(57)【要約】【課題】容易に合成できるペプチドを有効成分として含有し、副作用のない血管内皮細胞の遊走阻害剤を提供することを目的とする。【解決手段】血管内皮細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、及び、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕから選択される１以上のペプチドを有効成分として含有する。【選択図】図１
2011042608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、及び、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕから選択される１以上のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞の遊走阻害剤。
【請求項２】
ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦに起因する血管内皮細胞の遊走を阻害することを特徴とする請求項１に記載の血管内皮細胞の遊走阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを有効成分とする血管内皮細胞の遊走阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌等の種々の病気においては、血管新生が病状の悪化、進行に関与している。このため、このような病気の進行を抑えるために、患者に血管新生抑制薬剤を投与することが有効であると考えられている。
【０００３】
例えば、血管新生が関与して進行していく病気として子宮内膜症がある。この子宮内膜症の患者に血管新生抑制剤を投与すると、血管新生を抑制し病状の悪化の抑制効果、或いは、改善効果があるものの、性周期や排卵に対して副作用が生じることが判明している。
【０００４】
一方で、血管新生抑制タンパク質・ペプチドは、これらの副作用を起こさないことが動物実験で確認されており、タンパク質・ペプチドによる子宮内膜症治療は最も安全で有効な方法であると考えられている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「Ｓｈｏｒｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ」；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｍ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．ｄ．，Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｓａｒａｈ  Ｍ．Ｓｈｏｒｔ，Ｐｈ．Ｄ．，Ｋａｓｈｉ  Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ，Ｐｈ．Ｄ．，Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｍａｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｄ’Ａｍａｔｏ，Ｍ．Ｄ．；Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｖｏｌ．８５，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に開示されているペプチドは、アミノ酸残基が２４残基〜２８残基であり、残基数が多く、ペプチドの合成を容易に行うことが困難である。
【０００７】
また、タンパク質は、その作製に手間がかかる上、組織での透過性、安定性や純度などに問題がある。
【０００８】
本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、容易に合成できるペプチドを有効成分として含有し、血管新生を抑制し得る、副作用のない血管内皮細胞の遊走阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、
アミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、及び、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕから選択される１以上のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
また、好ましくは、ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦに起因する血管内皮細胞の遊走を阻害することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、６残基或いは９残基のアミノ酸配列であるペプチドを有効成分としている。アミノ酸配列が短いので、ペプチドを容易に合成することができる。また、有効成分がペプチドであるので、子宮内膜症等の患者に投与しても副作用が生じないという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１におけるＶＥＧＦ誘導によるＨＵＶＥＣ遊走へのペプチドの影響を示す図である。
【図２】実施例２におけるＶＥＧＦ誘導によるＨＵＶＥＣ遊走へのペプチドの影響を示す図である。
【図３】実施例３における吸光度の測定結果である。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、実施例４における管腔形成に対するペプチドの影響を示す撮影図である。
【図５】実施例４における管腔の長さの測定結果である。
【図６】実施例５におけるｂＦＧＦ誘導によるＨＵＶＥＣ遊走に対するペプチドの影響を示す図である。
【図７】実施例６におけるＶＥＧＦ誘導によるＨＵＶＥＣ遊走に対するペプチドの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本実施の形態に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、及び、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕから選択される１以上のペプチドを有効成分として含有している。
【００１４】
血管新生のプロセスにおいて、血管内皮細胞が特定の方向へ遊走することになるが、上記のペプチドは、この血管内皮細胞の遊走を特異的に阻害することで、結果的に血管新生を抑制することになる。
【００１５】
また、通常、癌細胞等が分泌する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ））や塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ））等の血管増殖因子によって、血管内皮細胞の遊走が惹起されるが、上記のペプチドはＶＥＧＦ、ｂＦＧＦいずれの血管増殖因子に起因する血管内皮細胞の遊走をも阻害する。
【００１６】
また、本実施の形態に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、上記のペプチドを有効成分としているので、例えば、子宮内膜症の患者に投与しても、性周期や排卵に対して副作用が起こらない。
【００１７】
このように、これらのペプチドは血管内皮細胞の遊走を阻害することにより、血管新生を抑制することができるので、これらのペプチドを含有する血管内皮細胞の遊走阻害剤は、血管新生が関与する癌や子宮内膜症等、種々の病気の治療等に有効である。
【００１８】
そして、上述のペプチドは、それぞれアミノ酸残基が６残基或いは９残基と、非特許文献１にて報じられているペプチドのアミノ酸残基（２４残基〜２８残基）に比べて非常に短い。
【００１９】
アミノ酸残基が短いので、ペプチドの合成工程が少なく、容易に合成することができる。そして、合成工程が少ないことから、高い収率で合成することができる。
【００２０】
なお、これらのペプチドは、公知の有機合成化学的な合成方法、遺伝子工学的な合成方法等によって、上記の配列になるよう合成すればよい。
【００２１】
本実施の形態に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤の投与は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤などによる経口投与、あるいは静脈注射、筋肉注射などの注射剤、坐剤、経皮などによる非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００２２】
血管内皮細胞の遊走阻害剤を非経口投与のための注射剤として用いる場合、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤などに上述したペプチドを添加して用いればよい。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水などが挙げられる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類などが挙げられる。
【００２３】
血管内皮細胞の遊走阻害剤を経口投与のための固体組成物として用いる場合、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などの形態とすることができる。このような固体組成物は、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸、アルミン酸マグネシウムなどの不活性な希釈剤を、有効成分としてのペプチドと混合して調製することができる。
【００２４】
血管内皮細胞の遊走阻害剤を経口投与のための液体組成物として用いる場合、薬理上許容される乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有してもよい。
【実施例１】
【００２５】
アミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであるペプチド（以下、ペプチド１と記す）がヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（以下、ＨＵＶＥＣと記す）の遊走を阻害するかを検証した。
【００２６】
基礎培地（０．１％牛血清アルブミンを含むＭ１９９培地）に、懸濁したヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を入れ、これを、ゼラチン処理したインサート膜（ポアサイズ８μｍの膜）に４００μｌ入れた。
【００２７】
基礎培地（０．１％牛血清アルブミンを含むＭ１９９培地）に、１０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（以下、ＶＥＧＦと記す）を入れた誘導培地を調製した。そして、この誘導培地に、ペプチド１を添加した。誘導培地は、ペプチド１が２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭの培地をそれぞれ調製した。
【００２８】
２４ｗｅｌｌ培養プレートに、それぞれの誘導培地を４００μｌ入れ、上記のインサートを置いた。
【００２９】
それぞれについて、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養を行った。この培養において、ＨＵＶＥＣの遊走が生じると、ＨＵＶＥＣはインサート膜上部（基礎培地側）からインサート膜下部（誘導培地側）へと移動することになる。
【００３０】
なお、参考例として、上記の誘導培地をそのまま用いて上記同様にＨＵＶＥＣの培養を行った（以下、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌと記す）。更に、参考例として、上記誘導培地の代わりに、上記の基礎培地を用いて上記同様にＨＵＶＥＣの培養を行った（以下、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌと記す）。
【００３１】
培養後、それぞれのインサート膜上部のＨＵＶＥＣを綿棒で除去し、インサート膜下部に移動してきたＨＵＶＥＣを染色した。そして、それぞれのインサート膜の任意の３点を選び、顕微鏡（倍率：２００）で観察することによって、遊走した細胞数を計測した。なお、培養時間が６時間と短いため、ＨＵＶＥＣの増殖は生じないと考えられるので、ここでは細胞増殖については考慮しない。
【００３２】
その結果を図１に示す。図１は、ＶＥＧＦ誘導によるＨＵＶＥＣ遊走へのペプチドの影響を示しており、それぞれ、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＣｏｎｔｒｏｌにおけるＨＵＶＥＣの遊走細胞数を１００とした相対値を表している。
【００３３】
誘導培地のペプチド１の濃度が高くなるに従って、大凡ＨＵＶＥＣの細胞数が少なくなっていることがわかる。したがって、ペプチド１によってＨＵＶＥＣの遊走が阻害されることを立証した。
【実施例２】
【００３４】
アミノ酸配列がＴｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕであるペプチド（以下、ペプチド２と記す）がＨＵＶＥＣの遊走を阻害するかを検証した。
【００３５】
基礎培地（０．１％牛血清アルブミンを含むＭ１９９培地）に、懸濁したヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を入れ、これを、ゼラチン処理したインサート膜（ポアサイズ８μｍの膜）に４００μｌ入れた。
【００３６】
基礎培地（０．１％牛血清アルブミンを含むＭ１９９培地）に、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを入れた誘導培地を調製した。そして、この誘導培地に、ペプチド２を添加した。誘導培地中のペプチド２の濃度が、それぞれ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなるように調製した。
【００３７】
２４ｗｅｌｌ培養プレートに、それぞれの誘導培地を４００μｌ入れ、上記のインサートを置いた。
【００３８】
それぞれについて、ＣＯ２インキュベーター中で６時間培養を行った。
【００３９】
なお、参考例として、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、及び、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌについても実施例１と同様に行った。
【００４０】
培養後、それぞれについて、実施例１と同様の手法にて、遊走した細胞数を計測した。
【００４１】
その結果を図２に示す。誘導培地のペプチド２の濃度が高くなるに従って、ＨＵＶＥＣの細胞数が少なくなっていること、即ち、ペプチド２がＨＵＶＥＣの遊走を阻害したことがわかる。このように、ペプチド２によっても、ＨＵＶＥＣの遊走が阻害されることを立証した。
【実施例３】
【００４２】
ペプチド１及びペプチド２のＨＵＶＥＣ増殖への影響について実験を行った。
【００４３】
ＨＵＶＥＣが１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように、専用培地（ＨｕＭｅｄｉａＥＧ−２）に懸濁し、９６ｗｅｌｌ培養プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した。
【００４４】
細胞が付着した後、専用培地を各ペプチド１００μＭ含有させたそれぞれの専用培地に交換し、ＣＯ２インキュベーター中で７２時間培養を行った。
【００４５】
また、参考例として、いずれのペプチドも含有しない専用培地に交換し、ＣＯ２インキュベーター中で７２時間培養を行った（以下、Ｃｏｎｔｒｏｌと記す）。
【００４６】
培養後、それぞれについて、ＷＳＴ−１試薬による発色法により、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定することで、ＨＵＶＥＣ増殖への影響を検討した。
【００４７】
それぞれの吸光度の測定結果を図３に示す。Ｃｏｎｔｒｏｌに比べて、ペプチド１を含有させた専用培地で培養したＨＵＶＥＣではやや細胞数が減少している。また、ペプチド２を含有させた専用培地で培養したＨＵＶＥＣは若干の細胞数の増加がみられる。この結果から、ペプチド１及びペプチド２は、ＨＵＶＥＣの増殖にはさほど影響を与えていないと考えられる。
【実施例４】
【００４８】
ペプチド１及びペプチド２のＨＵＶＥＣ管腔形成への影響について実験を行った。
【００４９】
９６ｗｅｌｌ培養プレートのｗｅｌｌに、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコートした。ＨＵＶＥＣを１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように専用培地（ＨｕＭｅｄｉａＥＧ−２）に懸濁し、これに各ペプチドを１００μＭ加えたものをそれぞれ準備した。
【００５０】
上記培養プレートに、各ペプチドを加えたそれぞれの専用培地を用いてＨＵＶＥＣを１００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ２インキュベーター中で１８時間培養した。
【００５１】
また、参考例として、ペプチドを加えない専用培地を用いて上記同様にＨＵＶＥＣの培養を行った。
【００５２】
培養後、それぞれの管腔形成の様子を倒立顕微鏡下で撮影し、画像処理により管腔の長さを測定し、各ペプチドによるＨＵＶＥＣの管腔形成への影響を検討した。
【００５３】
その撮影図を図４に、また、管腔の長さの測定結果を図５に示す。図４（Ａ）がＣｏｎｔｒｏｌ、図４（Ｂ）がペプチド１を添加した専用培地にて培養した管腔形成の様子の撮影図、図４（Ｃ）がペプチド２を添加した専用培地にて培養した管腔形成の様子の撮影図である。いずれの撮影図を比べても管腔形成の様子に大きな差異は見られない。
【００５４】
また、図５の管腔の長さの測定結果を見ても、管腔の長さはいずれの培地で培養した場合でもほとんど変わらないことがわかる。したがって、ペプチド１及びペプチド２は、管腔形成にほとんど影響を与えていないと考えられる。
【００５５】
以上の実施例１、２、３、及び、４の結果から、ペプチド１及びペプチド２は、ＨＵＶＥＣの増殖、及び、管腔形成にはほとんど影響を与えず、ＨＵＶＥＣの遊走を特異的に阻害することが確認できる。
【実施例５】
【００５６】
実施例１及び実施例２では、ＨＵＶＥＣの遊走を起因する細胞増殖因子としてＶＥＧＦを用いたが、他の細胞増殖因子でもＨＵＶＥＣの遊走が阻害されるか否か検証した。
【００５７】
ＶＥＧＦの代わりにｂＦＧＦを用い、実施例１と同様にして、ペプチド１を１００μＭ含有する誘導培地にてＨＵＶＥＣの培養を行った。また、ＶＥＧＦの代わりにｂＦＧＦを用い、実施例２と同様にして、ペプチド２を１００μＭ含有する誘導培地にてＨＵＶＥＣの培養を行った。更に、参考例として、実施例１及び２における参考例と同様に、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、及び、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌについても行った。
【００５８】
その結果を図６に示す。ペプチド１及びペプチド２をそれぞれ含有する誘導培地を用いて培養した場合、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌに比べて、インサート膜を通過したＨＵＶＥＣの細胞数が少ないことがわかる。ペプチド１及びペプチド２は、ＶＥＧＦだけではなく、ｂＦＧＦに起因するＨＵＶＥＣの遊走をも阻害することが確認できた。
【実施例６】
【００５９】
続いて、ペプチド２のＣ末端の３アミノ酸残基を除いたＴｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（以下、ペプチド２ｎ）、及び、ペプチド２のＮ末端の３アミノ酸残基を除いたＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（以下、ペプチド２ｃ）のＨＵＶＥＣ遊走への影響について検証した。
【００６０】
ペプチド１及びペプチド２の代わりに、ペプチド２ｎ及びペプチド２ｃを用いた以外は、実施例１及び実施例２と同様にして培養を行った。なお、誘導培地中のペプチド２ｎ及びペプチド２ｃの濃度は、それぞれ２００μＭとした。また、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、及び、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌについても、実施例１と同様に行った。そして、実施例１及び実施例２と同様の手法にて、それぞれ培養したＨＵＶＥＣの細胞数を計測した。
【００６１】
その結果を図７に示す。ペプチド２ｎ、及び、ペプチド２ｃは、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌに比べて、インサート膜を通過したＨＵＶＥＣの細胞数が少ないことがわかる。したがって、ペプチド２ｎ、及び、ペプチド２ｃは、いずれもＨＵＶＥＣの遊走を阻害することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
血管内細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、及び、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕから選択される１以上のペプチドを有効成分として含有している。これらのペプチドは、血管内皮細胞の遊走を阻害する機能を備えている。これらのペプチドが血管内細胞の遊走を阻害することで、血管新生抑制作用を奏するので、血管新生が関与する癌や子宮内膜症等、種々の病気の治療等に用いることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図４】
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