(57)【要約】【課題】ヒアルロン酸類の含有液を注射液として大量に製造するにあたり、ヒアルロン酸類の含有液中から異物を効率よく分離除去し、高純度の医薬品グレードのヒアルロン酸類を取得する。【解決手段】ろ過膜にてヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液をろ過処理することを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過膜にてヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液をろ過処理することを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項２】
ろ過膜処理時のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液のｐＨが２〜１０である請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項３】
ろ過膜処理時のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の温度が５〜１００℃である請求項２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項４】
ろ過膜処理時のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の濃度が７．５〜１２．５ｇ／ｌである請求項３記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項５】
ろ過膜の孔径が０．２〜５０μｍの範囲である請求項４記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物処理除去方法。
【請求項６】
ろ過膜のろ材形状が、平膜、フィルターカートリッジ及びディスポーザブルフィルターから選ばれた一種である請求項５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項７】
ろ過膜の材質がポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、テフロン(登録商標)、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン及びナイロンから選ばれた一種である請求項６記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項８】
ヒアルロン酸及び／又はその塩が、平均分子量１５０万〜４００万であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項９】
ヒアルロン酸及び／又はその塩が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【請求項１０】
ヒアルロン酸及び／又はその塩が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「ヒアルロン酸及び／又はその塩」の含有液から、医薬品に適合した「ヒアルロン酸及び／又はその塩」（以下、総称してヒアルロン酸類という）の注射液を製造するにあたり、ヒアルロン酸類の含有液中の異物を除去する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とが結合した２糖単位がくりかえし連鎖してなる、分子量が５００万にもおよぶと言われている高分子量の多糖類である。一般に、そのグルクロン酸がナトリウム塩の形となったヒアルロン酸ナトリウムとして分離精製される。分子量約２００万のヒアルロン酸ナトリウムは、分子量約８０万のものに比べて医薬品として、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、慢性関節リウマチ等の治療に優れた効果を発揮することが知られている（薬理と治療  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．９  ２８９（１９９４）；薬理と治療  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．９  ３１９（１９９４））。
【０００３】
更に、外科手術後の癒着防止用として、また皮膚科領域、眼科領域においても医薬品としての効果が知られており、実用化されているものもある。微生物発酵法により製造されるヒアルロン酸ナトリウムは、例えばある種のストレプトコッカス属を用いて培養し、得られた培養液を希釈し、種々の精製工程を経て、粉末状で取得される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】薬理と治療  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．９  ２８９（１９９４）
【非特許文献２】薬理と治療  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．９  ３１９（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
微生物発酵法によれば、ヒアルロン酸ナトリウムを高分子量のまま精製取得することができるが、ヒアルロン酸ナトリウム注射液を大量製造するに際しては、種々の困難な問題があった。
即ち、高分子量のヒアルロン酸ナトリウムの溶解を短時間で効率よく行うことが難しいこと、該溶液の粘度が非常に高いため取り扱いにくいこと、更に熱等に不安定でろ過あるいは滅菌が難しいこと等である。
従って、高分子量のヒアルロン酸ナトリウム注射液を大量に製造する方法については、明らかにされていなかった。
【０００６】
本発明者は、ヒアルロン酸類の含有液を注射液として大量に製造するにあたり、ヒアルロン酸類の含有液中から異物を効率よく分離除去し、高純度の医薬品グレードのヒアルロン酸類を取得する方法について鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下に記す方法に関するものである。
即ち、
（１）ろ過膜にてヒアルロン酸類の含有液をろ過処理することを特徴とするヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（２）ろ過膜処理時のヒアルロン酸類の含有液のｐＨが２〜１０である（１）記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（３）ろ過膜処理時のヒアルロン酸類の含有液の温度が５〜１００℃である（２）記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（４）ろ過膜処理時のヒアルロン酸類の含有液の濃度が７．５〜１２．５ｇ／ｌである（３）記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（５）ろ過膜の孔径が０．２〜５０μｍの範囲である（４）記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物処理除去方法、（６）ろ過膜のろ材形状が、平膜、フィルターカートリッジ及びディスポーザブルフィルターから選ばれた一種である（５）記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（７）ろ過膜の材質がポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、テフロン（登録商標)、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン及びナイロンから選ばれた一種である（６）記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（８）ヒアルロン酸類の平均分子量が１５０万〜４００万であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（９）ヒアルロン酸類が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法、（１０）ヒアルロン酸類が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸類の含有液中の異物除去方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、分子量１５０万〜４００万のヒアルロン酸類を注射用水、生理食塩水、及びリン酸緩衝生理食塩水から選ばれた一種の注射用溶解液に溶解して後、ろ過膜に通液させることにより、ヒアルロン酸類を含有する注射液の大量製造における異物の除去が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、更に本発明について詳しく説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸類は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、又はヒアルロン酸とヒアルロン酸の塩との混合物を包含している。ヒアルロン酸類は、遊離の形でもよく又その塩でもよく例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩等が挙げられるが、ナトリウム塩が好ましい。更に本発明で使用するヒアルロン酸類含有液は動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでも使用できる。好ましくは、発酵法で製造したものである。
【００１０】
発酵法によるヒアルロン酸類は例えばストレプトコッカス属のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。
【００１１】
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。
上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００１２】
本発明に使用されるヒアルロン酸類の分子量は１５０万〜４００万のものが適している。平均分子量が１５０万〜４００万より小さい場合には医薬品としての効能が低下する。また、該範囲より大きいものをこの方法で得ることは、困難である。
【００１３】
ヒアルロン酸類を溶解する工程で用いる注射用溶解液としては、注射用水、生理食塩水及びそれに酸、アルカリ、リン酸塩のような緩衝剤を含むｐＨ調整剤等を加えた日本薬局方の製剤総則注射剤の項で、認められているものを使用することができる。
【００１４】
溶解工程でのヒアルロン酸類の添加量としては、ヒアルロン酸類濃度が７．５〜１２．５ｇ／ｌとなるように設定する。ヒアルロン酸類濃度７．５ｇ／ｌ以下では、ヒアルロン酸類溶液の粘度は低く、製造が容易である。また１２．５ｇ／ｌ以上は、ヒアルロン酸類の溶解度から大量に調製することは難しい。高粘度の溶液となるヒアルロン酸類濃度７．５〜１２．５ｇ／ｌが本発明の製造条件に該当する。
【００１５】
溶解するヒアルロン酸類はバルブ付の気密容器に充填しておく。投入シュートの角度は、５０°以上の急勾配にしてあり、それは該容器を逆さにして、ヒアルロン酸類を投入するとき、ロスが少ないようにするためである。
【００１６】
バルブは、バタフライ弁を用い、その切り換えによりヒアルロン酸類を外気にふれさせることなく、無菌的に溶解用の撹拌槽に添加することができる。このバルブ付の気密容器の内面の材質は、ステンレス鋼もしくはそのテフロン（登録商標）コーティングしたものが好ましい。
従って、該容器は、洗浄性がよく、更に取り扱いが簡便である。
【００１７】
溶解には、撹拌装置を具備した撹拌槽を使用する。ヒアルロン酸類の注射用溶解液への溶解性がよくないことと、溶液が高粘度であることから、撹拌装置としては、タービン型及び／またはディスパー型の撹拌羽根を有するものが好ましく、しかも羽根は偏芯させた位置に取り付けるのが特に溶解速度を速めるのに効果がある。
【００１８】
撹拌羽根は一段もしくは多段にしてもよい。該撹拌羽根の回転数は１００〜５０００ｒｐｍ、好ましくは、８００〜２０００ｒｐｍが適当である。回転数が該範囲より小さい場合は、ヒアルロン酸類の注射用溶解液への浸透が悪く、完全に溶解するまでに長時間を要する。回転数が該範囲より大きい場合はヒアルロン酸類の注射用溶解液への分散が不良になり、撹拌槽内の界面上部への飛散が大きくなり、溶解が円滑に進まない。好ましい回転数であれば、溶解速度を上げるために撹拌槽外部から加温をする必要はなく、短時間で、溶解することができる。このように短時間で穏和な条件で溶解できるため、ヒアルロン酸類の分子量低下のような物性変化は少ない。
【００１９】
溶解操作に於て、適宜撹拌槽内を減圧することが好ましい。それはヒアルロン酸類及び液中の気泡を除去するためで、溶解速度を速めるためにも有効である。
ヒアルロン酸類溶液は高粘度であるが、その脱泡のために真空ポンプ等の通常の減圧手段を用い、５〜２０ｋＰａ  ａｂｓ程度まで減圧するのが好ましい。温度を上げたり、溶液の撹拌を併用して行うとさらに効果が上がる。
【００２０】
溶解用撹拌槽内面の材質は、食塩水に対する耐食性、溶解後の内面の洗浄性などから、ステンレス、ガラス、テフロン(登録商標)等が挙げられるが、ヒアルロン酸類溶液の材質表面への付着の点から、テフロン(登録商標)、テフロン(登録商標)ライニングまたはテフロン(登録商標)コーティングが好ましい。テフロン(登録商標)は他の材質に比べ、ヒアルロン酸類溶液の付着が少ないので、撹拌槽から溶解液を排出したり、撹拌槽を洗浄するのに適している。
【００２１】
ヒアルロン酸類溶液の滅菌は、異物除去の前、又はバイアル等の容器に充填した後で行う。
【００２２】
本発明において異物ろ過はろ過処理により行われる。ろ過で使用されるろ過膜は孔径０．２〜５０μｍが好ましい。孔径がその範囲より小さい場合は、前工程で得られた滅菌液が非常に高粘度液のため膜を通液させるのが困難であり、また孔径がその範囲より大きい場合は、異物ろ過が不完全になり、注射液中に目視で判別できる不溶性異物が混在するので好ましくない。
【００２３】
ろ過膜の材質はポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、テフロン(登録商標)、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン及びナイロン等の中から選定できるが、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン又はナイロンが好ましい。
【００２４】
ろ過膜の形状としては、平膜、フィルターカートリッジ、ディスポーザブルフィルターのいずれも可能であるが、大量に処理する場合には、フィルターカートリッジ又はディスポーザブルフィルターが好ましい。
【００２５】
本発明で使用できるろ過膜の具体例としては日本ミリポア社製ミリパックやデュラポアミリディスク等がある。
【００２６】
ヒアルロン酸類含有液のｐＨは２〜１０、温度は５〜１００℃の中で任意の条件が選択される。通液時の流量及び圧力については、フィルターの種類に応じて耐圧性を考慮して設定するが、圧力をかけるとフィルターから異物が流出することもあるので注意しなければならない。日本ミリポア社製ミリディスク４０では、流速５０〜３００ｌ／ｈｒ、処理圧０．０１〜０．５０ＭＰａが好ましい。ろ過液は注射用溶解液で希釈し、濃度調整することもできる。
【００２７】
充填工程で使用される充填機としては、ヒアルロン酸類溶液を容器に充填する部分と充填後の容器にゴム栓を打栓あるいは容器を熔封する密封部分からなる充填機が使用される。
【００２８】
注射液用容器としては、一般のアンプル、バイアル、デュファージョクト型やプレフィルドシリンジが使用できる。
【００２９】
次に、実施例により、本発明につき詳細に説明するが、本発明は、この実施例の記載内容に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）を用いて発酵法で得られた分子量２３７万のヒアルロン酸ナトリウム１５８０ｇを２０ｌのバタフライ弁のついた気密容器に充填した。内面がテフロン(登録商標)コーティングされているステンレス製の容量２００ｌの溶解槽にタービン型の撹拌羽根を内割で１：２の位置に取付け、ｐＨ７．３の２ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む生理食塩液（注射用溶解液）１４９ｌを溶解槽に仕込んだ。前述のヒアルロン酸ナトリウムを充填した容器を溶解槽の原末投入口に逆さにとりつけ、バタフライ弁を開き、ヒアルロン酸ナトリウムを溶解槽中に投入した。１８００ｒｐｍで撹拌を５０分間行い、ヒアルロン酸ナトリウムを完全に溶解した。液中の気泡を除去するため、溶解槽内圧力を２０分間、真空度１５ｋＰａ  ａｂｓ以下に維持し気泡を除去した後、常圧に戻した。撹拌開始後、１時間でヒアルロン酸ナトリウムは完全に溶解し、ヒアルロン酸ナトリウム濃度をカルバゾール硫酸法により測定したところ、１．００％となった。
この液の極根粘度を第十五改正日本薬局方に従って測定すると、３３．８ｄｌ／ｇであり、分子量に換算すると２３７万であった。
【００３１】
この溶解液をキッコーマン社製キッズクッカー連続滅菌機で連続滅菌した。この装置は、二重管からなり、内管は内径２３ｍｍで、固定の撹拌機が内蔵され、加熱部の容積３．４ｌ、ホールド部容積０．６ｌ、冷却部容積２．６ｌであった。ホールド部の温度が１３５℃になるように、加熱部外管の熱水を調節し、ホールド部での滞留時間が３４秒になるように加熱部入口の定量ポンプを制御した。
冷却部は、出口温度が４０℃以下になるように、冷却部外管の水を調節した。
冷却部出口圧力が０．３３ＭＰａなるように圧力調節弁で制御し、冷却したヒアルロン酸ナトリウム溶解液を孔径５μｍのナイロン製のろ過膜からなる日本ミリポア社製ミリディスク４０で流速６０ｌ／ｈｒろ過した。
【００３２】
ろ過液を、３０分間、１４４ｒｐｍで撹拌混合した。次いで、その液をダイアフラム型の充填ポンプを有する充填部、ゴム栓の打栓、巻締め機構を有するバイアル充填密封機で、バイアル瓶に２．８５ｌずつ充填した。ゴム栓はブチルゴム（大協精工社製）を打栓した。
製品の品質試験を第十五改正日本薬局方、製剤総則・注射剤の項に従って不溶性異物検査を行ったところ、合格率は９９．９％以上であった。
【００３３】
比較例１
実施例１で、異物ろ過膜処理なしで、充填密封したバイアル６０００本の不溶性異物試験合格率は６５．３％であった。