(57)【要約】【課題】受容体アゴニスト、逆アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定のために使用され得る受容体を提供すること。【解決手段】本発明の特許明細書の中で開示される本発明は、膜貫通受容体に関し、さらに具体的には内因性リガンドが未知であるヒトＧタンパク質共役型受容体（「オーファンＧＰＣＲ受容体」）に関し、そして最も具体的には、構成的活性の証拠のためのヒトＧＰＣＲの変異（非内因性）型に関する。【選択図】図１
2011097950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許明細書中に開示される本発明は膜貫通受容体に関し、そしてさらに具体的にはヒトＧタンパク質共役型受容体に関し、そして特定すると、受容体の構成的活性を確立または増強するために改変されたＧＰＣＲの非内因性型(version)に特に重点を置いた内因性ヒトＧＰＣＲに関する。好ましくは、改変されたＧＰＣＲは、治療薬剤として潜在的な適用可能性を有する受容体アゴニスト、逆アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定のために使用される。
【背景技術】
【０００２】
多数の受容体の種類がヒト内に存在するけれども、特に最も数が多くそして治療的に関連するものはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲｓ）の種類により代表される。ヒトゲノム内に約１００，０００個の遺伝子が存在すると推定され、これらの中の約２％、すなわち２，０００個の遺伝子がＧＰＣＲをコードすると推定される。そのための内因性リガンドが同定されているＧＰＣＲを含む受容体は、「既知」受容体と呼ばれ、一方そのための内因性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受容体と呼ばれる。ＧＰＣＲは薬剤製品の開発のために重要な分野であり、１００種の既知ＧＰＣＲの中の約２０種から、約６０％がすべて処方薬で開発されている。
【０００３】
ＧＰＣＲは、共通の構造モチーフを共有している。すべてのこれらの受容体は、７個のαラセンを形成する２２〜２４個の疎水性アミノ酸の７個の配列を有し、これらそれぞれは膜をスパン(span)する（それぞれのスパンは番号で特定され、すなわち、膜貫通部−１（ＴＭ−１）、膜貫通部−１（ＴＭ−１）、などである）膜貫通ラセンは、膜貫通部−２と膜貫通部−３、膜貫通部−４と膜貫通部−５、および膜貫通部−６と膜貫通部−７との間のアミノ酸の鎖により細胞膜の外側、すなわち「細胞外」側で結合される（これらは「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）とそれぞれ呼ばれる）。膜貫通ラセンは、膜貫通部−１と膜貫通部−２、膜貫通部−３と膜貫通部−４、および膜貫通部−５と膜貫通部−６との間のアミノ酸の鎖により細胞膜の内側、すなわち「細胞内」側でも結合される（これらは「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２およびＩＣ−３）とそれぞれ呼ばれる）。受容体の「カルボキシ」（”Ｃ”）末端は細胞内部の細胞内空間内にあり、そして受容体の「アミノ」（”Ｎ”）末端は細胞外側の細胞外空間内にある。
【０００４】
一般に、内因性リガンドが受容体を結合する場合には（しばしば受容体の「活性化」と呼ばれる）、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」との間の共役を許容する細胞内領域のコンホーメーションの変化がある。ＧＰＣＲはＧタンパク質に関して「多数関係」性である、すなわち、ＧＰＣＲは１個を越えるＧタンパク質と相互作用できると報告されている。非特許文献１参照。他のＧタンパク質も存在するけれども、現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏが同定されたＧタンパク質である。Ｇタンパク質との内因性リガンド活性化ＧＰＣＲ共役は、シグナル伝達カスケードプロセスを開始する（「シグナル伝達」と呼ばれる）。正常条件下で、シグナル伝達は、最終的に細胞活性化または細胞阻害をもたらす。受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられる。
【０００５】
生理的条件下で、ＧＰＣＲは、２個の異なるコンホーメーション、すなわち「不活性」状態および「活性」状態の間で平衡して細胞膜内に存在する。不活性状態にある受容体は、細胞内シグナル伝達経路に連結して生物学的応答を生成できない。活性状態への受容体コンホーメーションの変化は、シグナル伝達経路への連結を許容し（Ｇタンパク質を介して）そして生物学的反応を生成する。
【０００６】
受容体は、内因性リガンドまたは薬剤などの化合物により活性状態に安定化されてもよい。受容体のアミノ酸配列の変更を含みこれに限られない最近の発見は、活性状態コンホーメーションにおける受容体を促進および安定化するための内因性リガンドまたは薬剤以外の手段を提供する。これらの手段は、受容体に結合する内因性リガンドの作用を模擬することにより活性状態にある受容体を効果的に安定化する。このようなリガンド依存手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と呼ばれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kenakin,T., 43 Life Science 1095(1988)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本明細書中には、ヒトＧＰＣＲの内因性および非内因性型およびその使用を開示する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）  配列番号２のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目２）  項目１のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目３）  配列番号１のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目４）  項目３のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目５）  配列番号４のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目６）  項目５のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目７）  配列番号３のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目８）  項目７のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目９）  配列番号６のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目１０）  項目９のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目１１）  配列番号５のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目１２）  項目１１のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目１３）  配列番号８のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目１４）  項目１３のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目１５）  配列番号７のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目１６）  項目１５のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目１７）  配列番号１０のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目１８）  項目１７のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目１９）  配列番号９のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目２０）  項目１９のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目２１）  配列番号１２のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目２２）  配列番号８４のアミノ酸配列を含んでなる項目２１のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目２３）  配列番号１１のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目２４）  項目２３のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目２５）  配列番号１４のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目２６）  配列番号８８のアミノ酸配列を含んでなる項目２５のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目２７）  配列番号１３のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目２８）  項目２７のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目２９）  配列番号１６のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目３０）  配列番号９２のアミノ酸配列を含んでなる項目２９のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目３１）  配列番号１５のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目３２）  項目３１のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目３３）  配列番号１８のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目３４）  項目３３のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目３５）  配列番号１７のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目３６）  項目３５のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目３７）  配列番号２０のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目３８）  項目３７のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目３９）  配列番号１９のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目４０）  項目３９のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目４１）  配列番号２２のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目４２）  項目４１のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目４３）  配列番号２１のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目４４）  項目４３のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目４５）  配列番号２４のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目４６）  項目４５のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目４７）  配列番号２３のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目４８）  項目４７のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目４９）  配列番号２６のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目５０）  項目４９のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目５１）  配列番号２５のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目５２）  項目５１のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目５３）  配列番号２８のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目５４）  項目５３のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目５５）  配列番号２７のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目５６）  項目５５のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目５７）  配列番号３０のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目５８）  項目５７のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目５９）  配列番号２９のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目６０）  項目５９のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目６１）  配列番号３２のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目６２）  配列番号９６のアミノ酸配列を含んでなる項目６１のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目６３）  配列番号９５のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目６４）  項目６３のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目６５）  配列番号３４のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目６６）  項目６５のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目６７）  配列番号３３のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目６８）  項目６７のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目６９）  配列番号３６のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目７０）  項目６９のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目７１）  配列番号３５のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目７２）  項目７１のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目７３）  配列番号３８のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目７４）  項目７３のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目７５）  配列番号３７のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目７６）  項目７５のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
（項目７７）  配列番号４０のアミノ酸配列によりコードされるＧタンパク質共役型受容体。
（項目７８）  項目７７のＧタンパク質共役型受容体の非内因性、構成的活性化型。
（項目７９）  配列番号３９のベクターおよびｃＤＮＡを含んでなるプラスミド。
（項目８０）  項目７９のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】対照（「ＣＭＶ」）と比較した内因性型ＲＵＰ１２（「ＲＵＰ１２」）からの第二メッセンジャーＩＰ3 産生の説明である。
【図２】内因性ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１３」）と対照ベクター（「ＣＭＶ」）との構成的シグナル伝達の比較結果を与える第二メッセンジャー細胞基礎サイクリックＡＭＰアッセイの結果の図示である。
【図３】ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１３ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１３（Ａ２６８Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図４】ＲＵＰ１３：「Ｇｓ融合タンパク質」（「ＲＵＰ１３−Ｇｓ」）と対照ベクター（「ＣＭＶ」）による構成的シグナル伝達の比較結果を与える〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイの結果の図示である。
【図５】ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ１４（「ＲＵＰ１４ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ１３（「ＲＵＰ１４（Ｌ２４６Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図６】ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ１５（「ＲＵＰ１５ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ１５（「ＲＵＰ１５（Ａ３９８Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図７】内因性ＲＵＰ１５（「ＲＵＰ１５ｗｔ」）、ＲＵＰ１５の非内因性、構成的活性化型（「ＲＵＰ１５（Ａ３９８Ｋ）」）および対照ベクター（「ＣＭＶ」）の構成的シグナル伝達の比較結果を与える第二メッセンジャー細胞基礎サイクリックＡＭＰアッセイの結果の図示である。
【図８】ＲＵＰ１５：「Ｇｓ融合タンパク質」（「ＲＵＰ１５−Ｇｓ」）と対照ベクター（「ＣＭＶ」）による構成的シグナル伝達の比較結果を与える〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイの結果の図示である。
【図９】対照（「ＣＭＶ」）と比較した内因性型ＲＵＰ１７（「ＲＵＰ１７」）からの第二メッセンジャーＩＰ3 産生の説明である。
【図１０】対照（「ＣＭＶ」）と比較した内因性型ＲＵＰ２１（「ＲＵＰ２１」）からの第二メッセンジャーＩＰ3 産生の説明である。
【図１１】ＣＭＶ、内因性ＲＵＰ２３（「ＲＵＰ２３ｗｔ」）および非内因性、構成的活性化ＲＵＰ２３（「ＲＵＰ２３（Ｗ２７５Ｋ）」）を８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて比較して測定したシグナルの図示である。
【図１２】ＲＵＰ１３に対する各種の候補化合物の一次スクリーニングからの結果の図示である。「化合物Ａ」の結果はウエルＡ２に示されそして「化合物Ｂ」の結果はウエルＧ９に示される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な記述）
受容体に関連して作成された科学文献は、受容体に関して種々の作用を有するリガンドに関する多数の用語を採用している。明白さおよび統一のために、下記の定義を本特許明細書中を通じて使用する。これらの定義がこれらの用語のための他の定義と矛盾する場合には、下記の定義が優先する。
【００１１】
「アゴニスト」は、物質が受容体と結合した場合に細胞内反応を活性化するか、または膜にへのＧＴＰ結合を増強する物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。
【００１２】
本明細書中に使用される「アミノ酸の略字」を表Ａに記載する。
表Ａ
アラニン          ＡＬＡ          Ａ
アルギニン        ＡＲＧ          Ｒ
アスパラギン      ＡＳＮ          Ｎ
アスパラギン酸    ＡＳＰ          Ｄ
システイン        ＣＹＳ          Ｃ
グルタミン酸      ＧＬＵ          Ｅ
グルタミン        ＧＬＮ          Ｑ
グリシン          ＧＬＹ          Ｇ
ヒスチジン        ＨＩＳ          Ｈ
イソロイシン      ＩＬＥ          Ｉ
ロイシン          ＬＥＵ          Ｌ
リシン            ＬＹＳ          Ｋ
メチオニン        ＭＥＴ          Ｍ
フェニルアラニン  ＰＨＥ          Ｆ
プロリン          ＰＲＯ          Ｐ
セリン            ＳＥＲ          Ｓ
トレオニン        ＴＨＲ          Ｔ
トリプトファン    ＴＲＰ          Ｗ
チロシン          ＴＹＲ          Ｙ
バリン            ＶＡＬ          Ｖ
「部分アゴニスト」は、これらが受容体に結合された場合にアゴニストの作用よりも低い程度／範囲で細胞内反応を活性化するか、またはアゴニストの作用よりも低い程度／範囲で膜へのＧＴＰ結合を増強する物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。
【００１３】
「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するがしかし受容体の活性形により開始された細胞内反応を活性化せず、そしてこれによりアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内反応を阻害できる物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。「アンタゴニスト」は、アゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に基準細胞内反応を低下させない。
【００１４】
「候補化合物」は、スクリーニング技術に適用できる分子（例えば化学化合物であり、これに限定はされない）を意味するものとする。好ましくは、語句「候補化合物」は、あらかじめ間接同定過程により決定されたもの（「間接同定された化合物」）であって、受容体に対して逆アゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストからなる群から選ばれた化合物として一般的に知られている化合物を含まず、さらに好ましくは、少なくとも１種の哺乳動物内において治療効力を有すると以前に決定された間接同定された化合物を含まず、そして最も好ましくは、ヒトにおいて治療効力を有すると以前に決定された間接同定された化合物を含まない。
【００１５】
「組成物」は、少なくとも１種の成分を含んでなる物質を意味する。「薬剤組成物」は、組成物の一例である。
【００１６】
「化合物効力」は、受容体結合親和性に対抗して、受容体機能性を阻害または刺激するための化合物の能力の尺度を意味するものとする。化合物効力を検出するための例示的な手段は、本明細書の実施例の部分に開示される。
【００１７】
「コドン」は、一般に、リン酸基に結合し、そして翻訳されるとアミノ酸をコードするヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ））を含んでなる３個のヌクレオチド（またはヌクレオチドの等価基）の群を意味するものとする。
【００１８】
「構成的活性化受容体」は、構成的受容体活性化を受ける受容体を意味するものとする。構成的活性化受容体は内因性または非内因性であることができる。
【００１９】
「構成的受容体活性化」は、受容体とその内因性リガンドまたはその化学的等価物との結合以外の手段により活性状態にある受容体の安定化を意味するものとする。
【００２０】
「接触」または「接触する」は、生体外系または生体内系のいずれでも、少なくとも２個の部分を一緒にすることを意味するものとする。
【００２１】
語句「候補化合物」に関連する「直接同定する」または「直接同定」は、構成的活性化受容体、好ましくは構成的活性化オーファン受容体、そして最も好ましくは構成的活性化Ｇタンパク質共役細胞表面オーファン受容体に対して候補化合物をスクリーニングし、そしてこの化合物の化合物効力を評価することを意味するものとする。この語句は、いかなる場合でも、語句「間接同定する」または「間接同定された」により包含されまたはこれらを包含するとは解釈または理解されない。
【００２２】
「内因性」は、哺乳動物が本来的に産生する物質を意味するものとする。例えば、限定ではないが用語「受容体」に関する「内因性」は、哺乳動物（例えば、限定ではないがヒト）またはウイルスにより本来的に産生されるものを意味するものとする。反対に、この範囲内での用語「非内因性」は、哺乳動物（例えば、限定ではないがヒト）またはウイルスにより本来的には産生されないものを意味するものとする。例えば、限定ではないが、その内因性形では構成的活性ではないが、しかし操作されると構成的活性となる受容体は、本明細書内では「非内因性、構成的活性化受容体」と呼ばれるのが最も好ましい。両方の用語は、「インビボ」および「インビトロ」系の両方を記述するために使用できる。例えば、限定ではないが、スクリーニング法において、内因性または非内因性受容体は、生体内スクリーニング系に関連してもよい。別の例であって限定ではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性、構成的活性化受容体を含むように操作された場合に、生体内系の手段による候補化合物のスクリーニングが適用可能である。
【００２３】
「Ｇタンパク質共役型受容体融合タンパク質」および「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、本明細書中で開示する本発明の範囲内で、それぞれ、少なくとも１種のＧタンパク質、最も好ましくはこのようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これはＧＴＰを結合するサブユニットである）に融合された内因性、構成的活性化ＧＰＣＲまたは非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲを含んでなる非内因性タンパク質を意味し、ここでＧタンパク質は、好ましくは内因性オーファンＧＰＣＲと本来的に共役するＧタンパク質と同じ種類である。例えば、限定ではないが、内因性状態において、Ｇタンパク質”Ｇｓα”がＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質である場合に、特定のＧＰＣＲに基づく「ＧＰＣＲ融合タンパク質」はＧｓαに融合したＧＰＣＲを含んでなる非内因性タンパク質であろう。ある場合には、以下に記載するように、非−優勢Ｇタンパク質はＧＰＣＲに融合できる。Ｇタンパク質は、構成的活性ＧＰＣＲのｃ−末端に直接融合できるかまたはこれら２者の間にスペーサーがあってもよい。
【００２４】
「宿主細胞」は、その中に「プラスミド」および／または「ベクター」を組み込まれることができる細胞を意味するものとする。原核生物「宿主細胞」の場合に、「プラスミド」は、典型的には、「宿主細胞」複製物として自律性分子として複製される（従って一般に、「プラスミド」は、真核生物「宿主細胞」内への導入のために単離される）。真核生物「宿主細胞」の場合には、「プラスミド」は真核生物「宿主細胞」が複製された場合に「プラスミド」が複製されるように、「宿主細胞」の細胞ＤＮＡ中に組み込まれる。好ましくは、本明細書中に開示する本発明の目的のためには、「宿主細胞」は真核生物であり、さらに好ましくは、哺乳動物であり、そして最も好ましくは２９３、２９３ＴおよびＣＯＳ−７細胞からなる群より選ばれる。
【００２５】
「間接同定」または「間接同定された」は、内因性受容体に特異性の内因性リガンドの同定、リガンド−受容体相互作用を妨害および／またはこれと競合するものの決定のための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活性化受容体と関連する少なくとも１種の第二メッセンジャー経路に影響するための化合物の効力の評価を含む薬剤発見過程への伝統的な接近方法を意味する。
【００２６】
「阻害」または「阻害する」は、用語「反応」に関連して、化合物が存在しない場合の反対に、化合物が存在する場合には反応が低下または防止されることを意味するものとする。
【００２７】
「逆アゴニスト」は、受容体の内因性形または受容体の構成的活性化形のいずれかに結合し、そしてアゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に観察される正常の活性基準レベル以下の受容体の活性形により開始される基礎細胞内反応を阻害し、または膜へのＧＴＰ結合を低下させる物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味するものとする。好ましくは、基礎細胞内反応は、逆アゴニストが存在しない場合の基準反応と比較して、逆アゴニストの存在においては少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも７５％が阻害される。
【００２８】
「既知受容体」は、当該受容体に特異性の内因性リガンドが同定されている内因性受容体を意味するものとする。
【００２９】
「リガンド」は、内因性で本来的に存在する受容体に特異性の内因性で本来的に存在する分子を意味するものとする。
【００３０】
内因性受容体の核酸および／またはアミノ酸配列に関する「変異体」または「変異」は、内因性、非構成的活性化受容体の変異形が受容体の構成的活性化を明らかにするような内因性配列への特定の変化または多数の変化を意味するものとする。特定の配列の等価体に関して、（ａ）ヒト受容体の次の変異した形の構成的活性化のレベルが受容体の最初の変異により明らかにされたものと本質的に同じであり、そして（ｂ）受容体の次の変異形と受容体の最初の変異体との間の配列（アミノ酸および／または核酸）相同性の割合が少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％そして最も好ましくは少なくとも約９５％である場合に、ヒト受容体の次の変異形は、ヒト受容体の最初の変異に等価と考えられる。理想的には、そして構成的活性化を達成するために本明細書中で開示した最も好ましいカセットがＧＰＣＲの内因性と非内因性形との間の単一アミノ酸および／またはコドン変化を含むという事実のために、配列相同性の割合は少なくとも９８％でなければならない。
【００３１】
「非オーファン受容体」は、受容体へのリガンドの結合が分子内シグナル伝達経路を活性化する、内因性で本来的に存在するリガンドに特異性の内因性で本来的に存在する分子を意味するものとする。
【００３２】
「オーファン受容体」は、その受容体に特異性の内因性リガンドが同定されていないかまたは既知ではない内因性受容体を意味するものとする。
【００３３】
「薬剤組成物」は、少なくとも１種の活性成分を含んでなる組成物を意味するものとし、ここで組成物は哺乳動物（例えば、限定ではないがヒト）において特定の効力的な成果のための試験が可能である。通常の当該技術分野の熟練者は、活性成分が、熟練者の要求に基づいて所望の効力的な成果を有するかどうかを決定するために適当な技術を理解しそして認めるであろう。
【００３４】
「プラスミド」は、「ベクター」およびｃＤＮＡの組合せを意味するものとする。一般に、「プラスミド」は、タンパク質としてのｃＤＮＡの複製および／または発現の目的で「宿主細胞」内に導入される。
【００３５】
「第二メッセンジャー」は、受容体活性化の結果として生成した細胞内反応を意味するものとする。第二メッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ3 ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、およびサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を含むことができる。第二メッセンジャー反応は、受容体活性化の決定のために測定できる。さらに、第二メッセンジャー反応は、例えば逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストおよびアンタゴニストを含む候補化合物の直接同定のために測定できる。
【００３６】
「刺激」または「刺激する」は、用語「反応」に関連して、反応が化合物の存在下で、これが存在しない場合の反対に増加することを意味するものとする。
【００３７】
ｃＤＮＡの関連する「ベクター」は、少なくとも１種のｃＤＮＡを組み込むことが可能でそして「宿主細胞」内に組み込むことが可能な環状ＤＮＡを意味するものとする。
【００３８】
以下の各セクションの順序は、説明の効率のために決定したものであり、下記の開示または請求の制限を意図せず、そしてそのように解釈してはならない。
Ａ．はじめに
受容体の伝統的な研究は、発見が受容体に影響できるアンタゴニストおよびその他の分子を発見できるまで進行する前に内因性リガンドが最初に同定されなければならないというアプリオリな仮定（歴史に基づく）から常に前進していた。アンタゴニストが最初に判明した場合でも、探索は直ちに内因性リガンドの探索に進んだ。この思考の様式は、構成的活性化受容体の発見の後でも受容体研究で継続された。これまで認められていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、および逆アゴニストの発見に最も有用なことは受容体の活性状態であることである。過剰活性の受容体または不足活性の受容体からもたらされる疾患に対して、治療薬剤に望まれるものは、それぞれ、受容体の活性状態を低下するかまたは受容体の活性を増強する化合物であり、必ずしも内因性リガンドに対するアンタゴニストである薬剤ではない。これは、活性受容体状態の活性を低下または増強する化合物は、内因性リガンドとして同じ部位に結合する必要はないためである。従って、本発明の方法により教示されるように、治療化合物のためのあらゆる探索もリガンドに依存しない活性状態に対する化合物をスクリーニングすることにから開始すべきである。
Ｂ．ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの研究は、ヒトゲノム内に位置する核酸配列に関する
極めて多数の情報の同定をもたらした。この研究の場合に、ゲノム配列情報は、
特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳するオープンリーディングフレーム情
報を含むかまたは含まないかどうかに関する理解または認識を伴わずにに提供さ
れた。ヒトゲノム内の核酸配列を同定する数種の方法は、通常の当該技術分野を
有する熟練者の認識範囲内にある。例えば、限定ではないが、本明細書中で開示
される種々のヒトＧＰＣＲは、ジーンバンク(GeneBank)TMデータベースを調査し
て発見された。下記の表Ｂは、我々が発見した数種類の内因性ＧＰＣＲを、開示
ＧＰＣＲに相同である他のＧＰＣＲと共に表示する。
【００３９】
【表１】
2011097950.tif 000003
【００４０】
受容体相同性は、ヒト身体内の受容体の役割の評価を得るために有用である。本明細書の記載の進行に応じて、我々は、これらの受容体の非内因性、構成的活性化型を確立するためにこれらの受容体を変異するための技術を開示するであろう。
【００４１】
本明細書中に開示される技術は、当該技術分野では既知の他のヒト、オーファンＧＰＣＲにも適用され、これは本明細書の記載の進行に従って明らかとなるであろう。
【００４２】
Ｃ．受容体スクリーニング
本明細書中で開示されるヒトＧＰＣＲの非内因性、構成的活性化型に対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内因性リガンドの使用を必要としないで、この細胞表面受容体に作用する候補化合物の直接同定を可能とする。慣用でしばしば商業的に利用できる技術を用いて、本明細書中で開示されるヒトＧＰＣＲの内因性型が発現および／または過剰発現される身体内の領域を決定できる。受容体の発現および／または過剰発現と関連する関連疾患／障害状態を決定するためにこれらの技術を用いることも可能であり、このような方法は、本特許明細書中に開示される。
【００４３】
本明細書中で開示されるヒトＧＰＣＲの構成的活性化を明らかにするであろう変異の創成に関しては、ＧＰＣＲのＴＭ６内に位置すると想定されるプロリン残基からの距離に基づいている。このアルゴリズム技術は、２０００年４月２０日付けＷＯ００／２２１２９として公開された同時係属および共通して譲渡された特許明細書ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３９３８号中に開示されており、これは本明細書中に表示する他の特許文献と一緒に引用することにより本明細書中に編入される。このアルゴリズム技術は、従来の配列「整列(alignment) 」に基づいては断定されず、上記のＴＭ６プロリン残基（または、当然ではあるがこのようなプロリン残基の内因性構成的置換）からの指定の距離によりで決定される。この残基から１６アミノ酸残基に位置するアミノ酸（推定すると受容体のＩＣ３領域内に位置する）を最も好ましいリシン残基に変異することにより、このような活性化が得られるであろう。その他のアミノ酸残基は、この目的を達成するためにこの位置における変異に有用であろう。
【００４４】
Ｄ．疾患／障害同定および／または選択
以下に詳細に記載するように、最も好ましくは非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストは、本発明の方法論により同定できる。このような逆アゴニストおよびアゴニストは、本受容体に関連する疾患を治療するための薬剤発見プログラムにおけるリード化合物として理想の候補である。ＧＰＣＲに対する逆アゴニストを直接同定するための能力、これによる薬剤組成物の開発を可能とすることにより、ＧＰＣＲに関連する疾患および障害の探索が可能である。例えば、ＧＰＣＲの存在に関する疾患および正常組織試料の両方のスキャニングは、学問的な実験または特定のＧＰＣＲへの内因性リガンドを同定するための経路に沿って追跡する程度を越えてきている。組織スキャンは、健康および疾患組織の広い範囲にわたって行うことができる。このような組織スキャンは、特定の受容体を疾患および／または障害と関連させる場合の好ましい第一段階を提供する。
【００４５】
好ましくは、ヒトＧＰＣＲのＤＮＡ配列は、（ａ）組織−ｍＲＮＡに対するドット−ブロット分析、および／または（ｂ）組織試料中の受容体の発現のＲＴ−ＰＣＴ同定のためのプローブを作製するために使用される。組織採取元内の受容体の存在、または疾患組織、または正常組織と比較して疾患組織内の高い濃度にある受容体の存在は、限定はされないが治療方針とその疾患と関連する疾患との相関を同定するために好んで使用できる。受容体は、この技術により器官の領域に同様に良く定位できる。受容体が局在する特定組織の既知機能に基づいて、受容体の推定される機能的役割が推論できる。
【００４６】
Ｅ．候補化合物のスクリーニング
１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
Ｇタンパク質受容体が構成的活性となった場合に、これはＧタンパク質（例えばＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合しそしてＧタンパク質へのＧＴＰ結合を刺激する。従ってＧタンパク質はＧＴＰアーゼとして作用し、そしてゆっくりとＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、これにより正常の条件下で受容体は脱活性化する。しかし構成的活性化受容体は、ＧＤＰをＧＴＰに交換することを続ける。ＧＴＰの非加水分解性類似体である〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳは、構成的活性化受容体を発現する膜への増強された結合を測定するために使用できる。〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳが、リガンドが存在しないかまたは存在する場合に膜へのＧタンパク質共役を測定するために使用できることが報告されている。当該技術分野の熟練者に周知で使用できるその他の例の中でも、この測定の例は、Traynor およびNahorskiにより１９９５年に報告された。このアッセイ系の好ましい使用は、候補化合物の最初のスクリーニングであり、それは、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらずすべてのＧタンパク質共役型受容体に系が包括的に適用できるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術
候補化合物が「包括的」Ｇタンパク質共役型受容体アッセイ（すなわち、アゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いて同定され、さらに化合物が受容体部位で相互作用したことを確認するためのスクリーニングをすることが好ましい。例えば、「包括的」アッセイで同定された化合物は、受容体に結合しないであろうが、しかし細胞内ドメインからのＧタンパク質を単に「脱共役」するであろう。
【００４７】
ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ
Ｇｓは、酵素アデニル酸シクラーゼを刺激する。Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）は、反対にこの酵素を阻害する。アデニル酸シクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＭＰへの変換に触媒作用する。従って、Ｇｓタンパク質に共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの増加した細胞レベルと関連する。反対に、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質に共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低下した細胞レベルと関連する。一般的には「シナプス伝達の間接機序」第８章("Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt 8,FromNeuron To Brain(3rd Ed.) Nichols, J.G. et al eds, Sinauer Associates, Inc.(1992)) 参照。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が例えば受容体に対して逆アゴニストであるかどうかを決定するために使用できる（すなわちこのような化合物はｃＡＭＰのレベルを低下するであろう）。ｃＡＭＰを測定するために当該技術分野で既知の種々の方法が使用できる。最も好ましい方法は、ＥＬＩＳＡに基づくフォーマットでの抗−ｃＡＭＰ抗体の使用による。使用できる別のアッセイの種類は、全細胞第二メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子をコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ反応性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進して遺伝子発現を駆動し、転写因子は次いでｃＡＭＰ反応因子と呼ばれる特定部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前の多重ｃＡＭＰ反応因子を含むプロモーターを有するレポーター系が構築できる。従って、構成体活性化されたＧｓ−連結受容体は、次いで遺伝子を活性化するｃＡＭＰの蓄積およびレポータータンパク質の発現を起こす。レポータータンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼは、次いで標準生物化学アッセイを用いて検出できる(Chenet al. 1995)。
【００４８】
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｏおよびＧｑは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化と関連し、これは次いでリン脂質ＰＩＰ2 を加水分解し、２個の細胞内メッセンジャー、ジアシクログリセロール(diacycloglycerol)（ＤＡＧ）およびイノシトール  １，４，５−トリリン酸（ＩＰ3）を遊離する。ＩＰ3 の増加した蓄積は、ＧｑおよびＧｏ関連受容体の活性化と関連する。一般的には「シナプス伝達の間接機序」第８章("IndirectMechanisms of Synaptic Transmission," Chpt 8,From Neuron To Brain(3rdEd.) Nichols, J.G. et al eds, Sinauer Associates, Inc. (1992)) 参照。ＩＰ3蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えばＧｑまたはＧｏ関連受容体に対する逆アゴニストであるかどうかを決定するために使用できる（すなわち、このような化合物がＩＰ3のレベルを低下する）。Ｇｑ関連受容体は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１因子を含む遺伝子の活性化を起こすＡＰ１レポーターアッセイを用いてでも試験できる。従って、活性化Ｇｑ関連受容体は、この遺伝子の発現の増加を明らかにし、これによりその逆アゴニストはこの発現の低下を明らかにし、そしてアゴニストはこの発現の増加を明らかにする。このアッセイのために商業的に利用できるアッセイが利用できる。
【００４９】
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
逆アゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングに使用するための内因性、構成的活性オーファンＧＰＣＲまたは非内因性、構成的活性化オーファンＧＰＣＲの使用は、その定義により、結合する内因性リガンドが存在しない場合でも受容体が活性であるという興味あるスクリーニング問題を提供する。従って、例えば候補化合物の存在における非内因性受容体と、その化合物が存在しない場合の非内因性受容体との間を区別するために、このような化合物が逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストであるかどうかまたはこのような受容体に影響しないかどうかに関する理解を可能とさせるこのような区別の目的で、このような区別を増強できる方法を使用することが好ましい。好ましい方法は、「ＧＰＣＲ融合タンパク質」の使用である。
【００５０】
一般に、非内因性オーファンＧＰＣＲが上記のアッセイ技術（ならびのその他のもの）を用いて構成的に活性化されたことが一旦決定されると、内因性ＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質を決定できる。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の共役は、評価できるシグナル伝達経路を提供する。スクリーニングが哺乳動物発現系を用いて行われることが最も好ましいので、このような系は、その中に内因性Ｇタンパク質を有すると期待される。従って、定義により、このような系内で、非内因性、構成的活性化オーファンＧＰＣＲは、連続的にシグナル発生する。この点に関して、例えば受容体への逆アゴニストの存在下でこのシグナルが増強されることが好ましく、特にはスクリーニングの範囲内で、逆アゴニストと接触した受容体の間でさらに容易に区別できる可能性があるようにシグナルが増強されることがさらに好ましい。
【００５１】
「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、非内因性ＧＰＣＲと共役したＧタンパク質の効力を増強することを意図する。「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲを用いるスクリーニングに好ましく、それは、このような方法がこのスクリーニング技術で最も好ましく使用される信号を増加するからである。これは、有意の「信号対雑音比」を容易に得るために重要である。このような有意の比は、本明細書中に開示する候補化合物のスクリーニングに有利に導入される。
【００５２】
「ＧＰＣＲ融合タンパク質」の発現のために有用な構築物の構築は、当該技術分野の通常の熟練を有する者の認識範囲内である。商業的に利用できる発現ベクターおよび系は、研究者の特定の要求を満足できる各種の方法を提供する。このような「ＧＰＣＲ融合タンパク質」構築物のために重要な基準は、内因性ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の両方がインフレームであり（好ましくは、内因性ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質配列の上流にある）そしてＧＰＣＲの「終止」コドンが、ＧＰＣＲの発現の際にＧタンパク質も発現できるように欠失または置換されていなければならないことである。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に直接連結してもよく、または２個の間のスペーサー残基があることもできる（好ましくは、約１２個を越えず、この数は当該技術分野の通常の熟練者には容易に確認できるものである）。我々は、使用されない幾つかの制限部位が、効果的に発現の際にスペーサーとなるスペーサーの使用を好む（便利さのために）。最も好ましくは、非内因性ＧＰＣＲに共役するＧタンパク質は、「ＧＰＣＲ融合タンパク質」構築物の創成の前に同定される。同定されたＧタンパク質は僅かしかないので、Ｇタンパク質の配列を含んでなる構築物（すなわち汎用Ｇタンパク質構築物）は、本明細書内の内因性ＧＰＣＲ配列の挿入のために利用できる。これは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模スクリーニングの範囲内で効率を与える。
【００５３】
上記のように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの形成を阻害すると期待され、問題のＧＰＣＲのこれらの種類に基づくアッセイを興味あるものとする（すなわちｃＡＭＰシグナルは活性化の際に低下し、従って例えば逆アゴニストの直接同定を行う（これはこのシグナルをさらに低下させるであろう））。本明細書中で開示するように、受容体のこれらの種類に対して、使用可能なシクラーゼに基づくアッセイを確立する研究において、内因性ＧＰＣＲの内因性Ｇタンパク質には基づかない「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を創成することが可能であることを我々は確認した。従って、例えば、内因性Ｇｉ共役型受容体はＧｓタンパク質に融合でき、我々はこのような融合構築物が発現されると、内因性ＧＰＣＲを、「本来的な」Ｇｉタンパク質ではなくて、例えばＧｓと共役するように「駆動」または「強制」し、シクラーゼに基づくアッセイを確立できると信じる。このように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏ共役型受容体に対して、我々は、「ＧＰＣＲ融合タンパク質」が使用されそしてアッセイがアデニル酸シクラーゼ活性の検出に基づく場合に、融合構築物がＧｓ（または酵素アデニル酸シクラーゼの形成を刺激する等価Ｇタンパク質）を用いて確立されることを好む。
【００５４】
「Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚまたはＧｏタンパク質」と融合した「Ｇｑタンパク質」を用いる「Ｇタンパク質融合」構築物も同様に有効である。最も好ましい融合構築物は、「Ｇｑタンパク質」を用いて達成でき、ここで、Ｇタンパク質α−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６個のアミノ酸が欠失しそしてＧαｑのＣ−末端の最後の５個のアミノ酸が、関係するＧタンパク質のＧαの相当するアミノ酸を用いて置換される。例えば、融合構築物は、「Ｇｉタンパク質」と融合したＧｑ（アミノ酸６個欠失）を有するとができ、「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築物」をもたらす。我々は、この融合構築物が内因性Ｇｉ共役型受容体を非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑ、に共役させて、第二メッセンジャー、例えばイノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがｃＡＭＰ産生の代わりに測定できるように強制すると信じる。
【００５５】
４．シグナルエンハンサーＧｓ共役型ＧＰＣＲを用いる標的Ｇｉ共役型ＧＰＣＲ
のコトランスフェクション（ｃＡＭＰに基づくアッセイ）
Ｇｉ共役型受容体はアデニル酸シクラーゼを阻害するとして知られており、従ってｃＡＭＰ産生のレベルを低下し、これはｃＡＭＰレベルの評価を興味深くさせることができる。活性化の際に主としてＧｉに共役する受容体の構成的活性化の指標としてｃＡＭＰの産生の低下を測定する有効な手段は、シグナルエンハンサー、例えば、Ｇｉ連結ＧＰＣＲを用いる活性化の際にＧｓと主として共役する非内因性、構成的活性化受容体（例えば以下の開示するＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）をコトランスフェクションして達成できる。明らかなように、Ｇｓ共役型受容体の構成的活性化は、ｃＡＭＰの産生の増加に基づいて決定できる。Ｇｉ共役型受容体の構成的活性化は、ｃＡＭＰ産生の低下に導く。従って、コトランスフェクション法は、これらの「反対」効果を有利に活用することを意図する。例えば、非内因性、構成的活性化Ｇｓ共役型受容体（「シグナルエンハンサー」）と内因性Ｇｉ共役型受容体（「標的受容体」）とのコトランスフェクションは、基準ｃＡＭＰシグナルを与える（すなわち、Ｇｉ共役型受容体はｃＡＭＰレベルを低下するけれども、この「低下」は、構成的活性化Ｇｓ共役型受容体シグナルエンハンサーにより確立されるｃＡＭＰレベルの本質的な増加と関連する）。その際、シグナルエンハンサーと標的受容体の構成的活性化型とのコトランスフェクションにより、ｃＡＭＰは、Ｇｉ標的の増加した機能的活性（すなわち、これはｃＡＭＰを低下する）によりそれ以上に低下（基準に対する）すると予想される。
【００５６】
ｃＡＭＰに基づくアッセイを用いる候補化合物のスクリーニングは、次いで２条件下で達成できる。第一条件は、Ｇｉ共役標的受容体に関して、「反対」効果をもたらし、すなわちＧｉ共役標的受容体の逆アゴニストは測定されるｃＡＭＰシグナルを増加し、一方Ｇｉ共役標的受容体のアゴニストはこのシグナルを低下する。第二条件は、明らかなように、この方法を用いて直接同定される候補化合物は、これらがシグナルエンハンシング受容体を標的としないことを確認するために独立して評価されるべきであることである（これはコトランスフェクションした受容体に対するスクリーニングの前または後に行うことができる）。
【００５７】
Ｆ．薬剤化学
必ずではないが一般的には、候補化合物の直接同定は、好ましくは、組合せ化学技術を介して生成された化合物と関連して行われ、これにより数千の化合物がこの分析のためにランダムに調製される。一般に、このようなスクリーニングの結果は、独自のコア構造を有する化合物である。その後、これらの化合物は、好ましくは、これらの薬剤的性質をさらに増強するために好ましいコア構造の周囲に追加の化学修飾が行われる。このような技術は、当該技術分野の熟練者には公知でありそして本明細書中では詳細には取り扱わない。
【００５８】
Ｇ．薬剤組成物
さらに開発するために選択された候補化合物は、当該技術分野の熟練者には周知の技術を用いて薬剤組成物に調剤できる。適当な薬剤的に許容できるキャリヤーは、当該技術分野の熟練者には利用できる。例えば、「レミントンの薬剤科学」(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th. Edition, 1980, MackPublishing Co., (Oslo et al., eds.))参照。
【００５９】
Ｈ．その他の効用
本明細書に開示したヒトＧＰＣＲの非内因型の好ましい使用は、逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであるが（好ましくは薬剤としての使用のため）、ヒトＧＰＣＲのこれらの型は、研究設定にも使用できる。例えば、ＧＰＣＲを組み込んだ生体内および生体外系は、正常および疾患の両方のヒトの状態においてこれら受容体が演じる役割をさらに解明および理解するため、ならびにシグナル伝達カスケードを理解するめに適用された構成的活性化の役割を理解するために使用できる。非内因性ヒトＧＰＣＲの価値は、これらの独自の特徴により、非内因性ヒトＧＰＣＲが、内因性リガンドが同定される前にヒト身体内のこれら受容体の役割を理解するために使用できることにより、研究手段としてのこれらの有用性が高くなることである。開示された受容体のその他の利用は、なかでも本明細書を検討すると当該技術分野の熟練者には明らかとなるであろう。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明の説明の目的で提示するものであり、これを制限するものではない。特定の核酸およびアミノ酸配列が本明細書中で開示されるが、当該技術分野の通常の熟練者は、これらの配列に小さい変更を加えて以下に報告すると同じかまたは実質的に同様の結果を得る能力を有する。一つの配列から他のものへの配列カセットの適用または理解の従来の方法（例えば、ラット受容体からヒト受容体へ、またはヒト受容体Ａからヒト受容体Ｂへ）は、一般に配列整列技術に基づいて断定され、その際、配列は、共通の領域を決定するため研究において整列される。本明細書中に開示する変異法はこの方法にはよらないが、しかしその代わりにアルゴリズム法およびヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する保存されたプロリン残基からの位置的距離に基づく。この方法が確立されると、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に開示されると本質的に同じ結果（すなわち構成的活性化）を得るためにこれに小さい変更を加える能力を有すると信じられる。このような変更方法は、本開示の範囲内にあると考える。
【００６１】
実施例１
内因性ヒトＧＰＣＲ
１．ヒトＧＰＣＲの同定
開示される内因性ヒトＧＰＣＲは、ジーンバンク(GeneBank)TMデータベース情報の調査に基づいて同定された。データベースを調査する間に、下記のｃＤＮＡクローンが下記に明らかなように同定された（表Ｃ）
【００６２】
【表２】
2011097950.tif 000004
【００６３】
２．全長クローニング
ａ．ｈＲＵＰ８（配列番号１および２）
開示されるヒトＲＵＰ８は、ＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ）情報の使用に基づいて同定された。ｄｂＥＳＴを調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１２１７５５を有するｃＤＮＡクローンが、新規のＧＰＣＲをコードすると同定された。下記のＰＣＲプライマーがヒト精巣マラソン−レディー(Marathon-Ready)ｃＤＮＡ(Clontech)を用いるＲＴ−ＰＣＲのために鋳型として用いられた。
５’−ＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号４１、センス）および
５’−ＧＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧ−３’（配列番号４２、アンチセンス）
ＰＣＲはアドヴァンテージ(Advantage) ｃＤＮＡポリメラーゼ（Clontech、製造指針に従う）を用い、５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルにより行った：３０秒間９４℃、１０秒間９４℃、２０秒間６５℃、１．５分間７２℃、および７分間７２℃。サイクル２〜４を３５回反復した。
【００６４】
１．２ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(Big Dye Terminatorkit)(P.E. Biosystem)を用いて配列決定した。配列番号１参照、ＲＵＰ８の推定アミノ酸配列を配列番号２に記載する。
【００６５】
ｂ．ｈＲＵＰ９（配列番号３および４）
開示されるヒトＲＵＰ９は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１１３７５を有するｃＤＮＡクローンが、染色体５からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ９をプライマー
５’−ＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号４３、センス）、
５’−ＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号４４、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョン(Taq Plus Precision)ポリメラーゼ(Stratagene)を５％ＤＭＳＯを用いる１００μｌ反応物中で、下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、３０秒間９４℃、３０秒間５６℃、２分間７２℃、および５分間７２℃。
【００６６】
１．３ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中に１％アガロースゲルからクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E.Biosystem)を用いて完全に配列決定した。配列番号３参照、ＲＵＰ８の推定アミノ酸配列を配列番号４に記載する。ヒトゲノムＤＮＡから単離したＲＵＰ９クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。
【００６７】
ｃ．ｈＲＵＰ１０（配列番号５および６）
開示されるヒトＲＵＰ１０は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ００８７５４を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１９からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１０をプライマー
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧ−３’（配列番号４５、センス）および
５’−ＧＣＴＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＴＧ−３’（配列番号４６、アンチセンス）
およびヒト白血球マラソンレディーｃＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼ(Clontech)を５０μｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３０秒間９４℃、１０秒間９４℃、２０秒間６２℃、１．５分間７２℃、および７分間７２℃。１．０ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E.Biosystem)を用いて完全に配列決定した。新規のヒト受容体ＲＵＰ１０の核酸配列を配列番号５に記載し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号６に記載する。
【００６８】
ｄ．ｈＲＵＰ１１（配列番号７および８）
開示されるヒトＲＵＰ１１は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１３３９６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１１をプライマー
５’−ＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号４７、センス）、
５’−ＣＡＣＡＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号４８、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を５０μｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６７℃、１．５分間７２℃、および７分間７２℃。１．３ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E.Biosystem)を用いて完全に配列決定した。新規のヒト受容体ＲＵＰ１１の核酸配列を配列番号７に記載し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号８に記載する。
【００６９】
ｅ．ｈＲＵＰ１２（配列番号９および１０）
開示されるヒトＲＵＰ１２は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＰ０００８０８を有するｃＤＮＡクローンが、ラットＲＴＡおよびヒトｍａｓ１腫瘍遺伝子ＧＰＣＲと著しい相同性を有する新規のＧＰＣＲをコードすると同定された。全長ＲＵＰ１２をプライマー
５’−ＣＴＴＣＣＴＣＴＣＧＴＡＧＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号４９、センス）
５’−ＣＴＣＧＣＡＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号５０、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６５℃、２分間７２℃、および７分間７２℃。１．０ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E.Biosystem)を用いて完全に配列決定した（核酸配列に関しては配列番号９そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１０参照）。
【００７０】
ｆ．ｈＲＵＰ１３（配列番号１１および１２）
開示されるヒトＲＵＰ１３は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１１７８０を有するｃＤＮＡクローンが、ＧＰＣＲサカナＧＲＰＸ−ＯＲＹＬＡと著しい相同性を有する新規のＧＰＣＲをコードすると同定された。全長ＲＵＰ１３をプライマー
５’−ＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号５１、センス）
５’−ＣＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号５２、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を下記のサイクルでステップ２〜ステップ４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６５℃、２分間７２℃、および７分間７２℃。１．３５ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E.Biosystem)を用いて完全に配列決定した（核酸配列に関しては配列番号１１そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１２参照）。
ｇ．ｈＲＵＰ１４（配列番号１３および１４）
開示されるヒトＲＵＰ１４は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１３７１８８を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１３からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１４をプライマー
５’−ＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴＧＣＡＡＣＣ−３’（配列番号５３、センス）
５’−ＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣ−３’（配列番号５４、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼ(Stratagene)および５％ＤＭＳＯを下記のサイクルでステップ２およびステップ３の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２分間５８℃、１０分間７２℃。
【００７１】
１．１ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した（核酸配列に関しては配列番号１３そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１４参照）。ヒトゲノムＤＮＡから単離したＲＵＰ１４クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。
【００７２】
ｈ．ｈＲＵＰ１５（配列番号１５および１６）
開示されるヒトＲＵＰ１５は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０１６４６８を有するｃＤＮＡクローンが、ヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１５をプライマー
５’−ＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号５５、センス）
５’−ＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＡＧＡＡＣ−３’（配列番号５６、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼ(Stratagene)を下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：３分間９４℃、２０秒間９４℃、２０秒間６５℃、２分間７２℃および７分間７２℃。
【００７３】
１．５ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号１５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１６参照。ヒトゲノムＤＮＡから単離したＲＵＰ１５クローンの配列は、データベースから得た配列と一致した。
【００７４】
ｉ．ｈＲＵＰ１６（配列番号１７および１８）
開示されるヒトＲＵＰ１６は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１３６１０６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１３からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１６をプライマー
５’−ＣＴＴＴＣＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号５７、センス、開始コドンの５’）
５’−ＧＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５８、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒト骨格筋マラソンレディーｃＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼ(Clontech)を５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：３０秒間９４℃、５秒間９４℃、１５秒間６９℃、１分間７２℃および５分間７２℃。
【００７５】
１．１ＫｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＴ７シーケナーゼキット(sequenase kit)(Amersham) を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号１７そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号１８参照。ＲＵＰ１６クローンの配列は、ＡＬ１３６１０６の４個の不規則断片と一致し、これはＲＵＰ１６ｃＤＮＡが４個のエキソンからなることを示す。
【００７６】
ｊ．ｈＲＵＰ１７（配列番号１９および２０）
開示されるヒトＲＵＰ１７は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２３０７８を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１１からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１７をプライマー
５’−ＴＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号５９、センス、開始コドンを含む）
５’−ＣＴＧＴＣＴＧＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号６０、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス(Clontech)を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３０回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間６７℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００７７】
９７０ｂｐＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号１９そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２０参照。
【００７８】
ｋ．ｈＲＵＰ１８（配列番号２１および２２）
開示されるヒトＲＵＰ１８は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ００８５４７を有するｃＤＮＡクローンが、染色体５からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１８をプライマー
５’−ＧＧＡＡＣＴＣＧＴＡＴＡＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＣＧＣＴＣＣ−３’（配列番号６１、センス、開始コドンの５’）、
５’−ＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＣＣＴＴＡＧＣＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号６２、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：５分間９５℃、３０秒間９５℃、３０秒間６５℃、２分間７２℃および５分間７２℃。
【００７９】
１．３ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２１そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２２参照。
【００８０】
ｌ．ｈＲＵＰ１９（配列番号２３および２４）
開示されるヒトＲＵＰ１９は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６３３１を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ１９をプライマー
５’−ＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号６３、センス、開始コドンの５’）
５’−ＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＡＣ−３’（配列番号６４、アンチセンス、終止コドンを含む）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を５％ＤＭＳＯを用い下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間７０℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００８１】
１．１ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２３そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２４参照。
【００８２】
ｍ．ｈＲＵＰ２０（配列番号２５および２６）
開示されるヒトＲＵＰ２０は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＬ１６１４５８を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２０をプライマー
５’−ＴＡＴＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号６５、センス、開始コドンの５’）、
５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号６６、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス(Clontech)を５％ＤＭＳＯを用い下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９５℃、１５秒間９５℃、２０秒間６０℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００８３】
１．０ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２６参照。
【００８４】
ｎ．ｈＲＵＰ２１（配列番号２７および２８）
開示されるヒトＲＵＰ２１は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６７５６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１３からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２１をプライマー
５’−ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号６７、センス）
５’−ＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号６８、アンチセンス）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンポリメラーゼ(Stratagene)を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３０回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間５５℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００８５】
１，０１４ｂｐＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２７そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号２８参照。
【００８６】
ｏ．ｈＲＵＰ２２（配列番号２９および３０）
開示されるヒトＲＵＰ２２は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２７０２６を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１１からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２２をプライマー
５’−ＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号６９、センス、開始コドンを含む）
５’−ＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号７０、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３０回反復による増幅のために使用した：９４℃、１分間９４℃、１５秒間５５℃、２０秒間７２℃、１．５分間７２℃、５分間。
【００８７】
９７０ｂｐＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号２９そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３０参照。
【００８８】
ｐ．ｈＲＵＰ２３（配列番号３１および３２）
開示されるヒトＲＵＰ２３は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ００７１０４を有するｃＤＮＡクローンが、染色体４からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２３をプライマー
５’−ＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号７１、センス、開始コドンとしてのＡＴＣ）
５’−ＡＴＧＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴ−３’（配列番号７２、アンチセンス、終止コドンとしてのＴＣＡ）
およびヒト胎盤マラソンレディーＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼ(Clontech)を５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：３０秒間９５℃、１５秒間９５℃、２０秒間６６℃、１分２０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００８９】
１．０ｋｂＰＣＲ断片を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３１そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３２参照。
【００９０】
ｑ．ｈＲＵＰ２４（配列番号３３および３４）
開示されるヒトＲＵＰ２５は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６３３１を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２５をプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＡＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号７３、センス、開始コドンの５’）
５’−ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号７４、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス(Clontech)を５％ＤＭＳＯを用い、下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間５６℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００９１】
１．２ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３３そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３４参照。
【００９２】
ｒ．ｈＲＵＰ２５（配列番号３５および３６）
開示されるヒトＲＵＰ２５は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２６３３１を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２５をプライマー
５’−ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＡＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号７５、センス、開始コドンの５’）
５’−ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号７６、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒトゲノムＤＮＡ(Promega) を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス(Clontech)を５％ＤＭＳＯを用い、下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１５秒間９４℃、２０秒間５６℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００９３】
１．２ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３６参照。
【００９４】
ｓ．ｈＲＵＰ２６（配列番号３７および３８）
開示されるヒトＲＵＰ２６は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２３０４０を有するｃＤＮＡクローンが、染色体２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２６をＲＵＰ２６特異性プライマー
５’−ＡＧＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号７７、センス、開始コドンを含む）
５’−ＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＧＧ−３’（配列番号７８、アンチセンス、終止コドンを含む）
およびヒト胎盤マラソンレディーｃＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス(Clontech)を５％ＤＭＳＯを含む１００ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：５分間９４℃、３０秒間９５℃、３０秒間６５℃、２分間７２℃および５分間７２℃。
【００９５】
１．１ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３７そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３８参照。
【００９６】
ｔ．ｈＲＵＰ２７（配列番号３９および４０）
開示されるヒトＲＵＰ２７は、ジーンバンクデータベース情報の使用に基づいて同定された。調査する間に、アクセッション番号ＡＣ０２７６４３を有するｃＤＮＡクローンが、染色体１２からのヒトゲノム配列として同定された。全長ＲＵＰ２７をＲＵＰ１７特異性プライマー
５’−ＡＧＴＣＣＡＣＧＡＡＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７９、センス、開始コドンを含む）
５’−ＡＴＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号８０、アンチセンス、終止コドンの３’）
およびヒト成人脳マラソンレディーｃＤＮＡ(Clontech)を鋳型として用いるＰＣＲによりクローニングした。アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーゼミックス(Clontech)を５％ＤＭＳＯを含む５０ｕｌ反応物中で下記のサイクルでステップ２〜４の３５回反復による増幅のために使用した：１分間９４℃、１０秒間９４℃、２０秒間５８℃、１分３０秒間７２℃および５分間７２℃。
【００９７】
１．１ｋｂＰＣＲ断片を１％アガロースゲルから単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)中にクローニングし、そしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E. Biosystem)を用いて完全に配列決定した。核酸配列に関しては配列番号３５そして推論したアミノ酸配列に関しては配列番号３６参照。ヒト脳から単離されたＲＵＰ２７ｃＤＮＡクローンの配列は，ＡＣ０２７６４３の５個の不規則断片と一致することが決定され、ＲＵＰ２７ｃＤＮＡが５個のエキソンからなることを示す。
【００９８】
実施例２
非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲの調製
当該技術分野の熟練者は、核酸配列の変異のための技術を選択する能力を有すると信じられる。下記は、以上に開示した数種のヒトＧＰＣＲの非内因性型を創成するために使用される方法である。以下に開示される変異は、保存されるプロリン（またはこれの内因性の保存性置換基）残基（ＴＭ６／ＩＣ３界面近くのＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する）から１６番目のアミノ酸（ＧＰＣＲのＩＣ３領域内に位置する）が、好ましくはアラニン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基に、最も好ましくはリシンアミノ酸残基に変異されるアルゴリスム法に基づく。
【００９９】
１．トランスフォーマーサイトディレクテッドTM変異誘発
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、製造者の指針に従って、トランスフォーマーサイトディレクテッド(Transformer Site-Directed) TM変異誘発キット(Clontech)を用いて、ヒトＧＰＣＲについて行ってもよい。２個の変異誘発プライマーを使用し、最も好ましくはリシン変異を創成するリシン変異誘発オリゴヌクレオチド、および選択マーカーオリゴヌクレオチドを用いる。便宜のために、ヒトＧＰＣＲ内に組み込まれるべきコドン変異も標準形で記録する（表Ｄ）。
【０１００】
【表３】
2011097950.tif 000005
【０１０１】
２．クイクチェンジTMサイトディレクテッドTM変異誘発
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、クイクチェンジ(QuikChange)TMサイトディレクテッド(Site-Directed) TM変異誘発キット(Stratagene、製造者の指針に従う）によっても行うことができる。内因性ＧＰＣＲが好ましい鋳型として使用され、そして２個の変異誘発プライマーを用い、ならびに最も好ましくはリシン変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド（キット内に含まれる）が使用される。便宜のために、新規のヒトＧＰＣＲ内に組み込まれたコドン変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドを標準形で記録する（表Ｅ）
【０１０２】
【表４】
2011097950.tif 000006
【０１０３】
非内因性ヒトＧＰＣＲを次いで配列決定しそして誘導および確認された核酸およびアミノ酸配列を本特許明細書に添付した「配列表」に表示し、これを下記の表Ｆに要約した。
【０１０４】
【表５】
2011097950.tif 000007
【０１０５】
実施例３
受容体発現
種々の細胞がタンパク質の発現のために当該技術分野で利用できるが、哺乳動物細胞の使用が最も好ましい。この主要な理由は、実用性により定められ、すなわち例えばＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用は、可能な限り、哺乳動物系のために発展された受容体共役、遺伝機序および分泌経路を含まない（確かに酵母の場合には含まない）非哺乳動物細胞をプロトコール中に導入し、これにより非哺乳動物細胞で得られた結果は、利用可能な限り、哺乳動物細胞から得られたほどは好ましくない。使用される特定の哺乳動物細胞は熟練者の特定の要求により決定できるけれども、哺乳動物細胞のなかでは、ＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞が特に好ましい。
【０１０６】
ａ．一過性トランスフェクション
第一日目に、６ｘ１０6 ／（２９３細胞のウエル１０ｃｍ皿）をプレートアウトした。第二日目に、２本の反応管を調製した（それぞれの管についての下記の比率はプレートあたりである）。管Ａは、４μｇＤＮＡ（例えばｐＣＭＶベクター、受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクターなど）を０．５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ(GibcoBRL) 中で混合して調製した。管Ｂは、２４μｌリポフェクタミン(Gibco BRL) を０．５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中で混合して調製した。管ＡおよびＢを倒置（数回）により混合し、次いで室温で３０〜４５分間インキュベーションした。この混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレーティングした２９３細胞を１ＸＰＢＳを用いて洗浄し、次いで０．５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭを加えた。トランスフェクション混合物１ｍｌを細胞に加え、次いで３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベーションした。トランスフェクション混合物を吸引して取り出し、次いでＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清の１０ｍｌを加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーションした。４８時間インキュベーションした後、細胞を採取しそして分析に使用した。
【０１０７】
ｂ．安定細胞株：Ｇｓ融合タンパク質
約１２ｘ１０6 ２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上にプレーティングした。１０％ウシ胎児血清および１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含むＤＭＥハイ・グルコース媒体(HighGlucose Medium) 中で培養した。プレーティングした２４時間後に２９３細胞は約８０％集密度となり、細胞をＤＮＡ１２μｇを用いてトランスフェクションした。ＤＮＡ１２μｇを、リポフェクタミン６０ｕｌおよび血清を含まないＤＭＥハイ・グルコース媒体２ｍＬと混合した。媒体をプレートから吸引しそして細胞を血清を含まない媒体を用いて一回洗浄した。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および媒体混合物を血清を含まない媒体１０ｍＬと一緒にプレートに加えた。３７℃で４〜５時間のインキュベーションの後に、媒体を吸引し、そして血清を含む媒体２５ｍｌを加えた。トランスフェクションの２４時間後に媒体を再度吸引し、そして血清を含む新しい媒体を加えた。トランスフェクションの４８時間後に、媒体を吸引しそして血清を含みゲネチシン（Ｇ４１８薬剤）を含む媒体を加え、最終濃度５００μｇ／ｍＬまで加えた。トランスフェクションした細胞は、ここでＧ４１８耐性遺伝子を含む陽性にトランスフェクションされた細胞に関して選択する。選択が起きる度に媒体を４〜５日毎に交換した。選択の間に、細胞は安定なプールを創成するために増殖するか、または安定クローン選択のためにスプリットする。
【０１０８】
実施例４  非内因性ＧＰＣＲの構成的活性の決定のためのアッセイ
種々の方法が非内因性ヒトＧＰＣＲの構成的活性の評価のために利用される。以下は例示である。当該技術分野の通常の熟練者は、熟練者の要求に優先的に役立つこのような技術を決定する能力を有すると信じられる。
１．膜結合アッセイ：〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役型受容体がその活性状態にある場合に、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、受容体はＧタンパク質に結合しそしてＧＤＰの遊離およびその後のＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質共役型受容体複合体のαサブユニットは、ＧＴＰアーゼとして作用しそしてＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、その時点で受容体は通常は脱活される。構成的活性化受容体はＧＴＰをＧＤＰへ交換することを続ける。非−加水分解性ＧＴＰ類似体である〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳは、構成的活性化受容体を発現する膜への〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳの増強された結合を証明するために使用できる。構成的活性化を測定するために〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合を用いる利点は、（ａ）これがすべてのＧタンパク質共役型受容体に包括的に適用される、（ｂ）これが、膜表面の近くで細胞内カスケードに影響する分子を取り上げることを困難とすることである。
【０１０９】
このアッセイは、関係する受容体を発現する膜に結合する〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳを刺激するＧタンパク質共役型受容体の能力を利用する。従って、このアッセイは、既知のオーファンおよび構成的活性化Ｇタンパク質共役型受容体への候補化合物をスクリーニングするための直接同定法に使用できる。アッセイは包括的であり、そしてすべてのＧタンパク質共役型受容体における薬剤発見に適用される。
【０１１０】
〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１〜約２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 （この量は、２０ｍＭが好ましいけれども、結果の最適化のために調節できる）ｐＨ７．４、約０．３〜約１．２ｎＭ  〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ（この量は、１．２が好ましいけれども、結果の最適化のために調節できる）を含む結合緩衝液および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（例えばＧｓ融合タンパク質を発現する２９３細胞、この量は最適化のために調節できる）および１０μＭ  ＧＤＰ（この量は最適化のために調節できる）中で１時間インキュベーションした。次いでコムギ胚芽凝集素ビーズ（２５μｌ、Amersham）を加えそして混合物をさらに３０分間、室温でインキュベーションした。次いで管を１５００  ｘ  ｇで５分間、室温で遠心分離し次いでシンチレーションカウンターでカウントした。
【０１１１】
２．アデニル酸シクラーゼ
細胞に基づくアッセイのために設計されたフラッシュ・プレート(Flash Plate) TMアデニル酸シクラーゼキット（New England Nuclear;カタログ番号SMP004A）は、粗血漿膜と共に用いるために変更できる。フラッシュ・プレートウエルは、ｃＡＭＰを認識する特定の抗体も含むシンチラント(scintillant)コーティングを含むことができる。ウエル内で産生されたｃＡＭＰはｃＡＭＰ抗体に対する放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合に関する直接競合により定量できる。以下の記載は、受容体を発現する全細胞内のｃＡＭＰレベル内の変化の測定のための簡単なプロトコールとして役立つ。
【０１１２】
トランスフェクションされた細胞を一過性トランスフェクションの約２４時間後に採取した。媒体を注意して吸引して取り出し廃棄した。ＰＢＳ１０ｍｌを細胞のそれぞれの皿におだやかに加え次いで注意して吸引した。Sigma 細胞分離緩衝液１ｍｌおよびＰＢＳ３ｍｌをそれぞれのプレートに加えた。細胞を皿からピペットで取り出しそして細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐型遠心分離管内に集めた。次いで細胞を室温、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを注意して適当な体積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）内に再懸濁した。次いで細胞を血球計数器を用いて計数しそして追加のＰＢＳを加えて細胞の概略数を与えた（最終体積約５０μｌ／ウエル）。
【０１１３】
ｃＡＭＰ標準および「検出緩衝液」（「検出緩衝液」１１ｍｌにトレーサー〔125 ＩｃＡＭＰ（５０μｌ〕の１μＣｉを含んでなる）を調製し、そして製造者の指示に従って維持した。「アッセイ緩衝液」をスクリーニングのために新たに調製しそしてこれは「刺激緩衝液」５０μｌ、試験化合物３ｕｌ（１２ｕＭの最終アッセイ濃度）および細胞５０μｌを含み、「アッセイ緩衝液」は使用するまで氷上に保管した。アッセイは、適当なウエルにｃＡＭＰ標準５０μｌの添加から始まり、次いでウエルＨ−１１およびＨ−１２へＰＢＳＡ５０ｕｌを加えた。「刺激緩衝液」５０μｌをすべてのウエルに加えた。ＤＭＳＯ（または選択した候補化合物）を化合物溶液３μｌの供給ができるピン器具を用いて適当なウエルに加え、１２μＭ試験化合物の最終アッセイ濃度および全アッセイ体積１００μｌとした。次いで細胞をウエルに加えそして６０分間、室温でインキュベーションした。次いでトレーサーｃＡＭＰを含む「検出混合物」１００μｌをウエルに加えた。次いでプレートをさらに２時間インキュベーションし、次いでウオラック・マイクロベータ(WallacMicroBeta)シンチレーションカウンター内で計数した。次いでｃＡＭＰ／ウエルの値をそれぞれのアッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿した。
【０１１４】
３．Ｇｉ共役型標的ＧＰＣＲのための細胞に基づくｃＡＭＰ
ＴＳＨＲは、活性化の際にｃＡＭＰの蓄積を起こすＧｓ共役型ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を変異すること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化する）により構成的に活性化される。Ｇｉ共役型受容体は、アデニル酸シクラーゼを阻害すると予想され、そして、そのために、ｃＡＭＰ産生のレベルを低下し、これはｃＡＭＰレベルの問題の評価を可能とする。Ｇｉ共役型受容体の構成的活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の低下を測定するために有効な技術は、ｃＡＭＰの基準レベルを確立するためのＧｉ連結標的ＧＰＣＲを用いる「シグナルエンハンサー」として、最も好ましくは非内因性、構成的活性化ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３１）（または内因性、構成的活性Ｇｓ共役型受容体）を同時トランスフェクションすることにより達成できる。Ｇｉ共役型受容体の非内因性型が創成されると、次いで標的ＧＰＣＲのこの非内因性型は、シグナルエンハンサーと一緒に同時トランスフェクションされ、そしてスクリーニングに使用できるのはこの物質である。我々は、ｃＡＭＰアッセイを使用する場合にシグナルを効率的に発生するためにこの方法を使用した。この方法は、好ましくはＧｉ共役型受容体に対する候補化合物の直接同定に使用される。この方法を使用した場合に、Ｇｉ共役型受容体にとって標的ＧＰＣＲの逆アゴニストはｃＡＭＰシグナルを増加しそしてアゴニストはｃＡＭＰシグナルを低下するであろう。
【０１１５】
第一日目に、２Ｘ１０4 ２９３および２９３細胞／ウエルをプレートアウトする。第二日目に、２個の反応管を調製する（それぞれの管についての下記の比率はプレートあたりである）。管Ａは、哺乳動物細胞内にトランスフェクションされたそれぞれの受容体の２μｇＤＮＡを、１．２１の血清を含まないＤＭＥＭ(IrvineScientific, Irvine, CA) 中で全体で４μｇＤＮＡ（例えばｐＣＭＶベクター、変異ＴＨＳＲ（ＴＨＳＲ−Ａ６２３１Ｉ）を含むｐＣＭＶベクター、ＴＨＳＲ−Ａ６２３１ＩおよびＧＰＣＲなど）と混合して調製する。管Ｂは、１２０μｌリポフェクタミン(GibcoBRL) を１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中で混合して調製する。次いで、管ＡおよびＢを倒置（数回）してよく混合し、次いで室温で３０〜４５分間インキュベーションした。混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレーティングした２９３細胞を１ＸＰＢＳを用いて洗浄し、次いで血清を含まないＤＭＥＭ１０ｍｌを加える。次いでトランスフェクション混合物２．４ｍｌを細胞に加え、次いで４時間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーションする。次いでトランスフェクション混合物を吸引して取り出し、次いでＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清２５ｍｌを加える。次いで細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーションする。２４時間インキュベーションの後、細胞を採取しそして分析に使用する。
【０１１６】
しかし、細胞に基づくアッセイのために設計されたフラッシュ・プレートTMアデニル酸シクラーゼキット（New England Nuclear;カタログ番号SMP004A）は、熟練者の要求に従って粗血漿膜と用いるために変更できる。フラッシュ・プレートウエルは、ｃＡＭＰを認識する特定の抗体も含むシンチラントコーティングを含むことができる。ウエル内で産生されたｃＡＭＰはｃＡＭＰ抗体に対する放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合に関する直接競合により定量できる。以下の記載は、受容体を発現する全細胞内のｃＡＭＰレベル内の変化の測定のための簡単なプロトコールとして役立つ。
【０１１７】
トランスフェクションされた細胞を一過性トランスフェクションの約２４時間後に採取する。媒体を注意して吸引して取り出して廃棄する。ＰＢＳ１０ｍｌを細胞のそれぞれの皿におだやかに加え次いで注意して吸引する。Ｓｉｇｍａ細胞分離緩衝液１ｍｌおよびＰＢＳ３ｍｌをそれぞれのプレートに加える。細胞を皿からピペットで取り出しそして細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐型遠心分離管内に集める。次いで細胞を室温、１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを注意して適当な体積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）内に再懸濁する。次いで細胞を血球計数器を用いて計数しそして追加のＰＢＳを加えて細胞の概略数を与える（最終体積約５０μｌ／ウエル）。
【０１１８】
ｃＡＭＰ標準および「検出緩衝液」（「検出緩衝液」１１ｍｌにトレーサー〔125 ＩｃＡＭＰ（５０μｌ〕の１μＣｉを含んでなる）を調製し、そして製造者の指示に従って維持する。「アッセイ緩衝液」をスクリーニングのために新たに調製しなればならずそしてこれは「刺激緩衝液」５０μｌ、試験化合物３ｕｌ（１２ｕＭ最終アッセイ濃度）および細胞５０μｌを含み、「アッセイ緩衝液」は使用するまで氷上で保管できる。アッセイは、適当なウエルにｃＡＭＰ標準５０μｌの添加から始めることができ、次いでウエルＨ−１１およびＨ−１２へＰＢＳＡ５０ｕｌを加える。刺激緩衝液５０μｌをウエルに加える。選択した化合物（例えばＴＳＨ）を化合物溶液３μｌの供給ができるピン器具を用いて適当なウエルに加え、１２μＭ試験化合物の最終アッセイ濃度および全アッセイ体積１００μｌとする。次いで細胞をウエルに加えそして６０分間、室温でインキュベーションする。次いでトレーサーｃＡＭＰを含む「検出混合物」１００μｌをウエルに加える。次いでプレートをさらに２時間インキュベーションし、次いでウオラック・マイクロベータシンチレーションカウンター内で計数する。次いでｃＡＭＰ／ウエルの値をそれぞれのアッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
【０１１９】
４．レポーターに基づくアッセイ
ａ．Ｇｒｅ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ−関連受容体）
２９３および２９３ｔ細胞をウエルあたりに２ｘ１０4 細胞の密度で９６ウエルプレート上にプレートアウトし、そして製造者の指示に従って次の日にリポフェクタミン試薬(BRL)を用いてトランスフェクションした。ＤＮＡ／脂質混合物をそれぞれ６ウエルトランスフェクション物について次のように調製した：ＤＭＥＭ１００μｌ中のプラスミドＤＮＡ２６０ｎｇをＤＭＥＭ１００μｌ中の脂質２μｌとおだやかに混合した（８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド２００ｎｇ、内因性受容体または非内因性受容体を含んでなるｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独の５０ｎｇ、およびＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３中のＧＰＲＳ(Invitrogen)）１０ｎｇから成るプラスミドＤＮＡ２６０ｎｇ）。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、以下のようにして調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌは、ｐβｇａｌ−ベーシックベクター(BasicVector)(Clontech)中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位でラット・ソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローニングして得られた。ｃＡＭＰ反応因子の８個のコピーは、アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８(7Human Gene Therapy 1883(1996)参照）からＰＣＲにより得られそしてＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位でＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクター内にクローニングすると、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターが得られた。８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポタープラスミドは、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位におけるｐＧＬ３−ベーシックベクター(Promega)から得たルシフェラーゼ遺伝子と置換して生成した。３０分、室温でのインキュベーションの後に、ＤＮＡ／脂質混合物をＤＭＥＭ４００μｌを用いて希釈し、そして希釈混合物１００μｌをそれぞれのウエルに加えた。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１００μｌを、細胞カルチャーインキュベーター中での４時間のインキュベーションの後にそれぞれのウエルに加えた。次の日に、トランスフェクションした細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ２００μｌ／ウエルに交換した。８日後に、ＰＢＳを用いる洗浄１回の後にフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ１００μｌ／ウエルにウエルを交換した。ルシフェラーゼ活性は、ルクライト(LucLite)TMレポーター遺伝子アッセイキット(Packard)を用い製造者の指示に従いそして１４５０マイクロベータ(MicroBeta) TMシンチレーションおよび蛍光カウンター(Wallac)を用いて読み取って次の日に測定した。
【０１２０】
ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための方法は、これらのプロモーター中にＡＰ１因子を含む遺伝子の活性化を起こすＧｑ−依存性ホスホリパーゼＣの既知の性質に依存する。パスデテクト(Pathdetect) TM ＡＰ−１  ｃｉｓ−レポーティングシステム(Stratagene 、カタログ番号#219073)が、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して以上に記載したプロトコールにしたがって使用できるが、リン酸カルシウム沈降物の成分が４１０ｎｇ  ｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰであった点が異なる。
ｃ．Ｓｒｆ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ−関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出するための一つの方法は、そのプロモーター中に血清反応因子を含む遺伝子の活性化を起こすＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の性質に依存する。パスデテクトTMＳＲＦ−Ｌｕｃ−レポーティングシステム(Stratagene)が、例えばＣＯＳ７細胞中のＧｑ共役活性のアッセイに使用できる。細胞を系のプラスミド成分を用いてトランスフェクションしそして哺乳動物トランスフェクション(MannmalianTransfection) TMキット(Stratagene 、カタログ番号#200285)を製造者の指示に従って使用して内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする発現プラスミドを示す。要約すると、４１０ｎｇ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリホスファターゼ発現プラスミド。アルカリホスファターゼ活性は試料間のトランスフェクション効果における変動を制御するためにトランスフェクションされた細胞の媒体中で測定する）を、製造者の指示に従ってリン酸カルシウム沈降物中に混和する。沈降物の半分を９６−ウエルプレート中の３ウエル上に均等に分布させ、血清を含まない媒体中の細胞上に２４時間保持する。最後の５時間に、指示された場合に、細胞を１μＭアンギオテンシンを用いてインキュベーションする。次いで、細胞を溶解しそしてルシライト(Lucilite)TMキット(Packard、カタログ番号#6016911)および「トリラックス(Trilux)１４５０マイクロベータ(Micrebeta) 」液体シンチレーションおよび蛍光カウンター(Wallac)を用いて、製造者の指示に従ってルシフェラーゼ活性をアッセイする。データはグラフパッドプリズム(GraphPadPrism)TM2.0a(GraphPad Software Inc.)を用いて分析できる。
【０１２１】
ｄ．細胞内ＩＰ3 蓄積アッセイ（Ｇｗ−関連受容体）
第一日目に、受容体（内因性および／または非内因性）を含んでなる細胞を２４ウエルプレート上に、通常は１ｘ１０5 細胞／ウエルでプレーティングできる（この数は最適化できるが）。第二日目に、細胞を最初、血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌ／ウエル中の０．２５μｇＤＮＡおよび血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌ／ウエル中の２μｌリポフェタミンと混合してトランスフェクションできる。溶液をおだやかに攪拌しそして１５〜３０分間、室温でインキュベーションする。細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳを用いて洗浄し、血清を含まない媒体４００μｌをトランスフェクション媒体と混合しそして細胞に加える。次いで細胞を３〜４時間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーションし次いでトランスフェクション媒体を除きそして通常の増殖媒体１ｍｌ／ウエルで置き換えた。第三日目に、細胞を 3Ｈ−ミオ−イノシトールを用いて標識する。要約すると、媒体を除きそして細胞を０．５ｍｌＰＢＳを用いて洗浄する。次いで、０．５ｍｌイノシトール不含／血清不含媒体(GIBCOBRL) を、ウエルあたりに 3Ｈ−ミオ−イノシトールの０．２５μＣｉと一緒にウエルあたりに加えそして細胞を１６〜１８時間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーションする。第四日目に、細胞を０．５ｍｌＰＢＳで洗浄し、そしてイノシトール不含／血清不含媒体１０μＭパルジリン１０ｍＭ塩化リチウムを含むアッセイ媒体０．４５ｍｌもしくはアッセイ媒体０．４ｍｌおよび１０ｘケタンセリン(ketanserin、ｋｅｔ）５０μｌを最終濃度１０μＭとしたものを加える。次いで細胞を３０分間３７℃でインキュベーションする。次いで細胞をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄しそして新規／氷冷却停止溶液（１Ｍ  ＫＯＨ；１８ｍＭホウ酸Ｎａ；３．８ｍＭ  ＥＤＴＡ）２００μｌをウエルあたりに加える。溶液を氷上で５〜１０分間、または細胞が溶解するまで保持し、次いで新規／氷冷中和溶液（７．５％ＨＣＬ）２００μｌにより中和する。次いで１．５ｍｌエッペンドルフ(eppendorf)管内に溶解物を移しそしてクロロホルム／メタノール（１：２）１ｍｌを管当たりに加える。溶液を１５秒間ウズ攪拌し、上相をバイオラド(Biorad)ＡＧ１−Ｘ８TMアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に加える。最初に樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖの水を用いて洗浄しそして上相０．９ｍｌをカラム上に加える。カラムを５ｍＭミオ−イノシトール１０ｍｌおよび５ｍＭ  ホウ酸Ｎａ／６０ｍＭギ酸Ｎａ  １０ｍｌを用いて洗浄する。イノシトール・三リン酸が０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムの２ｍｌを含むシンチレーションカクテル１０ｍｌを含むシンチレーションバイアル内で溶離する。カラムを０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムの１０ｍｌを用いて洗浄しそして２回、ｄｄＨ2Ｏを用いてリンスしそして４℃水中で保管する。
【０１２２】
例示的な結果を以下の表Ｇに示す。
【０１２３】
【表６】
2011097950.tif 000008
【０１２４】
上記の実施例４（１）で開示した構成的活性化を検出するためのＧＴＰγＳアッセイの例示的な結果は、ヒトＲＵＰ１３およびＲＵＰ１５上での「Ｇｓ：融合タンパク質構築物」を用いて達成された。下記の表Ｈは、このアッセイから生成されたシグナルおよび示したようなシグナルの相違を表示する。
【０１２５】
【表７】
2011097950.tif 000009
【０１２６】
実施例５
融合タンパク質調製
ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物
構成的活性化ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計は、以下のように行った：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長形；Itoh et al., 83 PNAS 3776 (1986)）の５’および３’末端の両方を、この上にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含むように操作した。正しい配列（近接する(flanking)ＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）の確認の後に、全配列を、そのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてサブクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１（−）(Invitrogenカタログ番号V795-20)中にシャトル(shuttle) した。Ｇｓα配列の正しい方向は、ｐｃＤＮＡ３．１（−）中へのサブクローニングの後に決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ配列で変更したラットＧｓα遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１（−）を次いで確認した。これでこのベクターは、「汎用」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用できた。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは種々の周知の制限部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に含み、従ってＧｓタンパク質の上流に、内因性、構成的活性ＧＰＣＲのコーディング配列を挿入する能力を有利に与える。この同じ方法は、他の「汎用」Ｇ−タンパク質ベクターを創成するためにも利用でき、そして当然ながら、その他の商業的に利用可能、または熟練者に既知の独自のベクターも使用可能であり、その際、重要な基準は、ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質のものの上流でそしてインフレームであることである。
【０１２７】
ＲＵＰ１３は、Ｇｓを介して共役する。下記の例示的「ＧＰＣＲ融合タンパク質」について、Ｇｓαへの融合が達成された。
【０１２８】
ＲＵＰ１３−「Ｇｓα融合タンパク質」構築物を以下のようにして作製した。
プライマーは以下のように設計した。
５’−ｇａｔｃ〔ＴＣＴＡＧＡＡＴ〕ＧＧＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧ−３’（配列番号９７、センス）
５’−ｇａｔｃ〔ＧＡＴＡＴＣ〕ＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＴＧＡＧＧＣＧＧＣ−３’（配列番号９８、アンチセンス）
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＲＵＰ１３との間の制限部位（括弧内に示す）内のスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー（制限部位に帰属する）がＧタンパク質とＲＵＰ１５との間に存在するように、それぞれＸｂａＩとＥｃｏＲＶのための制限部位を含んでいた。
【０１２９】
次いで、上記に開示したＧｓα汎用ベクター内の融合ためのそれぞれの受容体配列を確保するためにＰＣＲを使用し、それぞれ下記のプロトコールを用いた。ＲＵＰ１５のための１００ｎｇ  ｃＤＮＡを、それぞれプライマー（センスおよびアンチ−センス）２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ３μＬ、１０ＸタックプラスTMプレシジョン緩衝液(Precision Buffer)１０μＬ、タックプラスTMプレシジョンポリメラーゼ(Stratagene:#600211) １μＬ、および水８０μＬを含む別々の管に加えた。ＲＵＰ１５のための反応温度およびサイクル時間は、サイクルステップ２〜４の３５回反復を含んで下記であった。１分間９４℃、３０秒間９４℃、２０秒間６２℃、１分４０秒間７２℃、および５分間７２℃。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上を流し次いで精製した（データは記載しない）。精製した産物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化しそして所望の内挿物を精製しそしてそれぞれの制限部位でＧｓ汎用ベクター内に連結した。陽性クローンを形質転換の後に単離しそして制限酵素消化により決定した。２９３細胞を用いる発現が、本明細書内に記載したプロトコールを用いて達成された。ＲＵＰ１５−「Ｇｓ融合タンパク質」のそれぞれの陽性クローンを正確さを確認するために配列決定した。（核酸配列に関しては配列番号９９、そしてアミノ酸配列に関しては配列番号１００参照）。
【０１３０】
ＲＵＰ１５は、Ｇｓを介して共役する。下記の例示的「ＧＰＣＲ融合タンパク質」について、Ｇｓαへの融合が達成された。
【０１３１】
ＲＵＰ１５−「Ｇｓα融合タンパク質」構築物を以下のようにして作製した。プライマーは以下のように設計した。
５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１０１、センス）
５’−ｇａｔａｔｃＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１０２、アンチセンス）
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＲＵＰ１５との間の制限部位内のスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセンスプライマーは、スペーサー（制限部位に帰属する）がＧタンパク質とＲＵＰ１５との間に存在するように、それぞれＥｃｏＲＶとＸｂａＩのための制限部位を含んでいた。
【０１３２】
次いで、上記に開示したＧｓα汎用ベクター内の融合ためのそれぞれの受容体配列を確保するためにＰＣＲを使用し、それぞれ下記のプロトコールを用いた。ＲＵＰ１５のための１００ｎｇ  ｃＤＮＡを、それぞれプライマー（センスおよびアンチ−センス）２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ３μＬ、１０ＸタックプラスTMプレシジョン緩衝液１０μＬ、タックプラスTMプレシジョンポリメラーゼ(Stratagene: #600211) １μＬ、および水８０μＬを含む別々の管に加えた。ＲＵＰ１５のための反応温度およびサイクル時間は、サイクルステップ２〜４の３５回反復を含んで下記であった。１分間９４℃、３０秒間９４℃、２０秒間６２℃、１分４０秒間７２℃、および５分間７２℃。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上を流し次いで精製した（データは記載しない）。精製した産物を消化した。）精製した産物をＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩを用いて消化しそして所望の内挿物を精製しそしてそれぞれの制限部位でＧｓ汎用ベクター内に連結した。陽性クローンを形質転換の後に単離しそして制限酵素消化により決定した。２９３細胞を用いる発現が、本明細書内に記載したプロトコールを用いて達成された。ＲＵＰ１５−「Ｇｓ融合タンパク質」のそれぞれの陽性クローンを正確さを確認するために配列決定した。（核酸配列に関しては配列番号１０３、そしてアミノ酸配列に関しては配列番号１０４参照）。
【０１３３】
ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物
Ｇｑ（欠失）／Ｇｉ融合構築物の設計は、以下のようにして達成できた。Ｎ−末端の６個のアミノ酸（ＴＥＬＳＩＭの配列（配列番号１２９）Ｇαｑ−サブユニットを有する２〜７のアミノ酸を欠失しそして配列ＥＹＮＬＢ（配列番号１３０）を有するＣ−末端の５個のアミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号１３１）を有する「ＧαＩタンパク質」の相当するアミノ酸と置き換える。この融合構築物は、下記のプライマー
５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔｃＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１３２）および
５’−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１３３）
およびマウスＧαｑ−野生型を含むプラスミド６３３１３を用い、鋳型として血球凝集素タグを用いるＰＣＲにより得られる。小文字のヌクレオチドはスペーサーとして含まれる。
【０１３４】
タックプラスプレシジョンＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)は、ステップ２〜４の３５回反復を含む下記のサイクルによる複製に使用される。２分間９５℃、２０秒間９５℃、２０秒間５６℃、２分間７２℃、および７分間７２℃。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)内にクローニングしそしてＡＢＩビッグダイターミネーターキット(P.E.Biosystems) を用いて配列決定した。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローンからの挿入物を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位で２段クローニング法によりシャトルした。
【０１３５】
実施例６
開示したヒトＧＰＣＲの組織分布：ＲＴ−ＰＣＲ
数種の新規のヒトＧＰＣＲの発現を確認しそして組織分布を決定するためにＲＴ−ＰＣＲを適用した。使用したオリゴヌクレオチドは、鋳型としてＧＰＣＲ特異性そしてヒト多重組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、Clontech) であった。タック  ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を製造者の指示に従う４０μｌ反応物内の増幅のために使用した。反応物２０μｌを１．５％アガロースゲル上に加えてＲＴ−ＰＣＲ産物を分析した。下記の表Ｊは、受容体、サイクル条件および使用したプライマーを表示する。
【０１３６】
【表８】
2011097950.tif 000010
【０１３７】
【表９】
2011097950.tif 000011
【０１３８】
実施例７
プロトコール：逆アゴニストおよびアゴニストの直接同定
Ａ．〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳアッセイ
我々は内因性、構成的活性ＧＰＣＲを候補化合物、例えば逆アゴニストの直接同定のために完全には理解されていない理由から使用したけれども、アッセイ内の変動が大きくなることがある。次いで好ましくは、以上に公開したように「ＧＰＣＲ融合タンパク質」も非内因性、構成的活性化ＧＰＣＲと一緒に使用される。我々は、このようなタンパク質を使用する場合にアッセイ内変動が本質的に安定化され、これにより効果的な信号対騒音比が得られるように見えることを認めた。これは候補化合物のさらに強固な同定を可能とする有利な結果を有する。このように、直接同定のために「ＧＰＣＲ融合タンパク質」が使用されそして利用する場合には下記のアッセイプロトコールを利用することが望ましい。
【０１３９】
１．膜調製
関係する構成的活性オーファン「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を含んでなりそして逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定に使用するための膜は、好ましくは下記のように調製される。
【０１４０】
ａ．材料
「膜スクレープ緩衝液」は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含んでなる。「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含んでなる。「結合緩衝液」は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、ｐＨ７．４を含んでなる。
【０１４１】
ｂ．操作
操作の間を通じてすべての材料を氷上に保持する。第一に、媒体を細胞の集密単層から吸引し、次いで１０ｍｌ冷ＰＢＳを用いてリンスし、次いで吸引する。その後、「膜スクレープ緩衝液」５ｍｌをスクレープ細胞に加える、これに続いて、５０ｍｌ遠心分離管内に細胞抽出物を移す（２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離する）。その後、上清を吸引しそしてペレットを膜「洗浄緩衝液」３０ｍｌ中に再懸濁し、次いで２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離する。次いで、上清を吸引しそしてペレットを「結合緩衝液」内に再懸濁する。次いでこれをブリンクマン・ポリトロン(Brinkman polytron) TMホモジナイザーを用いてホモジナイジングする（すべての材料が懸濁するまで１５〜２０秒間バースト）。これを本明細書中では「膜タンパク質」と呼ぶ。
【０１４２】
２．ブラドフォードタンパク質アッセイ
ホモジナイゼーションに次いで、膜のタンパク質濃度をブラドフォード(Bradford)タンパク質アッセイを用いて決定する（タンパク質は約１．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、アリコートに入れ、以後の使用のために冷凍（−８０℃）できる。冷凍した場合に、使用のためのプロトコールは以下である：アッセイの日に、冷凍した「膜タンパク質」を室温で解凍し、次いでウズ攪拌しそして約１２ｘ１．０００ｒｐｍで約５〜１０秒間ポリトロンを用いてホモジナイズする。複数の調製のためには、異なる調製物のホモジナイゼーションの間でホモジナイザーを完全に清浄化することに注意すること）
【０１４３】
ａ．材料
「結合緩衝液」（上記の通り）、「ブラドフォード染色試薬」、「ブラドフォードタンパク質標準」を製造者の指示に従って使用する(Biorad カタログ番号500-0006) 。
【０１４４】
ｂ．操作
２本の管を調製し、一方は膜を含みそして他方は対照の「ブランク」とする。それぞれは「結合緩衝液」８００ｕｌを含む。その後、「ブラドフォードタンパク質標準」（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌをそれぞれの管に加え、次いで膜「タンパク質」１０μｌを一本の管（ブランク以外）を除いて加える。その後、「ブラドフォード染色試薬」２００μｌをそれぞれの管に加え、次いでそれぞれウズ攪拌する。５分後に、管を再びウズ攪拌しそしてその中の材料をキュベットに移す。次いでキュベットをＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を用いて波長５９５で読み取る。
【０１４５】
３．直接同定アッセイ
ａ．材料
「ＧＤＰ緩衝液」は、３７．５ｍｌ「結合緩衝液」および２ｍｇ  ＧＤＰ(Sigmaカタログ番号G-7127) から成り、次いで「結合緩衝液」中の一連の希釈により０．２μＭ  ＧＤＰが得られる（それぞれのウエル内のＧＤＰの最終濃度は、０．１μＭ  ＧＤＰ）。候補化合物を含んでなるそれぞれのウエルは１００μｌ「ＤＰＧ緩衝液」（最終濃度、０．１μＭ  ＧＤＰ）、「結合緩衝液」中の「膜タンパク質」５０ｕｌ、および「結合緩衝液」中の〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌ（１０ｍｌ「結合緩衝液」あたり２．５μｌ〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ）から成る２００ｕｌの最終体積を有する。
【０１４６】
ｂ．操作
候補化合物は、好ましくは９６ウエルプレートフォーマットを用いてスクリーニングされる（これらは−８０℃で冷凍できる）。「膜タンパク質」（または対照として「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を含まない発現ベクターを有する膜）を懸濁するまで短時間ホモジナイズする。次いで、タンパク質濃度を上記の「ブラドフォードタンパク質アッセイ」セットを用いて決定する。次いで「膜タンパク質」（および対照）を「結合緩衝液」中で０．２５ｍｇ／ｍｌまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇウエル）。その後、「ＧＤＰ緩衝液」１００μｌをウオラックシンチストリップ(Wallac Scintistrip) TM (Wallac)のそれぞれのウエルに加えた。次いで候補化合物５ｕｌをこのウエル内に移すために５ｕｌピン器具を用いる（すなわち２００μｌの全アッセイ体積中の５ｕｌは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が１０μＭであるような１：４０の比である）。再度、汚染を防ぐために、それぞれの移動ステップの後、水（１Ｘ）、エタノール（１Ｘ）および水（２Ｘ）を含んでなる３基の容器内でピン器具を洗浄すること。過剰の液体をそれぞれのリンスの後に器具から振り払いそして紙およびキムワイプ(kimwipe)を用いて乾燥すること。その後、「膜タンパク質」５０μｌをそれぞれのウエルに加え（「ＧＰＣＲ融合タンパク質」を含まない膜を含んでなる対照ウエルも使用する）、そして５〜１０分間、室温で予備インキュベーションする。その後、「結合緩衝液」中の〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌをそれぞれのウエルに加え、次いで振とう器内で６０分間、室温でインキュベーションする（この実施例でもプレートをフォイルで覆う）。次いで、プレートを４００ｒｐｍで１５分間、２２℃で回転してアッセイを停止する。次いでプレートを８チャンネルマニホルドを用いて吸引しそしてプレートカバーを用いてシールする。次いで、ワラック１４５０で設定「Ｐｒｏｔ．＄３７」を用いてプレートを読み取る（製造者の指定に従う）
【０１４７】
Ｂ．サイクリックＡＭＰアッセイ
候補化合物を直接同定するための別のアッセイ方法は、シクラーゼに基づくアッセイを用いて達成される。直接同定に加えて、このアッセイ法は、上記のような〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ法からの結果の確認を与えるための独立した方法としても使用できる。
【０１４８】
変更したフラッシュプレートTMアデニル酸シクラーゼ・キット(New England Nuclear, カタログ番号SMP004A)が、下記のプロトコールに従う構成的活性化オーファンＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとしての候補化合物の直接同定のために好ましくは使用された。
【０１４９】
トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションの約３日後に採取した。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を含む緩衝液中に懸濁した細胞のホモジナイゼーションにより膜を調製した。ホモジナイゼーションは、ブリンクマンポリトロンTMを約１０秒間使用して氷上で行った。得られたホモジネートを４９，０００Ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離する。次いで得られたペレットを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中に再懸濁し、１０秒間ホモジナイズし、次いで４９，０００Ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離した。次いで得られたペレットを−８０℃で、使用するまで保管した。直接同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解凍し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む緩衝液中に再懸濁すると、０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度が得られた（再懸濁した膜は使用まで氷上に置く）。
【０１５０】
ｃＡＭＰ標準および「検出緩衝液」（「検出緩衝液」１１ｍｌにトレーサー〔12ＩｃＡＭＰ（１００μｌ〕の２μＣｉを含んでなる）を調製しそして製造者の指示に従って維持した。「アッセイ緩衝液」をスクリーニングのために調製し、これは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭホスホクレアチン(Sigma) 、０．１単位／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ(Sigma)、５０μＭ  ＧＴＰ(Sigma)、および０．２ｍＭ  ＡＴＰ(Sigma) を含んでいた。次いで「アッセイ緩衝液」を使用まで氷上で保管した。
【０１５１】
上記のようにして同定された候補化合物（冷凍された場合には、室温で解凍）を、４０μｌ「膜タンパク質」（３０μｇ／ウエル）および「アッセイ緩衝液」５０μｌと一緒に、好ましくは９６プレートウエルに加えた（３μｌ／ウエル、１２μＭ最終アッセイ濃度）。次いでこの混合物を３０分間、室温で穏やかに振とうしてインキュベーションした。
【０１５２】
インキュベーションの後、「検出緩衝液」１００μｌをそれぞれのウエルに加え、次いで２〜２４時間インキュベーションした。次いでプレートをワラック・マイクロベータTMプレートリーダーで「Ｐｒｏｔ＃３１」を用いて計数した（製造者の指示に従う）。
【０１５３】
代表的なスクリーニングアッセイプレート（９６ウエルフォーマット）結果を図１２に示す。それぞれの棒は、それぞれのウエル内の種々の化合物と、上記の実施例５（ａ）で調製したＲＵＰ１３−ＧαＡ融合タンパク質に対する結果を示す。図１２に示した代表的な結果は、それぞれのプレートの平均結果（「ｍ」）に基づいた標準偏差および平均も与え、そして一次スクリーンから「リード」としての逆アゴニストの選択のための平均プラス２個の任意選択は、少なくとも平均プレート反応による反応百分率から標準偏差の二倍を差し引いて減らした候補化合物の選択を含む。反対に、一次スクリーンから「リード」としてのアゴニストの選択のため任意選択は、少なくとも平均プレート反応による反応百分率に標準偏差の二倍を加えて増加した候補化合物の選択を含む。これらの選択手順に基づいて、以下のウエル内の候補化合物は、ウエルＡ２およびＧ９それぞれの中のＲＵＰ１３に対する推定逆アゴニスト（化合物Ａ）およびアゴニスト（化合物Ｂ）として直接同定された。図１２参照。明確化のために以下を記す。これらの化合物はこのＧＰＣＲのための内因性リガンドのいかなる知識も持たないで直接同定された。受容体機能に基づくアッセイ技術を中心とし、そして化合物結合親和性ではなくて、我々はこの受容体の機能的活性を低下でき（化合物Ａ）ならびに受容体の機能的活性を増加できる（化合物Ｂ）化合物を確認できる。肺組織内のこれら受容体の位置に基づいて（例えば実施例６のｈＲＵＰ１３およびｈＲＵＰ２１参照）、薬剤が肺ガンの可能な治療処置のために開発できる。
【０１５４】
本明細書内で引用された文献は、同時係属および関連特許を含み、特に断らない限り、引用することにより全体を本明細書中に編入される。熟練者の判断の範囲内にある開示された本発明の変更および延長は、上記の開示および特許請求範囲の範囲内に包含される。
【０１５５】
種々の発現ベクターが当該技術分野の熟練者により利用可能であるが、内因性および非内因性ヒトＧＰＣＲの両者のための使用の目的で、使用されるベクターがｐＣＭＶであることが最も好ましい。このベクターは、１９９８年１０月１３日付けで、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) 。ＤＮＡはＡＴＣＣＤにより試験されそして利用可能と決定された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに下記の寄託番号を割り当てた：ＡＴＣＣ＃２０３３５１。
【図１】
2011097950.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2011097950.tif 000019
【図９】
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【図１０】
2011097950.tif 000021
【図１１】
2011097950.tif 000022
【図１２】
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【配列表】
2011097950000001.app
【外国語明細書】
2011097950000001.pdf