(57)【要約】【課題】微生物反応プロセスにより、高濃度グリセリンから効率的にジヒドロキシアセトンを製造する方法を提供する。【課題を解決するための手段】グリセリン含有培地で、グリセリン代謝に関与する遺伝子が少なくとも１個破壊されている微生物を培養することを含む、ジヒドロキシアセトンを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロキシアセトンを製造する方法であって、グリセリン含有培地にて、グリセリン代謝に関与する遺伝子の少なくとも１個が破壊されているグリセリンからジヒドロキシアセトンを生産する能力を有する微生物を培養する工程、および該培地よりジヒドロキシアセトンを単離・精製する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
グリセリン代謝に関与する遺伝子がアルコール脱水素酵素遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリセリンからジヒドロキシアセトンを生産する能力を有する微生物が、グルコノバクター（Gluconobacter）属の細菌群から選択される微生物である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グリセリンからジヒドロキシアセトンを生産する能力を有する微生物が、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グリセリン含有培地が、１０〜２５ｗｔ％グリセリンを含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物反応プロセスによるジヒドロキシアセトンの製造方法において、グリセリン代謝に関与する少なくとも１個の遺伝子を破壊した微生物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年高騰する石油資源だけに依存しない原料転換政策として、あるいは二酸化炭素削減といった地球温暖化問題に対応する技術的概念としてバイオリファイナリーが注目されている。バイオマスは再生可能なエネルギーの中でもカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールやバイオディーゼルといったバイオ燃料の導入が世界的規模で進行している。バイオディーゼル燃料（以下、「BDF」と記載）は油脂類の主成分であるトリグリセリドをエステル交換反応により脂肪酸メチルエステルにして燃料とするが、本反応に伴って副生するグリセリンの有効利用法の開発がプロセス開発の鍵となっている。近年のBDF使用量の急速な増加を考えると、グリセリン問題の解決は急務といえる。またオレオケミカル産業においても、石油代替・再生産可能資源である植物油脂を原料としたプロセスが導入されていることから、同様にグリセリンの有効活用が大きな問題となっている。
【０００３】
これまでに、グリセリンから有用物質を生産する試みが数多くなされており（例えば非特許文献１、２）、エピクロロヒドリンやプロピレングリコールといったグリセリン誘導体が工業レベルで生産されつつある。しかし、例えば、２００７年末から２００８年にかけてみられたような油脂価格上昇に伴うグリセリン価格の急騰がおこると、これら価格設定の低い汎用化学品の生産プロセスはコスト的に大きな打撃をうける。従って、より高機能性かつ高付加価値のグリセリン誘導物質を製造することが期待されている。
【０００４】
グリセリン誘導物質の１つである、ジヒドロキシアセトンは様々な用途に有用であり、例えば、化粧品や医薬品の原料など高付加価値物質として広く利用されている。
【０００５】
ジヒドロキシアセトンの製造方法としては、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）を用いたバイオプロセス（醗酵法）が工業化されているが、醗酵法の場合は、醗酵終了時の反応液中に副生物など目的外物質が混在するため、発酵液からのジヒドロキシアセトンの分離・精製工程が非常に煩雑であり、多大な労力と経費を要することが問題であった（例えば特許文献１）。また、反応液中のグリセリン（原料）濃度が10重量％よりも高くなると、酢酸菌の生物活性に悪影響を及ぼすため、初発グリセリン濃度を高くできないといった問題があった（例えば非特許文献３）。そのため、近年、化学触媒を用いたグリセリンの酸化反応に関する研究も盛んに行われ、例えばBi-PtやAuなどの金属触媒を用いた酸化反応（例えば特許文献２、３、非特許文献４）や亜臨界水中で非金属触媒を用いた酸化反応（特許文献４）によりジヒドロキシアセトンも生産されているが、いずれも基礎研究の段階である。金属触媒が特殊かつ高価であり、高温・高圧の反応であるといった問題もあり、工業化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭５４−２８８９４号公報
【特許文献２】特公平４−３５６４３６号公報
【特許文献３】特公平５−２４５３７３号公報
【特許文献４】特公２００９−１３７８９１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】M. Pagliaro, R. Ciriminna, H. Kimura, M. Rossi, C. Della Pina: Angew. Chem. Int. Ed., 46, 2-20 (2007).
【非特許文献２】C.-H. Zhou, J. N. Beltramini, Y.-X. Fan, G. Q. Lu: Chem. Soc. Rev., 37, 527-549 (2008).
【非特許文献３】R. Mishra, S. R. Jain, A. Kumar: Biotechnol. Adv., 26, 293-303 (2008)
【非特許文献４】S. Carrettin, P. McMorn, P. Johnston, K. Griffin, G. J. Hutchings: Chem. Commun., 696-697 (2002).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、上記従来技術の問題を解消する点にあり、具体的には、バイオプロセスにより、ジヒドロキシアセトンを効率的に生産する技術を新たに構築することにあり、特に、高濃度グリセリンを原料とし、かつ醗酵液中の目的外物質の量を低減するようなジヒドロキシアセトン製造法を新たに提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者等は、鋭意研究した結果、醗酵法によりジヒドロキシアセトンを製造する工程において、グリセリン代謝に関与する遺伝子を破壊した微生物、具体的にはアルコール脱水素酵素遺伝子を破壊した微生物を利用した場合に、親株に比べ、高濃度グリセリンからジヒドロキシアセトンを効率的に生産することができ、かつ、グリセリン酸のような目的外物質の量を低減できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以上の知見を得て完成することができたものであり、具体的には以下のとおりである。
【００１１】
［１］  ジヒドロキシアセトンを製造する方法であって、グリセリン含有培地にて、グリセリン代謝に関与する遺伝子の少なくとも１個が破壊されているグリセリンからジヒドロキシアセトンを生産する能力を有する微生物を培養する工程、および該培地よりジヒドロキシアセトンを単離・精製する工程を含む、上記方法。
［２］  グリセリン代謝に関与する遺伝子がアルコール脱水素酵素遺伝子である、［１］の方法。
［３］  グリセリンからジヒドロキシアセトンを生産する能力を有する微生物が、グルコノバクター（Gluconobacter）属の細菌群から選択される微生物である、［１］または［２］の方法。
［４］  グリセリンからジヒドロキシアセトンを生産する能力を有する微生物が、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  グリセリン含有培地が、１０〜２５ｗｔ％グリセリンを含有する、［１］〜［４］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、バイオプロセスにより、ジヒドロキシアセトンを効率的に生産する技術、特に、高濃度グリセリンを原料とし、かつ醗酵液中の目的外物質の量を低減するようなジヒドロキシアセトンの製造法を新たに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例２におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトン、乾燥菌体重量の各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【図２】図２は、実施例３におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトン、乾燥菌体重量の各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【図３】図３は、実施例４におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトン、乾燥菌体重量の各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【図４】図４は、実施例５におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトンの各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【図５】図５は、実施例６におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトンの各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【図６】図６は、比較例１におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトン、乾燥菌体重量の各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【図７】図７は、比較例２におけるグリセロール、グリセリン酸、ジヒドロキシアセトン、乾燥菌体重量の各量を経時的に示す。黒丸：グリセリン(Glycerol)濃度（g/l）；白丸：グリセリン酸(GA)濃度（g/l）；白四角：ジヒドロキシアセトン(DHA)濃度（g/l）；黒四角：乾燥菌体重量（g/l）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に用いることができる微生物は以下の特徴を有する。
【００１５】
本発明に用いることができる微生物は第一に、グリセリンよりジヒドロキシアセトンを生産できることを特徴とする。このような微生物としては例えば、グリセリンをグリセリン酸へと変換する能力を有している酢酸菌などが挙げられるがこれらに限定されない。特に、グリセリンよりジヒドロキシアセトンを高生産可能なグルコノバクター属細菌が望ましく、具体的な例としては、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・ルビダス（Gluconobacter albidus）、グルコノバクター・セリナス（Gluconobacter cerinus）、グルコノバクター・フラテウリ(Gluconobacter frateurii）、グルコノバクター・コンドニ(Gluconobacter kondonii）、グルコノバクター・タイランディカス（Gluconobacter thailandicus）、その他グルコノバクター属細菌（Gluconobacter sp.）NBRC3259株等が挙げられる。好ましくは、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である。グリセリンをジヒドロキシアセトンに変換する能力を保持している限り、これら微生物の変異株も用いることができる。当該変異株は、自然突然変異によるものであってもよいし、紫外線照射や化学的変異原処理等、何らかの物理的または化学的処理を施すことによって得られたものであっても良い。さらにこれら微生物を遺伝子組換え体の宿主とした場合も含まれる。
【００１６】
本発明に用いることができる微生物は第二に、少なくとも１個のグリセリン代謝に関与する遺伝子が破壊されていることを特徴とする。グリセリン代謝に関与する遺伝子としては、特に限定されないが、グリセロール脱水素酵素遺伝子、グリセロールキナーゼ遺伝子、グリセロール-3-リン酸脱水素酵素遺伝子、ジヒドロキシアセトンキナーゼ遺伝子、アルコール脱水素酵素遺伝子などが挙げられる。好ましくは、アルコール脱水素酵素遺伝子である。
【００１７】
アルコール脱水素酵素は、細胞質や細胞膜、ペリプラズムなど様々な部位に局在する酵素であり、酵素活性に必要とする補因子も、ピロロキノリンキノン（PQQ）やニコチンアデニンジヌクレオチド（NAD/NADH）等と多様な種類が存在するが、好ましくは細胞膜結合型あるいはペリプラズムに局在するPQQ依存性のアルコール脱水素酵素である。
【００１８】
アルコール脱水素酵素遺伝子は、アルコールをアセトアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子である。アルコール脱水素酵素遺伝子は、各種微生物において既に同定されており、例えばグルコノバクター属細菌のものであればGenBank等にGene ID: NC_006677などとして登録されている。
【００１９】
なお、本発明の「アルコール脱水素酵素遺伝子」には、公知のアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列、例えばGenBank等に上記登録番号にて開示されるアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含む。「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から100個、好ましくは１から70個、より好ましくは１から50個、さらに好ましくは１から20個、特に好ましくは１から10個、あるいは１から５個である。また、本発明の「アルコール脱水素酵素遺伝子」には、公知のアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列、例えばGenBank等に上記登録番号にて開示されるアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAの塩基配列であって、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含む。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、2〜6×SSC（1×SSCの組成：0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム, pH 7.0）および0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中42〜55℃にてハイブリダイズを行い、0.1〜0.2×SSCおよび0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中55〜65℃にて洗浄を行う条件をいう。さらに、本発明の「アルコール脱水素酵素遺伝子」には、公知のアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列、例えばGenBank等に上記登録番号にて開示されるアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含む。
【００２０】
「少なくとも１個」とは、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上を指す。
【００２１】
「グリセリン代謝に関与する遺伝子が破壊されている」とは、当該遺伝子が完全にまたは著しく機能しないように、当該遺伝子または当該遺伝子の転写調節領域の塩基配列中に欠失、置換、付加または挿入などの変異を有することを意味する。これにより当該遺伝子からの転写または翻訳が阻害されるか、あるいは転写された不完全なmRNAより翻訳されたアミノ酸配列に変異が生じ、当該遺伝子にコードされるタンパク質は本来の機能を果たすことができなくなる。
【００２２】
遺伝子の破壊における変異は天然に導入されたものであっても良いし、何らかの物理的または化学的処理あるいは遺伝子組換え技術を用いて人工的に導入されたものであっても良い。遺伝子組換え技術を用いた変異導入法は特に限定されることなく公知の手法を用いて行うことができる。一例として、相同組換え法によるダブルクロスオーバー等が挙げられる。簡単に説明すると上記微生物の染色体上のグリセリン代謝に関与する標的遺伝子を遺伝子導入のために当業者に公知である一般的なベクターにクローニングする。その後、クローン化した当該標的遺伝子の配列中に外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）を挿入することで、外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）により分断された標的遺伝子を含むDNA構築物を調製する。このDNA構築物を上記微生物に導入することにより、DNA構築物上の分断された標的遺伝子と当該微生物染色体上の標的遺伝子とが相同組換えを生じ、微生物の当該遺伝子を破壊することができる。あるいは、標的遺伝子に外来遺伝子を挿入して分断するかわりに、標的遺伝子の塩基配列においてその一部または全体を欠失させた標的遺伝子を含むDNA構築物を調製し、これを上記微生物に導入することにより、DNA構築物上の一部または全体の欠失を有する標的遺伝子と当該微生物染色体上の標的遺伝子とが相同組換えを生じ、微生物の当該遺伝子を破壊することもできる。DNA構築物を微生物に導入する方法としては、リン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００２３】
本発明において微生物は、固相支持体（例えば、ポリマー、鉱物、金属、ゲル、多糖類など）に対して固定化されていても良い。微生物の固相支持体への固定化は共有結合または非共有結合を用いることができる。
【００２４】
下記実施例にて詳述されるように、本発明において上記微生物はグリセリン含有培地にて、従来的に用いられてきたグリセリンよりジヒドロキシアセトンを生産できる微生物と比較して、およそ２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の量のジヒドロキシアセトンを製造することが可能である。また本発明において上記微生物はグリセリン含有培地にて、従来的に用いられてきたグリセリンよりジヒドロキシアセトンを生産できる微生物と比較して、副生物（例えば、グリセリン酸）の生成量を、およそ1/10、1/20、1/30、1/40またはそれ以下に抑えることができる。さらに本発明において上記微生物は、従来的に用いられてきたグリセリンよりジヒドロキシアセトンを生産できる微生物と比較して、高濃度のグリセリン含有培地中にて生育でき、かつ高濃度のグリセリンよりジヒドロキシアセトンを生産できる。
【００２５】
上記微生物による醗酵反応によりジヒドロキシアセトンを効率的に製造することができる。醗酵反応は、当業者に公知である一般的な微生物培養法によって行うことができる。
【００２６】
ジヒドロキシアセトン生産のための微生物の培養は、炭素源、窒素源および無機塩等を含む栄養培地を用いて行うことができる。炭素源として、グリセリンを培地に含める。窒素源としては、例えば硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素等、微生物が資化できる物質をそれぞれ単独もしくは混合して用いることができる。また、無機塩として、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を使用することができる。この他にも必要に応じて、酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等の栄養素を培地に適宜添加でき、これら含窒素有機物を窒素源の代替にすることもできる。培地は、寒天やゼラチンを加えて固化した固体培地、低濃度の寒天を加えた半流動培地、培地成分のみを入れた液体培地（ブイヨン、またはブロスともいう）を用いることができるが、液体培地が好ましい。
【００２７】
炭素源として培地に加えられる原料のグリセリンは、目的に応じて、様々な由来・品質のグリセリンを適宜選択することができる。例えば、化学合成されたグリセリン、植物油や動物油など天然物由来のグリセリン、廃油など廃棄物由来のグリセリンのいずれも使用することができる。また、高純度の精製グリセリンや、例えばBDFの製造の際に副生する粗グリセリンのいずれであっても使用することができる。本発明において、原料として培地に加えられるグリセリンの量は、従来的に用いられているグリセリン量と比べて高濃度であり、５〜４０ｗｔ％、好ましくは１０〜２５ｗｔ％、さらに好ましくは１５〜２５ｗｔ％である。
【００２８】
培地のｐＨは、反応開始時においてｐＨ３〜１０付近、好ましくはｐＨ４〜８付近の範囲である。
【００２９】
微生物の培養条件は、用いる微生物の種類によって異なるが、培養温度については微生物が活動できる温度条件、例えば２０〜５０℃、好ましくは３０℃であり、培養時間は６時間〜４日、好ましくは１〜３日間である。
【００３０】
培養に用いることができる醗酵槽としては、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などが挙げられる。また、微生物の培養は、連続式で行っても、バッチ式で行っても良い。
【００３１】
培養終了後、培地を回収して培地中に生成蓄積されたジヒドロキシアセトンを単離・精製する。ジヒドロキシアセトンの単離・精製は例えば、以下の方法で行うことができる。
【００３２】
所定の時間培養して得られた培地を回収し、当該培地から微生物の培養菌体を分離・回収する。培養菌体の分離・回収方法としては、特に限定されることなく、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。回収された培養菌体は、次のジヒドロキシアセトンの生産のための微生物源として用いることができる。
【００３３】
培地中に生成蓄積されたジヒドロキシアセトンの単離・精製は任意の方法により行うことができるが、遠心分離等の方法により菌体を除去したあとの培地より、例えば、各種クロマトグラフィーによる分離方法、晶析による分離方法、膜を利用した分離方法等を用いて単離・精製することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３５】
なお下記実施例におけるグリセリンおよびジヒドロキシアセトンの定量は糖アルコールを分析するカラム（Shodex社製  SC1011）、グリセリン酸の定量は糖と有機酸を同時に分析するカラム（Shodex社製  SH1011）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて行った。
【００３６】
（実施例１）
Gluconobacter oxydans IFO12528の膜結合型アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子（adhA）について、公知の配列情報（GenBank NC_006677）に基づいて以下のプライマーを設計した：
5'-GAAGATCTTACAGCCCGCTCGACCAG-3'（配列番号１）
5'-ACGCGTCGACACAGGGGTGGGGACGCTT-3'（配列番号２）。
【００３７】
Gluconobacter oxydans IFO12528のゲノムDNAを常法に従って抽出し、上記プライマーを用いて膜結合型アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子（adhA）を含むDNA断片をPCRにより増幅した。増幅した3.6 kbのDNA断片を、ベクターpGEM T-easyにライゲーションさせたプラスミドを作製した後、そのadhA遺伝子内部のBamHIサイトに、約1.2 kbのカナマイシン耐性遺伝子を含むBamHI断片を挿入し、遺伝子破壊用プラスミドpGEM-△adhAを作製した。
【００３８】
エレクトロポレーション法により、作製したプラスミドpGEM-△adhAを、Gluconobacter oxydansIFO12528に導入し、相同組換えにより、破壊株Gluconobacter oxydans IFO12528△adhAを得た。Gluconobacter oxydans IFO12528△adhAのゲノムDNAを常法に従って抽出し、同様にPCRを行うことにより、adhA遺伝子の破壊を確認した。
【００３９】
（実施例２）
上記方法により作製したGluconobacter oxydans IFO12528△adhAを、グルコース3%、酵母エキス0.5%、ポリペプトン0.2%の組成を有する前培養培地5 mL入りの試験管5本に植菌し、30℃で48時間往復振とう培養を行った。続いて表１に示す組成を有する本培養培地のうちグリセリン濃度を10 wt%にした培地500 mLが入った１リットル容ミニジャーに、上記前培養液を全量（25 mL）植菌した。培養は、温度30℃、通気量1 vvm、攪拌500 rpmで行った。
【００４０】
【表１】
2011147378.tif 000002
【００４１】
反応液中のpHは5に制御し、pH調整剤として、10M NaOHを使用した。前述した方法による本培養開始から、３日目までに生成したジヒドロキシアセトンを経時的に定量したところ、図１の通りであり、３日間の反応でのジヒドロキシアセトン量は73.5 g/lであった。また、副生物であるグリセリン酸の生産は1.9 g/lであった。反応期間中に消費されたグリセリン１モルに対する、生成ジヒドロキシアセトンは0.693モルであった。
【００４２】
（実施例３）
Gluconobacter oxydans IFO12528△adhAに関して、実施例２と同様にジャー培養を行った。ただし、表１に示す組成を有する本培養培地のうちグリセリン濃度は15 wt%、通気量を0.5 vvmにして行った。生成したジヒドロキシアセトンを定量したところ、図２の通りであり、３日間の反応でジヒドロキシアセトン量は108 g/lであった。また、副生物であるグリセリン酸の生産は2.2 g/lであった。反応期間中に消費されたグリセリン１モルに対する、生成グリセリン酸は0.676モルであった。
【００４３】
（実施例４）
Gluconobacter oxydans IFO12528△adhAに関して、実施例２と同様にジャー培養を行った。ただし、表１に示す組成を有する本培養培地のうちグリセリン濃度は20 wt%にして行った。生成したジヒドロキシアセトンを定量したところ、図３の通りであり、３日間の反応でジヒドロキシアセトン量は125 g/lであった。また、副生物であるグリセリン酸の生産は1.7 g/lであった。反応期間中に消費されたグリセリン１モルに対する、生成グリセリン酸は0.801モルであった。
【００４４】
（実施例５）
Gluconobacter oxydans IFO12528△adhAに関して、実施例２と同様に前培養を行った後、表１に示す組成を有する本培養培地のうちグリセリン濃度を5 wt%にした培地500 mLが入った１リットル容ミニジャーに、上記前培養液を全量植菌した。培養は、pH調整剤として、10M NaOHを使用し、温度30℃、通気量0.5 vvm、攪拌500 rpmで、24時間行った。その後、遠心分離により全菌体を集菌し、表１に示す組成を有する本培養培地のうちグリセリン濃度を15 wt%にした培地500 mLに懸濁した後、１リットル容ミニジャーにて反応を行った。反応は、pH調整剤として、10M NaOHを使用し、温度30℃、通気量0.5 vvm、攪拌500 rpmで行い、反応開始２日後にそれぞれ75 gのグリセリンを添加し、４日間反応を続けた。生成したジヒドロキシアセトンを定量したところ、図４の通りであり、４日間の反応でジヒドロキシアセトン量は140 g/lであった。また、副生物であるグリセリン酸の生産はほとんど認められなかった。
【００４５】
（実施例６）
Gluconobacter oxydans IFO12528△adhAに関して、実施例５と同様に集菌までを行い、25 wt%グリセリン水溶液500 mLに懸濁した後、１リットル容ミニジャーにて反応を行った。反応は、pH調整剤として、10M NaOHを使用し、温度30℃、通気量0.5 vvm、攪拌500 rpmで行い、４日間反応を続けた。生成したジヒドロキシアセトンを定量したところ、図５の通りであり、４日間の反応でジヒドロキシアセトン量は86.4 g/lであった。残存グリセリンが認められるものの、25wt%という高濃度からでもジヒドロキシアセトンが生産可能であることを示した。また、副生物であるグリセリン酸の生産はほとんど認められなかった。
【００４６】
（比較例１）
実施例２の比較実験としてGluconobacter oxydans IFO12528（親株）に関して、実施例２と同様にジャー培養を行った。生成したジヒドロキシアセトンおよびグリセリン酸を定量したところ、実施例２の図１と比較し、３日間の反応でジヒドロキシアセトンの生産量は63.5 g/lであり、副生物のグリセリン酸は18.5 g/lであった（図６）。反応期間中に消費されたグリセリン１モルに対する、生成ジヒドロキシアセトンは0.617モルであった。
【００４７】
（比較例２）
実施例３の比較実験としてGluconobacter oxydans IFO12528に関して、実施例３と同様にジャー培養を行った。生成したジヒドロキシアセトンおよびグリセリン酸を定量したところ、実施例３の図２と比較し、３日間の反応でジヒドロキシアセトンの生産量は38.1 g/lであり、副生物のグリセリン酸は47 g/lであった（図７）。反応期間中に消費されたグリセリン１モルに対する、生成ジヒドロキシアセトンは0.357モルであった。
【００４８】
（比較例３）
実施例４の比較例として、Gluconobacter oxydans IFO12528に関して、実施例４と同様にジャー培養を行った。その結果、３日間の培養で菌体はほとんど生育しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によれば、医薬品および化粧品の原料等として工業的利用価値の高いジヒドロキシアセトンを、これまで使用していた微生物のグリセリン代謝に関与する遺伝子を破壊しただけで、副生成物量を低減して製造できるようになるほか、特に高濃度グリセリンを原料としたジヒドロキシアセトンの生産量が、飛躍的に増大するため、製造プロセスの効率化やコスト削減が期待できる。
【図１】
2011147378.tif 000003
【図２】
2011147378.tif 000004
【図３】
2011147378.tif 000005
【図４】
2011147378.tif 000006
【図５】
2011147378.tif 000007
【図６】
2011147378.tif 000008
【図７】
2011147378.tif 000009
【配列表】
2011147378000001.app