(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチドの製造法の提供。【解決手段】以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質、該蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるか、または該蛋白質を発現する形質転換体を培養することによる、ペプチドの製造法。[１]特定のアミノ酸配列を有する蛋白質。[２]特定のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質。[３]特定のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
ＡＴＰがポリリン酸キナーゼによって供給されるＡＴＰであることを特徴とする請求項１記載の製造法。
【請求項３】
以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
【請求項４】
形質転換体が、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたものであることを特徴とする請求項３記載のペプチド製造法。
[１]  配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
[２]  配列番号１または３で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[３]  配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
ＡＴＰがポリリン酸キナーゼによって生成されるＡＴＰであることを特徴とする請求項３または４記載の製造法。
【請求項６】
以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中より該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１]  配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
【請求項７】
形質転換体が、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたものであることを特徴とする請求項６記載のペプチド製造法。
[１]  配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
[２]  配列番号１または３で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[３]  配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、または該蛋白質を発現する形質転換体を用いたペプチドの製造法に関する。該蛋白質は遊離のアミノ酸を基質としてペプチドを合成することができる。
【背景技術】
【０００２】
L-アミノ酸リガーゼ（Lal, EC 6.3.2.28）は保護基を持たない遊離のアミノ酸を基質として、ＡＴＰの加水分解反応と共役することでペプチドを合成可能な微生物由来酵素である（非特許文献１および２）。
【０００３】
Lal遺伝子を発現する組換え微生物を用いることで、ペプチドを発酵法によって合成することも可能であることから（非特許文献３）、Lalは工業的にも非常に有用性の高い酵素であるといえ、これまで数種類のLalの報告がある（非特許文献４〜７）。しかしながら、Lalの基質特異性によって、蛋白質を構成するアミノ酸20種から組み合わされる400種のジペプチドすべてを効率よく製造することができるわけではない。
【０００４】
タブトキシン（Tabtoxin）は、シュードモナス・シリンジ（Pseudomonas syringae）由来の植物病原ペプチドとして知られている化合物であり、P. syringe  BR2株ではTabtoxin生合成クラスターも特定されている（非特許文献８）。しかしながら、各遺伝子産物がどのような機能を担っているかは知られておらず、またこのクラスター中にL-アミノ酸リガーゼが含まれているかもわかっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Bacteriology, 81, 13-22 (2008)
【非特許文献２】J. Bacteriology, 187, 5195-5202 (2005)
【非特許文献３】Appl. Environ. Microbiol., 73, 6378-6285 (2007)
【非特許文献４】Biosci. Biotechnol. Biochem., 273, 901-907 (2009)
【非特許文献５】Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 3048-3050 (2008)
【非特許文献６】J. Biosci. Bioeng., 106, 313-315 (2008)
【非特許文献７】Biochem. Biophys. Res. Commun., 371, 536-540 (2008)
【非特許文献８】J. Antibiot. 58, 817-821 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ペプチド合成活性を有する蛋白質を酵素源に用いたペプチドの製造法、該ペプチド合成活性を有する蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたペプチドの製造法および該蛋白質を発現する形質転換体を培養することによるペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（８）に記載の方法に関する。
（１）以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（２）ＡＴＰがポリリン酸キナーゼによって生成されるＡＴＰであることを特徴とする上記（１）の製造法。
（３）以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（４）形質転換体が、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたものであることを特徴とする上記（３）のペプチド製造法。
[１]  配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
[２]  配列番号１または３で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[３]  配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（５）ＡＴＰがポリリン酸キナーゼによって生成されるＡＴＰであることを特徴とする上記（３）または（４）の製造法。
（６）以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中より該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（７）形質転換体が、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたものであることを特徴とする上記（３）のペプチド製造法。
[１]  配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
[２]  配列番号１または３で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[３]  配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、遊離のアミノ酸を基質に用いてペプチドを効率よく製造する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
1.本発明の製造法で用いられる蛋白質
本発明の製造法で用いられる蛋白質としては、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
[１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
【００１０】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００１１】
欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００１２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００１３】
アミノ酸残基の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１０アミノ酸残基をあげることができる。
【００１４】
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００１５】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
【００１６】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００１７】
また、ペプチド合成活性を有する蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ他のタブトキシン生合成クラスターにコードされる蛋白質と共同してタブトキシンを合成する活性を有する蛋白質をあげることができる。
【００１８】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）。
【００１９】
本発明においてペプチド合成活性とは、アミノ酸を基質とし、アデノシン−５´−三リン酸（以下、ＡＴＰと略す）を利用してペプチドを生成する活性をいい、好ましくはL-アミノ酸、グリシンまたはペプチドのＣ末端を、L-アミノ酸、グリシンまたはペプチドのＮ末端に結合する反応によりペプチドを生成する活性をいう。
【００２０】
本発明の製造法で用いられる蛋白質が、ペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いてペプチド合成活性を有する蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を精製した後、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
【００２１】
２．本発明の製造法に用いられるＤＮＡ
本発明の製造法に用いられるＤＮＡとしては、
［４］配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［５］配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の相同性を有し、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［６］配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。
【００２２】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いられるＤＮＡとしては少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
【００２３】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００２４】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mmol/Lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/Lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/Lの塩化ナトリウム、0.2mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/LのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより、上記した様々な条件を設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加には、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００２６】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記した［４］に記載のＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００２７】
塩基配列の相同性は、上記したBLASTまたはFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
【００２８】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、並びに１種以上のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
【００２９】
３．本発明の製造法に用いられる形質転換体
本発明の製造法に用いられる形質転換体としては、本発明の製造法に用いることができる限り、形質転換体であれば特に限定されないが、上記[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体、および上記［４］〜[６]のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。宿主細胞としては、細菌等の原核生物をあげることができ、好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物をあげることができる。
【００３０】
４．本発明の製造法で用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法で用いられるＤＮＡは、配列番号１または３で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブやプライマーを用い、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、好ましくはシュードモナス・シリンジ（Pseudomonas syringe）、より好ましくはP. syringe NBRC14081株の染色体に対するサザンハイブリダイゼーション、または染色体を鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]等の手法により取得することができる。
【００３１】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１または３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。
【００３２】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００３３】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【００３４】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００３５】
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
【００３６】
本発明の製造法で用いられるＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
【００３７】
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。
【００３８】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
【００３９】
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/ pTABSをあげることができる。
【００４０】
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体の製造法
本発明で用いられるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００４１】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
【００４２】
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
【００４３】
宿主細胞としては、細菌等の原核生物であればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４４】
形質転換体の取得に用いる組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４５】
発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pHelix1（いずれもロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48,669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００４６】
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４７】
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
【００４８】
また、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００４９】
本発明のＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００５０】
原核生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・���ルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.）ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができる。
【００５１】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
【００５２】
また、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことにより、ペプチド合成活性を有する蛋白質を発現する形質転換体を取得することもできる。
【００５３】
ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込む方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができ、宿主、すなわち親株としてE. coliを用いる場合にはProc. Natl. Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)に記載の方法をあげることができる。
【００５４】
６．本発明のペプチドの製造法
（１）ペプチド合成活性を有する蛋白質の取得
上記１．のペプチド合成活性を有する蛋白質は、上記５．の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物から該蛋白質を単離することにより取得することができる。
形質転換体の培養は、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える天然培地または合成培地培を用いて培養することができる。
【００５５】
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、キシロース、アラビノースこれらを含有する糖蜜、セルロース系バイオマスの糖化液、グリセロール、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００５６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００５７】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００５８】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５９】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターを有する形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターを有する形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターを有する形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６１】
上記１．の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
【００６２】
上記１．の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)] 、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288（1990)] 、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、上記１．の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００６３】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、該蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００６４】
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００６５】
該形質転換体を用いて製造された上記１．のペプチド合成活性を有する蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
【００６６】
例えば、該蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【００６７】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF（GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００６８】
また、上記１．の蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
【００６９】
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００７０】
上記１．の蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
【００７１】
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００７２】
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
【００７３】
また、上記１の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288 （1990)] 、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、上記１．の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７４】
また、上記１．の蛋白質をFlagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288（1990)] や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００７５】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００７６】
（２）上記１．の蛋白質を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として上記１の蛋白質を用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸、より好ましくは２種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ましくはL-アミノ酸、グリシン（Gly）およびβ-アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-アラニン（L-Ala）、L-グルタミン（L-Gln）、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-バリン（L-Val）、L-ロイシン(L-Leu)、L-イソロイシン(L-Ile)、L-プロリン（L-Pro）、L-フェニルアラニン(L-Phe)、L-トリプトファン（L-Trp）、L-メチオニン（L-Met）、L-セリン（L-Ser）、L-スレオニン（L-Thr）、L-システイン（L-Cys）、L-アスパラギン（L-Asn）、L-チロシン（L-Tyr）、L-リジン（L-Lys）、L-アルギニン（L-Arg）、L-ヒスチジン（L-His）、L-アスパラギン酸（L-Asp）、L-ホモアルギニン(L-HomoArg)、L-α-アミノ酪酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリンおよびL-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシンなどをあげることができる。
【００７７】
上記製造法に用いられる、好ましいアミノ酸としては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaをあげることができる。
【００７８】
より好ましいアミノ酸としては、L-CysとL-MetまたはL-Leuとの組合せ、L-MetとL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-ValとL-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-LeuとL-Ala、L-Gln、L-Leu、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-IleとL-Ala、L-Gln、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-AlaとL-Ala、L-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Arg、L-His、L-Aspおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、GlyとL-Pro、L-PheまたはL-Trpとの組合せ、L-SerとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-ArgおよびL-Hisから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-ThrとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-ArgとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-LysとL-TrpまたはL-Pheの組合せ、L-HisとL-Gln、L-Phe、L-TrpおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-GlnとL-Pro、L-Phe、L-Trp、L-AsnおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-AsnとL-Pro、L-PheまたはL-Trpとの組合せ、L-AspとL-Trpとの組合せ、L-ProとL-Pro、L-Phe、L-Trpおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-TrpとL-Pro、L-Phe、L-Trpまたはβ-Alaとの組合せ、L-PheとL-PheまたはL-Tyrとの組合せ、並びにβ-Alaのみをあげることができる。 
【００７９】
さらに好ましいアミノ酸としてはL-AlaとL-Proの組合せ、L-LeuとL-Proの組合せ、L-ValとL-Proの組合せ、L-Proのみ、およびL-Pheとβ-Alaの組合せをあげることができる。
【００８０】
上記製造法において、ペプチド合成活性を有する蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。
【００８１】
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
【００８２】
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。
【００８３】
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
【００８４】
ペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
【００８５】
上記方法で製造されるペプチドとしては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、好ましくはL-CysとL-Met、L-MetとL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-ValとL-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-LeuとL-Ala、L-Gln、L-Leu、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-IleとL-Ala、L-Gln、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-AlaとL-Ala、L-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Arg、L-His、L-Aspおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、GlyとL-Pro、L-PheまたはL-Trp、L-SerとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-ArgおよびL-Hisから選ばれるアミノ酸、L-ThrとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-ArgとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-LysとL-TrpまたはL-Phe、L-HisとL-Gln、L-Phe、L-TrpおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸、L-GlnとL-Pro、L-Phe、L-Trp、L-AsnおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸、L-AsnとL-Pro、L-PheまたはL-Trp、L-AspとL-Trp、L-ProとL-Pro、L-Phe、L-Trpおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-TrpとL-Pro、L-Phe、L-Trpまたはβ-Ala、L-PheとL-PheまたはL-Tyr、並びにβ-Ala同士がペプチド結合で連結したジペプチド、３つのL-Leuがペプチド結合で連結したトリペプチド、３つのL-Metがペプチド結合で連結したトリペプチド、２つのL-LeuとL-Met、L-Arg、L-Ala、L-Lys、L-His、L-ProおよびL-Pheから選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したトリペプチド、２つのL-PheとL-Leuがペプチド結合で連結したトリペプチドをあげることができる。
【００８６】
さらに好ましくは、L-AlaとL-Pro、L-LeuとL-Pro、L-ValとL-Pro、L-Proのみ、およびL-Pheとβ-Alaがペプチド結合で連結したジペプチドをあげることができる。
【００８７】
より具体的には、上記方法で製造法されるペプチドとしてはL-Pro-L-Ala、L-Pro-L-Leu、L-Pro-L-Val、L-Pro-L-Pro、L-Ala-L-Ala、L-Leu-L-Leuおよびβ-Ala-L-Pheをあげることができる。
【００８８】
（３）形質転換体の培養物または培養物の処理物を酵素源として用いるペプチドの製造法
上記１．の蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体からペプチドを単離することにより、ペプチドを製造することができる。
【００８９】
本発明の製造法において酵素源として用いられる形質転換体の培養物としては、該形質転換体を上記（１）の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。
【００９０】
形質転換体の培養物または培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（２）と同様のアミノ酸をあげることができる。
【００９１】
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。
【００９２】
基質として用いるアミノ酸は、上記（２）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（２）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
【００９３】
ＡＴＰは、ポリリン酸キナーゼを上記水性媒体中に共存させることによっても供給することができる。ポリリン酸キナーゼ活性は、該活性を有する蛋白質であればその由来、調製方法などは問わないが、例えばAgric. Biol. Chem., 52(6), 1471-1477 (1988)、Biotech. Appl. Biochem., 10, 107-117 (1988)、Biotech. Appl. Biochem., 15, 125-133 (1992)、J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (1992)などに記載の細菌由来のポリリン酸キナーゼをあげることがでる。
【００９４】
ＡＴＰは、上記のポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、および反応の初発にポリリン酸キナーゼの反応が開始する程度の少量のＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰを水性媒体中に存在させることにより、ＡＤＰからＡＴＰを再生する反応が進行し、反応系にＡＴＰを供給し続けることができる。
【００９５】
またポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸キナーゼを生産する微生物の培養物、または該培養物の処理物そのものを酵素源として用いることもできる。微生物の培養法、培養物の処理物は上記と同じである。
【００９６】
水性媒体としては、上記（２）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
【００９７】
ペプチドの生成反応の反応条件は、上記（２）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるペプチドとしては、上記（２）と同様のペプチドをあげることができる。
【００９８】
（４）形質転換体を培養することによるペプチドの製造法
上記１．の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中より該ペプチドを採取することによりペプチドを製造することができる。
【００９９】
形質転換体の培養は、上記（１）と同様に行うことができる。
１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体は、該形質転換体の元である宿主細胞が１種以上のアミノ酸を生産する能力を既に有していれば、該形質転換体をそのまま培養することでペプチドを製造することができる。
【０１００】
該宿主細胞がアミノ酸を生産する能力を有していない場合は、宿主細胞に１種以上のアミノ酸を生産する能力を人為的に付与する、または上記１．の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られた形質転換体に１種以上のアミノ酸を生産する能力を付与することにより、上記製造法で用いられる上記１．の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を取得することができる。
【０１０１】
１種以上のアミノ酸としては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびGlyから選ばれる１種以上のアミノ酸をあげることができる。
【０１０２】
アミノ酸を生産する能力を人為的に付与する方法としては、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
【０１０３】
上記（ａ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに、上記（ｂ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに、上記（ｃ）については、例えばAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに、上記（ｄ）については、例えばAppl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに、上記（ｅ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
【０１０４】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、または組み合わせた方法によるアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
【０１０５】
上記方法によって調製することができるアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、例えばＬ−アラニン生産菌として、アラニン脱水素酵素遺伝子（ald遺伝子）の発現が強化された微生物、Ｌ−プロリン生産微生物として、フェニルアラニンの脱感作型pheA遺伝子および／またはチロシンの脱感作型aroF遺伝子を発現する微生物などをあげることができる。
【０１０６】
上記したアミノ酸を生成、蓄積する微生物としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法が適用することができる微生物または上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
【０１０７】
原核生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）等をあげることができ、好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
【０１０８】
アミノ酸を生産する微生物の具体例としては、Ｌ−アラニン生産株としてald遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ JM101株など、Ｌ−フェニルアラニン生産株として脱感作型pheA遺伝子および／またはaroF 遺伝子発現プラスミドを保有するエシェリヒア・コリ JM101株などをあげることができる。
【０１０９】
Ｌ−バリン生産株としてATCC13005およびATCC19561など、Ｌ−ロイシン生産株としてFERM BP-4704およびATCC21302など、Ｌ−アラニン生産株としてFERM BP-4121およびATCC15108など、Ｌ−プロリン生産株としてFERM BP-2807およびATCC19224などをあげることができる。なお、上記のFERM番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ATCC番号で表される菌株は、American Type Culture Collection（米国）からそれぞれ入手することができる。
【０１１０】
上記（２）〜（４）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【０１１１】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においてペプチドおよびアミノ酸のHPLCによる分析、定量、およびLC-ESI-MSによる解析は以下に示す方法により行った。
【０１１２】
（１）HPLC解析
ペプチドおよびアミノ酸は、１−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミドナトリウム（Ｎα−ＦＤＡＡ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。Ｎα−ＦＤＡＡを用いた誘導体化は、純水で希釈した試料100μlに、50μlの0.5％のＮα−ＦＤＡＡアセトン溶液と40μlの0.5mol/lの炭酸ナトリウム水溶液を加えて攪拌した後、40℃で60分間静置することにより行った。
【０１１３】
次に、40μlの1mol/lの塩酸と770μlのメタノールを加えて攪拌したものを、ＦＤＡＡ化試料とした。
【０１１４】
該ＦＤＡＡ化試料を、ＷＨ−Ｃ１８Ａカラム(日立サイエンスシステムズ、4×150mm)を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、下記の条件を用いた。
【０１１５】
移動相には、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が90:5:5の移動相Ａ、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が60:35:5の移動相Ｂ、アセトニトリルとテトラヒドロフランおよび水の混合比が3：1：3の移動相Ｃを用いた。移動相の流速は0.5ml/min、移動相Ａと移動相Ｂおよび移動相Ｃの混合比は、0〜24分は100:0:0から55:45:0への勾配、24〜30分は55:45:0の一定、30〜50分は55:45:0から0:100:0への勾配、50〜55分は0:100:0の一定で、55〜60分は0:100:0から0:0:100への勾配、60〜62分は0:0:100の一定、62〜62.1分は0:0:100から100:0:0への勾配、62.1〜80分は100:0:0の一定に変化させた。カラム温度は40℃、340nmの紫外吸収を測定した。
【０１１６】
（２）LC-ESI-MS解析
HPLCの分離カラムにSunFire C18カラム（Waters、4.6×150mm）を用い、ESI-MSとしてLCQ Deca（Thermo Scientific）を組み合わせたシステムによってサンプルを分析した。
【０１１７】
移動相には、50mmol/lのギ酸溶液（移動相A）、およびアセトニトリル（移動相B）を用いた。移動相の流速は1.0ml/min、移動相Ａと移動相Ｂの混合比は、0〜2分は100:0の一定、2〜9分は、100:0から0:100への勾配、9〜15分は0:100の一定、15〜15.1分は0:100から100:0への勾配、15.1〜20分は100:0の一定に変化させた。
【０１１８】
[実施例１]
ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのクローニングと該蛋白質を発現する形質転換体の作製
独立行政法人  製品評価技術基盤研究所  生物遺伝資源部門（NRBC）より、Pseudomonas syringe NBRC 14801株を入手し、その染色体ＤＮＡを公知の方法で抽出した。
【０１１９】
配列番号４および５で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットに用い、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを取得した。
【０１２０】
該ＤＮＡおよびpET28a(+)を、NdeIおよびEcoRIで消化した後、ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。得られた連結ＤＮＡを用いて、Escherichia coli BL21 (DE3)を形質転換し、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する形質転換株を取得した。該組換え体ＤＮＡをpTABS、該形質転換体をE. coli BL21(DE3)/pTABSとそれぞれ命名した。
【０１２１】
[実施例２]
ペプチド合成活性を有する蛋白質の取得
E. coliBL21(DE3)/pTABSを25μg/mlのカナマイシンを含有するLB液体培地で、37℃、120rpmで1〜2時間培養した後、終濃度が0.1mmol/lになるようにIPTGを添加して、25℃、120rpmで16時間培養した。
【０１２２】
培養物を遠心分離して菌体を集菌して100mmol/lのTris-HCl緩衝液に懸濁した後、菌体を超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離により菌体残渣を除去し、上清を無細胞抽出液として回収した。該抽出液をNi-アフニティーカラム（GEヘルスケア社製）に通塔して精製後、PD-10カラム（GEヘルスケア社製）を用いて脱塩し、精製蛋白質を取得した。本精製蛋白質をTabSと命名した。
【０１２３】
[実施例３]
ペプチドの製造
（１）L-Pro-L-Alaの製造
L-Pro  100mmol/l、L-Ala  20mmol/l、ATP  50mmol/l、MgSO4  25mmol/l、TabS  0.5mg/ml、Tris HCl  100mmol/l（pH 9）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド合成反応を行った。反応液上清を上記したHPLCの条件で分析し、L-Pro-L-Ala  6.3mmol/l、L-Pro-L-Pro 0.4mmol/l、L-Ala-L-Ala 0.6mmol/lの生成を確認した。 
【０１２４】
（２）L-Pro-L-Leuの製造
L-AlaをL-Leuに変えた以外は、上記（１）と同条件でペプチド合成反応を行い、同じ方法で反応液を分析した。その結果、L-Pro-L-Leu 9.4mmol/l、L-Leu-L-Leu  1.0mmol/lの生成を確認した。
【０１２５】
（３）L-Phe-β-Alaの製造
L-Phe  40mmol/l、β-Ala  40mmol/l、ATP  50mmol/l、MgSO4  25mmol/l、TabS  0.5mg/ml、Tris HCl  100mmol/l（pH 9）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド合成反応を行った。反応液上清を上記したHPLCの条件で分析し、L-Phe-β-Ala  0.12mmol/lの生成を確認した。
【０１２６】
（４）各種ペプチドの製造
アミノ酸１  12.5mmol/l、アミノ酸２  12.5mmol/l、ATP  12.5mmol/l、MgSO4  12.5mmol/l、TabS  0.1mg/ml、Tris HCl  100mmol/l（pH 8.0）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド合成反応を行った。アミノ酸１および２は、それぞれ表１中にアミノ酸１およびアミノ酸２として示す各アミノ酸である。反応終了後、それぞれの反応上清を上記したLC-ESI-MSで分析した。結果を表１に示す。
【０１２７】
表中のグレーで示したアミノ酸の組合せでペプチド合成反応を行った場合、上記システムにおいてジペプチドに相当するピークを検出した。
【０１２８】
【表１】
2011239707.tif 000002
【０１２９】
（５）L-Leu、およびL-Metを含むトリペプチドの製造
上記（４）において、アミノ酸１としてL-Leu、アミノ酸２としてL-Met、L-Arg、L-Ala、L-Lys、L-His、L-ProまたはL-Pheを用いた場合、L-Leu-L-Leu-L-Leu、L-Met-L-Met-L-Met、並びに２つのL-LeuとL-Met、２つのL-LeuとL-Arg、２つのL-LeuとL-Ala、２つのL-LeuとL-Lys、２つのL-LeuとL-His、２つのL-LeuとL-Pro、２つのL-LeuとL-Phe、および２つのL-PheとL-Leuからなるトリペプチドに相当するピークを検出した。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明を用いることにより、ペプチドを効率よく製造することが可能となった。
【配列表】
2011239707000001.app