(57)【要約】【課題】  被検物質に対する選択性、特異性が高く、且つ高検出感度、高耐久性の水晶発振子センサを提供する。【解決手段】    電圧印加により固有の周波数で振動できる水晶結晶板；当該水晶結晶板に電圧を印加するために、当該水晶結晶板の両面に設けられた電極；該電極の少なくとも一方の電極の表面の一部に設けられた粗面部；及び前記粗面部上に形成されていて、被検物質又はその一部の構造を捕捉できる鋳型が凹設されている有機選択膜を備えていて、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）用センサに、好適に用いられる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電圧印加により固有の周波数で振動できる水晶結晶板；
当該水晶結晶板に電圧を印加するために、当該水晶結晶板の両面に設けられた電極；
該電極の少なくとも一方の電極の表面の一部に設けられた粗面部；及び
前記粗面部上に形成されていて、被検物質又はその一部の構造を捕捉できる鋳型が凹設されている有機選択膜
を備えた水晶発振子センサ。
【請求項２】
水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）用である請求項１に記載の水晶発振子センサ。
【請求項３】
前記有機選択膜は、ポリピロール膜である請求項１又は２に記載の水晶発振子センサ。
【請求項４】
前記選択膜に形成されている鋳型は、リン酸アニオン鋳型である請求項３に記載の水晶発振子センサ。
【請求項５】
前記粗面部は、高さ１〜１００ｎｍの微小凹凸面からなる表面を有している請求項１〜４のいずれかに記載の水晶発振子センサ。
【請求項６】
前記微小凹凸面は、金属ナノ粒子メッキにより形成されたものである請求項５に記載の水晶発振子センサ。
【請求項７】
前記粗面部は、金属酸化物の多孔質体又は金属酸化物の多孔質層を表層とする金属部材で構成されている請求項１〜４のいずれか１項に記載の水晶発振子センサ。
【請求項８】
前記金属がアルミニウム又はチタンであり、前記金属酸化物が酸化アルミニウム又は酸化チタンである請求項７に記載の水晶発振子センサ。
【請求項９】
前記粗面部と前記有機選択膜との間には、導電層が介設されている請求項７又は８に記載の水晶発振子センサ。
【請求項１０】
前記導電層は、前記粗面部の表層を、金属ナノ粒子メッキすることにより形成されたものである請求項９に記載の水晶発振子センサ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の水晶発振子センサを検出部とするＱＣＭ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）装置に好適に用いることができる水晶発振子センサに関し、被検物質に対する選択性が高く、且つ感度が高い水晶発振子センサ及びこれを用いたＱＣＭ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）のセンサ素子として用いられている水晶発振子は、一般に、図７に示すように、水晶結晶板１の両面に金属電極２，２が設けられたものである。水晶結晶板１の両面の電極２，２に電圧をかけてひずみを生じさせ、その後、印加電圧を解除すると、水晶結晶板１は、ずり運動を生じてから元にもどる。この時の印加電圧を振動電場として、ずり方向運動の周期と同期させると、水晶発振子としてその水晶結晶板のもつ固有の周波数で振動させることができる。そして、水晶結晶板１の表面に物質が吸着すると物質の質量に比例して共鳴周波数が下がる。
ＱＣＭ装置はこの現象を利用したもので、発振回路や他の測定回路から得られる周波数の変化をもとに、水晶発振子の電極表面に物質が付着することによる微小質量変化を計測することができる。
【０００３】
例えば、特開２００１−１５３７７７号公報（特許文献１）に、定量しようとする物質（被検物質：アルキルフェノールエトキシレート）を特異的に結合できる抗体を、電極上に固定した水晶発振子センサが開示されている。この水晶発振子センサを周波数測定装置に取付けて、検体溶液中に浸漬し、前記被検物質添加前の初期周波数と前記被検物質添加後の周波数値との差から、アルキルフェノールエトキシレート濃度を測定している。
【０００４】
近年、電極表面に被検物質を捕捉する手法として、抗体に代えて、被検物質に対する選択性、特異性を有する選択膜を形成し、この選択膜の選択性、特異性を利用して、検体溶液中の被検物質濃度を測定することが提案されている。
【０００５】
例えば、特開２００７−５６０５５号公報（特許文献２）に、特定構造を有するカリックスアレーン誘導体を含む多孔性薄膜を分子認識として備えた水晶振動子微量天秤が提案されている。
特許文献２は、ハニカム構造の多孔性薄膜を金電極表面に形成した水晶発振子センサを開示している。多孔性薄膜は、カリックスアレーン誘導体およびバインダー樹脂としてのポリスチレンを、溶媒としてのクロロホルムに溶解させたクロロホルム溶液を製膜材料溶液としてガラス基板上に滴下した後、クロロホルムを蒸発させることにより作製している。電極上に多孔性薄膜が形成された水晶発振子センサは、平滑膜を設けた金電極を有する水晶発振子センサと比べて、クロロベンゼン系の気体に対して、大きな周波数変化を示し、優れた分子認識機能を備えていると説明されている（段落番号００４１）。
【０００６】
また、特開２０００−２７５１５７号公報（特許文献３）に開示されているセンサは、検出対象となる粒子が侵入可能な空洞構造をなし、正の電荷をもった第１の帯電膜と、負の電荷をもった第２の帯電膜とを交互に吸着させてなる交互吸着膜を基材上に設けたもので、帯電膜として多孔質膜又は繊維質膜を形成する性質をもったポリマー材料で作成した自己組織膜を用いることが提案されている。交互吸着膜の積層数を増大させるほど、吸着効率が高まり、高精度な検出が可能であると説明されている。
【０００７】
これらは、いずれも、被検物質のサイズに応じた空孔を有する膜を用いることによって、被検物質に対する選択性、吸着効率を高めたものであることから、抗体と比べると、被検物質に対する特異性、選択性が高いとは言えない。一方、抗体を利用した被検物質の捕捉は、特異性という点では優れているものの、一旦抗体に結合した被検物質を、抗体から完全に除去することは容易でない。このため、抗体を利用した水晶発振子センサは、測定１回限りの使い捨てタイプとなり、高コストの要因となっている。
【０００８】
被検物質の脱着が可能で、且つ被検物質に対する特異性を高めた膜の作製方法として、モレキュラーインプリンティング法（ＭＩ法）が知られている。ＭＩ法とは、認識対象である分子（目的分子）を鋳型として、その目的分子に対して選択性のある結合部位を人工的に材料中に構築する方法である。
【０００９】
ＭＩ法により作製した膜を用いたセンサとしては、例えば、特開２００９−５８２３２号公報（特許文献４）に、アニオン分子（例えば、アミノ酸、ＡＴＰなど）の鋳型が形成されたポリピロール膜を有するセンサが提案されている。具体的には、高分子膜の構成モノマーであるピロールを被検物質となるアニオン分子の存在下で重合した後、過酸化することにより、ＡＴＰ鋳型を有する過酸化ポリピロール選択膜を設けた電極を作製している。そして、この過酸化ポリピロール選択膜を付着させた電極を作用極として、対極との間に流れる電流を測定すると、測定電流値がＡＴＰ濃度に依存することを開示している。しかしながら、このセンサをＱＣＭ装置に用いた場合の評価は行われていない。
【００１０】
一方、電極自体に選択性を付与することも提案されている。例えば、特開２００７−３０３９３８号公報（特許文献５）に、ＭＩ法とＬＰＤ法（液相析出法）とを組み合わせ、基板上に、標的分子に相補的な結合部位（空孔）を有する金属酸化物膜を形成することが提案されている。具体的には、ポリイオン化合物を含有した反応液を用いて、液相析出法により、基板上に空孔を有するシリカ、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化スズなどの金属酸化物膜を形成した水晶発振子センサが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００１−１５３７７７号公報
【特許文献２】特開２００７−５６０５５号公報
【特許文献３】特開２０００−２７５１５７号公報
【特許文献４】特開２００９−５８２３２号公報
【特許文献５】特開２００７−３０３９３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献２〜５のように、選択膜を用いることで、被検物質に対する分子認識能を向上させることができ、吸着効率が高められて、高精度な検出が可能となると考えられる。一方、水晶発振子は、下式に示すように、周波数の変化量（ΔＦ）が、質量変化（Δｍ）、基本周波数Ｆ0に依存する。被検物質の付着による質量変化が微小になると、周波数変化も微小になるので、高分子の選択膜を金属電極上に設けることで、水晶振動子の重量が重くなって水晶発振子センサの基本周波数が下がると、目立った周波数変化が認められず、結果として、被検物質の検出が困難になる。換言すると、周波数変化に基づいて質量変化を測定するためには、ある程度の量の被検物質が必要となることから、検出感度の向上が求められる。
【００１３】
【数１】
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【００１４】
さらに、金属電極と選択膜との親和性、付着強度が低いと、水晶振動子の高速振動により、選択膜が脱離してしまうおそれがあり、繰り返し使用しようとしても、選択膜脱落により、被検物質の捕捉量が減少して、初期の測定感度を発揮できないといった問題がある。
【００１５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、被検物質に対する選択性、特異性が高く、且つ高検出感度、高耐久性の水晶発振子センサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の水晶発振子センサは、電圧印加により固有の周波数で振動できる水晶結晶板；当該水晶結晶板に電圧を印加するために、当該水晶結晶板の両面に設けられた電極；該電極の少なくとも一方の電極の表面の一部に設けられた粗面部；及び前記粗面部上に形成されていて、被検物質又はその一部の構造を捕捉できる鋳型が凹設されている有機選択膜を備えていて、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）用センサに、好適に用いられる。
【００１７】
前記有機選択膜は、ポリピロール膜であることが好ましく、前記選択膜に形成されている鋳型は、リン酸アニオン鋳型であることが好ましい。
【００１８】
前記粗面部は、高さ１〜１００ｎｍの微小凹凸面からなる表面を有していることが好ましく、前記微小凹凸面は、金属ナノ粒子メッキにより形成されたものであることが好ましい。
【００１９】
また、前記粗面部は、金属酸化物の多孔質体又は金属酸化物の多孔質層を表層とする金属部材で構成されていてもよい。この場合、前記金属はアルミニウム又はチタンであり、前記金属酸化物が酸化アルミニウム又は酸化チタンであることが好ましい。また、このような粗面部と前記有機選択膜との間には、導電層が介設されていることが好ましく、前記導電層は、前記粗面部の表層を、金属ナノ粒子メッキすることにより形成されたものであることが好ましい。
【００２０】
本発明は、以上のような構成を有する水晶発振子センサを検出部とするＱＣＭ装置も対象とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の水晶発振子センサは、粗面部の上に有機選択膜が形成されているので、有機選択膜の比表面積が大きく、ひいては被検物質を捕捉できる鋳型個数の増大を図ることが可能となるので、測定感度が高い。しかも、粗面上に有機選択膜が積層されているので、有機選択膜の付着強度が高まり、有機選択膜の耐久性が向上する。従って、高測定感度を保持したままでの繰り返し使用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明一実施形態の水晶発振子センサの構成を示す概略模式図である。
【図２】ＱＣＭ装置の検出部を説明するための概略模式図である。
【図３】電極板の表面状態を示す顕微鏡写真（１万倍）である。
【図４】電極版の表面をサイクリックボルタンモグラムで測定した結果を示すグラフである。
【図５】実施例の測定結果を示すグラフである。
【図６】比較例の測定結果を示すグラフである。
【図７】水晶発振子センサの構成を説明するための概略模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔水晶発振子センサ〕
本発明の水晶発振子センサを、図１に基づいて説明する。
図１に示す水晶発振子センサ１０は、水晶結晶板１の両面に、電極板１１，１１’が夫々設置されていて、作用極となる側の電極面１１の約１／２程度を覆うように、粗面部１２が設けられ、該粗面部１２上に、被検物質を捕捉できる有機選択膜１３が形成されている。
【００２４】
＜水晶結晶板＞
水晶結晶板１としては、特に限定しないが、ＡＴカットの水晶結晶板を用いることができる。ＡＴカット水晶結晶板は、その共振周波数が結晶板の板厚と反比例する現象を有し、その電極面に被検物質の吸着がおきると表面に存在する物質の単位面積あたりの重量に対応した周波数のシフトがおきる。水晶結晶板１の板厚は特に限定しない。
【００２５】
＜電極＞
電極１１，１１’は、水晶結晶板１を発振させるための電圧が印加される電極で、通常、蒸着、スパッタリング等により形成される導電性金属層で構成される。従って、電極１１，１１’には、水晶結晶板１と付着親和性に優れた導電性金属が用いられる。具体的には、金、銀、銅、白金、アルミニウム、シリコン、チタンなどの金属が用いられる。これらのうち、水晶結晶板に対する付着強度が高く、水晶発振子の高周波振動による脱落が生じにくいという点から、チタンが好ましく用いられる。
【００２６】
＜粗面部＞
粗面部１２は、有機選択膜１３が積層される側の面が粗面化されたもので、単に表面をエッチングや研磨等により粗面化されただけでもよいし、ハニカム構造のように、空孔が形成された多孔質体であってもよいし、表層に多数の凹部が凹設された多孔質層を有するもので構成されていてもよい。
【００２７】
具体的には、表面が高さ１〜１００ｎｍ程度の微小凹凸面となる程度に粗面化されたものが好ましい。１〜１００ｎｍ程度の凹凸を有する粗面の場合、当該粗面上に形成される有機選択膜１３の付着強度はアンカー効果により高められる。多孔質体の場合、平均空孔径は、選択有機膜の積層により空孔が閉塞されない程度の大きさであればよく、具体的には、１００〜１０００ｎｍ、好ましくは３００〜７００ｎｍである。粗面部１２となる多孔質体の空孔率は、表面積増大の観点からは大きいほど好ましい。
【００２８】
このような粗面部１２は、別途作成した粗面部材を、振動に影響を与えない硬質接着剤や振動溶着により電極１１表面に固着してもよいし、粗面部１２の構成材料となる金属を電極１１表面に蒸着、スパッタリングした後、粗面化処理することにより形成してもよい。
【００２９】
粗面部１２には、粗面加工性に優れ、電極１１に対する付着親和性が高く、さらに、導電性を有する材料が好ましく用いられる。
【００３０】
電極に対する付着親和性、導電性の観点から、金、プラチナ、パラジウムが好ましく用いられる。金の粗面化は、エッチング、粗面化メッキなどにより行うことができる。エッチングは、プラズマエッチングなどにより行うことが好ましい。粗面化に加えて、さらに金属ナノ粒子により微小凹凸をつけることで、選択膜を固定化するアンカー効果の増大を図ることができる。
【００３１】
粗面化の加工性という点からは、アルミニウム、チタンが好ましく用いられる。アルミニウム、チタンの場合、エッチング、陽極酸化処理により、容易に表面を多孔質化できる。特にアルミニウムでは、陽極酸化で印加する電圧を調節することにより、多孔質の空孔径を調節できるという優れた粗面加工性を有している。
【００３２】
アルミニウムの粗面化（多孔質化）は、通常以下のようにして行うことができる。溶液中で、アルミニウム板を陽極として電圧印加すると、アルミニウム板表面に多孔質のアルミナ層が形成できる。メカニズムについては不明な点もあるが、例えば、Ｊ．Electrochem. Soc. vol.151. B473-478(2004)などの事例がある。
陽極酸化に用いる電解液として使用する酸性又はアルカリ性溶液が、形成したアルミナ皮膜を適度に溶解できる場合、規則的な六角柱ハニカム構造の多孔質膜が形成される。さらに、印加電圧の大きさを調節することにより、形成された多孔質部分の空孔径を調節することもできる。アルミニウムの場合、印加電圧と得られる多孔質体の空孔との関係が２．５ｎｍ／Ｖであることが知られているので、この関係を利用することで、空孔径を調節すればよい。
【００３３】
アルミニウムの粗面化（多孔質化）のための陽極酸化処理条件は特に限定しないが、具体的には、以下の条件を採用することが好ましい。
電解液としては、例えば、リン酸、硫酸水溶液等の無機酸液の他、リンゴ酸、クエン酸等の有機酸を用いることができる。電解液濃度を調節することにより、空孔サイズ、形状を変えることができる。本件目的に適した多孔質化のための印加電圧としては、３０〜３００Ｖであることが好ましく、より好ましくは８０〜２００Ｖである。
【００３４】
チタンの場合もアルミニウム板と同様に、陽極酸化処理により、粗面化（多孔質化）することができる。チタン多孔質化のための陽極酸化処理条件は特に限定しないが、具体的には、以下の条件を採用することが好ましい。
電解液としては、例えば、リン酸、硫酸等の無機酸水溶液液の他、リンゴ酸、クエン酸等の有機酸を用いることができる。多孔質化のための印加電圧としては、１０〜１００Ｖである。
【００３５】
以上のような構成を有する粗面部１２は、別途作成した粗面部材を電極１１上に付着してもよいし、電極１１上に粗面部を構成する部材を付着させた後、粗面化処理することにより形成してもよい。
【００３６】
＜有機選択膜＞
有機選択膜１３は、モレキュラーインプリント法により作製した自己組織化膜であり、被検物質又はその一部の構造の三次元鋳型を有する膜である。
【００３７】
被検物質としては、アニオン分子が挙げられる。被検物質がタンパク、ペプチド、細胞のホモジェネート等のように比較的高分子の場合には、高分子の一部、例えば、アミノ酸、リン酸、ピロリン酸などのアニオン分子を被検物質として鋳型を形成することが好ましい。鋳型部分は、有機選択膜の種類、作製方法により適宜選択される。
【００３８】
有機選択膜としては、分子鋳型が凹設されているポリピロール膜が好ましく用いられる。分子鋳型が凹設されているポリピロール膜は、以下のようにして作成することができる。
ピロール及び／又はピロール誘導体をモノマー成分として含み、さらに過塩素酸イオン、鋳型形成のためのドーパント（アニオン）を含む電解液中で、作用電極及び対極に電圧を印加すると、作用電極上で電解重合がおこり、作用電極上に導電性高分子膜であるポリピロール膜が形成される。ここで、ポリピロールは、重合過程で電極に電子を放出するために、それ自体は、陽電荷を有し、この陽電荷を補償するために、ドーパントとして添加したアニオンがポリマー内にドープされる。
次いで、重合により得られたポリピロールを酸化（過酸化）すると、ポリマーが電気的に中性となるため、ドーパントがポリピロール膜外に放出され（脱ドーピング）、その結果、被検物質（ドーパント）の分子鋳型が形成される。また、過酸化により、ポリピロール膜の硬化が起こるとともに、形成された分子鋳型が安定化する。
【００３９】
上記ポリピロール膜においては、ドーパントを適宜選択することにより、種々の鋳型を有するポリピロール膜を形成することができる。具体的には、ポリピロール膜のドーパントとしては、ＡＴＰ、リン酸、セロトニン、ナフタレンスルホン酸、アミノ酸、胆汁酸などが挙げられ、これらのうち、リン酸鋳型が好ましい。
リン酸鋳型を有するポリピロール膜を作製する場合、例えば、リン酸緩衝液を電解質溶液に含有させればよい。
【００４０】
有機選択膜の膜厚としては、１０ｎｍ〜１０μｍであることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ〜５μｍである。
選択膜の膜厚は、印加電圧、電圧印加時間などにより調節可能である。
【００４１】
有機選択膜１３を粗面部１２上に形成する方法は特に限定しないが、粗面部１２を作用電極として用いて、例えば、電解重合法により、粗面部１２表面上に、直接選択膜を形成することが好ましい。
【００４２】
粗面部１２が金属酸化物のような絶縁物で構成されている場合であっても、粗面部表面を導電処理、すなわち粗面部１２の表面に導電層を形成することにより、電解重合法により、直接、有機選択膜を形成できる。
【００４３】
＜粗面部の導電処理＞
粗面部１２の導電処理としては、特に限定しないが、無電解メッキ、金属コーティング、金属ナノ粒子めっきなどが挙げられる。これらのうち、粗面部１２表面に、導電性金属ナノ粒子を付着する、金属ナノ粒子めっき法が好ましく用いられる。以下、金属ナノ粒子めっき法について説明する。
【００４４】
導電性金属ナノ粒子としては、金、プラチナ、パラジウム、銀、銅、アルミニウムなどの金属粒子を用いることができる。これらのうち、特に金、プラチナ、パラジウムのナノ粒子は導電性が高く、化学的に安定であり、より好ましく用いられる。
これらの金属ナノ粒子をバインダー溶液中に分散させてなる溶液をメッキ液として使用する。このメッキ液を粗面部材の導電処理しようとする側の面（粗面化されている面）と接触させればよい。ナノコロイド粒子は自己集積して、秩序ある結晶となる性質を有するので、乾燥により、金属コロイド粒子によるメッキを行うことができる。
【００４５】
以上説明した、金属ナノ粒子によるメッキは、粗面部の導電性処理のために行う場合に限らない。導電性の粗面部であっても、粗面部１２の表面粗さの微小化を図るために、施してもよい。
【００４６】
以上のような構成を有する水晶発振子センサは、有機選択膜１３が粗面部１２上に形成されているので、比表面積が大きくなる。このことは、電極単位面積あたりの選択膜１３の反応サイト（鋳型凹部）数が増大していることになる。従って、検体溶液中に検出すべき被検物質が微量しか含まれていない場合であっても、有効に被検物質を捕捉することで、感度の向上を図ることができる。
また、本発明の水晶発振子センサでは、有機選択膜１３が粗面部１２表面に付着するように設けられていることから、平板上に有機選択膜を形成した場合と比べて、選択膜の固定力が高められている。従って、高周波振動による有機選択膜の脱離、剥離を抑制でき、有機選択膜の耐久性の向上が期待できる。また、ポリピロール膜の過酸化プロセスで膜の収縮が生じるため、平坦面上のポリピロール膜が脱落しやすいなどの問題があったが、粗面部１２上に直接形成することで、これを防止できる。
【００４７】
尚、図１に示す水晶発振子センサ１０では、電極１１とは別に、粗面部１２を設けていたが、本発明の水晶発振子センサはこれに限定されない。電極１１の表面の一部を粗面化処理することによって粗面部を形成してもよい。
【００４８】
また、図１に示す水晶発振子センサ１０では、粗面部１２が電極１１の約１／２を覆う程度に設けられていたが、本発明の水晶発振子センサはこれに限定されない。粗面部１２上に形成される有機選択膜が、センサとして検体溶液と接触するのに有利なサイズが設定され、当該サイズに応じて、粗面部１２のサイズは適宜設定される。
【００４９】
＜ＱＣＭ装置＞
本発明の水晶発振子センサは、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等の測定技術のセンサ素子として用いることができるが、特にＱＣＭ装置のセンサ素子として好適である。
本発明のＱＣＭ装置は、上記のような構成を有する水晶発振子センサを検出部として用いたものである。
【００５０】
図２に、ＱＣＭ装置の検出部の構成の概要を示す。なお、以下において、作用極の電位はすべて飽和ＫＣｌ銀塩化銀参照電極１４（Ag／AgCl）に対する値と定義される。検出、定量しようとする被検物質を含有する検体溶液がはいった容器１５内に、本発明の水晶発振子センサ１０を作用極として使用し、対極１６との間で、ポテンショスタットにより一定電位を印加する。電解により、検体溶液中の被検物質が選択膜１３側に引き寄せられ、さらに選択膜１３に捕捉される。被検物質が捕捉されることにより、選択膜１３の重量、ひいては水晶発振子センサ１０の重量が重くなり、これにより、水晶発振子センサ１０の振動周波数が低下する。水晶発振子センサ１０を作用極として直流電圧を印加すると、電圧の切替制御に応じて、被検物質が選択膜１３に捕捉されたり、脱離したりする。被検物質の脱着に伴う周波数変化により、検体溶液中の被検物質を検出、定量することができる。また、負電圧を印加して、選択膜１３に捕捉された被検物質を完全脱離することで、水晶発振子センサ１０の繰り返し使用が可能となる。
【実施例】
【００５１】
本発明を実施するための形態を実施例により説明する。下記実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
〔実施例１〕
（１）粗面部の作製
水晶結晶板両面にチタン電極が形成された水晶発振子を用いた。この水晶発振子のチタン電極表面に、平坦な金箔を担持した。金箔表面の電子走査型顕微鏡写真（ＳＥＭ）を図３（ａ）に示す。プラズマエッチング装置（メイワフォーシス株式会社のＳＥＤＥ）を用いて、Ａｕ箔の表面を３０秒間エッチングして、表面を粗面化した。粗面化されたＡｕ箔表面のＳＥＭ写真を図３（ｂ）に示す。
粗面化されたＡｕ箔表面に、３０ｎｍの金ナノ粒子を含んだ溶液（０．０５４７重量％）５００μＬ滴下し、室温で２４時間放置した。放置後、Ａｕ箔を超純水で洗浄し、０．０１Ｍ  ＨＡｕＣｌ４、０．１Ｍアスコルビン酸、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、及び０．１Ｍ臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムＣＴＡＢを含有した溶液５００μｌを添加し、室温で２４時間放置して、金ナノ粒子を乾燥、固定化した。金ナノ粒子メッキが施された粗面部の表面のＳＥＭ写真を図３（ｃ）に示す。
【００５３】
エッチング処理前の金箔（ａ）の表面、エッチング処理後の金箔（ｂ）、及び金ナノ粒子メッキした表面（ｃ）について、フェロシアン化カリウムのサイクリックボルタンモグラム（ＣＶ）における酸化電流ピーク値を測定した結果を図４に示す。図４中、破線は金箔（ａ）、点線はエッチング処理後の金箔（ｂ）、実線は金ナノ粒子メッキ後（ｃ）の表面の測定値を示す。
ａとｂの比較から、エッチング処理により、表面積が３〜７倍増大したことが確認できた。さらに、ａとｃの比較から、エッチング処理及び金ナノ粒子メッキを行うことで、これらの処理を行わない金箔よりも表面積が５〜１１倍増大することが確認できた。
【００５４】
（２）過酸化ポリピロール膜の合成
純水を溶媒として、Ｈ３ＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４を混合してなるリン酸緩衝液（ｐＨ＝２．７）を調製し、これを用いて０．１Ｍのピロール溶液を調製した。このピロール溶液中に、（１）で作製したＡｕ製粗面部が形成された水晶発振子を作用極とし、対極にＰｔ棒を用いて、定電位９７５ｍＶを２８０秒間印加した。Ａｕ製粗面部表面に、Ｈ2ＰＯ4がドープされたポリピロール膜を析出させた。
次いで、このポリピロール膜（以下「ＰＰｙ膜」と略記）が形成された電極を作用極とし、対極をＰｔ棒として、０．１ＭのＮａＯＨ溶液中で、定電位９７５ｍＶで１８０秒間印加し、リン酸を脱ドープすることにより、リン酸の分子鋳型を有する過酸化ポリピロール膜（以下「ＯＰＰｙ膜」と略記）を作製した。このようにして、Ａｕ製粗面部上に過酸化ポリピロール膜が形成された水晶発振子センサを作成した。
【００５５】
（３）リン酸化ペプチドサンプルの検出
以上のようにして作成した水晶発振子センサを作用極とし、図２に示すように、検体溶液がはいった容器中で、Ｐｔ電極を対極１６として電解を行った。水晶発振子センサには、定電位−５００ｍＶ、＋５００ｍＶ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）を１５０秒間ずつ、交互に印加し、周波数変化を測定した。
検体溶液として、被検サンプル１（リン酸化ペプチド１ｍＭと過塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ4）０．９ｍＭの水溶液）、被検サンプル２（リン酸化されていないペプチド１ｍＭと過塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ4）０．９ｍＭの水溶液）、ブランク（ペプチドサンプルを含まない過塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ4）０．９ｍＭの水溶液）を用いた各場合について、周波数変化を測定した。
被検サンプル１、２、ブランクを用いた測定結果を、それぞれ図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す。図５中、破線は、印加電圧を示している。実線は、水晶発振子センサの周波数変化を示している。
【００５６】
被検サンプル１の周波数変化は３０６５９Ｈｚであった。被検サンプル２の周波数変化は、１００００Ｈｚ未満であり、ブランクの周波数変化は１００００Ｈｚ未満であった。従って、リン酸化ぺプチドが優位に選択膜に捕捉されたことがわかる。
【００５７】
〔比較例〕
金箔を粗面化処理しないで、実施例１の（２）と同様の操作により、リン酸の分子鋳型を有するＯＰＰｙ膜を作製した。粗面化されていない金箔上に、リン酸の分子鋳型を有するＯＰＰｙ膜が形成された水晶発振子センサを作用極として用いて、実施例１と同様にして、被検サンプル１について、周波数変化を測定した。測定結果を図６に示す。
被検サンプル１の周波数変化は、７２Ｈｚであった。従って、エッチング後に金ナノ粒子を固定した実施例１の水晶発振子センサの方が、４２６倍の感度を示すことが確認できた。
また、図６では、リン酸化ペプチド捕捉による周波数変動よりも選択膜剥離によると思われる周波数上昇の方が大きかったのに対し、図５（ａ）では、リン酸化ペプチド捕捉による周波数変動が経時的な周波数上昇より大きく、粗面化による選択膜固定化が向上したためと解釈できる。
【００５８】
〔実施例２〕
（１）アルミニウム製粗面部の作製
１０％リン酸水溶液を電解液として使用し、アルミニウム板に、対極に対して５０〜１００Ｖの電圧を数分間印加した。印加電圧４０Ｖ、８０Ｖとして、空孔径１００ｎｍ、２００ｎｍとなるように多孔質化処理を行い、表面が多孔質アルミナであるアルミニウム板を作製した。このアルミニウム板を、水晶発振子の一方の電極上に溶着により固着した。
【００５９】
（２）導電処理（導電層の形成）
水２５ｍＬに１％塩化金酸３ｍｌ及び２％クエン酸ナトリウム２．２５ｍｌを加えて８０℃で２０分間、マグネチックスターラーで攪拌し、粒径３０ｎｍの金ナノ粒子コロイド溶液を調製した。このコロイド溶液を、（１）で作製したアルミニウム製粗面部を浸漬し、室温で放置した。放置後、水晶発振子を水洗し、次いで０．０１Ｍの塩化金酸、０．１Ｍの水酸化ナトリウム、０．１ＭのＣＡＴＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）を含む液を粗面部表面に滴下し、乾燥して、金ナノ粒子を固着させた。
【００６０】
（３）過酸化ポリピロール膜の合成
Ｈ3ＰＯ4とＫＨ2ＰＯ4を混合して、ｐＨ＝２．７のリン酸緩衝液を調製した。ピロール（和光特級）３４．６μＬを分取し、上記リン酸緩衝液（９０ｍＭ、ｐＨ２．７）で５ｍＬでメスアップすることで、０．１Ｍのピロール溶液を調製した。
このピロール溶液中で、（２）で導電処理（金ナノ粒子メッキ）を施したアルミニウム製粗面部を形成した水晶発振子を作用極とし、対極をＰｔ棒として、定電位９７５ｍＶ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）で１２０秒間保持することで、粗面部の金メッキ面に、Ｈ2ＰＯ4アニオンがドープされたポリピロール膜（ＰＰｙ膜）を形成した。次いで、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で、得られたポリピロール膜が付着したアルミニウム製粗面部を作用極、対極を白金棒とし、定電位９７５ｍＶ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）で１８０秒間保持することにより、リン酸の分子鋳型を有する過酸化ポリピロール膜を形成した。このようにして、アルミニウム製粗面部上に過酸化ポリピロール膜が形成された水晶発振子センサを作製した。
【００６１】
〔実施例３〕
水晶結晶板の両面にチタン電極が設置されてなる水晶発振子を用いた。この水晶発振子を作用極とし、対極に白金電極を用いて、５％硫酸水溶液中で、定電圧（１０Ｖ）を印加した。数分後、電流が減少するのを確認した後、印加電圧を５０Ｖに変更した。陽極酸化によりチタン電極の表面が酸化チタンの多孔質層となった粗面部が形成された。
形成された粗面部の多孔質層について、実施例２と同様にして導電処理し、次いで過酸化ポリピロール膜を合成して、水晶発振子センサを作製した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の水晶発振子センサは、有機選択膜が多孔質層上に形成されているので、被検物質に対する感度が高い。従って、本発明の水晶発振子センサをＱＣＭ装置に用いれば、微量な被検物質であっても、特異的に検出、定量が可能である。
【符号の説明】
【００６３】
１  水晶結晶板
１０  水晶発振子センサ
１１，１１’  電極
１２  粗面部
１３  有機選択膜
１４  銀塩化銀参照極
１５  膜形成及び測定用容器
１６  対極
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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