(57)【要約】      （修正有）【課題】ビール、ソーセージ、またはチーズ、好ましくはチーズまたはチーズ由来の製品などの発酵食品における風味形成方法を提供する。【解決手段】カルボキシペプチダーゼを使用する発酵食品における風味形成方法。カルボキシペプチダーゼ活性の少なくとも９０％が単一酵素により惹起され、また、エンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比が、０．０１未満、好ましくは０．００１未満、最も好ましくは０．０００５未満であるカルボキシペプチダーゼの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシペプチダーゼが使用される、発酵食品における風味形成方法。
【請求項２】
前記発酵食品が、ビール、ソーセージ、またはチーズ、好ましくはチーズまたはチーズ由来の製品である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カルボキシペプチダーゼ活性の少なくとも９０％が単一酵素により惹起される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
エンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比が、０．０１未満、好ましくは０．００１未満、最も好ましくは０．０００５未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記カルボキシペプチダーゼが、ＣＰＤ−１、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＰＤ−１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発酵食品の調製における、０．０１未満のエンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比を有するカルボキシペプチダーゼの使用。
【請求項７】
チーズまたはチーズ由来の製品の調製における、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＥＭＣ（酵素変性チーズ）の調製における、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
風味発生のための、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チーズ熟成に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品の風味は、消費者にとって重要な属性の１つである。発酵製品（たとえば酪農製品）では、風味は、微生物の酵素活性により乳成分から誘導される。たとえばチーズでは、種々の風味化合物が、不可欠なものとして同定されており、それらのうちの多くは、カゼイン分解から誘導される。脂肪分解などの他の酵素過程も関与しており、最も顕著なのは、真菌が熟成過程に関与するチーズ（たとえば、カマンベールチーズやロックフォールチーズ）の場合である。それに加えて、ラクトース発酵がプロピオン酸などの風味化合物をもたらす可能性もある（スミット（Ｓｍｉｔ）ら著、国際食品研究（Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．）（２０００年）第３３巻、１５３−１６０頁）。
【０００３】
熟成中のチーズにおけるタンパク質加水分解は、質感や風味の形成にきわめて重要な役割を果たし、いくつかの総説の主題になっている（たとえば、マクスウィーニー（ＭｃＳｗｅｅｎｅｙ）およびスーザ（Ｓｏｕｓａ）著、乳（Ｌａｉｔ）（２０００年）第８０巻、２９３−３２４頁を参照されたい）。タンパク質加水分解は、タンパク質網状構造の破壊、遊離したカルボキシル基やアミノ基による水結合を介するａｗの減少、およびｐＨの増大により、チーズマトリックスの質感変化に寄与し、咀嚼中における呈味化合物の放出を促進する（スーザ（Ｓｏｕｓａ）ら著、国際酪農誌（Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）（２００１年）、第１１巻、３２７−３４５頁）。それは、ペプチドおよび遊離アミノ酸の生成を介して、さらには二次的異化変化（すなわち、アミノ基転移、脱アミノ化、脱カルボキシル化、脱硫化、芳香族アミノ酸の異化、およびアミノ酸と他の化合物との反応）に供される基質（アミノ酸）の放出を介して、チーズの風味および異風味（たとえば苦味）に直接寄与する。タンパク質加水分解の速度およびパターンは、チーズ内の位置により左右される可能性がある。
【０００４】
チーズ熟成は、解糖とタンパク質加水分解と乳成分の脂肪分解との間の複合的なかつバランスのとれた反応を必要とする時間のかかる過程である。ほとんどのチーズでは、細菌酵素がこの過程で主要な役割を果たす。チーズ中の細菌酵素含量の変化がチーズ熟成の速度およびその最終的風味に直接影響を及ぼすことはよく知られている（クライン（Ｋｌｅｉｎ）およびロータル（Ｌｏｒｔａｌ）著、国際酪農誌（Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）（１９９９年）第９巻、７５１−７６２頁）。チーズ熟成に影響を及ぼす方法は、増殖および有意レベルの乳酸の産生を行うことはできないが依然としてチーズ熟成中に活性熟成酵素を供給する全乳酸菌を添加することによりチーズカード中の細菌酵素プールを増大させることである。スターターは、通常、弱化され、弱力化スターターと呼ばれる。
【０００５】
チーズ熟成は、時間のかかる過程であるので、コストもかかる。チーズは、熟成中、温度および湿度が正確に規定された条件下で数週間〜数ヶ月にわたり貯蔵する必要がある。熟成時間は、３週間（たとえば、モッツァレッラ）から２年超（たとえば、パルメザン、エクストラマチュアチェダー）まで各種チーズごとに著しく異なる。チーズ熟成の促進をもたらすと思われる過程はいずれも、同一量のチーズがより短い期間で製造しうるという経済的観点から興味深い。
【０００６】
チーズにおけるタンパク質加水分解は、非常に複雑な過程であり、種々の起源に由来するプロテアーゼが関与する（総説については、たとえば、フォックス（Ｆｏｘ）およびマクスウィーニー（ＭｃＳｗｅｅｎｅｙ）著、国際食品総説（Ｆｏｏｄ  Ｒｅｖ．Ｉｎｔ）（１９９６年）第１２巻、４５７−５０９頁を参照されたい）。そのようなプロテアーゼは、チーズ製造中に使用された凝固剤（たとえば、キモシン、ペプシン、または真菌酸性プロテイナーゼ）、乳自体のタンパク質（たとえばプラスミン）、スターター細菌により提供されるプロテアーゼ、非スターター外来微生物叢由来のプロテアーゼ、第２の接種材（ｉｎｏｃｃｕｌｕｍ）由来のプロテアーゼ（いくつかの種、たとえば、Ｐ．ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、Ｐカマンベルティ（Ｐ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、Ｂｒ．リネンス（Ｂｒ．Ｌｉｎｅｎｓ））、弱力化細菌細胞、および外因性プロテアーゼである。弱力化細胞および外因性プロテアーゼは、チーズ熟成の促進を引き起こす最近のツールである。遊離アミノ酸の生成は、チーズ熟成の促進に重要な工程である。遊離アミノ酸は全チーズ風味に寄与するが、それらの寄与は比較的小さい。アミノ酸は、チーズ中に存在する微生物により風味化合物に後続的に変換される前駆体である。したがって、アミノ酸の利用可能性は、チーズの風味形成つまりチーズの熟成に重要である。
【０００７】
チーズ風味を必要とする消費者向け加工食品におけるナチュラルチーズの使用に代わる主要な代替物は、高強度チーズ風味濃厚物、たとえば、酵素変性チーズ（ＥＭＣ）、チーズパウダー、およびチーズフレーバーである（キルコーリー（Ｋｉｌｃａｗｌｅｙ）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、およびフォックス（Ｆｏｘ）著、国際酪農誌（Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）（１９９８年）、第８巻、１−１０頁）。チーズフレーバーは、チーズ自体に使用するために製造されるものではなく、従来的にナチュラルチーズを含有する他の食品で利用するために製造される。チーズは、伝統的には、風味、外観、および質感を強化するために噴霧乾燥調製物として製品に添加される。使用されるチーズの量はさまざまであり、製品の全体的な風味および品質は、使用されるチーズのタイプに依存する。風味を強化するために酵素処理されたチーズまたはそのチーズのプロファイルの有意部分は、ＥＭＣであるとみなれされ、それは、費用効果的で栄養価が高くかつ自然な形態で強いチーズ感を食品製造業者に提供する（キルコーリー（Ｋｉｌｃａｗｌｅｙ）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、およびフォックス（Ｆｏｘ）著、国際酪農誌（Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）（１９９８年）、第８巻、１−１０頁）。ＥＭＣは、ナチュラルチーズのものとかなり異なることもある風味プロファイルを有するが、好適な無味のまたはほぼ無味のベースで希釈すると最終製品において所望のチーズ感を提供する。ＥＭＣ技術の基本は、好適な基質から典型的なチーズ風味を生成する特定酵素の使用である。プロテアーゼ（この用語はエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼの両方を含む）は、ＥＭＣ製造における重要な酵素である。それらの役割は、チーズ熟成のときと類似している。ＥＭＣにおけるタンパク質加水分解は、顕著であり、高レベルの香味感と苦味感の両方を生成し；後者は、タンパク質加水分解の制御、特定のエキソペプチダーゼの添加、またはマスキング剤（たとえば、マチュアチーズもしくはグルタミン酸一ナトリウム）の組込みのいずかにより、防止、除去、またはマスキングすることが可能である（ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）およびキルコーリー（Ｋｉｌｃａｗｌｅｙ）著、ＩＤＦ広報（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＤＦ）（２００２年）、第３７１巻、１０−１５頁）。
【０００８】
多くのプロテアーゼがチーズ風味の生成に関与する。チーズ（またはＥＭＣのようなチーズ由来の製品）に適した風味を生成するには、関与するプロテアーゼのタンパク質分解活性の微妙なバランスが必要である。なんらかのアンバランスを生じると、苦味形成などの望まれない風味が容易に生じるであろう。とくに、チーズ（またはＥＭＣ）における苦味の形成については、詳細に報告され実証されている（たとえば、ルミュー（ＬｅＭｉｅｕｘ）およびシマール（Ｓｉｍａｒｄ）著、乳（Ｌａｉｔ）（１９９１年）第７１巻、５９９−６３６頁；ルミュー（ＬｅＭｉｅｕｘ）およびシマール（Ｓｉｍａｒｄ）著、乳（Ｌａｉｔ）（１９９２年）第７２巻、３３５−３８２頁を参照されたい）。したがって、熟成過程を促進するためのチーズ用またはＥＭＣ用のプロテアーゼの生成は、非常に精巧かつ複雑な過程である。エキソプロテアーゼは、苦味の形成を引き起こす傾向がより低いので、エンドプロテアーゼよりも好ましい。エンドプロテアーゼは、そのような苦味を容易に導入することが知られているので、使用しないほうが好ましい。しかしながら、プロテアーゼなどのチーズ熟成用酵素に対して明確な工業的需要が存在し、長年にわたりいくつかの市販のプロテアーゼ調製物が市場に導入されてきた。入手可能な市販品についての概説は、いくつかの論文に与えられている（ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、ヴァンデンバーク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ）、およびロー（Ｌａｗ）著、ＩＤＦ広報（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＤＦ）（２００２年）第３７１巻、１６−１９頁；キルコーリー（Ｋｉｌｃａｗｌｅｙ）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、およびフォックス（Ｆｏｘ）著、食品生物工学（Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）（２００２年）第１６巻、２９−５５頁；キルコーリー（Ｋｉｌｃａｗｌｅｙ）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、およびフォックス（Ｆｏｘ）著、酵素微生物技術（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）（２００２年）第３１巻、３１０−３２０頁）。例としては、真菌種に由来する酵素調製物（たとえば、限定されるものではないが、オランダ国のクエスト（Ｑｕｅｓｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製のバイオプロテアーゼＰコンク（Ｂｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  Ｃｏｎｃ）およびバイオプロテアーゼＡコンク（Ｂｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａ  ｃｏｎｃ）、天野（Ａｍａｎｏ）製のプロテアーゼＭ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ）およびプロテアーゼＡ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａ）ならびに酸性プロテアーゼＡ（Ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａ）、バイオキャタリスト（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）製のプロモド２１５（Ｐｒｏｍｏｄ  ２１５）、シュテルン（Ｓｔｅｒｎ）製のシュテルンツィームＢ５０２６（Ｓｔｅｒｎｚｙｍｅ  Ｂ５０２６）、デンマーク国のノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製のフレーバーザイムＭＧ／Ａ（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  ＭＧ／Ａ））および細菌種に由来する酵素調製物（たとえば、限定されるものではないが、デンマーク国のノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製のプロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）およびニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）、天野（Ａ���ａｎｏ）製のプロテアーゼＮ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｎ）、バイオキャタリスト（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）製のプロモド２４Ｐおよび２４Ｌ（Ｐｒｏｍｏｄ  ２４Ｐ  ａｎｄ  ２４Ｌ）、オランダ国のディーエスエム（ＤＳＭ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製のプロテアーゼＢ５００（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｂ５００）、およびフランス国のロディア・フーズ（Ｒｈｏｄｉａ  Ｆｏｏｄｓ，Ｆｒａｎｃｅ）製のプロテアーゼ２００Ｌ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ２００Ｌ））が挙げられる。プロテアーゼは、特定のプロテアーゼの存在および／またはこれらのプロテアーゼが特定の製品中に存在する比率に関連して組成が著しく異なる。先に参照したキルコーリー（Ｋｉｌｃａｗｌｅｙ）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）、およびフォックス（Ｆｏｘ）の論文は、ほとんどの市販のプロテアーゼ製品がエンドペプチダーゼ活性とエキソペプチダーゼ活性との混合であることを明確に示している。いくつかの製品は、エキソペプチダーゼ活性のみを含むように開発されている。食品用途では、これらは、常にアミノペプチダーゼであり、例としては、ＤＢＳ５０およびＤＢＰ２０（フランス国のロディア（Ｒｈｏｄｉａ，Ｆｒａｎｃｅ）製）、コロラーゼＬＡＰ（Ｃｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ）（ドイツ国のローム（Ｒｏｈｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製）、フレーバーザイムＭＧ／Ａ（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  ＭＧ／Ａ）（デンマーク国のノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製）、アクセルザイムＡＰ（Ａｃｃｅｌｌｅｒｚｙｍｅ  ＡＰ）（オランダ国のディーエスエム（ＤＳＭ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製）、およびペプチダーゼＲ（日本国の天野（Ａｍａｎｏ，Ｊａｐａｎ）製）が挙げられる。アミノペプチダーゼは、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンなどのチーズ風味の重要な前駆体であるアミノ酸を放出すべく開発され選択される。いくつかの特許出願（たとえば国際公開第９６／３８５４９号パンフレット）には、チーズ熟成を促進するために使用しうるアミノペプチダーゼ（エンドプロテアーゼを含まない）の調製および使用についての記載がある。乳カゼインペプチドに由来する苦味ペプチドの苦味を低減させるために単一のコムギカルボキシペプチダーゼを使用するという記載がなされているが（ウメツ（Ｕｍｅｔｓｕ）、マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）、およびイチシマ（Ｉｃｈｉｓｈｉｍａ）著、農業食品化学誌（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ）（１９８３年）第３１巻、５０−５３頁）、チーズ熟成の促進に有用である単一のカルボキシペプチダーゼ活性を含むプロテアーゼ調製物を使用するという記載はなされていない。カルボキシペプチダーゼ活性を含む市販のプロテアーゼ調製物は公知であるが（たとえば、バイオキャタリスト（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）製のフレーバープロ１９２（ＦｌａｖｏｒＰｒｏ  １９２））、これらは、常に、カルボキシペプチダーゼ活性のほかにアミノペプチダーゼ活性とエンドプロテアーゼ活性とおそらく他のプロテアーゼ活性との混合を含む。
【０００９】
チーズ熟成のためのプロテアーゼ添加は、チーズ調製の種々の段階で実施可能である。好ましくは、酵素は、凝固剤（たとえばキモシン）の添加前または添加と同時にチーズ乳に添加される。この時点で添加することにより、チーズ全体にわたる酵素の均一分布が確保される。他の選択肢として、より後の段階で、たとえば、チェダーチーズ製造において加塩段階中に、酵素を添加することも可能であるが、これは、チーズ中の不均一な酵素分布およびいわゆるホットスポットの生成の危険性を生じる。それが理由で、チーズ乳に酵素を添加することが好ましい。欠点は、大多数の酵素（６０〜９０％）が、多くの場合、チーズカードに組み込まれずにホエー画分中に廃棄されて望ましくない（タンパク質加水分解）を引き起こす可能性があり、それにより、ホエーがさらなる用途にそれほどまたはまったく適さなくなる点である。とくに、ｐＨ５〜７で顕著な活性を有するエンドプロテアーゼが、そのような望ましくない副活性の原因になる可能性があるだけでなく、このｐＨ範囲で最適な活性を有することの多いアミノペプチダーゼが、たとえば望ましくない風味の形成を引き起こす可能性もある。チーズ乳にとくにエンドプロテアーゼを添加したときに生じる可能性のある他の問題点は、凝固過程を妨害して特定の加水分解を引き起こし、チーズ収量の低下を招く点である。さらに、アミノペプチダーゼは、チーズ製造の通常のｐＨ範囲であるｐＨ６〜７において通常は十分に活性であるので、収量損失を引き起こす可能性もある。チーズ製造中のｐＨ値ではまったくまたはほとんど活性でないがチーズ中で活性になるプロテアーゼが好ましい。なぜなら、それらはチーズ製造プロセスを妨害しないであろうし、ホエー中において望ましくない反応を引き起こすこともないであろうからである。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明によれば、カルボキシペプチダーゼを用いることにより、チーズ熟成の促進を達成することが可能である。カルボキシペプチダーゼ調製物は、エンドプロテアーゼ活性を含まないものでなければならず、かつ少なくとも、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびメチオニンなどのチーズの風味形成に重要なアミノ酸を放出しうるものでなければならない。カルボキシペプチダーゼは、１〜２５００ＣＰＧ／ｇ基質（たとえばチーズ乳）、好ましくは１〜２５０ＣＰＧ／ｇ基質、またはより好ましくは１〜２５ＣＰＧ／ｇ基質の活性レベルで添加される。ＣＰＧ単位は、実施例１に定義されている。プロテアーゼ活性は、ｐＨ６．０、４℃で１時間かけてカゼイン（６ｇ／Ｌのアッセイ溶液）を加水分解することにより測定される。１ＰＵは、（２８０ｎｍ）吸光度が１μＭ）のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎ）溶液に等しい（ＴＣＡ可溶性）加水分解物を１分間で生成する酵素の量である。カルボキシペプチダーゼ調製物は、調製物中のエンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）／カルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）の比が０．０１未満、好ましくは０．００１未満、最も好ましくは０．０００５未満である場合、エンドプロテアーゼ活性を含まないと定義される。カルボキシペプチダーゼは、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質から天然のアミノ酸の大多数に放出しうる広域カルボキシペプチダーゼである。広域カルボキシペプチダーゼは、本出願の実施例３に記載の方法により検出可能な量で天然のアミノ酸の少なくとも８０％を放出しうる酵素として定義される。好ましくは、カルボキシペプチダーゼ調製物は、実施例１に記載されるように測定されるカルボキシペプチダーゼ活性の９０％が単一酵素により惹起されるカルボキシペプチダーゼを含有するが、カルボキシペプチダーゼの組合せも許容される。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株由来の精製カルボキシペプチダーゼＣＰＤ  Ｉ（ＰＥＰＧ）の使用がそれ自体でチーズ熟成を十分に促進しうることを見いだした。好適なアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の例は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．オリザエ（Ａ．Ｏｒｙｚａｅ）、およびＡ．ソヤエ（Ａ．ｓｏｊａｅ）である。好ましくは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＣＰＤ１が使用される。この酵素は、報告されており（ダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）、リバドー・デューマス（Ｒｉｂａｄｅａｕ−ｄｕｍａｓ）、およびブレッダム（Ｂｒｅｄｄａｍ）著、応用環境微生物学（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）（１９９２年）第５８巻、２１４４−２１５２頁）、配列決定がなされている（スヴェンセン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ）およびダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）著、生物化学生物物理紀要（Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）（１９９８年）第１３８７巻、３６９−３７７頁）。カルボキシペプチダーゼはまた、ＥＭＣにおいてチーズ風味形成を促進するために使用することも可能である。カルボキシペプチダーゼの他の好ましい用途は、チーズのときと同様に、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンのような遊離アミノ酸さらにはメチオニンのような硫黄含有アミノ酸の利用可能性がとくに重要であることが知られている発酵ソーセージやビールのような発酵食品における風味形成の分野である。
【００１２】
実施例１
ＣＰＤ−Ｉ（ＰＥＰＧ）のクローニング
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のカルボキシペプチダーゼＩ（ＰＥＰＧ）のアミノ酸配列は、報告されている（スヴェンセン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ）およびダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）著、生物化学生物物理紀要（Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）（１９９８年）第１３８７巻、３６９−３７７頁）。当業者に公知の方法により、縮重ＰＣＲプライマーをデザインしてアスペルギルス・ニガーＮ４００（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｎ４００）（ＣＢＳ１２０．４９）由来のゲノムライブラリーからｐｅｐＧ遺伝子をクローニングした。遺伝子をグルコアミラーゼプロモーターの３’末端に融合させた。構造遺伝子をグルコアミラーゼプロモーターに融合させる類似の例が報告されている（欧州特許出願公開第０４２０３５８Ａ号明細書、欧州特許出願公開第０４６３７０６Ａ号明細書、および国際公開第９９／３８９５６号パンフレット）。第１に、遺伝子を含有するゲノム断片からｐｅｐＧ構造遺伝子をＰＣＲ増幅し精製した。第２に、ｐｅｐＧ構造遺伝子の５’末端にオーバーラップするプライマーを３’末端で用いて、ｇｌａＡ遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲ増幅した。第３に、ｇｌａＡプロモーターの５’側のオリゴヌクレオチドプライマーと、反対方向のｐｅｐＧの停止コドンにオーバーラップするオリゴヌクレオチドと、を用いて、融合ＰＣＲにより、２つのＰＣＲ断片を融合した。第４に、得られた融合断片をＡニガー（Ａ  ｎｉｇｅｒ）発現ベクターｐＧＢＴＯＰ７（国際公開第９９／３８９５６号パンフレット）中にクローニングし、ｇｌａＡプロモーターとｐｅｐＧ構造遺伝子とｇｌａＡターミネーターとを含有する融合プラスミドを得た。国際公開第９９／３８９５６号パンフレットに基本的に記載されているように、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＸｈｏ  Ｉで消化されたｐＧＢＢＡＡＳ−１と共に、アスペルギルス・ニガーＩＳＯ５０２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＩＳＯ５０２）にコトランスフォームした。公知の技術を用いて、アセトアミドプレート上での増殖に供すべく選択された形質転換体をコロニーＰＣＲにより分析し、ｐｅｐＧ発現カセットの存在を確認した。遺伝子配列を決定した。また、ゲノムＤＮＡ配列、コード配列、および対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１、２、および３として与える。先に記載した方法（国際公開第９９／３８９５６号パンフレット）を用いて、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｐｅｐＧ形質転換体を振盪フラスコ中で培養した。３４℃で６日間増殖させた後、活性に関して上清を分析した。４５ｍＭのＮａ−アセテート（ｐＨ４．５）と０．９５ｍＭのＥＤＴＡと０．２ｍＭのＦＡ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（バッケム（Ｂａｃｈｅｍ）から入手）とを含有する９９０μｌの溶液に１０μｌの培養物上清を添加することにより、ＰＥＰＧの活性を決定した。３３７ｎｍにおいて光学濃度の変化を追跡した。光学濃度の減少は、ＰＥＰＧ活性の尺度である。１酵素単位（１ＣＰＧ）は、試験条件下で３３７ｎｍにおける光学濃度を毎分１吸光度単位だけ減少させるのに必要な酵素の量として定義される。１ｍｌあたり最高ＣＰＧ値を示す形質転換体をＰＥＰＧ発現に供すべく選択した。
【００１３】
実施例２
ＰＥＰＧの精製
ＣＡＢＳ−セファロース工程を省略した以外は記載の方法（ダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）、リバドー・デューマス（Ｒｉｂａｄｅａｕ−ｄｕｍａｓ）、およびブレッダム（Ｂｒｅｄｄａｍ）著、応用環境微生物学（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）（１９９２年）第５８巻、２１４４−２１５２頁）に従って、酵素を発現するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の培養物ブロスからＰＥＰＧを精製した。最終的な実質的に精製された酵素の活性は、実施例１に記載した活性測定を用いて１５０ＣＰＧ／ｍｌであることが確証された。エンドプロテアーゼ活性は、検出限界未満（＜０．６ＰＵ／ｍｌ）であった。ＰＥＰＧの生成および精製を繰り返して、６５０ＣＰＧ／ｍｌのカルボキシペプチダーゼ活性と２．２５ＰＵ／ｍｌのエンドプロテアーゼ活性とを含む最終調製物を得た。後者の調製物のＰＵ／ＣＰＧ比は、０．００３であった。
【００１４】
実施例３
ＰＥＰＧの基質特異性の決定
基質Ｚ−Ａｌａ−Ｘ〔式中、Ｚは、ベンジルオキシカルボニルであり、そしてＸは、アミノ酸（一文字コード）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙのうちのいずれかである〕を用いて、精製されたＰＥＰＧの基質特異性を決定した。Ｘ＝ＱまたはＴであるときの基質は、ペプスキャン（ＰＥＰＳＣＡＮ）（オランダ国）から入手したが、それ以外の基質はすべて、バッケム（Ｂａｃｈｅｍ）から入手した。３ｍＭのペプチド基質を含有する溶液中、ｐＨ４．０かつ４０℃で、酵素特異性を決定した。５μｌの酵素溶液（４４０単位／ｍｌ）を９５μｌの反応混合物に添加することにより、反応を開始させた。ｔ＝０分で各基質のサンプルをすばやく採取してＴＬＣプレート（メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＨＰＴＬＣ［プレート２０×１０シリカゲル６０）上にスポッティングし、そして４５分間インキュベートした後、他のサンプルを採取して同様に同一のＴＬＣプレート上にスポッティングした。対照として、酵素を含まない基質溶液を同一のＴＬＣプレート上にスポッティングした。即使用可能なニンヒドリンスプレー（アクロス（ＡＣＲＯＳ））でスプレーすることにより、遊離アミノ基に関してプレートを染色した。酵素活性は、−（活性なし）、±（不十分な活性）から＋（少し活性）さらには＋＋＋＋＋（非常に高い活性）まで等級付けられる。ｔ＝０のサンプルですべての基質がすでに変換されていた場合、特定の基質に対して非常に高い活性（＋＋＋＋＋）であると評価した。結果は以下のとおりである。
【００１５】
【表１】
2011172591.tif 000002
【００１６】
表は、クローニングされ精製されたＰＥＰＧが１９９２年にダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）により記載されたものに類似しているがいくつかの予想外の差異が存在することを示している。酵素は、疎水性アミノ酸Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＶを優先的に遊離する。しかしながら、クローニングされた遺伝子の優先度は、ダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）らにより記載されたもの（Ｉに対して最も高い優先度を有する）と異なり、クローニングされた酵素は、Ｌ、Ｍ、およびＶに対して最も高い活性を示す。さらに、精製された酵素は、むしろＫに対して活性であり、たとえば、ＡおよびＤに対するよりも活性であり、ダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）らにより記載されたデータとは異なる。明らかに、カルボキシペプチダーゼは、非常に広い基質特異性を有し、おそらく試験しなかったＣ以外のすべてのアミノ酸を取り扱うことが可能である。
【００１７】
実施例４
ミニチーズ（チェダータイプ）におけるＰＥＰＧによるチーズ熟成促進の実証
シャキール・ウル・レーマン（Ｓｈａｋｅｅｌ−Ｕｒ−Ｒｅｈｍａｎ）ら（乳（Ｌａｉｔ）、第７８巻（１９９８年）、６０７−６２０頁の「ミニチュアチーズ製造用プロトコル」）により記載されているように、ミニチュアチーズを作製した。６３℃で３０分間加熱することにより、生牛乳を低温殺菌した。低温殺菌乳を広口プラスチック遠心ボトルに移し（１ボトルあたり２００ｍＬ）、３１℃に冷却した。その後、０．７２ｍｌのスターター培養物ＤＳ  ５ＬＴ１（オランダ国デルフトのディーエスエム・ヒスト・ベーフェー（ＤＳＭ  Ｇｉｓｔ  Ｂ．Ｖ．，Ｄｅｌｆｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を遠心ボトル中の２００ｍｌの低温殺菌乳のそれぞれに添加して、乳を２０分間熟成した。次に、ＣａＣｌ２（熟成乳２００ｍＬあたり１３２μＬの１ｍｏｌ．Ｌ−１溶液）を添加し、続いて、凝固剤（１ｍｌあたり０．０４ＩＭＣＵ）を添加した。実験がＰＥＰＧの使用を伴う場合、この酵素を凝固剤と一緒に添加した。凝塊が生成されるまで、４０〜５０分間にわたり乳溶液を３１℃に保持した。伸張ワイヤのカッターにより手動で凝塊をカットして、１ｃｍ間隔でフレーム上に配置した。ヒーリングを２分間行い、続いて、穏やかに１０分間攪拌した。その後、カード／ホエー混合物を連続攪拌した状態で、３０分間かけて温度を３９℃に徐々に上昇させた。６．２のｐＨに達したときに、室温においてカード／ホエー混合物を１，７００ｇで６０分間遠心した。ホエーを排除し、カードを３６℃の水浴中に保持した。ｐＨが５．２〜５．３に低下するまで、１５分間ごとにチーズを反転させ、次に、室温において１，７００ｇで２０分間遠心した。製造後、チーズを１２℃で熟成し、そして熟成の３週間後および６週間後、３名の最小審査員によって官能分析を行った。
【００１８】
チーズ乳に対していくつかの用量のＰＥＰＧを使用した。すなわち、０（＝対照）、５、５０、および５００ＣＰＧ／２００ｍｌチーズ乳。ＰＥＰＧの添加は、明らかに、風味強度の全体的増加を引き起こし、対照チーズと比較してより成熟した味をもたらした。このことは、すべてのＰＥＰＧ添加レベルで言えることであったが、最低添加レベル（５ＣＰＧ／２００ｍｌ）では、明瞭な効果を得るために６週間の熟成が必要であった。他の用量（５０および５００ＣＰＧ／ｍｌ）では、味に及ぼす効果は、３週間の熟成の後、すでに明瞭であった。結果は、明らかに、ＰＥＰＧがチーズ風味形成を促進し、効果が用量依存性であり、かつ異味が形成されないことを示した。
【００１９】
実施例５
ゴーダタイプチーズにおけるＰＥＰＧによるチーズ熟成促進の実証
スターター培養物デルフォテック（ＤｅｌｖｏＴｅｃ）（登録商標）ＤＸ３１Ｄ（ディーエスエム（ＤＳＭ）から入手）およびマキシレン６００（Ｍａｘｉｒｅｎ６００）（ディーエスエム（ＤＳＭ）から入手；５５ＩＭＣＵ／ｌ乳；ディーエスエム（ＤＳＭ））を凝固剤として用いて、当業者に公知の標準的ゴーダチーズ製造プロトコルにより、２００Ｌバット中でゴーダチーズを調製した。カゼインに対して約０．９の脂肪比になるように生乳を標準化し、７２℃で１５秒間低温殺菌した。マキシレン（Ｍａｘｉｒｅｎ）の添加の直前に２５ＣＰＧ／ＬのレベルでＰＥＰＧを添加した。同一の製造方法を用いて同一の乳バッチから対照チーズを調製したが、ただし、ＰＥＰＧは添加しなかった。凝固後、カードをカットし、低速度で２０分間攪拌した。これに続いて、ホエーの半分を温水（初期体積の４０％）で置き換えて、温度を３１℃から３６℃に上昇させた。この後、カードが排液に十分な硬さになるまで、速度を増加させながらカード／ホエー混合物をさらに３０〜４０分間攪拌した。カードを箍締めして３０分間放置した後、５ｋｇモールドに入れた。圧力を増加させながら約４時間にわたりチーズをプレスし、その後、チーズを一晩静置した。翌朝、それらをブライン中に２４時間配置した。チーズを乾燥させた後、チーズに保護コーティングを施して、チーズの熟成期間を開始した。この期間中、それらを１５℃、約８０％の相対湿度で保持した。熟成期間中、チーズを定期的に裏返してコーティングを施した。６週間および３ヶ月間の熟成を行った後、最小人数８名よりなる訓練を受けた審査員により、チーズの官能特性を評価した。６週間後、ＰＥＰＧを含有するチーズは、対照チーズと比較して、甘味に関して有意に高い評点を得た。３ヶ月間の熟成の後、ＰＥＰＧを含有するチーズは、対照チーズと明らかに異なり、有意により高い風味（さらには明らかに異なるクリーミー性を示した。ＰＥＰＧを含有するチーズのチーズ風味は、対照チーズと比較して、心地よくかつより成熟したものであった。実験は、明らかに、ＰＥＰＧがチーズ風味形成を促進しかつ異味が形成されないことを示した。
【００２０】
実施例６
ＰＥＰＧのｐＨプロファイルの実証
種々のｐＨの緩衝液中で酵素反応を測定した。ｐＨ２、３、および４の緩衝液は、０．１Ｍリン酸ナトリウムと０．０５Ｍクエン酸と０．０５Ｍ酢酸とを含有し；ｐＨ４、５、および６の緩衝液は、０．０５Ｍリン酸ナトリウムと０．０５Ｍ酢酸と０．０５Ｍトリスとを含有していた。４Ｍ  ＨＣｌまたは４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを適正値に調整した。基質溶液は、メタノール中に８ｍＭ  ＦＡ−Ｐｈｅ−Ａｌａを含有していた。アッセイ溶液は、９６５μｌの緩衝液と２５μｌの基質溶液と１０μｌの精製された酵素とを含有していた。反応を２５℃で行い、３３７ｎｍにおける吸収の変化を１０分間追跡した。吸光度変化から相対活性を算出した。ｐＨが４のときの測定は２つの異なる緩衝液中で二重反復方式で行ったが、それ以外の結果は、２つの個別の測定の平均である。結果を図１に示す。
【００２１】
図１のプロファイルは、酵素がｐＨ４のｐＨ最適値を有することを示している。最適値は、明らかに、ダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）（ダル・デガン（Ｄａｌ  Ｄｅｇａｎ）、リバドー・デューマス（Ｒｉｂａｄｅａｕ−ｄｕｍａｓ）、およびブレッダム（Ｂｒｅｄｄａｍ）著、応用環境微生物学（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）（１９９２年）第５８巻、２１４４−２１５２頁およびそこに引用されている文献）により記載されたカルボキシペプチダーゼに対する３．１〜３．４のｐＨ最適値よりも高い。
【００２２】
実施例７
酵素変性チーズ調製物向けのカルボキシペプチダーゼの使用
スミット（Ｓｍｉｔ）ら（（１９９５年）、「Ｃｈ−ｅａｓｙモデル：チーズ熟成研究のためのチーズベースモデル」、ペ・エティエヴァン（Ｐ．Ｅｔｉｅｖａｎｔ）、バイオフレーバー（Ｂｉｏｆｌａｖｏｕｒｓ）中、（１８５−１９０頁）により基本的に記載されているように、９０％の製造後５週間のゴーダチーズと１０％のオールドゴーダチーズとの混合物からチーズペーストを調製した。
【００２３】
カルボキシペプチダーゼを用いるＥＭＣの調製
ヤングゴーダチーズ（製造後約６週間）を地元のスーパーマーケットから購入し、細かくすりつぶした。約５０％の最終水含量になるようにミリＱ水をすりつぶしたチーズに添加し、混合後、チーズペーストを２００グラムずつに分けて個別の容器中に分配した。混合物を８０℃で５分間加熱し、微生物の増殖を排除した。容器のうちの１つを分析にかけて、細菌、酵母、および糸状菌のプレートカウント分析により微生物の増殖の排除を確認した。他の容器をさらなる使用に供すべく４℃で貯蔵した。プレートカウント分析により微生物の増殖がないことが確認された場合、残りの容器中に調製されたチーズペーストを使用した。
【００２４】
添加を行う前に、チーズペーストを５５℃に加熱し、そして穏やかに３０℃に冷却した。１．６、０．１６、および０．０１６ＣＰＧ／ｍｌを含有するＰＥＰＧ溶液をミリＱ水で調製した。その後、２００ｇのチーズペーストを含有するそれぞれの容器に２ｍｌの各ＰＥＰＧ溶液を添加し、攪拌により混合物を混合した；対照ペーストは、ＰＥＰＧを含有せずにミリＱのみを含有していた。次に、容器を１７℃で貯蔵した。４週間後、官能審査員によりペーストの風味の官能特性を評価した。ＰＥＰＧ濃度を増大させることにより、チーズペーストの風味強度が明瞭に増大された。ＰＥＰＧは、チーズ風味を発生させるＥＭＣ過程に明らかに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｐＨに対する活性プロファイルを示している。
【図１】
2011172591.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月12日(2011.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−１が使用される、チーズまたはチーズ由来製品においてチーズ熟成を促進する方法であって、
（ｉ）カルボキシペプチダーゼ調製物を凝固剤の添加前または添加と同時にチーズ乳に添加すること、
（ｉｉ）カルボキシペプチダーゼ調製物を加塩段階で添加すること、
または、
（ｉｉｉ）カルボキシペプチダーゼ調製物をチーズペーストに添加すること、
を含み、
前記カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−１が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株由来のものであり、ｐＨ４のｐＨ最適値を有し、かつ下記（１）〜（５）に記載した条件で決定される基質特異性が下記表１に記載されたものである、チーズ熟成を促進する方法。
（１）基質Ｚ−Ａｌａ−Ｘ〔式中、Ｚは、ベンジルオキシカルボニルであり、そしてＸは、アミノ酸（一文字コード）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙのうちのいずれかである〕を用いる。
（２）３ｍＭの基質を含有する溶液中、ｐＨ４．０かつ４０℃で反応を行う。
（３）５μｌの酵素溶液（４４０単位／ｍｌ）を９５μｌの反応混合物に添加することにより、反応を開始させ、ｔ＝０分で各基質のサンプルをすばやく採取してＴＬＣプレート上にスポッティングし、そして４５分間インキュベートした後、他のサンプルを採取して同様に同一のＴＬＣプレート上にスポッティングする。
（４）即使用可能なニンヒドリンスプレー（アクロス（ＡＣＲＯＳ））でスプレーすることにより、遊離アミノ基に関してプレートを染色する。
（５）酵素活性を、−（活性なし）、±（不十分な活性）から＋（少し活性）さらには＋＋＋＋＋（非常に高い活性）まで等級付ける。ｔ＝０のサンプルですべての基質がすでに変換されていた場合、特定の基質に対して非常に高い活性（＋＋＋＋＋）であると評価する。
【表１】
2011172591.tif 000004
【請求項２】
カルボキシペプチダーゼ活性の少なくとも９０％が単一酵素により惹起される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比が、０．０１未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
エンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比が、０．００１未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
エンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比が、０．０００５未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
チーズまたはチーズ由来製品の調製における、カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−１の使用であって、前記カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−１が、０．０１未満のエンドプロテアーゼ活性（ＰＵ）とカルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰＧ）との比を有し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株由来のものであり、かつｐＨ４のｐＨ最適値を有し、かつ下記（１）〜（５）に記載した条件で決定される基質特異性が下記表２に記載されたものである、カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−１の使用。
（１）基質Ｚ−Ａｌａ−Ｘ〔式中、Ｚは、ベンジルオキシカルボニルであり、そしてＸは、アミノ酸（一文字コード）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙのうちのいずれかである〕を用いる。
（２）３ｍＭの基質を含有する溶液中、ｐＨ４．０かつ４０℃で反応を行う。
（３）５μｌの酵素溶液（４４０単位／ｍｌ）を９５μｌの反応混合物に添加することにより、反応を開始させ、ｔ＝０分で各基質のサンプルをすばやく採取してＴＬＣプレート上にスポッティングし、そして４５分間インキュベートした後、他のサンプルを採取して同様に同一のＴＬＣプレート上にスポッティングする。
（４）即使用可能なニンヒドリンスプレー（アクロス（ＡＣＲＯＳ））でスプレーすることにより、遊離アミノ基に関してプレートを染色する。
（５）酵素活性を、−（活性なし）、±（不十分な活性）から＋（少し活性）さらには＋＋＋＋＋（非常に高い活性）まで等級付ける。ｔ＝０のサンプルですべての基質がすでに変換されていた場合、特定の基質に対して非常に高い活性（＋＋＋＋＋）であると評価する。
【表２】
2011172591.tif 000005
【請求項７】
ＥＭＣ（酵素変性チーズ）の調製における、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
チーズ熟成を促進するための、請求項６または７に記載の使用。
【外国語明細書】
2011172591000001.pdf