(57)【要約】【課題】低コストでかつ、精子活性を維持し、従来よりも長期間冷蔵保存が可能な精液希釈液、及び希釈精液の保存方法を提供する。【解決手段】ルチン、特定油脂、或いはポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した特定油脂を含む精液希釈液、多段階冷却を採用すること特徴とする希釈精液の保存方法、及びルチン、特定油脂、或いはポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した特定油脂の何れか１以上を含み、多段階冷却を採用すること特徴とする希釈精液の保存方法。【選択図】図１
2011098972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルチンを含むことを特徴とする精液希釈液。
【請求項２】
アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂を含むことを
特徴とする精液希釈液。
【請求項３】
アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂と、パンプキ
ンシード油、ババス油、ルリヂサ油、クロスグリ種子油、カノーラ油、ヒマシ油、ココヤ
シ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、ブドウ種子油、アメリカホドイモ油、
カラシナ種油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ラッカセイ油、ナタネ油、サフラワ
ー油、ゴマ油、サメ肝油、ダイズ油、ヒマワリ油、それらの硬化油、それらの分抽油、レ
シチン、グリセリルトリカプロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカ
プレートグリセリルトリウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリ
オレエート、グリセリルトリリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリ
カプリレート／カプレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グ
リセリルトリカプリレート／カプレート／リノレエート、グリセリルトリカプリレート／
カプレート／ステアレート、飽和ポリグリコール化グリセリド、リノールグリセリド、カ
プリル酸／カプリン酸グリセリド、改変トリグリセリド、分別されたトリグリセリド、α
トコフェノールから選ばれる１種または２種以上の油脂との混合油脂を含むこと特徴とす
る精液希釈液。
【請求項４】
ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで、油脂が乳化された乳化油脂を含むこ
とを特徴とする請求項２又は３に記載の精液希釈液。
【請求項５】
ルチン、請求項２の油脂、請求項３の混合油脂、請求項４の乳化油脂の何れか２種以上
を含むことを特徴とする精液希釈液。
【請求項６】
精液に、請求項１、２、３または４の精液希釈液を添加し、精液を希釈し、低温に冷却
することを特徴とする希釈精液の保存方法。
【請求項７】
冷却が、多段階冷却であることを特徴とする請求項５に記載の希釈精液の保存方法。
【請求項８】
多段階冷却が、精液と精液希釈液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０
℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２
℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保
存することを特徴とする請求項６に記載の希釈精液の保存方法。
【請求項９】
希釈精液を室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に
１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間
保管し、その後４℃で保存することを特徴とする希釈精液の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子の低温保存用希釈液及び精子の低温保存方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
一般に家畜の精液は希釈され、低温或いは凍結して流通している。豚の精液の希釈保存溶液として、「モデナ液（商品名）」、「アンドロヘプ溶液」などが知られている。モデナ液の成分は、グルコース５．５０、クエン酸ＮＡ１．３８、重曹０．２０、ＥＤＴＡ０．４７、クエン酸０．５８、トリス１．１３（ｇ／２００ｍｌ）である。これら希釈保存溶液は、中温域希釈保存液であり、１６℃前後で、数日間豚精液を希釈保存することができる。
【０００３】
また、特許文献１に、豚の精液を希釈保存する溶液として、「下記Ａ液１０００部中にＢ液を２０部（重量部）、添加混合したことを特徴とする豚精液保存用希釈液。Ａ液−以下の試薬を１０００部中にそれぞれの配合割合で配合したもの。（１）クエン酸ナトリウム５．０部（２）アルブミン（牛血清）１．０部（３）βグリセロリン酸ナトリウム１．０部（４）重炭酸水素ナトリウム１．０部（５）ピルビン酸ナトリウム０．４〜０．５部（６）塩化カリウム０．５部（７）ＥＤＴＡ−２Ｎａ１．２〜１．３部（８）アミカシン０．０７〜０．０８部（９）ジベカシン０．０２〜０．０３部（１０）トリスヒドロキシメチルアミノメタン１．５〜２．０部（１１）ＧＳＨ（グルタチオン）１．５〜１．６部（１２）トレハロース４５〜４６部（１３）滅菌蒸留水残部Ｂ液−ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）２０部に、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を０．２０〜０．２５部（１０ｍＭ）溶解し、湯煎で７０℃以上に加熱し、これに同様に加熱した滅菌蒸留水を８０部加えたもの。」であることを特徴とする豚精液保存用精液希釈液が公開されている。
【０００４】
また、特許文献１には、豚の精液を希釈し、冷蔵保存する方法として、「精液に約３５℃の等温度で、下記Ａ液１０００部中にＢ液２０部を添加混合した豚精液保存用希釈液を精液の約４〜５倍程度になるよう添加し、精子数を０．５〜１億／ｍｌ程度に調整した上、得た希釈精液を小分けして恒温槽で１５℃まで温度を下降させて冷蔵保存するようにしたことを特徴とする豚精液の希釈保存法。Ａ液−以下の試薬を１０００部中にそれぞれの配合割合で配合したもの。（１）クエン酸ナトリウム５．０部（２）アルブミン（牛血清）１．０部（３）βグリセロリン酸ナトリウム１．０部（４）重炭酸水素ナトリウム１．０部（５）ピルビン酸ナトリウム０．４〜０．５部（６）塩化カリウム０．５部（７）ＥＤＴＡ−２Ｎａ１．２〜１．３部（８）アミカシン０．０７〜０．０８部（９）ジベカシン０．０２〜０．０３部（１０）トリスヒドロキシメチルアミノメタン１．５〜２．０部（１１）ＧＳＨ（グルタチオン）１．５〜１．６部（１２）トレハロース４５〜４６部（１３）滅菌蒸留水残部Ｂ液−ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）２０部に、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を０．２０〜０．２５部（１０ｍＭ）溶解し、湯煎で７０℃以上に加熱し、これに同様に加熱した滅菌蒸留水を８０部加えたもの。
さらに、約３５℃の希釈精液を、約２時間３０分で１５℃まで温度を下降させることを特徴とする請求項４に記載の豚精液の希釈保存法。また、約３５℃の希釈精液を、さらに１５℃から５℃まで約１時間２０分で下降させること、さらに、希釈精液を所定の間隔で撹拌すること」を特徴とする豚精液の希釈保存法が公開されている。
【０００５】
その他、精子、精液の保存液、低温保存方法として、特許文献２〜５などがある。特許文献２には、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質とを含有している精子低温傷害防止液が、また、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと、脂質と、血清アルブミンとを含有している細胞低温傷害防止液が記載されている。
【０００６】
特許文献３には、精子試料を提供する工程；前記精子試料を第１温度まで冷却する工程；前記精子試料を前記第１温度で維持する工程；前記精子試料を第２温度まで冷却する工程；前記精子試料を前記第２温度で維持する工程；および前記精子試料を第３温度で保管する工程を含む精子の低温保存が記載されている。
【０００７】
特許文献４には、性選別された精子を１〜４時間掛けて５℃まで冷却保存する方法、さらに凍結させて保存することを特徴とする選択された精子細胞の低温保存方法が記載されている。
【０００８】
特許文献５には、炭素数８〜13或いは炭素数１０〜１３脂肪族炭化水素、またはデカンを含む精子低温保護剤が記載されている。さらに、炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素を含む保護剤の存在下で精子を冷却する工程を含む精子の保存方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１１９１０１号公報
【特許文献２】特開平１０−２７９４０１号公報
【特許文献３】特表２００４−５０５６２４号公報
【特許文献４】特表２００３−５３０３１２号公報
【特許文献５】特開平８−２６９０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、「モデナ液」による豚の希釈精液の１０℃以下による冷蔵保存、及び１０℃以下で冷蔵保存した希釈精液を用いた人工受精は普及していない。冷蔵保存後、数日以内で精子の生存率が著しく低下するため、受胎に必要な精子を確保することが困難なためである。
【００１１】
また、特許文献１に記載の「豚精液保存用精液希釈液」は、希釈液の製造コストが既存のモデナ液に比べ極めて高く、加えて、その保存精液による受精率は高いとは言い難い。因みに、特許文献１に記載の希釈液は、モデナ液（８５円）の約３倍のコストになる。一方、本発明である精液希釈液では、モデナ液と同程度のコストである。
【００１２】
さらに、特許文献１に記載の「豚精液の希釈保存法」は、１４種の試薬を添加し、冷却保存を行っているものの、これらの試薬、温度降下方法は、上述のようにコストの面から実用的でない。
【００１３】
そこで、本発明は、低コストでかつ、精子活性を維持し、従来よりも長期間冷蔵保存が可能な精液希釈液、及び希釈精液の保存方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記の課題を解決するために、ルチンを含むことを特徴とする精液希釈液の構成とし、
アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂を含むことを特徴とする精液希釈液とし、アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂と、パンプキンシード油、ババス油、ルリヂサ油、クロスグリ種子油、カノーラ油、ヒマシ油、ココヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、ブドウ種子油、アメリカホドイモ油、カラシナ種油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ラッカセイ油、ナタネ油、サフラワー油、ゴマ油、サメ肝油、ダイズ油、ヒマワリ油、それらの硬化油、それらの分抽油、レシチン、グリセリルトリカプロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカプレートグリセリルトリウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリオレエート、グリセリルトリリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリカプリレート／カプレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／リノレエート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ステアレート、飽和ポリグリコール化グリセリド、リノールグリセリド、カプリル酸／カプリン酸グリセリド、改変トリグリセリド、分別されたトリグリセリド、αトコフェノールから選ばれる１種または２種以上の油脂との混合油脂を含むことを特徴とする精液希釈液の構成とし、
ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで、前記油脂又は混合油脂が乳化された乳化油脂を含むことを特徴とする精液希釈液の構成とし、
ルチン、前記油脂、前記混合油脂、前記乳化油脂の何れか２種以上を含むことを特徴とする精液希釈液の構成とし、
精液に、前記精液希釈液を添加し、精液を希釈し、低温に冷却することを特徴とする希釈精液の保存方法の構成とし、
前記冷却が、多段階冷却であることを特徴とする希釈精液の保存方法の構成とし、
前記多段階冷却が、精液と精液希釈液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することを特徴とする希釈精液の保存方法の構成とし、
希釈精液を室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することを特徴とする希釈精液の保存方法の構成とした。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、以上の構成であるから以下の効果が得られる。低コストで、簡易に精液希釈液が作成できる。また、本希釈液を用いることで希釈精液中の精子の過活性状態を従来の希釈液に比べ極めて高く維持することができる。さらに、冷蔵保存日数を従来（４日〜５日）に比べ格段に延長（７日〜１０日）することができる。
【００１６】
従って、豚においては、人工授精の普及に貢献する。それによって、種雄豚の飼育頭数を減らすことができ、養豚農家の労力が格段に軽減されるなどの経済効果は大きい。さらに、豚以外の哺乳動物、例えば、牛、馬などの家畜動物、その他希少野生動物などの精液の希釈及び冷蔵保存にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ルチンを含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。
【図２】本発明である精液希釈液を用いて精液を希釈し、冷蔵保存したときの精子の生存率を観察した結果である。
【図３】本発明である希釈精液の保存方法の実施形態の一例を示す図である。
【図４】特定の油脂を含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
精液を希釈し、液体状態で長期保存するという目的を、ルチンと、アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂（下記その他油脂を含んでもよい）と、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した乳化油脂とを含む精液希釈液と、精液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することすることで実現した。前記その他油脂が、パンプキンシード油、ババス油、ルリヂサ油、クロスグリ種子油、カノーラ油、ヒマシ油、ココヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、ブドウ種子油、アメリカホドイモ油、カラシナ種油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ラッカセイ油、ナタネ油、サフラワー油、ゴマ油、サメ肝油、ダイズ油、ヒマワリ油、それらの硬化油、それらの分抽油、レシチン、グリセリルトリカプロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカプレートグリセリルトリウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリオレエート、グリセリルトリリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリカプリレート／カプレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／リノレエート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ステアレート、飽和ポリグリコール化グリセリド、リノールグリセリド、カプリル酸／カプリン酸グリセリド、改変トリグリセリド、分別されたトリグリセリド、αトコフェノールから選ばれる１種または２種以上とする。
【実施例１】
【００１９】
以下、添付図面に基づき、本発明である精液希釈液について詳細に説明する。図１は、ルチンを含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。図１（Ａ）は、精子の過活性状態の評価結果である。図１（Ｂ）は、精子の過活性状態の評価方法を示す表である。図１（Ｃ）は、図１（Ａ）の評価結果をグラフにしたものである。
【００２０】
試験方法：採精した直後の豚（デュロック種）の精液、５０ｍｌと、モデナ液１０００ｍｌに、ルチン０．０１ｇ、または０．００５ｇを含む希釈液９５０ｍｌとを、３５℃〜３７℃の温度を保持しながら、精液が約２０倍になるように希釈混合し、希釈精液を作成した。なお、ルチンは、株式会社常磐植物科学研究所製を用いた。含有率は９９．７％である。
【００２１】
その後、１６℃のインキュベーターに保持し、約３時間経過後、約３７℃に保持したウォーターバスで１０分間加温した。続いて、３７℃に保持したスライドガラスに前記希釈精液を１５μ滴下し、顕微鏡下で過活性化状態の精子数を、無添加区と比較しながら観察し、図１（Ｂ）の判断基準で判断した。これら同一の精液希釈液の顕微鏡観察を３回繰り返した。
【００２２】
図１（Ａ）の「添加物」とは、モデナ液１０００ｍｌに添加したルチンの量（ｇ）である。従って、「ルチン０．０１ｇ」とは、精液の原液がルチン０．０１ｇ／モデナ液１０００ｍｌの濃度の精液希釈液で１０〜２０倍に希釈されていること、「ルチン０．００５ｇ」とは、精液の原液がルチン０．００５ｇ／モデナ液１０００ｍｌの濃度の精液希釈液で１０〜２０倍に希釈されていること、「無添加区」とは、精液の原液がモデナ液で１０〜２０倍に希釈されている希釈精液のことを意味する。
【００２３】
図１（Ａ）の「平均値」とは、低温保存試験を５回繰り返し、上述のように過活性状態の精子数を計測し、ルチン無添加区を１としたときの活性化状態にある精子の頻度を、図１（Ｂ）の基準で判定したときの評価点の平均値である。
【００２４】
なお、各繰り返し試験によって得られた平均値の「標準偏差」は、ルチン０．０１ｇで、「０．３３」、及びルチン０．００５ｇで「０．５０」であったことから、各繰り返し試験間に再現性があることが分かる。
【００２５】
図１の結果は、従来から使用されているモデナ液に、ルチンを添加した精液希釈液で、精液を１０〜２０倍に希釈した場合、従来のモデナ液（無添加区）に比べ、過活性状態の精子が極めて多いことを示している。
【００２６】
なお、ここでは、従来から使用されているモデナ液１０００ｍｌに対して、ルチンを０．０１ｇ、０．００５ｇ添加した精液希釈液で、精液を１０〜２０倍に希釈した結果のみ示したが、希釈精液中の精子の過活性状態は、モデナ液１０００ｍｌに対して、ルチン０．００１ｇ添加したときも有意に差があり良好であった。また、添加量を段階的に増やしたとき、モデナ液１０００ｍｌに対して、ルチン０．１ｇ以上では、過活性状態の増加傾向に変化は見られなかった。
【００２７】
つまり、ルチンにより冷蔵保存における精子の過活性状態を向上させるためには、好ましくはモデナ液などの精液の希釈液１０００ｍｌに対して、ルチンを０．００１ｇ〜０．１ｇ添加することである。０．００１ｇ／希釈液１０００ｍｌより低濃度では、過活性状態は、ルチン無添加のものと同程度であり、０．１ｇ／希釈液１０００ｍｌより高濃度では、過活性状態に０．１ｇ／希釈液１０００ｍｌの場合と差異はなく、希釈液製造コストが高くなり、好ましくない。
【００２８】
従って、ルチンの添加量は、より好ましくはモデナ液などの精液の希釈液１０００ｍｌに対して、ルチンを０．００５ｇ〜０．０１ｇである。
【００２９】
図１の結果から、ルチンを含む本発明である精液希釈液は、従来のモデナ液による希釈、冷蔵保存に比べ、初期の過活性精子が極めて多いことから、希釈され液体状態で、より長期の冷蔵保存が可能であると言える。また、従来の精液保存用希釈液（特許文献１）が４〜５倍の希釈であるのに対して、本発明では、２０倍に希釈しており、それでも受精率が実用可能範囲にあり、種雄の飼育頭数を減少することが可能であると言える。
【００３０】
図２は、本発明である精液希釈液を用いて精液を希釈し、冷蔵保存したときの精子の生存率を観察した結果である。図２（Ａ）は、各種添加物をモデナ液に添加し、各種冷却方法で冷却し、１０日間まで冷蔵保存したときの、精子の生存率を観察した結果である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の結果をグラフにしたものである。縦軸ＳＲ（％）は、生存率であり、横軸ｄａｙは、保存期間及び生存率を測定した日である。
【００３１】
図２（Ａ）のＴ１〜Ｔ６は各試験区であり、各試験区は以下の方法で精液を希釈し、０日（図中０）〜１０日間（図中１０Ｄ）まで４℃で保存し、０日（希釈後１時間目）、１日（図中１Ｄ）、４日（４Ｄ）、７日（７Ｄ）、１０日（１０Ｄ）目に生存精子を以下の方法で観測し、以下の方法で生存率を計算した。
【００３２】
なお、生存率は、同様の試験を５回繰り返したときの、平均値として記載した。また、±は全ての試験の値の内、平均値から最も離れた、最低値、最高値までの差分を表す。
【００３３】
ここで、使用した精液は、豚（デュロック種）精液であり、採精直後のものを使用した。モデナ液は、上述の組成である。生存精子の測定は、顕微鏡下で観察時に前進運動を行っているものを生存精子として判定した。生存率は、次式（１）により求めた。
生存率（％）＝（生存精子数／観察精子数）×１００・・・式（１）
【００３４】
「Ｔ１」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（対油当たり０．１重量％、残り蒸留水）で乳化したレシチン（０．４ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した、本発明である精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈した。なお、レシチンは卵黄黄レシチンであり、キューピー株式会社製、品番ＰＬ−３０Ｓを用いた。以下、同じ。また、ここでは卵黄レシチンを油脂として添加している。
【００３５】
次に、図３に示す（Ａ）の方法、即ち、前記２０倍希釈精液を、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管する多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００３６】
なお、乳化は高圧ホモミキサーを用いて、２５００ｒｐｍ、５分間行った。以下同じ。また、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルは、アクノーベル株式会社製、品番ＢＲＥＤＯＬ６９４を用いた。
【００３７】
「Ｔ２」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、モデナ液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００３８】
「Ｔ３」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、ラウリル硫酸ナトリウム（対レシチン当たり０．１％重量％、残り蒸留水）で乳化したレシチン（０．４ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、ラウリル硫酸ナトリウムは株式会社和光純薬社製、生化学用を使用した。
【００３９】
「Ｔ４」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、ＯＥＰ（対レシチン当たり０．１％重量％、残り蒸留水）で乳化したレシチン（０．４ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、ＯＥＰは株式会社宮崎化学薬品株式会社、ＥＱＵＥＸ  ＳＴＭのことである。
【００４０】
「Ｔ５」は、「Ｔ１」で調整した精液希釈液を、多段階冷却することなく、希釈後、直ちに、４℃のインキュベーターで冷却し、１０日間保持した。
【００４１】
「Ｔ６」は、「Ｔ２」で調整した精液希釈液を、多段階冷却することなく、希釈後、直ちに、４℃のインキュベーターで冷却し、１０日間保持した。
【００４２】
図２の結果は、従来から用いられている精液希釈液であるモデナ液を用い精液を希釈し、多段階冷却することなく、直ちに冷却した場合（Ｔ６）に比べ、レシチンをモデナ液に加えた本発明である精液希釈液（Ｔ５）は、各生存率測定日の全てで、約１．５倍の生存率があったことを示している。
【００４３】
また、図３に示す多段階冷却を採用した場合（Ｔ１）では、従来のモデナ液（Ｔ６）が、１日で生存率がほぼ５０％まで低下してしまうのに対して、１０日目においてもなお生存率が６０％以上あった。さらに、Ｔ１の結果では、従来から豚精液希釈液として使用されているラウリル硫酸ナトリウム（Ｔ３）、ＯＥＰ（Ｔ４）よりも生存率が、各生存率測定日の全てで上回っていた。
【００４４】
加えて、従来のモデナ液によって精液を希釈し、図３に示す多段階冷却を行った場合（Ｔ２）は、希釈後、直ちに４℃に冷却する場合（Ｔ６）の生存率５０％に低下する保存日数で比べると、Ｔ６が４℃保存後１日目で生存率５０％に低下するのに対して、Ｔ２では４℃保存１０日目まで生存率５０％に低下しなかった。
【００４５】
なお、豚の希釈精液が実用に耐えるためには、概ね７０％の生存率が必要であるとされる。ここでは、精液の希釈倍率２０倍としたため、生存率７０％を低下するときもあるが、適宜、精液の希釈倍率を選択することにより、生存率７０％と同等の受精率を維持し、１０日間、４℃で保存し、人工授精に利用することは十分可能である。
【００４６】
例えば、Ｔ１では８〜９倍希釈で十分である。またＴ２では３〜５倍程度、Ｔ５では２倍程度で十分受精率を維持し、実用に耐える。さらに、現代の流通事情を考慮すれば、７日間の４℃液体冷蔵保存が可能であれば、本発明である精液希釈液及び本発明である多段階冷却による希釈精液の保存方法によって作成された冷蔵保存希釈精液は、十分実用に耐えると言える。
【００４７】
さらに、本発明に上述の濃度のルチンを添加することで、生存率が伸び、過活性状態の精子が増加し、保存日数を延長することができるのは勿論である。また、本発明である精液希釈液、希釈精液の保存方法は、豚精子のみならず、ほ乳類、家畜全般の精液の希釈及び冷蔵保存に適用できることも勿論である。
【００４８】
従って、４℃で１０日間の保存でも、十分実用に耐えるほど、希釈精液の冷蔵保存技術が格段に進歩したことにより、冷蔵保存日数、受胎率に起因した豚の人工授精の問題を解決し、豚の人工授精普及率を向上させることができると言える。それにより、種雄豚の飼育頭数を低下させ、養豚農家の労力の低減など経済効果は極めて大きい。
【００４９】
なお、ここでの添加物は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した「レシチン０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液」としたが、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化したアーモンド油０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液、椿油０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液、アボガド油０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液で１０〜２０倍に希釈した精液でも、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した「レシチン０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液」で１０〜２０倍に希釈した精液と同等の精子の過活性状態、生存率、受精率を維持した冷蔵保存（急速冷却、多段階冷却ともに）が可能であった。詳細は図４を参照して後述する。
【００５０】
以下、添付図面に基づき、本発明である希釈精液の保存方法について詳細に説明する。図３は、本発明である希釈精液の保存方法の実施形態の一例を示す図である
【００５１】
図中の縦軸（ｔｅｍｐ．）は、希釈精液を冷却したときの外気の温度で、単位は℃である。横軸（ｔｉｍｅ）は、希釈精液の冷却時間である。
【００５２】
図中の（Ａ）は、本発明である希釈精液の冷却方法の一例である。図中の（Ｂ）は、特許文献１に示された冷却方法である。図中の（Ｃ）は、特許文献３に示された冷却方法である。
【００５３】
本発明である希釈精液の保存方法（Ａ）の一例は、精液と精液希釈液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、自然冷却し、続いてインキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で１６℃に達温させ、その雰囲気温度に１時間保管し、次にインキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で１２℃に達温させ、その雰囲気温度に２時間保管し、次にインキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で８℃に達温させ、その雰囲気温度に４時間保管し、その後インキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で４℃に達温させ、４℃で希釈精液を保存する。このような多段階冷却を特徴とする。
【００５４】
なお、多段階冷却は、６時間から１２時間程度の時間をかけ、緩やかに低下するよう（スムーズな曲線を描く場合も含む）に冷却する方法であれば、図３に示す温度、時間に限定されることなく、同等の精子の過活性状態を維持し、長期冷蔵（４℃で１０日ほど）が可能である。
【００５５】
また、多段階冷却に用いる希釈精液には、本発明である精液希釈液、従来から知られている精液希釈液、それらに他の試薬を添加した希釈液、その他希釈液が含まれ、さらに凍結保存用に希釈された希釈精液も含むものとする。
【００５６】
一方、特許文献１に示された冷却方法（Ｂ）は、希釈精液を約２時間３０分かけて精液の希釈温度である３５℃から１６℃に温度を降下させ、続いて約１時間２０分かけて５℃まで温度を降下させ、その温度で冷蔵保存する。上述したように、特許文献１の方法では、十分実用に耐える冷蔵保存を実現できるとは言い難い。
【００５７】
また、特許文献３に示された冷却方法（Ｃ）は、希釈精液を０．２℃〜０．５℃／分の温度の変化速度で０℃〜１０℃に温度を降下させ、その温度の中で４時間〜２１時間保持し、続いて−４０℃〜−１００℃に冷却し、その温度の中で７分〜２０分間保持し、さらに−１９０℃〜−２００℃に冷却し、その温度で凍結保存する。
【００５８】
上記冷却方法（Ｃ）では、第１に、乳化作用がある油脂（レシチン）を添加しているが、他の油脂を完全に乳化するわけではないため、顕微鏡で観察した時に、レシチンの粒子が不純物と混同してしまう可能性がある。第２に、現在流通している１６℃保存用の希釈精液（モデナ液）の製造に比べて、製品完成までの時間がかかってしまうなどの欠点がある。
【実施例２】
【００５９】
図４は、特定の油脂を含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。
【００６０】
図４（Ａ）は、上記油脂をモデナ液に添加し、各種冷却方法で冷却し、１０日間まで冷蔵保存したときの、精子の生存率を観察した結果である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の結果をグラフにしたものである。縦軸ＳＲ（％）は、生存率であり、横軸ｄａｙは、保存期間及び生存率を測定した日である。
【００６１】
図４（Ａ）のＮ１〜Ｎ６は各試験区であり、各試験区は実施例１と同様の方法で精液を希釈し、０日（図中０）〜１０日間（図中１０Ｄ）まで４℃で保存し、０日（希釈後１時間目）、１日（図中１Ｄ）、４日（４Ｄ）、７日（７Ｄ）、１０日（１０Ｄ）目に生存精子を実施例１で説明した方法で観測し、実施例１の方法で生存率を計算した。なお、ここでは、主にルチンに換え、アボガド油、椿油、アーモンド油について検討した。
【００６２】
「Ｎ１」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）で乳化したアーモンド油（０．３ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した本発明である精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈した。
【００６３】
次に、図３に示す（Ａ）の方法、即ち、前記２０倍希釈精液を、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管する多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、アーモンド油は、シグマアルドリッチジャパン株式会社製、品番Ａ２１５４を用いた。
【００６４】
「Ｎ２」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）で乳化したアボガド油（０．３ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した本発明である精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、アボガド油は、食用アボガドオイルを用いた。
【００６５】
「Ｎ３」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）で乳化した椿油（０．３ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、椿油は、山圭産業株式会社製を用いた。
【００６６】
「Ｎ４」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００６７】
「Ｎ５」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、モデナ液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００６８】
図４の結果は、従来から用いられている精液希釈液であるモデナ液を用い精液を希釈し、多段階冷却した場合に比べ、レシチン、レシチンで乳化されたアーモンド油、アボガド油、椿油を添加したモデナ液によって希釈した精液希釈液の多段階冷却では、各生存率測定日の全てにおいて生存率が高かったこと示している。
【００６９】
さらに、レシチン単独添加（Ｎ５）に比べ、アーモンド油、アボガド油、椿油を含む精液希釈液による希釈、保存では、同等以上の保存効果がみられた。従って、アーモンド油、アボガド油、椿油には、精子の活性低下抑制効果あるといえる。
【００７０】
なお、これらアーモンド油、アボガド油、椿油の含有量は、希釈液１０００ｍｌ当たり、単独で０．０５ｇ〜０．２ｇがよく、より好ましいくは０．１ｇである。さらには、アーモンド油、アボガド油、椿油をそれぞれ単独で添加する場合は、０．１ｇをレシチン０．３ｇで乳化することがより望ましい。
【００７１】
また、アーモンド油、アボガド油、椿油を単独で、モデナ液に０．０５より少ない量を添加しても、精子の生存率改善効果がなく、０．２ｇより多く添加した場案は、改善効果がみられず、逆に精子に致死的に作用してしまった。
【図１】
2011098972.tif 000003
【図２】
2011098972.tif 000004
【図３】
2011098972.tif 000005
【図４】
2011098972.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月2日(2011.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂を含むことを特徴とする精液希釈液。
【請求項２】
アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂と、パンプキンシード油、ババス油、ルリヂサ油、クロスグリ種子油、カノーラ油、ヒマシ油、ココヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、ブドウ種子油、アメリカホドイモ油、カラシナ種油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ラッカセイ油、ナタネ油、サフラワー油、ゴマ油、サメ肝油、ダイズ油、ヒマワリ油、それらの硬化油、それらの分抽油、レシチン、グリセリルトリカプロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカプレートグリセリルトリウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリオレエート、グリセリルトリリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリカプリレート／カプレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／リノレエート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ステアレート、飽和ポリグリコール化グリセリド、リノールグリセリド、カプリル酸／カプリン酸グリセリド、改変トリグリセリド、分別されたトリグリセリド、αトコフェノールから選ばれる１種または２種以上の油脂との混合油脂を含むこと特徴とする精液希釈液。
【請求項３】
ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで、油脂が乳化された乳化油脂を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の精液希釈液。
【請求項４】
請求項１の油脂、請求項２の混合油脂、請求項３の乳化油脂の何れか２種以上を含むことを特徴とする精液希釈液。
【請求項５】
精液に、請求項１、２または３の精液希釈液を添加し、精液を希釈し、低温に冷却することを特徴とする、希釈精液の保存方法。
【請求項６】
冷却が、多段階冷却であることを特徴とする請求項４に記載の希釈精液の、保存方法。
【請求項７】
多段階冷却が、精液と精液希釈液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することを特徴とする請求項５に記載の、希釈精液の保存方法。
【請求項８】
希釈精液を室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することを特徴とする、希釈精液の保存方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子の低温保存用希釈液及び精子の低温保存方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
一般に家畜の精液は希釈され、低温或いは凍結して流通している。豚の精液の希釈保存溶液として、「モデナ液（商品名）」、「アンドロヘプ溶液」などが知られている。モデナ液の成分は、グルコース５．５０、クエン酸ＮＡ１．３８、重曹０．２０、ＥＤＴＡ０．４７、クエン酸０．５８、トリス１．１３（ｇ／２００ｍｌ）である。これら希釈保存溶液は、中温域希釈保存液であり、１６℃前後で、数日間豚精液を希釈保存することができる。
【０００３】
また、特許文献１に、豚の精液を希釈保存する溶液として、「下記Ａ液１０００部中にＢ液を２０部（重量部）、添加混合したことを特徴とする豚精液保存用希釈液。Ａ液−以下の試薬を１０００部中にそれぞれの配合割合で配合したもの。（１）クエン酸ナトリウム５．０部（２）アルブミン（牛血清）１．０部（３）βグリセロリン酸ナトリウム１．０部（４）重炭酸水素ナトリウム１．０部（５）ピルビン酸ナトリウム０．４〜０．５部（６）塩化カリウム０．５部（７）ＥＤＴＡ−２Ｎａ１．２〜１．３部（８）アミカシン０．０７〜０．０８部（９）ジベカシン０．０２〜０．０３部（１０）トリスヒドロキシメチルアミノメタン１．５〜２．０部（１１）ＧＳＨ（グルタチオン）１．５〜１．６部（１２）トレハロース４５〜４６部（１３）滅菌蒸留水残部Ｂ液−ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）２０部に、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を０．２０〜０．２５部（１０ｍＭ）溶解し、湯煎で７０℃以上に加熱し、これに同様に加熱した滅菌蒸留水を８０部加えたもの。」であることを特徴とする豚精液保存用精液希釈液が公開されている。
【０００４】
また、特許文献１には、豚の精液を希釈し、冷蔵保存する方法として、「精液に約３５℃の等温度で、下記Ａ液１０００部中にＢ液２０部を添加混合した豚精液保存用希釈液を精液の約４〜５倍程度になるよう添加し、精子数を０．５〜１億／ｍｌ程度に調整した上、得た希釈精液を小分けして恒温槽で１５℃まで温度を下降させて冷蔵保存するようにしたことを特徴とする豚精液の希釈保存法。Ａ液−以下の試薬を１０００部中にそれぞれの配合割合で配合したもの。（１）クエン酸ナトリウム５．０部（２）アルブミン（牛血清）１．０部（３）βグリセロリン酸ナトリウム１．０部（４）重炭酸水素ナトリウム１．０部（５）ピルビン酸ナトリウム０．４〜０．５部（６）塩化カリウム０．５部（７）ＥＤＴＡ−２Ｎａ１．２〜１．３部（８）アミカシン０．０７〜０．０８部（９）ジベカシン０．０２〜０．０３部（１０）トリスヒドロキシメチルアミノメタン１．５〜２．０部（１１）ＧＳＨ（グルタチオン）１．５〜１．６部（１２）トレハロース４５〜４６部（１３）滅菌蒸留水残部Ｂ液−ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）２０部に、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を０．２０〜０．２５部（１０ｍＭ）溶解し、湯煎で７０℃以上に加熱し、これに同様に加熱した滅菌蒸留水を８０部加えたもの。さらに、約３５℃の希釈精液を、約２時間３０分で１５℃まで温度を下降させることを特徴とする請求項４に記載の豚精液の希釈保存法。また、約３５℃の希釈精液を、さらに１５℃から５℃まで約１時間２０分で下降させること、さらに、希釈精液を所定の間隔で撹拌すること」を特徴とする豚精液の希釈保存法が公開されている。
【特許文献１】特開２０００−１１９１０１号公報
【０００５】
その他、精子、精液の保存液、低温保存方法として、特許文献２〜５などがある。特許文献２には、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと脂質とを含有している精子低温傷害防止液が、また、炭素数１０〜１４の長鎖アルコールと、脂質と、血清アルブミンとを含有
している細胞低温傷害防止液が記載されている。
【０００６】
特許文献３には、精子試料を提供する工程；前記精子試料を第１温度まで冷却する工程；前記精子試料を前記第１温度で維持する工程；前記精子試料を第２温度まで冷却する工程；前記精子試料を前記第２温度で維持する工程；および前記精子試料を第３温度で保管する工程を含む精子の低温保存が記載されている。
【０００７】
特許文献４には、性選別された精子を１〜４時間掛けて５℃まで冷却保存する方法、さらに凍結させて保存することを特徴とする選択された精子細胞の低温保存方法が記載されている。
【０００８】
特許文献５には、炭素数８〜13或いは炭素数１０〜１３脂肪族炭化水素、またはデカンを含む精子低温保護剤が記載されている。さらに、炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素を含む保護剤の存在下で精子を冷却する工程を含む精子の保存方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献２】特開平１０−２７９４０１号公報
【特許文献３】特表２００４−５０５６２４号公報
【特許文献４】特表２００３−５３０３１２号公報
【特許文献５】特開平８−２６９０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、「モデナ液」による豚の希釈精液の１０℃以下による冷蔵保存、及び１０℃以下で冷蔵保存した希釈精液を用いた人工受精は普及していない。冷蔵保存後、数日以内で精子の生存率が著しく低下するため、受胎に必要な精子を確保することが困難なためである。
【００１１】
また、特許文献１に記載の「豚精液保存用精液希釈液」は、希釈液の製造コストが既存のモデナ液に比べ極めて高く、加えて、その保存精液による受精率は高いとは言い難い。因みに、特許文献１に記載の希釈液は、モデナ液（８５円）の約３倍のコストになる。一方、本発明である精液希釈液では、モデナ液と同程度のコストである。
【００１２】
さらに、特許文献１に記載の「豚精液の希釈保存法」は、１４種の試薬を添加し、冷却保存を行っているものの、これらの試薬、温度降下方法は、上述のようにコストの面から実用的でない。
【００１３】
そこで、本発明は、低コストでかつ、精子活性を維持し、従来よりも長期間冷蔵保存が可能な精液希釈液、及び希釈精液の保存方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記の課題を解決するために、以下の構成を有する。
１．アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂を含むことを特徴とする精液希釈液。
２．アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂と、パンプキンシード油、ババス油、ルリヂサ油、クロスグリ種子油、カノーラ油、ヒマシ油、ココヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、ブドウ種子油、アメリカホドイモ油、カラシナ種油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ラッカセイ油、ナタネ油、サフラワー油、ゴマ油、サメ肝油、ダイズ油、ヒマワリ油、それらの硬化油、それらの分抽油、レシチン、グリセリルトリカプロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカプレートグリセリルトリウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリオレエート、グリセリルトリリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリカプリレート／カプレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／リノレエート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ステアレート、飽和ポリグリコール化グリセリド、リノールグリセリド、カプリル酸／カプリン酸グリセリド、改変トリグリセリド、分別されたトリグリセリド、αトコフェノールから選ばれる１種または２種以上の油脂との混合油脂を含むこと特徴とする精液希釈液。
３．ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで、油脂が乳化された乳化油脂を含むことを特徴とする１又は２に記載の精液希釈液。
４．１の油脂、２の混合油脂、３の乳化油脂の何れか２種以上を含むことを特徴とする精液希釈液。
５．精液に、１、２または３の精液希釈液を添加し、精液を希釈し、低温に冷却することを特徴とする、希釈精液の保存方法。
６．冷却が、多段階冷却であることを特徴とする４に記載の希釈精液の、保存方法。
７．多段階冷却が、精液と精液希釈液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することを特徴とする請求項５に記載の、希釈精液の保存方法。
８．希釈精液を室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することを特徴とする、希釈精液の保存方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、以上の構成であるから以下の効果が得られる。低コストで、簡易に精液希釈液が作成できる。また、本希釈液を用いることで希釈精液中の精子の過活性状態を従来の希釈液に比べ極めて高く維持することができる。さらに、冷蔵保存日数を従来（４日〜５日）に比べ格段に延長（７日〜１０日）することができる。
【００１６】
従って、豚においては、人工授精の普及に貢献する。それによって、種雄豚の飼育頭数を減らすことができ、養豚農家の労力が格段に軽減されるなどの経済効果は大きい。さらに、豚以外の哺乳動物、例えば、牛、馬などの家畜動物、その他希少野生動物などの精液の希釈及び冷蔵保存にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ルチンを含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。
【図２】本発明である精液希釈液を用いて精液を希釈し、冷蔵保存したときの精子の生存率を観察した結果である。
【図３】本発明である希釈精液の保存方法の実施形態の一例を示す図である。
【図４】特定の油脂を含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
精液を希釈し、液体状態で長期保存するという目的を、アボガド油、椿油、アーモンド油から選ばれる１種または２種以上の油脂（下記その他油脂を含んでもよい）と、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した乳化油脂とを含む精液希釈液と、精液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管し、その後４℃で保存することすることで実現した。前記その他油脂が、パンプキンシード油、ババス油、ルリヂサ油、クロスグリ種子油、カノーラ油、ヒマシ油、ココヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、ブドウ種子油、アメリカホドイモ油、カラシナ種油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ラッカセイ油、ナタネ油、サフラワー油、ゴマ油、サメ肝油、ダイズ油、ヒマワリ油、それらの硬化油、それらの分抽油、レシチン、グリセリルトリカプロエート、グリセリルトリカプリレート、グリセリルトリカプレートグリセリルトリウンデカノエート、グリセリルトリラウレート、グリセリルトリオレエート、グリセリルトリリノレート、グリセリルトリリノレネート、グリセリルトリカプリレート／カプレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ラウレート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／リノレエート、グリセリルトリカプリレート／カプレート／ステアレート、飽和ポリグリコール化グリセリド、リノールグリセリド、カプリル酸／カプリン酸グリセリド、改変トリグリセリド、分別されたトリグリセリド、αトコフェノールから選ばれる１種または２種以上とする。
【実施例】
【００１９】
参考例１
以下、添付図面に基づき、精液希釈液について詳細に説明する。図１は、ルチンを含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。図１（Ａ）は、精子の過活性状態の評価結果である。図１（Ｂ）は、精子の過活性状態の評価方法を示す表である。図１（Ｃ）は、図１（Ａ）の評価結果をグラフにしたものである。
【００２０】
試験方法：採精した直後の豚（デュロック種）の精液、５０ｍｌと、モデナ液１０００ｍｌに、ルチン０．０１ｇ、または０．００５ｇを含む希釈液９５０ｍｌとを、３５℃〜３７℃の温度を保持しながら、精液が約２０倍になるように希釈混合し、希釈精液を作成した。なお、ルチンは、株式会社常磐植物科学研究所製を用いた。含有率は９９．７％である。
【００２１】
その後、１６℃のインキュベーターに保持し、約３時間経過後、約３７℃に保持したウォーターバスで１０分間加温した。続いて、３７℃に保持したスライドガラスに前記希釈精液を１５μ滴下し、顕微鏡下で過活性化状態の精子数を、無添加区と比較しながら観察し、図１（Ｂ）の判断基準で判断した。これら同一の精液希釈液の顕微鏡観察を３回繰り返した。
【００２２】
図１（Ａ）の「添加物」とは、モデナ液１０００ｍｌに添加したルチンの量（ｇ）である。従って、「ルチン０．０１ｇ」とは、精液の原液がルチン０．０１ｇ／モデナ液１０００ｍｌの濃度の精液希釈液で１０〜２０倍に希釈されていること、「ルチン０．００５ｇ」とは、精液の原液がルチン０．００５ｇ／モデナ液１０００ｍｌの濃度の精液希釈液で１０〜２０倍に希釈されていること、「無添加区」とは、精液の原液がモデナ液で１０〜２０倍に希釈されている希釈精液のことを意味する。
【００２３】
図１（Ａ）の「平均値」とは、低温保存試験を５回繰り返し、上述のように過活性状態の精子数を計測し、ルチン無添加区を１としたときの活性化状態にある精子の頻度を、図１（Ｂ）の基準で判定したときの評価点の平均値である。
【００２４】
なお、各繰り返し試験によって得られた平均値の「標準偏差」は、ルチン０．０１ｇで、「０．３３」、及びルチン０．００５ｇで「０．５０」であったことから、各繰り返し試験間に再現性があることが分かる。
【００２５】
図１の結果は、従来から使用されているモデナ液に、ルチンを添加した精液希釈液で、精液を１０〜２０倍に希釈した場合、従来のモデナ液（無添加区）に比べ、過活性状態の精子が極めて多いことを示している。
【００２６】
なお、ここでは、従来から使用されているモデナ液１０００ｍｌに対して、ルチンを０．０１ｇ、０．００５ｇ添加した精液希釈液で、精液を１０〜２０倍に希釈した結果のみ示したが、希釈精液中の精子の過活性状態は、モデナ液１０００ｍｌに対して、ルチン０．００１ｇ添加したときも有意に差があり良好であった。また、添加量を段階的に増やしたとき、モデナ液１０００ｍｌに対して、ルチン０．１ｇ以上では、過活性状態の増加傾向に変化は見られなかった。
【００２７】
つまり、ルチンにより冷蔵保存における精子の過活性状態を向上させるためには、好ましくはモデナ液などの精液の希釈液１０００ｍｌに対して、ルチンを０．００１ｇ〜０．１ｇ添加することである。０．００１ｇ／希釈液１０００ｍｌより低濃度では、過活性状態は、ルチン無添加のものと同程度であり、０．１ｇ／希釈液１０００ｍｌより高濃度では、過活性状態に０．１ｇ／希釈液１０００ｍｌの場合と差異はなく、希釈液製造コストが高くなり、好ましくない。
【００２８】
従って、ルチンの添加量は、より好ましくはモデナ液などの精液の希釈液１０００ｍｌに対して、ルチンを０．００５ｇ〜０．０１ｇである。
【００２９】
図１の結果から、ルチンを含む本発明である精液希釈液は、従来のモデナ液による希釈、冷蔵保存に比べ、初期の過活性精子が極めて多いことから、希釈され液体状態で、より長期の冷蔵保存が可能であると言える。また、従来の精液保存用希釈液（特許文献１）が４〜５倍の希釈であるのに対して、本発明では、２０倍に希釈しており、それでも受精率が実用可能範囲にあり、種雄の飼育頭数を減少することが可能であると言える。
【００３０】
実施例１
図２は、本発明である精液希釈液を用いて精液を希釈し、冷蔵保存したときの精子の生存率を観察した結果である。図２（Ａ）は、各種添加物をモデナ液に添加し、各種冷却方法で冷却し、１０日間まで冷蔵保存したときの、精子の生存率を観察した結果である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の結果をグラフにしたものである。縦軸ＳＲ（％）は、生存率であり、横軸ｄａｙは、保存期間及び生存率を測定した日である。
【００３１】
図２（Ａ）のＴ１〜Ｔ６は各試験区であり、各試験区は以下の方法で精液を希釈し、０日（図中０）〜１０日間（図中１０Ｄ）まで４℃で保存し、０日（希釈後１時間目）、１日（図中１Ｄ）、４日（４Ｄ）、７日（７Ｄ）、１０日（１０Ｄ）目に生存精子を以下の方法で観測し、以下の方法で生存率を計算した。
【００３２】
なお、生存率は、同様の試験を５回繰り返したときの、平均値として記載した。また、±は全ての試験の値の内、平均値から最も離れた、最低値、最高値までの差分を表す。
【００３３】
ここで、使用した精液は、豚（デュロック種）精液であり、採精直後のものを使用した。モデナ液は、上述の組成である。生存精子の測定は、顕微鏡下で観察時に前進運動を行っているものを生存精子として判定した。生存率は、次式（１）により求めた。
生存率（％）＝（生存精子数／観察精子数）×１００・・・式（１）
【００３４】
「Ｔ１」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（対油当たり０．１重量％、残り蒸留水）で乳化したレシチン（０．４ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した、本発明である精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈した。なお、レシチンは卵黄黄レシチンであり、キューピー株式会社製、品番ＰＬ−３０Ｓを用いた。以下、同じ。また、ここでは卵黄レシチンを油脂として添加している。
【００３５】
次に、図３に示す（Ａ）の方法、即ち、前記２０倍希釈精液を、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管する多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００３６】
なお、乳化は高圧ホモミキサーを用いて、２５００ｒｐｍ、５分間行った。以下同じ。また、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルは、アクノーベル株式会社製、品番ＢＲＥＤＯＬ６９４を用いた。
【００３７】
「Ｔ２」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、モデナ液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００３８】
「Ｔ３」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、ラウリル硫酸ナトリウム（対レシチン当たり０．１％重量％、残り蒸留水）で乳化したレシチン（０．４ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、ラウリル硫酸ナトリウムは株式会社和光純薬社製、生化学用を使用した。
【００３９】
「Ｔ４」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、ＯＥＰ（対レシチン当たり０．１％重量％、残り蒸留水）で乳化したレシチン（０．４ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、ＯＥＰは株式会社宮崎化学薬品株式会社、ＥＱＵＥＸ  ＳＴＭのことである。
【００４０】
「Ｔ５」は、「Ｔ１」で調整した精液希釈液を、多段階冷却することなく、希釈後、直ちに、４℃のインキュベーターで冷却し、１０日間保持した。
【００４１】
「Ｔ６」は、「Ｔ２」で調整した精液希釈液を、多段階冷却することなく、希釈後、直ちに、４℃のインキュベーターで冷却し、１０日間保持した。
【００４２】
図２の結果は、従来から用いられている精液希釈液であるモデナ液を用い精液を希釈し、多段階冷却することなく、直ちに冷却した場合（Ｔ６）に比べ、レシチンをモデナ液に加えた本発明である精液希釈液（Ｔ５）は、各生存率測定日の全てで、約１．５倍の生存率があったことを示している。
【００４３】
また、図３に示す多段階冷却を採用した場合（Ｔ１）では、従来のモデナ液（Ｔ６）が、１日で生存率がほぼ５０％まで低下してしまうのに対して、１０日目においてもなお生存率が６０％以上あった。さらに、Ｔ１の結果では、従来から豚精液希釈液として使用されているラウリル硫酸ナトリウム（Ｔ３）、ＯＥＰ（Ｔ４）よりも生存率が、各生存率測定日の全てで上回っていた。
【００４４】
加えて、従来のモデナ液によって精液を希釈し、図３に示す多段階冷却を行った場合（Ｔ２）は、希釈後、直ちに４℃に冷却する場合（Ｔ６）の生存率５０％に低下する保存日数で比べると、Ｔ６が４℃保存後１日目で生存率５０％に低下するのに対して、Ｔ２では４℃保存１０日目まで生存率５０％に低下しなかった。
【００４５】
なお、豚の希釈精液が実用に耐えるためには、概ね７０％の生存率が必要であるとされる。ここでは、精液の希釈倍率２０倍としたため、生存率７０％を低下するときもあるが、適宜、精液の希釈倍率を選択することにより、生存率７０％と同等の受精率を維持し、１０日間、４℃で保存し、人工授精に利用することは十分可能である。
【００４６】
例えば、Ｔ１では８〜９倍希釈で十分である。またＴ２では３〜５倍程度、Ｔ５では２倍程度で十分受精率を維持し、実用に耐える。さらに、現代の流通事情を考慮すれば、７日間の４℃液体冷蔵保存が可能であれば、本発明である精液希釈液及び本発明である多段階冷却による希釈精液の保存方法によって作成された冷蔵保存希釈精液は、十分実用に耐えると言える。
【００４７】
本発明である精液希釈液、希釈精液の保存方法は、豚精子のみならず、ほ乳類、家畜全般の精液の希釈及び冷蔵保存に適用できることも勿論である。
【００４８】
従って、４℃で１０日間の保存でも、十分実用に耐えるほど、希釈精液の冷蔵保存技術が格段に進歩したことにより、冷蔵保存日数、受胎率に起因した豚の人工授精の問題を解決し、豚の人工授精普及率を向上させることができると言える。それにより、種雄豚の飼育頭数を低下させ、養豚農家の労力の低減など経済効果は極めて大きい。
【００４９】
なお、ここでの添加物は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した「レシチン０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液」としたが、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化したアーモンド油０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液、椿油０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液、アボガド油０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液で１０〜２０倍に希釈した精液でも、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルで乳化した「レシチン０．４ｇ相当／１０００ｍｌモデナ液」で１０〜２０倍に希釈した精液と同等の精子の過活性状態、生存率、受精率を維持した冷蔵保存（急速冷却、多段階冷却ともに）が可能であった。詳細は図４を参照して後述する。
【００５０】
以下、添付図面に基づき、本発明である希釈精液の保存方法について詳細に説明する。図３は、本発明である希釈精液の保存方法の実施形態の一例を示す図である
【００５１】
図中の縦軸（ｔｅｍｐ．）は、希釈精液を冷却したときの外気の温度で、単位は℃である。横軸（ｔｉｍｅ）は、希釈精液の冷却時間である。
【００５２】
図中の（Ａ）は、本発明である希釈精液の冷却方法の一例である。図中の（Ｂ）は、特許文献１に示された冷却方法である。図中の（Ｃ）は、特許文献３に示された冷却方法である。
【００５３】
本発明である希釈精液の保存方法（Ａ）の一例は、精液と精液希釈液を３５℃〜３７℃に保持しながら混合し、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、自然冷却し、続いてインキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で１６℃に達温させ、その雰囲気温度に１時間保管し、次にインキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で１２℃に達温させ、その雰囲気温度に２時間保管し、次にインキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で８℃に達温させ、その雰囲気温度に４時間保管し、その後インキュベーターを０．７５℃／分の温度変化速度で４℃に達温させ、４℃で希釈精液を保存する。このような多段階冷却を特徴とする。
【００５４】
なお、多段階冷却は、６時間から１２時間程度の時間をかけ、緩やかに低下するよう（スムーズな曲線を描く場合も含む）に冷却する方法であれば、図３に示す温度、時間に限定されることなく、同等の精子の過活性状態を維持し、長期冷蔵（４℃で１０日ほど）が可能である。
【００５５】
また、多段階冷却に用いる希釈精液には、本発明である精液希釈液、従来から知られている精液希釈液、それらに他の試薬を添加した希釈液、その他希釈液が含まれ、さらに凍結保存用に希釈された希釈精液も含むものとする。
【００５６】
一方、特許文献１に示された冷却方法（Ｂ）は、希釈精液を約２時間３０分かけて精液の希釈温度である３５℃から１６℃に温度を降下させ、続いて約１時間２０分かけて５℃まで温度を降下させ、その温度で冷蔵保存する。上述したように、特許文献１の方法では、十分実用に耐える冷蔵保存を実現できるとは言い難い。
【００５７】
また、特許文献３に示された冷却方法（Ｃ）は、希釈精液を０．２℃〜０．５℃／分の温度の変化速度で０℃〜１０℃に温度を降下させ、その温度の中で４時間〜２１時間保持し、続いて−４０℃〜−１００℃に冷却し、その温度の中で７分〜２０分間保持し、さらに−１９０℃〜−２００℃に冷却し、その温度で凍結保存する。
【００５８】
上記冷却方法（Ｃ）では、第１に、乳化作用がある油脂（レシチン）を添加しているが、他の油脂を完全に乳化するわけではないため、顕微鏡で観察した時に、レシチンの粒子が不純物と混同してしまう可能性がある。第２に、現在流通している１６℃保存用の希釈精液（モデナ液）の製造に比べて、製品完成までの時間がかかってしまうなどの欠点がある。
【００５９】
実施例２
図４は、特定の油脂を含む精液希釈液で精液を希釈し、保存したときの精子の過活性状態を評価した結果を示す図である。
【００６０】
図４（Ａ）は、上記油脂をモデナ液に添加し、各種冷却方法で冷却し、１０日間まで冷蔵保存したときの、精子の生存率を観察した結果である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の結果をグラフにしたものである。縦軸ＳＲ（％）は、生存率であり、横軸ｄａｙは、保存期間及び生存率を測定した日である。
【００６１】
図４（Ａ）のＮ１〜Ｎ６は各試験区であり、各試験区は実施例１と同様の方法で精液を希釈し、０日（図中０）〜１０日間（図中１０Ｄ）まで４℃で保存し、０日（希釈後１時間目）、１日（図中１Ｄ）、４日（４Ｄ）、７日（７Ｄ）、１０日（１０Ｄ）目に生存精子を実施例１で説明した方法で観測し、実施例１の方法で生存率を計算した。なお、ここでは、主にルチンに換え、アボガド油、椿油、アーモンド油について検討した。
【００６２】
「Ｎ１」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）で乳化したアーモンド油（０．３ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した本発明である精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈した。
【００６３】
次に、図３に示す（Ａ）の方法、即ち、前記２０倍希釈精液を、室温（２０℃程度）に３０分〜１時間放置し、続いて１６℃の雰囲気温度に１時間保管し、次に１２℃の雰囲気温度に２時間保管し、次に８℃の雰囲気温度に４時間保管する多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、アーモンド油は、シグマアルドリッチジャパン株式会社製、品番Ａ２１５４を用いた。
【００６４】
「Ｎ２」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）で乳化したアボガド油（０．３ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した本発明である精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、アボガド油は、食用アボガドオイルを用いた。
【００６５】
「Ｎ３」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）で乳化した椿油（０．３ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。なお、椿油は、山圭産業株式会社製を用いた。
【００６６】
「Ｎ４」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、レシチン（０．１ｇ相当）をモデナ液１０００ｍｌに添加した精液希釈液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００６７】
「Ｎ５」は、採取した精液を３５℃〜３７℃に保持しながら、モデナ液（３５℃〜３７℃）で、２０倍に希釈し、図３に示す（Ａ）の方法で、多段階冷却を行い、最後に４℃のインキュベーター中に１０日間保持した。
【００６８】
図４の結果は、従来から用いられている精液希釈液であるモデナ液を用い精液を希釈し、多段階冷却した場合に比べ、レシチン、レシチンで乳化されたアーモンド油、アボガド油、椿油を添加したモデナ液によって希釈した精液希釈液の多段階冷却では、各生存率測定日の全てにおいて生存率が高かったこと示している。
【００６９】
さらに、レシチン単独添加（Ｎ５）に比べ、アーモンド油、アボガド油、椿油を含む精液希釈液による希釈、保存では、同等以上の保存効果がみられた。従って、アーモンド油、アボガド油、椿油には、精子の活性低下抑制効果あるといえる。
【００７０】
なお、これらアーモンド油、アボガド油、椿油の含有量は、希釈液１０００ｍｌ当たり、単独で０．０５ｇ〜０．２ｇがよく、より好ましいくは０．１ｇである。さらには、アーモンド油、アボガド油、椿油をそれぞれ単独で添加する場合は、０．１ｇをレシチン０．３ｇで乳化することがより望ましい。
【００７１】
また、アーモンド油、アボガド油、椿油を単独で、モデナ液に０．０５より少ない量を添加しても、精子の生存率改善効果がなく、０．２ｇより多く添加した場案は、改善効果がみられず、逆に精子に致死的に作用してしまった。