(57)【要約】【課題】  乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離する場合において、投入エネルギー、乳酸ラセミ化が抑制された分離、回収方法を提供することを目的とする。【解決手段】  乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離する方法であって、該培養液を３０〜６０℃で逆浸透膜に通じて得られる濃縮液を晶析して乳酸塩を分離することを特徴とする、乳酸塩の製造方法により、培養液を低エネルギーで濃縮することができるため、乳酸塩晶析のコストを低減化することができ、また、乳酸のラセミ化も抑制することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離する方法であって、該培養液を３０〜６０℃で逆浸透膜に通じて得られる濃縮液を晶析して乳酸塩を分離することを特徴とする、乳酸塩の製造方法。
【請求項２】
前記乳酸塩が乳酸カルシウムまたは乳酸マグネシウムである、請求項１に記載の乳酸塩の製造方法。
【請求項３】
前記逆浸透膜により、培養液の乳酸塩濃度を１０〜３０重量％に濃縮する、請求項１または２に記載の乳酸塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離することによる乳酸塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬用などといった用途の他に、生分解性プラスチックのモノマー原料として工業的用途にまで広く適用され、需要が増加している。２−ヒドロキシプロピオン酸、即ち乳酸は、微生物による発酵により生産されることが知られており、微生物はグルコースに代表される炭水化物を含有する基質を乳酸に変換する。乳酸は、カルボニルα位の炭素に結合している置換基の立体配座により、（Ｌ）−体および（Ｄ）−体の光学異性体に分類される。微生物発酵によれば、微生物を適宜選択することにより（Ｌ）−体または（Ｄ）−体の乳酸を選択的に、または（Ｌ）−体及び（Ｄ）−体の混合体（ラセミ体）の乳酸を生産することができる。
【０００３】
微生物発酵による乳酸の生産は、一般に培養液中にアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加されているために、培養液中で乳酸の多くは乳酸塩として存在している。具体的には、培養液中に添加するアルカリ性物質として水酸化カルシウムがしばしば用いられるが、この場合、微生物発酵により生産された乳酸は培養液中では乳酸カルシウムとして存在している。なお、乳酸カルシウムは、カルシウム吸収性が高いことから、良質なカルシウム供給源として食品用途に注目されている。
【０００４】
発酵終了後の培養液に酸性物質（例えば、硫酸）を添加後、膜分離、イオン交換、などといった通常の精製操作により、フリー体の乳酸が得られるが、ポリ乳酸の原料として用いるためには、純度の高い乳酸が必要とされるため、発酵終了後の培養液に含まれる糖、タンパク質などの不純物を除去するため、酸性物質を添加する前に培養液を晶析して乳酸塩を分離する方法が用いられる。
【０００５】
培養液を晶析して乳酸塩を分離する方法としては、培養液を加熱、減圧条件下、水を蒸発させて培養液中の乳酸塩濃度を飽和溶解度まで高めた後、温度を下げて晶析する方法が用いられる（例えば、特許文献１）。しかしながら、水の蒸発は投入エネルギーが高く、また、乳酸塩の回収率を高めるために固液分離後の低温の晶析母液を再度加熱濃縮する必要があり、エネルギーコストが高いという問題があった。さらに、加熱、減圧濃縮は水の蒸発速度が遅く、多大な時間を要する。培養液が長時間加熱条件下に曝されると、乳酸生産菌または雑菌が持つラセマーゼの影響により、乳酸がラセミ化するおそれがあるという問題がある。水の蒸発速度を上げる方法として、減圧度を下げる方法があるが、この場合、発酵液が突沸しやすくなり、配管が詰まるなど装置の運転上問題が生じる危険性があるため一般的ではない。そのため、発酵液の加熱、減圧濃縮は穏和な条件かつ、ラセミ化を防ぐために滅菌条件下で行う必要があった。
【０００６】
晶析の他に培養液から純度の高い乳酸塩を分離する方法として、特許文献２には、逆浸透膜により培養液を濃縮して電気透析法により分離精製する方法が開示されている。しかしながら、電気透析法は投入エネルギーが大きいプロセスであり、また、特許文献２には得られる乳酸塩の光学純度に関する記載がなく、該乳酸塩がポリ乳酸原料として適切であるかどうかについては不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６２−７２６４６号公報
【特許文献２】ＵＳ５００２８８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような課題、すなわち乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離する場合において、投入エネルギー、乳酸ラセミ化が抑制された分離、回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、乳酸塩を含む培養液を、逆浸透膜に通じて得られた濃縮液を晶析することにより、投入エネルギーを抑え、さらに乳酸のラセミ化を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（３）から構成される。
（１）乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離する方法であって、該培養液を３０〜６０℃で逆浸透膜に通じて得られる濃縮液を晶析して乳酸塩を分離することを特徴とする、乳酸塩の製造方法。
（２）前記乳酸塩が乳酸カルシウムまたは乳酸マグネシウムである、（１）に記載の乳酸塩の製造方法。
（３）前記逆浸透膜により、培養液の乳酸塩濃度を１０〜３０重量％に濃縮する、（１）または（２）に記載の乳酸塩の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を簡単な操作により低エネルギーで分離することができ、さらに乳酸のラセミ化も抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明で用いた逆浸透膜濾過装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】本発明で用いた逆浸透膜濾過装置の逆浸透膜が装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【符号の説明】
【００１３】
１  原水槽
２  逆浸透膜が装着されたセル
３  高圧ポンプ
４  膜透過液の流れ
５  膜濃縮液の流れ
６  高圧ポンプにより送液された培養液の流れ
７  逆浸透膜
８  支持板
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、乳酸塩を含む培養液から乳酸塩を分離する方法であって、該培養液を３０〜６０℃で逆浸透膜に通じて得られる濃縮液を晶析して乳酸塩を分離することを特徴としている。
【００１６】
微生物による乳酸発酵培養においては、培養時のｐＨ調整のためにアルカリ性物質が添加されるが、アルカリ性物質の添加により培養液中の乳酸は乳酸塩として存在している。本発明における「乳酸塩を含む培養液」とは、このような培養方法によって得られる培養液のことを意味する。
【００１７】
培養液に含まれる乳酸塩は特に限定されず、具体例として、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、乳酸マグネシウム、乳酸アルミニウムまたは乳酸アンモニウムが挙げられるが、乳酸塩が乳酸カルシウムまたは乳酸マグネシウムである場合、晶析操作における乳酸塩の回収率が高いため、好ましい。
【００１８】
本発明における「逆浸透膜に通じる」とは、乳酸塩を含む培養液を逆浸透膜に通じて濾過し、非透過液側に乳酸塩を含む培養液の濃縮液を回収し、透過液側に主に水を透過、除去させることを意味する。
【００１９】
本発明で用いられる逆浸透膜は特に限定はないが、逆浸透膜の膜分離性能として、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム（原水塩化ナトリウム濃度３．５％）を５．５ＭＰａの濾過圧で評価したときの塩化ナトリウム除去率が４０％以上のものが好ましく用いられ、６０％以上のものが好ましく用いられる。塩化ナトリウム除去率は前記海水の透過水塩化ナトリウム濃度を測定することにより、式１によって算出することができる。
【００２０】
塩化ナトリウム除去率＝１００×｛１−（透過水塩化ナトリウム濃度／原水塩化ナトリウム濃度）｝・・・（式１）。
【００２１】
また、逆浸透膜の透過性能としては、塩化ナトリウム（３．５％）を５．５ＭＰａの濾過圧において、膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））が０．２以上のものであれば、培養液の濃縮速度を早めることができることから、好ましく用いられる。ここで言う膜透過流束とは、膜単位面積、単位圧力当たりの透過流量のことであり、透過水量および透過水量を採水した時間および膜面積を測定することで、式２によって算出することができる。
【００２２】
膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））＝透過水量／（膜面積×採水時間）・・・（式２）。
【００２３】
また、本発明においては、乳酸塩の透過率が低く、培養液の透過率（透水性）が高い逆浸透膜が好ましく用いられる。ここで、培養液の逆浸透膜透過性の評価方法としては、乳酸塩透過率を算出して評価することができる。乳酸塩透過率は、高速液体クロマトグラフィーにより、原水（培養液）中に含まれる乳酸濃度（原水乳酸濃度）および透過水中に含まれる乳酸濃度（透過水乳酸濃度）を測定することで、式３によって算出することができる。
【００２４】
乳酸透過率（％）＝（透過水乳酸濃度／原水乳酸濃度）×１００・・・（式３）。
【００２５】
本発明で用いられる逆浸透膜の膜素材としては、一般に市販されている酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、該１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。
【００２６】
本発明で好ましく使用される逆浸透膜としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。また、とりわけポリアミド系の逆浸透膜は乳酸塩の回収率が高いことから、本発明においてはポリアミド系の逆浸透膜がより好ましく用いられる。
【００２７】
膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。
【００２８】
本発明で使用される好ましい逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製のポリアミド系逆浸透膜ＵＴＣ−７０、ＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐ、ＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、ＳＵ−６１０、ＳＵ−６２０、ＴＭ８００、ＴＭ８００Ｃ、ＴＭ８００Ａ、ＴＭ８００Ｈ、ＴＭ８００Ｅ、ＴＭ８００Ｌ、東レ株式会社製の酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製のＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製のＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＮＦ９９、ＮＦ９９ＨＦ、ＧＥ製のＧＥ  Ｓｅｐａ、ＯＳＭＯ  ＢＥＶ  ＮＦ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＨＬ    Ｓｅｒｉｅｓ、Ｄｕｒａｓｌｉｃｋ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＭＵＮＩ  ＮＦ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＣＫ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＫ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｓｅａｓｏｆｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｄｕｒａｔｈｅｒｍ  ＨＷＳ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＫＯＣＨ製のＳｅｌＲＯ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製のＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０、ＮＦ４５、ＮＦ９０、ＮＦ２００、ＮＦ４００などが挙げられる。
【００２９】
本発明は、乳酸塩を含んだ培養液を逆浸透膜に通じる際に、培養液の温度を３０〜６０℃、好ましくは３５〜５５℃に調整することを特徴としている。逆浸透膜による濃縮は、通常、固形分が析出しない濃度まで濃縮できるが、乳酸塩の飽和溶解度は、温度が高くなるほど大きくなるため、乳酸塩を含んだ培養液の温度が３０℃以上であれば、乳酸塩を析出させずに高濃度の濃縮液を調整することができる。一方、逆浸透膜に通じる操作温度が６０℃を越えると、逆浸透膜の構造変化により次第に透水性が低下し、長期間の逆浸透膜濾過運転に問題が生じる。
【００３０】
乳酸塩を含んだ培養液を逆浸透膜に通じる際の操作圧力は、１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、１〜８ＭＰａの範囲であることが好ましい。また、濾過圧が１〜７ＭＰａ以下の範囲であれば、膜透過流束が高いことから、水を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、２〜６ＭＰａ以下の範囲であることがさらに好ましい。
【００３１】
乳酸塩を含んだ培養液を逆浸透膜に通じて得られる濃縮液の乳酸塩濃度は特に限定されないが、１０〜３０重量％が好ましい。１０重量％以上であれば晶析による回収率が高いが、３０重量％を越えると、晶析槽内部を均一に撹拌できないなど、操作性に問題が生じる可能性があるためである。
【００３２】
本発明は、乳酸塩を含んだ培養液を逆浸透膜に通じて得られる濃縮液を晶析して乳酸塩を分離することを特徴としている。その際、濃縮液はそのまま晶析してもよいし、晶析操作の前に蒸発缶を用いて加熱、減圧濃縮により、さらに濃縮してもよいし、晶析缶内を減圧下とし、水を蒸発させながら晶析してもよいが、濃縮液をそのまま晶析することが好ましい。
【００３３】
濃縮液を晶析する温度は、逆浸透膜で得られた濃縮液の乳酸塩濃度に依存するが、３０℃以下で行うことが好ましい。また、乳酸塩回収率を上げるためには、より低温で晶析を行えばよいが、低温過ぎると多量の冷却エネルギーを必要とするため、１０〜３０℃で晶析を行うことが好ましい。
【００３４】
晶析後の母液については、再度逆浸透膜に通じることで、晶析操作によって回収できなかった乳酸塩を濃縮・回収できるため、晶析後の母液は乳酸塩を含んだ培養液と混合して逆浸透膜に通じることが好ましい。
【００３５】
本発明に供される乳酸塩を含む培養液は、ＷＯ２００９／００４９２２号に記載される微生物の乳酸発酵培養において、培養ｐＨ調整の際にアルカリ性物質を添加することによって得られる。培養液のｐＨはアルカリ性物質、具体的には塩基性物質の添加よって微生物の至適ｐＨに調節すればよい。添加される、アルカリ性物質としては特に限定されないが、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウムまたはアンモニアが好ましく用いられ、その結果として培養液には、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、乳酸マグネシウム、乳酸アルミニウムまたは乳酸アンモニウムが形成される。そして、本発明では培養液に含まれる乳酸塩が乳酸カルシウムまたは乳酸マグネシウムである場合において晶析操作における乳酸塩の回収率が高いことから、培養時に添加されるアルカリ性物質としては、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酢酸カルシウムまたは酢酸マグネシウムがより好ましく用いられ、水酸化カルシウムまたは水酸化マグネシウムがさらに好ましく用いられる。
【００３６】
培養液中の乳酸塩の光学純度は特に限定されないが、該乳酸塩をポリ乳酸の原料とする場合においては、９０％以上であることが好ましい。
【００３７】
本発明により分離・回収された乳酸塩から、当業者によって公知の方法により乳酸が回収される。例えば、晶析操作で得られた乳酸塩スラリーを固液分離により乳酸塩を回収後、硫酸等の酸性物質を添加することにより乳酸塩をフリー乳酸とし、膜分離、電気透析、イオン交換、蒸留等の精製操作により乳酸を回収することができる。なお、乳酸塩からポリ乳酸の原料の乳酸を得る場合、乳酸塩の光学純度が高いことが要求されるが、本発明によれば、培養液中の乳酸塩を、光学純度を低下させることなく回収することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（参考例１）Ｌ−乳酸発酵能力を有する酵母株の作製
本発明では、特開２００８−０２９３２９号公報に記載されているＢ３株を基に育種した株をＬ−乳酸発酵能力を有する酵母株として用いた。下記に育種方法を示す。
【００４０】
まずＢ３株に、配列番号１に記載のＬ−ＬＤＨ遺伝子をＳＥＤ１遺伝子座に導入した。ＳＥＤ１遺伝子座への導入は、特開２００８−０２９３２９号公報に記載されているｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２，３）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号２は、ＳＥＤ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００４１】
次に、プラスミドｐＲＳ４２３を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＨＩＳ３遺伝子を含む約１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号５は、ＳＥＤ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００４２】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた二種類の約１．３ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２，５）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＳＥＤ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＨＩＳ３遺伝子が連結された約２．６ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【００４３】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、Ｂ２株に形質転換し、ヒスチジン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ４株とする。
【００４４】
次に、特開２００８−４８７２６号公報に記載されている、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＢ４株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞の中から、ＰＤＣ１遺伝子、ＳＥＤ１遺伝子、ＴＤＨ３遺伝子座にアフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子が挿入され、かつ、ＰＤＣ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株をＭＡＴａ、およびＭＡＴαのそれぞれの接合型を選択した。得られた酵母株のうちＭＡＴａの接合型を有する株をＳＵ０１４−８Ａ株、ＭＡＴαの接合型を有する株をＳＵ０１４−３Ｂ株とした。
次にＳＵ０１４−８Ａ株のリジン要求性を復帰させた。フナコシ社製のＢＹ４７４１のゲノムＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号８，９）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＹＳ２遺伝子の前半約２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４−８Ａ株に形質転換し、ＬＹＳ２遺伝子のアンバー変異を解除した。リジン非添加培地で培養することにより、リジン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
【００４５】
上記のようにして得られた形質転換株が、ＬＹＳ２遺伝子のアンバー変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＹＳ２遺伝子を持つ２０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがリジン合成能を持っていることを確認した。なお、ＬＹＳ２の変異が解除されずにリジン合成能が復帰した場合には、上記で得られる１倍体細胞のうち、リジン合成能を持たない細胞が得られる。以下ＳＵ０１４−８Ａ株のリジン合成能が復帰した株をＨＩ００１とした。
【００４６】
次にＳＵ０１４−３Ｂ株のロイシン要求性を復帰させた。ｐＲＳ４２５を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１０，１１）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４―３Ｂ株に形質転換し、ＬＥＵ２遺伝子の変異を解除した。ロイシン非添加培地で培養することにより、ロイシン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
【００４７】
上記のようにして得られた形質転換株が、ＬＥＵ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＥＵ２遺伝子を持つ２０ＧＹ７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがロイシン合成能を持っていることを確認した。なお、ＬＥＵ２遺伝子の変異が解除されずにロイシン合成能が復帰した場合には、上記で得られる１倍体細胞のうち、ロイシン合成能を持たない細胞が得られる。以下ＳＵ０１４−３Ｂ株のロイシン合成能が復帰した株をＨＩ００２とした。
【００４８】
続いて上記のようにして得られたＨＩ００１株とＨＩ００２株とを接合させ、栄養要求性のない２倍体原栄養株を得た。得られた株を以下ＨＩ００３株とした。
乳酸は、培養液の遠心上清について、以下の条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【００４９】
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００５０】
また、Ｌ−乳酸またはＤ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００５１】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー株式会社製）
移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：３０℃。
【００５２】
また、乳酸の光学純度は次式で計算した。
光学純度（%）＝１００×（Ｌ−Ｄ）または（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００５３】
（参考例２）  バッチ発酵によるＬ−乳酸の製造
参考例１で作製したＨＩ００３株を用いて、原料糖培地（７０ｇ／Ｌ  “優糖精”（ムソー株式会社製）、１．５ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム）を用い、バッチ発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。参考例２の運転条件を以下に示す。
【００５４】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、  温度調整：３２（℃）、反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：１Ｎ  水酸化カルシウムによりｐＨ６．５に調整。
【００５５】
まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの原料糖培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な原料糖培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養を行った。バッチ発酵の結果、５０時間で乳酸蓄積濃度は４５〜４９ｇ／Ｌであり、光学純度はＬ−乳酸が９９．９％以上であった。
【００５６】
（参考例３）  逆浸透膜の塩化ナトリウム除去性評価
超純水１０Ｌに塩化ナトリウム（和光純薬株式会社製）を添加して２５℃１時間攪拌し、３．５％塩化ナトリウムを調整した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で調整した３．５％塩化ナトリウム１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φ逆浸透膜として、ポリアミド系逆浸透膜“ＵＴＣ７０”（逆浸透膜１；東レ株式会社製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＲＯ−９９”（逆浸透膜２；アルファラバル製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＨＲ９８ＰＰ”（逆浸透膜３；アルファラバル製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＧＥｓｅｐａ  ＰＡ−ＡＫ”（逆浸透膜４；ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）、酢酸セルロース系逆浸透膜“ＧＥｓｅｐａ  ＣＦ−ＣＡ”（逆浸透膜５；ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を５．５ＭＰａに調整し、透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、塩化ナトリウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、塩化ナトリウムの透過率を計算した。
【００５７】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００５８】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
2011172492.tif 000002
【００６０】
（参考例４）  逆浸透膜の透水性、乳酸カルシウム透過性評価
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に参考例１、２で得られた培養液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、前記逆浸透膜１〜５をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、原水槽の温度を４０℃に調整し、操作圧力５ＭＰａで透過液４を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる乳酸カルシウム濃度を参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）により分析し、乳酸カルシウム透過率を式４の方法で算出した。
【００６１】
乳酸カルシウム透過率（％）＝１００×透過液の乳酸カルシウム濃度／原水槽の乳酸カルシウム濃度・・・（式４）。
【００６２】
逆浸透膜の透水性評価を、式２の方法で算出した。それらの結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
2011172492.tif 000003
【００６４】
実施例１〜４  逆浸透膜による濃縮実験
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に参考例２を１０回行って得られた培養液２０Ｌを注入した。図１の符号２に逆浸透膜として、参考例３の逆浸透膜１（東レ株式会社製“ＵＴＣ−７０”）のスパイラル型４インチエレメント“ＴＭ−８１０”（東レ株式会社製、膜面積７ｍ２）をセットし、原水槽１の温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃にそれぞれ調整し、操作圧力５ＭＰａで乳酸カルシウムが析出するまで透過液４および、濃縮液を原水槽１から回収した。濃縮終了直前の膜透過流量を流量計で確認した。その後、それぞれの操作温度で得られた濃縮液を、２０℃に保温したガラス製容器に移し、２００ｒｐｍで２時間撹拌して晶析を行った。２時間後、乳酸カルシウムスラリーを遠心分離機で固液分離し、ウエット結晶中を得た。乳酸カルシウム回収率を式５の方法で算出した。
【００６５】
乳酸カルシウム回収率（％）＝１００×ウエット結晶中の乳酸カルシウム量（ｇ）／逆浸透膜濃縮後乳酸カルシウム量（ｇ）・・・（式５）。
【００６６】
その結果、表３（ａ）に示すように、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃のすべての操作温度において、乳酸カルシウムを含んだ水溶液を非透過液側から高効率で回収され、光学純度が低下することなく晶析できたことがわかった。
【００６７】
比較例１  加熱、減圧法による濃縮、晶析
参考例１、２で乳酸発酵した培養液（２Ｌ）を、ロータリーエバポレーター（東京理化製）を用いて４０℃、５０ｈＰａで水を蒸発させて濃縮し、得られた濃縮液を、２０℃に保温したガラス製容器に移し、２００ｒｐｍで２時間撹拌して晶析を行った。２時間後、乳酸カルシウムスラリーを遠心分離機で固液分離し、ウエット結晶中を得た。その結果、表３（ｂ）に示すように、加熱、減圧による濃縮では、乳酸カルシウム回収率は実施例２とほぼ同等であるが、蒸発速度が逆浸透膜濃縮速度よりも約１６０倍遅く、長時間加熱条件下に曝されていたため、晶析後に得られた乳酸カルシウムの光学純度は低下していた。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
実施例５、比較例２  逆浸透膜による連続運転
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に参考例２を１０回行って得られた培養液２０Ｌを注入した。図１の符号２に逆浸透膜として、“ＴＭ−８１０”（東レ株式会社製、膜面積７ｍ２）をセットし、原水槽の温度を６０℃（実施例５）、７０℃（比較例２）にそれぞれ調整し、操作圧力５ＭＰａで、透過液４を原水槽１に戻した循環運転を行った。２時間ごとの膜透過流量を流量計で確認した。その結果、表４に示すように、逆浸透膜操作温度が６０℃では２４時間経過しても膜透過流量に変化がないのに対して逆浸透膜操作温度７０℃では、連続運転時間経過とともに膜透過流量の低下が見られた。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
以上の実施例及び比較例の結果から、乳酸塩を含む培養液を、操作温度３０〜６０℃で逆浸透膜に通じて得られた濃縮液を晶析することにより、濃縮の投入エネルギーを抑えることができ、かつ、光学純度が低下することなく高品質の乳酸塩が得られることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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