(57)【要約】【課題】疼痛の処置方法を提供すること。【解決手段】本発明は、Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネル遺伝子からｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導性の分解を引き起こす、一本鎖、または二本鎖のいずれかの短い干渉核酸；このような短い干渉核酸を含む薬学的組成物；このような短い干渉核酸を含む組み換えベクター；ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法；ポリペプチドの発現を阻害するための方法；細胞における膜電位をブロックするための方法；細胞におけるナトリウム電流をブロックするための方法；および、慢性疼痛を阻害するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、２００４年１０月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／６２２，４８４号の米国特許法１１９（ｅ）の下の優先権の利益を主張し、この出願の開示は、その全体が本明細書により参考として援用される。
【０００２】
（本発明の背景）
（本発明の分野）
本発明は、Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネル遺伝子からｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導性の分解を引き起こす、一本鎖、または二本鎖の短い干渉核酸；このような短い干渉核酸などを含む薬学的組成物；このような短い干渉核酸などを含む組み換えベクター；ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法；ポリペプチドの発現を阻害するための方法；細胞における膜電位をブロックするための方法；細胞におけるナトリウム電流をブロックするための方法；および慢性疼痛を阻害するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（本発明の背景）
慢性疼痛は、ＡＩＤＳ、癌化学療法、糖尿病によって誘発されるものであれ、末梢神経に対する直接の物理的外傷によるものであれ、末梢神経障害の主要な症状である。このような神経障害性疼痛は、しばしば高度な衰弱をもたらし、かつ治療的なインターベンションに対する耐性がある。
【０００４】
神経障害性疼痛の動物モデルは、神経障害状態の維持における顕著な特徴が、損傷後の末梢神経における感覚求心性ニューロンの異常な、持続する過度の興奮状態であることを示した。さらに、一般的な臨床上の知見は、リドカインなどの広域スペクトルのナトリウムチャネル遮断薬が、急速に神経障害性疼痛を抑え得ることである。しかしながら、神経障害性疼痛における個々のナトリウムチャネルのサブタイプの相対的な寄与は、はっきりしないままである。
【０００５】
電位開口型ナトリウムチャネルは、ニューロンにおける活動電位の惹起および伝播に不可欠である。さらに、それらのチャネルは、ニューロンの興奮状態の調節に関与する。それゆえ、電位開口型ナトリウムチャネルは、末梢神経系および中枢神経系の両方の全体にわたり侵害受容情報を伝達することにおいて重要な役割を演じる。末梢神経傷害は、傷害部位の周囲の主要な求心神経の膜にナトリウムチャネルを蓄積させる。この蓄積は、傷害された求心神経および傷害されてない隣接する求心神経の両方において、反復的な放出および興奮状態の増加を引き起こす。この興奮状態の増加は、神経障害性疼痛の発現にとって不可欠であるようである。
【０００６】
ナトリウムチャネルの少なくとも１０の異なるアイソフォームが、脳、ニューロンおよび横紋筋において識別された。ナトリウムチャネルの主要成分は、このチャネルの細孔を形成する２６０キロダルトンのαサブユニットである。このαサブユニットは、４つの相同なドメイン、ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩＶから構成され、これらの各々は、６つの膜貫通セグメント、Ｓ１〜Ｓ６から構成される。ほとんどのナトリウムチャネルは、３０キロダルトンの平均分子量を有する補助βサブユニット、β１〜β４を伴う。これらのβサブユニットは、それらのチャネルの発現および開口のレベルを調節する。
【０００７】
３つのナトリウムチャネルアイソフォーム、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８およびＮａｖ１．９は、主にＰＮＳにおいて発現される。Ｎａｖ１．７は、末梢神経系に広く存在し、結果として、シュワン細胞および神経内分泌細胞における、あらゆる種類の後根神経節ニューロンに存在する。Ｎａｖ１．７は、ナノモル量のテトロドトキシンを知覚しうる。Ｎａｖ１．８は、後根神経節および三叉神経節の感覚求心性の神経およびニューロンにだけ存在する。このＮａｖ１．８チャネルは、５０μＭより大きいＩＣ５Ｏを有するテトロドトキシンに対する高度の耐性がある。Ｎａｖ１．９もまた、後根神経節および三叉神経節の細繊維において発現され、そして、ナノモル濃度のテトロドトキシンに対する耐性もあるが、約４０μＭのテトロドトキシンにより、最大の半分までブロックされる。
【０００８】
疼痛処置における治療標的を求める最近の関心は、成人の後根神経節ニューロンに見られるテトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルに集中した。これらのニューロンのかなりの部分が、疼痛を感知する「傷害受容器」であることは公知である。このようなナトリウムチャネルの１つは、正式にＰＮ３、または末梢神経ナトリウムチャネル３型として知られるＮａｖ１．８である。このチャネルは、慢性疼痛状態の後根神経節においてアップレギュレートされることが発見された。さらに、Ｎａｖ１．８の生物物理特性は、このチャネルを、損傷後の末梢ニューロンの持続する反復性の放出を維持する有望な候補とする。さらに、後根神経節の感覚ニューロンの周辺に限定されるＮａｖ１．８の発現は、このチャネルの遮断が、最小限の副作用で神経障害性疼痛からの解放を可能にし得ることを示す。しかしながら、この解放の可能性は、現在入手可能なナトリウムチャネル遮断薬が、ナトリウムチャネルのサブタイプ間を区別しないので、薬理学的に試験することができない。
【０００９】
神経障害性疼痛の動物モデルにおけるＮａｖ１．８発現のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる標的化が、このチャネルの選択的に減じられた発現が、神経障害性疼痛からの解放を可能にし得るかどうかを試験するために採用された。Ｐｏｒｒｅｃａら（非特許文献１）を参照のこと。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用したＮａｖ１．８発現の阻害はまた、他の動物の疼痛モデルにおける慢性疼痛を阻害することが発見された。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（非特許文献２）；およびＫｈａｓａｒら（非特許文献３）を参照のこと。さらにデータは、Ｎａｖ１．８に対して特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる後根神経節ニューロンにおけるＮａｖ１．８タンパク質の選択的ノックダウンが、脊髄神経結紮損傷により引き起こされる痛感過敏症および異痛を防止したことを示す。Ｋｉｍら（非特許文献４）を参照のこと。上記データは、幾つかの末梢神経性状態および炎症状態におけるＮａｖ１．８の病態生理学的役割を示す。
しかしながら、治療としてのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、インビボにおけるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの不安定さ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの限られた効用、および「標的を外れた」効果を生じるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの傾向により制限される。Ｎａｖ１．８を特異的にブロックし得る低分子は識別されなかったので、疼痛の処置においてＮａｖ１．８を調節する別の方法に対する必要が引き続きある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＰＮ３／ＳＮＳ  ａｎｄ  ＮａＮ／ＳＮＳ２，ｉｎ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｉｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９９，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．７６４０−７６４４
【非特許文献２】「Ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  Ｎａｖ１．８（ＰＮ３／ＳＮＳ）  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｐａｉｎ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．８６９０−８６９６
【非特許文献３】「Ａ  ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ」，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，ｖｏｌ．２５６，ｎｏ．１，ｐｐ．１７−２０
【非特許文献４】「Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｏｒａｔｈｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ」，Ｐａｉｎ，１９９２，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．３５５−３６３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｎａｖ１．８の発現を特異的にノックダウンするための短い干渉核酸およびｓｉＲＮＡを提供することにより上記必要を充たす。ｓｉＲＮＡの使用は、ｓｉＲＮＡが高度の標的特異性を有し、標的を外れた障害を減じ、かつ高いレベルの抑圧を達成するので、魅力的である。短い干渉ＲＮＡ、または低分子量干渉ＲＮＡを意味するｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の１形態である。ＲＮＡｉは、細胞における特定ｍＲＮＡを分解して、コードされたタンパク質のレベルをノックアウト、またはノックダウンすることにより、遺伝子機能を調査するために使用される技術である。ｓｉＲＮＡの作用メカニズムは、多段階プロセスを伴うと考えられる。まず、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーによって認識され、そして、２１個〜２３個のヌクレオチドのｓｉＲＮＡへと分割される。次に、それらのｓｉＲＮＡはが、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるＲＮＡｉ標的化複合体へと組み込まれる。ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡを認識する、二重機能のヘリカーゼおよびＲＮａｓｅである。標的ｍＲＮＡを認識した後、上記ＲＩＳＣは、このｍＲＮＡと結合し、そして、上記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が上記標的ｍＲＮＡに対し、相補的塩基対形成（ワトソン−クリック塩基対形成）によって結合することを可能とするｓｉＲＮＡを解放する。この解放は、上記ｍＲＮＡの加水分解および崩壊を引き起こし、タンパク質発現の減少をもたらす。その上に、ｓｉＲＮＡは、どうやら再利用されるようであり、結果として、１つのｓｉＲＮＡ分子が、約１０００のｍＲＮＡ分子の切断を誘発し得る。それゆえ、ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な他の技術よりも効率的である。
【００１２】
本明細書中で開示されたすべての参考文献、刊行物、特許出願および特許は、その全体が、本明細書により参考として援用される。
【００１３】
（本発明の概要）
本発明は、短い干渉核酸、特に上記Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネル遺伝子からｍＲＮＡのＲＮＡ誘導性の分解を標的とし、そして、この分解を引き起こす短い干渉核酸、および、このような短い干渉核酸を使用する方法に関する。
【００１４】
本発明の一実施形態は、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸を提供する。この単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸は、さらに３’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含み得る。上記短い干渉核酸のいずれか１つ以上および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含み、かつこれらに対する相補的なヌクレオチド配列をさらに含む、単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸を提供する。この単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸は、さらに３’オーバーハングを含み得る。上記短い干渉核酸のいずれか１つ以上および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００１６】
別の実施形態は、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含み、かつ、これらに対する相補的なヌクレオチド配列をさらに含む、単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸を提供し、ここで、上記ヌクレオチド配列および相補的なヌクレオチド配列は、ハイブリダイズして二重鎖を形成する。上記ヌクレオチド配列および相補的なヌクレオチド配列は、各々、さらに３’オーバーハングを含み得る。上記二重鎖のいずれか１つ以上および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００１７】
さらなる実施形態は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸を提供し、ここで、上記センス鎖およびアンチセンス鎖はハイブリダイズして二重鎖を形成し、上記センス鎖は標的配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして、上記標的配列は、以下：配列番号１２〜配列番号５７７からなる群より選択される。上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々、さらに３’オーバーハングを含み得る。上記二重鎖のいずれか１つ以上および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００１８】
本発明の一実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、組み換えベクターを提供する。
【００１９】
別の実施形態は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を阻害するための方法を提供し、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、１つ以上の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８  ｍＲＮＡを発現し得る細胞とを接触させる工程を包含する。
【００２０】
別の実施形態は、ポリペプチドの発現を阻害するための方法を提供し、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、１つ以上の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８ポリペプチドを発現し得る細胞とを接触させる工程を包含する。
【００２１】
別の実施形態は、細胞におけるＮａｖ１．８に由来する膜電位をブロックするための方法を提供し、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、１つ以上の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８ポリペプチドを発現する細胞とを接触させる工程を包含する。
【００２２】
さらなる実施形態は、細胞におけるＮａｖ１．８に由来するナトリウムイオンフラックスをブロックするための方法を提供し、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、１つ以上の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８ポリペプチドを発現する細胞とを接触させる工程を包含する。
【００２３】
さらなる実施形態は、慢性疼痛を阻害するための方法を提供し、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、１つ以上の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む有効量の薬学的組成物を、この薬学的組成物の投与を必要とする被験体に投与する工程を包含する。上記単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸は、さらに３’オーバーハングを含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下の短い干渉核酸などが提供される：
（項目１）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の配列番号からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれらのアナログを含む、単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸。
（項目２）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸。
（項目３）
さらに３’オーバーハングを含む、項目１に記載の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸。
（項目４）
項目１または項目３のいずれかに記載の短い干渉核酸、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目５）
項目１または項目３のいずれかに記載の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸であって、さらに、該短い干渉核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む、短い干渉核酸。
（項目６）
さらに３’オーバーハングを含む、項目５に記載の相補的なヌクレオチド配列。
（項目７）
項目５または項目６のいずれかに記載の短い干渉核酸および相補的なヌクレオチド配列、ならびに、薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目８）
前記ヌクレオチド配列と前記相補的なヌクレオチド配列とがハイブリダイズして二重鎖を形成する、項目５に記載の単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸。
（項目９）
前記ヌクレオチド配列が、さらに３’オーバーハングを含み、かつ前記相補的なヌクレオチド配列が、さらに３’オーバーハングを含む、項目８に記載の二重鎖。
（項目１０）
項目８または項目９のいずれかに記載の二重鎖、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１１）
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸であって、該センス鎖と該アンチセンス鎖とがハイブリダイズして二重鎖を形成し、該センス鎖が、実質的に標的配列と同一であるヌクレオチド配列を含み、そして、該標的配列が、配列番号１２〜配列番号５７７からなる群より選択される、短い干渉核酸。
（項目１２）
前記センス鎖が、さらに３’オーバーハングを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、さらに３’オーバーハングを含む、項目１１に記載の二重鎖。
（項目１３）
項目１１または項目１２のいずれかに記載の二重鎖、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１４）
項目１または項目３に記載のヌクレオチド配列を含む、組み換えベクター。
（項目１５）
ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を阻害するための方法であって、項目１または項目３に記載の短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８  ｍＲＮＡを発現し得る細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目１６）
ポリペプチドの発現を阻害するための方法であって、項目１または項目３に記載の短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８ポリペプチドを発現し得る細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目１７）
細胞における膜電位をブロックするための方法であって、項目１または項目３に記載の短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８ポリペプチドを発現し得る細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目１８）
細胞におけるナトリウム電流をブロックするための方法であって、項目１または項目３に記載の短い干渉核酸と、Ｎａｖ１．８ポリペプチドを発現し得る細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目１９）
慢性疼痛を阻害するための方法であって、項目４、項目７、項目１０または項目１３のいずれかに記載の薬学的組成物の有効量を、この組成物を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目２０）
慢性疼痛を阻害するための医薬の製造における、項目１または項目３に記載の１つ以上の短い干渉核酸の使用。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用されるすべての文献は、その全体が参考として援用される。
【００２５】
（定義）
本願において使用される場合、「アンチセンス鎖」という用語は、センス鎖と相補的である核酸配列を意味する。
【００２６】
本願において使用される場合、「慢性疼痛」という用語は、長期間継続する疼痛を意味する。
【００２７】
本願において使用される場合、「相補的な」という用語は、別のヌクレオチド配列とワトソン−クリック塩基対形成を示す（すなわち、プリンがピリミジンに結合する）、ヌクレオチド配列を意味する。例えば、ヌクレオチド配列が、センス鎖を表し得る一方で、それと相補的なヌクレオチド配列は、アンチセンス鎖を表し得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「二重鎖」という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖のようなハイブリダイズした２つの相補的な核酸配列を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「発現する」および「発現」という用語は、核酸の転写および翻訳がポリペプチドを生成する分子生物学的なプロセス、すなわち、遺伝情報が遺伝子からタンパク質へと流れるプロセス、および遺伝子の効果が発現される分子生物学的なプロセスを意味する。
【００３０】
「相同性」および「相同的な」という用語は、２つの核酸配列間の比較をいい、これらの配列が、整列および比較される場合、「相同性」および「相同的な」という用語は、類似性を示す。２つの核酸配列間の相同性は、配列比較により決定されても、ハイブリダイゼーション条件に基づいて決定されてもよい。ヌクレオチド配列の相同性は、ヌクレオチドの挿入または欠失を考慮するために最適に整列されるときに、２つの配列（またはその相補鎖）におけるヌクレオチド残基が同一である場合に観察される。相同性はまた、１つのヌクレオチド配列が、選択的なハイブリダイゼーション条件の下で、別の配列にハイブリダイズする場合にも存在する。相同性を確立するためのハイブリダイゼーションにおいて採用される条件のストリンジェンシーは、塩濃度、温度、有機溶媒の存在および他のパラメータなどの要素に依存する。
【００３１】
本願において使用される場合、「ノックダウン」という用語は、ｍＲＮＡの発現レベルを減少し、結果として、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が減縮されることを意味する。
【００３２】
本願において定義される「ノックアウト」という用語は、ｍＲＮＡの発現を妨害し、結果として、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が生じないことを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡを意味する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「膜電位」という用語は、細胞膜の両側にわたる電荷の差を意味する。
【００３５】
本願において使用される場合、「疼痛」という用語は、通常は疾患、傷害、またはストレスの結果である、微かな不快さから極端な苦痛もしくは激痛までの範囲の身体における不快な感覚などの肉体的な痛み；または思考の不快さ、精神的な苦痛、苦悩、不安もしくは悲嘆などの精神的な痛みを意味する。
【００３６】
本願において使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉を意味し、このＲＮＡ干渉は、細胞または生体における特定ｍＲＮＡ標的を分解し、これによりそのコードされるタンパク質のレベルをノックアウトするか、またはノックダウンすることにより、遺伝子機能を調査するために使用される技術である。これはまた、ＲＮＡサイレンシングとも呼ばれる。
【００３７】
本願において使用される場合、「センス鎖」という用語は、核酸のコーディング鎖を意味する。
【００３８】
本願において使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、短い干渉リボ核酸か、または低分子量干渉リボ核酸のいずれかを意味し、これは、ＲＮＡ干渉のＲＮＡサイレンシングメカニズムの型の１つである。
【００３９】
本願において定義される「短い干渉核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）か、リボ核酸（ＲＮＡ）のいずれか、またはそれらの両方の組み合わせの短い干渉性のストレッチを意味する。この用語はまた、これらの核酸への修飾および従来にない（ｎｏｎ−ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ）塩基も含む。好ましくは、短い干渉核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「ナトリウム電流」という用語は、細胞の膜電位のナトリウムイオンの効果に起因する部分を意味する。
【００４１】
「被験体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を意味する。
【００４２】
本願において使用される場合、「トランスフェクトする」という用語は、ウイルスの使用などを通して、細胞への核酸の導入を意味する。
【００４３】
本願において定義される「転写」という用語は、一本鎖ＲＮＡが二本鎖ＤＮＡから合成される分子生物学的なプロセスを意味する。
【００４４】
本願において使用される場合、「翻訳」という用語は、ポリペプチドがｍＲＮＡから合成される分子生物学的なプロセスを意味する。
【００４５】
本明細書中で定義される「処置」という用語は、任意の臨床上望ましい、または有益な効果（１つ以上の症状の軽減、疾患または障害の退行、疾患または障害の進行の遅滞または停止を含むが、それらに限定されない）をもたらす、疾患または障害に対する治療的、予防的、または抑制的な手段を意味する。
【００４６】
（Ｎａｖ１．８の特徴づけ）
Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネルは、１つのαサブユニットおよび少なくとも１つのβサブユニットを含む。Ｎａｖ１．８の完全なオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、当該分野において公知である。例えば、ラットＮａｖ１．８に対する核酸配列およびアミノ酸配列は両方とも、それぞれ、米国特許番号第６，４５１，５５４号の配列番号１および配列番号２において見られ得る。Ｎａｖ１．８およびそのサブユニットに対する核酸配列およびアミノ酸配列はまた、以下の表１に示されるように、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいても見られ得る。
【００４７】
【表１】
2011015695.tif 000002
ヒトＮａｖ１．８遺伝子は、ラットＮａｖ１．８遺伝子と、高度の相同性（約８２％）を有する。それゆえ、ラットＮａｖ１．８ナトリウムチャネルをノックダウンし得るラットＮａｖ１．８の短い干渉核酸に対応する、ヒトＮａｖ１．８の短い干渉核酸は、ヒトＮａｖ１．８ナトリウムチャネルのノックダウンに有効であるように思われる。
【００４８】
（核酸）
Ｎａｖ１．８  ｍＲＮＡを標的とする短い干渉リボ核酸を含む組成物および方法は、慢性疼痛の処置のためにＮａｖ１．８ナトリウムチャネルの発現をノックダウンまたはノックアウトするために有利に使用される。特に、本発明の短い干渉リボ核酸は、Ｎａｖ１．８  ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性の破壊を引き起こす。
【００４９】
Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネルは、慢性疼痛状態における後根神経節においてアップレギュレートされる。それゆえ、Ｎａｖ１．８  ｍＲＮＡの発現ならびにＮａｖ１．８の機能をノックダウンまたはノックアウトし得る短い干渉核酸配列は、慢性疼痛をブロックまたは処置することに有用であるはずである。
【００５０】
それゆえ、本発明は、単離されたか、または組み換えの短い干渉核酸を提供する。本明細書中に使用される場合、「単離された」という用語は、通常は細胞において、または組み換え発現系において見られる、他の成分から実質的に分離された、ＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子などの核酸、または混合ポリマーを意味する。これらの成分としては、リボゾーム、ポリメラーゼ、血清成分および隣接ゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、このようにその天然に存在する環境から単離された短い干渉核酸を含み、そして、組み換えの、もしくはクローン化された短い干渉核酸単離体、および化学的に合成されたアナログ、または異種の系によリ生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含む。
【００５１】
単離された核酸は、一般に、分子の均質な組成物であるが、いくつかの実施形態においては、微細な異種性を含んでいてもよい。このような異種性は、代表的には、核酸コーディング配列の末端、または、所望の生物学的な機能もしくは活性に重要ではない領域において見られる。
【００５２】
「組み換え」の短い干渉核酸は、その製造方法または構造のいずれかによって規定される。従って、いくつかの組み換え核酸は、操作または選択のいずれかにおいて、人間の介入を必要とする組み換えＤＮＡ技術を使用して作製される。他の組み換え核酸は、互いに本来は連続しない２つの断片を融合することによって作製される。加工されたベクター、ならびにあらゆる合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導された配列を含む核酸が包含される。
【００５３】
短い干渉核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖の短い干渉核酸は、センス鎖を含み、一方で、二本鎖の短い干渉核酸は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。好ましくは、二本鎖の短い干渉核酸におけるセンス鎖とアンチセンス鎖とは、ワトソン−クリック塩基対形成の相互作用によってハイブリダイズして二重鎖を形成するか、または、一本鎖ヘアピン領域によって接続される。後者の型のｓｉＲＮＡのヘアピン領域は、「ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）」タンパク質またはその等価物によって細胞内で切断され、２つの個々に塩基対形成したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【００５４】
短い干渉核酸は、１７ヌクレオチド長〜２９ヌクレオチド長、好ましくは、１９ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長、より好ましくは、２１ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長の範囲であり得、そして、最も好ましくは２１ヌクレオチド長である。
【００５５】
好ましくは、短い干渉核酸は、ｓｉＲＮＡである。すなわち、配列中の全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチド塩基である。
【００５６】
しかし、本発明はまた、低分子量干渉核酸のアナログを包含する。短い干渉核酸のアナログは、１以上のヌクレオチド塩基の付加、欠失、変更、置換または修飾を含む。例えば、短い干渉核酸は、1つ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基もしくは非伝統塩基、また
はこれらのいずれかの組み合わせを含むように、変更、置換または修飾され得る。
【００５７】
好ましくは、本発明の短い干渉核酸の一方、または両方の鎖は、３’オーバーハングを含む。本明細書に使用される場合、「３’オーバーハング」は、短い干渉核酸鎖の３’末端から伸長する少なくとも１つの不対ヌクレオチドをいう。この３’オーバーハングは、１個〜６個のヌクレオチド（リボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドを含む）、好ましくは１個〜５個のヌクレオチド、より好ましくは１個〜４個のヌクレオチド、特に好ましくは２個〜４個のヌクレオチドの範囲であり得、そして最も好ましくは２個のヌクレオチドであり得る。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも３’オーバーハングを含む。このオーバーハングの長さは、その二重鎖の各々の鎖に対して同じであっても、異なっていてもよい。最も好ましくは、３’オーバーハングは、その二重鎖の両鎖に存在し、そして、各々の鎖に対するオーバーハングは、２ヌクレオチド長である。例えば、その二重鎖の各鎖は、ジチミジル酸（「ｔｔ」）、またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含み得る。
【００５９】
上記短い干渉核酸の安定性を向上させるために、この３’オーバーハングはまた、分解に対しても安定化され得る。１つの実施形態において、３’オーバーハングは、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることにより安定化される。あるいは、修飾アナログによるピリミジンヌクレオチドの置換（例えば、２’−デオキシチミジンでの３’オーバーハング中のウリジンヌクレオチドの置換）は、許容され、そして、ＲＮＡｉ分解の有効性に影響しない。特に、２’−デオキシチミジンにおいて２’ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地における３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性をかなり向上させる。
【００６０】
上記短い干渉核酸は、Ｎａｖ１．８標的ｍＲＮＡを標的とする。本明細書に使用される場合、「Ｎａｖ１．８標的ｍＲＮＡを標的とする」短い干渉核酸は、センス鎖が、標的ｍＲＮＡの配列と同一か、または実質的に同一であるヌクレオチド配列を有し、かつこのｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性の分解を誘導し得る、一本鎖または二本鎖のいずれかの短い干渉核酸を意味する。勿論、二本鎖ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、このｓｉＲＮＡおよび標的ｍＲＮＡのセンス鎖の両方と相補的である配列を有する。
【００６１】
本明細書に使用される場合、標的配列と「実質的に同一である」短い干渉核酸は、標的配列と１個〜４個のヌクレオチド異なる核酸配列である。例えば、短い干渉核酸は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性の分解が、この短い干渉核酸により誘発されるかぎり、標的配列と１個、２個、３個、または４個のヌクレオチド異なるセンス鎖を含み得る。
【００６２】
本明細書に使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」、または「標的配列」は、ヒトＮａｖ１．８  ｍＲＮＡ、Ｎａｖ１．８ｍの変異体もしくは選択的スプライシング形態、または同族Ｎａｖ１．８遺伝子に由来するｍＲＮＡを意味する。本明細書に使用される場合、「変異体」という用語は、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、またはヌクレオチド修飾を有することにより上記標的ｍＲＮＡと異なる短い干渉核酸を意味する。これらの変更は、例えば、以下：上記短い干渉核酸の末端、またはこの短い干渉核酸の内部ヌクレオチドの１つ以上などへの非ヌクレオチド質の付加；上記短い干渉核酸にヌクレアーゼ消化に対する耐性を有させる修飾；またはデオキシリボヌクレオチドでの短い干渉核酸における１つ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。本明細書に使用される場合、「同族」という用語は、別の哺乳動物種に由来する核酸を意味する。ヒトＮａｖ１．８  ｍＲＮＡは、そのそれぞれの同族、または変異体と共通する標的配列を含み得ると理解される。それゆえ、このような共通する標的配列を含む短い干渉核酸は、この共通する標的配列を含む異なるＲＮＡ型のＲＮＡｉ媒介性の分解を誘導し得る。
【００６３】
本発明の短い干渉核酸は、任意の標的ｍＲＮＡ配列における約１９個〜２５個の隣接ヌクレオチドの任意のストレッチの標的とされ得る。短い干渉核酸に対する標的配列を選択するための技術は、当該分野で公知である。さらに、標的ｍＲＮＡに関する標的配列は、開始コドンから５０個のヌクレオチド〜１００個のヌクレオチド下流に、すなわち、３’方向に向かって始まる、標的ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡから選択され得る。しかしながら、この標的配列は、５’もしくは３’非翻訳領域に、または開始コドンの近くの領域に位置し得る。Ｎａｖ１．８  ｃＤＮＡ配列における適切な標的配列は、実施例１で与えられる。
【００６４】
本発明の短い干渉核酸は、部分的に精製された核酸、実質的に純粋な核酸、合成核酸、または組み換え生成された核酸を含み得る。本明細書に定義される「実質的に純粋な」という用語は、他の混入タンパク質、他の混入核酸および元々の起源となる生体に由来する他の生物学的因子、または組み換えＤＮＡ発現系にない短い干渉核酸を意味する。純粋性は、標準的な方法で分析され得、そして、代表的には少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の純粋性を超える。この純粋性評価は、大量基準、またはモル基準で為され得る。
【００６５】
本発明の短い干渉核酸は、当業者に公知の多数の技術のいずれか１つを使用して入手され得る。さらに、この短い干渉核酸はまた、２つの別個の相補的な核酸分子としても、または２つの相補的な領域を有する１つの核酸分子としても合成され得る。例えば、本発明の短い干渉核酸は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）および従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、または他の周知の方法を使用して化学的に合成される。さらに、この短い干渉核酸は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡの一部門）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）などの市場供給者により、生成され得る。
【００６６】
あるいは、短い干渉核酸はまた、任意の適切なプロモーターを使用して、環状ＤＮＡプラスミド、または線形ＤＮＡプラスミドなどの組み換え発現ベクターからも、発現され得る。組み換え発現ベクターは、代表的には、短い干渉核酸の１つをコードする核酸を含む自己複製ＤＮＡ構築物または自己複製ＲＮＡ構築物であり、この短い干渉核酸は、通常は適合性のある宿主細胞における核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子制御エレメントと作動可能に連結される。遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系、または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、そして、代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意のオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを高める転写プロモーター、適切なリボゾーム結合部位、翻訳開始部位、ポリアデニル化部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終了する配列を含み得る。発現ベクターはまた、このベクターが、宿主細胞から独立して複製することを可能にする複製起点、または抗体に対する耐性を付与する遺伝子などの選択遺伝子も含み得る。
【００６７】
本発明において使用され得るベクターは、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片、および宿主のゲノムへの核酸の組み込みを促進し得る他のビヒクルを含む。プラスミドは、一般に使用されるベクターの形態であるが、相当する機能を果たし、当該分野で公知であるか、または公知になるあらゆる他のベクターの形態が、本明細書での使用に適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８５および補遺、ならびにＲｏｄｒｉｇｕｅｚら編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９８８を参照のこと。
【００６８】
プラスミドからの本発明の短い干渉核酸を発現させるための適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ  プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当該分野の技術の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドはまた、特定の組織における、または特定の細胞内環境における短い干渉核酸の発現のための、誘導性もしくは調節可能なプロモーターも含み得る。
【００６９】
組み換えプラスミドから発現された短い干渉核酸は、標準的な技術により培養細胞発現系から単離されても、細胞内で発現されてもよい。本発明の短い干渉核酸は、２つの別個の相補的なＲＮＡ分子か、または２つの相補的な領域を有する１つのＲＮＡ分子のいずれかとして、組み換えプラスミドから発現され得る。本発明の短い干渉核酸を発現させるために適切であるプラスミドの選択、短い干渉核酸を発現させるための核酸配列をこのプラスミドに挿入するための方法、およびその組み換えプラスミドを目的の細胞に送達するための方法は、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，ｖｏｌ．２０、ｐｐ．４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，ｖｏｌ．２９６、ｐｐ．５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００２，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４８−９５８；Ｌｅｅら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．５００−５０５；Ｐａｕｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．５０５−５０８；およびＳｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ．９９，２００２，ｐｐ５５１５−５５２０を参照のこと。
【００７０】
一例として、プラスミドは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下のポリＴ終止配列と作動可能に結合したセンスＲＮＡ鎖コーディング配列およびヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下のポリＴ終止配列と作動可能に結合したアンチセンスＲＮＡ鎖コーディング配列を含み得る。
【００７１】
本明細書に使用される場合、「と作動可能に結合した」という用語は、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、別の配列に隣接することを意味する。好ましくは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードする配列は、５’方向においてポリＴ終止シグナルに直接的に隣接する。それゆえ、プラスミドからセンス配列またはアンチセンス配列を転写する間、このポリＴ終止シグナルは、転写を終了させるように作用する。
【００７２】
本明細書に使用される場合、「プロモーターの制御下」という用語は、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、このプロモーターの３’末端に位置し、結果として、このプロモーターがセンス鎖またはアンチセンス鎖のコーディング配列の転写を開始し得ることを意味する。
【００７３】
短い干渉核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法で実行され得る。原核生物としては、グラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方、例えば、大腸菌およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。より高等な真核生物細胞としては、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類およびげっ歯類）の両方の動物細胞から確立された組織培養細胞株が挙げられる。多くの適切な宿主細胞が、当該分野において公知である。好ましい宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞および神経芽種／ＤＲＧ細胞系ＮＤ７／２３である。
【００７４】
本発明の短い干渉核酸はまた、組み換えウイルスベクターからも発現され得る。本発明の組み換えウイルスベクターは、本発明の短い干渉核酸をコードする配列および短い干渉核酸配列を発現させるための任意の適切なプロモーターを含む。ウイルスベクターから短い干渉核酸を発現させるために適切なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当該分野の技術の範囲内である。本発明の組み換えウイルスベクターはまた、特定の組織において、または特定の細胞内環境において、短い干渉核酸の発現に対して、誘導性または調節可能であるプロモーターをも含み得る。本発明の短い干渉核酸をインビボで細胞に送達するための組み換えウイルスベクターの使用は、実施例５においてより詳細に議論される。
【００７５】
本発明の短い干渉核酸は、２つの別個の相補的な核酸分子か、２つの相補的な領域を有する１つの核酸分子のいずれかとして、組み換えウイルスベクターから発現され得る。
【００７６】
発現されるべき短い干渉核酸分子についてのコーディング配列を受容し得る任意のウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルスなどに由来するベクター）が使用され得る。さらに、ウイルスベクターの向性はまた、他のウイルスに由来するエンベロープタンパク質、または他の表面抗原を有するベクターを偽型することによっても改変され得る。
【００７７】
本発明における使用のために適切である組み換えウイルスベクターの選択、短い干渉核酸を発現させる核酸配列をこのベクターに挿入するための方法、およびウイルスベクターを目的の細胞に送達するための方法は、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．，１９９５，ｖｏｌ．２，ｐｐ．３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，ｖｏｌ．６，ｐｐ．６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．，１９９０，ｖｏｌ．１，ｐｐ．５−１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，ｖｏｌ．３９２，ｐｐ．２５−３０を参照のこと。
【００７８】
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスに由来するベクターである。特に好ましい実施形態において、本発明の短い干渉核酸は、Ｕ６プロモーターを含む組み換えアデノウイルスベクターからの一本鎖核酸分子として発現される。好ましいウイルスベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターでもある。例えば、Ｂｕｒｔｏｎ、Ｅ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００５  Ａｕｇ，７（４）：３２６−３６およびＹｅｏｍａｎｓ  Ｄ．Ｄ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．，２００５  Ｆｅｂ，１６（２）：２７１−７を参照のこと。制限ではなく一例として、上記発現された一本鎖核酸分子は、一本鎖のヘアピン領域によってつながれた２つの相補的な領域を含み得る。この一本鎖核酸分子は、さらに３’ハングオーバーを含み得る。
【００７９】
（インビボ方法およびインビトロ方法）
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性の分解を引き起こす短い干渉核酸の能力は、細胞におけるＲＮＡ、またはタンパク質のレベルを測定するための標準的な技術を使用して評価され得る。例えば、短い干渉核酸は、培養細胞に送達され得、そして、標的ｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット法、すなわち、ドットブロッティング技術により、または定量ＲＴ−ＰＣＲにより、測定され得る。あるいは、培養細胞におけるＮａｖ１．８タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロット法により測定され得る。標的ｍＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルに対する、本発明の短い干渉核酸の効果を測定するための適切な細胞培養系は、以下の実施例２に記載される。
【００８０】
既に議論されたように、本発明の短い干渉核酸は、Ｎａｖ１．８  ｍＲＮＡ、またはその選択的スプライシング形態、変異体もしくは同族のＲＮＡｉ媒介性の分解を標的とし、これを引き起こす。本発明の短い干渉核酸による標的ｍＲＮＡの分解は、Ｎａｖ１．８遺伝子からの機能的遺伝子産物の生成を減少させる。このように、本発明は、被験体におけるＮａｖ１．８の発現を阻害するための方法、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法、ポリペプチドの発現を阻害するための方法、細胞における膜電位に由来するＮａｖ１．８をブロックするための方法、および細胞におけるナトリウム電流に由来するＮａｖ１．８をブロックするための方法を提供する。本発明の方法において、ブロックは、膜電位に由来するＮａｖ１．８、またはナトリウム電流に由来するＮａｖ１．８における、消滅または減少を含むが、それらに限定されない。これらの方法は、実施例において、より徹底的に詳説されるが、これらの方法は全て、幾つかの共通の特性を共有する。
【００８１】
上記方法の各々の工程は、細胞と短い干渉核酸とを接触させる工程を含む。インビボにおいて、この接触工程は、薬学的組成物中の短い干渉核酸を被験体に投与する工程を包含する。インビトロにおいて、この接触工程は、細胞および短い干渉核酸が相互に接触し得るように、この細胞および短い干渉核酸を物理的に密接に近接にさせる工程を包含する。この接触工程は、短い干渉核酸が細胞に入ることを可能にし、そして、Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネル遺伝子からｍＲＮＡのＲＮＡｉ誘導性の分解を引き起こす。
【００８２】
好ましくは、上記接触工程は、配列番号１〜配列番号１１の短い干渉核酸を利用する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１０および配列番号１１の短い干渉核酸が好ましい。配列番号２および配列番号５の短い干渉核酸は、より好ましい。配列番号１および配列番号３の短い干渉核酸は、最も好ましい。制限ではなく一例として、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の１つ以上の短い干渉核酸もまた、本発明の方法において利用され得る。制限ではなく一例として、以下：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１０および配列番号１１の１つ以上の短い干渉核酸はまた、本発明の方法において使用され得る。その上、本発明の方法を実施する際、本発明の１つ以上の短い干渉核酸は、細胞または被験体に同時に、または連続的に投与され得ることが理解される。本発明は、さらに１つ以上のタンパク質および／または標的核酸と複合体化された本発明の短い干渉核酸と、１つ以上の本発明の短い干渉核酸を含む細胞とを提供する。
【００８３】
（薬学的組成物）
本発明の短い干渉核酸およびｓｉＲＮＡは、慢性疼痛を処置するために治療的に使用され得る。本発明の種々の化合物は、薬学的組成物内に組み込まれ得る。例えば、薬学的組成物は、一本鎖の短い干渉核酸、３’ハングオーバーを有する一本鎖の短い干渉核酸、二本鎖の短い干渉核酸、または各鎖が３’ハングオーバーを有する二本鎖の短い干渉核酸を含み得る。好ましくは、薬学的組成物は、配列番号１〜配列番号１１の短い干渉核酸を含む。配列番号２および配列番号５の短い干渉核酸は、より好ましいが、配列番号１および配列番号３の短い干渉核酸が、最も好ましい。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１の１つ以上の短い干渉核酸もまた、本発明の薬学的組成物において利用され得る。制限ではなく一例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１０および配列番号１１の１つ以上の短い干渉核酸は、本発明の薬学的組成物において使用され得る。
【００８４】
このような物質の治療的な投与のための代表的なプロトコルは、当該分野で周知である。本発明の組成物が単純な溶液で投与され得るとしても、これらの組成物は、より代表的には、キャリア、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアなどの他の物質との組み合わせで投与される。「薬学的に受容可能なキャリア」という用語は、被験体に本発明の組成物を送達するのに適切な、任意の適合性があり、非毒性の物質を意味する。例えば、滅菌水、アルコール、脂肪、蝋および不活性固体は、キャリアに含まれ得る。緩衝剤および分散剤などの薬学的に受容可能なアジュバントもまた、上記薬学的組成物中に組み込まれ得る。一般に、このような薬物の非経口投与に有用である組成物は、周知である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，第７版。
【００８５】
治療処方物が投与され得る。処方物は、代表的には、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアとともに、少なくとも１つの活性成分を含む。処方物は、経口、経直腸、経鼻腔、経皮、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適切である処方物を含み得る。処方物は、簡便に単位投薬形態で提供され得、そして薬学の分野において周知の任意の方法で調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら編、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、前出、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ；Ａｖｉｓら編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０を参照のこと。
【００８６】
一例として、任意の本発明の短い干渉核酸またはベクターは、経皮送達可能であり得る。この経皮組成物は、クリーム、ローション、エアロゾルおよび／または乳濁液の形態を取り得、そして、この目的のためには当該分野においてconventionalである、マトリクスまたはレザバ型の経皮パッチに含まれ得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，第１７版を参照のこと。
【００８７】
治療用途において必要とされる投薬レジメンは、治療物質の作用を変更し得る種々の因子（例えば、患者の状態、体重、性別および食事、あらゆる感染の重症度、投与時間および他の臨床上の因子）を考慮して、その主治医により決定される。しばしば、処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために低レベルから上方に滴定される。一般に、毎日の投薬量は、体重１キログラム当たり１００μｇ〜５００μｇの範囲に入る。代表的には、投薬量の範囲は、体重１キログラム当たり１５０μｇ〜２５０μｇである。好ましくは、投薬量の範囲は、体重１キログラム当たり２００μｇである。投薬量は、より小さな分子のサイズと、短縮する可能性のある投与後の半減期（クリアランス時間）とを考慮して調整され得る。本発明の組成物の「有効量」は、被験体における慢性疼痛を改善する量である。
【００８８】
慢性疼痛は、以下の特徴のうちの１つ以上を含む：約２ヶ月または約３ヶ月間存在する疼痛、日常の医療管理によって完全には解放されない疼痛、または通常の回復期間を超えて継続する疼痛。慢性疼痛の例としては、慢性神経障害性疼痛および慢性炎症性疼痛が挙げられるが、それらに限定されない。慢性神経障害状態および／または慢性炎症状態の例としては、ヘルペス後神経痛、痛みを伴う糖尿病性神経障害、神経根障害、神経圧迫傷害（例えば、手根管症候群、三叉神経痛、腫瘍関連神経圧迫）、上部および下部背痛（例えば、椎間板ヘルニア傷害、硬直性脊椎炎、または未知の病状から生じる症例）、複合型局部疼痛症候群Ｉ型およびＩＩ型、神経外傷痛（例えば、幻肢痛、手足の切断に起因する他の疼痛状態）、神経根剥離傷害、ＨＩＶ関連疼痛、化学療法計画から生じる神経障害、網膜疾患、坐骨神経痛、異常痛覚過敏、痛覚過敏、および継続する灼熱痛（例えば、術後痛を含むが、それに限定されない創傷関連痛）、関節痛、慢性関節リウマチおよび骨関節炎、線維筋痛、火傷の痛み、神経炎、坐骨痛、腱炎、骨痛、偏頭痛、尿生殖器痛ならびに膀胱反射亢進に起因する神経障害状態が挙げられるが、それらに限定されない。
【実施例】
【００８９】
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的な実施例を参照してより良く理解され得る。以下の実施例は、本発明をより十分に例示するために示され、決して本発明の広い範囲を限定するものと理解されるべきではない。格別に示されることがなければ、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に対して以下に与えられる割合は、各々、ｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌおよびｗｔ／ｖｏｌ基準に基づく。一般に、細胞培養中は、無菌状態が維持される。
【００９０】
（材料および一般的な方法）
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，Ｖｏｌｓ  １−３；Ａｕｓｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ；またはＡｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および補遺；ならびにＩｎｎｉｓら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０に記載されるような標準的な分子生物学的方法を使用する。
【００９１】
（実施例１）
この実施例は、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡの設計を示す。ラットＮａｖ１．８コーディング配列およびヒトＮａｖ１．８コーディング配列の両方に対する推定ｓｉＲＮＡ配列を、Ｔｕｓｃｈｌの予言則を使用して識別した。Ｔｕｓｃｈｌら、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，ｖｏｌ．１３，ｎｏ．２４，ｐｐ．３１９１−３１９７、Ｄｅｃ．１５、１９９９；およびＥｌｂａｓｈｉｒら、「Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１１，ｐｐ．４９４−４９８，２００１を参照のこと。表２は、ヒトＮａｖ１．８コーディング配列に対する推定ｓｉＲＮＡ配列を識別する。また、その標的配列、その遺伝子における各標的配列の位置、およびこの標的配列におけるグアニン／シトシンの割合も示す。表３は、ラットＮａｖ１．８コーディング配列に対する推定ｓｉＲＮＡ配列を識別する。また、その標的配列およびその遺伝子における各標的配列の位置も示す。
【００９２】
【表２−１】
2011015695.tif 000003
【００９３】
【表２−２】
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【００９４】
【表２−３】
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【００９５】
【表２−４】
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【００９６】
【表２−５】
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【００９７】
【表２−６】
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【００９８】
【表２−７】
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【００９９】
【表３−１】
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【０１００】
【表３−２】
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【０１０１】
【表３−３】
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【０１０２】
【表３−４】
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【０１０３】
【表３−５】
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【０１０４】
【表３−６】
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【０１０５】
【表３−７】
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上記ｓｉＲＮＡ配列のうち、５個を、インビトロにおいてＮａｖ１．８の発現および機能をノックダウンする能力を試験するために選択した。この５個のｓｉＲＮＡは、全５８７４ヌクレオチドのＮａｖ１．８コーディング配列の異なる領域を包含するように選択した。各配列がそのゲノム内で位置するヌクレオチドの位置を含め、この５個のｓｉＲＮＡ配列を、以下の表４に示す。
【０１０６】
【表４】
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（実施例２）
上記５個の選択されたｓｉＲＮＡ配列（配列番号１〜配列番号５）を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡにより合成した。次いで、本発明者らは、Ｎａｖ１．８  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングして、ｐｃＤＮＡ−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドを生成した。このコントロールプラスミドをＨＥＫ２９３細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ  Ｍ８Ｚ３Ａ８）にトランスフェクトさせると、これらの細胞は、高いレベルのＮａｖ１．８のＲＮＡおよびタンパク質の発現を示した。Ｎａｖ１．８  ＲＮＡの発現を、製造業者の指示に従って、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＮａｖ１．８タンパク質の発現を、Ｎａｖ１．８特異的ペプチド抗体、ＳＯＤ１（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ウェスタン免疫ブロット分析により検出した。公開されたペプチド配列を、ＳＯＤ１抗体を作製するために使用した。Ｎｏｖａｋｏｖｉｃら、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ＰＮ３  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ
ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｉｃｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１８，ｎｏ．６，ｐｐ．２１７４−２１８７，１９９８を参照のこと。
【０１０７】
（Ｎａｖ１．８  ＲＮＡのノックダウン）
上記５個の化学的に合成したｓｉＲＮＡ（配列番号１〜配列番号５）を、個別に、上記ｐｃＤＮＡ−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドとともに、ＨＥＫ２９３細胞へと同時にトランスフェクトした。このトランスフェクトした細胞における最終的なｓｉＲＮＡ濃度を、２５ｎＭに維持した。トランスフェクトの２４時間後、これらの細胞を溶解し、そして、全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＮＡｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して溶解産物から精製した。個々のｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトした細胞、またはコントロール細胞のいずれかから精製した全ＲＮＡを、Ｎａｖ１．８特異的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した。あらゆるラットＮａｖ１．８特異的プライマーは、この点に関して機能するべきである。ＰＣＲプライマーの設計は、当該分野で公知である。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＮａｖ１．８  ＲＮＡの発現レベルを、コントロール細胞におけるＲＮＡ発現と比較した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドをトランスフェクトしたコントロール細胞は、１００％のｒＮａｖ１．８  ＲＮＡ相対的発現レベルを示した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドおよび配列番号１のｓｉＲＮＡを共に同時にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １細胞は、２０％のｒＮａｖ１．８  ＲＮＡ相対的発現レベルを示した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドおよび配列番号２のｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ２細胞は、６５％のｒＮａｖ１．８  ＲＮＡ相対的発現レベルを示した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドおよび配列番号３のｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ３細胞は、３０％のｒＮａｖ１．８  ＲＮＡ相対的発現レベルを示した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドおよび配列番号４のｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ４細胞は、１１５％のｒＮａｖ１．８  ＲＮＡ相対的発現レベルを示した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドおよび配列番号５のｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ５細胞は、７０％のｒＮａｖ１．８  ＲＮＡ相対的発現レベルを示した。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡ  １またはｓｉＲＮＡ  ３のいずれかを同時にトランスフェクトした細胞が、高いレベルのＮａｖ１．８  ＲＮＡサイレンシングを示した一方で、ｓｉＲＮＡ  ２またはｓｉＲＮＡ  ５のいずれかを同時にトランスフェクトした細胞は、適度なレベルのＮａｖ１．８  ＲＮＡサイレンシングを示した。Ｎａｖ１．８  ＲＮＡ発現におけるノックダウンは、ｓｉＲＮＡ  ４を同時にトランスフェクトした細胞には見られなかった。
【０１１０】
（Ｎａｖ１．８タンパク質のノックダウン）
上記５個の化学的に合成したｓｉＲＮＡ（配列番号１〜配列番号５）を、個別に、ｐｃＤＮＡ−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドとともに、ＨＥＫ２９３細胞へと同時にトランスフェクトした。このトランスフェクトした細胞における最終的なｓｉＲＮＡ濃度を、２５ｎＭに維持した。トランスフェクトの２４時間後、これらの細胞を、変性溶解緩衝剤中で溶解し、そして、この溶解産物を、変性１２％ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）上で泳動させた。このゲルを、ニトロセルロースシートへブロットさせ、そして、Ｎａｖ１．８特異的抗体−ＳＯＤ１（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でプローブした。
【０１１１】
ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドをトランスフェクトした細胞（すなわち、コントロール細胞）からの溶解産物は、高いレベルのＮａｖ１．８タンパク質の発現を示した。ｐｃＤＮＡ−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドと、ｓｉＲＮＡ  １またはｓｉＲＮＡ  ３のいずれかとを同時にトランスフェクトした細胞からの溶解産物は、Ｎａｖ１．８タンパク質の発現のほとんど完全な消滅を示した。ｐｃＤＮＡ−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドと、ｓｉＲＮＡ  ２またはｓｉＲＮＡ  ５のいずれかとを同時にトランスフェクトした細胞からの溶解産物は、適度なレベルのＮａｖ１．８タンパク質発現を示した。ｐｃＤＮＡ−Ｎａｖ１．８コントロール発現プラスミドとｓｉＲＮＡ  ４とを同時にトランスフェクトした細胞からの溶解産物は、Ｎａｖ１．８タンパク質発現における減少を示さなかった。
【０１１２】
（実施例３）
次に、本発明者らは、ｓｉＲＮＡが、Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネルを機能的にノックダウンできるかどうかを測定した。この測定は、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）アッセイ（Ｎｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）および電位固定測定法を使用して行なった。本発明者らは、レトロウイルスの組み込みによって、神経芽細胞種／ＤＲＧ融合細胞株ＮＤ７／２３（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）においてＮａｖ１．８コーディング配列を安定して発現させた。上記ＮＤ７／２３細胞株は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ番号９２０９０９０３号により識別される、マウス神経芽細胞種およびラットニューロンのハイブリッドである。このＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞株は、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）膜電位分析および全細胞電位固定測定法の両方において、首尾一貫して高いレベルのＮａｖ１．８ナトリウム電流を示した。
【０１１３】
（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）アッセイ）
本発明者らは、上記５個の選択されたｓｉＲＮＡ配列（配列番号１〜配列番号５）を、個別に、ＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞株にトランスフェクトした。このｓｉＲＮＡによるＮａｖ１．８の機能的なノックダウンを、製造業者の指示に従って、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）における膜電位分析を使用して確認した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）における読み取りは、個々のｓｉＲＮＡによるトランスフェクトの１日後に行なった。
【０１１４】
コントロール細胞の発光レベルを、ｓｉＲＮＡ  １〜５を個別にトランスフェクトした細胞の発光レベルと比較した。全ての細胞に、Ｎａｖ１．８コーディング配列をトランスフェクトした。コントロール細胞は、１７５，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １細胞は、４８，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ２細胞は、７０，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号３のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ３細胞は、４５，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ
４細胞は、１５１，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号５のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ５細胞は、８０，０００単位の発光レベルを示した。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡ  １およびｓｉＲＮＡ  ３が、Ｎａｖ１．８に由来する膜電位をブロックした一方で、ｓｉＲＮＡ  ２および  ｓｉＲＮＡ  ５は、膜電位における適度なブロックレベルを示した。ｓｉＲＮＡ  ４は、膜電位における最小限のブロックレベルを示すか、全くブロックを示さなかった。個々のｓｉＲＮＡによる膜電位におけるブロックレベルは、上記ＨＥＫ系におけるｓｉＲＮＡによるタンパク質サイレンシングおよびＲＮＡサイレンシングの両方のレベルに類似した。この実験の別の例において、コントロール細胞は、１９８，６９８単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １細胞は、４６，０６８単位（コントロールシグナルの２３％に対応する）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ２細胞は、７１，５２３単位（コントロールの３６％に対応する）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号３のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ３細胞は、４２，４２２単位（コントロールの２１％に対応する）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ４細胞は、１５１，０６７単位（コントロールの７６％に対応する）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号５のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ５細胞は、８０，５６７単位（コントロールの４１％に対応する）の発光レベルを示した。
【０１１６】
（電位固定測定法（Ｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ））
さらにＮａｖ１．８ナトリウム電流の機能的なノックダウンを確認するために、本発明者らは、引き続いてｓｉＲＮＡ  １をトランスフェクトしたＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８コントロール細胞において全細胞電位固定測定法を実施した。簡単に述べると、ＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞を、非サイレンシングｓｉＲＮＡを擬似的にトランスフェクトした（すなわち、コントロール細胞）か、またはｓｉＲＮＡ  １をトランスフェクトした（すなわち、ｓｉＲＮＡ  １細胞）。このｓｉＲＮＡ  １の濃度を、２５ｎＭに維持した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を同時にトランスフェクトすることにより識別させた、トランスフェクトに成功した細胞を、全細胞電位固定測定法のために使用した。測定は、トランスフェクトの２４時間後およびトランスフェクトの４８時間後の両方において行なった。
【０１１７】
トランスフェクトの２４時間後において、コントロール細胞が、−９００の最高振幅を示した一方で、ｓｉＲＮＡ細胞は、−１７５の最高振幅を示した。トランスフェクトの４８時間後において、コントロール細胞が、−７７５の最高振幅を示した一方で、ｓｉＲＮＡ細胞は、−１７５の最高振幅を示した。それゆえ、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ  １をトランスフェクトした細胞におけるナトリウム電流のほとんど完全なブロックを観察した。実際、このブロックは、８５％以上の大きさであった。さらに、Ｎａｖ１．８ブロックの特異性を、ｓｉＲＮＡ  １で処理したＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞において、テトロドトキシン感応電流におけるブロックが見られなかったという観察により確認した。
【０１１８】
別の例において、トランスフェクトの２４時間後において、コントロール細胞（サンプルサイズ＝１０）が、−９１２ｐＡの平均最高全細胞Ｎａｖ１．８電流振幅を示した一方で、ｓｉＲＮＡ  １細胞（サンプルサイズ＝１１）は、−１６９ｐＡの平均最高振幅を示した。このように、トランスフェクトの２４時間後には、ｓｉＲＮＡ  １は、Ｎａｖ１．８電流振幅はコントロールの１８．５％に減少した。さらに、意図的なテトロドトキシン耐性Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネルに対するｓｉＲＮＡ  １の効果の特異性を、トランスフェクトの２４時間後または４８時間後のいずれかにおいて、ｓｉＲＮＡ  １で処理したＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞において、バックグラウンドとなるテトロドトキシン感応Ｎａｖ１．８ナトリウム電流における減少が見られなかったという観察により、確認した。
【０１１９】
（実施例４）
高いレベルのＮａｖ１．８ノックダウンを示すバックアップｓｉＲＮＡを識別するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ  １およびｓｉＲＮＡ  ３を含むＮａｖ１．８コーディング配列の領域において、６個のさらなるｓｉＲＮＡ（配列番号６〜配列番号１１）を設計した。これらの６個のさらなるｓｉＲＮＡは、実施例１において概略されたのと同じ手順を使用して設計し、そして、以下の表５で示されるように、以下：
【０１２０】
【表５】
2011015695.tif 000018
の配列を有する。
【０１２１】
６個のさらなるｓｉＲＮＡ：配列番号６〜配列番号１１を、ＮＤ７／２３におけるＮａｖ１．８に由来する膜電位をノックダウンする能力について選別した。実施例３における手順と類似した手順を使用して、コントロール細胞の発光レベルを、ｓｉＲＮＡ  ６〜ｓｉＲＮＡ  １１を個別にトランスフェクトした細胞の発光レベルと比較した。これらのコントロール細胞は、１７５，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号６のｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたｓｉＲＮＡ  ６細胞は、８５，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号７のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ７細胞は、５０，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号８のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ８細胞は、４５，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号９のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ９細胞は、４３，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号１０のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １０細胞は、１０，０００単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号１１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １１細胞は、３５，０００単位の発光レベルを示した。実施例２および実施例３における手順と類似した手順を使用して、本発明者らは、６個全てのｓｉＲＮＡが、Ｎａｖ１．８発現および機能をブロックし得、有効なｓｉＲＮＡのコレクションをもたらしたことを決定した。
【０１２２】
別の例において、上記コントロール細胞は、１９８，６９８単位の発光レベルを示した。引き続いて配列番号６のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ６細胞は、８６，１０５単位（コントロール細胞の４３％）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号７のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ７細胞は、５０，２３７単位（コントロール細胞の２５％）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号８のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ８細胞は、４４，０３８単位（コントロール細胞の２２％）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号９のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  ９細胞は、４６，９１７単位（コントロール細胞の２４％）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号１０のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １０細胞は、２１，８４７単位（コントロール細胞の７％）の発光レベルを示した。引き続いて配列番号１１のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたｓｉＲＮＡ  １１細胞は、３０，５８７単位（コントロール細胞の１５％）の発光レベルを示した。
【０１２３】
（実施例５）
（Ｎａｖ１．８  ｓｉＲＮＡのアデノウイルス送達）
長期間にわたる細胞へのｓｉＲＮＡ送達およびＮａｖ１．８機能のノックダウンのために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ発現を駆動するアデノウイルスベクターを設計した。簡単に述べると、この構築物は、Ｕ６プロモータカセットの制御下で、ｓｉＲＮＡ  ３（配列番号３）を発現するように設計した。次いで、このｓｉＲＮＡ  ３発現カセットを、Ｅ１欠失ｐＴＧ４２１３アデノウイルス骨格（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ，ＳＡ，Ｆｒａｎｃｅ）へとクローニングした。
【０１２４】
実施例３からのＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞を、１ｅ９粒子／ｍｌの濃度でｓｉＲＮＡ  ３アデノウイルスベクター構築物を感染させた。コントロール細胞を、Ｕ６プロモータカセットを含むコントロールアデノウイルスを、同じ濃度で感染させた。感染細胞は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ、またはＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）アッセイのいずれかを実行するために、全ＲＮＡ精製のために溶解させた。
【０１２５】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイのために、感染細胞を、感染の６、８および１０日後（ｄｐｉ）に溶解し、そして、溶解産物から精製したＲＮＡを、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＮａｖ１．８発現を測定するために使用した。感染の６日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡの割合として発現したＮａｖ１．８  ＲＮＡ発現は、１８％であった。感染の８日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡの割合として発現したＮａｖ１．８  ＲＮＡ発現は、２２％であった。感染の１０日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡの割合として発現したＮａｖ１．８  ＲＮＡ発現は、３０％であった。
【０１２６】
ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）アッセイのために、感染細胞を、感染の２、４、６、８および１０日後（ｄｐｉ）において、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）上のＮａｖ１．８に由来する膜電位を測定するために使用した。各時点において、ｓｉＲＮＡ  ３アデノウイルスベクター構築物を感染細胞における膜電位におけるノックダウンを、コントロールのアデノウイルス感染細胞における膜電位と比較した。感染の２日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡと比較したナトリウム電流の割合は、４５％であった。感染の４日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡと比較したナトリウム電流の割合は、１５％であった。感染の６日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡと比較したナトリウム電流の割合は、８％であった。感染の８日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡと比較したナトリウム電流の割合は、８％であった。感染の１０日後において、非サイレンシングアデノウイルスｓｉＲＮＡと比較したナトリウム電流の割合は、４％であった。
【０１２７】
ウイルス−ｓｉＲＮＡ構築物に伴って見られたＲＮＡ発現における減少が、Ｎａｖ１．８ナトリウムチャネル活性の機能における減少を表したものであることをさらに確認するために、本発明者らは、数回の全細胞電位固定実験を実行して、感染後の種々の時間において、Ｎａｖ１．８媒介性の電流を直接測定した。これらの実験の各々において、電流振幅は、コントロール非サイレンシングｓｉＲＮＡ構築物、またはアデノウイルス−ｓｉＲＮＡ構築物のいずれかを事前に感染させたＮＤ７／２３−Ｎａｖ１．８細胞のサンプルで測定した。非サイレンシングウイルス構築物による感染の４日後において、全平均（１０細胞をサンプルにした）全細胞Ｎａｖ１．８電流が、−８２１ｐＡであった一方、ｓｉＲＮＡ−ウイルス感染細胞において測定した電流は、−１０１ｐＡ（１２．３％のコントロールに対応する）であった。非サイレンシングウイルス構築物による感染の６日後において、全平均（１０細胞をサンプルにした）全細胞Ｎａｖ１．８電流が、−９３２ｐＡであった一方、ｓｉＲＮＡ−ウイルス感染細胞において測定した電流は、−２４７．７ｐＡ（２６．６％のコントロールに対応する）であった。非サイレンシングウイルス構築物による感染の１０日後において、全平均（１０細胞をサンプルにした）全細胞Ｎａｖ１．８電流が、−９７６．７ｐＡであった一方、ｓｉＲＮＡ−ウイルス感染細胞において測定した電流は、−５４２．７ｐＡ（５５．６％のコントロールに対応する）であった。
【０１２８】
このように、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）およびＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ならびに電位固定アッセイは、Ｎａｖ１．８  ＲＮＡ発現および少なくとも８ｄｐｉの間継続したＮａｖ１．８に由来する膜電位のノックダウンを示した。ｓｉＲＮＡ発現アデノウイルスによる感染は、Ｎａｖ１．８発現およびＮａｖ１．８機能の少なくとも８０％のノックダウンを引き起こした。このように、高いレベルの継続されたＮａｖ１．８ブロックを、ｓｉＲＮＡ送達のためのウイルスベクターを使用して示した。
【０１２９】
（実施例６）
（慢性的な痛みを有するラットモデルにおけるＮａｖ１．８  ｓｉＲＮＡの効果）
Ｎａｖ１．８−ｓｉＲＮＡの効果を、ｓｉＲＮＡ  ３を使用して、慢性疼痛を有するラットモデルにおいて調べた。後足触覚を、等級化されたフォン−フライマイクロフィラメント（＝ベースライン感度）を使用して、ラットのコホートにおいて測定した。次いで、これらのラットを、標準的な縫合材料を使用して生じさせた緩い結紮傷害の後に、中腿における左坐骨神経の露出を必然的に伴う外科手順に供した。この傷を閉じ、これらの動物を、あらゆるその後の行動評価の前に、少なくとも１週間、上記処置から回復させた。上記処置に起因する神経外傷が、左後足における触覚過敏（触覚異痛と呼ばれる状態）を引き起こした。異痛の程度を、ベースライン測定のために使用するのと同じフォン−フライマイクロフィラメント処置を使用して定量した。これらの測定を、処置日の１３日後に行なった。異痛に関するｓｉＲＮＡ  ３（配列番号３）の効果を測定するために、このｓｉＲＮＡを、恒久的なくも膜下留置カテーテルを通して、脊髄の周りのくも膜下腔に二重鎖として送達した。２μｇのｓｉＲＮＡ  ３の２回の別々の注射を、３日間にわたって毎日行い、コントロールラットには、同じ時間のプロトコルを用いて、ビヒクルのみの同一の注射を与えた。
【０１３０】
これらの実験で使用するラットのベースライン後足感度は、１３グラム〜１５グラムの間の力であった。上記神経外傷の１３日後、ラットの後足感度を各ラットにつき再決定し、そして、ｓｉＲＮＡ群と名付けたコホートにおいては１．２±０．４ｇであり、コントロールコホートおいては２．１±０．４ｇであることを発見した（薬物処置された群においては、コホートサイズ＝６ラット、コントロール群においては、コホートサイズ＝５ラット）。それゆえ、神経傷害が、慢性神経性疼痛状態を誘発する傷害に苦しむヒト被験体に見られる痛みに典型的な、ひどい痛みを伴う触覚過敏（異痛）を引き起した。通常の評価は、この痛みを伴う異痛状態が、ビヒクルのみの注射を受けたラットのコントロールコホートにおいて、１３日〜２１日維持される（代表的には、＜２．１ｇ）ことを示した。対照的に、１３日目の評価の直後に開始し、ｓｉＲＮＡ  ３の注射を３日間受けたラットは、痛みを伴う異痛（１６日目には、８．１±２．１ｇとの評価）の明白な逆転を示した。ｓｉＲＮＡ  ３で処置されたラットは、測定を行なったその後の数日間にわたり、コントールと比較して首尾一貫して改善された疼痛スコア（例えば、実験的に誘発された慢性疼痛状態の改善）を示した。
【０１３１】
（配列表）
【表６−１】
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【０１３２】
【表６−２】
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【０１３３】
【表６−３】
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【０１３４】
【表６−４】
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【０１３５】
【表６−５】
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【０１３６】
【表６−６】
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【０１３７】
【表６−７】
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【０１３８】
【表６−８】
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【０１３９】
【表６−９】
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【０１４０】
【表６−１０】
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【０１４１】
【表６−１１】
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【０１４２】
【表６−１２】
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【０１４３】
【表６−１３】
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【０１４４】
【表６−１４】
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【０１４５】
【表６−１５】
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【０１４６】
【表６−１６】
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【０１４７】
【表６−１７】
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【０１４８】
【表６−１８】
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【０１４９】
【表６−１９】
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【０１５０】
【表６−２０】
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【０１５１】
【表６−２１】
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【０１５２】
【表６−２２】
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【０１５３】
【表６−２３】
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【０１５４】
【表６−２４】
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【０１５５】
【表６−２５】
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【０１５６】
【表６−２６】
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【０１５７】
【表６−２７】
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【０１５８】
【表６−２８】
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【０１５９】
【表６−２９】
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【０１６０】
【表６−３０】
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【０１６１】
【表６−３１】
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【０１６２】
【表６−３２】
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【０１６３】
【表６−３３】
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【０１６４】
【表６−３４】
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【０１６５】
【表６−３５】
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【０１６６】
【表６−３６】
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【０１６７】
【表６−３７】
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【０１６８】
【表６−３８】
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【０１６９】
【表６−３９】
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【０１７０】
【表６−４０】
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【０１７１】
【表６−４１】
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【０１７２】
【表６−４２】
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【０１７３】
【表６−４３】
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【０１７４】
【表６−４４】
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【０１７５】
【表６−４５】
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【０１７６】
【表６−４６】
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【０１７７】
【表６−４７】
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【０１７８】
【表６−４８】
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【０１７９】
【表６−４９】
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【０１８０】
【表６−５０】
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【０１８１】
【表６−５１】
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【０１８２】
【表６−５２】
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【０１８３】
【表６−５３】
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【０１８４】
【表６−５４】
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【０１８５】
【表６−５５】
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【０１８６】
【表６−５６】
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【０１８７】
【表６−５７】
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【０１８８】
【表６−５８】
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【０１８９】
【表６−５９】
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【０１９０】
【表６−６０】
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【０１９１】
【表６−６１】
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【０１９２】
【表６−６２】
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【０１９３】
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【０１９４】
【表６−６４】
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【０１９５】
【表６−６５】
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【０１９６】
【表６−６６】
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【０１９７】
【表６−６７】
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【０１９８】
【表６−６８】
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【０１９９】
【表６−６９】
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【０２００】
【表６−７０】
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【０２０１】
【表６−７１】
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【０２０２】
【表６−７２】
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【０２０３】
【表６−７３】
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【０２０４】
【表６−７４】
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【０２０５】
【表６−７５】
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【０２０６】
【表６−７６】
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【０２０７】
【表６−７７】
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【０２０８】
【表６−７８】
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【０２０９】
【表６−７９】
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【０２１０】
【表６−８０】
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【０２１１】
【表６−８１】
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【０２１２】
【表６−８２】
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【０２１３】
【表６−８３】
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【０２１４】
【表６−８４】
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【０２１５】
【表６−８５】
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【０２１６】
【表６−８６】
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【０２１７】
【表６−８７】
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