(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の分子標的と相互作用する候補化合物の能力について、候補化合物をスクリーニングするための新規のアッセイを可能にする方法を提供する。【解決手段】内因性分子標的の発現を直接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞を使用することからなる。１つの実施形態においては、この細胞が、ジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、この細胞が、前記ポリヌクレオチドを用いて安定にトランスフェクトされていることからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性分子標的の発現を直接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞。
【請求項２】
前記細胞が、前記ジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が、前記ポリヌクレオチドを用いて安定にトランスフェクトされている、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記ジンクフィンガータンパク質が、前記分子標的の発現を直接的に調節する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記ジンクフィンガータンパク質が、前記分子標的の発現を抑制する、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記ジンクフィンガータンパク質が、前記分子標的の発現を活性化する、請求項４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞の操作および薬物の発見の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
過去何年もの間の製薬会社のリサーチ活動の多くは、既存の薬物の付加的な改良に焦点を当てていた。これらの努力は、反復ラウンドの化合物の改変および生物学的試験を含み、そして類似の標的に指向される利用可能な薬物を大きな割合で得た。
【０００３】
約１２年前、薬学的リサーチ活動の重点が、新規の化学的クラスおよび新規の分子標的の意図的な発見へとシフトし始めた。重点におけるこの変化、およびタイムリーな技術的躍進（例えば、分子生物学、実験の自動化、コンビナトリアルケミストリー）は、高スループットスクリーニング（すなわち、ＨＴＳ）を誕生させた。この高スループットスクリーニングは、現在、生物薬剤学的産業中に広まっている。
【０００４】
高スループットスクリーニングは、以下のいくつかの工程を包含する：特定の生理学的応答を予測するアッセイを開発する工程；何回も再現可能に実施し得るようにこのアッセイを自動化する工程；およびこのアッセイで「ヒット」し得る化学構造（このような構造が意図される生理学的応答を誘発し得ることを示唆する）を同定するために化学ライブラリーからサンプルを順次試験する工程。高スループットスクリーニングによるヒットを種々の二次アッセイにおいて追跡して、人為的な結果（特に、毒性化合物）を排除する。
【０００５】
高スループットスクリーニングは、２００，０００個以上の化合物サンプルを試験する工程を含み得、それ故、ラボロボットの使用を必要とする。このようなアッセイにおいて試験されるサンプルの例は、化合物アーカイブ中に保存された純粋な化合物（例えば、特定の製薬会社は、何十年もの医薬品化学の努力を通して生み出された化学ライブラリーを保有する）、学術源から購入されるサンプル、天然産物の抽出物および高スループットスクリーニングのために意図的に生成されたライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）を含む。
【０００６】
高スループットスクリーニングにおいて使用されるアッセイは、特定の生物学的性質または生化学的性質を有する化学サンプルの存在を検出することが意図される。これらの性質を選んで、インビボで適用される場合に特定の生物学的応答を惹起する潜在能力を有する化合物を同定する。高スループットスクリーニングは、代表的に、最終的に薬物として使用される因子よりもむしろ薬物候補を同定する。高スループットアッセイにおいていくらかのレベルの所望の生物学的性質を有することが見出された特定の化学的クラスの化合物は、次いで、医薬品化学者による誘導化合物の合成のための基礎となり得る。
【０００７】
これらのアッセイは、広範な２つのカテゴリに分類される：生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイ。生化学的アッセイは、細胞環境の外側の純粋な成分または半純粋な成分を利用する。酵素アッセイおよびレセプター結合アッセイは、生化学的アッセイの代表的な例である。細胞ベースのアッセイは、培養中のインタクトな細胞を利用する。このようなアッセイの例としては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイおよびカルシウムフラックス（ｆｌｕｘ）アッセイが挙げられる。
【０００８】
生化学的アッセイは、通常、実施するのがより容易であり、そして一般的に、従来の細胞ベースのアッセイよりも人為的結果への傾向がより少ない。生化学的アッセイにおいて「活性」として同定された化合物は、代表的に、所望のメカニズムに従って機能し、このことが、「ヒット」として化合物の状態を確証するために必要とされる追跡実験の回数を減少させる。しかし、生化学的アッセイの主な不利点は、生物学的内容物の欠如である。生化学的スクリーニングによる化合物の「ヒット」は、標的タンパク質に到達しそして作用するために、形質膜または他の構造物を横切る必要がない。結果的に、生化学的アッセイは、細胞ベースのアッセイよりも、動物における化合物の活性の予測性がはるかに少ない傾向にある。
【０００９】
細胞ベースのアッセイは、分子標的の多数の生物学的内容物を保存する。形質膜を通じて通過し得ない化合物または細胞に対して毒性のある化合物は、追跡されない。しかし、この内容物が、アッセイに複雑性を付加する。それ故、従来の細胞ベースのアッセイは、生化学的アッセイよりも、人為的な結果または偽陽性の結果に対するはるかに高い傾向がある。複雑な毒性反応を誘発するかまたはアポトーシスを誘発する化合物は、特に厄介である。従来の細胞ベースの高スループットスクリーニングにあてられる多くの労力は、誤ったヒットまたは望ましくないメカニズムで働くヒットを検出する追跡アッセイに向けられる。
【００１０】
偽陽性ヒットまたは人為的なヒットが迅速に同定されそして除外され得る場合、生化学的アッセイの容易さおよび有効性が、生物学的内容物を保存しながら、細胞ベースのアッセイにおいてアプローチされ得る。この結果は、生物学的機能の最適なスループットおよび最適な予測性を伴うアッセイである。要するに、新たな医薬品の発見のためのより効率的なプロセスが、実現される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、特定の分子標的と相互作用する候補化合物の能力について、候補化合物をスクリーニングするための新規のアッセイを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの局面において、本発明は、分子標的との相互作用について化合物をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）この化合物と第１細胞とを接触させる工程；
（ｂ）この第１細胞の性質の第１値を決定する工程であって、この性質が、この化合物を接触させている細胞に対して応答性である、工程；
（ｃ）この化合物と第２細胞とを接触させる工程であって、ここで、この第２細胞が、この分子標的の発現を直接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む、工程；
（ｄ）この第２細胞における性質の第２値を決定する工程であって、ここで、この第１値とこの第２値との間の差が、この化合物とこの分子標的との間の相互作用の指標を提供する、工程、を包含する。
【００１３】
１つの実施形態において、上記外因性ジンクフィンガータンパク質は、上記分子標的の発現を直接的に調節する。
【００１４】
１つの実施形態において、上記外因性ジンクフィンガータンパク質は、ポリペプチドとして提供される。
【００１５】
１つの実施形態において、上記外因性ジンクフィンガータンパク質は、このジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。
【００１６】
１つの実施形態において、上記外因性ジンクフィンガータンパク質は、機能的ドメインをさらに含む。
【００１７】
１つの実施形態において、上記機能的ドメインは、活性化ドメインを含む。
【００１８】
１つの実施形態において、上記活性化ドメインは、ＶＰ１６、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット、ＶＰ６４およびリガンド結合甲状腺ホルモンレセプターからなる群より選択される。
【００１９】
１つの実施形態において、上記機能的ドメインは、抑制ドメインを含む。
【００２０】
１つの実施形態において、上記抑制ドメインは、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメンバーからなる群より選択される。
【００２１】
１つの実施形態において、上記分子標的は、シグナル伝達経路に関連する。
【００２２】
１つの実施形態において、上記化合物は、上記分子標的を介するシグナルの伝達を阻害するその能力についてスクリーニングされる。
【００２３】
１つの実施形態において、上記第２細胞は、第２外因性ジンクフィンガータンパク質を含む。
【００２４】
１つの実施形態において、上記第１細胞および第２細胞は、上記ジンクフィンガータンパク質をコードする上記ポリヌクレオチド以外について実質的に同一である。
【００２５】
１つの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、上記第２細胞に安定にトランスフェクトされる。
【００２６】
１つの実施形態において、上記ジンクフィンガータンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
【００２７】
１つの実施形態において、上記ジンクフィンガータンパク質の発現は、上記第２細胞において誘導される。
【００２８】
１つの実施形態において、上記第１細胞および第２細胞は、上記誘導性のジンクフィンガータンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
１つの実施形態において、上記ジンクフィンガータンパク質の発現は、上記第１細胞において誘導されない。
【００３０】
１つの実施形態において、上記分子標的は、タンパク質である。
【００３１】
１つの実施形態において、上記分子標的は、細胞表面レセプターである。
【００３２】
１つの実施形態において、上記第２細胞における上記分子標的の発現のレベルは、上記第１細胞における発現レベルの２５％よりも小さい。
【００３３】
１つの実施形態において、上記第２細胞における上記分子標的の発現レベルは、上記第１細胞における発現レベルの１２５％よりも大きい。
【００３４】
１つの実施形態において、上記第２細胞における上記分子標的の発現レベルは、上記第１細胞における発現レベルの５％よりも小さい。
【００３５】
１つの実施形態において、上記性質は、増殖、新生血管形成、レポーター発現および選択マーカー発現からなる群より選択される。
【００３６】
別の局面において、本発明は、分子標的との相互作用について化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）この分子標的の発現を調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞から膜を単離する工程および（ｂ）工程（ａ）の単離された膜とこの化合物との相互作用をアッセイする工程、を包含する。
【００３７】
１つの実施形態において、上記分子標的は、細胞表面分子および膜結合分子からなる群より選択される。
【００３８】
１つの実施形態において、上記相互作用は、上記単離された膜への上記化合物の結合を測定することによってアッセイされる。
【００３９】
１つの実施形態において、上記化合物は、放射標識される。
【００４０】
別の局面において、本発明は、細胞プロセスに対するその効果について化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程であって、この第１ポリヌクレオチドは、第１転写制御エレメントに作動可能に連結された外因性ジンクフィンガータンパク質をコードする第１核酸分子を含み、ここで、この第１転写制御エレメントは、細胞プロセスに関連する分子に対して応答性であり、そして、この第２ポリヌクレオチドは、レポーターまたは選択マーカーをコードする第２核酸分子を含み、ここで、このレポーターまたは選択マーカーの発現は、この外因性ジンクフィンガータンパク質によって調節される、工程；
（ｂ）工程（ａ）の細胞をこの化合物と接触させる工程；および、（ｃ）レポーターまたは選択マーカーの発現レベルをアッセイする工程であって、ここで、このレポーターまたは選択マーカーの発現レベルにおける変化は、この化合物が細胞プロセスに対する効果を有することを示す、工程、を包含する。
【００４１】
１つの実施形態において、上記細胞プロセスは、シグナル伝達経路を含む。
【００４２】
１つの実施形態において、上記第１ポリヌクレオチドは、上記ジンクフィンガータンパク質に作動可能に連結された機能的ドメインをコードする配列をさらに含む。
【００４３】
１つの実施形態において、上記機能的ドメインは、抑制ドメインである。
【００４４】
１つの実施形態において、上記抑制ドメインは、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメンバーからなる群より選択される。
【００４５】
１つの実施形態において、上記レポーターまたは選択マーカーは、直接レポーター、酵素的レポーター、陽性選択マーカー、陰性選択マーカー、およびそれらの組合わせからなる群より選択される。
【００４６】
１つの実施形態において、上記直接レポーターは、蛍光タンパク質である。
【００４７】
１つの実施形態において、上記直接レポーターは、緑色蛍光タンパク質である。
【００４８】
１つの実施形態において、上記酵素的レポーターは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群より選択される。
【００４９】
１つの実施形態において、上記陽性選択マーカーは、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性、およびハイグロマイシン耐性からなる群より選択される。
【００５０】
１つの実施形態において、上記陰性選択マーカーは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。
【００５１】
別の局面において、本発明は、分子標的の発現を直接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞を提供する。
【００５２】
１つの実施形態において、上記細胞は、上記ジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされる。
【００５３】
１つの実施形態において、上記細胞は、上記ポリヌクレオチドを用いて安定にトランスフェクトされている。
【００５４】
１つの実施形態において、上記ジンクフィンガータンパク質は、上記分子標的の発現を直接的に調節する。
【００５５】
１つの実施形態において、上記ジンクフィンガータンパク質は、上記分子標的の発現を抑制する。
【００５６】
１つの実施形態において、上記ジンクフィンガータンパク質は、上記分子標的の発現を活性化する。
【００５７】
別の局面において、本発明は、ＺＦＰをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供し、この細胞は、レポーターをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、このＺＦＰの発現は、細胞プロセスに関連する分子に対して応答性である転写制御エレメントによって調節され；そして、ここで、このレポーターの発現は、ＺＦＰによって調節される。
【００５８】
１つの実施形態において、上記細胞プロセスは、シグナル伝達経路を含む。
【００５９】
１つの実施形態において、上記第１ポリヌクレオチドは、上記ジンクフィンガータンパク質に作動可能に連結された機能的ドメインをコードする配列をさらに含む。
【００６０】
１つの実施形態において、上記機能的ドメインは、抑制ドメインである。
【００６１】
１つの実施形態において、上記抑制ドメインは、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメンバーからなる群より選択される。
【００６２】
１つの実施形態において、上記レポーターまたは選択マーカーは、直接レポーター、酵素的レポーター、陽性選択マーカー、陰性選択マーカー、およびそれらの組合わせからなる群より選択される。
【００６３】
１つの実施形態において、上記直接レポーターは、蛍光タンパク質である。
【００６４】
１つの実施形態において、上記直接レポーターは、緑色蛍光タンパク質である。
【００６５】
１つの実施形態において、上記酵素的レポーターは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる群より選択される。
【００６６】
１つの実施形態において、上記陽性選択マーカーは、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性、およびハイグロマイシン耐性からなる群より選択される。
【００６７】
１つの実施形態において、上記陰性選択マーカーは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。
【００６８】
別の局面において、本発明は、分子標的との相互作用について化合物をスクリーニングするためのキットを提供し、このキットは、（ａ）上記第１細胞；（ｂ）上記外因性ジンクフィンガータンパク質を欠くことを除いて、この第１細胞と実質的に同一である第２細胞；（ｃ）補助試薬；（ｄ）指示書；および（ｅ）適切な容器を備える。
【００６９】
別の局面において、本発明は、分子標的との相互作用について化合物をスクリーニングするためのキットを提供し、このキットは、（ａ）上記細胞；（ｂ）補助試薬；（ｃ）指示書；および（ｄ）適切な容器を備える。
【００７０】
１つの局面において、分子標的との相互作用について化合物をスクリーニングするための方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この化合物と第１細胞とを接触させる工程；（ｂ）この第１細胞の性質の第１値を決定する工程であって、この性質が、この化合物を接触させている細胞に対して応答性である、工程；（ｃ）この化合物と第２細胞とを接触させる工程であって、ここで、この第２細胞が、この分子標的の発現を直接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む、工程；（ｄ）この第２細胞におけるこの性質の第２値を決定する工程。この第１細胞におけるこの細胞の性質の値とこの第２細胞におけるこの細胞の性質の値との間の差が、この化合物とこの分子標的との間の相互作用の指標を提供する。このジンクフィンガータンパク質は、好ましくは、この分子標的自体の発現を調節するが、いくつかの実施形態において、このジンクフィンガータンパク質は、例えば、次いで、この分子標的を調節および／またはこの分子標的に作用するタンパク質の発現を調節することによって、この分子標的の発現を間接的に調節し得る。それ故、これらのスクリーニング方法を用いて、当業者は、例えば、この分子標的を介するシグナルを伝達するその能力またはこの分子標的を介するシグナルの伝達をブロックするその能力について化合物を試験し得る。
【００７１】
特定の実施形態において、第１細胞および第２細胞は、第２の細胞が外因性ジンクフィンガータンパク質および／または外因性ジンクフィンガータンパク質コードする配列を含むことを除いて、実質的に同一である。特定の実施形態において、さらに、第１細胞と第２細胞との間に遺伝的差異（および／または表現型差異）が存在し得る。
【００７２】
本明細書において記載された方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガータンパク質は、融合分子（例えば、ジンクフィンガータンパク質と機能的ドメインとの融合体）の成分であり得る。この機能的ドメインは、例えば、抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメンバー）；活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット、リガンド結合ＴＲ、およびＶＰ６４）；インシュレータ（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ドメイン；クロマチン再構築タンパク質もしくはクロマチン再構築複合体の成分；ならびに／またはメチル結合ドメインであり得る。本方法に従って、ジンクフィンガータンパク質は、標的の発現を活性化するかまたは阻害するかのいずれかである。ジンクフィンガータンパク質（または融合体）は、発現を活性化し得、例えば、その結果、第２細胞における発現レベルが、第１細胞における発現レベルの１２５％または１７５％より大きい。ジンクフィンガータンパク質は、発現を阻害し得、例えば、その結果、第２細胞における発現レベルが、第１細胞における発現レベルの９５％、７５％、５０％、２５％、または５％より小さい。
【００７３】
特定の実施形態において、この分子標的はタンパク質である。しかし、分子標的は、その発現がジンクフィンガータンパク質によって調節され得る任意の分子（例えば、ＲＮＡ、炭水化物および／または脂質）である。
【００７４】
本明細書中に記載される任意の方法において、このジンクフィンガータンパク質（または融合タンパク質）は、タンパク質として、またはこのタンパク質もしくは融合分子をコードするポリヌクレオチドとして提供される。従って、この方法によって、このジンクフィンガータンパク質は、第２細胞中で発現されるかまたは第２細胞に付加されるかのいずれかである。このジンクフィンガータンパク質がポリヌクレオチドとして提供される特定の実施形態において、例えば、このジンクフィンガータンパク質をコードする配列に作動可能に連結された誘導性転写制御エレメント（例えば、プロモーター）を使用して、このジンクフィンガータンパク質の発現は誘導性であり得る。これらの実施形態において、第１細胞および第２細胞は、両方共ジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得るが、しかし発現は２つの一致する細胞のうち１つの細胞においてのみ誘導される。さらに、この第１細胞および／または第２細胞は、１つよりも多い外因性ジンクフィンガータンパク質または融合分子（あるいはこのジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド）を含み得る。
【００７５】
他の局面において、このスクリーニング方法において使用される第１細胞および／または第２細胞はまた、レポーター（例えば、選択可能なマーカー）を含み得る。例えば、特定の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質の発現が、公知の分子標的、好ましくは生化学的経路またはシグナル伝達経路のような細胞内プロセスの成分に応答性の転写制御エレメントに作動可能に連結されたこのジンクフィンガータンパク質を、細胞が含む方法が提供される。従って、シグナル伝達経路が活性な条件下で、このジンクフィンガータンパク質は発現される。この細胞はまた、好ましくはレポーター（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴなど）をコードするポリヌクレオチドを含む。レポーター分子のサブセットとしては、選択マーカー（例えば、薬物耐性、チミジンキナーゼなど）が挙げられる。このレポーターまたは選択マーカーは、ジンクフィンガータンパク質（またはジンクフィンガータンパク質を含む融合物）によって調節される転写制御エレメントに作動可能に連結され得る。従って、試験化合物がこの細胞に投与される場合、標的（例えば、シグナル伝達経路の成分）と相互作用してＺＦＰの産生を調節するこの化合物の能力は、産生されるレポーターおよび／または選択マーカーの量に反映される。特定の実施形態において、このジンクフィンガータンパク質（または融合物）は、レポーターおよび／または選択マーカーの発現を抑制する。これらの場合において、この化合物が、シグナル伝達経路を遮断するような方法でこの化合物の標的と相互作用する場合、ＺＦＰによって発現が制御されるレポーターの産生は上昇する。この細胞はまた、１つより多くのレポーター／選択マーカーを含み得る。
【００７６】
さらなる実施形態において、分子標的を過剰発現する細胞が提供され、ここでこの過剰発現は、外因性ジンクフィンガータンパク質の作用によって仲介される。同様に、分子標的の発現が不足する細胞（ここでこの発現不足は、外因性ジンクフィンガータンパク質の作用によって仲介される）が提供される。このような細胞を作成および使用する方法が、また提供される。
【００７７】
なおさらなる実施形態において、外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞から単離される１つ以上の細胞成分の使用を包含する方法が提供される。好ましい実施形態において、この細胞成分は、好ましくは、ジンクフィンガータンパク質（またはジンクフィンガータンパク質を含む融合物）の活性によって分子標的（例えば、レセプター）を過剰発現する細胞から単離される細胞膜である。この単離された膜は、例えば結合研究（例えば、放射標識リガンドを使用して）のために使用され得る。
【００７８】
別の局面において、本明細書中に記載される任意のジンクフィンガータンパク質を含む細胞が提供される。好ましい実施形態において、分子標的を発現する細胞が提供される。この種類の細胞は、分子標的と相互作用する化合物と接触される細胞に対して応答性であるという特徴を示す。この細胞は、この細胞中のタンパク質、好ましくは分子標的の産生を調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む。
【００７９】
さらに別の局面において、本明細書中に記載される任意の細胞、タンパク質、ポリヌクレオチドなどを含む、目的の化合物をスクリーニングするためのキットが提供される。好ましい実施形態において、このキットはさらに、補助試薬、指示書、および本明細書中に記載されるスクリーニング方法を実行するために設計された他の材料を含む。
【００８０】
これらの実施形態および他の実施形態は、本明細書中における開示から、当業者にとって容易に明白である。
【発明の効果】
【００８１】
本発明によれば、特定の分子標的と相互作用する候補化合物の能力について、候補化合物をスクリーニングするための新規のアッセイが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
（概要）本明細書中に開示される組成物および方法は、特定の分子標的と相互作用する候補化合物の能力について、候補化合物をスクリーニングするための新規のアッセイを含む。このアッセイは、細胞ベースのアッセイおよび生化学的アッセイの両方を含む。さらに、本明細書中に記載されるこのアッセイは、目的の遺伝子の発現を調節し得るジンクフィンガータンパク質を含む細胞を含むか、またはこの細胞から誘導される。
【００８３】
１つの実施形態において、ジンクフィンガータンパク質またはこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞内に導入されて（例えば、安定な形質転換または一過性のトランスフェクションを介して）、目的の分子標的を過剰発現する。ＺＦＰ含有細胞におけるこの分子標的に対する候補化合物の効果は、ＺＦＰ非含有細胞におけるこの候補化合物の効果と比較され、この標的と相互作用する化合物の能力を決定し得る。従って、このＺＦＰは、分子標的そのものの発現を調節（例えば、活性化）し得る。あるいは、このＺＦＰは、異なる分子の発現を調節し得、これは次いで、分子標的に対して直接的または間接的に作用し得、例えば、このＺＦＰはこの分子標的を調節するシグナル伝達経路において、上流の分子または下流の分子の発現を調節し得る。
【００８４】
他の実施形態において、ＺＦＰをコードする遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあり、そして第１細胞および第２細胞の両方は、この誘導性遺伝子を含む。従って、この細胞は、実質的に同一であり、そしてＺＦＰの発現は１つの細胞（試験細胞）中に誘導され得、そして他の細胞（コントロール細胞）には誘導されず、候補化合物の分子標的との相互作用を決定する。この細胞は、安定または一過性に誘導性ＺＦＰ構築物でトランスフェクトされ得る。
【００８５】
別の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、細胞中に導入され、細胞表面分子または膜結合分子（例えば、レセプター）を過剰発現する。次いで、このレセプターが豊富な膜は単離され、そして生化学的アッセイ（例えば、化合物の結合の測定によって）に使用される。
【００８６】
さらに他の実施形態において、化合物は、分子標的（例えば、細胞プロセス（例えば、生化学的経路またはシグナル伝達カスケード）に関する任意の標的）と相互作用するその能力について試験される。例えば、試験化合物が、特定のシグナル伝達カスケードを開始するレセプター発現することが公知である細胞に投与される。さらに、この試験細胞はまた、（１）外因性ジンクフィンガータンパク質および機能的ドメインを含む融合分子をコードするポリヌクレオチド、および（２）レポーター分子（例えば、緑色蛍光タンパク質、または薬物耐性のような選択マーカー）をコードするポリヌクレオチドを含む。この融合分子をコードするこのポリヌクレオチドは、目的の細胞プロセスに応答性の転写制御エレメントに作動可能に連結される。例えば、融合分子をコードするポリヌクレオチドは、発現がシグナル伝達カスケードの結果として調節される遺伝子から誘導される、転写制御配列に作動可能に連結される。この融合分子は、例えば、ジンクフィンガータンパク質および抑制ドメイン（これは、発現される場合、レポーター分子の発現を抑制する）を含み得る。従って、このレセプターおよび関連プロセス（例えば、シグナル伝達カスケード）が機能する場合、この融合分子は発現され、そして次々に、この融合分子はレポーター分子の発現の抑制を補助する。候補試験化合物が、シグナル伝達経路の成分と、この経路を遮断するように相互作用する場合、この抑制的な融合分子の発現は、減少または排除され、そしてレポーターのレベルは上昇する。従って、任意の化合物は、レポーターレベルをモニターすることによって、シグナル伝達カスケード干渉するこの化合物の能力についてスクリーニングされ得る。
【００８７】
開示される方法の実行は、他に指示がなければ、分子生物学、生化学、遺伝学、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当該分野の技術内にある関連の分野における従来の技術を利用する。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７および定期的な更新；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと。
【００８８】
（定義）
用語「核酸」「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そして一本鎖形状もしくは二本鎖形状のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。本開示の目的のために、これらの用語はポリマーの長さについての限定として解釈されるべきではない。この用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対特異性を有する；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成する。
【００８９】
用語「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも、適用される。
【００９０】
「ジンクフィンガー」は、亜鉛原子の配位によって安定化される構造を有するポリペプチド配列（一般に約３０アミノ酸）を含む、配列特異的結合ドメインである。ジンクフィンガーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはアミノ酸配列に結合し得る。ＤＮＡ結合に関して、単一のジンクフィンガーは、一般に、２〜４塩基対、代表的には３または４塩基対を含む標的サブサイトに結合する。ジンクフィンガーの例示的なクラスは、一般構造−Ｃｙｓ−Ｘ２〜４−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｈｉｓ−Ｘ３〜５−Ｈｉｓ−（ここでＸは、任意のアミノ酸である）を有し；これは亜鉛原子と配意する２つのシステイン残基および２つのヒスチジン残基を含む（いわゆるＣＣＨＨまたはＣ２Ｈ２ジンクフィンガー）。しかし、さらなるジンクフィンガーの構造（例えば、ＣＣＨＣ、ＣＣＣＨ、ＣＨＨＣ、ＣＨＣＨおよびＣＨＨＨ）もまた、開示された方法および組成物において有用である。
【００９１】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」は、１つ以上のジンクフィンガーの結合活性を介して配列特異的な様式でＤＮＡと結合する、より大きなタンパク質中の、タンパク質またはセグメントである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。ＺＦＰは、ジンクフィンガーに加えてポリペプチドドメインを含み得る；例えば、他のＤＮＡ結合ドメインおよび／または機能的ドメインである。
【００９２】
「設計された」ジンクフィンガータンパク質は、その設計／組成が主に合理的な判断基準から生じる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な判断基準には、置換法則の適用、および既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベースにおける、情報を処理するためのコンピューター化されたアルゴリズムが挙げられる（例えば、共同所有されたＰＣＴ ＷＯ００／４２２１９および共同所有された米国特許出願第０９／４４４，２４１号（１９９９年１１月９日提出）に記載される）。
【００９３】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その産生が、ファージディスプレイのような経験的なプロセスから主に生じる、天然に見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；ＷＯ ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６およびＷＯ ９８／５４３１１を参照のこと。
【００９４】
「最適化された」ジンクフィンガータンパク質は、上記に記載されたように設計または選択され、次いで結合特異性について試験され、そして共同所有された米国特許出願第０９／７１６，６３７号（２０００年１１月２０日提出、タイトル「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」）に記載されるように、このジンクフィンガータンパク質の結合特異性を改善するために配列において変更されたジンクフィンガータンパク質をいう。
【００９５】
用語「天然に存在する」は、ヒトによって人工的に産生された物とは別の、天然に見出され得る対象を記載するために使用される。
【００９６】
核酸またはアミノ酸配列は、互いに機能的な関係に配置された場合、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」（または、「作動可能的に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」）。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、このプロモーターもしくはエンハンサーがコード配列の転写を制御するか、または調節に寄与する場合、このコード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、代表的に連続し、そして作動可能に連結されたアミノ酸配列は、代表的に連続しかつ同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーが数ｋｂ以上プロモーターから離れ、そしてイントロン配列が可変の長さであり得る場合、一般にこのエンハンサーは機能するので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結し得るが、連続し得ない。同様に、一次ポリペプチド配列において非連続である特定のアミノ酸配列が、例えばポリペプチド鎖の折り畳みに起因して、それでも作動可能に連結し得る。
【００９７】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能的に連結する」は、それぞれの成分が他の成分との連鎖において、この成分がそのように連鎖していないかのように、同じ機能を実行するという事実をいい得る。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが転写活性化ドメイン（またはそれらの機能的フラグメント）と融合される融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよびこの転写活性化ドメイン（またはそれらの機能的フラグメント）は、融合ポリペプチドにおいてこのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合し得、一方、転写活性化ドメイン（またはそれらの機能的フラグメント）が転写を活性化し得る場合に、作動可能的に連結される。
【００９８】
例えば、ＺＦＰと特異的標的部位との間の「特異的結合」は、少なくとも１×１０６Ｍの結合親和性を意味する。
【００９９】
「調節ドメイン」または「機能的ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）に結合される場合、転写調節活性を有するポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインをいう。代表的に、調節ドメインは、ＺＦＰに共有結合または非共有結合し（例えば、融合分子を形成するために）、転写調節をもたらす。調節ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ドメインであり得る。活性化ドメインには、ＶＰ１６、ＶＰ６４、リガンドに結合された野生型甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）および特定のＴＲ変異体、ならびに核因子κ−Ｂのｐ６５サブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。抑制ドメインには、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ２Ｂ、結合していない野生型ＴＲおよび特定のＴＲ変異体、ならびにｖ−ＥｒｂＡが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる調節ドメインには、例えば転写因子および補助因子（例えば、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、早期成長応答因子１（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ １）、および核ホルモンレセプター）、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが挙げられる。活性化因子および抑制因子には、活性化補助因子および抑制補助因子が挙げられる（例えば、Ｕｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：４９８〜５０２（１９９８）を参照のこと）。あるいは、ＺＦＰは、調節ドメインなしで単独に作用し、転写調節をもたらし得る。
【０１００】
「融合分子」は、２つ以上のサブユニット分子が結合、好ましくは共有結合した分子である。このサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例としては、融合ポリペプチド（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインとメチル結合ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、本明細書中に記載される融合ポリペプチドをコードする核酸）が挙げられるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および副溝結合因子（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）と核酸との間の融合が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０１】
「外因性分子」は、細胞中に通常存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。細胞における通常の存在は、その細胞の特定の発育段階および環境条件に関して決定される。従って、例えば筋肉の胚発達の間でのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックされていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能的な異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）、または通常に機能する内因性分子の機能不全な異形を含み得る。
【０１０２】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって産生されるような小分子、または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の改変された誘導体、または上記分子の１つ以上を含む任意の複合体）であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖もしくは二本鎖であり得；直鎖状、分枝状、もしくは環状であり得、そして任意の長さで有り得る。核酸は、二本鎖を形成し得る核酸、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
外因性分子は、内因性分子（例えば、タンパク質または核酸）と同じ型の分子であり得る（すなわち、外因性遺伝子）が、ただし、内因性分子とは異なる配列を有する。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入されるプラスミドまたはエピソーム、あるいは通常は細胞中に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞中に導入するための方法は、当該分野で公知であり、そして、脂質介在転移（すなわち、中性脂肪および陽イオン性脂肪を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒ボンバードメント、カルシウムリン酸共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン介在転移およびウイルスベクター介在転移が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０４】
対照的に、「内因性分子」は、特定の環境条件下で、特定の細胞中に特定の発育段階で通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体のゲノムもしくは他の小器官のゲノム、または天然に存在するエピソームの核酸を含み得る。さらなる内因性分子としては、内因性遺伝子および内因性タンパク質（例えば、転写因子およびクロマチン再構築複合体の成分）が挙げられ得る。
【０１０５】
本開示の目的についての「遺伝子」とは、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するかしないに関わらず）を含む。従って、遺伝子は、限定される必要はないが、プロモーター配列、ターミネーター、転写調節配列（例えば、リボゾーム結合部位および内部リボゾーム流入部位、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、結合エレメント、複製起源、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられる。遺伝子は、正常または変異のいずれかの内因性細胞遺伝子、あるいは感染性生物（例えば細菌またはウイルスなど）の外因性遺伝子であり得る。
【０１０６】
「内因性細胞遺伝子」は、細胞に対してネイティブな遺伝子をいい、これはその細胞の正常のゲノム内容物（ｃｏｎｔｅｘｔ）および染色体内容物中にあり、そしてこれはこの細胞に対して異種ではない。このような細胞遺伝子には、例えば、動物遺伝子、植物遺伝子、細菌遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ミトコンドリア遺伝子および葉緑体遺伝子が挙げられる。
【０１０７】
「ネイティブなクロマチン内容物」とは、天然に存在する、構造的な関係のゲノムＤＮＡ（例えば細菌ゲノムＤＮＡ、動物ゲノムＤＮＡ、真菌ゲノムＤＮＡ、植物ゲノムＤＮＡ、原生動物ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアゲノムＤＮＡおよび葉緑体ゲノムＤＮＡ）、およびＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストン、非ヒストン染色体タンパク質および細菌ＤＮＡ結合タンパク質ＩＩ）をいい、これは共に染色体を形成する。内因性細胞遺伝子は、ネイティブなクロマチン内容物中で、転写的に活性な状態または非活性な状態であり得る。
【０１０８】
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）の直接的な転写産物、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、およびエディティングのようなプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン結合、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって改変されるタンパク質を含む。
【０１０９】
「遺伝子の活性化」および「遺伝子発現の増大」は、遺伝子産物の産生における増大を生じる任意の方法をいう。遺伝子産物は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、および構造ＲＮＡを含むがこれらに限定されない）またはタンパク質のいずれかであり得る。従って、遺伝子の活性化は、遺伝子の転写および／またはｍＲＮＡの翻訳を増大するプロセスを含む。転写を増大する遺伝子の活性化プロセスの例は、転写開始複合体の形成を促進するプロセス、転写開始率を増加するプロセス、転写の持続率を増加するプロセス、転写の進化性を増加するプロセス、および転写抑制を取り除くプロセス（例えば、転写抑制物の結合を遮断することによって）が挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子の活性化は、例えば、抑制の阻害ならびに、存在するレベル以上の発現の刺激を構成し得る。翻訳を増大する遺伝子の活性化プロセスの例は、翻訳開始を増大するプロセス、翻訳の持続を増大するプロセス、およびｍＲＮＡの安定性を増大するプロセスが挙げられる。一般に、遺伝子の活性化は、遺伝子産物の産生における任意の検出可能な増加、好ましくは遺伝子産物の産生における約２倍の増加、より好ましくは約２〜約５倍もしくはその間の任意の整数値、より好ましくは約５〜約１０倍の間もしくはその間の任意の整数値、より好ましくは約１０〜約２０倍の間もしくはその間の任意の整数値、さらにより好ましくは約２０〜約５０倍の間もしくはその間の任意の整数値、より好ましくは約５０〜約１００倍の間もしくはその間の任意の整数値、より好ましくは１００倍以上の増加を含む。
【０１１０】
「遺伝子抑制」および「遺伝子発現の阻害」は、遺伝子産物の生産において減少をもたらす任意のプロセスをいう。遺伝子産物は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび構造ＲＮＡを含むが、これらに限定されない）またはタンパク質のいずれかであり得る。従って、遺伝子抑制は、遺伝子の転写および／またはｍＲＮＡの翻訳を減少させるプロセスを含む。転写を減少させる遺伝子抑制プロセスの例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：転写開始複合体の形成を阻害するプロセス、転写開始率を減少させるプロセス、転写延長率を減少させるプロセス、転写のプロセシング率（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を減少させる方法および転写活性を拮抗するプロセス（例えば、転写活性化因子の結合をブロックすることによる）。遺伝子抑制は、例えば、活性化の防止および発現の存在レベルを下まわる発現の阻害からなり得る。翻訳を減少させる遺伝子抑制プロセスの例としては、翻訳開始を減少させる方法、翻訳延長を減少させる方法およびｍＲＮＡ安定性を減少させる方法が挙げられる。翻訳抑制としては、遺伝子転写の可逆的および不可逆的な不活性化の両方が挙げられる。一般的には、遺伝子抑制は、遺伝子産物の生産における任意の検出可能な減少を含み、好ましくは約２倍だけの遺伝子産物の生産における減少、さらに好ましくは約２〜約５倍またはそれらの間の任意の整数値、さらに好ましくは、約５〜約１０倍の間またはそれらの間の任意の整数値、さらに好ましくは、約１０〜約２０倍の間またはそれらの間の任意の整数値、なおさらに好ましくは、約２０〜約５０倍の間またはそれらの間の任意の整数値、さらに好ましくは、約５０〜約１００倍の間またはそれらの間の任意の整数値、さらに好ましくは、１００倍以上である。最も好ましくは、遺伝子抑制が、遺伝子発現の完全な阻害をもたらし、それゆえ遺伝子産物が検出されない。
【０１１１】
用語「調節する」は、機能の抑制、促進または誘導をいう。例えば、ＺＦＰは、転写制御配列内のモチーフに結合し、それによって転写制御配列に作動可能に連結される遺伝子の転写を促進または抑制することによって、遺伝子発現を調節し得る。さらに、調節は、遺伝子へのＺＦＰ結合の性質による遺伝子の転写阻害、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を最初から最後まで読ことをブロックしてそれゆえ遺伝子の転写を阻害することを含む。さらに、調節は、転写物の翻訳の阻害を含む。従って、遺伝子発現の「調節」は、遺伝子活性化および遺伝子抑制の両方を含む。
【０１１２】
調節は、標的遺伝子の発現により間接的または直接的に影響を受ける任意のパラメーターを決定することによって、アッセイされ得る。このようなパラメーターとしては、例えば以下のものが挙げられる：ＲＮＡまたはタンパク質のレベルにおける変化；タンパク質活性における変化；産物レベルにおける変化；下流の遺伝子発現における変化；レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＧＦＰ（例えば、ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：９６１−９６４を参照のこと）、または薬物耐性のような選択マーカー）の転写または活性化における変化；シグナル伝達における変化；リン酸化および脱リン酸化における変化；レセプター−リガンド相互作用における変化；セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、およびＣａ２＋）の濃度における変化；細胞増殖における変化；血管新生における変化；および／または遺伝子発現の任意の機能的効果における変化。測定は、インビトロ、インビボ、および／またはエキソビボでなされ得る。このような機能的効果は、従来の方法（例えば、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルの測定、ＲＮＡ安定性の測定、および／または下流遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現の同定）によって測定され得る。読み出しは、例えば、以下によりし得る：化学ルミネセンス、蛍光発光、比色定量反応、抗体結合、誘導マーカー、リガンド結合アッセイ；ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）のような細胞内セカンドメッセンジャーにおける変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；サイトカイン放出など。
【０１１３】
ジンクフィンガータンパク質（または融合分子）が細胞内タンパク質の発現を阻害するために使用される場合、細胞内タンパク質の発現レベル、および／またはそれをコードするｍＲＮＡは、好ましくは発現しないかまたは調節に影響を及ぼすジンクフィンガータンパク質を含む参照細胞中のものの７５％未満。好ましくは、発現レベルは、参照細胞中のものの５０％未満；より好ましくは参照細胞中のものの２５％未満；最も好ましくは参照細胞中のものの５％未満。ジンクフィンガータンパク質が細胞タンパク質の発現を活性化するために使用される場合、この発現レベルは、ＺＦＰを発現しない参照細胞中のレベルの１１０％よりも多い。より好ましくは、この発現レベルは参照細胞中のレベルの１２５％よりも多く；より好ましくは原始細胞（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｅｌｌ）中のレベルの１５０％よりも多く；最も好ましくは参照細胞中のレベルの１７５％よりも多い。
【０１１４】
用語「転写制御エレメント」「転写調節エレメント」「転写制御配列」および「転写調節配列」は、相互交換可能に使用され、転写の調節を媒介するＤＮＡ配列をいう。これらのエレメントまたは配列の例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：プロモーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結部位およびポリアデニル化部位。転写制御配列は、調節標的が制御エレメントによって媒介される転写の調節に直接的または間接的に参加する場合、分子標的に応答する。
【０１１５】
「真核生物細胞」は、以下のものを含むが、これらに限定されない：真菌細胞（例えば、酵母）、原生動物細胞、古細菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞。同様に、「原核生物細胞」は、細菌を含むがこれに限定されない。
【０１１６】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的フラグメント」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸によって示される一つ以上の機能をなお保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的フラグメントは、対応するネイティブ分子と比べてより多くの、より少ないまたは同数の残基を有し得、および／または一つ以上のアミノ酸置換またはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能を決定するための方法（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法が周知である。例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって、例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能が決定され得る。Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこと。例えば、同時免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性検定（遺伝子的相補性検定および生化学的相補性検定の両方）によって、タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
【０１１７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合タンパク質（例えば、ＺＦＰのような）によって結合される配列である。標的配列は、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）またはアミノ酸配列であり得る。例として、３−フィンガーＺＦＰに対するＤＮＡ標的配列は、一般的に、ＺＦＰと標的配列間の交差鎖相互作用の存在および／または性質に依存して、９または１０ヌクレオチド長のいずれかである。
【０１１８】
「標的サブサイト」または「サブサイト」は、単独のジンクフィンガーによって結合されるＤＮＡ標的部位の部分である。従って、交差鎖相互作用の非存在下において、サブサイトは、一般的に、３ヌクレオチド長である。交差鎖相互作用（例えば、共同所有されているＰＣＴ ＷＯ ００／４２２１９に記載される「Ｄ−ａｂｌｅサブサイト（Ｄ−ａｂｌｅ ｓｕｂｓｉｔｅ）」）が生じる場合において、サブサイトは４ヌクレオチド長であり、そして別の３または４ヌクレオチドサブサイトと重なり合う。
【０１１９】
「分子標的」は、候補化合物（例えば、薬物）との相互作用について試験される任意の分子（例えば、細胞内の分子、または細胞膜と結合する分子）をいう。分子標的の非限定の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質（例えば、レセプター（例えば、細胞表面レセプター、膜結合レセプターまたは核レセプター）、シグナル伝達経路の成分、転写因子またはそれらの機能的フラグメント）が挙げられる。分子標的としてはまた、高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の改変された任意の誘導体、または上記分子の１つ以上を含む任意の複合体）を含み得る。化合物が分子標的に直接的または間接的に作用する場合、その化合物はその分子標的と「相互作用」する。その化合物は、その分子標的に直接的に作用し得る。例えば、分子標的がタンパク質である場合、その化合物は、そのタンパク質に結合することによって直接的にそのタンパク質と相互作用し得るか、または転写調節エレメントへの作用を介してそのタンパク質の発現を直接的に調節し得る。同様に、例えば、分子標的に代わりに作用する別の分子をブロックするかまたは刺激することによって、その化合物はまた、間接的に分子標的に作用し得る。例えば、標的が非タンパク質分子であり、そしてその化合物が、非タンパク質分子標的の産生、安定性、活性、維持および／または修飾に関連するタンパク質と相互作用する場合、化合物の分子標的への間接的な作用が起こり得る。
【０１２０】
用語「有効量」は、所望される結果（例えば、既に活性化されている遺伝子の不活性化または不活性な遺伝子の活性化）をもたらす量、あるいはジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む遺伝子の不活性化をもたらす量、もしくは構造遺伝子の転写またはＲＮＡの翻訳をブロックする量を含む。
【０１２１】
「Ｋｄ」は、化合物に関する解離定数（すなわち、所定の条件下（すなわち、［標的］＜＜Ｋｄの場合）での、化合物の標的への最大結合の２分の１（すなわち、標的に結合される化合物分子の２分の１）を示す化合物（例えば、ジンクフィンガータンパク質）の濃度）をいい、所定のアッセイ系（米国特許第５，７８９，５３８号）を使用して測定される。このＫｄを測定するために使用されるアッセイ系が選択されるべきであり、そのためＺＦＰの実際のＫｄの最も厳密な測定が与えられる。ＺＦＰの実際のＫｄの厳密な測定が与えられる限り、任意のアッセイ系が使用され得る。１つの実施形態において、ＺＦＰのＫｄは、本明細書の実施例１に記載されるような電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）を使用して測定される。ＺＦＰの純度またはＺＦＰ活性のための調整がなされない限り、実施例１を使用してなされるＫｄの計算は、所定のＺＦＰの実際のＫｄよりも小さい見積もりをもたらし得る。好ましくは、内因性細胞遺伝子の転写を調節するために使用されるＺＦＰのＫｄは、約１００ｎＭ未満であり、さらに好ましくは約７５ｎＭ未満であり、さらに好ましくは約５０ｎＭ未満であり、最も好ましくは約２５ｎＭ未満である。
【０１２２】
（スクリーニングアッセイ）好ましい実施形態において、スクリーニングアッセイが、少なくとも１つの外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞を用いてかまたは少なくとも１つの外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞由来の物質を用いて実施される。本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイは、候補化合物の高スループットスクリーニングを可能にし、これは、疑陽性の発生を減少しながら達成され得る。
【０１２３】
（Ａ．ジンクフィンガータンパク質）本明細書中に開示される組成物および方法は、ＤＮＡ結合タンパク質、特にジンクフィンガータンパク質の使用を含む。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９−１６１４；Ｒｈｏｄｅｓら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂ．：５６−６５；およびＫｌｕｇ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：２１５−２１８を参照のこと。３つのフィンガーのＺｉｆ２６８マウス転写因子が、詳細に十分に研究されている（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：８０９−１７）。Ｚｉｆ２６８ ＺＦＰと二本鎖ＤＮＡとのＸ線共結晶構造によって、各フィンガーがＤＮＡと独立して相互作用することが示される（Ｎｏｌｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９５：２９３８−４３；Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１７０１−７）。３フィンガーのドメインの機構は、各フィンガーによる３つ連続する塩基対トリプレットの認識を可能にする。各フィンガーは、約３０アミノ酸長であり、ββα折り畳みをとる。この２つのβ鎖は、シートを形成し、ＤＮＡ結合のための主溝中に認識αへリックスを位置づける。塩基との特定の接触は、主に認識へリックスの直前およびこの認識ヘリックス内の４アミノ酸によって媒介される。従来、これらの認識残基は、αへリックス内のその位置に基づいて１、２、３、および６と番号付けられる。
【０１２４】
ＺＦＰ ＤＮＡ−結合ドメインは、共同所有されるＷＯ ００／４２２１９；ＷＯ ００／４１５６６；および米国出願番号０９／４４４，２４１（１９９９年１１月１９日出願）；同０９／５３５，０８８（２０００年３月２３日出願）；ならびに米国特許第５，７８９，５３８号；同第６，００７，４０８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，１４０，０８１号；同第および；同第６，１４０，４６６；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ ９５／１９４３１、同ＷＯ ９８／５４３１１、同ＷＯ ００／２３４６４および、同ＷＯ ００／２７８７８に記載されるように設計および／または選択されて、特定の標的部位を認識する。１つの実施形態において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの標的部位は、共同所有されるＷＯ ００／４２２１９に開示される部位選択規則に従って同定される。好ましい実施形態において、ＺＦＰは、共同所有される米国出願番号０９／７１６，６３７（２０００年１１月２０日出願）の表題「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎｓ」に記載されるように、設計および最適化される。特定の好ましい実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインの結合特異性は、問題の配列中（例えば、細胞性クロマチン中）の１つ以上の接近可能な領域を指向する。接近可能な領域は、例えば、共同所有される米国特許出願番号６０／２００，５９０（２０００年４月２８日出願）の表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇａｎ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」、および米国特許出願番号６０／２２８，５５６（２０００年８月２８日出願）の表題「Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＳｅｑｕｅｎｃｅｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」に記載されるように決定される。ＤＮＡ結合ドメインは、次いで、近接可能な領域内の標的部位に結合するために、設計され、そして／または、選択され、そして／または、最適化される。
【０１２５】
２つの代替方法が代表的に使用されて、新規に設計されたＤＮＡ結合ペプチドを発現するために必要とされるコード配列を作製する。１つのプロトコールの例は、３フィンガーＺＦＰの構築のためのＰＣＲベースの組み立て手順であり、これは、６つの重複オリゴヌクレオチドを利用する（図１を参照のこと）。３つのオリゴヌクレオチドは、認識へリックス間のＤＮＡ結合ドメインの一部をコードする「ユニバーサル」配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジンクフィンガー構築物に関して一定なままである。他の３つの「特異的」オリゴヌクレオチドは、認識へリックスをコードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、主に、認識へリックス上の１位、２位、３位、および６位に置換を含み、その結果、各々は、異なるＤＮＡ結合ドメインを特定する。
【０１２６】
ＰＣＲ合成は、２工程で実行される。最初に、二本鎖ＤＮＡ鋳型を、低い温度のアニーリング工程を用いた４サイクルのＰＣＲ反応において６つのオリゴヌクレオチド（３つはユニバーサル、３つは特異的）を合わせ、これによってオリゴヌクレオチドをアニーリングしてＤＮＡ「足場」を形成することによって作製する。この足場の中のギャップは、高い忠実度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の熱安定ポリメラーゼによって充填され、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼの組合せもまた、十分である。構築の第２段階において、ジンクフィンガー鋳型は、増幅産物の両末端に制限部位を組み込むために設計された外部プライマーを用いて増幅され、これがシャトルベクターまたは直接発現ベクターへクローニングされることを容易にする。
【０１２７】
設計されたＤＮＡ結合タンパク質をコードするために配列を組み立てる代替の方法は、所望のジンクフィンガータンパク質の特定の領域をコードする相補オリゴヌクレオチドをアニーリングすることに依存する。この特定の適用は、オリゴヌクレオチドが最終連結工程前にリン酸化されることを必要とする。これは通常、アニーリング反応を始める前に実施されるが、リン酸化（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼによる）はまた、アニーリング後に生じてもよい。簡単に言うと、タンパク質の定常領域をコードする「ユニバーサル」オリゴヌクレオチドは、相補オリゴヌクレオチドにアニーリングされる。さらに、フィンガー認識へリックスをコードする「特異的」オリゴヌクレオチドは、そのそれぞれの相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングされる。これらの相補的オリゴは、上記のプロトコールにおいてポリメラーゼによって以前に充填された領域を充填するように設計される。ユニバーサルオリゴ１および特異的オリゴ６（フィンガー３をコードする）に相補的なオリゴヌクレオチドは、操作されて、選択ベクターへのクローニングに使用される認識部位に特異的な突出配列を含む。第２の組み立てプロトコールは、最初のプロトコールと以下の面で異なる：新規に設計されたジンクフィンガータンパク質をコードする「足場」は、完全に合成ＤＮＡから構成され、これによってポリメラーゼ充填工程を排除し、さらにベクターにクローニングされるフラグメントは、増幅を必要としない。最後に、配列特異的突出を含むことは、ベクターへの挿入前の制限酵素消化の必要性を排除する。
【０１２８】
生じるフラグメント（新規に設計されたジンクフィンガータンパク質をコードする）は、発現ベクターに連結される。一般的に利用される発現ベクターとしては、改変ｐＭＡＬ−ｃ２細菌発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、「ＮＥＢ」、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）または真核生物発現ベクターのｐｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。従来の精製方法が使用され得る（Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと）。さらに、任意の適切な宿主（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など）が、使用され得る。
【０１２９】
マルトース結合タンパク質に融合されたジンクフィンガータンパク質（ＭＢＰ−ＺＦＰ）の細菌株ＪＭ１０９における発現は、アミロースカラム（ＮＥＢ）を介した直接的な精製を可能にする。ジンクフィンガーキメラタンパク質の高い発現レベルは、ＩＰＴＧを用いた誘導によって得ることができる。なぜなら、ｐＭａｌ−ｃ２発現プラスミド中のＭＢＰ−ＺＦＰ融合物は、ＩＰＴＧ誘導可能なｔａｃプロモーター（ＮＥＢ）の制御下にあるからである。ＭＢＰ−ＺＦＰ融合プラスミドを含む細菌は、２×ＹＴ培地（１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０２％ グルコース、および５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む）に接種され、３７℃で振盪される。中間の指数関数的な増殖期に、ＩＰＴＧが０．３ｍＭまで添加され、そして培養物が振盪される。３時間後、細菌が遠心分離によって回収され、超音波処理によって破壊され、次いで、不溶性物質が、遠心分離によって除去される。ＭＢＰ−ＺＦＰタンパク質は、アミロース結合樹脂上に捕獲され、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴおよび５０μＭ ＺｎＣｌ２を含む緩衝液で徹底的に洗浄され、次いで、本質的に同じ緩衝液中でマルトースを用いて溶出される（精製は、ＮＥＢからの標準的なプロトコールに基づく）。精製タンパク質は、定量され、そして生化学分析のために保存される。
【０１３０】
精製タンパク質の生化学特性（例えば、Ｋｄ）は、任意の適切なアッセイによって特徴付けられ得る。Ｋｄは、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）を介して特徴付けられ得る（Ｂｕｒａｔｏｗｓｋｉ＆Ｃｈｏｄｏｓｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２．２．１−１２．２．７頁（Ａｕｓｕｂｅｌ編、１９９６）；米国特許第５，７８９，５３８号；ＰＣＴ ＷＯ ００／４２２１９もまた参照のこと）。親和性は、低目に固定された量の標識二本鎖オリゴヌクレオチド標的に対して精製タンパク質を滴定することによって測定される。この標的は、天然の配列中に見出される３ｂｐが隣接した天然の結合部位配列（９または１８ｂｐ）を含む。結合部位および隣接配列の外部にあるのは、定常配列である。アニーリングされたオリゴヌクレオチド標的は、Ｔ４ファージポリヌクレオチドキナーゼを用いた効率的な標的の標識を可能にする１ｂｐの５’突出を保有する。このアッセイに関して、標的を、４０ｎＭ以下の濃度で添加し（実際の濃度は、最も低いタンパク質希釈よりも少なくとも１０分の１に維持される）、そして反応物を、少なくとも４５分間平衡させる。さらに反応混合物はまた、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ グリセロール、０．０２％ ＢＳＡも含む（ポリ（ｄＩｄＣ）または（ｄＡｄＴ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がまた、１０〜１００μｇ／μｌで添加され得る）。
【０１３１】
平衡された反応物は、１０％ ポリアクリルアミドゲル（これは、Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液中で４５分間、予備泳動された）に充填され、次いで、結合または未結合の標識標的が、１５０Ｖの電気泳動で分離される（あるいは、４％ポリアクリルアミドゲルスタッカーを含む１０〜２０％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルがまた、使用され得る）。乾燥させたゲルは、オートラジオグラフィーまたはホスホロイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｉｎｇ）によって可視化され、そして見かけのＫｄが、最大半減の結合を与えるタンパク質濃度を計算することによって決定される。
【０１３２】
類似のアッセイがまた、タンパク質調製物における活性な画分を決定することを含み得る。活性な画分は、タンパク質が高い濃度の標的ＤＮＡに対して滴定される化学量論的ゲルシフトによって決定される。滴定は、１００、５０、および２５％の標的で実施される（通常、マイクロモルのレベル）。
【０１３３】
（Ｂ．融合分子）ジンクフィンガー含有タンパク質の選択および／または設計はまた、遺伝子発現の調節を容易にする融合分子の設計を可能にする。従って、特定の実施形態において、本明細書中に開示される組成物および方法は、ジンクフィンガータンパク質（またはその機能フラグメント）と１つ以上の機能ドメイン（またはその機能フラグメント）との間の融合物、またはこのような融合物をコードするポリヌクレオチドを含む。このような融合分子が細胞に存在する場合、機能ドメインは、ジンクフィンガータンパク質が結合する遺伝子中の配列の近位にもたらされる。次いで、この機能ドメインの転写調節機能は、例えば、遺伝子発現を調節することによって遺伝子上で作用し得る。
【０１３４】
ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上の調節ドメインあるいは２つ以上の調節ドメイン（この２つ以上のドメインは、同じドメインの２つのコピーであるか、または２つの異なるドメインである）と、共有結合しても非共有結合してもよい。調節ドメインは、例えば、アミノ酸リンカーを介して、融合タンパク質の一部としてジンクフィンガータンパク質に共有結合で連結され得る。ジンクフィンガータンパク質はまた、非共有結合二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質）を介して調節ドメインと結合され得る（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：５３９（１９９１）Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８２２−８２６（１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）を参照のこと）。調節ドメインは、任意の適切な位置（ジンクフィンガータンパク質のＣ末端またはＮ末端を含む）でジンクフィンガータンパク質と結合され得る。
【０１３５】
ジンクフィンガータンパク質に加えるための通常の制御ドメインとしては、以下が挙げられる：例えば、転写因子由来のエフェクタードメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓおよび／またはｅｒｂファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにこれらの関連因子および修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素ならびにこれらの関連因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびこれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにこれらの関連因子および修飾因子。
【０１３６】
制御ドメインを入手し得る転写因子ポリペプチドは、制御されかつ基礎的な転写に関連する転写因子ポリペプチドを含む。このようなポリペプチドとしては、例えば、転写因子、これらのエフェクタードメイン、コアクチベーター、サイレンサーおよび核ホルモンレセプターが挙げられる。転写に関するタンパク質および核酸エレメントの概説については、例えば、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら，Ｃｅｌｌ８４：８２５−３０（１９９６）を参照のこと；一般に転写因子は、Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｄｒｏｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２５ Ｓｕｐｐｌ．２：４６−９（１９９５）およびＲｏｅｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５−７１（１９９６）に概説される。転写因子の専用データベースは公知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：６３０（１９９５）を参照のこと）。核ホルモンレセプター転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４８５５−７４（１９９５）に記載される。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、Ｗｅｄｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９３：１７１−８５（１９９５）に概説される。核ホルモンレセプターによって転写制御を媒介するコアクチベーターおよびコリプレッサーは、例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；およびＵｔｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：４９８−５０２（１９９８）に概説される。造血の制御に関連する、ＧＡＴＡ転写因子は、例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉｓｓら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）およびその関連ＴＡＦポリペプチド（これは、ＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０およびＴＡＦ２５０を含む）は、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ＆Ｔｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）およびＨｕｒｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６９−７５（１９９６）に記載される。ＳＴＡＴファミリーの転写因子は、例えば、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（１９９６）に概説される。疾患に関連する転写因子は、Ａｓｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９６）に概説される。
【０１３７】
ＺＦＰと融合するための例示的な機能的ドメインは、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインである（例えば、Ｔｈｉｅｓｅｎら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２，３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐａｎｇｕｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，４５１４−４５１８（１９９４）を参照のこと）。別の最適な抑制ドメインは、メチル結合ドメインタンパク質２Ｂ（ＭＢＤ−２Ｂ）である（ＭＢＤタンパク質の記述に関してＨｅｎｄｒｉｃｈら，（１９９９）Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ １０：９０６−９１２も参照のこと）。別の有用な抑制ドメインは、ｖ−ＥｒｂＡタンパク質に関連する抑制ドメインである。例えば、Ｄａｍｍら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５９３−５９７；Ｅｖａｎｓ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．４：２６−２８；Ｐａｉｎら、（１９９０）Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２：２８４−２９４；Ｓａｐら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４２−２４４：Ｚｅｎｋｅら，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：１０７−１１９；およびＺｅｎｋｅら，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：１０３５−１０４９を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：非リガンド化（例えば、Ｔ３に結合しない）甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）および特定のＴＲ変異体、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２。例えば、Ｚｈａｎｇら，（２０００）；Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６２：４３９−４６６；Ｂｒｉｄら，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４；Ｔｙｌｅｒら，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｒｎら，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ８：３０５−３２１；およびＷｕら，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９−２７を参照のこと。
【０１３８】
活性化を達成するための適切なドメインとしては以下が挙げられる：ＨＳＶＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍｅｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照のこと）、核ホルモンレセプター（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照のこと）；リガンド結合ＴＲおよび特定のＴＲ変異体；核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）ならびにＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７−２９４２（１９９７）；Ｌｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４のような人工キメラ機能的ドメイン（Ｓｅｉｆｐａｌら，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２））。
【０１３９】
さらなる例示的な活性化ドメインとしては以下が含まれるがこれらに限定されない：ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２。例えば、Ｒｏｂｙｒら，（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５；Ｌｅｏら，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａら，（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２；Ｍａｌｉｋら，（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３；およびＬｅｍｏｎら，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照のこと。さらなる例示的な活性化ドメインとしては以下が含まれるがこれらに限定されない：ＯｓＧＡＩ，ＨＡＬＦ−１，Ｃ１，ＡＰ１，ＡＲＦ−５，−６，−７，および−８，ＣＰＲＦ１，ＣＰＲＦ４，ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ，ならびにＴＲＡＢ１。例えば、Ｏｇａｗａら，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉら，（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７−９９；Ｇｏｆｆら，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８−３０９；Ｃｈｏら，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９；Ｕｌｍａｓｏｎら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら，（２０００）ＰｌａｎｔＪ．２２：１−８；Ｇｏｎｇら，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４；およびＨｏｂｏら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照のこと。
【０１４０】
さらなる機能的ドメインは、例えば、共有に係るＷＯ００／４１５６６に開示される。さらに、インシュレイタードメイン（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ）（融合分子における使用に適切なＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質のようなクロマチン再構築タンパク質）は、例えば、共有に係る米国特許出願番号６０／２３６，４０９号（「Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＩＳＷＩ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ＡＴＰａｓｅｓ」と題される）；米国特許出願番号６０／２３６，８８４号（「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題される）；および米国特許出願番号６０／２５３，６７８号（「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題される）に記載される。
【０１４１】
機能的ドメインはまた、核ホルモンレセプター由来であり得る。例えば、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）は、核ホルモンレセプターサブファミリーのメンバーであり、そして一般的にその標的遺伝子に構成的に結合される。ＴＲ結合の効果（すなわち、遺伝子発現の抑制かまたは活性化のいずれか）は、通常、そのリガンド（甲状腺ホルモン（Ｔ３））が存在するか、または存在しないかに依存する。Ｔ３の非存在下において、レセプターは、一般に、基礎レベルより下のレベルに遺伝子発現を抑制する。非リガンド化レセプターによって補充され、そして抑制的な複合体を構成すると考えられる多数のタンパク質が同定された。このようなタンパク質の例としては、レセプターと直接的に相互作用する、ＳＭＲＴおよびＮＣｏＲ、ならびにＳＭＲＴ／ＮＣｏＲに相互作用する、Ｓｉｎ３が挙げられる。Ｓｉｎ３はまた、多くのヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣの１〜８（このうちのいくつかはまた、ＴＲと直接的に相互作用し得る））と相互作用する。ＤＮＡ結合ＴＲによるヒストンデアセチラーゼの再補充は、抑制を与える能力において主要な役割を担うと考えられるが；ＨＤＡＣ以外の抑制因子が、ＴＲによって補充されることもまた可能である。
【０１４２】
ＤＮＡ結合ＴＲへのリガンドの結合は、ＴＲに関連する抑制性複合体の崩壊およびＤＮＡ結合、リガンド結合ＴＲへの活性因子の再補充を生じる。このような活性因子としては以下が含まれるがそれらに限定されない：ヒストンアセチルトランスフェラーゼＳＲＣ−１、ＣＢＰ／ｐ３００、およびＰ／ＣＡＦ。オリゴマーの活性化複合体はまた、リガンド結合ＴＲ（例えば、ＤＲＩＰおよびＡＲＣ）によって補充され得る。Ｒａｃｈｅｚら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：８２４−８２７；およびＮａａｒら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：８２８−８３２。これらは、リガンド結合への応答において、他の核ホルモンレセプターと相互作用すること、そしてクロマチンの鋳型の前後において遺伝子発現の活性化を容易にすることが示されている。核レセプターファミリー（糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ））の別のメンバーは、リガンド結合に応答してｈＢＲＧ１／ＢＡＦクロマチン再構築複合体を補充する。Ｆｒｙｅｒら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：８８−９１。
【０１４３】
ＴＲおよび関連する核レセプターは、（規定されていない機能の）アミノ末端領域、中心的なＤＮＡ結合ドメインおよびカルボキシ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含むモジュラータンパク質である。ＬＢＤは、ホルモンを結合することに加えて、上記される抑制因子と活性因子の両方との相互作用の原因である。ＬＢＤが、異種ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４）に融合される場合、Ｇａｌ４結合部位を含む標的プロモーターの抑制を媒介する。Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：４７６０−４７７０。さらに、転写のＴ３依存活性化は、ＧＡｌ４ ＤＮＡ結合ドメインとＴＲ ＬＢＤとの融合を使用して達成され得る。Ｔｏｎｅら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，１５７−３１，１６１。
【０１４４】
ＴＲおよび関連する核レセプターのＬＢＤの構造の知見（突然変異誘発の研究の結果と共に）は、ホルモン濃度に無感覚である抑制活性および活性化活性を有する変異体レセプターを設計するために使用され得る。例えば、生理学的なレベルのＴ３を結合し得ないＴＲの単一アミノ酸変異体（例えば、Ｇ３４４Ｅ、Δ４３０Ｍ、およびΔ２７６Ｉ）は、これらの結合部位にコリプレッサーを補充する。Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１２６２−１２７７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，（１９９８）前出。逆に、ホルモン結合によって誘導される構造変化を模倣するリガンド結合ドメインにおける構造変化を起こす変異は、エストロゲンレセプター（例えば、Ｌ５３６ＰおよびＹ５４１Ｄ／Ｅ／Ａ）において同定され、そしてレセプターの構成的活性形態を生じる。Ｅｎｇら，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：４６４４−４６５３；Ｗｈｉｔｅら，（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：１４２７−１４３５。
【０１４５】
従って、例えば、ＴＲまたはＧＲに由来する変異体核ホルモンレセプターＬＢＤは、細胞内のクロマチンにおける目的の領域に活性化タンパク質複合体または抑制タンパク質複合体を補充するために、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインとの融合の成分として使用され得、それによって標的分子の発現を制御する。特定の天然に存在する変異体ＬＢＤは、利用可能であり；そして新しい変異体は、当業者に周知の方法によって作製され得る。このような複合体の作用部位は、ＤＮＡ結合ドメインの特異性によって決定されるが；これらの活性は、ＬＢＤに対する変異の性質によって決定され、そしてこれは、リガンド濃度に依存しない。例えば、ホルモンを結合し得ないように変異されたＬＢＤを含む融合は、抑制性の複合体の形成を容易にするが；リガンド結合ＬＢＤに似ているようにＬＢＤの構造を変化するＬＢＤ変異を含む融合分子は、転写の活性化を容易にする複合体の形成を刺激する。従って、本発明の開示の目的に関して、変異体核ホルモンレセプターＬＢＤ（例えば、ＴＲ）は、活性化ドメインまたは抑制ドメインとして使用され得る。
【０１４６】
さらなる実施形態において、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」と題される共有に係る米国特許出願に開示されるように、クロマチンの標的再構築は、機能的ドメイン融合分子／ＤＮＡ結合ドメイン融合分子の結合にアクセス可能である細胞のクロマチンにおいて１つ以上の部位を産生するために使用され得る。
【０１４７】
キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子制御に関連するポリペプチドを改変する他のタンパク質はまた、ジンクフィンガータンパク質のための機能的ドメインとして有用である。このような修飾因子は、しばしば、例えば、ホルモンによって媒介される転写を作動するかまたは停止するかに関連する。転写制御に関連するキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２：４５９−６７（１９９５），Ｊａｃｋｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２８：２７９−８６（１９９３），およびＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．ＧｅｎｅＥｘｐｒ．５：１−７７（１９９５）に概説され、一方でホスファターゼは、例えば、Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ＆Ｓｅｍｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９５）に概説される。核のチロシンキナーゼは、Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３−６（１９９４）に記載される。
【０１４８】
有用なドメインはまた、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓおよび／またはｅｒｂファミリーナンバー）ならびにこれらに関連する因子および修飾因子の遺伝子産物から入手され得る。癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎＢｉｏｌｏｇｙ（第２版，１９９５）に記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８（１９９３）およびＣｒｅｐｉｅｕｘら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８（１９９４）に概説される。Ｍｙｃ癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）に概説される。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、Ｆｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ （Ａｎｇｅｌ＆Ｈｅｒｒｌｉｃｈ編，１９９４）に記載される。ｍａｘ癌遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９−１６に概説される。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉら，Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９−９８（１９９６）に概説される。ｍｏｓファミリーは、Ｙｅｗら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９−２５（１９９３）に概説される。
【０１４９】
ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ修復酵素ならびに関連因子および修飾因子から得られる機能的ドメインを含み得る。ＤＮＡ修復系は、例えば、Ｖｏｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：３８５−９５（１９９２）；Ｓａｎｃａｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：６９−１０５（１９９５）；Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．１７：１−１９（１９９５）；およびＷｏｏｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７（１９９６）に概説される。ＤＮＡ再構築酵素ならびにこれらの関連因子および修飾因子はまた、制御ドメインとして使用され得る（例えば、Ｇａｎｇｌｏｆｆら，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０：２６１−９（１９９４）；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：７６０−７（１９９３）を参照のこと）。
【０１５０】
同様に、制御ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ポスファターゼ、ポリメラーゼ）ならびにこれらの関連因子および修飾因子由来であり得る。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏｎら，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１６：１３−２２（１９９４）に概説され、そしてメチルトランスフェラーゼは、Ｃｈｅｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：４−１０（１９９５）に記載される。ヒストンデアセチラーゼ（Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：３７１−２（１９９６））のような、クロマチン関連タンパク質およびこれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）はまた、選択されたジンクフィンガータンパク質に加えるドメインとして有用である。転写性のリプレッサーとして作用するＤＮＡメチルトランスフェラーゼはまた、制御ドメインであり得る（例えば、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｗｙｎｇａｅｒｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：２８３−２８９（１９９８）；Ｆｌｙｎｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９：１０１−１１６（１９９８）；Ｏｋａｎｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２５３６−２５４０（１９９８）；およびＺａｒｄｏ＆Ｃａｉａｆａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７−１６５２０（１９９８）を参照のこと）。Ｆｏｋ１のようなエンドヌクレアーゼはまた、遺伝子切断を介して作用する、転写性のリプレッサーとして使用され得る（例えば、ＷＯ９５／０９２３３；およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２０１を参照のこと）。
【０１５１】
クロマチンならびにＤＮＡ構造、移動および局在ならびにこれらの関連因子および修飾因子を制御する因子；微生物（例えば、原核生物、真核生物およびウイルス）に由来する因子、およびこれらと結合するかまたはこれらを修飾する因子はまた、融合タンパク質を得るために使用され得る。リコンビナーゼおよびインテグラーゼは、機能的ドメインとして使用され得る。ヒストンアセチルトランスフェラーゼはまた、転写性のアクチベーターとして使用され得る（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８−４１１（１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５１９−３５２４（１９９８）を参照のこと）。ヒストンデアセチラーゼは、転写性のリプレッサーとして使用され得る（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉ＆Ｔｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２４４１９（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；およびＭａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３７８１−２３７８５（１９９８）を参照のこと）。
【０１５２】
ポリペプチドドメイン間（例えば、２つのジンクフィンガータンパク質間またはジンクフィンガータンパク質と機能的ドメインとの間）のリンカードメインは、含まれ得る。このようなリンカーは、典型的にポリペプチド配列である（例えば、約５〜２００アミノ酸の間のポリｇｌｙ配列）。好ましいリンカーは、典型的には組換え融合タンパク質の１部分として合成される可撓性のアミノ酸配列である。例えば、リンカーＤＧＧＧＳ（配列番号：２８）は、２つのジンクフィンガータンパク質を連結するために使用され得る。２つのジンクフィンガータンパク質を連結する可動性のリンカーはまた、配列ＴＧＥＫＰ（配列番号：２９）を含むアミノ酸配列であり得る（例えば、Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）。リンカーＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号：３０）は２つのジンクフィンガータンパク質を連結するために使用され得る。以下のリンカーはまた、２つのジンクフィンガータンパク質を連結するために使用され得る：ＧＧＲＲ（配列番号：３１）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら．１９９５，前出），（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号：４５）（Ｋｉｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１１５６−１１６０（１９９６）；およびＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号：３２）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号：３３）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号：３４）；ＬＲＱＫｄ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号：３５）。あるいは、可動性のリンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチドそれ自身の両方をモデル化し得るコンピュータープログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２２５６−２２６０（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））またはファージディスプレイ方法によって（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９９／４５１３２）合理的に設計され得る。
【０１５３】
化学的リンカーは、合成的にかまたは組換え的に産生されたドメイン配列を結合するために使用され得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。いくつかのリンカーは、アミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ機能的結合を有する。制御ドメインとジンクフィンガータンパク質との共有結合に加えて、非共有結合性の方法は、制御ドメインと関連するジンクフィンガータンパク質を有する分子の産生に使用され得る。
【０１５４】
ＺＦＰ融合分子はまた、１つ以上の機能的ドメインに加えて、または代わりに、精製、発現、モニタリングならびに／または細胞の局在および／もしくは細胞下の局在の検出を容易にする１つ以上のドメインを含み得る。例えば、これらとしては、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、およびＦＬＡＧエピトープのようなポリペプチドが挙げられる。
【０１５５】
融合分子は、当業者に周知であるクローニングの方法および生化学的な組み合わせによって作製される。特定の実施形態において、融合分子は、ジンクフィンガータンパク質および少なくとも２つの機能的ドメインを含む（例えば、インシュレイタードメインまたはメチル結合タンパク質ドメイン、そして、さらに、転写性活性化ドメインまたは転写性抑制ドメイン）。融合分子はまた、核局在シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗原由来のような）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝着素のような）を必要に応じて含む。融合タンパク質（およびこれらをコードする核酸）は、翻訳性リーディングフレームが、融合の成分間で保存されるように設計される。
【０１５６】
本明細書中で開示される融合分子は、標的部位に結合し、そして分子標的の発現を媒介するジンクフィンガー結合タンパク質を含む。特定の実施形態において、標的部位は、細胞のクロマチンのアクセス可能な領域に存在する。アクセス可能な領域は、共有に係る米国特許出願番号６０／２００，５９０号，米国特許出願番号６０／２１４，６７４号および米国特許出願番号６０／２２８，５５６号に記載されるように決定され得る。標的部位が、細胞のクロマチンのアクセス可能な領域に存在しない場合、１つ以上のアクセス可能な領域は、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」と題される共有に係る米国特許出願に記載されるように決定される。さらなる実施形態において、融合分子のジンクフィンガー成分は、その標的部位が、アクセス可能な領域にあるかどうかに関係なく細胞のクロマチンに結合し得る。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームのＤＮＡに結合し得る。「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインのこの型の例は、特定のストロイドレセプターおよび肝細胞核因子−３（ＨＮＦ３）において見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙら，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：２６１−２７０；Ｐｉｎａら，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：７１９−７３１；およびＣｉｒｉｌｌｏら，（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２４４−２５４。
【０１５７】
融合化ＤＮＡ結合ドメインの長所によって特定の配列に標的化された、１つ以上の機能的ドメインを使用する遺伝子制御の方法は、遺伝子発現のモジュレーションを達成し得る。遺伝子発現のモジュレーションは、低下した発現の形態であり得る（例えば、抑制）。この場合において、分子標的の発現が、ＺＦＰによって抑制されている細胞における細胞内の性質の価値は、しばしば、分子標的に指向される抑圧的なＺＦＰを発現しない細胞における性質の価値よりも低い。本明細書中に記載されるように、特定の標的遺伝子の抑制は、ジンクフィンガータンパク質および機能的ドメインを含む融合分子を使用することによって達成され得る。
【０１５８】
あるいは、分子標的をコードする遺伝子の活性化が、分子標的と化合物との相互作用を試験するために必要である場合、モジュレーションは、増大した遺伝子発現、または活性化の形態であり得る。この機能的ドメイン（例えば、インシュレイタードメイン、活性化ドメインなど）は、標的遺伝子の発現を増大および／または維持することを可能にする。分子標的の発現が、ＺＦＰによって増大される細胞内における細胞内の性質の価値は、しばしば、分子標的に指向される活性ＺＦＰを発現しない細胞における細胞内の性質の価値よりも高い。
【０１５９】
いくつかの細胞は、誘導性プロモーターに操作可能に連結されるジンクフィンガータンパク質をコードする配列を発現するように設計される。種々の誘導性プロモーターは、利用可能であり；誘導性プロモーターの多くは、低分子または他の環境因子（例えば、温度および栄養状態のような）によって制御され得る。誘導性プロモーターとの操作可能な連結は、ＺＦＰの活性化、そしてそれによってＺＦＰによる分子標的の発現のモジュレーションが、適切な低分子を細胞に供給することまたは刺激を誘導することによって制御されることを可能にする。誘導性プロモーターによるＺＦＰの発現の制御は、細胞に対して致死性を生じる持続性の過剰発現または過少発現下を有する分子標的の発現の一過性のモジュレーションを達成するのに有用である。誘導性発現はまた、分子標的のモジュレーションに帰する二次的な効果を軽減する利点がある。例えば、１つの細胞のタンパク質の発現のモジュレーションは、細胞内の多くの他のタンパク質（および他の分子）の相対的な量の変化を直接的にかまたは間接的に生じ得る。アッセイを実施する直前にジンクフィンガータンパク質の発現を誘導することによって、このような二次的な変化は最小化される。従って、制御された分子標的を含む試験細胞とコントロール細胞との間での応答の差異は、標的の制御によって起きる二次的な効果よりも化合物と分子標的との間の相互作用に全面的にかまたは実質的に全面的に帰する。
【０１６０】
（Ｃ．細胞に基づくアッセイ）１つの局面において、他の従来的な方法に共通した偽陽性の発生率を減少する、細胞に基づく薬物スクリーニングアッセイを行う方法が記載される。偽陽性は、例えば、化合物が、内因性の標的と相互作用しないが、代替のメカニズムによって同一または類似の効果を達成する場合に起こる。
【０１６１】
本方法において、好ましくは、少なくとも１つの分子標的（例えば、タンパク質標的または分子標的の発現を調節するタンパク質）の発現レベルのみが異なる一致した細胞集団でアッセイを行うことによって、偽陽性は、減少または排除される。代表的には、コントロール細胞集団は、特定の細胞型および環境（例えば、培養）条件について正常なレベルで分子標的を発現する。試験細胞集団は、コントロール集団と比較して変化したレベル（より高いか、またはより低いかのいずれか）で、分子標的を発現する。分子標的の変化した発現レベルは、標的分子の発現を調節するように作用するＺＦＰ分子またはＺＦＰ融合分子によって達成される。標的分子の発現は、例えば、ＺＦＰ分子またはＺＦＰ融合分子が、分子標的をコードする遺伝子の転写を調節する場合のように、直接的に調節され得る。あるいは、標的分子の発現の間接的な調節は、ＺＦＰ分子またはＺＦＰ融合分子が、標的分子の合成、安定性または調節に関連する遺伝子の発現を調節する場合に生じる。間接的な調節は、分子標的がタンパク質ではない場合に生じ得るが、タンパク質分子標的の間接的な調節もまた可能である。
【０１６２】
１つの実施形態において、分子標的は、試験細胞で過剰発現される。化合物は、試験細胞集団において、例えば、分子標的との相互作用を測定（定量的にまたは定性的に）する１以上のアッセイを使用して、過剰発現された分子標的と相互作用する能力についてスクリーニングされる。同一の化合物がまた、コントロール集団においてもスクリーニングされ、そして分子標的と相互作用するその能力がまた、試験細胞集団で使用されたアッセイを使用して決定される。化合物が、これらの２つの細胞集団において同様な応答を惹起する場合、その化合物は、分子標的との相互作用を介してその効果を発揮しないようである。逆に、化合物が、これらの２つの細胞集団において異なる応答を惹起する場合、その化合物は、分子標的と相互作用（例えば、直接的にまたは間接的に）するようである。一般的に、分子標的が、試験細胞で過剰発現される場合、応答の程度は、コントロール細胞においてよりも試験細胞において大きい。従って、標的と相互作用することが予期される化合物が、コントロール細胞よりも試験細胞に対してより大きな効果を発揮する場合、この化合物は、意図された標的を介してその効果を発揮しているようである。しかし、特定の場合において、例えば、分子標的が、応答に関連する細胞成分を抑制する場合、応答の程度は、分子標的を過剰発現している試験細胞においてより小さくあり得る。
【０１６３】
特定の実施形態において、試験細胞およびコントロール細胞は、この試験細胞が、コントロール細胞において発現される薬物スクリーニングのための分子標的を発現しないかまたは減少したレベルで発現するという点で異なる。標的と相互作用することが予期される化合物が、コントロール細胞および試験細胞に同様の効果を発揮する場合、この化合物は、意図された分子標的相互作用を介してその効果を発揮しない。コントロール細胞で発現されるよりも低いレベルで分子標的を発現する試験細胞について、分子標的と相互作用する化合物は、一般的に、コントロール細胞においてよりも試験細胞においてより小さな効果を有する。
【０１６４】
他の実施形態において、試験細胞およびコントロール細胞は、コントロール細胞が、構造的に分子標的と類似でありかつ分子標的を介する誘導により生じる細胞応答と同様の細胞応答を誘導し得るタンパク質を発現しないかまたは減少したレベルで発現するという点で異なる。標的と相互作用することが予期される化合物が、コントロール細胞および試験細胞に異なる効果を発揮する場合、その化合物は、意図された分子標的相互作用を介してその効果を発揮しない。
【０１６５】
試験細胞は、好ましくは、ジンクフィンガータンパク質または本明細書中で記載される融合分子で細胞遺伝子を調節することにより生成される。いくつかの方法において、試験細胞は、内因性分子標的の発現を抑制するように設計された外因性ジンクフィンガータンパク質（または融合分子）を発現するように細胞を操作することによって生成される。代替的な方法において、試験細胞は、内因性分子標的の発現を活性化または増加するように設計された外因性ジンクフィンガータンパク質（または融合分子）を発現するように細胞を操作することによって生成される。生じる試験細胞は、好ましくは、外因性ジンクフィンガー含有タンパク質をコードする外因性核酸（そして、おそらく、環境因子に起因するランダム変異の低い発生率）を除いて、対応するコントロール細胞と実質的に同一である。従って、特定の実施形態において、試験細胞集団およびコントロール細胞集団の表現型は、外因性ジンクフィンガー含有分子による調節（および、このタンパク質の調節に起因する他の二次的変化）に供されるタンパク質のレベルに関してのみ異なる。他の実施形態において、試験細胞およびコントロール細胞は、実質的に同一でなくともよいが、これらの場合において、遺伝的相違（任意の外因性ＺＦＰコードポリヌクレオチドに加えて）が、代表的に既知である。
【０１６６】
本願方法において使用されるコントロール細胞および試験細胞は、個々の細胞または細胞集団であり得、後者がより一般的である。細胞型は、細胞株または天然の（例えば、単離された）細胞（例えば、一次細胞）であり得る。細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能であるか、または例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４）、およびこの中に列挙された参考文献に記載されるように当該分野で公知の方法によって、生成され得る。類似の細胞は、当該分野で公知の方法によって単離され得る。細胞型の他の非限定的な例として、病理を有するか、または病理に供された細胞（例えば、癌性細胞および形質転換細胞）、病原体で感染させた細胞、幹細胞、完全分化細胞、部分的分化細胞、不死化細胞などが挙げられる。原核生物（例えば、細菌）および真核生物（例えば、酵母、植物、真菌、魚類および哺乳動物細胞（例えば、ネコ、イヌ、マウス、ウシ、ブタおよびヒト）の両方の細胞が使用され得、真核細胞が好ましい。哺乳動物（ヒトおよび非ヒト）細胞型が、特に好ましい。古細菌細胞もまた使用され得る。細胞型の選択は、試験される薬物の意図されたレシピエントに一部依存する。例えば、ヒト細胞型は、ヒトでの使用を意図された薬物をスクリーニングするために有利であり、そしてネコ細胞型は、ネコでの使用を意図された薬物をスクリーニングするために有利である。
【０１６７】
適切な哺乳動物細胞株として、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＰ−Ｇ２細胞、ＢａＦ−３細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現するサル腎臓細胞）、ＣＶ−１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞およびＨｅＬａ細胞、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９を参照のこと）、ならびにＳＰ２またはＮＳ０のような骨髄腫細胞（例えば、ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３〜４６を参照のこと）が挙げられる。他の真核生物細胞として、例えば、昆虫（例えば、ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、真菌細胞（酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を含む）、および植物細胞（Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：４８６〜４９６を参照のこと）が挙げられる。細菌細胞型として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられる。
【０１６８】
細胞は、ＺＦＰまたは融合分子（またはＺＦＰまたは融合分子をコードするポリヌクレオチド）で一過的にかまたは安定にトランスフェクトまたは形質転換され得る。細胞をトランスフェクトする方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）に記載される。実施例１１は、２９３細胞を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を活性化するＺＦＰをコードする核酸分子で安定にトランスフェクトし得る方法を示す。
【０１６９】
さらに、上記のように、ジンクフィンガータンパク質は、実質的に任意の細胞遺伝子の発現を抑制または活性化するように設計され得る。従って、ＺＦＰおよびＺＦＰ融合体は、意図された分子標的に構造的に関連するタンパク質の発現を抑制するか、または細胞に基くＨＴＳアッセイに適切な細胞を生成するために分子標的を過剰発現するように設計され得る。
【０１７０】
薬物発見のための細胞に基くアッセイについて、ジンクフィンガー含有細胞を適用する際に、多くの方法を使用し得る。試験細胞集団およびコントロール細胞集団を、例えば、２つの異なる容器に入れ得る。候補化合物の溶液を連続して両容器に添加し得、そして各細胞集団について細胞の特性を定量および／または観察し得る。それぞれの細胞集団についての細胞特性の値の間に有意差（すなわち、実験誤差の範囲外）が存在する場合、この候補化合物をこのアッセイにおける「ヒット」であると決定する。
【０１７１】
別の方法は、最初にコントロール細胞集団と候補化合物を接触する工程、および特定の細胞応答を測定する工程を包含する。この応答の値は、アッセイについてのベースライン尺度として役立つ。次いで、試験細胞集団を候補化合物と接触させ、そして同一の細胞応答を測定する。２つの応答について統計学的に異なる値は、この化合物が「ヒット」であること；これが、実質的に分子標的と相互作用することを示す。この方法は、順序が逆であっても行われ得、その場合、最初に試験細胞集団をアッセイする。
【０１７２】
他の方法において、ジンクフィンガータンパク質を使用して、試験細胞における分子標的の発現を増強する。このような試験細胞は、必要に応じて、コントロール細胞（ここで、この標的は、正常なレベルで発現される）か、または他の試験細胞（ここで、この標的は正常以下のレベルで発現される）と組み合わせて使用され得る。あるいは、分子標的の発現が、増強されている試験細胞を、コントロール細胞との比較なしで使用し得る。例えば、化合物の存在下および非存在下で、細胞応答を測定する分析を行い得る。
【０１７３】
いくつかの方法において、試験細胞およびコントロール細胞における細胞応答の分析は、並行して行われる。他の方法において、試験細胞における細胞応答の分析は、ヒストリカル（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロールと比較される。いくつかの方法において、化合物の存在下での試験細胞またはコントロール細胞のいずれかにおける細胞応答が、化合物の非存在下での同様の細胞応答と比較される。
【０１７４】
細胞の実質的に任意の成分が、薬物スクリーニングのための分子標的として役立ち得る。代表的には、分子標的はポリペプチドである。目的の分子標的の非限定的な例として、増殖因子レセプター（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ，ＥＦＧ、ＮＧＦＲ，およびＶＥＧＦ）が挙げられる。他の標的は、Ｇタンパク質レセプターであり、Ｋ物質レセプター、アンギオテンシンレセプター、αおよびβアドレナリン作用性レセプター、セロトニンレセプター、およびＰＡＦレセプターが挙げられる。例えば、Ｇｉｌｍａｎ、Ａｎｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６２５〜６４９（１９８７）を参照のこと。他の標的として、イオンチャネル（例えば、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル）、ムスカリン性レセプター、アセチルコリンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、グルタミン酸レセプター、およびドーパミンレセプター（Ｈａｒｐｏｌｄ、５，４０１，６２９号、および米国特許第５，４３６，１２８号を参照のこと）が挙げられる。他の標的は、接着タンパク質（例えば、インテグリン、セレクチン、および免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー）である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５〜４３３（１９９０）；Ｏｓｂｏｒｎ、Ｃｅｌｌ ６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ ６９：１１（１９９２）を参照のこと）。他の標的は、サイトカイン（例えば、インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ１３）、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ ＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌら編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１を参照のこと。他の標的は、ホルモン、酵素、ならびに細胞内メッセンジャーおよび細胞間メッセンジャー（例えば、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ）、ならびにホスホリパーゼＣ、核内レセプター（例えば、ＦＸＲ（ファルネソールＸレセプター（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））、ならびにＲＺＲ（レチノイドＺレセプター（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｚ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））、ならびにオルガネラレセプターである。標的分子は、ヒト、哺乳動物、ウイルス、植物、真菌、または細菌であり得る。他の標的は、抗原（例えば、微生物病原体（ウイルスおよび細菌の両方）由来ならびに腫瘍体由来のタンパク質、糖タンパク質、および炭水化物、）である。なお他の標的が、米国特許第４，３６６，２４１号に記載される。標的との相互作用についてスクリーニングされるいくつかの化合物は、ほとんど標的と結合しない。他の化合物は、標的をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズする。
【０１７５】
いくつかの方法において、化合物は、個々にスクリーニングされる。他の方法において、多くの化合物は、並行してスクリーニングされる。マイクロタイタープレートおよびロボット利用は、多くの化合物の並行的なスクリーニングに特に有用である。光学的検出がまた、迅速性および自動化について好ましい。数百、数千または数百万もの化合物が、１週間でスクリーニングされ得る。
【０１７６】
本発明の方法を使用して、一旦「ヒット」が同定されると、その化合物の誘導体が、作製され、その分子標的と相互作用する能力を最大化され得る。誘導体は、従来技術（例えば、自己一致領域（ＳＣＦ）分析（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｆｉｅｌｄ（ＳＣＦ） ａｎａｌｙｓｉｓ）、立体配置相互作用（ＣＩ）分析、および正規モード動力学分析）を使用して作製され得る。これらの技術を実行するためのコンピュータプログラムが、容易に入手可能である。例えば、Ｒｅｉｎら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆＲｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）を参照のこと。化合物誘導体を、細胞に基づくアッセイにおけるスクリーニングに供し、分子標的と最良の相互作用プロフィールを示す化合物を選択する。
【０１７７】
他の実施形態において、細胞が操作され、その結果、レセプター系が、分子標的を介してシグナル伝達に作動可能に関連付けられる。レセプター発現が、転写産物または翻訳産物の形成を検出することによって直接的に検出され得る。例えば、転写産物は、ＲＮＡ（ノーザン）ブロットを使用して検出され得、特定のタンパク質の形成は、特徴的な株を用いるか、またはタンパク質固有の特徴を検出することによって検出され得る。しかし、より代表的には、レセプターの発現は、レセプター活性の結果として形成される産物を検出することによって決定される。
【０１７８】
従って、細胞に基づくスクリーニングアッセイが実施され得る。ここでは、ＺＦＰが、陰性シグナル（例えば、シグナル伝達カスケードにおける事象の遮断の結果としてのＺＦＰ制御抑制からのリポーターまたは選択可能なマーカーの放出）に対する陽性応答（例えば、リポーターおよび／または選択可能なマーカーの活性化）を媒介する。例えば、化合物の既知のシグナル伝達カスケードへの影響について化合物をスクリーニングするために、この化合物は、特定のシグナル伝達カスケードに関連する標的を発現することが既知の細胞に投与される。特定の実施形態において、標的は、細胞表面または膜に結合したレセプターであり、その結果、この化合物は、細胞膜または細胞壁を横切る必要はない。他の実施形態において、この標的は、シグナル伝達カスケードの細胞内成分であり、従って、この化合物はまた、当該分野で公知であり、そして本明細書中で記載された方法を用いて細胞に直接投与され得る。
【０１７９】
代表的には、これらの陽性応答アッセイにおいて、試験細胞は（１）外因性ジンクフィンガータンパク質および機能的ドメイン（例えば、抑制ドメイン）を含む融合分子をコードするポリヌクレオチドならびに（２）リポーターおよび／または選択可能な分子（例えば、緑色蛍光タンパク質、薬物耐性など）をコードするポリヌクレオチドを含む。融合分子をコードするポリヌクレオチドは、目的のシグナル伝達カスケードに応答性の転写制御エレメントに作動可能に連結される。機能的ドメインが、抑制ドメインである実施形態において、融合分子は、発現される場合に、リポーター分子の発現を抑制するように設計される。従って、シグナル伝達カスケードが機能している場合、融合分子が発現され、次いでこれは、リポーター分子の発現を抑制するのに役立つ。試験化合物が、例えば、融合分子の転写を調節する制御エレメントに直接的または間接的に作用するシグナル伝達経路の成分をブロックすることによって、抑制性融合分子の発現を阻害する場合、リポーター分子発現の抑制が減少し、そして増加したレベルのリポーター発現が観察される。従って、任意の化合物は、リポーターレベルをモニタリングするか、またはＺＦＰによってリポーター（例えば、選択可能マーカー）分子の調節をモニターするための陽性および／または陰性選択を使用することによって、シグナル伝達カスケードを阻害する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１８０】
本明細書中に記載された任意の方法が、任意のリポーターおよび／または選択可能マーカーと共に使用され得る。直接検出され得るリポーターとして、蛍光分子（例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。蛍光は、市販の種々の蛍光検出システム（例えば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）システムを含む）を使用して検出される。他のリポーターは、検出可能な産物の形成を触媒する酵素である。適切な酵素として、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、糖加水分解酵素、およびエステラーゼが挙げられる。酵素をコードする適切なリポーター遺伝子の例として、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４〜８６９）、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（例えば、Ｔｏｈら（１９８０）Ｄｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１〜２３８；およびＨａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）が挙げられる。
【０１８１】
選択可能マーカーはまたサブセットまたはリポーター分子を形成し、そしてまた上記の直接検出可能なリポーターの代わりに、またはそれに加えて使用され得る。陽性選択マーカーは、この遺伝子を保有し、そして発現する細胞のみが特定の条件下で生存および／または増殖するのを可能にする産物をコードするポリヌクレオチドである。例えば、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に耐性であるが、Ｎｅｏｒを発現しない細胞は、Ｇ４１８によって死滅（ｓｋｉｌｌｅｄ）させられる。陽性選択マーカーの他の例として、ハイグロマイシン耐性、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性などが挙げられ、これらは、当業者に公知である。陰性選択マーカーは、この遺伝子を保有し、そして発現する細胞のみが、特定の条件下で死滅させられるのを可能にする産物をコードするポリヌクレオチドである。例えば、チミジンキナーゼ（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ＨＳＶ−ＴＫ）を発現する細胞は、ガンシクロビルが添加される場合に死滅する。他の陰性選択マーカーが、当業者に公知である。選択マーカーは導入遺伝子である必要はなく、そしてさらにリポーターと選択可能マーカーは、種々の組み合わせで使用され得る。
【０１８２】
（Ｄ．生化学的アッセイ）生化学的薬物スクリーニングアッセイを行う方法もまた本明細書中で記載される。特定のレセプターに影響する薬物を試験するための重要な生化学的アッセイは、目的のレセプターを含む細胞膜の単離および候補化合物の結合についての試験を含む。従って、細胞膜に結合する特定のタンパク質（例えば、レセプター）を過剰発現する細胞は、これらのタンパク質の発現を活性化するジンクフィンガータンパク質を使用して容易に生成され得る。引き続いて、目的のタンパク質を過剰発現する細胞の膜は、アッセイ（例えば、結合アッセイ）における使用のために容易に単離され得る。
【０１８３】
（Ｅ．化合物および細胞特性）本明細書中で記載された方法は、広範で多様な化合物のスクリーニングにおいて有用である。例えば、本方法でスクリーニングされる化合物は、ペプチドまたは低分子、ホルモン、増殖因子、およびサイトカインのコンビナトリアルライブラリー由来であり得るか、天然に生じる分子であり得るか、または製薬産業で合成される化合物の既存のレパートリー由来であり得る。コンビナトリアルライブラリーは、ステップバイステップ様式で合成され得る多くの型の化合物について作製され得る。このような化合物として、例えば、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、核酸、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換グリシンおよびオリゴカルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ９５／１２６０８、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ９３／０６１２１、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＷＯ９４／０８０５１、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、ＷＯ９５／３５５０３、およびＳｃｒｉｐｐｓ、ＷＯ９５／３０６４２に記載されるコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築され得る。ペプチドライブラリーもまた、ファージディスプレイ法によって作製され得る。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ９１／１８９８０を参照のこと。スクリーニングされる化合物はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手し得る。既知の効果を有する既存の化合物または薬物をまたスクリーニングして、副作用および／またはさらなる指標を評価し得る。
【０１８４】
さらに、種々の細胞および／または生化学的応答（細胞特性とも呼ばれる）が、測定され得、そして本明細書中で記載される方法において比較され得る。いくつかの方法において、細胞特性の値は、細胞増殖、新生血管形成、ホルモン放出、ｐＨ変化、細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ＧＭＰ）の変化、レセプターとの結合などの関数として測定される。
【０１８５】
別の実施形態において、化合物の投与に対する細胞の応答が、細胞特性の値として正常に定量される。値の単位は、特性に依存する。例えば、この単位は、吸光度、光子計数、放射活性粒子計数または光学密度であり得る。
【０１８６】
（分子の送達）分子標的が細胞内に存在する場合、分子と相互作用する化合物は、細胞膜を横断しなければならない。細胞と接触する化合物は、多くの手段で細胞膜を通過し得る。化合物が適切なサイズおよび適切な電荷特性を有する場合、化合物は、受動的に膜を横切って輸送され得る。膜通過の他のプロセスとして、能動輸送（例えば、レセプター媒介輸送）、エンドサイトーシスおよびピノサイトーシスが挙げられる。化合物が前述の任意の方法によって効率的に輸送され得ない場合、微量注入、微粒子銃、または他の方法を使用して細胞内部に化合物を送達し得る。あるいは、スクリーニングされる化合物がタンパク質である場合、タンパク質をコードする核酸が細胞内に導入され、そして細胞内で発現され得る。
【０１８７】
同様に、細胞内の調節をもたらす外因性ジンクフィンガータンパク質は、細胞内に導入されなければならない。代表的には、このことは、ＺＦＰ分子またはＺＦＰをコードする核酸のいずれかを、細胞内においてジンクフィンガータンパク質の発現をもたらす細胞に導入することによって達成される。核酸は、ウイルスに基づく方法、化学的方法、リポフェクションおよび微量注入を含む従来の手段によって導入され得る。導入された核酸は、宿主染色体に組み込まれ得るか、エピソーム形態で存続し得るか、または細胞質中で一過的に存在し得る。同様に、外因性タンパク質は、タンパク質の形態で細胞に導入され得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、リポフェクション、微粒子銃、もしくは微量注入によってか、または膜トランスロケーションドメインへの融合を介して導入され得る。
【０１８８】
従って、本明細書中で記載される組成物は、インビトロまたはインビボで標的細胞に提供され得る。さらに、この組成物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせとして提供され得る。
【０１８９】
（Ａ．ポリヌクレオチドの送達）特定の実施形態において、この組成物は、１つ以上のポリヌクレオチドとして提供される。さらに、上記のように、ジンクフィンガータンパク質含有組成物は、ポリペプチドのジンクフィンガーと機能的ドメイン（これは、融合核酸によってコードされる）との間の融合体として設計され得る。融合体および非融合体の両方の場合において、この核酸は、複製および／または発現のための原核生物細胞または真核生物細胞への形質転換のための中間ベクターにクローニングされ得る。核酸の貯蔵もしくは操作またはタンパク質の産生のための中間ベクターは、例えば、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）、シャトルベクター、昆虫ベクター、またはウイルスベクターであり得る。ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸はまた、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞、植物細胞、または魚細胞または哺乳動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）のような動物細胞への投与のための、発現ベクターにクローニングされ得る。
【０１９０】
クローニングされた核酸の発現を得るために、代表的に、核酸は、転写を指向するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌および真核生物プロモーターは、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９９０）において記載されている。細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５）。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた、例えば、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡおよびＣｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから市販されている。
【０１９１】
選択した核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強力な構成性プロモーターは、代表的に、発現および精製のために使用される。対照的に、タンパク質が、インビボで使用される場合、構成性または誘導性プロモーターのいずれかが使用され、これは、タンパク質の特定の用途に依存する。さらに、ＨＳＶ ＴＫまたは同様の活性を有するプロモーターのような弱いプロモーターが使用され得る。代表的に、これらのプロモーターはまた、トランス活性化に応答性であるエレメント（例えば、低酸素応答性エレメント、Ｇａｌ４応答性エレメント、ｌａｃリプレッサー応答性エレメント、ならびにｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系のような低分子制御系）を含み得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｇｉｎｏら（１９９８）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：４９１−４９６；Ｗａｎｇら（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８８：１１４７−１１５５；およびＲｅｎｄａｈｌら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１を参照のこと）。
【０１９２】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、宿主細胞（原核生物または真核生物のいずれか）における核酸の発現のために必要なさらなるエレメントを含む転写単位、または発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは、例えば、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および、例えば、転写産物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合、および／または翻訳終結に必要なシグナルを含む。このカセットのさらなるエレメントは、例えば、エンハンサー、および異種のスプライスされるイントロンシグナルを含み得る。
【０１９３】
遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、得られたＺＦＰポリペプチドの意図される用途（例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物類などにおける発現）に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄのようなプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺのような市販の融合発現系が挙げられる。エピトープタグはまた、組換えタンパク質に付加され、発現のモニタリングならびに細胞および細胞以下の局在化のモニタリングのための、単離の慣例的な方法（例えば、ｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧ）を提供する。
【０１９４】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントは、しばしば真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現に効果的であると示される他のプロモーターの指向下で、タンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１９５】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼのような、安定してトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカーを有する。昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターのような高収率発現系はまた、ポリへドリンプロモーターまたは任意の他の強力なバキュロウイルスプロモーターの転写制御下で、本明細書中に記載されるように、ＺＦＰをコードする核酸配列に適している。
【０１９６】
代表的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ（または、原核生物宿主、Ｅ．ｃｏｌｉ以外の場合）において機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）、および組換え配列の挿入を可能にするベクターの非必須な領域における特殊な制限部位を含む。
【０１９７】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、所望であれば標準的な技術を使用して精製され得る大量のジンクフィンガータンパク質を発現する、細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株、昆虫細胞株、または他の細胞株を作製し得る（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２；およびＧｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編）１９９０年を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行なわれる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編）を参照のこと）。
【０１９８】
外来のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための任意の手順が使用され得る。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、脂質媒介性送達（例えば、リポソーム）、微小注入、微粒子銃、裸のＤＮＡの導入、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソームおよび組込みの両方）およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来の遺伝物質を宿主細胞に導入するための周知の他の方法のいずれかの使用が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順は、選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾良く導入し得ることのみが必要である。
【０１９９】
慣習的なウイルスおよび非ウイルスベースの核酸送達方法を使用して、核酸を宿主細胞または標識組織に導入し得る。このような方法を使用して、核酸をインビトロで細胞に投与し得る。さらに、核酸は、インビボまたはエキソビボで投与される。非ウイルス送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後、エピソームまたは組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。核酸送達手順の総説としては、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３；Ｎａｂｅｌら（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：２１１−２１７；Ｍｉｔａｎｉら（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１６２−１６６；Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１６７−１７５；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４；Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６；Ｋｒｅｍｅｒら（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ（編）、１９９５年；ならびにＹｕら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６を参照のこと。
【０２００】
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、微小注入、バリスティックス（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増強性のＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、そして、リポフェクション試薬が市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適切な陽イオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。核酸は、細胞（インビトロもしくはエキソビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に送達され得る。
【０２０１】
脂質：核酸複合体（免疫脂質複合体のような標的化されたリポソームを含む）の調製は、当業者に周知である。例えば、Ｃｒｙａｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０；Ｂｌａｅｓｅら（１９９５）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７；Ｂｅｈｒら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９；Ｒｅｍｙら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４；Ｇａｏら（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２；Ａｈｍａｄら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０；ならびに米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９４６，７８７号を参照のこと。
【０２０２】
核酸の送達のためのＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、身体中の特定の細胞にウイルスを標的化するため、そしてウイルス荷重（ｐａｙｌｏａｄ）を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、直接被験体に投与され得るか（インビトロ）またはそれらを使用して、インビトロもしくはエキソビボで細胞を処置し得る。ＺＦＰの送達のための慣例的なウイルスベースの系としては、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびヘルペスウイルスベクターの系が挙げられる。宿主ゲノムにおける組込みは、特定のウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を含む）で可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる。さらに、高い形質転換効率が、多数の異なった細胞型および標的組織において観察される。
【０２０３】
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を取り込むことによって変更され得、潜在的な標的細胞集団の変更および／または増殖を可能にする。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染し得るレトロウイルスベクターであり、そして、代表的に高いウイルス力価を生成する。従って、レトロウイルス核酸送達系の選択は、標的細胞および／または組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有し、そして、シス作用性の長い末端配列（ＬＴＲ）から構成される。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、これらを使用して、外因性遺伝子を標的細胞に組込み、永続的な導入遺伝子発現を提供する。広範に使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づいたベクターが挙げられる（Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４；およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００）。ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されるレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５；Ｋｏｈｎら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２；Ｍａｌｅｃｈら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４；１２１３３−１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０）。５０％以上の形質転換効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージ化ベクターについて観察された（Ｅｌｌｅｍら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０；Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２）。
【０２０４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをまた使用して、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、そして、インビボおよびエキソビボ適用のために、標的核酸で細胞を形質導入する。例えば、Ｗｅｓｔら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７９３−８０１；およびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物において記載され、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８が挙げられる。
【０２０５】
欠損性および非病原性パルボウイルス属２型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−２）に基づいた組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、有望な核酸送達系である。例示的なＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端反復を含むプラスミドに由来する。核酸の効率的な移入および形質導入された細胞のゲノムへの組込みに起因する安定した導入遺伝子送達は、このベクター系についての重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ ３５１（９１１７）：１７０２−３；およびＫｅａｒｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−７５５）。
【０２０６】
一過的な発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系が有用である。アデノウイルスベースのベクターは、多数の細胞型において非常に高い効率で形質導入し得、そして、感染し得、従って、分裂細胞および非分裂細胞の両方に核酸を送達する。このようなベクターを用いて、高い力価および高い発現レベルが得られた。アデノウイルスベクターは、比較的単純な系で大量に生成され得る。
【０２０７】
複製欠損組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターは、高い力価で生成され得、そして、それらは、容易に多数の異なった細胞型に感染する。大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、Ａｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され；複製欠損ベクターは、トランスで必要なＥ１機能を提供するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベクターは、インビボで多数の型の組織（肝臓、腎臓および筋肉において見出されるような非分裂の分化した細胞を含む）を形質導入し得る。慣例的なＡｄベクターは、挿入されたＤＮＡについて大規模な保有能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの用途の例としては、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療が挙げられる（Ｓｔｅｒｍａｎら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９）。核酸送達のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：５−１０；Ｓｔｅｒｍａｎら、前出；Ｗｅｌｓｈら（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−２１８；Ａｌｖａｒｅｚら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３；およびＴｏｐｆら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３が挙げられる。
【０２０８】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、２９３細胞（これは、アデノウイルスをパッケージ化する）、およびΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞（これは、レトロウイルスをパッケージ化する）が挙げられる。核酸送達において使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージ化する産生細胞株によって、産生される。これらのベクターは、代表的に、パッケージングおよび引き続く宿主細胞への組込みに必要な最小限のウイルス配列、発現されるタンパク質の発現カセットによって置換される他のウイルス配列を含む。ウイルス機能を失うことは、必要な場合、細胞株をパッケージングすることによって、トランスで提供される。例えば、核酸送達において使用されるＡＡＶベクターは、代表的に、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを保有し、これは、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要である。ウイルスＤＮＡは、細胞株にパッケージ化され、この細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む。この細胞株はまた、ヘルパーとして、アデノウイルスで感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、有意な量でパッケージ化されない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスを優先的に不活化する熱処理によって減少され得る。
【０２０９】
多数の核酸送達適用において、ベクターは、特定の組織型に対して高度の特異性を有して送達されることが望ましい。ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として、リガンドを発現することによって、所定の細胞について特異性を有するように改変され得る。このリガンドは、目的の細胞型に存在することが知られているレセプターに親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）を発現するように改変され得、そして、組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよびレセプターを発現する標的細胞の他の組み合わせに広げられ得る。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選択された細胞レセプターについて特異的結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用するが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用され得る。このようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを助けると考えられている特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０２１０】
ベクターは、以下に記載のように、被験体への投与によって、代表的には、全身投与（例えば、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または頭蓋内注射）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、インビトロまたはエキソビボで細胞（例えば、被験体から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検））に送達され得る。
【０２１１】
１つの実施形態において、造血幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび核酸送達のためのインビトロ手順において使用される。幹細胞を使用することに対する利点は、それらが、インビトロで他の細胞型に分化し得ることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなサイトカインを使用する、インビトロでＣＤ３４＋幹細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法は、公知である（Ｉｎａｂａら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２）。
【０２１２】
幹細胞は、公知の方法を使用して、形質転換および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、不必要な細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞））に結合する抗体を用いて、骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、前出、を参照のこと）。
【０２１３】
（Ｂ．ポリペプチドの送達）他の実施形態において、ＺＦＰまたはＺＦＰ融合タンパク質は、直接標的細胞に投与される。特定のインビトロ内容物において、標的細胞は、１つ以上のＺＦＰに融合された機能的ドメインを含む１つ以上の融合タンパク質を含む培地中で培養される。
【０２１４】
ポリペプチド化合物の投与における重要な要因は、ポリペプチドが、細胞の原形質膜または核のような細胞内区画の膜を横断する能力を有することを保証することである。細胞膜は、小さい非イオン性の親油性化合物に対して自由に浸透可能であり、そして、極性化合物、マクロ分子、および治療薬剤または診断薬剤に対して固有に非浸透性である、脂質−タンパク質の２層から構成される。しかし、細胞膜を横切るポリペプチドを転位する能力を有する、タンパク質、脂質および他の化合物が記載される。
【０２１５】
例えば、「膜転位ポリペプチド」は、膜転移キャリアとして作用する能力を有する両親媒性または疎水性のアミノ酸のサブ配列を有する。１つの実施形態において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切って転移する能力を有する。ホメオドメインタンパク質（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）の最も短い内部移行可能なペプチドは、タンパク質の第３のヘリックス（アミノ酸４３〜５８位に由来する）であることが見出された（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９−６３４）。別のサブ配列（シグナルペプチドのｈ（疎水性）ドメイン）が、同様の細胞膜転移特徴を有することが見出された（Ｌｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５−１４２５８）。
【０２１６】
細胞へのその取り込みを促進するためのジンクフィンガーポリペプチド（またはこれを含む融合体）に連結され得るペプチド配列の例としては、以下を含むがこれらに限定されない：ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸ペプチド；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４〜１０３に対応する２０残基ペプチド配列（Ｆａｈｒａｅｕｓら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：８４）；Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａの長さ６０アミノ酸のホメオドメインの第３のヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４）；シグナルペプチドのｈ領域（例えば、カポージ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域（Ｌｉｎら、前出））；およびＨＳＶ由来のＶＰ２２転移ドメイン（Ｅｌｌｉｏｔら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３）。強化された細胞性取り込みを提供する他の適切な化学部位はまた、ＺＦＰに共有結合または非共有結合のいずれかで結合され得る。
【０２１７】
毒素分子はまた、細胞膜を横切ってポリペプチドを輸送する能力を有する。しばしば、このような分子（「バイナリー毒素」と呼ばれる）は、少なくとも２つの部分から構成される：転移または結合ドメインおよび別々の毒素ドメイン。代表的に、転移ドメイン（これは、必要に応じて、ポリペプチドであり得る）は、細胞レセプターに結合し、細胞への毒素の輸送を容易にする。いくつかの細菌毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ微小毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ毒素、および百日咳アデニルシクラーゼ（ＣＹＡ）を含む）を使用して、内部融合体またはアミノ末端融合体として、細胞細胞質へペプチドを送達する（Ａｒｏｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３３４−３３４１；Ｐｅｒｅｌｌｅら（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：５１４７−５１５６；Ｓｔｅｎｍａｒｋら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１３：１０２５−１０３２；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３５３０−３５３４；Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉら（１９９５）Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５；Ｓｅｂｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８５１−３８５７；Ｋｌｉｍｐｅｌ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０２７７−１０２８１；およびＮｏｖａｋら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６−１７１９３）。
【０２１８】
このようなサブ配列を使用して、細胞膜を横切って、ポリペプチド（本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む）を転移する。これは、例えば、これらの転移配列の１つで、融合ポリペプチドを誘導することによって、または、融合ポリペプチドと転移配列のさらなる融合を形成することによって、達成される。必要に応じて、リンカーを使用して、融合ポリペプチドおよび転移配列に連結し得る。任意の適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）が使用され得る。
【０２１９】
適切なポリペプチドがまた、リポソームおよび免疫リポソームのようなリポソーム誘導体を介して、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞に導入され得る。用語「リポソーム」は、水相をカプセル化する、１つ以上の同心性の向きの脂質の２層から構成される小胞をいう。代表的に、この水相は、細胞に送達される分子を含む。
【０２２０】
リポソームは原形質膜と融合し、それにより、分子を細胞質中に放出する。あるいは、リポソームは貧食されるか、または、輸送小胞体中の細胞に取り込まれる。一旦エンドソームまたは食胞中に入ると、リポソームは、分解されるかまたは輸送小胞体の膜と融合し、そしてその含有物を放出する。
【０２２１】
現在のリポソームを介した薬物送達方法において、リポソームは最終的に透過性になり、そして標的組織または標的細胞でカプセル化された分子を放出する。全身的送達または組織特異的送達にとって、このことは、例えば、リポソームの二重層が、体内の種々の因子の作用を通じて経時的に分解されるような受動的な様式で達成され得る。あるいは、活性な薬物の放出は、リポソームビヒクルにおける透過性の変化を誘導する因子の使用を伴う。リポソーム膜は、リポソーム膜付近の環境が酸性になる場合、不安定になるように構築され得る。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：９０８（１９８９）を参照のこと。例えば、リポソームが標的細胞によってエンドサイトーシスを受ける場合、これらは不安定になり、そして内容物を放出する。この不安定化は、フソジェネシス（ｆｕｓｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれる。ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、多くの「フソジェニック」システムの基本である。
【０２２２】
本明細書中で開示される方法および組成物を用いる使用のために、リポソームは代表的に、本明細書中で開示されるような融合ポリペプチド、脂質構成成分（例えば、中性脂質および／またはカチオン性脂質）を含み、そして必要に応じて、限定の細胞表面レセプターまたはリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体のような、レセプター認識分子を含む。例えば、以下の文献に記載されるような、リポソームを調製するための、種々の方法が利用可能である：米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；同第４，９４６，７８７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７４２４号；Ｓｚｏｋａら（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；Ｄｅａｍｅｒら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９−６３４；Ｆｒａｌｅｙら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８−３３５２；Ｈｏｐｅら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８１２：５５−６５；Ｍａｙｅｒら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１−１６８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４２−２４６；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｏｓｔｒｏ編，１９８３，Ｃｈａｐｔｅｒ １）；Ｈｏｐｅら（１９８６）Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （１９９３）。例えば、適切な方法として、超音波破砕、押し出し、高圧／ホモジェナイゼーション、ミクロ流体化、界面活性剤透析、小リポソームベシクルのカルシウム誘導性融合およびエーテル融合方法が挙げられ、これらの全ては当該分野で周知である。
【０２２３】
特定の実施形態において、特定の細胞型、組織などに特異的な標的化部分を用いてリポソームを標的化することが、望ましくあり得る。種々の標的化部分（例えば、リガンド、レセプター、およびモノクローナル抗体）を用いたリポソームの標的化は、これまでに記載されている。例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと。
【０２２４】
標的化部分の例として、新生物に関連する抗原（例えば、前立腺癌特異的抗原およびＭＡＧＥ）に特異的なモノクローナル抗体が挙げられる。腫瘍細胞もまた、癌遺伝子（例えば、ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ２）の活性化または過剰発現に起因する遺伝子産物を検出することによって標的化され得る。さらに、多くの腫瘍が、胎児組織によって通常は発現される抗原（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児抗原（ＣＥＡ））を発現する。ウイルス感染細胞は、種々のウイルス抗原（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ならびにパピローマウイルス抗原）を用いて標的化され得る。炎症細胞は、炎症部位で発現される表面分子（例えば、インテグリン（例えば、ＶＣＡＭ−１）、セレクチンレセプター（例えば、ＥＬＡＭ−１）など）によって特異的に認識される分子を用いて標的化され得る。
【０２２５】
リポソームに標的化因子をカップリングさせるための標準的な方法が、用いられる。これらの方法は一般に、リポソーム中への脂質成分（例えば、標的化因子の付着のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン）の組込みか、または誘導体化された親油性化合物（例えば、脂質誘導体化ブレオマイシン）の組込みを含む。抗体を標的化したリポソームは、例えば、プロテインＡを組み込んだリポソームを用いて構築され得る。Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３３７−１６３４２およびＬｅｏｎｅｔｔｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４４８−２４５１を参照のこと。
【０２２６】
（キット）上記の方法のいずれかを実施するためのキットもまた、提供される。このキットは代表的に、上記の方法において使用するための細胞またはこのような細胞を作製するための構成成分を含む。例えば、いくつかのキットは、１つの細胞集団が、試験細胞内の分子標的（例えば、タンパク質）の発現を調節するために設計されたジンクフィンガータンパク質をコードする外来核酸を用いて形質転換されている点で相違する、試験細胞およびコントロール細胞の対を含む。いくつかのキットは、１つの細胞型、およびこの細胞型から試験細胞を生成することを可能にする他の構成成分を含む。このような構成成分は、ジンクフィンガータンパク質をコードするベクターかまたはジンクフィンガータンパク質自体を含み得る。このキットはまた、必要な容器、細胞の形質転換のための緩衝液、細胞のための培養培地、および／またはアッセイを実施するための緩衝液を含み得る。代表的に、このキットはまた、この細胞が、化合物をスクリーニングするために用いられるべきことを示す標識を含み得る。標識は、備え付けであるか、そうでなければこのキットの他の構成成分を伴う包装用印刷物または広告用印刷物のような、任意の物質を含む。
【実施例】
【０２２７】
以下の実施例は、例示するために提供されるのであって、いかなる手段においても限定することを意図しない。
【０２２８】
（実施例１）この第１の実施例は、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子のプロモーター内に含まれたＤＮＡ配列を認識するよう設計されたＺＦＰの構築を実証する。ＶＥＧＦは、低酸素症により誘導される内皮細胞特異的マイトジェンであるおよそ４６ｋＤａの糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、癌、種々の網膜症、および他の重篤な疾患に関連する、脈管形成に関連するとみなされてきた。選択したＤＮＡ標的部位は、この遺伝子の転写開始部位の周囲の領域であった。選択した２つの９塩基対（ｂｐ）の部位は、配列
【０２２９】
【化１】
2011147448.tif 000002
（配列番号１）（ここで、大文字は、実際の９塩基標的をあらわす）中に存在することが見出された。上流の９ｂｐ標的を標的化したタンパク質を、ＶＥＧＦ１と命名し、そして下流の９ｂｐ標的を標的化したタンパク質をＶＥＧＦ３ａと命名した。ＶＥＧＦの主要な転写開始部位は、第１の９ｂｐ標的の３’末端におけるＴであり、上記の配列において下線を引いてある。
【０２３０】
ヒトＳＰ−１転写因子を、設計されたＺＦＰの構築のための前駆体分子として使用した。ＳＰ−１は、十分に研究されているマウスＺｉｆ２６８に関連する３フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する（Ｃｈｒｉｓｔｙら、ＰＮＡＳ ８５：７８５７−７８６１（１９８８））。このドメインを用いた部位特異的変異誘発実験は、Ｚｉｆ２６８において作動している提唱された「認識ルール」が、他の標的ＤＮＡ配列にＳＰ−１を適合するために用いられ得ることを示した（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ、ＰＮＡＳ ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））。ジンクフィンガークローンの構築のために用いられたＳＰ−１配列は、ＳＰ−１転写因子のアミノ酸５３３〜６２４に対応する。
【０２３１】
２つの設計されたＺＦＰであるＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａの認識ヘリックスにおけるアミノ酸の選択を、表１に要約する。
【０２３２】
（表１：ＶＥＧＦ−認識ＺＦＰの認識ヘリックスとして選択されたアミノ酸）
【０２３３】
【表１】
2011147448.tif 000003
６つの重複オリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲベースの構築手順を用いて、これらのペプチドを発現させるために、コード配列を構築した。これらのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックス間のＤＮＡ結合ドメインの一部をコードする「ユニバーサル」配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、どのジンクフィンガー構築物についても一定のままである。３つの「特異的な」オリゴヌクレオチドを、認識ヘリックスをコードするように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なるＤＮＡ結合ドメインそれぞれに対して特異的になるように、認識ヘリックスにおける１、２、３および６位での置換を含んだ。哺乳動物細胞およびＥ．ｃｏｌｉの両方において発現を可能にするよう、コドンのバイアスを選択した。
【０２３４】
ＰＣＲ合成を、２工程で実施した。第１に、二本鎖ＤＮＡテンプレートを、上記の６つのオリゴヌクレオチド（ユニバーサルな３つ、特異的な３つ）を組み合わせること、そして低温（２５℃）のアニーリング工程を含む４サイクルＰＣＲ反応を用いることによって作製した。この温度では、この６つのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ「骨格」を形成するよう結び付く。骨格中の間隙をＴａｑポリメラーゼとＰｆｕポリメラーゼとの組合せにより満たした。構築の第２段階において、ジンクフィンガーのテンプレートを、クローニングのためにｐＵＣ１９に制限部位を組み込むよう設計された外部プライマーによって、３０サイクルにて増幅した。ＶＥＧＦ ＺＦＰに対するクローンの正確さを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。この２つの構築物のそれぞれのＤＮＡ配列を、以下に列挙する。ＶＥＧＦ１：
【０２３５】
【化２】
2011147448.tif 000004
ＶＥＧＦ１翻訳物：
【０２３６】
【化３】
2011147448.tif 000005
ＶＥＧＦ３ａ：
【０２３７】
【化４】
2011147448.tif 000006
ＶＥＧＦ３ａ翻訳物：
【０２３８】
【化５】
2011147448.tif 000007
設計されたＺＦＰがそれらの標的部位に結合する能力を、Ｅ．ｃｏｌｉから組換えタンパク質を発現および精製し、そして電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実施することによって確認した。ＺＦＰの発現を、２つの異なる系において実行した。第１の系において、ＤＮＡ結合ペプチドを、それらを市販のｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入することにより、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。このベクターは、組換えタンパク質の発現を駆動するためのＴ７プロモーター配列を含む。この構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ＤＥ３（ｌａｑＩｑ）細胞に導入した。この細胞は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７ポリメラーゼを含む。培養物に５０μＭ ＺｎＣｌ２を補充し、６００ｎｍのＯＤが０．５〜０．６になるまで３７℃で培養し、そしてタンパク質産生を、ＩＰＴＧを用いて２時間誘導した。ＺＦＰ発現が、非常に高いレベル（総細胞タンパク質のおよそ３０％）で見られた。これらのタンパク質を、「非融合」ＺＦＰと呼ぶ。
【０２３９】
部分的に純粋な非融合ＺＦＰを、以下のように生成した（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：１０１−１０４（１９９２）から適合させた）。凍結細胞ペレットを、１／５０容量の１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００μＭ ＺｎＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴに再懸濁した。このサンプルを、１０分間沸騰させ、そして約３，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。この時点での上清中のＺＦＰタンパク質は、クマシーブルーを用いてＳＤＳポリアクリルアミドを染色することにより概算すると、５０％を超える精製度であり、そして生成物は、１１ｋＤａあたりの推定分子量に移動した。
【０２４０】
ＺＦＰを生成する第２の方法は、それらをＥ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合物として発現させることであった。ＺＦＰとのＮ末端ＭＢＰ融合物を、ｐＥＴ１５ｂクローンのＰＣＲ増幅およびＴａｑプロモーターの制御下でのベクターｐＭａｌ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）への挿入によって構築した。この融合物は、組換えタンパク質の容易な精製および検出を可能にする。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶化形態で高レベルにこのベクターから発現され得ること、および再フォールディングすることなく適切なＤＮＡ標的に効果的に結合し得ることが、これまでに報告されている（Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ９４：５５２５−５５３０（１９９７））。ＭＢＰ融合タンパク質の生成は、製造元（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって記載されている通りであった。形質転換体を、グルコースおよびアンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させ、そしてＩＰＴＧを用いて３７℃にて３時間誘導した。この細胞を、フレンチプレスによって溶解させ、次いでＭＢＰ部分に特異的に結合する（従って、このタンパク質に対するアフィニティー樹脂として作用する）アガロースベースのアミロース樹脂に曝した。ＭＢＰ融合タンパク質を、１０ｍＭマルトースを用いて溶出し、５０％を超える精製度のＺＦＰを遊離させた。いくつかの場合、このタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてさらに濃縮した。
【０２４１】
部分的に精製した非融合ＺＦＰおよびＭＢＰ融合ＺＦＰを、ＥＭＳＡによって試験し、それらの標的ＤＮＡ配列との結合を評価した。調製物中のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルが、いずれの精製方法によっても５０％を超える均質性を示したので、この算出におけるＺＦＰ精製度に対して調整は行わなかった。さらに、この調製物中に有意な量の不活性タンパク質が存在し得た。従って、以下のＥＭＳＡによって生じたデータは、タンパク質のそれらの標的に対する真の親和性の過小評価（すなわち、Ｋｄの過大評価）を示している。２つの別々の調製物を、それぞれのタンパク質に対して作製し、ＺＦＰ活性における相違の制御を手助けした。
【０２４２】
ＥＭＳＡ実験のためのＶＥＧＦ ＤＮＡ標的部位を、２９ｂｐの二重鎖オリゴヌクレオチド中に９ｂｐの結合部位を組み込むことによって作製した。このアッセイにおいて用いられる認識（「上方」）鎖の配列およびそれらの相補鎖（「下方」）の配列を以下に示す：
【０２４３】
【化６】
2011147448.tif 000008
ＶＥＧＦ ＤＮＡ標的部位は、下線を引かれている。９ｂｐの結合部位のそれぞれの端の３ｂｐもまた、実際のＶＥＧＦ ＤＮＡ配列に由来した。それぞれの標的部位の上方の鎖を、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２Ｐ ＡＴＰを用いて標識した。上方および下方の鎖を、０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ｍＭ ＮａＣｌにて、各オリゴヌクレオチドを含む反応においてアニールさせた。この混合物を９５℃で５分間加熱し、そして６０分間にわたって３７℃までゆっくり冷却した。二重鎖形成を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。標的調製物中に残存する遊離の標識ＤＮＡおよびｓｓＤＮＡは、この結合反応を妨害するようではなかった。
【０２４４】
標的オリゴヌクレオチドへのＺＦＰの結合を、固定量の二重鎖基質に対してタンパク質を滴定することにより行った。２０マイクロリットルの結合反応物は、１０フェムトモル（０．５ｎＭ）５’３２Ｐ標識二本鎖標的ＤＮＡ、３５ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオスレイトール、１０％グリセロール、２０μｇ／ｍｌ ポリｄＩ−ｄＣ（必要に応じて）、２００μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、および２５μＭ ＺｎＣｌ２を含んだ。タンパク質を、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ中に作製された連続希釈からの１／５容量として加えた。結合を、室温にて３０分間進行させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、プレキャストされた１０％または１０〜２０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ）および０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２を含む標準的なＴｒｉｓ−グリシン泳動緩衝液を用いて実行した。
【０２４５】
ＭＢＰ融合ＺＦＰを用いた代表的なＥＭＳＡを実施した。この場合、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ１タンパク質の３倍連続希釈を用いた。シフトされた生成物をホスホールイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で定量し、そして相対的なシグナル（プラトー値の％）対ｎＭタンパク質濃度のｌｏｇ１０をプロットした。見かけのＫｄを、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ１のその標的部位への最大結合の半値を与えるタンパク質濃度を決定することによって見出した。そしてこの実験においてこれは、およそ２ｎＭであった。
【０２４６】
ＶＥＧＦタンパク質に対する決定された結合親和性は、以下のように要約され得る。ＶＥＧＦ１は、より強いＤＮＡ結合親和性を示した；複数のＥＭＳＡ分析において、平均の見かけ上のＫｄを、ＶＥＧＦ部位１に結合する場合、およそ１０ｎＭであると決定した。ＶＥＧＦ３ａは、その標的部位に十分結合したが、ＶＥＧＦ１よりも高い見かけ上のＫｄを有した；ＶＥＧＦ３ａについての平均Ｋｄは、約２００ｎＭであった。両方の場合において、このタンパク質のＭＢＰ融合バージョンおよび非融合バージョンは、同様の親和性で結合した。またＫｄを、野生型Ｚｉｆ２６８とＳＰ−１ ＺＦＰとのＭＢＰ融合物について、これらの条件下で決定した（それぞれ、Ｋｄ６０ｎＭおよび６５ｎＭを生じた）。これらの結果は、およそ２〜３０ｎＭのＺｉｆ２６８について文献において報告された結合定数と同様である（例えば、Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：５６８９−５６９５（１９９４）を参照のこと）。従って、合成ＶＥＧＦ ＺＦＰについてのＫｄは、これらの天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質について決定されたＫｄと非常に好都合に比較される。
【０２４７】
要約すると、この実施例は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始付近の特定の標的に関する２つの新規のＤＮＡ結合タンパク質の生成を示す。これらのタンパク質は、天然に存在する転写因子のそれらの標的への結合の親和性と同様の親和性で結合する。
【０２４８】
（実施例２）９ｂｐ標的部位を認識するジンクフィンガードメインが、細胞内で発現された場合に必要な親和性または特異性を欠く場合、１８塩基対の標的部位を認識するために、リンカー配列を用いて別々の３−フィンガードメインを結び付け、６−フィンガードメインを形成することによって、より大きなドメインを構築し得る。このことは、ＺＦＰに融合された機能的ドメイン（例えば、アクチベーターまたはリプレッサー）が、特に少量のＺＦＰ融合タンパク質のみが生成されるような条件下で、適切な配列を特異的に標的化することを保証するはずである。ＶＥＧＦにおける９ｂｐ標的部位を、相互に隣接するよう選択し、その結果、ジンクフィンガーが、１８ｂｐ配列を認識するよう連結し得た。リンカーＤＧＧＧＳを、１つのヌクレオチドギャップによって分離された２つの９ｂｐ部位へのＺＦＰの結合を可能にすることが理由で選択した。ＶＥＤＦ１およびＶＥＧＦ３ａ部位についての場合も同様である（Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ５５２５−５５３０（１９９７）もまた参照のこと）。
【０２４９】
６−フィンガーＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質をコードする配列を、以下のように生成した。ＶＥＧＦ３ａを、プライマーＳＰＥ７（
【０２５０】
【化７】
2011147448.tif 000009
（配列番号１０））およびＳＰＥａｍｐ１２（
【０２５１】
【化８】
2011147448.tif 000010
（配列番号１１））を用いてＰＣＲ増幅し、その末端にＥｃｏＲＩ制限部位およびＸｂａＩ制限部位を生成した（制限部位に下線を引く）。ＶＥＧＦ１をプライマーＳＰＥａｍｐ１３（
【０２５２】
【化９】
2011147448.tif 000011
（配列番号１２））およびＳＰＥａｍｐ１１（
【０２５３】
【化１０】
2011147448.tif 000012
（配列番号１３））を用いてＰＣＲ増幅し、その末端にＳｔｙＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成した（制限部位に下線を引く）。合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下の配列を、ＸｂａＩ部位とＳｔｙＩ部位との間に連結した（ＸｂａＩ部位およびＳｔｙＩ部位に下線を引く）：
【０２５４】
【化１１】
2011147448.tif 000013
（配列番号１４）。これは、２つのＳＰ−１ドメイン間にリンカー配列ＤＧＧＧＳを導入した。この連結産物をプライマーＳＰＥ７およびＳＰＥａｍｐ１１を用いて再増幅し、そしてＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてｐＵＣ１９中にクローン化した。次いでこの連結ＺＦＰ配列を、以下のプライマーを用いて増幅し、上述したように、改変されたｐＭＡＬ−ｃ２発現ベクター中に、クローニングのためのＫｐｎＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を導入した：（１）ＧＢ１９
【０２５５】
【化１２】
2011147448.tif 000014
（配列番号１５）
（２）ＧＢ１０
【０２５６】
【化１３】
2011147448.tif 000015
（配列番号１６）。
【０２５７】
ＫｐｎＩからＢａｍＨＩまでの設計された６−フィンガーＺＦＰ ＶＥＧＦ３ａ／１のヌクレオチド配列は、以下のようなものである：
【０２５８】
【化１４】
2011147448.tif 000016
（配列番号１７）。
【０２５９】
ＶＥＧＦ３ａ／１アミノ酸翻訳物は、以下のようなものである（１文字コードを用いる）：
【０２６０】
【化１５】
2011147448.tif 000017
（配列番号１８）。
【０２６１】
１８ｂｐの結合タンパク質ＶＥＧＦ３ａ／１を、ＭＢＰ融合物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして実施例１に記載されるようなＥＭＳＡ実験において試験した。この標的オリゴヌクレオチドを、記載されたように調製した。そしてこれは以下の相補配列を含んだ：（１）ＪＶＦ９
【０２６２】
【化１６】
2011147448.tif 000018
（配列番号１９）、および（２）ＪＶＦ１０
【０２６３】
【化１７】
2011147448.tif 000019
（配列番号２０）。
【０２６４】
ＥＭＳＡ研究のために、２０μｌの結合反応物は、１０ｆｍｏｌ（０．５ｎＭ）の５’３２Ｐ−標識された二重鎖の標的ＤＮＡ、３５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール、１０％のグルコース、２０μｇ／ｍｌのポリｄＩ−ｄＣ、２００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、および２５μＭのＺｎＣｌ２を含んだ。タンパク質を、３倍に希釈したシリーズから１／５体積として添加した。結合を、室温または３７℃のいずれかで６０分間進行させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、成形済みの１０％または１０〜２０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ）および標準的Ｔｒｉｓ−グリシン泳動用緩衝液を使用して、室温または３７℃で実行した。この室温アッセイは、約１．５ｎＭのＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質についての見かけのＫｄを得た。従って、この１８−ｂｐの結合ＺＦＰは、その標的部位に高い親和性で結合した。平行する実験において、ＶＥＧＦ１タンパク質を、その標的に対して実施例１に記載されたオリゴヌクレオチドを使用して試験し、約２．５ｎＭの見かけのＫｄを得た。結合および電気泳動が３７℃で実施された場合、１８−ｂｐの標的に対して試験された場合には、その標的に対して試験されたＶＥＧＦ１についての４０ｎＭのＫｄと比較して、ＶＥＧＦ３ａ／１の見かけのＫｄは、約９ｎＭであった。これは、結合の親和性における差異が、より高い温度で強調されることを示す。
【０２６５】
見かけのＫｄは、そのＤＮＡ標的に対するタンパク質の親和性の有用な尺度である。しかし、インビトロまたはインビボのいずれかのＤＮＡ結合部位について、その占有率は、ＤＮＡ結合タンパク質の乖離率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）によって大部分、決定される。このパラメーターを、競合実験によって測定し得る。ＥＭＳＡのための条件は、上記のとおりである；結合および電気泳動を、３７℃で実施した。これらのデータは、タンパク質−ＤＮＡ複合体の半減期が、ＶＥＧＦ１に関してより、ＶＥＧＦ３ａ／１に関して、１０倍より長いことを示す。従って、これらのインビボ条件下では、標的部位の占有率は、９−ｂｐのタンパク質に関してより、１８−ｂｐのタンパク質に関して、より高い。
【０２６６】
（実施例３：）この実施例は、哺乳動物細胞内でＺＦＰを産生するための発現ベクターの構築、発現ベクターの核への転移、およびＺＦＰによって標的ＤＮＡに局在化される機能的ドメインの提供を記載する。採用された機能的ドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）抑制ドメインおよび単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）ＶＰ１６活性化ドメインである。
【０２６７】
特定のＤＮＡ結合タンパク質は、転写リプレッサーとして機能する分離可能なドメインを含む。約２０％のＺＦＰは、転写リプレッサーとして機能する約９０アミノ酸の非ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ ９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、（１９９４）、上記；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、（１９９４）、上記）。ＫＲＡＢドメインと命名されたこのドメインは、モジュラーであり、そして他のＤＮＡ結合タンパク質に連結されて、標的のＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現をブロックし得る（Ｍａｒｇｏｌｉｎら、（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、（１９９４）、上記）。このＫＲＡＢドメインは、それ自体では効果を有さない；リプレッサーとして機能するためには、ＤＮＡ結合ドメインを通じて、ＤＮＡ配列に連結されることが必要である。このＫＲＡＢドメインは、転写の開始をブロックすることが示されており、そして転写開始部位から少なくとも３ｋｂまで上流の距離で機能し得る。ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢドメイン（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：３６３−３７（１９９０）を、本明細書に記載される研究のために使用した。この６４アミノ酸のドメインは、ＺＦＰに融合され得、細胞培養物において抑制を与えることが示された（Ｌｉｕら、上記）。
【０２６８】
ＨＳＶ−１のＶＰ１６タンパク質は、広く研究されており、そしてＣ末端の７８アミノ酸が、ＤＮＡ結合ドメインと融合した場合、トランス活性化ドメインとして働き得ることが示された（Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：５９５２−５９６２（１９９７））。ＶＰ１６はまた、離れて、そして方向非依存的な様式で機能することが示された。これらの研究のために、ＶＰ１６タンパク質配列のアミノ酸４１３〜４９０を使用した。このドメインをコードするＤＮＡを、以下の配列を有するプライマーを使用して、プラスミドｐＭＳＶＰ１６Ｃ＋１１９からＰＣＲ増幅した：（１）ＪＶＦ２４
【０２６９】
【化１８】
2011147448.tif 000020
（配列番号２１）；および（２）ＪＶＦ２５
【０２７０】
【化１９】
2011147448.tif 000021
（配列番号２２）下流のプライマー、ＪＶＦ２５を、下流のＦＬＡＧエピトープをコードする配列を含むように設計した。
【０２７１】
３つの発現ベクターを、これらの研究のために構築した。これらのベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来であり、そしてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にＺＦＰ構築物を配する。このベクターは、それぞれ細菌および哺乳動物細胞培養物での選択のためのアンピシリンマーカーおよびネオマイシンマーカーを有する。適切な転写開始のためのＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０（１９９１））を、取り込んだ。この産物の核への局在を達成するために、ＳＶ４０大（ｌａｒｇｅ）Ｔ抗原由来の核局在配列（ＮＬＳ）（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ、配列番号４０）（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ ３９：４９９−５０９（１９８４）を付加した。ＺＦＰコード配列のためのこの挿入部位には、機能的ドメイン配列が続く。このベクターの３つの変形型は、その機能的ドメインにおいて異なる；「ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦ」は、ＫＲＡＢ抑制ドメイン配列を有し、「ｐｃＤＮＡ−ＮＶＦ」は、ＶＰ１６活性化ドメインを有し、そして「ＮＦ−コントロール」は、機能的ドメインを有さない。以下の機能的ドメインは、ＺＦＰの特異的な検出を可能にするためのＦＬＡＧエピトープ配列（Ｋｏｄａｋ）である。
【０２７２】
これらのベクターを、以下のように構築した。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＢは、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、付着末端をクレノウによって埋め、再連結させることによって構築した。このことにより、ポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を除外した。このベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカタログに記載される。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＮＫＦを、ｐｃＤＮＡ−ＨＢのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位中にフラグメントを挿入することによって生成した。ｐｃＤＮＡ−ＨＢは、以下を含む：１）開始コドンおよびＳＶ４０ＮＬＳ配列を含むＫｏｚａｋ配列を含む、全体でＤＮＡ配列
【０２７３】
【化２０】
2011147448.tif 000022
（配列番号２３）を構成するＥｃｏＲＩ〜ＫｐｎＩ断片、ここでＥｃｏＲＩ部位およびＫｐｎＩ部位を下線で示す；ならびに２）ＢａｍＨＩ部位、ＫＯＸ−１由来のＫＲＡＢ−Ａボックス（上記のＴｈｉｅｓｅｎ、１９９０におけるアミノ酸１１〜５３に相当する）、ＦＬＡＧエピトープ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩカタログから）、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、全体で配列
【０２７４】
【化２１】
2011147448.tif 000023
（配列番号２４）を構成するＫｐｎＩからＸｈｏＩの断片、ここでＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位を、下線で示す。
【０２７５】
ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐｃＤＮＡ−ＮＫＦ中に、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットを挿入することによって生成した。ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢおよびＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドを、同様の方法で構築した（プラスミドｐＬｉｔｍｕｓ ２８（ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の場合に、ＺＦＰ配列を最初にＮＬＳ−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧ配列中にクローン化し、そしてＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩカセットとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に続いて移動させることを除く）。ここで、このＢｇｌＩＩ部位を、ＥｃｏＲＩ部位の直ぐ上流に設置した（これらのベクターの発現については、実施例４を参照のこと）。
【０２７６】
実施例５に使用したエフェクタープラスミドを、以下のように構築した。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＮＶＦを、上記のように、ＶＰ１６トランス活性化ドメインをＰＣＲ増幅し、そしてこの産物をｐｃＤＮＡ−ＮＫＦのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＫＲＡＢ配列を置換することによって構築した。ＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩのこの挿入フラグメントの配列は：
【０２７７】
【化２２】
2011147448.tif 000024
（配列番号２５）であった。
【０２７８】
ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６ベクターを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐｃＤＮＡ−ＮＶＦ中に、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットを挿入することによって構築した。
【０２７９】
実施例６に使用したエフェクタープラスミドを、以下のように構築した。プラスミドＮＦ−コントロールを、ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位中に配列
【０２８０】
【化２３】
2011147448.tif 000025
（配列番号２６）を挿入することによって生成し、それによってＮＬＡ−ＦＬＡＧのみでＮＬＳ−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧ配列を置換した。
【０２８１】
ＶＥＧＦ１−ＮＦおよびＶＥＧＦ３ａ／１−ＮＦは、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断したＮＦ−コントロール中に挿入することによって構築した。ＣＣＲ５−ＫＲＡＢを、ＶＥＧＦ−ＫＲＡＢベクターと同じ方法によって構築した（ＺＦＰ配列が、ＶＥＧＦ標的に関連しないＤＮＡ標的部位に対して特異的であるように設計された点を除く）。
【０２８２】
最後に、ＫＲＡＢ発現プラスミドおよびＶＰ１６発現プラスミドの両方のコントロールの変形型を、構築した。プラスミドＮＫＦ−コントロールを、ジンクフィンガータンパク質配列なしのＮＬＳ−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧを発現するように設計した；プラスミドＮＶＦ−コントロールを、ＺＦＰ配列なしのＮＬＳ−ＶＰ１６−ＦＬＡＧを発現するように設計した。これらのプラスミドは、適切なリーディングフレーム中に下流のドメインを設置するために、ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦおよびｐｃＤＮＡ−ＮＶＦをそれぞれ、ＢａｍＨＩで切断し、クレノウで末端を埋め、そして再連結することによって作製した。これらのプラスミドは、細胞培養物研究のための厳密なコントロールとして働く。
【０２８３】
ＺＦＰを操作したＶＥＧＦの哺乳動物細胞の発現および核への局在を、免疫蛍光研究で実証した。２９３（ヒト胚性腎臓）細胞を、ＮＬＳ−ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧキメラをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を、以下に記載のように使用した。２４〜４８時間後、細胞を固定し、そしてＦＬＡＧエピトープに対する一次抗体に曝露した。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄで標識した二次抗体を用い、そしてこれらの細胞を、ＤＡＰＩで対比染色した。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ染色は、ＤＡＰＩ染色と一致して共局在することが観察された。これは、このプラスミドから発現されるＺＦＰが核に局在したことを示す。
【０２８４】
（実施例４：）この実施例は、細胞内でのＺＦＰ抑制タンパク質の活性を測定するための一過性の共トランスフェクションの使用を実証する。このような実験は、ＶＥＧＦ標的部位を有するレポータープラスミドを伴う、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ発現（「エフェクター」）プラスミドの共トランスフェクションを含む。効力を、空のベクターコントロールと比較した、エフェクタープラスミドの存在下でのレポーター遺伝子の発現の抑制によって、評価した。
【０２８５】
このレポータープラスミドシステムは、ｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づいた。ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを、ｐＶＦＲ１−４ｘを創出するために、プラスミドｐＧＬ３−コントロール中の、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動するＳＶ４０プロモーターの上流に挿入した。このプラスミドは、ＳＶ４０エンハンサーを含み、そして多くの細胞型においてホタルルシフェラーゼを高レベルで発現する。挿入を、実施例２に記載された２つの相補的な４２−ｂｐのオリゴヌクレオチド、ＪＶＦ９およびＪＶＦ１０の縦列コピーを共に連結させることによって作製した。アダプター配列を連結し、そしてこの組立を、ｐＧＬ３−コントロールのＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ部位中に挿入した。これは、これらの部位間の以下の配列の挿入を生じた：
【０２８６】
【化２４】
2011147448.tif 000026
（配列番号２７）示された最初の６ヌクレオチドおよび最後の６ヌクレオチドは、ＭｌｕＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位であり；小文字はＨｉｎｄＩＩＩ部位を示す。ＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａの結合部位を、下線で示す。
【０２８７】
エフェクタープラスミド構築物を、上に記した。ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ、ＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢおよびＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ発現ベクターを、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＳＶ４０核局在配列、ＶＥＧＦ ＺＦＰ、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、およびＦＬＡＧエピトープマーカー全ての融合を生成するように設計した。空のｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを、コントロール（ｐｃＤＮＡ）として使用した。
【０２８８】
全てのベクターを、ＱｉａｇｅｎのＤＮＡ精製キットを使用して、調製した。約４０，０００細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに撒き、１０％のウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）培地中で、５％のＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして血清なしのＤ−ＭＥＭの２００μｌを被せた。プラスミドを、リポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して導入した。各ウェルを、６μｌのリポフェクトアミンと２５μｌのＤ−ＭＥＭで３０分間３７℃で複合化した約０．３μｇのエフェクタープラスミド、０．３μｇのレポータープラスミド、および０．０１μｇのプラスミドｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、トランスフェクトした。トランスフェクションを、３連で行った。３時間後、１０％の血清を含む１ｍｌの培地を、各ウェルに添加した。細胞を、トランスフェクション後４０〜４８時間で回収した。ルシフェラーゼアッセイを、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。トランスフェクトされた第三のプラスミド、ｐＲＬ−ＳＶ４０は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を有し、そしてトランスフェクション効率についての基準として共トランスフェクトした。
【０２８９】
コントロールレポータープラスミドｐＧＬ３−コントロール（ｐＧＬ３−Ｃ）に関して、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ発現プラスミドの存在または不在は、ルシフェラーゼ発現レベルに影響しない。しかし、ｐＶＦＲ１−４ｘ、ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを含むレポーターに関しては、ＶＥＧＦ１（９−ｂｐ−結合ＺＦＰ）またはＶＥＧＦ３ａ／１（１８−ｂｐ−結合ＺＦＰ）発現プラスミドの存在が、空のｐｃＤＮＡベクターコントロールに対して、２〜３倍ルシフェラーゼの発現を減少させる。このＶＥＧＦ３ａ（９−ｂｐ−結合ＺＦＰ）発現プラスミドは、ほとんど影響を示さないかまたは影響を示さないようである。これらの実験は明らかに、設計されたＺＦＰが、その標的部位が存在する場合、細胞内で機能して遺伝子の転写を抑制し得ることを実証する。さらに、親和性の特定のレベルが、機能のために必要であるように思われる；すなわち、１０ｎＭ以下のＫｄを有するＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１は機能的であるが、一方２００ｎＭのＫｄを有するＶＥＧＦ３ａは機能的でない。
【０２９０】
第二のレポータープラスミド、ｐＶＦＲ２−４ｘを、ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーをＨｉｎｄＩＩＩを使用して取り除き、そしてそれをｐＧＬ３−コントロールのＨｉｎｄＩＩＩ部位中に（順方向に）挿入することによって構築した。これは、ＳＶ４０プロモーターについての転写の開始部位とルシフェラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンとの間の標的部位に位置する。記載されたものに類似の共トランスフェクション実験において、ｐｃＤＮＡコントロールと比較して、ルシフェラーゼシグナルの約３〜４倍の抑制が、ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢリプレッサーまたはＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢリプレッサーで観察された。これは、このリプレッサーが、転写の開始の上流または下流のいずれかに結合した場合に、活性であることを示す。
【０２９１】
（実施例５：）この実施例は、細胞におけるＺＦＰ転写活性化因子の活性を測定するための一過性の共トランスフェクション研究の使用を実証する。実験的な設定は、異なったトランスフェクション方法、異なった細胞株、ならびに異なったレポーターおよびエフェクタープラスミドの組を使用した点を除いて、実施例４のものと類似である。
【０２９２】
活性化実験に関して、レポーターは、構築された標識化されたｐＶＦＲ３−４ｘであった。このレポーターは、プラスミドｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｕｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位で、上に示した配列と共にＶＥＧＦ標的の４つのコピーを含む。このベクターは、ＳＶ４０のエンハンサー配列について欠失されており、従ってより低い基準レベルのホタルルシフェラーゼ発現を有する。ｐＶＦＲ３−４ｘは、ｐＶＦＲ１−４ｘのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメントを、ｐＧＬ３−プロモーターのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ部位中に交換することによって構築した。
【０２９３】
このエフェクタープラスミド構築物は、上に記載した。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６、ＶＥＧＦ３ａ−ＶＰ１６およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６発現ベクターを、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＳＶ４０核局在配列、ＶＥＧＦ ＺＦＰ、ＶＰ１６トランス活性化ドメインおよびＦＬＡＧエピトープタグ全ての融合を生成するように設計した。空のｐｃＤＮＡ３発現ベクターを、コントロールとして使用した。
【０２９４】
全てのベクターを、ＱｉａｇｅｎのＤＮＡ精製キットを使用して調製した。約４０，０００個の細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに撒き、そして１０％のウシ胎仔血清を含むＤ−ＭＥＭ培地中で、５％のＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。細胞を、血清なしのＤ−ＭＥＭ培地で洗浄し、血清なしのＤ−ＭＥＭ培地の２００μｌを被せた。プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して導入した。各ウェル中の細胞を、１．５μｇのレポータープラスミド、１．５μｇのエフェクタープラスミド、および０．５μｇのアクチン／β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドを、１５μｌのＣａＣｌ２と合わせ、ｄＨ２Ｏで１００μｌにした。１００μｌのＨＥＰＥＳ溶液を、ボルテックスで混合しながら滴下して添加した。この混合物を、室温で３０分間インキュベートした。次いで、リン酸カルシウム処理したＤＮＡの２００μｌを、各ウェル中の培地に添加した。トランスフェクションを３連で行った。５時間後、この培地を除去し、１０％の血清を含む１ｍｌの培地を添加した。細胞を、トランスフェクション後４０〜４８時間で回収した。ルシフェラーゼアッセイを、Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して行った。トランスフェクトされた第三のプラスミド、アクチンβ−ｇａｌは、アクチンプロモーターの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有し、トランスフェクション効率についての基準として共トランスフェクトした。このβ−ガラクトシダーゼアッセイをまた、製造業者のプロトコル（Ｔｒｏｐｉｘ）に従って行った。
【０２９５】
コントロールレポータープラスミド、ｐＧＬ３−プロモーター（ｐＧＬ３−Ｐ）に関して、ＺＦＰ−ＶＰ１６発現プラスミドの存在または不在は、ルシフェラーゼ発現レベルに有意に影響しない。ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを含むレポーター、ｐＶＦＲ３−４ｘに関しては、ＶＥＧＦ１（９−ｂｐ−結合ＺＦＰ）の存在が、空のｐｃＤＮＡベクターコントロールと比較して非常に僅かな活性化を示す。ＶＥＧＦ３ａ／１（１８−ｂｐ−結合ＺＦＰ）発現プラスミドは、ルシフェラーゼ発現をまさに実質的に活性化し、ｐｃＤＮＡと比較して約１４倍の増大を示す。これらの実験は明らかに、設計されたＺＦＰが、ＶＰ１６の活性化ドメインと融合した場合、その標的部位が存在する場合に、細胞において機能して遺伝子の転写を活性化し得ることを実証する。さらに、これらの結果は明らかに、このアッセイにおいて、１８−ｂｐの結合タンパク質、ＶＥＧＦ３ａ／１が、９−ｂｐの結合ＶＥＧＦ１タンパク質よりも、かなりよい活性化因子であることを実証する。これは、親和性の改善またはＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質の乖離率の減少の結果であり得る。
【０２９６】
第四のＶＥＧＦレポータープラスミドを、プラスミドｐＶＦＲ４−４ｘを創出するためにｐＶＦＲ２−４ｘのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメントをｐＧ３−プロモーター中にクローニングすることによって構築した。活性化は、ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６融合物を発現するエフェクタープラスミドと組み合わせてこのレポーターを使用した共トランスフェクションにおいて観察された。これは、これらの人工のトランス活性化因子が、転写開始の上流または下流のいずれかに結合した場合、機能的であることを示す。
【０２９７】
これらの共トランスフェクションデータは、ＺＦＰがレポーター遺伝子の発現を調節するために使用され得ることを実証する。このような実験は、内因性分子の標的の発現の調節因子としてのさらなる使用のために、ＺＦＰを同定するための有用なツールとして働き得る。
【０２９８】
（実施例６：）この実施例は、設計されたＺＦＰが、通常のゲノム状態およびクロマチン状態である内因性の細胞の遺伝子の発現を抑制し得ることを実証する。詳細には、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合したＶＥＧＦ ＺＦＰを発現するエフェクタープラスミドを、細胞中に導入し、これがＶＥＧＦ遺伝子をダウンレギュレートすることを示した。
【０２９９】
真核生物の発現ベクターを、実施例３で上に記したように、ＶＥＧＦ３ａ／１およびＶＥＧＦ１ ＺＦＰを、ＳＶ４０ ＮＬＳおよびＫＲＡＢに融合するように構築した。トランスフェクションを、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されるリポソーム調製物のリポフェクトアミンを使用して行った。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ精製システムを使用して調製した。総体積１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で、１０μｌのエフェクタープラスミドを、１００μｇのリポフェクトアミン（５０μｌ）と混合した。ｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）をまた、トランスフェクション効率についての内部コントロールとして、このＤＮＡ混合物中に含んだ。３０分間のインキュベーション後に、６．４ｍｌのＤＭＥＭを添加し、そしてこの混合物を３×１０６個の２９３細胞上に重ねた。５時間後、このＤＮＡ−リポフェクトアミン混合物を除去し、そして１０％のウシ胎仔血清を含む新鮮な培養培地を、これらの細胞上に重ねた。
【０３００】
トランスフェクション後１８時間で、これらの２９３細胞を、１００μＭのＤＦＸ（デスフェリオキサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ））での処理によって誘導し、ＶＥＧＦ遺伝子の迅速かつ持続する転写活性化を生じ、かつまたＶＥＧＦ ｍＲＮＡの安定性における段階的な増大を生じた（Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９７６１−１９７６６（１９９５））。慣用的な培養条件下で、２９３細胞は、培養培地中に低レベルのＶＨＧＦを分泌する。これらの細胞を、ＥＬＩＳＡアッセイによるＶＥＧＦレベルの決定のために上清を収集する前に、さらに２４時間インキュベートさせた。
【０３０１】
類似のレベルの抑制が実証された平行する実験において、細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ ＯｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してモニターした。１８時間のＤｆｘ処理後、元の２ｍｌの培地のうち５００μｌを除去し、上記のようにＶＥＧＦ発現について分析した。細胞の生存率を評価するために、３００μｌのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを、残りの１．５ｍｌに添加した。次いで、これらの細胞を３７℃で約２時間インキュベートした。各ウェルからの１００μｌを、９６ウェルプレートに移し、そしてＯＤ ４９０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレート読み取り機上で読み取った。空のベクターコントロールでトランスフェクトされた細胞と比較して、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ構築物を発現する細胞の生存率における有意な減少は存在しなかった。これは、観察されたＶＥＧＦ抑制が、一般化した細胞死に起因しないことを示す。
【０３０２】
ＶＥＧＦ発現の４０〜５０倍の減少を、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ（１８ｂｐの結合ＶＥＧＦ高親和性ＺＦＰをコードする発現するベクター）でトランスフェクトされたＤＦＸ処理細胞において示した。細胞をＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ（９ｂｐの結合ＶＥＧＦ高親和性ＺＦＰをコードする発現するベクター）でトランスフェクトした場合に、発現の２倍の減少を観察した。ＶＥＧＦ発現の有意な減少は、非ＶＥＧＦ ＺＦＰ（ＣＣＲ５−ＫＲＡＢ）またはＮＫＦコントロールでトランスフェクトした細胞において観察されなかった。同様の結果を、３つの独立したトランスフェクション実験において得た。
【０３０３】
別途の実験において、以下の結果を得た（データは示さない）。ＶＥＧＦ１−ＮＦ（機能的なドメインなしに９ｂｐの結合ＶＥＧＦ１ ＺＦＰを発現するする）は、ＶＥＧＦ遺伝子発現するに効果を示さなかった。ＶＥＧＦ発現するにおける有意な減少を、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＮＦ（機能的なドメインなしに１８ｂｐの結合タンパク質を発現するする）で観察した。この結果は、転写の開始部位への結合が、抑制ドメインなしでさえ、転写を妨げることを示唆する。ＫＲＡＢドメインに融合された場合でさえ、ＶＥＧＦ３ａ ＺＦＰは、発現レベル（プラスミドＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢ）に影響を及ぼし得ない。しかし、ＫＲＡＢに融合されたＶＥＧＦ１（ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ）は、発現における劇的な減少を生じる。ＫＲＡＢに融合されたＶＥＧＦ３ａ／１（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ）は、全体的にＶＥＧＦの発現を妨げる。
【０３０４】
これらのデータは、設計されたＺＦＰが、染色体上のその標的部位へ位置し得、そして結合し得、そして内因性の細胞標的遺伝子発現を防ぎ得ことを示す。特に、結果は、約２５ｎＭ未満のＫｄを有するＺＦＰ（例えば、ＶＥＧＦ１が約１０ｎＭの平均的な見かけのＫｄを有する）が発現における劇的な減少を提供することを示す。さらに、データは、ＫＲＡＢ機能性ドメインが遺伝子サイレンシングを高めることを示す。この発現におけるリプレッサーの誘導は、ＶＥＧＦのインデューサー（ＤＦＸ）が添加される前に起こるため、このデータは、設計されたリプレッサーがすでに休止の遺伝子の活性化を妨げる能力を示す。さらに、これらの結果は、転写開始部位と重なる標的を結合する場合、その標的に対するナノモルの親和性でシックスフィンガー（ｓｉｘ−ｆｉｎｇｅｒ）の操作したＺＦＰ（ＶＥＧＦ３ａ／１）がＶＥＧＦ遺伝子の低酸素性応答を阻害し得ることを示す。
【０３０５】
（実施例７：）本実施例は、設計したＺＦＰが正常なゲノムおよびクロマチン内容物にある内因性の細胞性遺伝子の発現を活性化し得ることを示す。特に、ＶＰ１６活性化ドメインに融合されたＶＥＧＦ ＺＦＰを発現するエフェクタープラスミドを、細胞に導入し、そしてＶＥＧＦ遺伝子を上方制御することを示した。
【０３０６】
真核生物発現ベクターを、実施例３に記載されるように、ＶＥＧＦ３ａ／１およびＶＥＧＦ１ ＺＦＰをＳＶ４０ ＮＬＳおよびＶＰ１６に融合させて構築した。トランスフェクションをリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されるリポソーム調製物）を使用して行った。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ精製システムを使用して調製した。１０μｇのエフェクタープラスミド（操作したＺＦＰを含む）を、１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭの総容積中１００μｇのリポフェクトアミン（５０μｌ）と共に混合した。ｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）をまた、トランスフェクション効率に関する内部コントロールとして、ＤＮＡ混合物中に含有した。インキュベート３０分後、６．４ｍｌのＤＭＥＭを添加し、そして混合物を３×１０６の２９３細胞上に積層した。５時間後、ＤＮＡ−リポフェクトアミン混合物を除去して、そして１０％のウシ胎仔血清を含有する新鮮な培養培地を細胞上に積層した。１日後、新鮮な培地を添加して、そして市販されるＥＬＩＳＡキット（Ｒａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＶＥＧＦレベルの測定のために、上澄みを２４時間後に収集した。
【０３０７】
スリーフィンガーのＶＥＧＦ１−特異的ＺＦＰ（ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６）について、コントロールプラスミド（ＮＶＦ−コントロール）および擬トランスフェクトした細胞と比較した場合に、ＶＥＧＦ発現の７〜１０倍の増加が観察された。同様の結果を、５つの独立した実験において観察している。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６トランスフェクト細胞におけるＶＥＧＦ分泌のレベルがＤＦＸで処理されている細胞におけるレベルと等価であるかまたは、それより大きいことを示すことが重要である。ＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６の導入は、より緩やかな導入を刺激した。この結果は、実施例６における知見と矛盾しない。この知見において、機能的なドメインなしでの１８ｂｐの結合タンパク質の発現は一定の程度まで活性化を妨げた。この結果は、転写の開始部位へのこのタンパク質の密接な結合が活性化を妨げることを示唆した。
【０３０８】
これらのデータは、設計したＺＦＰが、染色体上の標的部位に位置し得、そしてこの部位に結合し得、転写活性化ドメインを提示し得、そして劇的に内因性遺伝子の発現レベルを高め得ること示す。特に、この結果は、約２５ｎＭ未満のＫｄを有するＺＦＰ（例えば、ＶＥＧＦ１が約１０ｎＭの平均的な見かけのＫｄを有する）が、発現における劇的な増加を提供することを示す。
【０３０９】
（実施例８：）さらに実施例６および７における結果を実体化するため、リボヌクレオチド保護アッセイ（ＲＰＡ）を実施して、増加したレベルのＶＥＧＦタンパク質とＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルにおける増加とを相関させ（実施例７）、そして減少したレベルのＶＥＧＦタンパク質とＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの減少とを相関させた（実施例６）。
【０３１０】
ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした細胞から単離した。放射標識された複数のテンプレートプローブ（ＶＥＧＦ特異的プローブを含む）を、インビトロの転写によって調製し、そして５６℃で一晩、実験細胞およびコントロールトランスフェクトした細胞由来の５μｇの各ＲＮＡにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション混合物を、ＲＮａｓｅで処理し、そして保護されたプローブを精製し、そして５％の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そして放射能をオートラジオグラフィによって評価した。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６でトランスフェクトした２９３細胞は、ＮＶＦ−コントロールでトランスフェクトした細胞と比較した場合、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルにおける２〜４倍の増加を有した（実験の詳細については実施例７を参照のこと）。保護されたプローブのサイズは、ＲＮＡの完全性のためのコントロールトランスフェクトして提供したコントロールヒトＲＮＡから生成されるプローブのサイズと同一であった。
【０３１１】
別途の実験において、ＶＥＧＦ特異的ｍＲＮＡのレベルをまた、ＶＥＧＦ−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドでトランスフェクトされている細胞において定量した（実験の詳細については実施例６を参照のこと）。トランスフェクションの詳細を実施例６に記載する。細胞をＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドでトランスフェクトした場合、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルの劇的な減少を観察した。細胞をＮＫＦ−コントロールまたは非ＶＥＧＦ特異的ＺＦＰ（異なるＣＣＲ５標的部位を認識する、ＣＣＲ５−５−ＫＲＡＢおよびＣＣＲ５−３−ＫＲＡＢ）でトランスフェクトした場合、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにおける有意な減少を観察しなかった。
【０３１２】
この実験は、ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６キメラ転写因子でのトランスフェクションの際に観察されるＶＥＧＦタンパク質の増加は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルの増加によって媒介されることを示す。同様に、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢキメラ転写因子でのトランスフェクションの際に観察されるＶＥＧＦタンパク質の減少は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルの減少によって媒介されることを示す。
【０３１３】
（実施例９：ＶＥＧＦ２媒介マイトジェンシグナルのインヒビターの同定）
（工程１：細胞株の産生）ＶＥＧＦ−Ｒ２を過剰発現し、そしてＶＥＧＦ−Ｒ１を発現しないＥＣＶ３０４由来細胞株を以下のように産生する。ＶＥＧＦ−Ｒ１に対して設計したＺＦＰリプレッサーを上記のように産生した。ＶＥＧＦ−Ｒ２を高めるように設計したＺＦＰアクチベーターをまた、上記のように産生した。ＥＣＶ３０４細胞を、２つのＺＦＰ構築物で同時トランスフェクトする；クローンを薬物選択に続いてＦＡＣＳ分析（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＦＶＥ０）のために選んだ。ＦＡＣＳ分析を介してＶＥＧＦ−Ｒ１の欠失および膜表面上でのＶＥＧＦ−Ｒ２の増加を示すクローンを増殖させ、そして細胞株に高スループット（ＨＴＰ）スクリーニングを実行する。細胞株を、ＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２＋＋と再命名する。
【０３１４】
ＶＥＧＦ−Ｒ１を本質的に抑制し、そして条件付でＶＥＧＦ−Ｒ２を産生するコントロール細胞株を以下のように産生する。ＶＥＧＦ−Ｒ２に対して設計したＺＦＰリプレッサーを、Ｔ−Ｒｅｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへクローニングする。これおよびＶＥＧＦ−Ｒ１ ＺＦＰリプレッサーを、ＥＣＶ３０４細胞中へと同時トランスフェクトする。再度、安定なクローンを選択し、ＶＥＧＦ−Ｒ１の欠失およびＶＥＧＦ−Ｒ２の存在についてＦＡＣＳ分析を介して分析する。次いで、細胞をドキシサイクリンで処理し、そして、ＶＥＧＦ−Ｒ２の欠失についてＦＡＣＳ分析を介して試験する。ＶＥＧＦ−Ｒ１を発現せず、そしてドキシサイクリン処理後にＶＥＧＦ−Ｒ２の欠失を示す細胞株に、ＨＴＰスクリーニングを繰り返す。この細胞株を、ＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２ｉｎｄと再命名する。
【０３１５】
２．ＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２＋＋を用いて開始し、９６ウェルプレートにおいて、１ウェルあたり１０，０００細胞をプレートする。アッセイの最終容量が１００μｌであるので、細胞を５０μｌの培地中にプレートする。
【０３１６】
３．化合物ライブラリー由来の試験化合物を、３０ｎＭの最終濃度まで（２５μｌ）添加し、そしてプレートを１時間インキュベートする。２５μｌの培地を１ウェルに対して化合物なしで添加して、＋ＶＥＧＦコントロールとして利用する。別のウェルに対して、１ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで、ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１００−Ｂ−００１）（２５μｌ中に０．０７５ｎｇ）を添加して、ＶＥＧＦインヒビターコントロールとして利用する。
【０３１７】
４．各ウェルに対して、３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度までＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２９８−ｖｓ−００５）（２５μｌ中に３ｎｇ）を添加する。３０分間インキュベートする。
【０３１８】
５．膜を透過することによって細胞内のリン酸化チロシンについてアッセイする。タンパク質チロシンキナーゼ活性を測定する代替のアッセイもまた、利用可能であり、工程１７へ飛ぶ。
【０３１９】
６．培地を吸引する。細胞を３０分間１％ホルムアルデヒドで固定する。
【０３２０】
７．ＰＢＳで細胞を洗浄する。
【０３２１】
８．抗リン酸チロシン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，＃２９９２６）を５μｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加する。１時間インキュベートする。
【０３２２】
９．１％ＢＳＡおよび０．０５％ＮＰ−４０を含有するＰＢＳで細胞を洗浄する。
【０３２３】
１０．ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３１４３０）、１：２００希釈液を添加する。１時間インキュベートする。
【０３２４】
１１．上記のように細胞を洗浄する。
【０３２５】
１２．記載通りにＨＲＰ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３２０５２）を実施する。ＶＥＧＦ−刺激リン酸チロシン産生を低下させる化合物を同定する。
【０３２６】
１３．工程２のようにＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２ｉｎｄ細胞をプレートすることで２次スクリーニングのための準備をし、同時に複製プレートを調製する。
【０３２７】
１４．１つのプレートに対して、ドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。一晩インキュベートする。
【０３２８】
１５．両方のプレートに対して、工程３〜１１を繰り返す。
【０３２９】
１６．陽性ヒット（ｈｉｔ）は、ドキシサイクリンで未処理の細胞において減少したＶＥＧＦ刺激リン酸チロシン産生を示した。理想的な化合物は、ドキシサイクリン処理細胞と同様にふるまい、従ってＶＥＧＦ−Ｒ２誘導経路以外の任意の系では作用しないことを示す。
【０３３０】
１７．工程５から再開する。培地を吸引する。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する２００μｌのＰＴＫ抽出緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｖ６４８０）を添加することによって細胞を可溶化し、そして１０分間氷上でインキュベートする。
【０３３１】
１８．任意の残留細胞を分離し、そして数回ピペットで上げ下げすることで、細胞懸濁液を混合する。深いウェルブロックに懸濁液を移し、そして４℃で１５分間振動させる。
【０３３２】
１９．懸濁液を４℃で１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、そして上澄みを保存する。
【０３３３】
２０．Ｐｒｏｍｅｇａ（技術広報ＴＢ２１１）に記載されるようなＰＴＫアッセイプロトコールの工程ＩＩＩ．Ａ．１を続ける。
【０３３４】
（実施例１０：Ｔ細胞の活性化を生じないＴ細胞増殖の刺激因子の同定）カリウムチャンネルは、Ｔリンパ球のカルシウムシグナル伝達の調節において重大な役割を果たす。ヒトＴリンパ球において発現される２つの際立ったカリウムチャンネルは、Ｋｖ１．３（膜電位の変化に応答して開くチャンネル）およびＫＣａ４（細胞内のカルシウムレベルにおける上昇によって活性化されるチャンネル）である。Ｋｖ１．３が、Ｔ細胞増殖の制御においてきわめて重大な役割を果たし、一方ＫＣａ４はＴ細胞活性化において機能することを示している。次いで、Ｔ細胞の活性化は、ＩＦＮ−γの放出および免疫応答を導く。この経路に対する注意は、ＫＣａ４が公知のマイトジェン刺激および抗原性刺激に応答して上方制御されることである、従って、選択的にＴリンパ球の増殖を可能にし得るが、Ｔ細胞の活性化を生じない化合物を同定することは困難であった。いくつかのＫＣａ４インヒビターは同定されているが、これらのインヒビターは、完全には選択されていない；これらはまた、他のタンパク質（例えば、Ｔ細胞にまた存し得るカルシウム関連活性化Ｃａ２＋（ＣＲＡＣ）チャンネル）を阻害し得る。
【０３３５】
ヒトｈＫＣａ４遺伝子のＺＦＰベースのインヒビターを、上記のＺＦＰ設計の方法を使用して作製した。その標的配列を、ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号ＡＥ０２２７９７）の塩基対２１７に位置させる。標的配列は、５’−ＧＧＧＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号４１）である。認識へリックス（−１〜＋６）のアミノ酸配列（一文字コード）は以下である：Ｆ１＝ＲＳＤＨＬＡＲ（配列番号４２）。Ｆ２＝ＲＳＤＮＬＡＲ（配列番号４３）。Ｆ３＝ＲＳＤＨＬＳＲ（配列番号４４）。
【０３３６】
得られる３フィンガーＺＦＰ（ＺＦＰ３Ａと呼ばれる）は、ゲル移動度シフトアッセイによって測定されるように、その標的に対して０．３ｎＭの解離定数を有する。ＺＦＰ３Ａ ＤＮＡ結合ドメインに対するＶＰ１６融合物は、同時トランスフェクトされたレポーター遺伝子を５倍よりも大きく活性化する。
【０３３７】
ｈＫＣａ４遺伝子発現のインヒビターに影響するＫＲＡＢ−ＺＦＰ３Ａキメラ構築物を、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現ベクターと共にヒト赤白血球細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、蛍光顕微鏡を使用して同定した。次いで、トランスフェクトした細胞を、パッチクランプ方法によってｈＫＣａ４機能について試験した。イオンチャンネル機能を、勾配伝導度（ｎＳ）を決定することによって決定した。トランスフェクトしていないコントロールは、１２．５（ｎ＝１）の値を有する。空のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１０．０±２．５（ｎ＝４）の値を有する。ＺＦＰ３Ａでトランスフェクトされた細胞は、１．０±０．１の値を有する。これは、機能のほとんどの総損失を示す。
【０３３８】
ＺＰＦ３Ａトランスフェクトされた細胞をさらに、Ｋｖ１．３発現を活性化するように設計された第２ＺＦＰでトランスフェクトする。アクチベーターをコードする配列を、Ｔ−ＲｅｘＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドにクローニングする。安定なクローンを、ＦＡＣＳ分析を使用して選択して、Ｋｖ１．３の増加した発現を有するこれらのクローンを同定する。クローンを、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）有りまたは無しで処理した場合、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｉ蛍光画像化プレートリーダーシステム（Ｆｌｏｕｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を使用して、細胞内のカルシウム変動における変化について試験する。ドキシサイクリンの存在下では、細胞内のカルシウム変動において最小の変化があり、一方、ドキシサイクリン未処理細胞は、野生型Ｊｕｒｋａｔと同様の変動を示す。Ｋｖ１．３の増加した発現を有し、そしてドキシサイクリン処理後のＫＣａ４の損失を示す細胞株を、ＨＴＰスクリーニングについて繰り返す。これを、Ｋｖ１．３＋／ＫＣａ４＋／−と再命名する。
【０３３９】
Ｋｖ１．３＋／ＫＣａ４＋／−細胞を、９６ウェルディッシュにおいて１０，０００細胞／ウェルにて二重でプレートする。ドキシサイクリンを１プレートに１μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、そして両方のプレートを一晩インキュベートする。
【０３４０】
化合物ライブラリー由来の試験化合物を、３０ｎＭの最終濃度まで添加し、そして両方のプレートを２４時間インキュベートする。各プレートについて、コントロールウェルは、１０μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を有して、マイトジェン活性およびＴ細胞活性化に対する陽性コントロールとなる。第２コントロールウェルは、何も添加されず、バックグランドコントロールとしてなる。
【０３４１】
収集４時間前、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を各ウェルに添加する。
【０３４２】
プレートを回して、細胞をペレット化する。上清をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａのプロトコールおよび試薬）を使用して収集する。
【０３４３】
細胞をＰＢＳ中に再懸濁して、そしてグラスファイバーフィルター上で収集する。［３Ｈ］チミジン組み込みを、シンチレーションカウンターで測定する。
【０３４４】
マイトジェン性化合物に曝していない細胞は［３Ｈ］チミジン摂取およびＩＦＮ−γ分泌についてのベースラインとなる。ＣｏｎＡコントロールは、ドキシサイクリン処理細胞および未処理細胞の両方において増加した［３Ｈ］チミジン摂取を示す；さらに、未処置細胞における分泌ＩＦＮ−γの増加があるが、ドキシサイクリン処理細胞における増加はない。陽性ヒットは、ドキシサイクリン処理細胞または未処理細胞のいずれかにおいて［３Ｈ］チミジン組み込みの増加を刺激するがＩＦＮ−γ分泌の増加を刺激しない化合物である。
【０３４５】
（実施例１１：ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子のＺＦＰ調節）この実施例において、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子を、発現がＺＦＰによって調節され得る分子標的の例として使用した。従って、誘導性ＺＦＰを含む安定な細胞株を、Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：３３８５０〜３３８６０に記載されるように確立した。この細胞株は、ＶＰ１６活性化ドメインに融合したヒトＥＰＯ遺伝子の上流の標的部位８６２ヌクレオチドを結合するように設計したＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）をコードする安定に統合された融合遺伝子を含んでいた。この融合遺伝子の発現は、ｔｅｔ転写制御配列の制御下にあり；従ってドキシサイクリンによって誘導可能であった。
【０３４６】
ＥＰＯＺＦＰ−８６２タンパク質に対する標的部位は、ＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣ（配列番号３６）であった。その認識へリックス（−１位と＋６位の間）のアミノ酸配列は、Ｆ１：ＱＳＳＤＬＴＲ（配列番号：３７）；Ｆ２：ＲＳＤＡＬＳＲ（配列番号：３８）；およびＦ３：ＲＳＤＥＲＫＲ（配列番号：３９）であった。ＥＰＯＺＦＰ−８６２ジンクフィンガータンパク質をＳＰ−１骨格（この遺伝子をＰＣＲによって組み立てる）に設計し、マルトース結合タンパク質との融合体として精製し、そして上に記載されるように、標的部位に対するその親和性について試験した。
【０３４７】
一過性かつ安定にトランスフェクトしたヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞を、Ｚｈａｎｇら（２０００）（上述）に記載されるように産生した。簡単には、細胞を、１０％の胎仔子ウシ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地中で増殖させた。安定なＴｅｔ誘導性ＥＰＯＺＦＰ細胞株を産生するため、ｐＥＰＯＺＦＰ８６２ ＤＮＡ由来のコード領域を、ＡｆｌＩＩＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。生じたｐＴＯ−ＥＰＯＺＦＰ８６２構築物を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＴ−Ｒｅｘ−２９３ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞株にトランスフェクトした。ＺｅｏｃｉｎＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地における選択の２週間後、安定なクローンを、単離し、そしてＺＦＰ発現のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）−依存活性化について分析した。
【０３４８】
一過性のトランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥを使用して実施した。細胞溶解物をトランスフェクションの４０時間後に収穫し、そしてルシフェラーゼ活性をデュアルライト（Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ）ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼレポーターアッセイシステム（Ｔｒｏｐｉｘ）によって測定した。内因性染色体ＥＰＯ遺伝子活性化をアッセイするために、ＥＰＯ ｍＲＮＡのノーザン分析およびＴａｑｍａｎ分析を、Ｚｈａｎｇら（上記）に詳細に記載されるように実施した。
【０３４９】
図２に示されるように、内因性ＥＰＯ遺伝子を、ＥＰＯＺＦＰ８６２の合成に対応して誘導的に発現した。図２Ａは、ＥＰＯ発現およびＴｅｔ応答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＰＯＺＦＰ８６２遺伝子のコピーを含む安定にトランスフェクトした２９３細胞に対するＤｏｘ用量応答曲線を示す。この実験について、順化培地を、Ｄｏｘの添加（図に示す濃度で）の４８時間後に収穫し、そしてＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットによって分析した。図２Ｂは、示されるＤｏｘ濃度で処理したＥＰＯＺＦＰ８６２細胞からのタンパク質抽出物の免疫ブロットを、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して示す。抽出物を、導入４８時間後の細胞から調製した。図２Ｃは、ＥＰＯＺＦＰ８６２で誘導したＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮＡ（ノーザン）ブロット分析を示す。ＥＰＯ ｍＲＮＡシグナルを、トランスフェクトしていない２９３細胞およびＥＰＯＺＦＰ８６２ｃでトランスフェクトした２９３細胞について（それぞれ、レーン１およびレーン２）、ならびに誘導していないＥＰＯＺＦＰ８６２細胞およびＤｏｘ誘導したＥＰＯＺＦＰ８６２細胞について（それぞれ、レーン３およびレーン４）示す。ＥＰＯプローブ化された膜を、はがし、そしてＺＦＰ ｍＲＮＡならびに負荷コントロールとなるヒトβアクチン遺伝子にハイブリダイズするアンチセンスフラグメントを含む３２Ｐ標識化リボプローブで再ハイブリダイズさせた。
【０３５０】
従って、内因性のヒトＥＰＯを、ＥＰＯ遺伝子に対して標的化されるＺＦＰの一過性の発散、または安定な発現のいずれかに応答して活性化し得る。
【０３５１】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示的な目的としてのみであり、それらを考慮した種々の改変または変更は、当業者に示唆され、そして本願の趣旨および範囲内ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３５２】
【図１】図１は、設計されたＺＦＰをコードする核酸分子を構築するプロセスを示す。
【図２Ａ】図２のパネルＡ〜Ｃは、テトラサイクリン応答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下で、ジンクフィンガータンパク質（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）の合成に対する応答において、安定に形質転換された２９３細胞中の、内因生ＥＰＯ遺伝子の誘導性発現を示す。図２Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定された、ＥＰＯ発現についてのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）用量応答性を示す。
【図２Ｂ】図２のパネルＡ〜Ｃは、テトラサイクリン応答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下で、ジンクフィンガータンパク質（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）の合成に対する応答において、安定に形質転換された２９３細胞中の、内因生ＥＰＯ遺伝子の誘導性発現を示す。図２Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した、示された濃度のドキシサイクリンで処理された細胞におけるＥＰＯＺＦＰ−８６２発現のイムノブロット分析を示す。
【図２Ｃ】図２のパネルＡ〜Ｃは、テトラサイクリン応答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下で、ジンクフィンガータンパク質（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）の合成に対する応答において、安定に形質転換された２９３細胞中の、内因生ＥＰＯ遺伝子の誘導性発現を示す。図２Ｃは、ＥＰＯＺＦＰ−８６２によって誘導されるＥＰＯｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。レーン１は、トランスフェクトされない細胞を示すコントロールであり；レーン２は、ＥＰＯＺＦＰ−８６２で一過性にトランスフェクトした細胞を示し；レーン３およびレーン４は、Ｄｏｘの非存在（レーン３）および存在（レーン４）において、ＥＰＯＺＦＰ−８６２で安定にトランスフェクトした細胞を示す。
【図１】
2011147448.tif 000027
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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