(57)【要約】      （修正有）【課題】周囲の極性環境の違いにより蛍光発光波長又は蛍光発光強度が大きく変化する蛍光プリン塩基誘導体及びそれを利用したプローブの提供。【解決手段】下記式のプリン塩基誘導体及びこれを導入したポリヌクレオチド誘導体。2011037796.tif 000020[式中、環Ａ1及び環Ａ2は２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1及びＹ2はアシル基、アルコキシカルボニル基等から選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、水素原子又は水酸基である。]【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１６】
2011037796.tif 000017
［式中、環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ1及びＹ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。
但し、次の場合を除く：
（ａ）環Ａ1がフェニレン基であり、Ｘ1が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1がシアノ基であり、ｍが１であり、Ｒ1が水酸基である場合、
（ｂ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素二重結合であり、Ｙ2がシアノ基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合、
（ｃ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ2がアセチル基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合。］
で示されるＣ８位置換プリン塩基誘導体。
【請求項２】
前記Ｒ1及びＲ2が、水素原子である、請求項１記載のプリン塩基誘導体。
【請求項３】
前記環Ａ1及びＡ2が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基及びピレニレン基からなる群より選ばれるものである、請求項１又は２記載のプリン塩基誘導体。
【請求項４】
前記環Ａ1及びＡ2が、フェニレン基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
【請求項５】
前記置換基Ｙ1及びＹ2が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基及びベンジルビニル基からなる群より選ばれるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
【請求項６】
前記置換基Ｙ1及びＹ2が、アセチル基又はシアノ基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
【請求項７】
下記式のいずれかで示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
【化１７】
2011037796.tif 000018
【請求項８】
極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が変化するものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
【請求項９】
下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
【化１８】
2011037796.tif 000019
［式中、環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ1及びＹ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。
但し、次の場合を除く：
（ａ）環Ａ1がフェニレン基であり、Ｘ1が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1がシアノ基であり、ｍが１であり、Ｒ1が水酸基である場合、
（ｂ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素二重結合であり、Ｙ2がシアノ基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合、
（ｃ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ2がアセチル基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合。］
で示されるヌクレオチド誘導体。
【請求項１０】
前記Ｒ1及びＲ2が、水素原子である、請求項９記載のヌクレオチド誘導体。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが請求項９又は１０記載のヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
【請求項１２】
請求項１１記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ８位置換プリン塩基誘導体、それを含むヌクレオチド誘導体及びそれを利用した蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
周囲の極性環境の違いにより蛍光発光波長を変化させる化合物については、これまでにも多く報告されている。同様のヌクレオシドについてもいくつか報告例がある。例えば、国際公開第２００４／５８７９３号パンフレット（特許文献１）、国際公開第２００５／８５２６９号パンフレット（特許文献２）、特開２００６−１６９２４０号公報（特許文献３）、特開２００７−３１３８８号公報（特許文献４）、特開２００７−３１３８９号公報（特許文献５）、Base-discriminating fluorescent (BDF) nucleoside: distinction of thymine by fluorescence quenching Chem. Commun., (2004) 1704-1705（非特許文献１）及びSynthesis and properties of novel base-discriminating fluorescent (BDF) nucleosides: A highly polarity-sensitive fluorophore for SNP typing Tetrahedron Lett., (2004) vol.45, 7827-7831（非特許文献２）など参照。これらの化合物は、周辺の極性環境の違いにより蛍光発光強度又は発光波長を変化させるという特徴を持つことから、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用のプローブなど様々な用途に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００４／５８７９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／８５２６９号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−１６９２４０号公報
【特許文献４】特開２００７−３１３８８号公報
【特許文献５】特開２００７−３１３８９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】BASE-DISCRIMINATING FLUORESCENT (BDF) NUCLEOSIDE: DISTINCTION OF THYMINE BY FLUORESCENCE QUENCHING CHEM. COMMUN., (2004) 1704-1705.
【非特許文献２】SYNTHESIS AND PROPERTIES OF NOVEL BASE-DISCRIMINATING FLUORESCENT (BDF) NUCLEOSIDES: A HIGHLY POLARITY-SENSITIVE FLUOROPHORE FOR SNP TYPING TETRAHEDRON LETT., (2004) VOL.45, 7827-7831.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者はこれまで、ＤＮＡ中の局所的な極性環境の違いを利用して対面塩基の種類を識別するプローブである塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用のプローブなど）の開発を行ってきた。このプローブに利用可能な蛍光分子は、蛍光発光波長又は蛍光発光強度が周辺の極性環境の変化に伴って蛍光発光強度又は発光波長が大きく変化する分子ほど望ましく、特に発光波長の違いが色の違いとして現れるような分子は理想的であるといえる。
このような状況下、周囲の極性環境の違いにより蛍光発光強度又は発光波長が大きく変化するような新規蛍光性塩基及びそれを利用したプローブの開発が期待されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、本研究で鋭意検討したところ、プリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入して共役構造を形成させることで、蛍光発光波長が長波長化して蛍光発光強度を変化させるという新しいコンセプトを含むプリン塩基誘導体を合成した。このプリン塩基誘導体を種々の溶媒に溶解したところ、使用する溶媒の種類によって蛍光発光波長が大きく変化し、色の変化が見られるという特徴を持つことを見出した。さらに該プリン塩基誘導体は、周囲の極性環境の変化に応答して塩基の種類を色の違いで識別できることから、対面塩基識別プローブとして利用できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
［１］下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
2011037796.tif 000002
［式中、環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ1及びＹ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。
但し、次の場合を除く：
（ａ）環Ａ1がフェニレン基であり、Ｘ1が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1がシアノ基であり、ｍが１であり、Ｒ1が水酸基である場合、
（ｂ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素二重結合であり、Ｙ2がシアノ基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合、
（ｃ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ2がアセチル基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合。］
で示されるＣ８位置換プリン塩基誘導体。
［２］前記Ｒ1及びＲ2が、水素原子である、［１］記載のプリン塩基誘導体。
［３］前記環Ａ1及びＡ2が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基及びピレニレン基からなる群より選ばれるものである、［１］又は［２］記載のプリン塩基誘導体。
［４］前記環Ａ1及びＡ2が、フェニレン基である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
［５］前記置換基Ｙ1及びＹ2が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基及びベンジルビニル基からなる群より選ばれるものである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
［６］前記置換基Ｙ1及びＹ2が、アセチル基又はシアノ基である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
［７］下記式のいずれかで示される、［１］〜［７］のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
【化２】
2011037796.tif 000003
［８］極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が変化するものである、［１］〜［７］のいずれか１項に記載のプリン塩基誘導体。
［９］下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
【化３】
2011037796.tif 000004
［式中、環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ1及びＹ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。
但し、次の場合を除く：
（ａ）環Ａ1がフェニレン基であり、Ｘ1が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1がシアノ基であり、ｍが１であり、Ｒ1が水酸基である場合、
（ｂ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素二重結合であり、Ｙ2がシアノ基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合、
（ｃ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ2がアセチル基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合。］
で示されるヌクレオチド誘導体。
［１０］前記Ｒ1及びＲ2が、水素原子である、［９］記載のヌクレオチド誘導体。
［１１］ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが［９］又は［１０］記載のヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
［１２］［１１］記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、プリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる新規なＣ８位置換プリン塩基誘導体、それを含むヌクレオチド誘導体及びそれを利用したプローブが得られる。本発明の好ましい態様によれば、該Ｃ８位置換プリン塩基誘導体は、周囲の極性環境の違いにより蛍光発光波長を変化させることができる。この性質を利用することにより、該Ｃ８位置換プリン塩基誘導体をヌクレオチドに導入してなるプローブは、遺伝子検出用プローブあるいはタンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとして実用化可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】オリゴヌクレオチドＤＮＡ(T-rich)に各種相補鎖（N = A,G,C,T又はバルジ(bulge））を加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）、蛍光スペクトル（ｂ）及び励起スペクトル（ｃ）の測定結果を示したグラフである。
【図２】オリゴヌクレオチドＤＮＡ(C-rich)に各種相補鎖（N = A,G,C,T又はバルジ(bulge））を加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）、蛍光スペクトル（ｂ）及び励起スペクトル（ｃ）の測定結果を示したグラフである。
【図３】オリゴヌクレオチドＤＮＡ(probe 1)にターゲットＯＤＮを加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）及び蛍光励起スペクトル（ｂ）の測定結果を示したグラフである。
【図４】オリゴヌクレオチドＤＮＡ(probe 2)にターゲットＯＤＮを加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）及び蛍光励起スペクトル（ｂ）の測定結果を示したグラフである。
【図５】オリゴヌクレオチドＤＮＡ（probe 1及びprobe 2）がそれぞれ単独のときと、ターゲットＤＮＡが存在するときの蛍光発光の色を比較した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明のＣ８位置換プリン塩基誘導体、それを含むヌクレオチド誘導体及びそれを利用したプローブ等について詳細に説明する。
【００１１】
１．Ｃ８位置換プリン塩基誘導体
まず、本発明のＣ８位置換プリン塩基誘導体について説明する。本発明のＣ８位置換プリン塩基誘導体は、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示され、プリン塩基と五炭糖が結合してなるヌクレオシドにおいて、プリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入した化合物である（以下「プリン塩基誘導体」ということがある。）。
【化４】
2011037796.tif 000005
［式中、環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ1及びＹ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。
但し、次の場合を除く：
（ａ）環Ａ1がフェニレン基であり、Ｘ1が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1がシアノ基であり、ｍが１であり、Ｒ1が水酸基である場合、
（ｂ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素二重結合であり、Ｙ2がシアノ基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合、
（ｃ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ2がアセチル基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合。］
【００１２】
本発明のプリン塩基誘導体は、プリン塩基（式（Ｉ）ではアデニン、式（ＩＩ）ではグアニン）と五炭糖が結合してなるヌクレオシドにおいて、プリン塩基のＣ８位に炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を介して蛍光分子を導入することで、プリン塩基と蛍光分子が共役構造を形成するように設計されている。本発明の好ましい態様によれば、本発明のプリン塩基誘導体は、周辺環境たとえば極性環境の変化に応答して蛍光発光波長が大きく変化することで、蛍光発光強度（望ましくは蛍光発光の色）が変化するという特徴を有している。
【００１３】
本発明のプリン塩基誘導体において、プリン塩基と結合する五炭糖は、２−デオキシリボースでもリボースでもよく、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。本発明のプリン塩基誘導体をヌクレオチドに導入してＤＮＡ型のプローブとして用いるときはＲ1及びＲ2は水素原子が好ましく、ＲＮＡ型のプローブとして用いるときはＲ1及びＲ2は水酸基が好ましい。
【００１４】
環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、置換基を有していてもよい、２価又は３価の芳香環である。前記芳香環は、炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を介してプリン塩基との間に共役構造を形成できるものであれば特に制限されない。芳香環は、例えば、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、フェナントリレン基及びピレニレン基からなる群より選ばれるものが好ましく挙げられる。中でも、フェニレン基、ナフチレン基が好ましく、フェニレン基が特に好ましい。
【００１５】
芳香環基Ａ1及びＡ2はそれぞれ置換基Ｙ1及びＹ2を一つ又は二つ有している。該置換基としては、アシル基（ＲＣ（＝Ｏ）−）、アルコキシカルボニル基（Ｒ’ＯＣ（＝Ｏ）−）、カルボン酸アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ1Ｒ2）、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基（ベンジルビニル基（Ｃ6Ｈ6−Ｃ＝Ｃ−）など）からなる群より選ばれる置換基が好ましく挙げられる。ここで、式中のＲ、Ｒ’、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立して、同一又は異なって、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基である。置換基Ｙ1及びＹ2は、前記芳香環との組み合わせで蛍光を発光するものが好ましく、上記の中から目的及び用途等に応じて適宜選択すればよい。中でも、置換基Ｙ1及びＹ2としては、電子吸引性置換基が好ましく、具体的にはアセチル基、シアノ基、チオール基などが挙げられる。これらの中でもアセチル基又はシアノ基が特に好ましい。
置換基Ｙ1及びＹ2は、前記芳香環のいずれの位置で結合していてもよい。共役構造がより安定化することから、置換基の少なくとも一つは炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合に対してパラ位で結合していることが好ましい。
【００１６】
ここで、本明細書において「ハロゲン原子」、「Ｃ1〜Ｃ20炭化水素基」、「Ｃ1〜Ｃ20アルキル基」等の定義は下記のとおりである。
【００１７】
本明細書において、「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましい。
【００１８】
本明細書において、「Ｃ1〜Ｃ20炭化水素基」の炭化水素基は、飽和若しくは不飽和の非環式であってもよいし、飽和若しくは不飽和の環式であってもよい。Ｃ1〜Ｃ20炭化水素基が非環式の場合には、線状でもよいし、枝分かれでもよい。「Ｃ1〜Ｃ20炭化水素基」には、Ｃ1〜Ｃ20アルキル基、Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基、Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基、Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基、Ｃ6〜Ｃ18アリール基、Ｃ7〜Ｃ20アルキルアリール基、Ｃ7〜Ｃ20アリールアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基、Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基、（Ｃ3〜Ｃ10シクロアルキル）Ｃ1〜Ｃ10アルキル基などが含まれる。
【００１９】
本明細書において、「Ｃ1〜Ｃ20アルキル基」は、Ｃ1〜Ｃ12アルキル基であることが好ましく、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基であることがより好ましく、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であることが更に好ましい。アルキル基の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ドデカニル等を挙げることができる。
【００２０】
本明細書において、「Ｃ2〜Ｃ20アルケニル基」は、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル基であることが好ましく、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル基であることが更に好ましい。アルケニル基の例としては、制限するわけではないが、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチルアリル、２−ブテニル等を挙げることができる。
【００２１】
本明細書において、「Ｃ2〜Ｃ20アルキニル基」は、Ｃ2〜Ｃ10アルキニル基であることが好ましく、Ｃ2〜Ｃ6アルキニル基であることが更に好ましい。アルキニル基の例としては、制限するわけではないが、エチニル、プロピニル、ブチニル等を挙げることができる。
【００２２】
本明細書において、「Ｃ4〜Ｃ20アルキルジエニル基」は、Ｃ4〜Ｃ10アルキルジエニル基であることが好ましく、Ｃ4〜Ｃ6アルキルジエニル基であることが更に好ましい。アルキルジエニル基の例としては、制限するわけではないが、１，３−ブタジエニル等を挙げることができる。
【００２３】
本明細書において、「Ｃ6〜Ｃ18アリール基」は、Ｃ6〜Ｃ12アリール基であることが好ましい。アリール基の例としては、制限するわけではないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、インデニル、ビフェニリル、アントリル、フェナントリル等を挙げることができる。
【００２４】
本明細書において、「Ｃ7〜Ｃ20アルキルアリール基」は、Ｃ7〜Ｃ12アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基の例としては、制限するわけではないが、ｏ−トリル、ｍ−トリル、ｐ−トリル、２，３−キシリル、２，４−キシリル、２，５−キシリル、ｏ−クメニル、ｍ−クメニル、ｐ−クメニル、メシチル等を挙げることができる。
【００２５】
本明細書において、「Ｃ7〜Ｃ20アリールアルキル基」は、Ｃ7〜Ｃ12アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基の例としては、制限するわけではないが、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル等を挙げることができる。
【００２６】
本明細書において、「Ｃ4〜Ｃ20シクロアルキル基」は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を挙げることができる。
【００２７】
本明細書において、「Ｃ4〜Ｃ20シクロアルケニル基」は、Ｃ4〜Ｃ10シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基の例としては、制限するわけではないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態として、下記式Ｉ（ａ）〜（ｄ）で示される化合物が挙げられる。式中のＹ1の定義は上記と同じである。
【００２９】
【化５】
2011037796.tif 000006
【００３０】
本発明の他の好ましい実施形態として、下記式ＩＩ（ａ）〜（ｄ）で示される化合物が挙げられる。式中のＹ2の定義は上記と同じである。
【００３１】
【化６】
2011037796.tif 000007
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態の一例を下記に示す。
【化７】
2011037796.tif 000008
【００３３】
本発明のプリン塩基誘導体は、プリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入し共役構造を形成させることで、該プリン塩基誘導体の蛍光発光波長が長波長化し、蛍光発光強度が変化するように設計されている。蛍光発光波長の変化の程度は周囲の極性環境によって異なるので、本発明の好ましい態様によれば、本発明のプリン塩基誘導体を利用することで、周囲の極性環境の違いを蛍光発光の色の変化によって識別することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明のプリン塩基誘導体は上記のような性質を有するので、ＤＮＡ中の局所的な極性環境の違いにより対面塩基の種類を識別するプローブとして使用可能である。例えば、本発明のプリン塩基誘導体をポリヌクレオチドに導入することで、遺伝子検出用のプローブとして、あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブとして実用可能である。
【００３４】
本発明のＣ８位置換プリン塩基誘導体は、天然のプリンヌクレオシドに蛍光分子を導入することにより製造することができる。
【００３５】
例えば、本発明の式（Ｉ）で示されるプリン塩基誘導体は、下記のスキームＡに従って製造することができる。
【化８】
2011037796.tif 000009
【００３６】
（１）まず、アデニンヌクレオシド（ａ）を溶媒中でN−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）と反応させ、アデニンのＣ８位をブロモ化して化合物（ｂ）を得る。反応温度は、例えば、２０℃〜８０℃であり、好ましくは４０℃〜６０℃である。溶媒は、メタノールなどのアルコール系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素などを好ましく使用できる。臭素元であるN−ブロモスクシンイミドの使用量は特に制限されないが、化合物（ａ）に対して、１〜４倍量が好ましく、２〜３倍量がより好ましい。反応は窒素又はアルゴンガス雰囲気下で行うことが好ましい。
【００３７】
（２）次に、化合物（ｂ）及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）を溶媒に溶かし、この溶液にテトラビニルスズを加えて反応させる。反応温度は、例えば、４０℃〜１２０℃であり、好ましくは８０℃〜１００℃である。溶媒は、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを好ましく用いることができる。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）の使用量は、化合物（ｂ）に対して、０．０５〜０．５倍量が好ましく、０．１〜０．２倍量がより好ましい。また、テトラビニルスズの使用量は、化合物（ｂ）に対して、１〜３倍量が好ましく、１．２〜１．５倍量がより好ましい。反応は窒素又はアルゴン雰囲気下で行うことが好ましい。
【００３８】
（３）次に、化合物（ｃ）及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）を溶媒に溶かし、この溶液に４−ブロモアセトン、４−ブロモベンゾニトリル、４−ブロモスチルベンなどの対応する蛍光分子のブロモ化合物を加えて反応させる。反応温度は、例えば、６０℃〜１２０℃であり、好ましくは８０℃〜１００℃である。溶媒は、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを好ましく用いることができる。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）の使用量は、化合物（ｃ）に対して、０．０５〜０．５倍量が好ましく、０．１〜０．２倍量がより好ましい。また、蛍光分子のブロモ化合物の使用量は、化合物（ｃ）に対して、１〜５倍量が好ましく、２〜３倍量がより好ましい。反応は窒素又はアルゴンガス雰囲気下で行うことが好ましい。
【００３９】
なお、いずれの反応も窒素又はアルゴン雰囲気下で行うことが好ましい。各工程において反応生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーなど常法に従って精製することが好ましい。
【００４０】
本発明の式（ＩＩ）で示されるプリン塩基誘導体は、下記のスキームＢに従って製造することができる。
【化９】
2011037796.tif 000010
【００４１】
スキームＢの工程（１）〜（３）はそれぞれ、出発化合物としてグアニンヌクレオシド（ａ’）を用いることを除いて、スキームＡの工程（１）〜（３）と同様であるので、ここでは説明を繰り返さない。なお、スキームＡ及びＢはＲ2が水素原子の場合であるが、
Ｒ2が水酸基の場合も同様にして製造することができる。
【００４２】
本発明のプリン塩基誘導体は、上記のように天然のヌクレオシドを利用して簡便な方法で製造することができるので、本発明のプリン塩基誘導体の有用性は高い。
【００４３】
２．ヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体
本発明のヌクレオチド誘導体は、上述した本発明のプリン塩基誘導体にリン酸がエステル結合したものであり、下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
【化１０】
2011037796.tif 000011
［式中、環Ａ1及び環Ａ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、２価又は３価の芳香環であり、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｙ1及びＹ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルボン酸アミド基、シアノ基、チオール基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びＣ1〜Ｃ20炭化水素基からなる群より選ばれる置換基であり、ｍ及ｎは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１又は２であり、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。
但し、次の場合を除く：
（ａ）環Ａ1がフェニレン基であり、Ｘ1が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ1がシアノ基であり、ｍが１であり、Ｒ1が水酸基である場合、
（ｂ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素二重結合であり、Ｙ2がシアノ基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合、
（ｃ）環Ａ2がフェニレン基であり、Ｘ2が炭素−炭素三重結合であり、Ｙ2がアセチル基であり、ｎが１であり、Ｒ2が水酸基である場合。］
で示される。
【００４４】
式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）におけるＡ1、Ａ2、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、ｎは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＡ1、Ａ2、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、ｎで定義したとおりである。ｓ及びｔはそれぞれ１、２又は３であるが、１又は３が好ましく、ポリヌクレオチド誘導体に容易に導入できることから３が特に好ましい。
【００４５】
本発明のヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の一リン酸体（ｓ，ｔ＝１）は、通常、本発明のプリン塩基誘導体（Ｉ）又は（ＩＩ）をトリメチルホスファイトなどの溶媒に溶解し、０℃オキシ塩化リンを加えて反応させた後に水を加えることで簡単に合成することができる。また、三リン酸体（ｓ，ｔ＝３）は、水を加える前にトリブチルアンモニウムピロリン酸（二リン酸）を加えるステップを加えることを除いて一リン酸体と同様にして合成することができる。
【００４６】
また、本発明のヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の三リン酸体は、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡに容易に導入することができ、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが本発明のヌクレオチド誘導体で置換された本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。あるいは、実施例５に記載したとおり、本発明のプリン塩基誘導体にＮ，Ｎ−メチルホルムアミドジエチルアセタールを反応させ、その後、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン及びジメトキシトリチルクロリドを加えて反応させて得られる化合物を、更に２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロアミダイトと反応させて、得られたアミダイト体を直接ＤＮＡ自動合成機にかけることで本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。
【００４７】
本発明において、ポリヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の塩基数は特に制限されなく、例えば２から１０００が好ましく、２から２００がより好ましく、２から１００が特に好ましい。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチド誘導体又はオリゴヌクレオチド誘導体は、ＤＮＡ中の局所的な極性環境の違いを利用して対面塩基の種類を識別する塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用プローブ）として、あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用のプローブとして用いることができる。
【００４９】
本発明のプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせフルマッチしたときの極性環境の変化による前記プローブの蛍光発光の色の違いで標的ＤＮＡの対面塩基を識別することができる。
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、下記の実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
下記スキーム１に従って本発明のプリン塩基誘導体(4)を合成した。
【化１１】
2011037796.tif 000012
【００５２】
化合物(2)の合成
アルゴン雰囲気下、化合物(1) (6.00g, 22.0 mmol) のメタノール溶液 (50 ml)にNBS (7.94  g, 44.6 mmol) を加え、50℃で90分攪拌した。その後反応溶液を室温で20時間攪拌した後ろ過し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール/クロロホルム= 1/20)で精製して化合物(2) (4.55g, 13.8mmol, 61.7%) を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.20 (m, 1H), 3.25 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 5.35 (br, 2H), 6.29 (dd, J=6.56, 7.88 Hz, 1H), 7.55 (br, 2H), 8.12 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ36.4，61.5，70.6，85.8，87.7，119.1，126.1，149.3，151.7，154.5.
【００５３】
化合物(3)の合成
アルゴン雰囲気下、化合物(2) (1.82 g, 5.51 mmol)及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0) (378 mg, 32.7 mmol) のDMF溶液にテトラビニルスズ (0.750 ml, 4.12 mmol)を加え、80℃で1時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮して、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=10/1)で精製して化合物(3) (783 mg, 2.82 mmol, 86.3 %) を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.98 (m, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 5.31 (d, J=4.32, 1H), 5.38 (m, 1H), 5.67 (dd, J=1.96, 11.1 Hz, 1H), 6.33 (dd, J=1.96, 17.0 Hz, 1H), 6.44 (dd, J=6.36, 8.24 Hz, 1H), 7.14 (dd, J=11.1, 17.0 Hz, 1H), 7.37 (br, 2H), 8.10 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ36.7, 59.8, 68.8, 81.6, 85.8, 116.7, 120.6, 122.3, 145.3, 147.6, 147.6, 150.0, 153.7.
【００５４】
化合物(4)の合成
アルゴン雰囲気下、化合物(3) (210 mg, 0.757 mmol)とテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0) (175 mg, 0.151 mmol)のDMF溶液 (20 ml)に4-ブロモアセトフェノン(226 mg, 0.114 mmol)、TEA (2 ml)を加え、80℃で16時間攪拌した。溶媒を減圧留去して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝10/1)で精製して化合物(4)(151 mg, 0.382 mmol, 51 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.09 (m, 1H), 2.22 (s, 1H), 2.61 (s, 3H), 2.91 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 4.54 (m,, 1H), 5.35 (d, J = 4.34 Hz, 1H), 5.50(dd, J = 4.31, 6.88 Hz, 1H), 7.41 (br, 1H), 7.80 (m, 2H), 7.91 (d, J = 8.45 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 8.45 Hz, 2H), 8.81 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ26.7, 38.8, 61.6, 70.6, 83.4, 87.8, 117.7, 119.2, 127.6, 128.7, 134.6, 136.5, 140.1, 147.3, 149.9, 152.1, 155.7, 197.8.
【実施例２】
【００５５】
下記スキーム２に従って本発明のプリン塩基誘導体(7)を合成した。
【化１２】
2011037796.tif 000013
【００５６】
化合物(5)の合成
アルゴン雰囲気下、化合物(2) (880 mg, 2.67 mmol)、よう化銅 (53mg, 0.278 mmol)及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0) (39.0 mg, 0.337 mmol) のDMF溶液 (20 ml) にTEA (1 ml)、TMSアセチレン (0.500 ml, 3.61 mmol) を加え、50℃で30分間攪拌した。反応液を減圧下濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝20/1)で精製して化合物(5) (738 mg, 2.13 mmol, 79.7 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ0.30 (s, 9H), 2.21 (m, 1H), 3.08 (m, 1H), 3.52 (m, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 5.32 (m, 2H), 6.41 (dd, J=6.74, 7.76 Hz, 1H), 7.63 (br, 2H), 8.16 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ0.0, 38.4, 62.8, 71.9, 85.5, 88.9, 94.2, 102.8, 119.9, 132.9, 149.0, 154.3, 156.8.
【００５７】
化合物(6)の合成
アルゴン雰囲気下、化合物(5)(738 mg, 2.13 mmol)のTHF溶液(10 ml)にTBAF (668 mg, 2.55 mmol)を加え、60分間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝10/1) で精製して化合物(6) (438 mg, 1.59 mmol, 74.9 %) を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.21 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 4.47 (m, 1H), 5.03 (s, 1H), 5.35 (dd , J=4.32, 8.28 Hz, 2H), 6.43 (dd, J=6.34, 8.19 Hz,1H), 7.64 (br, 2H), 8.17 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 400MHz)δ36.5, 61.2, 70.3, 71.8, 84.3, 86.4, 87.4, 118.1, 131.4, 147.4, 152.5, 155.2.
【００５８】
化合物(7)の合成
アルゴン雰囲気下、化合物(6)(107 mg, 0.389 mmol), 4-ブロモアセトフェノン (209 mg, 1.05 mmol)、よう化銅(31.0 mg, 0.162 mmol)及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0) (112 mg, 0.0969 mmol) のDMF溶媒 (5 ml) にTEA (2 ml) を加え、80 oC で30分間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=10/1) で精製して化合物(7)(89.3 mg, 0.227 mmol, 58.4 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.31 (m, 1H), 2.63 (s, 3H), 3.17 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 5.30 (dd, J=4.56 Hz, 7.48 Hz, 1H), 5.38 (d, J=4.48Hz, 1H), 6.56 (m, 1H), 7.69 (br, 2H), 7.84 (d, J=8.48Hz, 2H), 8.06 (d, J=8.48Hz, 2H), 8.20 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ26.8, 37.8, 62.1, 71.1, 81.1, 85.0, 88.2, 93.3, 119.7, 124.3, 128.6, 132.1, 132.3, 137.3, 148.6, 153.6, 156.1, 197.3.
【実施例３】
【００５９】
下記スキーム３に従って本発明のプリン塩基誘導体(9)、(10)及び(11)を合成した。
【化１３】
2011037796.tif 000014
【００６０】
化合物(8)の合成
Tetrahedron Letters, 2009, 50, 1403-1406に記載されている合成法に従って化合物(8)を合成した。
【００６１】
化合物(9)の合成
化合物(8)(300 mg, 0.86 mmol) をDMF (10 ml) に溶解し、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム (99 mg, 0.086 mol)、４-ブロモアセトフェノン (259 mg, 1.3 mmol) を加え100 ℃で6時間撹拌した。TLCで化合物(8)の消失を確認した後、反応液に少量のシリカゲル（Wako-gel C-200）を加え溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝10/1) で粗精製した。これをメタノール/28%アンモニア水1/1に溶解し、50 ℃で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターでメタノールを減圧留去して化合物(9) (239 mg、0.58 mmol, 67 %）を得た。
2.11 (m, 1H), 2.50-2.61 (complex, 4H), 3.67-3.74 (complex, 2H), 3.85 (m, 1H), 4.47 (m, 1H), 5.27 (dd, 1H, J = 5.1 5.1 Hz), 5.31 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 6.40 (dd, 1H, J = 6.2, 8.9 Hz), 6.55 (bs, 2H), 7.60 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 7.69 (d, 1H, J = 15.8 Hz),7.85 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.95(d, 2H, J = 8.5 Hz), 10.71 (bs, 1H,); 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δ26.6, 40.6, 60.9, 69.9, 82.3, 87.1, 118.2, 119.9, 127.3 (2C), 128.6 (2C), 132.1, 136.0, 140.6, 144.8, 150.4, 156.9, 157.2, 197.2.
【００６２】
化合物(10)の合成
化合物(8)(300 mg, 0.86 mmol）をDMF (10 ml) に溶解し、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム (99 mg, 0.086mol)、４-ブロモベンゾニトリル (237 mg, 1.3 mmol) を加え100 ℃で4時間撹拌した。TLCで化合物(8)の消失を確認した後、反応液に少量のシリカゲル(Wako-gel C-200)を加え溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝10/1)で粗精製した。これをメタノール/28%アンモニア水1/1に溶解し、50 ℃で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターでメタノールを減圧留去し、化合物(10)(210 mg、0.53 mmol, 62 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.11 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 3.67-3.83 (complex, 2H), 3.84 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 5.27 (dd, 1H, J = 5.3 5.3 Hz), 5.31 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 6.40 (dd, 1H, J = 6.1, 8.8 Hz), 6.56 (s, 2H), 7.60 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 7.73 (d, 1H, J = 15.8 Hz),7.81 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.91(d, 2H, J = 8.4 Hz), 10.73 (s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δ40.0, 61.1, 70.2, 82.5, 87.3, 109.9, 116.9, 119.0, 119.5, 127.8 (2C), 130.8, 132.5 (2C), 141.0, 143.5, 151.8, 153.5, 156.4.
【００６３】
化合物(11)の合成
化合物(8)(300 mg, 0.86 mmol）をDMF (10 ml) に溶解し、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム (99 mg, 0.086mol)、4-ブロモスチルベン (337 mg, 1.3 mmol) を加え100 ℃で4時間撹拌した。TLCで化合物(8)の消失を確認した後、反応液に少量のシリカゲル(Wako-gel C-200)を加え溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール＝10/1)で粗精製した。これをメタノール/28%アンモニア水1/1に溶解し、50 ℃で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターでメタノールを減圧留去し、化合物(11)(112 mg、0.238 mmol、28 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ2.11 (m, 1H), 2.55 (m, 1H), 3.65-3.80 (complex, 2H), 3.84 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 5.22 (dd, 1H, J = 5.4 5.4 Hz), 5.30 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 6.40 (dd, 1H, J = 6.3, 8.8 Hz), 6.56 (bs, 2H), 7.26-7.73 (complex, 13H), 10.69(s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δ40.1, 61.2, 70.2, 82.4, 87.2, 115.7, 116.6, 126.5 (2C), 126.8 (2C), 127.7 (2C), 128.0, 128.6, 128.7 (2C), 132.5, 135.6 137.0, 137.0, 144.4, 151.7, 153.3, 156.3.
【実施例４】
【００６４】
下記スキーム４に従って本発明のプリン塩基誘導体(13)、(15)及び(16)を合成した。
【化１４】
2011037796.tif 000015
【００６５】
化合物(13)の合成
8-ブロモ-2'-デオキシグアノシン(12)(1.5080g, 4.347 mmol)をDMF (50 ml) に溶解しPd(PPh3)4 (1.0046 g, 0.869 mmol)及びCuI (163.7 mg, 0.869 mmol) を加えた。これにトリメチルシリルアセチレン(0.9 ml, 6.522 mmol)及びTEA(3 ml)を加え、50 ℃で3時間加熱した。溶媒を減圧留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3/MeOH = 10/1)で精製し化合物(13)(1326 mg, 84%)を得た。
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) 0.20 (s 9H), 2.14 (m 1H), 2.98 (m 1H), 3.68 (m 1H), 3.93 (m 1H),3.93 (m 1H), 4.78 (m 1H), 6.35 (m 1H), 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) 9.8, 40.0, 64.7, 74.0, 87.7, 90.3, 94.2, 103.8, 119.2, 132.9, 152.5, 156.1, 159.1.
【００６６】
化合物(14)の合成
化合物(13)(1.7596 g, 4.846 mmol)のTHF (40 ml)溶液にテトラブチルアンモニウムフルオリド(1.267 g)を加え室温で2時間撹拌した。析出物をろ過し、乾燥させて化合物(14)(1.1309 g, 80 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6 400 MHz) 2.11 (m 1H), 3.07 (m 1H), 3.51 (ddd 1H J = 5.6, 5.6, 11.7),3.62 (ddd 1H J = 5.6, 5.6, 11.7),3.80 (m 1H),4.37 (m 1H),4.79 (s 1H),4.90 (m 1H),5.28 (d 1H J = 4.1),6.25 (dd 1H J = 6.6, 8.1),6.58 (br 2H), 10.88 (br 1H); 13C NMR (DMSO-d6 100 MHz) 37.4, 62.4, 66.9, 71.5, 74.2, 84.5, 84.8, 88.2, 117.7, 127.1, 150.6.
【００６７】
化合物(15)の合成
化合物(14)(101.4 mg, 0.348 mmol)と4'ブロモアセトフェノン(97.1 mg, 0.488 mmol)の DMF(5 ml)溶液に Pd(PPh3) (80.5 mg, 0.0697 mmol)、CuI (13.3 mg, 0.0697 mmol)及びTEA (0.5 ml) を加えた。室温で3時間撹拌した後濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3/MeOH = 8/1)で精製して化合物(15)(77mg, 54 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6 400 MHz) 2.18 (m 1H), 2.93 (m 1H), 3.23 (s 3H), 3.63 (m 1H),3.82 (m 1H), 3.81 (m 1H), 4.39 (m 1H), 4.79 (m 1H), 5.31 (m 1H), 6.35(d 1H J = 6.4, 8.0), 6.59 (br 2H), 7.78 (d 2H J =8.4), 8.04 (d 2H J =8.4), 10.90(br 1H)
【００６８】
化合物(16)の合成
化合物(14)(135.3 mg, 0.465 mmol)と4'ブロモベンゾニトリル(118.4 mg, 0.651 mmol)のDMF(5 ml)溶液にPd(PPh 3)(107.4 mg,0.093 mmol)、CuI(17.7 mg, 0.093 mmol)及びTEA(0.5 ml)を加えた。室温で3時間撹拌した後濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3/MeOH = 8/1)で精製して化合物(16)(110.7 mg, 61 %)を得た。
1H NMR (DMSO-d6 400 MHz) 2.19 (ddd 1H J = 3.4, 6.8, 13.3), 3.02 (m 1H), 3.51(m 1H), 3.63 (m 1H), 3.81(m 1H),4.43 (m 1H),4.87 (m 1H), 5.30 (m 1H), 6.35 (dd 1H J = 6.4, 8.0), 6.66 (br 2H), 7.84 (d 2H J = 6.7), 7.98 (d 2H J = 8.5), 10.90 (br 1H)
【実施例５】
【００６９】
下記スキーム５に従って本発明のプリン塩基誘導体をＤＮＡ鎖に導入した。
【化１５】
2011037796.tif 000016
【００７０】
化合物(10)の合成
実施例３で得た化合物(9)(65 mg 0.16 mmol)のメタノール溶液(20ml)にN,N-メチルホルムアミドジエチルアセタールを0.5 ml加え、60 ℃で5時間撹拌した。TLCで化合物(9)の消失を確認し、反応液にヘキサン10 mlを加え、沈殿物を濾過して化合物(10)(62 mg, 0.13 mmol）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ2.18 (m, 1H), 2.51, (s, 3H), 3.05 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 3.67-3.75 (complex, 2H), 3.84 (m, 1H), 4.54 (m, 1H), 5.20 (dd, 1H, J = 5.4 5.4 Hz), 5.38 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 6.40 (dd, 1H, J = 7.0, 7.0 Hz), 7.65 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 7.87 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.96(d, 2H, J = 8.5 Hz), 11.46 (s, 1H,); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ26.6, 34.6 (2C), 40.6, 60.9, 69.9, 82.3, 87.1, 118.1, 119.8, 127.2 (2C), 128.6 (2C), 132.1, 136.0, 140.6, 144.8, 150.4, 156.9, 157.2, 158.0, 197.2.
【００７１】
化合物(11)の合成
化合物(10)(62 mg, 0.13 mmol)のピリジン溶液 (5 ml) に、触媒量のN,N-ジメチルアミノピリジン及びジメトキシトリチルクロリドを加え、室温で1時間撹拌した。これにメタノール (1 ml) を加え、ロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール/トリエチルアミン＝100/2/1）で精製し化合物(11)(60 mg) を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ2.29 (m, 1H), 2.50, (s, 3H), 3.05 (s, 3H), 3.07 (s, 3H), 3.05-3.25 (complex, 3H), 3.65 ( s, 6H), 3.90 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.43 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 6.62-6.75 (complex, 5H), 7.11-7.26 (complex, 11H) 7.65 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 7.70-8.00 (complex 5H), 8.42 (s, 1H), 11.50 (s, 1H) ; 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ26.6, 34.6 (2C), 40.7, 54.8, 54.8, 63.5, 70.1, 79.1, 82.6, 85.0, 112.8 (4C), 117.4, 120.4, 126.4, 127.1 (2C), 127.5, 128.6(2C), 129.4, 129.4, 132.0, 135.4, 136.0, 140.5, 144.8, 145.2, 149.9, 156.4, 157.3, 157.6, 157.7, 157.8, 197.1.
【００７２】
ＤＮＡ合成
化合物(11)(60 mg)をアセトニトリル(1 ml) に懸濁させ、トリエチルアミン100μlを加えた。これに、2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを50μl加えた。TLCで化合物(11)の消失を確認し、酢酸エチル10 mlを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液10 mlを3回, 飽和食塩水10mlで洗い、無水Na2SO4で脱水後ロータリーエバポレーターで濃縮し、黄色オイル状の粗精製物を得た。これをアセトニトリル600 μlに溶解させ、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：３４００DNAシンセサイザー）で４種類のＤＮＡ鎖へ導入した。
【００７３】
得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡ（T-rich、C-rich、プローブ１(probe 1)及びプローブ２(probe 2)）を用いたときのＵＶ吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを次のようにして測定した。測定結果を図１〜４に示す。
【００７４】
[１]ＵＶ吸収スペクトルの測定
得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でNaClを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）にてＵＶ吸収スペクトルを測定した。
【００７５】
[２]蛍光スペクトルの測定
得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でNaClを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）にて蛍光スペクトルを測定した（T-rich及びC-richの測定では380 nmで、プローブ１及びプローブ２の測定では370 nmでそれぞれ励起させた）。
【００７６】
[３]励起スペクトルの測定
得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でNaClを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）にて蛍光スペクトルを測定した（T-rich及びC-richの測定は540 nmで、プローブ１及びプローブ２の測定は535 nmでそれぞれモニターした）。
【００７７】
図１は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ(T-rich)に各種相補鎖（N = A,G,C,T又はバルジ(bulge））を加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）、蛍光スペクトル（ｂ）及び励起スペクトル（ｃ）を比較したものである。
T-rich  5'-CGCAATXTAACGC-3'（配列番号１）
相補鎖  5'- GCGTTANTAACGC-3' N = A,G,C,T,バルジ(bulge）（配列番号２）
図１（ａ）のＵＶスペクトルの結果から各ＤＮＡの量が揃っていることがわかる。また、図１（ｂ）及び（ｃ）の蛍光励起スペクトルの結果から蛍光ヌクレオシドがバルジ構造（N = バルジ(bulge））を形成するときに強い発光が見られることがわかる。
【００７８】
図２は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ(C-rich)に各種相補鎖（N = A,G,C,T又はバルジ(bulge））を加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）、蛍光スペクトル（ｂ）及び励起スペクトル（ｃ）を比較したものである。
C-rich  5'-CGCAACXCAACGC-3'（配列番号３）
相補鎖  5'- GCGTTGNGAACGC-3'   N = A,G,C,T,バルジ(bulge）（配列番号４）
図２（ａ）のＵＶスペクトルの結果から各ＤＮＡの量が揃っていることがわかる。また、図２（ｂ）及び（ｃ）の蛍光励起スペクトルに見られるように、蛍光ヌクレオシドの両端の配列がTのときには良好の結果が得られるが、両端がCの時にはバルジ構造での強い発光が得られない。このことから、プローブの設計の際に配列を選んでプローブを設計する必要があることがわかる。
【００７９】
図３は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ(probe 1)にターゲットＯＤＮを加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）及び蛍光励起スペクトル（ｂ）を比較したものである。
probe 1       5'-GTATCCAXAGATTGAA-3'（配列番号５）
ターゲットODN 3'-CATAGGT TCTAACTT-5'（配列番号６）
図３（ａ）のＵＶスペクトルの結果から各ＤＮＡの量が揃っていることがわかる。また、図３（ｂ）の蛍光励起スペクトルに見られるように、蛍光ヌクレオシドがバルジ構造を形成するようにプローブを設計することで、プローブ単独のとき（シングルストランド：ss）とターゲットＤＮＡが存在するとき（ダブルストランド：ds）の違いを蛍光発光で区別することが可能である。ターゲットＤＮＡが存在しないときには発光は弱いが、ターゲットＤＮＡを加えると強い発光が見られる。更に発光波長も大きく変化することがわかる。
【００８０】
図４は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ(probe 2)にターゲットＯＤＮを加えたときのＵＶ吸収スペクトル（ａ）及び蛍光励起スペクトル（ｂ）を比較したものである。
probe 2       5'-CTCAGTXTCTGGTCAATC-3'（配列番号７）
ターゲットODN 3'-GAGTCA  AGACCAGTTAG -5'（配列番号８）
図４（ａ）のＵＶスペクトルの結果から各ＤＮＡの量が揃っていることがわかる。また、図４（ｂ）の蛍光励起スペクトルに見られるように、蛍光ヌクレオシドがバルジ構造を形成するようにプローブを設計することで、プローブ単独のときとターゲットＤＮＡが存在するときの違いを蛍光発光で区別することが可能である。ターゲットＤＮＡが存在しないときには発光は弱いが、ターゲットＤＮＡを加えると強い発光が見られる。更に発光波長も大きく変化することがわかる。
【００８１】
図５は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（probe 1及びprobe 2）がそれぞれ単独のときと、ターゲットＤＮＡが存在するときの蛍光発光の色を比較した写真である（室温でトランスイルミネーターを用い、３６６nmのＵＶを下から照射してデジカメで撮影した）。図５から明らかなようにターゲットＤＮＡの有無により発光波長が大きく変化し、ターゲットＤＮＡの有無が色の違いで識別可能であることがわかる。
以上のとおり、本発明の好ましい態様によれば、本発明のプリン塩基誘導体をポリヌクレオチドに導入して用いることで、ターゲットＤＮＡとの相互作用による極性環境の変化を蛍光発光波長の変化、望ましくは蛍光発光の色の違いで検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のプリン塩基誘導体は周囲の極性環境の違いにより蛍光発光波長を変化させることができる。本発明の好ましい態様によれば本発明のプリン塩基誘導体は蛍光発光波長の変化が色の違いになって現れるので、本発明のプリン塩基誘導体をポリヌクレオチドに導入することで、対面塩基の種類を識別するプローブとして利用可能である。本発明のプローブは遺伝子検出用プローブあるいはタンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとして実用化可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
【図１】
2011037796.tif 000021
【図２】
2011037796.tif 000022
【図３】
2011037796.tif 000023
【図４】
2011037796.tif 000024
【図５】
2011037796.tif 000025
【配列表】
2011037796000001.app