(57)【要約】【課題】  サポウイルスＲＮＡを迅速かつ高感度に検出すること。【解決手段】  サポウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマーおよび第二のプライマー（該プライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブにて測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサポウイルスＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、前記特定塩基配列の増幅が、配列番号１から６に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上の第一のプライマー、および、配列番号７から１２に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上の第二のプライマーを用いてなされることを特徴とする、サポウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記特定塩基配列の増幅において、第一のプライマーとして、配列番号１９から２４に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、および、第二のプライマーとして、配列番号２５から３０に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項第一に記載のサポウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
前記特定塩基配列の増幅において、第一のプライマーとして、配列番号３７、３８、４０、４２に記載の塩基配列であるオリゴヌクレオチド、および、第二のプライマーとして、配列番号４３から４８に記載の塩基配列であるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１あるいは２に記載のサポウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの少なくとも一方は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、転写調節部位、制限酵素部位、ステム・ループ構造などから選ばれた機能的配列が、その末端にさらに付加されてなることを特徴とする、請求項１から３に記載のサポウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
試料中のサポウイルスＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、
（１）サポウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなることを特徴とする請求項１から４に記載のサポウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡ転写産物量の測定が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５５に示された配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列からなることを特徴とする請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記サポウイルスＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ  Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１３から１８記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項５に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号３１から３６に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項９に記載のサポウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項１１】
前記切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応を妨げるために、その３’末端水酸基が化学的に修飾されていることを特徴とする請求項９あるいは１０に記載のサポウイルスの検出方法。
【請求項１２】
試料中のサポウイルスＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出するための試薬であって、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１から６に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、および前記第二のプライマーが配列番号７から１２に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とするサポウイルスＲＮＡの検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、かつ高感度にサポウイルスＲＮＡを検出する方法、および該方法を用いた検出試薬に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
サポウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスであり、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムに持つノンエンベロープウイルスである。ヒトカリシウイルス科には、サポウイルスの他にノロウイルスが含まれている。
我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されており、これらのウイルス性食中毒例の大半からノロウイルスが検出されている。一方、サポウイルスは、主に乳幼児の散発性下痢症の起因ウイルスとして知られてきたが、ノロウイルスと比較して検出数が少なく、これまであまり重要視されてこなかった。
しかしながら、近年、サポウイルスを原因とする集団食中毒の発生が相次いで報告されており（非特許文献１および２）、発生件数が増加傾向にある。また、ヒトからヒトへの伝播が強く示唆されており、食中毒、および感染性胃腸炎の起因ウイルスとしての重要性が認識されつつある。
ノロウイルスと同様に、サポウイルスの流行を阻止するためにはできる限り迅速な対応が必要であり、サポウイルスの迅速検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となりつつある。
そのため、サポウイルスの高感度、かつ迅速な検査法の開発が望まれている。これに対し、現在、サポウイルスの検出は、電子顕微鏡による観察が基本である。この方法では、あらゆる遺伝子型の検出か可能であるが、検出するには１０６個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で感度が低いために、検体は患者糞便に限られている。また、ノロウイルスで開発されているウイルス様中空粒子を用いた、特異抗体検出ＥＬＩＳＡの試薬は、サポウイルスでは開発されていない。
サポウイルスを高感度に測定する手段としてサポウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、電気泳動により増幅産物を検出する方法があげられる（非特許文献３）。該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、コンタミネーションの危険性をも増加させることになる。また、コンタミネーションの危険性が極めて高い操作である、増幅産物の電気泳動による検出操作が必要である。さらに、前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程、さらには増幅産物の検出工程を合わせると通例４〜５時間以上の時間を要し、迅速であるとはいえず、また、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。
標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をＴａｑＭａｎプローブといったハイブリダイゼーションプローブを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法（特許文献１および非特許文献４）があげられる。
該方法は、ＰＣＲ工程と増幅産物の検出工程が同時に行なわれるため、増幅産物の電気泳動によるコンタミネーションリスクを回避し、かつ、検査時間の短縮を実現した優れた検出方法である。しかしながら、該方法でも一般的にはＲＴ工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、操作の煩雑性とコンタミネーションのリスクが完全に解決されてはいない。また、検査時間は短縮できるものの、ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例３時間以上の時間を要し、迅速検査とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−６８５３０号
【特許文献２】特許２６５０１５９号公報
【特許文献３】特許３１５２９２７号公報
【特許文献４】特許３２４１７１７号公報
【特許文献５】特開２０００−１４４００号
【特許文献６】特開２００１−３７５００号
【特許文献７】特開２００１−３５３０００
【特許文献８】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献９】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】病原微生物検出情報、Ｖｏｌ．２８、Ｎｏ．１０（Ｎｏ．３３２）、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００７
【非特許文献２】病原微生物検出情報、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．７（Ｎｏ．３４１）、Ｊｕｌｙ  ２００８
【非特許文献３】Ｏｋａｄａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１５１，２５０３−２５０９．
【非特許文献４】Ｏｋａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，７８，１３４７−１３５３．
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，１２４７−１２５２．
【非特許文献６】Ｈａｎｓｍａｎ, Ｇ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１３（１０），１５１９−１５２５．
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６
【非特許文献８】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
サポウイルスを検出する方法には、従来から用いられてきた方法として、電子顕微鏡による観察がある。この方法は、あらゆる遺伝子型の検出が可能であるが、検出するには１０６個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で感度が低いという問題があった。そのため、極めて高濃度にウイルスを含む試料でなければ検出することができないため、高感度な検出方法の開発が望まれていた。
そこで、サポウイルスを高感度に検出する方法として、前述したＲＴ−ＰＣＲ法が開発された。この方法は、サポウイルスのＲＮＡを鋳型に逆転写（ＲＴ）反応を行い、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成し、該ＤＮＡ鎖を鋳型としてＰＣＲ反応を行なうことにより、高感度にサポウイルスを検出する方法である。
該方法では、従来の電子顕微鏡観察と比較して、極めて高感度にサポウイルスを検出することが可能であるため、検査方法として広まりつつある。
しかしながら、一般的なＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＴ工程とＰＣＲ工程、さらには電気泳動による増幅産物の検出工程と、三つの工程から成り立っている。それぞれの工程の間には、反応産物を移し替える操作が要求されるため、操作が煩雑となり、かつ、コンタミネーションの可能性が増大するという問題点がある。また、上記の全工程を終了し、検査結果を得るまでには約４〜５時間程度要するため、迅速性に課題がある検査であるといえる。
ＲＴ−ＰＣＲ法における、上記した課題の一部を解決した方法として、Ｔａｑｍａｎプローブといったハイブリダイゼーションプローブを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法（特許文献１および非特許文献４）があげられる。該方法は、ＰＣＲ工程と増幅産物の検出工程が同時であるため、増幅産物の電気泳動によるコンタミネーションリスクを回避し、かつ、検査時間の短縮を実現した優れた検出方法である。しかしながら、該方法でも一般的にはＲＴ工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、操作の煩雑性とコンタミネーションの可能性を完全に克服した検査方法であるとはいえない。また、検査時間も、一般的に３時間程度要するため、迅速検査であるともいえない。
また、ＰＣＲ工程は、原則的に熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなる急激な温度サイクルを必要とし、システム化を考える場合に簡素化および低コスト化のための大きな障壁となっていた。
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、ＮＡＳＢＡ法（特許文献２および３）、ＴＭＡ法（特許文献４）およびＴＲＣ法（特許文献５および６、非特許文献５）などが報告されている。これらのＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
前記ＲＮＡ増幅法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。また、結果が出るまでに通常、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ共に９０分以上必要であり、迅速な結果を得るには至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に変性のための加温（例えば、６５℃）が必要であり（特許文献３実施例１および特許文献４実施例１に記載）、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
一方、簡便に、一定温度・一段階でＲＮＡを増幅・測定する方法としてはＴＲＣ法（特許文献５〜７、非特許文献５）が挙げられる。当該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって、蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、前記ＲＮＡ増幅法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、プライマーなどの結合領域を標的ＲＮＡの（二次構造を計算して推定した）高次構造フリー領域に設定することで、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を、同時にかつ迅速（３０分以内）・簡便に実施することが可能である（非特許文献５）。
このＲＮＡ増幅測定法は、前記ＲＮＡ検出法の中で、迅速性、簡便性、信頼性の点から、特に好適な方法といえる。ただし、該ＲＮＡ増幅測定法は、比較的低温度（３５〜６０℃）一定温度で実施し、変性工程をまったく行わないため、標的ＲＮＡの高次構造の影響だけでなく、プライマーダイマー等の非特異的増幅の影響も受けやすいため、そのプライマーセットの設計には細心の配慮が必要で、汎用されているＰＣＲプライマー用の設計手法では不十分なことが明らかである。
サポウイルスには多様な遺伝子群（ジェノグループ）が存在することが知られており、現在、ジェノグループ（以降Ｇと標記する）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖの５種類が報告されている。この中で、ヒトに対する感染性が認められているものは、ＧＩ，ＧＩＩ，ＧＩＶ，ＧＶである。さらに、非特許文献６によれば、ＧＩとＧＩＩには、それぞれ複数の遺伝子型（ジェノタイプ）への分類が提唱されている。
また、それぞれの遺伝子群／遺伝子型ごとの病原性の相違について詳細は調べられていないものの、ＧＩ、ＧＩＩ，ＧＩＶ，ＧＶはどれもヒトに対する病原性を有するため、これらの多様な遺伝子群を検出する必要である。
このように、サポウイルスの多様な遺伝子群／遺伝子型を、高感度、かつ簡便、迅速に測定することが可能な検出方法を提供することが、本発明が解決すべき課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、一度の測定でサポウイルスの多様な遺伝子群／遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出することが可能となった。
本発明中の第一の発明は、試料中のサポウイルスＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、前記特定塩基配列の増幅が、配列番号１から６に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上の第一のプライマー、および、配列番号７から１２に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上の第二のプライマーを用いてなされることを特徴とする、サポウイルスＲＮＡの検出方法である。
第二の発明は、第一の発明における特定塩基配列の増幅において、第一のプライマーとして、配列番号１９から２４に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、および、第二のプライマーとして、配列番号２５から３０に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、サポウイルスＲＮＡの検出方法である。
第三の発明は、第一の発明あるいは第二の発明における特定塩基配列の増幅において、第一のプライマーとして、配列番号３７、３８、４０、４２に記載の塩基配列であるオリゴヌクレオチド、および、第二のプライマーとして、配列番号４３から４８に記載の塩基配列であるオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、サポウイルスＲＮＡの検出方法である。
第四の発明は、第一の発明から第三の発明における第一のプライマーおよび第二のプライマーの少なくとも一方は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、転写調節部位、制限酵素部位、ステム・ループ構造などから選ばれた機能的配列が、その末端にさらに付加されてなることを特徴とする、サポウイルスＲＮＡの検出方法である。
第五の発明は、試料中のサポウイルスＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、
（１）サポウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなることを特徴とする、第一の発明から第五の発明に記載のサポウイルスＲＮＡの検出方法である。
第六の発明は、第五の発明におけるＲＮＡ転写産物量の測定が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする検出方法である。
第七の発明は、第六の発明における蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする検出方法である。
第八の発明は、第七の発明におけるインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３７に示された配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列からなることを特徴とする検出方法である。
第九の発明は、第五の発明におけるサポウイルスＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ  Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１３から１８記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする検出方法である。
【０００７】
第十の発明は、第九の発明における切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号３１から３６に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、サポウイルスＲＮＡの検出方法である。
【０００８】
第十一の発明は、第九および第十の発明における切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応を妨げるために、その３’末端水酸基が化学的に修飾されていることを特徴とするサポウイルスの検出方法である。
【０００９】
第十二の発明は、試料中のサポウイルスＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出するための試薬であって、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１から６に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、および前記第二のプライマーが配列番号７から１２に記載の塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた１種類以上のオリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とするサポウイルスＲＮＡの検出試薬である。
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明中の試料とは、食品、飲料水、環境水、糞便および嘔吐物、鼻腔および咽頭等のぬぐい液、血液、その他の分泌液、体液、組織洗浄液などである。
本発明中の特定塩基配列とは、サポウイルス  ゲノムＲＮＡ上で、第一のプライマーと相同領域の５’末端から第二のプライマーと相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、本発明では前記特定塩基配列あるいはその相補配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖に特定塩基配列を有する。
本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
本発明中のサポウイルスＲＮＡを増幅し検出する工程における、ＲＮＡ増幅法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣなどが使用可能であり、特に限定されないが、混入するＤＮＡの影響を受けず、一定温度で実施可能なＲＮＡ増幅法であるＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣなどが好ましい。
検出方法としては既知の核酸検出方法が使用可能であるが、ハイブリダイズすることによって蛍光特性が変化するように設計された蛍光物質標識プローブを使用することが好ましい。該蛍光物質標識プローブとしては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブやインターカレーター標識プローブなどが挙げられる。前記サポウイルスＲＮＡを増幅し検出する工程における最も好適な方法は、他法に比して顕著に迅速で、一定温度・一段階でＲＮＡを増幅し、同時に増幅産物をモニタリングする特許文献５に記載の方法であるが、本願以前にサポウイルスを迅速に検出する方法は提示されていなかった。
本発明中のストリンジェントな条件とは特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、や本明細書の実施例に記載のＲＮＡ増幅条件など、あるいはこれらの適宜改変された条件が挙げられる。本明細書中で単にハイブリダイズすると記載された場合、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることを指す。また、該条件におけるハイブリダイゼーションの十分な特異性や効率が得られる範囲内で、塩基の置換、欠失、付加、修飾等が可能であり、長さも任意に設定できる。
本発明の好適な態様では、配列番号１から６で示された塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にハイブリダイズ可能な配列、配列番号７〜１２に示された塩基配列の少なくとも連続する１５塩基にハイブリダイズ可能な配列を選定することができる。本発明中の、少なくとも連続する１５塩基とは、機能的なプライマーとして常識の範囲内で設定可能であることを示すものであり、通例は連続する１５塩基以上５０塩基未満を指す。
本発明中のＲＮＡポリメラーゼあるいはＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は特定のプロモーター配列が既知のものなら特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用されるバクテリアファージ由来の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどを使用することができる。本発明中のプロモーター配列としては、前記ＲＮＡポリメラーゼに対応するプロモーター配列を使用する。また前記プロモーター配列には、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域が付加されていても良い。
【００１１】
本発明中の、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用可能である。
前述したように、現時点でヒトに感染性のあるサポウイルスはＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶの４種の遺伝子群が存在し、ＧＩ、とＧＩＩに関しては、それぞれ５種、６種の遺伝子型に分類されることが提唱されている（非特許文献６）。
非特許文献６において系統樹解析されているサポウイルス株の塩基配列情報を入手し、遺伝子群間の塩基配列の相同性を確認した結果、塩基配列が高度に保存されている領域は非常に限られていることが分かった。
そのため、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ一種類ずつ用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、サポウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することは極めて困難であると考えられた。
そこで発明者らは、多様な遺伝子群／遺伝子型を測定するために、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ二種類以上用いたオリゴヌクレオチドの最適な組み合わせについて鋭意研究を重ねた結果、一度の測定でサポウイルスの多様な遺伝子群／遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出する方法を見出した。
すなわち、本発明において第一のプライマーはサポウイルス  ＧＩ／１  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩ／２  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号２に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩ／５  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号３に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩＩ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号４に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩＶ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号５に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＶ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号６に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、の中から選ばれる一種類以上のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーはサポウイルス  ＧＩ／１  ＲＮＡの一部に相同な配列番号７に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩ／２  ＲＮＡの一部に相同な配列番号８に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩ／５  ＲＮＡの一部に相同な配列番号９に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩＩ  ＲＮＡの一部に相同な配列番号１０に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩＶ  ＲＮＡの一部に相同な配列番号１１に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＶ  ＲＮＡの一部に相同な配列番号１２に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、の中から選ばれる一種類以上のオリゴヌクレオチドからなる。
本発明の一態様は、第一のプライマーが配列番号１９から２４に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号２５から３０に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなる。
本発明のより好ましい一態様は、第一のプライマーが配列番号３７、３８、４０、４２に記載の配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、かつ第二のプライマーが配列番号４３から４８に記載の配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなる。
さらに、本発明の別の一態様としては、サポウイルス  ゲノムＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなるサポウイルスＲＮＡの検出方法である。
前期した態様において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、サポウイルスＲＮＡがｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定塩基配列の前記５’末端部位で切断されることが好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。
このような切断方法として、サポウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化などされているものを使用するのが好ましい。
【００１２】
本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、サポウイルス  ＧＩ／１  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１３に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩ／２  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１４に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩ／５  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１５に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩＩ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１６に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＩＶ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１７に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、および、サポウイルス  ＧＶ  ＲＮＡの一部に相補的な配列番号１８に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列、の中から選ばれる一種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明のより好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドが配列番号３１から３６に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００１３】
なお、本発明中の配列番号１、７および１３はＭａｎｃｈｅｓｔｅｒ（ＧＩ／１）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ８６５６０）の部分配列、配列番号２、８および１４はＨｏｕｓｔｏｎ９０（ＧＩ／２）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ９５６４４）の部分配列、配列番号３、９および１５はＥｈｉｍｅ６４３（ＧＩ／５）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＤＱ３６６３４５）の部分配列、配列番号４、１０および１６はＭｃ１０（ＧＩＩ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＹ２３７４２０）の部分配列、配列番号５、１１および１６はＥｈｉｍｅ１１０７（ＧＩＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＤＱ０５８８２９）の部分配列、配列番号６、１２および１８はＮｏｎｇＫｈａｉ２４（ＧＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＹ６４６８５６）の部分配列、である。
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。
本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、サポウイルス  ＧＩＶ  ＲＮＡの一部に相同な配列番号３７に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００１４】
本発明の一態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１３から１８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。また、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号１から６に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。そして、第二のプライマーは配列番号７から１２に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。さらに、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、配列番号３７に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００１５】
より好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号３１から３６に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。また、第一のプライマーは、配列番号１９から２４に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。そして、第二のプライマーは配列番号２５から３０に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００１６】
さらに、好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号４９、５０、５２，５３，５４に記載の配列であるオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第一のプライマーは、配列番号３７、３８、４０、４２に記載の配列であるオリゴヌクレオチドの混合物からなり、さらに、第二のプライマーは配列番号４３から４８に記載の配列であるオリゴヌクレオチドの混合物からなる。
【００１７】
本発明のサポウイルスＲＮＡの検出方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素））が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足することなども可能である。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体が使用可能である。
【００１８】
本発明の一態様では、試料中のサポウイルスＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがサポウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００１９】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
【００２０】
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から５０℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
【００２１】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが利用できる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献５および非特許文献７）。
【００２２】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献８および非特許文献８）。
【００２３】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献９および非特許文献８）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）などを用いることも可能である。
【００２４】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１から６に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５８）を付加した配列、第二のプライマー（配列番号７から１２に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号５５に示す配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１３から１８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
【００２５】
前記態様において、最も好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号４９、５０、５２，５３，５４に記載の塩基配列であるオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第一のプライマーは、配列番号３７、３８、４０、４２に記載の塩基であるオリゴヌクレオチドの混合物からなり、さらに、第二のプライマーは配列番号４３から４８に記載の塩基であるオリゴヌクレオチドの混合物からなる。
【００２６】
前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００２７】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にサポウイルスＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００２８】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりサポウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度、かつ一段階の同時測定が可能となった。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、
（１）サポウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、第一のプライマー及び第二のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸重合酵素を用いて、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅する工程、
（２）該核酸増幅産物を測定する工程、
からなるサポウイルスＲＮＡの検出方法において、前記第一のプライマー配列番号１から６に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも１種類以上のオリゴヌクレトチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号７から１２に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも１種類以上のオリゴヌクレトチドからなることを特徴としている。
本発明により、試料中に含まれる微量なサポウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に増幅、検出することが可能となった。
【００３０】
さらに、プロモーター配列を有する第一のプライマー、または第二のプライマーを用いて得られるＲＮＡ転写産物量を測定する工程において、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブを共存させ、増幅されたサポウイルスＲＮＡの特定核酸に由来する蛍光強度の増加を経時的に測定することにより、サポウイルスＲＮＡの検出を簡便、迅速、かつ高感度に行なうことが可能となった。
【００３１】
本発明の検出方法を用いたサポウイルスＲＮＡの検出試薬は、一度の測定でサポウイルスＲＮＡの多くの遺伝子群／遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出することができる。特に、従来技術と比較すると圧倒的に迅速である、という特徴を有しているため、臨床現場において、糞便や吐瀉物といった臨床検体中にサポウイルスが存在するかを迅速、かつ簡便に判定することが可能となった。そのため、その後のサポウイルス感染の蔓延の防止、およびサポウイルス感染経路の調査研究などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献８）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【図２】図２は、実施例で使用した配列番号１から２０の配列を示す図である。
【図３】図３は、実施例で使用した配列番号２１から４０の配列を示す図である。
【図４】図４は、実施例で使用した配列番号４１から６０の配列を示す図である。
【図５】図５は、実施例で使用した配列番号６１から８０の配列を示す図である。
【図６】図６は、実施例で使用した配列番号８１から９３の配列を示す図である。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したサポウイルスＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているサポウイルスｃＤＮＡ配列のうち、表１に示す遺伝子型、および塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調整したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００３５】
【表１】
2011078389.tif 000002
なお、標準ＲＮＡの全長は４５７−７３３塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）と、サポウイルスＲＮＡの全長（約７０００塩基）の一部ではあるが、本発明の測定対象であるサポウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。
【００３６】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献８に記載の方法で、配列番号５５に記載の配列の５’末端から１１番目のＣと１２番目のＡの間、配列番号５６に記載の配列の５’末端から１１番目のＣと１２番目のＡの間、配列番号５７に記載の配列の５’末端側から１０番目のＣと１１番目のＡとの間のリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
【００３７】
実施例３  サポウイルスＲＮＡ検出用プライマーセットの検討
表２に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。  
【００３８】
【表２】
2011078389.tif 000003
（１）前記標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、ＧＩＶ標準ＲＮＡは５０コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、３００コピー／５μＬ、または、１０３コピー／５μＬになるよう希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００３９】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各０．７５μＭ  第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号４０）が付加されている
各０．７５μＭ  第二のプライマー
３０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ：該プローブは実施例２で調製したもの
各０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３％  ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４０】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００４１】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表２から７に示した。
【００４２】
表２のＡからＰの組合せは、表１に示したＧＩＶの塩基配列領域４８１１−５２９３を持つ標準ＲＮＡを、ＱからＴの組合せは、表１に示したＧＩＶの塩基配列領域３８５５−４５８８を持つ標準ＲＮＡをそれぞれ使用した。また、それぞれの標準ＲＮＡは１０３コピー／５μＬのものを使用した。
表３は、表２の組合せの中で、検出時間が早く良好な性能であると判断したＥ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐに示すオリゴヌクレオチドの組合せを用い、１０２コピーのＧＩＶ標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
表４は、表３の組み合わせの中で、検出時間が早く良好な性能であると判断したＫおよびＮに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを基本とし、切断用オリゴヌクレオチドの５’末端を延長し、第一のプライマーとの重なり塩基数を検討したものであり、１０２コピーのＧＩＶ標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
表５は、表４の組み合わせの中で、検出時間が早く良好な性能であると判断したＫ８およびＮ１０に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを基本とし、第二のプライマーを検討したものであり、１０２コピーのＧＩＶ標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
表６は、表５の組み合わせの中で、検出時間が早く良好な性能であると判断したＫ８３に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを基本とし、第一のプライマーを検討したものであり、１０２コピーコピーのＧＩＶ標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
表７は、表６の組み合わせの中で、検出時間が早く良好な性能であると判断したＫ８３４に示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを基本とし、第二のプライマーを検討したものであり、５０コピーのＧＩＶ標準ＲＮＡを測定したときの結果を示している。また、Ｎ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
【表４】
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【００４５】
【表５】
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【００４６】
【表６】
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【００４７】
【表７】
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表２から表７に示した検討結果より、サポウイルスを検出するのに好適なオリゴヌクレオチド配列が明らかになったとともに、迅速かつ高感度に検出することが可能なオリゴヌクレオチドの組合せを見出した。
【００４８】
表２の組合わせＡからＰを用いた場合の検出時間の結果より、第一のプライマーは配列番号５９から６２であり、かつ第二のプライマーは配列番号７３または７４である組合せを用いれば、ＲＮＡを比較的迅速に増幅し検出することが可能であることが分かった。
一方、組合せＱからＴでは、いずれの組合せを用いても、サポウイルスを迅速に検出することができなかった。
組合せＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊは、特許文献１に記載されている、ＰＣＲ法におけるサポウイルスの検出に好適なプライマーセットと同様な配列のオリゴヌクレオチドの組合せであるものの、本検討においては、好適なオリゴヌクレオチドの組合せであるとは言えないことが分かった。
これらのことから、本発明によってサポウイルスを検出するのに好適なオリゴヌクレオチド配列が初めて明らかになったとともに、迅速かつ高感度に検出できるオリゴヌクレオチドの組合せを見出すことに成功した。
また、表２から表７に示した結果より、第一のプライマーが配列番号１から６に記載した配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であり、第二のプライマーが配列番号７から１２に記載した配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるならば、サポウイルスを検出するための好適なオリゴヌクレオチドとして機能することが分かった。
また、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１３から１８に記載した配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるならば、サポウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドとして機能することが分かった。
実施例４  遺伝子型ごとのサポウイルスＲＮＡの検出
実施例３で明らかになった、サポウイルスを迅速かつ高感度に検出できるオリゴヌクレオチドの組合せを用い、サポウイルスの各種の遺伝子型の個別での測定を試みた。
それぞれの遺伝子群／遺伝子型の標準ＲＮＡは１０＾３コピー／ｔｅｓｔの濃度で使用した。
表８に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、ＩＮＡＦプローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、実施例３の（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。
その結果、それぞれの組合せにおける検出時間は表８に示した通りとなり、実施例３で明らかとなったオリゴヌクレオチドの組合せは、それぞれの遺伝子型を迅速かつ高感度に検出できることが分かった。
【００４９】
【表８】
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実施例５  サポウイルスＲＮＡの検出試薬
表８に示したサポウイルスを検出するのに好適なオリゴヌクレオチドを用い、多くの遺伝子群／遺伝子型のサポウイルスのＲＮＡを一度に測定可能な検出試薬の作製を試みた。
【００５０】
まずは、表８に示したオリゴヌクレオチドの全てを混合した系（表９の組合せＡ）で標準ＲＮＡの検出感度および１０３コピーの検出時間を測定した。その結果、表１０に示したように全ての遺伝子型を検出することは可能であったものの、遺伝子型別のオリゴヌクレオチドの組合せで測定した場合と比較して、標準ＲＮＡの検出感度の低下、および検出時間の遅延が顕著であった。
試料中のＲＮＡ量が等しい場合、検出時間が早いほど増幅効率が高いため、全てのオリゴヌクレオチドを混合した系では、増幅効率が低下してしまったといえる。これは、系中に存在するオリゴヌクレオチドの種類が多いため、プライマーダイマーといった非特異的な増幅が起こり易くなってしまったためであると考えられる。
そこで、非特的増幅が起こりにくいオリゴヌクレオチドの組み合わせを鋭意検討するこにより得られた本発明の系（表９の組合せＢ）にて、標準ＲＮＡの検出感度および１０３コピーの検出時間を測定したところ、１０３コピーの標準ＲＮＡ全てを２５分以内に検出でき、かつ、全てのオリゴヌクレオチドを混合した系よりも検出感度を向上させることに成功した。
非特許文献４に記載された従来の検出方法では、サポウイルスの核酸を抽出してから、サポウイルスＲＮＡの検出が終了するまでに約１８０分を要する。
一方、本実施例の表９の組合せＢによると、サポウイルスの核酸を抽出してから、サポウイルスＲＮＡの検出が終了するまでに要する時間は３よ０分以内であり、極めて迅速である。このことから、本実施例に示した方法により、サポウイルスＲＮＡの迅速かつ高感度な測定を実現するのに成功したと言える。本実施例が、本発明における最も好ましい系であるといえる。
【００５１】
【表９】
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【００５２】
【表１１０】
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【００５３】
【表１１】
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【００５４】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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