(57)【要約】【課題】滅菌性を担保しながら簡便に脂肪由来細胞を賦活化し、迅速に高い治療効果を得る。【解決手段】ヒトの脂肪組織から分離された脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与える脂肪由来細胞の賦活化方法を提供する。また、ヒトの脂肪組織から分離した脂肪由来細胞を含む移植材の製造方法であって、脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与える賦活化ステップを備える移植材の製造方法を提供する。本発明によれば、３８〜４２℃の熱を与えるだけで効果的に脂肪由来細胞を賦活化できる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの脂肪組織から分離された脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与える脂肪由来細胞の賦活化方法。
【請求項２】
前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を与える請求項１に記載の脂肪由来細胞の賦活化方法。
【請求項３】
前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を１０分間以上与える請求項２に記載の脂肪由来細胞の賦活化方法。
【請求項４】
前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を３０分間与える請求項３に記載の脂肪由来細胞の賦活化方法。
【請求項５】
ヒトの脂肪組織から分離した脂肪由来細胞を含む移植材の製造方法であって、
前記脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与える賦活化ステップを備える移植材の製造方法。
【請求項６】
前記賦活化ステップが、前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を与える請求項５に記載の移植材の製造方法。
【請求項７】
前記賦活化ステップが、前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を１０分間以上与える請求項６に記載の移植材の製造方法。
【請求項８】
前記賦活化ステップが、前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を３０分間与える請求項７に記載の移植材の製造方法。
【請求項９】
前記脂肪組織を消化酵素液と撹拌することにより、前記脂肪組織から前記脂肪由来細胞を分離させる消化ステップを備え、
前記賦活化ステップが、前記消化ステップにおいて前記脂肪組織を３８〜４２℃の前記消化酵素液と撹拌することにより行われる請求項５に記載の移植材の製造方法。
【請求項１０】
前記脂肪組織を消化酵素液と撹拌して消化することにより、前記脂肪組織から前記脂肪由来細胞を分離させる消化ステップと、
該消化ステップにおいて消化酵素液内で分離させられた脂肪由来細胞を洗浄液によって洗浄する洗浄ステップとを備え、
前記賦活化ステップが、前記洗浄ステップにおいて３８〜４２℃の洗浄液によって脂肪由来細胞を洗浄することにより行われる請求項５に記載の移植材の製造方法。
【請求項１１】
請求項５から請求項１０のいずれかに記載の移植材の製造方法により製造された移植材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪由来細胞の賦活化方法、移植材の製造方法および移植材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体から採取した脂肪組織から、幹細胞等を含む脂肪由来細胞を分離する細胞分離装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。分離された脂肪由来細胞は、移植材として脂肪組織の提供者の体内に移植されるなどして治療に利用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１３６１６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、脂肪由来細胞は、細胞分離装置によって様々な処理が施される間に活性が低下した状態となり、分離された脂肪由来細胞をそのまま治療に用いても迅速に十分な治療効果を得ることが難しいという問題がある。分離された脂肪由来細胞を細胞分離装置から取り出して賦活化の処理をしてから治療に用いる方法も考えられるが、人による操作が必要となり作業が煩雑になる上、それまで細胞分離装置内で滅菌性が担保されていた脂肪由来細胞に不純物が混入する可能性が有るという問題がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、滅菌性を担保しながら簡便に脂肪由来細胞を賦活化し、迅速に高い治療効果を得ることができる脂肪由来細胞の賦活化方法、移植材の製造方法および移植材を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、ヒトの脂肪組織から分離された脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与える脂肪由来細胞の賦活化方法を提供する。
本発明によれば、ヒトの脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与えるだけで脂肪由来細胞を賦活化することができる。したがって、簡便な操作で脂肪由来細胞を賦活化できるとともに、非接触で滅菌性を担保しながら脂肪由来細胞を賦活化することができる。また、このようにして賦活化された脂肪由来細胞を治療に用いた際に、迅速に高い治療効果を得ることができる。
【０００７】
上記発明においては、前記脂肪由来細胞に、４０℃の熱を与えることが好ましい。
このようにすることで、脂肪由来細胞をより効果的に賦活化することができる。
また、上記発明においては、前記脂肪由来細胞に、４０℃の熱を１０分間以上与えることが好ましく、４０℃の熱を３０分間与えることがさらに好ましい。
このようにすることで、脂肪由来細胞をさらに活性の高い状態にすることができる。
【０００８】
また、本発明は、ヒトの脂肪組織から分離した脂肪由来細胞を含む移植材の製造方法であって、前記脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与える賦活化ステップを備える移植材の製造方法を提供する。
本発明によれば、賦活化ステップにおいて脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱を与えるだけの簡便な操作で脂肪由来細胞が賦活化されるので、滅菌性を担保しながら迅速に高い治療効果を得ることができる移植材を製造することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記賦活化ステップが、前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を与えることが好ましい。
また、上記発明においては、前記賦活化ステップが、前記脂肪由来細胞に４０℃の熱を１０分間以上与えることが好ましく、４０℃の熱を３０分間与えることがより好ましい。
【００１０】
また、上記発明においては、前記脂肪組織を消化酵素液と撹拌することにより、前記脂肪組織から前記脂肪由来細胞を分離させる消化ステップを備え、前記賦活化ステップが、前記消化ステップにおいて前記脂肪組織を３８〜４２℃の前記消化酵素液と撹拌することにより行われてもよい。
このようにすることで、消化ステップと賦活化ステップとを並行して行い、移植材の製造に要する時間を短縮することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記脂肪組織を消化酵素液と撹拌して消化することにより、前記脂肪組織から前記脂肪由来細胞を分離させる消化ステップと、該消化ステップにおいて消化酵素液内で分離させられた脂肪由来細胞を洗浄液によって洗浄する洗浄ステップとを備え、前記賦活化ステップが、前記洗浄ステップにおいて３８〜４２℃の洗浄液によって脂肪由来細胞を洗浄することにより行われてもよい。
このようにすることで、脂肪由来細胞が賦活化されてから治療に使用されるまでの時間を短くし、脂肪由来細胞をより活性の高い状態で治療に使用することができる。
【００１２】
また、本発明は、上記いずれかに記載の移植材の製造方法により製造された移植材を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、滅菌性を担保しながら簡便に脂肪由来細胞を賦活化し、迅速に高い治療効果を得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る移植材の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】本実施形態に係る移植材の製造方法を実施するための移植材製造装置の全体構成図である。
【図３】脂肪由来細胞を熱処理したときの、加温温度と遊走細胞数との関係を示すグラフである。
【図４】脂肪由来細胞を４０℃で熱処理したときの、熱処理時間と遊走細胞数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る移植材の製造方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る移植材の製造方法は、図１に示されるように、脂肪組織を消化することにより該脂肪組織から脂肪由来細胞を分離させて細胞懸濁液を生成する消化ステップＳ１と、細胞懸濁液を所定温度に加温することにより脂肪由来細胞を賦活化する賦活化ステップＳ２と、細胞懸濁液を搬送する搬送ステップＳ３と、脂肪由来細胞を洗浄する洗浄ステップＳ４とを備えている。本発明に係る脂肪由来細胞の賦活化方法は、賦活化ステップＳ２に相当する。
【００１６】
図２に、本実施形態に係る移植材の製造方法を実施するための移植材製造装置の一例を示す。
移植材製造装置１は、消化ステップＳ１を行う分解処理部２と、洗浄ステップＳ４を行う細胞濃縮部３と、分解処理部２から細胞濃縮部３へ細胞懸濁液を搬送する搬送経路４とを備えている。
【００１７】
分解処理部２は、ヒトの体内からカニューレなどによって吸引した脂肪組織を収集容器５内に収集し、該収集容器５内で脂肪組織を消化酵素液とともに振とう機６によって撹拌することにより脂肪組織を消化する。これにより、脂肪組織に結合していた脂肪由来細胞が脂肪組織から分離し、消化酵素液内に脂肪由来細胞が遊離した細胞懸濁液が生成される。
【００１８】
分解処理部２は、収集容器５内を加温するヒータ７を備えている。ヒータ７は、収集容器５の外部で温度を調節することにより収集容器５内を少なくとも４０℃まで加温できるものであればよく、例えば、収集容器５の側面を覆うように配置されたエアジャケット方式、収集容器５の外側面に配置されたパイプ等内に加温した液体を循環させる液体循環方式、収集容器５の外側面に配置された伝熱線などが用いられる。
収集容器５内で生成された細胞懸濁液は、フィルタ８によって脂肪組織の残渣が取り除かれながら収集容器５の底部の排出口から排出されると、搬送経路４を介して細胞濃縮部３へ搬送されるようになっている。
【００１９】
細胞濃縮部３は、搬送経路４を介して分解処理部２から搬送されてきた細胞懸濁液を遠心分離容器９内に収容すると、遠心分離機１０によって細胞懸濁液を遠心分離することにより、脂肪由来細胞の沈殿塊と消化酵素液を含む上清とに分離する。遠心分離容器９内には深さ方向の途中位置まで配管９ａが挿入されている。これにより、遠心分離後に配管９ａから上清を吸引すると、脂肪由来細胞の沈殿塊と少量の上清とを残して上清が遠心分離容器９内から排出される。また、このようにして上清を排出した後に配管９ａを介して液体を遠心分離容器９内に供給すると、液体の流入の勢いによって凝集していた脂肪由来細胞が液体内に撹拌されるようになっている。
【００２０】
搬送経路４は、洗浄液を収容する洗浄液バッグ１１と、廃液を収容する廃液バッグ１２と、各容器５，９および各バッグ１１，１２を接続するチューブ１３と、該チューブ１３内に送りをかけるチューブポンプ１４と、チューブ１３の途中位置に設けられ送液経路を切り替えるバルブＶ１〜Ｖ１０とを備えている。
【００２１】
このように構成された移植材製造装置１を用いた移植材の製造方法について、以下に説明する。
まず、収集容器５内で脂肪組織と消化酵素液とを撹拌して消化ステップＳ１を行う。このときに、ヒータ７によって収集容器５内の温度を３８〜４２℃、より好ましくは４０℃に保ちながら脂肪組織と消化酵素液とを撹拌することにより、同時に賦活化ステップ２を行う。消化ステップＳ１および賦活化ステップＳ２は、１０分間以上、より好ましくは３０分間程度行われる。消化ステップＳ１および賦活化ステップＳ２の後、収集容器５内で生成された細胞懸濁液は搬送ステップＳ３において遠心分離容器９に搬送される。
【００２２】
続いて、洗浄ステップＳ４において、細胞懸濁液を遠心分離して脂肪由来細胞を沈降させ、上清を廃液バッグ１２に排出することにより、脂肪由来細胞から消化酵素を除去する。次に、搬送経路４を介して洗浄液バッグ１１から遠心分離容器９に洗浄液を供給し、洗浄液と脂肪由来細胞とを遠心分離し、上清を廃液バッグ１２に排出することにより脂肪由来細胞を洗浄する。必要であれば脂肪由来細胞の洗浄を複数回繰り返す。これにより、最終的に純度の高い脂肪由来細胞の沈殿塊が遠心分離容器９内に得られる。
【００２３】
そして、遠心分離容器９内から脂肪由来細胞の沈殿塊を少量の上清とともに回収することにより、脂肪由来細胞の濃縮液からなる移植材を製造することができる。移植材は、脂肪由来細胞の濃縮液に適宜他の材料が混合されてもよい。
【００２４】
このように製造された移植材によれば、賦活化ステップＳ２において脂肪由来細胞に３８〜４２℃の熱が与えられることにより脂肪由来細胞が刺激され、それまで低下していた脂肪由来細胞の機能が活性化された状態で製造される。これにより、製造後に移植材をそのまま治療に用いても迅速に十分な治療効果を得ることができるという利点がある。
【００２５】
また、収集容器５の外部から脂肪由来細胞に非接触で刺激が与えられるので脂肪由来細胞の滅菌性を担保することができるとともに、ヒータ７を利用しただけの簡便な構成と操作で効果的に脂肪由細胞を賦活化することができるというという利点がある。また、消化ステップＳ１と並行して賦活化ステップＳ２を行うことにより、移植材の製造に要する時間を短縮することができる。
【００２６】
図３および図４に、脂肪由来細胞に与える熱の温度および熱処理時間と、それによる脂肪由来細胞の活性化の効果との関係を調べた実験結果を示す。
実験は、２４ウェルのＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  マトリゲルインベージョンチャンバー（日本ディクソン・ベッキソン株式会社製）を使用して以下の手順で行った。
【００２７】
まず、無血清培地であるＥＢＭ−２（血管内皮細胞用基礎培地）を、コンパニオンプレート（以下、プレートという）から外したセルカルチャーインサート（以下、インサートという。）内に分注してインサートを十分に水和させた。一方、ヒトの脂肪組織から分離した脂肪由来細胞を所定温度で所定時間保温することにより熱処理した。次に、熱処理した脂肪由来細胞を、１×１０６ｃｅｌｌｓ／２００ｍＬの細胞密度になるようにＸ−ｖｉｖｏ（リンパ球用培地）で調整し、細胞懸濁液を作成した。
【００２８】
次に、インサート内からＥＢＭ−２を除去し、細胞懸濁液を２５０ｍＬずつ各インサート内に分注した。次に、プレート内に５００μＬの誘導培地を添加した。誘導培地として、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および１００ｎｇ／ｍＬのＳＤＦ（ストロマ細胞由来因子）を添加したＥＢＭ−２を使用した。次に、各インサートをプレートに設置し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間インキュベーションした。次に、プレートから各インサートを取り外し、クリスタルバイオレットによりプレート上の脂肪由来細胞を染色し、染色された脂肪由来細胞の数を計測した。
【００２９】
以上の実験により、ＦＢＳおよびＳＤＦに誘引されてインサートからプレートに遊走してきた脂肪由来細胞（以下、遊走細胞という。）、すなわち、十分に高い活性を有する脂肪由来細胞の数を計測し、異なる条件で脂肪由来細胞を熱処理したときの遊走細胞数を比較することにより、熱処理による脂肪由来細胞の賦活化の効果を評価した。
【００３０】
図３は、３７、３８、４０、４２および４３℃でそれぞれ３０分間脂肪由来細胞を熱処理したときの遊走細胞数を示すグラフであり、縦軸は、３７℃で熱処理したときの遊走細胞数を１としたときの割合を表している。この実験結果から、遊走細胞数は、熱処理の温度が上がるにつれて上昇して４０℃のときに最大となり、その後は昇温とともに低下していることが分かる。このように、脂肪由来細胞は、４０℃の熱が与えられたときに最も効果的に賦活化されて最も活性の高い状態となることが確認された。
【００３１】
次に、最も効果的に脂肪由来細胞を賦活化できることが確認された４０℃において、最適な熱処理時間を調べた。図４は、４０℃で１０、３０および６０分間脂肪由来細胞を熱処理したときの遊走細胞数を示し、縦軸は、熱処理していないとき（０分）の遊走細胞数を１としたときの割合を表している。この実験から、脂肪由来細胞は４０℃の熱が与えられてから１０分程度で活性化し始め、３０分程度で活性が十分に高い状態となることが確認された。したがって、脂肪由来細胞の４０℃における熱処理時間は１０分以上が好ましく、３０分程度が最適であると言える。
【００３２】
なお、上記実施形態においては、賦活化ステップＳ２を消化ステップＳ１と並行して行うこととしたが、これに代えて、搬送ステップＳ３または洗浄ステップＳ４と並行して行ってもよく、消化ステップＳ１または洗浄ステップＳ４の後に行ってもよい。
賦活化ステップＳ２を搬送ステップＳ３と並行して行う場合、例えば、細胞懸濁液が通過するチューブ１３の途中位置にヒータを配置し、細胞懸濁液がチューブ１３内を通過している間、３８〜４２℃に保温されるようにする。この場合、脂肪由来細胞の熱処理時間が十分に確保されるように、チューブ１３の途中位置に循環経路などを設けてもよい。
【００３３】
賦活化ステップＳ２を洗浄ステップＳ３と並行して行う場合、洗浄液バッグ１１内の洗浄液を３８〜４２℃に加温し、加温された洗浄液により脂肪由来細胞を洗浄する。
賦活化ステップＳ２を消化ステップＳ１の後に行う場合、消化ステップＳ１は、例えば収集容器５内を３７℃に保温した状態で行い、その後にヒータ７の設定温度を上昇させて収集容器内を３８〜４２℃に昇温する。このときに、収集容器５内の細胞懸濁液の温度が各位置において均一になるように、振とう機６によって細胞懸濁液を撹拌しながら賦活化ステップＳ２を行うことが好ましい。
【００３４】
賦活化ステップＳ２を洗浄ステップＳ４の後に行う場合、例えば、遠心分離容器９内を加温するもう１つのヒータを設け、遠心分離容器内を３８〜４２℃に保温する。
このようにしても、脂肪由来細胞の滅菌性を維持しつつ、簡便な構成と操作のみで脂肪由来細胞を賦活化し、移植材により迅速に高い治療効果を得ることができる。また、賦活化ステップＳ２を消化ステップＳ１より後に行う場合には、脂肪組織が賦活化されてから治療に使用されるまでの時間が短くなるので、脂肪由来細胞の活性をより高い状態に維持したまま移植材を治療に使用して移植材の治療効果をさらに向上することができる。
【符号の説明】
【００３５】
１  移植材製造装置
２  分解処理部
３  細胞濃縮部
４  搬送経路
５  収集容器
６  振とう機
７  ヒータ
８  フィルタ
９  遠心分離容器
９ａ  配管
１０  遠心分離機
１１  洗浄液バッグ
１２  廃液バッグ
１３  チューブ
１４  チューブポンプ
Ｓ１  消化ステップ
Ｓ２  賦活化ステップ
Ｓ３  搬送ステップ
Ｓ４  洗浄ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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