(57)【要約】【課題】多発性骨髄腫を有するヒトを処置するための方法を提供すること。【解決手段】多発性骨髄腫に対して被験体を処置するための治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、それらを必要とする患者に投与する工程を包含する。そのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さないが、その抗体がヒトＣＤ４０発現細胞のＣＤ４０抗原に結合する場合にアンタゴニスト活性を示す。抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントのアンタゴニスト活性は、ヒトＣＤ４０発現多発性骨髄種細胞の増殖および／または分化を有利に阻害する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を用いる多発性骨髄腫の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、低い増殖性指数および長い寿命を有する分泌性形質細胞の骨髄における潜在蓄積によって特徴付けられる、Ｂ細胞悪性疾患である。この疾患は、最終的に骨および骨髄を攻撃し、骨格系のいたるところに多発性腫瘍および病変を生じる。全ての癌の約１％および全ての血液学的な悪性疾患の１０％強は、多発性骨髄腫が原因であり得る。ＭＭの発病率は、老年層で増大し、診断時での中央値の年齢は約６１歳である。現在の処置プロトコル（このようなプロトコルとしては、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、メルファラン、シクロホスファミド、アドリアマイシンとプレドニゾンまたはデキサメタゾンとのような化学治療剤の組み合わせが挙げられる）は、わずか約５％の完全寛解率をもたらし、そして診断時からの生存期間の中央値は約３６ヶ月間〜約４８ヶ月間である。自己由来の骨髄または末梢血液前駆細胞（ＰＢＭＣ）移植後の高用量化学療法を用いる近年の発展は、完全寛解率および寛解期間を増大した。それにもかかわらず、全般的な生存はわずかに延期されたに過ぎず、かつ、治療についての証拠は得られていない。最終的に、全てのＭＭ患者は、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）単独またはステロイドとの併用による維持療法下でさえ、再発する。
【０００３】
ＭＭに対する利用可能な化学療法の処置レジメンの有効性は、低い細胞増殖率および多剤耐性の発達により制限される。９０％より多いＭＭ患者に対し、この疾患は化学療法抵抗性となる。その結果、表面抗原（例えば、形質細胞上のＣＤ２０およびＣＤ４０）を標的化する養子免疫療法に狙いを定めた代替の処置レジメンが求められる。
【０００４】
ＣＤ４０は、正常なヒトＢ細胞および腫瘍性のヒトＢ細胞の両方、樹状細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、内皮細胞、単球細胞ならびに上皮細胞の表面に存在する５５ｋＤａの細胞表面抗原である。Ｂ細胞表面上のＣＤ４０抗原へのＣＤ４０リガンドの結合はＢ細胞を刺激し、Ｂ細胞を高レベルの可溶性免疫グロブリンを分泌する形質細胞へと成熟させる。Ｂ細胞系統の１個または数個の腫瘍に由来する悪性Ｂ細胞は、高レベルのＣＤ４０を発現し、そして生存および増殖のためのＣＤ４０シグナル伝達に依存するようである。例えば、低グレードおよび高グレードのＢ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、骨髄芽球性白血病およびホジキン病を有する患者からの形質転換細胞は、ＣＤ４０を発現する。重要なことに、ＣＤ２０に比べて、ＣＤ４０は多発性骨髄腫の高い割合で見出される（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｌｏｎｅｙら「Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．」（１９９９年）第３６巻（補遺３）：ｐ．３０−３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多発性骨髄腫を有する患者に対する不十分な予後を考慮すると、代替的な処置プロトコルが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
多発性骨髄腫を有するヒト被験体を処置するための方法が提供され、この方法は、ヒトＣＤ４０発現細胞のＣＤ４０抗原に結合される場合に有意なアゴニスト活性を有さない抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをその被験体に投与する工程を包含する。ＣＤ４０抗原を発現する多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害するための方法もまた提供される。
【０００８】
本発明の方法において使用するのに適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０に対して強力な親和性を有し、少なくとも１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍの解離平衡定数（ＫＤ）によって特徴付けられる。これらのモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒト細胞の表面で発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得る。それらは有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合される場合にアンタゴニスト活性を示す。１つの実施形態において、抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントは、正常なヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合される場合にアンタゴニスト活性を示す。
別の実施形態において、この抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントは、悪性のヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合される場合にアンタゴニスト活性を示す。適切なモノクローナル抗体はヒト定常領域を有し；好ましくは適切なモノクローナル抗体はまた、全体的なヒト化フレームワーク領域または部分的なヒト化フレームワーク領域を有し；最も好ましくは、完全なヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０００９】
このようなモノクローナル抗体の例は、以下である：本明細書中に５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２として表される抗体であり、これらは組換え的に作製され得る；１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書中で細胞株５．９と称される）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書中で細胞株１２．１２と称される）で表されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体；配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６と配列番号７とに示される両方の配列、および配列番号６と配列番号８とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２と配列番号４とに示される両方の配列、および配列番号２と配列番号５とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、および配列番号１と配列番号３とに示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；ならびに、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持し、かつ有意なアゴニスト活性を有さないがヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合にアンタゴニスト活性を有する、これらのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント。このようなモノクローナル抗体の例としてはまた、ハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；ならびにＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体、または上述のモノクローナル抗体の任意のものが挙げられ、ここで、このフラグメントはヒトＣＤ４０抗原に対して特異的に結合する能力を保持する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、処置の方法は、患者に適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含する。抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。この処置の方法は、上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの、治療有効用量の一回投与または治療有効用量の複数回投与を包含し得ることが認識される。
【００１１】
本発明の方法における使用に適切であるとして本明細書中に同定されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、改変され得る。これらのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の改変としては、免疫学的に活性なキメラ抗ＣＤ４０抗体、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、および免疫学的に活性なマウス抗ＣＤ４０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
多発性骨髄腫についてヒト被験体を処置するための方法であって、該方法は、ヒトＣＤ４０発現細胞の表面に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の有効量を該被験体に投与する工程を包含し、該モノクローナル抗体は、有意なアゴニスト活性を有さず、それによって該モノクローナル抗体が該細胞の表面に発現された該ＣＤ４０抗原に結合する場合に、該細胞の増殖または分化は阻害され、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、以下：
ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２；
ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６と配列番号７とに示される両方の配列、および配列番号６と配列番号８とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２と配列番号４とに示される両方の配列、および配列番号２と配列番号５とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、および配列番号１と配列番号３とに示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体または前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、該抗体は組換え産生される、モノクローナル抗体；ならびに
ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、該フラグメントは該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
からなる群より選択される、方法。
（項目２）
前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
多発性骨髄腫についてヒト被験体を処置するための方法であって、該方法は、ヒトＣＤ４０抗原のドメイン２に特異的に結合するアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の有効量を該被験体に投与する工程を包含し、該抗体はヒトＣＤ４０抗原のドメイン２に結合する場合に有意なアゴニスト活性を有さない、方法。
（項目５）
前記抗体が、ヒト抗体である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株５．９によって産生される抗体およびハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生される抗体からなる群より選択される抗体の結合特異性を有する、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記抗体が、特許受託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、および特許受託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記抗体が、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９に関する結合特異性を有する、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記抗体が、配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合する、項目４に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体が、以下：
ａ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２と配列番号４とに示される両方の配列、および配列番号２と配列番号５とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｂ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、および配列番号１と配列番号３とに示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｃ）ハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｅ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｆ）前述の項目ａ）〜ｅ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、該抗体が組換え産生される、モノクローナル抗体；および
ｇ）ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントまたは前述の項目ａ）〜ｆ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、該フラグメントは該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目１１）
ＣＤ４０抗原を発現する多発性骨髄腫細胞の成長を阻害するための方法であって、該方法は、該ＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の有効量を該細胞に接触させる工程を包含し、該モノクローナル抗体は、ＣＤ４０抗原に結合する場合に有意なアゴニスト活性を有さず、該抗体は、以下：
ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２；
ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株ＣＨＩＲ−１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６と配列番号７とに示される両方の配列、および配列番号６と配列番号８とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２と配列番号４とに示される両方の配列、および配列番号２と配列番号５とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、および配列番号１と配列番号３とに示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体または前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、該抗体は組換え産生される、モノクローナル抗体；ならびに
ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、該フラグメントは該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
からなる群より選択される、方法。
（項目１２）
前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、ヒトＣＤ４０抗原に結合する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
ＣＤ４０抗原を発現する多発性骨髄腫細胞の成長を阻害するための方法であって、該方法は、ヒトＣＤ４０抗原のドメイン２に特異的に結合するアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の有効量を該細胞に接触させる工程を包含し、該抗体はヒトＣＤ４０抗原のドメイン２に結合する場合に有意なアゴニスト活性を有さない、方法。
（項目１５）
前記抗体が、ヒト抗体である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株５．９によって産生される抗体およびハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生される抗体からなる群より選択される抗体に関する結合特異性を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体が、特許受託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、および特許受託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記抗体が、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９の結合特異性を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記抗体が、配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合する、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体が、以下：
ａ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２と配列番号４とに示される両方の配列、および配列番号２と配列番号５とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｂ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、および配列番号１と配列番号３とに示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｃ）ハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｅ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｆ）前述の項目ａ）〜ｅ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、該抗体が組換え産生される、モノクローナル抗体；および
ｇ）ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントまたは前述の項目ａ）〜ｆ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、該フラグメントは該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖についてのアミノ酸配列を示す。軽鎖のリーダー領域（配列番号２の残基１〜２０）、可変領域（配列番号２の残基２１〜１３２）および定常領域（配列番号２の残基１３３〜２３９）は図１Ａに示される。重鎖のリーダー領域（配列番号４の残基１〜１９）、可変領域（配列番号４の残基２０〜１３９）および定常領域（配列番号４の残基１４０〜４６９）は図１Ｂに示される。図１Ｂに示されるｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖についての代替定常領域は、配列番号４の位置１５３におけるアラニン残基に対するセリン残基の置換を反映する。このｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の改変体についての完全配列は、配列番号５に示される。
【図２】図２は、ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２に関する軽鎖についてのコード配列（図２Ａ；配列番号１）および重鎖についてのコード配列（図２Ｂ；配列番号３）を示す。
【図３】図３は、ｍＡｂ  ５．９の軽鎖および重鎖についてのアミノ酸配列を示す。軽鎖のリーダー領域（配列番号６の残基１〜２０）、可変領域（配列番号６の残基２１〜１３２）および定常領域（配列番号６の残基１３３〜２３９）は図３Ａに示される。重鎖のリーダー領域（配列番号７の残基１〜１９）、可変領域（配列番号７の残基２０〜１４４）および定常領域（配列番号７の残基１４５〜４７４）は図３Ｂに示される。図３Ｂに示されるｍＡｂ  ５．９の重鎖についての代替定常領域は、配列番号７の位置１５８におけるアラニン残基に対するセリン残基の置換を反映する。このｍＡｂ  ５．９の重鎖の改変体についての完全配列は、配列番号８に示される。
【図４−１】図４は、ヒトＣＤ４０の短いアイソフォームについてのコード配列（図４Ａ；配列番号９）（アミノ酸配列は図４Ｂ；配列番号１０に示される）、およびヒトＣＤ４０の長いアイソフォームについてのコード配列（図４Ｃ；配列番号１１）（アミノ酸配列は図４Ｄに示される）を示す。
【図４−２】図４は、ヒトＣＤ４０の短いアイソフォームについてのコード配列（図４Ａ；配列番号９）（アミノ酸配列は図４Ｂ；配列番号１０に示される）、およびヒトＣＤ４０の長いアイソフォームについてのコード配列（図４Ｃ；配列番号１１）（アミノ酸配列は図４Ｄに示される）を示す。
【図５】図５は、ヒト多発性骨髄腫ＩＭ−９異種移植モデルを用いる、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２とｂｏｒｔｒｚｏｍｉｂ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））による併用処置の、増強されたインビボでの抗腫瘍活性を実証する。
【図６】図６は、示差走査熱分析（ＤＳＣ）によって測定された、様々なｐＨの処方物におけるＣＨＩＲ−１２．１２の熱融点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
「腫瘍」とは、本明細書中で使用される場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず、全ての腫瘍性の細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）および細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに全ての前癌および癌の、細胞および組織をいう。
【００１４】
用語「癌」および「癌性の」とは、代表的には、制御されていない細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的な状態をいうか、または説明する。癌の例としては、リンパ腫、多発性骨髄種および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が抗原に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低いレベルで産生され、骨髄腫によって増加したレベルで産生される。
【００１６】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））および上記のものを含む組換えペプチドを包含する。
【００１７】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、実質的に同質の抗体（すなわち、微量に存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて集団を構成する個々の抗体が同一である）の集団から得られる抗体をいう。
【００１８】
「天然の抗体」および「天然の免疫グロブリン」は、通常は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とからなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各々の軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変わる。各々の重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、次にいくつかの定常ドメインが続く。各々の軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で界面を形成すると考えられる。
【００１９】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体間で広範囲にわたって配列が異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性に使用される事実をいう。しかし、その可変性は、抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布しない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方で相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのうちより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ領域を含み、これらの領域は、大部分はβシート配置をとり、βシート構造に結合する（場合によってはβシート構造の一部分を形成する）ループを形成する３つのＣＤＲによって結合される。各々の鎖におけるＣＤＲは、他の鎖由来のＣＤＲと共にＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら（１９９１）ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，６４７−６６９頁を参照のこと）。
【００２０】
定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接的に関連しないが、種々のエフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合、抗体依存性の細胞の毒性における抗体の関与、オプソニン作用、補体依存性細胞毒性の惹起、および肥満細胞脱顆粒）を示す。
【００２１】
用語「超可変領域」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））ならびに／あるいは「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２２】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）、および残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名称は、容易に結晶化する能力を反映する）が生成される。ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋結合し得る。
【００２３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。２本の鎖（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ）のＦｖ種では、この領域は、固く非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーからなる。単鎖のＦｖ種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが、その軽鎖と重鎖とが２本の鎖のＦｖ種における構造に類似する「ダイマーの」構造に会合し得るように、フレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合され得る。この構成において、各々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面における抗原結合部位を規定する。合わせて、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、抗原を認識し結合する能力を有するが、完全な結合部位よりは親和性は低い。
【００２４】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、いくつかの残基が付加されている点でＦａｂ’フラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中で、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’についての呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、もともと、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた公知である。
【００２５】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なる型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）の一方に割り当てられ得る。
【００２６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンが異なるクラスに割り当てられ得る。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、そしてこれらの１または数個か、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性の細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の活性を媒介する。
【００２７】
語句「標識」とは、本明細書中で使用される場合、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接的または間接的に結合される検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体で検出可能である（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）か、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒し得る。検出可能な標識として機能し得る放射性核種としては、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２およびＰｄ−１０９が挙げられる。標識はまた、毒素のような検出可能で無い実体でもよい。
【００２８】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、本明細書中に開示される天然の標的の生物学的活性またはその転写もしくは翻訳を、部分的もしくは完全にブロック、阻害、または中和する任意の分子を包含する。
【００２９】
「キャリア」は、本明細書中で使用される場合、使用される投薬量および濃度でそのキャリアに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤を包含する。多くの場合、生理学的に受容可能なキャリアは、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例としては、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸および他の有機酸）；抗酸化物質（アルコルビン酸が挙げられる）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ）が挙げられる。１種以上のさらなる治療剤と「併用して」投与することは、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））投与および任意の順序での連続投与を包含する。
【００３０】
「宿主細胞」とは、本明細書中で使用される場合、組換えベクターまたは他の転移ポリヌクレオチドのためのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用される単細胞性実体として培養された微生物または真核細胞もしくは細胞株をいい、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。単一の細胞の子孫は、天然の変異、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
【００３１】
「ヒト効果細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、その細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、抗原依存性の細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、代表的には、抗体のＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ３アイソタイプである。ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ３抗体を単離することに加えて、このようなＡＤＣＣを媒介する抗体は、非ＡＤＣＣ抗体由来の可変領域またはＩｇＧ１アイソタイプもしくはＩｇＧ３アイソタイプ定常領域に対する可変領域フラグメントを操作することによって作製され得ることに注意すること。
【００３２】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表すために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γレセプター）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプター（これらのレセプターの対立遺伝子改変体および代替的スプライス形態を含む）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターとしてはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が挙げられ、これらは、類似のアミノ酸配列を有し、その細胞質ドメインが主に異なる。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４を参照のこと）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−３４１で概説される。他のＦｃＲ（将来同定されるものを含む）が、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語はまた、新生児レセプターであるＦｃＲｎを包含し、これは、母性ＩｇＧの胎児への転移を担う（Ｇｕｙｅｒら（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７およびＫｉｍら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００３３】
ヒト抗体を作製するための多くの方法が存在する。例えば、分泌細胞は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）による感染によって不死化され得る。しかし、ＥＢＶに感染した細胞は、クローニングするのが困難であり、通常は、わずかに比較的低い収量の免疫グロブリンしか産生しない（ＪａｍｅｓおよびＢｅｌｌ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００：５−４０）。将来、ヒトＢ細胞の不死化は、形質転換遺伝子の規定された組み合わせを導入することによって達成される可能性がある。そのような可能性は、Ｈ−ｒａｓのＳＶ４０の大きな腫瘍性タンパク質および発癌性対立遺伝子とともにテロメラーゼ触媒サブユニットの発現が正常なヒト上皮細胞および線維芽細胞の腫瘍変換を生じたという最近の実証によって強調されている（Ｈａｈｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：４６４−４６８）。現在、免疫の際に外因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７；Ｌｉｔｔｌｅら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０に概説される）。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が外因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５）。このような生殖細胞変異マウスにおけるヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８）。Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６）は、抗原でチャレンジされる場合に高親和性の完全ヒト抗体を生成するトランスジェニックマウスの系統を産生した。これは、上で記載されるように、メガベースのヒト重鎖遺伝子座およびヒト軽鎖遺伝子座を、外因性ＪＨセグメントへの欠失を有するマウスに生殖細胞統合することによって達成された。これらのマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＩＩ技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））は、約６６のＶＨ遺伝子、完全なＤＨ領域およびＪＨ領域、ならびに３つの異なる定常領域を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を含み、また、３２のＶκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を含む。これらのマウスで産生される抗体は、あらゆる点（遺伝子再配列、組立て、レパートリーを含む）で、ヒトで見られるものと酷似する。ヒト抗体は、マウス遺伝子座において遺伝子再配列を妨げる外因性セグメントにおける欠失に起因して、外因性抗体よりも優先的に発現される。このようなマウスは、特定の目的の抗原で免疫され得る。
【００３４】
そのような免疫動物由来の血清は、初期抗原に対する抗体反応性についてスクリーニングされ得る。リンパ球は、リンパ節または脾臓細胞から単離され得、そしてさらにＣＤ１３８陰性細胞およびＣＤ１９陽性細胞に対して選択することによってＢ細胞に対して選択され得る。一局面において、そのようなＢ細胞培養物（ＢＣＣ）は、骨髄腫細胞に融合されて上で詳述されるようなハイブリドーマを生成し得る。
【００３５】
別の局面において、そのようなＢ細胞培養物は、好ましくは、初期抗原に対する反応性についてさらにスクリーニングされ得る。そのようなスクリーニングは、標的／抗原タンパク質を用いるＥＬＩＳＡ、目的の抗原に結合する公知の抗体を用いる競合アッセイ、および一過性にトランスフェクトされたＣＨＯもしくは標的抗原を発現する他の細胞に対するインビトロ結合を含む。
【００３６】
本発明は、多発性骨髄腫を有するヒト被験体を処置するための組成物および方法に関する。この方法は、本明細書中に記載される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントによる処置を含み、ここで、その抗体またはその抗原結合フラグメントの投与はこの治療方法を受ける被験体内のポジティブな治療応答を促進する。本発明の方法において使用するのに適切な抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０を発現する正常なヒトＢ細胞および腫瘍性のヒトＢ細胞について実証されているように、ヒト細胞の表面に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し、有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０抗原に結合される場合にアンタゴニスト活性を示す。これらの抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントは、本明細書中でアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として参照される。そのような抗体としては、以下に記載される完全なヒトモノクローナル抗体５．９およびヒトモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２、ならびにモノクローナル抗体５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を有するモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。組換え的に産生され得るこれらのモノクローナル抗体は、以下で議論され、そして発明の名称「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」である、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日に出願され、それぞれ、米国特許出願番号第６０／５１７，３３７号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同第６０／５２５，５７９号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同第６０／５６５，７１０号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））と割り当てられた同時係属中の仮特許出願で開示されており、その各々の内容はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【００３７】
モノクローナル抗体５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を有する抗体としては、ＣＤ４０の結合と競合的に干渉し、そして／または５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２と同じエピトープに結合する抗体が挙げられる。当業者は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて、抗体が５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合的に干渉するかどうかを決定し得る。
【００３８】
これらの抗体がヒト細胞（例えば、ヒトＢ細胞）の表面に提示されたＣＤ４０に結合する場合、その抗体は有意なアゴニスト活性を有さない；いくつかの実施形態において、ヒト細胞の表面に提示されるＣＤ４０に対するそれらの結合は、これらのヒト細胞の増殖および分化の阻害を生じる。従って、本発明の方法において使用するのに適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、細胞表面ＣＤ４０抗原を発現する正常なヒト細胞および悪性のヒト細胞に対するアンタゴニスト活性を示し得るモノクローナル抗体を含む。
【００３９】
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体）
モノクローナル抗体５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、本発明の方法において使用するのに適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を示す。５．９抗体お１２．２抗体は、ハイブリドーマ細胞株１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書中で細胞株５．９と称される）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書中で細胞株１２．１２と称される）から産生されるＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。これらの細胞株は、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座およびヒトＫ鎖遺伝子座を含む免疫異種マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））由来の脾細胞を用いて作製された。その脾臓細胞は、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞と融合された（Ｓｉｅｒｒａ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）。得られたハイブリドーマは１回または数回サブクローニングされて、安定なモノクローナル細胞株５．９およびモノクローナル細胞株１２．１２が作製された。本発明の他の抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座についてトランスジェニックであるマウスを用いてか、または当該分野で公知および／もしくは本明細書中に記載される他の方法によって同様に調製され得る。
【００４０】
ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに５．９抗体の可変領域のアミノ酸配列は、発明の名称「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」である、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日に出願され、それぞれ、米国特許出願番号第６０／５１７，３３７号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同第６０／５２５，５７９号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同第６０／５６５，７１０号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））と割り当てられた同時係属中の仮特許出願に開示され、その各々の内容はその全体が参考として本明細書中に援用される。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖ならびに重鎖についてのリーダー領域、可変領域および定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ、図１Ａおよび図１Ｂに示される。また、配列番号２（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖についての完全配列）、配列番号４（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖についての完全配列）、および配列番号５（配列番号４に示されるｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の改変体についての完全配列、ここで、この改変体は配列番号４の位置１５３においてアラニン残基に対するセリン置換を含む）を参照のこと。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２についての軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、図２Ａおよび図２Ｂに示される。また、配列番号１（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖についてのコード配列）、および配列番号３（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖についてのコード配列）を参照のこと。５．９  ｍＡｂの軽鎖ならびに重鎖についてのリーダー領域、可変領域および定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ、図３Ａおよび図３Ｂに示される。また、配列番号６（ｍＡｂ  ５．９の軽鎖についての完全配列）、配列番号７（ｍＡｂ  ５．９の重鎖についての完全配列）、および配列番号８（配列番号７に示されるｍＡｂ  ５．９の重鎖の改変体についての完全配列、ここで、配列番号７の位置１５８においてアラニン残基に対するセリン置換を含む）を参照のこと。さらに、５．９抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体を発現するハイブリドーマは、それぞれ、ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３の特許寄託表示でＡＴＣＣに寄託されている。
【００４１】
アンタゴニスト活性に加えて、本発明の抗ＣＤ４０抗体が腫瘍細胞に対する別の作用機構を有することが好ましい。例えば、天然の５．９抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体はＡＤＣＣ活性を有する。あるいは、５．９抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域は、ＡＤＣＣ活性を有する別の抗体アイソタイプ上で発現され得る。５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２の、天然形態、組換え形態、または抗原結合フラグメントを細胞毒と結合体化することもまた可能である。
【００４２】
５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて可溶性ＣＤ４０に結合し、フローサイトメトリーアッセイによって決定されるように細胞表面ＣＤ４０に対するＣＤ４０リガンドの結合を妨げ、予め結合したＣＤ４０リガンドを置き換える。抗体５．９および抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、互いにＣＤ４０に対する結合について競合するが１５Ｂ８とは競合せず、この１５Ｂ８は、発明の名称「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」である、２０００年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号第６０／２３７，５５６号および発明の名称「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」である、２００１年１０月２日に出願されたＰＣＴ国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０８５７（代理人事件番号ＰＰ１６０９２．００３）に記載される抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であり、これらの両方が参考としてその全体が本明細書中で援用される。健常なヒト被験体由来のＢ細胞の増殖における効果についてインビトロで試験される場合、５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として作用する。さらに、５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、健常な被験体由来のヒトリンパ球の強力な増殖を誘導しない。これらの抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、ＣＤ４０を発現する標的細胞を殺傷することが可能である。ＢｉａｃｏｒｅＴＭアッセイによって決定されるように、ヒトＣＤ４０に対する５．９の結合親和性は１．２×１０−８Ｍであり、そしてＣＨＩＲ−１２．１２の結合親和性は５×１０−１０Ｍである。
【００４３】
本発明の方法において使用するのに適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０細胞表面抗原に対して強力な単一部位結合親和性を示す。本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも３×１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ〜約１０−１２ＭのＣＤ４０に対する解離平衡定数（ＫＤ）を示し、これはＢｉａｃｏｒｅＴＭのような標準的なアッセイを用いて測定される。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は当該分野で公知であり、詳細は「ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ」に提供されている。ＷＯ  ０１／２７１６０に記載される方法が結合親和性を調節するために使用され得る。
【００４４】
「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０レセプター」または「ＣＤ４０」によって、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーに属する膜貫通糖タンパク質が意図される（例えば、米国特許第５，６７４，４９２号および同第４，７０８，８７１号；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら（１９８９）ＥＭＢＯ  ８：１４０３；Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３６：３３；Ｂａｒｃｌａｙら（１９９７）Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ（第２版；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を参照のこと）。ヒトＣＤ４０の２つのアイソフォーム（この遺伝子の代替スプライス転写産物改変体によってコードされる）が同定されている。第１のアイソフォーム（「長いアイソフォーム」または「アイソフォーム１」としてもまた公知である）は、２７７個のアミノ酸の前駆ポリペプチド（配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４３０４５として最初に報告され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１においてアイソフォーム１として同定された）、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０を参照のこと）によってコードされる）として発現され、これは最初の１９残基によって表されるシグナル配列を有する。第２のアイソフォーム（「短いアイソフォーム」または「アイソフォーム２」としてもまた公知である）は、２０３個のアミノ酸の前駆ポリペプチド（配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６９０５９３）、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２８５４）によってコードされる）として発現され、これも最初の１９残基によって表されるシグナル配列を有する。ヒトＣＤ４０のこれら２つのアイソフォームの前駆ポリペプチドは、共通してその最初の１６５残基（すなわち、配列番号１０および配列番号１２の残基１〜１６５）を共有する。短いアイソフォームの前駆ポリペプチド（配列番号１０に示される）は、コードセグメントを欠失する転写産物改変体（配列番号９）（これは、翻訳のフレームシフトをもたらす）によってコードされ、得られるＣＤ４０アイソフォームは、ＣＤ４０の長いアイソフォームに含まれるもの（配列番号１２の残基１６６〜２７７に示されるＣ末端）とは異なる、より短いＣ末端（配列番号１０の残基１６６〜２０３）を含む。本発明の目的のために、用語「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０レセプター」または「ＣＤ４０」は、ＣＤ４０の短いアイソフォームおよび長いアイソフォームの両方を包含する。本発明の抗ＣＤ４０抗体は、本明細書中で以下に示されるようにヒトＣＤ４０のエピトープに結合し、このヒトＣＤ４０は、この細胞表面抗原の短いアイソフォームまたは長いアイソフォームのいずれかのうちの同じ位置に存在する。
【００４５】
ＣＤ４０抗原は、本明細書中で他の部分に記載されるように、種々の細胞型の表面に提示される。「表面に提示される」および「表面に発現される」により、ＣＤ４０抗原のうちのすべてまたは一部が、細胞の外側に曝露されることが意図される。提示または発現されたＣＤ４０抗原は、完全にまたは部分的にグリコシル化され得る。
【００４６】
「アゴニスト活性」により、その物質がアゴニストとして機能することが意図される。アゴニストは細胞上のレセプターと結合し、レセプターの天然のリガンドにより惹起されるものと類似または同じ反応もしくは活性を惹起する。例えば、ＣＤ４０のアゴニストは、以下の応答のうちのいずれかまたはすべてを誘導するが、これらに限定されない：Ｂ細胞増殖および分化、抗体産生、細胞間接着、Ｂ細胞記憶生成、アイソフォーム転換、ＭＨＣ  クラスＩＩおよびＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーション、ならびに、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦのような炎症誘発性サイトカインの分泌。「アンタゴニスト活性」により、その物質がアンタゴニストとして機能することが意図される。例えば、ＣＤ４０のアンタゴニストは、ＣＤ４０レセプターのアゴニストリガンド（特に、ＣＤ４０Ｌ）に対する結合により誘導される応答のうちのいずれかの誘導を妨げるかまたは減少させる。アンタゴニストは、アゴニスト結合に対する応答のうちのいずれか１つ以上の誘導を、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、そして最も好ましくは９０％、９５％、９９％、または１００％減少させ得る。抗ＣＤ４０抗体およびＣＤ４０リガンドの結合特異性およびアンタゴニスト活性を測定するための方法は、当業者に公知であり、標準的な競合結合アッセイ、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするためのアッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイ、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖アッセイ、抗体産生についてのＴ細胞ヘルパーアッセイ、Ｂ細胞増殖の同時刺激アッセイ、およびＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションについてのアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＷＯ  ００／７５３４８、米国特許第６，０８７，３２９号、ならびに発明の名称「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」である、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日に出願され、それぞれ、米国特許出願番号第６０／５１７，３３７号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同第６０／５２５，５７９号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同第６０／５６５，７１０号（代理人事件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））と割り当てられた同時係属中の仮特許出願（これらの各々の内容はその全体が参考として本明細書中に援用される）に開示されるアッセイを参照のこと。
【００４７】
「有意な」アゴニスト活性により、Ｂ細胞応答のアッセイで測定されるように、中性物質またはネガティブコントロールによって誘導されるアゴニスト活性を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％上回るアゴニスト活性が意図される。好ましくは、「有意な」アゴニスト活性は、Ｂ細胞応答のアッセイで測定されるように、中性物質またはネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性より少なくとも２倍もしくは少なくとも３倍上回るアゴニスト活性である。従って、例えば、目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、「有意な」アゴニスト活性は中性物質またはネガティブコントロールにより誘導されるＢ細胞増殖レベルよりも少なくとも２倍上回るかまたは少なくとも３倍上回るＢ細胞増殖レベルの誘導である。１つの実施形態において、ＣＤ４０に結合しない非特異的免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）は、ネガティブコントロールとしての役割を果たす。「有意なアゴニスト活性を有さない」物質は、Ｂ細胞応答のアッセイで測定されるように、中性物質またはネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性よりも高くて約２５％上回るアゴニスト活性、好ましくは、中性物質またはネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性よりも高くて約２０％上回る、約１５％上回る、約１０％上回る、約５％上回る、約１％上回る、約０．５％上回る、または高くて約０．１％上回るアゴニスト活性を示す。本発明の方法において有用なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合される場合に、上記のように有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の１つの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１つのＢ細胞応答において有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の別の実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１つのＢ細胞応答（例えば、増殖および分化、または増殖、分化、ならびに抗体産生）のアッセイにおいて有意なアゴニスト活性を有さない。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「抗ＣＤ４０抗体」は、ＣＤ４０  Ｂ細胞表面抗原を特異的に認識する任意の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、およびそれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび親の抗ＣＤ４０抗体の抗原結合機能を保持する他のフラグメント）が挙げられる）を包含する。本発明においてとりわけ関心があるのは、上記のモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を共有する、本明細書中に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。このような抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書中で細胞株５．９と称される）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書中で細胞株１２．１２と称される）（それぞれ、特許受託番号ＰＴＡ−５５４２および特許受託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに受託された）で表されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体；（２）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２と配列番号４とに示される両方の配列、および配列番号２と配列番号５とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（３）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６と配列番号７とに示される両方の配列、および配列番号６と配列番号８とに示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（４）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号３に示されるヌクレオチド配列、および配列番号１と配列番号３とに示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；（５）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって産生されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；（６）配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；（７）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；ならびに（８）ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体またはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントまたは上述の項目（１）〜（７）のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで、このフラグメントはヒトＣＤ４０抗原に対して特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体。当業者は、本明細書中に開示されるアンタゴニスト抗体およびこれらの抗体の抗原結合フラグメントは、当該分野で周知でありかつ本明細書中の以下に記載される方法を使用して組換え的に産生される抗体およびその抗原結合フラグメントを含むこと、および例えば、組換え的に産生されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２を含むことを認識する。
【００４９】
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の作製）
本発明の方法において使用するためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、当業者に公知の任意の抗体作製方法を使用して作製され得る。例えば、ポリクローナル血清は、従来の方法によって調製され得る。一般的に、ＣＤ４０抗原を含む溶液が最初に使用されて、適切な動物（好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、またはヤギ）を免疫化する。入手可能な血清の量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体が利用できることに起因して、ウサギまたはヤギが、ポリクローナル血清の調製に好ましい。
【００５０】
ポリクローナル血清は、トランスジェニック動物（好ましくは、ヒト免疫グロブリン座を有するマウス）において調製され得る。好ましい実施形態において、ＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞が、免疫原として使用される。免疫化はまた、生理的食塩水（好ましくは、フロイント完全アジュバントのようなアジュバント）中の抗原を含む溶液を混合または乳化し、そしてその混合物またはエマルジョンを非経口的（一般的には、皮下または筋肉内）に注射することによって、実施され得る。１回の注射あたり５０〜２００μｇの用量は、代表的に十分である。免疫化は、一般的に、生理的食塩水中のタンパク質の１回以上の注射によって、好ましくはフロイント不完全アジュバントを使用して、２〜６週間後にブーストされる。あるいは、本発明の目的がインビトロの免役化と等しいと考えられる場合、当該分野で公知の方法を使用したインビトロの免疫化によって、抗体が作製され得る。ポリクローナル抗血清は、免役化された動物の血液をガラスまたはプラスチックの容器に採取し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、次いで４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば、１，０００×ｇで１０分間）によって回収される。１回の採血あたり約２０〜５０ｍｌが、ウサギから得られ得る。
【００５１】
Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の作製は、米国特許第６，００４，５５２号において開示され、これは本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ヒトＣＤ４０をコードする配列は、輸送ベクターを使用してバキュロウイルスに組換えされる。上記プラスミドは、野生型バキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ９細胞に同時トランスフェクトされた。組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞が同定され、クローン的に精製された。
【００５２】
好ましくは、上記抗体は、本質的にモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」によって、実質的に同質な抗体の集団から得られた抗体が意図される。すなわち、上記集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る天然に生じ得る可能性のある変異体を除いて、同一である。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。この用語は、全ての免疫グロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのようなフラグメント、および抗体の抗原結合機能を保持する他のものを包含する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位（すなわち、本発明におけるＣＤ４０細胞表面抗原）に対して指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を代表的に包含する従来の（ポリクローナル）抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に同質である抗体の集団から得られる場合の抗体の性質を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製されても、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；および米国特許第５，５１４，５４８号において記載される技術を使用したファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００５３】
「エピトープ」によって、抗体が作製され、そしてその抗体が結合する抗原分子の部分が意図される。エピトープは、直鎖状のアミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が、直鎖状様式で連続して順々に配置される）、非直鎖状のアミノ酸残基（本明細書において「非直鎖状エピトープ」といわれ；これらのエピトープは、連続的には配置されない）、または直鎖状アミノ酸残基と非直鎖状アミノ酸残基との両方を含み得る。
【００５４】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９６の方法、またはその改変を使用して調製され得る。代表的には、マウスが、抗原を含む溶液を使用して免疫化される。免疫化は、生理的食塩水（好ましくは、フロイント完全アジュバントのようなアジュバント）中の抗原を含む溶液を混合または乳化し、そしてその混合物またはエマルジョンを非経口的に注射することによって実施され得る。当該分野で公知の任意の免疫化方法が、本発明のモノクローナル抗体を得るために使用され得る。動物を免疫化した後、脾臓（そして必要に応じて、１または数個の大きなリンパ節）が取り出され、そして単一の細胞に分離される。上記脾臓細胞は、目的の抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。上記抗原に特異的な膜結合型免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、リンスで除かれない。得られたＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次いでミエローマ細胞との融合が誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地中で培養される。得られた細胞は、連続希釈によってプレートされ、そして目的の抗原に特異的に結合する（かつ、無関係の抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌（ｓｅｃｒｅｔ）するハイブリドーマは、次いでインビトロ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維反応器において）、またはインビボ（例えば、マウスの腹水）のいずれかで培養される。
【００５５】
本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が、組換えＤＮＡ方法を使用して調製される場合、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に単離され、かつ配列決定される。本明細書におい記載されるハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、上記ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いでこの発現ベクターは、それ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの、細菌における組換え発現に関する概説の論文としては、Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６およびＰｈｉｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１が挙げられる。ハイブリドーマの使用に代わるものとして、抗体は、米国特許第５，５４５，４０３号；同第５，５４５，４０５号；および同第５，９９８，１４４号（これらは、本明細書において参考として援用される）に開示されるように、ＣＨＯ細胞株のような細胞株において産生され得る。手短に言えば、上記細胞株は、それぞれ軽鎖および重鎖を発現し得るベクターを用いてトランスフェクトされる。別個のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることによって、キメラ抗体が産生され得る。別の利点は、上記抗体の正しいグリコシル化である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体またはＣＨＩＲ−５．９抗体）またはその抗原結合フラグメントは、グルタミン合成をマーカーとして使用するＧＳ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を使用してＣＨＯ細胞中で産生され得る。米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，５９１，６３９号；同第５，６５８，７５９号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号；同第５，８７９，９３６号；同第５，８９１，６９３号；および同第５，９８１，２１６号もまた参照のこと；これらの内容は、その全体が参考として援用される。
【００５７】
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は、当該分野で公知である。例えば、以下におけるＢ細胞抗原のための節を参照のこと：ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（編）（１９８７；１９８９）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第５，６７４，４９２号；同第５，８７４，０８２号；同第５，６７７，１６５号；同第６，０５６，９５９号；ＷＯ
００／６３３９５；国際公開第０２／２８９０５号および国際公開第０２／２８９０４号；Ｇｏｒｄｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５；Ｖａｌｌｅら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３；Ｃｌａｒｋら（１９８６）ＰＮＡＳ  ８３：４４９４；Ｐａｕｌｉｅら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０；Ｇｏｒｄｏｎら（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１５３５；Ｊａｂａｒａら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１；Ｚｈａｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６；Ｇａｓｃａｎら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ３：８；およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７０；これらの全ては、本明細書において参考として援用される。本発明に対する特有の目的は、上記に記載のモノクローナル抗体５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を共有する、本明細書において開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ４０抗原エピトープ」は、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免役反応をし得る分子をいい、ＣＤ４０抗原それ自身は除く。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、炭水化物、脂質、および他の分子を含み得るが、本発明に関しては、最も一般的なタンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチドの模倣体（ｍｉｍｉｃ）（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、またはそれらの組み合わせである。適切なオリゴペプチド模倣体は、特に、ＰＣＴ出願ＵＳ９１／０４２８２に記載される。
【００５９】
さらに、用語「抗ＣＤ４０抗体」は、本明細書において使用される場合、キメラ抗ＣＤ４０抗体を包含する；本発明の方法で使用するためのこのようなキメラ抗ＣＤ４０抗体は、本明細書において記載される５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合特性を有する。「キメラ」抗体によって、最も好ましくは組換えデオキシリボ核酸技術を使用して誘導され、そしてヒト（免疫学的に「関連した」種（例えば、チンパンジー）を含む）と非ヒトの両方の構成要素を含む抗体が意図される。したがって、上記キメラ抗体の定常領域は、最も好ましくは、天然のヒト抗体の定常領域と実質的に同一であり；上記キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくは非ヒト供給源に由来し、そしてＣＤ４０細胞表面抗原に対して所望の抗原特異性を有する。上記非ヒト供給源は、ヒトＣＤ４０細胞表面抗原またはヒトＣＤ４０細胞表面抗原を含む物質に対する抗体を作製するために使用され得る任意の脊椎動物供給源であり得る。このような非ヒト供給源としては、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラット、マウスなど；例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書において、参考として援用される）を参照のこと）および非ヒト霊長類（例えば、旧世界サル、サルなど；例えば、米国特許第５，７５０，１０５号および同第５，７５６，０９６号（本明細書において、参考として援用される）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、語句「免疫学的に活性」とは、キメラ抗ＣＤ４０抗体をいう際に使用される場合、ヒトＣＤ４０に結合するキメラ抗体を意味する。
【００６０】
キメラ抗ＣＤ４０抗体およびヒト化抗ＣＤ４０抗体もまた、本明細書で使用される用語抗ＣＤ４０抗体によって包含される。キメラ抗体は、異なる種に由来する抗体のセグメントを含む。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、マウス可変領域およびヒト定常領域を有するキメラ抗体の例である。
【００６１】
「ヒト化」によって、非ヒト免疫グロブリン配列に由来する最小の配列を含む抗ＣＤ４０抗体の形態が意図される。大部分については、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンであり（レシピエント抗体）、このヒト化抗体において、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても公知）からの残基は、非ヒト種（例えば、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類）の超可変領域に由来する残基によって置換される（ドナー抗体）。語句「相補性決定領域」とは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および結合特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｋａｂａｔら（１９９１）米国保健省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２を参照のこと。語句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。ヒト疾患の治療において使用するための非免疫原性抗体の作製に関する先行する研究において、マウスの定常領域は、ヒト定常領域によって置換された。この対象のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来した。しかしながら、これらのヒト化抗体は、ヒトにおいて好ましくなく、かつ危険な可能性のある免疫応答を依然として誘発し、そして親和性が喪失した。本発明の方法において使用するためのヒト化抗ＣＤ４０抗体は、本明細書中に記載された５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示される結合特性と類似した結合特性を有する。
【００６２】
ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類もしくは変異体げっ歯類のＣＤＲまたはげっ歯類もしくは変異体げっ歯類のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施され得る。米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第５，８５９，２０５号もまた参照のこと；これらは、本明細書において参考として援用される。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンの１以上の可変領域のフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト残基によって置換される（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号を参照のこと）。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに洗練させるため（例えば、所望の親和性を得るため）になされる。一般的に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして代表的には２つの可変領域の全てを実質的に含み、この抗体において、非ヒト免疫グロブリンに対応する超可変領域の全てまたは実質的に全て、ならびに上記フレームワーク領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと；これらは、本明細書において参考として援用される。従って、このような「ヒト化」抗体は、実質的に決してインタクトでないヒト可変領域が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている抗体を包含し得る。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体におけるアナログ部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，８５９，２０５号を参照のこと。米国特許第６，１８０，３７０号および国際公開第０１／２７１６０号もまた参照のこと。ここで、ヒト化抗体および所定の抗原に対して改善された親和性を有するヒト化抗体を作製するための技術が、開示される。
【００６３】
用語抗ＣＤ４０抗体によって、不活化された内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）座によって特徴付けられる非ヒト哺乳動物宿主（より具体的には、トランスジェニックマウス）において産生される異種抗ＣＤ４０抗体または改変抗ＣＤ４０抗体もまた包含される。このようなトランスジェニック動物において、宿主免疫グロブリンの軽鎖サブユニットおよび重鎖サブユニットの発現に対して競合する内因性遺伝子は、非機能的になり、アナログのヒト免疫グロブリン座で置換される。これらのトランスジェニック動物は、軽鎖または重鎖の宿主の免疫グロブリンサブユニットが実質的にない場合に、ヒト抗体を産生する。例えば、米国特許第５，８７７，３９７号および同第５，９３９，５９８号（本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
【００６４】
好ましくは、トランスジェニックマウスを免疫化することによって、ＣＤ４０に対する完全ヒト抗体が得られる。このようなマウスの１つは、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して得られ、米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号および同第６，１１４，５９８号（これらの全ては、本明細書において参考として援用される）に開示される。本明細書において開示される抗体を作製するために、ヒトＩｇ  Ｇ１重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座についてのトランスジェニックマウスを、ヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞で免疫化した。マウスはまた、他のアイソタイプについてのトランスジェニックであってもよい。本発明の方法において有用な完全ヒト抗体は、本明細書において開示される５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示される結合特性と類似の結合特性によって特徴付けられる。
【００６５】
上記抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、それらが全長抗体の所望される親和性を保持する限り、本発明の方法においての使用に適切である。従って、抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、ＣＤ４０  Ｂ細胞表面抗原に結合する能力を保持する。このようなフラグメントは、対応する全長のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体に類似の特性によって特徴付けられる。すなわち、このフラグメントは、ヒト細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し、そして有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に結合された場合、アンタゴニスト活性を示す。このようなフラグメントは、本明細書において「抗原結合」フラグメントといわれる。
【００６６】
抗体の適切な抗原結合フラグメントは、全長抗体の一部分（一般的には、抗原結合領域またはその可変領域）を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖と重鎖の一部とからなる免疫グロブリンの一価の抗原結合フラグメントが意図される。Ｆ（ａｂ’）２によって、両方の軽鎖と両方の重鎖の一部を含む免疫グロブリンの二価の抗原結合フラグメントが意図される。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントによって、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインが一本のポリペプチド鎖中に提示されるフラグメントが意図される。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号および同第５，８５６，４５６号（これらは、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。一般的に、上記Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするためのポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと。本明細書において開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の抗原結合フラグメントはまた、本明細書の以下に記載されるように、細胞毒と結合体化されて標的癌細胞の殺傷を達成し得る。
【００６７】
抗体または抗体フラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）および米国特許第５，５１４，５４８号において記載される技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７は、それぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載する。以下の刊行物は、鎖の混合（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）、および非常に広範なファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしての、組み合わせ感染およびインビボの再組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体のハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である。
【００６８】
種々の技術が、抗体フラグメントの作製のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在は、組換え宿主細胞によって直接的に産生され得る。例えば、この抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントを作製するための他の技術は、当業者には明らかである。
【００６９】
本発明の方法において有用なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としては、本明細書において開示された５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体とは異なるが、そのＣＤＲを保持している抗体；および１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する抗体が挙げられる。ここで、上記アンタゴニスト活性は、Ｂ細胞の増殖および／または分化の阻害によって測定される。本発明はまた、脱免疫化された（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を包含する。この抗体は、例えば、国際公開第９８／５２９７６号および同第００３４３１７号（本明細書において参考として援用される）に記載されたとおりに作製され得る。この様式において、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体内の残基が改変されて、ヒトＣＤ４０発現細胞に対するアンタゴニスト活性を保持しながら、抗体を、ヒトに対して免疫原性がないか、または免疫原性を低くするようにする。ここで、このような活性は、本明細書の他で記述されるアッセイによって測定される。特許請求の範囲の範囲内には、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質もまた包含され、この融合タンパク質は、当該分野で公知のように、合成されても、対応するポリヌクレオチドベクターから発現されてもよい。このような融合タンパク質は、以下に記述される抗体の結合体化への参照とともに記載される。
【００７０】
本発明の抗体は、例えば欧州特許出願公開第０  ９８３  ３０３  Ａ１号、国際公開第００／３４３１７号および同第９８／５２９７６号（本明細書において参考として援用される）において記載される方法を使用して作製される配列のバリエーションを有し得る。例えば、ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、好ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘発し得ることが示されている。保存的置換は、上記抗体の結合活性は保持させるが、好ましくないＴ細胞応答を誘発するその能力を失わせ得る。任意のこのような保存的置換または非保存的置換は、当該分野で認められた方法（例えば、本明細書中で他の部分に記載される方法）を使用して作製され得、そして生じた抗体は、本発明の範囲内である。この改変抗体は、本明細書において記載された方法を使用して、通常、アンタゴニスト活性、親和性、および特異性について試験され得る。
【００７１】
上記に記載された任意の方法、または本明細書において開示されていない任意の他の方法によって作製された抗体は、以下の生物学的活性のうちの少なくとも１つを有する場合、本発明の範囲内である：Ｔ細胞によって刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害；ジャーカットＴ細胞によって刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の増殖の阻害；ＣＤ４０Ｌ発現細胞または可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）によって刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の増殖の阻害；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌによって刺激された任意の細胞における「生き残った」の抗アポトーシス性細胞内シグナルの阻害；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌとの連結の際の任意の細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の阻害；ならびに以下に示されるようなヒト悪性Ｂ細胞の増殖の阻害。これらのアッセイは、同時継続中の仮出願（発明の名称「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」であり、それぞれ、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日、および２００４年４月２７日出願、割り当てられた米国特許出願番号第６０／５１７，３３７号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同第６０／５２５，５７９号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同第６０／５６５，７１０号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））において記載されるように実施され得る。これらの特許文献の各々の内容は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎら（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９−４４４；ならびに米国特許第５，６７４，４９２号および同第５，８４７，０８２号（本明細書において参考として援用される）において記載されるアッセイもまた参照のこと。
【００７２】
本明細書において同定されるＣＤ４０抗原エピトープに特異的なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を検出するための代表的なアッセイは、「競合的結合アッセイ」である。競合的結合アッセイは、そのアッセイにおいて、未知のものが、特異的な抗体に対する標識された既知のリガンドの結合を阻害するその能力によって検出されて定量される血清学的アッセイである。これはまた、競合的阻害アッセイともいわれる。代表的な競合的結合アッセイにおいて、標識されたＣＤ４０ポリペプチドは、例えば、本発明のモノクローナル抗体の１つ以上のエピトープに対して惹起されたモノクローナル抗体と組み合わせて、サンプル中の候補抗体によって沈殿される。目的のエピトープと特異的に反応する抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質または目的のＣＤ４０タンパク質の特定のエピトープを含むタンパク質のフラグメントに対して調製された一連の抗体をスクリーニングすることによって同定され得る。例えば、ヒトＣＤ４０について、目的のエピトープとしては、図４Ｂ（配列番号１０）に記載されたヒトＣＤ４０の短いアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６９０５９３を参照のこと）（図４Ａに記載される配列（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２８５４もまた参照のこと）によってコードされる）、もしくは図４Ｄ（配列番号１２）に記載されたヒトＣＤ４０の長いアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４３０４５およびＮＰ＿００１２４１を参照のこと）（図４Ｃに記載される配列（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０もまた参照のこと）によってコードされる）の直鎖状アミノ酸残基および／または非直鎖状アミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。あるいは、以前に同定された適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を用いた競合的結合アッセイは、以前に同定された抗体に匹敵するモノクローナル抗体を選択するために使用される。
【００７３】
このような免疫アッセイで使用される抗体は、標識されていても標識されていなくてもよい。標識されていない抗体は、凝集反応において使用され得；標識された抗体は、多種多様の標識を使用して、多種多様のアッセイにおいて使用され得る。抗ＣＤ４０抗体と目的のエピトープとの間の抗体−抗原複合体の形成の検出は、上記抗体に検出可能な物質を結合させることによって容易にされ得る。適切な検出手段としては、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光剤、化学ルミネセンス、色素体、酵素基質または補因子、酵素インヒビター、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素など標識の使用が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；ルミネセンス物質の例は、ルミノールである；生物ルミネセンス物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。このような標識された試薬は、種々の周知のアッセイ（例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイなど）において使用され得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；および同第４，２３３，４０２号を参照のこと。
【００７４】
以前に記載されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗体フラグメントのいずれも、本発明の方法において使用する前に結合体化され得る。結合体化抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。従って、上記抗ＣＤ４０抗体は、間接的標識または間接的標識アプローチを使用して標識され得る。「間接的標識」または「間接的標識アプローチ」によって、キレート剤が抗体に共有結合され、そして少なくとも１種の放射性核種が、キレート剤に挿入されることが意図される。例えば、ＳｒｉｖａｇｔａｖａおよびＭｅａｓｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．１８：５８９−６０３（本明細書において参考として援用される）において記載されるキレート剤および放射性核種を参照のこと。適切な標識としては、発蛍光団、発色団、放射活性原子（特に、３２Ｐおよび１２５Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的には、その活性によって検出される。例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青色色素に変換する能力によって検出され、分光光度計で定量化可能である。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原およびその特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいう。他の特異的な結合パートナーとしては、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとタンパク質Ａ、および当該分野で公知の多くのレセプター−リガンド対が挙げられる。同じ標識は１または数種の異なる様式において機能し得るので、上記の説明は、種々の標識を別個のクラスに分類することを意味しないことが理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、放射活性標識としてか、または高電子密度試薬として機能し得る。ＨＲＰは、酵素としてか、またはｍＡｂに対する抗原として機能し得る。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせることもできる。例えば、ｍＡｂおよびアビジンもまた、本発明の実施において標識を必要とする：従って、ビオチンでｍＡｂを標識し、１２５Ｉで標識したアビジンまたはＨＰＲで標識した抗ビオチンｍＡｂを用いて、その存在を検出し得る。他の交換および可能性は、当業者には容易に明らかであり、本発明の範囲内の等価物として考えられる。
【００７５】
あるいは、上記抗ＣＤ４０抗体は、「直接的標識」または「直接的標識アプローチ」を使用して標識され得、ここで放射性核種は、抗体に直接共有結合される（代表的には、アミノ酸残基を介して）。好ましい放射性核種は、ＳｒｉｖａｇｔａｖａおよびＭｅａｓｅ（１９９１）（前出）において提供される。上記間接的標識アプローチが、特に好ましい。例えば、国際公開第００／５２０３１号および同第００／５２４７３号（ここでリンカーは、放射活性標識を抗体に結合するために使用される）；および米国特許第６，０１５，５４２号に記載された抗ＣＤ４０抗体の標識形態もまた参照のこと（これらは本明細書において参考として援用される）。
【００７６】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）は、細胞毒のような治療部分、治療剤、または放射活性金属イオンもしくは放射性同位元素に結合体化され得る。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を含む。例としては、以下が挙げられる：タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、ならびにこれらのアナログまたはホモログ。治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロアミン白金（ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｉｎｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ）（Ｉｔ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（ホルミルダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（ホルミルアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。放射性同位元素としては、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得；上記薬物部分は、典型的な化学的治療剤に限定されるとは解釈されない。例えば、上記薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質であってもポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、以下が挙げられる：毒素（アブリン、リシンＡ、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン賦活剤）；または、生物学的反応修飾物質（例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子）。
【００７７】
抗体に対するこのような治療部分を結合体化するための技術は、周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら（１９８５）、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−２５６；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら（編）（１９８７）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）（第２版；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−６５３；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）ｐｐ．４７５−５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ  Ｋｕｒｔｉｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ，１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８５），ｐｐ．３０３−３１６；およびＴｈｏｒｐｅら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照のこと。
【００７８】
あるいは、抗体は、第２の抗体に結合体化されて、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるような抗体ヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る。さらに、リンカーが、上記標識と本発明の抗体との間に使用され得る（例えば、米国特許第４，８３１，１７５号を参照のこと）。抗体またはその抗原結合フラグメントは、当該分野で公知の放射活性ヨウ素、インジウム、イットリウム、または他の放射活性粒子を用いて直接的に標識され得る（米国特許第５，５９５，７２１号）。処置は、同時または引き続いて投与される結合体化抗体および非結合体化抗体を用いた、処置の組み合わせからなり得る（ＷＯ  ００／５２０３１およびＷＯ  ００／５２４７３）。
【００７９】
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の改変体）
上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な適切な改変体が、本発明の方法において使用され得る。このような改変体は、親のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の所望の結合特性を保持する。抗体改変体を作製するための方法は、当該分野で一般的に利用可能である。
【００８０】
例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、本明細書において記載される５．９モノクローナル抗体またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体）のアミノ酸配列の改変体は、目的の抗体をコードするクローン化されたＤＮＡ配列中の変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更についての方法は、当該分野で周知である。例えば、以下を参照のこと：ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ（編）（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびこれらにおいて引用される参考文献（これらは、本明細書において参考として援用される）。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換基に関してのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（本明細書において参考として援用される）のモデルにおいて見出され得る。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で交換するような、保存的置換が好まれ得る。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
目的のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドの改変体の構築において、改変は、改変体が所望の活性（すなわち、類似の結合親和性）を保有し続け、そしてヒト細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合することができ、そして有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に結合された場合に、アンタゴニスト活性を示すようになされる。明らかに、上記改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ中に作製された任意の変異は、リーディングフレームの外の配列に位置してはならず、そして好ましくは、２次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補的領域を作製しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。
【００８２】
さらに、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定常領域が変異されて、多くの方法でエフェクター機能を変更し得る。例えば、米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号を参照のこと。これらは、Ｆｃレセプターへの抗体結合を最適化するＦｃ変異体を開示する。
【００８３】
好ましくは、参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の改変体は、参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子（例えば、本明細書において記載される５．９モノクローナル抗体またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体）についてのアミノ酸配列に対してか、あるいは参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％もしくは７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％もしくは８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、上記分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。本発明の目的のために、アフィンギャップサーチを使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズム（１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを使用）を使用して、配列同一性％が決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９において教示される。改変体は、例えば、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基（例えば、６〜１０）、わずか５、わずか４、３、２、またはさらに１アミノ酸残基だけ上記参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と異なり得る。
【００８４】
２つのアミノ酸配列の最適アラインメントに関して、上記改変アミノ酸配列の隣接するセグメントは、上記参照アミノ酸配列について、アミノ酸残基の付加またはアミノ酸残基の欠失を有し得る。上記参照アミノ酸配列を比較するために使用される隣接するセグメントは、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基を含み、そして３０個、４０個、５０個またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的な残基置換またはギャップに関連する配列同一性に対する補正が、なされ得る（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを参照のこと）。
【００８５】
特に、悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合された場合、ＣＤ４０を特異的に結合し、かつアンタゴニスト活性を保持し得るポリペプチドの正確な化学的構造は、多くの因子に依存する。イオン化可能なアミノ基およびカルボニル基が分子中に存在する場合、特定のポリペプチドは、酸性塩もしくは塩基性塩として、または中性形態で得られ得る。適切な環境状態に配置された場合に、その生物学的活性を保持するこのような調製物の全ては、本明細書において使用されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定義の中に含まれる。さらに、上記ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分を使用した誘導体化（グリコシル化）または他の補助的な分子（例えば、脂質、リン酸、アセチル基など）によって増加され得る。上記ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖類との結合体化によってもまた増加され得る。このような増加の特定の局面は、産生する宿主の翻訳後の処理システムを通じて達成され；他のこのような改変も、インビトロで導入され得る。とにかく、このような改変は、上記抗ＣＤ４０抗体のアンタゴニスト特性が破壊されない限り、本明細書において使用される抗ＣＤ４０抗体の定義の中に含まれる。このような改変体は、種々のアッセイにおいて、上記ポリペプチドの活性を増強させるか、または弱めるかのいずれかによって、その活性に量的または質的に影響し得ることが予想される。さらに、上記鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって改変され得、そして上記ポリペプチドは、活性を保持するフラグメントを得るために切断され得る。アンタゴニスト活性を破壊しないこのような変更は、本明細書において使用される目的の抗ＣＤ４０抗体の定義から上記ポリペプチド配列を除かない。
【００８６】
当該分野は、ポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的なガイダンスを提供する。抗ＣＤ４０抗体改変体の調製において、当業者は、天然のタンパク質ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの修飾が、本発明の方法において使用される薬学的組成物の治療的に活性な成分として使用するために適切である改変体を生じるかを容易に決定し得る。
【００８７】
（本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を使用する治療の方法）
本発明の方法は、多発性骨髄腫を有する被験体（すなわち、患者）を処置するためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用に関し、この使用において、この癌の細胞は、ＣＤ４０抗原を発現する。「ＣＤ４０発現多発性骨髄腫細胞」によって、上記ＣＤ４０抗原を発現する多発性骨髄腫細胞が意図される。多発性骨髄腫の成功する処置は、診断の際に上記癌がどのくらい進行しているかと、上記被験体が、抗ＣＤ４０抗体投与と組み合わせて他の治療方法を受けてきたか否か、またはそのような方法を受けるか否かとに依存する。
【００８８】
多くの診断基準が、多発性骨髄腫の病期を分類するために使用され得る。本発明の方法は、３つの病期を含むＤｕｒｉｅ−Ｓａｌｍｏｎ分類システムに従って分類された多発性骨髄腫を処置するために利用され得る。この分類システムに従って、Ｉ期の多発性骨髄腫を有する被験体は、低い「Ｍ成分（Ｍ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」を有し、貧血または高カルシウム血症の徴候はなく、Ｘ線によって示される骨病変はないか、または１個の病変のみを有する。「Ｍ成分」によって、１つの免疫グロブリン型の過剰な存在が意図される。多発性骨髄腫が進行するにつれて、被験体は、ＩｇＡ抗体またはＩｇＧ抗体の高いＭ成分を発現し、低いレベルの他の免疫グロブリンを発現する。ＩＩ期は、Ｉ期よりもより進行しているが、まだＩＩＩ期の特徴は欠いている中間状態を表す。この第３の病期は、１つ以上の以下のものが検出される場合に到達される：高カルシウム血症、貧血、多発性の骨病変、または高いＭ成分。
【００８９】
上記Ｄｕｒｉｅ−Ｓａｌｍｏｎ分類システムは、クレアチニンレベルの測定と組み合わされて、上記疾患の状態のより正確な特徴付けを提供し得る。多発性骨髄腫被験体におけるクレアチニンレベルは、「Ａ」または「Ｂ」として分類され、「Ｂ」の結果は、「Ａ」よりもより予後が不良であることを示す。「Ｂ」は、高いクレアチニンレベルおよび腎臓機能が不全であることを示す。この様式において、多発性骨髄腫の「ＩＡ期」の症例は、低いクレアチニンレベルと組み合わされて貧血も高カルシウム血症も他の症状も示さない。診断を評価するためのさらなる手段として、これら前述の診断基準は、多発性骨髄腫細胞によって産生されるβ−２−ミクログロブリンの血中レベルのモニタリングと組み合わせて利用され得る。上記タンパク質の高いレベルは、癌細胞が多くの数で存在してることを示す。
【００９０】
本発明の方法は、任意の前述の診断基準に従って分類された多発性骨髄腫の処置に適用可能である。これらの診断基準が、上記疾患の進行性の段階を特徴付けるために利用され得るのとちょうど同じように、これらの同じ診断基準（すなわち、貧血、高カルシウム血症、クレアチニンレベル、およびβ−２−ミクログロブリンレベル、骨病変の数、およびＭ成分）は、処置効果を評価するためにモニタリングされ得る。
【００９１】
「処置」は、本明細書において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントの被験体への適用または投与、あるいはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはそのフラグメントの被験体から単離された組織または細胞株への適用または投与として定義され、ここで上記被験体は、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫に関連する症状、または多発性骨髄腫の発症に対する素因を有し、その目的は、上記多発性骨髄症、多発性骨髄症の任意の関連する症状、または多発性骨髄腫の発症に対する素因を、治療（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、軽減（ｒｅｌｉｅｖｅ）、変更（ａｌｔｅｒ）、治療（ｒｅｍｅｄｙ）、改良（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）、あるいは影響する（ａｆｆｅｃｔ）ことである。「処置」によって、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはそのフラグメントを含有する薬学的組成物の被験体への適用または投与、あるいは抗ＣＤ４０抗体もしくはそのフラグメントを含有する薬学的組成物の被験体から単離された組織または細胞株への適用または投与もまた意図され、ここで上記被験体は、多発性骨髄症、多発性骨髄症に関連する症状、または多発性骨髄症の発症に対する素因を有しており、その目的は、上記多発性骨髄症、多発性骨髄症の任意の関連する症状、または多発性骨髄腫の発症に対する素因を、治療、治癒、緩和、軽減、変更、治療、改良、改善、あるいは影響することである。
【００９２】
「抗腫瘍活性」によって、悪性のＣＤ４０発現細胞の増殖または蓄積の速度の低下、そしてそれ故の既存の腫瘍もしくは治療の間に生じた腫瘍の成長速度の衰え（ｄｅｃｌｉｎｅ）、および／または既存の新生物性（腫瘍）細胞もしくは新しく形成された新生物性細胞の破壊、そしてそれ故の治療の間の腫瘍の全体の大きさの減少が意図される。少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体（またはその抗原結合フラグメント）を用いた治療は、多発性骨髄腫の処置に関して有益である生理学的応答を引き起こし、ここで上記疾患は、上記ＣＤ４０抗原を発現する細胞を含む。本発明の方法は、治療の間に生じる多発性骨髄腫細胞のさらなる増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および生長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を防止する際に有用であり得ることが認識される。
【００９３】
本発明の方法に従って、本明細書の他の部分で定義されるような少なくとも１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、多発性骨髄腫の処置または防止に関してポジティブな治療応答を促進するために使用される。癌の処置に関する「ポジティブな治療応答」によって、これらの抗体もしくはそのフラグメントの抗腫瘍活性に関連する疾患の改善、および／または上記疾患に関連する症状の改善が意図される。すなわち、抗増殖効果、さらなる腫瘍生長の防止、腫瘍の大きさの減少、癌細胞数の減少、および／またはＣＤ４０発現細胞の刺激によって媒介される１以上の症状の減少が、観察され得る。従って、例えば、上記疾患の改善は、完全応答（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）として特徴付けられ得る。「完全応答」によって、任意の先行する異常なＸ線写真研究、骨髄、および脳脊髄液（ＣＳＦ）の正常化による臨床的に検出可能な疾患がないことが意図される。このような応答は、本発明の方法に従う処置を受けて、少なくとも１ヶ月持続しなければならない。あるいは、上記疾患の改善は、部分的な応答であるとして分類され得る。「部分的な応答」によって、新規の病変がなく、かつ少なくとも１ヶ月持続する、全ての測定可能な腫瘍負荷量（すなわち、上記被験体において存在する腫瘍細胞の数）の少なくとも約５０％の減少が意図される。このような応答は、測定可能な腫瘍にのみ適用できる。
【００９４】
腫瘍応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影画像化法、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、生物ルミネスセンス画像化法（例えば、ルシフェラーゼ画像化法）、骨スキャン画像化法、および骨髄穿刺（ＢＭＡ）を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技術を使用した腫瘍形態（すなわち、全体の腫瘍負荷量、腫瘍の大きさなど）の変化について評価され得る。これらのポジティブな治療応答に加えて、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた治療を受ける被験体は、上記疾患に関連する症状において改善の有益な効果を経験し得る。
【００９５】
「治療有効用量または治療有効量」または「有効量」によって、投与された場合に、多発性骨髄腫を有する被験体の処置に関してポジティブな治療応答を引き起こす、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの量が意図される。本発明のいくつかの実施形態において、抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。処置の方法は、上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントの、治療有効用量の一回投与または治療有効用量の複数回投与を包含し得ることが認識される。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、臨床的な試験手順の一部として、例えば、与えられた処置レジメンの効能を決定するために、組織中のタンパク質レベルを診断的にモニタリングするためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を使用することである。検出は、上記抗体を検出可能な物質に結合させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス物質、生物ルミネセンス物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；ルミネセンス物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物ルミネセンス物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【００９７】
上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、多発性骨髄腫の処置のために、公知の化学療法薬と組み合わせて、単独か、または骨髄移植、放射線療法、ステロイド、およびインターフェロンαと組み合わせて使用され得る。この様式において、本明細書において記載されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１種の他の癌療法（放射線療法、化学療法、インターフェロンα療法、またはステロイド療法が挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて投与され、ここでこのさらなる癌療法は、抗ＣＤ４０抗体療法の前、その間、またはその後に投与される。従って、組み合わされた治療が、化学療法、放射線療法、またはインターフェロンαおよび／もしくはステロイドを用いた治療のような別の治療剤の投与と組み合わせた抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む場合、本発明の方法は、別個の処方物または単一の薬学的組成物を用いた同時投与、およびいずれかの順番での連続投与を包含し、この方法において、好ましくは、両方（または全て）の活性因子がそれらの治療的活性を同時に発揮する期間が存在する。本発明の方法が組み合わされた治療レジメンを含む場合、これらの治療は、同時に与えられ得る。すなわち、上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、同時にか、または他の癌療法として同じ期間内に投与される（すなわち、上記治療は同時に行われるが、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の癌療法のように正確に同時には投与されない）。あるいは、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、他の癌療法の前に投与されてもよいし、他の癌療法に続いて投与されてもよい。異なる癌療法の連続投与は、処置された被験体が、第１のクールの治療に対して応答して寛解または再発の可能性を減少させるか否かに関わらず、実施され得る。
【００９８】
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書において記載されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、またはその抗原結合フラグメントは、化学療法と組み合わせて投与され、そして必要に応じて自己骨髄移植と組み合わされる。ここで上記抗体および上記化学療法剤は、いずれの順番で連続的に投与されてもよいし、同時に（すなわち、同時または同じ期間内）投与されてもよい。適切な化学療法剤の例としては、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、メルファラン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、およびプレドニゾンまたはデキサメタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
従って、例えば、１つの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体は、メルファラン、アルキル化薬、およびステロイドプレドニゾン（ＭＰともいわれる）と組み合わせて投与される。あるいは、上記アルキル化薬剤であるシクロホスファミドおよびクロラムブシルは、メルファランの代わりに、ステロイドおよび本発明の抗ＣＤ４０抗体と組み合わせて使用され得る。被験体がＭＰまたはその代替物に反応しない場合、そしてＭＰ処置の後に再発する被験体に対して、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ビンクリスチン、ドキソルビシン、および高用量のデキサメタゾン（「ＶＡＤ」ともいわれる）の投与を含む化学療法レジメンと組み合わせて投与され得、この化学療法レジメンは、シクロホスファミドの同時投与をさらに含み得る。他の実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体は、抗脈管形成特性を有する別の薬剤（例えば、サリドマイド、またはインターフェロンα）と組み合わせて使用され得る。被験体がＭＰ療法および／またはＶＡＤ療法に耐性である場合、これらの後者の薬剤が有効であり得る。さらに他の実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体は、ボルテゾミブ（ＶｅｌｃａｄｅＴＭ）のようなプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与され得、後者は、疾患が２回の前の処置の後に再発し、かつその最後の処置に対する耐性が実証されている被験体に投与される。あるいは、上記抗ＣＤ４０抗体は、高用量の化学療法と組み合わせて、単独か、または自己の骨髄移植と共に、被験体に投与され得る。
【０１００】
本明細書において記載される抗ＣＤ４０抗体は、例えば、ＣＤ４０を発現している細胞を同定するために使用され得る標識抗体のような試薬を提供するために、さらに使用され得る。これは、未知のサンプルの細胞型を決定する際に非常に有用であり得る。モノクローナル抗体のパネルは、種によっておよび／または器官の型によって組織を同定するために使用され得る。類似の様式において、これらの抗ＣＤ４０抗体は、混入について組織培養物の細胞をスクリーニング（すなわち、培養物中のＣＤ４０発現細胞および非ＣＤ４０発現細胞の混合物の存在についてのスクリーニング）するために使用され得る。
【０１０１】
（薬学的処方物および投与の様式）
本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、治療上有効である濃度において投与されて、多発性骨髄腫を防止または処置する。この目的を達成するために、上記抗体は、当該分野で公知の種々の受容可能な賦形剤を使用して処方され得る。代表的には、上記抗体は、静脈内注射または腹腔内注射のいずれかによって投与される。この投与を達成するための方法は、当業者に公知である。局所投与もしくは経口投与され得る組成物、または粘膜を通過して透過し得る組成物を得ることもまた可能であり得る。
【０１０２】
静脈内投与は、投与される抗ＣＤ４０抗体に依存して、好ましくは約１時間〜約１０時間にわたる期間、より好ましくは約１時間〜約８時間にわたる期間、さらにより好ましくは約２時間〜７時間にわたる期間、なおより好ましくは約４時間〜６時間にわたる期間の注入によって起こる。薬学的組成物による最初の注入は、約４時間〜約６時間の期間にわたって行われ、続く注入はより迅速に送達され得る。続く注入は、約１時間〜約６時間（例えば、約１時間〜約４時間、約１時間〜約３時間、または約１時間〜約２時間を含む）の期間にわたって投与され得る。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物は、意図される投与の経路と適合するように処方される。可能な投与の経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、または注入）、経口投与および肺投与（例えば、吸入）、鼻投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与ならびに直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、もしくは皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水）、生理的食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節され得る。この非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアルの中に封じ込められ得る。
【０１０４】
上記抗ＣＤ４０抗体は、代表的には、標準的技術によって、薬学的に受容可能な緩衝剤（例えば、滅菌生理的食塩水、滅菌緩衝水、ポリピレングリコール、前述のものの組み合わせなど）内に提供される。非経口的に投与可能な薬剤を調製するための方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）（本明細書において参考として援用される）において記載される。例えば、本発明の方法において使用するために適切な安定化抗体の薬学的処方物を記載するＷＯ９８／５６４１８もまた参照のこと。
【０１０５】
投与される少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの量は、当業者によって過度の実験なしに容易に決定される。投与の様式および少なくとも１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（またはそのフラグメント）のそれぞれの量に影響する因子としては、治療を受ける特定の疾患、上記疾患の重篤度、上記疾患の病歴、ならびに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康状態、および生理学的状態が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、投与されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの量は、投与の様式およびその被験体がこの抗腫瘍剤の一回用量または複数用量のどちらを受けるかに依存する。一般的に、抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの投薬量をより高くすることが、治療を受ける患者の体重の増加に関して好ましい。投与される抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの用量は、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、例えば、用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、上記方法は、複数用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの投与を包含する。上記方法は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、もしくはそれ以上の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含有する薬学的組成物の投与を包含し得る。抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含有する薬学的組成物の複数用量の投与の頻度および期間は、当業者によって過度に実験なしに容易に決定され得る。さらに、治療有効量の抗体を用いた被験体の処置は、一回の処置を包含し得るか、または好ましくは一連の処置を包含し得る。好ましい例において、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて、約１〜１０週間の間、好ましくは約２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、そしてさらにより好ましくは約４週間、５週間、または６週間の間に週に１回処置される。処置は、再発を防止するためか、または再発の徴候に対して、毎年行われ得る。処置に使用される抗体またはその抗原結合フラグメントの有効な投薬量は、特定の処置のクールにわたって増加されても減少されてもよいこともまた、認識される。投薬量の変化は、本明細書において記載される診断アッセイの結果を生じ得、そしてそのアッセイの結果から明らかになり得る。従って、１つの実施形態において、その投薬レジメンは、処置期間の１日目、７日目、１４日目、および２１日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む。別の実施形態において、上記投薬レジメンは、処置期間の１週の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、および７日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む。さらなる実施形態は、処置期間の１週の１日目、３日目、５日目、および７日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を有する投薬レジメン；処置期間の１週の１日目および３日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む投薬レジメン；および処置期間の１週の１日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む好ましい投薬レジメンを包含する。この処置期間は、１週、２週、３週、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年を含み得る。処置期間は、続いてもよいし、互いに１日、１週、２週、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年離れていてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療上有効な用量の範囲は、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇである。従って、例えば、任意の１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメント）の用量は、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある他のそのような用量である得る。同じ治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体投薬の各週を通じて、投与され得る。あるいは、異なる治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、処置期間のクールにわたって使用され得る。
【０１０８】
他の実施形態において、本明細書の他の部分で定義されるように、最初の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、より低い用量範囲（すなわち、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）であり得、引き続く用量は、より高い用量範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）になり得る。
【０１０９】
代替的な実施形態において、本明細書の他の部分で定義されるように、最初の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、より高い用量範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）であり得、引き続く用量は、より低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）になり得る。従って、１つの実施形態において、上記最初の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ（約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、および約３５ｍｇ／ｋｇを含む）であり、そして引き続く治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ（約５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、および約１５ｍｇ／ｋｇを含む）である。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体療法は、「ローディング用量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」の抗体またはその抗原結合フラグメントを、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体療法を必要としている被験体に投与することによって開始される。「ローディング用量」によって、投与される抗体またはその抗原結合フラグメントの用量がより高い用量範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）にある、上記被験体に投与されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの最初の用量が意図される。上記「ローディング用量」は、完全な「ローディング用量」が約２４時間の期間内に投与される限り、一回投与（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントがＩＶ投与される一回注入）としてか、または複数投与（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントがＩＶ投与される複数注入）として投与され得る。「ローディング用量」の投与に続いて、次いで上記被験体は、１以上のさらなる治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与される。引き続く治療有効用量は、例えば、毎週の投薬スケジュールに従ってか、または２週間に一度、３週間に一度、もしくは４週間に一度、投与され得る。このような実施形態において、上記引き続く治療有効用量は、一般的により低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）内にある。
【０１１１】
あるいは、いくつかの実施形態において、「ローディング用量」に続いて、上記引き続く治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが、「維持スケジュール」に従って投与される。このスケジュールにおいて、上記治療有効用量の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１０週間に１回、３ヶ月に１回、１４週間に１回、４ヶ月に１回、１８週間に１回、５ヶ月に１回、２２週間に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１０ヶ月に１回、１１ヶ月に１回、または１２ヶ月に１回、投与される。このような実施形態において、上記治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、特に引き続く用量がより頻繁な間隔（例えば、２週間に１回〜１ヶ月に１回）で投与される場合、より低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）であるか、または特に引き続く用量がより頻繁でない間隔（例えば、引き続く用量が約１ヶ月〜約１２ヶ月離れて投与される）で投与される場合、より高い投薬範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）である。
【０１１２】
本発明の方法において使用するための、本明細書において記載される薬学的組成物中に存在するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、天然のものであっても、組換え技術によって得られても良いし、そして任意の供給源（例えば、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ブタおよびヒトのような哺乳動物供給源が挙げられる）に由来してもよい。好ましくは、このようなポリペプチドは、ヒト供給源に由来し、そしてより好ましくはハイブリドーマ細胞株からの組換えヒトタンパク質である。
【０１１３】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な改変体を包含し得る。このような改変体は、被験体に投与されたときに、改変体ポリペプチドを含有する薬学的組成物が、天然のポリペプチドを含有する薬学的組成物と同じ治療的効果を有するように、上記天然ポリペプチドの所望の生物学的活性を保持するべきである。すなわち、上記改変体の抗ＣＤ４０抗体は、天然のアンタゴニスト抗体（例えば、それぞれハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって発現される５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２）について観察されるものと類似した様式において、薬学的組成物中の治療上活性な成分として機能する。改変体抗ＣＤ４０抗体が、所望の生物学的活性を保持し、それ故、薬学的組成物中の治療的に活性な成分として機能するか否かを決定するための方法は、当該分野で利用可能である。抗体改変体の生物学的活性は、天然のアンタゴニスト抗体の活性を測定するために特異的に設計されたアッセイ（本発明において記載されるアッセイを含む）を使用して測定され得る。
【０１１４】
治療的に活性な成分として本明細書中に記載される結合特性を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する、あらゆる薬学的組成物が、本発明の方法において使用され得る。従って、１種以上の本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する液体、凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物は、本発明の方法に従う、その後の被験体への投与のために、水系もしくは非水系の溶液または懸濁液として調製され得る。これらの組成物の各々は、治療的または予防的に活性な成分として、少なくとも１種の本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する。「治療的または予防的に活性な成分」により、抗ＣＤ４０抗体が、組成物中に特異的に組み込まれて、薬学的組成物が被験体に投与されるときに、この被験体内の疾患もしくは状態の、処置、予防または診断に関して、所望の治療的または予防的な応答をもたらすことが意図される。好ましくは、薬学的組成物は、適切な安定化剤、充填剤、またはこれらの両方を含有し、調製および保存の間の、タンパク質の安定性および生物学的活性の喪失に伴う問題を最小限にする。
【０１１５】
処方用物質（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）が、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する薬学的組成物に添加され得る。これらの処方用物質としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミン酸（ａｍｉｎｅ  ａｃｉｄ）、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が挙げられ得るがこれらに限定されない。好ましくは、炭水化物としては、糖または糖アルコール（例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グリカン）が挙げられる。糖類またはグリカンとしては、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物が挙げられ得る。「糖アルコール」は、ヒドロキシル基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、そして、糖アルコールとしては、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールが挙げられる。これらの糖または糖アルコールは、個別または組み合わせで使用され得る。糖または糖アルコールの濃度は、１．０％ｗ／ｖと７％ｗ／ｖとの間であり、より好ましくは、２．０％ｗ／ｖと６．０％ｗ／ｖとの間である。好ましくは、アミノ酸としては、左旋（Ｌ）形態のカルニチン、アルギニンおよびベタインが挙げられる；しかし、他のアミノ酸も添加され得る。好ましいポリマーとしては、２，０００と３，０００との間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または、３，０００と５，０００との間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。処方物中に添加され得る界面活性剤としては、欧州特許第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示される。
【０１１６】
さらに、抗体は、例えば、その循環半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学的に修飾され得る。好ましいポリマー、およびこのポリマーをペプチドに結合させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号（これらは、全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）に示される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒを有する。この式において、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基のような保護基であり得る。好ましくは、この保護基は、１個と８個の間の炭素を有し、より好ましくは、この保護基はメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは、１と１，０００との間、より好ましくは、２と５００との間である。ＰＥＧは、１，０００と４０，０００との間、より好ましくは、２，０００と２０，０００との間、最も好ましくは、３，０００と１２，０００との間の好ましい平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは、末端のヒドロキシ基である。好ましくはインヒビター上の遊離アミノ基と反応するように活性化されるのは、このヒドロキシ基である。しかし、反応基の型および量は、本発明の共有結合化ＰＥＧ／抗体を達成するために変動し得ることが理解される。
【０１１７】
水溶性のポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。これらとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトのモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドにおいて天然に存在するものと同じ骨格であるからである。従って、この分枝形成は、必ずしも身体において外来因子として認識されない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の好ましい分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０に示され、ＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の考察については、米国特許第４，７６６，１０６号に見られ、これらは、いずれも、その全体が本明細書により参考として援用される。
【０１１８】
循環半減期を増加するための別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６４９：１２９；およびＳｚｏｋａ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．９：４６７において議論されている。他の薬物送達系が当該分野で公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（１９８０）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．２５３−３１５；Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ  ３６：２７７に記載される。
【０１１９】
薬学的組成物に組み込まれる処方用物質は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの安定性のために提供されるべきである。すなわち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、その物理的および／または化学的安定性を保持し、そして、所望の生物学的活性（すなわち、本明細書において上で定義される１種以上のアンタゴニスト活性（Ｔ細胞により刺激された正常なヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害；Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞により刺激された正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害；ＣＤ４０Ｌ発現細胞もしくは可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）により刺激された正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害；ｓＣＤ４０Ｌもしくは固相ＣＤ４０Ｌにより刺激された、あらゆる細胞における「生き残った」抗アポトーシス細胞内シグナルの阻害；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌとのライゲーションに対する任意の細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の阻害；ならびに、本明細書中の他の部分で言及した、ヒト悪性Ｂ細胞の増殖の阻害が挙げられるがこれらに限定されない））を有するべきである。
【０１２０】
タンパク質の安定性をモニターするための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｊｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０；Ｌｅｅ編（１９９１）Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；および本明細書中、以下に開示される安定性アッセイを参照のこと。一般に、タンパク質の安定性は、特定の時間にわたって、選択された温度において測定される。好ましい実施形態において、安定な抗体の薬学的処方物は、室温（約２５℃）において、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、もしくは少なくとも６ヶ月保存した場合に、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの安定性を提供し、そして／あるいは、約２〜８℃において、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月、安定である。
【０１２１】
薬学的組成物中に処方される場合、抗体のようなタンパク質は、その薬学的組成物中で、沈殿、凝集および／または変性の、目に見える徴候（すなわち、変色または透明性の喪失）または（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはＵＶ光散乱を使用して）測定可能な徴候を示さない場合に、所定の時点において、その物理的安定性を保持すると考えられる。化学的安定性に関して、薬学的組成物中に処方される場合、抗体のようなタンパク質は、その薬学的組成物中で、化学的安定性の測定が、そのタンパク質（すなわち、抗体）が、目的の生物学的活性を保持することを暗示する場合に、所定の時点において、その化学的安定性を保持すると考えられる。化学的安定性の変化をモニターするための方法は、当該分野で周知であり、この方法としては、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析を使用する、タンパク質の化学的に変更された形態（例えば、クリッピングからの結果）を検出するための方法；および、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用する、分子の電荷の変化に伴う分解（例えば、脱アミドに伴う分解）を検出する方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書中で、以下に開示される方法を参照のこと。
【０１２２】
薬学的組成物中に処方される場合、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、またはその抗原結合フラグメントは、所望の生物学的活性について適切なアッセイにおいて測定されるとき、その時点での所望の生物学的活性が、その薬学的組成物が調製された時点で示される所望の生物学的活性の約３０％以内、好ましくは、約２０％以内である場合に、所定の時点において所望の生物学的活性を保持すると考えられる。本明細書中に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントの所望の生物学的活性を測定するためのアッセイは、本明細書中の実施例に記載されるようにして実施され得る。また、Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎら（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９−４４４；ならびに米国特許第５，６７４，４９２号および同第５，８４７，０８２号に記載されるアッセイもまた参照のこと（これらは、本明細書中に参考として援用される）。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントは、液体薬学的処方物中に処方される。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、当該分野で公知の任意の方法を使用して調製され得、これらの方法としては、本明細書において上で開示された方法が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントは、ＣＨＯ細胞株において組換え的に産生される。
【０１２４】
その調製および精製の後、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書中に示される様式で液体薬学的処方物として処方され得る。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが、その処方前に保存される場合、これらは、例えば、≦−２０℃において凍結され、次いで、さらなる処方のために、室温にて融解され得る。この液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。この処方物中に存在する抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、投与経路および所望の投薬用量を考慮に入れる。
【０１２５】
この様式において、液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９抗体）またはその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約３０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、または約１５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態において、この液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３０．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約３５．０〜約４０．０ｍｇ／ｍｌ、約４０．０〜約４５．０ｍｇ／ｍｌ、または約４５．０ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。他の実施形態において、この液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約１６．０ｍｇ／ｍｌ、約１７．０ｍｇ／ｍｌ、約１８．０ｍｇ／ｍｌ、約１９．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２１．０ｍｇ／ｍｌ、約２２．０ｍｇ／ｍｌ、約２３．０ｍｇ／ｍｌ、約２４．０ｍｇ／ｍｌ、または約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。この液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９抗体）またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲（ｐＨ約５．０、ｐＨ約５．１、ｐＨ約５．２、ｐＨ約５．３、ｐＨ約５．４、ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．６、ｐＨ約５．７、ｐＨ約５．８、ｐＨ約５．９、ｐＨ約６．０、ｐＨ約６．１、ｐＨ約６．２、ｐＨ約６．３、ｐＨ約６．４、ｐＨ約６．５、ｐＨ約６．６、ｐＨ約６．７、ｐＨ約６．８、ｐＨ約６．９、ｐＨ約７．０、およびｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内の他のこのような値が含まれる）に維持する緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、処方物のｐＨを、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．５、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．０の範囲に維持する。
【０１２６】
液体抗ＣＤ４０抗体処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲に維持する任意の適切な緩衝液は、その抗体の物理化学的安定性および所望の生物学的活性が本明細書において上に言及されたように維持される限り、処方物において使用され得る。適切な緩衝液としては、従来の酸およびその塩が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、対イオンは、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、またはマグネシウムであり得る。薬学的な液体処方物を緩衝するために使用され得る従来の酸およびその塩の例としては、コハク酸またはコハク酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、酒石酸または酒石酸塩、リン酸またはリン酸塩、グルコン酸またはグルコン酸塩、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、アスパラギン酸またはアスパラギン酸塩、マレイン酸またはマレイン酸塩、およびリンゴ酸またはリンゴ酸塩の緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。処方物内の緩衝液の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ（約１ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約８ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の他のこのような値を含む）であり得る。いくつかの実施形態において、処方物内の緩衝液の濃度は、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ（約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲内の他のこのような値を含む）である。
【０１２７】
本発明のいくつかの実施形態において、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（たとえば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、好ましくは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．５の範囲に維持する濃度のコハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液を含む。「コハク酸緩衝液」または「クエン酸緩衝液」によって、それぞれ、コハク酸の塩またはクエン酸の塩を含む緩衝液が意図される。好ましい実施形態において、コハク酸またはクエン酸の対イオンは、ナトリウムカチオンであり、従って、緩衝液は、それぞれ、コハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムである。しかし、任意のカチオンが、有効であると予想される。他の可能なコハク酸カチオンまたはクエン酸カチオンとしては、カリウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウムが挙げられるがこれらに限定されない。上記のように、処方物内のコハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ（約１ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約８ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の他のこのような値を含む）であり得る。いくつかの実施形態において、処方物内の緩衝液の濃度は、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ（約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、または約１５ｍＭを含む）である。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、または約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で、そして、コハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液（例えば、コハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液）を、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、好ましくは、約１０ｍＭの濃度で含む。
【０１２８】
液体薬学的処方物が等張付近であることが望ましい場合、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体薬学的処方物は、さらに、この処方物を等張付近にするために十分な量の等張化剤を含み得る。「等張付近（ｎｅａｒ  ｉｓｏｔｏｎｉｃ）」により、水溶性処方物が、約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３４０ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは約２６０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは約２７０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３１０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有することが意図される。溶液の等張度を測定する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｓｅｔｎｉｋａｒら（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．４８：６２８を参照のこと。
【０１２９】
当業者は、薬学的組成物に等張性を提供するのに有用な、種々の薬学的に受容可能な溶質に精通している。等張化剤は、本発明の液体薬学的処方物の浸透圧を、体液の浸透圧にほぼ等しい値に調節し得る任意の試薬であり得る。生理学的に受容可能な等張化剤の使用が望ましい。従って、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体薬学的処方物は、さらに、等張性を提供するために使用され得る成分（例えば、塩化ナトリウム；アミノ酸（例えば、アラニン、バリンおよびグリシン）；糖類および糖アルコール（ポリオール）（グルコース、デキストロース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、トレハロース、グリセロール、ソルビトールおよびキシリトールが挙げられるがこれらに限定されない）；酢酸、他の有機酸またはその塩、および比較的少量のクエン酸またはリン酸）を含み得る。当業者は、液体処方物の最適な張度を提供するために適切なさらなる薬剤を知っている。
【０１３０】
いくつかの好ましい実施形態において、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨを、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体薬学的処方物は、さらに、等張化剤として塩化ナトリウムを含む。処方物中の塩化ナトリウムの濃度は、張度に対する他の成分の寄与に依存する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１３０ｍＭ〜約１７０ｍＭ、約１３０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１５５ｍＭ、約１４０ｍＭ〜約１５５ｍＭ、または約１４５ｍＭ〜約１５５ｍＭである。１つのこのような実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１５０ｍＭである。他のこのような実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１５０ｍＭであり、緩衝液は、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液であり、この液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントを含み、そして、この処方物は、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５のｐＨを有する。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、ｐＨ約５．５のｐＨにおいて、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、または約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、および約１０ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む。
【０１３１】
本発明の液体薬学的処方物を処理する間の凍結融解または機械的なせん断に起因するタンパク質の分解は、溶液−空気界面における表面張力を低下させるために、処方物内に界面活性剤を組み込むことによって阻害され得る。こうして、いくつかの実施形態において、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）またはその抗原結合フラグメント、処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含み、そしてさらに、界面活性剤を含む。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）を含み、そしてさらに、界面活性剤を含む。
【０１３２】
使用される代表的な界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、これらとしては、以下が挙げられる：ポリオキシエチレンソルビトールエステル（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０））；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）；ポリオキシエチレンアルコール（例えば、Ｂｒｉｊ  ３５）；シメチコン；ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）；リゾホスファチジルコリン；およびポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）。界面活性剤または乳化剤による薬剤の伝統的な安定化については、例えば、Ｌｅｖｉｎｅら（１９９１）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５（本明細書中に参考として援用される）に記載される。本発明を実施する際に使用される好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０である。界面活性剤が含まれる場合、界面活性剤は、代表的に、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の量で添加される。
【０１３３】
こうして、いくつかの実施形態では、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントを含み、緩衝液は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液であり；この処方物は、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５のｐＨを有し；そして、この処方物は、さらに、約０．００１〜約１．０％、または約０．００１％〜約０．５％の量の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含む。このような処方物は、必要に応じて、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭまたは約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、または約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ（約２０．０ｍｇ／ｍｌを含む）の濃度のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント；約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩化ナトリウム（約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）；約５ｍＭ〜約２０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム（約１０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む）；約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ（約１５０ｍＭを含む）の濃度の塩化ナトリウム；および必要に応じて、約０．００１％〜約１．０％（約０．００１％〜約０．５％を含む）の量の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）；を含み、ここで、この液体薬学的処方物は、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、約ｐＨ５．０〜ｐＨ約５．５，ｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５、または約ｐＨ５．５〜ｐＨ約６．０のｐＨを有する。
【０１３４】
液体薬学的処方物は、本質的に、保存料、および本明細書において上記された他のキャリア、賦形剤または安定化剤を含まなくてもよい。あるいは、この処方物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの物理化学的安定性に悪影響を及ぼさないという条件で、本明細書において上記される１種以上の保存剤（例えば、抗細菌剤）、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤を含み得る。受容可能なキャリア、賦形剤および安定化剤の例としては、さらなる緩衝化剤、共溶媒、界面活性剤、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、および生分解性ポリマー（例えば、ポリエステル）が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤、および等モル化剤（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の処方および選択の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【０１３５】
本明細書中に記載される液体薬学的処方物または他の薬学的組成物が調製された後、これらは、分解を防ぐために凍結乾燥され得る。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に公知である。使用の直前に、組成物は、さらなる成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、蒸留水または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成の際に、組成物は、好ましくは、当業者に公知の方法を使用して、被験体に投与される。
【０１３６】
（医薬の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用）
本発明はまた、被験体においてＣＬＬを処置するための医薬の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで上記医薬は、少なくとも１種の他の癌療法による処置と共働（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）される。「共働された（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）」によって、少なくとも１種の他の癌療法による上記被験体の処置の前、その間、またはその後のいずれかに使用される医薬が意図される。
【０１３７】
他の癌療法の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：外科手術；放射線療法；化学療法（必要に応じて自己の骨髄移植と組み合わせられる）、この療法において、適切な化学療法剤としては、フルダラビンもしくはリン酸フルダラビン、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾン、およびこれらの組み合わせ（例えば、ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、さらにプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、さらにドキソルビシン）、ＶＡＤ（ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｔｓｉｎｅ）、ドキソルビシン、さらにデキサメタゾン）、ＭＰ（メルファラン、さらにプレドニゾン）のようなアントラサイクリン−含有レジメン）、ならびに化学療法において使用される他の細胞傷害剤および／または治療剤（例えば、ミトザントロン、ダウノルビシン、インダルビシン、アスパラギナーゼ、および代謝拮抗物質（シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、ならびにネララビンが挙げられるが、これらに限定されない；他の抗癌モノクローナル抗体療法（例えば、アレムトツマブ（キャンパス（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ５２細胞表面糖タンパク質を標的にする他の抗ＣＤ５２抗体；リツキシマブ（リツキサビン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）））、完全ヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（ベキサール（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂｔｉｕｘｅｔａｎ）（ゼバリン（登録商標））、または悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０抗原を標的にする任意の他の治療的抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１９抗体（例えば、ＭＴ１０３、二重特異性抗体）；抗ＣＤ２２抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体エプラツズマブ）；ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））またはヒト血管内皮成長因子を標的にする他の抗癌抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ２２抗原を標的にする抗ＣＤ２２抗体（例えば、モノクローナル抗体ＢＬ−２２、αＣＤ２２毒素）；マクロファージコロニー刺激因子を標的にするα−Ｍ−ＣＳＦ抗体；核因子κＢ（ＲＡＮＫ）のレセプター活性因子を標的にする抗体およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）（これらは、多発性骨髄腫において過剰発現される）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ２３抗原を標的にする抗ＣＤ２３抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１５２）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ３８抗原を標的にする抗ＣＤ３８抗体；悪性Ｂ細胞上の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩレセプターを標的にする抗体（抗ＭＨＣ抗体）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原を標的にする他の抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＳＧＮ−４０）；ならびに多くの固体腫瘍および造血起源の腫瘍上に発現する腫瘍壊死因子関連性アポトーシス誘導リガンドレセプター１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）を標的にする抗体（例えば、アゴニスト性ヒトモノクローナル抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ１）；低分子ベースの癌療法（微小管イン���ビターおよび／またはトポイソメラーゼインヒビター（例えば、有糸分裂インヒビターのドラスタチンおよびドラスタチンアナログ）が挙げられるが、これらに限定されない）；チューブリン結合剤Ｔ９００６０７；ＸＬ１１９；ならびにトポイソメラーゼインヒビターのアミノカンプトテシン、ＳＤＸ−１０５（ベンダムスチンハイドロクロライド（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））、イキサベロピン（ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）（エポチロンアナログ（ＢＭＳ−２４７５５０ともいわれる））、プロテインキナーゼＣインヒビター（例えば、ミドスタウリン（ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ）（（ＰＫＣ−４１２、ＣＧＰ  ４１２５１、Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン（ｂｅｎｚｏｙｌｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）））、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、エロキサチン（抗新生物剤）、ガナイト（ｇａｎｉｔｅ）（硝酸ガリウム）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、サリドマイドの免疫調節誘導体（例えば、レブリミド（以前のレビミド（ｒｅｖｉｍｉｄ）））、ＡｆｆｉｎｉｔａｋＴＭ（プロテインキナーゼＣ−αのアンチセンスインヒビター）、ＳＤＸ−１０１（Ｒ−エトドラク（悪性リンパ球のアポトーシスを誘導する））、第２世代（ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）プリンヌクレオシドアナログ（例えば、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ））、癌細胞によるタンパク質Ｂｃｌ−２の産生のインヒビター（例えば、アンチセンス剤オブリマーゼン（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ）およびジェナセンス（登録商標））、プロテアソームインヒビター（例えば、ＶｅｌｃａｄｅＴＭ（ボルテゾミブ））、低分子キナーゼインヒビター（例えば、ＣＨＩＲ−２５８）、低分子ＶＥＧＦインヒビター（例えば、ＺＤ−６４７４）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０の低分子インヒビター（例えば、１７−ＡＡＧ）、ヒストンデアセチラーゼの低分子インヒビター（例えば、ハイブリッド／極性の細胞分化ＨＰＣ）薬剤（例えばスベラニロヒドロキシアミン酸（ｓｕｂｅｒａｎｉｌｏｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）、およびＦＲ−９０１２２８））およびアポトーシス剤（例えば、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）（三酸化ヒ素）およびＸｃｙｔｒｉｎ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム（ｍｏｔｅｘａｆｉｎ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ）））；ワクチン／免疫療法ベースの癌療法（ワクチンアプローチ（例えば、Ｉｄ−ＫＬＨ、オンコファージ（ｏｎｃｏｐｈａｇｅ）、ビタレシン（ｖｉｔａｌｅｔｈｉｎｅ））、個別の免疫療法もしくは活性イディオタイプ免疫療法（例えば、ＭｙＶａｘ（登録商標）個別の免疫療法、形式的に設計された（ｆｏｒｍａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ）ＧＴＯＰ−９９）、Ｐｒｏｍｕｎｅ（登録商標）（ＣｐＧ  ７９０９、ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）に対する合成アゴニスト）、インターフェロンα療法、インターロイキン−２（ＩＬ−２）療法、ＩＬ−１２療法；ＩＬ−１５療法、およびＩＬ−２１療法；ステロイド療法が挙げられるが、これらに限定されない）；あるいは他の癌療法；ここで、さらなる癌療法を用いた処置、またはさらなる癌療法は、上記に記述されたように、上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含有する医薬を用いて被験体を処置する前、その間、またはその後に起こる。
【０１３８】
従って、例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の多発性骨髄腫を処置するための医薬の製造の際の、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９、またはその抗体結合フラグメントの使用を提供し、ここで上記医薬は、化学療法を用いた処置と共働され、この化学療法剤は、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ＢＣＮＵ、メルファラン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、およびプレドニゾンまたはデキサメタゾンからなる群より選択される。１つのこのような実施形態において、上記化学療法は、メルファラン、さらにプレドニゾンであり；他の実施形態において、上記化学療法は、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびデキサメタゾン）である。
【０１３９】
他の実施形態において、本発明は、被験体において多発性骨髄腫を処置するための医薬の製造の際の、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９、またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。ここで、上記医薬は、以下からなる群より選択される少なくとも１種の他の抗癌抗体を用いた処置と共働される：完全ヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、マクロファージコロニー刺激因子を標的にするα−Ｍ−ＣＳＦ抗体；多発性骨髄腫において過剰発現される核因子−κＢ（ＲＡＮＫ）のレセプター活性因子およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）を標的にする抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ３８抗原を標的にする抗ＣＤ３８抗体；悪性Ｂ細胞上に発現される主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩレセプター（抗ＭＨＣ抗体）を標的にする抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原を標的にする他の抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＳＧＮ−４０）；ならびに腫瘍壊死因子関連性アポトーシス誘導リガンドレセプター１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）（例えば、アゴニスト性ヒトモノクローナル抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ１）および多くの造血起源の腫瘍上に発現されるＴＲＡＩＬ−Ｒ２を標的にする抗体；ならびに任意のこれらの組み合わせ。これらの医薬は、他の癌療法での被験体の処置の前、その間、もしくはその後のいずれかに使用されるか、または複数の併用療法の場合において、他の癌療法での被験体の処置の前、その間、もしくはその後のいずれかに使用される。
【０１４０】
さらに他の実施形態において、本発明は、被験体において多発性骨髄腫を処置するための医薬を製造する際の、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９、またはそれらの抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで上記医薬は、以下からなる群より選択される少なくとも１種の他の低分子ベースの癌療法による処置と共働される：Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、サリドマイドの免疫調節誘導体（例えば、レブリミド（以前のレブミド））、プロテアソームインヒビター（例えば、ＶｅｒｃａｄｅＴＭ（ボルテゾミブ））、低分子キナーゼインヒビター（例えば、ＣＨＩＲ−２５８）、低分子ＶＥＧＦインヒビター（例えば、ＺＤ−６４７４）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０の低分子インヒビター（例えば、１７−ＡＡＧ）、ヒストンデアセチラーゼの低分子インヒビター（例えば、ハイブリッド／極性の細胞分化ＨＰＣ）薬剤（例えば、スベラニロヒドロキシアミン酸（ＳＡＨＡ）、およびＦＲ−９０１２２８））およびアポトーシス剤（例えば、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）（三酸化ヒ素））、ならびに任意のこれらの組み合わせ。これらの医薬は、他の癌療法での被験体の処置の前、その間、もしくはその後のいずれかに使用されるか、または複数の併用療法の場合において、他の癌療法での被験体の処置の前、その間、もしくはその後のいずれかに使用される。
【０１４１】
本発明はまた、多発性骨髄腫について被験体を処置するための医薬の製造の際の、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、本明細書において開示されるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９）またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで上記医薬は、少なくとも１種の他の癌療法によって前処置されている被験体において使用される。「前処置された（ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ）」または「前処置（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」によって、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬を受ける前に、１種以上の他の癌療法を受けている（すなわち、少なくとも１種の他の癌療法で処置されている）被験体が意図される。「前処置された」または「前処置」は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、本明細書において開示されるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９）、またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬で処置の開始の前に、２年以内、１８ヶ月以内、１年以内、６ヶ月以内、２ヶ月以内、６週間以内、１ヶ月以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、またはさらに１日以内、少なくとも１種の他の癌療法で処置されている被験体を包含する。被験体が、前の癌療法での前処置または前の癌療法に対して応答者であることは、必ずしも必要ではない。従って、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬を受ける被験体は、事前の癌療法または１種以上の事前の癌療法での前処置（前処置には、複数の癌療法が含まれる）に対して応答しても、応答しなくてもよい（すなわち、この癌は、治療不応性であった）。被験体が、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬を受ける前に前処置を受け得る他の癌療法の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：外科手術；放射線療法；必要に応じて自己の骨髄移植と組み合わせた化学療法（この療法において、適切な化学療法剤は、本明細書の上に列挙したものが挙げられるが、これらに限定されない）；他の抗癌モノクローナル抗体療法（本明細書の上に列挙された抗癌抗体が挙げられるが、これらに限定されない）；低分子ベースの癌療法（本明細書の上に列挙された低分子が挙げられるが、これらに限定されない）；ワクチン／免疫療法ベースの癌療法（本明細書の上に列挙されたものが挙げられるが、これらに限定されない）；ステロイド療法；他の癌療法；あるいは任意のこれらの組み合わせ。
【０１４２】
本明細書において記載される医薬の１種以上の他の癌療法と一緒の共働された使用の状況における「処置」は、本明細書において、上記医薬もしくは他の癌療法の被験体への適用または投与、あるいは上記医薬または他の癌療法の組織から単離された組織または細胞株への適用または投与として定義される。ここで上記被験体は、多発性骨髄種、このような癌に関連する症状、またはこのような癌の発症に対する素因を有し、その目的は、上記癌、上記癌の任意の関連する症状、または上記癌の発症に対する素因を、治療、治癒、緩和、軽減、変更、治療、改良、改善、あるいは影響することである。
【０１４３】
以下の実施例は、説明のために提供され、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１４４】
（導入部）
以下の実施例で使用されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２である。この５．９抗ＣＤ４０抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖座およびヒトκ軽鎖座を有するトランスジェニックマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））の免疫化により作製されるヒトＩｇＧ１サブタイプ抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＣＤ４０細胞外ドメインを発現するＳＦ９昆虫細胞を、免疫原として使用した。
【０１４５】
簡単に述べると、免疫したマウスに由来する脾臓細胞を、ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１３：１４３により以前に記載されたとおりに、５０％ポリエチレングリコールを使用して、１０：１の比で、ＳＰ  ２／０マウス骨髄腫細胞またはＰ３  ｘ  ６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合させた。融合した細胞を、ヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）および０．５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を補充した完全ＩＭＤＭ培地中に再懸濁した。この融合した細胞を、次いで、各ウェルが、平均して１つの増殖するハイブリドーマを含むように、９６ウェル組織培養プレートのウェル間に分配した。
【０１４６】
１０〜１４日後、ハイブリドーマ集団の上清を、特異的抗体の産生についてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生をスクリーニングするために、各ウェルからの上清を、プールし、まず、ＥＬＩＳＡによって、抗ＣＤ４０活性の特異性について試験した。次いで、陽性のものを、標準的なＦＡＣＳアッセイを用いる、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の蛍光細胞染色のために使用した。陽性のハイブリドーマ細胞を、０．５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−６を含有するＩＭＤＭ／ＦＢＳ中で限界希釈することによって、２回クローン化した。
【０１４７】
合計３１匹のマウスの脾臓を、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞と融合させて、ＥＬＩＳＡにおいて組換えＣＤ４０を認識する８９５の抗体を作製した。平均して、Ａｂｇｅｎｉｘ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して産生されたハイブリドーマの約１０％が、ヒトκ鎖の代わりにマウスλ軽鎖を含み得る。これらのマウスλ軽鎖を含む抗体を選択した。細胞表面ＣＤ４０への結合もまた示す２６０の抗体のサブセットを、さらなる分析のために選択した。一連のサブクローニング手順の間に選択された安定なハイブリドーマを、結合アッセイおよび機能アッセイにおけるさらなる特徴付けに使用した。選択プロセスのさらなる詳細については、同時継続中の仮出願（両方ともに、発明の名称「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」であり、それぞれ、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日出願、割り当てられた米国特許出願番号第６０／５１７，３３７号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同第６０／５２５，５７９号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同第６０／５６５，７１０（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））を参照のこと。これらの特許文献の両方の内容は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０１４８】
７つの他のハイブリドーマからのクローンを、アンタゴニスト活性を有するものとして同定した。その相対アンタゴニスト能およびＡＤＣＣ活性に基づいて、２つのハイブリドーマクローンを、さらなる評価のために選択した（表１、以下）。これらを、１３１．２Ｆ８．５．９（５．９）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（１２．１２）と名付けた。
【０１４９】
【表１】
2011098989.tif 000002
マウスハイブリドーマ株１３１．２Ｆ８．５．９（ＣＭＣＣ＃１２０４７）およびハイブリドーマ株１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（ＣＭＣＣ＃１２０５６）は、それぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）に、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３の下、寄託されている。
【０１５０】
候補抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅し、クローン化し、そして、配列決定した。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖についてのアミノ酸配列を、それぞれ、図１Ａおよび１Ｂに示す。配列番号２（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖）および配列番号４（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖）もまた参照のこと。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の改変体を、図１Ｂに示す（配列番号５もまた参照のこと）。この改変体は、配列番号４の第１５３位のアラニン残基の代わりにセリン残基を有するという点で配列番号４と異なる。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ、図２Ａおよび２Ｂに示す。配列番号１（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖のコード配列）および配列番号３（ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖のコード配列）もまた参照のこと。５．９抗体の軽鎖および重鎖についてのアミノ酸配列を、それぞれ、図３Ａおよび３Ｂに示す。配列番号６（ｍＡｂ  ５．９の軽鎖）および配列番号７（ｍＡｂ  ５．９の重鎖）もまた参照のこと。ｍＡｂ  ５．９の重鎖の改変体を、図３Ｂに示す（配列番号８もまた参照のこと）。この改変体は、配列番号７の第１５８位のアラニン残基の代わりにセリン残基を有するという点で配列番号７と異なる。
【０１５１】
個々のハイブリドーマに由来する抗体について予測されるとおり、相補性決定領域（ＣＤＲ）内のヌクレオチド配列に実質的なバリエーションが存在する。ＶＨのＣＤＲ３領域内の多様性は、抗体特異性を最も有意に決定するものと考えられる。
【０１５２】
ＦＡＣＳ分析により示されるように、５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、そして、ＣＤ４０−リガンド結合を妨げ得る。両方のｍＡｂが、細胞表面のＣＤ４０に予め結合したＣＤ４０リガンドと競合し得る。５．９のヒトＣＤ４０への結合親和性は、１．２×１０−８Ｍであり、ＣＨＩＲ−１２．１２のヒトＣＤ４０への結合親和性は、５×１０−１０Ｍである。
【０１５３】
ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体および５．９モノクローナル抗体は、強力なアンタゴニストであり、正常なＢ細胞のインビトロＣＤ４０リガンド媒介性の増殖を阻害し、ならびに、ＮＨＬ患者およびＣＬＬ患者に由来する癌細胞のインビトロＣＤ４０リガンド媒介性の増殖を阻害する。インビトロで、両方の抗体は、ＮＨＬ患者に由来する原発性の癌細胞を、ＡＤＣＣによって死滅させる。用量依存性の抗腫瘍活性が、異種移植片ヒトリンパ種モデルにおいて見られた。これらの結果、およびこれらの結果を得るために使用したアッセイのより詳細な説明については、同時継続中の仮出願（発明の名称「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」であり、それぞれ、２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日および２００４年４月２７日出願、割り当てられた米国特許出願番号第６０／５１７，３３７号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、同第６０／５２５，５７９号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、および同第６０／５６５，７１０号（代理人事件整理番号：ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７１５２５）））を参照のこと。これらの各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１５４】
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ｍＡｂ  ５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２が以下の特徴を示すか否かを決定するための研究を行う：（１）多発性骨髄腫患者の細胞へ結合すること（フローサイトメトリーを使用して決定する）；（２）ＣＤ４０リガンドに誘導された生存シグナルを遮断することによって、多発性骨髄腫患者の細胞において細胞死を促進すること；（３）多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞に対する、それ自身による任意の刺激／阻害活性を有すること；および／または；（４）作用の様式として、ＡＤＣＣを媒介すること。
【０１５５】
（実施例１：ｍＡｂ  ５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の、ＭＭ患者からのＣＤ４０＋多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞への結合）
ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２を、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の染色について、コントロールのＦＩＴＣで標識したヒトＩｇＧ１と共に試験する。８人の患者から得られたＣＤ４０＋ＭＭ細胞を、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２、またはＦＩＴＣで標識したヒトＩｇＧ１と共にインキュベートする。ＦＡＣＳＣＡＮ  Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、フローサイトメトリー分析を行う。
【０１５６】
（実施例２：抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞におけるＣＤ４０リガンドが媒介する生存シグナルを遮断する）
８人の患者から得られた多発性骨髄腫細胞を、以下の条件下で、アンタゴニスト抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２およびコントロールのヒトＩｇＧ１と共に別個に培養する：
【０１５７】
【表２】
2011098989.tif 000003
７２時間後、この培養物を以下のように分析する：
・ＰＩおよびアネキシンＶでの染色による生存細胞計数および細胞死の測定
・一晩トリチウム化チミジンを適用し、増殖を測定する。
【０１５８】
（実施例３：多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞に対する抗ＣＤ４０  ｍＡｂ刺激性／阻害性活性の評価）
８人の患者からの多発性骨髄腫細胞を、以下の条件下で、抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２または抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５．９の存在下において、ＩｇＧをコントロールとして使用して培養する：
【０１５９】
【表３】
2011098989.tif 000004
７２時間後、この培養物を以下のように分析する：
・ＰＩおよびアネキシンＶでの染色による生存細胞計数および細胞死の測定
・一晩トリチウム化チミジンを適用し、増殖を測定する。
【０１６０】
（実施例４：抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって患者に由来する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を溶解する、抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２および抗ＣＤ４０
ｍＡｂ  ５．９の能力）
８人の患者から得られた多発性骨髄腫細胞を、以下の条件下で、アンタゴニスト抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２およびコントロールのヒトＩｇＧ１と共に別個に培養する：
【０１６１】
【表４】
2011098989.tif 000005
４時間後に、特異的な細胞溶解を、放出された５１Ｃｒのレベルまたは蛍光色素を測定することによって計算する。
【０１６２】
（実施例５：５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０上の１５Ｂ８とは異なるエピトープに結合する）
候補のモノクローナル抗体５．９およびＣＨＩＲ１２．１２は、ＣＤ４０の結合について互いに競合するが、１５Ｂ８（ＩｇＧ２抗ＣＤ４０  ｍＡｂ）とは競合しない（国際公開第０２／２８９０４号を参照のこと）。Ｂｉａｃｏｒｅを使用した抗体競合結合研究を、アミン結合を介して固定したプロテインＡを用いたＣＭ５バイオセンサーチップを使用して設計した。このバイオセンサーチップは、抗ＣＤ４０、ＣＨＩＲ−１２．１２、または１５Ｂ８のいずれかを捕捉するために使用した。標準の会合／解離結合曲線を、種々の濃度のＣＤ４０−ｈｉｓを用いて観察する（データは示さず）。競合研究のために、ＣＨＩＲ−１２．１２または１５Ｂ８のいずれかを、プロテインＡの表面上で捕捉した。続いて、ＣＤ４０−ｈｉｓ／５．９Ｆａｂ複合体（１００ｎＭ  ＣＤ４０：１μＭ  ５．９Ｆａｂ）を、種々の濃度において改変された表面に流した。ＣＨＩＲ−１２．１２の場合において、上記複合体の会合は観察されず、５．９は、ＣＨＩＲ−１２．１２のＣＤ４０−ｈｉｓへの結合を遮断することを示した。１５Ｂ８については、Ｆａｂ  ５．９複合体の会合が観察され、５．９は１５Ｂ８のＣＤ４０結合部位への結合を遮断しないことを示した。しかし、この複合体が離れる割合（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）は、劇的に増加した（データは示さず）。
【０１６３】
１５Ｂ８およびＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０−ｈｉｓ結合について競合しないことも決定した。プロテインＡバイオセンサーチップ上のＣＨＩＲ−１２．１２を捕捉し、コントロールのｈＩｇＧ１によって残りのプロテインＡ部位を遮断し、ＣＤ４０−ｈｉｓを結合し、次いで改変された表面に１５Ｂ８を流すことによって、この実験を組んだ。１５Ｂ８は、これらの条件下で結合し、ＣＨＩＲ−１２．１２は１５Ｂ８のＣＤ４０への結合を遮断しないことを示した。
【０１６４】
（実施例６：ＣＨＩＲ−１２．１２  ｍＡｂおよび５．９  ｍＡｂの結合特性）
プロテインＡを、アミンカップリングにより、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化した。ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１．５μｇ／ｍｌ）を、この修飾したバイオセンサの表面に１０μｌ／分で、１．５分間捕捉した。組換え可溶性ＣＤ４０−ｈｉｓを、種々の濃度で、バイオセンサの表面上に流した。抗体および抗原を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中に希釈した。動力学定数および親和性定数を、１：１の相互作用モデル／全体的なフィットを用いて、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して決定した。
【０１６５】
以下の表２に示すように、５．９とＣＨＩＲ−１２．１２の解離する速度には１２１倍の差があり、結果として、ＣＨＩＲ−１２．１２に対する親和性が２４倍高かった。
【０１６６】
【表５】
2011098989.tif 000006
（実施例７：モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２およびモノクローナル抗体５．９についてのエピトープの特徴づけ）
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２およびモノクローナル抗体５．９により認識されるＣＤ４０上のエピトープの位置を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を実施した。精製したＣＤ４０（０．５μｇ）を、還元条件および非還元条件下で、４〜１２％のＮＵＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、そして、１０μｇ／ｍｌ濃度のモノクローナル抗体でプローブした。ブロットを、アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＩｇＧでプローブし、そして、アルカリホスファターゼについてのＷｅｓｔｅｒｎ  ＢｌｕｅＲ安定化基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発色させた。
【０１６７】
結果は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２が、ＣＤ４０の非還元型形態および還元型形態の両方の上にあるエピトープを認識し、ＣＤ４０の非還元型形態が、ＣＤ４０の還元型形態よりも高い強度を示すことを示す（表３；ブロットは示さず）。ＣＤ４０の両方の形態についての認識が、陽性であるという事実は、この抗体が、線形配列である立体配座のエピトー部分と相互作用することを示す。モノクローナル抗体５．９は、主に、ＣＤ４０の非還元型形態を認識し、この抗体が、本来の立体配座のエピトープと相互作用することを示唆する（表３；ブロットは示さず）。
【０１６８】
【表６】
2011098989.tif 000007
ＣＤ４０上の抗原性領域をマッピングするために、ＣＤ４０の４つの細胞外ドメインをクローニングし、そして、ＧＳＴ融合タンパク質として昆虫細胞において発現させた。４つのドメインの分泌を、ＧＰ６７分泌シグナルで確認した。昆虫細胞の上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により分析し、エピトープを含むドメインを同定した。
【０１６９】
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、還元条件および非還元条件の両方の下で、ドメイン２上のエピトープを認識する（表４；ブロットは示さず）。対照的に、モノクローナル抗体５．９は、ドメイン２に対して、非常に弱い認識を示す（表４；ブロットは示さず）。これらの抗体のいずれもが、この分析において、ドメイン１、３または４は認識しない。
【０１７０】
【表７】
2011098989.tif 000008
ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２により認識されるエピトープをより正確に規定するために、ペプチドを、ＣＤ４０の細胞外ドメイン２から合成し、これは、配列
ＰＣＧＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＨＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣＴ（配列番号１０または配列番号１２に示される配列の残基６１〜１０４）
に対応する。１アミノ酸が相殺された（ｏｆｆｓｅｔ）１０マーペプチドを含む３５種のＳＰＯＴメンブレン（Ｓｉｇｍａ）を作製した。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２および抗ヒトＩｇＧ  β−ガラクトシダーゼを二次抗体として用いるウエスタンブロット分析を実施した。このブロットを、細片に分け、ｍＡｂ  ５．９で再度プローブして、この抗体により認識される領域を決定した。
【０１７１】
１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＨＩＲ１２．１２でプローブするＳＰＯＴ分析では、スポット１８〜２２の反応が陽性であった。これらのペプチドによりカバーされる配列領域を、表５に示す。
【０１７２】
【表８】
2011098989.tif 000009
これらの結果は、以下の線形エピトープに対応する：ＹＣＤＰＮＬ（配列番号１０または配列番号１２に示す配列の残基８２〜８７）。このエピトープは、Ｙ８２、Ｄ８４およびＮ８６を含み、これらは、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンドの相互作用に関与すると予測されている。
【０１７３】
ｍＡｂ  ５．９を用いるＳＰＯＴ分析は、表６に示されるスポット２０〜２２により表されるペプチドの弱い認識を示し、これは、そのＣＤ４０への結合において、領域ＹＣＤＰＮＬＧＬ（配列番号１０または配列番号１２に示す配列の残基８２〜８９）が関与することを示唆した。ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２および５．９は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析においてＣＤ４０への結合に関して、互いに競合することに注意すべきである。
【０１７４】
【表９】
2011098989.tif 000010
ＳＰＯＴ分析により同定した線形エピトープは、ＣＤ４０  Ｂ１モジュールの内部である。ＣＤ４０  Ｂ１モジュールの配列は；
ＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣ（配列番号１０または配列番号１２の残基８０〜１０３）
である。
【０１７５】
線形エピトープ内でＣＨＩＲ−１２．１２について同定されたのはＣ８３である。このシステイン残基がＣ１０３とジスルフィド結合を形成することは公知である。ＣＨＩＲ−１２．１２  ｍＡｂの立体配座のエピトープは、このジスルフィド結合（Ｃ８３−Ｃ１０３）および／またはＣ１０３にコンホメーション的に近い周囲のアミノ酸を含むようである。
【０１７６】
（実施例８：ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常なヒトＢ細胞においてＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０生存およびシグナル伝達経路を遮断する）
可溶化ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、Ｂ細胞を活性化し、種々の局面の機能応答（生存および増殖の促進、ならびにＮＦκＢ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、およびｐ３８のシグナル伝達経路の活性化を含む）を誘導する。さらに、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激は、正常Ｂ細胞において、切断されたＰＡＲＰの減少および抗アポトーシスタンパク質（ＸＩＡＰおよびＭｃｌ−１）の導入によって生存シグナルを提供する。ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激はまた、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３を増加させてＣＤ４０細胞質ドメインに結合する。
【０１７７】
以下の研究は、ＣＨＩＲ−１２．１２が、正常なヒトＢ細胞に影響するこれらの刺激の全てを直接阻害することを実証する。例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２処置は、時間用量依存性様式において、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰの切断の増加、ならびにＸＩＡＰおよびＭｃｌ−１の減少を生じ、Ｂ細胞のアポトーシスを回復させた。ＣＨＩＲ−１２．１２での処置はまた、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激に応答して、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）αおよびβ（ＮＦκＢ経路）、ＥＲＫ、Ａｋｔ、およびｐ３８のリン酸化を阻害した。さらに、ＣＨＩＲ−１２．１２は、最初のＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激なしに、これらのアポトーシス効果を引き起こさないことを見出した。
【０１７８】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、ＰＡＲＰの切断を誘導することによって、ＣＤ４０リガンドにより媒介された生存を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの０．６×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の純度（％））を、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧを添加した。０分、２０分、２時間、６時間、１８時間、および２６時間で細胞を回収した。細胞溶解物中の切断されたカスパーゼ−９、切断されたカスパーゼ−３、切断されたＰＡＲＰおよびβ−アクチンコントロールを、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１７９】
簡単に述べると、切断されたカスパーゼ−９、切断されたカスパーゼ−３、または切断されたＰＡＲＰの経時的な増加を生じなかったので、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０刺激が、生存シグナルを提供することを観察し、その細胞はアポトーシスを受けないことを示した。しかし、ＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、これらの切断生成物の増加を生じ、ＣＨＩＲ−１２．１２処理が、ＣＤ４０Ｌに刺激された正常なＢ細胞において、生存シグナルに関するＣＤ４０Ｌ結合の効果を排除し、Ｂ細胞のアポトーシスを回復することを示した（データは示さず）。
【０１８０】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、「生き残った」抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの０．６×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧを添加した。０分、２０分、２時間、６時間、１８時間、および２６時間において細胞を回収した。細胞溶解物中のＭｃｌ−１、ＸＩＡＰ、ＣＤ４０、およびβ−アクチンのコントロールを、ウエスタンブロットによって検出した。簡単に述べると、ｓＣＤ４０Ｌ刺激は、長期にわたるＭｃｌ−１およびＸＩＡＰの発現の持続を生じた。しかし、ＣＨＩＲ−１２．１２でのｓＣＤ４０Ｌで刺激した細胞の処理は、これらのタンパク質の発現の経時的な減少を生じた（データは示さず）。Ｍｃｌ−１およびＸＩＡＰは、アポトーシス経路を遮断し得る「生き残った」シグナルであるので、これらの結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２処理が、ｓＣＤ４０Ｌで刺激した正常なＢ細胞におけるアポトーシスに対する遮断を除くことを実証する。
【０１８１】
（ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、正常なＢ細胞において、ＩＫＫα（Ｓｅｒ  １８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ  １８１）のリン酸化を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの１．０×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧを添加した。０分および２０分において細胞を回収した。細胞溶解物中のリン酸化されたＩＫＫα（Ｓｅｒ
１８０）およびリン酸化されたＩＫＫβ（Ｓｅｒ  １８１）およびリン酸化された全ＩＫＫβのコントロールを、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１８２】
簡単に述べると、ｓＣＤ４０Ｌによる刺激は、ＩＫＫα（Ｓｅｒ  １８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ  １８１）の経時的なリン酸化を生じた；しかし、ＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、正常なＢ細胞において、ｓＣＤ４０Ｌ刺激に対するこの応答を排除した（データは示さず）。
【０１８３】
（ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、用量依存的様式でＣＤ４０リガンドによって媒介された生存を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの０．６×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧを添加した。２４時間において細胞を回収した。細胞溶解物中の切断されたＰＡＲＰ、およびβ−アクチンのコントロールを、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１８４】
簡単に述べると、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、用量依存的様式でｓＣＤ４０Ｌで刺激した細胞におけるＰＡＲＰ切断の増加を生じ、その結果、ｓＣＤ４０Ｌで刺激した正常なＢ細胞において、生存シグナル伝達経路を排除した（データは示さず）。
【０１８５】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、用量依存的様式で「生き残った」抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの０．６×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次いで、ＣＨＩＲ−１２．１２（０．５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧを添加した。２２時間において細胞を回収した。細胞溶解物中のＭｃｌ−１、ＸＩＡＰ、切断されたＰＡＲＰ、およびβ−アクチンのコントロールを、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１８６】
簡単に述べると、ＣＨＩＲ−１２．１２処理は、用量依存的様式でＭｃｌ−１およびＸＩＡＰの発現を減少させ、ｓＣＤ４０Ｌで刺激した細胞における切断されたＰＡＲＰ発現を増加し、その結果、ｓＣＤ４０Ｌで刺激した正常なＢ細胞において、アポトーシス経路に対するこれらの遮断を排除した（データは示さず）。
【０１８７】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、可溶性ＣＤ４０Ｌシグナル伝達がない場合、抗アポトーシスタンパク質（切断されたＰＡＲＰ、およびＸＩＡＰ）の発現に影響しなかった）
これらの実験において、健康なドナーからの１．０×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、ＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧのみで処理した（すなわち、抗体を添加する前に、細胞をｓＣＤ４０Ｌで前処理しなかった）。０時間、４時間、１４時間、および１６時間において細胞を回収した。細胞溶解物中のＸＩＡＰ、切断されたＰＡＲＰ、およびβ−アクチンのコントロールを、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１８８】
簡単に述べると、この結果は、ＩｇＧ処理のコントロール細胞およびＣＨＩＲ−１２．１２細胞の両方において、ｓＣＤ４０Ｌ刺激なしに、細胞が切断されたＰＡＲＰの濃度の上昇を表した一方で、ＸＩＡＰ発現は一定のままであることを示す（データは示さず）。これらのデータは、ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常なＢ細胞において、ＣＤ４０Ｌ刺激なしにアポトーシスを誘発しないことを示す。
【０１８９】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常なＢ細胞においてＩＫＫα（Ｓｅｒ  １８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ  １８１）、Ａｋｔ、ＥＲＫ、およびｐ３８のリン酸化を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの１．０×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１％ＦＢＳ含有培地において血清飢餓状態にし、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。この培養物をＣＨＩＲ−１２．１２（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）およびコントロールのＩｇＧで処理した。細胞を０分および２０分において回収した。細胞溶解物中のリン酸−ＩＫＫα、リン酸−ＩＫＫβ、全ＩＫＫβ、リン酸−ＥＲＫ、全ＥＲＫ、リン酸−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、リン酸−ｐ３８、および全ｐ３８を、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１９０】
簡単に述べると、ｓＣＤ４０Ｌ刺激は、ＩＫＫα／βリン酸化、ＥＲＫリン酸化、Ａｋｔリン酸化、およびｐ３８リン酸化の増加を生じ、従って、細胞の生存および／または増殖をもたらした。この細胞のＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、正常なＢ細胞においてこれらのシグナル伝達経路に関するｓＣＤ４０Ｌ刺激の効果を除去した（データは示さず）。
【０１９１】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、ＣＤ４０シグナル伝達カスケードにおいて、ＰＩ３ＫおよびＭＥＫ／ＥＲＫのような複数のシグナル伝達経路を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの１．０×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１％ＦＢＳ含有培地において血清を飢餓させ、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。この培養物をまた、ＣＨＩＲ−１２．１２（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）、Ｗｏｒｔｍａｎｉｎ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔインヒビター；１μＭおよび１０μＭ）、ＬＹ  ２９４００２（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔインヒビター；１０μＭおよび３０μＭ）およびＰＤ  ９８０９５（ＭＥＫインヒビター；１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌ）で処理した。細胞を０分および２０分において回収した。細胞溶解物中のリン酸−ＥＲＫ、リン酸−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、リン酸−ＩＫＫα／β、および全てを、ウエスタンブロットによって検出した。
【０１９２】
簡単に述べると、この結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２が、これらのシグナル伝達分子の全てのリン酸化を排除するのに対して、このシグナル伝達インヒビターは、シグナル伝達の特異的な排除のみを示したことを示し、ＣＨＩＲ−１２．１２は、おそらく、ＣＤ４０Ｌ刺激によって媒介されるこれらのシグナル伝達分子の上流を阻害することを示した（データは示さず）。
【０１９３】
（ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常なＢ細胞において、シグナル伝達分子ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３のＣＤ４０の細胞質ドメインへの結合を阻害する）
これらの実験において、健康なドナーからの４．０×１０６個の正常なヒトＢ細胞（８５〜９５％の間の純度（％））を、１％ＦＢＳ含有培地において４時間血清飢餓状態にし、１μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で２０分間刺激した。細胞を０分および２０分において回収した。ポリクローナル抗ＣＤ４０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）を使用してＣＤ４０を免疫沈降し、抗ＴＲＡＦ２  ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、抗ＴＲＡＦ３  ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、および抗ＣＤ４０  ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）を用いたウエスタンブロットにおいてプローブ化した。
【０１９４】
簡単に述べると、この結果は、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３は、ｓＣＤ４０Ｌ刺激の後、ＣＤ４０と共沈殿したことを示す。対称的に、ＣＨＩＲ−１２．１２での処理は、ｓＣＤ４０Ｌで刺激した正常なＢ細胞において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ２／３シグナル伝達複合体の形成を排除した。ＣＤ４０発現は変化しなかった（データは示さず）。
【０１９５】
理論に束縛されることなく、これらの実験の結果、および上に略述された実施例における結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体が固有の性質の組み合わせを有する二重作用（ｄｕａｌ  ａｃｔｉｏｎ）のアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であることを示す。この完全ヒトモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の生存および増殖に対する、ＣＤ４０Ｌ媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路を遮断する；このアンタゴニスト性は、最終的には細胞死をもたらす。ＣＨＩＲ−１２．１２はまた、エフェクター細胞による認識および結合を媒介し、抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を開始する。一旦ＣＨＩＲ−１２．１２がエフェクター細胞に結合されると、細胞溶解酵素が放出され、Ｂ細胞のアポトーシスおよび溶解をもたらす。ＣＨＩＲ−１２．１２は、前臨床腫瘍モデルにおいて比較した場合、リツキシマブよりもより強力な抗腫瘍抗体である。
【０１９６】
（実施例９：多発性骨髄腫動物モデルにおけるＣＨＩＲ−１２．１２の抗腫瘍活性）
合計３用量について週に１度腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された場合、ＣＨＩＲ−１２．１２は、用量依存的様式で、進行性の病期および発達段階ではない病期の多発性骨髄腫の成長を有意に阻害した。効能は、ボリテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））処置による抗体療法を組み合わせることによって、さらに改善され得る。
【０１９７】
（ＩＭ−９多発性骨髄腫の異種移植片モデル）
５０％ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ中のＩＭ−９腫瘍細胞（ＣＤ４０とＣＤ２０との両方を発現するヒト多発性骨髄腫細胞株）を、１匹のマウスにつき５×１０６個の細胞でＳＣＩＤマウスの皮下に接種した。発達段階ではない病期（ｕｎｓｔａｇｅｄ）のモデルにおいて、腫瘍移植の１日後に処置を開始した。進行性の病期モデルにおいて、腫瘍量が１５０〜２００ｍｍ３に達したときに、処置を開始した。週に１度、腫瘍を有するマウスに、示した用量で抗ＣＤ４０  ｍＡｂを腹腔内注射した。ログランク試験を使用してデータを分析した。
【０１９８】
発達段階ではない病期の状態の生存モデルにおいて、ＣＨＩＲ−１２．１２は、用量依存的様式で腫瘍を有するマウスの生存を有意に延長した。この生存は、それぞれ、５６日目において、０．１ｍｇ／ｋｇ  ＣＨＩＲ−１２．１２処置群において６０％の生存であり、１ｍｇ／ｋｇ  ＣＨＩＲ−１２．１２処置群および１０ｍｇ／ｋｇ  ＣＨＩＲ−１２．１２処置群において８０％の生存であった（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）（データは示さず）。コントロールＩｇＧ１の全ての動物、およびボルテゾミブ処置群を、腫瘍発症に関連する疾患に起因して１８日目と２６日目の間に安楽死させた。
【０１９９】
進行性の病期の皮下モデルにおいて、毎週０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇにおいて投与したＣＨＩＲ−１２．１２は、それぞれ１７％（ｐ＞０．０５；データは示さず）、３４％（ｐ＜０．０１；図Ａ）および４４％（ｐ＜０．００１；データは示さず）の腫瘍量の減少を伴って腫瘍成長を有意に阻害した。０．５ｍｇ／ｋｇにおいて週に２度試験した場合、ボルテゾミブは、腫瘍成長を阻害しなかった（データは示さず）。最大耐性量（ＭＴＤ）（週に２回の１ｍｇ／ｋｇ）において、ボルテゾミブは、図Ａに示すように、３０％まで腫瘍成長を阻害した（ｐ＜０．０１）。しかし、ＣＨＩＲ−１２．１２を、最大耐性用量のボルテゾミブと組み合わせて毎週投与した場合（１ｍｇ／ｍｌ）、５０％を超える腫瘍容量の減少を観察した（ｐ＜０．００１）。
【０２００】
要約すると、この抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２は、実験的多発性骨髄腫モデルにおいて、有意に腫瘍成長を阻害した。さらに、ボルテゾミブとのＣＨＩＲ−１２．１２の組み合わせは、全ての一回の単一治療を超えて効能を増大させる。これらのデータは、抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ＣＨＩＲ−１２．１２は、単独または他の化学療法剤と組み合わせのいずれかで、強力な抗腫瘍活性を有し、そして多発性骨髄腫の処置に対して臨床的に有効であることを示唆する。
【０２０１】
（実施例１０：５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２を用いた臨床研究）
（臨床の目的）
全体的な目的は、これらの癌細胞を抗ＣＤ４０  ＩｇＧ１で標的化することにより、多発性骨髄腫のための効果的な治療を提供することである。活性のいくつかの基準が、第Ｉ相において得られ得るにもかかわらず、この疾患についてのシグナルは、第ＩＩ相において決定される。最初は、薬剤を単剤として試験するが、開発が進むにつれ、他の薬剤、化学療法剤、および放射線療法と組み合わされる。
【０２０２】
（第Ｉ相）
・安全性および薬物動態を評価する−多発性骨髄腫を有する被験体における用量の段階的拡大。
・安全性、許容性、およびＣＤ４０の血清マーカーにおける変化に基づいて、用量を選択する。一般に、ＭＴＤが求められるが、他の効能の指標（ＣＤ４０＋多発性骨髄腫細胞の枯渇など）が、用量決定に適切であり得る。
・２以上の用量を考える。なぜならば、第ＩＩ相では、いくつかの用量決定が必須であり得るからである。
・患者に毎週投薬し、リアルタイム薬物動態学（Ｐｋ）のサンプリングをする。最初の４週のサイクルは、最大投薬を可能とする。Ｐｋは、疾患の状態、ＣＤ４０の密度などに依存して大きく変動し得る。
・この治験は、多発性骨髄腫を有する被験体に対して公開される。
・研究を中止するかまたは継続するかの決定は、安全性、用量、および抗腫瘍活性の予備的な評価に基づく。
・応答速度により決定された薬物の活性は、第ＩＩ相で決定される。
・第ＩＩ相のための用量を特定する。
【０２０３】
（第ＩＩ相）
１回または数回の治験を、多発性骨髄腫を有する被験体において開始する。２以上の用量、および２以上の計画が、無作為化された第ＩＩ相の設定において試験され得る。
【０２０４】
＊現行の標準的な医療が機能しない（化学療法による治療が機能しない）多発性骨髄腫の集団を対象とする
＊研究を中止するかまたは継続するかの決定は、第ＩＩ相における治療概念の証明に基づく
＊臨床上の効果の早期の指標として、代理マーカーが使用され得るか否かを決定する
＊第ＩＩＩ相のための用量を特定する。
【０２０５】
（第ＩＩＩ相）
第ＩＩＩ相は、第ＩＩ相においてシグナルがどこで検出されるか、そして、どのような競合する治療が標準的なものと考えられるかに依存する。標準的な治療が存在しない疾患の段階にシグナルがある場合、単群の、十分に制御された研究が、中心的な治験として機能し得る。標準的であると考えられる競合薬剤が存在する場合は、直接比較する研究が行なわれる。
【０２０６】
（実施例１１：アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体のための液体薬学的処方物）
本研究の目的は、この抗体についての最適な溶液環境を選択するために、生物物理学的方法および生化学的方法の両方により、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の安定性に対する溶液のｐＨの効果を調べることであった。示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）の結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２のコンホメーションの安定性が、ｐＨ５．５〜６．５を有する処方物において最適であることを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、およびカチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）分析の組み合わせに基づくと、ＣＨＩＲ−１２．１２の物理化学的な安定性は、ｐＨ約５．０〜５．５において最適である。これらの結果を鑑みて、この抗体を含有する１つの推奨される液体薬学的処方物は、約１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム中に処方された約２０ｍｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２を含有し、ｐＨ約５．５のｐＨを有する処方物である。
【０２０７】
（材料および方法）
処方物の研究において使用されるＣＨＩＲ−１２．１２抗体は、ＣＨＯ細胞培養手順により作製されたヒトモノクローナル抗体である。このＭＡｂは、１５０ｋＤａの分子量を有し、ジスルフィド結合により互いに連結された２つの軽鎖および２つの重鎖から構成される。この抗体は、種々の癌および自己免疫性／炎症性の疾患の処置のために、ＣＤ４０を発現する細胞（正常および悪性のＢ細胞を含む）上のＣＤ４０細胞表面レセプターに対して標的化される。
【０２０８】
この研究のために使用される抗ＣＤ４０薬物原料（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）は、ＣＨＯに由来する精製抗ＣＤ４０（ＣＨＩＲ−１２．１２）のバルクロットであった。この薬物原料の組成は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）中９．７ｍｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２抗体であった。この研究におけるコントロールサンプルは、一般に認められた薬物原料であり、その後、＜−６０℃にて凍結し、ＲＴで融解し、そして、所定の時点において、安定性サンプルとともに試験した。この安定性サンプルは、異なるｐＨ溶液に対する薬物原料の透析により調製したものであり、そして、各サンプルにおけるＣＨＩＲ−１２．１２の濃度を、表７に示すように、ＵＶ２８０により測定した。
【０２０９】
【表１０】
2011098989.tif 000011
種々の処方物におけるＣＨＩＲ−１２．１２抗体の物理化学的安定性を、以下のプロトコルを用いてアッセイした。
【０２１０】
（示差走査熱量測定法（ＤＳＣ））
異なる処方のサンプルのコンホメーションの安定性を、１℃／分で、１５℃から９０℃まで加熱しながら、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−ＤＳＣを用いてモニターした。
【０２１１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
分解（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および凝集を、非還元条件および還元条件下で、４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルを用いて評価した。タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色により検出した。
【０２１２】
（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ））
タンパク質の分解および凝集をまた、０．７ｍｌ／分の流速で、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を移動相として用いて、Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  ３０００ＳＷＸＬカラムを備えるＷａｔｅｒ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣにより測定した。
【０２１３】
（カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ））
０．５ｍｌ／分の流速で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を移動相Ａとして、そして、５００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を移動相Ｂとして用いて、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０カラムを備える、Ｗａｔｅｒｓ  ６００ｓ  ＨＰＬＣシステムを使用して、分解に関連する電荷の交換を測定した。
【０２１４】
（結果および考察）
（コンホメーション安定性研究）
ＣＨＩＲ−１２．１２の熱によるアンフォールディングは、少なくとも２つの熱遷移（ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を明らかにし、おそらく、それぞれ、ＦａｂドメインおよびＦｃドメインのアンフォールディング融解を表す。高温では、タンパク質は、おそらく凝集して、ＤＳＣシグナルの喪失をもたらした。処方物のスクリーニングの目的で、最も低い熱遷移温度を、この研究において、融点Ｔｍとして規定した。図６は、処方物のｐＨの関数としての熱融点を示す。ｐＨ５．５〜６．５の処方物は、より高い熱融点により実証されるように、より高いコンホメーション安定性を有する抗ＣＤ４０を提供した。
【０２１５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
ｐＨ４．５〜９．０のＣＨＩＲ−１２．１２処方物サンプルを、４０℃にて２ヶ月インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した（データ示さず）。非還元条件下では、ｐＨ５．５を上回る処方物において、２３ｋＤａおよび２７ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する種が観察され、そして、全ての処方物において、５１ｋＤａのＭＷを有する種が観察されたが、ｐＨ５．０〜５．５においては少ないようであった。１００ｋＤａのＭＷを有する種が、ｐＨ７．５およびｐＨ９．０において見られ得た。
【０２１６】
還元条件下では、ＣＨＩＲ−１２．１２は、それぞれ、５０ｋＤａのＭＷおよび２４ｋＤａのＭＷを有する、遊離重鎖および遊離軽鎖に還元された。１００ｋＤａの種は、完全には還元性ではなく、そして、溶液のｐＨの上昇に伴って増加するようであり、非ジスルフィド共有結合が、この分子において生じている可能性を示唆する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて未知の正体を有する他の種が存在しなかったので、各処方物の安定性の比較は、残存するＣＨＩＲ−１２．１２の純度に基づく。ｐＨ５．０〜６．０の処方物は、ＣＨＩＲ−１２．１２に対して、より安定な環境を提供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、わずかな凝集が検出された（データ示さず）。
【０２１７】
（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、主ピーク種としてインタクトなＣＨＩＲ−１２．１２を、主ピーク種とは別個の前ピーク種として凝集種を、主ピーク種の後にあるショルダー状のピークとして大きなフラグメントの種を検出し、そして、小さなフラグメントの種が、主ピーク後の種として検出された。５℃および２５℃で３ヶ月インキュベートした後、無視できる量（＜１．０％）のタンパク質のフラグメントおよび凝集が、上記処方物中で検出され、そして、ＣＨＩＲ−１２．１２主ピーク種は、９９％以上純粋なままであった（データ示さず）。しかし、タンパク質のフラグメントは、４０℃で保存すると、次第に進展し、表８に示すように、ｐＨ４．５およびｐＨ６．５〜９．０においては、より多くのフラグメントが形成された。ＣＨＩＲ−１２．１２処方物を４０℃にて３ヶ月間インキュベートした後、約２〜３％の凝集が、ｐＨ７．５およびｐＨ９．０において検出されたが、他のｐＨの処方物においては、１％未満の凝集が検出された（データ示さず）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果は、ＣＨＩＲ−１２．１２が、ｐＨ約５．０〜６．０においてより安定であることを示す。
【０２１８】
【表１１】
2011098989.tif 000012
（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析）
ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析は、インタクトなＣＨＩＲ−１２．１２を主ピーク種として検出し、酸性改変体は、主ピーク種よりも速く溶出し、そして、Ｃ末端リジン付加改変体は、主ピーク後の種として溶出した。表９は、残存する主ピークＣＨＩＲ−１２．１２種および酸性改変体の百分率の、溶液のｐＨに対する依存性を示す。コントロールサンプルは、すでに、高い度合の酸性種（約３３％）を含んでおり、おそらくこれは、初期段階での発酵および精製のプロセスに起因するものである。より高いｐＨ溶液に対するＣＨＩＲ−１２．１２の感受性は、２つの事実により証明される。第一に、ｐＨ９．０（ｔ＝０）の最初の処方物サンプルは、すでに、コントロールよりも１２％多い酸性種を生じていた。第二に、酸性種の百分率は、ｐＨの増加に伴って急に増加した。電荷の変化に関連する分解は、脱アミド化に起因するようである。上記のデータは、ＣＨＩＲ−１２．１２のこの型の分解が、ｐＨ約５．０〜５．５において最小であったことを示す。
【０２１９】
【表１２】
2011098989.tif 000013
（結論）
ｐＨは、ＣＨＩＲ−１２．１２のコンホメーションおよび物理化学的な安定性に有意な効果を有する。電荷の変化に関連する分解は、ＣＨＩＲ−１２．１２についての主な分解経路であると決定され、これは、ｐＨ５．０〜５．５において最小であった。全体的な安定性のデータに基づいて、この抗体を含有する１つの推奨される液体薬学的処方物は、約１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム中に処方された約２０ｍｇ／ｍｌのＣＨＩＲ−１２．１２を含有し、ｐＨ約５．５のｐＨを有する処方物である。
【０２２０】
本明細書中に示される本発明の多くの改変および他の実施形態は、上述の明細書および添付の図面に提示される教示を利用して、本発明が属する分野の当業者に想到される。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されないこと、そして、改変および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲および本明細書中に開示される実施形態一覧の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書において使用されるが、これらは、一般的かつ説明的な意味のみで使用されているのであり、制限する目的で使用されているわけではない。
【０２２１】
明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示している。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるのと同じ程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【０２２２】
【表１３−１】
2011098989.tif 000014
【０２２３】
【表１３−２】
2011098989.tif 000015
【０２２４】
【表１３−３】
2011098989.tif 000016
【図１】
2011098989.tif 000017
【図２】
2011098989.tif 000018
【図３】
2011098989.tif 000019
【図４−１】
2011098989.tif 000020
【図４−２】
2011098989.tif 000021
【図５】
2011098989.tif 000022
【図６】
2011098989.tif 000023
【配列表】
2011098989000001.app
【外国語明細書】
2011098989000001.pdf