(57)【要約】【課題】本発明は、Ｖｐｒタンパク質を検出する方法及び検出用試薬を提供することを課題とする。また、ＨＩＶの感染を診断する方法及び診断用試薬を提供することを課題とする。【解決手段】下記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を細胞に添加する工程、及び蛍光を検出する工程を含む方法により、Ｖｐｒタンパク質を簡便に検出することができる。これによりＨＩＶの感染過程をin vitro又はin vivoで可視的・動的（経時的）に解析する蛍光イメージングが可能となる。さらに本発明はＨＩＶ感染の診断、薬剤開発のスクリーニングと評価等に応用することもできる。2011013117.tif 000013【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を細胞に添加する工程、及び
蛍光を検出する工程、
を含むＶｐｒタンパク質の検出方法。
【化１】
2011013117.tif 000009
【請求項２】
前記蛍光色素がフルオレセインである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光色素が、式(I)で表される化合物の４位の水酸基の酸素原子を介して結合した、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物が、下記式(II)で表される化合物である、請求項１〜３の何れか一項に記載の検出方法。
【化２】
2011013117.tif 000010
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の検出方法を使用する、ＨＩＶ感染の診断方法。
【請求項６】
下記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を含有する、Ｖｐｒタンパク質の検出用試薬。
【化３】
2011013117.tif 000011
【請求項７】
前記蛍光色素がフルオレセインである、請求項６に記載の検出用試薬。
【請求項８】
前記蛍光色素が、式(I)で表される化合物の４位の水酸基の酸素原子を介して結合した、請求項６又は７に記載の検出用試薬。
【請求項９】
前記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物が、下記式(II)で表される化合物である、請求項６〜８の何れか一項に記載の検出用試薬。
【化４】
2011013117.tif 000012
【請求項１０】
請求項６〜９の何れか一項に記載の検出用試薬を含有する、ＨＩＶ感染の診断用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｖｐｒタンパク質の検出方法、及び該方法に用いる検出用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ；エイズ）は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の感染によりＣＤ４陽性Ｔ細胞が破壊されて宿主の免疫機能を著しく低下させ、種々の合併症を引き起こすことが知られている。エイズは、一般にＨＩＶ感染から発症まで長い潜伏期間を伴う。臨床現場において、他人へのさらなる感染を防止するためにも、ＨＩＶの感染を一刻も早く検出することが重要である。
【０００３】
従来、ＨＩＶ感染の診断は、ゼラチン粒子凝集反応、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法等により感染後に産生する抗ＨＩＶ抗体を検出する方法や、ＰＣＲ法でＨＩＶの遺伝子を検出する方法により行われてきた。
また、ＨＩＶ-1のタンパク質を検出して、ＨＩＶ感染を診断する方法も開発されている。そのターゲットタンパク質の１つにＶｐｒがある。
Ｖｐｒタンパク質は、ＨＩＶゲノムのアクセサリー遺伝子vprにコードされる96個のアミノ酸からなり、ＨＩＶ−１ウイルス粒子に結合する15kDaの核タンパク質である。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ等の霊長類のレンチウイルスには、何れも非常によく保存されたＶｐｒ様タンパク質が含まれている。Ｖｐｒタンパク質は多くの機能を有する多機能性タンパク質であり、ＨＩＶの複製・増殖に重要な役割を果たすことが知られている。そのため、in vitro又はin vivoでＶｐｒタンパク質の局在又は存在状態を評価できれば有用である。例えば、Ｖｐｒタンパク質のリアルタイムイメージングが実現すれば、感染の早期診断、薬剤開発のin vivoスクリーニングと評価、又はＶｐｒタンパク質活性の制御機構の研究等に応用できる。
これまでに抗Ｖｐｒタンパク質モノクローナル抗体を用いた免疫学的方法や（特許文献１）、Ｖｐｒタンパク質の存在下で分子量３００ないし３０００の物質の細胞への取り込みが促進されることを示標とする方法（特許文献２）でＨＩＶ感染を検出することが開発されてきた。また、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等で蛍光標識したタンパク質を用いて、Ｖｐｒタンパク質の局在状態のイメージングする方法もなされてきた。
しかしながら、in vitro又はin vivoで、低分子プローブを用いてＶｐｒタンパク質を簡便に検出し、イメージングする方法、及びＨＩＶ−１感染を検出する方法は未だ開発されていない。
【０００４】
ところで、ＨＩＶ−１は、感染後にＲＮＡゲノムの逆転写産物である核酸−タンパク質複合体（プレインテグレーション複合体；ＰＩＣ）を形成し、ＰＩＣは免疫細胞の核膜を通過して核へ移行し、マクロファージでのＨＩＶ−１複製に至る。この核移行及びＨＩＶ−１の複製は、Ｖｐｒタンパク質とインポーチン（Ｉｍｐ）αの相互作用によって媒介される（非特許文献１、２）。ここで、Ｖｐｒタンパク質は、そのＮ末端から１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるαヘリックス領域で、Ｉｍｐαと相互作用する。従って、この相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する薬剤が得られることが報告されている（特許文献３、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２９０７４３号公報
【特許文献２】特開２００２−０８５０９９号公報
【特許文献３】特開２００６−０６７９９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Virology, (2007) 81, 5284-5293
【非特許文献２】Journal of Virology, (2005) 79, 3557-3564
【非特許文献３】Biochem Biophys Res Commun (2009) 380, 838-843
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｖｐｒタンパク質を検出する方法及び検出用試薬を提供することを課題とする。また、ＨＩＶの感染を診断する方法及び診断用試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を行った。その結果、まず、下記式(I)で表されるヘマトキシリン化合物がＶｐｒタンパク質と結合し、Ｖｐｒタンパク質とＩｍｐαが相互作用するのを阻害することを見出した。
式(I)で表される化合物はヘマトキシリンとして知られている化合物であるが、従来ヘマトキシリンの用途は核染色剤などが知られているのみであり、ＨＩＶ診断等の用途は知られていない。
【化１】
2011013117.tif 000002
【０００９】
さらに本発明者らは、ヘマトキシリンに蛍光色素が結合した化合物も、Ｖｐｒタンパク質と特異的に結合することによりＶｐｒタンパク質とＩｍｐαの相互作用を阻害する効果を維持していることを見出した。また、前記相互作用阻害効果を利用することによりＶｐｒタンパク質を検出できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）下記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を細胞に添加する工程、及び蛍光を検出する工程、を含むＶｐｒタンパク質の検出方法。
【化２】
2011013117.tif 000003
（２）前記蛍光色素がフルオレセインである、（１）に記載の検出方法。
（３）前記蛍光色素が、式(I)で表される化合物の４位の水酸基の酸素原子を介して結合した、（１）又は（２）に記載の検出方法。
（４）前記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物が、下記式(II)で表される化合物である、（１）〜（３）の何れかに記載の検出方法。
【化３】
2011013117.tif 000004
（５）（１）〜（４）の何れかに記載の検出方法を使用する、ＨＩＶ感染の診断方法。
（６）下記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を含有する、Ｖｐｒタンパク質の検出用試薬。
【化４】
2011013117.tif 000005
（７）前記蛍光色素がフルオレセインである、（６）に記載の検出用試薬。
（８）前記蛍光色素が、式(I)で表される化合物の４位の水酸基の酸素原子を介して結合した、（６）又は（７）に記載の検出用試薬。
（９）
前記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物が、下記式(II)で表される化合物である、（６）〜（８）の何れかに記載の検出用試薬。
【化５】
2011013117.tif 000006
（１０）（６）〜（９）の何れかに記載の検出用試薬を含有する、ＨＩＶ感染の診断用試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、低分子プローブでＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質を検出する方法及び検出用試薬が提供される。また、ＨＩＶの感染を診断する方法及び診断用試薬が提供される。
これによりＨＩＶの感染過程をin vitro又はin vivoで可視的・動的（経時的）に解析する蛍光イメージングが可能となる。さらに本発明はＨＩＶ感染の早期診断、薬剤開発のスクリーニングと評価等に応用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヘマトキシリンをフルオレセインで蛍光標識したＨｅｍＦ−００１を合成するスキームを示す。
【図２】蛍光標識ヘマトキシリン（ＨｅｍＦ−００１）がヘマトキシリン同様に、Ｖｐｒタンパク質とＩｍｐαの相互作用及びＨＩＶ−１の複製を阻害する挙動を示す。  Ａ：GST-Impα-His6又はＧＳＴが結合したグルタチオン−セファロースビーズを、Ｈｉｓ6タグ付きVprN17C74-GFP-His 6又はＧＦＰと、ＨｅｍＦ−００１  1、10又は100μMの存在／非存在下で、2時間4℃でインキュベートし、結合能を解析した。抗ＧＦＰモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの写真を示す。  Ｂ：GST-Impα-His6が結合したグルタチオン−セファロースビーズを、Ｈｉｓ6タグ付きVprN17C74-GFP- His 6又はＧＦＰと、ヘマトキシリン  1、10又は100μMの存在／非存在下で、1時間4℃でインキュベートし、結合能を解析した。抗ＧＦＰモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの写真を示す。  Ｃ：ＴＺＭｂｌ細胞における、ＨｅｍＦ−００１及びヘマトキシリンのＨＩＶ−１複製に対する阻害効果を調べたルシフェラーゼアッセイの結果を示す。３回以上の独立実験で同様の結果を得て、代表的な結果を示す。○：ＤＭＳＯ、●：ＰＭＰＡ、□：ヘマトキシリン、■：ＨｅｍＦ−００１
【図３】ＨｅLａ細胞に、蛍光標識ヘマトキシリン（ＨｅｍＦ−００１）10μMを添加し、2時間インキュベートし、3回洗浄した後に、ＨｅｍＦ−００１の未添加の培地で0、12、24時間培養後の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す（励起波長：488nm）。
【図４】Ｖｐｒタンパク質を発現するＨｅLａ細胞に、蛍光標識ヘマトキシリン（ＨｅｍＦ−００１）を添加したときの共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。  Ａ：蛍光イメージ検出の概略図を示す。  Ｂ：ＨｅLａ細胞を、ｍＲＦＰ及びＦｌａｇタグ付き野生型Ｖｐｒ（mRFP-FVpr）をコードする発現ベクターpCS2＋-mRFP-FVpr、又はコントロールベクターpCS2＋でトランスフェクションした。トランスフェクション後24時間経過後、細胞をＨｅｍＦ−００１（10μM）と30分間インキュベートし、3回洗浄した後の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す（励起波長はＨｅｍＦ−００１：488nm、ｍＲＦＰ：584nm）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＶｐｒタンパク質検出方法は、下記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を細胞に添加する工程、及び蛍光を検出する工程を含む。
【００１３】
本発明に用いる化合物には、下記式(I)で表される化合物（ヘマトキシリン）部分が含まれる。ヘマトキシリンは、分子内に不正炭素原子を有するため光学異性体又はジアステレオマーなどの立体異性体が存在するが、本発明に用いる化合物のヘマトキシリン部分は、純粋な形態の立体異性体の他、任意の立体異性体の混合物又はラセミ体でもよい。
【化６】
2011013117.tif 000007
【００１４】
本発明に用いる化合物は、前記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合したものである。前記蛍光色素は、Ｖｐｒタンパク質と式(I)で表される化合物部分との結合を妨げないものであれば特に限定されない。例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、過塩素酸１，１'−ジオクタデシル−３，３，３'，３'−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ）、過塩素酸１，１'−ジオクタデシル−３，３，３７，３７−テトラメチル−ｅｎｄｏ−カルボシアニン（ＤｉＩ）等が挙げられ、これらの中ではフルオレセインが好ましい。
前記蛍光色素は、前記式(I)で表される化合物の４位の水酸基の酸素原子を介して、前記式(I)で表される化合物に結合していることが好ましい。また、蛍光色素部分がＶｐｒタンパク質と式(I)で表される化合物部分との結合を妨げないよう、適当なスペーサーを設けることができる。例えば、不飽和結合や酸素原子を含んでもよい炭化水素鎖をスペーサーとすることができる。
本発明に用いる好ましい化合物としては、式(I)で表される化合物の４位の水酸基の位置にスペーサーを介してフルオレセインが結合した化合物（下記式(II)）が挙げられる。
【化７】
2011013117.tif 000008
【００１５】
後述の実施例で示されるように、上記式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物は、ヘマトキシリン同様にin vitro又はin vivoでＶｐｒタンパク質と特異的に結合することができる。
従って、式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を細胞に添加すると、該細胞にＶｐｒタンパク質が存在している場合は、その細胞においてＶｐｒタンパク質に結合した式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物の蛍光パターンを検出することで、Ｖｐｒタンパク質を検出できる。
例えば、細胞を培養している培地に式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を50μM以下の濃度になるように添加し、10〜120分間インキュベートし、好ましくは非特異的結合を除くために洗浄を行った後に、蛍光パターンを検出することができる。蛍光の検出には、共焦点レーザー走査顕微鏡等を用いることができ、蛍光色素に応じた励起波長の励起光を照射し、細胞をスキャンして行うことができる。
【００１６】
ＨＩＶに感染した細胞では、ウイルスのＶｐｒタンパク質は核移行によりその大部分が核に局在する（Journal of Virology, (2000) 74, 7179-7186）。
本発明の式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物は、Ｖｐｒタンパク質が存在しない通常の細胞に添加すると、後述の実施例で示されるように、大部分が細胞質及び核膜に局在し、ある程度の量が核に存在する。
これに対し、ＨＩＶに感染している細胞、すなわちＶｐｒタンパク質の大部分が核に局在している細胞に、本発明の式(I)で表される化合物に蛍光色素が結合した化合物を添加すると、後述の実施例で示されるように、該化合物はＶｐｒタンパク質と特異的に結合するため、蛍光は核で検出される。従って、細胞の蛍光イメージングしたときに、核で蛍光が顕著に観察された細胞は、Ｖｐｒタンパク質が存在することが検出され、ＨＩＶに感染していることが診断されることとなる。
なお、本発明のＶｐｒタンパク質検出方法において細胞は、培養細胞であってもＨＩＶ感染が疑われる検体から単離された細胞であってもよい。
【００１７】
本発明のＶｐｒタンパク質検出方法は、ＨＩＶに感染している細胞において発現しているＶｐｒタンパク質をin vitro又はin vivoで可視的・動的（経時的）に解析する蛍光イメージングが可能となるので、ＨＩＶの感染の診断方法に使用することができる。係る診断方法は、ＨＩＶの初期感染の診断及び治療の最小限非侵襲的な評価方法の開発に対する強い需要に適うものである。
【００１８】
なお、本発明において「Ｖｐｒタンパク質」とは、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質（例えば、Journal of Virology, (1989) 63, 4110-4114及びGenBank Accession No. M28355、配列番号２）のことをいうが、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ等の霊長類のレンチウイルスにおいて非常によく保存されているＶｐｒ様タンパク質（Ｖｐｒ及び／又はＶｐｘ）が含まれていてもよい。
また、「インポーチンα」としては、配列番号４のタンパク質が例示される。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２０】
＜蛍光標識ヘマトキシリンの合成＞
図１に示すスキームに従ってフルオレセイン標識ヘマトキシリン（ＨｅｍＦ−００１）を合成した。
まず、ヘマトキシリンから化合物２を合成した。ヘマトキシリン（6.08g、20.1mmol）の脱水アセトン溶液（100mL）に、２，２−ジメトキシプロパン（2.18g、21.0mmol）、p−トルエンスルホン酸（200mg、1.16mmol）及び五酸化リン（3.14g、22.1mol）を添加した反応混合液を12時間還流した。５酸化リン（10.0g、70.4mmol）をさらに添加し、反応混合液をさらに10時間還流した。冷却後、反応混合液に氷水（100mL）を加えて反応を止め、酢酸エチル（3×200mL）で抽出し水相を除去した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム存在下で濃縮した。溶離剤としてヘキサン−酢酸エチル（2：1）を用いてフラッシュクロマトグラフィーを行い、粗精製物を精製した。化合物２（1.91g）を収率28%で得た。
1H-NMR(CDCl3) δ6.79 (1 H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 6.76 (1 H, s, ArH), 6.71 (1 H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 6.56 (1 H, s, ArH), 5.65.5 (2 H, br, ArOH), 4.11 (1 H, d, J = 11 Hz, CH2), 4.08 (1 H, s, CH), 3.87 (1 H, d, J = 11 Hz, CH2), 3.19 (1 H, d, J = 16 Hz, CH2), 2.84 (1H, d, J = 16 Hz, CH2), 2.52 (1 H, br, OH), 1.65 (3 H, s, CH3), 1.59 (3 H, s, CH3); LRMS (ESI pos.) m/z 343 [M+H]+.
【００２１】
次に、化合物２から化合物３を合成した。化合物２（178mg、0.521mmol）の脱水ジメチルホルムアミド溶液（4.0mL）に、臭化アリル（0.10mL、1.2mmol）及び炭酸カリウム（107mg、0.750mmol）を添加した反応混合液を、室温で20時間攪拌した。反応混合液を水（15mL）で洗浄し、酢酸エチル（3×200mL）で抽出し水相を除去した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム存在下で濃縮した。溶離剤としてヘキサン−酢酸エチル（2：1）を用いてフラッシュクロマトグラフィーを行い、粗精製物を精製した。化合物３（44.1mg）を収率22％で得た。
1H-NMR(CDCl3) δ6.97 (1 H, d, J = 8.5 Hz, ArH), 6.67 (1 H, s, ArH), 6.66 (1 H, d, J = 8.5 Hz, ArH), 6.56 (1 H, s, ArH), 6.05 (1 H, dddd, J = 6.3, 6.3, 10, 17 Hz, OCH2CHCH2), 5.79 (1 H, br s, ArOH), 5.34 (1 H, br dd, J = 1.4, 17 Hz, OCH2CHCH2), 5.24 (1 H, br d, J = 10 Hz, OCH2CHCH2), 4.59 (1 H, dd, J = 6.3, 12 Hz, OCH2CHCH2), 4.52 (1 H, dd, J = 6.3, 12 Hz, OCH2CHCH2), 4.11 (1 H, d, J = 11 Hz, CH2), 4.05 (1 H, s, CH), 3.85 (1 H, d, J = 11 Hz, CH2), 3.17 (1 H, d, J = 15 Hz, CH2), 2.83 (1H, d, J = 15 Hz, CH2), 2.64 (1 H, br, OH), 1.65 (3 H, s, CH3), 1.60 (3 H, s, CH3); LRMS (ESI pos.) m/z 383 [M+H]+.
【００２２】
次に、フルオレセインから化合物４を合成した。フルオレセイン（789mg、2.38mmol）の脱水ジメチルホルムアミド溶液（10mL）に、臭化アリル（512mg、4.24mmol）及び炭酸カリウム（316mg、2.29mmol）を添加した反応混合液を、55℃で12時間攪拌した。溶離剤としてヘキサン−酢酸エチル（2：1）を用いてフラッシュクロマトグラフィーを行い、反応混合液を精製した。化合物４（107mg）を収率12％で得た。
1H-NMR(CDCl3) δ8.02 (1 H, d, J = 7.3 Hz, ArH), 7.67 (1 H, ddd, J = 1.2, 7.3, 7.3 Hz, ArH), 7.61 (1 H, ddd, J = 1.2, 7.3, 7.3 Hz, ArH), 7.17 (1 H, d, J = 7.3 Hz, ArH), 6.77 (1 H, d, J = 2.4 Hz, ArH), 6.73 (1 H, d, J = 2.4 Hz, ArH), 6.67 (1 H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 6.63 (1 H, d, J = 2.4 Hz, ArH), 6.61 (1 H, d, J = 2.4 Hz, ArH), 6.61 (1 H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 6.53 (1 H, d, J = 2.4 Hz, ArH), 6.51 (1 H, d, J = 2.4 Hz, ArH), 6.04 (1 H, ddt, J = 10, 17, 5.4 Hz, OCH2CHCH2), 5.9-5.8 (1 H, br s, ArOH), 5.43 (1 H, br dd, J = 1.5, 17 Hz, OCH2CHCH2), 5.32 (1 H, br d, J = 10 Hz, OCH2CHCH2), 4.56 (2 H, ddd, J = 1.5, 1.5, 5.4 Hz, OCH2CHCH2); LRMS (ESI pos.) m/z 373 [M+H]+.
【００２３】
次に、化合物３と化合物４をカップリングさせて化合物５を合成した。化合物３（44.1mg、184μmol）及び化合物４（70.3mg、189μmol）のジクロロメタン溶液（3.0mL）に、第２世代グラブス触媒（4.1mg、4.83μmol、2.5mol％）を添加した反応混合液を、55℃で72時間攪拌した。溶離剤としてクロロホルム−アセトン（3：1）を用いて薄層クロマトグラフィーを行い、反応混合液を精製した。化合物５（59.3mg）を収率44％で得た。
1H-NMR(CDCl3) δ8.01 (1 H, d, J = 7.6 Hz, ArH), 7.67 (1 H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz, ArH), 7.61 (1 H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz, ArH), 7.16 (1 H, d, J = 7.6 Hz, ArH), 6.96 (1 H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, ArH), 6.72-6.50 (9 H, m, ArH), 6.07 (1 H, ddd, J = 5.9, 5.9, 15 Hz, OCH2CH), 5.99 (1 H, ddd, J = 5.9, 5.9, 15 Hz, OCH2CH), 5.80-5.70 (1 H, br, OH), 4.66-4.54 (4 H, m, OCH2CHCHCH2O), 4.09-4.05 (2 H, m, CH2, CH), 3.84 (1 H, dd, J = 1.2, 11 Hz, CH2), 3.17 (1 H, d, J = 16 Hz, CH2), 2.83 (1H, d, J = 16 Hz, CH2), 2.64 (1 H, s, OH), 1.64 (3 H, s, CH3), 1.59 (3 H, s, CH3); LRMS (ESI pos.) m/z 727 [M+H]+.
【００２４】
最後に、化合物５から化合物１（ＨｅｍＦ−００１）を合成した。化合物５（59.0mg、81.2μmol）のアセトン−水溶液（3：1、2.0mL）に３Ｎ塩酸溶液（0.10mL）を、60℃で12時間攪拌した。冷却後、反応混合液を蒸留水（5mL）で希釈し、重炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル（3×10mL）で抽出し水相を除去した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム存在下で濃縮した。溶離剤としてヘキサン−酢酸エチル（1：5）を用いて薄層クロマトグラフィーを行い、粗精製物を精製した。化合物１（14.6mg）を収率26％で得た。
1H-NMR(CD3CN) δ7.97 (1 H, br d, J = 7.6 Hz, ArH), 7.74 (1 H, dd, J = 7.1, 7.1 Hz, ArH), 7.68 (1 H, ddd, J = 1.2, 7.6, 7.6 Hz, ArH), 7.19 (1 H, br dd, J = 2.9, 8.6 Hz, ArH), 6.96 (1 H, d, J = 8.5 Hz, ArH), 6.78-6.47 (9 H, m, ArH), 6.07 (1 H, ddd, J = 5.9, 5.9, 16 Hz, OCH2CH), 5.95 (1 H, ddd, J = 5.2, 5.2, 16 Hz, CH2CH), 4.68-4.51 (4 H, m, OCH2CHCHCH2O), 3.74-3.72 (2 H, m, CH2, CH), 3.73 (1 H, d, J = 11 Hz, CH2), 2.95 (1 H, d, J = 16 Hz, CH2), 2.80 (1H, d, J = 16 Hz, CH2), 2.57 (1 H, s, OH); LRMS (ESI pos.) m/z 687 [M+H]+; HRMS (ESI pos.) calcd for C40H31O11Na [M+Na]+ 709.1686, found 709.1689.
【００２５】
＜タンパク質の発現と精製＞
プラスミドpGEX-6p3-N17C74-TEV linker-GFP-His 6及びpGEX-Impα-His6はBiochem Biophys Res Commun (2009) 380, 838-843に記載の方法に従って構築した。
pGEX-6p3-N17C74-TEV linker-GFP-His 6は、Ｉｍｐαと結合する、Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるαヘリックス領域（特開2006-067994号公報：配列番号２の１７〜７４番目のアミノ酸残基）に、ＧＳＴ（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）タグと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ6）タグとを結合させた融合タンパク質（GST-N17C74-GFP-His 6）を発現させるためのプラスミドである。また、pGEX-Impα-His6は、Ｉｍｐαに、ＧＳＴタグと、ポリヒスチジンタグとを結合させた融合タンパク質（GST-Impα-His6）を発現させるためのプラスミドである。
上記各プラスミドで大腸菌を形質転換して組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を培養することによって各融合タンパク質を発現させた。ＧＳＴカラム及びニッケルカラムを用いて得られた融合タンパク質を精製した。さらにGST-N17C74-GFP-His6は、PreScission protease （Amersham Biosciences）で切断して、VprN17C74-GFP-His 6を得た。
【００２６】
＜プラスミドの構築＞
赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）とＦｌａｇタグ付き野生型Ｖｐｒ（ＦＶｐｒ）との融合タンパク質をコードする発現ベクターpCS2＋を以下の手順で作製した。まず、特異的プライマーmRFP-BH1-5'（配列番号５）及びmRFP-ER1-3'（配列番号６）を用いて、pRSETB（Invitrogen）を鋳型としたＰＣＲによりmRFP配列を増幅し、pBluescript II-SK(+)（Stratagene）にサブクローニングした（pSK-mRFP）。また、特異的プライマーを用いてpSK(+)-FVpr（Biochem Biophys Res Commun (1997) 232, 550-554及びVirology (1999) 263, 313-322参照）を鋳型としたＰＣＲによりＦＶｐｒ配列を増幅し、BamHI/XhoIで消化したpSC2＋にサブクローニングした（pCS2＋-FVpr）。次に、pSK-mRFPのmRFP配列を、pCS2＋-FVprのBamHIサイトにサブクローニングした。得られたベクターを、pCS2＋-mRFP-FVprと命名した。
ｍＲＦＰのみを発現するコントロールベクターpCS2＋を以下の手順で作製した。pSK-mRFPのmRFP配列を、pCS2＋のBamHIサイトにサブクローニングした。得られたベクターを、pCS2＋-mRFPと命名した。
【００２７】
＜プルダウンアッセイ＞
in vitroでＧＳＴプルダウンアッセイを行い、Ｖｐｒタンパク質とＩｍｐα間の相互作用を、ＨｅｍＦ−００１が阻害するかを検証した。
VprN17C74-GFP-His6又はGFPを、予めグルタチオン−セファロース４ＦＦビーズ（Amersham Pharmacia Biotech）12.5μLに吸着させたGST-Impα-His6又はGSTと、ＨｅｍＦ−００１  1、10又は100μMの存在／非存在下で、4℃で2時間反応させた。ビーズをＰＢＳ／0.1% Triton X-100で6回洗浄した後、98℃で5分間加熱してビーズに結合したタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（15% polyacrylamide）で分離し、ＰＶＤＦ膜 （Invitrogen）に転写してイムノブロット解析した（Journal of Virology, (2000) 276, 16-26参照）。膜をＰＢＳ／0.05% Tween20／5%スキムミルクで１時間ブロッキングした後、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ＭＢＬ）と反応させた。膜をＰＢＳ／0.05% Tween20で洗浄した後、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno research）と反応させた。SuperSignalTM West Pico Chemiluuminescent substrate（Pierce）を用いてバンドを検出した。
図２Ａに示すとおり、ＨｅｍＦ−００１はＶｐｒタンパク質とＩｍｐα間の相互作用を用量依存的に阻害した。従って、ＨｅｍＦ−００１はＶｐｒタンパク質と特異的に結合することが分かる。
なお、ＨｅｍＦ−００１に代えてヘマトキシリンを用いたプルダウンアッセイも同様に行った。結果を図２Ｂに示す。ヘマトキシリンはＶｐｒタンパク質とＩｍｐα間の相互作用を用量依存的に阻害したことから、Ｖｐｒタンパク質と特異的に結合することが分かる。
【００２８】
＜ルシフェラーゼアッセイ＞
ＨｅｍＦ−００１がＨＩＶ−１複製を阻害するかを検証した。
ＴＺＭｂｌ細胞は、ＨＩＶ-１  ＬＴＲの２つの統合コピー遺伝子（ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼをそれぞれ発現させる）を持つ、ＨｅLａ細胞由来の細胞である（Journal of Virology, (2005) 79, 10108-10255）。ＨＩＶ−１に感染したＴＺＭｂｌ細胞におけるレポーターとしてのルシフェラーゼの発現状況により、添加した物質がＨＩＶ−１複製を阻害するか否かを調べることができる。すなわち、Ｖｐｒタンパク質とＩｍｐαの相互作用が阻害されてＨＩＶ−１複製が阻害されると、ルシフェラーゼ活性が低下することになる。
ＴＺＭｂｌ細胞を、10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Sigma）、ペニシリン（100U/mL）及びストレプトマイシン（100μg/mL）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
感染性分子クローンｐＮＬ４３２株ウイルスの取得方法はJournal of Virology, (1986) 59, 284-291に記載されている。
100〜1.5625μMに倍数希釈したＨｅｍＦ−００１又はヘマトキシリンの存在／非存在下で、ＴＺＭｂｌ細胞（5×103個／ウェル）を96穴プレートで培養し、感染性分子クローンｐＮＬ４３２株ウイルスのウイルスストックで感染させた。ウイルスストックの力価はＴＺＭｂｌで予め測定しておき、この実験条件下でのルシフェラーゼ活性が約2×106相対発光量（Relative Light Unit：ＲＬＵ）となるように調整した。2日後、回収した細胞を溶解緩衝液（PicaGene ReporterLysis Buffer、東洋ビーネット）に溶解させ、ルシフェラーゼの発現をPicaGene luciferase assay system（東洋ビーネット）及びマルチモードマイクロプレートリーダー（ベルトールドジャパン）を用いて定量化した。なお、逆転写酵素阻害剤である９−［２−（ホスホノメトキシ）プロピル］アデニン（ＰＭＰＡ）をポジティブコントロールとし、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）をネガティブコントロールとした。
図２Ｃに示すとおり、ＨｅｍＦ−００１の用量依存的にルシフェラーゼ活性が低下したことから、ヘマトキシリン同様にＨｅｍＦ−００１は、ＨＩＶ−１複製を用量依存的に阻害した。
【００２９】
＜Ｖｐｒタンパク質検出実験＞
ＨＩＶ−１に感染したＨｅLａ細胞において、ＨｅｍＦ−００１を用いてＶｐｒタンパク質を検出できるかを検証した。
ＨｅLａ細胞は、10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Sigma）、ペニシリン（100U/mL）及びストレプトマイシン（100μg/mL）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＨｅLａ細胞へのウイルス感染は、FuGENE HD transfection reagent（Roche）を用い取扱説明書に従って行った。
【００３０】
（１）まず、ＨｅｍＦ−００１のＨｅLａ細胞における挙動を明らかにするため、共焦点レーザー走査顕微鏡で経時的に観察した。
共焦点レーザー走査顕微鏡（FV 1000、オリンパス）を用いて経時的共焦点蛍光イメージングを行った。カバースリップ上のＨｅLａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Sigma）、ペニシリン（１００Ｕ／mL）、ストレプトマイシン（１００μg／mL）及びＨｅｍＦ−００１（10μM）を含むＤＭＥＭ培地中で、37℃で2時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで3回洗浄した後、ＨｅｍＦ−００１を含まないＤＭＥＭ培地で0、12又は24時間培養し、再度ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／４％ホルムアルデヒドで15分間固定した。細胞を3回洗浄しスライドガラスを乗せて共焦点イメージングを行った（励起波長：488nm）。
図３に示すとおり、Ｖｐｒタンパク質が存在しない場合は、ＨｅｍＦ−００１の大部分は細胞質及び核膜に局在し、ある程度の量は核に存在した。
【００３１】
（２）次に、ＨｅｍＦ−００１が、生きている細胞において蛍光プローブとして機能し、Ｖｐｒタンパク質を検出できるか検証した。
前述の通りＶｐｒタンパク質と波長５８４ｎｍで励起するｍＲＦＰとＦｌａｇタグとの融合タンパク質発現プラスミドを構築し、ＨｅｍＦ−００１を用いてmRFP-FVprの細胞内局在の検出を試みた。
既に報告したとおり、トランスフェクション後24時間に細胞で発現したＶｐｒタンパク質の大部分は、核に局在する（Journal of Virology, (2000) 74, 7179-7186）。そこで、トランスフェクション後24時間経過後に、細胞の核に存在するＶｐｒタンパク質と添加したＨｅｍＦ−００１が相互作用する様子（図４Ａ参照）を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
ＨｅLａ細胞をpCS2＋-mRFP-FVpr又はｐCS2＋-mRFPでトランスフェクションし、トランスフェクション後24時間経過後、ＨｅｍＦ−００１（10μM）存在下で30分間インキュベートした。細胞を3回洗浄し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した（励起波長はＨｅｍＦ−００１：488nm、ｍＲＦＰ：584nm）。
結果を図４Ｂに示す。コントロールの細胞ではＨｅｍＦ−００１の大部分は細胞質及び核膜に局在したのに対し、mRFP-FVprを発現した細胞ではＨｅｍＦ−００１は顕著に核に局在した。すなわち、核に存在するmRFP-FVprにＨｅｍＦ−００１が結合し、mRFP-FVprを発現した細胞では蛍光イメージングにより核が特異的に検出された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、Ｖｐｒタンパク質を検出する方法及び検出用試薬が提供され、また、ＨＩＶの感染を診断する方法及び診断用試薬を提供される。本発明によりＶｐｒタンパク質を低分子プローブで検出することができ、ＨＩＶの感染過程をin vitro又はin vivoで可視的・動的（経時的）に解析する蛍光イメージングが可能となる。さらに本発明はＨＩＶ感染の診断へ応用することもできるので、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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