(57)【要約】【課題】スライドガラス上への試料の移動が容易に行え、また作製効率が向上する生体試料標本の作製方法を提供する。【解決手段】パラフィンブロック２の通孔４内に組織８を充填する工程、パラフィンブロック２にて組織８が包埋された固形試料１０を切断刃によって薄切する工程、薄切片１２をスライドガラス２４上に乗せる工程、薄切片１２のパラフィンを溶融させる工程、および組織８を染色する工程を包含する生体試料標本の作製方法。薄切片１２をスライドガラス２４上に乗せる工程が、筒状の刃部１６を有する切断具１４を薄切片１２に押し付け、組織の周囲にパラフィンが配置された切断片１８を得る工程、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、刃部１６に付着した状態で切断片１８をスライドガラス２４上へ移動する工程、パラフィンに付与した静電気を開放して切断片１８をスライドガラス２４上に載せる工程を包含する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に組織を充填する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切する工程、得られた該薄切片をスライドガラス上に乗せる工程、および該薄切片のパラフィンを除去する工程、を包含する生体試料標本の作製方法であって、
該薄切片をスライドガラス上に乗せる工程が、先端に筒状の刃部を有する切断具を該薄切片に押し付けて、該組織の周囲にパラフィンが配置された切断片を得る工程、
該切断片のパラフィンに静電気を付与して、該切断具の刃部に付着した状態で該切断片をスライドガラス上へ移動する工程、
該パラフィンに付与した静電気を開放して該切断片をスライドガラス上に載せる工程、を包含する方法。
【請求項２】
前記切断具に、静電気の付与をオン、オフ制御する制御部が設けられている請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項３】
前記スライドガラス上に、シランコート又はリジンコートが施されている請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項４】
さらに、前記組織を染色する工程、を包含する請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を用いることを含む、疾患の病理診断方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法に使用される切断具であって、
切断具本体と、該切断具本体の先端部に設けられた筒状の刃部と、該刃部を通して、前記切断片のパラフィンに静電気を付与し得る電荷付与部と、該電荷付与部による静電気をオンオフ制御可能な制御部と、を備えた切断具。
【請求項７】
ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に生体試料を充填する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切する工程、得られた該薄切片を固相マトリクス上に乗せる工程、および該薄切片の周囲に形成された包埋剤を除去する工程、を包含する生体試料標本の作製方法であって、
該薄切片を固相マトリクス上に乗せる工程が、先端に筒状の刃部を有する切断具を該薄切片に押し付けて、該生体試料の周囲に包埋剤が配置された切断片を得る工程、
該切断片の包埋剤に静電気を付与して、該切断具の刃部に付着した状態で該切断片を固相マトリクス上へ移動する工程、
該包埋剤に付与した静電気を開放して該切断片を固相マトリクス上に載せる工程、を包含する方法。
【請求項８】
さらに、前記生体試料を染色する工程、を包含する請求項７に記載の生体試料標本の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織、細胞などの生体試料標本の作製方法とその方法に使用される切断具に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料（例えば組織切片、タッチスメア、細胞等）に存在する特定の標的物質（例えば抗原）の存在を判別する手法として、該標的物質をシグナルとして可視化し検出する免疫染色法が従来から用いられている。例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法および放射性同位元素標識抗体法がある。
【０００３】
蛍光抗体法は、標的抗原に対する抗体、通常はモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、組織切片上の抗原の分布を判別する手法で、直説法と間接法の２つの二重染色法に分類することができる。前者では、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、後者では、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化する。
【０００４】
酵素抗体法は、同様に抗原−抗体反応という特異反応を利用する手法である。抗体を酵素で標識し、抗原−抗体反応後に該酵素によって発色基質の沈着を生じさせて抗体の局在を示す点に特徴がある。標識酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ；ＧＯ）等が代表的である。
【０００５】
酵素抗体法には、酵素標識抗体法である直説法、間接法およびアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ）法と、非標識抗体法としてのペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ）法とがあり、卵白の塩基性蛋白質であるアビジンに代わり、中性に荷電した、即ち中性化処理が不要なストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を用いるストレプトアビジン・ビオチン化抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＡＢまたはＬＳＡＢ）法が主流となっている。
【０００６】
対象生体試料を上記免疫染色法に供する場合、通常、凍結切片やパラフィン切片として固相のマトリックス上に固定したものを調製して反応に付する。
【０００７】
このように免疫的染色法を用いることにより、組織または細胞に存在する種々ペプチド性抗原（組織抗原、腫瘍抗原、免疫担当細胞亜型抗原、酵素、ホルモン等）、非ペプチド性の抗原、その他組織に沈着する免疫複合体等の検出が可能であり、各種疾患の診断マーカーの分布を判別することによる病理診断（例えば腫瘍マーカーの判別による腫瘍診断）も行われている。
【０００８】
従来、組織観察用の薄切片試料作製工程において、固形試料の薄切作業はミクロトームを用いて作業者が行っている。固形試料には、主として生体試料をパラフィンや他のコンパウンドで包埋したものが用いられ、これを薄切し、薄切片を作製する。この薄切工程において重要かつ困難な作業に、薄切中および薄切工程終了後の薄切片のハンドリングがある。
【０００９】
図８は従来の組織観察用の薄切片試料作製工程図である。以下、その組織観察用の薄切片試料作製方法について説明する。
【００１０】
（１）まず、図８（ａ）に示すように、送り工程が終了した後の薄切工程で切断刃３６をＡの方向へ送り、固形試料３７の薄切を開始する。
【００１１】
（２）次に、図８（ｂ）に示すように、作業者は片手で切断刃３６を移動させながら、もう一方の手で、この時生成する薄切片３９の切れ始めに、水分を含ませた非常に細い筆などの治具３８の先端部を接触させる。
【００１２】
（３）次に、図８（ｃ）に示すように、そのまま切断刃３６を移動させる速度と同じ速度で薄切片３９に接触させた治具３８を動かしながら薄切を終了させることにより、薄切終了時には一端が治具３８に接触した状態の薄切片３９を取り出すことができる。そして、取り出した薄切片３９をガラス製のスライドガラスに乗せる。一般的には取り出した薄切片の皺や縮みを伸ばす目的で、一度水面に浮かべた後、スライドガラスですくい取る。
【００１３】
次に、脱パラフィン・染色・封入工程を経て組織観察用の薄切片試料が得られる。
【００１４】
上記した従来の薄切片試料の作製工程においては、以下に挙げる問題点がある。
【００１５】
薄切工程において作業者は片手で切断刃を、もう一方の手で薄切片取り出し用の治具を同時に操作しなければならず、この状況下で非常に薄い切片の切れ始めの一定の場所に、小さな治具の先端を正確に接触させるには高度な技術、熟練度かつ集中力を必要とする。この時、治具先端の薄切片への押しつけ力が大きすぎると薄切片が破れたり、皺になったりするという不具合が生じる。
【００１６】
また、切断刃は固形試料の薄切を開始した後、常に一定の速度で移動させなければならないため、切断刃の移動速度を変化させると薄切片の厚さむらや形状（皺、縮み）のバラツキの原因となる。そして、このようなバラツキは、測定結果のバラツキの原因となり、擬陽性、および／または、擬陰性の原因となる。また、この治具先端を薄切片の切り始めに接触させるという作業は、切断刃を停止させることなく行わなければならないという難しさもある。
【００１７】
このような問題を解決したものとして、例えば、特開平１０−１０４１３６号公報には、組織観察用の薄切片試料を作製する方法において、薄切工程前に、次に薄切片となる固形試料面に薄切補助部材を密着固定させ、この状態で薄切工程を行い、薄切補助部材に密着固定した薄切片を顕微鏡観察用のスライドガラスに乗せた後、脱パラフィン工程、染色・封入工程を施すようにする方法が提案されている。
【００１８】
しかし、この方法では、薄切補助部材を用意して薄切片に密着固定すること、および薄切片をスライドガラスに乗せた後、この薄切補助部材を溶解除去する操作が必要で、操作が煩雑になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開平１０−１０４１３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、容易に安定した品質の薄切片の切り出しが行え、またスライドガラス上への移動が容易に行え、薄切片試料の作製効率が向上する生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【００２１】
本発明の他の目的は、薄切の際に、薄切片に生じる皺、縮み、破れなどの不具合の発生を抑え、高度な技術を持った熟練者でなくても容易に安定した品質の薄切片の切り出しを行うことができる織標本の作製方法を提供することを目的とする。
【００２２】
本発明のさらに他の目的は、上記方法に使用する切断具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の生体試料標本の作製方法は、パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に組織を充填する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切する工程、得られた該薄切片をスライドガラス上に乗せる工程、該薄切片のパラフィンを溶融させる工程、および該組織を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法であって、該薄切片をスライドガラス上に乗せる工程が、先端に筒状の刃部を有する切断具を該薄切片に押し付けて、該組織の周囲にパラフィンが配置された切断片を得る工程、該切断片のパラフィンに静電気を付与して、該切断具の刃部に付着した状態で該切断片をスライドガラス上へ移動する工程、該パラフィンに付与した静電気を開放して該切断片をスライドガラス上に載せる工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００２４】
一つの実施形態では、前記切断具に、静電気の付与をオン、オフ制御する制御部が設けられている。
【００２５】
一つの実施形態では、前記スライドガラス上に、シランコート又はリジンコートが施されている。
【００２６】
本発明の疾患の病理診断方法は、上記方法を用いることを含む。
【００２７】
また、本発明の切断具は、上記方法に使用される切断具であって、切断具本体と、該切断具本体の先端部に設けられた筒状の刃部と、該刃部を通して、前記切断片のパラフィンに静電気を付与し得る電荷付与部と、該電荷付与部による静電気をオンオフ制御可能な制御部と、を備えている。
【００２８】
また、本発明の他の生体試料標本の作製方法は、ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に生体試料を充填する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切する工程、得られた該薄切片を固相マトリクス上に乗せる工程、該薄切片の周囲に形成された包埋剤を溶融させる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含し、該薄切片を固相マトリクス上に乗せる工程が、先端に筒状の刃部を有する切断具を該薄切片に押し付けて、該生体試料の周囲に包埋剤が配置された切断片を得る工程、該切断片の包埋剤に静電気を付与して、該切断具の刃部に付着した状態で該切断片を固相マトリクス上へ移動する工程、該包埋剤に付与した静電気を開放して該切断片を固相マトリクス上に載せる工程、を包含する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、以下の効果を奏する。
【００３０】
先端に筒状の刃部を有する切断具を薄切片に押し付けて、組織の周囲にパラフィンが配置された切断片を得、該切断片のパラフィンに静電気を付与して、該切断具の刃部に付着した状態で該切断片をスライドガラス上へ移動させ、該パラフィンに付与した静電気をアースし又は上記とは逆の電荷を付与して該切断片をスライドガラス上に載せることにより、切断の際に薄切片に生じる皺、縮み、破れなどの不具合の発生を抑え、高度な技術を持った熟練者でなくても、容易に安定した品質の薄切片の切り出しを行うことができる。また、両手を同時に使う必要がなくなる上に、非常に取り扱い易い。この切断具を用いることにより、薄切片作製作業を自動化することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔に組織を充填し、スライスした工程を示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に示す薄切片を切断具にて切断している状態の断面図である。
【図３】図３は、切断具の刃部に付着した切断片をスライドガラス上へ移動する状態を示す説明図である。
【図４】図４は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の分解斜視図である。
【図５】図５は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置した状態の断面である。
【図６】図６は、ガラス基板上に弾性層を設けた状態の断面図である。
【図７】図７は、本発明の生体試料標本の作製方法の他の実施形態の作用説明図である。
【図８】図８は、従来例の作用説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００３３】
図１に示すように、パラフィンブロック２に通孔４を形成し、該パラフィンブロック２の通孔４内に組織を充填する。パラフィンブロック２は、通常は直方体状である。パラフィンブロック２に、通孔４を１個形成するのがよく、その断面形状は限定されるものではないが、円形、矩形などであり得る。好ましくは円筒状の通孔４である。
【００３４】
次に、組織に円筒状の針部材を刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出して、上記パラフィンブロック２の通孔４内に充填する。
【００３５】
具体的には、腫瘍などの生体試料標本から針部材を用いて細長い組織試料を獲得する。組織試料は、生体試料標本の関心対象の領域から採取することができる。試料は円筒形の試料がよく、円筒形の試料は長さ約1〜4mmで、直径約0.1〜4mmとすることができる。採取した試料は、例えば、核酸の分析を妨害しないように（エタノール固定などの方法で）保存することができる。
【００３６】
このようにして、パラフィンブロック２にて組織８が包埋された固形試料１０が得られる。
【００３７】
次に、この固形試料１０を切断刃によって薄切する。
【００３８】
この工程は、従来より使用されているミクロトームを使用することができる。固形試料１０をミクロトームにかけて薄切を行い、通常、２〜４μｍの厚さの薄切片１２が得られる。図１に示すように、薄切片１２は、パラフィン片のほぼ中央に薄い組織８が配置された状態である。
【００３９】
この薄切片１２を切断具１４によって切断して切断片１８を調製すると共に、該切断片１８を、以下のようにして、スライドガラス２４上に乗せる。
【００４０】
本発明に使用する切断具１４は、ペン型に構成された切断具本体１５を有し、その先端部に筒状の刃部１６が設けられている。該刃部１６は、円筒状に形成され、その直径は薄切片１２における組織８の外径より大きく設定されている。切断具本体１５には、刃部１６を通じて切断片１８のパラフィンに静電気を付与できる電荷付与部２０およびスイッチなどの制御部２２が設けられている。この制御部２２を操作することにより、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、あるいはパラフィンの静電気を開放（アースし、又は逆電荷を付与）できるように構成されている。
【００４１】
切断具１４は手動で取り扱いできるように構成してもよく、あるいは自動昇降装置に取り付け、自動的に上下駆動できるように構成してもよい。この場合には、切断具１４を水平方向へも自動的に駆動できるように構成するのがよい。
【００４２】
切断具１４を用いて薄切片１２を切断し、およびスライドガラス２４へ移動するには次のように行う。
【００４３】
図２に示すように、切断具１４の下方位置において該薄切片１２の下側にゴムシートなどの柔軟性シート２６を配置する。
【００４４】
切断具１４を薄切片１２に押し付け、パラフィンの略中央に組織８が配置された切断片１８を得る。ここで、切断具１４の刃部１６は組織８を切断しないようにする。切断片１８の周囲にはパラフィンが組織８から延出している。
【００４５】
次に、切断具１４の制御部２２を操作することにより、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、切断片１８を切断具１４の先端に付着した状態で切断片１８をスライドガラス２４上へ移動する（図３）。
【００４６】
切断片１８がスライドガラス２４上に乗ったときに、切断具１４の制御部を操作し、パラフィンに付与した静電気を開放して切断片１８をスライドガラス２４上へ載置する。
【００４７】
スライドガラス２４上には、切断片１８との付着性を高めるために、シランコート又はリジンコートが施されているのが良い。
【００４８】
次に、定法に従って、切断片１８のパラフィンを除去する（脱パラフィン工程）。すなわち、キシレン，アルコール，水の入った槽に、切断片１８が付着したスライドガラス２４とを順次浸漬し、脱パラフィンが行われる。
【００４９】
次いで組織８を染色する（染色工程）。
【００５０】
染色工程は、図４および図５に示す抗体投入用器具２８を用いて実施することができる。
【００５１】
すなわち、複数の組織８が配置されたスライドガラス２４上に抗体投入用器具２８を配置する。この器具２８は、矩形状の基板２７の各組織８に対応する位置に通孔３０を設けて構成されている。基板２７の両側部には留め具３１が回動可能に取り付けられており、スライドガラス２４上に器具２８を配置した後、留め具３１を回動してスライドガラス２４に固定することで、器具２８の各通孔３０によってスライドガラス２４上に凹部３２が形成される。この凹部３２内に各種の抗体溶液が投入され組織８の反応に供される。
【００５２】
図６に示すように、スライドガラス２４の表面には、予めシリコンゴムなどの弾性層２６を形成しておくのが好ましい。スライドガラス２４上には弾性層２６が形成されているので、各凹部３２内の抗体溶液が漏れ出したり、隣接する凹部３２内の抗体溶液が混合することがない。
【００５３】
所定の染色液で染色を行った後、封入剤を滴下した後、カバーガラスをかぶせる封入工程を経て、組織観察用の薄切片試料が作製される。
【００５４】
このようにして、染色後に顕微鏡などを用いて、標的分析物質を決定することにより、それに対する特異的結合物質も決定される。
【００５５】
なお、図７は、他の実施形態を示したものである。
【００５６】
上記実施形態では、針部材を組織に刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出すようにしたが、図７に示すように薄切りした組織をロール状に巻いて、このロール状の組織をパラフィンブロックの通孔に充填してもよい。
【００５７】
すなわち、パラフィンブロックに通孔を形成し、その通孔内に組織を充填してパラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料４０を作成する。次に、この固形試料４０を図８に示すように、切断刃４４によって薄切し該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片４１を得る。この薄切片４１をロール状に巻き、この長尺なロール４２を適宜寸法に切断して所定寸法の組織の筒状体４５が得られる。
【００５８】
この組織の筒状体４５を、上記したようにパラフィンブロック２の通孔４内に配置する。この実施形態では、パラフィンブロック２に複数の通孔４が形成されている。その後、上記のようにスライスして組織観察用薄切片が作成される。
【００５９】
なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００６０】
スライドガラス２４上には、切断片１８との付着性を高めるために、シランコート又はリジンコートが施されていても良い。
【００６１】
また、本発明で使用する固相マトリクスは、標的分析物質とそれの特異的結合物質との結合反応が起きるマトリクスであり、且つ、生成したシグナルを検出する際の基板となるものであり、前記結合反応及びシグナル検出を阻害しない限りにおいてマトリクス素材は特に限定されないが、好適には顕微鏡のスライドグラスである。
【００６２】
なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００６３】
また、本発明において固相マトリックスとは、被検生体試料を固定でき、標的分析物質と特異的結合物質とが結合反応するのに支障なく、且つ、該反応の結果生成するシグナルの検出に支障ないものである限りにおいて特に限定されない。染色後に顕微鏡を用いてシグナルを検出する場合には、顕微鏡のスライドグラスが特に好適である。
【００６４】
このようにして、染色後に顕微鏡などを用いて、標的分析物質を決定することにより、それに対する特異的結合物質が決定される。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、次のような特異的結合物質に対して、組織、細胞などの生体試料を染色するための生体試料標本を提供できる。
【００６６】
例えば、（１）標的分析物質が蛋白質（各種細胞蛋白質、酵素、受容体、疾患マーカー等）である場合、該蛋白質に結合性を有する各種Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ・リガンド（例えば該蛋白質を抗原とする抗体、小分子）が用いられるが、好適には抗体であり、最も好適なのはその特異性と抗体価が確認されたモノクローナル抗体である。
【００６７】
（２）標的分析物質が核酸である場合、それに対する特異的結合物質として相補的核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、抗体等が用いられるが、好適には相補的核酸分子であり、かかる核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することが可能である（例えばＦＩＳＨ法）。
【００６８】
（３）標的分析物質が非ペプチド性物質（例えば脂質、糖鎖、金属等）である場合、該物質に対する特異的結合物質としては該物質に対する特異的抗体を用いるのが好適である。また、糖鎖の検出においては、例えばレクチンを特異的結合物質として使用すれば検出が容易である。
【符号の説明】
【００６９】
２    バラフィンブロック
４    通孔
８    組織
１０  固形試料
１２  薄切片
１４  切断具
１８  切断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図７】
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