(57)【要約】【課題】歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞に滑らかに並ぶ歯組織再生を図る非抜歯根管充填材を提供する。【解決手段】非抜歯根管充填材２００は、歯髄幹細胞２２０及び細胞外基質２１０を有し、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される。歯髄幹細胞は、例えば歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞である。根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子、及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させることが好ましい。【選択図】図３Ｃ
2011078752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有することを特徴とする非抜歯根管充填材。
【請求項２】
前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１記載の非抜歯根管充填材。
【請求項３】
前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることを特徴とする請求項２記載の非抜歯根管充填材
【請求項４】
前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の非抜歯根管充填材。
【請求項５】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ−ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項４記載の非抜歯根管充填材。
【請求項６】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項４記載の非抜歯根管充填材。
【請求項７】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項４記載の非抜歯根管充填材。
【請求項８】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の非抜歯根管充填材。
【請求項９】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の非抜歯根管充填材。
【請求項１０】
抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有する非抜歯根管充填材を注入することで、根管内の歯組織を再生することを特徴とする非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１１】
前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１０記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１２】
前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることを特徴とする請求項１１記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１３】
前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることを特徴とする請求項１０乃至１２の何れか１項に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１４】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ−ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項１３記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１５】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項１３記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１６】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項１３記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１７】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることを特徴とする請求項１０乃至１６の何れか１項に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１８】
前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにすることを特徴とする請求項１０乃至１７の何れか１項に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【請求項１９】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１０乃至１８の何れか１項に記載の非抜歯による歯組織再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非抜歯の根管に充填される非抜歯根管充填材、及び、その非抜歯根管充填材を使用する非抜歯における歯組織再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、歯を失う原因は、破折を含めると約半分がう蝕によるもので、歯髄を抜くと歯を失う可能性が激増することが知られている。
【０００３】
歯の平均寿命は現在５７歳といわれ、一生自分の歯で咬むことを考えると、歯の寿命は２０年以上高める必要がある。８０２０運動（８０歳になっても自分の歯を２０本以上残す運動）にもかかわらず、現在８０歳の人の歯の平均本数は約８本で、高齢者の残存歯数はほとんど増加しておらず、う蝕治療の抜本的改革が必要である。
【０００４】
歯の歯髄を除去（抜髄）すると、修復象牙質形成能及び感染防御機構が喪失し、痛みという警告信号の喪失により、う蝕拡大の危険性が増加する。また、抜髄治療に完璧な方法はなく、抜髄・根管充填後、歯冠側からの漏えいにより根尖病巣が生じたり、垂直性破折や審美性の消失、術後疼痛の可能性もある。
【０００５】
従って、超高齢社会では、安易に抜髄を行うことを避け、歯の延命化をめざして、歯再生医療技術を組み入れた象牙質・歯髄再生による新しいう蝕・歯髄炎治療法を開発することは非常に重要である。
【０００６】
象牙質再生に関しては、細胞治療法あるいは遺伝子治療法として、生体外で歯髄幹細胞／前駆細胞にBMP (Bone morphogenetic proteins, 骨形成因子)等の蛋白質あるいは遺伝子を導入し、三次元培養して分化した象牙芽細胞をその細胞外基質とともに生活歯髄切断面上に自家移植し、大量の象牙質を再生させることができる（非特許文献１及び２）。
【０００７】
しかしながら、歯髄炎が生じている場合には、象牙質ばかりでなく、歯髄組織そのものも再生させる必要がある。
【０００８】
一方、歯髄組織は非常に血管と神経に富む組織である。歯髄は創傷を受けると局所から遊走因子が放出され、歯髄深部血管周囲から幹細胞が創傷部に遊走し、増殖・分化し、血管が新生され、修復象牙質が形成される自然治癒メカニズムが存在する。特に歯髄の血管系は栄養や酸素の供給源、代謝産物の排出路、歯髄の恒常性維持に重要である。また、歯髄神経は血流・象牙細管内溶液の流れ・歯髄内圧の調節に重要な役割を有し、血管新生、免疫応答細胞あるいは炎症性細胞浸潤に関与して炎症を調節し、歯髄の恒常性の維持、歯髄防御反応の強化に寄与する。よって、象牙質・歯髄再生においては血管と神経の相互作用及び血管新生・神経再生を考慮する必要がある。
【０００９】
ＳＰ細胞はCD31-/CD146-ＳＰ細胞とCD31-/CD146+ＳＰ細胞がほぼ半々の割合で含まれ、CD31-/CD146-ＳＰ細胞は、CD31-/CD146+ＳＰ細胞に比べ、非常に有意に血管新生・神経再生・歯髄再生を促進し、Stromalcell-derived factor-1（ＳＤＦ−１）に対するケモカインレセプター、ＣＸＣＲ４ mRNAを有意に発現している。
【００１０】
皮フ等の創傷部位からはＳＤＦ−１が分泌され、ＳＤＦ−１に対するヒト幹細胞の遊走はＣＸＣＲ４の発現に依存することが知られている。ＣＸＣＲ４は幹細胞のマーカーともいわれ、ヒト臍帯血からは胚性幹細胞様細胞がCXCR4+/SSEA-4+/Oct-4+として分取されている（非特許文献３）。
【００１１】
また、マウス胎児の脳からは神経幹細胞として、中枢神経部位に遊走し顕著な神経分化能を有するCXCR4+/SSEA-1+細胞が分取されている（非特許文献４）。
【００１２】
更に、ヒト膵臓において、ＣＸＣＲ４陽性細胞は多潜能性を有し、インシュリンを分泌する細胞に分化可能な幹細胞・前駆細胞を分取するために用いることができるといわれている（非特許文献５）。
【００１３】
一方、歯髄再生に関しては、これまで、歯根未完成歯において、抜歯して抜髄・根管治療をした後に再度移植すると歯髄が再生されるといわれている。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、抜歯して徹底的な根管拡大・清掃を行い、セメント・象牙境まで血餅を満たしMineral trioxide aggregate（ＭＴＡ）で窩洞を完全封鎖することにより、歯髄様組織が再生されるとの報告がある。
【００１４】
また、イヌの健全歯根完成歯においては、抜歯後抜髄し、根尖部を切断するあるいは根尖部を１．１ｍｍ以上拡大し再び移植し、血餅を充填すると歯髄様組織の再生がみられるといわれている（非特許文献６）。
【００１５】
上述の根管内歯髄再生は、歯根未完成歯についての報告が大半であり、根管内に再生された組織が血管や神経を伴う歯髄固有の組織であることの証明もなされていない。また、すべて、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Nakashima and Reddi、2003 (PMID 12949568 doi 10.1038/nbt864)
【非特許文献２】Nakashima and Akamine、2006 (PMID 16186748)
【非特許文献３】Kucia M et al、2007 (PMID: 17136117doi:10.1038/sj.leu.2404470)
【非特許文献４】Corti S et al、2005（PMID: 16150803 doi:10.2478/v10042-008-0045-0)
【非特許文献５】Koblas T et al、2007（PMID: 17328838)
【非特許文献６】Laureys et al、2001  (PMID:11298308doi:10.1067/mod.2001.113259)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填する手法では、歯髄腔や根管内の象牙質に起こる特発性の歯質の吸収（内部吸収）が発生する場合があり、この内部吸収が大きくなると象牙質に穿孔が生じることもある。また、臨床で一般的に行われている歯根の完成した正常智歯等を他の歯喪失部位に再植する治療法については、再植後数年後に内部吸収や外部吸収による歯の動揺や脱落が生じる可能性がある。更に、歯根完成歯の場合における抜髄や感染根管治療における歯髄組織再生方法及び歯髄組織再生のための根管充填材の開発は全く確立されていない。
【００１８】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図る新規で独創的で適切な根管充填材、及び、そのような根管充填材を使用する歯組織再生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第１の観点に係る非抜歯根管充填材は、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有することを特徴とする。
【００２０】
前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。
【００２１】
前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることが好ましい。
【００２２】
前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
【００２３】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ−ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
【００２４】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
【００２５】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
【００２６】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
【００２７】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
【００２８】
また、本発明の第２の観点に係る非抜歯による歯組織再生方法は、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有する非抜歯根管充填材を注入することで、根管内の歯組織を再生することを特徴とする。
【００２９】
前記歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。
【００３０】
前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかであることが好ましい。
【００３１】
前記非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
【００３２】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ−ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
【００３３】
前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
【００３４】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、NeuropeptideY及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
【００３５】
前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
【００３６】
前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにすることが好ましい。
【００３７】
前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】第１実施形態に係る非抜歯根管充填材の説明図である。
【図２】第１実施形態に係る非抜歯根管充填材の製造工程を説明する説明図である。
【図３Ａ】歯髄炎に罹患している歯の説明図である。
【図３Ｂ】抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。
【図３Ｃ】非抜歯根管充填材を充填するところを説明する模式図である。
【図３Ｄ】スポンゼル（ゼラチン）及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図３Ｅ】歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。
【図３Ｆ】形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
【図３Ｇ】象牙質再生を示す模式図である。
【図３Ｈ】細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。
【図４Ａ】根管の歯冠側に遊走因子を付着させている非抜歯根管充填材の説明図である。
【図４Ｂ】根管の歯冠側に遊走因子を付着させ、歯冠部側に細胞外基質を残している非抜歯根管充填材の説明図である。
【図５】第２実施形態に係る非抜歯根管充填材の製造工程を説明する説明図である。
【図６Ａ】抜歯後、生体外で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入して再移植した１４日後を説明する図である。
【図６Ｂ】抜歯後、生体外で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入して再移植した１４日後における根管内部の象牙質壁の高倍像図である。
【図６Ｃ】抜歯後、生体外で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入して再移植した１４日後における歯根外側の象牙質・セメント質壁の高倍像図である。
【図７Ａ】抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後を説明する図である。
【図７Ｂ】抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＤ１０５陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後における根管内部の象牙質壁の高倍像図である。
【図８Ａ】抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＸＣＲ４陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後を説明する図である。
【図８Ｂ】抜歯せず生体内で抜髄後根管拡大して、I型・III型混合コラーゲンにＳＤＦ−１及びＣＸＣＲ４陽性細胞を吸着させて、根管内に注入した１４日後における根管内部の象牙質壁の高倍像図である。
【図９Ａ】イヌ永久歯歯髄組織から分離したフローサイトメトリーによる歯髄由来のＣＤ１０５陽性細胞の割合を示す図である。
【図９Ｂ】イヌ脂肪組織から分離したフローサイトメトリーによる脂肪由来のＣＤ１０５陽性細胞の割合を示す図である。
【図９Ｃ】イヌ永久歯歯髄組織から分離した培養３日目の初代歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。
【図９Ｄ】イヌ永久歯歯髄組織から分離した培養１０日目の初代歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。
【図９Ｅ】脂肪組織から分離した培養３日目の初代脂肪ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。
【図９Ｆ】脂肪組織から分離した培養１０日目の初代脂肪ＣＤ１０５陽性細胞を示す図である。
【図１０Ａ】３０日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪誘導能を示す図である。
【図１０Ｂ】３０日目において、未分取のトータル歯髄細胞の脂肪誘導能を示す図である。
【図１０Ｃ】３０日目において、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪誘導能を示す図である。
【図１０Ｄ】歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、未分取のトータル歯髄細胞、及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪誘導能の遺伝子発現比較を示す図である。
【図１０Ｅ】１２時間後において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の血管誘導能を示す図である。
【図１０Ｆ】１２時間後において、未分取のトータル歯髄細胞の血管誘導能を示す図である。
【図１０Ｇ】１２時間後において、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の血管誘導能を示す図である。
【図１０Ｈ】１４日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のNeurosphere形成能を示す図である。
【図１０Ｉ】１４日目において、未分取のトータル歯髄細胞のNeurosphere形成能を示す図である。
【図１０Ｊ】２８日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のニューロフィラメントによる免疫染色を示す図である。
【図１０Ｋ】歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のニューロフィラメント、neuromodulin及び電位依存性ナトリウムチャンネル、type Ia(Scn1A) mRNA 発現を示す図である。
【図１０Ｌ】２８日目において、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の象牙質・骨形成誘導能を示す図である。
【図１０Ｍ】２８日目において、未分取のトータル歯髄細胞の象牙質・骨形成誘導能を示す図である。
【図１０Ｎ】２８日目において、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の象牙質・骨形成誘導能を示す図である。
【図１０Ｏ】歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、未分取のトータル歯髄細胞、及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の象牙芽細胞への分化能の比較を示す図である。
【図１０Ｐ】ＳＤＦ−１最終濃度50ng/mlを添加した歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、分取していないトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞の増殖能を示す図であり、培養２，１２，２４，及び３６時間後の細胞数である。
【図１１Ａ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｂ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生のうちの一部拡大図である。
【図１１Ｃ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生のうちの一部拡大図である。
【図１１Ｄ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生における象牙芽細胞分化を示す図である。
【図１１Ｅ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内に歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のみを自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｆ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１のみを移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｇ】イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｈ】イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図であり、再生組織上部の新生血管を示す。
【図１１Ｉ】イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図であり、再生組織中央部の新生血管を示す。
【図１１Ｊ】正常歯髄組織の細胞を示す図である。
【図１１Ｋ】イヌの抜髄後、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植して、９０日目における、象牙質側壁に沿って新しく形成された骨様・細管象牙質(OD)に並列する象牙芽細胞を示す図である。
【図１１Ｌ】イヌの抜髄後、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植して、９０日目における、In situ hybridization分析による象牙芽細胞分化を示す図であり、Enamelysin/MMP20である。
【図１１Ｍ】イヌの抜髄後、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植して、９０日目における、In situ hybridization分析による象牙芽細胞分化を示す図であり、Dentin sialophosphoprotein(Dspp)である。
【図１１Ｎ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｏ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生における血管新生を示す拡大図である。
【図１１Ｐ】イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｑ】イヌの抜髄後、９０日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともにトータル歯髄細胞を移植することによる歯髄再生を示す拡大図である。
【図１１Ｒ】イヌの抜髄後、１４日目における、空洞の根管内にＳＤＦ−１とともに脂肪ＣＤ１０５陽性細胞を移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１１Ｓ】１４日目の新生再生組織の根管表面積に対する割合を示す図であり、データは５サンプルで平均値±SDで表したものである。
【図１１Ｔ】BS-1 lectinによる免疫染色を示す図である。
【図１１Ｕ】ホールマウントlectin染色による新生血管の三次元解析であり、移植歯髄ＣＤ１０５陽性細胞が新生毛細血管周囲に存在していることを示す図である。
【図１１Ｖ】ホールマウントlectin染色による新生血管の三次元解析であり、１４日目における再生組織の誘導血管の三次元像を示す図である。
【図１１Ｗ】ホールマウントlectin染色による新生血管の三次元解析であり、DiIラベルの移植細胞が再生組織全体に散在していることを示す図である。
【図１１Ｘ】正常歯髄組織を示す図である。
【図１１Ｙ】１４日目の新生再生組織のPGP 9.5.免疫染色を示す図である。
【図１１Ｚ】下顎第三切歯に再生された歯髄組織のDiIラベルを示す図である。
【図１２Ａ】正常歯髄組織の二次元電気泳動を示す図である。
【図１２Ｂ】再生歯髄組織の二次元電気泳動を示す図である。
【図１２Ｃ】正常歯髄組織の二次元電気泳動と再生歯髄組織の二次元電気泳動とを重ね合わせた図である。
【図１２Ｄ】正常歯髄組織の二次元電気泳動を示す図である。
【図１２Ｅ】歯根膜組織の二次元電気泳動を示す図である。
【図１２Ｆ】正常歯髄組織の二次元電気泳動と歯根膜組織の二次元電気泳動とを重ね合わせた図である。
【図１３Ａ】イヌの感染根管治療後、１４日目における、抜歯した根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１３Ｂ】イヌの感染根管治療後、１４日目における、抜歯していない根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１３Ｃ】イヌの感染根管治療後、１４日目における、抜歯していない根管内にＳＤＦ−１とともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す一部拡大図である。
【図１４Ａ】イヌの抜髄後、１４日目における、抜歯した根管内にＧ−ＣＳＦとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１４Ｂ】イヌの抜髄後、１４日目における、抜歯していない根管内にＧ−ＣＳＦとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す図である。
【図１４Ｃ】イヌの抜髄後、１４日目における、抜歯していない根管内にＧ−ＣＳＦとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を自家移植することによる歯髄再生を示す一部拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
≪第１実施形態≫
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明する。本実施形態に係る非抜歯根管充填材は、歯髄幹細胞及び細胞外基質を有し、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、非抜歯の根管の根尖側に挿入される。
【００４１】
図１は、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の説明図である。非抜歯根管充填材２００は、細胞外基質２１０に歯髄幹細胞２２０を付着させて形成される。歯髄幹細胞２２０は、非抜歯根管充填材２００の根管の根尖側に付着される。
【００４２】
歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞である。歯髄幹細胞は、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ−４陽性細胞、ＦＬＫ−１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、及びＣＤ９０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む。例えばイヌ永久歯歯髄細胞は、ＣＸＣＲ４細胞陽性を０．８％含み、血管新生能等の組織再生能力が高い。
【００４３】
歯髄ＳＰ細胞は、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、ＦＬＫ−１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、又はＣＤ９０陽性細胞の何れかとすることが好ましい。
【００４４】
なお、CD31-/CD146- side population（ＳＰ）細胞は、マウス下肢虚血部に移植すると血流回復・血管新生が促進され、ラット脳梗塞虚血部に移植すると神経細胞の分化促進、運動麻痺が回復する。また、イヌの生活歯髄切断面上に移植すると生活歯髄切断面上の窩洞内に血管新生・神経再生・歯髄再生が見られる。このように、歯髄幹細胞としてCD31-/CD146-ＳＰ細胞を用いる場合、歯髄再生能力は高いと考えられるが、ＳＰ細胞を分取するためには、ＤＮＡ結合蛍光色素であるHoechst 33342で細胞をラベルする必要があり、臨床応用をする際、安全性に問題を生じる可能性がある。
【００４５】
しかしながら、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞は、コンタミネーションの可能性があるため臨床で使用できないフローサイトメトリー法や高価で使用が限定されている抗体ビーズ法を用いずに、ＳＤＦ−１やＡＭＤ３１００、あるいはＧ−ＣＳＦ等を用いた遊走法により分取できるので、安全且つ安価に分取することができる。そのため、歯髄幹細胞としてＣＸＣＲ４陽性細胞を用いる場合は、臨床にて即座に使用することができ、且つ、経済的であるという重大な利点がある。
【００４６】
歯髄幹細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象動物自身から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象動物以外の動物から抽出した同種細胞でもよい。
【００４７】
非抜歯根管充填材２００における歯髄幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の含有率が、１×１０３セル／μｌよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、歯髄幹細胞の含有率が、１×１０６セル／μｌよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
【００４８】
細胞外基質（Scaffold）２１０は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＤＬＬＡ（ポリ−ＤＬ−乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖（グリコサミノグリカン）が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％〜９９．９９％とすることが好ましい。
【００４９】
細胞外基質として使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合であるＩ型・III型混合コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。III型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作る。
【００５０】
上述の混合コラーゲンにおける、III型コラーゲンの割合は１０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。III型コラーゲンの割合が５０重量％よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、III型コラーゲンの割合が１０重量％よりも少なくなると、Ｉ型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。
【００５１】
次に、図２を用いて、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する。図２は、非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
【００５２】
非抜歯根管充填材２００は、細胞外基質２１０の根尖側に歯髄幹細胞２２０を付着させて形成される。歯髄幹細胞２２０は非抜歯根管充填材２００の根尖部の１／４〜２／３に付着されているのが望ましく、より望ましくは根尖部の１／３である。根管充填材の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に１０μリットル〜１３μリットルのI型・III型混合コラーゲンを吸い込み、次に、歯髄幹細胞を混合させたI型・III型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））を７μリットル〜１０μリットル吸い込む。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が０．５〜０．７ｍｍのものが使用でき、例えばＱＳＰ社のＨ−０１０−９６ＲＳマイクロキャピラリーチップを使用できる。非抜歯根管充填材の形状は、特に限定されるものではなく、例えば円錐、円錐台、円柱等である。
【００５３】
次に、図３Ａ〜図３Ｆを用いて、非抜歯根管充填材２００を使用する歯組織再生方法について説明する。
【００５４】
本実施形態に係る歯髄組織再生方法は、図３Ａに示すように、例えば歯髄炎が発生している対象となる歯１００について、非抜歯にて歯組織再生を行う。対象となる歯とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。
【００５５】
対象となる歯１００について、図３Ｂに示すように、抜髄又は感染根管の根管拡大清掃が行われる。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を取り去る行為である。また、感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。
【００５６】
抜髄後は、対象となる歯の根管を拡大することで、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。なぜならば、後述するように、抜髄あるいは感染根管治療した根管内に非抜歯根管充填材２００を充填する際に、根管を拡大しておくほうが非抜歯根管充填材２００を充填しやすいからであり、また根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいからである。ここで、根尖とは、対象となる歯の歯槽骨に結合される端部（歯根の先端部分）をいう。
【００５７】
例えば、図３Ｂにおいて、根尖部の根管の太さｄは、根管の直径において０．７ｍｍ以上１．５ｍｍ以下とすることが望ましい。根管の太さｄが０．７ｍｍよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また非抜歯根管充填材２００の充填が難しいおそれがあるからであり、一方、根管の太さが１．５ｍｍよりも大きいと、対象となる歯に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
【００５８】
次に、図３Ｃに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により非抜歯根管充填材２００を充填する。非抜歯根管充填材２００は、生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。非抜歯根管充填材２００は、根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填することが望ましい。なお、細胞外基質２１０がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することになる。
【００５９】
根管の根尖側に非抜歯根管充填材２００を注入した後は、図３Ｄに示されるように、非抜歯根管充填材２００の上部にゼラチン６１０を注入し、レジン６２０により蓋をする。
【００６０】
これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図３Ｅに示されるように、例えば根管内の歯髄固有組織、血管４００、神経等である。また、ＢＭＰｓ等の形態形成因子を用いることにより、再生される歯組織としては象牙質がある。更に、感染根管に対して非抜歯根管充填材２００を充填する場合は、再生される歯組織として歯根膜（歯槽骨に歯を植立する歯周組織）やセメント質等の歯周組織がある。
【００６１】
その後は、レジン６２０を一度除去して、図３Ｆに示すように、ＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、レジン６２０により蓋をする。形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図３Ｇに示されるように象牙質５００も再生される。
【００６２】
更に、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００を用いる歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。また、出血による血餅が多量に存在すると歯髄組織再生の障害になると考えられるところ、本実施形態に係る発明は非抜歯であるため、血餅の発生を低く抑えられ、効率的に歯組織再生を促進させることができる。また、本実施形態に係る発明は非抜歯であるので、根管拡大後の出血や症状が消失するまで根管貼薬して根管充填を待つことができ、実際の臨床治療に近接させることができる。
【００６３】
なお、上述したように、対象となる歯１００は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であったが、これに限定されず、対象となる歯１００には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。係る場合は、抜髄後に、非抜歯根管充填材２００を充填することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図３Ｈに示すように、対象となる歯１００には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯（細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯）も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎１１０を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に、非抜歯根管充填材２００が注入される。
【００６４】
≪第２実施形態≫
図４Ａ及び図４Ｂは、本発明の第２実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の説明図である。図４Ａに示すように、非抜歯根管充填材２００は、歯髄幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側（例えば根管の上部１／２〜２／３）に細胞遊走因子、細胞増殖因子、神経栄養因子及び血管新生因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子２３０を付着させている。
【００６５】
歯髄幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる理由は、歯髄幹細胞２２０を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している歯髄幹細胞２２０が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図４Ｂに示すように、非抜歯根管充填材２００の根管の歯冠側に細胞外基質２１０を残しておくことも可能である。
【００６６】
細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。血管新生因子とは、それが受容体に結合することによって血管内皮細胞の増殖・遊走・抗アポトーシスに関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
【００６７】
細胞遊走因子は、ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭ−ＣＳＦのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。特に、ＭＭＰ３は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
【００６８】
細胞増殖因子は、ＩＧＦ，ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
【００６９】
神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Neuropeptide Y及びNeurotrophin 3のうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
【００７０】
血管新生因子は、E-selectin、VCAM1、ECSCR及びSLC6A6のうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
【００７１】
遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、０．１ｎｇ／μｌ以上５００ｎｇ／μｌ以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が０．１ｎｇ／μｌよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が５００ｎｇ／μｌよりも多いと、対象となる歯１００に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
【００７２】
次に、図５を用いて、本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する。図５は、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる非抜歯根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
【００７３】
実施形態２に係る非抜歯根管充填材２００の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させたI型・III型混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合割合は１：１）を１０μリットル〜１３μリットル吸い込む。次に、歯髄幹細胞を混合させたI型・III型混合コラーゲンを７μリットル〜１０μリットル吸い込む。実施形態２においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図４Ａに示す根管充填材２００が製造される。
【００７４】
実施形態２に係る非抜歯根管充填材２００の使用形態は、実施形態１と同様に、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に充填される。
【００７５】
本実施形態に係る非抜歯根管充填材２００によれば、遊走因子を有しているため更に効率的に、歯組織再生を行うことができ、再生組織には、内部吸収は無く、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。
【００７６】
≪第３実施形態≫
上述の第１実施形態では、歯髄幹細胞２２０が非抜歯根管充填材２００の根管の根尖側に付着されて非抜歯根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、歯髄幹細胞２２０は、非抜歯根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような非抜歯根管充填材２００も、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。
【００７７】
このような非抜歯根管充填材２００は、例えば、歯髄幹細胞と、I型・III型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））とを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
【００７８】
また、上述の第２実施形態では、歯髄幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させて、非抜歯根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、歯髄幹細胞２２０及び遊走因子２３０は共に非抜歯根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような非抜歯根管充填材２００も、歯根完成歯に対して、内部吸収や外部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。
【００７９】
この非抜歯根管充填材２００は、例えば、歯髄幹細胞と、遊走因子と、I型・III型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））とを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
【実施例】
【００８０】
≪実施例１≫
〈細胞分取と特徴化〉
ヒト歯髄を摘出後、３７℃で１時間半、コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離した後、２％血清を含むＤＭＥＭ中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞を分散させ、ＣＸＣＲ４抗体を用いて４℃で３０分ラベル後、フローサイトメトリーを行った。ヒト歯髄由来のＣＸＣＲ４陽性細胞は全体の２０％を占めた。
【００８１】
表１にフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ２９及びＣＤ４４については、ＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞と同様に９０％以上であった。また、ＣＤ１０５については、ＣＤ１０５陽性細胞は９０．０％であったが、ＣＸＣＲ４陽性細胞は１．７％であった。ＣＤ１４６については、ＣＸＣＲ４陽性細胞はＣＤ１０５陽性細胞と同様に低い値であった。また、より未分化な幹細胞のマーカーのＣＤ１５０については、ＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞に比べてやや高い値を示した。
【００８２】
【表１】
2011078752.tif 000003
【００８３】
Real-time  RT-PCRにて、歯髄由来ＣＸＣＲ４陽性細胞と歯髄由来ＣＤ１０５陽性細胞を表２及び表３に示すプライマーを用いてＲＮＡ発現を比較すると、前血管誘導因子ＶＥＧＦ−Ａはほぼ同様の発現量を示し、サイトカインＧＭ−ＣＳＦはＣＸＣＲ４陽性細胞が２．５倍高く、神経栄養因子ＮＧＦはＣＤ１０５陽性細胞の方が２倍高く、NeuropeptideY、Neurotrophine 3及びＢＤＮＦはＣＸＣＲ４陽性細胞がやや高く、幹細胞マーカーＳＯＸ２はＣＸＣＲ４陽性細胞の方が高く、Ｓｔａｔ３及びＲｅｘ１発現はほぼ同等であった。
【００８４】
【表２】
2011078752.tif 000004
【００８５】
【表３】
2011078752.tif 000005
【００８６】
〈イヌ抜髄後の歯髄再生〉
次に、ＣＤ１０５陽性細胞及びＣＸＣＲ４陽性細胞を用いたイヌ抜髄後の歯髄再生を示す。
【００８７】
イヌ歯髄組織よりＣＤ１０５陽性細胞及びＣＸＣＲ４陽性細胞を分取した。トータルで６０μリットルとし、ピペットマンのチップＳＤＦ−１（２００ｎｇ）を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン  Ｉ型・III型混合コラーゲン）を４０μリットル吸い込み、次に、１×１０６個のＣＤ１０５陽性細胞を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン  Ｉ型・III型混合コラーゲン）を２０μリットル吸い込むことにより、抜歯根管への挿入用の根管充填材を作成した。イヌ上顎前歯を抜去後、培地中で歯髄を除去して＃７０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に上記の根管充填材を、拡大した根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填した。３０分以内にイヌの抜歯窩に再移植し、上部は燐酸セメント及び化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。この結果を図６Ａに示す。また、根管内象牙質壁の高倍像図を図６Ｂに示す。更に、歯根外側の象牙質・セメント質壁の高倍像図６Ｃに示す。図６Ａ、図６Ｂ及び図６ＣはＨ・Ｅ染色である。
【００８８】
次に、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップＳＤＦ−１（２００ｎｇ）を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン  Ｉ型・III型混合コラーゲン）を１３μリットル吸い込み、次に、１×１０６個のＣＤ１０５陽性細胞を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン  Ｉ型・III型混合コラーゲン）を７μリットル吸い込むことにより、非抜歯根管充填材２００を作成した。この非抜歯根管充填材２００は、根管の歯冠部２／３にＳＤＦ−１が付着されており、根管の根尖側１／３にＣＤ１０５陽性細胞が付着されていた。イヌ上顎前歯を抜去しないで、そのまま歯髄を除去して＃７０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に上記の非抜歯根管充填材２００を、拡大した根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填した。３０分以内に上部は燐酸セメント及び化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。この結果を図７Ａに示す。また、根管内象牙質壁の高倍像図を図７Ｂに示す。図７Ａ及び図７ＢはＨ・Ｅ染色である。
【００８９】
次に、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップＳＤＦ−１（２００ｎｇ）を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン  Ｉ型・III型混合コラーゲン）を１３μリットル吸い込み、次に、１×１０６個のＣＸＣＲ４陽性細胞を混合させたコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン  Ｉ型・III型混合コラーゲン）を７μリットル吸い込むことにより、非抜歯根管充填材２００を作成した。この非抜歯根管充填材２００は、根管の歯冠部２／３にＳＤＦ−１が付着されており、根管の根尖側１／３にＣＸＣＲ４陽性細胞が付着されていた。イヌ上顎前歯を抜去しないで、そのまま歯髄を除去して＃７０まで拡大し、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。抜去後３０分以内に上記の非抜歯根管充填材２００を、拡大した根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填した。３０分以内に上部は燐酸セメント及び化学重合レジンで封鎖した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。１４日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。この結果を図８Ａに示す。また、根管内象牙質壁の高倍像図を図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８ＢはＨ・Ｅ染色である。
【００９０】
新生歯髄組織では、抜歯した場合（図６Ａ・図６Ｂ・図６Ｃ）は、抜歯しない場合（図７Ａ・図７Ｂ及び図８Ａ・図８Ｂ）と比較して、血餅が残存しやや炎症がみられた。特に、図６Ａには、再生された歯髄組織内の図中上部に血塊が見られ、更に再生された歯髄組織内の全般に小径の血塊が多数点在している状態が見られた。また、抜歯した場合の根管内象牙質壁には破歯細胞がみられ、内部吸収が見られた（図６Ｂ）。また、歯根外側の象牙質・セメント質に外部吸収が見られた（図６Ｃ）。内部吸収及び外部吸収は、いずれも軽度で吸収が終息している場合は生活に支障が出ないものの、吸収が高度に進行した場合は、歯の動揺、脱落等の危険性が高まり、また虫歯や歯周病に対するリスクも高まる。
【００９１】
一方、抜歯しない場合の根管内象牙質壁には破歯細胞が見られず、内部吸収及び外部吸収も見られず、更に、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいた（図７Ｂ、図８Ｂ）。また、歯髄幹細胞として、ＣＤ１０５陽性細胞を用いる場合と、ＣＸＣＲ４陽性細胞を用いる場合とでは、再生歯髄の新生毛細血管、神経及び固有歯髄組織の程度は両者に差は見られなかった。
【００９２】
以上の結果より、抜歯した根管に充填する場合より、非抜歯の根管に充填する場合の方が、明らかに歯髄再生に有利であることが判明した。また、歯髄由来のＣＸＣＲ４陽性細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞と同様に、歯髄再生に有効であることが判明した。
【００９３】
≪実施例２≫
次に、実施例２では、非抜歯根管充填材の歯組織再生能をより詳細に検証する。
〈フローサイトメトリ―による細胞分取〉
歯髄細胞を上顎犬歯より分離した。初代脂肪細胞は同一個体のイヌの脂肪組織よりコントロールとして分離した。細胞をマウスIgG1 陰性コントロール(W3/25) (AbD Serotec Ltd., Oxford, UK)として免疫染色した。細胞は、mouseIgG1 negative control (Phycoerythrin, PE) (MCA928PE) (AbD Serotec)及びmouseanti-human ＣＤ１０５ (PE) (43A3) (BioLegend, San Diego, CA, USA)で４℃、９０分免疫染色した。２μg/ml propidium iodide 含有HEPESbuffer (Sigma)に、再溶解し、JSAN (Bay Bioscience, Kobe,Japan)にて分取した。歯髄及び脂肪由来のＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ１０５陰性細胞及び、分取していないトータル歯髄細胞は３５mmcollagen type Iコートディッシュ (Asahi Technoglass Corp., Funabashi, JAPAN)に播種し、１０ng/mlIGF (Cambrex Bio Science)、５ng/ml EGF(Cambrex Bio Science)及び１０％ fetal bovineserum (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)を添加したEBM2(Cambrex Bio Science, Walkersville, Maryland, USA)中で培養し、細胞の形質を維持した。培地は４〜５日に一度交換し、６０〜７０％コンフレントに達した後、３７℃、１０分、０．０２％EDTAで反応させ、細胞を剥離し、１：４希釈にて継代した。
【００９４】
歯髄ＣＤ１０５陽性細胞は、更に三代目にて特徴化し、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及び未分取のトータル 歯髄細胞と比較した。mouse IgG1 negativecontrol (AbD Serotec Ltd.), mouse IgG1 negative control (fluoresceinisothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec),mouse IgG1 negative control (Phycoerythrin-Cy5,PE-Cy5)(MCA928C) (AbD Serotec), mouse IgG1 negative control (Alexa 647) (MRC OX-34) (AbDSerotec),及びCD24 (Alexa Fluor 647) (ML5) (BioLegend), CD29 (PE-Cy5)(MEM-101A) (eBioscience), CD31 (FITC) (Qbend10) (Dako), CD33 (FITC) (HIM3-4)(BD Bioscience), CD34 (Allophycocyanin, APC) (1H6) (R&D Systems, Inc.,Minneapolis, MN, USA), CD44 (Phycoerythrin-Cy7, PE-Cy7) (IM7) (eBioscience),CD73 (APC) (AD2) (BioLegend), CD90 (FITC) (YKIX337.217) (AbD Serotec), CD146(FITC) (sc-18837) (Santa Cruz, Biotech,Santa Cruz, CA, USA), CD150(FITC) (A12) (AbD Serotec), MHC class I (R-PE) (3F10) (AncellCorporation, Bayport, MN, USA), MHC class II (APC) (TDR31.1) (Ancell), 及びCXCR4 (FITC) (12G5) (R&D)に対する抗体でそれぞれ染色した。
【００９５】
〈幹細胞マーカー、血管新生、神経栄養因子のReal-time RT-PCRによる発現分析〉
細胞画分の形質を更に特徴化するために、Trizol (Invitrogen) を用いて三代目の歯髄及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞からトータル RNAを分離した。それぞれの実験において細胞数は５×１０４個に標準化した。First-strand cDNA 合成はReverTra Ace-α(Toyobo, Tokyo, Japan)を用いてトータルRNAから合成し、Light Cycler-Fast Start DNAmaster SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA)を用いてLight Cycler (RocheDiagnostics)にて９５℃で１０秒，６２℃で１５秒，７２℃で８秒のプログラムで、上記表２及び表３に示す幹細胞マーカーのイヌＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２，Ｓｔａｔ３，Ｂｍｉ１及びＲｅｘ１のReal time RT-PCRを行った。oligonucleotideプライマーは、公表されているイヌcDNAシークエンスを用いて作成した。イヌシークエンスが登録されていない場合、ヒトシークエンスを用いた。血管新生因子及び神経栄養因子のmRNA発現を検討するため、イヌmatrix metalloproteinase（ＭＭＰ）-３,ＶＥＧＦ−Ａ,granulocyte-monocytecolony-stimulating factor（ＧＭ−ＣＳＦ）,ＳＤＦ−１,ＮＧＦ,ＢＤＮＦ,Neuropeptide Y,Neurotrophin 3,E-selectin,ＶＣＡＭ１,rhombotin 2,ＥＣＳＣＲ及びＳＬＣ６Ａ６のreal-time RT-PCRを行った。RT-PCR産物は登録されたcDNAシークエンスを用いて確定した。三代目歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞は、β-actinで標準化してトータル歯髄細胞と比較した。
【００９６】
〈増殖及び遊走分析〉
stromal cell-derived factor-1(ＳＤＦ−１)(Acris, Herford, Germany)に対する歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の増殖能を、０．２％ bovine serum albumin (Sigma)及びＳＤＦ−１(５０ng/ml)添加EBM2中で９６wellに１０３個播種し、トータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞と、四代目において比較した。１０μｌ Tetra-colorone(登録商標、Seikagaku Kogyo, Co., Tokyo, JAPAN)を９６well plateに添加し、細胞数を吸光度４５０nmにて吸光度計を用いて２，１２，２４及び３６時間後に計測した。細胞を入れてないサンプルをnegativecontrolとした。
【００９７】
歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のＳＤＦ−１に対する遊走能を、水平化学走化性分析法にてトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞と比較した。TAXIScan-FL (Effector Cell Institute, Tokyo, JAPAN)を用いてreal-time水平化学走化性分析を行った。TAXIScan-FL は６μmの孔のあいたsilicon及びガラスプレートの間に、細胞の大きさに最適化したチャンネルを形成し、チャンネル内の一端に細胞(１０５個/mlを１μl)を入れ、もう一端に１０ng/μｌのＳＤＦ−１を一定濃度勾配に形成させるように投入して、遊走する細胞を顕微鏡下で６時間撮影した。
【００９８】
〈歯髄及び脂肪由来ＣＤ１０５陽性細胞の分取及び特徴化〉
ＣＤ１０５抗体を用いてイヌ永久歯歯髄組織からフローサイトメトリーにより分離した歯髄由来のＣＤ１０５陽性細胞及び同一個体の脂肪組織由来のＣＤ１０５陽性細胞は、図９Ａ及び図９Ｂに示すように、それぞれトータル細胞の６％及び５．８％であった。また、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ及び図９Ｆに示すように、歯髄及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞は、ともに星状で長い突起を有していた。図示しないが、歯髄ＣＤ１０５陰性細胞は、不規則な形で短い突起を有していた。IGF1,EGF及び１０％ウシ胎児血清をEBM2に添加すると、ＣＤ１０５陽性細胞の形質が維持され、６代目でも９８％以上ＣＤ１０５が陽性であった。３５mmcollagen type I コートディッシュにＣＤ１０５陽性細胞を一個播種すると、１０日でコロニーを形成し、この細胞のコロニー形成能を示した。歯髄、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及び歯髄ＣＤ１０５陰性細胞の細胞付着及び増殖効率はそれぞれ８％，３．７％，１％であった。三代目で限界希釈法により、コロニーフォーミングユニット(CFU)は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞では、８０％であり、トータル歯髄細胞では３０％、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞では５０％であった。
【００９９】
歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の特徴化を進めるために細胞表面抗原マーカーを用いて、フローサイトメトリーを行い、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞と比較した。歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞は三代目でＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性であり、ＣＤ３１が陰性であった。下記の表４に示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞は、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びトータル歯髄細胞に比べてＣＤ７３，ＣＤ１５０及びＣＸＣＲ４を強く発現していることは特筆すべきことである。
【０１００】
【表４】
2011078752.tif 000006
【０１０１】
歯髄ＣＤ１０５陽性細胞においては、トータル歯髄細胞に比べ、ＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２及びＢｍｉ１ ｍＲＮＡ等の幹細胞マーカーを１６．８，６４及び３．５倍高く発現しており、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の幹細胞としての性質が示唆された。ＣＸＣＲ４，Ｓｏｘ２及びＢｍｉ１ｍＲＮＡは歯髄ＣＤ１０５陽性細胞において脂肪ＣＤ１０５陽性細胞に比べて高く発現していた。表５に示すように、ＶＥＧＦ−Ａ，ＧＭ−ＣＳＦ，nerve growth factor（ＮＧＦ），brain-derivedneurotrophic factor（ＢＤＮＦ），neuropeptideY，neurotrophin 3，E-selectin及びＶＣＡＭ−１等の血管新生因子あるいは神経栄養因子は、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞に比べ歯髄ＣＤ１０５陽性細胞において高く発現していた。
【０１０２】
【表５】
2011078752.tif 000007
【０１０３】
〈in vitroにおける多分化能〉
三代目から五代目において歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の脂肪、血管、神経、及び象牙質／骨への分化誘導を行い、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及び未分取の歯髄細胞と比較した。
【０１０４】
図１０Ａ及び図１０Ｄに示すように、歯髄幹細胞は脂肪細胞への分化能を示した。また、図１０Ｅに示すように、歯髄幹細胞は血管内皮細胞への分化能を示した。また、図１０Ｈ、図１０Ｊ及び図１０Ｋに示すように、歯髄幹細胞は神経細胞への分化能を示した。また、図１０Ｌ及び図１０Ｏに示すように、歯髄幹細胞は、象牙芽細胞あるいは骨芽細胞系譜への分化能を示した。
【０１０５】
しかしながら、図１０Ｌ及び図１０Ｍに示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞に比べてトータル歯髄細胞においては石灰化基質が多く認められた。また、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｎ、図１０Ｏ及び図１０Ｇに示すように、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞は脂肪誘導能及び骨誘導能はあるが、血管誘導能あるいは神経誘導能は見られなかった。図１０Ｐに示すように、ＳＤＦ−１による増殖活性は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞においてトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞に比べて高かった。なお、図１０Ｐにおいて、データは４サンプルで平均値±SDで表しており(*P<0.01)、実験は３回繰り返し行った典型例を示したものである。TAXIScan-FLにおいて示されるように、ＳＤＦ−１による遊走活性は歯髄ＣＤ１０５陽性細胞においてトータル歯髄細胞及び脂肪ＣＤ１０５陽性細胞よりも高かった。
【０１０６】
〈幹細胞／前駆細胞の抜髄後根管内自家移植〉
イヌ(Narc, Chiba, Japan)永久歯完全根尖完成歯を全部歯髄除去し、細胞画分を移植して歯髄を再生させる実験的モデルを確立した。sodiumpentobarbital(Schering-Plough, Germany)で全身麻酔後、上顎第二切歯及び下顎第三切歯の完全歯髄除去を行い、根尖部を#70K-file (MANI. INC, Tochigi, Japan)を用いて０．７mmに拡大した。細胞外基質としてcollagen XYZを用い、根尖側に歯髄幹細胞を付着させると共に歯冠側にＳＤＦ−１を付着させた根管充填材を用いた。即ち、１ｘ１０６個の、三代目から四代目の歯髄ＣＤ１０５陽性細胞、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞あるいはトータル歯髄細胞をcollagen XYZ(新田ゼラチン,Osaka,Japan)とともにDiIラべリング後、根管内の下部に自家移植した。根管上部は更にcollagenXYZとともに最終濃度１５ng/μlのＳＤＦ−１を移植した。窩洞はリン酸亜鉛セメント(Elite Cement, GC, Tokyo, Japan)及びボンディング材(ClearfilMega Bond, Kuraray)で処理した後、コンポジットレジン(ClearfilFII,Kuraray,Kurashiki,Japan)で修復した。１５匹のイヌ６０歯を用いた。１０歯は歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１、５歯は脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１、５歯はトータル歯髄細胞及びＳＤＦ−１、５歯は細胞を入れずＳＤＦ−１のみ、５歯はＳＤＦ−１を入れず歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のみ、５歯は細胞を入れずscaffoldのみ注入し、１４日後に標本を作製した。６歯は歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１を注入し、２８日後に二次元電気泳動分析した。４歯に、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１、並びに、トータル歯髄細胞及びＳＤＦ−１を注入し、９０日後に標本を作製した。７歯の正常歯をcontrolとして用いた。形態分析のために４％paraformaldehyde(PFA) (Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)で４℃一晩固定し、１０％蟻酸にて脱灰後、paraffin wax (Sigma)に包埋した。paraffin切片(厚さ５μm)をhematoxylin-eosin(HE)染色し、形態学的に観察した。
【０１０７】
血管染色のため、５μm厚みのparaffin切片を脱パラフィンし、Fluorescein Griffonia (Bandeiraea)Simplicifolia Lectin 1/fluorescein-galanthus nivalis (snowdrop) lectin (２０μg/ml, Vector laboratories, Inc., Youngstown,Ohio)にて１５分染色し、fluorescence microscope BIOREVO, BZ−9000（KEYENCE, Osaka, Japan)にて新生血管に対する移植細胞の存在及び局在性を観察した。移植後１４日後の再生歯髄と正常歯髄を４％ paraformaldehydeで４５分固定した後、０．３％Triton X 含有PBSで処理後、ブロッキングを行い、GS-IB4 (Griffoniasimplicifolia, Alexa Fluor 488)レクチンにて１２時間４℃にてホールマウント免疫染色した。新生血管と移植細胞は二光子顕微鏡FV1000MPE (Olympus)にて三次元的に撮影した。
【０１０８】
新生神経の染色は、５μm厚みのparaffin切片を脱パラフィンし、３％ Triton X 含有PBSで処理後、２％ヤギ血清でブロッキングを行い、PGP-9.5にて１２時間４℃にて一次染色した。三回PBSで洗浄した後、biotinylatedgoat anti-rabbit IgG (Vector)(1:200)で二次染色を１時間室温で行った。ABC reagent (VectorLaboratories, Burlingame, CA)にて処理した後、DABにて１０分間発色させた。
【０１０９】
新生神経突起が下歯槽神経とつながっていることの確認のため、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をDiIラベルせずに下顎第三切歯に移植し、移植後に１４日目にDiIを再生歯髄上に適用し、移植後１７日目に下顎骨を摘出し、蛍光顕微鏡(Leica,M 205 FA, Wetzlar, Germany)にて観察した。
【０１１０】
１４日目における再生歯髄の再生量を統計学的に解析するため、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１、トータル歯髄細胞及びＳＤＦ−１、細胞を入れずＳＤＦ−１のみ、ＳＤＦ−１を入れず歯髄ＣＤ１０５陽性細胞のみ、並びに、細胞を入れずscaffoldのみの標本から５本ずつ１５０μm間隔で実体顕微鏡にて(Leica, M 205 FA)撮影、Leica Application Suite softwareを用いて解析した。根管の表面積に対する新生再生組織の割合はそれぞれの歯牙の三か所を平均して計算した。統計計算はスチューデントｔ検定を用いて行った。
【０１１１】
生体内における象牙芽細胞分化マーカーであるdentin sialophosphoprotein（Ｄｓｐｐ）とenamelysinの発現は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞及びＳＤＦ−１移植後９０日目の５μm-paraffin切片において、in situ hybridizationにて根管の側壁において観察した。イヌＤｓｐｐ（１８３ｂｐ）及びenamelysin（１９５ｂｐ）のcDNAをそれぞれNcoI 及びSpe Iにて切断して線状にリニアライズし、anti-senseprobesを作製した。プローブはPCR productをsubcloning後プラスミドから作成し、real-time RT-PCRで用いた表２及び表３記載のプライマーから作成した。DIGシグナルはTSAsystem (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)にて検出した。
【０１１２】
〈歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の抜髄後根管内移植による歯髄再生〉
次に、上述の図３に示したような手順にて、イヌにおいて永久歯の完全根尖完成歯の抜髄後根管内に、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに自家移植した。図１１Ａは、ＳＤＦ−１及び歯髄ＣＤ１０５陽性細胞による歯髄再生を示す図である。図１１Ｂは、図１１ＡにおけるエリアＢの拡大図である。図１１Ｃは、図１１ＡにおけるエリアＣの拡大図である。図１１Ａ、図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに移植すると、歯髄様組織が１４日までに形成された。図１１Ｅに示すように、ＣＤ１０５陽性細胞のみを移植しても歯髄様組織が形成されたが、ＳＤＦ−１とともに移植したほうが歯髄様組織の形成が促進された。一方、図１１Ｆに示すように、ＳＤＦ−１のみを移植すると、極めて少量の歯髄しか形成されなかった。図１１Ｓに示すように、non-pairedスチューデントｔ検定で統計学的解析を行うと、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに移植すると、ＣＤ１０５陽性細胞のみあるいはＳＤＦ−１のみと比べて、再生された面積は有意に増加した（それぞれ３．３倍及び４．２倍）。図１１Ｄに示すように、象牙芽細胞様細胞は、根管の象牙質壁に付着し、細管内に突起を伸ばしていた。図１１Ｇに示すように、歯髄様組織は、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに移植すると、９０日後にはセメント-エナメル質境まで達していた。図１１Ｈに示すように、再生組織の上部に存在する細胞は、紡錘形であり、また図１１Ｉに示すように、中央部では星状であった。これらの再生組織は、図１１Ｊに示す正常歯髄組織の細胞に類似していた。図１１Ｇ及び図１１Ｋに示すように、象牙質側壁に沿って、細管象牙質が観察されたのは特筆すべきことである。図１１Ｌ及び図１１Ｍに示すように、象牙異質側壁に並んで存在する象牙芽細胞は、象牙芽細胞の二つのマーカーであるenamelysin/matrixmetalloproteinase（ＭＭＰ）２０及びＤｓｐｐ陽性であった。
【０１１３】
しかしながら、図１１Ｎ及び図１１Ｏに示すように、ＣＤ１０５陽性細胞の代わりに、未分取のトータル歯髄細胞を移植した場合には、より少量の歯髄組織しか再生されず、図１１Ｐの矢印に示す石灰化組織及び図１１ＱにＯＤにて示す骨様象牙質のように、９０日後には石灰化がみられた。図１１Ｒに示すように、同様に脂肪由来のＣＤ１０５陽性細胞を移植した場合にも、より少量の再生組織しか見られなかった。図１１Ｓに示すように、更に、統計学的解析により、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに移植した場合、脂肪ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに移植、あるいはトータル歯髄細胞をＳＤＦ−１とともに移植した場合よりも、１４日目で、根管の表面積に対する新生再生組織の割合は、有意に高いことが分かった（５１．６倍及び２．２倍）。図１１Ｔに示すように、凍結切片をBS-1 lectinで染色後、共焦点レーザー顕微鏡分析により、再生組織における血管新生が認められた。図１１Ｕに示すように、二光子顕微鏡分析により、DiIでラベルした移植歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の多くが、新生毛細血管の近くに観察され、血管新生におけるこれらの細胞の血管新生因子を放出する役割が示唆された。図１１Ｖに示すように、１４日目における再生組織の誘導血管の三次元像は、図１１Ｘに示される正常歯髄の像と、密度及び方向性において類似していた。図１１Ｗに示すように、移植したＣＤ１０５陽性細胞は、新しく再生された歯髄のあらゆるところに観察され、ＳＤＦ−１により、上部に遊走する能力を歯髄ＣＤ１０５陽性細胞が持つことが示唆された。図１１Ｙに示すように、PGP9.5抗体で染色される神経突起は、根尖孔から新しく再生された組織中に伸長していた。図１１Ｚに示すように、下顎第三切歯に再生された歯髄組織をDiIラベルしたところ、新生歯髄組織(点線で示す)において再生された神経は下歯槽神経とつながっていることが明らかとなった。
【０１１４】
〈歯髄再生の二次元電気泳動分析及び遺伝子発現分析〉
再生組織の二次元電気泳動分析のために、２８日目の再生歯髄様組織、正常歯髄組織、及び歯根膜組織を細切し、lysis buffer(６Ｍ urea,１．９７Ｍ thiourea,２％（ｗ／ｖ） CHAPS,６４．８mM DTT,２％（ｖ／ｖ）Pharmalyte)に溶解し、超音波をかけた。15,000rpmで１５分、４℃で遠心し、上清を二次元電気泳動した。等電点電気泳動(IEF)はCoolPhoreSter2-DE systemにて行った。IPG strips (Immobiline DryStrips，ｐＨ４〜７，１８cm, GE)はmanufacturerの指示に従い用いた。IPGstripsはrehydration solution(６Ｍ urea,１．９７Ｍ thiourea,２％（ｖ／ｖ）TritonX-100,１３mM DTT,２％（ｖ／ｖ）Pharmalyte,２．５mMacetic acid,0.0025％ BPB)により一晩２０℃にて再度水和した。等電点電気泳動(IEF)は500Ｖ、２時間、700-3000Ｖ、１時間、及び3500Ｖ、２４時間の電圧を徐々に上昇させる方法で行った。等電点電気泳動後、IPGstripsは平衡緩衝液equilibration buffer (６Ｍ urea,２．４mM DTT,５mM Tris-HCl,pＨ６．８,２％（ｗ／ｖ）SDS,0.0025％BPB,３０%（ｖ／ｖ） Glycerol)にて３０分室温にて反応させた。IPG stripsは更に5mM Tris-HCl、pH６．８、２％（ｗ／ｖ）SDS、0.0025％BPB、３０%（ｖ／ｖ）Glycerol、２４３mM iodoacetamidにて２０分室温にて平衡化させた。その後、二次元目は12.5% SDS-PAGEgel (２０cm×２０cm)にて２５mA/gelで１５分、その後３０mA/gelで泳動した。GelはFlamingo Fluorescent GelStain (Bio-Rad Laboratories,CA,USA)で染色し、(FluoroPhorester 3000, Anatech, Tokyo,Japan)にてscanした。GelイメージはProgenesis (Nonlinear Dynamics, NC, USA)を用いて分析し、それぞれのパターンを比較した。
【０１１５】
歯根膜に特異的なイヌaxin2、periostin、及びasporin/periodontal ligament-associatedprotein 1 (PLAP-1)を用いてReal time RT-PCR 分析を行った。再生組織におけるCollagen type aI(I)、syndecan3、及びtenascin Cの発現を正常歯髄並びに歯根膜と比較した。
【０１１６】
〈再生歯髄の二次元電気泳動によるタンパク化学分析及び遺伝子発現解析〉
図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃに示すように、二次元電気泳動分析により、再生歯髄組織は２８日目において同一個体由来の正常歯髄組織に定性及び定量的にタンパク発現パターンが類似していることが明らかとなった。正常及び再生歯髄組織両方に見られるタンパクスポットは８５．５％（１２３ spots）であった。一方、図１２Ｄ、図１２Ｅ及び図１２Ｆに示すように、正常歯髄組織のタンパクスポットは、歯根膜組織と比べて、違いがみられた。従って、二次元電気泳動分析により、再生組織は機能的に正常歯髄組織であることが判明した。
【０１１７】
歯髄組織に特異的なマーカーはこれまでに見つかっていない。従って、再生組織が正常の歯髄組織であることを証明するために、歯根膜組織に特異的なマーカーとして、axin2,periostin及びasporin/periodontal ligament-associated protein 1 (PLAP-1)を更に用いた。axin2、periostin及びPLAP-1 mRNA発現は、正常歯根膜において再生歯髄組織のそれに比べて２８日目でそれぞれ２５、５３１倍、１７９倍及び１１倍と高い発現がみられた。表６に示すように、これらの遺伝子は、正常歯髄で再生組織と比べて、ほぼ同程度（０．４倍、０．４倍、及び２．４倍）に発現がみられた。
【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
表６に示すように、CollagenαI(I)は歯根膜において再生組織よりも9.3倍多く発現し、正常歯髄と再生歯髄の間ではほとんど違いが認められなかった。Syndecan 3及びTenascin Cは歯髄組織で高く発現していることが知られており、再生組織においては歯根膜組織と比較して、１４．３倍及び５０．０倍高く発現が見られた。従って二次元電気泳動分析及び、遺伝子発現分析により、再生組織は機能的に正常歯髄組織であることが判明した。
【０１２０】
〈歯髄ＣＤ１０５陽性細胞の感染根管治療後根管内自家移植による歯髄再生〉
イヌ永久歯完全根尖完成歯を全部歯髄除去し、根尖部をK-fileにて＃３０まで拡大し、そのまま根管を開放し２週間放置し、感染根管歯モデルを作製した。その後、次亜塩素酸ソーダおよびオキシドールにて交互洗浄し、さらにスメアクリーンを根管内に３０秒間入れた後、生理食塩水にてさらに洗浄した。さらにFC（ホルムクレゾール）を根管内に一週間貼薬し、根管内の無菌化を図った。その後、再度、生理食塩水にて洗浄し、根管内をペーパーポイントにて乾燥させた。細胞外基質としてcollagenXYZを用い、根尖側に歯髄幹細胞を付着させると共に歯冠側にＳＤＦ−１を付着させた根管充填材を用いた。即ち、抜髄後の根管内自家移植と同様の方法にて、１ｘ１０６個の、三代目から四代目の歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をcollagen XYZとともに、根管内の下部に自家移植した。根管上部は更にcollagenXYZとともに最終濃度１５ng/μｌのＳＤＦ−１を移植し、窩洞をリン酸亜鉛セメント及びコンポジットレジンで修復した。１４日後に標本を作製した。通法にて形態学的に観察した。
【０１２１】
図１３Ａは、ＳＤＦ−１及び歯髄ＣＤ１０５陽性細胞による歯髄再生を示す図である。図１３Ｂは、図１３Ａにおける根管内に再生された歯髄組織の中央部の拡大図である。図１３Ｃは、図１３Ａにおける根管内に再生された歯髄組織の象牙質側壁に接する部位の拡大図である。図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃに示すように、歯髄ＣＤ１０５陽性細胞をＳＤＦ−１とともに移植すると、歯髄様組織が１３日までに形成された。図１３Ｂに示すように、歯髄組織内は血管が新生され、歯髄細胞がみられたが、炎症性細胞も若干散在していた。図１３Ｃに示すように、象牙芽細胞様細胞は、根管の象牙質側壁に付着し、並列して存在していた。
【０１２２】
《実施例３》
次に、実施例３では、遊走因子Ｇ−ＣＳＦ及び歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を用いて、抜歯した根管に充填する場合と非抜歯の根管に充填する場合との比較を行った。
【０１２３】
上述の実施例１及び実施例２と同様に、イヌ前歯を抜歯した後、scaffoldとしてcollagen XYZとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を５ｘ１０５cells（１０μl）を根管内下部に、そして遊走因子としてＧ−ＣＳＦを２００ｎｇ（１０μl）を根管内上部に移植して、１４日経過させた。その結果を図１４Ａに示す。図１４Ａに示されるように、歯髄様組織は少量しか形成せず、矢印で示すように、強い炎症像及び外部吸収がみられた。
【０１２４】
次に、イヌ前歯を抜歯せずに、scaffoldとしてcollagenXYZとともに歯髄ＣＤ１０５陽性細胞を５ｘ１０５cells(１０μl）を根管内下部に、そして遊走因子としてＧ−ＣＳＦを２００ng（１０μl）を根管内上部に移植して、１４日経過させた。その結果を図１４Ｂに示す。図１４Ｂに示されるように、歯髄様組織が著明に形成され、炎症像はみられなかった。また外部吸収もみられなかった。図１４Ｃは、図１４Ｂに示した矢印部分の歯髄様組織の拡大図である。図１４Ｃに示すように、再生歯髄様組織中には、細長い紡錘形の線維芽細胞様の歯髄細胞が存在し、炎症性細胞はみられなかった。
【符号の説明】
【０１２５】
１００：対象となる歯
１１０：根尖性歯周炎
２００：非抜歯根管充填材
２１０：細胞外基質
２２０：歯髄幹細胞
２３０：遊走因子
４００：血管
５００：象牙質
６１０：ゼラチン
６２０：レジン
６３０：形態形成因子
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号１〜６４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｐ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
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【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
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【図１１Ｒ】
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【図１１Ｓ】
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【図１１Ｔ】
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【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
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【図１１Ｗ】
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【図１１Ｘ】
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【図１１Ｙ】
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【図１１Ｚ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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