(57)【要約】【課題】毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための薬学的組成物を提供すること。【解決手段】毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための薬学的組成物であって、該組成物が、少なくとも３つのアミノ酸およびＣ末端官能基を有するペプチドを含有し、該Ｃ末端官能基が、エポキシド、−Ｂ（ＯＲ）２基、−Ｓ（ＯＲ）２基および−ＳＯＯＲ基からなる群から選択され、ここで、ＲがＨ、アルキル（Ｃ１〜６）またはアリールであり、但し、該Ｃ末端官能基が−Ｂ（ＯＲ）２である場合、該ペプチドは、ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕではなく、そして該Ｃ末端官能基がエポキシドである場合、該化合物は、エポキソミシンではなく、該化合物は、プロテアソーム活性を阻害するか、またはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する、薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための薬学的組成物であって、該組成物が、少なくとも３つのアミノ酸およびＣ末端官能基を有するペプチドを含有し、該Ｃ末端官能基が、エポキシド、−Ｂ（ＯＲ）２基、−Ｓ（ＯＲ）２基および−ＳＯＯＲ基からなる群から選択され、ここで、ＲがＨ、アルキル（Ｃ１〜６）またはアリールであり、但し、該Ｃ末端官能基が−Ｂ（ＯＲ）２である場合、該ペプチドは、ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕではなく、そして該Ｃ末端官能基がエポキシドである場合、該化合物は、エポキソミシンではなく、該化合物は、プロテアソーム活性を阻害するか、またはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ペプチドがペプチドα’，β’−エポキシケトンである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが少なくとも４つのアミノ酸を有する、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ペプチドのＣ末端アミノ酸が疎水性アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記疎水性アミノ酸がロイシンまたはフェニルアラニンである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記ペプチドが、以下の式：
【化１】
2011195590.tif 000038
を含み、ここで、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が、以下からなる群
【化２】
2011195590.tif 000039
から独立して選択される、薬学的組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、Ｒ２およびＲ３が、
【化３】
2011195590.tif 000040
であり、そして前記化合物が、以下からなる群
【化４】
2011195590.tif 000041
から選択される、薬学的組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが以下の立体配置：
【化５】
2011195590.tif 000042
を有する、請求項６または７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが以下の式：
【化６】
2011195590.tif 000043
を含み、ここで、Ｒが以下からなる群
【化７】
2011195590.tif 000044
から選択される、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが以下の立体配置：
【化８】
2011195590.tif 000045
を有する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが
【化９】
2011195590.tif 000046
を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記化合物が、以下
【化１０】
2011195590.tif 000047
、ピラジルカルボニル−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ボロネート（ＰＳ−３４１）、トリ−ロイシンビニルスルホン（ＮＬＶＳ）、およびＮ−カルボベンゾイル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（ＰＳＩ）エポキシドからなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項１３】
毛の成長を促進するさらなる薬剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の薬学的組成物であって、前記さらなる薬剤が、成長ホルモン、エストロゲン、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、現在係属中である１９９８年７月１０日に提出された、米国特許出願番号第０９／１１３，９４７号の一部継続出願である、現在係属中の１９９９年７月２７日に提出された米国特許出願番号第０９／３６１，７７５号の一部継続出願である、現在係属中である１９９９年１０月２０日に提出された、米国特許出願番号第０９／４２１，５４５号の一部継続出願である。これらの出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、骨の損失の危険性を有する脊椎動物の骨格システムの障害を処置することにおいて、ならびに骨の成長を必要とすることによって特徴付けられる症状を処置することにおいて、骨折を処置することにおいて、そして軟骨の障害を処置することにおいて使用するための組成物および方法に関する。本発明はまた、毛の密度および成長を増強することに関連する。より詳細には、本発明は、プロテアソームの活性のインヒビターの使用（例えば、キモトリプシン様活性のインヒビター、および毛の成長を増強するためのＮＦ−κＢ活性のインヒビター）に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
プロテアソーム活性のインヒビター、およびＮＦ−κＢ活性のいくらかの程度のインヒビターが、２つの重要な生理学的な影響を有する。第１に、プロテアソームインヒビターは、骨の形成を増強することが可能であり、従って、種々の骨の障害を処置するために有用である。第２に、これらのインヒビターの両方ともが、毛嚢の産生を刺激し、そして従って、毛の増殖（それが所望される被験体においては、毛の密度を含む）を刺激することにおいて有用である。
【０００４】
（骨に対する影響）
骨は、骨芽細胞（これは、新しい骨を産生する）、および破骨細胞（これは、骨を崩壊させる）によって媒介される複雑なプロセスにおいて、一定の骨の分解および再合成に供される。これらの細胞の活性は、多数のサイトカインおよび成長因子によって調節され、これらの多くは現在同定されておりそしてクローン化されている。
【０００５】
骨の形成を増強するかまたは骨の再吸収を阻害することを必要とすることによって特徴付けられる血液過多の状態が存在する。おそらく、もっとも明らかなものは骨折の症例であり、ここでは、骨の成長を刺激することおよび骨の修復を早めそして完全にすることが所望される。骨の形成を増強する試薬もまた、顔の再構築手順において有用である。他の骨の欠損状態として、骨の断片の欠損、歯周病、転移性の骨の疾患、骨溶解性の骨の疾患および状態（ここでは、結合組織の修復（例えば、軟骨の欠損または損傷の治癒または再生）が有益である）が挙げられる。大きな趣旨は、骨粗鬆症の慢性的な状態でもあり、これは、年齢に関係する骨粗鬆症および閉経後のホルモン状態に関係する骨粗鬆症を含む。骨の増殖を必要としていることによって特徴付けられる他の状態として、一次的および二次的な副甲状腺機能亢進症、休止状態（ｄｉｓｕｓｅ）骨粗鬆症、糖尿病に関係する骨粗鬆症、およびグルココルチコイドに関係する骨粗鬆症が挙げられる。
【０００６】
これらの状態の任意のものを管理するための十分な薬学的なアプローチは現在は存在していない。骨折はなお、もっぱらギプス包帯、固定器、固定デバイス、および他の完全な機械的な手段を使用することによってのみ処置されている。さらに、閉経後の骨粗鬆症に関係する骨の劣化は、エストロゲンまたはビスホスホネートを用いて処置されている。これらは、いくつかの個体については欠点を有し得る。種々のアプローチが試みられているが、以下にさらに議論されるように、これらの症状を処置するために使用され得る試薬のレパートリーに対する付加物の必要性が残されている。
【０００７】
骨または他の骨格の障害（例えば、軟骨に関係する障害）の処置は、骨の形成を増強することまたは骨の再吸収を阻害することのいずれかによって、あるいはそれらの両方によって、達成され得る。骨の形成に関係している多数のアプローチが、示唆されている。
【０００８】
骨組織は、骨細胞を刺激する能力を有する因子についての優れた供給源である。従って、屠殺場から得たウシの骨組織の抽出物は、骨の構造的な完全性を維持する役割を果たす構造タンパク質だけではなく、骨細胞を増殖するように刺激し得る生物学的に活性な骨の成長因子をもまた含む。これらの後者の因子は、形質転換成長因子β、ヘパリン結合成長因子（例えば、酸性および塩基性の繊維芽細胞増殖因子）、インシュリン様成長因子（例えば、インシュリン様成長因子Ｉおよびインシュリン様成長因子ＩＩ）、ならびに最近記載された骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と呼ばれるタンパク質のファミリーである。これらの成長因子の全てが、他のタイプの細胞および骨細胞に対する影響を有する。
【０００９】
ＢＭＰは、拡大された形質転換成長因子βスーパーファミリーの中の新規の因子である。組換えのＢＭＰ２およびＢＭＰ４は、それらがラットの皮下組織中に局所的に注入された場合に、新しい骨の形成を誘導し得る（非特許文献１）。これらの因子は、それらが分化する際に、正常な骨芽細胞によって発現され、そして骨芽細胞の分化およびインビトロでの骨の結節の形成ならびにインビボでの骨の形成を刺激することが示されている（非特許文献２）。この後者の特性は、骨の損失を生じる疾患において治療薬としての可能性のある有用性を示唆する。
【００１０】
骨の形成に役割を果たす細胞は骨芽細胞である。前駆体から成熟した骨を形成する細胞へと骨芽細胞が分化する際に、これらは、多数の酵素および骨のマトリックスの構造タンパク質（これらには、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、およびアルカリホスファターゼを含む）を発現しそして分泌する。これらはまた、骨のマトリックス中に保存されている多数の成長調節ペプチドを合成し、そしておそらく、正常な骨の形成に役割を果たす。これらの成長調節ペプチドとして、ＢＭＰ（Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ．ら（１９９４）、前出）が挙げられる。胎児のラットの頭蓋冠の骨芽細胞の初代培養物の研究においては、ＢＭＰ１、２、３、４、および６が、石灰化した骨の結節の形成の前に培養された細胞によって発現される（Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ．ら（１９９４）、前出）。アルカリホスファターゼ、オステオカルシンおよびオステオポンチンと同様に、ＢＭＰは、それらが増殖しそして分化するに伴って培養された骨芽細胞によって発現される。
【００１１】
ＢＭＰはインビトロおよびインビボでの骨の形成の強力な刺激因子であるが、骨の治癒を増強するための治療薬としてのそれらの使用については欠点が存在する。骨の形態形成タンパク質のレセプターが、多くの組織において同定されており、そしてＢＭＰ自体は、特異的な時間および空間のパターンで、多くの種々の組織中で発現される。このことは、ＢＭＰが骨に加えて多くの組織に対して効果を有し得ることを示唆し、これによって全身的に投与された場合には、治療薬としてのそれらの有用性が限定される可能性がある。さらに、これらがペプチドであるので、これらは、注射によって投与される。これらの欠点は、治療薬としてのＢＭＰの開発に厳しい制限を課す。
【００１２】
この目的のためにまた示唆されるフッ化物は、例えば、非特許文献３に記載されるように、骨芽細胞上の成長因子レセプターのチロシンリン酸化に関係し得る作用の態様を有するが、フッ化物の投与は、おそらく、骨の石灰化に対する影響に起因して、増大した骨のもろさに関係する。
【００１３】
骨の形成を刺激し得る低分子が、１９９８年４月３０日に公開された特許文献１、１９９７年５月１日に公開された特許文献２、および１９９７年１２月２４日に公開された特許文献３に開示されている。これらの試薬は一般的には、リンカーによって空間的に分けられている２つの芳香族系を含む。さらに、１９９８年６月１８日に公開された特許文献４は、骨の形成を増強するスタチン（ｓｔａｔｉｎ）として公知の化合物のクラスの使用を開示している。１９９８年６月１２日に提出された米国特許出願番号第０９／０９６，６３１号は、一般的なイソプレノイド経路のインヒビターである、骨の成長を刺激するための化合物に関係している。この出願の内容、ならびに上記のＰＣＴ出願の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【００１４】
他の試薬が、骨の再吸収を妨げることによって作動するようである。従って、特許文献５は、骨粗鬆症の処置において有用であると記載されている化合物を開示する。これらの化合物は、おそらく、骨の再吸収を妨げることによってこの結果を達成する。
【００１５】
ロバスタチンおよびベザフィブレートによって例示される特定の脂質清澄剤を報告する非特許文献４は、ウサギにおいては、ストロイドの投与によって生じる骨の再吸収を阻害することができた。ステロイドでの処置の非存在下では、これらの２つの化合物による骨の形成に対する影響は存在しなかった。ステロイドの存在下で観察される骨の再吸収の阻害の機構（および、本質的には、骨に対するステロイドの作用機構）は、わかっていないと言われている。
【００１６】
Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＳＢＭＲ、第１８版、Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ（１９９６年９月）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．（１９９６）１１（Ｓ１）：Ｓ５１０において明らかにされた、Ｃｕｉ，Ｑ．らによる「Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｓｔｅｒｏｉｄ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ」と表題をつけられた要約は、ニワトリの骨髄間質からクローン化された骨の先祖細胞がデキサメタゾンを用いて培養物中で処理された場合に蓄積する、トリグリセリド小胞をロバスタチンが減少させることを報告する。ロバスタチンは、特定のｍＲＮＡの発現を減少させ、そして細胞がデキサメタゾンでの処置の後の骨形成性の表現形を維持することを可能にすること、ならびにデキサメタゾンでの処置の結果としての大腿骨の頭部での骨の欠損を受けたニワトリがロバスタチンでの処置にとって改善されたことを報告した。
【００１７】
しかし反対に、これらのデータは、デキサメタゾンおよび他のインデューサー（例えば、ＢＭＰ）が、骨芽細胞の分化を誘導し、そしてオステオカルシンｍＲＮＡを刺激するという報告とは対照的である（非特許文献５；非特許文献６）。さらに、非特許文献７は、最近、オステオカルシン欠損マウスが、骨の再吸収の損傷を伴うことなく、増大した骨の形成および改善された機能的な質の骨によって明らかである表現形を示すことを報告した。Ｄｕｃｙらは、彼らのデータが、オステオカルシンアンタゴニストがエストロゲン置換治療と組合せて治療的な使用（骨粗鬆症を予防または処置するため）であり得ることを示唆すると記載している。
【００１８】
ロバスタチンが、ヒトの糸球体間質細胞中のリポポリサッカライドによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化を阻害することもまた示されている。非特許文献８。
【００１９】
転写因子ＮＦ−κＢの発現を欠失しているマウスが、骨芽細胞の形成がないことに起因して、異常な骨の状態である大理石骨病（骨粗鬆症の逆）を発症することが、最近、示されている（非特許文献９；非特許文献１０）。大理石骨病は、例えば、破骨細胞機能が存在しないこと、および骨の軟骨形成材料で骨髄腔中が満たされることによって特徴付けられる。マウスは、異常な骨芽細胞機能は示さない。骨の成長を刺激するプロテアソームインヒビターの能力は、これらの結果を参照しても、骨芽細胞に対する影響が示されていない場合には、予想外である。なぜなら、プロテアソームインヒビターは、十分にＮＦ−κＢインヒビターとして機能すると予想されるからである。このことは、ＮＦ−κＢが特異的な標的遺伝子に対してその効果を発揮する核に侵入しなければならず、そしてその核への侵入を阻害する化合物はその活性を効果的に阻害することが原因である。プロテアソーム活性は、ＮＦ−κＢの転座のために必要である。ＮＦ−κＢは、その転座を妨げる阻害性タンパク質ＩκＢαおよびＩκＢβに結合して細胞質中に存在する。転座は、キナーゼがＩκＢβをリン酸化してプロテアソーム活性によってその分解を引き起こす場合に生じ、従って、核への侵入のためのその放出を生じる。プロテアソーム活性の阻害は、この放出を妨げ、従ってＮＦ−κＢを効果的に阻害する。
【００２０】
（毛の成長に対する影響）  ヒトの毛の成長の障害として、男性のパターン禿頭症、円形脱毛症、ガンの化学療法によって誘導される脱毛症、および加齢に関係する毛の菲薄化が挙げられる。これらの症状は、あまり理解されていないが、それにもかかわらず、一般的でありそして悩みの多い状態である。なぜなら、毛は、ヒトの社会的および性的なコミュニケーションにおいて重要な因子であるからである。
【００２１】
毛嚢の調節および成長はなお、十分には理解されていないが、組織の形態形成の間の増殖、分化、および細胞性の相互作用を含む動的なプロセスを示す。毛嚢は、発達の初期段階にのみ形成され、そして置き換えられないと考えられている。
【００２２】
非特許文献１１は、ＴＧＦスーパーファミリーのメンバーである骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が、発育の間に毛嚢中で異なって発現されるという証拠を記載する。非特許文献１２は、ＢＭＰ−２および骨細胞中の他の基質の発現に対するＴＧＦβの効果を記載する。成熟した毛嚢中でのＢＭＰ−２の発現はまた、成熟の間に生じ、そして細胞増殖期の後で生じる（Ｈａｒｄｙら（１９９２）、前出）。しかし、非特許文献１３によって記載されるように、毛嚢の成熟におけるＢＭＰ−２の正確な機能的な役割は明らかではないままである。
【００２３】
脱毛症を処置するためのアプローチは、米国特許の文献において豊富に存在する。例えば、特許文献６（シアノカルボン酸誘導体）、特許文献７（角質細胞成長因子）、および特許文献８（１６−ピラジニル−置換−４−アザ−アンドロスタン−５−α−レダクターゼイソ酵素１インヒビター）を参照のこと。多くの他のものが存在する。
【００２４】
非特許文献１４は、β−カテニンが成体の上皮細胞が毛嚢を作成するようにすることを実証した。これは、公知の、成熟した細胞がそのようになることが不能であるということを参照して、驚くべき結果である。Ｂ−カテニンは、細胞−細胞接着において、そして成長因子シグナルトランスフェクションにおいて役割を果たすことが公知である。ユビキチンの形成後に、β−カテニンがプロテアソームによって分解されることもまた公知である。非特許文献１５。毛の成長（またはその欠失）に関係している少なくとも１つの遺伝子もまた、報告されている。非特許文献１６。
【００２５】
毛の喪失の処置のために現在使用されている２つの認可されている試薬は、高血圧症薬であるミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）および５α−レダクターゼインヒビターであるフィナステライド（Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）である。いずれも完全には十分ではない。両方ともが中程度の効力のために苦しみ、そして投与する者にとっては不便である。特異的な局所的な活性およびこれらの試薬の効力よりも良好な効力を有する化合物を投与することが容易であることが、明らかな利点を示す。
【００２６】
（プロテアソームおよびＮＦ−κＢ）  本発明は、骨の障害の処置および毛の成長の刺激において有用である化合物についての便利なアッセイを開示する。このアッセイは、転写因子ＮＦ−κＢの活性の阻害またはプロテアソームのプロテアオゼーの活性の阻害（好ましくは、プロテアソームのプロテアーゼ）を含む。これらの活性を阻害する化合物は、一般的には、毛の成長の障害において有用である。プロテアソームインヒビターは骨の成長を増強する。転写因子およびこれらのプロテアーゼの産生を阻害する化合物もまた、本発明において有用である。これらのそのようにする能力はさらに、さらなるアッセイによって確認され得る。
【００２７】
プロテアソームは、関連していないプロテアーゼ（これは、そのタンパク質溶解サブユニットが自己組立てされて筒型の複合体が形成される共通の構造を形成する）の区分されていないコレクションである（概説については、Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ（１９９８）９２：３６７−３８０を参照のこと）。プロテアソームは、真核生物細胞の内部に異なるタンパク質溶解活性のアレイを含む。プロテアソーム活性を阻害する化合物はまた、ＮＦ−κＢ活性を、核に転座するその能力を制限することによって低下させる（非特許文献１７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】国際公開第９８／１７２６７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／１５３０８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７／４８６９４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９８／２５４６０号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，２８０，０４０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７６７，１５２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８２４，６４３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９１０，４９７号明細書
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ，１９９２年，３２：ｐ．１６０−６７
【非特許文献２】Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，１９９４年，９：ｐ．８５５−６３
【非特許文献３】Ｂｕｒｇｅｎｅｒら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ，１９９５年，１０：ｐ．１６４−１７１
【非特許文献４】Ｗａｎｇ，Ｇ．−Ｊ．ら、Ｊ  Ｆｏｒｍｏｓ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ，１９９５年，９４：ｐ．５８９−５９２
【非特許文献５】Ｂｅｌｌｏｗｓ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｂｉｏｌ，１９９０年，１４０：ｐ．１３２−３８
【非特許文献６】Ｒｉｃｋｒｄ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｂｉｏｌ  ，１９９４年，１６１：ｐ．２１８−２８
【非特許文献７】Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６年，３８２：ｐ．４４８−５２
【非特許文献８】Ｇｕｉｊａｒｏ，Ｃ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９９６年，１１：６：ｐ．９９０−９９６
【非特許文献９】Ｆｒａｎｚｏｓｏ，Ｇ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ，１９９７年，１１：ｐ．３４８２−３４９６
【非特許文献１０】Ｉｏｔｓｏｖａ，Ｖ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，１９９７年，３：ｐ．１２８５−１２８９
【非特許文献１１】Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｔｒａｎｓ  Ｇｅｎｅｔ，１９９２年，８：ｐ．５５−６１
【非特許文献１２】Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，１９９４年，９：ｐ．８５５−８６３
【非特許文献１３】Ｂｌｅｓｓｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ，１９９２年，７：ｐ．２０４−２１５
【非特許文献１４】Ｇａｔ，Ｕ．ら、Ｃｅｌｌ，１９９８年，９５：ｐ．６０５−６１４
【非特許文献１５】Ｏｒｆｏｒｄ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９７年，２７２：ｐ．２４７３５−２４７３８
【非特許文献１６】Ａｈｍｅｄ，Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年，２７９：ｐ．７２０−７２４
【非特許文献１７】Ｂａｒｎｅｓ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９９７年，３３６：ｐ．１０６６−１０７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明の目的は、毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、以下を提供する：
（項目１）  脊椎動物において、骨形成を増強するため、または病理学的な歯の状態を処置するため、または変形性関節状態を処置するための方法であって、該方法は、該処置を必要とする脊椎動物被験体に、有効量の、ＮＦ−κＢの活性を阻害するか、またはプロテアソーム活性を阻害するか、またはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する化合物を投与する工程を包含し、ここで、該化合物が該イソプレノイド経路を阻害しない、方法。
（項目２）  前記化合物が、プロテアソーム活性を阻害するか、またはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記化合物が、前記プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記化合物が、少なくとも３つのアミノ酸および前記プロテアソームのキモトリプシン様触媒性部位のトレオニン残基と反応するＣ末端官能基を有するペプチドである、項目３に記載の方法。
（項目５）  前記Ｃ末端官能基が、エポキシド、−Ｂ（ＯＲ）２基、−Ｓ（ＯＲ）２基および−ＳＯＯＲ基からなる群から選択され、ここで、ＲがＨ、アルキル（Ｃ１〜６）またはアリール（Ｃ１〜６）である、項目４に記載の方法。
（項目６）  前記官能基が、前記プロテアソームのキモトリプシン様触媒性部位のトレオニン残基とモルホリノ環を形成するエポキシドである、項目５に記載の方法。
（項目７）  前記ペプチドがペプチドα’，β’−エポキシケトンである、項目３に記載の方法。
（項目８）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが少なくとも４つのアミノ酸を有する、項目７に記載の方法。
（項目９）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンのＣ末端アミノ酸ペプチドが疎水性アミノ酸である、項目７に記載の方法。
（項目１０）  前記疎水性アミノ酸がロイシンまたはフェニルアラニンである、項目９に記載の方法。
（項目１１）  項目７に記載の方法であって、前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが、以下の式：
【化１】
2011195590.tif 000002
を有し、ここで、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が疎水性置換基である、方法。
（項目１２）  Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が、以下からなる群
【化２】
2011195590.tif 000003
から独立して選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  項目１１に記載の方法であって、Ｒ２およびＲ３が、
【化３】
2011195590.tif 000004
であり、そして前記化合物が、以下からなる群
【化４】
2011195590.tif 000005
から選択される、方法。
（項目１４）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが以下の立体配置：
【化５】
2011195590.tif 000006
を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１５）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが以下の式：
【化６】
2011195590.tif 000007
を有し、ここで、Ｒが以下からなる群
【化７】
2011195590.tif 000008
から選択される、項目７に記載の方法。
（項目１６）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが以下の立体配置：
【化８】
2011195590.tif 000009
を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが
【化９】
2011195590.tif 000010
である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  項目３に記載の方法であって、前記化合物が、以下からなる群
【化１０】
2011195590.tif 000011
、エポキソミシン、ＰＳ−３４１、ＮＬＶＳ、ＰＳＩエポキシド、ラクトシスチン、ＰＴＸおよびペプチドアルデヒドからなる群から選択される、方法。
（項目１９）  項目３に記載の方法であって、前記化合物が、以下の式：
【化１１】
2011195590.tif 000012
を有し、ここで、ヘッド部分が、前記プロテアソームの触媒性キモトリプシン部位と不可逆的に反応し；
Ａは独立してＣＯ−ＮＨまたはその同配体であり；
Ｒは独立して、ヒドロカルビルであり；
Ｘは極性基であり；そして
ｎ＝０〜２である、方法。
（項目２０）  Ｒが、ハロ基、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、＝Ｏ、−ＣＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＯ２、−ＣＮ、および−ＣＦ３からなる群から選択される置換基を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  Ｘが保護されている、項目１９に記載の方法。
（項目２２）  項目１に記載の方法であって、前記被験体が、骨粗しょう症、骨折または骨欠損、原発性上皮小体亢進症または続発性上皮小体機能亢進症、歯周病または歯周欠損、転移性骨疾患、溶骨性骨疾患、整形手術後、義関節手術後、および歯の移植後からなる群から選択される状態によって特徴付けられる、方法。
（項目２３）  骨成長を促進するかまたは骨の再吸収を抑制する１つ以上の薬剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）  項目２３に記載の薬学的組成物であって、前記薬剤が、骨形態形成因子、抗再吸収薬剤、骨原性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、成長ホルモン、エストロゲン、ビスホスホネート、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される、方法。
（項目２５）  哺乳動物被験体の、毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための方法であって、該方法が、該処置を必要とする哺乳動物被験体に、有効量の、ＮＦ−κＢの活性を阻害するかまたはプロテアソーム活性を阻害するかまたはこれらのタンパク質の産生を阻害する化合物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）  前記化合物が、プロテアソーム活性を阻害するかまたはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）  前記化合物が、前記プロテアソームのトリプシン様活性またはＰＧＰＨ活性を阻害する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）  前記化合物が、ラクトシスチンまたはペプチジルアルデヒドである、項目２５に記載の方法。
（項目２９）  骨疾患、歯病理学的状態または変形性関節症を処置するための薬学的組成物であって、該組成物が、ＮＦ−κＢの活性を阻害するかまたはプロテアソーム活性を阻害するかまたはこれらのタンパク質の産生を阻害する化合物を含み、該化合物が、該イソプレノイド経路を阻害しない、薬学的組成物。
（項目３０）  前記化合物が、プロテアソーム活性を阻害するかまたはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する、項目２９に記載の薬学的組成物。
（項目３１）  前記化合物が、前記プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する、項目３０に記載の薬学的組成物。
（項目３２）  前記化合物が、少なくとも３つのアミノ酸および前記プロテアソームのキモトリプシン様触媒性部位のトレオニン残基と反応するＣ末端官能基を有するペプチドである、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３３）  前記Ｃ末端官能基が、エポキシド、−Ｂ（ＯＲ）２基、−Ｓ（ＯＲ）２基および−ＳＯＯＲ基からなる群から選択され、ここで、ＲがＨ、アルキル（Ｃ１〜６）またはアリール（Ｃ１〜６）である、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目３４）  前記ペプチドがペプチドα’，β’−エポキシケトンである、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目３５）  項目３４に記載の薬学的組成物であって、前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが、以下の式：
【化１２】
2011195590.tif 000013
を有し、ここで、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が疎水性置換基である、薬学的組成物。
（項目３６）  前記ペプチドα’，β’−エポキシケトンが以下の式：
【化１３】
2011195590.tif 000014
を有し、ここで、Ｒが以下からなる群
【化１４】
2011195590.tif 000015
から選択される、項目３４に記載の薬学的組成物。
（項目３７）  項目３１に記載の薬学的組成物であって、前記化合物が、以下の式：
【化１５】
2011195590.tif 000016
を有し、ここで、ヘッド部分が、前記プロテアソームの触媒性キモトリプシン部位と不可逆的に反応し；
Ａは独立してＣＯ−ＮＨまたはその同配体であり；
Ｒは独立して、ヒドロカルビルであり；
Ｘは極性基であり；そして
ｎ＝０〜２である、薬学的組成物。
（項目３８）  前記化合物が、ラクトシスチン、ペプチジルアルデヒド、ＰＴＸ、エポキソミシンまたはＰＳＩエポキシドである、項目２９に記載の薬学的組成物。
（項目３９）  毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための薬学的組成物であって、該組成物が、ＮＦ−κＢの活性を阻害するかまたはプロテアソーム活性を阻害するかまたはこれらのタンパク質の産生を阻害する化合物を含む、薬学的組成物。
（項目４０）  前記化合物が、プロテアソーム活性を阻害するかまたはプロテアソームタンパク質の産生を阻害する、項目３９に記載の薬学的組成物。
（項目４１）  前記化合物が、前記プロテアソームのトリプシン様活性またはＰＧＰＨ活性を阻害する、項目４０に記載の薬学的組成物。
（項目４２）  前記化合物が、ラクトシスチンまたはペプチジルアルデヒドである、項目３９に記載の薬学的組成物。
（項目４３）  骨成長を増強するかまたは毛成長を刺激する化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
ＮＦ−κＢ活性を阻害する該化合物の能力を決定するためのアッセイに該化合物を供し、それにより、ＮＦ−κＢの活性を阻害する化合物が、骨成長を増強するかまたは毛成長を刺激する化合物として同定される工程；または
ＮＦ−κＢの産生を阻害する該化合物の能力を決定するためのアッセイに該化合物を供し、それにより、ＮＦ−κＢの産生を阻害する化合物が、骨成長を増強するかまたは毛成長を刺激する化合物として同定される工程；または
プロテアソーム活性を阻害する該化合物の能力を評価するためのアッセイに候補化合物を供し、それにより、プロテアソーム活性を阻害する化合物が、骨成長を増強するかまたは毛成長を刺激する化合物として同定される工程；または
プロテアソーム活性を有する酵素の産生を阻害する該化合物の能力を評価するためのアッセイに候補化合物を供し、それにより、プロテアソーム活性を有する酵素の産生を阻害する化合物が、骨成長を増強するかまたは毛成長を刺激する化合物として同定される工程。
（項目４４）  項目４３に記載の方法であって、阻害される前記プロテアソーム活性が、キモトリプシン様活性、トリプシン様活性、ＰＧＰＨ活性およびその組み合わせからなる群から選択される、方法。
【００３２】
（発明の開示）  本発明は、骨形成性の試薬および毛の成長を刺激する試薬のレパートリーに、プロテアソーム活性に関係している鍵となるタンパク質および酵素を阻害し、そして核転写因子であるＮＦ−κＢの活性を低下させ、従って骨または毛の成長を刺激する薬物を提供することによって、付け加える。本発明に従うと、本発明者らは、プロテアソームタンパク質の機能の阻害、および骨の細胞におけるＮＦ−κＢのより少ない程度の阻害が、骨の成長を増大させるように、そして毛嚢を形成および刺激するように導くことを、発見した。毛に対する効果はまた、ＮＦ−κＢインヒビターの阻害によっても示される。このように、そのプロテアソームタンパク質またはＮＦ−κＢを阻害する能力について候補の化合物を評価することによって、骨および毛の成長の同化作用の試薬を同定するために有用な手段を提供する。
【００３３】
従って、本明細書は、プロテアソーム活性を阻害するそれらの能力を評価することによって、骨の成長を刺激する骨形成性の化合物および毛の成長を刺激する化合物を同定する方法、ならびに転写因子であるＮＦ−κＢの活性を阻害する（好ましくは、プロテアソーム活性を阻害する）それらの能力を評価することによって毛の成長を刺激する化合物を同定する方法を提供する。プロテアソーム中に含まれる酵素の産生をインサイチュで阻害するかまたはＮＦ−κＢの産生を阻害する化合物（好ましくは、プロテアソームの酵素）もまた、本発明の方法において有用である。一旦、これらの活性を阻害する化合物が同定されると、これらは、本発明のさらなる局面−−適切な細胞を同定された化合物と接触させることによって、骨または毛の成長を刺激するための方法において使用され得る。細胞性の接触は、インビボでの投与を含み得、そして従って、本発明の化合物は、退行性の骨の疾患、骨折、歯の問題、禿頭症、脱毛症などを処置することにおいて有用である。これらの方法は、プロテアソーム活性のインヒビター、または転写因子ＮＦ−κＢの活性のインヒビター（好ましくは、プロテアソーム酵素のインヒビター、またはプロテアソーム酵素もしくはＮＦ−κＢの産生のインヒビター（好ましくは、プロテアソーム酵素））として同定された化合物を用いて、本発明に従って行われる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、毛成長を刺激することによって利益を受ける状態を処置するための薬学的組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、イソプレノイド経路の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明の実施の態様）
本発明に従うと、骨の不全を罹患している被験体における骨の不全（骨粗鬆症、骨折、骨溶解性の病変、および分節の骨の欠損）を処置する方法が提供される。上記の方法は、上記の被験体に対して、骨の成長を刺激するために十分な量で、プロテアソーム活性および機能、またはこのタンパク質の産生を阻害する化合物を投与する工程を包含する。ＮＦ−κＢのインヒビターもまた意図される。
【００３７】
本発明に従うと、毛の成長の障害を処置する方法もまた提供される。毛の成長の障害は、存在している毛嚢の毛を押出す能力における欠損の結果であり得るか、または毛嚢自体の数における不全の結果であり得る。「毛の成長の刺激」は、これが長さおよび／または同じ数の毛嚢による濃度における成長の速度の増大、増大した毛嚢の数が原因で生じる成長、またはこれらの両方の結果であるかどうかにかかわらず、被験体の特定の部分の毛の容量を増大させることをいう。毛嚢の数は、存在している毛嚢をさらに活性化することによって、または皮膚の特定の領域の毛嚢の出現もしくは増殖を刺激することによって、増強させられ得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、「被験体」は、ヒトならびに他の動物種（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、げっ歯類、など）を含む。被験体が、骨の成長または毛の成長を刺激することを望んでいることが、適切であることが当業者によって理解される。従って、一般的には、例えば、毛の成長の刺激は、このような成長を適切に示す動物についてほとんどの例において確認される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、「処置する」または「処置」は、骨の欠損の症状の発症を延期すること、および／または発症するかまたは発症することが予想されるこのような症状の重篤度を減少させることを含む。これらの用語はさらに、存在している骨または軟骨の欠損の症状を緩和すること、さらなる症状を予防すること、症状の根底に有る代謝による原因を緩和するかまたは予防すること、骨の再吸収を予防または逆転させること、ならびに／あるいは骨の成長を助長することを含む。従って、この用語は、有益な結果が、軟骨、骨、または骨格の欠損を有している脊椎動物の被験体に、またはこのような欠損を発症する可能性がある脊椎動物の被験体について確認されていることを示す。
【００４０】
「骨の欠損」は、骨の再吸収に対する骨の形成の比における不均衡を意味する。その結果、改変されない場合には、被験体は、所望されるよりも少ない骨を示すか、または被験体の骨は、不完全であり、そして所望されるよりも密集（ｃｏｈｅｒｅｎｔ）していない。骨の欠損はまた、骨折によって、外科的な介入によって、または歯の疾患もしくは歯周病によって生じ得る。「軟骨の欠損」によって、損傷した軟骨、所望されるよりも少ない軟骨、または不完全でありそして所望されるよりも密集していない軟骨が意味される。「骨の障害」は、骨の欠損および軟骨の欠損の両方を含む。
【００４１】
本発明のアッセイによって同定された化合物の代表的な使用は、以下を含む：骨の欠損および不全の修復（例えば、閉じている、開いている、および結合していない骨折において生じるもの）；閉じている、および開いている骨折の整復における予防的な使用；形成外科手術における骨の治癒の促進；非セメント補綴関節および歯の移植物中への骨の増殖の刺激；閉経前の女性におけるピークの骨質量の増大；成長不良の処置、歯周病および欠損の処置、ならびに他の歯の修復プロセス；伸延骨形成の間の骨の形成の増大；ならびに他の骨格の障害（例えば、年齢に関係する骨粗鬆症、閉経後の骨粗鬆症、グルココルチコイドによって誘導される骨粗鬆症、または休止状態骨粗鬆症および関節炎、あるいは骨の形成の刺激によって有益である任意の他の状態。本発明の化合物はまた、先天的な、外傷によって誘導される、または外科手術による骨の切除の修復において（例えば、ガンの処置）、ならびに美容外科手術においても有用であり得る。さらに、本発明の化合物は、軟骨の欠損または障害を限定または処置するために使用され得、そして創傷の治癒または組織の修復において有用であり得る。
【００４２】
毛の成長の刺激のための「処置する」または「処置」によって有益である状態として、男性のパターン禿頭症、化学療法によって誘導される脱毛症、加齢によって生じる毛の菲薄化、毛の被覆率の欠損を生じる遺伝的な障害が挙げられ、そして動物においては、低温からのさらなる保護を提供する。従って、ヒトでの使用は、主に美容上で有利であり得るが、動物での使用は、同様に治療的であり得る。
【００４３】
本発明の組成物は、全身的または局所的に投与され得る。全身的な使用については、本明細書中の化合物は、従来の方法に従って、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、または経皮的）または腸に（例えば、経口または直腸）送達のために処方される。静脈内投与は、一連の注射によって、または延長された期間にわたる連続的な注入により得る。注射または他の別々に配置された投与の他の経路による投与は、毎週または１日に１回から３回までの範囲の間隔で行われ得る。あるいは、本明細書中に開示されている化合物は、周期的な様式（開示される化合物の投与；続いて、投与しない；続いて開示される化合物の投与、など）で投与され得る。処置は、所望される結果が達成されるまで継続される。一般的には、薬学的処方物は、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、水中の５％のデキストロース、微量金属を含有しているホウ酸緩衝化生理食塩水など）と組合せて、本発明の化合物を含む。処方物はさらに、１つ以上の賦形剤、保存料、可溶化剤、緩衝剤、バイアルの表面上でのタンパク質の損失を防ぐためのアルブミン、潤滑剤、増量剤、安定剤などを含み得る。処方の方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（これは、本明細書中で参考として援用されている）に開示されている。本発明での使用のための薬学的組成物は、滅菌の、非発熱性の液体の溶液または懸濁物、コーティングされたカプセル、坐剤、凍結乾燥させられた散剤、経皮パッチの形態、または当該分野で公知の他の形態であり得る。局所的な投与は、損傷もしくは欠損の部位での注射により得るか、またはその部位での固体のキャリアの挿入もしくは接着により得るか、または粘性の液体の直接的な局所的な適用などにより得る。局所投与については、送達ビヒクルは、好ましくは、骨または軟骨を成長させるためのマトリックスを提供し、そしてより好ましくは、有害な影響を伴うことなく被験体によって吸収され得るビヒクルである。
【００４４】
本明細書中の化合物の創傷部位への送達は、本明細書中で参考として援用されている、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２０８５９号に記載されているもののような、制御放出組成物の使用によって増強され得る。このタイプのフィルムは、補綴デバイスおよび外科的な移植物についてのコーティングとして特に有用である。例えば、フィルムは、外科的なネジ、ロッド、ピン、プレートなどの外表面をラップで包まれ得る。このタイプの移植可能なデバイスは、整形外科手術において慣用的に使用されている。このフィルムはまた、骨充填材料（例えば、ヒドロキシアパタイトブロック、鉱物質除去骨マトリックスプラグ、コラーゲンマトリックスなど）をコーティングするために使用され得る。一般に、本明細書中に記載されているようなフィルムまたはデバイスは、骨折部位で骨に対して適用される。適用は、一般的には、標準的な外科手術手順を使用した、骨の中への移植、または表面への接着による。
【００４５】
上記のコポリマーおよびキャリアに加えて、生分解性のフィルムおよびマトリックスは、他の活性であるかまたは不活性な成分を含み得る。特に目的とするのは、組織の増殖または浸潤を促進する薬剤（例えば、増殖因子）である。この目的のための例示的な増殖因子として、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。骨の増殖を促進する因子（例えば、骨の形態形成タンパク質（米国特許第４，７６１，４７１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１３６６号）、オステオゲニン（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７１０９−１３）およびＮａＦ（Ｔｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．（１９８９）２３：５７１−８９））もまた、好ましい。生分解性のフィルムまたはマトリックスとして、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ無水物、骨または皮膚のコラーゲン、純粋なタンパク質、細胞外マトリックス成分など、およびそれらの組合せが挙げられる。このような生分解性の材料は、所望される機械的、美容的、または組織もしくはマトリックスの界面の特性を提供するように、非生分解性の材料と組合せて使用され得る。
【００４６】
本発明の化合物の送達のための代替の方法としては、ＡＬＺＥＴ浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；持続放出マトリックス材料（例えば、Ｗａｎｇら（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１３６６号）に開示されているもの））；電気的に荷電したデキストランビーズ（Ｂａｏら（ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０３１２５号）に開示されている通り）；コラーゲンに基づく送達システム（例えば、Ｋｓａｎｄｅｒら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）２１１（３）：２８８−９４に開示されている通り）；メチルセルロースゲルシステム（Ｂｅｃｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．（１９９１）６（１１）：１２５７−６５に開示されている通り）；アルギネートに基づくシステム（Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９１）１２：６１９−２６に開示されている通り）などの使用が挙げられる。骨の中での持続された局所的な送達のための当該分野で周知の他の方法として、含浸され得る多孔性のコーティングされた金属補綴物、および治療用組成物がその中に取り込まれている固体のプラスチックのロッドが挙げられる。
【００４７】
本発明の化合物はまた、骨の吸収を阻害する薬剤と組合せて使用され得る。抗再吸収薬剤（例えば、エストロゲン、ビスホスホネート、およびカルシトニン）が、この目的のために好ましい。より詳細には、本明細書中で開示されている化合物は、骨の欠損の状態の補正を得るために十分な時間（例えば、数ヶ月から数年）の間投与され得る。一旦、骨の欠損状態が補正されると、脊椎動物には、補正された骨の状態を維持するために抗再吸収化合物が投与され得る。あるいは、本明細書中で開示される化合物は、周期的な様式（開示される化合物の投与、続いて、抗再吸収化合物の投与、続いて開示される化合物の投与など）で抗再吸収化合物とともに投与され得る。
【００４８】
さらなる処方物においては、従来の調製物（例えば、以下に記載される従来の調製物）が使用され得る。
【００４９】
水性の懸濁物は、薬学的に受容可能な賦形剤（懸濁剤（例えば、メチルセルロース）；および湿潤剤（例えば、レシチン、リゾレシチン、または長鎖の脂肪アルコール）を含む）と組合せて、有効成分を含有し得る。上記の水性の懸濁物はまた、保存料、着色料、矯味矯臭剤、甘味料などを、産業的な基準に従って含有し得る。
【００５０】
局所的および局部での適用のための調製物は、エアゾールスプレー、ローション、ゲル、および軟膏を、低級脂肪族アルコール、ポリグリコール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、脂肪酸のエステル、油、および脂肪）、ならびにシリコーンを含み得る、薬学的に適切なビヒクル中に含有する。調製物はさらに、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはトコフェロール）および保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル）を含有し得る。
【００５１】
非経口調製物は、特に、無菌の、または滅菌された生成物を含有する。活性な化合物および任意の周知の注射可能なキャリアを含有している注射可能な組成物が、提供され得る。これらは、浸透圧を調節するための塩を含有し得る。
【００５２】
所望される場合は、骨形成性の薬剤は、種々の病理学的状態の処置における使用のためのリポソームを調製する報告された方法の任意のものによって、リポソーム中に取り込まれ得る。本発明の組成物は、マクロファージ、単球、ならびにリポソーム組成物を取り込む他の細胞および組織および器官に対して、これらの化合物を指向させるために、リポソーム中に取り込まれた上記の化合物を利用し得る。本発明のリポソームに取り込まれた化合物は、より少ない用量の化合物の効率的な使用を可能にするために、非経口投与によって利用され得る。リガンドはまた、リポソームの特異性に対してさらに焦点を合わせるために取り込まれ得る。
【００５３】
適切な従来のリポソーム調製方法として以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｂａｎｇｈａｍ，Ａ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６５）２３：２３８−２５２、Ｏｌｓｏｎ，Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９７９）５５７：９−２３、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８、Ｋｉｍ，Ｓ．ら、Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９８３）７２８：３３９：３４８、およびＭａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９８６）８５８：１６１−１６８によって開示されている方法。
【００５４】
リポソームは、天然の供給源（例えば、卵、植物、または動物の供給源）に由来するリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルイノシトールなど）を含めた、従来の合成また天然のリン脂質リポソーム材料の任意のものと組合せた本発明の化合物から作製され得る。また使用され得る合成のリン脂質として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリン、および対応する合成のホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルグリセロール。コレステロールまたは他のステロール、コレステロールヘミスクシネート、糖脂質、セレブロシド、脂肪酸、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ならびに他の陽イオン性脂質が、当業者に公知であるように、リポソーム中に取り込まれ得る。リポソーム中で使用されるリン脂質および添加物の相対的な量は、所望される場合、変更され得る。好ましい範囲は、リン脂質の約６０から９０モルパーセントまでであり；コレステロール、コレステロールヘミスクシネート、脂肪酸、または陽イオン性脂質が、０から５０モルパーセントの範囲の量で使用され得る。リポソームの脂質層中に取り込まれる本発明の化合物の量は、約０．０１から約５０モルパーセントまでの範囲の脂質の濃度で変更され得る。
【００５５】
上記の処方物を有するリポソームは、モノクローナル抗体または標的について特異的な他のリガンドの取り込みによって、それらの意図される標的についてなおよりさらに特異的にされ得る。例えば、ＢＭＰレセプターに対するモノクローナル抗体が、Ｌｅｓｅｒｍａｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８８：６０２−６０４の方法によってリポソーム中に取り込まれたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）への連結によって、リポソーム中に取り込まれ得る。
【００５６】
開示される化合物の獣医学的使用もまた、上記に示されるように意図される。このような使用は、家畜動物、家畜、およびサラブレッドのウマの毛または柔毛に関連している骨または軟骨の不全または欠損の処置を含む。
【００５７】
本発明の化合物は、インビトロまたはエキソビボのいずれかで、骨を形成する細胞またはそれらの前駆体の増殖を刺激するために、あるいは骨を形成する細胞の前駆体の分化を誘導するために、使用され得る。本明細書中に記載される化合物はまた、標的組織または標的器官の環境を、骨を形成する細胞をこのような細胞を必要としている環境に対して誘引するように改変し得る。本明細書中で使用される場合は、用語「前駆体細胞」は、分化の経路が拘束されているが、一般的には、成熟した完全に分化した細胞としてのマーカーも機能も発現していない細胞をいう。本明細書中で使用される場合は、用語「間葉細胞」または「間葉幹細胞」は、何回も分裂し得、そしてその子孫が骨格組織（軟骨、骨、腱、靭帯、骨髄支質、および結合組織を含む）を生じる多能性の前駆細胞をいう（Ａ．Ｃａｐｌａｎ，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．（１９９１）９：６４１−５０を参照のこと）。本明細書中で使用される場合は、用語「骨形成性細胞」は、骨芽細胞および骨芽細胞の前駆体細胞を含む。より詳細には、開示される化合物は、骨髄の間葉細胞を含有している細胞集団を刺激し、それによってその細胞集団中の骨形成性細胞の数を増大させるために有用である。好ましい方法においては、造血細胞は、細胞の集団から、開示される化合物での刺激の前または後のいずれかに採取される。このような方法の実施を通じて、骨形成性細胞は増大し得る。増大した骨形成性細胞は、それを必要としている脊椎動物被験体中に注入（または再注入）され得る。例えば、被験体自身の間葉幹細胞が、エキソビボで本発明の化合物に対して暴露され得、そして、骨形成性細胞のさらなる増殖および／または分化が免疫拒絶を伴うことなく生じ得る、被験体の所望される部位に対して得られた骨形成性細胞が注入され得るかまたはそこに対して指向され得る。あるいは、開示される化合物に対して暴露される細胞集団は、不死化されたヒトの胎児の骨芽細胞または骨形成性細胞であり得る。このような細胞が脊椎動物の被験体中に注入されるかまたは移植される場合には、これらの非自己細胞を「免疫防御」すること、またはレシピエントを免疫抑制（好ましくは、局所的に）して、移植および骨もしくは軟骨の修復を増強することが、有利であり得る。
【００５８】
上記に記載されるように、本発明の化合物はまた、存在している毛嚢からのその形成速度を増強すること、不活性な毛嚢を刺激すること、さらなる毛嚢の産生を達成すること、または上記のいくつかの組合せによって、あるいは現在理解されていても理解されていなくてもよい任意の他の機構によってのいずれかによって、毛の成長を刺激するために使用され得る。
【００５９】
本発明の範囲内では、組成物の「有効量」は、統計学的に有意な効果を生じる量である。例えば、治療的な使用のための「有効量」は、骨折の修復における治癒速度の臨床的に有意な増大；骨粗鬆症における骨の喪失の逆転；軟骨の欠損または障害の逆転；骨粗鬆症の発症の予防または遅延；骨折の偽関節および伸延骨形成における骨の形成の刺激および／または増大；補綴デバイス中への骨の増殖の増大および／または加速；ならびに歯の欠損の修復を提供するために必要とされる、本明細書中の活性な化合物を含有している組成物の量である。毛の増殖を刺激することにおける使用のための「有効量」は、毛の長さまたは密度に関して所望される効果を提供する量である。このような有効量は、慣用的な最適化技術を使用して決定され、そして処置される特定の状態、患者の状態、投与の経路、処方物、および医師の判断、ならびに当業者に明らかである他の因子に依存する。本発明の化合物について必要とされる投与量（例えば、骨の形成の増大が所望される骨粗鬆症において）は、処置グループとコントロールグループとの間の骨の質量における統計学的に有意な差異として、証明される。骨の質量におけるこの差異は、例えば、処置グループにおける骨の質量において５〜２０％以上の増大として、見られ得る。治癒における臨床的に有意な増大の他の測定値として、例えば、破壊強度および張力についての試験、破壊強度およびねじれ率、４点屈曲、骨の生検における増大した結合性、ならびに当業者に周知の他の生体力学的な試験が挙げられ得る。処置のレジメンについての一般的な指針は、目的の疾患の動物モデルにおいて行われる実験から得られる。毛の増殖の刺激に関して良好に処置された被験体とコントロールとの間の差異は、一般的には、直接的な観察によって確認され得る。
【００６０】
本発明の化合物の投与量は、処置の必要性の程度および重篤度、投与される化合物の活性、被験体の一般的な健康状態、および当業者に周知の他の考慮要因に従って変化する。一般的には、これらは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまで、そしてより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまでの経口用量としての毎日の基準で、代表的なヒトに対して投与され得る。非経口用量は、経口用量の約２０〜１００％である。経口投与は、その状態が骨の欠損であるほとんどの例において好ましくあり得る（容易さ、患者の受容性などの理由のために）が、代替の投与方法が、選択された化合物および選択された欠損または疾患について適切であり得る。一般的には局所的な効果のみが所望される場合には、局所的な投与が毛の増殖を刺激するために好ましいが、全身的な処置もまた、いくつかの例においては好適であり得る。
【００６１】
（本発明において有用である化合物についてのアッセイ）
化合物がプロテアソーム活性を阻害する能力を評価するためのアッセイ、およびＮＦ−κＢ活性のインヒビターについてのアッセイは、当該分野で周知である。２つの代表的な（限定的ではないが）アッセイが、以下に記載される。
【００６２】
（プロテアソーム活性の評価）
プロテアソーム阻害活性は、本明細書中以下の実施例５に記載されているアッセイによって最も便利に測定される。このアッセイは、蛍光発生性のペプチド基質とともに、可能性のあるインヒビターを、２０Ｓ好熱性のプロテアソーム（これは、精製された形態で市販される）とともにインキュベートすることを含む。インヒビターの存在は、蛍光発生性のペプチドに対するプロテアソーム画分の作用によって生成される蛍光の量を減少させる。このアッセイは、Ｃｏｕｘ，Ｏ．ら、Ｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９６）６５：８０１；Ａｄａｍｓ，Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９９）５９：２６１５；およびＣｒａｉｕ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：１３４３７にさらに詳細に記載されている。さらなる報告は、Ｈｉｌｔ，Ｗ．ら、Ｔｒａｎｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（１９９６）２１：９６；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（１９９４）１９：３７７；Ｍａｕｐｉｎ−Ｆｕｒｌｏｗ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２８６１７；およびＪｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９５）８３：１２９に示されている。蛍光発生性の基質および精製されたプロテアソームは、例えば、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【００６３】
（ＮＦ−κＢ活性のアッセイ）
細胞は、種々の濃度の化合物で処理され、そして核抽出物が調製される。簡潔には、細胞は、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄され、そして溶解緩衝液（０．６％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ、およびプロテアーゼインヒビターの混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＴＭ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））中に再懸濁させられる。氷上で１５分間のインキュベーションの後、核が遠心分離によって回収される。ペレットは、核抽出緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、４２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＮｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＴＭ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、２５％のグリセロール）中に再懸濁させられ、そして４℃で３０分間インキュベートされる。上清が回収され、そして１０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および２０％のグリセロールを含有している緩衝液中で透析される。透析後、核抽出物は、沈殿したタンパク質を除去するために遠心分離され、そしてアリコートが、−７０Ｃで保存される。核抽出物中のタンパク質濃度は、色素結合アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄの方法によって測定される。
【００６４】
電気泳動移動度シフトアッセイのためのプローブは、ＮＦ−κＢに特異的なコンセンサス配列を含有している、３２Ｐで標識された二本鎖のオリゴヌクレオチドである（Ｐｒｏｍｅｇａ）。核抽出物（５μｇ）は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、４％のグリセロール、および５μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）を含有している２０ｕｌの反応混合物中で予めインキュベートされる。室温で１０分後、１０〜２０ｆｍｏｌのプローブが添加され、そしてさらに２０分間インキュベートされる。ＤＮＡ−タンパク質複合体が、５％のポリアクリルアミド／０．５×ＴＢＥゲル（４５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４５ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）上で遊離のオリゴヌクレオチドから分離される。電気泳動後、ゲルが乾燥させられ、そしてオートラジオグラフに供される。
【００６５】
（産生の阻害についてのアッセイ）
プロテアソーム活性を有している酵素の産生を阻害する化合物またはＮＦ−κＢの産生を阻害する化合物が、候補の化合物の存在下および非存在下でのこれらのタンパク質の産生のレベルを測定することによって評価され得る。産生のレベルは、例えば、産生されたタンパク質のレベルについてのイムノアッセイを使用して、インビトロのシステムで容易に測定され得る。このようなタンパク質のレベルはまた、例えば、評価される細胞中のタンパク質のメチオニン標識およびサイズ分離を利用することによって、評価され得る。測定のために便利なレベルのタンパク質の産生を達成するためには、実質的な量が産生されるように関連する酵素またはＮＦ−κＢについての組換え発現システムを使用することが有利である。
【００６６】
ＮＦ−κＢまたはプロテアソーム酵素の産生を阻害するための代表的なアプローチとして、アンチセンス技術の使用、またはこの遺伝子の発現に関係している二本鎖形態のヌクレオチド配列との三重鎖の形成が挙げられる。さらに、種々の低分子もまた、この産生を阻害し得る。
【００６７】
（スクリーニングアッセイ−骨）
本発明の方法において使用される化合物の骨形成性の活性は、インビトロでのスクリーニング技術（例えば、骨の形態形成タンパク質に関係しているプロモーターに結合させられたレポーター遺伝子の転写の評価）を使用して、または代替のアッセイにおいて確認され得る。
【００６８】
（ＡＢＡスクリーニングアッセイ）
骨の形成を刺激する化合物がＢＭＰプロモーター（内因的に産生される骨の形態形成因子の産生の代用物）に連結されたレポーター遺伝子の発現を刺激し得ることの実証による、骨の形成を刺激する化合物についての迅速なスループットスクリーニング試験が、１９９５年６月２日に出願された米国出願第０８／４５８，４３４号に記載されている。その全ての内容は、本明細書中で参考として援用されている。このアッセイはまた、Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｅｒｙ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１３７：３３１−３９の、不死化されたマウスの骨芽細胞（Ｔ−抗原の発現を駆動するＢＭＰ２プロモーターを含むトランスジーンを発現するマウスに由来する）の研究の一部として記載されている。この研究においては、不死化された細胞は、マウスのＢＭＰ２プロモーター（−２７３６／１１４ｂｐ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有しているプラスミドで安定にトランスフェクトされ、そして組換えのヒトのＢＭＰ２に対して用量依存性の様式で応答した。
【００６９】
簡潔には、このアッセイは、骨の形態形成タンパク質（特に、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４）のプロモーターがレポーター遺伝子（代表的には、ルシフェラーゼ）に対して結合されている構築物で、永久にまたは一時的に形質転換された細胞を利用する。これらの形質転換された細胞は、次いで、レポーター遺伝子の産物の産生について評価される；ＢＭＰプロモーターを活性化する化合物は、レポータータンパク質の産生を駆動する。これは、容易にアッセイされ得る。数千もの化合物が、この迅速なスクリーニング技術に供されており、そしてごくわずかな割合のものだけが、ビヒクルによって産生されるよりも５倍多いレベルのレポーター遺伝子の発現を誘発し得る。ＢＭＰプロモーターを活性化する化合物は、それぞれのグループのメンバーが、不活性な化合物中には存在しない特定の構造的な特徴を共有するグループに分けられる。活性な化合物（「ＢＭＰプロモーター−活性化合物」または「活性な化合物」）は、骨または軟骨の増殖を促進することにおいて有用であり、従って、骨または軟骨の増殖を必要としている脊椎動物の処置において有用である。
【００７０】
ＢＭＰプロモーター−活性化合物は、特異性および毒性を試験する種々の他のアッセイにおいて試験され得る。例えば、非ＢＭＰプロモーターまたは応答エレメントが、レポーター遺伝子に対して連結され得、そして適切な宿主細胞中に挿入され得る。細胞傷害性は、例えば、ＢＭＰプロモーター−および／または非ＢＭＰプロモーター−レポーター遺伝子を含有している細胞の、可視的なまたは顕微鏡による試験によって決定され得る。あるいは、細胞による核酸および／またはタンパク質の合成がモニターされ得る。インビボでのアッセイについては、組織が採取され得、そして可視的にまたは顕微鏡によって試験され得、そして必要に応じて、組織学的な試験を容易にする色素または染料と組合せて試験され得る。インビボでのアッセイ結果を評価することにおいては、従来の医学的な化学／動物モデル技術を使用して、試験化合物の生体分布を試験することもまた有用であり得る。
【００７１】
（新生児のマウスの頭蓋冠アッセイ（インビトロ））
骨の再吸収または骨の形成についてのアッセイは、Ｇｏｗｅｎ  Ｍ．およびＭｕｎｄｙ  Ｇ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８６）１３６：２４７８−８２によって記載されているものと同様である。簡潔には、誕生の４日後、ＩＣＲ  Ｓｗｉｓｓ白色マウスの子供の前頭骨および頭頂骨が顕微解剖によって採取され、そして矢状縫合にそって分離される。再吸収についてのアッセイにおいては、骨は、ＢＧＪｂ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）および０．０２％（またはそれよりも低い濃度）のβ−メチルシクロデキストリン中でインキュベートされる。ここでは、培地は、試験基質またはコントロール基質をもまた含む。アッセイが骨の形成を評価するために行われる場合には、使用される培地は、６μｇ／ｍｌのインシュリン、６μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸、それぞれ、１．２５および３．０ｍＭのカルシウムおよびリン酸濃度が補充された、ＦｉｔｔｏｎおよびＪａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＢＧＪ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）であり、そして１００μｇ／ｍｌの濃度までのアスコルビン酸が２日ごとに添加される。インキュベーションは、３７℃で、５％のＣＯ２および９５％の空気の加湿大気中で、９６時間行われる。
【００７２】
この後、骨はインキュベーション培地から取り出され、そして１０％の緩衝化ホルマリン中で２４から４８時間固定され、１４％のＥＤＴＡ中で１週間、鉱物質除去され、段階的なアルコールによって処理され；そしてパラフィンろう中に包埋される。頭蓋冠の３μｍの切片が調製される。代表的な切片が、骨の形成または骨の再吸収の組織形態学的な評価のために選択される。骨の変化は、２００μｍ離れて切断された切片について測定される。骨芽細胞および破骨細胞が、それらの特徴的な形態によって同定される。
【００７３】
他の補助的なアッセイが、試験化合物の非ＢＭＰプロモーター媒介効果を決定するためのコントロールとして使用され得る。例えば、有糸分裂促進活性が、プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子として血清応答エレメント（ＳＲＥ）を特徴とするスクリーニングアッセイを使用して測定され得る。より詳細には、これらのスクリーニングアッセイは、ＳＲＥによって媒介される経路（例えば、プロテインキナーゼＣ経路）を通じたシグナル伝達を検出し得る。例えば、骨芽細胞活性化因子ＳＲＥルシフェラーゼスクリーニング、およびインシュリン模倣物ＳＲＥ−ルシフェラーゼスクリーニングが、この目的のために有用である。同様に、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）によって媒介される経路の試験化合物刺激もまた、アッセイされ得る。例えば、ＰＴＨおよびカルシトニン（２つの骨活性因子）のレセプターでトランスフェクトされた細胞は、上昇したｃＡＭＰレベルを検出するためのＣＲＥ−ルシフェラーゼスクリーニングにおいて使用され得る。従って、試験化合物のＢＭＰプロモーターの特異性は、これらのタイプの補助的なアッセイの使用を通じて試験され得る。
【００７４】
（マウスの頭蓋冠の骨の増殖に対する化合物の影響のインビボでのアッセイ）
雄性のＩＣＲ  Ｓｗｉｓｓ白色マウス（４〜６週齢、および体重１３〜２６ｇ）が、１つのグループあたり４〜５匹のマウスを使用して、使用される。頭蓋冠の骨の増殖のアッセイは、本明細書中で参考として援用されている、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２４２１１号に記載されているように行われる。簡潔には、試験化合物または適切なコントロールビヒクルが、正常なマウスの右側の頭蓋冠の上の皮下組織中に注入される。代表的には、コントロールビヒクルは、化合物が可溶化されたビヒクルであり、そして５％のＤＭＳＯを含有しているＰＢＳまたはＴｗｅｅｎ（２μｌ／１０ｍｌ）を含有しているＰＢＳである。動物は、１４日目に屠殺され、そして骨の増殖が、組織形態計測によって測定される。定量のための骨のサンプルは、隣接している組織をきれいに除去され、そして１０％の緩衝化ホルマリン中で２４から４８時間の間固定され、１４％のＥＤＴＡ中で１〜３週間の間鉱物質除去され、段階的なアルコールを通じて処理され；そしてパラフィンろう中に包埋される。３〜５μｍの頭蓋冠の切片が調製され、そして代表的な切片が、骨の形成および骨の再吸収に対する効果の組織形態測定による評価のために選択される。切片は、デジタル化プレート上に顕微鏡の画像を直接トレースするためのカメラルシダアタッチメントを使用して、測定される。骨の変化が、注射された側の頭蓋冠および注射されていない側の頭蓋冠の両方について、４つの隣接している１×１ｍｍの視野にわたって、２００μｍ離れて切断された切片について測定される。新しい骨は、その特徴的な織構造によって同定され、そして破骨細胞および骨芽細胞が、それらの特有の形態によって同定される。組織形態測定ソフトウェア（ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ、Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ａｔｌａｎｔａ）が、デジタル入力を処理して細胞数を決定するために、そして面積または全周を測定するために使用される。
【００７５】
試験のための代表的な処置レジメは、数日間の繰り返される投与にわたって試験される化合物の適用を利用する。
【００７６】
（さらなるインビボでのアッセイ−骨）
リード化合物が、さらに、インビボでの用量アッセイを使用して完全な動物中で試験され得る。試験的な用量が、皮下、腹膜内、または経口投与によって達成され得、そして注射、徐放、または他の送達技術によって行われ得る。試験化合物の投与のための時間は、変化し得る（例えば、２８日、および３５日が適切であり得る）。例として、インビボでの経口または皮下の用量アッセイが以下のように行われ得る：  代表的な研究においては、７０匹の３ヶ月齢の雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、体重が合わせられ、そして７つのグループに分けられる。それぞれのグループは１０匹の動物を有する。これは、研究の最初に屠殺される動物のベースラインコントロールのグループ；ビヒクルのみを投与されるコントロールのグループ；ＰＢＳで処置されるコントロールのグループ；および骨の成長を促進することが公知の化合物（非タンパク質またはタンパク質）を投与されるポジティブコントロールのグループを含む。試験される化合物の３種の投与量レベルが、残る３つのグループに対して投与される。
【００７７】
簡潔には、試験化合物、ポジティブコントロールの化合物、ＰＢＳ、またはビヒクルのみが、３５日間の間１日に１回皮下投与される。全ての動物が、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）を、屠殺の９日前および２日前に注射される（カルセインの２回の注射が、それぞれ示される日に投与される）。毎週、体重が測定される。３５日のサイクルの終わりに、動物が体重測定され、そして眼窩または心臓の穿刺によって採血される。血清のカルシウム、リン酸、オステオカルシン、およびＣＢＣが測定される。両足の骨（前足および後足）ならびに腰椎が採取され、接着している軟らかい組織が洗い流され、そして周辺の定量的なコンピューター化されたトポロジー（ｐＱＣＴ；Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｊ．，Ｂｏｎｅ（１９９５）１７：３５３Ｓ−６４Ｓ）、二相エネルギーＸ線光吸収分析（ＤＥＸＡ；Ｌａｖａｌ−Ｊｅａｎｔｅｔ  Ａ．ら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｌ（１９９５）５６：１４−１８；Ｊ．Ｃａｓｅｚら、Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ（１９９４）２６：６１−６８）、および／または組織形態計測によって行われるように、評価のために７０％のエタノール中で保存される。これにより、骨再構築における試験化合物の効果が評価され得る。
【００７８】
リード化合物はまた、インビボでの用量アッセイを使用して、緊急に卵巣切除された動物中（予防モデル）で、試験され得る。このようなアッセイはまた、コントロールとしてエストロゲンで処置されたグループを含み得る。例示的な皮下での用量アッセイは、以下のように行われる：  代表的な研究においては、８０匹の３ヶ月齢の雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、体重が合わせられ、そして８つのグループに分けられる。それぞれのグループは１０匹の動物を有する。これは、研究の最初に屠殺される動物のベースラインコントロールのグループ；３つのコントロールのグループ（擬似卵巣切除された（擬似ＯＶＸ）＋ビヒクルのみ；卵巣切除された（ＯＶＸ）＋ビヒクルのみ；ＰＢＳで処置したＯＶＸ）；およびコントロールのＯＶＸグループ（これは、骨の成長を促進することが公知の化合物を投与される）を含む。試験される化合物の３種の投与量レベルが、ＯＶＸ動物の残る３つのグループに対して投与される。
【００７９】
卵巣切除（ＯＶＸ）は、過食症を導くので、全てのＯＶＸ動物は、３５日の研究の間を通じて、擬似ＯＶＸ動物と対で餌を与えられる。簡潔には、試験化合物、ポジティブコントロールの化合物、ＰＢＳ、またはビヒクルのみが、３５日間の間１日に１回、経口または皮下投与される。あるいは、試験化合物は、３５日間にわたって移植される移植可能なペレット中に処方され得るか、または胃管栄養法による強制栄養のような経口的な投与であり得る。全ての動物（擬似ＯＶＸ／ビヒクルおよびＯＶＸ／ビヒクルグループを含む）が、カルセインを、屠殺の９日前および２日前に腹腔内に注射される（新しく形成された骨の適切な標識を確実にするために、カルセインの２回の注射が、それぞれ示される日に投与される）。毎週、体重が測定される。３５日のサイクルの終わりに、動物の血液および組織が、上記に記載されるように処理される。
【００８０】
リード化合物はまた、慢性的なＯＶＸ動物（処置モデル）においても試験され得る。同化作用の試薬の効率を評価するために使用され得る卵巣切除された動物中での確立された骨の欠損の処置のための例示的なプロトコールが、以下のように行われ得る。簡潔には、８０から１００匹の６ヶ月齢の雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、０日で擬似外科手術（擬似ＯＶＸ）または卵巣切除（ＯＶＸ）に供され、そして１０匹のラットが、ベースラインコントロールとして提供するために屠殺される。体重が、実験の間、毎週記録される。約６週間（４２日）またはさらなる骨の喪失の後、１０匹の擬似ＯＶＸおよび１０匹のＯＶＸラットが、喪失期間のコントロールとしての屠殺のためにランダムに選択される。残りの動物のうちの１０匹の擬似ＯＶＸおよび１０匹のＯＶＸラットが、偽薬処置コントロールとして使用される。残りのＯＶＸ動物が、５週間（３５日）の期間の間、試験薬物の３から５用量で処置される。ポジティブコントロールとして、ＯＶＸラットのグループを、このモデルにおいて、公知の同化作用試薬であるＰＴＨのような試薬で処置し得る（Ｋｉｍｍｅｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１３２：１５７７−８４）。骨の形成に対する効果を決定するために、以下の手順が行われ得る。大腿骨脛骨および腰椎１から４が切除されそして回収される。近位の左および右の脛骨が、ｐＱＣＴ測定、海綿上の骨の鉱物密度（ＢＭＤ）（重量の決定）、および組織学のために使用されるが、それぞれの脛骨のミッドシャフト（ｍｉｄｓｈａｆｔ）は、皮質のＢＭＤまたは組織学に供される。大腿骨は、生体力学的な試験の前のミッドシフトのｐＱＣＴスキャンのために調製される。腰椎（ＬＶ）に関して、ＬＶ２は、ＢＭＤのために処理される（ｐＱＣＴもまた、行われ得る）；ＬＶ３は、石灰化する前の骨の組織学のために調製される；そしてＬＶ４は、力学的な試験のために処理される。
【００８１】
（毛の成長についてのアッセイ）  本発明の組成物の、毛の成長を刺激する能力は、驚くべきことに、骨の成長を刺激するそれらの能力を評価する経過において発見された。従って、下記の記載は、これらの化合物の毛の成長を刺激する能力の発見を導く骨の成長アッセイである。
【００８２】
（毛包の増殖および毛の成長に対する化合物の影響のインビボでのアッセイ）  頭蓋冠骨の成長に対する化合物の効果を評価するための上記のアッセイはまた、毛の成長を刺激する化合物の能力を評価するためにも使用され得る。試験化合物または適切なコントロールビヒクルは、局所的または皮下注射のいずれかで、雄性のＩＣＲ  Ｓｗｉｓｓ白色マウスの背中の上部および下部に適用される。ビヒクルは、試験される化合物についておよび投与の経路について適切である場合に、選択される。必要に応じて、試験部分の毛が、投与の前の除去される。適切な間隔（代表的には、７日）の後、マウスは、麻酔され、そして背中の処置部分の生検が、６ｍｍの皮膚のパッチを使用して行われる。標本は、１０％の緩衝化ホルマリン中に固定され、そしてパラフィンワックス中に包埋され、そして切片にされ、そして毛包を観察するために染色される。さらに、写真撮影が、毛の成長を観察しそして記録するために使用される；代表的には、このような成長は、１４〜１８日後に観察される。適切な間隔（代表的には、２１日）の後、動物は安楽死させられ、そして毛が繊維分析のために分析され、そして処置領域に由来する組織が、毛包の定量のために分析される。
【００８３】
さらなる詳細においては、雄性のＩＲＣ  Ｓｗｉｓｓ白色マウス（年齢４〜６週、および体重１３〜２６ｇｍ）が、１つのグループあたり４〜５匹のマウスを使用して、使用される。頭蓋冠の骨の成長のアッセイは、上記に記載されているように行われる。簡潔には、簡潔には、試験化合物または適切なコントロールビヒクルが、正常なマウスの右側の頭蓋冠の上の皮下組織中に注入される。代表的には、コントロールビヒクルは、化合物が可溶化されるビヒクルであり、そして５％のＤＭＳＯを含有しているＰＢＳまたはＴｗｅｅｎ（２μｌ／１０ｍｌ）を含有しているＰＢＳである。動物は、１４日目に屠殺され、そして骨の成長が、組織形態計測によって測定される。定量のための骨のサンプルは、隣接している組織からきれいに除去され、そして１０％の緩衝化ホルマリン中で２４から４８時間の間固定され、１４％のＥＤＴＡ中で１〜３週間の間脱石灰化させられ、段階的なアルコールを介して処理され；そしてパラフィンワックス中に包埋される。３〜５μｍの頭蓋冠の切片が調製され、そして代表的な切片が、骨の形成および骨の再吸収に対する効果の組織形態測定による評価のために選択される。切片は、デジタル化プレート上に顕微鏡の画像を直接トレースするためのカメラルシダアタッチメントを使用して、測定される。骨の変化が、頭蓋冠の注射された部分と注射されていない部分の両方について、４つの隣接している１×１ｍｍの領域にわたって、２００μｍ離れた切片の断片上で測定される。新しい骨は、その特徴的な織構造によって同定され、そして破骨細胞および骨芽細胞が、それらの異なる形態学によって同定される。組織形態測定ソフトウェア（ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ、Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ａｔｌａｎｔａ）が、細胞数を決定するために、そして面積または周辺の長さを測定するために、入力をデジタル処理するために使用される。
【００８４】
試験のための代表的な処置レジメは、数日間の繰り返される投与にわたって試験される化合物の適用を利用する。
【００８５】
（本発明において有用である化合物の性質）
本発明の方法および組成物において有用である化合物は、プロテアソーム活性のインヒビター、転写因子ＮＦ−κＢのインヒビター（好ましくは、両方）である。これらの活性の公知のインヒビターは、文献から確定され得るか、または複数の化合物が、当該分野で公知のアッセイを使用してこれらの活性について試験され得る。さらに、プロテアソーム活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列またはＮＦ−κＢをコードするヌクレオチド配列の効率的な発現のレベルを低下させるインヒビターが評価され得、そして本発明の方法において使用され得る。
【００８６】
しかし、本発明の方法に従って使用される、このように同定された化合物は、それが骨の欠損を処置することに関係する場合には、好ましくは、イソプレノイド経路を阻害する化合物（例えば、スタチン）は含まない。これらの記載は、第ＷＯ９８／２５４６０号および米国特許出願番号第０９／０９６，６３１号において見出され得る化合物を除く。これらの両方が上記に記載され、そして本明細書中で参考として援用されている。簡単に、イソプレノイド経路は、図１において本明細書中で示されるように参照される。インヒビターである化合物の１つのクラスは、以下の化学式を有するスタチンである：
【００８７】
【化１６】
2011195590.tif 000017
ここでは、式（１）および式（２）のそれぞれにおいてＸは、２〜６Ｃの、置換されたかもしくは置換されていないアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンリンカーを示す；
Ｙは、１つ以上の炭素環式環またはヘテロ環式環を示し、ここで、Ｙが２つ以上の環を含む場合は、上記の環は縮合され得る；そして
Ｒ’は、陽イオン、Ｈ、または１〜６Ｃの置換されたかもしくは置換されていないアルキル基を示す；
そして、点線は、任意のπ結合を示す。
【００８８】
しかし、これらの化合物は、それが毛の成長の刺激に関係している場合には、本発明の方法において使用され得る。
【００８９】
プロテアソームまたはＮＦ−κＢインヒビターとして公知の化合物として、以下が挙げられる：
【００９０】
【表１Ａ】
2011195590.tif 000018
2011195590.tif 000019
例えば、Ｖｉｎｉｔｓｋｙ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：２９８６０−２９８６６；Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ−Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９４）６３：１５７８−１５８１；Ｗｏｊｃｉｋ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９６）７１：３１１−３１８を参照のこと。
【００９１】
上記のリストにおいては、ラクタシスチンは、プロテアソーム活性の不可逆的なインヒビターであることが公知である。これは、β触媒サブユニットに結合し、そして２０Ｓプロテアソームの特異的なインヒビターである。これもまた、ＮＦ−κＢを不可逆的に阻害する。
【００９２】
ＳＮ５０は、ｐ５０のＮＬＳ（核局在化配列）およびＫ−ＦＧＦの疎水性領域である。これは、ＮＦ−κＢ活性複合体の核への転移を阻害する。
【００９３】
特定のペプチジルエポキシケトン（例えば、ＥＳＴ）およびＰＳＩのエポキシドは、プロテアソームの不可逆的なインヒビターである。
【００９４】
特定の有用なエポキシケトンは、エポキソマイシンであり、これは、その構造が上記の表中に示される天然の産物である。これは、２０Ｓプロテアソームの少なくとも４個の触媒サブユニットを、共有的に改変することが示されている、プロテアソームの、高度に特異的でありそして不可逆的なインヒビターであるようである。これは、カテプシンＢ、パパイン、キモトリプシン、またはカルパインのような非プロテアソームプロテアーゼを、５０μＭまでの濃度で阻害することはないようである。エポキソマイシンもまた、インビトロで有効にＮＦ−κＢを活性化する。エポキソマイシンの合成は、Ｓｉｎ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９９９）９：２２８３−２２８８によって記載されている。
【００９５】
ＭＧ−１３２は、そのＡＴＰａｓｅまたはイソペプチダーゼ活性に影響を与えることなく、２０Ｓタンパク質のキモトリプシン活性に対して活性を示し、そしてＮＦ−κＢ活性を不可逆的に阻害する。ＭＧ−１１５およびＭＧ−３４１は、ＭＧ−１３２に対して同様の活性を示す。種々の他のＮＦ−κＢのインヒビターが、ＡＢＡアッセイにおいて少ない程度に活性である。これらとして、カプサイシン、クルクミン、およびレシニフェラトキシン（ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａｔｏｘｉｎ）が挙げられる。ＮＦ−κＢを阻害することが公知である他の化合物は、淋菌毒素およびＰＤＴＣ（１−ピロリジンカルボチオン酸（１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ  ｃａｒｂｏｔｈｉｏｔｉｃ  ａｃｉｄ））である。種々の他の化合物（例えば、ＢＡＹ−１１−７０８２およびＢＡＹ−１１−７０８５、ならびにカリクリン−Ａ）は、ＮＦ−κＢのリン酸化を阻害する。カルパインインヒビターは、カルパインおよびプロテアソームを阻害する；他の化合物（例えば、オロムチン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）およびロスコビチン（ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ））は、ｃｄｋ２および／またはｃｄｋ５を阻害する。
【００９６】
プロテアソームインヒビターであることが示されているさらなる化合物は、ペントキシフィリン（ＰＴＸ）である。Ｃｏｍｂａｒｅｔ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ（１９９９）２６：９５−１０１。これは、上記のインビトロでの頭蓋冠アッセイにおいて活性である。
【００９７】
上記に示されるように、本発明の方法の好ましい実施態様においては、骨の障害の処置において使用される同定された化合物は、代表的には、図１に示されるような、スタチンおよびイソプレノイド経路を阻害する他の化合物以外である。他の好ましい実施態様においては、本明細書中で引用されそして本明細書中で参考として援用されている、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／１７２６７号、同第ＷＯ９７／１５３０８号、および同第ＷＯ９７／４８６９４号に記載される化合物は、本発明の骨の障害の処置の方法における使用から除外される。しかし、これらの化合物の、本発明に従う毛の成長を刺激するための方法における使用は排除されない。
【００９８】
脊椎動物中の病理学的な歯の状態または退行性の関節の状態を処置するための方法および薬学的組成物において使用され得る、１つの特定の型の化合物は、プロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する化合物である。任意の公知のキモトリプシン様活性のインヒビターが使用され得る。例えば、使用される化合物は、「ヘッド部分（ｗａｒｈｅａｄ）」、すなわち、官能基を有し得、これは、プロテアソームのキモトリプシン様部位と反応する。例示的な「ヘッド部分」として、プロテアソームのキモトリプシン様触媒部位のスレオニン残基でモルホリノ環を形成し得るエポキシド（Ｅｌｏｆｓｓｏｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６：８１１−８２２（１９９９）；およびＧｒｏｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２３７−１２３８（２０００））、または−Ｂ（ＯＲ）２基、−Ｓ（ＯＲ）２基、もしくは−ＳＯＯＲ基（ここで、Ｒは、Ｈ、アルキル（Ｃ１〜６）、またはアリール（Ｃ１〜６）である）のようなキモトリプシン様活性の活性部位と不可逆的に反応し得る基が挙げられる。１つの特異的な実施態様においては、使用される化合物は、上記に記載される「ヘッド部分」を有している、ペプチドまたはそのアナログである。好ましくは、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸を有する。
【００９９】
使用され得るキモトリプシン様活性のインヒビターの１つの例は、ペプチドα’，β’−エポキシケトンである。ペプチドの長さは３であり得るが、好ましくは、少なくとも４アミノ酸である。ペプチドα’，β’−エポキシケトンのＣ末端のアミノ酸は、好ましくは、ロイシンまたはフェニルアラニンのような疎水性のアミノ酸である。より好ましくは、使用されるペプチドα’，β’−エポキシケトンは、以下の化学式を有する：
【０１００】
【化１７】
2011195590.tif 000020
ここでは、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲは、別々に、例えば、以下である：
【０１０１】
【化１８】
2011195590.tif 000021
好ましくは、ペプチドα’、β’−エポキシケトンは、以下の立体構造を有する：
【０１０２】
【化１９】
2011195590.tif 000022
上記の式を有する例示的な化合物においては、式Ｒ２およびＲ３は、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはフェニルアラニンである側鎖を有し、そしてこれらは以下を含む：
【０１０３】
【化２０】
2011195590.tif 000023
使用され得るペプチドα’，β’−エポキシケトンの別の例は、以下の化学式を有する：
【０１０４】
【化２１】
2011195590.tif 000024
ここでは、Ｒは、例えば、以下であり得る：
【０１０５】
【化２２】
2011195590.tif 000025
好ましくは、ペプチドα’、β’−エポキシケトンは、以下の立体構造を有する：
【０１０６】
【化２３】
2011195590.tif 000026
より好ましくは、使用されるペプチドα’、β’−エポキシケトンは以下である：
【０１０７】
【化２４】
2011195590.tif 000027
使用され得るプロテアソームインヒビターのなお別の例は、以下の化学式を有する：
【０１０８】
【化２５】
2011195590.tif 000028
ここでは、ヘッド部分は、プロテアソームの触媒性のキモトリプシン部位と不可逆的に反応する；
Ａは、別々に、ＣＯ−ＮＨまたはその同配体である；
Ｒは、別々に、ヒドロカルビルである；
Ｘは、極性の基である；そして
ｎ＝０〜２。
【０１０９】
必要に応じて、Ｒ基は、ハロ基、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、＝Ｏ、−ＣＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＯ２、−ＣＮ、または−ＣＦ３のような置換された基を含み得る。また必要に応じて、Ｘは、保護された基であり得る。
【０１１０】
あるいは、以下の化合物もまた使用され得る：
【０１１１】
【化２６】
2011195590.tif 000029
、エポキソマイシン、ＰＳ−３４１、ＮＬＶＳ、ラクタシスチン、ＰＴＸ、またはペプチジルアルデヒド。ＰＳＩのエポキシドが特に好ましい。
【０１１２】
さらに、米国特許第５，７８０，４５４号（その全体において本明細書中で参考として援用されている）に開示されているプロテアソームインヒビターが、使用され得る。詳細には、式（１ｂ）または（２ｂ）を有しているプロテアソームインヒビター（米国特許第５，７８０，４５４号に開示されている）が、使用され得る。
【０１１３】
プロテアソームのトリプシン様またはＰＧＰＨ活性を阻害する化合物が、哺乳動物の被験体中での毛の成長を刺激する方法および薬学的組成物において使用され得る。好ましくは、使用される化合物は、ラクタシスチンまたはペプチジルアルデヒドである。
【０１１４】
脊椎動物における病理学的な歯の状態または退行性の関節の状態を処置するための、または哺乳動物の被験体における毛の成長を刺激するための、本発明の方法および薬学的組成物において使用され得る他の化合物として、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）（Ｌｉｐｔａｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２８（７）：１３６１−９（１９９９））；およびＷａｈｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１（５）：１１６３−７４（１９９８））、およびカルパインインヒビターＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく、例示するように意図される。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１）
（ハイスループットスクリーニング）
数千の化合物を、１９９５年６月２日に提出されそして本明細書中で参考として援用されている、米国特許出願番号第０８／４５８，４３４号に示されるアッセイシステムにおいて試験する。本発明の代表的な化合物は、ポジティブな応答を生じ、一方、（無関係な）化合物の大部分は、不活性である。このスクリーニングにおいては、標準のポジティブコントロールは、以下の化学式である、化合物５９−０００８（「ＯＳ８」ともまた記載される）であった：
【０１１７】
【化２７】
2011195590.tif 000030
より詳細には、上記で参照されるＧｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１３７：３３１−３９に記載される、安定に形質転換された骨芽細胞株である、２Ｔ３−ＢＭＰ−２−ＬＵＣ細胞を使用した。この細胞を、α−ＭＥＭ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを有する１０％のＦＣＳ、および１％のグルタミン（「プレーティング培地」）を使用して培養し、そして１週間に１回、１：５に分けた。アッセイのために、細胞を、４％のＦＣＳを含有しているプレーティング培地中に再懸濁し、５×１０３細胞（５０μｌ）／ウェルの濃度でマイクロタイタープレート中にプレートし、そして５％のＣＯ２中で３７℃で２４時間インキュベートした。アッセイを開始するために、ＤＭＳＯ中の、５０μｌの試験化合物またはコントロールを、それぞれのウェルに２×濃度で添加し、その結果、最終容量は１００μｌであった。最終的な血清濃度は、２％のＦＣＳであり、そして最終的なＤＭＳＯ濃度は１％であった。化合物５９−０００８（１０μＭ）を、ポジティブコントロールとして使用した。
【０１１８】
処理した細胞を、３７℃で、そして５％のＣＯ２で、２４時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、そして細胞をＰＢＳで３回リンスした。過剰のＰＢＳの除去後、２５μｌの１×細胞培養物溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ１５３Ａ）をそれぞれのウェルに添加し、そして少なくとも１０分間インキュベートした。必要に応じて、プレート／サンプルを、この時点で凍結させることができる。それぞれのウェルに対して、５０μｌのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ１５２Ａ；７ｍｇのＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ基質あたり１０ｍｌのＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ緩衝液）を添加した。発光を、自動９６ウェル発光検出装置上で測定し、そして１ウェルあたりのルシフェラーゼ活性のピコグラムとして、または１マイクログラムのタンパク質あたりのルシフェラーゼ活性のピコグラムとしてのいずれかで、示した。
【０１１９】
このアッセイにおいては、化合物５９−０００８（３−フェニルアゾ−１Ｈ−４，１，２−ベンゾチアジアジン）は、約３〜１０μＭの濃度で最大である反応のパターンを示す。従って、他の試験した化合物を、種々の濃度で評価し、そしてこの結果を１０μＭで５９−０００８について得られた結果と比較する（値は１００に標準化される）。あるいは、試験される化合物の反応性を、化合物を含有していないネガティブコントロールと直接比較することができる。
【０１２０】
コントロール化合物５９−０３２８（これは、シムバスタチンである）は、良好な応答を生じる。公知のプロテアソームインヒビターであるＭＧ−１３２およびＭＧ−１１５もまた、高い活性を示す；ＭＧ−１３２は、低い濃度で有効である。ポジティブな応答もまた、ラクタシスチンを使用して得られる。しかし、淋菌毒素、オロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、ロスコビチン（ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ）、ＳＮ５０、ＰＤＴＣ、およびカプサイシンは、応答の促進は生じない。
【０１２１】
（実施例２）
（インビトロでの骨の形成）
選択された化合物および適切なコントロールを、骨の形成の活性についてインビトロ（エキソビボ）でアッセイした（「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃａｌｖａｒｉａ  Ａｓｓａｙ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」において上記に記載される）。エキソビボでの頭蓋冠の組織形態学的な評価を、ＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ骨形態計測測定プログラムを使用して、製造業者の説明書に従って行った。測定値を、標準的な点計数接眼レンズグラティキュールを用いて１０倍または２０倍のいずれかの対物レンズを使用して決定した。
【０１２２】
新しい骨の形成を、それぞれの骨（１つのグループあたり４個の骨）の３個の代表的な切片中の１つの領域において形成された新しい骨の領域を測定することによって、（１０×の対物レンズを使用して）決定した。それぞれの測定を、縫合線の末端から領域の１／２離れた場所で行った。全ての骨および古い骨の両方の面積を測定した。データは、新しい骨の面積をμｍ２で表した。
【０１２３】
実施例１の結果は、いくらか、このアッセイの結果とは不完全に相関した。コントロール化合物であるシンバスタチンは、ＭＧ−１３２およびラクタシスチンと同様に、このアッセイにおいて新しい骨の形成を示した。ＭＧ−１１５もまた、シムバスタチンのものよりも劇的ではないが、ポジティブな結果を示した。しかし、グリオトキシン（これは、実施例１のＡＢＡアッセイにおいてネガティブであるようであった）は、骨の成長を刺激する能力を実証した。残りの化合物である、オロムチン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、ロスコビチン、ＳＮ５０、ＰＤＴＣ、およびカプサイシンは、このアッセイにおいてはネガティブであるようであった。
【０１２４】
骨芽細胞の数は、点を計数することによって決定する。骨の表面および骨の両方の側面の両方に沿って並んでいる骨芽細胞の数を、２０×の対物レンズを使用して１つの領域中で計数する。データを、骨芽細胞の数／骨の表面のｍｍとして表す。
【０１２５】
アルカリホスファターゼ活性を、マウスの器官の培養の馴化培地中で、Ｍａｊｅｓｋａ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（１９７８）１１１：４６５−４６５によって記載されている方法を使用して、測定する。馴化培地を、ホスファターゼ基質１０４（Ｓｉｇｍａ）とともに２０分間、３７℃でインキュベートし、そして反応を、２ｍｌの０．１ＭのＮａＯＨを用いて停止させる。アルカリホスファターゼ活性を、ＯＤ４１０から、Ｂｅｃｋｍａｎ二重光線分光光度測定装置中で４１０ｎｍの光学密度で切断された基質を測定することによって計算し、そしてタンパク質濃度について補正する。
【０１２６】
ＰＳＩおよびＭＧ−１３２、ならびにコントロール化合物／因子ｂＦＧＦおよびＢＭＰ−２、ならびにビヒクルコントロールをこのアッセイにおいて試験し、そして頭蓋冠を、上記に記載されるように組織形態学的に分析した。濃度の関数としての骨の面積における増大；骨芽細胞における増大、およびＰＳＩについてのアルカリホスファターゼ活性の増強を、測定した。
【０１２７】
データは、ＰＳＩが、骨の形成を誘導することにおいて、ＢＭＰ−２およびｂＦＧＦ（骨の成長についての２つの「金標準」試薬；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ（１９９２）３２：１６０−６７；ＷＯ９５／２４２１１を参照のこと）と同様に良好であるかまたはそれらよりも良好であることを示す。
【０１２８】
さらなる実験は、ペントキシフィリン（ＰＴＸ）を、上記のアッセイにおいて試験した。これによって、０．１μｍ程度の低い濃度で新しい骨の形成を増強する能力を示した。１０μｍの濃度では、ＰＴＸは、新しい骨がコントロールよりも１００％上回って増強することを明らかにした；１００μｍでは、増大は、コントロールの約３倍であった。
【０１２９】
（実施例３）
（インビボでの頭蓋冠の骨の成長のデータ）
ＰＳＩおよびＭＧ−１３２を、以前に記載される手順に従ってインビボでアッセイした（「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃａｌｖａｒｉａｌ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ」、前出を参照のこと）。コントロールとして、シムバスタチンは、骨芽細胞の数において１．５倍の増大を提供した。
【０１３０】
１つの実験において、ビヒクルコントロールであるｂＦＧＦおよびＰＳＩの種々の容量を、インビボでの頭蓋冠の骨の成長のアッセイにおいて試験した。結果を、以下に示すように、全ての骨の面積の測定、ビヒクルコントロールを上回る面積の増大の％、および新しい骨の広さにおける増大の％として報告する。
【０１３１】
【表２Ａ】
2011195590.tif 000031
さらに、組織学的な試験は、５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＳＩが使用され、そして１ｍｇ／ｋｇ／日が使用された両方の場合に、骨の成長の確認を示した。
【０１３２】
（実施例４）
（骨の形成に対する影響のまとめ）
以下の表は、上記の種々のアッセイにおいて試験した化合物について得られた結果をまとめる。プロテアソームインヒビターである化合物もまた、骨の形成を増強することが見られる。しかし、この表中の試験した化合物において、ＮＦ−κＢのみのインヒビターであるが、プロテアソーム活性を阻害することができないことが公知である化合物が、高スループットアッセイにおいてルシフェラーゼ活性（ＢＭＰ−２プロモーター活性の指標）を増強せず、そしてこれらはまた、プロテアソームインヒビターと同じ程度の大きさで、インビトロの頭蓋冠アッセイにおいて骨の形成を増強しない。
【０１３３】
本発明において有用である化合物として、以下が挙げられる：
【０１３４】
【表３Ａ】
2011195590.tif 000032
2011195590.tif 000033
2011195590.tif 000034
（実施例５）
（プロテアソーム阻害の確認）
２０Ｓ好熱性プロテアソーム活性に対する化合物の影響を試験するためのアッセイを使用した。精製した２０Ｓ好熱性プロテアソームおよび蛍光発生性ペプチド基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣは、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ．から入手可能である。簡潔には、試験するインヒビターの段階稀釈を、０．０１ｍｇ／ｍｌのプロテアソーム濃度でプロテアソーム溶液と混合した。３７℃で３０分のインキュベーション後、２５〜３０μｇ／ｍｌの最終濃度の基質溶液を添加し、そして混合物を３７℃でインキュベートし、次いで１５分間、３０分間、および６０分間、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ機器で読み取った。次いで、インヒビターの非存在下と比較して存在下での蛍光における減少の割合を、計算する。
【０１３５】
エポキソミシン、ＰＳＩ、およびＭＧ−１３２を、このアッセイで試験し、結果を以下の表１に示す。これは、未処置のコントロールと比較した、これらの化合物の種々の濃度の存在下でのプロテアソーム活性の割合を示す。
【０１３６】
【表１】
2011195590.tif 000035
見られるように、エポキソミシンおよびＰＳＩの両方が、約６０ｎＭの濃度で約５０％までプロテアソーム活性を減少させることが可能であった。さらに、プロテアソームインヒビターＩ（ＰＳＩ）は、エポキソミシンのものと同様の用量応答曲線を生じた。
【０１３７】
（実施例６）
（さらなる高スループットアッセイ）
実施例１に記載する高スループットアッセイを、エポキソミシン、ＰＳＩの活性を検するために別々の実験として、そして標準のポジティブコントロールとしてシムバスタチンを用いて行った。このアッセイの結果を表２に示す。
【０１３８】
【表２】
2011195590.tif 000036
エポキソミシンおよびＰＳＩの両方が、このアッセイにおいてシムバスタチンよりも活性であった。
【０１３９】
（実施例７）
（頭蓋冠アッセイにおけるエポキソミシンの活性）
実施例３に記載する頭蓋冠アッセイを、エポキシミシンの骨の成長を刺激する能力を試験するために行った。新しい骨の面積に関する結果を、表３に示す。見られるように、５〜１０ｎＭの濃度で、コントロールにおけるよりも有意に、さらなる骨が形成された。
【０１４０】
【表３】
2011195590.tif 000037
（実施例８）
（毛嚢の産生に対するＰＳＩおよび他のプロテアソームインヒビターの影響）
実施例３のインビボでの骨の頭蓋冠成長アッセイを、処置されたマウスの毛嚢の数を観察するために改変した。最初の観察においては、ＰＳＩ（５ｍｇ／ｋｇ／日）を、上記に記載するように、Ｓｗｉｓｓ  ＩＣＲマウスの頭蓋冠全体に５日間にわたって１日に３回注入した。１６日後にマウスを屠殺した。頭蓋冠の組織学は、コントロールのマウスに対して、ＰＳＩで処置したそれらのマウス中での毛嚢の数における驚くほど大きな増大を明らかにした。ＰＳＩに加えて、同じ方法で投与したＭＧ−１３２（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＧ１１５（１０ｍｇ／ｋｇ）、およびラクタシスチンもまた、毛嚢の数における増大を刺激した。
【０１４１】
（実施例９）
（毛の成長の刺激）
雄性のＳｗｉｓｓ  ＩＣＲマウスを、最初に、以下のように頭皮および背中の領域から毛を除去するために処置した。パラフィンワックスを、５５℃に加熱することによって液状にし、次いで、液状にしたワックスを、頭皮および／または背中にブラシで塗布した（麻酔下で）。ワックスを固化させ、次いで除去した。脱毛の次の日に、ＰＳＩ（１ｍｇ／ｋｇ／日）を、頭皮および背中の領域に５日間にわたって１日に３回、皮下注射した。７日目に、皮膚の穿孔生検を行った；組織学的研究によって、コントロールのマウスに対して、ＰＳＩを投与したマウスにおいて毛嚢の数の大きな増大を明らかにした。１８日までに、処置したマウスが、コントロールのグループのマウスのものよりも大きな毛の成長速度を有したことが、観察可能であった。
【０１４２】
マウスを、２１日目に屠殺し、そして組織学的研究を、頭皮および背中の領域の真皮について行った。処置したマウスにおいては、コントロールにおけるよりもはるかに多い数の成熟した毛嚢が、真皮の下の方の領域に移動していた。より綿密な試験においては、ビヒクルのみを受容したマウスが、休止状態の毛嚢を有したことが観察された。ＰＳＩで処置した場合には、このような毛嚢は、成熟した毛嚢へと分化するように刺激され、そして真皮の下の方の領域に移動するように刺激された。
【０１４３】
（実施例１０）
（皮下組織に対する影響）
長手方向および横方向の切片に由来する、６週齢のＩＣＲマウスの頭皮の皮下組織に対するＰＳ１の影響を決定した。５０％のプロピレングリコール、１０％のＤＭＳＯ、および４０％の蒸留水中に溶解させたＰＳ１を、５日間にわたって、皮下組織中に毎日注射し（１ｍｇ／ｋｇ体重／日）、そして１６日後に組織を組織学的に試験した。毛嚢の数が増大し、そしてこれらの毛嚢の真皮組織内部への下方への伸張（１００×）を記録した。これらの両方が、成長期の特徴である。毛嚢の直径および毛根鞘の直径の大きさにおける明らかな増大が存在した（２００×）。
【０１４４】
（実施例１１）
（体外移植組織）
７２時間培養した５日齢のマウスに由来する培養した皮膚の外植片を、プロテアソームインヒビター、非プロテアソームプロテアーゼ、およびＮＦ−κＢの非プロテアソームインヒビターで処理し、そして毛嚢の直径および毛嚢の伸張に対する影響を、Ｋａｍｉｙａ、Ｔ．ら、Ｊ  Ｄｅｒｍ  Ｓｃｉ（１９９８）１７：５４−６０の方法に従って決定した。５日齢のＣ３Ｈ／ＨｅＳ１ｃマウスの背中の皮膚に由来する皮膚の組織切片を、１ｍｌのαＭＥＭおよび０．１％のＢＳＡ中で７２時間培養し、次いで、画像分析を使用して、倒立顕微鏡下で、毛嚢の直径および毛の伸張の変化について評価した。以下の用量を使用した−エポキソミシン（２．５ｎＭ）、ＰＳ１−エポキシド（１２．５ｎＭ）、ＰＳ１（１２．５ｎＭ）、ＭＧ−１３２（０．５μＭ）、ＰＤＴＣ（１０μＭ）、およびロスコボチン（１０μＭ）。ＮＦ−κＢインヒビターである１−ピロリジンカルボチオ酸（ＰＤＴＣ）およびサイクリン依存性キナーゼインヒビターであるロスコビチンは、毛嚢の成長には有意な影響を与えなかったが、プロテアーゼインヒビターであるラクタシスチン、ＰＳ１、およびＭＧ１３２は、毛嚢の分化を効率よく刺激し、そして毛の成長を増強した。エポキシケトンを含有している天然の産物であるエポキソミシン（これは、プロテアソームのキモトリプシン様触媒活性を特異的に阻害する）は、１２．５ｎＭ程度の低い濃度で有効であることを見出した。プロテアソーム（ＰＳ１−エポキシド）について選択性を生じるように、エポキソミシンのエポキシケトンのファルマコフォアに対して連結されたＰＳ１のペプチド側鎖を含有するハイブリッド化合物は、プロテアソームのキモトリプシン様活性を選択的に阻害し、そして新しい毛の成長を強力に刺激した。従って、プロテアソームのキモトリプシン様活性は、プロテアソームの触媒成分であり、これは、毛嚢の分化および毛の成長に対するこれらの化合物の影響の原因である。プロテアソームインヒビターのみが、これらのパラメーターに対して識別可能な影響を有した。
【０１４５】
（実施例１２）
（成長期の効果）
プロテアソームのキモトリプシン様活性のインヒビターを、８週齢のＣ５７黒色マウス中でインビボで、毛嚢の成長期への移行を誘導するその能力について、処置した。エポキソミシン、ＰＳ１（５ｍｇ／ｋｇ／日）またはＰＳ１−エポキシド（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を、５日間にわたって毎日頭皮に皮下注射し、そして基部組織を１６日後に試験した。全ての３つの化合物が、インビボでの毛嚢の分化を増大させた。対照的に、ＮＦ−κＢインヒビターであるカルパインインヒビター−Ｉ  ＰＤＴＣ、および２−ベンゾイルアミノ−１，４−ナフトグイノン（ｎａｐｈｔｈｏｇｕｉｎｏｎｅ）（ＰＰＭ−１８）、ならびにスタチンロバスタチン、およびシムバスタチンは、プロテアソーム活性に対して影響を有さなかった（Ｌａｗ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（１９９２）１２：１０３−１１１；Ｇｕｉｊａｒｒｏ，Ｃ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｐｌａｎｔ（１９９６）１１：９９０−９９６）。局所的な骨膜の骨の形成を生じるために十分な濃度で皮下組織中に局所的に注入されたロバスタチンおよびシムバスタチン（Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８６：１９４６−１９４９）は、毛嚢に対する影響は有さなかった。カルパインインヒビター−Ｉ、ＰＤＴＣ、およびＰＰＭ−１８もまた、毛嚢に対する影響は有さなかった。
【０１４６】
これらのデータは、これらの化合物だけが、インビボで休止状態にある成長期のプロテアソーム機能を刺激する誘導の阻害を生じることを示唆する。
【０１４７】
（実施例１３）
（局所的な投与）
ＰＳＩを、局所的な処方物として調製した。ここでは、ビヒクルは、５０％のプロピレングリコール、３０％のエタノール、２０％の脱イオン水、０．１％の濃度のＰＳＩであった、溶液を、５日間にわたって１日に３回塗布した。処置したグループのマウスを、ビヒクルのみで同様に処置したコントロールと比較して観察した。１６日目での結果は、コントロールと比較して、毛の成長の刺激を示した。
【０１４８】
毛の成長を刺激することに加えて、ＰＳＩは、毛および毛幹の両方を厚くすることが可能であった。ＰＳＩは、毛嚢の領域が０．０１ｍｍ２よりも大きい場合には、毛の数を増大させる。上記のプロトコールを、それぞれ５匹のマウスを含むグループにおいて、ＰＳＩの０．５％の溶液を使用して繰り返した場合には、０．８ｍｍ２あたりの毛の数は、コントロールのグループにおける約１０に対して、処置したグループにおいては６０であった。約０．８ｍｍ２の領域中の毛嚢の面積の割合は、コントロールのグループの平均としての１５％と比較して、処置したグループにおいては約３０％の平均であった。
【０１４９】
（実施例１４）
（用量の必要量）
ＰＳＩの最少有効投与量を決定するために、局所的に使用する場合には、ＰＳＩについての用量応答曲線を作製した。全ての実験を、現在の良好な研究室の実施規定（２１ＣＦＲ５８）に従って行った。マウスを、それぞれ１０匹のマウスである７個のグループに分けた。ここでは、１つのグループが、ビヒクルのみで処置されるコントロールであり、そしてグループ１〜６は、５０％のプロピレングリコール、３０％のエタノール、２０％の脱イオン水を含有しているビヒクル中の一連の漸増濃度のＰＳＩで処置した。濃度は、０．００６％、０．０１２％、０．０２５％、０．０５％、０．１１％、および０．５％であった。
【０１５０】
マウスを麻酔し（３ｍｌのケタミン、２ｍｌの小動物ロンプン（ｒｏｍｐｕｍ）、５ｍｌのＮａＣｌを含有している、５０μｌのＭｏｕｓｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）、耳の穿刺コードによって同定し、体重測定し、そして実施例６に記載するように背中の毛をワックスで剥いだ。ワックスで剥いだ後、動物を写真撮影した。１日後（１日目）、ビヒクル中の上記の濃度の１００μｌのＰＳＩを、脱毛した領域にブラシで塗布した。ＰＳＩ溶液の同様の塗布を、さらに４日間、毎日行った。
【０１５１】
７日目に、マウスを麻酔し、そして６ｍｍの背中の穿刺を使用して採取した背中の処置領域の生検を行った；標本を、１０％の緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィンワックス中に包埋した。切片を、標準的なミクロトームを使用してカットした。
【０１５２】
マウスを、毛の成長の徴候について毎日モニターし、そして全ての毛の成長を、写真で記録した。２１日目にマウスを安楽死させ（７５ｍｇ／ｋｇ体重のフェノバルビタール、ＩＰ注射）、２ｃｍの毛のサンプルを、光学に基づく繊維分析のために採取し、そして残りの背中の処置領域を、さらなる組織学的分析のために、１０％の緩衝化ホルマリン中に固定した。分析は、毛の厚みの定量、および成熟した毛嚢の定量を含んだ。結果を、平均＝平均の±標準偏差として表した。データを、分散の分析の繰り返しの測定によって分析し、続いて＜０．０５のＰ値のＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポスト試験を、有意であると考えた。
【０１５３】
結果は、ＰＳＩの最少有効用量が、４日間にわたる１日に１回の０．５％の塗布であることを示す；さらなる実験は、５日間にわたって１日に３回局所的に塗布された０．１％のＰＳＩもまた有効であったことを示した。
【０１５４】
有効用量を受容しているマウスの全体の観察は、増強された毛の成長の速度、毛の直径の肥厚、毛鞘の直径の増大、および休止状態の毛嚢のさらに成熟した形態への分化を示した。
【０１５５】
（実施例１５）
（脱毛を伴わない影響）
上記の応答が脱毛を伴わずに生じ、そしてマウスの他の株においても生じることを確認するために、ＰＳＩ（０．５％）を、８週齢の雄性のＣ５７  ＢＬ／６マウス（その背中の幹線が削られているが、脱毛はされていない）に対して、５日間にわたって１日に１回、局所的に適用した。この実験のために、１８  Ｃ５７  ＢＬ／６マウスを、背中の幹線から毛を注意深く切り取った。３つのグループを試験した。１つのグループは、毛を切り取った領域に対して局所的に毎日塗布したＰＳ１（０．５％）で処置した。第２のグループにおいては、ＰＳ１（１ｍｇ／ｋｇ体重／日）を、毛を切り取った領域の皮下組織中に局所的に注射した。これらの２つのグループを、第３のグループと比較した。第３のグループは、背中の幹線上の毛を同様に切り取った以外は未処置であった。金髪の毛の色素（１対１のｗ／ｖ比での強力な漂白粉末および１２％の過酸化水素）を、金髪にした領域でのメラニン形成の誘導に関連するマウスの自然な黒い毛の出現によって示される、新しい毛の成長を検出することを容易にするために、全てのマウスの背中の幹線に７日目に塗布した。１６日目までに、処置したマウスと未処置のマウスとの間での差異は、局所的に塗布したかまたはＰＳ１を注入したかのいずれかを受容した処置したマウスの背中の幹線上に現れた黒い毛によって明らかであった。このことは、これらのマウスにおいて薬物の塗布の部位での新しい毛のより迅速な成長を示す。塗布の部分、ならびにそれに隣接する部分、および毛鞘の刺激を示した部位とは離れた部位に直接由来する、雄性のＣ５７  ＢＬ／６マウスの背中の幹線から採取した横断面の切片は、直接的な局所適用の領域に限定した。これらのマウスの背中の幹線に由来する皮膚の横断面の切片は、塗布された領域内においてのみ、ＰＳ１が、毛の直径、ならびに毛根鞘の内部直径および外部直径の両方を増大させたことを示した。
【０１５６】
（実施例１６）
（毛のサイクルの段階の影響）
３週齢での休止期の間のマウスに由来する皮膚の移植片を、７２時間、プロテアソームインヒビターの存在下で培養し、次いで移植片を、組織学的に試験した。未処置のコントロール移植片においては、毛嚢は少なく、そして小さかった。ＰＳ１（５０ｎＭ）、エポキソミシン（２５ｎＭ）、およびハイブリッドのＰＳ１−エポキシド（５０ｎＭ）で処理した移植片においては、毛嚢の直径および毛嚢の伸張において明らかな増大があった。ミノキシジルもまた、これらの変化を生じたが、１０，０００倍大きい濃度であった。これらの小さい毛嚢は、雄性のパターン禿頭症において見られる小型化した毛嚢と似ているので、このことは、これらの化合物が、その状況において同じ効果を有し得ることを示唆する。
【０１５７】
上記に引用される全ての文献の内容が、本発明を理解するために必要とされる程度で、本明細書中で明確に引用される。
【０１５８】
上記から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【図１】
2011195590.tif 000048