(57)【要約】【課題】本発明はバルブ構造を有する試料プロセッシングデバイスを提供すること。【解決手段】可変性バルブ構造を有する試料プロセッシングデバイスおよびその使用法を開示する。このバルブ構造によって、プロセスチャンバー内に位置する試料材料の選択された部分の除去が可能となる。選択された部分の除去は、バルブセプタム中の所望の位置で開口を形成することによって達成される。プロセスチャンバー中の試料材料の特性に基づく開口の位置調節を可能にするために、バルブセプタムは十分大きい。開口の形成後、試料プロセッシングデバイスを回転させる時、回転軸のより近位に位置する材料の選択された部分は開口を通してプロセスチャンバーを出る。試料材料の残部は回転軸から開口よりも遠位に位置するため、開口を通して出ることは不可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料プロセッシングデバイス上のバルブ付きプロセスチャンバー
であって、
試料プロセッシングデバイスの第１および第２の主側面の間に位置するプロセスチャンバー体積を含み、該第２の主側面は該第１の主側面に対向し、該プロセスチャンバーは、試料プロセッシングデバイス上のプロセスチャンバー領域を占有し、軸および長さを含む、プロセスチャンバー；並びに
プロセスチャンバー領域内に少なくとも部分的に位置するバルブチャンバー、ここで、バルブチャンバーは、プロセスチャンバー体積と試料プロセッシングデバイスの第２の主側面との間に位置し、バルブチャンバーとプロセスチャンバーとを分離するバルブセプタムによってプロセスチャンバーから隔離され、そしてプロセスチャンバー体積の一部分がバルブセプタムと試料プロセッシングデバイスの第１の主側面との間に位置し、バルブセプタムは、プロセスチャンバーの軸に沿ってプロセスチャンバーの最大長さの３０％以上でプロセスチャンバー領域の長さに沿って延在し、開口が、プロセスチャンバーの長さに沿って選択された位置でバルブセプタムに形成される、
を備える、前記プロセスチャンバー。
【請求項２】
前記プロセスチャンバーが延在し、プロセスチャンバーの軸が試料プロセッシングデバイスの回転軸に関して半径方向に向いている、請求項１記載のバルブ付きプロセスチャンバー。
【請求項３】
プロセスチャンバー領域内に位置する検出窓であって、プロセスチャンバー体積中へと、および／または外へと指向する選択された電磁エネルギーに対して透過性である検出窓を更に含む、請求項１または２記載のバルブ付きプロセスチャンバー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
様々な化学的または生物学的プロセスが実行されるプロセスチャンバーを備えた試料プロセッシングデバイスは、科学的および／または診断的研究において益々高まる役割を果たしている。かかるデバイス中に提供されるプロセスチャンバーは、好ましくはプロセスを実行するために必要とされる試料材料の量を減少させるように体積が小さい。
【０００２】
プロセスチャンバーを備えた試料プロセッシングデバイスに関連する継続的な問題の１つは、デバイス中の異なる特徴間での流体の転送にある。プロセスチャンバーの流体内容物を分離および転送するための従来のアプローチ法は、しばしば人間の介在（例えば手動ピペット操作）および／またはロボット操作を必要としていた。かかる転送プロセスは、限定されないが、誤差の可能性、複雑さおよび関連する高いコスト等を含む多くの不都合を被る。
【０００３】
流体転送の問題を解決する試みでは、例えばバルブ、蛇行経路等を通してプロセスチャンバーの全流体内容物を転送することに焦点が合わせられている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明はバルブ構造を有する試料プロセッシングデバイスを提供する。このバルブ構造によって、プロセスチャンバー内に位置する試料材料の選択された部分の除去が可能となる。選択された部分の除去は、バルブセプタム中の所望の位置で開口を形成することによって達成される。
【０００５】
プロセスチャンバー中の試料材料の特性に基づく開口の位置調節を可能にするために、バルブセプタムは好ましくは十分長い。開口の形成後、試料プロセッシングデバイスを回転させる時、回転軸のより近位に位置する材料の選択された部分は開口を通してプロセスチャンバーを出る。試料材料の残部は回転軸から開口よりも遠位に位置するため、開口を通して出ることは不可能である。
【０００６】
バルブセプタム中の開口は、プロセスチャンバー内で検出された試料材料の１つ以上の特性に基づく位置に形成されてよい。好ましくは、プロセスチャンバーは、プロセスチャンバーの中へ、および／またはプロセスチャンバーから外へ光を伝達する検出窓を備える。試料材料の検出された特性としては、例えば試料材料の自由表面（プロセスチャンバー中の試料材料の体積を示す）が挙げられる。バルブセプタム中、自由表面の外側に向かって選択された半径距離で開口を形成することによって、試料材料の選択された体積をプロセスチャンバーから除去する機能を提供することが可能である。
【０００７】
様々な構成成分へと分離可能な試料材料、例えば全血に関して、試料プロセッシングデバイスの回転によって血漿および赤血球構成成分の分離が生じ、従って、例えば異なるプロセスチャンバーへの構成成分の選択的な除去が可能となる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、１個以上のバルブセプタム中の選択された位置で開口を形成することによって、試料材料の選択されたアリコートを除去することが可能である。（回転軸に関して測定された）開口間の半径距離および開口間のプロセスチャンバーの断面積に基づき、選択されたアリコート体積を決定することができる。
【０００９】
バルブセプタム中の開口は、好ましくは、例えばレーザーアブレーション、集束光加熱等を通して物理的接触のない状態で形成される。結果として試料プロセッシングデバイスの最外層を穿孔することなく開口が好ましく形成され得、従って、試料プロセッシングデバイスからの試料材料の漏出の可能性が制限される。
【００１０】
一態様において、本発明は、試料プロセッシングデバイスの対向する第１および第２の主側面の間に位置するプロセスチャンバー体積を有し、試料プロセッシングデバイス上の幅より大きい長さと長さに対して横断方向の幅とを有するプロセスチャンバー領域を占有するプロセスチャンバーを備えた、試料プロセッシングデバイス上のバルブ付きプロセスチャンバーを提供する。バルブ付きプロセスチャンバーは、プロセスチャンバー領域内に位置し、プロセスチャンバー体積と試料プロセッシングデバイスの第２の主側面との間に位置し、バルブチャンバーとプロセスチャンバーとを分離するバルブセプタムによってプロセスチャンバーから隔離されており、そしてプロセスチャンバー体積の一部分がバルブセプタムと試料プロセッシングデバイスの第１の主側面との間に位置するバルブチャンバーも備える。検出窓はプロセスチャンバー領域内に位置し、プロセスチャンバー体積中へと、および／または外へと指向する選択された電磁エネルギーに対して透過性である。
【００１１】
もう１つの態様において、本発明は、試料プロセッシングデバイスの対向する第１および第２の主側面の間に位置するプロセスチャンバー体積を有し、試料プロセッシングデバイス上の幅より大きい長さと長さに対して横断方向の幅とを有するプロセスチャンバー領域を占有するプロセスチャンバーを備えた、試料プロセッシングデバイス上のバルブ付きプロセスチャンバーを提供する。バルブ付きプロセスチャンバーは、プロセスチャンバー領域内に位置し、プロセスチャンバー体積と試料プロセッシングデバイスの第２の主側面との間に位置し、バルブチャンバーとプロセスチャンバーとを分離するバルブセプタムによってプロセスチャンバーから隔離されており、そしてプロセスチャンバー体積の一部分がバルブセプタムと試料プロセッシングデバイスの第１の主側面との間に位置し、さらにバルブチャンバーおよび検出窓がプロセスチャンバー領域の互いに排他的な部分を占有し、なおさらにバルブチャンバーの少なくとも一部分がプロセスチャンバー領域中に延在するバルブリップ内に位置し、そしてバルブセプタムがバルブリップ中に形成されるバルブチャンバーも備える。検出窓はプロセスチャンバー領域内に位置し、プロセスチャンバー体積中へと、および／または外へと指向する選択された電磁エネルギーに対して透過性である。
【００１２】
もう１つの態様において、本発明は、プロセスチャンバーから試料材料を選択的に除去する方法を含む。この方法は、プロセスチャンバー体積を有し、試料プロセッシングデバイス上のプロセスチャンバー領域を占有するプロセスチャンバーと；プロセスチャンバー領域内に位置し、バルブチャンバーとプロセスチャンバーとの間に位置するバルブセプタムによってプロセスチャンバーから隔離されたバルブチャンバーと；プロセスチャンバー領域内に位置し、選択された電磁エネルギーに対して透過性である検出窓とを備えた試料プロセッシングデバイスを提供する工程を含む。この方法は、プロセスチャンバー中で試料材料を提供する工程と；検出窓を通してプロセスチャンバー中の試料材料の特性を検出する工程と；試料材料の検出された特性に関係してプロセスチャンバーの長さに沿って選択された位置で、バルブセプタム中に開口を形成する工程とをさらに含む。この方法は、バルブセプタム中に形成された開口を通してプロセスチャンバーからバルブチャンバー中へと試料材料の一部分のみを移動させる工程も含む。
【００１３】
もう１つの態様において、本発明は、プロセスチャンバーから試料材料を選択的に除去する方法を提供する。この方法は、プロセスチャンバー体積を有し、試料プロセッシングデバイス上の幅より大きい長さと長さに対して横断方向の幅とを含むプロセスチャンバー領域を占有するプロセスチャンバーを有する試料プロセッシングデバイスを提供する工程を含む。また試料プロセッシングデバイスは、プロセスチャンバー領域内に位置し、バルブチャンバーとプロセスチャンバーとの間に位置するバルブセプタムによってプロセスチャンバーから隔離されたバルブチャンバーと；プロセスチャンバー領域内に位置し、選択された電磁エネルギーに対して透過性である検出窓とを備える。この方法は、プロセスチャンバー中で試料材料を提供する工程と；検出窓を通してプロセスチャンバー中の試料材料の特性を検出する工程と；試料材料の検出された特性に関係して、プロセスチャンバー領域内の選択された位置でバルブセプタム中に開口を形成する工程と；試料プロセッシングデバイスを回転させることによって、バルブセプタム中に形成された開口を通してプロセスチャンバーからバルブチャンバー中へと試料材料の一部分のみを移動させる工程とを含む。
【００１４】
もう１つの実施形態において、本発明は、全血から核酸を単離する方法を提供する。この方法は、装填チャンバーと可変性バルブ付きプロセスチャンバーとを備えたデバイスを提供する工程と；装填チャンバー中で全血を配置する工程と；全血をバルブ付きプロセスチャンバーへと転送する工程と；バルブ付きプロセスチャンバー中で全血を遠心分離にかけて、血漿層（しばしば、上層）と、赤血球層（しばしば、下層）と、白血球を含む界面層とを形成する工程と；界面層の少なくとも一部分を除去する工程と；分離された界面層中の白血球を溶解させ、そして任意にその中の核を溶解させて、抑制物質および／または核酸を遊離させる工程とを含む。
【００１５】
所望により、この方法は、白血球を溶解させる前に、試料の分離された界面層を水（好ましくは、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮＡｓｅ）を含まない無菌水）または緩衝液で希釈する工程と、任意に希釈された層をさらに濃縮して核酸材料の濃度を増加させる工程と、任意にさらに濃縮された領域を分離する工程と、任意に、希釈、次いで濃縮および分離が続くこのプロセスを繰り返して、増幅法を妨害しない濃度まで抑制物質濃度を低下させる工程とを含み得る。
【００１６】
あるいは白血球を溶解させる工程の前か、それと同時か、または後に、所望により、この方法は、分離された界面層を固体相材料との接触のための分離チャンバーへと転送して、抑制物質の少なくとも一部分を固体相材料へと優先的に接着させる工程を含み得、ここで固体相材料は捕獲部位（キレート官能基）、固体相材料上に被覆されたコーティング試薬または両方を含み；コーティング試薬は界面活性剤、強塩基、高分子電解質、選択的浸透性高分子バリアおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
本発明のもう１つの実施形態は、密度勾配材料を使用して全血から核酸を単離する方法を含む。この実施形態において、この方法は、装填チャンバーと可変性バルブ付きプロセスチャンバーとを備えたデバイスを提供する工程と；装填チャンバー中で全血を配置する工程と；全血をバルブ付きプロセスチャンバーへと転送する工程と；全血を密度勾配材料と接触させる工程と；バルブ付きプロセスチャンバー中で全血および密度勾配材料を遠心分離にかけて、少なくとも一層が対象の細胞を含有する層を形成する工程と；対象の細胞を含む層の少なくとも一部分を除去する工程と；分離された対象の細胞を溶解させて核酸を遊離させる工程とを含む。
【００１８】
もう１つの実施形態において、本発明は、病原体を含む全血から核酸を単離する方法を提供する。この方法は、装填チャンバーと、可変性バルブ付きプロセスチャンバーと、病原体捕獲材料を有する分離チャンバーとを備えたデバイスを提供する工程と；装填チャンバー中で全血を配置する工程と；全血をバルブ付きプロセスチャンバーへと転送する工程と；バルブ付きプロセスチャンバー中で全血を遠心分離にかけて、病原体を含む血漿層と、赤血球層と、白血球を含む界面層とを形成する工程と；病原体を含む血漿層の少なくとも一部分を病原体捕獲材料を含む分離チャンバーへと転送する工程と；病原体捕獲材料から病原体の少なくとも一部分を分離する工程と；病原体を溶解させて核酸を遊離させる工程とを含む。
【００１９】
また本発明は、本発明の様々な方法を実行するためのキットを提供する。
【００２０】
以下、本発明のデバイスおよび方法の様々な実例となる実施形態に関連して、本発明のこれらおよび他の特徴と利点を記載する。
【００２１】
定義
「核酸」は当該分野で既知の意味を有し、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡ）およびＰＮＡを指す。限定されないが、これは二重鎖または一重鎖配置、円形、プラスミド、相対的に短いオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡとも呼ばれる）（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、ケミカル  ソサエティ  レビューズ（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．）、２６、７３−７８（１９９７）に記載の通り）等を含む多種多様の形態であり得る。核酸は、全染色体または染色体の一部分を含み得るゲノムＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、コード配列（例えばコーディングｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび／またはｒＲＮＡ）および／または非コード配列（例えばセントロメア、テロメア、遺伝子間領域、イントロン、トランスポゾンおよび／またはマイクロサテライト配列）を含み得る。核酸は、天然ヌクレオチドならびに人工または化学的に変性されたヌクレオチド、突然変異ヌクレオチド等のいずれも含み得る。核酸は、非核酸構成成分、例えば、ペプチド（ＰＮＡ中のような）、標識（放射性同位元素または蛍光性マーカー）等を含み得る。
【００２２】
「核酸含有材料」は、細胞（例えば白血球、除核赤血球）、核またはウイルス、あるいは核酸を含む構造を収容するいずれかの他の構成（例えばプラスミド、コスミドまたはウイロイド、アルケオバクテリア（ａｒｃｈｅｏｂａｃｔｅｒｉａｅ））のような核酸の供給源を指す。細胞は原核（例えばグラム陽性またはグラム陰性バクテリア）または真核（例えば血球または組織細胞）であり得る。核酸含有材料がウイルスである場合、ＲＮＡまたはＤＮＡゲノムを含み得；毒性であり得るか、弱毒化され得るか、または非伝染性であり得；そして原核または真核細胞に感染し得る。核酸含有材料は、天然であり得るか、人工的に変性され得るか、または人工的に作成され得る。
【００２３】
「単離された」とは、試料中の抑制物質の少なくとも一部分（すなわち、少なくとも一種類の抑制物質の少なくとも一部分）から分離された核酸（または核酸含有材料）を指す。これは、他の材料、例えば、タンパク質、脂質、塩および他の抑制物質のような細胞の構成成分から所望の核酸を分離する工程を含む。より好ましくは、単離された核酸は実質的に精製される。「実質的に精製される」とは、最初の試料から少なくとも２０％まで、好ましくは少なくとも８０％まで、そしてより好ましくは少なくとも９９％まで抑制物質の量を減少させながら、１マイクロリットルあたり少なくとも３ピコグラム（ｐｇ／μＬ）、好ましくは少なくとも２ナノグラム／マイクロリットル（ｎｇ／μＬ）、そしてより好ましくは少なくとも１５ｎｇ／μＬの核酸の単離を指す。汚染物質は典型的に、試料中の溶媒以外のヘムおよび関連生成物（ヘミン、ヘマチン）および金属イオン、タンパク質、脂質、塩等のような細胞構成成分および核構成成分である。従って「実質的に精製される」という用語は、一般的に、単離された核酸のその後の使用を妨害する可能性のある化合物を少なくとも部分的に除去するために、試料から抑制物質（例えば、ヘムおよびその分解生成物）の大部分を分離することを指す。
【００２４】
「接着する」もしくは「接着」または「結合」は、ファンデルワース相互作用、静電的相互作用、親和力または物理的トラッピングのような弱い力を含む多種多様の機構を介して、任意の固体相材料への抑制物質の可逆的保持を指す。この用語の使用は作用機構を暗示せず、吸着および吸収機構を含む。
【００２５】
「固体相材料」（本発明の方法のデバイス内に任意に含まれ得る）は無機および／または有機材料、好ましくは天然および／または合成由来の有機および／または無機化合物の同一であっても異なってもよい繰り返し単位から製造された高分子を指す。これはホモポリマーおよびヘテロポリマー（例えば、ランダムまたはブロックであってもよい、コポリマー、ターポリマー、テトラポリマー等）を含む。この用語には、当該分野において周知の方法によって容易に調製可能な高分子の繊維状または粒子状が含まれる。特定の実施形態に関して、固体相は高分子材料の非多孔性シートのような固体表面も指すが、かかる材料は典型的に多孔性マトリックスを形成する。
【００２６】
任意の固体相材料は捕獲部位を含み得る。「捕獲部位」は、材料を接着させる固体相材料上の部位を指す。典型的に捕獲部位は、固体相材料に共有結合したか、または他の様式で結合（例えば、疎水性結合）したいずれかの官能基または分子を含む。
【００２７】
「固体相材料上に被覆されたコーティング試薬」という句は、固体相材料の少なくとも一部分上に、例えばフィブリルマトリックスおよび／または吸着粒子の少なくとも一部分上に被覆された材料を指す。
【００２８】
「界面活性剤」は、それが溶解されている媒体の表面または界面張力を低下させる物質を指す。
【００２９】
「強塩基」は、水中で完全に解離する塩基、例えばＮａＯＨを指す。
【００３０】
「高分子電解質」は、典型的に比較的高分子量の荷電高分子である電解質、例えばポリスチレンスルホン酸を指す。
【００３１】
「選択的浸透性高分子バリア」は、サイズおよび電荷をベースとして流体の選択的輸送を可能にする高分子バリアを指す。
【００３２】
「濃縮された領域」は、より濃縮されていない領域と関連して、ペレットの形態であり得るより高濃度の核酸含有材料、核および／または核酸を有する試料領域に関する。
【００３３】
「実質的に分離する」とは、本明細書で特に試料のより濃縮されていない領域から試料の濃縮された領域を分離する文脈において使用される場合、試料の総体積の２５％未満で核酸（遊離状態であっても、核内にあっても、または他の核酸含有材料内にあってもよい）の総量の少なくとも４０％を除去することを意味する。好ましくは試料の総体積の１０％未満で核酸の総量の少なくとも７５％が試料の残部から分離される。より好ましくは試料の総体積の５％未満で核酸の総量の少なくとも９５％が試料の残部から分離される。
【００３４】
「抑制物質」は、例えば増幅反応において使用される酵素の抑制物質を指す。かかる抑制物質の例としては、典型的に鉄イオンまたはそれらの塩（例えばＦｅ2+またはそれらの塩）および他の金属塩（例えばアルカリ金属イオン、遷移金属イオン）が挙げられる。他の抑制物質としては、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、ヘムおよびその分解生成物、尿素、胆汁酸、フミン酸、多糖類、細胞膜ならびにサイトゾル構成成分が挙げられる。ＰＣＲに関して、ヒト血液中の主要な抑制物質はヘモグロビン、ラクトフェリンおよびＩｇＧであり、これらはそれぞれ、赤血球、白血球および血漿中に存在する。本発明の方法は、核酸含有材料から抑制物質（すなわち、少なくとも一種類の抑制物質の少なくとも一部分）の少なくとも一部分を分離する。本明細書で説明される場合、抑制物質を含有する細胞は、核または他の核酸含有材料を含有する細胞と同一であり得る。抑制物質は細胞中に含有され得るか、または細胞外であり得る。細胞外の抑制物質とは細胞内に含有されない全ての抑制物質を含み、例えば血清またはウイルス中に存在する抑制物質が挙げられる。
【００３５】
「抑制物質の少なくとも一部分を固体相材料に優先的に接着させる」とは、一種以上の抑制物質を、核酸含有材料（例えば核）および／または核酸よりも高い程度まで任意の固体相材料へと接着させることを意味する。ここで典型的に、核酸含有材料および／または核の実質的な部分は固体相材料に接着されない。
【００３６】
「マイクロ流体」（本明細書で使用される場合）は、５００μｍ未満であり、典型的に０．１μｍと５００μｍとの間である少なくとも１つの内部断面寸法、例えば深さ、幅、長さ、直径等を有する１個以上の流体流路、チャンバーまたは導管を有するデバイスを指す。本明細書で使用されるデバイスにおいて、マイクロスケールのチャネルまたはチャンバーは、好ましくは０．１μｍと２００μｍとの間、より好ましくは０．１μｍと１００μｍとの間、そしてしばしば１μｍと２０μｍとの間の少なくとも１つの断面寸法を有し得る。典型的にマイクロ流体デバイスは、各チャンバーが試料を含有する体積を画定する複数のチャンバー（プロセスチャンバー、分離チャンバー、混合チャンバー、廃棄物チャンバー、希釈試薬チャンバー、増幅反応チャンバー、装填チャンバー等）と；配列の複数のチャンバーを連結する少なくとも１つの流通チャネルとを備える。例えば、配列内の少なくとも１つのチャンバーが固体相材料を含み得（従って、しばしば分離チャンバーとも呼ばれる）、そして／または配列内の少なくとも１つのプロセスチャンバーが溶解試薬を含み得る（従って、しばしば混合チャンバーと呼ばれる）。
【００３７】
用語「含んでなる（備える）」およびその変形は、明細書および請求の範囲にある場合、限定的な意味を有さない。
【００３８】
また本明細書において、終点による数範囲の記載は、範囲内に包括される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００３９】
本発明の上記概要では、本発明のそれぞれの開示された実施形態または全ての実装例を記載する意図はない。以下の記載は、実例となる実施形態を特に例証する。明細書を通していくつかの箇所では、様々な組み合わせで使用されてよい例のリストによってガイダンスが提供される。各例において記載されたリストは代表的な群としてのみ役割を果たし、そして排他的なリストとして解釈されるべきではない。さらに様々な実施形態が記載されており、特記されなくても各実施形態の様々な要素が他の実施形態において使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明による１つの代表的な試料プロセッシングデバイスの平面図である。
【図２】図２は、図１の線２−２に沿った、図１の試料プロセッシングデバイスの一部分の拡大断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、プロセスチャンバーおよびバルブチャンバーを備えたプロセス配列を通して流体を移動させる１つの代表的な方法を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、プロセスチャンバーおよびバルブチャンバーを備えたプロセス配列を通して流体を移動させる１つの代表的な方法を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プロセスチャンバーおよびバルブチャンバーを備えたプロセス配列を通して流体を移動させる１つの代表的な方法を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、プロセスチャンバーおよびバルブチャンバーを備えたプロセス配列を通して流体を移動させる１つの代表的な方法を示す図である。
【図４】図４は、本発明による別のプロセスチャンバーおよび複数のバルブチャンバーの平面図である。
【図５】図５は、試料プロセッシングデバイスの両方の主側面に面する任意の検出装置を備えた、本発明によるもう１つの別のプロセスチャンバーおよびバルブチャンバー構造の断面図である。
【図６】図６は、本発明の特定の方法で使用されるデバイスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の例証的実施態様の詳細な説明
本発明の実例となる実施形態の以下の詳細な記述において、その一部を形成し、図示によって本発明が実施され得る具体的な実施形態が示される添付の図面が参照される。本発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態が利用されてもよいこと、および構造の変更がなされてもよいことは理解されるべきである。
【００４２】
本発明は、所望の反応、例えば、ＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自立性配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、酵素の動力学的研究、均質配位子結合アッセイおよび他の化学的、生化学的または他の反応であって、例えば正確および／または迅速な熱的変動を必要とする反応を得るための複数のプロセスチャンバーにおける液体試料材料（または液体に同伴された試料材料）のプロセッシングにおいて使用可能な試料プロセッシングデバイスを提供する。特に本発明は、各プロセス配列が好ましくは装填チャンバー、少なくとも１つのプロセスチャンバー、バルブチャンバーおよびプロセス配列の様々な構成要素間で流体を移動させるための導管を備え得る１個以上のプロセス配列を備えた試料プロセッシングデバイスを提供する。本発明のデバイスは、マイクロ流体特徴を含んでも含まなくてもよい。
【００４３】
実例となる実施形態の様々な構造が以下に記載されるが、本発明の試料プロセッシングデバイスは、例えば米国特許公報第２００２／００６４８８５号明細書（ベディンハム（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ）ら）；米国特許公報第２００２／００４８５３３号明細書（ベディンハム（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ）ら）；米国特許公報第２００２／００４７００３号明細書（ベディンハム（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ）ら）；米国特許公報第２００３／１３８７７９号明細書（パータサラティ（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ）ら）；ならびに米国特許第６，６２７，１５９Ｂ１号明細書（ベディンハム（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ）ら）に記載のものと同様であってもよい。上記文献は全て、本発明の原理に従う試料プロセッシングデバイスを製造するために使用可能な様々な異なる構造の試料プロセッシングデバイスを開示する。
【００４４】
本発明の原理に従って製造される１つの実例となる試料プロセッシングデバイスを図１および図２に具体的に説明する。ここで図１は１つの試料プロセッシングデバイス１０の平面図であり、そして図２は試料プロセッシングデバイス１０の一部分の拡大断面図である（図１の線２−２に沿ったもの）。試料プロセッシングデバイス１０は、好ましくは図１に図示されるように円形ディスクの形状であり得るが、回転可能ないずれの他の形状も円形ディスクの代わりに使用可能である。
【００４５】
試料プロセッシングデバイス１０は、少なくとも１個、好ましくは複数のプロセス配列２０を備える。描写されるように試料プロセッシングデバイス１０が円形である場合、描写された各プロセス配列２０が、試料プロセッシングデバイス１０の中心１２付近から試料プロセッシングデバイス１０の周辺の方向へと延在することが好ましい。プロセス配列２０は、試料プロセッシングデバイス１０の中心１２に関して実質的に半径方向に整列するように描写される。この配列は好ましいが、プロセス配列２０のいずれの配列も代用され得ることは理解されるだろう。また図示される試料プロセッシングデバイス１０は４個のプロセス配列２０を備えるが、本発明に従って製造される試料プロセッシングデバイスに関連して提供されるプロセス配列の正確な数は４を超えていても４未満であってもよい。
【００４６】
（図１に描写される実施形態において）各プロセス配列２０は導管３２に沿ってプロセスチャンバー４０に連結した装填チャンバー３０を備える。プロセス配列２０は、導管６２によって第２のプロセスチャンバー７０に連結したバルブチャンバー６０も備える。バルブチャンバー６０は、好ましくは試料プロセッシングデバイス１０上のプロセスチャンバー４０によって占有される領域中へと延在しているバルブリップ５０内に位置する。
【００４７】
プロセス配列２０の１個以上と関連する多くの特徴が任意であってよいことは理解されるべきである。例えば、異なる装填構造を通して試料材料がプロセスチャンバー４０中に直接的に導入され得る装填チャンバー３０および関連する導管３２は、任意であってよい。同時に、プロセス配列２０の１個以上に追加的な特徴が提供されてもよい。例えば、２個以上のバルブチャンバー６０がプロセス配列２０の１個以上と関連してもよい。追加的なバルブチャンバーが追加的なプロセスチャンバーまたは他の特徴と関連してもよい。
【００４８】
プロセス配列２０と関連して提供されるいずれの装填構造も、試料材料を受け取る外部装置（例えば、ピペット、中空注射器または他の流体送達装置）と組み合わせて設計されてよい。装填構造自体が体積を画定してもよく（例えば、図１の装填チャンバー３０のように）、または装填構造が特定の体積を画定しないが、代わりに試料材料が導入される位置であり得る。例えば、ピペットまたは針が挿入されるポートの形態で装填構造が提供されてよい。一実施形態において、装填構造は、例えばピペット、注射器針等を受け取るように適応された導管に沿って設定された位置であり得る。手動または自動化システム（例えば、ロボット等）によって装填が実行されてもよい。さらに、もう１つのデバイスから直接的に試料プロセッシングデバイス１０が装填されてもよい（自動化システムを使用して、または手動）。
【００４９】
図２は、図１の線２−２に沿ったプロセッシングデバイス１０の拡大断面図である。いずれの数の適切な構造技術を使用して本発明の試料プロセッシングデバイスが製造されてもよいが、図２の断面図において１つの実例となる構造体が示される。試料プロセッシングデバイス１０は、バルブ層１６に結合されたベース層１４を備える。カバー層１８は、ベース層１４から外方に向くバルブ層１６の側面上でバルブ層１６に結合される。
【００５０】
いずれかの適切な材料または材料の組み合わせから試料プロセッシングデバイス１０の層を製造してよい。ベース層１４および／またはバルブ層１６のためのいくつかの適切な材料の例としては、限定されないが、高分子材料、ガラス、ケイ素、石英、セラミックス等が挙げられる。層が試料材料と直接接触する試料プロセッシングデバイス１０に関して、層のために使用される材料が試料材料と非反応性であることが好ましい。多くの異なる生物学的分析の用途において基材のために使用可能ないくつかの適切な高分子材料の例としては、限定されないが、ポリカーボネート、ポリプロピレン（例えば、アイソタクチックポリプロピレン）、ポリエチレン、ポリエステル等が挙げられる。
【００５１】
いずれかの適切な技術または技術の組み合わせによって、試料プロセッシングデバイス１０を形成する層を互いに結合することができる。適切な結合技術は、好ましくはプロセスチャンバー中での試料材料のプロセッシング間に経験する力に結合が耐性を示すような十分な完全性を有する。いくつかの適切な結合技術の例としては、例えば、接着結合（感圧接着剤、硬化性接着剤、ホットメルト接着剤等を使用する）、ヒートシール、熱溶接、超音波溶接、化学溶接、溶媒結合、共押出、押出キャスティング等およびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、異なる層を結合するために使用される技術は同一であっても異なってもよい。例えば、ベース層１４およびバルブ層１６を結合するために使用された技術は、カバー層１８およびバルブ層１６を結合するために使用された技術と同一であっても異なってもよい。
【００５２】
図２はプロセスチャンバー４０の断面図を描写する。また、描写された実施形態においてプロセスチャンバーによって占有される領域、すなわち、プロセスチャンバー領域中に位置するバルブリップ５０も図２に示されている。プロセスチャンバーは、好ましくは、試料プロセッシングデバイス１０の主側面のいずれか上にプロセスチャンバー境界を突出させることによって画定される。図２に描写される実施形態において、試料プロセッシングデバイス１０の第１の主側面１５はベース層１４の最低表面（すなわち、バルブ層１６から離れた表面）によって画定され、そして第２の主側面１９はカバー層１８の最上表面（すなわち、バルブ層１６から離れた表面）によって画定される。「上部」および「低部」が本明細書で使用される場合、図２のみに関してであり、そして使用中の試料プロセッシングデバイス１０の配向を限定するように解釈されないことは理解されるべきである。
【００５３】
バルブリップ５０は、プロセスチャンバー４０の最外境界によって画定されるプロセスチャンバー領域中へ延在するように描写される。バルブリップ５０がプロセスチャンバー領域の範囲内に位置するため、バルブリップ５０は、プロセスチャンバー４０の一部分上に張出すように、またはプロセスチャンバー４０の一部分上に飛出すように記載されてもよい。
【００５４】
本発明の好ましいプロセスチャンバーは、プロセスチャンバー４０中のいずれかの試料材料の１つ以上の特性の検出を可能にする検出窓を備えてもよい。選択された光を使用して検出を達成することが好ましく、ここで「光」という用語は、人間の目に可視であるかどうかに関係なく電磁エネルギーを指す。光が紫外線から赤外線の電磁エネルギーの範囲にあることが好ましく、そしていくつかの例において、光が人間の目に可視のスペクトルの電磁エネルギーを含むことが好ましい。さらに選択された光は、例えば、１以上の特定の波長、１以上の波長範囲、１以上の偏光状態またはそれらの組み合わせの光であってもよい。
【００５５】
図２に描写される実施形態において、検出窓はカバー層１８もしくはベース層１４（または両方）に提供されてよい。いずれの構成要素が検出窓として使用されるかにかかわらず、使用された材料は、好ましくは選択された光のかなりの部分を伝送する。本発明の目的に関して、かなりの部分とは、例えば、選択された垂直入射光の５０％以上、より好ましくは、選択された垂直入射光の７５％以上であってよい。検出窓のためのいくつかの適切な材料の例としては、限定されないが、例えば、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン−ポリエチレンコポリマー、シクロオレフィン高分子（例えば、ポリジシクロペンタジエン）等が挙げられる。
【００５６】
いくつかの例において、試料プロセッシングデバイス１０がプロセスチャンバー体積１４と試料プロセッシングデバイス１０の少なくとも一側面との間で不透明となるように、試料プロセッシングデバイス１０のベース層１４および／またはカバー層１８が不透明であることが好ましい。不透明とは、上記の選択された光の伝送が実質的に防止される（例えば、かかる垂直入射光の５％以下が伝送される）ことを意味する。
【００５７】
バルブチャンバー６０は図２に描写されており、好ましくは、図２に示されるようにバルブリップ５０の範囲内に少なくとも部分的に位置してよい。バルブチャンバー６０の少なくとも一部分は、好ましくは、試料プロセッシングデバイス１０の第２の主側面１９とプロセスチャンバー４０の少なくとも一部分との間に位置する。またバルブチャンバー６０は、好ましくは、バルブチャンバー６４およびプロセスチャンバー４０を分離しているバルブセプタム６４によって、プロセスチャンバー４０の体積の一部分がバルブセプタム６４と試料プロセッシングデバイス１０の第１の主側面１５との間にあるようにプロセスチャンバー４０から隔離される。描写された実施形態において、カバー層１８は、好ましくは、バルブチャンバー６０をプロセスチャンバー５０から隔離するように、表面５２に沿ってバルブリップ５０にシールされる。
【００５８】
バルブセプタム６４は、好ましくは、非接触方法、例えば、レーザーアブレーション等によって開口が形成可能である材料から形成される。セプタム６４中で使用されるかかる材料として、セプタム６４を開放するために使用されるエネルギーを優先的に吸収する材料が挙げられる。例えば、セプタム６４としては、例えば、カーボンブラック、ＵＶ／ＩＲ吸収剤等のような材料が挙げられる。
【００５９】
バルブセプタム６４の開口を形成するために使用されるエネルギーは、カバー層１８を通して、もしくはベース層１４を通して（または両方とも通して）、バルブセプタム６４上へ指向される。しかしながら、バルブセプタム６４に達する前にプロセスチャンバー４０中で試料材料を通してエネルギーが指向されることに関係する問題を避けるために、バルブセプタム６４においてカバー層１８を通してエネルギーが指向されることが好ましい。
【００６０】
プロセス配列１２０の使用方法の１つの実例を図３Ａ〜３Ｄに記載する。各図は、本発明に従う１つの実例となる方法の様々な段階におけるプロセス配列の平面図である。各図に描写されるプロセス配列１２０は、導管１３２を通してプロセスチャンバー１４０に連結された装填チャンバー１３０を備える。またプロセス配列は、バルブリップ１５０およびバルブリップ１５０の一部分の範囲内に位置するバルブチャンバー１６０も備える。いずれかの開口がバルブセプタム１６４を通して形成される前に、バルブリップ１５０およびバルブチャンバー１６０はプロセスチャンバー１４０からバルブチャンバー１６０を分離および隔離するバルブセプタム１６４を画定する。バルブセプタム１６４境界は裸眼では見えないため、図中では破線として描写される。
【００６１】
プロセス配列１２０のもう１つの特徴は、それを通してプロセスチャンバー１４０中へ、および／またはプロセスチャンバー１４０から外へ選択された光を伝送することができる検出窓１４２である。検出窓１４２は、プロセス配列１２０が位置するデバイスのいずれかの主側面を通して（または所望であれば両方の主側面を通して）形成されてよい。描写された実施形態において、検出窓１４２は、好ましくは、バルブリップ１５０によって占有されないプロセスチャンバー１４０によって占有される領域部分によって画定される。検出窓１４２を特徴づけるもう１つの様式において、検出窓１４２およびバルブリップ１５０（および／またはその中に含有されるバルブチャンバー１６０）がプロセスチャンバー１４０の領域の互いに排他的な部分を占有するように記載されてもよい。
【００６２】
プロセス配列１２０は、導管１６２を通してバルブチャンバー１６０に連結されたアウトプットプロセスチャンバー１７０も備える。アウトプットプロセスチャンバー１７０は、例えば、そこに位置する一種以上の試薬１７２を含み得る。試薬１７２はプロセスチャンバー１７０内に固定されても、またはプロセスチャンバー内で自由状態であってもよい。プロセスチャンバー１７０中に描写されているが、プロセス配列１２０内のいずれかの適切な位置、例えば、装填チャンバー１３０、導管１３２および１６２、プロセスチャンバー１４０、バルブチャンバー１６０等において一種以上の試薬が提供されてもよい。
【００６３】
試薬の使用は任意であり、すなわち、本発明の試料プロセッシングデバイスはプロセスチャンバー中にいずれかの試薬を含んでも、含まなくてもよい。もう１つの変形においては、異なるプロセス配列中のいくつかのプロセスチャンバーが試薬を含み、他が含まなくてもよい。なおもう１つの変形において、異なるプロセスチャンバーが異なる試薬を含有してもよい。さらに試薬の接着力を制御するために、プロセスチャンバー構造の内部が被覆または他の様式で加工されていてもよい。
【００６４】
プロセスチャンバー１４０（およびその関連するプロセスチャンバー領域）は、好ましくは、プロセスチャンバー１４０の幅より大きい長さ（例えば、図３Ａにおいて軸１２１に沿って測定される）を有し得る。プロセスチャンバー幅は、プロセスチャンバー長さに対して垂直方向で測定される。プロセスチャンバー１４０自体は「伸長された」ものとして記載される。それに沿ってプロセスチャンバー１４０が伸長される軸１２１が、プロセス配列を含有する試料プロセッシングデバイスが回転する回転軸から延在する半径方向で整列されることが好ましい（回転が流体転送をもたらすために使用される推進力である場合）。
【００６５】
他の態様において、検出窓１４２がプロセスチャンバー１４０の長さに沿ってバルブセプタム１６４と少なくとも同延であることが好ましい。描写された検出窓１４２は単一ユニタリー特徴であるが、２個以上の検出窓が各プロセスチャンバー１４０に提供され得ることは理解される。例えば、プロセスチャンバー１４０の長さに沿って複数の独立した検出窓を配置することができる（例えば、バルブセプタム１６４と並んで）。
【００６６】
様々な特徴の相対的なサイズを特徴付けるもう１つの様式は、例えば、バルブセプタム１６４が（その伸長軸１２１に沿って）プロセスチャンバー１４０の最大長さの３０％以上（または５０％以上）でプロセスチャンバー領域の長さに沿って延在することである。バルブセプタム１６４の寸法のかかる特徴づけは多くの試料プロセッシングデバイスに関して実際の尺度で表されてもよく、例えば、バルブセプタム１６４は、プロセスチャンバー１４０の長さに沿って１ミリメートル以上の長さで延在するものとして記載されてもよい。
【００６７】
描写された方法の第１段階を図３Ａに示す。ここで装填チャンバー１３０は、そこに位置する試料材料１８０を含む。図示された方法の目的のため、試料材料１８０は全血である。装填後、好ましくは、導管１３２を通して血液１８０をプロセスチャンバー１４０へ転送する。好ましくは、回転軸１１１に対してプロセス配列１２０を回転させることによって転送を実行してよい。プロセスチャンバー１４０から装填チャンバー１３０の反対側に位置する点に対してプロセスチャンバー１４０が弧状に移動される点１１１に対するいずれの回転も許容できるが、好ましくは、例えば図３Ａが位置する紙の平面上で回転が生じ得る。核酸を除去するための全血のプロセッシングの好ましいプロセスに関するさらなる記載は、以下に提供される。
【００６８】
本発明の試料プロセッシングデバイスにおいて使用されるプロセス配列は、好ましくは「非換気型」であってよい。本発明と関連して使用される場合、「非換気型プロセス配列」はプロセス配列中に導かれる開口のみが装填構造、例えば、装填チャンバーに位置するプロセス配列（すなわち、少なくとも２個の連結されたチャンバー）である。言い換えると、非換気型プロセス配列内のプロセスチャンバーに到達するように、試料材料は装填チャンバーに送達されなければならない。同様に、試料材料の装填前のプロセス配列内に位置するいずれの空気または他の流体も、装填チャンバーを通してプロセス配列から逃がされなければならない。対照的に、換気型プロセス配列は、装填チャンバーの外側に少なくとも１個の開口を備える。この開口は、装填前のプロセス配列内に位置するいずれの空気または他の流体も逃がすことができる。
【００６９】
非換気型プロセス配列を備えた試料プロセッシングデバイスを通しての試料材料の移動は、回転間、デバイスを交互に加速および減速することによって促進され得、そして導管およびプロセスチャンバーを通して本質的に試料材料が脱気される。少なくとも２回の加速／減速サイクル、すなわち初期加速、それに続く減速、第２回目の加速および第２回目の減速を使用して、回転を実行してよい。加速および／または減速が迅速である場合、それはさらに有益である。また好ましくは回転は一方向のみであり、すなわち、装填プロセス間に回転方向を逆にする必要はない。かかる装填プロセスによって、デバイスの回転中心からより遠くに位置するプロセス配列中の部分中の空気を試料材料に置き換えることが可能となる。実際の加速および減速の速度は、温度、デバイスのサイズ、回転軸からの試料材料の距離、デバイスの製造材料、試料材料の特性（例えば粘度）等のような様々な要因に基づいて変更されてよい。
【００７０】
図３Ｂは、プロセスチャンバー１４０中への血液１８０の移動後のプロセス配列を描写する。バルブチャンバー１６０がバルブセプタム１６４によってプロセスチャンバー１４０から隔離されているため、血液１８０はプロセスチャンバー１４０中に残って、すなわち、バルブチャンバー１６０中へと移動しない。
【００７１】
図３Ｃに示されるように、プロセス配列１２０の追加的な回転によって、好ましくは赤血球１８２、バフィーコート層１８４および血漿１８６への血液１８０の構成成分の分離が得られる。典型的に、分離は遠心力および材料の相対密度の結果である。
【００７２】
各血液試料１８０の異なる構成成分の正確な体積（または血液試料１８０自体の体積）が未知である場合、異なる分離された層間の境界の位置は未知である。しかしながら本発明と関連して、好ましくは異なる分離された構成成分間の境界の位置を検出することが可能である。
【００７３】
かかる検出は、好ましくは、いずれかの適切な選択された光を使用して検出窓を通して生じ得る。プロセスチャンバー１４０中の試料材料の像を得るために、光が血液構成成分１８２、１８４と１８６を通して伝達されても、またはそれらから反射されてもよい。もう１つの別法において、吸光度を使用して、１以上の選択された構成成分の境界または位置を検出することもできる。例えば、血液を回転後、充填された赤血球層、バフィー層（白血球）および血漿の間で境界を検出することが可能である。ビーズを回転後、充填ビーズ層および上澄み層の間で境界を検出することも可能である。
【００７４】
試料材料の全ての特徴または特性の位置、すなわち、血漿１８６の自由表面１８７を含む全ての境界の位置を決定することは好ましい。他の例においては、１つのみの特徴の位置、例えば、バフィーコート層１８４と血漿１８６との間の境界を決定することが十分であり、ここで検出された特徴は本方法において次の工程を実行するために十分な情報を提供する。
【００７５】
プロセスチャンバー１４０中の材料の適切な特性の検出後、開口１６８が、好ましくはバルブセプタム１６４の所望の位置で形成される。描写された方法において、開口１６８の所望の位置は、プロセスチャンバー１４０から血漿１８６の一部分を除去するために選択される。プロセスチャンバー１４０中に少量（図３Ｄの１８６ｒを参照せよ）のみを残して、血漿１８６の実質的に全てが除去されることが望ましい。プロセスチャンバー１４０から赤血球１８２の転送を制限または防止するために、プロセスチャンバー１４０中に少量の血漿を残す必要がある。
【００７６】
開口１６８は、いずれかの適切な非接触技術によって形成され得る。かかる技術の１つは、例えばバルブセプタム１６８のレーザーアブレーションであり得る。他の技術としては、限定されないが、例えば集束光加熱等が挙げられる。
【００７７】
開口１６８の形成後、プロセス配列１２０の追加的な回転によって、好ましくは、開口１６８を通してバルブチャンバー１６０へとプロセスチャンバー１４０から血漿１８６が移動して、従って、導管１６２を通してアウトプットプロセスチャンバー１７０へと転送する。結果として、プロセスチャンバー１４０中にバフィーコート層１８４および赤血球１８２と一緒に血漿の少量の残部１８６rがあって、血漿１８６はプロセスチャンバー１７０中に位置する。
【００７８】
本発明に従うプロセスチャンバー２４０およびバルブ構造を備えたプロセス配列２２０のもう１つの実施形態の一部分を図４に描写する。描写された実施形態において、プロセスチャンバー２４０は軸２２１に沿って伸長され、そしてプロセス配列２２０は、回転によって流体を移動させる力が提供されるように設計される。回転は、描写された実施形態において軸２２１上にある点２１１に対するものである。しかしながら、それに対してプロセス配列が回転する点が軸２２１上にある必要がないことは理解されるべきである。
【００７９】
プロセスチャンバー２４０は、バルブリップ２５０ａ、２５０ｂおよび２５０ｃがプロセスチャンバー領域へと延在する点線で、そしてバルブリップ２５０ａ、２５０ｂおよび２５０ｃがプロセスチャンバー領域へと延在しない実線で示される。バルブリップ２５０ａ、２５０ｂおよび２５０ｃによって占有されないプロセスチャンバー領域のそれらの部分において、プロセスチャンバー２４０がプロセスチャンバー２４０中へ、および／またはプロセスチャンバー２４０から外への選択された光の伝達を可能にする検出窓２４２を備え、プロセスチャンバー２４０中の試料材料２８０の検出が可能となることが好ましい。
【００８０】
プロセス配列２２０は、プロセスチャンバー２４０から隔離および分離されたバルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃも備える。バルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃは、それぞれチャンバー２７０ａ、２７０ｂおよび２７０ｃと連絡する（それぞれ）。バルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃは、図４に示されるように導管によってそれらの各チャンバー２７０ａ、２７０ｂおよび２７０ｃに連結され得る。
【００８１】
各バルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃは、好ましくは、少なくとも部分的に（それぞれ）バルブリップ２５０ａ、２５０ｂおよび２５０ｃ上に位置する。また各バルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃは、好ましくは、各バルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃ内に位置するバルブセプタム２６４ａ、２６４ｂおよび２６４ｃによってプロセスチャンバー２４０から隔離および分離されてよい。各バルブセプタム２６４ａ、２６４ｂおよび２６４ｃは、部分的にプロセスチャンバー２４０の破線によって画定される。
【００８２】
プロセスチャンバー２４０と関連して提供された複数のバルブチャンバー２６０ａ、２６０ｂおよび２６０ｃは、プロセスチャンバー中のいずれかの試料材料の異なる部分を選択的に除去する能力およびその試料材料を異なるチャンバー２７０ａ、２７０ｂおよび２７０ｃのへと移動させる能力を提供し得る。例えば、バルブチャンバー２６０ａのバルブセプタム２６４ａに開口２６８ａを形成することによって、プロセスチャンバー２４０中の試料材料２８０の第１の部分がチャンバー２７０ａ中に移動され得る。
【００８３】
バルブチャンバー２６０ａの開口２６８ａを通してチャンバー２７０ａ中に試料材料２８０の第１の部分を移動させた後、チャンバー２７０ｂ中に試料材料２８０の第２の部分を移動させるために、もう１つの開口２６８ｂをバルブチャンバー２６０ｂのバルブセプタム２６４ｂに提供してもよい。第２の部分は、典型的に、開口２６８ａおよび２６８ｂの間に位置する試料材料２８０を含む。プロセスチャンバー２４０の長さに沿って、それら２個の開口を分離する距離は図４においてｘによって示される。結果として、（軸２２１に対して垂直な平面に取られる）プロセスチャンバー２４０の断面積が既知である場合、試料材料２８０の第２の部分の体積は決定され得る。結果として、互いに選択された距離で開口２６８ａおよび２６８ｂを形成することによって、チャンバー２７０ｂ中に試料材料の既知または選択された体積を移動させることが可能である。
【００８４】
またプロセスチャンバー２４０は、それに対してプロセス配列２２０が回転する点２１１から最も遠くのプロセスチャンバー２４０の終端においてバルブリップ２５０ｃに位置する第３のバルブチャンバー２６０ｃも備える。バルブリップ２５０ｃはプロセスチャンバー２４０の全ての幅上に延在する（プロセスチャンバー２４０の幅の一部分のみの上に延在するバルブリップ２５０ａおよび２５０ｂと対照的）。
【００８５】
図５は、本発明と関連するもう１つのプロセスチャンバー３４０の断面を描写する。ベース層３１３、中間層３１４、バルブ層３１６およびカバー層３１８を備えた試料プロセッシングデバイス３１０中にプロセスチャンバー３４０が形成される。いずれかの適切な技術の組み合わせによって、様々な層が互いに結合され得る。
【００８６】
層は単一の均質構造として描写されているが、複数の材料および／または層から１以上の層を形成可能であることは理解される。さらに、いくつかの層を組み合わせることが可能である。例えば、層３１３および３１４が組み合わされてもよい（例として、図２の断面図の層１４を参照のこと）。あるいは、例えば、成型、押出等によって形成可能な単一構造へと層３１４および３１６を組み合わせることが可能である。
【００８７】
図５に示される構造は、バルブセプタム３６４によってプロセスチャンバー３４０から分離されたバルブチャンバー３６０を備える。バルブチャンバー３６０は、カバー層３１８によってさらに画定される。デバイス３９０も図５に描写され、これは、例えばバルブセプタム３６４に開口を形成するために使用することができる。デバイス３９０は、例えばレーザー等であってよく、これは、カバー層３１８に開口を形成することなくバルブセプタム３６４に開口を形成するために必要なエネルギーを好ましく送達し得る。
【００８８】
バルブセプタム３６４に開口を形成するために必要とされるエネルギーがカバー層３１８を通して指向される場合、かかるエネルギーを妨害し得るいずれかの材料からベース層３１３が形成されてよい。例えば、ベース層３１３は金属ホイル等の材料から製造されてよい。バルブ層３１６および／またはバルブセプタム３６４が、選択された波長の光の十分量の流路を与える場合、バルブ層３１６および／またはバルブセプタム３６４を通してプロセスチャンバー３４０中の試料材料を検出することが可能となり得る。
【００８９】
あるいは、プロセスチャンバー３４０中の試料材料の検出が実行されないように、バルブ層３１６およびバルブセプタム３６４が光の流路を妨害する場合、ベース層３１３を通してプロセスチャンバー３４０中の試料材料を検出することが望ましい。図５に示されるように、層３１３を通してプロセスチャンバー３４０中の試料材料を検出することができる検出デバイス３９２を使用して、かかる検出を達成することができる。いくつかの例において、層３１３を通してエネルギーが指向されるデバイス３９２を使用して、バルブセプタム３６４に開口を形成することが可能である（プロセスチャンバー３４０中の試料材料を通るかかるエネルギー流路が許容される場合）。
【００９０】
全血を使用する方法の実例
本発明は、核含有細胞（例えば、白血球）内に含まれる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）を含む全血から核酸を単離する方法およびキットも提供する。
【００９１】
この方法は核酸を試料から単離させることに関するが、この方法が必ずしも核酸を核酸含有材料（例えば、核）から除去するわけではないことは理解されるべきである。すなわち、例えば核酸を核からさらに分離するために、さらに工程が必要とされてもよい。
【００９２】
本発明の特定の方法は、増幅反応（例えばＰＣＲ反応において使用される場合）を抑制し得るため望ましくないヘムおよびその分解生成物（例えば鉄塩）のような抑制物質から核酸を最終的に分離する工程を伴ってよい。具体的には、本発明の特定の方法は、試料中の核酸の少なくとも一部分を少なくとも一種類の抑制物質の少なくとも一部分から分離する工程を伴う。好ましい方法は、核酸が実質的に純粋であるように、核酸を含有する試料中の実質的に全ての抑制物質を除去する工程を伴い得る。例えば、鉄を含有する抑制物質の最終濃度は、好ましくは約０．８マイクロモル（μＭ）以下であり、これは従来のＰＣＲ系で耐容性を示す現在のレベルである。
【００９３】
全血からクリーンなＤＮＡを得るために、ヘモグロビンならびに血漿タンパク質を除去することが典型的に望ましい。赤血球が溶解されると、Ｔａｑポリメラーゼを抑制するヘムおよび関連化合物が遊離する。全血中の通常のヘモグロビン濃度は１００ミリリットル（ｍＬ）あたり１５グラム（ｇ）であり、これに基づき、溶血された全血中のヘム濃度は約１０ミリモル（ｍＭ）である。ＰＣＲで満足な分析が得られるように、ヘムの濃度はマイクロモル（μＭ）レベルまで低下されるべきである。例えば、これは希釈によって、または抑制物質を結合する材料を使用して抑制物質を除去することによって達成され得る。
【００９４】
一実施形態において、本発明は、全血から核酸を単離する方法を提供する。この方法は、装填チャンバーと可変性バルブ付きプロセスチャンバーとを備えたデバイスを提供する工程と；装填チャンバー中で全血を配置する工程と；全血をバルブ付きプロセスチャンバーへと転送する工程と；バルブ付きプロセスチャンバー中で全血を遠心分離にかけて、血漿層（しばしば、上層）と、赤血球層（しばしば、下層）と、白血球を含む界面層（血漿層と赤血球層との間に位置する）とを形成する工程と；界面層の少なくとも一部分を除去する工程と；分離された界面層中の白血球を溶解させ、そして任意にその中の核を溶解させて、抑制物質および／または核酸を遊離させる工程とを含む。特定の実施形態において、溶解工程は、任意に加熱しながら白血球に強塩基を受けさせて核酸を遊離させる工程を含む。所望であれば、この方法は、遊離核酸を含む試料のｐＨが７．５〜９の範囲内となるように調節する工程をさらに含み得る。あるいは、溶解工程は白血球に界面活性剤を受けさせる工程を含み得る。
【００９５】
従って所望であれば、白血球の溶解と同時にまたは後に、この方法は、抑制物質の少なくとも一部分を固体相材料へと優先的に接着させる固体相材料との接触のため、分離チャンバーへと分離された界面層を転送する工程を含み得る。具体的には、本方法の特定の実施形態において、デバイスはその中に固体相材料を有する分離チャンバーをさらに備える。固体相材料は、好ましくは捕獲部位（例えばキレート官能基）、固体相材料上に被覆されたコーティング試薬または両方を含み、ここでコーティング試薬は、界面活性剤、強塩基、高分子電解質、選択的浸透性高分子バリアおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９６】
固体相材料が存在する場合、この方法は、分離チャンバー中で溶解試料を固体相材料と接触させて抑制物質の少なくとも一部分を固体相材料に優先的に接着させる工程を含み；ここでは溶解工程が固体相材料への接触の前か、それと同時か、または後に生じ得る。この方法は典型的に、次いで、抑制物質の少なくとも一部分を接着させた固体相材料から核および／または核酸の少なくとも一部分を分離する工程を含む。
【００９７】
固体相材料が使用されない特定の実施形態において、この方法は、溶解試料を水（好ましくはＲＮＡ分解酵素を含まない無菌水）または緩衝液で希釈して、増幅法を妨害しない濃度まで抑制物質濃度を低下させる工程と；任意に核をさらに溶解させて核酸を遊離させる工程と；任意に試料を加熱してタンパク質を変性させる工程および任意に遊離された核酸を含む試料のｐＨを調整する工程と、任意にＰＣＲを実行する工程とを含み得る。ヘム濃度を２マイクロモル未満まで低下させるために十分な水で、希釈を達成することができる。あるいは、溶解試料の２倍〜１０００倍希釈物を形成するために十分な水で、希釈を達成することができる。
【００９８】
あるいは、所望であれば白血球を溶解させる前に、この方法は、試料の分離された界面層を水または緩衝液で希釈する工程と、任意に希釈された層をさらに濃縮して核酸材料の濃度を増加させる工程と、任意にさらに濃縮された領域を分離する工程と、任意に、希釈、次いで濃縮および分離が続くこのプロセスを繰り返して、増幅法を妨害しない濃度まで抑制物質濃度を低下させる工程とを含み得る。
【００９９】
図６を参照すると、これらの実施形態による用途のために適切なデバイスの１つの潜在的に好ましい実施形態の例は、装填チャンバー６７０、可変性バルブ付きプロセスチャンバー６７２、任意の分離チャンバー６７６、溶出試薬チャンバー６７８、廃棄物チャンバー６８０および任意の増幅チャンバー６８２を備える。全血試料が装填チャンバー６７０中へ装填され得、次いで、可変性バルブ付きプロセスチャンバー６７２へ転送され得るように、これらのチャンバーは互いに流体連通状態にある。バルブ付きプロセスチャンバー６７２中で全血を遠心分離にかけて、血漿層（しばしば上層）、赤血球層（しばしば下層）および白血球を含む界面層を形成する時に、界面層の少なくとも一部分（および好ましくは実質的な部分）が任意の分離チャンバー６７６へと転送されて、少なくとも赤血球層から、そして好ましくは全血の他の２層（血漿層および赤血球層）の両方から白血球（バフィーコート）を分離する。これは任意の廃棄物チャンバー６８０へと転送される。そこでバフィーコート中の白血球を溶解して、抑制物質ならびに核および／または核酸を遊離させることができる。分離チャンバー６７６が固体相材料を含む場合、このプロセスは、抑制物質の少なくとも一部分を固体相材料へと優先的に接着させる工程を含み得る。次いで標的の核酸含有材料および／または核酸の少なくとも一部分を除去するために、溶出試薬チャンバー６７８中の溶出試薬を分離チャンバー６７６へと転送する。特定の実施形態において、例えば、ＰＣＲプロセスを実行するための増幅反応チャンバー６８２へとこの材料を直接的に転送することができる。増幅反応チャンバー６８２は、増幅反応（例えばＰＣＲ）のための予め配置された反応物を任意に含み得る。
【０１００】
溶解試薬および条件
本発明の特定の実施形態に関して、プロセス間のいくつかの点で、試料内の細胞、特に核酸含有細胞（例えば、白血球、バクテリア細胞、ウィルス細胞）は溶解され、細胞内容物を遊離し、そして試料を形成する（すなわち可溶化液）。本明細書で使用される場合、細胞溶解は細胞膜の物理的分裂であり、ここで、細胞膜とは外側の細胞膜および存在する場合は核膜を指す。これは、プロテイナーゼの熱失活を伴うプロテイナーゼによる加水分解、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤またはドデシル硫酸ナトリウム）、グアニジニウム塩または強塩基（例えばＮａＯＨ）による処理、物理的分裂（例えば、超音波による）、煮沸、または冷凍／解凍プロセスを含み得る加熱／冷却（例えば、少なくとも５５℃（典型的に９５℃）まで加熱、および室温以下（典型的に８℃）まで冷却）のような標準的な技術を使用して実行可能である。溶解試薬が使用される場合、必要に応じて有機溶媒が使用され得るが、典型的に水性媒体中である。
【０１０１】
溶解剤（すなわち、溶解試薬）として水を使用することによって（すなわち水性希釈）、全血中の白血球（ＷＢＣ）を破壊することなく赤血球（ＲＢＣ）を溶解して、抑制物質を遊離することが可能である。あるいは、塩化アンモニウムまたは第四級アンモニウム塩もＲＢＣを破壊するために使用可能である。また低張緩衝液の使用によって、低張ショックによってＲＢＣを溶解することができる。完全なＷＢＣまたはそれらの核を、例えば遠心分離によって回収できる。
【０１０２】
典型的に、界面活性剤のようなより強い溶解試薬を使用して、ＲＢＣならびに核酸含有細胞（例えば、白血球（ＷＢＣ）、バクテリア細胞、ウィルス細胞）を溶解させ、抑制物質、核および／または核酸を遊離させることができる。例えば、非イオン性界面活性剤を使用して、核が完全なままでＲＢＣならびにＷＢＣを溶解させることができる。細胞を溶解させるために、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤および双性イオン性界面活性剤を使用することができる。非イオン性界面活性剤が特に有用である。所望であれば、界面活性剤の組み合わせを使用することができる。核の単離のため、サッカロースおよびマグネシウム塩を含有するトリス（ＴＲＩＳ）緩衝液に、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤を添加することができる。
【０１０３】
溶解のために使用される界面活性剤の量は、試料を有効に溶解させるために十分高いが、例えば沈殿を回避するように十分低い。溶解手順において使用される界面活性剤の濃度は、試料の総重量を基準として典型的に少なくとも０．１重量％である。溶解手順において使用される界面活性剤の濃度は、試料の総重量を基準として典型的に４．０重量％以下、そして好ましくは１．０重量％以下である。濃度は、通常、得られる混合物がＰＣＲに対して適合性を有しながら、可能な最短の時間で完全な細胞溶解が得られるように最適化される。実際に、ＰＣＲカクテルに添加される配合物中の核酸は、リアルタイムＰＣＲを抑制するべきではない。
【０１０４】
所望であれば、界面活性剤との混合物中に緩衝液を使用することができる。典型的に、かかる緩衝液は少なくとも７、そして典型的に９以下のｐＨの試料を提供する。
【０１０５】
典型的に、強塩基のようなさらにより強い溶解試薬を使用して、核酸含有細胞（白血球のような）に含有されるいずれの核も溶解させて核酸を遊離することができる。例えば、米国特許第５，６２０，８５２号明細書（リン（Ｌｉｎ）ら）に記載の方法は、１分程度の短い時間枠で室温でのアルカリ処理（例えばＮａＯＨ）によって全血からＤＮＡの抽出を伴う方法であるが、本発明の特定の方法に適合し得る。一般的に、多種多様の強塩基を使用して、アルカリ細胞溶解手順において有効なｐＨ（例えば８〜１３、好ましくは１３）を生じ得る。強塩基は典型的に、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、ＫＯＨのような水酸化物；第四級窒素含有カチオン（例えば、第四級アンモニウム）による水酸化物、ならびに第三級、第二級または第一級アミンのような塩基である。典型的に強塩基の濃度は少なくとも０．０１規定（Ｎ）であり、そして典型的に１Ｎ以下である。次いで、特に核酸にＰＣＲを受けさせる場合、典型的に混合物を中和することができる。もう１つの手順において、塩基による溶解に続いて加熱を使用して、タンパク質特性をさらに変性し、その後に試料を中和することができる。
【０１０６】
加熱しながらプロテイナーゼＫを使用して、その後、より高温でプロテイナーゼＫを熱失活させて、核またはＷＢＣから核酸を単離することも可能である。
【０１０７】
所望であれば、例えば、マイクロ流体の寸法にスケール減少されたシグマズ  エクザクト−Ｎ−アンプ  ブラッド  ＰＣＲ  キット（Ｓｉｇｍａ’ｓ  Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  ＰＣＲ  ｋｉｔ）のような市販品として入手可能な溶解剤および中和剤を使用することも可能である。ブドウ球菌、連鎖球菌等のような困難なバクテリアを溶解させるため、ジェンポイント（ＧｅｎＰｏｉｎｔ）（ノルウェー、オスロ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））からパワーリス（ＰＯＷＥＲＬＹＳＥ）のようなより強い溶解溶液を使用することは、本発明の特定の方法において有利となり得る。
【０１０８】
もう１つの手順において、煮沸方法を使用して、同時に細胞および核を溶解させ、ＤＮＡを遊離し、そしてヘモグロビンを沈殿させることができる。上澄み中のＤＮＡを濃縮工程なしでＰＣＲに直接的に使用することができるため、低コピー数試料に関してこの手順は有用となる。
【０１０９】
伝染病に関して、全血からバクテリアまたはウイルスを分析する必要がある。例えばバクテリアの場合、白血球はバクテリア細胞と関連して存在し得る。デバイス中で赤血球を溶解させて抑制物質を遊離させることが可能であり、次いで例えば、さらなる溶解の前に遠心分離によってバクテリア細胞および白血球を分離することができる。核酸含有細胞のこの濃縮スラグ（バクテリアおよび白血球／核）を、抑制物質を除去するためのチャンバーへと移動させることができる。次いで、例えば、バクテリア細胞を溶解することができる。
【０１１０】
種類次第で加熱を使用してバクテリア細胞溶解を達成してよい。あるいは、酵素法（例えばリソチーム、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ））または化学的方法を使用してバクテリア細胞溶解が生じ得る。好ましくは、バクテリア細胞はアルカリ細胞溶解によって溶解される。
【０１１１】
プラスミド増殖のためのバクテリアの使用は、ゲノム学、分析分子生物学、予備分子生物学等の研究で共通である。プラスミドを含有するバクテリアの場合、バクテリアおよびプラスミドの両方からの遺伝物質が存在する。ゲノムＤＮＡから細胞タンパク質および細胞断片を分離するクリーンアップ手順は、本発明の方法を使用して実行可能である。そのようにして得られたプラスミドＤＮＡを含有する上澄みは、「クリアな可溶化液（ｃｌｅａｒｅｄ  ｌｙｓａｔｅ）」と呼ばれる。アニオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過またはアルコールによる沈殿のような様々な手段を使用して、クリアな可溶化液をさらに精製することができる。
【０１１２】
デバイス中に組み入れることができるバクテリアの培養手順の具体例において、大腸菌細胞培養液を遠心分離にかけ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ＴＲＩＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で再懸濁し、そして０．１Ｍ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の添加によって溶解させる。３Ｍ（３モル）酢酸カリウム（ｐＨ４．８）の１体積の添加によって細胞溶解は停止され、そして上澄みを遠心分離にかける。細胞可溶化液をさらに精製して、クリーンなプラスミドＤＮＡを得る。
【０１１３】
血漿および血清は、ウイルスを含む分子試験のために提出される大多数の試験片を表す。全血の分画後、ウイルス（すなわちウィルス粒子）の抽出のために血漿または血清試料を使用することができる。例えば、ウイルスからＤＮＡを単離するために、血液を回転させることによって血清から最初に分離することが可能である。可変性バルブの使用によって、血清を単独でもう１つのチャンバーへと移動することが可能である。次いで、血清を遠心分離にかけてウイルスを濃縮するか、または、例えば本明細書で記載されるような固体相材料を使用して抑制物質を除去した後、その次の細胞溶解工程で直接使用することができる。ウイルス粒子が材料を通過しないように、固体相材料は溶液を吸収可能である。次いでウイルス粒子を少量の溶出体積で抽出除去することができる。加熱または、酵素または化学的手段によって、例えば、界面活性剤の使用によってウイルスを溶解することが可能であり、そしてＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲのようなダウンストリームの適用に使用することができる。ウィルスＲＮＡが必要とされる場合、ＲＮＡの分解を防止するために溶液に添加されたＲＮＡ分解酵素抑制物質を有する必要がある。
【０１１４】
任意の固体相材料
本発明の特定の実施形態に関して、いずれかの形態（例えば、粒子、フィブリル、膜）の、好ましくは、それに結合された捕獲部位（例えばキレート官能基）、固体相材料上で被覆されたコーティング試薬（好ましくは界面活性剤）または両方を有する固体マトリックスを含む固体相材料に抑制物質が接着されることが見出された。コーティング試薬はカチオン性、アニオン性、非イオン性または双性イオン性界面活性剤であり得る。あるいはコーティング試薬は高分子電解質または強塩基であり得る。所望であれば、コーティング試薬の様々な組み合わせを使用することができる。
【０１１５】
本発明の方法において有用な固体相材料は、例えばヘムおよびヘム分解生成物、特に鉄イオンのような抑制物質を保持する多種多様な有機および／または無機材料を含み得る。かかる材料は捕獲部位（好ましくはキレート基）で官能化されるか、一種以上のコーティング試薬（例えば界面活性剤、高分子電解質または強塩基）で被覆されるか、または両方である。典型的に、固体相材料は有機高分子マトリックスを含む。
【０１１６】
一般的に適切な材料は化学的に不活性であって、物理的および化学的に安定しており、そして様々な生体試料に適応性を有する。固体相材料の例としては、シリカ、酸化ジルコニウム、アルミナビーズ、金のような金属コロイド、例えば捕獲部位を生じるためにメルカプト化学によって官能化された金被覆シートが挙げられる。適切な高分子の例としては、例えばポリオレフィンおよびフッ素化高分子が挙げられる。固体相材料は、典型的に使用前に塩および他の汚染物質を除去するために洗浄される。それは乾燥保存することも、すぐに使用できるように水性懸濁液中で保存することもできる。固体相材料は、好ましくは例えば、ピペット、シリンジもしくはより大きいカラム、マイクロタイタープレートまたは他のデバイスのような流入式容器で使用されるが、かかる入れ物を伴わない懸濁液方法も使用可能である。
【０１１７】
本発明の方法において有用な固体相材料は、多種多様の材料を多種多様の形態で含み得る。それは例えば、自由状態であっても固定されてもよい粒子またはビーズ、繊維、フォーム、フリット、微孔性フィルム、膜、またはマイクロ複製された（ｍｉｃｒｏｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ）表面を有する基材の形態であってよい。固体相材料が粒子を含む場合、良好な流体流れ特性を確実にするために、それらは好ましくは均一な球形で、かつ剛性である。
【０１１８】
本発明の流入式適用に関して、かかる材料は典型的に自由状態で多孔性の網状組織の形態であって、大きい分子の均一かつ損なわれない出入りを可能にし、そして大きい表面積を提供する。好ましくは、かかる適用に関して、固体相材料は、例えば１グラムあたり１平方メートル（ｍ2／ｇ）を超えるような比較的高い表面積を有する。流入式デバイスの使用を含まない適用に関して、固体相材料が多孔性マトリックス中にあっても、またはなくてもよい。従って、膜も本発明の特定の方法において有用であり得る。
【０１１９】
粒子またはビーズを使用する適用に関して、それらは試料、または粒子／ビーズの床に導入された試料に導入されてよく、そして例えば遠心分離によってそこから除去することができる。あるいは、様々な方法（例えばスプレー乾燥）によって接着剤で任意に被覆された不活発な基材（例えばポリカーボネートまたはポリエチレン）上へ粒子／ビーズを被覆（例えばパターン被覆）することができる。所望であれば、表面積の増加およびクリーンアップの強化のために基材をマイクロ複製することができる。また酸素プラズマ、電子ビームまたは紫外線放射線、熱またはコロナ処理プロセスによって前処理しておくことも可能である。この基材を例えばカバーフィルムとして使用することができるか、またはデバイス中の貯蔵器上のカバーフィルムに積層することができる。
【０１２０】
一実施形態において、固体相材料はフィブリルマトリックスを含み、これは、その内部に巻き込まれた粒子を有しても有さなくてもよい。フィブリルマトリックスは、多種多様な繊維のいずれかを含み得る。典型的に繊維は水性環境において不溶性である。例としては、ガラス繊維、ポリオレフィン繊維、特にポリプロピレンおよびポリエチレンマイクロ繊維、アラミド繊維、フッ素化高分子、特にポリテトラフルオロエチレン繊維および天然セルロース繊維が挙げられる。繊維の混合物は使用可能であり、それは核酸の結合に対して活性であっても不活発であってもよい。好ましくは、フィブリルマトリックスは少なくとも約１５ミクロン、そして約１ミリメートル以下、そしてより好ましくは約５００ミクロン以下の厚さであるウェブを形成する。
【０１２１】
使用される場合、粒子は水性環境において典型的に不溶性である。それらは、一種の材料から、または被覆された粒子の場合のように材料の組み合わせから製造可能である。それらは膨潤性または非膨潤性であり得るが、好ましくは、それらは水および有機液体において非膨潤性である。好ましくは、粒子が接着している場合、それは非膨潤性の疎水性材料から製造される。それらは核酸への親和力に関して選択され得る。いくつかの水膨潤性粒子の例は、米国特許第４，５６５，６６３号明細書（エレド（Ｅｒｒｅｄｅ）ら）、米国特許第４，４６０，６４２号明細書（エレド（Ｅｒｒｅｄｅ）ら）および米国特許第４，３７３，５１９号明細書（エレド（Ｅｒｒｅｄｅ）ら）に記載される。水中で非膨潤性である粒子は、米国特許第４，８１０，３８１号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）、米国特許第４，９０６，３７８号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）、米国特許第４，９７１，７３６号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）および米国特許第５，２７９，７４２号明細書（マーケル（Ｍａｒｋｅｌｌ）ら）に記載される。好ましい粒子は、ポリプロピレン粒子（例えば、粉末）のようなポリオレフィン粒子である。粒子の混合物は使用可能であり、それは核酸の結合に対して活性であっても不活発であってもよい。
【０１２２】
被覆された粒子が使用される場合、好ましくはコーティングは水不溶性または有機不溶性の非膨潤性材料である。コーティングは核酸が接着するものであっても、またはしないものでもよい。従って、被覆されるベース粒子は無機または有機であり得る。ベース粒子は、シリカ、アルミナ、チタニア、酸化ジルコニウム等のような無機酸化物を含み得、それに対して有機基が共有結合される。例えば、鎖長（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８基）の異なる脂肪族基のような共有結合された有機基が使用可能である。
【０１２３】
フィブリルマトリックスを含む適切な固体相材料の例としては、米国特許第５，２７９，７４２号明細書（マーケル（Ｍａｒｋｅｌｌ）ら）、米国特許第４，９０６，３７８号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）、米国特許第４，１５３，６６１号明細書（リー（Ｒｅｅ）ら）、米国特許第５，０７１，６１０号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）、米国特許第５，１４７，５３９号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）、米国特許第５，２０７，９１５号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）および米国特許第５，２３８，６２１号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）に記載される。かかる材料は、３Ｍ  カンパニー（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミネソタ州セントポール（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））から商標名ＳＤＢ−ＲＰＳ（スチレン-ジビニルベンゼン逆相スルホネート（Ｓｔｙｒｅｎｅ−Ｄｉｖｉｎｙｌ  Ｂｅｎｚｅｎｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（３Ｍ製品番号２２４１））、カチオン−ＳＲ膜（３Ｍ製品番号２２５１）、Ｃ−８膜（３Ｍ製品番号２２１４）およびアニオン−ＳＲ膜（３Ｍ製品番号２２５２）で市販品として入手可能である。
【０１２４】
ポリテトラフルオロエチレンマトリックス（ＰＴＦＥ）を含むものが特に好ましい。例えば米国特許第４，８１０，３８１号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）は、ポリテトラフルオロエチレンフィブリルマトリックスおよびマトリックス中に巻き込まれた非膨潤性吸着粒子を含む固体相材料を開示する。ここで、非膨潤性吸着粒子とポリテトラフルオロエチレンとの比率は重量で１９：１〜４：１であり、そしてさらに複合固体相材料が１メートルあたり２０〜３００ミリニュートンの範囲で正味表面エネルギーを有する。米国再発行特許第３６，８１１号明細書（マーケル（Ｍａｒｋｅｌｌ）ら）は、ＰＴＦＥフィブリルマトリックスおよびマトリックス中に巻き込まれた吸着粒子を含む固体相抽出媒体を開示する。ここで粒子は３０重量％超かつ１００重量％までの多孔性有機粒子と、７０重量％未満〜０重量％の多孔性無機（有機被覆されたか、または被覆されていない）粒子とを含み、吸着粒子とＰＴＦＥとの比率は重量で４０：１〜１：４である。
【０１２５】
特に好ましい固体相材料は、３Ｍ  カンパニー（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミネソタ州セントポール（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））から商標名エンポア（ＥＭＰＯＲＥ）で入手可能である。エンポア（ＥＭＰＯＲＥ）の技術の基礎は、いずれかの吸収剤粒子を使用して、粒子が装填された膜またはディスクを製造する機能である。粒子はポリテトラフルオロエチレンの不活性マトリックス内で一緒に密接に保持される（９０重量％吸収剤：１０重量％ＰＴＦＥ）。ＰＴＦＥフィブリルは、いずれの形態であっても粒子の活性を妨害しない。エンポア（ＥＭＰＯＲＥ）膜製造プロセスでは、同一サイズ粒子で調製された従来の固体相抽出（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ＳＰＥ）カラムまたはカートリッジにおいて達成できるものよりも高密度で均一な抽出媒体が得られる。
【０１２６】
好ましいもう１つの実施形態において、固体相（例えば、微孔性熱可塑性高分子支持体）は、フィブリルによって連結された熱可塑性物質高分子の、複数の間隔をあけられ、ランダムに分散し、不均一性の形状を有し、等軸である粒子を特徴とする微孔構造を有する。粒子は互いに間隔をあけて配置され、その間で微孔網状組織を提供する。各粒子から隣接粒子まで放射するフィブリルによって粒子は互いに連結する。粒子またはフィブリルの一方または両方が疎水性であってもよい。かかる材料の好ましい例は高い表面積を有し、しばしばＨｇ表面積技術で測定される４０平方メートル／グラム程度の高さであり、そして約５ミクロンまでの孔サイズを有する。
【０１２７】
相分離誘発の使用を伴う好ましい技術によって、この種類の繊維材料を製造することができる。これは、均一な混合物を形成するために十分な温度で熱可塑性高分子と非混和性液体とを溶融ブレンドする工程と、溶液から所望の形状へと物品を形成する工程と、液体および高分子の相分離を誘発するように成形物品を冷却して、最終的に高分子を凝固して液体の実質的な部分を除去し、微孔性高分子マトリックスを残す工程とを伴う。この方法および好ましい材料は、米国特許第４，７２６，９８９号明細書（ムロジンスキー（Ｍｒｏｚｉｎｓｋｉ））、米国特許第４，９５７，９４３号明細書（マカリスター（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ）ら）および米国特許第４，５３９，２５６号明細書（シップマン（Ｓｈｉｐｍａｎ））に詳述される。かかる材料は熱的に誘発された相分離膜（ＴＩＰＳ膜）と呼ばれ、特に好ましい。
【０１２８】
他の適切な固体相材料としては、米国特許第５，３２８，７５８号明細書（マーケル（Ｍａｒｋｅｌｌ）ら）に開示されるような不織材料が挙げられる。この材料は、収着効率の高いクロマトグラフィ級粒子を含む圧縮または溶融粒子含有不織ウェブ（好ましくはブローンマイクロ）を含む。
【０１２９】
他の適切な固体相材料としては、ＨＩＰＥフォーム（ＨＩＰＥ  Ｆｏａｍｓ）として既知のものが挙げられる。これは、例えば米国特許公報第２００３／００１１０９２号明細書（タン（Ｔａｎ）ら）に記載されている。「ＨＩＰＥ」または「高内相エマルジョン」は、連続反応相、典型的に油相と、油相と非混和性である不連続または共連続相、典型的に水相とを含み、非混和性の相がエマルジョンの少なくとも７４体積％で含まれるエマルジョンを意味する。典型的に、ＨＩＰＥから製造される多くの高分子フォームは相対的に連続気泡状である。これは、ほとんどまたは全ての気泡が、隣接する気泡と遮断のない連絡状態にあることを意味する。かかる実質的に連続気泡状のフォーム構造の中の気泡は、フォーム構造内で１個の気泡からもう１個への流体転送を可能にするために十分な典型的に大きい細胞間ウインドウを有する。
【０１３０】
固体相材料は、抑制物質に対する捕獲部位を含み得る。本明細書において「捕獲部位」とは、共有結合によって結合された基（例えば官能基）、または非共有結合（例えば疎水性）によって固体相材料に結合された分子を指す。
【０１３１】
好ましくは、固体相材料は抑制物質を捕獲する官能基を含む。例えば、固体相材料はキレート基を含み得る。この文脈において、「キレート基」は多座であり、そして金属原子またはイオンとキレート錯体を形成可能であるものである（抑制物質はキレート化機構によって固体相材料上に保持されても、されなくてもよい）。キレート基の組み入れは様々な技術によって達成され得る。例えば不織材料は、キレート基によって官能化されたビーズを保持し得る。あるいは、不織材料の繊維をキレート基によって直接的に官能化することができる。
【０１３２】
キレート基の例としては、例えば−（ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）2、トリス（２−アミノエチル）アミン基、イミノ二酢酸基、ニトリロ三酢酸基が挙げられる。様々な技術によって、キレート基を固体相材料中に組み入れることができる。材料を化学的に合成することによって、それらを組み入れることができる。あるいは、所望のキレート基を含有する高分子を不活性な基材（例えばポリカーボネートまたはポリエチレン）上に被覆することができる（例えばパターン被覆）。所望であれば、表面積の増加およびクリーンアップの強化のために基材をマイクロ複製することができる。また酸素プラズマ、電子ビームまたは紫外線放射線、熱またはコロナ処理プロセスによって前処理することも可能である。この基材を例えばカバーフィルムとして使用することができるか、またはデバイス中の貯蔵器上のカバーフィルムに積層することができる。
【０１３３】
キレート固体相材料は市販品として入手可能であり、そして本発明の固体相材料として使用可能である。例えば本発明の特定の実施形態に関して、イミノ二酢酸（ナトリウム塩型）のようなキレート基を含むエンポア（ＥＭＰＯＲＥ）膜が好ましい。かかる膜の例は米国特許第５，１４７，５３９号明細書（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら）に開示されており、そして３Ｍ  カンパニー（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からエンポア  エクストラクション  ディスク（ＥＭＰＯＲＥ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｉｓｋｓ）（４７ｍｍ、Ｎｏ．２２７１または９０ｍｍ、Ｎｏ．２３７１）として市販品として入手可能である。本発明の特定の実施形態に関して、キレート基を含むアンモニア誘導体化されたエンポア（ＥＭＰＯＲＥ）膜が好ましい。ディスクをアンモニウム型にするため、ｐＨ５．３の０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液５０ｍＬで洗浄して、続いて数回、試薬水で洗浄することができる。
【０１３４】
他のキレート材料の例としては、限定されないが、バイオ−ラド  ラボラトリーズ，インコーポレイテッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））から商標名ケレックス（ＣＨＥＬＥＸ）で入手可能な架橋されたポリスチレンビーズ、トリス（２−アミノエチル）アミン、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ポリアミンおよびポリイミンによって架橋されたアガロースビーズ、ならびにローム  アンド  ハース（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）（ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））から商標名デュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）Ｃ−４６７およびデュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）ＧＴ７３、アンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）ＩＲＣ−７４８、ダイアイオン（ＤＩＡＩＯＮ）ＣＲ１１、デュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）Ｃ６４７で市販品として入手可能なキレートイオン交換樹脂が挙げられる。
【０１３５】
典型的に、固体相材料上でのキレート基の所望の濃度密度は１平方ミリメートルあたり約０．０２ナノモルであるが、より広範囲の濃度密度が可能であると考えられる。
【０１３６】
他の種類の捕獲材料としては、アニオン交換材料、カチオン交換材料、活性化炭素、逆相、順相、スチレン−ジビニルベンゼン、アルミナ、シリカ、ジルコニアおよび金属コロイドが挙げられる。適切なアニオン交換材料の例としては、塩化物型の第四級アンモニウム、ジメチルエタノールアミン、第四級アルキルアミン、トリメチルベンジルアンモニウムおよびジメチルエタノールベンジルアンモニウムのような強アニオン交換体およびポリアミンのような弱アニオン交換体が挙げられる。適切なカチオン交換材料の例としては、典型的にナトリウム型のスルホン酸のような強カチオン交換体および典型的に水素型のカルボン酸のような弱カチオン交換体が挙げられる。適切な炭素をベースとする材料の例としては、エンポア（ＥＭＰＯＲＥ）炭素材料、炭素ビーズが挙げられる。適切な逆相Ｃ８およびＣ１８材料の例としては、オクタデシル基またはオクチル基によってエンドキャップされたシリカビーズ、ならびにＣ８およびＣ１８シリカビーズを有するエンポア（ＥＭＰＯＲＥ）材料（エンポア（ＥＭＰＯＲＥ）材料はミネソタ州セントポール（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）の３Ｍ  カンパニー（３Ｍ  Ｃｏ．）から入手可能である）が挙げられる。順相材料の例は、ヒドロキシ基およびジヒドロキシ基を含む。
【０１３７】
また市販品として入手可能な材料は、本発明の方法において変性可能であるか、または直接使用可能である。例えば、商標名リス  アンド  ゴー（ＬＹＳＥ  ＡＮＤ  ＧＯ）（イリノイ州、ロックフォード、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））、リリース−イット（ＲＥＬＥＡＳＥ−ＩＴ）（ニュージャージー州（ＮＪ）、ＣＰＧ）、ジーン  フィズ（ＧＥＮＥ  ＦＩＺＺ）（フランス、ユーロバイオ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ））、ジーン  リリーサー（ＧＥＮＥ  ＲＥＬＥＡＳＥＲ）（テネシー州、マーフリーズバラ、バイオベンチャー  インコーポレイテッド（Ｂｉｏｖｅｎｔｕｒｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｕｒｆｒｅｅｓｂｏｒｏ，ＴＮ））およびバグズ  Ｎ  ビーズ（ＢＵＧＳ  Ｎ  ＢＥＡＤＳ）（ノルウェー、オスロ、ジェンポイント（ＧｅｎＰｏｉｎｔ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、ならびにザイモズ  ビーズ（Ｚｙｍｏ’ｓ  ｂｅａｄｓ）（カリフォルニア州、オレンジ、ザイモ  リサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））およびダイナルズ  ビーズ（Ｄｙｎａｌ’ｓ  ｂｅａｄｓ）（ノルウェー、オスロ、ダイナル（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））で入手可能な固体相材料を本発明の方法に、特にデバイス中に固体相の捕獲材料として組み入れることができる。
【０１３８】
かかる方法の特定の実施形態において、固体相材料はコーティング試薬を含む。コーティング試薬は、好ましくは界面活性剤、強塩基、高分子電解質、選択的浸透性高分子バリアおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。かかる方法の特定の実施形態において、固体相材料はポリテトラフルオロエチレンフィブリルマトリックス、マトリックス中に巻き込まれた吸着粒子および固体相材料上で被覆されたコーティング試薬を含み、コーティング試薬は、界面活性剤、強塩基、高分子電解質、選択的浸透性高分子バリアおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。本明細書において、「固体相材料上で被覆されたコーティング試薬」という句は、固体相材料の少なくとも一部分上に、例えばフィブリルマトリックスおよび／または吸着粒子の少なくとも一部分上に被覆された材料を指す。
【０１３９】
適切な界面活性剤の例を以下に記載する。
【０１４０】
適切な強塩基の例としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、ならびに第一級、第二級または第三級アミンが挙げられる。
【０１４１】
適切な高分子電解質の例としては、ポリスチレンスルホン酸（例えば、ポリ（４-スチレンスルホン酸ナトリウム）またはＰＳＳＡ）、ポリビニルホスホン酸、ポリビニルホウ酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレンホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、リグノスルホン酸塩、カラギーナン、ヘパリン、コンドリチン（ｃｈｏｎｄｒｉｔｉｎ）スルフェートおよびそれらの塩または他の誘導体が挙げられる。
【０１４２】
適切な選択的浸透性高分子バリアの例としては、アクリレート、アクリルアミド、アズラクトン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、多糖類のような高分子が挙げられる。かかる高分子は様々な形態であり得る。それらは水溶性、水膨潤性、水不溶性、ヒドロゲル等であり得る。例えば、白血球、核、ウイルス、バクテリアならびにヒトゲノムＤＮＡおよびタンパク質のような核酸のようなより大きい粒子のフィルタとして作用するように高分子バリアを調製することができる。官能性基の適切な選択によって、架橋によって等でサイズおよび／または電荷に基づいて分離するために、当業者はこれらの表面を調整することができる。当業者はかかる材料を容易に入手可能であるか、または調製するだろう。
【０１４３】
好ましくは固体相材料を界面活性剤で被覆するが、所望であれば他のコーティング試薬はすすぎ除去されるが、いずれの界面活性剤も過剰に洗浄除去されない。典型的に、浸漬、回転、スプレー等のような様々な方法を使用してコーティングを実行することができる。次いで、例えば使用前に空気中で、コーティング試薬が装填された固体相材料を乾燥させる。
【０１４４】
界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤で被覆された固体相材料が特に望ましい。これは、実施例の項目で明らかにされる手順に従って達成することができる。理論に制限される意図はないが、界面活性剤の添加が固体相材料の湿潤性を増加して、それによって抑制物質が固体相材料中に浸漬され、そこに結合されると考えられる。
【０１４５】
固体相材料のコーティング試薬は、好ましくは水性溶液であるが、所望であれば有機溶媒（アルコール等）を使用可能である。試料が固体相材料を湿潤可能であるように、コーティング試薬の装填は十分に高くなければならない。しかしながら、コーティング試薬の著しい溶出があるほど高くてはならない。コーティング試薬が核酸で抽出される場合、好ましくは抽出試料中のコーティング試薬は約２重量％以下である。典型的にコーティング溶液濃度は、０．１重量％程度の低さの溶液中コーティング試薬および１０重量％程度の高さの溶液中コーティング試薬であり得る。
【０１４６】
界面活性剤
非イオン性界面活性剤。溶解試薬（上記で説明された）、溶出試薬（下記で説明される）および／または固体相材料上のコーティングとして使用可能である多種多様の適切な非イオン性界面活性剤は既知である。例えばポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル界面活性剤、カルボン酸アミド界面活性剤等が挙げられる。市販品として入手可能な非イオン性界面活性剤としては、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デカノイルスクロース、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクタノイルスクロース、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マルトシド、ジギトニン、および商標名プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）、トィーン（ＴＷＥＥＮ）で入手可能であるもの、ならびに多数の他の市販品として入手可能であるものおよびカーク  オスマー  テクニカル  エンサイクロ（登録商標）ペディア（Ｋｉｒｋ  Ｏｔｈｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）に記載のものが挙げられる。以下の表１に例を記載する。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレン界面活性剤である。より好ましい界面活性剤としては、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが挙げられる。
【０１４７】
【表１】
2011013237.tif 000002
【０１４８】
また米国特許公報第２００３／０１３９５５０号明細書（サブ（Ｓａｖｕ）ら）および米国特許公報第２００３／０１３９５４９号明細書（サブ（Ｓａｖｕ）ら）に開示される種類のフッ素化非イオン性界面活性剤も適切である。他の非イオン性フッ素化界面活性剤としては、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウェア州、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））から商標名ゾニル（ＺＯＮＹＬ）で入手可能なものが挙げられる。
【０１４９】
双性イオン性界面活性剤。固体相材料上のコーティング、溶解試薬および／または溶出試薬として使用可能である多種多様の適切な双性イオン性界面活性剤が既知である。例えばアルキルアミドベタインおよびそれらのアミンオキシド、アルキルベタインおよびそれらのアミンオキシド、スルホベタイン、ヒドロキシスルホベタイン、アンホグリシネート（ａｍｐｈｏｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、アンホプロピオネート（ａｍｐｈｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、平衡アンホポリカルボキシグリシネート（ｂａｌａｎｃｅｄ  ａｍｐｈｏｐｏｌｙｃａｒｂｏｘｙｇｌｙｃｉｎａｔｅ）およびアルキルポリアミノグリシネートが挙げられる。タンパク質は、ｐＨ次第で荷電されるか、または未荷電である性能を有し；従って、適切なｐＨでタンパク質は、好ましくは約８〜９のｐＩで例えば変性ウシ血清アルブミンまたはキモトリプシノーゲンは双性イオン性界面活性剤として機能し得る。双性イオン性界面活性剤の具体例は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から商標名チャップス（ＣＨＡＰＳ）で入手可能なクラミド（ｃｈｏｌａｍｉｄｏ）プロピルジメチルアンモニウムプロパンスルホネートである。より好ましい界面活性剤としては、Ｎ−ドデシルＮ，Ｎジメチル−３−アンモニア１−プロパンスルホネートが挙げられる。
【０１５０】
カチオン性界面活性剤。溶解試薬、溶出試薬および／または固体相材料上のコーティングとして使用可能である多種多様の適切なカチオン性界面活性剤は既知である。例えば第四級アンモニウム塩、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびアルキルアミンオキシドが挙げられる。典型的に適切な第四級アンモニウム塩は少なくとも１個の高分子量の基を含み、そして２個または３個のより低分子量の基が共通の窒素原子に結合してカチオンを生じ、ここで電気的に釣り合いの取れたアニオンは、ハライド（ブロミド、クロリド等）、アセテート、ニトリトおよび低級アルコスルフェート（メトスルフェート等）からなる群から選択される。窒素上のより高分子量の置換基は、約１０個〜約２０個の炭素原子を含有するより高級のアルキル基であることが多く、そしてより低分子量の置換基は、メチルまたはエチルのような約１個〜約４個の炭素原子のより低級のアルキルであってよく、これはいくつかの例において例えばヒドロキシで置換されていてもよい。１個以上の置換基がアリール部分を含んでもよく、またはベンジルもしくはフェニルのようなアリールで置換されていてもよい。中でも可能なより低分子量の置換基は、ポリオキシエチレン部分のような低級ポリアルコキシ部分で置換されたメチルおよびエチルのような約１個〜約４個の炭素原子の低級アルキルであり、ヒドロキシル末端基を有し、次一般式：
Ｒ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）(n-1)ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
（式中、Ｒは窒素に結合された（Ｃ1−Ｃ4）二価アルキル基であり、そしてｎは約１〜約１５の整数を表す）の範囲内である。あるいは末端ヒドロキシルを有するかかるより低級のポリアルコキシ部分の１個または２個は、前記されたより低級のアルキルを通して結合される代わりに、第四級窒素に直接結合されていてもよい。本発明での使用のために有用な第四級アンモニウムハライド界面活性剤の例としては、限定されないが、アクゾ  ケミカル  インコーポレイテッド（Ａｋｚｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）からのメチル−ビス（２−ヒドロキシエチル）ココ−アンモニウムクロリドまたはオレイル−アンモニウムクロリド（それぞれ、エトクワド（ＥＴＨＯＱＵＡＤ）Ｃ／１２およびＯ／１２）、ならびにメチルポリオキシエチレン（１５）オクタデシルアンモニウムクロリド（エトクワド（ＥＴＨＯＱＵＡＤ）１８／２５）が挙げられる。
【０１５１】
アニオン性界面活性剤。溶解試薬、溶出試薬および／または固体相材料上のコーティングとして使用可能である多種多様の適切なアニオン性界面活性剤は既知である。有用であるアニオン型界面活性剤としては、アルキルスルフェート、アルキルエーテルスルフェート、アルキルスルホネート、アルキルエーテルスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルベンゼンエーテルスルフェート、アルキルスルホアセテート、第二級アルカンスルホネート、第二級アルキルスルフェート等のようなスルホネートおよびスルフェートが挙げられる。これらの多くは、ポリアルコキシレート基（例えばエチレンオキシド基および／またはプロピレンオキシド基、これはランダム、連続またはブロック配列であり得る）ならびに／あるいはＮａ、Ｋ、Ｌｉ、アンモニウム、トリエタノールアミンのようなプロトン化第三級アミンまたは第四級アンモニウム基のようなカチオン対イオンを含み得る。例としては、ステパン  カンパニー（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（イリノイ州、ノースフィールド（Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬ））から商標名ポリステップ（ＰＯＬＹＳＴＥＰ）Ｂ１２およびＢ２２で入手可能なラウリルエーテルスルフェートならびに日光ケミカルズ（日本、東京）から商標名ニッコル（ＮＩＫＫＯＬ）ＣＭＴ３０で入手可能なナトリウムメチルタウレートのようなアルキルエーテルスルホネート；クラリアント  コーポレイション（Ｃｌａｒｉａｎｔ  Ｃｏｒｐ．）（ノースカロライナ州、シャーロット（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ））からのナトリウム（Ｃ１４〜Ｃ１７）第二級アルカンスルホネート（アルファ−オレフィンスルホネート）である商標名ホスタプア（ＨＯＳＴＡＰＵＲ）ＳＡＳで入手可能な第二級アルカンスルホネート；ステパン  カンパニー（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から商標名アルファスト（ＡＬＰＨＡＳＴＥ）ＰＣ−４８で入手可能なナトリウムメチル−２−スルホ（Ｃ１２〜Ｃ１６）エステルおよび二ナトリウム２−スルホ（Ｃ１２〜Ｃ１６）脂肪酸のようなメチル−２−スルホアルキルエステル；両方ともステパン  カンパニー（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏ．）から、ナトリウムラウリルスルホアセテート（商標名ランタノール（ＬＡＮＴＨＡＮＯＬ）ＬＡＬ）および二ナトリウムラウレススルホスクシネート（商標名ステパンマイルド（ＳＴＥＰＡＮＭＩＬＤ）ＳＬ３）として入手可能なアルキルスルホアセテートおよびアルキルスルホスクシネート；ならびにステパン  カンパニー（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏ．）から商標名ステパノール（ＳＴＥＰＡＮＯＬ）ＡＭで市販品として入手可能なアンモニウムラウリルスルフェートのようなアルキルスルフェートが挙げられる。
【０１５２】
もう一種類の有用なアニオン性界面活性剤としては、アルキルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アラルキルホスフェートおよびアラルキルエーテルホスフェートのようなホスフェートが挙げられる。これらの多くは、ポリアルコキシレート基（例えばエチレンオキシド基および／またはプロピレンオキシド基、これはランダム、連続またはブロック配列であり得る）を含み得る。例としては、一般的にトリラウレス−４−ホスフェートと呼ばれ、クラリアント  コーポレイション（Ｃｌａｒｉａｎｔ  Ｃｏｒｐ．）から商標名ホスタファト（ＨＯＳＴＡＰＨＡＴ）３４０ＫＬで市販品として入手可能であるモノ−、ジ−およびトリ−（アルキルテトラグリコールエーテル）−ｏ−リン酸エステルの混合物、ならびにクロダ  インコーポレイテッド（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．）（ニュージャージー州、パーシパニー（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）から商標名クロダホス（ＣＲＯＤＡＰＨＯＳ）ＳＧで入手可能なＰＰＧ−５  セテス（ｃｅｔｅｔｈ）１０  ホスフェート、ならびにアルキルおよびアルキルアミドアルキルジアルキルアミンオキシドが挙げられる。アミンオキシド界面活性剤の例としては、ステパン  カンパニー（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏ．）から商標名アモニックス（ＡＭＭＯＮＹＸ）ＬＯ、ＬＭＤＯおよびＣＯで市販品として入手可能なものが挙げられ、これらはラウリルジメチルアミンオキシド、ラウリルアミドプロピルジメチルアミンオキシドおよびセチルアミンオキシドである。
【０１５３】
溶出技術
抑制物質を保持するための固体相材料を使用する実施形態に関して、様々な溶出試薬を使用して、核酸含有材料（例えば核）および／または遊離された核酸を含む試料のより濃縮された領域を溶出することができる。かかる溶出試薬としては、水（好ましくはＲＮＡ分解酵素を含まない水）、緩衝液、カチオン性、アニオン性、非イオン性もしくは双性イオン性であり得る界面活性剤または強塩基が挙げられる。
【０１５４】
好ましくは、溶出試薬は塩基性である（すなわち７より高い）。特定の実施形態に関して、溶出試薬のｐＨは少なくとも８である。特定の実施形態に関して、溶出試薬のｐＨは１０までである。特定の実施形態に関して、溶出試薬のｐＨは１３までである。溶出された核酸をＰＣＲのような増幅プロセスで直接使用する場合、成分の濃度が酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を抑制しないように、または他の様式で増幅反応を阻止しないように溶出試薬を配合しなければならない。
【０１５５】
適切な界面活性剤の例としては、上記のもの、特に、ＳＤＳ、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００、トィーン（ＴＷＥＥＮ）、フッ素化界面活性剤およびプルロニックス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）として既知のものが挙げられる。典型的に、界面活性剤は水性ベースの溶液中で提供されるが、所望であれば、有機溶媒（アルコール等）を使用することができる。溶出試薬中の界面活性剤の濃度は、好ましくは溶出試薬の総重量に基づいて少なくとも０．１重量／体積％（ｗ／ｖ％）である。溶出試薬中の界面活性剤の濃度は、好ましくは溶出試薬の総重量に基づいて１ｗ／ｖ％以下である。ポリエチレングリコールのような安定剤を界面活性剤と一緒に任意に使用することができる。
【０１５６】
適切な溶出緩衝液の例としては、トリス（ＴＲＩＳ）−ＨＣｌ、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−エタンスルホン酸］（ＰＩＰＥＳ）、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、クエン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、炭酸塩および重炭酸塩等が挙げられる。
【０１５７】
溶出試薬中の溶出緩衝液の濃度は、好ましくは少なくとも１０ミリモル（ｍＭ）である。溶出試薬の中の界面活性剤の濃度は、好ましくは２重量％（ｗｔ％）以下である。
【０１５８】
典型的に核酸含有材料および／または遊離された核酸の溶出は、好ましくはアルカリ溶液を使用して達成される。理論に拘束される意図はないが、水による溶出と比較してアルカリ溶液は抑制物質の結合の改善をもたらすと考えられる。アルカリ溶液は核酸含有材料の細胞溶解も促進する。アルカリ溶液は、好ましくは８〜１３、より好ましくは１３のｐＨを有する。高ｐＨ供給源の例としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、第四級窒素ベースの水酸化物、第三級、第二級または第一級アミン等の水溶液が挙げられる。溶出のためにアルカリ溶液が使用される場合、例えばトリス（ＴＲＩＳ）緩衝液で、ＰＣＲ実行可能試料を形成するために、典型的にその後の工程で中和される。
【０１５９】
アルカリ溶液の使用によってＲＮＡを選択的に破壊することができ、ＤＮＡの分析が可能となる。あるいはＲＮＡ分解酵素を配合物に添加してＲＮＡを不活性化することができ、続いてＲＮＡ分解酵素を熱失活させる。同様に、ＤＮＡ分解酵素を添加してＤＮＡを選択的に破壊し、そしてＲＮＡの分析が可能であるが、がかかる方法においてＲＮＡを破壊しない他の細胞溶解緩衝液（例えばＴＥ）使用される。リアルタイムＰＣＲを受けるＲＮＡ調製のための配合物中で、ＲＮＡシン（ＲＮＡｓｉｎ）のようなＲＮＡ分解酵素抑制物質の添加を使用することもできる。
【０１６０】
溶出は典型的に室温で実行されるが、より高温ではより高い収量が生じ得る。例えば、所望であれば溶出試薬の温度は９５℃まで可能である。溶出は典型的に１０分以内で実行されるが、１〜３分の溶出時間が好ましい。
【０１６１】
追加的な実施形態
他の場合、既知の密度勾配材料を選択的に使用して様々な細胞種を単離させることが望ましい。これらの密度勾配材料としては、ショ糖ならびに商標名フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、アマシャム  バイオサイエンスズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、パーコール（ＰＥＲＣＯＬＬ）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、アマシャム  バイオサイエンスズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、ヒストパク（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ）（ミズーリ州、セントルイス、シグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、イソプレップ（ＩＳＯＰＲＥＰ）（カリフォルニア州、サニーヴェール、ロビンス  サイエンティフィック  コーポレイション（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））、ヒストデンズ（ＨＩＳＴＯＤＥＮＺ）（ミズーリ州、セントルイス、シグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））およびオプティプレップ（ＯＰＴＩＰＲＥＰ）（ミズーリ州、セントルイス、シグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で市販品として入手可能な他のものが挙げられる。具体的な対象の細胞、例えば、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、可変性バルブデバイスの使用によって選択的に除去することができる。具体的な対象の細胞の抽出後、勾配材料がＰＣＲ適合性を有する限り、細胞溶解後にＰＣＲを直接に実行することができる。勾配材料がＰＣＲ適合性ではない場合、（例えば水または緩衝液による）試料の適切な希釈を確実にするように配慮しなければならない。その後に細胞の濃縮が続き、このプロセスを数回繰返すことによって、ＰＣＲ実行可能な試料が製造される。あるいは、簡単に著しく希釈することは、ＰＣＲ実行可能な試料の製造のために十分であり得る。
【０１６２】
例えば、本発明の１つの実施形態において、この方法は、装填チャンバーと可変性バルブ付きプロセスチャンバーとを備えたデバイスを提供する工程と；装填チャンバー中で全血を配置する工程と；全血をバルブ付きプロセスチャンバーへと転送する工程と；全血を密度勾配材料と接触させる工程と；バルブ付きプロセスチャンバー中で全血および密度勾配材料を遠心分離にかけて、少なくとも一層が対象の細胞を含有する層を形成する工程と；対象の細胞を含有する層の少なくとも一部分を除去する工程と；分離された対象の細胞を溶解させて核酸を遊離させる工程とを含む。この方法のもう１つの態様において、分離された対象の細胞を溶解させる前に、この方法は、分離された対象の細胞を水または緩衝液で希釈する工程と、任意に希釈された層をさらに濃縮して対象の細胞の濃度を増加させる工程と、任意にさらに濃縮された領域を分離する工程と、任意に、希釈、次いで濃縮および分離が続くこのプロセスを繰り返す工程とを含む。この方法のもう１つの態様において、分離された対象の細胞を溶解させる前に、この方法は、分離された対象の細胞を水で希釈して、好ましくは十分に希釈して２０倍〜１０００倍希釈物を形成する工程を含む。
【０１６３】
本明細書に記載される通り、ビーズ上へのウィルス粒子の捕獲（例えば以下に説明される）の前または後に、固体相材料を使用して抑制物質を除去することができる（同様に、核酸の単離法および固体相材料を使用するキット（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＫＩＴＳ  ＵＳＩＮＧ  ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＭＡＴＥＲＩＡＬ）と題された＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿に出願された米国特許出願第＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿号明細書（代理人整理番号第５９０７３ＵＳ００３号）に記載される）。本明細書に記載の様々な方法において、および様々な試料中で、かかる固体相材料を使用することができる。
【０１６４】
これに加えて、例えば、核酸の単離法、ならびにマイクロ流体デバイスおよび濃縮工程を使用するキット（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＫＩＴＳ  ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ  ＤＥＶＩＣＥ  ＡＮＤ  ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ  ＳＴＥＰ）と題された＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿に出願された米国特許出願第＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿号明細書（代理人整理番号第５９８０１ＵＳ００２号）に開示の通り、濃縮／分離／任意の希釈工程を使用して抑制物質のレベルを減少することができる。
【０１６５】
他の実施形態において、白血球中ウィルスのＤＮＡ／ＲＮＡを捕獲することが必要とされ得る。これらの場合、可変性バルブを使用して白血球を単離することが可能であり、そしてウィルスのＤＮＡ／ＲＮＡを捕獲するためにビーズを使用することができる。
【０１６６】
例えば、特定の細胞、ウイルス、バクテリア、タンパク質、核酸等を単離するために適切な基でビーズを官能化することができる。遠心分離およびそれに続く分離によって、ビーズを試料から分離することができる。分離のために適切な密度およびサイズ（ナノメートル〜ミクロン）を有するようにビーズを設計することができる。例えばウィルス捕獲の場合、血清試料から少量の残留抑制物質の除去の前または後に、ウイルスの捕獲および濃縮のために、ウイルスのタンパク膜を認識するビーズを使用することができる。
【０１６７】
細胞溶解によって分離されたウィルス粒子から核酸を抽出することができる。従って、ビーズによって、デバイス内の特定の領域で適切な材料を濃縮し、また不適切な材料の洗浄および捕獲された粒子からの適切な材料の溶出をもたらす方法が提供され得る。
【０１６８】
かかるビーズの例としては、限定されないが、バイオ−ラド  ラボラトリーズ，インコーポレイテッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州、ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））から商標名ケレックス（ＣＨＥＬＥＸ）で入手可能な架橋されたポリスチレンビーズ、トリス（２−アミノエチル）アミン、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ポリアミンおよびポリイミンによって架橋されたアガロースビーズ、ならびにローム  アンド  ハース（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）（ペンシルバニア州、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））から商標名デュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）Ｃ−４６７およびデュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）ＧＴ７３、アンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）ＩＲＣ−７４８、ダイアイオン（ＤＩＡＩＯＮ）ＣＲ１１、デュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）Ｃ６４７で市販品として入手可能なキレートイオン交換樹脂が挙げられる。またこれらのビーズは、上記のような固体相材料としての使用のために適切である。
【０１６９】
ビーズの他の例としては、商標名ジーン  フィズ（ＧＥＮＥ  ＦＩＺＺ）（フランス、ユーロバイオ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ））、ジーン  リリーサー（ＧＥＮＥ  ＲＥＬＥＡＳＥＲ）（テネシー州、マーフリーズバラ、バイオベンチャー  インコーポレイテッド（Ｂｉｏｖｅｎｔｕｒｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｕｒｆｒｅｅｓｂｏｒｏ，ＴＮ））およびバグズ  Ｎ  ビーズ（ＢＵＧＳ  Ｎ  ＢＥＡＤＳ）（ノルウェー、オスロ、ジェンポイント（ＧｅｎＰｏｉｎｔ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、ならびにザイモズ  ビーズ（Ｚｙｍｏ’ｓ  ｂｅａｄｓ）（カリフォルニア州、オレンジ、ザイモ  リサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））およびダイナルズ  ビーズ（Ｄｙｎａｌ’ｓ  ｂｅａｄｓ）（ノルウェー、オスロ、ダイナル（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））で入手可能なものが挙げられる。
【０１７０】
他の材料も病原体捕獲のために利用可能である。例えば、本発明の特定の実施形態において、特定の細胞、ウイルス、バクテリア、タンパク質、核酸等を単離させるために、高分子コーティングも使用可能である。例えば、これらの高分子コーティングをデバイスのカバーフィルム上へ直接スプレー噴射することが可能である。
【０１７１】
ビーズ表面上へ抗体を共有結合させることによって、ウィルス粒子をビーズ上に捕獲することができる。抗体は、ウィルスのコートタンパク質に対して産生され得る。例えば、ダイナル（ＤＹＮＡＬ）ビーズを使用して抗体を共有結合させることができる。あるいは、合成高分子、例えばアニオン交換高分子を使用して、ウィルス粒子を濃縮することができる。バラフィニティ（ｖｉｒａｆｆｉｎｉｔｙ）（ニュージャージー州、イースト  ブランスウィック、バイオテック  サポート  グループ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ））のような市販品として入手可能な樹脂を使用してビーズを被覆することができるか、またはウィルス粒子を濃縮するためのデバイス中の選択位置上へ高分子コーティングとして適用することができる。バグズ  Ｎ  ビーズ（ＢＵＧＳ  Ｎ  ＢＥＡＤＳ）（ノルウェー、オスロ、ジェンポイント（ＧｅｎＰｏｉｎｔ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を、例えばバクテリア抽出のために使用することができる。本発明において、これらのビーズを使用してブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、サルモネラおよびクラミジア基本小体のようなバクテリアを捕獲することができる。
【０１７２】
従って本発明の１つの実施形態において、試料がウィルス粒子または他の病原体（例えばバクテリア）を含む場合、デバイスはウィルス捕獲ビーズまたは他の病原体捕獲材料の形態の固体相材料を含み得る。この方法において、試料はウィルス捕獲ビーズと接触する。特に、１つの事例において、ウィルス捕獲ビーズをウイルスまたはバクテリアの濃縮のみのために使用することが可能であり、例えば、続いてもう１つのチャンバーへとビーズを分離し、そしてウイルスまたはバクテリアの細胞溶解によって終了する。もう１つの事例において、ビーズをウイルスまたはバクテリアの濃縮のために使用することが可能であり、続いて同一ビーズ上へ核酸の細胞溶解および捕獲、ビーズの希釈、ビーズの濃縮、ビーズの分離を行ない、そして捕獲された核酸の溶出の前に複数回、このプロセスを繰返す。
【０１７３】
具体的な実施形態において、方法は、装填チャンバーと、可変性バルブ付きプロセスチャンバーと、病原体捕獲材料を含む分離チャンバーとを備えたデバイスを提供する工程と；装填チャンバー中で全血を配置する工程と；全血をバルブ付きプロセスチャンバーへと転送する工程と；バルブ付きプロセスチャンバー中で全血を遠心分離にかけて、一種以上の病原体を含む血漿層と、赤血球層と、白血球を含む（その間の）界面層とを形成する工程と；一種以上の病原体を含む血漿層の少なくとも一部分を病原体捕獲材料を有する分離チャンバーへと転送する工程と；病原体捕獲材料から一種以上の病原体の少なくとも一部分を分離する工程と；一種以上の病原体を溶解させて核酸を遊離させる工程とを含む。
【０１７４】
あるいはビーズ（または他の病原体捕獲材料）がウィルス捕獲（または他の病原体捕獲）のための選択方法ではない場合、超遠心分離機を使用して血清または血漿からウィルス粒子をペレット除去するように選択してもよい。ウィルスＲＮＡを単離して、続いて増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をする必要がある場合、これらの濃縮されたウィルス粒子を、例えばＲＮＡ分解酵素抑制物質の添加を伴って界面活性剤を含む溶解デバイスへと転送することができる。
【０１７５】
核酸のダウンストリーム適用がＰＣＲのような増幅プロセスを受ける場合、この方法で使用される全ての試薬は、好ましくはかかるプロセスに適合性（例えばＰＣＲ適合性）を有する。さらに、特に診断の目的のために、ＰＣＲ促進薬の添加が有用であり得る。また増幅される材料を増幅前に加熱することは有益であり得る。
【０１７６】
抑制物質が完全に除去されない実施形態において、緩衝液、酵素およびＰＣＲ促進薬の使用は、抑制物質の存在下で増幅プロセスの補助を追加し得る。例えば、抑制物質により高い耐性を示すｒＴｔｈのようなＴａｑポリメラーゼ以外の酵素を使用することが可能であり、それによってＰＣＲ増幅に関して大きな利益が提供される。増幅プロセスにおいてなおさらに補助となることが知られているため、ウシ血清アルブミン、ベタイン、プロテイナーゼ抑制物質、ウシトランスフェリン等の添加を使用することができる。あるいは広範囲の精製を必要とせずに、全血からの直接増幅のためのノバゲンズ  ブラッド  ダイレクト  ＰＣＲ  バッファー  キット（Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｋｉｔ）（ドイツ、ダルムシュタット、ＥＭＤ  バイオサイエンスズ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））のような市販品として入手可能な製品を使用することができる。
【０１７７】
以下の実施例によって本発明の目的および利点をさらに説明するが、これらの実施例に記載される特定の材料およびその量、ならびに他の条件および詳細は過度に本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７８】
実施例１：トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘ１００による固体相材料：アンモニアフォームの調製
３Ｍ  Ｎｏ．２２７１  エンポア  エクストラクション  キレーティング  ディスク（ＥＭＰＯＲＥ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｋ）をガラスフィルターホルダー中に配置した。抽出ディスクをアンモニア型へと変換し、添付文書に印刷された手順に従った。ディスクをバイアル瓶中に配置し、そして１％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘ１００（ミズーリ州、セントルイス、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））溶液（１０ｍＬの水中０．１グラム（ｇ）のトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘ１００）中に浸漬し、サーモリン  バリ−ミックス  モデルＭ４８７２５ロッカー（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｖａｒｉ−Ｍｉｘ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍ４８７２５  Ｒｏｃｋｅｒ）（アイオワ州、デュビュク、バーンステッド／サーモリン（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ））上で約６〜８時間混合させる。ディスクを洗浄またはすすがないことに配慮して、ディスクをガラスフィルターホルダー中に配置して、約２０分間、真空を適用することによって乾燥させ、次いで室温（約２１℃）で一晩乾燥させた。
【０１７９】
実施例２Ａ：ＰＣＲにおける抑制物質／ＤＮＡの影響：固定されたＤＮＡ濃度での抑制物質濃度の変更
ＰＣＲ上での抑制物質の影響を調査するために、クリーンなヒトゲノムＤＮＡによるスパイクの前に抑制物質の一連の希釈を実行した。１マイクロリットルあたり１５ナノグラム（ｎｇ／μＬ）のヒトゲノムＤＮＡ１０μＬに、１μＬの異なるミックス（Ｍｉｘ）Ｉ（そのまま、または希釈物）を添加し（試料２、抑制物質は添加しなかった、２Ｄ−そのまま、２Ｅ−１：１０、２Ｆ−１：３０、２Ｇ−１：１００、２Ｈ−１：３００）、そしてボルテックスした。各試料の２μＬアリコートは２０μＬ  ＰＣＲと考えられた。結果を表２に示す。
【０１８０】
ミックス（Ｍｉｘ）Ｉ：１００μＬの全血を１μＬのニートのトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘ１００に添加した。溶液を約５分間、室温（約２１℃）で温置し、そして断続的に溶液をボルテックスした（２０秒毎に約５秒間）。次の工程に進む前に、透明であることを確認するために溶液を調査した。約１０分間、４００ｒｃｆでエッペンドルフ  モデル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ）５４１５Ｄ遠心分離機において溶液を回転させた。マイクロ遠心分離管の上部約８０μＬをミックスＩと指定した。
【０１８１】
実施例２Ｂ：ＰＣＲにおける抑制物質／ＤＮＡの影響：固定された抑制物質濃度でのＤＮＡ濃度の変更
ヒトゲノムＤＮＡ１０μＬに、１μＬの１：３希釈されたミックス（Ｍｉｘ）Ｉ（上記）を添加した。調査されたＤＮＡ濃度は以下の通りであった：試料２Ｊ−１５ｎｇ／μＬ、２Ｋ−７．５ｎｇ／μＬ、２Ｌ−３．７５ｎｇ／μＬ、２Ｍ−１．５ｎｇ／μＬ。各試料の２μＬアリコートは２０μＬ  ＰＣＲと考えられた。結果を表２に示す。
【０１８２】
実施例２Ｃ：ＰＣＲにおける抑制物質／ＤＮＡの影響：抑制物質添加のないＤＮＡ
抑制物質の代わりに１μＬの水を各ＤＮＡ試料に添加することによって、以下の試料を調製した：試料２Ｎ−１５ｎｇ／μＬ、２Ｐ−７．５ｎｇ／μＬ、２Ｑ−３．７５ｎｇ／μＬ、２Ｒ−１．５ｎｇ／μＬ。各試料の２μＬアリコートは２０μＬ  ＰＣＲと考えられた。結果を表２に示す。
【０１８３】
【表２】
2011013237.tif 000003
【０１８４】
実施例３：キレート固体相材料の使用による全血からのゲノムＤＮＡの単離手順
６００μＬの全血を１０分間２５００ｒｐｍで回転させた。上澄みを分離して廃棄し、そしてバフィーコートを界面層から抽出した。５μＬのバフィーコートを５μＬの２％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘに添加した。溶液を徹底的に混合し、そして装填溶液として１％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘ１００の代わりに１０％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）−Ｘ１００を使用して、実施例１に記載されるように調製された３Ｍ  Ｎｏ．２２７１  エンポア  エクストラクション  キレーティング  ディスク（ＥＭＰＯＲＥ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｋ）上に配置した。溶液をディスク中に浸漬した後、試料を２０μＬアリコートの０．１Ｍ  ＮａＯＨで抽出した。４００ｒｃｆでエッペンドルフ  モデル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ）５４１５Ｄ遠心分離機において溶液を簡単に回転させた。試料の１１μＬのアリコートを３分間９５℃で加熱し、次いで３μＬの１Ｍ  トリス（ＴＲＩＳ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に添加した。
【０１８５】
実施例４：全血からのゲノムＤＮＡの単離手順
６００μＬの全血を１０分間２５００ｒｐｍで回転させた。上澄みを分離して廃棄し、そしてバフィーコートを界面層から抽出した。５μＬのバフィーコートを９５μＬのＲＮＡ分解酵素を含まない無菌水に添加した。色が均一になるまで溶液を混合し、そして約２分間、４００ｒｃｆでエッペンドルフ  モデル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ）５４１５Ｄ遠心分離機において回転させた。上部から溶液の９５μＬのアリコートを分離して廃棄し、遠心分離管の底部に約５μＬの濃縮された材料を残した。濃縮された材料の最後の５μＬにＲＮＡ分解酵素を含まない無菌水９５μＬを添加した。色が均一になるまで試料を混合した。約２分間、４００ｒｃｆでエッペンドルフ  モデル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ）５４１５Ｄ遠心分離機において溶液を回転させた。上部の９５μＬの溶液を分離して廃棄し、そして遠心分離管の底部に約１０μＬの濃縮された材料を残した。濃縮された材料の最後の１０μＬに、１μＬの１Ｍ  ＮａＯＨを添加した。１分間の温置後、試料を９５℃で３分間加熱した。３μＬの１Ｍトリス（ＴＲＩＳ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１１μＬの試料に添加した。
【０１８６】
結果
表３は、実施例１〜２に関して１０μＬ  ＰＣＲ試料（１０μＬのＳＹＢＲグリーン  マスター  ミックス（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、４μＬのβ−アクチン、４μＬの水中の２μＬの試料）の調製に関するクワンティテック  ＳＹＢＲ  グリーン  ＰＣＲ  ハンドブック（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｈ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）の第１０〜１２頁の指示に従って、ＡＢＩ  ７７００  ＱＰＣＲ  マシン（カリフォルニア州、フォスターシティ、アプレラ（Ａｐｐｌｅｒａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））上で得られた結果を報告し；実施例３〜４に関する結果は、１０μＬのＰＣＲ試料（５．５μＬのＲＮＡ分解酵素を含まない無菌水、１μＬの１０ｘ  ファクター  Ｖ  ライデン  リアクション  ミックス（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）および１μＬの１０ｘ  ファクター  Ｖ  ライデン  ミューテーション  ディテクション  ミックス（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）中の２．５μＬの試料）の調製に関するライトシティ  ファクター  Ｖ  ライデン  ミューテーション  キット（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）の添付文書の第２〜３頁の指示に従って、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）２．０（インディアナ州、インディアナポリス、ロシュ  アプライド  サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））上で得られた。４０５ｎｍでのスペクトラマックス  プラス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ）384分光光度計（カリフォルニア州、サニーヴェール、モレキュラー  デバイス  コーポレイション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ．））上でスペクトル測定を実行した。各試料に関する２、３または４個の値は二重、三重または四重を表す。
【０１８７】
【表３】
2011013237.tif 000004
【０１８８】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、文脈で明白に記載されない限り、単数形（「ａ」「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」）は複数形の指示を含む。従って、例えば、「バルブリップ」の言及は複数のバルブリップを含み、そして「プロセスチャンバー」の言及は１以上のプロセスチャンバーおよび当業者に既知のその均等物を含む。
【０１８９】
本発明の実例となる実施形態が説明されており、そして本発明の範囲内で可能な変更に対する引用がなされている。本発明におけるこれらおよび他の変更および改造は本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかであり、そして本発明が本明細書で明示された実例となる実施形態に限定されないことは理解されるべきである。従って、本発明は添付の請求の範囲およびその均等物によってのみ限定される。
【図１】
2011013237.tif 000005
【図２】
2011013237.tif 000006
【図３Ａ】
2011013237.tif 000007
【図３Ｂ】
2011013237.tif 000008
【図３Ｃ】
2011013237.tif 000009
【図３Ｄ】
2011013237.tif 000010
【図４】
2011013237.tif 000011
【図５】
2011013237.tif 000012
【図６】
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