(57)【要約】【課題】発光測定により試料中の核酸を分析する、ギャップを有する金属層を用いた核酸分析デバイスを歩留まり良く製造する。【解決手段】支持基体６０１上に形成された、ギャップを有する第一の金属層６０２と、支持基体６０１と第一の金属層６０２の間に第一の金属層６０２とは異なる第二の金属層又は絶縁層６０３を有する。第一の金属層６０２と第二の金属層又は絶縁層６０３をパターニングするためのマスクパターンの位置がギャップの位置６１４に対してずれたマスクパターンを用いて、第一の金属層６０２と第二の金属層又は絶縁層６０３をパターニングされる。そして、ギャップ位置の第二の金属層又は絶縁層６０３に、核酸を分析するプローブを固定し、ギャップへの光照射により局在型表面プラズモンを発生させ、試料中の核酸を分析する。【選択図】図６
2011013186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体と、
前記支持基体上に形成され、光照射により局在型表面プラズモンが発生可能なギャップを有する第一の金属層と、
前記支持基体と前記第一の金属層の間に、前記試料中の核酸を分析するためのプローブが前記ギャップ位置に固定される、前記第一の金属層とは異なる第二の金属層又は絶縁層とを備え、
前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層をパターニングするための位置が前記ギャップの位置に対して相対的にずれたマスクパターンを用いて、前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層がパターニングされた、
ことを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記支持基体は光学的に透明であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記第一の金属層が、金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属からなることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記ギャップを有する第一の金属層が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記ギャップの幅が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項８】
請求項１記載の核酸分析デバイスであって、
前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項９】
請求項１記載の核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法であって、
前記核酸分析デバイスに、前記試料として蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プライマ及び核酸からなる１種類以上の生体分子を供給し、
前記核酸分析デバイスに光を照射することにより、前記第一の金属層のギャップに局在型表面プラズモンを発生させ、
前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた前記蛍光色素の蛍光を測定し、前記試料中の前記核酸の塩基配列を解析する核酸分析方法。
【請求項１０】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスの製造方法であって、
支持基体上に、前記核酸を分析するためのプローブが固定される第二の金属層又は絶縁層と、前記第二の金属層又は絶縁層上に、光照射により局在型表面プラズモンが発生可能なギャップを有する、前記第二の金属層とは異なる第一の金属層とを形成し、
前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層をパターニングするための位置が前記ギャップの位置に対して相対的にずれたマスクパターンを用いて、前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層のパターニングを行う、
ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸分析デバイスの製造方法であって、
前記第二の金属層又は絶縁層上に、第一のマスクパターンを用いて、サイドウォール法により、前記ギャップを形成するためのサイドウォールを形成し、
前記第二の金属層又は絶縁層上に、前記第一の金属層を形成した後、前記サイドウォールを除去し、
前記ギャップの位置に対し相対的にずれた第二のマスクパターンを用いて、前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層のパターニングを行う、
ことを特徴とする核酸分析デバイスの製造方法。
【請求項１２】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置であって、
支持基体上に形成され、光照射により局在型表面プラズモンが発生可能なギャップを有する第一の金属層と、前記支持基体と前記第一の金属層の間に、試料中の前記核酸を分析するためのプローブが固定される、前記金属層とは異なる第二の金属層又は絶縁層とを備え、前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層をパターニングするためのマスクパターンの位置が前記ギャップの位置に対して相対的にずれたマスクパターンを用いて、前記第一の金属層と前記第二の金属層又は絶縁層がパターニングした核酸分析デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対し、前記試料を供給する反応チャンバーと、
前記核酸分析デバイスに蛍光を照射する光照射部と、
前記核酸分析デバイス上において前記蛍光を測定する蛍光検出部とを備え、前記試料中の前記核酸の塩基配列情報を取得する、
ことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１３】
請求項１２記載の核酸分析装置であって、
前記ギャップの位置が異なる複数の前記核酸分析デバイスを1グループとして、前記グループをアレイ状に配置した、
ことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸分析装置であって、
前記支持基体に、前記ギャップの位置が同じである核酸分析デバイスのアレイを複数搭載しており、前記アレイ各々の核酸分析デバイスの前記ギャップの位置が異なる、
ことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１５】
請求項１２記載の核酸分析装置であって、
前記支持基体は光学的に透明であり、
前記光照射部は、前記支持基体側から前記核酸分析デバイスに前記蛍光を照射する、
ことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１６】
請求項１２記載の核酸分析装置であって、
前記反応チャンバーは、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プライマ及び前記核酸からなる１種類以上の生体分子を前記試料として供給する、
ことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸分析装置であって、
前記ヌクレオチド、前記蛍光色素を有するヌクレオチド、前記核酸合成酵素、前記プライマ及び前記核酸からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた前記蛍光色素の蛍光を検出する、
ことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１８】
請求項１２記載の核酸分析装置であって、
前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１９】
請求項１２記載の核酸分析装置であって、
前記第一の金属層が、金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属からなることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項２０】
請求項１２記載の核酸分析装置であって、
前記ギャップの幅が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析デバイス、および核酸分析デバイスを用いた核酸分析技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、デオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic acid：ＤＮＡ）やリボ核酸（ribonucleic acid：ＲＮＡ）の塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成した相補的ＤＮＡ（complementary DNA：ｃＤＮＡ）断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００３】
これに対し、近年、非特許文献１にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、まず、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ、検出され得る標識を持つ４種のデオキシヌクレオシド三リン酸(Deoxyribonucleotide tri-phosphate：ｄＮＴＰ）の誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程を実施する。次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を実施する。
【０００４】
これら３工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより、試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、本技術を用いた核酸分析デバイスをアレイ状に数多く並べることによって、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ (Polymerase Chain Reaction)等での試料ＤＮＡの精製、増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
上述の蛍光等を高感度に検出する方法として、局在型表面プラズモンを利用する技術が挙げられる。特許文献１には３０ｎｍ以下のギャップ間隔をもって配置された複数の金属ナノドットによる検出素子が開示されている。同文献の手法では、ギャップにより局在型表面プラズモンを発生させ、金属ナノドットに標的物質の捕捉体、即ちプローブＤＮＡなどのプローブを固定することで検出の高感度化を図っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２１８９００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献１の手法では、局在型表面プラズモンが最も強く発生するのはギャップ内であるのに、プローブは金属ナノドットの表面や側面にランダムに固定されるため、強い局在型表面プラズモンの恩恵を受けるのは、金属ナノドットの側面、且つ、ギャップの側面に偶然固定された一部のプローブに捕捉された標的物質のみである。全てのプローブに捕捉された標的物質が強い局在型表面プラズモンの恩恵を受けるためには、プローブがギャップ内に固定される必要がある。
【０００９】
そこで、本願発明者らは先に、プローブをギャップ内に固定するために、ギャップの下にプローブを固定できるナノドットの材料とは異なる層を追加し、ギャップを構成するナノドットの材料にはプローブを固定しない材料を選ぶことを考案し、特許出願済みである（特許出願２００８−１５４７９８号、２００８年６月１３日出願、以下先願と呼ぶ）。
【００１０】
上記の先願に開示した局在型表面プラズモンを利用した核酸分析デバイスの形態について、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃを用いて説明する。発光測定によって核酸１０７を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体１０１を備え、支持基体１０１上に形成されたギャップを有する第一の金属層１０２を有し、支持基体１０１と第一の金属層１０２の間に第一の金属層とは異なる第二の金属層又は絶縁層１０３を有し、ギャップに光照射により局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属層又は絶縁層１０３上に、試料中の核酸１０７を分析するためのプローブ１０６を有する核酸分析デバイスが挙げられる。このデバイスは、第一の金属層１０２と第二の金属層又は絶縁層１０３との反応性の差を用いて、測定のためのプローブ１０６を第二の金属層又は絶縁層１０３上に特異的に配置することができる。プローブ１０６に補足された一塩基伸長反応によってＤＮＡ二本鎖中に取り込まれたヌクレオチドに付随した蛍光色素１０５のみを数倍から数十倍程度の蛍光増強場１０４に固定でき、プローブ１０６に捕捉された蛍光色素１０５のみが強い蛍光を発することから、浮遊する未反応のヌクレオチドに付随している蛍光色素１０８からの蛍光とは区別できる。
【００１１】
局在型表面プラズモンを発生可能なギャップを有した第一の金属層１０２はギャップを挟んで向き合わせた複数の金属体により実現できる。金属体の適切な形状、大きさは、照射する光の波長によって異なる。大きさは励起光を可視光とすると幅・厚さ共に10〜1000ｎｍ程度が適しているが、蛍光増強効果を高めるためには幅は100ｎｍ以下、厚さは50ｎｍ以下が好ましい。第二の金属層又は絶縁層１０３の幅と厚さも同程度であるが、第一の金属層１０２を形成した面と反対側の裏面より励起光を照射する場合には薄いほど好ましい。上記ギャップの幅は蛍光増強効果を高めるために１５ｎｍ以下が好ましい。
【００１２】
第一の金属層１０２の形状としては、図１Ａのように向き合った三角柱に類した構造体が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造や、図１Ｂのように円柱が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造や、図１Ｃのように大きな角柱が小さな角柱で結ばれ、小さな角柱にギャップ有する構造などが挙げられる。
【００１３】
図１Ａのように向き合った三角柱に類した構造体が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造による核酸分析デバイスの形態の例を図２に示す。支持基体２０１上の第一の金属層２０２と第二の金属層又は絶縁層２０３により構成された蝶ネクタイ状の柱の中心に第一の金属層２０２のギャップが設けられている。このギャップが光照射による局在型表面プラズモンによる蛍光増強場２０４となる。ギャップの下には測定のためのプローブ２０６を配置した第二の金属層又は絶縁層２０３があり、プローブ２０６に捕捉された測定対象の核酸２０７の蛍光色素２０５のみ蛍光増強場２０４内にあるため蛍光増強の恩恵を受け、浮遊する未反応基質の蛍光色素２０８とは数倍から数十倍以上の蛍光強度の差がもたらされる。核酸分析デバイスを支持基体２０１上に１００個以上アレイ状に配置することによって同時に数多くの分析を行うことができ、分析スループットを大きくできる。
【００１４】
上記のようなナノメートルオーダーの微細な構造を製造し、かつアレイ状に配置する手法として、半導体デバイスの製造に用いられている薄膜プロセスを活用することが挙げられる。この薄膜プロセスを用い、本願発明者が検討した、ギャップを挟んで三角柱の頂点が向かい合った構造による核酸分析デバイスの製造方法例を、図３のフロー図を用いて説明する。なお、同フロー図の（１）〜（１３）の左側が断面図を、右側が上面図を示している。
【００１５】
平滑な支持基体３０１上に第二の金属層又は絶縁層３０３を形成し（１）、その上に厚さ５ｎｍ以上のシリコン３０９膜を形成する（２）。次に、局在型表面プラズモンを発生させるギャップを形成するためにリソグラフィによるシリコン３０９のパターニングを行う（３）。その後、絶縁膜３１０をコンフォーマルに形成する（４）。この絶縁膜３１０の厚さによりギャップの幅を制御するため、絶縁膜３１０の厚さは１５ｎｍ以下が好ましい。絶縁膜３１０を異方性エッチングし、シリコン３０９の側壁に沿った絶縁膜３１０のサイドウォール３１１を形成する（５）。これは、半導体デバイスの製造で一般的に用いられる薄膜プロセスの一つである。（例えば、James D. Plummer, Michael D. Deal, and Peter B. Griffin, SILICON VLSI TECHNOLOGY, Prentice Hall, Inc., New Jersey NJ, 2000, p. 78.を参照。）その後、シリコン３０９をエッチングにより除去する（６）。その上に第一の金属層３０２となる金属膜を形成する（７）。尚、第一の金属層３０２と第二の金属層又は絶縁層３０３の接着性が悪い場合は、接着層を第一の金属層３０２よりも先に形成する。サイドウォール３１１を除去すると、第一の金属層３０２にギャップを形成できる（８）。絶縁膜３１０のサイドウォール３１１を用いてギャップを形成することにより、１５ｎｍ以下の幅の制御も精度良く行え、製造上のばらつきを小さくできる。レジスト膜３１２塗布（９）、リソグラフィにより第一の金属層３０２と第二の金属層又は絶縁層３０３のパターニングを行う（１０、１１）。中心をギャップに合わせた蝶ネクタイのようにパターニングすると、三角柱に類した構造が向かい合った構造となる。そして、レジスト膜３１２を除去（１２）後、プローブ３０６を固定する（１３）。
【００１６】
しかし、上述した製造プロセスにおいては、ギャップの位置を決めるためのサイドウォール形成のためのパターニング（３）と、第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層のパターニング（１０）の２回のパターニングを行う必要がある。２回目のパターニングでは、蛍光増強効果を最大にするために、ギャップ位置との位置合わせをする必要があるが、一般的なリソグラフィでは２０ｎｍ以上の位置合わせのずれがしばしば発生するという問題がある。そのため、ギャップに対して最適な位置に２回目のパターニングを行うことが困難である。本願発明者の検討によれば、この位置合わせのずれが発生すると、蛍光増強効果が小さくなり、位置合わせずれ量がある許容値を超えると、所望の蛍光増強効果が得られず、不良品となる恐れがある。
【００１７】
図１Ａに示すように向き合った三角柱に類した構造体が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造による核酸分析デバイスの製造過程において、この位置合わせのずれがゼロの場合と発生した場合を図４Ａ、４Ｂ、４Ｃを用いて説明する。ここで、合わせずれ量を第一の金属層４０２の中心と第二の金属層４０３が覗く第一の金属層４０２のギャップの中心とのＸ軸方向のずれ量と定義する。図４Ａは位置合わせずれ量がゼロの理想的な場合、図４Ｂは位置合わせずれ量がａだった場合、図４Ｃは位置合わせずれ量がｂ（ａ＜ｂ）だった場合である。図４Ａのように位置合わせずれ量がゼロのとき、本核酸分析デバイスの蛍光増強効果が最も大きく、図４Ｂ、図４Ｃの順で、位置合わせずれ量が大きくなるほど蛍光増強効果が小さくなる。
【００１８】
本願発明者の検討によれば、上述の構造の場合、ギャップの幅が１５ｎｍ以下の場合、２０ｎｍ以上の位置合わせのずれにより不良となり、歩留まり低下を引き起こす恐れがある。歩留まりが低下すると、分析スループットが低下する。位置合わせずれの要因としては、支持基体全体の基準位置からのＸ軸、Ｙ軸方向のシフト、支持基体のＸ軸、Ｙ軸方向の伸縮、支持基体の基準位置からの回転、支持基体の基準面に対する傾き、光学系の歪みなどである。
【００１９】
本発明の目的は、以上説明した位置合わせずれの主要因であるシフトによる歩留まり低下を解決することが可能な核酸分析デバイス、その製造方法、そのデバイスを用いた核酸分析装置、および分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を達成するため、本発明においては、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体上に形成され、光照射により局在型表面プラズモンが発生可能なギャップを有する第一の金属層と、支持基体と第一の金属層の間に、試料中の核酸を分析するためのプローブが固定される、第一の金属層とは異なる第二の金属層又は絶縁層とを備え、第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層をパターニングするためのマスクパターンの位置がギャップの位置に対して相対的にずれたマスクパターンを用いて、第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層がパターニングしたことを特徴とする核酸分析デバイス、及びその製造方法を提供する。
【００２１】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法であって、上記構成の核酸分析デバイスに、試料として蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プライマ及び核酸からなる１種類以上の生体分子を供給し、核酸分析デバイスに光を照射することにより、第一の金属層のギャップに局在型表面プラズモンを発生させ、ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定することにより、試料中の核酸の塩基配列を解析する核酸分析方法を提供する。
【００２２】
更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置であって、支持基体上に形成され、光照射により局在型表面プラズモンが発生可能なギャップを有する第一の金属層と、支持基体と第一の金属層の間に、試料中の核酸を分析するためのプローブが固定される、第一の金属層とは異なる第二の金属層又は絶縁層とを備え、第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層をパターニングするためのマスクパターンの位置が、ギャップの位置に対して相対的にずれたマスクパターンを用いて、第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層をパターニングした核酸分析デバイスと、この核酸分析デバイスに対し、核酸を含む試料を供給する反応チャンバーと、核酸分析デバイスに光を照射する光照射部と、核酸分析デバイス上において核酸に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出部とを備え、試料中の核酸の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置を提供する。
【００２３】
すなわち、本発明においては、ギャップの位置に対して相対的にずれたマスクパターンを用いて２回目のパターニングを行うことにより、核酸分析デバイスのアレイ構造を得る。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、２回目のパターニングにおいてシフトによる合わせずれが発生し、あるマスクパターンではギャップとの位置合わせずれ量がある許容値を超えて不良となっても、別のマスクパターンでは許容範囲内となり、不良とならず歩留まりが向上する。
【００２５】
本発明によれば、サイドウォール形成とリソグラフィ技術によりナノメートルオーダーの微細なギャップを有する金属層を有した核酸分析デバイスを、高い歩留まりで製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】核酸分析デバイスの一構造の概略図である。
【図１Ｂ】核酸分析デバイスの他の構造の概略図である。
【図１Ｃ】核酸分析デバイスの他の構造の概略図である。
【図２】核酸分析デバイスを用いた分析形態の概略を示す図である。
【図３】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図である。
【図４Ａ】核酸分析デバイスの位置合せずれ量を表す図である。
【図４Ｂ】核酸分析デバイスの位置合せずれ量（a）を表す図である。
【図４Ｃ】核酸分析デバイスの位置合せずれ量（b）を表す図である。
【図５】核酸分析デバイスのグループのアレイを示す図である。
【図６】第１の実施例に係わる、核酸分析デバイスのグループのアレイの一例を示す図である。
【図７】第２の実施例に係わる、核酸分析デバイスのグループのアレイの他の例を示す図である。
【図８】第３の実施例に係わる、核酸分析デバイスのグループのアレイの他の例を示す図である。
【図９】第４の実施例に係わる、核酸分析デバイスのアレイを表す図。
【図１０】第５の実施例に係わる、核酸分析デバイスのアレイを表す図。
【図１１】第６、７の実施例に係わる、核酸分析デバイスの使用形態の一例を説明するため概略図である。
【図１２】第８の実施例に係わる、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
まず、本発明の、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスの構成を概説する。核酸分析デバイスは、支持基体を備え、支持基体上に形成されたギャップを有する第一の金属層を有し、支持基体と第一の金属層の間に第一の金属層とは異なる第二の金属層又は絶縁層を有し、第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層をパターニングするためのマスクパターンの位置がギャップの位置に対してずれた複数のマスクパターンを用いて第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層がパターニングされており、ギャップに光照射により局在型表面プラズモンが発生させ、また第二の金属層又は絶縁層上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを固定する。これによりプローブが第二の金属層又は絶縁層上に固定されたギャップへの光照射により表面プラズモン励起させる構造を得る。
【００２８】
支持基体にはガラス基板、サファイヤ基板、樹脂基板等を用いる。第一の金属層は金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む一種類以上の金属とすることで、局在型表面プラズモンによる増強効果を高めることができる。第二の金属層又は絶縁層は、第一の金属層表面との化学的な性質の差を用いて、プローブを特異的に固定化できるものであれば特に制限は無い。また、適した官能基を選択し、それを第二の金属層又は絶縁層に付与するか、あるいはプローブ内の官能基と前記官能基またはこれを反応基点として、さらに修飾が施された官能基を反応させることで所望のプローブを固定化しても良い。
【００２９】
第一の金属層と第二の金属層又は絶縁層の組み合わせとしては、第一の金属層が金、銀、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウムなどの貴金属であれば、第二の金属層は、チタン、ニッケル、クロム、鉄、コバルト、カドミウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ジルコニア、ニオブ、ハフニウム、タンタルから選ばれる少なくとも１種類以上の金属、また、これらの合金が挙げられる。または、ＩＴＯなどの導電性の酸化膜を用いても良い。
【００３０】
第二の金属層表面上に形成した酸化膜上に、カルボン酸、ホスホン酸、リン酸エステル、有機シラン化合物を反応させることで、プローブを固定するための所望な官能基を導入することができる。第一の金属層がアルミニウム、または銅などの場合、第二の金属層として、金、銀、水銀、インジウム、パラジウム、ルテニウム、亜鉛から選ばれる少なくとも１種類以上の金属、または、これらの合金が挙げられる。第二の金属表面に、有機硫黄化合物、有機セレン化合物、または、有機テルル化合物などを反応させることで、プローブを固定するための所望な官能基を導入することができる。絶縁層の候補としては、シリコン、チタン、ベリリウム、ジルコニウム、タングステン、ホウ素、ハフニウム、バナジウム、タンタル、アルミニウム、トリウム、モリブデン、鉄などの炭化物、窒化物、ホウ化物、ケイ化物、または酸化物などが挙げられる。
【００３１】
第二の金属層又は絶縁層上に導入される官能基についても特に制限はないが、プローブを固定するための反応基点として、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、ケトン基などが挙げられる。さらに、プローブを固定するための反応効率を高める手法として、二価性の化合物を用いて、ＮＨＳ−エステル基、イミドエステル基、スルフィジル基、エポキシ基、ヒドラジド基などの官能基を導入しても良い。また、増強場内への単分子固定化率を高めるために、アビジン、デンドロン、クラウンエーテルなどの嵩高い化合物を介して、プローブを固定しても良い。
【００３２】
プローブについても、測定対象の核酸を捕捉できるものであれば特に制限はない。核酸を直接捕捉できる様なプローブとしては、酵素などのタンパク質、テンプレート、プライマ、またはこれらの複合体が挙げられる。また、染色体、核様体、細胞膜、細胞壁、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、レセプター、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などを介して、核酸を捕捉しても良い。
【００３３】
以下、図面を用いて本発明の種々の実施例を説明する。本明細書において核酸分析デバイスのアレイあるいは核酸分析デバイスアレイとは、複数の核酸分析デバイスが支持基体、すなわち基板上に配置されているもの、あるいは複数の核酸分析デバイスからなるグループが複数、支持基体上に形成されているものをいう。なお、本明細書においては、この核酸分析デバイス、そのグループ、それらのアレイを「核酸分析デバイス」と総称する場合がある。
【実施例１】
【００３４】
図１Ａの核酸分析デバイスの構造を使って、第１の実施例について説明する。まず、図５に、本発明を適用しない場合の図１Ａのように向き合った三角柱に類した構造体が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造による核酸分析デバイスのアレイを示す。支持基体５０１上に、複数の核酸分析デバイス５１３が所定の間隔毎に規則的に配列している。発光測定により試料中の核酸を分析する際には、各核酸分析デバイス５１３が１輝点となり、各輝点の蛍光を受光素子で検出することにより試料核酸を分析する。図５のように第一の金属層５０２のギャップ位置５１４と２回目のパターニングにおけるマスクパターンの位置関係（図５の横方向の位置関係をいう）が全て同一であると、ギャップと２回目のパターニングとの位置合わせずれが発生し、位置合わせずれ量がある許容値を超えた場合、全て不良となる。
【００３５】
これに対し、第１の実施例の核酸分析デバイスアレイを図６に示す。ギャップ位置６１４に対して左右にずらした複数のマスクパターンにより作製した複数の核酸分析デバイスをグループ６１５として、支持基体６０１上に、そのグループ６１５を所定の間隔毎に規則的に配列している。発光測定により試料中の核酸を分析する際には、１グループ６１５が１輝点となる。図６のようにギャップ位置６１４に対して左右にずらした複数のマスクパターンを用いることによって、位置合わせずれが発生しても不良とならない核酸分析デバイスが形成される可能性が高まり、歩留まりが向上する。
【００３６】
１グループのマスクパターンの数やギャップ位置６１４から左右にずらす寸法は、単独の核酸分析デバイスにおけるギャップと２回目のパターニングとの位置合わせずれ量の許容値と使用するリソグラフィ装置において想定される最大の位置合わせずれ量から適切に決めることができる。単独の核酸分析デバイスにおけるギャップと２回目のパターニングとの位置合わせずれ量の許容値はマスクパターンの形状や寸法によって異なるが、近接場強度シミュレーションから求めることができる。
【００３７】
例えば、図１Ａのように向き合った三角柱に類した構造体が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造において、三角柱に類した構造体の長辺が６０ｎｍ、角柱の横方向長さが３０ｎｍ、角柱の縦方向長さが１０ｎｍ、ギャップの幅が１０ｎｍの場合、位置合わせずれ量の許容値は約１０ｎｍであった。最大位置合わせずれ量が約５０ｎｍのリソグラフィ装置を使用した場合、本発明を適用しなければ所望の蛍光増強効果が得られた輝点の割合（歩留まり）は１０％程度であった。これに対し、本実施例の構成を適用し、５個のマスクパターンを左右に２０ｎｍずつずらして互いが重ならないよう上下に配置したものをグループとし、グループの中心をギャップの中心に配置した核酸分析デバイスアレイの場合、歩留まりは９０％以上に改善した。
【実施例２】
【００３８】
実施例１では図１Ａのように向き合った三角柱に類した構造体が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造による核酸分析デバイスに本発明を適用し、歩留まり向上の効果を得たが、別形状・別寸法であっても同様の歩留まり向上効果が得られる。次に、図７を用い、第２の実施例として、図１Ｂのように円柱が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造による核酸分析デバイスのアレイを説明する。同図において、７０１は支持基体、７０２は第一の金属層、７０３は第二の金属層又は絶縁層、７１４は第一の金属層のギャップ位置、７１５は核酸分析デバイスのグループを示す。
【００３９】
図１Ｂのように円柱が角柱で結ばれ、角柱にギャップ有する構造による核酸分析デバイスにおいて、円の直径が６５ｎｍ、角柱の横方向長さが４５ｎｍ、角柱の縦方向長さが１５ｎｍ、ギャップの幅が１５ｎｍの場合、位置合わせずれ量の許容値は約１５ｎｍであった。最大位置合わせずれ量が約５０ｎｍのリソグラフィ装置を使用した場合、本発明を適用しなければ歩留まりは２０％程度であった。これに対し、本実施例を適用し、４個のマスクパターンを左右に３０ｎｍずつずらして互いが重ならないよう上下に配置して形成した核酸分析デバイスをグループとし、グループの中心をギャップの中心に配置した場合、歩留まりは９０％以上に改善した。
【実施例３】
【００４０】
続いて、第３の実施例として、実施例1や２のように、真っ直ぐに形成したギャップに対して複数のマスクパターンをずらすのではなく、図８のように斜めに形成したギャップに対して複数のマスクパターンをずらさずに配置する構成を説明する。同図において、８０１は支持基体、８０２は第一の金属層、８０３は第二の金属層又は絶縁層、８１４は第一の金属層のギャップ位置、８１５は核酸分析デバイスのグループを示す。
【００４１】
この図８に示す構成を取ることで、相対的にギャップとマスクパターンとの位置をずらして形成した核酸分析デバイスアレイにおいても同様の歩留まり向上効果を得ることができる。斜めに形成するギャップ８１４の傾きは、実施例１や２と同様に、単独の核酸分析デバイスにおける位置合わせずれ量の許容値と、想定される最大の位置合わせずれ量、マスクパターンの数と配置から決めることができる。本実施例の核酸分析デバイスアレイの場合、並んだ５つの核酸分析デバイスのグループ８１５で１輝点となる。
【実施例４】
【００４２】
以上説明した実施例１〜３の場合、理想的には、１つの輝点を構成する複数の核酸分析デバイスのグループの内１つの核酸分析デバイスが所望の蛍光増強効果を満たす良品となり、それ以外は不良品となる。しかし、１つの輝点を構成する複数の核酸分析デバイスのグループの内２つ以上の核酸分析デバイスが良品となり、１つの輝点から２つ以上の試料の蛍光が発せられる恐れがある。１つの輝点から２つ以上の試料の蛍光が発せられた場合、お互いの蛍光がノイズとなり正確に分析することが困難となる。
【００４３】
これを回避するための第４の実施例の構成を図９に示す。図９に示す構造のように、支持基体９０１上に単独の核酸分析デバイスをアレイ状に配置した領域９１６を複数作製する。図９は核酸分析デバイスをアレイ状に配置した領域９１６を３つ、支持基体９０１上に作製した例である。各領域９１６内の核酸分析デバイス９１３のギャップ位置とマスクパターン位置とのずれ量（図９の横方向のずれ量）は同様であるが、異なる領域９１６間の核酸分析デバイス９１３のギャップ位置とマスクパターン位置とのずれ量は異なる。１つの核酸分析デバイス９１３が１つの輝点となる。本実施例によれば、１つの輝点から２つの試料の蛍光が発せられる恐れはないものの、アレイの種類の増加と共に支持基体の面積が増加するという欠点があるが、全アレイを同じ核酸分析デバイス９１３で作製するよりは歩留まり低下のリスクを回避できる。
【実施例５】
【００４４】
実施例４と同様に１つの輝点を１つの核酸分析デバイスで構成し、歩留まりを向上させる第５の実施例を図１０を用いて説明する。支持基体１００１上にＮ種類のギャップ位置の異なる核酸分析デバイス１０１３をアレイ状に配置することにより、位置合わせずれによる歩留まり低下を抑制する。Ｎの値やギャップ位置１０１４から左右にずらす寸法は、単独の核酸分析デバイスにおけるギャップと２回目のパターニングとの位置合わせずれ量の許容値と使用するリソグラフィ装置において想定される最大の位置合わせずれ量から適切に決めることができる。図１０はＮを３とした例である。Ｎが大きいほど、大きな位置合わせずれが発生しても不良とならない核酸分析デバイスが存在する可能性が高くなるが、歩留まりが低下する可能性も高くなるという欠点がある。図１０では真っ直ぐなギャップ位置１０１４に対してマスクパターンをずらしたが、図８に示した実施例３のようにギャップを斜めに形成し、複数のマスクパターンをずらさずに配置することによって、相対的にギャップとマスクパターンとの位置をずらしてもよい。
【実施例６】
【００４５】
次に、核酸分析デバイスアレイの使用形態についての第６の実施例を図１１を用いて説明する。支持基体１１０１の上に、ギャップの位置が異なる複数の核酸分析デバイスを1グループとして、それをアレイ状に１００以上配置した核酸分析デバイスアレイの領域１１０２が複数搭載されている。アレイ状に配置する核酸分析デバイスのグループの間隔は１０マイクロメートル以下で、解析しようとする核酸試料、蛍光検出装置、蛍光検出部の仕様、１つの核酸分析デバイスのグループの占める面積によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを支持基体１１０１とし、核酸分析デバイスのグループの中心を２マイクロメートル間隔でアレイ状に配置した領域１１０２を１０ｍｍ×１０ｍｍとすると、歩留まり１００％の場合、１領域当たり２５００万種類の核酸分子を解析でき、その領域１１０２を４個程度、支持基体１１０１上に搭載することができる。
【００４６】
従って、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分に正確に行うことができ、１つの支持基体上で４解析程度行うことができる。核酸を分析するには、前記の核酸分析デバイスのグループをアレイ状に配置した領域１１０２を核酸試料、反応酵素、バッファー、ヌクレオチド基質等で構成される反応液に浸して、反応領域を支持基体１１０１上に設けることになる。反応領域を支持基体１１０１上に設けるには、予め流路１１０４を設けた反応チャンバー１１０３を光学的に透明な支持基体１１０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー１１０３は、支持基体１１０１と接する側に流路１１０４を有しており、流路１１０４の大きさは核酸分析デバイスのグループをアレイ状に配置した領域１１０２をカバーできる大きさとする。流路１１０４の形成には流路１１０４の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体からなり、支持基体１１０１上に張り合わせて使用することになる。
【００４７】
具体的に述べると、核酸試料、反応酵素、バッファー、ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット１１０５、反応液を送り出す分注ユニット１１０６、液の流れを制御するバルブ１１０７、廃液タンク１１０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応開始時には、反応液を分注ユニット１１０６により反応チャンバー１１０３の流路１１０４へ送り出し、バルブ１１０７により所望の反応領域を設ける。反応終了時には、洗浄液が反応チャンバー１１０３の流路１１０４を通じて供給され、廃液タンク１１０８に収納される。
【実施例７】
【００４８】
続いて、核酸分析デバイスアレイの使用形態についての第７の実施例について説明する。まず、支持基体の上に、単独の核酸分析デバイスを１００個以上アレイ状に配置した領域を複数作製する。例えば、図９の実施例４のように各領域内の核酸分析デバイスのギャップ位置とマスクパターン位置とのずれ量は同一であるが、各領域間の核酸分析デバイスのギャップ位置とマスクパターン位置とのずれ量は異なる核酸分析デバイスアレイを使用する。又は、図１０の実施例５のように複数種類のギャップ位置の異なる核酸分析デバイスをアレイ状に配置してもよい。アレイ状に配置する核酸分析デバイスの間隔は１０マイクロメートル以下で、解析しようとする核酸試料、蛍光検出装置の仕様、１つの核酸分析デバイスの占める面積によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを支持基体とし、核酸分析デバイスをアレイ状に配置した領域を１０ｍｍ×５ｍｍとすると、その領域を8個程度支持基体上に搭載することができる。核酸分析デバイスを１マイクロメートル間隔でアレイ状に配置すると、１領域当たりの核酸分析デバイスは５０００万個となる。歩留まり１００％の場合、５０００万種類の核酸分子を解析でき、歩留まりが２０％であっても１０００万種類の核酸分子を解析できる。従って、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分に正確に行うことができる。このような支持基体と反応チャンバーを用いて実施例６と同様の方法で核酸分析デバイスをアレイ状に配置した領域を反応液に浸す。
【実施例８】
【００４９】
第８の実施例として、核酸分析装置の一構成について図１２を用いて説明する。本実施例では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段（反応チャンバー）と、前記核酸分析デバイスに励起光を照射する手段（光照射部）と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段（蛍光検出部）と、1塩基毎の伸長反応を制御する手段（制御部）とを備える。より具体的には、カバープレート１２０２と検出窓１２０３と、試料供給部としての溶液交換用口である注入口１２０４と排出口１２０５から構成される反応チャンバーに前述の支持基体１２０１を設置する。なお、カバープレート１２０２と検出窓１２０３の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓１２０３の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）１２０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ、出力２０ｍＷ）１２０７から発振するレーザ光１２０８および１２０９を、レーザ光１２０９のみをλ／４板１２１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー１２１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ１２１２によって集光し、その後、プリズム１２１３を介して支持基体１２０１裏面へ臨界角以上で照射する。光照射部を構成するＹＡＧレーザ光源１２０６は蛍光体の励起用で、制御部を構成するＹＡＧレーザ光源１２０７は反応基質に付いている反応制御用の保護基を外すための光源である。本実施例によれば、レーザ照射により、支持基体１２０１表面上に存在する核酸分析デバイスにおいて局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属層又は絶縁層に結合したプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓１２０３を介して出射される。また、検出窓１２０３より出射される蛍光は、対物レンズ１２１４（×６０、ＮＡ１.３５、作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ１２１５により背景光及び励起光が遮断され、分光手段により蛍光色毎に結像レンズ１２１６により２次元ＣＣＤカメラ１２１７上に結像される。塩基伸長反応は、１塩基伸長すると反応基質に付いている保護基の存在により止まる。制御部を構成するＹＡＧレーザ１２０７により保護基を外すと再度１塩基伸長が可能となるので、１塩基伸長反応、蛍光観察、保護基を外すことを繰り返すことにより、１塩基毎の伸長反応を制御しながら塩基配列を決定することができる。
【実施例９】
【００５０】
さらに、核酸分析デバイスのアレイの使用形態についての第９の実施例として、例えば、P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181などに開示されているような、洗浄工程が必要ないリアルタイム反応方式での伸長反応を計測することも可能である。この場合、洗浄工程がないため解析時間の短縮化、デバイス・分析装置の簡略化が図れる。また、スループットも向上する。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上詳述した本発明は、核酸分析デバイス、および核酸分析デバイスを用いた核酸分析技術として極めて有用である。
【符号の説明】
【００５２】
１０１、２０１、３０１、５０１、６０１、７０１、８０１、９０１、１００１、１１０１、１２０１…支持基体
１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２、７０２、８０２、９０２…第一の金属層
１０３、２０３、３０３、４０３、５０３、６０３、７０３、８０３、９０３…第二の金属層又は絶縁層
１０４、２０４、３０４…局在型表面プラズモンが生じる空間
１０５、２０５…蛍光色素
１０６、２０６、３０６…プローブ
１０７、２０７…核酸
２０８…未反応基質の蛍光色素
３０９…シリコン
３１０…絶縁膜
３１１…サイドウォール
３１２…レジスト
５１３、９１３、１０１３…核酸分析デバイス
５１４、６１４、７１４、８１４、１０１４…第一の金属層のギャップ位置
６１５、７１５、８１５…核酸分析デバイスのグループ
９１６…核酸分析デバイスをアレイ状に配置した領域
１１０２…核酸分析デバイスのグループをアレイ状に配置した領域
１１０３…反応チャンバー
１１０４…流路
１１０５…温調ユニット
１１０６…分注ユニット
１１０７…バルブ
１１０８…廃液タンク
１２０２…カバープレート
１２０３…検出窓
１２０４…注入口
１２０５…排出口
１２０６…ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）
１２０７…ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ、出力２０ｍＷ）
１２０８、１２０９…レーザ光
１２１０…λ／４板
１２１１…ダイクロイックミラー
１２１２…レンズ
１２１３…プリズム
１２１４…対物レンズ
１２１５…光学フィルタ
１２１６…結像レンズ
１２１７…２次元ＣＣＤカメラ。
【図１Ａ】
2011013186.tif 000003
【図１Ｂ】
2011013186.tif 000004
【図１Ｃ】
2011013186.tif 000005
【図２】
2011013186.tif 000006
【図３】
2011013186.tif 000007
【図４Ａ】
2011013186.tif 000008
【図４Ｂ】
2011013186.tif 000009
【図４Ｃ】
2011013186.tif 000010
【図５】
2011013186.tif 000011
【図６】
2011013186.tif 000012
【図７】
2011013186.tif 000013
【図８】
2011013186.tif 000014
【図９】
2011013186.tif 000015
【図１０】
2011013186.tif 000016
【図１１】
2011013186.tif 000017
【図１２】
2011013186.tif 000018