(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の診断および治療剤として用いることができる遺伝子およびタンパク質を提供する。【解決手段】特定のヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント、これらを認識する抗体またはその抗原結合性フラグメント、または特定のヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。【選択図】図１
2011015681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項２】
配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項３】
請求項２記載のタンパク質またはそのフラグメントを含む、肺癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項４】
配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項５】
請求項４記載のタンパク質またはそのフラグメントを含む、胃癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項６】
配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項７】
請求項６記載のタンパク質またはそのフラグメントを含む、大腸癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項８】
配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項９】
請求項８記載のタンパク質またはそのフラグメントを含む、肝癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項１０】
前記遺伝子が、配列番号１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３８、３９、４０、４４、５１、５２、５３、５４および５８のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載のタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項１１】
前記遺伝子が、配列番号１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載のタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項１２】
配列番号６６−１２３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項１３】
請求項１，２，４，６，８，１０，１１および１２のいずかに記載のタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体。
【請求項１４】
配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１２個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号が１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１のいずれかである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６記載のポリヌクレオチドを含む、肺癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項１８】
配列番号が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５のいずれかである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８記載のポリヌクレオチドを含む、胃癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項２０】
配列番号が３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０のいずれかである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０記載のポリヌクレオチドを含む、大腸癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項２２】
配列番号が１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５のいずれかである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２記載のポリヌクレオチドを含む、肝癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項２４】
配列番号が１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３８、３９、４０、４４、５１、５２、５３、５４および５８のいずれかである、請求項１４または１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１４，１５，１６，１８，２０，２２および２４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５記載のベクターを含む細胞。
【請求項２７】
抗癌活性を有する化合物を同定する方法であって、
培養ヒト細胞を試験化合物と接触させ、そして
前記細胞において配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量の変化を引き起こす化合物を抗癌活性を有する化合物として同定する
の各工程を含む方法。
【請求項２８】
請求項１，２，４，６，８，１０，１１および１２のいずかに記載のタンパク質、または請求項１４，１５，１６，１８，２０，２２および２４のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項２９】
C20orf102タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項３０】
癌が肺癌、肝癌、または膵癌である請求項２９記載の診断方法。
【請求項３１】
分泌されたC20orf102タンパク質を検出することを特徴とする請求項２９記載の診断方法。
【請求項３２】
C20orf102タンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項２９記載の診断方法。
【請求項３３】
血液中、血清中、または血漿中のC20orf102タンパク質を検出することを特徴とする請求項２９記載の診断方法。
【請求項３４】
以下の工程：
（ａ）  被験者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるC20orf102タンパク質を検出する工程
を含む癌の診断方法。
【請求項３５】
被験者から採取される試料が血液、血清、または血漿である請求項３４記載の診断方法。
【請求項３６】
C20orf102タンパク質細胞外領域を検出することを特徴とする請求項３４記載の診断方法。
【請求項３７】
C20orf102タンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項３４記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に関連する遺伝子、この遺伝子によりコードされるタンパク質、およびこのタンパク質を認識する抗体に関する。本発明の遺伝子、タンパク質および抗体は、癌の診断および治療、ならびに癌の治療薬の開発において用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、細胞の癌化と関連してその発現量が変化する遺伝子や、癌のマーカーとなりうる抗原が多数見いだされており、多くの研究が行われている。しかし、特定の癌を特異的に検出または治療することは依然として困難である。したがって、当該技術分野においては、癌の診断および治療に用いることができる、さらに別の癌関連遺伝子およびタンパク質を同定することが求められている。
【０００３】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：EP1033401; US2002022248; US2002042096; US200208150; US6337195; US6362321; WO9738098; WO9920764; WO9929729; WO0006698; WO0012702; WO0034477; WO0036107; WO0037643; WO0055174; WO0055320; WO0055351; WO0055633; WO0058473; WO0073509; WO0100828; WO0109317; WO0121653; WO0122920; WO0151513; WO0151628; WO0154733; WO0155355; WO0157058; WO0159111; WO0160860; WO0164835; WO0164886; WO0166719; WO0170976; WO0173027; WO0175177; WO0177168; WO0192578; WO0194629; WO0200677; WO0200889; WO0200939; WO0204514; WO0210217; WO0212280; WO0220598; WO0229086; WO0229103; WO0258534; WO0260317; WO0264797。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】EP1033401
【特許文献２】US2002022248
【特許文献３】US2002042096
【特許文献４】US200208150
【特許文献５】US6337195
【特許文献６】US6362321
【特許文献７】WO9738098
【特許文献８】WO9920764
【特許文献９】WO9929729
【特許文献１０】WO0006698
【特許文献１１】WO0012702
【特許文献１２】WO0034477
【特許文献１３】WO0036107
【特許文献１４】WO0037643
【特許文献１５】WO0055174
【特許文献１６】WO0055320
【特許文献１７】WO0055351
【特許文献１８】WO0055633
【特許文献１９】WO0058473
【特許文献２０】WO0073509
【特許文献２１】WO0100828
【特許文献２２】WO0109317
【特許文献２３】WO0121653
【特許文献２４】WO0122920
【特許文献２５】WO0151513
【特許文献２６】WO0151628
【特許文献２７】WO0154733
【特許文献２８】WO0155355
【特許文献２９】WO0157058
【特許文献３０】WO0159111
【特許文献３１】WO0160860
【特許文献３２】WO0164835
【特許文献３３】WO0164886
【特許文献３４】WO0166719
【特許文献３５】WO0170976
【特許文献３６】WO0173027
【特許文献３７】WO0175177
【特許文献３８】WO0177168
【特許文献３９】WO0192578
【特許文献４０】WO0194629
【特許文献４１】WO0200677
【特許文献４２】WO0200889
【特許文献４３】WO0200939
【特許文献４４】WO0204514
【特許文献４５】WO0210217
【特許文献４６】WO0212280
【特許文献４７】WO0220598
【特許文献４８】WO0229086
【特許文献４９】WO0229103
【特許文献５０】WO0258534
【特許文献５１】WO0260317
【特許文献５２】WO0264797
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌の診断および治療剤として用いることができる遺伝子およびタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、癌組織において特定の遺伝子の発現が亢進していることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。
【０００７】
１つの観点においては、本発明は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１および３２のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号１または２に記載されるヌクレオチド配列を有する。
【０００８】
これらのタンパク質やフラグメントは肺癌の診断または治療のための組成物として有用である。
【０００９】
別の観点においては、本発明は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
これらのタンパク質やフラグメントは胃癌の診断または治療のための組成物として有用である。
【００１１】
別の観点においては、本発明は、配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、７、２０、２１、４６、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号３、７、２０および２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
これらのタンパク質やフラグメントは大腸癌の診断または治療のための組成物として有用である。
【００１３】
別の観点においては、本発明は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４５、５６、５７、５８、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００１４】
これらのタンパク質やフラグメントは肝癌の診断または治療のための組成物として有用である。
【００１５】
好ましくは、本発明の組成物において、該遺伝子は、配列番号１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３８、３９、４０、４４、５１、５２、５３、５４および５８のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
また好ましくは、本発明の組成物において、該遺伝子は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２３、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、５６、５７、５９、６０、６１、６２および６３のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１および２３のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００１７】
別の観点においては、本発明は、上述の遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞またはベクターを提供する。これらの細胞やベクターは、本発明のタンパク質の製造、該タンパク質に対する抗体の製造、癌の診断・治療などに有用である。
【００１８】
また別の観点においては、本発明は、配列番号６６−１２３に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを提供する。これらのタンパク質またはそのフラグメントは、抗体の製造の際の抗原として、または癌の診断・治療に有用である。
【００１９】
さらに別の観点においては、本発明は、上述のタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、このような抗体を産生する細胞を提供する。
【００２０】
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１２ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２２】
これらのポリヌクレオチドは、癌の診断、タンパク質の製造、プライマー、遺伝子発現阻害の為のアンチセンス・siRNAなどに有用である。
【００２３】
さらに別の観点においては、本発明は、抗癌活性を有する化合物を同定する方法であって、培養ヒト細胞を試験化合物と接触させ、そして前記細胞において配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量の変化を引き起こす化合物を抗癌活性を有する化合物として同定する、の各工程を含む方法を提供する。
【００２４】
さらに別の観点においては、本発明は、C20orf102タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。好ましくは、癌は、肺癌、肝癌、または膵癌である。本発明の方法においては、好ましくは、細胞外に分泌されたC20orf102タンパク質が検出される。また好ましくは、本発明の方法はC20orf102タンパク質を認識する抗体を用いて行われる。好ましくは、本発明の方法においては、血液中、血清中、または血漿中のC20orf102タンパク質、あるいは細胞から分離したC20orf102タンパク質が検出される。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、以下の工程：
（ａ）  被験者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるC20orf102タンパク質を検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１の発現解析の結果を示す。
【図２】図２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２の発現解析の結果を示す。
【図３】図３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２の発現解析の結果を示す。
【図４】図４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３の発現解析の結果を示す。
【図５】図５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４の発現解析の結果を示す。
【図６】図６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５の発現解析の結果を示す。
【図７】図７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６の発現解析の結果を示す。
【図８】図８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６の発現解析の結果を示す。
【図９】図９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ７の発現解析の結果を示す。
【図１０】図１０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ８の発現解析の結果を示す。
【図１１】図１１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ９の発現解析の結果を示す。
【図１２】図１２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１０の発現解析の結果を示す。
【図１３】図１３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１１の発現解析の結果を示す。
【図１４】図１４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１２の発現解析の結果を示す。
【図１５】図１５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１３の発現解析の結果を示す。
【図１６】図１６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１４の発現解析の結果を示す。
【図１７】図１７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１５の発現解析の結果を示す。
【図１８】図１８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１６の発現解析の結果を示す。
【図１９】図１９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１７の発現解析の結果を示す。
【図２０】図２０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１８の発現解析の結果を示す。
【図２１】図２１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１９の発現解析の結果を示す。
【図２２】図２２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２０の発現解析の結果を示す。
【図２３】図２３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２１の発現解析の結果を示す。
【図２４】図２４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２２の発現解析の結果を示す。
【図２５】図２５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２３の発現解析の結果を示す。
【図２６】図２６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２４の発現解析の結果を示す。
【図２７】図２７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２５の発現解析の結果を示す。
【図２８】図２８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２６の発現解析の結果を示す。
【図２９】図２９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２７の発現解析の結果を示す。
【図３０】図３０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２８の発現解析の結果を示す。
【図３１】図３１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２９の発現解析の結果を示す。
【図３２】図３２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３０の発現解析の結果を示す。
【図３３】図３３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３１の発現解析の結果を示す。
【図３４】図３４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３２の発現解析の結果を示す。
【図３５】図３５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３３の発現解析の結果を示す。
【図３６】図３６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３４の発現解析の結果を示す。
【図３７】図３７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３５の発現解析の結果を示す。
【図３８】図３８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３６の発現解析の結果を示す。
【図３９】図３９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３７の発現解析の結果を示す。
【図４０】図４０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３８の発現解析の結果を示す。
【図４１】図４１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３９の発現解析の結果を示す。
【図４２】図４２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４０の発現解析の結果を示す。
【図４３】図４３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４１の発現解析の結果を示す。
【図４４】図４４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４２の発現解析の結果を示す。
【図４５】図４５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４３の発現解析の結果を示す。
【図４６】図４６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４４の発現解析の結果を示す。
【図４７】図４７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４５の発現解析の結果を示す。
【図４８】図４８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４６の発現解析の結果を示す。
【図４９】図４９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４７の発現解析の結果を示す。
【図５０】図５０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４８の発現解析の結果を示す。
【図５１】図５１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４９の発現解析の結果を示す。
【図５２】図５２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５０の発現解析の結果を示す。
【図５３】図５３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５１の発現解析の結果を示す。
【図５４】図５４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５２の発現解析の結果を示す。
【図５５】図５５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５３の発現解析の結果を示す。
【図５６】図５６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５４の発現解析の結果を示す。
【図５７】図５７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５５の発現解析の結果を示す。
【図５８】図５８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５６の発現解析の結果を示す。
【図５９】図５９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５７の発現解析の結果を示す。
【図６０】図６０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５８の発現解析の結果を示す。
【図６１】図６１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５９の発現解析の結果を示す。
【図６２】図６２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６０の発現解析の結果を示す。
【図６３】図６３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６１の発現解析の結果を示す。
【図６４】図６４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６２の発現解析の結果を示す。
【図６５】図６５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６３の発現解析の結果を示す。
【図６６】図６６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６４の発現解析の結果を示す。
【図６７−１】図６７は、新規遺伝子K#1の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６７−２】図６７は、新規遺伝子K#1の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６７−３】図６７は、新規遺伝子K#1の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６７−４】図６７は、新規遺伝子K#1の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６８−１】図６８は、新規遺伝子K#1とGenBank No. XM＿067369とのアライメントを示す。
【図６８−２】図６８は、新規遺伝子K#1とGenBank No. XM＿067369とのアライメントを示す。
【図６８−３】図６８は、新規遺伝子K#1とGenBank No. XM＿067369とのアライメントを示す。
【図６８−４】図６８は、新規遺伝子K#1とGenBank No. XM＿067369とのアライメントを示す。
【図６８−５】図６８は、新規遺伝子K#1とGenBank No. XM＿067369とのアライメントを示す。
【図６９】図６９は、新規遺伝子K#1のアミノ酸配列モチーフの解析結果を示す。
【図７０−１】図７０は、新規遺伝子K#2（クローン１１）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７０−２】図７０は、新規遺伝子K#2（クローン１１）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７０−３】図７０は、新規遺伝子K#2（クローン１１）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７１−１】図７１は、新規遺伝子K#2（クローン１８）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７１−２】図７１は、新規遺伝子K#2（クローン１８）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７１−３】図７１は、新規遺伝子K#2（クローン１８）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７２】図７２は、新規遺伝子K#2（クローン１１）と、ヒトLIN-28、線虫LIN-28、アフリカツメガエルLIN-28、ショウジョウバエLIN-28およびマウスLIN-28のアミノ酸配列の比較を示す。
【図７３】図７３は、C20orf102遺伝子の肺扁平上皮癌における発現を示す。
【図７４】図７４は、抗C20orf102抗体を用いる、各種癌細胞株およびその培養上清におけるC20orf102タンパク質分子の検出を示す。
【図７５】図７５は、抗C20orf102抗体を用いる、肺腺癌組織におけるC20orf102タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図７６】図７６は、抗hNotum抗体を用いる、各種癌細胞株およびその培養上清におけるhNotumタンパク質分子の検出を示す。
【図７７】図７７は、抗hNotum抗体を用いる、肝癌組織におけるhNotumタンパク質の発現解析の結果を示す。
【図７８】図７８は、抗K#2抗体を用いる、K#2強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるK#2タンパク質分子の検出を示す。
【図７９】図７９は、抗K#2抗体を用いる、肝癌組織におけるK#2タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図８０】図８０は、抗KIAA1359抗体を用いる、KIAA1359強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるKIAA1359タンパク質分子の検出を示す。
【図８１】図８１は、抗KIAA1359抗体を用いる、胃癌組織におけるKIAA1359タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図８２】図８２は、抗PEG10/ORF2抗体を用いる、PEG10強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるPEG10タンパク質分子の検出を示す。
【図８３】図８３は、抗PEG10/ORF2抗体を用いる、肝細胞癌組織におけるPEG10タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図８４】図８４は、抗DUSP9抗体を用いる、DUSP9強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるDUSP9タンパク質分子の検出を示す。
【図８５】図８５は、抗DUSP9抗体を用いる、肝細胞癌組織におけるDUSP9タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図８６】図８６は、抗CystatinSN抗体を用いる、大腸癌組織におけるCystatinSNタンパク質の発現解析の結果を示す。
【図８７】図８７は、抗SFRP4抗体を用いる、胃癌組織におけるSFRP4タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図８８】図８８は、抗SFRP4抗体を用いる、SFRP4を強制発現させたCOS7細胞の培養上清におけるSFRP4タンパク質の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、癌組織において特定の遺伝子の発現が亢進している遺伝子、およびこの遺伝子によりコードされるタンパク質を利用する、癌の診断および治療のための組成物を提供する。
【００２８】
蛋白質
第１の観点においては、本発明は、配列番号１−６５に記載される癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、本発明の組成物は、配列番号６６−１２３に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを含む。
【００２９】
本発明のタンパク質またはそのフラグメントは、癌の診断・治療や、抗体作製の際の抗原として有用である。
【００３０】
本発明の組成物においては、タンパク質またはそのフラグメントは、所望の免疫原性を有する限り、上述の配列から、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加された変異体であってもよい。このような変異体は、好ましくは、上述のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３１】
アミノ酸配列の同一性は、比較すべき２つの配列において、同一である残基の数を残基の総数で割り、１００を乗ずることにより表される。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能である。
【００３２】
あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
【００３３】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００３４】
当業者であれば公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、アミノ酸に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と同等なタンパク質を調製することが可能である。
【００３５】
本発明のタンパク質は、後述するタンパク質を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。例えば、本発明のタンパク質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のタンパク質のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明のタンパク質はこのようなタンパク質も包含する。
【００３６】
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
【００３７】
また、本発明のタンパク質をグルタチオン S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち、目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
【００３８】
天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００３９】
本発明は、また、本発明のタンパク質のフラグメント（部分ペプチド）を包含する。本発明のフラグメントは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明のタンパク質のアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。
【００４０】
本発明のフラグメントは、免疫原とする場合には、少なくとも7アミノ酸以上、好ましくは8アミノ酸以上、さらに好ましくは9アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明のタンパク質の競合阻害剤として用いる場合には、少なくとも100アミノ酸以上、好ましくは200アミノ酸以上、さらに好ましくは300アミノ酸以上のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本発明のフラグメントは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
【００４２】
本発明は、また、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持させたり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
【００４３】
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有していることが好ましい。
【００４４】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。
【００４５】
本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【００４６】
また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００４７】
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００４８】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００４９】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００５０】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００５１】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００５２】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
【００５３】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
【００５４】
これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
【００５５】
一方、in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするDNAを導入し、動物または植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
【００５６】
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
【００５７】
例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
【００５８】
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。
【００５９】
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望のタンパク質を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
【００６０】
これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
【００６１】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
【００６２】
なお、タンパク質を精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【００６３】
後述の実施例において示されるように、配列番号１−６５に示される癌関連遺伝子の遺伝子配列（表１を参照）を元にPCRプライマーを設計し、ヒトの正常および癌組織から得たcDNAを用いて、定量PCRによりヒト組織における癌関連遺伝子の発現量の定量化を行ったところ、本発明の癌関連遺伝子は特定のヒト癌組織においてその発現が亢進されていることが見いだされた。
【００６４】
配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、肺癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、肺癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１および３２のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号１または２に記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００６５】
配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、胃癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、胃癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００６６】
配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、大腸癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、大腸癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、７、２０、２１、４６、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号３、７、２０および２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、肝癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、肝癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４５、５６、５７、５８、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
【００６８】
配列番号１−６５に記載される癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを含む本発明の組成物は、癌に対するワクチンとして用いることができる。上述のタンパク質またはその免疫原性フラグメントを、適当なアジュバントとともに、あるいは他の適当なポリペプチドとの融合タンパク質として、対象となるヒトまたはその他の動物に投与することにより、そのヒトまたは動物の体内で免疫応答を生じさせることができる。あるいは、本発明の組成物は、上述の癌関連遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞の形で投与してもよい。
【００６９】
また、本発明の組成物は、被検者が配列番号１−６５に記載される癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を有するか否かを測定することにより、特定の癌に罹患しているか否かを診断するために用いることができる。
【００７０】
抗体
別の観点においては、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。さらに、該抗体またはその結合フラグメントを含む、癌を診断または治療するための組成物を提供する。本発明の抗体は、好ましくは、配列番号６６−１２３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを認識することができる。本発明はまた、このような抗体を産生する細胞を提供する。
【００７１】
認識するとは、抗体が、特定の条件下において、上述の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントに対して、他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもって結合することを意味する。
【００７２】
本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体およびＴ−細胞レセプターフラグメント等の、抗体の変種および誘導体が含まれる。
【００７３】
又、本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856.）。
【００７４】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
【００７５】
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Diabodyなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００７６】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００７７】
又、本発明においては、細胞傷害活性を増強する目的などで、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ00/61739、ＷＯ02/31140など）。
【００７８】
又、本発明においては、2種以上の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体も含まれる。通常このような分子は2個の抗原を結合するものであるが(即ち、二重特異性抗体)、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上(例えば、3種類の)抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片(例えば、F(ab')2二特異性抗体)であり得る。
【００７９】
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖の共発現を含むものである(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ(クワドローマ)は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、CH2およびCH3領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のCH1領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするDNA、および、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
【００８０】
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖-軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、WO94/04690参照。二特異性抗体の作成方法については、さらに、Sureshら（Methods in Enzymology 121:210 (1986)）の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのCH3を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の1若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きさ側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（WO96/27011）。
【００８１】
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第4,676,980号;WO91/00360;WO92/00373;EP03089）。このようなヘテロ共役抗体の作成に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第4,676,980号にもそのような例が記載されている。
【００８２】
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずF(ab')2断片を作成し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にF(ab')2断片をチオニトロ安息香酸塩(TNB)誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のF(ab')2-TNB誘導体をFab'-チオールに再還元した後、F(ab')2-TNB誘導体およびFab'-チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
【００８３】
組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている(Kostelny et al., J,Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。まず、FosおよびJunタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のFab'部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体へテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を、これら2つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のVLおよびVHドメンと対を形成させ、それにより2つの抗原結合部位を形成させる方法もある(Hollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448 (1993))。また、一本鎖Fv(sFV)を用いたダイマーについても報告されている(Gruger et al., J.Immunol. 152:5368 (1994))。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている(Tutt et al., J.Immunol. 147:60 (1991))。
【００８４】
本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
【００８５】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、および組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。
【００８６】
モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１，１９８０）。上述の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下または腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。
【００８７】
ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
【００８８】
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とするタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６を参照）。
【００８９】
モノクローナル抗体をコードするDNAは、慣用な方法(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの好ましい出発材料である。一度単離したならば、DNAを発現ベクターに挿入し、E.coli細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、McCaffertyら(Nature 348:552-554 (1990))により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。
【００９０】
上述の抗体は、検出可能なように標識することができる。標識としては、放射性同位体、アフィニティー標識（例えばビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等が挙げられる。そのような標識を行う方法は当該技術分野においてよく知られている。上述の抗体は、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例には、プラスチック、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズ等が含まれる。抗体をそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【００９１】
後述の実施例において記載されるように、本発明の癌関連遺伝子は、特定の癌組織において亢進された発現を示すため、本発明の抗体は、癌診断マーカーとして有用である。本発明の抗体を、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、組織染色法などの手法において用いて、組織または細胞における、癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出することができる。被験者の組織に由来する試料（例えば、生検サンプル、血液サンプル等）と本発明の組成物とを免疫複合体が形成されるような条件下で接触させ、該試料に抗体が結合するか否かを判定することにより、該試料中の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質の存在または量を判定することができ、このことにより癌の診断、癌の進行または治癒のモニタリング、および予後の予測を行うことができる。本発明の診断用組成物は、試料中で上述の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を検出するためのキットとして提供することができる。このようなキットは、上述の抗体に加えて、洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬、例えば、標識第２抗体、標識された抗体と反応しうる発色団、酵素、または抗体結合試薬、ならびに使用の指針を含むことができる。
【００９２】
さらに、本発明の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、特定の癌細胞に対する特異性を有するため、癌の治療剤として、あるいは、薬剤を癌組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法において用いることができる。好ましくは、本発明の組成物は、肺癌、胃癌、大腸癌および肝癌の診断および治療において用いられる。
【００９３】
本発明の治療剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００９４】
経口投与用には、本発明の治療剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００９５】
非経口投与用には、本発明の治療剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明の治療剤を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。座剤処方は、本発明の治療剤をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００９６】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、本発明の治療剤は、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
【００９７】
治療剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、特に限定されず、経口投与でもよい。
【００９８】
ポリヌクレオチド
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
【００９９】
さらに、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１２ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１００】
これらのポリヌクレオチドは、癌の診断、タンパク質の製造、プライマー、遺伝子発現阻害の為のアンチセンス・siRNAなどに有用である。癌は、好ましくは、肺癌、胃癌、大腸癌および肝癌から選択される。
【０１０１】
配列番号１−６５に示される本発明の癌関連遺伝子は、後述の実施例において示されるように、特定のヒト癌組織においてその発現が亢進されている。したがって、本発明の組成物は、癌関連遺伝子の発現をサイレンシングするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等の薬剤として、および癌関連遺伝子を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いることができる。又、本発明のタンパク質を製造する際に用いることも可能である。
【０１０２】
本発明の組成物に含まれるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの混合物、あるいはＰＮＡ等の誘導体であってもよい。これらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、塩基および／または糖において化学的に修飾されていてもよく、５'末端および／または３'末端に修飾基を有していてもよい。ヌクレオシド間結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール等が挙げられる。塩基修飾の例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、および５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル等が挙げられる。糖修飾の例としては、２'−Ｏ−アルキル、２'−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２'−フルオロ修飾等が挙げられる。また、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソース等の糖を用いてもよい。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、通常、高い同一性を有する。ここで、高い同一性とは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有し、好ましくは、８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有することを言う。
【０１０４】
塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【０１０５】
さらに、本発明は、配列番号６６−１２３に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは本発明のタンパク質を製造する際に用いることができ、又、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列またはその相補的な配列を有するポリヌクレオチドが癌細胞で高発現していることから、それらのポリヌクレオチドを検出して癌の診断を行う際のプローブとして用いること等が可能である。
【０１０６】
又、本発明の組成物は、これを導入した細胞内で所望のアンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡを生成させることができる核酸構築物として提供してもよい。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをアンチセンス、リボザイム、siRNAなどとして用いる場合、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは少なくとも１２ヌクレオチド以上の鎖長を有していることが好ましく、さらに好ましくは１２−５０ヌクレオチドであり、特に好ましくは１２−２５ヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、所望のアンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡの活性を有する限り、上述したヌクレオチド配列から、１または数個の塩基が欠失、置換または付加された変異体であってもよい。このような変異体は、好ましくは、上述のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。あるいは、このようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションとの用語は、ＤＮＡまたはこれに対応するＲＮＡが、溶液中でまたは固体支持体上で、別のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、ストリンジェンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジェンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"、第２版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．、１９８９）に記載されている。
【０１０９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、５０％ホルムアミドの存在下で、７００ｍＭのＮａＣｌ中４２℃、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄である。
【０１１０】
本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法で製造することが可能である。例えば、当該技術分野において知られるプロトコルを用いて、市販のＤＮＡ合成機（例えば３９４合成器、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で合成することができる。あるいは、本明細書に開示される配列情報に基づいて、適当なテンプレートとプライマーとを組み合わせて用いて、当該技術分野においてよく知られるＰＣＲ増幅技術により製造することができる。
【０１１１】
さらに、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、本発明のポリヌクレオチドの配列の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えば、文献（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載の方法により調製してもよいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、本発明のDNAの配列（例えば、配列番号：１）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
【０１１２】
また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することも可能である。
【０１１３】
より具体的には、例えば、まず本発明のタンパク質を発現する細胞、組織（例えば、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞）などから、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia社) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia社) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
【０１１４】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR）を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) に従い、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
【０１１５】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
【０１１６】
また、本発明のDNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、本発明のDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）および／または終止コドン（TAA、TGA、またはTAG）の挿入等が挙げられる。
【０１１７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、試料中において癌関連遺伝子を検出するための核酸プローブとして用いることができる。本発明のプローブは、配列番号１−６５に記載される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列の少なくとも１２塩基、２０、３０、５０または１００塩基またはそれ以上の連続する塩基配列を有し、癌関連遺伝子の特定の領域に特異的にハイブリダイズするよう選択される。組織、血液等の資料からＤＮＡを抽出するか、またはｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、これをハイブリダイゼーションが生じるような条件下でプローブと接触させ、試料に結合したプローブの存在または量を検出することにより、試料中における癌関連遺伝子またはその転写産物の存在または量または変異を検出することができる。
【０１１８】
プローブは、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例としては、限定されないが、プラスチック、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ラテックスビーズおよびニトロセルロース等が含まれる。プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。プローブは、標準的な標識技術、例えば放射性標識、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光等を用いて標識することにより可視化することができる。すなわち、本発明の組成物は、試料中の癌関連遺伝子またはその転写産物の存在を検出するためのキットとして提供することができる。このようなキットは、上述のプローブに加えて、洗浄試薬、結合したプローブの存在を検出することができる試薬、ならびに使用の指針を含むことができる。
【０１１９】
あるいは、本発明の診断用組成物は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を増幅することができる１組のプライマーを含んでいてもよい。このようなプライマーを用いて、適当なｃＤＮＡライブラリをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅した後、ハイブリダイゼーションまたは塩基配列決定などの手法によりＰＣＲ産物を分析し、試料中の癌関連遺伝子またはその転写産物の存在または量または変異を検出することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、"ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９０に記載されている。
【０１２０】
プライマーとして用いるためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１−６５のいずれかに示される塩基配列、またはこれと相補的な塩基配列中の連続する少なくとも１２塩基、好ましくは１２−５０塩基、より好ましくは１２−２０塩基の配列を有する。
【０１２１】
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、癌関連遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに結合しその発現を阻害するアンチセンス分子、またはｍＲＮＡを切断するリボザイムまたはｓｉＲＮＡとして用いて、癌関連遺伝子をサイレンシングすることができる。アンチセンス、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ技術を用いて遺伝子発現を制御する方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、本発明の組成物を適当な担体とともに投与してもよく、あるいは、アンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡをコードするベクターを投与してインビボでこれらの発現を誘導してもよい。
【０１２２】
"リボザイム"との用語は、ｍＲＮＡを切断する触媒活性を有する核酸分子を表す。リボザイムは、一般に、エンドヌクレアーゼ、リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々のタイプのトランス作用性リボザイム、例えばハンマーヘッドおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。
【０１２３】
"アンチセンス"とは、ゲノムＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、その転写および／または翻訳を阻害することによりそのタンパク質の発現を阻害する、核酸分子またはその誘導体を表す。結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく、または、例えば、ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には、二重ヘリックスの主溝における特異的相互作用によるものでもよい。アンチセンス核酸の標的部位としては、ｍＲＮＡの５'末端、例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含む５'非翻訳配列が好ましいが、ｍＲＮＡの３'非翻訳配列またはコーディング領域の配列もｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが知られている。
【０１２４】
ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を行うことができる二本鎖核酸を意味する（例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８を参照）。ｓｉＲＮＡは、配列特異的にｍＲＮＡを分解し、このことにより遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的とする配列に相補的な配列を含む２０−２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０１２５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質を製造する際に用いることも可能である。
【０１２６】
スクリーニング
さらに別の観点においては、本発明は、抗癌活性を有する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、培養ヒト細胞を試験化合物と接触させ、そして前記細胞において配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量の変化を引き起こす化合物を抗癌活性を有する化合物として同定する工程を含む。
【０１２７】
試験化合物としては、天然または合成の任意の化合物を用いることができ、コンビナトリアルライブラリを用いてもよい。細胞における癌関連遺伝子の発現量は、例えば、上述した定量的ＰＣＲ法により簡便に測定することができるが、当該技術分野において知られる他のいずれの方法を用いてもよい。
【０１２８】
検査方法
本発明は、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、癌の検査方法を提供する。以下に検査方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定されるものではない。
【０１２９】
本発明の検査方法の1つの態様としては、まず、被検者からRNA試料を調製する。次いで、該RNA試料に含まれる本発明のタンパク質をコードするRNAの量を測定する。次いで、測定されたRNAの量を対照と比較する。別の態様としては、まず、被検者からcDNA試料を調製する。次いで、該cDNA試料に含まれる本発明のタンパク質をコードするcDNAの量を測定する。次いで、測定されたcDNAの量を対照と比較する。
【０１３０】
これらのような方法としては、当業者らに周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。
【０１３１】
DNAアレイ法においては、被検者から調製したRNAを鋳型としてcDNA試料を調製し、本発明のオリゴヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該cDNA試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該cDNA試料に含まれる本発明の遺伝子の発現量を測定する。次いで、測定された本発明の遺伝子の発現量を対照と比較する。
【０１３２】
被検者からのcDNA試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。cDNA試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の細胞あるいは組織（例えば、肺、大腸、胃、肝臓、など）から全RNAの抽出を行う。全RNAの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全RNA抽出には純度の高い全RNAが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。例えばAmbion社 "RNA later"を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社"Isogen"を用いて全RNAの抽出を行う。具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。
【０１３３】
次いで、抽出した全RNAを鋳型として、逆転写酵素を用いてcDNAの合成を行い、cDNA試料を調製する。全RNAからのcDNAの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したcDNA試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法(L Luo et al., Gene expression profiles of laser-capturedadjacent neuronal subtypes. Nat Med. 1999, 117-122)で実施することができる。
【０１３４】
ヌクレオチドプローブと該cDNAとのハイブリダイズの強度の検出は、cDNA試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、cDNAが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
【０１３５】
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者の細胞あるいは組織からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれる本発明のタンパク質の量を測定する。次いで、測定されたタンパク質の量を対照と比較する。
【０１３６】
このような方法としては、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びに本発明の抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。又、本発明の遺伝子の発現量の測定のかわりに、本発明のタンパク質の発現量を測定することによっても、癌の診断を行うことが可能である。
【０１３７】
上記の方法において、対照と比較して、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現量が有意に上昇していた場合、被検者は、癌を発症している、もしくは発症する可能性が高いと判定される。
【０１３８】
本発明はまた、癌の検査方法に用いるための検査薬を提供する。このような検査薬としては、本発明のオリゴヌクレオチドを含む検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）、本発明の抗体を含む検査薬が挙げられる。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。抗体は必要に応じて標識される。
【０１３９】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【０１４０】
C20orf102の検出
別の観点においては、本発明は、C20orf102タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。本発明の方法は、C20orf102タンパク質を検出することを特徴とする。C20orf102はN末端に分泌シグナルを有する分泌タンパク質であり、そのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列およびアミノ酸配列は、GenBank番号NM＿080607（配列番号２および６６）に開示されている。本発明において、C20orf102タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、C20orf102タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のC20orf102タンパク質の機能を有していなくてもよい。C20orf102タンパク質の分泌シグナルは配列番号６６のアミノ酸配列において１−24番目（Psort予測：http://psort.nibb.ac.jp/）が相当する。
【０１４１】
本発明においては、癌細胞、特に肺癌、肝癌（例えば、中分化型肝癌）、膵癌において、非常に高頻度でC20orf102がタンパク質レベルで発現亢進していることが見いだされた。また、C20orf102に特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、免疫組織診断が可能であることが示された。
【０１４２】
本発明で検出するC20orf102タンパク質はヒトC20orf102タンパク質が好ましいが、それに限定されず、イヌC20orf102、ネコC20orf102、マウスC20orf102、ハムスターC20orf102などいかなるC20orf102でもよい。
【０１４３】
本発明において検出されるC20orf102は分泌前のC20orf102でもよいが、分泌後のC20orf102が好ましい。C20orf102はN末端に分泌シグナルを有する分泌タンパク質であり、細胞内で産生された後に細胞外に分泌される。分泌後のC20orf102とは、細胞外に存在するC20orf102のことをいう。
【０１４４】
本発明において検出とは、定量的または非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にC20orf102タンパク質が存在するか否かの測定、C20orf102タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、C20orf102タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、C20orf102タンパク質の濃度の測定、C20orf102タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
【０１４５】
被検試料としては、C20orf102タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、細胞、細胞破砕物、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、または血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
【０１４６】
診断される癌は、特に制限されず如何なる癌でもよいが、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、腎癌、脳腫瘍、子宮癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができる。好ましいものは肺癌、肝癌、膵癌である。
【０１４７】
肝癌は、低分化型肝癌、中分化型肝癌、高分化型肝癌などに分類され、本発明による検出は如何なる肝癌でもよいが、中分化形肝癌の検出が好ましい。肺癌は、さらに肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、肺大細胞癌などに分類され、本発明による検出は如何なる肺癌でもよいが、肺腺癌の検出が好ましい。
【０１４８】
本発明においては、被験試料中にC20orf102タンパク質が検出された場合、陰性コントロールまたは健常者と比較して被験試料中に検出されるC20orf102タンパク質の量が多いと判断される場合に、被験者が癌であるまたは癌になる可能性が高いと判定される。
【０１４９】
本発明の診断方法の好ましい態様としては、細胞から遊離し、血中に存在するC20orf102タンパク質を検出することを特徴とする診断方法を挙げることができる。特に好ましくは、血中に存在するC20orf102タンパク質またはその断片を検出する。
【０１５０】
被検試料に含まれるC20orf102タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗C20orf102抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)（例えば、sandwich ELISA）である。ELISAなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【０１５１】
抗C20orf102抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗C20orf102抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗C20orf102抗体とC20orf102タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗C20orf102抗体を介して支持体に結合したC20orf102タンパク質を検出することにより、被検試料中のC20orf102タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【０１５２】
本発明において抗C20orf102抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（96穴マルチウェルプレート等）や、バイオセンサーチップなどを用いることができる。抗C20orf102抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【０１５３】
抗C20orf102抗体とC20orf102タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜24時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、C20orf102タンパク質と抗C20orf102抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Tween20等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【０１５４】
本発明のC20orf102タンパク質検出方法においては、C20orf102タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、C20orf102タンパク質を含まない陰性コントロール試料やC20orf102タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、C20orf102タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、C20orf102タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のC20orf102タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるC20orf102タンパク質を定量的に検出することも可能である。
【０１５５】
抗C20orf102抗体を介して支持体に結合したC20orf102タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗C20orf102抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗C20orf102抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、C20orf102タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【０１５６】
抗C20orf102抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗C20orf102抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【０１５７】
具体的には、抗C20orf102抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗C20orf102抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSA、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗C20orf102抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗C20orf102抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやRIA法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、2,2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）、1,2-フェニレンジアミン（オルソ-フェニレンジアミン）、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
【０１５８】
本発明のC20orf102タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗C20orf102抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【０１５９】
具体的には、抗C20orf102抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗C20orf102抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばBSAなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗C20orf102抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にC20orf102タンパク質を検出する。
【０１６０】
本発明のC20orf102タンパク質検出方法の他の態様として、C20orf102タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【０１６１】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗C20orf102抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているC20orf102タンパク質を、一次抗C20orf102抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【０１６２】
本発明のC20orf102タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗C20orf102抗体を感作した担体を用いてC20orf102を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン-ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗C20orf102抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりC20orf102を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【０１６３】
本発明のC20orf102タンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、BIAcore（アマーシャムバイオサイエンス社製）等のバイオセンサーを用いることによりC20orf102タンパク質と抗C20orf102抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗C20orf102抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗C20orf102抗体に結合するC20orf102タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
【０１６４】
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【０１６５】
本発明は、癌の診断のための被検試料中のC20orf102タンパク質を検出するための診断薬またはキットの提供をも目的とするが、該診断薬またはキットは少なくとも抗C20orf102抗体を含む。該診断薬またはキットがELISA法等のEIA法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【０１６６】
抗C20orf102抗体の作製
本発明で用いられる抗C20orf102抗体はC20orf102タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１６７】
又、支持体に固定される抗C20orf102抗体と標識物質で標識される抗C20orf102抗体はC20orf102分子の同じエピトープを認識してもよいが異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。
【０１６８】
本発明で使用される抗C20orf102抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗C20orf102抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【０１６９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、C20orf102を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【０１７０】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
【０１７１】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるC20orf102を、GenBank受託番号：NM＿080607に開示されたC20orf102遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、C20orf102をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトC20orf102タンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のC20orf102を精製して用いることもできる。
【０１７２】
次に、この精製C20orf102タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、C20orf102の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトC20orf102のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、C20orf102遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のC20orf102をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるC20orf102の部分および大きさは限られない。
【０１７３】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
【０１７４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4〜21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【０１７５】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【０１７６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、 P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【０１７７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【０１７８】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【０１７９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【０１８０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液（例えば平均分子量1000〜6000程度）を通常30〜60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【０１８１】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【０１８２】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【０１８３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでC20orf102に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、C20orf102への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるC20orf102を投与して抗C20orf102抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からC20orf102に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 94/25585 号公報、WO 93/12227 号公報、WO 92/03918 号公報、WO 94/02602 号公報参照）。
【０１８４】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【０１８５】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【０１８６】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。具体的には、抗C20orf102抗体を産生するハイブリドーマから、抗C20orf102抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit （Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
【０１８７】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【０１８８】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
【０１８９】
目的とする抗C20orf102抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
【０１９０】
本発明で使用される抗C20orf102抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【０１９１】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【０１９２】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【０１９３】
本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Humanized）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【０１９４】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【０１９５】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【０１９６】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。
【０１９７】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
【０１９８】
キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
【０１９９】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【０２００】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、C20orf102に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Fab、F（ab'）2、Fv、1個のFabと完全なFcを有するFab/c、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【０２０１】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12〜19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【０２０２】
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【０２０３】
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。
【０２０４】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【０２０５】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗C20orf102抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【０２０６】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体はC20orf102分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がC20orf102を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のHL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
【０２０７】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【０２０８】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【０２０９】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【０２１０】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。laczプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEB J.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【０２１１】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（refold）使用する。
【０２１２】
複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【０２１３】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【０２１４】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞中で発現される。
【０２１５】
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【０２１６】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【０２１７】
本発明の癌関連遺伝子
本発明において同定された癌関連遺伝子の名称、発現が亢進している癌組織、ならびにこれらの遺伝子の配列およびコードされるタンパク質の配列を示す配列番号の一覧を表１に示す。
【０２１８】
【表１】
2011015681.tif 000003
【０２１９】
【表２】
2011015681.tif 000004
【０２２０】
ＴＥＧ１（配列番号２；配列番号６６）は、C20orf102をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAA206763（参照配列NM＿080607）である。この遺伝子は、肺癌、中分化型肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２１】
ＴＥＧ２（配列番号３；配列番号６７）は、EST(ASCL2)をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI393930である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２２】
ＴＥＧ３（配列番号４）は、EST(EPST1isoform)をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBE645480である。この遺伝子は、胃癌、中分化型肝癌、大腸癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２３】
ＴＥＧ４（配列番号５）は、ESTをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAA447317である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２４】
ＴＥＧ５（配列番号６）は、ESTをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI217375である。この遺伝子は、胃癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２５】
ＴＥＧ６（配列番号７；配列番号６８）は、OK/SW-CL30をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI217375である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、中分化型肝癌、で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２６】
ＴＥＧ７（配列番号８）は、DKFZp686L1533をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBG492359である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、中・低分化型肝癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２７】
ＴＥＧ８（配列番号１０；配列番号６９）は、EST(Gene#30）をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBF825703である。この遺伝子は、胃癌、低分化型肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２８】
ＴＥＧ９（配列番号１１；配列番号７０）は、BC012317をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAL389981.1である。この遺伝子は、胃癌、低分化型肝癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２２９】
ＴＥＧ１０（配列番号１２）は、EST242881をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBG285837である。この遺伝子は、胃癌、中・低分化型肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３０】
ＴＥＧ１１（配列番号１３；配列番号７１）は、FLJ11041をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI343467である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中分化型肝癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３１】
ＴＥＧ１２（配列番号１５；配列番号７２）は、ESTをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBF057073である。後述の実施例に記載されるように、本発明においてこの遺伝子の全長配列が明らかになった。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３２】
ＴＥＧ１３（配列番号１６）は、ESTをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はH66658である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３３】
ＴＥＧ１４（配列番号１７；配列番号７３）は、ASPMをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿018123.1である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３４】
ＴＥＧ１５（配列番号１８；配列番号７４）は、Sp5をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI380207である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３５】
ＴＥＧ１６（配列番号１９）は、IMAGE:297403をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAF339813.1である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３６】
ＴＥＧ１７（配列番号２０；配列番号７５）は、DKFZp434k2435をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAL136855.1（参照配列NM＿032256）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３７】
ＴＥＧ１８（配列番号２２；配列番号７６）は、CBRC7TM＿249をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI694413である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中・低分化型肝癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３８】
ＴＥＧ１９（配列番号１；配列番号７７）は、VLGR1をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAF055084.1（参照配列NM＿032119）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２３９】
ＴＥＧ２０（配列番号９；配列番号７８）は、C20orf54をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAA903862（参照配列NM＿033409）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２４０】
ＴＥＧ２１（配列番号１４；配列番号７９）は、RHBGをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿020407.1（参照配列NM＿020407）である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２４１】
ＴＥＧ２２（配列番号２１；配列番号８０）は、COPG2をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAB047847.1（参照配列NM＿012133）である。この遺伝子は、大腸癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２４２】
ＴＥＧ２３（配列番号６４、６５；配列番号８１、８２）は、ESTをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAL039884である。後述の実施例に記載されるように、本発明において、この遺伝子の全長配列が明らかになった。この遺伝子は、低分化型肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２４３】
ＴＥＧ２４（配列番号２３；配列番号８３）は、BE670584をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBE670584である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２４４】
ＴＥＧ２５（配列番号２４；配列番号８４）は、GRP49をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAL524520（参照配列NM＿003667）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中分化型肝癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
【０２４５】
ＴＥＧ２６（配列番号２５；配列番号８５）は、MUC17をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAK026404.1である。この遺伝子は、胃癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２４６】
ＴＥＧ２７（配列番号２６；配列番号８６）は、EPHB2をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAF025304.1（参照配列NM＿004442）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
【０２４７】
ＴＥＧ２８（配列番号２７；配列番号８７）は、GPCR41（FLJ11856）をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAK021918.1（参照配列NM＿024531）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２４８】
ＴＥＧ２９（配列番号２８；配列番号８８）は、HS6ST2をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAI767756である。この遺伝子は、肺癌、大腸癌、低分化型肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
【０２４９】
ＴＥＧ３０（配列番号２９；配列番号８９）は、PCDHB2をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿018936.1（参照配列NM＿018936）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
【０２５０】
ＴＥＧ３１（配列番号３０；配列番号９０）は、WFDC3（C20orf167)をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAL050348である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
【０２５１】
ＴＥＧ３２（配列番号３１；配列番号９１）は、C20orf42をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿017671.1（参照配列NM＿017671）である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
【０２５２】
ＴＥＧ３３（配列番号３２；配列番号９２）は、PIGRをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿002644.1（参照配列NM＿002644）である。この遺伝子は、肺癌、大腸癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
【０２５３】
ＴＥＧ３４（配列番号３３；配列番号９３）は、2FE2L3をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿004289.3（参照配列NM＿004289）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２５４】
ＴＥＧ３５（配列番号３４；配列番号９４）は、TRAG3をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿004909.1（参照配列NM＿004909）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２５５】
ＴＥＧ３６（配列番号３５；配列番号９５）は、TRIM31をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿007028である。この遺伝子は、胃癌、膵癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２５６】
ＴＥＧ３７（配列番号３６；配列番号９６）は、KIAA1359をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAB037780である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２５７】
ＴＥＧ３８（配列番号３７；配列番号９７）は、ubiqutinDをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿006398である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、中・低分化型肝癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２５８】
ＴＥＧ３９（配列番号３８；配列番号９８）は、Hephaestinをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿014799.1（参照配列NM＿014799）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２５９】
ＴＥＧ４０（配列番号３９；配列番号９９）は、KIAA0152をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBC000371.1（参照配列NM＿014730）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、グリア芽腫、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２６０】
ＴＥＧ４１（配列番号４０；配列番号１００）は、KIAA0703をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿014861.1（参照配列NM＿014861）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２６１】
ＴＥＧ４２（配列番号４１；配列番号１０１）は、MEST/PEG1をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿002402.1（参照配列NM＿002402）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２６２】
ＴＥＧ４３（配列番号４２；配列番号１０２）は、KIAA1199をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAB033025.1である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２６３】
ＴＥＧ４４（配列番号４３；配列番号１０３）は、ELOVL2をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBF508639（参照配列NM＿017770）である。この遺伝子は、肝癌、グリア芽細胞腫、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２６４】
ＴＥＧ４５（配列番号４４；配列番号１０４）は、ROBO1をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBF059159（参照配列NM＿133631）である。この遺伝子は、肝癌、グリア芽細胞腫、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２６５】
ＴＥＧ４６（配列番号４５；配列番号１０５）は、FLJ10504MISATOをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBC002535.1（参照配列NM＿018116）である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
【０２６６】
ＴＥＧ４７（配列番号４６；配列番号１０６）は、cystatinSNをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿001898.1（参照配列NM＿001898）である。この遺伝子は、大腸癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
【０２６７】
ＴＥＧ４８（配列番号４７；配列番号１０７）は、LOC116238をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBE328850（参照配列NM＿138463）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、低分化型肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２６８】
ＴＥＧ４９（配列番号４８；配列番号１０８）は、MRPL50をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBG028213（参照配列NM＿019051）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中・低分化型肝癌、グリア芽腫、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２６９】
ＴＥＧ５０（配列番号４９；配列番号１０９）は、TOP1mtをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAW592604（参照配列NM＿052963）である。この遺伝子は、大腸癌、低分化型肝癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
【０２７０】
ＴＥＧ５１（配列番号５０；配列番号１１０）は、FKSG14をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBC005400.1（参照配列NM＿022145）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
【０２７１】
ＴＥＧ５２（配列番号５１；配列番号１１１）は、CDH3をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿001793.1（参照配列NM＿001793）である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２７２】
ＴＥＧ５３（配列番号５２；配列番号１１２）は、NRP2をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はN90777（参照配列NM＿003872）である。この遺伝子は、肺癌、グリア芽腫、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２７３】
ＴＥＧ５４（配列番号５３；配列番号１１３）は、CLDN3をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBE791251（参照配列NM＿001306）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２７４】
ＴＥＧ５５（配列番号５４；配列番号１１４）は、CLDN4をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿001305.1（参照配列NM＿001305）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２７５】
ＴＥＧ５６（配列番号５５；配列番号１１５）は、sfrp4をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAW089415（参照配列NM＿003014）である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、グリア芽腫、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
【０２７６】
ＴＥＧ５７（配列番号５６；配列番号１１６）は、ASPSCR1をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿024083.1（参照配列NM＿024083）である。この遺伝子は、肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
【０２７７】
ＴＥＧ５８（配列番号５７；配列番号１１７）は、GAGEC1をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿007003.1（参照配列NM＿007003）である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
【０２７８】
ＴＥＧ５９（配列番号５８；配列番号１１８）は、RHAMMをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿012485.1（参照配列NM＿012484）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
【０２７９】
ＴＥＧ６０（配列番号５９；配列番号１１９）は、PEG10をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBE858180（参照配列NM＿015068）である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、肝芽腫で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２８０】
ＴＥＧ６１（配列番号６０；配列番号１２０）は、PAEPをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿002571.1（参照配列NM＿002571）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２８１】
ＴＥＧ６２（配列番号６１；配列番号１２１）は、MGC10981をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はBC004397.1（参照配列NM＿032654）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２８２】
ＴＥＧ６３（配列番号６２；配列番号１２２）は、DUSP9をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はNM＿001395.1（参照配列NM＿001395）である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２８３】
ＴＥＧ６４（配列番号６３；配列番号１２３）は、KIAA1089をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はAB029012.1である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
【０２８４】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−２９０７０４号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【０２８５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【０２８６】
実施例１
ヒト癌組織において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒトの各種癌組織（肺腺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、脳腫瘍）において正常組織に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を行うために、ヒト各種癌摘出組織におけるmRNAの発現解析をGeneChip（Gene ChipTM HG-133A,B Target；Affymetryx社製）を用いて実施した。
【０２８７】
1.1.  ヒト肺腺癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト肺腺癌においてヒト正常肺組織に比べ発現が亢進する遺伝子を同定するために、下記のようにしてmRNAの発現解析を実施した。
【０２８８】
すなわち、初めに各種分化度・ステージを含む12例の肺腺癌摘出組織の癌部位、および1例の正常肺より、ISOGEN（日本ジーン社）を用いて添付の方法に従い全RNAを調製した。続いて、肺腺癌ならびに正常肺におけるmRNAの発現をGeneChipTM  HG-U133A,B（Affymetryx社製）を用いて解析した。すなわち、癌部位に関しては12例分より調製した全RNAをそれぞれ等量ずつ混合したもの5μgを、また対照として1例の正常肺より調製した全RNA 5μgを試料として用い、Expression Analysis Technical Manual（Affymetryx社）に準じて遺伝子発現解析を行った。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
【０２８９】
1.2.  ヒト胃癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト胃癌においてヒト正常胃組織に比べ発現が亢進する遺伝子を同定するために、上記と同様の方法によりmRNAの発現解析を実施した。
【０２９０】
すなわち、3例の胃癌摘出組織、および1例の正常胃より上記と同様に全RNAを調製し、癌部位に関しては3例分の全RNAをそれぞれ等量ずつ混合したもの5μgを、また対照として1例分の正常胃より調製した5μgの全RNAを試料として用い、GeneChipTM  HG-U133A,B（Affymetryx社製）を用いてmRNAの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
【０２９１】
1.3.  ヒト大腸癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト大腸癌においてヒト正常大腸組織に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を上記と同様に実施した。
【０２９２】
すなわち、3例の大腸癌摘出組織の癌部位および1例の正常大腸組織より上記と同様に全RNAを調製し、癌部位に関しては3例分の全RNAをそれぞれ等量ずつ混合したもの5μgを、また対照として1例分の正常胃より調製した5μgの全RNAを試料として用い、GeneChipTM  HG-U133A,B（Affymetryx社製）を用いてmRNAの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
【０２９３】
1.4.  ヒト肝細胞癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト肝細胞癌においてヒト正常肝臓に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を上記と同様に実施した。
【０２９４】
すなわち、3例のC型肝炎ウイルス感染型の中分化型肝細胞癌、3例のC型肝炎ウイルス感染型の低分化型肝細胞癌部位および1例の正常肝臓組織より上記と同様に全RNAを調製し、各種分化度の異なる癌部位に関しては各3例分の全RNAを等量ずつ混合したもの5μgを、また対照として1例分の正常肝臓より調製した5μgの全RNAを試料として用い、GeneChipTM  HG-U133A,B（Affymetryx社製）を用いてmRNAの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
【０２９５】
1.5.  ヒトグリア芽腫において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒトグリア芽腫においてヒト正常脳組織に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を上記と同様に実施した。
【０２９６】
すなわち、5例のグリア芽腫摘出組織の癌部位および1例の正常脳組織より上記と同様に全RNAを調製し、癌部位に関しては5例分の全RNAをそれぞれ等量ずつ混合したもの5μgを、また対照として1例分の正常脳組織より調製した5μgの全RNAを試料として用い、GeneChipTM  HG-U133A,B（Affymetryx社製）を用いてmRNAの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
【０２９７】
以上の解析の結果、表２に示す遺伝子がそれぞれ対応する正常組織に比べmRNAの発現が亢進していることが明らかとなった。
【０２９８】
【表３】
2011015681.tif 000005
【０２９９】
【表４】
2011015681.tif 000006
【０３００】
特にTEG1−TEG18に関しては今までにいかなる癌細胞においてもその発現亢進が明らかになっておらず、今回の解析によりある種の癌において発現が亢進することが示された。また、TEG19−TEG60の各遺伝子に関しては、今までに報告されていた癌種以外に、今回新たな癌種で発現が亢進することが明らかとなった。
【０３０１】
1.6.  各種癌組織において発現が亢進する遺伝子の同定
TEG1−TEG64の各遺伝子の、それぞれの癌種における発現解析を、GeneChipTM HG-U133A,B（Affymetryx社製）、およびGeneChipTM HG-U133plus2（Affymetryx社製）を用いて実施した。すなわち、肺小細胞肺癌10例、肺扁平上皮癌5例、肺腺癌5例、大腸癌7例、大腸癌肝転移組織8例、腎癌2例、および膵癌4例の各検体を個々に上項と同様に全RNAを調製した。そして、その全RNA5μgを、GeneChipTM HG-U133A,Bを用いてmRNAの発現解析を実施した。肺小細胞癌、大腸癌および大腸癌肝転移組織の一部についてはU-133Aチップのみの解析である。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。また、小細胞癌22例、および膵癌27例は、GeneChipTM HG-U133 plus 2を用いて、同様に解析を実施した。
【０３０２】
その結果、表３および４に示すように、TEG1−TEG64の各遺伝子が各癌種においても発現亢進していることが明らかとなった。
【０３０３】
【表５】
2011015681.tif 000007
【０３０４】
【表６】
2011015681.tif 000008
【０３０５】
【表７】
2011015681.tif 000009
【０３０６】
【表８】
2011015681.tif 000010
【０３０７】
【表９】
2011015681.tif 000011
【０３０８】
実施例２
RT-PCRを用いた発現亢進頻度の確認
上記のGene chip解析では各種摘出癌組織より調製したRNAをまとめて解析した点、ならびにGene chip解析の結果を確認するために、個々の癌サンプルならびに非癌部の正常組織における各遺伝子のmRNAの発現量をRT-PCR法により解析し、発現亢進の程度、ならびに発現亢進頻度を検討した。
【０３０９】
2.1. 各種癌組織からの一本鎖cDNAの調製
各種ヒト癌組織、ならびに正常組織より以下のようにしてPCRの際の鋳型DNAとして用いる一本鎖cDNAを調製した。
【０３１０】
すなわち、肺腺癌に関しては肺腺癌組織12例ならびに正常肺組織４例より、ヒト大腸癌に関しては10例のヒト大腸癌組織ならびに同摘出組織中の非癌部の正常大腸組織より、ヒト胃癌に関しては12例のヒト胃癌摘出組織、ならびに同摘出組織中の非癌部の正常胃組織より、ならびにヒト肝癌に関しては9例のヒト摘出肝癌組織ならびに同摘出組織中の非癌部よりそれぞれ全RNAを上記と同様の方法を用いて調製した後、全RNAより逆転写酵素SuperscriptII（GIBCO BRL社製）を用いて一本鎖 cDNAを合成した。このようにして調製した一本鎖cDNAは後述のPCRの際に鋳型DNAとして用いた。
【０３１１】
2.2. RT-PCRを用いた発現解析
続いて、表２に示す各遺伝子に関してRT-PCR法によりｍRNAの発現量を解析した。すなわち、25μLのPCR反応液は、500mM KCl, 100 mM Tris-HCl(pH8.3), 20mM MgCl2, 0.1% Gelatin、各1.25 mM dNTPs（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、1μLの一本鎖cDNA、5 pmoleずつの各遺伝子に特異的なセンスプライマー、アンチセンスプライマーのセット、0.75 μLのSYBR Green I (1000倍希釈溶液, 宝酒造社製)、0.25μLのrecombinant Taq polymerase Mix（FG Pluthero, Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase、Nucl. Acids. Res. 1993 21: 4850-4851.）を含むように調製した後、初めに94℃で3分間一次変性を行い、94℃で15秒、57℃で15秒、72℃で30秒からなるサイクルを30回行なった。各遺伝子のRT-PCRに用いたプライマーは表５に示すものをそれぞれデザインし解析に用いた。
【０３１２】
また、個々のRNA中のヒトβ-アクチン遺伝子発現量もヒトβ-アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号２５２：AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC）ならびにアンチセンスプライマー（配列番号２５３：CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG）を用い上記と同様に解析を行った。
【０３１３】
【表１０】
2011015681.tif 000012
【０３１４】
【表１１】
2011015681.tif 000013
【０３１５】
PCR法により増幅された産物は1.0%アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色にて確認を行う、またはiCyclerQリアルタイムPCR解析システム（BIO-RAD社）によりmRNA量を定量した。
【０３１６】
TEG1の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG1遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した12例の肺腺癌組織の内10例で明らかにTEG1遺伝子の高発現が確認された（図１）。
同様にして、正常肺5例と肺扁平上皮癌9例の定量的PCR解析を実施した。PCRの結果、TEG1遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した9例の肺扁平上皮癌組織の内3例でTEG1遺伝子の発現亢進が確認された（図７３）。
【０３１７】
TEG2の発現解析
5 例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNA、ならびに11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG2遺伝子のmRNAは解析した大腸癌においては5例中3例において、また胃癌においては11例中全てで明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２、３）。
【０３１８】
TEG3の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG3遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中9例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４）。
【０３１９】
TEG4の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG4遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中7例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５）。
【０３２０】
TEG5の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG5遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中7例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図６）。
【０３２１】
TEG6の発現解析
9例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNA、ならびに11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG6遺伝子のmRNAは解析した大腸癌においては9例中3例で明らかに癌部において発現の亢進が確認され、また胃癌においては解析した全ての正常胃においては全く発現が認められなかったのに対し、2例で非常に強いmRNAの発現が確認された（図７、８）。
【０３２２】
TEG7の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG7遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中6例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図９）。
【０３２３】
TEG8の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG8遺伝子のmRNAは解析した正常胃においてはほとんど発現が認められないのに対し、胃癌においては11例中1例で顕著なｍRNAの発現が確認された（図１０）。
【０３２４】
TEG9の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG9遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中6例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１１）。
【０３２５】
TEG10の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG10遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中10例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１２）。
【０３２６】
TEG11の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG11遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中10例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１３）。
【０３２７】
TEG12の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG12遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中6例で明らかに癌部において発現の亢進が確認され、特に中分化型肝癌（#21、29、32）および低分化型肝癌（#22、111、115）において顕著な発現亢進が認められた（図１４）。
【０３２８】
TEG13の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG13遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中4例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１５）。
【０３２９】
TEG14の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG14遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例全てで癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図１６）。
【０３３０】
TEG15の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG15遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中6例で癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図１７）。
【０３３１】
TEG16の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG16遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中5例で癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図１８）。
【０３３２】
TEG17の発現解析
10例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG17遺伝子のmRNAは解析した10例全てにおいて癌部での発現亢進が確認され、特に5例において明らかに高発現していた（図１９）。
【０３３３】
TEG18の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG18遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中7例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２０）。
【０３３４】
TEG19の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG19遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した12例の肺腺癌組織の内3例で明らかに発現が亢進することが確認された（図２１）。
【０３３５】
TEG20の発現解析  
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG20遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中6例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２２）。
【０３３６】
TEG21の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG21遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中5例で明らかに癌部において発現の亢進が確認され、特に中分化型肝癌（#21、27、29、32）において顕著な発現亢進が認められた（図２３）。
【０３３７】
TEG22の発現解析
6例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG22遺伝子のmRNAは解析した6例中3例で癌部での発現亢進が確認された（図２４）。
【０３３８】
TEG23の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG23遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中6例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２５）。
【０３３９】
TEG24の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG24遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中5例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２６）。
【０３４０】
TEG25の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG25遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中7例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２７）。
【０３４１】
TEG26の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG26遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中4例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２８）。
【０３４２】
TEG27の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG27遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては11例中8例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２９）。
【０３４３】
TEG28の発現解析
8例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG28遺伝子のmRNAは解析した胃癌においては8例中5例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３０）。
【０３４４】
TEG29の発現解析
肺腺癌組織8例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG29遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した8例の肺腺癌組織の内7例で明らかに発現が亢進することが確認された（図３１）。
【０３４５】
TEG30の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG30遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現はほとんど認められなかったのに対し、解析した12例の肺腺癌組織の内11例でmRNAの発現が確認され、さらにそれらの内4例で正常肺に比べ明らかに発現が亢進することが確認された（図３２）。
【０３４６】
TEG31の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG31遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現はほとんど認められなかったのに対し、解析した12例の肺腺癌組織の内7例で明らかに発現が亢進することが確認された（図３３）。
【０３４７】
TEG32の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG32遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現に比べ、解析した12例の肺腺癌組織の内4例で明らかに明らかに発現が亢進することが確認された（図３４）。
【０３４８】
TEG33の発現解析  
上記と同様に肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG33遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した12例の肺腺癌組織の内9例でmRNAの発現が確認され、特に4例において極めて高いmRNAの発現が確認された（図３５）。
【０３４９】
TEG34の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG34遺伝子のmRNAは解析した11例中8例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３６）。
【０３５０】
TEG35の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG35遺伝子のmRNAは解析した11例中7例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３７）。
【０３５１】
TEG36の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG36遺伝子のmRNAは解析した11例中8例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３８）。
【０３５２】
TEG37の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG37遺伝子のmRNAは解析した11例中7例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３９）。
【０３５３】
TEG38の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG38遺伝子のmRNAは解析した11例中8例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４０）。
【０３５４】
TEG39の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG39遺伝子のmRNAは解析した全体的に癌部での発現が高い傾向が認められ、特に11例中6例で癌部において発現の亢進が確認された（図４１）。
【０３５５】
TEG40の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG40遺伝子のmRNAは解析した11例中4例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４２）。
【０３５６】
TEG41の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG41遺伝子のmRNAは解析した11例中4例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４３）。
【０３５７】
TEG42の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG42遺伝子のmRNAは正常胃においては全体的に発現が低いのに対し、解析した11例中6例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４４）。
【０３５８】
TEG43の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG43遺伝子のmRNAは正常胃ではほとんどmRNAの発現が認められなかったのに対し、癌部においては解析した11例中9例でｍRNAの発現が確認された（図４５）。
【０３５９】
TEG44の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG44遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中5例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図４６）。
【０３６０】
TEG45の発現解析
11例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG45遺伝子のmRNAは解析した肝癌11例中7例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図４７）。
【０３６１】
TEG46の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG46遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例全てにおいて癌部での発現の方が高い値を示し、特に6例で癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図４８）。
【０３６２】
TEG47の発現解析  
10例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG47遺伝子のmRNAは解析した10例中8例のサンプルにおいて正常大腸組織に比較し、明らかに癌部での発現亢進が認められた（図４９）。
【０３６３】
TEG48の発現解析
10例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG48遺伝子のmRNAは解析した10例中9例において癌部での発現亢進が確認された（図５０）。
【０３６４】
TEG49の発現解析
6例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG49遺伝子のmRNAは解析した6例中3例において非癌部に比べ癌部において発現が亢進していることが確認された（図５１）。
【０３６５】
TEG50の発現解析  
6例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、解析した6例全ての正常大腸組織ではTEG50由来のバンドの増幅は認められなかったのに対し、癌部では6例中4例においてバンドの増幅が認められ、癌部において発現が亢進することが確認された（図５２）。
【０３６６】
TEG51の発現解析  
6例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG51遺伝子のmRNAはいずれの正常大腸組織でもPCRによる増幅が認められなかったのに対し、解析した6例の大腸癌組織の内5例でTEG51遺伝子の明らかな増幅が確認されたことより、大腸癌において発現が亢進していることが確認された（図５３）。
【０３６７】
TEG52の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG52遺伝子のmRNAは正常肺組織に比べ解析した12例中7例で明らかに肺癌において発現が亢進することが確認された（図５４）。
【０３６８】
TEG53の発現解析
肺腺癌組織8例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG53遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した8例の肺腺癌組織の全てで発現の亢進が確認された（図５５）。
【０３６９】
TEG54の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG54遺伝子のmRNAは正常胃においては解析した11例中9例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５６）。
【０３７０】
TEG55の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG55遺伝子のmRNAは解析した11例中6例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５７）。
【０３７１】
TEG56の発現解析
11例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG56遺伝子のmRNAは正常胃においては全体的に発現が低いのに対し、解析した11例中9例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５８）。
【０３７２】
TEG57の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG57遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中5例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図５９）。
【０３７３】
TEG58の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG58遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中5例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図６０）。
【０３７４】
TEG59の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG59遺伝子のmRNAは解析した非癌部9例においては発現量が全体的に少ないのに対し、解析した肝癌9例全てで癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図６１）。
【０３７５】
TEG60の発現解析
9例の肝芽腫組織および2例の正常肝臓より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG60遺伝子のmRNAは解析した正常肝臓においてはほとんど発現が認められないのに対し、解析した肝芽腫9例の内8例において明らかに発現の亢進が確認された（図６２）。
【０３７６】
TEG61の発現解析  
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
その結果、TEG61遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した12例の肺腺癌組織の内3例でPAEP遺伝子の高発現が確認された（図６３）。
【０３７７】
TEG62の発現解析
肺腺癌組織12例および正常肺組織4例より調製したRNAを用い、定量的RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG62遺伝子のmRNAは正常肺組織での発現に比べ、解析した12例の肺腺癌組織の内8例で明らかに発現が亢進することが確認された（図６４）。
【０３７８】
TEG63の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG63遺伝子のmRNAは解析した非癌部9例においては発現がほとんど認められないのに対し、解析した肝癌9例中8例で明らかに発現の亢進が確認された（図６５）。
【０３７９】
TEG64の発現解析
9例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したRNAを用い、RT-PCR法により遺伝子発現比較を行った。
PCRの結果、TEG64遺伝子のmRNAは解析した肝癌9例中8例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図６６）。
【０３８０】
以上の結果より、これらの遺伝子、または蛋白の現量量を測定することで癌の診断に用いられることが明らかになった。
【０３８１】
実施例３
肝癌発現遺伝子TEG12の全長cDNAの単離、同定
上記のGene chip解析ならびにRT-PCR解析の結果、肝癌において発現が亢進することが明らかになったTEG12のcDNA配列を明らかにするために、cDNAの単離、同定を試みた。
【０３８２】
すなわち、Gene chip解析の際にプローブ配列の由来となったEST（GenBank; BF057073：配列番号２５４）の近傍に存在するEST（GenBank; BU844373）をGenBankより抽出し各ESTにハイブリダイズするプライマーをデザインしPCRによるcDNAの増幅を行った。PCRはヒト肝癌細胞株であるHep3B、HuH6、HepG2より調製したRNAを等量ずつ用い作製した一本鎖cDNAを鋳型とし、各5 pmoleのPCRプライマーLS557（ATCCGCCAGG TGAAAGCCAA GTC：配列番号２５５）ならびにLS589（GGGATTCACA TTACCACGGC AGTGC：配列番号２５６）を用い実施した。なお、PCRはLA-PCRキット（宝酒造社製）を用い、94℃で30秒、63℃で30秒、そして72℃で5分からなるサイクルを35サイクル実施した結果、約2000 bpのバンドが増幅された。PCR増幅産物をpGEM-T easyベクター（Promega社製）に挿入した後、増幅遺伝子の塩基配列を定法により解析した結果、元々のEST（BF057073）のDNA配列より5'側の上流領域の配列を含む遺伝子であることが明らかになった。なお、PCRにより増幅されたDNA配列は配列番号２５７に示す。
【０３８３】
続いて、BF057073の近傍にあると考えられる別のEST配列（BU859386）と上記により単離・同定された遺伝子の配列を元にデザインしたPCRプライマーを用いPCRを実施した。PCRプライマーとしては各5 pmoleのLS858（ATGGCTTCGT TCCCCGAGAC CGATTC：配列番号２５８）ならびにLS859（GAAGACGAGG ATTCGATTGT TGCCAAAGT CCACC：配列番号２５９）を用い、95℃で30秒、68℃で3分のサイクルからなる反応を35サイクル行った以外は上記と同様の条件にて実施した結果、約2,500bpのバンドが増幅された。PCR増幅産物は上記と同様にpGEM-T easyベクターに挿入した後、塩基配列の同定を行った結果、さらに5'-側の配列を含むことが明らかになった。なお、PCRにより増幅されたDNA配列は配列番号２６０に示す。
【０３８４】
以上のPCR法により得られた2つの増幅産物の配列を基に全長3,401 bpからなる新規cDNAを同定し、一つのオープン・リーディング・フレームが見出された（図６７）。その塩基配列を配列番号１５に、また塩基配列から類推されるアミノ酸配列を配列番号７２に示した。今回単離・同定された配列を基にBlast検索を実施した結果、GenBank No. XM＿067369（配列番号２６３）と相同性を示すことが明らかになったものの、一部配列が異なっている領域が認められた（図６８）。以上の結果より肝癌細胞において特異的に発現が亢進する新規遺伝子を単離・同定し、K#1と命名した。
【０３８５】
今回単離した塩基配列より類推されるアミノ酸配列を元に既知蛋白との相同性検索を行った結果、ヒトTRIM3α（Tripartite motif-containing 3、GenBank番号NM＿006458）と28.6%の相同性を、ヒトTRIM2と27.5%の相同性をそれぞれ示した。TRIMファミリーは現在までに37種が報告されており、いくつかの特徴的なモチーフをもつことが知られている（Reymond A., ら、EMBO J. (2001) 20. 2140-2151）。そこで、K#1のアミノ酸配列を基にモチーフ解析を行った結果、アミノ酸配列の相同性と同様にTRIM3ならびにTRIM2と比較的類似したモチーフ構造を持つことが明らかになり、実際にTRIM3αとは図６９に示すように特徴的なモチーフが保存されていた。しかしながら、既知のTRIMファミリーには完全にK#1の示すモチーフ構造と同一の構造を示す分子は存在していないことより、今回単離・同定したK#1はTRIM2およびTRIM3に比較的類似した新規TRIM分子であることが強く示唆された。また、今回単離したK＃1と同様にTRIM３と同様の構造を示すラットBERPは、細胞内に局在し、ミオシンV等と共役し蛋白の細胞内輸送に関与すること、あるいは神経突起の伸展に関与することが示唆されている（El-Husseini,Aら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、267、 906-911、2000、El-Husseini,Aら、J. Biol. Chem. 274、19771-19777、1999）。以上のことより、今回同定したK#1蛋白はTRIMファミリーに属し、さらにラットBERPと同様に細胞内の蛋白輸送などに関与することで細胞の形態形成や増殖などに関与する可能性が考えられ、肝癌等の発現が亢進する病態において重要な役割を示すこと、ならびに医薬品のターゲット分子としての可能性が考えられた。
【０３８６】
実施例４
4-1.  肝癌発現遺伝子（TEG23）の全長cDNAの単離、同定
上記のGene chip解析ならびにRT-PCR解析の結果、肝癌において発現が亢進することが明らかになったTEG23の全長cDNA配列を明らかにするために、RACE（Rapid amplification of cDNA ends）法を用いcDNAの単離、同定を試みた。
【０３８７】
すなわち、Gene chip解析の際のプローブ配列（229349＿at＿u133B）より5'-側の配列を同定するためにSMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を用いて5'-RACE解析を実施した。初めに、プローブの由来となったヒトEST（GenBank Accession No.AL039884：配列番号２６１）の配列を元に設計したプライマーLS900（配列番号２６２：GGGTTCACTT TGGTCTCTAG TACGG）を用い、肝癌細胞株HepG2、HuH6、ならびにHep3Bより調製した全RNAをそれぞれ等量ずつ混合した1000 ngの全RNAよりキット添付の方法に従い一本鎖 cDNAを合成した。続いて、合成した一本鎖cDNAを鋳型としてPCRにより5'-側の配列を含むcDNAを増幅した。すなわち、1.25 μLの一本鎖 cDNA、5 pmoleのLS900 をPCRプライマーとして用い、キット添付の方法に従いPCR反応を行った。PCRは初めに94℃で1分間編成を行った後、98℃で10秒、68℃で3分のサイクルからなる反応を35サイクル、そして72℃で5分間インキュベートした。約5,000 bpのPCR産物をpGEM-T easyベクター（Promega社製）に挿入し、常法により大腸菌DH5α（東洋紡社製）を形質転換後、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNA中の挿入遺伝子の塩基配列を解析した結果、二種類の塩基配列持つclone-11とclone-18を得た。それぞれの配列の3'側にヒトEST（GenBank Accession No.AL039884）の配列を付加したものを配列番号６４と配列番号６５に示す。今回単離された二種類のクローンいずれにおいてもそれぞれ250アミノ酸（clone-11）、または210アミノ酸（clone-18）をコードするオープン・リーディング・フレームを持つことが明らかになった（図７０、７１）。なお、clone-11より類推されるアミノ酸配列を配列番号８１に、clone-18より類推されるアミノ酸配列を配列番号８２に示す。今回得られた二種のクローンにおいて類推されるアミノ酸配列を比較すると、clone-11はclone-18よりN末側に40アミノ酸長いことより、今回単離された二種のクローンは5'-側の使用しているエクソンの異なるスプライシング・バリアントである可能性が予測された。以上の結果より肝癌細胞において発現が亢進する新規遺伝子を単離・同定し、K#2と命名した。
【０３８８】
K#2（clone-11）のアミノ酸配列を基にBlast検索を実施し、類縁の蛋白を同定した結果、ヒトLIN-28（GenBank No. NM＿024674）（配列番号２６４）と71.8%の相同性、線虫LIN-28とは（GenBank No. NM＿059880）（配列番号２６５）と33.1％の相同性を示すことが明らかになった。LIN-28ホモログは線虫やショウジョウバエに加えマウス、ヒトといった高等生物においても保存されている蛋白であることより（Moss, E.G.ら、Dev. Biol.、258、432-442、2003）、ヒトLIN-28、線虫LIN-28に加え、さらにアフリカツメガエルLIN-28（GenBank No.AF521098）（配列番号２６６）、ショウジョウバエLIN-28（GenBank No.AF521096）（配列番号２６７）、マウスLIN-28（GenBank No.NM＿145833）（配列番号２６８）を加え、それぞれのアミノ酸配列を比較したところ、いずれにおいてもコールド・ショック・ドメインおよびZnフィンガー・ドメインを保持することが明らかとなったことより（図７２）、今回単離・同定したK#2は新たなヒトLIN-28ホモログである可能性が強く示唆された。なお、LIN-28はmRNAに結合しｍRNAからの翻訳やmRNAの安定性に関与することで、発生期の細胞運命の制御に関わるタンパク質であることが明らかになっている（Moss,E.G.ら、Cell、88、637-646、1997）。以上のことより、K#2蛋白もLIN-28と同様の機能を有する可能性が考えられ、ヒト発生期の制御、あるいは癌細胞の発生、増殖、あるいは肝炎ウイルス等のウイルスの複製等に関与することが予測された。
【０３８９】
4-2.  抗K#2抗体の作製
抗K#2抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗K#2抗体の作製を行った。
【０３９０】
K#2の免疫用抗原としてK#2（clone-18）のアミノ酸の部分配列（1−210aa）をGST融合タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、K#2 cDNA clone-18を鋳型とし、プライマーF（配列番号２７８）、およびプライマーR（配列番号２７９）を用いPCR法にてK#2（1-210aa）をコードする遺伝子を増幅し、続いてpGEM-Teベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素EcoRI-NotIを用いて切断した遺伝子断片をpDEST15（Invitrogen社製）に挿入し、発現ベクターpDEST15-K#2を構築した。
配列番号２７８（F）: CACCATGGGATTTGGATTCATCTCCATGAT
配列番号２７９（R）: TGTCTTTTTCCTTTTTTGAACTGAAGGCCCC
【０３９１】
続いて、発現ベクターpDEST15-K#2を上項と同様にGST結合型抗原タンパク質（k#2(1-210aa)）を上項と同様に調製し、K#2ポリクローナル抗体の作製のため、k#2(1-210aa)-GST融合タンパク質を免疫したウサギ抗血清の調製を実施した。すなわち、ニュージーランドホワイト種ウサギ（10週齢雌、日本クレア社製）にPBS懸濁したK#2＿GST融合タンパク質100μg/0.5mL/匹をフロイント完全アジュバント（DIFCO社）0.5 mLと混合してエマルジョンにしたものを皮下注射により投与して初回免疫を行った。以後2週間間隔で、PBSに懸濁したK#2＿GST融合タンパク質100μg/0.5mL/匹をフロイント不完全アジュバント0.5 mLと混合してエマルジョンにしたものを、皮下注射により投与して合計４回免疫を実施した。免疫前、3回、そして4回目免疫後に採血を実施し、K#2＿GST融合タンパク質に対する抗体価上昇をELISA法で確認した。抗体価の上昇を確認した後、全採血を行い、K#2免疫ウサギ抗血清を得た。これを抗K#2ポリクローナル抗体とした。
【０３９２】
4-3.  抗K#2ポリクローナル抗体を用いたK#2タンパク質分子の検出
上記により調製したK#2免疫ウサギ抗血清の反応性を確認するために、K#2強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いK#2の検出を行った。
【０３９３】
K#2発現用動物細胞発現ベクターは前述のK#2をコードするcDNAをpcDNA3.1に挿入し、K#2遺伝子発現ベクターpcDNA3.1-K#2とした。そして、1 μgの発現ベクターpcDNA3.1-K#2を2 x 105個HEK293細胞にFuGene6試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、K#2を一過性発現させた。発現ベクター導入3日後の細胞を回収し、培養細胞をRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。それぞれ3 mgタンパク質相当量のライゼートをSDS-ポリアクリルアミドゲルに供し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離した後、Hybond-P（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体として抗K#2ポリクローナル抗体（抗血清5000倍希釈）を使用し、二次抗体にHRP標識抗ウサギIgG抗体（ジャクソン社製）を用い、ECLプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、K#2と考えられるバンドが検出された。
【０３９４】
同時に各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、GeneChipU133の解析結果と一致し、mRNA発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約27kDaの全長のK#2と考えられるバンドを検出することに成功した（図７８）。なお、Li-7細胞およびHep3B細胞に関してGeneChipデータはない。
【０３９５】
4.4  抗K#2ポリクローナル抗体を用いた肝癌組織におけるK#2のタンパク質の発現解析
K#2癌の組織抽出物を用いて抗K#2ポリクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、4mg/mLとなるように調製した後、SDS-サンプルバッファーと等量混合し、95℃で5分間加熱処理を行った。15％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを10mgずつアプライし、SDS-PAGEを行った。
【０３９６】
上記と同様に、抗K#2ポリクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的なK#2付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図７９）。
【０３９７】
以上の結果により、TEG23:K#2分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において分泌されていることが明らかになったことにより、抗K#2抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０３９８】
実施例５
抗TEG1：C20orf102モノクローナル抗体の作製
抗C20orf102抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗C20orf102モノクローナル抗体の作製を行った。
【０３９９】
5-1．C20orf102 cDNAの単離
C20orf102の発現を行うために、まずC20orf102のcDNAを以下のようにして単離した。肺腺癌組織より前述の方法に従い一本鎖cDNAを調製し、それを鋳型としてＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩの制限酵素サイトのついたプライマーF（配列番号:２６９）とR（配列番号:２７０）を用いてPCR法にて、C20orf102予測配列と一致する約615bp付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ用酵素および試薬には、アドバンテージHF ポリメラーゼミックス（Advantage HF Polymerase Mix；クロンテック社製）およびアドバンテージHF ＰＣＲバッファー（Advantage HF PCR buffer）、２００μＭ デオキシヌクレオチド三リン酸、０．２μＭプライマーを用い、ｃＤＮＡ １μＬを鋳型にしたＰＣＲ（９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃３分、３５サイクル）を行った。PCR法で得られた特異的増幅断片はＤＮＡライゲーションキット（タカラ社製）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したcDNAがC20orf102に相当することが明らかとなった。なお、プライマーＦはC20orf102遺伝子（GenBank: NM＿080607）の5'-端にハイブリダイズするように、そしてＲは3'-端にハイブリダイズするようにデザインした。
配列番号２６９（Ｆ）: CGAATTCATGGGGGCCCCGCTCGCCGTAGC
配列番号２７０（Ｒ）: CCTCGAGGAGGCTGCAGGCCTCCTGGTCCA
【０４００】
5-2．C20orf102の免疫用抗原の調製
ＰＣＲ産物を組み込んだｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターはコンピテント細胞ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）へ形質転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−β−インドリルーガラクトピラノシド（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-Galactopyranoside；X-gal）を用いたカラーセレクションを行い、ＰＣＲ産物が組み込まれたベクターのみを選出した。形質転換は、コンピテント細胞に１０μLのライゲーション反応産物を加え、３０分間氷冷後に、４２℃のヒートショック４５秒、続けて２分間氷冷して形質転換を起こさせた。さらに、抗生物質耐性遺伝子の発現を行うために抗生剤を含まないＬＢ培地を９００μL加え、３７℃で３０分間穏やかに撹拌した。遠心で菌体を回収し、２０mg/mLのＸ−ｇａｌを２０μＬ散布させた、アンピシリンを含むＬＢプレートに菌体をまき込み、３７℃で１６時間培養した。プレート上で生育したコロニーのうち、発色をしていないコロニー（ＰＣＲ産物がベクターに組み込まれていることが予想されるもの）を５個選択し、最終濃度が１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間激しく撹拌し、菌体を増殖させた。増殖した菌体の一部から、フェノール／クロロホルム抽出によってプラスミドＤＮＡを回収し、ＥｃｏＲ  Ｉ（８Ｕ／μＬ）を０．５μＬ、１０×Ｈ  バッファーを２μＬ、蒸留水を７．５μＬ加え、３７℃で１時間消化を行った。０．８％のアガロースゲルを用いた電気泳動で消化物のサイズが目的のＰＣＲ産物のサイズと同一であることを確認した。C20orf102の遺伝子が組み込まれたと考えられるプラスミドＤＮＡの回収はカンタムプレップ  プラスミド  ミニプレップキット（Quantum Prep Plasmid MiniPrep Kit （バイオラッド社製）を用いて行った。溶出は蒸留水で行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素EcoRI-XhoIを用いて切断した遺伝子断片を、大腸菌タンパク質発現用ベクターであるpET41aベクター（Novagen社製）に挿入に組み換えた。ｐＥＴ４１に組み込まれた遺伝子は、ＧＳＴ融合タンパク質として翻訳される。
【０４０１】
ｐＥＴ４１を制限酵素（EcoRIおよびXhoI）で消化し、電気泳動を行い、キアクイック  ゲル抽出キットで精製を行った。ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙによって増幅したC20orf102の配列をもつフラグメントはＤＮＡライゲーションキットを用いてｐＥＴ４１に組み込みを行った。
【０４０２】
ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙから精製を行ったC20orf102フラグメント４μＬに、ライゲーションバッファー５μＬおよびｐＥＴ４１を１μＬ加え、１６℃で３０分間保温した。
【０４０３】
ライゲーション反応の終了したプラスミドＤＮＡはＸＬ−１  Ｂｌｕｅへ形質転換を行い、カナマイシンを含むＬＢ培地で１６時間振盪を行い、菌体を増殖させた。増殖させた大腸菌から、カンタムプレップ  プラスミド  ミニプレップキットを用いて、プラスミドの精製を行った。ｐＥＴ４１へのC20orf102の挿入を確認するために、ｐＥＴがもつ配列に対するプライマー（配列番号２７１および２７２）でシーケンスを行った。
配列番号２７１: TTCGAACGCCAGCACATGGAC
配列番号２７２: GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG
【０４０４】
ｐＥＴ４１ベクターに組み込まれたC20orf102を、Ｔ７プロモーターを持つコンピテント細胞ＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ  ＰＬＵＳ  ＲＩＬ（ノバジェン社製）に形質転換させた。
【０４０５】
形質転換は、以下の手順で行った。１００μLのＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ  ＰＬＵＳ  ＲＩＬにｐＥＴ−C20orf102−ＦＬを１μg／μL濃度で１μL加え５分間氷冷した。その後、４２℃の恒温層に２０秒間漬け、ヒートショックを与えた。さらに２分間氷冷した後、９００μLの抗生剤無添加のＬＢを加え、３７℃で１０分間インキュベートした後に、遠心（１０００×ｇ、５分）を行った。上清を廃棄した後コンピテント細胞を再懸濁させ、カナマイシンを含んだＬＢプレートにまきこんで３７℃で１６時間、選択培養を行った。
【０４０６】
大腸菌を用いて発現させたC20orf102のＧＳＴ融合タンパク質の精製はＧＳＴとグルタチオンの結合を利用したアフィニティ精製で行った。まず、培養液を６０００×ｇ、４℃で１０分間遠心することで大腸菌の菌体を回収した。菌体溶解バッファー（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩, pH８．０）を加え、氷上で超音波処理を行った。その後、最終濃度が１％になるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、１３４００×ｇ、４℃で４５分間遠心を行って上清を回収した。この上清にグルタチオンセファロース（アマシャムバイオサイエンス社製）を５００μＬ加え、４℃で１時間転倒混和を行い、ＧＳＴ−C20orf102融合蛋白質を吸着させた。
【０４０７】
遠心（３０００×ｇ、４℃、５分）でグルタチオンセファロースを回収し、１０ｍLのＰＢＳ−Ｔ（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ還元型グルタチオン、２００ｍＭ塩化ナトリウム１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を加えて４℃で１時間転倒混和し、ＧＳＴ融合タンパク質を溶出させた。遠心（３０００×ｇ、４℃、５分）によってグルタチオンセファロースを除去し、ＧＳＴ融合C20orf102精製蛋白質を得た。ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）でＰＢＳ溶液とし、ブラッドフォード法によってタンパク質濃度を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を検定し、免疫に必要なタンパク質の量および純度を満たしていることを確認し、このタンパク質を以下に示すモノクローナル抗体作製のための免疫原とした。
【０４０８】
5-3．C20orf102モノクローナル抗体の作製
ヒトC20orf102の完全長蛋白質のＧＳＴ−融合発現物（大腸菌発現物）精製品を免疫原とした。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌６週齢）に５０μｇ／匹で３回免疫した後、血清中の抗体価を検定した。抗体価検定法として、免疫原０．５μｇ／wellを固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、予めＧＳＴ蛋白質で抗ＧＳＴ抗体のノイズを吸収させた免疫マウス血清の希釈列を反応させ、ＨＲＰ標識抗マウス抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について４５０nmの吸光度を測定する方法（免疫抗原固相ＥＬＩＳＡ法）を使用した。
【０４０９】
抗体価亢進を認めたマウスに２５μｇ／匹を最終免疫し、７２時間後に脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）と細胞融合（Kohler G, Milstein C: Nature 256, 495(1975)）を行った。ＨＡＴ選択培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマを得た。ハイブリドーマの培養上清を予めＧＳＴ蛋白質で吸収させた後に免疫抗原固相ＥＬＩＳＡを行い、C20orf102（大腸菌発現物）に対して反応するものを一次選抜した。免疫抗原ＥＬＩＳＡ陽性のバイブリドーマについては、ＣＯＳ７細胞にC20orf102を強制発現させた細胞株のタンパク質抽出液を用いたウエスタン・ブロッティングにおいて特異性を検定した。陽性のものについて限界希釈法にてクローニングを行い、モノクローナル抗体産生株を樹立した。抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに接種することによってマウス腹水を得た。腹水中のモノクローナル抗体を硫安塩析法で精製し、精製抗体を調製した。以上により、抗C20orf102抗体H9615を作製した。
【０４１０】
実施例６
抗C20orf102モノクローナル抗体を用いたC20orf102タンパク質分子の検出
上記により調製した抗C20orf102モノクローナル抗体H9615の反応性を確認するために、C20orf102強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いC20orf102の検出を行った。
【０４１１】
初めに、C20orf102強制発現COS7細胞を用いウエスタンブロット解析により抗C20orf102モノクローナル抗体H9615の反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは前述のC20orf102をコードするcDNAをpcDNA4Mys-His（Invitrogen社製）に挿入したC20orf102遺伝子発現ベクターを使用した。すなわち、1μgの発現ベクターを 5 x 104個のCOS7細胞にFuGene6試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、C20orf102を一過性発現させた。発現ベクター導入3日後の細胞を回収し、培養細胞をRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。それぞれ10μgタンパク質相当量のライゼートをSDS-ポリアクリルアミドゲルに供し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離した後、Hybond-P（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして抗C20orf102モノクローナル抗体H9615（1μg/mL）を使用し、二次抗体にHRP標識抗マウスIgG抗体（ジャクソン社製）を用い、ECLプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、理論分子量22.5kDa付近に特異的なC20orf102と考えられるバンドが検出された。
【０４１２】
同時に、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、GeneChipU133の解析結果と一致し、mRNA発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約22.5kDaの全長のC20orf102と考えられるバンドを検出することに成功した（図７４）。
【０４１３】
さらに、C20orf102遺伝子が予測配列として分泌シグナルを有することから、C20orf102を発現する癌細胞株において分泌型のC20orf102が培養上清中に検出できるか確認したところ、C20orf102を高発現する癌細胞株の培養上清中にも強制発現細胞の培養上清と同じ分子量のバンドが抗C20orf102モノクローナル抗体により検出された（図７４）。
【０４１４】
以上の結果より、抗C20orf102モノクローナル抗体H9615はC20orf102を特異的に検出できること、ならびにGeneChip解析によるmRNA発現の程度とC20orf102タンパク質の発現の程度が一致することが明らかとなった。さらに、抗C20orf102モノクローナル抗体を用いた検討からC20orf102発現細胞の培養上清中に分泌型のC20orf102が存在することが明らかとなったことより、分泌型C20orf102を検出することで癌細胞の有無を判断できる可能性が強く示唆された。
【０４１５】
実施例７
抗C20orf102モノクローナル抗体を用いた肺腺癌組織におけるC20orf102のタンパク質の発現解析
肺腺癌の組織抽出物を用いて抗C20orf102モノクローナル抗体H9615によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、4mg/mLとなるように調製した後、SDS-サンプルバッファーと等量混合し、95℃で5分間加熱処理を行った。15％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを10μｇずつアプライし、SDS-PAGEを行った。上記と同様に、抗C20orf102モノクローナル抗体H9615によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な約22.5kDa付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図７５）。
【０４１６】
以上の結果により、TEG1:C20orf102分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において分泌されていることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０４１７】
実施例８
抗OK/SW-CL..30抗体の作製
TEG6：OK/SW-CL..30に関して、抗OK/SW-CL..30抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗OK/SW-CL..30抗体の作製を行った。
【０４１８】
8-1．  hNotum cDNAの単離
公共データベース（UCSCおよびGenBank）の検索によって、OK/SW-CL..30のcDNA配列は部分配列であり、実際にはOK/SW-CL..30配列をすべて含み、かつ、さらなる５'領域を含んだ仮想タンパク質LOC147111（GenBank:NM＿178493：配列番号２７３−２７４）が全長ORF遺伝子である可能性が見出された。その配列はシグナル配列を含み、かつ、ハエNotum（NM＿168642）と相同性42.7%示すことから、新規遺伝子としてhNotumと命名し、以下の解析を実施した。まずhNotumのcDNAを以下のようにして単離した。HepG2細胞より前述の方法に従い一本鎖cDNAを調製し、それを鋳型としてプライマーWT164（配列番号２７５）とLS746（配列番号２７６）を用いてPCR法にて、hNotum予測配列と一致する約1.5kbp付近のバンドの検出に成功した。PCR法はKOD plusキット（TOYOBO社製）のプロトコールに準じて調整した反応液に反応液総量の5%に相当するDMSOを加え、初めに95 ℃で2分間一次変性を行い、94 ℃で15秒、68℃で90秒からなるサイクルを35回行なった。PCR法で得られた特異的増幅断片をTOPOクローニング法によりpENTR（インビトロジェン社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したcDNAがhNotumであることが明らかとなった。
【０４１９】
なお、プライマーWT164はhNotum遺伝子（GenBank: NM＿178493）の5'-端にハイブリダイズするように、そしてLS746は3'-端にハイブリダイズするようにデザインした。
配列番号２７５（WT164）: CACCGAATTCATGGGCCGAGGGGTGCGCGTG
配列番号２７６（LS746）: CTCGAGGCTTCCGTTGCTCAGCATCCCCAG
【０４２０】
8-2．  hNotumの免疫用抗原の調製
hNotumの免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（143aa-496aa）をGST-結合型タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、上記のhNotum cDNAを鋳型とし、LS695プライマー（配列番号２７７）、およびLS746（配列番号２７６）を用いPCR法にてhNotum（143aa-496aa）をコードする遺伝子を増幅し、続いてpGEM-T Easyベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素EcoRI-XhoIを用いて切断した遺伝子断片をpET41aベクター（Novagen社製）に挿入し、発現ベクターを構築した。
配列番号２７７（LS695）: GAATTCATGCGGCGCCTCATGAGCTCCCGGGA
【０４２１】
GST融合抗原タンパク質（hNortum 143aa-496aaを含む）の調製、およびマウス免疫によるモノクローナル抗体の作製は上項と同様に実施した。その結果、hNotumモノクローナル抗体H9541を作製した。
【０４２２】
実施例９
抗hNotum抗体を用いたhNotumタンパク質分子の検出
作製したモノクローナル抗体の反応性を確認するために、hNotum強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いhNotumの検出を行った。コントロールには上記で使用した抗原部位143aa-496aaをpcDNA4に挿入したベクターを使用した。予測分子量は39.9kDaである。ウエスタンブロット解析は上項と同様に実施し、一次抗体であるH9541は終濃度100 μg/mLで実施した。
【０４２３】
その結果、図７６に示すとおり37kDaマーカー位置付近にhNotum（143aa-496aa）と考えられる特異的なバンドが検出された。
【０４２４】
続いて、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、GeneChipU133の解析結果と一致し、mRNA発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約55kDaの全長のhNotumと考えられるバンドを検出することに成功した（図７６）。
【０４２５】
さらに、hNotum遺伝子が予測配列として分泌シグナルを有することから、hNotumを発現する癌細胞株において分泌型のhNotumが培養上清中に検出できるか確認したところ、hNotumを高発現する癌細胞株の培養上清中にも強制発現細胞の培養上清と同じ分子量のバンドが抗hNotum抗体により検出された（図７６）。
【０４２６】
以上の結果より、hNotumモノクローナル抗体H9541はhNotumを特異的に検出できること、ならびにGeneChip解析によるmRNA発現の程度とhNotumタンパク質の発現の程度が一致することが明らかとなった。さらに、抗hNotum抗体を用いた検討からhNotum発現細胞の培養上清中に分泌型のhNotumが存在することが明らかとなったことより、分泌型hNotumを検出することで癌細胞の有無を判断できる可能性が強く示唆された。
【０４２７】
実施例１０
hNotum抗体を用いた肝癌組織におけるhNotumのタンパク質の発現解析
肝癌の組織抽出物を用いて抗hNotum抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。上記と同様に、hNotum抗体によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的なhNotum付近のバンドが、癌部特異的に検出され、（図７７）。3検体調査し、2検体において陽性であった。、また、検体26に関しては、同一患者より得た2ヶ所の肝細胞癌組織（S2、S5）のうち、一箇所の組織でhNortumが陽性であった。
【０４２８】
以上の結果により、TEG6:hNotum(OK/SW-CL..30)分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において分泌されていることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０４２９】
実施例１１
11-1.  抗KIAA1359抗体の作製
TEG37:KIAA1359について、抗KIAA1359抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗KIAA1359抗体の作製を行った。すなわち、KIAA1359の免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（76aaから88aa）をペプチドタンパク質として、常法によりペプチド配列合成を実施した。ペプチドN末端にC：システイン残基を付加し、Keyhole limpet hemocyanin (KLH) にコンジュゲーションし免疫原とした。そしてモノクローナル抗体は上項と同様に実施した。そしてモノクローナル抗体A8409Aの単離に成功した。
ペプチド配列：PEAETRGAKRISPA（配列番号２８０）
【０４３０】
11-2.  KIAA1359 cDNAの単離
KIAA1359の発現を行うために、まずKIAA1359のcDNAを以下のようにして単離した。KIAA1359発現細胞であるMKN74細胞より前述の方法に従い一本鎖cDNAを調製し、それを鋳型としてプライマーＦ（配列番号２８１）とＲ（配列番号２８２）を用いてPCR法にて、KIAA1359の予測配列と一致する約1.6kbp付近のバンドの検出に成功した。PCR法はAdvanvtede HF2キット（クロンテック社製）のプロトコールに準じて反応液を調製し、初めに95 ℃で1分間一次変性を行い、94 ℃で15秒、63 ℃で30秒、68 ℃で2分からなるサイクルを35回行なった後、最後の伸長反応を68 ℃で6分間からなる条件で実施した。PCR法で得られた特異的増幅断片をTAクローニング法によりpGEM-T Easy（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したcDNAがKIAA1359であることが明らかとなった。そして、このcDNAをpcDNA4/myc-His A（Invitrogen社製）に挿入し、KIAA1359遺伝子発現ベクターとした。なお、プライマーＦはKIAA1359遺伝子（GenBank: NM＿152673）の5'-端にハイブリダイズするように、そしてＲは3'-端にハイブリダイズするようにデザインした。
配列番号２８１（Ｆ）: GGATCCATGGGCTGTCTCTGGGGTCTGGCTCTGC
配列番号２８２（Ｒ）: CTCGAGGCCTCTCCTGACACGCAGTAAGGAGACC
【０４３１】
11-3.  抗KIAA1359抗体A8409Aを用いたKIAA1359タンパク質分子の検出
上記により作製した抗KIAA1359抗体A8409Aの反応性を確認するために、KIAA1359強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いKIAA1359の検出を行った。
【０４３２】
コントロールとして、KIAA1359を強制発現させたCOS7ライゼートを用い、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。A8409A抗体濃度は100μg/mLで使用した。その結果、GeneChipU133の解析スコアの高い、Capan1において、コントロールの強制発現KAII1359と同等な約100kDaのKAII1359分子と考えられるバンドの検出に成功した（図８０）。
【０４３３】
11-4.  抗KIAA1359抗体A8409Aを用いた胃癌組織におけるKIAA1359のタンパク質の発現解析
胃癌の組織抽出物を用いて抗KIAA1359抗体A8409Aによるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、4mg/mLとなるように調製した後、SDS-サンプルバッファーと等量混合し、95℃で5分間加熱処理を行った。10％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを10mgずつアプライし、SDS-PAGEを行った。
【０４３４】
上記と同様に、抗KIAA1359抗体A8409Aによるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な100kDa付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８１）。
【０４３５】
以上の結果により、TEG37:KIAA1359分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において発現亢進していることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０４３６】
実施例１２
12-1.  抗PEG10抗体の作製
TEG60：PEG10は通常のコドンユーセージにより翻訳するORF1と、ORF1の終止コドン領域でフレームシフトが起こり、新たに翻訳されるORF2の存在が、Shigemotoら、Nucleic Acids Research, 29, 4079-4088, 2001のマウスPEG10の報告、あるいはOnoら、Genomics, 73, 232-237, 2001のヒトPEG10のゲノム配列からの予測により、示唆されているが、実験的にヒトPEG10のORF2存在を証明した報告は見つかっていない。そのため、我々はORF2部分のフレームシフトが実際に起こっているのかどうか、また、その新たに翻訳された領域が癌組織で存在するどうかを証明するため、予測したORF2アミノ酸配列をもとに抗PEG10/ORF2モノクローナル抗体を作製し、証明することを試みた。
ORF2アミノ酸配列（配列番号２８３）
QLSCQGLKVFAGGKLPGPAVEGPSATGPEIIRSPQDDASSPHLQVMLQIHLPGRHTLFVRAMIDSGASGNFIDHEYVAQNGIPLRIKDWPILVEAIDGRPIASGPVVHETHDLIVDLGDHREVLSFDVTQSPFFPVVLGVRWLSTHDPNITWSTRSIVFDSEYCRYHCRMYSPIPPSLPPPAPQPPLYYPVDGYRVYQPVRYYYVQNVYTPVDEHVYPDHRLVDPHIEMIPGAHSIPSGHVYSLSEPEMAALRDFVARNVKDGLITPTIAPNGAQVLQVKRGWKLQVSYDCRAPNNFTIQNQYPRLSIPNLEDQAHLATYTEFVPQIPGYQTYPTYAAYPTYPVGFAWYPVGRDGQGRSLYVPVMITWNPHWYRQPPVPQYPPPQPPPPPPPPPPPPSYSTL
【０４３７】
12-2．  PEG10 cDNAの単離
PEG10の発現を行うために、まずPEG10のcDNAを以下のようにして単離した。ヒト胎児肝組織より前述の方法に従い一本鎖cDNAを調製し、それを鋳型としてプライマーF1（配列番号２８４）とR1（配列番号２８５）を用いてPCR法にて、PEG10予測配列と一致する約2200kbp付近のバンドの検出に成功した。PCR法はAdvantage2 cDNA PCRキット（Clontech社製）のプロトコールに準じて反応液を調製し、初めに94 ℃で1分間一次変性を行い、94 ℃で30秒、68 ℃で3分からなるサイクルを35回行なった後、最後の伸長反応を68 ℃で10分間からなる条件で実施した。PCR法で得られた特異的増幅断片をTAクローニング法によりpGEM-T easy（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したcDNAがPEG10であることが明らかとなった。なお、プライマーF1はPEG10遺伝子（GenBank: AB049834）の5'-端にハイブリダイズするように、そしてR1は3'-端にハイブリダイズするようにデザインした。
配列番号２８４（F1）: GGATCCATGACCGAACGAAGAAGGGACGAG
配列番号２８５（R1）: TCTAGACAGGGTACTGTAAGATGGAGGCGG
【０４３８】
12-3．  PEG10/ORF2の免疫用抗原の調製およびモノクローナル抗体の作製
PEG10/ORF2の免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（ORF2/51aa-251aa）をGST-結合型タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。
【０４３９】
すなわち、上記のPEG10 cDNAを鋳型とし、F2プライマー（配列番号２８６）、およびR2プライマー（配列番号２８７）を用いPCR法にてPEG10（ORF2/51aa-251aa）をコードする遺伝子を増幅し、続いてpGEM-T easyベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素BamHI-XhoIを用いて切断した遺伝子断片をpET41cベクター（Novagen社製）に挿入し、発現ベクターpETc＿PEG10＿ORF2を構築した。
配列番号２８６（F2）: GGATCCATCTTCCGGGCAGACACACCCT
配列番号２８７（R2）: CTCGAGTGCCATTTCAGGTTCGGACAGTG
【０４４０】
続いて、発現ベクターpETc＿PEG10＿ORF2を上項と同様にGST結合型PEG10＿ORF2タンパク質として調製、マウス免疫によるモノクローナル抗体の作製を実施した。そしてPEG10＿ORF2に対するモノクローナル抗体H4128を作製した。
【０４４１】
12-4.  抗PEG10/ORF2抗体を用いたPEG10タンパク質分子の検出
上記により調製した抗PEG10/ORF2抗体H4128の反応性を確認するために、PEG10強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いPEG10の検出を行った。
【０４４２】
初めに、PEG10強制発現COS7細胞を用いウエスタンブロット解析により抗PEG10/ORF2抗体B0000Aの反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは前述のPEG10全長をコードするcDNAをpcDNA4HisMaxC（Invitrogen社製）に挿入したPEG10遺伝子発現ベクターpcDNA4/HisMax＿PEG10＿Fullを使用した。PEG10のN末端にXpressタグ配列が挿入されたコンストラクトとなっている。すなわち、1 μgの発現ベクターpcDNA4/HisMax＿PEG10＿Full、もしくは陰性対照としてpcDNA4（Mock）を 5 x 104個のCOS7細胞とHep3B細胞にFuGene6試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、PEG10を一過性発現させた。発現ベクター導入3日後の細胞を回収し、培養細胞をRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。それぞれ5 mgタンパク質相当量のライゼートをSDS-ポリアクリルアミドゲルに供し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離した後、Hybond-P（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体として抗Xpress抗体（5000倍希釈）（インビトロジェン社製）もしくはPEG10/ORF2抗体H4128（2μg/mL）を使用し、二次抗体にHRP標識抗マウスIgG抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、ECLプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、Mockの陰性コントロールに対し、H4128抗体により、PEG10と考えられる83kDa、50kDa付近のバンドが得意的に検出された（図８２）。また、N末に標識されたXpressタグ抗体においても同様に約83kDa付近のバンドは特異的に検出されている。その約83kDa付近のものはORF1以降フレームシフトを起こし、ORF2の融合した全長サイズでなはないかと考察している。また、抗原としたORF2部分のアミノ酸配列は通常のフレームでは翻訳されないことから、ヒトPEG10においてフレームシフトが行われていることが、抗PEG10/ORF2抗体H4128を用いることにより明らかとなった。
【０４４３】
12-5.  抗PEG10抗体H4128を用いた肝細胞癌組織におけるPEG10のタンパク質の発現解析
肝細胞癌および肝芽種の組織抽出物を用いて抗PEG10抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、4mg/mLとなるように調製した後、SDS-サンプルバッファーと等量混合し、95℃で5分間加熱処理を行った。12％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを10mgずつアプライし、SDS-PAGEを行った。
【０４４４】
上記と同様に、抗PEG10抗体H4128によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な83kDa付近のバンドと50kDa付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８３）。このことにより強制発現させたPEG10のみならず、肝細胞癌、肝芽種組織においてもPEG10/ORF2が存在することが明らかとなった。
【０４４５】
以上の結果により、TEG60：PEG10分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進していることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０４４６】
実施例１３
13-1.  DUSP9の免疫用抗原の調製およびモノクローナル抗体の作製
TEG63：DUSP9に関して、モノクローナル抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗DUSP9抗体の作製を行った。
【０４４７】
DUSP9の免疫用抗原としてDUSP9全長配列をGST融合タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、HepG2 cDNAを鋳型とし、Ls772プライマー（配列番号２８８）、およびLs773プライマー（配列番号２８９）を用いPCR法にてDUSP9（385aa）をコードする遺伝子を増幅し、続いてpGEM-Teベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素EcoRI-HindIIIを用いて切断した遺伝子断片をpET41aベクター（Novagen社製）に挿入し、発現ベクターpET41a-DUSP9を構築した。
配列番号２８８（Ｆ）: GAATTCATGGAGGGTCTGGGCCGCTC
配列番号２８９（Ｒ）: CTCGAGGGTGGGGGCCAGCTCGAAG
【０４４８】
続いて、発現ベクターpET41a-DUSP9を用いて上項と同様にGST融合DUSP9（1-385aa）タンパク質の調製を行い、マウス免疫によるモノクローナル抗体の作製を実施した。そして、抗DUSP9抗体#8901を作製した。
【０４４９】
13-2.  抗DUSP9抗体を用いたDUSP9タンパク質分子の検出
上記により調製した抗DUSP9抗体#8901の反応性を確認するために、DUSP9強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いDUSP9の検出を行った。
【０４５０】
初めに、DUSP9強制発現COS7細胞を用いウエスタンブロット解析により抗DUSP9抗体#8901の反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは前述のDUSP9をコードするcDNAをpcDNA4Mys-His（Invitrogen社製）に挿入したDUSP9遺伝子発現ベクターpcDNA4-DUSP9を使用した。すなわち、1 μgの発現ベクターpcDNA4-DUSP9を 5 x 104個のCOS7細胞にFuGene6試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、DUSP9を一過性発現させた。発現ベクター導入3日後の細胞を回収し、培養細胞をRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。その3 mgタンパク質相当量のライゼートをSDS-ポリアクリルアミドゲルに供し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離した後、Hybond-P（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体としてDUSP9抗体（1 μg/mL）を使用し、二次抗体にHRP標識抗マウスIgG抗体（ジャクソン社製）を用い、ECLプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、約42kDa付近にDUSP9と考えられるバンドが検出された。
【０４５１】
同時に各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、GeneChipU133の解析結果と一致し、mRNA発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約42kDaの全長DUSP9と考えられるバンドを特異的に検出することに成功した（図８４）。
【０４５２】
13-3.  抗DUSP9抗体を用いた肝細胞癌組織におけるDUSP9のタンパク質の発現解析
肝細胞癌の組織抽出物を用いて抗DUSP9抗体＃8901によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にRIPA緩衝液（150 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸、0.1% ＳＤＳ、50 mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（pH8.0））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、4mg/mLとなるように調製した後、SDS-サンプルバッファーと等量混合し、95℃で5分間加熱処理を行った。12％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを10mgずつアプライし、SDS-PAGEを行った。
【０４５３】
上記と同様に、抗DUSP9抗体＃8901によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な42kDa付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８５）。特に低分化型肝細胞癌において3例中3例にて検出された。
【０４５４】
以上の結果により、TEG63：DUSP9分子は癌部位において遺伝子発現亢進のみならず、タンパク質レベルにおいても癌部および癌細胞株において、発現亢進していることがモノクローナル抗体を用いることにおいて証明された。このことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０４５５】
実施例１４
14-1.  抗CystatinSN抗体の作製
TEG47:CystatinSNに関して、抗CystatinSN抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗CystatinSN抗体の作製を行った。
【０４５６】
すなわち、CystatinSNの免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（60aaから75aa）をペプチドタンパク質として（GenBank No.：NM＿001898参照）、常法によりペプチド配列合成を実施した。ペプチドN末端にC：システイン残基を付加し、Keyhole limpet hemocyanin (KLH) にコンジュゲーションし免疫原とした。そしてモノクローナル抗体は上項と同様に作製した。そしてモノクローナル抗体の単離に成功した。
ペプチド配列： C-KDDYYRRPLRVLRARQ（配列番号２９０）
【０４５７】
14-2.  抗CystatinSN抗体を用いた大腸癌組織におけるCystatinSNのタンパク質の発現解析
大腸癌の組織抽出物を用いて抗CystatinSN抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製およびウエスタンブロット解析は上項と同様に実施した。抗CystatinSN抗体（４μg/mL）によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な15kDa付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８６）。CystatinSNの予測分子量が約16kDaであることから、癌部において特異的にCystatinSNが発現亢進していることが明らかとなった。
【０４５８】
以上の結果により、TEG47:CystatinSN分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいて発現亢進していることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【０４５９】
実施例１５
抗SFRP4抗体の作製
TEG56：SFRP4に関して、抗SFRP4抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗SFRP4抗体の作製を行った。
【０４６０】
15-1．  SFRP4 cDNAの単離
SFRP4の発現を行うために、まずSFRP4のcDNAを以下のようにして単離した。胃癌組織より前述の方法に従い一本鎖cDNAを調製し、それを鋳型としてEcoRIまたはXhoIの制限酵素サイトのついたプライマーGC898（配列番号２９１）とGC899（配列番号２９２）を用いてPCR法にて、目的サイズと一致する約1000bp付近のバンドの検出に成功した。PCR用酵素および試薬には、アドバンテージHF ポリメラーゼミックス（Advantage HF Polymerase Mix；クロンテック社製）およびアドバンテージHF ＰＣＲバッファー（Advantage HF PCR buffer）、２００μＭ デオキシヌクレオチド三リン酸、０．２μＭプライマーを用い、ｃＤＮＡ １μLを鋳型にしたＰＣＲ（９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃３分、３５サイクル）を行った。PCR法で得られた特異的増幅断片はＤＮＡライゲーションキット（タカラ社製）を用いてpGEM-T easyベクター（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したcDNAがSFRP4に相当することが明らかとなった。
【０４６１】
なお、プライマーGC898はSFR4＿ORF遺伝子（GenBank: NM＿003014）の5'-端にハイブリダイズするように、そしてGC899は3'-端にハイブリダイズするようにデザインした。
配列番号２９１（GC898）: CGGGATCCATGTTCCTCTCCATCCTAGTGG
配列番号２９２（GC899）: CGCTCGAGACACTCTTTTCGGGTTTGTTC
【０４６２】
15-2．  SFRP4の免疫用抗原の調製
SFRP4の免疫用抗原として上記の全長SFRP4配列をGST-結合型タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、上記のpGEM-Tに挿入されたSFRP4配列を、制限酵素EcoRI-XhoIを用いて切断し、そしてpET41aベクター（Novagen社製）に挿入し、発現ベクターGST-SFRP4を構築した。
【０４６３】
GST融合抗原タンパク質の調製、およびマウス免疫によるモノクローナル抗体の作製は上項と同様に実施した。その結果、抗SFRP4モノクローナル抗体A7113を作製した。
【０４６４】
15-3.   抗SFRP4抗体を用いた胃組織におけるSFRP4のタンパク質の発現解析
胃癌の組織抽出物を用いて抗SFRP4抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。上項と同様に、抗SFRP4抗体A7113（40μg/mL）によるウエスタンブロット解析を実施したところ、癌部において特異的な約50ｋDa付近のバンドが検出された（図８７）。
【０４６５】
同時に上記でクローニングしたSFRP4配列を挿入した発現ベクターSFRP4＿pcDNA4His-Myc（Invitrogen社）をCOS7細胞に強制発現させ、その細胞ライゼートに対する抗Myc抗体（5千倍希釈、Invitrogen）によるウエスタンブロット解析を実施したところ、臨床検体で検出されたものと同一サイズのバンドが検出された(図８８)。そのため、臨床検体で抗SFRP4モノクローナル抗体により検出された50kDaのバンドはSFRP4であると考えられ、モノクローナル抗体によりSFRP4が癌部での亢進が特異的に検出されたことが明らかとなった。さらに、SFRP4を強制発現させたCOS7細胞の培養上清の解析を試みたところ、シグナル配列を持つSFRP4が培養上清に分泌することが明らかとなった（図８８）。
【０４６６】
以上の結果により、TEG56:SFRP4分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞において分泌されていることが示唆されたことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
【産業上の利用可能性】
【０４６７】
本発明の遺伝子、タンパク質および抗体は、癌の診断および治療、ならびに癌の治療薬の開発において用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【図６７−３】
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【図６７−４】
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【図６８−１】
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【図６８−２】
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【図６８−３】
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【図６８−４】
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【図６８−５】
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【図６９】
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【図７０−１】
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【図７０−２】
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【図７０−３】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７１−３】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月20日(2010.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６４または６５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質またはそのフラグメントを含む，肝癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項３】
配列番号８１または８２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメント。
【請求項４】
請求項１または３に記載のタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体。
【請求項５】
配列番号６４または６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド，およびこれらのポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号６４または６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド，およびこれらのポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１２個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号６４または６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する，請求項５または６記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含む，肝癌を診断または治療する為の組成物。
【請求項９】
請求項５−７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１】
抗癌活性を有する化合物を同定する方法であって，
培養ヒト細胞を試験化合物と接触させ，そして
前記細胞において配列番号６４または６５に記載されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量の変化を引き起こす化合物を、抗癌活性を有する化合物として同定する
の各工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項１または３に記載のタンパク質，または請求項５−７のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項１３】
癌が肝癌である請求項１２記載の診断方法。
【請求項１４】
配列番号８１または８２で示されるタンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項１５】
癌が肝癌である請求項１４記載の診断方法。
【請求項１６】
配列番号８１または８２で示されるタンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項１４記載の診断方法。
【請求項１７】
以下の工程：
（ａ）  被験者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれる配列番号８１または８２で示されるタンパク質を検出する工程
を含む癌の診断方法。
【請求項１８】
癌が肝癌である請求項１７記載の診断方法
【請求項１９】
配列番号８１または８２で示されるタンパク質を認識する抗体を用いることを特徴とする請求項１７または１８に記載の診断方法。