(57)【要約】【課題】（１）細胞培養・細胞増殖のさらなる大量高速化、（２）「piPS細胞)技術」にうよるiPS細胞の実用的な大量取得（量産）。【解決手段】培養液にマイクロバブラーで気体バブリングさせた組成物。好適なマイクロバブルの懸濁状態を形成し、（１）（２）の課題を解決した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて製造する、細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、
微小気泡発生器の液体吸引手段、液体吐出手段をともに細胞培養液内に入れ、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡となし、液体吐出手段に連続的に吐出される操作で得た微小気泡含有の細胞培養用組成物。
【請求項２】
複数の気体供給手段、気体の選択手段、選択された気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて製造する、細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、
微小気泡発生器の液体吸引手段、液体吐出手段をともに細胞培養液内に入れ、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体の選択手段で時間的に順次に選択された複数の気体を気体吸引手段から吸引し、該複数の気体を微小気泡となし、液体吐出手段に時間的に順次連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物。
【請求項３】
気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体をそれぞれ具備した複数の微小気泡発生器を用いて製造する、細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、
複数の微小気泡発生器の複数の液体吸引手段、複数の液体吐出手段をすべて細胞培養液内に入れ、複数の微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、複数の気体吸引手段から吸引した複数の気体を微小気泡となし、複数の液体吐出手段に連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物。
【請求項４】
請求項１から請求項３いずれかの組成物において、
さらに濁度を透過光または散乱光測定方式で測定する濁度センサーが細胞培養液の濁度を測定すべく配設され、該センサーによって得られる細胞培養液の濁度の変化に基づいて、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作を制御することで、該操作前の細胞培養液が示す濁度値に対して大きい所望の濁度値となるまで操作を実施して得た組成物。
【請求項５】
請求項１から請求項３いずれかの組成物において、
微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作の前に細胞培養液中に観測可能な流体マーカを混入し、操作中に該マーカが、微小気泡発生器を２回以上の所望の回数通過するまで操作を実施して得た組成物。
【請求項６】
気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物を製造する装置であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、
微小気泡発生器の液体吸引手段の先端部分、液体吐出手段の先端部分がともに入る大きさ、かつまた、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡となし、液体吐出手段に連続的に吐出される操作が可能な細胞培養液の量が保持できる容量の細胞培養液容器を有する組成物製造装置。
【請求項７】
複数の気体供給手段、気体の選択手段、選択された気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物を製造する装置であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、
微小気泡発生器の液体吸引手段の先端部分、液体吐出手段の先端部分がともに入る大きさ、かつまた、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体の選択手段で時間的に順次に選択された複数の気体を気体吸引手段から吸引し、該複数の気体を微小気泡となし、液体吐出手段に時間的に順次連続的に吐出される操作が可能な細胞培養液の量が保持できる容量の細胞培養液容器を有する組成物製造装置。
【請求項８】
気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体をそれぞれ具備した複数の微小気泡発生器を組合わせてなる細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物を製造する装置であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、
複数の微小気泡発生器の複数の液体吸引手段の先端部分、複数の液体吐出手段の先端部分がすべて入る大きさ、かつまた、複数の微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、複数の気体吸引手段から吸引した複数の気体を微小気泡となし、複数の液体吐出手段に連続的に吐出される操作が可能な細胞培養液の量が保持できる容量の細胞培養液容器を有する組成物製造装置。
【請求項９】
請求項６から請求項８いずれかの組成物製造装置において、
細胞培養液容器に、濁度を透過光または散乱光測定方式で測定する濁度センサーが細胞培養液の濁度を測定すべく配設され、該センサーによって得られる細胞培養液の濁度の変化に基づいて、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作を制御する手段が、さらに具備され、該操作前の細胞培養液が示す濁度値に対して大きい所望の濁度値となるまで操作を制御する組成物製造装置。
【請求項１０】
請求項６から請求項８いずれかの組成物製造装置において、
微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作の前に細胞培養液中に観測可能な流体マーカが混入され、細胞培養液の流動経路の少なくとも１つの箇所に細胞培養液中に混入した流体マーカの検知器が配設され、該流体マーカ検知器によって得られる細胞培養液の循環回数に基づいて、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作を制御する手段が、さらに具備した組成物製造装置。
【請求項１１】
請求項１から請求項５のいずれかに記載された微小気泡含有組成物、を用いた細胞変化促進方法であって、
気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を調整する工程、および、かかる細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を対象細胞に接触させる工程を有する細胞変化促進方法。
【請求項１２】
請求項１から請求項５のいずれかに記載された微小気泡含有組成物、を用いた細胞変化促進方法であって、
気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて微小気泡含有細胞培養用組成物を調整する工程、該微小気泡含有細胞培養用組成物に細胞変化促進物質を混入する工程、および、かかる細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を対象細胞に接触させる工程を有する細胞変化促進方法。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２の細胞変化促進方法において、
細胞変化促進物質が、対象細胞の自然生育環境に存在する物質、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する物質、および／または、生体内産生物質である細胞変化促進方法。
【請求項１４】
請求項１１または請求項１２の細胞変化促進方法において、
気体吸引手段に接続された気体供給手段をさらに具備し、該気体が対象細胞の自然生育環境に存在する気体種、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する気体種である細胞変化促進方法。
【請求項１５】
請求項１１から請求項１３のいずれかに記載された微小気泡含有組成物を用いた細胞変化促進方法であって、
対象細胞の細胞膜を物理的および／または化学的に部分破壊する細胞膜の部分破壊工程をさらに含む細胞変化促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として細胞膜に刺激を与え、かかる細胞を利用する者にとって有効な変化を細胞に醸成促進させる組成物に関する、その組成物の製造装置に関する、その組成物の利用方法に関するものである。
【０００２】
以上の記述は、やや漠然としているが、「有効な変化を細胞に醸成促進」を「細胞培養の促進」「細胞増殖の促進」あるいは「ｉＰＳ化の促進」に置換すれば、その意味は明確になるだろう。
【０００３】
一方、いわゆる「マイクロバブル」には通常の気泡とは異なった性質がある、とされている。この「マイクロバブル」には、低濃度タイプ：直径が30μm 付近に分布のピークがあり、気泡濃度としては数百個/mL 程度。見た目は水が少し曇った状態のもの。および、高濃度タイプ：10μm 付近に気泡分布のピークがあり、気泡個数は数千個/mL 以上。見た目は牛乳のような状態のものがある。 
【０００４】
本発明の組成物には、この「マイクロバブル」が含有され、かかる気泡が細胞膜に刺激を与え、細胞膜での物質取り込み（エンドサイト−シス）を促進し、その結果として、（１）細胞培養に要する時間短縮、（２）通常細胞iPS化のための物質取り込みを促進し、iPS細胞（誘導多能性幹細胞）獲得歩留まり向上、その他の産業上有効な効果を得るためのものである。
【０００５】
ここで、前記の「マイクロバブル」２種：低濃度タイプ（30μm）、高濃度タイプ（10μm）による経験的差異は、概して、高濃度タイプ（10μm）の与える種々の効果の方が、低濃度タイプ（30μm）のそれよりもはるかに大きいということである。
【０００６】
ゆえに本発明の実施の際も同様であり、高濃度タイプ（10μm）にて実施するのがよりよい効果を与える。
【０００７】
高濃度タイプ（10μm）マイクロバブルを生成する技術は、たとえば、特許文献６に記載されている。それに対し、低濃度タイプ（30μm）あるいは、さらにバブル径が大きな低級（ミリスケール）タイプの技術が特許文献７および特許文献８に記載されている。
【０００８】
特許文献７および特許文献８には、本発明と同じコンセプトである「微細気泡による細胞培養」の記述が散見されるものの、バブル径が本発明のものよりはるかに大きいこと、エンドサイトーシスなどの用語で細胞膜に対する明確な現象把握をなしえていないこと、の２点から本発明の特許性を損なうものではない。
【０００９】
細胞培養は、実験研究および実用的細胞量産にて無数の実施態様がある。一例を厳選して挙げるなら、あとで述べるiPS細胞研究のための皮膚細胞の培養、味噌・醤油・酒その他に多種かつ大量の実用用途がある酵母の培養が挙げられる。
【００１０】
かかる細胞培養においては、いかにして細胞に、栄養分および酸素等のエネルギー獲得に要する分子を、多量、かつ、迅速に取込ませるか、が必要条件である。ここで、細胞の物質取り込みを「エンドサイトーシス」という用語で記載することにする。
【００１１】
市販の培養液は、おおまかな対象細胞群ごとに個別商品化されている。これらは多くの試行錯誤から、その対象細胞の細胞膜におけるエンドサイトーシスが頻繁かつ迅速に起こるものをスクリーニングして得られた組成物である。
【００１２】
しかし、エンドサイトーシスの条件は細胞によって大きく異なる。おおまかな対象群ごとに最小公倍数的にブレンドされた市販培養液は、個別の対象細胞ごとに、こまかなチューニングが必要だろう
だが、チューニングは、適切な方法論（技術）がなく、費用対効果が不明であることから、実施されることはほとんどなかった。一方、実際の培養対象細胞は無限にあるので、市販培養液と理想的培養環境（養分を含む）とは、小さからぬ乖離があった。
【００１３】
たとえば、ある酵母が通常の培養条件よりもやや多目、すなわち、高濃度の酸素下のほうが好ましい、と推察されていても、酸素圧を上げる設備は高価であるし、簡便な低級（ミリスケール）タイプの酸素バブリングでは、酸素濃度不均一；一部では貧酸素、一部では必要以上に豊酸素となってしまって望む効果が得られていなかった。
【００１４】
こういった細胞培養環境の理想からの乖離は、迅速性を要する実験研究の大きなネックであり、細胞培養に費やされるバイオ系実験のヘッドロスタイムは大きいまま放置されている。本発明は、この問題を解決する適切な方法論を提供する。
【００１５】
一方、受精卵をもちいないので倫理的が問題がないiPS細胞（誘導多能性幹細胞）の再生医療上における重要性はいうまでもない。皮膚など増殖旺盛な通常細胞、その他の細胞をもちいてiPS細胞を得る実験的な試みがなされている。（前記のごとく、ここでも皮膚細胞等の大量かつ高速な培養増殖のニーズがある）
iPS細胞の獲得について、特許文献１から特許文献５の、いわゆる山中技術が開示されている。この技術は、通常細胞のiPS化のため、４つの遺伝子（Oct3/4・Sox2・Klf4・c-Myc）を用いる。これらは発見者の名を取り「山中因子 (Yamanaka factors)」とも呼ばれている（図５参照）。
【００１６】
しかしながら、iPS化のための遺伝子が通常細胞の染色体DNAに組み込まれるため、かかる染色体が体内に湧出し、他の細胞をがん化させる危険性がある。
【００１７】
その問題を解決すべく、非特許文献１は、遺伝子を用いずにiPS細胞を樹立した最近の論文で、合成化合物によるiPS細胞樹立の研究で注目されたスクリプス研究所のSheng Dingらのグループの成果である。すなわち、遺伝子を用いない、安全かつ効率的な「蛋白質によるiPS化」の技術である。
【００１８】
この技術は、山中因子遺伝子がコードする蛋白質（リコンビナント蛋白質）をもちいる、ということがアイデアの核心である。非特許文献１の論文筆者ら、は、protein-induced pluripotent stem cells (piPS細胞)の技術と命名した。
【００１９】
しかしながら、「piPS細胞の技術」でも、かかる蛋白質が核内になかなか取り込まれない。現在の公開情報から、山中因子遺伝子では、通常細胞１００個に１個、piPS細胞の技術では、１０００個に１個のiPS細胞が得られている。ゆえにいまのところ、山中遺伝子法が１０：１で蛋白質によるiPS化法に対して勝利している。
【００２０】
とはいえ、山中遺伝子法には前述の癌化等欠点があるので、蛋白質によるiPS化法（piPS法）にて、核内への蛋白取込を向上させ、実用において蛋白質によるiPS化法を勝利に導く技術が求められている。
【特許文献１】再公表07-69666号公報「核初期化因子」 国立大学法人京都大学
【特許文献２】特開2009-165478号公報「誘導多能性幹細胞の製造方法」国立大学法人京都大学
【特許文献３】特開2009-165479号公報「誘導多能性幹細胞を製造するための核初期化因子の使用」国立大学法人京都大学
【特許文献４】特開2009-165480号公報「誘導多能性幹細胞およびその製造方法」国立大学法人京都大学
【特許文献５】特開2009-165481号公報「誘導多能性幹細胞からの体細胞の製造方法」国立大学法人京都大学
【特許文献６】特許第３６２０７９７号公報「微細気泡発生装置」アイピーエムエス
【特許文献７】特許第２７６２３７２号公報「微細気泡発生装置」小松製作所
【特許文献８】特公平５-６０３５３号公報「液中通気による培養方法及び培養装置」日立製作所
【非特許文献１】Hongyan Zhou et．al 「Generation of iPS-Cell Using Recombinant Proteins」Cell Stem Cell 4, May 8, 2009
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の第一の課題は、（１）細胞培養・細胞増殖のさらなる大量高速化のための培養液組成の提示であり、本発明の第二の課題は、（２）「piPS細胞)技術」すなわち「蛋白によるiPS化」法において、かかる蛋白質が核内になかなか取り込まれない、という問題を解決する組成物の提示である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、最近になって研究が活発化している「マイクロバブル」が、（１）細胞培養・細胞増殖、（２）iPS化のための特定蛋白の取り込みに、促進方向の影響を与えている、と着想した。
【００２３】
牡蠣など貝類や魚類養殖場で、海中マイクロバブル・バブリングすると、かかる貝類・魚類の成育が飛躍的によくなることが知られている。また、皮膚にマイクロバブル水を接触させ、皮下の血流を測定すると、血流量が増大することも知られている。
【００２４】
これらの事実は、細胞レベルにおいて。マクロバブルがなんらかのバイオロジカルな影響を体表に与えていることを示唆している。その影響機序は、現時点では研究中で明らかでない。
【００２５】
本発明の発明者は、こういった実験・経験的事実から、マイクロバブルが細胞膜のエンドサイトーシス、さらには、細胞内の核膜の物質取込みに対し、促進作用がある、と推論した。
【００２６】
エンドサイトーシスでは、細胞膜近傍のマイクロバブルが、細胞に対してより活発な活動と増殖促進のシグナルを与え、より多くの酸素・栄養素が細胞膜を通過し、細胞内でエネルギーを生成する。その結果、細胞培養・高速化が実現する、と推論した。
【００２７】
核膜の物質取込みはエンドサイトーシス（細胞膜通過）が条件である。山中因子遺伝子がコードする蛋白質（リコンビナント蛋白質）が、まずエンドサイトーシスにて細胞膜から侵入、細胞内のリコンビナント蛋白濃度を上昇させ、単純な核内拡散、あるいは、細胞内侵入した微小気泡によるなんらかの促進作用で核内に取込まれる。
【００２８】
その結果、現状１０００個に１個の「piPS細胞)技術」によるiPS細胞獲得率が飛躍的に向上するだろう、と推論した。
【００２９】
さて、請求項の順に本発明を特定する。請求項１から請求項５は、プロダクト・バイ・プロセスによる組成物のクレーム、請求項６から請求項１０は、前記組成物に対応した装置である。
【００３０】
まず組成物の第一クレームは（請求項１）、気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて製造する、細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、微小気泡発生器の液体吸引手段、液体吐出手段をともに細胞培養液内に入れ、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡となし、液体吐出手段に連続的に吐出される操作で得た微小気泡含有の細胞培養用組成物である。
【００３１】
ここで、その粒径が１０μｍ以下（高濃度タイプ）のほうが効果が顕著である。粒径が１０μｍ以下（高濃度タイプ）のマイクロバブルを得るには、たとえば特許文献６の技術をもちいればよい。
【００３２】
これに対応した装置は（請求項６）、気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物を製造する装置であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、微小気泡発生器の液体吸引手段の先端部分、液体吐出手段の先端部分がともに入る大きさ、かつまた、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡となし、液体吐出手段に連続的に吐出される操作が可能な細胞培養液の量が保持できる容量の細胞培養液容器を有する組成物製造装置である。
【００３３】
次に（請求項２）、複数の気体供給手段１１、気体の選択手段１２、選択された気体吸引手段１３、液体吸引手段１４、液体吐出手段１５、および、微小気体を生成する本体１６を具備した微小気泡発生器１０を用いて製造する、細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、微小気泡発生器１０の液体吸引手段１４、液体吐出手段１５をともに細胞培養液内に入れ、微小気泡発生器１８へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体の選択手段１２で時間的に順次に選択された複数の気体を気体吸引手段１３から吸引し、該複数の気体を微小気泡となし、液体吐出手段１５に時間的に順次連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物である。
【００３４】
これに対応した装置は（請求項７  図１参照）、  複数の気体供給手段１１、気体の選択手段１２、選択された気体吸引手段１３、液体吸引手段１４、液体吐出手段１５、および、微小気体を生成する本体１６を具備した細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物を製造する装置であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、微小気泡発生器１０の液体吸引手段の先端部分１４、液体吐出手段の先端部分１５がともに入る大きさ、かつまた微小気泡発生器１８へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体の選択手段１２で時間的に順次に選択された複数の気体を気体吸引手段１３から吸引し、該複数の気体を微小気泡となし、液体吐出手段１５に時間的に順次連続的に吐出される操作が可能な細胞培養液の量が保持できる容量の細胞培養液容器を有する組成物製造装置である。
【００３５】
図１で、複数の気体例、Ｏ2（酸素）、Ｎ2（窒素）、ＣＯ2（二酸化炭素）を例示している。
【００３６】
培養に適するガス環境は、動物細胞ではＯ2（酸素）リッチ、植物細胞ではＣＯ2（二酸化炭素）リッチと推定される。しかし、重要で高価な細胞培養は例外として、このような、ごく簡単な推定ですら細胞培養技術に、あまり反映されていない。
【００３７】
この請求項７（図１）の装置は、個々の細胞種の最適ガス環境を研究するのにも有効である。
【００３８】
もっとも、直接的には、バブルガス環境の最適条件を追求できる。その条件再現は比較的容易であるので、一度条件を取得すれば、かかる細胞にて高速培養が実現できる。
【００３９】
請求項８（図２）の装置も、請求項７（図１）の装置類似の機能を有する。
【００４０】
これは（請求項８）、気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体をそれぞれ具備した複数の微小気泡発生器を用いて製造する、細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、複数の微小気泡発生器の複数の液体吸引手段、複数の液体吐出手段をすべて細胞培養液内に入れ、複数の微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、複数の気体吸引手段から吸引した複数の気体を微小気泡となし、複数の液体吐出手段に連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物である。
【００４１】
順序が逆になったが、該装置による組成物は（請求項３）、気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した細胞変化を促進する微小気泡を含有する組成物を製造する装置であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、微小気泡発生器の液体吸引手段の先端部分、液体吐出手段の先端部分がともに入る大きさ、かつまた、微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡となし、液体吐出手段に連続的に吐出される操作が可能な細胞培養液の量が保持できる容量の細胞培養液容器を有する組成物製造装置である。  
【００４２】
また、実施態様として、濁度センサーを利用して（請求項９）、細胞培養液容器に、濁度を透過光または散乱光測定方式で測定する濁度センサー１７が細胞培養液の濁度を測定すべく配設され、該センサーによって得られる細胞培養液の濁度の変化に基づいて、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作を制御する手段が、さらに具備され、該操作前の細胞培養液が示す濁度値に対して大きい所望の濁度値となるまで操作を制御するのが望ましい。
【００４３】
濁度センサーによって、マイクロバブルの濃度がより定量的に把握される。濁度系兼備の装置で製造した組成物は（請求項４）さらに濁度を透過光または散乱光測定方式で測定する濁度センサーが細胞培養液の濁度を測定すべく配設され、該センサーによって得られる細胞培養液の濁度の変化に基づいて、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作を制御することで、該操作前の細胞培養液が示す濁度値に対して大きい所望の濁度値となるまで操作を実施して得た組成物である。
【００４４】
また別の実施態様として、流体マーカを利用して（請求項１０）、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作の前に細胞培養液中に観測可能な流体マーカが混入され、細胞培養液の流動経路の少なくとも１つの箇所に細胞培養液中に混入した流体マーカの検知器が配設され、該流体マーカ検知器によって得られる細胞培養液の循環回数に基づいて、微小気泡発生器へ細胞培養液を吸引しつつ気体吸引手段から吸引した気体を微小気泡化して液体吐出手段に連続吐出するという一連の操作を制御する手段が、さらに具備したものであってもよい。
【００４５】
さらに、請求項１１から請求項１４に微小気泡含有組成物を用いた細胞変化促進方法を記載した。細胞変化促進物質を混入本発明の培養液に混ぜて細胞変化を促進する
すなわち（請求項１１：図３参照）、気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を調整する工程、および、かかる細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を対象細胞に接触させる工程を有する細胞変化促進方法である。
【００４６】
ここでいう細胞変化の典型例が、細胞分裂を促進された内部状態であること、あるいは、細胞のiPS化である。
【００４７】
また（請求項１２：図４参照）、気体吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて微小気泡含有細胞培養用組成物を調整する工程、該微小気泡含有細胞培養用組成物に細胞変化促進物質を混入する工程、および、かかる細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を対象細胞に接触させる工程を有する細胞変化促進方法である。
【００４８】
さらに上記２つの方法において（請求項１３）、細胞変化促進物質が、対象細胞の自然生育環境に存在する物質、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する物質、および／または、生体物質である細胞変化促進方法となる。
【００４９】
ここにおいて、対象細胞の自然生育環境に存在する物質・対象細胞中の生体反応に寄与する物質・生体内産生物質を例示すると、遺伝子・酵素・補酵素・助酵素および遺伝子によって生合成されるリコンビナント蛋白質およびアミノ酸・ぺプチド・糖鎖などが挙げられる。
【００５０】
特にホットな研究課題として注目されるのは、生体物質を、山中因子遺伝子がコードする蛋白質（リコンビナント蛋白質）として、細胞変化を通常細胞のiPS細胞化として、この変化を促進する課題であろう。本発明は、この研究課題に大きな進展を与えるものである。
【００５１】
また（請求項１４）、気体吸引手段に接続された気体供給手段をさらに具備し、該気体が対象細胞の自然生育環境に存在する気体種、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する気体種である。
【００５２】
典型的には、気体は酸素（Ｏ2）、窒素（Ｎ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）である。
【００５３】
また本発明の方法は（請求項１５）、対象細胞の細胞膜を物理的および／または化学的に部分破壊する細胞膜の部分破壊工程と組合わせて実施してよい。
【００５４】
すなわち公知の、ニードルによる細胞膜穿刺、エレクトフォレシス現象による細胞膜電気化学流動による脆弱化、超音波による細胞膜の物理振動破壊による細胞膜部分破壊と組合わせて実施してよい。
【００５５】
また最近の膜部分破壊に関する研究成果、たとえば、対象細胞が保持される容器等の環境全体の圧力を大気圧以外に制御して、膜近傍の気体の容積変化によって物理的に細胞膜を部分破壊する手法も有効性が確かめられている。
【００５６】
すなわち、高圧時にバブルを混入すると、そのバブルは、静電チャージから細胞膜近傍に誘引される。その誘引移動のあとで対象細胞が保持される容器等の環境全体の圧力を相対的に減じる。すると、バブルが膨張・爆発を起こし近傍細胞膜を部分破壊する。
【００５７】
本発明は、こうといった手法との組合わせで種々の細胞変化に関する相乗効果が得られるものである。
【発明の効果】
【００５８】
本発明によって、（１）細胞培養・細胞増殖のさらなる大量高速化、（２）「piPS細胞)技術」すなわち「蛋白によるiPS化」法において、かかる蛋白質の核内取込み率を向上させiPS細胞の実用的な大量取得（量産）が可能となった。
【００５９】
また、本発明、たとえば図１のような装置にてデータを採取すれば、対象細胞個別の最適ガス環境がより明確化され、その知見を細胞培養時間圧縮に反映させることができる。
【００６０】
また、培養液中のマイクロバブルは、すぐに上昇散逸してしまうミリスケール・バブルと異なり、比較的拡散均一化するので、細胞培養のシャーレなどの狭い培養空間なら増殖が偏在しにくい。これも実験研究の条件一般化の要請に好ましい特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本案発明請求項７の複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物製造装置の模式図。
【図２】本案発明請求項８の複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物製造装置の模式図。
【図３】本案発明請求項１１の微小気泡含有組成物を用いた細胞変化促進方法の実施態様例の模式図であって、（ａ）（ｂ）が、微小気泡発生器を用いて細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を調整する工程、（ｃ）が細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物を対象細胞に接触させるためピペッタで接触用組成物を吸引している。
【図４】本案発明請求項１２の微小気泡含有組成物を用いた細胞変化促進方法の実施態様例の模式図であって、（ａ）（ｂ）が微小気泡発生器を用いて微小気泡含有細胞培養用組成物を調整する工程、（ｃ）が微小気泡含有細胞培養用組成物に細胞変化促進物質を混入する工程。
【図５】細胞変化促進物質の例：細胞をｉＰＳ化するための山中因子遺伝子、および、アルギニン。アルギニンは核内への物質伝達にプラス方向の影響を与える。
【符号の説明】
【００６２】
１    細胞培養液（の原料）
２    細胞変化促進物質
３    本発明の細胞変化促進物質を混入した微小気泡含有細胞培養用組成物
４    気体吸引手段
１０  微小気泡発生器
１１  複数の気体供給手段（のひとつ）
１２  気体の選択手段
１３  選択された気体吸引手段
１４  １０の液体吸引手段（の先端部分）
１５  １０の液体吐出手段（の先端部分）
１６  微小気体を生成する本体
１７  濁度を透過光または散乱光測定方式で測定する濁度センサー
１８  細胞培養液容器
２０  複数の微小気泡発生器（のひとつ）
２１  ２０の複数の液体吸引手段の先端部分（のひとつ）
２２  ２０の複数の液体吐出手段の先端部分（のひとつ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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