(57)【要約】【課題】骨再建能力を有効に導き出すための化学組成物を徐放する仕組みをもち、患部へのフィッティングを良好にする柔軟性のある三次元立体構造をとる生体吸収性骨欠損部充填材料およびその製造方法を提供する。【解決手段】生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する物質を溶剤に溶解させた溶液またはスラリーに、生分解性樹脂より比誘電率の大きな水を添加した溶液を用い、電圧印加装置１によりコレクター３に正電荷を印加し、シリンジ２のノズルには電荷を印加せずアースとしてエレクトロスピニング法を実施し、コレクター３上に三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料を生成する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される綿状の三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料。
【請求項２】
前記繊維状物質の直径が0.05μｍ以上10μｍ未満である請求項１に記載の骨欠損部充填材料。
【請求項３】
前記繊維状物質の表面が水酸アパタイトで被覆されていることを特徴とする請求項１または２に記載の欠損部充填材料。
【請求項４】
前記生分解性樹脂がポリ乳酸またはその共重合体であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１つに記載の骨欠損部充填材料。
【請求項５】
前記シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で前記繊維状物質に組み込まれていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１つに記載の骨欠損部充填材料。
【請求項６】
生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する物質を溶剤に溶解させた溶液またはスラリーを用い、前記溶液またはスラリーに電荷を印加せず、コレクター側に電荷を印加してエレクトロスピニング法を実施し、前記コレクター上に前記生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料を生成することを特徴とする骨欠損部充填材料の製造方法。
【請求項７】
前記溶液またはスラリーに前記生分解性樹脂より比誘電率の大きな液体を添加することを特徴とする請求項６に記載の骨欠損部充填材料の製造方法。
【請求項８】
前記生分解性樹脂はポリ乳酸またはその共重合体であり、前記溶剤はクロロホルムもしくはジクロロメタンであり、前記比誘電率の大きな液体は水であり、前記溶液またはスラリーに前記溶剤と前記水とに混ざり合いやすい両親媒性の液体を添加することを特徴とする請求項７に記載の骨欠損部充填材料の製造方法。
【請求項９】
前記両親媒性の液体はメタノール、エタノール、プロパノール、アセトンであることを特徴とする請求項８に記載の骨欠損部充填材料の製造方法。
【請求項１０】
前記エレクトロスピニング法により得られた骨欠損部充填材料を、水酸アパタイトに対して過飽和となっている緩衝溶液に浸漬することを特徴とする請求項６ないし９のいずれか１つに記載の骨欠損部充填材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔や顎顔面手術、整形外科手術の分野において利用される骨欠損部分に充填する骨修復材料として有用な生体活性材料、とくに骨との親和性を高め、かつ生体内で吸収される性質を有する生体吸収性の生分解性樹脂との複合体繊維を骨格とする三次元立体構造体を有する骨欠損部充填材料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損部に埋入されると、骨と反応して直接化学結合する材料は生体活性材料と呼ばれ、さらに、反応が材料表面に限定される表面活性材料と、反応が材料の内部にまでおよび次第に骨と置き換えられていく生体吸収性材料に分けられる。表面活性材料としては水酸アパタイトセラミックス（たとえばＨＯＹＡ製の商品名アパセラム）、生体吸収性材料としてはβ型リン酸三カルシウムセラミックス（たとえばオリンパステルモバイオマテリアル製の商品名オスフェリオン）が実用化されている。
【０００３】
炭酸カルシウム（CaCO３）、石膏（CaSO4・2H2O）についても、生体吸収性であることが知られている。しかし、強度や靱性は低く機械的に加工することも容易ではない。一方、ポリ乳酸やポリグリコール酸、あるいはその共重合体、さらにはポリカプロラクトンなどの生分解性高分子は柔軟性に富み、機械加工も容易であるが、生体内で分解されて排出されるという形態の生体吸収性であり、骨形成性は示さない。また分解される過程で乳酸となるなど酸性化し、周囲組織に影響を及ぼすことがあるという報告も一部にはなされている。そこで、これらの無機化合物と有機化合物を複合して骨形成性と生体吸収性を持たせ、さらには機械的性質も向上させる研究がされてきた。たとえば、ポリ乳酸と炭酸カルシウムを複合して生体吸収性材料を作製する方法が、特許文献１に記載されている。炭酸カルシウムの中でも水への溶解度が高いバテライトを主成分とするものとポリ乳酸等の生分解性高分子化合物を混合して生体吸収性材料を合成する方法が報告されている。ポリ乳酸が分解して酸性化しても炭酸カルシウムが溶解することで緩衝効果を発揮し、ｐＨは常に中性付近で保たれるという利点もある。
【０００４】
超高齢化社会における健康維持において、咀嚼能力や運動能力の維持確保は極めて重要であり、骨欠損には一刻も早い治癒が望まれている。骨形成能を向上させるために生体吸収性膜に骨形成伝導剤（特許文献２参照）、成長因子または骨形態発生因子（特許文献３、４参照）を含有させる試みもあるが、このような因子を取り扱うことは容易ではない。骨の自己再生をより確実に早くさせる骨再建能力に優れた生体吸収性材料の開発が求められている。
【０００５】
最近の生体関連材料の研究技術動向を見ると、材料と骨とを結合させるという材料設計から、骨を再生させるための材料設計に研究内容が移行しており、骨形成に及ぼすケイ素の役割が注目され、ケイ素含有を特徴とした材料設計が見られるようになった（非特許文献１参照）。例えば、ケイ素の徐放により細胞への遺伝子的働きかけが行なわれ、骨生成が促進されることが報告されている（非特許文献２参照）。また、３種の炭酸カルシウム（カルサイト、アラゴナイト、バテライト）とポリ乳酸の複合体を擬似体液（SBF）に浸漬させると、最も短時間で骨と類似した組成や形態をもつ水酸アパタイトが材料表面に生成するものはバテライトとポリ乳酸の複合体であることが示されている（非特許文献３参照）。これらのことから、ケイ素を徐放するバテライトを用いることが骨再建の速い材料を提供するための重要な手段となる。
【０００６】
骨欠損部充填材料の使用にあたっては、患部を切開し、患部を十分に埋める大きさの緻密質あるいは多孔質の材料を直接埋め込む、あるいは、顆粒状の材料を充填する、という方法がとられる。
【０００７】
骨形成を確実にするためには、患部に隙間無く材料が埋入されていることが望ましいが、緻密質あるいは多孔質の材料の場合、患部の形状にあわせて加工するのは容易ではなく、また、顆粒状の材料を充填した場合には、術後に患部から脱落することが多く、対策が必要であった。
【０００８】
一方、患部に充填する方法ではないが、骨形成に寄与しない細胞や組織の骨欠損部への侵入を防ぎ、骨の自己再生能力を活かし、骨を再建させるために欠損部を覆う遮蔽膜を用いる骨再生誘導法も知られている。これは、生体が本来もっている治癒力を利用して骨欠損を治癒するものであって、特許文献５には、ケイ素溶出型炭酸カルシウム（バテライト）と生分解性樹脂とを主成分とする不織布層と、生分解性樹脂を主成分とする不織布層との二層構造を有する骨再生誘導膜とその製造方法が記載されている。この膜ではマウス由来骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1）の増殖性が良好で、兎の頭蓋骨に設けた骨欠損部を被覆した場合に、その膜内に旺盛な骨形成が見られたことが報告されている（非特許文献４参照）が、厚さが230〜300μｍであるため骨欠損部充填材料として用いることはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２９４６７３号公報
【特許文献２】特開平６−３１９７９４号公報
【特許文献３】特表２００１−５１９２１０号公報
【特許文献４】特開２００６−１８７３０３号公報
【特許文献５】特開２００９−６１１０９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】都留寛治、小川哲朗、大串始、「生体関連材料の研究技術および標準化の動向」、セラミックス、41, 549-553 (2006）
【非特許文献２】H.Maeda, T.Kasuga and L.L.Hench, “Preparation of Poly(L-lactic acid)-Polysiloxane-Calcium Carbonate Hybrid Membranes for Guided Bone Regeneration”, Biomaterials, 27, 1216-1222 (2006)
【非特許文献３】H.Maeda, T.Kasuga, M.Nogamiand Y.Ota, “Preparation of Calcium Carbonate Composite and Their Apatite-Forming Ability in Simulated Body Fluid”, J.Ceram.Soc.Japan, 112, S804-808 (2004)
【非特許文献４】T.Wakita, A.Obata and T.Kasuga, “New Fabrication Process of Layered Membranes Based on Poly(Lactic Acid) Fibers for Guided Bone Regeneration”, Materials Transactions, 50 [7], 1737-1741 (2009）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、骨再建能力を有効に導き出すための化学組成物の徐放システムと患部へのフィッティングを良好にする柔軟性のある三次元立体構造をもつ生体吸収性骨欠損部充填材料およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、請求項１に記載の発明では、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される綿状の三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料を特徴とする。
【００１３】
ここで、請求項２に記載の発明のように、前記繊維状物質の直径が0.05μｍ以上10μｍ未満のように細いものとすることができる。また、請求項３に記載の発明のように、前記繊維状物質の表面が水酸アパタイトで被覆されているものとすることができる。また、請求項４に記載の発明のように、前記生分解性樹脂がポリ乳酸またはその共重合体であるものとすることができる。さらに、請求項５に記載の発明のように、前記シロキサンが炭酸カルシウム微粒子に分散された状態で前記繊維状物質に組み込まれているものとすることができる。
請求項６に記載の発明では、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する物質を溶剤に溶解させた溶液またはスラリーを用い、前記溶液またはスラリーに電荷を印加せず、コレクター側に電荷を印加してエレクトロスピニング法を実施し、前記コレクター上に前記生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料を生成することを特徴とする。
【００１４】
エレクトロスピニング法において、前記溶液またはスラリーに電荷を印加せず、コレクター側に電荷を印加することにより、コレクター側に引っ張られた前記溶液またはスラリーは、それ自体帯電していないため、コレクター上では静電的な反発はなく、三次元的に堆積する。これにより、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される綿状の三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料を生成することができる。
【００１５】
この場合、請求項７に記載の発明のように、前記溶液またはスラリーに前記生分解性樹脂より比誘電率の大きな液体を添加すれば、分極作用で前記溶液またはスラリーがコレクター側に容易に引っ張られるようにすることができる。
【００１６】
なお、前記生分解性樹脂はポリ乳酸またはその共重合体であり、前記溶剤はクロロホルムもしくはジクロロメタンであり、前記比誘電率の大きな液体は水であるとすることができるが、この場合、請求項８に記載の発明のように、前記溶液またはスラリーに前記溶剤と前記水とに混ざり合いやすい両親媒性の液体を添加するのが好ましい。その両親媒性の液体としては、請求項９に記載の発明のように、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトンとすることができる。
【００１７】
また、請求項１０に記載の発明のように、前記エレクトロスピニング法により得られた骨欠損部充填材料を、水酸アパタイトに対して過飽和となっている緩衝溶液に浸漬することによって、繊維状物質の表面を水酸アパタイトで被覆したものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】従来のエレクトロスピニング法を説明するための図である。
【図２】本実施形態のエレクトロスピニング法を説明するための図である。
【図３】実施例１で作製した三次元立体構造体の外観である。マス目は10 mm角である。
【図４】実施例１で作製した三次元立体構造体を構成する繊維のSEM写真である。
【図５】実施例１で作製した三次元立体構造体Si-PLA15の細胞培養液中へのケイ素イオンの溶出量である。
【図６】実施例１で作製した三次元立体構造体Si-PLA50の細胞培養液中へのケイ素イオンの溶出量である。
【図７】実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA三次元立体構造体を構成する繊維のSEM写真である。
【図８】実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA三次元立体構造体を1.5SBFに浸漬した後のSi-CaCO3/PLA三次元立体構造体を構成する繊維のSEM写真である。
【図９】実施例２で作製したSi-CaCO3/PLA三次元立体構造体を1.5SBFに浸漬前後のX線回折パターンを示した図である。
【図１０】実施例２で作製した水酸アパタイトを被覆したSi-CaCO3/PLA三次元立体構造体および比較試料の細胞増殖性評価結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の好ましい実施の形態では、エレクトロスピニング法により、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される三次元立体構造を有する骨欠損部充填材料を製造する。このエレクトロスピニング法において、本実施形態では、独自の方法を用いる。すなわち、コレクターに電圧を印加してプラスに帯電させ、ポリマー溶液にアースをとるという、通常とは逆方向に電圧印加する状態の中でスプレーされる過程でファイバー化を起こさせ、ファイバーを絡ませながら立体構造を形成させる。このような独自の改良型エレクトロスピニング法と、水酸アパタイトに対して過飽和となっている緩衝溶液に浸漬する工程を経ることにより、三次元立体構造を有し柔軟性のある骨欠損部充填材料を製造することができる。
【００２０】
生分解性樹脂として、好ましくはポリ乳酸（PLA）、あるいはポリ乳酸とポリグリコール酸（PGA）との共重合体の他、使用可能な生分解性樹脂として、ポリエチレングリコール（PEG)、ポリカプロラクトン（PCL)や、PLA、PGA、PEG及びPCLの共重合体のような合成高分子の他、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサンのような天然高分子が挙げられる。最も代表的には、PLAをクロロホルム（CHCl3）もしくは、ジクロロメタンに溶解させ、これにアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）の水溶液を混合した溶液を用意する。このときのPLA：APTESの重量比は１：0.01〜１：0.5が可能であるが、多量にAPTESを加えても水溶液に浸漬すると初期にほとんどが溶出してしまうため効果が薄く、好ましくはPLA：APTES＝１：0.01〜１：0.05（重量比）である。PLA（分子量：20〜30万kDa程度）の濃度は4〜12wt%が紡糸しやすい。良好な紡糸状態を維持するためにジメチルホルムアミドまたは、メタノールをクロロホルムやジクロロメタンに対して50wt%程度まで適宜加えてもよい。
【００２１】
ここに、さらに生分解性樹脂より比誘電率の大きな液体、たとえば乳酸より比誘電率の大きな液体を加えて三次元立体構造作製用の紡糸溶液とする。ここで、乳酸（比誘電率：22.0）より比誘電率の大きな液体としては、たとえば、メタノール（比誘電率：32.6）、エタノール（比誘電率：24.6）、エチレングリコール（比誘電率：37.7）１，２−プロパンジオール（比誘電率：32.0）、２，３−ブタンジオール、グリセリン（比誘電率：42.5）、アセトニトリル（比誘電率：37.5）、プロピオニトリル（比誘電率：29.7）、ベンゾニトリル（比誘電率：25.2）、スルホラン（比誘電率：43.3）、ニトロメタン（比誘電率：35.9）などがあり、いずれも有効であるが、最も好適には水（比誘電率：70〜80）を用いることである。ただし、PLAを溶解させるためのクロロホルムもしくはジクロロメタンに水を添加すると完全に分離するので、これを解消するため、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等を共存させることが好ましい。これらは比誘電率には関係なく、クロロホルムやジクロロメタン等と水とに共に混ざり合いやすい、両親媒性であればよいものを選択することを意味している。このときの代表的添加量としては、PLA１ｇに対して、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等を0.5〜５ｇ、水を0.5〜３ｇとしたときである。
【００２２】
また、細胞の初期接着性を向上させる吸収性水酸アパタイトを水酸アパタイトに対して過飽和となっている緩衝溶液に浸漬して形成させる工程を迅速に進めるために、上記の紡糸溶液に炭酸カルシウムを加えてスラリーとしてもよい。この場合には最大60重量％までが可能である。60重量％を超えると均一な混合が難しいためである。ただし、10重量％より少ない場合にはその効果は顕著には現れない。さらには、生体用として問題ない水酸アパタイト、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウム、ピロリン酸カルシウム、塩化カルシウム等の無機物が含まれていてもよい。
【００２３】
シロキサンが分散された炭酸カルシウム微粒子（Si-CaCO3）を例えば特開２００８−１００８７８号公報に記載される方法を用いて調製し、これを最大60重量％までPLAと混合することで、生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する物質とすることもできる。混合量としては上記の炭酸カルシウムと同様に10〜60重量％が好適である。予め所定の割合のPLAとSi-CaCO3微粒子を加熱ニーダーで混練して調製した複合体を上記の溶媒に溶かして紡糸溶液とする方法が微粒子の均一な分散化をはかるために好適である。
【００２４】
通常、エレクトロスピニング法では、図１に示すように、電圧印加装置１によりシリンジ２のノズルに電荷を印加し、即ち、紡糸溶液にプラス電荷をかけ、ゆっくりとノズル先端から溶液を押し出すと、表面張力より電界の効果が大きくなったときに、溶液は細く引き延ばされ繊維状となってアース電極のコレクター３に向かい、溶媒を揮発させながらコレクター３上に到達し、結果として薄い繊維不織布層を形成する。しかし、紡糸条件（紡糸溶液の濃度や溶媒の種類や供給速度、紡糸時間、印加電圧、ノズルとコレクターの距離など）を変えることによっても、基本的には三次元立体構造を得ることはできない。これは、溶媒がほとんど揮発して堆積したコレクター３上でもわずかに残留している溶液および樹脂そのものが帯電しているため、静電的に反発して厚さ方向へは堆積しないことが原因である。
【００２５】
一方、本実施形態では、図２に示すように、あえてシリンジ２のノズルには電荷を印加せずアースとし、逆に、コレクター３にプラス電荷を印加することで三次元立体構造の形成を実現する。この場合には通常の紡糸溶液では、ゆっくりとノズル先端から溶液を押し出しても、溶液が帯電していないために、そのまま液滴として落下してしまうが、この紡糸溶液に水のような比誘電率の大きな液体が混合されている場合には、その液体が電場の影響を受け、分極作用でコレクター側に引っ張られる場合が出てくる。紡糸溶液自体は帯電していないため、コレクター３上では静電的な反発はなく、三次元的に堆積しやすくなる。この場合、シリンジ２のノズルからは液体が複数本に分かれてコレクター側に引っ張られ、それらが絡まってコレクター３上に綿状の三次元立体構造体が生成される。ただし、このような現象を生じさせるためには、ある程度、紡糸溶液の粘性が低い場合に限られる。粘性が高い場合には電場の影響を受けていてもコレクター３までたどり着くことができない。したがって、本実施形態の方法で得られる三次元立体構造体を構成する繊維状物質の直径は紡糸溶液の粘性によってほぼ制御され、とくに粘性が低い場合に三次元的立体化させやすく、繊維径は細くなりやすい。たとえばPLAをクロロホルム溶液に溶かし、これにエタノールと水を加えて作製した場合には、その繊維径は0.05μｍ以上10μｍ未満となる。なお、紡糸溶液が分極作用でコレクター側に引っ張られるのであれば、コレクター３にプラス電荷でなくマイナス電荷を印加するようにしてもよい。
【００２６】
得られた三次元立体構造体を必要なサイズに切り取り、水酸アパタイトに対して過飽和となっているカルシウムイオンとリン酸イオンを含む緩衝溶液に浸漬することにより、その繊維状骨格表面に容易に水酸アパタイトで被覆される。ここで、その緩衝溶液としては、たとえば、ヒト血漿の無機イオン濃度にほぼ等しい濃度のイオンを含有するトリス緩衝溶液（ｐＨ7.2〜7.4）（SBF）や、これを1.5倍濃度のイオン量とした溶液（1.5SBF）等がある。後者はより迅速に水酸アパタイトを被覆できるので好適である。
【００２７】
本実施形態によれば、代表的にはポリ乳酸（PLA）のような生分解性樹脂を主成分とし、シロキサンを含有させた繊維状物質から構成される三次元立体構造を有し柔軟性のある骨欠損部充填材料を得ることができる。また、上記のような三次元立体構造を構成する繊維状物質の表面に水酸アパタイトを被覆した骨修復用充填材料を得ることができる。三次元立体構造体の製造にエレクトロスピニング法を用いた不織布製造技術を利用することで、細胞の進入のための連通スペースを確保するとともに、患部とのフィッティング性を向上させた材料を容易に作製することができる。さらに、細胞の初期接着性を向上させる吸収性水酸アパタイトは水酸アパタイトに対して過飽和となっている緩衝溶液に浸漬することにより容易に被覆される。
【００２８】
上記のようにして得られた骨欠損部充填材料は、繊維状物質で構成される三次元立体構造に由来した柔軟性が示され、かつ、骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞）を用いた細胞親和性評価において細胞増殖性が高いことを示し、骨再建能力に優れている。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明に係る三次元立体構造体の製造方法の実施例について説明する。以下の実施例についての説明は本発明をより深く理解するためのものであって、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
〔実施例で用いた原料〕
・ポリ乳酸（PLA）：PURASORB PL Poly(L-lactide)、分子量20-30万、PURAC biochem
・クロロホルム（CHCl3）：特級試薬、純度99.0％以上、キシダ化学株式会社
・γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）：（TSL8331、純度98％以上、GE東芝シリコーン株式会社）
・シロキサン含有炭酸カルシウム（Si-CaCO3）：消石灰（ミクロスターＴ、純度96％以上、矢橋工業株式会社）、メタノール（特級試薬、純度99.8％以上、キシダ化学株式会社）、APTES、炭酸ガス（高純度液化炭酸ガス、純度99.9％、大洋化学工業株式会社）を用いて調製された、シロキサンを含む（ケイ素イオン量換算で2.9重量％）のバテライト
〔実施例のエレクトロスピニングの条件〕
紡糸溶液供給速度：0.1 ml/min、印加電圧：25kVでプレートコレクター側に印加、ノズル側に接地、ノズルとプレートコレクター間の距離：100 mm、紡糸時間：約60分
（実施例１）
超純水0.5 gにAPTES 1 gを加え、撹拌した。得られた溶液を、APTES量が0.015、0.050 gになるように、CHCl3に溶解した8重量％PLA溶液に滴下し、撹拌した。この間に、APTESは縮合してシロキサンとなる。これに、PLA１gに対してエタノール1.5 gと超純水１gを加え、これを紡糸溶液として、エレクトロスピニング法にて生分解性樹脂を主成分としシロキサンを含有する繊維状物質から構成される三次元立体構造を作製した(以後、この立体構造体をSi-PLA15、Si-PLA50とする)。
Fig.2.image of three-dimensional Si-PLA15
図３は、得られた三次元立体構造体（Si-PLA15）の外観である。図４はこの走査型電子顕微鏡（SEM）写真である。数十nm〜8 μmの直径の繊維からなる綿状の構造体であることがわかる。この状態で重量は40 mgであった。細胞培養に用いる溶液に浸漬し、取り出した後も柔軟性や弾力性は失われなかった。
【００３０】
得られた立体構造体を10mm×10mm×1mmに切り出し、細胞培養液α-MEM 4 ml中へ浸漬し、5％炭酸ガスインキュベータ内で温度37℃に保持して、１、３、５日目に細胞培養液を新しいものと交換した。図５、図６は細胞培養液中へ浸漬したときのケイ素イオンの溶出量を誘導結合型プラズマ発光分析により測定した結果を示す。どちらの試料も１日目に多くのケイ素イオンが溶出し、その後溶出量は大きく減少するが、少なくとも７日目までは溶出傾向が続くことがわかる。Si-PLA50では、１日目に約6.5 ppmのケイ素イオンが溶出するが、その後大きく減少し、６〜７日の溶出量は１ppm以下となり、Si-PLA15と比べて差はわずかであった。
（実施例２）
PLAとSi-CaCO3を加熱ニーダーで200℃、15分間混練してSi-CaCO3を40重量％含有するSi-CaCO3/PLA複合体を調製した。Si-CaCO3/PLA複合体：1.67 g、CHCl3:8.33 gを混合した溶液に、エタノール1.5 gと超純水1 gを加えて、上記条件にてエレクトロスピングを行い、Si-CaCO3/PLA三次元立体構造体を作製した。
【００３１】
得られた三次元立体構造体の外観は図３に示されたものとほぼ同様な綿状であり、柔軟性と弾力性に富んでいた。図７はSi-CaCO3/PLA三次元立体構造体のSEM写真である。直径約0.1〜３μmの細い繊維に、約１μm径の球状の炭酸カルシウム粒子が埋め込まれた構造となっている。繊維の直径は繊維間の空隙は数十μm以上大きく、細胞が進入するのに好適である。実施例１と同じ方法でケイ素イオンの溶出量を調べたところ、初日の溶出量は5.3 ppm、2〜3日目：0.8 ppm、4〜5日目：0.4 ppmであった。6〜7日目：0.4 ppmであり、微量の溶出が続いた。
【００３２】
上記の立体構造体を10mm×10mm×10mmに切り出し、1.5SBF 40 mlに浸漬し、37℃で1日保持した。その後、取り出してSEM観察すると、図８に示されるような凝集粒子が多数析出していた。細胞が進入できる程度の数十μm程度の空隙も残されていた。図９に上記溶液に浸漬前後のX線回折パターンを示す。浸漬後には水酸アパタイトのピークが認められる。したがって、Si-CaCO3/PLA三次元立体構造体を構成する繊維表面は、1.5SBFに浸漬することにより、容易に水酸アパタイトで被覆できることが確認された。
【００３３】
図１０に、水酸アパタイトが被覆された立体構造体と比較試料（Thermanox：細胞培養用プラスチックディスク）にマウス由来骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1）を播種した後の細胞数（1cm2あたりの細胞数に換算）の変化を示す。比較試料は細胞培養用として増殖性を高める表面処理が施されているが、立体構造体はそれに比べて極めて細胞増殖性が高いことを示し、骨再建能力に優れた材料と期待される。
〔細胞培養実験の条件〕
・培養
24wellプレート使用
細胞種；マウス骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞：理研）
細胞播種数；1×104cell/well
培地；α-MEM（10％ウシ胎仔血清含有）
培地交換；播種翌日、その後は１日おき
立体構造体試料を10mm×10mm×1mmに切断して使用。
・細胞カウント方法
Cell Counting Kit-8（細胞増殖/細胞毒性測定試薬、株式会社同仁化学研究所）を使用。試薬添付のプロトコルに沿って処理。
【図１】
2011015865.tif 000003
【図２】
2011015865.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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