(57)【要約】【課題】  疾患、薬剤代謝等に関与する遺伝子の一塩基多型を、特別な装置等を用いず簡便に検出できる方法を提供する。【解決手段】  （１）一塩基多型部位を有するプローブＤＮＡに、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを形成させる工程、（２）該二本鎖ＤＮＡに、ヨウ化物イオン及びデンプンの存在下で３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する工程、及び（３）紫外線照射後の該二本鎖ＤＮＡを含有する試料のヨウ素デンプン反応による色の変化によってターゲットＤＮＡの一塩基多型を検知する工程を含む一塩基多型の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）一塩基多型部位を有するプローブＤＮＡに、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを形成させる工程、ここで、該二本鎖ＤＮＡ内のアデニン−チミン塩基対は、Ｘ−チミン（Ｘは、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基を表す）に置換されており、該二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端は、光増感剤で修飾されている；
（２）該二本鎖ＤＮＡに、ヨウ化物イオン及びデンプンの存在下で３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する工程；及び
（３）紫外線照射後の該二本鎖ＤＮＡを含有する試料のヨウ素デンプン反応による色の変化によってターゲットＤＮＡの一塩基多型を検知する工程を含む
ことを特徴とする一塩基多型の検出方法。
【請求項２】
二本鎖ＤＮＡが、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有し、該二本鎖ＤＮＡにおいては、該光増感剤で修飾された末端から、一塩基多型部位及び正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基が、この順に並んでいる請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基が、ジアミノプリン又はデアザアデニンである請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
プローブＤＮＡの５’末端が光増感剤で修飾されており、プローブＤＮＡが、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を、一塩基多型部位から１〜５位離れた位置に有する請求項２又は３に記載の検出方法。
【請求項５】
正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基が、デアザグアニンである請求項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
光増感剤が、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン及びキサントンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
工程（２）において、さらに、フリーラジカル消去活性を有する物質の存在下で紫外線を照射する請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
フリーラジカル消去活性を有する物質が、スーパーオキシドジスムターゼである請求項１〜７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
（ａ）一塩基多形部位を有する一本鎖プローブＤＮＡ、（ｂ）ヨウ化物イオン又は水溶液中でヨウ化物イオンを発生する化合物、及び（ｃ）デンプンを含有し、
該ＤＮＡは、アデニンが、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基で置換された配列を有するものであることを特徴とする一塩基多形検出用キット。
【請求項１０】
さらに、（ｄ）フリーラジカル消去活性を有する物質を含有する請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人間の遺伝子は約３０億の塩基対により構成されているが、遺伝子は各個人で１０００塩基対あたり１、２塩基対程度の割合で異なり、これを一塩基多型（ＳＮＰ）とよぶ。ＳＮＰにより、各個人の疾患の発症しやすさ、薬剤への応答性等が異なるため、このＳＮＰを簡便に、安価に、汎用装置で検出できる技術の開発が非常に重要となっている。現在までに様々なＳＮＰ検出法が開発され実用化されているが、大部分はＳＮＰによるＤＮＡ２重鎖の安定性の違いを利用したものであり、感度が不十分である、又は特殊な配列にしか用いることができないという欠点があった。
【０００３】
一方、ＳＮＰに基づくＤＮＡ内の電荷移動速度の違いを利用したＳＮＰ検出法が検討され、高感度なＳＮＰ検出が可能となった（特許文献１及び２）。しかしながらこの方法では、電荷移動速度の違いを観測するために複雑な装置及び技術が必要とされる。また、２種類ある塩基対、すなわちＡ−Ｔ（アデニン−チミン）塩基対とＧ−Ｃ（グアニン−シトシン）塩基対のうち、電荷移動が主にＧ−Ｃ塩基対を介して進行するため、Ｇ−Ｃ塩基対で構成されたＤＮＡにしか適用できず改良の余地があった。
このため、ＳＮＰを簡便に、安価に、汎用装置で検出できる方法の開発が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２８１２６６号公報
【特許文献２】特開２００８−１７３０１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、疾患、薬剤代謝等に関与する遺伝子の一塩基多型を、特別な装置等を用いず簡便に検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、Ｇ−Ｃ塩基対、及びＡ−Ｔ塩基対の割合に依存せず、電荷が効率よく移動するＤＮＡの開発に成功した。具体的には、ＤＮＡのもつ情報を保持したまま、アデニンの代わりに、アデニンに修飾を施した修飾塩基（例えば、ジアミノプリン、デアザグアニン）を使用し、ＤＮＡを構成する２種類の塩基対のHOMO-levelを近づけた合成ＤＮＡを用いることにより、ＤＮＡ内の電荷移動を高効率化した（Nature Chem. 2009, 1, 156）。該ＤＮＡでは、Ｇ−Ｃ塩基対及びＡ−Ｔ塩基対を有する通常のＤＮＡと比較して、ＤＮＡ内の電荷移動効率（電荷移動速度）が、Ｇ−Ｃ塩基対、Ａ−Ｔ塩基対の割合に依存せず３桁（１０００倍）以上向上した（データは記載せず）。
本発明者らは、このようなＤＮＡとヨウ素デンプン反応とを組合わせると、二本鎖ＤＮＡにおける一塩基のマッチ又はミスマッチにより、ＤＮＡにおける電荷移動速度に差異が生じることを利用して、その結果生じる光電荷分離状態から生成するヨウ素をヨウ素デンプン反応より目視で検出し、ＳＮＰを判定することができることを見出し、種々の配列におけるＳＮＰを目視で識別できることに想到した。
【０００７】
本発明者らは、上記電荷移動効率が向上した合成ＤＮＡに、さらに正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を導入し、光増感剤で修飾された末端から、一塩基多型部位及び正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基をこの順に配置すると、該ＤＮＡとヨウ素デンプン反応とを組合わせることにより、より多様なＤＮＡ配列におけるＳＮＰを目視で識別できることを見出した。
【０００８】
図１（ｉｉｉ）を用いて上記方法の一例を説明すると、上記方法においては、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとをハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを形成させ、次いで、ヨウ化物イオン及びデンプンの存在下で、プローブＤＮＡ又はターゲットＤＮＡに結合している光増感剤（図１（ｉｉｉ）のＡＱ）への紫外線照射（図１では３６５ｎｍ）によりＤＮＡを酸化しＤＮＡ中に正電荷を注入する。この光増感剤への紫外線照射によりＤＮＡ中に正電荷（ホール）を発生させると、ホールは該二本鎖ＤＮＡ中を移動する。二本鎖ＤＮＡ中に一塩基のミスマッチ（ＳＮＰ）が存在すると（図１中の被験者Ｂからの抽出ＤＮＡ）、電荷がＳＮＰ部位よりも遠くへと移動できず、電荷再結合が進行しヨウ素が生成しない（ヨウ素デンプン反応による試料の色の変化が起こらない）。
【０００９】
二本鎖ＤＮＡ中の一塩基多型部位において正しく塩基対が形成される二本鎖ＤＮＡ（ＳＮＰ部位の塩基がマッチしている二本鎖ＤＮＡ）では、電荷がＳＮＰ部位を越えてさらに遠くへと移動する（図１中の被験者Ａからの抽出ＤＮＡ）。ＳＮＰ部位を越えて移動した電荷は、ＳＮＰ部位よりも光増感剤から離れた位置に存在する正電荷捕捉剤（図１中、Ｚ）等に捕捉され、長寿命電荷分離状態が生じる。この正電荷捕捉剤に捕捉された正電荷はヨウ化物イオンと反応し、正電荷捕捉剤が再生されヨウ素が生じる。生じたヨウ素は、デンプンと反応（ヨウ素デンプン反応）して青紫色を呈するため、目視で検出できる。さらに、光増感剤上の負電荷は酸素へと移動してスーパーオキサイドが生じ、光増感剤が再生される。スーパーオキサイドは、フリーラジカル消去活性を有する物質が共存する場合には、その作用により過酸化水素に変換され、過酸化水素とヨウ化物イオンの反応によってもヨウ素が生じる。
【００１０】
従って、上記ＤＮＡ、ヨウ素及びデンプンを用いる方法においては、ＳＮＰ部位の塩基がマッチしている二本鎖ＤＮＡでは最大で一つの光子により２分子のヨウ素が生成し、かつ、反応は触媒的に進行するためヨウ素デンプン反応により目視で、高感度でのＳＮＰ検出が可能となる。
【００１１】
このようなＳＮＰ検出方法では、ＳＮＰの有無を、ヨウ素デンプン反応による呈色により目視で検出できるため、特別な技術等も必要なく、簡便にＳＮＰを識別できる。さらに、この検出方法では、あらゆるＳＮＰ検出法において必須となる遺伝子増幅装置（ＰＣＲ装置）以外に特別な装置を必要としない。また、このＳＮＰ検出方法においては、反応が触媒的に進行するよう系を設計することもできるため、ＤＮＡ配列情報を増幅させて検出することができる。
【００１２】
なお本明細書において「マッチ」とは、二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）を形成したＤＮＡの塩基対が完全に相補的である状態をいい、ターゲットＤＮＡは正常型であることを意味する。一方、本明細書において「ミスマッチ」とは、二本鎖を形成したＤＮＡの塩基対に、相補的な関係にない塩基対が一つ存在する状態をいい、ターゲットＤＮＡは異常型である（すなわち一塩基多型（ＳＮＰ）を有する）ことを意味する。
【００１３】
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１４】
項１．  （１）一塩基多型部位を有するプローブＤＮＡに、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを形成させる工程、ここで、該二本鎖ＤＮＡ内のアデニン−チミン塩基対は、Ｘ−チミン（Ｘは、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基を表す）に置換されており、該二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端は、光増感剤で修飾されている；
（２）該二本鎖ＤＮＡに、ヨウ化物イオン及びデンプンの存在下で３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する工程；及び
（３）紫外線照射後の該二本鎖ＤＮＡを含有する試料のヨウ素デンプン反応による色の変化によってターゲットＤＮＡの一塩基多型を検知する工程を含む
ことを特徴とする一塩基多型の検出方法。
項２．  二本鎖ＤＮＡが、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有し、該二本鎖ＤＮＡにおいては、該光増感剤で修飾された末端から、一塩基多型部位及び正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基が、この順に並んでいる項１に記載の検出方法。
項３．  チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基が、ジアミノプリン又はデアザアデニンである項１又は２に記載の検出方法。
項４．  プローブＤＮＡの５’末端が光増感剤で修飾されており、プローブＤＮＡが、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を、一塩基多型部位から１〜５位離れた位置に有する項２又は３に記載の検出方法。
項５．  正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基が、デアザグアニンである項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
項６．  光増感剤が、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン及びキサントンからなる群より選択される少なくとも１種である項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
項７．  工程（２）において、さらに、フリーラジカル消去活性を有する物質の存在下で紫外線を照射する項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
項８．  フリーラジカル消去活性を有する物質が、スーパーオキシドジスムターゼである項１〜７のいずれかに記載の検出方法。
項９．  （ａ）一塩基多形部位を有する一本鎖プローブＤＮＡ、（ｂ）ヨウ化物イオン又は水溶液中でヨウ化物イオンを発生する化合物、及び（ｃ）デンプンを含有し、
該ＤＮＡは、アデニンが、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基で置換された配列を有するものであることを特徴とする一塩基多形検出用キット。
項１０．  さらに、（ｄ）フリーラジカル消去活性を有する物質を含有する項９に記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、疾患、薬剤代謝等に関与する遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を、汎用装置を用いて簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の方法の実施形態の一例を説明するための概略図である。
【図２】図２は、一塩基多型の有無をヨウ素デンプン反応により検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一塩基多型の検出方法は、
（１）一塩基多型部位を有するプローブＤＮＡに、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを形成させる工程；
（２）該二本鎖ＤＮＡに、ヨウ化物イオン及びデンプンの存在下で３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する工程；及び
（３）紫外線照射後の該二本鎖ＤＮＡを含有する試料のヨウ素デンプン反応による色の変化によってターゲットＤＮＡの一塩基多型を検知する工程を含む。
本発明の方法は、本発明の効果を奏することになる限り、工程（１）〜（３）以外の工程を含んでもよい。例えば、工程（１）の前に、被験者、被検試料等からＤＮＡを抽出する工程、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡを合成する工程、ターゲットＤＮＡを増幅させる工程等を行なってもよい。
【００１８】
工程（１）において、一塩基多型部位を有するプローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、通常、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡを含む水溶液中で行われる。ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡを含む水溶液には、ＤＮＡのハイブリダイゼーションに通常用いられるリン酸緩衝液等の緩衝液を用いればよい。水溶液のｐＨは、通常６．５〜７．５程度である。プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡの比率は、通常、ターゲットＤＮＡの量がプローブＤＮＡの量以上であることが好ましく、プローブＤＮＡに対してターゲットＤＮＡが過剰となるようにすることがより好ましい。プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡそれぞれの濃度は特に限定されないが、プローブＤＮＡは通常約１０−７〜１０−４Ｍが好ましく、より好ましくは約１０−６〜１０−５Ｍである。ハイブリダイズさせる条件は特に限定されず、通常使用される条件を使用することができる。例えば、通常、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡを室温で混合することにより行われる。工程（１）で得られた二本鎖ＤＮＡを含有する水溶液は、通常、そのまま工程（２）に用いることができる。
【００１９】
工程（１）で形成される二本鎖ＤＮＡ内のアデニン−チミン塩基対は、Ｘ−チミン（Ｘは、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基を表す）に置換されている。
本発明においては、二本鎖ＤＮＡ内のアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）塩基対を、Ｘ−Ｔ（Ｘは、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基）で置換することにより、二本鎖ＤＮＡ内の電荷移動（charge transfer: CT）の効率を高くすることができる。二本鎖ＤＮＡ内のアデニン−チミン塩基対をＸ−Ｔ塩基対に置換する方法としては、通常、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡとして、アデニンが、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基で置換された配列を有するＤＮＡを用いる。本発明におけるプローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡは、このような配列を有する一本鎖ＤＮＡである。
【００２０】
チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基としては、アデニンを構成する窒素原子の一部を炭素原子と水素原子の組み合わせに置き換えたアデニンのアナログ等が好ましい。このようなアデニンのアナログとしては、例えば、ジアミノプリン（ＣＡＳ番号：１９０４−９８−９、化学名２，６−ジアミノプリン）、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン等のデアザアデニンを使用できる。好ましくは、ジアミノプリン（Ｄ）、７−デアザアデニン等である。中でも、ジアミノプリンは、ＰＣＲの好適な基質であるため、より好ましい。ジアミノプリンは、アデニンのプリン環のＣ２の水素がアミノ基に置換されたアデニンのアナログである。
【００２１】
ターゲットＤＮＡは、一塩基多型の有無を検出したいＤＮＡ配列（被験ＤＮＡ）において、アデニンが、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基に置換された配列を有する。ターゲットＤＮＡは、被験ＤＮＡのもつ情報を保持したまま、アデニンの代わりに、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基を有するＤＮＡである。ターゲットＤＮＡは、ＳＮＰ以外の箇所に、後述する正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有してもよい。
【００２２】
ターゲットＤＮＡは、通常、一塩基多型の有無を検出したいＤＮＡ配列を基に、Ａ−Ｔ（アデニン−チミン）塩基対におけるアデニン（Ａ）の代わりに、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基を使用して、公知のＤＮＡ合成機により通常の方法で合成することができる。具体的には、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基、グアニン、シトシン及びチミンの４種の核酸塩基、並びにリボース及びリン酸から、公知のＤＮＡ固相合成機を用いて、任意の配列を有するターゲットＤＮＡを合成することができる。粗生成物は、通常の精製方法、例えば、逆相液体クロマトグラフィー等により精製することができる。ジアミノプリン、７−デアザアデニン等の修飾塩基は、グレンリサーチ（Glen  Research）社等から市販されている。
【００２３】
ターゲットＤＮＡの増幅は、アデニンの代わりにジアミノプリン（Ｄ）、７−デアザアデニン等の修飾塩基を用い、通常用いられるＰＣＲ装置を用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。
【００２４】
一塩基多型部位を有するプローブＤＮＡは、ターゲットＤＮＡに対し鋳型となる塩基配列を有するＤＮＡである。プローブＤＮＡは、少なくとも、光増感剤で修飾された末端からＳＮＰ部位までの塩基配列を有すればよい。具体例を挙げて説明すると、例えば、二本鎖ＤＮＡの光増感剤で修飾された側の末端からｎ位（ｎは１以上の整数）にＳＮＰ部位が位置する場合、プローブＤＮＡは、該修飾された側の末端からｎ位までの塩基配列を、少なくとも有すればよい。
ここで、プローブＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）部位とは、本発明による検出方法により被検出対象となりうる塩基部分、つまり標的となる部分である。本発明は、１個のＳＮＰをターゲットとした検出方法であり、プローブＤＮＡ内には一塩基多型部位が通常１個存在している。一塩基多型部位は、プローブＤＮＡ中の特定位置に存在し、プローブＤＮＡのどの部位に存在していてもよい。好ましくは、５’及び３’の末端（５’末端から１〜７位及び３’末端から１〜３位）以外に位置する。プローブＤＮＡは、後述する正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有してもよい。
【００２５】
プローブＤＮＡの合成は、通常、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基、グアニン、シトシン及びチミンの４種の核酸塩基、リボース及びリン酸から、公知のＤＮＡ固相合成機を用いて行うことができ、任意の配列を有するプローブＤＮＡを合成することができる。粗生成物は、通常の精製方法、例えば、逆相液体クロマトグラフィー等により精製することができる。
【００２６】
プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡから形成される二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端は、光増感剤で修飾されている。つまり二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端には光増感剤が結合している。光増感剤は、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれに結合していてもよい。実用的なＳＮＰ検出に用いる場合には、光増感剤で修飾されたプローブＤＮＡが好適に用いられる。光増感剤は、５’末端及び３’末端のいずれに結合していてもよいが、合成が安価で簡便であることから、５’末端が光増感剤で修飾されていることが好ましい。すなわち本発明の好ましい実施態様においては、５’末端が光増感剤で修飾されたプローブＤＮＡが用いられる。
【００２７】
本発明においては、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡの両方が光増感剤で修飾されていてもよい。この場合には、プローブＤＮＡの５’末端及びターゲットＤＮＡの３’末端、又はプローブＤＮＡの３’末端及びターゲットＤＮＡの５’末端が光増感剤で修飾されていることが好ましく、プローブＤＮＡの５’末端及びターゲットＤＮＡの３’末端が光増感剤で修飾されていることがより好ましい。
【００２８】
光増感剤としては、ナフタルイミド、ナフタルジイミド、ジフェニルアセチレン、フラビン、アントラキノン、ベンゾフェノン、ベンゾイン及びキサントンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。より好ましくは、アントラキノン、フラビン等である。
【００２９】
上記光増感剤は、公知の方法で合成してもよく、例えば、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−１，８−ナフタルイミド、Ｎ−（５−ヒドロキシエチル）−２−アントラキノンカルボキシアミド、及び１０−（２−ヒドロキシル）フェノチアジンのシアノエチルホスホラミダイト（Cyanoethyl phosphoramidite）は、既知の方法（例えば、Rogersら、J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3854；Tierneyら、J. Phys. Chem. B 2000, 104, 7574；Tierneyら、J. Org. Chem. 2000, 65, 5355；Kawaiら、J. Phys. Chem. B 2003, 107, 12838, Gasper ら、J. Am. Chem. Soc. 119, 12762等に記載された方法）に従って合成することができる。また、市販品を使用してもよい。例えば、アントラキノン等は（Glen Research）から市販されている。
【００３０】
光増感剤によるＤＮＡの修飾、すなわち光増感剤とＤＮＡとの結合は、光増感剤からＤＮＡへの電荷移動が速やかに行われるものであればよく、特に限定されない。例えば、光増感剤がリンカー（例えば、炭素数２〜６程度の炭化水素鎖）を介してＤＮＡに結合していてもよい。
光増感剤によるＤＮＡの５’又は３’末端の修飾は、例えば、J. Org. Chem. 2000, 65, 5355-5359 又は J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 12838-12841に記載の方法に従って実施できる。具体的には、例えば、水酸基の結合したアルキルリンカーを有する光増感剤（例、アントラキノン、ナフタルイミド、ジフェニルアセチレン等）をアミダイト化反応して活性化し、ＤＮＡ合成機上で一本鎖ＤＮＡの５’末端の水酸基とカップリングさせることで、プローブＤＮＡ又はターゲットＤＮＡの５’末端を光増感剤で修飾することができる。
【００３１】
プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡから形成される二本鎖ＤＮＡは、さらに、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有することが好ましい。正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、プローブＤＮＡ中に存在してもよく、ターゲットＤＮＡ中に存在してもよいが、実用的には正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有するプローブＤＮＡが好適に用いられる。
【００３２】
正電荷捕捉剤として作用するとは、酸化電位がジアミノプリンを含む他の塩基よりも低いことを意味する。正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、Glen Researchより市販されており、簡便にかつ容易に選択することができる。例えば、分子軌道計算の方法によって、ＤＮＡを構成するジアミノプリンを含む他の塩基よりも酸化電位が低い塩基であればどのような修飾塩基でもよい。
【００３３】
正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、通常、ＤＮＡ二本鎖中のＸ−チミン塩基対（Ｘは、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基）及びグアニン−シトシン塩基対よりも酸化電位の低い塩基対を形成する修飾塩基であり、例えば、Ｄ−Ｔ（ジアミノプリン−チミン）塩基対、デアザアデニン−チミン塩基対、及びＧ−Ｃ（グアニン−シトシン）塩基対よりも酸化電位の低い塩基対をシトシン等と形成する修飾塩基等が好ましい。本発明においては、酸化電位が０．６Ｖ（ヨウ素の還元電位０．５３６Ｖより高い）〜１．１Ｖ程度の塩基対をシトシン等の他の塩基と形成する修飾塩基等が好ましい。塩基対の酸化電位は、通常、Nakataniら、J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 5893等に記載の方法に従って分子軌道計算により容易に予測することができ、そのような塩基を容易に選択できる。正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、二本鎖ＤＮＡ中で、他の塩基と塩基対を形成してもよく、形成しなくてもよい。
【００３４】
正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基としては、グアニンのアナログが好ましく、例えば、７−デアザグアニン等のデアザグアニン（Ｚ）、８−オキソグアニン等が好ましい。中でも、７−デアザグアニンが好ましい。
【００３５】
プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとから形成される二本鎖ＤＮＡが正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有する場合には、該二本鎖ＤＮＡにおいて、光増感剤で修飾された側の末端から、一塩基多型部位及び正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基が、この順に並んでいる。例えば、二本鎖ＤＮＡの光増感剤で修飾された側の末端からｎ位（ｎは１以上の整数）に一塩基多型部位が位置する場合、該正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、該修飾された側の末端から（ｎ＋１）位以降に位置する。
このように、二本鎖ＤＮＡにおいて、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基が、一塩基多型部位よりも光増感剤から離れた位置に存在することにより、ターゲットＤＮＡの一塩基多型をより高感度で、かつ効率よく検出できることになる。
【００３６】
プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとから形成される二本鎖ＤＮＡは、上記正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有する場合には、通常、Ｘ−チミン塩基対及びグアニン−シトシン塩基対と共に、これらの塩基対よりも酸化電位の低い塩基対を有することが好ましい。この場合、二本鎖ＤＮＡは、光増感剤で修飾された側の末端から、一塩基多型部位及び該酸化電位の低い塩基対をこの順に有することになる。
【００３７】
二本鎖ＤＮＡにおいて、正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、一塩基多型部位よりも光増感剤から１〜１０位離れた位置に存在することが好ましく、２〜５位離れた位置に存在することがより好ましい。つまり、二本鎖ＤＮＡの光増感剤で修飾された側の末端からｎ位（ｎは１以上の整数）に一塩基多型部位が位置する場合、該正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基は、該修飾された側の末端からｎ＋１〜ｎ＋１０位に位置することが好ましく、ｎ＋２〜ｎ＋５位に位置することがより好ましい。二本鎖ＤＮＡがこのような位置に正電荷捕捉剤として作用する塩基を有することにより、本発明の効果をより十分に奏することができることになる。本発明においては、ＤＮＡ中の一塩基多型部位よりも光増感剤から１〜１０位離れた位置に存在するグアニン、アデニン、シトシン、又はチミンが正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基に置換された配列を有するプローブＤＮＡを用いることが好ましい。
【００３８】
本発明の好ましい態様の１つは、５’末端が光増感剤で修飾されており、正電荷捕捉剤として作用する塩基を、一塩基多型部位から１〜１０位離れた位置に有するプローブＤＮＡを用いることである。該プローブＤＮＡにおいては、５’末端から一塩基多型部位及び正電荷捕捉剤として作用する塩基がこの順に並んでいる。
【００３９】
正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を有するＤＮＡの合成は、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基、グアニン、シトシン、チミン及び正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基の５種の核酸塩基、リボース及びリン酸から、公知のＤＮＡ固相合成機を用いて行うことができ、任意の配列を有するＤＮＡを合成することができる。粗生成物は、通常の精製方法、例えば、逆相液体クロマトグラフィー等により精製することができる。デアザグアニン等は市販されており、グレンリサーチ（Glen  Research）社等から購入できる。デアザグアニン等の正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基を用いるＤＮＡ合成は、通常のＤＮＡ合成法により容易に行なうことができるが、必要であれば、各修飾塩基に最適な合成条件が製造元のグレンリサーチ社より記されているので、その条件を適宜採用すればよい。
【００４０】
本発明におけるプローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡは、アデニンを含有してもよいが、二本鎖ＤＮＡは、光増感剤で修飾された側の末端から１〜３位を除き、最初のグアニン又は正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基との間の配列にアデニンを含有しないことが好ましい。具体例を挙げて説明すると、例えば、プローブＤＮＡの５’末端が光増感剤で修飾されている場合には、プローブＤＮＡは、５’末端と正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基との間の配列にアデニンを含有せず、かつ、ターゲットＤＮＡは、３’末端と、プローブＤＮＡ中の正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基と塩基対（水素結合）を形成する塩基との間の配列にアデニンを含有しないことが好ましい。
【００４１】
工程（２）において、工程（１）で形成された二本鎖ＤＮＡに、ヨウ化物イオン及びデンプンの存在下で３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する方法としては特に限定されず、例えば、二本鎖ＤＮＡ、ヨウ化物イオン及びデンプンを含有する水溶液を試料として調製し、該水溶液に３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する方法が挙げられる。二本鎖ＤＮＡ、ヨウ化物イオン及びデンプンを含有する水溶液の調製方法は、特に限定されず、例えば、１）工程（１）で得られた二本鎖ＤＮＡを含有する水溶液に、水溶液中でヨウ化物イオンを発生する化合物及びデンプンを添加して混合する方法、２）ヨウ化物イオン及びデンプンを含有する水溶液に二本鎖ＤＮＡを添加して混合する方法、３）ヨウ化物イオンを含有する水溶液及びデンプンを含有する水溶液を別々に調製し、これらの２種の水溶液と二本鎖ＤＮＡを混合する方法等が挙げられる。二本鎖ＤＮＡを含有する水溶液は、ｐＨ約６〜７．５が好ましく、ｐＨ約６．８〜７．２がより好ましい。水溶液は、リン酸緩衝液等の緩衝液を含んでもよい。ヨウ化物イオンを含有する水溶液は、ヨウ化物イオンを発生する化合物を水又はｐＨ約６〜７．５の緩衝液に溶解させることにより調製することができる。ヨウ化物イオンを発生する化合物としては、例えば、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ素酸カリウム、ヨウ素酸カルシウム、ヨウ化水素酸、ヨウ化アンモニウム等が挙げられ、１種又は２種以上を使用することができる。中でも、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム等が好ましい。デンプンを含有する水溶液は、デンプンを水又はｐＨ約６〜７．５の緩衝液に溶解させることにより調製することができる。
【００４２】
工程（２）において、３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する際には、ヨウ化物イオン及びデンプンは、それぞれ二本鎖ＤＮＡよりも過剰であることが好ましい。二本鎖ＤＮＡは、水溶液中通常約１０−７〜１０−４Ｍが好ましく、より好ましくは約１０−６〜１０−５Ｍである。ヨウ化物イオンは、二本鎖ＤＮＡを含む水溶液中に約０．０１〜０．２Ｍが好ましく、約０．０２〜０．０６Ｍがより好ましい。デンプンは、二本鎖ＤＮＡより過剰であればよいが、二本鎖ＤＮＡを含む水溶液中に体積濃度で約０．１％〜１％が好ましい。工程（２）において、３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射前には、二本鎖ＤＮＡ、ヨウ化物イオン及びデンプンを含有する水溶液の色は通常無色である。
【００４３】
工程（２）においては、さらに、フリーラジカル消去活性を有する物質の存在下で紫外線を照射することが好ましい。フリーラジカル消去活性を有する物質としては、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等が好適であり、中でもスーパーオキシドジスムターゼが好ましい。フリーラジカル消去活性を有する物質の存在下で紫外線を照射する方法としては特に限定されず、例えば、二本鎖ＤＮＡ、ヨウ化物イオン及びデンプン、並びにフリーラジカル消去活性を有する物質を含有する水溶液を試料として調製し、該水溶液に３５０ｎｍ以上の波長の紫外線を照射する方法が挙げられる。水溶液は、ｐＨ約６〜７．５が好ましく、ｐＨ約６．８〜７．２がより好ましい。水溶液は、リン酸緩衝液等の緩衝液を含んでもよい。水溶液の調製方法は、特に限定されない。フリーラジカル消去活性を有する物質の使用量としては、モル濃度で約１０−６〜１０−４Ｍが好ましく、約５×１０−６〜８×１０−５Ｍがより好ましい。
【００４４】
工程（２）において照射する紫外線は、約３５０〜５００ｎｍが好ましく、約３５０〜４００ｎｍがより好ましい。紫外線の照射時間は、光源の強さ等に応じて適宜選択すればよいが、約１０〜５４００秒が好ましく、約１０〜３００秒がより好ましい。紫外線照射は、二本鎖ＤＮＡが１本鎖に解離しない温度で行うことが好ましく、例えば、約０〜４０℃の温度下で行うことが好ましい。
【００４５】
工程（３）においては、紫外線照射後の該二本鎖ＤＮＡを含有する試料のヨウ素デンプン反応による色の変化によってターゲットＤＮＡの一塩基多型を検知する。
上述したように、二本鎖ＤＮＡ中の正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基等に捕捉された正電荷はヨウ化物イオンにより再生され、ヨウ素が生じる。一方、この際生じる一電子還元されたアントラキノン等の光増感剤は酸素へと電子を受け渡し、スーパーオキサイドが生成する。スーパーオキサイドがＳＯＤ等のフリーラジカル消去活性を有する物質と反応することにより過酸化水素を生じ、過酸化水素がヨウ化物イオンを酸化してヨウ素を生じる。従って、最大で一つの光子により２分子のヨウ素が生成し、かつ、反応は触媒的に進行するため非常に高感度でのＳＮＰ検出が可能となる。一方、二本鎖内にミスマッチを形成するＳＮＰを有するＤＮＡでは速い電荷再結合のためヨウ素は生成しない。ヨウ素デンプン反応による色の変化は、目視により確認することができる。試料の色の変化の確認は、光源の強さ等に応じて異なるが、通常、紫外線照射後約１０秒〜９０分の間に行なうことが好ましく、約１〜５分の間に行なうことが好ましい。上記時間内であれば、試料の色の変化を目視により十分確認できる。ヨウ素デンプン反応は触媒反応であるため、時間経過に伴って色が濃くなる。色の変化を確認しにくい場合には、紫外線照射時間を長くすればよい。
【００４６】
本発明の方法の実施態様の１例として、一塩基多型を検出したい被験者等から抽出したＤＮＡの一塩基多型を検出する場合を、図１を用いて簡単に説明する。図１中、Ｔは、チミン、Ｄは、ジアミノプリン、Ｃは、シトシン、Ｚはデアザグアニンをそれぞれ表わす。
まず、一塩基多型を検出したい被験者等（図１中、被験者Ａ及びＢ）からＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出方法は、公知の方法で行うことができる。なお図１の（ｉ）及び（ｉｉ）においては、ＤＮＡ鎖中の一塩基多型部位の塩基（被験者Ａ：Ｔ／Ｄ、被験者Ｂ：Ｃ／Ｇ）のみ表記されている。
次に、抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによりターゲットＤＮＡを調製する（図１中、（ｉ）ＰＣＲ）。次いで、非対称ＰＣＲ等の二次ＰＣＲを行なうと、（ｉ）で増幅させた一本鎖のターゲットＤＮＡを効率よく増幅させることができる。図１の（ｉ）ＰＣＲ及び（ｉｉ）非対照ＰＣＲにおいては、アデニンの代わりに上述したジアミノプリン（Ｄ）等のチミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基を使用する。ターゲットＤＮＡを増幅させた後、光増感剤が結合しているプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとをハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡを形成させる（図１の（ｉｉｉ））。なお図１の（ｉｉｉ）においては、二本鎖ＤＮＡ中の一塩基多型部位の塩基対（被験者Ａ：Ｔ／Ｄ、被験者Ｂ：Ｔ／Ｇ）、及び正電荷補足剤として作用する修飾塩基（Ｚ）のみ表記されている。
【００４７】
次いで、該二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、ヨウ化カリウム、デンプン及びＳＯＤを添加し、３５０ｎｍ以上の紫外線を照射する（図１では、３６５ｎｍ）。光増感剤（アントラキノン：ＡＱ）への紫外線照射によりＤＮＡ中に正電荷（ホール）を発生させると、ホールは該二本鎖ＤＮＡ中を移動する。一塩基のミスマッチ（ＳＮＰ）が存在する場合には、電荷がＳＮＰ部位よりも遠くへと移動できず、電荷再結合が進行しヨウ素が生成しない（被験者Ｂからの抽出ＤＮＡ）。二本鎖ＤＮＡ中の一塩基多型部位において正しく塩基対が形成される二本鎖ＤＮＡ（ＳＮＰ部位の塩基がマッチしている二本鎖ＤＮＡ）では、電荷がＳＮＰ部位を越えてさらに遠くへと移動し、ＳＮＰ部位よりも光増感剤から離れた位置に存在する正電荷捕捉剤（図１中、Ｚ）に捕捉され、長寿命電荷分離状態が生じる。この正電荷捕捉剤に捕捉された正電荷はヨウ化物イオンと反応し、正電荷捕捉剤が再生されヨウ素が生じる。その結果試料が青紫〜紫色に呈色する（被験者Ａからの抽出ＤＮＡ）。
【００４８】
従って、本手法によりヨウ素デンプン反応に基づき、目視でのＳＮＰの検出が可能となる。ターゲットＤＮＡにマッチするＳＮＰである場合には、紫外線を照射された試料はヨウ素デンプン反応により青紫色に呈色する（図２（Ａ）、照射前の試料溶液の色は無色）。ターゲットＤＮＡにマッチしないＳＮＰである場合には、ヨウ素デンプン反応が起こらないため、紫外線照射前後に試料の色は変化しない（図２（Ｂ））。
【００４９】
本発明の方法は、ＳＮＰを簡便に検出することができることから、医療分野等において有用である。ＳＮＰから遺伝的背景を調べることができる他、原因遺伝子のわかっている遺伝病については、将来的な危険率も診断することができる。また、ＳＮＰを利用して連鎖解析、関連解析等によって疾患関連遺伝子を特定することができる。
【００５０】
また、特定の遺伝子に体内の酵素活性を低下させるようなＳＮＰがあると、薬剤の血中濃度が長時間に渡って高く保たれた結果、効果が強く発現しすぎたり、有毒な中間代謝産物が蓄積されたりすることがある。また、薬剤が作用できないようなＳＮＰがあると、投薬量を増やすなどの処置が必要となる。このため、投薬前にこのような遺伝子のＳＮＰを検査し、その遺伝子の型から判断して適切な薬剤の種類、投薬量等を決定することにより、副作用を回避し、より安全で効率的な治療効果を得ることができる。このように、ＳＮＰを利用した疾病等の診断、治療、予防等において、本発明は好適に用いられる。しかも本発明の方法に用いられる試薬、装置は汎用されているものであり、操作も簡便であることから、小さな診療所、発展途上国等でもＳＮＰの検出が可能となる。
【００５１】
本発明は、（ａ）一塩基多形部位を有する一本鎖プローブＤＮＡ、（ｂ）ヨウ化物イオン又は水溶液中でヨウ化物イオンを発生する化合物、及び（ｃ）デンプンを含有し、該ＤＮＡは、アデニンが、チミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基で置換された配列を有するものである一塩基多形検出用キットも包含する。
このようなキットは、上述した一塩基多形の検出方法に好適に用いられるものである。該キットは、さらに、（ｄ）フリーラジカル消去活性を有する物質を含有することが好ましい。
【００５２】
（ａ）一塩基多形部位を有する一本鎖プローブＤＮＡやその好ましい態様としては、上述した一塩基多型の検出方法に用いられるプローブＤＮＡと同様である。例えば、５’末端が光増感剤で修飾されており、かつ正電荷捕捉剤として作用する塩基を、一塩基多型部位よりも光増感剤から１〜５位離れた位置に有するＤＮＡ等が好適である。
【００５３】
水溶液中でヨウ化物イオン発生する化合物及びフリーラジカル消去活性を有する物質は、上述したものと同様である。
本発明のキットは、上記（ａ）〜（ｄ）以外に、ジアミノプリン等のチミンと安定な塩基対を形成する修飾塩基、デアザグアニン等の正電荷捕捉剤として作用する修飾塩基、緩衝液、説明書等を含んでもよい。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５５】
実施例１
喘息と心筋梗塞の罹りやすさを判断する上で重要となる、血中好酸球量に影響を及ぼすＳＮＰ（ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース：ｒｓ１２６１９２８５）を検出した。
【００５６】
１．ＤＮＡの合成
ＤＮＡの修飾に使用したアントラキノンは、Gasper ら、J. Am. Chem. Soc. 119, 12762の記載に従い合成した。ＤＮＡ合成のための試薬（２，６−ジアミノプリン（Ｄ）、７−デアザグアニン（Ｚ）のホスホラミダイトを含む）は、グレンリサーチ（Glen  Research）社から購入した。
【００５７】
ターゲットＤＮＡ及びプローブＤＮＡを合成した。プローブＤＮＡは、光照射によりＤＮＡを酸化しＤＮＡ中に正電荷を発生するアントラキノン（ＡＱ）により５’末端を修飾した。プローブＤＮＡ及びターゲットの合成においては、Ｇ−Ｃ塩基対の割合に依存せずＤＮＡ内電荷移動速度を進行させるため、Ａ−Ｔ塩基対をＤ−Ｔ塩基対に置き換えた（Ｄ：ジアミノプリン（２，６−ジアミノプリン））。
【００５８】
具体的には、プローブＤＮＡとして、血中好酸球量に影響を及ぼすＳＮＰ（ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース：ｒｓ１２６１９２８５）の配列を基に、該配列と相補的な配列を合成した。合成においては、アデニンの代わりにジアミノプリン（Ｄ）を使用して、ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems社製）により合成を行なった。
また、プローブＤＮＡの合成においては、ＳＮＰの位置よりもさらにＡＱ（５’末端）から離れた位置に、Ｄ−Ｔ塩基対及びＧ−Ｃ塩基対よりも酸化電位の低いＺ−Ｃ塩基対（Ｚ：デアザグアニン（正電荷捕捉剤））を形成する７−デアザグアニンをグアニンの代わりに配置した。つまり、ＳＮＰの位置よりもさらにＡＱ（５’末端）から離れた位置にあるグアニンを７−デアザグアニン（Ｚ）で置換した。アントラキノン（ＡＱ）よる５’末端の修飾は、既知の方法（Gasper ら、J. Am. Chem. Soc. 119, 12762）に従って行った。
【００５９】
ターゲットＤＮＡ１として、ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース：ｒｓ１２６１９２８５の配列を基に、プローブＤＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡを合成した。ターゲットＤＮＡ１の合成は、アデニンの代わりにジアミノプリン（Ｄ）を使用して、ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems社製）により行った。ミスマッチ配列を有するターゲットＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ２）の合成は、ＳＮＰ部位のアデニンをグアニンに置換した以外は上記と同様に行った。
【００６０】
合成したＤＮＡを、逆相ＨＰＬＣ（使用カラム：Nacalai Tesque 5C18MSII、溶出溶媒：５０ｍＭ  ギ酸アンモニウム／アセトニトリル、速度：１ｍＬ／分）で精製して凍結乾燥させた。
実験に用いたＡＱ及びジアミノプリン（Ｄ）で修飾されたＤＮＡは、すべてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦマススペクトルによって確認した。これらのＤＮＡの濃度を、ヌクレアーゼＰ１及びＡＰを用いた２−デオキシリボヌクレオチドへの完全消化によって決定した。
合成したプローブＤＮＡ（配列番号１）、並びにターゲットＤＮＡ１（配列番号２）及びターゲットＤＮＡ２（配列番号３）の配列を、表１に示す。
【００６１】
【表１】
2011147368.tif 000002
【００６２】
上記表１中、ＡＱは、アントラキノンを表す。Ｄは、２，６−ジアミノプリンを表す。Ｚは、７−デアザグアニンを表す。Ｔはチミンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、それぞれ表わす。矢印は、一塩基多型部位を示す。
【００６３】
２．ハイブリダイゼーション
二本鎖溶液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））は、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ１又は２）とを等モル量（それぞれ５μＭ）混合することによって調製し、８０℃から室温に冷却することによってプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡを徐々にアニーリングさせた。
【００６４】
３．ヨウ素デンプン反応によるＳＮＰの検出
上記で二本鎖を形成させたＤＮＡを含む水溶液に、１％のデンプン、５０ｍＭのヨウ化カリウム、及び５μＭのスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）を添加して混合した。このとき、いずれのＤＮＡを含む溶液の色も、無色であった。得られた水溶液に３６５ｎｍの紫外光をトランスイルミネーター（フナコシ社製、型番ＬＭＳ−２０Ｅ）を用いて１８００秒照射しＤＮＡ内に電荷を注入した。
【００６５】
４．結果
結果を図２に示す。図２（Ａ）は、ＳＮＰ部位で正しい塩基対を形成する二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ１：表１の「マッチ」）を含有する試料であり、ヨウ素デンプン反応により紫色に呈色した。図２（Ｂ）は、ＳＮＰ部位でミスマッチ配列を有するターゲットＤＮＡから形成された二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ２：表１の「ミスマッチ」）を含有する試料であり、溶液の色は変化しなかった（ヨウ素デンプン反応が起こらず、呈色しなかった）。図２から明らかなように、本手法によりヨウ素デンプン反応に基づき、目視でのＳＮＰの検出が可能となった。
【００６６】
５．考察
ＳＮＰ部位で正しい塩基対を形成する二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ１：表１の「マッチ」）では、電荷移動により正電荷がデアザグアニン（Ｚ）へと達し、長寿命電荷分離を生じる。ＤＮＡ中のＺに捕捉された正電荷はヨウ化物イオンにより再生され、ヨウ素が生じる（図１（ｉｉｉ）、被験者Ａからの抽出ＤＮＡ）。一方、この際生じる一電子還元されたアントラキノン（ＡＱ）は、酸素へと電子を受け渡し、スーパーオキサイドが生成する。スーパーオキサイドがＳＯＤと反応することにより過酸化水素を生じ、過酸化水素がヨウ化物イオンを酸化してヨウ素を生じた。従って、最大で一つの光子により２分子のヨウ素が生成し、かつ、反応は触媒的に進行するため非常に高感度でのＳＮＰ検出が可能となった。一方、鎖内にミスマッチを形成するＳＮＰを有するターゲットＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ２：表１の「ミスマッチ」）から形成された二本鎖ＤＮＡでは速い電荷再結合のためヨウ素は生成しなかった（図１（ｉｉｉ）、被験者Ｂからの抽出ＤＮＡ）。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、疾病の診断、予防及び治療等に有用である。
【図１】
2011147368.tif 000003
【図２】
2011147368.tif 000004
【配列表】
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