(57)【要約】【課題】組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞の培養液中から組換え体ヒトＦＳＨを，有機溶媒の使用を排した工程のみを用いて，高純度まで高収率で精製する方法を提供する。【解決手段】組換え体ヒトＦＳＨの製造方法であって，(a)組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトＦＳＨを培養液中に分泌させるステップ，(b)培養上清を調製するステップ，(c)培養上清を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付しヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップ，(d)該画分を色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付しヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップ，(e)該画分を，疎水性カラムクロマトグラフィーに付してヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップ，及び(f) 該画分をゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付してヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップを，この順で含んでなるものである，製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用できる組換え体ヒトＦＳＨの製造方法であって，
（ａ）ヒトＦＳＨα鎖ｃＤＮＡをＥＦ−１αプロモーター及びその第１イントロンの下流に組み込んでなる発現ベクターと，ヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡをＥＦ−１αプロモーター及びその第１イントロンの下流に組み込んでなる発現ベクターをそれぞれ構築するステップと，
（ｂ）それらの発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトして組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞を作成するステップと，
（ｃ）該細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトＦＳＨを培養液中に分泌させるステップと，
（ｄ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，
（ｅ）上記ステップ（ｄ）で得た培養上清を，５０〜２５０ｍＭの塩を含むｐＨ５〜６．５に調整した緩衝液により平衡化した陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨを該カラムに結合させ，次いで３００〜９００ｍＭの塩を含むｐＨ５〜６．５に調整した緩衝液により組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップと，
（ｆ）上記ステップ（ｅ）で回収された該画分を，ｐＨ７．８〜８．２の緩衝液により平衡化した色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨを該カラムに吸着させ，次いで１．８〜２．２Ｍの塩を含むｐＨ７．８〜８．２の緩衝液により組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップと，
（ｇ）上記ステップ（ｆ）で回収された該画分を，２．３〜２．７Ｍの塩を含むｐＨ７．８〜８．２に調整した緩衝液により平衡化したフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨを該カラムに吸着させ，次いで１．２〜１．８Ｍの塩を含むｐＨ７．８〜８．２に調整した緩衝液により組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップと，
（ｈ）上記ステップ（ｇ）で回収された該画分を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである製造方法であり，
且つ該製造方法により得られる組換え体ヒトＦＳＨが，そのまま医薬として使用できる純度を有し，比活性が１４０００〜１８０００ＩＵ／ｍｇであるものである製造方法。
【請求項２】
陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が，弱陽イオン交換体である請求項１の製造方法。
【請求項３】
該弱陽イオン交換体が，疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つものである，請求項２の製造方法。
【請求項４】
該弱陽イオン交換体が，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を備えたものである，請求項２又は３の製造方法。
【請求項５】
該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素がブルートリアジン色素である請求項１ないし４の何れかの製造方法。
【請求項６】
該そのまま医薬として使用できる純度が，該組換え体ヒトＦＳＨをＲＰ−ＨＰＬＣ分析したときα鎖のピーク及びβ鎖のピーク以外のピークが面積比で約１％にとどまるものである，請求項１ないし５の何れかの製造方法。
【請求項７】
該比活性が，ラット卵巣重量増加法により測定されたものである，請求項１ないし６の何れかの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，組換え体ヒトＦＳＨの製造方法に関し，より詳しくは，組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞を，無血清培地を用いて培養することによる組換え体ヒトＦＳＨの製造方法，及び，これにより培養上清中に得られた組換え体ヒトＦＳＨを，そのまま医薬として使用できる高純度にまで高収率で精製するための製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は，αおよびβサブユニット各１個ずつから構成される分子量３４ｋＤの糖タンパク質であり，卵巣でのエストロゲンの生産及び分泌を促進する活性を有する。ヒトＦＳＨを主剤とする医薬品が不妊症の治療薬として使用されているが，当初これに含まれるヒトＦＳＨはヒト尿から精製されたものであった。最近になって，遺伝子組換え技術を用いて製造した組換え体ヒトＦＳＨの販売が認められ，「複数卵胞発育のための調節卵巣刺激」及び「視床下部−下垂体機能障害に伴う無排卵及び希発排卵における排卵誘発」をその用法とする不妊治療薬として用いられている。
【０００３】
ヒトＦＳＨのαサブユニットとβサブユニットをコードする遺伝子はクローニングされており，このうちαサブユニットはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のαサブユニットと共通である（特許文献１及び非特許文献１を参照）。
【０００４】
ヒトＦＳＨの２つのサブユニットをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換させた哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞等）を用いた，組換え体ヒトＦＳＨの製造方法が開示されている（特許文献２を参照）。ここでは，ヒトＦＳＨの２つのサブユニットをコードする遺伝子は，別々の発現ベクターに組込みまれ，同じＣＨＯ細胞に導入されている。そして，別々の発現ベクター発現させた２つのサブユニットは，細胞内でヘテロ２量体を構成し，活性を有するヒトＦＳＨが得られる。但し，ここにはヒトＦＳＨの精製方法について具体的な記載はない。
【０００５】
組換え体ヒトＦＳＨを精製する方法として，血清含有又は無血清培地を用いて培養した組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞の培養上清から，青色色素，疎水性，及び逆相カラムクロマトグラフィーをこの順で用いる方法が開示されている（特許文献３を参照）。ここでは，上記のクラマトグラフィーに続けて，更に陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて組換え体ヒトＦＳＨを精製する方法も開示されている。これら何れの本法においても，逆相カラムクロマトグラフィーからのＦＳＨの溶出の際に２−プロパノールが使用されているが，２−プロパノールのような有機溶媒はタンパク質を変性させるおそれがあり，またこのような有機溶媒の使用は，環境面から好ましくなく，これを含む廃液の処理のための施設が必要となるため，工業的生産においては経済面からも好ましくない。
【０００６】
また，組換え体ヒトＦＳＨを精製する方法として，陰イオン交換，固定化金属イオン吸着，疎水性，及び逆相カラムクロマトグラフィーをこの順で用いる方法が開示されている（特許文献４）。本法でも，逆相カラムクロマトグラフィーからの組換え体ヒトＦＳＨの溶出の際に２−プロパノールが使用されており，上記と同様の理由により，環境面からも経済面からも好ましい精製方法とはいえない。この他，尿由来のヒトＦＳＨではあるものの，ヒトＦＳＨを精製する方法として，抗ヒトＦＳＨ抗体アフィニティー，及び逆相カラムクロマトグラフィーを用いる方法が開示されている（特許文献５）。本法でも，逆相カラムクロマトグラフィーからのヒトＦＳＨの溶出の際に２−プロパノールが使用されており，上記の方法と同様の問題を有する。
【０００７】
一方，有機溶媒を使わない組換え体ヒトＦＳＨを精製する方法として，色素，弱陰イオン交換，疎水性，強陰イオン交換及び疎水性カラムクロマトグラフィーをこの順で用いる方法が開示されている（特許文献６）。しかしながら同文献には，野生型のヒトＦＳＨではなくこれに別のアミノ酸配列断片を挿入することにより構成した変異型タンパク質についてしか，実施例が開示されていない。
【０００８】
また，従来からヒト尿からヒトＦＳＨを精製する方法が知られているが（特許文献７），有機溶媒（エタノール）を使用する工程を含んでおり，前記したのと同様の問題がある。
【０００９】
【特許文献１】特許第２００８３４４号公報
【特許文献２】特許第２５５９１９６号公報
【特許文献３】ＷＯ２００６／０５１０７０
【特許文献４】ＷＯ２００５／０６３８１１
【特許文献５】特許第２５２３８４３号公報
【特許文献６】ＷＯ２００７／０６５９１８
【特許文献７】特開第２００１−３２３０００号公報
【非特許文献１】Nature,  286: 684-687（1980）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の背景の下，本発明は，組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞の培養液中から，組換え体ヒトＦＳＨを，有機溶媒の使用を排した工程のみを用いて，そのまま医薬として使用できる高い純度にまで，高収率で精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは，無血清培地中で培養した組換え体ヒトＦＳＨ産生細胞の培養液の培養上清中に含まれる組換え体ヒトＦＳＨを，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，色素アフィニティーカラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，及びゲルろ過カラムクロマトグラフィーの組み合わせにより精製することによって，極めて純度の高い組換え体ヒトＦＳＨを，極めて高い効率で精製することができることを見出した。本発明は，これらの知見に基づき更に検討を加えて完成させたものである。
【００１２】
すなわち，本発明は以下を提供する。
１．組換え体ヒトＦＳＨの製造方法であって，
（ａ）組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトＦＳＨを培養液中に分泌させるステップと，
（ｂ）該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）で得た培養上清を，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップと，
（ｄ）上記ステップ（ｃ）で回収された該画分を，色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップと，
（ｅ）上記ステップ（ｄ）で回収された該画分を，疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップと，
（ｆ）上記ステップ（ｅ）で回収された該画分を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトＦＳＨ活性画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである，製造方法。
２．陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が，弱陽イオン交換体である上記１．の製造方法。
３．該弱陽イオン交換体が，疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つものである，上記２の製造方法。
４．  該弱陽イオン交換体が，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を備えたものである，上記項２又は３の製造方法。
５．該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素がブルートリアジン色素である上記１ないし４の何れかの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば，血清を使用しない細胞培養で組換え体ヒトＦＳＨを製造することができるため，血清の使用に由来するウイルスやプリオンによる汚染のおそれのない組換え体ヒトＦＳＨを製造することができる。このため本発明により得られる組換え体ヒトＦＳＨは，これらの汚染因子による感染のリスクを完全に排除した，安全な不妊治療薬としてヒトの体内に投与することができる。また，本発明によれば，組換え体ヒトＦＳＨを，有機溶媒を使用することなく精製できるため，有機溶媒との接触による組換え体ヒトＦＳＨの変性のおそれが除かれ，更には，精製工程において生じる廃液中に有機溶媒が含まれないため環境面において好ましく，また廃液中の有機溶媒を処理するための設備が不要となり，経済面においても好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において，「組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞」というときは，ヒトＦＳＨの２つのサブユニット（αサブユニットとβサブユニット）をコードする遺伝子が発現又は強発現するように，人為的な操作を加えた哺乳動物細胞のことをいう。このとき強発現させる該遺伝子は，該遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換させることにより該哺乳動物細胞内に導入するのが一般的であるが，これに限らず，内在性の遺伝子を強発現できるように人為的に改変したものでもよい。内在性の遺伝子を強発現できるように人為的に改変する手段としては，内在性の遺伝子の上流に存在するプロモーターを，強力な遺伝子発現を誘導するプロモーターに置き換える方法が挙げられるが，これに限られない。また，該哺乳動物細胞について特に限定はないが，ヒト，マウス，ハムスター由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞が好ましい。
【００１５】
本発明において，「組換え体ヒトＦＳＨ」というときは，上記の組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞を培養したときに，培地中に分泌されるヒトＦＳＨのことをいう。
【００１６】
本発明において，組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞の培養のための無血清培地としては，例えば：
アミノ酸・・・３〜７００ｍｇ／Ｌ，
ビタミン類・・・０．００１〜５０ｍｇ／Ｌ，
単糖類・・・０．３〜１０ｇ／Ｌ，
無機塩・・・０．１〜１００００ｍｇ／Ｌ，
微量元素・・・０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌ，
ヌクレオシド・・・０．１〜５０ｍｇ／Ｌ，
脂肪酸・・・０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ，
ビオチン・・・０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，
ヒドロコルチゾン・・・０．１〜２０μｇ／Ｌ，
インシュリン・・・０．１〜２０ｍｇ／Ｌ，
ビタミンＢ１２・・・０．１〜１０ｍｇ／Ｌ，
プトレッシン・・・０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，
ピルビン酸ナトリウム・・・１０〜５００ｍｇ／Ｌ，及び
水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬および抗生物質を添加してもよい。
【００１７】
また無血清培地として，ＤＭＥＭ／F１２培地（ＤＭＥＭとF１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ−グルタミン，Ｄ−グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄(II)，アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，CDoptiCHO，CHO-S-SFM IIまたはCD CHO（インビトロジェン社），IS CHO-VまたはIS CHO-V-GS（アーバイン社），EX-CELL302またはEX-CELL305（JRH社）等を基本培地として使用してもよい。
【００１８】
組換え体ヒトＦＳＨ精製のための各クロマトグラフィーは，状況に応じて，タンパク質の非特異的吸着を防止するため，非イオン性界面活性剤の存在下で行うことができる。非イオン性界面活性剤としては，特に限定はないが，好ましくはポリソルベート系界面活性剤が，更に好ましくはポリソルベート８０が用いられる。非イオン性界面活性剤の濃度は，好ましくは0.00５％(w/v)〜0.015％(w/v)，より好ましくは0.01％(w/v)である。
【００１９】
ヒトＦＳＨ精製は，室温又は低温環境で行うことができるが，好ましくは低温環境で，特に１〜10℃で行われる。
【００２０】
精製の第一クロマトグラフィー工程においては，塩を添加したリン酸緩衝液により平衡化させた陽イオン交換カラムに，組換え体ヒトＦＳＨを結合させる。このときのリン酸緩衝液のｐＨは５〜6.5に調製しておくことが好ましく，5.5〜6.0付近に調製しておくことが更に好ましい。また，このときリン酸緩衝液に添加する塩としては，特に限定はないが，好ましくは塩化ナトリウムであり，その濃度は50〜250ｍＭが好ましい。
【００２１】
組換え体ヒトＦＳＨを結合させた陽イオン交換カラムを洗浄した後，塩濃度を上昇させたリン酸緩衝液により組換え体ヒトＦＳＨを溶出させる。このときのリン酸緩衝液のｐＨは5.5〜6.5に調製しておくことが好ましく，6.0付近に調製しておくことが更に好ましい。また，このときリン酸緩衝液に添加する塩としては，特に限定はないが，好ましくは塩化ナトリウムであり，その濃度は300〜900ｍＭが好ましく，400〜800ｍＭが更に好ましい。
【００２２】
また，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いるイオン交換体について特に限定はないが，弱陽イオン交換体が好ましく，疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ弱陽イオン交換体が更に好ましい。例えば，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を備え疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ弱陽イオン交換体として，CaptoMMC（ＧＥヘルスケア社）等を使用することができる。
【００２３】
精製の第二工程における，色素アフィニティークロマトグラフィーは，ヒトＦＳＨが，特定の色素に対して強い親和性を示すことを利用して，夾雑物を除去するためのものである。ブルートリアジン色素が好適に利用されるが，その他のトリアジン色素も適当である。特に好ましいのは，色素CibacronＴＭ Blue F3GAをSepharose 6 Fast Flowマトリックスに共有結合で固定した，Blue
Sepharose 6 FF, Fast Flow（ＧＥヘルスケア社）である。
【００２４】
色素アフィニティークロマトグラフィーカラムを中性付近，好ましくはｐＨ7.8〜8.2に，緩衝液で平衡化し，これに第一工程の溶出画分を供する。その際，第一工程の溶出画分は，予め緩衝液で，ｐＨを中性付近，好ましくはｐＨ7.8〜8.2に調整する。溶出は塩濃度を上昇させることにより行うことができる。溶出に用いる塩としては，特に限定はないが，好ましくは塩化カリウムであり，その濃度は好ましくは1.8〜2.2ｍｏｌ／Ｌ，特に好ましくは約２ｍｏｌ／Ｌである。
【００２５】
精製の第三工程における，疎水性クロマトグラフィーは，夾雑蛋白質等を除去するためのものである。疎水性クロマトグラフィー交換樹脂としては，特に限定はないが，Phenyl-Sepharoseが好適に利用できる。
【００２６】
疎水性クロマトグラフィーに供されるヒトＦＳＨ含有画分は，塩濃度を調整しておく必要がある。このとき用いられる塩は，特に限定は無いが，好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。その濃度は，塩化ナトリウムイオン濃度換算で，好ましくは2.5〜3.5ｍｏｌ／Ｌに，更に好ましくは，2.8〜3.2ｍｏｌ／Ｌである。カラムは，塩を添加した緩衝液でｐＨを中性付近，好ましくはｐＨ7.8〜8.2に，更に好ましくは約８に調整しておく。このとき添加する塩としては，特に限定はないが，好ましくは塩化ナトリウムであり，その濃度は，好ましくは２〜３ｍｏｌ／Ｌ，更に好ましくは，2.3〜2.7ｍｏｌ／Ｌ，特に好ましくは約2.5ｍｏｌ／Ｌである。
【００２７】
溶出は塩濃度を低下させることにより行うことができる。溶出に用いる塩としては，特に限定はないが，好ましくは塩化ナトリウムであり，その濃度は好ましくは1.2〜1.8ｍｏｌ／Ｌ，更に好ましくは約1.4〜1.6ｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
精製の第四工程における，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーは，エンドトトキシン等の低分子の不純物，ヒトＦＳＨの多量体，分解物等を除去するためのものであり，これにより，実質的に純粋なヒトＦＳＨが得られる。
【実施例】
【００２９】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００３０】
〔ヒトＦＳＨ発現用ベクターの構築〕
pEF/myc/nucベクター（インビトロジェン社）を，KpnIとNcoIで消化し，EF-1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo（インビトロジェン社）を，BglIIおよびEcoRIで消化して，CMVのエンハンサー／プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して，pE-neoベクターを構築した（図１−１及び図１−２）。
【００３１】
pE-neoベクターを，SfiIおよびBstXIで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１kbpの領域を切除した（図２−１）。pcDNA3.1/Hygro(+)（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi (5'-GAGGCCGCCTCGGCCTCTGA-3'；配列番号１)およびプライマーHyg-BstX（5’-AACCATCGTGATGGGTGCTATTCCTTTGC-3’；配列番号２）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した（図２−２）。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，SfiIおよびBstXIで消化し，上記のpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した（図２−３）。
【００３２】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー(タカラバイオ)を鋳型にして，プライマーHCG-A-F（5'-ATCCTGCAAAAAGCCCAGAG-3'；配列番号３）およびプライマーHCG-A-R
(5'-CTTGAAGCGTGTCAAAGTGG-3'；配列番号４)を用いて一次ＰＣＲ反応を行った。さらに得られたＰＣＲ産物を鋳型に，一次反応プラーマーHCG-A-Fよりやや3’側下流の位置の配列を持つプライマーHCGA-ORF-F（5'-GCGAATTCGCCACCATGGATTACTACAGAA-3'；配列番号５），および一次反応プラーマーHCG-A-Rよりやや5’側上流の位置の配列を持つプライマーHCGA-ORF-R（5'-GCGAATTCTTAAGATTTGTGATAAT-3'配列番号６）を用いて二次ＰＣＲ反応を行いヒトＦＳＨα鎖のｃＤＮＡを増幅した。また，同様に，ヒト脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー(タカラバイオ)を鋳型にして，１次プラーマーFSH-F（5'-GACCACAGGTGAGTCTTGGC-3'；配列番号７）およびFSH-R（5'-TGGTCCTTCAGGACAAGGGT-3'；配列番号８）と２次プライマーFSH-F2（5'-GCGAATTCGCCACCATGAAGACACTCCAGT-3';配列番号９）及びFSH-R2(5'- TAAGAATGCGGCCGCCCACTGATCTTTATT-3'；配列番号１０)を用いて，ＰＣＲ反応によりヒトＦＳＨβ鎖のｃＤＮＡを増幅した。
【００３３】
ヒトＦＳＨα鎖の１次PCR反応は，ヒト胎盤cDNAライブラリー100ｎｇを鋳型に，（95℃／10秒，55℃／10秒，72℃／10秒）を１サイクルとして40サイクルさせた。２次ＰＣＲ反応は，１次ＰＣＲ反応の反応液１μＬを鋳型に，（95℃／10秒，60℃／10，72℃／10秒）を１サイクルとして30サイクル反応させた。また，ヒトＦＳＨβ鎖の１次ＰＣＲ反応は，ヒト脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー10ｎｇを鋳型に，（98℃／2秒，60℃／10，72℃／10秒）を１サイクルとして40サイクル反応させた。２次ＰＣＲ反応は，１次ＰＣＲ反応の反応液1μＬを鋳型に，（98℃／2秒，60℃／10，72℃／10秒）を１サイクルとして30サイクル反応させた。
【００３４】
増幅させたヒトＦＳＨα鎖ｃＤＮＡを，EcoRIで切断した後，EcoRI で消化したpBluescriptIISK(-)（pBS: Stratagene社）のEcoRIサイトへ挿入した。得られたプラスミドＤＮＡをXbaIとEcoRVで消化し，ヒトＦＳＨα鎖ｃＤＮＡを切り出し，これをXbaIとSmalで消化したｐE-neoベクターに挿入し，ヒトＦＳＨα鎖発現用ベクターpE-neo（hCGα）とした（図３）。
【００３５】
増幅させたヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを，EcoRIおよびNotIで切断した後，EcoRIとNotIで消化した
pBluescriptIISK(-)に挿入した。得られたプラスミドＤＮＡを，EcoRIで消化し，Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に，NotIで消化し，ヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを切り出した。pE-hygrベクターをXbaIで消化し，Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に，NotIで消化した。このpE-hygrベクターに，ヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを挿入し，ヒトＦＳＨβ鎖発現用ベクターｐE-hygr(FSHβ)とした（図４）。
【００３６】
〔ヒトＦＳＨ発現用組換え細胞の作成〕
ＣＨＯ細胞（CHO-K1：American Type Culture Collectionより購入）に，Lipofectamine2000（lnvitrogen社）を用いて，前記発現用ベクターpE-neo(ｈCGα)および pE-hygr(FSHβ)を下記の方法でトランスフェクトした。すなわち，予めトランスフェクション前日にコンフルエントに近い細胞密度となるように3.5ｃｍ培養皿にCHO-K1細胞を播種し，一晩5％炭酸ガス通気下37℃で培養した。翌日，PBS(-)で２回洗浄した後，血清を含まないD-MEM/F12培地（インビトジェン社）１ｍLに交換した。Opti-MEM I培地（インビトロジェン社）で20倍に希釈したLipofectamine2000溶液とプラスミドDNA溶液（pE-neo(ｈCGα)13.2μｇ／ｍＬ /pE-hygr(FSHβ)6.6μｇ／ｍＬ）の等量混液を200μＬ添加し，37℃５時間トランスフェクションした。
【００３７】
トランスフェクション後，５％FCS を含むD-MEM／F12（D-MEM/F12／5％FCS）培地に交換して5%炭酸ガス通気下37℃で２日間培養した。その後，0.6ｍｇ／ｍｌ G418および0.4ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むD-MEM/F12/5％FCS培地に交換して５％炭酸ガス通気下37℃で選択培養を行った。選択培地中で増殖する細胞を数代継代し，組換え体細胞を得た。
【００３８】
次に，限界希釈法にて96穴プレートに１穴あたり1個以下の細胞が播種される条件で組換え体細胞を播種し，10日間ほど培養し，単一コロニーを形成させた。単一コロニーを形成した穴の培養上清を採取しELISAにてＦＳＨ発現量を調べ，ヒトＦＳＨの高発現株を選択した。
【００３９】
選択した細胞株を，無血清浮遊細胞へ馴化させるため，Ｌ−グルタミンを４ｍＭ，ヒポキサンチンを10ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，Ｇ４１８を120ｍｇ／Ｌ，ハイグロマイシンＢを80ｍｇ／Ｌ添加した市販の無血清培地EX-CELL302培地（JRH社）で細胞の増殖が安定するまで維代培養を行った。更に，培地をIS CHO-V-GS培地に切り換えて，細胞の増殖速度が安定するまで培養を継続し，これを10％DMSOを添加したIS CHO-V-GS 培地に懸濁させて液体窒素中に保存し，種細胞とした。
【００４０】
〔ヒトＦＳＨ発現用組換え細胞の培養〕
前記種細胞を融解し，２×10５個／ｍＬの濃度に希釈して，まずIS CHO-V-GS培地で３日間培養した。次いで，IS CHO-V-GS培地と，Ｌ−グルタミンを８ｍＭ，ヒポキサンチンを10ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，G418を0.12ｍｇ／ｍＬ及びハイグロマイシンＢを80ｍｇ/L添加したCDoptiCHO（ＣＤ）培地（インビトロジェン社）を１：１の比率で混合した培地で細胞濃度を２×10５個／ｍＬに希釈して４日間，更にＣＤ培地で細胞濃度を２×10５個／ｍＬに希釈し４日間，37℃で５％Ｃ０２存在の下に静置培養し，拡大培養を行った。
【００４１】
細胞数を計測し，細胞濃度が５×10５個／ｍＬとなるようにＣＤ培地で希釈し，５Ｌの細胞液を，培養器に移して３日間振とう培養した。更に，培養器に新鮮なＣＤ培地20Ｌを添加して，３日間振とう培養した。このときの培養条件は，攪拌速度60ｒｐｍ，ｐＨ7.2，溶存酸素70％，温度37℃，上面通気（空気）500ｍＬ／分，液内通気（Ｃ０２）50ｍＬ／分，液内通気（０２）50ｍＬ／分とした。
【００４２】
次に，上記の培養器の細胞培養液を２×10５個／ｍＬとなるようにG418及びハイグロマイシンＢを含まないＣＤ培地で希釈し，このうち250Ｌの細胞液を，250L容培養器に移して７日間振とう培養した。このときの培養条件は，攪拌速度120ｒｐｍ，ｐＨ7.2，溶存酸素70％，温度37℃，上面通気（空気）10Ｌ／分，液内通気（空気）250ｍＬ／分，液内通気（Ｃ０２）2500ｍＬ／分，液内通気（０２）2500ｍＬ／分とした。培養中は毎日サンプリングを行い，細胞数，生存率，グルコース濃度，乳酸濃度，ヒトＦＳＨの発現量を測定した。
【００４３】
上記細胞の培養は３回繰り返し行った（ロット番号１〜３）。いずれの場合も，生細胞密度は，培養６〜７日目にかけて，ほぼ１×10７個／ｍＬ以上にまで達し，高密度な細胞培養が実現できたことがわかった（図５）。細胞から培地中に分泌されたヒトＦＳＨの濃度をELISA法により測定したところ，その濃度は，細胞増殖曲線にやや時間的遅れを示しながら上昇し，培養７日目には，おおよそ８〜10ｍｇ／Ｌに達した（図６）。
【００４４】
細胞培養液を回収し，ゼータプラスＴＭフィルターカートリッジ90MZ03M（３Ｍ社）を用いて細胞を除去し，更に0.22μｍフィルターでろ過して，培養上清を得た。
【００４５】
〔ヒトＦＳＨの精製方法〕
回収した培養上清に，６ＮＨCｌを添加して，培養上清のｐＨを5.5に調整し，沈殿物をフィルターろ過して除去した。この培養上清を，カラム体積の４倍量の50ｍＭリン酸ナトリウム／100ｍＭ ＮａＣｌ（pH5.5）溶液で平衡化した，疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ陽イオン交換カラムであるCaptoMMCカラム（カラム体積；約10Ｌ，ベット高：約20ｃｍ）に，150ｃｍ／時の線流速で負荷し，吸着させた。引き続き同流速で，カラム体積の４倍量の50ｍＭリン酸ナトリウム／100ｍＭ ＮａＣｌ（pH5.5）溶液でカラムを洗浄した後，カラム体積の5倍量の50ｍＭリン酸ナトリウム／400ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ6.0）溶液で吸着蛋白質を溶出した。
【００４６】
次いで，ウイルス不活化工程として，上記のCaptoMMCカラム溶出画分に，最終濃度が各々0.3％(v/v)および１％(w/v)となるようにトリ−ｎ−ブチルリン酸（TNBP）および Tween80を添加して，室温で６時間静置した。
【００４７】
上記のウイルス不活化処理をしたCaptoMMCカラム溶出画分に，体積％で約４０ ％量の250ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ8.5）を加え，導電率を約２．６Ｓ／ｍに調製した。この溶液を，カラム体積４倍量の50ｍＭTris-HCl／300 ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ8.0）溶液で平衡化した色素カラムであるBlue
sepharose 6FFカラム（カラム体積：約６Ｌ，ベット高：約20ｃｍ）に，60ｃｍ／時の線流速で負荷し，吸着させた。引き続き同流速で，カラム体積4倍量の50ｍＭ Tris-HCl／500ｍＭ
ＫＣｌ（ｐＨ8.0）溶液でカラムを洗浄した後，カラム体積５倍量の50 mM
Tris-HCl／２Ｍ ＫＣｌ／0.01％(w/v) Tween80（ｐＨ8.0）溶液で吸着蛋白質を溶出した。
【００４８】
次いで，上記Blue sepharose 6FFカラム溶出画分に，４Ｍ ＮａＣｌ溶液を等量添加し塩濃度を調製した。この溶液を，カラム体積4倍量の50ｍＭ Tris-HCl／２Ｍ
ＮａＣｌ（ｐＨ8.0）溶液で平衡化したPhenyl sepharose HPカラム（カラム体積：約６Ｌ，ベット高：約20ｃｍ）に，60ｃｍ／時の線流速で負荷し，吸着させた。引き続き同流速で，カラム体積4倍量の50ｍＭ Tris-HCl，2.5Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ8.0）溶液でカラムを洗浄した後，カラム体積5倍量の50ｍＭ Tris-HCl，1.6 Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ8.0）溶液で吸着蛋白質を溶出した。
【００４９】
次いで，上記Phenyl sepharose HPカラム溶出画分を，バイオマックス５膜（５ｋＤａカットオフ，ミリポア社）で順次濃縮した。この濃縮液を，20ｍＭリン酸ナトリウム／133ｍＭ ＮａＣｌ／0.01％(w/v) Tween80（ｐＨ7.4）溶液で平衡化したSuperdex peptide 75ｐｇ（カラム体積：約4.8Ｌ，ベット高：約60ｃｍ）に，14.9ｃｍ／時の線流速で負荷し，280ｎｍの吸光度ピーク（図７）を，精製ヒトＦＳＨとして分離，回収した。
【００５０】
各精製ステップにおけるヒトＦＳＨの回収率を，表１に示した。ここで，工程ＦＳＨ回収率とは，各々の工程において，負荷したヒトＦＳＨ量に対する，回収したヒトＦＳＨ量の比率のことをいい，通算ＦＳＨ回収率とは，精製工程に供したスタート時点におけるヒトＦＳＨ量に対する，各行程において回収したヒトＦＳＨ量の比率のことをいう。
【００５１】
精製第一工程である陽イオンカラムクラマトグラフィーに供したヒトＦＳＨの量は2256.1ｍｇであったが，最終的に1043.5ｍｇのヒトＦＳＨを回収することができ，回収率は43.9％に達した。このことから，上記の精製方法により，高収率で大量の組換えヒトＦＳＨが精製できることがわかった。
【００５２】
【表１】
2011172602.tif 000002
【００５３】
〔精製ヒトＦＳＨの分析〕
上記精製ヒトＦＳＨを非還元・非加熱条件でSDS-PAGE電気泳動をした。ゲルをクマジー染色した結果，分子量約４５ｋＤａに単一バンドのみが認められた（図８）。このバンドは抗ヒトＦＳＨ抗体を用いたウェスタンブロッティングで染色され，ヒトＦＳＨのものであった（データは示さず）。
【００５４】
また，上記精製ヒトＦＳＨを，ＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ，α鎖に由来するピーク３，β鎖に由来するピーク１以外に，面積比約１％のピーク２を認めるものの，高純度に精製されたヒトＦＳＨであることがわかった（図９）。なお，ピーク２は，Ｎ末端アミノ酸配列解析とアミノ酸組成分析から，α鎖に由来するペプチド鎖であることがわかった。
【００５５】
また，上記精製ヒトＦＳＨを，等電点電気泳動で分析したところ，ｐＩ
3.5〜5.5の間に複数のバンドを認めた（図１０）。これは，既報の組換えＦＳＨの等電点電気泳動パターンと同様であった（Loumaye E., Human Reprod. Update 4: 862-881,1998）。
【００５６】
ラット卵巣重量増加法により，上記精製ヒトＦＳＨの比活性を測定したところ，14,000〜18,000ＩＵ／ｍｇであった。この値は，既に日本国内で医薬品として販売されている組換えヒトＦＳＨ製剤の比活性と同等かそれ以上であった(de Leeuw R., Mol. Hum. Reprod. 2: 361-369, 1996)。
【００５７】
〔ＥＬＩＳＡ法によるヒトＦＳＨの定量〕
ＥＩＡ用96ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社）の各ウェルに，0.05Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液で１μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＦＳＨαサブユニット抗体（Leinco Technologies社）100μＬを添加し室温で２時間以上静置して吸着させた。次いで，各ウェルを，0.05％ Tween20を含むPBS（PBS-T）で3回洗浄したのち，各ウェルに，0.5％BSA及び0.05％Tween20を含むPBS（PBS-BT）で適度に希釈した検体またはヒトＦＳＨスタンダード（シグマ社）を，100μＬ添加して室温で2時間以上静置した。次いで，各ウェルを，PBS-Tで3回洗浄したのち，各ウェルに，PBS-BTで1000倍希釈したＰＯ標識抗ヒトＦＳＨβ鎖抗体（Leinco Technologies社）を100μＬ添加して室温で2時間以上静置した。次いで，各ウェルを，PBS-Tで3回洗浄したのち，各ウェルに，基質溶液を100μＬずつ添加し，室温で酵素反応を行った。上記基質溶液として，0.025Ｍクエン酸と0.05M Ｎａ２ＨＰＯ４を混合してｐＨ5.0に調整した緩衝液に，オルトフェニレンジアミン（OPD）を0.4ｍｇ／ｍＬおよびH2O2を0.008％含むように添加したものを用いた。次いで，各ウェルに，２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を100μＬずつ添加して反応を停止させた後，各ウェルの492ｎｍにおける吸光度を，96ウェル用プレートリーダーで測定した。
【００５８】
〔ＲＰ−ＨＰＬＣ法によるヒトＦＳＨの分析〕
高速液体クロマトグラフィーはＬＣ-20ＡSystem,SPD-20AV UV/VIS Detector（島津製作所）を用いて実施した。TSKgel Octadecyl-4PW（4.6ｍｍ径Ｘ１５０ｍｍ長，東ソー社）を，０．１％トリフルオロ酢酸を含む4％アセトニトリル溶液で平衡化した。これにサンプルを負荷し，アセトニトリル濃度を直線的に４％から18％に上昇させて溶出した。検出は214ｎｍの吸光度を測定した。
【００５９】
〔ラット卵巣重量増加法によるヒトＦＳＨの活性測定〕
ヒトＦＳＨの活性測定はラット卵巣重量増加法で行った（Steelman S., Endocrinology 53（6）: 604-616, 1953）。体重約45〜65ｇの雌性ＳＤラット（日本チャールスリバー）を，入荷後３日間飼育して馴化させた。ラットに，試料希釈液を用いて0.2ｍＬに希釈した被験試料又はヒトＦＳＨスタンダードを，１日目の午後，２日目の午前，正午，午後，３日目の午前および午後の計６回皮下投与した。５日目に，ラットの卵巣を摘出し，重量を測定した。ヒトＦＳＨスタンダードには，「First international standard for Follicule Stimulating Hormone,(FSH)
Recombinant,Human for Bioassay ; NIBSC code 92/642 ; WHO 」を用いた。また，試料希釈液は，ｈＣＧ製剤（10000ＩＵ，日本薬局方）３アンプルに，１アンプルにつき添付溶解液２ｍＬを加えて溶解し（5000ＩＵ／ｍＬ），得られた溶液4.0ｍＬとウシ血清アルブミン3.0ｇを，適量のリン酸塩緩衝液（ｐＨ7.1）に加えて溶解した後，上記緩衝液で全量250ｍＬに調整，これを，0.22μｍメンブレンフィルターでろ過して調製した。１群５匹のラットに，希釈倍率を変えた４種類の被験試料を投与し力価の推定を行った後，本試験を行った。本試験は，卵巣質量が95〜105ｍｇになると推定される希釈倍率のものを高濃度群，高濃度群の1.5〜２倍の希釈倍率のものを低濃度群とし，１群10匹で，２−２用量検定法により，ヒトＦＳＨの活性を測定した。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の組換え体ヒトＦＳＨの製造方法は，無血清培地を用いて組換え体ヒトＦＳＨ産生哺乳動物細胞を培養することにより，ウイルスの混入を防止することができ，また，発現させた組換え体ヒトＦＳＨを，そのまま医薬として使用できる高純度にまで高収率で精製することができることから，組換え体ヒトＦＳＨの製造方法の製造方法として高い有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１−１】pE-neoベクターの構築方法の流れ図を示す。
【図１−２】pE-neoベクターの構築方法の流れ図を示す。
【図２−１】pE-hygrベクターの構築方法の流れ図を示す。
【図２−２】pE-hygrベクターの構築方法の流れ図を示す。
【図２−３】pE-hygrベクターの構築方法の流れ図を示す。
【図３】ヒトＦＳＨα鎖発現用ベクターpE-neo(hCGα)の構造図を示す。
【図４】ヒトＦＳＨβ鎖発現用ベクターpE-hygr(FSHβ)の構造図を示す。
【図５】無血清培養時における，ヒトＦＳＨ発現用組換え細胞の生細胞密度を示す。
【図６】無血清培養時における ，培地中のヒトＦＳＨの濃度を示す。
【図７】ゲルろ過カラムグラフィーにおける，280ｎｍ吸光度のパターンを示す。
【図８】精製したヒトＦＳＨの，非還元，非加熱条件でのSDS-PAGEゲル電気泳動のパターンを示す。各レーンに約５μｇのヒトＦＳＨをアプライした。レーン１−３にはそれぞれ，ロット番号１〜３の最終精製物をアプライした。
【図９】精製したヒトＦＳＨ（ロット番号１）の，RP-HPLCのチャートを示す。
【図１０】精製したヒトＦＳＨの等電点電気泳動のパターンを示す。各レーンに約10μｇのヒトＦＳＨをアプライした。レーン１−３にはそれぞれ，ロット番号１〜３の最終精製物をアプライした。
【図１−１】
2011172602.tif 000003
【図１−２】
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【図２−１】
2011172602.tif 000005
【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011172602.tif 000010
【図６】
2011172602.tif 000011
【図７】
2011172602.tif 000012
【図９】
2011172602.tif 000013
【図８】
2011172602.tif 000014
【図１０】
2011172602.tif 000015
【配列表】
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