(57)【要約】【課題】ｓｉＲＮＡのような小分子核酸と生理的条件下で安定な複合体を形成し、かつ、細胞内で好適に該小分子核酸を放出し得るキャリアを提供すること。【解決手段】側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸残基とを含み、核酸との会合能を有する、カチオン性ポリアミノ酸であって、該カチオン性アミノ酸残基を１〜２０個含む、カチオン性ポリアミノ酸；および、該カチオン性アミノ酸と親水性ポリマーとを含む、ブロックコポリマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸残基とを含み、核酸との会合能を有する、カチオン性ポリアミノ酸であって、該カチオン性アミノ酸残基を１〜２０個含む、カチオン性ポリアミノ酸。
【請求項２】
前記疎水性アミノ酸残基として、２５℃の水１００ｇに対する溶解度が５ｇ以下であるアミノ酸に由来する残基を含む、請求項１に記載のカチオン性ポリアミノ酸。
【請求項３】
前記カチオン性アミノ酸残基からなるセグメントと疎水性アミノ酸残基からなるセグメントとから構成されるブロック型のポリアミノ酸である、請求項１または２に記載のカチオン性ポリアミノ酸。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む、ブロックコポリマー。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸および／または請求項４に記載のブロックコポリマーを含む、ポリマー粒子組成物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸および／または請求項４に記載のブロックコポリマーと核酸とを含む、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖のカチオン性ポリアミノ酸、該ポリアミノ酸を有するブロックコポリマー、ならびに、これらを用いたポリマー粒子組成物および複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを特異的かつ効果的にノックダウンできることから、その医療応用に対する期待が高まっているが、ｓｉＲＮＡを医療に応用するには効果的なデリバリーシステムの開発が必要不可欠である。近年、臨床治験中であるｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡの眼球内投与による加齢黄斑変性（ＣＮＶ）の治療効果が、ｓｉＲＮＡによる配列特異的な遺伝子ノックダウン効果によるものではなく、細胞表面のＴｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ−３）による認識を介した配列非特異的な効果によることが明らかにされ、いかなるｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ応用においても、細胞外では安定であるが細胞内に的確にｓｉＲＮＡを送達できるキャリアの開発が重要であると考えられている。
【０００３】
これまでに、ＤＮＡとポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成して真核細胞に該核酸を導入し、発現させるキャリアとして、種々のカチオン性ポリマーが提供されている。例えば、ポリ（Ｌ−リシン）のε−アミノ基を介して親水性基（例えば、ポリエチレングリコール）と疎水性基（例えば、パルミトイル）が導入されたポリ（Ｌ−リシン）誘導体は、水性媒体中においてコレステロールの存在下でベシクルを形成し、該ベシクルは遺伝子の組み込まれたプラスミドＤＮＡを凝集し、安定な複合体を形成することが知られている（特許文献１）。また、ポリ（Ｌ−リシン）−ポリ（エチレングリコール）のコポリマーであって、ポリ（Ｌ−リシン）のε−アミノ基をチオレート化することによりカチオン荷電とジスルフィド架橋密度を調節したコポリマー誘導体とプラスミドＤＮＡとのＰＩＣは細胞外媒体中での高い安定性と細胞内コンパートメント内での効果的な該ＤＮＡの放出を示すことが知られている（非特許文献１）。また、側鎖にエチレンジアミン構造を有するポリ（Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））および該ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）をブロックコポリマーの一ブロック成分として含むコポリマーを製造したところ、このようなポリマーは、低い細胞毒性を示し、しかも、プラスミドＤＮＡを高効率で細胞内に導入し、該ＤＮＡ中に組み込まれた遺伝子を効率よく発現することが確認されている（非特許文献２、特許文献２、特許文献３参照）。
【０００４】
上記のとおり、ＤＮＡ等の高分子核酸に対する有効なキャリアは開発されているが、ｓｉＲＮＡのような小分子核酸と生理的条件下で安定なＰＩＣのような複合体を形成し、かつ、細胞内で好適に該小分子核酸を放出し得るキャリアは未だ提供されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ９９／６１５１２
【特許文献２】ＷＯ  ２００６／０８５６６４  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ２００７／０９９６６０  Ａ１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｈａｔａ ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００４，１２６，２３５５−２３６１
【非特許文献２】Ｋ．Ｍｉｙａｔａ ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００８，１３０，１６２８７−１６２９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、ｓｉＲＮＡのような小分子核酸と生理的条件下で安定な複合体を形成し、かつ、細胞内で好適に該小分子核酸を放出し得るキャリアを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、カチオン性ポリアミノ酸が提供される。該カチオン性ポリアミノ酸は、側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸残基とを含み、核酸との会合能を有する、カチオン性ポリアミノ酸であって、該カチオン性アミノ酸残基を１〜２０個含む。
本発明の別の局面によれば、ブロックコポリマーが提供される。該ブロックコポリマーは、上記カチオン性ポリアミノ酸鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む。
本発明のさらに別の局面によれば、ポリマー粒子組成物が提供される。該ポリマー粒子組成物は、上記カチオン性ポリアミノ酸および／またはブロックコポリマーを含む。
本発明のさらに別の局面によれば、複合体が提供される。該複合体は、上記カチオン性ポリアミノ酸および／またはブロックコポリマーと核酸とを含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ｓｉＲＮＡのような小分子核酸と生理的条件下で安定な複合体を形成し、かつ、細胞内で好適に該小分子核酸を放出し得るキャリアが提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物を電気泳動した後のゲル像である。
【図２】ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物を電気泳動した後のゲル像である。
【図３】比較例のｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。
【００１２】
Ａ．カチオン性ポリアミノ酸
本発明のカチオン性ポリアミノ酸は、側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸残基とを含み、核酸との会合能を有する。ここで、「核酸との会合能を有する」とは、生理条件であるｐＨ７．４において核酸と相互作用することにより複合体（例えば、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ））を形成し得ることを意味する。また、核酸とは、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、およびリン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味する。また、上記アミノ酸残基が由来するアミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基との両方の官能基を有し、アミド結合（ペプチド結合）を介してポリアミノ酸を形成し得る範囲において、任意の化合物であり得る。
【００１３】
本発明のカチオン性ポリアミノ酸が含むカチオン性アミノ酸残基の数は、１〜２０、好ましくは１〜１５、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜５である。該カチオン性ポリアミノ酸が含む疎水性アミノ酸残基の数は、好ましくは１〜８０、さらに好ましくは５〜７０、特に好ましくは１０〜６０である。本発明のカチオン性ポリアミノ酸によれば、カチオン性アミノ酸残基を有することにより、アニオン性分子である核酸と静電的に結合し得、さらには、該アミノ酸残基の個数が２０個以下とされているので、該結合が過度に強くなることを回避し得る。その結果、核酸の適切な放出が可能となる。すなわち、１つの実施形態において、本発明は、側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸残基とを含み、核酸との会合能を有するカチオン性ポリアミノ酸基材であって、該カチオン性アミノ酸残基の個数が１〜２０個の範囲に制限されていることによって、基材からの核酸の脱離（放出）が促進される、カチオン性ポリアミノ酸基材に関する。カチオン性ポリアミノ酸が含むカチオン性アミノ酸残基の数が２個以上であれば複合体の安定性を向上できる。また、本発明のカチオン性ポリアミノ酸によれば、疎水性アミノ酸残基を有することにより、疎水性相互作用が働き、その結果、核酸との複合体の安定性が向上して、小分子量の核酸とも安定な複合体を形成し得る。さらに、疎水性アミノ酸残基が細胞膜の疎水性部分に突き刺さり、基材を細胞膜に固定するアンカーとして機能し得るので、核酸の細胞内への導入率が向上し得る。
【００１４】
上記カチオン性アミノ酸残基が由来するアミノ酸としては、アミノ酸の主要骨格以外の側鎖構造におけるアミノ基に由来して規定されるｐＫa値が例えば３〜１３、好ましくは４〜１２、より好ましくは５〜１１であるアミノ酸が挙げられる。
【００１５】
上記疎水性アミノ酸残基が由来するアミノ酸としては、好ましくは２５℃の水１００ｇに対する溶解度が５ｇ以下、さらに好ましくは４ｇ以下であるアミノ酸が挙げられる。このようなアミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性天然アミノ酸や、側鎖に疎水性基が導入されたアミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。アミノ酸の疎水性誘導体としては、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。
【００１６】
上記導入される疎水性基としては、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基が好ましく例示され得る。
【００１７】
本発明のカチオン性ポリアミノ酸は、必要に応じて、上記カチオン性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基以外の他のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基等の酸性アミノ酸残基）を含んでもよい。
【００１８】
本発明のカチオン性ポリアミノ酸１ｇに含まれるアミノ基のモル数としては、例えば０．１ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌ、また例えば０．２ｍｍｏｌ〜５ｍｍｏｌ、また例えば０．４ｍｍｏｌ〜３ｍｍｏｌであってよい。
【００１９】
本発明のカチオン性ポリアミノ酸は、好ましくは下記式（１）で表され得る：
【化１】
2011173802.tif 000002
上記式中、
Ｒ１は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基あるいは炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル基あるいは炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、リシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍは、５〜８０の整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｘは、０〜２０の整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜２０の整数であり、
但し、ｘとｚとの和は１以上２０以下であり、上記各反復単位の結合順は任意であり、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ８は１つのポリアミノ酸内の各アミノ酸残基において任意に選択可能である。
【００２０】
上記式（１）において、Ｒ１およびＲ２の基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、アルキル置換イミノ基、およびアルキル基のアルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２〜１２の直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基または炭素数２〜１２の直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基における、アルケニルまたはアルキニル部分は、炭素数が２以上の上記に例示したアルキル基中に二重結合または三重結合を含むものを挙げることができる。
【００２１】
このような基または部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素またはフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、Ｃ１−６のごとき表示は、炭素数１〜６を意味し、以下同様な意味を表すものとして使用する。さらに、炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。
【００２２】
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、およびＲ４ｂの基を有する反復単位の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。Ｒ３ａおよびＲ３ｂの両者がエチレン基を表す場合には、代表的には、ｎが整数０であるか、またはｍ−ｎが整数０であるポリアミノ酸を表すことになる。前者は、例えば、グルタミン酸γ−ベンジルエステルのＮ−カルボン酸無水物の重合により得られるポリ−α−グルタミン酸を表し、後者は、例えば、納豆菌をはじめとする細菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株が生産するポリ−γ−グルタミン酸を表す。一方、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの両者ともメチレン基を表す場合には、これらの基を有するそれぞれの反復単位は共存し得るものと理解されている。Ｒ４ａおよびＲ４ｂについても同様である。製造効率の観点からは、好ましくはＲ３ａおよびＲ３ｂがエチレン基であり、Ｒ４ａおよびＲ４ｂがメチレン基である。
【００２３】
Ｒ６ａおよびＲ６ｂの基について定義する、脂肪族炭化水素基が飽和である場合は、炭素数６〜２７のアルキル基に等価であり、上記アルキル基に加えてペンタコシル基、ヘキサコシル基、へプタコシル基等が例示される。不飽和の脂肪族炭化水素基は、該アルキル基の鎖中の炭素−炭素単結合の１〜５個が炭素−炭素二重結合となっている基に該当する。このような基が由来する不飽和の脂肪族炭化水素の例としては、限定されるものでないが、ラウリン酸（またはドデカン酸）、ミリスチン酸（またはテトラデカン酸）、パルミチン酸（またはヘキサデカン酸）、パルミトオレイン酸（または９−ヘキサデセン酸）、ステアリン酸（またはオクタデカン酸）、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸（または９，１１，１３−オクタデカトリエン酸）、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸等を挙げることができる。
【００２４】
Ｒ６ａおよびＲ６ｂの基について定義する、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基としては、アリール基、アラルキル基等が挙げられる。これらの好ましい具体例としては、フェニル基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
【００２５】
Ｒ６ａおよびＲ６ｂの基について定義する、ステリル基が由来するステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ１−１２アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。上記ステリル基が由来するステロールとしては、好ましくはコレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等の動植物油起源のステロールであり、さらに好ましくはコレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールであり、特に好ましくはコレステロールである。
【００２６】
Ｒ７ａおよびＲ７ｂの基について定義する、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
よりなる群から選ばれる基は、同一の基であることが好ましく、式（ｉ）の基であることがさらに好ましい。また、ｐ１〜ｐ４およびｑ１〜６は、それぞれ相互に独立して２または３であることが好ましく、より好ましくは２である。一方、ｒ１およびｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜３の整数であることが好ましい。
【００２７】
ｍ−ｎおよびｎは、疎水性アミノ酸残基の繰り返し数を表し、ｘ−ｙ、ｙ、およびｚは、カチオン性アミノ酸残基の繰り返し数を表す。ｘは、好ましくは１〜２０、好ましくは１〜１５、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜５である。ｘが１以上である場合、本発明のポリアミノ酸は、少なくとも上記Ｒ７ａまたはＲ７ｂの基を有することとなる。上記Ｒ７ａまたはＲ７ｂの基は、異なる複数のアミン官能基を有するので、ｐＫａが複数段階を示し、生理条件であるｐＨ７．４においては複数のアミン官能基は部分的にプロトン化状態にあり核酸と相互作用することにより複合体（例えば、ＰＩＣ）を好適に形成することができる。また、こうして形成された複合体がエンドソーム内（ｐＨ５．５）へ取り込まれてｐＨが下がると、カチオン性ポリアミノ酸のプロトン化がさらに進行し、バッファー効果（またはプロトンスポンジ効果）によりエンドソームエスケープを促進させ得る。その結果、細胞に対するダメージを軽減し得る。
【００２８】
式（１）中の各反復単位の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。カチオン性ポリアミノ酸が上記カチオン性アミノ酸残基からなるセグメントと疎水性アミノ酸残基からなるセグメントとを含むブロック型であることにより、該ブロック型カチオン性ポリアミノ酸を基材として核酸との複合体を形成した場合に、核酸の細胞内への導入が促進されると共に、基材からの核酸の脱離を促進しつつ基材への核酸の保持力が確保され得る。
【００２９】
式（１）で表されるカチオン性ポリアミノ酸は、例えば、それ自体公知のβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）の重合によりポリアミノ酸エステルを製造し、次いで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびのＲ８基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリアミノ酸の側鎖にカチオン性基を導入することによって、製造することができる。
【００３０】
１つの実施形態においては、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメートを重合した後にβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテートを重合し、次いで、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等のアミン化合物と反応させることにより、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）に対して優先的にエステルアミド交換反応が生じ、アスパラギン酸側鎖にＤＥＴ基等のアミン残基が導入される。その結果、側鎖にカチオン性基が導入されたアスパラギン酸由来のカチオン性アミノ酸残基セグメントと側鎖にベンジル基が導入されたグルタミン酸由来の疎水性アミノ酸残基セグメントとから構成されるブロック型のカチオン性ポリアミノ酸が得られ得る。一方、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテートとγ−ベンジル−Ｌ−グルタメートとを同時に重合させ、次いで、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等のアミン化合物と反応させると、側鎖にカチオン性基が導入されたアスパラギン酸由来のカチオン性アミノ酸残基と側鎖にベンジル基が導入されたグルタミン酸由来の疎水性アミノ酸残基とが任意に配置されたランダム型のカチオン性ポリアミノ酸が得られ得る。
【００３１】
なお、上記合成の過程でアミノ酸エステル残基の一部にアミンの求核攻撃に起因した構造変化（例えば、アミノ酸エステル残基の脱アルコールによるイミド環の形成）が生じる場合があるが、本明細書ではこのような構造変化を経た残基をさらに含むカチオン性ポリアミノ酸についても、上記一般式（１）に含めて取り扱うこととする。この場合、上記構造変化を経た残基の数は、カチオン性アミノ酸残基の数および疎水性アミノ酸残基の数には含めないものとする。また、カチオン性アミノ酸残基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基が合成過程での酸（主に塩酸）の使用に起因して塩（主に塩酸塩）になる場合があるが、本明細書ではこうした構造を含むカチオン性ポリアミノ酸についても、上記一般式（１）に含めて取り扱うこととする。すなわち、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびのＲ８の基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基は塩（例えば、塩酸塩）となっていてもよい。
【００３２】
Ｂ．ブロックコポリマー
本発明のブロックコポリマーは、Ａ項に記載のカチオン性ポリアミノ酸からなるセグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む。このような構成をとることにより、本発明のブロックコポリマーは、上記カチオン性ポリアミノ酸自体が有する上記の特性を少なくとも保持したまま、循環血液中における良好な滞留性を示すポリマー粒子（例えば、ポリマーミセル）を形成することができる。
【００３３】
上記親水性ポリマーとしては、任意の適切な親水性ポリマーが採用され得る。該親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。これらのなかでも、ポリ（エチレングリコール）は、末端に種々の官能基を有する末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、また、種々の分子量のものが市販されており、容易に入手できることから、好ましく用いられ得る。
【００３４】
本発明のブロックコポリマーは、好ましくは下記式（２）または（３）で表され得る：
【化２】
2011173802.tif 000003
2011173802.tif 000004
上記各式中、
Ｒ１〜Ｒ８、ｍ−ｎ、ｎ、ｘ−ｙ、ｙ、およびｚについては、上記式（１）について定義したのと同義であり、
Ｌ１およびＬ３は、相互に独立して、−Ｓ−Ｓ−または原子価結合であり、
Ｌ２は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ２ｂ−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ２ｂはＮＨまたはＯであり、
Ｌ４は、−ＯＣＯ−（ＣＨ２）ｐ２−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｐ３−ＣＯ−、または−Ｌ４ａ−（ＣＨ２）ｑ２−ＣＯ−であり、ここで、ｐ２、ｐ３、およびｑ２は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ４ａは、ＯＣＯＮＨ、−ＣＨ２ＮＨＣＯ−、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、
Ｒ９およびＲ１０は、相互に独立して、水素原子あるいは未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基であり、
ｋは、３０〜２０，０００の整数を表す。
【００３５】
上記Ｌ１およびＬ３は、相互に独立して、−Ｓ−Ｓ−または原子価結合である。一方、Ｌ２は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ２ｂ−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ２ｂはＮＨまたはＯである。また、Ｌ４は、−ＯＣＯ−（ＣＨ２）ｐ２−ＣＯ−、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｐ３−ＣＯ−、または−Ｌ４ａ−（ＣＨ２）ｑ２−ＣＯ−であり、ここで、ｐ２、ｐ３、およびｑ２は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ４ａは、ＯＣＯＮＨ、−ＣＨ２ＮＨＣＯ−、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯである。上記定義において、Ｌ１およびＬ２の組み合わせ、ならびに、Ｌ３およびＬ４の組み合わせは、一緒になって一つの連結基となり得るように組み合わされる必要がある。例えば、Ｌ２が−ＮＨ−である場合、Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−でなく、原子価結合である。上記組み合わせとしては、Ｌ１またはＬ３が−Ｓ−Ｓ−である場合の連結基を形成する組み合わせが好ましい。
【００３６】
Ｒ９およびＲ１０の基で定義する炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基としては、上記式（１）においてＲ１およびＲ２の基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、アルキル置換イミノ基、およびアルキル基のアルキル部分と同様の基が挙げられる。また、その置換基も同様である。
【００３７】
エチレングリコール（またはオキシエチレン）の繰り返し数を表すｋは、３０〜２０，０００、好ましくは４０〜２，０００、さらに好ましくは５０〜１，０００の整数を表す。
【００３８】
本発明のブロックコポリマーは、例えば、上記カチオン性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとをそのまま、または必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって形成できる。また、例えば、一般式（２）のブロックコポリマーは、Ｒ９を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンといった保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させ、得られたポリアミノ酸の側鎖にカチオン性基を導入することによって、製造することができる。なお、上記のとおり、カチオン性ポリアミノ酸の合成の過程でアミノ酸エステル残基の一部にポリアミンの求核攻撃に起因した構造変化（例えば、アミノ酸エステル残基の脱アルコールによるイミド環の形成）が生じる場合があるが、本明細書ではこのような構造変化を経た残基を含むブロックコポリマーについても、上記一般式（２）および（３）に含めて取り扱うこととする。また、カチオン性アミノ酸残基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基が合成過程での酸（主に塩酸）の使用に起因して塩（主に塩酸塩）になる場合があるが、本明細書ではこうした構造を含むブロックコポリマーについても、上記一般式（２）および（３）に含めて取り扱うこととする。
【００３９】
Ｃ．ポリマー粒子組成物
本発明のポリマー粒子組成物は、上記Ａ項に記載のカチオン性ポリアミノ酸および／またはＢ項に記載のブロックコポリマーを含む。上記カチオン性ポリアミノ酸（ブロック型／ランダム型）およびブロックコポリマーは、カチオン性ポリアミノ酸中の疎水性アミノ酸残基の割合が高くなると、水溶液中で会合して好適にポリマー粒子を形成し得る。なお、本発明においては、複数の分子が粒子状に集合した集合体も粒子に含めるものとし、このようなポリマーの集合体もポリマー粒子と称する。該ポリマー粒子の平均粒子径は、例えば、５ｎｍ〜５μｍ、好ましくは５〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜３００ｎｍである。
【００４０】
本発明のポリマー粒子組成物は、本発明の効果が得られる範囲において、上記カチオン性ポリアミノ酸およびブロックコポリマー以外の他のポリマーを含み得る。このような他のポリマーとしては、例えば、親水性ポリマー鎖セグメントと疎水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーが挙げられる。このようなブロックコポリマーは、水溶液中で好適に会合して安定なポリマー粒子（例えば、ポリマーミセル）を形成し得るので、これらを共存させることにより安定性に優れたポリマー粒子組成物が得られ得る。このような効果は親水性ポリマー鎖セグメントを有さないカチオン性ポリアミノ酸を含むポリマー粒子組成物において、特に好適に奏され得る。上記他のブロックコポリマーとしては、例えば、ＷＯ２００４／０８２７１８に記載のポリマーが挙げられる。
【００４１】
本発明のポリマー粒子組成物中における上記カチオン性ポリアミノ酸およびブロックコポリマーと上記他のポリマーとの重量比は、ポリマーの種類等に応じて適切に設定され得る。該重量比は、例えば２０：１〜１：２０であり得、好ましくは１０：１〜１：１０であり、さらに好ましくは１：５〜５：１である。
【００４２】
本発明のポリマー粒子組成物は、特にその方法は限定されないが、例えば、目的のポリマーに水または緩衝液等の水性媒体を加えて攪拌し、超音波、圧力、剪断力またはそれらを組み合わせた物理的エネルギーを与えること、目的のポリマーを揮発性の有機溶媒に溶解後、有機溶媒を揮発させて乾固し、そこに上記水性媒体を加えて、上記のような物理的エネルギーを与えること等によって調製することができる。あるいは、目的のポリマーに該ポリマーを溶解可能な水溶性有機溶媒を加えて溶解し、上記の水性媒体に対して透析することによっても調製することができる。ここで、上記揮発性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等を挙げることができる。また、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド等が挙げられる。
【００４３】
Ｄ．複合体
本発明の複合体は、上記Ａ項に記載のカチオン性ポリアミノ酸および／またはＢ項に記載のブロックコポリマーと核酸とを含む。上記カチオン性ポリアミノ酸およびブロックコポリマーは、カチオン性基を有するので、生理的条件下で、アニオン荷電性化合物と複合体（例えば、ＰＩＣ）を形成し得る。該アニオン荷電性化合物としては、タンパク質、脂質、ペプチド、核酸等が挙げられ、なかでも、上記カチオン性ポリアミノ酸およびブロックコポリマーは核酸と好適に複合体を形成し得る。後述する実施例において示されるように、上記カチオン性ポリアミノ酸またはブロックコポリマーと核酸とから形成される複合体は、カチオン性ポリアミノ酸の構造がブロック型であるかランダム型であるかによって、ＦＢＳ処理時の核酸のリリース形態が異なるので、目的に応じて、適切な構造のポリマーが選択され得る。
【００４４】
上述したとおり、上記カチオン性ポリアミノ酸が側鎖に疎水性基を有することにより、該カチオン性ポリアミノ酸および該ポリアミノ酸を有するブロックコポリマーは小分子量の核酸との複合体であっても生理的条件下で安定なベシクルまたは会合体を提供できる。上記カチオン性ポリアミノ酸またはブロックコポリマーとの複合体を提供できる核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを挙げることができる。また、同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も含まれる。また核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。限定されるものでないが、該核酸は、４〜２０，０００塩基、好ましくは１０〜１０，０００塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムを挙げることができる。
【００４５】
上記ｓｉＲＮＡとしては、例えば、標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡの鎖長は、二重鎖を構成する部分の長さが好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜３０塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫等に関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌等に関係のあるｃ−ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌等に関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ  Ｒｉａ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ  ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌等に関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎ及びＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。アンチセンス核酸についても同様に、当該術分野で公知ものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを本発明に従い複合体を形成する対象とすることができる。
【００４６】
核酸がｓｉＲＮＡである場合の本発明の複合体は、生理的条件下での安定性を向上させる観点からはＮ／Ｐ比が２以上であることが好ましく、ポリマーによる毒性を抑制する観点からはＮ／Ｐ比が２００以下であることが好ましい。なお、Ｎ／Ｐ比の意味については後述する。
【００４７】
上記カチオン性ポリアミノ酸を用いてｓｉＲＮＡとの複合体を得る場合、至適のＮ／Ｐ比は総アミノ基中に占める疎水性基の割合によって変動するので特定できないが、Ｎ／Ｐ比は、一般的には５以上、好ましくは７以上である。このようなＮ／Ｐ比でｓｉＲＮＡとの複合体を形成すると、循環血液中等の生理的条件下で平均粒径が約５ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲にある安定な会合体を提供できる。このような複合体は必要により緩衝化された水溶液中で上記カチオン性ポリアミノ酸とｓｉＲＮＡとを上記のＮ／Ｐ比となるように混合することにより調製できる。また、上記Ｃ項に記載のカチオン性ポリアミノ酸を含むポリマー粒子組成物とｓｉＲＮＡとを所望のＮ／Ｐ比となるように混合および静置して、ポリマー粒子にｓｉＲＮＡを内包させること等により調製できる。
【００４８】
上記ブロックコポリマーを用いてｓｉＲＮＡとの複合体を得る場合、特に、カチオン性ポリアミノ酸セグメント中の疎水性アミノ酸残基の割合が高くなると、このようなコポリマーのみでも水溶液中で自立的に会合してポリマー粒子（例えば、ポリマーミセル）を形成する傾向があるので、上記カチオン性ポリアミノ酸そのものを用いる場合より、より広範なＮ／Ｐ比の下で安定な複合体を形成することができる。このような複合体は上記Ｃ項に記載のブロックコポリマーを含むポリマー粒子組成物とｓｉＲＮＡとを所望のＮ／Ｐ比となるように混合および静置して、ポリマー粒子にｓｉＲＮＡを内包させること等により調製できる。
【００４９】
上記複合体は、そのままの状態で使用してもよく、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）のキャリアとして使用され得る任意の適切なキャリアに内包された状態で使用してもよい。このようなキャリアの代表例としては、ポリマーミセル、リポソーム等が挙げられる。ＤＤＳキャリアに内包されることにより、例えば、血中成分の複合体周囲での凝集が防止されて、核酸の適切な放出が好適に行われ得る。このような効果は、上記カチオン性ポリアミノ酸と核酸とを含む複合体において特に好適に奏され得る。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。以下の実施例においては、ＰＥＧの分子量（ｋＭｗ）、ＰＢＬＧの重合度、およびＰＢＬＡまたはその誘導体の重合度の順序でポリマー構造を記す。例えば、ＰＥＧの分子量が１０，０００、ＰＢＬＧの重合度が３５およびＰＢＬＡの重合度が５の場合は、「ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  １０−３５−５」と略記する。ここで、各アミノ酸残基の重合度は、統計的な値であって範囲を有し得るので、上記のように略記された値は、実際の測定値との間に数個（例えば、±２個程度）の変動を有し得るものとする。また、ＰＢＬＧの重合後にＰＢＬＡを重合することで、ポリアミノ酸内のアミノ酸残基配列が規則的であるポリマーを、その構造からＢｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒと略記する。また、ＰＢＬＧとＰＢＬＡとを同時に添加して重合することで、ポリアミノ酸内のアミノ酸残基配列が順不同であるポリマーを、そのポリマー構造からＲａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒと略記する。なお、実施例における各特性の分析方法は、特に記載がない限り、以下の通りである。
【００５１】
（１）核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）
核磁気共鳴装置（日本電子製、ＪＥＯＬ  ＡＬ３００  （３００ＭＨｚ））を用い、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６、測定温度：２５℃で行った。
（２）アミノ酸分析
ポリマー中のポリ（β−ベンジル−Ｌ−グルタメート）（ＰＢＬＧ）およびポリ（Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））濃度は、以下のとおり、ポリマーを酸加水分解し、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）として、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ・ＴａｇＴＭアミノ酸分析法のマニュアル（日本ウォーターズ）に従って測定した。
（２−１）酸加水分解
ポリマーをねじ口栓付きガラス製試験管に１０ｍｇ分取し、６Ｎ  塩酸をポリマー濃度として５ｍｇ／ｍＬになるように加えた。この溶液を１０５℃、１９時間加熱処理することで、ポリマーを酸加水分解した。次いで、１．５ｍＬ容マイクロチューブに４Ｎ  ＮａＯＨ  ３００μＬ、超純水  ５００μＬおよび得られた酸加水分解溶液  ２００μＬを加えて中和し、０．２２μｍのフィルター（日本ミリポア、登録商標「Ｍｉｌｌｅｘ」  ＧＶ  １３ｍｍφ）でろ過した。次いで超純水にて５０倍希釈し、サンプル溶液とした。
（２−２）アミノ酸分析
１．５ｍＬ容マイクロチューブに、ＡｃｃＱ・Ｆｌｕｏｒ  Ｂｏｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ７０μＬおよび（２−１）で得られたサンプル溶液  １０μＬを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。次いで、ＡｃｃＱ・Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ２０μＬを加えて直ちにボルテックスミキサーで１５秒間攪拌し、ＨＰＬＣ測定サンプルとした。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。また特に記載がない場合、ＨＰＬＣ分析はすべて同条件で行った。
［ＨＰＬＣ条件］
システム：Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ２６９５,  ２４７５，  ２９９６)
カラム:ＡｃｃＱ・ＴａｇＴＭ  Ｃｏｌｕｍｎ  ｆｏｒ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ（φ３．９×１５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）
移動相：ＡｃｃＱ・ＴａｇＴＭ  Ｅｌｕｅｎｔ  Ａ／Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ  ＝  Ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
温度:３７℃
インジェクション体積：１０μＬ
検出:蛍光（２５０／３９５ｎｍ）
定量用標準物質:アミノ酸混合標準，Ｈ型(和光純薬)
【００５２】
《試験群Ａ：ポリマーの合成》
［実施例Ａ−１］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
（１）ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  １０−３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
アルゴン下、反応容器に片末端アミノプロピルのポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２、平均分子量１０，０００）  ２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）および脱水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）  ２５ｍＬを加えて溶解した。ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２のモル数に対して３８．５倍量のβ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ、Ｍｗ＝２６３．２５）  ２．０３ｇ（７．７ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で一昼夜反応させた。室温まで放冷後、６倍量のβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート  Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、Ｍｗ＝２４９．２２）  ０．３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で一昼夜反応させた。反応後、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）  ２０ｍＬを用いて桐山ろ紙（φ４０ｍｍ、５Ｂ）にて吸引ろ過を行い、ろ液をヘキサン／酢酸エチル（６／４）混合溶液５００ｍＬに滴下し、晶析を行った。析出したポリマーを桐山ろ紙（φ６０ｍｍ、５Ｃ）にて吸引ろ過を行い、さらに清浄なヘキサン／酢酸エチル（５／５）溶液５００ｍＬを加えて、同様の洗浄操作を２回繰り返した後、減圧乾燥を経てポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。中間化合物であるポリマー（ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ）では、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでＰＥＧ鎖の積分値を基準としてベンジルエステルの総数が算出される。アミノ酸分析によって得られたポリマー中のグルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）のモル分率より、ＰＢＬＧおよびＰＢＬＡの重合度を算出した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は３６であり、ＰＢＬＡの重合度は５であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１８，７００であった（収量３．５３ｇ、収率９４％）。
【００５３】
（２）ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
アルゴン下、ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  １０−３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒ  １．５ｇ（０．０８０ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ  １５ｍＬを加えて溶解した。アルゴン下、別の反応容器にＰＢＬＡに対し５０倍量（２５０当量）のジエチレントリアミン（ＤＥＴ）  ２．１８ｍＬ（２０．１ｍｍｏｌ）を加えた。各々の反応溶液を氷水浴で１０℃以下に冷却した。冷却後、ＤＥＴ溶液に対してポリマー溶液を脱水ＤＭＦ  ５ｍＬを用いて洗い入れ、５℃で１時間反応させた。別の容器にＤＥＴに対し２倍量の６Ｎ  塩酸  ６．７ｍＬ（４０．１ｍｍｏｌ）を加え、予め−２０℃にて冷却した。反応後、反応溶液を氷水浴で冷却しながら、−２０℃に冷却した塩酸溶液中に１０℃を超えないように加えた。次いで、透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）に移し、５℃下で０．０１Ｎ  塩酸３Ｌに対して１日間（外液を２回交換）、さらに５℃下で水３Ｌに対して１日間（外液を５回交換）透析を行った（透析外液はすべて予め５℃に冷却した）。透析後、フィルター（日本ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ  ＧＰ  ０．２２μｍ）にて処理後、凍結乾燥を経てポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。中間化合物であるポリマー（ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ）のようにポリマー構造中にアミノ酸のベンジルエステル誘導体であるＰＢＬＧとＰＢＬＡの両者が存在する場合、アミン化合物であるジエチレントリアミン（ＤＥＴ）と反応させると、ＰＢＬＡに対して優先的にエステルアミド交換反応が生じ、アスパラギン酸側鎖にＤＥＴ基が導入される。ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）のポリマーでは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルよりポリマー中のＰＢＬＧのベンジルエステル数が算出され、すなわちＰＢＬＧの重合度に相当する。アミノ酸分析によって得られたポリマー中のグルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）のモル分率より、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度を算出した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は３６、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は５であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１９，０００であった（収量１．４ｇ、収率９２％）。
【００５４】
［実施例Ａ−２］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２  ２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のモル数に対して２７．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  １．４５ｇ（５．５ｍｍｏｌ）および６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を用いたこと、および、最初の晶析に用いた貧溶媒をジエチルエーテルとしたこと以外は、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２４、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は５であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１６，８００であった（収量１．４３ｇ、収率９４％）。
【００５５】
［実施例Ａ−３］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２０−１０  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２  ２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のモル数に対して２２倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  １．１６ｇ（４．４ｍｍｏｌ）および１２倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を用いたこと、および、最初の晶析に用いた貧溶媒をジエチルエーテルとしたこと以外は、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は１９、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は１１であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２０−１０  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１７，１００であった（収量１．４１ｇ、収率９０％）。
【００５６】
［実施例Ａ−４］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−３５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２  ２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のモル数に対して３８．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ２．０３ｇ（７．７ｍｍｏｌ）および６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を同時に加えて４０℃で一昼夜反応させたこと以外は、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は３６、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は５であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−３５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１９，０００であった（収量１．４ｇ、収率９２％）。
【００５７】
［実施例Ａ−５］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２  ２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のモル数に対して２７．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  １．４５ｇ（５．５ｍｍｏｌ）および６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．３ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−４と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２６、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は５であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１６，８００であった（収量１．３７ｇ、収率９０％）。
【００５８】
［実施例Ａ−６］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２０−１０  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２  ２ｇ（０．２ｍｍｏｌ）のモル数に対して２２倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  １．１６ｇ（４．４ｍｍｏｌ）および１２倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−４と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は１８、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は１０であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−２０−１０  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約１７，１００であった（収量１．４２ｇ、収率９１％）。
【００５９】
［実施例Ａ−７］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
（１）ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  ３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
アルゴン下、脱水ＤＭＳＯ  １５ｍＬにｎ−ブチルアミン  ４０μＬ（０．４０ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。ｎ−ブチルアミンのモル数に対して３８．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ４．１ｇ（１５．６ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で一昼夜反応させた。室温まで放冷後、６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．６１ｇ（２．４３ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で一昼夜反応させた。反応後、ＤＭＦ  ２０ｍＬを用いて桐山ろ紙（φ４０ｍｍ、  ５Ｂ）にて吸引ろ過を行い、ろ液をジエチルエーテル  １Ｌに滴下し、晶析を行った。析出したポリマーを桐山ろ紙（φ６０ｍｍ、  ５Ｂ）にて吸引ろ過を行い、さらに清浄なヘキサン／酢酸エチル（８／２）溶液１Ｌを加えて、同様の洗浄操作を２回繰り返した後、減圧乾燥を経てポリマー粉体（ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  ３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒ）を得た。
【００６０】
（２）ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ＰＢＬＧ−ＰＢＬＡ  ３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒ  １．５ｇ（０．１７１ｍｍｏｌ）および透析膜（ＭＷＣＯ：１，０００）を用い、透析精製後はフィルター処理をしないこと以外は、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に、１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は３５、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は６であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約９，１１０であった（収量１．２２ｇ、収率７８％）。
【００６１】
［実施例Ａ−８］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３０−１０  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ−ブチルアミン  ４０μＬ（０．４１ｍｍｏｌ）のモル数に対して３３倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ３．５２ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）および１２倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  １．２１ｇ（４．９ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−７と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２９、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は１２であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３０−１０  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約９，３８０であった（収量１．１９ｇ、収率７４％）。
【００６２】
［実施例Ａ−９］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ−ブチルアミン  ５０μＬ（０．５１ｍｍｏｌ）のモル数に対して２７．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ３．６６ｇ（１３．９ｍｍｏｌ）および６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．７６ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−７と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２５、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は６であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２５−５  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約６，９２０であった（収量１．２３ｇ、収率７８％）。
【００６３】
［実施例Ａ−１０］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２０−１０  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ−ブチルアミン  ５０μＬ（０．５１ｍｍｏｌ）のモル数に対して２２倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ２．９３ｇ（１１．１ｍｍｏｌ）および１２倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  １．５１ｇ（６．１ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−７と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は１９、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は１０であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２０−１０  Ｂｌｏｃｋ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約７，１９０であった（収量１．２６ｇ、収率７６％）。
【００６４】
［実施例Ａ−１１］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ−ブチルアミン  ４０μＬ（０．４１ｍｍｏｌ）のモル数に対して３８．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ４．１ｇ（１５．６ｍｍｏｌ）および６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．６１ｇ（２．４３ｍｍｏｌ）を同時に加えて４０℃で一昼夜反応させたこと以外は、実施例Ａ−７と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は３４、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は５であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約９，１１０であった（収量１．２６ｇ、収率８１％）。
【００６５】
［実施例Ａ−１２］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３０−１０  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ−ブチルアミン  ４０μＬ（０．４１ｍｍｏｌ）のモル数に対して３３倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ３．５２ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）および１２倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  １．２１ｇ（４．９ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−１１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２８、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は１０であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ３０−１０  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約９，３８０であった（収量１．０８ｇ、収率６７％）。
【００６６】
［実施例Ａ−１３］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ−ブチルアミン  ５０μＬ（０．５１ｍｍｏｌ）のモル数に対して２７．５倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  ３．６６ｇ（１３．９ｍｍｏｌ）および６倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ０．７６ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−１１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２６、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は５である。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２５−５  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約６，９２０であった（収量１．０８ｇ、収率６８％）。
【００６７】
［実施例Ａ−１４］ＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２０−１０  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの合成
ｎ-ブチルアミン  ５０μＬ（０．５１ｍｍｏｌ）のモル数に対して２２倍量のＢＬＧ-ＮＣＡ  ２．９３ｇ（１１．１ｍｍｏｌ）および１２倍量のＢＬＡ-ＮＣＡ  １．５１ｇ（６．１ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例Ａ−１１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ-ＮＭＲおよびアミノ酸分析より確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は２０、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は１１であった。なお、こうして合成したＰＢＬＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  ２０−１０  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒの分子量は約７，１９０であった（収量１．１１ｇ、収率６７％）。
【００６８】
［参考例Ａ−１］ＰＥＧ−ＰＢＬＧ−Ａｃ  １０−４０の合成
アルゴン下、片末端アミノプロピルのポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２、平均分子量１０，０００）１８ｇ（１．８ｍｍｏｌ）に、脱水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｍＬを加えて溶解した。ＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２のモル数に対して４２倍量のＢＬＧ−ＮＣＡ  １９．８９ｇ（７５．６ｍｍｏｌ）を加えて４０℃で一昼夜反応させた。この反応液にＭｅＯ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２のモル数に対し１０倍量の無水酢酸  １．７ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）を加え、さらに４０℃で６時間反応させた。反応後、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）  ２０ｍＬを用いて桐山ろ紙（φ６０ｍｍ、  ５Ｂ）にて吸引ろ過を行い、ヘキサン／酢酸エチル（１／１）混合溶液２．５Ｌに滴下し、晶析を行った。析出したポリマーを桐山ろ紙（φ９５ｍｍ、  ５Ｂ）にて吸引ろ過を行い、さらに清浄なヘキサン／酢酸エチル（１／１）溶液２．５Ｌにて同様の洗浄操作を２回繰り返した後、減圧乾燥を行ってポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは実施例Ａ−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲより確認した。その結果、ＰＢＬＧの重合度は４０であった。なお、こうして合成したＰＥＧ−ＰＢＬＧ−Ａｃ  １０−４０の分子量は約１８，８００であった（収量３３．１８ｇ、収率９８％）。
【００６９】
［比較例Ａ−１］長鎖型ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ  ＳＴ２０％）の合成
（１）Ｓｔｅａｒｙｌ−ＮＨＳの合成
アルゴン下、ステアリン酸  ３ｇ（１０．５５ｍｍｏｌ）、ステアリン酸に対して１．２倍量のＮ−ヒドロキシこはく酸イミド  １．４５６ｇ（１２．６５ｍｍｏｌ）、１．２倍量の１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)  カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）  ２．４２６ｇ（１２．６５ｍｍｏｌ）、および脱水クロロホルム４０ｍＬを加えて溶解し、室温で一昼夜反応させた。反応後、エバポレーターにてクロロホルムを留去し、ジエチルエーテルに溶解した。蒸留水と共に分液ロートで数回に分けて抽出を行い、水層を除去後、ジエチルエーテル層を回収した。回収したジエチルエーテル層に無水硫酸マグネシウムを加えて３０分程度攪拌後、桐山ろ紙（φ４０ｍｍ、５Ｂ）にて吸引ろ過を行った。エバポレーターにてろ液からジエチルエーテルを留去し、クロロホルム３０ｍＬに溶解した。得られた溶液をＥｔＯＨ  ３００ｍＬへ滴下し、晶析を行った後に吸引ろ過を行った。次いで、ＥｔＯＨ  ３００ｍＬで約１０分間攪拌後、桐山ろ紙（φ４０ｍｍ、５Ｂ）にて吸引ろ過を行い、減圧乾燥を経て結晶を回収した。得られた化合物が目的物であることは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ｄ、Ｔ＝２０℃）より確認した。活性エステル化率は、ステアリン酸由来ピーク（Ｒ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ：２．４ｐｐｍ）とＳｔｅａｒｙｌ−ＮＨＳ由来ピーク（Ｒ−ＣＨ２−ＮＨＳ：２．６ｐｐｍ）より算出したところ、８６％であった。なお、反応に用いる際、添加量は活性エステル化率より換算し、目的の添加量の１．１６倍量を加えた。こうして合成したＳｔｅａｒｙｌ−ＮＨＳの分子量は約３８１．５５であった（収量１．９ｇ、収率４７％）。
【００７０】
（２）ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １０−１００の合成
アルゴン下、ＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２  １ｇ（０．１ｍｍｏｌ）に、脱水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）  １５ｍＬを加えて溶解した。アルゴン下、別の容器にＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２のモル数に対して１１０倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ２．７４ｇ（１１ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ  ６ｍＬ、および脱水ＣＨ２Ｃｌ２  ３０ｍＬを加えて溶解した。ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に対してＰＥＧ１０Ｋ−ＮＨ２溶液を脱水ＣＨ２Ｃｌ２  １５ｍＬを用いて洗い入れ（最終ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ＝１０／１）、３５℃で２日間反応させた。反応後、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６,Ｔ＝６０℃）より確認した（収量２．７３ｇ、収率９０％）。
【００７１】
（３）ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−１００の合成
アルゴン下、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １０−１００  １．２１ｇ（０．０３９７ｍｍｏｌ）に脱水Ｎ‐メチル‐２‐ピロリドン（ＮＭＰ）  ５０ｍＬを加えて溶解した。アルゴン下、別の反応容器にＰＢＬＡのモル数に対し５０倍量のジエチレントリアミン（ＤＥＴ）  ２１．５ｍＬ（１９８．４ｍｍｏｌ）および脱水ＮＭＰ  １０ｍＬを加えた。これ以外は、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｔ＝７０℃）より確認した（収量１．０ｇ、収率６８％）。
【００７２】
（４）ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ  ＳＴ  ２０％）  １０−１００の合成
アルゴン下、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−１００  ４００ｍｇ（０．０１０７ｍｍｏｌ）にメタノール  １５ｍＬ、ＤＥＴのモル数に対して１０倍量のトリエチルアミン（ＴＥＡ）  １．４９ｍＬ（１０．７２ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。アルゴン下、別の容器にアスパラギン酸のモル数に対して０．２倍量のＳｔｅａｒｙｌ−ＮＨＳ  ９５．１ｍｇ（０．２１４ｍｍｏｌ）を加え、ＣＨ２Ｃｌ２  ５ｍＬで溶解した。各々の溶液を氷水浴で冷却し、ポリマー溶液に対してＳｔｅａｒｙｌ−ＮＨＳ溶液をＣＨ２Ｃｌ２  １０ｍＬを用いて洗い入れ（最終：ＭｅＯＨ  １５ｍＬ／ＣＨ２Ｃｌ２  １５ｍＬ）、５℃にて一昼夜反応した。反応後、ジエチルエーテル２７０ｍＬに滴下し、晶析を行った。遠心分離操作（２，３８０Ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を行い、ポリマーを回収した。清浄なジエチルエーテル９０ｍＬにて、同様の遠心操作による洗浄を２回繰り返し、上清を除去した。次いで、５０％  ＭｅＯＨ水溶液  ４０ｍＬに溶解して透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）に移し、５℃下で０．０１Ｎ  塩酸３Ｌに対して１日間（外液を２回交換）、さらに５℃下で水３Ｌに対して１日間（外液を２回交換）透析を行った（透析外液はすべて予め５℃に冷却した）。透析後、フィルター（ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ  ＧＰ  ０．２２μｍ）にて処理後、凍結乾燥を経てポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｔ＝７０℃）より確認した。その結果、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度は９９、ステアロイル（ＳＴ）基導入率は２１%であった。こうして合成したＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ  ＳＴ  ２０％）  １０−１００の分子量は約４２，７００であった（収量４３２ｍｇ、収率９５％）。
【００７３】
［比較例Ａ−２］長鎖型ｐＡｓｐ（ＤＥＴ  ＳＴ２０％）の合成
（１）ＰＢＬＡ  １００の合成
アルゴン下、ｎ−ブチルアミンに対し１１０倍量のＢＬＡ−ＮＣＡ  ２．７７ｇ（１１．１３ｍｍｏｌ）へ脱水ＤＭＦ  ４ｍＬおよび脱水ＣＨ２Ｃｌ２  ３０ｍＬを加えて溶解した。アルゴン下、別の容器にｎ−ブチルアミン  １０μＬ（０．１０１ｍｍｏｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２  １ｍＬを加えた。ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に対してｎ−ブチルアミン溶液を脱水ＣＨ２Ｃｌ２  ９ｍＬを用いて洗い入れ（最終ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ＝１０/１）、３５℃で２日間反応させた。反応後、実施例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６,Ｔ＝６０℃）より確認した（収量１．７８ｇ、収率８６％）。
【００７４】
（２）ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）１００の合成
アルゴン下、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ  １０−１００の代わりにＰＢＬＡ  １００を１．２ｇ（０．０５８５ｍｍｏｌ）用いたこと以外は、比較例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｔ＝７０℃）より確認した（収量１．２９ｇ、収率８１％）。
【００７５】
（３）ｐＡｓｐ（ＤＥＴ  ＳＴ  ２０％）１００の合成
アルゴン下、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １０−１００の代わりにｐＡｓｐ（ＤＥＴ）  １００を４００ｍｇ（０．０１４７ｍｍｏｌ）用いたこと以外は、比較例Ａ−１と同様にして、ポリマー粉体を得た。得られた化合物が目的物であることは１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、Ｔ＝７０℃）より確認した。ステアロイル（ＳＴ）基導入率は２１％であった。こうして合成したｐＡｓｐ（ＤＥＴ  ＳＴ  ２０％）  １００の分子量は約３２，７００であった（収量４７１ｍｇ、収率９８％）。
【００７６】
《試験群Ｂ：ポリマー粒子組成物の調製》
［実施例Ｂ−１〜Ｂ−１０、比較例Ｂ−１〜２］
表１に記載のポリマー  ３０ｍｇに１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）  ２ｍＬを加え、１時間４℃で攪拌して懸濁させた。この懸濁液を超音波処理（１３０Ｗ、１秒パルス、５分間）することで、１５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度でポリマー成分を含有するポリマー粒子組成物１〜１０およびＣ１〜Ｃ２を得た。
【００７７】
［実施例Ｂ−１１〜１４］
表１に記載のポリマー各４０ｍｇにジメチルスルホキシド２ｍＬを加え、溶解させた。この溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：３，５００）へ移し、外液として１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）５００ｍＬを用い、室温で２時間透析した。その後、外液を交換して５℃で１２時間、さらにもう一度外液を交換して５℃で２時間の透析を行った。透析後の溶液を回収し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）により溶液の全量を５．３ｍＬに調製することで、１５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度でポリマー成分を含有するポリマー粒子組成物１１〜１４を得た。
【００７８】
［実施例Ｂ−１５〜１７］
表１に記載のポリマー各２０ｍｇにアセトン２ｍＬおよびメタノール２ｍＬを加え、溶解させた。この溶液に窒素ガスを吹き付け、溶媒を揮発させた後、さらに真空ポンプで６時間減圧乾燥を行った。得られたポリマーフィルムに１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）２．７ｍＬを加え、１時間４℃で攪拌して懸濁させた。この懸濁液を超音波処理（１３０Ｗ、１秒パルス、５分間）することで、１５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度でポリマー成分を含有するポリマー粒子組成物１５〜１７を得た。
【００７９】
＜ポリマー粒子組成物の粒子径評価＞
上記で得られたポリマー粒子組成物１〜１７およびＣ１〜２  各５０μＬに１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）  ７００μＬを加えて、サンプルを調製した。これらのサンプルについて、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2011173802.tif 000005
【００８１】
《試験群Ｃ：複合体の調製》
後述する複合体の調製に用いたｓｉＲＮＡは、以下のとおりである。これらｓｉＲＮＡは、株式会社日本イージーティーを通じて入手できる。
（１）ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ウミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
（２）ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）：ヒトＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＣＡＵＵＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖として５’−ＵＵＡＡＧＣＡＧＣＵＣＧＵＵＡＡＵＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号４）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。Ｐｌｋ１遺伝子は、細胞分裂のＭ期において重要なキナーゼである。ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）は、細胞内に導入された場合にアポトーシスを誘導する。
【００８２】
［実施例Ｃ−１］ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物
ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させ、８０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。このｓｉＲＮＡ溶液１２．５μＬに、Ｎ／Ｐ比が１６となるように濃度を調製したポリマー粒子組成物１〜１７およびＣ１〜２を８７．５μＬ添加し、混合した後に４℃で２時間静置することにより、ポリマー粒子へのｓｉＲＮＡの内包処理を行った。これにより、ポリマーとｓｉＲＮＡとの複合体としてのｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物１〜１７およびＣ１〜２を得た。ここで、「Ｎ／Ｐ比」とは、［ポリマー粒子組成物に含有されるポリマー中のポリアミノ酸側鎖のアミノ基濃度］／［核酸中のリン酸基濃度］を意味する。
【００８３】
＜粒子径評価＞
上記で得られたｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物１〜１７およびＣ１〜２の各々について、該組成物７０μＬに１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）  ６３０μＬを加えて、１μＭのｓｉＲＮＡを含有するサンプルを調製した。これらのサンプルについて、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した。結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
＜ｓｉＲＮＡリリース率の評価＞
上記で得られたｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物１〜６、１１〜１７、およびＣ１〜Ｃ２の各々について、該組成物  ５μＬ（ｓｉＲＮＡ濃度  １０μＭ）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）  ９０μＬおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ５μＬを添加し、３７℃で２４時間静置した（ＦＢＳ処理）。対照として、ＦＢＳおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡに代えて１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）  ９５μＬを用いて同様の処理を行った（対照処理）。
【００８６】
ＦＢＳ処理または対照処理後の各組成物におけるｓｉＲＮＡのリリース率を、次のようにして電気泳動法により分析した。ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ  ２０％ＴＢＥ  Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１００ｎｇのｓｉＲＮＡを含有する各組成物をロードし、ＴＢＥ溶液を泳動バッファーとして用い、引加電圧１００Ｖ、泳動時間１時間の条件で泳動を行った。泳動後、ゲルはエチジウムブロマイドにより染色し、ＵＶトランスイルミネーター上にてゲル像を撮影した。その後、バンド強度を画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ、ＮＩＨ）により解析し、ｓｉＲＮＡリリース率を定量化した。ｓｉＲＮＡリリース率を定量化した結果を表３および表４に示す。各組成物のｓｉＲＮＡリリース率は、ｓｉＲＮＡ単体を評価した場合のバンド強度を１００％とし、バンド強度の相対値から算出した。
【００８７】
また、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物１〜６およびＣ１について得られた電気泳動後のゲル像を図１に、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物１１〜１７およびＣ２について得られた電気泳動後のゲル像を図２に示す。図１および２中、（Ａ）はＦＢＳ処理したサンプルの結果であり、（Ｂ）は対照処理をしたサンプルの結果を意味する。
【００８８】
【表３】
2011173802.tif 000007
【００８９】
表３に示すように、ＰＥＧ鎖を有する短鎖型ポリマー基材から形成した各組成物では、４％以上のｓｉＲＮＡリリースがあった。そして、ｒａｎｄｏｍ型のカチオン性ポリアミノ酸鎖セグメントを有するポリマー基材から形成した実施例の組成物では、７０％以上のｓｉＲＮＡリリースがあった。また、ｂｌｏｃｋ型のカチオン性ポリアミノ酸鎖セグメントを有するポリマー基材から形成した実施例の組成物では、ｓｉＲＮＡリリース率を１５％以下に抑えることができた。このことから、ｂｌｏｃｋ型ポリマー基材は、その後の放出に向けて残りのｓｉＲＮＡを基材に保持することが可能であり、ｒａｎｄｏｍ型ポリマー基材に比べて長期徐放型の基材として適していることがわかる。
【００９０】
【表４】
2011173802.tif 000008
【００９１】
表４に示すように、ＰＥＧ鎖を有さない短鎖型ポリマー基材から形成した各組成物でも４％以上のｓｉＲＮＡリリースがあった。そして、ｒａｎｄｏｍ型ポリマー基材から形成した実施例の組成物では、４０％以上のｓｉＲＮＡリリースがあった。また、ｂｌｏｃｋ型ポリマー基材から形成した実施例の組成物では、ｓｉＲＮＡリリース率を３０％以下に抑えることができた。このことから、ｂｌｏｃｋ型ポリマー基材は、その後の放出に向けて残りのｓｉＲＮＡを基材に保持することが可能であり、ＰＥＧ鎖の有無にかかわらず、やはりｒａｎｄｏｍ型ポリマー基材に比べ長期徐放型の基材として適していることがわかる。
【００９２】
［実施例Ｃ−２］ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物
ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）を用いたこと、および、Ｎ／Ｐ比が４、８、１６、および３２となるように濃度を調製したポリマー粒子組成物７〜１０およびＣ２を用いたこと以外は実施例Ｃ−１と同様にして、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物７〜１０およびＣ２を得た。
【００９３】
＜ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する活性評価＞
上記で得られたｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物７〜１０およびＣ２の各々に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を加え、ｓｉＲＮＡ濃度を１μＭ／ｍｌに調整した。ヒト乳癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１ウェル当たり細胞２０００個の割合で９６ウェルのディッシュに播き、２４時間後に各組成物を培地に添加した。ｓｉＲＮＡの培地中での最終濃度は１００ｎＭとなるように調整した。９６時間さらに培養した後、細胞の生存率を細胞数測定キットＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁堂）を用いて評価した。なお、不活性なコントロール配列としてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、同様の実験を行った。
【００９４】
評価の結果、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物７〜１０は、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物７〜１０に比べて細胞数の減少が顕著であった。具体的には、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物７では、Ｎ／Ｐ比が４、８、１６、および３２場合の細胞生存率（％）がそれぞれ４８．２（ｓ．ｄ．＝１．１）、２６．５（ｓ．ｄ．＝１．２）、１２．４（ｓ．ｄ．＝１．６）、および６．７（ｓ．ｄ．＝０．８）であったのに対し、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物７ではそれぞれ、６７．１（ｓ．ｄ．＝３．６）、４５．５（ｓ．ｄ．＝１．９）、３３．８（ｓ．ｄ．＝１．６）、および３６．１（ｓ．ｄ．＝０．７）であった。また、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物８では、Ｎ／Ｐ比が４、８、１６、および３２場合の細胞生存率（％）がそれぞれ６０．０（ｓ．ｄ．＝９．０）、２３．２（ｓ．ｄ．＝５．０）、２．６（ｓ．ｄ．＝０．３）、および３．３（ｓ．ｄ．＝１．２）であったのに対し、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物８ではそれぞれ、８８．３（ｓ．ｄ．＝２．２）、６６．４（ｓ．ｄ．＝１．７）、２４．９（ｓ．ｄ．＝１．８）、および２９．４（ｓ．ｄ．＝１．５）であった。また、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物９では、Ｎ／Ｐ比が８および１６の場合の細胞生存率（％）がそれぞれ４８．８（ｓ．ｄ．＝８．５）および０．９（ｓ．ｄ．＝１．５）であったのに対し、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物９ではそれぞれ、７９．０（ｓ．ｄ．＝１１．６）および１６．９（ｓ．ｄ．＝３．９）であった。また、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物１０では、Ｎ／Ｐ比が１６の場合の細胞生存率が１３．９（ｓ．ｄ．＝１０．７）であったのに対し、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）内包ポリマー粒子組成物１０では５２．８（ｓ．ｄ．＝３．９）であった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）内包ポリマー粒子組成物７〜１０が正常に機能したことを意味する。これに対し、図３に示すように、ポリマー粒子組成物Ｃ２では、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）を内包する場合と、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を内包する場合とで顕著な差は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明のカチオン性ポリアミノ酸およびブロックコポリマーは、製薬、医療等の分野で好適に用いられ得る。
【図１】
2011173802.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2011173802000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月18日(2010.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖にカチオン性基を有するカチオン性アミノ酸残基と側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸残基とを含み、核酸との会合能を有する、カチオン性ポリアミノ酸であって、該カチオン性アミノ酸残基を１〜２０個含み、
下記式（１）で表わされる、カチオン性ポリアミノ酸：
【化１】
2011173802.tif 000012
式中、Ｒ１は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基あるいは炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル基あるいは炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、リシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍは、５〜８０の整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｘは、１〜２０の整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜２０の整数であり、
但し、ｘとｚとの和は１以上２０以下であり、上記各反復単位の結合順は任意であり、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびＲ８は１つのポリアミノ酸内の各アミノ酸残基において任意に選択可能である。
【請求項２】
前記カチオン性アミノ酸残基からなるセグメントと疎水性アミノ酸残基からなるセグメントとから構成されるブロック型のポリアミノ酸である、請求項１に記載のカチオン性ポリアミノ酸。
【請求項３】
請求項１または２に記載のカチオン性ポリアミノ酸鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む、ブロックコポリマー。
【請求項４】
請求項１または２に記載のカチオン性ポリアミノ酸および／または請求項３に記載のブロックコポリマーを含む、ポリマー粒子組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載のカチオン性ポリアミノ酸および／または請求項３に記載のブロックコポリマーと核酸とを含む、複合体。