(57)【要約】【課題】クマリンおよびその誘導体の標的としての、新規ポリペプチド、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）を提供すること。【解決手段】本発明は、クマリンおよびその誘導体の標的としての、新規ポリペプチド、ビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）に関する。本発明はさらに、クマリン誘導体を同定する方法を提供し、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症、例えば、ワルファリン耐性と関連する配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸であって、これらの欠乏症の診断に用いられ得るＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸もまた特許請求する。さらに、本発明は、げっ歯動物の駆除に使用可能なクマリン誘導体を同定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワルファリン耐性げっ歯動物において毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）該げっ歯動物に対する該候補クマリン誘導体の毒性（候補クマリン誘導体毒性値）を決定する工程；
（ＩＶ）該候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）該候補クマリン誘導体毒性値が、該コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、該候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、ワルファリン耐性げっ歯動物は、ビタミンＫエポキシドリサイクリング（ＶＫＯＲＣ１）ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物であり、
ここで、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、哺乳動物における、クマリンおよびその誘導体の標的であって、
（ａ）配列番号１、１２および１７に記載の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有し、ここで、該ポリペプチド配列がＶＫＯＲＣ１活性を有する、ポリペプチド配列；ならびに
（ｄ）ＶＫＯＲＣ１活性を有し、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定されるポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列、
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含み、
ここで、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも１つの配列異常、好ましくは、配列番号１４に記載の配列によってコードされるポリペプチドを含む、方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１２に記載のポリペプチドであり、かつ、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、およびＹ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）からなる群から選択される、方法。
【請求項４】
げっ歯類を殺すための組成物であって、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法によって同定されたクマリン誘導体のげっ歯類を殺すために有効な量を含む、組成物。
【請求項５】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、クマリンおよびその誘導体の標的となる、新規ポリペプチド、ビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）に関する。本発明はさらに、クマリン誘導体を同定する方法を提供し、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症、例えば、ワルファリン耐性と関連する配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸であって、これらの欠乏症の診断に用いることが可能なＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸の特許も主張する。さらに、本発明は、げっ歯類の駆除に使用が可能なクマリン誘導体を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血栓発生に対し緊急な処置および、長期的な防止をするためには、不時の血液凝固の抑制が治療選択肢となる。いくつかの抗凝固剤のある中で、クマリンは、例えば、術後で動けない患者、慢性心不全患者、アテローム硬化性血管病を抱える患者、悪性腫瘍患者、および妊娠患者における血栓症の予防に広く使用されている。さらに、クマリンは、血栓症の治療および予防においてもっとも広く使用される経口性抗凝固剤である［非特許文献１］。クマリンは、典型的には、６−ヒドロキシクマリンの誘導体、例えば、３−（アセトニルベンジル）−４−ヒドロキシクマリン（ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））である。
【０００３】
クマリンは、ビタミンＫサイクルを抑制することによって間接的にではあるが血液凝固カスケード反応を標的にする。
【０００４】
ビタミンＫは、調節タンパクの一種であるＧｌａタンパクのγ−カルボキシル化による翻訳後活性化において必須の補因子である。いくつかの代謝経路において、重要なタンパクのいくつかが、適正な働きのためにカルボキシル化を必要とする。血液凝固カスケードは、もっともよく研究された例である。ここで、凝固促進因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、および抗凝固因子であるタンパクＣ、タンパクＳ、タンパクＺは、γ−カルボキシル化に依存する。この翻訳後修飾によって、血液凝固活性化の必須段階である、修飾タンパクの−カルシウムの存在下における−リン脂質二重層膜に対する付着が可能になる［非特許文献２］［非特許文献３］。γ−カルボキシル化を必要とする他のタンパクとしては、いずれも骨代謝の調節因子である基質ｇｌａタンパクおよびオステオカルシン［非特許文献４］、細胞サイクルのシグナル伝達タンパクである「成長停止特異的遺伝子」［非特許文献５］［非特許文献６］がある。
【０００５】
γ−カルボキシル化の最中、肝臓のミクロソームにおいて、カルボキシル基は、酵素γ−グルタミルカルボキシラーゼによって、標的タンパクのグルタミン酸残基に導入される［非特許文献７］［非特許文献１］。この反応は、補因子として、定量の還元型ビタミンＫ１ヒドロキノン（ビタミンＫ１Ｈ２）を必要とする。このビタミンＫ１Ｈ２は、酸化されるとビタミンＫ−２，３エポキシドになる［非特許文献８］。この活性型補因子の再生は、ビタミンＫ−２，３−エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）と呼ばれる多数タンパク質の複合体によって仲介される［非特許文献９］。この同じ複合体は、げっ歯類駆除に使用されるクマリン型毒素の標的となる。この「ビタミンＫサイクル」の特性は生化学的にその詳細が明らかにされているが、その分子成分はまだ、均質性に至るまで精製されていない［非特許文献１０］。さらに、クマリン活性の分子的性質、およびクマリンと相互作用を有する分子も依然として判明していない。
【０００６】
クマリンの服用は、全体として効果的ではあるけれども、いくつか限界のあることが従来技術において認められている。先ず、クマリン治療が効かないヒトがいることが挙げられる。クマリンによる経口的抗凝固治療を受けているにも拘わらず凝固因子の活性を正常に保つ人々に対して、ワルファリン耐性（ＷＲ）という用語が用いられる（ＯＭＩＭアクセス番号１２２７００）。いくつかの家系において常染色体優勢伝達が観察されている［非特許文献１１］［非特許文献１２］。ビタミンＫ依存性凝固因子（ＶＫＣＦＤ）全てが組み合わさった欠乏症は、ヒトにおける極めて稀な常染色体劣勢遺伝の出血障害であり、これまで１４例しか報告されていない［非特許文献１３］［非特許文献１４］［非特許文献１５］［非特許文献１６］［非特許文献１７］［非特許文献１８］［非特許文献１９］［非特許文献２０］［非特許文献２１］［非特許文献２２］［非特許文献２３］［非特許文献２４］［非特許文献２５］。この病気の臨床症状としては、時に致命的な結果をもたらす周産期における脳内出血エピソードが挙げられる。この出血傾向は、通常は、ビタミンＫの経口投与によって完全に覆される。新生児では、ワルファリン胎児障害に似た鼻および末端指節骨の発育不全、および骨端の早すぎる石灰化の新たな症状が加わることがある［非特許文献１９］。この疾患は、不十分なビタミンＫの吸収／肝臓輸送［非特許文献２６］か、または、γ−カルボキシル化に関与する複数の遺伝子の内の一つにおける突然変異、のいずれかによって起こる可能性がある。サブタイプ１では（ＶＫＣＤＦ１、ＯＭＩＭ＃２７７４５０）、染色体２ｐ１２のＧＧＣＸ遺伝子の突然変異が、凝固因子の不十分なカルボキシル化を招く［非特許文献２３］［非特許文献２４］。家族性複数凝固因子欠乏症（ＦＭＦＤ、現在では名前を改めてＶＫＣＦＤ２、ＯＭＩＭ＃６０７４７３）を有する二つの家系を連鎖解析したところ、染色体１６ｐ１２−ｑ２１の挟動原体領域の２０Ｍｂ間隔に連鎖が見られることが報告されている［非特許文献２７］。ＶＫＣＦＤ２を有する患者では、ビタミンＫエポキシドの血清レベルが有意に増加することが示された。これは、ＶＫＯＲ複合体のサブユニットの内の一つに欠損のあることを示唆する。以上まとめると、ワルファリン耐性を示す患者が存在することが証明される。そのため、これらの患者を治療するのに有効な抗凝固剤となる、新規のクマリン誘導体を同定する必要があり、従って、それらクマリン誘導体を同定する方法を実現する必要がある。
【０００７】
クマリンの服用は、かなりの死亡率を示す自発性出血の危険性がつきものである。さらに、クマリンの維持用量を正確に予測することは難しい。クマリンの作用を受ける標的分子が存在しない場合、治療処方は患者毎に決めなければならない。最適処方がまだ決まらない内は、血栓形成の危険性が増すか、または出血の危険性が増し、そのため患者は苦しむことになる。従って、より速やかで、より安全な最適治療処方を確定する方法が求められている。さらに、最適治療処方の確立は、クマリンの投与から抗凝固活性の開始まで相当の時間がかかるため複雑になっている。クマリンの作用には遅延のあること、クマリンは時間と共に蓄積する傾向のあることから、当技術分野で既知のクマリンよりも速やかに血液凝固をもたらすクマリン誘導体が求められている。さらに、クマリンの蓄積を防止または緩和することが可能であり、ひいては過剰投与の危険を低下または阻止することが可能なように、より速やかに代謝されるクマリンが求められている。
【０００８】
血栓がある状態においてクマリン投与を始めた場合、タンパクＣおよびＳの濃度が低下し、従って一時的に血栓発生の可能性が高まることがある。これは、通常、数日間、ヘパリンとクマリンの投与を重複させることによって補償される。このような制限のない、または、少なくとも制限の程度がより低くなった、新規のクマリン誘導体をスクリーニングすることを可能とするために、上記と同じくクマリン作用の分子標的を同定することが求められている。
【０００９】
クマリン治療は、場合によって、患者に皮膚壊死を招き、妊娠時に適用されると胎児障害をもたらすことがある。従って、このような作用を招くことのない新規クマリン誘導体が求められている。
【００１０】
薬剤とクマリンの間にはいくつかの相互作用がある。このような薬剤のいくつか、例えば、フェノバルビタールは、クマリンの代謝を促進することによってクマリンの血漿レベルを下げるが、これは、シトクロームＰ４５０混合機能オキシダーゼのような混合機能オキシダーゼによっておこされると考えられている。このような相互作用は臨床的関連を有する。例えば、フェノバルビタールとクマリンの適切な処方が決められ、後になってフェノバルビタールの投与のみが中断された場合、クマリンの血漿レベルの上昇を招くことになり、これは過度の抗凝固作用の原因となる。その他の薬剤、例えばアミオダロンもクマリンの代謝を遅らせるので、この場合も、クマリンと同時投与した場合、過度の抗凝固作用をもたらす。クマリンの作用を受ける分子は当技術分野で知られていないので、上記諸問題を解決するために、新規のクマリンの開発、および新規クマリンを同定するためのツールが求められている。
【００１１】
最後に、クマリン、特にワルファリンは、ヒトにおいて使用されるのみならず、１９５０年代以来、殺鼠組成物における活性成分として用いられている。殺鼠剤としてのワルファリンの有効性の根拠は、それが、少量、複数回の用量で効果的な抗凝固剤であるという事実にある。この化合物の１回または２回投与量では、推奨濃度で摂取した場合でも致命的になることは滅多にない。従って、ヒト、家畜、および野生動物に対する急性毒性の危険性は大きく緩和される。通常、げっ歯類は、この物質を４から５日間毎日摂った後に死に始めるので、集団は、ほぼ３週間内で激減するか、根絶される。死は、血液の凝固作用を下げるワルファリンの作用によって引き起こされる出血によってもたらされる。これらの出血は、外部的な場合も内部的な場合もあるが、ごく僅かな傷または毛細管傷害によって開始されることがある。クマリンの、他の利点の内のもう一つを挙げると、げっ歯類を殺すのに複数回の摂取が必要とされるので、げっ歯類は、撒き餌忌避に至らないという点である。１９６９年を最初に、げっ歯類、特にラットは、それよりやや程度は劣るが二十日ネズミも、ワルファリン撒き餌に対して耐性を示し始めている。このような耐性は遺伝的根拠に基づくものとするのが一般的仮説である。そのメカニズムについては、げっ歯類駆除において使用されるワルファリン誘導体が標的とするのが、前述のＶＫＯＲＣ１複合体である［Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８］。げっ歯類のいくつかの野性集団においてクマリン誘導体に対する耐性が自然発生的に生じ、このため、げっ歯類駆除用にこれらの薬剤を使用することが局所的に無効になっている。ワルファリン耐性に対する常染色体優勢座位が、マウス（Ｗａｒ）の染色体７に位置づけられ［非特許文献２８］、ラット（Ｒｗ）では、染色体１の長腕に位置づけられる［非特許文献２９］[非特許文献３０]。ＶＫＯＲ複合体が、クマリン薬剤の標的であるのだから、耐性は、ＶＫＯＲ複合体のタンパク成分の一つの変化を介して起こるものと考えられる［非特許文献３１］。げっ歯類における耐性の進行から、クマリン作用の標的を同定することが求められている。なぜなら、そのような標的が見つかれば、それは、害獣駆除に使用される新規クマリン誘導体の開発を促進すると考えられるからである。
以上を総合し、哺乳類においてクマリンおよびその誘導体における標的分子を提供するのが本発明の一つの目的である。前述の問題点の内少なくとも一つを解決する新規クマリンを同定するための方法を提供するのが本発明のもう一つの目的である。ヒト、および非ヒト哺乳類、特にげっ歯類においてワルファリン耐性を引き起こすポリペプチド、およびそれらポリペプチドをコードする核酸を同定するのが、本発明のさらにもう一つの目的である。本発明のさらにもう一つの目的は、ワルファリン耐性による疾患、家族性複数因子欠乏症、血液凝固上昇と関連する障害または疾患、例えば、血栓症を抱える患者および／または血栓発生の危険度の高い患者、例えば、遺伝的に血栓形成の危険度が高い患者、特に手術または妊娠のために血栓形成の危険度が上昇している患者、および、血管石灰化が進んでいる患者、の内から選択される障害および疾患を診断、予防、および／または治療することである。さらに、本発明の目的は、血液凝固の低下と関連する疾患または障害、例えば、血友病、障害関連性の血管石灰化低下、および、出血危険度が上昇する障害および疾患を診断、予防、および／または治療することである。最後に、非ヒト哺乳類の害獣駆除に効果的なクマリンおよびその誘導体、および、げっ歯類を殺す組成物を同定するための方法を提供するのが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｕｔｔｉｅ，  Ｊ．  Ｗ．「Ｔｈｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  （１９８７年）２１４：ｐ．３−１６．
【非特許文献２】Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，  Ｒ．，  Ｆｕｒｉｅ，  Ｂ．  Ｃ．，  Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｍ．，  Ｋｅｙｔ，  Ｂ．，およびＦｕｒｉｅ，  Ｂ．「Ｍｅｔａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９７８年）２５３：ｐ．３８９８−３９０６．
【非特許文献３】Ｅｓｍｏｎ，  Ｃ．  Ｔ．，  Ｓｕｔｔｉｅ，  Ｊ．  Ｗ．，およびＪａｃｋｓｏｎ，  Ｃ．  Ｍ．「Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９７５年）２５０：ｐ．４０９５−４０９９．
【非特許文献４】Ｐｒｉｃｅ，  Ｐ．  Ａ．「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ−Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  （１９８８年）８：ｐ．５６５−５８３．
【非特許文献５】Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ，  Ｇ．，  Ｂｒａｎｃｏｌｉｎｉ，  Ｃ．，  Ａｖａｎｚｉ，  Ｇ．，およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｃ．「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ（ｇａｓ６）  ｉｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ，  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （１９９３年）１３：ｐ．４９７６−４９８５．
【非特許文献６】Ｓｔｉｔｔ，  Ｔ．  Ｎ．，  Ｃｏｎｎ，  Ｇ．，  Ｇｏｒｅ，  Ｍ．，  Ｌａｉ，  Ｃ．，  Ｂｒｕｎｏ，  Ｊ．，  Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉ，  Ｃ．，  Ｍａｔｔｓｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｊ．，  Ｇｉｅｓ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．  Ｆ．，ら「Ｔｈｅ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｖｅ，  Ｇａｓ６，  ａｒｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｙｒｏ  ３／Ａｘｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ」Ｃｅｌｌ  （１９９５年）８０：ｐ．６６１−６７０．
【非特許文献７】Ｆｕｒｉｅ，  Ｂ．，およびＦｕｒｉｅ，  Ｂ．  Ｃ．「Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ  （１９８８年）５３：ｐ．５０５−５１８．
【非特許文献８】Ｃａｉｎ，  Ｄ．，  Ｈｕｔｓｏｎ，  Ｓ．  Ｍ．，およびＷａｌｌｉｎ，  Ｒ．「Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ２，３−ｅｐｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９７年）２７２：ｐ．２９０６８−２９０７５．
【非特許文献９】Ｗａｌｌｉｎ，  Ｒ．，およびＭａｒｔｉｎ，  Ｌ．  Ｆ．「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｗａｒｆａｒｉｎ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  （１９８５年）７６：ｐ．１８７９−１８８４．
【非特許文献１０】Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｃａｉ，  Ｄ．，およびＷａｌｌｉｎ，  Ｒ．「Ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｅｐｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ１  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｃｙｃｌｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  （１９９８年）５５：ｐ．１６９−１７５．
【非特許文献１１】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｒ．  Ａ．，  Ａｇｇｅｌｅｒ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｓｉｌｖｉｊａ  Ｈｏａｇ，  Ｍ．，  Ｌｅｏｎｇ，  Ｌ．  Ｓ．，およびＫｒｏｐａｔｋｉｎ，  Ｍ．  Ｌ．「Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｏｕｍａｒｉｎ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｄｒｕｇｓ：  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｋｉｎｄｒｅｄ」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  （１９６４年）２７１：ｐ．８０９−８１５．
【非特許文献１２】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｒ．  Ａ．「Ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｋｉｎｄｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｏｒａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｄｒｕｇｓ」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  （１９７０年）２８２：ｐ．１４４８−１４５１．
【非特許文献１３】ＭｃＭｉｌｌａｎ，  Ｃ．  Ｗ．，およびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｈ．  Ｒ．「Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＩＩ，  ＶＩＩ，  ＩＸ  ａｎｄ  Ｘ．  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｃａｓｅ」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  （１９６６年）２７４：ｐ．１３１３−１３１５．
【非特許文献１４】Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｍ．，およびＥ．，  Ｚ．「Ｋｏｎｇｅｎｉｔａｌｅｒ  Ｍａｎｇｅｌ  ｄｅｒ  Ｆａｋｔｏｒｅｎ  ＩＩ，  ＶＩＩＩ  ｕｎｄ  Ｘ」Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ  （１９６６年）９５：ｐ．３０９−３２３．
【非特許文献１５】Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｃｈｕｎｇ，  Ｋ．  Ｓ．，  ＭｃＧｒａｔｈ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｂｅａｎ，  Ｐ．  Ｅ．，およびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｈ．  Ｒ．「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＩＩ，ＶＩＩ，  ＩＸ  ａｎｄ  Ｘ」Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  （１９８０年）４４：ｐ．４６１−４６９．
【非特許文献１６】Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｈ．，  Ｊｒ．，  Ｐｅｎｃｅ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｒａｔｎｏｆｆ，  Ｏ．  Ｄ．，  Ａｄｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｄ．  Ｊ．，およびＦｕｒｉｅ，  Ｂ．「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  （１９８２年）６９：ｐ．１２５３−１２６０．
【非特許文献１７】Ｖｉｃｅｎｔｅ，  Ｖ．，  Ｍａｉａ，  Ｒ．，  Ａｌｂｅｒｃａ，  Ｉ．，  Ｔａｍａｇｎｉｎｉ，  Ｇ．  Ｐ．，およびＬｏｐｅｚ  Ｂｏｒｒａｓｃａ，  Ａ．「Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ」Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  （１９８４年）５１：ｐ．３４３−３４６．
【非特許文献１８】Ｅｋｅｌｕｎｄ，  Ｈ．，  Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ，  Ｌ．，およびＷｒａｎｎｅ，  Ｌ．「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＩＩ，  ＶＩＩ，  ＩＸ，  ａｎｄ  Ｘ：  ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｏｒｉｇｉｎ」Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  （１９８６年）３：ｐ．１８７−１９３．
【非特許文献１９】Ｐａｕｌｉ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｌｉａｎ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｍｏｓｈｅｒ，  Ｄ．  Ｆ．，およびＳｕｔｔｉｅ，  Ｊ．  Ｗ．「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｐａｔｈｙ：  ｃｌｕｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｅｒａｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｕｍａｒｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  （１９８７年）４１：ｐ．５６６−５８３．
【非特許文献２０】Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｃ．Ｏ．「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：  ａ  ｇｅｎｏｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｐａｔｈｙ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ  （１９８８年）７：ｐ．１６５−１６６．
【非特許文献２１】Ｐｅｃｈｌａｎｅｒ，  Ｃ．，  Ｖｏｇｅｌ，  Ｗ．，  Ｅｒｈａｒｔ，  Ｒ．，  Ｐｕｍｐｅｌ，  Ｅ．，およびＫｕｎｚ，  Ｆ．「Ａ  ｎｅｗ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  （１９９２年）６８：ｐ．６１７．
【非特許文献２２】Ｂｏｎｅｈ，  Ａ．，およびＢａｒ−Ｚｉｖ，  Ｊ．「Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  （１９９６年）６５：ｐ．２４１−２４３．
【非特許文献２３】Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｂ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｖｅｇａ，  Ｂ．，  Ｗｕ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｌａｎｉｒ，  Ｎ．，  Ｓｔａｆｆｏｒｄ，  Ｄ．  Ｗ．，およびＳｏｌｅｒａ，  Ｊ．「Ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｌｌ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」Ｂｌｏｏｄ  （１９９８年）９２：ｐ．４５５４−４５５９．
【非特許文献２４】Ｓｐｒｏｎｋ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ｆａｒａｈ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｇ．  Ｒ．，  Ｖｅｒｍｅｅｒ，  Ｃ．，およびＳｏｕｔｅ，  Ｂ．  Ａ．「Ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｌｌ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」Ｂｌｏｏｄ  （２０００年）９６：ｐ．３６５０−３６５２．
【非特許文献２５】Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ，  Ｊ．，  ｖｏｎ  Ｂｒｅｄｅｒｌｏｗ，  Ｂ．，  Ｆｒｅｇｉｎ，  Ａ．，  Ｒｏｓｔ，  Ｓ．，  Ｗｏｌｚ，  Ｗ．，  Ｅｂｅｒｌ，  Ｗ．，  Ｅｂｅｒ，  Ｓ．，  Ｌｅｎｚ，  Ｅ．，  Ｓｃｈｗａａｂ，  Ｒ．，  Ｂｒａｃｋｍａｎｎ，  Ｈ．  Ｈ．，ら「Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｅｐｏｘｉｄｅ−  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ−ｃｏｍｐｌｅｘ」Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  （２０００年）８４：ｐ．９３７−９４１．
【非特許文献２６】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ｈａ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ｃｕｒｒｙ，  Ｓ．，およびＢｈａｇａｖａｎ，  Ｎ．  Ｖ．「Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （２００２年）４７：ｐ．１１６−１２５．
【非特許文献２７】Ｆｒｅｇｉｎ，  Ａ．，  Ｒｏｓｔ，  Ｓ．，  Ｗｏｌｚ，  Ｗ．，  Ｋｒｅｂｓｏｖａ，  Ａ．，  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｃ．  Ｒ．，およびＯｌｄｅｎｂｕｒｇ，  Ｊ．「Ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ  ｆｏｒ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６」Ｂｌｏｏｄ  （２００２年）１００：ｐ．３２２９−３２３２．
【非特許文献２８】Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｍ．  Ｅ．，およびＭａｃＳｗｉｎｅｙ，  Ｆ．  Ｊ．「Ａ  ｍａｊｏｒ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｗａｒｆａｒｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｕｓｅ  ｍｏｕｓｅ」Ｊ  Ｈｙｇ（Ｌｏｎｄ）  （１９７６年）７６：ｐ．１７３−１８１．
【非特許文献２９】Ｇｒｅａｖｓｅｓ，  Ｊ．  Ｈ．，およびＡｙｒｅｓ，  Ｐ．「Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ」Ｎａｔｕｒｅ  （１９６７年）２１５：ｐ．８７７−８７８．
【非特許文献３０】Ｋｏｈｎ，  Ｍ．  Ｈ．，およびＰｅｌｚ，  Ｈ．  Ｊ．「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｌｏｃｕｓ，  Ｒｗ，  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ」Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ  （１９９９年）１０：ｐ．６９６−６９８．
【非特許文献３１】Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｗ．  Ｂ．，  Ａｓｈｔｏｎ，  Ａ．  Ｄ．，およびＤｅｌｖｅｎｔｈａｌ，  Ｋ．（１９８８年）「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅ  ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｓｕｔｔｉｅ（編）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｅｌｓｉｖｉｅｒ），ｐ．３８１−３９７．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
前述の目的を解決する試みにおいて、下記の群から選択されるポリペプチド配列を含む、または該配列から成るビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）が提供される。
（ａ）配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７による配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に定義され、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列。
【００１４】
さらに、本発明の別の局面によれば、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸（ＶＫＯＲＣ１核酸）が提供される。
【００１５】
さらに、本発明の別の局面によれば、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、下記の工程を含む方法が提供される。すなわち、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１核酸、または、ＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞においてＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＶ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（候補活性値）を決定する工程；
（Ｖ）候補活性値をコントロール活性値と比較する工程；および、
（ＶＩ）候補活性値がコントロール活性値と有意に異なる場合、その候補クマリン誘導体を、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程。
【００１６】
さらに、本発明の別の局面によれば、ＶＫＯＲＣ１活性に対して発揮されるクマリン作用を伝達するＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を決定する方法であって、下記の工程：
（Ｉ）少なくとも一つの配列異常を有する、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程を含み、
ここで、コントロール配列活性値に対する、配列異常活性値の有意な偏差は、そのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列異常は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して発揮されるクマリン作用を伝えるものであることを示すものとする方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の局面では、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、少なくとも一つの配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドが提供される。
【００１８】
さらに、本発明の別の局面によれば、患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）患者から得られたＤＮＡサンプルを増幅する工程、または、患者から得られたＲＮＡサンプルを逆転写してＤＮＡとし、そのＤＮＡを増幅する工程；
（ＩＩ）工程（Ｉ）の増幅ＤＮＡを分析し、請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも一つの配列異常を決定する工程、
を含み、ここで、求められた配列異常は、患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患すること、好ましくは該配列異常は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすことを示すものとする方法が提供される。
【００１９】
さらに、本発明の別の局面によれば、ワルファリン耐性げっ歯類に対して毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）げっ歯動物に対する候補クマリン誘導体の毒性（候補クマリン誘導体毒性値）を決定する工程；
（ＩＶ）候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）候補クマリン誘導体毒性値が、コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、その候補クマリン誘導体を、げっ歯類殺作用において効果的なクマリン誘導体であると同定する工程、
を含む方法が提供される。
本発明の別の局面によれば、特定されたクマリン誘導体は、げっ歯類を殺すための組成物に含めることも可能である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
哺乳動物における、クマリンおよびその誘導体の標的としてのビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）であって、
（ａ）配列番号１、１２および１７に記載の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ここで、該ポリペプチド配列がＶＫＯＲＣ１活性を有する、ポリペプチド配列；
（ｄ）ＶＫＯＲＣ１活性を有し、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定されるポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列、
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、ビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）。
（項目２）
ＶＫＯＲＣ１核酸であって、
（ａ）項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｂ）配列番号２、１３および１８に記載の配列からなる群から選択される核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸配列に対してストリンジェントな条件の下にハイブリダイズする核酸配列であって、ここで、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列がＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列；および、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定される核酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントがＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、
からなる群から選択される核酸配列を含む、ＶＫＯＲＣ１核酸。
（項目３）
融合タンパクであって、
（ａ）項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、または、項目２のＶＫＯＲＣ１核酸によってコードされるポリペプチド、および
（ｂ）異種部分
を含む、融合タンパク。
（項目４）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクター。
（項目５）
前記ベクターが発現ベクターである、項目４のベクター。
（項目６）
前記ベクターがノックアウト遺伝子構築物である、項目４または５のベクター。
（項目７）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸、または項目４〜６のいずれか１項のベクターを含む、宿主細胞。
（項目８）
非ヒト胚性幹細胞である、項目７の宿主細胞。
（項目９）
項目８の宿主細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目１０）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ。
（項目１１）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＰＣＲプライマーであって、好ましくは、配列番号５３〜６９および７０に記載のＰＣＲプライマーからなる群から選択される、ＰＣＲプライマー。
（項目１２）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する低分子干渉性ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であって、好ましくは、配列番号２９、３０、３３、３４、３７、３８、４１、４２、４５、４６、４９および５０からなる群から選択される、ｓｉＲＮＡ。
（項目１３）
項目２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ。
（項目１４）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対するＲＮＡアプタマーであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、ＲＮＡアプタマー。
（項目１５）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
（項目１６）
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを生産する方法であって、
（Ｉ）項目２のＶＫＯＲＣ１核酸、または、項目４〜６のいずれか１項のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞において該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）該宿主細胞から該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１核酸、または、該ＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞において該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＶ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（候補活性値）を決定する工程；
（Ｖ）該候補活性値をコントロール活性値と比較する工程；および、
（ＶＩ）該候補活性値が該コントロール活性値と有意に異なる場合、該候補クマリン誘導体を、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
項目１７の方法であって、前記コントロール活性値は、
（Ａ）工程（Ｉ）に従って宿主細胞を提供する工程；
（Ｂ）該宿主細胞において前記ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；および、
（Ｃ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール活性値）を決定する工程
を包含する方法によって決定される、方法。
（項目１９）
項目１７の方法であって、前記決定されたＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドのビタミンＫキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる活性値は、前記コントロール活性値よりも有意に高い候補活性値である、方法。
（項目２０）
項目１７の方法であって、少なくとも１つのさらなる化合物が前記宿主細胞に導入され、該化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
（項目２１）
ＶＫＯＲＣ１活性に対して発揮されるクマリン作用を伝えるＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を決定する方法であって、
（Ｉ）少なくとも１つの配列異常を有する、項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程を包含し、
ここで、該コントロール配列活性値に対する、該配列異常活性値の有意な偏差は、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列異常が、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して発揮されるクマリン作用を伝えることの指標である、方法。
（項目２２）
項目２１の方法であって、前記コントロール配列活性値は、
（Ｉ）項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；および、
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール配列活性値）を決定する工程
を包含する方法によって決定される、方法。
（項目２３）
項目２１の決定方法であって、前記決定された活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドのビタミンＫキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる値とは、前記コントロール配列活性値よりも有意に高い配列異常活性値である、方法。
（項目２４）
項目２１の方法であって、少なくとも１つのさらなる化合物が前記細胞に導入され、該化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
（項目２５）
項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、少なくとも１つの配列異常を含む、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド。
（項目２６）
項目２５のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１または１２に記載のポリペプチドであり、かつ、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ，およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される、ポリペプチド。
（項目２７）
ＶＫＯＲＣ１核酸であって、
（ａ）項目２５または２６のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列番号３、４、５、６、７、１４および９４に記載の配列からなる群から選択される核酸配列；および、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列が、項目２５または２６のポリペプチドをコードする、核酸配列、
からなる群から選択される、核酸。
（項目２８）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクター。
（項目２９）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ。
（項目３０）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＰＣＲプライマー。
（項目３１）
項目２５または２６のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
（項目３２）
トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸、または項目２８に記載のベクターを含む幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目３３）
項目２７のＶＫＯＲＣ１核酸、項目２９のＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ、項目３０のＰＣＲプライマー、および項目３１の抗体からなる群から選択される化合物を含む、診断薬。
（項目３４）
患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）該患者から得られたＤＮＡサンプルを増幅するか、または該患者から得られたＲＮＡサンプルを逆転写してＤＮＡとし、該ＤＮＡを増幅する工程；および、
（ＩＩ）工程（Ｉ）の増幅されたＤＮＡを分析し、項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１つの配列異常を決定する工程を包含し、
ここで、該決定される配列異常は、該患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患すること、好ましくはワルファリン耐性を患っていることの指標である、方法。
（項目３５）
項目３４の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、配列番号１に記載のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの少なくとも部分配列をコードし、ここで、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８ＲおよびＹ１３９Ｃからなる群から選択される、方法。
（項目３６）
項目３４の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、ＰＣＲベースの分析、制限消化分析、およびＤＮＡ配列決定分析からなる群から選択される技術によって分析される、方法。
（項目３７）
患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）該患者からのサンプルを提供する工程；および、
（ＩＩ）項目３１の抗体を用いて、該サンプルにおいて配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出する工程を包含し、
ここで、決定される配列異常は、該患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患することの指標である、方法。
（項目３８）
項目３７の方法であって、前記サンプルは、免疫組織化学的検出、イムノブロッティング、好ましくはウェスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される技術によって分析される、方法。
（項目３９）
少なくとも１つの配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）項目２５または２６に記載のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号３、４、５、６、７、１４および９４からなる群から選択される配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）候補クマリン誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
（Ｖ）該候補クマリン誘導体の投与が、該コントロール配列活性値よりも有意に低い配列異常活性値をもたらす場合、該候補クマリン誘導体を、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体として同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４０）
ワルファリン耐性げっ歯動物において毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）該げっ歯動物に対する該候補クマリン誘導体の毒性（候補クマリン誘導体毒性値）を決定する工程；
（ＩＶ）該候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）該候補クマリン誘導体毒性値が、該コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、該候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４１）
項目４０の方法であって、ワルファリン耐性げっ歯動物は、項目１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物であり、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも１つの配列異常を含む、好ましくは、配列番号１４に記載の配列によってコードされるポリペプチドを含む、方法。
（項目４２）
項目４０の方法であって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１２に記載のポリペプチドであり、かつ、配列異常は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、およびＹ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）からなる群から選択される、方法。
（項目４３）
げっ歯類を殺す組成物であって、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法によって同定されたクマリン誘導体のげっ歯類を殺すのに有効な量を含む、組成物。
（項目４４）
配列番号８８〜９１に記載のＰＣＲプライマーの使用であって、ラットから得たサンプルにおいて、該ラットがワルファリン耐性遺伝子型を有するか否かを決定するための、使用。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒト、ラット、およびマウスにおけるＶＫＯＲＣ１遺伝子座位を含む遺伝子マップにおける３ｃＭの候補間隔の比較を示す。ヒト染色体１６のイディオグラムが示される。ファミリー１および２のホモ接合体領域は、ほぼ２５Ｍｂに相当する１６ｐ１１．２から１６ｑ１３まで延びる。図の右側に、マウスとラット染色体の相同部位がある。１６ｐ１１．２および１６ｑ１２．１の合成遺伝子が、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＭＭＵ）およびＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＲＮＯ）の対応する相同遺伝子と共に描かれている。マウス（Ｗａｒ）およびラット（Ｒｗ）におけるワルファリン耐性表現型の座位は、１６ｐ１１．２に相同な領域にマップされる。ＭＭＵ：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ；ＲＮＯ：Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；ＰＲＫＣＢ１；Ｐｒｋｃｂ；ＩＬ４Ｒ：インターロイキン４受容体（ヒトにおける）；Ｉｌ４ｒａ：インターロイキン４受容体（マウスにおける）；Ｉｌ４ｒ：インターロイキン４受容体（ラットにおける）；ＳＰＳ２：セレノフォスフェート合成酵素（ヒト）；Ｓｐｓ２：セレノフォスフェート合成酵素（マウス／ラット）；ＨＵＭＭＬＣ２Ｂ：ミオシン軽鎖２（ヒト）；Ｍｙｌｐｆ：ミオシン軽鎖２（マウス）；Ｍｙｌ２：ミオシン軽鎖２（ラット）；ＳＰＮ：シアロフォリン（ヒト）；Ｓｐｎ：シアロフォリン（マウス／ラット）
【図２】図２は、ヒトのビタミンＫ依存性凝固因子２（ＶＫＣＦＤ２）およびワルファリン耐性（ＷＲ）患者におけるＶＫＯＲＣ１突然変異を示す。図の上方部分は、二つのＶＫＣＦＤ２家系におけるＲ９８Ｗ突然変異の分離を示し、コントロール（右）と比べた場合のホモ接合の突然変異体（左）のエレクトロフェログラムを示す。図の下方部分は、４人のＷＲ患者（８５Ｇ＞Ｔ、１３４Ｔ＞Ｃ、１７２Ａ＞Ｇ、３８３Ｔ＞Ｇ）およびＲｗラット（４１６Ａ＞Ｇ）のヘテロ接合の突然変異を示す。
【図３】図３は、ＶＫＯＲＣ１および、ＶＫＯＲＣ１様タンパク１（ＶＫＯＲＣ１Ｌ１）ポリペプチド同士の配列アラインメントを示す。このアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＰＲＥＴＴＹＢＯＸによって作成した。ヒト（ｈＶＫＯＲＣ１）、マウス（ｍＶＫＯＲＣ１）、およびラットＶＫＯＲＣ１（ｒＶＫＯＲＣ１）、および、ＶＫＯＲＣ１Ｌ１ポリペプチド、すなわち、ヒト（ｈＶＫＯＲＣ１Ｌ１）、マウス（ｍＶＫＯＲＣ１Ｌ１）、およびＦｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ（ｆＶＫＯＲＣ１Ｌ１）のＶＫＯＲＣ１Ｌ１は、両タンパク群内において約８４％の配列同一性を分かち有し、両タンパク群間において約５０％の同一性を分かち持っている。ｘＶＫＯＲＣ１は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を示し、ｆＶＫＯＲＣ１は、Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ（トラフグ）のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を示し、ａＶＫＯＲＣ１は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ（ハマダラカ）のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を示す。ツリー分析によって、Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ、およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅのタンパクは、適当な群にまとめることを可能にする。予測された膜貫通ドメインの位置に下線を付けている。ＷＲ患者において突然変異を示した残基２９、４５、５８、および１２８は、全ての動物種において保存されていた。ＶＫＣＦＤ２患者において突然変異を示した９８位置におけるアルギニンは、ヒト、ラット、およびマウスにおいて保存されている（プラス符号）。
【図４】図４は、ヒトの胎児および成人組織におけるＶＫＯＲＣ１のノーザンブロット分析を示す。上のブロットは、成人組織のノーザンブロットを示し、一方、下のブロットは、胎児組織のノーザンブロットを示す。さらに詳細については実施例４を参照されたい。サイズ２．４、４．４、７．５、および９．５ＫＢのフラグメントによる線は、分子量マーカーを示し、全ての可視的バンドのサイズの推定を可能とする。
【図５】図５は、ＶＫＯＲＣ１の細胞内局在を示す。さらに詳細については、実施例６を参照されたい。このために、ＣＯＳ−７細胞を一過性にＶＫＯＲＣ１構築物でトランスフェクトし、それぞれ、抗カルネキシン（赤：左側カラム）、および、抗ＧＦＰまたは抗ｍｙｃ（緑：中央カラム）で染色した。二重染色細胞の合体させた図を右側カラムに示す。両ＶＫＯＲＣ１構築物とも（ＧＦＰまたはｍｙｃ標識）、ＥＲ特異的カルネキシン染色と共通局在を示す。コントロール構築物（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）は、原形質全体に渡って拡散的な染色パターンを示す。
【図６−１】図６は、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１に対するｓｉＲＮＡおよび、例えば、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商標）Ｕ６カセットＲＮＡ干渉システムを用いてｓｉＲＮＡを発現させる際に使用が可能な、これらｓｉＲＮＡをコードするプライマーのリストを示す。
【図６−２】図６は、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１に対するｓｉＲＮＡおよび、例えば、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商標）Ｕ６カセットＲＮＡ干渉システムを用いてｓｉＲＮＡを発現させる際に使用が可能な、これらｓｉＲＮＡをコードするプライマーのリストを示す。
【図７】図７は、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体サブユニット１（Ｈｓ＿ＶＫＯＲＣ１）のコード配列におけるｓｉＲＮＡ標的の位置を示す。該位置は明るい灰色で示す。二つの可能なｓｉＲＮＡ標的の一部となる領域は、より暗い灰色で示す。２個以上の可能なｓｉＲＮＡ配列を含む領域は、さらに暗い灰色で示す。
【図８】図８は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＫＯＲＣ１Ｌ１増幅のための、ＰＣＲプライマー配列およびＰＣＲ条件のリストを示す。
【図９−１】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−２】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−３】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−４】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−５】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図９−６】図９は、配列、およびそれぞれの配列番号のリストを示す。
【図１０】図１０は、ＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＶＫＯＲ活性を示す。数値は、ビタミンＫキノンに変換されたビタミンＫエポキシドのパーセント（産物／残留基質＋産物）として表される。野生型ＶＫＯＲＣ１活性も、ワルファリンに対する感受性によって規定される（抑制されないものと比べると、８０μＭワルファリンにおいて４．３％の残留活性）。ワルファリン耐性をもたらす突然変異Ｙ１３９ＣおよびＶ２９Ｌは、それぞれ、８０μＭワルファリンにおいて６９および１１％残留活性を示す）。試験は全て二重に行った。トランスフェクトされない細胞および擬似トランスフェクト細胞は、１．４９％および０．９６％の活性を示し、１０μＭワルファリンによって＞９０％抑制された。詳細については実施例７を参照されたい。
【図１１】図１１は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチドのアミノ酸配列（ＨＳ＿ＶＫＯＲＣ１：配列番号１）を示す。
【図１２】図１２は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチドの核酸のコード配列（ＨＳ＿ＶＫＯＲＣ１：配列番号２）を示す。
【図１３】図１３は、試験ラットがワルファリン耐性を有するかどうかを決めるために行ったＡＲＭＳ−ＰＣＲ実験の結果を示す。野生型ラットは、１２３ｂｐにおいてバンドを示した（プローブ番号３３５１、３１３３、３１３７、３１４２、４７２４、４６８４、３１３８、３１６２）。突然変異（プローブ番号４７０１）に対してホモ接合のラットは、１０１ｂｐにおいてバンドを示した。最後に、ヘテロ接合の突然変異を有するラット（プローブ番号３０６６、３３５０、３３５２、３３５４、３１３９、３１４０、４７５４、３１４６、３１４８、３１４９）は、２本のバンド、一本は１０１において、もう一本は１２３ｂｐにおいて示した。詳細は実施例９を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
新規クマリン誘導体の開発の必要性、クマリンおよびその誘導体の標的の特定の必要性に応えるために、ビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）をクローニングした。この遺伝子は、今まで知られていない５１２６ｂｐのゲノム領域に及び、１６３個のアミノ酸から成るタンパクをコードする３個のエキソンを含んでいた。トポロジー分析から、少なくとも２個の膜貫通ドメインを有する、疎水性の高いタンパクであることが示唆される。これは、ＶＫＯＲＣ１複合体の活性がＥＲ膜に局在するという既知の事実、および、ＶＫＯＲＣ１構築物によってトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の免疫蛍光染色データ（図５）とも一致する。
【００２２】
実は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子は、ワルファリン耐性患者の突然変異体スクリーニングにおいて特定された（詳細については、実施例１および２参照）。本発明によれば、意外なことに、全てのビタミンＫ依存性凝固因子（ＶＫＣＦＤ２）の複合欠損を有する患者、ワルファリン耐性（ＷＲ）を有する患者それぞれにおいて突然変異を示す遺伝子ＶＫＯＲＣ１が特定された。これは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドが、ワルファリンに対する結合部位を含むこと、従ってクマリンとその誘導体の標的であることを示す。これらの突然変異が二つの表現型の原因であるという証拠は下記の通りである。
（ｉ）Ｒ９８Ｗ突然変異は、ＶＫＣＦＤ２を有する、互いに無関係の二つ家族において病気と共に分離する；
（ｉｉ）９８位置におけるこのアルギニンは、それぞれ、ヒト遺伝子、およびマウスとラットの相同遺伝子において保存されている；
（ｉｉｉ）三人のワルファリン耐性の兄弟が、Ｒ５８Ｇ置換を共通に持っている；
（ｉｖ）このアミノ酸、および、さらに二人の、互いに無関係なＷＲ患者（Ｖ２９ＬおよびＬ１２８Ｒ）において突然変異していることが判明した他のアミノ酸残基が、３種の細菌遺伝子を除き、分析した全ての種において保存されている（図３参照）；および、
（ｖ）５種の予想突然変異のどれも、１９２個のコントロールＤＮＡサンプルの中に見られなかった。
【００２３】
さらに、ゲノムおよびタンパクデータベースについてホモロジー探索をしたが、ＶＫＯＲＣ１は、指定の機能のいずれのタンパクまたはペプチドドメインに対しても全く類似性を示さなかった。しかしながら、相同遺伝子が、脊椎動物（ラット、マウス、アフリカツメガエル、フグ）、昆虫（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）、および細菌に認められた（図３）。驚くべきことに、３種の哺乳動物およびフグは、それぞれ、同族遺伝子と中等度の近似性を有する、第２のＶＫＯＲＣ１様遺伝子を持っている。これらの遺伝子の中のいくつかのアミノ酸位置は、進化を通じて保存されている。これは、γ−カルボキシル化が、従って、その過程において補因子としてビタミンＫが使用されることが、進化的に古い、翻訳後タンパク修飾であるという確実とされる事実に一致する［Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２］。
【００２４】
バリン２９、アルギニン５８、ロイシン１２８、これらは全ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドにおいて広く分散しているけれども、これらの置換は、ワルファリンによるＶＫＯＲＣ１活性の抑制を明らかに無効にする。これらのアミノ酸は、ＶＫＯＲＣ１タンパク１の三次元構造と機能的に協働することが予想される。以上まとめると、二つの異なる表現型を有する患者における突然変異データから、ＶＫＯＲＣ１が、ビタミンＫおよびワルファリンの結合の両方に対して標的タンパクであることが提供される。
【００２５】
本発明の一つの局面では、下記からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、または、好ましくは該配列から成るビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）が提供される。
（ａ）配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７による配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に定義され、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列。
【００２６】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、哺乳類において、クマリンおよびその誘導体に対する標的であることが好ましい。
【００２７】
本発明における意味として、「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語は、先行パラグラフで定義したＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列全長を指す。「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語はまた、単離されたＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、および、組み換え法、例えば、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現するサンプルや、宿主細胞から単離および精製することによって、ライブラリーをスクリーニングすることによって、タンパク合成することによって調製されるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを含む。上記方法は全て一般に当業者には既知である。ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド全体、またはその一部は、例えば、従来の合成法、例えば、メリーフィールド法を用いて合成可能であることが好ましい。「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語はまた、そのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７の内の一つによるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドと、約８０％、好ましくは約９０％、特に約９５％、特別に約９８％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。さらに、「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語はまた、そのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、ヒト以外の生物、好ましくは、非ヒト哺乳類、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、あるいは、サルおよびブタ、およびその他の脊椎動物および無脊椎動物に由来する相同ポリペプチド、例えば、配列番号１２、１７、２１、２５、２７によるアミノ酸配列を含むことが好ましい。「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語は、そのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、異なる個体、１個の生物の異なる器官、または、異なる発達相における、その遺伝子の別の対立遺伝子によってコードされるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを含むことがさらに好ましい。さらに、「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して全く作用を及ぼさない、またはごく僅かな作用を及ぼす天然の突然変異、または合成突然変異をも含むものとする。「ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド」という用語に含まれるその他の好ましいポリペプチドとしては、そのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、ＶＫＯＲＣ１転写物の識別的スプライシングによって生じさせることができるＶＫＯＣＲ１ポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
「ポリペプチド配列のフラグメント」という用語は、フラグメントがＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列全長の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％を含む、または、好ましくは上記パーセントから成る、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの部分配列を含むものとする。特に、フラグメントは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの単一連続配列から成ることが好ましいが、フラグメントは、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも約５個の異なる配列部分を含んでもよく、その配列部分は、その間に、異種配列が分散していてもいなくともよく、あるいは、余分なポリペプチド配列を全く含まなくともよい。
【００２９】
「配列相同性」という用語は、当然のことながら、二つの配列の同一性の程度（同一性％）を指し、ポリペプチドの場合であれば、例えば、ＢｌａｓｔＰ２．０．１を用いて、核酸の場合であれば、例えば、ＢＬＡＳＴＩＮ２．０１４を用いて決定が可能である。ただし、フィルターはオフに設定しＢＬＯＳＵＭは６２とする（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００３０】
本発明の意味における「ＶＫＯＲＣ１活性」とは、配列番号１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの生物学的活性を意味するものとする。さらに好ましくは、「ＶＫＯＲＣ１活性」は、ビタミンＫ２，３−エポキシドを、ビタミンＫ−キノンに酵素的に変換する（または酵素的変換を支持する）、および／または、ビタミンＫキノンをビタミンＫヒドロキノンに変換するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性と規定される。ＶＫＯＲＣ１活性は、実施例７および図１０に詳細に記述される実験に基づくアッセイを用いて決定してもよい。このアッセイを用いて、所定のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、またはそのようなＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸分子を発現する細胞において、ビタミンＫキノン（産物／基質＋産物）に変換されたビタミンＫエポキシドのパーセント測定値を求めた場合、ＨＥＫ２９３細胞のＶＫＯＲ基礎活性を、約１％（ＨＥＫ２９３細胞で、トランスフェクトされていなものは１．４９％、擬似トランスフェクトされたものは０．９６％）から約１５％以上、好ましくは約１８％以上、好ましくは約２０％以上、もっとも好ましくは２５％以上に上昇する値が、本発明の意味におけるＶＫＯＲＣ１活性と考えられる。
【００３１】
本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、下記にさらに精しく述べる方法を用いて生産してもよい。取り分け、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、前述の問題点を回避するクマリン誘導体を同定するのに有用である。特に、このＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、ＶＫＯＲＣ１活性を効果的に抑制するクマリン誘導体を同定するのに有用であり、独立アッセイにおいて、（１）当技術分野で既知のクマリンよりも速やかに代謝されるクマリン誘導体を同定するために、その代謝半減期について試験する際に有用であり、（２）皮膚壊死を全く起こさない、または当技術分野で既知のクマリンよりも起こす程度が低いクマリン誘導体を同定するために、皮膚壊死惹起能力を試験する際にも、（３）当技術分野で既知のクマリンに比べて副作用の少ないクマリン誘導体を同定するために、クマリン誘導体−薬剤相互作用を試験する際にも有用である。さらに、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、クマリンおよびその誘導体と相互作用を有するＶＫＯＲＣ１配列を特定したり、コントロールレベルに比べてＶＫＯＲＣ１活性が低い、または高い患者を治療するのに有用である。
【００３２】
別の局面において、本発明は、下記からなる群から選択される核酸配列を含む、好ましくは実質的に該配列から成るＶＫＯＲＣ１核酸に関する。
（ａ）本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｂ）配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８による配列からなる群から選択される核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸配列に対して厳密条件の下にハイブリダイズし、かつ、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、好ましくは厳密条件下にハイブリダイズし、かつ、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に規定される核酸配列のフラグメントであって、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント。
好ましくは、ＶＫＯＲＣ１核酸は哺乳動物においてクマリンおよびその誘導体の標的である。
【００３３】
「ＶＫＯＲＣ１核酸」という用語は、１本鎖であってもよいが、好ましくは２本鎖分子であってよいＲＮＡまたはＤＮＡに関する。ＶＫＯＲＣ１核酸の配列はさらに、少なくとも１個のイントロンおよび／または１個のポリＡ配列を含んでもよい。「ＶＫＯＲＣ１核酸」という用語はまた、前段階、例えば、そのプロポリペプチド、またはプレプロポリペプチドを含んでもよい。さらに、コードされたポリペプチドの活性が大きく変更されない限り、核酸の５′末端および／または３′末端に、非翻訳配列が存在することが可能であると理解される。しかしながら、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域が特に好ましい。真核細胞では、この領域は、コザック配列（Ｋｏｚａｋ，１９８７）に配される最初の開始コドン（ＡＴＧ）で始まり、そのＡＴＧと同じ読み枠に配される次の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）まで延びる。原核生物では、この領域は、シャインダルガルノ配列の後の最初のＡＵＧ（またはＧＵＧ）で始まり、そのＡＴＧと同じ読み枠に配される次の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）で終わる。さらに、「ＶＫＯＲＣ１核酸」という用語はまた、その核酸によってコードされるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８による配列に対し、好ましくは配列番号２による配列に対し、少なくとも約７０％、特に少なくとも約８０％、特別に少なくとも約９０％の配列相同性を示す配列を含んでもよい。本発明の好ましい実施態様では、核酸は、先行パラグラフに規定されるＶＫＯＲＣ１核酸に対して相補的な配列、および／または、そのアンチセンス配列を有する核酸を含む。ＶＫＯＲＣ１核酸はまた、その核酸によってコードされるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、上に定義したＶＫＯＲＣ１核酸の非機能的突然変異種、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、例えば、配列番号８および９による核酸配列を含んでもよい。
【００３４】
「厳密ハイブリダイゼーション条件」という用語は、例えば、ハイブリダイゼーションが起こるのが、６０℃の２．５ｘＳＳＣバッファー、その後比較的低いバッファー濃度において３７℃で数回の洗浄工程で安定が保たれる条件を意味するものと理解しなければならない。
【００３５】
「ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列のフラグメント」という用語は、そのフラグメントによってコードされるポリペプチドがＶＫＯＲＣ１活性を有する限りにおいて、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする配列全長、好ましくは配列番号１によるポリペプチドをコードする配列全長に対し、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％を含む、好ましくは上記パーセントから成る核酸配列フラグメントを含むと理解される。特に、フラグメントは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする単一連続配列から成ることが好ましいが、フラグメントは、全ての配列部分が同じ読み枠に配置されている限りにおいて、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも５個の異なる配列部分を含んでもよく、その配列部分は、その間に、異種配列が分散していてもいなくともよく、あるいは、余分な核酸配列を全く含まなくともよい。これらのフラグメントの定義において、フラグメントがＶＫＯＲＣ１活性を示すことは必須である。
【００３６】
ＶＫＯＲＣ１核酸は、熟練した当業者に一般的に既知の方法によって生産することが可能である。核酸は合成的に調製してもよい。すなわち、ＶＫＯＲＣ１核酸は、例えば、化学的に、例えば、上に定義した核酸配列の助けを借りて、および／または、同様に配列番号１として上に定義したポリペプチド配列の助けを借り、遺伝子コードを参照することによって（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，１９９０を参照）フォスフォトリエステル法に従って化学的に合成することが可能である。ＶＫＯＲＣ１核酸は、当業者には一般的に既知の組み換え遺伝子技法によって生産されるのが好ましい。
【００３７】
取り分け、ＶＫＯＲＣ１核酸は、（１）前述の問題点を回避するクマリン誘導体を同定するのに有用であり、（２）ＰＣＲプライマー、ＤＮＡおよびＲＮＡプローブ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの生産に有用であり、（３）コントロール値に比べてＶＫＯＲＣ１活性が低下、または上昇している患者を治療するのに有用であり、かつ、（４）げっ歯類の駆除に使用が可能なクマリン誘導体を同定するのに有用である。なお、これらは全て下記に詳述される。
【００３８】
本発明はさらに、別の局面において、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７によるポリペプチドを生産する法であって、下記の工程、すなわち、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１核酸、好ましくは配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８による核酸、または、ＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞においてＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）宿主細胞からＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを単離する工程、
を含む方法を提供する。
【００３９】
宿主細胞は、下記に規定されるものの内のいずれの宿主細胞であってもよい。その宿主細胞を選択し培養する方法、および、宿主細胞にポリペプチドを発現させる方法は当業者には既知である。同じことは、宿主細胞から発現ポリペプチドを単離する方法についても当てはまる。このために、本発明による抗体が、免疫アフィニティー沈殿のために使用されてもよい。別法として、前記ベクターは、熟練した研究者には既知の標準的プロトコールによる標識特異的抗体によって免疫アフィニティー沈殿される（ポリ）ペプチド標識を含んでもよい（下記も参照）。
【００４０】
別の局面において、本発明は、下記を含む、好ましくは事実上下記から成る融合タンパクに関連する。すなわち、
（ａ）上に規定されるＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは配列番号１、１２、１７、２１、２５、２７によるポリペプチド、または、ＶＫＯＲＣ１核酸によって、好ましくは、配列番号２、１３、１８、２２、２６、２８による核酸によってコードされるポリペプチド、および、
（ｂ）異種部分、である。
【００４１】
これは、前述のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを含む融合タンパクであって、該融合タンパク自体が既に活性を有するか、その異種部分が除去されて始めて活性を有するようになる融合タンパクを含む。このために、異種部分はさらに、プロテアーゼによって分断することが可能なペプチドを含んでもよい。異種部分は、タンパク様化合物、ペプチド、または異なる化合物であってもよい。これらの融合タンパクは、特に、異種部分を構成する、約１−３００、好ましくは約１−２００、特に好ましくは約１−１５０、特に約１−１００、特別に１−５０個の外来アミノ酸から成る内容物を有する融合タンパクを含む。異種部分は、ＶＫＯＲＣ１に対して、Ｎ−末端に、Ｃ−末端に、および／または、内部的に配置されてもよい。このようなペプチド配列の例としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉガラクトシダーゼ由来の原核生物のペプチド配列がある。
【００４２】
融合タンパクにおいて好ましいその他のペプチド配列の例としては、該融合タンパクの検出を促進するペプチドがある。そのようなペプチドの例としては、緑色蛍光タンパク、またはその機能的変種がある。さらに、例えば、前述のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを精製するために、少なくともさらにもう一つの「ポリペプチド標識」を付加することも可能である。例えば、好適なタンパク標識によって、精製される融合タンパクを、高い親和性の下に基質に吸収することが可能になる。この次には、例えば、融合タンパクを目立って溶出せずに適当なバッファーによる厳密洗浄を行い、次いで融合タンパクの特異的溶出を行う。当業者には既知のタンパク標識の例としては、（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘムアグルチニンタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、アフィニティーキチン結合タグおよびマルトース結合タンパク（ＭＢＰ）タグを有するインテインがある。これらのタンパク標識は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して、Ｎ−末端に、Ｃ−末端に、および／または、内部的に配置されてもよい。融合タンパクは、例えば、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）の生産、およびその後の単離のために有用である。さらに、融合タンパクは、細胞または生物体における発現産物の局在を検出するのに用いてもよい。
【００４３】
別の局面において、本発明は、上に定義したＶＫＯＲＣ１核酸、好ましくは配列番号２によるＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターに関連する。ベクターは発現ベクターであることが好ましい。ＶＫＯＲＣ１核酸を本発明に従って使用可能とするために、それら核酸を、トランスフェクション、形質転換、または感染を通じて真核細胞または原核細胞に導入し、それによってそのポリペプチドを発現可能としてもよい。このＶＫＯＲＣ１核酸は、プラスミドとして存在してもよいし、または、ウィルス、または非ウィルスベクターの一部として存在してもよい。これに関連して特に好適なウィルスベクターは、バキュロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、およびヘルペスウィルスである。特に好適な非ウィルス性ベクターとしては、例えば、ウィロソーム、リポソーム、陽イオン脂質、およびポリリシン結合ＤＮＡがある。ベクターは、原核生物または真核生物発現ベクターであってもよい。原核生物発現ベクターの例としては、いずれもＥ．ｃｏｌｉにおける発現のために用いられるｐＧＥＭベクター、またはｐＵＣ誘導体がある。真核生物発現ベクターの例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現に用いられるｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇ
ｅｔ  ａｌ．，１９９４）というベクターがあり、欧州特許Ｂ１０１２７８３９号または欧州特許Ｂ１０５４９７２１号に開示される、昆虫細胞での発現に用いられるバキュロウィルスベクターがあり、哺乳類細胞での発現に用いられるＲｃ／ＣＭＶとＲｃ／ＲＳＶベクター、またはＳＶ４０ベクターがあるが、これらのベクターは全て一般に入手が可能である。一般に、発現ベクターは、それぞれの細胞に相応しいプロモーター、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現用のｔｒｐプロモーター（例えば、欧州特許Ｂ１−０１５４１３３号参照）、酵母における発現用のＭｅｔ２５、ＧＡＬ１、またはＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｍｕｍｂｅｒｇ，上記参照）、および、昆虫細胞における発現用のバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター（例えば、欧州特許Ｂ１０１２７８３９号参照）も含む。
【００４４】
真核細胞における構成的、調整的、組織特異的、細胞タイプ特異的、細胞周期特異的、または代謝特異的発現を可能とするプロモーターが、例えば、哺乳類細胞における発現のためには好適である。本発明による調整可能な要素としては、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサー、および／または、リプレッサー配列がある。真核生物における構成的発現を可能とする、好ましい調整的要素の例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターまたはウィルスプロモーターである、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーター、例えば、ＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウィルス；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）由来のプロモーターやその他のウィルスプロモーター、および、例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、またはＨＩＶ由来のアクチベーター配列がある。真核生物における誘発的発現を可能とする調整的要素の例としては、適当なリプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレーターがある（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＶＫＯＲＣ１核酸の発現は、組織特異的プロモーターの調節下に行われることが好ましい。発現ベクターは、本発明に従って使用される、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ、またはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを調製するために用いてもよい。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施態様では、ベクターは、ノックアウト遺伝子構築物である。このような構築物の構築、およびノックアウト動物の構築法は、当業者において、例えば、米国特許第５，６２５，１２２号、５，６９８，７６５号、５，５８３，２７８号、および５，７５０，８２５号の記載から既知である。このようなベクターは、例えば、ノックアウト細胞および動物を生成するのに有用であり、次に、このノックアウト細胞および動物を用いて、ＶＫＯＲＣ１活性障害に関連する障害および疾患を同定することが可能である。
【００４６】
本発明の意味における「ＶＫＯＲＣ１活性障害」とは、ＶＫＯＲＣ１タンパクの活性および／または発現が、健康な被験者において決定された活性（上に定義）および／または発現のコントロールレベルよりも低レベルであることに関わる。それぞれの活性レベルは、実施例７に記載されるアッセイに基づいて決定されてもよい。
【００４７】
別の局面では、本発明は、前述のベクターの内の一つ、好ましくは、発現ベクターまたはノックアウト遺伝子構築物を含む宿主細胞、好ましくは非ヒト胚性幹細胞に関する。この宿主細胞は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよび／またはＶＫＯＲＣ１核酸の発現に好適であればいずれの細胞であってもよいが、好ましくはＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞である。細胞は、原核細胞でも真核細胞でも、異種細胞でも同種細胞でもよい。原核細胞の例としてはＥ．ｃｏｌｉがあり、真核細胞の例としては一次肝細胞、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または昆虫細胞が挙げられる。より好ましくは、宿主細胞は細胞系統であり、例えば、ＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、または、ＨｅｐＧ２細胞のような肝細胞系統である。さらに、宿主細胞は、非ヒト胚性幹細胞であるのが好ましい。宿主細胞を選択し培養する方法、および、宿主細胞にポリペプチドを発現させる方法は、当業者には広く知られる。細胞および／または幹細胞を形質転換する過程も当業者にはよく知られており、例えば、電気穿孔またはマイクロインジェクションが挙げられる。本発明の宿主細胞を、例えば、クマリン誘導体を同定する方法、本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよびＶＫＯＲＣ１核酸、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを生産する方法、および、新規薬剤、例えば、ＶＫＯＲＣ１活性および／または発現に作用するクマリン誘導体をスクリーニングする方法に採用することも可能である。
【００４８】
別の局面では、本発明は、上に定義した通りの、本発明による宿主細胞、好ましくは非ヒト胚性幹細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の調製に関する。一般にトランスジェニック動物は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよび／またはＶＫＯＲＣ１核酸の組織特異的発現増加を示し、凝固障害およびワルファリン耐性の分析および、そのような障害に対する治療戦略の開発および評価のために使用することが可能である。トランスジェニック動物は、更にＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの生産に用いることができる。この動物によって生産されるポリペプチドは、例えば、該動物の体液において濃縮され得る。
【００４９】
本発明の別の好ましい局面では、下記に詳しく規定される、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用する、少なくとも一つの配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについて遺伝子導入された、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。この動物は、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについてトランスジェニックであることが好ましく、かつ、配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ、およびＹ１３９Ｃからなる群から選択されることが好ましい。これらのトランスジェニック動物は、例えば、（１）クマリン誘導体をワルファリン耐性について試験するために、（２）当技術分野で既知のクマリンによる抗凝固治療に対して耐性を有する、またはより感度の低い生物、例えば、ワルファリン耐性患者において効果的な抗凝固剤となる新規クマリン誘導体を同定するために、かつ、（３）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよび／またはＶＫＯＲＣ１核酸を発現する細胞源として、有用である。さらに、これらの動物は、新規クマリン誘導体を同定するために使用することも可能である。
【００５０】
トランスジェニック動物、特に、トランスジェニックマウスの調製法も同様に、独国特許第１９６２５０４９号、および米国特許第４，７３６，８６６号、５，６２５，１２２号、５，６９８，７６５号、５，５８３，２７８号、および５，７５０，８２５号の記述から当業者には既知であるが、本発明による発現ベクターの、胚または精母細胞への直接注入、または、発現ベクターの、有精卵の前核への注入、または、発現ベクターによる胚性幹細胞のトランスフェクション、または、適当な受容細胞への核輸送によって（Ｐｏｌｉｔｅｓ  ＆  Ｐｉｎｋｅｒｔ，１９９４；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，ｉｎ  Ｐｉｎｋｅｒｔ，１９９４，上記；Ｗｏｏｄ  ｉｎ  Ｐｉｎｋｅｒｔ，１９９４、上記；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  ｉｎ  Ｐｉｎｋｅｒｔ，１９９４、上記）生産することが可能なトランスジェニック動物を含む。
【００５１】
本発明の意味において、「ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症」という用語は、ワルファリン耐性に関連する障害または疾患を含む。すなわち、患者は、クマリンまたはその誘導体による治療に対し感受性が低下しているか、感受性を全く持たず、かつ、そのワルファリン耐性は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列異常に由来することが好ましい。さらに、用語はまた、健康な患者の状態と有意に異なる、ＶＫＯＲＣ１の活性および／または発現レベルと関連する障害または疾患を含むことが好ましい。例えば、プロトロンビン時間を、例えば、国際標準比（ＩＮＲ）プロトコールに従って測定することによって決定される、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの発現および／またはその活性は、有意に低下している、または全く見られないことが好ましい。このようなＶＫＯＲＣ１関連欠乏症は、下記に詳述するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドまたはＶＫＯＲＣ１核酸の配列異常が原因になってもよい。さらに、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドまたはＶＫＯＲＣ１核酸の発現および／または活性レベルが低下する、または全く見られない場合、ビタミンＫ依存性タンパクのγ−カルボキシル化も同様に損なわれていてもよい。上記から、この文脈における「ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症」という用語はさらに、家族性の複数因子欠乏症、血友病のような血液凝固低下と関連する障害または疾患、血管石灰化低下と関連する障害、ビタミンＫ依存性タンパクのγ−カルボキシル化障害に関連する疾患および／または障害、の内から選択される疾患および／または障害を含む。
【００５２】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの発現および／または活性レベルが、健康な患者の状態に対して相対的に増加していることも考えられる。この、「ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症」という用語にさらに含まれる欠乏症も、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよび／または対応する遺伝子における配列異常によって招かれたものであってもよい。さらに、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドまたはＶＫＯＲＣ１核酸の発現および／または活性レベルが増加した場合、ビタミンＫ依存性タンパクのγ−カルボキシル化も同様に促進されてもよい。従って、この文脈における「ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症」という用語はさらに、血栓を患う患者、および／または、好ましくは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドまたはその遺伝子における配列異常のために血栓を発生する危険度の高い患者を含む、血液凝固上昇と関連する疾患または障害、ビタミンＫ依存性タンパクのγ−カルボキシル化改善と関連する疾患および／または障害、の内から選択される欠乏症を含んでもよい。
【００５３】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよび／または対応遺伝における配列異常が、そのような配列異常を抱える患者においてクマリンおよびその誘導体による治療に対する感受性を高め得ることも考えられる。その結果、クマリン治療を受けた患者が、極めて低い血液凝固値を示してもよい。クマリンによる治療に対する高い感受性と関連する障害も、「ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症」という用語によってカバーされることが意図される。終止突然変異を有するＶＫＯＲＣ１遺伝子を抱える患者は、クマリン感受性増大と関連する欠乏症を患うことになる。
【００５４】
別の局面では、本発明は、本発明によるＶＫＯＲＣ１核酸、好ましくは、配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８によるＶＫＯＲＣ１核酸の内から選択される核酸に対して向けられたＤＮＡまたはＲＮＡプローブに関する。プローブとは、それの向けられたＶＫＯＲＣ１核酸の検出を可能とする核酸分子である。プローブは、標的配列、すなわち、ＶＫＯＲＣ１核酸にハイブリダイズする配列を有する。プローブは、ＶＫＯＲＣ１核酸の特異的検出を可能とするものであることが好ましい。すなわち、少なくとも厳密なハイブリダイゼーション条件下では、プローブは、その特定のＶＫＯＲＣ１核酸以外の分子には結合しないことが好ましい。好適なプローブとしては、例えば、約１０から約４９２のヌクレオチド長、好ましくは約１０から約４００のヌクレオチド長、好ましくは約１０から約２５０のヌクレオチド長、特に、約１０から約１５０ヌクレオチド長、特に、コード配列全長であって、その配列が、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドから導かれるもの、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドから選ばれたポリペプチドから導かれるもの、または、直接ＶＫＯＲＣ１核酸から得られるもの、好ましくは、配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８から選択される核酸から得られるコード配列全長を有するＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントである。プローブはさらに、直接的または間接的検出のために好適な標識、例えば、ビオチン、蛍光標識、例えば、フルオレセン、または、放射性標識、例えば、［Ｈ］３、または、熟練した研究者には既知のその他の標識を含んでもよい。検出は、熟練した研究者には一般的に既知の方法、例えば、ノーザンブロッティングおよびｃＤＮＡライブラリーブロッティング法を含む方法を用いて実行してよい。本発明によるプローブの構築も、熟練した研究者には既知である（前述の核酸の構築を参照）。このようなプローブは、例えば、診断目的のために使用が可能であり、配列異常の検出に好適なプローブ、例えば、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１４、および９４による配列の内から選択される配列を含む、またはそのような配列から成ることが好ましい。
【００５５】
別の局面では、本発明は、ＰＣＲプライマー、好ましくはＶＫＯＲＣ１核酸に対する、好ましくは配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８によるＶＫＯＲＣ１核酸に対する、少なくとも２本から成る１組のＰＣＲプライマーに関する。好適なプライマーは、例えば、約１０から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約１５から約５０ヌクレオチド長、特に、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、好ましくは約３０ヌクレオチド長を有するＤＮＡフラグメントである。このようなプライマーの設計および合成は、一般に当業者には既知である。プライマーはさらに制限部位、例えば、増幅配列をベクターに組み込むのに好適な制限部位、または、例えば、前節で記述したような標識を有する、他のアダプターまたはオーバーハング配列を含んでもよい。例えば、本発明によれば、好ましくは実施例９に記載するアッセイに基づいてＶＫＯＲＣ１配列異常を検出するのに好適な、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断薬を調製することが可能である（ＡＲＭＳＰＣＲ）。
【００５６】
ＶＫＯＲＣ１の発現量を決定しなければならない場合、診断または治療目的のためには、ＶＫＯＲＣ１核酸に対して特異的なＰＣＲプライマーが用いられる。このために、ＲＴ−ＰＣＲ法、好ましくは定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を実行してもよい。この方法では、サンプルから全体またはｍＲＮＡを分離して、このＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとし、その後、本発明による特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応を受けさせる。この技術は、熟練した研究者にはよく知られている。これによって、さらに、前述のＶＫＯＲＣ１核酸を、例えば、適当な遺伝子またはｃＤＮＡライブラリーから、例えば、肝臓障害特異的または肝臓特異的遺伝子バンクから、適当なプライマーの助けを借りて単離することによって入手することが可能になる。ＶＫＯＲＣ１核酸を単離するために好ましいＰＣＲプライマーの組および条件は、実施例５に記載される。配列番号２に対して向けられた、本発明による好ましいＰＣＲプライマーの例としては、配列番号５３−７０によるプライマーがあり、これらのＰＣＲプライマーを用いるための好ましい条件は、図８に示される。
【００５７】
「サンプル」という用語は、胎児または成人の一つの組織または細胞、好ましくは複数の組織または細胞であって、好ましくは、心臓、腎臓と肺、膵臓、脳、胎盤および骨格筋および血液から、好ましくは肝臓から分離されたかあるいはそれらに由来する組織または細胞を含む生体材料を指すことが意図される。サンプルは、一人の患者、または別の被験者から、侵襲的または非侵襲的方法を含む方法によって分離することが可能である。侵襲的方法は一般に熟練した技術者には既知であり、例えば、穿刺、切開した生体からサンプルを外科的に切除することによるか、または、内視鏡装置によるサンプルの単離を含む。侵襲極小の方法および非侵襲的方法も当業者には既知であり、例えば、体液、例えば、血液を、好ましくは静脈穿刺によって、または尿または大便を採取することを含む。「サンプル」という用語はまた、ゲノムライブラリーまたは発現ライブラリーであって、好ましくは、患者から単離したサンプルに基づいて構築されたライブラーを含んでもよい。その場合、ｃＤＮＡの分離のために、一般に熟練研究者には既知の方法を用いてもよい。
【００５８】
別の局面で、本発明は、ＶＫＯＲＣ１核酸に対して向けられた、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７から導かれる配列に、または、配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８による核酸に対する低分子干渉的ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）および／または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。これによって、ＶＫＯＲＣ１核酸の安定度を下げる、および／または、細胞培養における、またはインビボにおけるＶＫＯＲＣ１核酸の翻訳を抑制することが可能となる。二本鎖ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡを通じて遺伝子発現の、配列特異的、転写後抑制を仲介する。ｓｉＲＮＡは、極めて特異的な構造を有する。すなわち、３′末端に２ヌクレオチド突出部（オーバーハング）を有する、１７から２５の、好ましくは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長の２本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、通常、比較的長い二本鎖ＲＮＡ分子を酵素的に分断することによって得られるが、ｓｉＲＮＡはまた、細胞の外部において化学的に、または酵素的に合成し、次に細胞に輸送する（例えば、トランスフェクションによって）ことも可能である。従って、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いると、細胞中の対応遺伝子の発現を、インビボであれ、インビトロであれ、抑制、または完全阻止することが可能である（ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ｓｈＲＮＡは、（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１核酸のｍＲＮＡ配列に対して相補的な、好ましくは、配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８に対して相補的な、少なくとも１８、好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドから成る配列を含む第１ステム部分、（ＩＩ）第１ステム部分に対して十分に相補的で、第１ステム部分にハイブリダイズして二重ステムを形成する、少なくとも１８、好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドから成る配列を含む第２ステム部分、および、（ＩＩＩ）二つのステム部分を接続するループ部分、から成る。ループ部分は、少なくとも４、好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも１１個のヌクレオチドを含んでもよい。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡはまたベクターに含められて、宿主細胞が形質転換される際、宿主細胞においてそのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが構成的に発現されるようになっていてもよい（国際公開第０３／００６４７７号参照）。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列設計のための方策、および、これらの分子の構築および生産法は、一般に当業者には既知である（ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。本発明によるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子は、例えば、ＶＫＯＲＣ１遺伝子発現の治療的調節のために、および、クマリン誘導体を同定するための方法において、クマリン活性の陽性コントロールとして含めるのに有用である。本発明によるｓｉＲＮＡ配列の好ましい例が図６および７に掲げられるが、これらは、配列番号２９、２０、３３、３４、３７、３８、４１、４２、４５、４６、４７、５０から選択される。図６はまた、ｓｉＲＮＡ発現の標的とされる細胞においてｓｉＲＮＡが発現されるようにｓｉＲＮＡ分子をベクターに組み込むのに使用するこ���ができる、これらｓｉＲＮＡそれぞれの下流プライマーも示す。
【００５９】
ＶＫＯＲＣ１活性および／または発現を完全停止させる別法として、本発明は、上に定義したＶＫＯＲＣ１核酸、好ましくは、配列番号２、１３、１８、２２、２６、および２８による核酸に対して向けられる、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７から導かれる配列に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する（Ｚｈｅｎｇ  ＆  Ｋｅｍｅｎｙ，１９９５；Ｎｅｌｌｅｎ  ＆  Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，１９９３）。
【００６０】
本発明の別の局面によれば、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに、好ましくは、配列番号１による配列に対するＲＮＡ−アプタマーであって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼすＲＮＡ−アプタマーが提供される。ＲＮＡ−アプタマーは、凝固因子ＩＸａ（Ｒｕｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）において示されたように、アプタマーの標的とするタンパクの効果的な作用剤または拮抗剤となる。本発明によるアプタマーは、クマリンよりも微調整的にＶＫＯＲＣ１活性を下げることによる抗凝固剤として使用することが可能である。アプタマーを試験するには、実施例７に記載するように、それらをＶＫＯＲＣ１反応系に加え、ＨＰＬＣによって分析することが可能である。
【００６１】
本発明の別の局面では、上に定義したＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し結合する抗体、または、その抗体のフラグメントが提供される。この抗体または抗体フラグメントは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して特異的なポリクロナールまたはモノクロナール抗体であることが好ましい。この抗体または抗体フラグメントは、一般的に当業者には既知の方法に従って生産される。すなわち、哺乳動物、例えば、ウサギを、本発明によるＶＫＯＲＣ１核酸、またはＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、または、少なくとも約６アミノ酸長、好ましくは少なくとも８アミノ酸長、特に少なくとも１２アミノ酸長を有するその部分を、もし適切ならば、例えば、フロインドのアジュバント、および／または、水酸化アルミニウムゲルの存在下に免疫化することによって生産される（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，１９９８参照）。次に、免疫反応の結果その動物において形成されるポリクロナール抗体は、一般的に既知の方法に従って血液から簡単に単離することが可能であり、例えば、カラムクロマトグラフィーによって精製することが可能である。モノクロナール抗体は、例えば、既知のＷｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）の方法に従って生産することが可能である。本発明による抗体は、例えば、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症の診断に使用することが可能である。さらに、この抗体は、クマリン−ＶＫＯＲＣ１相互作用を明らかにするのに有用である可能性がある。最後に、抗体を用いて、患者から分離された組織または細胞サンプルから、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを単離し、および／または精製してもよい。
【００６２】
本発明によれば、「抗体」または「抗体フラグメント」という用語は、遺伝子工学的に調製され、要すれば随意に修飾される抗体または、その、抗原結合性部分、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、複数機能抗体、二重または複数特異的抗体、１本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２フラグメントを意味するものとしても理解される（例えば、欧州特許Ｂ１−０３６８６８４号、米国特許第４，８１６，５６７号、４，８１６，３９７号、国際特許公開第８８／０１６４９号、９３／０６２１３号、９８／２４８８４号を参照）。
【００６３】
別の局面で、本発明は、上に定義したＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７から選択される配列を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、下記の工程を含む方法を提供する。すなわち、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１核酸、または、ＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞においてＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＶ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（候補活性値）を決定する工程；
（Ｖ）候補活性値をコントロール活性値と比較する工程；および、
（ＶＩ）候補活性値がコントロール活性値と有意に異なる場合、その候補クマリン誘導体を、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程。
【００６４】
ここで決定されたＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドの、ビタミンＫキノンへの、ジチオスレイトール依存性変換であり、ここにおいて、有意に異なる活性値とは、上に、および実施例７と図１０にさらに詳細に記述するように、コントロール活性値よりも有意に高い候補活性値である。もしも事実上同じ濃度の候補クマリン誘導体が、その濃度のワルファリンが実現するよりも低いパーセントのビタミンＫエポキシドしかビタミンＫキノンに変換しないのであれば（産物／基質＋産物）、これは、その候補クマリン誘導体が、ワルファリンよりも強い抑制作用を有すること、逆ならばまたその逆の結論となることを示す。
【００６５】
本発明によるクマリン誘導体を同定する方法において、好ましくは、コントロール活性値は、下記の工程を含む方法によって決定される。すなわち、
（Ａ）工程（Ｉ）に従って宿主細胞を提供する工程；
（Ｂ）宿主細胞においてＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；および、
（Ｃ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール活性値）を決定する工程。
【００６６】
本発明に従ってクマリン誘導体を同定する方法において、少なくとも一つの別の化合物が宿主細胞に導入されるとさらに好ましい。この化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、および、γ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸からなる群から選択される。核酸を宿主細胞に導入する方法は上に詳細に記述した。核酸は、構成的に活性なプロモーター、または、選ばれた宿主において特異的に活性化され得るプロモーターの調節下に発現するのが好ましい。
【００６７】
クマリン誘導体を同定するための方法は、当技術分野で既知のクマリンおよびその誘導体の限界点の少なくとも一つを回避する、新規のクマリン誘導体を開発するのに有用である。もしも血液凝固速度論の分析が、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド活性の決定の中に別アッセイとして組み込まれたならば、本発明によるこの方法は、当技術分野で既知のクマリンおよびその誘導体よりも速やかに血液凝固を仲介し、および／または、より急速に代謝されるクマリン誘導体を同定するのに有用と考えられ、従って、クマリンおよびその誘導体の蓄積が阻止されるか、または緩和され、その結果、過剰投与の危険性が実質的に低下、または根絶すら可能になると考えられる。さらに、この特定法を他のアッセイと組み合わせて、ＶＫＯＲＣ１活性に対して、さらに進んで血液凝固に対してより強い（弱い）作用を有するクマリン誘導体を特定可能とするようにしてもよい。いくつかの独立アッセイにおいてこのクマリン誘導体は、（１）より速やかに代謝されるので、クマリンの蓄積は回避または緩和され、その結果過剰投与の危険は実質的に低下または除去され、（２）患者に対して皮膚壊死を起こすことがなく、起こしてもその程度は低く、妊娠時投与されても胎児障害を起こすことがなく、起こしてもその程度は低く、および／または、（３）より速やかに代謝され、より安定であり、および／または、ペントバルビタールまたはアミオダロンのような他の薬剤による影響が少ないことが判明する。クマリン誘導体のこのような特質についてスクリーニングするのに好適で、本発明によるクマリン誘導体特定法と組み合わせてスクリーニングに用いるアッセイは、一般に当業者には既知である。
【００６８】
「クマリン」という用語は、３−（アセトニルベンジル）−４−ヒドロキシクマリン、すなわち、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標）またはワルファリンナトリウムを意味するものと理解される。
【００６９】
「クマリンの誘導体」という用語は、有機または無機の化合物、ペプチド、ポリペプチド、またはその複合体であって、それらが、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性および／または発現に対して作用を及ぼす限り、好ましくは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性を抑制する作用を有する限り、さらに好ましくは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド特異的作用を有する限り、前記化合物、ペプチド、ポリペプチド、または複合体を含むと理解される。すなわち、クマリン誘導体は、凝固経路に与る他の分子とは直接相互作用を持たない。このような化合物の例としては、化合物のライブラリー、好ましくは、その薬理学的活性について分析済みの化合物のライブラリーから得られた有機分子がある。その相互作用のために、クマリンの誘導体は、インビボおよび／またはインビトロにおいてＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に影響を及ぼし、互いに共有的に、または非共有的な相互作用を有するに至ることがある。クマリン誘導体がキラル化合物である場合には、その「クマリンの誘導体」も、国際特許公開第００／４３００３号に開示されるものと同様、その化合物のＲ−およびＬ−エナンチオマー形それぞれを包含することが理解される。特に、「クマリンの誘導体」は、４−ヒドロキシクマリンから得られた化合物、特に、ＣＯＵＭＡＤＩＮから得られた化合物を指す。さらに好ましくは、「クマリンの誘導体」はまた、活性型ビタミンＫの再生を抑制する全ての凝固因子を含む。
【００７０】
「候補クマリン誘導体」という用語は、有機または無機の化合物、ペプチド、ポリペプチド、または複合体を含むと理解される。このような化合物の例としては、化合物のライブラリー、好ましくは、その薬理学的活性について分析済みの化合物のライブラリーから得られた有機分子がある。用語は、４−ヒドロキシクマリンと構造的に関連するかまたはそれから得られた化合物、特に、ＣＯＵＭＡＤＩＮと構造的に関連するかまたはそれから得られた化合物を指すことが好ましい。候補クマリン誘導体がキラル化合物である場合には、国際特許公開第００／４３００３号に開示されるものと同様、その化合物のＲ−およびＬ−エナンチオマー形それぞれも、「候補クマリン誘導体」という用語に含められる。
【００７１】
別の局面では、本発明は、ＶＫＯＲＣ１活性に対して発揮されるクマリン作用を伝達するＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を決定する方法であって、下記の工程：
（Ｉ）本発明によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７によるポリペプチドであって、少なくとも一つの配列異常、好ましくは、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ，およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程を含み、
ここで、コントロール配列活性値に対する、配列異常活性値の有意な偏差は、そのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列異常は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して発揮されるクマリン作用を伝えるものであることを示すものとする方法を提供する。ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性は上に詳述したやり方で決定してもよい。
【００７２】
さらに好ましくは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を決定する方法において、コントロール配列活性値は、下記の工程を含む方法によって決定される。すなわち、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２１、２５、および２７によるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；および、
（ＩＩＩ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール配列活性値）を決定する工程。
【００７３】
決定されたＶＫＯＲＣ１活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドの、ビタミンＫキノンへの、ジチオスレイトール依存性変換であり、有意に異なる値は、コントロール配列活性値よりも有意に高い配列異常活性値である。詳細は、上に、および実施例７と図１０に記載される。この方法は、クマリンに対して感受性の低いＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを同定するのに有用であると考えられる。様々の配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを導入することによって、この方法により、試験クマリンとＶＫＯＲＣ１との間の相互作用にとって決定的に重要なポリペプチドの部位を同定することが可能になる。この情報は、例えば、新規クマリンを設計するために有用である。
【００７４】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を同定する方法において、少なくとも一つの別の化合物が前記細胞に導入されることは特に好ましい。この化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、および、γ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸からなる群から選択される。
【００７５】
本発明のさらなる局面は、上に定義したＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは配列番号１によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼす、少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに関する。さらに好ましくは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１によるポリペプチドであって、配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ，およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される。別の実施態様では、本発明は、一つの配列異常を有する配列番号１２による、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに関する。配列異常は、Ｙ１３９（４１６Ａ＞Ｇ）であることが好ましい。別の実施態様では、本発明は、一つの配列異常を有する配列番号１２による、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ核酸に、好ましくは、一つの配列異常、好ましくは４１６Ａ＞Ｇ配列異常を有する配列番号１２によるＶＫＯＲＣ１核酸に関する。前記４１６Ａ＞Ｇ異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸配列は、配列番号１４による核酸配列である。
【００７６】
このような、少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、熟練した研究者には一般的に知られる方法、例えば、組み換え法、および例えば、部位指定突然変異誘発法、または、患者、好ましくはＶＫＯＲＣ１関連欠乏症の患者のサンプルから、少なくとも一つの配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを単離する方法を含む方法によって生産することが可能である。サンプルからタンパクを単離する方法は上に詳述した。
【００７７】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼす、少なくとも一つの配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、例えば、これらのＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を生産するのに用いることが可能である。次に、この抗体を用いて、同様にＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断することが可能である。
【００７８】
「配列異常」という用語は、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列、好ましくは、配列番号１によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列の変更をもたらす、少なくとも１個のアミノ酸の付加、挿入、欠失、置換を含むことを意味する。さらに、ＶＫＯＲＣ１核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の変更をもたらす、少なくとも１個のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換も含まれる。さらに、前記核酸配列の読み枠に変化をもたらす、ＶＫＯＲＣ１核酸配列の変化も含まれる。
【００７９】
配列異常は、一文字アミノ酸コードによって示されるが、この場合、元のアミノ酸は、配列番号１によるポリペプチド配列のアミノ酸番号を示す数字の左側に配される。アミノ酸番号の右側の数字は、元のアミノ酸を置換するアミノ酸を示す。例えば、配列異常Ｖ２９Ｌは、配列番号１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの位置２９において、アミノ酸バリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）によって置換されたことを示す。配列番号１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド以外のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドにおいて配列異常が見られる場合には、コードにおける数字は、その特定の他のポリペプチドにおけるアミノ酸番号による配列位置を指す。
【００８０】
別の局面において、本発明は、
（ａ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼす、少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸であって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１によるポリペプチドであり、配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ、およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される核酸；
（ｂ）配列番号３、４、５、６および７、１４、および９４による配列からなる群から選択される核酸配列；および、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズする核酸配列であって、上に定義した少なくとも１個の配列異常を含むポリペプチドをコードする核酸配列
からなる群から選択されるＶＫＯＲＣ１核酸を提供する。
【００８１】
これらの核酸は、例えば、そのような配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドおよび核酸を単離するため、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡプローブを生産するため、抗体を生産するため、トランスジェニック動物およびノックアウト動物を構築するため、およびクマリン誘導体を同定するためのスクリーニングに組み込むために有用である。
【００８２】
さらなる局面では、本発明は、上に定義した少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを提供する。このようなベクターは、上に詳述したベクターから選択されてもよい。このようなベクターを構築する方法も既に上に詳述した。このようなベクターは、例えば、次のパラグラフ、特に診断目的に記述されるプローブの調製に有用である。
【００８３】
本発明の別の局面では、上に定義した少なくとも一つの配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸、好ましくは、配列番号３、４、５、６、および７、１４、および９４による核酸配列に向けられたＤＮＡまたはＲＮＡプローブが提供される。このようなＤＮＡおよびＲＮＡプローブを設計、生産する方法は、上に長々と記述されている。このようなプローブは、例えば、遺伝子ライブラリー、発現ライブラリー、または患者から、例えば、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症診断の意図のもとに、および、配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸を生産するための部位指定突然変異誘発法のために単離されたサンプルにおいてＶＫＯＲＣ１遺伝子の配列異常を検出するのに有用である。ライブラリーをスクリーニングする技術は、一般に熟練した研究者には既知である。
【００８４】
本発明の別の局面では、上に定義した少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸に向けたＰＣＲプライマーが提供される。Ｙ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）配列を検出するのに好ましいＰＣＲプライマーは、配列番号８８から９１によるプライマーである（実施例９参照）。ＰＣＲプライマーを、本発明の目的のために、前述のもの（Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ）のような、その他の配列異常を検出するのに使用が可能となるように設計することは当業者には一般的に既知である。このようなＰＣＲプライマーの設計および作製法、ＰＣＲ増幅を実行する技術は、長々と上に説明した。大きな違いは、配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸配列のみが特異的に増幅され、一方、配列異常を含まない、生得のＶＫＯＲＣ１核酸および他のＶＫＯＲＣ１核酸配列、例えば、配列番号２のＶＫＯＲＣ１核酸は検出されないままであることである。このようなプライマーは、例えば、遺伝子ライブラリー、発現ライブラリー、または患者から、例えば、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症診断との関係において、単離されたサンプルにおいてＶＫＯＲＣ１遺伝子の配列異常を検出するのに有用である。ライブラリーをスクリーニングする技術は、一般に熟練した研究者には既知である。
【００８５】
さらなる局面では、本発明は、上に定義した少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する抗体に関する。前記ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１によるポリペプチドであり、配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ、およびＹ１３９Ｃからなる群から選択されるのが好ましい。含まれる抗体のタイプ、そのような抗体およびそのフラグメントを構築し、生産する方法は、上に細かく記述した。このような抗体は、例えば、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症の診断との関係において、および、ヒト、およびラットのようなげっ歯類においてワルファリン耐性を検出するために、上に定義した少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出し、単離するのに有用である。
【００８６】
別の局面によれば、本発明は、少なくとも１個の配列異常、好ましくは、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ，およびＹ１３９Ｃから選択される少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸からなる群から選択される化合物；前記少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸に対して向けられたＤＮＡまたはＲＮＡプローブ；前記少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸に対して向けられたＰＣＲプライマー；および、前記少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸に対して向けられた抗体を含む診断薬に関する。なお、これらは全て上に定義されている。ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症が、配列異常のせいである、または配列異常と相関する場合、原則としてその診断薬を用いて、患者から得られたプローブの中にその配列異常を検出する。本発明の診断薬に使用が好適な方法は後述する。要すれば随意に、該診断薬はさらに、製薬学的に受容可能な添加剤および／または補助剤を含む。このような診断薬は、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症、特にワルファリン耐性を診断するのに有用である。
【００８７】
一方、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症は、サンプル中のＶＫＯＲＣ１  ｍＲＮＡ、ＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡ、またはＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの発現レベルを検出することによって診断される。この発現レベルは、当業者には一般的に既知の方法によって決定が可能である。ＶＫＯＲＣ１  ｍＲＮＡの存在を検出する方法の例としては、ＲＮＡ（ノーザン）ブロット分析、ヌクレアーゼ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、定量的動的ＲＴ−ＰＣＲを含む）が挙げられる。ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド・マイクロアレイもこの方法に含められる。患者から得られた発現ライブラリーも、熟練研究者には一般的に既知の技術を用いて診断目的のためにスクリーニングされてよい。ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドも、熟練研究者には一般的に既知の方法によって決定が可能である。それらの方法の内いくつかは後述する。要すれば随意に、診断薬はさらに、製薬学的に受容可能な添加剤および／または補助剤を含む。
【００８８】
本発明の意味においては、「添加剤」および「補助剤」は、特に限定されるものではなく、当業者には一般的に既知であり、例えば、生食液、脱ミネラル水、ゼラチンまたはグリセロール系タンパク安定化試薬を含む。別態様として、本発明によるＶＫＯＲＣ１核酸、プローブ、プライマー、またはポリペプチドは、安定化のために凍結乾燥してもよい。
【００８９】
別の局面では、本発明は、患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）患者から得られたＤＮＡサンプルを増幅する工程、または、患者から得られたＲＮＡサンプルを逆転写してＤＮＡとし、そのＤＮＡを増幅する工程；および、
（ＩＩ）工程（Ｉ）の増幅ＤＮＡを分析し、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも一つの配列異常を決定する工程、
を含み、求められた配列異常は、患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患すること、好ましくはワルファリン耐性に罹患することを示し、好ましくはその配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ、およびＹ１３９Ｃから選択される方法を提供する。
【００９０】
患者からサンプルを入手し、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離する方法は、一般に熟練研究者には既知であり、そのいくつかは既に記載した。ＤＮＡを増幅する技術は特に限定はされず、これも前述したＰＣＲ技術を含む。同じ根拠に基づいて、逆転写技術は前述しており、特に限定されることはなく、通常、逆転写酵素とオリゴｄＴプライマーを使用する従来のプロトコールと市販のキットを用いた逆転写を含む。分析もまた、患者から得たサンプルから分離されたゲノムＤＮＡに基づいたものであってもよい。
【００９１】
増幅されると、ＤＮＡは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列において少なくとも１個の配列異常を確定するために分析される。増幅ＤＮＡを分析する方法は特に限定はされない。好ましくは、増幅ＤＮＡは、好ましくは配列異常に対して特異的なＰＣＲプライマーによるＰＣＲ分析、制限消化分析、およびＤＮＡ配列決定分析からなる群から選択される技術によって分析される。好ましい実施態様では、配列異常を担う核酸は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、Ｙ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）からなる群から選択される配列異常を有するＶＫＯＲＣ１配列をコードしている。診断法の好ましい実施態様では、増幅ＤＮＡは、配列番号１によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの少なくとも部分的配列をコードする。ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症と関連する配列異常を決定する一つの方法が、実施例８に示される。
【００９２】
突然変異８５Ｇ＞Ｔ、１３４Ｔ＞Ｃ、１７２Ａ＞Ｇ、２９２Ｃ＞Ｔ、および３８３Ｔ＞Ｇを含む、本発明によるＶＫＯＲＣ１配列が、配列番号３から７に示されるが、これらは、患者から得られた核酸サンプル分析に基づくハイブリダイゼーション技術を用いてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断するためのプローブとして用いてもよい。
【００９３】
別法として、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドのレベルを知るためにＶＫＯＲＣ１発現を検出してもよい。従って、別の局面では、本発明は、患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症を診断する方法であって、
（Ｉ）患者から得たサンプルを提供する工程；および、
（ＩＩ）上に定義した配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに向けた抗体を用いて、該サンプルにおいて配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出する工程、
を含み、求められた配列異常は、患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患することを示すものとする方法を提供する。好ましくはその配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ、およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される。
【００９４】
サンプルを獲得する方法は既に詳述した。配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出する方法は、配列異常（単数または複数）を担うタンパクを特異的に検出するものである限り、特に限定はされない。そのような方法の例としては、例えば、免疫組織化学的検出、イムノブロッティング、好ましくはウェスタンブロッティング、および、ポリペプチドのＥＬＩＳＡが挙げられ、特に、上に定義した配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いる方法が好ましい。アミノ酸配列のレベルにおける配列異常の分析は特に限定されないが、例えば、１個以上の配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合するＶＫＲＯＰ１抗体を用いて実施してもよい。
【００９５】
好ましくは、診断法は、ワルファリン耐性、家族性の複数因子欠乏症、血友病のような血液凝固低下・停止と関連する障害または疾患、血管石灰化低下と関連する障害、ビタミンＫ依存性タンパクのγ−カルボキシル化障害に関連する疾患および／または障害、の内から選択される疾患および／または障害を診断するために用いられる。
【００９６】
さらに、診断法はまた、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドまたはその遺伝子における配列異常のために血栓を発生する患者および／またはその危険度の高い患者を含む、血液凝固上昇と関連する疾患および障害、ビタミンＫ依存性タンパクのγ−カルボキシル化改善と関連する疾患および／または障害を診断するのに用いられてもよい。
【００９７】
別の局面では、本発明は、少なくとも一つの配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、３、４、５、６、７、１４、および９４からなる群から選択される配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）候補クマリン誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（配列異常活性値）を決定する工程；および、
（ＩＶ）配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
（Ｖ）候補クマリン誘導体の投与が、コントロール配列活性値よりも有意に低い配列異常活性値をもたらす場合、その候補クマリン誘導体を、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体と同定する工程、
を含む方法を提供する。
【００９８】
さらに好ましくは、コントロール配列活性値は、下記の工程を含む方法によって決定される。すなわち、
（Ｉ）請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号１または１２によるＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンを該細胞に投与する工程；および、
（ＩＩＩ）ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性（コントロール活性値）を決定する工程。
【００９９】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性は、上に詳述した通りに決定してよい。実施例７に記載した方法を用いてもよい。この、クマリン誘導体を同定する方法は、ワルファリン耐性患者において抗凝固剤として使用することが可能なクマリン誘導体を同定するのに有用である。
【０１００】
別の局面では、本発明は、ワルファリン耐性げっ歯類に対して毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）げっ歯動物に対する候補クマリン誘導体の毒性（候補クマリン誘導体毒性値）を決定する工程；
（ＩＶ）候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）候補クマリン誘導体毒性値が、コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、その候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を含む方法を提供する。
【０１０１】
ワルファリン耐性げっ歯動物は、上に定義したＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物であって、前記ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも１個の配列異常、好ましくは、配列番号１４による配列によってコードされるポリペプチドを含むげっ歯動物、または、市販のワルファリン耐性ラット、または、ワルファリン耐性を有する野生の捕獲ラットである。より好ましくは、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１２によるポリペプチドであり、配列異常は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、Ｙ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）からなる群から選択される。
【０１０２】
サンプルは、それが、試験されるラットのゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む限り、任意の器官、組織、体液、またはプローブであってもよい。好ましくは、サンプルは、血液、尾または耳の組織、尿または大便である。方法の詳細は実施例９に示される。
【０１０３】
ワルファリン耐性げっ歯類については既に記述されており（Ｋｏｈｏｎ  ＆  Ｐｅｌｚ，１９９９）、市場の供給業者から入手が可能である（例えば、Ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｏｐｐｈｅｉｄｅｗｅｇ  ８８，４８１６１  Ｍｕｅｎｓｔｅｒ、ドイツ）。好ましい実施態様では、ワルファリン耐性げっ歯動物は、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも一つの配列異常を含む、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに関してトランスジェニックなげっ歯動物である。より好ましくは、前記少なくとも１個の配列異常を含むＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号３から７、および１５による核酸配列によってコードされるポリペプチドであり、配列異常は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、Ｙ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）からなる群から選択される。前記ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物、特にマウスを生産する方法は既に上述した。
【０１０４】
別の局面によれば、本発明は、ラットが、ラットから得られたサンプルにおいてワルファリン耐性遺伝型を有するかどうかを確定するために、配列番号８８から９１によるＰＣＲプライマーを使用するその使用に関する。
【０１０５】
クマリンおよびその誘導体の投与は特に限定はされない。典型的には、クマリン（ワルファリン）を含む、毒物学的に有効な組成物は、クマリンおよびその誘導体を約５０−３００ｐｐｍ、好ましくは約２５０ｐｐｍ含む、顆粒状の食餌組成物として処方される。食餌は、典型的には、コーン油のような適切な結合剤における０．５％から２．５％のワルファリン濃縮体として処方される。コーン油を結合剤として用いた場合、コーン油は、全体組成物の約０．５％から約２％の量として存在することが可能である。次に、結合剤とワルファリンは、例えば、穀物製品、例えば、コーンミール、押しオート麦、動物混合飼料、および、当技術分野で既知の類似の製品に基づく製品と共に混合される。投与、すなわち、量、処方、および投与頻度および期間は、げっ歯類におけるワルファリンの毒性を評価するための標準的プロトコールに従ってもよいが、より好ましくは、試験される所定の毒物における致死量の５０値（ＬＤ５０）を評価するための標準的プロトコールに従う。これらは全て、当業者には一般的に既知であり、実施例９にも記載される。
【０１０６】
クマリン誘導体が毒物学的に有効であるためには、げっ歯動物を殺すのに複数回の摂取が要求されることが望ましい。なぜなら、そうすることによって、げっ歯動物は、食餌忌避を養成することがなくなるからである。以上から、候補クマリン誘導体組成物の投与を数回繰り返すことが好ましい。通常、げっ歯動物は、組成物の、４から５回の連日投与後に死亡し始める。さらに、実験中の苦痛を緩和するために、熟練研究者には一般的に既知である鎮痛剤の投与によってラットの苦痛を抑制することが好ましいと考えられる。クマリンおよびクマリン誘導体組成物に鎮痛剤を含めることは、げっ歯動物が食物忌避を養成する機会をさらに少なくするという点でさらに有利となる可能性がある。
【０１０７】
投与後、候補クマリン誘導体の、げっ歯動物に対する毒性が決定され、それは、候補クマリン誘導体の毒性値を与える。候補クマリン誘導体の毒性を決定する方法は、熟練研究者には一般的に既知であり、ＬＤ５０分析、例えば、国際標準比（ＩＮＲ）プロコールによる、プロトロンビン時間計測による血液凝固作用の分析を含む。次に、候補クマリン誘導体毒性の決定値は、ワルファリン耐性げっ歯動物の別標本を同様に処理して、ただし、クマリン誘導体を、標準的なげっ歯類用クマリン組成物と、すなわち、通常害獣駆除に用いられるがそれに対してげっ歯類は耐性を獲得している組成物と交換して得られた、適当なコントロールクマリン毒性値と比較される。コントロールにも、候補クマリン誘導体投与に関して前述したものと同じ実験条件が用いられる。もしも候補クマリン誘導体の毒性値が、コントロールクマリンの毒性値よりも等しいか、または好ましくは統計的に有意に高いのであれば、その候補クマリン誘導体は、毒物学的に有効なクマリン誘導体を表すことになる。
【０１０８】
本発明の別の局面では、本発明は、前述の方法によって特定されたクマリン誘導体の毒物学的に有効な量を含む、げっ歯類を殺す組成物を提供する。クマリンおよびその誘導体を含む食餌組成物の処方は前述した。典型的な調合物は下記の構成成分を有する。成分％：顆粒状担体９４％、コーン油１．０％、クマリンまたはクマリン誘導体の濃縮物（０．５％）５．０、合計１００．０％。
【０１０９】
本発明はさらに、下記の実施態様に関する。すなわち、要すれば随意に、製薬学的に受容可能な担体と組み合わされる、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、ＶＫＯＲＣ１核酸、本発明による融合タンパク、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞からなる群から選ばれた化合物を含む、凝固性製薬組成物である。
【０１１０】
このような治療を必要とする患者を治療する方法であって、凝固性製薬組成物の治療的有効量を該患者に投与する工程を含む。この方法は、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に悩む患者の治療に使用することも可能である。
【０１１１】
要すれば随意に、製薬学的に受容可能な担体と組み合わされる、本発明によるｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡ、本発明によるアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、本発明によるＲＮＡ−アプタマー、本発明による抗体からなる群から選ばれた化合物を含む、抗凝固性製薬組成物。
【０１１２】
このような治療を必要とする患者を治療する方法であって、抗凝固性製薬組成物の治療的有効量を該患者に投与する工程を含む。
【０１１３】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドをγ−カルボキシル化するためにＶＫＯＲＣ１ポリペプチドまたはＶＫＯＲＣ１核酸を用いる使用。好ましくは、γ−カルボキシル化ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ，タンパクＣ、タンパクＳ、タンパクＺ、基質ｇｌａタンパク、およびオステオカルシンからなる群から選択されるポリペプチドである。好ましい実施態様では、ＶＫＯＲＣ１は、好ましくは、細胞背景において少なくとも一つの付加化合物と組み合わせて用いられる。その付加化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、および、γ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸からなる群から選択される。
【０１１４】
これから下記に、本発明の好ましい実施態様と特質を表す、しかし、本発明はそれらに限定されるものではないが、図と実施例を援用しながら本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【０１１５】
（実施例１：ゲノム候補領域の特性解明）
ビタミンＫ依存性凝固因子２型（ＶＫＣＦＤ２）の複合欠損症の座位は、染色体１６のセントロメア周辺領域のマーカーＤ１６Ｓ３１３１とＤ１６Ｓ４１９の間にマップされた［Ｆｒｅｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２］。この領域は約２０Ｍｂを含む。ラット（Ｒｗ）およびマウス（Ｗａｒ）におけるワルファリン耐性に関与する遺伝子は、ミオシンの軽鎖２遺伝子（Ｍｙｌ２）と密接連鎖して染色体１［Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９］および染色体７［Ｗａｌｌａｃｅ，１９７６］［Ｇｅａｖｅｓｅｓ  ＆  Ａｙｒｅｓ，１９６７］にマップされた。Ｍｙｌ２のヒトのオーソログ、ＨＵＭＭＬＣ２Ｂは、ＶＫＣＦＤ２候補領域内の、染色体１６ｐ１１に位置し、保存連鎖の遺伝子群の一部となる。このシンテニーおよび生化学的考察に基づくと、ＶＫＣＦＤ２とワルファリン耐性は、同じ遺伝子における対立遺伝子突然変異によるものと仮定される。もしそうなら、これによって、ヒトにおける最重要間隔が、染色体１６の短腕における、インターロイキン４受容体遺伝子（ＩＬ４Ｒ）とインテグリンアルファＭ鎖遺伝子（ＩＴＧＡＭ）との間の約４．５Ｍｂの領域に狭められる（図１）。
【０１１６】
ゲノムアセンブリによれば、この領域は、約１０００エキソンを含む１４１のＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子を含む。これらの遺伝子の内、１１７は既知として注記された。これらの遺伝子の多くは以下の分析から除外することが可能である。なぜならこれらの機能は十分に確立され、明らかにビタミンＫの代謝過程とは無関係だからである。一方、この領域の上流および下流の遺伝子は機能的候補と見なされ、突然変異スクリーニングに含められた。
【０１１７】
（実施例２：突然変異スクリーニング）
２人のＶＫＣＦＤ２および３人のＷＲ被験者からのゲノムＤＮＡを用いて、残余の候補遺伝子の比較配列決定による系統的な突然変異スクリーニングを行った。このＶＫＣＦＤ２家系の臨床データは以前に記述されている［Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］。ワルファリン耐性患者は、血栓症治療または予防の際のワルファリン経口投与に対するその異常な反応に基づいて確認された。患者ＣとＥは散発的な症例である。患者Ｄは、ワルファリン耐性を病む二人の兄弟を持っている。患者ＣおよびＤは、経口的に抗凝固作用の治療範囲を実現するのに週当たり約１５０−２５０ｍｇのワルファリンを必要とし、一方、患者Ｅは全く反応を示さなかった。患者は全て参加する前にインフォームドコンセントを提出した。
【０１１８】
驚くべきことに、調査した全てのＶＫＣＦＤ２およびＷＲ被験者において、機能不明の遺伝子にミスセンス突然変異が認められた（図２）。この遺伝子（ＩＭＡＧＥ３４５５２００）は、５１２６ｂｐのゲノム領域に広がっており、１６３個のアミノ酸から成るタンパクをコードする３個のエキソンを含む。これを、ビタミンＫエポキシドリサイクリングタンパク１（ＶＫＯＲＣ１）と名づけた。無関係のＶＫＣＦＤ２患者、および同様の病気を有する兄弟達のいずれも第３エキソン（２９２Ｃ＞Ｔ）に同じホモ接合の点突然変異を抱えているが、一方、両親はヘテロ接合であることが判明した。この突然変異は、アミノ酸残基９８において、アルギニンがトリプトファンによって置換されたことによって生じたものである（Ｒ９８Ｗ）。この家系はドイツおよびレバノン起源を有する。突然変異遺伝子周辺のホモ接合体領域におけるハプロタイプは、両家系で異なっており、独立した突然変異事象であることを示している。ＷＲ患者では、３種の異なるヘテロ接合の突然変異が、バリンのロイシンによる置換（患者Ｃ：Ｖ２９Ｌ）、アルギニンのグリシンによる置換（患者Ｄ：Ｒ５８Ｇ）、および、ロイシンのアルギニンとの交換（患者Ｅ：Ｌ１２８Ｒ）をもたらすことが判明した。このＲ５８Ｇ突然変異は、指標患者Ｄの二人の同病兄弟も共有している。このミスセンス突然変異は、３８４本のコントロール染色体には存在しなかった。コントロール染色体の配列決定を行うことによって、二つの、非同義的一塩基多型（Ｃ４３Ｃ；Ｌ１２０Ｌ）が明らかにされた。
【０１１９】
ゲノム配列および注記は、ＮＣＢＩ、ＵＣＳＣ、およびＥｎｓｅｍｂｌから得た。突然変異スクリーニング用のプライマーは、プライマーの自動的設計を可能とするために、スクリプトＥｘｏｎＰｒｉｍｅｒに組み込んだＰｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを用いて設計した（不完全！  参照源は見出せなかった）。突然変異スクリーニングのために、イントロンプライマーを含むエキソンを増幅し、その増幅フラグメントを、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ配列決定キット（ＡＢＩ）による直接的配列決定によって分析した。プライマー配列は請求により入手可能であった。トポロジー予想は、ＴＭＰＲＥＤとＴＭＨＭを用いて行った。
【０１２０】
（実施例３：相同性およびタンパク構造）
ＶＫＯＲＣ１遺伝子のオーソログは、マウスに存在しており（ＮＭ＿１７８６００）、ラットおよびＦｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓにおけるオーソログは、相同性探索とＲＴ−ＰＣＲによって確かめられた（図３）。対応するタンパクは、ヒトのタンパクと７９％から８４％の同一性を共有している。データベース探索では、既知の遺伝子に対しても、特性が明らかにされた任意のタンパクドメインに対しても相同性は認められなかった。トポロジー予想プログラムでは、３個の膜貫通ドメイン（ＴＭ）が予想された。試験した全てのプログラムにおいて、第１ＴＭは１０から２９残基の間に配置された。予想は、第２および第３ＴＭに関しては一致しなかった。これらは、アミノ酸１００と１５０の間に配置された。ＰＳＯＲＴＩＩサーバーは、６７％の確率で、ヒトＶＫＯＲＣ１の１５９−１６３位置にＥＲ膜保持シグナル（ＫＫＸＸまたはＫＸＫＸＸ）を予想した［Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０］。他のＶＫＯＲＣ１タンパクには共通配列も存在した。これは、ＶＫＯＲＣ１複合体は恐らくＥＲ膜システムの中に配されるものとする予想と一致する［Ｃａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７］。
【０１２１】
ＶＫＯＲＣ１によってＴｂｌａｓｔｎ探索を行ったところ、それぞれ５０％のタンパク同一性を示す、ヒト（ＢＣ０２７７３４）とマウス（ＡＫ００９４９７）の相同遺伝子が検出された。いずれのｍＲＮＡも、ＶＫＯＲＣ１とは相同性を示さないタンパクをコードすると誤って予想されていた。予想されたヒトタンパクは第３のメチオニンで開始する。マウスのｍＲＮＡ配列は、別の読み枠で予想されたタンパクでは不完全である。マウス、およびＦｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓにおいて完全なｃＤＮＡが確かめられ、ラットでも部分的に確かめられた。これらのタンパクは、ＶＫＯＲＣ１様タンパク１（ＶＫＯＲＣ１Ｌ１）と表示された。ヒト、マウス、およびラットのＶＫＯＲＣ１Ｌ１タンパクは、互いに、約８４％の同一性を共有し、対応するＶＫＯＲＣ１タンパクと約５０％の同一性を共有する。さらに、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＡＡＨ４３７４２）でも、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ（ＥＡＡ０６２７１）でも−相同性はより低いが（１ｅ−１４）−相同性タンパクが検出された。ツリー分析により、これら二つのタンパクは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子にたいするオーソログであることが示唆された。
【０１２２】
（実施例４：発現分析）
ＶＫＯＲＣ１は広く発現されるように見える。対応するＵｎｉｇｅｎｅ記入は、様々な組織において１００を超えるＥＳＴを含む。ヒトの胎児および成人組織におけるＶＫＯＲＣ１の発現をノーザンブロット分析によって調べる。このために、ヒトの複数組織のノーザンブロット（胎児ブロット１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ヒト１２−レーン、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、２μｇのポリ（Ａ）＋−ＲＮＡを含んでいた。ヒトのＶＫＯＲＣ１ｃＤＮＡ全長を、ランダムプライマーＤＮＡ標識システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて放射能標識し、ｍｉｒａｃｌｅＨｙｂ高性能ハイブリダイゼーション液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてハイブリダイズした。複数組織のノーザンブロットを備えるβアクチンプローブを、コントロールハイブリダイゼーションとして用いた。
【０１２３】
ＶＫＯＲＰの最高発現レベルは、胎児および成人の肝臓に観察することができる（図４）。胎児の心臓、腎臓および肺において、また、成人の心臓および膵臓においても高い発現レベルが観察された。胎児の脳、成人の胎盤と骨格筋は、中等度の発現レベルを示した。僅かな発現レベルが成人の脳、肺、および腎臓に検出された。
【０１２４】
（実施例５：ＶＫＯＲＣ１のクローニングおよび発現ベクターの構築）
ＶＫＯＲＣ１の完全コード配列の増幅を、ヒトの肝臓および腎臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩに対する切断部位を含む下記のプライマーを用いて実行した。すなわち、
ＶＫＯＲＣ１−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ：  ＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴ（配列番号５３）
ＶＫＯＲＣ１−ＥｃｏＲＩ−Ｒ：  ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧ（配列番号５４）
この産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、対応する制限酵素で切断し、直接配列決定で確認した。免疫細胞化学的実験のために、挿入体を再度哺乳類発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再クローニングした。
【０１２５】
発現実験のために、ＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡを、プライマーＶＫＯＲＣ１−ｐｃｄｎａ３−Ｆ：  ＧＧＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＡＴＧＧＧＣＡ（配列番号９２）、およびＶＫＯＲＣ１−ｐｃｄｎａ３−Ｒ：  ＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＴＧＣ（配列番号９３）によって増幅後ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。突然変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。発現のために、野生型、および突然変異ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を用いてｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において再クローニングした。構築物は全て配列決定によって確認した。
【０１２６】
（実施例６：細胞培養、一過性トランスフェクションと免疫細胞化学、および細胞内局在）
生化学的分画実験から、ＶＫＯＲＣ１活性は、ミクロソーム膜画分と共に精製されることが分かっている［Ｃａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７］。さらに、免疫細胞化学によってγ−グルタミル−カルボキシラーゼは、小胞体の膜に局在することが示されている［Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，２００２＃３１］。ヒトのＶＫＯＲＣ１の細胞内局在を調べるために、ＧＦＰ−およびｍｙｃ−エピトープ標識ＶＫＯＲＣ１融合タンパク構築物を、ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクション実験のために作製した。エピトープタグに対する一次抗体、および、フルオロクローム標識二次抗体を用いて融合タンパクを可視化した。ＥＲ−特異的タンパクカルネキシンに対する抗体をコントロールとして用いた。このために、ＣＯＳ−７細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を、１０％ウシ胎児血清を添加した、ダルベッコの改定イーグル培地にて維持した。細胞を、６ウェルプレートのガラスカバースリップに静置し、１８−２４時間培養後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーの指示に従って用いて発現ベクター構築物によってトランスフェクトした。さらに４８−６０時間培養した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％アセトン／３０％メタノールにて−２０℃で１５分固定した。固定後、細胞をＰＢＳ、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＳＩＧＭＡ  Ｎ−６５０７）において透過させ、次に、３７℃で、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、および０．１％ＮＰ−４０でブロックした。一次抗体、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｓ  Ａ．ｖ．（ＪＩ−８）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、抗ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および抗カルネキシン（ＳＩＧＭＡ）を、ブロッキング液にて希釈し（１：１００）、３７℃で４５分インキュベートした。カバースリップを、ＰＢＳ、０．１％ＮＰ−４０にて３０分洗浄した。二次抗体、すなわち、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ＳＩＧＭＡ）および抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ′）２フラグメント−Ｃｙｓ（ＳＩＧＭＡ）にも同じインキュベーションおよび洗浄工程を用いた。カバースリップを、ＤＡＰＩ（１：５００）にて１分間カウンターステインし、脱イオン水にて洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いてスライドにマウントし、Ｌｅｉｃａの蛍光顕微鏡にて視像化した。
【０１２７】
ＶＫＯＲＣ１融合タンパクの緑色の免疫蛍光が、細胞原形質内のＥＲの網状構造を彩っており、ＥＲ−マーカーカルネキシンのラベル（赤）と完全に同一配置された（図５）。
【０１２８】
（実施例７：ＶＫＯＲＣ１酵素活性決定のためのアッセイ）
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭにて育成した。各実験のために、６ｘ１０５個の細胞を、９４ｍｍペトリ皿に静置した。３７℃、５％ＣＯ２に３０時間暴露後、リン酸カルシウム法によりトランスフェクション（１個の皿当たり２０μｇのＤＮＡ構築物）を行った。３５℃、３％ＣＯ２に４０時間暴露後、トランスフェクト細胞（ほぼ集密に近く増殖）をＰＢＳにて洗浄し、収穫し、４５０μｌの０．２５ｍＭイミダゾール（ｐＨ＝７．６）、０．５％ＣＨＡＰＳにて細胞溶解した。トランスフェクション効率は、細胞分液のＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定によってチェックした。
【０１２９】
ＶＫＯＲ酵素活性は、３０μｌの全細胞抽出物を、５００μｌバッファーＡ（０．２５ｍＭイミダゾール（ｐＨ＝７．６）、０．５％ＣＨＡＰＳ）に再懸濁させたものについて測定した。次に、２０μｌの１２５ｍＭ  ＤＴＴを加えて１分インキュベートした。次に、５μｌの４００ｍＭＣａＣｌ２、および、１０μｌのＤＭＳＯに溶解したワルファリン（最終濃度０−８０μＭ）を加えた。反応は、２μｌのビタミンＫ２，３−エポキシドを加える（最終濃度５μＭ）ことによって開始し、３０℃で１時間インキュベートした。反応は、基質（ビタミンＫ２，３−エポキシド）および反応産物（ビタミンＫ−キノンおよびヒドロキノン）を１ｍｌの２−プロパノール／ヘキサン（３：２、ｖ／ｖ）を用いて抽出することよって停止させ、上清の有機相を収集し、乾燥し、５０μｌのメタノールに溶解し、２５４ｎｍにおいてＨＰＬＣにて分析した。ビタミンＫキノンは、逆相Ｃ−１８カラムにおいてＨＰＬＣによってエポキシドから分離した。抽出工程中、ビタミンＫヒドロキノンを、定量的に酸化してキノン形とした。ＨＰＬＣの出力は、各ピークの境界線下の面積を自動計算することによって分析した。基質変換のパーセントは、残余基質ピーク（エポキシド）プラス産物ピーク（キノン）の面積を１００パーセントに設定することによって推定した。測定は二重に行い、活性は、キノンに変換された基質のパーセントで表した。ビタミンＫ２，３−エポキシドは、ビタミンＫキノン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨ２Ｏ２で酸化することによって調製した。ワルファリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＤＭＳＯに加えた（＜１容量％）。
【０１３０】
５から８０μＭの最終濃度においてワルファリン抑制に対する用量−反応を測定した。トランスフェクトされない細胞、および擬似トランスフェクト細胞は、ワルファリン感受性であるが、低い基礎活性を示した。野生型ＶＫＯＲＣ１の過剰発現は、ＶＫＯＲ活性の著明な刺激をもたらした。ビタミンＫキノンの生産は、トランスフェクトされない細胞および擬似トランスフェクト細胞に比べて１４から２１倍増加した。この活性は、ワルファリンによって用量依存的に抑制された（図１０）。
【０１３１】
我々はまた、突然変異ＶＫＯＲＣ１構築物によるトランスフェクション後のＶＫＯＲ活性を決定した（図１０）。二つのＶＫＣＦＤ２家系に観察されたＲ９８Ｗ突然変異の組み換え発現は、ＨＥＫ２９３細胞においてごく僅かにＶＫＯＲ活性を増した。これらの患者では自発性の出血エピソードの見られること、ビタミンＫエポキシドの血清濃度が高いことは、ビタミンＫリサイクリングの効率が、インビボでも大きく低下していることを示している（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。５個のＷＲ突然変異では、Ｌ１２８Ｒ変種の５％からＶ２９Ｌ変異の９６％に渡るＶＫＯＲＣ活性の低下が示された。突然変異Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、およびＹ１３９Ｃは、それぞれ、約２３％、２１％、および４８％の活性を示した（表１）。ヘテロ接合およびホモ接合のＲｗラットにおいて、高いビタミンＫ要求および自発的出血による死亡と関連するＶＫＯＲ活性の低下が観察されている（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｔｈｉｊｓｓｅｎ  ＆  Ｐｅｌｚ，２００１，Ｆａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３ｂ）。同様に、ホモ接合の状態を模倣する我々の発現システムでも、ＷＲ突然変異は、ＶＫＯＲ複合体の機能的効率の低下をもたらした。表現型レベルでは、全てのＷＲ変種が、ワルファリンの抗凝固作用に対して少なくとも部分的な耐性を示したが、野生型および変異タンパクのいずれも、インビトロではワルファリンに対して感受性を示した。２０μＭを超える濃度では、突然変異Ｖ２９ＬとＹ１３９Ｃは、野生型よりも高いＶＫＯＲ活性を維持したが、突然変異Ｖ４５Ａ，Ｒ５８Ｇ，Ｌ１２８Ｒでは、ＶＫＯＲ活性は、検出限界を下回った（図１０）
（実施例８：ＶＫＯＲＣ１配列異常を診断する方法）
標本（ヒト患者または哺乳動物）のゲノムＤＮＡを、熟練研究者には一般的に既知の標準法に従って単離する。ＶＫＯＲＣ１の所望のエキソン（１−３）のゲノムＤＮＡを、これも熟練した専門家によって設計が可能な特異的プライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。次に、このＰＣＲ産物を、例えば、ＳＡＰ／Ｅｘｏ（小エビ・アルカリフォスファターゼおよびエキソヌクレアーゼ）を用いて標準条件下に精製する。
【０１３２】
次に、この精製ＤＮＡに、下記のように標準的配列決定工程を施す。すなわち、１μｌの精製ＰＣＲ産物に、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（順行または逆行プライマー）の０．３μｌを加え、次に、８μｌのＤＴＣＳ−Ｍｉｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）および１０．７μｌの水を加え、下記の条件下でサイクル配列決定する。
【０１３３】
【表１】
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サイクル配列決定後、沈殿による精製が続く。
＊２μｌの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μｌの５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）、１μｌのグリコーゲンを加えて、渦流攪拌、
＊６０μｌの９５％エタノールを加えて、渦流攪拌、
＊１３０００ｇにて遠心（１０分）、
＊上清を除去、
＊ペレットを１８０μｌの７０％エタノールで洗浄、
＊ペレットを乾燥、
＊ペレットを、３５μｌのサンプル負荷液（ＳＬＳ）に溶解。
【０１３４】
次に、プローブを、１滴のパラフィンオイルで被ったマクロタイタープレートにピペットする。次に、シークエンサーにおいて４．２Ｖで６０−１２０分分離する。生データを分析し、配列を、ＣＥＱ２０００ＸＬソフトウェア（４．３．９バージョン、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてコントロール配列と揃える。コントロール配列（ゲノムＶＫＯＲＣ１核酸配列、または配列番号２によるそのコード配列が好ましい）と、配列決定されたＤＮＡとの相違は、そのプローブ配列が、配列異常を含むＶＫＯＲＣ１核酸を表すものであることを示す。
【０１３５】
（実施例９：ラットにおけるワルファリン耐性を決定するためのＰＣＲに基づくアッセイ）
あるラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）がワルファリン耐性を有するかどうか、すなわち、配列番号１３によるＶＫＯＲＣ１コード配列がＹ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ）突然変異を有するかどうかを決めるために、ＡＲＭＳ−ＰＣＲに基づく下記のアッセイを、ラットゲノムＤＮＡの供給源としてラット糞を用いて行った。
【０１３６】
本アッセイの原理として、ＰＣＲ反応には、（１）ワルファリン耐性突然変異対立遺伝子４１６Ｇを含むＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする１本のＰＣＲプライマー（ｒＶＫＯＲＣ１−内部Ｆ）、および、（２）野生型対立遺伝子４１６Ａを含む野生型ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズするもう１本のＰＣＲプライマー（ｒＶＫＯＲＣ１−内部Ｒ）が含まれる。さらに、この２本のプライマーは、本反応に含まれるさらに２本のＰＣＲプライマーの内の一方とペアを造るように、反対方向に向かわせる。後のプライマーは、４１６部位に対して、異なる距離で、かつ、反対方向に配される。その結果、４１６部位が突然変異しているか否かに従って、ｒＶＫＯＲＣ１−内部Ｒプライマーか、ｒＶＫＯＲＣ１−内部Ｆプライマーのどちらかがアニールするので、ＰＣＲ反応は、異なるサイズの増幅ＤＮＡをもたらし、これは、そのＤＮＡが分析されるラットの遺伝子型を示すことになる。野生型ラットでは、ＰＣＲ反応は１２３ｂｐのバンドをもたらすが、一方、４１６Ｇ変異に対してホモ接合のラットでは、ＰＣＲ反応は１０１ｂｐの所にバンドを生ずる。最後に、ヘテロ接合の遺伝型を有するラットでは、ＰＣＲ反応は、一つは１０１ｂｐ、もう一つは１２３ｂｐの二つのバンドを生ずる。
【０１３７】
ゲノムＤＮＡが、熟練した専門家には一般的に既知の、標準的ＤＮＡ単離過程を用いて糞から単離された。下記の成分がＰＣＲ反応のために組み合わされた。すなわち、１μｌのＤＮＡ（ラット）、１μｌの５ＭのＢｅｔａｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、２ｐｍｏｌの外部プライマーＦ（１：５０希釈液１μｌ）、２ｐｍｏｌの外部プライマーＲ（１：５０希釈液１μｌ）、１０ｐｍｏｌの内部プライマーＦ（１：１０希釈液１μｌ）、１０ｐｍｏｌの内部プライマーＲ（１：１０希釈液１μｌ）、０．２５μｌのＴａｑ／Ｐｆｕ−ポリメラーゼ（１．２５ＵのＴａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．２５ＵのＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、２５μｌのＰＣＲ−バッファー添加（１ｍｌのＰＣＲ−バッファーは、１００μｌの１０ｘＰＣＲ−バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１６０μｌのヌクレオチドステム液（１．２５ｍＭのｄＮＴＰ）、３０μｌのＭｇＣｌ２、６１０μｌの蒸留水を含む）。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分、その後、９５℃で２０秒、６２℃で２０秒、および７０℃で１０秒を３２サイクル。最後に、反応物を７０℃で３分インキュベートする。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウム（１００ｍｌ毎に１％ステム液を１０μｌ）を含む３．５％ＴＡＥ−アガロースゲルにおけるゲル電気泳動によって分離した。ゲル電気泳動は１３０Ｖで３０分動作させた。
【０１３８】
下記のプライマーを用いた。
−ｒＶＫＯＲＣ１−外部Ｆ：  ＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＴＧ（配列番号８８）
−ｒＶＫＯＲＣ１−外部Ｒ：  ＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣ（配列番号８９）
−４１６Ｇ−突然変異体対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマー「ｒＶＫＯＲＣ１−内部Ｆ」：
ＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧ（配列番号９０）
−４１６Ａ−野生型対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマー「ｒＶＫＯＲＣ１−内部Ｒ」：  ＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴ（配列特定番号９１）
ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）において、ワルファリン耐性を有するもの、および持たないものをアッセイに用いた。ＰＣＲの結果を図１３に示す。野生型ラットは、１２３ｂｐにバンドを示し、突然変異に対してホモ接合のラットは、１０１ｂｐにバンドを示し、最後に、ヘテロ接合の変異を有するラットは、２本のバンド、１本は１０１ｂｐ、もう１本は１２３ｂｐを示した。
【０１３９】
その結果、このデータは、このアッセイは、所定のラットがワルファリン耐性を有するかどうかを決定するために使用することが可能であることを証明する。このアッセイは、ある所定の区域における害獣駆除を管理するに当たってきわめて強力である。なぜなら、ワルファリン耐性ラットの頻度に関する知識は、どの殺鼠剤が効果的に使用可能であるかを決めるに当たって決定的に重要だからである。所定の区域においてワルファリン耐性ラットの高い出現頻度が見られる場合、ワルファリンおよびその類縁体は、それらのラットを殺すのに不適切な手段である。一方、ワルファリン耐性ラットに関して求められた頻度が低い場合には、ワルファリンは、げっ歯類の駆除に効果的に使用される可能性がある。
【０１４０】
（参考文献のリスト）
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
【表７】
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【０１４７】
【表８】
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【０１４８】
【数１】
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【０１４９】
【数２】
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【０１５０】
【数３】
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【０１５１】
【数４】
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【０１５２】
【数５】
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【０１５３】
【数６】
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【０１５４】
【数７】
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【０１５５】
【数８】
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【０１５６】
【数９】
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【０１５７】
【数１０】
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【０１５８】
【数１１】
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【０１５９】
【数１２】
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【０１６０】
【数１３】
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【０１６１】
【数１４】
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【０１６２】
【数１５】
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【０１６３】
【数１６】
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【０１６４】
【数１７】
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【０１６５】
【数１８】
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【０１６６】
【数１９】
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【０１６７】
【数２０】
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【０１６８】
【数２１】
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【０１６９】
【数２２】
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【０１７０】
【数２３】
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【０１７１】
【数２４】
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【０１７２】
【数２５】
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【０１７３】
【数２６】
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【０１７４】
【数２７】
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【０１７５】
【数２８】
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【０１７６】
【数２９】
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【０１７７】
【数３０】
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【０１７８】
【数３１】
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【０１７９】
【数３２】
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【０１８０】
【数３３】
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【０１８１】
【数３４】
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【０１８２】
【数３５】
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【０１８３】
【数３６】
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【０１８４】
【数３７】
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【０１８５】
【数３８】
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【０１８６】
【数３９】
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【０１８７】
【数４０】
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【０１８８】
【数４１】
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【０１８９】
【数４２】
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【０１９０】
【数４３】
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【０１９１】
【数４４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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