(57)【要約】【課題】新規ポリペプチドの提供。【解決手段】新奇なポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および関連する組成物と方法を、新奇なサイトカイン受容体であるにザルファル１について開示する。このポリペプチドは、インビトロおよびインビボの造血細胞、リンパ系細胞、および骨髄細胞の増殖および／または成長を刺激する配位子の検出方法において用いられる。配位子と結合する受容体ポリペプチドはまた、インビトロおよびインビボの配位子の活性を阻止するために用いることができる。ザルファル１をコードするポリペプチドは１６番染色体に位置し、ヒトの病気の状態と関係しているゲノム領域を同定するために用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含むｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸の同一性のパーセントがＦＡＳＴＡプログラムを用い、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップエクステンションペナルティ＝１、置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２とし、他のパラメーターをデフォルトとして設定して決められる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される１番ヌクレオチドから１６１４番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される１２６番ヌクレオチドから７７９番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される１２６番ヌクレオチドから８３３番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される８３４番ヌクレオチドから１６８２番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される１２６番ヌクレオチドから１６８２番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列、および
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される６９番ヌクレオチドから１６８２番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドの配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドが、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸残基の配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドが、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）から２５５番アミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸残基の配列からなる、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリペプチドがさらにＷＳＷＳＸドメインを含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリペプチドがさらにトランスメンブレンドメインを含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
トランスメンブレンドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２３８番（Ｌｅｕ）から２５５番（Ｌｅｕ）の残基からなる、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
ポリペプチドがさらに細胞内ドメインを含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
細胞内ドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２５６番（Ｌｙｓ）から５３８番（Ｓｅｒ）の残基からなる、請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
細胞内ドメインがさらにＢｏｘＩおよびＢｏｘＩＩ部位を含む、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリペプチドがさらにアフィニティータグを含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
作用可能式に結合した下記の要素：
転写プロモーターと、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列を有するｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと、
転写ターミネーターとを含む発現ベクターであって、前記プロモーターがＤＮＡセグメントと作用可能式に結合し、前記ＤＮＡセグメントが転写ターミネーターと作用可能式に結合している、発現ベクター。
【請求項１３】
さらにＤＮＡセグメントと作用可能式に結合した分泌シグナル配列を含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、前記細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項１５】
転写プロモーターと、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列を有するｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと、
転写ターミネーターとを含む発現ベクターであって、前記プロモーターとＤＮＡセグメントとターミネーターが作用可能式に結合している、発現ベクター。
【請求項１６】
さらにＤＮＡセグメントと作用可能式に結合した分泌シグナル配列を含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
ポリペプチドがさらにＤＮＡセグメントと作用可能式に結合したトランスメンブレンドメインを含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
トランスメンブレンドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２３８番（Ｌｅｕ）から２５５番（Ｌｅｕ）の残基を含む、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
ポリペプチドがさらにＤＮＡセグメントと作用可能式に結合した細胞内ドメインを含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
細胞内ドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２５６番（Ｌｙｓ）から５３８番（Ｓｅｒ）の残基からなる、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１５に記載の発現ベクターの導入された培養細胞であって、前記細胞がＤＮＡセグメントによりコードされる可溶性の受容体ポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項２２】
細胞が増殖のために外因的に供給された造血増殖因子に依存している、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築体であって、前記ＤＮＡ構築体が、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号１９（Ｇｌｙ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸２３８（Ｌｅｕ）からアミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２３８（Ｌｅｕ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、からなる群から選択されたアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコードする第一ＤＮＡセグメントと、
追加のポリペプチドをコードする少なくとも１個の別のＤＮＡセグメントとを含む構築体であって、
前記第一ＤＮＡセグメントおよび別のＤＮＡセグメントがイン・フレームで結合し、かつ前記第一ＤＮＡセグメントおよび別のＤＮＡセグメントが融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ構築体。
【請求項２４】
作用可能式に結合した下記の要素：
転写プロモーターと、
請求項２３に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築体と、
転写ターミネーターとを含む発現ベクターであって、前記プロモーターがＤＮＡ構築物と作用可能式に結合し、前記ＤＮＡセ構築体が転写ターミネーターと作用可能式に結合している、発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、前記細胞がＤＮＡ構築体によりコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の細胞を培養することと、前記細胞により生成したポリペプチドを単離することを含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項２７】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）から２５５番アミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸の同一性のパーセントがＦＡＳＴＡプログラムを用い、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップエクステンションペナルティ＝１、置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２とし、他のパラメーターをデフォルトとして設定して決められる、単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載の単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸残基の配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２７に記載の単離されたポリペプチドであって、アミノ酸残基の配列が、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２５５（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２５６（Ｌｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、および
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸残基の配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
ポリペプチドがさらにＷＳＷＳＸモチーフを含む、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチドがさらにトランスメンブレンドメインを含む、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
トランスメンブレンドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２３８番（Ｌｅｕ）から２５５番（Ｌｅｕ）の残基からなる、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
ポリペプチドがさらに細胞内ドメインを含む、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
細胞内ドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２５６番（Ｌｙｓ）から５３８番（Ｓｅｒ）の残基を含む、請求項３３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
細胞内ドメインがさらにＢｏｘＩおよびＢｏｘＩＩ部位を含む、請求項３４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１５に記載の細胞を培養すること、および前記細胞により生成したｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドを単離することを含むｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドの製造方法。
【請求項３７】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが造血受容体と通常結合しているトランスメンブレンドメインおよび細胞内ドメインを実質上含まない、単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
さらにアフィニティータグを含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
請求項２１に記載の細胞を培養すること、および前記細胞により生成したｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドを単離することを含むｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドの製造方法。
【請求項４０】
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドに対する抗体の製造方法であって、
（ａ）９から５１９個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２中のアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸の連続配列からなるポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号１０１（Ｌｅｕ）からアミノ酸番号１２２（Ｇｌｙ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号１４１（Ａｓｎ）からアミノ酸番号１７４（Ａｌａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号１９３（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２６１（Ｖａｌ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号５１（Ｔｒｐ）からアミノ酸番号６１（Ｇｌｕ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号１３６（Ｉｌｅ）からアミノ酸番号１４３（Ｇｌｕ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号１８７（Ｐｒｏ）からアミノ酸番号１９５（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号２２３（Ｐｈｅ）からアミノ酸番号２３２（Ｇｌｕ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸番号３６０（Ｇｌｕ）からアミノ酸番号３６８（Ａｓｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
からなる群から選択されたポリペプチドであって、動物中の免疫応答を誘発して抗体を生成させるポリペプチドを動物に接種すること、および
前記動物から抗体を単離することを含む、方法。
【請求項４１】
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドと特異的に結合する請求項４０の方法により製造された抗体。
【請求項４２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
請求項２７に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項４４】
請求項１５に記載の発現ベクターの導入された細胞の培養であって、前記細胞が試験試料の存在および不在下でＤＮＡセグメントによりコードされるｚａｌｐｈａ１１タンパク質を発現させる培養を行なうことと、
試験試料の存在および不在下で生物学的または生化学的検定によりｚａｌｐｈａ１１の活性レベルを比較することと、
前記比較から試験試料中のｚａｌｐｈａ１１の活性の活性調節因子の存在を決定することを含む、試験試料中でｚａｌｐｈａ１１タンパク質活性の活性調節因子の存在を検出する方法。
【請求項４５】
試験試料と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号２３７（Ｈｉｓ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを接触させること、および
ポリペプチドと試料中のリガンドとの結合を検出することを含む、試験試料内のｚａｌｐｈａ１１受容体のリガンドの検出方法。
【請求項４６】
ポリペプチドがさらにトランスメンブレンドメインおよび細胞内ドメインを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ポリペプチドが培養した細胞内で結合された膜であり、かつ検出のステップが培養した細胞中の生物学的応答の測定を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
生物学的応答が細胞の増殖またはリポーター遺伝子の転写の活性化である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ポリペプチドを固体の担体上で固定化する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
多細胞生物の細胞の増殖及び分化はホルモン及びポリペプチド成長因子によりコントロールされている。これら拡散性分子により細胞は相互連絡でき、協調して細胞及び器官を形成し、損傷組織の修復と再生が可能になる。ホルモン及び成長因子の例としては、ステロイドホルモン（例えば、エストロゲン、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、濾胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子(EGF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エリスロポイエチン（EPO）及びカルシトニンがある。
【０００２】
ホルモン及び成長因子はタンパク質に結合して細胞の代謝に影響を及ぼす。受容体は第２メッセンジャーシステムの様な細胞内シグナル伝達経路に連結した膜内蛋白質である。その他クラスの受容体は、転写因子の様な可溶性分子である。
特に興味深いものは、細胞の増殖及び／又は分化を促進する分子であるサイトカインである。サイトカインの例としては、赤血球の発生を促進するエリスロポイエチン（EPO）；巨大核細胞系細胞の発生を促進するトロンボポイエチン（TPO）；及び好中球の発生を促進する顆粒球−コロニー刺激因子（G-CSF）がある。これらサイトカインは、貧血、血小板減少症、及び好中球減少症の患者又は癌の化学療法を受けている患者に於いて、正常血球レベルを快復させるのに有用である。
【０００３】
これらサイトカインに示されたin vivo活性からは、その他サイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの持つ数多い臨床の可能性、及び需要を描写する。本発明は、新規造血性サイトカイン受容体、ならびに関連組成体及び方法を提供することで、この求めに答えるものである。
【０００４】
本発明は、ここでの教示より当業者にとって明らかなこれら及びその他利用に適したポリペプチドを提供する。
【０００５】
発明の要約
本発明の１つの観点は、以下より成るグループから選択されるアミノ酸配列に少なくとも90％同一であるアミノ酸残基の配列を含むzalpha11ポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチドを提供する：アミノ酸配列がktup=1、ギャップオープニングペナルティー（gap opening penaly）＝10、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）＝１、及び置換マトリックス＝BLOSUM62であり、その他パラメータがデフォルトに設定されたFASTAプログラムを用い決定される(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(c)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：及び(e)アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列。実施態様の１つでは、上記開示の分離されたポリヌクレオチドは以下より成るグループから選択されるポリヌクレオチドの配列を含む：(a)ヌクレオチド１ないしヌクレオチド1614の配列番号４に示すポリヌクレオチド配列；(b)ヌクレオチド１26ないしヌクレオチド779の配列番号１に示すポリヌクレオチド配列；(c)ヌクレオチド126ないしヌクレオチド833の配列番号１に示すポリヌクレオチド配列；(d)ヌクレオチド834ないしヌクレオチド1682の配列番号１に示すポリヌクレオチド配列；(e)ヌクレオチド126ないしヌクレオチド1682の配列番号１に示すポリヌクレオチド配列；(f)ヌクレオチド69１ないしヌクレオチド1682の配列番号１に示すポリペプチド配列。別の実施態様では、上記分離されたポリヌクレオチドは以下より成るグループから選択されるアミノ酸残基の配列を含む：(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(c)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：及び(e)アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列。別の実施態様では上記開示の分離ポリヌクレオチドは以下より成るグループから選択されるアミノ酸残基の配列より成る：(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(c)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：及び(e)アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列。別の実施態様では、上記分離ポリペプチドは更にWSWSXドメインを含む。別の実施態様では、上記分離ポリヌクレオチドは更にトランスメンブレンドメインを含む。別の実施態様では、上記開示のポリヌクレオチドは配列番号２の残基238（Leu）ないし255（Leu)より成るトランスメンブレンドメインを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリヌクレオチドは更に細胞内ドメインを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリヌクレオチドは配列番号２の残基256（Lys）ないし538（Ser)より成る細胞内ドメインを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリヌクレオチドは、ボックスＩ及びボックスIIを更に含む細胞内ドメインを含み、ポリペプチドが更にアフィニティータグを含む細胞内ドメインを含む。
【０００６】
第２の観点では、本発明は以下の作用可能式に結合された要素を含む発現ベクターを提供する：プロモータがDNA断片に作用可能式に連結し、DNA断片が転写ターミネーターに作用可能式に連結している転写プロモーター；アミノ酸番号20（Cys)ないしアミノ酸番号538（Ser）の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するzalpha11ポリペプチドをコードするDNA断片；転写ターミネーター。実施態様の一つでは、上記開示の発現ベクターは更にDNA断片に作用可能式に連結した分泌シグナル配列を含む。
【０００７】
第３の観点では本発明は、上記開示の発現ベクターを含む培養細胞にあって、その細胞がDNA断片によりコードされたポリペプチドを発現する培養細胞を提供する。
【０００８】
第４の観点では、本発明は以下の作用可能式に結合された要素を含む発現ベクターを提供する：転写プロモーター；アミノ酸番号20（Cys)ないしアミノ酸番号237（His）の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するzalpha11ポリペプチドをコードするDNA断片；転写ターミネーターにあって、前記プロモータはDNA断片に作用可能式に連結され、DNA断片は転写ターミネーターに作用可能式に連結されている。実施態様の一つでは、上記開示の発現ベクターは更にDNA断片に作用可能式に連結した分泌シグナル配列を含む。別の実施態様では、上記開示の発現ベクターは更に作用可能式にDNA断片と連結したトランスメンブレンドメインを含む。別の実施態様では上記開示の発現ベクターは、配列番号２の238（Leu)ないし255(Leu)の残基より成るトランスメンブレンドメインを更に含む。別の実施態様では、上記開示の発現ベクターはDNA断片に作用可能式に連結された細胞内ドメインを含む。別の実施態様では上記開示の発現ベクターは、配列番号２の残基256（Lys)ないし538（Ser）より成る細胞内ドメインを更に含む。
【０００９】
別の観点では、本発明はその中に請求項15による発現ベクターが導入される培養細胞にあって、細胞がDNA断片によりコードされた可溶性受容体ポリペプチドを発現する培養細胞を提供する。実施態様の一つでは、上記開示の培養細胞は外因性に添加された増殖に関する造血性成長因子に依存している。
【００１０】
別の観点では、本発明は融合蛋白質をコードするDNA構築体にあって、以下を含むDNA構築体を提供する；以下より成るグループから選択されるアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコードする第１DNA断片；(a)アミノ酸番号１（Met)ないしアミノ酸番号19（Gly）の配列番号２のアミノ酸配列；(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２のアミノ酸配列：(c)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２のアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号238（Leu）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２のアミノ酸配列：(e)アミノ酸番号238（Leu）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２のアミノ酸配列：(f)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２のアミノ酸配列：及び(g)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２のアミノ酸配列：及び追加ポリペプチドをコードする少なくとも１の他DNA断片であり、上記第１DNA断片と前記他DNA断片はインフレームに接続され；そして第１DNA断片及び他DNA断片が融合蛋白質をコードするもの。
【００１１】
別の観点では、本発明は以下の作用可能式に連結した要素を含む発現ベクターを供給する：転写プロモーター；上記融合蛋白質をコードするDNA構築体；及び転写ターミネーターであり、前記プロモターは作用可能式にDNA構築体に連結され、そしてDNA構築体は転写ターミネーター作用可能式に連結されている。
【００１２】
別の観点では、本発明は上記開示の発現ベクターを含む培養細胞にあって、該細胞がDNA構築体によりコードされたポリペプチドを発現する培養細胞を提供する。
【００１３】
別の観点では、本発明は以下を含む融合蛋白質を産生する方法を提供する：上記開示の細胞を培養すること；及び細胞により産生されたポリペプチドを分離すること。
【００１４】
別の観点では、本発明は以下より成るグループから選択されるアミノ酸配列に少なくとも90％同一であるアミノ酸残基の配列を含む分離ポリペプチドを提供する：上記アミノ酸％同一がktup=1、ギャップオープニングペナルティー（gap opening penaly）＝10、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）＝１、及び置換マトリックス＝BLOSUM62であり、その他パラメータがデフォルトに設定されたFASTAプログラムを用い決定される(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２に示すアミノ酸配列： (c)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：及び(e)アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列。実施態様の一つでは、上記開示の分離ポリペプチドは以下より成るグループから選択されるアミノ酸残基の配列を含む：(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(c)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：及び(e)アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列。別の実施態様では、上記開示の分離ポリペプチドは以下よりなるグループから選択されるアミノ酸残基の配列より成る：(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号255（Leu)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(c)アミノ酸番号256（Lys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：(d)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列：及び(e)アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２に示すアミノ酸配列。別の実施態様では、上記開示の分離ポリペプチドは更にWSXWSモチーフを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリペプチドは更にトランスメンブレンドメインを含む。別の実施態様では、上記開示のポリヌクレオチドは配列番号２の残基238（Leu）ないし255（Leu)より成るトランスメンブレンドメインを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリヌクレオチドは更に細胞内ドメインを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリヌクレオチドは配列番号２の残基256（Lys）ないし538（Ser)より成る細胞内ドメインを含む。別の実施態様では、上記開示の分離ポリヌクレオチドは、ボックスＩ及びボックスIIを更に含む細胞内ドメインを含み、ポリペプチドが更にアフィニティータグを含む細胞内ドメインを含む。
【００１５】
別の観点では本発明は以下を含む、zalpha11ポリペプチドの産生方法を提供する：上記開示の細胞を培養すること；及び細胞により産生されたzalpha11ポリペプチドを分離すること。
【００１６】
別の観点では、本発明は以下より成るグループから選択されるアミノ酸配列を含む分離ポリペプチドを提供する：(a)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列：そして前記ポリペプチドは造血性受容体に元来結合しているトランスメンブレンドメイン及び細胞内ドメインを実質的に持たない。別の実施態様では、上記開示の分離ポリペプチドはアフィニティータグを含む。
【００１７】
別の観点では本発明は以下を含む、zalpha11ポリペプチドを産生する方法を提供する：上記開示の細胞を培養すること；及び細胞より産生されたzalpha11ポリペプチドを分離すること。
【００１８】
別の観点では本発明は以下を含む、zalpha11ポリペプチドに対する抗体を産生する方法を提供する：動物に以下より成るグループから選択されたポリペプチドを接種すること：(a)９ないし519アミノ酸より成るポリペプチドにあって、前記ポリペプチドがアミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号538（Ser)の配列番号２のアミノ酸の連続配列であるもの：(b)アミノ酸番号20（Cys）ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２のアミノ酸の連続配列より成るポリペプチド、(c)アミノ酸番号101（Leu）ないしアミノ酸番号122（Gly)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：(d)アミノ酸番号141（Asn）ないしアミノ酸番号174（Ala)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：(e)アミノ酸番号193（Cys）ないしアミノ酸番号261（Val)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：(f)アミノ酸番号51（Trp）ないしアミノ酸番号61（Glu)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：(g)アミノ酸番号136（Ile）ないしアミノ酸番号143（Glu)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：(h)アミノ酸番号187（Pro）ないしアミノ酸番号195（Ser)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：(i)アミノ酸番号223（Phe）ないしアミノ酸番号232（Glu)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：及び(j)アミノ酸番号360（Glu）ないしアミノ酸番号368（Asp)の配列番号２のアミノ酸配列より成るポリペプチド：そして前記ポリペプチドが動物内に抗体を産生する免疫反応を誘導すること；及び動物より抗体を分離すること。
【００１９】
別の観点では、本発明は上記開示の方法により産生された、zalpha11ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。実施態様の一つでは、上記開示の抗体はモノクローナル抗体である。
【００２０】
別の観点では、本発明は上記開示のポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００２１】
別の観点では、本発明は以下を含む、試験サンプル中のzalpha11蛋白質活性の存在を検出する方法を提供する：
【００２２】
別の観点では、本発明は以下を含む、試験サンプル中のzalpha11蛋白質活性調節因子の存在を検出する方法を提供する：細胞が試験サンプルがある状態及び無い状態でDNA断片によりコードされるzalpha11蛋白質を発現する、発現ベクターが導入された細胞を培養すること；及び生物学的又は生化学的アッセイにより、試験サンプル有り無しでのzalpha11活性のレベルを比較すること；ならびに試験サンプル中のzalpha11活性調節因子の存在を、前記比較より決定すること。
【００２３】
別の観点では、本発明は以下を含む、試験サンプル中のzalpha11受容体検出法を提供する：試験サンプルをアミノ酸番号20（Cys)ないしアミノ酸番号237（His)の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；及びサンプル中のリガンドへのポリペプチドの結合を検出すること。実施態様の一つでは、上記開示の方法は、トランスメンブレン及び細胞内ドメインを含むポリペプチドを更に含む。別の実施態様では、上記開示の方法は培養細胞内に膜に結合するポリペプチドであるポリペプチド及び、培養細胞内の生物学的反応を測定することを含む検出段階を更に含む。別の実施態様では、上記開示の方法は、培養細胞内に膜に結合するポリペプチドであるポリペプチド、及び生物学的反応が細胞増殖又はレポーター遺伝子の転写活性化である培養細胞内の生物学的反応を測定することを含む検出段階を更に含む。別の実施態様では、上記開示の方法は固相支持体上に固定されたポリペプチドであるポリペプチドを更に含む。
本発明のこれら及びその他の観点は、以下の詳細な説明を参照することより明瞭になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ヒトzalpha11のHopp/Woods親水性プロットである。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図１Ｃ】図１Ｂの続き。
【図１Ｄ】図１Ｃの続き。
【図１Ｅ】図１Ｄの続き。
【図１Ｆ】図１Ｅの続き。
【図１Ｇ】図１Ｆの続き。
【図１Ｈ】図１Ｇの続き。
【図１Ｉ】図１Ｈの続き。
【図１Ｊ】図１Ｉの続き。
【図１Ｋ】図１Ｊの続き。
【図１Ｌ】図１Ｋの続き。
【図２Ａ】ヒトzalpha11（zalpha)(配列番号２）及びマウスzalpha11（muzalp)（配列番号85）のアラインメントである。
【図２Ｂ】図２Ａの続き。
【００２５】
発明の詳細な説明
発明を詳細に記載する前に、以下用語を定義することはその理解に役立つだろう：
”アフィニティータグ”という用語は、ここでは第２ポリペプチドの精製又は検出に供される第２ポリペプチドに結合できるポリペプチド断片、又は基質への第２ポリペプチドの結合に関する部位を提供するポリペプチド断片を意味するために用いられる。原則的には抗体又はその他特異的結合作用物質が利用できるペプチド又はポリペプチドは、アフィニティータグとして利用できる。アフィニティータグには、ポリ−ヒスチジントラクト、プロテインＡ（Nilssonら、 EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilssonら、 Methods Enzymol. 198: 3, 1991）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（SmithとJohnson, Gene 67:31, 1988）、Glu-Gluアフィニティータグ（Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985）、サブスタンスＰ、FlagＴＭペプチド（Hoppら、Biotechnology 6; 1204-10, 1988）、ストレプトアビジン結合ペプチド、又はその他抗原性エピトープ又は結合ドメインを含む。一般には、Fordら、Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を見よ。アフィニティータグをコードするDNAは市販品が利用できる（例えばファルマシアバイオテック社（Pharmacia Biotech）、Piscataway、NJ）。
【００２６】
”対立遺伝子変異”という語は、ここでは同一染色体座を占める遺伝子の２またはそれ以上の変化形のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は突然変異により自然に発生し、集団内に遺伝子及び表現形多形を生じる。遺伝子突然変異はサイレントであるか（コードされたポリペプチドは変化しない）、または変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。対立遺伝子変異という語は、ここでは遺伝子の対立遺伝子変異によりコードされた蛋白質も意味する。
【００２７】
”アミノ末端”及び”カルボキシル末端”という用語は、ここではポリペプチド内の位置を示すために用いられる。文脈より可能な場合、これら用語は特定の配列を引用して、近接する位置又は相対位置を示すために用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置する特定配列とは、参照配列のカルボキシル末端に隣接し位置するものであるが、必ずしもポリペプチドの完全なカルボキシル末端に存在する必要はない。
【００２８】
”相補体／抗相補体対”という用語は、適当な条件の下に非共有結合的に結合した、安定した対を形成する非同一成分を意味する。例えば、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）は相補体／抗相補体対の原型メンバーである。その他の相補体／構想補体対の例には、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテンあるいはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対等が含まれる。相補体／構想補体対が後に分離することが望まれる場合、相補体／構想補体値は＜１０9Ｍ-1の結合親和性を持つことが好ましい。
”ポリヌクレオチド分子の相補体”という用語は、参照配列に比し相補的な配列と逆向きの方向性を持つポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、配列5'ATGCACGGG3'は5'CCCGTGCAT3'に相補的である。
【００２９】
”コンティグ”という用語は、他のポリヌクレオチドに対する同一配列又は相補的配列の、連続的な張り出し部分を有するポリヌクレオチドを意味する。コンティグ配列とは、ポリヌクレオチドの張り出し部分が、あるポリヌクレオチド全体、又は一部張り出し部分と”重複”することを意味する。例えば、ポリヌクレオチド配列5'-ATGGCTTAGCTT-3'に対する代表的コンティグは5'-TAGCTTgagtct-3'及び3'-gtcgacTACCGA-5'である。
【００３０】
用語”縮重ヌクレオチド配列”は、１又はそれ以上の縮重コドン（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比べ）を含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンは、ヌクレオチドの別のトリプレットを含むが、同一アミノ酸残基をコードする（即ち、GAUとGACトリプレットは共にAspをコードする）。
【００３１】
用語”発現ベクター”は、その転写体を提供する為の追加の断片と作用可能式に連結された所望ポリペプチドをコードする断片を含む、直鎖状又は環状のDNA分子を意味するのに用いられる。この様な追加断片は、プロモーター及びターミネーター配列を含み、又１またはそれ以上の複製起点、１又はそれ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニレーションシグナル等を含むだろう。発現ベクターは、一般にプラスミド又はウイルスDNAに由来するか、又はその両方のエレメントを含むだろう。
【００３２】
用語”単離された”とは、ポリヌクレオチドに用いる場合には、ポリヌクレオチドがその天然環境より取り出され、従ってその他外部の、又は不要なコーディング配列は含まず、そして遺伝的に加工された蛋白質産生システム内での利用に好適な形状にあることを意味する。この様な分離された分子は、それらの天然環境より分離され、そしてcDNA及びゲノム性クローンを含むものである。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常結合している他の遺伝子を含まないが、しかし天然に生ずるプロモーターやターミネーターの様な5'及び3'非翻訳域は含むだろう。結合領域の特定は当分野熟練者にとって明瞭であろう（例えばDynanとTijan、Nature 316:774-78、1985）。
【００３３】
”単離された”ポリペプチド又は蛋白質は、例えば血液及び動物組織から離れている様な、その天然環境以外の状態にて見いだされるポリペプチド又は蛋白質である。好ましい形態では、単離されたポリペプチドは本質的にその他のポリペプチド、特に動物起源のその他ポリペプチドを含まない。高度に精製された形状のポリペプチド、即ち95％以上、より好ましくは99％以上の純度であるポリペプチドを提供することが好ましい。この関連で利用される場合は、用語”単離された”は例えばダイマー、又は別の形に糖化もしくは誘導された形状の様な、別の物理形状の同一ポリペプチドの存在を排除しない。
【００３４】
用語”作用可能式に連結された”は、DNA断片を参照する場合、断片がそれらが意図する目的、例えばプロモーター内にて転写が開始し、コーディング断片を経てターミネーターに至る様な目的に関し機能する様に配置されていることを意味する。
【００３５】
用語”オルトログ”は、異なる種に由来するポリペプチド又は蛋白質の機能的な対応体である、ある種より得たポリペプチド又は蛋白質を意味する。オルトログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【００３６】
”パラログ”とは、生物体により作られる別種ではあるが構造的に関連した蛋白質である。パラログは遺伝子複製を介して生まれると考えられている。例えばα−グロブリン、β−グロブリン及びミオグロビンは相互にパラログである。
【００３７】
”ポリヌクレオチド”は5'から3'末端に読みとられるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の単−又は２本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドはRNA及びDNAを含み、そして天然源より分離されるか、インビトロで合成されるか、又は天然及び合成分子の組合せより調製される。ポリヌクレオチドの大きさは塩基対（"bp"と略される）、ヌクレオチド（"nt"）又はキロベース（"kb"）により表される。文脈より可能な場合、後者２用語は単鎖又は２本鎖であるポリヌクレオチドを記述する。本用語を２本鎖分子に用いる場合、これは全長を意味する時に用いられ、用語”塩基対”に等しいことが理解されるだろう。当業者は、２本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は長さが僅かに異なること、及び酵素切断の結果としてその端部がずれることがあることを理解するだろう；即ち２本鎖ポリヌクレオチド分子内の全ての鎖が対合しないこともあるだろう。
【００３８】
”ポリペプチド”は、天然または合成的に作られるかに関わらず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは通常”ペプチド”と呼ばれる。
【００３９】
用語”プロモーター”は、ここでは当分野にて認識される意味に用いられ、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始に供される遺伝子含有ＤＮＡ配列の一部を意味する。プロモーター配列は、絶対ではないが通常遺伝子の5'非翻訳域内に存在する。
【００４０】
”蛋白質”（タンパク質）は、１またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。蛋白質は、炭水化物の様な非ペプチド成分も含むだろう。炭水化物及びその他非ペプチド性基質は、その蛋白質が産生される細胞により蛋白質に付加され、また細胞の型により変わるだろう。ここでは蛋白質はそれらのアミノ酸主鎖構造により定義される；炭水化物基の様な基質は一般には明記されていないが、その場合でも存在することがある。
【００４１】
用語”受容体”は、生物活性分子（即ちリガンド）に結合し、そして細胞にリガンドの作用を伝達する細胞結合蛋白質を意味する。受容体へのリガンドの結合は、受容体内に立体構造の変化を招き（そして、幾つかの例では受容体の多量体化、即ち同一または別レセプターサブユニットの結合）、これがエフェクタードメインと細胞内の他分子との間に相互作用を誘導する。次にこれら相互作用は細胞の代謝に変化を招く。受容体−リガンド相互作用に連結した代謝現象には、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生上昇、細胞カルシウムの代謝、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解が含まれる。細胞表面サイトカイン受容体は、下記詳細論じる様な多ドメイン構造により特徴付けられる。これら受容体は、一般的には正に荷電された残基（Lys又はArg）が近接する疎水性アミノ酸残基（典型的には21−25残基）の配列により特徴付けられるトランスメンブレンドメインにより、細胞膜内に固定される。一般に受容体は、膜結合性の細胞質性又は核性である；単量体（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータアドレナリン性受容体）又は多量体（例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSP受容体、G-CSF受容体、エリスロポイエチン受容体及びIL-6受容体）である。用語”受容体ポリペプチド”は、分離された機能ドメイン（例えばリガンド結合ドメイン）を含む、完全な受容体ポリペプチド及びその一部を意味するのに利用される。
用語”分泌シグナル配列”は、大型のポリペプチドの成分として、それが合成される細胞内の分泌経路に大型のポリペプチドを方向付けするポリペプチド（”分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を意味する。大形ポリペプチドは通常分泌経路通過中に分断され、分泌ペプチドが除かれる。
【００４２】
”可溶性受容体”は、細胞膜に結合しない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体の多くは一般に、トランスメンブレン及び細胞質ドメインを欠くリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチド精製又は基質へのポリペプチドの結合のために提供されるアミノ酸残基の様なアフィニティータグ、もしくは免疫グロブリン定常域配列の様な追加のアミノ酸残基を含むことができる。多くの細胞表面受容体は天然に生じ、その可溶型は蛋白質分解により産生される。可溶性受容体ポリペプチドは、それらが膜固定又はシグナル伝達それぞれを提供するそれら断片の十分な部分を欠くとき、実質的には膜貫通及び細胞質ポリペプチド断片を持たないと言われている。
【００４３】
用語”スプライス変異体”はここでは遺伝子から転写されるRNAの別形状を意味するのに用いられる。スプライス変異は天然には、転写されたRNA分子内、又は一般的ではないが別々に転写されたRNA分子間にある別のスプライシング部位が利用されることで生じ、その結果同一遺伝子より複数のmRNAが生じるだろう。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするだろう。スプライス変異体という用語は、ここでは遺伝子より転写されたmRNAのスプライス変異体によりコードされる蛋白質を意味する場合にも用いられる。
【００４４】
不正確な分析方法（例えばゲル電気泳動法）により決定されたポリマーの分子量及び長さは、おおよその値と理解されるだろう。この様な値を”約”Ｘ又は”おおよそ”Ｘと表される場合には、記載された値Ｘは±10％の正確性であると理解されるだろう。
【００４５】
ここに引用された参考資料は、その全てが参照されて取り込まれている。
本発明は、クラスＩサイトカイン受容体の構造を持つ蛋白質をコードする新規DNA配列の発見に一部基づく。演繹アミノ酸配列は、コードされた受容体がIL-2受容体β-サブユニット、及びβ-共通受容体（即ちIL3、IL-5及びGM-CSF受容体β-サブユニット）を含む受容体サブファミリーに属していることを示した。この新規DNAに対応するmRNAの組織分布の分析から、リンパ節、末梢白血球（PBLs）、脾臓及び胸腺内での発現が示された。更にmRNAはバーキットリンパ腫由来のRaji細胞株（ATCC番号CCL-86）内に豊富であった。ポリペプチドはzalpha11と命名された。
【００４６】
本発明の新規zalpha11ポリペプチドは、ESTデータベースの検索により最初に同定された。ESTが発見されその対応cDNAが配列決定された。このcDNAにコードされた新規ポリペプチドはクラスＩサイトカイン受容体と相同性を示した。zalpha11ポリペプチド配列は推定蛋白質の全コーディング配列をコードしていた。zalpha11はアポトーシス細胞経路、細胞−細胞シグナル伝達分子、増殖因子受容体又は増殖因子ホルモン活性を持つ細胞外マトリックス結合蛋白質等と関係する新規サイトカイン受容体である。
【００４７】
zalpha11ポリペプチドの配列は、その対応ポリペプチド配列を含む単一クローンより演繹された。このクローンは脊髄ライブラリーより得た。この様な配列が検索あれるであろう他のライブラリーにはPBL、胸腺、脾臓、リンパ節、ヒト赤白血病細胞株（例えばTF-1）、Raji細胞、急性単核球性白血病細胞株、その他リンパ腫、及び造血性細胞株等が含まれる。
【００４８】
代表的なzalpha11をコードするDNAは配列番号１（ヌクレオチド69ないし1682）に記載されており、それより演繹された538アミノ酸配列は配列番号２に記載される。その全体に於いて、zalpha11ポリペプチド（配列番号２）は完全長ポリペプチド断片（配列番号２の残基１（Met)から残基538（Ser））を表す。zalpha11のドメイン及び構造上の特徴を以下詳細に記す。
【００４９】
配列番号１のDNA配列によりコードされたzalpha11ポリプチドの分析は、19アミノ酸残基の推定分泌シグナルペプチド（配列番号２の残基１（Met）ないし残基19（Gly））及び519アミノ酸の成熟ポリペプチド（配列番号２の残基20（Cys）ないし残基538（Ser））を含む519アミノ酸）を含む538アミノ酸（配列番号２）コードするオープンリーディングフレームを表した。配列番号２の残基214ないし218に相当するWSXWSモチーフ（配列番号３）に加え、受容体は約200アミノ酸残基（配列番号２の残基20（Cys)ないし237（His)）のサイトカイン結合ドメイン；ドメインリンカー（配列番号２の残基120（Pro)ないし123（Pro)）；末位から２番目の鎖領域（配列番号２の残基192（Lys)ないし202（Ala)）；トランスメンブレンドメイン（配列番号２の残基238（Leu)ないし255（Leu)）；”ボックスＩ”シグナル伝達部位（配列番号２の残基267（Ile)ないし273（Pros）及び”ボックスII”シグナル伝達部位（配列番号２の残基301（Leu)ないし304（Gly)）を含む完全細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号２の残基256（Lys)ないし538（Ser)）、を含む。当業者はこれらドメインの境界がおおよそであり、既知蛋白質のアラインメント及び蛋白質折りたたみの推測に基づくものであることを容易に認識するだろう。これらドメインに加え、コードされた受容体中の保存された受容体の特徴には（配列番号２に示すように）、位置138の保存Trp残基及び位置201の保存Arg残基がある。上記のzalpha11ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基、及び配列をコードする対応ヌクレオチドは配列番号１に示される。
【００５０】
トランスメンブレン領域の存在、及び保存された低変異性モチーフの存在は一般に、蛋白質内の重要な構造領域に関連するか、又はこれを規定している。低変異性領域（例えば疎水性クラスター）は、一般には構造上重要な領域に存在している（Sheppard、Pら、上記）。この様な低変異性領域は、しばしばトリプトファンの様な稀又は低頻度アミノ酸を含む。これら保存された低変異性モチーフに隣接する、及びその間にある領域は、結合ドメイン、生物学的及び酵素的活性、シグナル伝達、細胞−細胞相互作用、組織局在ドメイン等の様な重要な構造及び活性に関連または規定していることから、より多様性であるが、しばしば機能的には重要であろう。例えば、上記の領域１から４は機能的に重要であろう。
【００５１】
上記のzalpha11内の保存アミノ酸残基領域は、新規ファミリーメンバーの同定のツールに利用できる。例えば逆転写ポリメラーゼチェインリアクション（RT-PCR)を使い、各種組織源又は細胞株より得たRNAから保存域をコードする配列を増幅できる。特にこの目的に関しては、zalpha11配列より設計された高度に縮重されたプライマーが有用であろう。この様な縮重プライマーの設計及び利用は、当業者に容易に実施されるだろう。
【００５２】
本発明は更に、ここに開示されたzalpha11ポリペプチドをコードするDNA及びRNA分子を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。当分野熟練者は、遺伝子コードの縮重性の観点に於いて、これらポリヌクレオチド分子には相当の配列多様性があることを容易に理解するだろう。配列番号４は、配列番号２のzalpha11ポリペプチドをコードする全てのDNAを包含する縮重DNA配列である。当分野熟練者は、配列番号４の縮重配列はＴをＵに置換することで配列番号２をコードする全てのRNA配列も提供することを理解するだろう。即ち、zalpha11ポリペプチドをコードする、配列番号４のヌクレオチド１ないしヌクレオチド1614ポリヌクレオチド及びそれらのRNA等価体は本発明に包含される。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すための配列番号４内で使用された１文字コードを示している。”リソリューション”は、コード文字で表されたヌクレオチドである。”相補体”は、相補的ヌクレオチドのコードを示す。例えばコードＹは、Ｃ又はＴであり、その相補体ＲはＡ又はＧであり、ＡはＴに対し相補的であり、そしてＧはＣに相補的であることを表している。
【００５３】
表１
ヌクレオチド    リソリューション    相補体          リソリューション
Ａ              Ａ                  Ｔ              Ｔ
Ｃ              Ｃ                  Ｇ              Ｇ
Ｇ              Ｇ                  Ｃ              Ｃ
Ｔ              Ｔ                  Ａ              Ａ
Ｒ            Ａ｜Ｇ                Ｙ            Ｃ｜Ｔ
Ｙ            Ｃ｜Ｔ                Ｒ            Ａ｜Ｇ
Ｍ            Ａ｜Ｃ                Ｋ            Ｇ｜Ｔ
Ｋ            Ｇ｜Ｔ                Ｍ            Ａ｜Ｃ
Ｓ            Ｃ｜Ｇ                Ｓ            Ｃ｜Ｇ
Ｗ            Ａ｜Ｔ                Ｗ            Ａ｜Ｔ
Ｈ          Ａ｜Ｃ｜Ｔ              Ｄ          Ａ｜Ｇ｜Ｔ
Ｂ          Ｃ｜Ｇ｜Ｔ              Ｖ          Ａ｜Ｃ｜Ｇ
Ｖ          Ａ｜Ｃ｜Ｇ              Ｂ          Ｃ｜Ｇ｜Ｔ
Ｄ          Ａ｜Ｇ｜Ｔ              Ｈ          Ａ｜Ｃ｜Ｔ
Ｎ        Ａ｜Ｃ｜Ｇ｜Ｔ            Ｎ        Ａ｜Ｃ｜Ｇ｜Ｔ
【００５４】
あるアミノ酸に関し考え得る全てのコドンを包含する配列番号４に用いられる縮重コドンを表２に示す。
表２
アミノ酸    １文字コード            コドン                縮重コドン  
Cys             C            TGC TGT                       TGY
Ser             S            AGC AGT TCA TCC TCG TCT       WSN
Thr             T            ACA ACC ACG ACT               ACN
Pro             P            CCA CCC CCG CCT               CCN
Ala             A            GCA GCC GCG GCT               GCN
Gly             G            GGA GGC GGG GGT               GGN
Asn             N            AAC AAT                       AAY
Asp             D            GAC GAT                       GAY
Glu             E            GAA GAG                       GAR
Gln             Q            CAA CAG                       CAR
His             H            CAC CAT                       CAY
Arg             R            AGA AGG CGA CGC CGG CGT       MGN
Lys             K            AAA AAG                       AAR
Met             M            ATG                           ATG
Ile             I            ATA ATC ATT                   ATH
Leu             L            CTA CTC CTG CTT TTA TTG       YTN
Val             V            GTA GTC GTG GTT               GTN
Phe             F            TTC TTT                       TTY
Tyr             Y            TAC TAT                       TAY
Trp             W            TGG                           TGG
Ter             .            TAA TAG TGA                   TRR
AsnlAsp         B                                          RAY
GluGlu          Z                                          SAR
Any             X                                          NNN
【００５５】
当業熟練者は、各アミノ酸をコードする可能性のある全てのコドンを代表する縮重コドンの決定には、若干の多義性が導入されることを認識するだろう。例えば、セリン（WSN）の縮重コドンは、ある条件ではアルギニン（AGR）をコードでき、アルギニン(MGM)の縮重コドンはある場合にはセリン（AGY）をコードできる。同様の関係は、フェニルアラニンとロイシンをコードするコドンの間にも存在する。即ち縮重コドンにより包含される幾つかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列コードすることがあるが、当業者は配列番号２に示すアミノ酸配列を参照することで、この様の変異体配列を特定することができる。変異体配列はここに記す機能性に関し容易に試験することができる。
【００５６】
当業熟練者は、別種が”優先的コドン利用”を示すことを理解するだろう。一般にはGranthamら、Nuc. Acids Res. 8:1393-912, 1980; Hassら、 Curr. Biol.6:315-24, 1996; Wain-Hobsonら、Gene 13: 355-64, 1981; Wain-Hobsonら、Gene 13:355-64, 1981; GrosjeanとFiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986;ならびにIkemura, J. Mol. Biol. 158:573-97;1982を見よ。ここで使用する”優先的コドン利用”又は”優先コドン”とは、特定の細胞内に最も頻繁に利用される蛋白質翻訳コドン、即ち核アミノ酸をコードする考え得るコドンの中にある１または若干数の好都合例を示す用語である（表２参照）。種に好ましいコドンは、当分野既知の各種方法により、本発明のポリペプチド内に取り込むことができる。組換え体DNAに好適コドン配列を導入することで、例えば特定のタイプ又は種の細胞に於ける蛋白質の翻訳をより効率化することにより、蛋白質の産生を促進する。例えばアミノ酸のスレオニン（Thr）はACA、ACC、ACG、又はACTによりコードされるが、哺乳動物細胞ではACCが最も一般的に利用されるコドンである；別の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルス、又は細菌では、別のThrコドンが優先するだろう。特定種に関する優先コドンは、当分野既知の各種方法により、本発明のポリヌクレオチド内に導入できる。優先コドン配列の組換え体DNA内への導入は、例えば特定の細胞型又は種内でより効率的な蛋白質翻訳を行うことで、蛋白質の産生を増強する。従って、配列番号４に開示されている縮重コドン配列は、当分野に通常用いられここに開示されている各種タイプの細胞及び種に於けるポリヌクレオチドの発現を最適化する為の鋳型として機能する。優先コドンを含む配列は、様々な種に於ける発現に関し試験及び最適化でき、またここに開示された機能性に関しても試験できる。
【００５７】
発明の好適実施態様では、分離されたポリヌクレオチドは配列番号１の同様の大きさの領域、又はそれに相補的な配列とストリンジェント条件下にハイブリダイズするだろう。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びpHに於ける特定配列に関する熱融解点(Tm）より約５℃低くなる様に選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合するプローブにハイブリダイズする温度（所定イオン強度とpHに於いて）である。各種Tm温度計算法が当分野既知であり、またDNA、RNA及びDNA-RNAハイブリッド及び各種長さのポリヌクレオチドプローブ配列に特異的である（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubelら、(編集)Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley and Sons, Inc. 1987)；BergerとKimmel（編集）  Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987);及びWetmur、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227(1990)）。OLIGO 6.0（LSR;Long Lake, MN)及びPrimer Premier 4.0(Premier Biosoft International; Palo Alto, CA）の様な配列分析ソフトウエアー、ならびにインターネントサイトは、特定配列の分析とユーザーが規定した基準に基づくTmの計算に利用可能なツールである。この様なプログラムは特定配列を一定条件下に分析することも、また好適なプローブ配列を特定することもできる。典型的には、長さの長い配列のハイブリダイゼーション（例えば＞50塩基対）は、計算されたTmに比べ約20-25℃低い温度で実施される。より小さいプローブ（例えば＜50塩基対）のハイブリダイゼーションは、典型的にはTm又はそれより5-10℃低い温度で実施される。これによりDNA-DNA及びDNA-RNAハイブリッドに関し、ハイブリダイゼーション率は最大になる。低温に於ける高厳密性は、緩衝液中のフォルムアミド濃度１％毎に、ハイブリッド温度を約１℃下げるフォルムアミドの添加により達成される。好適ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液に於ける42℃、５時間から一晩のインキュベーションである：約40-50%のフォルムアミド、約６×までのSSC、約５×Denhardt溶液、０から10%までの硫酸デキストラン、及び約10-20μg/mlの変性された市販のキャリアーDNA。一般にこのストリンジェント条件は、20-70℃の温度、及び６×までのSSC及び0-50%のフォルムアミドを含むハイブリダイゼーション液を含む；ハイブリダイゼーション後、フィルターは更に約２×までのSSCにて洗浄される。例えば、好適な洗浄条件は、0.1×SSCから２×SSC、0.1%SDS、55℃から65℃である。標的配列への最大の特異結合を達成することを目的とし、様々なストリンジェンシー度を利用することができる。典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄では、ストリンジェンシー度を高めることによってハイブリダイズ複合体から非ハイブリダイズポリヌクレオチドプローブを除く。ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェント条件は、Tmの温度を反映し、プローブの長さ及び使用するハイブリダイゼーション液と洗浄液に依存し、そして日常的には当業者により経験的に決定される。
【００５８】
前述の様に、単離された本発明のポリヌクレオチドはDNA及びRNAを含む。DNA及びRNAの調製方法は当分野公知である。一般にRNAは大量のzalpha11 RNAを産生する組織、又は細胞から分離される。これら組織及び細胞は、ノーザンブロッティングにより特定され（Thomas、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201, 1980）、及びPBLs、脾臓、胸腺及びリンパ組織、Raji細胞、ヒト赤白血病細胞株（例えばTF-1）、急性単球性白血病細胞株、その他リンパ腫及び造血性細胞株等を含む。総RNAはグアニジンイソチオシアネート抽出法と、それに続くCsCl勾配中での遠心分離による分離によって調製できる（Chirgwinら、Biochemistry 18: 52-94, 1979）。相補的DNA（cDNA)は既知の方法を利用し、ポリ(A)+RNAより調製される。あるいは、ゲノムDNAが分離できる。次にzalpha11ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーション法又はポリメラーゼチェインリアクション（PCR）（Mullis、米国特許第4,683,202号）により特定され、また分離される。
【００５９】
zalpha11をコードする全長クローンは、通常のクローニング法により得ることができる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、幾つかの応用では（例えば、トランスジェニック動物での発現）ゲノムクローンを利用すること、又は少なくとも１つの同遺伝子又は別遺伝子に由来するゲノミックイントロンを含む様にcDNAを変更することが好ましい。cDNA又はゲノミッククローンの調製方法は当分野公知であり、熟練者のレベル内であり、またライブラリーをプロービングし、又はプライミングすることへのここに開示された配列又はその一部の利用を含む。発現ライブラリーは、zalpha11、受容体断片に対する抗体、又はその他特異的結合相手により探索できる。
【００６０】
本発明ポリヌクレオチドは、DNA合成装置を使用して合成することもできる。今回選択された方法は、フォスフォルアミダイト法である。遺伝子又は遺伝子断片の合成の様な応用に化学的に合成された２本鎖DNAが必要な場合、各相補鎖は別々に合成される。短いポリヌクレオチド（60ないし80bp）の製造は、技術的には直線的に行われ、相補鎖を合成し、次にそれらをアニーリングすることで達成できる。しかし、より長い鎖を作る場合（＞300bp）には、DNAの化学合成中の各サイクルの結合効率が100%になることは殆どないことから、特別な方策が通常用いられる。この問題を克服するために、20ないし100ヌクレオチド長の１本鎖断片から合成遺伝子（２本鎖）をモジュラー形式が組み立てられる。
【００６１】
合成遺伝子を形成するための方法の１つでは、まずそれぞれが20ないし60ヌクレオチドの長さである重複する相補的オリゴヌクレオチドのセットを合成することを必要とする。遺伝子のそれぞの内部部分は、近接する部分と正確に塩基対を形成する様に設計された相補的な3'末端及び5'末端突起を有している。即ち、この遺伝子を組み立てた場合、その工程は２本の鎖の骨格にそって存在している切れ目をT4DNAライゲーズを用いて埋めることで完了する。蛋白質コーディング域に加え、合成遺伝子はクローニングベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位内への挿入を促進する、ターミナル配列を持つように設計できる。更に、適当な転写及び翻訳の開始及び停止に関するシグナルを含む別の配列を加えることができる。
【００６２】
完全長遺伝子を調製する別の方法は、重複するオリゴヌクレオチド（40ないし100ヌクレオチド）の特異的セットを合成することである。3'及び5'の短い重複した相補域（６ないし10ヌクレオチド）をアニーリングすると大きなギャップがまだ残っているものの、構造を一つに保持するのに十分な長さと安定性を持つ短い塩基対域ができる。このギャップを埋め、大腸菌DNAポリメラーゼＩにより酵素的にDNAを合成することでDNA２重鎖を完成させる。酵素による合成が終了した後、切れ目はT4DNAリガーゼにより埋められる。続いて２本鎖構築体は相互に結合され、全遺伝子が形成され、更にDNA配列分析により確認される。GlickとPasternak、 Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994; Itakuraら、Annu. Rev. Biochem,53: 323-56, 1984;及びClimieら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-7, 1990を見よ。
【００６３】
本発明は更に別種（オルトログ）由来の対応するポリペプチド及びポリヌクレオチドも提供する。これら他種には哺乳動物、鳥類、両生類、は虫類、魚類、昆虫及びその他脊椎動物、並びに無脊椎動物が含まれるが、これに限定されない。特に興味深いものは、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ及びその他霊長類ポリペプチドを含む、他哺乳動物種由来のzalpha11ポリペプチドである。ヒトzalpha11のオルトログは、本発明により提供される情報と組成物を、通常のクローニング技術と組み合わせることでクローン化できる。例えば、cDNAはここに開示されるzalpha11を発現するタイプの組織又は細胞より得たmRNAを用い、クローン化できる。mRNAの好適供給源はここに開示された配列より設計されるプローブを用いたノーザンブロットをプロービングすることで特定できる。次に、陽性組織、又は細胞株のmRNAよりライブラリーが調整できる。次にzalpha11をコードするcDNAは、完全又は部分ヒトcDNAを用いたプロービング、又は開示配列に基づく１またはそれ以上の変性プローブのセットを用いたプロービングの如くの各種方法により分離できる。cDNAもここに開示された代表的ヒトzalpha11配列より設計されたプライマーを利用するポリメラーゼチェインリアクション又はPCR（Mullis、上記）を用いクローン化できる。その他の方法では、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換、又はトランスフェクトすることができ、また所望cDNAの発現をzalpha11ポリペプチドに対する抗体により検出することができる。同様の技術はゲノムクローンの分離にも応用できる。
【００６４】
サイトカイン受容体サブユニットは、細胞外ドメイン、細胞膜内にペプチドを固定するトランスメンブレンドメイン、及び細胞内ドメインを含む複数ドメイン構造により特徴付けられる。リガンド結合及びエフェクター機能は多量体受容体の別々のサブユニットに属すると考えられるが、細胞外ドメインはリガンド結合ドメインであり、細胞内ドメインはシグナル伝達に関係していると考えられている。リガンド結合ドメイン自体は多ドメイン構造体である。多量体受容体はホモダイマー（例えばPDGF受容体αα及びββイソ型、エリスロポイエチン受容体、MPL、ならびにG-CSF受容体）、サブユニットそれぞれがリガンド結合及びエフェクタードメイン（例えばPDGF受容体αβイソ型）ヘテロダイマー、及び異なる機能を持ったコンポーネントサブユニット（例えばIl-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7及びGM-CSF受容体）を有する多量体を含む。幾つかの受容体レセプターは複数の受容体で共通である。例えばそれ自体の上にリガンドを結合できないがシグナル伝達ドメインを含むAIC2BサブユニットはIL-3及びGM-CSF受容体の構成成分である。多くのサイトカイン受容体はその構造と機能に基づく４つの関連ファミリーの一つに分類される。例えば造血性受容体は、保存されたシステイン残基及びWSXWSモチーフ（配列番号３）を含むドメインの存在によって特徴付けられる。サイトカイン受容体の構造についてはUrdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991及びCosman, Cytokine 5:95-106, 1993にレビューされている。新たな生物学的機能獲得に関する選択圧の下、既存受容体遺伝子の複製により新規受容体ファミリーが生じ、多遺伝子ファミリーが存在する様になったのだろう。従ってファミリーメンバーは先祖遺伝子の痕跡を含んでおり、これら特徴的な特質は更なるファミリーメンバーの分離と同定に活用できる。即ち、サイトカイン受容体スーパーファミリーは更に例えば免疫グロブリンファミリー（CSF-1、MGF、IL-1及びPDGF受容体を含む）；造血因子ファミリー（IL-2受容体βサブユニット、GM-CSF受容体αサブユニット、GM-CSF受容体βサブユニット；及びG-CSF、EPO、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7ならびにIL-9の受容体を含む）；TNF受容体ファミリー（TNF9p80) TNF8p60)受容体、CD27、CD30、CD40、Fas及びNGF受容体）の様な複数のファミリーに分類される。
【００６５】
zalpha11配列の解析は、これがIL-2受容体βサブユニット、IL-3、IL-4及びIL-6受容体と同一の受容体サブファミリーのメンバーであることを示唆している。このサブファミリー（例えばG-CSF）の特定受容体は結合し、シグナルを伝達するホモダイマーを形成する。このサブファミリーの他のメンバー（例えばIL-6、IL-11及びLIF受容体）は第２サブユニット（βサブユニットと呼ばれる）と連合してリガンドに結合し、シグナルを伝達する。特有のβサブユニットは複数の特異的サイトカイン受容体サブユニットに結合する。例えば、βサブユニットgp130（Hibiら、Cell 63:1149-1157, 1990）はIL-6、IL-11及びLIFに特異的な受容体サブユニットに結合する（Gearingら、EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearingら、米国特許第5,284,755号）。オンコスタチンＭはLIF受容体のヘテロダイマー及びgp130に結合する。CNTGはCNTF受容体、LIF受容体及びgp130サブユニットを含む３量体受容体に結合する。
【００６６】
ヒトzalpha11のマウス相同体のポリヌクレオチド配列が同定されており、配列番号84に示され、そして対応するアミノ酸配列は配列番号85に示されている。配列番号84のDNA配列にコードされるマウスzalpha11ポリペプチドの分析は、19アミノ酸残基の推定分泌シグナルペプチド（配列番号２の残基１（Met）ないし残基19（Gly））及び510アミノ酸の成熟ポリペプチド（配列番号２の残基20（Cys）ないし残基529（Ser））を含む529アミノ酸（配列番号85）コードするオープンリーディングフレームを表した。配列番号85の残基214ないし218に相当するWSXWSモチーフ（配列番号３）に加え、受容体は約200アミノ酸残基（配列番号２の残基20（Cys)ないし237（His)）のサイトカイン結合ドメイン；ドメインリンカー（配列番号85の残基120（Pro)ないし123（Pro)）；末位から２番目の鎖領域（配列番号85の残基192（Lys)ないし202（Ala)）；トランスメンブレンドメイン（配列番号85の残基238（Met)ないし254（Leu)）；”ボックスＩ”シグナル伝達部位（配列番号85の残基266（Ile)ないし273（Pro)及び”ボックスII”シグナル伝達部位（配列番号２の残基301（Leu)ないし304（Val)）を含む完全細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号85の残基255（Ile)ないし529(Ser)）、を含む。ヒト及びマウスアミノ酸配列の比較は、ヒト及びオルトログポリペプチドが上記の対応する構造的特徴を含むことを示している（図２参照）。マウスzalpha11の成熟配列は、Cys２０（配列番号85に示す）で開始するが、これはヒト配列中のCys２０（配列番号２に示す）に相当する。マウスとヒト配列は、配列番号２及び配列番号85に相当する全体アミノ酸配列に関し約63％の同一性を有している。配列番号の残基20（Cys)ないし237（His）及び配列番号85の残基20（Cys)ないし237（His)に相当する細胞外サイトカイン結合ドメインについては、マウス及びヒトZalpha11配列間には約69％の同一性がある。配列番号の残基256（Lys)ないし538（Ser）及び配列番号85の残基255(Lys)ないし529（Ser)に相当する細胞内シグナル伝達ドメインに関しては、マウス及びヒトZalpha11配列間に約60％の同一性がある。上記％同一率は、ktup=1、ギャップオープニングペナルティー（gap opening penaly）＝12、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）＝２、及び置換マトリックス＝BLOSUM62であり、その他パラメータがデフォルトに設定されたFASTAプログラムを用い決定された。上記のマウスzalpha11ポリペプチド域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードする対応ポリヌクレオチドは配列番号84に示されている。
【００６７】
当業者は配列番号１開示の配列がヒトzalpha11の１対立遺伝子を表すものであること、そして対立遺伝子及び変更スプライシングを含む自然変異の生起が予想されることを認識するだろう。この配列の対立遺伝子変異体は、cDNA又は各種個体より通常法によって得たゲノムライブラリーをプロービングすることでクローン化できる。サイレント変異及びアミノ酸配列を変化させる突然変異を含む配列番号１に示すDNA配列の対立遺伝子変異体、及び配列番号２の対立遺伝子変異体である蛋白質は本発明の範囲である。zalpha11のポリペプチドの特性を保持する、別の形にスプライシングされたmRNAより生じたcDNAは、これらcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドが上記である場合は本発明の範囲である。これら配列の対立遺伝子変異及びスプライス変異は、当分野公知の標準的方法により各種個体又は組織より得たcDNA又はゲノムライブラリーをプロービングすることで、クローン化できる。
【００６８】
本発明は配列番号２のポリペプチド及びそれらのオルトログに本質的に類似である分離されたzalpha11ポリペプチドも提供する。用語”本質的に類似”とは、ここでは配列番号２に示す配列又はそのオルトログに対し少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を持つポリペプチドを意味するのに用いられる。この様なポリペプチドは、より好ましくは配列番号２又はそのオルトログに対し少なくとも90％、最も好ましくは95％同一である。％配列同一性は通常の方法によって決定される；例えばAltschulら、Bull. Math. Bio. 48:603-616,1986, 及びHenikoffとHenikoff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992を参照せよ。簡単に述べると、２つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティー10、ギャップエクステンションペナルティー１、そして表３（アミノ酸は通常の１文字コードで示している）に示すHenikoffとHenikoff（上記）の”blosum62"スコアリングマトリックスを用い、アラインメントスコアが最適になるよう整列させる。次に同一性％を次式より計算する：
同一適合の総数                          ×１００
［２配列を整列するために長い方の配列に加えた
ギャップ数＋長い方の配列の長さ］
【００６９】
【表１】
2011015700.tif 000002
【００７０】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は上記に開示した割合を利用し、同様の方法によって決定される。
【００７１】
当業者は２種類のアミノ酸配列の整列に利用できる確立されたアルゴリズムが多く存在することを認識している。PearsonとLipmanによる"FASTA"類似性検索アルゴリズムは、ここに開示されたアミノ酸配列と推定変異体zsig57ポリペプチドの持つ同一性レベルの検討に適した好適な蛋白質整列法である。FASTAアルゴリズムはPearsonとLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, (1988）及びPearson、Meth. Enzymol. 183:63（1990）により記述されている。
【００７２】
簡単に述べると、FASTAはまず保存的なアミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を考慮せずに同一体（ktup変数が１の場合）、あるいは同一ペア（ktup=2の場合）の密度が最大になる様に、対象配列（例えば配列番号２）と試験配列間に共有される領域を特定して配列の類似性を特徴付ける。次にアミノ酸置換マトリックスを用い、対合する全てのアミノ酸の類似性を比較し、最高のスコアになる様に残基を切断し領域端部を”切りそろえ”、最高の同一性密度を示す10カ所の領域を再度スコア化する。”カットオフ”値（配列の長さとktup値より前もって定めれられた式に従い計算された）よりも大きなスコアを示す領域が複数ある場合には、続いて切りそろえられた最初の領域を再度検討、領域を連結してギャップを持つ適当なアラインメントができるか調べる。最後に、アミノ酸挿入と欠失を考慮したNeedlema-Wunsh-Sellersのアルゴリズム（NeedlemanとWuncsch, J. Mo;. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974））の変法を利用し、２アミノ酸配列の最高スコア域を揃え並べる。FASTA分析の好適パラメータは：ktup=1、ギャップオープニングペナルティー＝10、ギャップエクステンションペナルティー＝１、置換マトリックス＝BLOSUM62である。これらパラメータは、Pearson、Meth. Enzymol. 183:63(1990)の付録２内に説明されているスコア化マトリックスファイル（"SMATRIX"）を改良することで、FASTAプログラム内に導入。
【００７３】
FASTAは、上記同様に比率を利用した核酸分子の配列同一性決定にも利用できる。ヌクレオチド配列の比較では、ktup値は１から６の間の範囲であり、好ましくは３から６、最も好ましくは３であり、その他のパラメータはデフォルトであるとすることができる。
BLOSUM62表（表３）は2,000の蛋白質配列断片を局所的に多数整列させたアラインメントに基づくアミノ酸置換マトリックスであり、500以上の関連蛋白質グループに於ける高度に保存された領域を表している（HenikoffとHenikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915(1992))。従って、BLOSUM62置換頻度を利用し、本発明のアミノ酸配列内に導入できる保存的アミノ酸置換を規定することができる。化学的特性のみに基づきアミノ酸置換を設計することも可能である（以下考察の如く）が、”保存的アミノ酸置換”という語は望ましくはBLOSUM62の値が−１以上である置換を表す。例えば、アミノ酸置換は、その置換がBLOSUM62の値０、１、２又は３で特徴付けられる場合に保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば１、２又は３）のBLOSUM62値により特徴付けられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも２（例えば２又は３）のBOSUM62値により特徴付けられる。
【００７４】
変異体zalpha11ポリペプチド又は本質的に相同なzalpha11ポリペプチドは、１又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を持つことで特徴付けられる。これら変化は、好ましくは保存的アミノ酸置換（表４参照）又はポリペプチドの畳み込み、又は活性に大きく影響しないその他の置換；小さな欠失、典型的には１ないし約30アミノ酸；及び例えばアミノ末端メチオニン残基の様なアミノ−あるいはカルボキシル末端の延長、約20-25残基までの小リンカーペプチド又は親和性タグの様な軽微な性質のものである。従って本発明は、配列番号２の対応領域に少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、及びより好ましくは95%またはそれ以上相同である約489ないし約568アミノ酸残基のポリペプチドを含む。親和性タグを含むポリペプチドは更に、zalpha11ポリペプチドと親和性タグとの間に蛋白質分解性切断部位を含むことができる。好ましい部位は、トロンビン切断部位及び第Xa因子切断部位を含む。
【００７５】
表４
保存的アミノ酸置換
塩基性：        アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：          グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：          グルタミン
アスパラギン
疎水性：        ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香性：        フェニルアラニン
トリプトファン
トリプシン
小：            グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
【００７６】
本発明は更に、各種ポリペプチド融合体及び１又はそれ以上のポリペプチド融合体を含む関連多量体蛋白質も提供する。例えば、zalpha11ポリペプチドは米国特許第5,155,027号及び5,567,584号に開示の如くにして融合体ないし２量体として調製することができる。この観点での好ましい２量体蛋白質は免疫グロブリンの定常域ドメインを含む。免疫グロブリン-zalpha11ポリペプチド融合体は遺伝的に加工された細胞内にて発現し、多量体型のzalpha11類似体を産生することができる。補助ドメインをzalpha11ポリペプチドに融合させ、それらに特異的細胞、組織、又は高分子（例えばコラーゲン）に狙わせることができる。例えば、zalpha11ポリペプチド又は蛋白質は、zalpha11ポリペプチドを、標的細胞の表面上の受容体に特異的に結合するリガンドと融合することで、前もって決められた型の細胞を標的にできるだろう。zalpha11ポリペプチドは、例えば精製の為のタグ又は標的化もしくは２量体化ドメインの様な２又はそれ以上の成分と融合することができる。ポリペプチド融合体は、更に１又はそれ以上の切断部位を、特にドメイン間に具備することもできる。Tuanら、 Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996参照。
【００７７】
本発明の蛋白質は、非天然に生じるアミノ酸残基を含む事ができる。非天然に生ずるアミノ酸には、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが含まれるが、これに限定されるものではない。当分野では、非天然に生ずるアミノ酸残基を蛋白質内に取り込ませるための方法が複数知られている。例えば化学的にアミノアシル化した抑制性tRNAsを利用し、ナンセンス変異を抑制するインビトロシステムが利用できる。アミノ酸合成及びtRNAをアミノアシル化する方法は当分野既知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は大腸菌S30抽出物、及び市販の酵素及びその他試薬を含む無細胞系内で実施される。蛋白質はクロマトグラフィーにより精製される。例えば、Robertsonら、J. Am, Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellmanら、Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chungら、Science 259; 806-9, 1993: Chungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993）を参照せよ。第２の方法では、翻訳は変異mRNA及び化学的にアミノアシル化された抑制tRNAsをマイクロインジェクションを用い、Xenopus卵細胞内にて実施される（Turcattiら、J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996）。第３の方法では、大腸菌細胞は、置き換えられる予定の天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）が無い状態、もしくは所望する非天然に作製されるアミノ酸（例えば2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン又は4-フルオロフェニルアラニン）存在下に培養される。非天然型アミノ酸は、対応する天然型アミノ酸に代わって蛋白質内に取り込まれる。 Koideら、Biochem. 33: 7470-7476, 1994参照せよ。天然に生ずるアミノ酸残基は、インビトロでの化学的修飾により非天然型に変換することができる。化学修飾は、部位特異的変異誘導と組合せることで、置換基の範囲を更に拡張できる（WynnとRichards、Protein Sci. 2: 395-403, 1993）。
【００７８】
限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされていないアミノ酸、非天然に作製されたアミノ酸、及び非天然型アミノ酸がzalpha11アミノ酸残基と置換されるだろう。
【００７９】
本発明のポリペプチド内にある必須アミノ酸は、部位特異的変異誘導又はアラニンスキャニング変異誘導法の様な当分野既知の方法により特定できる（CunninghamとWells、Science 244: 1081-5, 1989; Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-502, 1991）。後者の技術では、単一のアラニン変異を分子内の全ての残基について導入し、得られた変異体分子を以下に開示する様な生物活性について試験し、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。Hiltonら、J.Biol. Chem. 271; 4699-4708, 1996も参照せよ。蛋白質−蛋白質又はその他生物学的相互作用部位も、核磁気共鳴、血漿分析、電子分散又はフォトアフィニティーラベリングの様な技術と、推定接触部位のアミノ酸の突然変異とを組合せることで決定される様な、構造体の物理分析より決定することもできる。例えばdeVosら、Science 255:306-312, 1992; Smithら、J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaverら、 FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照せよ。必須アミノ酸の同定は、関連受容体との相同性を分析することで推論することもできる。
【００８０】
構造の完全性を維持する上で重要な領域、又はドメイン内にあるアミノ酸残基を決定することができる。これら領域内では、変化により耐性である、又は耐性でない特異的残基、及び分子の全体的完全性を維持する特異的残基を決定することができる。配列構造体を分析する方法には、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を持つ多数の配列のアランメント、及び利用可能なソフトウエアー（tatoeｂInsight IIRビュワー、及びモデリングツール；MSI、San Diego, CA）、二次構造特性、バイナリーパターン、相補的パッケージング、及び埋没極相互作用（Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:272-376, 1995及びCordesら、CurrentOpin. Struct. Biol 6:3-10, 1996）を利用したコンピューター分析を含むが、これに限定されるものではない。一般に、分子の就職を計画する場合、及び特異的断片を特定する場合、構造の決定することで修飾分子の活性も評価されるだろう。
【００８１】
生物学的活性に必須な高次構造の最少破壊を目的とし、zalpha11ポリペプチド内のアミノ酸配列を変化させる。例えば、Zalpha11ポリペプチドが１またはそれ以上の螺旋を含む場合、アミノ酸の変化は螺旋構造及び立体構造の変化が、例えば結合相手への分子の結合の様な重要機能を障害する様なその他分子成分を破壊しないようになされるだろう。アミノ酸配列の変化の影響は、例えば上記開示の様なコンピューターモデリングにより推測でき、又は結晶構造の分析（例えば、Lapthornら、Nat. Struct. Biol.2:266-268, 1995参照）により決定できるだろう。当分野高値の他技術は変位蛋白質の折りたたみを標準的分子（例えば天然蛋白質）と比較する。例えば、変異体と標準分子内のシステインのパターンを比較することができる。還元及びアルキル化を利用したマススペクトロメトリー及び化学修飾は、ジスルフィド結合を伴う、あるいはこれら結合を持たないシステイン残基を決定する方法を提供する（Beanら、Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci, 2:1732-1748, 1993;及びPattersonら、Anal. Chem. 66.3727-3732, 1994）。修飾された分子が標準分子と同一のジスルフィド結合パターンを持たない場合、折りたたみに影響が及ぶと一般に考えられている。折りたたみの測定に関するその他の公知及び受け入れられている方法は、円偏光二色性(CD）である。変更された分子及び標準分子により作られるCDスペクトルを測定し、比較することは日常的作業である（Johnson、Proteins 7:205-214, 1990）。結晶学は、折りたたみ及び構造の分析に関する別の公知方法である。核磁気共鳴（NMR）、消化ペプチドマッピング、及びエピトープマッピングも、蛋白質及びポリペプチド間の折りたたみ及び構造の類似性を分析する公知方法である（Schaananら、Science 257:961-964, 1992）。
【００８２】
配列表２に示すzalpha11蛋白質配列のHopp/Woods親水性プロフィールが作製できる（Hoppら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun,Meth. 88:1-18, 1986及びTriquierら、Protein Engineering 11:153-169, 1998）。図１参照。プロフィールは６残基枠のスライディングに基づいている。埋没したG、 S、及びT残基、及び露出したH、Y、及びW残基は無視した。例えばzalpha11では、親水性領域は配列表２のアミノ酸残基55ないし60、配列表２のアミノ酸残基56ないし61、配列表２のアミノ酸残基139ないし144、配列表２のアミノ酸残基227ないし232、及び配列表２のアミノ酸残基364ないし369を含む。
【００８３】
当業者は、zalpha11のアミノ酸配列内に変化を企画する場合には、親水性又は疎水性を考慮し、全体構造及び生物学的プロフィールを破壊しないようにすることを認識するだろう。特に興味深い置換は、Val、Leu及びIleより成るグループ、又はMet、Gly、Ser、Ala、Tyr及びTrpより成るグループから選択される疎水性残基である。例えば、置換の残基寛容性、配列表２に示す残基を含むことが出きるだろう。しかし、システイン残基は比較的置換に不寛容である。
【００８４】
必須アミノ酸の同定も、クラスＩサイトカイン受容体ファミリーメンバーとzalpha11との間の配列類似性の分析より可能である。前記の”FASTA"分析の様な方法を利用することで、高い類似性を持つ領域を蛋白質がファミリー内に同定され、保存域に関するアミノ酸配列の分析に利用される。構造に基づく別の変位体zalpha11ポリヌクレオチド同定方法は、潜在的zalpha11ポリヌクレオチドをコードする核酸分子が上記の配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるか決定するものである。
【００８５】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を同定する別の方法は、部位特異的突然変異導入法あるいはアラニン−スキャニング突然変異法（（CunninghamとWells、Science 244: 1081(1989); Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991）、CoombsとCorey、" Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering," in Proteins; Analysis and Design. Angeletti(編集）、ページ259-311（Academic Press, Inc. 1998)。後者の技術では、単一のアラニン変異を分子内の全ての残基について導入し、得られた変異体分子を以下に開示する様な生物活性について試験し、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。Hiltonら、J. Biol. Chem. 271; 4699-708, 1996も参照せよ。
【００８６】
本発明はzalpha11ポリペプチドの機能的断片及びそれら機能的断片をコードする核酸分子も含む。ここに規定する”機能的”zalpha11又はその断片は、その増殖又は分化活性により、特定細胞機能を誘導または阻害するその能力、又は抗zalpha11抗体又はzalpha11リガンド（可溶性または固定化された）に特異的に結合する能力により特徴付けられる。前記の如く、zalpha11はクラスＩサイトカイン受容体構造により特徴付けられている。即ち、本発明は以下を含む融合蛋白を更に提供する：(a)ここに記した細胞外又は細胞内ドメインを含むポリペプチド分子；及び(b)１またそれ以上のこれらドメインを含む機能的断片。融合蛋白質の他ポリペプチド部分は、別のクラスＩサイトカイン受容体、例えばIL-2受容体βサブユニット及びβ共通サブユニット（即ちIL3、IL-5及びGM-CSF受容体βサブユニット）により提供されるか、又は融合蛋白質の分泌を促進する非天然及び／又は無関係の分泌シグナルペプチドにより提供される。
【００８７】
核酸分子の通常の欠失分析を実施することで、zalpha11ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。例示として、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化し、一連の両端欠失体を得ることができる。次にこれらDNA断片は発現ベクターの適当なリーディングフレーム内に挿入され、発現されたポリペプチドは分離され、zalpha11活性に関し、また抗zalpha11抗体又はzalpha11リガンドに結合する能力について試験される。エクソヌクレアーゼ消化の代替法の一つは、オリゴヌクレオチド部位指定突然変異を利用し、所望zalpha11断片の産生を指定する欠失又はストップコドンを誘導する方法である。あるいは、ポリメラーゼチェインリアクションを利用し、zalpha11ポリヌクレオチドの特定断片を合成することができる。
【００８８】
機能的ドメインを同定する標準的方法は、当分野熟練者に公知である。例えば、インターフェロンの一端又は両端の切断に関する研究はHorsbergerとDi Marco, Pharmac. Ther. 66:507(1995)にまとめられている。更に蛋白質の機能分析に関する標準的方法は、例えばTreuterら、Molec. Gen. Genet. 240:113(1993); Contentら、"Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5 A synthetase induced by human interferon" in Biological Interferon Systems. Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell（編集）、ページ65-72（Nijhoff 1987); Herschman, " The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation 1, Boyntonら、（編集）ページ169-199（Academic Press 1985); Coumailleauら、 J. BIol. Chem. 270:29270(1995); Fukunagaら、J. Biol. Chem. 270:25291(1995); Yamaguchiら、Biochem. Pharmacol. 50: 1295(1995);及びMeiselら、Plant Molec. Biol. 30:1(1996)により記述されている。
【００８９】
Reidhaar-Olson及びSauer（Science 241:53-57, 1988）又はBowie及びSauer（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156, 1989）により開示されている様な、既知突然変異法を用いることで、多アミノ酸置換を行い、また試験することができる。簡単に述べると、これら著者らはポリペプチド中の２又はそれ以上の部位を同時に無作為化すること、機能的ポリペプチドを選別すること、そしてその後変異したポリペプチドの配列を分析し、部位毎に可能な置換基のスペクトルを決定する方法を開示している。利用可能なその他の方法には、ファージディスプレー（例えば、Lowmanら、Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladnerら、米国特許第5,223,409号；Huse、WIPO公開WO92/062045号）及び部位特異的変異誘導（Derbyshireら、Gene 46:145, 1986; Nerら、DNA 7:127, 1988）が含まれる。
【００９０】
開示されたzalpha11DNAの変異体及びポリペプチド配列はStemmer、Nature 370, 389-91、1994、Stemmer, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994及びWIPO公開WO97/20078号に開示されているようなDNAシャッフリング法により作製することができる。簡単に述べると、変異型DNAは、親DNAを無作為に断片化した後にPCRを使い組立て直し、その結果無作為に導入された点突然変異体を得るインビトロでの相同的組み換えにより作製される。この技術は、対立遺伝子変異体又は異なる種に由来するDNAの様な親DNAのファミリーを利用することで、工程に更に多様性を加える様に変更できる。更に変異導入とアッセイを繰り返し所望活性に関し選別し、又はスクリーニングすることで、有害な変化について同時に選別しながら所望変異を選別するため、迅速な”展開”が提供される。
【００９１】
ここに開示される変異導入法は、大量処理可能な、自動化されたスクリーニング法と組み合わせることができ、宿主細胞内にクローン化され、変異導入されたポリペプチドの活性を検出することができる。活性なポリペプチド（例えばシグナル伝達、又は結合活性）をコードする変異導入DNA分子は宿主細胞より回収でき、現代的装置を利用し迅速に配列決定することができる。これら方法は、問題のペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要を迅速に決定でき、構造不明なポリペプチドにも応用できる。
【００９２】
更に、本発明の蛋白質（又はそのポリペプチド断片）は別の生物活性分子、特に他のサイトカインと結合でき、多機能性分子を提供する。例えばzalpha11由来の１又はそれ以上の螺旋を他のサイトカインと結合し、それらの生物学的特性または産生効率を高めることができる。
【００９３】
従って本発明は、zalpha11の１またはそれ以上の螺旋を含む断片が別のポリペプチドと融合している一連の新規のハイブリッド分子を提供する。融合はDNAレベルのスプライシングにより好ましく行われ、組換え体産生システムにキメラ分子の発現を可能にする。続いて得られた分子は改良された可溶性、改良された安定性、延長された排除寿命、改良された発現及び分泌レベル、及び薬物動態といった特性に関しアッセイされる。この様なハイブリッド分子は。成分蛋白質又はポリペプチド間に別のアミノ酸残基（例えばポリペプチドリンカー）を更に含むだろう。
【００９４】
ここに考察された方法を利用することで、当業者は配列番号２の、又は例えば野生型zalpha11蛋白質の結合、細胞−細胞連絡、又はシグナル伝達活性を保持している各種ポリペプチド断片又はその変異種を同定し、及び／又は調製することができる。例えば、サイトカイン結合ドメイン（配列番号２の残基20(Cys)ないし237（His）又はその対立遺伝子変異体あるいは種オルトログ）に実質的に相同であり、また野生型のzalpha11蛋白質のリガンド結合活性を保持する各種ポリペプチドを調製することでzalpha11”可溶性レセプター”を作ることができる。この様なポリペプチドは例えばトランスメンブレン及び細胞内ドメインの一部又は全てに由来する追加のアミノ酸を含むだろう。この様なポリペプチドは一般的にここに開示される様に、アフィニティータグの様な追加のポリペプチド断片も含むだろう。
【００９５】
変異体及び融合蛋白質を含むzalpha11ポリペプチドに関し、当業者は上記表１及び２記載の情報を利用し、この変異体をコードする完全な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に作成することができる。
【００９６】
全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片、及び融合ポリペプチドを含む本発明のzalpha11ポリペプチドは、通常技術を用い遺伝的に作られた宿主細胞内にて産生させることができる。好適宿主細胞は、外因性DNAで形質転換又はトランスフェクションでき、培地中にて増殖できる細胞であり、そして細菌、真菌細胞ならびに培養高等真核細胞を含む。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化DNA分子を取り扱い、外因性DNAを各種宿主細胞に導入するための技術は、Sambrookら、Molecular Clonign: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,及びAusubelら、編集、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Inc., NY, 1987に開示されている。
【００９７】
一般に、zalpha11ポリペプチドをコードしているDNA配列は、一般には転写プロモーター及びターミネーターを含む、発現ベクター内でのその発現に必要なその他の遺伝的要素に作用可能式に連結されている。ベクターはまた通常１またはそれ以上の選択可能なマーカー、及び１又はそれ以上の複製起点を有しているが、当業者はあるシステム内では選択可能マーカーが別のベクター上に供給され、そして外因性DNAの複製が宿主ゲノム内への組み込みによって提供されることを認識するだろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクター及びその他要素の選択は、当分野通常技術の範囲にある通常設計の問題である。多くのこれら要素は文献中に記載されており、また販売会社を通じ入手できる。
【００９８】
zalpha11ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に乗せる為には、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる）が発現ベクター内に供給される。分泌シグナル配列はzalpha11の分泌シグナル配列、又はその他の分泌蛋白質（例えばt-PA）に由来する、又は新たに合成された分泌シグナル配列である。分泌シグナル配列は、zalpha11DNA配列と作用可能式に連結し、即ち２配列は正しい読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞内の分泌経路内に向かわせる位置に配置される。分泌シグナル配列は通常所望するポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置するが、特定のシグナル配列は所望するDNA配列内の何れかの場所に位置することもある（Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照せよ）。
【００９９】
あるいは、本発明のポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は他のポリペプチドを分泌経路に向かわせるのに利用される。本発明はこの様な融合ポリペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドは、当分野既知であり又ここに開示される方法を使い、配列番号２のアミノ酸残基１（Met)ないし残基19（Gly)に由来する分泌シグナル配列が作用可能式に他ポリペプチドをコードするDNA配列に連結されることで作製できる。本発明の融合ポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は、追加のペプチドにアミノ末端を介して好ましく融合し、追加ペプチドを分泌経路内に導く。この様な構築体は当分野既知の多くの応用を持っている。例えばこれら新規分泌シグナル配列融合構築体は、通常は非分泌型である蛋白質の活性成分を分泌に導くことができる。この様な融合体は、インビボ又はインビトロでのペプチドの分泌経路への方向付けに用いられる。
【０１００】
培養した哺乳動物細胞は本発明での利用に好適な宿主である。外因性DNAを哺乳動物細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム伝達トランスフェクション法（Wiglerら、Cell 14:725, 1978; CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics7:603, 1981: GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレーション法（Neumannら、EMBO J. 1:841-845, 1982）、DEAE-デキストラン伝達トランスフェクション法（Ausubelら、上記）、及びリポソーム伝達トランスフェクション法（Hawley-Nelsonら、Foucs 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993、及びウイルスベクター（MillerとRosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; WangとFiner, Nature Med. 2: 714-716, 1996）が含まれる。培養哺乳動物細胞内での組換え体ポリペプチドの産生は、例えばLevinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；及びRingold、米国特許第4,656,134号に開示されている。好適哺乳動物培養細胞にはCOS-1（ATCC No.CRL 1650), COS-7(ATCC No. CRL 1651), BHK(ATCCNo. CRL 1632), BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No. CRL 1573; Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72,1977）及びチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1；ATCC No. CCL 61）細胞株が含まれる。追加の好適細胞株は当分野既知であり、米国標準培養体コレクション、マナサス、バージニア州、（American Type Culture Collection, Manassas, VA ）等の公的供託機関より入手することができる。一般に、SV-40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターの様な強い転写プロモーターが好まれる。米国特許4,956,268号参照。その他好適プロモーターには、メタロチオネン遺伝子（米国特許第4,579,821号及び、4,601,978号）及びアデノウイルス主後期プロモーターが含まれる。
【０１０１】
外来DNAが挿入された培養哺乳細胞に関しては、一般には薬物選択を用いて選別が行われる。この様な細胞は一般には”トランスフェクタント”と呼ばれる。選択薬剤存在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝達することができる細胞は、”安定トランスフェクタント”と呼ばれる。好適選択マーカーは抗生物質であるネオマイシンに対する耐性をコードしている遺伝子である。選択は、G-418等のネオマイシン型薬物の存在下に行われる。選択システムは所望遺伝子の発現レベルの増加にも利用でき、この工程は”増幅”と呼ばれている。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選択薬剤存在下に培養し、続いて選択薬剤の量を増加し、導入遺伝子の産物を高レベルに産生する細胞を選択することで、実施される。好ましい増幅可能な選択マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素であり、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬剤耐性遺伝子（例えばヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も利用できる。別の表現形を導入する、例えば緑色蛍光蛋白質、又はCD4、CD8、クラスＩMHCの様な細胞表面蛋白質、胎盤性アルカリフォスファターゼの様な別のマーカーは、FACSソーティング、又は磁性ビーズ分離法の様な手段により、非トランスフェクト細胞よりトランスフェクト細胞を選別するのに利用されるだろう。
【０１０２】
昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として利用できる。植物細胞での遺伝子発現に関するベクターとしてのAgrobacterium rhizogenesの利用はSinkarら, J. Biosci. (Bangalore)11:47-58,1987にレビューされている。昆虫細胞の形質転換、及びその中での外来性ポリペプチドの酸性はGuarinoら；米国特許第5,162,222号及びWIPO公開WO94/06463号により開示されている。昆虫細胞も、一般にAutographa californica多核性ポリヘドロシスウイルス（AcMNPV）に由来する組換え体バキュロウイルスベクターを使って感染させることができる。King, L.A.及びPossee、R.D., The Baculovirus Expression System;A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R.ら、Baculovirus Expression Vectors; A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994;及び、Richardson, C. D.,編集., Baculovirus Expression Protcols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照せよ。組換え体zalpha11バキュロウイルスを作製する第２の方法は、Luckow（Luckow, V.Aら、J Virol 67: 4566-79, 1993)記載のトランスポゾンをベースとした系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系はBac-to-BacＴＭキットとして市販されている（Life Technologies,Rockwille、MD）。このシステムはTn7トランスポゾンを含むトランスファーベクターpFastBac1ＴＭ（Life Technologies）を利用し、zalpha11ポリペプチドをコードするDNAを大腸菌中に維持している”bacmid"と呼ばれる大形プラスミドであるバキュロウイルスゲノム中に移す。Hill-Perkins, M.S.及びPossee、R.D. Gen Virol 71:971-6, 1990; Bonning, B.Cら、 J Gen Virol 75:1551-6, 1994及び、Chazenbalk, G.D.,とRapoport,B., J Biol Chem 270:1543-9, 1995参照。更にトランススファーベクターは、発現したzalpha11ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端にエピトープタグ、例えばGlu-Gluエピトープタグ（Grussenmeyer, Tら、Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985） をコードするDNAのインフレーム融合体を含むことができる。zalpha11を含むトランスファーベクターは当分野既知の技術を用いて大腸菌内に導入され、組換え体バキュロウイルスの指標である切断されたlacZ遺伝子を含むbacmidsについてスクリーニングされる。組換え体バキュロウイルスゲノムを含むbacmidDNAは、一般的方法により分離され、これを用いSpodoptera frugiperda細胞、例えばSf9細胞をトランスフェクトする。これによりzalpha11を発現する組換え体ウイルスが作られる。組換え体ウイルスのストックは、当分野一般的に用いられる方法により作成される。
【０１０３】
組換え体ウイルスは、宿主細胞、典型的にはアワヨトウ、Spodoptera frugiperdaの幼虫より得た細胞株の感染に用いられる。一般にはGlick及びPasternak, Molecular Miotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994を見よ。別の好適細胞株はTrichoplusia ni(米国特許第5,300,435号）由来のHigh FiveOＴＭ細胞株（Invitrogen）である。市販の無血清培地を使い、細胞を増殖及び維持する。好適な培地は、Sf9細胞についてはSf900IIＴＭ（Life Technologies）又はEST921ＴＭ（Expression Systems)である；T.ni細胞に関してはEx-cell0405ＴＭ（JBH Biosciences, Lenexa,KS)又はExpress FiveOＴＭ(Life Technologies)である。上清からのzalpha11ポリペプチド精製は、ここに記述した方法を用い行うことができる。
【０１０４】
酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に利用できる。この観点において特に興味ある酵母種には、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris及びPichia methanolicaが含まれる。S. cerevisiae細胞を外因性DNAにて形質変換し、それより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；及びMurrayら、米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は選択可能マーカー、一般的には薬剤耐性、あるいは特定栄養素（例えばロイシン）欠損状態での増殖能によって決定される表現形により選別される。Saccharomyces cerevisiaeでの利用に適した好適ベクターシステムはKawasakiらにより開示されている（米国特許第4,931,373号）、グルコース含有培地中の増殖により形質変換細胞が選択できるPCT1ベクターシステムである。酵母での利用に適した好適プロモーター及びターミネーターには、糖分解酵素遺伝子由来（例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；及びBitter、米国特許第4,977,092号を見よ）及びアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが含まれる。米国特許第4,990,446号、5,063,154号、第5,139,936号及び第4,661,454号も参照せよ。当分野ではHansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragillis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii及びCandida maltosaを含むその他酵母に適した形質変換システムが知られている。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol, 132: 3459-3465, 1986及びCregg、米国特許第4,882,279号を参照せよ。アスペルギルス細胞はMcKnightら、米国特許第4, 935,349号の方法に従い利用されるだろう。Acremonium chrysogenumを形質変換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号により開示されている。ニューロスポラを形質転換する方法はLambowitz、米国特許第4,486,533号により開示されている。
【０１０５】
Pichia methanolicaの組換え体蛋白質産生に関する宿主としての利用はWIPO公開WO97/17450号、WO97/17451号、WO98/02536号及びWO98/02565号に開示されている。P.methanolicaの形質転換へ利用に適したDNA分子は、一般には２本鎖の環状プラスミドとして調製され、これは形質転換前に直鎖化することが好ましい。P.methanolicaでのポリペプチド産生に関しては、プラスミド中のプロモーター及びターミネーターは、P.methnaolica遺伝子、例えばP.methnaolicaアルコール利用遺伝子（AUG1又はAUG2）のプロモーター及びターミネーターが好ましい。その他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトン合成酵素（DHAS）、蟻酸脱水素酵素（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のプロモーターが含まれる。宿主染色体へのDNAの組み込みを促進するには、プラスミドの全発現断片が両端で宿主DNA配列により連結されることが好ましい。Pichia methanolicaの利用に関する好適な選択可能マーカーは、ade2宿主細胞をアデニン無しの状態で増殖させるフォスフォリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC;EC4.1.1.21）をコードするP.methanolicaのADE2遺伝子である。メタノールの利用を最小化することが望まれる大規模な工業工程に関しては、メタノール利用遺伝子（AUG1及びAUG2）が欠失した宿主細胞の利用が好ましい。分泌蛋白質の産生に関しては空胞性プロテアーゼ遺伝子（PEP4及びPRB1）を欠く宿主細胞が好ましい。目的のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドのP.methanolica細胞内への導入を促進するために、エレクトロポレーションが利用される。P.methanolicaは対数的に減衰する、2.5ないし4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/mの強度と１ないし40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒である一定時間のパルス状電場を用いたエレクトロポレーションにより形質転換されることが好ましい。
【０１０６】
Escherichia coli, Bacillus及びその他の属の細菌株を含む前核生物宿主細胞も、本発明での有用な宿主細胞である。これら宿主を形質転換し、その中にクローン化された外来性DNA配列を発現させる技術は当分野公知である（Sambrookら、上記参照）。E.coliの様な細菌に於いてzalpha11ポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性の顆粒球として細胞質内に保持されるか、細菌由来の分泌配列によって細胞周辺腔内に送られる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素により変性させられる。次に尿素及び還元型ならびに酸化型グルタチオンの溶液に透析し、続いて緩衝生理食塩水に対し透析する様にし、変性剤を希釈して変性したポリペプチドを再度折り畳ませ、ダイマー化する。後者の場合、細胞を破壊し（例えば超音波処理、又は浸透圧ショックにより）細胞周辺腔含有物を放出させ、蛋白質を回収することでポリペプチドを可溶性及び機能的な形で回収することができるため、変性や再折りたたみの必要がない。
【０１０７】
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は、通常の方法に従い栄養素及び選択した細胞の増殖に必要とされるその他成分とを含む培地中にて培養される。限定培地や複合培地を含む各種好適培地が当分野既知であり、一般には炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルが含まれる。培地は更に成長因子又は血清の様な成分を随意含むだろう。一般に増殖培地は、例えば薬剤選択により、あるいは発現ベクター上に乗せられ、又は宿主細胞にコトランスフェクトされた選択マーカーによって補償されている必須栄養素の欠失により、外来性に加えられたDNAを含む細胞を選別する。P.methanolica細胞は適当な炭素源、窒素源、微量栄養素源を含む培地中、約25℃ないし50℃の温度にて培養される。液体培地には、小型フラスコの振盪、又はファーメンターの噴霧散布の様な通常の方法によって十分な通気が行われる。P.methanolicaに取って好ましい培地はYEPD（2%D-グルコース、2%BactoＴＭペプトン（Difco Laboratories, Detroit, MI),1% BactoＴＭ 酵母抽出物（Difco Laboratories)、0.004%アデニン及び0.006%L-ロイシンである）。
【０１０８】
本発明の観点の一つでは、zalpha11サイトカイン受容体（膜貫通及び細胞内ドメインを含む）は培養細胞により産生され、また細胞は天然リガンド及び天然リガンドのアゴニスト及びアンタゴニストを含む、受容体に対するリガンドのスクリーニングに利用される。この方法を概略すると、cDNA又はレセプターをコードする遺伝子はその発現に必要とされる他の遺伝的エレメント（例えば転写プロモーター）に結合され、そして得られた発現ベクターは宿主細胞内に挿入される。DNAを発現し、機能的受容体を産生する細胞を選択し、各種スクリーニングシステム内にて使用する。
【０１０９】
本発明の新規受容体の発現、及び受容体介在シグナル伝達への利用に好適な哺乳動物細胞には、gp130の様なベータサブユニットを発現する細胞、ならびにgp130及びLIF受容体を共発現する細胞が含まれる（Gearingら、EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearingら、米国特許第5,284,755号）。この観点では、一般にはそれら細胞が必要とするシグナル伝達経路を含んでいることから、IL-6又はLIFの様な同一ファミリーの受容体に結合する他のサイトカインに反応する細胞を使用することが好ましい。このタイプの好適細胞には、ヒトTF-1細胞株（ATCC番号CRL-2003）及びDA-1細胞株（Branchら、Blood 69:1782,1987; Broudyら、Blood 75:1622-1626,1990)が含まれる。あるいは、好適宿主細胞はβサブユニット又は所望細胞反応に必要なその他細胞構成成分を産生するように加工することができる。例えばマウス細胞株BaF3（PalaciosとSteinmetz、Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevotら、Mol. Cell. Biol/ 6:4133-4135, 1986),ベビーハムスター腎臓（BHK)細胞株、又はCTLL-2細胞株（ATCC TIB-214)をトランスフェクトし、zalpha11に加えてマウスgp130サブユニット、あるいはマウスgp130及びLIF受容体を発現させることができる。宿主細胞と受容体は同一種起源のもとを利用することが一般には好ましいが、この方法ではいずれの種に由来する複数の受容体サブユニットを発現する様に細胞株を加工することができ、それにより種特異性に拠る潜在的限界を克服することができる。あるいは、BaF3細胞株でのマウスcDNAの様に、ヒト受容体cDNAの種相同体をクローン化し、同一種由来の細胞株内にて利用することができる。即ちIL-3の様な造血性増殖因子に依存した細胞株を、zalpha11リガンド依存性に加工することができる。
【０１１０】
機能的zalpha11を発現している細胞はスクリーニングアッセイに利用される。各種好適アッセイが当分野に知られている。これらアッセイは標的細胞中の生物学的反応の検出に基づく。この様なアッセイの一つは細胞増殖アッセイである。細胞を試験化合物存在下、又は非存在下に培養し、細胞の増殖を例えばトリチウム標識チミジンの取り込みを測定することにより、又はAlymar BlueＴＭ（AccuMed、Chicago、IL）又は3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT)（Mosman、J.Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983）の代謝性ｂんかいに基づく発色アッセイにより検出される。代替アッセイフォーマットは、レポーター遺伝子を発現するように更に加工された細胞を利用する。レポーター遺伝子は受容体連結経路に反応するプロモーターエレメントに連結されており、またアッセイはレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。この観点に於いて好ましいプロモーターエレメントは、血清反応エレメント又はSRE（例えば、Shawら、Cell 56;5630572,1989参照）である。この様な好適レポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子（de Wetら、Mol. Cell. Biol. 7.725, 1987）である。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は当分野既知の方法を利用し、ルシフェラーゼにより検出される（例えば、Baumgartnerら、 J. Biol. Chem. 269:19094-29101, 1994; SchenbornとGiffin, Promega Notes 41:11, 1993)。ルシフェラーゼアッセイキットは、例えばPromega Corp., Madison, WIの如く市販されている。このタイプの標的細胞株は化学物質、細胞コンディショニング培養媒体、真菌ブロス、土壌サンプル、水サンプル等のライブラリーのスクリーニングに利用できる。例えば、細胞又は組織コンディショニング媒体サンプルのバンクを標的細胞上にアッセイし、リガンドを産生する細胞を同定することができる。次に陽性細胞を用いて哺乳動物細胞発現ベクター内にcDNAライブラリーを作製し、これをプールに分割し、宿主細胞をトランスフェクションして、発現させる。次にトランスフェクトされた細胞由来の媒体サンプルをアッセイし、プールを更に分割し、再度トランスフェクションし、培養し、陽性細胞を再度アッセイしてリガンドを発現するクローン化細胞株を分離する。腎臓、肝臓、脾臓、胸腺、その他リンパ系組織又はＴ細胞によりコンディショニングされた媒体サンプルが、スクリーニング法での利用に適したリガンド源である。
【０１１１】
zalpha11に関する天然リガンドは、zalpha11を発現するサイトカイン依存性細胞株を突然変異誘導し、その細胞をオートクリン増殖に関し選択する条件下に培養することで同定することができる。WIPO公開WO95/21930号参照。典型的な方法では、zalpha11を発現している細胞をEMSの様なもので突然変異誘導する。次に細胞を必要とするサイトカイン存在下に快復させ、続いてこのサイトカインを欠く培地中に移す。例えば可溶性（リガンド結合）受容体ポリペプチドを培地に加えることにより、又は野生型細胞及びzalpha11を発現しているトランスフェクト細胞のコンディショニング培地についてアッセイすることで、生存細胞をzalpha11に対するリガンドの産生についてスクリーニングする。この方法での利用に適した細胞株には、gp130又はLIF受容体と組み合わせgp130を発現する様にトランスフェクトされた細胞を含む。この様な好適宿主細胞株には、トランスフェクトされたCTLL-2細胞（GillisとSmith、Nature 268:154-156, 1977）及びトランスフェクトされたBaF3細胞が含まれる。
【０１１２】
更に、zalpha11可溶性受容体ポリペプチドを利用した分泌トラップ法を使い、zalpha11リガンドを分離することができる（Aldrichら、Cell 87:1161-1169, 1996）。既知又は推定リガンド源より調製されたcDNA発現ライブラリーをCOS-7細胞にトランスフェクトする。cDNAライブラリーベクターは一般にはCOS-7細胞での増幅に適したSV40起源、及び高発現い適したCMVプロモーターを有している。トランスフェクトされたCOS-7細胞は単層に増殖され、次に固定され、透過処理される。次にここに記すタグ付き、又はビオチンラベルしたzalpha11可溶性受容体を細胞層に接触させ、抗相補性分子、即ちzalpha11リガンドを発現する単層中の細胞に結合させる。その結果リガンドを発現している細胞は受容体分子と結合するだろう。西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP)で標識された抗タグ抗体（Ig融合体に関する抗Ig、M2又はFLAGタグ付き融合体に対する抗FLAG、ストレプトアビジン等）を使い、タグの付いた、又はビオチンでラベルされたzalpha11可溶性受容体が結合した細胞を視覚化する。HRPはチラミド試薬、例えばチラミドFITCの蓄積を触媒する。市販のキットをこの検出に利用できる（例えばRenaissance TSA-DirectＴＭキット、NEN Life Science Products, Boston, MA）。zalpha11受容体リガンドを発現する細胞は、蛍光顕微鏡下に緑色の細胞として同定され、その後Aldrichら、上記によるプラスミドレスキュー法を用いてリガンドスクリーニングを行い、更に単一クローンが同定されるまで分泌トラップアッセイを繰り返すために採取される。
【０１１３】
受容体として、zalpha11ポリペプチドの活性は、細胞外の酸度、又は受容体結合に関連したプロトン分泌及びその後の生理学的細胞反応を測定するシリコンをベースとするバイオセンサーマイクロフィジオメーターにより測定できる。装置の例としてはMolecular Devices, Sunnyvale, CA製造のCytosensorＴＭマイクロフィジオメーター がある。細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症反応、制御又は受容体活性化等の各種細胞反応は、この方法で測定できる。例えばMcConnell, H.M.ら、Science 257: 1906-1912, 1992: Pitchford, Sら、Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S.ら、J.Immunol. Meth. 212:40-59, 1998; Van Liefde, I.ら、Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998を見よ。マイクロフィジオメーターは真核生物、前核生物、接着性又は非接着性細胞のアッセイに利用できる。細胞培地中の細胞外酸度変化を経時的に測定することで、マイクロフィジオメーターはzalpha11ポリペプチドのアゴニスト、リガンド、又はアゴニストを含む各種刺激に対する細胞反応を直接測定する。好ましくは、マイクロフィジオメーターを用いzalpha11発現真核細胞の反応を測定し、zalfa11ポリペプチドを発現していないコントロールの真核細胞と比較する。zalfa11発現真核細胞は、ここに記した如くにその中にzalpha11がトランスフェクトされた細胞を含み、zalpha11変調刺激に対し反応する細胞を作り、又はリンパ系組織、脾臓、胸腺組織又はPBLsに由来するzalpha11発現細胞の様なzalpha11を天然に発現する細胞である。細胞外酸度の増加又は減少により測定されるコントロールに対するzalpha11発現細胞の反応差は、zalpha11変調細胞反応を直接示す測定値である。更に、この様なzalpha11変調反応は各種刺激下にアッセイできる。また、マイクロフィジオメーターを利用し、zalpha11ポリペプチドを発現している細胞を提供すること、試験化合物が存在しない状態で細胞の第１部分を培養すること、試験化合物が存在する状態で細胞の第２部分を培養すること、そして細胞の第１部分に比べた細胞の第２部分の細胞反応の増加又は減少を検出することを含む、zalpha11ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法が提供される。この方法を利用することで、zalpha11ポリペプチドの天然リガンドを含むアンタゴニスト及びアゴニストを迅速に同定することができる。
【０１１４】
本発明により提供されるその他アッセイには、ハイブリッド受容体ポリペプチドの利用が含まれる。これらハイブリッドポリペプチドは大きく２クラスに分けられる。第１のクラスでは、配列番号２のおおよその残基256（Lys）ないし528（Ser）を含むzalpha11の細胞内ドメインは第２受容体のリガンド結合ドメインに結合される。第２受容体はmpl受容体（Souyriら、Cell 63:1137-1147, 1990）の様な造血性サイトカイン受容体であることが好ましい。ハイブリッド受容体は更に何れかの受容体に由来するトランスメンブレンドメインも含むだろう。次にハイブリッド受容体をコードするDNA構築体は宿主細胞内に挿入される。ハイブリッド受容体を発現する細胞を結合ドメインに関するリガンド存在下に培養し、反応についてアッセイする。このシステムは、利用可能なリガンドを容易に利用し、zalpha11により伝達されるシグナル伝達を分析する手段を提供する。本システムは特定の細胞株がzalpja11により伝達されるシグナルに反応できるか決定するのに利用することもできる。ハイブリッド受容体ポリペプチドの第２のクラスは、第２受容体、好ましくはサイトカイン受容体の細胞質ドメイン、及びトランスメンブレンドメインと共にzalpha11（配列番号２のおおよその残基20（Cys)ないし237（Hisi））の細胞外（リガンド結合）ドメイン含む。このトランスメンブレンドメインは何れかの受容体に由来するだろう。この第２のクラスのハイブリッド受容体は、第２受容体により誘導されるシグナルに反応できることが既知の細胞内に発現される。合わせて、これら２つのクラスのハイブリッド受容体は、受容体をベースとするアッセイシステム内で広範囲タイプの細胞の利用を可能にする。
【０１１５】
次にzalpha11に関するリガンドを発現することが知られている細胞を利用し、上記開示の如くにリガンドをコードするcDNA分離のためのcDNAライブラリーを調製される。即ち、本発明は新規受容体ポリペプチドに加え、受容体に関するポリペプチドリガンドをクローニングする方法も提供する。
【０１１６】
zalpha11発現の組織特異性は、初期胸腺細胞の発生及び免疫反応制御に於ける役割を示唆している。これらプロセスは、同起源受容体に対する１又はそれ以上のサイトカインの結合への反応としての細胞増殖及び分化の促進を含む。本受容体に観察されている組織分布を見ると、アゴニスト（天然リガンドを含む）及びアンタゴニストは多くのインビトロ及びインビボ応用の可能性を有する。受容体アゴニストとして同定された化合物はインビトロ及びインビボでの標的細胞の増殖及び発生の刺激に有用である。例えば、アゴニスト化合物は限定細胞培地の成分として有用であり、単独または他のサイトカインやホルモンと組合せ利用し、細胞培養に一般的に利用されている血清の代替になるだろう。従ってアゴニストは培養Ｔ細胞、Ｂ細胞及びその他のリンパ系及び骨髄系細胞、ならびに造血細胞の増殖及び／又は発生の促進に特に有用である。
【０１１７】
zaopha11に関するアゴニストリガンドは、特定のウイルス感染を含む免疫抑制に関係する感染症の治療の様な細胞性免疫の促進及びリンパ細胞増殖の促進に有用であろう。アゴニストリガンドを利用し、Ｔ細胞、NK（ナチュラルキラー）細胞又はLAK（リンパ細胞活性化キラー）細胞の様なエフェクター細胞の活性化を通じ伝達される、あるいはアポトーシス経路を介し直接伝達される細胞傷害性を誘導できるだろう。アゴニストリガンドは症状を示す型の細胞のレベルを増加することによる白血球減少症の治療、及び骨髄移植後のＴ細胞レパートリーの再生の促進にも有用である。
【０１１８】
アンタゴニストリガンド又は化合物は、リューマチ関節炎、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、クローン病等を含む自己免疫疾患の治療の様な、免疫系の抑制に有用性を見いだせる。免疫抑制を利用することで、組織または器官移植片及び移植体の拒絶を減らし、そして症状を表しているタイプの細胞の増殖を阻害することでＴ細胞特異的白血病またはリンパ腫を治療することができる。
【０１１９】
zalpha11はリガンド血中レベルの検出に関する診断システムに利用できるだろう。関連実施態様では、抗体又はzalpha11と特異的に結合する他の作用物質を利用し、血液中の受容体ポリペプチドを検出することができる。リガンド又は受容体ポリペプチドのレベルの増加、又は低下は癌を含む病的状態の表示であろう。可溶性受容体ポリペプチドはおそらく病的プロセスに関係しており、基礎疾患の間接的マーカーに成るだろう。例えばヒト血清中の可溶性IL-2受容体のレベル増加には心筋梗塞、喘息、重症筋無力症、リューマチ性関節炎、急性Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ細胞性白血病、大腸癌、乳癌及び卵巣癌の様な各種炎症性、及び新生物性の状態が関係している（Heaneyら、Blood 87:847-857, 1996）。
【０１２０】
zalpha11受容体のリガンド結合性ポリペプチド、又は”可溶性受容体”は、zalpha11サイトカイン結合ドメイン（ヒト受容体（配列番号２）のおおよその残基20（Cys)から残基237（HIs））又は非ヒト型受容体の対応領域をコードする切断DNAを発現させることで表性できる。細胞外ドメインは実質的にトランスメンブレン及び細胞内ポリペプチド部分を含まない形に調製されることが好ましい。更に上記のzalpha11サイトカイン結合ドメイン内のリガンド結合ポリペプチド断片は、ここに記載の利用に関するzalpha11可溶性受容体としても機能できる。宿主細胞から受容体ポリペプチドを外に向かわせるためには、受容体DNAに例えばt-PA分泌ペプチド又はzalpha11分泌ペプチドの様な分泌ペプチドをコードする第２のDNAを連結する。分泌された受容体ポリペプチドの精製を促すために、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスＰ、フラッグＴＭペプチド（Hoppら、Bio/Technology 6:1204-1210, 1998;Eastman Kodak Co., New Haven, CTより入手可能）又は抗体又はそのた特異的結合作用物質が利用できる他のポリペプチド又は蛋白質を受容体ポリペプチドに融合することができる。
【０１２１】
別の方法では、免疫グロブリン重鎖定常域、典型的には受容体細胞外ドメインは２つある定常域ドメインは含むが可変域を欠くFc断片を持つ融合体として発現することができる。これら融合体は典型的にはFc部分が相互にジスルフィド結合し、そして２つの受容体ポリペプチドが相互に近接し並列している多量体分子として分泌される。このタイプの融合体はインビトロアッセイの道具として、溶液中からの同種リガンドのアフィニティー精製、特異的なリガンド滴定によるインビトロのシグナル遮断に、及び非腸管的に投与して血中リガンドに結合させ血液よりそれを排除するインビボのアンタゴニストとして利用できる。リガンドを精製するために、zalpha11-Igキメラをリガンド（例えば細胞コンディショニング培地、又は組織抽出物）を含むサンプルに、受容体−リガンド結合を促進する条件下に添加える（典型的には、生理学的に近い温度、pH及びイオン強度）。次にキメラ−リガンド複合体は、固相支持体（例えば不溶性樹脂ビーズ）上に固定されたプロテインＡを利用した混合体により分離される。続いてリガンドは塩又はpH勾配の様な通常の化学技術を利用して溶出される。あるいは、キメラ自体を固相支持体に結合させ、上記同様に結合及び溶出することができる。収集した分画は所望レベルの純度に達するまで再分画できる。
【０１２２】
更に、zalpha11可溶性受容体は”リガンドシンク”、即ちインビボ又はインビトロでリガンドに結合するアンタゴニストとして、リガンドの存在が望ましくない治療又はその他応用に使用できる。例えば、大量の生物活性的zalpha11リガンドを発現している癌では、zalpha11可溶性受容体をインビボでのリガンドに対する直接的アンタゴニストとして利用することができ、疾患の進行及びそれに伴う症状の緩和を支援するだろう。更に、zalpha11可溶性受容体を利用し、zalpha11受容体を過剰発現している癌の増殖を促進するであろうリガンドをインビボに結合することで、これら癌の進行を遅延させることができる。同様に、zalpha11可溶性受容体のインビトロ応用は、例えばzalpha11リガンドの非存在下で増殖する細胞株を選択するネガティブ選別に利用できる。
【０１２３】
更に、zalpha11可溶性受容体は、インビボ又は組織サンプル中のzalpha11リガンドを発現している癌を検出する診断応用に利用することができる。例えばzalpha11可溶性受容体はここに記した様な放射標識体、又は蛍光標識体と結合でき、そしてインビトロでのリガンド−受容体型結合アッセイ、又は蛍光イメージングアッセイを利用することで、組織サンプル中のリガンドの存在の検出に利用できる。更に、放射標識zalpha11可溶性受容体はインビボに投与でき、当分野既知の放射線イメージング法により、リガンド発現固形癌を検出することができるだろう。
【０１２４】
この新規DNAに対応するmRNAの組織分布の分析は、胸腺、非存、リンパ節及び末梢血白血球を含むリンパ系組織での発現を示した。これらデータは免疫細胞の増殖、分化及び／又は活性化に於けるzalpha11の役割を指示するものであり、免疫反応の発生及び制御に於ける役割を示唆している。データは更に、zalpha11とそのリガンドとの相互作用が、骨髄細胞の増殖及び発生を刺激し、IL-2、IL-6、LIF、IL-11及びOSM（Baumannら、J. Biol. Chem. 268:8414-8417, 1993）等の急性期蛋白質の肝臓での合成を誘導する可能性を示唆している。
【０１２５】
本発明の蛋白質は純度≧80％、より好ましくは≧90％、さらにより好ましくは≧95％に精製することが好ましく、そして特に汚染高分子、特に他種蛋白質及び核酸に関しての純度が99.9％以上であり、感染及び発熱物質を含まない、医薬品としての純粋状態が特に好ましい。好ましくは、精製蛋白質は他種蛋白質、特に動物起源の他種蛋白質を実質上含まない。
【０１２６】
発現された組換え体zalpha11蛋白質（又はキメラzalpha11ポリペプチド）は、分画法、及び／又は通常の蛋白質精製法及び媒体を利用し精製することができる。硫安沈殿及びSan又はカオトロープ抽出はサンプルの分画に利用できるだろう。精製段階の例には、ハイドロキシアパタイト、分子篩、FPLC、及び逆相高性能液体クロマトグラフィーが含まれる。好ましいクロマトグラフィー媒体には、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ等が含まれる。PEI、DEAE、QAE及びＱ誘導体が好ましい。クロマトグラフィー媒体の例には、フェニル、ブチル、又はオクチル基により誘導化されたこれら媒体、例えばフェニル−セファロースFF（Pharmacia）、Toyopearlブチル650（Toso、Hass、Montgomeryville、PA）、オクチル−セファロース（Pharmacia）等；又はAmberchrom CG71(Toso Hass)等の様なポリアクリル性樹脂が含まれる。好適な固相支持体には、ガラスビーズ、シリカベース樹脂、セルロース性樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂及び、それらが用いられる条件下に不溶性である同等のものが含まれる。これら支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分により蛋白質の結合を可能にする反応基により修飾されるだろう。共役化学物質の例にはブロモシアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド共役化学に関するカルボキシル及びアミノ誘導体が含まれる。これら及びその他固体媒体は当分野公知であり、また広く利用されており、市販品より入手できる。支持媒体への受容体ポリペプチドを結合させる方法は、当分野既知である。具体的な方法の選択は通常業務の問題であり、選択される支持体の特性により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照せよ。
【０１２７】
本発明のポリペプチドは、その生化学的、構造的、及び生物学的特性を活用することで分離できる。例えば、固定化された金属イオン吸収（IMAC)クロマトグラフィーを利用し、ポリヒスチジンタグを含む富ヒスチジン蛋白質を精製することができる。要約すると、まずゲルに２価金属イオンを付加し、キレートを形成させる（Sulkowski、Trends in Biochem. 3:1-7,1985)。富ヒスチジン−蛋白質は、使用する金属イオンに依存し、マトリックスに様々な親和性で吸着され、そして競合溶出、pHの低下、又は強キレート剤の利用によって溶出されるだろう。その他の精製方法には、レシチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシレート蛋白質の精製が含まれる（Mehtods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher,(編集), Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529-39)。発明の別の実施態様では、精製を容易にするために目的のポリペプチド及びアフィニティータグ（例えばマルトース結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が構築される。
【０１２８】
更に、ポリペプチド融合体又はハイブリッドzalpha11蛋白質は、当分野記載の方法を用いて発明のzalpha11の領域又はドメインを他のヒトサイトカイン受容体ファミリー蛋白質又は異種蛋白質の上記領域又はドメインと組み合わせることで構築される（Sambrookら、上記；Altschulら、上記；Picard、 Cur. Opin, Biology, 5:511-5, 1994,及びその中の参考文献）。これら方法により、目的のポリペプチド中にあるより大きなドメイン、又は領域の生物学的重要性を決定できる。これらハイブリッドは、反応動態、結合を変化させ、基質特異性を抑制し、又は拡張し、ポリペプチドの組織及び細胞局在を変え、また未知構造のポリペプチドに応用できる。
【０１２９】
融合ポリペプチド又は蛋白質は、融合蛋白質の成分及びそれらを化学的に結合する成分を別々に調製することで、当分野熟練者既知の方法により調製できる。あるいは、適当なリーディングフレーム内に融合蛋白質の１またはそれ以上の成分をコードするポリヌクレオチドを既知技術により作製し、ここに記載の方法により発現することもできる。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又は全ては、本発明のzalpha11と別のファミリーメンバー由来の機能的に等価なドメインとの間で交換できるだろう。この様なドメインには、ここに開示されている分泌シグナル配列、細胞外サイトカイン結合ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン、ボックスＩ及びボックスII部位を含むが、もとよりこれに限定されない。この様な融合蛋白質は、構築された融合体に依存して本発明のポリペプチド、またはそれが融合する蛋白質と同一、又は近似している生物学的に機能的なプロフィールを持つと考えられている。更に、これら融合蛋白質はここに開示された様なその他特性を示す。
【０１３０】
標準的分子生物学及びクローニング技術を利用することで、zalpha11ポリペプチドおよびそれが融合する相手との間で相当ドメインを交換することができる。一般に所望ドメイン、例えば上記ドメインをコードするDNA断片、例えばここに記したzalpha11ドメインは、追加のポリペプチド（例えばIL-2受容体の様な他サイトカイン受容体由来のドメインまたは領域）をコードする少なくとも１の他DNA断片と作用可能式にフレーム内に連結され、そしてここに記載の様な適当な発現ベクター内に挿入される。一般にDNA構築体は、ポリペプチドの対応領域をコードする複数のDNA断片が作用可能式にフレーム内に連結して全融合蛋白質、またはその機能部分を形成する様に作製される。例えばDNA構築体は、その後にサイトカインカイン結合ドメイン、トランスメンブレンドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインが順番につながる単一のシグナルポリペプチドを含む融合蛋白質をＮ末端からＣ末端にかけコードしている。この様な融合蛋白質は、ここに記載た活性に対し発現でき、分離でき、そしてアッセイできる。
【０１３１】
zalpha11ポリペプチド、またはその断片は、化学的合成によっても調製できる。zalpha11ポリペプチドは、モノマー又は多量体である；グリコシル化されているか非グリコシル化型であり；ペギル化又は非ペギル化状態；及び開始メチオニンアミノ酸残基を含まないだろう。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、排他的固相合成法、部分固相法、断片濃縮又は古典的液相合成法によっても合成できる。ポリペプチドの合成方法は当分野公知である。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149,1963; Kaiserら、Anal/ Biochem. 34:595, 1970を参照せよ。固相支持体上での所望ペプチドの全合成の後、ペプチド−樹脂は樹脂よりポリペプチドを切り離す試薬で処理され、側鎖保護基の大部分が取り除かれる。この様な方法は当分野でよく確立されている。
【０１３３】
本発明の分子の活性は、特定の型の細胞の増殖及び／又は分化を測定する各種アッセイを利用し測定することができる。
【０１３４】
本発明の蛋白質は例えばリンパ性、免疫性、炎症性、脾臓性、血液性又は骨性の疾患の治療に有用であり、そして培養細胞を利用し、あるいはクレームの発明分子を適当な動物モデルに投与することでインビボに測定できる。例えば、zalpha11可溶性受容体ポリペプチドを発現している宿主細胞はアルギン酸塩環境内に包埋でき、レシピエント動物内に注射（移植）することができる。アルギン酸塩−ポリＬリジンマイクロカプセル化、選択透過型膜カプセル化、及び拡散型チャンバーはトランスフェクトされた哺乳動物細胞又は初代哺乳動物細胞を捕捉するための手段である。これら非免疫原性型の”カプセル化”は、捕捉された細胞から分泌又は放出される蛋白質及びその他高分子のレシピエント動物への拡散を可能にする。最も重要なことは、カプセルが外来物である包埋細胞をレシピエント動物の免疫反応から隠蔽し、遮蔽することである。この様なカプセル化は注入細胞の寿命を数時間又は数日間（裸細胞）から数週間（包埋細胞）に延長することができる。アルギニン酸化糸は包埋細胞作製に関する簡便かつ迅速な手段を提供する。
【０１３５】
アルギン酸糸を作製するのに必要な材料は当分野既知である。方法の一例では、3%アルギニン酸を無菌H２O内に調製し、無菌濾過する。アルギン酸糸の調製直前にアルギン酸塩溶液を再度濾過する。約50%の細胞懸濁液（約５×105ないし約５×107細胞/mlを含む）を3%アルギン酸塩溶液と混合する。アルギン酸塩／細胞懸濁液1mlを100mMの滅菌濾過したCaCl2溶液内に〜15分間かけて押出し、”糸”を作製する。次に押し出された糸を50mMのCaCl2溶液内に移し、続いて25mMCaCl2内に移す。次に糸を脱イオン水で濯ぎ、そして糸を0.01％のポリＬリジン液内にインキュベーションしコーティングする。最後に、糸を乳糖付加リンガー液で濯ぎ、シリンジ筒（針無し）内に入れる。大口径の針をシリンジに取り付け、最少量の乳糖付加リンガー液内の糸をレシピエント内に腹腔内注射する。
【０１３６】
本発明の蛋白質をアッセイするインビボの方法は、ウイルス供給システムを含む。本牧的のウイルスの例には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、及びアデノ関連ウイルス（AAV）が含まれる。アデノウイルスは２本鎖DNAウイルスで、現在最も研究されている異種核酸の供給に関する遺伝子輸送ベクターである（レビューとしては、T. C. Beckerら、Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994;及びJ.T.DouglasとD.T.Curiel、Sciuence & Medicine 4: 44-53, 1997を見よ）。アデノウイルスシステムは、幾つかの利点を有する：アデノウイルスは(i)比較的大きなDNA挿入体に適合しており；(ii)高力価まで増殖し、(iii)広範囲の哺乳動物細胞に感染し、そして(iv)各種プロモーターを含む数多くの入手可能なベクターに利用できる。また、アデノウイルスは血液中で安定であることから、それらは静脈注射により投与することができる。
【０１３７】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることで、より大きな異種DNA挿入体に適合できる。これら挿入体は、直接接続、又はコトランスフェクトしたプラスミドとの相同的組み換えによってウイルスDNA内に取り込ませることができる。例示的システムでは、必須E1遺伝子をウイルスベクターより欠失させると、E1遺伝子が宿主細胞（例えばヒト293細胞株）から提供されるまでウイルスは複製しなくなる。無償の動物に静脈投与した場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的とする。アデノウイルス供給システムがE1遺伝子を欠失している場合、ウイルスは宿主細胞内では複製できない。しかし、宿主組織（例えば肝臓）は異種蛋白質を発現し、また加工（ならびにシグナル配列がある場合には分泌し）するだろう。分泌された蛋白質は高度に血管形成された肝臓内の血流に入り、そして感染動物に対する作用を決定することができる。
【０１３８】
更に、各種ウイルス遺伝子の欠失を持つアデノウイルスベクターを利用し、ベクターに対する免疫反応を除く試みができる。この様なアデノウイルスはE1欠失であり、また更にE2A又はE4の欠失も含む（Lusky、Mら、J. Virol. 72:2022-2032,1998, Raper, S.E.ら、Human Gene Therapy 9:671-679, 1998)。更に、E2bの欠失は免疫反応を低下させると報告されている（Amalfitano, A.ら、J. Virol. 72:926-933,1998)。更に、全アデノウイルスゲノムを欠失させることで、非常に大きな異種DNAの挿入に対応できる。全てのウイルス遺伝子が欠失した”gutless"と呼ばれるアデノウイルスの生成は、異種DNAの大きな挿入には特に有益である。レビューとしては、Yeh、P.とPerricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997を見よ。
【０１３９】
アデノウイルスシステムはインビトロでの蛋白質産生にも利用できる。アデノウイルスを感染させた非293細胞を、細胞が迅速に分裂しない条件下に培養することで、細胞は長時間にわたり蛋白質を産生することができる。例えば、BHK細胞は細胞向上内にて周密的に増殖され、次に問題の分泌蛋白質をコードするアデノウイルスベクターに曝される。続いて細胞は、感染細胞が数週間明瞭な細胞分裂なしに生存できる無血清状態下に増殖される。あるいは、アデノウイルスベクターが感染した293細胞は、比較的高細胞密度で接着細胞として、又は懸濁細胞中に増殖し、大量の蛋白質を産生することができる（Garnierら、Cytotechnol.15:145-55, 1994参照)。いずれのプロトコールでも、発現され、分泌された異種蛋白質は、発現蛋白質の細胞内での蓄積状態によって細胞培養上清、溶解体、または膜分画から繰り返し分離できる。感染293細胞産生法では、非分泌型蛋白質も効果的に得ることができるだろう。
【０１４０】
zalpha11に関し観察された組織分布の観点では、アゴニスト（天然リガンド／置換基／コファクター等を含む）及びアンタゴニストはインビトロ及びインビボ両方の応用に多くの可能性を有している。zalpha11アゴニストとして同定された化合物は各種インビトロ及びインビボに於ける免疫及び造血細胞の増殖の刺激に関し有用であろう。例えば、zalpha11アゴニスト化合物は、限定細胞培養培地の成分として有用であり、そして単独又は他のサイトカイン及びホルモンと組合せ、細胞培養に通常利用されている血清の代替となる。即ち、アゴニストはＴ細胞、Ｂ細胞、及びリンパ系ならびに骨髄系培養細胞の増殖及び／又は発生の特異的促進に有用である。更にzalpha11可溶性受容体、アゴニスト、またはアンタゴニストは初代骨髄分離培養体からのコロニー形成の促進を計測するアッセイにインビトロ利用できるだろう。この様なアッセイは当分野既知である。
【０１４１】
zalpha11はその活性に関する阻害剤（アンタゴニスト）の同定にも利用できる。試験化合物はここに開示されたアッセイに加えられ、zalpha11の活性を阻害する化合物が同定される。これらここに開示されたアッセイに加え、サンプルはzalpha11結合、オリゴマー形成、又はzalfa11依存性細胞反応の促進／阻害を測定することを目的とした各種アッセイ内に利用し、zalpha11の阻害について試験することができる。例えば、zalpha11発現細胞株は、zalpha11刺激細胞経路に反応するレポーター遺伝子構築体によりトランスフェクトすることができる。このタイプのレポーター遺伝子構築体は当分野公知であり、また一般にはルシフェラーゼの様なアッセイ可能な蛋白質をコードする遺伝子と作用可能式に連結されたzalpha11-DNA反応要素を含むだろう。DNA反応要素は、環状AMP反応要素（CRE）、ホルモン反応要素（HRE)、インシュリン反応要素（IRE) (Nasrin ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990)及び血清反応要素（SRE)(Shaw ら、 Cell 56: 563-72, 1989)を含むことができるが、これに限定されるものではない。環状AMP反応要素はRoestlerら、 J. Biol. Chem. 263 (19):9063-6; 1988及び Habener, Molec. Endocrinol.4 (8):1087-94; 1990にレビューされている。ホルモン反応要素はBeato, Cell 56:335-44; 1989 によりレビューされている。候補化合物、溶液、混合体、又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のzalpha11による促進を低下させることで証明される標的細胞に対するzalpha11活性の阻害能力について試験される。このタイプのアッセイは、受容体への結合を介して、またはシグナルカスケードの一部を刺激することによるzalpha11シグナル伝達活性を直接刺激する化合物を検出するだろう。これら同様、zalphallポリペプチドに反応性である細胞を提供すること、細胞の第２部分を試験化合物存在下に培養すること、そして細胞の第１部分に比べた細胞の第２部分の細胞反応の増加を検出することを含む、zalpha11ポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供する。更に上記のレポーター遺伝子構築体を含むがzaplpha11受容体は発現していない第３の細胞をコントロール細胞に利用し、非特異的又は非zalpha11介在型の受容体刺激を評価することができる。従って、天然リガンドを含むアゴニストはzalpha11ポリペプチド機能の刺激または増加に有用である。
【０１４２】
ここに開示されたサイトカイン結合ドメインの様なzalpa11リガンド結合ポリペプチドは、リガンド精製にも利用できる。ポリペプチドはアガロースビーズ、架橋型アガロース、ガラス、セルロース性樹脂、シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、架橋したポリアクリルアミド等の使用条件下に安定である素材である固相支持体上に固定される。固相支持体へのポリペプチド結合法は当分野既知であり、アミン化学、ブロモシアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポシド活性化、スルフィドリル活性化、及びヒドラジド活性化を含む。得られた媒体は一般にカラムの形に形成され、リガンドを含む溶液をこのカラムに１回以上通し受容体ポリペプチドにリガンドを結合させる。続いてリガンドは塩濃度、カオトロピック剤（グアニジンHCl）、又はpHの変化を利用しリガンド−受容体結合を破壊し、溶出される。
【０１４３】
リガンド結合受容体（または抗体、補体／抗補体対の一員）またはその結合断片、ならびに市販のバイオセンサー計器を用いる検定系を用いるのが有益である（例えば、BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ;またはSELDI technology, Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA）。このような受容体、抗体、補体／抗補体対または断片は、受容体チップの表面に固定される。この計器の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993に開示されている。受容体、抗体、成員または断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学作用を用いて、流動細胞内の金皮膜に結合されるデキストラン繊維と共有結合される。リガンド、エピトープあるいは補体／抗補体対の反対成員が試料中に存在する場合、それはそれぞれ固定化受容体、抗体または成員と結合して、培地の屈折率の変化を引き起こし、これは金皮膜の表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系は、結合親和性が算出され得るオン−およびオフ−レートの測定、ならびに結合の化学量論の査定を可能にする。
【０１４４】
リガンド結合受容体ポリペプチドも、当業界で既知のその他の検定系内で用いられ得る。このような系としては、結合親和性の測定のためのScatchard分析が挙げられる（Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991）。
【０１４５】
Zalpha11ポリペプチドも、Zalpha11エピトープ、ペプチドまたはポリペプチドと結合する抗体を調製するために用いられ得る。Zalpha11ポリペプチドまたはその断片は、動物に接種し、免疫応答を引き出すための抗原（免疫原）として役立つ。抗原または免疫原性エピトープは、ポリペプチドによって約10アミノ酸からポリペプチドの約全長までまたはそれより長い長鎖ポリペプチド内の一続きのアミノ酸で構成され得る、と当業者は認識する。適切な抗原としては、配列番号２によりコードされるZalpha11ポリペプチド：アミノ酸20（Cys）〜アミノ酸538（Ser）またはそのアミノ酸断片AA9〜519が挙げられる。抗原として用いるための好ましいペプチドは、サイトカイン結合ドメイン、細胞内シグナリングドメイン、本明細書中で開示されているボックスＩおよびボックスＩＩ部位、ならびに例えば、埋没Ｇ、ＳおよびＴ残基および露出Ｈ、ＹおよびＷ残基を無視し、滑り６残基ウインドウを基礎にしたHopp/Woods親水性プロフィールから決定された疎水性プロットから当業者が予測したようなZalpha11親水性ペプチドである（図１参照）。Zalpha11親水性ペプチドとしては、（１）配列番号２のアミノ酸51（Trp）〜アミノ酸61（Glu）；（２）配列番号２のアミノ酸136（Ile）〜アミノ酸143（Glu）；（３）配列番号２のアミノ酸187（Pro）〜アミノ酸195（Ser）；（４）配列番号２のアミノ酸223（Phe）〜アミノ酸232（Glu）；（５）配列番号２のアミノ酸360（Glu）〜アミノ酸368（Asp）；から成る群から選択されるアミノ酸配列を包含するペプチドが挙げられる。さらに、保存モチーフおよびZalpha11の保存モチーフ間の可変部は、適切な抗原である。さらに、マウスZalpha11ポリペプチド（配列番号85）の対応する残基は、マウスZalpha11に対する抗体を生成するために用いられ得る。この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載したように単離し、精製し得る。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製および単離方法は、当業者には周知である（例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al.（eds.）,National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989;およびHurrell, J.G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982参照）。
【０１４６】
当業者には明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスおよびラットにZalpha11ポリペプチドまたはその断片を接種することにより生成され得る。Zalpha11ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイント完全または不完全アジュバントの使用により増大され得る。免疫感作に有用なポリペプチドとしては、融合ポリペプチド、例えばZalpha11またはその一部の免疫グロブリンポリペプチドとの、またはマルトース結合タンパク質との融合体も挙げられる。ポリペプチド免疫原は、全長分子またはその一部であり得る。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、このような部分は、有益には、免疫感作のために高分子担体（例えばカギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風毒素）と連結または結合され得る。
【０１４７】
本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗原結合断片、例えばＦ（ａｂ‘）２およびＦａｂタンパク質分解性断片を含む。遺伝子工学処理無傷抗体または断片、例えばキメラ抗体、Ｆｖ断片、一本鎖抗体等、ならびに合成抗原結合ペプチドおよびポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトＣＤＲをヒト枠組み構造および定常部上に移植することにより、または全非ヒト可変ドメインを組み入れることにより、ヒト化され得る（任意に、露出残基の置換によりヒト様表面でそれらを「被う」が、この場合、その結果は「薄く被われた」抗体である）。いくつかの場合には、ヒト化抗体は、適正な結合特徴を増強するために、ヒト可変部枠組み構造ドメイン内に非ヒト残基を保持し得る。抗体をヒト化することにより、生物学的半減期が増大され、ヒトに及ぼすどう予示の悪免疫応答の可能性が低減される。
【０１４８】
本明細書中で有用な抗体を生成または選択するための代替的技法としては、Zalpha11タンパク質またはペプチドへのリンパ球のin vitro曝露、およびファージまたは類似のベクター中での抗体表示ライブラリーの選択が挙げられる（例えば、固定化または標識化Zalpha11タンパク質またはペプチドの使用による）。潜在的Zalpha11ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージで（ファージディスプレイ）または細菌、例えば大腸菌で表示される無作為ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法で、例えば無作為突然変異誘発および無作為ポリヌクレオチド合成により得られる。これらの無作為ペプチド表示ライブラリーは、タンパク質またはポリペプチド、例えばリガンドまたは受容体、生物学的または合成高分子、あるいは有機または無機物質であり得る既知の標的と相互作用するペプチドに関し得スクリーニングするために用いられ得る。このような無作為ペプチド表示ライブラリーを作製およびスクリーニングするための技法は、当業界で既知であり（Landner et al., 米国特許第5,223,409号；Landner et al., 米国特許第4,946,778号；Landner et al., 米国特許第5,403,484号およびLandner et al., 米国特許第5,571,698号）、そして無作為ペプチド表示ライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech（Palo Alto, CA）、Invtrogen Inc.（San Diego, CA）、New England Biolads, Inc.（Beverly, MA）およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.（Piscataway, NJ）から市販されている。無作為ペプチド表示ライブラリーを本明細書中に開示したZalpha11配列を用いてスクリーニングして、Zalpha11と結合するタンパク質を同定し得る。Zalpha11ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ペプチド」は、細胞をタグ処理するために、アフィニティー精製により相同ポリペプチドを単離するために用いられ得る。それらは、直接または間接的に、薬剤、毒素、放射性核種等と共役され得る。これらの結合ペプチドは、例えば発現ライブラリーおよび中和活性をスクリーニングするための分析方法に用いられ得る。結合ペプチドは、Zalpha11ポリペプチドの循環レベルを測定するために、根元的病状または疾患のマーカーとして可溶性Zalpha11ポリペプチドを検出または低領するために、用いられ得る。これらの結合ペプチドは、in vitroおよびin vivoのZalpha11結合およびシグナル伝達を遮断するために、Zalpha11「拮抗物質」としても作用し得る。これらの抗−Zalpha11結合ペプチドは、Zalpha11と結合するリガンドの作用を抑制するのに有用である。
【０１４９】
抗体は、１）それらが閾値レベルの結合活性を示すか、および／または２）それらが関連ポリペプチド分子と有意に交差反応する場合に、特異的に結合すると確定される。第一に、抗体は、本明細書中では、それらがZalpha11ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープと、（非Zalpha11）ポリペプチドを制御するための結合親和性より少なくとも10倍の親和性で結合する場合、特異的に結合する。抗体が、106 M-1またはそれより大きい、好ましくは10７ M-1またはそれより大きい、さらに好ましくは10８ M-1またはそれより大きい、最も好ましくは10９ M-1またはそれより大きい結合親和性（Ｋａ）を示すのが好ましい。抗体の結合親和性は、例えばScatchard分析（Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672,1949）により、当業者が容易に確定し得る。
【０１５０】
第二に、抗体は、それらが関連ポリペプチドと有意に交差反応しない場合に、特異的に結合することが確定される。抗体は、例えばそれらが、標準ウエスタンブロット分析（Ausubel et al.,同上）を用いて、Zalpha11を検出するが、しかし既知の関連ポリペプチドを検出しない場合、関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。既知の関連ポリペプチドの例は、タンパク質族の成員である同一種からのタンパク質である、オルトログ（例えば、ＩＬ−６）、Zalpha11ポリペプチドおよび非ヒトZalpha11である。さらに、抗体は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連ポリペプチド「に対してスクリーニングされ」得る。例えば、Zalpha11に対して生じた抗体は、不溶性マトリックスに付着した関連ポリペプチドに吸着される。Zalpha11に特異的な抗体は、適正な緩衝条件下でマトリックスを通って流動する。このようなスクリーニングは、密接に関連したポリペプチドと非交差反応性であるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の単離を可能にする（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane（eds.）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al.（eds.）, National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995）。特異抗体のスクリーニングおよび単離は、当業界で周知である（Fundamental Immunology, Paul（eds.）, Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W.（eds.）, Academic Press Ltd, 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984参照）。
【０１５１】
Zalpha11タンパク質またはペプチドと特異的に結合する抗体を検出するために、当業者に既知の種々の検定が利用され得る。検定例は、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane（eds.）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳述されている。このような検定の代表的例としては、以下のものが挙げられる：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウエスタンブロット検定、抑制または競合検定、ならびにサンドイッチ検定。さらに、抗体は、野生型対突然変異体Zalpha11タンパク質またはポリペプチドとの結合に関してスクリーニングされ得る。
【０１５２】
Zalpha11に対する抗体は、Zalpha11を発現する細胞をタグ処理するために、アフィニティー精製によりZalpha11を単離するために、Zalpha11ポリペプチドの循環レベルを確定するための診断検定のために、根元的病状または疾患のマーカーとしての可溶性Zalpha11を検出または定量するために、ＦＡＣＳを用いる分析方法に、発現ライブラリーをスクリーニングするために、抗イディオタイプ抗体を生成するために、そしてin vitroおよびin vivoのZalpha11活性を遮断するための中和抗体としてまたは拮抗剤として、用いられ得る。適切な直接タグまたは標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子等が挙げられる。間接的タグまたは標識は、中間体としてのビオチン−アビジンまたはその他の補体／抗補体対の使用を特徴とする。抗体は、直接または間接的に、本明細書中では、薬剤、毒素、放射性核種等と共役され、これらの共役体は、in vivo診断または治療用途に用いられ得る。さらに、Zalpha11またはその断片に対する抗体は、検定、例えばウエスタンブロットまたは当業界で既知のその他の検定において、変性Zalpha11またはその断片を検出するために、in vitroで用いられ得る。
【０１５３】
Zalpha11に対する抗体は、可溶性受容体ポリペプチドの循環レベルを確定するために診断検定内で、アフィニティー精製のために、受容体を発現する細胞をタグ処理し、そしてZalpha11発現レベルを検定するために有用である。検定方法は、蛍光活性化細胞分類法を用いる。二価抗体は、Zalpha11リガンドの作用を模倣するための作動剤として用いられ得る。
【０１５４】
抗体は、本明細書中では、直接または間接的に、薬剤、毒素、放射性核種等とも共役され、これらの共役体は、in vivo診断または治療用途に用いられ得る。例えば、本発明のZalpha11を認識する抗体または結合ポリペプチドは、対応する抗補体分子（即ち、Zalpha11受容体）を発現する組織または器官を同定または治療するために用いられ得る。特に、抗Zalpha11抗体あるいはその生物活性断片またはペプチドは、検出可能または細胞傷害性分子と結合され、そしてZalpha11分子を発現する細胞、組織または器官を有する動物に送達され得る。
【０１５５】
適切な検出可能分子は、直接または間接的に、Zalpha11を結合するポリペプチド（前記の結合ペプチドを含めた「結合ポリペプチド」）、抗体、あるいは生物活性断片またはその一部と結合され得る。適切な検出可能分子としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子等が挙げられる。適切な細胞傷害性分子は、直接または間接的に、ポリペプチドまたは抗体に結合され、その例としては、細菌または植物毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン等）、ならびに治療用放射性核種、例えばヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90（ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合されるか、または例えばキレート化部分の手段を介して間接的に結合される）が挙げられる。結合ポリペプチドまたは抗体は、細胞傷害性剤、例えばアドリアマイシンとも共役され得る。検出可能または細胞傷害性分子の間接的結合のためには、検出可能または細胞傷害性分子は、補体／抗補体の一成員と共役され得る。この場合、他方の成員は結合ポリペプチドまたは抗体部分に結合される。これらの目的のために、ビオチン／ストレプタビジンは補体／抗補体対の一例である。
【０１５６】
別の実施態様では、結合ポリペプチド−毒素融合タンパク質または抗体−毒素融合タンパク質は、標的化細胞または組織の抑制または除去のために（例えば、癌細胞または組織を治療するために）用いられ得る。あるいは、結合ポリペプチドが多重機能ドメイン（即ち、活性化ドメインまたはリガンド結合ドメイン＋ターゲッティングドメイン）、ターゲッティングドメインのみを含む融合タンパク質は、検出可能分子、細胞傷害性分子または補体分子を問題の種類の細胞または組織に向けるのに適している。単一ドメインのみを含む融合タンパク質が補体分子を含む場合、抗補体分子は検出可能または細胞傷害性分子と共役され得る。このようなドメイン−補体分子融合タンパク質は、したがって、遺伝子抗補体−検出可能／細胞傷害性分子共役体の細胞／組織特異的送達のための遺伝子ターゲッティングビヒクルを表す。
【０１５７】
別の実施態様では、Zalpha11結合ポリペプチド−サイトカインまたは抗体−サイトカイン融合タンパク質は、結合ポリペプチド−サイトカインまたは抗Zalpha11抗体が過増殖性細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、血液、リンパ、結腸および骨髄癌）のin vivo殺害を増強するために用いられ得る（一般的に、Hornick et al., Blood 89:4437-47, 1997参照）。彼等は、作用の所望部位へのサイトカインのターゲッティングを可能にし、それによりサイトカインの局所濃度の増大を提供する融合タンパク質を記載する。適切な抗Zalpha11抗体は、望ましくない細胞または組織（即ち腫瘍または白血病）を標的にし、融合サイトカインは、エフェクター細胞により標的細胞溶解の改良を媒介する。この目的のための適切なサイトカインとしては、例えば、インターロイキン２および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。
【０１５８】
あるいは、本明細書中に記載したZalpha11結合ポリペプチドまたは抗体融合タンパク質は、Zalpha11介在性アポトーシス経路を直接的に刺激することにより標的組織のin vivo殺害を増強し、Zalpha11を発現する過増殖性細胞の細胞死を引き起こすために用いられ得る。
【０１５９】
本明細書中に記載した生物活性結合ポリペプチドまたは抗体共役体は、経口的に、静脈内に、動脈内に、または導管内に送達され得るか、あるいは意図された作用部位に局所的に導入され得る。
【０１６０】
サイトカイン受容体と結合する４−らせん束サイトカイン、ならびに活性化リンパ球により産生されるその他のタンパク質は、身体全体の細胞分化、活性化、漸増およびホメオスタシスに重要な生物学的役割を演じる。療法的効用としては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデスおよび糖尿病のような自己免疫疾患を含めた免疫調節を必要とする疾患の治療が挙げられる。可溶性受容体および天然リガンドを含めたZalpha11拮抗薬または作動薬は炎症の調節に重要であり、したがって、慢性関節リウマチ、喘息、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、および敗血症を治療するのに有用である。可溶性受容体および天然リガンドを含めたZalpha11拮抗薬または作動薬は、腫瘍誘発の媒介にある役割を演じ、したがって癌の治療に有用であり得る。可溶性受容体および天然リガンドを含めたZalpha11拮抗薬または作動薬は、移植片拒絶を低減するために重要である免疫系抑制に治療的可能性を有し得る。Zalpha11リガンドは、移植片対宿主病の防止に有用性を有し得る。
【０１６１】
あるいは、可溶性受容体および天然リガンドを含めたZalpha11拮抗薬または作動薬は、感染性疾患に対する免疫を増強し、ＨＩＶ溶性患者のような免疫無防備状態患者を治療し、あるいはワクチンを改良するのに重要である免疫系を活性化し得る。特に、可溶性受容体および天然リガンドを含めたZalpha11拮抗薬または作動薬は、ＮＫ細胞またはそれらの先祖を調節し、刺激しまたは拡充し、そしてウイルス感染の治療における、そして抗新生物形成因子としての療法的価値を提供する。ＮＫ細胞は、転移性腫瘍細胞の排除に主要な役割を演じると考えられ、そして転移性および固形の両方の腫瘍を有する患者はＮＫ細胞活性を示していた（Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-224, 1998）。
【０１６２】
Zalpha11ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Zalpha11活性を増大または抑制するのが望ましい遺伝子療法用途内で有用である。哺乳類が突然変異化Zalpha11遺伝子を有するかまたはZalpha11遺伝子を有さない場合、Zalpha11遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。一実施態様では、Zalpha11ポリペプチドをコードする遺伝子がin vivoでウイルスベクターに導入される。このようなベクターとしては、弱毒化または欠陥ＤＮＡウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス遺伝子を完全に、またはほぼ完全に欠いた欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞に導入後は感染性でない。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染する可能性を心配することなく、特異的局限化領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例としては、欠陥単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Kaplitt et al., Molec.Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991）；弱毒化アデノウイルスベクター、例えばStratford-Perricauder et al., J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992に記載されたベクター；および欠陥アデノ関連ウイルスベクター（Samulski et al., J. Virol. 61:3096-101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-8, 1989）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
別の実施態様では、Zalpha11遺伝子は、例えばAnderson等、米国特許第5,399,346号；Mann et al., Cell 33:153, 1983; Temin等、米国特許第4,650,764号； Temin等、米国特許第4,980,289号；Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988； Temin等、米国特許第5,124,263号；国際特許公告WO 95/07358（Dougherty等、1995年3月16日公開）；およびKuo et al., Blood 82:845, 1993に記載されているように、レトロウイルスベクターに導入され得る。あるいは、ベクターは、リポソームを用いて、in vivoでのリポフェクションにより導入され得る。合成陽イオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製するために用いられ得る（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988）。特定の器官にin vivoで外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実際的利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは、利点の一領域を表す。特に、特定細胞に対するトランスフェクションの指示は、利点の一領域を表す。例えば、特定細胞型へのトランスフェクションの指示は、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような細胞不均一性を有する組織において特に有益である。脂質は、ターゲッティングの目的のためにその他の分子と化学的に結合され得る。標的化ペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームと化学的に結合され得る。
【０１６４】
裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、次に身体に形質転換化細胞を再移植するために、身体から標的化細胞を取り出すことができる。遺伝子療法のための裸ＤＮＡベクターは、当業界で既知の方法により、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用またはＤＮＡベクター輸送体の使用により所望の宿主細胞中に導入され得る（例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988参照）。
【０１６５】
アンチセンス法は、Zalpha11遺伝子転写を抑制するために、例えばin vivoで細胞増殖を抑制するために用いられ得る。Zalpha11コードポリペプチド（例えば、配列番号１で記述されるようなポリヌクレオチド）のセグメントと相補的なポリヌクレオチドは、Zalpha11コードｍＲＮＡと結合し、そしてこのようなｍＲＮＡの翻訳を抑制するよう設計される。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養中での、または被験者における、Zalpha11ポリペプチドコード遺伝子の発現を抑制するために用いられる。
【０１６６】
さらに、細胞表面分子として、Zalpha11ポリペプチドは、細胞中への遺伝子療法の導入のための標的として用いられ得る。この適用は、Zalpha11が常態で発現される細胞、例えばリンパ様組織およびＰＢＦ、またはZalpha11ポリペプチドを発現する癌細胞中に治療用遺伝子を導入するのに特に適している。例えば前記のようなウイルス遺伝子療法は、ウイルス受容体というよりむしろZalpha11ポリペプチドのような細胞性受容体を発現する特異的細胞型に対して標的化され得る。抗体、または標的細胞表面のZalpha11分子を認識するその他の分子は、標的細胞に遺伝子療法物質をウイルスが感染させ、投与するのを指図するために用いられ得る（Woo, S.L.C, Nature Biotech. 14:1538, 1996: Wickham, T.J. et al., Nature Biotech. 14:1570-1573, 1996; Douglas, J.T. et al., Nature Biotech.14:1574-1578, 1996; Rihova, B., Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169, 1997;およびVile, R.G. et al., Mol. Med. Today 4:84-92, 1998参照）。例えば、Zalpha11特異的抗体と結合したウイルス中和Ｆａｂ断片を含有する二特異的抗体は、Zalpha11受容体を発現する細胞にウイルスを向け、遺伝子阻止を含有するウイルスの細胞への侵入を可能にするために用いられ得る（例えば、Wickham, T.J., et al., J. Virol. 71:7663-7669, 1997;およびWickham, T.J., et al., J. Virol. 70:6831-6838, 1996参照）。
【０１６７】
本発明は、診断適用に用途を見出す試薬も提供する。例えば、Zalpha11、Zalpha11ＤＮＡまたはＲＮＡを包含するプローブ、あるいはその亜配列は、Zalpha11遺伝子が第１６染色体上に存在するか否か、または突然変異が起きているか否かを確定するために用いられ得る。Zalpha11は、第１６染色体の16p11.1領域に局限される（実施例３参照）。Zalpha11遺伝子座での検出可能染色体異常としては、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化および再配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような異常は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、蛍光in-situハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ技法を用いる短タンデム反復（ＳＴＲ）分析および当業界で既知のその他の遺伝子連鎖分析法（Sambrook et al., 同上；Ausubel et al., 同上；Marian, Chest 108:255-65, 1995）のような分子遺伝子技術を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る。
【０１６８】
遺伝子の位置についての正確な知識は、例えば：１）配列が既存のコンティグの一部であるか否かを確定して、ＹＡＣ、ＢＡＣまたはｃＤＮＡクローンのような種々の形態の付加的周囲遺伝子配列を得て、２）同一染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患に対する考え得る候補遺伝子を提供し、そして３）特定の遺伝子がどの機能を有し得るかを確定する助けとなり得るマウスのようなモデル生物を相互参照することを含めた多数の目的のために有用であり得る。
【０１６９】
Zalpha11遺伝子は、第１６染色体の16p11.1領域に局限される。既知の機能を有するいくつかの遺伝子が、この領域に認められる。例えば、造血素受容体族の一成員であるインターロイキン４（ＩＬ−４）サイトカイン受容体αサブユニットは、16p12.1〜p11.2に認められる。このサブユニットは、Zalpha11とヘテロ二量体を形成し得る。さらに、Zalpha11ポリヌクレオチドプローブは、ＩＬ−４受容体の欠損に関連した異常または遺伝子型、例えばいくつかのアレルギー性炎症性疾患および喘息に関与するものを検出するために用いられ得る（Deichman, K.A. et al., Exp. Allergy 28:151-155, 1998; Mitsuyasu, H. et al., Nature Genet. 19:119-120, 1998）。さらに、Zalpha11ポリペプチドプローブは、感受性マーカーが16p12〜q13に認められる炎症性腸疾患に関連した異常または遺伝子型を検出するために用いられ得る（Cho, J.H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95:7502-7507, 1998）。さらに、Zalpha11ポリペプチドプローブは、16pter〜p13.3に位置するヘモグロビンに関連した異常または遺伝子型、特に胎児水症のようなαサラセミア症候群に関連したヘモグロビンα欠損を検出するために用いられ得る（例えば、Chui, M.P. and Waye, J.S., Blood 91:2213-2222, 1998参照）。さらに、他の遺伝子座の中で、ＩＩＩ型ウィルムス腫瘍（16q）、ルービンスタイン−テービ症候群（16p13.3）、重症乳児多嚢胞性腎疾患（16p13.3）はすべて、ヒトの疾患状態でそれ自体現れて、ヒトゲノムのこの領域に認められる。第１６染色体のこの領域に関しては、オンラインヒトメンデル性遺伝Online Mendellian Inheritance of Man（OMIM）遺伝子地図、およびその中の参考文献を参照していただきたい（WWWサーバー（http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/getmap?chromosome=16p11.1））。これらはすべて、Zalpha11遺伝子と同一染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患に関する潜在的候補遺伝子として役立つ。
【０１７０】
同様に、Zalpha11遺伝子座それ自体の欠損は、遺伝性ヒト疾患状態を引き起こし得る。本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、拮抗薬、作動薬、ポリヌクレオチドおよび抗体は、Zalpha11遺伝子欠損に関連した検出、診断、予防および治療に役立つ。
【０１７１】
「トランスジェニックマウス」と呼ばれるZalpha11遺伝子を発現するよう工学処理されたマウス、および「ノックアウトマウス」と呼ばれるZalpha11遺伝子機能の完全不在を示すマウスも生成され得る（Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740-42,1993; Capecchi, M.R., Science244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al., Annu Rev Genet, 20:465-499,1986）。例えば、遍在的に、あるいは組織特異的または組織制限性プロモーター下で、Zalpha11を過剰発現するトランスジェニックマウスを用いて、過剰発現が表現型を生じるか否かを調べ得る。例えば、野生型Zalpha11ポリペプチド、ポリペプチド断片またはその突然変異体の過剰発現は、正常細胞工程を変えて、Zalpha11発現が機能的に関連する組織を同定する表現型を生じ得るし、Zalpha11、その作動薬または拮抗薬に関する治療標的を示し得る。例えば、工学処理するための好ましいトランスジェニックマウスは、「優性ネガティブ」表現型を発現するもの、例えば結合したトランスメンブレンドメインを有するZalpha11細胞外サイトカイン結合ドメインを過剰発現するものである（配列番号２の約アミノ酸20（Cys）〜255（Leu））。さらに、このような過剰発現は、ヒト疾患との類似性を示す表現型を生じ得る。同様に、ノックアウトZalpha11マウスを用いて、Zalpha11がin vivoで絶対に必要であるか否かを確定し得る。ノックアウトマウスの表現型は、例えば本明細書中に記載したようなZalpha11拮抗薬が有し得るin vivo作用を予測する。マウスまたはヒトZalpha11ｃＤＮＡを用いて、ネズミZalpha11ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを単離し、その後これを用いて、ノックアウトマウスを生成し得る。これらのマウスは、in vivo系におけるZalpha11遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質を調べるために用いられ得るし、対応するヒト疾患のin vivoモデルとして用いられ得る。さらに、本明細書中に記載したZalpha11に対して向けられるZalpha11アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムのトランスジェニックマウス発現は、前記のトランスジェニックマウスと同様に用いられ得る。
【０１７２】
製薬的使用に関しては、本発明の可溶性受容体ポリペプチドは、慣用的方法による非経口的、特に静脈内または皮下送達のために処方される。静脈内投与は、1〜数時間という典型的時間のボーラス注射または注入による。概して、製剤処方物は、Zalpha11可溶性受容体ポリペプチドを、製薬上許容可能なビヒクル、例えば緩衝化食塩水、水中の5％デキストロース等と組合せて包含する。処方物は、１つ又はそれ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、ウイルス表面のタンパク質損失を防止するためのアルブミン等をさらに含み得る。処方法は当業界で周知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示されている。治療用量は、一般的には0.1〜100μg／患者の体重１kg／日の範囲、好ましくは0.5〜20μg／患者の体重１kg／日であって、的確な用量は、治療される症状の性質および重症度、患者の特徴等を考慮して、許容基準にしたがって臨床医が決定する。用量の決定は、当業者の水準内である。タンパク質は、短期治療のために、１週間またはそれ未満に亘って、しばしば１〜3日間投与され得るし、あるいは長期治療に、数ヶ月または数年間用いられ得る。概して、Zalpha11可溶性受容体ポリペプチドの治療的有効量は、臨床的に有意の作用を生じるのに十分な量である。
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【０１７３】
実施例１
全長Zalpha11を得るためにＥＳＴ配列を用いたヒトZalpha11の同定
翻訳化ＤＮＡデータベースの走査により、クラスＩサイトカイン受容体族の一成員であることが判明し、Zalpha11と呼ばれている発現化配列タグ（ＥＳＴ）配列を同定した。
【０１７４】
ＥＳＴの元となったｃＤＮＡの配列分析により、ＥＳＴ配列を確証した。このｃＤＮＡクローンを生成し、以下のプライマーを用いてシーケンシングした：ＺＣ447（配列番号５）、ＺＣ976（配列番号６）、ＺＣ19345（配列番号７）、ＺＣ19346（配列番号８）、ＺＣ19349（配列番号９）、ＺＣ19350（配列番号10）、ＺＣ19458（配列番号11）、ＺＣ19459（配列番号12）、ＺＣ19460（配列番号13）、ＺＣ19461（配列番号14）、ＺＣ19572（配列番号15）、ＺＣ19573（配列番号16）、ＺＣ19657（配列番号17）。挿入物は2945 bpで、全長であった。
【０１７５】
実施例２
組織分布
ヒト多組織ノーザンブロット（MTN I、MTN IIおよびMTN III）（Clontech）を用いて、ノーザンブロット分析を実施した。プライマーとしてオリゴＺＣ19,181（配列番号18）およびＺ19,182（配列番号19）を用いて、ＰＣＲ反応で、実施例１に記載したｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲ条件を以下に示す：94℃ で1.5分；94℃で15秒、次に68℃で30秒を35回；72℃で10分；4℃一夜。ＰＣＲ反応生成物の試料を、1.5％アガロースゲル上を走行させた。175 bpという予測サイズの帯域が観察された。175 bpＰＣＲ断片を、市販キット（QiaexII;Qiagen）を用いてゲル精製し、次に、メーカーの使用説明書にしたがって、Rediprime II（Amersham）無作為プライム標識系を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰで放射能標識した。次に、メーカーの使用説明書にしたがって、Nuc-Trapカラム（Stratagene）を用いて、プローブを精製した。ExpressHyb（Clontech）溶液を予備ハイブリダイゼーションのために、ノーザンブロット用ハイブリダイズ溶液として用いた。ハイブリダイゼーションは、1〜2x106 cpm/mlの標識化プローブを用いて、65℃で一夜実施した。次にプローブを2X SSC/1%SDS中で25℃で４回洗浄し、その後0.1X SSC/0.1%SDS中で50℃で洗浄した。約3 kbおよび5 kbの転写体を、リンパ節、末梢血液白血球および胸腺で検出した。
【０１７６】
ヒトＲＮＡMaster Blots（Clontech）を用いて、ドットブロットも実行した。ドットブロットの方法および条件は、前記の多組織ブロットと同一である。ドットブロットは、胸腺、リンパ節および脾臓で最強シグナルを有した。
【０１７７】
ヒト癌細胞株ＭＴＮ（Clontech）を用いて、ノーザン分析も実行した。プライマーとしてオリゴＺＣ19,907（配列番号20）およびＺ19,908（配列番号21）を用いて、ＰＣＲ反応で、実施例１に記載したｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲ条件を以下に示す：95℃で1分、次に60℃で1分を35回；72℃で1.5分；72℃で10分；4℃一夜。ＰＣＲ反応生成物の試料を、1.5％アガロースゲル上を走行させた。1.2 kbという予測サイズの帯域が観察された。1.2 kbＰＣＲ断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、市販キット（QiaexII ゲル抽出キット;Qiagen）を用いてゲル精製し、次にPrime-It II（Stratagene）無作為プライム標識系を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰで放射能標識した。次に、メーカーの使用説明書にしたがって、Nuc-Trapカラム（Stratagene）を用いて、プローブを精製した。ExpressHyb（Clontech）溶液を予備ハイブリダイゼーションのために、ノーザンブロット用ハイブリダイズ溶液として用いた。ハイブリダイゼーションは、1〜2x106 cpm/mlの標識化プローブを用いて、65℃で２時間実施した。次にプローブを2X SSC/1%SDS中で25℃で４回洗浄し、その後0.1X SSC/0.1%SDS中で50℃で洗浄した。バーキットリンパ腫由来のRaji細胞株中で、強シグナルを観察した。
【０１７８】
実施例３
Zalpha11遺伝子のＰＣＲベースの染色体マッピング
市販の「GeneBridge 4放射線ハイブリッドパネル」（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL）を用いて、Zalpha11を第１６染色体にマッピングした。GeneBridge 4放射線ハイブリッドパネルは、93の放射線ハイブリッドクローンの各々からのＰＣＲ可能ＤＮＡ＋２つの対照ＤＮＡ（ＨＦＦドナーおよびＡ23レシピエント）を含有した。WWWサーバー（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）は、 GeneBridge 4放射線ハイブリッドパネルを用いて構築されたWhitehead Institute/MIT Center for Genome Researchのヒトゲノムの放射線ハイブリッドマップ（“WICGR”放射線ハイブリッドマップ）と比較したマッピングを可能にした。
【０１７９】
「GeneBridge 4ＲＨパネル」を用いたZalpha11のマッピングのために、20μlの反応物を96ウエルマイクロタイタープレート（Stratagene, La Jolla, CA）中に用意し、「RoboCycler Gradient 96」熱サイクラー（Stratagene）中で用いた。95のＰＣＲ反応物は各々、2μlの10XＰＣＲ反応緩衝液（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）、1.6μlのｄＮＴＰミックス（各2.5 Mm、Perkin-Elmer, Foster City, CA）、１μlのセンスプライマー、ＺＣ19,954（配列番号22）、１μlのアンチセンスプライマー、ＺＣ19,955（配列番号23）、2μlの「ReadLoad」（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL）、0.4μlの50X Advantage KlenTaqポリメラーゼミックス（Clontech）、個々のハイブリッドクローンまたは対照からの25 ngのＤＮＡおよび全容積を20μlにするための蒸留水。反応物を等量の鉱油で被い、密封した。ＰＣＲサイクラー条件を以下に示す：最初に94℃で4分の変性を１回；94℃で45分、68℃で45秒および72℃で1分を35回；その後72℃で7分。2％アガロースゲル（Life Technologies）上での電気泳動により、反応物を分離した。
【０１８０】
結果は、Zalpha11が、第１６染色体WICGR放射線ハイブリッドマップ上に、枠組み構造マーカーWI-3768から、9.54 cR 3000に認められるということを示した。近位および遠位枠組み構造マーカーは、それぞれWI-3768およびTIGER-A002K05であった。周囲マーカーの使用は、一体化ＬＤ第１６染色体マップueno 16p11.1領域にZalpha11を配置する（The Genetic Location Database, University of Southampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public html/）。
【０１８１】
実施例４
ヒトＭＰＬ−Zalpha11ポリペプチドキメラの構築：Zalpha11細胞内シグナリングドメインと融合したＭＰＬ細胞外およびＴＭドメイン
ＭＰＬ受容体の細胞外および細胞内ドメインを、プライマーＺ17,212（配列番号24）およびＺＣ19,914（配列番号25）によるＰＣＲを用いて、ＭＰＬ受容体（PHZ1/MPLプラスミド）を含有するプラスミドから単離した。反応条件を以下に示す：95℃で1分；95℃で1分、45℃で1分、72℃で2分を35回；その後72℃で10分；次に10℃で浸漬。ＰＣＲ反応生成物を、1％低融点アガロース（Boerhinger Mannheim, Indianapolis,IN）上を走行させ、1.5 kbＭＰＬ受容体断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、QiaexII ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離した。
【０１８２】
Zalpha11の細胞内ドメインを、プライマーＺ19,913（配列番号26）およびＺＣ20,097（配列番号27）によるＰＣＲを用いて、Zalpha11受容体ｃＤＮＡを含有するプラスミドから単離した。Zalpha11受容体コード配列に対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド69〜1682で示される。反応条件は前記と同様であった。ＰＣＲ生成物を、1％低融点アガロース（Boerhinger Mannheim）上を走行させ、900 bpのZalpha11断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、QiaexII ゲル抽出キットを用いて単離した。
【０１８３】
前記の単離断片の各々を1:1の容量比で混合して、プライマーＺ17,212（配列番号24）およびＺＣ20,097（配列番号27）を用いるＰＣＲで使用して、ＭＰＬ−Zalpha11キメラを作製した。反応条件を以下に示す：95℃で1分；95℃で1分、55℃で1分、72℃で2分を35回；その後72℃で10分；次に10℃で浸漬。ＰＣＲ反応生成物を、1％低融点アガロース（Boerhinger Mannheim）上を走行させ、約2.4 kbＭＰＬZalpha11キメラ断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、QiaexII ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離した。ＭＥＬ−Zalpha11キメラ断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、ＥｃｏＲＩ（BRL）およびＸｂａＩ（Boerhinger Mannheim）で消化した。全消化物を、1％低融点アガロース（Boerhinger Mannheim）上を走行させ、切断ＭＰＬZalpha11キメラ断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、QiaexII ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離した。その結果生じた切断ＭＰＬ−Zalpha11キメラを、前記と同様に発現ベクター中に挿入した。
【０１８４】
レシピエント発現ベクターｐＺＰ−５Ｎを、メーカーの使用説明書にしたがって、ＥｃｏＲＩ（BRL）およびＨｉｎｄＩＩＩ（BRL）で消化し、前記と同様にゲル精製した。このベクター断片を、結紮反応において、前記で単離したＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ切断ＭＰＬ−Zalpha11キメラおよびＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカー断片と併合した。Ｔ４リガーゼ（BRL）を用いて、15℃で一夜、結紮を実行した。結紮の試料を、ＤＨ10ＢElectroMAXエレクトロコンピテント大腸菌細胞（25μF、200Ω、2.3V）中で電気穿孔処理した。形質転換体をＬＢ＋アンピシリンプレート上に載せ、単一コロニーをＰＣＲによりスクリーニングして、ＺＣ17,212（配列番号24）およびＺＣ20,097（配列番号27）を用いてＭＰＬ−Zalpha11キメラを調べた。ＰＣＲ条件は前記と同様であった。
【０１８５】
以下のプライマーを用いた配列分析により、ＭＰＬ−Zalpha11キメラ配列を確証した：ＺＣ12,700（配列番号28）、ＺＣ5,020（配列番号29）、ＺＣ6,675（配列番号30）、ＺＣ7,727（配列番号31）、ＺＣ8,290（配列番号32）、ＺＣ19,572（配列番号15）、ＺＣ6,622（配列番号33）、ＺＣ7,736（配列番号34）およびＺＣ9,273（配列番号35）。挿入物は2.4 bpで、全長であった。
【０１８６】
実施例５
Alamar Blueを用いたＢＡＦ３検定におけるＭＰＬ−Zalpha11ベースの増殖
Ａ．ＭＰＬ−Zalpha11キメラを発現するＢａＦ３細胞の構築
ネズミ骨髄由来インターロイキン−３（ＩＬ−３）依存性前リンパ様細胞株であるＢａＦ３（Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986）を、10％加熱不活性化ウシ胎仔血清、2 ng/mlネズミＩＬ−３（ｍＩＬ−３）（R & D, Minneapolis, MN）、2 mMＬ−グルタマックス（Gibco, BRL）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Gibco,BRL）およびＰＳＮ抗体（Gibco, BRL）を補給した完全培地（ＲＰＭＩ培地（JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS））中に保持した。電気穿孔前に、ｐＺＰ−５Ｎ／ＭＰＬ−Zalpha11ＤＮＡ（実施例４）を、メーカーの使用説明書にしたがって、Qiagen Maxi Prepキット（Qiagen）を用いて調製し、精製した。電気穿孔用のＢａＦ３細胞をＲＰＭＩ培地中で１回洗浄して、次に107細胞／mlの細胞濃度でＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。１mlの再懸濁ＢａＦ３細胞を30μgのｐＺＰ−５Ｎ／ＭＰＬ−Zalpha11プラスミドＤＮＡと混合し、別個の使い捨て電気穿孔小室（Gibco, BRL）に移した。室温で15分間インキュベーション後、電気穿孔装置（CELL-PORATOR; GIBCO BRL）で送達される連続衝撃（800 lFad/300V; 1180 lFad/300V）を細胞に与えた。５分間の回復時間後、電気穿孔処理細胞を50 mlの完全培地に移して、インキュベーター中に15〜24時間（37℃、5％ＣＯ２）入れた。次に細胞を回転沈降させて、Ｔ−１６２フラスコ中のGeneticin（Gibco）選択液（500μg/ml, G418）を含有する50 mlの完全培地中に再懸濁して、Ｇ４１８耐性プールを単離した。トランスフェクト化ＢａＦ３細胞のプール（以後、ＢａＦ３／ＭＰＬ−Zalpha11細胞と呼ぶ）を、下記のようにシグナリング能力に関して検定した。
【０１８７】
Ｂ．Alamar Blueを用いたＢａＦ３／ＭＰＬ−Zalpha11細胞のシグナリング能力の検定
前記と同様にＢａＦ３／ＭＰＬ−Zalpha11細胞を遠心分離して、完全培地中で洗浄したが、但し、ｍＩＬ−３（以後、「ｍＩＬ−３無含有培地」と呼ぶ）は用いなかった。細胞を遠心分離して、３回洗浄し、ｍＩＬ−３を確実に除去した。次に細胞を血球計で計数した。細胞を、ｍＩＬ−３無含有培地を用いて、100μl／ウエルの容量で、5000細胞／ウエルで96ウエルフォーマットでプレート化した。
ｍＩＬ−３無含有培地で500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62 ng/ml、30 ng/ml、15 ng/ml、7.5 ng/ml、1.8 ng/ml、0.9 ng/ml、0.5 ng/mlおよび0.25 ng/ml濃度に稀釈したトロンボポイエチン（ＴＰＯ）を用いて、ＢａＦ３／ＭＰＬ−Zalpha11細胞の増殖を査定した。100μlの稀釈ＴＰＯをＢａＦ３／ＭＰＬ−Zalpha11細胞に付加した。全検定容量は、200μlである。陰性対照を、ｍＩＬ−３無含有培地のみを用いて、ＴＰＯを付加せずに、平衡して走行させた。検定プレートを37℃で5％ＣＯ2で３日間インキュベートし、その時点でAlamar Blue（Accumed, Chicago, IL）を20μl/ウエルで付加した。 Alamar Blueは生細胞の数を基礎にして蛍光測定読み取り値を生じた。したがって、これは陰性対照と比較した場合、細胞増殖の直接測定値である。プレートを再び37℃で5％ＣＯ2で24時間インキュベートした。プレートを、544（励起）および590（発光）の波長で、SoftMax Proプログラムを用いてＦｍａｘプレート読取機（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で読み取った。
【０１８８】
結果は、62 ng/ml以上のバックグラウンドの約10倍のトロンボポイエチン誘導性増殖として、Zalpha11の細胞内部分のシグナリング能力を確証した。
【０１８９】
実施例６
全長Zalpha11を発現する発現ベクターの構築
プライマーＺ19,905（配列番号36）およびＺＣ19,906（配列番号37）によるＰＣＲを用いて、Zalpha11受容体ｃＤＮＡを含有するプラスミドから全Zalpha11受容体を単離した。反応条件を以下に示す：95℃で1分；95℃で1分、55℃で1分、72℃で2分を35回；その後72℃で10分；次に10℃で浸漬。ＰＣＲ反応生成物を、1％低融点アガロース（Boerhinger Mannheim）上を走行させ、約1.5 kbZalpha11ｃＤＮＡ断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、QiaexII ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離した。
【０１９０】
精製Zalpha11ｃＤＮＡを、メーカーの使用説明書にしたがって、ＢａｍＨＩ（Boerhinger Mannheim）およびＥｃｏＲＩ（BRL）で消化した。全消化物を、1％低融点アガロース（Boerhinger Mannheim）上を走行させ、メーカーの使用説明書にしたがって、QiaexII ゲル抽出キットを用いて切断Zalpha11断片を精製した。その結果生じた切断Zalpha11キメラを、下記のようにして、発現ベクター中に挿入した。
【０１９１】
レシピエント発現ベクターｐＺＰ−５Ｎを、前記と同様にメーカーの使用説明書にしたがって、ＢａｍＨＩ（Boerhinger Mannheim）およびＥｃｏＲＩ（BRL）で消化し、ゲル精製した。このベクター断片を、結紮反応において、前記で単離したＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ切断Zalpha11断片と併合した。Ｔ４リガーゼ（BRL）を用いて、15℃で一夜、結紮を実行した。結紮の試料を、ＤＨ10ＢElectroMAXエレクトロコンピテント大腸菌細胞（25μF、200Ω、2.3V）中で電気穿孔処理した。形質転換体をＬＢ＋アンピシリンプレート上に載せ、単一コロニーをＰＣＲによりスクリーニングして、ＺＣ19,905（配列番号36）およびＺＣ19,906（配列番号37）を用いてZalpha11配列に関して調べた。ＰＣＲ条件は前記と同様であった。
【０１９２】
以下のプライマーを用いた配列分析により、ＭＰＬ−Zalpha11配列を確証した：ＺＣ12,700（配列番号28）、ＺＣ5,020（配列番号29）、ＺＣ20,114（配列番号38）、ＺＣ19,459（配列番号12）、ＺＣ19,954（配列番号39）およびＺＣ20,116（配列番号40）。挿入物は約1.6 kbで、全長であった。
実施例７
Alamar Blueを用いたＢＡＦ３検定におけるZalpha11ベースの増殖
Ａ．Zalpha11受容体を発現するＢａＦ３細胞の構築
前記の実施例６に記載したZalpha11発現ベクター30μgを用いて、前記の実施例５Ａと同様にして、全長Zalpha11受容体を発現するＢａＦ３を構築した。Zalpha11受容体ｍＲＮＡを発現するＢａＦ３細胞を消化して、ＢａＦ３／Zalpha11とした。これらの細胞を用いて、実施例８および１２に後述するように、Zalpha11活性に関してスクリーニングした。
【０１９３】
実施例８
Alamar Blue増殖検定を用いたＢＡＦ３／Zalpha11細胞を用いたZalpha11活性に関するスクリーニング
Ａ．Zalpha11活性の存在に関して検定するために用いられるサル一次供給源
一次サル脾臓細胞からのコンディショニング培地を用いて、下記のように活性の存在を検定した。サル脾臓細胞を5 ng/mlのフォルボール１２-ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Calbiochem, San Diego, CA）および0.5μg/mlイオノマイシン（Calbiochem）を用いて72時間、活性化した。刺激サル脾臓細胞からの上清を用いて、ＢａＦ３／Zalpha11細胞の増殖を後述のように検定した。
【０１９４】
Ｂ． Alamar Blue増殖検定を用いたＢＡＦ３／Zalpha11細胞を用いたZalpha11活性に関するスクリーニング
ＢａＦ３／Zalpha11細胞を遠心分離して、ｍＩＬ−３無含有培地中で洗浄した。細胞を遠心分離して、３回洗浄し、ｍＩＬ−３を確実に除去した。次に細胞を血球計で計数した。細胞を、ｍＩＬ−３無含有培地を用いて、100μl／ウエルの容量で、5000細胞／ウエルで96ウエルフォーマットでプレート化した。
【０１９５】
ｍＩＬ−３無含有培地で50 ％、25％、12.5％、6.25％、3.12％、1.5％、0.75％および0.375％濃度に稀釈した活性化サル脾臓（前記実施例８Ａ参照）から状態調節培地を用いて、ＢａＦ３／Zalpha11細胞の増殖を査定した。全検定容量は、200μlである。検定プレートを37℃で5％ＣＯ２で３日間インキュベートし、その時点でAlamar Blue（Accumed, Chicago, IL）を20μl/ウエルで付加した。プレートを再び37℃で5％ＣＯ２で24時間インキュベートした。プレートを、前記（実施例５）と同様に、Ｆｍａｘプレート読取機（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で読み取った。
【０１９６】
結果は、活性化サル脾臓状態調節培地中に存在する因子に対するＢａＦ３／Zalpha11細胞の増殖応答を確証した。測定されたように、応答は、50％濃度でのバックグラウンドの約4倍であった。ＢａＦ３野生型細胞はこの因子に応答して増殖せず、これは、この因子がZalpha11受容体に特異的であることを示す。
【０１９７】
Ｃ．Zalpha11活性を単離するために用いられるヒト一次供給源
６名のドナーの各々から、100 mlの血液を採血した。血液は、ヘパリンを含入する10 x 10 mlバキュウテイナー管を用いて採血した。６名のドナーからの血液（600 ml）をプールし、ＰＢＳ中で１：１に稀釈し、Ficoll-PaqueＰＬＵＳ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用いて分離した。フィコール勾配の分離後に産生された単離一次ヒト細胞は、1.2 x 109細胞であった。
【０１９８】
9.6 mlのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、0.5％ＥＤＴＡ、2 mMＥＤＴＡ）中に細胞を懸濁した。1.6 mlの細胞懸濁液を取り出して、0.4 mlのＣＤ３マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を付加した。混合物を4℃で15分間インキュベートした。ＣＤ３ビーズで標識したこれらの細胞を、30 mlのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次に2 mlのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
【０１９９】
ＶＳ＋カラム（Miltenyi）を、メーカーの使用説明書にしたがって、調製した。ＶＳ＋カラムを次にVarioＭＡＣＳ磁場（Miltenyi）に入れた。カラムを5 mlのＭＡＣＳ緩衝液で平衡させた。単離一次ヒト細胞を次にカラムに適用した。ＣＤ３陰性細胞をそこに通した。カラムを9 ml（3 x 3 ml）のＭＡＣＳ緩衝液ですすいだ。次にカラムを磁場から取り出して、15 mlのファルコン管に入れた。5 mlのＭＡＣＳ緩衝液をカラムに入れて、ＣＤ３＋細胞を溶離し、メーカーにより提供されたプランジャーを用いて、結合細胞を洗い落とした。ＣＤ３磁気ビーズとともに細胞をインキュベートし、洗浄して、前記のＶＳ＋カラム工程（インキュベーション〜溶離）をさらに５回反復した。その結果生じたＣＤ３＋６回のカラム分離からの分画をプールした。ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞の収量は、全部で3 x 108細胞であった。
【０２００】
プールしたＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞の試料を取り出して、染色し、蛍光抗体細胞分類機（ＦＡＣＳ）で分類して、その純度を査定した。ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞は91％ＣＤ３＋細胞であった。
【０２０１】
ＲＰＭＩ＋5％ＦＢＳ＋ＰＭＡ  10 ng/mlおよびイオノマイシン0.5μg/ml（Calbiochem）中で37℃で13時間インキュベートすることにより、ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞を活性化した。これらの活性化ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞からの上清を、下記のようにZalpha11活性に関して検定した。
【０２０２】
Ｄ．ＢａＦ３／Zalpha11細胞および Alamar Blue増殖検定を用いたZalpha11活性に関する活性化ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞からの上清の検定
ＢａＦ３／Zalpha11細胞を遠心分離して、ｍＩＬ−３無含有培地中で洗浄した。細胞を遠心分離して、３回洗浄し、ｍＩＬ−３を確実に除去した。次に細胞を血球計で計数した。細胞を、ｍＩＬ−３無含有培地を用いて、100μl／ウエルの容量で、5000細胞／ウエルで96ウエルフォーマットでプレート化した。
【０２０３】
ｍＩＬ−３無含有培地で50 ％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％および0.375％濃度に稀釈した活性化ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞（前記実施例８Ｃ参照）からコンディショニング培地を用いて、ＢａＦ３／Zalpha11細胞の増殖を査定した。100μlの稀釈状態調節培地をＢａＦ３／Zalpha11細胞に付加した。全検定容量は200μlである。検定プレートを前記の実施例８Ｂと同様にインキュベートし、検定した。
【０２０４】
結果は、活性化ＣＤ３＋選定ヒトＴ細胞状態調節培地中に存在する因子に対するＢａＦ３／Zalpha11細胞の増殖応答を確証した。測定されたように、応答は、50％濃度でのバックグラウンドの約10倍であった。ＢａＦ３野生型細胞はこの因子に応答して増殖せず、これは、この因子がZalpha11受容体に特異的であることを示す。
【０２０５】
実施例９
ｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプター；ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥ、ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧ、ｚａｌｐｈａ１１ＣＨＩＳ及びｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４を発現する哺乳動物発現ベクターの構築
Ａ．ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥ、ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧ及びｚａｌｐｈａ１１ＣＨＳを含むｚａｌｐｈａ１１哺乳動物発現ベクターの構築
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインの発現のため、発現ベクターｐＣ４ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥを調製した。ここで、この構築体は推定開始メチオニンを含んで成り、推定トランスメンブランドメインの隣りでトランスケーションされ、そしてＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグを有するｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドを発現するようにデザインされている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）。
【０２０６】
７００ｂｐのＰＣＲ構築ｚａｌｐｈａ１１ＤＮＡフラグメントをＰＣＲプライマーとしてＺＣ１９，９３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）及びＺＣ１９，９３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）を用いて構築し、Ａｓｐ７１８及びＢａｍＨＩ制限部位を付加した。ｚａｌｐｈａ１１レセプターｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として用いた。ｚａｌｐｈａ１１フラグメントのＰＣＲ増幅は下記の通りに実施した。９４℃、０．５分を２５サイクル；９４℃を１０秒、５０℃３０秒、６８℃を４５秒を５サイクル；次いで４℃に維持。反応体はクロロホルム／フェノール抽出及びイソプロパノール沈殿により精製し、そしてＡｓｐ７１８及びＢａｍＨＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）でその製造者のプロトコールに従って消化した。推定サイズ７００ｂｐのバンドを１％のアガロースゲル電気泳動により目視化し、切り出し、そしてＱｉａｅｘII（商標）精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を利用し、その製造者の仕様書に従って精製した。
【０２０７】
切り出したＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＡｓｐ７１８で切断したプラスミドｐＣ４ＥＥにサブクローニングした。ｐＣ４ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥ発現ベクターは天然ｚａｌｐｈａIIシグナルペプチドを利用し、そしてＧｌｕ−Ｇｌｕタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）をｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドコードポリヌクレオチド配列のＣ末端に付加する。プラスミドｐＣ４ＥＥはマウスメタロチオネイン−１プロモーター、コード配列の挿入のための多重制限部位、停止コドン及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。このプラスミドは更にＥ．コリ複製起点、ＳＶプロモーター、エンハンサー及び複製起点を有する哺乳動物選択マーカー発現ユニット、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを有する。
【０２０８】
約３０ｎｇの制限消化ｚａｌｐｈａ１１インサート及び約１２ｎｇの消化ベクターを１６℃で一夜かけてライゲーションした。１μｌの各ライゲーション反応体を個別のＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の中に製造者の指示に従ってエレクトロポレーションし、そして５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレーティングし、そして一夜インキュベーションした。コロニーを２ｍｌの個々のコロニーの液体を培養物から調製したＤＮＡの制限分析によりスクリーニングした。陽性クローンのインサート配列を配列分析に確認した。大量スケールプラスミド調製をＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｍａｘｉ  ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者の仕様書に従って行った。
【０２０９】
一列に並んだ６個のＨｉｓ残基から成るＣ末端ｈｉｓタグ、及びＣ末端フラグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）タグ、ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＡＧを有するｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプターを調製するために同じ手順を利用した。これらの構築体を構築するため、上記のベクターはｇｌｕ−ｇｌｕタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の代わりにＨＩＳ又はＦＬＡＧ（登録商標）のいずれかを有する。
【０２１０】
Ｂ．可溶性ｚａｌｐｈａ１１レセプターｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４の哺乳動物発現構築
ｚａｌｐｈａ１１をコードするポリヌクレオチド全体又は一部を含む発現プラスミドを相同組換を介して構築した。ｚａｌｐｈａ１１レセプターの細胞外ドメイン由来のポリヌクレオチド配列を含むｚａｌｐｈａ１１ｃＤＮＡのフラグメントをＰＣＲを利用して単離した。ｚａｌｐｈａ１１フラグメントの製造に用いた２つプライマーは：（１）各々が５′から３′末端にかけて：４０ｂｐのベクターフランキング配列（インサートの５′）及びｚａｌｐｈａ１１細胞外ドメインの５′末端と対応する１７ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を含むＰＣＲ用プライマー；並びに（２）４０ｂｐのＦｃ４ポリヌクレオチド配列の５′末端（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）及びｚａｌｐｈａ１１細胞外ドメインの３′末端に対応する１７ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）とした。ｚａｌｐｈａ１１との融合のためのＦｃ−４のフラグメントは同じようにしてＰＣＲにより作った。Ｆｃ４フラグメントの製造に利用した２つのプライマーは：（１）ｚａｌｐｈａ１１細胞外ドメインの３′末端から４０ｂｐの配列及びＦｃ４の５′末端の１７ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）から成る５′プライマー；並びに（２）ベクター配列の４０ｂｐ（インサートの３′）及びＦｃ４の３′末端の１７ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）から成る３′プライマー；とした。
【０２１１】
上記の各々の反応のＰＣＲ増幅は下記の通りにして実施した：９４℃、２分を１サイクル；９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル；７２℃で５分を１サイクル；次いで４℃で保持。１００μｌのＰＣＲ反応物のうち１０μｌを分析のために０．８％のＬＭＰアガロースゲル（Ｓｅａｐｌａｕｑｕｅ  ＧＴＧ）上に１×ＴＢＥバッファで泳動させた。残りの９０μｌの反応物は５μｌの１ＭのＮａＣｌ及び２５０μｌの無水エタノールの添加により沈殿させた。使用した発現ベクターはプラスミドｐＣＺＲ１９９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、Ｎｏ．９８６６８と番号付与されている）とし、そしてＳｍａＩ（ＢＲＬ）で切った。この発現ベクターはプラスミドｐＣＺＲ１９９に由来し、そしてＣＭＶ即時初期プロモーター、マウスイムノグロブリン重鎖座の可変領域由来の共通イントロン、コード配列の挿入のための多重制限部位、停止コドン及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む。この発現ベクターはＥ．コリ複製起点、ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製起点を有する哺乳動物選択マーカー発現ユニット、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを有する。使用した発現ベクターはｐＣＺＲ１９９から、メタロチオネインプロモーターのＣＭＶ即時初期プロモーターとの置換により構築した。
【０２１２】
１００μｌのコンピテント酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を約１ｍｇづつのｚａｌｐｈａ１１及びＦｃ４インサートを含む１０μｌ並びに１００ｎｇのＳｍａＩ（ＢＲＬ）消化発現ベクターと合わせ、そして０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、「無限」ｏｈｍ、２５μＦでエレクトロパルスした。各キュベットに６００μｌの１．２Ｍのソルビトールを加え、そして酵母を２つの３００μｌのアリコートにわけて２枚のＵＲＡ−Ｄプレートに載せ、そして３０℃でインキュベーションした。
【０２１３】
４８時間後、一枚のプレートに由来するＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ2Ｏに再懸濁し、そして軽く遠心分離して酵母細胞をペレットにした。この細胞ペレットを１ｍｌの溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。５００μｌのこの溶解混合物を３００μｌ、酸洗浄ガラスビーズ及び２００μｌのフェノール−クロロホルムを含むエッペンドルフチューブに入れ、１分の間隔で２又は３回ボルテックスにかけ、次いでエッペンドルフ遠心機で最大スピードで５分遠心分離した。３００μｌの水性相を新鮮なチューブに移し、そしてＤＮＡを６００μｌのエタノール（ＥｔＯＨ）で沈殿させ、次いで４℃で１０分遠心分離した。このＤＮＡペレットを１００μｌのＨ2Ｏに再懸濁した。
【０２１４】
エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（ＤＨ１０Ｂ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）の形質転換は０．５〜２ｍｌの酵母ＤＮＡプレプ及び４０μｌのＤＨ１０Ｂ細胞で行った。細胞を２．０ｋＶ、２５ｍＦ及び４００ｏｈｍでエレクトロパルスした。エレクトロポレーションの後、１ｍｌのＳＯＣ（２％のＢａｃｔｏｅ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、０．５％の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２０ｍＭのグルコース）を２５０μｌのアリコートで４枚のＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％のＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）にまいた。
【０２１５】
ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４についての適正な発現構築体を保有する個々のクローンを制限消化により固定し、ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４の存在を確認し、且つ様々なＤＮＡ配列が互いと連結し合ったかを確認した。陽性クローンのインサートを配列分析にかけた。大量スケールプラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用し、製造者の仕様に従って単離した。
【０２１６】
実施例１０
Ｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプターポリペプチドのトランスフェクションおよび発現
２７継代のＢＨＫ  ５７０細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１０３１４）を１．２×１０6細胞／穴（６穴プレート）で、８００μｌの血清を含まない（ＳＦ）ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で培養した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、血清を含まない（ＳＦ）ＤＭＥＭ中で、上述のｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥ／ＣＦＬＧ／ＣＨＩＳを含む発現プラスミドでトランスフェクションした。ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥ／ＣＦＬＧ／ＣＨＩＳのそれぞれ３マイクログラムを別々に１．５ｍｌチューブ中で全最終容積１００μｌのＳＦ  ＤＭＥＭまで希釈した。別々なチューブ中で、１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を１００μｌのＳＦ  ＤＭＥＭと混合した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）ミックスを室温で３０〜４５分培養し、ＤＮＡミックスを加えて室温で約１０〜１５分培養した。
【０２１７】
全ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）混合物を培養した細胞に加え、それらに均一に分配した。細胞を３７℃で約５時間培養し、最終容積３０ｍｌのＤＭＥＭ／５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で別々な１５０ｍｍ  ＭＡＭＩプレートに移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2で終夜培養し、翌日ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）混合物を選択培地（１μＭメトトレキセート（ＭＴＸ）を含む５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。
【０２１８】
トランスフェクション後約１０〜１２日に、プレートを１０ｍｌ  ＳＦ  ＤＭＥＭで洗浄した。洗浄媒体を吸引し７．２５ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭと交換した。ＳＦ  ＤＭＥＭに予備浸漬した滅菌済みテフロン（登録商標）の網（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）をクローン細胞コロニーの上に置いた。ＳＦ  ＤＭＥＭに予備浸漬した滅菌済みニトロセルロースフィルターを網の上に置いた。ニトロセルロースの方向付けマークを培養皿に移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で５〜６時間インキュベーションした。
【０２１９】
インキュベーションの後、フィルター／網を除去し、培地を吸引して１μＭのＭＴＸを含む５％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭと交換した。１０％脱脂粉乳／Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａバッファー（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％ＮＰ−４０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２５％ゼラチン）中で、回転震盪器を用い１５分間室温でフィルターをブロックした。フィルターを、それぞれ抗−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧまたは抗−ＨＩＳ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともに、２．５％脱脂粉乳／Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａバッファー中で、回転震盪器を用い１時間室温で培養した。フィルターを室温で、各洗浄毎５〜１０分間Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａで３回洗浄した。フィルターをｕｌｔｒａ  ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）でメーカーの指示どおり現像し、Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｒｐ．）上に映像化した。
【０２２０】
正の発現クローンコロニーを機械的に１２穴プレートの５μＭ  ＭＴＸを含む５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭの１ｍｌ中に拾って移し、集密まで成長させた。コンディショニング済み培地試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ分析により発現レベルについて試験した。各コンストラクトについて最も高い３つの発現クローンを拾った。３つのうち２つはバックアップとして凍結し、1つをマイコプラズマ試験および大規模工場播種のために展開した。
【０２２１】
Ｂ．可溶性ｚａｌｐｈａ１１レセプターｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４の哺乳類発現
ＢＨＫ  ５７０細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１０３１４）を１０ｃｍ細胞培養皿で培養し、ＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で、３７℃、５％ＣＯ2で終夜約５０〜７０％の集密度まで成長させた。次いで細胞を、血清を含まない（ＳＦ）培地配合物（ＤＭＥＭ，１０ｍｇ／ｍｇトランスフェリン，５ｍｇ／ｍｌインシュリン，２ｍｇ／ｍｌフェチュイン，１％Ｌ−グルタミンおよび１％ピルビン酸ナトリウム）中で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４（実施例９参照）を含むプラスミドでトランスフェクションした。ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４を含むプラスミドを１５ｍｌチューブ中で、ＳＦ培地で全最終容積６４０ｍｌに希釈した。３５ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を６０５ｍｌのＳＦ培地と混合した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ミックスをＤＮＡミックスに加え、室温で約３０分間培養した。５ｍｌのＳＦ培地をＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）混合物に加えた。細胞を５ｍｌのＳＦ培地で１回すすぎ、吸引して、ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）混合物を加える。細胞を３７℃で５時間培養し、次いで６．４ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ，１％ＰＳＮ培地を各プレートに加えた。プレートを３７℃で終夜培養し、翌日ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）混合物を新鮮な５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地と交換した。トランスフェクション後２日目に、細胞を、１５０ｍｍプレート中の選択培地（上記のＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地に１ｍＭメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えたもの）中に１：１０，１：２０および１：５０で分割した。細胞上の培地はトランスフェクション後５日目に新鮮な選択培地と交換した。トランスフェクション後約１０日目に、各トランスフェクションからのメトトレキセート耐性コロニーの１５０ｍｍ培養皿２つをトリプシン処理し、細胞をＴ−１６２フラスコに溜めて培養し、大規模培養へと移した。
【０２２２】
実施例１１
ＢＨＫ５７０細胞からのｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプターの精製
Ａ．ＢＨＫ５７０からのｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥポリペプチドの精製
特に記さない限り、全ての操作は４℃で行った。以下の手順により、Ｃ−末端ＧｌｕＧｌｕ（ＥＥ）タグを含むｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドを精製した。細胞工場コンディショニング済み培地３０リットルを、ＰｒｏＦｌｕｘ  Ａ３０でＡｍｉｃｏｎ  Ｓ１０Ｙ３らせん型カートリッジを用い１．６リットルに濃縮した。プロテアーゼインヒビター溶液を、トランスフェクションされたＢＨＫ５７０細胞から得た（実施例１０参照）濃縮された１．６リットルの細胞工場コンディショニング済み培地に加え、最終濃度を２．５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．００３ｍＭのロイペプチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、０．００１ｍＭのペプスタチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および０．４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とした。試料を分析のために除き、大部分を、精製を始めるまで−８０℃で凍結した。濃縮された細胞工場コンディショニング済み培地の全標的タンパク質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抗−ＥＥ  ＨＲＰ複合抗体を用いたウェスタンブロット分析により決定した。
【０２２３】
１００ｍｌカラムの抗−ＥＥ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（以下で述べるように調製）を、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＰ−５、５ｃｍ×１０ｃｍガラスカラムに注いだ。カラムをフローパックし、ＢｉｏＣａｄ  Ｓｐｒｉｎｔ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）でｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と平衡化した。濃縮された細胞工場コンディショニング済み培地を解凍し、０．２ミクロン滅菌済みフィルターに通し、ｐＨを７．４に調整し、次いで１ｍｌ／分の流量で終夜カラムに充填した。カラムを、１０カラム体積（ＣＶｓ）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で洗浄し、５ｍｌ／分で０．５ｍｇ／ｍｌＥＥペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）の２００ｍｌでプラグ溶出させた。使用したＥＥペプチドは、配列ＥＹＭＰＭＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）を有する。カラムを１０カラム体積のＰＢＳで洗浄し、５カラム体積の０．２ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。グリシン溶出カラムのｐＨを２カラム体積の５Ｘ  ＰＢＳで７．０に調整し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で平衡化した。溶出クロマトグラフィー全体にわたり５ｍｌのフラクションを集め、２８０および２１５ｎｍでの吸光度をモニターした。通過液および洗浄用液体も取っておき分析した。ＥＥポリペプチド溶出ピークフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色および抗−ＥＥ  ＨＲＰ複合抗体を用いたウェスタンブロットにより、標的タンパク質について分析した。目的とするポリペプチド溶出フラクションを溜め、１０，０００ダルトン分子量カットオフ膜スピン濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いメーカーの指示に従い６０ｍｌから５．０ｍｌに濃縮した。
【０２２４】
ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥをともに精製された他のタンパク質から分離するため、濃縮ポリペプチド溶出液を溜めたフラクションを、ｐＨ８．０でＰＯＲＯＳ  ＨＱ−５０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡの強アニオン交換樹脂）にかけた。１．０×６．０ｃｍカラムを注ぎ、ＢｉｏＣａｄ  Ｓｐｒｉｎｔでフローパックした。カラムに対イオンを充填し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））で平衡化した。試料を１：１３に希釈し（ＰＢＳのイオン強度を下げるため）、次いでＰｏｒｏｓ  ＨＱカラムに５ｍｌ／分で充填した。カラムを１０カラム体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で洗浄し、１０ｍｌ／分で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の４０カラム体積勾配で溶出した。溶出クロマトグラフィー全体にわたり１．５ｍｌのフラクションを集め、２８０および２１５ｎｍでの吸光度をモニターした。溶出ピークフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色で分析した。目的とするフラクションを溜め、１０，０００ダルトン分子量カットオフ膜スピン濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いメーカーの指示に従い１．５〜２．０ｍｌに濃縮した。
【０２２５】
ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥポリペプチドを遊離ＥＥペプチドおよび同時に精製される汚染性のタンパク質から分離するため、溜めておいた濃縮フラクションを、ＢｉｏＣａｄ  ｓｐｒｉｎｔを用い、ＰＢＳで平衡化しそれを充填してある１．５×９０ｃｍ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムのカラムクロマトグラフィーに１．０ｍｌ／分でかけた。溶出クロマトグラフィー全体にわたり１．５ｍｌのフラクションを集め、２８０および２１５ｎｍでの吸光度をモニターした。ピークフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色でキャラクタリゼーションし、最も純粋なフラクションのみを集めた。この物質は、ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥポリペプチドを表している。
【０２２６】
最後に、残存するエンドトキシンを除くため、この精製された物質を４ｍｌ  ＡｃｔｉＣｌｅａｎ  Ｅｔｏｘ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ）カラムにかけた。試料を、ＰＢＳで平衡化したグラビティーカラムに４回通し、次いでカラムを３ｍｌのＰＢＳで洗浄しそれを「浄化された」試料とともに溜めた。前記物質を、０．２ミクロン滅菌済みフィルターに通し、小分けするまで−８０℃で保存した。
【０２２７】
ウェスタンブロットを行ったクマジーブルーおよび銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥポリペプチドは、見かけの分子量５０，０００ダルトンの単一の主要なバンドであった。このバンドの移動性は、還元性および非還元性ゲルで同じであった。
【０２２８】
精製された物質のタンパク質濃度は、ＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定し、タンパク質を等分し、発明者らの標準手順により−８０℃で保存した。このタンパク質はＩＥＦ（等電収束）ゲル上で４．５未満のＰＩで移動する。ｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥポリペプチドの濃度は１．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０２２９】
精製されたｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥポリペプチドをウサギへの注射用に調製し、抗体製造のためＲ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）に送った。ウサギに注射し、抗−ｈｕｚａｌｐｈａ１１−ＣＥＥ−ＢＨＫ血清（以下の実施例１５）を製造した。
【０２３０】
抗−ＥＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを調製するため、１００ｍｌ床容積のプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、５００ｍｌのＮａｌｇｅｎｅ  ０．４５ミクロンフィルターユニットを用いて、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ  １００ｍｌで３回洗浄した。ゲルを、６容積の２００ｍＭのトリエタノールアミンｐＨ８．２（ＴＥＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で洗浄し、９００ｍｇの抗体を含む等容積のＥＥ抗体溶液を添加した。４℃で終夜培養後、未結合の抗体を、上述のとおり２００ｍＭのＴＥＡ５容積で樹脂を洗浄することにより除いた。樹脂を２容積のＴＥＡ中に再懸濁し、適当な容器に移し、ＴＥＡに溶解しているジメチルピミリミデート−２ＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加えて、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルの最終濃度を３６ｍｇ／ｍｌにした。ゲルを室温で４５分間震盪し、上述のとおりフィルターユニットを用いて液体を除いた。ゲル上の非特異的部位を、２００ｍＭのＴＥＡ中の２０ｍＭエタノールアミン５容積により室温で１０分間培養することによりブロックした。０．０２％のアジ化ナトリウムを含む５容積のＰＢＳでゲルを洗浄し、この溶液中に４℃で保存した。
【０２３１】
Ｂ．ＢＨＫ５７０から得たｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＡＧポリペプチドの精製
特に断りのない限り、全ての操作は４℃で行った。以下の手順により、Ｃ末端ＦＬＡＧ（ＦＬＧ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）タグを含むｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドを精製した。３０リットルの細胞工場コンディショニング済み培地をＰｒｏＦｌｕｘ  Ａ３０でＡｍｉｃｏｎ  Ｓ１０Ｙ３らせん型カートリッジを用い１．７リットルに濃縮した。プロテアーゼインヒビター溶液を、トランスフェクションされたＢＨＫ５７０細胞から得た（実施例１０参照）濃縮された細胞工場コンディショニング済み培地１．７リットルに加え、最終濃度を２．５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．００３ｍＭのロイペプチン（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、０．００１ｍＭのペプスタチン（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および０．４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とした。試料を分析のために除き、大部分を、精製を始めるまで−８０℃で凍結した。細胞工場コンディショニング済み培地の全標的タンパク質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−ＦＬＡＧ（Ｋｏｄａｋ）ＨＲＰ複合抗体を用いたウェスタンブロット分析により決定した。１２５ｍｌカラムの抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ａｇａｒｏｓｅアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＰ−５、５ｃｍ×１０ｃｍガラスカラムに注いだ。カラムをフローパックし、ＢｉｏＣａｄ  Ｓｐｒｉｎｔ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）でｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と平衡化した。濃縮された細胞工場コンディショニング済み培地を解凍し、０．２ミクロン滅菌済みフィルターに通し、ｐＨを７．４にコンディショニングし、次いで１ｍｌ／分の流量で終夜カラムに充填した。カラムを、１０カラム体積（ＣＶｓ）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で洗浄し、５ｍｌ／分で０．５ｍｇ／ｍｌのＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）ペプチドを含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）の２５０ｍｌでプラグ溶出させた。使用したＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）を有している。カラムを１０カラム体積のＰＢＳで洗浄し、５カラム体積の０．２ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。グリシン溶出カラムのｐＨを２カラム体積の５Ｘ  ＰＢＳで７．０にコンディショニングし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で平衡化した。溶出クロマトグラフィー全体にわたり５ｍｌのフラクションを集め、２８０および２１５ｎｍでの吸光度をモニターした。通過液および洗浄用液体も取っておき分析した。ＦＬＡＧポリペプチド溶出ピークフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色およびａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ＨＲＰ複合抗体を用いたウェスタンブロットにより、目標タンパク質について分析した。目的とするポリペプチド溶出フラクションを溜め、１０，０００ダルトン分子量カットオフ膜スピン濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いメーカーの指示に従い８０ｍｌから１２ｍｌに濃縮した。
【０２３２】
ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧをともに精製された他のタンパク質から分離するため、ポリペプチド溶出を溜めたフラクションを、ｐＨ８．０でＰＯＲＯＳ  ＨＱ−５０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡの強アニオン交換樹脂）にかけた。１．０×６．０ｃｍカラムを注ぎ、ＢｉｏＣａｄ  Ｓｐｒｉｎｔでフローパックした。カラムに対イオンを充填し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））で平衡化した。試料を１：１３に希釈し（ＰＢＳのイオン強度を下げるため）、次いでＰｏｒｏｓ  ＨＱカラムに５ｍｌ／分で充填した。カラムを１０カラム体積の２０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．０で洗浄し、１０ｍｌ／分で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の４０カラム体積勾配で溶出した。溶出クロマトグラフィー全体にわたり１．５ｍｌのフラクションを集め、２８０および２１５ｎｍでの吸光度をモニターした。溶出ピークフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色で分析した。目的とするフラクションを溜め、１０，０００ダルトン分子量カットオフ膜スピン濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いメーカーの指示に従い１．５〜２．０ｍｌに濃縮した。
【０２３３】
ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧポリペプチドを遊離ＦＬＡＧペプチドおよび同時に精製される汚染性のタンパク質から分離するため、溜めておいた濃縮フラクションを、ＢｉｏＣａｄ  Ｓｐｒｉｎｔを用い、ＰＢＳで平衡化しそれを充填してある１．５×９０ｃｍ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムのカラムクロマトグラフィーに１．０ｍｌ／分でかけた。溶出クロマトグラフィー全体にわたり１．５ｍｌのフラクションを集め、２８０および２１５ｎｍでの吸光度をモニターした。ピークフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色でキャラクタリゼーションし、最も純粋なフラクションのみを集めた。この物質は、ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧポリペプチドを表している。
【０２３４】
最後に、残存するエンドトキシンを除くため、この精製された物質を４ｍｌ  ＡｃｔｉＣｌｅａｎ  Ｅｔｏｘ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ）カラムにかけた。試料を、ＰＢＳで平衡化したグラビティーカラムに４回通し、次いでカラムを３ｍｌのＰＢＳで洗浄しそれを「浄化された」試料とともに溜めた。前記物質を、０．２ミクロン滅菌済みフィルターに通し、小分けするまで−８０℃で保存した。
【０２３５】
ウェスタンブロットを行ったクマジーブルーおよび銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧポリペプチドは、見かけの分子量５０，０００ダルトンの単一の主要なバンドであった。このバンドの移動性は、還元性および非還元性ゲルで同じであった。
【０２３６】
精製された物質のタンパク質濃度は、ＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定し、タンパク質を小分けし、発明者らの標準手順により−８０℃で保存した。このタンパク質は、ＩＥＦ（等電収束）ゲル上で４．５未満のＰＩで移動する。ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧポリペプチドの濃度は１．２ｍｇ／ｍｌであった。
【０２３７】
Ｃ．トランスフェクションされたＢＨＫ  ５７０細胞から得たｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４ポリペプチドの精製
特に断りのない限り、全ての操作は４℃でおこなった。以下の操作により、ヒトＩｇＧ／Ｆｃ（ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４；実施例８および９）へのＣ末端融合を含むｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドを精製した。ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４（実施例１０）でトランスフェクションしたＢＨＫ  ５７０細胞から得た１２，０００ｍｌのコンディショニング済み培地を、０．２ｍｍ滅菌フィルターに通して濾過し、プロテアーゼインヒビターの溶液を補い、最終濃度を０．００１ｍＭのロイペプチン（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、０．００１ｍＭのペプスタチン（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および０．４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とした。プロテインＧセファロース（６ｍｌ床容積、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を詰め、５００ｍｌ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で洗浄した。補われたコンディショニング済み培地を１０ｍｌ／分の流量でカラムに通し、その後１０００ｍｌ  ＰＢＳ（ＢＲＬ／Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４を０．１ＭのグリシンｐＨ３．５でカラムから溶出させ、２ｍｌのフラクションを直接０．２ｍｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に集め、フラクション中の最終ｐＨを７．０に調整した。
【０２３８】
溶出したフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ヒトＦｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）抗体を用いたウェスタンブロットでキャラクタリゼーションした。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット分析は、フラクション２〜１０中の８０，０００ｋＤａの免疫反応性プロテインを示した。銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルも、フラクション２〜１０中の８０，０００ｋＤａ  ｚａｌｐｈａ１１：Ｆｃポリペプチドを示した。フラクション２〜１０を集めた。
【０２３９】
集めたフラクションのタンパク質濃度は、ＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定し、前記物質を小分けし、発明者らの標準手順により−８０℃で保存した。集めたフラクションの濃度は０．２６ｍｇ／ｍｌであった。
【０２４０】
実施例１２
拮抗的阻害アッセイにおけるｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプターｚａｌｐｈａ１１ＣＥＥ，ｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧおよびｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４（突然変異体）を用いるアッセイ
ＢａＦ３／Ｚａｌｐｈａ１１細胞をスピンダウンし、ｍＩＬ−３無含有培地中で洗浄した。細胞をスピンし３回洗浄して確実にｍＩＬ−３を除去した。次いで細胞をヘマサイトメーターで計測した。ｍＩＬ−３無含有培地を用い、穴あたり１００μｌの容積に穴あたり５０００細胞で、細胞を９６穴フォーマットに培養した。
【０２４１】
サル脾臓細胞活性化および上記の実施例８で記載したＣＤ３＋選択細胞からの両培地を、１０μｇ／ｍｌのｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプター（ＣＥＥ，Ｃ−フラッグおよびＦｃ４構築体；実施例１０および１１参照）のある条件とない条件で、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％、３．１２５％、１．５％、０．７５％および０．３７５％の濃度で別々の実験に添加した。全アッセイ容積は２００μｌであった。
【０２４２】
アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ2で３日間培養し、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ａｃｃｕｍｅｄ）を２０μｌ／穴で加えた。プレートを再び、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。上述のとおり（実施例５）、プレートをＦｍａｘ（商標）プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。その結果は、１０μｇ／ｍｌでの異なるｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプター構築体のそれぞれからの細胞成長の完全な阻害を示し、各試料中の因子がｚａｌｐｈａ１１レセプターに特異的であることを確認した。
【０２４３】
可溶性レセプターを希釈した滴定曲線も上述のアッセイを用いて行った。ｚａｈｐｈａ１１  ＣＥＥおよびｚａｌｐｈａ１１ＣＦＬＧ可溶性ｚａｌｐｈａ１１レセプターは、２０ｎｇ／ｍｌの低濃度で成長を完全に阻害できた。突然変異体ｚａｌｐｈａ１１−Ｆｃ４可溶性ｚａｌｐｈａ１１レセプターは１．５μｇ／ｍｌでやっと同様の効果を示した。
【０２４４】
実施例１３
大腸菌中でのヒトｚａｌｐｈａ１１の発現
Ａ．ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ融合ポリペプチドを発現する発現ベクターｐＣＺＲ２２５の構築
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）にＣ末端で融合しているヒトｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを相同的組換えにより構築した。ＭＢＰ−ｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプター融合ポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、配列番号５０に示されており、対応するタンパク質配列は配列番号５１に示されている。実施例１４においてｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈと呼ばれる融合ポリペプチドは、ヒトｚａｌｐｈａ１１可溶性レセプター（配列番号５１のアミノ酸３８９（Ｃｙｓ）からアミノ酸６０６（Ｈｉｓ））に融合したＭＢＰ部分（配列番号５１のアミノ酸１（Ｍｅｔ）からアミノ酸３８８（Ｓｅｒ））を含む。ヒトｚａｌｐｈａ１１  ｃＤＮＡ（配列番号５２）のフラグメントを、ＰＣＲを用いて単離した。ＰＣＲ反応においてヒトｚａｌｐｈａ１１フラグメントの製造に２つのプライマーを用いた。（１）４０ｂｐのベクターフランキング配列およびヒトｚａｌｐｈａ１１のアミノ末端に対応する２５ｂｐを含むプライマーＺＣ２０，１８７（配列番号５３）ならびに（２）フランキングベクター配列に対応する３’末端の４０ｂｐおよびヒトｚａｌｐｈａ１１のカルボキシ末端に対応する２５ｂｐを含むプライマーＺＣ２０，１８５（配列番号５４）である。ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間２５サイクル；その後４℃で浸漬、複製運転である。１００μｌのＰＣＲ反応物の２μｌを、１×ＴＢＳ緩衝液を含む１．０％アガロースゲルに流して分析し、予想された６６０ｂｐのフラグメントが見られた。残りの９０μｌのＰＣＲ反応物を、４００μｌ無水エタノールで沈殿した第２のＰＣＲチューブと合わせた。沈殿したＤＮＡは、Ｓｍａ切断したレシピエントベクターｐＴＡＰ９８への組み換えに使用し、以下のとおりＭＢＰ−ｚａｌｐｈａ１１融合をコードする構築体を作った。
【０２４５】
プラスミドｐＴＡＰ９８を、プラスミドｐＲＳ３１６およびｐＭＡＬ−ｃ２から誘導した。プラスミドｐＲＳ３１６は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  シャトルベクター（Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ．ａｎｄ  Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−２７，１９８９）である。ｐ−ＭＡＬ−Ｃ２は（ＮＥＢ）、Ｅ．Ｃｏｌｉ発現プラスミドである。これは、ＭａｌＥ（ＭＢＰをコードする遺伝子）を駆動するタックプロモーターを担持し、その後にＨｉｓタグ、トロンビン開裂部位、クローニング部位およびｒｒｎＢターミネーターがある。ベクターｐＴＡＰ９８は、酵母相同的組み換えを用いて構築した。１００ｎｇのＥｃｏＲ１切断ｐＭＡＬ−ｃ２を、１μｇのＰｖｕｌ切断ｐＲＳ３１６、１μｇのリンカーおよび１μｇのＳｃａｌ／ＥｃｏＲ１切断ｐＲＳ３１６で組み換えた。前記リンカーは、ＰＣＲ反応で結合させたオリゴＺＣ１９，３７２（配列番号５５）（１００ｐｍｏｌ）；ＺＣ１９，３５１（配列番号５６）（１ｐｍｏｌ）；ＺＣ１９，３５２（配列番号５７）（１ｐｍｏｌ）およびＺＣ１９，３７１（配列番号５８）（１００ｐｍｏｌ）からなっていた。ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間１０サイクル；その後４℃で浸漬である。ＰＣＲ生成物を１００％エタノール沈殿により濃縮した。
【０２４６】
コンピテント酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１００マイクロリットルを、上記のヒトｚａｌｐｈａ１１レセプターＰＣＲ生成物約１μｇおよびＳｍａＩ消化ｐＴＡＰ９８ベクター１００ｎｇを含む混合物１０μｌと混合し、０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、無限オーム、２５μＦで電気パルスをかけた。各キュベットに、１．２Ｍソルビトール６００μｌを加え、次いで酵母を２つのＵＲＡ  Ｄプレート上の２つの３００μｌずつに分け、３０℃でインキュベーションした。
【０２４７】
約４８時間後に、１つのプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌＨ2Ｏに再懸濁させ、短時間スピンして酵母細胞をペレットにした。細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１％  ＳＤＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。溶解混合物５００マイクロリットルを、３００μｌの酸洗浄済みグラスビーズおよび２００μｌのフェノール−クロロホルムを含むエッペンドルフチューブに加え、１分間隔で２，３回渦を作って撹拌し、エッペンドルフ遠心分離器内で最大スピードで５分間スピンした。水層３００μｌを新しいチューブに移しＤＮＡを６００μｌエタノール（ＥｔＯＨ）で沈殿させ、４℃で１０分間遠心分離した。ＤＮＡペレットを１００μｌのＨ2Ｏに再懸濁した。
【０２４８】
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＭＣ１０６１，Ｃａｓａｄａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８，１７９−２０７）の形質転換を、１μｌの酵母ＤＮＡプレプおよび４０μｌのＭＣ１０６１細胞で行った。細胞に、２．０ｋＶ、２５μＦおよび４００オームで電気パルスをかけた。電気穿孔の後、０．６ｍｌのＳＯＣ（２％  Ｂａｃｔｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＺ），０．５％の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ，２．５ｍＭのＫＣｌ，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，１０ｍＭのＭｇＳＯ4，２０ｍＭのグルコース）を、ＭＭ／ＣＡ＋ＡＭＰ  １００ｍｇ／Ｌプレートに１つとして加えた（Ｐｒｙｏｒ  ａｎｄ  Ｌｅｉｔｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１０：３０９−３１９，１９９７）。
【０２４９】
ヒトｚａｌｐｈａ１１レセプターの正しい発現構築体を宿す細胞を発現により確認した。細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＭＭ／ＣＡ中で震盪しながら３７℃で２時間培養した。１ｍｌの培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２〜４時間後に、各培養物２５０μｌを２５０μｌの酸洗浄済みガラスビーズならびに５％のβＭＥおよび染料を含む２５０μｌ  Ｔｈｏｒｎｅｒ緩衝液（８Ｍ尿素，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０，１０％グリセロール，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，５％  ＳＤＳ）と混合した。試料に渦をつくって１分間撹拌し、１０分間６５℃に加熱した。２０μｌを、４％〜１２％ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上の各レーンに置いた。ゲルは１ＸＭＥＳ緩衝液中で移動した。陽性のクローンをｐＣＺＲ２２５と呼び、配列分析を行った。ＭＢＰ−ｚａｌｐｈａ１１融合のポリヌクレオチド配列を配列番号５０に示す。
【０２５０】
Ｂ．ヒトｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ融合ポリペプチドの細菌発現
１ｍｌの配列ＤＮＡを、ＢＬ２１株を形質転換するために用いた。細胞に、２．０ｋＶ、２５μＦおよび４００オームで電気パルスをかけた。電気穿孔の後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む０．６ｍｌ  ＭＭ／ＣＡ。
【０２５１】
１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＭＭ／ＣＡ中で、震盪しながら３７℃で２時間細胞を培養した。培養物の１ｍｌを１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２〜４時間後に、各培養物２５０μｌを２５０μｌの酸洗浄済みガラスビーズならびに５％βＭＥおよび染料を含む２５０μｌ  Ｔｈｏｒｎｅｒ緩衝液（８Ｍ尿素，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０，１０％グリセロール，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，５％  ＳＤＳ）と混合した。試料に渦をつくって１分間撹拌し、１０分間６５℃に加熱した。２０μｌを、４％〜１２％ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上の各レーンに置いた。ゲルは１ＸＭＥＳ緩衝液中に移動した。陽性のクローンを、ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ融合タンパク質のタンパク質精製のために培養した（以下の実施例１４）。
【０２５２】
実施例１４
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵からのｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性レセプターの精製
特に断りのない限り、全ての操作を４℃でおこなった。以下の手順により、ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性レセプターポリペプチドを精製した。ｐＣＺＲ２２５構築体を含みｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性レセプター（実施例１３）を発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞をＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ  ＩＩ（１２ｇ／Ｌ  Ｃａｓｉｅｎ、２４ｇ／Ｌの酵母エキス、１１．４ｇ／Ｌのリン酸二カリウム、１．７ｇ／Ｌのリン酸カリウム；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で培養し、０．５％グリセロール中で凍結した。ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ  ＩＩ＋グリセロール中の２０グラムの凍結細胞を用いてタンパク質を精製した。凍結した細胞を解凍し、プロテアーゼインヒビター溶液（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に１：１０で希釈した後、細胞を溶解しｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性レセプタータンパク質を放出した。希釈された細胞は、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ，Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ，Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μｇ／ｍｌのロイペプチン（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および２μｇ／ｍｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）の最終濃度であった。−７〜−１０℃の温度および３０Ｋ  ＰＳＩのＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ細胞破壊システム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ，Ｗａｒｗｉｃｋ，ＵＫ）を用いて細胞を溶解した。希釈された細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓの前後でＡ600の読みにより破壊について確認した。溶解した細胞を１８，０００Ｇで４５分間遠心分離して破壊された細胞のかけらを除き、上清をタンパク質精製に用いた。上清の全目標タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりメーカーの指示に従って決定した。
【０２５３】
２５ｍｌカラムのＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（以下で述べるように調製）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ２．５ｃｍ  Ｄ×１０ｃｍ  Ｈガラスカラムに注いだ。カラムに、１０カラム体積（ＣＶｓ）のＴａｌｏｎ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を詰め重力により平衡化した。上清をＴａｌｏｎメタルアフィニティーレジンにバッチ充填し、終夜震盪した。樹脂を再びカラムに注ぎ、１０カラム体積のＴａｌｏｎ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで重力により洗浄し、１４０ｍｌの溶出緩衝液（Ｔａｌｏｎ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ＋２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）により重力で溶出した。ｔａｌｏｎカラムを５カラム体積の２０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸  ｐＨ５．０（ＭＥＳ，Ｓｉｇｍａ）、５カラム体積の蒸留水により洗浄し、２０％エタノール／０．１％アジ化ナトリウム中に保存した。溶出クロマトグラフィー全体にわたり１４ｍｌのフラクションを集め、２８０および３２０ｎｍの吸光度およびＢＣＡタンパク質分析によりフラクションを読んだ。通過液および洗浄用液体も取っておき分析した。目的とするタンパク質溶出フラクションを溜め、直接Ａｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に詰めた。
【０２５４】
より純粋なｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ  ポリペプチドを得るため、ｔａｌｏｎアフィニティー溶出の溜めて置いたフラクションを、ｐＨ７．４でＡｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ（２２ｍｌ）にかけた。２．５ｃｍ  Ｄ×１０ｃｍ  Ｈ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  カラムを注ぎ、詰め、１０カラム体積のＡｍｙｌｏｓｅ平衡緩衝液−２０ｍＭのＴｒｉｓ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、１００ｍＭのＮａＣｌ（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）、１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのβメルカプトエタノール（ＢＭＥ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）ｐＨ７．４中で平衡化した。試料を０．５ｍｌ／分の流量で重力により詰めた。カラムを、１０カラム体積のアミロース平衡緩衝液で洗浄し、約２カラム体積のアミロース平衡緩衝液＋１０ｍＭマルトース（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で重力により溶出した。溶出クロマトグラフィー全体にわたり５ｍｌのフラクションを集め、２８０および３２０ｎｍの吸光度を読んだ。アミロースカラムを、１カラム体積の蒸留水、５カラム体積の０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ）、５カラム体積の蒸留水、次いで５カラム体積のアミロース平衡緩衝液で再生した。
【０２５５】
目的とするフラクションを溜めておき、４×４ＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ）を用いＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）で透析し、低分子量の汚染物質を除き、緩衝液交換および脱塩した。ＰＢＳの変更の後、得られた物質は、精製されたｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを表していた。精製されたｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマジー染色および抗ウサギＨＲＰ複合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を用いたウェスタンブロット分析で分析した。ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドの濃度は、ＢＣＡ分析で測定すると１．９２ｍｇ／ｍｌであった。
【０２５６】
精製されたｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドをウサギへの注射用に調製し、抗体製造のためＲ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）に送った。ウサギに注射し、抗−ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈ血清（以下の実施例１５）を製造した。
【０２５７】
実施例１５
ｚａｌｐｈａ１１ポリクローナル抗体
２匹のメスニュージーランドホワイトラビットを、精製されたｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチド（実施例１４）または精製された組換えｚａｌｐｈａ１１  ＣＥＥ  可溶性レセプター（実施例１１Ａ）で免疫処置することにより、ポリクローナル抗体を調製した。対応するポリクローナル抗体を、それぞれウサギ抗−ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈおよびウサギ抗−ｈｕｚａｌｐｈａ１１−ＣＥＥ−ＢＨＫと呼ぶ。ウサギにはそれぞれ、フロイントの完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中の精製タンパク質２００ｍｇの初期の腹腔内（ＩＰ）注射をし、その後フロイントの不完全アジュバント中の精製タンパク質１００ｍｇのブースターＩＰ注射を３週間毎に行った。３回目のブースター注射の投与７〜１０日後に、ウサギから血を採取し血清を集めた。次いでウサギにブーストを施し、３週間毎に採血した。
【０２５８】
ｚａｌｐｈａ１１特異性ポリクローナル抗体は、ＣＮＢｒ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥのグラムあたり１０ｍｇの精製ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチド（実施例１４）を用いて調製されたＣＮＢｒ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂ  プロテインカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）を用い、次いでＰＢＳ中での２０Ｘ透析により、ウサギ血清からアフィニティー精製した。ｚａｌｐｈａ１１特異性抗体を、１ｍｇ／ｍｌの適当なタンパク質抗原を抗体標的として用いＥＬＩＳＡ力価検定によりキャラクタリゼーションした。ウサギ抗−ｈｕｚａｌｐｈａ１１／ＭＢＰ−６Ｈアフィニティー精製された抗体の検出下限（ＬＬＤ）は、５００ｐｇ／ｍｌの希釈度であった。ウサギ抗−ｈｕｚａｌｐｈａ１１−ＣＥＥ−ＢＨＫアフィニティー精製された抗体の検出下限は、５０ｐｇ／ｍｌの希釈度であった。
【０２５９】
実施例１６
ＲＴ−ＰＣＲを用いたｚａｌｐｈａ１１レセプターを発現する細胞の同定
特定種類のヒトの細胞を単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりｚａｌｐｈａ１１発現についてスクリーニングした。１００μｍナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ（商標）；Ｂｅｃｔｉｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を通した機械的分裂により、Ｂ細胞を新鮮なヒトの扁桃から単離した。Ｂ細胞懸濁液を、ＶａｒｉｏＭＡＣＳ  ＶＳ＋磁気カラムおよびＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）でメーカーの指示どおりポジティブ選択することにより、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に対してエンリッチした。ヒトアフェレーシス血液試料からＴ細胞および単核細胞を単離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞はＣＤ３マイクロビーズＶａｒｉｏＭＡＣＳポジティブ選択により精製し、単核細胞はメーカーの指示どおりＶａｒｉｏＭＡＣＳネガティブ選択カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて精製した。各母集団からの試料を染色し、蛍光抗体細胞分類（ＦＡＣＳ）（Ｂｅｃｔｉｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）分析により分析してエンリッチパーセントおよび得られた収率を求めた。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は約９６％の純度であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞は約９５％の純度であり、単核細胞は約９６％の純度であった。
【０２６０】
休息中および活動中のこれら３種の細胞から、当業界で標準的な方法を用いてＲＮＡを調製した。上述のカラム調製法から直接休息中細胞からＲＮＡを単離した。ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびイオノマイシン０．５μｇ／ｍｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むＲＰＭＩおよび１０％ＦＢＳ中で、５００，０００細胞／ｍｌで、４時間および２４時間培養することにより活性化した。単核細胞は、ＬＰＳ  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）およびｒｈＩＦＮ−ｇ  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＲＰＭＩおよび１０％  ＦＢＳ中で２４時間培養することにより活性化した。細胞を取り入れＰＢＳ中で洗浄した。メーカーの指示どおりＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（商標）Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて細胞ペレットからＲＮＡを調製し、第一鎖ｃＤＮＡ合成を、メーカーの指示どおりＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（商標）Ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて行った。
【０２６１】
オリゴＺＣ１９９０７（配列番号２０）およびＺＣ１９９０８（配列番号２１）をＰＣＲ反応に用いて、上述の試料をｚａｌｐｈａ１１メッセージに対応する１．２ｋｂフラグメントについてスクリーニングした。Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＲＬ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）でＰＣＲ増幅を行い、条件は以下のとおりである。９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で３０秒で３５サイクル；７２℃で１０分間１サイクル；および４℃で浸漬である。それぞれ５０μｌの反応容積の１０μｌを２％アガロース１ＸＴＡＥゲル上で流し、得られた生成物を同定した。ＰＣＲ生成物は、（−）生成物なし、（＋）バンドが見える、（＋＋）バンドがよりはっきり存在するおよび（＋＋＋）最もはっきりしたバンドで評価し、結果を表５に示す。
【０２６２】
第５表
ｃＤＮＡ供給源        活性化            ＰＣＲ生成物
ＣＤ１９＋細胞      ０時間休止              ＋
４時間活性化            ＋＋
２４時間活性化          ＋＋＋  
ＣＤ３＋細胞        ０時間休止              −
４時間活性化            ＋＋
２４時間活性化          −      
単球                ０時間休止              −
２４時間活性化          −
【０２６３】
これらの結果は、zalpha11のメッセージが休止ヒトＣＤ１９＋ Ｂ細胞に存在し、マイトジェン活性と共に増大することを示した。さらにそれは、わずか４時間の活性化の後にヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞によって発現されるようである。休止または活性化ヒト単球のいずれにも、明らかなメッセージはなかった。
【０２６４】
実施例１７
Zalpha11免疫組織化学
Ａ．細胞および組織の調製
正の対照組織は、zalpha11（実施例７）によりトランスフェクトされたＢａＦ３細胞、ならびに、ＨＳＤ（Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、ＩＮ）より受領したマウスリンパ節、脾臓および胸腺、Regional Primate Research Center（ワシントン大学、シアトル、ＷＡ）より受領したサルリンパ節および脾臓、ＣＨＴＮ（クリーブランド、ＯＨ）より受領したヒトリンパ節および脾臓、を包含するzalpha11を発現することが知られているリンパ球様組織で構成されていた。各組織試料について実施された負の対照は、（１）トランスフェクトされていないＢａＦ３細胞、（２）zalpha11を発現しないことが知られているマウスおよびヒト由来の肝および脳、（３）一次抗体の不在下での抗体希釈緩衝液（Ventann Bioteck Systems、タクソン、ＡＺ）での染色、および（４）競合実験におけるzalpha11可溶性蛋白の使用、を包含していた。
【０２６５】
他の細胞試料を調査した。刺激していないおよび刺激したＨＬ６０細胞の両方を検定した。ＨＬ６０細胞は前骨髄球性セルラインであり、異なる試薬によって骨髄性または顆粒球系統へと分化することができる。刺激されたＨＬ６０試料は以下のように調製した：（１）ＨＬ６０細胞を１０ng/mLのホルボール-ミリステート-アセテート（ＰＭＡ）(Sigma、セントルイス、ＭＯ)で４８時間処理して、単球系列の細胞へと分化させ；そして、（２）ＨＬ６０細胞を１.２５％ＤＭＳＯ（Sigma）で４日間処理して好中球様細胞へと分化させた。さらに、新鮮なヒト血液由来の、ヒト多形核（ＰＭＮ）細胞、ヒト顆粒球、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）およびヒト単球を調査した（当分野での常法を用いて社内で調製した）。上記の細胞および組織を１０％のＮＢＦ（Surgipath、リッチモンド、ＩＬ）中で一夜固定し、パラフィンＸ−ｔｒａ（Oxford Scientific、セントルイス、ＭＯ）に包埋し、Reichart-Jung 2050 microme（Leica Instruments GmbH、ヌスロッホ、ドイツ）で５μmの切片を作成した。
【０２６６】
Ｂ．免疫組織化学
組織スライドを脱パラフィン化し、緩衝液（水）に水和させ、Antigen Retrieval Citra緩衝液（BioGenex、サンローマン、ＣＡ）中２０分間の蒸気ＨＩＥＲ処理に付した。非特異結合をブロックするため、５％正常ヤギ血清（Vector、バーリンガム、ＣＡ）を１０分間使用した。zalpha11可溶性レセプター蛋白に対するポリクローナル抗体（ウサギ抗huzalpha11−ＭＢＰ−６Ｈおよびウサギ抗huzalpha11−ＣＥＥ−ＢＨＫ；実施例１５を参照されたい）を一次抗体として使用し、それぞれ１：２００および１：４００の希釈で免疫組織化学的スクリーニング分析を実施した。二次抗体として、ビオチンコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector；Cat.No.BA-1000、１.５mg/mL）を１：２００の希釈で使用した。別の試料において、一次抗体の免疫反応をプレブロックするため、一次抗体に対するzalpha11ＣＥＥ可溶性レセプター蛋白（１０倍過剰）(実施例１１Ａ)をさらに使用することにより、蛋白の競合を実施した。この競合は、zalpha11に対するウサギポリクローナル抗体の特異性についての対照として使用した。検出は、製造者の指示に従いChemMate DABキット（ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを適用した標識化ストレプトアビジン−ビオチンキット、およびＤＡＢ基質）、そして製造者のヘマトキシリン対比染色を３０秒間使用して（Ventana Biotek Systems、タクソン、ＡＺ）、Ventana ChemMate 500装置で実施した。
【０２６７】
ＰＭＡ活性化ＨＬ−６０細胞に、zalpha11の高い発現が観察された。刺激無しのＨＬ６０細胞およびＰＢＬでは低いレベルの発現が観察された。マウスの脾臓、胸腺およびリンパ節の細胞のサブセットは正の染色を示した。ヒトおよびサルのリンパ節および脾臓の両細胞、ならびにＤＭＳＯ刺激したＨＬ６０細胞は、ごく僅かな染色を示し、または全く染色を示さなかった。細胞および組織に認められたシグナルは、過剰のzalpha11可溶性受容体蛋白を使用することにより、ほぼ競合した。脳および肝の負の対照組織は染色を示さなかった。
【０２６８】
実施例１８
zalpha11可溶性受容体に対するポリクローナルウサギ抗血清を使用した、zalpha11受容体を発現する末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）の同定
健常なドナーから新鮮なヘパリン処理した血液２００mLを得た。血液をＰＢＳで１：１に希釈し、Ficoll-Paque PLUS勾配（Pharmacia Biotech、ウプサラ、スウェーデン）を用いて分離し、リンパ球界面を採集した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＲＭＩ＋５％ＦＢＳ培地に２ｘ１０6細胞／mLの濃度で再懸濁した。
【０２６９】
zalpha11レセプターの発現がリンパ球細胞の活性化状態、即ち休止および活性化細胞の違いにより影響を受けるかどうかを判定するため、幾つかの刺激条件を使用した：１）非刺激、即ち培地のみ（ＲＰＭＩ＋５％ＦＢＳ培地）；２）ＰＭＡ１０ng/mL＋イオノマイシン０.５μg/mL（共にCalbiochemより）；および、３）ＰＨＡ活性化（フィトヘマグルチニン−Ｐ、Difco/VWR）。細胞を３７℃で１７時間インキュベートし、次いで染色のために採集してzalpha11レセプターの発現を検出した。
【０２７０】
間接染色プロトコルを使用した。簡潔に述べると、ヒトリンパ球細胞を染色緩衝液（ＰＢＳ＋０.０２％ＮａＮ3＋ＢＳＡ１％正常ヒト血清２％）に懸濁し、９６ウェル平板に２ｘ１０5細胞を５０μL/ウェル蒔いた。zalpha11 CEE可溶性レセプターに対する抗体（実施例１５）を使用して、それらが、単離されたヒトリンパ球上のＢ細胞（ＣＤ−１９）、Ｔ細胞（ＣＤ−３）または単球マーカーを含むかどうかを決定した。１０μg/mLのzalpha11可溶性レセプターに対するウサギポリクローナル血清（Ｒｂ抗huzalpha11−ＣＥＥ−ＢＨＫ）(実施例１５)を、リンパ球上のzalpha11を同定するための抗体として使用した。二次抗体、ヤギ抗ウサギＩｇ−ＦＩＴＣ（Biosource、カマリロ、ＣＡ）を使用して、zalpha11レセプターに対するＲｂ抗huzalpha11−ＣＥＥ−ＢＨＫ抗体の結合を視覚化した。Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球といった細胞型における抗zalpha11レセプター抗体の同時染色を同定するために、他の抗体を同時使用してＴ細胞（ＣＤ３−ＰＥ；PharMingen、サンディエゴ、ＣＡ）、Ｂ細胞（ＣＤ１９−ＰＥ）(PharMingen)、および単球（ＣＤ−１４−ＰＥ）(PharMingen)を染色した。種々の対照を使用して、非特異結合および染色のバックグラウンド結合を決定した：（１）無関係なウサギポリクローナル血清を非特異対照として使用し；そして、（２）その試薬のバックグラウンドレベルを決定するため、二次抗体のみを使用した。精製したzalpha11ＣＥＥ可溶性レセプター（実施例１１）を競合的インヒビターとして約１０倍過剰で使用し、zalpha11可溶性レセプターに対するウサギ抗huzalpha11−ＣＥＥ−ＢＨＫ抗体の特異性を確認した。
【０２７１】
細胞を平板培養し、一次および同時染色抗体を添加した後、細胞を氷上で３０分間インキュベートし、染色緩衝液で２回洗浄し、二次抗体、ヤギ抗ウサギＩｇ−ＦＩＴＣ（Biosource）により氷上で３０分間染色した。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、約１μg/mLの最終濃度で生存染色剤７ＡＡＤを含有する染色緩衝液中に、ウェル当たり２００μLで再懸濁した（Sigma、セントルイス、ＭＯ）。ＦＡＣＳ−Caliber（Becton-Dickinson、サンノゼ、ＣＡ）で試料を読み取り、生存細胞を分析した。
【０２７２】
zalpha11レセプターに対するウサギポリクローナルは休止Ｂ細胞を染色した。休止Ｂ細胞上のシグナルは、無関係のウサギ血清を用いて達成されたシグナルより明確であり、そしてこのシグナルは、過剰のzalpha11−ＣＥＥ可溶性レセプターの添加により、Ｔ細胞よりもＢ細胞上で、より大きく低減した。分離されたＢおよびＴ細胞を用いてこの実験を反復したが、結果は極めて似かよっていた。さらに、zalpha11レセプターに対するポリクローナルウサギ抗huzalpha11−ＣＥＥ−ＢＨＫ抗体による染色は、休止Ｂ細胞で最も高かった。
【０２７３】
実施例１９
リアルタイム定量的ＲＴ／ＰＣＲを用いた種々の組織でのzalpha11レセプター発現
Ａ．定量的ＲＴ−ＰＣＲ−のためのプライマーおよびプローブ
ABI PRISM７７００配列検出システム（PE Applied Biosystems,Inc.、フォスターシティー、ＣＡ）を用いるリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲは過去に記載されている（Heid,C.A.等、Genome Research 6:986-994、1996；Gibson,U.E.M.等、Genome Research 6:995-1001、1996；Sundaresan,S.等、Endocrinology 139:4756-4764、1998。この方法は、リポーターおよび消去剤蛍光色素の両者を含有する遺伝子特異的プローブの使用を取り入れている。プローブが無傷である時、リポーター色素の放射は、消去剤色素が接近しているため、打ち消される。さらなる遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲ伸長の最中に、このプローブがＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂し、それによりリポーター色素がプローブから開放され、その結果、蛍光放出の増大が起こる。
【０２７４】
zalpha11発現のリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用するプライマーおよびプローブは、プライマー設計ソフトウェアPrimer Express(商標)(PE Applied Biosystems、フォスターシティー、ＣＡ)を用いて設計した。ヒトzalpha11のためのプライマーは、ゲノムＤＮＡの増幅を排除するためイントロン−エクソン接合部をつないで設計した。フォワードプライマーＺＣ２２２７７（配列番号５９）およびリバースプライマーＺＣ２２２７６（配列番号６０）を約３００nM濃度でＰＣＲ反応に使用して（下記）１４３bpの生成物を合成した。ＺＧ３１（配列番号６１）と呼称される、対応するzalpha11 TaqMan(商標)プローブを合成し、PE Applied Biosystemsによって標識した。このZG31プローブは、リポーター蛍光色素（６−カルボキシ−フルオレセイン）(ＦＡＭ)(PE Applied Biosystems)によって５’末端を、そして消去剤蛍光色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）(ＴＡＭＲＡ)(PE Applied Biosystems)によって３’末端を標識した。
【０２７５】
試験されたＲＮＡ試料の完全性および品質を試験する対照として、全てのＲＮＡ試料（下記）を、PE Applied Biosystemsに注文した（cat No.4304483）プライマーおよびプローブの組を用いてｒＲＮＡについてスクリーニングした。このキットは、ｒＲＮＡフォワードプライマー（配列番号６６）およびｒＲＮＡリバースプライマー（配列番号６７）、ｒＲＮＡTaqMan(商標)プローブ（配列番号６８）を含んでいる。このｒＲＮＡプローブは、リポーター蛍光色素ＶＩＣ(PE Applied Biosystems)によって５’末端を、そして消去剤蛍光色素ＴＡＭＲＡ(PE Applied Biosystems)によって３’末端を標識した。ｒＲＮＡの結果はさらに、内因性対照としての役割を有し、被験試料において見られたzalpha11ｍＲＮＡ発現結果の正規化を可能にする。
【０２７６】
ヒトＣＤ３、ＣＤ１９および単球細胞型由来のＲＮＡ試料を調製し、これは上記実施例１６に記載した。対照RNAは、製造者の指示に従い、RNeasy Miniprep(商標)キット（Qiagen、ヴァレンシア、ＣＡ）を用いて、ヒトzalpha11レセプターを発現するおよそ１０００万のＢａＦ３細胞から調製した（実施例７）。
【０２７７】
Ｂ．リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ−
zalpha11ｍＲＮＡの相対レベルを、一段階ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて総ＲＮＡ試料を分析することにより決定した（PE Applied Biosystems）。ヒトzalpha11レセプターを発現するＢａＦ３細胞由来の総ＲＮＡを標準法により単離し、定量用の標準曲線の作成に使用した。この曲線は、ｒＲＮＡスクリーニングについては２.５−２.５ｘ１０-4ng/μLの範囲、そしてzalpha11スクリーニングについては２５０−０.０２５ng/μLの範囲の１０倍連続希釈で構成され、各標準曲線の点は３ずつ分析した。さらにヒトＣＤ３、ＣＤ１９および単球細胞由来の総ＲＮＡ試料を、ヒトzalpha11転写物レベルについて、そして内因性対照としてのｒＲＮＡのレベルについて、３ずつ分析した。総体積２５μLで、各ＲＮＡ試料を、緩衝液Ａ（５０mMＫＣＬ、１０mMトリスＨＣｌ）中の総ＲＮＡおよそ２５ng；内部標準色素カルボキシ−ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；適当なプライマー（ｒＲＮＡ試料のためのｒＲＮＡプライマー（配列番号６６および配列番号６７）およそ５０nM；ならびにzalpha11試料のためのＺＣ２２，２７７（配列番号５９）およびＺＣ２２，２７６（配列番号６０）プライマーおよそ３００nM）；適当なプローブ（ｒＲＮＡ試料のためのｒＲＮＡTaqMan(商標)プローブ（配列番号６８）およそ５０nM、zalpha11試料のためのＺＧ３１（配列番号６１）プローブおよそ１００nM）；ＭｇＣｌ2５.５mM；ｄ−ＣＴＰ、ｄ−ＡＴＰ、およびｄ−ＧＴＰ各３００μM、ならびにｄ−ＵＴＰ６００μM；ＭｕｌＶ逆転写酵素（０.２５U/μL）；AmpliTaq(商標) GoldＤＮＡポリメラーゼ（０.０２５U/μL）(PE Applied Biosystems)；およびＲＮアーゼインヒビター（０.４U/μL）(PE Applied Biosystems)、を含有する一段階ＲＴ−ＰＣＲ反応に付した。ＰＣＲの熱循環条件は以下の通りであった：最初の逆転写（ＲＴ）工程が４８℃３０分間を１サイクル；続いてAmpliTaq Gold(商標)(PE Applied Biosystems)活性化工程が９５℃１０分間を１サイクル；その後、９５℃１５秒間および６０℃１分間の増幅を４０サイクル。
【０２７８】
相対的zalpha11ＲＮＡレベルを、製造者PE Biosystemsによる記載のように標準曲線法を用いて決定した（ユーザー広報No.２：ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム、遺伝子発現の相対的定量、１９９７年１２月１１日）。ｒＲＮＡ測定を用いてzalpha11レベルを正規化し、休止ＣＤ３＋ ＲＮＡ試料を標準物質として使用した。休止ＣＤ３は標準物質として任意に選択し、１.００の数値を与えた。残りの試料を標準物質に対して比較した。データを下の第６表に示す。
【０２７９】
第６表
試料      休止        ４時間の刺激      ２４時間の刺激
ＣＤ３    １.００      １５.２７         １６.７０
ＣＤ１９  ２０.１４    ６５.０８         ２５.４２
単球      ０.０５      データ無し        ０.２６
【０２８０】
４および２４時間では、ＣＤ３＋におけるzalpha11レセプター発現に１５倍の増大があった。休止ＣＤ１９は、休止ＣＤ３＋に比較してレセプター発現で２０倍の増大があった。４時間の刺激では３倍の増大があり、これは２４時間によって休止のレベルに戻った。単球は、この検定では検出可能なzalpha11レセプター発現を示さなかった。
【０２８１】
実施例２０
in situハイブリダイゼーションを用いたzalpha11レセプターを発現する細胞の同定
特異的なヒト組織を単離し、in situハイブリダイゼーションによりzalpha11の発現についてスクリーニングした。調製し、切片作成し、in situハイブリダイゼーションに付した種々のヒト組織は、胸腺、脾臓、扁桃、リンパ節および肺を包含していた。組織を１０％緩衝化ホルマリンで固定し、標準技術によりパラフィンでブロック化した（実施例１７）。組織を４ないし８ミクロンの切片とした。組織は標準プロトコルを用いて調製した（「非同位体のin situハイブリダイゼーションの開発」、http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/ ish.html）。簡潔に述べると、組織切片をHistoClear（National Diagnostics、アトランタ、ＧＡ）で脱パラフィン化し、次いでエタノールで脱水した。次にこれらをプロテイナーゼＫ（５０μg/mL）(Boehringer Diagnostics、インディアナポリス、ＩＮ)を用いて３７℃で２ないし２０分間消化した。この工程の後、組織のアセチル化および再水和を行った。
【０２８２】
ＰＣＲにより作成した２個のin situプローブをヒトzalpha11配列に対して設計した。zalpha11ｃＤＮＡの個別の領域のためのプローブを作成するため、２組のオリゴを設計した：（１）オリゴＺＣ２３，６８４（配列番号６２）およびＺＣ２３，６５６（配列番号６３）を使用してzalpha11のための４１３ｂｐプローブを作成し、そして、（２）オリゴＺＣ２３，６８５（配列番号６４）およびＺＣ２３，６５７（配列番号６５）を使用してzalpha11のための４３０bpプローブを作成した。第二のプローブは第一のzalpha11プローブの１５００ｂｐ ３’である。各組由来のアンチセンスオリゴはまた、これらのＰＣＲ生成物からアンチセンスＲＮＡプローブの容易な転写を可能にするための、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター用の有効配列を含んでいた。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りであった：９４℃３０秒間を３０サイクル、６０℃１分間、７２℃１.５分間。ＰＣＲ生成物をQiagen遠沈カラムにより精製した後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱した。引き続きプローブを、製造者の指示に従い、インビトロ転写系（Promega、マディソン、ＷＩ）を用いてジゴキシゲニン（Boehringer）またはビオチン（Boehringer）で標識した。
【０２８３】
ジゴキシゲニン−またはビオチン−標識したzalpha11プローブ（上記）を用いてin situハイブリダイゼーションを実施した。プローブを、５５−６０℃で１２ないし１６時間、１ないし５pmol/mLの濃度でスライドに添加した。引き続きスライドを２ＸＳＳＣおよび０.１ＸＳＳＣで５０℃で洗浄した。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を用いてシグナルを増幅し（ＴＳＡ、in situ間接キット；ＮＥＮ）、製造者の指示に従いVector Red基質キット（Vector Lab）を用いて視覚化した。次いでこのスライドをヘマトキシリン（Vector Laboratories、バーリンガム、ＣＡ）を用いて対比染色した。
【０２８４】
胸腺、扁桃、肺、およびリンパ節にシグナルが認められた。陽性染色細胞はリンパ球および関連細胞であるように見受けられた。
【０２８５】
実施例２１
マウスzalpha11レセプターの単離
Ａ．マウスゲノムライブラリースクリーニング
全ｃＤＮＡを含むヒトzalpha11受容体ポリヌクレオチドプローブでマウスゲノムライブラリーをプロービングすることにより、最初の部分的マウスzalpha11配列を取得した。ＺＣ１９，９０５（配列番号３６）およびＺＣ１９，９０６（配列番号３７）プライマーを用いるＰＣＲによりヒトzalpha11ｃＤＮＡを作成し、全長ヒトzalpha11を含むプラスミド（例えば実施例１）を鋳型として使用した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９８℃１分間を３５サイクル、６８℃１分間；および７２℃２分間；その後７２℃１０分間を１サイクル。このＰＣＲ生成物を１％低融点アガロース（Boehringer Mannheim）にかけ、製造者の指示に従いQiaquick(商標)ゲル抽出キット（Qiagen）を用いておよそ１.５kbのヒトzalpha11ｃＤＮＡを単離した。このヒトzalpha11ｃＤＮＡを使用してマウスゲノムＤＮＡライブラリー（下記）をスクリーニングした。
【０２８６】
使用したマウスゲノムＤＮＡライブラリーは、ｅｍｂｌ３ ＳＰ６／Ｔ７ラムダＢａｍＨＩクローン化ライブラリー（Clontech、パロアルト、ＣＡ）であった。７.２ｘ１０5pfuを表すこのライブラリーを、２４ ＮＺＹ平板のＥ.Ｃｏｌｉ Ｋ８０２宿主ローン上に蒔いた。製造者の指示に従いHybond-Nフィルター（Amersham Pharmacia、バッキンガムシア、イングランド、英国）を用いてプラークの釣り上げを行った。このフィルターを１.５ＭのＮａＣｌおよび０.５ＭのＮａＯＨ中で１０分間変性し、次いで１.５ＭのＮａＣｌおよび０.５Ｍのトリス−ＨＣｌ（pH７.２）で１０分間中和した。ＤＮＡをSTRATALINKER UVクロスリンカー（Stratagene）を用いて１２００ジュールでフィルターに付着させた。フィルターは、プレ洗浄緩衝液（０.２５ｘＳＳＣ、０.２５％ＳＤＳおよび１mMＥＤＴＡ）中、溶液を３回交換して合計４５分間６５℃でプレ洗浄して細胞残屑を除去した。このフィルターを、０.１mg/mL変性鮭精子ＤＮＡを含有するExpresshyb(商標)溶液（Clontech）中、５０℃で一夜プレハイブリダイズした。およそ５０ngの精製したヒトzalpha11ｃＤＮＡ（上記）を、製造者の指示に従いRediprime II Random Prime Labelig System(Amersham Pharmacia)を用いて32Ｐで標識した。取り込まれなかった放射性をNucTrap(商標)プッシュカラム（Stratagene、ラホーヤ、ＣＡ）を用いてzalpha11ｃＤＮＡプローブから除去した。約０.５ないし約１ｘ１０6cpm/mLのzalpha11ｃＤＮＡプローブ、約０.１mg/mLの変性鮭精子ＤＮＡおよび変性させた０.５μg/mLのcot-1ＤＮＡを含有するExpresshyb(商標)溶液（Clontech）中でフィルターをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは５０℃で一夜実施した。フィルターを２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、室温で２時間洗浄し（洗浄液を数回交換）、次に温度を１時間６０℃に上げた（緩衝液を１回交換）。−８０℃で一夜暴露すると一次単離物を表す６個のプラークが示された。
【０２８７】
二次プラーク単離物を取得するため、一次単離物であるこの６個のプラークをパスツールピペットで釣り上げ、クロロホルム数滴を含有するＳＭ（０.１MＮａＣｌ、５０mMトリスpH７.５、１０mMＭｇＳＯ4、０.０２％ゼラチン）中４℃で一夜溶離した。ファージの力価を決定した後、６個の一次単離物の最初のplug(１２.５倍のカバレッジ)にあるファージの推定量の約１２.５倍を、ＮＺＹマクシ平板上の１０mM ＭｇＳＯ4／ＮＺＹトップアガロースに植えたＥ.ｃｏｌｉ Ｋ８０２細胞のローン上に蒔いた。プラークの釣り上げは、製造者の指示に従いHybond-Nフィルター（Amersham Pharmacia）を用いて行った。フィルターを上記のように固定した。二巡目のフィルターは細胞残屑を除くためプレ洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳおよび１mMＥＤＴＡ）中、計４５分間の間に３回溶液を交換しながら、６５℃でプレ洗浄した。次いで二巡目のフィルター釣り上げ物をプレハイブリダイズし、zalpha11ｃＤＮＡプローブを上記のように調製した。二巡目のフィルターを、約０.１mg/mLの変性鮭精子ＤＮＡを含有する約１０6cpm/mLのzalpha11ｃＤＮＡプローブを含むExpresshyb(商標)溶液（Clontech）中で上記のようにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは５０℃で一夜実施した。一次スクリーニングについて上に述べた洗浄条件をこの二次スクリーニングについて反復した。−８０℃で一夜暴露させた後、最初の６個の一次プラーク単離物のうち２個を、二次スクリーニングにおいて陽性であると確認した。二次スクリーニングにおいてヒトzalpha11ｃＤＮＡとハイブリダイズする陽性プラークをパスツールピペットで釣り上げ、７ｂ１および２０ｂ１と命名した。
【０２８８】
単離したプラーク７ｂ１および２０ｂ１番をＳＭ ２００μLで、４℃で一夜溶離した。各単離物の１０-2ないし１０-6までの範囲の１０倍連続希釈物を宿主Ｅ.Ｃｏｌｉ Ｋ８０２細胞上に蒔いて力価を決定した。単離物２０ｂ１は４ｘ１０3pfu/μLの力価を持ち、これをさらに追跡した。ファージＤＮＡ調製物を作成するため、１０5pfu/平板を密集状態の宿主Ｅ.Ｃｏｌｉ Ｋ８０２細胞上に蒔くことにより、４枚の平板を調製した。平板を、ファージの溶菌が融合状態となり始めるまで３７℃で約６.５時間増殖させた。次いでこのファージを平板当たりＳＭ１２mLで４℃で一夜溶離した。次に平板を室温で１時間振盪し、上清を除去し、１％クロロホルムを加え、上清を再度１５分間振盪した。２０ｂ１ファージＤＮＡはWizard Lambda PrepsＤＮＡ精製系（Promega、マディソン、ＷＩ；セクションIVおよびVI）を用いて調製した。
【０２８９】
２０ｂ１ファージDNAの試料を幾つかの制限酵素で切断し、サザンブロッティング用のＤＮＡフラグメントを作成した。この消化物を１％ＴＢＥアガロースゲルにかけた。このゲルを０.２５ＭのＨＣｌに３０分間浸漬し、蒸留したＨ2０ですすぎ、溶液を１回交換しながら０.５ＭのＮａＯＨおよび１.５ＭのＮａＣｌに４０分間浸漬し、溶液を１回交換しながら１.５ＮａＣｌおよび０.５トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.２）で４０分間中和した。TURBOBLOTTER(商標) 迅速下方移動系（Schleicher & Schuell、キーン、ＮＨ）を準備してNytran/BA-Sメンブレン（Schleicher & Schuell）上にＤＮＡを移した。このＤＮＡをSTRATALINKERＵＶクロスリンカー（Stratagene、ラホーヤ、ＣＡ）を用いて１２００ジュールでNytranに付着させた。ブロットを上記のようにプレハイブリダイズした。ヒトzalpha11ｃＤＮＡ 約５０ngを上記のように標識しプローブについて精製した。zalpha11ｃＤＮＡプローブ約１０6cpm/mLおよび変性鮭精子ＤＮＡ約０.１mg/mLを含有するExpresshyb(商標)溶液（Clontech）中で上記のようにフィルターをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは５０℃で一夜実施した。ブロットを上記のように洗浄し、−８０℃で一夜フィルムに暴露した。
【０２９０】
サザンは、ＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ消化物から生成したＤＮＡフラグメントを示し、これは予想されたサイズ範囲１.３ないし１.６kbでヒトzalpha11ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。このフラグメントを追跡した。２０ｂ１ラムダＤＮＡおよそ３μgをＢａｍＨＩ（Boehringer Mannheim、インディアナポリス、ＩＮ）２０単位およびＳｔｕＩ（ＮＥＢ、ビヴァリー、ＭＡ）２０単位を用いて３７℃で２時間切断した。消化物を１％ＴＢＥゲルにかけ、１.３kbダブレットおよび１.６kbダブレットバンドをゲルから切り取り、このＤＮＡをQiaquickゲル抽出キット（Qiagen、ヴァレンシア、ＣＡ）を用いてアガロースから抽出した。この調製物からのＤＮＡ収率が低かったため、ヒトzalpha11ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズしたフラグメントがＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩであったのか、それともＳｔｕＩ／ＳｔｕＩフラグメントであったのかをさらなる制限消化分析によって判定することはできなかった。したがって、Zero BluntＰＣＲクローニングキット（Invitrogen、カールスバッド、ＣＡ）を用いて、１.３kbダブレットフラグメント５μLおよび１.６kbダブレットフラグメント５μLを使用する平滑ライゲーションを行った。この平滑ライゲーションは、１.６kbフラグメントの両方および１.３kbフラグメントの一方を伴う陽性クローンを生成した。これらのクローンをＥｃｏＲＩ（Life Technologies）で消化したが、これはＴ−突出部位に隣接し、ここに１.６および１.３kbフラグメントが挿入された。どちらがヒトzalpha11ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズする元のフラグメントであるかを判定するため、もう一つのサザンブロットを実施した。１％ＴＢＥゲルを処理し、ＤＮＡを上記のようにNytranブロットに移した。
【０２９１】
ブロットを上記のようにハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌ中でプレハイブリダイゼーションさせた。別のヒトｚａｌｐｈａ１ポリヌクレオチドのプローブを調製した。さらに全長ｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡのヒトのｚａｌｐｈａ１断片をオリゴＺＣ１９，９０５（配列番号３６）およびＺＣ２０，０９７（配列番号２７）とのＰＣＲによるプローブとして用いるため生成させた。ＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。９５℃で１分間；９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間を３５サイクル；続いて７２℃で１０分間を１サイクル。ＰＣＲ生産物を低融点の１％アガロース（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に流し、約１．５ｋｂのヒトのｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の手引き書に従って単離した。この単離したヒトのｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡ断片約５０ｎｇを32Ｐで標識し、上記に従って精製した。フィルターを、ｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡプローブ約１０6ｃｐｍ／ｍｌ、変性したサケの精液約０．１ｍｇ／ｍｌ、および変性したｃｏｔ−１ＤＮＡ０．５μｇ／ｍｌを含有するＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ（商標）溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で上記のようにハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は上記の記載のとおりである。ブロットを−８０℃で１．５時間フィルムに暴露したところ、１．３ｋｂ挿入物はヒトのｚａｌｐｈａ１プローブと強くハイブリダイゼーションしていた。
【０２９２】
このクローンを配列決定し、終止コドンおよび上流のイントロン配列を有するマウスのｚａｌｐｈａ１の３′をコードエキソンを含むことが分かった。用いた配列決定用プライマーは、ＺＣ３,４２４（配列番号８６）、ＺＣ６９４（配列番号８７）、ＺＣ２４，３９９（配列番号８８）、およびＺＣ２４，４００（配列番号８９）であった。３′エキソンを含むマウスのｚａｌｐｈａ１のゲノム配列は、配列番号６９に示される。３′エキソンコード配列は、２４０個のアミノ酸のエキソン（配列番号７０）をコードする配列番号６９中の５４３番ヌクレオチドで始まり、１２６２番ヌクレオチドで終わる。
【０２９３】
Ｂ．マウスｃＤＮＡパネルのＰＣＲスクリーニング
入手可能なインハウスの市販マウスｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のパネルを、プライマーとしてＺＣ２４，４３２（配列番号７１）およびＺＣ２４，４３３（配列番号７２）（それぞれ２０ｐモル）を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。９４℃で２分間；９４℃で２０秒間、６４℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３２サイクル；続いて７２℃で５分間を１サイクル。マウスの脾臓、樹枝状細胞、新生皮膚、骨髄、野生型ＢａＦ３細胞、ＥＬ４細胞、および肺は、予想された４５０ｂｐサイズの強いＰＣＲ生産物を示した。
【０２９４】
Ｃ．５′入れ子ＲＡＣＥ
５′ＲＡＣＥ反応を、プライマーＺＣ９，７３９（配列番号７３）およびＺＣ２４，４３４（配列番号７４）それぞれ２０ｐモルと、鋳型としてＣＤ＋で選択されたマウスの脾臓のマラソンｃＤＮＡを用いて行なった。マラソンｃＤＮＡは、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造業者の手引き書に従って調製した。ＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。９４℃で１分間；９４℃で２０秒間および７０℃で１．５分間を５サイクル；続いて９４℃で２０秒間、６４℃で２０秒間、および７０℃で１．５分間を２５サイクル；続いて７２℃で５分間を１サイクル。
【０２９５】
マウスのｚａｌｐｈａ１の５′ＲＡＣＥ生産物を富化するために、入れ子５′ＲＡＣＥ反応を、入れ子プライマーＺＣ２４，４３１（配列番号７５）およびＺＣ９，７１９（配列番号７６）と、鋳型として始めの５′ＲＡＣＥ反応物（上記）の１／２０希釈物１μｌとを用いたことを除いて、始めの５′ＲＡＣＥについて上記に記載したＰＣＲ反応条件を用いて行なった。生成物をゲル電気泳動により精製し、ＤＮＡをＱｉａｅｘ  ＩＩ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて希釈し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローン化した。ポジティブクローンを、ＺＣ２４，４３１（配列番号７５）およびＺＣ２４，５１１（配列番号７７）それぞれ１０ｐモルを用いてコロニーＰＣＲにより同定した。ＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。９４℃で２分間；９４℃で２０秒間、６４℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間を３５サイクル；続いて７２℃で５分間を１サイクル。入れ子５′ＲＡＣＥ反応物各々からとった２つのサブクローンを配列決定した。全てのクローンが若干のｚａｌｐｈａ１配列を含有したが、完全なものはなかった。編集された配列を、不完全な５′ＲＡＣＥクローンと、マウスのｚａｌｐｈａ１ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの先行部分の配列を表す３′エキソン配列（配列番号７０）とから生成させた。部分的なマウスのｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡの先行配列は配列番号７８（５′末端）および配列番号８０（３′末端）に示され、配列番号７８（５′末端）と配列番号８０（３′末端）の間には完全なマウスのｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡを含む約３３０個の未知の配列がある（下記を参照）。配列番号７８および配列番号８０に対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７９（Ｎ末端）および配列番号８１（Ｃ末端）に示す。
【０２９６】
Ｄ．全長ＰＣＲ
プライマーを、全長のＰＣＲに対してマウスの開始Ｍｅｔの上流ＵＴＲおよび終止コドンの下流から設計した。プライマーＺＣ２４，６１６（配列番号８２）およびＺＣ２４，６１５（配列番号８３）各２０ｐモルを、マウスの樹枝状細胞のマラソンｃＤＮＡまたは新生児マウスの皮膚のインハウスｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用するＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲの反応条件は下記のとおりである。９４℃で１分間；９４℃で２０秒間および６６℃で２分間を３０サイクル；続いて７２℃で５分間を１サイクル。ＰＣＲ生成物をゲル電気泳動により精製し、ｃＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて希釈し、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローン化した。各ＰＣＲ反応物からとった２つのサブクローンを配列決定した。用いた配列決定用プライマーは、ＺＣ６９４（配列番号８７）、ＺＣ３，４２４（配列番号８６）、ＺＣ２４，４３１（配列番号７５）、ＺＣ２４，５１１（配列番号７７）、ＺＣ２４，８０６（配列番号９０）、およびＺＣ２４，８０７（配列番号９１）であった。全長マウスのｚａｌｐｈａ１ｃＤＮＡの配列は配列番号８４に示される。対応するアミノ酸配列は配列番号８５に示される。
例示のために本明細書に本発明の特殊な実施形態を記述したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずにさまざまな改変を行なうことができることは上記の記載から理解されるであろう。したがって本発明は添付の特許請求の範囲によることを除いては限定されない。
【図１Ａ】
2011015700.tif 000003
【図１Ｂ】
2011015700.tif 000004
【図１Ｃ】
2011015700.tif 000005
【図１Ｄ】
2011015700.tif 000006
【図１Ｅ】
2011015700.tif 000007
【図１Ｆ】
2011015700.tif 000008
【図１Ｇ】
2011015700.tif 000009
【図１Ｈ】
2011015700.tif 000010
【図１Ｉ】
2011015700.tif 000011
【図１Ｊ】
2011015700.tif 000012
【図１Ｋ】
2011015700.tif 000013
【図１Ｌ】
2011015700.tif 000014
【図２Ａ】
2011015700.tif 000015
【図２Ｂ】
2011015700.tif 000016
【配列表】
2011015700000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月12日(2010.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される１２６番ヌクレオチドから１６８２番ヌクレオチドまでのポリヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
作用可能式に結合した下記の要素：
転写プロモーターと、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと、
転写ターミネーターとを含む発現ベクターであって、前記プロモーターがＤＮＡセグメントと作用可能式に結合し、前記ＤＮＡセグメントが転写ターミネーターと作用可能式に結合している、発現ベクター。
【請求項４】
さらにＤＮＡセグメントと作用可能式に結合した分泌シグナル配列を含む、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、前記細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項６】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築体であって、前記ＤＮＡ構築体が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする第一ＤＮＡセグメントと、
追加のポリペプチドをコードする少なくとも１個の別のＤＮＡセグメントとを含む構築体であって、
前記第一ＤＮＡセグメントおよび別のＤＮＡセグメントがイン・フレームで結合し、かつ前記第一ＤＮＡセグメントおよび別のＤＮＡセグメントが融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ構築体。
【請求項７】
作用可能式に結合した下記の要素：
転写プロモーターと、
請求項６に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築体と、
転写ターミネーターとを含む発現ベクターであって、前記プロモーターがＤＮＡ構築物と作用可能式に結合し、前記ＤＮＡ構築体が転写ターミネーターと作用可能式に結合している、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、前記細胞がＤＮＡ構築体によりコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を培養することと、前記細胞により生成したポリペプチドを単離することを含む融合タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸残基の配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドに対する抗体の製造方法であって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるポリペプチドであって、動物中の免疫応答を誘発して抗体を生成させるポリペプチドを動物に接種すること、および
前記動物から抗体を単離することを含む、方法。
【請求項１２】
ｚａｌｐｈａ１１ポリペプチドと特異的に結合する請求項１１の方法により製造された抗体。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１０に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が抗原結合断片、遺伝子工学処理無傷抗体または断片、およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
抗原結合断片がＦ（ａｂ‘）2またはＦａｂ断片である、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
遺伝子工学処理無傷抗体または断片がキメラ抗体、Ｆｖ断片、または一本鎖抗体である、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
試験試料と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドとを接触させること、および
ポリペプチドと試料中のリガンドとの結合を検出することを含む、試験試料内のｚａｌｐｈａ１１受容体のリガンドの検出方法。
【請求項２０】
ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸番号２０（Ｃｙｓ）からアミノ酸番号５３８（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ検出のステップが培養した細胞中の生物学的応答の測定を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的応答が細胞の増殖またはリポーター遺伝子の転写の活性化である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドを固体の担体上で固定化する、請求項１９に記載の方法。