(57)【要約】【課題】簡便で正確に、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなくＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、ＡＰＴＴ測定試薬、及びそれを用いたＡＰＴＴ測定方法を提供する。簡便で正確に、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく血液凝固抑制物質の有無を判定する方法を提供する。【解決手段】本発明の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬は、リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン中和剤を含む活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項２】
リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、
ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬と、
を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項３】
ヘパリン中和剤がポリブレンである請求項１又は２に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項４】
カルシウム塩が塩化カルシウムである請求項２又は３に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項５】
活性化剤がエラグ酸、コロイダルシリカ、及び無水ケイ酸の少なくとも一つである請求項２〜４のいずれか１項に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項６】
リン脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルグリセロールの少なくとも一つである請求項２〜５のいずれか１項に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項７】
被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む試薬とを混合した後に、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定するために用いられる試薬であって、
ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含有する試薬。
【請求項８】
ヘパリン中和剤がポリブレンである請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、
第１混合工程で得られた試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、
第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程と、
を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法。
【請求項１０】
ヘパリン中和剤がポリブレンである請求項９に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法。
【請求項１１】
カルシウム塩が塩化カルシウムである請求項９又は１０に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法。
【請求項１２】
活性化剤がエラグ酸、コロイダルシリカ、及び無水ケイ酸の少なくとも一つである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法。
【請求項１３】
リン脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルグリセロールの少なくとも一つである請求項９〜１２のいずれか１項に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法。
【請求項１４】
血液凝固抑制物質の存在が疑われる被検血漿及び正常血漿を、少なくとも３つの異なる割合で混合し測定試料を調整する調整工程と、
調製工程で得られたそれぞれの測定試料とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、
第1混合工程で得られたそれぞれの試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、
第２混合工程で得られたそれぞれの試料の凝固時間を測定する工程と、
測定工程で得られた、それぞれの試料の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無を判定する工程と、
を含む、被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無の判定方法。
【請求項１５】
判定工程が、測定工程で得られた、それぞれの試料の凝固時間に基づいて、ロスナーインデックス値を取得し、取得したロスナーインデックス値に基づいて、被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無を判定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
血液凝固抑制物質が、ループスアンチコアグラント、後天性血友病、凝固因子インヒビター、又はＣ１インアクチベーターである請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヘパリン中和剤がポリブレンである請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬、活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法、及び血液凝固抑制物質の有無の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固検査の対象となる患者の中には、血栓の治療薬としてヘパリンの投与を受けている患者が存在する。また、点滴を行う際に、カテーテル内の血液凝固反応を防止することを目的として、カテーテル内にヘパリンを用いた生理食塩水を充填するヘパリンロックを施したカテーテルを使用している患者がいる。これらの患者から採取した被検血漿には、外的要因のヘパリンが含まれる場合がある。この被検血漿を使用して、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定すると、ヘパリンの影響により血液凝固時間が延長してしまう。
【０００３】
特許文献１には、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンによるＡＰＴＴ測定への影響を除く方法が開示されている。この方法では、被検血漿をヘパリン中和剤で中和してからＡＰＴＴを測定することにより、被検血漿に含まれるヘパリンの影響を除去している。しかし、特許文献１に記載の方法では、予め被検血漿中にヘパリン中和剤を添加する必要が有る。そのため、ＡＰＴＴ測定の工程が煩雑であった。また、特許文献１に記載の方法では、ＡＰＴＴ測定を行う際に、被検血漿にヘパリンが存在する可能性を常に意識する必要があった。特に、医療現場において、緊急にＡＰＴＴ測定を行う際は、被検血漿中の外的要因のヘパリンの有無を確認せず、ＡＰＴＴ測定が行われてしまう場合がある。
【０００４】
また、近年、ＡＰＴＴ測定試薬を用いるクロスミキシング試験においても、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響が問題になっている（非特許文献１）。クロスミキシング試験は、被検血漿と正常血漿との混合血漿の血液凝固時間を測定することで、患者の凝固因子欠損や、被検血漿中の血液凝固抑制物質の存在を検査する試験である。上述のように、被検血漿に外的要因のヘパリンが含まれると血液凝固時間が延長してしまう。そのため、クロスミキシング試験においても、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンが含まれると、内的要因の血液凝固抑制物質の存在が正確に検査できないおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平５−５０７２９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】検査と技術  ｖｏｌ．３４  ｎｏ．８  ２００６年８月  ｐ．７３８−７３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、ＡＰＴＴ測定試薬を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明は、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、安定性の高い、ＡＰＴＴ測定試薬を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む試薬とを混合した後にＡＰＴＴを測定するために用いられる試薬であって、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、安定性の高い、試薬を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることがなく、簡便で、正確であり、かつ、試薬の安定性が高い、ＡＰＴＴ測定方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることがなく、簡便で、正確であり、かつ、試薬の安定性が高い、血液凝固抑制物質の有無を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＡＰＴＴ測定試薬に予めヘパリン中和剤を含有させることで、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明の第１の局面の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬は、ヘパリン中和剤を含む。
本発明の第２の局面の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬は、リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬と、を含む。
本発明の第３の局面の試薬は、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む試薬とを混合した後に、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定するために用いられる試薬であって、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含有する。
本発明の第４の局面の活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法は、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、第１混合工程で得られた試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程と、を含む。
本発明の第５の局面の被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無の判定方法は、血液凝固抑制物質の存在が疑われる被検血漿及び正常血漿を、少なくとも３つの異なる割合で混合し測定試料を調整する調整工程と、調製工程で得られたそれぞれの測定試料とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、第1混合工程で得られたそれぞれの試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、第２混合工程で得られたそれぞれの試料の凝固時間を測定する工程と、測定工程で得られた、それぞれの試料の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無を判定する工程と、を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の第１の局面の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬によれば、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、ＡＰＴＴ測定試薬を提供することができる。
【００１５】
本発明の第２の局面の活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬によれば、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、安定性の高い、ＡＰＴＴ測定試薬を提供することができる。
【００１６】
本発明の第３の局面の試薬によれば、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む試薬とを混合した後にＡＰＴＴを測定するために用いられる試薬であって、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることなく、簡便で、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能な、安定性の高い、試薬を提供することができる。
【００１７】
本発明の第４の局面の活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法によれば、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることがなく、簡便で、正確であり、かつ、試薬の安定性が高い、ＡＰＴＴ測定方法を提供することができる。
【００１８】
本発明の第５の局面の被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無の判定方法によれば、被検血漿中に含まれる外的要因のヘパリンの影響を受けることがなく、簡便で、正確であり、かつ、試薬の安定性が高い、血液凝固抑制物質の有無を判定する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ポリブレンを含むカルシウム溶液を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定で得られたＡＰＴＴから算出したロスナーインデックス値を棒グラフで示している図である。
【図２】ポリブレンを含まないカルシウム溶液を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定で得られたＡＰＴＴから算出したロスナーインデックス値を棒グラフで示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本実施形態における活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定試薬は、ヘパリン中和剤を含む。ＡＰＴＴ測定試薬は、例えば、リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬と、を含む構成であってもよいし、リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、カルシウム塩を含む第２試薬と、ヘパリン中和剤を含む第３試薬と、を含む構成であってもよい。ここで、第３試薬は、第１試薬の添加後で第２試薬の添加前、に添加されてもよいし、第１試薬と第２試薬を添加した後、に添加されてもよい。
【００２１】
なお、本発明者らは、ＡＰＴＴ測定試薬において、カルシウム塩を含む試薬にヘパリン中和剤を添加することで、沈殿を生ずることなく、且つ被検血漿中に含まれるヘパリンの影響を受けずに、ＡＰＴＴ測定を行うことができることを見出した。そのため、本実施形態では、ヘパリン中和剤を含むＡＰＴＴ測定試薬の構成としては、リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬と、を含む構成であることが好ましい。
【００２２】
本実施形態における活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定試薬は、リン脂質及び活性化剤を含む第１試薬と、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬と、を含む。
【００２３】
第１試薬中のリン脂質は、ＡＰＴＴ測定試薬に一般的に用いることができるリン脂質であれば特に制限されない。例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルグリセロールなどが挙げられる。また、リン脂質は、ウシ脳由来、ウサギ脳由来、ヒト胎盤由来、大豆由来、及び卵黄由来などの天然のもの、又は合成リン脂質のいずれであってもよい。好ましくは、ウサギ脳由来セファリン、大豆由来セファリン及び合成リン脂質等が挙げられる。
【００２４】
第１試薬中のリン脂質の濃度としては、リン脂質の種類やＡＰＴＴの測定条件等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されない。例えば、第１試薬中のリン脂質の濃度として、２０〜２００μｇ／ｍＬが挙げられ、５０〜１５０μｇ／ｍＬが好ましい。リン脂質としてウサギ脳由来セファリン、大豆由来セファリン又は合成リン脂質を用いる場合の、第１試薬中のリン脂質の濃度としては、２０〜２００μｇ／ｍＬが好ましく、５０〜１５０μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００２５】
第１試薬中の活性化剤は、接触因子系を活性化する物質であれば特に制限されない。例えば、エラグ酸、カオリン、セライト、コロイダルシリカ、及び無水ケイ酸等からなる群より選択される少なくとも１種を用いることができる。本実施形態における好ましい活性化剤としては、エラグ酸、及びコロイダルシリカが挙げられる。
【００２６】
第１試薬中の活性化剤の濃度としては、活性化剤の種類やＡＰＴＴの測定条件等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されない。例えば、第１試薬中の活性化剤の濃度としては、５〜１０００μｇ／ｍＬが挙げられ、２０〜５００μｇ／ｍＬが好ましい。活性化剤としてエラグ酸を用いる場合の、第１試薬中の活性化剤の濃度としては、５〜１００μｇ／ｍＬが好ましく、２０〜５０μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００２７】
また、第１試薬は、リン脂質及び活性化剤の他に、ＡＰＴＴ測定試薬に添加可能な、他の成分をさらに含んでも良い。ここで、他の成分としては、例えば、緩衝剤、防腐剤、及び抗酸化剤などが挙げられる。
【００２８】
ここで、緩衝剤は、ＡＰＴＴ測定試薬に用いられる公知の緩衝剤であれば、特に制限されない。緩衝剤としては、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、及びＭＯＰＳなどが挙げられる。なお、第１試薬のｐＨは、ｐＨが５〜９が好ましく、より好ましくは６〜８である。この第１試薬のｐＨを、上記の緩衝剤を用いて調整することができる。
【００２９】
また、防腐剤は、ＡＰＴＴ測定試薬に用いられる公知の防腐剤であれば、特に制限されない。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、フェノール及び抗生物質（シプロフロキサシン）などが挙げられ、フェノールが好ましい。第１試薬中の防腐剤の濃度は、適宜調整すれば良く、特に制限されないが、例えば、１〜５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
【００３０】
また、抗酸化剤は、ＡＰＴＴ測定試薬に用いられる公知の抗酸化剤であれば、特に制限されない。抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられる。
【００３１】
本実施形態における、第２試薬中のヘパリン中和剤は、ＡＰＴＴ測定に影響を及ぼさない公知のヘパリン中和剤であればよく、特に制限されない。例えば、ポリブレン、硫酸プロタミン、及びヘパリナーゼ等からなる群より選択される少なくとも１種を、ヘパリン中和剤として用いることができる。本実施形態におけるヘパリン中和剤としては、ポリブレンが好ましい。
【００３２】
ここで、第２試薬中のヘパリン中和剤の濃度としては、ヘパリン中和剤の種類やＡＰＴＴの測定条件等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されない。例えば、第２試薬中のヘパリン中和剤の濃度としては、０．５〜１００μｇ／ｍＬが挙げられる。ヘパリン中和剤としてポリブレンを用いる場合、第２試薬中のポリブレンの濃度は、５〜５０μｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２０μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００３３】
ここで、第２試薬中のカルシウム塩は、ＡＰＴＴ測定試薬に一般的に用いることができるカルシウム塩であれば特に制限されない。例えば、無機酸とカルシウムとの塩、及び有機酸とカルシウムの塩のいずれも使用することができる。無機酸とカルシウムとの塩としては、塩化カルシウム、亜硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び炭酸カルシウム等が挙げられる。有機酸とカルシウムの塩としては、乳酸カルシウム、及び酒石酸カルシウム等が挙げられる。第２試薬中のカルシウム塩としては無機酸とカルシウムとの塩が好ましく、特に塩化カルシウムが好ましい。
【００３４】
第２試薬中のカルシウムの濃度としては、カルシウム塩の種類やＡＰＴＴの測定条件等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されない。例えば、第２試薬中のカルシウム塩の濃度として、１５〜５０ｍＭが挙げられ、２０〜３０ｍＭが好ましい。カルシウム塩として塩化カルシウムを用いる場合の、第２試薬中のカルシウム塩の濃度としては、１５〜３０ｍＭが好ましく、２０〜２５ｍＭがより好ましい。
【００３５】
また、第２試薬は、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩の他に、ＡＰＴＴ測定試薬に添加可能な、他の成分をさらに含んでも良い。ここで、他の成分としては、例えば、緩衝剤、及び防腐剤が挙げられる。
【００３６】
ここで、緩衝剤としては、上記第１試薬と同様の緩衝剤を用いることができる。なお、第２試薬のｐＨは、ｐＨが５〜９が好ましく、より好ましくは６〜８である。この第２試薬のｐＨも、第１試薬と同様に、上記の緩衝剤を用いて調整することができる。
【００３７】
また、防腐剤としては、上記第１試薬と同様の緩衝剤を用いることができる。なお第２試薬中の防腐剤の濃度は、適宜調整すれば良く、特に制限されないが、例えば、１〜５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
【００３８】
本実施形態における、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む試薬とを混合した後に、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定するために用いられる試薬であって、ヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含有する試薬は、上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定試薬の第２試薬と同様である。
【００３９】
本実施形態における活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定方法は、上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定試薬を用いて行われる。すなわち、本実施形態におけるＡＰＴＴ測定方法は、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する第１混合工程、第１混合工程で得られた試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程、第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程、を含む。
【００４０】
第１混合工程は、被検血漿とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する工程であればよく、被験血漿及び第１試薬との添加の順序は制限されない。
【００４１】
ここで、被検血漿は、患者の全血から得られた血液中から血球を取り除いた部分であれば良く、特に制限されない。被検血漿を取得する方法は公知である。例えば、被検血漿を取得する方法として、患者から取得した血液に血液凝固阻止剤を加えて遠心した後、上清を取ることで被検血漿を得る方法が挙げられる。また、被検血漿は上記方法で得たもの以外にも市販の血漿を用いることもできる。市販の血漿としては、正常血漿、血液凝固因子を欠損している血漿、及び血液凝固抑制物質を含有している血漿等が挙げられる。正常血漿としては、コアグトロールＮ（シスメックス社製）、血液凝固試験用標準ヒト血漿（シスメックス社製）などが挙げられる。血液凝固因子を欠損している血漿としては第VIII因子欠乏血漿（シスメックス社製）、及び第IX因子欠乏血漿（シスメックス社製）などが挙げられる。血液凝固抑制物質を含有している血漿としては、ＬＡ陽性血漿（ジョージキング社製）、及びFACTOR VIII DEFICIENT PLASMA WITH INHIBITOR（ジョージキング社製）などが挙げられる。また上記被検血漿はＡＰＴＴの測定条件等に応じて適宜希釈して用いてもよい。
【００４２】
なお、第１混合工程で用いる第１試薬は、上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定試薬の第１試薬と同様である。
【００４３】
第１混合工程における反応温度は、被検血漿と第１試薬との混合割合や被検血漿の希釈割合等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されないが、例えば、２５℃〜４５℃が挙げられ、好ましくは、３０℃〜４０℃、より好ましくは、３５℃〜３８℃である。
【００４４】
また、第１混合工程における反応時間も、被検血漿と第１試薬との混合割合や被検血漿の希釈割合等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されないが、例えば、１分〜１５分が挙げられ、好ましくは、２分〜１０分、より好ましくは、３分〜５分である。
【００４５】
第１混合工程における、被検血漿と第１試薬との混合割合は、被検血漿の希釈割合や第１試薬の組成等に応じて適宜設定すればよく、特に制限されない。例えば、被検血漿と第１試薬との混合割合は容量比で、８：２〜２：８が挙げられ、好ましくは６：４〜４：６、より好ましくは５：５である。
【００４６】
第２混合工程は、第１混合工程で得られた試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する工程であればよく、第１混合工程で得られた試料及び第２試薬との添加の順序は制限されない。
【００４７】
なお、第２混合工程で用いる第２試薬は、上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定試薬の第２試薬と同様である。
【００４８】
第２混合工程における反応温度としては、第１混合工程で得られた試料と第２試薬との混合割合や被検血漿の希釈割合等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されないが、例えば、２０℃〜４５℃が挙げられ、好ましくは、３０℃〜４０℃、より好ましくは、３５℃〜３８℃である。
【００４９】
第２混合工程における、第１混合工程で得られた試料と第２試薬との混合割合は、被検血漿と第１試薬との混合割合や第２試薬の組成等に応じて適宜設定すればよく、特に制限されない。例えば、第１混合工程で得られた試料と第２試薬との混合割合は容量比で、８：２〜５：５が挙げられ、好ましくは７：３〜６：４、より好ましくは２：１である。
【００５０】
測定工程は、一般的にＡＰＴＴ測定で用いられる公知の凝固時間の測定方法により、第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定すればよい。ここで、試料の凝固時間の測定方法としては、例えば、人が目視によりストップウォッチ等を用いて試料が凝固するまでの時間を測定する方法や、光学的情報を測定する装置により試料の凝固時間を測定する方法等が挙げられる。なお、試料の凝固時間を測定するための市販の血液凝固測定装置を用いることもできる。市販の血液凝固測定装置としては、例えば、シスメックス社製のＣＳ−２０００ｉ及びＣＳ−２１００ｉ等が挙げられる。
【００５１】
本実施形態における被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無の判定方法は、上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定方法を用いたクロスミキシング試験により行われる。すなわち、本実施形態における判定方法は、血液凝固抑制物質の存在が疑われる被検血漿及び正常血漿を、少なくとも３つの異なる割合で混合し測定試料を調整する調整工程、調製工程で得られたそれぞれの測定試料とリン脂質及び活性化剤を含む第１試薬とを混合する第１混合工程、第1混合工程で得られたそれぞれの試料とヘパリン中和剤及びカルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程、第２混合工程で得られたそれぞれの試料の凝固時間を測定する工程、測定工程で得られた、それぞれの試料の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無を判定する工程、を含む。
【００５２】
調製工程は、一般的なクロスミキシング試験に用いる測定試料を調製する工程であればよい。すなわち、血液凝固抑制物質の存在が疑われる被検血漿及び正常血漿を、少なくとも３つの異なる割合で混合し測定試料を調整する工程である。なお、血液凝固抑制物質の存在が疑われる被検血漿及び正常血漿との添加の順序は制限されない。
【００５３】
ここで、血液凝固抑制物質は、被検血漿に含まれる、ヘパリン以外の血液凝固抑制物質であれば良い。より具体的な血液凝固抑制物質としては、例えば、ループスアンチコアグラント（ＬＡ）、後天性血友病、凝固因子インヒビター、及びＣ１インアクチベーター等が挙げられる。
【００５４】
なお、被検血漿は、上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定方法で用いる被検血漿と同様の被検血漿である。
【００５５】
ここで、正常血漿は、健常者の全血から得られた血液中から血球を取り除いた部分であれば良く、特に制限されない。正常血漿を取得する方法は公知である。例えば、正常血漿を取得する方法として、健常者から取得した血液に血液凝固阻止剤を加えて遠心した後、上清を取ることで正常血漿を得る方法が挙げられる。また、正常血漿は上記方法で得たもの以外にも市販の正常血漿を用いることもできる。市販の正常血漿としては、コアグトロールＮ（シスメックス社製）、血液凝固試験用標準ヒト血漿（シスメックス社製）などが挙げられる。また上記正常血漿はＡＰＴＴの測定条件等に応じて適宜希釈して用いてもよい。
【００５６】
ここで、調製工程で調製される、被検血漿と正常血漿との混合割合が異なる測定試料の数としては、３つ以上であればよく、特に制限されない。なお、測定試料の数を増やすことで、本実施形態の判定方法の精度を向上させることができる。本実施形態における測定試料の数としては、３〜６が挙げられる。
【００５７】
また、調製工程で調製される測定試料における、被検血漿と正常血漿との混合割合は、一般的なクロスミキシング試験に用いられる測定試料の被検血漿と正常血漿の混合割合であればよい。すなわち、混合割合としては、被検血漿：正常血漿が０：１０〜１０：０の容量比が挙げられる。つまり、調製工程における、被検血漿と正常血漿との混合には、被検血漿又は正常血漿の混合割合が０の混合も含まれる。例えば、調製工程で調製される被検血漿と正常血漿との混合割合が異なる測定試料の数が３つの場合、被検血漿と正常血漿とを１０：０、１：１、及び０：１０の３つの異なる容量比で混合することができる。
【００５８】
調製工程における反応温度としては、判定対象である血液凝固抑制物質の種類、被検血漿の希釈割合、及び正常血漿の希釈割合等に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されないが、例えば、２５℃〜４５℃が挙げられ、好ましくは、３０℃〜４０℃、より好ましくは、３５℃〜３８℃である。
【００５９】
また、調製工程における反応時間は、判定対象である血液凝固抑制物質の種類、被検血漿の希釈割合、及び正常血漿の希釈割合等に応じて、適宜設定すればよい。例えば、被検血漿中の判定したい血液凝固物質がループスアンチコアグラント（ＬＡ）等の即時的に血液凝固反応を阻害する物質の場合、調製工程における反応時間としては１分〜１５分が挙げられ、好ましくは１分〜５分、より好ましくは１分である。また、被検血漿中の判定したい血液凝固物質が後天性血友病等の比較的緩やかに血液凝固反応を阻害する物質の場合は、調製工程における反応時間としては０．２時間〜５時間が挙げられ、好ましくは０．５時間〜４時間、より好ましくは１時間〜３時間である。
【００６０】
なお、本実施形態の被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無の判定方法において、第１混合工程、第２混合工程、及び測定工程は、調製工程で調製された測定試料に対し、それぞれ上記の本実施形態のＡＰＴＴ測定方法の第１混合工程、第２混合工程、及び測定工程と同様の処理を行う。
【００６１】
判定工程は、クロスミキシング試験において、測定工程で得られた、それぞれの試料の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる血液凝固抑制物質の有無を判定する、公知の方法を用いればよく、特に制限されない。例えば、混合比及び凝固時間のグラフの形状や、ロスナーインデックス値を用いた判定方法等が挙げられる。より具体的には、混合比及び凝固時間のグラフの形状を用いた判定方法の場合、被検血漿と正常血漿との混合比を横軸にし、試料の凝固時間を縦軸にしたグラフを作成し、グラフの形が凹型であれば血液凝固抑制物質が有ると判定し、凹型でなければ血液凝固抑制物質が無いと判定することができる。また、ロスナーインデックス値を用いた判定方法の場合、ロスナーインデックス値に閾値を設定しておき、試料の凝固時間から算出されたロスナーインデックス値が閾値より高い場合、血液凝固抑制物質が有ると判定し、試料の凝固時間から算出されたロスナーインデックス値が閾値より低い場合、血液凝固抑制物質が無いと判定することができる。
【００６２】
なお、ロスナーインデックス値とは、下記の式（１）より算出される値である。
ロスナーインデックス値＝（（被検血漿と正常血漿との混合割合が１：１の試料のＡＰＴＴ）−（正常血漿のＡＰＴＴ））／（被検血漿のＡＰＴＴ）  ×１００・・・式（１）
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
＜実験例１＞
［ＡＰＴＴ測定試薬へのポリブレンの添加］
（試薬１）
トロンボチェックＡＰＴＴ−ＳＬＡ（シスメックス社製）のリン脂質及び活性化剤を含む試薬３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬのポリブレン溶液（１０ｍｇ ポリブレン（ナカライテスク社製）、１ｍＬ 精製水）を３μＬ添加し、試薬１を調整した。
（試薬２）
アクチンＦＳＬ（シスメックス社製）３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬのポリブレン溶液を３μＬ添加し、試薬２を調整した。
（試薬３）
ヒーモスアイエルＡＰＴＴ−ＳＰ（三菱化学メディエンス社製）のリン脂質及び活性化剤を含む試薬３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬのポリブレン溶液を３μＬ添加し、試薬３を調整した。
（試薬４）
ヒーモスアイエルシンサシルＡＰＴＴ（三菱化学メディエンス社製）のリン脂質及び活性化剤を含む試薬３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬのポリブレン溶液を３μＬ添加し、試薬４を調整した。
（試薬５）
２５ｍMのカルシウム溶液（２７８ｍｇ 塩化カルシウム、１００ｍＬ 精製水）３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬのポリブレン溶液を３μＬ添加し、試薬５を調整した。
【００６５】
なお、トロンボチェックＡＰＴＴ−ＳＬＡ、アクチンＦＳＬ、ヒーモスアイエルＡＰＴＴ−ＳＰ、及びヒーモスアイエルシンサシルＡＰＴＴの、それぞれのリン脂質及び活性化剤の種類を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2011133396.tif 000003
【００６７】
［ＡＰＴＴ測定試薬へのポリブレンの添加の影響の観察］
試薬１〜５の、６時間経過後の沈殿の有無を、目視により観察した。観察結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2011133396.tif 000004
＋：沈殿あり
−：沈殿なし
【００６９】
表２から明らかなように、ＡＰＴＴ測定試薬のリン脂質及び活性化剤を含む試薬は、リン脂質の種類や活性化剤の種類に係わらず、ポリブレンの添加により沈殿が生じることが分かる。一方、ＡＰＴＴ測定試薬のカルシウム溶液は、ポリブレンを添加しても、沈殿が生じないことが明らかとなった。
【００７０】
＜実験例２＞
［測定試料の調整］
（測定試料１）
コアグトロールＮ（シスメックス社製）を、３７℃で１分間加温して、測定試料１とした。
（測定試料２）
ジョージキング社製のループスアンチコアグラント（ＬＡ）陽性血漿を、３７℃で１分間加温して、測定試料２とした。
（測定試料３）
正常血漿として、コアグトロールＮを用いた。また、被検血漿として、ジョージキング社製のＬＡ陽性血漿を用いた。そして、正常血漿と、被検血漿とを、１：１で混合し、３７℃で２分間加温して、測定試料３を調製した。
（測定試料４）
コアグトロールＮにノボ・ヘパリン注（ノボノルディスクＡ／Ｓ社製）を０．５Ｕ／ｍＬとなるように添加したものを、３７℃で２分間加温して、測定試料４とした。
（測定試料５）
正常血漿として、コアグトロールＮを用いた。被検血漿として、コアグトロールＮにノボ・ヘパリン注（ノボノルディスクＡ／Ｓ社製）を０．５Ｕ／ｍＬとなるように添加したものを用いた。そして、正常血漿と、被検血漿とを、１：１で混合し、３７℃で２分間加温して、測定試料５を調製した。
（測定試料６）
ジョージキング社製のＬＡ陽性血漿にノボ・ヘパリン注（ノボノルディスクＡ／Ｓ社製）を０．５Ｕ／ｍＬとなるように添加したものを、３７℃で２分間加温して、測定試料６とした。
（測定試料７）
正常血漿として、コアグトロールＮを用いた。また、被検血漿として、ジョージキング社製のＬＡ陽性血漿にノボ・ヘパリン注を０．５Ｕ／ｍＬとなるように添加したものを用いた。そして、正常血漿と、被検血漿とを、１：１で混合し、３７℃で２分間加温して、測定試料７を調製した。
【００７１】
［ＡＰＴＴ測定］
５０μＬの測定試料１をキュベットに分注した。次いで、５０μＬのトロンボチェックＡＰＴＴ−ＳＬＡのリン脂質及び活性化剤を含む試薬を、キュベットに添加し、３７℃で３分間加温した。その後、ポリブレンを含むカルシウム溶液である上記の試薬５を５０μＬ添加し、試料が凝固するまでの時間を全自動血液凝固測定装置ＣＳ−２０００ｉ（シスメックス社製）で測定し、測定値１を得た。
【００７２】
測定試料１に代えて、測定試料２、測定試料３、測定試料４、測定試料５、測定試料６、又は測定試料７を用いた以外、測定試料１のＡＰＴＴ測定と同様の操作により、測定試料２〜７の凝固時間を測定し、それぞれ測定値２〜７を得た。
【００７３】
［ロスナーインデックス値によるクロスミキシング試験の解析］
測定試料１〜７の凝固時間の測定値（ＡＰＴＴ）を用い算出したロスナーインデックス値によるクロスミキシング試験の解析結果を図１に示す。ここで、ロスナーインデックス値は上述の式（１）を用いて算出した。なお、式（１）中、正常血漿のＡＰＴＴとして、測定値１を用いた。具体的な算出式を式（２）に示す。
ロスナーインデックス値＝（（混合血漿の測定値）−（測定値１））／（被検血漿の測定値）  ×１００・・・式（２）
【００７４】
図１における、棒グラフ１及び棒グラフ２は、ヘパリンを含まない血漿を用いた際の、ロスナーインデックス値を示す。ここで、棒グラフ１は、式（２）において、（被検血漿の測定値）及び（混合血漿の測定値）として、測定値１を代入した際の、ロスナーインデックス値を示す。棒グラフ２は、（被検血漿の測定値）として測定値２、（混合血漿の測定値）として測定値３を代入した際の、ロスナーインデックス値を示す。
【００７５】
図１における、棒グラフ３及び棒グラフ４は、ヘパリンを含む血漿を用いた際の、ロスナーインデックス値を示す。ここで、棒グラフ３は、式（２）において、（被検血漿の測定値）として測定値４、（混合血漿の測定値）として測定値５を代入した際の、ロスナーインデックス値を示す。棒グラフ４は、（被検血漿の測定値）として測定値６、（混合血漿の測定値）として測定値７を代入した際の、ロスナーインデックス値を示す。
【００７６】
＜実験例３＞
実験例２のポリブレンを含むカルシウム溶液である試薬５に代えて、ポリブレンを含まない２５ｍＭ カルシウム溶液（２７８ｍｇ 塩化カルシウム、１００ｍＬ 精製水）を用いた以外、実験例２と同様の操作で、ＡＰＴＴ測定及びロスナーインデックス値によるクロスミキシング試験の解析を行った。クロスミキシング試験の解析結果を図２に示す。なお、図２における、棒グラフ１〜４は、上記図１の棒グラフ１〜４と同じく、棒グラフ１及び棒グラフ２は、ヘパリンを含まない血漿を用いた際のロスナーインデックス値を示し、棒グラフ３及び棒グラフ４は、ヘパリンを含む血漿を用いた際のロスナーインデックス値を示す。
【００７７】
図１及び図２の棒グラフ１及び２から、ポリブレンを含むカルシウム溶液を用いたＡＰＴＴ測定でも、ポリブレンを含まないカルシウム溶液を用いたＡＰＴＴ測定と同様のロスナーインデックス値が得られることが明らかになった。このことから、カルシウム溶液へのポリブレンの添加は、ＡＰＴＴ測定に影響を与えないことが示唆された。
【００７８】
また、図２の棒グラフ３及び棒グラフ４から明らかなように、ポリブレンを含まないカルシウム溶液を用い、外因性のヘパリンを含む血漿のＡＰＴＴ測定を行った場合、正常血漿とＬＡ陽性血漿のロスナーインデックス値の差が無くなり、ＬＡが陽性か陰性かの判断が困難になることが分かる。一方、図１の棒グラフ３及び棒グラフ４から明らかなように、ポリブレンを含むカルシウム溶液を用いた場合、外因性のヘパリンの影響が軽減され、外因性のヘパリンを含む血漿であっても、ＬＡが陽性か陰性かの判断が可能であることが分かる。
【００７９】
上述の結果から、ポリブレンを含むカルシウム溶液を用いても、ＡＰＴＴ測定自体に影響を及ぼすことがないことが分かった。また、ポリブレンを含むカルシウム溶液を用いることで、外因性のヘパリンを含む血漿であっても、正確にＡＰＴＴ測定を行うことが可能となることが分かった。
【図１】
2011133396.tif 000005
【図２】
2011133396.tif 000006