(57)【要約】【課題】古典的な反応容器を用いずにＰＣＲを首尾よく実施するための技術を提供する。【解決手段】ＰＣＲを行なう際に反応液を貯留するためのＰＣＲ用反応器具であって、上記反応液を貯留したときに当該反応液が接する面が、親水性材料が疎水化されてなる、ＰＣＲ用反応器具を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲを行なう際に反応液を貯留するためのＰＣＲ用反応器具であって、
上記反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が、親水性材料が疎水化されてなることを特徴とするＰＣＲ用反応器具。
【請求項２】
上記面が、上記親水性材料が疎水性の被覆部材によって被覆されてなることを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ用反応器具。
【請求項３】
上記被覆部材が、シリコーン樹脂であることを特徴とする請求項２に記載のＰＣＲ用反応器具。
【請求項４】
上記親水性材料が、ガラス、石英、またはプラスチックであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のＰＣＲ用反応器具。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＰＣＲ用反応器具を備えていることを特徴とするＰＣＲ用キット。
【請求項６】
ＰＣＲを行なう際に反応液を貯留するためのＰＣＲ用反応器具を製造する方法であって、
上記反応液を貯留する器具であって、当該反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が親水性材料からなる器具の、当該面を疎水化することによりＰＣＲ用反応器具を製造する疎水化工程を包含していることを特徴とするＰＣＲ用反応器具の製造方法。
【請求項７】
器具に反応液を貯留してＰＣＲを行なう核酸増幅方法であって、
上記反応液を貯留する器具であって、当該反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が親水性材料からなる器具の、当該面を疎水化する疎水化工程と、
上記疎水化工程において上記面が疎水化された上記器具に上記反応液を貯留し、ＰＣＲを行なう反応工程とを包含していることを特徴とする核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料の解析技術に関し、具体的には、ＰＣＲ用反応器具、ＰＣＲ用キット、ＰＣＲ用反応器具の製造方法、及び核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応）は、例えば、病気の診断、遺伝子異常の検査、感染症の感染の有無、又はバイオテクノロジーにおける遺伝子増幅など非常に多くのケースにおいて、目的の核酸を増幅させる手法として世界的に使用されている。
【０００３】
ＰＣＲは、古典的には、マイクロチューブ、マイクロタイタープレート等のプラスチック製の反応容器内に必要な試薬および試料からなる反応液を貯留し、反応容器をサーマルサイクラーにセットすることにより実施される（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Molecular Cloning 3rd Edition (2001) Vol. 2: 8.18-8.22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、近年のバイオテクノロジー分野では、プロテオソーム解析、ＤＮＡチップ、マイクロ化学チップ、μＴＡＳ（Micro Total Analysis System）等の新規の技術が開発されており、さらなる高性能化、小型化及びハイスループット化が求められている。それゆえ、ＰＣＲにおいても、サーマルサイクラーを用いる段階から、極小空間においてＰＣＲを行なうことが試みられており、ＰＣＲに使用する器具も多様化している。
【０００６】
しかし、マイクロチューブ、マイクロタイタープレート等の古典的な反応容器を用いずにＰＣＲを実施した場合、問題が生じることがある。例えば、極小空間においてＰＣＲを行なうため、ガラス製のマイクロ化学チップに反応液を貯留してＰＣＲを実施した場合、反応が起こらないことがある。
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、古典的な反応容器を用いずにＰＣＲを首尾よく実施するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、シリコーンコーティング等を用いて反応液を貯留する器具の表面を予め疎水化することにより、マイクロ化学チップ又はガラス管等の様々な器具を用いてもＰＣＲを再現性よく行ない得ることを見出し、発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明に係るＰＣＲ用反応器具は、ＰＣＲを行なう際に反応液を貯留するためのＰＣＲ用反応器具であって、上記反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が、親水性材料が疎水化されてなることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係るＰＣＲ用反応器具では、上記面が、疎水性の被覆部材によって被覆されており、これによって疎水化されていることが好ましく、疎水性の被覆部材としては、シリコーン樹脂を用いることが好ましい。また、本発明は、上記親水性材料がガラス、石英、またはプラスチックである場合に好適に使用することができる。
【００１１】
本発明に係るＰＣＲ用キットは、本発明に係るＰＣＲ用反応器具を備えていればよく、ＰＣＲのために用いるその他の試薬、器具、および装置をさらに備えていてもよい。
【００１２】
また、本発明に係るＰＣＲ用反応器具を製造する方法は、ＰＣＲを行なう際に反応液を貯留するためのＰＣＲ用反応器具を製造する方法であって、上記反応液を貯留する器具であって、当該反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が親水性材料からなる器具に対の、当該面を疎水化することによりＰＣＲ用反応器具を製造する疎水化工程を包含していることを特徴としている。
【００１３】
また、本発明に係る核酸増幅方法は、器具に反応液を貯留してＰＣＲを行なう核酸増幅方法であって、上記反応液を貯留する器具であって、当該反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が親水性材料からなる器具の、当該面を疎水化する疎水化工程と、上記疎水化工程において上記面が疎水化された上記器具に上記反応液を貯留し、ＰＣＲを行なう反応工程とを包含していることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＰＣＲのために好適に用いることができる新規なＰＣＲ用反応器具を提供することができるため、古典的な反応容器を用いずにＰＣＲを首尾よく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例１においてＰＣＲ後の反応液を電気泳動したときの泳動パターンを示す図である。
【図２】本発明の実施例２においてＰＣＲ後の反応液を電気泳動したときの泳動パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態について以下に説明する。なお、以下の記載は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１７】
（核酸増幅方法）
本発明に係る核酸増幅方法は、器具に反応液を貯留してＰＣＲを行なう核酸増幅方法であって、上記反応液を貯留する器具であって、当該反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が親水性材料からなる器具の、当該面を疎水化する疎水化工程と、上記疎水化工程において上記面が疎水化された上記器具に上記反応液を貯留し、ＰＣＲを行なう反応工程とを包含していればよい。
【００１８】
ＰＣＲは、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプライマーとＤＮＡ合成酵素（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）によるＤＮＡ合成反応の器具（反応容器）内における繰り返しで、その特定ＤＮＡ領域を増幅する方法であり、遺伝子工学分野において一般的に用いられている周知技術である。ＰＣＲ法にはＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等も含まれる。
【００１９】
ＰＣＲは、典型的には、鋳型となるＤＮＡ、２種類のプライマー、ｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液からなる反応液を、器具（反応容器）に貯留し、温度を所定のサイクルで変化させることにより、熱変性、アニーリングおよび合成反応を繰り返す。
【００２０】
本発明は、少なくとも一部が親水性材料からなる器具を用いてＰＣＲを行う場合について適用される。このような器具としては、反応液を貯留し得るものであれば特に限定されるものではないが、例えば、親水性材料からなるマイクロ化学チップ、パスツール管を含むガラス管等を例示することができる。親水性材料としては、例えば、ガラス、石英、プラスチック等が挙げられる。なお、上記器具は疎水性材料を含んでいてもよい。この場合、ＰＣＲの反応液を貯留する部分が、親水性材料から構成されている場合に本発明を好適に適用することができる。
【００２１】
疎水化工程とは、上記器具に含まれる親水性材料の表面を疎水化する工程である。疎水化の対象となる表面は、上記器具全体の表面であってもよいし、ＰＣＲの反応液を貯留したとき当該反応液と接触する接触面のみであってもよい。
【００２２】
疎水化の方法としては、特に限定されないが、親水性材料の表面を疎水性の被覆部材によって被覆（コーティング）することが好ましい。これにより、上記器具における親水性材料の表面を好適に疎水化して、当該器具をＰＣＲに好適に供することができる。
【００２３】
被覆部材としては、疎水性である限り特に限定されるものではなく、例えば、シリコーン樹脂等を例示することができる。親水性材料の表面を被覆部材によりコーティングする方法としては、例えば、塗布法、噴霧法、浸漬法等が挙げられる。すなわち、シリコーン樹脂を、有機溶媒に溶解させるか、または水系溶媒に分散させてなるコーティング剤を、上記反応液と接する面に塗布または噴霧してもよいし、上記器具を、上記コーティング剤に浸漬してもよい。上記コーティング剤としては、例えば、市販されているシリコーンコーティング剤を用いることができる。
【００２４】
反応工程とは、疎水化工程において疎水化された上記器具を用いて、ＰＣＲ反応を実施する工程である。
【００２５】
具体的なＰＣＲ反応の手順としては、ＰＣＲミクスチャー（緩衝液、ｄＮＴＰｍｉｘ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を混合したもの）を鋳型ＤＮＡとともに上記器具内に添加し、さらにプライマーを加えてＰＣＲ用遺伝子増幅機器（サーマルサイクラー）等を用いてＰＣＲを行なえばよい。
【００２６】
プライマーについては、１つのＰＣＲについて様々な標的核酸を特異的に増幅するプライマーセットを用いる。ＰＣＲの条件（反応液の量、酵素や基質の濃度、反応温度等）は特に限定されるものではなく、用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な条件を選択すればよい。
【００２７】
ＰＣＲにより増幅される断片は、標的核酸が特異的に有する配列部分であることが好ましい。試料に含まれる核酸は標的部分以外の部分が大多数であるため、標的微生物に特異的な配列部分にプライマーを設計しなければ、非特異的な増幅産物が生じる可能性が高くなる。したがって、標的核酸の特異的配列をあらかじめ調べておき、その配列部分を増幅するようにプライマーを設計することが重要である。
【００２８】
増幅される断片の長さは５０ｂｐ〜５，０００ｂｐの範囲内であることが好ましく、１００ｂｐｐ〜２，０００ｂｐの範囲内であることがより好ましい。この範囲を外れると、特異的な増幅産物を有効に得ることができなくなるおそれがある。
【００２９】
後述する実施例に示すように、本発明に係る核酸増幅方法によれば、例え、親水性材料からなる器具を用いたとしても、ＰＣＲを首尾よく実施することができる。
【００３０】
また、本発明は、ＰＣＲを行なう際に反応液を貯留するための新規なＰＣＲ用反応器具を提供する。本発明に係るＰＣＲ用反応器具は、少なくとも一部が親水性材料からなり、上記反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が、該親水性材料が疎水化されてなるものである。このようなＰＣＲ用反応器具は、特に限定されるものではないが、例えば、親水性材料からなるマイクロ化学チップ、パスツール管を含むガラス管等の、上記反応液を貯留したときに当該反応液と接する面（例えば、マイクロ化学チップであれば溝部など、カラス管であれば管内部など）が疎水化されているものを例示することができる。親水性材料としては、例えば、ガラス、石英、プラスチック等が挙げられる。なお、ＰＣＲ用反応器具は親水性材料の他にも疎水性材料を含んでいてもよい。
【００３１】
一実施形態において、本発明に係るＰＣＲ用反応器具では、上記面の疎水化は、上記親水性材料が疎水性の被覆部材によって被覆されていることによりなされている。被覆部材としては、疎水性である限り特に限定されるものではなく、例えば、シリコーン樹脂等を例示することができる。被覆部材をコーティングする方法としては、例えば、塗布法、噴霧法、浸漬法等が挙げられる。
【００３２】
本発明に係るＰＣＲ用反応器具は、少なくとも一部が親水性材料からなるが、上記反応液を貯留したときに当該反応液と接する面が、疎水化されているため、ＰＣＲのために好適に用いることができる。
【００３３】
本発明に係るＰＣＲ用反応器具は、例えば、少なくとも一部が親水性材料からなるＰＣＲ用反応器具の、上記反応液を貯留したときに当該反応液と接する面を、疎水化する疎水化工程と包含しているＰＣＲ用反応器具の製造方法により製造することができる。
【００３４】
すなわち、一つの観点において、本発明に係るＰＣＲ用反応器具は、上述した本発明に係る核酸増幅方法における疎水化工程の実施後の上記器具に相当する。また、一つの観点において、上記疎水化工程は、ＰＣＲ用反応器具の製造方法を構成すると言える。
【００３５】
さらに、本発明は、本発明に係るＰＣＲ用反応器具を含む、ＰＣＲ用キットを包含する。
【００３６】
上記キットは、本発明に係るＰＣＲ用反応器具の他に、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および緩衝液等の試薬、本発明に係るＰＣＲ用反応器具の温度を調整するためのサーマルサイクラー等を含んでいてもよい。
【００３７】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００３８】
〔実施例１：パスツール管を用いたＰＣＲ〕
実施例１では、パスツール管の中で、総量５０．０μｌの反応液によりＰＣＲを行なった。パスツール管は、反応液を貯留する面をシリコーン樹脂によってコーティングしたものと、コーティングしていないものとを用意した。シリコーン樹脂によるコーティングは、市販のシリコーンコーティング剤（Ｓｉｇｍａｃｏａｔ：Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、パスツール管内を５〜２０分間浸漬し、充分に風乾することにより行った。
【００３９】
反応液は、テンプレートＤＮＡ：０．５μｌ、５×ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファー：１０．０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ：５．０μｌ、フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）：１．０μｌ、リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）：１．０μｌ、ｐｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）：０．５μｌ、蒸留水：２８．５μｌを混合して調整した。
【００４０】
２種類のパスツール管におけるＰＣＲは、通常のサーマルサイクラーを使用できないため、９８℃，６５℃，７２℃にそれぞれ保持した３種類の湯浴（５００ｍｌ）を用いて行なった。
【００４１】
反応時間は、９８℃：３０秒→（１）９８℃：１０秒→（２）６５℃：２０秒→（３）７２℃：２０秒→（１）〜（３）の繰り返し（２９サイクル）→７２℃：７分→４℃で維持、とした。
【００４２】
また、ポジティブコントロールとして、０．６ｍＬのＰＣＲチューブに反応液を入れて上記パスツール管と同様の条件にして湯浴中で反応させたものと、ＰＣＲチューブに１０μｌスケールで反応液を入れて、同様の反応時間に設定したサーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ社製）において反応させたものとを用意した。
【００４３】
ＰＣＲ反応後の反応液を、マイクロチップ電気泳動装置（ＭＣＥ−２０２“ＭｕｌｔｉＮＡ”、ＳＨＩＭＡＺＵ製）で電気泳動し、増幅を確認した。このとき、反応前溶液をネガティブコントロールとした。その結果を図１に示す。図１は、実施例１においてＰＣＲ後の反応液を電気泳動したときの泳動パターンを示す図である。
【００４４】
この泳動パターンにおいて、レーン「Ｍ」はマーカーであり、レーン「Ａ」はポジティブコントロール（反応前溶液）であり、レーン「Ｂ」はシリコンコートをしていないパスツール管において反応させた反応液であり、レーン「Ｃ」はシリコンコートをしたパスツール管において反応させた反応液であり、レーン「Ｄ」はポジティブコントロール（ＰＣＲチューブを湯浴中で反応させた反応液）であり、レーン「Ｅ」はポジティブコントロール（ＰＣＲチューブをサーマルサイクラーで反応させた反応液）である。
【００４５】
図１に示すように、７００ｂｐ付近に見られるバンドが増幅産物であり、レーンＣ，Ｄ，Ｅでは見られるが、レーンＡ，Ｂでは見られなかった。つまり、パスツール管では、シリコーンによってコーティングしていない場合には増幅が全く見られないが、シリコーンによってコーティングしている場合には明確に増幅のバンドが確認できた。
【００４６】
よって、パスツール管の反応液を貯留する面をシリコーンコーティングすることによって、ＰＣＲを好適に実施することができることがわかった。
【００４７】
〔実施例２：マイクロ化学チップを用いたＰＣＲ〕
実施例２では、マイクロチップ上で、総量５．０μｌの反応液によりＰＣＲを行なった。
【００４８】
マイクロチップとしては、スタンダードマイクロ化学チップ（耐熱ガラス：テンパックス）、マイクロ化学技研製、製品番号：ＩＣＣ−ＰＴ１００、製造番号：Ｐａ０７０００３、プールサイズ：１０ｍｍ×５ｍｍ、チャネル深さ：１１５．７μｍを用いて、表面をシリコーン樹脂によってコーティングしたものと、コーティングしていないものとを用意した。シリコーン樹脂によるコーティングは、実施例１と同様に行った。
【００４９】
プライマー及びテンプレートＤＮＡは、実施例１と同一のものを使用した。また、反応液も実施例１と同様に調整した。
【００５０】
ＰＣＲは、実施例１と同様に湯浴を用いて行なった。反応時間は、９８℃：３０秒→（１）９８℃：１０秒→（２）６５℃：２０秒→（３）７２℃：２０秒→（１）〜（３）の繰り返し（２９サイクル）→７２℃：７分→４℃で維持、とした。
【００５１】
ＰＣＲ後の反応液を、マイクロチップ電気泳動装置（ＭＣＥ−２０２“ＭｕｌｔｉＮＡ”、ＳＨＩＭＡＺＵ製）で電気泳動し、増幅を確認した。このとき、反応前容液をネガティブコントロールとし、０．６ｍＬのＰＣＲチューブを用いて同様の反応時間に設定したサーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ社製）において反応させたものをポジティブコントロールとした。その結果を図２に示す。図２は、実施例２においてＰＣＲ後の反応液を電気泳動したときの泳動パターンを示す図である。
【００５２】
この泳動パターンにおいて、レーン「Ｍ」はマーカーであり、レーン「Ａ」はポジティブコントロール（反応前溶液）であり、レーン「Ｂ」はシリコンコートをしたマイクロチップにおいて反応させた反応液であり、レーン「Ｃ」はポジティブコントロール（ＰＣＲチューブをサーマルサイクラーで反応させた溶液）であり、レーン「Ｄ」はシリコンコートをしていないマイクロチップにおいて反応させた反応液である。
【００５３】
図２に示すように、７００ｂｐ付近に見られるバンドが増幅産物であり、レーンＢ，Ｃでは見られるが、レーンＡ，Ｄでは見られなかった。つまり、マイクロチップでは、シリコーンによってコーティングしていない場合には増幅が全く見られないが、シリコーンによってコーティングしている場合には明確に増幅のバンドが確認できた。
【００５４】
よって、マイクロチップの表面をシリコーンコーティングすることによって、ＰＣＲを好適に実施することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、病気の診断、遺伝子異常の検査、感染症の感染の有無、又はバイオテクノロジーにおける遺伝子増幅等に利用することができる。
【図１】
2011239745.tif 000002
【図２】
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