(57)【要約】      （修正有）【課題】正確にスプライスバリアントを検出することができるプローブセット、及びそれらが搭載されたＤＮＡマイクロアレイの提供。【解決手段】ジャンクションプローブを構成する２つのエキソン部分配列の各々の融解温度が、ジャンクションプローブの配列の融解温度と比較して十分に低い条件となるよう設計したジャンクションプローブを使用し、スプライス部位を明確に判断することができるプローブセットとその検出方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、各々のジャンクションプローブの塩基配列が、複数のエキソン領域の塩基配列、且つそれらエキソン間の連結部分を含み、全てのプローブ配列の融解温度が、それらプローブを構成する全てのエキソン領域配列のそれぞれの融解温度よりも５℃以上高い、スプライシングバリアント検出用プローブセットの製造方法。
（１）１００塩基長以下のジャンクションプローブ候補の塩基配列を設計する工程、
（２）０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣの溶液中において、前記ジャンクションプローブ候補の融解温度及び当該ジャンクションプローブを構成する各エキソン領域の塩基配列の融解温度を算出又は測定する工程、
（３）０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣの溶液中における全てのジャンクションプローブの融解温度が、当該ジャンクションプローブを構成する全てのエキソン領域の塩基配列の０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣの溶液中における融解温度より５℃以上高いものを選択する工程
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１で得られたプローブセットが搭載されたスプライシングバリアント検出用マイクロアレイの製造方法。
（１）１００塩基長以下のジャンクションプローブ候補の塩基配列を設計する工程、
（２）０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣの溶液中において、前記ジャンクションプローブ候補の融解温度及び当該ジャンクションプローブを構成する各エキソン領域の塩基配列の融解温度を算出又は測定する工程、
（３）０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣの溶液中における全てのジャンクションプローブの融解温度が、当該ジャンクションプローブを構成する全てのエキソン領域の塩基配列の０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣの溶液中における融解温度より５℃以上高いものを選択する工程
【請求項３】
標識された試料を請求項２で得られたマイクロアレイに供し、マイクロアレイ中のプローブと試料とをハイブリダイズさせる工程を含む、スプライシングバリアントを検出する方法。
【請求項４】
スプライシングバリアントがＰＴＣＨ遺伝子由来である、請求項１記載のプローブセットの製造方法。
【請求項５】
スプライシングバリアントがＰＴＣＨ遺伝子由来である、請求項２記載のマイクロアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子のスプライシングバリアントを検出するために使用されるプローブセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の多くの遺伝子は、遺伝情報として意味を有するエキソンがイントロンと呼ばれる遺伝情報としては意味がないと考えられている領域によって分断された形でＤＮＡ上に存在している。イントロンを含む遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体は、イントロン部分を除去する過程を経て成熟ｍＲＮＡとなり、タンパク質に翻訳される。このイントロンを除去する過程をスプライシングと呼ぶ。またこのスプライシングにおいて、イントロンの除去とその前後のエキソンの再結合が行われる部位を、スプライス部位と呼ぶ。
【０００３】
ｍＲＮＡ前駆体中に、複数のイントロンが存在する場合、通常、互いに隣あったスプライス部位間でスプライシングが行われるが、異なるスプライス部位を選択してスプライシング反応を行うことにより、同一のｍＲＮＡ前駆体から異なった構造の成熟ｍＲＮＡが産生され得る。この現象を、選択的スプライシング（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）と呼ぶ。選択的スプライシングの結果、産生され得る種々の成熟ｍＲＮＡの変異型（ｖａｒｉａｎｔ）を、スプライシングバリアントと称する。
【０００４】
生命の発生段階で脳などでは、多様なスプライシングバリアントが発現されることが報告されている。しかし、スプライシングバリアントと発生、分化段階における機能相関などは、ほとんど明らかにされていないのが現状である。また、スプライシングバリアントと疾病との関連も指摘されており、そのほとんどは遺伝子産物が異常となるものである。
【０００５】
近年、細胞内で転写された産物を一括で捕らえようとする手段の一つとして、ＤＮＡマイクロアレイによる検証法が確立されつつある。ＤＮＡマイクロアレイとは、ガラスなどの固相基盤上に、多数の異なったＤＮＡプローブが各々特定の位置に固定化されているものである。このＤＮＡマイクロアレイ上のＤＮＡプローブに、標識ＤＮＡまたはＲＮＡサンプルをハイブリダイズさせ、発現解析等が実施される。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイでは、従来のノーザンブロッティング法などと比較し、大量解析、検出感度の向上、マイクロ化によるサンプルの節約、データ取得の自動化、およびデータ処理による簡便化などの点で期待されている。
【０００７】
ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、大きく分けてＤＮＡを基盤上で合成する方法（非特許文献１）と、あらかじめ調製したＤＮＡを基盤上に機械的に並べていく方法（非特許文献２）がある。
【０００８】
また最近では、単一の転写産物だけでなく、スプライシングバリアントをＤＮＡマイクロアレイで検出しようとする試みも行われつつある。ＤＮＡマイクロアレイを用いて、スプライシングバリアントを検出する方法としては、エキソン、イントロン部分を含んだ遺伝子配列に対して相補な断片からなるプローブを、一定の間隔で並べて配置する方法（非特許文献３）や、エキソン、イントロン部分に対応するプローブを使用する方法がある（特許文献１）。
【０００９】
また、エキソン間の結合部分をプローブとして、スプライシングの違いを検出しようとする試みも行われている。エキソン間の結合部分を検出するためのプローブをジャンクションプローブという。ジャンクションプローブは、１つ目のエキソン配列の３‘末端部分を含んだ配列と、２つ目のエキソン配列の５’末端部分を含んだ配列によって構成される。
【００１０】
さらには、ＤＮＡマイクロアレイとＲＴ−ＰＣＲの別々の手法で、スプライシングバリアントの検出結果が開示されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−２２３７６０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９  ７８７−７９２，１９９９
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３  ６５５−６５７，２００３
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３０，１３−１９，２００２
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｌ３０２  １９，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、これまでのＤＮＡマイクロアレイを用いたスプライシングバリアントの検出では、単純に特定の長さでエキソン部分配列を連結したジャンクションプローブを用いており、片側のエキソン部分配列だけに相補的な核酸がハイブリダイゼーションした場合にも蛍光が検出される（図１参照）。よって、連結した配列のみを明確に検出できず、結果として実験から得られた蛍光強度のみでスプライス部位を明確に判断することができなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために、明確にスプライスバリアントを検出することができるプローブについて、鋭意検討を行った結果、ジャンクションプローブを構成する２つのエキソン部分配列の、各々の融解温度が、ジャンクションプローブの配列の融解温度と比較して、十分に低い条件となるように、設計したジャンクションプローブを使用することにより、スプライス部位を明確に判断することができることを見出し、本発明を完成させた（図２参照）。
【００１５】
すなわち、本発明は、各々のジャンクションプローブの塩基配列が、複数のエキソン領域の塩基配列、且つそれらエキソン間の連結部分を含み、
全てのプローブ配列の融解温度は、それらプローブを構成する全てのエキソン領域配列
の融解温度よりも高い、
スプライシングバリアント検出用プローブセット、に関する。
【発明の効果】
【００１６】
ジャンクションプローブを構成する２つのエキソン部分配列の、各々の融解温度が、ジャンクションプローブの配列の融解温度と比較して、十分に低い条件となるように、設計したジャンクションプローブを使用することにより、スプライス部位を明確に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】これまでのジャンクションプローブを使用した際のエキソン連結部位の認識を示す模式図。
【図２】エキソン部分配列の位置とジャンクションプローブのＴｍの比較を示した図。
【図３】スプライシングパターンを例示した模式図。
【図４】２つのエキソン間のスプライシング部位を特定するためのジャンクションプローブの配列パターンを示した図。
【図５】各エキソン配列と各ジャンクションプローブのＴｍをプロットした図。
【図６】マイクロアレイ作成時のスポットパターンを示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、各々のジャンクションプローブの塩基配列が、複数のエキソン領域の塩基配列、且つそれらエキソン間の連結部分を含み、全てのプローブ配列の融解温度は、それらプローブを構成する全てのエキソン領域配列の融解温度よりも高い、スプライシングバリアント検出用プローブセットである。
【００１９】
ジャンクションプローブとは、エキソンの部分配列を２つつなげた配列をもつプローブをいう。エキソン部分配列とはあるエキソン配列の３‘端または５’端を含むエキソン配列の部分配列である（図３参照）。前記エキソンの部分配列としては、エキソン配列の３‘端または５’端を含む、エキソン配列の部分配列から１ｂａｓｅずつ延長したものが候補として挙げられる。よって、エキソン部分配列の候補としては、Ｎ番目のエキソンから数十種類程度、Ｎ＋α番目のエキソンからも数十種類程度を選択することができる（図４参照）。
【００２０】
また、これらを連結したジャンクションプローブは、数百種類の候補が使用できる。このうち、連結した長さが１００ｂａｓｅ以下のものは、その合成・精製が容易である観点から好適に使用される。図４には、１箇所のエキソン連結部位に関して例示したが、同様の手順を用いて、各エキソン連結部分に対してエキソンの部分配列候補、ジャンクションプローブ候補を使用することができる。
【００２１】
次にエキソンの部分配列の候補及びジャンクションプローブの候補、全ての融解温度を計算する。これら融解温度は、実験又は机上での計算によって求めることが出来る。
【００２２】
実験によって求める場合、求めたい配列に相補な核酸を混合した溶液の温度を、上昇または下降させながら吸光度を測定し、温度と吸光度のグラフを作成する。グラフの変曲点を見出し、その温度を融解温度とする。
【００２３】
机上での計算によって求める場合、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１８（２１）．，６４０９−６４１２（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３．，３７４６−３７５０（１９７６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３４（３５）．，１１２１１−６（１９９５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐ１１．４６（１９８９，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）等の文献を参考に計算することが出来る。
【００２４】
融解温度は、ハイブリダイゼーション時の塩濃度が変化することによって変わるため、どの塩濃度の条件で実験を行うかについても考える必要がある。通常の実験でハイブリダイゼーションを行う場合は０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣ程度の溶液を用いてハイブリダイゼーションが行われる。
【００２５】
各エキソン及び各ジャンクションプローブの融解温度を測定後、最適なジャンクションプローブ及びそれらのセットを選択する。選択の指標としては、エキソン間を連結しているジャンクションプローブ候補塩基配列の融解温度を、Ｔｍ−ｊｕｎｃｔｉｏｎとし、更に該プローブ塩基配列を構成している第一エキソン領域の塩基配列の融解温度をＴｍ−ｅｘｏｎ（Ｎ）、第二エキソン領域の塩基配列の融解温度をＴｍ−ｅｘｏｎ（Ｎ＋α）とするとき、全てのＴｍ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ、つまりジャンクションプローブセットの融解温度が、ジャンクションプローブセットを構成している全てのＴｍ−ｅｘｏｎ（Ｎ）、Ｔｍ−ｅｘｏｎ（Ｎ＋α）より、高いものを選択する。好ましくは、５℃以上、さらに好ましくは１０℃以上、高いものを選択する。
【００２６】
もし、あるエキソン配列とジャンクションプローブとの融解温度が近い場合、図１に示すように、片側のエキソン部分配列のみでハイブリダイゼーションしてしまい、クロスハイブリダイゼーションが避けられず、明確なスプライシングバリアントのパターンの判定が出来ない。
【００２７】
このようにして設計されたジャンクションプローブ及びそのセットは、ＤＮＡマイクロアレイに搭載される。
【００２８】
ＤＮＡマイクロアレイは、すでに様々な形態物が知られている。いずれの形態であっても、本発明のプローブセットを搭載することにより、スプライシングバリアント検出用ＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。搭載する方法としては、搭載する支持体により適宜選択され、支持体へ化学的固定、物理的固定等、を行うことによりマイクロアレイに搭載される。
【００２９】
上記のごとく調製されたＤＮＡマイクロアレイを使用した、スプライシングバリアントを検出する方法の一例を以下に示す。まず、試料に適当な標識を行う。試料はどのような起源由来でもよい。標識は、放射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、酵素による二次標識等、が適用できる。次に前記標識した試料を、前記マイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行う。この時、上述した全てのＴｍ−ｅｘｏｎ（Ｎ）、Ｔｍ−ｅｘｏｎ（Ｎ＋α）より高い温度、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃以上高い温度で、ハイブリダイゼーションを行う。この工程により、クロスハイブリダイゼーションの影響を回避でき、正確にスプライシングバリアントを捕捉することが出来る。次いで、捕捉された標識試料を適当な検出手段により検出する。
【００３０】
このように、適当なジャンクションプローブの選択及びそれを搭載したＤＮＡマイクロアレイの使用により、ゲノム上の遺伝子配列の転写から成熟ｍＲＮＡが形成される過程で、どのようにイントロンが除去され、エキソンがつながり、成熟ｍＲＮＡが形成されるかを、数多くの遺伝子に対して簡便に調べることができる。さらに、疾病患者の病理組織あるいは細胞中における遺伝子の選択的スプライシングを調べて、その異常を正確かつ簡便に検出できることから、疾病とスプライシング異常との関連性をもとにして臨床・診断に応用することができる。
【実施例】
【００３１】
本発明の実施の形態について、以下具体例を示して詳細に説明する。
【００３２】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐａｔｃｈｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ＰＴＣＨ遺伝子のエキソン１〜６、エキソン９〜１３に関連するスプライシングバリアントを検出するため、表１に示す配列のジャンクションプローブ配列の末端アミノ化オリゴヌクレオチドを合成した。大文字で示す塩基は第一エキソン領域の塩基配列、小文字で示す塩基は第二エキソン領域の塩基配列を示している。ジャンクションプローブ配列の融解温度とそれを構成する各エキソン領域配列の融解温度（０．５×ＳＳＣ溶液中）は、図５に示すとおりである。
【００３３】
【表１】
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これらの末端アミノ化オリゴヌクレオチドプロ−ブ水溶液（濃度０．４μＭ）２．５μＬと、６×ＳＳＣ、２．５μＬを混合してスポッティング溶液を作製した。このスポッティング溶液をＤＮＡマイクロアレイ用スポッタ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  Ｍｉｃｒｏｓｙｓ４１００−４ＳＱ）を用いて、ＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅスライドガラス上に図６に示すようにスポッティングした。ＢＬＡＮＫと記してある部分には３×ＳＳＣのみをスポッティングした。スポッティング後、室温で乾燥させた。
【００３４】
次いで、０．２％ＳＤＳで２分間洗浄後、ミリＱ水で２回洗浄した。続いて０．３Ｎ  ＮａＯＨに５分間浸漬しミリＱ水で２回洗浄した。さらに沸騰水（ミリＱ水）に２分間浸漬後冷エタノール（４℃）に３分間浸漬した後圧縮窒素ガスで完全に乾燥させた。使用するまでデシケータ中で暗所保存した。
【００３５】
表２に示す５’末端ｃｙ５標識オリゴＤＮＡを合成し、それぞれ２ｆｍｏｌ／μＬの濃度に調製した。各オリゴＤＮＡ１０μＬに１０×ＳＳＣ  ２．５μＬ、１０％  ＳＤＳ１μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅｆｒｅｅ水３６．５μＬを加えハイブリダイゼーション溶液をそれぞれ作製した。これらのハイブリダイゼーション溶液５０μＬをＤＮＡマイクロアレイ上に滴下し、カバーガラスをかけた後、恒温層内で６５℃１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００３６】
【表２】
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その後０．５×ＳＳＣ・０．２％ＳＤＳの溶液中にＤＮＡマイクロアレイを浸漬してカバ−ガラスをはずした後、０．５×ＳＳＣ・０．２％ＳＤＳ溶液に５分間浸漬して静置した。その後さらに０．０５×ＳＳＣ溶液中に１分間浸漬した後、溶液中から取り出し、圧縮窒素ガスを吹き付けてスライドガラス上の水分を除いて乾燥させた。
【００３７】
マイクロアレイ用スキャナ−（日立ソフト社製  ＣＲＢＩＯ）を用いてスポットの蛍光強度（ハイブリダイゼ−ションシグナル）を測定した。各スポットについて、得られたハイブリダイゼ−ションシグナルの測定結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
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この結果よりエキソン部分配列の融解温度より高い温度でハイブリダイゼーションを行えば、特定のジャンクションプローブにのみ特異的にハイブリダイゼーションが起こることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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