(57)【要約】【課題】有機溶媒を用いることなく且つ装置を大型化させることなく薬剤の内包化率の高いリポソームを製造する。【解決手段】リポソームと薬剤とを含む溶液を層流を形成するようにマイクロキャピラリ１３に流通させる。マイクロキャピラリ１３の一部は、温度調整が可能であり且つ超音波を照射する温調式超音波槽１２内に設置される。層流を形成するリポソームと薬剤とを含む溶液に超音波が照射される。超音波照射後の溶液に、薬剤の内包化率が高いリポソームが含まれる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム及び薬剤を含む第一液を、層流を形成するように流路に流通させる第一工程と、
上記流路に流通している第一液に対して超音波を照射し、流路から流出した第二液を回収する第二工程と、を含む薬剤内包リポソームの製造方法。
【請求項２】
上記流路におけるレイノルズ数が１５００以下になるように上記第一液を流通させる請求項１に記載の薬剤内包リポソームの製造方法。
【請求項３】
上記第二液に含まれるリポソームの薬剤内包化率が４４％以上である請求項１又は２に記載の薬剤内包リポソームの製造方法。
【請求項４】
リポソームと薬剤とを含む溶液が流通される流路部と、
上記流路部に上記溶液を流通させる流通機構と、
上記流路部を流通する上記溶液に超音波を照射する超音波照射機構と、を具備する薬剤内包リポソーム製造装置。
【請求項５】
上記流通機構が、上記溶液の流路部におけるレイノルズ数が１５００以下になるように上記溶液を流路部に流通させるものである請求項４に記載の薬剤内包リポソーム製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い内包化率で薬剤を内包するリポソームの製造方法及び製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質やステロール類のような油脂、又は乳タンパクなどの両親媒性物質やその混合物は、溶液中で粒状に会合することによりミセルを形成する。ミセルの中でも特に、脂質が球状の二重膜を形成し、当該二重膜の内側に水相を形成する形態をとるものは、ベシクル、もしくはリポソームと称される。
【０００３】
リポソームは、脂質二重膜の内側に物質を内包する能力を有し、薬理作用を有する物質（薬剤）を脂質二重膜の内側に内包した状態でその物質を生体内において作用させるべき部位に送達することができる。この能力により、リポソームは、「ドラッグ・デリバリー・システム（以下、「ＤＤＳ」とも称される。）」のキャリアとして用いることができ、生物学、医学、薬学分野などにおいて近年注目されている。ＤＤＳは、薬剤を生体内の器官や細胞に送達して生体内の薬物分布を量的、空間的、時間的に制御するシステムである。
【０００４】
リポソームを用いたＤＤＳにおいて、リポソーム全体に対して、薬剤を内包しない空のリポソームの割合が多ければ、投与する薬物（薬剤及びリポソーム）の量が多くなる。薬物の総投与量が多くなると副作用が生じる虞がある。また、必要な薬剤の投与量を予め計算により算出することが困難になる。
【０００５】
リポソームに薬剤を内包させる一般的な技術として、リポソームを含む溶液に薬剤を加え相転移温度以上に加熱するものがある。この技術で得られるリポソームの内包化率（リポソームが内包する薬物の割合）は一般に低く、そのため、内包化率の高いリポソームを得る技術が望まれている。
【０００６】
内包化率の高いリポソームを得る技術として、流路部の一部が特に細くなった部分を挟んだ両側の一方に水相を設け他方に油相を設け、水相側から油層側へ溶液を押し進めることにより、リポソームに薬剤を内包させるものがある（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。しかしながら、この技術で得られたリポソームを人体に投与するためには、リポソームの溶液から油相の形成に用いた有機溶媒（特許文献１では、ヘキサン）を除去しなければならない。
【０００７】
有機溶媒を用いず、且つ、リポソームと薬剤とを含む溶液を相転移温度以上に加熱する技術よりも高い内包化率のリポソームを得る技術として、リポソームと薬剤とを含む溶液に二酸化炭素ガスによる加圧ろ過を施す技術がある（例えば、特許文献２参照）。この技術では、二酸化炭素ガスで加圧ろ過するため、リポソームの製造装置が大型化するという問題があった。
【０００８】
ところで、リポソームによる人体などの細胞への薬剤の送達は、リポソームと細胞との融合（いわゆる、トランスフェクション法）により行われると推定されている。リポソームに内包させる薬剤は、内包化のため脂質膜の透過性を有し、リポソームを例え相転移温度未満に保温したとしても徐々にリポソームの外にリークする。したがって、臨床試験などにおいて高い内包化率を保ったままでリポソームを被験者に投与するためには、臨床現場でリポソームに薬剤を内包させることが必要である。
【０００９】
特許文献２に記載された内包化の技術では前述したように装置が大型化するため、臨床現場など被験者のいる施設内にリポソームの製造装置を設置することが困難であり、被験者に高い内包化率を保ったままでリポソームを被験者に投与することが難しいという問題がある。
【００１０】
特許文献２に記載された技術に対して、脂質を溶媒でハイドロレーションさせた溶液をバッチ反応器に入れて超音波を照射する技術がある（例えば、特許文献３参照）。特許文献３に記載された技術では、特許文献２に記載された技術と同じく有機溶媒の除去が不要であり、また、特許文献２に記載された技術のようにリポソームの製造装置が大型化することがなく、臨床現場など被験者を収容した施設内に容易に設置できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−２１２８１３号公報
【特許文献２】特開２００７−２６２０２６号公報
【特許文献３】特開２００７−７６２５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｖｏｌ．３２，２２９−２３３，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特許文献３に記載された技術では、有機溶媒の除去が不要であり、臨床現場などに容易に設置することができるが、リポソームの内包化率が十分に高くないという問題があった。
【００１４】
本発明は、前述された問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、装置を大型化させることなく且つ有機溶媒を用いることなく、高い内包化率のリポソームを製造することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、リポソーム及び薬剤を含む第一液を、層流を形成するように流路に流通させる第一工程と、上記流路に流通している第一液に対して超音波を照射し、流路から流出した第二液を回収する第二工程と、を含むものである。
【００１６】
リポソームは、溶液中に脂質を分散させることにより得られる。
【００１７】
上記脂質には、リン脂質、スフィンゴリピド、糖脂質、ステロール、コレステロール、スフィンゴミエリン、ステアリン酸、ソルビタン脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステル等が用いられる。
【００１８】
脂質が分散した上記溶液は、脂質から成るフィルムに溶媒を加えてゆっくりと揺とうする（ハイドレーション）ことにより生成される。脂質は、溶媒に浸透されることにより溶媒中に分散する。溶媒中の脂質は、自己集合することでリポソームを形成する。溶媒には、人体へ投与する場合を考慮し、生体内で害のないｐＨと浸透圧を有するものが用いられる。例えば、ＨＥＰＥＳやＰＢＳ等の緩衝液が溶媒に用いられる。  
【００１９】
脂質が分散した上記溶液には、リポソームに内包させる薬剤が加えられる。薬剤には、脂質膜に対して透過性を有するものが用いられる。薬剤が加えられた溶液は、流通機構により上記流路部に流通される。流通機構には、例えばポンプが用いられる。流通機構には、流路部を流通する溶液の流通速度を調整する調整部が設けられることが望ましい。
【００２０】
一般に、流路部における溶液の流通面積が小さく、溶液の流速が小さく、密度が小さく且つ粘度が大きいほど層流になり易いとされている。層流は、溶液の流線が流路部の軸方向に対して全て平行である。また、管の壁面に近くなる程、流体は管の壁面の抵抗を受けるため、流速が遅くなる。
【００２１】
上記流路部には、マイクロキャピラリのような細長い円管やマイクロ流路プレートが用いられる。流路部は、例えばテフロン（登録商標）及びＰＥＥＫ樹脂等の脂質が吸着し難く超音波を吸収または反射し難い材質のものや、ガラスにより形成される。ガラスは、ある程度脂質が吸着する可能性があるが、流路部の壁を薄くすることができ、溶液に照射される超音波の強度を設定し易いので好適である。流路部の壁の厚み寸法は、例えば1ミリメートル以下に、好ましくは、０．５ミリメートル以下に、さらに好ましくは０．１ミリメートル以上０．２ミリメートル以下に設定される。
【００２２】
上記溶液が層流を形成して流通する上記流路部は、超音波照射と温度調整が可能な温調式超音波槽中に設置される。温調式超音波槽により、温度が一定に保たれた状態で層流を形成する溶液に超音波が照射される。温調式超音波槽には、溶液に照射する超音波の強度や、周波数を調整する制御部が設けられることが望ましい。
【００２３】
バッチ反応器に入れられた上記溶液に超音波が照射される従来技術においては、溶媒分子が等方的に衝突する乱流下や静置条件下での超音波の照射であるが、層流を形成する上記溶液に超音波が照射される本発明においては、層流を形成する溶液に超音波を照射するから、幅広い種類の分子の変形や配向状態の変化が生じると考えられる。
【００２４】
本発明者らは、この層流環境の下における現象は、分子の種類ではなく、分子の大きさや形状、流れの条件に依存するということを突きとめた。加えて、層流がもたらす分子の変形や配向状態の変化は、そのような場において調製や化学反応を行う際に、その反応性へ影響を与えることを突きとめた。
【００２５】
層流と乱流とを分ける基準として一般に用いられているレイノルズ数は、流体の粘度、速度、密度及びその液体が流通する管の長さから算出される。そして、管内の流れにおいては、このレイノルズ数が、約２０００から４０００より大きければ乱流と判断され、この範囲よりも小さければ層流であると判断とされる。
【００２６】
本発明では、上記溶液は、低レイノルズ数であって層流を形成するように流通機構により上記流路部を流通される。流路部を流通する溶液のレイノルズ数は層流を形成する１５００以下であることが好ましい。
【００２７】
本発明者らは、層流を形成する上記溶液に超音波が照射された場合と、バッチ反応器に入れられた上記溶液に超音波が照射された場合とにおけるリポソームの挙動の違いについて詳細に検討した。従来技術のようにバッチ反応器に入れられたリポソームと薬剤とを含む上記溶液（静置条件下または乱流下）に超音波が照射されると、複数個のリポソームの融合と、リポソームの分裂との両方の反応が生じる。上記薬剤は、脂質膜の透過性による内包化に加え、リポソームの融合と分裂の際にも内包化され、超音波を照射しない場合よりも内包化率が高くなる。
【００２８】
一方、リポソームのような柔軟性のある巨大分子集合体は、層流を形成することにより、せん断力によって球形から球形以外の形状に変形する。しかしながら、表面エネルギーを最小にして安定化するためには球形であることが必要である。このような状況下で超音波が照射されると、リポソームは分裂して粒径の小さなリポソームになる。リポソームの分裂は、層流により生じるせん断力の影響がなくなる大きさの粒径にリポソームがなるまで繰り返される。つまり、層流を形成する上記溶液に超音波が照射される場合（本発明）の方が、バッチ反応器に入れられた上記溶液に超音波が照射された場合（従来技術）よりも、分裂と融合との頻度が高くなると考えられる。上述したように上記薬剤は、脂質膜の透過性による内包化に加え、リポソームが融合、分裂を行うことによっても内包化されるので、層流を形成する上記溶液に超音波が照射された場合の方（本発明）が薬剤の内包化率が高くなると考えられる。
【００２９】
リポソームの分裂は、上記流路部を流通する溶液の流通速度と、流路部の管径と長さ及び材質と、照射される超音波の強度及び照射時間と、流路部内での温度等の条件とに影響される。つまり、本発明のにおける薬剤の内包化率は、上記条件に影響されると考えられる。例えば、超音波の照射強度を低くしたり、溶液の流通速度を遅くすることで内包化率を低くすることができる。つまり、リポソームにおける薬剤の内包化率は、上記条件の設定により調整することができる。
【００３０】
超音波が照射された後の溶液は、内包化率の高いリポソームとしてビンなどを用いて回収される。なお、温調式超音波槽による溶液の調整温度は、前述の脂質の種類に応じて適宜設定される。 
【００３１】
本発明において、リポソームにおける薬剤の内包化率は、蛍光物質であるカルセインを薬剤の代わりに用いて計測される。カルセインは、薬剤と同じく脂質膜の透過性を有し、さらに、リポソームに内包されている状態とリポソームに内包されていない状態とで蛍光強度が異なる特性を有し、リポソームの内包化率を計測するのに多用されている。
【００３２】
超音波が照射された後の溶液は、ゲルろ過法を用いてリポソームと、リポソームに内包されなかった薬剤（カルセイン）とに分離される。ゲルろ過法では、リポソームが先に、カルセインが後に溶出する。ゲルろ過法により得られたリポソームに内包されたカルセインの量は、蛍光分析により蛍光強度として計測される。ゲルろ過法により得られたリポソームを含む溶液の蛍光強度をＦ０とする。蛍光分析後、ゲルろ過法により得られたリポソームを含む溶液に界面活性剤等が加えられることによりリポソームが破壊され、リポソームに内包されていたカルセインがリポソームから溶媒中に放出される。この放出されたカルセインの量は、蛍光分析により蛍光強度として計測される。リポソーム破壊後の蛍光強度をＦとする。内包化率は、（１−Ｆ０／Ｆ）×１００により算出される。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、製造装置を大型化させることなく、且つ有機溶媒を用いることなく高い内包化率のリポソームを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の一実施形態に係るリポソーム製造装置１０の模式図である。
【図２】流路部１３の内部の本発明の実施形態である層流の概念を模式的に現した図である。
【図３】リポソーム製造方法を示したフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下に、適宜図面が参照されて、本発明の好ましい実施形態が説明される。なお、以下に説明される各実施形態は本発明の一例にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で、本発明の実施形態を適宜変更できることは言うまでもない。
【００３６】
［リポソーム製造装置１０の概略］
図１は、本発明の一実施形態であるリポソーム製造装置１０の模式図である。リポソーム製造装置１０は、主として、送液機構２０、流路４８、超音波照射機構１５、溶液回収機構４９に大別される。流路４８の一端１７が送液機構２０と接続され、流路４８の他端１８が溶液回収機構４９内部に挿入されている。各構成の詳細については、以下に説明される。
【００３７】
［送液機構２０］
図１に示されるように、リポソーム製造装置１０は、送液機構２０としてシリンジポンプ２１を有する。シリンジ１１は、液体が充填されうる筒形状のものであり、その先端に送液口１９が形成されている。シリンジ１１の内部空間にはガスケット３４が設けられている。ガスケット３４によって、シリンジ１１の内部空間における送液口１９側と反対側とが液密に封止されている。このガスケット３４には、プランジャ３１が接続され、かつ、プランジャ３１がシリンジ１１から突出されている。したがって、シリンジ１１の外側においてプランジャ３１を操作すると、シリンジ１１内においてガスケット３４がスライド移動する。
【００３８】
シリンジ１１とガスケット３４及びプランジャ３１からなる注射器３６は、シリンジポンプ２１の可動機構１６に対して着脱可能である。シリンジ１１内に第一液が充填される際には、注射器３６が可動機構１６から外される。また、シリンジ１１内に充填された第一液が流路４８に送液される際には、注射器３６が可動機構１６に装着される。可動機構１６は、装着された注射器３６のプランジャ３１を送液口１９側へ等速で動作させ得る。この可動機構１６の動作によって、シリンジ１１に充填された第一液が送液口１９から流路４８へ流出される。なお、図には示されていないが、シリンジポンプ２１には、可動機構１６の移動速度を調整する調整部が設けられており、第一液の送液速度を調整することができる。
【００３９】
この送液速度は、マイクロキャピラリ１３の長さや内径を勘案し、少なくとも十分な超音波照射時間、すなわち、滞留時間が確保される範囲内でなければならない。送液速度が速すぎると、マイクロキャピラリ１３において液体の滞留時間が十分に確保されない。一方、送液速度が遅すぎると、マイクロキャピラリ１３において十分なせん断力をリポソームへ付与できない。超音波の周波数や強度は、例えば、前述された滞留時間を考慮して設定される。この滞留時間は、１分以上、さらに好ましくは２分以上確保されることが好適であり、上限は、好ましくは３０分以内、さらに好ましくは５分以内であることが望ましい。
【００４０】
［流路４８］
図１に示されるように、流路４８はマイクロキャピラリ１３によって構成されている。マイクロキャピラリ１３の断面形状は、理論上特に定める必要はない。超音波の透過性を考慮して、星形のような複雑な形状とすることが好適ではあるが、円形のマイクロキャピラリ１３が安価に入射可能である。マイクロキャピラリ１３の材質は、できるだけ超音波を透過しやすいものが望ましい。例えば、音響インピーダンス値が水に比して極端に高いガラスよりも、テフロン（登録商標）のような合成樹脂材料からなるものが好適である。マイクロキャピラリ１３は、その内径が１ミリメートル未満の円管である。マイクロキャピラリ１３の一端１７は、ジョイント３５を介して、シリンジ１１の送液口１９と接続されている。マイクロキャピラリ１３の他端１８は、溶液回収機構４９に挿入されている。マイクロキャピラリ１３の中央部分の殆どは、温調式超音波槽１２の貯留槽３２に貯留された水中に配置されている。
【００４１】
［超音波照射機構１５］
図１に示されるように、温調式超音波槽１２は、水などの液体を貯留可能な貯留槽３２を有する。この貯留槽３２の底付近には、水などの液体を加熱又は冷却可能な温度制御機構３３が設けられている。各図には詳細に示されていないが、この温度制御機構３３は、温度センサ、ヒータ及び制御板から構成されており、貯留槽３２に貯留された液体の温度を温度センサによって検知して、その液体の温度が制御板に設定された温度を含む一定の温度範囲となるように、ヒータの動作を制御するものである。温調式超音波槽１２の内部には貯留槽３２に貯留された液体に対して超音波を照射する超音波発生機構１５が設けられている。この超音波発生機構１５は、公知の機構を採用することができるので、詳細な説明が省略されるが、超音波照射機構１５は、所定の超音波を貯留槽３２に貯留された液体に対して照射し得るものである。超音波の加速度は、その周波数の２乗と出力の１乗とにそれぞれ比例する。超音波の出力は強いほど好適であるが、５０Ｗ以上さらに好ましくは２００Ｗ以上であることが望まれる。超音波の周波数は、高いほど好適であると推察されるが、２０ｋＨｚの低周波超音波でも十分に目的を達成できる。この超音波発生機構１５には、超音波の強度を調整する調整部が設けられていることが望ましい。
【００４２】
［溶液回収機構４９］
溶液回収機構４９は、マイクロキャピラリ１３の他端１８から流出される第二液を貯留可能な大きさの容器によって構成されている。このような容器としては、例えば、広口ビン１４などが用いられる。
【００４３】
［リポソーム製造方法］
以下に、前述されたリポソーム製造装置１０を用いたリポソーム製造方法が説明される。リポソーム製造方法は、図３のフローチャートに示されるように、主として次の構成に大別される。
（１）脂質に溶媒を加えハイドロレーションを行った後、薬剤の内包化率の指標となるカルセインを加えた第一液を、層流を形成するようにマイクロキャピラリ１３へ送液する第一工程（Ｓ１）。
（２）マイクロキャピラリ１３を流通している第一液に対して超音波照射機構１５によって超音波を照射し、マイクロキャピラリ１３から流出した第二液を溶液回収機構４９に回収する第二工程（Ｓ２）。
【００４４】
［第一液の調製］
リン脂質を、茄子型フラスコ中でクロロホルムに溶解させる。ロータリーエバポレーター及び真空ポンプを用いて、クロロホルムをゆっくり蒸発除去し、茄子型フラスコ壁面にリン脂質から成るフィルムを得る。更に、デシケーター内で茄子型フラスコ中に得られたリン脂質のフィルムを真空ポンプを用いて減圧乾燥させることにより、フィルム内に含まれるクロロホルムを完全に除去する。壁面にリン脂質のフィルムが形成された茄子型フラスコにＨＥＰＥＳ緩衝液を加えてゆっくりリン脂質のフィルムを溶媒に浸透させてハイドロレーションを行う。ＨＥＰＥＳ緩衝液に浸透されることにより、リン脂質はＨＥＰＥＳ緩衝液中に分散する。緩衝溶液中に分散したリン脂質は、自己集合することによりリポソームを形成する。この溶液に蛍光物質であり且つ脂質膜の透過性を有するカルセインを薬剤の代わりに加えたものを第一液とする。なお、薬剤（カルセイン）は、ハイドレーションを行う前に緩衝液に加えておいてもよい。                             
【００４５】
［第一工程］
図１に示される注射器３６が、可動機構１６から外される。外された注射器３６のシリンジ１１内に前述された第一液が充填される。注射器３６が可動機構１６に装着され、可動機構１６がプランジャ３１を送液口１９側へ等速で動作させることによって、ガスケット３４が送液口１９側へ移動される。また、ガスケット３４が移動されることによって、シリンジ１１の内部空間に充填された第一液に圧力が付与されて、シリンジ１１内の第一液が送液口１９から等速でマイクロキャピラリ１３へ流出する。第一液は、マイクロキャピラリ１３の一端１７から他端１８へ向かう過程において、層流として流通される。層流については、以下に詳細に説明される。
【００４６】
図２に示されるように、マイクロキャピラリ１３内において、第一液は、流通向き２９へ層流として流通される。なお、図２において、矢印４５の向きにマイクロキャピラリ１３の一端１７があり、矢印４６の向きにマイクロキャピラリ１３の他端１８がある。また、図２において、流速２３から流速２６によって、マイクロキャピラリ１３内の層流における速度の流線が示されている。流速２３から流速２７は、マイクロキャピラリ１３の軸に対して全て平行であり、流通向き２９と同じ向きである。マイクロキャピラリ１３の壁面に近くなる程、壁面の抵抗を受けることによって、第一液の流速が小さくなる。したがって、図２に示された２点鎖線４０及び２点鎖線４１で挟まれたマイクロキャピラリ１３の中央側の空間を流される流速２５から流速２７は、２点鎖線４０とマイクロキャピラリ３７の壁面４２との間に挟まれた空間を流される流速２４、及び２点鎖線４１とマイクロキャピラリ３８の壁面４３との間に挟まれた空間を流される流速２３に比べて大きい。
【００４７】
［第二工程］
第二工程において、マイクロキャピラリ１３内を層流として流通する第一液は、温調式超音波槽１２の貯留槽３２に貯留された水を介して、温度制御機構３３で調整された温度に調整される。また、超音波発生機構１５が貯留槽３２に貯留された水に対して超音波を照射することにより、マイクロキャピラリ１３内を流通する第一液に超音波が照射される。図２において、超音波発生機構１５から発生された貯留槽３２中の超音波が、模式的に矢印４７として示される。
【００４８】
リポソーム２２のような柔軟性のある巨大分子集合体は、層流を形成することによりせん断力を受け球形から球形以外の形状に変形する。しかしながら、表面エネルギーを最小化するためは球形の方が安定であり、このような状況下で超音波が照射されると、リポソーム２２は分裂して粒径の小さなリポソームになる。リポソーム２２の分裂は、せん断力の影響がなくなる粒径にリポソーム２２がなるまで繰り返される。薬剤（カルセイン）５１は、脂質膜に対して透過性を有することによる内包化に加え、リポソーム２２が融合と分裂を行うことによっても内包化され、リポソーム２８における薬剤の内包化率が高められる。リポソーム２２の分裂の頻度は、マイクロキャピラリ１３を流通する第一液の流通速度と、マイクロキャピラリ１３の管径と長さ及び材質と、照射される超音波の強度及び照射時間と、マイクロキャピラリ１３内での第一液の温度等の条件に影響されると考えられる。つまり、上記条件によりリポソーム２８における薬剤の内包化率が変化する。なお、図２においては、模式的に、カルセイン５１を内包しないリポソームに参照符号２２が付されており、カルセイン５１を内包するリポソームに参照符号２８が付されている。
【００４９】
超音波が照射された後の溶液は、第二液と称され、マイクロキャピラリ１３の他端１８から流出して、広口瓶１４で回収される。
【００５０】
なお、本実施形態では、本発明に係る送液機構としてシリンジポンプ２１が例示されているが、シリンジポンプ２１に代えて、送液ポンプなどの公知の装置等が採用されてもよい。
【実施例】
【００５１】
以下に、本発明の実施例が説明される。実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載されたものに限定されないことは言うまでもない。
【００５２】
［実施例１］
［第一液の調製］
Ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（１．７５ｍｇ）と、Ｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｅｇｇ  ｙｏｌｋ  ｌｅｃｉｔｈｉｎ（２．５ｍｇ）を含有するクロロホルム（５ｍｌ）溶液を茄子型フラスコに入れロータリーエバポレーターで回転させながら真空ポンプ（ＰＴＦＥダイヤフラム真空ポンプＶ−７００  ＥＣＯ，柴田化学）を用い、約一時間かけてクロロホルムを突沸しないように監視の下、ゆっくりと減圧蒸留しながら除去した。さらにデシケーター内に上記茄子型フラスコを入れたものを３時間、上記真空ポンプを用いて減圧乾燥させてクロロホルムを完全に除去することにより上記２種類の脂質の混合物のフィルムを得た。上記フラスコにＨＥＰＥＳ緩衝液（１．２５ｍｌ）を加え、このフラスコを傾けた状態でゆっくり回転させてハイドロレーション操作を行うことによって、上記２種類の脂質混合物が緩衝液中に分散した溶液を得た。当該溶液にカルセインを最終濃度５０ｎｍとなるように添加した溶液を第一液とした。
【００５３】
[第二液の調製]
得られた第一液を注射器３６に充填した。送液機構２０を作動させることによって、シリンジ１１に充填された第一液をマイクロキャピラリ１３に流通させた。マイクロキャピラリ１３として、流通向き２９に垂直な断面における最大寸法が３３０μｍであって、流通向き２９に沿った長さが９２ｃｍのものを用いた。また、第一液は、マイクロキャピラリ１３に対して流速３９μＬ／ｍｉｎで流通させた。このとき、第一液がマイクロキャピラリ１３中に滞留される時間は約２分であった。マイクロキャピラリ１３を貯留槽３２（６０℃）に貯蓄された水に浸して超音波（３．７ｋＨｚ、６００Ｗ）を照射した。これにより、マイクロキャピラリ１３の他端１８から流出する第二液を得た。
【００５４】
[内包化率の決定]
リポソームと、リポソームに内包されなかったカルセインを分離するために、ゲルろ過を行った。ゲルろ過には、担体としてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製）を用い、カラムは内径１ｃｍのものを用い、ゲル部分の長さはおよそ２０ｃｍであった。移動相には、ハイドレーションと同じＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた。溶出液を１分ごとに集め、蛍光分光光度計（日本分光（株）ＦＰ−６３００）により、同溶出液の５１７ｎｍにおける蛍光強度を測定した。なお、励起光は、４９４ｎｍとした。その後、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を最終濃度０．１％となるように添加し、上記と同じ手法で蛍光強度を再び測定した。
【００５５】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００添加前の蛍光強度をＦ０、同添加後の蛍光強度をＦとし、内包化率を、(１−Ｆ０／Ｆ)×１００で算出した。ゲルろ過操作は、Ｆ０≒Ｆとなるフラクションが得られるまで続けられた。Ｆ０≒Ｆとは、すなわちリポソームに内包化されなかったカルセインのみが溶出されている状態、言いかえれば、リポソームの溶出が終わっている状態を示す。
【００５６】
Ｆ０＜Ｆとなっているフラクションは、最初の第一及び第２フラクションの２つであった。第一フラクションのＦ０は１３．８５（任意単位）、Ｆは２５．９４であったので、（１−１３．８５／２５．９）×１００により内包化率は４７％と計算される。第二フラクションのＦ０は３．０９３、Ｆは５．５４８であったので、同じく内包化率は４４％と計算される。この２つのフラクションを合わせると、内包化率はおよそ４６％と計算される。
【００５７】
［比較例１］
実施例１と共通の第一液を、ポリカーボネート製容器（従来技術のバッチ反応器に相当する）に入れ、貯留槽３２（６０℃）に貯蓄された水に浸して超音波（３．７ｋＨｚ、６００Ｗ）を２分間照射した。この溶液を、実施例１の内包化率の計測と同じ手順にて処理することにより、内包化率を算出した。
【００５８】
Ｆ０＜Ｆとなっているフラクションは、第二から第四フラクションであった。第二フラクションのＦ０は４６．９６、Ｆは６３．００であったので、内包化率は２５％と計算される。第三フラクションのＦ０は３０．４４、Ｆは４１．５５であったので、内包化率は２７％と計算される。第四フラクションのＦ０は２８．５３、Ｆは３８．６４であったので、内包化率は２６％と計算される。この３つのフラクションを合わせると、内包化率はおよそ２６％と計算される。
【００５９】
実施例１による内包化率と比較例１による内包化率とを比較すると、実施例１による内包化率が高いことが確認された。これは、リポソームの融合、分裂の頻度が、実施例１の方が比較例１よりも高いためと考えられる。
【符号の説明】
【００６０】
１０・・・リポソーム製造装置
１１・・・シリンジ
１２・・・温調式超音波槽
１３・・・マイクロキャピラリ
１４・・・広口ビン
１５・・・超音波照射機構
１６・・・プランジャ可動機構
１７・・・シリカキャピラリーチューブの一端（流路入口側）
１８・・・シリカキャピラリーチューブの他端（流路出口側）
１９・・・シリンジ１１の送液口
２１・・・シリンジポンプ
２２・・・リポソーム
２８・・・リポソーム
３１・・・プランジャ
３２・・・貯留槽
３３・・・温度制御機構
３４・・・ガスケット
３５・・・ジョイント
３７、３８・・・マイクロキャピラリ
４２、４３・・・マイクロキャピラリの壁面
５１・・・薬剤（カルセイン）
【図１】
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【図２】
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【図３】
2011140468.tif 000005