(57)【要約】【課題】蛍光標識を用いることなくリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する。【解決手段】まず、第１過程では、例えばＬＤＬまたはＨＤＬ等のリポタンパク質に対して２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光、例えば３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光、または４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を照射することによって、リポタンパク質を励起する。次に、第２過程では、このリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質に対して２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光を照射することによって、該リポタンパク質を励起する第１過程と、
励起された該リポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する第２過程と
を含むことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第１過程において、前記リポタンパク質に対して、前記２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光として、ＵＶ光を照射する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項３】
請求項２に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記ＵＶ光として、３６５±１０ｎｍの範囲内の波長の光を照射する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記リポタンパク質として、ＬＤＬを用いる
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項５】
請求項４に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの３９９〜６００ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの３９９〜４９９ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項７】
請求項２または３に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記リポタンパク質として、ＨＤＬを用いる
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの３９９〜６００ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項９】
請求項８に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの３９９〜４７９ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第１過程において、前記リポタンパク質に対して、前記２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光として、Ｂｌｕｅ光を照射する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記Ｂｌｕｅ光として、４７０±１０ｎｍの範囲内の波長の光を照射する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記リポタンパク質として、ＬＤＬを用いる
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの５１１〜６９９ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの５１１〜５５９ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記リポタンパク質として、ＨＤＬを用いる
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの５１１〜６９９ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第２過程において、前記蛍光スペクトルの５１１〜５５９ｎｍの範囲内の波長における強度を測定する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第１過程において、前記励起をする前に前記リポタンパク質を酸化しておく
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
空気酸化によって前記リポタンパク質を酸化する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記リポタンパク質に対してＵＶ光を照射することによって、該リポタンパク質を酸化する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載のリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法であって、
前記第１過程において、薬剤酸化によって前記リポタンパク質を酸化する
ことを特徴とするリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、蛍光標識を用いることなくリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
周知の通り、人の血清中に含まれる例えばＬＤＬ（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：低密度リポタンパク質）、ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：高密度リポタンパク質）等のリポタンパク質は、その状態や量を分析することにより、人体の健康状態を判定する基準になり得るため、このリポタンパク質を分析するための様々な方法が研究されている（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
ここで、リポタンパク質を分析する方法の１つとして、蛍光標識を用いることによって、リポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する技術が知られている（例えば非特許文献２参照）。
【０００４】
すなわち、例えば非特許文献２によれば、本来的には蛍光スペクトルの強度（以下、蛍光強度とも称する）が微弱であるリポタンパク質を、例えばｄｉ−１５−ＡＳＰ（Ｎ，Ｎ−ｄｉｐｅｎｔａｎｄｅｃｙｌａｍｉｎｏｓｔｙｒｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）等の蛍光標識となる試薬と結合させることによって、蛍光強度を増大させることができる。その結果、このような蛍光標識を用いることによって、リポタンパク質の定量的な蛍光スペクトル分析が可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】岐阜薬科大学紀要  Ｖｏｌ．５２，５５−５６（２００６）「酸化高密度リポタンパクによる動脈硬化発症および進展機序の解明」松永俊之
【非特許文献２】Ｃｏｒｓｅｔｔｉ Ｊ．Ｐ．；Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｈ．；Ｃｉａｎｃｉ，Ｊ．；Ｓｐａｒｋｓ，Ｃ．Ｅ．  “Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”１９９１、１９５、１２２−１２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、既に説明したように、リポタンパク質は蛍光強度が微弱である。そのため、リポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する際には、上述したような蛍光標識を用いることが必須であると考えられていた。
【０００７】
そのため、より簡易な方法でリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定するために、蛍光標識を用いることなく、測定可能な程度にリポタンパク質の蛍光強度を増大させ、蛍光スペクトルを測定する方法が望まれていた。
【０００８】
そこで、この発明の目的は、従来と比してより簡易に、すなわち、蛍光標識を用いることなくリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明に係る発明者が種々検討したところ、リポタンパク質を、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光、特にＵＶ光またはＢｌｕｅ（ブルー）光を照射して励起することによって、蛍光標識を用いることなく、測定可能な強度でリポタンパク質の蛍光スペクトルが得られることを見出した。
【００１０】
そこで、上述の目的の達成を図るため、この発明によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法は、以下の第１過程及び第２過程の各過程を含んでいる。
【００１１】
すなわち、まず、第１過程では、リポタンパク質に対して２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光を照射することによって、リポタンパク質を励起する。
【００１２】
次に、第２過程では、リポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する。
【００１３】
また、この発明によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法は、以下の第１過程及び第２過程の各過程を含んでいる。
【００１４】
すなわち、まず、第１過程では、リポタンパク質に対してＵＶ光を照射することによって、リポタンパク質を励起する。
【００１５】
次に、第２過程では、リポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する。
【００１６】
また、この発明によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法は、以下の第１過程及び第２過程の各過程を含んでいる。
【００１７】
すなわち、まず、第１過程では、リポタンパク質に対してＢｌｕｅ光を照射することによって、リポタンパク質を励起する。
【００１８】
次に、第２過程では、リポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する。
【発明の効果】
【００１９】
この発明によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、蛍光標識を用いることなくリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定することができる。そのため、この発明によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、従来とは異なり、蛍光標識を用意する必要がなく、さらに蛍光標識をリポタンパク質と結合させる過程を省略できるため、その分の処理時間及びコストを削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＬＤＬの光吸収スペクトルを示す図である。
【図２】第１の実施の形態に係る測定方法を用いて測定されたＬＤＬの蛍光スペクトルを示す図である。
【図３】第１の実施の形態に係る測定方法を用いて測定されたＬＤＬの蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】ＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合の、ＬＤＬの蛍光強度と試料中のＬＤＬの濃度との相関を示す図である。
【図５】Ｂｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合の、ＬＤＬの蛍光強度と試料中のＬＤＬの濃度との相関を示す図である。
【図６】（Ａ）及び（Ｂ）は、ＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合において、互いに異なる波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と試料中のＬＤＬの濃度との相関を比較する図である。
【図７】（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合において、互いに異なる波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と試料中のＬＤＬの濃度との相関を比較する図である。
【図８】ＨＤＬの光吸収スペクトルを示す図である。
【図９】第１の実施の形態に係る測定方法を用いて測定されたＨＤＬの蛍光スペクトルを示す図である。
【図１０】第１の実施の形態に係る測定方法を用いて測定されたＨＤＬの蛍光スペクトルを示す図である。
【図１１】ＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合の、ＨＤＬの蛍光強度と試料中のＨＤＬの濃度との相関を示す図である。
【図１２】Ｂｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合の、ＨＤＬの蛍光強度と試料中のＨＤＬの濃度との相関を示す図である。
【図１３】（Ａ）〜（Ｃ）は、ＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合において、互いに異なる波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と試料中のＨＤＬの濃度との相関を比較する図である。
【図１４】（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合において、互いに異なる波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と試料中のＨＤＬの濃度との相関を比較する図である。
【図１５】（Ａ）は、ＵＶ光を照射することによって励起させた場合の、ＬＤＬの空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図であり、（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによって励起させた場合の、ＬＤＬの空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。
【図１６】（Ａ）は、ＵＶ光を照射することによって励起させた場合の、ＨＤＬの空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図であり、（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによって励起させた場合の、ＨＤＬの空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。
【図１７】（Ａ）は、励起光としてＵＶ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＬＤＬと空気酸化されていないＬＤＬとの蛍光強度を比較する図であり、（Ｂ）は、励起光としてＢｌｕｅ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＬＤＬと空気酸化されていないＬＤＬとの蛍光強度を比較する図である。
【図１８】（Ａ）は、励起光としてＵＶ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＨＤＬと空気酸化されていないＨＤＬとの蛍光強度を比較する図であり、（Ｂ）は、励起光としてＢｌｕｅ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＨＤＬと空気酸化されていないＨＤＬとの蛍光強度を比較する図である。
【図１９】（Ａ）は、ＵＶ光を照射することによって励起させた場合の、ＬＤＬのＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図であり、（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによって励起させた場合の、ＬＤＬのＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。
【図２０】（Ａ）は、ＵＶ光を照射することによって励起させた場合の、ＨＤＬのＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図であり、（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによって励起させた場合の、ＨＤＬのＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。
【図２１】（Ａ）は、ＵＶ光を照射することによって励起させた場合の、ＬＤＬの薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図であり、（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによって励起させた場合の、ＬＤＬの薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図である。
【図２２】（Ａ）は、ＵＶ光を照射することによって励起させた場合の、ＨＤＬの薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図であり、（Ｂ）は、Ｂｌｕｅ光を照射することによって励起させた場合の、ＨＤＬの薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、この発明の好適な実施の形態について説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、単なる好適例に過ぎず、従って、この発明の構成は、以下に説明する構成例のみに何ら限定されるものではなく、この発明の範囲を逸脱することなく、多くの変形や変更を行い得ることが明らかである。また、以下の説明において記載する例えば濃度、体積等の値は、この発明の効果を達成し得る範囲内の値であり、同様の効果が得られるならば、この値の近傍の値であってもよく、何らこの数値に限定されるものではない。
【００２２】
〈第１の実施の形態〉
第１の実施の形態では、リポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法について説明する。
【００２３】
この第１の実施の形態によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法は、第１過程及び第２過程を含んでいる。以下、第１過程から順に各過程につき説明する。
【００２４】
まず、第１過程では、リポタンパク質を励起する。
【００２５】
ここで、第１の実施の形態において測定の対象とするリポタンパク質は、人の血清中に複数種類含まれて存在している。そして、この実施の形態では、これら複数種類のリポタンパク質のうち、特にＬＤＬ及びＨＤＬを試料として用いる。
【００２６】
そこで、第１の実施の形態では、これら複数種類混在して血清中に含まれているリポタンパク質から、試料として用いるＬＤＬ及びＨＤＬを予め選び分け、取り出しておく必要がある。そのために、人から採取した血清を例えば周知の超遠心分離器に掛けることによって、各種類のリポタンパク質を比重毎に分画する。ＬＤＬとＨＤＬとは、互いに密度が異なるため、このように分画することによってそれぞれ取り分けることができる。
【００２７】
また、例えば、この第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法を用いて、複数の試料の蛍光強度を測定し、それらの結果から各ＬＤＬまたは各ＨＤＬの状態を比較分析する場合等においては、試料とするＬＤＬまたはＨＤＬの濃度を互いに統一しておく必要がある。その場合には、ＬＤＬ及びＨＤＬを超純水によって希釈し、濃度を調整して測定用の試料とするのが好ましい。
【００２８】
そして、この第１過程では、このように用意した、試料としてのＬＤＬまたはＨＤＬに対して、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光、より好ましくは、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を照射することによって、これらＬＤＬまたはＨＤＬを励起する。
【００２９】
ここで、ＬＤＬ及びＨＤＬから蛍光スペクトルを測定するためには、これらＬＤＬ及びＨＤＬを励起するためのＵＶ光またはＢｌｕｅ光の波長を好適に設定するのが望ましい。すなわち、ＵＶ光によって励起させる場合には、例えば励起光の照射装置において、このＵＶ光の波長を３６５±１０ｎｍに設定して、また、Ｂｌｕｅ光によって励起させる場合には、このＢｌｕｅ光の波長を４７０±１０ｎｍに設定して、試料とするＬＤＬ及びＨＤＬに対して照射することが好ましい。
【００３０】
また、この第１過程において、ＬＤＬまたはＨＤＬを励起させる、すなわちＵＶ光またはＢｌｕｅ光を照射するためには、例えばＮａｎｏＤｒｏｐ３３００  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）等の周知の蛍光強度測定装置を用いるのが好ましい。
【００３１】
また、この第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法では、この第１過程において用意するリポタンパク質を酸化しておくのが好ましい。このように、予めリポタンパク質を酸化しておくことによって、続く第２過程における蛍光スペクトルの測定時において、得られるリポタンパク質の蛍光強度を増大させることができる。
【００３２】
リポタンパク質を酸化する場合には、この酸化の手段として、例えば、空気酸化、ＵＶ光を照射することによる酸化、または、薬剤酸化によってリポタンパク質を酸化するのが好ましい。
【００３３】
空気酸化を行う場合には、例えば、２００μｌの容器中に試料となるリポタンパク質を
２０μｌ程度収容し、この容器を密閉し、すなわち例えば蓋を閉めた状態で、常温の暗所中において例えば好ましくは５０時間以上放置することによって、リポタンパク質を酸化するのが好ましい。
【００３４】
また、例えば長期間保存されることにより経日的に空気酸化されたリポタンパク質を試料として用いることによって、上述した空気酸化と同様に、リポタンパク質の蛍光強度を増大させるという効果を得ることができる。すなわち、例えば、パラフィルムで覆われた蓋付きのガラス製サンプル瓶中に収容され、低温暗所中、より具体的には例えば５℃程度の冷蔵庫中において、好ましくは１年程度保存されたリポタンパク質を試料として用いることによって、リポタンパク質の蛍光強度を増大させることができる。
【００３５】
また、ＵＶ光の照射による酸化を行う場合には、例えば、ＵＶランプを用いてリポタンパク質に対して好ましくは２５０〜２６０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を、好ましくは少なくとも２５時間以上照射することによって、リポタンパク質を酸化するのがよい。
【００３６】
また、薬剤酸化を行う場合には、例えばＡＡＰＨ（２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等のラジカル発生剤を、試料となるリポタンパク質に添加することによって、このリポタンパク質を酸化するのが好ましい。
【００３７】
次に、第２過程では、上述した第１過程において励起されたリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定する。
【００３８】
この第２過程における蛍光スペクトルの測定は、上述した例えば周知の蛍光強度測定装置内において、上述した第１過程、すなわちＬＤＬまたはＨＤＬの励起過程と連続的に行われる。
【００３９】
そして、ＬＤＬを試料とし、第１過程においてＵＶ光を励起光として使用した場合には、３９９〜６００ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは３９９〜４９９ｎｍ程度の範囲内の波長における蛍光スペクトルの強度を測定するのが好適である。
【００４０】
また、ＬＤＬを試料とし、第１過程においてＢｌｕｅ光を励起光として使用した場合には、５１１〜６９９ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは５１１〜５５９ｎｍ程度の範囲内の波長における蛍光スペクトルの強度を測定する。
【００４１】
また、ＨＤＬを試料とし、第１過程においてＵＶ光を励起光として使用した場合には、３９９〜６００ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは３９９〜４７９ｎｍ程度の範囲内の波長における蛍光スペクトルの強度を測定するのが好適である。
【００４２】
また、ＨＤＬを試料とし、第１過程においてＢｌｕｅ光を励起光として使用した場合には、５１１〜６９９ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは５１１〜５５９ｎｍ程度の範囲内の波長における蛍光スペクトルの強度を測定する。
【００４３】
ここで、この出願に係る発明者は、この第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法によって、蛍光標識を用いることなくリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定することが可能であることを確認するために種々の実験を行った。以下、図１〜図１４を参照して、これらの実験とその結果について説明する。
【００４４】
まず、発明者は、ＬＤＬを励起させるのに好適な範囲の波長を特定するために、ＬＤＬの光吸収スペクトルを測定した。なお、この測定では、測定装置としてＮａｎｏＤｒｏｐ１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用して吸光度を測定した。
【００４５】
図１は、ＬＤＬの光吸収スペクトルを示す図である。この図１において、縦軸は吸光度の相対値を任意単位で、また、横軸は波長をｎｍ単位でそれぞれ目盛ってある。また、この光吸収スペクトルを得た測定では、３．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＬＤＬを試料として使用した。ここで、この試料としたＬＤＬの濃度は、ＬＤＬの質量（ｍｇ）とこのＬＤＬを超純水で希釈して調製した各試料の総体積（ｍｌ）との比（ｍｇ／ｍｌ）を以って規定してある。なお、以下、この実施の形態においては、リポタンパク質、すなわちＬＤＬまたはＨＤＬの濃度を、特に説明がない限りこのｍｇ／ｍｌ単位を以って規定する。
【００４６】
図１から、ＬＤＬの光吸収スペクトルでは、２３０ｎｍ付近の波長において吸光度のピークを、６００ｎｍ付近の波長においてテールを確認することができる。この結果から、２３０〜６００ｎｍの範囲の波長領域において、ＬＤＬの光吸収帯域が存在すると考えられる。従って、ＬＤＬを励起するに当たり、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光を励起光として用いるのが有効であることがわかる。また、この２３０〜６００ｎｍの波長領域にはＵＶ領域（波長領域：２３０〜４００ｎｍ）及びＢｌｕｅ領域（青及び緑の領域を含む。波長領域：４５５〜５７７ｎｍ）が含まれている。そのため、ＬＤＬを励起するに当たり、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を励起光として用いるのが有効であることも確認できる。
【００４７】
従って、第１の実施の形態に係る測定方法において、ＬＤＬの蛍光スペクトルを測定する場合、上述した第１過程で、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光、例えばＵＶ光またはＢｌｕｅ光を励起光として用いるのが好適であることが確認された。
【００４８】
次に、発明者は、上述した第１の実施の形態に係る測定方法を用いてＬＤＬの蛍光スペクトルを測定した。以下に説明するこれらの測定では、ＬＤＬの蛍光スペクトルを測定するに当たり、上述した図１の結果に基づき、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光として、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を励起光として用いてＬＤＬを励起させた。
【００４９】
図２及び図３は、第１の実施の形態に係る測定方法を用いて測定されたＬＤＬの蛍光スペクトルを示す図である。そして、図２は、上述した第１過程において、３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合の、また、図３は、上述した第１過程において、４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合の蛍光スペクトルをそれぞれ示している。また、図２及び図３において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は波長をｎｍ単位でそれぞれ目盛ってある。
【００５０】
なお、この実施の形態では、上述したＮａｎｏＤｒｏｐ３３００  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用してＵＶ光及びＢｌｕｅ光の照射、及び蛍光スペクトルの測定を行った。この装置では、励起光としてのＵＶ光及びＢｌｕｅ光が上述した３６５±１０ｎｍ及び４７０±１０ｎｍに固定されおり、他の波長領域の選択ができないものである。従って、ＵＶ光には、３５５ｎｍから３７５ｎｍまでの一部分または全ての波長が含まれており、また、Ｂｌｕｅ光には４６０ｎｍから４８０ｎｍまでの一部分または全ての波長が含まれている。
【００５１】
また、これら図２及び図３に係る各測定では、リポタンパク質、ここではＬＤＬを各々超純水によって希釈することによって互いに異なる濃度の溶液として調製した、複数のＬＤＬを試料として用いた。
【００５２】
そして、図２において、曲線２１は、０．６４ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２２は、０．８０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２３は、１．０６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２４は、１．２８ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２５は、１．６０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２６は、２．１３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２７は、２．５６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２８は、３．２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線２９は、４．２６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。
【００５３】
また、図３において、曲線３１は、０．６４ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３２は、０．８０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３３は、１．０６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３４は、１．２８ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３５は、２．１３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３６は、２．５６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３７は、３．２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３８は、４．２６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。
【００５４】
図２の結果から明らかなように、上述した第１過程においてＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、４５０ｎｍ付近の波長領域に蛍光スペクトルの蛍光強度のピークが現れることが確認できる。
【００５５】
また、図３の結果から明らかなように、上述した第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、５５０ｎｍ付近の波長領域に蛍光スペクトルの蛍光強度のピークが現れることが確認できる。
【００５６】
従って、これら図２及び図３の結果から、第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法では、ＵＶ光でＬＤＬを励起した場合には、４５０ｎｍ付近の波長領域に現れるピークによって、また、Ｂｌｕｅ光でＬＤＬを励起した場合には、５５０ｎｍ付近の波長領域に現れるピークによって、それぞれＬＤＬの蛍光強度を測定可能な値として、すなわち実用上支障がない値として測定することができる。
【００５７】
また、図４及び図５は、上述した図２及び図３に基づいて作成された、ＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示す図である。これら図４及び図５において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＬＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【００５８】
図４は、上述した第１過程においてＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合の、ＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示す図である。そして、図４における蛍光強度と濃度との相関を示す相関線（以下、蛍光強度線とも称する）４１は、上述した図２における曲線２１〜２９の各ピーク付近の波長である波長４５０ｎｍの蛍光強度をプロットして決定した近似線である。また、蛍光強度線４２は、図２における曲線２１〜２９の各テール付近の波長である波長６００ｎｍの蛍光強度をプロットして決定した近似線である。これらの蛍光強度線４１及び４２から、ＬＤＬ濃度が高くなるに従って蛍光強度が大きくなることがわかる。
【００５９】
また、図５は、上述した第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合の、ＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示す図である。そして、図５における蛍光強度線５１は、上述した図３における曲線３１〜３８の各ピーク付近の波長である波長５５０ｎｍの蛍光強度をプロットして決定した近似線である。また、蛍光強度線５２は、図３における曲線３１〜３８の各テール付近の波長である波長６００ｎｍの蛍光強度をプロットして決定した近似線である。これらの蛍光強度線５１及５２から、ＬＤＬ濃度が高くなるに従って蛍光強度が大きくなることがわかる。
【００６０】
図４から、上述した第１過程においてＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、４５０ｎｍ及び６００ｎｍのいずれの波長の蛍光についても、このＬＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。さらに、蛍光強度線４１に係る波長４５０ｎｍが図２における各曲線２１〜２９のピーク付近の波長である点、及び蛍光強度線４２に係る波長６００ｎｍが、図２における各曲線２１〜２９のテール付近の波長である点を考慮すれば、少なくとも４５０〜６００ｎｍの範囲内の蛍光の波長であれば、測定可能な蛍光強度でＬＤＬの蛍光スペクトルを得ることが確かめられた。
【００６１】
そして、図４から明らかなように、４５０ｎｍの波長の蛍光についてＬＤＬの蛍光強度を測定する場合には、６００ｎｍの波長の蛍光について測定する場合と比して、より低濃度のＬＤＬの試料である場合においても測定が可能であることがわかる。また、図４から、試料とするＬＤＬの濃度を高くするに従って蛍光強度が高くなることが明白であるため、測定環境または測定の目的に応じて適宜試料とするＬＤＬの濃度を高く調整することによって、６００ｎｍの波長の蛍光についても、ＬＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。
【００６２】
また、図５から、上述した第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、５５０ｎｍ及び６００ｎｍのいずれの波長の蛍光についても、このＬＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。さらに、蛍光強度線５１に係る波長５５０ｎｍが図３における各曲線３１〜３８のピーク付近の波長である点、及び蛍光強度線５２に係る波長６００ｎｍが、図３における各曲線３１〜３８のテール付近の波長である点を考慮すれば、少なくとも５５０〜６００ｎｍの範囲内の蛍光の波長であれば、測定可能な蛍光強度でＬＤＬの蛍光スペクトルを得ることが確かめられた。
【００６３】
そして、図５から明らかなように、５５０ｎｍの波長の蛍光についてＬＤＬの蛍光強度を測定する場合には、６００ｎｍの波長の蛍光について測定する場合と比して、より低濃度のＬＤＬが試料である場合においても測定が可能であることがわかる。また、図５から、試料とするＬＤＬの濃度を高くするに従って蛍光強度が高くなることが明白であるため、測定環境または測定の目的に応じて適宜試料とするＬＤＬの濃度を高く調整することによって、６００ｎｍの波長の蛍光についても、ＬＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。
【００６４】
従って、これら図４及び図５の結果から、第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法では、ＵＶ光でＬＤＬを励起した場合には、４５０〜６００ｎｍの範囲内の波長において、また、Ｂｌｕｅ光でＬＤＬを励起した場合には、５５０〜６００ｎｍの範囲内の波長において、それぞれＬＤＬの蛍光強度を測定可能な値として、すなわち実用上支障がない値として測定することができる。
【００６５】
次に、発明者は、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を照射することによって励起したＬＤＬの蛍光スペクトルを測定するに当たり、測定可能な蛍光強度が得られる波長領域の範囲、及びその範囲内において、特に大きな蛍光強度が得られる好適な波長領域を特定するための実験を行った。
【００６６】
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、この実験の結果を示す図であり、上述した第１過程において３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を照射することによって励起したＬＤＬを試料として、互いに異なる波長において測定された蛍光強度と濃度との相関を比較する図である。これら図６（Ａ）及び（Ｂ）において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＬＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【００６７】
この実験では、ＬＤＬを超純水で希釈することによってそれぞれ０．１７ｍｇ／ｍｌ、０．２１ｍｇ／ｍｌ、０．２８ｍｇ／ｍｌ、０．３３ｍｇ／ｍｌ、０．４２ｍｇ／ｍｌ、０．５６ｍｇ／ｍｌ、０．６７ｍｇ／ｍｌ、０．８４ｍｇ／ｍｌ、及び１．６９ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液に調製したＬＤＬを試料として用いた。そして、これら各濃度における蛍光強度の値を、発光した蛍光を測定した波長毎にプロットすることによって図６（Ａ）及び（Ｂ）に示す結果を得た。なお、図６（Ａ）及び（Ｂ）では、これらの図を得るための蛍光強度をプロットした、上述の各濃度の値を横軸に記してある。
【００６８】
図６（Ａ）における蛍光強度線６１ａは、３９９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６２ａは、４１１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６３ａは、４１９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６４ａは、４３１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６５ａは、４３９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６６ａは、４５１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６７ａは、４５９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６８ａは、４７１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【００６９】
また、図６（Ｂ）における蛍光強度線６１ｂは、４７９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６２ｂは、４９１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６３ｂは、４９９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６４ｂは、５１９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６５ｂは、５３９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６６ｂは、５５９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６７ｂは、５７９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線６８ｂは、５９９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【００７０】
図６（Ａ）及び（Ｂ）の結果から明らかなように、第１過程においてＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、蛍光の波長領域が３９９〜５９９ｎｍの範囲内であれば、試料とするＬＤＬを少なくとも０．１７ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製しておくことによって、ＬＤＬを測定可能な蛍光強度で、すなわち実用上支障がない蛍光強度で測定することができる。
【００７１】
また、図６（Ａ）及び（Ｂ）の結果では、これら図６（Ａ）における各蛍光強度線６１ａ〜６８ａ及び図６（Ｂ）における各蛍光強度線６１ｂ〜６８ｂのうち、図６（Ａ）における蛍光強度線６１ａ〜６８ａ及び図６（Ｂ）における蛍光強度線６１ｂ〜６３ｂ、特に蛍光強度線６１ａは、他の蛍光強度線と比して、より高い蛍光強度を示していることがわかる。従って、第１過程においてＵＶ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、ＬＤＬを少なくとも０．１７ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製することによって、ＬＤＬの発光する蛍光の蛍光強度を、３９９〜４９９ｎｍ程度の範囲内の波長領域、特に３９９ｎｍの波長で測定するのが好適であることがわかる。
【００７２】
従って、上述した図２、図４、図６（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、この第１の実施の形態によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、ＬＤＬを試料とし、このＬＤＬを第１過程においてＵＶ光によって励起させた場合には、ＬＤＬの、３９９〜６００ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは３９９〜４９９ｎｍ程度の範囲内の波長、特に４１１ｎｍの波長における蛍光の蛍光スペクトルの強度を測定するのが好適であることが確認された。
【００７３】
また、発明者は、上述した図６（Ａ）及び（Ｂ）に係るのと同様の実験を、Ｂｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合についても行った。
【００７４】
図７（Ａ）及び（Ｂ）は、その実験の結果を示す図であり、上述した第１過程において４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を照射することによって励起したＬＤＬを試料として、互いに異なる波長において測定された蛍光強度と濃度との相関を比較する図である。これら図７（Ａ）及び（Ｂ）において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＬＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【００７５】
この実験では、ＬＤＬを超純水で希釈することによってそれぞれ０．２１ｍｇ／ｍｌ、０．２８ｍｇ／ｍｌ、０．３３ｍｇ／ｍｌ、０．４２ｍｇ／ｍｌ、０．５６ｍｇ／ｍｌ、０．６７ｍｇ／ｍｌ、０．８４ｍｇ／ｍｌ、及び１．６９ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液に調製したＬＤＬを試料として用いた。そして、これら各濃度における蛍光強度の値を、測定した波長毎にプロットすることによって図７（Ａ）及び（Ｂ）に示す結果を得た。なお、図７（Ａ）及び（Ｂ）では、これらの図を得るための蛍光強度をプロットした、上述の各濃度の値を横軸に記してある。
【００７６】
図７（Ａ）における蛍光強度線７１ａは、５１１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７２ａは、５１９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７３ａは、５３１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７４ａは、５３９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７５ａは、５５１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７６ａは、５５９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【００７７】
また、図７（Ｂ）における蛍光強度線７１ｂは、５７９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７２ｂは、５９９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７３ｂは、６５１ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線７４ｂは、６９９ｎｍの波長において測定されたＬＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【００７８】
図７（Ａ）及び（Ｂ）の結果から明らかなように、第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、蛍光の波長領域が５１１〜６９９ｎｍであれば、試料とするＬＤＬを少なくとも０．２１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製しておくことによって、ＬＤＬを測定可能な蛍光強度で、すなわち実用上支障がない蛍光強度で測定することができる。
【００７９】
また、図７（Ａ）及び（Ｂ）の結果では、これら図７（Ａ）における各蛍光強度線７１ａ〜７６ａ及び図７（Ｂ）における各蛍光強度線７１ｂ〜７４ｂのうち、図７（Ａ）における各蛍光強度線７１ａ〜７６ａ、特に蛍光強度線７１ａは、図７（Ｂ）における各蛍光強度線７１ｂ〜７４ｂと比して、より高い蛍光強度を示している。従って、第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＬＤＬを励起させた場合には、ＬＤＬを少なくとも０．２１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製することによって、ＬＤＬの発光する蛍光の蛍光強度を、５１１〜５５９ｎｍ程度の範囲内の波長領域、特に５１１ｎｍの波長で測定するのが好適であることがわかる。
【００８０】
従って、上述した図３、図５、図７（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、この第１の実施の形態によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、ＬＤＬを試料とし、このＬＤＬを第１過程においてＢｌｕｅ光によって励起させた場合には、ＬＤＬの、５１１〜６９９ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは５１１〜５５９ｎｍ程度の範囲内の波長、特に５１１ｎｍの波長における蛍光スペクトルの強度を測定するのが好適であることが確認された。
【００８１】
また、発明者は、上述した図１〜図１４に係るのと同様の実験を、ＨＤＬを試料とした場合についても行った。
【００８２】
まず、発明者は、ＨＤＬを励起させるのに好適な範囲の波長を特定するために、ＨＤＬの光吸収スペクトルを測定した。なお、この測定では、上述した図１に係る測定と同様に、測定装置としてＮａｎｏＤｒｏｐ１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）を使用して吸光度を測定した。
【００８３】
図８は、ＨＤＬの光吸収スペクトルを示す図である。この図８において、縦軸は吸光度の相対値を任意単位で、また、横軸は波長をｎｍ単位でそれぞれ目盛ってある。また、この吸収スペクトルを得た測定では、７．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＤＬを試料として使用した。
【００８４】
図８から、ＨＤＬの光吸収スペクトルでは、２３０ｎｍ付近の波長においてピークを、６００ｎｍ付近の波長においてテールを確認することができる。この結果から、２３０〜６００ｎｍの範囲の波長領域において、ＨＤＬの光吸収帯域が存在すると考えられる。従って、ＨＤＬを励起するに当たり、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光を励起光として用いるのが有効であることがわかる。また、この２３０〜６００ｎｍの波長領域にはＵＶ領域及びＢｌｕｅ領域が含まれている。そのため、ＨＤＬを励起するに当たり、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を励起光として用いるのが有効であることも確認できる。
【００８５】
従って、第１の実施の形態に係る測定方法において、ＨＤＬの蛍光スペクトルを測定する場合、上述した第１過程で、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光、例えばＵＶ光またはＢｌｕｅ光を励起光として用いるのが好適であることが確認された。
【００８６】
次に、発明者は、上述した第１の実施の形態に係る測定方法を用いてＨＤＬの蛍光スペクトルを測定した。以下に説明するこれらの測定では、ＨＤＬの蛍光スペクトルを測定するに当たり、上述した図８の結果に基づき、２３０〜６００ｎｍの範囲内の波長の光として、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を励起光として用いてＨＤＬを励起させた。
【００８７】
図９及び図１０は、第１の実施の形態に係る測定方法を用いて測定されたＨＤＬの蛍光スペクトルを示す図である。そして、図９は、上述した第１過程において、３６５±１０ｎｍの波長のＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合の、また、図１０は、上述した第１過程において、４７０±１０ｎｍの波長のＢｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合の蛍光スペクトルをそれぞれ示している。また、図９及び図１０において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は波長をｎｍ単位でそれぞれ目盛ってある。
【００８８】
また、これら図９及び図１０に係る各測定では、ＨＤＬを各々超純水によって希釈することによって互いに異なる濃度の溶液として調製した、複数のＨＤＬを試料として用いた。
【００８９】
そして、図９において、曲線９１は、１．５３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９２は、１．９１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９３は、２．５５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９４は、３．０６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９５は、３．８３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９６は、５．１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９７は、６．１２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線９８は、７．６５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。
【００９０】
また、図１０において、曲線１０１は、１．５３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線１０２は、１．９１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線１０３は、２．５５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線１０４は、３．０６ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線３５は、３．８３ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線１０６は、５．１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線１０７は、６．１２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。また、曲線１０８は、７．６５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された試料の蛍光スペクトルを示している。
【００９１】
図９の結果から明らかなように、上述した第１過程においてＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、４５０ｎｍ付近の波長領域に蛍光スペクトルの蛍光強度のピークが現れることが確認できる。
【００９２】
また、図１０の結果から明らかなように、上述した第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、５５０ｎｍ付近の波長領域に蛍光スペクトルの蛍光強度のピークが現れることが確認できる。
【００９３】
従って、これら図９及び図１０の結果から、第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法では、ＵＶ光でＨＤＬを励起した場合には、４５０ｎｍ付近の波長領域に現れる傾向強度のピークによって、また、Ｂｌｕｅ光でＨＤＬを励起した場合には、５５０ｎｍ付近の波長領域に現れる蛍光強度のピークによって、それぞれＨＤＬの蛍光強度を測定可能な値として、すなわち実用上支障がない値として測定することができる。
【００９４】
また、図１１及び図１２は、上述した図９及び図１０に基づいて作成された、ＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示す図である。これら図１１及び図１２において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＨＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【００９５】
図１１は、上述した第１過程においてＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合の、ＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示す図である。そして、図１１における蛍光強度と濃度との蛍光強度線１１１は、上述した図９における曲線９２〜９８の各ピーク付近の波長である波長４５０ｎｍの蛍光強度をプロットして決定してある。また、蛍光強度線１１２は、図９における曲線９２〜９８の各テール付近の波長である波長６００ｎｍの蛍光強度をプロットして決定してある。これらの蛍光強度線１１１及び１１２から、ＨＤＬ濃度が高くなるに従って、蛍光強度が大きくなることがわかる。
【００９６】
また、図１２は、上述した第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合の、ＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示す図である。そして、図１２における蛍光強度線１２１は、上述した図１０における曲線１０１〜１０８の各ピーク付近の波長である波長５５０ｎｍの蛍光強度をプロットして決定してある。また、蛍光強度線１２２は、図１０における曲線１０１〜１０８の各テール付近の波長である波長６００ｎｍの蛍光強度をプロットして決定してある。これらの蛍光強度線１２１及び１２２から、ＨＤＬ濃度が高くなるに従って、蛍光強度が大きくなることがわかる。
【００９７】
図１１から、上述した第１過程においてＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、４５０ｎｍ及び６００ｎｍのいずれの波長の蛍光についても、このＨＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。さらに、蛍光強度線１１１に係る波長４５０ｎｍが図９における各曲線９１〜９８のピーク付近の波長である点、及び蛍光強度線１１２に係る波長６００ｎｍが、図９における各曲線９１〜９８のテール付近の波長である点を考慮すれば、少なくとも４５０〜６００ｎｍの範囲内の蛍光の波長であれば、測定可能な蛍光強度でＨＤＬの蛍光スペクトルを得ることが確かめられた。
【００９８】
そして、図１１から明らかなように、４５０ｎｍの波長の蛍光についてＨＤＬの蛍光強度を測定する場合には、６００ｎｍの波長の蛍光について測定する場合と比して、より低濃度のＨＤＬの試料である場合においても測定が可能であることがわかる。また、図１１から、試料とするＨＤＬの濃度を高くするに従って蛍光強度が高くなることが明白であるため、測定環境または測定の目的に応じて適宜試料とするＨＤＬの濃度を高く調整することによって、６００ｎｍの波長の蛍光についても、ＨＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。
【００９９】
また、図１２から、上述した第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、５５０ｎｍ及び６００ｎｍのいずれの波長の蛍光についても、このＨＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。さらに、蛍光強度線１２１に係る波長５５０ｎｍが図１０における各曲線１０１〜１０８のピーク付近の波長である点、及び蛍光強度線１２２に係る波長６００ｎｍが、図１０における各曲線１０１〜１０８のテール付近の波長である点を考慮すれば、少なくとも５５０〜６００ｎｍの範囲内の蛍光の波長であれば、測定可能な蛍光強度でＨＤＬの蛍光スペクトルを得ることが確かめられた。
【０１００】
そして、図１２から明らかなように、５５０ｎｍの波長の蛍光についてＨＤＬの蛍光強度を測定する場合には、６００ｎｍの波長の蛍光について測定する場合と比して、より低濃度のＨＤＬの試料である場合においても測定が可能であることがわかる。また、図１２から、試料とするＨＤＬの濃度を高くするに従って蛍光強度が高くなることが明白であるため、測定環境または測定の目的に応じて適宜試料とするＨＤＬの濃度を高く調整することによって、６００ｎｍの波長の蛍光についても、ＨＤＬの蛍光強度を測定することが可能であることがわかる。
【０１０１】
従って、これら図１１及び図１２の結果から、第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法では、ＵＶ光でＨＤＬを励起した場合には、４５０〜６００ｎｍの範囲内の波長において、また、Ｂｌｕｅ光でＨＤＬを励起した場合には、５５０〜６００ｎｍの範囲内の波長において、それぞれＨＤＬの蛍光強度を測定可能な値として、すなわち実用上支障がない値として測定することができる。
【０１０２】
次に、発明者は、ＵＶ光またはＢｌｕｅ光を照射することによって励起したＨＤＬの蛍光スペクトルを測定するに当たり、測定可能な蛍光強度が得られる波長領域の範囲、及びその範囲内において、特に大きな蛍光強度が得られる好適な波長領域を特定するための実験を行った。
【０１０３】
図１３（Ａ）〜（Ｃ）は、この実験の結果を示す図であり、上述した第１過程において３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を照射することによって励起したＨＤＬを試料として、互いに異なる波長において測定された蛍光強度と濃度との相関を比較する図である。これら図１３（Ａ）〜（Ｃ）において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＨＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【０１０４】
この実験では、ＨＤＬを超純水で希釈することによってそれぞれ１．５３ｍｇ／ｍｌ、１．９１ｍｇ／ｍｌ、２．５５ｍｇ／ｍｌ、３．０６ｍｇ／ｍｌ、３．８３ｍｇ／ｍｌ、５．１０ｍｇ／ｍｌ、６．１２ｍｇ／ｍｌ、及び７．６５ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液に調製したＨＤＬを試料として用いた。そして、これら各濃度における蛍光強度の値を、発光した蛍光の測定した波長毎にプロットすることによって図１３（Ａ）〜（Ｃ）に示す結果を得た。なお、図１３（Ａ）〜（Ｃ）では、これらの図を得るための蛍光強度をプロットした、上述の各濃度の値を横軸に記してある。
【０１０５】
図１３（Ａ）における蛍光強度線１３１ａは、３９５ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３２ａは、３９９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３３ａは、４０３ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３４ａは、４１１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３５ａは、４１９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３６ａは、４４３ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３７ａは、４５１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【０１０６】
また、図１３（Ｂ）における蛍光強度線１３１ｂは、４５１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３２ｂは、４５９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３３ｂは、４７９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３４ｂは、４９９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３５ｂは、５１１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３６ｂは、５１９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３７ｂは、５３１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【０１０７】
また、図１３（Ｃ）における蛍光強度線１３１ｃは、５５１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３２ｃは、５９９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３３ｃは、６５１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１３４ｃは、６９９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【０１０８】
図１３（Ａ）〜（Ｃ）の結果から明らかなように、第１過程においてＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、蛍光の波長領域が３９５〜５９９ｎｍの範囲内であれば、試料とするＨＤＬを少なくとも１．５３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製しておくことによって、ＨＤＬを測定可能な蛍光強度で、すなわち実用上支障がない蛍光強度で測定することができる。また、６５１〜６９９ｎｍの範囲内の波長については、試料とするＨＤＬの濃度を、これら図１３（Ａ）〜（Ｃ）に係る測定において用いたＨＤＬの濃度と比して、より高く調製することによって、測定可能な蛍光強度で測定することができる可能性がある。
【０１０９】
また、図１３（Ａ）〜（Ｃ）の結果では、これら図１３（Ａ）における各蛍光強度線１３１ａ〜１３７ａ、図１３（Ｂ）における各蛍光強度線１３１ｂ〜１３７ｂ、及び図１３（Ｃ）における各蛍光強度線１３１ｃ〜１３４ｃのうち、図１３（Ａ）における蛍光強度線１３２ａ〜１３７ａ及び図１３（Ｂ）における蛍光強度線１３１ｂ〜１３３ｂ、特に蛍光強度線１３６ａは、他の蛍光強度線と比して、より高い蛍光強度を示していることがわかる。従って、第１過程においてＵＶ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、ＨＤＬを少なくとも１．５３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製することによって、ＨＤＬの発光する蛍光の蛍光強度を３９９〜４７９ｎｍの範囲内の波長、特に４４３ｎｍの波長で測定するのが好適であることがわかる。
【０１１０】
従って、上述した図９、図１１、及び図１３（Ａ）〜（Ｃ）の結果から、この第１の実施の形態によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、ＨＤＬを試料とし、このＨＤＬを第１過程においてＵＶ光によって励起させた場合には、ＨＤＬの、３９９〜６００ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは３９９〜４７９ｎｍ程度の範囲内の波長における蛍光の蛍光スペクトルの強度を測定するのが好適であることが確認された。
【０１１１】
また、発明者は、上述した図１３（Ａ）及び（Ｂ）に係るのと同様の実験を、Ｂｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合についても行った。
【０１１２】
図１４（Ａ）及び（Ｂ）は、その実験の結果を示す図であり、上述した第１過程において４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を照射することによって励起したＨＤＬを試料として、互いに異なる波長において測定された蛍光強度と濃度との相関を比較する図である。これら図１４（Ａ）及び（Ｂ）において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＨＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【０１１３】
この実験では、ＨＤＬを超純水で希釈することによってそれぞれ１．５３ｍｇ／ｍｌ、１．９１ｍｇ／ｍｌ、２．５５ｍｇ／ｍｌ、３．０６ｍｇ／ｍｌ、３．８３ｍｇ／ｍｌ、５．１０ｍｇ／ｍｌ、６．１２ｍｇ／ｍｌ、及び７．６５ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液に調製したＨＤＬを試料として用いた。そして、これら各濃度における蛍光強度の値を、測定した波長毎にプロットすることによって図１４（Ａ）及び（Ｂ）に示す結果を得た。なお、図１４（Ａ）及び（Ｂ）では、これらの図を得るための蛍光強度をプロットした、上述の各濃度の値を横軸に記してある。
【０１１４】
図１４（Ａ）における蛍光強度線１４１ａは、５１１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４２ａは、５１９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４３ａは、５３１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４４ａは、５３９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４５ａは、５５１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４６ａは、５５９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４７ａは、５７９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【０１１５】
また、図１４（Ｂ）における蛍光強度線１４１ｂは、５９１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４２ｂは、６１９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４３ｂは、６５１ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。また、蛍光強度線１４４ｂは、６９９ｎｍの波長において測定されたＨＤＬの蛍光強度と濃度との相関を示している。
【０１１６】
図１４（Ａ）及び（Ｂ）の結果から明らかなように、第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、蛍光の波長領域が５１１〜６９９ｎｍの範囲内であれば、試料とするＨＤＬを少なくとも１．５３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製しておくことによって、ＨＤＬを測定可能な蛍光強度で、すなわち実用上支障がない蛍光強度で測定することができる。
【０１１７】
また、図１４（Ａ）及び（Ｂ）の結果では、これら図１４（Ａ）における各蛍光強度線１４１ａ〜１４７ａ及び図１４（Ｂ）における各蛍光強度線１４１ｂ〜１４４ｂのうち、図１４（Ａ）における各蛍光強度線１４１ａ〜１４６ａは、他の蛍光強度線と比して、より高い蛍光強度を示している。従って、第１過程においてＢｌｕｅ光を照射することによってＨＤＬを励起させた場合には、ＨＤＬを少なくとも１．５３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に調製することによって、ＨＤＬの発光する蛍光の蛍光強度を５１１〜５５９ｎｍの範囲内の波長で測定するのが好適であることがわかる。
【０１１８】
従って、上述した図１０、図１２、図１４（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、この第１の実施の形態によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、ＨＤＬを試料とし、このＨＤＬを第１過程においてＢｌｕｅ光によって励起させた場合には、ＨＤＬの、５１１〜６９９ｎｍの範囲内の波長、より好ましくは５１１〜５５９ｎｍ程度の範囲内の波長における蛍光スペクトルの強度を測定するのが好適であることが確認された。
【０１１９】
ここで、この出願に係る発明者は、試料とするリポタンパク質を予め酸化しておくことによって、この酸化されたリポタンパク質の蛍光スペクトルの強度が増大することを見出した。すなわち、上述した第１過程において、用意するリポタンパク質、すなわちＬＤＬまたはＨＤＬを励起前に酸化しておくことによって、得られる蛍光強度が増大することがわかった。
【０１２０】
そこで、発明者らは、このようなリポタンパク質を酸化することによって蛍光強度が増大するという効果を確認するために種々の実験を行った。以下、図１５〜図２２を参照して、これらの実験とその結果について説明する。
【０１２１】
まず、発明者は、リポタンパク質を空気酸化することによって、このリポタンパク質から測定される蛍光スペクトルの強度が増大することを確認した。
【０１２２】
そのために、試料とする２０μｌのＬＤＬ及び２０μｌのＨＤＬをそれぞれ２００μｌの容器中に収容し、この容器を密閉し、すなわち蓋を閉めた状態で、常温、ここでは室温の暗所中に放置することによってリポタンパク質の空気酸化を行った。そして、この放置後、すなわち空気酸化の開始後において、一定の経過時間毎に試料の蛍光強度を測定した。なお、この実験では、空気酸化開始後、５時間後、２５時間後、及び５０時間後において、各試料の蛍光強度を測定した。
【０１２３】
図１５（Ａ）及び（Ｂ）と図１６（Ａ）及び（Ｂ）は、この実験の結果を示す図であり、リポタンパク質の空気酸化開始後の経過時間、すなわち空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。これら各図において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は空気酸化時間を時間単位でそれぞれ目盛ってある。なお、これら各図における縦軸の蛍光強度では、空気酸化開始後０時間後、すなわち空気酸化がなされていないときに測定された各試料の蛍光強度を０又は−５に設定してある。
【０１２４】
図１５（Ａ）は、試料としてＬＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合の、空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図１５（Ａ）に係る測定では、ＬＤＬの濃度を０．８ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、空気酸化時間毎に得られたＬＤＬの蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１２５】
また、図１５（Ｂ）は、試料としてＬＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合の、空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図１５（Ｂ）に係る測定では、ＬＤＬの濃度を０．８ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、空気酸化時間毎に得られたＬＤＬの蛍光スペクトルの５２５ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１２６】
また、図１６（Ａ）は、試料としてＨＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合の、空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図１６（Ａ）に係る測定では、ＨＤＬの濃度を１．９ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、空気酸化時間毎に得られたＨＤＬの蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１２７】
また、図１６（Ｂ）は、試料としてＨＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合の、空気酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図１６（Ｂ）に係る測定では、ＨＤＬの濃度を１．９ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、空気酸化時間毎に得られたＨＤＬの蛍光スペクトルの５２５ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１２８】
これら図１５（Ａ）及び（Ｂ）と図１６（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、ＬＤＬ及びＨＤＬは、空気酸化されることによって、ＵＶ光及びＢｌｕｅ光のいずれを励起光として用いた場合においても、ともに蛍光強度が増大することが明らかである。また、これら各図から、ＬＤＬ及びＨＤＬに対する空気酸化時間が長い程、蛍光強度が増大することがわかる。そして、これら各図から、ＬＤＬ及びＨＤＬの蛍光強度を増大させるために、例えば少なくとも５０時間以上空気酸化することが好ましいことが確認できる。
【０１２９】
次に、発明者は、長期間保存されることにより経日的に空気酸化（以下、経日空気酸化とも称する）されたリポタンパク質を試料として用いることによって、上述した空気酸化と同様に、リポタンパク質の蛍光強度を増大させられることを実験的に確認した。
【０１３０】
そのために、パラフィルムで覆われた蓋付きのガラス製サンプル瓶中に密閉した状態で収容し、低温暗所中、より具体的には５℃の冷蔵庫中において約１年放置したＬＤＬ及びＨＤＬを試料として用意した。そして、密閉されたサンプル瓶中に存在する空気によって経日空気酸化されたＬＤＬ及びＨＤＬと、上述した経日空気酸化がなされていないＬＤＬ及びＨＤＬとの蛍光強度をそれぞれ測定し、これらの結果を比較した。
【０１３１】
図１７（Ａ）及び（Ｂ）と図１８（Ａ）及び（Ｂ）は、この実験の結果を示す図であり、経日空気酸化されたリポタンパク質と空気酸化されていないリポタンパク質との蛍光強度を比較する図である。これら各図において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸は試料としたＬＤＬまたはＨＤＬの濃度をｍｇ／ｍｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【０１３２】
図１７（Ａ）は、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＬＤＬと空気酸化されていないＬＤＬとの蛍光強度を比較する図である。そして、図１７（Ａ）における蛍光強度と濃度との相関を示す蛍光強度線１７１ａは、経日空気酸化されたＬＤＬを試料とし、このＬＤＬをそれぞれ３．０５ｍｇ／ｍｌ、２．４４ｍｇ／ｍｌ、２．０３ｍｇ／ｍｌ、１．５３ｍｇ／ｍｌ、１．２２ｍｇ／ｍｌ、１．０２ｍｇ／ｍｌ、０．７６ｍｇ／ｍｌ、及び０．３８ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。また、蛍光強度線１７２ａは、空気酸化されていないＬＤＬを試料とし、このＬＤＬをそれぞれ４．２６ｍｇ／ｍｌ、３．２０ｍｇ／ｍｌ、２．５６ｍｇ／ｍｌ、２．１３ｍｇ／ｍｌ、１．６０ｍｇ／ｍｌ、１．２８ｍｇ／ｍｌ、１．０６ｍｇ／ｍｌ、０．８０ｍｇ／ｍｌ、及び０．６４ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。なお、この図１７（Ａ）に係る測定では、各試料の蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１３３】
図１７（Ｂ）は、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＬＤＬと空気酸化されていないＬＤＬとの蛍光強度を比較する図である。そして、図１７（Ｂ）における蛍光強度と濃度との相関を示す蛍光強度線１７１ｂは、経日空気酸化されたＬＤＬを試料とし、このＬＤＬをそれぞれ３．０５ｍｇ／ｍｌ、２．４４ｍｇ／ｍｌ、２．０３ｍｇ／ｍｌ、１．５３ｍｇ／ｍｌ、１．２２ｍｇ／ｍｌ、１．０２ｍｇ／ｍｌ、０．７６ｍｇ／ｍｌ、及び０．３８ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。また、蛍光強度線１７２ｂは、空気酸化されていないＬＤＬを試料とし、このＬＤＬをそれぞれ４．２６ｍｇ／ｍｌ、３．２０ｍｇ／ｍｌ、２．５６ｍｇ／ｍｌ、２．１３ｍｇ／ｍｌ、１．６０ｍｇ／ｍｌ、１．２８ｍｇ／ｍｌ、１．０６ｍｇ／ｍｌ、０．８０ｍｇ／ｍｌ、及び０．６４ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。なお、この図１７（Ｂ）に係る測定では、各試料の蛍光スペクトルの６００ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１３４】
図１８（Ａ）は、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＨＤＬと空気酸化されていないＨＤＬとの蛍光強度を比較する図である。そして、図１８（Ａ）における蛍光強度と濃度との相関を示す蛍光強度線１８１ａは、経日空気酸化されたＨＤＬを試料とし、このＨＤＬをそれぞれ７．６５ｍｇ／ｍｌ、６．１２ｍｇ／ｍｌ、５．１０ｍｇ／ｍｌ、３．８３ｍｇ／ｍｌ、３．０６ｍｇ／ｍｌ、２．５５ｍｇ／ｍｌ、１．９１ｍｇ／ｍｌ、及び１．２６ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。また、蛍光強度線１８２ａは、空気酸化されていないＨＤＬを試料とし、このＨＤＬをそれぞれ７．６５ｍｇ／ｍｌ、６．１２ｍｇ／ｍｌ、５．１０ｍｇ／ｍｌ、３．８３ｍｇ／ｍｌ、３．０６ｍｇ／ｍｌ、２．５５ｍｇ／ｍｌ、及び１．９１ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。なお、この図１８（Ａ）に係る測定では、各試料の蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１３５】
図１８（Ｂ）は、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合における、経日空気酸化されたＨＤＬと空気酸化されていないＨＤＬとの蛍光強度を比較する図である。そして、図１８（Ｂ）における蛍光強度と濃度との相関を示す蛍光強度線１８１ｂは、経日空気酸化されたＨＤＬを試料とし、このＨＤＬをそれぞれ７．６５ｍｇ／ｍｌ、６．１２ｍｇ／ｍｌ、３．８７ｍｇ／ｍｌ、３．０６ｍｇ／ｍｌ、１．９１ｍｇ／ｍｌ、及び０．９４ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。また、蛍光強度線１８２ｂは、空気酸化されていないＨＤＬを試料とし、このＨＤＬをそれぞれ７．６５ｍｇ／ｍｌ、６．１２ｍｇ／ｍｌ、５．１０ｍｇ／ｍｌ、３．８３ｍｇ／ｍｌ、３．０６ｍｇ／ｍｌ、２．５５ｍｇ／ｍｌ、１．９１ｍｇ／ｍｌ、及び１．５３ｍｇ／ｍｌに調製して各々測定した蛍光強度をプロットして決定した近似線である。なお、この図１８（Ｂ）に係る測定では、各試料の蛍光スペクトルの６００ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１３６】
これら図１７（Ａ）及び（Ｂ）と図１８（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、上述した図１５（Ａ）及び（Ｂ）と図１６（Ａ）及び（Ｂ）に係る空気酸化と同様に、ＬＤＬ及びＨＤＬは、経日空気酸化されることによって、ＵＶ光及びＢｌｕｅ光のいずれを励起光として用いた場合においても、ともに蛍光強度が増大することが明らかである。また、これら各図の経日空気酸化されたＬＤＬまたはＨＤＬと空気酸化されていないＬＤＬまたはＨＤＬとの蛍光強度を比較すると、試料の濃度が高いほど、経日空気酸化による蛍光強度増大の効果が顕著に得られることがわかる。従って、これら各図から、１年程度ＬＤＬ及びＨＤＬを経日空気酸化することによって、これらＬＤＬ及びＨＤＬの蛍光強度を増大させられることが確認できる。
【０１３７】
次に、発明者は、リポタンパク質に対してＵＶ光を照射し、この照射によってリポタンパク質を酸化する（以下、ＵＶ酸化とも称する）ことによって、このリポタンパク質から測定される蛍光スペクトルの強度が増大することを確認した。
【０１３８】
そのために、試料とする２０μｌのＬＤＬ及び２０μｌのＨＤＬをそれぞれ２００μｌのマイクロチューブ中に密閉した状態で収容し、常温において、ＵＶランプを用いて２５０〜２６０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光をＬＤＬ及びＨＤＬに対して照射することによって、リポタンパク質のＵＶ酸化を行った。そして、ＵＶ光の照射開始後、すなわちＵＶ酸化の開始後において、一定の経過時間毎に試料の蛍光強度を測定した。なお、この実験では、ＵＶ酸化開始後、５時間後、２５時間後、及び５０時間後において、各試料の蛍光強度を測定した。
【０１３９】
図１９（Ａ）及び（Ｂ）と図２０（Ａ）及び（Ｂ）は、この実験の結果を示す図であり、リポタンパク質のＵＶ酸化開始後の経過時間、すなわちＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。これら各図において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸はＵＶ酸化時間を時間単位でそれぞれ目盛ってある。なお、これら各図における縦軸の蛍光強度では、ＵＶ酸化開始後０時間後、すなわちＵＶ酸化がなされていないときに測定された各試料の蛍光強度を０に設定してある。
【０１４０】
図１９（Ａ）は、試料としてＬＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合の、ＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図１９（Ａ）に係る測定では、ＬＤＬの濃度を０．８ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、ＵＶ酸化時間毎に得られたＬＤＬの蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１４１】
また、図１９（Ｂ）は、試料としてＬＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合の、ＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図１９（Ｂ）に係る測定では、ＬＤＬの濃度を０．８ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、ＵＶ酸化時間毎に得られたＬＤＬの蛍光スペクトルの５２５ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１４２】
また、図２０（Ａ）は、試料としてＨＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合の、ＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図２０（Ａ）に係る測定では、ＨＤＬの濃度を１．９ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、ＵＶ酸化時間毎に得られたＨＤＬの蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１４３】
また、図２０（Ｂ）は、試料としてＨＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合の、ＵＶ酸化時間と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図２０（Ｂ）に係る測定では、ＨＤＬの濃度を１．９ｍｇ／ｍｌに調製してあり、また、ＵＶ酸化時間毎に得られたＨＤＬの蛍光スペクトルの５２５ｎｍの波長における蛍光強度を測定した。
【０１４４】
これら図１９（Ａ）及び（Ｂ）と図２０（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、ＬＤＬ及びＨＤＬは、ＵＶ酸化されることによって、ＵＶ光及びＢｌｕｅ光のいずれを励起光として用いた場合においても、ともに蛍光強度が増大することが明らかである。また、これら各図から、ＬＤＬ及びＨＤＬに対するＵＶ酸化時間が長いほど蛍光強度が増大し、さらに、ＵＶ酸化時間が２５時間以上となると、その後はほぼ一定の蛍光強度を示すことがわかる。従って、これら各図から、ＬＤＬ及びＨＤＬの蛍光強度を増大させるために、少なくとも２５時間以上ＵＶ酸化することが好ましいことが確認できる。
【０１４５】
次に、発明者は、リポタンパク質を薬剤酸化することによって、このリポタンパク質から測定される蛍光スペクトルの強度が増大することを確認した。
【０１４６】
そのために、試料とするＬＤＬ及びＨＤＬに対して、水溶液の状態でＡＡＰＨを添加することによってリポタンパク質の薬剤酸化を行った。この実験では、異なる濃度の複数のＡＡＰＨ水溶液を用意し、これら各濃度のＡＡＰＨ水溶液を添加したＬＤＬ及びＨＤＬのそれぞれについて蛍光強度を測定した。なお、この実験では、４００ｍｍｏｌ／ｌ、４０ｍｍｏｌ／ｌ、及び４．０ｍｍｏｌ／ｌの濃度のＡＡＰＨ水溶液を用意し、これらを各試料に添加してそれぞれの蛍光強度を測定した。また、この実験では、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された９０μｌのＬＤＬ及び１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製された９０μｌのＨＤＬに対して、上述した各濃度のＡＡＰＨ水溶液をそれぞれ１０μｌ添加した。
【０１４７】
図２１（Ａ）及び（Ｂ）と図２２（Ａ）及び（Ｂ）は、この実験の結果を示す図であり、リポタンパク質を薬剤酸化するために添加したＡＡＰＨ水溶液の濃度（以下、薬剤酸化濃度とも称する）と蛍光強度との相関を示す図である。これら各図において、縦軸は蛍光強度の相対値を任意単位で、また、横軸はＡＡＰＨ水溶液の濃度をｍｏｌ／ｌ単位でそれぞれ目盛ってある。
【０１４８】
図２１（Ａ）は、試料としてＬＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合の、薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図２１（Ａ）は、ＬＤＬの蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における、１．０ｍｇ／ｍｌのＬＤＬに対する蛍光強度を示している。
【０１４９】
図２１（Ｂ）は、試料としてＬＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合の、薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図２１（Ｂ）は、ＬＤＬの蛍光スペクトルの５２５ｎｍの波長における、１．０ｍｇ／ｍｌのＬＤＬに対する蛍光強度を示している。
【０１５０】
図２２（Ａ）は、試料としてＨＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として３６５±１０ｎｍの範囲内の波長のＵＶ光を用いた場合の、薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図２２（Ａ）は、ＨＤＬの蛍光スペクトルの４５０ｎｍの波長における、１．０ｍｇ／ｍｌのＬＤＬに対する蛍光強度を示している。
【０１５１】
図２２（Ｂ）は、試料としてＨＤＬを、また、上述した第１過程において励起光として４７０±１０ｎｍの範囲内の波長のＢｌｕｅ光を用いた場合の、薬剤酸化濃度と蛍光強度との相関を示す図である。なお、この図２２（Ｂ）は、ＨＤＬの蛍光スペクトルの５２５ｎｍの波長における、１．０ｍｇ／ｍｌのＨＤＬに対する蛍光強度を示している。
【０１５２】
これら図２１（Ａ）及び（Ｂ）と図２２（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、ＬＤＬ及びＨＤＬは、ＡＡＰＨ水溶液によって薬剤酸化されることによって、ＵＶ光及びＢｌｕｅ光のいずれを励起光として用いた場合においても、ともに蛍光強度が増大することが明らかである。また、これら各図から、ＬＤＬ及びＨＤＬに添加するＡＡＰＨ水溶液の濃度が高いほど蛍光強度が増大することがわかる。そして、これら各図から、ＬＤＬ及びＨＤＬの蛍光強度を増大させるために、例えば少なくとも１０ｍｏｌ／ｌ以上の濃度のＡＡＰＨを添加することによって薬剤酸化することが好ましいことが確認できる。
【０１５３】
このように、第１の実施の形態による蛍光スペクトル測定方法では、上述した波長のＵＶ光またはＢｌｕｅ光を照射してリポタンパク質を励起することによって、蛍光標識を用いることなくリポタンパク質の蛍光スペクトルを測定することができる。そのため、この発明によるリポタンパク質の蛍光スペクトル測定方法では、従来とは異なり、蛍光標識を用意し、さらにその蛍光標識をリポタンパク質と結合させる過程を省略できるため、その分の時間及びコストを削減することができる。
【図１】
2011058914.tif 000002
【図２】
2011058914.tif 000003
【図３】
2011058914.tif 000004
【図４】
2011058914.tif 000005
【図５】
2011058914.tif 000006
【図６】
2011058914.tif 000007
【図７】
2011058914.tif 000008
【図８】
2011058914.tif 000009
【図９】
2011058914.tif 000010
【図１０】
2011058914.tif 000011
【図１１】
2011058914.tif 000012
【図１２】
2011058914.tif 000013
【図１５】
2011058914.tif 000014
【図１６】
2011058914.tif 000015
【図１７】
2011058914.tif 000016
【図１８】
2011058914.tif 000017
【図１９】
2011058914.tif 000018
【図２０】
2011058914.tif 000019
【図２１】
2011058914.tif 000020
【図２２】
2011058914.tif 000021
【図１３】
2011058914.tif 000022
【図１４】
2011058914.tif 000023