(57)【要約】【課題】シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを経済的・効率的に製造する方法を開発すること。【解決手段】本発明は、Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを提供する。この酵素は、放線菌ストレプトスポランギウム・ロセウムＳｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＮＢＲＣ  ３７７６株由来である。本発明は前記酵素を用いてＬ−プロリンからシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン及びシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法を提供する。本発明は、前記酵素をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、該ベクターを含む形質転換体とを提供する。【選択図】図９
2011097903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（３）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（４）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（５）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、
（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質であることを特徴とする、Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼ。
【請求項２】
（１）請求項１に記載のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼと、Ｌ−プロリンとを用意するステップと、
（２）前記Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを前記Ｌ−プロリンに対して作用させて、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン及びシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを得るステップとを含むことを特徴とする、シス−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする、形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌由来のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼと、該ヒドロキシラーゼを使用するシス−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法と、前記ヒドロキシラーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、該組換えベクターを含む形質転換体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、Ｌ−プロリンにヒドロキシル基が導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種である。ヒドロキシル基が導入される部位（３位又は４位の炭素原子）の違いと、ヒドロキシル基の空間的配置（トランス配置又はシス配置）の違いとにより４種類の異性体が存在する。ヒドロキシプロリンの異性体のうち、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、カルバペネム系抗生物質、消炎剤として利用されているＮ−アセチルヒドロキシプロリン等の医薬品の合成中間原料として有用な物質である。
【０００３】
シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法としては、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン誘導体からシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン誘導体を有機合成する方法（特許文献１）が提案されているが、合成の原料であるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン誘導体自体が高価だという問題点を有する。ヘリコセラス属等の微生物を使用してＬ−プロリンからシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する方法（特許文献２及び３）も提案されているが、生成量が０．６５ｇ／Ｌと極めて低く、実用的ではない。
【特許文献１】特開２００５−１１２７６１号公報
【特許文献２】特許第３００５０８５号公報
【特許文献３】特許第３００５０８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
産業上有用なシス−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを経済的・効率的に製造する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを提供する。本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは、（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質の場合がある。
【０００６】
本発明はシス−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法を提供する。本発明のシス−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼと、Ｌ−プロリンとを用意するステップと、（２）前記Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを前記Ｌ−プロリンに対して作用させて、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン及びシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを得るステップとを含む。
【０００７】
本発明は、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【０００８】
本発明は、本発明の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
【０００９】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００１０】
本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ−又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００１１】
本明細書では、ヒドロキシプロリン（以下、「Ｈｙｐ」という。）の異性体について、ヒドロキシル基が導入される部位（３位又は４位の炭素原子）の違いと、ヒドロキシル基の空間的配置（トランス配置又はシス配置）の違いとにより、トランス−３−Ｈｙｐ、シス−３−Ｈｙｐ、トランス−４−Ｈｙｐ、シス−４−Ｈｙｐとそれぞれ表す場合がある。
【００１２】
シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シス−４−Ｈｙｐ）の構造は化学式Ｉで表される。
【００１３】
【化１】
2011097903.tif 000003
【００１４】
本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明の酵素タンパク質は、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のシス−３−Ｈｙｐ及び／又はシス−４−Ｈｙｐの製造方法に使用される場合がある。本発明の酵素タンパク質を前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記酵素タンパク質を発現する宿主生物、例えば本発明の形質転換体が生きた状態で本発明のシス−３−Ｈｙｐ及び／又はシス−４−Ｈｙｐの製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のシス−３−Ｈｙｐ及び／又はシス−４−Ｈｙｐの製造は、休止菌体反応系や発酵法によって行うことができる。あるいは、前記酵素タンパク質は、精製された状態で本発明のシス−３−Ｈｙｐ及び／又はシス−４−Ｈｙｐの製造方法に使用されてもよい。
【００１５】
配列番号１のアミノ酸配列は、放線菌ストレプトスポランギウム・ロセウムＳｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＮＢＲＣ  ３７７６株由来のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列は、放線菌ストレプトスポランギウム・ロセウムＳｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０２１株由来のアクセッション番号ＥＥＰ１３５９５として登録されており、２−オキソグルタル酸依存型ヒドロキシラーゼとしてアノテーションされていた。本発明の実施例で示すとおり、このＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼが、プロリンからシス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐを生成するＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼ活性を有するとの発見から本発明が想到された。
【００１６】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００１７】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００１８】
本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは、（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００１９】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼのアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００２０】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がＬ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００２１】
本発明のタンパク質のＬ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性は、本発明のタンパク質と、Ｌ−プロリンと、２−オキソグルタル酸と、２価鉄イオンと、Ｌ−アスコルビン酸とを含む反応液中で前記タンパク質をＬ−プロリンに対して作用させることにより生成したシス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐを定量することにより評価される場合がある。
【００２２】
シス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐの定量は、ＬＣ／ＭＳ等のような当業者に周知の分析機器の使用により実施される場合がある。
【００２３】
本発明の製造方法のステップ（２）では、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼとＬ−プロリンとに加えて、ｐＨ調整のための緩衝液成分を含む反応液を用いて実施される場合がある。好ましくは前記緩衝液成分としてＨＥＰＥＳが使用され、ｐＨは７．０〜７．５に調整される場合がある。好ましくは前記反応液は、本発明のタンパク質による水酸化反応に電子供与体として関与する２−オキソグルタル酸をさらに含む場合がある。前記反応液は、２価鉄イオン、Ｌ−アスコルビン酸等をさらに含む場合がある。
【００２４】
本発明の製造方法のステップ（２）において本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをＬ−プロリンに対して作用させるために、反応液が所定の反応時間及び反応温度でインキュベーションされる。本発明の製造方法において、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼ、Ｌ−プロリン、２価鉄イオン、２−オキソグルタル酸等の反応液中における濃度か、反応液量か、反応時間か、反応温度か、その他の反応条件かは、シス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐの目標とする製造量及び収率と、製造に要する時間、費用、設備等と、その他の条件との関係で当業者により決定される場合がある。本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの反応温度は１５°Ｃに設定されることが好ましく、前記Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの反応ｐＨ条件は、ｐＨ６．０に設定されることが好ましい。
【００２５】
本発明の製造方法で取得されるシス−４−Ｈｙｐは、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等のような当業者に周知の操作の組合せにより回収される場合がある。また、本発明の製造方法で取得されるシス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐは、ＬＣ／ＭＳのような当業者に周知の分析技術を使用して生成量又は純度を評価される場合がある。
【００２６】
本明細書において「組換えベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、該所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００２７】
本明細書において「ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。
【００２８】
本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００２９】
本明細書において「形質転換体」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入され、該所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物である。
【００３０】
本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。
【００３１】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。組換えベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の組換えベクターのマップ。
【図２】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの電気泳動図。
【図３】水酸化反応試験についての反応停止とアミノ酸の誘導体化との手順を示す概念図。
【図４】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの２種類の産物のピークが分離できることを示すＨＰＬＣ分析結果のクロマトグラム。
【図５】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼ活性の２−オキソグルタル酸依存性を示すグラフ。
【図６】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの反応温度依存性を示すグラフ。
【図７】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの反応ｐＨ依存性を示すグラフ。
【図８】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの反応阻害剤特異性を示すグラフ。
【図９】本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは２種類の産物を同時に生成することを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
１．Ｌ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをエンコードする遺伝子のクローニング、導入及び発現
１−１．方法
（遺伝子増幅の鋳型となる微生物染色体ＤＮＡの抽出）
放線菌ストレプトスポランギウム・ロセウムＳｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＮＢＲＣ  ３７７６株は独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手し、この染色体ＤＮＡを遺伝子増幅の鋳型として使用した。
【００３５】
前記放線菌を５ｍＬのＩＳＰ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｎｏ．２（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．４％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．４％  グルコース）中で、２８°Ｃ、２日間液体振とう培養を行なった。培養後遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって菌体を回収し、定法に従いそれぞれの微生物菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。
【００３６】
（目的の遺伝子の増幅）
本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをエンコードする遺伝子をストレプトスポランギウム・ロセウムＳｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＮＢＲＣ  ３７７６株の放線菌菌体の染色体ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。前記ＰＣＲには、ＧＣ-ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  システム（ロッシュ）を使用した。その反応条件は表１に示す。クローニング及び発現の条件を表２に示す。放線菌ストレプトスポランギウム・ロセウムＳｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＮＢＲＣ  ３７７６株を鋳型とするセンスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ、配列番号２及び３に示す。
【００３７】
【表１】
2011097903.tif 000004
【００３８】
【表２】
2011097903.tif 000005
【００３９】
（組換えプラスミドの取得）
ＰＣＲにより増幅した目的のＤＮＡをインサート用ＤＮＡとし、それぞれのインサート用ＤＮＡ１μｇとベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）１μｇとを、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを使用する３７°Ｃ、１６時間の反応により切断した。切断産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）で精製した後、それぞれのインサート用ＤＮＡとベクターとを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ）を使用する１６°Ｃ、３時間の反応により連結した。ライゲーション産物を、塩化カルシウム処理した大腸菌ＪＭ１０９株にヒートショック法により導入した。それぞれの組換えプラスミドを保持した大腸菌ＪＭ１０９株を、ＬＢ−Ａ寒天培地（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ、１．５％  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３７°Ｃ、１６時間培養し、次いでＬＢ−Ａ液体培地（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）５ｍＬ中で３７°Ｃ、１６時間培養し、その後ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの内部塩基配列をＤＮＡシークエンサーにて解析し、所望のＤＮＡが挿入されていることを確認した。作製した組換えプラスミドのプラスミドマップを図１に示す。
【００４０】
（目的の遺伝子の発現）
本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをエンコードするＤＮＡの挿入が確認された組換えプラスミド（ｐＥＳｒＰ４Ｈ）を、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）にヒートショック法により導入し、表３に示す手順で発現させた。すなわち前記大腸菌をＬＢ−ＡＣ寒天培地（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ、１．５％  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン、３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）にて３７°Ｃで一晩培養した。生育したシングルコロニーをＬＢ−ＡＣ液体培地（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン、３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）５ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで１６時間振とう培養を行なった。その後、前記液体培地１ｍＬを１００ｍＬの新鮮なＬＢ−ＡＣ液体培地に接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで振とう培養を行なった。Ｏ．Ｄ．６６０＝０．５に達した時点で、終濃度が０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５°Ｃ、１００ｒｐｍで培養し遺伝子発現を誘導した。６時間後、培養菌体を遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）して回収し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁した。前記懸濁液を超音波破砕（３分間）した後、遠心分離（４°Ｃ、２００００×ｇ、３０分間）して上清（無細胞抽出液）を回収した。
【００４１】
１−２．結果
上述の抽出及び増幅操作により、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼをエンコードする遺伝子のクローニングに成功した。上述の組換え操作等により、前記遺伝子を含む組換えプラスミドを作製することができた。得られた組換えプラスミドのプラスミドマップを図１に示す。前記組換えプラスミドの導入操作により、該組換えプラスミドを有する形質転換体を作製することができた。前記形質転換体による前記遺伝子の発現操作により、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを含む無細胞抽出液をそれぞれ取得することができた。得られた無細胞抽出液を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで単一バンドとして得られたタンパク質を図２に示す。前記タンパク質を精製酵素とし、以下の実験に使用した。
【実施例２】
【００４２】
２．本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼによるＬ−プロリンの水酸化反応
２−１．方法
実施例１で得られた本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼによるＬ−プロリンの水酸化反応をそれぞれ実施した。表３に示す組成の反応液（以下、「標準反応液」という。）を調整し、１時間、２５°Ｃで反応を行なった。反応後、図３の手順に従い反応停止と、マーフィー試薬（１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−５−Ｌ−ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ）を使用して反応液中に含まれる全アミノ酸の誘導体化とを行なった。その後、０．４５μｍフィルターを用いて反応液をろ過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。ＨＰＬＣ分析の各種条件は表４（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００４３】
【表３】
2011097903.tif 000006
【００４４】
【表４】
2011097903.tif 000007
【００４５】
２−２．結果
Ｌ−プロリンと、Ｈｙｐの４種類の異性体との標準試料についてＨＰＬＣ分析を行なったところ、Ｈｙｐの異性体はいずれも分離された単一のピークとして検出された（図４）。そこで、ピーク物質の同定は保持時間により行なうこととした。
【００４６】
図５に精製酵素について反応の２−オキソグルタル酸依存性を検討した結果を示す。表３に示す反応混合液の組成から、プロリン、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、ＦｅＳＯ４及び酵素のいずれを省いても、反応活性が完全に失われた。そこで、本発明の本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼの反応は２−オキソグルタル酸依存性であることが示された。
【００４７】
図６に精製酵素について反応至適温度を検討した結果を示す。酵素活性は１５°Ｃで最も高く、５０°Ｃでは完全に失われた。
【００４８】
図７に精製酵素について反応至適ｐＨを検討した結果を示す。酵素活性はｐＨ６．０で最も高く、ｐＨ７−１０では５０％ないし３０％に低下し、ｐＨ５．５では完全に失われた。
【００４９】
図８に精製酵素について反応阻害剤特異性を検討した結果を示す。酵素活性は、ＭｇＳＯ４によっては阻害されなかった。ヒドロキシルアミン、ＭｎＣｌ２及びＦｅＣｌ３によって若干の阻害が認められた。ＥＤＴＡ、ＣｏＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４及びＮｉＳＯ４によって反応が強く阻害された。
【００５０】
図９に本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは２種類の産物を同時に生成することを示す。本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼはＬ−プロリンを３位より４位に優先的に水酸化し、シス−３−Ｈｙｐよりも約３倍多い量のシス−４−Ｈｙｐを生成する水酸化酵素であることが示された。
【００５１】
これらの結果より、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼとＬ−プロリンとの存在下でシス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐが生成されることから、前記タンパク質はＬ−プロリンを位置優先的及び立体選択的に水酸化しシス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐを生成する水酸化酵素であることが確認された。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ等のデータベースで公開されている推定タンパク質機能は「２−オキソグルタル酸依存型ヒドロキシラーゼ」であった。しかし、本実験の結果からは前記タンパク質の機能がＬ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼであることが確認された。また、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼに触媒される反応では２−ＯＧの存在下でシス−３−Ｈｙｐ及びシス−４−Ｈｙｐが生成されることから、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは２−ＯＧの存在下でＰｒｏの３位及び４位の炭素原子とそれに結合する水素原子との間に酸素原子を添加する２−ＯＧ依存型ジオキシゲナーゼであることが確認された。
【００５２】
表５に本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼを発現する形質転換体の大腸菌の休止菌体の反応液の組成を示す。
【００５３】
【表５】
2011097903.tif 000008
【００５４】
表５に示す休止菌体反応液を用いても、本発明のＬ−プロリン  シス−ヒドロキシラーゼは、Ｌ−プロリン  シス−３−ヒドロキシラーゼ活性及びＬ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ活性を示した（図示されない）。
【図１】
2011097903.tif 000009
【図２】
2011097903.tif 000010
【図３】
2011097903.tif 000011
【図４】
2011097903.tif 000012
【図５】
2011097903.tif 000013
【図６】
2011097903.tif 000014
【図７】
2011097903.tif 000015
【図８】
2011097903.tif 000016
【図９】
2011097903.tif 000017
【配列表】
2011097903000001.app