(57)【要約】【課題】  試料中の標的ＲＮＡを迅速、簡便、高感度に測定すること。【解決手段】（１）標的ＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーションにより、捕捉プローブを通じて標的ＲＮＡを固体支持体に結合する工程、（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により捕捉された標的ＲＮＡとＤＮＡプローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し、標的ＲＮＡを捕捉プローブから分離する工程、及び、（３）分離したＲＮＡを増幅・測定する工程からなる、ＲＮＡの測定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の各工程からなる、ＲＮＡの測定方法。
（１）標的ＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーションにより、捕捉プローブを通じて標的ＲＮＡを固体支持体に結合する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により捕捉された標的ＲＮＡとＤＮＡプローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し、標的ＲＮＡを捕捉プローブから分離する工程、及び、
（３）分離したＲＮＡを増幅・測定する工程。
【請求項２】
前記ＲＮＡの増幅が以下各工程からなることを特徴とする、請求項１のＲＮＡの測定方法。
（１）分離した標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二又は第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、及び
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程。
【請求項３】
前記捕捉プローブが前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的なオリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ  Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断することを特徴とする請求項１又は２に記載のＲＮＡの測定方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ転写産物量の測定が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする請求項１から３に記載のＲＮＡの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在するＲＮＡを簡便かつ迅速に測定するための方法に関し、詳しくは、当該ＲＮＡの固体支持体への捕捉及び断片化による遊離の後、断片化された当該ＲＮＡを測定することからなる、臨床検査、公衆衛生、食品検査の分野で有用なＲＮＡの測定方法である。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、公衆衛生、食品検査の分野では、試料中に含まれる細胞、細菌、真菌、ウイルス等のＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を測定するための検査が実施される。試料中に含まれる標的ＲＮＡは微量であるため、検査では標的ＲＮＡを増幅するのが普通であるが、そのためには試料から標的ＲＮＡを抽出し精製する操作（前処理）が必要となる。
【０００３】
標的ＲＮＡの前処理には、ＡＧＰＣ法（非特許文献１）、ＢＯＯＭ法（特許文献１）、固体支持体を用いる捕捉法（標的ＲＮＡにハイブリダイズするプローブを固定化した固体支持体と試料を接触させて標的ＲＮＡのみを捕捉する方法、特許文献２）等がある。特に、固体支持体を用いる捕捉法は、標的ＲＮＡのみを精製することができ、有用である。ただし、ＲＮＡは二次構造を形成しやすく、その影響で、前記プローブがハイブリダイズする標的ＲＮＡの位置によっては、ハイブリダイゼーション効率が低下し、回収量が著しく低下するという問題があった。
【０００４】
ＲＮＡの増幅法には、逆転写（ＲＴ）反応を行い、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成した後、該ＤＮＡ鎖を鋳型としてＰＣＲ反応を行なうＲＴ−ＰＣＲ法や、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３及び４）及びＴＭＡ法（特許文献５）のように、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法が知られている。しかし、前者は、一般的には逆転写（ＲＴ）工程及びＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、コンタミネーションの危険性をも増加させることになる。また、コンタミネーションの危険性が極めて高い操作である、増幅産物の電気泳動による測定操作が必要である。さらに、前記ＲＴ工程及びＰＣＲ工程、さらには増幅産物の測定工程を合わせると通例４から５時間以上の時間を要し、迅速であるとはいえず、また、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程で、ＴａｑＭａｎプローブといったハイブリダイゼーションプローブを用いるＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法も提案されている。この方法では、ＰＣＲ工程と増幅産物の測定工程が同時に行なわれるため、増幅産物の電気泳動によるコンタミネーションリスクを回避し、かつ、検査時間の短縮を実現した優れた測定方法である。しかし、該方法でも一般的にはＲＴ工程及びＰＣＲ工程の二段階の工程が必要であり、操作の煩雑性とコンタミネーションのリスクが完全に解決されてはいない。また、検査時間は短縮できるものの、ＲＴ工程及びＰＣＲ工程を合わせると通例３時間以上の時間を要し、迅速検査とはいえない。
【０００５】
これに対して後者（ＲＮＡのみを増幅する方法）は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動又は測定可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法等により増幅されたＲＮＡを測定する。この方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法等による測定は煩雑な操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。また、結果が出るまでに通常、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ共に９０分以上必要であり、迅速な結果を得るには至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に変性のための加温（例えば、６５℃）が必要であり（特許文献４実施例１及び特許文献５実施例１に記載）、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許２６８０４６２号公報
【特許文献２】特許２８１７９２６号公報
【特許文献３】特許２６５０１５９号公報
【特許文献４】特許３１５２９２７号公報
【特許文献５】特許３２４１７１７号公報
【特許文献６】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献７】特開２００１−３７５００号公報
【特許文献８】特開２００１−３５３０００号公報
【特許文献９】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献１０】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９．
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，１２４７−１２５２．
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
臨床検査、公衆衛生、食品検査の分野では試料中のＲＮＡを抽出・精製し、増幅操作を行った後、測定操作を行う遺伝子検査が実施されている。前述したＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡに適しているが、ハイブリダイゼーション法等による測定は煩雑な操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。また、結果が出るまでに、通常、ＮＡＳＢＡ法及びＴＭＡ法では９０分以上必要であり、迅速に測定結果を得るには至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に変性のための加温（例えば、６５℃）が必要であり（特許文献４（実施例１）及び特許文献５（実施例１）参照）、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっている。
【０００９】
一定温度・一段階でＲＮＡを増幅・測定する他の方法として、ＴＲＣ法（特許文献６から８、非特許文献２）が挙げられる。当該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって、蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、前記ＲＮＡ増幅法を実施し、蛍光特性の変化を測定するものである。さらに、切断用オリゴヌクレオチド及びＲＮａｓｅＨ活性を有した酵素により、標的ＲＮＡを切断し、標的ＲＮＡの高次構造形成を抑制するのに加え、プライマー等の結合領域を標的ＲＮＡの（二次構造を計算して推定した）高次構造フリー領域に設定することで、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅及び測定を、同時にかつ迅速（３０分以内）・簡便に実施することが可能である（非特許文献２）。
【００１０】
ＴＲＣ法は、以上に述べてきたＲＮＡ測定法の中で、迅速性、簡便性、信頼性の点から、特に好適な方法といえる。しかし、ＴＲＣ法は、比較的低温度（３５から６０℃）の一定温度で実施し、変性工程をまったく行わないため、前述したＡＧＰＣ法（非特許文献１）、ＢＯＯＭ法（特許文献１）で抽出・精製されたＲＮＡを増幅・測定する場合、多量に含まれる非標的ＲＮＡの競合阻害の影響で、標的ＲＮＡに対する測定感度が低下してしまうという課題があった。
【００１１】
従って本発明は、ＲＮＡの高次構造の影響を軽減しつつ、簡便に試料中の標的ＲＮＡを非標的ＲＮＡが含まれないように抽出・精製する前処理し、迅速かつ高感度なＲＮＡの測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＲＮＡの高次構造の影響を軽減しつつ、簡便に試料中の標的ＲＮＡを非標的ＲＮＡが含まれないように抽出・精製する前処理することにより、迅速かつ高感度なＲＮＡの測定方法を実現するに至った。かかる課題を解決した本発明は、以下の各工程からなる、ＲＮＡの測定方法である。以下に本発明を詳細に説明する。
（１）標的ＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーションにより、捕捉プローブを通じて標的ＲＮＡを固体支持体に結合する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により捕捉された標的ＲＮＡとＤＮＡプローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し、標的ＲＮＡを捕捉プローブから分離する工程、及び、
（３）分離したＲＮＡを増幅・測定する工程。
【００１３】
本発明中の試料とは、食品、飲料水、環境水、糞便及び嘔吐物、鼻腔及び咽頭等のぬぐい液、血液、その他の分泌液、体液、組織洗浄液等である。
【００１４】
本発明中の特定塩基配列とは、標的ＲＮＡ、即ち測定されるべきＲＮＡ上に存在する部分で、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列と相同なＲＮＡ又はＤＮＡの塩基配列をいう。すなわち、本発明では前記特定塩基配列又はその相補配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖又はアンチセンス鎖に特定塩基配列を有する。また、本発明中の部分配列とは、標的ＲＮＡ上で、前記特定塩基配列を含まない塩基配列を意味する。
【００１５】
本発明中の捕捉プローブとは、標的ＲＮＡの部分配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なＤＮＡプローブをいう。捕捉プローブと固体支持体の結合にはビオチン/アビジン又はストレプトアビジン、アミノ基/カルボキシル基等の反応が使用可能であるが、ビオチン/アビジン又はストレプトアビジンの反応による結合が好ましい。ここで、固体支持体は、ラテックスビーズ、ガラスビーズ等の使用可能であるが、自動化、簡便化の点から磁性ビーズの使用が好ましい。
【００１６】
ストリンジェントな条件とは特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム等といった条件下においてハイブリダイズ可能であることを意味する。
【００１７】
本発明の（１）の工程では、標的ＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーションにより、捕捉プローブを通じて標的ＲＮＡが固体支持体に結合する。捕捉プローブは、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションに先だって固体支持体に結合していても良いし、その最中に固体支持体に結合しても良いし、又は、ハイブリダイゼーション後に固体支持体に結合しても良い。例えば、ビオチンを結合した捕捉プローブと標的ＲＮＡとを混合してまずハイブリダイゼーションさせ、後にアビジンを結合した固体指示体を加える等とすることが例示できる。以上の（１）の工程を終了した段階で、少なくとも固体支持体を試料から分離し、好ましくは適当な緩衝液で洗浄して非標的ＲＮＡが固体支持体に共存しないようにする。かかる非標的ＲＮＡが混入すると、標的ＲＮＡの測定感度が低下するからである。
【００１８】
上記したハイブリダイゼーションの工程に先立ち、本発明では、好ましくは標的ＲＮＡを後の増幅や検出の操作の支障にならない範囲で断片化するものである。断片化の処理としては、例えばアルカリ加水分解処理による断片化が例示できる。具体的には、ｐＨ９から１２の溶液中で標的ＲＮＡを断片化する方法が例示できる（特許第３１７８０１４号参照）。なお、断片化の度合いはアルカリ溶液のｐＨや温度によって調節が可能であり、標的ＲＮＡの長さによってアルカリ溶液のｐＨ、温度を任意に設定して断片化を行うことができる。このように、標的ＲＮＡを予め断片化しておくことにより、標的ＲＮＡを捕捉プローブとハイブリダイゼーションした場合に、標的ＲＮＡが高次構造を形成し、後の増幅操作の際のプライマーの結合を妨げるといった減少を抑制し、プライマーを標的ＲＮＡに容易に結合させて増幅効率を向上し、結果的に測定感度の向上を図ることが可能となる。
【００１９】
続く（２）の工程では、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により捕捉された標的ＲＮＡとＤＮＡプローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し、標的ＲＮＡを捕捉プローブから分離する。リボヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素等を例示することができる。またこの酵素は、後述する増幅操作で使用する「リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素」の役割も担わせることが可能である。
【００２０】
本発明の（３）の工程は、上記（２）で分離した標的ＲＮＡを増幅し測定する工程である。標的ＲＮＡの増幅法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣ等の種々の増幅方法が使用可能であり、特に限定されないが、ＤＮＡの混入があったとしても標的ＲＮＡの増幅が影響を受けず、しかも一定温度で実施可能なＲＮＡ増幅法であるＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣ等が好ましい。そこで、本発明の実施の具体的な一態様を説明すると、（ａ）分離した標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（ｂ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、（ｃ）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第二又は第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、（ｄ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、及び、（ｅ）該ＲＮＡ転写産物が、前記（ａ）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程とを含む、というものである。
【００２１】
上記の具体的態様において、ＲＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は特定のプロモーター配列が既知のものなら特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用されるバクテリアファージ由来の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ等を使用することが例示できる。そして当然のことであるが、前記プロモーター配列としては、前記ＲＮＡポリメラーゼに対応するプロモーター配列を使用することになる。なおプロモーター配列には、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域が付加されていても良い。本発明の増幅のために使用する酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素））は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。例えば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、及び１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素が知られている。例えば、分子生物学的実験で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素又はこれらの誘導体が好ましい酵素として例示できるが、中でもＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。当該酵素にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足すること等も可能である。
【００２２】
上記した増幅において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合は、標的ＲＮＡは、その特定塩基配列の前記５’末端部位で切断されていることが好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成するからである。この目的のため、例えば、前記した捕捉プローブとは異なる切断用プローブを投入し、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により標的ＲＮＡと切断用プローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し、標的ＲＮＡを所定の位置で切断することが例示できるが、より好ましくは、捕捉用プローブを切断用プローブとして使用することである。即ち、固体支持体へ捕捉した標的ＲＮＡはリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素によって分解して遊離させるのであるから、標的ＲＮＡをその特定塩基配列の前記５’末端部位で切断できる捕捉用プローブを用いれば、固体支持体からの遊離の際、同時に、プロモーター配列が付加された第一のプライマーを使用する場合に必要な標的ＲＮＡの切断が完了することになる。
【００２３】
試料中の標的ＲＮＡと捕捉プローブを接触させ、標的ＲＮＡを固体支持体に捕捉し、該標的ＲＮＡと捕捉プローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡをリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により分解することで、固体支持体から標的ＲＮＡは分離する。分離した標的ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマー及び第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーが標的ＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一及び第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００２４】
本発明では、標的核酸を増幅した後に測定する。測定は、既知の核酸測定法により測定することが可能であるが、具体的には電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）等の蛍光標識をはじめとする、測定可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法等を例示することができる。これらの手法の中でも、操作工程が少なく、増幅産物を反応系から取り出して分析する必要がないために二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が少ない核酸プローブを用いる方法が好ましく、特に好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを使用する方法を例示することができる（特許文献７及び非特許文献３）。標的ＲＮＡを増幅し測定する工程における最も好適な方法は、他法に比して顕著に迅速で、一定温度・一段階でＲＮＡを増幅し、同時に増幅産物をモニタリングする特許文献６に記載の方法である。ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同又は相補領域以外の配列に、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的結合が可能である。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中のＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有しているものが使用可能であるが、この核酸プローブもまた、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同又は相補領域以外の配列の一部に相同な配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。
【００２５】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、及びこれらの誘導体等が利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献９及び非特許文献４）。
【００２６】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献１０及び非特許文献４）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を用いることも可能である。
【００２７】
本発明は、上述した事項に加え、以下のような条件で実施することが特に好ましい。即ち、試料から標的ＲＮＡを捕捉する場合、試料中に存在するＲＮａｓｅの影響を軽減するために、捕捉プローブと標的ＲＮＡをハイブリダイズするための反応液は、グアニジン塩酸塩やグアニジンチオシアネートといったカオトロピック塩を添加することが好ましい。また試料中に含まれる非標的ＲＮＡやＲＮＡ増幅反応阻害物、更にはカオトロピック塩といった増幅操作を妨害する可能性のある物質を除去するために、標的ＲＮＡを捕捉した固体支持体をナトリウム、カリウム又はリチウム塩を含んだ洗浄液で洗浄することが特に好ましい。
【００２８】
前記した増幅の操作においては、連鎖反応を進行させるために、本発明で使用する各酵素に必須な既知の要素として、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸及びリボヌクレオシド−三リン酸を含む反応液を使用することが好ましい。更に好ましくは、反応効率を向上するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び糖を添加することが好ましい。
【００２９】
本発明の各工程を実施する温度条件は特に制限されないが、増幅の工程は特に温度に敏感であるため、例えばＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から５０℃の範囲で設定することが特に好ましい。
【００３０】
本発明の具体的態様として、（１）の工程を捕捉プローブ、固体支持体、カオトロピック塩を含む反応液により実施し、（２）の工程で塩類を含む洗浄液を用いて試料中の標的ＲＮＡを遊離させ、（３）の工程で標的ＲＮＡに対し、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法が包含される。この態様においては、標的ＲＮＡを固体支持体に捕捉し遊離させ、増幅し、測定する、という一連の操作が単一の容器内で実施可能である。また、標的ＲＮＡの増幅・測定に必要な試薬と試料を単一の容器に封入可能であるから、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＲＮＡを増幅し測定することができることになる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００３１】
さらに、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅及び測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００３２】
前記態様のＲＮＡの測定方法は、単一の容器で実施可能であるため、簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明により、標的ＲＮＡを高感度、迅速、かつ簡便に測定することが可能となった。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、以下の工程からなることを特徴とする。
（１）標的ＲＮＡと捕捉プローブとのハイブリダイゼーションにより、捕捉プローブを通じて標的ＲＮＡを固体支持体に結合する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により捕捉された標的ＲＮＡとＤＮＡプローブのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し、標的ＲＮＡを捕捉プローブから分離する工程、及び、
（３）分離したＲＮＡを増幅・測定する工程。
ここで、上記（１）の構成を採用したことにより、その終了段階に適当な緩衝液で洗浄すれば、非標的ＲＮＡが固体支持体と共存しないようにして、標的ＲＮＡの測定感度が低下することを防止できるという効果を達成することができる。また、その後に標的ＲＮＡをアルカリ加水分解等するという構成を採用すれば、標的ＲＮＡが高次構造を形成し、後の増幅操作の際のプライマーの結合を妨げるといった減少を抑制し、プライマーを標的ＲＮＡに容易に結合させて増幅効率を向上し、結果的に測定感度の向上を図れるという効果を達成できる。そしてその後の（３）の工程でＴＲＣ法を採用すれば、ＲＮＡのみを増幅する増幅方法を採用すれば、ＤＮＡの混入があったとしても標的ＲＮＡの増幅が影響を受けず、しかも一定温度で実施可能となるという効果を達成することができる。特に、測定の操作を前記したインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを採用して実施すれば、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作のみでその後は自動的にＲＮＡを増幅し測定することができる増幅方法を提供することが可能となる。
【００３４】
このように、アルカリ加水分解によるＲＮＡの高次構造形成の抑制、プロモーター配列を有する第一のプライマー及び第二のプライマーを用いたＲＮＡ転写産物の生成、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブを共存させ、増幅されたＲＮＡ転写産物に由来する蛍光強度の増加を経時的に測定することにより、標的ＲＮＡの測定を簡便、迅速、かつ高感度に行なうことが可能となる。ちなみに、本発明の測定方法を用いたＲＮＡの測定は、従来技術と比較すると圧倒的に迅速かつ高感度である、という特徴を有しているため、臨床検査、公衆衛生、食品検査の分野等の迅速検査に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１  ＲＮＡの測定
ノロウイルス陽性糞便乳剤の上澄み液をノロウイルス陰性１０％糞便乳剤上澄み液にて段階希釈した。各希釈液１００μＬに１０ｐｍｏｌの捕捉プローブ（３’末端をＢｉｏｔｉｎ化したオリゴヌクレオチド 配列番号１）及び１００μＬの変性・捕捉液（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ：ＱＩＡＧＥＮ）を混合し、室温で５分間、静置した。その後、５０μｇのストレプトアビジン修飾磁性ビーズ（ＭＡＧＮＯＴＥＸ-ＳＡ：ＴＡＫＡＲＡ）を添加し、室温で５分間静置した。磁石により個液分離後、洗浄液２００μＬ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＫＣｌ）にて洗浄し、ストレプトアビジン修飾磁性ビーズを回収した。回収した磁性ビーズに２５μＬの切断反応液（Ａ）を添加し、４３℃で５分間反応させ、個液分離により反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に回収した。上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、予め４３℃で２分間保温した増幅反応液（Ｂ）５μＬを添加した。引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で保温して、励起波長４７０ ｎｍ、蛍光波長５２０ ｎｍで、反応溶液を経時的に１５分間測定した。
【００３７】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．３を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を測定時間とした結果を表１に示した。
（１）切断反応液（Ａ）の組成：増幅反応時（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
０．７５μＭ  第二のプライマー（塩基番号３）
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス製）
１３％  ＤＭＳＯ
（２）増幅反応液（Ｂ）の組成：増幅反応時（３０μＬ中）の最終濃度
０．７５μＭ  第一のプライマー （配列番号１）該プライマーは５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５）が付加されている。
【００３８】
３０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号４）
２．０％  ソルビトール
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
比較として、上記希釈液を１３８μＬからＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡＭｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、６０μＬのＲＮＡ抽出液を得た。
以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブに分注し、これに前記ＲＮＡ抽出液５μＬを添加した。
（１）反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
０．７５μＭ  第一のプライマー（前記第一のプライマーと同じ配列）
０．７５μＭ  第二のプライマー（前記第二のプライマーと同じ配列）
３０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（前記ＩＮＡＦのプライマーと同じ配列）
０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド：前記捕捉プローブと同じ塩基配列。該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている。
【００３９】
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３％  ＤＭＳＯ
上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
（１）酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に１５分間測定した。本実施例で使用した配列番号１から配列番号５までの各配列について、表３にその概要を示す。
【００４０】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．３を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を測定時間とした結果を表１に示した。
【００４１】
表１に示すように、比較法は１０４希釈までしか測定ができなかったのに対して、本発明に示す方法では１０５希釈まで測定が可能であった。以上の結果から、本発明に示す方法は非標的ＲＮＡを除去することにより、高感度に標的ＲＮＡを測定できることが示された。
【００４２】
【表１】
2011147412.tif 000002
実施例２  アルカリ加水分解処理したＲＮＡを用いた測定
ノロウイルス陽性糞便検体から抽出されたノロウイルスＲＮＡ溶液（約７５００塩基）５μＬに１００ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）５０μＬを添加して６０℃で０、５、１５、３０、４５分間放置した。この溶液に５μＬの停止液（１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を添加して、アルカリ加水分解を停止した。この溶液を実施例１と同様の手順でストレプトアビジン修飾磁性ビーズに捕捉、切断、増幅、測定した。各アルカリ加水分解時間における測定時間の結果を表２に示した。
【００４３】
【表２】
2011147412.tif 000003
表２に示したように、５から１５分間、アルカリ加水分解処理によるＲＮＡの断片化により、ＲＮＡが立体構造を有さなくなり、捕捉効率が向上したことが確認された。
【００４４】
【表３】
2011147412.tif 000004
【配列表】
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