(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝的に改変されたヒトニューロン幹細胞、該幹細胞の生存する子孫細胞、及びクローンの提供。【解決手段】ニューロン幹細胞（ＮＣＳ）の安定なクローンがヒト胎児終脳から単離されている。これらの自己再生するクローンは、インビトロで、全３種の基礎的ニューロン細胞型（ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイト）を自発的に生じさせることができる。これらのＮＣＳは、発生中の新生マウス脳の胚領域への移植後に、それらのげっ歯類の対照物と同様に、正常な発生の局面に関与することができる。これらは、確立した移動経路に沿った散在したＣＮＳ領域への移動、微小環境の刺激に応答した発生的かつ領域的に適切な細胞型への分化、および宿主祖先を伴う非破壊的な非腫瘍形成性の点在を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）で安定な細胞系として維持されかつ生存する宿主被験者への要求に沿ったインビボ（ｉｎ−ｖｉｖｏ）の移植に適する、遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞であって、
（ｉ）有糸分裂性の自己複製する細胞系としてインビトロで継代される間は未拘束かつ未分化のままであり、
（ｉｉ）未拘束細胞としてインビボで移植可能であり、
（ｉｉｉ）移植後、生存する宿主被験者の神経系内での統合のために、移植部位から他の解剖学的部位へインビボで任意に移動し、
（ｉｖ）移植後、生存する宿主被験者中で、局所の解剖学的部位で実質組織中にインシトゥ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で統合し、そして
（ｖ）統合後に、インシトゥで、ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイトより成る群から選択される基本細胞型に分化する、
ヒト起源の原始ニューロン幹細胞；および
特定のタンパク質産物をコードする外来遺伝子より構成される最低１個のＤＮＡセグメントを担持するウイルスベクターを包含するよう遺伝子的に改変されているヒトゲノムＤＮＡ、
を含んで成る前記遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞。
【請求項２】
ウイルスベクターが両種指向性レトロウイルスのウイルスベクターである、請求項１に記載の遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞。
【請求項３】
ウイルスベクターが外因性ｖｍｙｃＤＮＡ配列を包含し、かつ、
（ａ）前記ｖｍｙｃＤＮＡ配列がインビトロで高度に発現されて、インビトロで維持される間に前記ヒトニューロン幹細胞を増殖細胞周期に存在させかつ迅速に増殖させ、さらに（ｂ）インビボの細胞増殖の速度が終止するような生存する宿主被験者の構成組織により、インビボの細胞移植後に、前記ｖｍｙｃＤＮＡ配列の発現が制御されるようになりかつダウンレギュレートされる、
請求項１に記載の遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞。
【請求項４】
インビトロで安定な細胞系として維持されかつ生存する宿主被験者への要求に沿ったインビボの移植に適する、遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞の生存する子孫細胞であって、
（ｉ）有糸分裂性の細胞としてインビトロで維持される間は未拘束のままであり、
（ｉｉ）未拘束細胞としてある選択された部位にてインビボで移植可能であり、
（ｉｉｉ）移植後、生存する宿主被験者の神経系内での統合のために、移植部位から他の解剖学的部位へインビボで任意に移動し、
（ｉｖ）移植後、生存する宿主被験者中で、局所の解剖学的部位で実質組織中にインシトゥで統合し、そして
（ｖ）統合後に、インシトゥで、ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイトより成る群から選択される基本細胞型に分化する、
ヒトニューロン幹細胞起源の多能性子孫細胞；および
特定のタンパク質産物をコードする外来遺伝子より構成される少なくとも１個のＤＮＡセグメントを担持するウイルスベクターを包含するよう遺伝子的に改変されているヒトゲノムＤＮＡ、
を含んで成る前記の遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞の生存する子孫細胞。
【請求項５】
ウイルスベクターが両種指向性レトロウイルスのウイルスベクターである、請求項４に記載の遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞の生存する子孫細胞。
【請求項６】
ウイルスベクターが外因性ｖｍｙｃＤＮＡ配列を持ち、かつ、
（ｉ）前記ｖｍｙｃＤＮＡ配列がインビトロで高度に発現されて、インビトロで維持される間に前記多能性子孫細胞を増殖細胞周期に存在させかつ迅速に増殖させ、さらに
（ｉｉ）インビボの多能性子孫細胞増殖の速度が終止するような生存する宿主被験者の構成組織により、インビボの細胞移植後に、前記ｖｍｙｃＤＮＡ配列の発現が制御されるようになりかつダウンレギュレートされる、
請求項４に記載の遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞の生存する子孫細胞。
【請求項７】
生存する宿主被験者への要求に沿ったインビボの移植に適する、個々の明確な細胞系としてインビボで安定に維持される遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞のクローンであって、
（ｉ）単一の遺伝的に改変されたヒトニューロン幹細胞に由来し、かつ、該幹細胞の子孫細胞であり、
（ｉｉ）有糸分裂性の自己複製する細胞系としてインビトロで継代される間は未拘束かつ未分化のままであり、
（ｉｉｉ）未拘束細胞としてインビボで移植可能であり、
（ｉｖ）移植後、生存する宿主被験者の神経系内での統合のために、移植部位から他の解剖学的部位へインビボで任意に移動し、
（ｖ）移植後、生存する宿主被験者中で、局所の解剖学的部位で実質組織中にインシトゥで統合し、
（ｖｉ）統合後に、インシトゥで、ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイトより成る群から選択される基本細胞型に分化し、そして
（ｖｉｉ）共通に同じ遺伝的に改変されたヒトゲノムＤＮＡを有する
複数のヒト起源の原始ニューロン幹細胞；および
特定のタンパク質産物をコードする外来遺伝子より構成される少なくとも１個のＤＮＡセグメントを持つウイルスベクターを包含するよう遺伝子的に改変されているヒトゲノムＤＮＡ、
を含んで成る前記遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞のクローン。
【請求項８】
生存する宿主被験者への要求に沿ったインビボの移植に適する、個々の明確な細胞系としてインビボで安定に維持される遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞子孫のクローンであって、
（ｉ）単一の遺伝的に改変されたヒトニューロン幹細胞の先祖に由来し、かつ、該幹細胞の子孫細胞であり、
（ｉｉ）有糸分裂性の自己複製する細胞系としてインビトロで継代される間は未拘束かつ未分化のままであり、
（ｉｉｉ）未拘束細胞としてインビボで移植可能であり、
（ｉｖ）移植後、生存する宿主被験者の神経系内での統合のために、移植部位から他の解剖学的部位へインビボで任意に移動し、
（ｖ）移植後、生存する宿主被験者中で、局所の解剖学的部位で実質組織中にインシトゥで統合し、
（ｖｉ）統合後に、インシトゥで、ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイトより成る群から選択される基本細胞型に分化し、そして
（ｖｉｉ）共通に同じ遺伝的に改変されたヒトゲノムＤＮＡを有する
複数の多能性の生存する子孫細胞；および
特定のタンパク質産物をコードする外来遺伝子より構成される少なくとも１個のＤＮＡセグメントを持つウイルスベクターを包含するよう遺伝子的に改変されているヒトゲノムＤＮＡ、
を含んで成る前記遺伝子的に改変されたヒトニューロン幹細胞子孫のクローン。
【請求項９】
ウイルスベクターが両種指向性レトロウイルスのウイルスベクターである、請求項７または８に記載のクローン。
【請求項１０】
ウイルスベクターが外因性ｖｍｙｃＤＮＡ配列を包含し、かつ、
（ａ）前記ｖｍｙｃＤＮＡ配列がインビトロで高度に発現されて、インビトロで維持される間に前記ヒトニューロン幹細胞を増殖細胞周期に存在させかつ迅速に増殖させ、さらに（ｂ）インビボの細胞増殖の速度が終止するような生存する宿主被験者の構成組織により、インビボの細胞移植後に、前記ｖｍｙｃＤＮＡ配列の発現が制御されるようになりかつダウンレギュレートされる、
請求項７または８に記載のクローン。
【請求項１１】
インビトロで安定および同定可能な細胞系として維持されかつ生存する宿主被験者への要求に沿ったインビボの移植に適する、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの両受容体を含んでなる原始ヒトニューロン幹細胞クローンであって、
（ｉ）ヒトの介在する手段により遺伝的に改変されていない天然のヒトゲノムＤＮＡを持ち、
（ｉｉ）有糸分裂性細胞系としてエピジェネティクス手段を用いてインビトロで継代される間は未拘束かつ未分化のままであり、
（ｉｉｉ）移植後、生存する宿主被験者の神経系内でのインビボでの統合のために、移植部位から他の解剖学的部位へインビボで移動でき、
（ｉｖ）移植後、生存する宿主被験者中で、局所の解剖学的部位で実質組織中にインシトゥで統合でき、
（ｖ）インシトゥで、ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイトより成る群から選択されるいずれか１種のニューロン細胞型に分化でき、そして
（ｖｉ）ＥＧＦおよびｂＦＧＦの両受容体を発現する
ヒト起源の多能性かつ自己複製性ニューロン幹細胞を含んでなる、
前記の原始ヒトニューロン幹細胞クローン。
【請求項１２】
インビトロで安定および同定可能な細胞系として維持されかつ生存する宿主被験者への要求に沿ったインビボの移植に適する、前記のＥＧＦおよびｂＦＧＦの両受容体を含んでなる原始ヒトニューロン幹細胞クローンの生存する子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に改変されたヒトニューロン幹細胞、該幹細胞の生存する子孫細胞、該幹細胞のクローン、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロン幹細胞（ＮＳＣ）は、発生中の神経系のおよび成体の神経系にさえ存在しそして成熟ＣＮＳのひと続きのより特化された細胞を生じさせている原因である比較的原始の未拘束(uncommitted)細胞であると仮定されている1-12。それらは、（ａ）複数の領域および発生の情況において全部のニューロン系統の細胞（ニューロン（理想的には複数のサブタイプ）、稀突起膠細胞、大グリア細胞）に分化する（すなわち多分化能または多能性である）；（ｂ）自己再生または自己複製する（すなわち類似の潜在能力をもつ新たなＮＳＣもまた生じさせる）；（ｃ）発生および／もしくは変性するＣＮＳ領域を占めるそれらの能力により、機能上定義されている。単クローンの派生の明白な立証が定義に必須である。すなわち、単一の細胞がこれらの属性を所有しなければならない。培養物中で増殖された、幹細胞の特性をもつげっ歯類のニューロン細胞が、哺乳動物の脳中に再移植可能であり、そこでそれらが適切に再統合しかつ外来遺伝子を安定に発現することができた13-16という最も初期の認識を伴い、遺伝子治療学者および回復推進(restorative)神経生物学者は、治療的利点ならびに発生の機構の理解のためにこうした現象をどのように利用することができるのかを推測し始めた。これら、および彼らが開始した研究（別の場所で概観されている2,9-11,17-21）は、ＮＳＣの使用は、それらの固有の生物学によって、現在利用可能な移植片材料および遺伝子伝達ベヒクルの限界のいくつかを回避し、そして多様な新規治療戦略を実行可能にするかも知れないという希望を提供した20-22。
【０００３】
幹細胞の特性をもつニューロン細胞は、胚、新生および成体のげっ歯類のＣＮＳから単離され、そして後成的（例えば、上皮増殖因子［ＥＧＦ］もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子［ｂＦＧＦ］のような分裂促進因子1,5,16,23-27または膜基質7を用いて）および遺伝子的（例えばｖｍｙｃもしくはＳＶ４０ラージＴ抗原のような増殖遺伝子(propagating
gene)1,9-15,17-19,28-32を用いて）双方の多様な同等に有効かつ安全な手段によりインビトロで増殖されている。培養物中でこうしたＮＳＣを増殖状態に維持することは、移植後のインビボの正常な発生の刺激に応答する（細胞周期から引き離す、宿主細胞と相互作用する、適切に分化する9-16,29-33）それらの能力を覆すようではない。これらの極めて形成的な細胞は、とりわけ脳全体の胚領域(germinal zone)への移植(implantation)後に、時間的かつ領域的に適切な様式で移動かつ分化する。それらはマウスの中枢神経軸に沿った正常な発生に参画し、内在性の祖先と非破壊的に混ざり、それらの表現型決定のため局所の微小環境の刺激に対し類似に応答し、そして多様なニューロン細胞型およびグリア細胞型に適切に分化する。加えて、それらはインビボで外来遺伝子（レポーター遺伝子および治療遺伝子双方）を発現することができ9-21,29-32、そしてニューロンおよび／もしくはグリアの非存在もしくは変性の設定において特定のニューロン細胞の置換えが可能である9,11,31,32。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書は、これらの重要な機能をインビトロおよびインビボで演じるヒトＮＳＣのクローンの潜在能力を例証する。われわれは、それらが多分化能であり、自己再生し、移植可能であり、形成性であり、そして移動性であること；原型の神経変性性の遺伝的酵素欠損を交差修正(cross-correct)することができる遺伝子産物（こうした疾患の遺伝子治療に必要な前駆体）を分泌すること；所定の領域および段階（細胞が最初に得られたものと異なる場合であっても）に適切な発生プログラムを（多様な胚領域への移植後に）インビ
ボで実行すること；エクスビボの遺伝子操作（例えば外来遺伝子のレトロウイルス媒介性の形質導入）が可能であること、また、移植後に、広範に散在するＣＮＳ領域中でインビボでその導入遺伝子(transgene)を発現する（遺伝子送達／治療の潜在能力をさらに確立する）ことが可能であること；そして、（治療的なＣＮＳ細胞の置換えの潜在能力を示唆する）神経変性および損なわれた発生の原型のマウス突然変異体モデルにおいて特定の欠陥のあるニューロン集団の置換えに向かって分化することが可能であることを示す。（ｂＦＧＦを用いて）後成的もしくは（構成的にダウンレギュレートされたｖｍｙｃを介して）遺伝子的のいずれかの手段により増殖されるヒトＮＳＣの能力の間での比較もまた行い；その知見は、増殖のこれら２種の普遍的な手段が同等に有効かつ安全であることを示唆する（研究者が彼らの研究もしくは臨床の要求に最良に適合する技術を自由に選んでよいことを意味する）。
【０００５】
（発明の詳細な記述）
われわれは、厳格に定義された幹細胞の特徴をもつニューロン細胞が、実際にヒト脳から単離されることができ、また、下等哺乳動物のＮＳＣの挙動を模倣することができるという証拠を提示する。これらの観察結果は、ヒトＣＮＳに対するある種の神経発生の原理の保存を与えるのみならず、しかし、それらは、この分類のニューロン細胞が、ヒトでの研究および臨床の問題にも同様に最終的には適用されることができることを示唆している。実際のところ、本報告書に記述される実際のヒトＮＳＣクローンがその機能をはたすことができるのみならず、しかし、われわれのデータは、こうした細胞が複数の研究および／もしくは治療の問題の要求を満足するであろうということを除き、他の研究者が、多様な同等に安全かつ有効な（後成的および遺伝子的双方の）方法によってヒト材料の他の供給源からこうした細胞を容易に得かつ増殖することができることを示唆している。
【０００６】
ＮＳＣの潜在能力において増大する興味は造血幹細胞におけるものと類似であった。この興味は、ＮＳＣは、単に移植の規範での胎児組織の置換物、もしくは遺伝子送達のための単に別のベヒクルでないという認識から生じている。それらの基礎生物学は、少なくとも細胞の検査により示されるとおり、遺伝子治療および遺伝子修復のための他のベヒクルが所有していないかも知れない潜在能力をそれらに付与しているようである。例えば、それらが移植後にニューロン構造に統合している(integrate)かも知れないことは、多様な遺伝子産物の調節された放出ならびに文字どおりの細胞の置換えを見込むことができる。（現在利用可能な遺伝子伝達ベクターは通常、実際には変性しておりかつ置換えを必要とすることができる確立されたニューロン回路により新たな遺伝情報を中継することに依存している一方で、ＮＳＣはこれらの経路の再構成に参画することができる。）酵素および細胞の置換えは、ＣＮＳの特定の解剖学的に範囲を定められた領域にのみならず、しかしまた、所望の場合は、胚領域への単純な移植により広く行き渡った様式でＣＮＳのより大きな領域に標的を定めることができる。多くの神経学的疾患は、パーキンソン病でそうであるように特定の部位に限局されないため、この能力は重要である。むしろ、それらの神経病理学は、しばしば広範囲、多病巣、もしくは包括的（例えば、多様な外傷性、免疫学的、感染性、虚血性、遺伝的、代謝性もしくは神経変性性の過程に存在する病変）でさえある。これらは、ニューロンの移植の範囲を超えると慣習的に見なされる治療の挑戦である。従って、ＮＳＣは、ＣＮＳでの移植および遺伝子治療の規範の範囲を広めるよう助けてきた。ＮＳＣは容易にかつ妨害されずに血液脳関門を通過し、そして、直ちに、直接、そして必要な場合は散在した様式で、それらの外来遺伝子産物をＣＮＳに送達する。加えて、ＮＳＣは神経変性に応答性であることができ、欠陥のある細胞型を補償するようにそれらの分化を移動させる。これらの特性の根底にある生物学は、実際的価値があるかも知れないだけでなく、しかし基礎的な発生の機構を解明するかも知れない。
【０００７】
われわれの結果を要約するために、（共通のレトロウイルス挿入部位の存在により明白に主張されかつ後成的もしくは遺伝子的手段のいずれかにより増殖された）ヒトＮＳＣの
クローンが、インビボで正常なＣＮＳの発生に参画し、かつ、確立した移動経路に沿った多様な胚領域から広範に散在した領域までの移動を包含する、正常な微小環境の刺激に対して応答することが可能である。単一のＮＳＣは、全３種の基礎的ニューロン系統（（多様な型の）ニューロン、稀突起膠細胞および大グリア細胞（これゆえに多分化能））で子孫を生じさせ、ならびに類似の潜在能力をもつ新たなＮＳＣを生じさせる（すなわち自己再生）ことが可能である。所定のヒトＮＳＣクローンは、インビボで、マウス宿主への移植後に、内在性のマウス祖先（それらはこれらと一様に混ざる）について確立したパターンを模倣して、ニューロン軸の長さに沿って、領域および発生段階に適切な系統のニューロン細胞に（すなわち、神経発生が正常に持続しているニューロン、およびグリア発生が優位を占めるグリアに）分化するのに十分に形成的である。従って、例えば、それらは、中枢神経軸の一端でＯＢへの、そして他端で小脳中の顆粒ニューロンへの移動後にニューロンを生じさせることができ、なおまた大グリア細胞および稀突起膠細胞（生後新皮質、皮質下白質および線条体で生じる適切な細胞型）も生じることができる。さらに重要なことは、真の幹細胞に期待されることができるとおり、われわれは、これらのＮＳＣが分化することが可能であったニューロン型の多くが、該細胞が当初得られた発生段階（例えば懐胎中）で産生されないが、しかしむしろＮＳＣ移植の段階および領域で産生されることを立証することができ、こうして適切な（領域に加えて）時間的な発生の応答性を主張した。
【０００８】
興味深いことに、最も確固たる分化は、細胞がより未分化の外観を長期間維持することができた培養皿においてではなく、しかし、それらが分化された表現型を迅速に達成した移植脳において、最終的に達成された。この結論は、インビトロ実験については、大グリア細胞発生（脳の発生において典型的に産生される最後の細胞型）の誘導は共培養される一次ＣＮＳ細胞（おそらく「環境」を再創製する）の存在を必要とした一方、インビボ環境へのＮＳＣの単純な移植は移植実験で十分であったという観察結果によってもまた支持されている。
【０００９】
こうした豊富な遺伝子的に均一の操作可能な細胞は、インビボおよびインビトロでヒトＮＳＣの生物学を研究するための価値あるモデルを明瞭に代表する。われわれは、本論文で、ヒトＮＳＣクローンが、真の臨床医の立場でそれらを有効であると期待するよう導くことができる能力を所有することを立証した。
【００１０】
われわれは、（単一の単純な移植処置からであっても）それらの広範に散在した位置で、レトロウイルスで形質導入される外来遺伝子（ｌａｃＺ）を発現するこれらの細胞の能力を立証し、将来の治療的遺伝子伝達戦略の見込みを提供する。これらのヒトＮＳＣにより送達される遺伝子産物が、全部の型の機能不全のニューロン細胞を交差修正することを期待することができることは、その特定の遺伝子産物が（標的を定められた突然変異誘発を介して）欠乏しているニューロン細胞の原型モデル（テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）マウス細胞）への指標の治療タンパク質（ヘキソサミニダーゼ）の成功裏の送達を立証するわれわれの実験により示唆された。ニューロン、グリアおよび未熟な感覚上皮の祖先の表現型までものテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）の脳細胞は、これらのヒトＮＳＣの分泌性産物により効果的に救助することができ、そしてそれらを効果的に補完することができた。この遺伝子産物は、標的ニューロン細胞中に内在化されると、大多数の突然変異された細胞での病的ＧＭ2蓄積を未然に防いだ。この成功裏の分子交差修正は、細胞移植およびインビボ移動データと一緒になって、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）が一代表例である、広範囲の遺伝性代謝疾患および他の神経発生的ヒト疾患の治療のためのヒトＮＳＣ媒介性の戦略の実行可能性を確立する助けとなる。
【００１１】
要約すれば、ＮＳＣは、移植可能な応答性ニューロン細胞の生成において同等に有効かつ安全である多様な（後成的および遺伝子的双方の）手段により増殖することができ（そ
して、実際のところ、細胞周期調節タンパク質と可逆的に相互作用する共通の最後の分子経路に接近することができ）る。従って、１つの技術により永続されるＮＳＣの研究から獲得される洞察は、他を使用する研究に由来する洞察と正当に結合されて、ＮＳＣの生物学のより完全な像を提供する助けとなるかも知れない。さらに、ＮＳＣを単離および操作するためにはどの技術が最も効果的であるかに関するＮＳＣの文献での論争の解決の補助、およびヒト起源の細胞でそうすることにおいて、研究者および／もしくは臨床医の特定の研究もしくは臨床の問題の要求に最良に役立つ増殖技術を選ぶための扉は彼らに開かれている。これらは重要な実際的意味を有することができる。遺伝子的手段（例えば、通常の発生機構および環境の刺激により構成的にダウンレギュレートされるｖｍｙｃ構築物）によるＮＳＣの増殖が、多くの要求に対して今日までのところ最も安全で、容易で、有効で、信頼できかつ費用効率のよい方法であるようであることは興味深い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明にかかる、各推定のヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）クローンの単クローン性の性質は、それぞれのゲノム内の単一のレトロウイルス挿入部位を立証することにより確認される。［Ａ］（ｂＦＧＦにより増殖されそしてその後ｌａｃＺおよびｎｅｏをコードするレトロウイルスで形質導入された）推定のヒトＮＳＣクローンＨ１からのゲノムＤＮＡを（プロウイルス内で１ヶ所のみ切断する）ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｎｅｏに相補的な放射標識されたヌクレオチドプローブとともにインキュベートした。単クローンの派生は、それらが単一の感染した「親」細胞（矢印）由来であったことを示す、コロニー中の全細胞に共通の組込み部位をもつ単一の組込まれたレトロウイルスの存在により確認される。陽性対照として、ｎｅｏをコードする２種の組込まれたレトロウイルス（組込まれたｖｍｙｃをコードするレトロウイルスからの１種および別個のｌａｃＺをコードするレトロウイルスからの１種13,28）を含有するマウスＮＳＣクローン１７．２は、２バンド（矢印）を適切に示す。プローブの特異性は、レトロウイルスに感染しておらずそのゲノム中にｎｅｏ配列、そしてこれゆえにハイブリダイゼーション産物を示さない陰性対照、ヒト髄芽腫細胞系ＤａＯＹにより立証される。［Ｂ］推定のクローンＨ９、Ｈ６、Ｄ１０およびＣ２（ｂＦＧＦおよび／もしくはＥＧＦ中で増殖されそしてそれから増殖遺伝子ｖｍｙｃをコードするレトロウイルスにその後感染したヒトＮＳＣコロニー）からのゲノムＤＮＡを、Ｂｇｌ  ＩＩもしくはＢａｍ  ＨＩ（そのそれぞれはプロウイルス内で１ヶ所のみ切断する）で消化し、そしてその後、プロウイルスのｖｍｙｃに相補的なプローブを利用するサザン分析にかけた。単一のレトロウイルス組込み部位が全コロニーで認識され、各推定のクローンの単クローン性の性質を確認する。単一コピーのｖｍｙｃを含有し13,28そして陽性対照としてはたらくマウスＮＳＣクローンＣ１７．２もまた１バンドを有する。［Ａ］でのように、陰性対照（ウイルスに感染していないヒトＤａＯＹ細胞）はバンドを有しない。
【図２】本発明にかかる、インビトロでのヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）の特徴づけ。［Ａ］ＮＳＣは、血清を含まないｂＦＧＦを補充された培地中でクラスターとして成長する傾向がある。それらは、血清を含有する培地に移された場合には神経細糸に免疫反応性のニューロン［Ｂ］もしくはＣＮＰアーゼに免疫反応性の稀突起膠細胞［Ｃ］に、または、例えば、典型的なタイプ−１の原形質性アストロサイトを具体的に説明する［Ｄ］でのように、一次マウスＣＮＳ培養物とともに共培養され（かつヒト特異的抗ＧＦＡＰ抗体で同定され）る場合にＧＦＡＰを発現するアストロサイトに、自発的に分化する。これゆえに、単一のクローンは全ニューロン系統の細胞を発生させる潜在能力を有する（「多分化能」）。全条件下で、クローン中に新たな未熟な未分化のビメンチンに免疫反応性のＮＳＣ［Ｅ］が存在し、クローンの「自己再生する」（すなわち新たな多分化能ＮＳＣを産生する）能力を示唆している。
【図３】本発明にかかる、ヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）は、遺伝子が突然変異されている多系統のニューロン細胞（例えば、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）マウスからの脳細胞）において、原型の遺伝子産物欠乏（例えばβ−ヘキソサミニダーゼ−Ａ）を補完することが可能である。ヒトＮＳＣは（マウスＮＳＣと同様に）神経発生的欠損を交差修正することが可能であるという原理の証明として、ヘキソサミニダーゼ−Ａの非存在をもたらすβ−ヘキソサミニダーゼのα−サブユニットの標的を定められた突然変異誘発を介して発生された39、原型の神経発生的障害、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）疾患のマウスの脳からのニューロン細胞を、ヒトＮＳＣからの分泌性遺伝子産物に曝露して、この欠損の補完を遂行するそれらの能力を評価した。［Ａ−Ｃ］ＮＡＳＢＧ組織化学（ノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学）により測定されるようなヘキソサミニダーゼ活性。機能的ヘキソサミニダーゼは活性のレベルに比例した強度をもつ赤桃色沈殿を生成する。［Ａ］ＮＳＣに曝露されないテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ニューロン細胞（矢印）は、検出可能なヘキソサミニダーゼを有しないか、もしくは最小限の検出可能なヘキソサミニダーゼを有する。（低い残余のヘキソサミニダーゼ−Ｂ活性を反映する、少数のわずかに桃色のＮＡＳＢＧ＋の細胞がときに観察される）。比較すれば、マウスＮＣＳ（例えばクローンＣ１７．２Ｈ）［Ｂ］もしくはヒトＮＳＣ［Ｃ］からの分泌性産物に曝露されたテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ニューロン細胞は、今や、強く赤色に染色し（野性型の強度）、それらが交差修正された、すなわち、ＮＳＣ馴化培地から有意の量の機能的に活性なヘキソサミニダーゼを内在化したことを示唆している。［Ｄ−Ｌ］テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）の脳からのどのニューロン細胞型が交差修正されたかを決定する助けとするため、（［Ｃ］でのように）トランスウェル系でヒトＮＳＣとともに共培養されていた一次解離テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ニューロン細胞を、ヘキソサミニダーゼのヒトα−サブユニットに対するフルオレセイン標識抗体［Ｄ−Ｆ］およびニューロン細胞型特異的抗原に対する抗体（ＴＲ標識二次抗体により可視化される）［それぞれＧ−Ｉ］の双方と反応させた。二重フィルターを通した顕微鏡写真は、細胞型マーカーを伴うα−サブユニットの共局在化を確認した［それぞれＪ−Ｌ］。これらの今やα−サブユニット陽性の修正された細胞のあるサブセット［Ｄ］は、ニューロンマーカーＮｅｕＮのそれらの発現により示されるとおり［Ｇ、Ｊ］ニューロンであり；α−サブユニット＋の細胞のあるサブセット［Ｅ］は、グリアのマーカーＧＦＡＰのそれらの共発現により具体的に説明されるとおり［Ｈ、Ｋ］グリアであり；そしてα−サブユニット＋の細胞のあるサブセット［Ｆ］は、中間フィラメントネスチンの存在により示されるとおり［Ｉ、Ｌ］未熟な未分化のＣＮＳ前駆体であった。（テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）の脳からの未処理の細胞はα−サブユニットについて染色しなかった。）［Ｍ］［Ａ−Ｃ］でみられるような、成功裏に救助された（すなわちＮＡＳＢＧ＋の）一次テイ−サックス（���ａｙ−Ｓａｃｈｓ）ニューロン細胞のパーセント。ＮＡＳＢＧ＋であった（第一のヒストグラム）「未処理の」テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）のα−サブユニットが存在しない細胞（−／−）（すなわちＮＳＣに曝露されない）の数は極めて少なかった。（このパーセンテージが０でないことは、いくつかの細胞において薄桃色の評価可能な細胞を産生させるのにときに十分に十分である突然変異体細胞における若干の低い残余のヘキソサミニダーゼ−Ｂ活性を反映する。）対照的に、マウスＮＳＣ（Ｃ１７．２）（第二のヒストグラム）、ヘキソサミニダーゼを過剰発現するよう工作されたマウスＮＳＣ（Ｃ１７．２Ｈ）（第三のヒストグラム）、もしくはヒトＮＳＣ（第四のヒストグラム）からの分泌性産物で「処理された」テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ニューロン細胞のなかで、交差修正されたヘキソサミニダーゼ含有細胞のパーセントは有意に増加した（ｐ＜０．０１）。ＮＳＣは、この救助を遂行するそれらの能力では相互と有意に異ならなかった。（野性型マウスからのニューロン細胞のＮＡＳＢＧ染色は陽性対照としてはたらき、そして、ほぼ１００％がＮＡＳＢＧ＋であった。ヒストグラムは提示されない。）［Ｎ］遺伝子産物の欠乏の補完は、減少されたＧＭ2蓄積を伴うテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ＣＮＳ細胞のパーセントにより具体的に説明されるとおり、突然変異されたニューロン細胞中での病的な表現型の救助をもたらす。ＮＳＣに曝露されないテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）細胞（第一のヒストグラム）のなかで、ＧＭ2＋の細胞のパーセントは大きく、それらの病理学的に高いレベルの貯蔵を反映し、そして［Ｍ］による酵素の欠如と矛盾しない。対照的に、マウス（［Ｍ］でのとおり、第二および第三のヒストグラム）もしくはヒトのＮＳＣ（第四のヒストグラム）への曝露後の検出可能なＧＭ2貯蔵を伴わない、交差修正されたテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）細胞のパーセントは、突然変異体におけるより有意により小さく（ｐ＜０．０１）、野性型（＋／＋）マウス脳（第五のヒストグラム）におけるものに接近していた。再度、ＮＳＣは、この救助を遂行するそれらの能力で相互と有意に異ならなかった。
【図４】本発明にかかる、新生マウスの脳室下胚領域（ＳＶＺ）への移植後のヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）の発生的に適切な移動。［Ａ、Ｂ］ドナー由来のヒトＮＳＣは、移植後２４時間までに、宿主ＳＶＺ内で内在性の祖先に統合しかつ非破壊的にそれらと混ざる。［Ａ］で強調されている、典型的な短い突起を伴う代表的なドナー由来の細胞（赤色）は、密に充填された内在性ＳＶＺ細胞とともに点在している（［Ｂ］の重なり合う画像中でＤＡＰＩ（青色）により可視化されている）。［Ｃ］移植２週間後、多くのドナー由来細胞（赤色）が、この冠状断面で可視化されるとおり、側方脳室（ＬＶ）での移植のそれらの部位から皮質下白質（矢印）および脳梁（ｃ）内に広範囲に混ざっている。皮質下白質（矢印）内の代表的な移動する細胞（囲まれた挿入物中で高倍率で可視化されている）が、移動する前駆体細胞に特徴的な先導突起を有することが示されている。［Ｄ、Ｅ］この代表的なクレシルバイオレットで対染色された傍矢状切片でみられるとおり、他のドナー由来細胞が、前ＳＶＺ中のそれらの統合部位から移動して吻側移動流（「ＲＭＳ」）に進入した（嗅球（「ＯＢ」）につながる）。ＲＭＳ内の代表的なＢｒｄＵ−イムノペルオキシダーゼ(immunoperoxidase)陽性（褐色）のドナー由来細胞（矢印）が［Ｄ］に低倍率で見られ、また、［Ｅ］ではより高倍率で可視化され、移動する宿主細胞と混ぜられている。ＯＢ中のそれらの最終位置におけるこれらのドナーのヒトＮＳＣ由来細胞のさらなる特徴づけおよび可視化を図５に提示する。目盛棒線：１００μｍ。
【図５】本発明にかかる、発生中の新生マウスのＳＶＺへの移植後のインビボでのヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）クローンの分化および外来遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）発現の散在。［Ａ−Ｃ］安定に移植された、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を発現する、代表的ヒトＮＳＣクローンＨ１からのドナー由来細胞を、Ｘｇａｌ組織化学［Ａ、Ｂ］および抗β−ｇａｌ  ＩＣＣ［Ｃ］で検出した。［Ａ］の一連の顕微鏡写真中に写真で示されるドナー由来細胞は室周および皮質下白質領域内にある（図４による）。（上図および下図（左に低倍率、右に対応する高倍率）は、単一のレシピエント内の代表的ないくぶん隣接する(semi-adjacent)領域からであり、細胞の有意の分布を示唆し；矢印は側方脳室を示す。）さらに、（図４Ｄでのように位置される）嗅球（ＯＢ）を通る代表的な高倍率の顕微鏡写真により［Ｂ、Ｃ］に具体的に説明されるとおり、このクローンからのドナー由来細胞は、この発生的に適切な部位に広範囲に移動したのみならず、しかしこの離れた位置で（すなわちインビボで散在した様式で）βｇａｌを発現し続ける。この発生段階でＯＢに移動していたＳＶＺ由来の祖先の亜集団の通常の運命はニューロン性になることである。［Ｄ−Ｇ］では、出生時にＳＶＺに移植されたＢｒｄＵ標識されたＮＳＣ（代表的クローンＨ６）由来の成熟ＯＢ中のドナー由来のニューロンが、ヒト特異的ＮＦ抗体に対するそれらの免疫反応性［Ｄ］、ならびに成熟ニューロンのマーカー、ＮｅｕＮのそれらの発現［Ｅ−Ｇ］の双方により同定され；共焦点顕微鏡検査下では、ＢｒｄＵ＋（これゆえにドナー由来）の細胞（［Ｅ］中の矢印、フルオレセイン）は、ＮｅｕＮ＋（［Ｆ］中の矢印、テキサスレッド）であり、二重フィルターを用いて最良に認識される（［Ｇ］中の矢印）。ドナー由来細胞［Ｆ中の矢印］と類似の大きさ、形態および位置を共有する２種の宿主のＯＢニューロン（［Ｇ］中のＢｒｄＵ−／ＮｅｕＮ＋）が、この代表的なドナー由来のＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋ニューロン（矢印）に隣接している。［Ｈ、Ｉ］稀突起膠細胞特異的なタンパク質ＣＮＰアーゼ［Ｈ］およびＢｒｄＵ［Ｉ］に対する抗体で二重標識された、新生の脳室内移植後の成体皮質下白質（図４Ｃによる）中で適切な、代表的なドナー由来の（クローンＨ６）稀突起膠細胞（矢印）の高倍率図。細胞体から伸長する特徴的な細胞質突起が示される（［Ｈ］中の矢尻）。（ＣＮＰアーゼ＋の細胞の形態は、ＢｒｄＵ二重標識に必要とされるＨＣｌ前処理によりいくぶん損傷されている。）［Ｊ］ヒト特異的抗ＧＦＡＰ抗体で同定される、新生の脳室内移植後の成体の皮質下白質（矢印）（図４Ｃによる）および線条体における成熟のドナー由来のアストロサイト（クローンＨ６）。差し込み図が、代表的なヒトのＧＦＡＰ＋の細胞の特徴的な成熟アストロサイトの形態をより高倍率でより良好に具体的に説明する。［Ｋ−Ｑ］ｖｍｙｃの発現は移植後４８時間以内にダウンレギュレートされる。［Ｋ］、［Ｍ］および［Ｏ］は、それぞれ隣接する図［Ｌ］、［Ｎ］および［Ｐ、Ｑ］のＤＡＰＩに基づく核染色である。代表的ヒトＮＳＣクローンＨ６は、増殖遺伝子ｖｍｙｃを用いて（十分に特徴づけられたマウスのＮＳＣクローンＣ１７．２でそうであったように）発生させた。移植後２４時間でのＳＶＺ（矢印）中のＨ６由来細胞（赤色）におけるｖｍｙｃの免疫反応性（［Ｌ］、および［Ｎ］により高倍率で）は、統合されたＨ６由来細胞（［Ｑ］（ここでは移植後３週間が示されるが、しかし移植後２４時間のいかなる点も代表する）でＢｒｄＵ標識により可視化される）で持続的に非存在である［Ｐ］。目盛棒線：［Ａ］、［Ｋ］および［Ｌ］に適用される：１００μｍ；［Ｄ］、［Ｅ］および［Ｆ、Ｇ］、［Ｈ］に適用され、また［Ｉ］、［Ｊ］、［Ｍ］に適用され、そして［Ｎ］に適用される：１０μｍ；［Ｏ］および［Ｐ、Ｑ］に適用される：５０μｍ
【図６】本発明にかかる、神経変性の顆粒ニューロンに欠陥のある曲がり尾（ｍｅａ）マウスモデルの小脳への移植後のヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）によるニューロンの置換え。［Ａ−Ｇ］新生のｍｅａ外胚層（ＥＧＬ）への移植後の抗ＢｒｄＵイムノペルオキシダーゼ細胞化学（褐色の核）により成熟小脳で同定される（代表的クローンＨ６からの）ＢｒｄＵ挿入されたドナー由来の細胞。（小脳表面上のＥＧＬは、内顆粒層（ＩＧＬ）が出現する際に消失して、器官形成の終了時に最深の小脳皮質層となる13。）［Ａ］クローンＨ６由来の細胞が、この傍矢状切片で成熟小脳の全葉のＩＧＬ（「ｉｇｌ」；矢尻）に存在する。（顆粒ニューロンは、前葉で若干の突出を伴い小脳全体で減少している。）［Ｂ］より高倍率の、レシピエントのＩＧＬ内に存在する多数のドナー由来細胞を立証する、［Ａ］で矢尻「ｂ」により示された代表的小脳後葉。［Ｃ−Ｇ］増大する倍率の、ｍｅａの小脳前葉のＩＧＬ内のドナー由来細胞（褐色の核）。（［Ａ、Ｂ］におけるものと異なる動物。）［Ｇ］ノルマルスキ（Ｎｏｒｍａｒｓｋｉ）光学が、いくつかの残余の宿主のＢｒｄＵ陰性の小脳顆粒ニューロン（矢尻）およびＢｒｄＵ＋のドナー由来ニューロン（矢印）（全動物の全部の移植された葉で見られるものを代表する）の大きさおよび形態の類似性をもたらす。［Ｈ、Ｉ］［Ａ−Ｇ］からのドナー由来のＢｒｄＵ＋の細胞の亜集団のニューロンの分化の確認を、抗ＢｒｄＵ［Ｈ中の緑色］および成熟ニューロンのマーカーＮｅｕＮ［Ｉ中の赤色］（対応する矢印で示される）での共標識により具体的に説明する。（いくつかの隣接するドナー由来細胞は、それらのＢｒｄＵ＋（［Ｈ］中の矢尻）により示されるように非ニューロン性であるが、しかしＮｅｕＮ表現型である（免疫染色の特異性もまた具体的に説明する））。［Ｊ］ヒト染色体のセントロメアを同定するヒト特異的プローブ（赤色）を用いるＦＩＳＨにより、ＩＧＬ内の細胞がヒトドナー由来の細胞であることが確認される。目盛棒線：［Ａ］、［Ｂ］：１００μｍ；［Ｆ］、［Ｇ］、［Ｊ］：１０μｍ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
実験プロトコル
培養物中でのヒトＮＳＣの維持および増殖
妊娠１５週のヒト胎児（別の場所55に詳述される）の終脳（とりわけ周室部）から調製された一次解離ニューロン細胞（細胞５×１０5個／ｍｌ）の懸濁物を、以下の成長培地、すなわちｂＦＧＦ（１０〜２０μｇ／ｍｌ）（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
））およびヘパリン（８μｇ／ｍｌ）ならびに／もしくはＥＧＦ（１０〜２０μｇ／ｍｌ）を添加したＮ２培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を補充されたＦ１２培地を含む（１：１）ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、未被覆の組織培養皿（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））上で培養した。培地は５日ごとに交換した。細胞の凝集物は、大きさが１０個の細胞直径より大きい場合に以下のとおり解離した。すなわち、ハンク（Ｈａｎｋ）の平衡塩溶液およびＨｅｐｅｓ緩衝液で２回すすぎ、３７℃で１５分間トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）中に置き、ダイズトリプシンインヒビター中で摩砕し、穏やかな遠心分離によりペレットにし、そして細胞５×１０5個／ｍｌで上のような成長培地中で再培養した。
【００１４】
分化の培養条件
解離されたＮＳＣを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含むＤＭＥＭ中、ポリ−ｌ−リシン（ＰＬＬ）被覆された８穴チャンバースライド（ヌンク（Ｎｕｎｃ））上で培養し、そしてＩＣＣのため毎週（インビトロで４週まで）継代した。大部分の場合、分化が自発的に発生した。（ヒト特異的抗ＧＦＡＰ抗体に対する免疫反応性により評価されるような）アストロサイトの成熟のためには、ヒトクローンを新生ＣＤ−１マウス脳の一次解離培養物とともに共培養した。
【００１５】
ヒトＮＳＣへのレトロウイルス媒介性の遺伝子伝達
２種の異なる異種栄養性の複製能力のないレトロウイルスベクターを使用してヒトＮＳＣを感染させた。ウイルスのＬＴＲから転写されたｌａｃＺおよび内的ＳＶ４０初期プロモーターから転写されたｎｅｏをコードするレトロウイルスベクターは、それがＰＧ１３異種栄養性エンベロープを担持したことを除いてＢＡＧベクター13に類似であった。このベクターは、移植実験のための安定な、組織学的に検出可能および免疫検出可能な遺伝子マーカーを提供したのみならず、しかしまた所定のコロニー中に存在する細胞のサザン分析での単一の共通のレトロウイルス挿入部位の立証による単クローン性の確認も可能にした。（ＬＴＲから転写された）ｖｍｙｃ（および内的ＳＶ４０初期プロモーターから転写されたｎｅｏ）をコードする両栄養性の複製能力のないレトロウイルスベクターは、遺伝子的手段によるヒトＮＳＣクローンの増殖を可能にしたのみならず、しかし上述されたような全部の子孫の単クローン性の起源の確認もまた可能にした。この両栄養性ベクターは、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２両栄養性パッケージング系統54を感染させるのに、（マウスＮＳＣクローンＣ１７．２を生成するために記述された13,28とおり）ｖｍｙｃをコードする環境栄養性レトロウイルスベクターを使用して生成した。成功裏の感染体(infectant)を選択しかつ拡張した。これらの新たなプロデューサー(producer)細胞からの上清は、４×１０5ＣＦＵの力価で両栄養性のエンベロープを担持する複製能力のないレトロウイルス粒子を含有し、これら粒子はＧ４１８耐性により示されるとおり、ヒトニューロン細胞を効率的に感染させた。ヘルパーウイルス粒子もしくは複製能力のある組換えウイルス粒子は産生されなかった。いずれかのベクターでのｂＦＧＦおよび／もしくはＥＧＦで維持されるヒトニューロン細胞の感染は類似の手順に従った。すなわち、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌの成長培地中の標的細胞の懸濁物に、それぞれのパッケージング系統からの３ｍｌの上清（４×１０5ＣＦＵ）を添加し、そして３７℃で４時間インキュベートし；培地をその後新鮮な成長培地で置換え；感染を２４時間後に反復し；第二の感染の７２時間後に、感染した細胞をＧ４１８（０．３〜１．０ｍｇ／ｍｌ）で１０日間選択し、そして、下述されるとおり制限希釈法および増殖により個々のクローンを生成させた。全部の場合での単クローン性は、下述されるとおり、ｌａｃＺもしくはｖｍｙｃのいずれかをコードするウイルスについてのサザン分析で単一ゲノム挿入部位を同定することにより確認した。
【００１６】
ヒトＮＳＣのクローニング
細胞を上のとおり解離し、成長培地で細胞１個／１５μｌの濃度に希釈し、そしてテラ
サキ（Ｔｅｒａｓａｋｉ）皿のウェルあたり１５μｌで培養した。単一の細胞を含むウェルをプレーティング直後に記録した。単一細胞クローンを拡張させ、そしてｂＦＧＦを含有する成長培地中で維持した。レトロウイルスは各感染事象で宿主細胞のゲノムに１回無作為に組込むため、その挿入部位は独特の分子標識としてはたらき；その細胞の全部の子孫もまたそれおよびその標識のみを担持することができる。従って、全部の場合での単クローン性を、その後、ｌａｃＺもしくはｖｍｙｃのいずれかをコードするウイルスについて、サザン分析で単一かつ同一のゲノム挿入部位を全部の子孫で同定することにより確認した。独特のウイルス配列に相補的な放射標識されたプローブへのハイブリダイゼーションは、レトロウイルス組込み部位あたり所定の分子量の１個のバンドを生じる。プローブは、該クローンに対し適切なように、ｌａｃＺをコードするベクターのｖｍｙｃもしくはｎｅｏ部分のいずれかに対して発生させた。ｖｍｙｃプローブは32Ｐ  ｄＣＴＰでのニックトランスレーション標識により発生させた。ｎｅｏプローブは32Ｐ  ｄＣＴＰを利用するＰＣＲにより発生させた。ゲノムＤＮＡを標準的手順により推定のヒトＮＳＣクローンから単離し、そして組込まれたプロウイルス内で１ヶ所のみ切断し残存する切断は隣接領域中のみである制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｖｍｙｃプローブを用いる分析のためには、ＤＮＡをＢｇｌ  ＩＩもしくはＢａｍ  ＨＩで消化し；ｎｅｏプローブについてはＤＮＡをＢｇｌ  ＩＩで切断した。サザン分析の残りは標準的手順に従った。検出可能なバンドを有しないはずである、ウイルスで感染されていないＤａＯＹヒト細胞系が陰性対象としてはたらいた。（一度発生されたクローンの健全(health)を保証するため（とりわけ小型の場合）、１０％ＦＢＳおよび５％ウマ血清（ＨＳ）をときに培地に添加した。）
【００１７】
ヒトＮＳＣクローンの低温保存
トリプシン処理されたヒト細胞をペレットにし、そして以下（すなわち１０％ＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、５０％ＦＢＳ、４０％ｂＦＧＦを含有する成長培地）のように構成された凍結溶液に再懸濁した。懸濁物を１．５ｍｌのヌンク（Ｎｕｎｃ））バイアルに分割し、長期貯蔵のためゆっくりと−１４０℃にした。バイアルを３７℃の水浴中に置くことにより細胞を融解し、そしてバイアルからの穏やかな取り出しの後に、過剰の成長培地に再懸濁しかつ培養した。成長培地は当初８時間後に交換してＤＭＳＯを除いた。
【００１８】
突然変異に誘発されるβ−ヘキソサミニダーゼ欠乏症の交差修正
ヒトＮＳＣを上述されたとおり維持した。マウスＮＳＣクローン「Ｃ１７．２」および「Ｃ１７．２Ｈ」（後者はβ−ヘキソサミニダーゼのヒトのα−サブユニットをコードするレトロウイルスで形質導入されたＣ１７．２のサブクローン30）を、類似の血清を含まない条件で維持した。ＮＳＣを、新生マウス（野性型もしくはα−サブユニットが存在しない（テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ））マウス39のいずれか）の脳からの一次解離ニューロン培養物13とともに（結果で詳述されるような）トランスウェル(transwell)系で共培養した。これらの一次培養物を、血清を含まない条件下で調製し（トリプシンはダイズトリプシンインヒビターで不活性化した）、ＰＬＬ被覆された１２ｍｍのガラス製カバーガラス上で培養し、そしてＮＳＣについて上述された培地中で維持し；一組の対照条件においては、ｂＦＧＦおよびヘパリンを培地から除外したが；しかしながら結果は影響されなかった。ヘキソサミニダーゼ活性の存在を標準的組織化学的技術30によりアッセイした。すなわち、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）で洗浄し、そして５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中ＮＡＳＢＧ（０．２５ｍＭ）とともに４０℃で３時間インキュベートした。その後、それらを２０℃で２〜３時間、１０００倍希釈されたパラローザニリンヘキサソニウム塩の存在下で同一の基質に曝露した。ヘキソサミニダーゼを含有する細胞は、それらの酵素活性レベルに直接比例してだんだんに桃赤色に染色する30。野性型マウスの解離された脳からの一次ニューロン細胞のＮＡＳＢＧ染色は、正常染色（図３Ｂ、Ｃ中のものに同一）の強度およびＮＡＳＢＧ＋の細胞のパーセント（〜１００％）の双方の陽性対照としてはたら
いた。一次解離培養物中のニューロン細胞型は、標準的ニューロン細胞型特異的マーカー；ニューロンについてはＮｅｕＮ（１００倍）；アストロサイトについてはＧＦＡＰ（５００倍）；稀突起膠細胞についてはＣＮＰアーゼ（５００倍）；未熟な未分化の感覚上皮由来の祖先についてはネスチン（１０００倍）について、ＩＣＣにより同定した。ヒトβ−ヘキソサミニダーゼのα−サブユニットの存在は特異的抗体を用いるＩＣＣを介して検出した30。細胞は、どの型の突然変異体のテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ＣＮＳ細胞がヒトＮＳＣからの交差修正酵素を内在化したかを評価するために、その抗体およびニューロン細胞型特異的抗体に対する二重免疫反応性について評価した。細胞質内ＧＭ2ガングリオシドもまた特異的抗体により認識した39。
【００１９】
移植
上のとおり解離されたＮＳＣを、０．０４５％トリパンブルーを含むリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）１μｌ中細胞４×１０4個で再懸濁し、そして移植されるまで氷上で十分に摩砕されて維持した。いくつかの移植の規範については、低温麻酔された出生後第０日（Ｐ０）のマウスの側方脳室を透照により可視化し、そして、既に記述されたとおり29,30引かれたガラスマイクロピペットを介して各脳室中に２μｌの細胞懸濁物を穏やかに注入した。ＥＧＬ移植については、Ｐ０マウスの小脳を透照し、そして、既に記述されたとおり13,31、各小脳半球および虫部のＥＧＬに２μｌの細胞懸濁物を類似に直接移植した。これらの動物を小脳の器官形成の完了後に殺した。全部の移植レシピエントおよび移植されない対照は、移植の日に開始して、シクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇＩＰ）（サンド（Ｓａｎｄｏｚ））を毎日受領した。
【００２０】
インビボでのドナーヒトＮＳＣの検出および特徴づけ
移植されたマウスを、連続的時間点、すなわちＰ１、Ｐ２および第５週齢まで毎週殺し、そして４％ＰＦＡ（０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．９中）で灌流した。脳を２０μｍ間隔にて低温で薄片にした。ドナー由来の細胞は多数の方法で認識された。ｌａｃＺで形質導入された細胞は、下に詳述されるような13,32Ｘｇａｌ組織化学もしくは抗βｇａｌ抗体を用いたＩＣＣのいずれかにより同定した。全部のＮＳＣ（ｌａｃＺを運搬するものでさえ）は、移植前に、ＢｒｄＵもしくは非拡散性のバイタルレッド蛍光膜色素ＰＨＫ−２６（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で前標識した。ＢｒｄＵ標識のためには、２０μＭのヌクレオチド類似物を移植４８時間前に培養物に添加し；これらの細胞をその後、下述されるとおり抗ＢｒｄＵ抗体によりインビボで同定した。製造元の説明書により調製されたＰＨＫ標識された細胞は、テキサスレッド（ＴＲ）フィルターを通して蛍光により検出された。マウス宿主中のヒトドナー由来の細胞の存在、およびインビボでの特定のニューロン細胞型のヒト起源の確認もまた、ヒト特異的抗ニューロン細胞型抗体の使用、およびヒト染色体セントロメアに特異的なプローブを使用するＦＩＳＨにより確認した。双方の手順を下述する。宿主およびドナー双方の細胞の細胞核を可視化するため、ならびに解剖学的位置および関係を確認するのを助けるために、いくつかの切片を青色蛍光核標識ＤＡＰＩ中でもまたインキュベート（２０℃で１０分間）した。
【００２１】
ＩＣＣ
ヒト特異的抗体および抗ニューロン細胞型抗体を用いるＩＣＣを、標準的手順を使用して実施した。移植された脳からの低温切片を０．３％トリトンＸ−１００中で浸透化(permeabilized)し、そして、抗ヒトＮＦ抗体（１５０倍；ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））もしくは抗ヒトＧＦＡＰ抗体（２００倍；スターンバーガー（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ））とともに４℃で一夜インキュベートした。フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（２００倍；ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ））により免疫反応性を示した。切片は、細胞核を可視化するためにＤＡＰＩ中でもまたインキュベートした。ドナー由来の細胞がβｇａｌもしくはＢｒｄＵの存在により認識されるはずであった場合には、ニューロン細胞型特異的マーカーに対する抗体とともに、βｇａｌもしくはＢｒｄＵのいずれかに対す
る抗体とともに組織切片をインキュベートすることにより、これらの細胞の表現型を特徴づけた。βｇａｌ免疫染色（１０００倍；カペル（Ｃａｐｅｌ））のための切片は上のとおり調製した。ＢｒｄＵが挿入された細胞をＩＣＣを介して示すためには、組織切片をいくぶん異なって調製した。それらをＰＢＳ中で水を加えて元に戻し、２Ｎ  ＨＣｌ中３７℃で３０分間インキュベートし、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）で２回洗浄し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．３％トリトンＸ−１００中で浸透化し、そして抗ＢｒｄＵ抗体（１０倍；ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））とともに３７℃で１時間インキュベートした。フルオレセイン結合（２５０倍；ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ））二次抗体もしくはビオチニル化（２００倍；ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ））二次抗体のいずれかを用いて免疫反応性を示した。使用されたニューロン細胞型特異的抗体は以下のとおりであった。すなわち、ニューロンを同定するための抗ＮＦ（２５０倍；スターンバーガー（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ））および抗ＮｅｕＮ（２０倍；マレン（Ｒ．Ｍｕｌｌｅｎ）の贈与）；稀突起膠細胞を同定するための抗ＣＮＰアーゼ（２００〜５００倍；スターンバーガー（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ））；アストロサイトを同定するための抗ＧＦＡＰ（１５０倍；シグマ（Ｓｉｇｍａ））。これらのマーカーについての免疫染色はＴＲ結合二次抗体［２００倍；ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）］を用いて示された。ｖｍｙｃ発現（ドナー由来細胞に独特）は、該タンパク質に対する抗体（１０００倍；ＵＢＩ）で評価した。
【００２２】
ヒト特異的セントロメアについてのＦＩＳＨ
動物を４％ＰＦＡおよび２％グルタルアルデヒドで灌流した。脳の低温切片を４％ＰＦＡ中で後固定し、０．２％トリトンＸ−１００中で浸透化し、ＰＢＳ中で洗浄し、０．２Ｎ  ＨＣｌ中で２０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で再度洗浄し、そしてその後０．１Ｍトリス、０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中でプロテイナーゼＫ（１００μｇ／ｍｌ）に３７℃で１５分間曝露した。その後、切片を、ＰＢＳ中０．１％グリシン中で２分間、およびその後ＰＢＳ中で５分間洗浄した。切片を４％ＰＦＡ中で再度後固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、そしてその後５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで５分間すすいだ。全部のヒト染色体上に独特にかつ特異的に存在するセントロメアの領域に相補的な、ジゴキシゲニン標識されたプローブ（オンコール（Ｏｎｃｏｒ））をその後切片に添加し、切片をカバーガラスで覆い、ゴムのりで封止し、１００℃で１０分間変性させ、そしてその後氷上に５分間置いた。切片を３７℃で１５時間ハイブリダイズさせ、その後それらを６５％ホルムアミド、その後２×ＳＳＣ中４３℃で３０分間、そしてその後２×ＳＳＣ中３７℃で３０分間、そして最後にＰＢＳ中２０℃で１５分間洗浄した。ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡおよび５％ＮＨＳ中５倍希釈された抗ジゴキシゲニンＴＲ結合抗体（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））によりプローブを検出した（３７℃で３０分）。スライドをＰＢＳ中で３回すすぎ（洗浄あたり１５分）、ＤＡＰＩとともにインキュベートし、ＰＢＳ中で再度すすぎ、そして蛍光顕微鏡検査のため検鏡用に作った。
【００２３】
結果
ヒトニューロン幹細胞の単離、増殖およびクローニング
ヒトＣＮＳからのＮＳＣの単離、増殖、特徴づけ、クローニングおよび移植は、構成的にダウンレギュレートされたｖｍｙｃおよび増殖因子（とりわけｂＦＧＦ）で拡張されたＮＳＣクローンの形質導入後に増殖された「青写真(blueprint)」に従った。ＮＳＣが（遺伝子的に増殖されたクローンでさえ34）血清を含まない培地中でｂＦＧＦおよびＥＧＦに応答して分割するようであるという観察結果5,35に基づき、解離された一次ヒトニューロン組織の開始集団のこの用件を充たす細胞についてのスクリーニングおよび濃縮の双方のための方法として、この二重の応答性を選んだ。加えて、一次ニューロン細胞は、当初、ＮＳＣの比較的豊富な集団を（下等哺乳動物で）もつと仮定されたＣＮＳの領域、すなわち胎児終脳の脳室領域（ＶＺ）1,7,8,23から（われわれの能力の最高の状態まで）得た。
【００２４】
１５週のヒト胎児脳からの解離されたニューロン細胞を、当初、ｂＦＧＦおよび／もしくはＥＧＦを含有する血清を含まない培地中で多クローン性集団として成長させた。培養された細胞は、二重応答性について樹立しかつ選択するために、しばしば、２種の分裂促進因子の一方もしくは他方を含有する培地の間で移動させた。そうして、いくつかの集団を、下述されるとおりにその後の操作およびクローニングのためｂＦＧＦ単独中で維持し；他者は、また下述されるとおりにｖｍｙｃのレトロウイルス媒介性の形質導入およびその後のクローニングに使用した。
【００２５】
細胞のクローンの関係を評価するための明白な分子標識を提供するため、ならびに移植後のいくつかの細胞の同定を助長しかつインビボで外因性遺伝子を発現するそれらの能力を評価するために、いくつかのｂＦＧＦで増殖された亜集団を、ｌａｃＺ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼ［βｇａｌ］遺伝子）およびｎｅｏ（ネオマイシン耐性の遺伝子）双方をコードする両栄養性の複製能力のないレトロウイルスベクターに感染させた。感染した細胞をＧ４１８（ネオマイシン類似物）中で生存について選択した。単一のコロニーを最初に限界希釈法により単離し；その後、独特の染色体挿入部位をもつ１コピーのみのｌａｃＺ／ｎｅｏをコードするレトロウイルスが存在したことを立証することにより、所定のコロニー中の細胞の単クローン性を確認した。組込まれたプロウイルス中で１ヶ所切断する制限エンドヌクレアーゼで消化された、個別のコロニーからのゲノムＤＮＡを、ｎｅｏに相補的な放射標識されたプローブを用いるサザン分析にかけた。例えば、クローンＨ１では、全部のｌａｃＺ／ｎｅｏ＋の細胞が、実際のところ、単一の共通のレトロウイルス組込み部位を有し、それらが単一の感染した「親」細胞に由来したことを示した［図１Ａ］。
【００２６】
上述されたようなヒトＮＳＣについて濃縮された幾つかの集団をｖｍｙｃで形質導入して、複数の安定なクローンを生じさせた。とりわけ、ｂＦＧＦで維持された細胞を、ｖｍｙｃおよびｎｅｏをコードする両栄養性（または両種性）の複製能力のないレトロウイルスベクター28に感染させた。個々のＧ４１８耐性のコロニーを単離し、そして別個の培養物として維持した。再度、各推定のクローンが唯一の独特のレトロウイルス挿入部位を有したことを立証することにより、各コロニーの単クローン性を主張した［図１Ｂ］。全部のｖｍｙｃで形質導入されたヒト細胞のコロニー（ならびに陽性対照として包含された樹立マウスＮＳＣクローンＣ１７．２）は、プロウイルスのエンドヌクレアーゼ二分およびｖｍｙｃプローブへのハイブリダイゼーション後に同一分子量の単一のバンドを生成した。従って、後成的に維持された細胞について真実であったとおり、全部のｖｍｙｃで形質導入されたコロニーは単クローン性であった。５種のクローン（Ｈ６、Ｈ９、Ｄ１０、Ｃ２、Ｅ１１）をこの手順により発生させ、そしてｂＦＧＦを含有する血清を含まない培地中で維持した。
【００２７】
所定の細胞がＮＳＣとして分類されるためには、全部のニューロン系統で子孫を生じかつそうすることができる他の単一の細胞を生じさせなければならず；従って、所定のコロニー中の全細胞が同一クローンのメンバーであったことを明白に主張することが絶対必要であった。この必須の基準に合致したため、クローンの追加の特徴づけを進めることが可能であった。
【００２８】
クローンのインビトロでの特徴づけ
多分化能および自己再生
未被覆の皿、およびｂＦＧＦを補充された血清を含まない培地においては、全部のクローンがクラスターとして培養物中で成長し、このクラスターは最低１年間毎週継代することが可能であった［図２Ａ］。これらのクラスター内の細胞は、未熟な多分化能ニューロンの祖先の頻繁に使用されかつ信頼できるマーカー25、中間フィラメントビメンチンを発
現した。これらのクラスターを解離しかつそれらを血清含有培地中で培養する（ｂＦＧＦで増殖されるげっ歯類のＮＳＣおよび祖先を分化させるのに既に使用されている技術16,25,37）ことにより、これらのクローンはニューロンおよび稀突起膠細胞に自発的に分化した［図２Ｂ、Ｄ］。これらの分化する条件下で５日後に、全クローン中の大多数の細胞（９０％）がニューロンマーカー神経細糸（ＮＦ）に対し免疫反応性となった［図２Ｂ］一方、より小さい比率（１０％）が稀突起膠細胞のマーカーＣＮＰアーゼを発現した［図２Ｃ］。神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現する成熟アストロサイトは、これらの培養条件下では当初（インビトロで１ヶ月後であっても）認識されなかった。しかしながら、一次解離胚マウスＣＮＳ組織との共培養により、これらのヒトクローン中でＧＦＡＰ発現を誘導することができた［図２Ｄ］。上に言及された多様な分化系統特異的なマーカーを発現する（「多分化能」を樹立する）細胞に加えて、各クローンは、新たな未熟なビメンチン＋の細胞もまた生じさせ［図２Ｅ］、これは順に、その後の継代に際して、複数の分化したニューロンのマーカーを発現する新たな細胞、ならびに新たなビメンチン＋の継代可能な細胞を生じさせることができた（すなわち「自己再生の可能性」）。
【００２９】
これらの結果は、移植後にインビトロおよびインビボで検討されるべきクローンの全部が、ＮＳＣの操作上の定義（全３種の基礎的ニューロン系統の子孫に分化する能力をもった、単一細胞由来の安定な自己再生する多分化能のビメンチン＋のクローン）を満足したことを主張した。全部のクローンは、遺伝子的に改変されたにしろ後成的に維持されたにしろ、インビトロでのそれらの挙動および表現型において顕著に類似であった。この比較を継続するために、下述されるインビボ移植実験でこれらの多様なクローンを同時に使用した。
【００３０】
保存
注目すべきことに、全部のクローンは、細胞生存率に対する最小限の副作用を伴い、かつ、融解に際しての増殖もしくは分化に対する識別できる影響を伴わずに、効率的に低温保存することができた（実験プロトコルで詳述される）。
【００３１】
遺伝子欠損を補完および交差修正する能力
分子治療のためのベヒクルとしてのそれらの潜在能力の評価を助けるため、われわれは次に、十分に制御されかつ観察可能な条件下で、マウスＮＳＣと同一の効率で原型の遺伝子的代謝欠損を補完かつ交差修正するヒトＮＳＣの能力を評価した30,29,38。選ばれた指標の遺伝子欠損は、ヒトにおいて治療不可能かつ変えられない神経変性性のリソソーム貯蔵疾患、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）の原因である突然変異、β−ヘキソサミニダーゼのα−サブユニットの非存在であった。α−サブユニットの非存在は、ＧＭ2ガングリオシドをＧＭ3に代謝するのに必要とされるヘキソサミニダーゼＡの欠乏症につながる。脳中での病的なＧＭ2の蓄積は該疾患の進行性の神経変性の特徴につながる。交差修正を遂行するヒトＮＳＣの能力を、以下の２種の確立したマウスＮＳＣ、すなわち「クローンＣ１７．２」およびヘキソサミニダーゼを過剰発現するようにα−サブユニットのレトロウイルスの形質導入を介して工作されたＣ１７．２のサブクローン30（「クローンＣ１７．２Ｈ」と呼ばれる）と比較した。これらのマウスＮＳＣクローンを使用した以前の研究は、それらがかなりの量の機能的なヘキソサミニダーゼＡ（ヒトテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）患者からの線維芽細胞により細胞内取込みされるとみられる30）を合成および分泌の双方をしたことを確立した。α−サブユニットをコードする遺伝子が特に突然変異された39最近の世代のトランスジェニックマウスは、今や、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）の動物モデル由来の実際のニューロン細胞を交差修正するヒトＮＳＣ（ならびにマウスＮＳＣ）の能力の検査を可能にした。さらに、特定の遺伝子産物、リソソーム酵素活性および細胞内の病的表現型の迅速かつ信頼できる検出のための確立された標準化されたツールの利用可能性は、このモデルを理想的にした。
【００３２】
突然変異体のニューロンの表現型を救助することが可能な分泌可能な遺伝子産物を産生するそれらの能力を評価するために、ＮＳＣ（マウスおよびヒト）ならびに対照細胞を、ヘキソサミニダーゼの通過を可能にするのに十分であるがしかし細胞の通過には十分でない孔径（０．４μｍ）をもつメンブレンの一側上で培養した。メンブレンを部分的にウェル中に浸積し、その底部にカバーガラスをのせ、その上に新生テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）マウスの脳から解離されたニューロン細胞を培養した。このトランスウェル系での１０日の共培養後に、突然変異体のニューロン細胞を担持するカバーガラスを、以下（すなわち（１）ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−Ｎ−アセチル−β−Ｄグルクロニシド（ＮＡＳＢＧ）への曝露後の赤色沈殿の産生によりアッセイされるようなヘキソサミニダーゼ活性の存在について［図３Ａ−Ｃ、Ｍ］；（２）α−サブユニットに対する抗体およびＣＮＳ細胞型特異的マーカーに対する抗体の双方を用いて、どのテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）ニューロン細胞型が修正する遺伝子産物を内在化したかを決定すること［図３Ｄ−Ｌ］；および（３）ＧＭ2の貯蔵の減少について［図３Ｎ］）のとおり検査した。
【００３３】
単独で培養されたテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）のＣＮＳ細胞では最小限の固有のヘキソサミニダーゼ活性が存在した［図３Ａ］一方、ヘキソサミニダーゼ活性は、細胞をマウスもしくはヒトのＮＳＣとともに共培養した場合に正常の強度まで増大した［図３Ｂ、Ｃ］。ヒトＮＳＣに媒介される交差修正の程度は、マウスＮＳＣにより遂行されたものと同じくらい成功裏かつ有効であり、未処理の対照でよりも有意により大きい（ｐ＜０．０１）ＮＡＳＢＧ＋のテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）のＣＮＳ細胞のパーセントを生じた［図３Ｍ］。図３Ｄ−Ｌにより示唆されるとおり、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）マウスの脳からの全部のニューロン細胞型（ニューロン、グリア、祖先）が修正された。この増大された酵素活性が基礎的な細胞の神経病理学的過程に好都合に強い影響を与えたことの表示として、異常な細胞質内のＧＭ2蓄積を伴わないテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）のＣＮＳ細胞のパーセントは、ヒトＮＳＣからの分泌性産物に曝露されたもので、未処理のテイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）培養物でよりも有意により低く（ｐ＜０．０１）、野性型のマウス脳からのものに近づいていた［図３Ｎ］。
【００３４】
従って、ヒトＮＳＣクローンは、遺伝子に基づく欠損を修正しそして病的状態を低下させるために、複数の系統の標的を定められた損なわれたＣＮＳ細胞により利用されるはずである、十分な有効性をもつ機能的遺伝子産物を産生かつ分泌することが可能である。これらのデータは、遺伝子治療のための潜在的ベヒクルとしてのそれらの妥当性を確立する助けとなる。
【００３５】
クローンのインビボの特徴づけ
インビボでの発生プログラムの多分化能、形成性および遂行
われわれは、次に、ヒトＮＳＣクローン（後成的に増殖されようと遺伝子的に増殖されようと）が、未熟な脳への移植(transplantation)後に移植する(engraft)ことができたのみならず、しかしインビボの正常な発生の刺激に適切に応答しかつ適応することもまたできた（すなわち、適切に移動し、宿主実質に統合し、所定の発生の時間的な「窓」で（その窓がＮＳＣが得られた場合と異なっていたとしても）所定の領域に適切なニューロン細胞型に分化する）かどうかを決定した。
【００３６】
個別のヒトＮＳＣクローンからの解離された細胞を、新生マウスの側方脳室(lateral ventricle)に両側で注入して、それらをＳＶＺに到達させた。移植前に、いくつかのヒト細胞を、上で詳述されたとおりｌａｃＺレポーター遺伝子を用いて形質導入した。導入遺伝子のダウンレギュレーションの危険（移植されたドナー由来の細胞の誤った同定の付随した危険を伴う）について制御しかつこれを回避するために、細胞をまた、移植２日前のＢｒｄＵへのインビトロ曝露により、および／もしくは移植直前の非拡散性のバイタル蛍光膜色素ＰＨＫ−２６を用いてのいずれかでも前標識した。安定に移植された細胞をその
後、Ｘｇａｌ組織化学により；ＢｒｄＵ、βｇａｌ、ヒト特異的ＮＦおよび／もしくはヒト特異的ＧＦＡＰに対し向けられた抗体を用いる免疫細胞化学（ＩＣＣ）により；ヒト特異的汎染色体α−セントロメアプローブを使用する蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により；ならびに／またはＰＨＫ蛍光により、適切なように検出した。いくつかの細胞については、それらのドナーのヒト起源を確認するために複数の同定技術を使用した。ドナー由来細胞の細胞型の同一性もまた、ニューロン細胞型特異的マーカーに対し向けられた抗体を用いる二重染色により必要なように確立した。
【００３７】
ヒトＮＳＣクローンは、脳室内移植の後に、それらのマウスの対照物のものを模倣する、発生的に適切な挙動を示した［図４、５］。さらに、後成的に永続にされたクローンの移植、移動および分化は、遺伝子的に（ｖｍｙｃで）永続にされたクローンのものに同一であった。（後者の範疇の５クローンのうち３種が十分に移植し［表］；不十分に移植した残りの２クローンは下で論考するであろう。）後成的および遺伝子的の双方で維持されたドナー細胞は、移植後４８時間以内にＳＶＺに統合した［図４Ａ、Ｂ；５Ａ、Ｋ−Ｎ］。ＳＶＺ由来の内在性の宿主の祖先は、２８日の期間にわたって、皮質下白質および皮質中に背側および側方にのみ移動し、そして大グリア細胞および稀突起膠細胞になることが既知であり；その段階でグリア発生がそれらの領域で優位を占める一方、神経発生は終了している44。類似の様式で、移植されたヒトＮＳＣはまた、移植後２週間までに皮質下白質に沿って広範囲に移動し［図４Ｃ］、そして、３〜５週までに、稀突起膠細胞およびアストロサイトに適切に分化していた［図５Ｈ−Ｊ］。興味深いことに、インビボでのドナー由来のアストロサイトの即座の検出［図５Ｊ］は、インビボの環境からの単離においてインビトロでヒトＮＳＣクローンが維持されていた場合の成熟したアストロサイトの初期の非存在と対照をなす（一次マウスＣＮＳとの共培養が大グリア細胞発生を誘導するのに必要とされたことを想起されたい［図２Ｄ］）。マウスＣＮＳの他の成分から生ずる有益なシグナルは、多分化能細胞からのアストロサイトの分化および／もしくは成熟を誘発もしくは促進するのに必要なようである。
【００３８】
内在性のＳＶＺの祖先の第二の既知の運命は、ＲＭＳに沿って前方に移動しかつＯＢ介在ニューロンに分化することである。移植後１週間までに、ＳＶＺからのドナー由来のヒト細胞の亜集団がＲＭＳに沿って移動することが示された［図４Ｄ、Ｅ］。いくつかの場合においては、ＲＭＳ中のこれらの細胞は小さな群中で一緒に移動する［図４Ｅ］（内在性のマウスＳＶＺ前駆体について典型的な挙動43,44）。移植３週間後に、ＲＭＳ内の祖先の期待された運命により、ヒト起源のドナー由来のニューロンの亜集団（例えばヒト特異的なＮＦ＋の細胞）が、宿主ニューロンと混ぜられてＯＢの実質内に存在した［図５Ｂ−Ｇ、これは図４Ｄの写真で示されるようなＯＢを通る切片の高倍率図を表す］。これらのドナー由来細胞がヒトＮＦ＋であったのみならず［図５Ｄ］、しかし、ＯＢを通る切片を、ＢｒｄＵに対する抗体（前標識されたドナー由来のヒト細胞を同定するため）および成熟したニューロンのマーカーＮｅｕＮに対する抗体の双方と反応させた場合、ヒト起源の多数の二重標識されたＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋のドナー由来細胞が顆粒層内に統合され［図５Ｅ−Ｇ］、内在性の宿主のマウス介在ニューロンのＮｅｕＮ発現パターンを模倣した［図５Ｆ、Ｇ］。
【００３９】
ヒトＮＳＣの形成性の程度をさらに検査するため、同一のクローンを、中枢神経軸の反対端で異なる胚領域に移植した。新生マウス小脳のＥＧＬへの同一のヒトＮＳＣの移植は、この異なる位置で多様なニューロン細胞型を適切に生じ（主としてＩＧＬ中の小脳顆粒細胞介在ニューロン［図６Ｃ−Ｉ］）、この結果は次のセクションでより詳細に論考する。
【００４０】
従って、インビボでは、インビトロ［図２］でのように、全部の移植可能なヒトＮＳＣクローンが、全３種の基礎的ニューロン系統、すなわちニューロン［例えば図５Ｄ−Ｇ；
６］；稀突起膠細胞［例えば図５Ｈ、Ｉ］；およびアストロサイト［例えば図５Ｊ］の細胞を生じさせることができる。移植された脳は組織学的に正常に見えた（ドナー細胞は宿主実質中に一様に移動しかつ統合し、認識可能な移植片の縁を生じなかった）のみならず、しかし、移植された動物は、挙動の異常もしくは神経学的機能不全の他の表示を示さなかった。従って、ドナーのヒトＮＳＣからの寄与を受領した脳構造は正常に発生したようであった。
【００４１】
これらの移植研究において、大部分のクローンは極めて良好に移植した一方、５種の遺伝子的に増殖されたＮＳＣクローンの２種は不十分に移植したようであった［表］。にもかかわらず、インビトロで、これらのクローンは、より確固として移植するクローンのものに外見上同一の特徴を示した。従って、インビトロでの見かけ上同等な多分化能は、必ずしもインビボで同等な潜在能力に訳されず、研究者が移植の規範において各クローンを個々に試験する必要性を示唆している。この観察結果は、混合された多クローン性集団（現在文献16,33,41,45,46中にある多くの移植研究の出発原料）の移植は、それらの不可避的な変化する特徴、および多様なクローンの表示の移動のため、問題の多い戦略かも知れないことをさらに警告している。
【００４２】
インビボでの外来の導入遺伝子の発現
とりわけ広範囲の、多病巣性のもしくは包括的な病変を特徴とする疾患のための遺伝子治療の規範は、臨床状況が要求する場合は、ドナー細胞が（解剖学的に制限された位置で統合することが可能である10,16,32,45,46ことに加えて）広範に散在した位置で外来遺伝子を発現することが可能であることを必要とする。図５Ａ−Ｃに写真で示される、レトロウイルスで形質導入されたｌａｃＺを発現する代表的クローン（新生マウスの脳室およびＳＶＺに移植後）は、成熟した動物の離れた部位での宿主実質への移動ならびにその内への安定な統合および成熟の後、容易に検出可能なβｇａｌを産生し続けた。
【００４３】
ｖｍｙｃ発現の自発的、構成的ダウンレギュレーション
興味深いことに、また、重要なことに、遺伝子的に操作されたヒトＮＳＣクローンの場合には、移植レシピエントの脳が多数の安定に移植される健康な十分に分化した非破壊的ドナー由来細胞を含有している［図４；５Ａ−Ｊ、Ｑ；６］という事実にもかかわらず、増殖遺伝子産物ｖｍｙｃは、移植後２４〜４８時間を越えてドナーのヒト細胞中で検出不可能である［図５Ｋ−Ｑ］。これらの観察結果は、核分裂停止および／もしくは分化の間、ＣＮＳ前駆体中では内在性の細胞のｍｙｃをダウンレギュレートする正常な発生の機構によりｖｍｙｃが調節されていることを示唆している。移植後の安定に移植されたＮＳＣからの自発的かつ構成的なｖｍｙｃ発現の喪失は、インビボで数年後でさえ、移植されたｖｍｙｃが増殖されたＮＳＣ由来のＣＮＳ腫瘍の不変の非存在と矛盾しない9,13,29-32。ヒトＮＳＣでは脳腫瘍はみられていない。
【００４４】
インビボでのニューロン細胞の置換え
遺伝子治療戦略の基礎として、ヒトＮＳＣ媒介性の外来遺伝子発現のインビトロおよびインビボの有望な効力を確立したため、われわれは次に、こうした細胞がニューロン細胞の置換えもまた媒介することができるかどうかの確立を追求した。確立した神経学的マウス突然変異体は、特定のニューロン細胞の置換えの規範を試験するための理想的モデルを古典的に提供している。屈曲尾(meander tail)（ｍｅａ）突然変異体は、神経変性および損なわれた発生の１つのこうしたモデルである。ｍｅａは小脳、とりわけ前葉において顆粒ニューロンが細胞自律性に発生および／もしくは生存できないことを特徴とする47。マウスＮＳＣは顆粒ニューロンが不完全なＩＧＬを再構成することが可能である31。
【００４５】
ＣＮＳの障害においてニューロンを置換えるそれらの能力を評価するため、ヒトＮＳＣクローンを新生ｍｅａマウス小脳のＥＧＬに移植した。小脳の器官形成の完了時に分析さ
れた場合、ドナー由来のヒト細胞は小脳のＩＧＬ全体に存在した［図６］。それらは、それらが混ざったいくつかの残余の内在性のマウス宿主顆粒ニューロンに同一の［図６Ｇ］小脳の顆粒ニューロンの決定的な大きさ、形態および位置を所有した［図６Ｅ−Ｇ］。これらの「置換え」ニューロンがヒト起源のものであったということはＦＩＳＨにより確認され、上述されたヒト特異的な染色体プローブについて陽性の細胞の存在を立証する［図６Ｊ］。ヒト由来の細胞が実際上ニューロン性であったということは、ｍｅａのＩＧＬ中の大部分の移植された細胞がＮｅｕＮに対し免疫反応性であった［図６Ｈ、Ｉ］ことを立証することにより確認され；ＯＢでのように、ＩＧＬ中の内在性の介在ニューロンは同様にＮｅｕＮを発現する。従って、ヒト起源の移植されたＮＳＣは、系統決定のための変動する局所刺激に対し適切に応答するのに十分に形成性なようである。
【００４６】
表：ヒトニューロン幹細胞*クローン
クローン   増殖技術   移植可能
Ｈ１            ｂＦＧＦ        ＋
Ｈ６            ｖｍｙｃ        ＋
Ｈ９            ｖｍｙｃ        ＋
Ｃ２            ｖｍｙｃ        ＋
Ｄ１０          ｖｍｙｃ        −
Ｅ１１          ｖｍｙｃ        −
*ニューロン幹細胞は、（複数の型の）ニューロン、稀突起膠細胞およびアストロサイト、ならびに新しいニューロン幹細胞を（インビトロおよび／もしくはインビボで）生じさせることが可能である単一の細胞と定義されている。これらの子孫がその単一の細胞および相互にクローン的に関連しているということは、この定義の必須の部分である。従って、多分化能および自己再生の双方を主張するためには単クローン性の明白な立証が必要である。
【００４７】
【表１】
2011015693.tif 000002
【００４８】
【表２】
2011015693.tif 000003
【００４９】
【表３】
2011015693.tif 000004
【００５０】
【表４】
2011015693.tif 000005
【００５１】
【表５】
2011015693.tif 000006
【００５２】
【表６】
2011015693.tif 000007
【図１−１】
2011015693.tif 000008
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2011015693.tif 000013
【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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