(57)【要約】 【課題】  従来よりも特異性および反応性が向上し、かつ免疫測定試薬用途にも使用可能なタグペプチド、および前記ペプチドを用いたタンパク質の精製・検出方法を提供すること。【解決手段】  Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のうちＣ末端側７アミノ酸からなるオリゴペプチドをタグペプチドとして用い、前記タグペプチドを付加したタンパク質と前記タグペプチドを認識する物質により前記タンパク質を精製・検出することにより、前記課題を解決することができた。なお、前記オリゴペプチドは、Ｎ末端側１番目から３番目までのアミノ酸のうちの一つ以上を酸性アミノ酸に置換したペプチドであってもよいし、Ｎ末端側１番目から３番目までのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させたペプチドであってもよい。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチド。
【請求項２】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を酸性アミノ酸に置換した、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチド。
【請求項３】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させた、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチド。
【請求項４】
請求項１から３に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質と、前記ペプチドを認識する物質とを用いた、タンパク質の精製・検出方法。
【請求項５】
前記タンパク質がＣ末端側に請求項１から３のいずれかに記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質であり、前記ペプチドを認識する物質が前記ペプチドを認識する抗体である、請求項４に記載の精製・検出方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴペプチドを遺伝子工学的に付加することで得られたタンパク質である、請求項４または５に記載の精製・検出方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴペプチドを化学的に付加することで得られたタンパク質である、請求項４または５に記載の精製・検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を高感度に検出するためのタグペプチド、およびそれを用いたタンパク質の精製・検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的に発現させたタンパク質の精製・検出や、担体への固定化を簡便に行なうための技術として、前記タンパク質を発現させる際に、タグペプチドとよばれる、前記ペプチドを認識する物質（例えば抗体など）と特異的に結合可能なペプチドを、前記タンパク質に付加した状態で発現後、前記ペプチドを認識する物質を用いて精製・検出・固定化を行なう方法が知られている。
【０００３】
従来から知られているタグペプチドの例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグ（特許文献１および２）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ（非特許文献１）、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨｉｓタグ（特許文献３および４）、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＥタグ、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＨＡタグ、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＴ７タグ、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＰｋタグ、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶタグ、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＶＳＶ−Ｇタグ、などの正常細胞内には本来存在しない、ウイルス、ファージ、癌遺伝子由来のタンパク質の部分領域や、同じアミノ酸配列の繰り返しからなる、１０アミノ酸程度のペプチドがあげられる。前記例示した９種類のタグペプチドの中で、ＦＬＡＧタグ（配列番号１）は高性能なタグとして知られている。しかしながら、近年の実験の高感度化に伴い、特異性および反応性がさらに向上したタグペプチドが要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許４７０３００４号公報
【特許文献２】特許２６６５３５９号公報
【特許文献３】特開昭６３−２５１０９５号公報
【特許文献４】米国特許５３１０６６３号公報
【特許文献５】特開２００９−０２４０３０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、５（１２）、３６１０−３６１６（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規のタグペプチドを検討する際、タグペプチドの原理から考えると、一見いかなるアミノ酸配列からなるペプチドでも、その配列を特異的に認識する物質（抗体など）があれば、タグペプチドとして使用できると思われる。しかしながら、現実的にタグペプチドとして産業上で使用することを考えた場合、タグペプチドの配列を決定することは容易ではない。その理由として、タグペプチドを付加したタンパク質を特異的に精製・検出するには、前記タグペプチドのアミノ酸配列が通常の実験系で使用されるタンパク質のアミノ酸配列の中に含まれないことはもちろん、それに類似するアミノ酸配列も存在しないことが必要なためである。相同配列・類似配列の有無を確認するには、ＢＬＡＳＴといったデータベースを用いた相同性検索により可能である。しかしながら、タグペプチドを認識する物質（例えば、抗体など）が、前記タグペプチドのアミノ酸配列と類似した配列からなるペプチドに対してどの程度の交差反応性があるかを推測するのは困難であり、また前記データベースに未登録のタンパク質に対する交差反応性については予測がさらに困難である。
【０００７】
ならば、本来タンパク質には組み込まれないアミノ酸や低分子有機化合物をタグとして用いればよいのではないかと思われるが、実際には交差反応性の原因はアミノ酸の一次配列だけではなく、配列特異的ではない静電的相互作用、疎水的相互作用などの影響で起こることもある。つまり、天然に存在しないような物質をタグとして使用することは、かえって交差反応性の予測を困難にする可能性がある。また、前記アミノ酸や有機化合物をタグとする場合、タグを遺伝子工学的にタンパク質へ付加するのが困難という新たな問題が発生する。
【０００８】
さらに、タグペプチドを免疫測定試薬用途に用いる場合、検体中に含まれる各種成分は検体間で異なるため、検体ごとにタグペプチドに対し異なる影響を与える可能性もある。つまり、たとえ産業上有効なタグペプチドが設計できても、前記タグペプチドがそのまま免疫測定試薬用途に用いることができるとは限らない。設計したタグペプチドを免疫測定試薬用途で使用可能かどうかを判断するには、非常に多数の検体を評価するしかないが、タグペプチドの有用性を確かめる目的で、非常に多数の検体を評価することは事実上極めて困難である。
【０００９】
そこで本発明の目的は、従来よりも特異性および反応性が向上し、かつ免疫測定試薬用途にも使用可能なタグペプチド、および前記タグペプチドを用いたタンパク質の精製・検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を鑑み発明者が鋭意検討した結果、これまでに報告例がなく、かつ免疫測定試薬用途においても使用可能なタグペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち第一の発明は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチドである。
【００１２】
また第二の発明は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を酸性アミノ酸に置換した、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチドである。
【００１３】
また第三の発明は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させた、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチドである。
【００１４】
また第四の発明は、第一から第三の発明のいずれかに記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質と、前記ペプチドを認識する物質とを用いた、タンパク質の精製・検出方法である。
【００１５】
また第五の発明は、前記タンパク質がＣ末端側に第一から第三の発明のいずれかに記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質であり、前記ペプチドを認識する物質が前記ペプチドを認識する抗体である、第四の発明に記載の精製・検出方法である。
【００１６】
また第六の発明は、前記タンパク質が、第一から第三の発明のいずれかに記載のオリゴペプチドを遺伝子工学的に付加することで得られたタンパク質である、第四または第五の発明に記載の精製・検出方法である。
【００１７】
また第七の発明は、前記タンパク質が、第一から第三の発明のいずれかに記載のオリゴペプチドを化学的に付加することで得られたタンパク質である、第四または第五の発明に記載の精製・検出方法である。
【００１８】
以降、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
タンパク質を精製・検出するのに有用なタグペプチドには、
（１）融合させるタンパク質に与える影響を少なくするためにアミノ酸の長さが短いこと、
（２）類似した配列が存在せず特異性が高いこと、
（３）ペプチドに対する親和性の高い物質が存在すること、
が要求される。そこで、前記要求を満たすペプチドを鋭意検討した結果、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のＣ末端側７アミノ酸（配列番号１０、以下ＢＮＣと略する）がタグペプチドとして有用であることを見出した。
【００２０】
ＢＮＰは３２アミノ酸からなる環状ペプチドである。健常人における血漿中ＢＮＰ濃度は２０ｐｇ／ｍＬ以下と極めて低いが、慢性および急性心不全患者では重症度に応じて著しく増加し、ＢＮＰの測定により心不全の病態の把握に重要な意義を持っていることから、近年極めて多くの検体が測定されている。通常ＢＮＰは、ＢＮＰのＣ末端を認識する抗体と環状部分を認識する抗体でＢＮＰを挟み込むサンドイッチ法で測定されている。配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣは、
（１）アミノ酸の長さが短く、
（２）ＢＮＣと交差反応性を有する物質の存在が否定されており、
（３）親和性および特異性の高い物質が存在する、
ためタグペプチドとして有用である。
【００２１】
これまでに報告されているタグペプチドは１０アミノ酸程度の長さのものが多く、高性能なタグペプチドとして知られているＦＬＡＧタグ（配列番号１）は８アミノ酸である。一方、ＢＮＣは７アミノ酸であることから、付加するタンパク質への影響がより低減することが予想される。
【００２２】
また、ＢＮＣに結合する抗体を使ったＢＮＰの測定系は、すでに免疫測定試薬として上市（例えば、東ソー社製Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＢＮＰ））されている。つまり、これまでに非常に多数の検体が測定されているが、原因不明の交差反応などの問題は発生していない。このことは、ＢＮＣまたはそれと類似した配列を有するタンパク質およびペプチドは検体中には存在しないか、あるいは存在しても測定に影響を与える濃度ではないことを意味している。以上より、ＢＮＣは特異性の高いタグペプチドとして有用であることを示唆しており、免疫測定試薬用途で有効に使用できるのはもちろん、通常の実験においても特異性や反応性の高いタグペプチドとして利用可能である。
【００２３】
さらに、ＢＮＣに対する親和性および特異性の高い物質として、ＢＮＣを認識する抗体が存在する。前記抗体は、単にＢＮＣのアミノ酸配列を認識しているのはなく、ＢＮＣがタンパク質のＣ末端側に存在することまでも認識する。Ｃ末端側にＢＮＣのアミノ酸配列を有するタンパク質の存在確率は極めて低い。そのため、ＢＮＣはタグペプチドとして有用であり、Ｃ末端側にＢＮＣを付加したタンパク質とＢＮＣを認識する抗体とを用いることで、特異性が高く、高感度な検出が可能である。
【００２４】
ＢＮＣをタグペプチドとして用いる際、検体（血液）に含まれるＢＮＰにより、Ｃ末端側にＢＮＣを付加したタンパク質とＢＮＣを認識する物質との結合性に影響を与えるおそれが考えられた。しかしながら、実際の測定系でＢＮＰ混入による影響を確認したところ、臨床検体でみられる濃度よりもはるかに高い１００ｎｇ／ｍＬのＢＮＰが検体中に含まれていても、Ｃ末端側にＢＮＣを付加したタンパク質とＢＮＣを認識する物質との結合性に影響を及ぼさないことが確認されている（実施例９参照）。しかしながら測定系により、抗体や抗原の濃度、ブロッキング剤、緩衝液の条件などが異なるため、測定系を新たに構築した際は、大過剰のＢＮＰを測定系に添加し、どの程度の濃度で影響がではじめるかを確認したほうがよい。
【００２５】
ＢＮＣをタグペプチドとして利用することで、ＢＮＣを付加したタンパク質をアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製は、適切な担体に、ＢＮＣを認識する物質をＢＮＣを付加したタンパク質との結合性を保持した状態で結合させたものを用いて精製すればよい。ＢＮＣを認識する物質としては、ＢＮＣを認識するモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差の考慮が不要なモノクローナル抗体が、安定的な精製ができる点で好ましい。ＢＮＣを認識する物質と結合したＢＮＣを付加したタンパク質の溶出は、通常ｐＨを変化させて溶出すればよいが、ｐＨ変化に対して不安定なタンパク質を精製する場合は大過剰のＢＮＣを添加して溶出させてもよい。
【００２６】
発現させるタンパク質にＢＮＣを付加する方法として、遺伝子工学的方法で付加する方法があげられる。具体的には、発現させるタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にＢＮＣをコードするポリヌクレオチドを付加すればよい。なお、発現させるタンパク質にＢＮＣを付加する際、発現させるタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側の直後にＢＮＣを付加してもよいし、発現させるタンパク質との相互作用を避けるための任意のリンカーペプチドを介してＢＮＣを付加してもよい。前記リンカーペプチドの一態様として、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるフレキシブルなリンカーペプチドが例示できるが、前記配列に限定されるものではない。発現させるタンパク質にＢＮＣを付加する別の方法として、化学的に付加する方法があげられる。前記方法の一態様として、発現させるタンパク質とＳＭＣＣなどの試薬とを反応させることで前記タンパク質にマレイミド基を導入後、ＢＮＣと反応させて、ＢＮＣを化学的に導入する方法があげられるが、発現させるタンパク質とＢＮＣとの結合方法に特に限定はなく、例えば、ポリエチレングリコールやポリエチレンイミンなどの高分子を介して付加してもよいし、マレイミド基以外の官能基を介して化学的に付加してもよい。
【００２７】
ＢＮＣは、前述したタンパク質の精製・検出目的のほかに、タンパク質の担体への固定化目的で使用することもできる。タンパク質を直接水不溶担体に固定化すると、立体構造の変化がおきやすく、活性が失われる場合が多い。そこで、ＢＮＣを認識する物質を水不溶性担体に固定化しておき、前記固定化担体にＢＮＣを付加したタンパク質を固定化させる方法を採用することにより、立体構造の変化がおきにくい状態で担体に固定化することができる。
【００２８】
免疫測定試薬でしばしば問題になるのは、異好性抗動物抗体である。たとえば、ウサギ由来ポリクローナル抗体（抗原認識）と抗ウサギ抗体（水不溶性担体に固定化）とが反応系の中に含まれる場合、測定検体の中に抗ウサギ抗体が存在すると、検体中の抗ウサギ抗体により、本来想定している量のウサギ由来ポリクローナル抗体が水不溶性担体に捕捉されなくなり、正確な測定値が得られなくなってしまう。そこで、ウサギポリクローナル抗体にＢＮＣを付加し、水不溶性担体に抗ＢＮＣ抗体を固定化することで、異好性抗動物抗体の影響をなくした測定系が構築できる。
【００２９】
なお、ＢＮＣは配列番号１０に記載の７アミノ酸からなるオリゴペプチドであるが、ＢＮＣを構成するアミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換したオリゴペプチド（以下、改変ＢＮＣ）も本発明のオリゴペプチドに含まれる。改変ＢＮＣは、ＢＮＣと比較し親和性（結合性能）および／または特異性が変化しているため、使用目的に応じ適切な改変ＢＮＣを選定し、タグペプチドとして使用すればよい。改変ＢＮＣの好ましい一態様として、ＢＮＣを構成するアミノ酸のうち１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上をアスパラギン酸またはグルタミン酸（すなわち酸性アミノ酸）に置換したオリゴペプチドがあげられる。さらに、ＢＮＣを構成する各アミノ酸のうち、親和性および／または特異性が変化した置換を組み合わせることで、より好ましい改変ＢＮＣが得られる。前記より好ましい改変ＢＮＣの一例として、１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸を全てアスパラギン酸に置換したオリゴペプチド（ＤＤＤＬＲＲＨ、配列番号２１）があげられる。前述したように、ＢＮＣをタグペプチドとして利用することで、ＢＮＣを付加したタンパク質のアフィニティー精製が可能である。そのため、親和性（結合性能）および／または特異性の向上した改変ＢＮＣをタグペプチドと利用することで、ＢＮＣを付加したタンパク質のアフィニティー精製をより効率的に行なうことができる。
【００３０】
一方、ＢＮＣを構成するアミノ酸のうち一部のアミノ酸を欠失させたオリゴペプチド（以下、欠失ＢＮＣ）も本発明のオリゴペプチドに含まれる。具体的には、ＢＮＣを構成するアミノ酸のうち１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させた欠失ＢＮＣであれば、ＢＮＣと比較して親和性（結合性能）は低下するものの、使用目的によってはタグペプチドとしての性能を十分に有している。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、長さが７アミノ酸と短く、これまでの実績から交差反応性を有する物質の存在が否定されており、親和性および特異性の高い物質（抗体）が存在する、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のＣ末端側７アミノ酸（ＢＮＣ）、およびそれを用いたタンパク質の精製・検出方法である。精製・検出対象タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に遺伝子工学的にまたは化学的にＢＮＣを付加させ、それとＢＮＣを認識する物質とを結合させて精製・検出する方法により、従来知られているＦＬＡＧタグを用いた精製・検出方法と比較し、特異性や感度を向上させることができる。
【００３２】
なお前記ＢＮＣは、ＢＮＣを構成するアミノ酸のうち１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を酸性アミノ酸に置換した改変ＢＮＣであってもよく、１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させた欠失ＢＮＣであってもよい。特に１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を酸性アミノ酸に置換した改変ＢＮＣは、結合性能（親和性）が向上しており、ＢＮＣと比較し、より高感度／高特異的な検出およびより効率的なアフィニティー精製が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例２で得られた、各タグペプチドを付加したマルトース結合タンパク（ＭＢＰ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図中、ＭＢＰ−ＢＮＣはＭＢＰのＣ末端にＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）を付加したＭＢＰを示す。同様に、ＭＢＰ−ＦＬＡＧはＦＬＡＧタグを、ＭＢＰ−ＭｙｃはＭｙｃタグを、ＭＢＰ−ＨｉｓはＨｉｓタグをそれぞれＭＢＰのＣ末端に付加したＭＢＰを示す。
【図２】実施例４の結果を示すものである。図上部の数値は各ウエルで電気泳動した各タグペプチドを付加したＭＢＰのモル数を示し、右側は本ウエスタンブロッティングのアッセイフォーマットを示す。
【図３】実施例５の結果を示すものである。縦軸はＥＬＩＳＡで得られたシグナルを示し、横軸は各タグペプチドを付加したＭＢＰの添加量（μｇ／ｍＬ）を示す。なお、図上部の数値は各ウェルで反応させた各タグペプチドを付加したＭＢＰのモル数を示し、右側は本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図４】実施例６の結果を示すものである。図右側は本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図５】実施例７の結果を示すものである。図右側は本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図６】実施例８の結果を示すものである。
【図７】実施例９で実施した、抗Ｅ２抗体へのＢＮＣ導入スキームを示すものである。
【図８】実施例９の結果を示すものである。図右側には、本測定系のアッセイフォーマットを示す。
【図９】Ｈ鎖Ｃ末端側に直接ＢＮＣが結合した遺伝子組み換え型抗エストラジオール抗体（ＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣ）の検量線を示すものである。図左側は蛍光強度（ＦＩ）測定用ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを、図右側は抗体濃度測定用ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを、それぞれ示す。
【図１０】図９の検量線を用いた、結合性能評価の概要を示すものである。
【図１１】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの１番目のシステインを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１２】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの２番目のリジンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１３】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの３番目のバリンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１４】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの４番目のロイシンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１５】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの５番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１６】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの６番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１７】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの７番目のヒスチジンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２−７で評価した結果である。
【図１８】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの１番目のシステインを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図１９】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの２番目のリジンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図２０】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの３番目のバリンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図２１】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの４番目のロイシンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図２２】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの５番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図２３】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの６番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図２４】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの７番目のヒスチジンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ２３−１１で評価した結果である。
【図２５】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの１番目のシステインを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図２６】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの２番目のリジンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図２７】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの３番目のバリンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図２８】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの４番目のロイシンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図２９】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの５番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図３０】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの６番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図３１】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの７番目のヒスチジンを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図３２】実施例１４の結果を示すものである。なお、ＢＮＣ認識抗体はＢＣ３０−７３を使用している。
【図３３】実施例１３の結果のうち、ＢＮＣの１番目のシステイン、２番目のリジンまたは３番目のバリンをそれぞれアスパラギン酸に置換したオリゴペプチドをＢＮＣ認識抗体ＢＣ３０−７３で評価した結果である。
【図３４】実施例１５の結果を示すものである。黒丸はＢＮＣ（配列番号１０）、黒三角はＮ末端側１アミノ酸欠失体（配列番号２５）、白丸はＮ末端側２アミノ酸欠失体（配列番号２６）、白三角はＮ末端側３アミノ酸欠失体（配列番号２７）の結果をそれぞれ示す。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  タグペプチドを付加したタンパク質を発現可能な形質転換体の調製
マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）のＣ末端側にタグペプチドを付加したタンパク質を発現可能な形質転換体を以下の方法で調製した。
（１）各タグペプチドをコードするオリゴヌクレオチド（相同鎖および相補鎖）をそれぞれ１０μＭとなるようにＴＥで希釈し、それらを混合後、９５℃で５分間熱処理し、その後２５℃まで徐々に冷却することで、アニーリングを行なった。なお、使用したオリゴヌクレオチドとして、ＦＬＡＧタグ（配列番号１）の場合は配列番号１２（相同鎖）および１３（相補鎖）を、Ｍｙｃタグ（配列番号２）の場合は配列番号１４（相同鎖）および１５（相補鎖）を、Ｈｉｓタグ（配列番号３）の場合は配列番号１６（相同鎖）および１７（相補鎖）を、ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（配列番号１０、以降ＢＮＣと略する）の場合は配列番号１８（相同鎖）および１９（相補鎖）を、それぞれ用いた。
（２）（１）で得られた各タグペプチドをコードするオリゴヌクレオチド（二本鎖ＤＮＡ）を、あらかじめＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＭＡＬ−ｃ４Ｘベクター（ニューイングランドレイブス社製）に挿入した。挿入方法は、制限酵素処理したｐＭＡＬ−ｃ４Ｘベクター６７ｎｇと（１）のオリゴヌクレオチド１００ｎｇに、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を４μＬ添加し、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行なうことで挿入した。
（３）（２）で得られた、各タグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挿入したｐＭＡＬ−ｃ４Ｘベクターで、定法に従い大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。
【００３６】
実施例２  タグペプチドを付加したタンパク質の調製
実施例１で得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、６００ｎｍの濁度が０．５になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加後、さらに３７℃で４時間培養した。その後大腸菌を集菌し、アミロースカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーにより、発現した各タグペプチドを付加したマルトース結合タンパク（ＭＢＰ）を精製した。精製した前記タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１に示す。
【００３７】
実施例３  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）認識抗体の単離
ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）を認識する抗体を以下の方法で単離した。
（１）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＢＮＣ  ２０ｍｇを、１０ｍｇのマレイミドで活性化した１０ｍｇのオボアルブミン（ＰＩＥＲＣＥ社製）に、添付された説明書に従い結合させた。その後ＰＢＳで透析し、１ｍｇ／ｍＬに調製した。
（２）（１）で調製したタンパク質とＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）とを等量混合したエマルジョンを、１００μＬ／匹でマウス腹腔内に注射した（１回目の免疫）。
（３）２回目以降は、ＦＣＡをＦＩＣＡ（フロイント不完全アジュバント）に変更したほかは、（２）と同様に毎週免疫を行ない、これを３回繰り返した。
（４）免疫後のマウスから脾臓Ｂ細胞を取り出し、ミエローマ細胞株とＰＥＧ法による細胞融合を行なった。
【００３８】
前記操作により、ＢＮＣに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマ６種（ＢＣ２−７、ＢＣ２３−１１、ＢＣ２５−２、ＢＣ２５−３２、ＢＣ３０−６２、ＢＣ３０−７３）が得られた。
【００３９】
実施例４  各タグペプチドを用いた検出感度比較（その１）
ウエスタンブロッティング法により、各タグペプチドを用いた検出感度比較を行なった。
（１）実施例２で精製した各タグペプチドを付加したＭＢＰ（濃度；２４００ｆｍｏｌ、８００ｆｍｏｌ、２４０ｆｍｏｌ、８０ｆｍｏｌ、２４ｆｍｏｌ、８ｆｍｏｌ、２．４ｆｍｏｌ、０．８ｆｍｏｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。なお、試料量が少ない場合における非特異的な吸着によるロスを防止するために、精製した各タグペプチドを付加したＭＢＰは、ミエローマ細胞をＰＢＳで破砕した上清で希釈したものを用いた。具体的には、マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）の４×１０７個を１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、超音波で破砕後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を使用した。
（２）各タグペプチドを付加したＭＢＰを定法に従いＰＶＤＦ膜に転写後、下記に示すウエスタンブロッティングを行なった。
（２−１）転写後のＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ中で、４℃で一晩放置することによりブロッキングした。
（２−２）一次抗体（抗ＦＬＡＧ抗体：ＳＩＧＭＡ社製（Ｍ２）、抗Ｍｙｃ抗体：和光純薬社製（９Ｅ１０）、抗Ｈｉｓ抗体：Ｒｏｃｈｅ社製（１９２２４１６）、ＢＮＣ認識抗体：ＢＣ２−７／ＢＣ２３−１１／ＢＣ２５−２／ＢＣ２５−３２／ＢＣ３０−６２／ＢＣ３０−７３（実施例３で単離した抗体））を０．５μｇ／ｍＬとなるように、５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈した。
（２−３）室温で２時間反応し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）でＰＶＤＦ膜を４回洗浄後、ＴＢＳ−Ｔで５００００倍に希釈したＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識された抗マウス抗体（ＧＥヘルスケア社製、ＮＡ９３１）を添加し、室温で２時間反応した。
（２−４）ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製、ＲＰＮ２１３２）で発色させた。
【００４０】
結果を図２に示す。一般的に使用されているタグペプチドの中では、ＦＬＡＧタグが最も性能が高く（検出感度：２４ｆｍｏｌ）、以下、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグの順番になった。一方、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣを認識する抗体を用いると、ＦＬＡＧタグを用いた系と比較し、同等から１０倍程度高感度に検出（検出感度：２．４から２４ｆｍｏｌ）することが判明した。
【００４１】
実施例５  各タグペプチドを用いた検出感度比較（その２）
ＥＬＩＳＡ法により、各タグペプチドを用いた検出感度比較を行なった。
（１）評価したい抗体（タグペプチド認識抗体）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウエルで固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例２で精製した各タグペプチドを付加したＭＢＰを添加し反応させた（濃度：２４ｐｍｏｌ／ウェル、２．４ｐｍｏｌ／ウェル、２４０ｆｍｏｌ／ウェル、２４ｆｍｏｌ／ウェル、２．４ｆｍｏｌ／ウェル、０．２４ｆｍｏｌ／ウェル）。
（３）ＨＲＰ標識された抗ＭＢＰ抗体（ニューイングランドレイブス社製、Ｅ８０３８Ｓ）で、固相に捕捉された各タグペプチドを付加したＭＢＰの量を測定した。
【００４２】
結果を図３に示す。配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣを認識する抗体（ＢＣ２−７／ＢＣ２３−１１／ＢＣ２５−２／ＢＣ２５−３２／ＢＣ３０−６２／ＢＣ３０−７３）を固相に固定化したものは、ＦＬＡＧタグ（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）またＨｉｓタグ（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ）を認識する抗体を固相に固定化したものと比較し、特に低濃度領域（２４０ｆｍｏｌ／ウェル以下の領域）で、タグペプチドを付加したＭＢＰの補足量が増大していることが判明した。なお、今回検討したＢＮＣ認識抗体のうち、ＢＣ３０−７３を固相に固定化したものは、ＦＬＡＧタグを認識する抗体（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）を固相に固定化したものと比較し、１００倍以上の感度を有している。
【００４３】
実施例６  アフィニティー精製用タグとしての性能（ｐＨ変化による溶出）
ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）認識抗体と結合した、ＢＮＣを付加したペプチドの、ｐＨ変化による溶出を確認した。
（１）実施例３で得られたＢＮＣ認識抗体のうちの５種（ＢＣ２−７／ＢＣ２３−１１／ＢＣ２５−２／ＢＣ３０−６２／ＢＣ３０−７３）を、９６ウエルプレートにそれぞれ０．１μｇ固定化した。
（２）１％スキムミルクを含むＰＢＳで十分にブロッキングした後、Ｎ末端にビオチンを導入した配列番号２０（９番目から１５番目のアミノ酸が配列番号１０に記載のアミノ酸に相当）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを１μｇ添加し、反応させた。
（３）１時間反応後、ｐＨが異なる緩衝液（ＰＢＳ、１００ｍＭ  グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ１．５）、１００ｍＭ  グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、１００ｍＭ  グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ  グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．５））で３回洗浄した。
（４）アルカリホスファターゼで標識されたストレプトアビジンを反応させ、洗浄後ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を反応させ酵素活性を測定した。
【００４４】
結果を図４に示す。いずれのＢＮＣ認識抗体を用いた場合においても、ｐＨの変化により配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを完全に解離できることがわかり、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（ＢＮＣ）がアフィニティー精製用のタグペプチドとして十分な性能を有していることが判明した。なお、今回検討したＢＮＣ認識抗体のうち、ＢＣ２−７は比較的温和な条件（ｐＨ３．５）で結合したペプチドを完全に解離できるため、アフィニティー精製用の抗体として優れていることがわかる。
【００４５】
実施例７  アフィニティー精製用タグとしての性能（ペプチド添加による溶出）
ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）認識抗体と結合した、ＢＮＣを付加したペプチドの、ＢＮＣ添加による溶出を確認した。
（１）実施例３で得られたＢＮＣ認識抗体のうちの５種（ＢＣ２−７／ＢＣ２３−１１／ＢＣ２５−２／ＢＣ３０−６２／ＢＣ３０−７３）を、９６ウエルプレートにそれぞれ０．１μｇ固定化した。
（２）１％スキムミルクを含むＰＢＳで十分にブロッキングした後、Ｎ末端にビオチンを導入した配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを１μｇ添加し、反応させた。
（３）１時間反応後、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）を含んだ溶液を１００μＬ添加し（ペプチド濃度：１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）、反応させた。
（４）１時間反応後、十分に洗浄し、アルカリホスファターゼで標識されたストレプトアビジンを反応させた。
（５）洗浄後、ＰＮＰＰを反応させ酵素活性を測定した。
【００４６】
結果を図５に示す。いずれのＢＮＣ認識抗体を用いた場合においても、ＢＮＣの添加により、結合した配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドと完全に解離できることが判明した。ｐＨの変化を伴わずにタグペプチドを付加したタンパク質（ペプチド）の溶出が可能なことは、ｐＨの変化に弱いタンパク質に対しても適用可能であることを意味するため、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（ＢＮＣ）がアフィニティー精製用のタグペプチドとして好ましい性能を有していることがわかる。
【００４７】
実施例８  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）を付加したタンパク質の精製
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）をタグペプチドとして用い、タンパク質の精製を行なった。
（１）実施例１で得られたＢＮＣを付加したＭＢＰを発現する形質転換体（大腸菌）を、実施例２に記載の方法で培養後、超音波で破砕し、可溶性画分（ライセート）を得た。
（２）実施例３で得られたＢＮＣ認識抗体のうちの５種（ＢＣ２−７／ＢＣ２３−１１／ＢＣ２５−２／ＢＣ３０−６２／ＢＣ３０−７３）を、ＮＨＳで活性化されたカラム（ＧＥヘルスケア社製：ＮＨＳ  ＨＰ  ＳｐｉｎＴｒａｐ）に、商品添付の説明書に従い固定化することで、抗体固定化カラムを調製した。
（３）（２）の抗体固定化カラムに（１）の可溶性画分をロードすることで、ＢＮＣを付加したＭＢＰを抗体固定化カラムに吸着させた。
（４）吸着したＢＮＣを付加したＭＢＰを１００ｍＭ  グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出した。なお、アミロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるＢＮＣを付加したＭＢＰの精製を比較例として行なった。
【００４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度検定結果を図６に示す。左から２列目のレーンが可溶性画分（ライセート）、黒四角の位置にあるバンドがＢＮＣを付加したＭＢＰに相当するバンドである（その他のバンドは形質転換体由来のタンパク質に相当するバンド）。図６より、ＢＮＣ認識抗体結合カラムを用いてＢＮＣを付加したＭＢＰを精製した場合におけるタンパク質の精製度が、アミロースカラムを用いた場合と同等であることがわかる。よって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（ＢＮＣ）をタグペプチドとして用いることにより、タンパク質を夾雑物の混入なしに高純度に精製できることが判明した。
【００４９】
実施例９  Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）濃度の影響
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）を免疫測定用途に用いた場合、検体中に存在するＢＮＰの濃度によっては、前記ＢＮＰによりＢＮＣと抗体との結合が競合的に阻害されるおそれがあった。そこで、ＢＮＰ濃度によるＢＮＣとＢＮＣ認識抗体との結合性の影響を検討した。
（１）ＢＮＣを共有結合した抗エストラジオール抗体（以下抗Ｅ２抗体と略する）を作製した。
（２）（１）で作製した抗Ｅ２抗体とＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製、２２３２２）とを説明書に従い反応後、大過剰のＢＮＣと反応させることで、ＢＮＣと共有結合した抗Ｅ２抗体を作製した（図７）。
（３）３μｇのＢＮＣ認識抗体（ＢＣ２３−１１）を固定化した磁性ビーズに、（１）で作製した抗Ｅ２抗体を一定量反応させた。
（４）以下に示す３つの成分のうち、（ｂ）と（ｃ）とをそれぞれ５０μＬ加えた中に、（ａ）を５０μＬ添加することで反応を開始した。三つの成分は、
（ａ）ＢＮＣ標識抗体（５ｎｇ／５０μＬ）、
（ｂ）エストラジオール標識アルカリホスファターゼ（０．０５ｍＡ／５０μＬ）、
および
（ｃ）種々の濃度のＢＮＰである。
（５）３７℃で１０分間反応後、十分に洗浄し、固相に残ったＡＬＰの酵素活性を定法により測定した。
【００５０】
反応後に得られたシグナルを縦軸に、横軸にＢＮＰの濃度をプロットしたものを図８に示す。なお、図８においてＣａｌ２からＣａｌ６とは、東ソー株式会社で販売している免疫測定試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＢＮＰ））の検量線で使用している標準品であり、それぞれ、１５．２ｐｇ／ｍＬ（Ｃａｌ２）、４２．５ｐｇ／ｍＬ（Ｃａｌ３）、１５３ｐｇ／ｍＬ（Ｃａｌ４）、６４３ｐｇ／ｍＬ（Ｃａｌ５）、２４５０ｐｇ／ｍＬ（Ｃａｌ６）である。今回の測定条件では、市販試薬における高濃度標準品よりもさらに高い濃度である、１００ｎｇ／ｍＬのＢＮＰが検体中に存在しても、ＢＮＣを付加したタンパク質とＢＮＣ認識抗体との結合性に影響を与えないことがわかる。
【００５１】
なお、臨床上ではＢＮＰの濃度が非常に高いと判定された検体でも、ＢＮＰ濃度が１０００ｐｇ／ｍＬをこえることはまずない（健常人は数ｐｇ／ｍＬ）。ＢＮＰの分子量は３４６４であることから、１０００ｐｇ／ｍＬをモル濃度に換算すると０．２９ｐｍｏｌ／ｍＬとなる。反応に持ち込む検体（血清）は緩衝液で２倍希釈して１５０μＬ使用すると仮定すると、０．０２１７５ｐｍｏｌのＢＮＰが各ウェルに持ち込まれることになる。一方、ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製、マキシソープ）に固定化できるＢＮＣ認識抗体量を見積もると、ＥＬＩＳＡプレートの吸着容量は６５０ｎｇ／ｃｍ２で、ウェルあたりの面積は２．７ｃｍ２（カタログ記載値）であることから、前記抗体固定量は１７７５ｎｇ／ウェルとなる。前記抗体の分子量を１．５×１０５と仮定して固定化される抗体のモル数を計算すると、１１．７ｐｍｏｌとなる。前記抗体には抗原結合サイトが２箇所あるため、反応に関与できる結合部位は２３．４ｐｍｏｌとなる。つまり２３．４ｐｍｏｌの抗原結合サイトがあるのに対し、ＢＮＰ濃度は前述したように０．０２１７５ｐｍｏｌ（モル比で約１０００倍）である。したがって、実際臨床上の検体において高濃度のＢＮＰが存在してもほとんどの結合サイトは残っているため、測定系への影響はないと考えられる。
【００５２】
実施例１０  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）一置換体を結合させた抗体の調製
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）を構成するアミノ酸のうちの一つを他のアミノ酸に置換したオリゴペプチド（以下、一置換ＢＮＣ）の結合性能を評価するため、一置換ＢＮＣを結合させた抗体を調製した。
（１）遺伝子工学的手法で、重鎖（Ｈ鎖）Ｃ末端側に直接ＢＮＣが結合した遺伝子組み換え型抗エストラジオール抗体（以下、ＲａＭｏＡｂ）を発現可能なベクターを調製した。
（２）（１）で調製したベクターのうち、ＲａＭｏＡｂのＨ鎖Ｃ末端側に結合させたＢＮＣをコードするオリゴヌクレオチドに対し、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて変異導入することで、Ｈ鎖Ｃ末端側に直接一置換ＢＮＣが結合したＲａＭｏＡｂを発現可能なベクターを調製した（置換位置および置換アミノ酸の一覧を表１に示す）。
【００５３】
【表１】
2011140483.tif 000003
（３）特許文献５の方法に基づき、（１）で調製したベクターを用いてＨ鎖Ｃ末端側に直接ＢＮＣが結合したＲａＭｏＡｂ（以下、ＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣ）を、（２）で調製したベクターを用いてＨ鎖Ｃ末端側に直接一置換ＢＮＣが結合したＲａＭｏＡｂ（以下、ＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣ）を、それぞれ培養上清に発現させた。
【００５４】
実施例１１  ＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの定量
実施例１０で培養上清中に発現したＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの濃度は一定でないため，ＢＮＣ一置換体の結合性能を正確に比較するには，ＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの濃度補正が必要である。そこで、ＥＬＩＳＡ法を用いて培養上清中のＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの濃度を定量した。
（１）抗ウサギ抗体（ミリポア社製、ＡＰ１３２）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウエルで固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例１０で得られたＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣを含む培養上清を添加し反応させた。
（３）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識した抗ウサギ抗体（ミリポア社製、ＡＰ１３２Ａ）で、固相に捕捉されたＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの量を測定した。
（４）あらかじめ前記（１）から（３）に示すＥＬＩＳＡ法で種々の濃度のＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣを測定したものを検量線とし、ＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの濃度を算出した。
【００５５】
実施例１２  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）認識抗体の標識
実施例３で得られたＢＮＣ認識抗体のうち４種（ＢＣ２−７／ＢＣ２３−１１／ＢＣ３０−６２／ＢＣ３０−７３）について、アルカリホスファターゼキット（同仁化学社製、ＬＫ１２）を用いて、キットに添付のプロトコールに従いＡＬＰを標識した。
【００５６】
実施例１３  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）一置換体の結合性能評価
まずＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣの検量線を下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて作製した。
（１）エストラジオール標識ＢＳＡ（シグマ社製：Ｅ５６３０）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウエルで固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）種々の濃度のＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣを添加し反応させた。
（３）実施例１２で調製したＡＬＰ標識ＢＮＣ認識抗体のうち、ＢＣ２３−１１にＡＬＰを標識したものを１０００倍希釈し、固相に捕捉されたＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣと反応させた。
【００５７】
得られたＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣの検量線を図９に示す。図９よりＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣの濃度が高くなると、固相に結合するＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣの量が増加するため、ＡＬＰ標識ＢＣ２３−１１に由来する蛍光強度（ＦＩ）が増加していることがわかる。
【００５８】
このことから、まず、
（Ａ）（１）から（３）の方法で種々の濃度のＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣを添加したときのＡＬＰ標識ＢＮＣ認識抗体に由来する蛍光強度を測定し、
（Ｂ）ＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣ濃度を横軸とし（Ａ）で測定した蛍光強度を縦軸として、それぞれプロットすることでＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣの検量線を作成する。
次に、
（Ｃ）実施例１１に記載の方法で培養上清中のＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの濃度を定量し、
（Ｄ）（１）から（３）の方法でＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣと結合したＡＬＰ標識ＢＮＣ認識抗体（前記抗体は（Ａ）と同じ抗体）に由来する蛍光強度を測定し、
（Ｅ）（Ｃ）で定量した濃度を横軸とし（Ｄ）で測定した蛍光強度を縦軸としてプロットする。
その結果、（Ｅ）のプロット位置が（Ｂ）で作成した検量線より上方であれば結合性能が向上するアミノ酸置換であり、下方であれば結合性能が低下するアミノ酸置換であることがわかる（図１０）。前記（Ａ）から（Ｅ）に示す方法は、培養上清中のＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの濃度が異なっていても，結合性能を評価することができる点で有用な方法である。
【００５９】
そこで、前記（Ａ）から（Ｅ）に示す方法を用いて、ＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣの結合性能を評価した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いたときの結果を図１１から図１７に、ＢＣ２３−１１を用いたときの結果を図１８から図２４に、ＢＣ３０−７３を用いたときの結果を図２５から３１に、それぞれ示す。
【００６０】
図１１から図３１に示す結果のうち、図１８を例として結果を詳細に説明する。図１８のうち、白丸で示したプロットはＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣ精製品の希釈系列を用いて得られた結果であり当該プロットを用いて作成した検量線が図１８に示されている。また、黒丸で示したプロットは実施例１０の方法で培養上清に発現させたＲａＭｏＡｂ−ｍＢＮＣにおける結果である。なお、星印で示したプロットは対照実験として行なった実施例１０の方法で培養上清に発現させたＲａＭｏＡｂ−ＢＮＣにおける結果である。前記星印で示したプロットが検量線と誤差範囲で重なっていることから、本実験に妥当性があることがわかる。図１８の結果より、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち、１番目のシステイン（Ｃ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した場合は結合性能に変化はないものの、アスパラギン酸（Ｄ）に置換すると結合性能が若干低下し、それ以外のアミノ酸に置換すると結合性能がほぼ消失することがわかる。
【００６１】
図１１から図３１に示す結果を以下にまとめる。
【００６２】
（ア）１番目のシステイン（Ｃ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１１）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）に置換すると結合性能が向上したものの、その他のアミノ酸に置換すると結合性能が低下した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２３−１１を用いた場合（図１８）、グルタミン酸（Ｅ）に置換した場合は結合性能に変化はなかったものの、アスパラギン酸（Ｄ）に置換すると結合性能が若干低下し、その他のアミノ酸に置換すると結合性能がほぼ消失した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ３０−７３を用いた場合（図２５）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）に置換すると結合性能が若干向上したものの，その他のアミノ酸に置換すると結合性能が低下した。
【００６３】
（イ）２番目のリジン（Ｋ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１２）、アルギニン（Ｒ）に置換した場合は結合性能に変化はなかったものの、その他のアミノ酸に置換することで結合性能が向上しており、特にアスパラギン酸（Ｄ）に置換すると効果的であった。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２３−１１を用いた場合（図１９）、アスパラギン酸（Ｄ）に置換した場合は結合性能が若干低下したものの、その他のアミノ酸については置換による結合性能への影響はなかった。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ３０−７３を用いた場合（図２６）、アルギニン（Ｒ）に置換した場合は結合性能が低下したものの、その他のアミノ酸に置換することで結合性能が向上しており、特にアスパラギン酸（Ｄ）に置換すると効果的であった。
【００６４】
（ウ）３番目のバリン（Ｖ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１３）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）に置換することで結合性能が向上した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２３−１１を用いた場合（図２０）、結合性能が向上するアミノ酸置換と変化しないアミノ酸置換と低下するアミノ酸置換とが一様に存在するが、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、プロリン（Ｐ）またはスレオニン（Ｔ）に置換すると結合性能が特に向上した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ３０−７３を用いた場合（図２７）も、結合性能が向上するアミノ酸置換と変化しないアミノ酸置換と低下するアミノ酸置換とが一様に存在するが、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に置換すると結合性能が特に向上した。
【００６５】
（エ）４番目のロイシン（Ｌ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１４）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）またはイソロイシン（Ｉ）に置換した場合は結合性能に変化がなかったものの、その他のアミノ酸に置換すると結合性能は低下した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２３−１１を用いた場合（図２１）、結合性能が向上するアミノ酸置換と変化しないアミノ酸置換と低下するアミノ酸置換とが一様に存在するが、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に置換すると結合性能が特に向上した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ３０−７３を用いた場合（図２８）、他のアミノ酸への置換により結合性能がほぼ消失した。
【００６６】
（オ）５番目のアルギニン（Ｒ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１５）、プロリン（Ｐ）に置換した場合は結合性能に変化がなかったものの、その他のアミノ酸に置換すると結合性能は低下した。ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２３−１１を用いた場合（図２２）、他のアミノ酸への置換により結合性能が低下またはほぼ消失した。一方、ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ３０−７３を用いた場合（図２９）、プロリン（Ｐ）に置換した場合は結合性能に変化がなかったものの、その他のアミノ酸に置換すると結合性能は向上した。
【００６７】
（カ）６番目のアルギニン（Ｒ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１６）、ＢＣ２３−１１を用いた場合（図２３）、ＢＣ３０−７３を用いた場合（図３０）、いずれにおいても他のアミノ酸への置換により結合性能が低下またはほぼ消失した。
【００６８】
（キ）７番目のヒスチジン（Ｈ）を置換した場合
ＢＮＣ認識抗体としてＢＣ２−７を用いた場合（図１７）、ＢＣ２３−１１を用いた場合（図２４）、ＢＣ３０−７３を用いた場合（図３１）、いずれにおいても他のアミノ酸への置換により結合性能が消失した。
【００６９】
前記（ア）から（キ）の結果をまとめると、使用したＢＮＣ認識抗体により一部傾向が異なるものの、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち１番目のシステイン（Ｃ）、２番目のリジン（Ｋ）または３番目のバリン（Ｖ）を、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）（すなわち酸性アミノ酸）に置換することで、ＢＮＣと比較し結合性能が向上していることがわかる。一方、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち６番目のアルギニン（Ｒ）または７番目のヒスチジン（Ｈ）は他のアミノ酸に置換すると結合性能が低下または消失することから、前記場所のアミノ酸置換は好ましくないことがわかる。
【００７０】
実施例１４  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）多重置換体の結合性能評価
実施例１３での検討により、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち１番目のシステイン（Ｃ）、２番目のリジン（Ｋ）または３番目のバリン（Ｖ）を、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）（すなわち酸性アミノ酸）に置換することで、結合性能（親和性）が向上することが判明した。そこで、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち１番目のシステイン（Ｃ）から３番目のバリン（Ｖ）を、全てアスパラギン酸（Ｄ）に置換したオリゴペプチド（ＤＤＤＬＲＲＨ、配列番号２１）を作製し、実施例１０、実施例１１および実施例１３と同様の方法で結合性能を評価した。なお、ＢＮＣ認識抗体はＢＣ３０−７３を使用している。
【００７１】
結果を図３２に示す。また、対照として、１番目のシステイン（Ｃ）のみをアスパラギン酸（Ｄ）に置換したオリゴペプチド（ＤＫＶＬＲＲＨ、配列番号２２）での評価結果（図２５のＤのプロット）、２番目のリジン（Ｋ）のみをアスパラギン酸（Ｄ）に置換したオリゴペプチド（ＣＤＶＬＲＲＨ、配列番号２３）での評価結果（図２６のＤのプロット）、３番目のバリン（Ｖ）のみをアスパラギン酸（Ｄ）に置換したオリゴペプチド（ＣＫＤＬＲＲＨ、配列番号２４）での評価結果（図２７のＤのプロット）、をまとめたものを図３３に示す。検量線（種々の濃度のＢＮＣでの結果）との比較から、結合性能の向上が一置換ＢＮＣでは最大３倍程度（配列番号２３のとき）であったが、配列番号２１に示す三置換ＢＮＣでは４倍程度まで向上することが判明した。したがって、特定の好ましいアミノ酸置換をＢＮＣに複数導入することで、結合性能がより向上することがわかる。
【００７２】
実施例１５  ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）欠失体の結合性能評価
配列番号１０記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち、Ｎ末端側から１アミノ酸ずつ欠失させたものを調製し、前記オリゴペプチドの結合性能を評価した。
（１）実施例１および実施例２の方法に従い，マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）のＣ末端側にＢＮＣのＣ末端から一個ずつアミノ酸を欠失させたオリゴペプチドを結合させた融合タンパク質を作製した。実際にＭＢＰのＣ末端に結合させたペプチド配列は，ＫＶＬＲＲＨ（配列番号２５）、ＶＬＲＲＨ（配列番号２６）およびＬＲＲＨ（配列番号２７）である。
（２）下記に示すＥＬＩＳＡ法で前記オリゴペプチドに対する反応性を評価した．
（２−１）精製タンパク質を０．１μｇ／ウエルから２倍希釈系列で固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２−２）実施例１２で得られたＡＬＰ標識されたＢＮＣ認識抗体（ＢＣ２−７、ＢＣ３０−７３、ＢＣ３０−６２、ＢＣ２３−１１）を１０００倍希釈して反応させ，固相に残ったＡＬＰの酵素活性を定法により測定した。
【００７３】
結果を図３４に示す。使用したＢＮＣ認識抗体によって傾向は異なるものの、アミノ酸の欠失により、ＢＮＣ全長（７アミノ酸、配列番号１０）と比較して、結合性能は低下している。しかしながら、Ｎ末端側３アミノ酸欠失させても一定の結合性能は残存していることがわかる。そのため、タグペプチドとしての使用目的にもよるが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＣのうち、少なくともＣ末端側４アミノ酸（配列番号２７）を含んでいれば（すなわち１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させたオリゴペプチドであれば）、タグペプチドとして使用可能といえる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰのＣ末端側ペプチドをタンパク質に付加することで、タンパク質の高純度な精製および高感度な検出を可能とする。これは免疫測定試薬用のタンパク質の固定化および検出において極めて有効な方法である。なお、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰのＣ末端側ペプチドのうち、
（Ａ）１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を酸性アミノ酸に置換したオリゴペプチド、または
（Ｂ）１番目のシステインから３番目のバリンまでのアミノ酸のうちの一つ以上を欠失させたオリゴペプチド、
であっても、前記高純度な精製および高感度な検出が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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