(57)【要約】【課題】高発現かつ高活性の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来組換型ビリルビンオキシダーゼを得るための簡便な手法の提供。【解決手段】不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、発現させる工程を含む組換型ビリルビンオキシダーゼの製造方法と、この製造方法により得られる組換型ビリルビンオキシダーゼを提供する。この組換型ビリルビンオキシダーゼは、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来の天然型ビリルビンオキシダーゼよりも高い酵素活性を有する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、発現して得られる組換型ビリルビンオキシダーゼ。
【請求項２】
不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来の天然型ビリルビンオキシダーゼよりも高い酵素活性を有する請求項１記載の組換型ビリルビンオキシダーゼ。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する請求項２記載の組換型ビリルビンオキシダーゼ。
【請求項４】
酵素電池の電極酵素として用いられる請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換型ビリルビンオキシダーゼ。
【請求項５】
不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、発現させる工程を含む組換型ビリルビンオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】
Ｋ−１２由来株大腸菌を用いる請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
配列番号２に示す塩基配列を有する不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を用いる請求項５又は請求項６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換型ビリルビンオキシダーゼとその製造方法に関する。より詳しくは、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来の組換型ビリルビンオキシダーゼ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin oxidase）」は、ビリルビンをビルベルジンに酸化する反応を触媒する酵素であり、マルチ銅オキシダーゼ（複数の銅イオンを活性中心に持つ酵素の総称）に属する酵素の一種である。ビリルビンオキシダーゼは、従来、肝機能等の臨床検査用試薬（血清中のビリルビンの測定試薬）として広く使用されている。また、近年、ビリルビンオキシダーゼは、酵素電池のカソード（Cathode、正極）側において、酸素の電気化学的４電子還元反応を触媒するための電極酵素としても用いられている。
【０００３】
ビリルビンオキシダーゼには、従来、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）から抽出して部分精製した酵素標品（以下、「天然型ビリルビンオキシダーゼ」と称する。）が使用されてきた（特許文献１参照）。また、非特許文献１では、ビリルビンオキシダーゼ遺伝子をコードする遺伝子の塩基配列の決定と、酵母を用いた組換型ビリルビンオキシダーゼの発現系の構築が報告されている（特許文献２も参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−１９９８８２号公報
【特許文献２】特開２００５−７３６６０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】"Molecular cloning of the gene for bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria and its expression in yeast." J Biol Chem. 1993 Sep 5;268(25):18801-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
臨床検査用試薬や酵素電池の電極酵素などとして不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来のビリルビンオキシダーゼを大量に供給するため、優れた組換型ビリルビンオキシダーゼの発現系の構築が望まれている。しかしながら、従来の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアや酵母を用いた方法では、酵素の発現量が低かったり、発現された酵素の活性が十分でなかったりという問題があった。
【０００７】
そこで、本発明は、高発現かつ高活性の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来組換型ビリルビンオキシダーゼを得るための簡便な手法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本発明者らは、真核生物の真菌である不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来のビリルビンオキシダーゼ遺伝子を、原核生物の細菌である大腸菌（Escherichia coli）で発現させることを試みた。そして、本発明者らは、簡便な大腸菌発現系で十分な活性を有する組換型ビリルビンオキシダーゼを発現精製できること見出した。さらに、本発明者らは、翻訳後糖鎖修飾を欠く大腸菌発現系において、予想外にも、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来の天然型ビリルビンオキシダーよりも高い活性を有する組換型ビリルビンオキシダーゼが得られることを明らかにした。
【０００９】
本発明は、これらの知見に基づき、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、発現して得られる組換型ビリルビンオキシダーゼを提供する。
この組換型ビリルビンオキシダーは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来の天然型ビリルビンオキシダーゼよりも高い酵素活性を有する。配列番号１に示すアミノ酸配列は、天然型ビリルビンオキシダーゼのアミノ酸配列から分泌シグナルペプチドの３７残基を除いた配列とされている。
【００１０】
また、本発明は、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、発現させる工程を含む組換型ビリルビンオキシダーゼの製造方法を提供する。
この組換型ビリルビンオキシダーゼの製造方法では、配列番号２に示す塩基配列を有する不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を用い、Ｋ−１２由来株大腸菌を用いることが好適となる。配列番号２に示す塩基配列は、分泌シグナルペプチドをコードする部分が除かれた配列とされている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高発現かつ高活性の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来組換型ビリルビンオキシダーゼを得るための簡便な手法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】pET-BOベクターの構造を説明する模式図である。
【図２】精製組換型ビリルビンオキシダーゼのSDS-PAGEの結果を示す図面代用写真である。
【図３】精製組換型ビリルビンオキシダーゼの吸収スペクトルを示すスペクトログラムである。
【図４】組換型ビリルビンオキシダーゼの活性評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１４】
本発明に係る組換型ビリルビンオキシダーゼは、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌に導入し、発現することにより得られる。この組換型ビリルビンオキシダーゼは、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来の天然型ビリルビンオキシダーゼよりも高い酵素活性を有することを特徴とする（「実施例」参照）。なお、この組換型ビリルビンオキシダーゼは、翻訳後糖鎖修飾を欠く大腸菌で発現して得られるものであるため、天然型ビリルビンオキシダーゼや酵母で発現した組換型（野生型）ビリルビンオキシダーゼと異なり、糖鎖修飾を有さない。
【００１５】
不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来ビリルビンオキシダーゼ遺伝子には、配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡ断片を用いることができる。この塩基配列は、天然型ビリルビンオキシダーゼをコードするＤＮＡから分泌シグナルペプチドをコードする部分が除かれた配列とされている。このビリルビンオキシダーゼ遺伝子を発現させて得られる組換型ビリルビンオキシダーゼは、天然型ビリルビンオキシダーゼのアミノ酸配列から分泌シグナルペプチドの３７残基を除いた配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。なお、本発明に係る組換型ビリルビンオキシダーゼは、この配列番号１に示すアミノ酸配列から、開始コドンに対応するメチオニン（Ｎ末端から１番目のメチオニン）を除いた配列を有するものとしてもよい。
【００１６】
組換型ビリルビンオキシダーゼの発現のためのベクターには、組換タンパクの発現のために通常用いられるプラスミドベクターを採用できる。ベクターとしては、ｐＥＴ２２ｂ，ｐＵＣ１８，ｐＨＳＧ３９８，ｐＨＳＧ３９９，ｐＲＩＴ２Ｔ，ｐＵＥＸ１〜３，ｐＫＫ２２３−３，ｐＩＮIII １，ｐＴＴＱ１８，ｐＧＥＭＥＸ−１，ｐＧＨ−Ｌ９，ｐＫＫ２３３−２などが挙げられる。
【００１７】
組換型ビリルビンオキシダーゼの発現のための宿主細胞には、組換タンパクの発現のために通常用いられ大腸菌細胞を採用できる。大腸菌としては、特にＫ−１２由来株が好ましく、ＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＢ４，ＢＭ２５．５，ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ，ＢＷ３１３，Ｃ−ｌａ，Ｃ６００，ＣＪ２３６，ＤＨ１，ＤＨ５，ＤＨ５α，ＤＨ１０Ｂ，ＤＰ５０ｓｕｐＦ，ＥＤ８６５４，ＥＤ８７６７，ＥＲ１６４７，ＨＢ１０１，ＨＭＳ１７４，ＨＳＴ０２，ＨＳＴ０４ｄａｍ−／ｄｃｍ−，ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ，ＪＭ８３，ＪＭ１０１，ＪＭ１０５，ＪＭ１０６，ＪＭ１０７，ＪＭ１０８，ＪＭ１０９，ＪＭ１１０，Ｋ８０２，Ｋ８０３，ＬＥ３９２，ＭＣ１０６１，ＭＶ１１８４，ＭＶ１１９３，ＮｏｖａＢｌｕｅ，ＲＲ１，ＴＡＰ９０，ＴＧ１，ＴＧ２，ＴＨ２，ＸＬ１−Ｂｌｕｅ，Χ−１７７６，γ−１０８８，γ−１０８９，γ−１０９０などのストレインが挙げられる。
【００１８】
宿主細胞へのベクターの導入（形質転換）は、使用する宿主細胞に応じてエレクトロポレーション法やカルシウム法などの従来公知の手法よって行うことができる。また、培養した形質転換体からの変異型ビリルビンオキシダーゼの抽出精製は、例えば超音波破砕によって細胞を破壊し、遠心分離により未破砕の細胞及び沈殿物を取り除き、透析を行うことによって行うことができる。このようにして得た粗精製物は、さらに液体クロマトグラフィーを用いた精製に供してもよい。
【実施例】
【００１９】
＜実験例１＞
１．不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアNBRC(IFO)6113株（Myrothecium verrucaria NBRC(IFO)6113）由来ビリルビンオキシダーゼのｃＤＮＡクローニング
（１−１）ミロテシウムベルカリアの培養
Myrothecium verrucaria NBRC(IFO)6113株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部から分譲を受けた。入手した乾燥菌体を、復水液（ポリペプトン：0.5％、酵母エキス：0.3％、MgSO4・7H2O：0.1％）に懸濁し、懸濁液をポテトデキストロース寒天（PDA）プレート（ポテトデキストロース：2.4％、アガロース：1.5％）に接種した。室温で５〜７日間培養を行ったところ、PDAプレートの表面は白色の菌糸により覆われた。菌糸をスパチュラでかき集めて-80℃で保存した。菌体の収量は、PDAプレート１枚（直径９cm）当たり50〜60 mg（湿重量）であった。
【００２０】
（１−２）ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成
約100 mgのMyrothecium verrucaria NBRC(IFO)6113株の凍結菌体粉末から100μｇ（UV吸収により定量）のトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡを逆転写PCRの鋳型RNAとして用いた。
【００２１】
上記トータルＲＮＡを鋳型とし、OneStep RT-PCR Kit（キアゲン）を用いて、逆転写PCRを行った。逆転写PCRに用いたプライマーの塩基配列は、既報のＢＯのcDNAの塩基配列を参照して「表１」に示すように設計した。
【００２２】
【表１】
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（塩基配列中、下線部は制限酵素サイトを示し、それぞれNdeIサイト(CATATG）、EcoRIサイト（GAATTC）を示す。）
【００２３】
PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、1600 bp付近に目的のビリルビンオキシダーゼ遺伝子を含む増幅断片が確認できた。この増幅断片をアガロースゲルスラブより切り出して、次の工程に用いた。
【００２４】
（１−３）クローニング
上記増幅断片を制限酵素NdeI、EcoRIにより消化した後、同酵素で消化したpET22b+プラスミドベクターとライゲーション反応を行った。ライゲーション後のプラスミドベクターを大腸菌TOP10株（インビトロジェン）に導入し、LB/Amp寒天平板培地に接種した。一晩培養後、アンピシリンに対する薬剤耐性を有する形質転換体のコロニーを得た。コロニーを3mlのLB/Amp培地に継代し、一晩培養して得られた菌体からプラスミドベクターを単離した。
【００２５】
プラスミドベクターの挿入領域の塩基配列を調べたところ、配列番号２であった。配列番号２に示した塩基配列は1608ｂｐ（開始コドンのATG、終止コドンのTAAを含む）であり、配列番号１に記載の535残基分のアミノ酸（開始コドン由来のメチオニンを含む）に相当する。このアミノ酸配列は、Myrothecium verrucaria由来の天然型ビリルビンオキシダーゼの成熟型酵素のアミノ酸配列に一致した。以下、このプラスミドベクターを「pET-BOベクター」と称する。図１に、pET-BOベクターの構造を示す。
【００２６】
＜実験例２＞
２．大腸菌による組換型ビリルビンオキシダーゼの発現
（２−１）大腸菌の形質転換と組換型ビリルビンオキシダーゼの発現
上記pET-BOベクターを用いて、大腸菌（Ｋ-12由来株、ストレインBL21(DE3)）の形質転換を行った。形質転換体のコロニーを5 ml のLB/Amp液体培地に接種し、37℃で4時間震とう培養を行った。得られた菌液1 mlを、100 mLのTB/Amp培地に継代し、37℃で4時間震とう培養した。
【００２７】
培養液にIPTG（終濃度0.25 mM）と硫酸銅五水和物（2.0 mM）を加え、18℃で16時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。菌体は、50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.6, 0.1 mM PMSF，0.3 mM硫酸銅五水和物）に再けん濁して、超音波破砕機により破砕した。遠心分離により未破砕の細胞及び沈殿物を取り除き、50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.6）に対して透析を行った。
【００２８】
（２−２）アニオン交換カラムによる組換型ビリルビンオキシダーゼの精製
DEAEセルロース樹脂によるアニオン交換クロマトグラフィー（Hi-trap DEAE（5 ml）、GEヘルスケア）により、組換型ビリルビンオキシダーゼの精製を行った。透析後のサンプルを同カラムに吸着させ、500 mM NaClを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.6）によるリニアーグラジエント（0-50%）により、吸着した組換型ビリルビンオキシダーゼを溶離した。
【００２９】
この方法で精製を２回繰り返した後の組換型ビリルビンオキシダーゼのSDS-PAGEを図２に示す。図中、レーン１は精製組換型ビリルビンオキシダーゼ、レーン２は市販品の天然型ビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin oxidase(BO) "Amono" 3 (BO-3)、アマノエンザイム）、レーン３は酵母で発現させた組換えビリルビンオキシダーゼである。また、レーンＭはサイズマーカーである。
【００３０】
また、精製組換型ビリルビンオキシダーゼの吸収スペクトルを図３に示す。吸収スペクトルの600 nmと500 nmの吸光度差（Δε＝4000）から見積もった培養液100 mL当たりのBOの収量は0.6 mgであった。
【００３１】
＜実験例３＞
３．組換型ビリルビンオキシダーゼの活性測定
組換型ビリルビンオキシダーゼの活性評価を行い、市販品の天然型ビリルビンオキシダーゼと比較した。活性測定はABTSを基質に用い、反応進行に伴う730 nmの吸光度変化（ABTSの反応物の増加に由来する）を追跡した。測定条件を「表２」に示す。なお、ビリルビンオキシダーゼ濃度は、730 nmの吸光度変化が1分間当たり0.01 〜 0.5 程度となるように調製した。反応は0.05〜10 mMのABTSを含むリン酸緩衝液（2995μＬ）に酵素溶液（5 μＬ）を加えることで開始した。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
活性評価の結果を図４に示す。また、組換型ビリルビンオキシダーゼ及び市販品の天然型ビリルビンオキシダーゼのＫｍ、ｋｃａｔを「表３」に示す。大腸菌による組換型ビリルビンオキシダーゼは、天然型ビリルビンオキシダーゼに対して１．８倍程度の活性（ｋｃａｔ）を示し、優れた活性を有することが確認された。
【００３４】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明に係る組換型ビリルビンオキシダーゼの製造方法によれば、非常に簡単で、経済的な方法により不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来ビリルビンオキシダーゼを大量に提供できる。さらに、得られる組換型ビリルビンオキシダーゼは、天然型ビリルビンオキシダーゼと同等以上の高い酵素活性を有する。従って、本発明は、臨床検査用試薬や酵素電池の電極酵素などとして不完全糸状菌ミロテシウムベルカリア由来ビリルビンオキシダーゼを安価に供給するために用いられ得る。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【配列表】
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