(57)【要約】【課題】治療遺伝子を損傷、疾患、または移植された血管へターゲティング運搬すること。【解決手段】壁を有するプロテオリポソームであって、該プロテオリポソームの壁が細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含有するターゲティングポリペプチドを有する、プロテオリポソーム；およびベクター粒子を細胞外マトリックス成分へターゲティングさせる為の修飾ウイルス表面蛋白質を有するベクター粒子であって、該ウイルス表面蛋白質は細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含有するターゲティングポリペプチドを含むように修飾されている、ベクター粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−１】
2011234740.tif 000002
【０００２】
【数２−１】
2011234740.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
【数２−２】
2011234740.tif 000004
【０００４】
【数３】
2011234740.tif 000005
【０００５】
【数４−１】
2011234740.tif 000006
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１，ｐｇｓ５−１４（１９９０）
【非特許文献２】Ｌｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｃｋｒｉｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．４６７−４８５
【非特許文献３】Ｎａｂｅｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９１，ｐｇｓ５４１−５４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
【数４−２】
2011234740.tif 000007
【０００８】
【数５−１】
2011234740.tif 000008
【０００９】
本発明により、さらに、以下が提供される。
【００１０】
【数５１】
2011234740.tif 000009
【００１１】
【数５２】
2011234740.tif 000010
【００１２】
【数５３】
2011234740.tif 000011
【００１３】
【数５４】
2011234740.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明を以下の図面に関して記載する。
【図１Ａ】図１Ａは、同種指向性ｇｐ７０蛋白質（配列番号１）の受容体結合領域の模式図であり、アミノ酸残基１８及び１９の間へのコラーゲン結合ドメインを含むポリペプチドの挿入が示されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、リンカーアミノ酸残基が結合したコラーゲン結合ポリペプチドを、同種指向性ｇｐ７０蛋白質のＮ末端領域内のＢｓｔＥＩＩユニーク部位に挿入する為のクローニング戦略及びエンベロープ構造の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、表面（ＳＵ）及び膜貫通（ＴＭ）ポリペプチド、並びにシグナルペプチド、追加のコラーゲン結合ドメイン、膜スパニング及びＲペプチド領域が特定されているモロニーマウス白血病ウイルスのエンベロープ蛋白質を示す模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、コラーゲン結合ドメインを含むキメラエンベロープ蛋白質の発現、精製、及び再生(renaturation)を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、コラーゲン被覆マイクロタイターウェルにおける再生した組換えキメラエンベロープ蛋白質の結合を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ｇｐ７０エンベロープ蛋白質に対して陽性染色を示さない偽(mock)トランスフェクションされた（コントロール）ＧＰＬ細胞を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＥＥ＋でトランスフェクションされた、野生型ｇｐ７０を発現するＧＰＬ細胞を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋プラスミドＤＮＡでトランスフェクションされたＧＰＬ細胞を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質と、野生型ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質との共移動(co-migration)、及び３０ｋｄａ領域におけるｇａｇ蛋白質の共移動を示すウエスタンブロットである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、マイクロタイターウエル中のコラーゲンマトリックスに対するキメラウイルスの選択的結合を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質を保有するウイルスで形質導入された培養物におけるβ−ガラクトシダーゼに対する陽性染色を示す細胞培養プレート、及び野生型ＣＥＥ＋で形質導入された培養物及び形質導入されなかった培養物における陰性染色を示す細胞培養プレートである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープを保有するコラーゲン結合ベクターによる形質導入後にβ−ガラクトシダーゼを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の高倍率での写真である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋蛋白質を保有するウイルスの正常ヒト血清存在下での形質導入効率を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、カテーテルで傷つけられたマウス大動脈の未処置セグメントを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに示したカテーテルで傷つけられたマウス大動脈のセグメント部分を高倍率で示したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質のマウス大動脈の傷つけられたセグメントに対する結合を示したものである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質がマウス大動脈の傷つけられていないセグメントに対しては結合しないことを示したものである。
【図５Ｅ】図５Ｅは、キメラＥＣＢ−ＣＥＥ＋エンベロープ蛋白質の下大静脈の傷つけられたセグメントに対する結合を示したものである。
【図５Ｆ】図５Ｆは、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ウイルスによる軟骨細胞へのインビボ形質導入を、新生マウス尾内へのベクター上清の注射後の核標的β−ガラクトシダーゼの発現によって示したものである。
【図６Ａ】図６Ａはバルーンカテーテルによる損傷の９日後で、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ベクター上清（力価：８×１０５cfu/ml）点滴２日後の、ラットの左総頚動脈（縦方向に切開）のセグメントの全体像を示す。括弧でくくられた領域が血管損傷及びインビボ形質導入の実際の部位を示す。括弧でくくられた領域の右側の動脈セグメントは傷を受けていないが、同じベクターに暴露された。右頚動脈の短いセグメントが、未損傷、未処置コントロールとして右下に示されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｘ−ガル染色した後にホルマリン固定したラットの損傷総頚動脈の縦方向断面を低倍率（１０×）で示したものである。ブルー染色核を有する多くの細胞（矢印）が中膜の長さに沿って見られる。
【図６Ｃ】図６Ｃは、核標的β−ガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現する平滑筋細胞を示す動脈壁セグメント（図６Ｂにおける括弧でくくられた領域）を高倍率で示す（矢印が顕著なブルー核を有する細胞を示している）。
【図７】図７は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ．ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞の細胞溶解物のウエスタンブロットである。
【図８Ａ】図８は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。
【図８Ｂ】図８は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。
【図９Ａ】図９は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞及びＣＨ０１０細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。
【図９Ｂ】図９は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞及びＣＨ０１０細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。
【図９Ｃ】図９は、レトロウイルスベクターＣＥＥ＋、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋、ＣＡＥ、ＥＣＢ−ＣＥＥ＋ＣＡＥに感染、又は偽感染（コントロール）した２９３Ｔ細胞及びＣＨ０１０細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による結果を示す。
【図１０】図１０は、ＣＡＥ及びＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥベクターのコラーゲン結合アフィニティに関するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１１Ａ】図１１は、レトロウイルスベクターＣＡＥ又はレトロウイルスベクターＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理したマウスの左総頚動脈の断面を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、レトロウイルスベクターＣＡＥ又はレトロウイルスベクターＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理したマウスの左総頚動脈の断面を示す。
【図１２Ａ】図１２は、ＣＡＥ又はＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理した損傷ヒト伏在静脈断面を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、ＣＡＥ又はＥＣＢ−ＣＥＥ＋．ＣＡＥで処理した損傷ヒト伏在静脈断面を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ及びＢは、キメラエンベロープ蛋白質ＳＵ−ＥＣＢ−ＣＥＥ＋又は緩衝液（コントロール）で処理したヒトのアテローム性動脈硬化症プラークを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ及びＢは、キメラエンベロープ蛋白質ＳＵ−ＥＣＢ−ＣＥＥ＋又は緩衝液（コントロール）で処理したヒトのアテローム性動脈硬化症プラークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
【数９−１】
2011234740.tif 000013
【００１６】
【数１０】
2011234740.tif 000014
【００１７】
【数１１】
2011234740.tif 000015
【００１８】
【数１２】
2011234740.tif 000016
【００１９】
【数１３】
2011234740.tif 000017
【００２０】
【数１４】
2011234740.tif 000018
【００２１】
【数１５】
2011234740.tif 000019
【００２２】
【数１６】
2011234740.tif 000020
【００２３】
【数１７】
2011234740.tif 000021
【００２４】
【数１８】
2011234740.tif 000022
【００２５】
【数１９】
2011234740.tif 000023
【００２６】
【数２０】
2011234740.tif 000024
【００２７】
【数２１】
2011234740.tif 000025
【００２８】
【数２２】
2011234740.tif 000026
【００２９】
【数２３】
2011234740.tif 000027
【００３０】
【数２４】
2011234740.tif 000028
【００３１】
【数２５】
2011234740.tif 000029
【００３２】
【数２６】
2011234740.tif 000030
【００３３】
【数２７】
2011234740.tif 000031
【００３４】
【数２８】
2011234740.tif 000032
【００３５】
【数２９】
2011234740.tif 000033
【００３６】
【数３０】
2011234740.tif 000034
【００３７】
【数３１】
2011234740.tif 000035
【００３８】
【数３２】
2011234740.tif 000036
【００３９】
【数３３】
2011234740.tif 000037
【００４０】
【数３４】
2011234740.tif 000038
【００４１】
【数３５】
2011234740.tif 000039
【００４２】
【数３６】
2011234740.tif 000040
【００４３】
【数３７】
2011234740.tif 000041
【００４４】
【数３８】
2011234740.tif 000042
【００４５】
【数３９】
2011234740.tif 000043
【００４６】
【数４０】
2011234740.tif 000044
【００４７】
【数４１】
2011234740.tif 000045
【００４８】
【数４２】
2011234740.tif 000046
【００４９】
【数４３】
2011234740.tif 000047
【００５０】
【数４４】
2011234740.tif 000048
【００５１】
【数４５】
2011234740.tif 000049
【００５２】
【数４６】
2011234740.tif 000050
【００５３】
【数４７】
2011234740.tif 000051
【００５４】
【数４８】
2011234740.tif 000052
【００５５】
【数４９】
2011234740.tif 000053
【００５６】
【数５０】
2011234740.tif 000054
【図１Ａ】
2011234740.tif 000055
【図３Ａ】
2011234740.tif 000056
【図３Ｂ】
2011234740.tif 000057
【図３Ｃ】
2011234740.tif 000058
【図４Ｂ】
2011234740.tif 000059
【図５Ａ】
2011234740.tif 000060
【図５Ｂ】
2011234740.tif 000061
【図５Ｃ】
2011234740.tif 000062
【図５Ｄ】
2011234740.tif 000063
【図５Ｅ】
2011234740.tif 000064
【図５Ｆ】
2011234740.tif 000065
【図６Ａ】
2011234740.tif 000066
【図６Ｂ】
2011234740.tif 000067
【図６Ｃ】
2011234740.tif 000068
【図７】
2011234740.tif 000069
【図８Ｂ】
2011234740.tif 000070
【図１１Ａ】
2011234740.tif 000071
【図１１Ｂ】
2011234740.tif 000072
【図１２Ａ】
2011234740.tif 000073
【図１２Ｂ】
2011234740.tif 000074
【図１３Ａ】
2011234740.tif 000075
【図１３Ｂ】
2011234740.tif 000076
【図１Ｂ】
2011234740.tif 000077
【図２Ａ】
2011234740.tif 000078
【図２Ｂ】
2011234740.tif 000079
【図２Ｃ】
2011234740.tif 000080
【図３Ｄ】
2011234740.tif 000081
【図３Ｅ】
2011234740.tif 000082
【図４Ａ】
2011234740.tif 000083
【図４Ｃ】
2011234740.tif 000084
【図８Ａ】
2011234740.tif 000085
【図９Ａ】
2011234740.tif 000086
【図９Ｂ】
2011234740.tif 000087
【図９Ｃ】
2011234740.tif 000088
【図１０】
2011234740.tif 000089
【配列表】
2011234740000001.app