(57)【要約】【課題】がんの予防または治療剤を提供すること。【解決手段】次の式（１）2011157342.tif 000011で示されるαリポ酸誘導体、その薬理学的に許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分とする抗がん剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１） 
【化１】
2011157342.tif 000010
で示されるαリポ酸誘導体、又はその薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を有効成分とする抗がん剤。
【請求項２】
式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がα−アミノ酸、ω−アミノ酸及び特殊アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、請求項１記載の抗がん剤。
【請求項３】
式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がグリシン、アラニン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、メチオニン、ノルロイシン、システイン、ハイドロキシプロリン、ヒスチジン、5−ハイドロキシトリプトファン、ペニシラミン、リジン、3−アミノプロピオン酸、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、トランス−4−アミノメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、2−アミノエタンスルホン酸、スルファニル酸及びアントラニル酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、請求項１または２に記載する抗がん剤。
【請求項４】
式（１）中、Ｍで示される金属が亜鉛である請求項１乃至３の何れかに記載の抗がん剤。
【請求項５】
がんが、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん、及び前立腺がんからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１乃至４の何れかに記載の抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、αリポ酸誘導体を有効成分とする新規かつ有用ながんの予防または治療剤（抗がん剤）に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、細胞が何らかのきっかけでＤＮＡの突然変異を来し、制御不能の細胞分裂を始め、条件を問わず転移、増殖を繰り返し、宿主を死に至らしめる病である。制がん剤（抗がん剤）としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質剤、植物アルカロイド剤、ホルモン療法剤、白金錯体剤およびアスパラギナーゼ剤などが知られている。殆どの制がん剤は、細胞分裂をターゲットとして、短時間に効果的に、がん細胞の細胞分裂を阻害することを目的にしている。このような薬剤は、通常、正常細胞にも障害を与えるので、細胞毒性を免れ得ない。
【０００３】
ある種のαリポ酸誘導体について、従来より抗がん作用があることが知られている。例えば、特許文献１及び２には、パラジウム含有リポエート化合物に抗がん作用があることが記載されている。特許文献３によると、その抗がん作用をもたらす活性部位はパラジウムであることが確認されている（特許文献３の段落［０００７］参照）。また特許文献３には、リポ酸のチオール部分の一方または両方が、パラジウム以外の金属等の試薬で誘導体化されているか、また付加体が形成されているリポ酸誘導体に抗がん作用があることが記載されている。さらに特許文献３では、その抗がん作用は、当該リポ酸誘導体がアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘発することによってがん細胞を死滅させることが証明されている。
【０００４】
一方、αリポ酸誘導体、例えば、6，8−ジメルカプトオクタン酸金属キレート化合物をアミノ酸と縮合させて得られる化合物については、チロシナーゼ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、メラニン産生抑制作用、抗酸化作用、及び頭皮脱毛治療作用があり、しみ、そばかす、日焼け等の予防や治療に有用であることが知られているものの（特許文献４〜６、非特許文献１）、抗がん作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5,463,093号公報
【特許文献２】米国特許第5,679,679号公報
【特許文献３】特表2002−528446号公報
【特許文献４】国際公開公報WO 02/076935 A1
【特許文献５】国際公開公報WO 04/024139 A1
【特許文献６】特開2008−174453号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kazumi Ogata, Takahiro Sakaue, The new material development of the alpha lipoic acid derivative., Fragrance Journal 2007; 35: 74-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、αリポ酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とするがんの予防または治療剤を提供することを目的とする。より好ましくは、アポトーシス誘発とは異なる作用機序、具体的には細胞周期阻害作用に基づいて、がん細胞の増殖を抑制する作用を発揮する新しいがんの予防または治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、下記の式（１）で示される化合物、又はその薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物（本明細書中、これらを「本発明の化合物（Ｉ）」または「本化合物（１）」と総称する場合がある。）が、がん細胞の増殖抑制や減少をもたらし、また腫瘍組織の増大化を抑制すること、すなわちがんに対する予防または治療作用を示すことを見出した。さらに本発明者らは、当該本化合物（１）のがん細胞増殖抑制作用には、アポトーシス誘発作用ではなく、細胞周期の抑制作用が関与していることを確認し、アポトーシスとは異なるメカニズムに基づく新しいがんの予防または治療薬としての可能性を見出した。
【０００９】
本発明は、上記の知見に基づいて完成したものであって、下記の実施形態を包含するものである。
【００１０】
（Ｉ）抗がん剤
（I-1）次の式（１） 
【００１１】
【化１】
2011157342.tif 000002
で示されるαリポ酸誘導体、又はその薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物（化合物（１））を有効成分とする抗がん剤。
【００１２】
（I-2）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がα−アミノ酸、ω−アミノ酸及び特殊アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（I-1）記載の抗がん剤。
（I-3）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がグリシン、アラニン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、メチオニン、ノルロイシン、システイン、ハイドロキシプロリン、ヒスチジン、5−ハイドロキシトリプトファン、ペニシラミン、リジン、3−アミノプロピオン酸、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、トランス−4−アミノメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、2−アミノエタンスルホン酸、スルファニル酸及びアントラニル酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（I-1）または（I-2）記載の抗がん剤。
【００１３】
（I-4）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がジペプタイド残基である、上記（I-1）記載の抗がん剤。
（I-5）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がアスパルチルグリシン残基又はスレオニルグリシン残基である、上記（I-4）記載の抗がん剤。
（I-6）式（１）中、Ｍで示される金属が亜鉛である上記（I-1）ないし（I-5）の何れかに記載の抗がん剤。
（I-7）がんが、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん及び前立腺がんからなる群から選択される少なくとも１種である上記（I-1）ないし（I-6）の何れかに記載の抗がん剤。
（I-8）細胞周期阻害作用に基づいてがん細胞の増殖を抑制する作用を発揮する（I-1）ないし（I-7）の何れかに記載する抗がん剤。
【００１４】
後述する実験例５〜７によると、本発明の化合物（１）は、がん細胞の細胞周期を阻害することでがん細胞の増殖を抑制し、その結果、抗がん作用を発揮すると考えられる。従って、上記（I-1）〜（I-7）に記載する「抗がん剤」は「がん細胞に対する細胞周期阻害剤」と言い換えることができる。
【００１５】
（II）抗がん療法
（II-1）次の式（１） 
【００１６】
【化２】
2011157342.tif 000003
で示されるαリポ酸誘導体、又はその薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物（化合物（１））の有効量を、がんに罹患しているか、がんに罹患する可能性のある哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物に対する抗がん療法。
【００１７】
（II-2）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がα−アミノ酸、ω−アミノ酸及び特殊アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（II-1）記載の抗がん療法。
（II-3）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がグリシン、アラニン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、メチオニン、ノルロイシン、システイン、ハイドロキシプロリン、ヒスチジン、5−ハイドロキシトリプトファン、ペニシラミン、リジン、3−アミノプロピオン酸、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、トランス−4−アミノメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、2−アミノエタンスルホン酸、スルファニル酸及びアントラニル酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（II-1）または（II-2）記載の抗がん療法。
（II-4）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がジペプタイド残基である、上記（II-1）記載の抗がん療法。
【００１８】
（II-5）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がアスパルチルグリシン残基又はスレオニルグリシン残基である、上記（II-4）記載の抗がん療法。
（II-6）式（１）中、Ｍで示される金属が亜鉛である上記（II-1）ないし（II-5）の何れかに記載の抗がん療法。
（II-7）がんが、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん及び前立腺がんからなる群から選択される少なくとも１種である上記（II-1）ないし（II-6）の何れかに記載する抗がん療法。
（II-8）化合物（１）の有効量が、化合物（１）ががん細胞の細胞周期を阻害してがん細胞の増殖を抑制する量である（II-1）ないし（II-7）の何れかに記載する抗がん療法。
【００１９】
前述するように、本発明の化合物（Ｉ）による抗がん療法の効果は、がん細胞の細胞周期を阻害することで、がん細胞の増殖を抑制することによって得られると考えられる。従って、上記（II-1）〜（II-7）に記載する「抗がん療法」は「がん細胞に対する細胞周期阻害方法」と言い換えることができる。
【００２０】
（III）抗がん療法に用いられる化合物（１）
（III-1）がんの予防または治療に用いられる、式（１） 
【００２１】
【化３】
2011157342.tif 000004
で示されるαリポ酸誘導体、又はその薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物（化合物（１））。
【００２２】
（III-2）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がα−アミノ酸、ω−アミノ酸及び特殊アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（III-1）記載の化合物（１）。
（III-3）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がグリシン、アラニン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、メチオニン、ノルロイシン、システイン、ハイドロキシプロリン、ヒスチジン、5−ハイドロキシトリプトファン、ペニシラミン、リジン、3−アミノプロピオン酸、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、トランス−4−アミノメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、2−アミノエタンスルホン酸、スルファニル酸及びアントラニル酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（III-1）記載の化合物（１）。
【００２３】
（III-4）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がジペプタイド残基である、上記（III-1）記載の化合物（１）。
（III-5）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がアスパルチルグリシン残基又はスレオニルグリシン残基である、上記（III-4）記載の化合物（１）。
（III-6）式（１）中、Ｍで示される金属が亜鉛である上記（III-1）ないし（III-5）の何れかに記載の化合物（１）。
（III-7）がんが、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん、及び前立腺がんからなる群から選択される少なくとも１種である上記（III-1）ないし（III-6）の何れかに記載する化合物（１）。
（III-8）がん細胞の細胞周期を阻害してがんを予防または治療する（III-1）ないし（III-7）の何れかに記載する化合物（１）。
【００２４】
前述するように、本発明の化合物（１）によるがんの予防または治療効果は、がん細胞の細胞周期を阻害することで、がん細胞の増殖を抑制することによって得られると考えられる。従って、上記（III-1）に記載する「がんの予防または治療に用いられる」は「がん細胞の細胞周期を阻害するために用いられる」と言い換えることができる。
【００２５】
（IV）抗がん剤の製造のための化合物（１）の使用
（IV-1）抗がん剤の製造のための、式（１） 
【００２６】
【化４】
2011157342.tif 000005
で示されるαリポ酸誘導体、又はその薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物（化合物（１））の使用。
【００２７】
（IV-2）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がα−アミノ酸、ω−アミノ酸及び特殊アミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（IV-1）記載の使用。
（IV-3）式（１）中、Ｒで示されるアミノ酸残基がグリシン、アラニン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、メチオニン、ノルロイシン、システイン、ハイドロキシプロリン、ヒスチジン、5−ハイドロキシトリプトファン、ペニシラミン、リジン、3−アミノプロピオン酸、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、トランス−4−アミノメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、2−アミノエタンスルホン酸、スルファニル酸及びアントラニル酸からなる群から選ばれるアミノ酸の残基である、上記（IV-1）記載の使用。
（IV-4）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がジペプタイド残基である、上記（IV-1）記載の使用。
【００２８】
（IV-5）式（１）中、Ｒで示されるペプタイド残基がアスパルチルグリシン残基又はスレオニルグリシン残基である、上記（IV-4）記載の使用。
（IV-6）式（１）中、Ｍで示される金属が亜鉛である上記（IV-1）ないし（IV-5）の何れかに記載の使用。
（IV-7）がんが、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん、及び前立腺がんからなる群から選択される少なくとも１種である上記（IV-1）ないし（IV-6）の何れかに記載する使用。
（IV-8）抗がん剤が、がん細胞の細胞周期を阻害してがん細胞の増殖を抑制する作用を有するものである（IV-1）ないし（IV-7）の何れかに記載する使用。
【００２９】
前述するように、本発明の化合物（１）によるがんの抗がん作用は、がん細胞の細胞周期を阻害することで、がん細胞の増殖を抑制することによるものであると考えられる。従って、上記（IV-1）に記載する「抗がん剤」は「がん細胞の細胞周期阻害剤」と言い換えることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の化合物（１）は、がん細胞の増殖抑制や減少をもたらし、また腫瘍組織の増大を抑制する作用を有することから、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）のがん（例えば、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、精巣がん、甲状腺がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍など。好ましくは大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん及び前立腺がん等の固形がん）の予防または治療に有用である。なお、本発明において、がんの予防とは、がんの転移を抑制すること、及び原発の、極めて初期の限られた個数のがん細胞について、それが腫瘍へと増殖することを抑制すること、及び増殖する以前に消滅させてしまうことを含むものである。
【００３１】
本発明の化合物（１）は極めて毒性が低く、例えば、N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）ヒスチジン亜鉛キレート化合物のラットでの急性毒性LD50は、経口投与で2000mg/kg以上であり、無毒性の分類に属する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】胃がん細胞（MKN45P）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.1mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例１）。
【図２】大腸がん細胞（HT29）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.1mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例１）。
【図３】大腸がん細胞（HT29）の増殖に対する、調製例９の化合物（DHLTauZn）（0.1mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例１）。
【図４】大腸がん細胞（HT29）の増殖に対する、調製例２０の化合物（DHLTraZn）（0.1mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例１）。
【図５】胃がん細胞（MKN45P）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.25mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例２）。
【図６】大腸がん細胞（HT29）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.25mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例２）。
【図７】膵臓がん細胞（MIA Paca2）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.25mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例２）。
【図８】胆管がん細胞（HuCCT-1）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.25mM及び0.5mM）の抑制効果を示す（実験例２）。
【図９】正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）（0.25mM及び0.5mM）の効果を示す（実験例２）。
【図１０】男性ホルモン依存性前立腺がん細胞（LNCAP）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLTauZn）（10，50，100，500，1000μg/ml）の抑制効果を示す（実験例３）。
【図１１】男性ホルモン非依存性前立腺がん細胞（PC3）の増殖に対する、調製例１１の化合物（DHLTauZn）（10，50，100，500，1000μg/ml）の抑制効果を示す（実験例３）。
【図１２】ラットの背部に皮下移植した腫瘍（大腸がん）の重量の経時的変化を示す（実施例４）。
【図１３】ラットの背部に皮下移植した腫瘍（大腸がん）の体積の経時的変化を示す（実施例４）。
【図１４】（Ａ）は、APO-BrdU（登録商標）キットに附属の陽性コントロール細胞のアポトーシス誘導結果を示す（フローサイトメトリー分析結果）。（Ｂ）は、左から、0.5mM DHLHZnの存在下で培養する前の大腸がん細胞の分析結果（0h）、培養開始後24時間後の大腸がん細胞の分析結果（24h）、及び培養開始後48時間後の大腸がん細胞の分析結果（48h）をそれぞれ示す（フローサイトメトリー分析結果）（実験例５（２））。
【図１５】DHLHZnで0時間、24時間及び48時間処理した大腸がん細胞の細胞周期を、フローサイトメトリーで分析した結果を示す（実験例５（３））。各図中に、G1期、S期、及びG2/M期にある細胞の割合を示す。
【図１６】本化合物（（Ａ）DHLHZn、（Ｂ）DHLTauZn）による大腸がん細胞におけるp53タンパク質のリン酸化に与える影響を調べた結果を示す（実験例６）。縦軸は、大腸がん細胞中のp53タンパク質総量に対するリン酸化p53タンパク質の割合を、本化合物（DHLHZn、DHLTauZn）で処理しない大腸がん細胞（図中、0hで示す）での割合を100％として換算して示したものである。横軸は、0.5mMのDHLHZnまたはDHLTauZnで0時間（0h）、6時間（6h）及び24時間（24h）処理した大腸がん細胞を意味する。
【図１７】細胞周期に対するDHLHZnの影響を調べた結果を示す（実験例７）。DHLHZnで0時間、6時間及び24時間処理した大腸がん細胞中の、p21タンパク質、リン酸化Rb（p-Rb）、総Rbタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析により測定した結果を示す。
【図１８】各種の本化合物（Ｉ）（Glu：調製例１２の化合物（DHLGluZn）、NL：調製例１６の化合物（DHLNLZn）、Ser：調製例１５の化合物（DHLSerZn）、Ant：調製例８の化合物（DHLAntZn）、Tau：調製例９の化合物（DHLTauZn）、Pen：調製例１８の化合物（DHLPenZn）、H：調製例１１の化合物（DHLHZn））について、５α−リダクターゼ阻害活性を測定した結果を示す（実験例８）。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明が対象とする抗がん剤は、下式（１）で示されるαリポ酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を有効成分とする。
【００３４】
【化５】
2011157342.tif 000006
【００３５】
上記式（１）において、Ｒで示されるアミノ酸残基とは、同一分子内にカルボキシル基とアミノ基を有する化合物、または同一分子内にスルホン酸基とアミノ基を有する化合物の残基をいい、アミノ酸として、例えば、いわゆるα−アミノ酸の他、ω−アミノ酸及び特殊アミノ酸が挙げられる。なお、アミノ酸残基とは、アミノ酸において一つのアミノ基から水素原子が一つとれた部分構造をいう。
【００３６】
α−アミノ酸とは、カルボキシル基（又はスルホン酸基）が結合した炭素（α−炭素）にアミノ基も結合した化合物をいい、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンなど並びにこれらの異性体及び誘導体が挙げられる。異性体としてはノルロイシンなどが挙げられ、誘導体としては4−ヒドロキシプロリン、ペニシラミン、5−ヒドロキシトリプトファンペニシラミンなどが挙げられる。
【００３７】
ω−アミノ酸とは、カルボキシル基（又はスルホン酸基）の結合した炭素と反対側の炭素鎖末端の炭素にアミノ基が結合した化合物をいい、例えば4−アミノ酪酸（γ−アミノ酪酸）、6−アミノヘキサン酸、2−アミノエタンスルホン酸（タウリン）、3−アミノプロピオン酸、トランス−4−（アミノメチル）シクロヘキサン−1−カルボン酸などが挙げられる。なお、例えばリジンの如き同一分子内に複数のアミノ基を有するアミノ酸については、式（１）においてα−炭素に結合したアミノ基が結合する場合はα−アミノ酸に、ε−炭素に結合したアミノ基が結合する場合はω−アミノ酸に分類される。
【００３８】
特殊アミノ酸とは、その構造上、α−アミノ酸にもω−アミノ酸にも分類されないアミノ酸をいい、例えばアントラニル酸、4−アミノベンゼン−1−スルホン酸などが挙げられる。
【００３９】
制限はされないものの、これらアミノ酸のうち、好ましくはヒスチジン、グルタミン酸、ペニシラミン、及びノルロイシン等のα−アミノ酸；2−アミノエタンスルホン酸、トランス−4−（アミノメチル）シクロヘキサン−1−カルボン酸等のω−アミノ酸；及びアントラニル酸等の特殊アミノ酸を挙げることができる。制限されないが、大腸がん、胃がん、膵臓がん、胆管がん、及び前立腺がんなどの固形がんに対する抗がん剤の有効成分としては、Ｒで示されるアミノ酸残基がヒスチジン、2−アミノエタンスルホン酸、またはトランス−4−（アミノメチル）シクロヘキサン−1−カルボン酸である本化合物（１）を好適に例示することができる。また、前立腺がんに対する抗がん剤の有効成分としては、Ｒで示されるアミノ酸残基がグルタミン酸、ノルロイシン、セリン、アントラニル酸、2−アミノエタンスルホン酸、ペニシラミン、またはヒスチジンである本化合物（１）を好適に例示することができる。
【００４０】
また  上記式（１）において、Ｒで示されるペプタイド残基とは、ペプタイドにおいてＮ末端のアミノ酸のアミノ基から水素原子が一つとれた部分構造をいう。
【００４１】
ここでペプタイドとは、複数のアミノ酸がアミド結合により結合した化合物をいい、このうち、二つのアミノ酸がアミド結合したジペプタイドが好ましい。ジペプタイドとしては、例えばアスパルチルグリシン、スレオニルグリシンが挙げられる。
【００４２】
上記式（１）において、Ｍで示される金属としては、パラジウム以外の薬学的に許容される金属を挙げることができ、具体的には亜鉛、コバルト、鉄、ゲルマニウム、セレンが挙げられる。これらのうち亜鉛が好ましい。
【００４３】
本発明に係るαリポ酸誘導体（１）は、立体異性体の混合物または純粋若しくは実質的に純粋な状態の各立体異性体を包含する。例えば、炭素原子のいずれかに不斉中心を有するαリポ酸誘導体（１）は、エナンチオマー若しくはジアステレオマー又はこれらの混合物として存在し得る。
【００４４】
αリポ酸誘導体（１）の薬理学的に許容される塩としては、無機塩基、例えばナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩およびカルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びに、有機塩基、例えばモノエタノールアミンなどのアミン類との塩が挙げられるが、これら以外の塩であっても薬理学的に許容される塩であれば何れのものであっても本発明の目的のため適宜に用いることが出来る。またαリポ酸誘導体（１）の薬理学的に許容される塩には、その分子内塩も含まれる。
【００４５】
αリポ酸誘導体（１）またはその薬理学的に許容される塩の溶媒和物には、水和物が含まれる。かかる水和物としては、例えば、1水和物，2水和物、1／2水和物、1／3水和物、1／4水和物、2／3水和物、3／2水和物、5／6水和物が含まれる。
【００４６】
本発明の有効成分であるαリポ酸誘導体（１）の合成法を次に掲げる。
【００４７】
【化６】
2011157342.tif 000007
【００４８】
本発明に係るαリポ酸誘導体（１）は、α−リポ酸を所望によりアミノ酸若しくはペプタイドと反応させアミド体としたものを、酸で還元し金属と反応（金属キレート化）させることにより、製造することができる。
【００４９】
具体的には、α−リポ酸を有機溶媒（例えば、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなど）に溶かし、これに3級アミン（トリエチルアミン、トリブチルアミン、N−メチルモルホリンなど）の存在下、−15℃〜−5℃で、ハロゲン化炭酸エステル（例えば、クロル炭酸エチル、クロル炭酸ブチルなど）、イソブチルオキシカルボニルクロリド、塩化ジエチルアセチル又は塩化トリメチルアセチルなどの混合酸無水物試薬と反応させてα−リポ酸の混合酸無水物とする。反応時間は1〜2分から数10分程度である。さらに、これに所望のアミノ酸やペプタイドを、必要に応じ塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムや、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの三級アミンなど）の存在下、水又はアルコール又はそれらの混液などの溶媒に溶かしたものを加えて反応させた後、適当な溶媒、例えば水又はアルコールから再結晶させて、α−リポ酸に所望のアミノ酸またはペプタイドがアミド結合したα−リポ酸誘導体を得ることができる。
【００５０】
金属キレート化は、上記で得られたα−リポ酸誘導体を、適当な溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、水、アルコールなど）中、酸で還元し金属と反応させることにより、実施することができ、これにより、ジヒドロ体を経て、式（１）で示されるαリポ酸誘導体（１）を得ることができる。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸及び酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができる。
【００５１】
さらに，このようにして得たαリポ酸誘導体（１）は、これを水に溶解または懸濁しておき、水酸化アルカリで中和して溶かした後、溶液を濃縮し、これにアルコールを加え、析出する結晶を濾取することによりアルカリ塩とすることができる。
【００５２】
ジヒドロリポ酸、すなわち，6，8−ジメルカプトオクタン酸は、本来、空気中で非常に不安定であるが、上記のようにして得た本発明に係るαリポ酸誘導体（１）及びその薬理学的に許容される塩やそれらの溶媒和物は、チオール部位を金属でキレート化したものであり、例えば金属が亜鉛の場合には、六員環の結晶性の良い安定な化合物となる。かかるαリポ酸誘導体（１）及びその薬理学的に許容される塩やそれらの溶媒和物は、還元作用並びにラジカル抑制作用も強く、また安全性面に問題ない優れた化合物である。
【００５３】
斯くして調製される本発明の化合物（１）は、これを有効成分として適宜製剤化することにより、がんの予防または治療剤（抗がん剤）として、経口的にあるいは非経口的に投与することができる。経口投与のための製剤の形態としては、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）等の固形製剤、又はシロップ剤、乳剤、懸濁剤等の液剤が挙げられる。非経口投与のための製剤の形態としては、例えば、注射剤、坐剤等が挙げられる。
【００５４】
これらの製剤は、いずれも公知の方法により調製することができ、製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調整化剤等の各種添加剤を適宜含むものである。
【００５５】
本化合物（１）をがんの予防若しくは治療剤、又はがん細胞に対する細胞周期阻害剤として使用する際の投与量は、使用する本化合物（Ｉ）の種類、患者の体重、年齢及び性別、対象とする疾患の種類やその状態、並びに投与方法などによって異なり得るが、例えば注射剤の成人への投与量は、1日1回約10mg〜約100mg、内服剤の成人への投与量は、1日数回、1回に約10mg〜約1000mg程度とするのがよい。
【００５６】
本化合物（１）を、がんの予防若しくは治療剤、又はがん細胞に対する細胞周期阻害剤として用いる場合、目的と必要に応じて、本化合物（Ｉ）のうち1種または2種以上を適宜組み合わせて含有させて用いることもでき、更に、本発明の目的に反しない限り、その他の同種又は別種の薬効成分を適宜含有させてもよい。
【００５７】
また、本発明の薬剤は、既存の抗がん剤と組み合わせて用いることができる。この際、それぞれの投与時期は限定されず、同時に又はある時間差をおいて投与しても良い。本発明の薬剤と該抗がん剤との配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００５８】
次に、参考例、調製例、実験例および製剤実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。なお、後述する試験のうち、動物を用いた試験は、大分大学の動物実験倫理委員会の承認のもと、動物実験倫理規定に従って行った。
【００５９】
参考例１    6，8−ジメルカプトオクタン酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸6.2gをメタノール70mLに溶かし、亜鉛末3.0gおよび1N−塩酸40mLを加えて50℃、1時間撹拌した。つぎに、未反応の亜鉛を濾別し、濾液を減圧下で濃縮し、これに水を加えて析出した白色結晶を濾取した。これを水150mLに懸濁して置き、2N−水酸化ナトリウムで約pH9として溶かし、不溶物を濾別し、濾液を濃縮し、これにエタノールを加えて析出する白色結晶を濾取した。これを水／エタノールから再結晶させて、標記化合物6.0gを得た。mp.300℃以上。TLC，Rf ＝0.88（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００６０】
参考例２    6，8−ジメルカプトオクタン酸・亜鉛キレート・モノエタノールアミン（2−アミノエタノール）塩
参考例1において、水酸化ナトリウムの代わりに、モノエタノールアミンを用い、その他は同様に処理して、標記化合物8.5gを得た。mp．137〜139℃。
【００６１】
参考例３    6，8−ジメルカプトオクタン酸エチル・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸エチル3.5gをテトラヒドロフラン60mLに溶かし、これに亜鉛末2.0gおよび70％酢酸水溶液40mLを加えて、50℃で2時間撹拌した。その後、未反応の亜鉛を濾別し、濾液を濃縮し、これに水を加えて析出した白色結晶を濾取した。これを、酢酸／水から再結晶させて、標記化合物3.6gを得た。mp．290℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.88（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００６２】
参考例４    6，8−ジメルカプトオクタン酸アミド・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸アミド4.2gをテトラヒドロフラン70mLに溶かし、これに亜鉛末2.5gおよび50％酢酸水溶液30mLを加えて50℃で2時間撹拌した。溶媒を留去した後、析出した亜鉛混じりの結晶を濾取し、水およびエタノールで洗い、酢酸／水から再結晶させて標記化合物4.5gを白色結晶として得た。mp．257〜259℃。TLC，Rf＝0.80（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００６３】
調製例１    N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）グリシンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびグリシン1.9gを用い、N−α−リポイルグリシンナトリウム（mp．218〜220℃）を経て、これを参考例４と同様に処理して標記化合物3.9gを白色結晶として得た。mp．297℃付近から分解。TLC，Rf＝0.64（クロロホルム：メタノール：水＝5：4：1）。
【００６４】
調製例２    N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）アスパラギン酸モノナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−アスパラギン酸2.9gを用いて，N−α−リポイルアスパラギン酸ナトリウム（mp．300℃以上）を経て、これを参考例４と同様に 処理して標記化合物4.2gを白色結晶として得た。mp．295℃付近から分解。TLC，Rf＝0.53（クロロホルム：メタノール：水＝5：4：1）。
【００６５】
調製例３    N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）メチオニンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−メチオニン3.5gを用い、N−α−リポイルメチオニン（mp．108〜109℃）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物2.8gを白色結晶として得た。mp．260℃付近から分解。TLC，Rf＝0.82（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００６６】
調製例４  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）システイン・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−システイン2.6gを用い、N−α−リポイルシステインナトリウム（mp．150℃付近から分解）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物4.1gを白色結晶として得た。mp．280℃付近から分解。TLC，R f＝0.71（クロロホルム：メタノール：水＝5：4：1）。
【００６７】
調製例５    N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）フェニルアラニンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−フェニルアラニン3.5gを用い、N−α−リポイルフェニルアラニン（mp．154〜156℃）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物3.9gを白色結晶として得た。mp．270℃付近から分解。TLC，Rf＝0.82（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００６８】
調製例６    N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−4−アミノ酪酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよび4−アミノ酪酸2.3gを用い、N−α−リポイル−4一アミノ酪酸（mp．235℃付近から分解）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物5.2gを白色結晶として得た。mp．297℃付近から分解。TLC，Rf＝0.70（クロロホルム：メタノール：水＝5：4：1）。 
【００６９】
調製例７  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−6−アミノヘキサン酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよび6−アミノヘキサン酸3.0gを用い、N−α−リポイル−6−アミノヘキサン酸ナトリウム（mp．200〜202℃）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物2.0gを白色結晶として得た。mp．295℃付近から分解。TLC，Rf＝0.84（クロロホルム：メタノール：水＝5：4：1）。
【００７０】
調製例８  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）アントラニル酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびアントラニル酸2.9gを用い，N−α−リポイルアントラニル酸ナトリウム（mp．300℃以上）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物2.1gを白色結晶として得た。mp．290℃付近から分解。TLC，Rf＝0.88（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７１】
調製例９  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−2−アミノエタンスルホン酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸6.2gおよび2−アミノエタンスルホン酸4.5gを用い、N−α−リポイルアミノエタンスルホン酸ナトリウム（mp．235〜237℃）を経て、これを参考例４と同様に処理して、標記化合物4.5gを白色結晶として得た。mp．293 ℃付近から分解。TLC，Rf＝0.51（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７２】
調製例１０  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−4−ヒドロキシプロリンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−4−ハイドロキシプロリン2.8gから、調製例９と同様にして、標的化合物4.9gを白色結晶として得た。mp．300℃以上。TLC，Rf＝0.66（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７３】
調製例１１  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）ヒスチジンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−ヒスチジン3.4gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.8gを白色結晶として得た。mp．300℃以上。TLC，Rf＝0.39（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７４】
調製例１２  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）グルタミン酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−グルタミン酸3.5gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.7gを白色結晶として得た。mp．3000℃以上。TLC，Rf＝0.74（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７５】
調製例１３  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）スレオニンナトリウム亜鉛・キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−スレオニン2.6gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.5gを白色結晶として得た。mp．300℃以上。TLC，Rf＝0.73（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７６】
調製例１４  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）アラニンナトリウム亜鉛・キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−アラニン2.1gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.4gを白色結晶として得た。mp．290℃付近から分解。TLC，Rf＝0.78（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７７】
調製例１５  N−（6，8一ジメルカプトオクタノイル）セリンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−セリン2.4gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.0gを白色結晶として得た。mp．285℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.64（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７８】
調製例１６   N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）ノルロイシンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−ノルロイシン3.0gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.1gを白色結晶として得た。mp．295℃付近から徐々に分解。 TLC，Rf＝0.90（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００７９】
調製例１７  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−5−ヒドロキシトリプトファンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびL−5−ハイドロキシトリプトファン5.0gから、調製例９と同様にして、標記化合物6.5gを灰白色結晶として得た。mp．290℃ 付近から分解。TLC，Rf＝0.81（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。 
【００８０】
調製例１８  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）ペニシラミンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびD−ペニシラミン3.5gから、調製例９と同様 にして、標記化合物6.0gを白色結晶として得た。mp．280℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.80（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８１】
調製例１９  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−3−アミノプロピオン酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびβ−アラニン2.0gから、調製例９と同様にして、標記化合物5.8gを白色結晶として得た。mp．295℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.83（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８２】
調製例２０  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）−トランス−4−（アミノメチル）シクロヘキサン−1−カルボン酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物（別名：N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）トラネキサム酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物）
DL−α−リポ酸4.2gおよびトランス−4−（アミノメチル）シクロヘキサン−1−カルボン酸3.5gから、調製例９と同様にして、標記化合物5．8gを白色結晶として得た。mp．297℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.81（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８３】
調製例２１  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）スルファニル酸ナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびスルファニル酸（4−アミノベンゼン−1−スルホン酸）3.8gから、調製例９と同様に、標記化合物5．4gを白色結晶として得た。mp．300℃以上。TLC，Rf＝0.57（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８４】
参考例５   N−イソプロピル−6，8−ジメルカプトオクタン酸アミド・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2gおよびトリエチルアミン2.4gをアセトニトリル50mLに溶かして攪拌下−5℃に冷却し、これにクロル炭酸エチル2.4gを徐々に滴下し、滴下終了20分後、さらに、イソプロピルアミン1．5gをアセトニトリル30mLに溶かしたものを、速やかに加え、これを30分間、さらに、室温に戻して1時間攪拌した。該混合物から減圧下溶媒を留去し、残渣に水を加えて冷却し、析出した淡黄色結晶を濾取した。これをテトラヒドロフラン（THF）60mLに溶かし、50％酢酸水溶液20mLおよび亜鉛末2.0gを加えて、50℃、2時間攪拌した後、未反応の亜鉛を濾別し、濾液を濃縮した。残渣に水を加えて析出した白色結晶を濾取し、これをTHF／酢酸／水から再結晶させて標記化合物5.0gを白色結晶として得た。mp．271〜273℃。T LC，R f＝0.89（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８５】
調製例２２  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）メラトニン・亜鉛キレート化合物
イソプロピルアミン1．5gに代えてメラトニン4.0gを用い、参考例５と同様にして、標記化合物6.5gを白色結晶として得た。mp．210〜212℃。TLC，R f＝0.84（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８６】
調製例２３  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）アントラニル酸エチル・亜鉛キレート化合物
イソプロピルアミン1.5gに代えてアントラニル酸エチル3.6gを用い、参考例５と同様にして、標記化合物4.6gを白色結晶（THF−酢酸−水から再結晶）として得た。mp．290℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.88（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）
調製例２４  Nε−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）リシン・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸4.2g、トリエチルアミン2.4gおよびクロル炭酸エチル2.4 gをアセトニトリル50mL中、冷却下で混合酸無水物とし、これにL−リシン3.1g、硫酸銅（5水和物）5．5gおよび水酸化ナトリウム2.0gを水60mLに溶かしたものを加えて反応させた。析出したNε−（α−リポイル）リシンの銅塩を濾取し、水およびメタノールで洗った後，これを70％の酢酸水溶液にサスペンドしてしばらく放置した。これに硫化水素を通じて銅を硫化銅として濾別し、濾液を濃縮した。残渣にメタノールを加えて析出物を濾取し，淡黄色結晶3.5gを得た。mp．254〜255℃。
【００８７】
つぎに、これを60％酢酸水溶液に溶かし、亜鉛末2.0gを加えて、50℃で3時間攪拌した。反応混合物から亜鉛を濾別した後、濾液を濃縮し、これにメタノールを加えて析出物を濾取し、標記化合物3.4gを白色結晶として得た。mp．295℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.47（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８８】
調製例２５  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）アスパルチルグリシンジナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸2.1gおよびL−アスパルチルグリシン2.1gを用い、参考例５と同様にして、N−（α−リポイル）アスパラチイルグリシンナトリウムを径由して、標記化合物3.1gを白色結晶として得た。mp．270℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.54（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００８９】
調製例２６  N−（6，8−ジメルカプトオクタノイル）スレオニルグリシンナトリウム・亜鉛キレート化合物
DL−α−リポ酸2.1gおよびL−スレオニルグリシン2.1gを用い、参考例５と同様にして、標記化合物2.6gを淡黄白色結晶として得た。mp．260℃付近から徐々に分解。TLC，Rf＝0.60（n−ブタノール：酢酸：水＝4：1：2）。
【００９０】
実験例1    がん細胞増殖能に対する抑制効果（その１）
がん細胞増殖能に対する本化合物（Ｉ）の抑制効果について試験した。
（１）試験方法
細胞を培養するための培地として、10％牛胎仔血清（fetal bovine serum：Gibco BRL Life Technologies）、抗菌剤（100 IU／mlペニシリン（penicillin），0.1mg／mlストレプトマイシン（streptomycin）、及び2.5×104mg／LアムホテリシンB（amphotericin B:Gibco BRL Life Technologies）を加えて調製したRPMI1640培地（Gibco BRL Life Technologies）を使用した。かかる培地に、各試験化合物を加え、その最終濃度をそれぞれ0.1mM及び0.5mMとした。対照試験用に試験化合物を加えない培地を調製した（コントロール）。
【００９１】
6ウェル・ディッシュの各ウェルに、上記で調製した培地（試験化合物含有及び非含有）を加え、さらに胃がん細胞（MKN45P）又は大腸がん細胞（HT29）(human colon cancer cell line HT29）を、それぞれ5.0×105個／ウェル加え、これを5％二酸化炭素，37℃の条件下で培養した。培養開始後24時間ごとに、0．25％トリプシンを用いて細胞を剥離し、トリパンブルー色素排除試験法にて、へモサイトメーター（Haemocytometer）を用いて生細胞数を測定した。
【００９２】
（試験化合物） 
調製例１１の化合物（略号：DHLHZn） 
調製例９の化合物（略号：DHLTauZn） 
調製例２０の化合物（略号：DHLTraZn）。
【００９３】
（２）試験結果
胃がん細胞増殖能に対する調製例１１の化合物（DHLHZn）の抑制効果を図1に示す。コントロール（図中、0で示す：―◆―）と比較して、該化合物は0.1mM（―■―）及び0.5mM（―▲―）の濃度で濃度依存的に、胃がん細胞MKN45Pの増殖を抑制した。
【００９４】
大腸がん細胞増殖能に対する、調製例１１の化合物（DHLHZn）、調製例９の化合物（DHLTauZn）、及び調製例２０の化合物（DHLTraZn）の抑制効果を図２〜図４に示す。コントロール（図中、0で示す：―◆―）と比較して、DHLHZn及びDHLTauZnはいずれも0.1mM（―■―）及び0.5mM（―▲―）の濃度で濃度依存的に大腸がん細胞HT29の増殖を抑制した（図２及び３）。また、DHLTraZnは、0.5mM（―▲―）の濃度で、コントロール（図中、0で示す：―◆―）と比較して、大腸がん細胞HT29の増殖を抑制した（図４）。
【００９５】
これら３つの化合物（0.5ｍＭ）の存在下で大腸がん細胞HT29を４日間培養し、大腸がん細胞の増殖に対する抑制作用を評価した結果を、下記表1に示す。
【００９６】
【表１】
2011157342.tif 000008
【００９７】
実験例２    がん細胞増殖能に対する抑制効果（その２）
実験例１の結果を受けて、本化合物（Ｉ）として調製例１１の化合物（DHLHZn）を用いて、本発明の化合物（Ｉ）の各種がん細胞（胃がん細胞[MKN45P]、大腸がん細胞[HT29]、膵臓がん細胞[MIA Paca2]、及び胆管がん細胞[HuCCT-1]）の増殖に対する抑制効果を評価した。また、比較として、DHLHZnの正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対する抑制効果を評価した。
【００９８】
（１）試験方法
実験例１と同様にして調製した培地〔10％牛胎仔血清、抗菌剤（100 IU／mlペニシリン、0.1mg／mlストレプトマイシン、及び2.5×104mg／LアムホテリシンB）を加えて調製したRPMI1640培地〕に、調製例１１の化合物（DHLHZn）を加え、その最終濃度をそれぞれ0.25mM及び0.50mMとした。対照試験用にDHLHZnを加えない培地を調製した（コントロール）。
【００９９】
96ウェル・ディッシュの各ウェルに、上記で調製した培地（DHLHZn配合及び非配合）を加え、さらに各種がん細胞（胃がん細胞[MKN45P]、大腸がん細胞[HT29]、膵臓がん細胞[MIA Paca2]、及び胆管がん細胞[HuCCT-1]）、又は正常ヒト皮膚線維芽細胞を、それぞれ5.0×103個／ウェル加え、これを5％二酸化炭素，37℃の条件下で培養した。培養開始後24時間ごとにMTSテトラゾリウム塩を添加し、生細胞の還元作用によって生じるホルマザン産物に基づく吸光度（波長：490nm）を測定し、生細胞数を評価した。
【０１００】
（２）試験結果
胃がん細胞[MKN45P]、大腸がん細胞[HT29]、膵臓がん細胞[MIA Paca2]、及び胆管がん細胞[HuCCT-1]の増殖に対するDHLHZnの抑制作用を各々図５〜８に、正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対するDHLHZnの作用を図９に示す。各結果は、コントロール実験で得られた吸光度を１として、それとの相対比として示す。
【０１０１】
この結果からわかるように、本化合物（DHLHZn）は、正常細胞の増殖に対しては抑制作用を示さないものの（図９）、胃がん、大腸がん、膵臓がん、及び胆管がん等のがん細胞に対しては濃度依存的にその増殖を抑制することが判明した（図５〜８）。このことから、本化合物は正常細胞に作用せずに、がん細胞に対して特異的にその増殖を抑制する作用を発揮すると考えられる。
【０１０２】
実験例３  がん細胞増殖能に対する抑制効果（その３）
本化合物（Ｉ）として調製例９の化合物（DHLTauZn）を用いて、本発明の化合物（Ｉ）の前立腺がん細胞の増殖に対する抑制効果を評価した。前立腺がん細胞として、男性ホルモン依存性前立腺がん細胞（LNCAP）及び男性ホルモン非依存性前立腺がん細胞（PC3）を使用した。
【０１０３】
（１）試験方法
6ウェル・ディッシュの各ウェルに、実験例１と同様にして調製した培地〔10％牛胎仔血清、抗菌剤（100 IU／mlペニシリン、0.1mg／mlストレプトマイシン、及び2.5×104mg／LアムホテリシンB）を加えて調製したRPMI1640培地〕を加え、これに男性ホルモン依存性前立腺がん細胞（LNCAP）または男性ホルモン非依存性前立腺がん細胞（PC3）を、それぞれ2.0×105個／ウェル加え、これを5％二酸化炭素，37℃の条件下で培養した。24時間培養した後、これに各濃度の調製例９の化合物（DHLTauZn）（最終濃度：10，50，100，500，1000μg/ml）を加え、さらにこれを48時間、5％二酸化炭素、37℃の条件下で培養した。対照試験用にDHLTauZnを加えない培地も併せて調製して培養した（DHLTauZn最終濃度：0μg/ml）。
【０１０４】
培養から48時間後に、0．25％トリプシンを用いて細胞を剥離し、トリパンブルー色素排除試験法にて、へモサイトメーター（Haemocytometer）を用いて生細胞数を測定した。
【０１０５】
（２）試験結果
男性ホルモン依存性前立腺がん細胞（LNCAP）の増殖に対する化合物（DHLTauZn）の作用を図１０に、男性ホルモン非依存性前立腺がん細胞（PC3）の増殖に対する化合物（DHLTauZn）の作用を図１１に示す。この結果から、本化合物（DHLTauZn）は男性ホルモン依存型及び非依存型に関わらず、いずれの前立腺がん細胞に対しても細胞増殖を抑制する作用があることがわかる。
【０１０６】
後述する実験例８に示すように、本化合物（１）は５α−リダクターゼ阻害作用を有しており、テストステロンから５αジヒドロテストステロン（DHT）への変換を阻害することで前立腺細胞の増殖を抑制する作用を有する。しかし、上記実験例３によれば、本化合物（１）は男性ホルモン非依存性前立腺がん細胞（PC3）の増殖をも抑制することから、本化合物（１）の前立腺がん細胞の増殖抑制作用は、５α−リダクターゼ阻害作用だけに起因するものではないことが理解できる。後述する実験例５〜７に示すように、本化合物（１）は細胞周期を阻害することにより、がん細胞の増殖を抑制する作用を発揮する。このことから、本化合物（１）による前立腺がん細胞の増殖抑制効果は、細胞周期阻害作用と５α−リダクターゼ阻害作用の両方の作用に基づくものと考えられる。
【０１０７】
実験例４  ラット皮下腫瘍モデルにおける腫瘍増殖抑制効果
実験例１〜３で各種のがん細胞に対して細胞増殖抑制作用が認められた調製例１１の化合物（DHLHZn）を用いて、本化合物（１）のラット皮下腫瘍モデルにおける腫瘍増殖抑制効果について試験した。
【０１０８】
（１）試験方法
ヌードラット（F344／NJcl−rnu／rnuラット、8週齢雌）の外頚静脈よりカニュレーションを行い、化合物（DHLHZn）（0.01mg/kg/h、または0.1mg/kg/h）または対照として生理食塩水を７日間にわたって持続的に静脈投与した。投与開始後１日目に、ラットの背部に5×106個／匹の大腸がん細胞株HT29（human colon cancer cell line HT29）を皮下投与した。その後、３日ごとに腫瘍の直径を測定し、腫瘍体積｛（長径）×（短径）2／2｝を算出した。大腸がん細胞株を皮下投与してから15日目に犠死させ、皮下腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。
【０１０９】
（２）試験結果
腫瘍重量の測定結果を図１２に，腫瘍体積の測定結果を図１３に示す。図に示すように、DHLHZnは対照と比較して、0.01mg/kg/h及び0.1mg/kg/hの投与の双方で、大腸がん細胞HT29（皮下腫瘍）の増殖を顕著に抑制した。
【０１１０】
実験例５  細胞周期及びアポトーシス誘導に関する評価
実験例１〜３で各種のがん細胞に対して細胞増殖抑制作用が認められた調製例１１の化合物（DHLHZn）を用いて、本化合物（１）の細胞周期とアポトーシス誘導に対する作用を評価した。
【０１１１】
（１）細胞の調製
大腸がん細胞（HT29）(human colon cancer cell line HT29）1.0×106個を、0.5mM DHLHZnの存在下で、5％二酸化炭素及び37℃の条件で培養した。培養開始後24時間及び48時間後に、0.25％トリプシンを用いて細胞を剥離し、1％パラホルムアルデヒド処理と70％冷エタノール処理をして固定化した。
【０１１２】
（２）アポトーシス誘導作用の評価
上記で固定化した細胞について、APO-BrdU（登録商標）キット（Becton Dickinson）を用いて、指示書に沿ってアポトーシス誘導作用を評価した。
【０１１３】
簡単に説明すると、まず固定化した細胞を洗浄し、terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）及びbromodeoxyuridine triphosphate nucleotides(Br-dUTP)を含むDNA標識溶液に懸濁し、37℃で60分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、室温下、暗室で30分間、蛍光標識した抗BrdU抗体（fluorescein標識した抗BrdUモノクローナル抗体）とともにインキュベートした。次いで、室温下、暗室で30分間、プロピジウムヨウ素（PI：Propidium idodide）とRNase Aともにインキュベートした。得られた細胞を、１試料あたり少なくとも10,000個になるように調製し、FACSCalibur フローサイトメーター (Becton Dockinson)を用いて分析した。
【０１１４】
結果を図１４に示す。アポトーシス細胞は、細胞中のDNAがアポトーシスによって断片化している。このため、上記APO-BrdUキットによる反応によれば、断片化によって表出した3’-OH末端にTdTの作用によりBr-dUTPが結合・連結する。Br-dUTPが結合したアポトーシス細胞は、蛍光標識した抗BrdU抗体を用いて標識することでフローサイトメーターで容易に検出することができる。
【０１１５】
図１４の（Ａ）は、APO-BrdU（登録商標）キットに附属の陽性コントロール細胞の結果を示す。図１４の（Ｂ）は、左から、0.5mM DHLHZnの存在下で培養する前の大腸がん細胞の分析結果（0h）、培養開始後24時間後の大腸がん細胞の分析結果（24h）、及び培養開始後48時間後の大腸がん細胞の分析結果（48h）をそれぞれ示す。この結果からわかるように、この結果から、大腸がん細胞を0.5mMのDHLHZnで処理してもアポトーシスの誘発は認められなかった。このことから、本化合物（DHLHZn）のがん細胞増殖抑制作用はアポトーシス誘導に起因するものではないことが示唆される。
【０１１６】
（３）細胞周期の評価
0.5mM DHLHZnの存在下で培養する前の大腸がん細胞（0h）、培養開始後24時間後の大腸がん細胞（24h）、及び培養開始後48時間後の大腸がん細胞（48h）のそれぞれを、蛍光色素（プロピジウムヨウ素（PI：Propidium idodide））で処理して、細胞内全DNAを染色した。これをフローサイトメーターにかけて各細胞の細胞周期（G0-G1、S、G2-M）を分析した。
【０１１７】
結果を図１５に示す。図１５の左から、0.5mM DHLHZnの存在下で培養する前の大腸がん細胞の分析結果（0h）、培養開始後24時間後の大腸がん細胞の分析結果（24h）、及び培養開始後48時間後の大腸がん細胞の分析結果（48h）をそれぞれ示す。この結果からわかるように、大腸がん細胞を本化合物（DHLHZn）で処理することで、G1期にある大腸がん細胞の数が時間依存的に増加することがわかる。
【０１１８】
実験例６  p53蛋白質のリン酸化に対する作用
本化合物（Ｉ）として、調製例１１の化合物（DHLHZn）及び調製例９の化合物（DHLTauZn）を用いて、細胞増殖に対する抑制作用のメカニズム（細胞周期G1期制御機序）を解明するために、大腸がん細胞（HT29）を0.5mMのDHLHZnまたはDHLTauZnの存在下で0時間、6時間または24時間培養して、大腸がん細胞中のp53タンパク質のリン酸化を測定した。
【０１１９】
具体的には、大腸がん細胞（1×106）を0.5mMのDHLHZnまたはDHLTauZnの存在下で、5％二酸化炭素及び37℃の条件で培養した。培養開始から24時間後及び48時間後に、細胞溶解キット（Bio-Rad）を用いて採取した試料から蛋白溶解物を取得した。当該蛋白溶解物について、Bio-Plex Phosphoprotein Assay（Bio-Rad）及びPhosphoprotein Testing Reagent kit（Bio-Rad）を用いて、指示書に従ってリン酸化されたp53タンパク質を検出した。簡単に説明すると、50μlの細胞溶解物（200〜900μg/ml protein）を、抗リン酸基抗体でコートした96穴のウエルに添加し、室温で振盪（300rpm）した。非結合タンパク質を洗浄除去した後、ビオチン化された検出抗体の混合物を添加して、標的抗体（抗リン酸基抗体）とサンドイッチ構造を形成させた。ビオチン化した抗リン酸基抗体を検出するために、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（streptavidin-PE）を添加した。リン酸化p53タンパク質は、Bio-Plex suspension array system（Luminex 100, Bio-Rad）で分析し、p53タンパク質の総量は、Bio-Plex total protein assay kit (Bio-Rad)を用いて測定した。
【０１２０】
DHLHZnの結果を図１６に、DHLTauZnの結果を図１７に示す。各図の縦軸は、大腸がん細胞中のp53タンパク質総量に対するリン酸化p53タンパク質の割合を、試験化合物（DHLHZn、DHLTauZn）で処理しない大腸がん細胞（図中、0hで示す）での割合を100％として換算して示したものである。図１６に示すように、大腸がん細胞中のリン酸化されたp53タンパク質の量は、大腸がん細胞をDHLHZnで6時間処理することで２倍に上昇することが判明した。また図１７に示すように、大腸がん細胞中のリン酸化されたp53タンパク質の量は、大腸がん細胞をDHLTauZnで6時間以上処理することで４倍以上に上昇することが判明した。
【０１２１】
実験例７  がん細胞の核タンパク質のウエスタンブロット分析
0.5mMのDHLHZnの存在下、5％二酸化炭素及び37℃の条件で６時間または24時間処理した大腸がん細胞（HT29）のタンパク質をウエスタンブロットにより分析した。
【０１２２】
細胞内タンパク質は、M-PERTMExtraction Reagents（Pierce Chemical Co.,）を用いて採取し、15,000×gで10分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度をDC Protein Assay Reagent (Bio-Rad)で測定した。１試料あたりの等量（75μg）のタンパク質をSDS-PAGEにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。得られた膜を、0.5％の無脂肪乾燥乳を配合したTris-緩衝生理食塩水（TBS）（0.1％のTween-20添加）でブロックして、p21タンパク質に対する第１抗体（C-19；Santa Cruz Biotechnology, Inc.,）、リン酸化Rbに対する第１抗体（Ser608；Santa Cruz Biotechnology, Inc.,）、総Rbに対する第１抗体（C-15；Santa Cruz Biotechnology, Inc.,）と室温で10分間インキュベートした。次いで、膜を0.1％のTween 20を添加したTBSで洗浄し、抗マウスの第２抗体及び抗ウサギの第２抗体（Immuno-Biological Laboratories Co.,）とともに室温で10分間インキュベートした。各タンパク質は、ECL Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare  UK Ltd.,）を用いて視覚化した。
【０１２３】
ウエスタンブロットの結果を図１７に示す。図１７に示すように、大腸がん細胞をDHLHZnで処理することにより、時間依存的にp21タンパク質の発現量が増加した。一方、リン酸化Rb量はいずれも時間依存的に有意に減少した。
【０１２４】
Rbの発現とそのリン酸化はいずれも、G1/S細胞周期のチェックポイント制御に極めて重要な役割を担っている（C.J. Sherr, Principles of tumor suppression, Cell 116 (2004) 235-246.；T. Sandal, Molecular aspects of the mammalian cell cycle and cancer, Oncologist 7 (2002) 73-81.）。これらのことから、本化合物（DHLHZn）によって、p21タンパク質の発現量が増加することでサイクリンＤ（CDK）が阻害され、Rbの発現とそのリン酸化が抑制されて、その結果、G1期からS期への移行が阻止されて、細胞周期が抑制的に制御されると考えられる。実験例５（３）で示した本化合物（DHLHZn）処理によるG1期にある大腸がん細胞数の増加、実験例６で示した本化合物（DHLHZn）処理によるリン酸化p53タンパク質の増加は、いずれもこのことから説明することが可能である。
【０１２５】
以上の一連の結果から，本発明の化合物（１）には，細胞周期を阻害することによってがん細胞増殖を抑制する作用を有し、この作用に基づいて各種のがん細胞の増殖を抑制する作用を発揮することが判明した。このことから、本発明の化合物（１）は、がんの予防剤または治療剤（抗がん剤）として有用であるといえる。
【０１２６】
実験例８    ５α−リダクターゼに対する阻害作用
５α−リダクターゼに対する本化合物（１）の阻害作用を、試験化合物として下記の化合物を使用して測定した。
（試験化合物）
調製例８の化合物：略号「DHLAntZn」または「Ant」
調製例９の化合物：略号「DHLTauZn」または「Tau」
調製例１１の化合物：略号「DHLHZn」または「H」
調製例１２の化合物：略号「DHLGluZn」または「Glu」
調製例１５の化合物：略号「DHLSerZn」または「Ser」
調製例１６の化合物：略号「DHLNLZn」または「NL」
調製例１８の化合物：略号「DHLPenZn」または「Pen」。
【０１２７】
（１）試験方法
蓋付Ｖ底試験管にて、プロピレングリコールで調製した4.2mg/mLテストステロン20μL、1mg/mL NADPHを配合した5mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH7.13）825μLを混合した。これにエタノール、50%濃度の含水エタノール、または精製水で調製した試験化合物（50，250，500μg/mL）80μL、及び5α−リダクターゼ（S-9分画）75μLを加えて、再び混合庫し、37℃で30分間反応させた後、塩化メチレン1mLを加えて反応を停止した。これを遠心して（1600×g、10分間）、分離した塩化メチレン層をガスクロマトグラフィーに供して、基質として使用したテストステロンと反応生成物（DHT：Dihydrotestosterone）の割合から、各試験化合物の5α−リダクターゼに対する阻害活性を評価した。
【０１２８】
（２）試験結果
結果を図１８に示す。これからわかるように、DHLGluZn、DHLNLZn、DHLSerZn、DHLAntZn、DHLTauZn、DHLPenZn及びDHLHZnの順番で、5α−リダクターゼに対して強い阻害活性が認められた。中でもDHLGluZn、DHLNLZn、及びDHLSerZnの5α−リダクターゼ阻害活性は極めて高いことが確認された。
【０１２９】
このことから上記試験化合物を始めとする本発明の化合物（１）は、その5α−リダクターゼ阻害作用に基づいて前立腺細胞の増殖を抑制する効果があると考えられる。
【０１３０】
実験例９  本化合物（１）の肝機能保護作用
上記実験で５α−リダクターゼに対して阻害作用が確認された試験化合物のうち「DHLHZn」を用いて、肝機能を評価した。
【０１３１】
（１）試験方法
マウスを３群に分け（１群：n=6）、コントロール群、「アセトアミノフェン」投与群、「アセトアミノフェン＋DHLHZn」投与群とした。アセトアミノフェン及びDHLHZnは事前に生理食塩水に溶解し、水溶液として調製しておいた。
【０１３２】
「アセトアミノフェン＋DHLHZn」投与群または「アセトアミノフェン」投与群には、アセトアミノフェンを投与する30分前に予め10mg/kgのDHLHZnまたは生理食塩水をそれぞれ皮下投与し、またアセトアミノフェンを投与する1分前に、10mg/kgのDHLHZnまたは生理食塩水をそれぞれ静脈投与した。DHLHZnまたは生理食塩水を投与した後、各群のマウスにアセトアミノフェンを1.2g/kg/日の割合で腹腔内投与した。腹腔内投与から24時間後に採血して、血清中の肝毒性指標酵素であるアラニンアミノトランスフェラーザ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の活性を測定した。また、DHLHZn及びアセトアミノフェンのいずれも投与しないコントロール群も、同様に採血して、血清ALT、AST及びLDHを測定した。
【０１３３】
（２）試験結果
結果を表２に示す。
【０１３４】
DHLHZn投与の結果を表１に示す。なお、表１の結果は各群のマウス（n=6）の平均値である。
【０１３５】
【表２】
2011157342.tif 000009
【０１３６】
この結果からわかるように、アセトアミノフェン投与によって血清中の肝毒性指標酵素（ALT、ASTおよびLDH）量は増加するが（「アセトアミノフェン」投与群の結果参照）、事前にDHLHZnを投与しておくことで、その増加量を有意に抑制することができた。つまり、DHLHZn等の本化合物（Ｉ）には、アセトアミノフェン等の薬物誘発の肝毒性に対して保護作用を有すること、言い換えると肝機能障害に対する防御作用（肝臓保護作用）を有すると考えられる。
【０１３７】
［製剤実施例］
以下、本発明の前立腺肥大症の予防または治療剤の製剤処方例を挙げる。但し、本発明の予防または治療剤はかかる処方や製剤形態に何ら限定されるものではない。なお、下記に記載する「本発明の化合物（１）」には、一般式（１）で示されるαリポ酸誘導体、その薬理学的に許容される塩、またはそれらの溶媒和物のいずれかを意味する。
【０１３８】
製剤実施例1    内服錠
本発明の化合物（１）            30mg
乳糖                            80mg
馬鈴薯澱粉                      17mg
ポリエチレングリコール6000       3mg
以上の成分を1錠分の材料として常法により成型する。
【０１３９】
製剤実施例２    注射剤
本発明の化合物（１）            1.0g
マンニトール                    4.0g
注射用蒸留水                全量100mL
以上を常法により混合溶解させ注射剤とする。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明に係るαリポ酸誘導体、及びその薬理学的に許容される塩またはその溶媒和は、がん細胞の増殖抑制をもたらし、これを投与しない場合（コントロール）と比較して、腫瘍の重量や体積を減少させることから、哺乳動物のがんの予防または治療に有用である。
【図１】
2011157342.tif 000012
【図２】
2011157342.tif 000013
【図３】
2011157342.tif 000014
【図４】
2011157342.tif 000015
【図５】
2011157342.tif 000016
【図６】
2011157342.tif 000017
【図７】
2011157342.tif 000018
【図８】
2011157342.tif 000019
【図９】
2011157342.tif 000020
【図１０】
2011157342.tif 000021
【図１１】
2011157342.tif 000022
【図１２】
2011157342.tif 000023
【図１３】
2011157342.tif 000024
【図１４】
2011157342.tif 000025
【図１５】
2011157342.tif 000026
【図１６】
2011157342.tif 000027
【図１７】
2011157342.tif 000028
【図１８】
2011157342.tif 000029