(57)【要約】【課題】多糖類と細胞接着ペプチドを用いて、従来より簡便な方法で製造できる多糖類ゲル組成物を提供すること。【解決手段】多糖類溶液に細胞接着ペプチドを混合し、乾燥、及び再水和することによって得られる多糖類ゲル組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類溶液に細胞接着ペプチドを混合し、乾燥、及び再水和することによって得られる多糖類ゲル組成物。
【請求項２】
多糖類がアガロースである、請求項１に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項３】
多糖類の量が０．１５〜１５μｇ／ｍｍ2である、請求項１又は２に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項４】
細胞接着ペプチドの量が３〜３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2である、請求項１から３の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項５】
細胞接着ペプチドが、細胞表面受容体のシンデカンに作用するペプチドである、請求項１から４の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項６】
細胞接着ペプチドが、Arg-Lys-Arg-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Thrである、請求項１から５の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項７】
細胞接着ペプチドが、Lys-Ala-Phe-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Pheである、請求項１から５の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項８】
細胞接着ペプチドが、
Ala-Thr-Leu-Gln-Leu-Gln-Glu-Gly-Arg-Leu-His-Phe-Xaa-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Arg
（XaaはNleを示す）である、請求項１から５の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項９】
膜状の形態である、請求項１から８の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物を含む、細胞培養基材。
【請求項１１】
多糖類溶液に細胞接着ペプチドを混合し、得られた混合物を乾燥し、再水和する工程を含む、請求項１から９の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物の製造方法。
【請求項１２】
細胞を請求項１から９の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、細胞培養方法。
【請求項１３】
細胞を請求項１から９の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、神経突起伸長の誘導法。
【請求項１４】
細胞を請求項１から９の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、管腔様構造形成の誘導法。
【請求項１５】
細胞を請求項１から９の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、腺房様構造形成の誘導法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類と細胞接着ペプチドを含む多糖類ゲル組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は、様々な医療機器や医薬品等の開発あるいは支援を目的として種々の様態において実施されている。生体内の細胞が細胞外マトリックスと呼ばれる基質に支えられて存在するように、細胞培養には細胞を物理的、生物学的に支える基質が欠かせない（非特許文献１及び２）。
【０００３】
生物学的性質だけでなく、基質の物理的性質も細胞機能に影響を及ぼすことから、基質の材質としてヒドロゲルがしばしば用いられる。細胞培養基質のヒドロゲルとして、細胞外マトリックス成分であるマトリゲルや、コラーゲン等が広く用いられている。しかし、マトリゲルはマウス肉腫株由来であり、コラーゲンも動物由来なので、それらを用いて培養した細胞のヒトへの適応には安全面で問題がある。また、合成ポリマーのヒドロゲルも用いられているが、細胞接着性に乏しい等の問題が知られている。
【０００４】
一方、細胞を生物学的に支える手段の一つとして、細胞接着ペプチドが用いられている。細胞接着ペプチドは、細胞接着蛋白質中の細胞接着活性を担う部分ペプチドであり、その配列としてはRGD、YIGSR、IKVAV等が広く知られているが、他にも多くの配列が同定されている（非特許文献３）。細胞接着ペプチドは細胞の表面に存在する受容体（インテグリン、シンデカン等）に特異的に作用することによって細胞の接着、伸展、分化等の様々な生物活性を誘導するため、機能的な生体材料の開発に有用である。
【０００５】
これまでに、細胞接着ペプチドをアガロース、キトサン、アルギン酸等の多糖類に結合させ、細胞培養する方法が開発されており（特許文献１）、ペプチド−多糖類ゲルの細胞培養基材としての有用性は既に明らかにされている。その際、多糖類にペプチドを共有結合で固定化することが生物活性を得るために重要であることが述べられている。ペプチドの共有結合での固定化は、活性化剤等を用いた、いくつかのステップにより行われている。例えば、特許文献１の細胞接着ペプチド結合アガロースゲルの調製は、アガロースの前処理としてアセトンによる洗浄、脱水、カルボジイミダゾールによる活性化、アセトンによる洗浄を行い、次にペプチドのカップリング、PBSによる洗浄、重炭酸ナトリウムによるクエンチング、凍結乾燥、といったステップで行われている。このように、従来の多糖類と細胞接着ペプチドからなる細胞培養基材の作製方法には、ペプチドと多糖類を共有結合させるための様々なステップが必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１０−５０３０９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Badylak S. F., Biomaterials, 28, 3587-3593 (2007).
【非特許文献２】Badylak S. F., Freytes D. O., Gilbert T. W., Acta. Biomater., 5, 1-13 (2009).
【非特許文献３】Suzuki N., Yokoyama F., Nomizu M., Connect Tissue Res., 46, 142-152 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、多糖類と細胞接着ペプチドを用いて、従来より簡便な方法で製造できる多糖類ゲル組成物を提供することを解決すべき課題とする。より詳細には、本発明は、多糖類と細胞接着ペプチドとを共有結合させることなく使用することで製造できる多糖類ゲル組成物を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、加熱したアガロースに、細胞接着ペプチドを均一に混合し、冷却によるゲル化後、乾燥、再水和するという非常に短いステップで、細胞接着性、神経突起伸長活性、管腔様構造形成活性、及び腺房様構造形成活性を有する薄いアガロースゲルが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  多糖類溶液に細胞接着ペプチドを混合し、乾燥、及び再水和することによって得られる多糖類ゲル組成物。
（２）  多糖類がアガロースである、（１）に記載の多糖類ゲル組成物。
（３）  多糖類の量が０．１５〜１５μｇ／ｍｍ2である、（１）又は（２）に記載の多糖類ゲル組成物。
【００１１】
（４）  細胞接着ペプチドの量が３〜３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2である、（１）から（３）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
（５）  細胞接着ペプチドが、細胞表面受容体のシンデカンに作用するペプチドである、（１）から（４）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
（６）  細胞接着ペプチドが、Arg-Lys-Arg-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Thrである、（１）から（５）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
（７）  細胞接着ペプチドが、Lys-Ala-Phe-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Pheである、（１）から（５）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
（８）  細胞接着ペプチドが、
Ala-Thr-Leu-Gln-Leu-Gln-Glu-Gly-Arg-Leu-His-Phe-Xaa-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Arg
（XaaはNleを示す）である、（１）から（５）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
【００１２】
（９）  膜状の形態である、（１）から（８）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物。
（１０）  （１）から（９）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物を含む、細胞培養基材。
（１１）  多糖類溶液に細胞接着ペプチドを混合し、得られた混合物を乾燥し、再水和する工程を含む、（１）から（９）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物の製造方法。
【００１３】
（１２）  細胞を（１）から（９）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、細胞培養方法。
（１３）  細胞を（１）から（９）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、神経突起伸長の誘導法。
（１４）  細胞を（１）から（９）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、管腔様構造形成の誘導法。
（１５）  細胞を（１）から（９）の何れか１項に記載の多糖類ゲル組成物上で培養することを含む、腺房様構造形成の誘導法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明における細胞接着性を有する多糖類ゲル組成物の製造方法は、ペプチドとアガロースを混合して乾燥、再水和するだけという極めて簡単なステップである。また、このペプチドを混合した多糖類ゲル組成物の物性は多糖類の物性と大差無く、その取り扱いは容易であった。細胞接着ペプチドを混合することにより、単独では全く細胞接着活性を有さない多糖類が高い細胞接着活性を示すようになった。さらに、本発明の多糖類ゲル組成物は、これまでペプチドを結合したキトサンまたはアルギン酸ではできなかった血管内皮細胞の管腔様構造形成や唾液腺細胞の腺房様構造形成を誘導することができた。上記の通り、本発明の多糖類ゲル組成物は、細胞接着活性、神経細胞の神経突起伸長活性だけでなく、従来の多糖類ゲルでは不可能であった血管内皮細胞の管腔様構造形成や唾液腺細胞の腺房様構造形成等を促進し、細胞特異的な高い生物活性を有するものである。従って、本発明の多糖類ゲル組成物は、細胞分化を目的として用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は細胞接着の観察結果を示す。アガロース：１．５μｇ／ｍｍ2、ペプチド：３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2
【図２】図２は神経突起伸長の観察結果を示す。アガロース：１．５μｇ／ｍｍ2、ペプチド：３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2
【図３】図３は血管内皮細胞の管腔様構造の形成の観察結果を示す。アガロース：７．５μｇ／ｍｍ2、AG73：７．５ｐｍｏｌ／ｍｍ2
【図４】図４は唾液腺細胞の腺房様構造の形成の観察結果を示す。アガロース：１．５μｇ／ｍｍ2、AG73：３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）多糖類
本発明で用いる多糖類の種類は、本発明の効果が達成できる限り、特に限定はされない。多糖類の具体例としては、アガロース、デンプン、グリコーゲン、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、キシログルカン、ペクチン、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記の中でもアガロースは、キトサンやアルギン酸等の多糖類と比べ、架橋剤等を必要とせずに温度の操作のみでゲル化が可能であるため、最も好ましい。アガロースには、様々な規格のものが知られ、市販もされているが、一定の条件でヒドロゲルを形成するものであれば、何れのアガロースを用いても構わない。
【００１７】
本発明の多糖類ゲル組成物における多糖類の量は特に限定されないが、好ましくは０．１５〜１５μｇ／ｍｍ2である。多糖類の量が０．１５μｇ／ｍｍ2未満になるとゲルの強度が低下し、また、多糖類の量が１５μｇ／ｍｍ2を超えると取り扱いが困難になり、何れも好ましくない。
【００１８】
（２）細胞接着ペプチド
本発明で用いる細胞接着ペプチドの種類は、本発明の効果が達成できる限り、特に限定はされない。細胞接着ペプチドとしては、細胞表面受容体のシンデカンに作用するペプチドが好ましい。特に好ましくは、ラミニンに由来するペプチド、例えば、ラミニンα1鎖又はラミニンγ1鎖に由来する細胞接着ペプチドを使用することができる。本発明で用いることができる細胞接着ペプチドの具体例としては、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。
【００１９】
RKRLQVQLSIRT
Arg-Lys-Arg-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Thr(配列番号１)
【００２０】
KAFDITYVRLKF
Lys-Ala-Phe-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe (配列番号２)
【００２１】
ATLQLQEGRLHFXDLGKGR（X=Nle(ノルロイシン)）
Ala-Thr-Leu-Gln-Leu-Gln-Glu-Gly-Arg-Leu-His-Phe-Xaa-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Arg(配列番号３)
【００２２】
細胞接着ペプチドは、化学合成により製造することができる。ペプチドの化学合成は、任意の方法を用いて行うことができる。例えば、Fmoc固相合成法にてマニュアルで合成することによって、所望のペプチドを合成することができる。また、ペプチドのＮ−末端又はＣ−末端は、細胞接着活性を損なわい限り、適当な保護基等によって保護されていてもよいし、フリーのアミノ基又はカルボキシ基であってもよい。
【００２３】
本発明の多糖類ゲル組成物における細胞接着ペプチドの量は特に限定されないが、好ましくは３〜３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2である。細胞接着ペプチドの量が３ｐｍｏｌ／ｍｍ2未満になると細胞接着性が低下するため好ましくなく、また、細胞接着ペプチドの量が３００ｐｍｏｌ／ｍｍ2を超えても特に利点はない。
【００２４】
（３）多糖類ゲル組成物の製造方法
本発明においては、多糖類溶液に細胞接着ペプチドを混合し、得られた混合物を乾燥して多糖類乾燥組成物とし、再水和することによって、多糖類ゲル組成物を製造することができる。具体的には、例えば、多糖類（特に好ましくはアガロース）を水に加え、例えば、電子レンジを用いて加熱して多糖類を溶解させる。溶解した状態の多糖類（特に好ましくはアガロース）を、例えば、５０℃ぐらいまで冷却してから、細胞接着ペプチドを加えて均一な混合物とすることができる。この混合物を、例えば、プラスチックプレート等の容器に注ぎ、ヒドロゲルを得た後、例えば、室温で２４時間以上乾燥して多糖類乾燥組成物とし、該多糖類乾燥組成物に水を添加してヒドロゲル化することによって、細胞接着ペプチドを含む本発明の多糖類ゲル組成物を製造することができる。なお、本発明の多糖類ゲル組成物の形態は特に限定されず、膜状、粒子状、筒状等任意の形態で用いることができる。
【００２５】
（４）多糖類ゲル組成物を用いた細胞培養
上記した本発明の多糖類ゲル組成物は、細胞培養基材として使用することができる。本発明の多糖類ゲル組成物を用いて細胞培養を行うには、例えば、その多糖類ゲル組成物の上で、通常の細胞培養に準じた操作を行えばよい。本発明の多糖類ゲル組成物を用いて細胞培養を行うことによって、神経突起伸長能を誘導したり、管腔様構造形成能を誘導したり、腺房様構造形成を誘導することができる。
【００２６】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例中では次の略号を用いる。
PBS: phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+
EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid
Trypsin-EDTA: 0.05 % Trypsin in 53 mM EDTA-4Na+
FBS: fetal bovine serum
HS: horse serum
NGF: nerve growth factor
BSA: bovine serum albumin
DMEM: dulbecco's modified eagle's medium
DMEM/F-12: dulbecco's modified eagle's medium/nutrient mixture F-12 ham
Milli-Q: ultra pure water
HDF: human dermal fibroblast(s)
PC12: rat pheochromocytoma cell line
SVEC: small vessel endothelial cell(s)
HSG: human submandibular gland
AG73: RKRLQVQLSIRT, mouse laminin α1 chain
C16: KAFDITYVRLKF, mouse laminin γ1 chain
EF1zz: ATLQLQEGRLHFXDLGKGR, X=Nle, mouse laminin α1 chain
【００２８】
［細胞接着ペプチドを混合した膜状のアガロースの作製］
粉末のアガロースをMilli-Q水に加え、電子レンジ等で加熱して溶解させる。溶解したアガロースをゲル化する手前の50 ℃ぐらいまで冷まし、ペプチドを加える（0.002-0.2 mM）。アガロースを96 wellプレートに50 μlずつ加え、室温で24時間以上乾燥させ、再水和し、アガロース：0.15〜15 μg/mm2、ペプチド：3〜300 pmol/mm2のアガロースゲルを作製した。
【００２９】
［細胞接着の観察］
HDFは10% FBS、100 units/ml ペニシリン及び100 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEMを用い、37 ℃、5 % CO2雰囲気下で培養した。
【００３０】
HDFをPBSで洗浄し、Trypsin-EDTAを加え，培養ディッシュから剥離した。剥離したHDFを10% FBS、100 units/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン含有DMEMに懸濁させ、37℃、5% CO2雰囲気下20分間のインキュベートでリカバリーした後、0.1% BSA/DMEMで3回洗浄した。HDFを0.1% BSA/DMEMに懸濁し、AG73、C16、EF1zzを含んだアガロースゲル（アガロース：0.15〜15μg/mm2、ペプチド：3〜300 pmol/mm2）をコートした各wellに100μlずつ（2×104 cells/well）加えて37 ℃、5% CO2雰囲気下にて2時間インキュベートした。2時間後、0.2%クリスタルバイオレット/20%メタノール水溶液で15分間染色し、Milli-Q水で3回洗浄後1晩乾燥させた。HDFは顕微鏡（Keyence, BZ-8000）下で観察した。その結果、AG73、C16、EF1zzを含むアガロースゲルは上記の範囲のアガロース量、ペプチド量において細胞接着活性を有することがわかった（図１）。
【００３１】
［神経突起伸長の観察］
PC12は7.5 % FBS、7.5% HS、100 units/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシンを含むHigh glucose DMEMを用い、37 ℃、5% CO2雰囲気下で培養した。
【００３２】
アッセイの24時間前にNGF 100 ng/mlで刺激したPC12細胞をPBSで洗浄し、ピペッティングにより培養ディッシュより剥離した。PC12細胞を7.5% FBS、7.5% HS、100 units/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシンを含むDMEMに懸濁し、37℃、5% CO2雰囲気下で30分間のインキュベートでリカバリーした後、30 nM NaSeO3含有DMEM/F-12で3回洗浄した。さらにPC12細胞を100 μg/mlトランスフェリン、20 nMプロゲステロン、5 μg/mlインシュリン、100 ng/ml NGF及び30 nM NaSeO3含有DMEM/F-12に再懸濁し、AG73、C16、EF1zzを含むアガロースゲル（アガロース：0.15 - 15 μg/mm2、ペプチド：150 pmol/mm2）をコートした各wellに100 μlずつ（3×103 cells/well）加えて37 ℃、5% CO2雰囲気下で24時間インキュベートした。その後、予め37 ℃に温めておいた20%ホルマリンで10分間固定し、0.2%クリスタルバイオレット/20%メタノール水溶液で染色した。Milli-Q水で3回洗浄した後、1晩乾燥させた。PC12細胞は顕微鏡（Keyence, BZ-8000）下で観察した。その結果、AG73を含むアガロースゲルは上記の範囲のアガロース量、AG73量において神経突起伸長活性を有することがわかった（図２）。
【００３３】
［血管内皮細胞の管腔様構造の形成の観察］
SVECは10% FBS、100 units/ml ペニシリン及び100 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEMを用い、37 ℃、5 % CO2雰囲気下で培養した。
SVECをPBSで洗浄し、Trypsin-EDTAを加え，培養ディッシュから剥離した。剥離したSVECを10% FBS、100 units/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン含有DMEMに懸濁させ、37℃、5% CO2雰囲気下で20分間のインキュベートでリカバリーした後、0.1% BSA/DMEMで3回洗浄した。SVECを0.1% BSA/DMEMに懸濁し、AG73、C16、EF1zzを含むアガロースゲル（アガロース：0.15 - 15 μg/mm2、ペプチド：3 - 300 pmol/mm2）をコートした各wellに100 μlずつ（5×104 cells/well）加えて37 ℃、5% CO2雰囲気下にて24時間インキュベートした。24時間後、0.2%クリスタルバイオレット/20%メタノール水溶液で15分間染色し、Milli-Q水で3回洗浄後1晩乾燥させた。SVECは顕微鏡（Keyence, BZ-8000）下で観察した。その結果、AG73を含むアガロースゲルはいくつかの条件で管腔様構造を形成した。特に、アガロース：7.5 μg/mm2、AG73：7.5 pmol/mm2の条件が最もネットワークの形が鮮明な管腔様構造を形成した（図３）。
【００３４】
［唾液腺細胞の腺房様構造の形成の観察］
HSG細胞は5% FBS、100 units/ml ペニシリン及び100 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM/F-12を用い、37 ℃、5 % CO2雰囲気下で培養した。
HSG細胞をPBSで洗浄し、Trypsin-EDTAを加え，培養ディッシュから剥離した。剥離したHSG細胞を5% FBS、100 units/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン含有DMEM/F-12に懸濁させ、37℃、5% CO2雰囲気下で20分間のインキュベートでリカバリーした後、0.1% BSA/DMEMで3回洗浄した。HSG細胞を0.1% BSA/DMEMに懸濁し、AG73を含むアガロースゲル（アガロース：1.5 μg/mm2、AG73：300 pmol/mm2）をコートした各wellに150 μlずつ（3×104 cells/well）加えて37 ℃、5% CO2雰囲気下にて72時間インキュベートした。72時間後、HSG細胞を顕微鏡（Keyence, BZ-8000）下で観察した。その結果、HSG細胞はAG73を含むアガロースゲル上で複数の細胞が集合した腺房様の構造を形成した（図4）。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の多糖類ゲル組成物は、細胞分化誘導等を目的とした細胞培養実験の基材として利用可能である。また、本発明の多糖類ゲル組成物は、in vitroにおける細胞培養実験だけでなく、in vivoでの細胞移植や創傷被覆等にも応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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