(57)【要約】【課題】反応複合体に含まれる蛍光体の濃度に拘わらず、短時間で被分析物質の濃度を測定することができる濃度測定方法及び濃度測定装置を提供する。【解決手段】抗体の結合した磁性体、抗体の結合した第１発光標識、抗体の結合した第２発光標識、及び、抗原を反応させ、反応により生じた反応複合体を集めて光を照射し、この光照射による反応複合体からの発光スペクトルから、第１発光標識の発光強度と第２発光標識の発光強度とをそれぞれ求め、求めた第１発光標識及び第２発光標識の発光強度に基づいて、検査容器内の抗原の濃度を求める。【選択図】図１
2011013143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の結合した磁性体を検査容器内に拡散させる工程と、
抗体の結合した第１発光標識を前記検査容器内に拡散させる工程と、
前記第１発光標識とは異なる発光スペクトルを持ち、抗体の結合した第２発光標識を前記検査容器内に拡散させる工程と、
抗原を前記検査容器内に拡散させる工程と、
前記抗体の結合した磁性体、前記抗体の結合した第１発光標識、前記抗体の結合した第２発光標識、及び、前記抗原を反応させる工程と、
前記反応により生じた反応複合体を集める収集工程と、
前記収集工程で集められた反応複合体に光を照射する光照射工程と、
前記光照射工程における光照射による前記反応複合体からの発光スペクトルを検出するスペクトル検出工程と、
前記スペクトルから前記第１発光標識の発光強度を求める第１発光標識発光強度算出工程と、
前記スペクトルから前記第２発光標識の発光強度を求める第２発光標識発光強度算出工程と、
前記第１発光標識発光強度算出工程で求められた第１発光標識の発光強度と、及び、前記第２発光標識発光強度算出工程で求められた第２発光標識の発光強度に基づいて、前記検査容器内の前記抗原の濃度を求める濃度算出工程と、
を備えることを特徴とする濃度測定方法。
【請求項２】
前記濃度算出工程は、前記第１発光標識の既知の発光スペクトルと前記第２発光標識の既知の発光スペクトルの情報に基づいて、前記第１発光標識の発光強度と前記第２発光標識の発光強度を求めることを特徴とする請求項１に記載の濃度測定方法。
【請求項３】
前記第１発光標識の発光スペクトルのピーク波長であって前記第２発光標識が発光しない波長、及び、前記第２発光標識の発光スペクトルのピーク波長であって前記第１発光標識が発光しない波長と、前記抗原の濃度と、の関係を示す検量線を作成する検量線作成工程を備え、
前記濃度算出工程において、前記検量線を用いて前記検査容器内の前記抗原の濃度を求めることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の濃度測定方法。
【請求項４】
抗体の結合した磁性体、抗体の結合した第１発光標識、前記第１発光標識とは異なる発光スペクトルを持ち、抗体の結合した第２発光標識、及び、抗原を反応させて出来た反応複合体の入った検査容器と、
前記反応複合体に光を照射する光照射手段と、
前記光照射手段の光照射による前記反応複合体からの発光スペクトルを検出し、この発光スペクトルに基づいて、前記第１発光標識及び前記第２発光標識それぞれの発光強度を求める発光強度算出手段と、
予め測定した、前記抗原の濃度と、前記第１発光標識の発光強度及び前記第２発光標識の発光強度と、の関係を記憶する記憶手段と、
前記スペクトル検出手段で得られた、前記第１発光標識及び前記第２発光標識それぞれの発光強度、及び、前記記憶手段が記憶している、前記抗原の濃度と、前記第１発光標識の発光強度及び前記第２発光標識の発光強度と、の関係、に基づいて前記検査容器内の前記抗原の濃度を解析する解析手段と、
を備えることを特徴とする濃度測定装置。
【請求項５】
前記第１発光標識の発光スペクトルのピーク波長は、前記光照射手段から照射する励起光の波長と略一致していることを特徴とする請求項４に記載の濃度測定装置。
【請求項６】
前記抗体が結合した第１発光標識の数は、前記抗体が結合した第２発光標識の数より多いことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の濃度測定装置。
【請求項７】
前記第１発光標識に結合した抗体の数は、前記第２発光標識に結合した抗体の数より多いことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、濃度測定方法及び濃度測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から知られている抗原抗体反応を利用した濃度測定方法として、蛍光免疫測定がある（特許文献１）。この測定方法では、まず、検査容器内で抗体を結合した蛍光体と抗原（被分析物質）を反応させ、該反応物に抗体を結合した磁気粒子を添加反応させて、反応複合体を作製する。その後、前記反応複合体に光を照射したときに発する蛍光強度を測定して、被分析物質の量を測定する。被分析物質の測定においては、磁石で集めた反応複合体にレーザ光を照射し、反応複合体の蛍光体から発生する蛍光強度を検出する。蛍光強度は被分析物質の量に比例することを利用して、検出された蛍光強度から被分析物質を定量測定する。
【０００３】
また、磁石で磁気粒子を集合させる時間を短縮する手法が提案されている。特許文献２では、撹拌吸引ノズルから液体または気体を検査容器内に吐出し、検査容器底部に存在していた磁性ビーズを吹き上げることで、磁石によって作られる磁場を通過する反応複合体の数を増加せしめ、検査溶液内の磁気粒子を短時間で集合させる方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２４９１１４号公報
【特許文献２】特開２００１−１１６７５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、蛍光観察において、反応複合体に含まれる蛍光体の濃度が高い場合、濃度を検出する検出器の測定上限を超えることにより、検出結果としての輝度が飽和してしまうおそれがある。このため、反応複合体から発生した蛍光の強度情報を正確に取得することができない。
【０００６】
これに対して、光学系にＮＤフィルタを出し入れることにより、ダイナミックレンジを広げる手法をとることも考えられる。しかし、ＮＤフィルタがある場合とない場合とで複数回検出する必要があり、測定に時間がかかるという問題がある。
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、反応複合体に含まれる蛍光体の濃度に拘わらず、短時間で被分析物質の濃度を測定することのできる濃度測定手法及び濃度測定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る濃度測定方法は、抗体の結合した磁性体を検査容器内に拡散させる工程と、抗体の結合した第１発光標識を検査容器内に拡散させる工程と、第１発光標識とは異なる発光スペクトルを持ち、抗体の結合した第２発光標識を検査容器内に拡散させる工程と、抗原を検査容器内に拡散させる工程と、抗体の結合した磁性体、抗体の結合した第１発光標識、抗体の結合した第２発光標識、及び、抗原を反応させる工程と、反応により生じた反応複合体を集める収集工程と、
収集工程で集められた反応複合体に光を照射する光照射工程と、光照射工程における光照射による反応複合体からの発光スペクトルを検出するスペクトル検出工程と、スペクトルから第１発光標識の発光強度を求める第１発光標識発光強度算出工程と、スペクトルから第２発光標識の発光強度を求める第２発光標識発光強度算出工程と、第１発光標識発光強度算出工程で求められた第１発光標識の発光強度と、及び、第２発光標識発光強度算出工程で求められた第２発光標識の発光強度に基づいて、検査容器内の抗原の濃度を求める濃度算出工程と、を備えることを特徴としている。
【０００９】
本発明の濃度測定方法において、濃度算出工程は、第１発光標識の既知の発光スペクトルと第２発光標識の既知の発光スペクトルの情報に基づいて、第１発光標識の発光強度と第２発光標識の発光強度を求めるが好ましい。
【００１０】
本発明の濃度測定方法は、第１発光標識の発光スペクトルのピーク波長であって第２発光標識が発光しない波長、及び、第２発光標識の発光スペクトルのピーク波長であって第１発光標識が発光しない波長と、抗原の濃度と、の関係を示す検量線を作成する検量線作成工程を備え、濃度算出工程において、検量線を用いて検査容器内の抗原の濃度を求めることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の濃度測定装置は、抗体の結合した磁性体、抗体の結合した第１発光標識、第１発光標識とは異なる発光スペクトルを持ち、抗体の結合した第２発光標識、及び、抗原を反応させて出来た反応複合体の入った検査容器と、反応複合体に光を照射する光照射手段と、光照射手段の光照射による反応複合体からの発光スペクトルを検出し、この発光スペクトルに基づいて、第１発光標識及び第２発光標識それぞれの発光強度を求める発光強度算出手段と、予め測定した、抗原の濃度と、第１発光標識の発光強度及び第２発光標識の発光強度と、の関係を記憶する記憶手段と、スペクトル検出手段で得られた、第１発光標識及び第２発光標識それぞれの発光強度、及び、記憶手段が記憶している、抗原の濃度と、第１発光標識の発光強度及び第２発光標識の発光強度と、の関係、に基づいて検査容器内の抗原の濃度を解析する解析手段と、を備えることを特徴としている。
【００１２】
本発明の濃度測定装置において、第１発光標識の発光スペクトルのピーク波長は、光照射手段から照射する励起光の波長と略一致していることが好ましい。
【００１３】
本発明の濃度測定装置において、抗体が結合した第１発光標識の数は、抗体が結合した第２発光標識の数より多いことが好ましい。
【００１４】
本発明の濃度測定装置において、第１発光標識に結合した抗体の数は、第２発光標識に結合した抗体の数より多いことが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る濃度測定方法及び濃度測定装置は、反応複合体に含まれる発光標識の濃度に拘わらず、短時間で被分析物質の濃度を測定することができる、という効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態に係る濃度測定装置の構成を示す上面図であって、一部をブロック図で示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る、抗体、第１発光標識、第２発光標識、抗原、磁気ビーズ、及び、反応複合体を模式的に示す図である。
【図３】（ａ）は第１発光標識の発光スペクトルＳｏ１（λ）を示すグラフであり、（ｂ）は第２発光標識の発光スペクトルＳｏ２（λ）を示すグラフである。
【図４】本発明の実施形態に係る第１発光標識及び第２発光標識の検量線を示すグラフである。
【図５】本発明の実施形態の変形例に係る光検出部の構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明に係る濃度測定方法及び濃度測定装置の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下の実施形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００１８】
図１は、本発明の実施形態に係る濃度測定装置の構成を示す上面図であって、一部をブロック図で示す図である。濃度測定装置１００は、検査容器１１０と、光源部１４１と、光検出部１４２と、演算部１４３と、記憶手段としての記憶部１４６と、を備える。光源部１４１は光照射手段を構成する。光検出部１４２と演算部１４３はスペクトル算出手段を構成する。また、演算部１４３は解析手段を構成する。
【００１９】
検査容器１１０には、抗体の結合した第１発光標識、抗体の結合した第２発光標識、抗体の結合した磁気ビーズ（磁性体）、及び、被分析物質としての抗原が拡散収容される。検査容器１１０内でこれらの物質を反応させると反応複合体が生成される。検査容器１１０は、マイクロリットルからミリリットル程度の試料を収納できるプラスチック製の容器（例えばキュベット）が好ましく、例えばエッペンドルフチューブやマイクロチューブを用いることができる。検査容器１１０の材質は、磁力を通すものであれば良く、ガラス製等であってもかまわない。さらに、検査容器１１０は使い捨てであってもよい。
【００２０】
図２は、抗体１５１、第１発光標識１５２、第２発光標識１６２、被分析物質としての抗原１５３、磁性体としての磁気ビーズ１５４、及び、反応複合体１５５を模式的に示す図である。図２（ａ）は、抗体１５１が結合された第１発光標識１５２を示し、（ｂ）は抗体１５１が結合された第２発光標識１６２を示し、（ｃ）は被分析物質としての抗原１５３を示し、（ｄ）は抗体１５１が結合された磁気ビーズ１５４を示し、（ｅ）はこれらから生成される反応複合体１５５を示している。
【００２１】
図２（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）における、略Ｙ字形状の物体が抗体１５１であり、抗体１５１は、図２（ｃ）に示す、被分析物質としての抗原１５３と特異的に抗原抗体反応する。
【００２２】
第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２は、光源部１４１からの励起光の照射によって蛍光もしくはラマン散乱光等を発する物質であって、発光スペクトルが互いに異なるものを用いる。また、上記励起光による発光強度を第１発光標識１５２と第２発光標識１６２とで異なることにすることが好ましく、ここでは、光源部１４１から同じ強度で励起した時、強い強度で発光する発光標識を第１発光標識１５２、弱い強度で発光する発光標識を第２発光標識１６２で定義する。
【００２３】
第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２は、化学的に安定であること、光源部１４１からの光の波長で発光可能な吸収帯を有すること、発光標識と磁気ビーズとの非特異的な吸着が無い材質であることが望ましい。
【００２４】
第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２としては、例えば、蛍光色素、蛍光マイクロビーズ、量子ドット、ＳＥＲＳナノタグを用いる。
【００２５】
蛍光マイクロビーズとしては、例えば、４８８ｎｍの光で励起し、５１５ｎｍから６６０ｎｍの蛍光を発するプローブ（フローサイトメトリーアラインメントビーズ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いることができる。
【００２６】
量子ドットは、例えばＣｄＳ、ＣｄＳｅで作られたナノ粒子であって、光を照射すると発光する。発光波長は、粒子直径と相関関係にあり、粒径が大きくなるに連れて長波長側にシフトする。
【００２７】
ＳＥＲＳナノタグとは、光照射によって強いラマン散乱光を発する直径数１０ｎｍ〜数１００ｎｍの大きさを持つ微小球である。例えば、米国特許第７１９２７７８号明細書には、８００〜１８００ｃｍ-1のラマン散乱光の発光が開示されており、波長６３３ｎｍの励起光（レーザ光）を照射すると波長６７０ｎｍ〜７１０ｎｍのラマン散乱光が発生する例がある。ＳＥＲＳナノタグの構造は、例えば、約６０ｎｍのラマン活性レポーター分子を付着させた金ナノ粒子をポリマー、ガラスまたは任意の他の誘電性材料を含む被包シェルでシールドした構造である。レーザを照射すると、金属ナノ粒子で電場が増強され，吸着したラマン活性レポーター分子から強いラマン散乱光が発光される。ここで、「ＳＥＲＳ」は、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇの略称である。
【００２８】
ここで、第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２のより具体的な例を挙げる。
ラマン散乱光を発する発光標識（ＳＥＲＳナノタグ）とする場合は、第１発光標識１５２は金属ナノ粒子を複数含むＳＥＲＳナノタグとし、第２発光標識１６２は金属ナノ粒子を単数含むＳＥＲＳナノタグとする。複数の金属ナノ粒子が互いに隣接していると、励起光照射時にこの隣接部において大変強い電場増強が起きることが知られている。そのため、金属ナノ粒子が単数のときに比べて、光照射によって、強いラマン散乱光が発生する。
【００２９】
一方、第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２を、蛍光を発する発光標識とする場合の一例としては、第１発光標識１５２を量子効率の高い蛍光色素（半導体量子ドット）とし、第２発光標識１６２を量子効率の低い蛍光色素とする。これに対して、第１発光標識１５２を量子効率の高い半導体量子ドットとし、第２発光標識１６２を量子効率の低い半導体量子ドットとすることもできる。さらに別の例としては、第１発光標識１５２を蛍光体含有量の多い蛍光ビーズとし、第２発光標識１６２を蛍光体含有量の少ない蛍光ビーズとすることも可能である。
【００３０】
磁性体としての磁気ビーズ１５４は、可磁化物質（Ｆｅ2Ｏ3）が一様に分布したポリスチレン製のコアを親水性ポリマーで被った直径数１００ｎｍ〜数μｍの大きさを持つビーズであり、例えば、ダイナビーズ（商標）（ダイナル社製）を用いることができる。
【００３１】
磁界発生部１３０は、検査容器１１０内の反応複合体１５５を所定位置に集めるように配置される。この所定位置において、光源部１４１からの所定の光が反応複合体１５５に照射されるとともに、光検出部１４２によって反応複合体１５５からの光が検出される。また、磁界発生部１３０には、例えばネオジウム磁石や電磁石のような、比較的強力な磁力を有する磁石を用いることが好ましい。
【００３２】
光源部１４１としては、例えばハロゲンランプ、水銀ランプ、レーザ、レーザダイオード、ＬＥＤを用いることができる。
光検出部１４２には、例えば、分光器、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトンカウンティングを用いることができる。反応複合体からの光の検出において、励起光の除去が必要ならば、干渉フィルタを光検出部１４２の前に入れて、励起光の影響を除くことが好ましい。
【００３３】
光検出部１４２では、反応複合体１５５中の、第１発光標識１５２、および第２発光標識１６２からの光信号が測定される。光検出部１４２の出力は、データ処理用コンピュータの演算部１４３に入力される。演算部１４３は、光検出部１４２の検出結果に基づいて、データの解析を行う。より具体的には、演算部１４３は、光検出部１４２により検出された光強度に基づいて、第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２の数、抗原１５３の濃度を算出する。演算部１４３としては、データ処理用のコンピュータ等を用いることができる。
【００３４】
記憶部１４６は、演算部１４３による算出結果や光検出部１４２による検出結果を記憶するほか、予め測定した、抗原の濃度と、第１発光標識の発光強度及び第２発光標識の発光強度と、の関係を記憶する。
【００３５】
光源部１４１から発せられた光は、励起光照射用のレンズ１４４によって検査容器１１０の測定領域に励起光が集光される。このレンズ１４４としては、開口数（ＮＡ）の大きいものが好ましい。ＮＡが大きいと、光源スポット径を１０ｕｍ以下に小さく設定できるからである。すなわち、磁界発生部１３０によって、反応複合体１５５を所定の狭い領域に集合させるため、光源部１４１からの光は狭い領域に集まった反応複合体１５５に効率よく照射される。
【００３６】
一方、反応していない第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２からの発光は、バックグラウンドノイズになる。従って、励起光照射用のレンズ１４４のＮＡが大きい場合、反応複合体１５５を構成する、第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２のみを効率よく励起できるとともに、未反応の第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２の励起を抑制することができる。
【００３７】
反応複合体１５５から発せられた蛍光もしくはラマン散乱光等は、信号検出用のレンズ１４５によって集められ、光検出部１４２で集光する。このレンズ１４５としては、開口数（ＮＡ）の大きいものが好ましい。ＮＡが大きいと、反応複合体１５５から発せられた蛍光もしくは、ラマン散乱光等を効率よく集光することができる。励起光の除去が必要ならば、干渉フィルタを検出器の前に入れて、励起光の影響を除くことも可能である。
【００３８】
ここで、磁界発生部１３０の先端位置と、励起光照射用のレンズ１４４の焦点位置と、信号検出用のレンズ１４５の焦点位置と、は略一致している。
以上の構成においては、磁界発生部１３０の先端には、磁気ビーズ１５４の磁力と磁界発生部１３０が発生する磁界との作用により、検査容器１１０内の反応複合体１５５及び磁気ビーズ１５４が集められる。
【００３９】
つづいて、本実施形態に係る濃度測定方法について説明する。
まず、検査容器１１０内に、抗体１５１の結合した磁気ビーズ１５４、抗体１５１の結合した第１発光標識１５２、抗体１５１の結合した第２発光標識１６２、及び、被分析物質としての抗原１５３をそれぞれ拡散させる。
【００４０】
磁気ビーズ１５４、第１発光標識１５２、第２発光標識１６２、及び抗原１５３が拡散した検査容器１１０では、これらの物質間の抗原抗体反応により、所定の反応複合体１５５が生成され、試料として検査容器１１０内に収容される。
【００４１】
この検査容器１１０を濃度測定装置１００の所定位置にセットすると、磁界発生部１３０の磁気が、検査容器１１０内の反応複合体１５５の磁気ビーズ１５４に作用することにより、反応複合体１５５が、所定の位置に集められる。より具体的には、反応複合体１５５は、検査容器１１０の内壁部であって、磁界発生部１３０の磁力が強い箇所に集められる（収集工程）。
【００４２】
つづいて、磁界発生部１３０の磁気によって所定位置に集められた反応複合体１５５に対して、光源部１４１から励起光を照射する（光照射工程）。この励起光照射により反応複合体１５５は発光し、光検出部１４２はこの発光の発光スペクトル（Ｓ（λ））を測定する（スペクトル検出工程）。
【００４３】
スペクトル検出工程で測定された発光スペクトルのデータは、演算部１４３に入力され、演算部１４３は入力された発光スペクトルのデータに基づいて解析を行う。具体的には次のとおりである。
【００４４】
（ａ）発光強度算出工程
まず、スペクトル検出工程で得られた発光スペクトルのうち、第１発光標識のピーク波長における発光強度と、第２発光標識のピーク波長における発光強度を求める。このピーク波長算出工程では、第１発光標識の既知の発光スペクトルと第２発光標識の既知の発光スペクトルの情報に基づいて、第１発光標識ピーク波長における発光強度と第２発光標識のピーク波長における発光強度を求める。具体的には、第１発光標識のピーク波長λ１の強度Ｉ（λ１）、第２発光標識のピーク波長λ２の強度Ｉ（λ２）を求める。ここで、波長λ１は第１発光標識のピーク波長であって第２発光標識が発光しない波長であり、波長λ２は第２発光標識のピーク波長であって第１発光標識が発光しない波長である。
【００４５】
（ｂ）濃度算出工程
次に、波長Ｉ（λ１）、Ｉ（λ２）の強度と検量線（図４）を利用して、抗原の濃度を求める。
検量線において、第１発光標識のピーク波長λ１の強度Ｉ（λ１）の値が飽和していない場合は、強度Ｉ（λ１）から抗原の濃度を求める。また、第２発光標識のピーク波長λ２の強度Ｉ（λ２）の値が飽和していない場合は、強度Ｉ（λ２）から抗原の濃度を求める。
【００４６】
ここで、検量線作成工程について説明する。
検量線作成工程は、検査容器１１０内に磁性体、第１発光標識１５２、第２発光標識１６２、抗原を拡散させる前に実行され、第１発光標識の発光スペクトルのピーク波長であって第２発光標識が発光しない波長、及び、第２発光標識の発光スペクトルのピーク波長であって第１発光標識が発光しない波長と、抗原の濃度と、の関係を示す検量線を作成する。作成された検量線データは、記憶部１４６に記憶される。
【００４７】
検量線作成工程は、（１）第１発光標識の発光スペクトル測定ステップ、（２）第２発光標識の発光スペクトル測定ステップ、（３）反応複合体の発光スペクトル測定ステップ、及び、（４）検量線作成ステップからなる。各ステップにおける測定結果、計算結果は記憶部１４６に記憶される。
【００４８】
（１）第１発光標識の発光スペクトル測定ステップ（Ｓｏ１（λ））
まず、第１発光標識１５２を検査容器１１０内に収納し、濃度測定装置１００の所定位置にセットする。次に、検査容器１１０に対して励起光を照射し、光検出部１４２で第１発光標識１５２の発光スペクトルＳｏ１（λ）（図３（ａ））を測定する。ここで、図３（ａ）は、第１発光標識１５２の発光スペクトルＳｏ１（λ）を示すグラフである。
第１発光標識１５２の発光スペクトルＳｏ１（λ）は、光の波長λの関数として得られた発光強度｛Ｓｏ１（λ［１］）、Ｓｏ１（λ［２］）・・・Ｓｏ１（λ［Ｎ］）｝（Ｎは離散データ点数）である。このスペクトルにおいて発光強度のピーク波長λ１では、第２発光標識１６２は発光していない。
【００４９】
（２）第２発光標識の発光スペクトル測定ステップ（Ｓｏ２（λ））
第１発光標識１５２の場合と同様に、第２発光標識１６２を検査容器１１０内に収納し、濃度測定装置１００の所定位置にセットする。つづいて、検査容器１１０に対して励起光を照射し、光検出部１４２で発光スペクトルＳｏ２（λ）（図３（ｂ））を測定する。ここで、図３（ｂ）は、第２発光標識１６２の発光スペクトルＳｏ２（λ）を示すグラフである。
【００５０】
第２発光標識１６２の発光スペクトルＳｏ２（λ）は、光の波長λの関数として得られた発光強度｛Ｓｏ２（λ［１］）、Ｓｏ２（λ［２］）・・・Ｓｏ２（λ［Ｎ］）｝（Ｎは離散データ点数）である。このスペクトルにおいて発光強度のピーク波長λ２では、第１発光標識１５２は発光していない。
なお、強い強度で発光する発光標識を第１発光標識１５２、弱い強度で発光する発光標識を第２発光標識１６２とした場合、第２発光標識１６２は第１発光標識に比べて測定を行う標識濃度を濃くすることが望ましい。
【００５１】
（３）反応複合体の発光スペクトル測定ステップ
検査容器１１０内で、抗体が結合した第１発光標識１５２、抗体が結合した第２発光標識１６２、及び、抗体が結合した磁気ビーズを拡散させる。これらの第１発光標識１５２、第２発光標識１６２、及び磁気ビーズは、一定数としている。この検査容器１１０に、濃度が既知である抗原を一定量添加攪拌して反応させることにより、反応複合体１５５を作製する。
【００５２】
次に、この検査容器１１０を濃度測定装置１００の所定位置に配置する。磁界発生部１３０によって検査容器１１０内の反応複合体１５５は一か所に集められ、集められた反応複合体１５５に対して光源部１４１からの励起光を照射し、光検出部１４２で反応複合体１５５の発光スペクトル（Ｓ（λ））を測定する。
【００５３】
（４）検量線作成ステップ
演算部１４３は、反応複合体の発光スペクトル測定ステップで光検出部１４２が測定した結果について、データの解析を行う。具体的には、反応複合体１５５の発光スペクトル（Ｓ（λ））のうち、第１発光標識１５２のピーク波長λ１の強度をＩ（λ１）、第２発光標識１６２のピーク波長λ２の強度をＩ（λ２）し、これらの強度Ｉ（λ１）、Ｉ（λ２）を抗原の濃度に対応させて検量線（図４）を作成する。ここで、図４は、本実施形態の第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２の検量線を示すグラフである。図４では、破線ＩＶＡは第１発光標識１５２の検量線を、実線ＩＶＢは第２発光標識１６２の検量線を、それぞれ示している。
【００５４】
図４から分かるように、第１発光標識１５２は、第２発光標識１６２に比して、励起光によって強く発光する。また、第１発光標識１５２は、第２発光標識１６２よりも、抗原の濃度が小さくても、波長λ１の強度Ｉ（λ１）を測定することができる。さらに、抗原の濃度が高い領域では、第１発光標識１５２からの発光強度が光検出部１４２の測定上限よりも高くなることから、検量線上の発光強度Ｉ（λ１）の値は飽和する。
【００５５】
一方、第２発光標識１６２は、励起光による発光が第１発光標識１５２よりも弱い。このため、抗原の濃度が低い領域では、光検出部１４２の測定下限よりも暗くなることから、検量線上の発光強度Ｉ（λ２）の値はゼロとなる。これに対して、第２発光標識１６２からの発光強度は測定範囲内にあるため、抗原の濃度が高い領域の広い範囲において、検量線上の発光強度Ｉ（λ２）は飽和することなく実際の測定値となる。
【００５６】
本実施形態の濃度測定装置及び濃度測定方法によれば、ダイナミックレンジを広げることができるため、ＮＤフィルタを用いなくても、反応複合体に含まれる蛍光体の濃度に関わらず短時間で抗原の濃度を測定できる。
【００５７】
また、図１の光検出部１４２に代えて、図５に示す構成を用いることもできる。図５は、変形例に係る光検出部の構成を示す図である。
図５に示す光検出部は、励起光カットフィルタ２４１と、波長選択フィルタ２４２と、第１検出部２４３と、第２検出部２４４と、を備える。
【００５８】
励起光カットフィルタ２４１には、光源部１４１の光照射によって反応複合体１５５が発した励起光が入射する。励起光カットフィルタ２４１で反応複合体１５５からの発光以外の光を除去した後、波長選択フィルタ２４２により、第１発光標識１５２からの発光信号と、第２発光標識１６２からの発光信号と、を分離する。第１発光標識１５２からの発光信号は第１検出部２４３で受光され、発光強度が測定される。また、第２発光標識１６２からの発光信号は第２検出部２４４で受光され、発光強度が測定される。ここで、波長選択フィルタ２４２としては、例えばダイクロイックミラーを用いる。
【００５９】
図５に示す光検出部を用いる場合の検量線の作成工程について説明する。なお、検量線作成以外の工程は上述の実施形態と同様であるため、詳細な説明は省略する。
第１検出部２４３の発光強度をＩ（１）、第２検出部２４４の発光強度をＩ（２）とし、抗原１５３の濃度と、第１発光標識１５２及び第２発光標識１６２の発光強度Ｉ（１）、Ｉ（２）と、をそれぞれ対応させて検量線を作成する。ここで、第１発光標識１５２、第２発光標識１６２は、上述の実施形態と同様に、互いに異なる発光スペクトルを有し、かつ、第１発光標識１５２の方が第２発光標識１６２よりも発光強度が強い。
【００６０】
第１発光標識１５２は、反応複合体１５５からの励起光によって強く発光する。このため、検査容器１１０中の抗原１５３の濃度が低くても、強度Ｉ（１）を測定することができる。なお、抗原１５３の濃度が高いときは、第１発光標識１５２からの発光は第１検出部２４３の測定上限よりも明るくなり、強度Ｉ（１）の値は飽和する。
【００６１】
一方、第２発光標識１６２は、反応複合体１５５からの励起光によって弱い強度で発光するため、抗原１５３の濃度が低い場合、第２検出部２４４の測定下限よりも暗くなる。また、抗原１５３の濃度が高いときには、２４４の測定範囲内の明るさになる。
【００６２】
また、図５に示す光検出部に代えて、分光器を用いることもできる。分光器には、反応複合体１５５の励起光が入射し、第１発光標識１５２からの発光と第２発光標識１６２からの発光を分離する。反応複合体１５５と分光器の間には、図５に示す光検出部と同様に、反応複合体１５５からの発光以外の光を除去する励起光カットフィルタを配置することが好ましい。
【００６３】
さらにまた、上述の実施形態及び各変形例において、第１発光標識１５２の吸収スペクトルの吸収ピーク波長は光源部１４１の波長と略一致していることが好ましい。
ラマン散乱光を発する発光標識（ＳＥＲＳナノタグ）の場合、金属ナノ粒子はサイズによって吸収スペクトルが変化し、粒子が大きくなると吸収ピークの波長が長波長にシフトすることが知られている（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １０３，８４１０−８４２６  （１９９９））。第１発光標識１５２にＳＥＲＳナノタグを用いる場合、金属ナノ粒子の吸収スペクトルのピーク波長が励起波長に一致するように、金属ナノ粒子の大きさに設定することが好ましい。
【００６４】
蛍光を発する発光標識を用いる場合、例えば、励起光の波長を４８８ｎｍとするときは、第１発光標識１５２にＣｙ２（吸収ピーク波長４８９ｎｍ）、第２発光標識１６２にＣｙ５（吸収ピーク波長６５０ｎｍ）をそれぞれ使用するとよい。すなわち、第１発光標識１５２の吸収ピーク波長と励起光の波長とを略一致させている。
ここで、「Ｃｙ２」、「Ｃｙ５」は、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社（ア
マシャムバイオサイエンス社）のシアニン蛍光色素の商品名である。
【００６５】
これにより、第１発光標識１５２は、略同一の波長において、光を吸収するとともに発光も行う。このため、吸収ピーク波長では、エネルギーの多くを吸収するため、より明るく発光する。従って、第１発光標識１５２は、さらに明るく発光する。従って、さらに被分析物質の濃度が薄いときでも測定できるため、測定レンジを広げることができる。
【００６６】
また、検査容器１１０内での抗原抗体反応に使用する抗体１５１が結合された第１発光標識１５２の数は、抗体１５１が結合された第２発光標識１６２の数に比べて多くすることが好ましい。
これにより、抗原１５３と結合する発光標識のうち、第１発光標識１５２が第２発光標識１６２に比べて多くなるため、第１発光標識１５２からの発光強度はより強くなる。従って、抗原１５３の濃度が低いときでも測定が可能となり、測定レンジを広げることができる。
【００６７】
さらにまた、第１発光標識１５２に結合した抗体１５１の数は、第２発光標識１６２に結合した抗体１５１の数に比べて多いことが好ましい。
これにより、抗原１５３と結合する発光標識のうち、第１発光標識１５２が第２発光標識１６２に比べて多くなるため、第１発光標識１５２からの発光強度はより強くなる。従って、抗原１５３の濃度が低いときでも測定が可能となり、測定レンジを広げることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上のように、本発明に係る濃度測定装置及び濃度測定方法は、反応複合体に含まれる発光標識の濃度に拘わらず、短時間で抗原の濃度を測定することが必要な濃度測定に有用である。
【符号の説明】
【００６９】
１００    濃度測定装置
１１０    検査容器
１３０    磁界発生部
１４１    光源部（光照射手段）
１４２    光検出部（スペクトル算出手段）
１４３    演算部（スペクトル算出手段、解析手段）
１４４、１４５    レンズ
１４６    記憶部（記憶手段）
１５１    抗体
１５２    第１発光標識
１５３    抗原
１５４    磁気ビーズ（磁性体）
１５５    反応複合体
１６２    第２発光標識
２４１    励起光カットフィルタ
２４２    波長選択フィルタ
２４３    第１検出部
２４４    第２検出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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