(57)【要約】【課題】夾雑物が混ざっていたとしても、正確かつ短時間で標的微生物を検出することができる微生物検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】微生物検出方法が、試料から標的微生物を検出する微生物検出方法であって、試料中の夾雑物の蛍光色を標的微生物の蛍光と異なる色に変異させる夾雑物蛍光色変異工程を具備する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から標的微生物を検出する微生物検出方法であって、
前記試料中の夾雑物の蛍光色を前記標的微生物の蛍光と異なる色に変異させる夾雑物蛍光色変異工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記夾雑物蛍光色変異工程において、前記試料中の夾雑物の蛍光色を変異させる夾雑物蛍光色変異液を添加することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記夾雑物蛍光色変異液は、親油性蛍光色素を希釈した溶液であることを特徴とする請求項２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性蛍光色素として親油性スリチル色素、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドを希釈した溶液であることを特徴とする請求項３に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを希釈した溶液であることを特徴とする請求項４に記載の微生物検出方法。
【請求項６】
前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを５０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することを特徴とする請求項５に記載の微生物検出方法。
【請求項７】
前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを１００〜４００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することを特徴とする請求項６に記載の微生物検出方法。
【請求項８】
前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを２００〜３００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することを特徴とする請求項７に記載の微生物検出方法。
【請求項９】
ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法を使用することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から微生物を検出する微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、微生物検出方法として、位相差顕微鏡を用いた方法あるいは蛍光染色法などがある。上記位相差顕微鏡は、微生物の反射光の位相差をコントラストに変換して像を作り出し、透明に近い微生物の観察を可能にする。また、蛍光染色法は、微生物を蛍光染色して観察する方法であり、微生物の持つＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）やＲＮＡ（Ribonucleic acid）を蛍光染色することで微生物のみを明瞭にするＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法、特定微生物を核酸の配列から染め分けるＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法、蛍光染色した抗体を用いる方法、蛍光染色したファージを用いる方法等の多くの方法が存在する。
【０００３】
そして、その他の微生物検出方法として、下記特許文献１には、キャピラリー等電点電気泳動法を用いて試料中のレジオネラ属菌を分離して検出するレジオネラ属菌検出方法が開示されている。また、上記蛍光染色法を活用した方法として、下記特許文献２には、標的微生物を蛍光標識抗体で標識し、蛍光強度に基づいて試料中の粒子から標的微生物を検出する方法であって、粒子の前方散乱光強度、蛍光標識抗体による蛍光強度及び夾雑物の特有な蛍光強度を測定し、蛍光標識抗体が夾雑物に非特異結合した擬陽性を示す粒子を測定結果に基づいて排除して標的微生物のみを検出する微生物検出方法が開示されている。さらに、下記特許文献３には、試料中の微生物を生死菌染色試薬と死菌染色試薬で染色し、試料の３種類の蛍光画像を撮影し、当該蛍光画像から微生物の発光点を抽出し、抽出した発光点毎の輝度のドットプロットを作成し、当該プロットを用いて生菌を計数するプログラム及び微生物計数装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１０９９２７号公報
【特許文献２】特開２００７−２３２３８２号公報
【特許文献３】特開２００７−０９７５８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上述した位相差顕微鏡を用いた方法または蛍光染色法では、環境中から採取した試料中に自家蛍光を持つ粒子が多数存在する場合に、標的微生物の判別が難しい。例えば、蛍光染色法のひとつであるＦＩＳＨ法は、定量性があり、また検出時間も短いことから便利な方法であるが、試料中に自家蛍光を持つ夾雑物が混ざっていると、標的微生物を選択的に検出することが困難となるとともに定量性が低下してしまう。そして、このような場合には、検出に時間がかかり、検出した標的微生物を計数するにも、時間と熟練を要する。
【０００６】
また、上記特許文献１では、キャピラリー等電点電気泳動法を用いて試料中のレジオネラ菌を分離して検出しているが、同じような電荷を持つタンパク質（夾雑物）が試料に含まれている場合にレジオネラ菌のみを検出するのが困難である。また、特許文献２では、標的微生物と夾雑物との蛍光波長の違いによって標的微生物と夾雑物とを判別しているが、夾雑物が藻類に限定されている発明であるために、他の夾雑物に対応することができない。さらに、特許文献３では、試料の３種類の蛍光画像を撮影し、当該３種類の画像から微生物の発光点を抽出しているが、３種類の蛍光画像の撮影という時間のかかる作業が必要になる。
【０００７】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、自家蛍光する夾雑物が混ざっていたとしても、正確かつ短時間で標的微生物を検出することができる微生物検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、試料から標的微生物を検出する微生物検出方法であって、前記試料中の夾雑物の蛍光色を前記標的微生物の蛍光と異なる色に変異させる夾雑物蛍光色変異工程を具備するという手段を採用する。
【０００９】
本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記夾雑物蛍光色変異工程において、前記試料中の夾雑物の蛍光色を変異させる夾雑物蛍光色変異液を添加するという手段を採用する。
【００１０】
本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記夾雑物蛍光色変異液は、親油性蛍光色素を希釈した溶液であるという手段を採用する。
【００１１】
本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第３の解決手段において、前記親油性蛍光色素として親油性スリチル色素、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドを希釈した溶液であるという手段を採用する。
【００１２】
本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第４の解決手段において、前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを希釈した溶液であるという手段を採用する。
【００１３】
本発明では、微生物検出方法に係る第６の解決手段として、上記第５の解決手段において、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを５０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用するという手段を採用する。
【００１４】
本発明では、微生物検出方法に係る第７の解決手段として、上記第６の解決手段において、前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを１００〜４００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用するという手段を採用する。
【００１５】
本発明では、微生物検出方法に係る第８の解決手段として、上記第７の解決手段において、前記夾雑物蛍光色変異液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを２００〜３００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用するという手段を採用する。
【００１６】
本発明では、微生物検出方法に係る第９の解決手段として、上記第１〜８のいずれかの解決手段において、ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法を使用するという手段を採用する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明では、試料中の夾雑物の蛍光色を標的微生物の蛍光と異なる色に変異させる。これにより、標的微生物と夾雑物との蛍光色に違いが生じるので、標的微生物の蛍光が明瞭になる。このように、本発明では、標的微生物の蛍光が明瞭になるので、正確かつ短時間で標的微生物を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法において、第２の工程に使用するろ過装置１０の要部斜視図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の第７の工程（夾雑物蛍光色変異工程）を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法において、蛍光顕微鏡で観察される試料の画像を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態に係る微生物検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて微生物を検出する方法であり、図１に示すように第１〜第８の工程からなる。また、これら第１〜第８の工程のうち、第７の工程は、本実施形態における夾雑物蛍光色変異工程である。
【００２０】
〔第１の工程〕
第１の工程では、レジオネラ菌の固定標本を作製する（ステップＳ１）。すなわち、レジオネラ菌（標的微生物）を含む水を主成分とする液体試料に、終濃度が４質量％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加すると共に液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することにより、レジオネラ菌を液体試料中に化学固定した固定標本を作製する。
【００２１】
〔第２の工程〕
第２の工程では、上記レジオネラ菌の固定標本を液体試料から分離する（ステップＳ２）。すなわち、上記第１の工程で得られたレジオネラ菌の固定標本を含む液体試料を、ろ過装置１０（図２参照）によってろ過することで、レジオネラ菌の固定標本を液体試料から分離する。
【００２２】
ここで、第２の工程で使用するろ過装置１０は、図２に示すように、ガイドタワー１、ろ過器２及び吸引器３を備えている。ガイドタワー１は、ろ過器２に液体試料を導入するための筒形状の流路であり、ろ過器２の上側に取り付けられている。ろ過器２は、ガイドタワー１を介して導入された液体試料中の０．２２μｍ未満の粒子及び液体をメンブレンフィルタ２ａを通じて下側の吸引器３に通過させて、メンブレンフィルタ２ａ上にレジオネラ菌の固定標本を捕集するものである。
【００２３】
このろ過器２では、メンブレンフィルタ２ａが着脱可能になっており、ろ過毎にメンブレンフィルタ２ａを交換することが可能である。メンブレンフィルタ２ａは、装着に必要な余白を含めた直径が２５ｍｍの円形部材である。このメンブレンフィルタ２ａは、孔径が０．２２μｍの微細孔が無数に形成されたポリカーボネート製のフィルタである。このようなメンブレンフィルタ２ａでは、中心部の直径１６ｍｍの円形領域が上記液体試料のろ過に供される。吸引器３は、上記メンブレンフィルタ２ａの下側から液体試料中の０．２２μｍ未満の粒子及び液体を吸引するものである。
【００２４】
〔第３の工程〕
第３の工程では、レジオネラ菌の固定標本を乾燥させる（ステップＳ３）。すなわち、レジオネラ菌の固定標本が付着したメンブレンフィルタ２ａをろ過器２から取り外し、さらにメンブレンフィルタ２ａを常温の空気中で乾燥させた後に９９．５質量％のエタノールで脱水し、再度、常温の空気中で乾燥させる。
【００２５】
〔第４の工程〕
第４の工程では、レジオネラ菌の固定標本にプローブを結合させる(ステップＳ４)。すなわち、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）によって標識したプローブ（レジオネラ菌用ＤＮＡプローブ）と、ハイブリダイゼーションバッファとを「１：９」の割合で混合したプローブ溶液をシャーレ内に作製し、レジオネラ菌が付着したメンブレンフィルタ２ａから切り取った扇形のフィルタ部分（菌サンプル２ｂ）をピンセットによってプローブ溶液に浸し、４６℃の温度下で約２時間保存することで、レジオネラ菌の固定標本にプローブを結合させる。
なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの成分構成は、ＮａＣｌが０．９質量％、Tris‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５質量％、Blocking reagentが２質量％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２質量％である。
【００２６】
〔第５の工程〕
第５の工程では、上記菌サンプル２ｂから未反応のプローブを除去する(ステップＳ５)。すなわち、ウォッシングバッファを５０ｍｌの遠沈管に入れ、当該ウォッシングバッファに上記菌サンプル２ｂを４８℃の環境下で１５分浸すことで、菌サンプル２ｂ上の未反応のプローブを除去する。ウォッシングバッファ内では、未反応のプローブが自然拡散によって菌サンプル２ｂから剥がれ落ちる。
なお、上記ウォッシングバッファの成分構成は、Tris−Ｃｌが２０ｍＭ、ＮａＣｌが８０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）が５ｍＭ、ＳＤＳが０．０１質量％である。
【００２７】
〔第６の工程〕
第６の工程では、菌サンプル２ｂを乾燥させる（ステップＳ６）。すなわち、ウォッシングバッファによって未反応のプローブが除去された菌サンプル２ｂを９９．５質量％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる。
【００２８】
〔第７の工程〕
第７の工程（夾雑物蛍光色変異工程）では、菌サンプル２ｂに含まれる夾雑物の蛍光色を変異させる（ステップＳ７）。この第７の工程は、最初に夾雑物蛍光色変異液Ｃを作製する前工程と、夾雑物蛍光色変異液Ｃを用いて菌サンプル２ｂに含まれる夾雑物の蛍光色を変異させる後工程とからなる。前工程では、親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide（親油性蛍光色素）の原液をベクターシールドによって５０〜５００ｎｇ／ｍｌに希釈した夾雑物蛍光色変異液Ｃ（溶液）を作製する。この夾雑物蛍光色変異液Ｃとしては、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを１００〜４００ｎｇ／ｍｌの範囲で希釈したものが好ましい。また、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを２００〜３００ｎｇ／ｍｌに希釈したものがより好ましい。
【００２９】
後工程では、図３に示すように、菌サンプル２ｂをスライドガラス１１に載せ、マイクロピペット１２で菌サンプル２ｂのレジオネラ菌捕集部分２ｃ（試料）に上記夾雑物蛍光色変異液を添加し、さらにカバーガラスを載せてスライドガラス１１に密着させることにより試料への気泡の侵入を防止する。この結果、夾雑物蛍光色変異液Ｃがレジオネラ菌捕集部分２ｃに浸透して夾雑物の蛍光色が本来の蛍光色（レジオネラ菌の蛍光色に類似する蛍光色）から変異する。
【００３０】
〔第８の工程〕
第８の工程では、蛍光顕微鏡を用いて試料中のレジオネラ菌を検出する（ステップＳ８）。すなわち、上記後工程で処理されたスライドガラス１１を蛍光顕微鏡に装着し、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス１１上の試料に照射することにより、プローブが結合したレジオネラ菌を波長５２０ｎｍの緑色光として蛍光させる。そして、蛍光顕微鏡で得られる試料の画像を所定の画像処理アルゴリズムで画像処理することによって試料中に含まれるレジオネラ菌のみを検出する。
【００３１】
ここで、蛍光顕微鏡には、光学フィルタセットとして顕微鏡付属の緑色蛍光観察用セットを用いても良いが、微生物染色用蛍光試薬の励起波長（レジオネラ菌用ＤＮＡプローブを標識したＦＩＴＣの励起波長４９５ｎｍ）を選択的に透過するバンドパスフィルタを励起波長光路に装着する方がより好ましい。
【００３２】
図４（ａ）に示すように、夾雑物蛍光色変異液Ｃを添加した試料の画像は、背景ｂｋ（赤色）に対してレジオネラ菌ｌｇ（緑色）がコントラスト良く映し出される。これに対して、図４の（ｂ）に比較例として示すように、夾雑物蛍光色変異液Ｃを添加しない試料の画像は、夾雑物ｉｐがレジオネラ菌ｌｇの蛍光色（緑色）と略同じ蛍光色で自家蛍光するので、レジオネラ菌ｌｇと夾雑物ｉｐとを容易に識別できない画像である。実験によって確認した結果、夾雑物蛍光色変異液Ｃを添加した試料の画像は、背景ｂｋ及び夾雑物ｉｐが赤色として観察され、これに対してレジオネラ菌ｌｇは緑色として観察された。
【００３３】
ここで、背景ｂｋ及び夾雑物ｉｐが赤色として観察される理由としては、以下のことが考えられる。レジオネラ菌ｌｇは、その表面に夾雑物蛍光色変異液Ｃ（N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide）が上述の濃度ではあまり付着しないので、赤色に変異せずに緑色を発する。しかし、背景ｂｋや夾雑物ｉｐは、付着性の良い物質が含まれることで、レジオネラ菌以上に夾雑物蛍光色変異液Ｃ（N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide）がその表面に付着するので、自家蛍光が吸収されて赤色になる。この結果、レジオネラ菌ｌｇの緑色光のみが明瞭となる。
【００３４】
以上のように、本実施形態に係る微生物検出方法では、第７の工程（夾雑物蛍光色変異工程）において試料に夾雑物蛍光色変異液Ｃを添加するので、夾雑物が赤色に染まるため、レジオネラ菌の緑色蛍光が明瞭になる。このように、本実施形態では、レジオネラ菌の色（緑色）と夾雑物の色（赤色）とが異なるので、正確かつ短時間でレジオネラ菌を検出することができる。
【００３５】
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法によってレジオネラ菌を染色したが、本発明はこれに限定されない。例えば、核酸染色法及び抗体染色法等、ＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法によってレジオネラ菌を染色するようにしてもよい。
【００３６】
（２）上記実施形態において、夾雑物蛍光色変異液は、親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを希釈した溶液であるが、本発明はこれに限定されない。
例えば、夾雑物蛍光色変異液として、親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを希釈した溶液を用いてもよい。
【符号の説明】
【００３７】
１…ガイドタワー、２…ろ過器、２ａ…メンブレンフィルタ、２ｂ…菌サンプル、２ｃ…レジオネラ菌捕集部分、３…吸引器、１０…ろ過装置、１１…スライドガラス、１２…マイクロピペット、Ｃ…夾雑物蛍光色変異液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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