(57)【要約】【目的】自動分析装置を用いて，乳酸脱水素酵素のアイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ５）活性を簡便に求める．【構成】各アイソザイム測定用試薬を密封したカートリッジに入れ，その各液量を１ｍｌから，最大１０ｍｌとし，液量を増量する場合は，各測定試薬の濃度を増す．【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸脱水素酵素（ＬＤ）のアイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ５）を測定する自動分析装置において，ＬＤ１〜ＬＤ５の測定のための試薬液はそれぞれカートリッジに納められ，通常処方による測定試薬濃度の場合を最少液量とし，カートリッジ内の試薬液量を増加させる場合は，試薬濃度を増加させることとし，しかも液量は１〜１０ｍｌの間にあることを特徴とする乳酸脱水素酵素アイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ５）測定方法．
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は，試薬を自動的に吸引，混合，定量を行う自動分析装置において，乳酸脱水素酵素のアイソザイムの測定を，ｐＨを変えた５種類の緩衝液を用いて行うための試薬部分に特徴をもたせ，乳酸脱水素酵素アイソザイムを測定できる方法に関する．
【技術背景】
【０００２】従来から，乳酸脱水素酵素のアイソザイムは，電気泳動法と吸光濃度測定装置（デンシトメーター）によって測定されている．この方法では，電気泳動膜への試料の塗布，電気泳動，活性染色，デンシトメトリー（吸光濃度測定）の作業が必要で，すべて手作業によるもので大変煩雑であり，かつ迅速な測定ができないという問題がある．
【０００３】上記の問題を解決するためにｐＨ値を変えた５種類の緩衝液で，試料中の酵素活性を測定し，得られた結果から連立方程式を用いてアイソザイムの測定を電気泳動法および吸光濃度測定装置を用いないで行うことができる（下記非特許文献１参照）．この方法を用いて，ｐＨ値を変えた５種類の緩衝液を作製し，汎用の自動分析装置に適用することで簡便・迅速な測定ができる（下記非特許文献２参照）．しかし，この方法では，調製した試薬は，試薬瓶に入った状態で置かれるため，試薬のｐＨ値が空気中の二酸化炭素を吸収して変化することにより，安定した測定値を得ることができない問題がある．
【０００４】
【非特許文献１】山内淳一ら．酵素活性測定の基礎．臨床病理．特集５５号．１−２２，１９８３．
【非特許文献２】白田忠雄ら．超微量分析装置ＪＣＡ−ＢＭ１６５０の応用測定−ＬＤアイソザイムの測定，日本臨床検査自動化学会会誌．２５（４）：６０４，２０００．
【発明が解決しようとしている課題】
【０００５】本発明は，試薬のｐＨ値を小数点以下第２位まで安定に保つ方法を提供することを目的とするものである．
【課題を解決するための手段】
【０００６】本発明は，基本的には，調製した試薬を大気に直接触れない専用容器に封入することで，使用時まで試薬を大気から遮断することでき，安定なｐＨ値の試薬を提供できる．しかし，いったん開封し，測定を行い，その残液を保存している間にｐＨが変化してしまう．
【０００７】（１）上記の課題を解決するために，本発明の試薬は，調製した試薬を，溶液のまま少量を専用容器（カートリッジ）に封入する．
（２）上記の課題を解決するために，本発明の試薬は，使用時の濃度より高い濃度に調製した試薬を，溶液のまま専用容器（カートリッジ）に封入する．
【０００８】（１）と（２）をそれぞれ別個にではなく，溶液量を少なくして試薬濃度を減らすか，溶液量をなくして試薬濃度を濃くすることにより，様々な問題を解決した．
【０００９】（３）上記の課題を解決するために，本発明の試薬は，溶解時に所定の濃度になるように試薬を粉末状態に調製したものを，粉末状のまま専用容器（カートリッジ）に封入する．これで安定なｐＨ値の試薬が提供できる．
【発明の効果】
【００１０】すなわち，本発明によれば，電気泳動法および吸光濃度測定装置による煩雑な手段を用いないで，汎用の自動分析装置で乳酸脱水素酵素のアイソザイムの測定が，簡便・迅速に行うことができる．
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】図面１は，本発明の試薬カートリッジの基本構成を表す概略図である．図面１に示されるとおり，本発明の試薬は，溶液または粉末状で専用容器に封入されて，気密性に富んでおり，使用時に開封する．粉末状のものは，開封したら，水を所定量入れて，混ぜる．【００１２】図面１の▲１▼はカートリッジの専用容器で，気密性に富んだ材質である．▲２▼はシールで，カートリッジを封じるもの．装置の試薬ノズルの挿入で，穴が容易に開く材質である．【００１３】試薬の部分が，溶液状態の場合は、実施例１に記載の通常処方による試薬［通常処方とは，これを典型例とし，現在，一般的に用いられている処方すべてを含む］を用いる場合の液量をおよそ１ｍｌとし，試薬を２倍に濃くした場合約５ｍｌ，３倍に濃くした場合は約１０ｍｌというように，液量に応じて濃度を増加させる．【００１４】試薬が，粉末の場合，上述になるように水の量を加減するか、試薬量を少なめ，多め，などと充てん量を変えておく．【００１５】試薬の部分が，粉末状態で複数回のみの使用の場合は，試薬は，高濃度の状態で使用に十分な量を封入し，使用後は容器を廃棄する．【００１６】本発明の試薬カートリッジの製造方法は，気密性に富んだ材質による容器に，所定の量の試薬（溶液または粉末）を入れ，シールで蓋をする．【００１７】次に、ＬＤ１〜ＬＤ５の求め方を記すと，
（１）検量線を作成する．すなわちあらかじめ乳酸脱水素酵素（ＬＤ）の総活性値が既知の検量用試料を測定して吸光度を求め，総活性値と吸光度の関係を検量係数として設定する．この総括性値を求める試薬は，本発明のカートリッジと
（２）しないで，ＬＤ１〜ＬＤ５とは別に設けて設定してもよいし，本発明のようなカートリッジ式にして別個にしてもよいし，ＬＤ５のカートリッジを共用してもよい．【００１８】（３）乳酸脱水素酵素（ＬＤ）のアイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ４，ＬＤ１〜ＬＤ３，ＬＤ１〜ＬＤ２，ＬＤ１）測定用のそれぞれの試薬を用いた活性測定の検量線は，上記（１）の検量係数を用いる．【００１９】（４）上記で得られた各ｐＨ値による試薬でのＬＤ活性値を用いて，連立方程式を立てる．【００２０】（５）患者血清などの被測定試料をｐＨ値の異なる５種類の試薬で活性測定を行い得られた活性値を上記（３）の式にそれぞれ代入してＬＤ１〜ＬＤ５の活性値および相対パーセント値を求める．【００２１】以下に通常処方による測定試薬の調製法を記す．本発明では，これを基本に液量に応じて２倍，３倍濃度を調製する．ただし，基質は一定とし，緩衝液のみ２倍，３倍としてもよい．
（ア）乳酸脱水素酵素（ＬＤ）の総活性用の基質緩衝液は，Ｌ−乳酸塩（和光純薬工業社製）５１ｍｍｏｌ／Ｌと緩衝液をジエタノールアミン（和光純薬工業社製）と塩酸（和光純薬工業社製）を用いてｐＨを８．８０にしたもの．緩衝液中のジエタノールアミンの濃度は３６０ｍｍｏｌ／Ｌである．反応中の濃度は，Ｌ−乳酸塩は６０ｍｍｏｌ／Ｌ，ジエタノールアミンは３００ｍｍｏｌ／Ｌである．【００２２】（イ）乳酸脱水素酵素アイソザイムＬＤ１〜ＬＤ４測定用の基質緩衝液は，Ｌ−乳酸塩（和光純薬工業社製）５１．５ｍｍｏｌ／Ｌと緩衝液をＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（和光純薬工業社製）と水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）を用いてｐＨを９．４０にしたもの．緩衝液中のＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸の濃度は２０６ｍｍｏｌ／Ｌである．反応中の濃度は，Ｌ−乳酸塩は４０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸は１６０ｍｍｏｌ／Ｌである．【００２３】（ウ）乳酸脱水素酵素アイソザイムＬＤ１〜ＬＤ３測定用の基質緩衝液は，Ｌ−乳酸塩（和光純薬工業社製）５１．５ｍｍｏｌ／Ｌと緩衝液をＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（和光純薬工業社製）と水酸化ナトリウム（和光純薬業社製）を用いてｐＨを９．８０にしたもの．緩衝液中のＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸の濃度は２０６ｍｍｏｌ／Ｌである．反応中の濃度は，Ｌ−乳酸塩は４０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸は１６０ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２４】（エ）乳酸脱水素酵素アイソザイムＬＤ１〜ＬＤ２測定用の基質緩衝液は，Ｌ−乳酸塩（和光純薬工業社製）５１．５ｍｍｏｌ／Ｌと緩衝液をＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（和光純薬工業社製）と水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）を用いてｐＨを１０．２５にしたもの．緩衝液中のＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸の濃度は２０６ｍｍｏｌ／Ｌである．反応中の濃度は，Ｌ−乳酸塩は４０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸は１６０ｍｍｏｌ／Ｌである．【００２５】（オ）乳酸脱水素酵素アイソザイムＬＤ１測定用の基質緩衝液は，Ｌ−乳酸塩（和光純薬工業社製）５１．５ｍｍｏｌ／Ｌと緩衝液をＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（和光純薬工業社製）と水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）を用いてｐＨを１０．６０にしたもの．緩衝液中のＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸の濃度は２０６ｍｍｏｌ／Ｌである．反応中の濃度は，Ｌ−乳酸塩は４０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸は１６０ｍｍｏｌ／Ｌである．【００２６】（カ）反応開始液は，補酵素β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（和光純薬工業社製）の２５．７５ｍｍｏｌ／Ｌの水溶液である．反応中の濃度は２０ｍｍｏｌ／Ｌである．【００２７】（キ）分析装置ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子社製）の汎用の自動分析装置を用いたときの測定に用いる試料の量と試薬の量は，乳酸脱水素酵素（ＬＤ）の総活性測定用は，試料量は２μＬ，試薬の基質緩衝液量は８０μＬ，補酵素液量は２０μＬである．【００２８】（ク）分析装置ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子社製）の汎用の自動分析装置を用いたときの測定に用いる試料の量と試薬の量は，乳酸脱水素酵素（ＬＤ）アイソザイム測定用は，試料量は３μＬ，試薬の基質緩衝液量は８０μＬ，補酵素液量は２０μＬである．
【産業上の利用可能性】
【００２９】本発明の専用カートリッジを用いる乳酸脱水素酵素アイソザイムの測定は，汎用の自動分析装置に適用可能であり，簡便・迅速に行うことができる．得られた結果を用いることで，病態の識別および診断を迅速に行うことができる．
【図面の簡単な説明】
【００３０】図面１はカートリッジの正面図である．▲１▼は空間，▲２▼は試薬，▲３▼は密封シール．【００３１】図面２は，本発明のカートリッジを組み込んだ自動分析装置の基本構成を表す概略図である．装置側には，２本の専用ノズルがある．▲１▼は，サンプリングノズルで，測定試料の血清の一定量を採取し，装置の反応管に吐き出すもの．▲２▼は，試薬ノズルで，カートリッジに入った試薬の一定量を採取し，装置の反応管テーブルにある反応管に吐き出すもの．▲４▼〜▲９▼はカートリッジで，反応に用いる試薬が入っている。▲４▼は乳酸脱水素酵素（ＬＤ）の総活性を測定する乳酸と緩衝液が入ったもの．▲５▼〜▲８▼は乳酸脱水素酵素（ＬＤ）のアイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ４，ＬＤ１〜ＬＤ３，ＬＤ１〜ＬＤ２，ＬＤ１）測定用の乳酸とｐＨの異なる緩衝液（基質緩衝液）が入ったもので，▲５▼はＬＤ１〜ＬＤ４測定用，▲６▼はＬＤ１〜ＬＤ３測定用，▲７▼はＬＤ１〜ＬＤ２測定用，▲８▼はＬＤ１測定用である。【００３２】▲９▼は反応の開始に用いる補酵素（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）液である．▲１０▼は反応テーブルで，▲１１▼の反応管が数十本装着されている．▲１１▼の反応管は，３７℃の保温されている．反応は，▲１１▼の反応管に，▲３▼の血清試料の一定量を▲１▼のサンプリングノズルで採取し，▲１１▼の所定の反応管に吐出する．▲２▼の試薬ノズルで▲４▼の試薬（基質緩衝液）の一定量を採取し，▲１１▼の血清試料が入った反応管に分注する．一定時間後に，▲２▼の試薬ノズルで▲９▼の試薬（補酵素液）の一定量を採取し，▲１１▼の血清試料と▲４▼の試薬（基質緩衝液）が入った反応管に分注して反応を行う．一定時間後に，反応の大きさを３４０ｎｍの波長の光を反応管に当て，反応で生成する補酵素（ＮＡＤＨ）の吸光度の大きさを測定する．【００３３】測定した吸光度の大きさから，乳酸脱水素酵素の総活性を算出する．▲４▼の代わりに▲５▼〜▲８▼について同様な操作を行い，乳酸脱水素酵素（ＬＤ）のアイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ４，ＬＤ１〜ＬＤ３，ＬＤ１〜ＬＤ２，ＬＤ１）の活性をそれぞれ測定する．得られた総活性と乳酸脱水素酵素（ＬＤ）のアイソザイム（ＬＤ１〜ＬＤ４，ＬＤ１〜ＬＤ３，ＬＤ１〜ＬＤ２，ＬＤ１）の活性から，連立方程式により，乳酸脱水素酵素（ＬＤ）のアイソザイム（ＬＤ１，ＬＤ２，ＬＤ３，ＬＤ４，ＬＤ５）をそれぞれ算出する．
【実施例】
【００３４】ヒトプール血清について，［００２１］〜［００２８］の通常処方の試薬液１ｍｌの場合，通常処方濃度の２倍試薬４ｍｌの場合のカートリッジをセットし、ＪＣＡ−ＢＭ１６５０を用いてＬＤ１〜ＬＤ５を測定した．その結果を表に示す．
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月6日(2010.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
【図１】本発明のカートリッジの正面図である。符号１は空間、２は試薬、３は密封シールである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【図２】本発明のカートリッジを組み込んだ自動分析装置の基本構成を表す概略図である。符号１はサンプルノズルであり、測定試料の血清の一定量を採取し、装置の反応管に吐き出す。２は試薬ノズルであり、カートリッジに入った試薬の一定量を採取し、装置の反応管テーブルにある反応管に吐き出す。３はサンプル管であり、測定試料の血清を入れるもの。４は乳酸脱水素酵素（ＬＤ）の総活性を測定する乳酸と緩衝液が入ったカートリッジ。５はＬＤのアイソザイムＬＤ１〜ＬＤ４測定用の乳酸とｐＨ緩衝液が入ったカートリッジ。６はＬＤのアイソザイムＬＤ１〜ＬＤ３測定用の乳酸とｐＨ緩衝液が入ったカートリッジ。７はＬＤのアイソザイムＬＤ１〜ＬＤ２測定用の乳酸とｐＨ緩衝液が入ったカートリッジ。８はＬＤ１測定用の乳酸とｐＨ緩衝液が入ったカートリッジである。