(57)【要約】      （修正有）【課題】互いにくっ付かず、ペレット状に凍結された乳酸菌培養物の提供。【解決手段】少なくとも５０ｇの重量の凍結物質を有する商業用パッケージ中の凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物であって、ここで当該凍結培養物が、個別のペレットの形態で存在し、-４６℃で７〜１４日間貯蔵されたとき、凍結培養物の個別のペレットが互いにくっ付かず、その結果、実質的に個別の粒子として残る凍結乳酸菌培養物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５０ｇの重量の凍結物質を有する商業用パッケージ中のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物であって、  当該凍結物質が個別のペレット形態で存在し、  １ｇの凍結物質あたり少なくとも１０9コロニー形成ユニットの生菌量を有し、そして  凍結物質のｗ/ｗとして計測される０.５％〜１３％の添加化合物であって、凍結物質のｗ/ｗとして計測される１０％の量の当該添加化合物を使用することにより、添加化合物を伴わない場合に(ＤＳＣにより計測された)-７０℃〜-４６℃のＴｍ’値を有する凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’(融解の開始温度)を、-４６℃を超えるＴｍ’値、例えば-４５℃〜-１５℃に増加できる化合物の群から選ばれる上記添加化合物を含み、  そしてここで、当該凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物が約−４６℃で、７〜１４日間貯蔵された場合に、凍結培養物の個別のペレットが互いにくっ付かず、それゆえ実質的に個別のペレットとして残ることにより特徴付けられ、ここで当該特徴決定は、以下の試験：        当該凍結培養物の個別のペレットが液体窒素中で凍結されたペレットであり、そして１００個の個別のペレット(約５〜１００ｇのペレット)が、ペトリ皿に入れられ、こうして固まっていない個別の単一ペレットの薄層であって、当該ペレットの多くが１以上のその近隣のペレットと物理的に接触していることにより特徴付けられる上記薄層を形成し、約−４６℃で７〜１４日間置かれ、そしてペレットが未だに固まっていないか、又はペレットが塊を形成する若しくは互いにくっ付くかを観察するために試験され、当該試験において、凍結培養物の個別のペレットが個別のペレットとして残るという判断基準は、１００個の個別のペレットの内の少なくとも８０個が個別の固まっていない単一ペレットとして残るということである        により測定される、前記ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物。  但し、スクロースを利用できるＬＡＢを含む凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物であって、凍結物質のｗ／ｗとして計測される２％〜１３％の量のスクロース；及び凍結物質のｗ／ｗとして計測される４％〜６％の量のトレハロース；並びに凍結物質のｗ／ｗとして計測される１３％の量のトレハロース／スクロース両方の混合物からなる群から選ばれる抗凍結薬剤化合物を含む、前記培養物を除く。
【請求項２】
前記培養物が、約３０℃にて最適増殖温度を有する中温性細菌からなる、混合された中温性の培養物である、請求項１に記載のペレット凍結培養物。
【請求項３】
前記ＬＡＢが、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium spp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium spp.)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium spp.)、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)を含むラクトコッカス属(Lactococcus spp.)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)を含むラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus spp.)、オエノコッカス属(Oenococcus spp.)、並びにペニシリウム属(Pencillium spp.)、クリプトコッカス属(Cryptococcus spp.)、デブラヨマイシス属(Debraryomyces spp.)、クリベロマイシス属(Klyveromyces spp.)、及びサッカロマイシス属(Saccharomyces spp.)を含む菌類(fungal spp.)を含む群から選ばれるＬＡＢである、請求項１又は２に記載のペレット凍結培養物。
【請求項４】
前記凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物が、請求項１に記載の添加化合物を含まない場合に-７０℃〜-４６℃のＴｍ’を有する培養物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペレット凍結培養物。
【請求項５】
前記凍結乳酸菌培養物が、凍結物質のｗ/ｗとして計測される５％〜１０％の添加化合物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペレット凍結培養物。
【請求項６】
前記添加化合物が、シクロデキストリン、マルチトール、トレハロース、魚ゼラチン、マルトデキストリン、酵母抽出物、及びスプレー・ガムからなる群から選ばれる添加化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペレット凍結培養物。
【請求項７】
以下のステップ：  (ｉ)  添加化合物を生菌に加えて、物質１ｇあたり少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)の生菌量を有する少なくとも５０ｇの物質を得て、そして物質のｗ/ｗとして計測される０.５％〜１３％の量で当該添加化合物を含み、  (ii)  当該物質を凍結して、ペレット凍結物質を獲得し、そして  (iii)  ペレット凍結物質を適切な方法でパッキングして、請求項１〜６のいずれか一項に記載のパックされた凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物を得る  を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の製造方法。
【請求項８】
請求項７のステップ(ｉ)に記載の添加化合物を加える前に、添加化合物を含まない凍結乳酸菌(ＬＡＢ)のＴｍ’値を計測し、そして当該培養物が-７０℃〜−４６℃のＴｍ’値を有することを同定し；そして  添加化合物を加えた後に、添加化合物を含む凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’値を計測し、そしてＴｍ’値が−４９℃〜−１５℃、より好ましくは−３９℃〜−１５℃であることを確認する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の製造方法により獲得できる、ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物。
【請求項１０】
食品又は飼料の製造工程における、請求項１〜６、及び９のいずれか一項に記載のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも５０ｇの重量の凍結物質を有する商業用パッケージ中のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)に関する。ここで、当該凍結物質は、培養物の初融点(Ｔｍ’)以下の温度、例えば-４６℃で７〜１４日間貯蔵されたとき、凍結培養物の個別のペレットが、互いにくっつかず、それゆえ実質的に個別のペレットとして残るという事実により特徴付けられる。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、多くの乳製品を含む食品及び飼料の製造に関する。細菌培養物、特に乳酸菌と一般的に分類される細菌の培養物は、全ての発酵乳製品、チーズ及びバターの製造において必須である。かかる細菌の培養物は、スターター・カルチャーと呼ばれることもあり、そして多くの機能を発揮することにより様々な乳製品に特有な特徴を付与する。
【０００３】
乳製品のスターター・カルチャーは、一般的に乳酸菌から構成される。この文脈では、「乳酸菌(ＬＡＢ)”という表現は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、非運動性、非胞子形成性、微好気性又は嫌気性の細菌であって、主に産生される酸として乳酸、ギ酸、及びプロピオン酸を含む有機酸の産生を伴って糖を発酵する細菌の群を指す。この文脈では、乳酸菌は、グラム陽性細菌門の多くの細菌属から構成される。カルノバクテリウム属(Carnobacterium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクトスファエラ属(Lactosphaera)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、メリソコッカス属(Melissococcus)、オエノコッカス属(Oenococcus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、テトラゲノコッカス属(Tetragenococcus)、バゴコッカス属(Vagococcus)、及びウェイセラ属(Weissella)はＬＡＢとして認められている。放線菌門に属する乳酸産生グラム陽性細菌、例えばアエロコッカス属(Aerococcus)、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、及びプロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、並びにビフィドバクテリウム属も、本文脈でＬＡＢと考えられている。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種(Lactococcus)、ストレプトコッカス種(Streptococcus)、エンテロコッカス種(Enterococcus)、ラクトバチルス種(Lactobacillus)、ロイコンストック種(Leuconostoc)、ビフィドバクテリウム種(Bifidobacterium)、及びペディオコッカス種(Pediococcus)の中で見つかっている。
【０００４】
乳工業での使用に加えて、乳酸菌培養物はまた、食肉加工業並びに多くの他の工業において広く使用されることが知られている。
【０００５】
商業用スターター・カルチャーは、凍結培養物として分配されうる。高濃縮された凍結培養物は、中間体へ移すことなく発酵培地(例えば、乳汁又は肉)に直接植菌することができるので、商業的にかなり関心が高い。言い換えると、かかる高濃縮凍結培養物は、末端利用者の自家バルク・スターター・カルチャーを不要なものとする量の菌を含む。「バルク・スターター」は、本明細書中において、発酵培地に植菌するために食品加工工場で増殖されたスターター・カルチャーとして定義される。高濃縮培養物は、ダイレクト・バット・セット(ＤＶＳ)-カルチャーとよばれうる。末端利用者においてＤＶＳカルチャーとして使用される十分な細菌を含むために、濃縮凍結培養物は、少なくとも５０ｇの重量、そして少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇの生菌量を含まねばならない。
【０００６】
従来の凍結培養物の使用における重大な問題は、培養物の実際の取り扱いにおける利便性である。「ブロック状」に凍結された培養物は取り扱いが難しい一方で、ペレット状に凍結された培養物は、製造者及び消費者の両者の取り扱いがかなり容易である。
【０００７】
結果として、高濃縮ペレット状凍結培養物、いわゆる凍結ダイレクト・バット・セット(Ｆ-ＤＶＳ)カルチャー、繁栄している市場が形成された。
【０００８】
凍結培養物の生存率に関する多くの刊行物が出版された。
【０００９】
Chavarriら、(1988)は、純粋なストレプトコッカス・ラクチス(Streptococcus lactis)の凍結培養物の生存率が、５％ラクトース又は５％スクロースの添加により改善されうるということを記載した。
【００１０】
Carcobaら、(2000)は、純粋なラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis)の凍結培養物が、糖(ラクトース、スクロース、及びトレハロース)、グルタミン酸、及びゼラチンなどの異なる抗凍結剤を加えることにより改善されうるということを記載した。
【００１１】
米国特許第4,140,800号(Kline)は、異なる抗凍結剤の添加により、凍結乾燥培養物の生存率が改善されうるということを記載する。ラクトース、スクロース、又はマルトースを加えられた凍結培養物の生存率も記載されている。
【００１２】
ＷＯ００／３９２８１(Kringelumら)は、非凍結液体スターター・カルチャーの生存率が種々の抗凍結剤を加えることにより改善されうるということを記載する。
【００１３】
ＷＯ２００４／０６５５８４Ａ１(Bisgaard-Frantzen)は、高濃縮凍結スターター・カルチャーの生存率が、様々な抗凍結剤を加えることにより改善されうるということを記載する。
【００１４】
ＷＯ２００４／０６５５８４Ａ１のみが、ペレット凍結培養物を記載し、そして上記刊行物のどれも、貯蔵の間におけるペレット凍結培養物の物理的安定性について記載していない。
【発明の概要】
【００１５】
商業的に、ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物は、通常、適切なパッケージで提供されている(例えば、２ｌの紙パック製のテトラパック（登録商標）)。当該培養物は、通常約-４６度の貯蔵温度で貯蔵され、そして凍結物質は、比較的軽い重量の個別のペレット形態で存在する。
【００１６】
本発明以前には、本発明者は、かかる商業用ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の貯蔵に関して重大な問題がないと信じていた。
【００１７】
しかしながら、様々な研究に基づき、本発明者は、約-４６℃で７日間以上貯蔵された多くの商業用培養物の場合、個別のペレットが互いにくっ付き、そして大きな塊になることを同定した。工場環境では、塊の形成は、取り扱い上の問題となる。培養物が固まる場合、培養物パッケージから適切な量を加えることはかなり難しくなる。さらに、都合のよい方法でパッケージから塊となった培養物を取り出すことは難しいことがある。
【００１８】
さらなる研究により、「問題のある」培養物は、約-４６℃の貯蔵温度以下の、ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’値(融解の始まり、Roos(1995)に定義される)を有することにより特徴づけられると同定された。Ｔｍ’値は、食品工業及びその他において使用される標準的な物理化学的用語である。Ｔｍ’値は、Roos(1991)により記載されるように示唆走査熱量測定(ＤＳＣ)技術により通常計測される。Ｔｍ’値は、食品(ここでは、凍結ＬＡＢ培養物)の融解の開始温度を指す。さらなる詳細については、教科書”Food Chemistry”Fennema(1996)及び”Phase Transition in Foods”Roos(1995)を参照のこと。
【００１９】
理論に束縛されることなく、凍結培養物がその貯蔵温度、例えば約-４６℃以下のＴｍ’値を有する場合、最初の相移転(融解)が起こり、そして個別のペレットが互いにくっつき、そして大きな塊を形成することが信じられている。
【００２０】
要約すると、本発明者の研究により、幾つかのタイプの商業用高濃縮ペレット凍結乳酸菌培養物の物理的な外観に関して、今まで認識されなかった貯蔵の問題点が同定された。この問題がひとたび同定されると、本発明者は、問題を解決しようとした。
【００２１】
可能な理論上の説明とは無関係に、本発明者は、ある適切な添加化合物を問題のペレット凍結培養物に加えることにより、-４６℃で７〜１４日間貯蔵したあと個別のペレットの塊を形成しないペレット凍結培養物を得ることができるということを同定した。かかる培養物は、凍結培養物の個別のペレットが互いにくっ付かず、それゆえ約-４６℃での長期の貯蔵のあとでさえ、実施的に個別のペレットとして残ることにより特徴付けられた。
【００２２】
概して、適切な添加化合物は、凍結培養物のＴｍ’値を貯蔵温度、例えば-４６℃以上に増加できること、例えばＴｍ’値を-７０〜-４６℃の範囲から-４５℃〜-１５℃に上昇させることができるということにより特徴付けられうる。
【００２３】
本明細書中の実施例は、適切な添加化合物の好ましい実施例を記載する。記載された化合物は、トレハロース、マルトデキストリン、シクロデキストリン、スプレー・ガム、魚ゼラチン粉、及びマルチトールを含む。一般的な知識に基づいて、当業者は、凍結培養物のＴｍ’値を、貯蔵温度、例えば-４６℃以上に増加させることができる更なる適切な添加化合物を同定できる。
【００２４】
上で記載されるように、十分な細菌を含むために、商業用高濃縮凍結培養物は、一般的に少なくとも５０ｇの重量を有し、そして少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇの生菌量を有した。Chavarri(1988)及びCarcoba(2000)の論文に記載される培養物は、ペレット凍結培養物の物理的安定性を対象にしておらず、むしろ本文脈において商業用高濃縮凍結培養物とは考えられていない凍結細菌の生存率を対象としていた。なぜなら、当該培養物はかなり小規模で作られ、そしてかなり少ないグラムの凍結培養物しか含まず、そしてさらに記載された培養物はペレット凍結培養物ではないからである。また、Chavarri(1988)及びCarcoba(2000)により記載される培養物は、ペレット凍結培養物の物理的安定性を対象としておらず、むしろ凍結細菌の生存率を対象としていた。
【００２５】
従って、本発明の第一の態様は、少なくとも５０ｇの重量の凍結物質を有する商業用パッケージ中のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)に関する。ここで凍結物質は、個別のペレットの形態で存在し、少なくとも凍結物質１ｇあたり１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)の生細菌量を有し、凍結物質のｗ／ｗとして計測される０.５％〜１３％の添加化合物を含む。
【００２６】
添加化合物は、凍結物質のｗ／ｗとして計測される１０％の量の添加化合物を使用することにより、凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物(添加化合物を有さない当該凍結乳酸菌培養物は-７０℃〜-４６℃のＴｍ’値を有する)のＴｍ’値(融解の開始温度)を、-４５℃〜-１５℃に上昇できる化合物の群から選ばれる(ＤＳＣにより計測された)。
【００２７】
さらに、凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物は、約-４６℃で７〜１４日貯蔵したとき、凍結培養物の個別のペレットが互いにくっ付かず、それゆえ実質的に個別のペレットとして残っていることにより特徴付けられる。ここでこのことは以下の試験により計測される：
凍結培養物の個別のペレットが、液体窒素中で凍結されたペレットであり、そして１００個の個別のペレット(約５〜１００ｇのペレット)をペトリ皿に注ぎ、そうして個別の単一ペレットの固まっていない薄層を形成させ、およそ-４６℃で７〜１４日間置き、そしてペレットが未だに固まっていないか、又はペレットが塊を形成する若しくは互いにくっ付くかを観察するために試験した。ここで凍結培養物の個別のペレットが、実質的に個別のペレットとして残っているかについての判断基準は、１００個の個別のペレットのうちの少なくとも８０個が固まっていない個別の単一のペレットとして残っていることである。
【００２８】
しかしながら、スクロースを利用できるＬＡＢを含む凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物(ここで、当該培養物は、以下の：凍結物質のｗ／ｗとして計測される２％〜１３％の量のスクロース；及び凍結物質のｗ／ｗとして計測される４％〜６％の量のトレハロース；並びに凍結物質のｗ／ｗとして計測される１２％〜１４％の量のトレハロース／スクロース混合物からなる群から選ばれる抗凍結剤化合物を含む)は、本発明の第一態様から特異的に除かれる。
【００２９】
第一態様の最後に記載される「除く部分」は、ＰＣＴ出願ＷＯ2004/065584A1に関連している。この出願は、2004年１月19日に出願された。本出願の優先権の基礎出願の出願日では、PCT出願WO2004/065584A1は開示されていなかった。
【００３０】
WO2004/065584A1は、凍結培養物の貯蔵の間において生存率を改善することに関する。これは、本発明の「ペレットの粘着性」の問題を記載しない。一般的なメーン・クレーム１は、「スクロースを利用できるＬＡＢを含み、少なくとも５０ｇの重さの凍結物質及び凍結物質１ｇあたり少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)の生菌量を有する凍結乳酸細菌(ＬＡＢ)培養物であって、当該凍結培養物が、凍結物質のｗ／ｗとして計測される０.５％〜８０％の抗凍結剤を含むことを特徴とする培養物」に関する。
【００３１】
抗凍結剤を有するペレット凍結培養物がＷＯ２００４／０６５５８４Ａ１に記載されているが、ＷＯ２００４／０６５５８４Ａ１は、スクロースを利用できる培養物を特異的に特許請求するのみであるので、当業者が不可避的にＷＯ２００４／０６５５８４Ａ１の範囲内となる結果に到達することは、除外されうる。
【００３２】
本発明の凍結培養物に関して、添加化合物は、好ましくは凍結される前に生菌に加えられるべきである。
【００３３】
従って、第二態様において、本発明は、本発明の第一態様及び以下に記載される実施態様のペレット凍結乳酸細菌(ＬＡＢ)培養物を作成する方法であって、以下のステップ：
(ｉ)  添加化合物を生菌に加えて、物質１ｇあたり少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)の生菌量を有し、かつ物質のｗ／ｗとして計測される０.５％〜１３％の量の添加化合物を含む、少なくとも５０ｇの物質を得て、
(ii)  ペレット凍結物質を得るために物質を凍結し、そして
(iii)  適切な方法で凍結物質をパックして、本発明の第一態様及びここに記載される実施態様の、パックされたペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物を得る
を含む方法に関する。
【００３４】
本発明の第三の態様は、本発明の第二態様のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物を作る方法により獲得されたペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物に関する。
【００３５】
本発明の第四の態様は、食品又は飼料の製造方法において上記ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】融解の開始が生じる温度(Ｔｍ’)と加えられた二糖の量との間の相関を図に表す。さらなる詳細について、上記の実施例３を参照のこと。-４６℃の貯蔵温度を点線で示す。
【図２】マルトデキストリン(グルシデックス１２)濃度(％w／w)(Ｘ軸)の関数としての、多くの培養物の融解の開始温度(Ｔｍ’)(Ｙ軸)。培養物名にＡを付けたものは、グリセリンを培養物に加えたことを指し、Ｂを付けたものは、グリセリンをペレット凍結前に培養物に加えなかったことを指す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本発明の詳細な実施態様を議論する前に、本発明の主態様に関連する特定の用語の定義を与える。
【００３８】
「スクロースを利用できるＬＡＢ」という用語は、酸を産生しながら糖であるスクロースを発酵できるＬＡＢを指す。当該用語は、ＰＣＴ公開番号WO2004／065584A1における定義と同一である。
【００３９】
培養物の「物質」という用語は、生菌及び抗凍結物質の両者を含む培養物の適切な構成要素を指す。パッキングは含まれない。結果として、培養物の物質の重量は、パッキングの重量を含んでいない。
【００４０】
「パッキング」又は「パッケージ」という用語は、広く理解されるべきである。ユーザーに提供するために、ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物はパッキングされるべきである。当該培養物は、ボトル、テトラパック（登録商標）コンテナなどにパッキングされてもよい。
【００４１】
「添加化合物」という用語は、本文脈において、単一の特異的添加化合物であってもよいし、又は２以上の異なる添加化合物であってもよい。従って、培養物質内の添加化合物のｗ／ｗ割合は、添加化合物の量の合計として理解されるべきである。好ましくは、当該用語は、発酵後に培養物に加えられる化合物に関する。従って、そのようなものとして、当該化合物は、培養物発酵培地に有意な量で存在しない化合物であってもよい。
【００４２】
「ペレット凍結」及び「ペレット凍結培養物」という用語は、凍結培養物のペレット又は顆粒をもたらす方法の使用により凍結された培養物を指す。ペレット凍結培養物は、培養物を滴下して液体Ｎ2に加えることにより上手く作られて、培養物の凍結ペレット又は顆粒を形成する。典型的に、当該方法は、従来の工業的凍結乾燥工場におけるトレー上で行われるが、必ずしもそうではない。
【００４３】
「ペレット」又は「顆粒」という用語は、小さい固体状の物体であって、０.１〜１０ｍｍの平均サイズの凍結した液体により形成される物体を指す。
【００４４】
本発明の実施態様は、例示のみの様式により、以下に記載される。
【００４５】
Ｔｍ’値
上に説明されるように、Ｔｍ’値は、物理化学において標準的に知られている用語であり、融解の開始が生じる温度を指す。本文脈では、Ｔｍ’は、凍結ＬＡＢ培養物の融解の開始が生じる温度を指す。
【００４６】
好ましくは、Ｔｍ’値は、本明細書において実施例１の「Ｔｍの計測」と名づけられる欄において記載されるＤＳＣ法の使用により計測される。
【００４７】
ペレット塊試験
本発明の第一態様に関して説明されるように、ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物が、約-４６℃(本状況では、-５０℃に予め設定された冷凍庫は、-４６℃のサンプル温度を有した)で、７〜１４日貯蔵されるとき、凍結培養物の個別のペレットは、互いにくっつかず、その結果、個別のペレットとして実質的に残ることにより特徴付けられる培養物であるかを分析する試験は、以下の試験を含む：
凍結された培養物の個別のペレットは、液体窒素中で凍結されたペレットであり、そして１００個の個別のペレット(約５〜１００ｇのペレット)を、ペトリ皿に注ぎ、そうして、固まっていない個別の単一のペレットの薄層を形成させる。当該層は、多くのペレットが、その隣のペレットの１以上と物理的に接触しており、約-４６℃で７〜１４日置かれ、そして当該ペレットが未だに固まっていないか、又は当該ペレットが塊を形成する若しくは互いにくっ付くかを観察するために試験した。ここで凍結培養物の個別のペレットが実質的に個別のペレットとして残るということの基準は、１００個の個別のペレットのうちの少なくとも８０が、個別の単一のペレットとして残っているということである。より好ましくは、１００個の個別のペレットのうちの少なくとも９０個が、固まっていない個別の単一のペレットとして残り、そしてさらにより好ましくは、１００個の個別のペレットのうちの少なくとも９５が、固まっていない個別の単一のペレットとして残る。
【００４８】
固まっていない個別の単一のペレットとして残っている個別のペレットを試験及び計数することは、視覚的に行われうる。これを継続的に行うことは当業者の能力の範囲内であり、ここで当該結果は、通常の限定された技術的不確定性の範囲内で一貫しており、そして反復可能である。本明細書の実施例１はさらに技術的詳細を提供する。
【００４９】
ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物
好ましくは、「凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物」という用語は、本明細書中に記載されるように、添加化合物を含まないときに、-７０〜-４６℃のＴｍ’値を有する培養物を指す。当該培養物は、ペレット又は顆粒の形態で凍結されることもあり、「ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物」を形成する。ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物は、当該培養物を、液体Ｎ2に滴下して加えて、当該培養物の凍結ペレット又は顆粒を形成することにより都合よく作られうる。
【００５０】
培養物のＬＡＢは、適切なＡＰＩ試験キット(bioMerieux SA, Lyon, France)の利用による国際ＩＤＦ基準１４６Ａ：１９９８"微生物特徴の同定”に従ったスクロースを利用しない任意の商業用ＬＡＢでありうる。ＡＰＩキット「rapid ID 32 STREP」及び「５０ＣＨＬMedium」を使用して、多くのＬＡＢ属についてスクロース利用状態を確立する。
【００５１】
好ましくは、ＬＡＢは、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium spp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium spp.)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium spp.)、ラクトコッカス(Lactococcus spp.)、例えばラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、ラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)、例えばラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus spp.)、ロイコノストック属(Leuconostoc spp.)、オエノコッカス属(Oenococcus spp.)、及び菌類(fungal spp.)、例えばペニシリウム属(Pencillium spp.)、クリプトコッカス属(Cryptococcus spp.)、デブラヨマイシス属(Debraryomyces spp.)、クリベロマイシス属(Klyveromyces spp.)、及びサッカロマイシス属(Saccharomyces spp.)を含む群から選ばれるＬＡＢである。
【００５２】
これらの種の幾つかは、一般的にスクロースを利用できると記載されているけれども、スクロースを利用できない突然変異体が、単離されてきており、そして継続して単離されるであろう。このような突然変異体がどんなに単離され、又は獲得されようとも、それらは本発明の一の態様である。
【００５３】
工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種(Lactococcus species)、ストレプトコッカス種(Streptococcus species)、エンテロコッカス種(Enterococcus species)、ラクトバチルス種(Lactobacillus species)、ロイコノストック種(Leuconostoc species)、及びペディオコッカス種(Pediococcus species)の中から見られる。
【００５４】
「混合された乳酸菌(ＬＡＢ)培養物」という用語は、２以上の異なるＬＡＢ種を含む混合された培養物を指す。「純粋な乳酸菌(ＬＡＢ)培養物」という用語は、単一のＬＡＢ種のみを含む純粋な培養物を指す。
【００５５】
本明細書中に記載される培養物は、約３０℃の最適成長温度を有する中温菌からなる中温培養物でありうる。「中温培養物」は、２以上の異なる中温ＬＡＢ種を含む培養物である。
【００５６】
中温菌の群に属する典型的な生物は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis)、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・クレモリス(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス・次亜種ジアセチラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis)、及びラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ(Lactobacillus casei subsp. casei)を含む。
【００５７】
本明細書中に記載される培養物は、スクロースを利用できないＬＡＢを含んでもよい。いわゆるＯ-培養物は、穴がないチーズ(チェダー・チーズ、チェシャー・チーズ、フェタチーズ)を作るために使用され、そして典型的にラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis)、及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)を含む群から選ばれる１以上の生物を含む。一般的に、Ｏ-培養物はスクロースを利用しないと考えられている。
【００５８】
高濃縮ペレット凍結乳酸菌培養物
本明細書中に記載される凍結培養物は、食品工業において高濃縮ペレット凍結乳酸菌培養物と名づけられる培養物である。十分な細菌を含むようにするため、かかる培養物は、比較的高濃度の生菌と混合された比較的大きい量である(十分な重量を有する)べきである。比較的多くの細菌が必要とされるならば、生菌の重量及び／又は濃度を増加させるべきであることは明らかである。
【００５９】
好ましくは、本明細書中に記載されるペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物は、少なくとも１００ｇの凍結物質、より好ましくは少なくとも２５０ｇの重量の凍結物質、さらにより好ましくは少なくとも５００ｇの重量の凍結物質、そして最も好ましくは少なくとも９００ｇの重量の凍結物質を有する。好ましくは、凍結物質の重量は、５００ｋｇ未満である。
【００６０】
好ましくは、本明細書中に記載されるペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物は、少なくとも５×１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇ凍結物質の生菌量、より好ましくは少なくとも１０10のコロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇ凍結物質の生菌量、そして最も好ましくは少なくとも２×１０10コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇ凍結物質の生菌量を有する。
【００６１】
ＬＡＢの発酵及び適切な発酵培地は、当該技術分野に知られており、そして当業者は、特定のＬＡＢについて適切な培地及び発酵条件を選ぶことができる。適切な培地及び発酵を本明細書の実施例において与える。
【００６２】
十分な量の細菌を得るために、本文脈において、適切な巨大発酵タンク中で比較的大規模の発酵を行うことが好ましい。少なくとも５０ｌ、好ましくは９０ｌ、さらにより好ましくは５００ｌ、又はそれ以上の発酵タンクが好ましい。
【００６３】
適切な発酵の後に、生菌は、好ましくは、(例えば遠心により)発酵培地の液体(上清)を取り除くことにより単離される。単離された生菌は、単離バイオマスと名づけられうる。単離された生菌は、好ましくは少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇ凍結物質の生菌量、より好ましくは５×１０9ＣＦＵ／ｇ凍結物質の生菌量、そして最も好ましくは少なくとも１０10ＣＦＵ／ｇ凍結物質の生菌量を有するべきである。
【００６４】
添加化合物(以下を参照のこと)を濃縮培養物に加えた後に、培養物は、当該混合物を液体Ｎ2中に滴下して加えることにより都合よく凍結されて、当該混合物の凍結ペレット又は顆粒を形成しうる。適した凍結方法は、ＤＥ２８０５６７６及びＦＲ２３９３２５１に記載されている。
【００６５】
ペレット凍結培養物は、次に、使用者に提供するために適切な方法でパッケージされる。
【００６６】
添加化合物
上で記載されるように、好ましくは適切な添加化合物は、凍結培地のＴｍ’値を貯蔵温度、例えば-４６℃より高い値に増加させる、例えば、-４５℃〜-１５℃のＴｍ’値、より好ましくは-４３℃から-１５℃Ｔｍ’値、そしてさらにより好ましくは-３９℃から-１５℃のＴｍ’値に増加させることができるということにより特徴付けられる。
【００６７】
本明細書の実施例２は、適切な添加化合物を同定するための迅速な実験戦略を記載する。様々な適切な化合物(１０％ｗ／ｗ)を-４６℃未満のＴｍ’値を有する「モデル」凍結培養物(実施例２では、「モデル」培養物は、-５４℃のＴｍ’値を有する)に加え、そして添加前後においてＴｍ’値をＤＳＣにより計測した。
【００６８】
実施例２の「モデル」培養物及び実施例２の試験プロトコルは、好ましくは、関心の特定の添加化合物が凍結培養物のＴｍ’値を-４６℃を越える値、例えば-４５℃〜-１５のＴｍ’値、より好ましくは-４３℃〜-１５℃のＴｍ’値、さらに好ましくは-３９℃〜-１５℃のＴｍ’値に増加できるということにより、当該添加化合物が特徴付けられるかを評価するために使用される。
【００６９】
実施例２において、シクロデキストリンが、Ｔｍ’を-４４℃に増加させ、マンニトールがＴｍ’値を-４２℃に増加させ、トレハロースがＴｍ’を-３８℃に増加させ、魚ゼラチンがＴｍ’値を-３７℃に増加させ、マルトデキストリンがＴｍ’値を-３２℃に増加させ、そしてスプレー・ガムがＴｍ’値を-３１℃に増加させることを見ることができる。
【００７０】
好ましくは添加化合物は、１５０〜１０００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは２５０〜１０００００ｇ／ｍｏｌ、さらにより好ましくは３００〜４００００ｇ／ｍｏｌ、そして最も好ましくは５００〜１５０００ｇ／ｍｏｌの分子量(ＭＷ)を有する化合物である。
【００７１】
好ましい実施態様では、添加化合物は、抗凍結剤である。
【００７２】
「抗凍結剤」という用語は、培養物の生存率により計測される凍結培養物の貯蔵安定性を改善することができる物質を指す。本文脈では、抗凍結剤は、一の特異的抗凍結薬剤であってもよいし、又は２以上の異なる薬剤であってもよい。従って、培養物質中の抗凍結物質のｗ／ｗパーセントは、抗凍結剤の量の合計として理解されるべきである。
【００７３】
抗凍結剤は、タンパク質又はタンパク質加水分解物から選ばれてもよい。好ましい適切な抗凍結剤の例は、小麦抽出物、スキムミルク粉末、乳清粉末、酵母抽出物、グルテン、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ケラチン、及びアルブミンからなる群から選ばれる物質を含む。
【００７４】
より好ましくは、抗凍結剤は、炭水化物又は核酸の清合成に関与する化合物である。好ましい適切な炭水化物は、ペントース(例えば、リボース、キシロース)、ヘキソース(例えば、フルクトース、マンノース、ソルボース)、二糖類(例えば、スクロース、トレハロース、メリビオース、ラクチュロース)、オリゴ糖(例えば、ラフィノース)、オリゴフルクトース(例えば、アクチライト(Actilight)、フリブロロース(Fribroloses))、多糖類(例えば、マルトデキストリン、キサンタン・ガム、ペクチン、アルギネート、微結晶セルロース、デキストラン、ＰＥＧ)、及び糖アルコール(ソルビトール、マンニトール)からなる群から選ばれる炭水化物を含む。最も好ましくは、当該炭水化物は、１５０〜１０００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは、２５０〜１０００００ｇ／ｍｏｌ、さらにより好ましくは３００〜４００００ｇ／ｍｏｌ、及び最も好ましくは５００〜１５０００ｇ／ｍｏｌを有する炭水化物である。
【００７５】
かなり好ましい実施態様では、添加化合物は、シクロデキストリン、マルチトール、魚ゼラチン、マルトデキストリン、(好ましくは、マルトデキストリンＤＥ２〜マルトデキストリンＤＥ１９)、スプレー・ガム(例えば、スプレー・ガムＩＲＸ５１６９３)、イノシン-５'-モノホスフェート(ＩＭＰ)、及びイノシンからなる群から選ばれる添加化合物である。
【００７６】
凍結培養物は、凍結物質のｗ／ｗとして計測される０.５％〜１３％の添加化合物を含み、凍結物質のｗ／ｗとして計測される１％〜１２％の添加化合物、より好ましくは凍結物質のｗ／ｗとして計測される２％〜１０％の添加化合物、そしてさらにより好ましくは、凍結物質のｗ／ｗとして計測される添加化合物の５％〜１０％を含む。
【００７７】
発酵後における添加化合物(当該化合物は抗凍結剤であってもよい)の単離生菌(バイオマス)への添加は、適切な温度にて例えば３０分間バイオマスと固体添加化合物とを混合することにより行われてもよい。或いは、添加化合物の滅菌溶液は、バイオマスと混合されてもよい。
【００７８】
ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の製造法
上で記載されるように、本発明の第二態様は、本発明の第一態様のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の製造方法であって、以下のステップ：
(ｉ)  添加化合物を生菌に加えて、少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)／ｇ物質の生菌量を有する少なくとも５０ｇの物質を取得し、
(ｉｉ)  当該物質を凍らせて、ペレット凍結物質を取得し、
(ｉｉｉ)  当該ペレット凍結物質を適切な方法でパッキングする
を含む、前記方法に関する。
【００７９】
上で記載されるように、ここで最も適切な「問題の」培養物は、ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物であって、本明細書中に記載される添加化合物を含まない場合に、-７０℃〜-４６℃のＴｍ’値を有する、前記培養物である。
【００８０】
従って、好ましい実施態様では、上記ステップ(ｉ)に従って添加化合物を加える前に、添加化合物を含まない凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’値を計測し、そして-７０℃〜-４６℃、又はそれ以下のＴｍ’値を有することを同定する。
【００８１】
上記ステップ(ｉ)に従って添加化合物を加える前に、ペレット塊試験(上の記載を参照のこと)を行い、そして凍結培養物の個別のペレットが-４６℃での貯蔵で互いにくっ付くことを同定する。
【００８２】
好ましくは、添加化合物を加えた後の、添加化合物を含む凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’値を計算し、そしてＴｍ’値が-４６℃を超えているか、好ましくは-４５℃〜-１５℃、より好ましくは-４３℃〜-１５℃、そしてさらにより好ましくは-３９℃〜-１５℃であるかを確かめる。
【００８３】
最後に、添加化合物を加えた後に、培養物をペレット凍結し、そして、１００個の個別のペレットのうちの少なくとも８０個が、固まっていない個別の単一ペレットとして残っていることを保証するペレット塊試験(上の記載を参照のこと)を行う。
【００８４】
凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の使用
本明細書中に記載される凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物は、当該技術分野に従って、食品又は飼料の製造方法において使用されうる。
【実施例】
【００８５】
実施例１：
Ｒ６０４-Ｅ(商業用凍結Ｏ-培養物、Chr.Hansen A/S, Denmark)は、凍結貯蔵の間粘着性のペレットを形成する傾向がある。本研究において、融点について詳細に調べること、そしてカゼイン塩、スクロース、又はマルトデキストリンを加えることにより融点を増大する試みによって、この問題に取り組む。
【００８６】
目的：
Ｒ６０４−ＥのＦ-ＤＶＳの融点を、添加物を用いることにより高めることが可能であるかを評価することを目的とする。添加物を用いてＲ６０４-Ｅの融点を増大させる効果が、視覚的に評価され、そして試験製剤の各々についてＤＳＣによりＴｍ’を計測することにより評価される。
【００８７】
ｉ)  材料：
市販の培養物であるＦ-ＤＶＳ Ｒ ６０４-Ｅ(Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmark, Batch 2441258, 物質番号616581)、２キロ
ii)  融点を上昇させるために製剤について使用される添加溶液
５０％(w／w)スクロース溶液(Danisco, Denmark)。
１０％(w／w)カゼイン酸Ｎａ溶液(Arla, Denmark)
３０％(w／w)マルトデキストリンＤＥ１０溶液(Glucidex10, Roquette Feres, Lestrem, France)。
３０％(w／w)マルトデキストリンＤＥ２溶液(Glucidex２, Roquette Feres, Lestrem, France)。
【００８８】
ｉｉｉ)Ｆ−ＤＶＳ・Ｒ６０４−Ｅの製法
凍結濃縮物を融解し、そして以下の表１に記載の添加物と混合する：
【表１】
2011234725.tif 000002
【００８９】
Ｆ−ＤＶＳ Ｒ６０４の融点の視覚的な評価
Ｆ−ＤＶＳ Ｒ６０４Ｅの６個の製剤を、液体窒素中でペレット凍結し、そして１００の個別のペレット(約２０〜３０ｇ)をペトリ皿に移し、そうして固まっていない単一ペレットの薄層を形成した。
【００９０】
各製剤の一のサンプルを、−５０℃に設定された冷凍庫に配置した。実際のサンプル温度は−４６℃であった。貯蔵から７日後、サンプルが未だに固まっていないか、又はペレットが塊を形成する若しくは粘着性でありそうかを観察するためにサンプルを試験し、そしてもしそのような場合、揺すって固まっていない粒子に再び戻るかを試験した。
【００９１】
【表２】
2011234725.tif 000003
【００９２】
Ｔｍ’の計測：
サンプルを１００μｌのアルミナるつぼの中で調製し、そして液体窒素中で凍結した。各製剤の一のサンプル及びＦ−ＤＶＳ Ｒ６０４を６日間−４６℃で置いた。
【００９３】
相転移を、１００μｌのアルミナるつぼ、温度プログラム、インサート温度−９０℃、実行温度プログラム：５℃／分−１３０℃〜０℃を備えたMettler Toledo 822e示差走査熱量形(ＤＳＣ)で計測した。
【００９４】
Ｔｍ’値(融解の開始、Roos(1995)により定義される)を計測した。結果を表２に示す。
【００９５】
我々は、６％超のスクロース及び６％のマルトデキストリン(２又は１０)の使用が、凍結ペレットのＴｍ’値を増大させることを観測した。カゼイン酸Ｎａの効果を見ることができなかった。目視検査から、１０％スクロース及び２の異なるマルトデキストリンが、粘着性のペレットを形成する傾向に対して、正の効果を示した。
【００９６】
実施例２：
目的
どの種類の添加物が凍結培養物の融点を増加できるかを同定するために、スクリーニング研究を行った。以下の添加物を試験した：
トレハロース、マルトデキストリン１２、シクロデキストリン、スプレー・ガム、ＰＥＧ、魚ゼラチン、マルチトール、塩化ナトリウム、グリセロール。
【００９７】
ｉ)  材料
Ｆ-ＤＶＳ Ｒ ６０４(バッチ２４７１７５５、物質６１６５８１)詳細については実施例を参照のこと。
ii)  融点を上昇させるために製剤に使用する添加溶液
５０％(ｗ／ｗ)トレハロース
３０％(ｗ／ｗ)マルトデキストリンＤＥ１２(グルシデックス１２(Glucidex12)、Roquette Freres、Lestrem, France)
３０％(ｗ／ｗ)シクロデキストリン
３０％(ｗ／ｗ)スプレー・ガム(ＩＲＸ５１６９３、ＣＮＩ)
３０％(ｗ／ｗ)ＰＥＧ(ＰＥＧ６０００、Merck Germany)
３０％(ｗ／ｗ)魚ゼラチン粉200(SKW Biosystems, France)
３０％(ｗ／ｗ)マルチトール
３０％(ｗ／ｗ)塩化ナトリウム
３０％(ｗ／ｗ)グリセロール
【００９８】
Ｆ-ＤＶＳ Ｒ６０４-Ｅの製造方法：
凍結Ｆ-ＤＶＳ Ｒ６０４-Ｅ濃縮物を融解し、そして様々な添加物と混合して最終製剤の１０％(ｗ／ｗ)にした。
【００９９】
Ｔｍ’の計測：
サンプルを１００μｌのアルミナるつぼ中に調製し、そして液体窒素中で凍結させた。相転移曲線をMettler Toledo 822e Differential Scanning Caloriometerで、９の製剤について記録し、そしてレファレンス・サンプル(添加物を含まないＲ６０４Ｅ)と比較した。-９０℃でサンプルをＤＳＣに挿入し、そして以下の温度プログラム：挿入温度-９０℃；温度スキャン-１３０℃〜０℃において７℃／分を使用して実行した。
【０１００】
結果
相転移曲線を作成し、そしてＲｏｏｓ(1991)により記載されるようにＴｍ’値を測定した。当該値を以下の表３に与える。
【表３】
2011234725.tif 000004
【０１０１】
レファレンス・サンプルについてのＴｍ’は、-５４℃であることが分かった(氷融解の開始)。
以下の添加物はＴｍ’を増加させる：
ＰＥＧ(-５３℃)
シクロデキストリン(-４４℃)
マルチトール(-４２℃)
トレハロース(-３８℃)
魚ゼラチン(-３７℃)
マルトデキストリン１２(-３２℃)
スプレー・ガム(-３１℃)。
グリセロール及び塩化ナトリウムは凍結培養物ペレットの融点を増加させなかった。
【０１０２】
実施例３
この試験に、添加物の量とＤＳＣで測ったＴｍ’の増加との間の関係を評価することが含まれる。
ｉ)材料
Ｆ-ＤＶＳ ＣＨ Ｎ １９(バッチ２４２１８６８) (市販の凍結ＬＤ-培養物、Chr. Hansen A/S, Denmark)。
【０１０３】
【表４】
2011234725.tif 000005
【０１０４】
ii)  融点を上昇させるために製剤に用いた添加溶液
１ｇのバイオマスあたりのスクロースの濃度を、３％(w／w)〜１３％(w／w)で変化させた。トレハロースは、５％(w／w)レベルでのみ試験した。全てのスクロース濃度を、５０％スクロース溶液をバイオマスに加えることから調製した。トレハロース濃度は、４０％(w／w)溶液から調製した。
【０１０５】
Ｔｍ’値の計測：
凍結Ｆ-ＤＶＳ Ｒ６０４-Ｅの濃縮物を融解し、そして表４に記載されるように様々な添加物と混合した。次にサンプルを１００μｌのアルミナるつぼに移し、そして液体窒素中で凍結させ、そして分析するまで-４６℃で貯蔵した。相転移曲線を８の製剤についてＤＳＣで記録し、そしてレファレンス・サンプル(添加物を含まないＲ６０４Ｅ)と比較した。当該サンプルをＤＳＣに-９０℃で挿入し、そして以下の温度プログラム：挿入温度-９０℃；温度スキャン：５℃／分で１３０℃〜０℃を用いて実行した。
【０１０６】
相転移曲線からＴｍ’と添加された二糖類の量との間の相関を図１において見ることができる。図１から、８％以上のスクロースにより、凍結培養物が-４６℃の貯蔵において融解を開始しないということが保証されるということが分かる。
【０１０７】
実施例４
Chr. Hansen A/S, Denmarkから市販される培養物(ＨＰ、ＨＰＳ、ＨＰ−１、ＬＰ、ＬＬ−２)をマルトデキストリン (グルシデックス１２、Roquette Freres, Lestrem, France) の添加前後において初融点を分析した。当該製品は凍結ペレットとして販売されており、そしてこれらはかたまらない状態を維持すべきであり、当該状態は貯蔵温度より高い初融点により保証される。
【０１０８】
目的：
本発明の研究の目的は、固まっていないペレットを得るために、貯蔵温度より高く初融点を上昇させることである。
【０１０９】
材料と方法
ｉ)  材料
グルシデックス１２(Roquette Freres, Lestrem, France)を添加化合物として使用した。
以下の表５に記載される１００ｇの各培養物を用いた。Ｂは、グリセリンが培養物に加えられていないことを示し、一方、Ａは、１０％ｖ／ｖのグリセリンがペレット凍結前に加えられたことを示す。
【０１１０】
【表５】
2011234725.tif 000006
【０１１１】
ii)  サンプルの製剤の製法：
凍結濃縮培養物を融解し、そして様々な量のグルシデックス１２溶液と混合して、最終製剤の３.５％〜１０.１％(w／w)とした。
様々な製剤を以下の表６に記載する。
【０１１２】
iii)  Ｔｍ’の計測
サンプルを、１００μlアルミナるつぼ中で調製した。相転移曲線を全ての製剤についてMettlet DSCで記録した。サンプルをＤＳＣに-９０℃で挿入した。スキャン温度プログラムは、７℃／分で１００℃〜０℃であった。
【０１１３】
iiii)  Ｆ−ＤＶＳ Ｒ６０４の融点の目視評価
製剤を、液体窒素中でペレット凍結し、そして１００の個別のペレット(約２０〜３０ｇ)をペトリ皿に移し、そうして固まっていない単一のペレットの薄い層を形成した。各製剤の一のサンプルを-４６℃で置いた。１４日間の貯蔵後、サンプルがいまだに固まっていないか、又はサンプルが塊を形成する若しくは粘着性でありそうかを観察するために試験した。もしそのような場合、揺すって固まっていない粒子に戻るかを観察するために試験した。
【０１１４】
結果：
様々な量でマルトデキストリン(グルシデックス１２)を様々な培養物へと加えた結果を図１に示す。マルトデキストリンの濃度を増加させることがＴｍ’値を増加させることが明らかである。表２において、粘着性／塊形成の評価についての結果が記載されている。-４６℃の貯蔵温度より高いＴｍ’を有するサンプルは、固まっていないペレットであり、一方、-４６℃より低いＴｍ’を有するサンプルは互いにくっ付いた。
【０１１５】
【表６】
2011234725.tif 000007
【０１１６】
結果を表６及び図２に示す。マルトデキストリンが、１０％ｖ／ｖグリセリンを含む培養物(Ａ-シリーズ)並びにグリセリンを含まない培養物(Ｂ-シリーズ)において、Ｔｍ’を増加させるために有効な薬剤であるということが示される。この実験により、既知の抗凍結剤(つまり、グリセリン)が、ペレット凍結培養物の貯蔵の間、物理的安定性を増大させるためには使用できないということがさらに示される。
【０１１７】
参考文献
【表７】
2011234725.tif 000008
【図１】
2011234725.tif 000009
【図２】
2011234725.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月22日(2011.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５０ｇの重量のペレット凍結乳酸菌培養物を有する商業用パッケージ中のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物であって、
当該ペレット凍結乳酸菌培養物が個別のペレット形態で存在し、
１ｇのペレット凍結乳酸菌培養物あたり少なくとも１０9コロニー形成ユニットの生菌量を有し、そして
ペレット凍結乳酸菌培養物のｗ/ｗとして計測される０.５％〜１３％の添加化合物であって、当該添加化合物が、シクロデキストリン、マルチトール、トレハロース、魚ゼラチン、マルトデキストリン、及びアラビアガムからなる添加化合物の群から選ばれ、そしてさらに、ペレット凍結乳酸菌培養物のｗ/ｗとして計測される０．５〜１３％の量の当該添加化合物を使用する場合、当該化合物が、添加化合物を伴わない場合に(ＤＳＣにより計測された)-７０℃〜-４６℃のＴｍ’値を有する凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’(融解の開始温度)を、-４５℃〜-１５℃に増加できることを特徴とする上記添加化合物を含み、
そしてここで、当該凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物が約−４６℃で、７〜１４日間貯蔵された場合に、凍結培養物の個別のペレットが互いにくっ付かず、それゆえ実質的に個別のペレットとして残ることにより特徴付けられ、ここで当該特徴決定は、以下の試験：
当該凍結培養物の個別のペレットが液体窒素中で凍結されたペレットであり、そして１００個の個別のペレット(約５〜１００ｇのペレット)が、ペトリ皿に入れられ、こうして固まっていない個別の単一ペレットの薄層であって、当該ペレットの多くが１以上のその近隣のペレットと物理的に接触していることにより特徴付けられる上記薄層を形成し、約−４６℃で７〜１４日間置かれ、そしてペレットが未だに固まっていないか、又はペレットが塊を形成する若しくは互いにくっ付くかを観察するために試験され、当該試験において、凍結培養物の個別のペレットが個別のペレットとして残るという判断基準は、１００個の個別のペレットの内の少なくとも８０個が個別の固まっていない単一ペレットとして残るということである
により測定される、前記ペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物。
但し、スクロースを利用できるＬＡＢを含む凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物であって、ペレット凍結乳酸菌培養物のｗ／ｗとして計測される２％〜１３％の量のスクロース；及びペレット凍結乳酸菌培養物のｗ／ｗとして計測される４％〜６％の量のトレハロース；並びにペレット凍結乳酸菌培養物のｗ／ｗとして計測される１３％の量のトレハロース／スクロース両方の混合物からなる群から選ばれる抗凍結薬剤化合物を含む、前記培養物を除く。
【請求項２】
前記培養物が、約３０℃にて最適増殖温度を有する中温性細菌からなる、混合された中温性の培養物である、請求項１に記載のペレット凍結培養物。
【請求項３】
前記ＬＡＢが、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium spp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium spp.)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium spp.)、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)を含むラクトコッカス属(Lactococcus spp.)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)を含むラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus spp.)、オエノコッカス属(Oenococcus spp.)、並びにペニシリウム属(Pencillium spp.)、クリプトコッカス属(Cryptococcus spp.)、デブラヨマイシス属(Debraryomyces spp.)、クリベロマイシス属(Klyveromyces spp.)、及びサッカロマイシス属(Saccharomyces spp.)を含む菌類(fungal spp.)を含む群から選ばれるＬＡＢである、請求項１又は２に記載のペレット凍結培養物。
【請求項４】
前記凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物が、請求項１に記載の添加化合物を含まない場合に-７０℃〜-４６℃のＴｍ’を有する培養物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペレット凍結培養物。
【請求項５】
前記凍結乳酸菌培養物が、ペレット凍結乳酸菌培養物のｗ/ｗとして計測される５％〜１０％の添加化合物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペレット凍結培養物。
【請求項６】
以下のステップ：
(ｉ)  添加化合物を生菌に加えて、物質１ｇあたり少なくとも１０9コロニー形成ユニット(ＣＦＵ)の生菌量を有する少なくとも５０ｇの物質を得て、そして物質のｗ/ｗとして計測される０.５％〜１３％の量で当該添加化合物を含み、
(ii)  当該物質を凍結して、ペレット凍結乳酸菌培養物を獲得し、そして
(iii)  ペレット凍結乳酸菌培養物を適切な方法でパッキングして、請求項１〜５のいずれか一項に記載のパックされた凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物を得る
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の製造方法。
【請求項７】
請求項６のステップ(ｉ)に記載の添加化合物を加える前に、添加化合物を含まない凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’値を計測し、そして当該培養物が-７０℃〜−４６℃のＴｍ’値を有することを同定し；そして
添加化合物を加えた後に、添加化合物を含む凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物のＴｍ’値を計測し、そしてＴｍ’値が−４９℃〜−１５℃であることを確認する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記添加化合物を含む凍結乳酸菌培養物のＴｍ’値が、−３９℃〜−１５℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養物が、約３０℃にて最適増殖温度を有する中温性細菌からなる、混合された中温性の培養物である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＡＢが、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium spp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium spp.)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium spp.)、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)及びラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)を含むラクトコッカス属(Lactococcus spp.)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)を含むラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus spp.)、オエノコッカス属(Oenococcus spp.)、並びにペニシリウム属(Pencillium spp.)、クリプトコッカス属(Cryptococcus spp.)、デブラヨマイシス属(Debraryomyces spp.)、クリベロマイシス属(Klyveromyces spp.)、及びサッカロマイシス属(Saccharomyces spp.)を含む菌類(fungal spp.)を含む群から選ばれるＬＡＢである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結乳酸菌培養物が、ペレット凍結乳酸菌培養物のｗ/ｗとして計測される５％〜１０％の添加化合物を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記添加化合物が、シクロデキストリン、マルチトール、トレハロース、魚ゼラチン、マルトデキストリン、及びアラビアガムからなる群から選ばれる添加化合物である、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
食品又は飼料の製造工程における、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペレット凍結乳酸菌(ＬＡＢ)培養物の使用。
【外国語明細書】
2011234725000001.pdf