(57)【要約】      （修正有）【課題】移植における免疫応答抑制のための方法及び組成物を提供する。【解決手段】移植片の宿主拒絶を減少または阻害するのに有効な繊維芽細胞または繊維芽細胞培養物からの上澄みの量で受容者を処置することにより前記受容者にある移植応答を減少するように誘導する一つの方法である。繊維芽細胞または繊維芽細胞培養物からの上澄みは移植の前、移植と同時に、または移植後に投与することができる。この方法は他の外部抗原に対する免疫応答と妥協することなく移植片に対する免疫応答を減少するのに有効である。更に、外部組織による宿主に対する免疫応答、すなわち対宿主移植片病の減少を誘導する方法も開示される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片受容者における提供者組織に対する免疫応答の減少を誘導する一つの方法であって、移植された提供者組織に対する受容者の免疫応答を減少するのに有効な量で線維芽細胞と線維芽細胞培養からの上澄みよりなるグループから選択される少なくとも１個の部材で受容者を処置することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、ここで前記少なくとも１個の部材が線維芽細胞であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が受容者に自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が受容者に同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法であって、ここで線維芽細胞が移植片の提供者から得られることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が移植片の提供者と受容者両方に対して同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が移植片の投与の前に受容者に投与されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が移植片の投与と同時に投与されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法であって、ここで線維芽細胞が移植片の一部として投与されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が移植片の後で投与されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞が受容者による移植片の拒絶を処置するために移植片受容者に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項２記載の方法であって、ここで線維芽細胞がヒトのものであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法であって、更に受容者に免疫抑制剤を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法であって、ここで提供者組織が固形器官（solid organ）であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法であって、ここで固形器官が心臓、腎臓、肺または肝臓から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
提供者組織による受容者組織に対する免疫応答を減少する一つの方法であって、受容者に対する提供者組織による免疫応答を減少するのに有効な量で線維芽細胞と線維芽細胞培養からの上澄みよりなるグループから選択される少なくとも１個の部材に提供者組織を接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法であって、ここで前記少なくとも１個の部材が線維芽細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法であって、ここで線維芽細胞が受容者に自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法であって、ここで線維芽細胞が提供者に自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法であって、ここで線維芽細胞が提供者と提供者組織の受容者両方に対して同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１７記載の方法であって、ここで提供者組織と線維芽細胞が提供者組織の移植の前に生体外で接触されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法であって、ここで提供者組織が線維芽細胞と接触される前に受容者組織に露出されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１８記載の方法であって、ここで線維芽細胞が受容者から得られることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１６記載の方法であって、ここで提供者組織が骨髄であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１６記載の方法であって、ここで提供者組織が末梢血であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１６記載の方法であって、更に受容者に免疫抑制剤を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
対宿主性移植片病に対し移植片受容者を処置する一つの方法であって、移植された提供者組織による受容者に対する免疫応答を減少するのに有効な量で線維芽細胞と線維芽細胞培養からの上澄みよりなるグループから選択される少なくとも１個の部材で移植片の受容者を処置することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法であって、ここで前記少なくとも１個の部材が線維芽細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法であって、ここで線維芽細胞が受容者に自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２８記載の方法であって、ここで線維芽細胞が提供者に自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２８記載の方法であって、ここで線維芽細胞が提供者と受容者両方にとって同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２７記載の方法であって、更に受容者に免疫抑制剤を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
有害な免疫応答を処置する一つの組成物であって、移植片受容者における提供者組織に対する有害な免疫応答を阻害しまたは減少させるのに有効な量のヒト線維芽細胞と薬理担体とを含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９８年１１月１３日出願された（合衆国）暫定出願番号６０／１０８，２３４号に基づく優先権を主張する。
本発明は移植片およびまたは対宿主性移植片反応の宿主拒絶反応を予防しまたは処置する領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐性は免疫応答が通常発生する抗原に対する応答性の後天的欠乏である。典型的には耐性を誘導するために、耐性化抗原への露出がなければならず、それはある種のリンパ球の死滅または機能的不活性化に帰着する。完全な耐性は第二抗原攻撃に対して抗体仲介または細胞仲介のいずれかの検出可能免疫応答の欠乏により特徴づけられる。部分的耐性は免疫応答の量的減少で象徴される。
【０００３】
免疫系（免疫機構）の機能は病原体を含む異物（外部物体）を排除し、自己抗原に対する非応答性または耐性を維持することである。Ｔ細胞耐性は、１）自己ペプチドに反応する胸腺細胞がクローン欠失で排除される胸腺で（中心耐性で）、また２）免疫寛容条件下で自己抗原に露出することによる末梢で（末梢耐性で）達成される。
【０００４】
不幸なことに、免疫系は有害な侵入者から移植組織などの有益な侵入者を区別せず、かくして免疫系は移植組織または器官を拒絶する。移植器官の拒絶は提供者同種異系抗原または異種抗原を認識する宿主に存在する同種異系反応性Ｔ細胞により著しく仲介される。
【０００５】
現在移植を拒絶する患者は強力な免疫抑制剤で処置される。Ｔ細胞免疫応答を予防しまたは抑制する薬剤の注入は移植片拒絶を阻害するが、全身免疫抑制、毒性更には日和見感染による死に終る可能性もあり得る提供者組織拒絶に対する毒性と不完全な応答の故で、現在の薬剤治療のやり方に耐えられないか応答しない患者を処置するための代替的なアプローチが必要される。
【０００６】
従って、提供者組織の宿主拒絶を避ける方法として、移植片に対する宿主の望ましくない免疫応答を減少または排除する必要がある。また対宿主性移植片病として知られる受容者組織に対する提供者組織による望ましくない免疫応答を排除しまたは減少する方法も有利となるであろう。
【０００７】
ＩＦＮ−γで処置されＴ細胞とも接触されると、ヒト歯肉線維芽細胞は同種異系反応抹梢Ｔ細胞の非効果的刺激薬となり、同種異系抗原提示細胞またはミトゲン刺激細胞の増殖応答を阻害したことが報告されている（Ｙ．島袋他、免疫学７６；３４４−３４７（１９９２））。
【発明の概要】
【０００８】
ヒト線維芽細胞は、抗原に対する免疫応答が減少または排除されるように免疫系による応答を改善するために移植で使用できることが発見された。ここに記載される免疫応答の線維芽細胞（ＦＢＬｓ）による減少または排除は、提供者組織または器官の移植片に対する受容者の免疫応答を改善するために使用することができる。かくして一つの見地において、本発明の方法は提供者組織移植片に対する望ましくないＴ細胞免疫応答を抑制するのに特に有用である。
【０００９】
従って、一つの見地において、本発明の方法は、提供者組織の、受容者の分離された線維芽細胞への接触を提供する。この見地での一つの実施例において、この方法は、提供者組織の受容者に、分離線維芽細胞を投与することを含む。線維芽細胞は移植の前、移植と同時に、または移植後に投与することができる。線維芽細胞は受容者に自己由来または同種異系であることができる。同種異系線維芽細胞は提供者から得ることができ、従ってこの場合は移植組織に対して自己由来のものである。本発明のも一つの見地において、同種異系線維芽細胞も提供者以外の源から得ることとができ、このような源は提供者の型あるいは受容者の型のいずれにも適合する必要はない。
【００１０】
線維芽細胞は更に移植片の一部として受容者に投与できる。この目的に対して、本発明は、線維芽細胞を灌流されまたはそれを含む提供者組織または器官を受容者に提供することにより、免疫応答を減少しまたは改善する方法を提供する。望ましい実施例において、線維芽細胞は同種異系であり、望ましくは提供者および受容者両方に対して同種異系である。線維芽細胞はそれが受容者に移植される時に、外部組織に対する受容者のＴ細胞により免疫応答を改善する。
【００１１】
も一つの実施例において、提供者組織または器官は、提供者または受容者のＭＨＣ型のいずれにも適合する必要のない提供者以外の源から得た線維芽細胞で灌流されあるいはそれを含む。
【００１２】
も一つの見地において、本発明の方法は、移植に対する拒絶エピソードの発病度を減少しまた排除するために、提供者組織が受容者に移植された後に提供者組織の受容者に線維芽細胞を投与することにより移植を受けた患者を処置することを提供とする。線維芽細胞は受容者または提供者から得ることができ、また望ましくは第三者源から得られる。
【００１３】
移植片に対する有害な免疫反応を受けている受容者への線維芽細胞の提示は更なる抗原刺激に対するＴ細胞の低応答性を減少または誘導し、それにより提供者組織に対して活性化されたＴ細胞による有害な応答を減少または排除する。
【００１４】
本発明の更なる見地において、組織または器官の受容者への移植の前に、生体外で提供者組織または器官を線維芽細胞で処置することを含む、受容者に対する提供者組織による免疫応答、すなわち対宿主性移植応答を減少する方法が提供される。線維芽細胞は受容者に自己由来または同種異系であってもよい。同種異系線維芽細胞は提供者から得られ、または望ましくは線維芽細胞は提供者と受容者両方に対して同種異系である。線維芽細胞は受容者細胞に対して活性化され得る移植組織内でＴ細胞の応答性を減少し、そのため組織は宿主に対する提供者組織の有害な応答の発生なしであるいは減少の下で受容者（宿主）の体内に導入される。かくして「対宿主性移植片」病を防ぐことができる。
【００１５】
更なる実施例において、提供者組織または器官は提供者組織内のＴ細胞を「事前活性化する」ために、生体外で受容者組織にまず露出される。提供者組織は次いで線維芽細胞に、望ましくは第三者線維芽細胞に接触される。線維芽細胞は、提供者組織が受容者に配置される時に受容者による抗原刺激に対して提供者組織内でのＴ細胞による有害な二次免疫応答を減少しあるいは阻害するであろう。
【００１６】
本発明の更なる実施例は、提供者組織に対する受容者の有害な免疫応答を減少しまたは予防するために、移植後第三者線維芽細胞を受容者に投与することを含む。
も一つの実施例において、線維芽細胞は移植の前、移植の間もしくは移植の後に移植片受容者に投与される。
【００１７】
かくして本発明の望ましい実施例に従って、ヒト線維芽細胞は移植結果として移植片拒絶およびまたは対宿主性移植片病を処置し、およびまたは移植片拒絶およびまたは対宿主性移植片病を予防または減少するために採用される。ヒトまたは非ヒトの線維芽細胞は、更に異種移植または移植片の使用を促進するために採用することができる。
【００１８】
線維芽細胞培養および線維芽細胞／混合リンパ球反応培養から誘導される上澄みは同種異系抗原に対するＴ細胞応答に抑制効果を持つ。かくして、本発明は更に上澄みを使用する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒト繊維芽細胞が２個の異なる固体からのリンパ球の間の進行中の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制したことを示す図。繊維芽細胞はＭＬＲでの刺激細胞と応答細胞両方に不適合であった。刺激Ｔ細胞は事前平板培養繊維芽細胞で保温された。
【図２】ヒト繊維芽細胞が２個の異なる固体からのリンパ球の間の進行中の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制したことを示す図。繊維芽細胞はＭＬＲの刺激細胞と応答細胞両方に不適合であった。刺激Ｔ細胞は新鮮なトリプシン消化繊維芽細胞で保温された。
【図３】ヒト繊維芽細胞が二次混合リンパ球反応を抑制したことを示す図。同種異系繊維芽細胞で保温され、次いで同種異系、自己由来または第三者刺激細胞で接触された前もって刺激されたＴ細胞の再刺激は抑制された。
【図４】繊維芽細胞培養物からの上澄みが混合リンパ反応を抑制することを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ここで定義されるように、同種異系線維芽細胞は受容者と同種の異なる個体から得られる。提供者抗原は受容体に移植される提供者組織により発現される抗原を指示する。同種異系抗原は受容者により発現される抗原とは異なる抗原である。移植される提供者組織は移植片である。
【００２１】
発明者は、ヒト線維芽細胞が試験管内で同種異系Ｔリンパ球と接触する時、繊維芽細胞が進行する混合リンパ球反応を抑制したことを発見した。通常異なる個体からの共存培養は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）としても知られるＴ細胞の活性化と増殖で立証されるＴ細胞応答に帰着する。ＭＬＲを受けるＴ細胞を線維芽細胞と接触させると、それはＭＬＲを抑制した。
【００２２】
一つの見地において、本発明は受容者にある提供者組織または器官移植片に対する免疫応答を減少しまたは阻害しもしくは排除する方法を提供する。本発明の一つの見地において、この方法は受容者への線維芽細胞の投与を含む。線維芽細胞は提供者組織または器官に対する受容者のＴ細胞応答を改善し、阻害しまたは減少するのに有効な量で採用される。
【００２３】
従って、本発明は線維芽細胞を提供者組織または器官の受容者に投与することにより免疫応答を減少し、阻害しまたは排除する方法を提供する。一つの実施例において、線維芽細胞は移植と同時期に受容者に投与される。選択肢として、ヒト線維芽細胞は移植片の投与の前に投与することができる。例えばヒト線維芽細胞は提供者組織の移植の約３日乃至７日前に受容者に投与することができる。更なる選択肢として、線維芽細胞は移植後に投与できる。
【００２４】
かくして、受容者Ｔ細胞による免疫応答を減少しまたは排除するのに有効な量で、提供者組織の移植の前、あるいは移植と同時に線維芽細胞を受容者に投与することにより、線維芽細胞は提供者または外部組織に対する受容者の免疫系をよいコンディションに持っていくように使用することができる。線維芽細胞は受容者のＴ細胞に影響し、そのためＴ細胞は低応答性となり受容者が提供者または外部組織を与えられるとＴ細胞応答は減少または排除される。かくして移植片の宿主拒絶あるいはその発病度は避けられる。
【００２５】
発明者は更に、抗原刺激に露出されすなわち活性化されたＴリンパ球が続けて線維芽細胞に露出された時、Ｔ細胞が続く抗原刺激に対し免疫応答を産出しないことを発見した。かくして線維芽細胞はＴ細胞を刺激した抗原、または他の抗原からの刺激に対し、低応答性の状態を誘導する。
【００２６】
これらの予期しない結果は、同種異系ヒト線維芽細胞に露出された後、活性化Ｔ細胞が更なる抗原刺激に低応答性にされ、これにより進行中の有害な免疫応答を減少しまたは改善することを示した。
【００２７】
従って、本発明は患者に線維芽細胞を投与ることで移植片に対する有害な免疫応答を受けているそのような患者を処置する方法を提供する。望ましい実施例において、線維芽細胞は提供者または受容者にＭＨＣ適合を必要としない第三者から得られる。
【００２８】
線維芽細胞は免疫応答を減少しまたは排除するのに有効な量で受容者に投与され、それにより有害な免疫応答を改善する。
も一つの見地において、本発明は受容者に対する提供者組織または器官（対宿主性移植片）による免疫応答を減少しまたは阻害しあるいは排除する方法を提供する。従って本発明は、移植の前に、望ましくは提供者組織にあるＴ細胞の受容者組織による事前刺激で、提供者器官または組織の線維芽細胞への接触を提供する。線維芽細胞は受容者に対する提供者組織による有害な免疫応答を改善し、阻害しまたは減少する。
【００２９】
も一つの実施例において、線維芽細胞は移植の前、移植の間または移植後に移植片受容者に静脈内投与される。
線維芽細胞はこのように受容者の免疫系に対する提供者組織または外部組織を事前調整して使用することができる。一つの実施例において、これは受容者への組織の移植の前に生体外で提供者組織または外部組織を単離線維芽細胞に接触して行うことができる。この実施例において、提供者の組織または器官は組織を受容者に配置する前に１日以下乃至７日間の同時保温で受容者線維芽細胞と同時に保温することができる。線維芽細胞は組織または器官に存在しあるいはその中にあるＴ細胞を抑制するものと考えられ、従ってそれが続いて受容者に配置される時には組織内のＴ細胞を受容者に対して低応答性にする。かくして組織または器官の線維芽細胞での処置は移植組織に存在する活性化Ｔ細胞が宿主を攻撃する対宿主性移植片病の発生数およびまたは発病度を改善する。
【００３０】
かくして骨髄（造血幹細胞）移植に関連して、移植による宿主の攻撃を減少または排除することができる。提供者の骨髄は骨髄または抹梢血幹細胞を受容者に移植する前に単離線維芽細胞で事前処置することができる。繊維芽細胞は、受容者が骨髄により有害な影響を受けることを減少または排除するようにＴ細胞応答を阻害しまたは減少する。つまりこの療法は対宿主性移植片応答を減少しまたは排除する。
【００３１】
更なる実施例において、対宿主性移植片病で苦しむ移植片受容者は、宿主の移植拒絶を減少し、または排除するのに有効な量で受容者または提供者のいずれかに自己由来のものである単離線維芽細胞、あるいは第三者線維芽細胞をそのような受容者に投与することにより発病度を減少しまたは排除することで処置される。線維芽細胞は受容者に対して免疫応答を配備することから提供者組織内の活性化Ｔ細胞を阻害し、これにより対宿主性移植片応答を減少または排除する。
【００３２】
受容者の線維芽細胞は移植の前に受容者から得られ、例えば進行中の宿主に対する移植片攻撃で多数の処置を提供するために十分な量での線維芽細胞の貯蔵品を提供するために貯蔵されおよびまたは培養拡張される。
【００３３】
更に本発明のも一つの方法において、提供者の組織は単離線維芽細胞に露出され、そのため線維芽細胞は移植の前に線維芽細胞がそれ自身器官移植片に組み込まれる。この状態において、移植拒絶を予防する標準処置、例えば薬剤仲介免疫抑制を逃れたいずれかの同種異系反応性宿主細胞は線維芽細胞が移植片に入りそれを破壊することで線維芽細胞により免疫抑制されるであろう。繊維芽細胞は受容者にとって自己由来または同種異系のものであり、更に望ましくは提供者または受容者以外の第三者から得られ。
【００３４】
ここに記載された本発明の方法に基づいて、本発明の線維芽細胞は提供者組織の拒絶または対宿主性移植片病を処置する現在のやり方と併用して使用できることが考慮される。このような使用の利点は、移植片受容者での免疫応答の発病度を改善することにより、処置で使用される薬剤量およびまたは薬剤治療の投与頻度を減少することができ、その結果全体的な免疫抑制と望ましくない副作用を軽減することに帰着する。
【００３５】
更に本発明の線維芽細胞で１回だけの処置が必要とされ、慢性的な免疫抑制薬剤治療の必要性が排除されることも考慮される。選択肢として、線維芽細胞の複数の投与も行われることはある。
【００３６】
従って、ここに記載の発明は、同一種から器官または組織、あるいは異種移植器官または組織およびまたは対宿主性移植片病の移植片拒絶の予防または処置もしくは改善のための予防あるいは治療有効量で線維芽細胞を投与することにより、移植片拒絶の予防または処置を提供する。
【００３７】
線維芽細胞の単一用量投与は、とりわけＴリンパ球が線維芽細胞から単離された後に、同種異系細胞に対しその非応答特性（すなわち耐性あるいはアネルギー（免疫力低下状態））を保持する場合には、Ｔ細胞または「非自己」組織に同種異系の組織に対するＴ細胞応答を減少し、または排除するのに有効である。
【００３８】
活性成分の用量は広い範囲で変化し、また勿論各特定の場合個々の必要条件に適合するものとなるであろう。一般に非経口投与の場合には、受容者の体重キログラム当り約０．０１乃至約２０百万細胞を投与することが通例である。使用される細胞数は受容者の体重と体調、投与の回数と頻度及び当業者にとって公知の他の変数に依存する。細胞は移植される組織または器官に適したルートで投与することができ、それは全身に、すなわち非経口で、静脈内注射で投与でき、または骨髄などのような特定の組織または器官を標的とすることができる。ヒト線維芽細胞は細胞の皮下移植を介して、または結合組織、例えば筋への幹細胞の注射により投与することができる。
【００３９】
細胞は約０．０１乃至約５×１０6細胞／ｍｌの濃度で適切な希釈剤に懸濁することができる。注射液のための適切な賦形剤は緩衝生理食塩水またはほかの適切な賦形剤などのような細胞とまた受容者と生物学的生理学的に融和性のものである。投与のための組成物は適当な無菌性と安定性を満たす標準方法に従って処方され、生産されかつ貯蔵されねばならない。
【００４０】
本発明はそれで限定されないが、線維芽細胞をここに記載の方法で使用するために皮膚から得ることができる。
本発明者は更に、線維芽細胞培養物から誘導される上澄みが同種異系細胞間にあるＭＬＲを制御できることを発見した。ここで使用されるように、またここで「線維芽細胞上澄み」として指摘される線維芽細胞培養物から誘導される上澄みは、単独で培養された線維芽細胞および免疫応答を受ける細胞すなわち結合リンパ球反応を受けるＴ細胞を共存培養される繊維芽細胞から得ることができる。
【００４１】
線維芽細胞上澄みは用量依存のやり方で混合リンパ球での同種異系Ｔ細胞応答を活発に減少する。線維芽細胞との場合と同じく、異なる提供者からの線維芽細胞培養物からの上澄みはＭＨＣ型と関連する減少した応答の特異性を示さない。
【００４２】
加えて、線維芽細胞と接触した混合リンパ球反応から誘導される上澄みは同じく同種異系細胞管のＭＬＲを抑制できる。これらのＭＬＲ／線維芽細胞上澄みは用量依存のやり方で混合リンパ球反応での同種異系Ｔ細胞応答を減少させ、またＭＨＣ型に関して減少した応答の特異性を示さない。
【００４３】
ここに記載された方法は従来の技術で公知の数多くのやり方でまた各種の修飾と順列で実行することができることは理解されるべきである。細胞間の作用または相互作用のやり方について測定される何らかの理論がどのようなやり方でもこの発明を制限するものとして解釈されるべきものではなく、発明の方法がより完全に理解できるように提示されることが評価されてしかるべきであろう。
【００４４】
下記の実施例は本発明の更なる見地を説明する。しかしそれはここに設定された本発明の教示または開示を限定するものではない。
実施例１
混合リンパ球本能の抑制
混合リンパ球反応は提供者表面抗原の融和性を測定し、また提供者組織の拒絶の尤度の微候である。移植片拒絶を引き出すのに原因となる細胞表面抗原はＭＨＣ抗原クラスＩとクラスＩＩである。Ｔ細胞は外部ＭＨＣ抗原に対して同種異系である。ＭＨＣ分子クラスＩとクラスＩＩは混合リンパ球反応を刺激する。
【００４５】
繊維芽細胞が同種異系応答を活発に抑制したかどうかを決定するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）が刺激細胞または応答細胞のいずれかと関係なく提供者から得た繊維芽細胞ありまたはなしで細胞培養平板に設定された。
【００４６】
リンパ球調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が密度勾配遠心法によりフィコール−パック（ファルマチア）で調製された。細胞のアリコートは１０％ＤＭＳＯを持つ９０％ＦＣＳに凍結され液体チッ素で貯蔵された。解凍後、細胞はＭＳＣ培地（ＤＭＥＭ低グルコースと１０％ＦＣＳ）で２回洗浄され、検定培地（２５ｍＭへペス、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００μＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５．５×１０-5Ｍ、２メルカプトエタノール（すべてジブコＢＬＲよりの試薬）を持つイスコーブと５％ヒトＡＢ血清（シグマ、試験されたＭＬＲ））で再懸濁された。
【００４７】
Ｔ細胞富化分画を調製するために、ＰＢＭＣは免疫磁性負選択により単核球とＢ細胞を使い果した。ＰＢＭＣはマウス抗ヒトＣＤ１９とＣＤ１４ｍＡｂｓ（アジ化物なし／低エンドトキシン（ＮＡ／ＬＥ）形態）で保温され、次いでビオチン接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（多吸着）Ａｂ（すべてファーミンゲンよりの試薬）およびストレプトアビジン・マイクロビード（ミルテニイ・バイオテック）で続けられた。細胞は次いで磁気細胞ソータ（ＭＡＣＳ、ミルテニイ・バイオテック）を用いて分離された。Ｔ細胞富化分画は約７０−９０％ＣＤ３＋細胞を含有していた。
【００４８】
線維芽細胞
線維芽細胞はＡＴＣＣ（Ｃａｔ＃ＣＲＬ−２１０４）から得た１８歳の女性からのヒト正常皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−１０８７Ｓｋであり、ＤＭＥＭ−低グルコース／１０％ＦＣＳで維持された。
【００４９】
活性化Ｔ細胞／線維芽細胞培養物
線維芽細胞（第三者）はＴ細胞との混合４日前に組織培養皿当り１×１０6細胞で平板培養された。ＩＦＮ−γ（ファーミンゲン、５ｎｇ／ｍｌ）が３日間加えられ繊維芽細胞をＴ細胞と混合する前に集中的に洗浄された。
【００５０】
第一次（１°）ＭＬＲ
応答細胞と刺激細胞は無関係の個体から得られた。刺激に使用されたＰＢＭＣはキャビネットＸ放射線システム（ファクシトロンＸレイ、バッファロー、イリノイ）を用いて３，０００ラドでＸ線照射された。富化Ｔ細胞は応答細胞として使用された。
【００５１】
Ａ．提供者２４８からのＴ細胞が提供者２４４からの照射ＰＢＭＣｓで７日間（５％ＣＯ2で３７℃）刺激され、次いで収集され事前平板培養ＦＢＬｓで２４時間保温された（１×１０5Ｔ細胞／ウエル、２×１０4ＦＢＬｓ／ウエル）。3Ｈ−チミジンがＴ細胞増殖を測定するために培養期間の追加の１８時間に加えられた。図１で示された結果は線維芽細胞が進行中のＭＬＲを抑制したことを明示する。
【００５２】
Ｂ．提供者２７３からのＴ細胞が提供者２４８からの照射ＰＢＭＣｓで９６ウエル平板で結合された（１．５×１０5細胞／各ウエル）。新鮮なトリプシンで消化された線維芽細胞がＩＦＮなしで２×１０4細胞／ウエルで４日後に加えられ、培養物は更に３日間保温された（ＭＬＲ全体で７日間）。3Ｈ−チミジンが追加の１８時間加えられた。図２で示された結果は線維芽細胞がウエル表面に接触されない時もまた進行中のＭＬＲを抑制したことを明示する。
【００５３】
実施例２
Ｔ細胞非応答性の誘導
１°ＭＬＲ（提供者２４４と２４８のＴ細胞）で活性化されたＴ細胞が収集され、ＭＳＣ培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ／１０％ＦＣＳ）で１回洗浄され検定培地で１×１０6細胞／ｍｌで再懸濁された。細胞は事前平板培養線維芽細胞と線維芽細胞当り１０Ｔ細胞の大体の比率で混合された。Ｔ細胞は線維芽細胞と３日間保温された。対照培地でＴ細胞は単独で保温された。
【００５４】
再刺激検定
Ｔ細胞培養物が収集され、１×１０6細胞／ｍｌで再懸濁され、９６ウエル平板（５０マイクロリットルで５×１０4細胞／ウエル）に加えられた。培養物は提供者２４４からのもとの刺激細胞、第三者刺激細胞、植物性血球凝集素（ＰＨＡ、５マイクログラム／ｍｌ）、ミリスチン酸酢酸ホルボール、プラス、カルシウムイオノフォア（ＰＭＡ、１０ナノグラム／ｍｌ＋ＣａＩｏ、１ナノグラム／ｍｌ）、またはブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ１００ナノグラム／ｍｌ）を含む各種の刺激剤と混合された。細胞は０，１，２，３，４，５、または６日目に3Ｈ−チミジン（５μＣｉ／ｍｍｏｌ，１μＣｉ／ウエル）で１晩（１８時間）パルス標識され、次いで収穫された。２日目の結果が図３で示される。前に刺激され次いで同種異系繊維芽細胞に露出されたＴ細胞はいずれかの刺激剤の存在下で再刺激はされなかった。
【００５５】
実施例３
成人の真皮繊維芽細胞の密集培養物から上澄みが収集された（＃１０８７ＳＫ、メリーランド、ロックビル、ＡＴＣＣより）。細胞は継代６であり、上澄み収穫の際には１ヶ月培養されたものであった。馴化培養は培地変更の３日後に収穫された。上澄み（「繊維芽細胞」）がＭＬＲ培養（上部パネル）の開始時にあるいは培養の４日目（進行中、下部パネル）のいずれかに指示された希釈で加えられた。ＭＬＲは提供者１５５からの応答Ｔ細胞を提供者２７３からの照射（３０００Ｒ）刺激細胞ＰＢＭＣｓと混合して構成された。培養物の両セットは細胞を収穫しＤＮＡへのチミジンとり込みで評価される増殖応答を決定する前に培養６日に１８時間3Ｈ−チミジンでパルス標識された。対照は、何も加えられないＭＬＲ培養物（「なし」）と無関係で３日目のＭＬＲ培養物からの上澄みが加えられた培養物（「ＭＬＲ」）で構成された。この結果は、培養の開始時に加えられた時に繊維芽細胞上澄みが全般的に第一次ＭＬＲを抑制したことを示す。たとえ１：８１９２の希釈であっても効果を希釈し去ることができないことで示されるように、抑制はきわめて強力であった。進行中の培養物に加えられた時に、上澄みは１：２０４８までの希釈でも５０％以上の抑制を示した。
【００５６】
しかし本発明の範囲は前に記載の特異的実施例に限定されるべきでないことは理解されるべきである。本発明は特に記載されたもの以外にも実施することができ、しかもなお冒頭に掲げた特許請求の範囲内にある。
【図１】
2011037865.tif 000003
【図２】
2011037865.tif 000004
【図３】
2011037865.tif 000005
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年10月19日(2010.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容者組織の免疫原性を減少する方法であって、
（１）提供者組織を受容者組織に接触させること；および
（２）提供者組織を、受容者組織の免疫原性を減少するのに有効な量で単離された線維芽細胞と接触させること
を含む方法。
【請求項２】
線維芽細胞が受容者に自己由来であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
線維芽細胞が提供者に自己由来であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
線維芽細胞が受容者に同種異系であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
線維芽細胞が提供者と受容者の両方に同種異系であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
線維芽細胞がヒトのものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
線維芽細胞が懸濁液中にあることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
線維芽細胞が懸濁液の上澄みであることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
提供者組織が充実性組織または器官であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
充実性組織または器官が心臓、腎臓、肺または肝臓から選択されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
提供者組織が骨髄であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
提供者組織が末梢血であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
更に提供者組織を免疫抑制剤と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【外国語明細書】
2011037865000001.pdf