(57)【要約】      （修正有）【課題】少ないＲＣＡを有し、２９３細胞株からの野生型アデノウイルス産生のような産生レベルで、複製欠損アデノウイルスを産生するより効率的な組換え細胞株を提供する。【解決手段】Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの機能を補う、Ｅ１欠損アデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターの産生のための細胞株。Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ２Ｂのポリメラーゼ機能を補う、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターおよびＥ２欠損アデノウイルスベクターの産生のための細胞株。および２４３Ｒタンパク質および２８９Ｒタンパク質中に変異を含むＥ１Ａ配列、ならびにＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子を含むＥ１Ｂ配列の挿入によって、Ｅ１Ａ機能を補う特定の細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、米国特許法（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．）第１１９（ｅ）の下での２００４年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／６３５，５６１号および２００５年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／６７４，４８８号（これらの開示は、本明細書においてその全体を参考として援用する）に関する優先権の利益を請求する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、複製欠損アデノウイルスを効率的に産生するための有用な細胞株に関する。本発明は、複製欠損アデノウイルスを産生するためにこのような細胞株を使用する方法も記載する。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターは、広い組織親和性および細胞親和性、大型の発現カセットの収容能力および高い形質導入効率を包含する、遺伝子送達のための望ましい特徴を有している。加えて、アデノウイルスは、ウイルスが高い特定の力価まで増殖し、かつ大規模に実現可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）製造プロセスが確立されているので、医薬の開発によく適合している（非特許文献１；非特許文献２）。ｒＡｄベクターの産生には、ウイルスゲノムから除去された機能を相補し得る、操作された細胞株が必要である。ウイルスベクターの医薬の開発および商業上の製造のためには、ベクター−細胞株の組み合わせも、スケールアップに適合し、かつ十分な質と純度の材料を提供しなければならない。
【０００４】
遺伝子療法に使用するための複製欠損ｒＡｄベクターは、一般にウイルス初期領域１（Ｅ１）が欠失している。Ｅ１は、２つの転写単位、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを含み、これらは溶解サイクルの初期および後期で重要な役割を果たす多数のタンパク質をコードする。ｒＡｄベクターの産生は、これらのＥ１活性の相補を必要とする。Ｅ１Ａ遺伝子機能およびＥ１Ｂ遺伝子機能は、広く特徴づけられている。Ｅ１Ａ機能およびＥ１Ｂ機能の総説が、非特許文献３、非特許文献４に提供される。最初のＥ１相補性細胞株（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｌｉｎｅ）の２９３は、物理的に切断されたアデノウイルス５ＤＮＡを用いて、初代（ｐｒｉｍａｒｙ）胚腎臓細胞のトランスフェクションによって生成された（非特許文献５）。その後、ゲノム分析によって２９３細胞が、Ｅ１領域および追加の隣接配列を含む、アデノウイルスゲノムの左端の組み込まれた断片（塩基番号１−４３４４）を有していることが、証明された（非特許文献６）。
【０００５】
２９３細胞は、Ｅ１欠損ｒＡｄベクターを許容可能レベルで産生するが、ｒＡｄベクターと２９３ゲノム中に存在するアデノウイルス配列との間での相同組換えによって、複製能力を有する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アデノウイルス（「ＲＣＡ」）と呼ばれる、望ましくない不純物が時々生成される（非特許文献７；非特許文献８）。相同組換えによるＲＣＡの生成の危険性を減少させるために、Ｆａｌｌａｕｘら（非特許文献９）は、Ｅ１ＡプロモーターおよびＥ１Ｂポリアデニル化配列が異種の制御エレメントによって置き換わったＥ１遺伝子を含む組換えプラスミドで、ヒト胚網膜芽細胞をトランスフェクトした。Ｅ１プラスミドにおけるアデノウイルス隣接配列の欠失は、細胞株ＰＥＲ．Ｃ６を得、これは、細胞株と適合した（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）ｒＡｄベクターが使用される場合、相同組換えによってＲＣＡを産生しない（非特許文献９）。しかし、最近の研究が、適合していないアデノウイルスベクターをＰＥＲ．Ｃ６細胞において増殖させた場合、ヘルパー依存性Ｅ１−陽性粒子（ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｌ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）と呼ばれる、ＲＣＡの異形型を形成し得ることを示している（非特許文献１０）。
【０００６】
２９３細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞において、Ｅ１欠失アデノウイルスの相補のために使用されるＥ１領域は、全Ｅ１Ｂ転写単位を含み、これは２つの主要なタンパク質のＥ１Ｂ−１９ＫおよびＥ１Ｂ−５５Ｋをコードする。アデノウイルス複製において、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質は、初期溶解サイクルで機能し、Ｅ１Ａ誘発性アポトーシスを制限する（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。加えて、Ｅ１Ｂ−５５Ｋは後期において機能し、ウイルス後期ｍＲＮＡの蓄積および翻訳を刺激する（非特許文献１４；非特許文献１５）。Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ａと共同して働き、初代細胞を形質転換することも示されており（非特許文献１６）、そして特にアポトーシスへのＥ１Ａ感作から保護する（非特許文献１３）。
複製欠損アデノウイルスベクターを、効果的かつ効率的に相補する安定なヒト細胞株の構築は、困難であり得る。Ｅ１−相補性細胞株を開発するための障害は、高レベルのＥ１Ａ遺伝子産生物発現に付随する毒性である。例えば、Ｅ１タンパク質、特にＥ１Ａの構成性の発現が、樹立した細胞株では困難であることが証明された（非特許文献１７）。Ｅ１Ａは、細胞増殖を抑制し、アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）を誘発することが示されている（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献１２）。このように、構成的にＥ１Ａタンパク質を発現する、当該分野において公知であるものなどの、相補性細胞株は、アデノウイルスベクター産生より前のおよび／または産生の間の乏しい生存率と関係し得る。
他の者は、以前に、Ａ５４９細胞株などのヒト腫瘍細胞株を使用して、Ｅ１−相補性細胞株を開発した。例えば、Ｍａｓｓｉｅ（特許文献１）は、アデノウイルスＥ１Ａプロモーターをヒトα−アクチンプロモーターで置き換えたＥ１領域発現カセットで、Ａ５４９細胞を形質転換した。しかし、細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するアデノウイルス遺伝子療法ベクターの収量は、２９３細胞からのそれよりも低いことが示された。Ｉｍｌｅｒらは、Ｅ１Ａの構成的発現に付随する毒性を回避する戦略として、Ｅ１の制御された誘導を使用し、Ａ５４９細胞に基づくｒＡｄ産生細胞株の生成を可能にした（非特許文献１７）。これらのＧａｌ４−誘導性産生細胞株からのｒＡｄベクターの産生収量は、２９３細胞の５分の１〜１０分の１であることが報告された（非特許文献１７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，８９１，６９０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９５）  第６巻、ｐ．１４０３−１４１６
【非特許文献２】Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９７）第８巻、ｐ．４５３−４６５
【非特許文献３】Ｂａｙｌｅｙら  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９４）５巻、ｐ．４２５−４４４
【非特許文献４】Ｓｈｅｎｋら、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、（Ｋ．Ｄ．Ｍ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．，およびＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，編）、２  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、（１９９６）、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．
【非特許文献５】Ｇｒａｈａｍら、Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９７７）３６巻、ｐ．５９−７４
【非特許文献６】Ｌｏｕｉｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９９７）、２３３巻、ｐ．４２３−４２９
【非特許文献７】Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９４）５巻、ｐ．１４８５−１４９１
【非特許文献８】Ｚｈｕら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、（１９９９）１０巻、ｐ．１１３−１２１
【非特許文献９】Ｆａｌｌａｕｘら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９８）９巻、ｐ．１９０９−１９１７
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、（２００２）、１３巻、ｐ．１９０９−１９２０
【非特許文献１１】Ｑｕｅｒｉｄｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、（１９９７）、７１巻、ｐ．３７８８−３７９８
【非特許文献１２】Ｒａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９９２）、８９巻、ｐ．７７４２−７７４６
【非特許文献１３】Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、（１９９１）、６５巻、ｐ．２９６８−２９７８
【非特許文献１４】Ｂａｂｉｓｓら、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、（１９８５）、５巻、ｐ．２５５２−２５５８
【非特許文献１５】ＨａｒａｄａおよびＢｅｒｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、（１９９９）、７３巻、ｐ．５３３３−５３４４
【非特許文献１６】Ｂｒａｎｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、（１９８５）、７８０巻、ｐ．６７−９４
【非特許文献１７】Ｉｍｌｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、（１９９６）、３巻、ｐ．７５−８４
【非特許文献１８】Ｆｒｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、（１９９１）、８８巻、ｐ．９０７７−９０８１
【非特許文献１９】ＦｒｉｓｃｈおよびＭｙｍｒｙｋ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、（２００２）、３巻、ｐ．４４１−４５２
【非特許文献２０】Ｍｙｍｒｙｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、（１９９４）、９巻、ｐ．１１８７−１１９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、少ないＲＣＡを有し、２９３細胞株からの野生型アデノウイルス産生のような産生レベルで、複製欠損アデノウイルス（即ち、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａコード領域およびＥ１Ｂコード領域の欠失を含むアデノウイルス）を産生するより効率的な組換え細胞株が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（３．発明の概要）
本発明は、アデノウイルス複製に必要とされる、選択されたウイルス機能および宿主機能の組み合わせに基づく、組換えアデノウイルスの産生のための新しい細胞株を提供することによって、前述の必要性に取り組む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
単離ヒト細胞株であって、該細胞株は、以下：
（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；ならびに
（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子
を含む、細胞株。
（項目２）
前記第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、項目１に記載の細胞株。
（項目３）
単離ヒト細胞株であって、該細胞株は、以下：
（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；
（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに
（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子
を含む、細胞株。
（項目４）
前記第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３に記載の細胞株。
（項目５）
項目１に記載の細胞株であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９
に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）
に対応する第２の欠失
を含む、細胞株。
（項目６）
項目３または項目４に記載の細胞株であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９
に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）
に対応する第２の欠失
を含む、細胞株。
（項目７）
項目１に記載のヒト細胞であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失
を含む、細胞。
（項目８）
項目３または項目４に記載のヒト細胞であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失
を含む、細胞。
（項目９）
アデノウイルスＥ２ａ  ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ２ｂ末端タンパク質前駆体、またはアデノウイルスＥ２ｂ  ＩＶａ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子をさらに含む、項目１に記載の細胞株。
（項目１０）
アデノウイルスＥ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子をさらに含む、項目１に記載の細胞株。
（項目１１）
前記アデノウイルスＥ４タンパク質は、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ  ６、ＯＲＦ
３およびＯＲＦ６／７によってコードされる、項目１０に記載の細胞株。
（項目１２）
Ｌ４  １００Ｋによってコードされるアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子をさらに含む、項目１に記載の細胞株。
（項目１３）
アデノウイルスＥ２ａ  ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ２ｂ末端タンパク質前駆体、またはアデノウイルスＥ２ｂ  ＩＶａ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第４核酸分子をさらに含む、項目３に記載の細胞株。
（項目１４）
アデノウイルスＥ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第４核酸分子をさらに含む、項目３に記載の細胞株。
（項目１５）
前記アデノウイルスＥ４タンパク質は、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７によってコードされる、項目１４に記載の細胞株。
（項目１６）
Ｌ４  １００Ｋによってコードされるアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第４核酸分子をさらに含む、項目３に記載の細胞株。
（項目１７）
前記第１核酸分子および前記第２核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目１または項目５に記載の細胞株。
（項目１８）
前記第１核酸分子、前記第２核酸分子および前記第３核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目３または項目４に記載の細胞株。
（項目１９）
前記第１核酸分子、前記第２核酸分子および前記第３核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目６に記載の細胞株。
（項目２０）
前記細胞株は、Ａ５４９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞株、ＩＧＲＯＶ−１細胞株、ＨｅＬａ細胞株、Ｕ８７細胞株、Ｗ１６２細胞株または２９３−Ｄ２２細胞株に由来する、項目１に記載の細胞株。
（項目２１）
前記細胞株は、Ａ５４９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞株、ＩＧＲＯＶ−１細胞株、ＨｅＬａ細胞株、Ｕ８７細胞株、Ｗ１６２細胞株または２９３−Ｄ２２細胞株に由来する、項目３または項目４に記載の細胞株。
（項目２２）
前記第１核酸分子は、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列を含む、項目１、項目３または項目４に記載の細胞株。
（項目２３）
前記第２核酸分子は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の細胞株。
（項目２４）
前記第２核酸分子は、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３または項目４に記載の細胞株。
（項目２５）
前記第３核酸分子は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３に記載の細胞株。
（項目２６）
前記第３核酸分子は、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載の細胞株。
（項目２７）
アクセッション番号ＰＴＡ−６２３１の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された、ＳＬ０００３の名称を有する組換えアデノウイルス産生細胞株。
（項目２８）
アクセッション番号ＰＴＡ−６６６３の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された、ＳＬ０００６の名称を有する組換えアデノウイルス産生細胞株。
（項目２９）
組換えアデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するためのプラスミド系であって、該プラスミド系は、別個の容器に、以下：
（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第１発現カセット；および
（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第２発現カセット
を含む、プラスミド系。
（項目３０）
前記第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、項目２９に記載のプラスミド系。
（項目３１）
組換えアデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するためのプラスミド系であって、該プラスミド系は、別個の容器に、以下：
（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第１発現カセット；
（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第２発現カセット；および
（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第３発現カセット
を含む、プラスミド系。
（項目３２）
前記第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３１に記載のプラスミド系。
（項目３３）
項目２９、項目３１または項目３２に記載のプラスミド系であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９
に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）
に対応する第２の欠失
を含む、プラスミド系。
（項目３４）
複製欠損アデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するための方法であって、該方法は、ヒト細胞を第１核酸分子および第２核酸分子で形質転換させる工程を包含し、該第１核酸分子は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、そして該第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３５）
前記第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
複製欠損アデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するための方法であって、該方法は、ヒト細胞を第１核酸分子、第２核酸分子および第３核酸分子で形質転換させる工程を包含し、該第１核酸分子は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該第２核酸分子は、アデノウイルスＥ２ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、そして該第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３７）
前記第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
項目３４、項目３６または項目３７に記載の方法であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９
に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）
に対応する第２の欠失
を含む、方法。
（項目３９）
前記第１核酸分子および前記第２核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記第１核酸分子、前記第２核酸分子および前記第３核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞は、Ａ５４９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞株、ＩＧＲＯＶ−１細胞株、ＨｅＬａ細胞株、Ｕ８７細胞株、Ｗ１６２細胞株または２９３−Ｄ２２細胞株に由来する、項目３４、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記第１核酸分子は、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３４、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目４３）
前記第２核酸分子は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３４に記載の方法。
（項目４４）
前記第２核酸分子は、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目４５）
前記第３核酸分子は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
前記第３核酸分子は、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４７）
組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたヒト細胞を、該細胞において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該細胞は、以下：
（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；ならびに
（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子
を含む、方法。
（項目４８）
前記第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたヒト細胞を、該細胞において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該細胞は、以下：
（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；
（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに
（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子
を含む、方法。
（項目５０）
前記第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞を収集する工程および前記組換えアデノウイルスを回収する工程をさらに包含する、項目４７、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目５２）
項目４７、項目４９または項目５０に記載の方法であって、前記Ｅ１Ａタンパク質は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９
に対応する第１の欠失；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または
（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）
に対応する第２の欠失
を含む、方法。
（項目５３）
前記第１核酸分子および前記第２核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記第１核酸分子、前記第２核酸分子および前記第３核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞は、Ａ５４９細胞株、ＨＣＴ−１５細胞株、ＩＧＲＯＶ−１細胞株、ＨｅＬａ細胞株、Ｕ８７細胞株、Ｗ１６２細胞株または２９３−Ｄ２２細胞株に由来する、項目４７、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目５６）
前記第１核酸分子は、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列を含む、項目４７、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目５７）
前記第２核酸分子は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５８）
前記第２核酸分子は、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列を含む、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目５９）
前記第３核酸分子は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、項目４９に記載の方法。
（項目６０）
前記第３核酸分子は、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載の方法。
（項目６１）
前記組換えアデノウイルスは、複製欠損である、項目４７、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目６２）
前記組換えアデノウイルスは、異種遺伝子を含む、項目４７、項目４９または項目５０に記載の方法。
（項目６３）
組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたＳＬ０００３の名称を有するヒト細胞株を、該細胞株において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該ヒト細胞株は、アクセッション番号ＰＴＡ−６２３１の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている、方法。
（項目６４）
組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたＳＬ０００６の名称を有するヒト細胞株を、該細胞株において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該ヒト細胞株は、アクセッション番号ＰＴＡ−６６６３の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている、方法。
（項目６５）
前記組換えアデノウイルスは、複製欠損である、項目６３または項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記組換えアデノウイルスは、異種遺伝子を含む、項目６３または項目６４に記載の方法。
【００１１】
本発明は、本明細書において記載される組換えアデノウイルスベクターおよび組換えアデノウイルスを相補する宿主細胞の生成において使用するための、ヘルパーアデノウイルス核酸配列を提供する。本発明のヘルパーアデノウイルス核酸配列は：（ｉ）組換えアデノウイルスベクターの複製および／またはその感染性ビリオンへのパッケージのためのウイルス機能を提供し；そして（ｉｉ）複製もされず、測定可能な程度までのウイルス粒子へも構築されない。ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、いずれのアデノウイルス科またはアデノウイルス科の組み合わせから得られ得るか、および／または由来し得る。好ましい実施形態では、ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、ヒトアデノウイルス科から得られるか、および／または由来する。
【００１２】
一つの実施形態では、ヘルパーアデノウイルス核酸配列としては：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーのメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーのメンバーへの結合を欠損するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および（ｉｉ）Ｅ１Ｂ−５５Ｋおよび／またはＥ１Ｂ−１９Ｋなどの、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が挙げられる。この実施形態によると、ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下の１つ、２つまたは３つ以上も含み得る：（ｉ）アデノウイルスＥ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｉｉ）アデノウイルスＥ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および／または（ｉｉｉ）アデノウイルスＬ４  １００Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。アデノウイルスＥ２タンパク質の非限定的例としては、Ｅ２Ａ結合タンパク質、Ｅ２Ｂポリメラーゼ、Ｅ２Ｂ末端タンパク質前駆体（ｐｒｅ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＥ２Ｂ  ＩＶａ２タンパク質が挙げられる。アデノウイルスＥ４タンパク質の非限定的例としては、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）−６、ＯＲＦ３、およびＯＲＦ６／７によってコードされるものが挙げられる。以下の表１が、血清型５のヒトアデノウイルス、Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の例を提供する。
【００１３】
【表１−１】
2011015696.tif 000002
【００１４】
【表１−２】
2011015696.tif 000003
具体的な実施形態において、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、このＥ１Ｂタンパク質は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を含むがＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を含まない、核酸分子。好ましい実施形態において、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｉｉ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００１５】
細胞性タンパク質ｐ３００／ＣＢＰおよびｐＲｂに対する結合に欠陥を有するＥ１Ａタンパク質を産生するために、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒコード領域およびＥ１Ａ  ２４３Ｒコード領域に変異が導入され得る。具体的な実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ
２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。好ましい実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００１６】
本発明は、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を提供する。このような細胞は、組換えアデノウイルスの産生において有用であり、特に、複製欠損組換えアデノウイルスの産生において有用である。本発明の宿主細胞は、目的の組換えアデノウイルスベクターもしくは組換えアデノウイルスから失われている機能を補う（すなわち、アデノウイルスＥ１Ａコード領域（例えば配列番号１７）およびアデノウイルスＥ１Ｂコード領域（例えば配列番号１８））。好ましくは、この宿主細胞は、目的の組換えアデノウイルスベクター中の遺伝子に対する相同性を何ら有さない相補的アデノウイルス遺伝子を含み、この遺伝子は、複製能力を有するアデノウイルスを産生する細胞性ＤＮＡによるウイルスゲノム組換えの可能性を低減する。本明細書中で記載される組換えアデノウイルスベクターおよび組換えアデノウイルスを補う宿主細胞は、本明細書中で時々、「相補性細胞株」、「ｒＡｄ産生細胞株」、「ｒＡｄ相補性細胞」および「ｒＡｄ相補性細胞株」と呼ばれる。
【００１７】
具体的な実施形態において、本発明は、単離宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；ならびに（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子。この実施形態に従い、この第２核酸分子は、特定の実施形態において、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。さらに、この実施形態に従い、この宿主細胞は、アデノウイルスＥ２ａ  ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ２ｂ末端タンパク質前駆体、アデノウイルスＥ２ｂ  ＩＶａ２タンパク質、アデノウイルスＥ４タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７）、および／またはＬ４  １００Ｋによってコードされるアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸分子をさらに含み得る。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明は、以下を含む単離宿主細胞を提供する：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子。この実施形態に従い、この宿主細胞は、アデノウイルスＥ２ａ  ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ２ｂ末端タンパク質前駆体、アデノウイルスＥ２ｂ  ＩＶａ２タンパク質、アデノウイルスＥ４タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７）、および／またはＬ４  １００Ｋによってコードされるアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、さらなる核酸分子をさらに含み得る。
【００１９】
具体的な実施形態において、上記宿主細胞によって発現されるＥ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。好ましい実施形態において、この宿主細胞によって発現されるＥ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００２０】
任意の細胞型が、宿主細胞として使用され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルス（好ましくはヒトアデノウイルス）感染に対して許容性である細胞が、使用される。好ましい実施形態において、ヒト細胞（初代細胞および細胞株を含む）が、宿主細胞として使用される。ヒト腫瘍細胞に由来する細胞株のような樹立ヒト細胞株もしくはヒト腫瘍細胞株は、培養物中で無限に複製する能力を有する。具体的な実施形態において、この宿主細胞は、Ａ５４９細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＩＧＲＯＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｕ８７細胞、Ｗ１６２細胞または２９３−Ｄ２２細胞である。好ましい実施形態において、この宿主細胞は、Ａ５４９細胞である。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、以下を含む核酸配列を安定的に組み込んだヒト細胞を提供する：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第１発現カセット；および（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第２発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このＥ１Ｂタンパク質は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を含むがＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を含まず、このＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第２発現カセット。特定の実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含むヒト細胞によって発現される：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。好ましい実施形態において、このＥ１Ａタンパク質は、以下を含むヒト細胞によって発現される：（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００２２】
本発明は、上記のヒト細胞を提供し、ここで、上記第１発現カセットは、配列番号２６に記載の核酸配列を含み、かつ／または上記第２発現カセットは、配列番号１５に記載の核酸配列を含む。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含み、かつ／または上記第２発現カセットは、配列番号２に記載の核酸配列を含む。本発明はまた、上記のヒト細胞を提供し、ここで、この細胞は、ＳＬ０００３の名称を有し、アクセッション番号ＰＴＡ−６２３１の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。本発明の具体的な実施形態において、上記組換えアデノウイルス産生細胞株は、ＳＬ０００３の名称を有し、アクセッション番号ＰＴＡ−６２３１の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている細胞株である。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、以下の核酸配列を安定的に組み込んだヒト細胞を提供する：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第１発現カセット；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第２発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第２発現カセット；および（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第３発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第３発現カセット。特定の実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含むヒト細胞によって発現される：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。好ましい実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含むヒト細胞によって発現される：（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００２４】
本発明は、上記のヒト細胞を提供し、ここで、上記第１発現カセットは、配列番号２６に記載の核酸配列を含み、上記第２発現カセットは、配列番号２３に記載の核酸を含み、そして／または上記第３発現カセットは、配列番号１８に記載の核酸配列を含む。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含み、上記第２発現カセットは、配列番号２０に記載の核酸を含み、そして／または上記第３発現カセットは、配列番号１９に記載の核酸配列を含む。本発明はまた、上記のヒト細胞を提供し、ここで、この細胞は、ＳＬ０００６の名称を有し、アクセッション番号ＰＴＡ−６６６３の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。本発明の好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルス産生細胞株は、ＳＬ０００６の名称を有し、アクセッション番号ＰＴＡ−６６６３の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている細胞株である。
【００２５】
宿主細胞は、当該分野で公知の技術および／または本明細書中に記載される技術を用いて、一時的にまたは安定的に、ヘルパーアデノウイルス核酸配列でトランスフェクトされ得る。好ましくは、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、上記宿主細胞の核ゲノム内に安定的に組み込まれる。
【００２６】
本発明は、複製欠損アデノウイルスの産生のための宿主細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、細胞（好ましくはヒト細胞）を第１核酸分子および第２核酸分子で形質転換またはトランスフェクトさせる工程を包含し、この第１核酸分子は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなアデノウイルスタンパク質の例は、以下に記載される）をコードするヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（そして好ましくは、アデノウイルスＥｌＢ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）。この細胞は、第１核酸分子および第２核酸分子によって、同時に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよく、または任意の順番で連続的に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよい。具体的な実施形態において、この細胞は、第１核酸分子で形質転換もしくはトランスフェクトされ、次いで、第２核酸分子で形質転換もしくはトランスフェクトされる。
【００２７】
本発明は、複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、細胞（好ましくは、ヒト細胞）を第１核酸分子、第２核酸分子および第３核酸分子で形質転換およびトランスフェクトさせる工程を包含し、この第１核酸分子は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなアデノウイルスタンパク質の例は、以下に記載される）をコードするヌクレオチド配列を含み、この第２核酸分子は、アデノウイルスＥ２ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、そして該第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列（そして好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含む。この細胞は、第１核酸分子、第２核酸分子および第３核酸分子によって、同時に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよく、または任意の順番で連続的に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよい。具体的な実施形態において、この細胞は、第１核酸分子で形質転換もしくはトランスフェクトされ、第２核酸分子で形質転換もしくはトランスフェクトされ、次いで、第３核酸分子で形質転換もしくはトランスフェクトされる。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、複製欠損アデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ヒト細胞を第１発現カセットで形質転換させる工程であって、ここでこの第１発現カセットは、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ここでこのプロモーターはこのヒト細胞において活性であり、ここでこのタンパク質は、このヒト細胞において発現される、工程；および（ｂ）このヒト細胞を第２発現カセットで形質転換させる工程であって、ここでこの第２発現カセットは、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ここでこのプロモーターはこのヒト細胞において活性であり、ここでこのＥ１Ｂタンパク質は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を含むがＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を含まず、ここでこのＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質は、このヒト細胞において発現される工程を、包含する。特定の実施形態において、上記第１発現カセットによってコードされる上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。別の実施形態において、上記第１発現カセットによってコードされる上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００２９】
本発明は、上記の方法を提供し、ここで、上記細胞は、樹立細胞株、腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、およびＨｅＬａ細胞株に由来する。また、上記第１発現カセットは配列番号２６に記載の核酸配列を含み、そして／または上記第２発現カセットは配列番号１５に記載の核酸配列を含む、上記方法が、提供される。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含み、そして／または上記第２発現カセットは、配列番号２に記載の核酸配列を含む。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明は、複製欠損アデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ヒト細胞を第１発現カセットで形質転換させる工程であって、ここでこの第１発現カセットは、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ここでこのプロモーターはこのヒト細胞において活性であり、ここでこのタンパク質は、このヒト細胞において発現される、工程；（ｂ）このヒト細胞を第２発現カセットで形質転換させる工程であって、ここでこの第２発現カセットは、アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ここでこのプロモーターはこのヒト細胞において活性であり、ここでこのタンパク質は、このヒト細胞において発現される、工程；および（ｃ）このヒト細胞を第３発現カセットで形質転換させる工程であって、ここでこの第３発現カセットは、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ここでこのプロモーターはこのヒト細胞において活性であり、ここでこのタンパク質は、このヒト細胞において発現される工程を、包含する。特定の実施形態において、上記第１発現カセットによってコードされる上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。別の実施形態において、上記第１発現カセットによってコードされる上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００３１】
本発明は、上記の方法を提供し、ここで、上記細胞は、樹立細胞株、腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、およびＨｅＬａ細胞株に由来する。また、上記第１発現カセットは、配列番号２６に記載の核酸配列を含み、上記第２発現カセットは、配列番号２３に記載の核酸配列を含み、そして／または上記第３発現カセットは、配列番号１８に記載の核酸配列を含む、上記の方法が提供される。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含み、上記第２発現カセットは、配列番号２０に記載の核酸配列を含み、そして／または上記第３発現カセットは、配列番号１９に記載の核酸配列を含む。
【００３２】
本発明に従い、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）は、ｒＡｄ産生細胞株をｒＡｄベクターでトランスフェクトして、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）を産生することによって産生され得る。具体的な実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを産生するための方法を提供し、この方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたｒＡｄ相補性細胞株を、この細胞株においてウイルスゲノムの複製を可能にするような条件下で培養する工程を包含し、ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなＥ１Ａタンパク質に関する上記の説明を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；ならびに（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（そして好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）第２核酸分子。好ましい実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを産生するための方法を提供し、この方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたｒＡｄ相補性細胞株を、この細胞株においてウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなＥ１Ａタンパク質に関する上記の説明を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質および好ましくはアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子。
【００３３】
ｒＡｄ産生細胞株内にトランスフェクトされた組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスヌクレオチド配列、および必要に応じて、１種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、この組換えアデノウイルスベクターは、ヘルパーアデノウイルス核酸配列に対する相同性を何ら有さないアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。アデノウイルスヘルパー核酸配列と組換えアデノウイルスベクターとの間の相同性の欠如は、ウイルスゲノム組換えによる複製能力を有するアデノウイルスの産生の可能性を低下させる。好ましい実施形態において、この組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードする。この実施形態に従い、この組換えアデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスゲノム中の１つ以上の変異の導入（例えば、アデノウイルスタンパク質の１つ以上のコード領域における欠失の導入）によって変異アデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。好ましくは、アデノウイルスゲノム中の変異は、野生型アデノウイルスよりもアデノウイルスタンパク質の低いレベルの発現をもたらす。アデノウイルスタンパク質発現における低下は、被験体におけるアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答を低減させる。
【００３４】
具体的な実施形態において、上記組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）およびＥ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）の部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）欠失を有する変異ゲノムを含み、そして１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態において、上記組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）、Ｅ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域（例えば、配列番号２３）の部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）欠失を有する変異ゲノムを含み、そして１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。この異種ヌクレオチド配列は、ゲノムの任意の領域内（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端）に導入され得る。具体的な実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、変異アデノウイルスゲノムのアデノウイルスコード領域の欠失の１つ（例えばＥ１Ａコード領域もしくはＥ２Ｂコード領域）の中に導入される。好ましい実施形態において、この組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）、Ｅ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域（例えば、配列番号２３）、およびＥ３コード領域の部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）欠失を有する変異ゲノムを含み、そして欠失したＥ３コード領域内に異種ヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
本発明に従い、上記組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターは、任意のアデノウイルス科またはアデノウイルス科の組み合わせから得られ、かつ／またはこれらに由来するアデノウイルスゲノムもしくはその一部分を含む。好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス科から得られ、かつ／またはこれに由来するアデノウイルスゲノムもしくはその一部分を含む。別の好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２もしくは５から得られ、かつ／またはこれに由来するアデノウイルスゲノムもしくはその一部分を含む。
【００３６】
本発明に従い、本明細書中で記載されるｒＡｄ産生細胞株を用いて、任意の組換えアデノウイルスが、産生され得、そして／または増殖され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス科に由来する。本発明の別の好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２または５に由来する。具体的な実施形態において、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）およびＥ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）の部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）欠失を有する変異ゲノムを含み、かつ１つ以上のさらなる異種遺伝子を含み得る。本発明の好ましい実施において、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）、Ｅ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）、およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域（例えば、配列番号２３）の部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）欠失を有する変異ゲノムを含み、かつ１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。本発明の好ましい組換えアデノウイルスは、ｒＡｄ産生細胞株におけるアデノウイルスＤＮＡ配列に対する相同性を何ら有さないウイルスＤＮＡ配列を含み、このことは、ＲＣＡを産生する細胞性ＤＮＡへのウイルスゲノムの組換えの可能性を低下させる。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを産生し、そして／または増殖させる方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）ヒト細胞を感染させる工程であって、このヒト細胞は、以下：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第１発現カセット；および（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第２発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このＥ１Ｂタンパク質は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を含むがＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を含まず、このＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第２発現カセットを含む、安定的に組み込まれた核酸配列を含む、工程；（ｂ）この感染細胞を、この細胞内でのこのウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程；（ｃ）この細胞を収集する工程；ならびに（ｄ）この組換えアデノウイルスを回収する工程を包含し、ここで、工程（ｃ）および工程（ｄ）は、任意である。
【００３８】
また、上記の方法であって、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む方法が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。また、上記の方法であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含む方法が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００３９】
また、上記の方法であって、上記細胞が、樹立細胞株、腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、およびＨｅＬａ細胞株からなる群に由来する方法が、提供される。また、上記の方法であって、上記細胞は、ＳＬ０００３の名称を有し、アクセッション番号ＰＴＡ−６２３１の下でＡＴＣＣに寄託されている方法が、提供される。また、上記の方法であって、上記第１発現カセットは、配列番号２７に記載の核酸配列を含む方法が提供され；そして、上記の方法であって、上記第２発現カセットは、配列番号１５に記載の核酸配列を含む方法が提供される。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含み；そして、上記方法であって、上記第２発現カセットは、配列番号２に記載の核酸配列を含む。また、上記方法であって、ここで上記組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａコード領域およびＥ１Ｂコード領域の欠失を含む方法が、提供される。また、上記の方法であって、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損である方法が、提供される。また、上記方法であって、上記組換えアデノウイルスは、異種遺伝子をさらに含む方法が、提供される。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを産生しそして／または増殖させる方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）ヒト細胞を感染させる工程であって、このヒト細胞は、以下：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第１発現カセット；（ｉｉ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第２発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第２発現カセット；および（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質−５５ＫおよびＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第３発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、これらのタンパク質は、このヒト細胞において発現される、第３発現カセットを含む、安定的に組み込まれた核酸配列を含む、工程；（ｂ）この感染細胞を、この細胞内でのこのウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程；（ｃ）この細胞を収集する工程；ならびに（ｄ）この組換えアデノウイルスを回収する工程を包含し、ここで、工程（ｃ）および工程（ｄ）は、任意である。
【００４１】
また、上記の方法であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含む方法が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。また、上記の方法であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含む方法が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【００４２】
また、上記の方法であって、上記細胞は、樹立細胞株、腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株およびＨｅＬａ細胞株からなる群に由来する方法が、提供される。また、上記の方法であって、上記細胞は、ＳＬ０００６の名称を有し、アクセッション番号ＰＴＡ−６６６３の下でＡＴＣＣに寄託されている方法が、提供される。
【００４３】
また、上記の方法であって、上記第１発現カセットは、配列番号２７に記載の核酸配列を含み、上記第２発現カセットは、配列番号２３に記載の核酸配列を含み、そして／または上記第２発現カセットは、配列番号１８に記載の核酸配列を含む方法が、提供される。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含み、上記第２発現カセットは、配列番号２０に記載の核酸配列を含み、そして／または上記第２発現カセットは、配列番号１９に記載の核酸配列を含む。また、上記の方法であって、上記組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａコード領域、Ｅ２ｂポリメラーゼコード領域、およびＥ１Ｂコード領域の欠失を含む方法が、提供される。また、上記の方法であって、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損である方法が、提供される。また、上記の方法であって、上記組換えアデノウイルスは、異種遺伝子をさらに含む方法が、提供される。
【００４４】
本発明の組換えアデノウイルスは、インビトロで、目的のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを発現するために使用され得る。本発明の組換えアデノウイルスはまた、遺伝子治療において使用され得る。さらに、本発明の組換えアデノウイルスは、被験体を免疫化するために使用され得る。組換えアデノウイルスによる免疫化により、抗原に対して産生された抗体は、診断イムノアッセイ、受動免疫治療および抗イディオタイプ抗体の産生において使用され得る。
【００４５】
本発明はまた、組換えアデノウイルスの産生および／または増殖のためのｒＡｄ産生細胞を産生するためのプラスミド系を提供する。１つの実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスの産生および／または増殖のためのヒト細胞を産生しそして／または増殖するためのプラスミド系を提供し、このプラスミド系は、別個の容器に、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性である、第１発現カセット；および（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第２発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性であり、このＥ１Ｂタンパク質は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を含むがＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を含まない、第２発現カセット。また、上記プラスミド系であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含むプラスミド系が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。さらに、上記プラスミド系であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含むプラスミド系が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。また、上記プラスミド系であって、上記細胞が、樹立細胞株、腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、およびＨｅＬａ細胞株からなる群に由来するプラスミド系が、提供される。また、上記プラスミド系であって、上記第１発現カセットが、配列番号２６に記載の核酸配列を含むプラスミド系が、提供される。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含む。また、上記プラスミド系であって、上記第２発現カセットが、配列番号１５に記載の核酸配列を含むプラスミド系が、提供される。具体的な実施形態において、上記第２発現カセットは、配列番号２に記載の核酸配列を含む。
【００４６】
本発明は、組換えアデノウイルスの産生および／または増殖のためのヒト細胞を産生するためのプラスミド系をさらに提供し、このプラスミド系は、別個の容器に、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第１発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性である、第１発現カセット；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第２発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性である、第２発現カセット；および（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む第３発現カセットであって、このプロモーターは上記ヒト細胞において活性である、第３発現カセット。また、上記プラスミド系であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含むプラスミド系が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。さらに、上記プラスミド系であって、上記Ｅ１Ａタンパク質が以下を含むプラスミド系が、提供される：（ａ）第１の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。また、上記プラスミド系であって、上記細胞が、樹立細胞株、腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、およびＨｅＬａ細胞株からなる群より選択される細胞株に由来するプラスミド系が、提供される。また、上記プラスミド系であって、上記第１発現カセットが、配列番号２６に記載の核酸配列を含むプラスミド系が、提供される。具体的な実施形態において、上記第１発現カセットは、配列番号１に記載の核酸配列を含む。また、上記プラスミド系であって、上記第２発現カセットが、配列番号２３に記載の核酸配列を含むプラスミド系が、提供される。具体的な実施形態において、上記第２発現カセットは、配列番号２０に記載の核酸配列を含む。また、上記プラスミド系であって、上記第３発現カセットが、配列番号２５に記載の核酸配列を含むプラスミド系が、提供される。具体的な実施形態において、上記第３発現カセットは、配列番号１９に記載の核酸配列を含む。
【００４７】
（３．１  用語）
本明細書中で使用される場合、用語「Ａ５４９」は、ヒト肺癌腫細胞株をいい、これは、当該分野で一般に知られている。１つの実施形態において、Ｅ１−相補性細胞株を産生するために使用されるＡ５４９親細胞株は、ＡＴＣＣ株ＣＣＬ−１８５である。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科の属のウイルスをいう。用語「組換えアデノウイルス」は、ウイルスゲノムが従来の組換えＤＮＡ技術を通して改変されている、細胞に感染することが可能なアデノウイルス科の属のウイルスをいう。用語「組換えアデノウイルス」は、また、キメラベクター（またはさらには、多量体ベクター）、すなわち１つより多いウイルスサブタイプ由来の相補的コード配列を用いて構築されたベクターを含む。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「アデノウイルス科」は、マストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを集合的にいい、ヒトアデノウイルス亜属、ウシアデノウイルス亜属、ヒツジアデノウイルス亜属、ウマアデノウイルス亜属、イヌアデノウイルス亜属、ブタアデノウイルス亜属、マウスアデノウイルス亜属およびサルアデノウイルス亜属を含むが、これらに限定されない。より詳細には、ヒトアデノウイルスとしては、Ａ〜Ｆ亜属およびその個々の血清型が挙げられる。Ａ〜Ｆ亜属としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、７ａ型、７ｄ型、８型、９型、１０型、１１（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）型、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型、および９１型。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程」は、組換えアデノウイルスで感染させられかつ／またはｒＡｄベクターによりトランスフェクトされたｒＡｄ相補性細胞株のための、細胞内でウイルスを増殖し得る条件を維持することを意味する。各細胞によって産生されたウイルス粒子の数を最大化するような条件に制御することが望ましい。従って、温度、溶存酸素、ｐＨなどの反応条件をモニタリングし、そして制御する必要がある。ＣｅｌｌｉＧｅｎ  Ｐｌｕｓ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．４４  Ｔａｌｍａｄｇｅ  Ｒｏａｄ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪから購入可能である）のような市販のバイオリアクターは、このようなパラメータをモニタリングしかつ維持するための設備を有する。感染条件、トランスフェクション条件および培養条件の最適化は、いくらか変動し得るが、ウイルスの効率的な複製および産生のための条件が、産生細胞株の公知の特性、ウイルスの特性およびバイオリアクターの型を考慮して、当業者によって達成され得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子における欠損」または「遺伝子機能における欠損」は、核酸配列が完全にまたは部分的に変異されている遺伝子の機能を損なうかまたは除去するように働く変異の型をいう。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「結合における欠陥」は、遺伝子産物が、生理学的条件下で、野生型遺伝子産物の複合体の熱力学的安定性の５０％未満で、その基質と複合体を形成することをいう。例えば、ｐ３００結合ドメイン内に欠失を含む１３Ｓ遺伝子産物は、野生型１３Ｓタンパク質の熱力学的安定性の５０％未満で、ｐ３００タンパク質と結合する。結合の熱力学的安定性は、従来のアッセイ技術によって容易に決定され得、生理学的条件下での平衡結合定数を決定し得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｅ１Ａ遺伝子」は、感染後に最初に転写されたアデノウイルスゲノムの即時型初期遺伝子をいう。このゲノム配列は、９Ｓタンパク質、１０Ｓタンパク質、１１Ｓタンパク質、１２Ｓタンパク質および１３Ｓタンパク質をコードする少なくとも５つのｍＲＮＡの転写物を表す。１２Ｓタンパク質および１３Ｓタンパク質は、感染後の初期段階で発現され、一方、９Ｓタンパク質、１０Ｓタンパク質および１１Ｓタンパク質は、アデノウイルスのサイクルにおいてより後期に発現される。１２Ｓタンパク質および１３Ｓタンパク質は、それぞれ、２４３個および２８９個のアミノ酸を有する。１２Ｓタンパク質および１３Ｓタンパク質はまた、それぞれ２４３Ｒタンパク質および２８９Ｒタンパク質としても公知である。このＥ１Ａゲノム配列中には３つの保存的領域が存在し、保存的領域（「ＣＲ」）−１、ＣＲ２およびＣＲ３と呼ばれる。ＣＲ１は、１２Ｓタンパク質および１３Ｓタンパク質のアミノ酸４１〜８０を表す。ＣＲ２は、１２Ｓ配列および１３Ｓ配列のアミノ酸１２１〜１３９を表す。
【００５４】
完全アデノウイルス５型ゲノムのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）の寄託物（例えば、ＡＹ３３９８６５およびＡＣ  ０００００８を参照）は、利用可能である。ヒトアデノウイルス５型、２８９Ｒ、野生型、アミノ酸配列は、配列番号４によって規定される。ヒトアデノウイルス５型、２４３Ｒ、野生型、アミノ酸配列は、配列番号６によって規定される。ヒトアデノウイルス５型、２８９Ｒ、野生型、アミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託物は、利用可能であり、例えば、ＡＰ  ０００１９７、ＡＹ３３９８６５およびＡＣ  ００００８を参照されたい。ヒトアデノウイルス５型、２４３Ｒ、野生型、アミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託物も、利用可能であり、例えば、ＡＹ３３９８６５を参照されたい。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「発現カセット」は、本明細書中で、異種コード配列の転写および翻訳を指向し得るヌクレオチド配列、および発現されるこの異種コード配列を規定するために使用される。発現カセットは、異種コード配列に作動可能に連結した制御エレメントを含み、それによって、この異種コード配列によってコードされるタンパク質産物の細胞内での発現が、達成される。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「ヘルパーアデノウイルス核酸配列」は、（ｉ）組換えアデノウイルスベクターの複製および／または感染性ビリオンへのパッケージングのためのウイルス機能を提供し；そして（ｉｉ）測定可能な程度までウイルス粒子を複製も、それへの組み立てもしない、核酸配列をいう。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、核酸配列、アミノ酸配列および抗原に関して用語「異種」は、外来性であり、かつ特定のアデノウイルスに関連することが天然で見出されていない、核酸配列、アミノ酸配列および抗原をいう。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「感染させる」は、産生細胞の組換えアデノウイルスによる感染を容易にする条件下で、組換えアデノウイルスをｒＡｄ産生細胞株に曝露することを意味する。多コピー数の所定のウイルスによって感染している細胞において、ウイルス複製のために必要な活性とビリオンパッケージングのために必要な活性とが、協働する。従って、細胞がウイルスに多重感染する有意な可能性が存在するように、条件が調整されることが、好ましい。細胞においてウイルスの産生を増強する条件の例は、感染段階におけるウイルス濃度の上昇である。しかし、１細胞あたりのウイルス感染の総数が、過剰であり、細胞に毒性効果をもたらし得る可能性がある。従って、１ｍｌあたり１０６個〜１０１０個、好ましくは約１０９個のビリオンのウイルス濃度における感染を維持するように努めるべきである。化学薬剤もまた、細胞株の感染性を増大させるために使用され得る。例えば、本発明は、カルパインインヒビターを含めることによって、ウイルス感染性についての細胞株の感染性を上昇させるための方法を提供する。本発明の実施において有用なカルパインインヒビターの例としては、カルパインインヒビター１（Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナルとしても公知であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入可能である）が挙げられる。カルパインインヒビター１は、細胞株の組換えアデノウイルスに対する感染性を上昇させることが観察されている。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」は、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸配列は、別の核酸配列と機能的に関係するように配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、これらは、コード配列に作動可能に連結される。作動可能な連結は、代表的には、連結されるヌクレオチド配列が連続していることを意味する。しかし、エンハンサーは、一般的に、プロモーターから数キロ塩基離れている場合に機能し、イントロン配列は、長さが変動し得る。いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されるが、直接隣接して連結されなくてもよく、そして異なる対立遺伝子もしくは染色体からトランスで機能すらし得る。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「ｐ３００タンパク質ファミリーメンバー」は、Ｅ１Ａのアミノ末端に結合するタンパク質をいい、ｐ３００およびＣＢＰが挙げられる。より詳細には、ｐ３００は、トランス活性化遺伝子であるＭｙｂおよびＣ／ＥＢＰの活性を同時活性化する（Ｍｉｎｋ，ら（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７：６６０９−６６１７）。ヒトｐ３００タンパク質は、当該分野で公知であり、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから、Ｑ０９４７２のアクセッション番号の下で公に利用可能であり、その対応するｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋから、Ｕ０１８７７のアクセッション番号（１９９４年６月６日に寄託され、Ｅｃｋｎｅｒら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：８６９−８８４において記載される）の下で利用可能である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、絶縁領域、サイレンシング領域、ポリアデニル化部位などをいう。用語「プロモーター」は、その従来的な意味で使用され、ヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列においてコード配列の転写の開始および速度が制御されるものをいう。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する部位を含み、そしてまた調節因子（例えば、リプレッサーもしくは転写因子）の結合のための部位をも含む。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであっても、合成プロモーターであってもよい。使用されるベクターがウイルスベクターである場合、プロモーターは、ウイルスに対して内因性であってもよく、または他の供給源由来であってもよい。調節エレメントは、従って、特定の細胞型においてのみトランスジーンの発現を可能にするか、増大するか、または促進するように配列され得る。例えば、発現カセットは、トランスジーンがプロモーターの制御下にあるように設計され得、このプロモーターは、構成的に活性であるプロモーターか、または一時的に制御されるプロモーター（一時的プロモーター）か、外部刺激に応答して活性化される（誘導可能な）プロモーターか、特定の細胞型もしくは特定の細胞状態において活性である（選択的）構成的プロモーター、一時的ウイルスプロモーターもしくは調節可能プロモーターである。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「組換えアデノウイルスベクター」は、アデノウイルスヌクレオチド配列および必要に応じて１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むベクター構築物をいう。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスヌクレオチド配列を含み、この配列は、ヘルパーアデノウイルス核酸配列に対し何ら相同性を有さない。別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードする。この実施形態に従い、組換えアデノウイルスベクターは、例えばアデノウイルスゲノム中に１つ以上の変異を導入する（例えば、アデノウイルスタンパク質についての１つ以上のコード領域における欠失を導入する）ことによって変異されたアデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「ｒＡｄ産生細胞株」、「ｒＡｄ相補性細胞」、および「ｒＡｄ相補性細胞株」は、同義語であり、そして組換えアデノウイルスの複製および／または感染性ビリオンへのそのパッケージングのためのウイルス機能を提供することによって、組換えアデノウイルスを増殖可能である細胞を意味する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｒｂタンパク質ファミリーメンバー」は、網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐｂ１０５）、ｐ１０７およびｐ１３０をいう。網膜芽細胞腫遺伝子は、当該分野で十分に特徴付けられている。ヒトＲｂのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号１９０９５９の下で利用可能である（１９９５年７月１２日に寄託され、Ｌｅｅら（１９８８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：６０１７−６０２１によって記載される）。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「安定的に組み込まれる」は、異種核酸配列に関して、細胞の後継の世代が、異種核酸配列を保持するように、このような配列が細胞のゲノム内に組み込まれることを意味する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」もしくは「形質転換」は、細胞内への核酸の導入を意味する。導入されたＤＮＡもしくはＲＮＡを受容する宿主細胞は、「形質転換」されており、そしてそれらは「形質転換体」または「クローン」である。当該分野で非常に周知の形質転換方法の例としては、リポソーム送達、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ４形質転換、ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換、マイクロインジェクションおよびウイルス感染が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」はまた、インビトロ動物細胞培養物に関して、不可逆的に遺伝的変更を介して生じたと考えられる細胞の表現型の永久的な改変を意味し得る。「形質転換細胞」は、通常、他の可能性のある表現型特性の中でも、永久的な寿命を有するか、もしくはこの細胞が由来する有限細胞株すなわち一次細胞株の細胞と比較して有意に（または非常に）長い寿命を有する細胞をいう。用語が使用される文脈は、意味を左右する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、２４３Ｒ  Ｅ１Ａタンパク質および２８９Ｒ  Ｅ１Ａタンパク質の機能的ドメインの概略図である。細胞性タンパク質ｐ３００／ＣＢＰおよびｐＲｂの結合のために必要とされる領域は、細胞性アポトーシスの活性化、休止細胞における細胞周期の進行の誘導およびアデノウイルス初期遺伝子領域の転写活性化のために必要なドメインとして示される。
【図２】ｐＲｃＲＳＶ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７のプラスミドマップ。ＲＳＶプロモーター：開始：２０９  終止：６０５ＢＧＨポリＡシグナル：開始：１５５６  終止：１７８２ｆ１起点：開始：１８３８  終止：２３６０ＳＶ４０プロモーター：開始：２４２２  終止：２７４７ＳＶ４０起点：開始：２６１６  終止：２７０１ネオマイシン耐性遺伝子：開始：２７５３  終止：３５４７  ＳＶ４０ポリＡシグナル：開始：３５５１  終止：３７６０ｐＵＣ１９配列（４４８〜２６２２）：開始：３９００  終止：６０７４Ｃｏｌ  Ｅ１起点：開始：４０８３  終止：４６０６アンピシリン耐性遺伝子：相補体（５０９０．．５９５０）Ｅ１Ａ  １２Ｓ  ＣＤＳ  Ｎ−末端：開始：６３３  終止：９４４Ｅ１Ａタンパク質開始（ＡＴＧ）：開始：６３３  終止：６３５Ｅ１Ａ  １３Ｓ  ＣＤＳ  Ｎ−末端：開始：６３３  終止：１０８２Ｅ１Ａ  １２ｓ  ｍＲＮＡについてのスプライシングドナー：開始：９４２  終止：９４２Ｅ１Ａ  １３ｓ  ｍＲＮＡについてのスプライシングドナー：開始：１０８０  終止：１０８０Ｅ１Ａ  １２Ｓ／１３Ｓ  ＣＤＳ  Ｃ−末端ＣＤＳ：開始：１１９９  終止：１５１３Ｅ１Ａ  ３２ｋ／２７ｋのための停止ＴＡＡ：開始：１５１１  終止：１５１３ｄｌ１１０１変異（ＷＴのアミノ酸４〜２５を欠失）：開始：６４４  終止：６４５ｄｌ１１０７変異（ＷＴのアミノ酸１１１〜１２３を欠失）：開始：８９６  終止：８９７。
【図３】ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｅ１Ｂ−５５ｋ  Ｈｙｇｒｏのプラスミドマップ。ＣＭＶプロモーター：開始：２０９終止：８６３Ｔ７プロモーター／プライミング部位：開始：８６３  終止：８８２ｐｃＤＮＡ３．１  ＢＧＨ逆プライミング部位：開始：２４７０  終止：２４８７ＢＧＨポリＡシグナル：開始：２４６９  終止：２６８３ｆ１起点：開始：２７４６  終止：３１５９ＳＶ４０プロモーターおよび起点：開始：３２２４  終止：３５４８ハイグロマイシン耐性遺伝子ＣＤＳ：開始：３５６６  終止：４５８９ＳＶ４０初期ポリＡシグナル：開始：４６０２  終止：４９７４ｐＭＢ１（ｐＵＣ由来）起点：相補体（５２３４．．５９０４）アンピシリン耐性遺伝子：相補体（６０４９．．６９０９）Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ（４９５Ｒ）ＣＤＳ：開始：９４２  終止：２４３０。
【図４】ｐＶＩＴＲＯ２１ＲＥＳＰｕｒｏＥ１ｂのプラスミドマップ：ヒトフェリチン重サブユニットプロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーによって駆動され、細胞選択のためにアデノウイルス配列の下流のＩＲＥＳエレメントの後にピューロマイシン耐性遺伝子を含む、全Ｅ１ｂおよびｐＩＸコード配列をコードするプラスミド。
【図５】ｐＭＧＣＭＶＥ２Ｂｐｏｌのプラスミドマップ。全長Ｅ２ｂポリメラーゼコード配列の発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを用い、これの後ろに、ＩＲＥＳ配列およびハイグロマイシン耐性遺伝子（選択のために使用される）を有するプラスミド。
【図６】ウイルス構築物の概略図。Ｅ１領域、Ｅ２ｂ領域、およびＥ３領域におけるウイルス構築物間の類似および相違を示す。ＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットは、ＧＦＣＢウイルスおよびＣＧＡＢウイルスのＥ１領域内に挿入され、そして４２ＧＣ、２ＧＣＰ、および４６ＧＣについては、５’から３’への方向の挿入物としてＥ３領域内に挿入される。ＣＯＮＧは、示すように、Ｅ１領域およびＥ３領域の両方において発現カセットを有する。２ＧＣＰ構築物は、Ｅ２ｂウイルスＤＮＡポリメラーゼ領域において欠失を有し、これは、その発現を妨げる。さらなる詳細は、実施例２において見出され得る。
【図７Ａ】細胞におけるＥ２ｂポリメラーゼの発現およびＥ２ｂポリメラーゼ欠損ウイルスのウイルス産生性における効果。単離されたクローン３Ｃ４、３Ｃ９および３Ｄ８の細胞溶解物からのＥ２ｂポリメラーゼタンパク質の、Ｅ２ｂポリメラーゼを補わない親クローン４および未改変Ａ５４９細胞に対するウエスタン分析。ウエスタンの下部は、β−アクチンタンパク質の検出を示し、１レーンにつきローディングしたタンパク質の総量が同じであることを検証する。
【図７Ｂ】細胞におけるＥ２ｂポリメラーゼの発現およびＥ２ｂポリメラーゼ欠損ウイルスのウイルス産生性における効果。Ｅ２ｂポリメラーゼ欠損２ＧＣＰウイルスで感染させた細胞１個あたりに産生されるウイルス粒子。プロットした結果は、５×１０８Ｐ／ｍｌの精製２ＧＣＰウイルスで感染させた記載のクローンの２連の１０ｃｍプレートからの結果＋／−標準偏差である。
【図８Ａ】Ｅ１ｂ相補性およびウイルス産生性に対する効果。５×１０８Ｐ／ｍｌのＧＦＣＢウイルスまたはＣＯＮＧウイルスのいずれかで感染させた個々のクローンからの感染４８時間後のＧＦＰ蛍光の写真。
【図８Ｂ】Ｅ１ｂ相補性およびウイルス産生性に対する効果。細胞蛍光分析（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定される、ＣＯＮＧ感染細胞からのＧＦＰ蛍光対ＧＦＣＢで感染させた同じクローンからの蛍光の比をプロットする。
【図８Ｃ】Ｅ１ｂ相補性およびウイルス産生性に対する効果。５×１０８Ｐ／ｍｌの精製２ＧＣＰウイルスで感染させた記載のクローン１細胞あたりに産生されるウイルス粒子＋／−標準偏差。
【図９Ａ】異なる細胞株におけるウイルス産生性およびクローン１５Ｍ１５の安定性。親クローン３Ｄ８（Ｅ１ｂ相補なし）、選択したクローン１５Ｍ１５（Ｅ１ｂ相補あり）もしくはＣ７細胞（２９３に基づく、Ｅ２ｂポリメラーゼ相補性）のいずれか由来の細胞１個あたりに産生されるウイルス粒子。プロットした結果は、５×１０８Ｐ／ｍｌの精製２ＧＣＰウイルスで感染させた記載のクローンの２連の１０ｃｍプレートからの結果＋／−標準偏差である。
【図９Ｂ】異なる細胞株におけるウイルス産生性およびクローン１５Ｍ１５の安定性。クローン１５Ｍ１５からのウイルス産生性。細胞を感染させ、そしてハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびＧ４１８含有選択混合培地もしくは選択薬物非含有の標準増殖培地のいずれかにおける増殖の１回、５回または１０回の継代後に収集した。記載のように、細胞を、２×１０９Ｐ／ｍｌウイルスまたは１×１０９Ｐ／ｍｌウイルスのいずれかの２ＧＣＰウイルスで感染させた。結果を、ウイルス粒子／細胞として各サンプルからプロットする。
【図９Ｃ】異なる細胞株におけるウイルス産生性およびクローン１５Ｍ１５の安定性。Ｅ１ａポリメラーゼタンパク質およびＥ２ｂポリメラーゼタンパク質の発現。パネルＢで概説した並行感染物を収集し、そして細胞溶解産物からのＥ１ａポリメラーゼタンパク質およびＥ２ｂポリメラーゼタンパク質を、ウエスタンブロット分析によって分析した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ結果に基づき、サンプルを、１ウェルあたり等量のタンパク質濃度の総量でローディングした。
【図１０】感染細胞からの後期Ａｄ遺伝子発現。パネルＡ〜Ｄは、感染細胞から発現され、ウエスタンブロット分析によって検出されるヘキソンおよび線維のレベルを示す。（パネルＡ）クローン１５Ｍ１５産生細胞株。（パネルＢ）非相補性ＣＨＯ細胞株。（パネルＣ）および（パネルＤ）部分的Ｅ１ａ機能相補性細胞株（それぞれＨｅｌａおよびＨｅｐＧ２）。ウイルス名：Ｇ＝ＧＦＣＢ、Ｃ＝ＣＧＡＢ、４＝４２ＧＣ、２＝２ＧＣＰ、６＝６ＧＣＰ、Ｕ＝未感染、Ｌ＝ラダー。
【図１１Ａ】インビトロＧＦＰ発現。５×１０８Ｐ／ｍｌのＣＧＡＢウイルス、４２ＧＣウイルス、もしくは２ＧＣＰウイルスによる感染後の経時的な、ＨＯＦ細胞もしくはＳａｏｓ２細胞からのＧＦＰ発現。グラフは、２連の感染ウェルのＧＦＰ発現の細胞蛍光定量＋／−標準偏差をプロットする。感染８日後の感染細胞の写真を、右に示す。
【図１１Ｂ】インビトロＧＦＰ発現。５×１０８Ｐ／ｍｌのＣＧＡＢウイルス、４２ＧＣウイルス、もしくは２ＧＣＰウイルスによる感染後の時間にわたる、ＨＯＦ細胞もしくはＳａｏｓ２細胞からのＧＦＰ発現。グラフは、２連の感染ウェルのＧＦＰ発現の細胞蛍光定量＋／−標準偏差をプロットする。感染８日後の感染細胞の写真を、右に示す。
【図１１Ｃ】インビトロＧＦＰ発現。５×１０８Ｐ／ｍｌのＣＧＡＢウイルス、４２ＧＣウイルス、もしくは２ＧＣＰウイルスによる感染後の時間にわたる、ＨＯＦ細胞もしくはＳａｏｓ２細胞からのＧＦＰ発現。グラフは、２連の感染ウェルのＧＦＰ発現の細胞蛍光定量＋／−標準偏差をプロットする。感染８日後の感染細胞の写真を、右に示す。
【図１１Ｄ】インビトロＧＦＰ発現。５×１０８Ｐ／ｍｌのＣＧＡＢウイルス、４２ＧＣウイルス、もしくは２ＧＣＰウイルスによる感染後の時間にわたる、ＨＯＦ細胞もしくはＳａｏｓ２細胞からのＧＦＰ発現。グラフは、２連の感染ウェルのＧＦＰ発現の細胞蛍光定量＋／−標準偏差をプロットする。感染８日後の感染細胞の写真を、右に示す。
【図１１Ｅ】インビトロＧＦＰ発現。パネルＤにおける感染ＣＨＯ細胞からのＧＦＰ発現。グラフは、２連の感染ウェルのＧＦＰ発現の細胞蛍光定量＋／−標準偏差をプロットする。感染１５日後の感染細胞の写真を、右に示す。
【図１１Ｆ】インビトロＧＦＰ発現。パネルＤにおける感染ＣＨＯ細胞からのＧＦＰ発現。グラフは、２連の感染ウェルのＧＦＰ発現の細胞蛍光定量＋／−標準偏差をプロットする。感染１５日後の感染細胞の写真を、右に示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、ｒＡｄ産生細胞株、このｒＡｄ産生細胞株を産生する方法、およびこのｒＡｄ産生細胞株を用いて組換えアデノウイルスを産生するための方法を、提供する。
【００６９】
本発明に従い、当該分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献において説明される。例えば、以下を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）。
【００７０】
（５．１  ヘルパーアデノウイルス核酸配列）
本発明のヘルパーアデノウイルス核酸配列は：（ｉ）組換えアデノウイルス構築物の複製および／またはその感染性ビリオンへのパッケージングのためのウイルス機能を提供し；そして（ｉｉ）測定可能な程度でウイルス粒子に複製もされず、ウイルス粒子へも組み立てられない。このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、任意のアデノウイルス科またはアデノウイルス科の組み合わせから得られ得、そして／またはこれらに由来し得る。好ましい実施形態において、このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、ヒトアデノウイルス科から得られ、そして／またはこれに由来し得る。別の好ましい実施形態において、このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、ヒトアデノウイルス血清型２もしくは５から得られ、そして／またはこれに由来し得る。アデノウイルスタンパク質についての核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースもしくはそれに類似のデータベース、刊行物文献から得られるか、または慣用的なクローニングおよび配列決定によって得られる。
【００７１】
１つの実施形態において、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質（例えば、Ｅ１Ｂ−５５Ｋおよび／またはＥ１Ｂ−１９Ｋ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。この実施形態に従い、このヘルパーアデノウイルス核酸配列はまた、以下のうちの１つ、２つもしくはそれ以上を含み得る：（ｉ）アデノウイルスＥ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｉｉ）アデノウイルスＥ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および／または（ｉｉｉ）アデノウイルスＬ４  １００Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。アデノウイルスＥ２タンパク質の非限定的な例としては、Ｅ２Ａ結合タンパク質、Ｅ２Ｂポリメラーゼ、Ｅ２Ｂ末端タンパク質前駆体、およびＥ２ＢＩＶａ２タンパク質が挙げられる。アデノウイルスＥ４タンパク質の非限定的な例としては、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）−６、ＯＲＦ３、およびＯＲＦ６／７によってコードされるタンパク質が挙げられる。表１は、ヒトアデノウイルス血清型  ５  Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ２Ｂポリメラーゼタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の例を提供する。
【００７２】
特定の実施形態において、上記のヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下を含む核酸分子を含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列；および（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質（例えば、Ｅ１Ｂ−５５Ｋおよび／またはＥ１Ｂ−１９Ｋ）をコードするヌクレオチド配列。これらの実施形態に従い、この核酸配列はまた、以下の１つ、２つまたはそれ以上を含み得る：（ｉ）アデノウイルスＥ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）アデノウイルスＥ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および／または（ｉｉｉ）アデノウイルスＬ４  １００Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００７３】
特定の実施形態において、ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、ペプチド結合を介して異種タンパク質配列に結合したアデノウイルスタンパク質を含む融合タンパク質産物もしくはキメラタンパク質産物をコードする。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を、当該分野で公知の方法によって正しいコーディングフレーム内に互いにライゲーションすること、および当該分野で公知の方法によりキメラ産物を適切な宿主において発現させることによって作製され得る。
【００７４】
具体的な実施形態において、上記のヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、このＥ１Ｂタンパク質は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を含むがＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を含まない、核酸分子。別の好ましい実施形態において、このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｉｉ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００７５】
アデノウイルス変異体Ｅ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本発明に従うヘルパーアデノウイルス核酸配列として使用され、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターの高レベルの産生のために必要とされる機能のみを提供する。より具体的には、このヌクレオチド配列は、細胞性タンパク質ｐ３００／ＣＢＰおよび細胞性タンパク質ｐＲｂに対する結合に欠陥を有するが、なお野生型ＣＲ３ドメインを保有するＥ１Ａタンパク質をコードし、この野生型ＣＲ３ドメインは、溶解性増殖の第１段階のために必要である初期ウイルスプロモーターをトランス活性化する。このようなヌクレオチド配列の使用は、腫瘍細胞における野生型アデノウイルスＥ１Ａタンパク質に伴う毒性を克服する。
【００７６】
ｐ３００およびｐＲｂの結合に欠陥を有するＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いることの理論的根拠は、部分的に、細胞性ＤＮＡ合成の誘導のために必要なＥ１Ａ機能および初期アデノウイルス転写単位の活性化のために必要なＥ１Ａ機能を切り離したマッピング研究に基づく。Ｅ１Ａアデノウイルスタンパク質が初期転写単位を活性化する能力は、首尾よい産生性の感染のために、全ての産生細胞株において必要とされるが、Ｅ１Ａが細胞周期を誘導する能力は、連続的に分裂する樹立細胞株においては必要とされない場合がある。本明細書中に記載の変異したアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、転写を活性化する能力を有するが、細胞性ＤＮＡ合成の誘導に欠陥を有する。細胞性ＤＮＡ合成の刺激のために必要とされるアデノウイルスＥ１Ａ領域はまた、アポトーシスの誘導を担い得、そしてこれは、Ｅ１−相補性細胞株の首尾よい樹立を妨げ得る。
【００７７】
細胞性タンパク質ｐ３００／ＣＢＰおよび細胞性タンパク質ｐＲｂに対する結合に欠陥を有するＥ１Ａタンパク質を産生するために、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒコード領域およびＥ１Ａ  ２４３Ｒコード領域における変異が、導入され得る。具体的な実施形態において、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒコード領域およびＥ１Ａ２４３コード領域における欠失は、ｐ３００ファミリーメンバーおよびｐＲｂファミリーメンバーのＥ１Ａタンパク質に対する結合における減少を達成するように誘導される。好ましくは、ｐ３００結合およびｐＲｂ結合の減少を達成するために必要であるＥ１Ａ  ２８９Ｒコード配列およびＥ１Ａ  ２４３Ｒコード配列における欠失は、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質の二次構造および三次構造の大幅な破壊を防止し得るように、可能な限り最小限である。
【００７８】
ｐ３００結合を除去するために、Ｅ１Ａ  ２８９ＲおよびＥ１Ａ  ２４３Ｒのｐ３００結合ドメインをコードするヌクレオチド配列において、変異を導入することが、好ましい。Ｅ１Ａ−１２Ｓタンパク質および１３Ｓタンパク質のｐ３００結合ドメインは、最初の６９アミノ酸にまで狭められている（Ｅｇａｎ，ら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３９５５−３９５９）。しかし、アミノ酸２６〜３５は、ｐ３００結合のために必要ではないことが示されている。１２Ｓ分子および１３Ｓ分子において、ｐ３００結合の２つの領域が存在し、およそアミノ酸残基４〜２５およびアミノ酸残基３６〜４９である。それらの一方もしくは両方の除去は、ｐ３００結合を破壊するために十分である。好ましくは、アミノ酸残基４〜２５の除去が、ｐ３００結合機能を除去するために使用される。ｐ３００結合を除去するためにはＣ末端領域における約３０アミノ酸未満の欠失が好ましいが、より小さな改変が、より好ましい。具体的な実施形態において、ｐ３００結合を除去するためのＣ末端領域における欠失は、２５アミノ酸またはそれ未満、２０アミノ酸またはそれ未満、１５アミノ酸またはそれ未満、あるいは１０アミノ酸またはそれ未満である。２８９Ｒタンパク質および２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５の欠失は、ＣＲ３のトランス活性化機能に影響を及ぼすことなく、ｐ３００結合を破壊するために十分である。「ＣＲ３ドメインのトランス活性化機能」は、Ｅ１Ａ遺伝子の産物の、ウイルス周期のより後期のプロモーター（例えば、Ｅ１ＢおよびＥ３）の転写を活性化する能力をいう。ＣＲ３領域は、１３Ｓタンパク質のみにおいて機能的に存在し、そしてアミノ酸１４０〜１８８を表す。Ｅ１Ａ遺伝子産物のトランス活性化機能は、ＣＲ３領域内に含まれる。あるいは、ｐ３００結合を除去するために、アミノ酸残基３０〜アミノ酸残基４９（ｄｌ１１０３）のアミノ酸、およびより好ましくは、アミノ酸残基３６〜アミノ酸残基４９のアミノ酸の欠失が、好ましい。
【００７９】
ｐ３００結合を破壊するために十分な点変異が、特に好ましい。例えば、２８９Ｒタンパク質における第２のアミノ酸のアルギニンからグリシンへ（Ａｒｇ２からＧｌｙ２へ）の点変異は、ｐ３００結合を破壊することが示されている（例えば、ｐｍ５６３、Ｗｈｙｔｅ，ら，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：６７−７５を参照）。
【００８０】
Ｅ１Ａ−１２Ｓタンパク質およびＥ１Ａ−１３Ｓタンパク質のＲｂ−１０５結合ドメインは、アミノ酸１１１〜１２７内に配置されることが特徴付けられている。同様に、ｐＲｂ１０５結合を除去することに関して、最小の改変が好ましい。具体的な実施形態において、ｐＲｂ結合ドメインにおいて、２０アミノ酸未満、１５アミノ酸以下、または１０アミノ酸以下の欠失が、導入される。ｐＲｂ１０５結合ドメインにおける選択的なアミノ酸の除去、例えばアミノ酸１１１〜１２３の除去（ｄｌ１１０７）およびアミノ酸１２４〜１２７の除去（ｄｌ１１０８）が、好ましい。１つの実施形態において、Ｍｏｒａｎらによって示された変異（ｐｍ９２８（Ｃ１２４Ｇ））が、ｐＲｂ１０５結合を破壊するために使用される（（１９８６）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（１０）：３４７０−３４８０）。
【００８１】
具体的な実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａ変異体Ｅ１Ａｄｌ０１／０７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が、ヘルパーアデノウイルス核酸配列として使用される。Ｅ１Ａｄｌ０１／０７タンパク質は、細胞性タンパク質ｐ３００／ＣＢＰおよび細胞性タンパク質ｐＲｂに対する結合に欠陥を有するが、野生型ＣＲ３ドメインをなお保有し、この野生型ＣＲ３ドメインは、溶解性増殖の第１段階のために必要である初期ウイルスプロモーターをトランス活性化する。これは、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質が細胞性ＤＮＡ合成およびアポトーシスを誘導する能力に影響する変異を有するが、野生型ＣＲ３ドメインをなお保有し、この野生型ＣＲ３ドメインは、溶解性増殖の第１段階のために必要である初期ウイルスプロモーターをトランス活性化する（ＷｉｎｂｅｒｇおよびＳｈｅｎｋ，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１９０７−１９１２）。
【００８２】
ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、微生物において（例えば、細菌性プラスミドもしくはバクテリオファージの一部として）増殖され得る。アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、組換えプラスミド、組換えバクテリオファージなどの中に、当該分野で周知の方法によって組み込まれ得る。
【００８３】
具体的な実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、調節エレメントに作動可能に連結される。特定の実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質コード配列を転写しそして翻訳するために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入される。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、アデノウイルスタンパク質の天然のプロモーターによって供給されてもよく、そして／または異種プロモーターによって供給されてもよい。当該分野で利用可能な任意の方法が、ヌクレオチド配列のベクター内への挿入により、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含む発現ベクターを構築するために使用され得る。
【００８４】
１つの実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードする各ヌクレオチド配列は、発現ベクター内に挿入される。代替の実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードする２つ以上のヌクレオチド配列は、１つの発現ベクター内に挿入される。
【００８５】
具体的な実施形態において、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター、１つ以上の複製起点、および必要に応じて、１つ以上の選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが、使用される。この実施形態に従い、プロモーターは、当業者に公知の任意のプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導可能プロモーターであり得る。本発明に従って使用され得るプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｍｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復内に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ−αプロモーター、ｈＦｅｒ／ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、Ｅｌｆ−１プロモーター、Ｔｅｔプロモーター、エクジソンプロモーターおよびラパマイシンプロモーター。
【００８６】
具体的な実施形態において、天然のプロモーターが、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節するために使用される。代替の実施形態において、発現されるタンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子に対して天然ではないプロモーター（すなわち、異種プロモーター）が、このタンパク質の発現を調節するために使用される。特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ウイルス構成的プロモーター、細胞性構成的プロモーターもしくはハイブリッド構成的プロモーター）である。他の実施形態において、プロモーターは、誘導可能プロモーターである。なお他の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
【００８７】
特定の実施形態において、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＲ−αプロモーターもしくはｈＦｅｒ／ＳＶ４０プロモーター）を、１種以上の以下のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節するために使用することが望ましい：Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ２Ａタンパク質および／またはＥ２Ｂタンパク質。特定の他の実施形態において、構成的プロモーター（例えば、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターもしくはＥｌｆ−１プロモーター）を、１種以上の以下のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を調節するために使用することが望ましい：Ｅ１Ａタンパク質および／またはＥ４タンパク質。なお他の実施形態において、誘導可能プロモーター（例えば、Ｔｅｔプロモーターもしくはエクジソンプロモーター）を、Ｌ４  １００Ｋの発現を調節するために使用することが、望ましい。
【００８８】
目的のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、３つの一般的アプローチによって同定され得る：（１）核酸ハイブリダイゼーション、（２）「マーカー」遺伝子機能の存在もしくは非存在、および（３）挿入された配列の発現。第１のアプローチにおいて、コード配列は、挿入された配列に対して相同でありかつ相補的である配列を含むプローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター内への目的の配列の挿入によって生じる特定の「マーカー」機能（例えば、抗生物質に対する耐性、バキュロウイルスにおける包埋体の形成など）の存在もしくは非存在に基づいて同定され得かつ選択され得る。例えば、アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部分が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、コードされるタンパク質もしくはその一部分によってトランスフェクトされた細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性の喪失）によって同定される。第３のアプローチにおいて、発現ベクターは、組換えベクターによって発現されるアデノウイルスタンパク質についてアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系において相互作用する種の物理的特性もしくは機能的特性（例えば、抗体に対する結合）に基づき得る。
【００８９】
ヘルパーアデノウイルス核酸は、細胞株内に組み込まれ得、それによって、ヘルパーアデノウイルス核酸配列と組換えアデノウイルスベクター配列とを同時トランスフェクトする必要を回避する。その代わり、ヘルパーアデノウイルス核酸配列含有細胞株の組換えアデノウイルスベクターによるトランスフェクションは、組換えアデノウイルスの産生を直接的にもたらす。本発明は、このような細胞株を提供する。下記の５．３章を参照されたい。
【００９０】
（５．２  組換えアデノウイルス構築物）
本発明の組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスヌクレオチド配列、および必要に応じて、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヘルパーアデノウイルス核酸配列に対する相同性を有さないアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。アデノウイルスヘルパー核酸配列と組換えアデノウイルスベクターとの間の相同性の欠如は、複製能力を有するアデノウイルスを産生するウイルスゲノム組換えの可能性を低下させる。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードする。この実施形態に従い、組換えアデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスゲノム内の１つ以上の変異の導入（例えば、アデノウイルスタンパク質についての１つ以上のコード領域における欠失の導入）によって、変異したアデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。好ましくは、アデノウイルスゲノム内の変異は野生型アデノウイルスよりも低いレベルのアデノウイルスタンパク質の発現をもたらす。アデノウイルスタンパク質発現の低下は、被験体におけるアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答を減少させる。
【００９１】
具体的な実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）およびＥ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）の部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）欠失を有する変異したゲノムを含み、そして１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）、Ｅ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）、およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域（例えば、配列番号２３）の部分的もしくは完全な（好ましくは完全な）欠失を有する変異したゲノムを含み、そして１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。異種ヌクレオチド配列は、ゲノムの任意の領域（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端）内に導入され得る。具体的な実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、変異したアデノウイルスゲノムにおける欠失したアデノウイルスコード領域（例えばＥ１Ａコード領域もしくはＥ２Ｂコード領域）の１つの中に導入される。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードし、そしてＥ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）、Ｅ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）、Ｅ２Ｂポリメラーゼコード領域（例えば、配列番号２５）およびＥ３コード領域の部分的もしくは完全な（好ましくは完全な）欠失を有する変異したゲノムを含み、そして欠失したＥ３コード領域内に異種ヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
本発明に従い、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターは、任意のアデノウイルス科もしくはアデノウイルス科の組み合わせから得られかつ／またはこれらに由来する、アデノウイルスゲノムもしくはその一部分を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス科から得られかつ／またはこれらに由来する、アデノウイルスゲノムもしくはその一部分を含む。別の好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２もしくは５から得られかつ／またはこれらに由来する、アデノウイルスゲノムもしくはその一部分を含む。
【００９３】
本発明のｒＡｄベクターは、任意の異種ヌクレオチド配列（遺伝子もしくは遺伝子の一部分を含む）を組み込み得る。ｒＡｄベクターの一部分として、容易に検出可能な産物を有する遺伝子（当該分野で、マーカー遺伝子、レコーダー遺伝子もしくはレポーター遺伝子として公知である）を組み込むことが、所望され得るが、本発明は、このような構築物に限定されない。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、ほんの２、３例を挙げると、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスホロトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【００９４】
本発明の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ｒＡｄベクター以外の供給源から得られ、そして／またはこれらに由来する。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、このｒＡｄベクターが由来するアデノウイルスの種、サブグループもしくは改変体とは異なる種、サブグループもしくは改変体に属するウイルスの抗原性タンパク質、抗原性ポリペプチドもしくは抗原性ペプチドをコードする。他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルス起源ではない。これらの実施形態に従い、異種ヌクレオチド配列は、所望の生物学的特性もしくは活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードし得る。このような異種ヌクレオチド配列は、タグもしくはマーカーをコードし得る。このような異種ヌクレオチド配列は、生物学的応答改変因子（例としては、インターロイキン、ホルモンもしくは増殖因子が挙げられる）をコードし得る。
【００９５】
特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、アデノウイルス以外のウイルスから得られ、そして／またはこれに由来する、抗原性タンパク質、抗原性ポリペプチドもしくは抗原性ペプチドをコードする。このようなウイルスの非限定的な例は、以下の科に由来する：アデノウイルス科（例えば、アレナウイルス属、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピイ（Ｉｐｐｙ）ウイルスおよびラッサウイルス）、アルテリウイルス属（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）（例えば、ウマ動脈炎ウイルス）、アストロウイルス科（例えば、アストロウイルス属）、ブンヤウイルス科（例えば、ブンヤウイルス属、ブンヤムウェラウイルス、ハンタウイルス属、クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、フレボウイルス属、およびリフトバレー熱複合体（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  ｆｅｖｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ））、カリシウイルス科（例えば、カリシウイルス属）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス属、トロウイルス属およびＳＡＲＳ）、デルタウイルス属、フィロウイルス科（例えば、フィロウイルス属、マルブルクウイルスおよびエボラウイルスザイール）、フラビウイルス科（例えば、フラビウイルス属、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス群、日本脳炎群、ペストウイルス属およびＣ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、１型ヒトヘルペスウイルス、ワリセラウイルス属（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、３型ヒトヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス属、５型ヒトヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス属、６型ヒトヘルペスウイルス、および４型ヒトヘルペスウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルス）、パポバウイルス科（例えば、パピローマウイルス属）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス属、１型ヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス属、麻疹ウイルス、ルブラウイルス属、ムンプスウイルス、肺炎ウイルス属およびヒトＲＳウイルス）、パルボウイルス科（例えば、パルボウイルス属およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルス属、１型ヒトポリオウイルス、ライノウイルス属、ヘパトウイルス属、ヒトＡ型肝炎ウイルス、カルジオウイルス属、脳炎心筋炎ウイルス、アフトウイルス属およびＯ型口蹄疫ウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよびミクソーマウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス属、ロタウイルス属、コルチウイルス属、シポウイルス属およびフィジーウイルス属）、レトロウイルス科（例えば、マウス白血病ウイルス、ヒトＴリンパ球性白血病（ＨＴＬＶ）−１および２、ならびにレンチウイルス属（例えば、１型ヒト免疫不全ウイルス、２型ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス属、リッサウイルス属および狂犬病ウイルス）、ならびにトガウイルス科（例えば、シンドビスウイルス、ルビウイルス属および風疹ウイルス）。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（編）１９９１，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ウイルスおよびウイルス抗原の記載について、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照されたい。
【００９６】
特定の実施形態において、上記異種ヌクレオチド配列は、細菌、真菌および／もしくは他の病原体または寄生生物から得られかつ／あるいはこれらに由来する、抗原性タンパク質、ポリヌクレオチドまたはペプチドをコードする。細菌から得られかつ／または細菌に由来する異種ヌクレオチド配列の例としては、以下の属の種：
【００９７】
【数１】
2011015696.tif 000004
ならびに以下のような細菌種：
【００９８】
【数２】
2011015696.tif 000005
に由来する抗原をコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
真菌に由来する異種ヌクレオチド配列の例としては、以下のような真菌：
【０１００】
【数３】
2011015696.tif 000006
ならびに病原性であることが現在公知であるかまたは後に同定される任意の他の酵母または真菌から得られかつ／またはこれらの真菌に由来する抗原をコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
最後に、寄生生物から得られかつ／または寄生生物に由来する異種ヌクレオチド遺伝子配列の例としては、
【０１０２】
【数４】
2011015696.tif 000007
ならびに病原性であることが現在公知であるかまたは後に同定される任意の他の寄生虫に由来する抗原をコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明の他の異種ヌクレオチド配列としては、自己免疫疾患を特徴付ける抗原をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。これらの抗原は、代表的に、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどに由来する。このような抗原の例としては、真性糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アディソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病および円板状紅斑性狼瘡を特徴付ける抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
特定の実施形態において、本発明の異種ヌクレオチド配列としては、アレルゲンである抗原が挙げられる。アレルゲンである抗原としては、一般に、タンパク質もしくは糖タンパク質が挙げられ、これらとしては、花粉、塵、黴、胞子、フケ、昆虫および食物に由来する抗原が挙げられる。他の実施形態において、本発明の異種ヌクレオチド配列としては、腫瘍抗原が挙げられる。腫瘍抗原は、代表的に、腫瘍組織の細胞表面、細胞質、核、細胞内小器官などに由来する。腫瘍抗原の非限定的な例としては、変異したオンコジーンによってコードされるタンパク質；腫瘍に関連するウイルスタンパク質；および糖タンパク質が挙げられる。腫瘍としては、以下の癌の型に由来する腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない：唇、鼻咽頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺および気管支、皮膚の黒色腫、乳房、子宮頚部、子宮、卵巣、膀胱、腎臓、子宮、脳および神経系の他の部分、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および白血病。
【０１０５】
特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、生物学的応答改変因子（例えば、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、成長因子もしくは成長因子レセプター）をコードする。このような生物学的応答改変因子の非限定的な例としては、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮγ、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、脈管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、内皮成長因子（ＥＧＦ）、胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）、ＴＮＦＲおよびＴＮＦＲリガンドスーパーファミリーメンバー（ＴＮＦＲＳＦ１８およびＴＮＦＳＦ１８を含む）が挙げられる。他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、抗体をコードする。なお他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質をコードする。
【０１０６】
本発明に従い、ｒＡｄベクターの異種ヌクレオチド配列が、宿主細胞において発現されるべきである場合、転写制御エレメント（プロモーター／エンハンサー配列とも呼ばれる）が、提供されるべきである。このプロモーター／エンハンサー配列は、広範に活性であってもよく、または、組織特異的であってもよい。このプロモーター／エンハンサー配列は、非アデノウイルス供給源に由来してもよく、または、アデノウイルスプロモーターであってもよい。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列の発現を調節するために使用されるこのプロモーター／エンハンサー配列は、ヘルパーアデノウイルス核酸配列の発現を調節するプロモーター／エンハンサー配列と共通ではない。特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、誘導可能プロモーターである。なお他の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。プロモーターの例については、前出の５．１節を参照されたい。
【０１０７】
挿入された非アデノウイルスヌクレオチド配列もしくは異種ヌクレオチド配列の望ましい大きさは、ｒＡｄベクターをビリオン内にパッケージングすることを可能にするように制限され、そして保有するアデノウイルス配列の大きさに依存する。ヒトアデノウイルスのゲノムは、約３６キロ塩基対の長さである（３５９３８ヌクレオチドの長さであることが、Ｄａｖｉｓｏｎら（２００３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４（Ｐｔ１１），２８９５−２９０８によって測定された）。ビリオン内にパッケージングされるべきｒＡｄの大きさの合計は、約３７７３５ヌクレオチドの長さであるべきである（正常なゲノムの長さの約１０５％）。従って、挿入された異種ヌクレオチド配列の発現を最大化するために、ｒＡｄベクターにおいてアデノウイルスゲノムの部分を除外することが望ましい。
【０１０８】
本発明のｒＡｄベクターへの外来性遺伝子配列の挿入は、異種ヌクレオチド配列によるウイルスコード領域の完全な置き換えによって、または異種ヌクレオチド配列のウイルスゲノムへの部分的な置き換えまたは付加によって達成され得る。完全な置き換えは、おそらく、ＰＣＲによって指向される変異誘発の使用を介して最もよく達成される。簡潔には、ＰＣＲ−プライマーＡは、５’から３’末端へ、以下を含む：固有の制限酵素部位（例えば、クラスＩＩＳ制限酵素部位（すなわち、「シフター（ｓｈｉｆｔｅｒ）」酵素；これは、特異的配列を認識するが、この配列の上流もしくは下流のいずれかのＤＮＡを切断する）；置き換えられる遺伝子の領域に対して相補的なヌクレオチドのストレッチ；ならびに異種ヌクレオチド配列のカルボキシ末端コード部分に対して相補的なヌクレオチドのストレッチ。ＰＣＲ−プライマーＢは、５’から３’末端へ、以下を含む：固有の制限酵素部位；置き換えられる遺伝子の領域に対して相補的なヌクレオチドのストレッチ；ならびに異種遺伝子もしくは非天然遺伝子の５’コード部分に対応するヌクレオチドのストレッチ。これらのプライマーおよび異種遺伝子もしくは非天然遺伝子のクローニングしたコピーを用いたＰＣＲ反応の後、産物を、固有の制限部位を用いて、切り出し得、そしてクローニングし得る。ここで、クラスＩＩＳ酵素による消化および精製ファージポリメラーゼによる転写によって、異種遺伝子挿入物もしくは非天然遺伝子挿入物を保有するウイルス遺伝子の正確な非翻訳末端を含むＲＮＡ分子が産生される。代替の実施形態において、ＰＣＲによってプライムされた反応を、バクテリオファージプロモーター配列およびハイブリッド遺伝子配列を含むことにより、ＲＮＡテンプレートがクローニングなしで直接的に転写され得る、二本鎖ＤＮＡを調製するために使用し得る。
【０１０９】
異種ヌクレオチド配列を本発明のｒＡｄベクター内に挿入する場合、異種ヌクレオチド配列のコード配列の末端と下流遺伝子のコード配列の開始部との間の遺伝子間領域が、所望の効果を達成するように変更され得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子間領域」は、１つの遺伝子の停止シグナルと次の下流のオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン（例えば、ＡＵＧ）との間のヌクレオチド配列をいう。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域（すなわち、転写開始部位と遺伝子のコード配列の開始部（ＡＵＧ）との間）を含み得る。この非コード領域は、ある種のウイルス遺伝子において天然に存在する。
【０１１０】
挿入された異種ヌクレオチド配列の発現は、種々の指標によって決定され得る。これらの指標としては、以下のアッセイの非限定的な例によって測定されるタンパク質レベルもしくはｍＲＮＡ発現レベルが挙げられるが、これらに限定されない：免疫染色、免疫沈降およびイムノブロッティング、酵素結合イムノソルベントアッセイ、核酸検出（例えば、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析）、レポーター遺伝子の使用（例えば、目的の異種遺伝子と同様の様式で、タンパク質発現を観察するためにウイルスゲノムに組み込まれたレポーター遺伝子（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））の使用）、またはこれらの組み合わせ。これらのアッセイを実施する手順は、当該分野で周知である（例えば、Ｆｌｉｎｔら、ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ，ＡＮＤ  ＣＯＮＴＲＯＬ，２０００，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ２５−５６、全体の内容は本明細書中で参考として援用される）。
【０１１１】
例えば、発現レベルは、本発明の組換えアデノウイルスによって培養物中の細胞を感染させ、そしてその後、例えばこの異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いるウェスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡによってタンパク質発現のレベルを測定することによるか、または、例えばこの異種配列に特異的なプローブを用いるノーザンブロット分析によってＲＮＡ発現のレベルを測定することにより、決定され得る。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルを感染させ、そしてこの動物モデルにおいて、本発明の組換えウイルスの異種ヌクレオチド配列から発現されるタンパク質のレベルを測定することによって決定され得る。タンパク質レベルは、感染させた動物由来の組織サンプルを得、次いで、この組織サンプルを、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡに供することによって、測定され得る。さらに、動物モデルが使用される場合、異種配列の遺伝子産物に対して動物によって産生される抗体の力価は、当業者に公知の任意の技術によって決定され得る。これらとしては、ＥＬＩＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明に従って、ｒＡｄベクターは、大量のｒＡｄベクターを得るために、微生物中で（例えば、細菌プラスミドもしくはバクテリオファージの一部分として）増殖され得る。
【０１１３】
（５．３  組換えアデノウイルスの産生のための細胞株の作製）
本発明は、本明細書中で記載のヘルパーアデノウイルス核酸配列を含む宿主細胞、およびこのような細胞を産生するための方法を提供する。上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞は、組換えアデノウイルス、特に複製欠損組換えアデノウイルスの産生において有用である。具体的には、本発明の宿主細胞は、目的の組換えアデノウイルスベクターおよび／または組換えアデノウイルスから失われた機能（すなわち、アデノウイルスＥ１Ａ（例えば配列番号１７）コード領域、およびＥ１Ｂ（例えば配列番号１８）コード領域）を補う。より具体的には、本明細書中で記載のヘルパーアデノウイルス核酸配列によってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞は、本明細書中で記載の組換えアデノウイルスベクターを補うアデノウイルスタンパク質を発現する。好ましくは、上記宿主細胞は、目的の組換えアデノウイルスベクターにおける遺伝子に対して何ら相同性を有さない相補性アデノウイルス遺伝子を含み、このことは、ウイルスゲノムが細胞性ＤＮＡと組換えて、複製能力を有するアデノウイルスを産生する可能性を低下させる。本明細書中で記載の組換えアデノウイルスベクターを補う宿主細胞は、時々、本明細書中で、「相補性細胞株」、「ｒＡｄ産生細胞株」、「ｒＡｄ相補性細胞」および「ｒＡｄ相補性細胞株」と呼ばれる。
【０１１４】
具体的な実施形態において、本発明は、以下を含む単離宿主細胞を提供する：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；および（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子。この実施形態に従い、上記第２核酸分子は、特定の実施形態において、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。好ましい実施形態において、本発明は、以下を含む単離宿主細胞を提供する：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子。これらの実施形態に従い、上記宿主細胞は、以下をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる核酸分子をさらに含み得る：アデノウイルスＥ２ａ  ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ２ｂ末端タンパク質前駆体、アデノウイルスＥ２ｂ  ＩＶａ２タンパク質、アデノウイルスＥ４タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６、ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７）、および／またはＬ４  １００Ｋによってコードされるアデノウイルスタンパク質。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む核酸分子を含む単離宿主細胞を提供する：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列；および（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列。特定の他の実施形態において、本発明は、以下を含む核酸分子を含む単離宿主細胞を提供する：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【０１１６】
具体的な実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む宿主細胞によって発現される：（ａ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。好ましい実施形態において、上記Ｅ１Ａタンパク質は、以下を含む宿主細胞によって発現される：（ａ）第１の欠失であって、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、Ｅ１Ａ
２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）に対応する第２の欠失。
【０１１７】
Ｅ１Ａアデノウイルスタンパク質が初期転写単位を活性化する能力は、首尾よい産生性の感染のために、全ての産生細胞株において必要とされるが、Ｅ１Ａが細胞周期を誘導する能力は、連続的に分裂する樹立細胞株においては必要とされない場合がある。本発明のｒＡｄ相補性細胞株において発現される変異したアデノウイルスＥ１Ａタンパク質は、転写を活性化する能力を有するが、細胞性ＤＮＡ合成の誘導に欠陥を有する。細胞性ＤＮＡ合成の刺激のために必要とされるアデノウイルスＥ１Ａ領域（本発明のｒＡｄ相補性細胞株においては発現されない）はまた、アポトーシスの誘導を担い得、そしてこれは、Ｅ１−相補性細胞株の首尾よい樹立を妨げ得る。
【０１１８】
任意の細胞型が、宿主細胞として使用され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルス（好ましくはヒトアデノウイルス）感染に対して許容性である細胞が、使用される。遺伝子産物の発現を、特定の所望の様式で調節するかまたは改変し、そしてプロセシングする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、このタンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび翻訳後改変について特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株は、発現される外来性タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞性機構を有する真核生物の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞およびＴ４７Ｄ細胞、ＮＳ０細胞（内因性の免疫グロブリン鎖を全く産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞。具体的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ａ５４９細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＩＧＲＯＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｕ８７細胞、Ｗ１６２細胞もしくは２９３−Ｄ２２細胞である。好ましい実施形態において、上記宿主細胞は、Ａ５４９細胞である。特定の実施形態において、上記宿主細胞は、懸濁液中で培養および増殖され得る。
【０１１９】
好ましい実施形態において、ヒト細胞が、宿主細胞として使用される。例えばヒト腫瘍細胞由来のヒト樹立細胞株もしくはヒト腫瘍細胞株は、培養物中で無限に複製する能力を有する。本発明の相補性細胞株を作製するために、ヒト腫瘍細胞、ヒト樹立細胞株由来の細胞もしくはヒト腫瘍細胞株由来の細胞が、ヒト初代細胞よりも好ましい。何故なら、本発明のＥ１相補性細胞株において発現される変異Ｅ１Ａアデノウイルス遺伝子は、転写を活性化する能力を有するが、細胞性ＤＮＡ合成の誘導に欠陥を有し、そして初代細胞株の連続的に複製する細胞株もしくは樹立細胞株への形質転換に欠陥を有するからである。このような細胞株は、標準的分子生物学技術に従って作製され得る。
【０１２０】
宿主細胞は、一過的にもしくは安定的に、ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってトランスフェクトされ得る。宿主細胞をトランスフェクトするための非限定的な方法としては、ＤＥＡＥデキストラン方法（ＭｃＣｕｔｃｈｅｎおよびＰａｇａｎｏ，１９６８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４１：３５１−３５７）、リン酸カルシウム手順（Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：７３９−７４８）、マイクロインジェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび当該分野で公知の任意の他の方法が挙げられる。好ましくは、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列は、宿主細胞の核ゲノム中に安定的に組み込まれる。相補性因子をコードする異種核酸配列のゲノム組み込みが、アデノウイルスベクター産生のための安定的な組換え細胞株を作製するために必要であると考えられる。さらに、一過的トランスフェクションによる相補性は、労力がかかり、スケールアップすることが困難であり、そして低いアデノウイルス収量しか提供し得ない。細胞のゲノム中への異種核酸配列の導入および安定的な組み込みは、当業者の技術範囲内である標準的分子生物学技術を必要とする（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０１２１】
組換えアデノウイルスタンパク質の長期的な高収量の産生のために、安定的な発現が、好ましい。例えば、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってコードされるアデノウイルスタンパク質を安定的に発現する細胞株が、作製され得る。宿主細胞は、適切な制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化シグナルなど）によって制御されるヌクレオチド配列、ならびに選択可能マーカーによって形質転換され得る。外来性ヌクレオチド配列の導入の後、操作された細胞は、富化培地中で１〜２日間成長させられ得、次いで、選択培地に移され得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞の染色体中にプラスミドを安定的に組み込ませ、そして増殖して病巣（ｆｏｃｕｓ）を形成し、この病巣が、次にクローニングされ、そして細胞株に拡張され得る。この方法は、上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってコードされるアデノウイルスタンパク質を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。
【０１２２】
多くの選択系が使用され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：８−１７）が、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞もしくはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用され得る。また、代謝拮抗剤耐性が、以下の遺伝子についての選択の基礎として使用され得る：ｄｈｆｒ（メトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７））；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２））；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（ＷｕおよびＷｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５））；ならびにｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知である方法は、所望の組換えクローンを選択するために慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、例えば、以下に記載される：Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（これらは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１２３】
ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってコードされるアデノウイルスタンパク質の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇され得る（概説について、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照）。アデノウイルスタンパク質を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターのレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増大する。増幅した領域はアデノウイルスタンパク質と関連しているので、アデノウイルスタンパク質の産生もまた、増大する（Ｃｒｏｕｓｅら，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０１２４】
本発明は、複製欠損アデノウイルスの産生のために宿主細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、細胞（好ましくは、ヒト細胞）を第１核酸分子および第２核酸分子で形質転換させる工程を包含し、この第１核酸分子は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなアデノウイルスタンパク質の例としては上を参照）をコードするヌクレオチド配列を含み、そして第２核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（そして好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）。この細胞は、第１核酸分子および第２核酸分子によって、同時に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよく、任意の順番で連続的に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよい。具体的な実施形態において、この細胞は、第１核酸分子によって形質転換もしくはトランスフェクトされ、次いで、第２核酸分子によって形質転換もしくはトランスフェクトされる。
【０１２５】
本発明は、複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、細胞（好ましくはヒト細胞）を第１核酸分子、第２核酸分子および第３核酸分子で形質転換またはトランスフェクトさせる工程を包含し、この第１核酸分子は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなアデノウイルスタンパク質の例は、上記を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み、そしてこの第２核酸分子は、アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、そしてこの第３核酸分子は、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（そして好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥｌＢ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）。この細胞は、第１核酸、第２核酸および第３核酸により、同時に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよく、任意の順番で連続的に形質転換もしくはトランスフェクトされてもよい。具体的な実施形態において、この細胞は、第１核酸分子、第２核酸分子、ついで第３核酸分子によって、形質転換もしくはトランスフェクトされる。
【０１２６】
本発明のｒＡｄ産生細胞株は、標準的細胞培養技術（例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８７を参照）を用いて増殖され得る。ｒＡｄ産生細胞株は、適切な細胞培養培地（例えば、１〜１０％ウシ胎仔血清（特定の実施形態において、これは１％ウシ胎仔血清であり、そして他の実施形態において、これは１０％ウシ胎仔血清である）ならびに抗生物質（例えば、ＳＬ０００３のために２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢおよび２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、そしてＳＬ０００６のために１５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、３５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、および０．２μｇ／ｍｌピューロマイシン）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地）中で細胞を培養することによって増殖される。ｒＡｄ産生細胞株の浮遊培養物について、ｒＡｄ産生細胞株は、例えば、０．１％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、１％化学精製脂質、４ｍＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ、および抗生物質（例えば、ＳＬ０００６のために１５μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、３５μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、および０．０２μｇ／ｍｌピューロマイシン）を補充したＯｐｔｉＰｒｏ培地中で培養することによって増殖される。例えば、ハイグロマイシンＢ、Ｇ４１８およびピューロマイシンのような抗生物質は、細胞株における選択圧を維持するために、細胞培養物中に含められる。特定の実施形態において、本発明のｒＡｄ産生細胞株は、浮遊培養物中で増殖される。
【０１２７】
細胞は、将来の使用のために凍結保存され得、そして保存され得る。好ましくは、この細胞は、対数増殖期の後期まで増殖し；細胞を濃縮し；成長培地を凍結保護剤および安定剤によって補充された培地に交換し；細胞を凍結し；そして細胞を０℃以下の温度で保存することによって、凍結保存される。好ましくは、細胞は、−７０℃以下（例えば、−８０℃）もしくは液体窒素中または液体窒素の蒸気相中で保存される。細胞は、当該分野で公知の任意の方法によって濃縮され得る。例えば、細胞は、遠心分離、遠心沈降、灌流デバイス（例えば、篩）による濃縮、もしくは濾過によって濃縮され得る。好ましくは、細胞は、少なくとも約１×１０７細胞／ｍｌまで濃縮される。細胞は、当該分野で公知の任意の凍結保護剤中で保存され得る。例えば、凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはグリセロールであり得る。細胞は、当該分野で公知の任意の安定剤中で保存され得る。例えば、この安定剤は、メチルセルロースもしくは血清であり得る。
【０１２８】
凍結の前に、濃縮した細胞は、いくつかの別個の容器に分配されて、細胞バンクを作製し得る。細胞は、例えば、ガラスもしくはプラスチックのバイアルまたはチューブあるいは細胞培養バッグ中で保存され得る。細胞が将来の使用のために必要である場合、凍結保存した細胞の（１つの容器からの）一部分が、細胞バンクから選択され、溶解して増殖され得る。
【０１２９】
上記ｒＡｄ産生細胞株は、哺乳動物細胞培養物について当該分野で公知である任意の方法によって、増殖され得そして成長させられ得る。増殖は、１工程手順によってなされてもよく、または多工程手順によってなされてもよい。１工程増殖手順において、産生細胞は、保存庫から取り出され、そしてウイルスの産生が起こる培養容器に直接的に接種される。多工程増殖手順において、産生細胞は、保存庫から取り出され、そして組換えアデノウイルス産生が起こる最終培養容器に達するまで徐々にサイズが大きくなる、多くの培養容器を介して増殖される。増殖工程の間、細胞は、成長のために最適化された条件下で成長させられる。培養条件（例えば、温度、ｐＨ、溶存酸素レベルなど）は、特定の細胞株のために最適化されることが公知である条件であり、そしてこの分野の当業者に明らかである（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第２版，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照）。
【０１３０】
上記ｒＡｄ産生細胞もしくはｒＡｄ産生細胞株は、当該分野で公知の任意の適切な容器中で成長させられ得る。例えば、細胞が増殖させられ得、そして感染細胞が、バイオジェネレーターもしくはバイオリアクター内で培養され得る。一般に、「バイオジェネレーター」もしくは「バイオリアクター」は、０．５リットル以上の容量の一般的にステンレス鋼製もしくはガラス製の培養タンクであって、撹拌システム、ＣＯ２気体流れを注入するためのデバイス、および酸素付加デバイスを備える培養タンクを意味する。代表的に、これは、このバイオジェネレーターの内部パラメータ（例えば、ｐＨ、溶存酸素、温度、タンク圧もしくは培養の特定の物理化学パラメータ（例えば、グルコースもしくはグルタミンの消費、または乳酸イオンおよびアンモニウムイオンの産生））を測定するプローブを備える。ｐＨプローブ、酸素プローブおよび温度プローブは、永久的にこれらのパラメータを調節するバイオプロセッサーに接続される。他の実施形態において、上記容器は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、シェーカーフラスコもしくは機械的撹拌を提供する撹拌バーを備えたフラスコである。別の実施形態において、上記容器は、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒである（ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
【０１３１】
培養物中の細胞密度は、当該分野で公知の任意の方法によって決定され得る。例えば、細胞密度は、顕微鏡的に決定され得る（例えば、血球計）か、もしくは電気細胞計数デバイス（例えば、ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ；ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒ）によって決定され得る。
【０１３２】
（５．３．１  ＳＬ０００３細胞株）
実施例１に記載されるように、Ｅ１Ａ変異Ｅ１Ａｄｌ０１／０７遺伝子を構成的に発現する形質転換細胞株Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７が、野生型Ｅ１Ａまたは単一の１変異Ｅ１Ａｄ１１０１もしくはＥ１Ａｄｌ１１０７のいずれかを発現するＡ５４９細胞クローンよりも高いレベルでＥ１欠失ｒＡｄベクターの複製を支持したので、これをさらなる開発のために選択した。下記の実施例１に示されるように、Ａ５４９細胞クローンであるＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−１〜Ａ５４９Ｅ１Ａｄ０１／０７−５は、Ｅ１欠失ｒＡｄベクターの複製を、Ａ５４９細胞クローンＡ５４９Ｅ１Ａｗｔ−１〜Ａ５４９Ｅ１Ａｗｔ−５、またはＡ５４９細胞クローンＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０１−１〜Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０１−５、またはＡ５４９細胞クローンＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０７−１〜Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０７−５よりも高いレベルで支持した。
【０１３３】
形質転換細胞株Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７もまた、アデノウイルスベクター産生の間のアポトーシスに対するその低い感度ゆえに、さらなる開発のために選択した。野生型Ｅ１Ａを発現するＡ５４９クローン（すなわち、Ａ５４９Ｅ１Ａｗｔ）は、Ｅ１欠失ｒＡｄベクターによる感染後のアポトーシスに対して特に感受性であり、そしてウイルス収量は極めて低かった。クローンＡ５４９Ｅ１Ａｗｔ−２におけるアポトーシスの迅速な誘導は、ウイルス感染における初期事象が、野生型Ｅ１Ａを発現するがＥ１Ａｄｌ０１／０７を発現しないＡ５４９細胞によって認識され得る死のシグナルを供給し得ることを示唆した。
【０１３４】
アデノウイルス感染細胞におけるアポトーシスは、ｐ５３依存的経路およびｐ５３非依存的経路を介して刺激されることが報告されている（Ｔｅｏｄｏｒｏら，（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：４６７−４７４）。Ｅ２Ｆ経路およびｐ５３経路の両方が、Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７クローン（このクローンにおいて、Ｅ２Ｆ転写活性およびｐ５３転写活性は親Ａ５４９細胞と類似する）と比較して、Ａ５４９ｗｔ−２クローンにおいて刺激されたことが、見出された。Ａ５４９Ｅ１Ａｗｔ−２細胞は、低レベルのシクロヘキシミドによってアポトーシスに誘導されたが、Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７クローンは、この処理によって影響を受けなかったことが、見出された。野生型Ｅ１ＡによるＥ２Ｆ経路およびｐ５３経路の刺激は、Ａ５４９ｗｔ−２クローンにおいてアポトーシスを誘導するために十分ではなかったが、これは、死の刺激に対するこれらの細胞の感受性を増大することに寄与し得た。
【０１３５】
形質転換細胞株Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７は、複製欠損アデノウイルスを産生可能であったが、ウイルス収量は、Ｅ１Ｂを用いる相補によってさらに改善され得ると考えられる。両方のＥ１Ｂ遺伝子が、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７発現Ａ５４９細胞株におけるｒＡｄベクター相補のために必要であったか否かは、わからなかった。一連のＥ１Ｂ変異体ウイルスを用いるウイルス収量の分析は、Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞において、Ｅ１Ｂ−５５Ｋのみの発現は、野生型レベルでの変異体ウイルスの産生のために十分であったことを示した。これらの結果は、有効な相補が、Ａ５４９細胞においてＥ１Ａｄｌ０１／０７およびＥ１Ｂ５５Ｋによって達成され得ることを示唆し、このことは、その後ＳＬ０００３細胞株において達成された。ＳＬ０００３細胞株からのｒＡｄベクターの収量は、検出可能な複製能力を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）を産生せずに、２９３細胞から得られた収量と類似していた。
【０１３６】
ＳＬ０００３細胞株は、ブダペスト条約の下で、２００４年９月２２日に、以下の名称およびアクセッション番号の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託された：受託名称：「ＳＬ０００３」；ＡＴＣＣアクセッション番号：ＰＴＡ−６２３１。ＡＴＣＣに寄託した細胞株に対するアクセスの全ての制限は、特許の付与の際に取り払われる。
【０１３７】
（５．３．２  ＳＬ０００６細胞株）
実施例２に記載されるように、ウイルス収量を改善するために、形質転換細胞株Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７を、アデノウイルスＥ２ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子ならびにアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子によって形質転換した。実施例２に示した結果は、有効な相補が、Ａ５４９細胞においてＥ１Ａｄｌ０１／０７ならびにＥ２ｂポリメラーゼ、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ１Ｂ−１９Ｋによって達成され得ることを示す。ＳＬ００６細胞株からのｒＡｄベクターの収量は、検出可能な複製能力を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）を産生せずに、２９３細胞から得られた収量と類似していた。
【０１３８】
ＳＬ０００６細胞株は、ブダペスト条約の下で、２００５年４月７日に、以下の名称およびアクセッション番号の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託された：受託名称：「ＳＬ０００６」；ＡＴＣＣアクセッション番号：ＰＴＡ−６６６３。ＡＴＣＣに寄託した細胞株に対するアクセスの全ての制限は、特許の付与の際に取り払われる。
【０１３９】
（５．４  組換えアデノウイルスの産生）
本発明に従い、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）が、適切な細胞型をｒＡｄベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列によって同時トランスフェクトすることにより、産生され得る。同時トランスフェクションは、ＤＥＡＥデキストラン方法（ＭｃＣｕｔｃｈｅｎおよびＰａｇａｎｏ，１９６８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４１：３５１−３５７）、リン酸カルシウム手順（Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：７３９−７４８）または当該分野で公知の任意の他の方法（マイクロインジェクション、リポフェクションおよびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない）によって実施され得る。トランスフェクションにおいて使用されるｒＡｄベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列の量は、１０６個の細胞あたり約０．２〜１０μｇのＤＮＡであるが、異なるＤＮＡ構築物および細胞型の間で変動し得る。トランスフェクションに適した細胞としては、アデノウイルス感染に対して許容性である任意の細胞株が挙げられ、これらとしては、ＨｅＬａ細胞、２９３−Ｄ２２細胞、Ａ５４９細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＩＧＲＯＶ−Ｉ細胞、Ｕ８７細胞およびＷ１６２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
あるいは、ｒＡｄ相補性細胞株は、ｒＡｄベクターによってトランスフェクトされて、組換えアデノウイルス（好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス）を産生し得る。具体的な実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを産生するための方法を提供し、この方法は、組換えアデノウイルスベクターによってトランスフェクトしたｒＡｄ相補性細胞株を、この細胞株においてウイルスゲノムの複製を許容するような条件下で培養する工程を包含し、ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなＥ１Ａタンパク質に関しては上の記載を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；および（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（そして好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）第２核酸分子。好ましい実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを産生するための方法を提供し、この方法は、組換えアデノウイルスベクターによってトランスフェクトしたｒＡｄ相補性細胞株を、この細胞株におけるウイルスゲノムの複製を許容する条件下で培養する工程を包含し、ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなＥ１Ａタンパク質に関しては上の記載を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質および好ましくはアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子。
【０１４１】
具体的な実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを増殖するための方法を提供し、この方法は、組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損アデノウイルス）によってトランスフェクトしたｒＡｄ相補性細胞株を、この細胞株においてウイルスゲノムの複製を許容するような条件下で培養する工程を包含し、ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなＥ１Ａタンパク質に関しては上の記載を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；および（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む（そして好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない）第２核酸分子。好ましい実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスを増殖させるための方法を提供する。この方法は、組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損アデノウイルス）によって感染させたｒＡｄ相補性細胞株を、この細胞株におけるウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、この細胞株は、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（このようなＥ１Ａタンパク質に関しては上の記載を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子；ならびに（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質および好ましくはアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子。
【０１４２】
本発明の組換えアデノウイルスは、任意の適切な方法によって産生され得、これらの方法の多くは、当該分野で公知である（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９２５−９４１（１９８４）；Ｂｅｒｋｎｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１１：６００３−６０２０（１９８３）；Ｂｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌ．１９０：６２４−６３４（１９９２）を参照）。本発明の好ましい実施において、上記組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス科に由来する。本発明の好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２または５に由来する。本発明の別の好ましい実施において、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、そして部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）Ｅ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）およびＥ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）の欠失を有する変異したゲノムを含み、そして１つ以上のさらなる異種遺伝子を含み得る。本発明の別の好ましい実施において、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、そして部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）Ｅ１Ａコード領域（例えば、配列番号１７）、Ｅ１Ｂコード領域（例えば、配列番号１８）、およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域（例えば、配列番号２３）の欠失を有する変異したゲノムを含み、そして１つ以上のさらなる異種ヌクレオチド配列を含む。本発明のより好ましい実施において、上記組換えアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスであり、そして部分的もしくは完全な（好ましくは、完全な）Ｅ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域、Ｅ２ｂポリメラーゼコード領域、およびＥ３コード領域の欠失を有する変異したゲノムを含み、そして欠失したＥ３コード領域における１つ以上のさらなる異種ヌクレオチド配列を含む。本発明の好ましい組換えアデノウイルスは、ｒＡｄ産生細胞におけるアデノウイルスＤＮＡ配列に対して何ら相同性を有さないウイルスＤＮＡ配列を含み、これは、ウイルスゲノムが細胞性ＤＮＡと組み換わり、ＲＣＡを産生する可能性を低下させる。
【０１４３】
特定の実施形態において、組換えアデノウイルスの量が、滴定される。培養物におけるアデノウイルスの量の滴定は、当該分野で公知の技術によって実施され得る。特定の実施形態において、ウイルス粒子の濃度は、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑアッセイ（Ｓｈａｂｒａｍら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）によって記載される）によって決定される。本明細書中で使用される場合、用語「溶解」は、ウイルス含有細胞の破壊を意味する。溶解は、当該分野で周知の種々の手段によって達成され得る。例えば、哺乳動物細胞は、低圧（１００〜２００ｐｓｉ差次的圧力）条件下で、ホモジナイゼーションによって、微小流動化によって、もしくは従来の凍結−溶解方法によって溶解され得る。外因性の遊離のＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅによる分解によって除去され得る。
【０１４４】
ウイルス含有細胞は、凍結され得る。ウイルスは、ウイルス含有細胞および培地から収集され得る。１つの実施形態において、ウイルスは、ウイルス含有細胞および培地の両方から同時に収集され得る。特定の実施形態において、ウイルス産生細胞および培地は、例えば、米国特許第６，１４６，８９１号に記載のように、ウイルス含有細胞を溶解しそして培地から細胞屑を除去する（さもなければこの細胞屑はウイルス精製を妨げる）ことの両方を同時に行う条件下で、クロスフロー微細濾過に供される。
【０１４５】
本明細書中で使用される場合、用語「収集する」は、培地からの組換えアデノウイルスを含有する細胞の収集を意味し、そして培地からの組換えアデノウイルスの収集も含み得る。このことは、差次的遠心分離もしくはクロマトグラフィー手段のような従来の方法によって達成され得る。この段階において、回収した細胞は、保存され得るか、溶解および精製によってさらに処理されて組換えウイルスが単離され得る。保存のために、収集した細胞は、生理学的ｐＨまたはその付近で緩衝化され、そして−７０℃で凍結されなければならない。
【０１４６】
ウイルスはまた、ウイルス含有細胞および培地から、別個に収集されてもよい。ウイルス含有細胞は、差次的遠心分離のような従来の方法によって、培地と別個に収集され得る。収集された細胞は、凍結保存されるか、ウイルスを放出するように溶解によってさらに処理され得る。ウイルスは、培地から、クロマトグラフィー手段によって収集され得る。エキソゲナーゼ非含有ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）のようなＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅを用いた分解によって除去され得る。
【０１４７】
ウイルス収集物は、例えば米国特許第６，１４６，８９１号；同第６，５４４，７６９号および同第６，７８３，９８３号において記載されるような限外濾過もしくは接線流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過のような方法によって、ウイルスを濃縮するようにさらに処理され得る。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、用語「回収する」は、溶解した産生細胞および必要に応じて培地上清からの、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団の単離を意味する。本発明の細胞培養物において産生されたウイルス粒子は、当該分野で一般に公知の任意の方法によって単離され得、そして精製され得る。従来の精製技術（例えば、クロマトグラフィー方法もしくは差次的密度勾配遠心分離方法）が、使用され得る。例えば、ウイルス粒子は、塩化セシウム勾配精製、カラムクロマトグラフィーもしくはバッチクロマトグラフィー、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー（Ｈａｒｕｎａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３：２６４−２６７（１９６１）；Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９：５３６−５４５（１９５９）；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０：４５９−４６５（Ｉ９６０））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（米国特許出願公開第ＵＳ  ２００２／００６４８６０号）、ならびに、軟質ゲル（例えばアガロース）を含む均一に架橋した多糖類、大きな「通過孔（ｔｈｒｏｕｇｈｐｏｒｅｓ）」を有する灌流クロマトグラフィー樹脂を含む合成ポリマーベースのマクロ孔質ポリマー、タンパク質との相互作用を速めるように設計された触手を有する「触手（ｔｅｎｔａｃｕｌａｒ）」吸収剤（例えば、ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）、ならびに軟質ゲルの高容量および複合材料の剛性を利用する剛性殻中の軟質ゲルに基づく材料（例えば、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆ）（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６５８：２０７（１９９４）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６９９：４７−６１（１９９７））のような他の樹脂を用いるクロマトグラフィーによって、精製され得る。本発明の好ましい実施において、ウイルスは、Ｈｕｙｇｈｅら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１４０３−１４１６のプロセス（Ｓｈａｂｒａｍら，米国特許第５，８３７，５２０号（１９９８年１１月１７日発行、その全ての教示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される）に実質的に従うカラムクロマトグラフィーによって、精製される。
【０１４９】
ウイルスを産生するｒＡｄ産生細胞株は、当該分野で公知の任意の適切な容器中で培養され得る。例えば、細胞は、成長させられ得、そして感染細胞は、バイオジェネレーターもしくはバイオリアクター中で培養され得る。一般に、「バイオジェネレーター」もしくは「バイオリアクター」は、０．５リットル以上の容量の一般的にステンレス鋼製もしくはガラス製の培養タンクであって、撹拌システム、ＣＯ２気体流れを注入するためのデバイス、および酸素付加デバイスを備える培養タンクを意味する。代表的に、これは、このバイオジェネレーターの内部パラメータ（例えば、ｐＨ、溶存酸素、温度、タンク圧もしくは培養の特定の物理化学パラメータ（例えば、グルコースもしくはグルタミンの消費、または乳酸イオンおよびアンモニウムイオンの産生））を測定するプローブを備える。ｐＨプローブ、酸素プローブおよび温度プローブは、永久的にこれらのパラメータを調節するバイオプロセッサーに接続される。他の実施形態において、上記容器は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、シェーカーフラスコもしくは機械的撹拌を提供する撹拌バーを備えたフラスコである。別の実施形態において、上記容器は、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒである（ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
【０１５０】
組換えアデノウイルスは、本発明のｒＡｄ産生細胞株において増殖され得る。ウイルスは、細胞を培養すること；必要に応じて新鮮な成長培地を細胞に添加すること；細胞にウイルスを接種すること；接種した細胞をインキュベートすること；必要に応じて新鮮な成長培地を接種細胞に添加すること；および必要に応じてウイルスを細胞および培地から収集することによって産生され得る。代表的に、ウイルス粒子の濃度（Ｓｈａｂｒａｍら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）に記載されるような、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムを用いる高処理液体クロマトグラフィーのような従来の方法によって決定される）がプラトーになり始める時、収集を実施する。
【０１５１】
本発明のｒＡｄ産生細胞において増殖させられる組換えアデノウイルス（例えば、Ｅ１Ａコード領域およびＥ１Ｂコード領域の欠失を含み、そして異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス、またはＥ１Ａコード領域、Ｅ１Ｂコード領域およびＥ２Ｂポリメラーゼコード領域の欠失を含み、そして異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルス）によって産生されたタンパク質もまた、単離され得そして精製され得る。タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、標準的方法によって精製され得、これらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：塩沈殿もしくはアルコール沈殿、親和性、分取ディスク−ゲル電気泳動、等電集束法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、カチオン交換およびアニオン交換ならびに分配クロマトグラフィー、ならびに向流分布。このような精製方法は、当該分野で周知であり、そして、例えば、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにおいて開示される。
【０１５２】
（５．５  組換えアデノウイルスの有用性）
本発明の組換えアデノウイルスは、目的のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを発現させるために、インビトロで使用され得る。本発明の組換えアデノウイルスはまた、遺伝子治療において使用され得る。遺伝子治療の方法の一般的概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。
【０１５３】
上記の組換えアデノウイルスは、インビボ遺伝子治療もしくはエキソビボ遺伝子治療のために使用され得る。インビボ遺伝子治療のために、組換えアデノウイルスは、被験体に直接投与される。エキソビボ遺伝子治療のために、細胞は、インビトロで組換えアデノウイルスに感染させられ、次いで、感染細胞は、被験体に移植される。具体的な実施形態において、上記組換えアデノウイルスは、インビボで直接的に投与され、ここで、目的のタンパク質は発現される。
【０１５４】
別の実施形態において、細胞は、組換えアデノウイルスによって感染させられ、そして生じた組換え細胞が、被験体に投与される。得られた組換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法によって被験体に送達され得る。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞もしくは先祖細胞）は、好ましくは、静脈内投与される。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして、当業者によって決定され得る。本発明に従い、組換えアデノウイルスによって感染させられ得る任意の細胞は、遺伝子治療の目的のための細胞であり得る。非限定的な例としては、上皮細胞（例えば、気道上皮細胞）、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血球（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球）、および種々の幹細胞もしくは先祖細胞（特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる、造血性の幹細胞もしくは先祖細胞）が挙げられる。好ましい実施形態において、遺伝子治療のために使用される細胞は、被験体に対して自系の細胞である。組換え細胞が遺伝子治療において使用される１つの実施形態において、組換えアデノウイルスのゲノムによってコードされるタンパク質は、細胞もしくはその子孫によって発現可能であり、そして組換え細胞は、治療効果のためにインビボで投与される。
【０１５５】
本発明の組換えアデノウイルスは、被験体を免疫化するために使用され得る。例えば、組換えアデノウイルスは、この組換えアデノウイルスによって発現される異種抗原に対する抗体を産生するために使用され得る。被験体を免疫化するために使用される組換えアデノウイルスの量および免疫化スケジュールは、当該技術分野の通常の技術を持つ医師によって決定され、そして被験体の免疫応答および抗体力価を参照して投与される。
【０１５６】
上記組換えアデノウイルスを用いた免疫化による抗原に対して産生される抗体は、診断的イムノアッセイ、受動免疫治療および抗イディオタイプ抗体の産生において使用され得る。産生された抗体は、当該分野で公知の標準的方法（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈殿など）によって単離され得、そして診断的イムノアッセイにおいて使用され得る。この抗体はまた、処置および／または疾患の進行をモニタリングするためにも使用され得る。当該分野で公知の任意のイムノアッセイ系が、この目的のために使用され得、これらとしては、ほんの一例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射分析、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系。
【０１５７】
本発明の組換え体は、受動免疫治療（ここで、異種抗原を指向する事前に形成された抗体の投与により被験体の短期間の保護が達成される）での使用のための抗体を産生するために使用され得る。本発明の組換えアデノウイルスによって産生される抗体はまた、抗イディオタイプ抗体の産生においても使用され得る。次いで、抗イディオタイプ抗体は、最初の抗原に結合する抗体の部分集団を産生するために、免疫化のために使用され得る（Ｊｅｒｎｅ，１９７４，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５ｃ：３７３；Ｊｅｒｎｅら，１９８２，ＥＭＢＯＪ．１：２３４）。
【０１５８】
特定の実施形態において、組換えアデノウイルスによる免疫化によって産生された抗体は、被験体への投与の前に改変される。例えば、この抗体は、ヒト化され得、そして／または親和性成熟させられ得る。
【０１５９】
（５．６  組換えアデノウイルスを投与する組成物および方法）
本発明は、本発明の方法によって産生された組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス）を含有する組成物を包含する。好ましい実施形態において、この組成物は、被験体への投与に適した薬学的組成物である。
【０１６０】
本発明の薬学的組成物は、有効量の組換えアデノウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能である」は、動物（より詳細には、ヒト）における使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって認可されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に挙げられていることを意味する。用語「キャリア」は、薬学的組成物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤もしくはビヒクルを意味する。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液ならびにグリセロール溶液はまた、液体キャリアとして、特に注射可能溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、一ステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物などの形態を取り得る。これらの組成物は、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる）に記載される。このような組成物は、好ましくは精製形態である有効量の組換えアデノウイルスを、患者への適切な投与のための形態を提供するような適切な量のキャリアと共に含有する。処方物は、投与の様式に適合するべきである。
【０１６１】
特定の障害もしくは状態の処置において有効である本発明の薬学的組成物の量は、その障害もしくは状態の性質に依存し、そして標準的臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、最適な投薬範囲を同定することを補助するために、必要に応じて使用され得る。処方物中で使用される正確な用量はまた、投与経路およびその疾患もしくは障害の深刻さに依存し、そして臨床医の判断および各患者の状況にしたがって決定しなければならない。有効な用量は、インビトロ試験系もしくは動物モデル試験系で得られる用量−応答曲線から外挿され得る。
【０１６２】
組成物の投与の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路。本発明の薬学的組成物は、任意の便利な経路（例えば、輸液もしくはボーラス注射、上皮内層もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通した吸収）によって投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。投与は、全身投与であっても、局所投与であってもよい。さらに、本発明の薬学的組成物を任意の適切な経路によって肺内に導入することが、所望され得る。肺投与は、例えば、吸入器もしくはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む処方物の使用によって使用され得る。
【０１６３】
具体的な実施形態において、本発明の薬学的組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが、所望され得る。これは、例えば、限定としてではなく、外科手術の間の局所（ｌｏｃａｌ）輸液、例えば外科手術後の包帯と組み合わせた局所（ｔｏｐｉｃａｌ）塗布、注射、カテーテルの手段、坐剤の手段、または移植物（この移植物は、膜（例えばシラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜）もしくは繊維を含む、多孔性、非多孔性もしくはゼラチン状の材料からなる）の手段によって、達成され得る。１つの実施形態において、投与は、悪性腫瘍の部位（もしくは前駆部位）または新生物組織もしくは新生物前駆組織への直接注射による投与であり得る。
【０１６４】
別の実施形態において、薬学的組成物は、制御放出系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料が、使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ＆  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照；また、Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照のこと）。なお別の実施形態において、制御放出系は、組成物の標的（すなわち、肺）の近位に配置され得、従って、全身用量の一部分しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，第２巻，ｐｐ．１１５−１３８を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による概説において議論される。
【０１６５】
具体的な実施形態において、本発明の組成物は、本発明の方法によって作製される組換えアデノウイルス（好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス）および適切な賦形剤を含有するワクチンもしくは免疫性組成物である。多くの方法が、このワクチン組成物を導入するために使用され得、これらとしては、鼻腔内経路、気管内経路、経口経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路および皮下経路が挙げられるが、これらに限定されない。組換えアデノウイルスワクチン組成物を、アデノウイルスの感染の天然の経路を介して導入することが、好ましくあり得る。
【０１６６】
（５．７  プラスミド系）
本発明は、組換えアデノウイルスの産生のための細胞株を作製するためのプラスミド系を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスの産生のための細胞株（好ましくは、ヒト細胞株）を作製するためのプラスミド系を提供し、これは、別個の容器に、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第１発現カセット；および（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子に作動可能に連結したこの細胞株中の調節エレメントを含む第２発現カセット。代替の実施形態において、このプラスミド系は、ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、１つの発現カセットを含む。
【０１６７】
具体的な実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスの産生のための細胞株（好ましくは、ヒト細胞株）を作製するためのプラスミド系を提供し、このプラスミド系は、別個の容器に、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第１発現カセット；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第２発現カセット；および（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第３発現カセット。代替の実施形態において、このプラスミド系は、以下を含む核酸分子を含む１つの発現カセットを含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列。
【０１６８】
別の実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスの産生のための細胞株（好ましくは、ヒト細胞株）を作製するためのプラスミド系を提供し、このプラスミド系は、別個の容器に、以下を含む：（ａ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第１発現カセット；（ｂ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第２核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第２発現カセット；ならびに（ｃ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第３発現カセット。代替の実施形態において、このプラスミド系は、以下を含む核酸分子を含む１つの発現カセットを含む：（ｉ）ｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよびｐＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスＥ１Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質およびアデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ｂポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列。
【０１６９】
具体的な実施形態において、上記第１発現カセットによってコードされるＥ１Ａタンパク質は、以下を含む：（ａ）第１の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基４〜２５（ｄｌ１１０１）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基３６〜４９に対応する第１の欠失；ならびに（ｂ）第２の欠失であって、（ｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）；または（ｉｉ）Ｅ１Ａ  ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）およびＥ１Ａ  ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸残基１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）に対応する第２の欠失。
【実施例】
【０１７０】
（６．実施例）
以下の実施例は単に例示的なものであり、そして本明細書において記載される本発明の範囲を限定する意味はない。
【０１７１】
（実施例１：Ｅ１ＡおよびＥ１ｂ相補性細胞株の産生および組換えアデノウイルス産生における、この細胞株の使用）
この実施例は、高力価の複製欠損、ヘルパー非依存性組換えウイルスの産生のためのＥ１ＡおよびＥ１ｂ相補性細胞株の有用性を実証する。
【０１７２】
（Ｉ．材料および方法）
（細胞培養）
２９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７３）細胞、Ａ５４９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）細胞およびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２）細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌剤溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｋａｎｓａｓ、ＭＯ）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を追加した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【０１７３】
（プラスミド）
Ａｄ５野生型Ｅ１Ａ遺伝子、およびＥ１Ａｄｌ１１０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７およびＥ１Ａｄｌ０１／０７変異を含有するＥ１Ａ配列を、標準的手順によって、ｐＸＣ１（ＭｃＫｉｎｎｏｎら，（１９８２）Ｇｅｎｅ１９：３３−４２）またはＡｄ−ｄｌ０１／０７（Ｈｏｗｅら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：５８８３−５８８７）から、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＲＳＶプロモーター／ＳＶ４０ポリＡ発現カセットへクローニングし、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｗｔ、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｄｌ１１０１、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｄｌ１１０７およびｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７を作製した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ−５５Ｋを、ｐＸＣ１由来のＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子をＰＣＲを使用してｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＣＭＶプロモーター／ＢＧＨポリＡ発現カセットへクローニングすることで作製した。ｐ５３ｃｏｎ−ｌｕｃは、４つのコンセンサスｐ５３結合部位、およびサルウイルス−４０（ＳＶ４０）初期プロモーター由来のＴＡＴＡボックス（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０３５−１０４１）を、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のルシフェラーゼ遺伝子の上流に含んだ。ｐＥ２Ｆ−ｌｕｃは、アデノウイルス初期領域２プロモーター由来のＥ２Ｆ結合部位の４つのコピーおよびＳＶ４０のＴＡＴＡボックスを、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ中のルシフェラーゼ遺伝子の上流に含んだ。
【０１７４】
（ウイルス構築物）
ｒＡｄ−β−ｇａｌおよびｒＡｄ−ＧＦＰは、構成的に活性なＣＭＶ即時初期プロモーターの制御下にある、β−ガラクトシダ−ゼ（β−ｇａｌ）遺伝子かまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のいずれかを含む、発現カセットをＥ１−欠失中に挿入した、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスベクターであった（Ｃｈｅｎｅｙら，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２３３１−２３３４；Ｗｉｌｌｓら，（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１０７９−１０８８）。ｐ５３レポーターのｒＡｄ−ＰＲＥ−ＧＦＰは、発現カセットをＥ３欠失中に含み、そこではｐ５３−応答エレメント（ｐ５３−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０３５−１０４１）が、ＧＦＰの発現を調節した。Ａｄ５−ｄｌ３０９（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ，（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：３６６５−３６６９）を野生型コントロールウイルスとして使用した。Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質を産生しないＡｄ５−ｄｌ３０９に基づく変異体ウイルスのＥ１Ｂ／１９Ｋ−（Ｍａｒｃｅｌｌｕｓら，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６２０７−６２１５）、およびＥ１Ａ領域に大きな欠失を有するＮＴ１０１０（Ｗｈｙｔｅら，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：６７−７５）が、以前に記載されている。ｄｌ１５２０（ＢａｒｋｅｒおよびＢｅｒｋ，（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６：１０７−１２１）は、Ｅ１Ｂコード領域での欠失（Ａｄ５等価物の２４９６−３２３３）およびＥ１Ｂ−５５Ｋの３番目のコドンでの終了コドンを含む、キメラアデノウイルス（Ａｄ２およびＡｄ５−ｄｌ３０９）であった。このＡｄ−Ｅ１Ｂ−ウイルスは、プラスミドのｐＸＣ１中のＥ１Ｂコード領域を、Ｅｃｏ／ＶＩおよびＢｇ／ＩＩの消化によって取り除き、クレノウ補充（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｉｌｌ  ｉｎ）ならびに平滑末端連結（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって構築され、ｐＸＣ１−Ｅ１Ｂ−を作製する。変異したＥ１Ｂ領域を含むＡｄ配列をｐＸＣ１−Ｅ１Ｂ−から、大型の転移プラスミド（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）のｐＴＧ９５３０（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）へ移し、ｐＴＧ９５３０−Ｅ１Ｂ−を作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３（Ｃｈａｒｔｉｅｒら，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５−４８１０）における相同組換えを、ｐＴＧ９５３０−Ｅ１Ｂ−およびウイルスプラスミドｐＴＧ４２１３−Ａｄ５−ｄｌ３０９の形質転換によって、感染性のＡｄ−Ｅ１Ｂ−アデノウイルスＤＮＡを産生するために使用した。生じたＡｄ−Ｅ１Ｂ−プラスミドを単離し、そして２９３細胞にトランスフェクトし、ウイルスを産生した。全てのウイルスは、以前記載された方法（Ｈｕｙｇｈｅら，（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１４０３−１４１６）を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。内部アデノウイルス標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に対してインタクトなアデノウイルス粒子の濃度を決定する、イオン交換ＨＰＬＣに基づく方法（ＲＱ−ＨＰＬＣ）によって、粒子濃度を推��した（Ｓｈａｂｒａｍら，（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：４５３−４６５）。
【０１７５】
（Ｅ１Ａｗｔ、Ｅ１Ａ−変異体タンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋを発現するＡ５４９細胞クローンの選抜）
Ｅ１ＡｗｔまたはＥ１Ａ−変異体タンパク質を発現するクローンの選抜のために、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｗｔ、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａ１１０１、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａ１１０７およびｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａ０１／０７をＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＡ５４９細胞にトランスフェクトさせた。２日間のインキュベーションの後、３５０μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有する増殖培地中で選抜を開始した。Ｅ１Ａｗｔ、またはＥ１Ａ変異体選抜プラスミドでトランスフェクトした培養物由来の薬剤耐性コロニーを、トリプシン処理し、細胞プールとして確立し、９６ウェルプレートに希釈クローニングした。ネオマイシンを含有する培養培地中の選抜を、さらに３週間行い、その後各トランスフェクションに由来する４８個のそれぞれクローンを増殖させ、そしてウイルス産生能力についてスクリーニングした。Ａ５４９−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４に基づく細胞株は、Ａ５４９−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ−５５Ｋでトランスフェクトし、そして３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で選抜する点を除いて、同じ手順を用いて、Ｅ１Ｂ−５５Ｋを発現するように操作した。
【０１７６】
（Ｅ１相補性細胞株の産生）
Ｅ１Ａｄｌ０１／０７変異を含むＡｄ５Ｅ１Ａ配列を、Ａｄ−ｄｌ０１／０７（Ｈｏｗｅら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：５８８３−５８８７）から標準的手順によって、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１ＡのＲＳＶプロモーター／ＳＶ４０ポリＡ発現カセットへクローニングし、ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７を作製した。ｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７の地図については、図２を参照のこと。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ−５５Ｋを、ｐＸＣ１からのＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子（ＭｃＫｉｎｎｏｎら，（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３３−４２）を、ＰＣＲを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＣＭＶプロモーター／ＢＧＨポリＡ発現カセットへクローニングすることによって作製した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ−５５Ｋの地図については、図３を参照のこと。
【０１７７】
プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−Ｅ１Ａ０１／０７をＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＡ５４９細胞にトランスフェクトさせた。２日間のインキュベーションの後、３５０μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有する増殖培地中で選抜を開始した。トランスフェクトした培養物由来の薬剤耐性コロニーを、トリプシン処理し、細胞プールとして確立し、９６ウェルプレートに希釈クローニングした。ネオマイシンを含有する培養培地中の選抜を、さらに３週間行い、その後トランスフェクション由来の４８個のそれぞれのクローンを増殖させ、そしてウイルス産生能力についてスクリーニングした。プラスミドのｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ−５５Ｋを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬を用いて、形質転換細胞株のＡ５４９−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４へトランスフェクトさせた。２日間のインキュベーションの後、ハイグロマイシン（３５０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有する増殖培地中で選抜を開始した。トランスフェクトした培養物由来の薬剤耐性コロニーを、トリプシン処理し、細胞プールとして確立し、９６ウェルプレートに希釈クローニングした。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）およびネオマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を追加した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の培養培地中の選抜を、さらに３週間行い、その後トランスフェクション由来の４８個のそれぞれのクローンを増殖させ、そしてウイルス産生能力についてスクリーニングした。
【０１７８】
（細胞クローンのスクリーニング手順）
Ｅ１ＡｗｔまたはＥ１Ａ変異体タンパク質を発現するＡ５４９に基づくクローンのウイルス産生能力を、６ウェルプレートに平板培養された細胞にｒＡｄ−ＧＦＰ（１×１０８粒子／ｍｌ）を感染させることによって評価した。ウイルス複製効率を緑色蛍光タンパク質強度および細胞障害効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）（ＣＰＥ）をモニターすることによって推定した。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ−５５Ｋでトランスフェクトすることによって確立されたＥ１Ａ０１／０７−４に基づくクローンをスクリーニングするために、細胞をｒＡｄ−ＰＲＥ−ＧＦＰ（１×１０８粒子／ｍｌ）に感染させ、そしてｐ５３活性の低下、および確固としたＣＰＥを示す、低いＧＦＰ強度のクローンをさらなる特徴づけのために選択した。
【０１７９】
選択されたクローンのウイルス産生を、細胞当たりの基準で、産生した粒子の数を測定することによって決定した。このアッセイのために、細胞を５×１０ｅ８粒子／ｍｌのｒＡｄベクターで感染させ、そして、感染時に、二連のプレートまたはフラスコの細胞をトリプシン処理し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を用いてカウントした。感染が完了した時点（３〜４日）で、細胞および培地を回収し、３回凍結／解凍しそして細胞破片を取り除くために遠心分離した。清澄化した溶解産物中の粒子濃度を、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定した（Ｓｈａｂｒａｍら，（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４５３−４６５）。
【０１８０】
（Ｅ１Ａタンパク質レベルを決定するためのウェスタンブロッティング分析）
全細胞タンパク質溶解産物を、示した細胞を溶解Ａ緩衝液（５０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、０．５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０［Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ］およびプロテアーゼインヒビターカクテル［Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ］）中でインキュベートし、続けて遠心分離することによって調製した。溶解産物中の総タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定し、そして５０μｇのアリコートを、勾配（４％〜１２％）ＮＵＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いた、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上へ移した後、ウェスタン検出を、Ｅ１Ａ（Ｍ７３、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはα−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に特異的な抗体を使用して行った。結合パターンを、この膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスイムノグロブリンＧおよびＭ抗体（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてインキュベートすることによって、決定し、そして増強された化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって検出した。
【０１８１】
（ウイルスＤＮＡの分析）
低分子量のＤＮＡを、改変Ｈｉｒｔ抽出（Ｈｉｒｔ、１９６７）を用いて、示された時点で、６ウェルのプレート上でｒＡｄ−β−ｇａｌ（１×１０ｅ８粒子／ｍｌ）を用いて感染させた細胞から単離した。感染した細胞を、引っかくことによって採取し、そしてＴＮＥ緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣＩ、１０ｍＭトリス（７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）、０．２５ｍｇ／ｍｌプロナーゼＥ（Ｓｉｇｍａ））に溶解した。凍結−解凍サイクルの後に、溶解産物を遠心分離によって清澄化し、フェノール：クロロホルム混合物（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）で抽出し、そしてエタノール沈殿させた。核酸ペレットを、ＲＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を含有する６０μｌのＴＥ中に懸濁し、その後１２μｌのサンプルをＸｈｏＩで制限切断し、１％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡ制限パターンを、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【０１８２】
（ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫを用いたアポトーシスのフローサイトメトリーによる決定）
Ｅ１Ａｗｔクローン、Ｅ１Ａ−変異体クローンおよびＡ５４９コントロール細胞を、ウェル当たり１５０，０００細胞で、６ウェルプレート上で平板培養し、そして２４時間後にｒＡｄ−β−ｇａｌ（１×１０８粒子／ｍｌ）を用いて感染させた。感染から２０時間後に、５μＭのＣａｓｐＡＣＥ  ＦＩＴＣＴＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を直接に培養培地に加えた。２０℃で２０分間のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗い、そして２０℃で３０分間０．５％ホルムアルデヒド中で固定した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行い、そして蛍光は５３０ｎｍ（４８８ｎｍの励起）において測定した
（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、レポータープラスミドでトランスフェクトした細胞の溶解産物を、製造者の仕様書に従い、再構成したルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と混合した。各溶解産物のルシフェラーゼ活性を、Ａｎａｌｙｓｔ  ＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて決定した。
【０１８３】
（Ｅ１Ｂ−５５Ｋの免疫沈降）
上記のようにして調製した、タンパク質溶解産物（総タンパク質量１ｍｇ）を、プロテイン−Ｇセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用い予め清澄化し、そして５μｇのＥ１Ｂ−５５Ｋ特異的マウスモノクローナル抗体２Ａ６（Ｓａｒｎｏｗら，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２８：３８７−３９４）とともにインキュベートした。Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−イムノグロブリン複合体を、プロテイン−Ｇセファロース上で精製し、溶解緩衝液で徹底的に洗い、そして還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液とともにインキュベートした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を、２Ａ６モノクローナル抗体を使用して、上記のようにウェスタンブロットによって検出した。
【０１８４】
（Ｅ１−欠失ｒＡｄ−ベクターの２９３またはＳＬ０００３中の連続継代）
連続継代のために使用されるｒＡｄ−β−ｇａｌウイルスを、まず３回プラーク精製し（ｐｌａｑｕｅ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ、Ｋａｍｓｔｒｕｐｖｅｊ、Ｄｅｎｍａｒｋ）中で生長させたＳＬ０００３細胞を使用して増殖させ、そしてカラムクロマトグラフィーによって精製した。生じたウイルスストック（ｖｉｒｕｓ  ｓｔｏｃｋ）、ｒＡｄ−β−ｇａｌ（ｐ０）は、以下に記載する２１日間のバイオアッセイを使用して、複製能力を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）を含まないことを試験した。最初の連続継代のために、２９３またはＳＬ０００３を含むｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙを、精製した５×１０ｅ８粒子／ｍｌのｒＡｄ−β−ｇａｌ（ｐ０）で感染させた。感染が完了した時に調製した細胞溶解産物を、ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙに接種された新鮮な２９３またはＳＬ０００３細胞の２回目のセットに感染させるのに使用した。継代２回目から５回目の感染の溶解産物を、同様にして調製し、継代５回目において、ウイルスをカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０１８５】
（ＲＣＡについてのアッセイ）
以前に記載されたプロトコール（Ｚｈｕら，（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１１３−１２１）に基づいた改変バイオアッセイを、２９３またはＳＬ０００３での増殖の後に精製された１×１０ｅ１１の総粒子のｒＡｄ−β−ｇａｌを用いて、ＲＣＡを検出するのに用いた。最初のＲＣＡバイオアッセイ感染のために、１０個のＴ２２５フラスコのそれぞれに１×１０ｅ７細胞のＡ５４９細胞を接種し、そして２４時間後に、２９３またはＳＬ０００３細胞から調製されたフラスコ当たり１×１０ｅ１０粒子のｒＡｄ−β−ｇａｌを感染させた。３日後、感染したＡ５４９細胞から細胞溶解産物を調製し、そして３×１０ｅ６のＡ５４９細胞で接種してあったフラスコの２番目のセットに感染させるのに使用した。２回目の感染のために、最初の感染からのｒＡｄ−β−ｇａｌおよびコントロールの溶解産物を半分に分け、そして５個のＴ２２５フラスコのセットを感染させるのに使用した。最初の感染から１２日後に、第２回目の感染からの溶解産物を調製した。各溶解産物を半分に分け、そして３×１０ｅ６のＡ５４９細胞で接種した５個のフラスコを感染させるのに使用し、そしてさらに９日間インキュベートした。コントロールサンプルは、Ａｄ５野生型（１０フラスコ当たり６ウイルス粒子）および６ウイルス粒子のＡｄ５野生型により増強された（ｓｐｉｋｅｄ）１×１０ｅ１１ウイルス粒子のｒＡｄ−β−ｇａｌを包含した。増強されたコントロールおよび野生型アデノウイルスコントロールの両方が、２１日間の感染の間にＣＰＥを生成するために必要であった。このバイオアッセイの間にＣＰＥがｒＡｄ−β−ｇａｌサンプル中で観察された場合、低分子量ＤＮＡを、およそ１×１０ｅ７細胞から、ウイルスＤＮＡ分析のために単離した。
【０１８６】
（ＩＩ．結果）
（産生レベル）
選択された細胞株のウイルス産生能力は、複製能力を有するウイルスのＡｄ５−ｄｌ３０９を用いた感染によって評価した。Ａ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞は、それぞれ５５８，０００粒子／細胞および４４４，０００粒子／細胞のウイルスを産生した。試験した他の細胞株としては、ＤＬＤ−１、Ｕ８７ＭＧ、ＭＤＡ４６８およびＩＧＲＯＶ−１が挙げられ、全て１２０，０００粒子／細胞未満のウイルスを産生した。２９３細胞はＡｄ５−ｄｌ３０９ウイルスを１３９，０００粒子／細胞で、およびｒＡｄ−β−ｇａｌウイルスを１２７，０００粒子／細胞で産生した。ＨｅＬａ細胞株およびＡ５４９細胞株におけるＡｄ５−ｄｌ３０９の産生能力は、これらのヒト腫瘍細胞株が、Ｅ１−相補性細胞株の開発における使用の最良の候補であることを示唆している。
【０１８７】
（Ａ５４９細胞におけるＥ１Ａの相補）
野生型Ｅ１Ａの発現は、Ａ５４９細胞の増殖能力を減少させ、そして血清枯渇条件下でアポトーシスをもたらすことが報告されている（Ｈｕｂｂｅｒｓｔｅｙら，（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：３２１−３２９）。Ａ５４９細胞におけるＥ１Ａ発現に付随する毒性を制限するために、数個のＥ１Ａ変異体を、ｒＡｄベクター産生のためのＥ１機能の安定的発現および相補について試験した。使用したＥ１Ａ変異体（Ｅ１Ａｄｌ１１０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７およびＥ１Ａｄｌ０１／０７）は、細胞周期の進行およびアポトーシスの誘起に必要とされる（図１）Ｅ１Ａタンパク質の領域中の欠失を保持したが、他の初期ウイルスプロモーターの刺激のために必要とされるＥ１Ａトランスアクチベーションドメインを損なっていなかった。特に、このＥ１Ａｄｌ１１０１およびＥ１Ａｄｌ１１０７変異体は、それぞれ細胞タンパク質ｐ３００／ＣＢＰおよび細胞タンパク質ｐＲｂへの結合に欠陥がある一方、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７変異体は、両方の細胞タンパク質への結合に欠陥がある。
【０１８８】
ＲＳＶプロモーターの制御下のＥ１Ａｄｌ１１０１、Ｅ１Ａｄｌ１１０７、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７または野生型Ｅ１Ａのいずれかを発現するプラスミドを、Ａ５４９細胞をトランスフェクトするために使用した。プラスミドは、選択可能マーカーとして、ネオマイシン耐性遺伝子も含んでいた。Ｇ４１８耐性細胞のプールからの個々のクローンを単離し、そしてｒＡｄ−ＧＦＰで感染させることによってスクリーニングした。ＧＦＰ発現のレベルを４８クローンにおいて視覚的に検査し、そしてさらなる特徴づけのために５つのクローンを選択した。各クローン（Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０１−１からＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０１−５、Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０７−１からＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ１１０７−５、Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−１からＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−５、Ａ５４９Ｅ１Ａｗｔ−１からＡ５４９Ｅ１Ａｗｔ−５）の産生能力を、本明細書において記載されるようにして、細胞当たりで産生されるｒＡｄ−ＧＦＰ粒子の定量によって決定した。産生アッセイの結果（表２を見よ）は、Ｅ１ＡｗｔまたはＥ１Ａｄｌ１１０１のいずれかを発現する細胞クローンが、低いウイルス産生性を有したことを示す。Ｅ１Ａｄｌ１１０７から分離された細胞クローンは、概して乏しい産生収量を示したが、例外的に、細胞クローンＥ１Ａｄｌ１１０７−１は、細胞当たり２０，０００粒子を超える収量を有した。対照的に、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７トランスフェクションプールから単離された細胞クローンは、アッセイした５つの細胞クローンのうち４つが、細胞当たり２０，０００および３０，０００の間の粒子濃度を産生したように、最も高い産生収量を有した。
【０１８９】
【表２】
2011015696.tif 000008
（Ｅ１Ａ発現Ａ５４９クローンにおけるＥ１Ａタンパク質レベルの測定）
選択されたクローン（Ｅ１Ａｄｌ１１０１−１からＥ１Ａｄｌ１１０１−５、Ｅ１Ａｄｌ１１０７−１からＥ１Ａｄｌ１１０７−５、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−１からＥ１Ａｄｌ０１／０７−５、Ｅ１Ａｗｔ−１からＥ１Ａｗｔ−５）のＥ１Ａタンパク質レベルを、Ｅ１ＡのＣ−末端領域のエピトープを認識するＥ１Ａ特異的モノクローナル抗体（Ｈａｒｌｏｗら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：５３３−５４６）を使用して、ウェスタンブロット分析によって決定した。このエピトープは、ｄｌ１１０１およびｄｌ１１０７変異によっては、影響を受けなかった。ウェスタン分析は、Ｅ１Ａタンパク質の発現レベルは、クローン間で大きく変化することを示した。加えて、発現された野生型または変異体Ｅ１Ａタンパク質の量は産生収量と相関しなかった。野生型Ｅ１ＡまたはＥ１Ａｄｌ１１０１変異体を発現する全ての細胞クローンは、発現されるＥ１Ａタンパク質の量にかかわらず、非効率的な産生クローンであった。ほとんど検出不可能なレベルのＥ１Ａタンパク質を発現するが、Ｅ１Ａｄｌ１１０７細胞クローンの中では、Ｅ１Ａｄｌ１１０７−１のみが効率的な産生クローンであった。Ｅ１Ａｄｌ１１０７−１細胞クローンは、増殖が貧弱（産生細胞株には望ましくない特徴）なので、さらには分析しなかった。Ｅ１Ａｄｌ０１／０７細胞クローンもまた種々のレベルのタンパク質を示し、最良の産生細胞クローンであるＥ１Ａｄｌ０１／０７−４は、比較的高レベルで発現するＥ１Ａｄｌ０１／０７−５よりも低いレベルでタンパク質を発現する。
【０１９０】
（感染後のウイルスの複製およびアポトーシスの分析）
異なる産生収量についての生物学的基礎をさらに特徴づけるために、同様なレベルでＥ１Ａタンパク質を発現したＥ１Ａｗｔ−２細胞クローンおよびＥ１Ａｄｌ０１／０７−５細胞クローンを選択した。Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞クローンは、あらゆる他の株よりも、ウイルス粒子を効率よく産生したので（表２を見よ）、さらなる特徴づけのために、これも選択した。
【０１９１】
Ａ５４９−Ｅ１Ａｗｔ−２および２つのＡ５４９−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７細胞クローン（Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４およびＥ１Ａｄｌ０１／０７−５）がＥ１−欠失ウイルスのｒＡｄ−β−ｇａｌウイルスの複製を支援する能力を、感染細胞からの低分子量ＤＮＡの制限酵素消化によって分析した。制限酵素消化分析は、種々の細胞株から単離されたウイルスＤＮＡは、量および質において異なっていることを示した。Ｅ１Ａｄｌ０１／０７細胞クローンからのｒＡｄ−β−ｇａｌＤＮＡの質は２９３細胞から単離されたウイルスＤＮＡに匹敵した。Ｅ１Ａｗｔ−２クローンからは、非常に低レベルのｒＡｄ−β−ｇａｌウイルスＤＮＡが産生され、単離されたＤＮＡは、ＤＮＡ断片化によってアガロースゲル上で不鮮明になり、これらの細胞における高レベルのアポトーシスを示唆した。
【０１９２】
クローンＥ１Ａｗｔ−２から産生されるウイルスＤＮＡの分析は、アポトーシスは起こり得、産生されるウイルスの量を制限する可能性があることを示唆した。ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ＦＭＫペプチドを、感染後のアポトーシス性の（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）細胞死の指標として、フローサイトメトリーによってカスパーゼ活性を測定するために用いた。表３に示すように、ほとんど半数のＥ１Ａｗｔ−２細胞が、感染から２０時間後にアポトーシス性であった一方、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞クローンおよびＥ１Ａｄｌ０１／０７−５細胞クローンにおいては、アポトーシスは誘発されなかった。これらの結果をまとめると、Ｅ１Ａｗｔ−２細胞のウイルス感染は、未成熟アポトーシスを誘発し、ウイルスＤＮＡ複製およびその後のウイルス粒子産生を制限することを示唆する。
【０１９３】
【表３】
2011015696.tif 000009
（Ｅ１ＡｗｔおよびＥ１Ａｄｌ０１／０７細胞クローンにおけるＥ２Ｆおよびｐ５３転写因子の状態）
Ｅ１Ａによるアポトーシスの誘発は、ｐＲｂおよびｐ３００／ＣＢＰの結合と関連し、Ｅ２Ｆおよびｐ５３転写因子の活性化をもたらすことが示されている（Ｑｕｅｒｉｄｏら，  （１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３５２６−３５３３）。選択された産生細胞クローンにおけるＥ２Ｆおよびｐ５３活性レベルを測定するために、コンセンサスｐ５３プロモーターかまたはＥ２Ｆプロモーターのいずれかの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を置いたレポータープラスミドを作製した。ｐ５３およびＥ２Ｆプロモーター活性はＥ１Ａｗｔ−２クローンにおいて上昇しているのが見出だされた（表４を参照のこと）。対照的に、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４およびＥ１Ａｄｌ０１／０７−５クローンにおいては、ｐ５３およびＥ２Ｆ活性レベルは、コントロールのＡ５４９細胞と同様であった。
【０１９４】
【表４】
2011015696.tif 000010
（Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４におけるＥ１Ｂの相補）
Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４クローンは、複製欠損アデノウイルスを小規模形式で産生することができたが、収量はＥ１Ｂを使用した相補によってさらに改善され得ることが推論された。Ｅ１Ｂ相補の後のＥ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞の産生収量を試験するために、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞を、２つの異なる濃度で（１×１０ｅ８粒子／ｍｌおよび５×１０ｅ８粒子／ｍｌ）、Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＥ１Ｂ５５Ｋを個別にかまたは共にかのいずれかで発現する一連のＥ１アデノウイルス変異体で感染させた。Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞に、機能のない切断型Ｅ１Ａおよび野生型Ｅ１Ｂを産生するウイルス（Ａｄ−ＮＴ１０１０）を感染させるとＡｄ５−ｄｌ３０９に匹敵するウイルスを産生することが見出された（表５を見よ）。対照的に、Ｅ１Ａを発現するがＥ１Ｂは発現しない変異体ウイルス（ＡｄＥ１Ｂ−）は、試験ウイルスの両濃度における感染の後にも細胞当たり約５５，０００粒子しか産生しなかった。これらの結果は、Ｅ１Ｂの相補は産生収量を増加させることを示唆した。Ｅ１Ｂ領域の寄与をさらに明確にするために、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（ｄｌ１５２０）かまたはＥ１Ｂ−５５Ｋ（ＡｄＥ１Ｂ−１９Ｋ−）かのいずれかのみを発現するウイルスをＥ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞での増殖に関して試験した。Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現するウイルスの産生性は、Ａｄ５−ｄｌ３０９のそれより相当に低かった一方、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ発現ウイルスは、Ａｄ５−ｄｌ３０９よりも高いレベルで生産した。
【０１９５】
【表５】
2011015696.tif 000011
これらの結果は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の付加が、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞株においてウイルス収量を増加させることを示唆した。Ｅ１Ｂ−５５Ｋをコードする配列のみの使用は、ｒＡｄ産生の間のＲＣＡを産生する可能性をさらに減少させ得る。Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞においてＥ１Ｂ−５５Ｋ機能を相補するために、ＣＭＶプロモーターの制御下にＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子をクローニングした、選抜プラスミド（ｐｃＤＮＡ−５５Ｋ）を使用した。ｐｃＤＮＡ−５５Ｋ中の発現カセットの配列をＤＮＡ配列決定によって確かめ、そして完全なＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の発現をＨｅＬａ細胞における一過性トランスフェクションによって証明した。
【０１９６】
Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４細胞を、ハイグロマイシン耐性マーカーも保持するｐｃＤＮＡ−５５Ｋでトランスフェクトし、そして個々のクローン（Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−１からＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−６）を薬剤耐性プールから希釈クローニングによって選抜した。ｒＡｄ−ＰＲＥ−ＧＦＰと名づけられた複製欠損アデノウイルス中に保持される、ＧＦＰ発現を制御するｐ５３応答性プロモーター（ＰＲＥ）の阻害を測定する免疫蛍光アッセイを使用して、クローンをＥ１Ｂ−５５Ｋ機能についてスクリーニングした。親のＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４株などの野生型ｐ５３を発現する細胞においては、ＧＦＰはｒＡｄ−ＰＲＥ−ＧＦＰから高レベルで発現された。対照的に、ｒＡｄ−ＰＲＥ−ＧＦＰからのＧＦＰの発現は、２９３細胞（コントロール）および、Ｅ１Ｂ−５５Ｋおよび野生型のｐ５３を発現するＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ細胞においては、低かった。Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−２を含む数個のクローンを、このアッセイを使用して選抜し、そしてＥ１Ｂ−５５Ｋ発現およびウイルス産生についてさらに特徴づけた。
【０１９７】
同様のレベルのＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を、選択されたクローンの全て（Ａ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−１からＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−６）からの細胞溶解産物中で、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ特異的モノクローナル抗体２Ａ６を用いて、免疫沈降法によって検出した。そして一つのクローンのＡ５４９Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−４−Ｅ１Ｂ−５５Ｋ−２（以降ＳＬ０００３と呼ぶ）を、その増殖特性およびウイルス産生に基づいてさらに特徴づけるために選択した。
【０１９８】
細胞株安定性は、薬学的なスケールアップ産生のためには重要であり、そしてそれゆえに、ＳＬ０００３細胞のウイルス増殖能力を、２０回の細胞培養継代の間に評価した。表６は、培養継代５回目、１５回目および２０回目にアッセイしたＳＬ０００３細胞は、平均して細胞当たり約９６，０００粒子のｒＡｄ−β−ｇａｌウイルスを産生したことを示す。
【０１９９】
【表６】
2011015696.tif 000012
（ＳＬ０００３細胞中で産生されたウイルスのＲＣＡ試験）
ｒＡｄベクターの産生の間のＲＣＡ生成を試験するため、ＲＣＡを含まないウイルスロットを最初の接種材料として使用して、およそ１×１０ｅ９細胞を含有するｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙで増殖させたＳＬ０００３細胞かまたは２９３細胞のいずれかにおいて、ｒＡｄ−β−ｇａｌを連続的に継代した。ＲＣＡの検出のために使用したバイオアッセイは、ｒＡｄ−β−ｇａｌ、１．７×１０ｅ１０粒子当たり野生型ウイルス１粒子の感度レベルを有した（上記を参照のこと）。５回の連続継代の後、ＲＣＡは２９３細胞から精製されたｒＡｄ−β−ｇａｌウイルス中に検出されたが、ＳＬ０００３細胞から精製されたｒＡｄ−β−ｇａｌ中にはＲＣＡは検出されなかった。ＰＣＲ分析によって、２９３細胞からこのＲＣＡアッセイで検出されたウイルスは、Ａｄ５による汚染よりはむしろ組換えから生じたことが確認された。
【０２００】
（ＩＩＩ．考察）
本明細書において例示されるように、２つの別個の発現カセットを取り込んだヒト細胞株（「ＳＬ０００３」と呼ぶ）を作製した。ここで、この第一の発現カセットは、ｄｌ０１／０７欠失を含むアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を含み、第２の発現カセットは、Ａ５４９腫瘍細胞においてアデノウイルスの複製を相補するための選択されたウイルス機能および細胞機能を提供する、アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子を含む。ＳＬ０００３細胞株におけるＥ１相補の最適化は、別々のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ発現カセットの連続的付加を用いて達成された。ＳＬ０００３細胞株においては、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７変異体遺伝子が、Ｅ１Ａ機能を提供しそして野生型Ｅ１Ａに付随する細胞毒性を減少させるために、構成的に発現される。ＳＬ０００３細胞株におけるＥ１Ｂ機能は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の構成的発現によって提供され；Ｅ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子は含まない。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂカセットの分離、変異体Ｅ１Ａ遺伝子、およびＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子のみの使用は、相同組換えかまたは非相同組換えのいずれかを通した完全なＥ１領域の再構成およびその後のＲＣＡの産生の可能性を排除した。ＳＬ０００３細胞株において相補のために用いられたアデノウイルス配列は、２９３細胞における野生型Ｅ１アデノウイルス配列と比較して、広範に改変されているが、ＳＬ０００３細胞株は２９３細胞株から得られるものに匹敵するウイルス産生レベルでｒＡｄベクターを産生し、かつ検出可能なＲＣＡを生成しないことが示された。
【０２０１】
（実施例２：Ｅ１Ａ、Ｅ１ｂおよびＥ２ｂ相補性細胞株の産生および組換えアデノウイルスの産生における細胞株の使用）
この実施例は、高力価の複製欠損、ヘルパー非依存性組換えウイルスの産生のためのＥ１Ａ、Ｅ１ｂおよびＥ２ｂ相補性細胞株の有用性を例示する。
【０２０２】
（Ｉ．材料および方法）
（組織培養）
Ａ５４９、ＣＨＯ−Ｋｌ、Ｓａｏｓ２、ＨｅＬａ、およびＨｅｐＧ２細胞は、全てＡＴＣＣから購入した。Ｃ７細胞（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：３３５２−３３５６）はＵ．ｏｆ  ＭｉｃｈｉｇａｎのＪ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎから好意的に提供された。ヒトトノン嚢眼線維芽細胞（ＨＯＦ細胞と呼ぶ）は、Ｐｅｒｋｉｎｓら（２００２）Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２０：９４１−９に記載されているようにして単離した。クローン４細胞の開発は実施例１に上記した；このクローンは、指定されたクローン、Ｅ１Ａ０１／０７−４ｉである。Ａ５４９、Ｃ７、およびＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）で維持した。ＨｅＬａ細胞は５％ＦＢＳを追加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）で維持した。ＣＨＯ−Ｋ１およびＳａｏｓ２細胞は、１０％ＦＢＳを追加したＨａｍｓ  Ｆ１２／ＤＭＥ培地で維持した。ＨＯＦ細胞はＤＭＥ＋２０％ＦＢＳで維持した。クローン４細胞は、３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＤＭＥ＋１０％ＦＢＳで維持した。
【０２０３】
（Ａｄ  Ｅ２ｂ  Ｐｏｌ発現細胞の単離）
クローン４細胞を、１０μｇの直線化プラスミドｐＭＧＣＭＶＥ２ｂＰｏｌでＣａＰＯ４トランスフェクション法を用いてトランスフェクトした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。トランスフェクションに続けて、細胞を１５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを追加したＤＭＥ＋１０％血清中で選抜した。このプールは、薬剤選抜下で限界希釈クローニングをうけ、そしてクローン３Ｄ８を選択した。クローン３Ｄ８を、１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を追加したＤＭＥ＋１０％血清で増殖させた。
【０２０４】
（Ａｄ  Ｅ１ｂ発現細胞の単離）
１５Ｍ１５細胞を、上記のクローン３Ｄ８に由来した。３Ｄ８細胞を、１０μｇの直線化ｐＶＩＴＲＯ２ＩＲＥＳＰｕｒｏＥ１ｂ（図４）で、先のようにＣａＰＯ４トランスフェクション法を用いてトランスフェクトした。クローン１５を、初め、０．２μｇ／ｍｌピューロマイシンで処理したトランスフェクトされたプールから単離した。クローン１５Ｍ１５を、さらにクローン１５から限界希釈単離を通して単離し、そして３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８、１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン、および０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを追加したＤＭＥ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた。
【０２０５】
（アデノウイルス機能を発現するプラスミド構築物）
アデノウイルスＥ２ｂポリメラーゼ配列を、プラスミドｐＡＣＮ（Ｗｉｌｌｓら（１９９５）Ｃａｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１９１−１９７）から、最初の３つの上流アミノ酸「ＭＡＬ」（Ｓｈｕら（１９８８）Ｖｉｒｏｌ．１６５：３４８−３５６によって記載される）を、残りのＡｄ  ５  Ｅ２ｂポリメラーゼコード配列に加えるプライマーを利用したＰＣＲによって、単離した。プライマーは制限部位もまた加え、この制限部位は、このＰＣＲ断片がベクターｐＭＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の、ＣＭＶプロモーターの下流のＢａｍ  ＨＩ制限部位へクローニングされることを可能にする。生じたプラスミドはｐＭＧＣＭＶＥ２Ｂｐｏｌと名づけられた（図５）。ＣＭＶに駆動される全長のＥ２ｂポリメラーゼコード配列に、ＩＲＥＳ配列および選抜のために使用されるハイグロマイシン耐性遺伝子が続く。
【０２０６】
プラスミドｐＩＲＥＳＰｕｒｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡから）を、ＮｄｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、そしてアンピシリンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含む４．７ｋｂの断片を、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）のＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ゲル抽出キットからのプロトコールに従い、１％ＴＡＥアガロースゲルから単離した。プラスミドｐＶＩＴＲＯ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから）をＮｄｅＩおよびＡｃｃＩで消化し、そしてエンハンサーを伴ったヒトフェリチン軽および重サブユニットプロモーターを含む３．９ｋｂの断片を、上と同様にして、１％ＴＡＥアガロースゲルから単離した。この２つの断片をともに連結し、プラスミドｐＶＩＴＲＯ２ＩＲＥＳＰｕｒｏを形成した。アデノウイルスＥ１ｂ配列を、アデノウイルスプラスミドｐＴＧ４６０９（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ、ＦＲ）からＰＣＲによって単離し、そしてプラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）クローニングベクターへサブクローニングした。そこから、Ｅ１ｂ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてクレノウで処理し、そして平滑末端をＥｃｏＲＶで消化されたｐＶＩＴＲＯ２ＩＲＥＳＰｕｒｏへクローニングした。これによって、Ｅ１ｂ領域がヒトフェリチン重サブユニットプロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーによって駆動され、細胞選抜のためのピューロマイシン耐性遺伝子を有する、プラスミドｐＶＩＴＲＯ２ＩＲＥＳＰｕｒｏＥ１ｂが作製された。Ｅ１ｂ配列が正しく配向していることを、制限消化パターンによって確かめた。
【０２０７】
（ウイルス構築物）
ＧＦＣＢの構築は以前に記載されている（Ｃｈｅｎｅｙら，（１９９８）Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５８：２３３１−２３３４）。手短に言えば、これは、ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーター／エンハンサーから増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＥ１欠失領域からＡｄ  ２  ＴＰＬ  ｃＤＮＡを発現し、Ｅ１ｂ／ＰＩＸウイルスポリＡシグナルを、そのメッセージを終了させるために利用する、Ｅ１、ＰＩＸ、Ｅ３欠失ウイルスである。ＣＯＮＧもまた以前に記載されている。これは、ＧＦＣＢと類似するＥ１／Ｅ３欠失ウイルスバックボーンにおいて，欠失Ｅ３領域中の３’から５’の方向でｅＧＦＰを駆動するコンセンサスｐ５３応答エレメントを含む。ウイルス構築物ＣＧＡＢ、４２ＧＣ、４６ＧＣ、および２ＧＣＰは、全て、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から単離した同一の発現カセットを利用する。カセットは、ヒトＣＭＶ即時初期プロモーター／エンハンサー、増強型緑色蛍光タンパク質遺伝子、およびＳＶ４０初期ｍＲＮＡポリアデニル化シグナルを含む。ＣＧＡＢについては、この発現カセットは、ＧＦＣＢに含まれるものを置き換える。４２ＧＣ、４６ＧＣおよび２ＧＣＰは、全て、それらの発現カセットを、ウイルスバックボーンのＥ３欠失領域において５’から３’の方向に含む。４２ＧＣおよび２ＧＣＰは、また、ｐＩＸは完全なままで含み、Ｅ１ａおよびＥ１ｂを欠失している。４６ＧＣは、Ｅ１は完全であるウイルスで、かつ複製能力を有する。２ＧＣＰウイルスはまた、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら（１９９８）（（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：３３５２−３３５６）に報告されるように、Ｅ２ｂウイルスＤＮＡポリメラーゼ領域におよそ６００ｂｐの欠失を有し、外因性のＥ２ｂポリメラーゼタンパク質なしでは、このウイルスは複製不能である。
【０２０８】
（ウェスタンブロッティング）
Ｅ２ｂポリメラーゼ発現レベルを決定するために、クローン３Ｃ４、３Ｃ９、３Ｄ８および親クローン４およびＡ５４９細胞を、１０ｃｍデッシュに接種した。細胞をインキュベートし、そして２日間増殖し、そして次に採取した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｃａｔ＃５００−０００６）によって決定した、等量のタンパク質を４−１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−トリス  ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にロードした。タンパク質を移し、そしてフィルターをブロックし、次に１：２，０００希釈のウサギ抗Ｅ２ｂポリメラーゼポリクローナル抗体（Ｄｒ  Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ、Ｕ．Ｋａｎｓａｓによって提供された）とともにインキュベートし、続けて１：２０００希釈のヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とインキュベートした。フィルターを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で発光させ、そしてフィルムに曝した。このフィルターをストリッピング（ｓｔｒｉｐ）し、１：１０，０００希釈のβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で再プローブし、続けて１：２，０００希釈のヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で処理した。
【０２０９】
アデノウイルス後期遺伝子タンパク質発現を決定するために、ＣＨＯ、ＨＥＬＡ、ＨｅｐＧ２、および１５Ｍ１５細胞を６ウェルプレートに接種し、そして翌日５×１０８Ｐ／ｍｌのＣＧＡＢ、４２ＧＣ、２ＧＣＰ、４６ＧＣまたはＧＦＣＢウイルスで感染させた。細胞を形質導入の４日後に採取し、総タンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。等量の総タンパク質量を、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−トリス  ゲル二ロードし、そしてＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上へ移した。フィルターを、１：２，５００希釈の５型アデノウイルスに対するウサギ抗血清（Ａｃｃｅｓｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でインキュベートし、続けて１：２，０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰによってインキュベートした。フィルターを、次に、上記のように処理した。
【０２１０】
（ウイルス産生性）
操作した細胞のウイルス産生性を評価するために、選抜したクローンを１０ｃｍデッシュに接種し、そして５×１０８ｐ／ｍｌの２ＧＣＰウイルスで感染させた。感染時のカウントのために、追加のコントロールプレートを接種した。感染させた細胞を感染後３−４日に採取した。この時、細胞の大多数が集まり、そしてプレートから離れており、このことはウイルス複製が起こっていたことを示していた。ウイルスは細胞溶解産物から、３サイクルの凍結／解凍および遠心分離による細胞破片の除去によって、放出された。次に、ウイルスを、先に記載されるように、カラムクロマトグラフィーによって精製し、そして定量した（Ｓｈａｂｒａｍら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：４５３−４６５）。
【０２１１】
産生性を、感染時の細胞数で総ウイルス粒子数を割ることによって決定し、ウイルスの増殖を相補することにおける細胞の産生性の尺度として、細胞当たりのウイルス粒子の比を与えた。
【０２１２】
（細胞蛍光（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）／トランスジーン発現）
細胞を６ウェルプレートに接種し、そして細胞が８０−９０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達するまでインキュベーターに戻した。次に、細胞を、ウェル当たり３ｍｌの総容量となるように、５×１０８Ｐ／ｍｌのウイルスにより三連で感染させた。細胞を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒシリーズ４０００マルチウェルプレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＧＦＰトランスジーン発現について測定し、そしてＨａｍｍａｍａｔｓｕ  ３ＣＣＤアナログカメラおよびコントローラーを使用して撮影した。ＧＦＰ蛍光を、バックグラウンドの蛍光を差し引いた、各時点での三連のウェルの相対細胞蛍光値の平均、および＋／−標準偏差としてプロットする。週に２回、０．５ｍｌの新鮮な培地を、ウェル毎に全ての細胞に対して加えた。
【０２１３】
（Ｅ１ｂ相補）
Ｅ１ｂ発現について分析するクローンを、６ウェルプレートに接種し、そしてそれらがおよそ８０−９０％の集密度に達するまでインキュベートし、そして増殖させた。この時点で、細胞を５×１０８Ｐ／ｍｌのＧＦＣＢウイルスまたはＣＯＮＧウイルスのいずれかで、三連で感染させた。次に、感染させた細胞を、感染から４８時間後に、Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  ３ＣＣＤアナログカメラおよびコントローラを使用して撮影し、そして、４５０ｎｍの励起および５０８ｎｍの放射にセットした、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒシリーズ４０００マルチウェルプレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＧＦＰ蛍光についてアッセイした。二連のウェルからの平均値＋／−標準偏差を、ＧＦＣＢに由来する蛍光値に対するＣＯＮＧ蛍光の比として、プロットした。
【０２１４】
（ＩＩ．結果）
（Ｅ１ａ相補細胞へのＥ２ｂポリメラーゼの追加）
クローン４細胞のＥ２ｂポリメラーゼ発現プラスミドｐＭＧＣＭＶＥ２ｂＰｏｌでのトランスフェクションに続いて、耐性細胞をハイグロマイシンでの処理によって選抜し、そして限界希釈精製によって個々のクローンを単離した。細胞溶解産物のウェスタン分析を、Ｅ２ｂポリメラーゼを表す１４０ｋｄのバンドを特異的に発現するクローンを選択するのに使用した。図７Ａでは、クローン３Ｃ４，３Ｃ９、および３Ｄ８の全てがＥ２ｂ  Ｐｏｌと予測されるバンドを示す。このバンドは、親クローン＃４にも、全てのクローンが基づくＡ５４９細胞にも存在しない。全てのレーンに、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定され、かつβ−アクチン検出によって確かめた等量の総タンパク質濃度をロードした。レーン当たり等しい総タンパク質をロードしたので、ポリメラーゼバンドの密度は、特定のクローンにおけるその発現のレベルを反映している。特定のクローンがポリメラーゼ欠失ウイルス２ＧＣＰを産生する能力と比較した場合、発現されるポリメラーゼの量とクローンの産生性の間には正の相関がある（図７Ｂ）。クローン４は、Ｅ２ｂポリメラーゼを発現するように操作されていないので、ポリメラーゼ欠失ウイルスの増殖を支援することができず、ウイルスは回収されなかった。クローン３Ｄ８は、最も多量のポリメラーゼタンパク質を発現し、そして細胞当たり最も多くのウイルスも産生した。このクローンを、さらなる分析のために選択し、そしてアデノウイルスＥ１ｂタンパク質を導入および発現させるための親株として使用した。
【０２１５】
（３Ｄ８へのＥ１ｂの追加）
クローン３Ｄ８を、Ｅ１ｂをコードするプラスミドｐＶＩＴＲＯ２ＩＲＥＳＰｕｒｏＥ１ｂでトランスフェクトし、そして先のように、ピューロマイシン処理に耐性の個々のクローンを選抜および単離した。機能アッセイを、ウイルスＣＯＮＧおよびＧＦＣＢを使用して、単離過程の間、Ｅ１ｂ機能を検出するために使用した。二連の６ウェルプレートまで増殖したクローンを限界希釈によって単離し、そして５×１０ｅ８Ｐ／ｍｌのＣＯＮＧまたはＧＦＣＢウイルスで感染させた。４８時間後、感染クローンからのＧＦＰ発現を、細胞蛍光分析によって測定した。ＧＦＣＢでの感染は、クローンのアデノウイルスに対する潜在的に異なる被感染能力を制御するために使用され、そしてＧＦＰ蛍光のＥ１ｂ媒介性減少の比が確立され得る。ＣＯＮＧは、ＧＦＰ発現を駆動するのに、ｐ５３コンセンサス配列応答エレメント（ｐ５３ＲＥ）を使用するウイルスである。これらのクローンは、ｐ５３発現について陽性である、Ａ５４９細胞に基づいている。それゆえ、３Ｄ８などのＡ５４９に基づくクローンの感染は、ｐ５３媒介性のＧＦＰの発現をもたらす。アデノウイルスＥ１ｂ  ５５ｋｄタンパク質は、ｐ５３を結合し、そしてそれを転写アクチベーターから転写リプレッサーへ変換することが知られている（ＹｅｗおよびＢｅｒｋ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８２−８５，ＲｏｔｈおよびＤｏｂｂｅｌｓｔｅｉｎ（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２３４：１３５−１４９）。Ｅ１ｂ  ５５を発現するクローンは、次にｐ５３を拘束し、そしてＣＯＮＧ感染細胞からのＧＦＰ蛍光を防止するか減少させるはずである。ＧＦＰ発現を駆動するｐ５３ＲＥは、ＧＦＣＢにおいて使用されるＣＭＶよりも弱いプロモーターであるが、Ｅ１ｂタンパク質を発現するクローンは、発現されるＥ１ｂ  ５５の量に依存して、ＣＯＮＧからのＧＦＰ発現をさらに減少させるはずである。図８Ａでは、ＧＦＣＢウイルスかまたはＣＯＮＧウイルスのいずれかで感染させた、親細胞株３Ｄ８および３つのクローンが撮影されており、そしてこれらのＧＦＰ蛍光レベルを、細胞蛍光分析を使用して定量した。図８Ｂでは、ＧＦＣＢに対するＣＯＮＧのＧＦＰ蛍光の比をプロットした。値の変化は、細胞からのＥ１ｂ  ５５ｋｄの発現の差による、親３Ｄ８クローンに対しての、ＣＯＮＧ感染からのＧＦＰ発現の種々の程度の減少を表す。クローン１５が、最も大きな差を示し、これが最も多い量のＥ１ｂタンパク質を発現していることが示唆された。既にＥ１ａ機能を発現するＡ５４９に基づくクローンにＥ１ｂ  ５５を追加することが、細胞におけるウイルス増殖の産生性の増大を導くことが先に示された。図８のクローンを、２ＧＣＰウイルスの増殖における産生性について試験した場合、ＧＦＰ発現の程度および産生性の間には、逆相関が見られた（図８Ｃ）。より多いＥ１ｂ  ５５タンパク質の発現から生じたに違いない最も減少したＧＦＰ発現を示したクローンが、Ｅ１ｂを発現しない親クローン３Ｄ８に比較して、最も増加した産生性を有した（図８Ｃ）。これらの結果に基づいて、クローンＣ１５を、さらなる試験のために選択した。
【０２１６】
（最終的なクローン分析１５Ｍ１５）
クローン１５を、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンの組み合わせ選抜培地中でのサブ−クローニングによるさらなる精製に供した。この組み合わせは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ２ｂ機能の保持を選抜するはずである。２ＧＣＰウイルスを用いた産生性アッセイによる、単離されたクローンのさらなるスクリーニングが、新規の相補性細胞株の最終的な選択として、１５Ｍ１５の選抜をもたらした。図９Ａは、親クローン３Ｄ８ならびにＣ７細胞と比較した、クローン１５Ｍ１５の２ＧＣＰ増殖の産生性を示す。Ｃ７細胞は、Ｅ２ｂポリメラーゼも発現するようにさらに操作された、Ａｄ  Ｅ１相補２９３細胞に基づいている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：３３５２−３３５６）。この１５Ｍ１５細胞株は、ポリメラーゼ欠失ウイルス２ＧＣＰを、その２９３に基づく対応物（Ｃ７）またはそのＥ１ｂ欠損親細胞株３Ｄ８よりも高度に増殖させることができる。この新しい株のゲノム安定性を、それらの完全な選抜培地混合物かまたは培地のみのいずれかの中で、細胞を連続継代および感染させることによって試験した。図９Ｂは、２つの異なる２ＧＣＰウイルスの用量で感染させた細胞について、継代１、５、および１０回目での、各条件下の、ウイルス産生性の結果を示す。このクローンの、ポリメラーゼ欠失ウイルスを高収量まで増殖させるために必要とされるアデノウイルス機能を相補する能力は、１０回の継代まで非常に安定なようであり、培地中に選抜薬剤がなくても安定なようである。ウェスタン分析を使用して、１回目、５回目、および１０回目の継代で単離された細胞からＥ１ａおよびＥ２ｂポリメラーゼタンパク質を検出した。図９Ｃに示されるように、選抜培地の非存在下でさえ、両方のタンパク質もまた、１０回の継代にわたって安定なようであった。
【０２１７】
（ウイルス構築物）
図６は、本研究で使用されるウイルスの概略図を示す。示されるＥ３およびＥ１欠失は、２種を除く全てのウイルスで同じである。コントロールウイルスＧＦＣＢについては、Ｅ１欠失が、ｐＩＸコード配列へ、追加の７００塩基対延長し、Ｅ１ｂ／ｐＩＸウイルスポリＡシグナルがＧＦＰ発現カセットのために使用されることを可能にしている。ウイルス４６ＧＣは、Ｅ１野生型であり、そして複製能力を有する。ＣＭＶ−ＧＦＰ−ｐＡ発現カセットは、制限酵素分析、ＰＣＲ、および配列決定によって確かめられるように、ＣＧＡＢ、４２ＧＣ、２ＧＣＰおよび４６ＧＣウイルスについて同一である。ＣＯＮＧウイルスでは、この発現カセット中のＣＭＶプロモーターが、ＧＦＰ遺伝子を駆動するために、ｐ５３コンセンサス応答エレメントによって置き換わっている。２ＧＣＰ中のＥ２ｂポリメラーゼ欠失は、その増殖を、Ｅ２ｂポリメラーゼを発現する細胞株に限る。２ＧＣＰは、最初、Ｅ２ｂポリメラーゼ発現細胞株Ｃ７中で単離された。
【０２１８】
（後期Ａｄ遺伝子発現の減少）
感染細胞溶解産物を、アデノウイルスタンパク質発現について、Ａｄ５に対するポリクローナル抗体を使用したウェスタン分析によって分析した。相補産生細胞株１５Ｍ１５を、ＧＦＣＢ、ＣＧＡＢ、４２ＧＣ、および２ＧＣＰで感染させた。全ての４つのウイルスは、この細胞株で良好に複製することができ、そして全てが予期されるウイルスバンドを示した（図１０Ａ）。
【０２１９】
ＣＨＯ細胞をＣＧＡＢ、４２ＧＣ、２ＧＣＰおよび４６ＧＣウイルスで感染させた。図１０Ｂに示されるように、複製能力を有する４６ＧＣウイルスのみが、この非相補性細胞株においては、ヘキソンおよび線維に相当するいずれかのウイルスバンドを示した。
【０２２０】
ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞を、ＣＧＡＢ、４２ＧＣ、２ＧＣＰおよび４６ＧＣウイルスで感染させた。ＨｅｐＧ２細胞は、またＧＦＣＢウイルスでも感染させた。ＨｅＬａ細胞は、組み込んだヒトパピロマウイルスからのＥ７遺伝子の発現により、部分的にＥ１ａ機能を相補することができ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−ＧａｄｉｃｋｅおよびＳｃｈｗａｒｚ（１９８６）ＥＭＢＯ  ５：２２８５−２２９２，Ｐｈｅｌｐｓら（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５３：５３９−５４７）、同時に、ＨｅｐＧ２細胞は、他のアデノウイルスプロモーターの活性化において、Ｅ１ａを機能的に置換し得る、高いＮＦＩＬ−６応答活性を有することが報告されている（ＳｐｅｒｇｅｌおよびＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：６４７２−６４７６）。両方の細胞株においては、他のＥ１／Ｅ３を欠失するがポリメラーゼは完全であるウイルスと比較して、ポリメラーゼ欠失２ＧＣＰウイルスによるウイルスタンパク質の発現に大きな減少または欠如が観察された（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。これらの結果は、必須の複製機能を欠失したウイルスを使用した他者の発見と一致する（Ｅ２ｂ  ｐｏｌ、ｐＴｐ、ＤＢＰを参照のこと）。感染細胞における、ウイルスのそれ自身のタンパク質を発現する能力の減少は、感染細胞の免疫系に媒介される除去を減少しかつトランスジーン発現を長引かせるための基礎である（Ｙａｎｇら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４４０７−４４１１；Ｇｉｌｇｅｎｋｒａｎｔｚら（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２６５−１２７４；Ｙａｎｇら，（１９９５）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２５６４−２５７０）。複製能力を有する４６ＧＣウイルスは、予期されるように、最も高いレベルのウイルスタンパク質を示す。
【０２２１】
（トランスジーン発現の改善）
インビトロでＧＦＰ蛍光を比較する場合、同一発現カセットを有するにもかかわらず、構築物には一貫した序列があった。ＧＦＰ蛍光は一貫して２ＧＣＰで最も大きく、続いて４２ＧＣ、そして次にＣＧＡＢであった。これは、図１１に示されるようなＣＨＯ細胞、Ｓａｏｓ２細胞、およびヒト眼線維芽（ＨＯＦ）細胞を含む、複数の細胞型で見られた。細胞蛍光値を三連の感染の平均値＋／−標準偏差として、図１１Ａ−ＤにはＨＯＦ細胞およびＳａｏｓ２細胞について、示された構築物で感染させた細胞の代表的写真とともに、図１１Ｅ−ＦにはＣＨＯ細胞について、示された構築物で感染させた細胞の代表的写真とともに、プロットした。新しい構築物の高いレベルのインビトロの発現は、長期間にわたって持続した。
【０２２２】
本発明は、本明細書において説明される具体的な実施形態によって、範囲を限定されるべきではない。実際に、前述した説明から、本明細書において説明されるものに加えて、本発明の種々の改変が、当業者にとって明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０２２３】
特許、特許出願、刊行物、製品説明書、およびプロトコールが、この出願を通して引用されるが、全ての目的のために、これらの開示の全体が、参考として本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【配列表】
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