(57)【要約】【課題】高感度でタンパク質を検出できるタンパク質の検出方法、およびこのような検出方法のための化学反応用カートリッジを提供する。【解決手段】アドレッシングによりタンパク質を検出するタンパク質の検出方法である。検出対象のタンパク質にアドレッシングのためのＤＮＡを結合するステップと、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするステップと、を備える。このタンパク質の検出方法によれば、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするので、抗原・抗体反応をチップ上で行わせる必要がなく、予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる溶液中で行わせることができ、高感度でタンパク質を検出することができる。【選択図】図１
2011242263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドレッシングにより特定のタンパク質の存在を検出するタンパク質の検出方法において、
検出対象のタンパク質にアドレッシングのための検出対象側ＤＮＡを結合するステップと、
前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップと、
前記検出対象側ＤＮＡと相補的に結合するプローブＤＮＡが固定された基板を用いて、前記検出対象のタンパク質をアドレッシングするステップと、
を備えることを特徴とするタンパク質の検出方法。
【請求項２】
前記検出対象のタンパク質に検出対象側ＤＮＡを結合するステップでは、検出対象のタンパク質と検出対象側ＤＮＡとの間を結合する抗体を利用することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項３】
前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップでは、検出対象のタンパク質と蛍光ラベルとの間を結合する抗体を利用することを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質の検出方法。
【請求項４】
前記検出対象のタンパク質に検出対象側ＤＮＡを結合するステップと、前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップとを、溶液中で同時に実行することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のタンパク質の検出方法。
【請求項５】
前記検出対象のタンパク質に検出対象側ＤＮＡを結合するステップおよび前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップでは、ELISA法、サンドイッチELISA法、または競合反応型ELISA法を用いることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のタンパク質の検出方法。
【請求項６】
前記基板におけるプローブＤＮＡの固定方法として、共有結合方式、静電結合方式、アビジン・ビオチン結合による方法、金・チオール結合による方法、フォトリソグラフィーを利用した成膜方式、またはインクジェット方式を用いることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質の検出方法。
【請求項７】
アドレッシングにより特定のタンパク質の存在を検出する化学反応用カートリッジにおいて、
検出対象のタンパク質を含むサンプルを収容するサンプル収容部と、
アドレッシングのための検出対象側ＤＮＡを含む第一の溶液を収容する第一の溶液収容部と、
蛍光ラベルを含む第二の溶液を収容する第二の収容部と、
前記サンプルと前記第一および第二の溶液とを混合し、前記検出対象のタンパク質に前記検出対象側ＤＮＡおよび前記蛍光ラベルを結合させる結合部と、
前記検出対象側ＤＮＡと相補的に結合するプローブＤＮＡが固定された基板を有し、前記検出対象のタンパク質のアドレッシングを行う検出部と、
を備えることを特徴とする化学反応用カートリッジ。
【請求項８】
前記結合部では、溶液中で前記検出対象のタンパク質に前記検出対象側ＤＮＡを結合させることを特徴とする請求項７に記載の化学反応用カートリッジ。
【請求項９】
前記結合部では、抗原・抗体反応を用いて前記検出対象のタンパク質に前記検出対象側ＤＮＡを結合させることを特徴とする請求項８に記載の化学反応用カートリッジ。
【請求項１０】
前記検出部では、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ検出を同時に実行することを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
【請求項１１】
前記検出部には、アドレッシングのための、プローブＤＮＡを固定したタンパクチップが取り付けられていることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アドレッシングによりタンパク質を検出するタンパク質の検出方法および外力を加えた際の変形によって内容物を移送することで化学的処理を行う化学処理用カートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
基板上に抗体を固定し、ターゲットとなる抗原を結合させることにより抗原タンパク質の検出を行う方法が知られている。この方法では、蛍光分子を付した二次抗体を予めターゲットとなる抗原に溶液中で結合させ、一次抗体を固定した基板上にこの溶液を滴下する。抗原は基板上の一次抗体と特異的に結合するため、洗浄後の基板を蛍光観察することにより、蛍光の発する位置に基づいて、ターゲットとなる抗原（タンパク質）の有無を調べることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１８４３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記方法では、抗原と抗体との反応を、一次抗体が固定された基板上で行っている。このため、反応場が基板近傍にある場合には、抗原と抗体が会合する確率が低くなる。また、基板表面では溶液の流動性が悪く、反応の速度および感度が低下する。このため、検出感度が低下するとともに、検出に長時間を要する。
【０００５】
また、バイオチップにより生体高分子を検出する技術が知られているが（特許文献１参照）、この方法ではタンパク質を検出できない。
【０００６】
本発明の目的は、高感度でタンパク質を検出できるタンパク質の検出方法、およびこのような検出方法のための化学反応用カートリッジを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のタンパク質の検出方法は、アドレッシングにより特定のタンパク質の存在を検出するタンパク質の検出方法において、検出対象のタンパク質にアドレッシングのための検出対象側ＤＮＡを結合するステップと、前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップと、前記検出対象側ＤＮＡと相補的に結合するプローブＤＮＡが固定された基板を用いて、前記検出対象のタンパク質をアドレッシングするステップと、を備えることを特徴とする。
【０００８】
このタンパク質の検出方法によれば、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするので、抗原・抗体反応をチップ上で行わせる必要がなく、予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる溶液中で行わせることができ、高感度でタンパク質を検出することができる。
【０００９】
前記検出対象のタンパク質に検出対象側ＤＮＡを結合するステップでは、検出対象のタンパク質と検出対象側ＤＮＡとの間を結合する抗体を利用してもよい。
【００１０】
前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップでは、検出対象のタンパク質と蛍光ラベルとの間を結合する抗体を利用してもよい。
【００１１】
前記検出対象のタンパク質に検出対象側ＤＮＡを結合するステップと、前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップとを、溶液中で同時に実行してもよい。
【００１２】
前記検出対象のタンパク質に検出対象側ＤＮＡを結合するステップおよび前記検出対象のタンパク質に蛍光ラベルを結合するステップでは、ELISA法、サンドイッチELISA法、または競合反応型ELISA法を用いてもよい。
【００１３】
前記基板におけるプローブＤＮＡの固定方法として、共有結合方式、静電結合方式、アビジン・ビオチン結合による方法、金・チオール結合による方法、フォトリソグラフィーを利用した成膜方式、またはインクジェット方式を用いてもよい。
【００１４】
前記検出対象のタンパク質をアドレッシングするステップでは、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ検出を同時に実行してもよい。
【００１５】
前記検出対象のタンパク質をアドレッシングするステップでは、プローブＤＮＡを固定したタンパクチップを用いてアドレッシングしてもよい。
【００１６】
本発明の化学反応用カートリッジは、アドレッシングにより特定のタンパク質の存在を検出する化学反応用カートリッジにおいて、検出対象のタンパク質を含むサンプルを収容するサンプル収容部と、アドレッシングのための検出対象側ＤＮＡを含む第一の溶液を収容する第一の溶液収容部と、蛍光ラベルを含む第二の溶液を収容する第二の収容部と、前記サンプルと前記第一および第二の溶液とを混合し、前記検出対象のタンパク質に前記検出対象側ＤＮＡおよび前記蛍光ラベルを結合させる結合部と、前記検出対象側ＤＮＡと相補的に結合するプローブＤＮＡが固定された基板を有し、前記検出対象のタンパク質のアドレッシングを行う検出部と、を備えることを特徴とする。
【００１７】
この化学反応用カートリッジによれば、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするので、抗原・抗体反応を検出部の基板上で行わせる必要がなく、予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる結合部の溶液中で行わせることができ、高感度でタンパク質を検出することができる。
【００１８】
前記結合部では、溶液中で前記検出対象のタンパク質に前記検出対象側ＤＮＡを結合させてもよい。
【００１９】
前記結合部では、抗原・抗体反応を用いて前記検出対象のタンパク質に前記検出対象側ＤＮＡを結合させてもよい。
【００２０】
前記検出部では、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ検出を同時に実行してもよい。
【００２１】
前記検出部には、アドレッシングのための、プローブＤＮＡを固定したタンパクチップが取り付けられていてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のタンパク質の検出方法によれば、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするので、抗原・抗体反応をチップ上で行わせる必要がなく、予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる溶液中で行わせることができ、高感度でタンパク質を検出することができる。
【００２３】
本発明の化学反応用カートリッジによれば、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするので、抗原・抗体反応を検出部の基板上で行わせる必要がなく、予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる結合部の溶液中で行わせることができ、高感度でタンパク質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】検体を蛍光標識する操作手順を示す図。
【図２】ハイブリダイゼーションの操作手順を説明する図であり、（ａ）はタンパクチップの構成を模式的に示す図、（ｂ）はハイブリダイゼーションの様子を模式的に示す図。
【図３】本実施例の化学反応用カートリッジの構成を示す図であり、（ａ）はカートリッジの平面図、（ｂ）は図３（ａ）のＢ−Ｂ線断面図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図１〜図３を参照して、本発明によるタンパク質の検出方法について説明する。
【００２６】
図１は検出対象のタンパク質を蛍光標識する操作手順を示している。図１に示すように、検出対象のタンパク質（抗原）４１を含む検体と、蛍光分子４２により蛍光標識された二次抗体４３と、検出対象側ＤＮＡ４４と結合させた一次抗体４５と、をバッファー液４６中で混合する。タンパク質（抗原）は、一次抗体および二次抗体と特異的に結合するので、検体中に複数種類の特定のタンパク質（抗原）が存在した場合には、それぞれのタンパク質（抗原）４１は、それぞれに対応する一次抗体４５および二次抗体４３と結合する。このため、図１に示すように、検出対象のタンパク質（抗原）４１には、二次抗体４３を介して蛍光分子４２が結合（蛍光標識）されるとともに、一次抗体４５を介して検出対象側ＤＮＡ４４が結合される。
【００２７】
図２（ａ）はタンパクチップの構成を模式的に示す図、図２（ｂ）はハイブリダイゼーションの様子を模式的に示す図である。
【００２８】
図２（ａ）に示すように、タンパクチップ５の基板５１上には、プローブＤＮＡ５２が固定されたサイトが、２次元的に配置されている。
【００２９】
図２（ｂ）に示すように、図１の操作手順で調製された混合液を基板５１上に滴下すると、混合液中の検出対象側ＤＮＡ４４は、そのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ５２とそれぞれ特異的に結合（ハイブリダイゼーション）する。したがって、基板５１上に固定するプローブＤＮＡ５２の種類とその固定位置を選択することにより、その位置に応じて、検体中に存在する検出対象側ＤＮＡ４４、言い換えれば、この検出対象側ＤＮＡ４４が特異的に結合した検出対象のタンパク質４１の種類を特定（アドレッシング）することができる。
【００３０】
上記のハイブリダイゼーションの有無は、蛍光読取装置により確認することが可能であり、蛍光を発するタンパクチップ５上のサイトの位置を読み取ることで、検体中に存在するタンパク質（抗原）４１の有無およびその種類を同定することができる。
【００３１】
次に、図３を参照して、本発明による化学反応用カートリッジについて説明する。このカートリッジは、本発明によるタンパク質の検出方法に従ってタンパク質の検出を行うためのものである。
【００３２】
図３（ａ）は本実施例のカートリッジの平面図、図３（ｂ）は図３（ａ）のＢ−Ｂ線断面図である。
【００３３】
図３（ｂ）に示すように、本実施例のカートリッジは、タンパクチップ５が埋め込まれた基板１と、基板１に重ね合わされる弾性部材２とを備える。
【００３４】
弾性部材２の裏面（図３（ｂ）において下面）には、その表面（図３（ｂ）において上面）側に凹んだ所定形状の凹部が形成されている。この凹部は、カートリッジ基板１と弾性部材２との間に空間を生み出すことで、図３（ａ）および図３（ｂ）に示すように、サンプルを受け入れるウェル２１と、予め後述の試薬が収容されたウェル２２およびウェル２３と、サンプルと試薬を混合するためのウェル２４と、タンパクチップ５を収容する収容部２５と、廃液を収容するウェル２６と、ウェル２１にサンプルを注入するための注入路２７と、ウェル２１およびウェル２４を接続する流路２８と、ウェル２２およびウェル２４を接続する流路２９と、ウェル２３およびウェル２４を接続する流路３０と、ウェル２４および収容部２５を接続する流路３１と、収容部２５およびウェル２６を接続する流路３２と、が形成されている。
【００３５】
ウェル２２には、蛍光分子４２により標識された二次抗体４３およびバッファー液が、ウェル２３には、検出対象側ＤＮＡ４４と結合された一次抗体４５およびバッファー液が、それぞれ収容されている。
【００３６】
次に、カートリッジを用いた検出方法について説明する。
【００３７】
注射針等を用いることで、ウェル２１に注入路２７を介してタンパク質を含むサンプルが注入される。
【００３８】
次に、図３（ｂ）に示すように、ローラ６をカートリッジに押し付けながら右方に回転させると弾性部材２が弾性変形し、カートリッジ内の溶液がローラ６の移動に従って搬送される。したがって、ウェル２１に収容されたサンプルと、ウェル２２およびウェル２３に収容された試薬とが、それぞれ流路２８、流路２９および流路３０を介してウェル２４に到達し、これらが混合される。これにより、図１に示した操作手順が自動的に実行される。
【００３９】
さらにローラ６を回転させると、混合液は流路３１を介して収容部２５に到達し、タンパクチップ５におけるハイブリダイゼーションが行われる。余分な混合液は、ウェル２６に収容される。なお、洗浄液をカートリッジに収容しておき、洗浄液を用いてハイブリダイゼーション後のタンパクチップ５を洗浄するように構成してもよい。また、この場合、ローラ６を往復移動させることで、洗浄液をタンパクチップ５上で往復させてもよい。
【００４０】
その後、カートリッジに固定されたタンパクチップ５上の蛍光を発している位置を読み取ることで、上記のように検体の同定をすることができる。タンパクチップ５をカートリッジから取り外した後に、蛍光読取装置による読み取りを行ってもよい。
【００４１】
本実施形態の検出方法によれば、抗原・抗体反応を予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる溶液中で行うため、抗原と抗体の会合の確率が高く、高感度の検出が可能となる。また、溶液の移動が容易であるため、抗原・抗体反応の反応速度が速く、短時間で微量の検体を検出することができる。一般に、溶液の濃度と反応速度の積の値が大きいほど抗原・抗体反応が飽和するまでの時間が短縮されるが、本実施例では、この値を容易に改善することができる。
【００４２】
また、プローブＤＮＡを基板に固定する技術は既に確立されている。このため、信頼性の高いタンパクチップを低コストで作成することができる。
【００４３】
さらに、検出対象となるタンパク質（抗原）が変わっても、抗体の選択と、抗体と検出対象側ＤＮＡ４４との結合のみを考慮すればよく、タンパクチップ５のプローブＤＮＡ５２は同一のものを使用できる。したがって、低コストでタンパクチップを得ることができるとともに、ＤＮＡの相違によるハイブリダイゼーション効率の変動等を考慮する必要がなく、チップ間でのばらつきが抑制される。また、同一のタンパクチップを用いて、多種多様なタンパク質（抗原）の検出をすることが可能となる。
【００４４】
本発明のタンパク質の検出方法において、従来の種々の技術を適用することができる。例えば、検出ターゲットとなるタンパク質（抗原）と蛍光分子との接続方法としては、ELISA法、サンドイッチELISA法、競合反応型ELISA法などを用いることができる。また、タンパクチップの基板とプローブＤＮＡとの接続方法としては、共有結合方式、静電結合方式、アビジン・ビオチン結合による方法、金・チオール結合による方法、フォトリソグラフィーを利用した成膜方式、インクジェット方式などを用いることができる。
【００４５】
本発明のタンパク質の検出方法は、上記実施形態に限定されることなく、種々の変形が可能である。例えば、タンパク質（抗原）に予め二次抗体を結合させる代わりに、基板上でのハイブリダイゼーションによるアドレッシングの後に、基板上のタンパク質（抗原）に二次抗原を結合させることで、これを蛍光標識してもよい。また、上記実施形態の一次抗体に相当する抗体に蛍光マーカーを付加してもよい。さらに、インターカレーター法を適用して、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡを蛍光標識してもよい。
【００４６】
また、ＦＲＥＴを適用して一次抗体と二次抗体に異なる蛍光マーカーを付加し、蛍光エネルギー移動を利用したサイト検出を行ってもよい。
【００４７】
さらに、上記実施形態では、平面での検出を行うタンパクチップを示したが、３次元での検出を行うタンパクチップを用いてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションに際して、サンプル（上記の混合液）がチップ内を貫通可能に構成されたものなどが挙げられる。
【００４８】
また、タンパクチップ上に、ＤＮＡを検出するためのサイトを併せて設けてもよい。この場合、例えば、体液に含まれる特定の感染症について病原菌のＤＮＡと、病原菌に対抗して作られる抗体とを、単一のチップで同時検出することが可能となる。
【００４９】
以上説明したように、本発明のタンパク質の検出方法によれば、相補的なＤＮＡ同士の結合によるハイブリダイゼーションを用いて、検出対象のタンパク質をアドレッシングするので、抗原・抗体反応をチップ上で行わせる必要がなく、予め抗原と抗体が三次元的に自由に移動できる溶液中で行わせることができ、高感度でタンパク質を検出することができる。
【００５０】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、アドレッシングによりタンパク質を検出する場合に、広く適用することができる。
【符号の説明】
【００５１】
５      タンパクチップ
２１    ウェル（サンプル収容部）
２４    ウェル（結合部）
２５    収容部（検出部）
４１    タンパク質（抗原）
４２    蛍光分子
４３    二次抗体
４４    検出対象側ＤＮＡ
４５    一次抗体
４６    バッファー液
５２    プローブＤＮＡ
【図１】
2011242263.tif 000003
【図２】
2011242263.tif 000004
【図３】
2011242263.tif 000005