(57)【要約】【課題】簡便かつ高収率で高品質なヒアルロン酸類を工業的規模で分離精製する方法を提供する。【解決手段】セラミックス膜からなる濾材にヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を接触させることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミックス膜からなる濾材にヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を接触させることを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２】
ヒアルロン酸の塩がナトリウム塩である請求項１記載の精製法。
【請求項３】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液のｐＨが３〜１０である請求項１又は２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の温度が０〜８０℃である請求項１、２又は３記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項５】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の濃度が１０ｇ／ｌ以下である請求項１、２、３又は４記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項６】
セラミックス膜の濾材がアルミナを含む請求項１、２、３、４又は５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項７】
セラミックス膜の濾材がジルコニアを含む請求項１、２、３、４又は５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項８】
セラミックス膜の濾材がシリカを含む請求項１、２、３、４又は５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項９】
セラミックス膜の濾材がチタニアを含む請求項１、２、３、４又は５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１０】
セラミックス膜の濾材がアルミナ、ジルコニア、シリカ及びチタニアから選ばれたセラミックスの２種以上からなる請求項１、２、３、４又は５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１１】
濾材構造が対称膜である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１２】
濾材構造が非対称膜である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１３】
濾材形状がシート形状である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１４】
濾材形状がカートリッジ形状である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１５】
濾材形状がホローファイバー形状である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１６】
セラミックス膜の濾過精度が０．１μｍ〜１０μｍの範囲である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１７】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液をセラミックス膜に通液する速度が有効濾過表面積１ｍ２当たり２００ｌ／ｈｒ以下である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液からヒアルロン酸及び／又はその塩（以下、総称してヒアルロン酸類という）を分離精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等の医薬品として用いられている。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は動物組織、例えば、工業規模ではニワトリのトサカ等から抽出する方法や、微生物を用いた発酵法により製造されている（ジェービー・ウールコック（Ｊ．Ｂ．Ｗｏｏｌｃｏｃｋ）、ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー，８５，３７２−３７５（１９７６））。
【０００３】
抽出法や発酵法によって製造されるヒアルロン酸にはタンパク質や発熱性物質等が不純物として存在し、これらを分離除去して高純度の製品を得る方法が検討されている。特に発熱性物質の除去は非常に困難であり（特開昭５４−６７０２４号公報）、医薬品としても使用できる高純度な製品を得る方法の開発が待たれていた。例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩との錯体を形成させ不純物を分離した後、フロリジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を吸着させる方法（公表特許昭６２−５０１４７１号公報）がある。また、アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱性物質やタンパク質等を除去するヒアルロン酸の精製法も開示されている（特開昭６３−１２２９３号公報）。しかし、これらの方法は操作が煩雑で収率が低い等の課題があった。
【０００４】
本発明者らは、ヒアルロン酸類を高純度に精製する方法について検討し、発熱性物質、蛋白質、核酸等を除去するためにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法（特開平１−３１３５０３号公報）、及びヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後、シリカゲルに接触させる方法（特開平２−１０３２０４号公報）について提案した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５４−６７０２４号公報
【特許文献２】公表特許昭６２−５０１４７１号公報
【特許文献３】特開昭６３−１２２９３号公報
【特許文献４】特開平１−３１３５０３号公報
【特許文献５】特開平２−１０３２０４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジェービー・ウールコック（Ｊ．Ｂ．Ｗｏｏｌｃｏｃｋ）、ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー，８５，３７２−３７５（１９７６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの方法においても、工業的規模で医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには、
（ｉ）不純物のアルミナ、シリカゲルヘの吸着量が少ないので、アルミナやシリカゲルを多量に消費する。
（ｉｉ）アルミナ、シリカゲルは再生使用することができない。
（ｉｉｉ）ヒアルロン酸類の回収率が低い。
などの課題が残っていた。
【０００８】
従って、本発明は、簡便かつ高収率で高品質なヒアルロン酸類を工業的規模で分離精製する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは、ヒアルロン酸類含有液から発熱性物質やタンパク質等の不純物を効率よく分離除去し、高純度のヒアルロン酸類を精製する方法について種々検討した結果、セラミックス膜からなる濾材にヒアルロン酸類含有液を接触させることにより、発熱性物質やタンパク質等を非常に効率よく吸着除去し、さらに使用したセラミックス膜は通常の洗浄処理で容易に性能が回復することを見いだし本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）セラミックス膜からなる濾材にヒアルロン酸類含有液を接触させることを特徴とするヒアルロン酸類の精製法、（２）ヒアルロン酸の塩がナトリウム塩である（１）記載の精製法、（３）ヒアルロン酸類含有液のｐＨが３〜１０である（１）又は（２）記載のヒアルロン酸類の精製法、（４）ヒアルロン酸類含有液の温度が０〜８０℃である（１）、（２）又は（３）記載のヒアルロン酸類の精製法、（５）ヒアルロン酸類含有液の濃度が１０ｇ／ｌ以下である（１）、（２）、（３）又は（４）記載のヒアルロン酸類の精製法、（６）セラミックス膜の濾材がアルミナを含む（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）記載のヒアルロン酸類の精製法、（７）セラミックス膜の濾材がジルコニアを含む（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）記載のヒアルロン酸類の精製法、（８）セラミックス膜の濾材がシリカを含む（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）記載のヒアルロン酸類の精製法、（９）セラミックス膜の濾材がチタニアを含む（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１０）セラミックス膜の濾材がアルミナ、ジルコニア、シリカ及びチタニアから選ばれたセラミックスの２種以上からなる（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１１）濾材構造が対称膜である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）又は（１０）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１２）濾材構造が非対称膜である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）又は（１０）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１３）濾材形状がシート形状である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）又は（１２）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１４）濾材形状がカートリッジ形状である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）又は（１２）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１５）濾材形状がホローファイバー形状である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）又は（１２）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１６）セラミックス膜の濾過精度が０．１μｍ〜１０μｍの範囲である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）又は（１５）記載のヒアルロン酸類の精製法、（１７）ヒアルロン酸類含有液をセラミックス膜に通液する速度が有効濾過表面積１ｍ２当たり２００ｌ／ｈｒ以下である（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）記載のヒアルロン酸類の精製法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、発熱性物質、タンパク質、微生物などの除去された高品質なヒアルロン酸類を簡便、高収率かつ工業的規模で製造することが出来る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、さらに本発明について詳しく説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸類はヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、又はヒアルロン酸とヒアルロン酸の塩の混合物を包含している。
【００１３】
本発明に用いるセラミックス膜の材質はアルミナ、ジルコニア、シリカ、チタニア等から選ばれた少なくとも１種以上からなるものであるが、特にアルミナが好ましい。
また、セラミックス膜の材質や構造等にとらわれるものでない。濾材構造として、対称膜や非対称膜が使用出来る。また、形状はシートやカートリッジ、ホローファイバー等、どのような形でも良い。
【００１４】
セラミックス膜の濾過精度は０．１μｍ〜１０μｍの範囲で使用できるが、ウイルスやバクテリアの完全除去を目的とする場合には０．４５μｍ以下の濾過精度が好ましい。
セラミックス膜として、例えばＮＧＫ  モノリス型セラミックスフィルター（日本ガイシ社製）、セラミックスフィルターＣＥＬＡＦＬＯ（日本ミリポア・リミテッド社製）等が挙げられる。
【００１５】
本発明で使用するヒアルロン酸類含有液は動物組織から抽出したものでも、また、発酵法で製造したものでも使用できる。
発酵液を用いる場合には、既知の方法、例えば、遠心分離や濾過処理等で除菌した液を使用することが望ましい。場合によっては、透析処理による低分子化合物の除去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を行っても良く、アルコール等の水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸類を析出精製したものを使用しても良い。
【００１６】
ヒアルロン酸類含有液のセラミックス膜処理を行うに当たり、含有液のｐＨは３〜１０、特に４〜９、温度は０〜８０℃、ヒアルロン酸類濃度は１０ｇ／ｌ以下、特に５ｇ／ｌ以下が良い。含有液のｐＨが３未満の場合にはヒアルロン酸類のゲル化が生じ、ろ過困難となる。ｐＨが９を越えた場合には、セラミックス膜の吸着効果が低下する傾向にある。
温度が８０℃を越えると処理中にヒアルロン酸類が徐々に分解し、分子量が低下する。
ヒアルロン酸類濃度が１０ｇ／ｌを越えると溶液粘度が高くなりセラミックス膜処理が難しくなる。
【００１７】
ヒアルロン酸類含有液の粘度を下げる目的で食塩等の塩を共存させても良いが、高濃度になるとセラミックス膜の吸着効果が低下する。
【００１８】
本発明の処理方法として、クロスフローや直濾過方法が使用出来る。通常、セラミックス膜にヒアルロン酸類含有液を１回通液するだけで充分であるが、必要なら、反復処理しても良い。また、セラミックス膜は１段、あるいは複数個を直列に接続して使用することもできる。
【００１９】
ヒアルロン酸類含有液をセラミックス膜に通液する速度はヒアルロン酸類含有液の性状や膜の種類により異なり一律に規定することが出来ないが、例えば、表面濾過膜の場合、有効濾過表面積１ｍ２当たり２００ｌ／ｈｒ以下が好ましい。一般に、通液速度の遅い方が良い結果を与える場合が多い。
【００２０】
タンパク質や発熱性物質等の不純物を吸着する能力が低下したセラミックス膜は、通常の酸・アルカリ洗浄、酵素洗剤、界面活性剤洗浄、キレート洗浄、次亜塩素酸洗浄、過酸化水素洗浄等の化学的洗浄、ブラッシングや逆洗等の物理的洗浄等で初期の性能に回復させることが出来る。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を比較例及び実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２２】
比較例１
ストレプトコッカス・エキＦＭ−１００ (微工研寄第９０２７号) を用いて培養した培養液４５リットルを純水２５リットルに希釈し (ヒアルロン酸ナトリウム濃度２．２ｇ／Ｌ) 、遠心分離で菌体を除き、限外ろ過 (分画分子量１万)した。このヒアルロン酸溶液に、食塩２．１ｋｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２１０リットルで析出、２４リットルで洗浄し、４０℃で真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を表１に示す。
【００２３】
実施例１
比較例１で得られたヒアルロン酸溶液を、ろ過精度５．０μｍのアルミナからなるセラミックスフィルター（φ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫモノリス型、日本ガイシ社製）に７０Ｌ／ｈｒ／ｍ２の流量で通液した。得られた液に食塩２．１ｋｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２１０リットルで析出、２４リットルで洗浄し、４０℃で真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を表１に示す。
【００２４】
実施例２
比較例１で得られたヒアルロン酸溶液を、ろ過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミックスフィルター（φ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫモノリス型、日本ガイシ社製）に３５Ｌ／ｈｒ／ｍ２の流量で通液した。得られた液に食塩２．１ｋｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２１０リットルで析出、２４リットルで洗浄し、４０℃で真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を表１に示す。
【００２５】
実施例３
比較例１で得られたヒアルロン酸溶液を、ろ過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミックスフィルター（φ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫモノリス型、日本ガイシ社製）に１７．５Ｌ／ｈｒ／ｍ２の流量で通液した。得られた液に食塩２．１ｋｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２１０リットルで析出、２４リットルで洗浄し、４０℃で真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を表１に示す。
【００２６】
実施例４
実施例２を実施後、使用後のアルミナからなるセラミックスフィルター（φ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫモノリス型、日本ガイシ社製）に純粋１０Ｌを３５Ｌ／ｈｒ／ｍ２の流量で通液し、さらに２％水酸化ナトリウム水溶液を６０℃に保ちながら３５Ｌ／ｈｒ／ｍ２の流量で循環した。次に、充分量の純水で水酸化ナトリウムを洗い出し、置換した。次に、この再生処理したセラミックスフィルターを用いて実施例１と同様にして比較例１で得られたヒアルロン酸溶液を精製し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
2011195607.tif 000002
【００２８】
測定方法
（１）タンパク質：精製ヒアルロン酸を０．１N水酸化ナトリウムに溶かし、ローリー法でタンパク質含量を測定した。
（２）核酸：０．１％ヒアルロン酸ナトリウムの２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３）エンドトキシン：生化学工業社製トキシカラーシステムにより比色分析した。
（４）アミノ酸：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％濃度に溶解し、ＬＣ−ＯＰＡ法にて行った。
（５）異物：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％となるように、ペプトン緩衝液に溶解し、日本薬局方、一般試験法の無菌試験・メンブレンフィルター法で行った。
（６）極限粘度：ヒアルロン酸ナトリウムを０．０２％となるように、０．２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、３０℃における極限粘度を測定した。
（７）無菌試験：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％となるように、ペプトン緩衝液に溶解し、日本薬局方、一般試験法の無菌試験・メンブレンフィルター法で行った。