(57)【要約】      （修正有）【課題】外来遺伝子の導入に際してライゲーション反応を要せず、かつ、当該外来遺伝子が内在する開始コドンを利用することができる組換えタンパク質発現のためのベクター及びその作製方法の構築。【解決手段】組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターであって、プロモーター下流に切断面を有し、挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部が形成され、プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位が配置されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターであって、
プロモーター下流に切断面を有し、挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部が形成され、前記プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位が配置されている、組換えタンパク質発現のためのクローニングベクター。
【請求項２】
前記一本鎖突出部が、10〜20塩基長である請求項１に記載のクローニングベクター。
【請求項３】
前記リボソーム結合部位が、前記プロモーター側の一本鎖突出部の末端から4〜16塩基上流に配置されている請求項１又は２に記載のクローニングベクター。
【請求項４】
組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターの作製方法であって、
（ａ）ベクターをプロモーター下流で一箇所切断する工程、
（ｂ）挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部を形成し、このとき、前記プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位を配置するよう形成する工程、を有する組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターの作製方法。
【請求項５】
前記一本鎖突出部を、10〜20塩基長に形成する請求項４に記載のクローニングベクターの作製方法。
【請求項６】
前記リボソーム結合部位が、前記プロモーター側の一本鎖突出部の末端から4〜16塩基上流に配置されるように形成される請求項４又は５に記載のクローニングベクターの作製方法。
【請求項７】
外来遺伝子を導入した組換えベクターの作製方法であって、
（ａ）ベクターをプロモーター下流で切断する工程、
（ｂ）挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部を形成し、このとき、前記プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位を配置するよう形成する工程、
（ｃ）前記外来遺伝子の両端に前記ベクターに形成された一本鎖突出部と相補的な一本鎖突出部を形成する工程、
（ｄ）前記ベクターの一本鎖突出部と、前記外来遺伝子の一本鎖突出部をアニーリングさせる工程、を有する外来遺伝子を導入した組換えベクターの作製方法。
【請求項８】
前記アニーリング工程の前に、前記外来遺伝子を、開始コドンがコード領域の上流に連続して配置されるように改変する工程を有する請求項７に記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項９】
前記一本鎖突出部を、10〜20塩基長に形成する請求項７又は８に記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項１０】
前記リボソーム結合部位が、前記プロモーター側の一本鎖突出部の末端から4〜16塩基上流に配置されるように形成される請求項７〜９のいずれか一項に記載の組換えベクターの作製方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組換えベクターの作製方法により構築された組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、組換えタンパク質発現のためのベクター及びその作製方法に関する。より詳細には、本願発明は、外来遺伝子に内在する開始コドンを利用して当該外来遺伝子がコードするタンパク質を発現できる組換えタンパク質発現のためのベクター及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子クローニングは、目的外来遺伝子をプラスミド、ファージ、コスミド等の自己複製能を持つベクターに結合し、大腸菌等の宿主に導入して増殖させることにより、同じ遺伝子集団を大量に作り出す技術である。一般に、ゲノム、cDNAライブラリー、PCR産物等から目的領域のDNA断片を制限酵素で切り出す。そして、プラスミド等のベクターも同じ制限酵素で切断した後、インサート側のDNA断片とベクターをリガーゼによりライゲーションし、組換えDNAを作製する。この組換えDNAを大腸菌等の適当な宿主に導入し、目的外来遺伝子を発現させ、コードするタンパク質を合成する。しかしながら、既存のクローニング技術において要求される、制限酵素による切断反応とリガーゼによるライゲーション反応は、高度かつ煩雑な技術であり、しかも、高価な酵素によるコストも決して少なくないという問題点があった。
【０００３】
そこで、近年、外来遺伝子を、ライゲーション過程を経ずに直接的にベクターにクローニングする方法が報告されている。非特許文献１には、非相補的な13又は14塩基の一本鎖突出部を両端に有する開環プラスミドベクターが記載されている。そして、インサート側のDNA断片にも、その一本鎖突出部に対合する一本鎖突出部をT4 DNA ポリメラーゼの3’ →5’エキソヌクレアーゼ活性を利用して作製する。続いて、ベクターとDNA断片の一本鎖突出部を互いにアニーリングさせて組換えDNAを作製し、大腸菌に導入する方法が記載されている。また、非特許文献２には、ベクターを制限酵素BseRIにより切断した後、T4 DNA ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を利用してベクターに特異的な13又は14鎖長の一本鎖突出部を作製することが記載されている。さらに、非特許文献２には、非特許文献１と同様に、インサート側のDNA断片にも、ベクターの一本鎖突出部に対合する一本鎖突出部をT4 DNA ポリメラーゼ活性を利用して作製することが記載されている。そして、ベクターとDNA断片の両端に形成された一本鎖突出部を互いにアニーリングさせて組換えDNAを作製し、大腸菌に導入する方法が記載されている。
【０００４】
しかしながら、上記技術で作製された組換えDNAを発現させた場合には、目的外来遺伝子に内在される開始コドンの上流から翻訳が開始される。そのため、目的外来遺伝子がコードするタンパク質のアミノ末端側に、ベクター等に由来する余分なアミノ酸配列が付加された融合タンパク質として構築されるという問題点があった。一方、タンパク質構造解析等に際しては、余分な配列を含まない目的タンパク質のみが要求される。そのような要求に応えるべく、上記技術では、エンテロキナーゼ、トロンビン等のプロテアーゼにより部位特異的に切断し、融合パートナーを除去する工程が必要となる。また、タンパク質の中には，その片端または両端に不要な配列があると活性を示さないものもある。そのため、目的タンパク質のみを、少ない工程で簡便に組換え体として発現できる技術の構築が依然として望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Novagen、“User Protocol TB163 Rev. K0908 : Ek/LIC Cloning Kits”、〔online〕、〔平成22年1月14日検索〕、インターネット  URL: http://www.merck-chemicals.jp/chemdat/ja_JP/Merck-JP-Site/JPY/ViewProductDocuments-File?ProductSKU=EMD_BIO-69077&DocumentType=TI&DocumentId=200905.365.ProNet&DocumentSource=PRONET
【非特許文献２】Stephen D. Weeks他著、“Ligation Independent Cloning Vectors for Expression of SUMO Fusions（SUMO 融合体の発現のためのライゲーションから独立したクローニングベクター）”、Protein Expression and  Purification. 、2007年5月、第53巻、第1号、第40〜50頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、外来遺伝子の導入に際してライゲーション反応を要せず、かつ、当該外来遺伝子が内在する開始コドンを利用することができる組換えタンパク質発現のためのベクター及びその作製方法の構築を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ベクターのクローニング部位とリボソーム結合部位との位置関係に着目することにより、クローニング部位を外来遺伝子の翻訳開始点となるようにベクターを設計できることを見出した。これにより、導入された外来遺伝子がその配列上に内在する開始コドンを利用できるベクターを構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［１１］に示す発明を提供する。
［１］組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターであって、プロモーター下流に切断面を有し、挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部が形成され、前記プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位が配置されている、組換えタンパク質発現のためのクローニングベクター。
［２］前記一本鎖突出部が、10〜20塩基長である。
［３］前記リボソーム結合部位が、前記プロモーター側の一本鎖突出部の末端から4〜16塩基上流に配置されている。
【０００９】
上記［１］の構成によれば、外来遺伝子中に内在する開始コドンを利用できるクローニングベクターを提供できる。本願発明によって提供されるクローニングベクターに、外来遺伝子を導入すると、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえる距離で配置されることなる。したがって、かかるクローニングベクターを利用して外来遺伝子を発現させると、外来遺伝子内在の開始コドンからタンパク質の翻訳が開始されることとなる。そして、ベクター由来タンパク質のような目的遺伝子のコード領域に関係のないタンパク質と融合することなく、所望のタンパク質のみを合成することができる。また、本願発明により提供されるクローニングベクターを利用することにより、外来遺伝子導入のためのライゲーション反応を要せず、少ない工程で簡便にクローニングを行うことができる。
更に、上記［２］のように構成することにより、前記一本鎖突出部同士の非特異的結合を排除できる。これにより、クローニング対象となるインサート側の外来遺伝子上の特定配列を特異的に認識することができ、クローニング効率を一段と向上させることができる。
また、上記［３］のように構成することにより、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえるのに最適な距離で配置されることなり、クローニング後、効率的かつ正確な目的タンパク質の合成が可能となる。
【００１０】
［４］組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターの作製方法であって、
（ａ）ベクターをプロモーター下流で一箇所切断する工程、（ｂ）挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部を形成し、このとき、前記プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位を配置するよう形成する工程、を有する組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターの作製方法。
［５］前記一本鎖突出部を、10〜20塩基長に形成する。
［６］前記リボソーム結合部位が、前記プロモーター側の一本鎖突出部の末端から4〜16塩基上流に配置されるように形成される。
【００１１】
上記［４］の構成によれば、外来遺伝子中に内在する開始コドンを利用できるクローニングベクターの作製方法を提供できる。本願発明の作製方法によって、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえる距離で配置され、ベクター由来タンパク質のような目的遺伝子のコード領域に関係のないタンパク質と融合することなく所望のタンパク質のみを合成でき、かつ外来遺伝子の導入の際のライゲーション反応を要せず、少ない工程で簡便にクローニングを行うことができる有用なクローニングベクターを提供することができる。
更に、上記［５］のように構成することにより、前記一本鎖突出部同士の非特異的結合を排除できる。これにより、クローニング対象となるインサート側の外来遺伝子上の特定配列を特異的に認識可能であり、クローニング効率が一段と向上した高精度なクローニングベクター提供することができる。
また、上記［６］のように構成することにより、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえるのに最適な距離で配置された、効率的かつ正確な目的タンパク質の合成が可能なクローニングベクターを提供することができる。
【００１２】
［７］外来遺伝子を導入した組換えベクターの作製方法であって、（ａ）ベクターをプロモーター下流で切断する工程、（ｂ）挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部を形成し、このとき、前記プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位を配置するよう形成する工程、（ｃ）前記外来遺伝子の両端に前記ベクターに形成された一本鎖突出部と相補的な一本鎖突出部を形成する工程、（ｄ）前記ベクターの一本鎖突出部と、前記外来遺伝子の一本鎖突出部をアニーリングさせる工程、を有する外来遺伝子を導入した組換えベクターの作製方法。
［８］前記アニーリング工程の前に、前記外来遺伝子を、開始コドンがコード領域の上流に連続して配置されるように改変する工程を有する。
［９］前記一本鎖突出部を、10〜20塩基長に形成する。
［１０］前記リボソーム結合部位が、前記プロモーター側の一本鎖突出部の末端から4〜16塩基上流に配置されるように形成される。
【００１３】
上記［７］の構成によれば、外来遺伝子中に内在する開始コドンを利用できる組換えベクターの作製方法を提供できる。本願発明の作製方法によって、提供される組換えベクターは、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえる距離で配置され、ベクター由来タンパク質のような目的遺伝子のコード領域に関係のないタンパク質と融合することなく、所望のタンパク質のみを合成できる。また、本願発明の組換えベクターの作製方法は、外来遺伝子導入のためのライゲーション反応を要せず、少ない工程で簡便に組換えベクターを作製することができる。
そして、上記［８］のように構成することにより、外来遺伝子の開始コドンが、所望のコード領域に正確に対応すると共に、リボソーム結合部位と翻訳制御機能を発揮しえる距離で正確に配置された、効率的かつ高精度な目的タンパク質の合成が可能な組換えベクターを提供することができる。
更に、上記［９］のように構成することにより、前記一本鎖突出部同士の非特異的結合を排除することができる。これにより、クローニング対象となるインサート側の外来遺伝子上の特定配列を特異的に認識し、外来遺伝子を組込み発現することができる、高精度な組換えベクター提供することができる。
また、上記［１０］のように構成することにより、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえるのに最適な距離で配置された、効率的かつ正確な目的タンパク質の合成が可能な組換えベクターを提供することができる。
【００１４】
［１１］上記本発明の組換えベクターの作製方法により構築された組換えベクター。
【００１５】
上記［１１］の構成によれば、外来遺伝子中に内在する開始コドンを利用できる組換えベクターを提供できる。本願発明によって、提供される組換えベクターは、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、翻訳制御機能を発揮しえる距離で配置され、ベクター由来タンパク質のような目的遺伝子のコード領域に関係のないタンパク質と融合することなく、所望のタンパク質のみを合成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ベクターpQE-80Lの構造を模式的に示すベクターマップである。
【図２】本願発明のクローニングベクターの構築方法の一例を示し、クローニング部位の形成方法（カセットDNAの挿入）を説明する図である。
【図３】本願発明のクローニングベクターの構築方法の一例を示し、クローニング部位の形成方法（一本鎖突出部の形成）を説明する図である。
【図４】実施例１で使用したウシ反芻胃生息微生物群メタゲノム由来の小ラッカーゼの塩基配列と、それがコードするアミノ酸配列を示す図である。
【図５】本願発明のクローニングベクターに挿入するインサートDNA断片の調製方法の一例を説明する図である。
【図６】本願発明の組換えベクターの構築方法の一例を説明する図である。
【図７】本願発明の組換えベクターにおけるタンパク質（全タンパク質）の発現を確認した実施例１の結果を示す図である。
【図８】本願発明の組換えベクターにおけるタンパク質（Hisタグ融合タンパク質）の発現を確認した実施例１の結果を示す図である。
【図９】本願発明の組換えベクターにおける発現タンパク質のN末端アミノ酸配列（第１アミノ酸残基）を確認した実施例１の結果を示す図である。
【図１０】本願発明の組換えベクターにおける発現タンパク質のN末端アミノ酸配列（第２アミノ酸残基）を確認した実施例１の結果を示す図である。
【図１１】本願発明の組換えベクターにおける発現タンパク質のN末端アミノ酸配列（第３アミノ酸残基）を確認した実施例１の結果を示す図である。
【図１２】本願発明の組換えベクターにおける発現タンパク質のN末端アミノ酸配列（第４アミノ酸残基）を確認した実施例１の結果を示す図である。
【図１３】本願発明の組換えベクターにおける発現タンパク質のN末端アミノ酸配列（第５アミノ酸残基）を確認した実施例１の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本願発明について詳細に説明する。
【００１８】
本願発明のクローニングベクターは、プロモーター下流に切断面を有し、挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部が形成され、プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位が配置されている。このように構成することにより、クローニング部位に外来遺伝子が挿入されたときに、プロモーター、リボソーム結合部位（以下、「RBS」と略する場合がある。）と外来遺伝子内在の開始コドンが、好適に翻訳制御機能を発揮しえる距離で配置されることなる。その結果、外来遺伝子の発現に際して、内在の開始コドンが翻訳開始点として利用されることとなり、目的のタンパク質のみを組換え合成することが可能となる。
【００１９】
本願発明のクローニングベクターの構築の基礎となるベクターの種類は特に制限はなく、公知の通常の組換え実験によって外来核酸断片を導入することが可能な全てのベクターに適用することができる。また、ベクターの形態も環状及び直鎖状の別も問わない。したがって、公知のプラスミド、ファージ、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）等、いずれにも適用できるが、好ましくはプラスミドベクターである。プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドであるpQE系（pQE-80L、pQE-30L等）、pEX系、pBR系（pBR322等）、pUC系（pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等）、pBluescript等、枯草菌由来のプラスミドであるpUB110、pTP5等、酵母由来のプラスミドであるYEp13、YEp24、YCp50等、が例示されるが、これらに制限されるものではない。
【００２０】
ベクターの両端に形成される一本鎖突出部は、互いに非相補的であり、ベクターが自己閉環しないように構成される。ここで、非相補的とは、一本鎖突出部同士が塩基対合則に従って特異的に結合できず、二重鎖構造を形成しないことを意味する。一本鎖突出部の長さは、クローニング対象となるインサート側の外来遺伝子上の特定配列を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に、非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さは、一本鎖突出部の配列情報、並びに、アニーリング等の反応温度、反応液中の塩濃度等の多くの因子に依存して決定され、通常は2〜40塩基、好ましくは6〜30塩基、特に好ましくは10〜20塩基である。
【００２１】
プロモーターとしては、ここでは、宿主細胞で機能しえるものであれば特に制限はなく、宿主ベクター系の種類に応じて、公知のプロモーターを利用できる。プロモーターとしては、例えば、大腸菌のlacUV5プロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、ファージのPLプロモーター、T7プロモーター等が例示されるが、これに制限されるものではない。そして、市販のベクターに予め組み込まれているプロモーターを好適に利用することができる。
【００２２】
リボソーム結合部位とは、通常、遺伝子の翻訳開始コドンの約10塩基上流に位置する約3〜9塩基長のプリンに富む配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ベクター宿主系が大腸菌などの原核細胞の場合には、原核生物の16SrRNAの３'末端‐CCUCCUAに相補的に結合するシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno：以下、「SD」と略する場合がある）配列を選択することができる。具体的には、-AGGAGG-のようにプリン塩基（アデニン、グアニン）に富んだ3〜9塩基の配列が例示される。しかしながら、これに限定されるものではなく類似の配列であってもリボソームによって認識されることは公知であり、そのような配列をも広く使用できる。一方、宿主が酵母や動物細胞などの真核細胞の場合にはコザック配列を選択することができる。そして、市販のベクターに予め組み込まれているリボソーム結合部位をも好適に利用することができる。
【００２３】
そして、前記リボソーム結合部位が、プロモーター側の一本鎖突出部の末端から通常は、4〜16塩基、好ましくは5〜15塩基、特に好ましくは6〜14塩基上流の範囲に配置される。そして、クローニング部位に外来遺伝子が挿入されたときに、リボソーム結合部位と外来遺伝子の内在の開始コドンとの間に、4〜10塩基、好ましくは5〜9塩基、特に好ましくは6〜8塩基のスペーサー部分が形成される。これにより、リボソーム結合部位と外来遺伝子内在の開始コドンが、好適に翻訳制御機能を発揮しえる距離で配置されることなる。このように構成することで、リボソーム結合部位がmRNAにリボソームを動員するのを助け、リボソームを開始コドンに配置することによって、外来遺伝子に内在する開始コドンを使ってタンパク質合成を開始させることができる。
【００２４】
ここで、プロモーター配列とリボソーム結合部位の間には、任意の配列を有するスペーサーが存在し、そのスペーサーの長さは、プロモーターの転写制御機能を発揮できる限り特に限定されない。通常10〜100塩基、好ましくは30〜90塩基である。
【００２５】
さらに、本願発明のクローニングベクターは、好ましくは、プロモーター側とは反対側の一本鎖突出部の下流側にターミネーター配列を含んで構成される。さらに、外来遺伝子の機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、オペレーター配列、エンハンサー配列等が挙げられる。
【００２６】
更に、本願発明のクローニングベクターには、ベクターが細胞内に取り込まれた宿主において特定の表現型選択を付与することが可能なマーカー遺伝子配列等をも含ませることができる。このようなマーカー遺伝子としては、薬剤耐性、栄養要求性、蛍光・発光遺伝子等が例示される。例えば、薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が挙げられる。栄養要求性遺伝子としては、グルタミン合成遺伝子又はプロリン合成酵素遺伝子等、蛍光・発光標識遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質遺伝子、基質の存在下で発光できるβ−ガラクトシターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が例示される。
【００２７】
本願発明には、クローニングベクターのクローニング部位に、開始コドンを内在する外来遺伝子を挿入して得られる、組換えベクター、特には発現ベクターも含まれる。外来遺伝子は、その両端に、互いに非相補的であるが、クローニングベクターの一本鎖突出部と相補的な一本鎖突出部を有する。一本鎖突出部の長さは、ベクターの一本鎖突出部とアニーリングするのに適した長さに調製する。同一長であることが好ましいが、外来遺伝子の発現に影響が無い範囲における相違は許容される。通常は2〜40塩基、好ましくは6〜30塩基、特に好ましくは10〜20塩基である。ただし、このとき、例えば、クローニングベクターのセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端側に突出するように一本鎖突出部が形成された場合には、外来遺伝子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端側に突出するように一本鎖突出部を形成する。クローニングベクターのセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端側に突出するように一本鎖突出部が形成された場合には、外来遺伝子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端側に形成する。このように構成することにより、アニーリングより、外来遺伝子がクローニングベクターに定方向性に挿入される。そして、プロモーター配列、リボソーム結合部位、開始コドンを内在する所望の外来遺伝子の順序で配置され、これにより外来遺伝子を発現制御可能な組換えベクターが構成される。
【００２８】
ここで、相補的とは、一本鎖突出部が塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここでは、完全な相補性のみならず、一本鎖突出部同士が安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。
【００２９】
本願発明のクローニングベクター及び組換えベクターは、公知の技術を利用して作製することができ、これらも本願発明に含まれる。
したがって、本願発明は、組換えタンパク質発現のためのクローニングベクターの作製方法に関し、これは、
（ａ）ベクターをプロモーター下流で一箇所切断する工程、
（ｂ）挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部を形成し、このとき、プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位を配置するよう形成する工程、を有する。
【００３０】
また、本願発明は、外来遺伝子を導入した組換えベクターの作製方法にも関し、（ａ）ベクターをプロモーター下流で切断する工程、
（ｂ）挟み合う両切断面に所望の外来遺伝子を導入するためのクローニング部位となる互いに非相補的な一本鎖突出部を形成し、このとき、プロモーター側の一本鎖突出部上にリボソーム結合部位を配置するよう形成する工程、
（ｃ）外来遺伝子の両端に前記ベクターに形成された一本鎖突出部と相補的な一本鎖突出部を形成する工程、
（ｄ）前記ベクターの一本鎖突出部と、前記外来遺伝子の一本鎖突出部をアニーリングさせる工程、を有する。
【００３１】
プロモーター下流でベクターを切断する。切断位置は、かかる位置がクローニング部位となるため、外来遺伝子が導入された際にプロモーターの転写制御機能が外来遺伝子に対して十分に発揮しえる位置であることが必要である。好ましくは、プロモーター下流、かつ、リボソーム結合部位から4〜16塩基下流である。更に好ましくは、リボソーム結合部位から5〜15塩基、特には、6〜14塩基下流である。
【００３２】
ベクターの切断は、適当な制限酵素によって行われ、ベクターがプラスミドのような環状ベクターの場合は、これにより開環する。このとき、制限酵素は、ベクター上に一箇所の認識部位を有しているものが好ましい。一方、ベクター上に、使用する制限酵素に対して２箇所以上の認識部位を有している場合には、クローニングしたい箇所以外の箇所でベクターが開裂することとなり、好ましくない。更に、形成する一本鎖突出領域の形状等をも考慮して制限酵素を選択することが好ましい。BseRIのようにDNA上の認識部位と切断部位が異なる制限酵素の使用が、切断部位の塩基配列の制限が無いためクローニング部位の配列自由度が増し好ましい。そのような酵素は公知であり、酵素リストを下記表１にまとめる。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
一本鎖突出部の形成は、制限酵素による切断部位を起点として行われ、例えば、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して作製される。エキソヌクレアーゼは、二本鎖DNAの片方の鎖を加水分解し、ここでは、３’→５’エキソヌクレアーゼであっても、５’→３’エキソヌクレアーゼの別は問わない。また、DNAポリメラーゼに属する酵素の多くが有するエキソヌクレアーゼ活性を利用することができる。原核生物のDNAポリメラーゼのうち、DNAポリメラーゼIは、DNA鎖重合活性に加え、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も有し、DNAポリメラーゼII及びIIIは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ここでは、特に、DNAポリメラーゼII及びIIIに分類される酵素、例えば、T4 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼを好適に利用する事ができる。また、真核生物DNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼγ、DNAポリメラーゼδ、DNAポリメラーゼε等が、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有することが報告されており、これらを利用することもできる。
【００３５】
T4 DNA ポリメラーゼは、T4 ファージに由来するDNAポリメラーゼであり、５’→３’へDNAの合成を触媒する一方、強い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有している。そのため、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（以下、「dNTP」と略する。）が存在しない場合には、 ３’末端から順に一塩基ずつ削っていく反応を触媒する。しかしながら、どれか一種類のヌクレオチドに対応するdNTPが存在すると、当該ヌクレオチドに対応する鋳型配列が出てきたところでエキソヌクレアーゼ活性とポリメラーゼ活性が平衡に達してその箇所で反応が停止する。かかる性質を利用して、一種類の第１のヌクレオチドに対応するdNTPの存在下で、ベクターをT4 DNA ポリメラーゼに接触させる。このとき、ベクター上の所望の一本鎖突出部形成領域内のセンス鎖及びアンチセンス鎖の切断部位が３’末端側となっている方の鎖上の配列は、前記の第１のヌクレオチド以外の第２のヌクレオチドの群で構成される。そして、さらに当該鎖上の所望の一本鎖突出部形成領域の端部に隣接する塩基が第１のヌクレオチドにより構成されることが必要である。そして、プロモーター側の所望一本鎖突出部形成領域上には、リボソーム結合部位に対応する配列が配置されていることが好ましく、その位置は、一本鎖突出部領域の端部となる部位から4〜16塩基上流、更に好ましくは、5〜15塩基、特には、6〜14塩基上流である。このとき、第２ヌクレオチド群で構成される配列の長さは、所望の一本鎖突出部の長さに応じて定められ、2〜40塩基、好ましくは6〜30塩基、特に好ましくは10〜20塩基長とする。このように構成することにより、第１ヌクレオチドの存在下でのT4 DNA ポリメラーゼの作用により、第２ヌクレオチド群で形成された領域が３’末端から切除され、センス鎖、アンチセンス鎖の夫々の５’側が突出した一本鎖突出部が形成される。
【００３６】
一本鎖突出部を、T4 DNA ポリメラーゼのような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して作製する場合には、ベクターの切断に際して切断部位が５’側に突出した付着末端となる５’突出型の制限酵素の使用には制限がある。５’突出型制限酵素の場合、一本鎖突出部の末端に５’突出型制限酵素によって形成される付着末端に由来する配列が残り、一本鎖突出部同士が相補性を有することとなる。そのため、ベクターがインサートとアニーリングする前に自己閉環するという望ましくない反応を誘発し、特に４塩基以上の付着末端を形成する場合にはその傾向が強くなる。BamHIは、切断酵素部位がG/GATCC（（/）が切断箇所）であり、最終的にできあがるベクターの両末端が、ともに５’ - ...CTAG -３’と同じ形となる。したがって、３’→５’エキソヌクレアーゼと、BamHIやXhoIのような４塩基以上の５’突出型の制限酵素の組み合わせは適当ではない。しかしながら、３塩基以下の付着末端を形成する５’突出型の制限酵素の場合、自己閉環の可能性が低いため使用に制限はない。ApaIのような３’突出型の制限酵素の場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって付着末端に由来するヌクレオチドが切除されていくので、４塩基以上の付着末端を形成するとしても使用に制限はない。一方、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する場合には、逆に３’突出型の制限酵素の利用には同様の制限あり、５’突出型の制限酵素は問題なく使用することができる。
【００３７】
また、クローニング部位として所望する部位の配列が、一本鎖突出部作製に際して使用する制限酵素、及びエキソヌクレアーゼに対して適当なものではない場合には、プロモーター下流を適当な制限酵素で２箇所切断し、所望の配列を有するカセットDNAを挿入することもできる。このとき、カセットDNAは、適当な一箇所の制限酵素部位を含み、かつ所望の一本鎖突出部形成領域には、使用するエキソヌクレアーゼの消化に適した配列とする。更に、プロモーター側の一本鎖突出部に相当する領域には、一本鎖突出部領域の端部となる部位から4〜16塩基上流、更に好ましくは、5〜15塩基、特には、6〜14塩基上流には、リボソーム結合部位に対応する配列を含んで構成する必要がある。このとき、プロモーター配列とリボソーム結合部位は、プロモーターのその転写制御機能を発揮し得る特定の範囲内に配置されるように調製することが好ましい。通常10〜100塩基、好ましくは30〜90塩基、離れるように調製する。更に、例えば、T4 DNA ポリメラーゼを使用する場合には、所望の一本鎖突出部形成領域のうち、センス鎖及びアンチセンス鎖の制限酵素の切断部位から夫々の５’側は、特定の第１ヌクレオチド以外の第２のヌクレオチド群で構成し、所望の一本鎖突出部形成領域の５´側端に隣接する塩基は第１ヌクレオチドを配置する。このとき、第２ヌクレオチド群で構成される配列の長さは、所望の一本鎖突出部の長さに応じて定められ、2〜40塩基、好ましくは6〜30塩基、特に好ましくは10〜20塩基長とする。このように構成することにより、制限酵素消化によってベクターに組み込まれたカセットDNA上の制限酵素部位で切断される。その後、第１ヌクレオチドの存在下でT4 DNA ポリメラーゼを作用させることによって、センス鎖、アンチセンス鎖の夫々の５’側が突出した一本鎖突出部が形成される。
【００３８】
一方、発現を目的とする外来遺伝子の両端、特にはコード領域の両端に一本鎖突出部を形成する。一本鎖突出部は、外来遺伝子のその両端に、互いに非相補的であるが、クローニングベクターの一本鎖突出部と相補的なものとして形成される。このとき、例えば、クローニングベクターのセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端側に突出するように一本鎖突出部が形成された場合には、外来遺伝子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端側に突出するように一本鎖突出部を形成する。クローニングベクターのセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端側に突出するように一本鎖突出部が形成された場合には、外来遺伝子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端側に形成する。そして、外来遺伝子への一本鎖突出部の形成は、例えば、PCRと、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して行うことができる。PCRを利用する場合、ベクターの一本鎖突出部と相補的な領域を、所望の目的遺伝子の両端に付加した核酸断片として増幅する。プライマーは、フォワードプライマーは、ベクターのプロモーター側の一本鎖突出部と相補的な配列を５’末端に有し、目的核酸分子の所望のコード領域に相当する配列を ３’側に有する。このとき、目的遺伝子の所望のコード領域の初めに開始コドンに対応した配列を内在した形で当該遺伝子に相当する配列を含むようにする。そのため、所望のコード領域の初めに開始コドンがない場合には、開始コドンがコード領域の上流に連続して配置されるようフォワードプライマーを設計する。一方、リバースプライマーは、ベクターのプロモーター側と反対側の一本鎖突出部と相補的な配列を５’末端に有し、当該遺伝子に相補的な配列を３’側に有するように構成する。増幅後に、ベクターと同様の処理をして一本鎖突出部を形成することができる。
【００３９】
プライマーは、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報及びクローニングベクターに形成された一本鎖突出部の配列情報に基づいて設計され、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。
【００４０】
外来遺伝子は、ベクターに、一本鎖突出部を介したアニーリング反応を利用して導入され、従来において必要とされた煩雑なライゲーション反応を必要とせず、少ない工程で簡便に組換えベクターを構築することができる。ここで、アニーリング条件は、一本鎖突出部の長さ、GCヌクレオチド配列の含有量に応じて経験的に適宜選択して設定されるものであり、相補性の程度が高いヌクレオチド同士が塩基対合則にしたがって特異的に対合するのに、十分な特異性を示す条件を適宜選択することができる。好ましくは、一本鎖突出部のTmを推定し、Tm値以下で、かつ十分な特異性を示す温度に設定する。当該分野において、そのようなアニーリング条件のバリエーションのための十分に確立された公式は周知であり、例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning： A Laboratory Manual"， 第２版、p.9.47-9.51， Cold Spring Harbor, New York：Cold Spring Harbor Laboratory、1989年、等を参照することができる。特には、実施例に記載した条件が好ましく例示される。
【００４１】
本願発明はまた、上記組換えベクター、特に発現ベクターによって形質転換された宿主細胞にも関する。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia）属細菌、例えば、Escherichia coli （以下、「E.coli」と略する。）DH5α、E.coli BL21、E.coli JM109等の大腸菌、バシルス（Bacillus）属細菌、例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌など汎用の宿主微生物を用いることができる。真核生物としては、例えば、酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロマイセス(Saccharomyces)属細菌、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス(Aspergillus)属細菌等が挙げられる。さらに、昆虫細胞、動物細胞または植物細胞が使用できる。昆虫細胞としては。カイコやヨガ等の細胞系、具体的にはSf9細胞等が例示され、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系、具体的にはCHO細胞、COS-7細胞等が例示される。
【００４２】
前記した組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得るには、例えば、エレクトロポーレーション法、塩化カルシウム法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。本願発明においてはこれらに限定されるものではなく、他の形質転換法によって形質転換体を得てもよい。
【００４３】
本願発明の組換えベクターにより形質転換した形質転換体の選別は、例えば、組換えベクターに含まれるマーカー遺伝子などの適当な遺伝子の発現を指標とする方法、ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによる方法、および組換えタンパク質の基質特異性を利用する方法などを用いることができる。
【００４４】
形質転換体から組換えタンパク質の製造方法は、形質転換体を培養し、得られた培養物から組換えタンパク質を回収することにより行う。培養工程は、本願発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、LB培地、M9培地等が好適に利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００４５】
ベクターにマーカー遺伝子配列として薬剤耐性遺伝子を含む場合には、好ましくは薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養する。たとえば、選択マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する場合は、適当な濃度に調製したテトラサイクリン溶液およびクロラムフェニコール溶液をそれぞれ加える。また、必要であれば、導入遺伝子の発現を誘導する発現誘導剤を培養開始時または培養開始から形質転換体の増殖を確認した後に加える。たとえば、発現誘導剤としては、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いることができる。
【００４６】
回収工程は、前述の培養工程において得られた形質転換体の培養物からの組換えタンパク質を回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。本願発明の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本願発明のグルコース脱水素酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、既知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本願発明の酵素を単離精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、SDS-PAGE電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の既知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィを利用する場合、本願発明の酵素をHisタグ等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、組換えタンパク質が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）外来遺伝子導入ベクターの構築及び組換えタンパク質の発現確認
本実施例において、大腸菌由来のベクターを改変することにより本願発明のクローニングベクターを構築し、更に当該ベクターに外来遺伝子を導入した組換えベクターを構築した。続いて、組換えベクターを大腸菌宿主に導入し組換えタンパク質の発現を確認した。
【００４８】
１．クローニングベクターの構築
改変の基礎となるベクターとしては、大腸菌由来の環状プラスミドベクターであるpQE-80L（QIAGEN社製）を使用した。図１に、pQE-80Lの構造を模式的に示したベクターマップを示す。図中、「EcoRI」、「BamHI」は制限酵素部位を表し、「bla」はbla遺伝子を表しアンピシリン耐性機能を有し、「lacIq」はlacIq遺伝子を表し発現制御機能を有する。図２に示すように、プロモーター下流に存在するEcoRI及びBamHI制限酵素部位でpQE-80Lベクターを開裂し、その間にカセットDNAを挿入してベクターを改変し閉環した。カセットDNAは、オリゴDNA1（5’ - AATTC ATTAA AGAGG AGAAA ATTAA CACAT CACCA TCACC ATCAC TAGTA AG-3’：配列番号１）とオリゴDNA2（5’ - GATCC TTAGT AGTGA TGGTG ATGGT GATGT GTTAA TTTTC TCCTC TTTAA TG - 3’：配列番号２）をアニーリングさせ２本鎖を形成させたものであり、両側にEcoRI及びBamHI制限酵素切断末端配列を、内部にBseRI制限酵素部位を含む。
【００４９】
次に、図３に示すように、この改変ベクターを制限酵素BseRIで開裂させ、2.5mMのdCTP存在下でT4 DNAポリメラーゼ（0.5ユニット／μｌ）と22℃で30分間反応させた。T4 DNAポリメラーゼの３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性により、ベクターの両端に一本鎖突出部が形成された。
【００５０】
２．インサートDNA断片の調製
本実施例においては、目的タンパク質として、ウシ反芻胃生息微生物群メタゲノム由来の小ラッカーゼ（small laccase）を選択した（図４：配列番号４、262アミノ酸、分子量約28,000）。図５に示すように、小ラッカーゼ遺伝子（図４：配列番号３）を鋳型にして、プライマー１（5’ - ATTAA AGAGG AGAAA ATTAA CATGA TCGAA CTGGA GAAGC TG - 3’：配列番号５）とプライマー２（5’ - TAGTG ATGGT GATGG TGATG CTTAC GGTAG ATACC GGTGA AG - 3’：配列番号６）でPCR反応を行った。プライマーは、目的タンパク質をコードする領域を挟むべく、外来遺伝子の二本鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖夫々の３’側に相補的になるように設計されたものである。ここでは、フォワードプライマーであるプライマー１の５’側に、ベクターのプロモーター側の一本鎖突出部と相補的な配列が付加されると共に、そして外来遺伝子配列の５’側の連続した位置に開始コドン配列（ATG）が付加されて構成される。一方、リバースプライマーであるプライマー２の５’側に、ベクターのプロモーターとは反対側の一本鎖突出部と相補的な配列を付加した。したがって、両プライマーは３´側に目的遺伝子を特異的に増幅させるに十分な配列を有する。更に、プライマー２は、後のタンパク質の発現確認の便宜を図るべく、発現タンパク質のカルボキシル末端へのHisタグ（6×His）挿入のための付加配列を含んで設計された。PCR反応は、通常の条件で行った。続いて、増幅断片をQIAquick （QIAGEN社製）で精製した後、2.5ｍMのdGTP存在下でT4 DNAポリメラーゼと、22℃にて30分間反応させ、DNA断片の両端にベクターの一本鎖突出部に相補的な一本鎖突出部を形成した。
【００５１】
３．タンパク質発現と確認
上記ベクターと上記DNA断片を各50ngずつ混合し、22℃で5分間静置して相補的な一本鎖突出部同士をアニーリングさせ組換えベクターを作製した（図６）。続いて、組換えベクターを、常法により大腸菌に形質転換した。
【００５２】
得られた形質転換体をLB培養培地で37℃にて、600nmの吸光度が0.7に達するまで振とう培養し、次に、発現誘導剤であるIPTGを終濃度1mM添加して更に23℃で終夜振とう培養を行った。培養後、遠心分離により回収した菌体を超音波破砕処理によって破砕して可溶性画分を得た。次に、可溶性画分からC末端にHisタグが融合したタンパク質のみを回収するためTALON樹脂カラム（Clontech）で精製を行ってHisタグ精製画分を得た。
【００５３】
そして、超音波破砕処理前の大腸菌のトータル画分、超音波破砕処理後の可溶性画分、Hisタグ精製画分を、夫々、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、Quick-CBB（和光純薬製）によりすべてのタンパク質を可視化した（図７）。続いて、Hisタグ融合タンパク質用染色液（His-Detect In-Gel Stain）により、Hisタグ融合タンパク質のみを可視化した（図８）。なお、IPTGを添加せずに培養したものについても同様に処理し、発現確認を行った（図７及び図８）。
【００５４】
図７及び図８左端の数字は分子量（×1000）を示し、左端のレーンは、分子量マーカーを示す。図中、「IPTG（−）」は、IPTGにより発現誘導を行わなかったサンプル、「IPTG（＋）は、IPTGにより発現誘導を行ったサンプルを示し、「T」は超音波破砕前の大腸菌のトータル画分、「S」は超音波破砕処理後の可溶性画分、「H」はHisタグ精製画分を示す。
【００５５】
図７より、超音波破砕処理後の可溶性画分から目的の大きさを示すタンパク質の大量発現が確認された。更に図８より、Hisタグを融合するタンパク質として同じ大きさのタンパク質の発現が確認された。以上の結果より、目的の大きさのタンパク質が得られたことは、本願発明により、ベクター由来のタンパク質との融合タンパク質ではなく、外来遺伝子の所望の領域によってコードされるタンパク質のみを合成できることを示すものある。
【００５６】
４．配列解析
精製された発現タンパク質が、目的の開始コドンから翻訳されており、そのアミノ末端（N末端）に余分なアミノ酸配列が付加されていない事を、精製タンパク質のN末端アミノ酸配列解析により確認した。図９〜１３に結果を示すように、N末端5残基の配列は目的のタンパク質アミノ酸配列と一致し、外来遺伝子の所望の領域のみを含むタンパク質が合成できたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本願発明は、組換えタンパク質発現のためのベクター及びその作製方法に関し、医療、食品、環境分野等の組換えタンパク質を必要とする様々な産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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