(57)【要約】【課題】リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＡスーパーファミリーに属する修飾リボヌクレアーゼを提供する。【解決手段】各修飾リボヌクレアーゼは、ウシ膵臓ＲＮａｓｅＡのアミノ酸８５〜９４に対応するループ領域に追加された立体障害部分を有する。前記修飾リボヌクレアーゼはリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＩ）に対する低下した結合親和性を有し、野生型リボヌクレアーゼ活性を示し、野生型リボヌクレアーゼと比較して増強された腫瘍細胞に対する細胞傷害性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された細胞傷害性リボヌクレアーゼであって、
ＲＮａｓｅＡスーパーファミリーのリボヌクレアーゼについてのアミノ酸配列及び該リボヌクレアーゼのループ領域に位置するアミノ酸の側鎖に共有結合的に結合した立体障害部分を含み、
ここで、該ループ領域は、２つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により定義される１０〜１２のアミノ酸残基を含み、
該ループ領域は該リボヌクレアーゼのＮ末端から７５〜８５アミノ酸残基で開始し、
該ＲＮａｓｅＡスーパーファミリーのメンバーが、ウシ膵臓ＲＮａｓｅＡ、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ、ヒトアンジオゲニン、ヒト好酸球カチオン性タンパク質、ヒト好酸球由来神経毒及びヒトリボヌクレアーゼ４からなる群より選ばれ、
該改変された細胞傷害性リボヌクレアーゼが、該立体障害部分による立体障害による、リボヌクレアーゼインヒビターに対して低下した結合親和性を有し、リボ核酸分解活性を保持している
ことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記修飾リボヌクレアーゼがヒト膵臓リボヌクレアーゼに由来する、請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記ループ領域が、ウシ膵臓ＲＮａｓｅＡのアミノ酸８５〜９４に対応する、請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記修飾リボヌクレアーゼが、天然配列の部位８８におけるアミノ酸についての置換を有し、該部位にシステインが挿入されている、請求項２に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項５】
前記立体障害部分が葉酸誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項６】
前記立体障害部分が下記式で表される、請求項５に記載のリボヌクレアーゼ。
【化１】
2011078428.tif 000011
【請求項７】
ＲＮａｓｅＡスーパーファミリーの修飾リボヌクレアーゼであって、  前記修飾リボヌクレアーゼは人間による修飾により改変されており、
前記修飾リボヌクレアーゼは、その構造中に、対応の野生型リボヌクレアーゼと比較しての改変を有し、
前記改変は該タンパク質への立体障害部分の追加であり、
該立体障害部分はＲＮａｓｅＡのアミノ酸８５〜９４に対応する位置のアミノ酸の側鎖に共有結合的に結合しており、
該立体障害部分はリボヌクレアーゼインヒビターへの結合を妨げるが、リボ核酸分解活性には干渉しない十分な大きさであり、
該ＲＮａｓｅＡスーパーファミリーのメンバーが、ウシ膵臓ＲＮａｓｅＡ、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ、ヒトアンジオゲニン、ヒト好酸球カチオン性タンパク質、ヒト好酸球由来神経毒及びヒトリボヌクレアーゼ４からなる群より選ばれる
ことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
【請求項８】
前記修飾リボヌクレアーゼがヒト膵臓リボヌクレアーゼである、請求項７に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項９】
前記リボヌクレアーゼが、アミノ酸部位８８におけるシステイン残基の置換により天然アミノ酸配列から修飾されている、請求項８に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項１０】
前記立体障害部分が葉酸誘導体である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項１１】
前記立体障害部分が下記式で表される、請求項１０に記載のリボヌクレアーゼ。
【化２】
2011078428.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願のクロスレファレンス
本出願は、出願第０８／９５０，８６６号（１９９７年１０月１５日出願、現在は米国特許第５，８４０，２９６号）の一部係属出願である。更に本出願は、仮出願第６０／０９７，７９７号（１９９８年９月２８日出願）に基づく優先権を主張するものである。
連邦委託研究又は開発に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた助成番号ＣＡ７３８０８による政府支援によりなされたものである。アメリカ合衆国政府は本発明に関し一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
新規薬剤の開発は、近年、種々のタイプの癌の治療においてなされてきた進歩に貢献してきている。しかしながら、特定の癌は、現在使用されている化学療法剤に対しては抵抗性である。これらの悪性腫瘍は特に悪性であり、高い死亡率と関連している。更に、現存の化学療法剤のほとんどは、望ましくない副作用を有している。したがって、医学界及び一般大衆の中で、悪性腫瘍及びその他のタイプの癌を治療するための新規な化学療法剤の開発に対する興味が継続している。
ヒョウガエル（Rana pipiens）から単離された１つの天然リボヌクレアーゼは、フェーズII研究において、進行した手術不能の膵臓癌及び悪性中皮腫患者において抗腫瘍活性を示した（Delmonte, Oncology Times Vol.18, No.8, August 1996）。このリボヌクレアーゼ（以下、オンコナーゼ（Onconase）とする）の抗腫瘍活性は種々の固形腫瘍を有する３５０を越える患者において試験され、転移性膵癌、進行性転移性乳癌及び悪性中皮腫に対する抗腫瘍活性を有することが示された。オンコナーゼは現在、膵癌及び肝臓癌に対するフェーズIIIヒト臨床試験において使用されている。
一般的に、オンコナーゼは、ヒトにおける化学療法剤としての使用に対して比較的安全であると思われる。慣習的な細胞傷害性薬剤、例えば骨髄抑制、胃腸毒性又はムコシティス（mucositis）等に関連する際立った毒性を全く引き起こさない。オンコナーゼで治療した患者の約３分の１がインフルエンザ様症状及び末梢性浮腫を伴う又は伴わないグレード３の関節痛を発現させた。オンコナーゼ投与に関連するもっとも重篤な合併症は、腎臓機能の低下である。これはフェーズＩの用量範囲試験において観察された。低下した腎臓機能は用量の減少に可逆的であった。
種々のタイプの癌の治療に加えて、リボヌクレアーゼはＨＩＶ感染者の治療においても有用性を有するだろう。非細胞傷害性濃度のオンコナーゼは、ＨＩＶに持続感染したいくつかのヒト細胞系におけるＨＩＶ産生を有意に阻害することが報告されている。
【０００３】
リボヌクレアーゼの細胞傷害性は、最初に、ｍｇ量のウシ膵臓由来リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ、ＥＣ３．１２．２７．５）を注射した固形腫瘍において実証された（Ledoux, L. Nature 176:36-37, 1955; Ledoux, L. Nature 175:258-259）。少ない投与量は腫瘍に影響しないことが見いだされた（de Lamirande, Nature 192:52-54, 1961）。低レベルで細胞傷害性であるリボヌクレアーゼは、雄ウシ精漿において発見された（Floridiら, Ital. Biol Sper. 43:32-36, 1967; Dostalら, J. Reprod. Fertil. 33:263-274, 1973）。より細胞傷害性の強いリボヌクレアーゼがカエルの卵から単離され（Ardeltら, J. Biol. Chem. 266:245-251, 1991）、このリボヌクレアーゼはオンコナーゼの名の下で現在臨床試験が行われているものである。
リボヌクレアーゼはＲＮＡの分解を触媒する。細胞傷害性リボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性は細胞傷害性にとって必要とされることが実証されている（Kimら, J. Biol. Chem. 270:10525-1-530, 1995; Ardeltら, J. Biol. Chem. 266:245-251, 1991）。リボヌクレアーゼの細胞傷害性はリボ核酸分解活性を必要とするけれども、リボ核酸分解活性単独では、リボヌクレアーゼ間で観察される差動的な細胞傷害性を十分に説明されない。例えば、ＲＮａｓｅＡのリボ核酸分解活性は、オンコナーゼよりも約１０００倍大きいが、オンコナーゼはＲＮａｓｅＡよりも非常に強い細胞傷害性を有する。したがって、この差異については、酵素のその他の特性を考慮しなければならない。
脊椎動物細胞はリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＩ）を含んでおり、これはリボヌクレアーゼの強力な致死作用から細胞を保護する。ＲＩは５０ｋＤａのサイトゾルタンパク質であり、変動する親和性によりリボヌクレアーゼと結合する。例えば、ＲＩはリボヌクレアーゼのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）スーパーファミリーのメンバーに、次数１０の大きさの範囲の定数、１０-6〜１０-16の範囲のＫiＳで結合する。
リボヌクレアーゼの細胞傷害性は、ＲＩとリボヌクレアーゼとの間の相互作用の強さと反比例の関係にあるようである。例えば、高い親和性（Ｋi＝１０-14Ｍ）でＲＩと結合するＲＮａｓｅＡは細胞傷害性ではない。対照的に、オンコナーゼはＲＩと比較的低い親和性（Ｋi≧１０-6Ｍ）で結合する。
【０００４】
幾つかの天然リボヌクレアーゼはＲＩに結合しない。ウシ精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮａｓｅ）はＲＮａｓｅＡのアミノ酸配列と８０％同一であるが、ＲＮａｓｅＡとは異なり、ＢＳ−ＲＮａｓｅは二量対形態で存在する。ＢＳ−ＲＮａｓｅの四次構造はＲＩによる結合を妨げ、これが前記酵素がＲＩの存在下でリボ核酸分解活性を維持することを許容する（Kimら, Biochem. J. 308:547-550, 1995; Kimら, J. Biol. Chem. 270:10525-10530, 1995; Kimら, J. Biol. Chem. 270:31097-31102, 1995）。オンコナーゼはＲＮａｓｅＡと高いホモロジーを共有する１０４アミノ算残基タンパク質であるにもかかわらず、ＲＩによる結合に耐性を有する。ＲＩ−オンコナーゼ複合体はＫd≧１０-6Ｍを有し（Boixら, J. Mol. Biol. 257:992-1007, 1996）、これはＲＩ−ＲＮａｓｅＡ複合体よりも少なくとも１億倍低い値である。
したがって、オンコナーゼとＲＮａｓｅＡとの間で観察される差動的な細胞傷害性の原因となるこれらの酵素間の鍵となる相違点は、オンコナーゼはＲＩによる阻害に対して耐性を有するということである。正常細胞は、リボヌクレアーゼと化学量論的に１：１に非共有結合的に結合して、リボ核酸分解活性を阻害するＲＩを産生する。オンコナーゼのＲＩに対する低い結合親和性は、リボ核酸分解活性の効果的な阻害を妨げる。これが、オンコナーゼが細胞傷害性であり、一方リボヌクレアーゼＡが細胞傷害性でないという観察結果についての最良の説明である。
マウスにおけるオンコナーゼとＲＮａｓｅＡの血漿クリアランス及び組織分布について試験した最近の研究は、オンコナーゼ又はＲＮａｓｅＡの注射３時間後において、オンコナーゼの５７％が腎臓において見いだされたのに対し、ヒト膵臓リボヌクレアーゼのわずか０．９％が腎臓において見いだされたことを示した（Sungら, Cancer Res. 56:4180, 1996）。オンコナーゼを投与された患者において見いだされた腎臓機能の低下は、オンコナーゼタンパク質を腎臓から効率的に除去することができないことの結果であろう。
【０００５】
好ましい治療用リボヌクレアーゼは、オンコナーゼよりも容易に腎臓から除去されることができる細胞傷害性リボヌクレアーゼであろう。腎臓から容易に除去される細胞傷害性リボヌクレアーゼは、腎臓毒性を引き起こしにくいだろう。腎臓機能の低下はオンコナーゼの用量制限であるので、腎臓機能に干渉しない細胞傷害性リボヌクレアーゼは、最適投与量の決定における大きなフレキシビリティーの利点を潜在的に提供するだろう。低毒性のリボヌクレアーゼは、例えば投与量の増加が特定のタイプの癌又は特定の個体により効果的な治療を提供するような場合に、高い投与量で投与することができるだろう。
オンコナーゼの臨床試験の参加者が経験した副作用は、免疫反応に一般に関連する症状である。ヒョウガエルよりもよりヒトに近い種に由来するリボヌクレアーゼは免疫反応を引き起こしにくいと予想することは妥当である。免疫応答を引き起こしそうにないのはヒトのリボヌクレアーゼであろう。大量の免疫原性タンパク質を投与するとき、免疫反応の強度は大きくなるだろう。それゆえ、オンコナーゼよりも高い特異的活性を有する細胞傷害性リボヌクレアーゼは、潜在的により効果的な化学療法剤であろう。少量のタンパク質の投与により効果的な細胞傷害性を達成し、これにより免疫反応に関連する発病及び症状の重症度を減少させることは可能であろう。
抗腫瘍活性を有する新規な細胞傷害性リボヌクレアーゼは、ヒトの癌治療に利用可能な化学療法剤のスペクトルを増大させるために必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要約
本発明の目的は、ヒトの疾患治療における潜在的な有用性を有する新規な細胞傷害性リボヌクレアーゼを提供することである。
本発明の目的は、野生型リボヌクレアーゼのアミノ酸配列を修飾して新規な細胞傷害性リボヌクレアーゼを生成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、修飾されたアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼである。前記修飾リボヌクレアーゼは、そのリボ核酸分解活性を保持し、未修飾リボヌクレアーゼよりもＲＩに対する結合親和性が低く、かつ、野生型のリボ核酸分解活性を保持している。
本発明はリボヌクレアーゼのアミノ酸配列を修飾して修飾リボヌクレアーゼを生成する方法である。前記修飾リボヌクレアーゼは、そのリボ核酸分解活性を保持し、未修飾リボヌクレアーゼよりもＲＩに対する結合親和性が低く、かつ、野生型のリボ核酸分解活性を保持している。
更に本発明は癌細胞の増殖を阻害する方法であって、修飾リボヌクレアーゼの有効量を細胞へ送達する工程を含む方法である。前記修飾リボヌクレアーゼは、未修飾リボヌクレアーゼよりもＲＩに対する結合親和性が低く、かつ、野生型のリボ核酸分解活性を保持している。
本発明のその他の目的、利点及び特徴は、明細書、図面及び請求の範囲を検討することにより明らかになるだろう。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の研究は１つの仮定に基づいている。その仮定とは、ＲＩへの結合の回避が、リボヌクレアーゼの細胞傷害性の作成におけるキーファクターであるというものである。ＲＩとの結合の回避は、ＲＩとリボヌクレアーゼとの間の好ましくない立体相互作用により引き起こすことができる。２つの原子は空間における同一のポイントを占めることができない。したがって、リボヌクレアーゼがＲＩに結合するときにリボヌクレアーゼがＲＩに典型的に接触するポイントへバルク（bulk）を追加することにより、リボヌクレアーゼをＲＩから回避することが可能になる。
立体バルクのリボヌクレアーゼへの追加は、複数の方法により達成することができる。１つの方法は、タンパク質のアミノ酸残基をその他の天然アミノ酸に変更することを含んでいる。２０の天然アミノ酸のうちのいくつかは、その他のアミノ酸より大きい。ＲＩとリボヌクレアーゼとの間の接触ポイントにおける立体バルクを増加させるために、接触領域において小さいアミノ酸を大きいアミノ酸で置換することができる。類似の方法において、追加のアミノ酸をタンパク質の当該領域へ挿入することができる。いずれの場合においても、その効果は、当該領域における追加したバルクの立体障害によりタンパク質がＲＩに結合することを不可能にすることである。
立体バルクを追加する第二の戦略は、好ましくはアミノ酸を修飾し、次いで立体障害部分を当該分子へ共有結合的に追加することである。当該部分は、野生型タンパク質の天然アミノ酸へ追加することもできる。しかしながら、修飾可能なアミノ酸を部位特異的突然変異により適切な位置へ挿入し、立体障害部分を修飾したアミノ酸へ追加するようにすることが好ましい。しばしば修飾される２つのアミノ酸はリジン及びシステインである。リジンはその側鎖にアミノ基（−ＮＨ2）を有する唯一の天然アミノ酸である。アミノ基とのみ反応する化学試薬はリジン側鎖のみを修飾するだろう。同様に、システインはその側鎖にスルフヒドリル基（−ＳＨ）を有する唯一の天然アミノ酸である。スルフヒドリル基とのみ反応する化学試薬はシステイン側鎖のみを修飾するだろう。システイン（全アミノ酸残基の１．７％）はタンパク質中にリジン（全タンパク質の５．７％）よりも低い頻度で現れる。更に、システイン残基はしばしばジスルフィド結合（−ＳＳ−）に関連するが、これは修飾試薬とは反応しない。そのため、立体バルクをタンパク質の特定のポイントへ追加するために、有利な戦略は、部位特異的突然変異誘発を用いて現存のアミノ酸をシステイン残基で置換し、次いで新規なシステイン残基のスルフヒドリル基を化学反応により修飾することである。この技術は「システインエラボレーション（cysteine elaboration）」と呼ばれており、以前本発明者らはこの技術をＲＮａｓｅＡによる触媒の研究に適用した（Messmoreら, J. Am. Chem. Soc. 117:8057-8060）。
【０００９】
立体障害部分は、リボヌクレアーゼインヒビターのリボヌクレアーゼへの結合に干渉するのに十分な大きさを有する化学的実体であるように選択される。立体障害部分はタンパク質であることができ、リボヌクレアーゼなどのタンパク質へ共有結合的に結合することができるその他全てのタイプの有機分子から選択することができる。立体障害部分が標的細胞に対する強力な親和性を有する場合、有利である。例えば、悪性細胞は葉酸の取り込みに対して特別の親和性を有することが観察されている。以下に検討するように、葉酸をリボヌクレアーゼに追加して、立体障害部分として効率的に役立てることができ、葉酸も標的細胞による細胞傷害性リボヌクレアーゼの取り込みを補助することができる。立体障害部分についてのその他の候補には、標的細胞表面上の受容体分子に結合するペプチドリガンドが含まれる。その他の可能な立体障害部分には、ビタミン及び標的細胞に対して特定の親和性を有するターゲティング分子が含まれる。
修飾部位の選択は重要である。ＲＮａｓｅＡのアミノ酸残基ループは、ＲＩ  ＲＮａｓｅＡ複合体におけるＲＩとの親密な接触を可能にすることが同定されている。これらの残基は天然ＲＮａｓｅＡのアミノ酸配列における８５〜９４のメンバーである。この部位は、ＲＮａｓｅＡのアミノ酸残基をその他の天然アミノ酸へ変更することによる立体バルクの追加にとって好ましい部位として同定されている。これらの残基は、化学修飾による立体バルクの追加にとっての好ましい部位でもある。なぜなら、化学的修飾はアミノ酸残基の変更よりもより可変的な方法であり、多様な特性を有する大きな基を添加することができるからである。
したがって、本発明は対応の野生型リボヌクレアーゼのアミノ酸配列のなかの少なくとも１つのアミノ酸残基において異なるアミノ酸配列又はタンパク質へ化学的に追加された立体障害部分において異なるアミノ酸配列のいずれか又は両方を有する修飾かつ改変されたリボヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼは好ましくは、リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＡスーパーファミリーのメンバーである。修飾リボヌクレアーゼはそのリボ核酸分解活性を保持し、修飾リボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼインヒビターに対する結合親和性は未修飾リボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼインヒビターに対する結合親和性よりも低下しており、かつ、修飾リボヌクレアーゼは増加した細胞傷害活性を有する。
【００１０】
天然ＲＮａｓｅＡアミノ酸配列のアミノ酸残基８５〜９４により定義されるループ領域に存在するウシ膵臓リボヌクレアーＡのアミノ酸配列に対する、前記の立体的干渉を作成する修飾は、ＲＩに対する結合親和性の低下、野生型リボ核酸分解活性及び増加した細胞傷害性を有する修飾リボヌクレアーゼを生成するだろう。更に立体的阻害を提供するためのその他の共有結合的に結合した部分又は側鎖、例えば当該タンパクの当該部分に結合した糖側鎖も同様に機能することが本明細書にて予想され、記載されている。
ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ及びヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ｈｐＲＮａｓｅ）に加えて、リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＡスーパーファミリーのその他のメンバーを本発明の実施に使用することができることが予想される。ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ以外のリボヌクレアーゼにおけるウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのアミノ酸残基８５〜９４に対応するループ領域に生じる修飾は、ＲＩに対する結合親和性の低下、野生型のリボ核酸分解活性及び増加した細胞傷害性を有するリボヌクレアーゼを生成することが予想される。「ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのアミノ酸残基８５〜９４に対応するループ領域」とは、２つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により定義される約１０〜１２のアミノ酸を有するループを意味する。当該ループ領域はリボヌクレアーゼのＮ末端から約７５〜８５アミノ酸残基で開始し、ウシＲＮａｓｅＡの残基８５及び９４に対応する「ベストフィット」アミノ酸配列により配列している。
リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＡスーパーファミリーは、多くの哺乳類、鳥類、は虫類及び両生類源に由来する相同（すなわち、進化的に関連した）タンパク質を構成する。これらのタンパク質はそのポリペプチド鎖の同様の折りたたみを有し、ＲＮＡの切断を触媒する。このスーパーファミリーについての記載は、Beintemaら, Ribonucleases: Structures and Functions 1997 pp245-269に見いだすことができる。当該文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。
ヒトの疾患治療における使用のための細胞傷害性リボヌクレアーゼの開発に有用であることが期待される、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡの５つの例示的なヒト相同体が存在する。５つの相同体のそれぞれは、ＲＮａｓｅＡの１０アミノ酸残基ループ領域に類似の保存されたループ領域を有する（表１）。
【００１１】
表１
酵素                 整列化配列                                 配列番号
ウシ膵臓            (C) R  E  T  G  S  S  K  Y  P  N (C)        3
リボヌクレアーゼＡ   84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
ヒト膵臓            (C) R  L  T  N  G  S  R  Y  P  N (C)        4
リボヌクレアーゼ     84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
ヒトアンジオゲニン  (C) K  L  H  G  G  S  P  W  P  P (C)        5
82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93
ヒト好酸球          (C) D  L  I  N  P  G  A  Q  N  I  S  N (C)  6
カチオン性タンパク質 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
ヒト好酸球          (C) N  L  T  T  P  S  P  Q  N  I  S  N (C)  7
由来神経毒           83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
ヒト                (C) R  D  T  G  S  S  R  A  P  N (C)        8
リボヌクレアーゼ４   81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
【００１２】
「増強した細胞傷害性」とは、修飾リボヌクレアーゼが対応の未修飾リボヌクレアーゼよりも強い細胞傷害性を示すことを意味する。以下の実施例において、細胞傷害性はヒト赤白血病細胞系Ｋ−５６２を用いて評価した。本発明の修飾リボヌクレアーゼは、Ｋ−５６２細胞に加えてその他の腫瘍細胞に対しても細胞傷害性であることが予想される。
細胞増殖の阻害は、修飾又は未修飾リボヌクレアーゼで処理した生存Ｋ−５６２細胞の百分率を計算することにより決定する。ここで１００％の生存率は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で処理した生存細胞数であるとみなす。
好ましくは、修飾リボヌクレアーゼは、細胞の生存率を少なくとも約１０％まで減少させる。より好ましくは、修飾リボヌクレアーゼは細胞の生存率を少なくとも約２０％まで減少させる。特に好ましくは、修飾リボヌクレアーゼは細胞の生存率を少なくとも約５０％まで、さらには約７５％程度まで減少させる。
更に本発明は腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、修飾細胞傷害性リボヌクレアーゼを提供する工程及び前記リボヌクレアーゼの有効量を前記腫瘍細胞へ送達する工程を含んでいる方法である。
「有効量」とは、腫瘍細胞の増殖における有意な低下を引き起こすのに必要なリボヌクレアーゼ量を意味する。
ＲＩはＲＮａｓｅＡと化学量論的に１：１で非共有結合的に結合する。ＲＩ及びＲＮａｓｅＡの複合体の三次元構造は分解能２．５まで決定されている。（Ｒ因子１９．４％）（Kobeら, Nature 374:183-186, 1995）。この構造は、ＲＮａｓｅＡの１２４アミノ酸残基のうち２４がＲＩと接触することを示した。ＲＩと接触するＲＮａｓｅＡの幾つかの領域は、触媒部位とは異なることが見いだされた。
立体障害部分をリボヌクレアーゼに追加して、ＲＩへの結合を妨害することが本明細書において企図される。立体障害部分の選択は重要である。成功する立体障害部分は、ＲＩとの結合に干渉するのに十分であるが、リボヌクレアーゼのその他の特性には干渉しない十分な立体バルクを追加するものである。たとえこれらの制約が与えられても、可能な修飾が多数存在する。なぜなら、多数の化学反応をシステイン残基又はその他のアミノ酸に対して行うことができるからである。
【００１３】
立体障害部分における別の望ましい特徴は、標的細胞による結合及び取り込みの増強である。特定の試薬はこの特性を有することが知られている。例えば、糖ラクトースをヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）にコンジュゲートすると、肝細胞によるＬＤＬの取り込みが増加する（Attieら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5923-5927）。Ｂ−ビタミンである葉酸を種々のタンパク質（ＲＮａｓｅＡを含む）にコンジュゲートすると、種々のタイプの細胞による当該タンパク質の結合及び取り込みが増加する（Leamon及びLow, J. Biol. Chem. 267:24966-24971）。これらの修飾実験において、コンジュゲートはランダムな方法で行った。
換言すると、結合ポイントは特定しなかった。むしろ、反応は修飾試薬とタンパク質中の多数のリジン残基のうちの１つ以上との間で起こった。
以下の実施例では、葉酸の誘導体を、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ｈｐＲＮａｓｅ）の８５〜９４ループに結合した。葉酸を選択した。なぜなら、葉酸はＲＩ結合に干渉する可能性があるバルキーな試薬であるからである。更に本発明者らは葉酸を選択した。なぜなら、細胞による結合及び取り込みを増強する可能性があるからである。特定の癌細胞は葉酸の能動的な取り込みを補助するレセプターを有することが知られているからである。
【化１】
2011078428.tif 000002
リボヌクレアーゼスーパーファミリーの別のメンバーはアンジオゲニンとして知られるタンパク質であり、これは血管形成を誘導する。アンジオゲニンはＲＩと結合し、ｈｐＲＮａｓｅの残基８５〜９４に類似のドメインを有する。アンジオゲニンに、既知の血管拡張剤であるイソソルビドジニトレートの立体障害部分追加することは有利であろう。これは、ＲＩによる阻害のブロッキング及び体内の患部における血管拡張を誘導することによるアンジオゲニンへの二重の効果の追加であろう。
【００１４】
実施例
バルキーな分子をヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ｈｐＲＮａｓｅ）の特定の残基に結合するための一般的方法を設計した。前記の理由により、本発明者らが選択した残基はシステインであった。システイン残基のスルフヒドリル基は炭素への攻撃のための優れた求核試薬である。本発明者らが選択したバルキーな分子は、「バムフォレート（bamfolate）」と呼ぶ葉酸のブロモアセトアミド誘導体であった。バムフォレートのブロモアセトアミド基のメチレン炭素は、スルフヒドリル基による攻撃に対する優れた求電子試薬である。
【化２】
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フォレート（folate）〜ｈｐＲＮａｓｅコンジュゲートの構築のための一般的スキームは以下のとおりであり、これを以下に詳述する。
【化３】
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バムフォレートの化学合成
フォレート誘導体は易可溶性ではない。したがって、本発明者らの合成は固相で行った。Ｆｍｏｃオルニチン及びワング（Wang）樹脂をNovabiochemより入手した。プテロイル酸をSigma Chemicalより入手した。その他全ての化学品はAldrich Chemicalより入手した。全ての化学品は受け入れられたままで使用した。
ワング樹脂（１０９ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ、０．９６ｍｍｏｌ／ｇ）及びＦｍｏｃオルニチン（２．０当量）をジメチルホルムアミド（０．７５ｍｌ）へ添加し、得られた混合物を１５分間振盪した。ピリジン（２８．４μｌ、３．３当量）及び２，６−ジクロロベンゾイルクロライド（６０μｌ）を添加し、得られた混合物を２４時間振盪した。次いでこの樹脂をジクロロメタンで洗浄した。
全ての残留ヒドロキシル基をベンゾイル化するために、ピリジン（４３μｌ、５．０当量）及びベンゾイルクロライド（４３μｌ）を含有するジクロロエタン溶液（２．０ｍｌ）を樹脂へ添加した（Sieber, Tet. Lett. 28:6147-6150）。得られた混合物を２時間振盪した。樹脂を分離し、ピペラジン（２０％  ｖ／ｖ）のジメチルホルムアミド溶液（１．１ｍｌ）中に懸濁した。得られた混合物を１５分間振盪してＦｍｏｃ基を除去した。次いで樹脂をジメチルホルムアミドで３回洗浄し、イソプロパノールで３回洗浄した。
【００１５】
プテロイル酸（３２．８ｍｇ）をジメチルホルムアミド（１．９ｍｌ）中でスラリー化した。イソブチルクロロフォルメート（isobutylchloroformate）（１０．３μｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１４．７μｌ、１．０当量）を添加し、得られた混合物を３０分間攪拌し、その後、樹脂へ添加した。得られた混合物を５時間振盪し、次いでジクロロメタンで洗浄した（Rosowskyら, Pteridines, Vol 1, No.2, pp 91-98）。
ジクロロメタン（９５％  ｖ／ｖ）、トリイソプロピルシラン（４％  ｖ／ｖ）及びトリフルオロ酢酸（１％  ｖ／ｖ）の溶液を用いた洗浄により、メチルトリチル基を除去した。
樹脂をジクロロメタン（１．８ｍｌ）中に懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（２６．６μｌ、２当量）及びブロモアセチルブロミド（８．９μｌ、１．０当量）を添加し、得られた混合物を４時間振盪した。
バムフォレートをトリフルオロ酢酸（９５％  ｖ／ｖ）、水（２．５％  ｖ／ｖ）及びトリイソプロピルシラン（２．５％  ｖ／ｖ）の溶液（２．０ｍｌ）で洗浄し、氷冷ジエチルエーテルへ滴下することにより、樹脂から離した。
ＤＮＡ突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発によるＲＮａｓｅＡの修飾は、米国特許第５，３８９，５３７号明細書に詳述される方法によって行った。当該文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。ヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ｈｐＲＮａｓｅ）をコードするｃＤＮＡを、ＲＮａｓｅＡを発現するために使用した方法に類似の方法により発現させた。プラスミドｐＨＰＲのオリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発（Kunkeら, 1987）を使用して、特定の位置に特定のアミノ酸置換を有する修飾ｈｐＲＮａｓｅ分子用の発現ベクターを生成した。前記修飾ｈｐＲＮａｓｅは残基８８にシステインを有し、これをＮ８８Ｃ  ｈｐＲＮａｓｅと命名した。Ｎ８８Ｃ  ｈｐＲＮａｓｅを得るために使用したオリゴヌクレオチドを配列番号１に示す。これはＮ８８Ｃ  ｈｐＲＮａｓｅの残基８５〜９３の逆相補物をコードしている。
【００１６】
タンパク質変異体の精製
ヒト膵臓リボヌクレアーゼ（ｈｐＲＮａｓｅ）は、ＲＮａｓｅＡとアミノ酸配列で約８０％同一である。このレベルの同一性は、これらのタンパク質が類似の特性を有することを示唆している。野生型ｈｐＲＮａｓｅ及びＮ８８Ｃ  ｈｐＲＮａｓｅは、前記のＲＮａｓｅＡと本質的に同様にして、Messmoreら, J. Am. Chem. Soc. 117:8057-8060に記載されるようにして酸化から保護した部位８８の新規なシステイン残基と共に精製した。
バムフォレートのタンパク質変異体へのカップリング
求電子試薬のＫ４１Ｃ  ＲＮａｓｅＡのスルフヒドリル基へのカップリングについての既報（Messmoreら, J. Am. Chem. Soc. 117:8057-8060）と同様にして、バムフォレートをＮ８８Ｃ  ｈｐＲＮａｓｅへカップリングした。
リボ核酸分解活性
変異体リボヌクレアーゼの重合ＲＮＡ切断触媒能力を、既報（delCardayre & Raines, Biochemistry, 33:6031-6037, 1994; delCardayre & Raines, J. Mol. Biol. 252:328-336, 1995）と同様にしてＵＶ分光法により決定した。
抗腫瘍活性アッセイ
リボヌクレアーゼの抗腫瘍活性を、既報（Kimら, J. Biol. Chem. 270:10525-10530, 1995）と同様にして評価した。オンコナーゼを正の対照として含め、未修飾ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡを負の対照として含めた。ヒト骨髄性白血病細胞系Ｋ−５６２（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−２４３）の増殖に対する種々のリボヌクレアーゼの効果を以下のようにして評価した。細胞はＡＴＣＣの勧めにしたがい抗生物質の添加を用いて維持した。Ｋ−５６２細胞に対するリボヌクレアーゼの細胞傷害性は、新規合成されたＤＮＡへの［3Ｈ］−チミジン取り込みを測定することにより評価した。要約すると、Ｋ−５６２細胞（０．５×１０4／ウェル）を９５ｌ容の９６ウェルマイクロタイタープレートへまいた。細胞をリボヌクレアーゼの存在下で４４時間培養し、続いて［3Ｈ］−チミジン（０．２Ｃｉ）による４時間のパルスを与えた。次いで細胞を、ＰＨＤ細胞収穫器（Cambridge Technology, Inc.; Cambridge, MA）を使用してグラスファイバーフィルター上に収穫し、前記フィルターに数ｍｌの水を通過させることにより溶菌した。ＤＮＡ及びその他の細胞性高分子をフィルターにより保持し、未取り込み標識を含む小分子はフィルターを通過させた。水で大規模に洗浄した後、フィルターをメタノールで乾燥し、液体シンチレーションカウンターを用いて計数した。
［3Ｈ］−チミジンの取り込みは実際に新規ＤＮＡ合成を測定している。［3Ｈ］−チミジンの取り込みの減少は、細胞死よりも細胞分裂停止を反映している。
しかしながら、その他のアッセイにより、オンコナーゼは細胞死を引き起こすことが示された（Wuら, J. Biol. Chem. 268:10686-10695）。
【００１７】
ＲＩについての結合親和性
野生型ｈｐＲＮａｓｅ及びフォレート〜ｈｐＲＮａｓｅの結合親和性を、ゲルを基本としたアッセイにより定性的に評価した（Wuら, J. Biol. Chem. 268:10686-10693）。
結果
ｈｐＲＮａｓｅのＲＮａｓｅＡへの類似性により予想されたとおり、ＲＩは野生型ｈｐＲＮａｓｅへ密接に結合した。対照的に、ＲＩはフォレート〜ｈｐＲＮａｓｅに密接に結合しなかった。フォレート〜ｈｐＲＮａｓｅはＲＩの存在下で触媒活性を保持した。
野生型ｈｐＲＮａｓｅはヒト骨髄性白血病細胞系Ｋ−５６２に対して毒性がなかった。一方、フォレート〜ｈｐＲＮａｓｅは、細胞増殖の阻害の点においてオンコナーゼより毒性が高かった。特に、フォレート〜ｈｐＲＮａｓｅは０．１μＭのＩＣ50値を有していたが、オンコナーゼのＩＣ50値は０．７μＭであった。
これらの結果は、リボヌクレアーゼの残基８５〜９４を化学基を用いて修飾して細胞傷害性を与えることができることを示している。
この結果は、追加した立体障害部分を有する化学的に修飾されたリボヌクレアーゼが細胞傷害性の点において天然のリボヌクレアーゼよりも優れていることを示唆している。
【００１８】
より詳細には、本発明は以下に関するものである。
１．改変された細胞傷害性リボヌクレアーゼであって、
ＲＮａｓｅＡスーパーファミリーのリボヌクレアーゼについてのアミノ酸配列及びウシ膵臓ＲＮａｓｅＡのアミノ酸残基８５〜９４の領域に機能的に等価なループ領域において該リボヌクレアーゼのアミノ酸に共有結合的に結合した立体障害部分を含み、
該立体障害部分による立体障害による、リボヌクレアーゼインヒビターに対して低下した結合親和性を有し、リボ核酸分解活性を保持していることを特徴とするリボヌクレアーゼ。
２．前記修飾リボヌクレアーゼがヒト膵臓リボヌクレアーゼに由来する、前記１に記載のリボヌクレアーゼ。
３．前記修飾リボヌクレアーゼが、天然配列の部位８８におけるアミノ酸についての置換を有し、該部位にシステインが挿入されている、前記２に記載のリボヌクレアーゼ。
４．前記立体障害部分が葉酸誘導体である、前記１に記載のリボヌクレアーゼ。
５．前記立体障害部分がバムフォレートである、前記４に記載のリボヌクレアーゼ。
６．ＲＮａｓｅＡスーパーファミリーの修飾リボヌクレアーゼであって、
前記修飾リボヌクレアーゼは人間による修飾により改変されており、
前記修飾リボヌクレアーゼは、その構造中に、対応の野生型リボヌクレアーゼと比較しての改変を有し、
前記改変は該タンパク質への立体障害部分の追加であり、
該立体障害部分はＲＮａｓｅＡのアミノ酸８５〜９４に対応する位置のアミノ酸に共有結合的に結合しており、
該立体障害部分はリボヌクレアーゼインヒビターへの結合を妨げるが、リボ核酸分解活性には干渉しない十分な大きさであることを特徴とするリボヌクレアーゼ。
７．前記修飾リボヌクレアーゼがヒト膵臓リボヌクレアーゼである、前記６に記載のリボヌクレアーゼ。
８．前記リボヌクレアーゼが、アミノ酸部位８８におけるシステイン残基の置換により天然アミノ酸配列から修飾されている、前記７に記載のリボヌクレアーゼ。
９．前記立体障害部分が葉酸誘導体である、前記６に記載のリボヌクレアーゼ。
１０．前記立体障害部分がバムフォレートである、前記９に記載のリボヌクレアーゼ。
【００１９】
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【配列表】
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