(57)【要約】【課題】発熱性物質、蛋白質、微生物、微粒子などの除去された高純度の医薬品グレードのヒアルロン酸及び／又はその塩（以下、ＨＡという）を高収率かつ工業的規模で製造する。【解決手段】下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５工程を含む。Ａ工程：無機吸着剤、又は無機吸着剤と活性炭にＨＡの含有液を接触させる工程、Ｂ工程：ＨＡの含有液を酸性側のｐＨ範囲内に調整した後、限外ろ過膜にて透析処理する工程、Ｃ工程：ＨＡの含有液をセラミックス膜に接触させる工程、Ｄ工程：ＨＡの含有液を天然物を基材としたクロマトグラフィー用充填剤又は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程、Ｅ工程：ＨＡの含有液を精密ろ過膜に接触させる工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５工程を含むことを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
Ａ工程：無機吸着剤、又は無機吸着剤と活性炭にヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を接触させる工程。
Ｂ工程：ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を酸性側のｐＨ範囲内に調整した後、限外ろ過膜にて透析処理する工程。
Ｃ工程：ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液をセラミックス膜に接触させる工程。
Ｄ工程：ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を天然物を基材としたクロマトグラフィー用充填剤又は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程。
Ｅ工程：ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を精密ろ過膜に接触させる工程。
【請求項２】
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３】
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４】
Ａ、Ｄ、Ｂ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項５】
Ａ、Ｃ、Ｂ、Ｄ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項６】
Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｂ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項７】
Ａ、Ｄ、Ｃ、Ｂ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項８】
Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項９】
Ｂ、Ａ、Ｄ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１０】
Ｂ、Ｄ、Ａ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１１】
Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１２】
Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｂ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１３】
Ｄ、Ｂ、Ａ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１４】
Ａ工程の無機吸着剤の組成由来がＳｉＯ２、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣａＯ等のある適当な配合比よりなるものであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１５】
Ａ工程の無機吸着剤が請求項１４に記載の物であり、活性炭が水蒸気賦活活性炭、ウェットな活性炭、粉末活性炭、粒状活性炭、薬品賦活活性炭、石炭由来活性炭、木材由来活性炭、及びドライな活性炭から選ばれた一種であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１６】
Ｂ工程の限外ろ過膜の材質が、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、及びポリビニリデンジフルオライドから選ばれたものであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１７】
Ｃ工程のセラミック膜の材質が、Ａｌ２Ｏ３、ＺｒＯ３、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＣ、ＢＮ、ＭｇＯ、及びＺｎＯ等のある適当な配合比によりなることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１８】
Ｄ工程の充填剤がセルロース、ヒスチジン、メチルグルタメート、キチンキトサン等の天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基特にオクチル基およびこれらの末端を改変した官能基、オクタデシル基およびこれらの末端を改変した宮能基から選ばれた一種の官能基を有する逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項１９】
Ｅ工程の精密ろ過膜が、ポリスルフォン等の親水性膜、６−ナイロン、６，６−ナイロン、７−ナイロン、１１−ナイロン、１２−ナイロン、６，１１−ナイロン、６，１２−ナイロン等からなるポリアミド膜、ポリビニリデンジフルオライド、ポリテトラフロロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる疎水性膜、プラスのゼータ電位を有する膜から選ばれたものであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２０】
下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５工程順に処理することを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
Ａ工程：  請求項１４記載の無機吸着剤と水蒸気賦活活性炭、ウェットな活性炭、粉末活性炭、粒状活性炭、薬品賦活活性炭、石炭由来活性炭、木材由来活性炭、ドライな活性炭から選ばれた少なくとも一種の混合物にヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を接触させる工程。
Ｂ工程：  Ａ工程で得られた溶液を酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデンから選ばれた材質よりなる限外ろ過膜にて酸性側のｐＨ範囲内に調整した後、透析処理する工程。
Ｃ工程：  Ｂ工程で得られた溶液をＡｌ２Ｏ３、ＺｒＯ３、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＣ、ＢＮ、ＭｇＯ、及びＺｎＯ等のある適当な配合比の材質よりなるセラミック膜に接触させる工程。
Ｄ工程：  Ｃ工程で得られた溶液をセルロース、ヒスチジン、メチルグルタメート、キチンキトサン等の天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基特にオクチル基およびこれらの末端を改変した官能基、オクタデシル基およびこれらの末端を改変した官能基から選ばれた一種の官能基を有する逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程。
Ｅ工程：  Ｄ工程で得られた溶液をポリスルフォン等からなる親水性膜、６−ナイロン、６，６−ナイロン、７−ナイロン、１１−ナイロン、１２−ナイロン、６，１１−ナイロン、６，１２−ナイロン等からなるポリアミド膜、ポリビニリデンジフルオライド、ポリテトラエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる疎水性膜、プラスのゼータ電位を有する膜から選ばれたものに接触させる工程。
【請求項２１】
ヒアルロン酸の塩がナトウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びリチウム塩から選ばれたものである請求項２０記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２２】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の温度が０〜８０℃である請求項２１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２３】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の濃度が０．１〜１０ｇ／ｌである請求項２２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２４】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液のｐＨがＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ工程においては３〜１２であり、Ｂ工程においては２．５〜５．０である請求項２３記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２５】
前記Ａ工程における無機吸着剤の量がヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液１００重量％に対し０〜２０．０重量％である請求項２４記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２６】
前記Ａ工程における活性炭の量がヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液１００重量％に対し、５．０〜２０．０重量％である請求項２５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２７】
前記Ｂ工程における限外ろ過の方法が全量ろ過方式又はクロスフロー方式である請求項２６記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２８】
前記Ｂ工程における限外ろ過膜のろ材形状が平面膜、管型、スパイラル、ホロファイバー、プリーツ膜から選ばれた一種である請求項２７記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項２９】
前記Ｂ工程における限外ろ過膜の分画分子量が１〜１０万の範囲である請求項２８記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３０】
前記Ｂ工程における限外ろ過処理時の循環又はろ過速度が５ｍ／ｓ以下である請求項２９記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３１】
前記Ｃ工程におけるろ材構造が対称や非対称構造である請求項３０記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３２】
前記Ｃ工程におけるろ材形状が平面膜、管型、カートリッジ、ホロファイバー等から選ばれた一種である請求項３１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３３】
前記Ｃ工程におけるろ過精度が０．１〜１０μｍの範囲である請求項３２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３４】
前記Ｃ工程における通液する速度が有効ろ過表面積１ｍ２当たり２００ｌ／ｈｒ以下である請求項３３記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３５】
前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液がその他の塩を含むことを特徴とする請求項３４記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３６】
前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液がその他の塩が硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、から選ばれた少なくとも一種以上からなる請求項３５記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３７】
前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の塩濃度が０．５〜２０ｗ／ｖ％である請求項３６記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３８】
前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が水系である請求項３７記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項３９】
前記Ｄ工程における天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体の形状が球状又は破砕状である請求項３８記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４０】
前記Ｄ工程における天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体の平均粒径が数μｍ〜約１００μｍである請求項３９記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４１】
前記Ｄ工程における天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる方法が、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液に逆相クロマトグラフィー用充填剤を添加してバッチ式で撹拌するか又は、充填剤を充填塔等に充填後、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を通液処理する請求項４０記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４２】
前記Ｅ工程におけるろ材構造が表面ろ過構造又は深層ろ過構造である請求項４１記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４３】
前記Ｅ工程におけるろ材形状がシート、カートリッジ、ホロファイバーから選ばれた一種である請求項４２記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４４】
前記Ｅ工程におけるろ過精度が０．１〜１０μｍの範囲である請求項４３記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４５】
前記Ｅ工程における通液する速度が有効ろ過表面積１ｍ２当たり５００ｌ／ｈｒ以下である請求項４４記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
【請求項４６】
ヒアルロン酸及び／又はその塩が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする請求項１〜４５のいずれかに記載の精製法。
【請求項４７】
ヒアルロン酸及び／又はその塩が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする請求項１〜４５のいずれかに記載の精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「ヒアルロン酸及び／又はその塩」の含有液から「ヒアルロン酸及び／又はその塩」（以下、総称してヒアルロン酸類という〉を分離精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等の医薬品として用いられている。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は動物組織、例えば、工業規模ではニワトリのトサカ等から抽出する方法や、微生物を用いた発酵法により製造されている（ジェービー・ウールコック（Ｊ．Ｂ．Ｗｏｏｌｃｏｃｋ）、ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー，８５，３７２−３７５（１９７６））。
【０００３】
抽出法や発酵法によって製造されるヒアルロン酸には蛋白質や発熱性物質等が不純物として存在し、これらを分離除去して高純度の製品を得る方法が検討されている。特に発熱性物質の除去は非常に困難であり（特開昭５４−６７０２４号公報）、医薬品としても使用できる高純度な製品を得る方法の開発が待たれている。
【０００４】
例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩との錯体を形成させ不純物を分離した後、フロリジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を吸着させる方法（公表特許昭６２−５０１４７１号公報）がある。また、アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱性物質や蛋白質等を除去するヒアルロン酸の精製法も開示されている（特開昭６３−１２２９３号公報）。しかし、これらの方法では、操作が煩雑で収率が低いなどの課題があった。
【０００５】
本発明者らは、ヒアルロン酸類を高純度に精製する方法について検討し、発熱性物質、蛋白質、核酸等を除去するためにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法（特開平１−３１３５０３号公報）、及びヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後、シリカゲルに接触させる方法（特開平２−１０３２０４号公報）について提案した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５４−６７０２４号公報
【特許文献２】公表特許昭６２−５０１４７１号公報
【特許文献３】特開昭６３−１２２９３号公報
【特許文献４】特開平１−３１３５０３号公報
【特許文献５】特開平２−１０３２０４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ジェービー・ウールコック（Ｊ．Ｂ．Ｗｏｏｌｃｏｃｋ）、ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー，８５，３７２−３７５（１９７６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
工業的規模で医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには、上記の方法においても、（１）不純物のアルミナ、シリカゲルヘの吸着量が少ないので、アルミナやシリカゲルを多量に消費する、（２）アルミナ、シリカゲルは再生使用することができない、（３）ヒアルロン酸の回収率が低いなどの課題が残っていた。
【０００９】
本発明の目的は、高収率で高品質な医薬品グレードのヒアルロン酸類を工業的規模で分離精製する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明者等は、ヒアルロン酸類含有液からの発熱性物質や蛋白質等の不純物を効率よく分離除去し、高純度の医薬品のグレードのヒアルロン酸類を精製する新規方法について鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は、以下に記す方法に関するものである。すなわち、
（１）下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５工程を含むことを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
Ａ工程：  無機吸着剤、又は無機吸着剤と活性炭にヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を接触させる工程。
Ｂ工程：  ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を酸性側のｐＨ範囲内に調整した後、限外ろ過膜にて透析処理する工程。
Ｃ工程：  ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液をセラミックス膜に接触させる工程。
Ｄ工程：  ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を天然物を基材としたクロマトグラフィー用充填剤又は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程。
Ｅ工程：  ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を精密ろ過膜に接触させる工程。
（２）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３）Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４）Ａ、Ｄ、Ｂ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（５）Ａ、Ｃ、Ｂ、Ｄ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（６）Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｂ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（７）Ａ、Ｄ、Ｃ、Ｂ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（８）Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（９）Ｂ、Ａ、Ｄ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１０）Ｂ、Ｄ、Ａ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１１）Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１２）Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｂ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１３）Ｄ、Ｂ、Ａ、Ｃ及びＥの工程順に処理することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１４）Ａ工程の無機吸着剤の組成由来がＳｉＯ２、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣａＯ等のある適当な配合比よりなるものであることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１５）Ａ工程の無機吸着剤が（１４）に記載の物であり、活性炭が水蒸気賦活活性炭、ウェットな活性炭、粉末活性炭、粒状活性炭、薬品賦活活性炭、石炭由来活性炭、木材由来活性炭、及びドライな活性炭から選ばれた一種であることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１６）Ｂ工程の限外ろ過膜の材質が、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、及びポリビニリデンジフルオライドから選ばれたものであることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１７）Ｃ工程のセラミック膜の材質が、Ａｌ２Ｏ３、ＺｒＯ３、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＣ、ＢＮ、ＭｇＯ、及びＺｎＯ等のある適当な配合比によりなることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１８）Ｄ工程の充填剤がセルロース、ヒスチジン、メチルグルタメート、キチンキトサン等の天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基特にオクチル基およびこれらの末端を改変した官能基、オクタデシル基およびこれらの末端を改変した官能基から選ばれた一種の官能基を有する逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（１９）Ｅ工程の精密ろ過膜が、ポリスルフォン等の親水性膜、６−ナイロン、６，６−ナイロン、７−ナイロン、１１−ナイロン、１２−ナイロン、６，１１−ナイロン、６，１２−ナイロン等からなるポリアミド膜、ポリビニリデンジフルオライド、ポリテトラフロロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる疎水性膜、プラスのゼータ電位を有する膜から選ばれたものであることを特徴とする（１）〜（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２０）下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５工程順に処理することを特徴とするヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法。
Ａ工程：    （１４）記載の無機吸着剤と水蒸気賦活活性炭、ウェットな活性炭、粉末活性炭、粒状活性炭、薬品賦活活性炭、石炭由来活性炭、木材由来活性炭、ドライな活性炭から選ばれた少なくとも一種の混合物にヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を接触させる工程。
Ｂ工程：    Ａ工程で得られた溶液を酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデンから選ばれた材質よりなる限外ろ過膜にて酸性側のｐＨ範囲内に調整した後、透析処理する工程。
Ｃ工程：    Ｂ工程で得られた溶液をＡｌ２Ｏ３、ＺｒＯ３、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＣ、ＢＮ、ＭｇＯ、及びＺｎＯ等のある適当な配合比の材質よりなるセラミック膜に接触させる工程。
Ｄ工程：  Ｃ工程で得られた溶液をセルロース、ヒスチジン、メチルグルタメート、キチンキトサン等の天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基特にオクチル基およびこれらの末端を改変した官能基、オクタデシル基およびこれらの末端を改変した官能基から選ばれた一種の官能基を有する逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程。
Ｅ工程：    Ｄ工程で得られた溶液をポリスルフォン等からなる親水性膜、６−ナイロン、６，６−ナイロン、７−ナイロン、１１−ナイロン、１２−ナイロン、６，１１−ナイロン、６，１２−ナイロン等からなるポリアミド膜、ポリビニリデンジフルオライド、ポリテトラエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる疎水性膜、プラスのゼータ電位を有する膜から選ばれたものに接触させる工程。
（２１）  ヒアルロン酸の塩がナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びリチウム塩から選ばれたものである（２０）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２２）ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の温度が０〜８０℃である（２１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２３）ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の濃度が０．１〜１０ｇ／ｌである（２２）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２４）ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液のｐＨがＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ工程においては３〜１２であり、Ｂ工程においては２．５〜５．０である（２３）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２５）前記Ａ工程における無機吸着剤の量がヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液１００重量％に対し０〜２０．０重量％である（２４）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２６）前記Ａ工程における活性炭の量がヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液１００重量％に対し、５．０〜２０．０重量％である（２５）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２７）前記Ｂ工程における限外ろ過の方法が全量ろ過方式又はクロスフロー方式である（２６）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２８）前記Ｂ工程における限外ろ過膜のろ材形状が平膜、管状膜、スパイラル膜、ホロファイバー（中空糸）膜、プリーツ膜から選ばれた一種である（２７）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（２９）前記Ｂ工程における限外ろ過膜の分画分子量が１〜１０万の範囲である（２８）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３０）前記Ｂ工程における限外ろ過処理時の循環又はろ過速度が５ｍ／ｓ以下である（２９）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３１）前記Ｃ工程におけるろ材構造が対称や非対称構造である（３０）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３２）前記Ｃ工程におけるろ材形状が平面膜、管型、カートリッジ、ホロファイバー等から選ばれた一種である（３１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３３）前記Ｃ工程におけるろ過精度が０．１〜１０μｍの範囲である（３２）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３４）前記Ｃ工程における通液する速度が有効ろ過表面積１ｍ２当たり２００ｌ／ｈｒ以下である（３３）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３５）前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液がその他の塩を含むことを特徴とする（３４）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３６）前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液がその他の塩が硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、から選ばれた少なくとも一種以上からなる（３５）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３７）前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液の塩濃度が０．５〜２０ｗ／ｖ％である（３６）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３８）前記Ｄ工程におけるヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が水系である（３７）��載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（３９）前記Ｄ工程における天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体の形状が球状又は破砕状である（３８）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４０）前記Ｄ工程における天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体の平均粒径が数μｍ〜約１００μｍである（３９）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４１）前記Ｄ工程における天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる方法が、ヒアルロン酸及び／又はその塩の合有液に逆相クロマトグラフィー用充填剤を添加してバッチ式で撹拌するか又は、充填剤を充填塔等に充填後、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を通液処理する（４０）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４２）前記Ｅ工程におけるろ材構造が表面ろ過構造又は深層ろ過構造である（４１）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４３）前記Ｅ工程におけるろ材形状がシート、カートリッジ、ホロファイバーから選ばれた一種である（４２）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４４）前記Ｅ工程におけるろ過精度が０．１〜１０μｍの範囲である（４３）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４５）前記Ｅ工程における通液する速度が有効ろ過表面積１ｍ２当たり５００ｌ／ｈｒ以下である（４４）記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法、（４６）ヒアルロン酸及び／又はその塩が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする（１）〜（４５）のいずれかに記載の精製法、（４７）ヒアルロン酸及び／又はその塩が、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００を用いて、発酵法により製造されるものであることを特徴とする（１）〜（４５）のいずれかに記載の精製法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、発熱性物貿、タンパク質、微生物、微粒子などの除去された高純度の医薬品グレードのヒアルロン酸類を高収率かつ工業的規模で製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、更に本発明について詳しく説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸類は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、又はヒアルロン酸とヒアルロン酸の塩との混合物を包含している。ヒアルロン酸類は、遊離の形でもよく又その塩でもよく例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩等が挙げられるが、ナトリウム塩が好ましい。さらに本発明で使用するヒアルロン酸類含有液は動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでも使用できる。
【００１４】
発酵法によるヒアルロン酸は例えばストレプトコッカス属のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。
【００１５】
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、または特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研条寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。発酵液を用いる場合には、既知の方法、例えば、遠心分離やろ過処理等で除菌した液を使用することが望ましい。場合によっては、精密ろ過処理による水不溶微粒子の除去等の操作を行ってもよく、アルコール等の水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を析出したものを使用してもよい。また、膜の負荷を軽減する目的でアルミナや活性炭で処理してもよい。
【００１６】
Ａ工程：ヒアルロン酸含有液を無機吸着剤又は無機吸着剤と活性炭等と接触させることにより、タンパク質や発熱性物質等の大量の不純物を効率よく除去する工程。Ａ工程は、プロセスの比較的初期段階にて有効である。
【００１７】
本工程に用いる活性炭は、粉末活性炭、粒状活性炭等の形状に制限されるものではないが、好ましくは、粉末活性炭がよい。又、活性炭の由来（石炭または、ヤシガラ等）、製法（薬品賦活、水蒸気賦活）などに制限されるものではない。又、ドライ炭、ウエット炭等も制限されない。
【００１８】
活性炭として、ツルミコールＧＬ―３０Ｓ、同ＨＣ―３０Ｓ［粒状、（株）ツルミコール］、白鷺ＷＨ５Ｃ８／３２、同ＬＨ２Ｃ２０／４８、同ＷＨ２Ｃ８／３２ＳＳ［粒状・武田薬品工業（株）］、白鷺Ａ、白鷺Ｐ、精製白鷺、特性白鷺、カルボラフィン［粉状・武田薬品工業（株）］、北越ＳＤ、北越ＧＳＡ［粉状・北越炭素工業（株）］、シルバーＡ、花Ｆ、雪Ａ［粉状・大三工業（株）］等が使用できるが、これらに制限されるものではない。
【００１９】
本工程に用いる無機吸着剤の組成由来は、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２、ＭｇＯ、ＣａＯ、及びＡｌ（ＯＨ）３等があるがこれらの配合比や、製法、水和物の有無等に制限されるものではない。
【００２０】
無機吸着剤として、モンモロリナイトの酸処理物から成る活性白土［日本活性白土（株）］、ニッカナイトＧＨＣ―３６、ニッカナイトＧ―３６［日本活性白土（株）］、ニッカゲルＭ―３０、ＳｉＯ２・Ａｌ２Ｏ３から成るニッカゲルＳ−６５［日本活性白土（株）］、Ａｌ２Ｏ３・１０ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏから成るトミックスＡＤ−７００ＮＳ、Ａｌ２Ｏ３・ｘＨ２Ｏから成るトミックスＡＤ−２００ＮＳ、Ａｌ（ＯＨ）３・ＮａＨＣＯ３から成るトミックスＡＤ−４００ＮＳ、６ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・ＣＯ２・Ｈ２Ｏから成るトミックスＡＤ―５００ＮＳ、ＭｇＯ・３ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏから成るトミックスＡＤ―６００ＮＳ、ＭｇＯから成るトミックスＡＤ―１００Ｇ、ＭｇＯ・Ａｌ２Ｏ３・２ＳｉＯ２から成るトミックスＡＤ―３００ＮＳＳ、トミックスＡＤ―８００顆粒［富田製薬（株）］、Ｑ―Ｆｉｎｅ２０００、同３０００［富田製薬（株）］、合成ゼオライトＡ―４、合成ゼオライトＦ―９［東洋曹達工業（株）］、天然ゼオライト［日本活性白土（株）］、ベントナイト［和光純薬工業（株）］等が使用できるが、これらに制限されるものではない。
【００２１】
ヒアルロン酸類含有液（発酵液も含む）の活性炭及び無機吸着剤処理を行うにあたり、含有液のｐＨは３〜１２、特に４〜１１が好ましい。温度は０〜８０℃、ヒアルロン酸類濃度は０．１〜２０ｇ／ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／ｌである。含有液のｐＨが２．５未満の場合にはヒアルロン酸類のゲル化が生じ、１２以上の場合には、ヒアルロン酸が徐々に分解し、分子量が低下する。温度が８０℃を越えると処理中にヒアルロン酸類が徐々に分解し、分子量が低下する。ヒアルロン酸類濃度が１０ｇ／ｌを越えると溶液粘度が高くなり活性炭及び／又は無機吸着剤処理が難しくなる。ヒアルロン酸類含有液の粘度を下げる目的で食塩等の塩を共存させてもよい。
【００２２】
本工程の処理方法として、通常、活性炭及び無機吸着剤又は無機吸着剤のみをヒアルロン酸類含有液（発酵液も含む）に１回懸濁・撹拌処理するだけで充分であるが、好ましくは、無機吸着剤、活性炭の順で別々に懸濁・撹拌処理した方がよい。
【００２３】
ヒアルロン酸類含有液を処理する活性炭の量は、ヒアルロン酸類含有液１００重量％に対し０．５〜２０．０重量％、好ましくは５．０〜２０．０重量％である。無機吸着剤の量は、ヒアルロン酸類含有液１００重量％に対し０．５〜２０．０重量％、好ましくは５．０〜２０．０重量％である。撹拌時間は１０分〜２時間、好ましくは２０分〜１時間である。
【００２４】
Ｂ工程：    ヒアルロン酸類含有液を酸性側のｐＨ範囲内に調整した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより、蛋白質、乳酸、金属、培地由来の無機塩類等を除去する工程。
【００２５】
本工程に用いる限外ろ過膜は、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。又、限外ろ過膜の材質や構造等にとらわれるものではない。ろ過形状としては、平面膜、管型、スパイラル、ホロファイバー等、どのようなモジュール形式でもよい。
【００２６】
限外ろ過膜のろ過精度は、分画分子量は１〜１０万の範囲で使用できる。例えば、ＰＭ―１０、ＰＭ―５０、ＰＭ―１００（ロミコン社製）、ＮＴＵ―３０５０（日東電工社製）、ＩＲＩＳ３０６５（ローヌ・プラン社製）、ＦＳ―１００（旭化成社製）、ＤＵＳＯ４００（ダイセル化学工業社製）、ＭＵ―６０２２、ＭＵ―６３０２、ＭＵ―６３０３（クラレ社製）等が使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
ヒアルロン酸類含有液の限外ろ過膜透析処理を行うにあたり、含有液のｐＨは２．５〜５．０、温度は０〜８０℃、ヒアルロン酸類濃度は０．１〜１０ｇ／ｌが好ましい。含有液のｐＨが２．５未満又は温度が８０℃を越す場合には、ヒアルロン酸が徐々に分解し、分子量が低下する。ヒアルロン酸類濃度が１０ｇ／ｌを越えると溶液粘度が高くなり限外ろ過処理が難しくなり、ヒアルロン酸類含有液の粘度を下げる目的で食塩等の塩を共存させてもよい。
【００２８】
本工程の処理方法としては、一般的な定容量に純水を希釈しながら透析ろ過する方法あるいは、濃縮と純水の希釈を繰り返しながら透析ろ過する方法がある。この時の透析ろ過は全量ろ過法または、クロスフロー法のいずれでもよいが、好ましくはクロスフロー法である。
【００２９】
ヒアルロン酸類含有液を限外ろ過透析処理を行う場合、クロスフローに通液する濃縮側の線速度はヒアルロン酸類含有液の性状や限外ろ過膜の種類により異なり一律に規定する事ができないが、例えば、中空糸の場合５ｍ／ｓ以下が好ましい。線速度が５ｍ／ｓ以上の場合には、せん断によりヒアルロン酸の分子量の低下をきたす。又、限外ろ過透析処理を行うにあたり、膜前処理として、２％以下のアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム水溶液）、過酸化物（例えば、次亜塩素酸ナトリウム水溶液）、界面活性剤、クエン酸、クエン酸アンモニウム、酵素洗剤等の薬剤で膜を洗浄処理する化学的方法や、フラッシング、スポンジボール、空気インジェクション法等の物理的方法により行うことが望ましい。
【００３０】
Ｃ工程：  ヒアルロン酸類含有液をセラミック膜からなる濾材に接触させることにより、微粒子、発熱性物質やタンパク質等を効率良く除去し、更に使用したセラミック膜は通常の洗浄処理で容易に性能が回復し、高純度のヒアルロン酸類を取得する工程。
【００３１】
本工程に用いるセラミック膜はＡｌ２Ｏ３、ＺｒＯ３、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＣ、ＢＮ、ＭｇＯ、及びＺｎＯ等の適当な配合比により焼結させた物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。ろ過形状としては、平面膜、管型、カートリッジ、ホロファイバー等、どのような形式でもよい。
【００３２】
セラミック膜のろ過精度は０．１μｍ〜１０μｍの範囲で使用できるが、微粒子の除去を目的とする場合には２μｍ以下、ウイルスやバクテリアの完全除去を目的とする場合には０．４５以下のろ過精度が好ましい。
【００３３】
セラミック膜として、例えば、ＮＧＫ  モノリス型セラミック膜フィルター、ＮＧＫ  チューブラー型セラミック膜フィルター（日本ガイシ社製）、セラミックフィルターＣＥＬＡＦＬＯ（日本ミリポア・リミテッド社製）等が使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
ヒアルロン酸類含有液のセラミック膜処理を行うにあたり、含有液のｐＨは３〜１０、温度は０〜８０℃、ヒアルロン酸類濃度は０．１〜１０ｇ／ｌが好ましい。含有液のｐＨが３未満の場合にはヒアルロン酸類のゲル化が生じ、温度が８０℃を越す場合には、ヒアルロン酸が徐々に分解し、分子量が低下する。ヒアルロン酸類濃度が１０ｇ／ｌを越えると溶液粘度が高くなりセラミック膜処理が難しくなり、ヒアルロン酸類含有液の粘度を下げる目的で食塩等の塩を共存させてもよい。
【００３５】
本工程の処理方法としては、クロスフローや直ろ過方法が使用できる。通常、セラミック膜にヒアルロン酸類含有液を１図通液するだけで充分であるが、必要なら、反復処理しても良い。また、セラミック膜は１段、あるいは複数個を直列に接続して使用することもできる。
【００３６】
ヒアルロン酸類含有液をセラミック膜に通液する速度はヒアルロン酸類含有液の性状や膜の種類によりことなり一律に規定することが出来ないが、有効ろ過面積１ｍ２当たり４０ｌ／ｈｒを越えると閉塞を生じやすくなる。その結果、ゲル付着等により収率低下となるので、有効ろ過面積１ｍ２当たり２００ｌ／ｈｒ以下が好ましい。
【００３７】
微粒子、タンパク質や発熱性物質等の不純物を吸着する能力が低下したセラミック膜は、通常の酸、アルカリ洗浄、酵素洗浄、界面活性剤洗浄、キレート洗浄、次亜塩素酸洗浄、過酸化水素洗浄等の化学的洗浄、フラッシングや逆洗浄の物理的洗浄等で初期性能に回復させることが出来る。
【００３８】
Ｄ工程：ヒアルロン酸類含有液を天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させ、発熱性物質、タンパク質、核酸、金属等の不純物を効率よく除去し、高純度のヒアルロン酸類を取得する工程。
【００３９】
本工程に用いられる天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤の担体は、セルロース、ヒスチジン、メチルグルタメート、キチンキトサン系の球状又は破砕状のものが好ましい。逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体は、シリカゲル又は、合成樹脂の球状又は破砕状のものが好ましい。その平均粒径は、数μｍから約１００μｍのものが好ましい。
【００４０】
本工程に用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に、置換又は未置換の炭化水素基を結合させたものであり、特に鎖長が炭素数８以上のものを用いることを特徴とする。その例として、オクチル基、オクタデシル基およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００４１】
鎖長が炭素数８以下の置換又は未置換の炭化水素基として、例えばトリメチル基、ブチル基、フェニル基、シアノプロピル基、アミノプロピル基、等が挙げられるが、これらは本工程には適さない。
【００４２】
本工程に適するものとして、例えば市販されているオクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤［ＹＭＣ・ＧEＬ  Ｃ８−１２０−Ｓ５（ＹＭＣ製）］、［ＹＭＣ・ＧEＬ  Ｃ８−３００−Ｓ５（ＹＭＣ製）］、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤［ＹＭＣ・ＧEＬ  ＯＤＳ−ＡＭ−１２０−Ｓ５０（ＹＭＣ製）］、［ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−Ａ１２０−Ｓ３０／５０（ＹＭＣ製）］、［ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＱ６０−Ｓ５０（ＹＭＣ製）］、［ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ５０（ＹＭＣ製）］、アルキル基をビニルアルコール・コポリマーに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤［ＯＤＰ−４００（昭和電工社製）］、［Ｃ８Ｐ−４００（昭和電工社製）］、［Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ＰＷ（東ソー社製）］、γ−メチルＬ−グルタメートをアミノ化した［パイロトール（日本濾水機社製）］、セルロースをアミノ化した［パイロセップ−Ｃ（ダイセル化学社製）］、キチンキトサンをアミノ化した［クリムーバ（栗田工業社製）］などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００４３】
天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる溶媒は、水−有機溶媒の混合溶媒系に塩を含むものが一般的に用いられるが、本工程に於いては、塩を含むヒアルロン酸類水溶液を天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが特に良い。本工程に用いられる塩の種類は、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸力リウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等を使用することが出来るが、これに制限されるものではない。すなわち、ヒアルロン酸類含有液を天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるに当たり、ヒアルロン酸類含有液は、水系で、塩濃度は０．５〜２０ｗ／ｖ％が好ましい。また水溶液のｐＨは３〜１２、温度は０〜８０℃、ヒアルロン酸類の濃度は０．１〜１０ｇ／ｌが好ましい。
【００４４】
天然物を基材とするクロマトグラフィー用充填剤又は逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる方法としては、ヒアルロン酸類含有液に逆相クロマトグラフィー用充填剤を添加して、バッチ式で撹拌する方法と、充填塔等に充填後、ヒアルロン酸類含有液を通液処理する方法、またはその組合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択により、１回の処理で十分である。
【００４５】
発熱性物質、タンパク質、核酸等の不純物を除去する能力の低下した天然物を基材としたクロマトグラフィー用充填剤又は、逆相クロマトグラフィー用充填剤は、通常の脱着、洗浄、再生処理で簡単に初期の性能に回復させることが出来る。
【００４６】
Ｅ工程：  ヒアルロン酸類含有液を親水性膜、ポリアミド膜、疎水性膜、プラスのゼータ電位を有する膜から選ばれた一種の濾材に接触させることにより、発熱性物質やタンパク質等を効率よく吸着除去し、高純度のヒアルロン酸類を取得する工程。
【００４７】
本工程に用いる親水性膜としては、ポリスルフォン等であり、ポリアミド膜としては、６−ナイロン、６，６−ナイロン、７−ナイロン、１１−ナイロン、１２−ナイロン、６，１１−ナイロン、６，１２−ナイロン等であり、疎水性膜としては、ポリビニリデンジフルオライド、ポリテトラフロロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、等であり、これらに制限されるものではない。また、荷電膜としては、ヒアルロン酸類含有水溶液中でゼータ電位がプラスに荷電している膜であれば良く、例えば、膜の材質や構造、荷電方法などにとらわれるものではない。
【００４８】
また、膜の材質や構造等にとらわれるものではない。濾材構造として表面濾過構造や深層濾過構造等が使用できる。また、形状はシートやカートリッジ、ホロファイバー等、どのような形でも良い。
【００４９】
膜の濾過精度は０．１μｍ〜１０μｍの範囲で使用できるが、ウイルスやバクテリアの完全除去を目的とする場合には０．４５μｍ以下の濾過精度が好ましい。
【００５０】
具体的には、親水性膜としては例えば、デュラポア（日本ミリポア社製）、スーポア（ゲルマンサイエンス社製）、ポリアミド膜としては例えば、ウルチポアＮ６６、ポジダイン（以上、日本ポール社製）、ゼータポア（以上、キュノ社製）。
【００５１】
疎水性膜としては、例えばデュラポア（日本ミリポア社製）、エンフロン（日本ポーラ社製）、マイクロフローフィルター（キュノ社製）、ステラポア（三菱レーヨン社製）。
【００５２】
荷電膜として、例えばポジダイン、プロファイル  プラス、ウルチポアＧＦ  ＰＬＵＳ  （以上、日本ポール社製）、ゼータポア、ゼータプラス（以上、キュノ社製）等が使用できるがこれらに制限されるものではない。
【００５３】
ヒアルロン酸類含有液の膜処理を行うに当たり、含有液のｐＨは３〜１２、特に４〜９、温度は０〜８０℃、ヒアルロン酸類濃度は０．１〜１０ｇ／ｌが良い。含有液のｐＨが２．５未満の場合にはヒアルロン酸類のゲル化が生じ、ろ過困難となる。ｐＨが９を越えた場合には、膜の吸着効果が低下する傾向にある。
【００５４】
温度が８０℃を越えると処理中にヒアルロン酸類が徐々に分解し、分子量が低下する。
【００５５】
ヒアルロン酸類濃度が１０ｇ／ｌを越えると溶液粘度が高くなり膜処理が難しくなる。
【００５６】
ヒアルロン酸類水溶液の粘度を下げる目的で食塩等の塩を共存させても良いが、高濃度になるとポリアミド膜の吸着効果が低下する傾向にある。
【００５７】
本発明の処理方法としては、通常、膜にヒアルロン酸類水溶液を１回通液するだけで充分であるが、必要なら、反復処理しても良い。また、膜は１段、あるいは複数個を直列に接続して使用することもできる。
【００５８】
ヒアルロン酸類含有液を膜に通液する速度はヒアルロン酸類含有液の性状や膜の種類により異なり一律に規定することが出来ないが、有効ろ過面積１ｍ２当たり５００ｌ／ｈｒを越えると閉塞を生じやすくなる。その結果、ゲル付着等により収率低下となるので、有効ろ過面積１ｍ２当たり５００ｌ／ｈｒ以下が好ましい。
【００５９】
ただし、疎水性膜処理を行うにあたり、膜前処理として、エタノールを通液し親水化処理することが望ましい。タンパク質や発熱性物質等の不純物を吸着する能力が低下した膜は、通常の酸・アルカリ洗浄、酵素洗剤、界面活性剤洗浄、キレート洗浄、次亜塩素酸洗浄、過酸化水素洗浄等の化学的洗浄、フラッシングや逆洗等の物理的洗浄等で初期の性能に回復させることが出来る。
【００６０】
以上、上記は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの工程順に処理することを詳細に説明したが、工程順は請求項２〜９のような工程順に処理することも可能であるが、特に好ましくはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの工程順に処理することである。
【００６１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００６２】
実施例１
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤として活性白土［日本活性白土社製］６．７５０ｋｇ（１５重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ―６３０３―ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６３】
実施例２
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤として活性白土［日本活性白土社製］３．３７５ｋｇ（７．５重量％）、有機吸着剤としてクリムーバ［栗田工業社製］３．３７５ｋｇ（７．５重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４２ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６４】
実施例３
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］１．１２５５ｋｇ（２．５重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．３７５ｋｇ（７．５重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６５】
実施例４
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてＱ−Ｆｉｎｅ２０００［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．６００ｋｇ（８．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１３９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６６】
実施例５
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ―１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し有機吸着剤としてＰＭＬＧ―ＥＤ［ファルマシア社製］１．１２５ｋｇ（２．５重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］１．１２５ｋｇ（２．５重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター（日本ポール社製）に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６７】
実施例６
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤として活性白土［日本活性白土社製］２．２５０ｋｇ（５．０重量％）、活性炭としてウエットな白鷺Ａ［武田薬品工業社製］２．２５０ｋｇ（５．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０１を線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６８】
実施例７
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤として合成ゼオライトＡ−４［東洋曹達社製］０．２２５ｋｇ（０．５重量％）、活性炭としてウエットな白鷺Ａ［武田薬品工業社製］２．０２５ｋｇ（４．５重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００６９】
実施例８
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７０】
実施例９
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤として活性白土［日本活性白土社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７１】
実施例１０
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤として合成ゼオライトＡ−４［東洋曹達工業社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７２】
実施例１１
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてベントナイト［和光純薬工業社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７３】
実施例１２
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７４】
実施例１３
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量５万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＰＭ―５０［ロミコン社製］２ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４３ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７５】
実施例１４
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量１０万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＰＭ―１００［ロミコン社製］２ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４３ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７６】
実施例１５
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量１万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＰＭ−１０［ロミコン社製］２ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１３９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７７】
実施例１６
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量３万材質ポリエーテルスルフォンの限外ろ過膜ＦＳ―１００［旭化成社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７８】
実施例１７
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微王研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４―２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量２万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＮＴＵ―３０５０［日東電工社製］３ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００７９】
実施例１８
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量４万材質ポリビニリデンジフロライドの限外ろ過膜ＩＲＩＳ−３０６５［ローヌプラン社製］３ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０ｘ１０００ｍｍ、φ４ｘ１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４０ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８０】
実施例１９
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ２．９に調整した後、分画分子量４万材質ポリアクリロニトリルの限外ろ過膜ＤＵＹＬ−０００［ダイセル化学工業社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８１】
実施例２０
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［冨田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．９に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して９４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８２】
実施例２１
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８３】
実施例２２
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［冨田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ１６×８４０ｍｍＣＥＬＡＦＬＯ［日本ミリポア・リミテッド社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８４】
実施例２３
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ１０×１０００ｍｍ  マルチポアロンＴＣ−２［三井研削砥石社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８５】
実施例２４
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．５μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３１×７５０ｍｍ  ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ  チューブタイプ  メディア［東芝セラミックス社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８６】
実施例２５
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ＰＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＹＭＣ・ＧＥＬＯＤＳ−ＡＱ−１２０−Ｓ５０［ＹＭＣ社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４０ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８７】
実施例２６
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ＰＷ［東ソー社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒナルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８８】
実施例２７
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ  ７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍ樹脂製カラムに、γ−メチル  Ｌ−グルタメートをアミノ化した充填剤パイロトール［日本濾水機工業社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００８９】
実施例２８
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、セルロースを基材とした充填剤パイロセップ−Ｃ［ダイセル化学工業社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンプランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９０】
実施例２９
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、キトサンを基材とした充填剤クリムーバＩＩ［栗田工業社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９１】
実施例３０
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．２μｍのプラスのゼータ電位を有するポジダイン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９２】
実施例３１
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度１μｍのプラスのゼータ電位を有するプロファイルプラス・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９３】
実施例３２
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．２μｍのプラスのゼータ電位を有するウルチポアＧＦプラス・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１３９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９４】
実施例３３
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍの疎水性膜デュラポア・メンブランフィルター［日本ミリポア社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９５】
実施例３４
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン醸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｒｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．２μｍの疎水性膜エンフロン・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４１ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９６】
実施例３５
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・工クイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［冨田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．２μｍのポリアミド膜ウルチポアＮ６６・メンブランフィルター［日本ポール社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９７】
実施例３６
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．２μｍのポリアミド膜ゼータポア・メンブランフィルター［キュノ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４３ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９８】
実施例３７
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［冨田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．２μｍのポリスルフォン膜スーポアフロー・メンブランフィルター［ゲルマンサイエンス社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４２ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００９９】
実施例３８
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度１．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤ＯＤＰ４００［昭和電工社製］を１．０ｌ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍのポリスルフォン膜スーポアフロー・メンブランフィルター［ゲルマンサイエンス社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４２ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【０１００】
実施例３９
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり８５ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ＰＷ［東ソー社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．８５ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍの親水性膜デュラポア・メンブランフィルター［日本ミリポア社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２６０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４２ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【０１０１】
実施例４０
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり４５ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ＰＷ［東ソー社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．４５ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍの親水性膜デュラポア・メンブランフィルター［日本ミリポア社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり１４５ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【０１０２】
実施例４１
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製」０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ＰＷ［東ソー社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．７ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍの親水性膜デュラポア・メンブランフィルター［日本ミリポア社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２２０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【０１０３】
実施例４２
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｃ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌを濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり８５ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｂ工程］
Ｃ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｄ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ｐｗ［東ソー社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＢ工程で得られた溶液７０ｌをＳ線速０．８５ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍの親水性膜デュラポア・メンブランフィルター［日本ミリポア社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２６０ｌ／ｈｒの流量で通液した。得られた溶液をエタノール２１０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して１４４ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【０１０４】
比較例１
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ３．５）を２００ｌのポリエチレン製タンクに採取する。前記処理液を濾紙（アドバンテック東洋社製１０３４−２）で加圧による濾過処理を行った。得られた溶液に塩化ナトリウム１．３４ｋｇを溶解、ｐＨ７に調整後、エタノール１３５ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥した。分析結果を表１に示す。
【０１０５】
比較例２
［Ａ工程］
ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７）を用いて培養した発酵液４５ｌ（ヒアルロン酸ナトリウム濃度３．５ｇ／ｌ、ｐＨ４．０）を１００ｌのポリエチレン製タンクに採取し無機吸着剤としてトミックスＡＤ−７００ＮＳ［富田製薬社製］０．４５０ｋｇ（１．０重量％）、活性炭として白鷺Ｐ［武田薬品工業社製］３．１５０ｋｇ（７．０重量％）を添加し、撹拌機を用い５０ｒｐｍで０．５時間懸濁撹拌処理した。前記処理液を濾紙１０３４−２［アドバンテック東洋社製］で加圧による濾過処理を行った。
［Ｂ工程］
Ａ工程で得られた溶液４５ｌをｐＨ３．５に調整した後、分画分子量１．３万材質ポリスルフォンの限外ろ過膜ＭＵ−６３０３−ＨＧ［クラレ社製］５ｍ２にて循環線速度０．５ｍ／ｓ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回で処理した。
［Ｃ工程］
Ｂ工程で得られた溶液７０ｌに塩化ナトリウム２．１ｋｇを溶解した後、濾過精度２．０μｍのアルミナからなるセラミック膜フィルターφ３０×１０００ｍｍ、φ４×１９穴、ＮＧＫ  モノリス型［日本ガイシ社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり２５ｌ／ｈｒの流量で通液した。
［Ｄ工程］
内径２５ｃｍ、高さ２ｃｍの樹脂製カラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−４ＰＷ［東ソー社製］を１．０ｌ充填し、水、塩化ナトリウム溶液の順に平衡化し、上記カラムにＣ工程で得られた溶液７０ｌを線速０．２５ｍ３／ｍ２・ｈｒの流量で通液した。
［Ｅ工程］
Ｄ工程で得られた溶液７０ｌを濾過精度０．４５μｍの親水性膜デュラポア・メンブランフィルター［日本ミリポア社製］に有効ろ過表面積１ｍ２あたり７０ｌ／ｈｒの流量で通液した。流量を速くすることで膜表面にゲル等が形成されて膜に閉塞を生じるようになったので、Ｅ工程で得られた溶液は６０ｌであった。得られた溶液をエタノール１８０ｌで析出し、エタノール８ｌで洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して７９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【０１０６】
【表１Ａ】
2011195611.tif 000002
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１０７】
【表１Ｂ】
2011195611.tif 000003
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１０８】
【表１Ｃ】
2011195611.tif 000004
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１０９】
【表１Ｄ】
2011195611.tif 000005
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１１０】
【表１Ｅ】
2011195611.tif 000006
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１１１】
【表１Ｆ】
2011195611.tif 000007
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１１２】
【表１Ｇ】
2011195611.tif 000008
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１１３】
【表１Ｈ】
2011195611.tif 000009
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１１４】
【表１Ｉ】
2011195611.tif 000010
＊  Ｃａ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｒ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｐｂの合計組成
N.D.  検出せず
【０１１５】
測定方法
（１）タンパク質：精製ヒアルロン酸を０．１N水酸化ナトリウムに溶かし、ローリー法でタンパク質含量を測定した。
（２）乳酸：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％の濃度に溶解し、Ｌ−ＬＤＨ法にて行った。
（３）核酸：０．１％ヒアルロン酸ナトリウムの２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（４）アミノ酸：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％濃度に溶解し、ＬＣ−ＯＰＡ法にて行った。
（５）エンドトキシン：生化学工業社製トキシカラーシステムにより比色分析した。
（６）重金属：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１ｇ白金るつぼにとり、局方第二法にて行った。
（７）金属：ヒアルロン酸ナトリウムを０．０５％の濃度になるように８Ｎ硝酸に溶解し、ＩＣＰ発光分光分析を行った。
（８）異物：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％となるように、ペプトン緩衝液に溶解し、日本薬局方、一般試験法の無菌試験・メンブレンフィルター法で行った。
（９）極限粘度：ヒアルロン酸ナトリウムを０．０２％となるように、０．２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、３０℃における極限粘度を測定した。