(57)【要約】【課題】蛍光染色法によって１匹の微生物内に点在するリボソームＲＮＡが蛍光する場合でも、１匹毎の微生物を明確に認識することができる微生物検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】微生物検出方法が、試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、蛍光染色した微生物を含む試料に、微生物の輪郭を染色する微生物輪郭染色液を添加する微生物輪郭染色工程を具備する。【選択図】図４
2011172509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、
蛍光染色した微生物を含む試料に、前記微生物の輪郭を染色する微生物輪郭染色液を添加する微生物輪郭染色工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記微生物輪郭染色液は、親油性蛍光色素を希釈した溶液であることを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記親油性蛍光色素は、親油性スリチル色素、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドであることを特徴とすることを特徴とする請求項２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記親油性蛍光色素は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneであることを特徴とする請求項３に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
前記微生物輪郭染色液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを２５ng/ml〜２．５μg/mlの濃度にしたものであることを特徴とする請求項４に記載の微生物検出方法。
【請求項６】
ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法を使用することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本としての微生物を検出する微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物を顕微鏡によって検出する時には、位相差顕微鏡や蛍光染色法が用いられている。上記位相差顕微鏡には、透明に近い微生物を明確に観察できる利点がある。また、蛍光染色法には、微生物の持つＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）やＲＮＡ（Ribonucleic acid）を蛍光染色することによって微生物のみを染色するＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法、特定微生物を核酸の配列から染め分けるＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法、蛍光染色した抗体を用いる方法、蛍光染色したファージを用いる方法等の多くの方法が存在する。
【０００３】
そして、このような微生物の検出に関する発明として、下記特許文献１には、キャピラリー等電点電気泳動法によって、検出対象微生物であるレジオネラ属菌を、迅速、簡易、高感度かつ定量的に分離して検出するレジオネラ属菌検出方法が開示されている。
また、下記特許文献２には、検出対象微生物を特異的に認識し、蛍光物質が結合した標識抗体による抗原抗体反応を用いて、試料に含まれる粒子の蛍光強度から該検出対象微生物を検出する微生物検出方法であって、上記粒子の前方散乱光強度、上記標識抗体による蛍光強度及び夾雑物に特有の蛍光強度を測定し、測定した光学的情報に基づいて、上記標識抗体が上記夾雑物に非特異結合した擬陽性を示す粒子を排除することによって検出対象微生物のみを検出し、該検出対象微生物を計数する微生物検出方法が開示されている。
【０００４】
さらに、下記特許文献３には、微生物を生死菌染色試薬と死菌染色試薬で染色し、生菌及び死菌の輝度を求め、発光点ごとに輝度のドットプロットを作成し、当該プロットを用いて生菌を計数することによって、従来より計数の正確性を向上することができるプログラム及び微生物計数装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１０９９２７号公報
【特許文献２】特開２００７−２３２３８２号公報
【特許文献３】特開２００７−０９７５８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上記従来技術の蛍光染色法では、微生物が有するＤＮＡまたはＲＮＡを蛍光染色することによって、容易に試料中の微生物を検出することができる。しかしながら、微生物の細胞内にはリボソームＲＮＡが大量に存在し、微生物の個体によって、リボソームＲＮＡが細胞内の１箇所に集中している個体と、リボソームＲＮＡが細胞内に点在している個体とが存在している。
【０００７】
そのため、このような微生物を蛍光染色法によって染色すると、細胞内の１箇所に集中的にリボソームＲＮＡが存在する個体の場合には、微生物の細胞の１箇所のみが蛍光を発するために、蛍光発色を頼りに微生物の各個体を識別することができるが、細胞内にリボソームＲＮＡが点在している個体の場合には、微生物の個体の複数箇所が蛍光を発するために、蛍光発色を頼りに微生物の個体を識別することが大変困難である。
【０００８】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、蛍光染色法によって１匹の微生物内に点在するリボソームＲＮＡが蛍光する場合でも、１匹毎の微生物を明確に認識することができる微生物検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、蛍光染色した微生物を含む試料に、前記微生物の輪郭を染色する微生物輪郭染色液を添加する微生物輪郭染色工程を具備するという手段を採用する。
【００１０】
本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記微生物輪郭染色液は、親油性蛍光色素を希釈した溶液であるという手段を採用する。
【００１１】
本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記親油性蛍光色素は、親油性スリチル色素、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドであるという手段を採用する。
【００１２】
本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第３の解決手段において、前記親油性蛍光色素は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneであるという手段を採用する。
【００１３】
本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第４の解決手段において、前記微生物輪郭染色液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを２５ng/ml〜２．５μg/mlの濃度にしたものであるという手段を採用する。
【００１４】
本発明では、微生物検出方法に係る第６の解決手段として、上記第１〜５のいずれかの解決手段において、前記試料に含まれる微生物は、核酸の配列に基づいて染め分けるＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法で蛍光染色されているという手段を採用する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、蛍光染色した微生物を含む試料に、微生物の輪郭を染色する微生物輪郭染色液を添加する微生物輪郭染色工程を具備する。
これにより、蛍光染色した場合に、１匹の微生物の細胞内に点在する蛍光発色が存在したとしても、１匹毎の微生物を明確に認識することができる。そして、１匹毎の微生物を明確に認識することができることによって、微生物をより短時間かつ正確に検出／定量することが可能となる。上記３種類の微生物輪郭染色液は、いずれも蛍光色が異なるものの、１匹毎の微生物を明確に認識することができるという点においては同じある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の工程を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の第２の工程におけるろ過装置１０の部分斜視図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の微生物輪郭染色工程を示す模式図である。
【図４】N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを含まない溶液を添加した試料と、本発明の一実施形態に係る微生物検出方法によって微生物輪郭染色液を添加した試料との蛍光顕微鏡の観察結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態に係る微生物検出方法における工程について説明する。
本実施形態に係る微生物検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて微生物を検出する方法であり、微生物輪郭染色工程を備えている。
【００１８】
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、水を主成分とするレジオネラ菌ｌｇを含む液体試料に、終濃度が４質量％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することによってパラホルムアルデヒドに化学固定を行わせる。第１の工程では、この化学固定によって、液体試料中にレジオネラ菌ｌｇの固定標本を作製する（ステップＳ１）。
【００１９】
〔第２の工程〕                                  
そして、上記第１の工程が終了すると、次に、第２の工程において、第１の工程において作製した固定標本を含む液体試料を、図２に示すろ過装置１０によって、ろ過することで、固定標本を取り出す。ろ過装置１０は、図２に示すように、ガイドタワー１、ろ過器２及び吸引器３を備えている。
【００２０】
ガイドタワー１は、ろ過器２に液体試料を導入するための筒形状の流路であり、ろ過器２の上側に取り付けられている。
ろ過器２は、ガイドタワー１を介して導入された液体試料から固定標本をメンブレンフィルタ２ａ上に取り出す。
【００２１】
このろ過器２では、メンブレンフィルタ２ａが着脱可能になっており、ろ過毎にメンブレンフィルタ２ａを交換することが可能である。
メンブレンフィルタ２ａは、装着に必要な余白を含めた大きさの直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。このメンブレンフィルタ２ａの中心部の直径１６ｍｍの円形領域がろ過に使用される。
【００２２】
吸引器３は、ろ過を促進させるためにメンブレンフィルタ２ａの下側から吸引を行う。より詳しくは、吸引器３は、吸引ビンと、吸引ポンプとを備えており、吸引ポンプが吸引ビン内の空気を吸引することで、メンブレンフィルタ２ａを下側から吸引する。
【００２３】
そして、第２の工程では、上記構成のろ過装置１０によってレジオネラ菌ｌｇの固定標本をメンブレンフィルタ２ａ上に取り出した後に、ろ過器２からメンブレンフィルタ２ａを取り外す。そして、第２の工程では、取り外したメンブレンフィルタ２ａを、常温の空気中で乾燥させ、その後に９９．５質量％エタノールによって脱水し、さらに再度、常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ２）。
【００２４】
〔第３の工程〕
そして、上記第２の工程が終了すると、次に、第３の工程において、シャーレに、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）によって標識したプローブ（レジオネラ菌用ＤＮＡプローブ）と、ハイブリダイゼーションバッファとを「１：９」の割合で混合したプローブ溶液を作製し、レジオネラ菌が付着したメンブレンフィルタ２ａから切り取った扇形のフィルタ部分（菌サンプル２ｂ）をピンセットによってプローブ溶液に浸し、４６℃の温度下で約２時間保存することで、レジオネラ菌の固定標本にプローブを結合させる（ステップＳ３）。
上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９質量％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５質量％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２質量％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２質量％である。
【００２５】
〔第４の工程〕
そして、上記第３の工程が終了すると、次に、第４の工程において、５０ｍｌの遠沈管にウォッシングバッファを入れ、遠沈管のウォッシングバッファに第３の工程において約２時間プローブ溶液に反応させた扇形の菌サンプル２ｂを浸し、４８℃の温度下で、ウォッシングバッファに菌サンプル２ｂを１５分浸した状態にすることによって、菌サンプル２ｂ上の未反応のプローブを洗浄する（ステップＳ４）。
上記ウォッシングバッファの構成は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌが２０ｍＭ、ＮａＣｌが８０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）が５ｍＭ、ＳＤＳが０．０１質量％である。ウォッシングバッファでは、未反応のプローブが自然拡散によって、菌サンプル２ｂから剥がれ落ちる。
【００２６】
〔第５の工程〕
そして、上記第４の工程が終了すると、次に、第５の工程において、ウォッシングバッファによって洗浄された扇形の菌サンプル２ｂを、９９．５質量％のエタノールに浸すことによって、菌サンプル２ｂを１分間脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ５）。
【００２７】
〔第６の工程（微生物輪郭染色工程）〕
そして、上記第５の工程が終了すると、次に、第６の工程（微生物輪郭染色工程）において、親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide（親油性蛍光色素）の原液を、ＨＢＳＳ（Mg-free Hanks balanced salt solution）溶液によって１／２００に希釈し、ＨＢＳＳ溶液によって希釈したものをＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液（退色防止剤）のみまたはＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液とベクターシールド（他の退色防止剤）の混合溶液によって、１／１０〜１／１０００に希釈した溶液である微生物輪郭染色液を作製する。すなわち、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideの濃度が２５ng/ml〜２．５μg/mlである微生物輪郭染色液を作製する。
【００２８】
なお、この微生物輪郭染色液は、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideをＨＢＳＳ溶液によって１／２００に希釈しものを、ＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液のみまたはＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液とベクターシールドの混合溶液によって、１／５０〜１／５００の範囲に希釈したものが好ましく、さらに、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideをＨＢＳＳ溶液によって１／２００に希釈しものを、ＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液のみまたはＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液とベクターシールドの混合溶液によって、１／１００〜１／３００に希釈したものがより好ましい。
【００２９】
そして、微生物輪郭染色工程では、第５の工程において乾燥させた扇形の菌サンプル２ｂをスライドガラス１１に載せ、図３に示すように、マイクロピペット１２によって、スライドガラス１１上の菌サンプル２ｂのレジオネラ菌捕集部分２ｃに微生物輪郭染色液を滴下することで添加し、カバーガラスを載せて、泡がはいらないように密着させる（ステップＳ６）。図３は、本実施形態に係る微生物検出方法の微生物輪郭染色工程を示す模式図である。
【００３０】
〔第７の工程〕
そして、上記微生物輪郭染色工程が終了すると、次に、第７の工程において、蛍光顕微鏡を用いて試料中のレジオネラ菌ｌｇを検出する（ステップＳ７）。すなわち、菌サンプル２ｂが載ったスライドガラス１１を蛍光顕微鏡に装着し、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス１１上の試料に照射することにより、プローブが結合したレジオネラ菌を波長５２０ｎｍの緑色光として蛍光させる。
【００３１】
なお、第７の工程では、蛍光顕微鏡の光学フィルタセットに顕微鏡付属の緑色蛍光観察用セットを用いても良いが、微生物染色用蛍光試薬の励起波長（レジオネラ菌用ＤＮＡプローブを標識したＦＩＴＣの励起波長４９５ｎｍ）を選択的に透過するバンドパスフィルタを励起波長光路に装着する方がより好ましい。
【００３２】
そして、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを含まない溶液、すなわちＨＢＳＳ溶液とＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液のみまたはＣＩＴＩＦＬＵＯＲ溶液とベクターシールドの混合溶液とによって構成された溶液を添加した試料と、微生物輪郭染色工程によって微生物輪郭染色液を添加した試料とを蛍光顕微鏡によって見比べた。
【００３３】
図４は、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを含まない溶液を添加した試料と、本実施形態に係る微生物検出方法によって微生物輪郭染色液を添加した試料との蛍光顕微鏡の観察結果を示す図である。図４の（ａ）は、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを含まない溶液を添加した試料の観察結果を示し、図４の（ｂ）は、微生物輪郭染色液を添加した試料の観察結果を示している。なお、図４の（ｂ）における、レジオネラ菌ｌｇ及び夾雑物ｉｐ２の斜線部分は、赤色であることを示している。
【００３４】
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを含まない溶液を添加した試料と、微生物輪郭染色工程によって微生物輪郭染色液を添加した試料とを蛍光顕微鏡によって見比べると、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを含まない溶液を添加した試料では、図４の（ａ）に示すように、レジオネラ菌ｌｇの細胞内にリボソームＲＮＡが点在しているために、プローブと類似の色によって自家蛍光する夾雑物ｉｐ１と共に、レジオネラ菌ｌｇのリボソームＲＮＡに結合したプローブの緑色蛍光が点在して観察される。
【００３５】
しかしながら、微生物輪郭染色液を添加した試料では、微生物輪郭染色液によってレジオネラ菌ｌｇの細胞膜が赤色に染色されるため、図４の（ｂ）に示すように、１匹のレジオネラ菌ｌｇの細胞内にリボソームＲＮＡに応じて点在する緑色蛍光が存在するものの１匹毎のレジオネラ菌ｌｇの輪郭が赤色に染色されているので、１匹毎のレジオネラ菌ｌｇを明確に区別することができる。
【００３６】
また、この際に、図４の（ｂ）に示すように、微生物輪郭染色液に類似する赤色の夾雑物ｉｐ２が存在する場合であっても、レジオネラ菌ｌｇは、リボソームＲＮＡに結合したプローブの緑色蛍光が赤色の輪郭によって覆われる状態で観察されるために、容易にレジオネラ菌ｌｇを識別することができる。
【００３７】
そして、微生物検出用の画像処理アルゴリズムを使って、上記蛍光顕微鏡によって撮影したカラー画像の解析を行った。
上述したように、この解析では、レジオネラ菌ｌｇの細胞膜が赤色に染色されることで輪郭が明確になるために、レジオネラ菌ｌｇの細胞膜を染色しない試料に比べて、カラー画像におけるレジオネラ菌ｌｇの検出が容易になった。
【００３８】
以上のように、本実施形態に係る微生物検出方法では、微生物輪郭染色工程において、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを希釈した溶液である微生物輪郭染色液を試料に添加することによって、レジオネラ菌ｌｇの細胞膜を赤色に染色するので、１匹毎のレジオネラ菌ｌｇの輪郭が明確になる。これにより、ＦＩＳＨ法によって蛍光染色した場合に、１匹のレジオネラ菌ｌｇの細胞内に点在するリボソームＲＮＡに応じて蛍光発色したとしても、１匹毎のレジオネラ菌ｌｇを明確に認識することができる。したがって、レジオネラ菌ｌｇをより短時間かつ正確に検出／定量することが可能となる。
【００３９】
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法によって検出対象微生物を染色したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、核酸染色法及び抗体染色法等のＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法によって検出対象微生物を染色するようにしてもよい。
（２）上記実施形態において、微生物輪郭染色液は、親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを希釈した溶液であるが、本発明はこれに限定されない。
例えば、夾雑物蛍光色変異液として、親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを希釈した溶液を用いてもよい。上記の微生物輪郭染色液は、蛍光色が異なるものの、１匹毎の微生物を明確に認識することができるという点においては同じある。
【符号の説明】
【００４０】
１…ガイドタワー、２…ろ過器、２ａ…メンブレンフィルタ、２ｂ…菌サンプル、２ｃ…レジオネラ菌捕集部分、３…吸引器、１０…ろ過装置、１１…スライドガラス、１２…マイクロピペット
【図１】
2011172509.tif 000003
【図２】
2011172509.tif 000004
【図３】
2011172509.tif 000005
【図４】
2011172509.tif 000006