(57)【要約】【課題】アミノ酸の発酵産生のために有用な、新規の細菌株、方法およびプロセスを提供すること。【解決手段】本発明は、新規な微生物、その産生のための方法、およびアミノ酸の産生のための新規なプロセスを提供する。親細菌株の変異誘発、および改善されたラフィネート耐性の表現型の選択により、より多量のアミノ酸を産生する増強された増殖特性を有する株の単離が可能となる。本発明の微生物は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍのようなアミノ酸産生親株から産生され、特に好ましくは、Ｌ−リジンを産生する親株である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、微生物学および微生物遺伝学の分野に関する。より詳細には、本発明は、アミノ酸の発酵産生のために有用な、新規の細菌株、方法およびプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａは、アミノ酸の発酵産生のために有用であるという認識（Ｓ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２：４６４〜４６８（１９５７））に従って、Ｌ−リジンの工業的生産は、経済的に重要な産業プロセスになった。この必須アミノ酸の商業的生産は、主に、グラム陽性のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍを利用して行われる（Ｋｌｅｅｍａｎｎ，Ａ．ら、「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、ＵＬＬＭＡＮＮ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第Ａ２巻、５７〜９７頁、Ｗｅｉｎｈａｍ：ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（１９８５））。これらの生物は、現在、年間に生成されるＬ−リジンの約２５０，０００トンを占める。
【０００３】
Ｌ−リジンの商業的生産の効率は、より多量のＬ−リジンを産生する変異細菌株の単離によって増大され得る。アミノ酸産生のための微生物プロセスにおいて用いられる微生物は、４つのクラス：野生型株、栄養要求性変異体、調節性変異体、および栄養要求性調節性変異体に分けられる（Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｆｅｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｍ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編、（１９７８）、６４９〜６６１頁）。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異体および関連の生物は、直接発酵によって、安価な炭素源（例えば、糖蜜、酢酸およびエタノール）からのアミノ酸の安価な生成を可能にする。さらに、発酵によって産生されるアミノ酸の立体特異性（Ｌ異性体）により、このプロセスは合成プロセスと比較して有利になる。
【０００４】
発酵プロセスによるＬ−リジンの生成の経済的な重要性を考えると、リジン合成のための生化学的経路は、表向きは生成されるＬ−リジンの総量を増加しそして生産コストを減少する目的のために、集中的に研究されている（最近、Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５〜３９（１９９６）により再検討された）。リジン経路に入ることは、Ｌ−アスパルテートで始まり（図１を参照のこと）、このＬ−アスパルテート自体は、オキサロ酢酸のアミノ基転移によって生成される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの特別な特徴は、リジン中間体のピペリジン２，６−ジカルボキシレートをジアミノピメレートに、２つの異なる経路（すなわち、スクシニル化中間体に関与する反応によって、またはジアミノピメレートデヒドロゲナーゼの単一の反応によって）によって変換するその能力である。全体として、この経路への炭素フラックスは、以下の２点において調節される：第１に、Ｌ−スレオニンおよびＬ−リジンの両方のレベルによるアスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害によって；そして第２に、ジヒドロジピコリン酸シンターゼのレベルの制御によって。従って、Ｌ−リジンの増加した生成は、これら２つの酵素の活性を調節解除および増加することによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにおいて得られ得る。
【０００５】
Ｌ−リジン合成に至る生化学的経路に加えて、最近の証拠によって、細胞から培地へのＬ−リジンの輸送は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリジン過剰産生株の開発において考慮されるべき別の因子であることが示された。Ｋｒａｅｍｅｒらによる研究により、漏出性膜の結果として、細胞からのリジンの受動輸送は、リジン流出の唯一の説明ではないことが示され；それらのデータは、以下の特性を有する特定のキャリアを示唆する：（１）輸送体はリジンについてかなり高いＫｍ値（２０ｍＭ）を有する；（２）輸送体はＯＨ-共輸送系である（取込み系は、Ｈ+対向輸送系である）；そして（３）輸送体は、正に荷電しており、そして膜電位は分泌を刺激する（Ｓ．ＢｒｏｅｅｒおよびＲ．Ｋｒａｅｍｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：１３７〜１４３（１９９１））。
【０００６】
栄養要求特性または耐性特性について単離された様々な株を利用するいくつかの発酵プロセスは、Ｌ−リジンの産生の分野で公知であり：米国特許第２，９７９，４３９号は、ホモセリン（またはメチオニンおよびスレオニン）を必要とする変異体を開示し；米国特許第３，７００，５５７号は、スレオニン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、シスチンまたはシステインについての栄養的要件を有する変異体を開示し；米国特許第３，７０７，４４１号は、リジンアナログに対する耐性を有する変異体を開示し；米国特許第３，６８７，８１０号は、Ｌ−リジンを産生する能力、およびバシトラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンに対する耐性の両方を有する変異体を開示し；米国特許第３，７０８，３９５号は、ホモセリン、スレオニン、スレオニンおよびメチオニン、ロイシン、イソロイシン、またはそれらの混合物についての栄養的要件、ならびにリジン、スレオニン、イソロイシンまたはそれらのアナログに対する耐性を有する変異体を開示し；米国特許第３，８２５，４７２号は、リジンアナログに対する耐性を有する変異体を開示し；米国特許第４，１６９，７６３号は、Ｌ−リジンを産生し、そして少なくとも１つのアスパラギン酸アナログおよびサルファ剤に対して耐性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異体株を開示し；米国特許第５，８４６，７９０号は、いずれのビオチン作用抑制剤の非存在下でも、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リジンを産生し得る変異体株を開示し；そして米国特許第５，６５０，３０４号は、４−Ｎ−（Ｄ−アラニル）−２，４−ジアミノ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース、またはそれらの誘導体に対して耐性であるＬ−リジンの産生のためのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する株を開示する。
【０００７】
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにおけるＬ−リジンの発酵産生の領域のより最近の開発は、リジン産生を増加する分子生物学的技術の使用を包含する。以下の例は、当該分野の例示として提供される：米国特許出願番号第４，５６０，６５４号および同第５，２３６，８３１号は、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対して感受性である宿主ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物を組換えＤＮＡ分子で形質転換することによって得られる、Ｌ−リジン産生変異体株（ここで、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対する耐性およびリジン産生能力を与えるＤＮＡフラグメントは、ベクターＤＮＡに挿入される）を開示し；米国特許出願番号５，７６６，９２５号は、アスパルトキナーゼについてコードし、Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌由来であり、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンにより除感作されるフィードバック阻害を有する遺伝子を、漏出型ホモセリンデヒドロゲナーゼを有するＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌の染色体ＤＮＡ、またはホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損するＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌の染色体ＤＮＡに組み込むことによって産生される変異体株を開示する。
【０００８】
細菌変異体株を利用して設計される多くのプロセスは、他の栄養素を補充することによって細菌増殖を弱め、それ故、アミノ酸産生の収量を高めるように設計される。通常、グルコースのような基質由来のアミノ酸の収率％を改良するように設計された変異体はまた、それらの野生型株のような活発な増殖能力を失う。アミノ酸収率の全体的な減少となることに加えて、これらの変異体はまた、それらの増殖を支持するためにより多くの栄養素を必要とし、これは製造コストを有意に増加し得る。
【０００９】
従って、当該分野において、低コストの製造で特定のアミノ酸の収率を最大にし得る新規のアミノ酸産生細菌株の開発の継続的な必要性が存在する。これらの問題の観点から、代替の方法は、生産力を増大し、そして成分のコストを減少するために用いられる特別な変異体および培地を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は一般的に、より高い収量のアミノ酸が産生されることを可能にする、改善されたラフィネート耐性および改善された増殖特性を有する新規の微生物を提供する。
【００１１】
本発明の第１の目的は、アミノ酸を産生する能力が増した微生物の産生のための新規の方法を提供することである。本発明の第１の実施形態では、アミノ酸を産生する親細菌株の変異誘発、その後の本発明の改善されたラフィネート耐性株についての選択による新規の株の産生のための方法が提供される。本発明のより特定の実施形態では、この方法は、アミノ酸を産生する親細菌株（例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に関する。特に好適な実施形態は、Ｌ−リジンを産生するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである、改善されたラフィネート耐性のアミノ酸産生細菌株の産生のための方法に関する。
【００１２】
本発明の別の目的は、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴を有し、そしてより多量のアミノ酸を産生する、新規の細菌株に関する。第１の実施形態では、本発明の細菌株は、プロセスによって産生され、ここで、親細菌株は変異誘発に供され、そして変異体子孫細菌は、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴および改善されたアミノ酸産生について選択される。より特定の実施形態は、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴および改善されたアミノ酸産生を有する、新規のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物または新規のＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物に関する。本発明の特に好適な実施形態は、多量のＬ−リジンを産生するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍに関する。最も好適な実施形態は、ＡＤＭ  Ｌ６３．１４８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３００５９）、ＡＤＭ  Ｌ６４．１３２株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６０）、ＡＤＭ  Ｌ６９．５３株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６１）、ＡＤＭ  Ｌ６９．７４株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６２）およびＡＤＭ  Ｌ６９．１００株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６３）またはそれらの変異体に関する。
【００１３】
本発明の第３の目的は、アミノ酸の産生のためのプロセスを提供することであり、このプロセスは、（ａ）細菌をラフィネート含有培地中で培養する工程、および（ｂ）アミノ酸を培養培地から回収する工程を包含する。好ましい実施形態では、工程（ａ）の培養された細菌は、アミノ酸を産生する親細菌株が変異誘発に供され、そして子孫が、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴およびアミノ酸の改善された産生について選択される方法によって得られる。好適な実施形態は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍを利用したアミノ酸の産生のためのプロセスに関する。アミノ酸の産生のためのプロセスについての本発明の特に好適な実施形態は、Ｌ−リジンを産生するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍを利用する。
【００１４】
上記の一般的記載および以下の詳細な説明の両方が、単なる例示および説明であって、請求された発明のさらなる説明を提供することを意図していることが理解されるべきである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  改良されたラフィネート耐性のアミノ酸産生細菌株Ｂを産生するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）親細菌株Ａを変異誘発に供する工程；
（ｂ）該変異誘発された親株Ａを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地と接触させる工程；
（ｃ）ラフィネート耐性細菌株Ｂを選択する工程；および
（ｄ）該ラフィネート耐性細菌株Ｂのアミノ酸産生を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２）  前記親細菌株が、ランダムな化学変異誘発に供される、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記親細菌株が、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；
（ｃ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；および
（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、
からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）  前記細菌株Ｂが、
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）スレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；
（ｑ）ヒスチジン；
（ｒ）イソロイシン；
（ｓ）ロイシン；および
（ｔ）バリン、
からなる群から選択されるアミノ酸を産生する、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記親細菌株が、Ｌ−リジンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．である、項目１に記載の方法。
（項目６）  以下であるプロセスにより産生されるアミノ酸を産生する細菌株Ｂであって、ここで：
（ａ）親細菌株Ａが、変異誘発に供され；
（ｂ）該変異誘発された親株が、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地と接触され；
（ｃ）ラフィネート耐性細菌株Ｂが、該変異誘発された親株から選択され；そして
（ｄ）該細菌株Ｂのアミノ酸産生が決定される、
細菌株。
（項目７）  前記親細菌株Ａが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；
（ｃ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；および
（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、
からなる群から選択される、項目６に記載の細菌株。
（項目８）  前記細菌株Ｂが、
（ａ）グリシン；
（ｂ）アラニン；
（ｃ）メチオニン；
（ｄ）フェニルアラニン；
（ｅ）トリプトファン；
（ｆ）プロリン；
（ｇ）セリン；
（ｈ）スレオニン；
（ｉ）システイン；
（ｊ）チロシン；
（ｋ）アスパラギン
（ｌ）グルタミン；
（ｍ）アスパラギン酸；
（ｎ）グルタミン酸；
（ｏ）リジン；
（ｐ）アルギニン；
（ｑ）ヒスチジン；
（ｒ）イソロイシン；
（ｓ）ロイシン；および
（ｔ）バリン、
からなる群から選択されるアミノ酸を産生する、項目７に記載の細菌株。
（項目９）  少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地中で増殖される場合、２４時間で少なくとも約１０ｇ／ｌのＬ−リジンを産生する、Ｃｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．株。
（項目１０）  少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地中で増殖された場合、２４時間で少なくとも約１０ｇ／ｌのＬ−リジンを産生する、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株。
（項目１１）  Ｌ−リジン産生細菌株であって、ここで該株が、
（ａ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００５９；
（ｂ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６０；
（ｃ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６１；
（ｄ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６２；
（ｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６３；および
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）の変異体、
からなる群から選択される、Ｌ−リジン産生細菌株。
（項目１２）  前記株が、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００５９である、項目１１に記載の株。
（項目１３）  前記株が、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６０である、項目１１に記載の株。
（項目１４）  前記株が、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６１である、項目１１に記載の株。
（項目１５）  前記株が、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６２である、項目１１に記載の株。
（項目１６）  前記株が、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６３である、項目１１に記載の株。
（項目１７）  アミノ酸を産生するためのプロセスであって、以下：
（ａ）ラフィネートを含有する培地中で細菌Ｂを培養する工程であって、該株が、以下の方法：
（ｉ）アミノ酸を産生する親細菌株Ａを選択する工程；
（ｉｉ）該親株を変異誘発に供する工程；
（ｉｉｉ）該変異誘発された親株から、改良されたラフィネート耐性細菌株Ｂを選択する工程、により得られる、工程；ならびに
（ｂ）該培養培地から該アミノ酸を回収する工程、を包含する、
プロセス。
（項目１８）  ラフィネートの培地濃度が、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約１％である、項目１７に記載のプロセス。
（項目１９）  産生されるＬ−リジンの量が、２４時間で少なくとも約１０ｇ／ｌのＬ−リジンである、項目１７に記載のプロセス。
（項目２０）  ラフィネートの培地濃度が、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約１％であり、そして産生されるＬ−リジンの量が、２４時間で、少なくとも約１０ｇ／ｌのＬ−リジンである、項目１７に記載のプロセス。
（項目２１）  前記ラフィネートの濃度が、硫酸アンモニア含有量に基づいて約５％であり、そして産生されるＬ−リジンの量が、２４時間で少なくとも約１０ｇ／ｌのＬ−リジンである、項目１７に記載のプロセス。
（項目２２）  細菌Ｂが、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；
（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；
（ｃ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；および
（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、
からなる群から選択される、項目１７に記載のプロセス。
（項目２３）  前記細菌Ｂが、以下：
（ａ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００５９；
（ｂ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６０；
（ｃ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６１；
（ｄ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６２；
（ｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６３；および
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）の変異体、
からなる群から選択される、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．である、項目２２に記載のプロセス。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいてＬ−リジン産生をもたらす生化学的経路の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいてＬ−イソロイシン産生をもたらす生化学的経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（好適な実施形態の詳細な説明）
（１．定義）
明細書および特許請求の範囲（このような用語が与えられる範囲を含む）の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００１７】
高収量誘導体：本明細書中で使用される場合、この用語は、デキストロースから、その株を誘導した親株と比較して高収量の特定のアミノ酸を産生する微生物株をいう。
【００１８】
変異：本明細書中で使用される場合、この用語は、目的のヌクレオチド配列における単一塩基対の変化、挿入または欠失をいう。
【００１９】
オペロン：本明細書中で使用される場合、この用語は、ＤＮＡ中の構造遺伝子および調節エレメントを含めて、細菌遺伝子発現および調節の単位をいう。
【００２０】
親株：本明細書中で使用される場合、この用語は、何らかの形態の変異誘発に供されて、本発明の微生物を生じた微生物株をいう。
【００２１】
表現型：本明細書中で使用される場合、この用語は、微生物の遺伝的構成に依存して観察可能な物理的特徴をいう。
【００２２】
ラフィネート：本明細書中で使用される場合、この用語は、リジン回収のためのイオン交換操作からの廃流（ｗａｓｔｅｓｔｒｅａｍ）産物をいう。ラフィネートは、多量の硫酸アンモニア、Ｌ−リジン、他のアミノ酸、塩および炭水化物（例えば、イソマルトース）を含む。熱処理を用いたラフィネート含有培地の滅菌は、培養物の増殖阻害を引き起こす、アミノ酸誘導体および他の代謝アンタゴニストを産生する。
【００２３】
熱で滅菌されたラフィネート含有培地を用いて、その中に含まれる、培養物の増殖を阻害するアミノ酸誘導体に耐性である；その中に含まれる、培養物の増殖を阻害する代謝インヒビターに耐性である、ならびに／またはその中に含まれる、培養物の増殖を阻害するリジンおよび／もしくはリジンの前駆体の分解産物に耐性である、微生物（例えば、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を選択し得る。
相対的増殖：本明細書中で使用される場合、この用語は、親株の増殖を、子孫の株の増殖と、規定された時間の期間にわたって、そして規定された培地を用いて直接比較することによって増殖の評価を提供する測定値をいう。
【００２４】
変異誘発：本明細書中で使用される場合、この用語は、ＤＮＡ中に変異が産生されるプロセスをいう。「ランダム」変異誘発を用いると、正確な変異部位は予測可能ではなく、微生物の染色体のどこにでも生じ、そしてこの変異は、因子（例えば、放射線または化学的処理）によって引き起こされる物理的損傷の結果として生じる。
【００２５】
（２．親細菌株の変異誘発）
本発明は、多量のアミノ酸を産生し、そしてラフィネートに対する改善された耐性を有する微生物の産生のための方法を提供する。研究経過を通して、増殖およびアミノ酸生合成に必要とされる硫酸アンモニアが、ラフィネート（リジン回収のイオン交換操作からの廃流産物）で置換され得ることが今や見出された。ラフィネートは、多くの硫酸アンモニア、Ｌ−リジン、他のアミノ酸、塩および炭水化物（例えば、イソマルトース）を含む。しかし、培地を滅菌するための熱処理の間に、このラフィネート培地は、培養物の増殖阻害を引き起こす、多くのアミノ酸誘導体および他の代謝アンタゴニストを産生する。この問題を克服するために、培地中の高レベルのラフィネートに耐え得、そしてそれらのアミノ酸産生を増大させ得る株を選択するために方法が設計された。
【００２６】
本発明の細菌株は好ましくは、親細菌株の変異誘発、続いて改善されたラフィネート耐性表現型の選択によって作製される。親微生物は、アミノ酸の発酵産生に有用であることが当該分野で公知の任意の生物から選択され得る；好適な親微生物は、アミノ酸を産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、そして特に最も好適な生物は、Ｌ−リジンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである。
【００２７】
第１の実施形態では、本発明は、改善されたラフィネート耐性の、アミノ酸産生細菌株の産生のための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）親細菌株Ａを変異誘発に供する工程；
（ｂ）上記変異誘発された親株Ａを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約１％のラフィネートを含む培地と接触させる工程；
（ｃ）ラフィネート耐性細菌株Ｂを選択する工程；および
（ｄ）上記ラフィネート耐性細菌株ＢのＬ−リジン産生を決定する工程。
【００２８】
親株は、放射線および化学的手順を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意のランダム変異誘発技術を用いて変異誘発され得る。特に好適なのはランダム化学的変異誘発であり、そして最も好適なのは、適切な薬剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ））を用いた変異誘発である。
【００２９】
新規の細菌株の変異誘発および選択についての一般的方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下に記載される：Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｒ．ＧｌｉｃｋおよびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；ならびにＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅ  Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）。
【００３０】
本発明の株は、改善されたラフィネート耐性表現型を有し、この表現型は、用いられた選択培地中の硫酸アンモニウム含有量によって測定した場合のラフィネートの濃度によって決定される。第１の実施形態では、表現型選択は、少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地中で行われ得る。最も好ましい実施形態では、本発明の微生物は、約５％のラフィネートを含有する培地中で選択される。他の例としては、改善されたラフィネート耐性株の選択において使用するための、少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％および約８％のラフィネートを含有する培地が挙げられる。
【００３１】
本発明は一般的に、より高い収量のアミノ酸が産生されるのを可能にする、改善されたラフィネート耐性および改善された増殖特性を有する新規の微生物を提供する。本発明の方法、プロセスまたは微生物の重要な要因または特性は、ラフィネート耐性に関する。
【００３２】
発酵アミノ酸産生の分野の当業者は、本明細書中で使用される用語「ラフィネート」との用語に精通している。しかし、出願人の発明の詳細な説明をより充分に提供する目的のために、ラフィネートの定義およびその産生のための方法が提供される。
【００３３】
用語「ラフィネート」は、液体−液体抽出の領域の化学的操作分野に最も密接に関連する。この用語は、溶剤精製において、「処理された液体混合物のうちの、不溶性のままであり、そして選択溶媒によって除去されない部分」と定義される（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ，Ｓｙｂｉｌ  Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９８９））。本明細書中で使用される場合、この用語は、アミノ酸の単離におけるイオン交換クロマトグラフィーの適用に関連する。液体−液体抽出のプロセスと類似の様式で、イオン交換クロマトグラフィーと関連して用いられる場合、用語ラフィネートは、液体混合物のうちの、クロマトグラフィー樹脂によって選択的に結合された部分をいう。より詳細には、アミノ酸の発酵産生に関連して、ラフィネートは、細胞培養培地のうちの、クロマトグラフィーカラムに結合しない部分である；ラフィネートは、アミノ酸のイオン交換クロマトグラフィー精製の間に産生されるブロス流出物廃流産物である。代表的に、本明細書中で使用される場合、ラフィネートとは、イオン交換樹脂への増殖培地の最初の適用後に産生される第１の廃流産物をいう。
【００３４】
種々のイオン交換クロマトグラフィー方法が、アミノ酸の精製のために利用され得る。代表的に、カチオン交換樹脂は、リジンの精製のために利用される。イオン交換クロマトグラフィーは、固定層（ｆｉｘｅｄ  ｂｅｄ）またはシミュレート移動層（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｄ）樹脂を利用して行われ得る。例えば、Ｖａｎ  ＷａｌｓｅｒｎおよびＴｈｏｍｐｓｏｎは、リジンの単離のためのシミュレート移動層技術を記載する（Ｖａｎ  Ｗａｌｓｅｍ，Ｈ．Ｊ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５９：１２７−１３２（１９９７））；米国特許第４，７１４，７６７号および同第５，６８４，１９０号は、アミノ酸の精製のための固定層クロマトグラフィー技術の使用を記載し、そしてＷｏｌｆｇａｎｇおよびＰｒｉｏｒは、環状クロマトグラフを利用して、炭水化物の分離における連続形態の操作を達成する（Ｗｏｌｆｇａｎｇ，Ｊ．およびＰｒｉｏｒ，Ａ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２：７１−８２（１９９７））。従って、ラフィネートを作製する特定のクロマトグラフィー方法は変化し得るが、ラフィネートを規定する基礎となる原理は一定のままである。
【００３５】
例示の目的のみで、出願人は、実施例５において、細胞増殖培地補充物として使用するためのラフィネートの産生についての詳細を提供する。当業者にはわかるように、ラフィネートは、ラフィネートが単離される発酵培地において産生される特定のアミノ酸に従って定性的に特徴付けられ得る；例えば、ラフィネートは、リジン発酵培地から単離された場合、リジン−ラフィネートとして、グリシン発酵培地から単離された場合、グリシン−ラフィネートとして、イソロイシン発酵培地から単離された場合、イソロイシン−ラフィネートとして、などとして公知であり得る。一般的用語ラフィネートが本明細書中で用いられる場合、選択された特定の型のラフィネートが実施者の設計に依存することが当業者に容易に明らかである。
【００３６】
本明細書中に提供される実施例は、ラフィネート、特にリジン−ラフィネートの産生についての例示である。当業者に明らかであるように、他の方法が、ラフィネートの作製において利用され得る。
【００３７】
（３．本発明の改善されたラフィネート耐性株）
本発明の別の目的は、改善されたラフィネート耐性を有し、そしてアミノ酸を産生する微生物に関する。当業者にはわかるように、このような微生物は、任意の特定の型のラフィネート（例えば、グリシン−ラフィネート、バリン−ラフィネート、イソロイシン−ラフィネート、リジン−ラフィネートなど）に対する改善された耐性を有するように選択され得る。特に好ましい実施形態では、この微生物は、リジン−ラフィネートに対する改善された耐性を有する。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、ラフィネート耐性微生物は、プロセスによって産生され、ここで：
（ａ）親細菌株Ａが変異誘発に供される；
（ｂ）変異誘発された親株Ａを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地と接触させる；
（ｃ）ラフィネート耐性細菌株Ｂが選択される；および
（ｄ）上記のラフィネート耐性細菌株Ｂのアミノ酸産生が決定される。
【００３９】
親細菌株の選択、変異誘発および改善されたラフィネート耐性を有する本発明の微生物の選択は、これまで記載された通りに行われ得る。
【００４０】
本発明のより特定の実施形態は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍに関し；特に好適なのは、Ｌ−リジンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである。
【００４１】
本発明はまた、少なくとも約１％のラフィネートを含有する培地において増殖させた場合、少なくとも約１０ｇのＬ−リジン／リットル／２４時間を産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を提供する。
【００４２】
本発明の特に好適な実施形態は、Ｌ−リジン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株に関し、ここで、この株は、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００５９、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６０、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６１、ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６２、ＮＲＲＬ
Ｂ−３００６３およびそれらの変異体からなる群より選択される。
【００４３】
（４．アミノ酸産生および精製）
本発明の他の実施形態は、ラフィネート含有培地におけるアミノ酸の産生のためのプロセスに関する。このようなプロセスは、（ａ）改良されたラフィネート耐性細菌株の培養工程および（ｂ）培養培地からのアミノ酸の回収工程、を包含する。
【００４４】
第１の特定の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸産生のためのプロセスを提供する：
（ａ）ラフィネートを含む培地において、細菌Ｂ株を培養する工程であって、それによって株を、以下の方法によって得る、工程：
（ｉ）アミノ酸を産生する親細菌株Ａを選択する工程；
（ｉｉ）その親株Ａを突然変異する工程；
（ｉｉｉ）改良されたラフィネート耐性細菌株Ｂ選択する工程；および
（ｂ）培養培地からアミノ酸を回収する工程。
【００４５】
親細菌株の選択、突然変異誘発および改良されたラフィネート耐性を有する本発明の微生物の選択は、これまでに記載されるように行われ得る。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、他のプロセスは、Ｌ−リジン産生ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物からなる群から選択された親株に関し、そして本発明の最も好ましい実施形態は、アミノ酸Ｌ−リジンを産生するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである親株に関する。
【００４７】
本発明のプロセスは、さらに、本発明の微生物を培養する特定の方法のために、異なり得る。従って、種々の発酵技術が、当該分野で公知であり、アミノ酸の産生に関する本発明のプロセスに使用され得る。
【００４８】
適切な炭素源の具体例としては、炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖密）；有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸）ならびにアルコール（例えば、グリセロール）が挙げれるが、これらに限定されない。
【００４９】
適切な窒素源の具体例としては、アンモニア（気体アンモニアおよび液体アンモニアを含む）；無機酸または有機酸のアンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム）；ならびに他の窒素含有物（食肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、カゼイン加水分解産物、大豆油粕（ｓｏｙｂｅａｎ  ｃａｋｅ）加水分解産物および酵母抽出物を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
一般的に、アミノ酸は、バッチ型またはフェッドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）型のような発酵プロセスにおいて、本発明から商業的に産生され得る。バッチ型発酵プロセスにおいて、すべての栄養分は、発酵の開始時に添加される。フェッドバッチまたは拡張フェッドバッチ型発酵において、１または多数の栄養分が、発酵の開始即座に、または培養が特定の熟度に達した後に、連続的に培地に添加されるか、または供給される栄養物が培養流体から消耗された場合に連続的に培地に添加される。フェッドバッチ型発酵の拡張バッチの変形は、反復フェッドバッチまたはフィルアンドドロー（ｆｉｌｌ−ａｎｄ‐ｄｒａｗ）発酵であり、ここで、例えば発酵槽が充満した場合に、栄養分の供給が続く間に、発酵槽の内容物の一部が、時折除去される。この方法において、発酵は長時間に及ぶ。
【００５１】
発酵の別の型である、連続発酵またはケモスタット培養は、完全培地の連続供給を使用し、その間、培養流体は、発酵槽内の培養液の容量が、およそ一定であるような様式で、連続的または半連続的に取り除かれる。連続発酵は、原則的に時間制限なく維持され得る。
【００５２】
バッチ発酵において、培地中の１つの必須の栄養物が消費されるまで、または発酵条件が好ましくなくなるまで（例えば、微生物の増殖を阻害する値までの、ｐＨの減少）、生物は増殖する。フェッドバッチ発酵において、測定は、通常、好ましい増殖条件を維持するために（例えば、ｐＨ制御の使用によって）行われ、そして１以上の必須栄養物の消費は、これらの栄養物を培地に供給することによって防がれる。微生物は、栄養物供給の速度によって示される増殖速度で、増殖し続ける。一般的に、単一の栄養物（頻繁には、炭素源）が、増殖に対して限界となる。同じ原理を連続発酵に適用し、通常、培地供給中の１つの栄養物が限定され、すべての他の栄養物は過剰である。制限栄養物は、培養流体中に非常に低い濃度（しばしば測定不可能に低い）で存在する。異なる型の栄養物の制限が、使用され得る。炭素源の制限は、もっともよく使用される。他の例は、窒素源による限定、酸素による限定、特定の栄養分（例えば、ビタミンまたはアミノ酸）による限定（微生物が、このような化合物を要求性である場合）、硫黄による限定およびリンによる限定である。
【００５３】
アミノ酸、特にＬ−リジンの回収および精製のための方法は、当業者に周知である。代表的には、アミノ酸は、細胞を除去するための遠心分離および濾過の後に、陽イオン交換によって、増殖培地から回収され得る。米国特許第５，６８４，１９０号は、以下に関与するＬ−リジンのようなアミノ酸の回収を記載する：（１）その等電点より低いｐＨで、アミノ酸を樹脂に吸着するための、第１陽イオン交換樹脂のアミノ酸含有水溶液の通過、続いて、第１溶液を生成するために水酸化アンモニウムを用いたｐＨの増加によるアミノ酸の溶出；および（２）さらに不純物を溶出するための類似の様式での、第２の陽イオン交換樹脂の第１溶液の通過。
【００５４】
別の例は、米国特許第４、７１４、７６７号に記載され得、それは直列の陽イオン交換樹脂タワーを使用して、水溶液から塩基性アミノ酸を分離するプロセスを提供する。このプロセスは、順にそれぞれ吸着および溶出の工程を包含し、ここで吸着および溶出工程において使用される洗浄水は、第１のタワー吸着工程または続くサイクルの溶出工程から排出された溶液の後の部分を再利用することによって得られる。
【００５５】
このような陽イオン交換単離手順から得た溶出液は、アンモニアの除去をさらに提供する、エバポレーションによって濃縮され得る。次いでアミノ酸は、塩酸を用いて、溶液から結晶化され得、例えばＬ−リジン・ＨＣｌ・２Ｈ2Ｏを生成する。遠心分離または濾過後、単離されたＬリジンの結晶を乾燥する。
【００５６】
（実施例）
（実施例１．改良されたラフィネート耐性微生物の変異誘発、スクリーニングおよび選択）
より高い濃度のラフィネートによってその増殖が阻害されるリジン産生株（例えば、Ｔ１２５、Ｌ５８．２３および９６Ｔ１１６）を、突然変異に供し、そしてより高い濃度のラフィネートに対する耐性を示す変異体を回収した。変異誘発について、細菌培養物を、培地Ｂにおいて中間の対数期まで増殖させ（表１）、遠心分離によってペレットにし、そして１５ｍｌのポリプロピレンコニカルチューブ内の２ｍＬのフィルター滅菌されたＴＭ緩衝液中（Ｔｒｉｓ．ＨＣＬ  ６．０ｇ／Ｌ、マレイン酸  ５．８ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  １．０ｇ／Ｌ、Ｃａ（ＮＯ3）2  ５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＫＯＨを使用してｐＨ６．０に調整した）に再懸濁した。２ｍＬの細胞懸濁液を、Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）の５０μＬの５．０ｍｇ／Ｌ溶液（５０μＬ）と混合し、次いで、３０℃で３０分間インキュベートした。未処理の細胞懸濁液を同様にコントロールとしてインキュベートし、死滅率を推定した。インキュベーション後、１０ｍＬのＴＭ緩衝液を各チューブに添加し、そして細胞を遠心分離によってペレットにし、ＴＭ緩衝液で２度洗浄し、そして４．０ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4（リン酸緩衝液）に再懸濁し、ＫＯＨを使用してｐＨ７．２に調整した。洗浄した細胞懸濁液を、リン酸緩衝液にさらに希釈し、そしてアリコートを培地Ａのプレートに広げた（表１）。３０℃で４〜６日間インキュベートした後、培地Ａ寒天上で増殖するコロニーを選び、そして振盪フラスコおよび発酵槽内のブドウ糖からＬ−リジンを産生する、改良された可能性について試験した。
【００５７】
（実施例２  ラフィネート培地における株の増殖）
各試験株について（表２）、０．１ｍＬの凍結培地を、２０ｍＬのラフィネート培地Ｃ（表１）を含む２５０ｍＬのバッフルフラスコに接種し、次いで、３０℃で２４０ｒｐｍで、１８時間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの培養物を取り出し、そして０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液中に１：１００の比に希釈した。分光光度計を用いて、希釈サンプルの光学密度（ＯＤ）を、６６０ｎｍで測定した。結果を表２に示す。改良されたラフィネート耐性（ＲＦ）を有するすべての株、Ｌ６３．１４８、Ｌ６４．１３２、Ｌ６９．５３およびＬ６９．７４は、それらの親株、１０８Ｔ１２５、ＬＳ８．２３および９６Ｔ１１６よりも、ラフィネート培地Ｃ中で、優れて増殖した（より高いＯＤ）。
【００５８】
（実施例３  振盪フラスコ発酵槽におけるブドウ糖消費、増殖およびリジン産生）
各株について、０．１ｍＬの凍結培地を、２０ｍＬの種培地Ｃを含む２５０ｍＬのバッフルフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋ）に接種し、そして１８時間３０℃で２４ｒｐｍでインキュベートした。２ｍＬの種培地を使用し、２５０ｍＬバッフルフラスコ中に２０ｍＬの発酵培地Ｄを接種した。次いで、そのフラスコを、２４時間３０℃かつ２４０ｒｐｍで振盪した。２４時間の発酵後、サンプルを分析のために取り出した。ブドウ糖濃度を測定するために、１００μＬのサンプルを取り出し、そして脱イオン（ＤＩ）水を用いて１：５０に希釈し、そしてＹＳＩ生化学分析機（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．）を用いて測定した。Ｌ−リジン濃度を、ＨＰＬＣにより決定した。光学密度測定を実施例２に記載されるように、増殖を測定するために行った。結果を表３に示す；すべてのラフィネート耐性株、Ｌ６３．１４８、Ｌ６４．１３２、Ｌ６９．５３およびＬ６９．７４は、優れて増殖し、ブドウ糖をより効率的に使用し、そしてＬ−リジンをそれらの親株、１０８Ｔ１２５、Ｌ５８．２３、および９６Ｔ１１６よりも産生した。
【００５９】
（実施例４  ベンチスケール発酵槽における増殖およびＬ−リジン産生）
２段階接種物プロトコルを使用してベンチスケール発酵槽を作動した。第１段階の培地は、５０．０ｇ／ｌ  スクロース、３．０ｇ／ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、３．０ｇ／ｌ  尿素、０．５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、３０．０ｇ／ｌ  ダイズペプトン、５．０ｇ／ｌ  酵母抽出物、０．７６５ｍｇ／ｌ  ビオチン、３．０ｍｇ／ｌ  チアミンＨＣｌ、および０．１２５ｇ／ｌ  ナイアシンアミドからなる。５００ｍｌのこの培地を含む２リットルのバッフルフラスコに、培養物を接種し、そして３０℃かつ２５０ｒｐｍで１９時間インキュベートした。この時点で、２２．５ｍｌの成熟第１培養物を使用し、第２段階接種物培地をインキュベートした。
【００６０】
第２段階接種物を、３０００ｍｌの培地を用いて、６．６リットルの発酵槽内に調製した。培地処方は、２０．２ｇ／ｌ（ｄｂ）コーンステープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｉｏｒ）、ラフィネートとしての１０．０ｇ／ｌ  硫酸アンモニウム、１２．０ｍｇ／ｌ  ＭｎＳＯ4−Ｈ2Ｏ、３．０ｍｇ／ｌ  ビオチン、３．０ｇ／ｌ  チアミンＨＣｌ、１２５ｍｇ／ｌ  ナイアシンアミド、０．５ｍｌ／ｌ  消泡剤、および６０ｇ／ｌ  ブドウ糖であり、３６０ｇ／ｌ溶液として別に滅菌され、そして接種のすぐ前に発酵槽に添加される。発酵槽を３２℃、１．２ｖｖｍ空気、６００ｒｐｍ、および７．２のｐＨ制御点で操作した。ｐＨ制御を、ＮＨ3またはＮＨ4ＯＨの添加によって達成した。１８〜２０時間後、接種物が成熟したと考え、そして産生段階容器に接種した。
【００６１】
産生段階培地は、４０ｇ／ｌ（ｄｂ）コーンステープリカー、ラフィネートとしての２０ｇ／ｌ  硫酸アンモニウム、１２．０ｍｇ／ｌ  ＭｎＳＯ4−Ｈ2Ｏ、０．７５ｍｌ／ｌ  消泡剤および１２ｇ／ｌブドウ糖からなり、２５０ｇ／ｌ溶液として別に滅菌され、そして接種のすぐ前に添加される。培地処方は、５００ｍｌの成熟第２段階培養液を、接種物として含む２．１リットルの開始容量に基づく。パラメーターの操作は以下のようである：３２℃、２．１ｖｖｍ空気、および７．２の開始および制御点ｐＨ。ｐＨ制御を再び、ＮＨ3またはＮＨ4ＯＨを用いて行った。攪拌を初めに６００ｒｐｍ、９時間の培養時間で７００ｒｐｍに増加し、そして１９時間の培養時間で９００ｒｐｍに増加した。ブドウ糖の消費に起因する、ｐＨ増加によって示される場合、発酵に、必要に応じてブドウ糖および硫酸アンモニウムを供給した。供給物を、２３１０ｇのブドウ糖および８００ｍｌの水、ならびに合計１７６ｇの硫酸アンモニウムを含むラフィネートの量を、別に滅菌することによって調製し、次いで、２つの溶液を混合し、室温まで冷却した。合計発酵時間は、４８時間であった。容器のサイズは、第２段階接種の発達に使用したサイズと同じであった。
【００６２】
ベンチスケール発酵において、上記の単離物と親株とを比較した実験の結果を表４に示す。
【００６３】
（実施例５  ラフィネートの産生）
上記のように、ラフィネートは、ラフィネートが単離された発酵培地において産生される特定のアミノ酸によって定性的に特徴付けられ得る。本明細書中で提供される例は、リジンラフィネートの産生のための例である。しかし、当業者は、他の型のラフィネート（例えば、バリン−ラフィネート、またはイソロイシン−ラフィネートなど）が、単に適切な発酵培地（例えば、バリンまたはイソロイシン発酵培地など）を用いて開始することによって、同様に産生され得ることを知り得る。
【００６４】
リジン−ラフィネートの産生における第１工程として、リジン発酵増殖培地は、６５．５ｇ／ｌのリジン濃度まで希釈される。限外濾過して４０．３ｇ／ｌのリジン濃度を有する透過物を生成した後、次いで透過物を２０７ｇ／ｌの合計乾燥固体濃度を有する１２３ｇ／ｌ  リジンまで濃縮する。
【００６５】
次いで、透過物の濃縮物を、クロマトグラフィー分離システム（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬ）により製造されるＩ−ＳＥＰまたはＣ−ＳＥＰ）に供給する。イオン交換クロマトグラフィー分離システムは、米国特許第４、８０８、３１７号および同第４，７６４，２７６号（これらは本明細書中で、参考として援用される）に例証されるように、当該分野で一般的に公知である。そこから得られる廃棄溶出液は、「希釈リジン−ラフィネート」溶液であると考えられる。希釈リジン−ラフィネートは、５．１のｐＨを有し、そして３４．３ｇ／ｌ  硫酸アンモニウムおよび総固体レベル６７ｇ／ｌを有する２．８ｇ／ｌ  リジンを含む。
【００６６】
希釈リジン−ラフィネート溶液を、２９５ｇ／ｌ  総固体まで濃縮する。この「濃縮リジン−ラフィネート」の定量化成分は、以下を含む：１３７．９ｇ／ｌ  硫酸アンモニウム、１４．８ｇ／ｌ  リジン、８．７ｇ／ｌ  バリン、８．１ｇ／ｌ  アラニン、２．４ｇ／ｌ  乳酸および２．２ｇ／ｌ  酢酸。この濃縮リジン−ラフィネート溶液を培地調製に使用する。
【００６７】
（表）
以下の表を、実施例の節において参照する。
【００６８】
（表１  実施例１、２、および３において使用された培地）
【００６９】
【表１】
2011147459.tif 000002
１．コーンステープリカーの量を、培地１リットルあたりの乾燥固体グラムとして表す。
２．ラフィネートの量を、培地１リットルあたりの硫酸アンモニウムのグラムとして表す。
【００７０】
（表２  ラフィネートを含む培地Ｃにおける株の増殖）
【００７１】
【表２】
2011147459.tif 000003
１．１０８Ｔ１２５株、Ｌ５８．２３株および９６Ｔ１１６株は、親株かつ野生型株であり、それらを使用して、本発明の改良された耐性株を産生する。
２．Ｌ６３．１４８株、Ｌ６４．１３２、Ｌ６９．５３株およびＬ６９．７４株は、改良されたラフィネート耐性（ＲＦ）株であり、それらは、記載されたそれらの野生型親株に由来する。
【００７２】
（表３  培地Ｄ内で２４時間の振盪フラスコ発酵における株のブドウ糖消費（Ｄｅｘ）、増殖（ＯＤ660）、およびリジン産生（Ｌｙｓ））
【００７３】
【表３】
2011147459.tif 000004
（表４  ６．６ｌの発酵槽内での、増殖（ＯＤ６６０）およびＬ−リジン産生の親および子孫の比較）
【００７４】
【表４】
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１．総産物は、収穫時の発酵槽におけるリジンの合計グラムを表す。
２．計算は、初めの２．１リットル容量に基づく。
【受託番号】
【００７５】
（ａ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００５９
（ｂ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６０
（ｃ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６１
（ｄ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６２
（ｅ）ＮＲＲＬ  Ｂ−３００６３
【図１Ａ】
2011147459.tif 000006
【図１Ｂ】
2011147459.tif 000007
【外国語明細書】
2011147459000001.pdf