免疫したマウスにおいて測定されるｇＤ２特異的ＩｇＧサブクラス抗体力価である。図１２Ａ，ＩｇＧ１；図１２Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図１２Ｃ、ＩｇＧ２ｂ。
【図１３】図１３は、１日目、２１日目および４２日目において、ｇＤ２（５μｇ）単独またはｇＤ２（５μｇ）を、１μｇのＣＴ、ＭＬ−ＩまたはＵＥＡ−１とともに用いて鼻内免疫したマウスにおいて測定されるｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価である。図１３Ａ、唾液；図１３Ｂ、膣洗浄液；図１３Ｃ、腸洗浄液；図１３Ｄ、鼻気管洗浄液。
【図１４】図１４は、ＩＬ−５、ＩＬ−４およびＩＦＮ産生の平均濃度およびＴ細胞増殖アッセイについて１分当たりの計数である。図１４Ａ、脾臓細胞おけるＩＬ−５産生；図１４Ｃ、脾臓細胞におけるＩＬ−４産生；図１４Ｅ、脾臓細胞におけるＩＦＮ産生；図１４Ｂ、頸部リンパ節におけるＩＬ−５産生；図１４Ｄ、頸部リンパ節におけるＩＬ−４産生；図１４Ｆ、頸部リンパ節におけるＩＦＮ産生；図１４Ｇ、脾臓細胞におけるＴ細胞増殖。応答は、ｇＤ２、ＭＬＩもしくはＵＥＡ−１で、またはｇＤ２＋ＭＬＩ、ＵＥＡ−ＩまたはＬＴＫ６３での３回免疫（０日目、２１日目、４２日目）の後第８週において測定した。脾臓細胞および頸部リンパ節細胞を単離し、そしてｇＤ２（０μｇ、１μｇまたは５μｇ）またはラテックスビーズと結合させたｇＤ２（１：１０００または１：５０００希釈）またはＰＭＡ／ｃｄ３でインビトロ刺激した。
【図１５】図１５は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独またはＯＶＡ（５ｍｇ）とともにＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）のいずれかで、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に胃管栄養により免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ抗体力価である。図１５Ａ、１回用量後（１３日目）の血清ＩｇＧ力価；図１５Ｂ、２回用量後の血清ＩｇＧ力価（２７日目）；図１５Ｃ、３回用量後の血清ＩｇＧ力価（４８日目）；図１５Ｄ、最終用量後の血清ＩｇＧ力価（６２日目）。
【図１６】図１６は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独またはＯＶＡ（５ｍｇ）とともにＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）のいずれかで、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に胃管栄養により免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧサブクラスおよびＩｇＡ抗体力価である。図１６Ａ，ＩｇＧ１；図１６Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図１６Ｃ、ＩｇＧ２ｎ；図１６Ｄ、ＩｇＧ３。
【図１７】図１７は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独またはＯＶＡ（５ｍｇ）とともにＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）のいずれかで、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に胃管栄養により免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＡ抗体力価である。図１７Ａ、唾液；図１７Ｂ、膣洗浄液；図１７Ｃ、鼻気管洗浄液；図１７Ｄ、腸洗浄液。
【図１８】図１８は、１ｍｇのＷＧＡの単回用量で胃管洗浄した後６時間でのマウスから収集された腸ホモジネートにおけるＷＧＡを示すウェスタンブロットである。
【図１９】図１９は、１ｍｇのＰＨＡの単回用量で胃管洗浄した後１時間でのマウスから収集された胃および小腸のホモジナイズした洗浄液のウェスタンブロットである。
【図２０】図２０は、１ｍｇのＵＥＡ−１の単回用量で胃管洗浄した後２４時間でのマウスから収集された抽出されたマウス腎臓組織おけるＵＥＡ１を示すウェスタンブロットである。
【図２１】図２１は、１ｍｇのＷＧＡの単回用量で胃管洗浄した後２４時間でのマウスから収集されたマウス肝臓組織におけるＷＧＡを示すウェスタンブロットである。
【図２２】図２２は、トリプシンによる分解に対する、ネイティブおよび腎臓抽出されたＵＥＡ−１の感受性を示すウェスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本発明の一つの局面は、特定の植物レクチンが、粘膜アジュバントとして働い
て、種々の免疫原に対する免疫応答を増強すること（増加された抗体力価ヲ含む
）により、単純で、非毒性で、かつ安価なワクチンまたは免疫原性組成物が調製
されることを可能にすることである。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は
、植物レクチンおよび免疫源を含む混合物である。そのような混合物は、哺乳動
物（ヒトを含む）に対する粘膜送達に特に適切であり、そして従って獣医学およ
びヒトの医学目的のために有用である。
【００１２】
本発明の混合物は、植物レクチンおよび免疫原を含む。免疫原およびレクチン
は、化学的に結合していなしが、適切な液体媒体（例えば、リン酸緩衝化生理食
塩水または他の等張性生理食塩水溶液）中で単に一緒に混合されているだけであ
る。必要に応じて、混合物は、安定化剤（抗微生物剤、保存剤などを含む）を含
み得る。この混合物における免疫原およびレクチンの比率は変動し得、例えば、
少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：
１、９：１、または１０：１であり、これは、選択した免疫原とレクチンの特定
の組合せに依存する。所望の場合、少なくとも２、３、４またはそれを越える異
なる免疫原および／またはレクチンが、種々の比率で混合物中に含有され得る。
【００１３】
本発明において有用なレクチンとしては、植物レクチン（例えば、ヤドリギレ
クチンＩ（ＭＬ−１）、ヤドリギレクチンＩＩ（ＭＬ−ＩＩ）、ヤドリギレクチ
ンＩＩＩ（ＭＬ−ＩＩＩ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、およびＵｌｅｘ  ｅ
ｕｒｏｐａｅｕｓ（ＵＥＡ−１）が挙げられる。有用であり得る他のレクチンと
しては、レンズマメレクチン、ナタマメレクチン（コンカナバリンＡ）、および
アスパラガスマメ、ソラマメ、キャメルズフットトリー（ｃａｍｅｌ’ｓ  ｆｏ
ｏｔ  ｔｒｅｅ）、トウゴマ、ソラマメ（ｆａｖａ  ｂｅａｎ）、ヘアリーベッ
チ、ホースグラム、フジ、トウアズキ（Ｊｅｑｕｉｒｉｔｙ）、スコッチラバナ
ム（Ｓｃｏｔｃｈ  ｌａｂｕｒｎｕｍ）、リママメ（ｌｉｍａ  ｂｅａｍ）、月
桂樹、リョクトウ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）、オセージオレンジ、パゴダ状樹木（
Ｐａｇｏｄａ  ｔｒｅｅ）、エンドウマメ、ポテト、アカイインゲンマメ（ｒｅ
ｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ｂｅａｎ）、シベリアマメの木（Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｐｅａ
ｔｒｅｅ）、ニシキギ、スイトピー、トマト、およびウイングドピー（ｗｉｎ
ｇｅｄ  ｐｅａ）のレクチンが挙げられる。
【００１４】
２型のリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）（例えば、ニグリンｂ、塩基性
ニグリンｂ、エブリン１，エブリンｒ、エブリンｆ、ニグリンｆ、ＳＮＡ１、Ｓ
ＮＡＩ、ＳＮＡ  Ｖ、ＳＮＡ  ＶＩ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ、ＳＮＬＲ
Ｐ１、ＳＮＬＲＰ２、リチン、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ，、Ｐｏｌｙｇｏ
ｎａｔｕｍ  ＲＩＰ、シエボルディン−６、アブリン、アブリンＩＩ、モデシン
、ボルケンシン、ＳＳＡ、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Ｅｖａｎｔｈｉ
ｓ  ｈｙｅｍａｌｉｓ、ＲＩＰ、アヤメ凝集素、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−１１、および
ＭＬ−ＩＩＩがアジュバントとして特に有用である。そのようなレクチンとして
は、リボソーム不活化活性を担うＮ−グリコシダーゼＡサブユニット、およびガ
ラクトース特異的糖結合Ｂサブユニットが含まれる（２９）。ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−
ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩは、強力な粘膜アジュバントであり、これは、血清お
よび粘膜分泌物において高い抗体力価を刺激し得る。２型ＲＩＰであって、イン
ビボ毒性を示さないもの（例えば、エブリン−１（３２）、ニグリンｂ（３３）
および塩基性ニグリンｂ（３４））が特に好ましい。あるいは、レクチンは、部
位特異的変異誘発による１つ以上のアミノ酸の改変を行ってレクチンがそのアジ
ュバント特性を保持するが、哺乳動物レシピエントに非毒性になるようにするこ
とによって遺伝子的に「非毒性化」され得る（以下を参照のこと：３５−３９；
ＥＰ  ０８８０３６１；ＥＰ  ６２０８５０；ＥＰ  ９５／９０３８８９．４）
。
【００１５】
レクチンは、好ましくは非結合の水溶性形態で存在する。本発明の混合物中に
おいて使用するための適切なレクチンは、商用供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ）か
ら購入され得る。あるいは、レクチンは、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸
アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、結晶化、エレクトロフォーカシング、および調製ゲル電気泳動を含む
、当該分野において周知のタンパク質精製プロトコルを用いて精製され得る。
【００１６】
細胞性および／または体液性の応答が植物レクチンアジュバントを用いて増強
され得る免疫原としては、感染性因子のタンパク質（例えば、ウイルス、細菌、
マイコプラズマ、プリオンおよび酵母）ならびにホルモン、アレルゲン（例えば
、草、雑草、樹木および植物の花粉、動物（例えば、ネコ、イヌ、ラットおよび
ブタ）の上皮、ハウスダストおよびコムギの籾殻が挙げられる。そのような免疫
原ヲ取得する手段は、当該分野において周知である。免疫源は、植物レクチンの
非存在下で細胞性および／または体液性の応答を惹起し得る必要はない。
【００１７】
本発明の混合物は、レシピエント哺乳動物に種々の処方物として投与され得る
。例えば、混合物はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）のような微粒
子中に捕捉され得るかまたはその表面に吸着され得る（３５，米国特許第５，８
０４，２１２号、同第６，８７６，７６１号および同第５，６０３，９６０号；
ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８）。混合物はまた、生体接着性ポリマー（例えば
、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１２１０５，ＰＣＴ／ＵＳ９９／１１９０６，ならびに米
国特許第５，９５５，０９７号、同第５，８００，８３２号、同第５，７４４，
１５５号、および同第５，８１４，３２９号に記載されるポリマー）とともに投
与され得る。あるいは、混合物の腸処方物は、経口投与の使用され得る（米国特
許第５，９６８，５５４ヲ参照のこと）。
【００１８】
本発明の混合物は、注射（すなわち、皮下、筋肉内または他の非経口の注射（
例えば、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎ
ｅｏｕｓ）の注射、経口または経鼻）によって哺乳動物に投与され得る。
【００１９】
混合物は、免疫応答を増強することが所望される任意の哺乳動物に投与され得
る。そのような動物としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ラット
、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ウシ、マウス、モルモット、チンパンジー、ヒヒ
、およびヒト。
【００２０】
粘膜投与（特に、一方または両方のいずれかの鼻孔への鼻内投与）が好ましい
。用量は、１以上の小滴またはスプレー（例えば、エアゾールもしくは非エアゾ
ールスプレー）を用いて送達され得る。所望の場合、混合物の複数回の投与を用
いて特定の免疫原に対する抗体力価を上昇させ得る。複数回投与の間の間隔は、
混合物中の特定の免疫原および／またはレクチンに依存して、少なくとも１日、
２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日、またはそれを超える日数か、ある
いは少なくとも２週間、３週間もしくは４週間またはそれを超える週数であり得
る。投与されるべき混合物の容量は、投与形態および哺乳動物の大きさに従って
変動する。鼻内投与のための代表的な容量は、１鼻内用量あたり、少なくとも５
、１０、１５、２５、５０、７５、１００、２００または２５０μｌから、少な
くとも５００またはそれを超えるμｌで変動する。
【００２１】
混合物中の免疫原の濃度もまた、特定の免疫原および選択される投与の経路に
従って変動する。鼻内投与について、例えば、混合物中の免疫原の濃度は、少な
くとも０．０３３μｇ／μｌ、０．０６７μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、０．
２μｇ／μｌ、０．３３μｇ／μｌ、０．５μｇ／μｌ、０．６７μｇ／μｌ、
０．７５μｇ／μｌ、１μｇ／μｌ、２μｇ／μｌ、２．５μｇ／μｌ、５μｇ
／μｌ、７．１μｇ／μｌ、１０μｇ／μｌ、１２．５μｇ／μｌ、１５μｇ／
μｌ、１７．５μｇ／μｌ、２０μｇ／μｌまたは２５μｇ／μｌの間を変動す
る。
【００２２】
本発明の混合物は、好ましくは、抗体産生およびＴ細胞応答を増強する。これ
には、サイトカイン産生、標的細胞殺傷、マクロファージ活性化、Ｂ細胞活性化
、およびリンホカイン産生が含まれる。本発明の混合物は好ましくは、職部連れ
クチンの非存在下で単独で免疫原に対そのような応答に比較して、Ｔ細胞応答ま
たは抗体力価を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、
５０％、７５％または１００％またはそれを超える程度増加させる。
【００２３】
Ｔ細胞応答を測定する方法は、当該分野において周知である。例えば、以下を
参照のこと：Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９７，ＩＭＭＵＮ
ＯＢＩＯＬＯＧＹ：ＴＨＥ  ＩＭＭＵＮＥ  ＳＹＳＴＥＭ  ＩＮ  ＨＥＡＬＴＨ
ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥ，３ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．２：３１−２−３３；Ａｂｂ
ａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．２５０−２７７、ｐｐ．２９
０−２９３）。
【００２４】
本発明に従って、混合物中の免疫原に対して指向される抗体が産生され得る。
免疫現に特異的に結合する抗体は、代表的に、免疫化学アッセイ（例えば、ウェ
スタンブロット、ＥＬＩＳＡ，放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫
沈降または当該分野において公知の他の免疫化学アッセイ）において使用される
他のタンパク質で提供される検出シグナルよりも、少なくとも５倍、１０倍また
は２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、特定の免疫現に特異的に結
合する抗体は、免疫化学アッセイにおける他のタンパク質を検出せず、溶液から
免疫原を沈降させ得る。
【００２５】
抗体力価は、好ましくは、以下の実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡによ
って測定される。免疫原に対して指向される、ＩｇＧ（ＩｇＧサブタイプＩｇＧ
１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）ならびにＩｇＡ抗体は、血清、唾
液、および粘膜分泌物（膣内洗浄液、鼻洗浄液、および腸洗浄液を含む）におい
て測定され得る（実施例１を参照のこと）。
【００２６】
この開示において引用されるすべての特許および特許出願のすべての内容は、
明示的に本明細書において援用される。
【００２７】
以下の実施例は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲を制限する
意図はない。これは、上記に広い意味で記載してきた。
【００２８】
（実施例１：材料および方法）
免疫原およびレクチン。コレラ毒素（ＣＴ）、オボアルブミン（ＯＶＡ、Ｖ型
、鶏卵）およびＷＧＡを、Ｓｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から入手した。イン
ゲンマメは、以前に記載のように（１５）調製した。ＵＥＡ−ＩおよびＬＥＡを
、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＭＬ−Ｉを、以前に
記載のように分離した（１６）。
【００２９】
動物。８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｏｌａｃ，Ｂｉｃｅ
ｓｔｅｒ，ＵＫ）に自由に市販の食餌および水に対するアクセスを与えた（Ｌａ
ｂｓｕｒｅ，Ｍａｎｅａ，ＵＫ）。
【００３０】
粘膜免疫スケジュール。マウスのグループ（ｎ＝１０）から、最初の免疫前１
週間に採血した。１日目、１４日目、２８日目および４２日目に、マウスを、以
下のもので鼻内免疫した：ＰＢＳ、ＯＶＡ（１０μｇ）単独またはＣＴ（１ＣＴ
（１μｇ）、ＭＬ−１（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、
ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−Ｉ（１０μｇ）とＯＶＡ（１０μｇ）との
混合物。別の例において、マウスを、５μｇの単純ヘルペスウイルス２型の糖タ
ンパク質Ｄ２（ｇＤ２）で、１日目、１４日目、２８日目および４９日目に、単
独または１μｇのＣＴ、ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩまたはＭＬ−ＩＩＩとともに鼻内
免疫した。マウスに３０μｌの各々の調製物（１鼻孔あたり１５μｌ）を、ピペ
ットに付着したファインチップを通じて与えた。
【００３１】
血液および粘膜の分泌物の収集物。血液サンプルを各々の免疫の１日前に、３
７℃での１０分間のインキュベーション後に尾静脈から採血することによって収
集した。最終免疫後２週間で、動物を最終麻酔して（ヒプノリンおよびジアゼパ
ム）唾液および膣の分泌物の収集を可能とした。ついで、マウスを、麻酔の過剰
投与によって殺傷し、ついで放血した。血液をすぐに収集し、そして遠心分離し
、そして血液を−２０℃で格納した。
【００３２】
吸着性セルロースウイック（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，
ＵＫ）を、以前に記載されるように（１７）唾液および膣液の収集のために用い
た。洗浄流体（氷冷、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＰＭ
ＳＦ、５μｇ／ｍｌアプロチニン）をウイックからの抗体の溶出に、ならびに鼻
および腸洗浄のために用いた。唾液を、ウイックチップを２分間口に挿入するこ
とによって収集した（１７）。抗体を、ウイックから４００μｌの粘膜洗浄流体
から抽出した。膣液を、５０μｌの洗浄液の反復フラッシングおよび吸引ならび
にウイックの２分間の挿入によって収集した。抗体を、ウイックから４００μｌ
の洗浄液へと抽出した。
【００３３】
鼻気管洗浄液を、０．５ｍｌの粘膜洗浄液を気管からバックフラッシュするこ
とによって断頭した動物から収集した。腸洗浄液を、１０ｍｌの氷冷洗浄液で小
腸をフラッシュすることによって得た。すべての分泌物を、分析に必要となるま
で−２０℃で格納した。
【００３４】
ＥＬＩＳＡによる特定の抗体の検出。ＥＬＩＳＡを設定して、ＯＶＡ、ＣＴお
よび植物レクチンに対する特定のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＧサブクラスを測定
可能にした。血清（１；１００から）および粘膜分泌物（１：２から）を、適切
な希釈緩衝液中で力価測定した。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｎ  ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、炭酸重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中の１ウェルあた
り７５μｌの免疫原でコーティングし（ＣＴ／レクチンについて１μｇ／ｍｌ、
５０μｇ／ｍｌ（ＯＶＡに対する応答を測定するとき）および２μｇ／ｍｌ（ｇ
Ｄ２に対する応答を測定するとき））、そして４℃で一晩インキュベートした。
洗浄後、プレートを２％ゼラチン／希釈緩衝液でブロッキングし、そして３７℃
で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてサンプルを添加し、連
続希釈し、そして３７℃で１時間インキュベートした。
【００３５】
希釈緩衝液中のビオチン化抗血清を添加し、そして３７℃で１時間インキュベ
ートした。さらなる洗浄後、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓ
ｉｇｍａ）（希釈緩衝液中１：７５０希釈）を添加し、そして３７℃で３０分間
インキュベートした。プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルの現像液（Ｔ
ＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（１−Ｃ），Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  
ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）を加えた。プレートを、暗がりで３７℃で３０分間振盪しながらインキュ
ベートした。この反応を、１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4の添加により停止し、そして吸光度を
４５０ｎｍで読んだ。
【００３６】
ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液は以下のとおりであった：ＣＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ（ＰＢＳＴ））、ＯＶＡ（ＰＢＳＴ）、ＷＧＡ（１００ｍＭ  Ｎ−アセチ
ルグルコサミン／ＰＢＳＴ）、ＰＨＡ（０．１％  フェチュイン／ＰＢＳＴ）、
ＵＥＡ−Ｉ（３０ｍＭ  Ｌ−フコース／ＰＢＳＴ）、ＬＥＡ（キチン加水分解物
（１：２００）（Ｖｅｃｔｏｒ）／ＰＢＳＴ）、ＭＬ−１（１００ｍＭ  Ｄ−ガ
ラクトース／ＰＢＳＴ）。抗ＩｇＧ（１：８０００）およびＩｇＡ（１：２６０
０）のビオチン化捕捉血清（Ｓｉｇｍａ）の作業希釈液を、予備免疫し、そして
プールした陽性血清での予備的アッセイの後に決定した。ＩｇＧのサブクラス抗
血清の作業希釈液（Ｓｅｒｏｔｅｃｔ）を、製造業者が推奨するとおりであった
（ＩｇＧ１（１：４０００）、ＩｇＧ２ａ（１：４０００）、ＩｇＧ２ｂ（１：
２０００）、ＩｇＧ３（１：２０００））。末端点の力価を、血清または粘膜の
サンプルの希釈として決定し、これは、同じ希釈でのコントロールサンプルの平
均よりも０．１単位大きなＯＤを与えた。
【００３７】
総ＩｇＡを、以下の改変を用いて特異的ＩｇＡとして定量した：プレートを、
ヤギ抗マウスＩｇＡ（１：８０００；ａ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）でコーティング
した。ＰＢＳＴを希釈液として用い、そしてＰＢＳＴ中の２％ゼラチンをブロッ
キング溶液として用いた。総ＩｇＡレベルを、ＩｇＡ（ＩｇＡκ、Ｓｉｇｍａ）
標準曲線の直線領域から算出した。総ＩｇＡの末端点力価は、サンプルの希釈と
して決定し、これは、緩衝液単独よりも０．１単位大きなＯＤを与えた。
【００３８】
統計：データを、平均±標準偏差として表す。ついになっていない両側ｔ検定
を用いてグループの間の有意性を試験した。標準偏差がグループ間で有意に異な
った場合、非母数検定（Ｄｕｎｎの多数比較事後検定（ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）で
のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を行った。Ｄｕｎｎの多数比較事後検定
でのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ日母数検定はまた、総ＩｇＡデータの有意性
を評価するためにも用いた。
【００３９】
（実施例２：血清および分泌物における総ＩｇＡレベルに対する免疫の効果）
マウスを、１日目、１４日目、２８日目および４２日目に、ＰＢＳ、ＯＶＡ（
１０μｇ）単独またはＯＶＡ（１０μｇ）とＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ
）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵ
ＥＡ−１（１０μｇ）とをともにもちいて鼻内経路により免疫した。サンプルを
、最後の免疫の２週間後に収集した。結果を図１に示す。データは、平均±ＳＤ
をあらわす。
【００４０】
ＣＴ＋ＯＶＡでの４回の鼻内免疫後、総鼻気管洗浄ＩｇＡ（ｐ＜０．０１）の
濃度は、すべての他のグループと比較して有意に増加していた。ＣＴとＯＶＡと
の同時投与は、血清においても他のサンプリングした粘膜分泌物においても総Ｉ
ｇＡ濃度において有意な増加を生じなかった。分泌物または血清のいずれかにお
ける総ＩｇＡレベルにおける植物レクチンのいずれかでの免疫の有意な効果はな
かった。
【００４１】
（実施例３：植物レクチンの、ＯＶＡ特異的血清抗体応答に対するアジュバン
ト効果）
マウスを、鼻内で１日目、１４日目、２８日目、および４２日目に、ＯＶＡ（
１０μｇ）単独、またはＯＶＡ（１０μｇ）単独またはＯＶＡ（１０μｇ）とＣ
Ｔ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）
、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−１（１０μｇ）とをともにもちいて鼻内
経路により免疫した。血清を、各々の免疫の１日前および研究の停止の前に収集
した。図２Ａ−Ｄは、この実験の結果を示す。点は、個々のデータを示し、そし
てシンボル（−）は平均力価を示す。
【００４２】
単回免疫後２週間で、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧは、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫された
マウス中で５／１０で、およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫されたマウスの１／１０
中で検出されたが、ＯＶＡ特異的ＩｇＧは、他のグループでは検出されなかった
。第二の投与の後、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したすべてのマウスにおいて（平均力価
４０３２１）、およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスの９／１０（平均力価
１１０９０）において、より高い応答が検出可能な抗体を用いて測定された。他
のグループのなかでは、特異的ＩｇＧは、ＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウス
においてのみ検出された（平均力価９１）。
【００４３】
４回の投与の後、最高の平均ＩｇＧ力価は、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したマウスに
おいて存在した。これは、ＯＶＡ単独を受けたマウスよりもおよそ２８６倍高か
った。ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したグループにおける平均力価は、約ＯＶＡ単独
を受けたマウスにおけるよりも１１８倍高かった。ＰＨＡ＋ＯＶＡで免疫下マウ
スにおける力価は、ＯＶＡ単独で投与したマウスにおける力価に類似していた。
ＬＥＡ＋ＯＶＡの投与は、ＯＶＡ単独に比較して平均力価の少量の増加を生じた
（５倍）。ＯＶＡとＷＧＡおよびＵＥＡ−Ｉとの送達は、ＯＶＡ単独に比較して
、平均血清ＩｇＧ抗ＯＶＡ力価におけるそれぞれ４１倍および５１倍の増加を生
じた。
【００４４】
ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡを受けたグループとは対照的に、ＷＧＡ
またはＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したグループにおける応答は、かなり変動性で
あった。結果として、最終投与後には、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡグ
ループのみ（相違はグループ間で有意ではなかった）は、ＯＶＡ単独グループよ
りも有意に高い（ｐ＜０．００１）平均ＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価を有した。これ
らのグループにおける力価はまた、ＰＨＡ＋ＯＶＡグループ（ｐ＜０．００１）
よりも有意に高かった。
【００４５】
高レベルの特異的ＩｇＧとは対照的に、非常に低い力価のＯＶＡ特異的血清Ｉ
ｇＡが検出された。事実、最終投与後、有意なレベルのＯＶＡ特異的血清ＩｇＡ
は、ＣＴ＋ＯＶＡ（平均力価、２２０）およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ（平均力価、８
０）で免疫したマウスにおいてのみ検出された。
【００４６】
（実施例４：ＯＶＡ特異的ＩｇＧサブクラスパターン）
マウスを、１日目、１４日目、２８日目および４２日目に、ＯＶＡ（１０μｇ
）単独またはＯＶＡ（１０μｇ）とＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥ
Ａ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）もしくはＵＥＡ−１
（１０μｇ）とをともにもちいて鼻内経路により免疫した。サンプルを、最終免
疫後２週間で収集した。図３は、この実験の結果を示す。ここのデータに当たる
点およびシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００４７】
ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体のサブクラスプロファイルの分析は、非常に偏重のか
かった応答を示した。ＩｇＧ１力価は、ほとんどのグループにおけるＯＶＡ特異
的ＩｇＧの力価に類似した。ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免
疫したマウスにおいて、その平均力価は、ＯＶＡ単独で面益したマウスよりもそ
れぞれ約４５０倍および２５５倍高かった。ＣＴ＋ＯＶＡグループにおける力価
は、ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ（ｐ＜０．０５）を除いてすべての郡において有意に高か
った。ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡグループにおける力価は、ＯＶＡ単独を受けたグループ
よりも、ＰＨＡ＋ＯＶＡを受けたグループよりも有意に高かった（ｐ＜０．００
１）。
【００４８】
ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａは、それぞれ８／１０および２／１０のＣＴ＋ＯＶＡ
（平均力価５６１）およびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡ（平均力価３３１）で免疫したマウ
スにおいて検出された。特定のＩｇＧ２ａは、他のグループにおいて検出されな
かった。特異的なＩｇＧ２ｂは、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫したマウスの２／１０にお
いてのみ検出され、他のグループではなんら検出されなかった。特異的なＩｇＧ
３は、検出されなかった。これらのデータは、これらのマウスにおけるＣＴ特異
的ＩｇＧアイソタイプ応答に対して驚くほど異なり、ここで、比較的高力価の特
異的ＩｇＧ２ａおよび有意なレベルのＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３が検出された（
表１）。
【００４９】
（実施例５：ＯＶＡ特異的粘膜ＩｇＡ応答に対する植物レクチンのアジュバン
ト効果）
マウスをＯＶＡ（１０μｇ）単独、またはＣＴ（１μｇ）ＭＬ−Ｉ（１μｇ）
、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨＡ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）、またはＵＥ
Ａ−Ｉ（１０μｇ）と共にＯＶＡ（１０μｇ）で、１日目、１４日目、２８日目
、および４２日目に鼻内免疫した。力価を最終免疫の２週間後に測定した。結果
を図４Ａ〜Ｄに示す。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）は、平均
力価を表す。
【００５０】
特異的ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにお
いてサンプリングした全ての粘膜部位で検出された。２つの群の間には、有意な
差異はなかった。ＯＶＡ特異的唾液ＩｇＡは、ＯＶＡ単独、ＬＥＡ＋ＯＶＡまた
はＰＨＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては検出されず、ＷＧＡ＋ＯＶＡおよ
びＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免疫したマウスでは、１０匹のうちそれぞれ２
匹および４匹において検出された。逆に、特異的唾液ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡお
よびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ免疫したマウスでは、１０匹のうちそれぞれ９
匹および１０匹において測定され、これはＣＴ＋ＯＶＡ群における平均力価の２
倍以上である。
【００５１】
膣洗浄では、ＯＶＡ特異的ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡの
それぞれで免疫したマウスにおいて、１０匹のうち９匹および７匹で検出された
。平均力価は、ＣＴ＋ＯＶＡ群において４倍高かったが、これは、大きくは、１
つの高い応答者の結果であった。ＯＶＡ特異的膣洗浄液ＩｇＡは、ＰＨＡ＋ＯＶ
Ａで免疫したマウスにおいて検出されず、ＯＶＡ単独、ＬＥＡ＋ＯＶＡ、または
ＷＧＡ＋ＯＶＡのいずれかで免疫したマウスにおいて１０匹のうち１匹において
検出され、そしてＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては１０匹のうち
３匹において検出された。
【００５２】
ＯＶＡ特異的ＩｇＡの高い力価は、ＣＴ＋ＯＶＡまたはＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免
疫した全てのマウスからの経鼻気管洗浄液で検出された。これは、ＣＴ＋ＯＶＡ
群においておよそ５倍高い力価であった。ＯＶＡ特異的経鼻気管洗浄液ＩｇＡ力
価は、ＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡを除く全ての群においてよりも、ＣＴ＋ＯＶＡで免疫し
たマウスにおいて有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００５３】
顕著なことに、これらの群におけるＯＶＡ特異的経鼻気管洗浄液ＩｇＡ力価は
、血清ＩｇＡ力価に匹敵した。ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡでそれぞれ
免疫したマウス由来の血清中の総ＩｇＡ力価は、それぞれ経鼻気管洗浄液におい
て３３倍および７３倍高かった。特異的ＩｇＡは、ＯＶＡ単独で免疫したマウス
において１０匹のうち１匹の経鼻気管洗浄液で検出されたが、ＰＨＡ＋ＯＶＡで
免疫したマウスでは検出されなかった。ＯＶＡ特異的経鼻気管洗浄液ＩｇＡは、
ＷＧＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては１０匹のうち７匹で測定され、そし
てＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡまたはＬＥＡ＋ＯＶＡのそれぞれで免疫したマウスにおい
ては１０匹のうち５匹で測定された。
【００５４】
ＯＶＡ特異的ＩｇＡは、ＣＴ＋ＯＶＡまたはＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫した全て
のマウスからの腸洗浄液において検出され、ＣＴ＋ＯＶＡ群においておよそ４倍
高い力価であった。これらの群における力価は、互いには有意に異ならないが、
他の全ての群におけるよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。他の群の間では
、ＯＶＡ特異的腸洗浄液ＩｇＡは、１：２の最大力価で散発的にのみ検出された
。
【００５５】
（実施例６：ＣＴ／植物レクチン特異的応答）
マウスを、ＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＬＥＡ（１０μｇ）、ＰＨ
Ａ（１０μｇ）、ＷＧＡ（１０μｇ）、またはＵＥＡ−Ｉ（１０μｇ）と共にＯ
ＶＡ（１０μｇ）で１日目、１４日目、２８日目、および４２日目に鼻内免疫し
た。結果を図５Ａ〜Ｆに示す。データは平均±ＳＤで示す。データは、免疫原の
最終投与の２週間後に測定された特異的血清ＩｇＧの力価である。
【００５６】
ＣＴ特異的血清ＩｇＧは、ＣＴ＋ＯＶＡの一回の投与後に全ての動物において
検出され、そして力価は、この後の各投与で増大した。全ての４つのＩｇＧサブ
クラスの特異的抗体は、４回の投与後の血清中で検出された（表１）。最も高い
力価は、ＩｇＧ１であった。一方、ＣＴ特異的ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩ
ｇＧ３もまた検出された。最終投与後、ＣＴ特異的血清ＩｇＡは、全てのマウス
において検出され、平均力価は４４８１であった。
【００５７】
特異的ＩｇＡはまた、唾液、膣洗浄液、経鼻気管洗浄液、および腸洗浄液にお
いては全ての動物において検出された。唾液ＩｇＡ力価は、動物間で比較的一致
していた（血清中よりもおよそ１０倍低い平均力価）。これらのマウス由来の唾
液中の全ＩｇＡ力価は、血清中よりも１３４０倍低かった。膣ＩｇＡ力価は、非
常に可変性であり、単一の高い応答者が平均力価を増大した。ＣＴ特異的ＩｇＡ
の高い力価は、全ての動物からの経鼻気管洗浄液において測定され、平均力価は
、血清ＩｇＡ力価に匹敵した。特異的ＩｇＡはまた、全てのマウスの腸洗浄液に
おいても検出されたが、サンプリングされた他の粘膜部位でよりも低い平均力価
であった。
【００５８】
単回用量のＭＬ−１＋ＯＶＡの鼻内送達は、１０匹のマウスのうち３匹におい
てＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧの産生を刺激した。二回目の投与およびその後の投与後
に、高い力価の特異的ＩｇＧが全てのマウスにおいて検出された（図５）。ＭＬ
−Ｉ特異的血清ＩｇＧサブクラスの分析は、高い力価のＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧ１
を見出した（表１）。ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂもまた検出さ
れたが、特異的ＩｇＧ３は検出されなかった。ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＡは、血清中
、および４回投与後にサンプリングした全ての粘膜部位で、全てのマウスにおい
て検出された。唾液中の力価は、全ての動物について一致したが、単一の非常に
高い応答者が、膣洗浄液の平均力価を増大した。高ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＡ力価が
、全ての動物の経鼻気管洗浄液において測定された。ＣＴを用いるのと同様に、
経鼻気管洗浄液における平均ＭＬ−Ｉ特異的力価は、血清ＩｇＡ力価と匹敵し（
およそ２倍低い）、これは、経鼻気管洗浄液における全ＩｇＡ力価がこれらのマ
ウスに由来の血清中におけるよりも７３倍低いので顕著なことであった。特異的
ＩｇＡはまた、全ての動物からの腸洗浄液においても検出された。
【００５９】
ＬＥＡ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおいては、ＬＥＡ特異的血清ＩｇＧは、１
回の投与後に１０匹のマウスのうち９匹で検出された。力価は、その後の各投与
後に、最終免疫後の比較的高いレベルにまで増大した（図５）。ＩｇＧサブクラ
スの分析は、高い力価のＬＥＡ特異的ＩｇＧ１および低い平均ＩｇＧ２ａ力価を
見出した（表１）。特異的血清ＩｇＡは、４回の投与後に１０匹のマウスのうち
７匹において、低いレベルであるが検出された。特異的ＩｇＡはまた、試験した
４つの全ての粘膜分泌物において検出されたが、ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋
ＯＶＡ群におけるデータに比較して、力価は非常に可変性であった。
【００６０】
ＰＨＡ特異的血清ＩｇＧは、ＰＨＡ＋ＯＶＡの一回の投与後に１０匹のマウス
のうち１匹で検出された。その後の投与後に、力価は増加し、そして特異的Ｉｇ
Ｇは、最終の投与後に１０匹の動物のうち８匹において存在した（図５）。Ｉｇ
Ｇサブクラスのうち、特異的ＩｇＧ１のみが検出された（表１）。全ての動物に
おいて、低い力価の特異的血清ＩｇＡが検出された。ＰＨＡ特異的ＩｇＡは、唾
液においても膣洗浄液において検出されなかったが、経鼻気管洗浄液においては
、１０匹のマウスのうち５匹において、腸洗浄液においては１０匹のマウスのう
ち１匹において検出された。
【００６１】
最も低い力価の特異的抗体は、ＷＧＡ＋ＯＶＡの４回の投与後であってもＷＧ
Ａに対して惹起された（図５）。特異的ＩｇＧ１は、１０匹のマウスのうち２匹
において検出され、そして他のＩｇＧサブクラスは、検出されなかった（表１）
。特異的ＩｇＡは、４回の投与後に、最大力価の１：１００であるが、多数のマ
ウスにおいて検出された。低い力価の特異的ＩｇＡが、唾液、膣洗浄液、および
経鼻気管洗浄液において、少数のマウスにおいて測定された。これらのデータは
、この群（ここでは、比較的高いレベルのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧが多数のマウ
スで検出された）からのＯＶＡ特異的データと対照的である。
【００６２】
ＵＥＡ−Ｉ特異的血清ＩｇＧは、ＵＥＡ−Ｉ＋ＯＶＡの１回の投与後に検出さ
れなかったが、その後の投与後では検出され、そして最終投与後には１０匹のマ
ウスのうち８匹において検出された（図５）。特異的ＩｇＧ１は、最終の投与後
に１０匹のマウスのうち９匹のマウスにおいて検出された（表１）が、特異的Ｉ
ｇＧ２ａは、１０匹のマウスのうち１匹で、そしてＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３は
検出されなかった。特異的血清ＩｇＡは、最終投与後に１０匹のマウスのうち３
匹において検出された。比較的低いレベルのＩｇＡが、唾液、膣洗浄液、および
経鼻気管洗浄液において検出された。
【００６３】
本データは、アジュバントに対しておよび免疫原に対して惹起される応答のタ
イプが異なり得ることを示す。高い力価の特異的ＩｇＧ１が、ＯＶＡおよびＣＴ
の両方に対して検出されたが、比較的高い力価のＣＴ特異的ＩｇＧ２ａが測定さ
れる一方、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａはほとんどまたは全くなかった。ＭＬ−Ｉ＋
ＯＶＡの送達は、同様の結果に至ったが、一方ＭＬ−Ｉ特異的ＩｇＧ２ａ力価は
比較的低かった。以前の研究は、ＯＶＡ＋ＣＴの送達後にＩｇＧ２ａ力価よりも
高いＯＶＡ特異的ＩｇＧ１を見出したが、同じマウスにおいてＩｇＧ１よりも高
い力価のＣＴ特異的ＩｇＧ２ａが見いだされた（２４）。ＣＴ＋キーホールリン
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をマウスに供給することは、ＣＴに対して高い応
答者であるマウスにおいて強いＫＬＨ特異的分泌ＩｇＡ応答を刺激し、乏しい応
答者においてはずっと小さい効果であった（２９）。従って、ＣＴの経口アジュ
バント効果は、ＣＴそれ自体に対する強い免疫応答に依存した。しかし、ＷＧＡ
およびＵＥＡ−Ｉは、ＯＶＡに対する血清ＩｇＧ応答を増大し（有意ではないが
）、高度に免疫原性ではなかった。近年の研究は、いくつかの食物レクチン（Ｐ
ＨＡを含む）が、ヒト好塩基球を誘発してＩＬ−４およびＩＬ−１３を放出し得
たことを見出した。例えば、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ−Ｅは、ＩＬ−４レベルを抗
ＩｇＥ抗体での刺激により得られるレベルと同程度に高くに誘導した。高レベル
のＩＬ−４を刺激したレクチンはまた、おそらくＩＬ−４（これは、Ｔｈ２タイ
プ応答に転換するのに必要である（３０））を誘導することにより、ＩＬ−１３
およびヒスタミンの放出を誘導した。
【００６４】
ＣＴまたはＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫したマウスにおけるＯＶＡに対する抗血清
ＩｇＧ力価の誘導にも関わらず、血清ＩｇＡは、わずかに検出可能であった。以
前の研究は、免疫原特異的血清ＩｇＡは、Ｖ．  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｚｏｔタン
パク質またはＬＴ＋ＯＶＡでの２回の鼻内免疫後、マウスにおいて検出されなか
ったことを見出した（１９）。同様に、ＬＴ＋ＴＴの経口送達は、ＴＴに対する
高レベルの血清ＩｇＧ抗体を刺激したが、一方、抗ＴＴ血清ＩｇＡは検出されな
かったことが見いだされた（２３）。ＣＴおよびＭＬ−Ｉは、全ての粘膜分泌物
において抗ＯＶＡ  ＩｇＡを有効に刺激したが、レベルは、経鼻気管洗浄液およ
び唾液において最も高かった。ＣＴ＋ＯＶＡおよびＭＬ−Ｉ＋ＯＶＡで免疫した
マウスにおける全血清ＩｇＡ力価はそれぞれ、経鼻気管洗浄液において３３倍お
よび７３倍高く、そして唾液において１３４０倍および１１７６倍高かったので
、これらの部位でのＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価は、局所応答の誘導を示す。膣洗浄
液における抗体力価は、非常に可変性であったが、これは、ホルモン影響を反映
し得る（３１）。
【００６５】
【表１】
2011098986.tif 000002
（実施例７：欧州ヤドリギ（Ｖｉｓｃｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来の３つの異なる
レクチン（ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩ）は、鼻内投与後のｇＤ
２特異的血清ＩｇＧ抗体の力価を増大させる）
これらの３つのレクチンの各々の１μｇを、５μｇの単純ヘルペスウイルス２
型由来糖タンパク質Ｄ２（ｇＤ２）と混合し、そして上記のように１日目、１４
日目、２８日目および４９日目にマウスに鼻内送達した。他のマウスを、５μｇ
ｇＤ２単独または１μｇ  ＣＴと混合した５μｇ  ｇＤ２で鼻内免疫した。血
清を、各免疫の１日前、および研究の終了時に採集した。ｇＤ２特異的血清Ｉｇ
Ｇ抗体の力価を上記のように測定した。
【００６６】
結果を図６Ａ〜Ｄに示す。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）は
、平均力価を表す。この３つのヤドリギレクチンの各々は、ＣＴによって示され
るのに匹敵するアジュバント活性を示した。
【００６７】
（実施例８：鼻内投与後のｇＤ２特異的血清ＩｇＧサブクラス抗体の力価の増
加）
マウスを、１日目、１４日目、３５日目、および４９日目に、ｇＤ２単独（５
μｇ）またはＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１μｇ）、も
しくはＭＬ−ＩＩＩ（１μｇ）と共にｇＤ２  （５μｇ）のいずれかで鼻内免疫
した。サンプルを最終免疫の２週間後に採集した。データは、最終免疫の２週間
後に測定した力価である。図７Ａ、ＩｇＧ１；図７Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図７Ｃ、Ｉ
ｇＧ２ｂ；図７Ｄ、ＩｇＧ３。点は、個々のデータを参照し、そして記号（−）
は、平均力価を表す。括弧内のｐ値は、ｇＤ２のみ群と比較したデータの有意性
を参照する。
【００６８】
血清特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂ抗体の力価は、３つのヤ
ドリギレクチンの各々で処置したマウスにおいて増大した。
【００６９】
（実施例９：ＭＬ−Ｉ、ＭＬ−ＩＩ、およびＭＬ−ＩＩＩは、鼻内免疫後にマ
ウスにおいてｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を増大する）
ｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価は、１日目、１４日目、３５日目、および４９日
目に、ｇＤ２（５μｇ）単独またはＣＴ（１μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１μｇ）、ＭＬ
−ＩＩ（１μｇ）もしくはＭＬ−ＩＩＩ（１μｇ）と共にｇＤ２（５μｇ）のい
ずれかで鼻内免疫したマウスの分泌において測定された。データは、図８におい
て、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図８Ａ、唾液；図８Ｂ、膣洗浄
液；図８Ｃ、鼻内気管洗浄液；図８Ｄ、腸洗浄液。点は、個々のデータを参照し
、そして記号（−）は、平均力価を表す。括弧内のｐ値は、ｇＤ２のみ群と比較
したデータの有意性をいう。
【００７０】
ヤドリギレクチンの各々は、試験した分泌物の各々におけるｇＤ２特異的Ｉｇ
Ａ抗体の力価を増大した。
【００７１】
表２は、ｇＤ２（５μｇ）を単独またはＣＴ／植物レクチン（１μｇ）と共に
用いて鼻内免疫したマウスにおけるレクチン特異的抗体応答を示す。マウス（ｎ
＝１０）を０日目、１４日目、２８日目、および４２日目に免疫し、そしてサン
プルを５６日目および５７日目に採集した。
【００７２】
【表２】
2011098986.tif 000003
（実施例１０  非毒性ＩＩ型ＲＩＰおよび関連する分子の粘膜免疫原性および
アジュバント活性）
非毒性型ＩＩ型ＲＩＰ（ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ、エブリンｒＩ）およ
びそれらのＢ型サブユニットに関連する分子（ＳＮＡ  ＩＩ、ＳＥＬｆｄ）の粘
膜（鼻腔内）免疫原性およびアジュバント活性を、ＭＬ−１およびＣＴのそれと
比較した。マウスを、ｇＤ２（５μｇ）単独および植物レクチンまたはコレラト
キシン（ＣＴ）（１μｇ）とともに鼻内免疫した。マウスを
、０、２１、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６および５７日目に
収集した。レクチン特異的応答およびバイスタンダー抗原であるｇＤ２に対する
応答を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７３】
図９は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、また
はｇＤ２（５μｇ）を１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、ニグリンＢ、塩基性ニグリンＢ
、エブリンｒＩ、ＳＮＡ  ＩＩ、またはＳＥＬｆｄを用いて、鼻腔内に免疫した
マウスからのｇＤ２特異的な総血清ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラス力価を示す。
血清を研究の終わりに収集した。個々のデータおよびシンボル（−）に言及する
点は、平均力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデ
ータの有意性をいう。
【００７４】
図１０は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、ま
たはｇＤ２（５μｇ）を１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、ニグリンＢ、塩基性ニグリン
Ｂ、エブリンｒＩ、ＳＮＡ  ＩＩまたはＳＥＬｆｄを用いて、鼻腔内免疫したマ
ウスの分泌液において測定したｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を示す。データは、
（ａ）唾液、（ｂ）膣内洗浄、（ｃ）経鼻洗浄、（ｄ）腸洗浄における最終免疫
の２週間後に測定した力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボ
ル（−）は、平均の力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比
較したデータの有意性に言及する。
【００７５】
表３は、ＩＩ型  ＲＩＰおよび関連する分子の免疫原性を示す。抗体応答は、
ｇＤ２（５μｇ）単独、またはＣＴ／レクチン（１μｇ）とともに用いて鼻腔内
免疫したマウスにおいて測定した。マウスのグループ（ｎ＝１０）を、０、１４
、２８、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６および５７日目に収集
した。
【００７６】
【表３】
2011098986.tif 000004
図１１は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、ま
たはｇＤ２（５μｇ）と１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、またはＵＥＡ−１とを用いて
経鼻免疫したマウスにおいて測定されたｇＤ２特異的血清ＩｇＡおよびＩｇＧ抗
体力価を示す。データは、最終免疫の２週間後に測定された力価である。点は、
個々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。カッコ内の
ｐ値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７７】
図１２は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、ま
たはｇＤ２（５μｇ）と１μｇのＣＴ、ＭＬ−１、またはＵＥＡ−１とを用いて
経鼻免疫したマウスにおいて測定したｇＤ２特異的サブクラス抗体力価を示す。
データは、最終免疫の２週間後に血清において測定された力価である。点は、個
々のデータに言及し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。カッコ内のｐ
値は、ｇＤ２のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７８】
図１３は、１日目、２１日目、および４２日目に、ｇＤ２（５μｇ）単独、ま
たはｇＤ２（５μｇ）を１μｇのＣＴ、ＭＬ−１またはＵＥＡ−１を用いて、鼻
腔内免疫したマウスの分泌液において測定したｇＤ２特異的ＩｇＡ抗体力価を示
す。データは、（ａ）唾液、（ｂ）膣内洗浄、（ｃ）経鼻洗浄、（ｄ）腸洗浄に
おける最終免疫の２週間後に測定した力価である。点は、個々のデータに言及し
、そしてシンボル（−）は、平均の力価を表す。カッコ内のｐ値は、ｇＤ２のみ
のグループと比較したデータの有意性に言及する。
【００７９】
図１４は、ＩＬ−５、ＩＬ−４、およびＩＦＮ生産の平均濃度、および、ｇＤ
２、ＭＬ−１、またはＵＥＡ−１を用いて、またはｇＤ２をＭＬ−１、ＵＥＡ−
１、またはＬＴＫ６３とともに用いての、３回の免疫（０日目、２１日目、４２
日目）の８週間後の、（ａ）脾臓細胞および（ｂ）子宮頚管リンパ節におけるＴ
細胞増殖アッセイについての１分あたりの計数を示す。脾臓細胞および子宮頚管
リンパ節細胞を単離し、そしてインビトロでｇＤ２（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍ
ｌ、または５μｇ／ｍｌ）または１：１０００もしくは１：５０００に希釈して
ラテックスビーズに結合させたｇＤ２、またはＰＭＡ／ｃｄ３で刺激した。
【００８０】
図１５は、１日目、１４日目、２８日目、および４９日目に、ＯＶＡ（５ｍｇ
）単独、またはＯＶＡ（５ｍｇ）とＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、
ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）、またはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）とを一緒に用いて、
強制飼養によって免疫したマウスからのＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ抗体力価を示す
。血清を、各免疫の１日前および研究の終わりに収集した。図１５Ａ、１用量後
の血清ＩｇＧ力価（１３日目）；図１５Ｂ、２用量後の血清ＩｇＧ力価（２７日
目）；図１５Ｃ、３用量後の血清ＩｇＧ力価（４８日目）；図１５Ｄ、最終用量
後の血清ＩｇＧ力価（６２日目）。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボ
ル（−）は、平均力価を表す。
【００８１】
図１６は、１日目、１４日目、３５日目、および４９日目に、ＯＶＡ（５ｍｇ
）単独、またはＯＶＡ（５ｍｇ）とＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、
ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）、またはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）とを一緒に用いて、
強制飼養によって免疫したマウスにおいて測定したＯＶＡ特異的血清ＩｇＧサブ
クラスおよびＩｇＡ抗体力価を示す。サンプルを最終免疫の２週間後に収集した
。データは、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図１６Ａ、ＩｇＧ１；
図１６Ｂ、ＩｇＧ２ａ；図１６Ｃ、ＩｇＧ２ｂ；図１６Ｄ、ＩｇＧ３。点は、個
々のデータを表し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００８２】
図１７は、強制飼養によって免疫したマウスの分泌物中において、１日目、１
４日目、３５日目、および４９日目に、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはＯＶＡ（
５ｍｇ）とＣＴ（１０μｇ）、ＭＬ−Ｉ（１０μｇ）、ＭＬ−ＩＩ（１０μｇ）
、またはＭＬ−ＩＩＩ（１０μｇ）とを一緒に用いて、測定したＯＶＡ特異的Ｉ
ｇＡ抗体力価を示す。データは、最終免疫の２週間後に測定した力価である。図
１７Ａ、唾液；図１７Ｂ、膣洗浄；図１７Ｃ、経鼻洗浄；図１７Ｄ、腸洗浄。点
は、個々のデータを表し、そしてシンボル（−）は、平均力価を表す。
【００８３】
表４は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、または０．５ｍｌの重炭酸ナトリウム中にお
いて投与されるレクチン（１０μｇ）とともに用いて、強制飼養によって免疫し
たマウスにおけるＯＶＡ特異的抗体応答を示す。マウスのグループ（ｎ＝１０）
を、０、１４、２８、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６日目およ
び５７日目に収集した。
【００８４】
【表４】
2011098986.tif 000005
表５は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはレクチン（１０μｇ）とともに免疫し
たマウスにおけるＯＶＡ特異的抗体応答を示す。マウスに、０．１ｍｌ  ＰＢＳ
中において強制飼養によって、または食餌ペレット中に組み込んで免疫した抗原
（±ＭＬ１）を投与した。マウスのグループ（ｎ＝５）を、０日目、１４日目、
２８日目、および４２日目に免疫し、そしてサンプルを５６日目および５７日目
に収集した。
【００８５】
表６は、ＯＶＡ（５ｍｇ）単独、またはレクチン（１０μｇ）とともに経口免
疫したマウスにおけるＭＬ１特異的抗体応答を示す。マウスに、０．１ｍｌ  Ｐ
ＢＳ中において強制飼養によって、または食餌ペレット中に組み込んだ抗原（±
ＭＬ１）を投与した。マウスに、０日目、１４日目、２８日目、および４２日目
に免疫し、そしてサンプルを５６日目および５７日目に収集した。
【００８６】
【表５】
2011098986.tif 000006
【００８７】
【表６】
2011098986.tif 000007
（実施例１１）
（経皮経路で抗原とともに送達された場合の、ＩＩ型ＲＩＰ（ＭＬ１，エブリ
ンＲＩ）のアジュバントとしての効力）
粘膜アジュバントとしてのヤドリギレクチンの効力を実証した研究からの続き
で、これらの研究を、経皮投与された場合のアジュバントとしての、ＩＩ型ＲＩ
Ｐのアジュバントとしての能力を評価するために行った。最近の研究は、ＣＴが
この経路でアジュバントとして使用された場合の、免疫応答の効果的な誘導を実
証している（Ｇｌｅｎｎら、１９９８、１９９９）。ＭＬ  １に加えて、ＣＴを
陽性コントロールとしておよびエブリンｒＩを使用した。なぜなら、それは、鼻
腔内投与された場合に、非毒性ＩＩ型ＲＩＰの最も免疫原性のものであったから
である。
【００８８】
（プロトコル）
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）のグループを、０日目および２１日目に免疫
し、そして血清サンプルを、０日目、２０日目、および３５日目にＥＬＩＳＡに
よる分析のために採取した。３つの異なるバイスタンダー抗原、ＢＳＡ、ＤＴ、
およびｇＤ２を調査した。抗原（５０μｇ）を、単独で、またはレクチン／トキ
シン（５０μｇ）と混合して、マウスに投与した。特異的な抗体応答を、ＥＬＩ
ＳＡによって決定した。さらに、ＣＴおよびレクチンに対する応答を測定して、
それらの免疫原性を、経皮経路で評価した。マウスの背をｎｏ．４０のクリッパ
ーで剃り、そして動物を４８時間休ませた。マウスに、免疫化手順の間、ｈｙｐ
ｎｏｒｍジアゼパムで麻酔した。その皮膚を、溶液を適用する１分前にエタノー
ルで拭いた。免疫化溶液（１００μｌ）を、剃った皮膚に２ｃｍ2の範囲にわた
って適用した。３０分後、さらに１００μｌの蒸留水を適用し、そしてマウスを
９０分間放置した。マウスを生温かい水道水で十分に洗浄し、たたいて乾燥し、
そして再び洗浄した。
【００８９】
（研究グループ）
Ｉ．ＢＳＡ
１．ＢＳＡ  ５０μｇ
２．ＢＳＡ  ５０μｇ＋ＣＴ  ５０μｇ
３．ＢＳＡ  ５０μｇ＋ＭＬＩ  ５０μｇ
４．ＢＳＡ  ５０μｇ＋エブリン  ｒＩ  ５０μｇ
ＩＩ．ジフテリア毒素（ＤＴ）
１．ＤＴ  ５０μｇ
２．ＤＴ  ５０μｇ＋ＣＴ  ５０μｇ
３．ＤＴ  ５０μｇ＋ＭＬＩ  ５０μｇ
４．ＤＴ  ５０μｇ＋エブリンｒＩ  ５０μｇ
ＩＩＩ．単純ヘルペスウイルス２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）
１．ｇＤ２  ５０μｇ
２．ｇＤ２  ５０μｇ＋ＣＴ  ５０μｇ
３．ｇＤ２  ５０μｇ＋ＭＬＩ  ５０μｇ
４．ｇＤ２  ５０μｇ＋レクチンＩＩ  ５０μｇ
表７は、１および２経皮用量のＢＳＡ（５０μｇ）単独、またはＣＴ／植物レ
クチン（５０μｇ）と一緒に投与した後に測定した、ＢＳＡ特異的血清抗体力価
を示す。
【００９０】
【表７】
2011098986.tif 000008
表８は、ＤＴ（５０μｇ）単独でまたはＣＴ／植物レクチン（５０μｇ）を伴
ったＤＴの、１回および２回の経皮用量の後に測定したＤＴ特異的血清抗体力価
を示す。
【００９１】
【表８】
2011098986.tif 000009
表９は、ｇＤ２（５０μｇ）単独でまたはＣＴ／植物レクチン（５０μｇ）を
伴ったｇＤ２の、１回および２回の経皮用量の後に測定したｇＤ２特異的血清抗
体力価を示す。乏しい応答に起因して、血清ＩｇＧａおよびＩｇＧ１レベルを決
定しなかった。
【００９２】
【表９】
2011098986.tif 000010
表１０は、ＣＴ／ＭＬ１／Ｅｂｕｌｉｎ  ｒ１（５０μｇ）を伴った１回およ
び２回の経皮的用量の後に測定したＣＴおよびレクチン特異的血清抗体力価を示
す。
【００９３】
【表１０】
2011098986.tif 000011
（実施例１２）
マウスにおいて経口送達したレクチンの結合、取り込みおよび転移（ｔｒａｎ
ｓｌｏｃａｔｉｏｎ））
（レクチンの投与および組織の回収）  雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、実験前に
は自由給水にして通常の仕入れ飼料で維持した。マウスを、一晩絶食させ、そし
て２４匹のマウスの群に、弯曲した経口投薬針（２０ｇ×２５ｍｍ）を用いて胃
管栄養法によりレクチンを送達した（１００μｌの生理食塩水中１ｍｇレクチン
／マウス）。水は、自由給水とした。８匹の動物の群を、ハロタン麻酔により屠
殺し、続いて１時間後、６時間後および２４時間後に瀉血した。血液を心臓穿刺
により採取した。マウスを解剖し、そして腸全体を取り出し、そして胃、２つの
部分の小腸、および大腸に分けた。腸の内容物を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗い出
して、存在している非結合レクチンの量の指標を与えた。腸組織をポリエチレン
バッグに入れ、そして液体窒素中で急速冷凍した。腸の切片を、各場合において
採取し、そして組織学によるレクチン結合の試験のために４％ホルマリンで固定
した。全ての腸組織および洗浄物を、分析が必要になるまで−２０℃で保存した
。さらに、肝臓、秘蔵および腎臓を動物から採取した。
【００９４】
（組織からのレクチンの抽出）  レクチンまたはコントロールの生理食塩水を
投与した動物由来の組織を、ジアミノプロパンの２０ｍＭ溶液中でホモジナイズ
することにより抽出した。組織片を、抽出溶液（９９５μｌ  ２０ｍＭ  ジアミ
ノプロパン＋５μｌの５ｍｇ／ｍｌ  アプロチニン（Ｓｉｇｍａ））に入れ、そ
して氷上で２分間２４０００ｒｐｍでホモジナイズした（Ｊａｎｋｅ  ａｎｄ  
Ｋｕｎｋｅｌ  ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｕｌｔｒａ−
Ｔｕｒｒａｘ（登録商標））。ホモジナイザーのヘッドを、蒸留水で洗浄し、抽
出溶液１ｍｌ中で、そしてサンプルの間に再び蒸留水で洗浄した。サンプルを、
２０分間２℃で１８６００ｇで遠心分離した（Ｊｏｕａｎ，ＭＲＩ２２）。上清
を回収し、そして分析が必要になるまで−２０℃で保存した。
【００９５】
（腸洗浄物の処理）  腸に存在するフリー（非結合）レクチンの量の指標を提
供するために、腸の洗浄物に存在するレクチンの量を分析した。洗浄物（５００
μｌ）を、希釈緩衝液（４９５μｌ）＋プロテアーゼインヒビターであるアプロ
チニン（５ｍｇ／ｍｌを５μｌ）に添加し、そして１０分間８０００ｒｐｍで遠
心分離した（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  １２Ｓ，Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｕ  Ｐｏｎｔ）。
【００９６】
（血液サンプルの処理）  採取の後、血液サンプルを室温で１時間放置し、そ
して６分間７０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  １２Ｓ，Ｓｏ
ｒｖａｌｌ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｕ  Ｐｏｎｔ）。血漿を回
収し、そして分析が必要になるまで−２０℃で保存した。
【００９７】
（腸への植物レクチンの結合のＥＬＩＳＡ分析）  ＥＬＩＳＡアッセイを設定
して、抽出した組織サンプルおよび洗浄物中のＷＧＡの定量を可能とした。マイ
クロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、ウェ
ルあたり炭酸−炭酸水素緩衝液（ｐＨ９．６）で１：６４０００希釈した７５μ
ｌのウサギ抗ＷＧＡでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートした。
洗浄後、プレートをＰＢＳＴ／２％ゼラチン／２００ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコ
サミンでブロッキングし、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレート
を洗浄し；標準物質およびサンプルを添加し、希釈緩衝液（ＰＢＳＴ／２００ｍ
Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミン）で段階希釈し、そして３７℃で１時間インキュ
ベートした。１０ｎｇ／ｍｌ〜７８ｐｇ／ｍｌのＷＧＡ溶液を力価測定すること
により、ＷＧＡの標準曲線を構築した。希釈緩衝液で１：１６０００希釈したビ
オチン化抗ＷＧＡを添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。さらに
洗浄した後、希釈緩衝液で１：１０００希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商
標）ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキ
ュベートした。プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色溶液（ＴＭＢマイク
ロウェルペルオキシダーゼ基質（１−Ｃ）Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅ
ｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＵＳＡ）を添
加し、そして遮光して、３７℃で３０分間振盪しながらインキュベートした。１
Ｍ  Ｈ2ＳＯ４（５０μｌ／ウェル）を添加することにより反応を停止させ、そ
して吸光度を４５０ｎｍで読み取った。標準曲線の線形領域からＷＧＡレベルを
計算した。
【００９８】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルを泳動し、そしてタンパク質を、セミドライ転写装置を用いてＰＶＤＦ膜に転
写した。転写後、膜を２．５％カゼイン溶液中で３０分間室温でブロッキングし
た。膜を洗浄し、そして一次抗体（ビオチン標識抗レクチン）を１．２％カゼイ
ン溶液で１：２５００希釈して添加した。室温で一晩攪拌しながらインキュベー
トした後、膜をＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商
標）ペルオキシダーゼを１．２％カゼインで１：５０００希釈して添加した。室
温で１時間インキュベートした後、膜をＰＢＳおよび蒸留水で徹底的に洗浄した
。過剰な液体を膜から除去し、そして発色溶液を添加し（Ｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎ
ａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ検出キット）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＵＳＡ）、そして遮光して５分間放置した。過剰な液体を膜から乾燥さ
せ、そして膜をフィルムに露出し（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＬＳ（Ｓｉｇｍ
ａ））、そして処理した。
【００９９】
（結果）
（経口胃管栄養法後のマウス腸における植物レクチンの安定性および結合）  
レクチン（ＰＨＡ、ＷＧＡおよびＵＥＡ−１）は、胃管栄養法後、６時間までの
間、マウス消化管において安定であった（表１１および１２；図１８および１９
）。小腸において、レクチンは、ポジティブコントロールのサブユニットＭＷで
検出されたに過ぎなかった。胃においては、ＰＨＡおよびＵＥＡ−１の場合、６
時間および２４時間後にレクチン凝集の指標があった。しかし、胃で検出された
レクチンの大部分は、やはりインタクトであった。腸に結合するレクチンの分析
により、送達して１時間および６時間後に、結合したレクチンの位置に差異が見
出された。ＰＨＡ（およびＷＧＡ（示さず））は、小腸の近位に結合したが、Ｕ
ＥＡ−１はこの領域において検出されなかったが、小腸の遠位に結合した（表１
１）。結合のパターンは、レクチン投与して１時間および６時間後のパターンと
類似であった。送達の２４時間後に、レクチンはホモジナイズした腸組織におい
て検出されなかった。このことは、レクチンが腸から解離し、そして再結合する
のではなく、解離した後に分泌されるようであることを示した。
【０１００】
表１１は、胃管栄養法によりＰＨＡ（アイソタイプＥ２Ｌ２）を１ｍｇ送達し
て１時間、６時間および２４時間後の、マウス消化管におけるＰＨＡの検出を示
す。＋記号は、レクチンがウェスタンブロッティングで検出されたことを示し、
そして陽性シグナルを有するマウスの数（各場合で８匹のうち）を括弧に入れて
示す。ポジティブコントロールのＰＨＡサブユニット分子量は、２９．５ｋＤａ
であった。
【０１０１】
表１２は、胃管栄養法によりＵＥＡ１を１ｍｇ送達して１時間、６時間および
２４時間後の、マウス消化管におけるＵＥＡ１の検出を示す。＋記号は、レクチ
ンがウェスタンブロッティングで検出されたことを示し、そして陽性シグナルを
有するマウスの数（各場合で８匹のうち）を括弧に入れて示す。ポジティブコン
トロールのＵＥＡ１のみかけのサブユニット分子量は、３４．７ｋＤａであった
。
【０１０２】
【表１１】
2011098986.tif 000012
【０１０３】
【表１２】
2011098986.tif 000013
（内部器官および血液におけるレクチンの検出）  鋭敏な化学発光ウェスタン
ブロットアッセイを用いて、レクチン取り込みを決定した。３つ全てのレクチン
について、肝臓および腎臓への取り込みを測定した（表１３、図２０および２１
）。図２０は、腎臓組織において検出されたＵＥＡ１がポジティブコントロール
よりより高い分子量で存在することを示す。コントロール腎臓組織とは交差反応
性が存在する。しかし、レクチンを投与した動物由来のマウス組織においてさら
なるバンドが見える。これらのバンドは、コントロールより高い分子量で存在す
る。
【０１０４】
レクチンを、投与して１〜２４時間後に肝臓組織において検出した。しかし、
反応性バンドのＭＷは、予測したサブユニットＭＷよりかなり高かった。実際に
、３つのレクチンのうちいずれも、予測したサブユニットＭＷで内部器官におい
て検出されなかった。レクチン取り込みの程度の指標を得るために、サンドイッ
チＥＬＩＳＡを設定して、ＷＧＡを定量した。このことは、腸および内部器官に
おけるレクチンの測定を可能にした（表１３）。レクチンは、送達して６時間ま
での間、投与したレクチンのおよそのレベルで腸ホモジネートにおいて検出され
た。２４時間では、ホモジネート中にレクチンは検出されなかった。内部器官の
うち、最高レベルのレクチンは、肝臓組織において検出された。この部位でのレ
クチンのレベルは、１〜２４時間まで増加した。しかし、検出されたレクチンの
最高量（２８９．３ｎｇ）は、送達した用量のわずかな割合を示した。非常に低
レベルのＷＧＡは、血球もしくは血清、または脾臓において検出された。肝臓お
よび腎臓における最高レベルのレクチンの検出は、ウェスタンブロットの結果と
一致する。ここで、このレクチンは、肝臓および腎臓組織において検出可能であ
ったが、血液または他の器官においては検出可能でなかった。
【０１０５】
（ネイティブかつ吸収されたレクチンのトリプシンによるタンパク質分解に対
する安定性）  ネイティブなレクチンの特性を保持して、吸収されたレクチンが
肝臓および腎臓において検出されたか否かを決定するために、ネイティブなおよ
び組織抽出したＰＨＡ、ＷＧＡおよびＵＥＡ−１を、トリプシンの溶液とともに
１時間インキュベートした。３つのレクチン全てが、それらのネイティブな形態
でこの酵素に対して非常に安定であった。しかし、肝臓および腎臓組織において
検出した改変されたレクチンは、酵素により分解された（図２２）。このことは
、肝臓および腎臓における細胞が、タンパク質分解に対して感受性の形態に植物
レクチンを改変しうることを示す。これは、消化管において残存し、かつ吸収さ
れる、消化された植物レクチンの分解についての機構であり得る。
【０１０６】
表１３は、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１ｍｇのレクチン（１回の用量）を用いた
マウス群（ｎ＝８）の経口胃管栄養法後の、組織におけるＷＧＡの検出を示す。
このレクチンを、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、そしてデータを
器官あたりまたは血液１ｍｌあたりのμｇレクチンとしてあらわす。
【０１０７】
【表１３】
2011098986.tif 000014
【０１０８】
【表１４】
2011098986.tif 000015
【０１０９】
【表１５】
2011098986.tif 000016
【０１１０】
【表１６】
2011098986.tif 000017
【０１１１】
【表１７】
2011098986.tif 000018
【図１】
2011098986.tif 000019
【図２】
2011098986.tif 000020
【図３】
2011098986.tif 000021
【図４】
2011098986.tif 000022
【図５】
2011098986.tif 000023
【図６】
2011098986.tif 000024
【図７】
2011098986.tif 000025
【図８】
2011098986.tif 000026
【図９】
2011098986.tif 000027
【図１０】
2011098986.tif 000028
【図１１】
2011098986.tif 000029
【図１２】
2011098986.tif 000030
【図１３】
2011098986.tif 000031
【図１４】
2011098986.tif 000032
【図１５】
2011098986.tif 000033
【図１６】
2011098986.tif 000034
【図１７】
2011098986.tif 000035
【図１８】
2011098986.tif 000036
【図１９】
2011098986.tif 000037
【図２０】
2011098986.tif 000038
【図２１】
2011098986.tif 000039
【図２２】
2011098986.tif 000040
【外国語明細書】
2011098986000001.pdf