(57)【要約】【課題】アルカリ成分を含有するガラス基材を用い、アルカリ成分の溶出が抑制され、安定して生体物質を固定することが可能な生体物質固定用基材を提供する。【解決手段】アルカリ成分を含有するガラス基材、前記ガラス基材上に形成されたＳｉＯ2スパッタ膜、および前記スパッタ膜と結合したシランカップリング剤層を含む生体物質固定用基材とする。当該生体物質固定用基材は、アルカリ成分を含有するガラス基材の表面にＳｉＯ2をスパッタリングして、ＳｉＯ2スパッタ膜を形成する工程、および得られたＳｉＯ2スパッタ膜の表面をシランカップリング剤で処理する工程を実施して製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ成分を含有するガラス基材、
前記ガラス基材上に形成されたＳｉＯ2スパッタ膜、および
前記スパッタ膜と結合したシランカップリング剤層
を含む生体物質固定用基材。
【請求項２】
前記スパッタ膜の厚さが１〜１００ｎｍである請求項１に記載の生体物質固定用基材。
【請求項３】
前記シランカップリング剤層のシランカップリング剤成分が、ＳＨ基と反応性を有する官能基を含む請求項１または２に記載の生体物質固定用基材。
【請求項４】
前記ＳＨ基と反応性を有する官能基が、ハロゲン原子である請求項３に記載の生体物質固定用基材。
【請求項５】
前記シランカップリング剤層のシランカップリング剤成分が、アミノ基および／またはＳＨ基を含み、当該アミノ基および／またはＳＨ基に貴金属コロイドが結合している請求項１または２に記載の生体物質固定用基材。
【請求項６】
カバーガラスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体物質固定用基材。
【請求項７】
アルカリ成分を含有するガラス基材の表面にＳｉＯ2をスパッタリングして、ＳｉＯ2スパッタ膜を形成する工程、および
得られたＳｉＯ2スパッタ膜の表面をシランカップリング剤で処理する工程を含む生体物質固定用基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質固定用基材およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、糖鎖、ペプチド、蛋白質、酵素、抗体、抗原、ウイルス、細菌、細胞等の生体物質は、診断、治療、培養、物質生産等のために様々な担体（生体物質固定用基材）に固定されて用いられる。担体としては、ガラス、シリコンウェーハ、樹脂、セラミックス、金属等の基材に、合成高分子、細胞接着性蛋白、シランカップリング剤、貴金属等をコーティングしたものが知られている。
【０００３】
生体物質を固定化した担体を用いた分析、測定等には、発光、蛍光、吸光、透過、反射、表面プラズモン共鳴などを利用する、光を用いた測定が多く行われている。このような測定に対しては、シリコンウェーハ、セラミックス、金属基材を用いた担体、および貴金属をコーティングした担体は、光透過性の面から不向きである。また、樹脂基材の中には透明なものもあるが、透過率が不十分であり、高感度（高倍率）の測定には不向きである。さらに、樹脂基材は、蛍光顕微鏡観察では、樹脂由来の自家蛍光によって蛍光観察が妨げられるという問題もある。以上のことから、光を用いた生体物質の分析および測定には、光透過性の高いガラス基材が好適であり、例えば、特に高倍率顕微鏡観察においては、対物レンズ特性に合致したカバーガラス上で細胞を培養し、そのままそれを顕微鏡観察に供するということが行われている。
【０００４】
ガラス基材を用いた担体への生体物質の固定化には、ガラス基材上へ生体物質を直接物理吸着させることも可能であるが、この場合、ガラスと生体物質間の結合が弱く安定性に乏しい。そこで、ガラス基材の表面に、アミノ基やカルボキシル基等の官能基をシランカップリング剤により導入し、これらの官能基と生体物質との間で安定な共有結合を形成させて、生体物質を固定することが行われている。
【０００５】
ガラス基材には、安価であることからソーダライムガラス等のアルカリ成分を含有するガラスが一般に用いられている。しかし、このアルカリ成分がガラスから溶出し、シロキサン結合またはガラス−シランカップリング剤間の結合を切断していまい、固定化された生体物質が基材から脱離するという問題があった。
【０００６】
そこで、特許文献１では、アルカリ成分の溶出を抑制するために、ガラス基板表面を、ゾルゲル法によりＳｉＯ2層などの表面活性層でコーティングした生体物質固定用基板が提案されている。しかし、特許文献１に記載の生体物質固定用基板では、生体物質の固定化の安定性は向上しているものの、未だ改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１７７１２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アルカリ成分を含有するガラス基材を用い、アルカリ成分の溶出が抑制され、安定して生体物質を固定することが可能な生体物質固定用基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決した本発明は、アルカリ成分を含有するガラス基材、
前記ガラス基材上に形成されたＳｉＯ2スパッタ膜、および
前記スパッタ膜と結合したシランカップリング剤層
を含む生体物質固定用基材である。
【００１０】
本発明はまた、別の側面から、アルカリ成分を含有するガラス基材の表面にＳｉＯ2をスパッタリングして、ＳｉＯ2スパッタ膜を形成する工程、および
得られたＳｉＯ2スパッタ膜の表面をシランカップリング剤で処理する工程を含む生体物質固定用基材の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ガラス基材からのアルカリ成分の溶出が抑制されるため、長期間安定に生体物質を基材に固定することができる。従って、例えば、細胞培養時には、細胞をより多く増殖させることができる。本発明の生体物質固定用基材は、光透過性に優れるため、光を用いた生体物質の分析および測定に好適である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、光学特性の観点から、ガラス基材が用いられ、中でも、アルカリ成分を含有するガラス基材が用いられる。アルカリ成分としては、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ等が挙げられ、これらはガラス中にＬｉ2Ｏ、Ｎａ2Ｏ、Ｋ2Ｏとして含まれる。アルカリ成分を含有するガラスとしては、ソーダライムガラス、ほう珪酸塩ガラス、アルミノほう珪酸塩ガラス、アルミノ珪酸塩ガラス等が挙げられ、コスト面からはソーダライムガラスが好ましく、化学的耐久性の面からはほう珪酸ガラスが好ましく、顕微鏡観察などの光学面からは屈折率が１．５２３５であるほう珪酸ガラスが好ましい。
【００１３】
ガラス基材の形状としては特に制限がなく、生体物質の取扱い方法、分析方法および測定方法に応じて適宜決定すればよく、汎用性およびＳｉＯ2スパッタリングの容易さの観点から、好ましくは板状であり、分析の容易さの観点から、より好ましくはカバーガラスの形状である。
【００１４】
本発明においては、当該ガラス基材上にはＳｉＯ2スパッタ膜が形成される。ＳｉＯ2膜は、透過率等の光学特性に優れるため、光を用いた生体物質の分析および測定には非常に好適である。従来の技術では、アルカリ成分の溶出を抑制するために、ゾルゲル法により、ＳｉＯ2膜（パッシベーション膜）が形成されていた。しかし、ゾルゲル法により形成されたＳｉＯ2膜は、ＳｉＯ2のネットワーク構造の緻密さに欠け、アルカリ成分が膜を透過する余地が残っていた。一方、スパッタリングにより形成されたＳｉＯ2膜は、ＳｉＯ2のネットワーク構造が緻密に形成されているため、アルカリ成分の膜の透過をより抑制することができる。その結果、アルカリ成分による、シロキサン結合またはガラス−シランカップリング剤間の結合の切断がより起こりにくくなる。
【００１５】
ＳｉＯ2スパッタ膜の厚さとしては、アルカリ成分の溶出が抑制できる限り特に制限はない。本発明においては、ゾルゲル法により形成されたＳｉＯ2膜の厚さよりも小さい膜厚で、高いアルカリ成分の溶出抑制能を発揮することができ、ＳｉＯ2スパッタ膜の厚さとしては、１〜１００ｎｍが好ましく、１０〜３０ｎｍがより好ましい。膜厚が小さすぎると、アルカリ成分の溶出抑制効果が十分に得られないおそれがある。一方、膜厚が大きすぎると、基材との屈折率差により光学的に悪影響を及ぼす場合がある。
【００１６】
ＳｉＯ2スパッタ膜は、少なくともガラス基材表面の生体物質の分析または測定を行う領域に形成されていればよい。
【００１７】
本発明の生体物質固定用基材は、前記スパッタ膜と結合したシランカップリング剤層を有する。シランカップリング剤は、一分子中に、有機基等と反応または相互作用が可能な官能基と、加水分解性基とを有する含ケイ素化合物であり、一般的には、Ｙ−Ｒ−Ｓｉ−Ｚ3で表される（式中、Ｙは、有機基等と反応または相互作用が可能な官能基であり、Ｒは２価の炭化水素基であり、Ｚは加水分解性基であり、Ｚの一部が低級アルキル基である場合もある）。シランカップリング剤の加水分解性基と、ＳｉＯ2スパッタ膜の表面水酸基との反応により形成された共有結合を介して、シランカップリング剤は、前記スパッタ膜に結合する。あるいは、シランカップリング剤の加水分解性基が加水分解して生成した水酸基と、ＳｉＯ2スパッタ膜の表面水酸基とが形成する水素結合を介して、シランカップリング剤は、前記スパッタ膜に結合する。
【００１８】
シランカップリング剤の、有機基等と反応または相互作用が可能な官能基としては、生体物質と反応または相互作用可能である官能基、あるいは生体物質と接着性または反応性を有する物質と反応または相互作用可能である官能基である限り、特に制限はない。当該官能基の例としては、アミノ基、ＳＨ基、アルデヒド基、カルボキシル基、ハロゲン原子（例、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子）等が挙げられる。シランカップリング剤の加水分解性基としては、アルコキシル基（例、メトキシ基、エトキシ基など）が挙げられる。
【００１９】
シランカップリング剤の具体例としては、アミノ基を有するものとして、２−アミノエチルトリメトキシシラン、２−アミノエチルトリエトキシシラン、２−アミノエチルメチルジメトキシシラン、２−アミノエチルメチルジエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルメチルジエトキシシラン、４−アミノブチルトリメトキシシラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン、４−アミノブチルメチルジメトキシシラン、４−アミノブチルメチルジエトキシシラン、２−アミノウンデシルトリメトキシシラン、２−アミノウンデシルトリエトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチルアミノプロピル）メチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチルアミノプロピル）メチルジエトキシシラン、３−フェニルアミノプロピルトリメトキシシラン、３−フェニルアミノプロピルトリエトキシシランなど；ＳＨ基を有するものとして、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジエトキシシランなど；アルデヒド基を有するものとして、４−トリメトキシシリルブタナール、４−トリエトキシシリルブタナールなど；カルボキシル基を有するものとして、カルボキシメチルトリメトキシシラン、カルボキシメチルトリエトキシシランなど；ヨウ素原子を有するものとして、ヨードメチルトリメトキシシラン、ヨードメチルトリエトキシシラン、ヨードメチルメチルジメトキシシラン、ヨードメチルメチルジエトキシシラン、２−ヨードエチルトリメトキシシラン、２−ヨードエチルトリエトキシシラン、２−ヨードエチルメチルジメトキシシラン、２−ヨードエチルメチルジエトキシシラン、３−ヨードプロピルトリメトキシシラン、３−ヨードプロピルトリエトキシシラン、３−ヨードプロピルメチルジメトキシシラン、３−ヨードプロピルメチルジエトキシシラン、ｎ−ヨードブチルトリメトキシシラン、ｎ−ヨードブチルトリエトキシシラン、ｎ−ヨードブチルメチルジメトキシシラン、ｎ−ヨードブチルメチルジエトキシシラン、（ｐ−ヨードメチル）フェニルトリメトキシシラン、（ｐ−ヨードメチル）フェニルトリエトキシシラン、（ｐ−ヨードメチル）フェニルメチルジメトキシシラン、（ｐ−ヨードメチル）フェニルメチルジエトキシシラン、（ｍ−ヨードメチル）フェニルトリメトキシシラン、（ｍ−ヨードメチル）フェニルトリエトキシシラン、（ｍ−ヨードメチル）フェニルメチルジメトキシシラン、（ｍ−ヨードメチル）フェニルメチルジエトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルメチル〕トリメトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルメチル〕トリエトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルメチル〕メチルジメトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルメチル〕メチルジエトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルエチル〕トリメトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルエチル〕トリエトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルエチル〕メチルジメトキシシラン、〔（ヨードメチル）フェニルエチル〕メチルジエトキシシラン、２−（ヨードメチル）アリルトリメトキシシラン、２−（ヨードメチル）アリルトリエトキシシラン、２−（ヨードメチル）アリルメチルジメトキシシラン、２−（ヨードメチル）アリルメチルジエトキシシラン、２−（４−ヨードスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（４−ヨードスルホニルフェニル）エチルトリエトキシシラン、２−（４−ヨードスルホニルフェニル）エチルメチルジメトキシシラン、２−（４−ヨードスルホニルフェニル）エチルメチルジエトキシシラン、３−（４−ヨードスルホニルフェニル）プロピルトリメトキシシラン、３−（４−ヨードスルホニルフェニル）プロピルトリエトキシシラン、３−（４−ヨードスルホニルフェニル）プロピルメチルジメトキシシラン、３−（４−ヨードスルホニルフェニル）プロピルメチルジエトキシシランなど；臭素原子を有するものとして、ブロモメチルトリメトキシシラン、ブロモメチルトリエトキシシラン、ブロモメチルメチルジメトキシシラン、ブロモメチルメチルジエトキシシラン、２−ブロモエチルトリメトキシシラン、２−ブロモエチルトリエトキシシラン、２−ブロモエチルメチルジメトキシシラン、２−ブロモエチルメチルジエトキシシラン、３−ブロモプロピルトリメトキシシラン、３−ブロモプロピルトリエトキシシラン、３−ブロモプロピルメチルジメトキシシラン、３−ブロモプロピルメチルジエトキシシラン、ｎ−ブロモブチルトリメトキシシラン、ｎ−ブロモブチルトリエトキシシラン、ｎ−ブロモブチルメチルジメトキシシラン、ｎ−ブロモブチルメチルジエトキシシラン、（ｐ−ブロモメチル）フェニルトリメトキシシラン、（ｐ−ブロモメチル）フェニルトリエトキシシラン、（ｐ−ブロモメチル）フェニルメチルジメトキシシラン、（ｐ−ブロモメチル）フェニルメチルジエトキシシラン、（ｍ−ブロモメチル）フェニルトリメトキシシラン、（ｍ−ブロモメチル）フェニルトリエトキシシラン、（ｍ−ブロモメチル）フェニルメチルジメトキシシラン、（ｍ−ブロモメチル）フェニルメチルジエトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルメチル〕トリメトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルメチル〕トリエトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルメチル〕メチルジメトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルメチル〕メチルジエトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルエチル〕トリメトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルエチル〕トリエトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルエチル〕メチルジメトキシシラン、〔（ブロモメチル）フェニルエチル〕メチルジエトキシシラン、２−（ブロモメチル）アリルトリメトキシシラン、２−（ブロモメチル）アリルトリエトキシシラン、２−（ブロモメチル）アリルメチルジメトキシシラン、２−（ブロモメチル）アリルメチルジエトキシシラン、２−（４−ブロモスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（４−ブロモスルホニルフェニル）エチルトリエトキシシラン、２−（４−ブロモスルホニルフェニル）エチルメチルジメトキシシラン、２−（４−ブロモスルホニルフェニル）エチルメチルジエトキシシラン、３−（４−ブロモスルホニルフェニル）プロピルトリメトキシシラン、３−（４−ブロモスルホニルフェニル）プロピルトリエトキシシラン、３−（４−ブロモスルホニルフェニル）プロピルメチルジメトキシシラン、３−（４−ブロモスルホニルフェニル）プロピルメチルジエトキシシランなど；塩素原子を有するものとして、クロロメチルトリメトキシシラン、クロロメチルトリエトキシシラン、クロロメチルメチルジメトキシシラン、クロロメチルメチルジエトキシシラン、２−クロロエチルトリメトキシシラン、２−クロロエチルトリエトキシシラン、２−クロロエチルメチルジメトキシシラン、２−クロロエチルメチルジエトキシシラン、３−クロロプロピルトリメトキシシラン、３−クロロプロピルトリエトキシシラン、３−クロロプロピルメチルジメトキシシラン、３−クロロプロピルメチルジエトキシシラン、ｎ−クロロブチルトリメトキシシラン、ｎ−クロロブチルトリエトキシシラン、ｎ−クロロブチルメチルジメトキシシラン、ｎ−クロロブチルメチルジエトキシシラン、（ｐ−クロロメチル）フェニルトリメトキシシラン、（ｐ−クロロメチル）フェニルトリエトキシシラン、（ｐ−クロロメチル）フェニルメチルジメトキシシラン、（ｐ−クロロメチル）フェニルメチルジエトキシシラン、（ｍ−クロロメチル）フェニルトリメトキシシラン、（ｍ−クロロメチル）フェニルトリエトキシシラン、（ｍ−クロロメチル）フェニルメチルジメトキシシラン、（ｍ−クロロメチル）フェニルメチルジエトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルメチル〕トリメトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルメチル〕トリエトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルメチル〕メチルジメトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルメチル〕メチルジエトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルエチル〕トリメトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルエチル〕トリエトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルエチル〕メチルジメトキシシラン、〔（クロロメチル）フェニルエチル〕メチルジエトキシシラン、２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシラン、２−（クロロメチル）アリルトリエトキシシラン、２−（クロロメチル）アリルメチルジメトキシシラン、２−（クロロメチル）アリルメチルジエトキシシラン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルトリエトキシシラン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルメチルジメトキシシラン、２−（４−クロロスルホニルフェニル）エチルメチルジエトキシシラン、３−（４−クロロスルホニルフェニル）プロピルトリメトキシシラン、３−（４−クロロスルホニルフェニル）プロピルトリエトキシシラン、３−（４−クロロスルホニルフェニル）プロピルメチルジメトキシシラン、３−（４−クロロスルホニルフェニル）プロピルメチルジエトキシシランなどが挙げられる。
【００２０】
本発明の生体物質固定用基材において、ＳＨ基を有する化合物を固定可能な基材は有利な実施態様の一つである。この実施態様では、ＳＨ基を有する蛋白質等のＳＨ基を有する生体物質を固定することができ、また、生体物質を接着可能なチオール化合物を固定し、観察対象の生体物質の接着用の層を形成することもできる。
【００２１】
よって、有利な実施態様においては、シランカップリング剤層のシランカップリング剤成分は、ＳＨ基と反応性を有する官能基を含む。ＳＨ基と反応性を有する官能基とは、ＳＨ基と反応して共有結合（例えば、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合）を生じ得る官能基を指す。ＳＨ基と反応性を有する官能基としては、例えば、ハロゲン原子（好適には、ハロゲン原子は、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロアセチル基、酸ハライド基等の形態で含まれる）、ケト基、アルデヒド基、エポキシ基、マレイミド基などが挙げられる。なかでも、入手の容易さの観点からは、ハロゲン原子が好ましく、反応性の観点から、臭素原子、ヨウ素原子がさらに好ましい。ハロゲン原子を含むシランカップリング剤については上記例示した通りである。なお、この実施形態の生体物質固定用基材は、光学特性に特に優れており、様々な形状の基材に適用可能であるという利点を有する。
【００２２】
あるいは、別の有利な実施態様においては、シランカップリング剤層のシランカップリング剤成分が、アミノ基および／またはＳＨ基を含み、当該アミノ基および／またはＳＨ基に貴金属コロイドが結合する。貴金属コロイドの例としては、金コロイド、白金コロイド、銀コロイド等が挙げられ、アミノ基および／またはＳＨ基と結合できれば特にこれらに限定されないが、細胞毒性が無い金コロイドが好適である。アミノ基およびＳＨ基を有するシランカップリング剤については上記例示した通りである。アミノ基は、正電荷を有するために、貴金属コロイドを保持することが可能である。ＳＨ基は、貴金属と反応して結合を形成することにより、貴金属コロイドを保持することが可能である。そして、貴金属コロイドは、ＳＨ基と高い反応を有する。このため、この実施形態の生体物質固定用基材は、ＳＨ基との反応性が特に優れたものとなる
【００２３】
本発明の生体物質固定用基材は、例えば、アルカリ成分を含有するガラス基材の表面にＳｉＯ2をスパッタリングして、ＳｉＯ2スパッタ膜を形成する工程（スパッタリング工程）、および得られたＳｉＯ2スパッタ膜の表面をシランカップリング剤で処理する工程（シランカップリング剤処理工程）を実施して製造することができる。
【００２４】
ガラス基材にＳｉＯ2をスパッタリングする方法は公知であり、スパッタリング工程は、公知方法に準じて行うことができ、例えば、ＳｉＯ2をターゲットに用い、ＲＦマグネトロンスパッタリング法により行うことができる。スパッタリング条件は、所望の厚さのＳｉＯ2スパッタ膜が得られるように適宜設定すればよい。
【００２５】
シランカップリング剤処理工程は、公知方法に準じて行うことができる。
【００２６】
本発明の生体物質固定用基材では、ガラス基材からのアルカリ成分の溶出が抑制されているため、アルカリ成分による、シロキサン結合またはガラス−シランカップリング剤間の結合の切断がより起こりにくい。また、溶出したアルカリ成分による生体物質への悪影響が低減されている。従って、長期間安定に生体物質を基材に固定することができる。よって、例えば、細胞培養時には、細胞をより多く増殖させることができる。また、本発明の生体物質固定用基材は、光の透過性に優れるため、光を用いた生体物質の分析および測定に好適であり、カバーガラスとして構成することもできる。カバーガラスを構成するには、ガラス基材に、カバーガラスに適したもの（例、ショット社製Ｄ２６３、コーニング社製マイクロシート０２１１等）を選択すればよい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例および比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
参考例  ＳｉＯ2膜の形成法の違いによるＮａ溶出量の評価
まず、ＳｉＯ2膜の形成方法の違いによるアルカリ成分（Ｎａ）溶出抑制効果を、シランカップリング剤層を設けていない基材を用いて評価した。
【００２９】
（１）スパッタリング法によるＳｉＯ2膜の形成
水酸化カリウム水溶液および純水により洗浄した清浄なガラス基板上に、ＳｉＯ2ターゲットを用いてＲＦマグネトロンスパッタリング法にてＳｉＯ2膜を形成した。成膜条件として、背圧は３．０×１０-4Ｐａ以下、成膜温度は室温、スパッタ圧力は０．４Ｐａ、アルゴンガス流量は９５ｓｃｃｍ、酸素ガス流量は５ｓｃｃｍ、入射電力は１．５ｋＷとした。
【００３０】
（２）ゾルゲル法によるＳｉＯ2膜の形成
水酸化カリウム水溶液および純水により洗浄した清浄なガラス基板に、ゾルゲルコーティング液をフローコートした。ゾルゲルコーティング溶液は、テトラエチルオルトシリケート４ｇを、エタノール４０ｇおよび水２．６ｇの混合溶媒に加えた後、さらに塩酸０．２５ｇを添加して調製した。フローコートは、前記ガラス基板を垂直に立て掛け、ガラス基板上部に前記ゾルゲルコーティング溶液１ｍｌ程度を垂らす事により行った。コート後、２００℃で１０分間焼成して、ガラス基板上にＳｉＯ2膜を形成した。
【００３１】
（３）膜厚およびＮａ溶出量測定
各ガラス基板上に形成したＳｉＯ2膜厚は、接触式段差計にて測定した。各ガラス基板からのＮａ溶出量は、純水３０ｍｌをＳｉＯ2膜（ＳｉＯ2膜がない試料についてはガラス基板）に接触面積２８ｃｍ2で接触させ、その状態で温度９５℃で２４時間保持し、純水に溶出したＮａ量を炎光光度法により定量した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
表１より、スパッタリングにより形成したＳｉＯ2膜によれば、ゾルゲル法により形成したＳｉＯ2膜に比べ、小さい膜厚でＮａの溶出を驚くほどに抑制できることがわかる。
【００３４】
次に、シランカップリング剤層を設けた生体物質固定用基材を作製して、細胞培養実験を行った。
【００３５】
実施例１
参考例（１）と同様にして、ガラス基板上にＳｉＯ2膜を作製した。得られたガラス基板を、０．５ｗｔ％ヨードプロピルトリメトキシシランエタノール溶液に浸漬することにより、ＳｉＯ2膜上にシランカップリング剤層を設けた。こうして実施例１の生体物質固定用基材を得た。
【００３６】
比較例１
参考例（２）と同様にして、ガラス基板上にＳｉＯ2膜を作製した。得られたガラス基板を、０．５ｗｔ％ヨードプロピルトリメトキシシランエタノール溶液に浸漬することにより、ＳｉＯ2膜上にシランカップリング剤層を設けた。こうして比較例１の生体物質固定用基材を得た。
【００３７】
比較例２
水酸化カリウム水溶液および純水により洗浄した清浄なガラス基板を、０．５ｗｔ％ヨードプロピルトリメトキシシランエタノール溶液に浸漬することにより、ガラス基板上にシランカップリング剤層を設けた。こうして比較例２の生体物質固定用基材を得た。
【００３８】
上記作製した実施例１並びに比較例１および２の生体物質固定用基材を１５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、ウェル数１２の樹脂製マイクロウェルプレートのウェルにコーティング面が上となるように入れ、７０％エタノールで滅菌を行った。生体物質固定用基材が入った各ウェルに、培地で１×１０4個／ｍｌの濃度に調整したＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。培養後１１日目に生体物質固定用基材をＰＢＳで洗浄し、接着していない細胞を除いた後、ＤＡＰＩで細胞の核染色を行った。２０倍の対物レンズの蛍光顕微鏡でこれを観察し、同一視野面積内の細胞数を計測した。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
ガラス基材よりアルカリ成分が溶出すると、アルカリ成分によりシロキサン結合またはガラス−シランカップリング剤間の結合の切断が起こり、基材から細胞の一部がシランカップリング剤ごと脱離する。また、溶出したアルカリ成分によって、細胞の活性が低下し、細胞が死滅などにより基材から脱離する。よって、アルカリ成分の溶出が多いほど、培養される細胞数は少なくなる。表２の結果では、細胞数は、実施例１＞比較例１＞比較例２という順に多くなっており、本発明の生体物質固定用基材によれば、アルカリ成分の溶出が少なく、多くの細胞を培養できることがわかる。