(57)【要約】【課題】NF-κB関連状態を処置するための組成物および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、刺激誘導性IKKシグナルソームならびにその成分および改変体を提供する。IKKシグナルソームまたはその成分は、例えば、NF-κBカスケードを介したシグナル伝達を阻害または活性化する抗体および他の調節因子を同定するために使用され得る。IKKシグナルソーム、その成分、および／または調節因子はまた、NF-κB活性化に関連した疾患の処置に使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的に、核因子κB(NF-κB)の活性化を導くカスケードの研究およびこの
ような経路に関連する疾患の処置に有用な組成物および方法に関する。本発明は、より詳細には、刺激誘導性IκBキナーゼ[IKK]シグナルソーム（signalsome）、構成IκBキナーゼ、およびこのようなキナーゼの改変体に関する。本発明はまた、NF-κB経路を介したシグナル伝達を阻害または活性化する抗体および他の因子を同定するための、刺激誘導性IKKシグナルソームまたはIκBキナーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
NF-κB/Relファミリーの転写因子は、炎症、細胞増殖、およびアポトーシスに関与する遺伝子の重要なレギュレーターである（概説については、Vermaら、Genes  Dev.9:2723-35,1995；Siebenlist,Biochem.Biophys.Acta  1332:7-13,1997；BaeuerleおよびHenkel,Ann.Rev.Immunol.12:141-79,1994；BarnesおよびKarin,New  Engl.J.Med.366,1066-71,1997；BaeuerleおよびBaltimore,Cell  87:13-20,1996；Grilliら、NF-κB  and  Rel:Participants  in  a  multiform  transcriptional  regulatory  system(Academic  Press,Inc.,1993),第143巻；BaichwalおよびBaeuerle,Curr.Biol.7:94-96,1997を参照のこと）。このファミリーの原型メンバーであるNF-κBは、p50  NF-κBおよびp65  RelAからなる（BaeuerleおよびBaltimore,Cell  53:211-17,1988；BaeuerleおよびBaltimore,Genes  Dev.3:1689-98,1989）。NF-κBは、免疫、炎症、および急性期応答の遺伝子（インターロイキン１、インターロイキン８、腫瘍壊死因子、および特定の細胞接着分子を含む）で観察されるされる高度に特異的な遺伝子発現パターンにおいて中心的な役割を果たす。
【０００３】
転写アクチベーターのRelファミリーの他のメンバーと同様に、NF-κBは、ほとんどの
細胞型において細胞質に不活性形態で隔離されている。種々の細胞外刺激（マイトジェン、サイトカイン、抗原、ストレス誘導因子、UV光、およびウイルスタンパク質を含む）は、最終的にNF-κBの放出および活性化を導くシグナル伝達経路を開始する。従って、シグナル伝達経路のインヒビターおよびアクチベーターを使用して、活性NF-κBのレベルを変化させ、そしてNF-κBの活性化に関連する疾患の処置における潜在的な有用性を有し得る。
【０００４】
これらの刺激の各々に応答したNF-κBの活性化は、細胞質中でNF-κBを保持する、阻害サブユニットIκBにより制御される。６つの既知メンバーがあるIκBタンパク質は、各々NFκB/Relダイマーとの会合および活性の阻害に必要とされる５〜７のアンキリン様反復を含む（Begら、Genes  Dev.7,2064-70,1993；GilmoreおよびMorin,Trends  Genet.9,427-33,1993；Diaz-Mecoら、Mol.Cell.Biol.13:4770-75,1993；Haskillら、Cell  65:1281-89,1991を参照のこと）。IκBタンパク質は、IκBαおよびIκBβを含む。
【０００５】
NFκB活性化は、IκBの連続的なリン酸化、ユビキチン化、および分解を含む。IκBのリン酸化は、標識残基に高度に特異的である。例えば、IκBタンパク質IκBαのリン酸化はセリン残基S32およびS36で起こり、そしてIκBβのリン酸化はセリン残基S19およびS23で起こる。改変および分解工程の編成されたシリーズは、それまでにIκBによりマスクされていたNFκB上の核局在化シグナルの暴露により転写的に活性なNFκBの核移入をもたらす（Begら、Genes  Dev.6:1899-1913,1992）。従って、NFκB活性化は、１つ以上の特異的IκBキナーゼ、E1、E2、およびE3ユビキチン酵素の連関したシリーズ、26Sプロテアソーム、ならびに核輸入機構を含むシグナル伝達カスケードにより媒介される。IκBのリン酸化は、NF-κBの活性化において重要な工程であり、そしてIκBキナーゼの同定、ならびにそのキナーゼ活性を調節するタンパク質は、活性化プロセスのさらなる理解、ならびに治療方法の開発に重要である。
【０００６】
いくつかのプロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＡ（GhoshおよびBaltimore,Nature  344:678-82,1990）、プロテインキナーゼＣ（GhoshおよびBaltimore,Nature  344:678-82,1990）、ならびに２本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（Kumarら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  91:6288-92,1994）を含む）は、インビトロでIκBをリン酸化することが見出されている。カゼインキナーゼIIによるIκBαの構成的リン酸化もまた観察されている（Barrogaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  92:7637-41,1995を参照のこと）。しかし、これらのキナーゼのいずれもが、NF-κBのインビボ活性化を担わないようである。例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣによるインビトロでのIκBαリン酸化はNF-κBとのその会合を妨げ、そして２本鎖RNA依存性プロテインキナーゼによるリン酸化は、NF-κBの解離をもたらす。これらのいずれもが、インビボでのリン酸化の効果（S32およ
びS36でのIκBαリン酸化は、NF-κBからの解離をもたらさない）に即応しない。
【０００７】
他の以前に知られていないIκBキナーゼ活性を有するタンパク質が報告されているが、これらのタンパク質はまた、インビボで重要なアクチベーターではないようである。推定IκBαキナーゼは、非特許文献１により同定されたが、このキナーゼは、インビボ調節に重要であることが知られているS32およびS36ではなく、IκBαのＣ末端領域の残基をリン酸化するようである。非特許文献２はまた、リン酸化部位が特徴付けられていない、50kD  IκBキナーゼを同定した。非特許文献３は、推定IκBαキナーゼとしてp90rskiを同定したが；p90rskiはTPAにより活性化されるのみであり、そしてSer32上でのみIκBαをリン酸化し、これはIκBαをユビキチン化の標的にするのに不十分である。最後に、非特許文献４は、IκBαをリン酸化するキナーゼを同定したが、このキナーゼは、IκBαキナーゼ活性の非生理学的インデューサーを用いて同定され、そしてインビトロリン酸化のために外因性因子の添加を必要とする。
【０００８】
従って、インビボキナーゼの基質特異性および他の特性を有するIκBキナーゼが当該分野で必要とされる。NF-κBの活性化に関与するタンパク質の活性を調節し、そしてNF-κBの活性化に関連する疾患を処置するための改善した方法もまた必要とされる。本発明はこれらの必要を満たし、そして他の関連した利点をさらに提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kunoら、J.Biol.Chem.270:27914-27919,1995
【非特許文献２】Diaz-Mecoら、EMBO  J.13:2842-2848,1994
【非特許文献３】Schoutenら、EMBO  J.16:3133-44,1997
【非特許文献４】Chenら、Cell  84:853-862,1996
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
手短に述べると、本発明は、大きなマルチサブユニットIKKシグナルソームまたはその成分もしくは改変体を使用する組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、外因性補因子の添加なく、残基S36およびS36でIκBαをならびに残基19および23でIκBβを特異的にリン酸化し得るIKKシグナルソームを提供する。
【００１１】
さらに関連した局面において、IKKシグナルソームの成分またはこのような成分の改変体を含むポリペプチドが提供され、ここでこの成分は、配列番号９に示される配列を有する。このようなポリペプチドをコードする単離されたDNA分子および組換え発現ベクター、ならびにトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
【００１２】
別の局面において、IKKシグナルソームを調製するための方法が提供され、この方法は、適切な緩衝液中にIKKシグナルソームの成分を組み合せる工程を包含する。
【００１３】
なお別の局面において、IKKシグナルソームの基質をリン酸化するための方法が提供され、この方法は、基質とIKKシグナルソームまたはその成分とを接触させ、それにより基質をリン酸化する工程を包含する。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、IKKシグナルソーム活性を調節する因子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）候補因子とIKKシグナルソームとを接触させる工程であって、ここで接触させる工程が、候補因子およびIKKシグナルソームを相互作用させるのに十分な条件下および時間で行われる工程；および（ｂ）続いて、候補因子が、IKKシグナルソームの活性を調節する能力を測定する工程、を包
含する。
【００１５】
関連する局面において、本発明はIKKシグナルソーム活性を調節するためのスクリーニングのための方法を提供し、この方法は、以下の工程：上記のように候補因子とIKKシグナルソームの成分を含むポリペプチドとを接触させる工程であって、ここで接触させる工程が、候補因子およびポリペプチドを相互作用させるのに十分な条件下および時間で行われる工程；および（ｂ）続いて、候補因子が、ポリペプチドがIκBタンパク質をリン酸化する能力を調節する能力を測定する工程、を包含する。
【００１６】
別の局面において、IKKシグナルソームの成分（例えば、IKK-1および／またはIKK-2）に結合する抗体が提供され、ここで成分はIκBαをリン酸化し得る。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、患者のNF-κB活性を調節するための方法を提供し、この方法は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せてIκBキナーゼ活性を調節する因子を患者に投与する工程を包含する。IKKシグナルソーム活性化に関連する疾患に冒されている患者を処置するための方法がまた提供され、この方法は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せて、IκBキナーゼ活性を調節する治療的に有効な量の因子を患者に投与する工程を包含する。
【００１８】
なお別の局面において、サンプル中のIKKシグナルソーム活性を検出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：（ａ）抗体がIKKシグナルソームを免疫沈降させるのに十分な条件下および時間で、サンプルとIKKシグナルソームに結合する抗体とを接触させる工程；（ｂ）免疫沈降された物質をサンプルから分離する工程；および（ｃ）免疫沈降された物質がインビボで特異性を有するIκBタンパク質を特異的にリン酸化する能力を決定する工程、を包含する。１つのこのような実施態様において、免疫沈降された物質が残基S32および／またはS36でIκBαをリン酸化する能力が決定される。
【００１９】
関連した局面において、適切な緩衝液と組み合せてIKKシグナルソームに結合する抗体を含む、サンプル中のIKKシグナルソーム活性を検出するためのキットが提供される。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、NF-κBシグナル伝達カスケードにおける上流キナーゼを同定するための方法を提供し、この方法は、候補の上流キナーゼがIKKシグナルソーム、その成分、またはこのような成分の改変体をリン酸化する能力を評価する工程、を包含する。
【００２１】
IKKシグナルソームの成分を同定するための方法もまた提供され、この方法は、以下の工程：（ａ）IKKシグナルソームを単離する工程；（ｂ）シグナルソームを成分に分離する工程、および（ｃ）成分の部分配列を得る工程、を包含する。
【００２２】
なお別の局面において、IKKシグナルソームを生物学的サンプルから調製するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：（ａ）生物学的サンプルを２つ以上の画分に分離する工程；および（ｂ）画分中のIκBキナーゼ活性をモニターする工程、を包含する。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々が別々に援用されるように、それらの全体が参考として本明細書により援用される。
【００２４】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
１．外因性補因子の添加なく、IκBαを残基S32およびS36で、ならびにIκBβを残基19および23で特異的にリン酸化し得るIKKシグナルソーム。
【００２５】
２．前記シグナルソームがヒト組織または細胞株に由来する、項目１に記載のIKKシグナルソーム。
【００２６】
３．項目１に記載のIKKシグナルソームの成分、またはこのような成分の改変体を含むポリペプチドであって、ここで該成分が配列番号９に列挙される配列を有する、ポリペプチド。
【００２７】
４．項目３に記載のポリペプチドをコードする単離されたDNA分子。
【００２８】
５．項目４に記載のDNA分子を含む組換え発現ベクター。
【００２９】
６．項目５に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【００３０】
７．項目６に記載の宿主細胞であって、ここで宿主細胞は、細菌、酵母、バキュロウイルス感染昆虫細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される、宿主細胞。
【００３１】
８．IKKシグナルソームを調製するための方法であって、適切な緩衝液中にIKKシグナルソームの成分を組み合せる工程を包含する、方法。
【００３２】
９．IKKシグナルソームの基質をリン酸化するための方法であって、基質と項目１に記載のシグナルソームとを接触させ、それにより該基質をリン酸化する工程を包含する、方法。
【００３３】
１０．IKKシグナルソームの基質をリン酸化するための方法であって、基質とIκBキナーゼ活性を有するIKKシグナルソームの成分を含むポリペプチドとを接触させ、それにより該基質をリン酸化する工程を包含する、方法。
【００３４】
１１．前記ポリペプチドがIKK-1（配列番号10）を含む、項目１０に記載の方法。
【００３５】
１２．前記ポリペプチドがIKK-2（配列番号９）を含む、項目１０に記載の方法。
【００３６】
１３．前記基質がIκBαまたはその改変体である、項目９または１０のいずれかに記載の方法。
【００３７】
１４．IKKシグナルソーム活性を調節する因子をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）候補因子と項目１に記載のIKKシグナルソームとを接触させる工程であって、ここで接触させる工程が、該候補因子および該IKKシグナルソームを相互作用させるのに十分な条件下および時間で行われる工程；および
（ｂ）続いて、該候補因子が該IKKシグナルソーム活性を調節する能力を測定する工程、
を包含する、方法。
【００３８】
１５．前記調節されるIKKシグナルソーム活性が、IκBキナーゼ活性、p65キナーゼ活性、およびIKKホスファターゼ活性からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
【００３９】
１６．IKKシグナルソーム活性を調節する因子をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）候補因子と項目１に記載のIKKシグナルソームの成分を含むポリペプチドとを接触させる工程であって、ここで接触させる工程が、該候補因子および該ポリペプチドを相互作用させるのに十分な条件下および時間で行われる工程；および
（ｂ）続いて、該候補因子が、該ポリペプチドがIκBタンパク質をリン酸化する能力を調節する能力を測定する工程、
を包含する、方法。
【００４０】
１７．前記ポリペプチドがIKK-1（配列番号10）を含む、項目１６に記載の方法。
【００４１】
１８．前記ポリペプチドがIKK-2（配列番号９）を含む、項目１６に記載の方法。
【００４２】
１９．IKK-1（配列番号10）および／またはIKK-2（配列番号９）に結合する抗体。
【００４３】
２０．前記抗体がIKKシグナルソームによるIκBタンパク質のリン酸化を阻害する、項目１９に記載の抗体。
【００４４】
２１．患者のNF-κB活性を調節する薬物の製造における使用のための、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せたIKKシグナルソーム活性を調節する因子を含む組成物。
【００４５】
２２．前記因子がIKKシグナルソームの活性化を阻害する、項目２１に記載の組成物。
【００４６】
２３．前記因子が活性化IKKシグナルソームのキナーゼ活性を阻害する、項目２１に記載の組成物。
【００４７】
２４．IKKシグナルソーム活性化に関連する疾患に冒された患者を処置する薬物の製造における使用のための、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せたIKKシグナルソーム活性を調節する因子を含む組成物。
【００４８】
２５．前記因子がモノクローナル抗体である、項目２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【００４９】
２６．前記因子がポリヌクレオチドを含む、項目２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【００５０】
２７．サンプル中のIKKシグナルソーム活性を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）抗体がIKKシグナルソームを免疫沈降させるのに十分な条件下および時間で、サンプルとIKKシグナルソームに結合する抗体とを接触させる工程；
（ｂ）免疫沈降された物質を該サンプルから分離する工程；および
（ｃ）該免疫沈降された物質がインビボで特異性を有するIκBタンパク質をリン酸化する能力を決定する工程、
を包含する、方法。
【００５１】
２８．前記免疫沈降された物質がIκBαを残基S32およびS36でリン酸化する、項目２７に記載の方法。
【００５２】
２９．適切な緩衝液と組み合せてIKKシグナルソームに結合する抗体を含む、サンプル中のIKKシグナルソーム活性を検出するためのキット。
【００５３】
３０．NF-κBシグナル伝達カスケードにおける上流キナーゼを同定するための方法であって、該方法は、候補上流キナーゼがIKKシグナルソーム、またはその成分もしくは改変体の酵素活性をリン酸化し、そして誘導する能力を評価し、それにより該NF-κBシグナル伝達カスケードにおける上流キナーゼを同定する工程を包含する、方法。
【００５４】
３１．IKKシグナルソームの成分を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）IKKシグナルソームを単離する工程；
（ｂ）該シグナルソームを成分に分離する工程；および
（ｃ）成分の部分配列を得、それにより該IKKシグナルソームの成分を同定する工程、
を包含する、方法。
【００５５】
３２．IKKシグナルソームを生物学的サンプルから調製するための方法であって、以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを２つ以上の画分に分離する工程；および
（ｂ）画分中のIκBキナーゼ活性をモニターする工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】図1A〜1Cは、イムノブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図1Aは、刺激の際のIκBαの高分子量複合体への動員(recruitment)を示す。無刺激Jurkat細胞またはPMA(50ng/ml)およびPHA(１μg/ml)刺激(10分)Jurkat細胞いずれかの細胞質抽出物を、ゲル濾過カラムで分画した。IκBαをイムノブロット分析により可視化した。上段パネルは、無刺激細胞の溶出プロフィールを示し、そして下段パネルは、PMA/  PHA刺激細胞の溶出プロフィールを示す。分子量標準を上端の矢印により示す。
【図１Ｂ】図1A〜1Cは、イムノブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図1Bは、刺激依存性IκBαキナーゼ活性が、高分子量複合体(Mr  500〜700kDa)としてクロマトグラフしたことを示す。TNFα刺激(20ng/ml、７分)HeLa  S3細胞の全細胞抽出物をSuperdex  200ゲル濾過カラムで分画し、そしてIκBαキナーゼ活性についてモニターした。GST  IκBα  1-54(野生型)基質のリン酸化を、右側の矢印により示す。分子量標準を上端の矢印により示す。
【図１Ｃ】図1A〜1Cは、イムノブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図1Cは、IKKシグナルソームと共に共同クロマトグラフするタンパク質の同定を示す。IKKシグナルソームを、Q  Sepharose、Superdex  200、Mono  QおよびPhenyl  Superoseカラムでの連続分画により、TNFα刺激HeLa  S3細胞の抽出物から部分精製した。IKKシグナルソーム活性のピークを含むPhenyl  Superose画分を、各パネルのそれぞれの左側に示されるいくつかの異なる抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた。IKKシグナルソーム活性のレベルを、漸増数の(＋)により上部陰影領域に示す。
【図２】図２は、IKKシグナルソーム調製のための代表的な精製手順を示すフローチャートである。
【図３Ａ】図3Aおよび3Bは、ゲル濾過後のHeLa  S3細胞質抽出物中のIκBαレベルのウェスタンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。抽出物を、TNFαに暴露した細胞(図3B)および暴露していない細胞(図3A)から調製した。
【図３Ｂ】図3Aおよび3Bは、ゲル濾過後のHeLa  S3細胞質抽出物中のIκBαレベルのウェスタンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。抽出物を、TNFαに暴露した細胞(図3B)および暴露していない細胞(図3A)から調製した。
【図４Ａ】図4Aおよび4Bは、インビトロキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムであり、ここで上記の細胞抽出物がIκBαのＮ末端部分をリン酸化する能力を評価した。図4Aは、TNFαで処理しなかった細胞に由来する抽出物を使用した結果を示す。
【図４Ｂ】図4Aおよび4Bは、インビトロキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムであり、ここで上記の細胞抽出物がIκBαのＮ末端部分をリン酸化する能力を評価した。図4Bは、細胞をTNFαで処理した場合の結果を示す。
【図５Ａ】図5Aおよび5Bは、TNFα処理HeLa  S3細胞の細胞質抽出物を用いたインビトロキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムであり、ここで抽出物は、Q  Sepharose分画に供される。基質は短縮型IκBα(残基１〜54)であり、図5Aは、野生型IκBα配列を用いて得た結果を示す。
【図５Ｂ】図5Aおよび5Bは、TNFα処理HeLa  S3細胞の細胞質抽出物を用いたインビトロキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムであり、ここで抽出物は、Q  Sepharose分画に供される。基質は短縮型IκBα(残基１〜54)であり、図5Bは、32位および36位にスレオニン置換を含むポリペプチドを用いて得た結果を示す。
【図６Ａ】図6Aおよび6Bは、TNFα処理HeLa  S3細胞の細胞質抽出物を用いたインビトロキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムであり、ここでは、抽出物を、Q  Sepharose、Superdex  200、Mono  Q  Sepharose、およびPhenyl  Superoseによるクロマトグラフィー分画に連続して供した。基質は短縮型IκBα(残基１〜54)であり、図6Aは、野生型IκBα配列を用いて得た結果を示す。
【図６Ｂ】図6Aおよび6Bは、TNFα処理HeLa  S3細胞の細胞質抽出物を用いたインビトロキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムであり、ここでは、抽出物を、Q  Sepharose、Superdex  200、Mono  Q  Sepharose、およびPhenyl  Superoseによるクロマトグラフィー分画に連続して供した。基質は短縮型IκBα(残基１〜54)であり、図6Bは、32位および36位にスレオニン置換を含むポリペプチドを用いて得た結果を示す。
【図７】図７は、ゲル濾過後にTNFα処理HeLa  S3細胞の細胞質抽出物を用いて行われたイムノキナーゼアッセイ(抗MKP-1抗体を使用)の結果を示すオートラジオグラムである。アッセイを、基質GST-IκBα1-54野生型(レーン１)およびGST-IκBα1-54  S32/36→T(レーン２)を用いて行った。IκBαおよびGST-IκBα1-54の位置を左に示す。
【図８Ａ】図8A〜8Cは、イムノブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図8Aにおいて、上段パネルは、シグナルソーム活性誘導の時間経過を示す。示された時間TNFα(20ng/ml)で刺激したHeLa  S3細胞の抽出物からの抗MKP-1免疫沈降物を、標準的な免疫複合体キナーゼアッセイにより、IKKシグナルソーム活性についてアッセイした。４μgのGST  IκBα1-54  WT(野生型)またはGST  IκBα1-54  S32/36→T変異体(S>T)のいずれかを基質として使用した。下段パネルにおいて、上段パネルに記載されるように調製したHeLa細胞抽出物を、IκBα分解についてウェスタンブロット分析により調べた。IκBαスーパーシフト(supershifting)リン酸化は、刺激の３および５分後に観察され得、続いてIκBαが消失した。
【図８Ｂ】図8A〜8Cは、イムノブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図8Bは、TPCKによりブロックされる、IKKシグナルソームの刺激依存性活性化を示す。TNFα(20ng/ml、レーン２および６)、IL-1(10ng/ml、レーン３)、またはPMA(50ng/ml、レーン４)で７分間刺激されたか、あるいはTNFα誘導前にTPCK(15μM、レーン７)で30分間前処理されたかのいずれかされた、HeLa  S3細胞の細胞抽出物からの抗MKP-1免疫沈降物を、IKKシグナルソーム活性について調べた。GST  IκBα1-54  WT(４μg)を基質として使用した。
【図８Ｃ】図8A〜8Cは、イムノブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図8Cは、RelA：IκBα複合体において、IKKシグナルソームが、IκBαホロタンパク質のセリン32および36を特異的にリン酸化する能力を示す。TNFα(20ng/ml、７分)で刺激したHeLa  S3細胞の細胞抽出物からの抗MKP-1免疫沈降物を、IκBα  WT(レーン３)またはIκBα  S32/36→A変異体(レーン４)ホロタンパク質のいずれかを含むバキュロウイルス発現RelA：IκBα複合体をリン酸化する能力について調べた。使用した特異的基質を上部に示す。リン酸化された基質の位置を、パネルの左に矢印により示す。
【図９Ａ】図9Aは、ペプチドがIKKシグナルソームによりリン酸化されるイムノキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。上段パネルにおいて、リン酸化されていないか、またはSer-32もしくはSer-36のいずれかで化学的にリン酸化されたIκBα(21-41)ペプチドを、γ-[32P]-ATPの存在下でIKKシグナルソームと共にインキュベートした。２つにリン酸化されたペプチドP32,36は、IKKシグナルソームによりリン酸化されず、そして遊離のセリンおよびスレオニン残基を有する無関係なc-Fos(222-241)ホスホペプチドは、シグナルソームの基質として機能しなかった。
【図９Ｂ】図9Bは、IκBα(21-41)ペプチドによるGST-IκBα(1-54)のリン酸化の阻害を示すグラフである。IκBα(21-41)ペプチドP32,36は、14μMのKi値を有する産物インヒビターとしてGST-IκBα(1-54)を阻害する。無関係なホスホペプチドc-Fos(222-241)はインヒビターとして機能しない。このアッセイは、沈降した32P標識タンパク質のみを検出し、32P標識ペプチドを検出しない。単一にリン酸化されたか、またはリン酸化されていないIκBα(21-41)ペプチドの添加は、GST-IκBα(1-54)のより少ないリン酸化をもたらし、そして見かけの阻害をもたらす。
【図１０】図10は、刺激誘導性IkBキナーゼ複合体内のユビキチンレベルのウェスタンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。レーン１は100ngユビキチンの検出を示し、レーン２は10ngユビキチンを示し、そしてレーン３はPhenyl  Superose工程により精製された3.4μgのIKKシグナルソーム(10キナーゼ反応に十分な量)を示す。ユビキチンの位置を左の矢印により示す。
【図１１Ａ】図11Aは、IKKシグナルソームの精製手順を示す。全細胞抽出物を、TNFα刺激(20ng/ml、７分誘導)したHeLa  S3細胞(1.2g総タンパク質)から調製した。次いで、IKKシグナルソームを、抗MKP-1抗体を用いて抽出物から免疫沈降させ、3.5M尿素を含む緩衝液で洗浄し、そして過剰なMKP-1特異的ペプチドの存在下で４℃にて一晩溶出させた。次いで、溶出したIKKシグナルソームをMono  Qカラムで分画し、IκBキナーゼ活性画分をプールし、濃縮し、そして調製SDS-PAGEに供した。個々のタンパク質バンドを切り出し、そしてペプチド配列決定のために提出された。
【図１１Ｂ】図11Bは、SDS-PAGEおよび標準的な銀染色プロトコル後の活性なIKKシグナルソーム活性を含むMono  Q画分を示す写真である。IKKシグナルソーム活性のピーク活性は、レーン３、４、および５に示される。IKK-1およびIKK-2に対応するタンパク質バンドを、図の左側に示す。分子量標準(kDa)を図の左側に示す。
【図１２】図12Aおよび12Bは、ナノエレクトロスプレー質量分析法によるIKK-2の配列決定間に得られた質量スペクトルである。図12Aは、図11BのIKK-2バンドのゲル内消化(in-gel  digestion)から生じたトリプシン処理ペプチドの非分離混合物の質量スペクトルの一部を示す。図12Bは、m/z  645.2のピークのタンデム質量スペクトルを示す。
【図１３Ａ１】図13A１は、IKK-1およびIKK-2のアミノ酸配列を示す。記号：矢印、キナーゼドメインの境界；下線、ナノエレクトロスプレー質量分析法により同定されたペプチド配列；星印、ロイシンジッパーモチーフを含むロイシンを示す；太文字、IKK-1とIKK-2との間で保存されるアミノ酸同一性を示す；強調した囲み、ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン；ダッシュ、アラインメントを最適化するために挿入されたギャップ。
【図１３Ａ２】図13A２は、図１３Ａ１の続きであり、IKK-1およびIKK-2のアミノ酸配列を示す。記号：矢印、キナーゼドメインの境界；下線、ナノエレクトロスプレー質量分析法により同定されたペプチド配列；星印、ロイシンジッパーモチーフを含むロイシンを示す；太文字、IKK-1とIKK-2との間で保存されるアミノ酸同一性を示す；強調した囲み、ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン；ダッシュ、アラインメントを最適化するために挿入されたギャップ。
【図１３Ｂ】図13Bは、成人ヒト組織におけるIKK-2  mRNAのノーザンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。組織の供給源を上端に示す。ヒトIKK-2のコード領域およびβ-アクチン  cDNAにわたるプローブを使用し、そして左に示す。分子量標準を右に示す。
【図１４Ａ】図14Aは、IKK-1およびIKK-2を用いたキナーゼアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。IKK-1およびIKK-2を、ウサギ網状赤血球溶解物から免疫沈降させた。これは、IκBαおよびIκBβをリン酸化する。HAタグ化IKK-1(レーン１)またはFlagタグ化IKK-2(レーン２)のいずれかを、左に矢印により示されるように、ウサギ網状赤血球溶解物中で翻訳し、免疫沈降し、そしてGST  IκBα  1-54  WTおよびGST  IκBβ  1-44をリン酸化する能力について調べた。IKK-1(レーン１)は、より長い暴露時間でのみ同定されるIKK-2(レーン２)とは対照的に、著しい自己リン酸化を受ける。
【図１４Ｂ】図14Bおよび14Cは、IKK-1およびIKK-2のキナーゼ不活性変異体が、TNFα刺激HeLa細胞におけるRelA転座を阻害する能力を評価するアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。HeLa細胞を、HAタグ化IKK-1  K44→M変異体発現ベクター(14B)またはFlagタグ化IKK-2  K44→M変異体発現ベクター(14C)のいずれかを用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション後36時間に、細胞を、図の右に示すように、刺激しなかったか(Unstim)、または30分間TNFα刺激(20ng/ml)した(TNFα)。次いで、細胞を、IKK-1  K44→MまたはIKK-2  K44→Mの発現を視覚化するために、それぞれ抗HA抗体または抗Flag抗体を用いる免疫蛍光染色に供した。RelAの刺激依存性転座を、抗RelA抗体を用いてモニターした。使用した抗体を図の上端に示す。トランスフェクトされたIKK変異体を、図の左に示す。
【図１４Ｃ】図14Bおよび14Cは、IKK-1およびIKK-2のキナーゼ不活性変異体が、TNFα刺激HeLa細胞におけるRelA転座を阻害する能力を評価するアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。HeLa細胞を、HAタグ化IKK-1  K44→M変異体発現ベクター(14B)またはFlagタグ化IKK-2  K44→M変異体発現ベクター(14C)のいずれかを用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション後36時間に、細胞を、図の右に示すように、刺激しなかったか(Unstim)、または30分間TNFα刺激(20ng/ml)した(TNFα)。次いで、細胞を、IKK-1  K44→MまたはIKK-2  K44→Mの発現を視覚化するために、それぞれ抗HA抗体または抗Flag抗体を用いる免疫蛍光染色に供した。RelAの刺激依存性転座を、抗RelA抗体を用いてモニターした。使用した抗体を図の上端に示す。トランスフェクトされたIKK変異体を、図の左に示す。
【図１５Ａ】図15Aおよび15Bは、インビトロ翻訳後に免疫沈降されたIKK-1およびIKK-2のオートラジオグラムである。図15Aにおいて、HAタグ化IKK-1およびFlagタグ化IKK-2を、示すように、別々にまたは組み合せてのいずれかで、コムギ胚芽溶解物中でインビトロ翻訳させた。次いで、プログラムされた翻訳混合物を、示した抗体を用いた免疫沈降に供した。サンプルをSDS-PAGEで泳動し、そしてオートラジオグラフィーに供した。
【図１５Ｂ】図15Aおよび15Bは、インビトロ翻訳後に免疫沈降されたIKK-1およびIKK-2のオートラジオグラムである。図15Bにおいて、HAタグ化IKK-1およびFlagタグ化IKK-2を、示すように、別々にまたは組み合せてのいずれかで、ウサギ網状赤血球溶解物中でインビトロ翻訳させた。次いで、プログラムされた翻訳混合物を、示した抗体を用いて免疫沈降に供した。サンプルをSDS-PAGEで泳動し、そしてオートラジオグラフィーに供した。結果は、IKK-1およびIKK-2が、ウサギ網状赤血球溶解物中で翻訳させる場合に共沈することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、一般に、NF-κB活性化を導くシグナル伝達を調節する(すなわち、刺激または阻害する)ための組成物および方法に関する。特に、本発明は、後のユビキチン化およびインビボでの分解に重要な２つのＮ末端セリン残基におけるIκBαおよびIκBβの刺激依存性リン酸化が可能なIκBキナーゼ(kinase)(IKK)シグナルソーム(本明細書中で「刺激誘導性IκBキナーゼ複合体」または「IκBキナーゼ複合体」とも呼ばれる)を含む組成物に関する。このような刺激依存性リン酸化は、外因性補因子を添加することなく達成され得る。特に、IKKシグナルソームは、IκBα(配列番号１)を残基S32およびS36で特異的にリン酸化し、そしてIκBβ(配列番号２)を残基S19およびS23で特異的にリン酸化する。本発明はまた、このようなIKKシグナルソームの１つ以上の成分またはこのような成分の改変体を含む組成物を包含する。本明細書中で「IKKシグナルソームキナーゼ」、「IκBキナーゼ」、またはIKKと呼ばれる好ましい成分は、IKKシグナルソームに組込まれた場合、IκBαをS32およびS36でリン酸化し得るキナーゼである。特に好ましい成分は、IKK-1(配列番号10)およびIKK-2(配列番号９)である。
【００５８】
IKKシグナルソームおよび/またはIκBキナーゼは、一般に、基質(すなわち、IκB(例えば、IκBα)またはインビボでリン酸化される残基でリン酸化され得るその一部もしくは改変体)をリン酸化するために、およびIκBキナーゼ活性のモジュレーターを同定するために使用され得る。このようなモジュレーターならびにインビボおよび/またはインビトロでIκBαキナーゼ活性を調節するためにそれらを使用する方法もまた、本発明により包含される。一般に、IκBキナーゼ活性を阻害する組成物は、IκBリン酸化を阻害し得るか、またはIκBキナーゼおよび/またはIKKシグナルソームの活性化を阻害し得る。
【００５９】
IKKシグナルソームは、いくつかの特有な特性を有する。このような複合体は安定であり(すなわち、その成分が本明細書中に記載されるような精製後に会合したままである)、そして高分子量(ゲル濾過クロマトグラフィーにより決定される場合、約500〜700kD)を有する。図３(AおよびB)ならびに図４(AおよびB)に示されるように、IKKシグナルソームのIκBキナーゼ活性は、それが、TNFα(すなわち、TNFαでの細胞の処理は、増大したIκBキナーゼ活性およびIκB分解をもたらす)および/またはNF-κBの１つ以上の他のインデューサー(例えば、IL-1、LPS、TPA、UV照射、抗原、ウイルスタンパク質、およびストレス誘導因子)により刺激されるという点で「刺激誘導性」である。TNFαによる刺激の速度論は、インビボで見出されるものに対応する。IKKシグナルソームのIκBキナーゼ活性はまた、IκBαのS32およびS36に特異的である。図５(AおよびB)ならびに図６(AおよびB)に示されるように、IKKシグナルソームは、IκBαのＮ末端配列(GST-IκBα1-54；配列番号３)を有するポリペプチドをリン酸化し得るが、このようなリン酸化は、32位および36位にスレオニン置換を含むIκBα誘導体において検出され得ない。さらに、IκBキナーゼ活性は、２つにリン酸化された(すなわち、S32およびS36でリン酸化された)IκBαペプチドにより強力に阻害されるが、単一のホスホスレオニンを含む無関係なc-fosホスホペプチドにより阻害されない。IKKシグナルソームのさらなる特徴は、外因性補因子を添加することなく、標準的なキナーゼ緩衝液中でインビトロで基質をリン酸化する能力である。遊離ユビキチンは、非常に長い暴露でさえ、IKKシグナルソームの調製物中で検出され得ない(図10を参照のこと)。従って、IKKシグナルソームは、Chenら、Cell  84:853-62,1996により記載されるユビキチン依存性IκBαキナーゼ活性とは異なる。
【００６０】
IKKシグナルソームは、MKP-1(MAPキナーゼホスファターゼ-1；Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA  #SC-1102)に対して惹起された抗体により免疫沈降され得、そしてその活性は、インビトロIκBαキナーゼアッセイを用いて検出され得る。しかし、以下でさらに議論されるように、MKP-1は、IκBキナーゼ複合体の成分であると思われない。免疫沈降したIKKシグナルソームの基質特異性は維持される(すなわち、野生型GST-IκBα  1-54(配列番号３)およびGST-IκBβ  1-44(配列番号４)の強力なリン酸化、ならびにGST-IκBα  1-54(ここで、セリン32および36はスレオニンにより置換されている)(GST-IκBα  S32/36→T；配列番号５)またはGST-IκBβ  1-44(ここで、セリン19および23はアラニンにより置換されている)(GST-IκBβ  1-44  S19/23→A；配列番号６)の実質的に検出可能でないリン酸化が存在する)。
【００６１】
IKKシグナルソームは、ヒトまたは他の細胞から、そして種々の組織および/または細胞型の任意のものから単離され得る。例えば、標準的なプロトコルを用いて、細胞質および/または核/膜抽出物は、30ng/mL  TNFαでの７分間の誘導後にHeLa  S3細胞から調製され得る。次いで、抽出物は、Q  Sepharose、ゲル濾過(HiLoad  16/60  Superdex  200)、Mono  Q、Phenyl  Superose、ゲル濾過(Superdex  200  10/30)、およびMono  Qを含む一連のクロマトグラフィー工程に供され得る。この代表的な精製手順は図２に図解され、そして高度に富化されたIKKシグナルソームをもたらす(例えば、図5Aおよび6Aと比較のこと)
。
【００６２】
代替精製手順は、MKP-1抗体によるIKKシグナルソームの認識に基づく、２段階アフィニティ方法を使用する（図11A）。TNFα刺激HeLa細胞からの全細胞溶解物は、抗MKP-1抗体で免疫沈降され得る。IKKシグナルソームは、それに対して抗体が生成された特定のMKP-1ペプチドを用いて溶出され、そしてMono  Qカラムでさらに分画され得る。
【００６３】
分画の間を通じて、インビトロキナーゼアッセイを使用して、IKKシグナルソームのIκBキナーゼ活性をモニターし得る。このようなアッセイにおいて、画分が適切な基質（例えば、IκBα（配列番号１）またはその誘導体もしくは改変体）をリン酸化する能力は、当業者に明らかな任意の種々の手段により評価される。例えば、基質は、32P  γ-ATP、ホスファターゼインヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含むプロテインキナーゼ緩衝液中でクロマトグラフィー画分と組み合わされ得る。混合物は、30℃で30分間インキュベートされ得る。次いで、反応は、SDSサンプル緩衝液の添加により停止され、そして後のオートラジオグラフィーと共にSDS-PAGEを用いて分析され得る。適切な基質は、完全長IκBα（配列番号１）、IκBαのＮ末端54アミノ酸を含むポリペプチド、完全長IκBβ（配列番号２）、およびIκBβのＮ末端44アミノ酸を含むポリペプチドを含む。任意のこれらの基質は、Ｎ末端タグととともにまたはともなわずに使用され得る。１つの適切な基質は、IκBαの残基1-54およびＮ末端GSTタグを含むタンパク質（本明細書中でGST-IκBα  1-54；配列番号３と呼ばれる）である。IκBキナーゼ複合体の特異性を評価するために、32および36位にスレオニンまたはアラニン残基および／または他の修飾を含むIκBα変異体が使用され得る。
【００６４】
あるいは、IKKシグナルソームは、その成分（これもまた本発明に含まれる）から調製され得る。このような成分は、以下により詳細に記載されるように、周知の組換え技術を用いて生成され得る。IKKシグナルソームの成分は天然であり得るか、または天然成分の改変体であり得る（すなわち、成分改変体を含む複合体のIκBαを特異的にリン酸化する能力が、実質的に減少されなければ、成分配列は１つ以上の置換および／または修飾において天然配列とは異なり得る）。置換および／または修飾は、一般的に、天然タンパク質の重要でないおよび／または重要な領域において作製され得る。改変体は、一般的に、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸、またはその任意の組み合せの残基を含み得る。アミノ酸は天然に生じ得るか、または少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つのカルボキシル基が分子内に存在するのであれば、非天然であり得；αおよびβアミノ酸が一般的に好ましい。改変体はまた、任意の広範な種々の側鎖修飾および／または置換（例えば、メチル化、ベンジル化、t-ブチル化、トシル化、アルコキシカルボニル化など）の存在または非存在下で、１つ以上の希なアミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシリジン）、有機酸またはアミド、ならびに／あるいは一般的なアミノ酸の誘導体（例えば、エステル化された（例えば、ベンジル、メチル、もしくはエチルエステル）またはアミド化されたＣ末端カルボン酸および／あるいはＮ末端アミノ基の修飾（例えば、アセチル化またはアルコキシカルボニル化）を有するアミノ酸）を含み得る。成分改変体はまた、あるいは、他の修飾（ポリペプチド活性に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含む）を含み得る。特に、改変体は、アミノおよび／またはカルボキシ末端にさらなるアミノ酸配列を含み得る。このような配列は、例えば、成分ポリペプチドの精製または検出を容易にするために使用され得る。一般的に、１つ以上の置換および／または修飾の効果は、本明細書中で提供される代表的なアッセイを用いて評価され得る。
【００６５】
成分は、一般的に、周知の組換え方法を用いて成分をコードするDNA配列から調製され得る。IKKシグナルソームの成分をコードするDNA配列は、例えば、適切な発現ライブラリー（すなわち、IKKシグナルソームを発現する細胞株または組織（例えば、脾臓、白血球、HeLa細胞、またはJurkat細胞）から調製されたライブラリー）をIKKシグナルソームに対してまたはその１つ以上の成分に対して惹起された抗体を用いてスクリーニングすることにより単離され得る。次いで、タンパク質成分は、周知の組換え技術を用いて、同定されたDNA配列の発現により調製され得る。
【００６６】
あるいは、成分の部分配列は、標準的な生化学的精製および微量配列決定技術を用いて得られ得る。例えば、上記のような精製された複合体は、SDS-PAGEゲル上で泳動され得、そして個々のバンドは単離され、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。次いで、成分をコードするDNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および当業者に周知の方法を用いて、適切なヒトcDNAライブラリーからの増幅により調製され得る。例えば、IKKシグナルソームを発現する細胞株または組織（例えば、HeLaもしくはJurkat細胞）から調製されたアダプター連結cDNAライブラリーは、縮重5’特異的正方向プライマーおよびアダプター特異的プライマーを用いてスクリーニングされ得る。縮重オリゴヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法を用いてcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、既知のタンパク質は、特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析を介して同定され得る。
【００６７】
IKKシグナルソームの成分はまた、当業者に公知の任意の種々のタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを行うことにより同定され得る。例えば、既知の成分は、他の調節分子を同定するための標準的なツーハイブリッドスクリーニングにおいて「おとり（bait）」として使用され得、これはIKK-1、IKK-2、NFκB1、RelA、IκBβ、および／またはp70  S6キナーゼを含み得る（Kieranら、Cell  62:1007-1018,1900；Nolanら、Cell  64:961-69,1991；Thompsonら、Cell  80:573-82,1995；Groveら、Mol.Cell.Biol.11:5541-50,1991）。
【００６８】
IKKシグナルソームの特に好ましい成分はIκBキナーゼである。IκBキナーゼは、１つ以上のIκBタンパク質をリン酸化するその能力に基づいて同定され得、これは本明細書中に記載される代表的なキナーゼアッセイを用いて容易に決定され得る。一般的に、IκBキナーゼは、このようなアッセイを行う前に本明細書中に記載されるIKKシグナルソームに組込まれる。なぜなら、複合体会合しないIκBキナーゼは、複合体会合IκBキナーゼと同じリン酸化活性を示さないかもしれないからである。上記のように、IKKシグナルソーム内のIκBキナーゼは、特定の刺激に応答して、IκBαを残基S32およびS36で特異的にリン酸化し、そしてIκBβを残基19および23でリン酸化する。
【００６９】
上記のように、IKK-1およびIKK-2は、特に好ましいIκBキナーゼである。IKK-1およびIKK-2は、ピークIκBキナーゼ活性を含むMono  Qカラムからの画分をプールし、そしてプールされた画分を調製用SDSゲル電気泳動に供することにより調製され得る。約85および約87kDaの２つの顕著なタンパク質バンドの強度（それぞれ、IKK-1およびIKK-2として図11Bにおいて銀染色により示される）は、IκBキナーゼ活性のプロフィールと相関する。IKK-1に対応する約85kDaバンドは、本発明の状況でCHUK（保存されたヘリックス-ループ-ヘリックス偏在キナーゼ；ConnelyおよびMarcu,Cell.Mol.Biol.Res.41:537-49,1995を参照のこと）として同定されている。約87kDaバンドは、IKK-2を含む。
【００７０】
配列分析は、IKK-1およびIKK-2が、タンパク質相互作用モチーフを含む関連したタンパク質セリンキナーゼ（51％同一性）であることを明らかにする（図13A）。IKK-1およびIKK-2の両方は、Ｎ末端にキナーゼドメイン、ならびにそれらのＣ末端領域にロイシンジッパーモチーフおよびヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフを含む。ノーザン分析は、IKK-2をコードするmRNAが、約4.5kbおよび６kbの転写物サイズでヒト組織に広く分布することを示す（図13B）。IKK-1およびIKK-2の配列はまた、それぞれ、配列番号７および８として提供される。
【００７１】
本発明の状況において、IKK-1またはIKK-2を含むウサギ網状赤血球溶解物免疫沈降物は、正しい基質特異性でIκBαおよびIκBβをリン酸化することが見出された（図14Aを参照のこと）。これらのキナーゼの変化したバージョンは、RelAのTNFα刺激HeLa細胞核への転座を妨げる。従って、IKK-1およびIKK-2は、NFκB活性化の著しく初期の段階を制御するようである。
【００７２】
IKKシグナルソームの他の成分もまた本発明により意図される。このような成分は、上流キナーゼ（例えば、MEKK-1(Leeら、Cell  88,:213-22,1997；Hiranoら、J.Biol.Chem.271:13234-38,1996)またはNIK(Malininら、Nature  385:540-44,1997)）；IKK-1：IKK-2相互作用を媒介するアダプタータンパク質；抗MKP-1と交差反応する成分；誘導性RelAキナーゼ；および／または多（multi）ユビキチン鎖をリン酸化IκBに移すE3ユビキチンリガーゼ（HershkoおよびCiechanover,Annu.Rev.Biochem.61:761-807,1992）を含み得るが、これらに限定されない。
【００７３】
IKKシグナルソームの成分は、一般的に、培養宿主細胞（安定な細胞株または一過的にトランスフェクトされた細胞であり得る）におけるDNA発現により成分をコードするDNAから調製され得る。好ましくは、宿主細胞は、細菌、酵母、バキュロウイルス感染昆虫細胞、または哺乳動物細胞である。組換えDNAは、当業者に周知の技術を用いて、宿主細胞内での使用に適した任意の発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターは、エピトープをコードするDNAを含むかもしれないが、含む必要はなく、その結果組換えタンパク質は、ＮまたはＣ末端にエピトープを含む。エピトープ（例えば、グルタチオン-Sトランスフェラーゼタンパク質（GST）、HA（赤血球凝集素）タグ、FLAG、およびヒスチジンタグ）は、当業者に周知の技術を用いて付加され得る。
【００７４】
この様式で発現されるDNA配列は、上記のように、IKKシグナルソームの天然成分をコードし得るか、または天然成分の一部または改変体をコードし得る。改変体をコードするDNA分子は、一般的に、標準的な変異誘発技術（例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発）を用いて調製され得る。あるいは、DNA配列の断片はまた、短縮ポリペプチドの調製を可能にするために除去され得、そしてさらなる配列をコードするDNA（例えば「タグ」）は、DNA分子の5’または3’末端に付加され得る。
【００７５】
IKKシグナルソーム成分は、一般的に、IKKシグナルソームを再構成するために使用され得る。このような再構成は、適切な緩衝液中でIKKシグナルソーム成分を組み合せることによりインビトロで達成され得る。あるいは、再構成は、本明細書中に記載されるように、適切な宿主細胞（例えば、HeLaまたはHUVEC）において成分を発現させることによりインビボで達成され得る。
【００７６】
発現されたIKKシグナルソームまたはその成分は、実質的に純粋な形態で単離され得る。好ましくは、IKKシグナルソームまたは成分は、少なくとも80重量％の純度まで、より好ましくは少なくとも95重量％の純度まで、そして最も好ましくは少なくとも99重量％の純度まで単離される。一般的に、このような精製は、例えば、本明細書中に記載の代表的な精製法、または硫酸アンモニウム分画、SDS-PAGE電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィーの標準的技術を用いて達成され得る。本発明の方法における使用のためのIKKシグナルソームおよび成分は、天然であるか、精製されているか、または組換え体であり得る。
【００７７】
本発明の１つの局面において、IKKシグナルソームおよび／またはその１つ以上の成分を使用して調節因子を同定し得、これは抗体（例えば、モノクローナル）、ポリヌクレオチド、または他の薬物であり得、NF-κBカスケードを介したシグナル伝達を阻害または刺激する。調節は、NF-κB活性の抑制または増強を含む。調節はまた、IκBリン酸化の抑制もしくは増強、または活性化された（すなわち、リン酸化された）IKKシグナルソームが基質をリン酸化する能力の刺激もしくは阻害を含み得る。IκBリン酸化を阻害することによりNF-κB活性を阻害する組成物は、IκBαキナーゼ活性を阻害またはブロックする１つ以上の因子（例えば、IKKシグナルソームを中和する抗体、IκBキナーゼの基質結合ドメインまたはIκBのリン酸化モチーフを代表する競合ペプチド、IκBキナーゼの転写および／または翻訳を妨げるアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイム、複合体に結合することによりIKKシグナルソームを不活化する分子、IκBに結合しそしてIKKシグナルソームによるリン酸化を妨げる分子、あるいはキナーゼから基質へのリン酸基の転移を妨げる分子）を含み得る。特定の実施態様で、調節因子は、IKK-1および／またはIKK-2の発現または活性を阻害または増強する。
【００７８】
一般的に、調節因子は、試験化合物とIKKシグナルソーム、IκBキナーゼ、またはIκBキナーゼをコードするポリヌクレオチドとをインビトロまたはインビボで組み合せ、そして例えば、本明細書中に記載の代表的なアッセイを用いて、IκBキナーゼ活性に対する試験化合物の効果を評価することにより同定され得る。キナーゼ活性の増大または減少は、放射性化合物（例えば、32P-ATP）を添加し、そしてIKKシグナルソームの適切な基質への放射能取り込みを観察し、それにより化合物がキナーゼ活性を阻害または刺激するか否かを決定することにより測定され得る。簡単には、候補因子は、IKKシグナルソーム、IκBキナーゼ、またはIκBキナーゼをコードするポリヌクレオチドと共に、キナーゼ反応に必要な化合物（本明細書中に記載される）およびIκB基質を含む反応混合物中に含まれ得る。一般的に、このようなアッセイにおける使用のための抗体または他の因子の適切な量は、約0.01μM〜約10μMの範囲である。次いで、IκBキナーゼ活性に対する因子の効果は、[32P]リン酸のIκB（例えば、IκBα）（またはその誘導体もしくは改変体）への取り込みを定量し、そして候補因子の添加なしでIκBキナーゼを用いて達成した取り込みレベルを比較することにより評価され得る。あるいは、IκBキナーゼの転写に対する候補調節因子の効果は、例えば、ノーザンブロット分析またはプロモーター／レポーターに基づく全細胞アッセイにより測定され得る。
【００７９】
あるいは、試験化合物がIKKシグナルソームと組み合せられるアッセイについて、異なるIKKシグナルソーム活性に対する効果がアッセイされ得る。例えば、IKKシグナルソームはまた、p65キナーゼ活性およびIKKホスファターゼ活性を示す。このような活性に対する試験化合物の効果を評価するためのアッセイは、周知の技術を用いて行われ得る。例えば、p65キナーゼ活性についてのアッセイは、一般的に、Zhongら、Cell  89:413-24,1997により記載されるように行われ得る。ホスファターゼ活性について、アッセイは、一般に、組換えリン酸化IκBキナーゼを基質として用いて、Sullivanら、J.Biomolecular  Screening  2:19-24,1997により記載されるように行われ得る。
【００８０】
本発明の別の局面において、IKKシグナルソームまたはIκBキナーゼは、IκB（例えば、IκBα）（またはその誘導体もしくは改変体）をリン酸化して、それをユビキチン化および続く分解のための標的にするために使用され得る。IκBは、IKKシグナルソームまたはIκBキナーゼとIκBとを、適切な緩衝液中で30℃で30分間インキュベートすることによりインビトロでリン酸化され得る。一般的に、約0.01μg〜約９μgのIκBキナーゼ複合体は、約0.5μg〜約２μgのIκBをリン酸化するために十分である。次いで、リン酸化された基質は、GSH-sepharoseに結合し、そして洗浄することにより精製され得る。基質リン酸化の程度は、一般的に、[γ-32P]ATPを試験アリコートに添加し、そして本明細書中に記載されるように基質リン酸化レベルを評価することによりモニターされ得る。
【００８１】
IKKシグナルソーム、その成分、調節因子、ならびに／あるいは成分および／または調節因子をコードするポリヌクレオチドはまた、患者のNF-κB活性を調節するために使用され得る。このような調節は、任意の種々の機構（成分または調節因子を用いたIκBリン酸化の直接阻害または増強；あるいはIKKシグナルソームまたはその成分を用いた上流アクチベーター（例えば、NIKまたはMEK）の阻害を含むが、それらに限定されない）により起こり得る。本明細書中で使用する「患者」は、任意の哺乳動物（ヒトを含む）であり得、そしてIκBキナーゼ活性化およびNF-κBカスケードに関連する疾患に罹患していてもよく、または検出可能な疾患がなくてもよい。従って、処置は、現存する疾患の処置であり得るか、または予防であり得る。NF-κBカスケードに関連する疾患は、炎症性疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、ガン、およびウイルス感染を含む。
【００８２】
処置は、IKKシグナルソーム、その成分、および／またはIκBキナーゼ活性を調節する因子の投与を含み得る。患者への投与のために、１つ以上のこのような化合物は、一般的に、薬学的組成物として処方される。薬学的組成物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、またはエマルジョンであり得、これは生理学的に受容可能なキャリア（すなわち、活性成分の活性を妨げない非毒性物質）をさらに含む。当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物中に使用され得る。代表的なキャリアは、生理学的食塩水溶液、ゼラチン、水、アルコール、天然または合成油、糖類溶液、グリコール、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、またはこのような物質の組み合せを含む。任意に、薬学的組成物は、保存料、および／もしくは他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および／もしくは不活性ガス）、ならびに／または他の活性成分をさらに含み得る。
【００８３】
あるいは、薬学的組成物は、生理学的に受容可能なキャリアと組み合せて、（成分および／または調節因子がインサイチュで生成されるように）IKKシグナルソームの成分および／または調節因子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。このような薬学的組成物において、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の種々の送達系（核酸、細菌およびウイルス発現系、ならびにコロイド分散系（リポソームを含む）を含む）内に存在し得る。適切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なポリヌクレオチド配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。DNAはまた、例えば、Ulmerら、Science  259:1745-49,1993に記載されるように「裸」であり得る。
【００８４】
標的化された患者細胞に核酸配列を導入するために使用され得る種々のウイルスベクターは、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスを含むが、それらに限定されない。DNAをこのようなベクターに取り込むための技術は、当業者に周知である。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルス（モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳房腫瘍ウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）を含むが、これらに限定されない）の誘導体である。レトロウイルスベクターは、（形質導入された細胞の同定または選択を助けるために）選択マーカー遺伝子および／または（ベクター標的を特異的にするために）特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子を、さらに転移または組込み得る。例えば、レトロウイルスベクターは、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することにより標的特異的にされ得る。標的化はまた、当業者に公知の方法により、抗体を用いて達成され得る。
【００８５】
ウイルスベクターは、代表的には、感染性ベクター粒子を産生するために補助を必要とする非病原性（欠損）の複製コンピテントウイルスである。この補助は、例えば、LTR内の調節配列制御下のレトロウイルスの全ての構造遺伝子をコードするプラスミドを含むが、カプセル化のためのRNA転写物を認識するパッケージング機構を可能にするヌクレオチド配列がない、ヘルパー細胞株を使用することにより提供され得る。このようなヘルパー細胞株は、Ψ2、PA317、およびPA12を含むが、それらに限定されない。このような細胞に導入されたレトロウイルスベクターはパッケージングされ、そしてベクタービリオンが産生され得る。次いで、この方法により産生されたベクタービリオンを使用して、組織細胞株（例えば、NIH  3T3細胞）を感染し、多量のキメラレトロウイルスビリオンを産生し得る。
【００８６】
別のポリヌクレオチドの標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）を含む。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとしての使用に好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。大型単層小胞（LUV）（サイズが0.2〜4.0μmの範囲である）は、大きな巨大分子を含む水性緩衝液の実質的な割合をカプセル化し得ることが示されている。RNA、DNA、およびインタクトなビリオンは水性内部内にカプセル化され、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Fraleyら、Trends  Biochem.Sci.6:77,1981）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、および細菌細胞におけるポリヌクレオチドの送達に使用されてきた。リポソームが効率的な遺伝子導入ビヒクルであるために、以下の特徴が存在すべきである：（１）高い効率での目的の遺伝子のカプセル化（一方、それらの生物学的活性を傷つけない）；（２）非標的細胞と比較して標的細胞への優先的および実質的な結合；（３）高い効率での標的細胞質への小胞水性含有物の送達；および（４）遺伝情報の正確なおよび効果的な発現（Manninoら、Biotechniques  6:882,1988）。
【００８７】
リポソームの標的化は、解剖学的および力学的要因に基づいて分類され得る。解剖学的分類は感受性レベルに基づき、そして例えば、器官特異的、細胞特異的、および／または細胞小器官特異的であり得る。力学的標的化は、受動的または能動的であるか否かに基づいて区別され得る。受動的標的化は、リポソームが洞様毛細血管を含む器官における網内皮細胞系（RES）細胞に分布する自然の傾向を利用する。一方、能動的標的化は、リポソームを特異的リガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）に結合させることによるか、または天然に存在する局在化部位以外の器官および細胞型への標的化を達成するためにリポソームの組成またはサイズを変えることによるリポソームの改変を含む。
【００８８】
投与の経路および頻度、ならびに用量は、患者間で変化する。一般的に、薬学的組成物は、静脈内的、腹腔内的、筋肉内的、皮下的、腔内的、または経皮的に投与され得る。１〜６用量が毎日投与され得る。適切な用量は、NF-κBカスケードに関連した疾患に罹患した患者の徴候において改善を示すに十分な量である。このような改善は、炎症応答（例えば、浮腫、移植拒絶、過敏）をモニターすることにより、または疾患に関連した臨床徴候における改善を通して検出され得る。投薬量は、一般的に、調節因子の性質および処置されるべき疾患に依存して変化し得る。代表的には、１用量に存在する調節因子の量、または１用量に存在するDNAによりインサイチュで生成された調節因子の量は、宿主１kgあた
り約１μg〜約200mgの範囲である。適切な用量サイズは患者のサイズと共に変化するが、代表的には、10〜60kg動物について約10mL〜約500mLの範囲である。
【００８９】
別の局面において、本発明は、サンプル中の刺激誘導性IκBキナーゼ活性レベルを検出するための方法を提供する。IκBキナーゼ活性レベルは、一般的に、イムノキナーゼアッセイを介して決定され得、ここでIKKシグナルソームは、複合体に結合する抗体で最初に免疫沈降される。次いで、免疫沈降された物質は、本明細書中に記載のようにキナーゼアッセイに供される。基質特異性は、刺激誘導性IκBキナーゼ複合体の活性を他のキナーゼ活性から区別するために、本明細書中に記載のようにさらに評価され得る。
【００９０】
本発明はまた、サンプル中のIKKシグナルソームまたはその成分のレベルを検出するための方法を提供する。IKKシグナルソーム、IκBキナーゼ、またはIκBキナーゼをコードする核酸の量は、一般的に、IκBキナーゼ、またはその成分をコードするDNAもしくはRNAに結合する試薬を用いて決定され得る。成分をコードする核酸を検出するために、標準的なハイブリダイゼーションおよび／またはPCR技術が、核酸プローブまたはPCRプライマーを用いて使用され得る。適切なプローブおよびプライマーは、成分配列に基づいて当業者により設計され得る。IKKシグナルソームまたはその成分を検出するために、代表的には、試薬は抗体であり、これは以下に記載のように調製され得る。
【００９１】
サンプル中のタンパク質を検出するために、抗体を用いた当業者に公知の種々のアッセイフォーマットがある。例えば、HarlowおよびLane,Antibodies:A  Laboratory  Manual,Cold  Spring  Harbor  Laboratory,1988を参照のこと。例えば、抗体は、それがタンパク質に結合し、そしてサンプルからタンパク質を取り出し得るように、固体支持体に固定化され得る。次いで、結合したタンパク質は、抗体／タンパク質複合体に結合し、そして検出可能なレポーター基を含む第２の抗体を用いて検出され得る。あるいは、競合アッセイが利用され得、ここで固定化抗体に結合するタンパク質は、レポーター基で標識され、そして抗体とサンプルとのインキュベーション後に固定化抗体に結合させられる。サンプル成分が標識タンパク質の抗体への結合を阻害する程度は、サンプル内のタンパク質レベルの指標である。これらの方法にける使用に適切なレポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基、およびビオチンを含むが、それらに限定されない。
【００９２】
本発明に包含される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そしてIKKシグナルソームおよび／または１つ以上のその成分（例えば、IKK-1および／またはIKK-2）に結合し得る。好ましい抗体は、上記のように、インビボおよびインビトロアッセイ内でIκBキナーゼ活性を阻害またはブロックする抗体である。他の好ましい抗体は、１つ以上のIκBタンパク質に結合する抗体である。上記のように、IκBキナーゼ活性に対して所望の効果を有する抗体および他の因子は、インビボでのIκB（例えば、IκBα）のリン酸化を調節するために、（予防的であるかまたは現存する疾患の処置のためであるかのいずれかで）患者に投与され得る。
【００９３】
抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る（例えば、HarlowおよびLane,Antibodies:A  Laboratory  Manual,Cold  Spring  Harbor  Laboratory,1988を参照のこと）。１つのこのような技術では、目的のタンパク質を含む免疫原は、好ましくは、１回以上の追加抗原刺激免疫を組込む予め決定されたスケジュールに従って、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヤギ）に最初に注射され、そして動物は周期的に採血される。次いで、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合したタンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーによりこのような抗血清から精製され得る。
【００９４】
IKKシグナルソームまたはその成分に特異的なモノクローナル抗体は、例えば、KohlerおよびMilstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976の技術およびそれに対する改良を用いて調製され得る。簡単には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち目的の複合体および／または成分との反応性）を有する抗体を産生し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られた脾臓細胞から生成され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合により不死化される。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、２、３分間非イオン性界面活性剤と組み合せられ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない、選択培地上に低い密度でプレーティングされ得る。好ましい選択技術は、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常、１〜２週間）の後、ハイブリッドコロニーが観察される。単一のコロニーが選択され、そしてポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００９５】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術（例えば、ハイブリドーマ細胞株の適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔への注射）が、収量を増強するために使用され得る。次いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から採集され得る。汚染物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降、および抽出）により抗体から除去され得る。
【００９６】
本発明の関連した局面では、サンプル中のIKKシグナルソーム、IκBキナーゼ、IκBキナーゼをコードする核酸、および／またはIκBキナーゼ活性のレベルを検出するためのキットが提供される。任意の種々のサンプル（真核生物細胞、細菌、ウイルス、このような生物から調製された抽出物、および生存生物内で見出される体液を含む）が、このようなアッセイにおいて使用され得る。一般的に、本発明のキットは、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を囲む１つ以上の容器を含む。
【００９７】
IKKシグナルソーム、IκBキナーゼ、またはIκBキナーゼをコードする核酸のレベルを検出するためのキットは、代表的には、目的の化合物に結合する試薬を含む。IκBキナーゼをコードする核酸を検出するために、試薬は、核酸プローブまたはPCRプライマーであり得る。IKKシグナルソームまたはIκBキナーゼを検出するために、試薬は、代表的には、抗体である。このようなキットはまた、試薬の直接的または間接的検出に適切なレポーター基を含む（すなわち、レポーター基は、試薬に共有結合し得るか、または第２の分子（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、またはレシチン）（これ自体が試薬に結合し得る）に結合し得る）。適切なレポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基、およびビオチンを含むが、それらに限定されない。このようなレポーター基は、当業者に公知の標準的な方法を用いて、試薬のサンプル成分への結合を直接的または間接的に検出するために使用され得る。
【００９８】
なお別の局面において、IKKシグナルソームは、当業者に周知の方法を用いて、１つ以上のネイティブな上流キナーゼ（すなわち、インビボでIKKシグナルソームをリン酸化および活性化するキナーゼ）またはIκBキナーゼ活性に影響する他の調節分子（例えば、ユビキチン化に関与するホスファターゼまたは分子）を同定するために使用され得る。例えば、IKKシグナルソーム成分は、このような成分と相互作用するタンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。あるいは、発現ライブラリーは、IKKシグナルソームまたはその成分をリン酸化するcDNAについてスクリーニングされ得る。
【００９９】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：活性化の間のNFκBのIKKシグナルソーム中への漸増
本実施例は、NFκBの、IκBキナーゼおよび他のシグナリングタンパク質を含むタンパク質複合体（IKKシグナルソーム）への漸増を例示する。
【０１０１】
非刺激Jurkat細胞または刺激Jurkat細胞のいずれかの細胞質抽出物を、Superdex  200ゲル濾過カラムで分画し、そしてIκBαを免疫ブロット分析により視覚化した。Jurkat細胞を1.5×106細胞/mlの細胞密度まで増殖し、そして刺激しなかったか、またはPMA(50ng/ml)/PHA(１μg/ml)で10分間誘導したかのいずれかであった。細胞を採集し、そして２容量のHLB緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、２mM  EDTA、１mM  EGTA、10mM  β-グリセロホス
フェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、300μM  Na3VO4、１mMベンズアミジン、２mM  PMSF、10μg/mlアプロトニン、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン、１mM  DTT）に懸濁し、0.1％  NP40とし、そして15分間氷上に放置し、そしてガラスDounceホモジナイザーで溶解した。核を、Sorval  SS34ローター中で10,000rpmで20分間ペレット化した。上清を、Ti50.1ローター中で40,000rpmで60分間さらに遠心分離した。全ての手順は４℃で行った。S-100画分を濃縮し、そしてGF緩衝液（20mM  Tris  HCl(pH8.0)、150mM  NaCl、１mM  EDTA、１mM  EGTA、５％グリセロール、0.025％Brij35、１mMベンズアミジン、２mM  PMSF、10mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、300μM  Na3VO4、10μg/mlアプロトニン、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン、１mM  DTT）で平衡化した、Hi  Load  16/60  Superdex  200プレップグレードゲル濾過カラムでクロマトグラフした。単離された画分を、抗IκBαまたは抗JNK抗体（Santa  Cruz,Inc.,Santa  Cruz,CA）のいずれかを用いてウェスタンブロット分析により分析した。
【０１０２】
図1Aに示されるように、非刺激細胞からの細胞抽出物中のIκBαは、不活性NFκB-IκB複合体のクロマトグラフィー特性（BaeuerleおよびBaltimore,Genes  Dev.3:1689-98,1989）と一致して、約300kDaの見かけの分子量で溶出した（レーン５〜７）。対照的に、リン酸化されたIκBα（刺激された期間が短すぎてタンパク質の完全な分解を可能にしなかった細胞に由来する）は、同じクロマトグラフィーカラムで約600kDaで移動した（レーン２、３）。移動におけるこの差異は、IκBに特異的であった。なぜなら、同じ画分の分析は、Jun  Ｎ末端キナーゼJNK1およびJNK2が低い見かけの分子量で移動することを示し、そして刺激細胞と非刺激細胞との間のクロマトグラフィー挙動における差違を示さなかったからである。IκBのこのより大きなタンパク質複合体への刺激依存性漸増はリン酸化IκBの出現と一致し、これは複合体がIκBリン酸化を仲介する特異的IκBキナーゼを含んでいたことを示唆する。これらの結果は、NFκB活性化が、IκBキナーゼおよび他のシグナリングタンパク質を含むタンパク質複合体（IKKシグナルソーム）中への漸増を含むことを証明する。
【０１０３】
実施例２：IKKシグナルソームの部分精製および同時精製成分の同定
本実施例は、IκBキナーゼを含む抽出物の分画を例示する。TNFα刺激細胞からの全細胞抽出物を、上記のように、ゲル濾過、イオン交換、および他のクロマトグラフィー方法により分画した。画分中のIκBキナーゼ活性を、GST-IκBα(1-54)（配列番号３）またはGST-IκBβ(1-44)（配列番号４）のリン酸化によりアッセイした。キナーゼアッセイを、20mM  HEPES(pH7.7)、２mM  MgCl2、２mM  MnCl2、10μM  ATP、１〜３μCi  γ-[32P]-ATP、10mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、300μM  Na3VO4、１mMベンズアミジン、２μM  PMSF、10μg/mlアプロトニン、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン、１mM  DTT）中で30℃で30〜60分間、示された基質の存在下で行った。キナーゼ反応を、６×SDS-PAGEサンプル緩衝液の添加により止め、SDS-PAGE分析に供し、そしてオートラジオグラフィーを用いて視覚化した。上記のアッセイにおける使用のためのGST-IκB基質を、細菌発現GSTタンパク質のための標準的な技術を用いて調製した(Current  Protocols  in  Molecular  Biology  2:16.7.1-16.7.7,1996を参照のこと）。細菌細胞を溶解し、GSTタンパク質をGSTアガロースビーズへの結合を介して精製し、数回洗浄し、グルタチオンでビーズから溶出させ、キナーゼアッセイ緩衝液に対して透析し、そして-80℃で保存した。キナーゼの特異性を、セリン32、36がスレオニンに変異した変異体GST-IκBα(1-54)（配列番号５）、およびセリン19、23がアラニンに変異したGST-IκBβ(1-44)（配列番号６）を用いることにより確立した。
【０１０４】
IκBキナーゼ活性は、非刺激細胞からの抽出物において観察されなかったが、一方５〜７分間のTNFαでの刺激は、キナーゼ活性の強力な誘導をもたらした。図1Bに示されるように、刺激細胞に由来するIκBキナーゼ活性は、NFκB活性化に必要とされる他の成分を潜在的に含む大きなタンパク質複合体におけるその存在と一致して、約500〜700kDaの広いピークとしてゲル濾過でクロマトグラフした。
【０１０５】
NFκBの活性化は、MAPキナーゼ経路もまた刺激する条件下で起こることが知られている（Leeら、Cell  88:213-22,1997；Hiranoら、J.Biol.Chem.271:13234-38,1996）。従って、IKKシグナルソーム精製の種々の段階でMAPキナーゼおよびホスファターゼカスケードに関連するタンパク質を検出するために、さらなる実験を行った。RelAおよびIκBβに加えて、MEKK-1および約55および約40kDaの２つのチロシンリン酸化タンパク質は、IκBキナ
ーゼ活性と共に同時精製した（図1C）。RelAおよびIκBβに対する抗体を、Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.(Santa  Cruz,CA)から得、そしてMEKK-1に対する抗体を、Upstate  Biotechnology(Lake  Placid,NY)から得た。他のシグナリング成分（PKCζ、PP1、およびPP2Aを含む）を、初期クロマトグラフィー段階においてIκBキナーゼと同じ画分中に検出したが、より後期のクロマトグラフィー段階で同時精製しなかった（データ示さず）。最も興味深いことには、MKP-1に対する抗体とのその交差反応により検出された約50kDaの同定されなかったタンパク質は、いくつかの精製段階を通してIκBキナーゼと共に同時精製した（図1C）。このタンパク質は、本物のMKP-1の分子量が38kDaであるので、MKP-1自身ではないようである。
【０１０６】
実施例３：HeLa  S3細胞抽出物からのIKKシグナルソームの調製
本実施例は、IKKシグナルソームの代替調製および複合体の特徴付けを例示する。
【０１０７】
HeLa  S3細胞を約0.6×106/mLの細胞密度まで増殖させ、10倍濃縮し、そして７分間TNFα（30ng/mL）で誘導した。次いで、ホスファターゼインヒビター（10mMフッ化ナトリウム、0.3mMオルトバナジウム酸ナトリウム、および20mMβ-グリセロホスフェート）を含む氷冷PBSの２容量を添加した。細胞をスピンダウンし、ホスファターゼインヒビターを含む氷冷PBSで１回洗浄し、そして急速凍結した。
【０１０８】
次いで、標準的なプロトコルを使用して、細胞質および核抽出物を調製した。より詳細には、凍結したHeLa  S3細胞ペレットを37℃で急速解凍し、２容量の氷冷低張溶解緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、２mM  EDTA、１mM  EGTA、10mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、0.3mM  Na2VO4、５mMリン酸ナトリウム、１mMベンズアミジン、２mM  PMSF、10μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチン）に再懸濁し、そして氷上で30分間放置し、インキュベートした。次いで、膨張した細胞を堅い乳棒で30回すりつぶし（dounced）、そして核を、４℃で15分間10,000rpmでペレット化した。上清を超遠心分離（４℃で１時間50,000rpm）を介して清澄して、最終細胞質抽出物を生成した。核／膜ペレットを、等容量の高塩抽出緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、0.5M  NaCl、１mM  EDTA、１mM  EGTA、0.25％  Triton  X-100、20mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、0.3mM  Na2VO4、１mMベンズアミジン、１mM  PMSF、10μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチン）に再懸濁し、そして４℃で30分間回転させた。細胞破片を、４℃で30分間12,500rpmの遠心分離を介して除去し、そして得られた上清を、核／膜抽出物として保存した。
【０１０９】
次いで、これらの抽出物を、独立して、Pharmacia  FPLCシステム（Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）を用いる一連のクロマトグラフィー工程（図２に示される）に供した：
（１）Q  Sepharose(Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ)−このカラムを、0.0M  NaCl  Q緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、0.5mM  EDTA、0.5mM  EGTA、0.025％  Brij  35、20mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、0.3mM  Na2VO4、１mMベンズアミジン、１mM  PMSF、２mM  DTT、10μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチン）で始まり、そして0.5M  NaCl  Q緩衝液で終わる直線勾配で作動させた。IκBαキナーゼ活性は、0.25〜0.4M  NaClで溶出した。
【０１１０】
（２）ゲル濾過HiLoad  16/60  Superdex  200)(Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）−このカラムを、ゲル濾過緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、150mM  NaCl、１mM  EDTA、１mM  EGTA、0.05％  Brij  35、20mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、0.3mM  Na2VO4、１mMベンズアミジン、１mM  PMSF、１mM  DTT、10μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチン）で作動させた。ピークIκBαキナーゼ活性は40〜48mLで溶出し、これは731kD〜623kDの分子量に対応する。
【０１１１】
（３）HR  5/5  MonoQ(Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）−このカラムを、0.0M  NaCl  Q緩衝液で始まり、そして0.5M  NaCl  Q緩衝液（Phenyl  Superoseカラムのためのサンプルを調製するためにBrij界面活性剤を含まない）で終わる線状勾配で作動させた。IκBαキナーゼ活性は、0.25〜0.4M  NaClで溶出した。
【０１１２】
（４）HR  Phenyl  Superose(Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）−このカラムを、Phenyl  Superose緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、0.25mM  EDTA、１mM  EGTA、20mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、0.1mM  Na2VO4、１mMベンズアミジン、１mM  PMSF、１mM  DTT、10μg/mlアプロチニン、１μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチン）中の1.0M〜0.0M硫酸アンモニウムの線上勾配で作動させた。IκBαキナーゼ活性は、0.35〜0.2M硫酸アンモニウムで溶出した。
【０１１３】
（５）ゲル濾過Superdex  200  HR  10/30(Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）−このカラムを、ゲル濾過緩衝液（上記（２）を参照のこと）で作動させた。活性ピークは８〜10mLで溶出し、これは720kD〜600kDの分子量に対応する。
【０１１４】
（６）HR  5/5  MonoQ−このカラムを、0.05％  Brij  35が全てのQ緩衝液に含まれる以外は、上記の（３）のように作動させた。
【０１１５】
類似した基質特異性および分子量を有するIκBαキナーゼ活性を、細胞質および核／膜両方の抽出物から単離した。
【０１１６】
分画の各工程で、IκBキナーゼ活性をインビトロアッセイを用いてモニターした。アッセイを、２μgの各IκB基質（以下に記載されるような、GST-IκBα  1-54(野生型)またはGST-IκBα(S32/36→T)）と、３〜５μLのクロマトグラフィー画分および20μLのγ32P-ATPを含むキナーゼアッセイ緩衝液（20mM  HEPES(pH7.4)、10mM  MgCl2、10mM  MnCl2、20mM  NaCl、１M  DTT、20mM  PNPP、20μM  ATP、20mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、0.1mM  Na2VO4、１mMベンズアミジン、１mM  PMSF）とを組み合せ、そして30℃で30分間インキュベートすることにより行った。キナーゼ反応を、８μLの６×SDS-PAGEサンプル緩衝液を添加することにより終結させた。全サンプルを、12％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーに供した。
【０１１７】
上記のアッセイにおける使用のためのIκB基質を、標準的な技術（Haskillら、Cell  65:1281-1289,1991を参照のこと）を用いて調製した。GST-IκBα  1-54(野生型)またはGST-IκBα(S32/36→T)基質を、細菌発現したGSTタンパク質のための標準的な技術を用いて調製した。細菌細胞を溶解し、GSTタンパク質をGSTアガロースビーズへの結合を介して精製し、数回洗浄し、グルタチオンでビーズから溶出させ、50mM  NaClキナーゼアッセイ緩衝液に対して透析し、そして-80℃で保存した。
【０１１８】
IκBキナーゼ活性のTNFα誘導性を、ゲル濾過後のHeLa  S3細胞質抽出物中のIκBレベルのウェスタンブロット分析により最初に評価した。10％SDS  PAGEで18μLのゲル濾過画分を泳動させ、標準的なブロッティング技術を用いてニトロセルロース膜（Hybond-ECL,Amersham  Life  Sciences,Arlington  Height,IL）に移し、そして抗IκBα抗体（Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA）でプローブすることにより、IκBαをアッセイした。TNFα誘導性を、TNFα（上記のように７分間30ng/mL）に暴露した細胞（図3B）と暴露しなかった（図3A）細胞におけるIκBαレベルを比較することにより評価した。
【０１１９】
これらの細胞質抽出物のIκBキナーゼ活性を、上記のキナーゼアッセイを用いて評価した。図4Bに示されるように、TNFα処理細胞の抽出物はGST-IκBα  1-54(野生型)をリン酸化し、一方、未処理細胞抽出物は、著しく低いレベルのIκBαキナーゼ活性を示した（図4A）。
【０１２０】
TNFα処理HeLa  S3細胞の細胞質抽出物（Q  Sepharose分画後）もまた、基質としてIκBαのＮ末端部分（残基１〜54）を用いてインビトロキナーゼアッセイに供した。野生型基質を用いると、GST-IκBα  1-54のリン酸化は容易に明らかであった（図5A）。対照的に、32および36位にスレオニン置換を含む基質はリン酸化されなかった（図5B）。
【０１２１】
Q  Sepharose、Superdex  200、MonoQ  Sepharose、およびPhenyl  Superoseによるクロマトグラフィー分画後、インビトロキナーゼアッセイは、IκBキナーゼ活性の実質的な精製を示した（図6A）。IκBキナーゼのさらなる精製は、サンプルを、分析Superdex  200およびMonoQ  HR5/5に連続して通過させることにより達成し、銀染色により決定されるような８つの主要なタンパク質バンドをもたらした。以前のように、32および36位にスレオニン置換を含む基質の使用は、リン酸化を著しく低減した（図6B）。これらの結果は、外因性因子の添加なくIκBαの32および36位のセリン残基を特異的にリン酸化する、刺激誘導性IκBαキナーゼ複合体の精製を証明する。
【０１２２】
実施例４：抗MKP-1抗体を用いたIKKシグナルソームの免疫沈降
本実施例は、刺激細胞から調製された細胞質抽出物に由来するIκBキナーゼ活性の免疫沈降を例示する。
【０１２３】
Ａ．HeLa細胞に由来するIκBキナーゼ複合体の免疫沈降
HeLa細胞をTNFα処理し（30μg/mL、７分）、そして実施例３に記載のようにゲル濾過により分画した。20μLのゲル濾過画分＃６（約700kD分子量に対応する）および１μgのMKP-1に対して惹起された精製抗体（Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA）を、400μLの氷冷１×プルダウン（Pull  Down）緩衝液（20mM  Tris(pH8.0)、250mM  NaCl、0.05％  NP-40、３mM  EGTA、５mM  EDTA、10mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、300μM  Na3VO4、１mMベンズアミジン、２mM  PMSF、10μg/mlアプロトニン、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン、１mM  DTT）に添加した。サンプルを４℃で１時間穏やかに回転し、この時に40μLのプロテインＡ-アガロースビーズ（50:50スラリー、Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA）を添加した。次いで、サンプルを、４℃でさらに1.5時間回転させた。プロテインＡ-アガロースビーズを４℃で２分間3,000rpmでペレット化し、そしてペレットを氷冷プルダウン緩衝液（洗浄あたり800μL）で３回洗浄した。
【０１２４】
ペレットを、基質として２μgのGST-IκBα1-54（野生型）または２μgのGST-IκBα1-54（S32/36→T）のいずれかを用いて、（上記のように）標準的なインビトロIκBαキナーゼアッセイに供した。
【０１２５】
図７に示される結果は、MKP-1に対して指向された抗体は、刺激誘導性IκBαキナーゼ
活性を免疫沈降することを証明する。このIκBαキナーゼ活性の基質特異性は、インビボで記載されたもの（GST-IκBα1-54（野生型）の強力なリン酸化およびGST-IκBα1-54（S32/36→T）を用いたリン酸化なし）に一致する。
【０１２６】
Ｂ．免疫沈降されたIKKシグナルソームの特徴づけ
これらの研究のために、小規模の免疫沈降を、HeLa細胞の２つの150mmプレート（刺激細胞および非刺激細胞）を用いて行った。全細胞溶解物を、２×プルダウン緩衝液（40mM  Tris(pH8.0)、500mM  NaCl、0.1％  NP-40、６mM  EDTA、６mM  EGTA、10mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、300μM  Na3VO4、１mMベンズアミジン、２μM  PMSF、10μg/mlアプロトニン、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン、１mM  DTT）で４倍に希釈し、そして２〜４μgの示された抗体を添加した。溶解物を１〜２時間氷上でインキュベートし、10μlのプロテインＡまたはＧビーズを添加し、そして溶解物を、４℃でさらに１時間穏やかに回転しながらインキュベートしたままにした。次いで、免疫沈降物を、２×プルダウン緩衝液で３回、ATPを含まないキナーゼ緩衝液で１回洗浄し、そして実施例２に記載のようにキナーゼアッセイに供した。免疫沈降物を、例えば、RIPA緩衝液（20mM  Tris、250mM  NaCl、１％  NP-40、１％  DOC、0.1％  SDS、３mM  EDTA、３mM  EGTA、10mM  β-グリセロホスフェート、10mM  NaF、10mM  PNPP、300μM  Na3VO4、１mMベンズアミジン、２μM  PMSF、10μg/mlアプロトニン、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン、１mM  DTT）でのより激しい洗浄、または3.5M尿素までの洗浄に供した。
【０１２７】
試験された大きなパネルの抗体のうち、３つの抗MKP-1抗体のうちの１つは、HeLa細胞ならびに初代ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）由来の誘導性IκBキナーゼ活性を効率的に共同免疫沈降した。共同免疫沈降キナーゼ（IKKシグナルソームキナーゼ）は、非刺激HeLa細胞において不活性であったが、TNFα刺激の数分内で迅速に活性化された（図8A、上方のパネル）。IKKシグナルソームキナーゼは、セリン残基32および36がスレオニンに変異している変異体GST-IκBαタンパク質をリン酸化しなかった（図8A上方のパネル、偶数のレーン）。シグナルソームキナーゼの活性化は５分で最大であり、そしてその後低下し、時間経過は同じ条件下のIκBαリン酸化および分解の時間経過と一致した（図8A、下方のパネル）。期待されたように、シグナルソームIκBキナーゼはまた、IL-1またはPMAでの細胞の刺激により活性化され（図8B、レーン１〜４）；さらに、その活性は、NFκB活性化の既知のインヒビターであるTPCKで処理された細胞において阻害された（図8B、レーン７）。さらに、IKKシグナルソームキナーゼは、生理学的RelA-IκBα複合体の状況において、完全長野生型IκBαを特異的にリン酸化したが、セリン32、36でのアラニン変異を有する変異体IκBαをリン酸化しなかった（図8C、レーン３、４）。同時に、これらの結果は、抗MKP-1抗体がIKKシグナルソームを共同免疫沈降したことを示す。シグナルソーム関連IκBキナーゼは、標準のIκBキナーゼの期待される全ての基準を満たし、そして検出可能なIκBαＣ末端キナーゼ活性を有さなかった。
【０１２８】
IKKシグナルソームキナーゼの特異性は、速度論的分析により、ならびに種々のペプチドおよび組換えタンパク質基質に対するその活性を調べることによりさらに確立された（図9A）。これらの研究のために、合成ペプチド（Alpha  Diagnostics  International,San  Antonio,TX）を以下の配列を用いて調製した：
IκBα（21-41）：CKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE（配列番号11）
IκBα（21-41）S/T変異体：CKKERLLDDRHDTGLDTMKDEE（配列番号12）
c-Fos(222-241)：DLTGGPEVAT(PO3)PESEEAFLP（配列番号13）
MKP-1：CPTNSALNYLKSPITTSPS（配列番号14）
cJun(56-70)：CNSDLLTSPDVGLLK（配列番号15）
cJun(65-79)：CVGLLKLASPELERL（配列番号16）
これらのペプチド（100μM）のリン酸化を、上記のようにキナーゼ反応を用いて行った。反応は、室温で１時間であり、そしてSDS-PAGEローディング緩衝液の添加により終結させた。16％  Tris/トリシンゲル（Novax,San  Diego,CA）または４〜20％  Tris/グリシンゲル（Novax,San  Diego,CA）を用いたSDS-PAGEを使用して、反応産物を特徴付けた。ゲルを洗浄し、真空乾燥し、そしてオートラジオグラフフィルムに暴露した。
【０１２９】
免疫精製されたIKKシグナルソーム活性の阻害を、上記の反応条件を用いた不連続アッセイにおいてGST-IκBα(1-54)への32P取り込みにより測定した。阻害研究において使用されるGST-IκBα(1-54)およびATPの濃度は、それぞれ0.56μMおよび３μMであった。酵素反応（32μL）を、室温で１時間96ウェルアッセイプレートのウェル中で行い、そしてトリクロロ酢酸（TCA）（12.5％  w/vの150μL/ウェル）の添加で終結させた。続く20分のTCAとのインキュベーションによって、タンパク質は沈降したが、溶液からはペプチドは沈降しなかった。TCA沈降物を、96ウェルガラスファイバープレート（Packard）上に収集し、そしてPackard  Filermate  196を用いてウェルあたり約0.3mLのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）（Sigma）で10回洗浄した。シンチレーション液（0.50mL、MicroScint,  Packard）を各ウェルに添加し、そしてプレートを、Packard  TopCountシンチレーションカウンターを用いて32Pについて分析した。10％未満のATPをアッセイ反応の経過において代謝回転させ、速度論データが初速度データを示すことを確実にした。P32、P36ペプチドの阻害定数を、Dixon分析（DixonおよびWebb,In  Enzymes(Academic  Press:New  York,第３版,1979),350-51頁）により決定した。
【０１３０】
キナーゼは、正常なミカエリス-メンテン速度論を示し、これは異なる非関連キナーゼの混合物でないことを示唆した。キナーゼは、IκBα（21-41）ペプチド（図9Aおよび9B）ならびに２つの異なるIκBα（21-41）ペプチド（各々、32または36位のいずれかに遊離セリン、および他の位置にホスホセリンを有する）（図9Aおよび9B、レーン２、３）をリン酸化し得た。期待されたように、両方の位置にホスホセリンを有するペプチドは、全くリン酸化されず（図9B、上方）、本発明者らの反応条件下でリン酸の有意なターンオーバーが存在しなかったことを示す。これらの実験は、セリン32および36の両方がIKKシグナルソームキナーゼのホスホアクセプター部位であることを示し、従って、それと他のキナーゼ（例えば、セリン32のみでIκBαをリン酸化するpp90Rsk（Schoutenら、EMBO  J.16:3133-44,1997））とを区別する。
【０１３１】
IKKシグナルソームキナーゼはIκBペプチドを効率的にリン酸化したが、遊離セリンおよび遊離スレオニンを含むc-Fosホスホペプチド（図9B、上方）、２つのc-Junペプチド（それぞれセリン63および73を含む）（図9A、上方のパネル、レーン４、５）、または４つのセリンおよび３つのスレオニンを含むMKP-1ペプチド（図9A、レーン６）をリン酸化しなかった。後者のペプチドは、JNK2の基質であった（図9A、下方のパネル、レーン４〜６）。セリン32および36がスレオニンにより置換されたIκBα（21-41）ペプチドは、野生型セリン含有ペプチドより少なくとも10倍少ないシグナルソームによりリン酸化され、これは、細胞におけるIκBα(S32/S36→T)のより遅いリン酸化および分解速度論（DiDonatoら、Mol.Cell.Biol.16:1295-1304,1996）、ならびに完全長IκBαおよびGST-IκBα(1-54)の両方における32、36位でのスレオニンを越えるセリンに対するキナーゼの優先（図8AおよびC）と一致した。さらに、キナーゼは、低い親和性にもかかわらず、GST-IκBβ(1-54)をリン酸化した。ほとんどの実験において、IκBキナーゼ活性はまた、強力なRelAキナーゼ活性（図8C、レーン３、４）に関連したが、いくつかの他の基質（ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、GST-ATF2(1-112)、GST-cJun(1-79)、GST-ERK3、GST-Elk(307-428)、GST-p38、およびIκBα(242-314)のＣ末端領域を含むGST融合タンパク質を含む）に対する活性は観察されなかった。
【０１３２】
IKKシグナルソームキナーゼの特異性は、産物阻害に対するその感受性によりさらに強調された（図9B、下方）。キナーゼは、32および36位の両方にホスホセリンを有する二重にリン酸化されたIκBαペプチドにより強力に阻害されたが、単一のホスホスレオニンを含む非関連c-Fosホスホペプチドにより阻害されなかった。単一にリン酸化されたIκBαペプチド、およびリン酸化されなかったIκBαペプチドは、あまり効果的なインヒビターでなかった。
【０１３３】
実施例５：精製IKKシグナルソームにおける遊離ユビキチンの非存在
本実施例は、実施例３におけるように調製されたIKKシグナルソームを用いた検出可能な遊離ユビキチンの非存在を例示する。標準的なウェスタンブロット手順を行った（Amersham  Life  Scienceプロトコル、Arlington  Heights,IL）。100ngユビキチン、10ngユビキチン、および20μl精製IκBαキナーゼ複合体を、16％Tricine  SDS-PAGE(Novex,San  Diego,CA)に供し、Hybond  ECLニトロセルロース膜（Amersham  Life  Science,  Arlington  Heights,IL）に移し、そしてユビキチンに対して指向された抗体（MAB1510；Chemicon,Temecula,CA）でプローブした。結果を図10に示す。遊離ユビキチンは、精製IκBαキナーゼ調製物中で検出され得なかった（非常に長い曝露でさえ）。本明細書中に記載の複合体は、IκBαキナーゼ活性を検出するために内因性ユビキチンの添加を必要としないし、遊離ユビキチンは、本発明の精製IκBαキナーゼ調製物における成分でもない。
【０１３４】
実施例６：NFκBシグナルソームの精製ならびにIKK-1およびIKK-2の同定  本実施例は、MKP-1抗体によるその認識に基づくIKKシグナルソーム精製（図11Aに示される）およびIκBキナーゼ同定のための２段階アフィニティ方法を例示する。
【０１３５】
大規模IKKシグナルソーム精製のために、HeLa  S3細胞を20ng/ml  TNFα（R&D  Systems,Minneapolis,MN）で７分間刺激し、採集し、全細胞溶解物を調製し（1.2g総タンパク質）、そして約５mgの抗MKP-1抗体(Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA)を添加し、そして穏やかに回転しながら４℃で２時間インキュベートした。続いて、50mlのプロテインＡアガロース（Calbiochem,San  Diego,CA）を添加し、そして混合物をさらに２時間インキュベートした。次いで、免疫沈降物を、４×プルダウン緩衝液、２×RIPA緩衝液、２×プルダウン緩衝液、１×3.5M  尿素-プルダウン緩衝液、および３×プルダウン緩衝液で連続的に洗浄した。次いで、免疫沈降物を10mlのプルダウン緩衝液の添加により厚いスラリーにし、25mgの特異的MKP-1ペプチド（これに対して抗体が作製された(Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA)）を添加し、そして混合物を、穏やかに回転しながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、溶出されたIKKシグナルソームを、50mM  Q緩衝液で平衡化したPD  10脱塩カラム（Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）で脱塩し、そしてMono  Qカラム（Pharmacia  Biotech,Piscataway,NJ）でクロマトグラフした。ピークIkBキナーゼ活性を含む画分をプールし、濃縮し、そして調製SDS-PAGEに供した。約85および約87kDaの２つの顕著なタンパク質バンド（それぞれ、IKK-1およびIKK-2として図11Bにおいて銀染色により示される）の強度は、IκBキナーゼ活性のプロフィールと相関した。
【０１３６】
クマシー染色された約85および約87kDaバンドを切除し、トリプシンでインゲル消化し（Wilmら、Nature  37:466-69,1996）、そして上清の少ないアリコートを、Shevchenkoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  93:14440-45,1996により記載されるように、高質量精度MALDIペプチド質量マッピングにより分析した。IKK-1バンドに由来するペプチド質量マップを、EMBL  Heidelbergの建物において開発されたプログラムPeptideSearchを用いて包括的タンパク質配列データベースに対して検索した。８つの測定されたペプチド質量が、30ppm内でCHUK（保存性ヘリックス-ループ-ヘリックス偏在(ubiquitous)キナーゼ；ConnelyおよびMarcu,Cell.Mol.Biol.Res.41:537-49,1995）に由来する計算されたトリプシン処理ペプチド質量に適合し、このタンパク質を明瞭に同定した。IKK-2バンドのペプチド質量マップは明らかな同定をもたらさず、従ってサンプルは、ナノエレクトロスプレー質量分析（WilmおよびMann,Anal.Chem.68:1-8,1996）に供された。ゲル断片の抽出後に得られたペプチド混合物を、50nLのPOROS  R2樹脂（PerSeptive  Biosystems,Framingham,MA）を含む毛細管で微量精製した。洗浄後、ペプチドを、ナノエレクトロスプレー針へ５％ギ酸中の50％MeOH  0.5μlで段階溶出した。この針をAPIII質量分析計（Perkin-Elmer,Sciex,Toronto,Canada）に移し、そしてサンプルを約20分間スプレーした。この時間の間、質量スペクトルから明らかなペプチドイオンを選択し、そして順に単離し、そして質量分析計の衝突チャンバー内でフラグメント化した。タンデム質量スペクトルから、配列の短い範囲を、ペプチド配列タグに組み立て(MannおよびWilm,Anal.Chem.66:4390-99,1994)、そしてタンパク質配列データベースに対してか、またはPeptideSearchを用いるdbESTに対して検索した。
【０１３７】
３つのペプチドがIKK-1配列に適合した。A1：IIDLGYAK(配列番号17)；A2：VEVALSNIK（配列番号18）；A3  SIQLDLER（配列番号19）。３つの他のペプチドがdbESTにおいてヒトEST配列に適合し；B1：ALELLPK（配列番号20）、B2：VIYTQLSK（配列番号21）、B6：LLLQAIQSFEK（配列番号22）、全てがESTクローンAA326115に適合する。配列LGTGGFGNVIR（配列番号23）を有するペプチドB4は、クローンR06591において見出された。完全長IKK-2配列が（以下に記載のように）得られた後、さらに２つのペプチドB3：ALDDILNLK（配列番号24）およびB5：DLKPENIVLQQGEQR（配列番号25）はこの配列において見出された。ペプチドA1は、IKK-1およびIKK-2両方の配列に存在する。同定された全てのESTクローンは、今まで未知であった機能のセリン／スレオニンキナーゼである、ヒトおよびマウスCHUKに明らかに相同であった。一旦IKK-2の完全なコード配列が（以下に記載のように）得られると
、全ての配列決定されたペプチド（IKK-1に由来する２つのペプチドを除いて）は、このタンパク質に割り当てられ得る。
【０１３８】
代表的な質量スペクトルを図12Aおよび12Bに示す。図12Aにおいて、Ａと標識したピークは、フラグメント化、それに続くペプチド配列タグでのデータベース検索の際にIKK-1のトリプシン処理ペプチドに適合させられた。B2、B4、B6と標識したピークは、タンパク質データベースに見出されなかったが、その代わりヒトEST配列に適合した。ヒトESTクローンに適合するもう１つのペプチド（B1）はm/z392.2で観察された。そしてこれはパネルＡに示さない。図12Bにおいて、連続シリーズのＣ末端含有フラグメント（Y”-イオン）を使用して、囲んだ文字により示されるようにペプチド配列タグを構築した。このタグの検索は、ヒトESTクローンAA326115中のペプチドLLLQALQSFEK（配列番号22）に対する適合をもたらした。もう２つのペプチドB1（ALELLPK；配列番号20）およびB2（VIYTQLSK；配列番号21）は、同じESTクローンの配列において見出された。
【０１３９】
完全長ヒトIKK-1およびIKK-2  cDNAを、Genome  Systems,Inc.(St.Lois,MO)から得た、ヒトESTクローンに基づいてクローニングした。正確なヌクレオチド配列を決定し、そしてこれを使用して、ヒトHeLa細胞cDNAライブラリー（Clontech,Inc.,Palo  Alto,CA）からヒトIKK-2をPCRクローニングするためのプライマーを設計した。いくつかのIKK-2  cDNAクローンを単離し、そして配列決定した。完全長マウスIKK-1および部分的ヒトIKK-1ヌクレオチド配列は、包括的データベースにおいて利用可能であり、それぞれのヒトおよびマウスIKK-1  cDNAをPCRクローニングするためのプライマーを設計した。部分的ヒトIKK-1コード領域を使用して、標準的な手順を用いて完全長ヒトIKK-1  cDNAクローンを得るために、HeLa  cDNAファージライブラリー（Stratagene,Inc.,La  Jolla,CA）をプローブした。
【０１４０】
これらのクローンの配列分析は、IKK-1およびIKK-2が、タンパク質相互作用モチーフを含む関連プロテインセリンキナーゼ（51％同一性）であることを明らかにした（図13A）。IKK-1およびIKK-2の両方は、Ｎ末端にキナーゼドメインならびにＣ末端領域にロイシンジッパーモチーフおよびヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフを含む（図13A）。ノーザン分析は、IKK-2をコードするmRNAが、約4.5kbおよび６kbの転写サイズでヒト組織に広く分布することを示した（図13B）。IKK-1（CHUK）転写物の分布は以前に報告されている（Connelyら、Cell.Mol.Biol.Res.41:537-49,1995）。IKK-1  mRNAおよびIKK-2  mRNAは、Jurkat、HeLa、およびHUVEC細胞株において構成的に発現され、そしてそれらのレベルは、NFκBインデューサー（例えば、TNFα（HeLa、HUVEC）または抗CD28＋PMA（Jurkat））での刺激後８時間まで変えられない。
【０１４１】
IKK-1およびIKK-2の特性をさらに特徴付けるために、組換えHAタグ化IKK-1およびFlagタグ化IKK-2は、別々または単独のいずれかで、コムギ胚芽またはウサギ網状赤血球溶解物（Promega,Madison,WI）においてインビトロで転写および翻訳された。反応を、製造者のプロトコルに記載のように正確に行った。次いで、エピトープタグ化IKK-1およびIKK-2は、適切な抗タグ抗体で免疫沈降した。これらのタンパク質を含む免疫沈降物は、正しい基質特異性でIκBαおよびIκBβをリン酸化した（すなわち、IKK-1およびIKK-2の免疫沈降物は、GST-IκBα（図14A、パネル３）およびGST-IκBβ（パネル４）の両方をリン酸化したが、T変異体タンパク質に対応するS32/36をリン酸化しなかった）。ウサギ網状赤血球溶解物において発現されたIKK-1もまた自己リン酸化が可能であったが（図14A、パネル２、レーン１）、一方IKK-1のキナーゼ不活性バージョン（ここで保存性リジン44がメ
チオニンに変異している）は自己リン酸化を示さなかった。対照的に、IKK-2は、溶解物中で等価なレベルで発現したが（レーン１）、非常に弱い自己リン酸化を示した（パネル２、レーン２）。
【０１４２】
IKK-1およびIKK-2のキナーゼ不活性変異体（KからM）の発現は、免疫蛍光研究により実証されるように、両方がNFκB活性化において重要な役割を果たすことを示す（図14Bおよび14C）。これらの研究のために、HeLa細胞を、HAタグ化IKK-1またはFlagタグ化IKK-2のいずれかで一過的にトランスフェクトした。細胞を、メタノールで30分間固定した。免疫蛍光染色のために、細胞を、10％ロバ血清および0.25％  Triton  X-100を含むPBS中の１次抗体で２時間、続いて蛍光結合またはテキサスレッド結合２次抗体（Jackson  Immunoresearch  Laboratories,Inc.,West  Grove,PA；1:500希釈で使用）で室温で１時間、連続的にインキュベートした。カバーガラスをリンスし、そしてスコア付けおよび代表的な視野の写真撮影の前にVectashield(Vector  Laboratories,Burlingame,CA)でカバーガラスを付けた。免疫蛍光染色に使用された１次抗体は、RelA(Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.,Santa  Cruz,CA)、HAタグ（Babco,Berkeley,CA）、およびFlagタグ（IBI-Kodak,New  Haven,CT）に対する抗体を含んだ。
【０１４３】
IKK-1およびIKK-2のキナーゼ不活性バージョン（K44からM）は、非刺激HeLa細胞におけるRelAの亜細胞局在化に対して効果を有さなかった。なぜならRelAは、エピトープタグ化タンパク質を発現する細胞および隣接したトランスフェクトされていない細胞の両方において細胞質に残存したからである（図14Bおよび14C、上のパネル）。対照的に、両方の変異体タンパク質は、TNFα刺激細胞におけるRelA核転座を阻害した（図14Bおよび14C、下
のパネル）。IKK-2変異体により媒介される阻害は著しくかつ完全であったが（図14C：同じ視野における、変異体IKK-2発現細胞とトランスフェクトされていない細胞を比較せよ）、明らかに等価なレベルで発現された変異体IKK-1タンパク質により媒介される阻害は、有意であったが不完全であった（図14B）。２つの変異体キナーゼの機能的活性における差異は、NFκB活性化におけるこれらの２つのキナーゼの異なる役割を示し得る。
【０１４４】
IKK-1およびIKK-2におけるロイシンジッパーおよびヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフの存在は、それらがシグナルソームにおける他のタンパク質を機能的に相互作用したことを示唆した。明らかな可能性は、タンパク質が互いにヘテロまたはホモダイマーを形成したことであった。HAタグ化IKK-1およびFlagタグ化IKK-2は、単独または共にのいずれかで、ウサギ網状赤血球溶解物において翻訳され、次いで適切なエピトープタグに対する抗体で免疫沈降した。この実験は、IKK-2がIKK-1免疫沈降物に存在し（図15A、レーン３）そして逆もまた同じ（レーン４）ことを明らかに証明し、これはこれらのタンパク質が直接的に会合するか、またはウサギ網状赤血球溶解物に存在するアダプタータンパク質／IKKシグナルソーム成分を介して会合するかのいずれかを示唆した。しかし、対照的に、コムギ胚芽溶解物おいて同時翻訳されたIKK-1およびIKK-2の会合についての証拠はなく（図15B）、これはタンパク質が直接的にヘテロダイマーを形成しなかったことを示唆した。完全長IKK-1が、タンパク質相互作用モチーフをなお有したIKK-1の短縮バージョンと共にコムギ胚芽抽出物において共に翻訳された場合、会合の証拠もなく、IKK-1もまたこれらの条件下でホモダイマーを形成し得なかったことを示唆した。
【０１４５】
IKK-1およびIKK-2キナーゼの両方は、それらが自己リン酸化し得たので、コムギ胚芽抽出物において発現された場合に活性であったが、それらはIκB基質のリン酸化に関して不活性であった。自己リン酸化および基質リン酸化の両方はウサギ網状赤血球溶解物においてインタクトであったので、より高次のタンパク質複合体へのIKK-1およびIKK-2の会合とIKK-1およびIKK-2免疫沈降物における特定のIκBキナーゼ活性の存在との間に直接的相関があると思われる。このより高次の複合体は、ほとんどIKKシグナルソーム自身であるらしい。確かに、抗MKP-1抗体でのウサギ網状赤血球溶解物の免疫沈降は、IKKシグナルソームに特徴的な低いレベルの活性IκBキナーゼの活性を下げた。
【０１４６】
IKKシグナルソームが、IKK-1およびIKK-2に加えて複数のタンパク質成分を含むことは明らかである（図11B）。これらのうちのいくつかは、上流のキナーゼ（例えば、MEKK-1(Chenら、Cell  84:853-62,1996)またはNIK（Malininら、Nature  385:540-44,1997））であり得；他は、IKK-1：IKK-2相互作用を媒介するアダプタータンパク質であり得る。実際に、MEKK-1を、IKKシグナルソーム活性と共に同時精製し（図1C）、そして他の２つのシ
グナルソームタンパク質を機能的に同定している。抗MKP-1と交差反応性のタンパク質が、この抗体と同時沈降したIκBキナーゼ活性が２〜４M尿素での洗浄に安定であるので、IKKシグナルソームキナーゼの内因性成分である。さらに、IKK-1免疫沈降物、およびIKKシグナルソームを含むMKP-1免疫沈降物（図8C）の両方は、その活性化速度論が、同じ免疫沈降物におけるIκBキナーゼのものと類似している誘導性RelAキナーゼを含む。シグナルソーム複合体におけるタンパク質の別の強力な候補は、多ユビキチン(multiubiquitin)鎖をリン酸化IκBに転移するE3ユビキチンリガーゼである（Hershkoら、Annu.Rev.Biochem.61:761-807,1992）。
【０１４７】
これらの結果は、IKK-1およびIKK-2が、IκBリン酸化およびNFκB活性化を媒介する、IKKシグナルソーム内で機能的キナーゼであることを示す。IKK-1およびIKK-2の適切な調節は、より高次のタンパク質複合体へのそれらの組み立てを必要とし得、より高次のタンパク質複合体は、アダプタータンパク質、完全なIKKシグナルソーム、またはIKK-1およびIKK-2の両方を含むいくつかの中間亜複合体により促進にされるヘテロダイマーであり得る
。
【０１４８】
前述から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的のために本明細書中で記載されたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが認識される。
(配列表)
SEQUENCE LISTING 
(1) GENERALINFORMATION:
(i) APPLICANTS: Signal Pharmaceuticals, Inc. 
(ii) TITLE OF INVENTION: STIMULUS-INDUCIBLE PROTEIN KINASE
COMPLEX AND METHODS OF USE THEREFOR
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 25 
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Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 
145 150 155 160 
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 
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ATACTGTTCTGGAGGAGATC TCCGAAAGCT GCTCAACAAA CCAGAAAATT GTTGTGGACT 360
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
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Glu Leu Ser Pro Arg Asn Arg Glu Arg Trp Cys Leu Glu Ile Gln Ile 
50 55 60 
Met Arg Arg Leu Thr His Pro Asn Val Val Ala Ala Arg Asp Val Pro 
65 70 75 80 
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100 105 110 
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130 135 140 
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Ile His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Gln Gly 
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210 215 220 
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Val Asp Ile Val Val Ser Glu Asp Leu Asn Gly Thr Val Lys Phe Ser 
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Ser Ser Leu Pro Tyr Pro Asn Asn Leu Asn Ser Val Leu Ala Glu Arg 
260 265 270 
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305 310 315 320 
Thr Ile His Thr Tyr Pro Val Thr Glu Asp Glu Ser Leu Gln Ser Leu 
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Lys Ala Arg Ile Gln Gln Asp Thr Gly Ile Pro Glu Glu Asp Gln Glu 
340 345 350 
Leu Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Leu Ile Pro Asp Lys Pro Ala Thr 
355 360 365 
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370 375 380 
Asp Leu Val Phe Leu Phe Asp Asn Ser Lys Ile Thr Tyr Glu Thr Gln 
385 390 395 400 
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405 410 415 
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420 425 430 
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435 440 445 
Gln Gly Gln Arg Ala Ala Met Met Asn Leu Leu Arg Asn Asn Ser Cys 
450 455 460 
Leu Ser Lys Met Lys Asn Ser Met Ala Ser Met Ser Gln Gln Leu Lys 
465 470 475 480 
Ala Lys Leu Asp Phe Phe Lys Thr Ser Ile Gln Ile Asp Leu Glu Lys 
485 490 495 
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545 550 555 560 
Asp Asp Leu Glu Glu Gln Ala Arg Glu Leu Tyr Arg Arg Leu Arg Glu 
565 570 575 
Lys Pro Arg Asp Gln Arg Thr Glu Gly Asp Ser Gln Glu Met Val Arg 
580 585 590 
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595 600 605 
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Leu Leu Lys Ile Ala Cys Ser Lys Val Arg Gly Pro Val Ser Gly Ser 
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Pro Asp Ser Met Asn Ala Ser Arg Leu Ser Gln Pro Gly Gln Leu Met 
675 680 685 
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Ser Glu Glu Leu Val Ala Glu Ala His Asn Leu Cys Thr Leu Leu Glu 
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Glu Gln Ala Ser 
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Met Arg Glu Arg Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asn Val Cys Leu Tyr 
20 25 30 
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35 40 45 
Glu Leu Ser Thr Lys Asn Arg Glu Arg Trp Cys His Glu Ile Gln Ile 
50 55 60 
Met Lys Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Lys Ala Cys Asp Val Pro 
65 70 75 80 
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85 90 95 
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Gly Ser Gly Ile Arg Tyr Leu His Glu Asn Lys Ile Ile His Arg Asp 
130 135 140 
Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Asp Val Gly Gly Lys Ile Ile 
145 150 155 160 
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165 170 175 
Leu Cys Thr Ser Phe Val Gly Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Glu Leu 
180 185 190 
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195 200 205 
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210 215 220 
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225 230 235 240 
Cys Ile Phe Ala Cys Glu Glu Met Ser Gly Glu Val Arg Phe Ser Ser 
245 250 255 
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260 265 270 
Glu Asn Trp Leu Gln Leu Met Leu Asn Trp Asp Pro Gln Gln Arg Gly 
275 280 285 
Gly Pro Val Asp Leu Thr Leu Lys Gln Pro Arg Cys Phe Val Leu Met 
290 295 300 
Asp His Ile Leu Asn Leu Lys Ile Val His Ile Leu Asn Met Thr Ser 
305 310 315 320 
Ala Lys Ile Ile Ser Phe Leu Leu Pro Pro Asp Glu Ser Leu His Ser 
325 330 335 
Leu Gln Ser Arg Ile Glu Arg Glu Thr Gly Ile Asn Thr Gly Ser Gln 
340 345 350 
Glu Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Ser Leu Asp Pro Arg Lys Pro Ala 
355 360 365 
Ser Gln Cys Val Leu Asp Gly Val Arg Gly Cys Asp Ser Tyr Met Val 
370 375 380 
Tyr Leu Phe Asp Lys Ser Lys Thr Val Tyr Glu Gly Pro Phe Ala Ser 
385 390 395 400 
Arg Ser Leu Ser Asp Cys Val Asn Tyr Ile Val Gln Asp Ser Lys Ile 
405 410 415 
Gln Leu Pro Ile Ile Gln Leu Arg Lys Val Trp Ala Glu Ala Val His 
420 425 430 
Tyr Val Ser Gly Leu Lys Glu Asp Tyr Ser Arg Leu Phe Gln Gly Gln 
435 440 445 
Arg Ala Ala Met Leu Ser Leu Leu Arg Tyr Asn Ala Asn Leu Thr Lys 
450 455 460 
Met Lys Asn Thr Leu Ile Ser Ala Ser Gln Gln Leu Lys Ala Lys Leu 
465 470 475 480 
Glu Phe Phe His Lys Ser Ile Gln Leu Asp Leu Glu Arg Tyr Ser Glu 
485 490 495 
Gln Met Thr Tyr Gly Ile Ser Ser Glu Lys Met Leu Lys Ala Trp Lys 
500 505 510 
Glu Met Glu Glu Lys Ala Ile His Tyr Ala Glu Val Gly Val Ile Gly 
515 520 525 
Tyr Leu Glu Asp Gln Ile Met Ser Leu His Ala Glu Ile Met Glu Leu 
530 535 540 
Gln Lys Ser Pro Tyr Gly Arg Arg Gln Gly Asp Leu Met Glu Ser Leu 
545 550 555 560 
Glu Gln Arg Ala Ile Asp Leu Tyr Lys Gln Leu Lys His Arg Pro Ser 
565 570 575 
Asp His Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Glu Met Val Lys Ile Ile Val His 
580 585 590 
Thr Val Gln Ser Gln Asp Arg Val Leu Lys Glu Arg Phe Gly His Leu 
595 600 605 
Ser Lys Leu Leu Gly Cys Lys Gln Lys Ile Ile Asp Leu Leu Pro Lys 
610 615 620 
Val Glu Val Ala Leu Ser Asn Ile Lys Glu Ala Asp Asn Thr Val Met 
625 630 635 640 
Phe Met Gln Gly Lys Arg Gln Lys Glu Ile Trp His Leu Leu Lys Ile 
645 650 655 
Ala Cys Thr Gln Ser Ser Ala Arg Ser Leu Val Gly Ser Ser Leu Glu 
660 665 670 
Gly Ala Val Thr Pro Gln Ala Tyr Ala Trp Leu Ala Pro Asp Leu Ala 
675 680 685 
Glu His Asp His Ser Leu Ser Cys Val Val Thr Pro Gln Asp Gly Glu 
690 695 700 
Thr Ser Ala Gln Met Ile Glu Glu Asn Leu Asn Cys Leu Gly His Leu 
705 710 715 720 
Ser Thr Ile Ile His Glu Ala Asn Glu Glu Gln Gly Asn Ser Met Met 
725 730 735 
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1 5 10 15 
Thr Met Lys Asp Glu Glu 
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Ester ofThreonine"
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Ser Pro Ser 
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Cys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly Leu Leu Lys 
1 5 10 15 
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Cys Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu 
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Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asn Val Ile Arg 
1 5 10 
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1 5 
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Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Gln Gly Glu Gln Arg 
1 5 10 15 
【図１Ａ】
2011097945.tif 000002
【図１Ｂ】
2011097945.tif 000003
【図１Ｃ】
2011097945.tif 000004
【図２】
2011097945.tif 000005
【図３Ａ】
2011097945.tif 000006
【図３Ｂ】
2011097945.tif 000007
【図４Ａ】
2011097945.tif 000008
【図４Ｂ】
2011097945.tif 000009
【図５Ａ】
2011097945.tif 000010
【図５Ｂ】
2011097945.tif 000011
【図６Ａ】
2011097945.tif 000012
【図６Ｂ】
2011097945.tif 000013
【図７】
2011097945.tif 000014
【図８Ａ】
2011097945.tif 000015
【図８Ｂ】
2011097945.tif 000016
【図８Ｃ】
2011097945.tif 000017
【図９Ａ】
2011097945.tif 000018
【図９Ｂ】
2011097945.tif 000019
【図１０】
2011097945.tif 000020
【図１１Ａ】
2011097945.tif 000021
【図１１Ｂ】
2011097945.tif 000022
【図１２】
2011097945.tif 000023
【図１３Ａ１】
2011097945.tif 000024
【図１３Ａ２】
2011097945.tif 000025
【図１３Ｂ】
2011097945.tif 000026
【図１４Ａ】
2011097945.tif 000027
【図１４Ｂ】
2011097945.tif 000028
【図１４Ｃ】
2011097945.tif 000029
【図１５Ａ】
2011097945.tif 000030
【図１５Ｂ】
2011097945.tif 000031