(57)【要約】【課題】簡単な構成で、試料内の空間的に異なる複数の測定点における応答光を、同時にかつ連続的に検出できて、試料を高精度で評価できる生体システムの機能解明に適した試料評価装置を提供する。【解決手段】試料14を照明する照明光学系(11,12,13)と、照明光学系からの照明光により刺激されて試料の照明領域内の微小領域から放出される応答光を空間的に分離して、該分離された応答光の１光子を検出する検出部(13,12,15,16,17,22)と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光により試料を照明し、該試料の照明領域内の微小領域において前記照明光による刺激により放出される応答光を空間的に分離し、該分離された応答光の１光子を検出して前記試料を評価する、ことを特徴とする試料評価方法。
【請求項２】
試料を照明する照明光学系と、
該照明光学系からの照明光により刺激されて前記試料の照明領域内の微小領域から放出される応答光を空間的に分離して、該分離された応答光の１光子を検出する検出部と、
を備えることを特徴とする試料評価装置。
【請求項３】
前記検出部は、
前記試料の照明領域内を複数の微小領域に空間的に分離する分離光学系と、
該分離光学系により分離された複数の微小領域からの応答光の１光子をそれぞれ検出する複数の光検出器と、
を有することを特徴とする請求項２に記載の試料評価装置。
【請求項４】
前記分離光学系は、
前記試料の照明領域内を複数の微小領域に空間的に分離して各微小領域からの応答光を増幅するマイクロチャンネルプレートを有する、ことを特徴とする請求項３に記載の試料評価装置。
【請求項５】
前記分離光学系は、
前記試料の照明領域内を複数の微小領域に空間的に分離するマイクロレンズアレイを有する、ことを特徴とする請求項３に記載の試料評価装置。
【請求項６】
前記検出部は、
前記分離光学系と前記光検出器とを光学的に結合する光ファイバを有する、ことを特徴とする請求項３乃至５のいずれか一項に記載の試料評価装置。
【請求項７】
前記光検出器は、アバランシュフォトダイオードまたは光電子増倍管からなる、ことを特徴とする請求項３乃至６のいずれか一項に記載の試料評価装置。
【請求項８】
前記検出部は、前記応答光として、前記照明光の照射により前記試料から放出される蛍光または散乱光を検出するように構成されている、ことを特徴とする請求項２乃至７のいずれか一項に記載の試料評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料評価方法および試料評価装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料評価方法として、例えば、溶液または生体試料内の分子の運動を解析する蛍光相関分析法（ＦＣＳ法）が知られている。蛍光相関分析法は、ブラウン運動などの粒子の拡散運動に関する解析に古くから用いられている。例えば、図３に示すように、希薄な蛍光分子１０１の溶液１０２に、細いレーザ励起光ビーム１０３を集光させて、蛍光強度を長時間測定すると、測定される蛍光強度は、測定領域内の蛍光分子数に比例する。したがって、揺らぎの大きは、測定領域内の蛍光分子数をＮとして、Ｓ／Ｎで表現すると、（１／Ｎ）１／２となる。
【０００３】
蛍光相関分析法は、このように蛍光の小さな揺らぎの大きさと、後述する時間相関とを計測する方法である。この計測法において、物理量である蛍光相関関数が１／２に減少する時間、すなわち相関時間t０は、次式で表される。
【０００４】
【数１】
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【０００５】
上記式（１）において、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数であり、Ｗはレーザビームの動径方向の強度分布関数がガウス分布であるときのビーム半径である。このτ０は、物理的には、蛍光分子が拡散によってレーザ励起光ビーム１０３を横切る時間に相当する。
【０００６】
蛍光の揺らぎを測定する場合、通常、蛍光を光電子増倍管で受光して、その出力電流ｆ（ｔ）を測定する。この場合、出力電流ｆ（ｔ）は、レーザ光の強度が極端に大きくなければ、蛍光量に比例する。したがって、蛍光相関関数は、このｆ（ｔ）について時間（Ｔ）に関する相関関数を求めることに他ならない。この蛍光相関関数をＧ（τ）とすると、Ｇ（τ）は次式で与えられる。
【０００７】
【数２】
2011179912.tif 000004
【０００８】
また、レーザ強度がガウス分布に近い場合、蛍光相関関数Ｇ（τ）は、次式のようになる。
【０００９】
【数３】
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【００１０】
前述したように、蛍光相関分析法は、蛍光性分子の並進拡散係数（式（１）におけるＤ）が得られる物理量を測定するものであるが、基本的には、蛍光の揺らぎを与える熱力学量であれば、どんな量でも同じ原理で測定することができる。例えば、蛍光分子が流動してレーザビームを横切れば、蛍光の揺らぎを観測することができる。また、化学反応などで蛍光性分子が他の分子と結合すれば、その結合した分子の速度を揺らぎとして観測することができる。これにより、化学反応の進行をリアルタイムで知ることが可能となる。
【００１１】
また、蛍光の偏光を解析すれば、分子の回転運動を測定することもできる。さらに、Ｇ（τ）の強度から、観察領域に存在する分子数を直接測定することもできる。具体的には、図３において、期待する揺らぎ現象が完結するような特定の計測時間（Ｔ）内の揺らぎ関数ｆ（ｔ）を測定し、その測定した揺らぎ関数ｆ（ｔ）から上記式（２）を用いて蛍光相関関数Ｇ（τ）を求めればよい。なお、図３において、レーザ励起光ビーム１０３の光源としては、一般に、アルゴンレーザやクリプトンレーザの連続発振レーザが用いられる。
【００１２】
図４は、従来の蛍光相関分析装置の要部構成図である。この蛍光相関分析装置は、例えば特許文献１に開示されているもので、励起光源としてアルゴンレーザ等の連続発振レーザ１１１が用いられる。連続発振レーザ１１１から射出されたレーザビームは、ビームスプリッタ１１２を透過してレンズ１１３により蛍光色素を含有した観察試料溶液１１４に集光照射される。これにより、蛍光色素は励起されて、蛍光を発生する。
【００１３】
観察試料溶液１１４から発生した蛍光は、レンズ１１３により平行光にされた後、ビームスプリッタ１１２で反射され、さらに、レンズ１１５により集光されてピンホール１１６を経て、光電子増倍管やＣＣＤ等の検出器１１７で検出される。この光検出器１１７の出力は、プリアンプ１１８で増幅された後、アナログ・デジタル（ＡＤ）変換器１１９によりデジタルデータに変換されて、時系列データとしてコンピュータ１２０のメモリに取り込まれる。そして、コンピュータ１２０により、上記式（２）に従って蛍光相関関数Ｇ（τ）が計算される。
【００１４】
ところで、現在、バイオサイエンスの現場では、細胞内微小器官（オルガネラ）の機能の解明を行うため、細胞内外における代謝現象を解析する研究が盛んに行われている。その際、細胞膜の内外におけるオルガネラ間の相互作用と連携とについて調べる作業が重要となっている。この場合、複数の距離の離れた異なるオルガネラの代謝現象を同時に計測する必要がある。すなわち、同時に異なる複数計測点において、蛍光相関計測を行うことが要求される。
【００１５】
しかしながら、図４に示したような従来の蛍光相関分析装置は、連続発振レーザから射出されたレーザビームを、観察試料溶液に集光して、その集光点の１点における蛍光相関関数を計測するものであり、細胞膜を挟んだ任意の距離の複数点における蛍光相関関数を同時に計測することはできない。そのため、空間的に異なる測定点における蛍光相関関数を同時に計測でき、細胞内の代謝現象を分析できるような機能を有する蛍光相関分析法の開発が望まれている。
【００１６】
このような要望に応えるものとして、本出願人は、例えば特許文献２において、時系列に複数の測定点での蛍光相関分析を可能とした蛍光相関分析装置を既に提案している。この蛍光相関分析装置は、励起光を複数の測定点の各々に所定時間停止させながら順次繰り返し移動させ、その各測定点において検出される蛍光強度の断続的な時系列信号に基づいて蛍光相関分析を行うものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２００１−２７２３４６号公報
【特許文献２】特許第３９８４１３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、上記特許文献２に開示の蛍光相関分析装置は、複数の測定点での蛍光相関分析が可能であるものの、複数の測定点で検出される蛍光強度は、それぞれ異なるタイミングで検出された断続的な時系列信号である。このため、オルガネラ間の相互作用および連携に関して、高精度の評価ができないことが懸念される。また、励起光を複数の測定点に順次移動させるための走査機構を要するため、構成が複雑化することが懸念される。
【００１９】
なお、上述したような試料の評価法は、蛍光に限らず、散乱光等の他の応答光を検出して行われる場合もあり、その場合も同様の不都合が生じることになる。
【００２０】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、簡単な構成で、試料の空間的に異なる複数の測定点における応答光を、同時にかつ連続的に検出することが可能で、試料を高精度で評価できる生体システムの機能解明に適した試料評価方法および試料評価装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成する第１の観点に係る試料評価方法の発明は、
照明光により試料を照明し、該試料の照明領域内の微小領域において前記照明光による刺激により放出される応答光を空間的に分離し、該分離された応答光の１光子を検出して前記試料を評価する、ことを特徴とするものである。
【００２２】
さらに、上記目的を達成する第２の観点に係る試料評価装置の発明は、
試料を照明する照明光学系と、
該照明光学系からの照明光により刺激されて前記試料の照明領域内の微小領域から放出される応答光を空間的に分離して、該分離された応答光の１光子を検出する検出部と、
を備えることを特徴とするものである。
【００２３】
第３の観点に係る発明は、第２の観点に係る試料評価装置において、
前記検出部は、
前記試料の照明領域内を複数の微小領域に空間的に分離する分離光学系と、
該分離光学系により分離された複数の微小領域からの応答光の１光子をそれぞれ検出する複数の光検出器と、
を有することを特徴とするものである。
【００２４】
第４の観点に係る発明は、第３の観点に係る試料評価装置において、
前記分離光学系は、
前記試料の照明領域内を複数の微小領域に空間的に分離して各微小領域からの応答光を増幅するマイクロチャンネルプレートを有する、ことを特徴とするものである。
【００２５】
第５の観点に係る発明は、第３の観点に係る試料評価装置において、
前記分離光学系は、
前記試料の照明領域内を複数の微小領域に空間的に分離するマイクロレンズアレイを有する、ことを特徴とするものである。
【００２６】
第６の観点に係る発明は、第３乃至５のいずれかの観点に係る試料評価装置において、
前記分離光学系と前記光検出器とを光学的に結合する光ファイバを有する、ことを特徴とするものである。
【００２７】
第７の観点に係る発明は、第３乃至６のいずれかの観点に係る試料評価装置において、
前記光検出器は、アバランシュフォトダイオードまたは光電子増倍管からなる、ことを特徴とするものである。
【００２８】
第８の観点に係る発明は、第２乃至７のいずれかの観点に係る試料評価装置において、
前記検出部は、前記応答光として、前記照明光の照射により前記試料から放出される蛍光または散乱光を検出するように構成されている、ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、試料を照明し、これにより照明領域内の微小領域から放出される応答光の１光子を空間的に分離して検出するので、簡単な構成で、試料の空間的に異なる複数の測定点における応答光を、同時にかつ連続的に検出することが可能となり、試料を高精度で評価できる生体システムの機能解明に資することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る蛍光相関分析装置の要部構成図である。
【図２】本発明の第２実施の形態に係る蛍光相関分析装置の要部構成図である。
【図３】蛍光相関分析法を説明するための図である。
【図４】従来の蛍光相関分析装置の要部構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の実施の形態は、本発明を蛍光相関分析装置に適用した場合を例示するが、本発明は蛍光相関分析装置に限らず、試料を評価する種々の装置に適用できるものである。
【００３２】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光相関分析装置の要部構成図である。この蛍光相関分析装置は、試料を照明し、それにより励起（刺激）されて試料から発生する蛍光（応答光）の像を結像光学系により結像し、その結像面を複数の微小領域に空間的に同時に分離して、各微小領域における蛍光の１光子を独立して検出するものである。図１において、レーザ光源（例えば、Ｋｒレーザ）１１から射出される照明光（励起光）は、ダイクロイックミラー１２を透過して、対物レンズ１３により蛍光色素を含有する観察試料溶液１４に照射される。これにより、観察試料溶液１４の有限領域が、励起光によって落射照明される。
【００３３】
また、励起光による照明により観察試料溶液１４から発生する蛍光（信号光）は、対物レンズ１３により捕集されて、ダイクロイックミラー１２で反射される。そして、蛍光分離フィルタ１５により励起光成分が除去された後、結像光学系を構成する結像レンズ１６により光電増幅器１７に結像される。
【００３４】
光電増幅器１７は、結像レンズ１６により結像される蛍光像を、複数の微小領域に空間的に分離して各微小領域における応答光を増幅する。この光電増幅器１７は、蛍光像を光電変換する第１光電変換素子１８と、蛍光像を複数の微小領域に空間的に分離して第１光電変換素子１８から放出される光電子を増幅する複数のファイバチャンネルを有するマイクロチャンネルプレート１９と、マイクロチャンネルプレート１９で増幅された光電子を光に変換する第２光電変換素子２０と、第２光電変換素子２０から放出される光が入射するように、マイクロチャンネルプレート１９の複数のチャンネルに対応して配置された複数の光ファイバ２１と、を有する。
【００３５】
そして、この光電増幅器１７の複数の光ファイバ２１からそれぞれ射出される光は、複数の光検出器２２により独立して検出され、その各光検出器２２の出力が、それぞれプリアンプ２３で増幅された後、ＡＤ変換器２４によりデジタルデータに変換されて、コンピュータを含む解析部２５に同時に取り込まれて処理される。なお、図１では、図面を簡潔とするため、一つの光検出器２２に対応するプリアンプ２３およびＡＤ変換器２４を示し、他の光検出器２２に対応するプリアンプ２３およびＡＤ変換器２４は、図示を省略している。
【００３６】
したがって、図１においては、レーザ光源１１、ダイクロイックミラー１２および対物レンズ１３により、照明光学系が構成されている。また、対物レンズ１３、ダイクロイックミラー１２、蛍光分離フィルタ１５、結像レンズ１６、光電増幅器１７および複数の光検出器２２により、検出部が構成されている。なお、マイクロチャンネルプレート１９の口径は、対物レンズ１３および結像レンズ１６により決定される２次元点像分布関数による蛍光像の大きさとほぼ等しくなっている。また、複数の光検出器２２の各々は、１光子型のアバランシュフォトダイオードあるいは光電子増倍管を用いて構成される。
【００３７】
上記構成において、観察試料溶液１４が励起光によって照明されると、それによって励起された観察試料溶液１４の蛍光像が、結像レンズ１６により光電増幅器１７の第１光電変換素子１８上に結像されて、該第１光電変換素子１８の蛍光が入射した位置の背面から光電子が放出される。この第１光電変換素子１８から放出される光電子は、その放射位置と対応する位置のマイクロチャンネルプレート１９のファイバチャンネルに入射して空間的に分離されてそれぞれ増幅され、その後、第２光電変換素子２０で再び光電変換されて光（フォトン）として放出される。そして、この第２光電変換素子２０から放出される光は、その放出位置に対応する位置の光ファイバ２１に入射されて、対応する光検出器２２で検出される。
【００３８】
これにより、観察試料溶液１４の照明領域内の蛍光を空間分解して蛍光相関を分析する。すなわち、マイクロチャンネルプレート１９の各ファイバチャンネルの入射口を共焦点ピンホールとして機能させて、第１光電変換素子１８に結像される蛍光像を微小領域に同時に空間分解する。そして、さらに、最終段の各光検出器２２により時間分解を行う。ここで、光電増幅器１７のマイクロチャンネルプレート１９により空間分解する微小領域、すなわち一つのファイバチャンネルの口径は、例えば１０μｍとし、この口径に対応する観察試料溶液１４の照明領域内の微小領域は、共焦点ピンホール径に相当する、例えば０．５μｍ程度として、観察試料溶液１４の像をほぼ２０倍に拡大して光電増幅器１７に結像する。
【００３９】
したがって、本実施の形態によれば、各光検出器２２から得られる出力信号（蛍光強度）に基づいて、観察試料溶液１４内で、照明光学系の光軸と直交する平面内の空間的に異なる位置における蛍光の揺らぎを、上述した公知の方法で、同時に測定することができる。また、複数の光検出器２２のうち、所望の２個の光検出器２２から得られる蛍光強度をＩＡ（ｔ）、ＩＢ（ｔ）とするとき、これらＩＡ（ｔ）およびＩＢ（ｔ）に基づいて、図示しない解析部により下記の式（４）を演算することにより、２個の光検出器２２と対応する観察試料溶液１４内の位置における蛍光相互相関分析法（ＦＣＣＳ法）による相互相関関数ｇ（τ）を算出することができる。
【００４０】
【数４】
2011179912.tif 000006
【００４１】
さらに、共焦点蛍光コインシデンス分析法（ＣＦＣＡ法）により、所望の２個の光検出器２２から得られる出力信号（蛍光強度）に基づいて、二つの蛍光分子からの蛍光揺らぎの一致度をハイスループットで検出することができる。
【００４２】
このように、本実施の形態では、観察試料溶液１４を照明し、その照明光により励起されて発生する観察試料溶液１４の蛍光像を光電増幅器１７に結像させて、複数の微小領域に空間分解して各微小領域の蛍光を増幅する。そして、光電増幅器１７により複数の微小領域に空間分解されて増幅された蛍光を、それぞれ１光子型の光検出器２２で検出する。したがって、走査機構を要することなく、簡単な構成で、観察試料溶液１４の照明領域内の複数点の蛍光を同時に検出することができる。これにより、例えば、細胞膜を挟んだ細胞内部と外部との生体情報分子の拡散状態を同時に計測することが可能となり、生体システムの機能解明に資することができる。また、観察試料溶液１４には、励起光が１点に集光されないので、観察試料溶液１４内の細胞への影響を最小限に抑えられる効果もある。
【００４３】
（第２実施の形態）
図２は、本発明の第２実施の形態に係る蛍光相関分析装置の要部構成図である。この蛍光相関分析装置は、試料を照明し、その照明領域をマイクロレンズアレイを用いて複数の微小領域に空間的に分離し、その各微小領域から励起（刺激）されて発生する蛍光の１光子を独立して検出するものである。図２において、照明ランプ３１から射出される照明光（励起光）は、コリメータレンズ３２により平行光束に変換されて、例えばカバーグラスに保持された蛍光色素を含有する観察試料溶液３３に照射される。これにより、励起光の平行光束径に相当する観察試料溶液３３の有限領域が、励起光によって透過照明される。
【００４４】
また、励起光による照明により観察試料溶液３３から発生する蛍光（応答光）は、観察試料溶液３３に対して照明ランプ３１とは反対側に配置された第１マイクロレンズアレイ３４により捕集される。第１マイクロレンズアレイ３４は、多数のマイクロレンズが一次元または二次元に配列して構成され、その焦点位置に観察試料溶液３３が位置するように配置される。これにより、観察試料溶液３３から発生する蛍光は、第１マイクロレンズアレイ３４の対応するマイクロレンズで捕集されて、それぞれ平行光束として射出される。すなわち、本実施の形態においては、各マイクロレンズによる焦点領域（回折限界領域）を微小領域として、観察試料溶液３３の照明領域が空間分解され、その微小領域において励起されて発生する蛍光が対応するマイクロレンズで捕集される。
【００４５】
第１マイクロレンズアレイ３４により捕集された蛍光は、蛍光分離フィルタ３５により励起光が除去された後、第２マイクロレンズアレイ３６により集光される。第２マイクロレンズアレイ３６は、第１マイクロレンズアレイ３４と同様に構成され、該第２マイクロレンズアレイ３６により第１マイクロレンズアレイ３４の対応するマイクロレンズからの蛍光が集光されて、それぞれ対応する光ファイバ３７を経て光検出器３８で検出される。各光検出器３８の出力は、第１実施の形態の場合と同様に、それぞれプリアンプ３９で増幅された後、ＡＤ変換器４０によりデジタルデータに変換されて、コンピュータを含む解析部４１に同時に取り込まれて処理される。なお、図２においても、図面を簡潔とするため、一つの光検出器３８に対応するプリアンプ３９およびＡＤ変換器４０を示し、他の光検出器３８に対応するプリアンプ３９およびＡＤ変換器４０は、図示を省略している。
【００４６】
したがって、図２においては、照明ランプ３１およびコリメータレンズ３２により照明光学系が構成されている。また、第１マイクロレンズアレイ３４、蛍光分離フィルタ３５、第２マイクロレンズアレイ３６、複数の光ファイバ３７および複数の光検出器３８により、検出部が構成されている。なお、複数の光検出器３８の各々は、第１実施の形態の場合と同様に、１光子型のアバランシュフォトダイオードあるいは光電子増倍管を用いて構成される。
【００４７】
このように、本実施の形態の蛍光相関分析装置は、観察試料溶液３３を励起光により照明し、その照明領域を第１マイクロレンズアレイ３４により複数の微小領域に同時に空間分解して、その空間分解された微小領域からの蛍光を、蛍光分離フィルタ３５を経て第２マイクロレンズアレイ３６に導く。そして、第２マイクロレンズアレイ３６により集光される各微小領域からの蛍光を、対応する光ファイバ３７を経て対応する光検出器３８で独立して検出して時間分解を行う。
【００４８】
したがって、走査機構を要することなく、簡単な構成で、観察試料溶液３３の照明領域内の複数点の蛍光を同時に検出することができる。これにより、第１実施の形態の場合と同様に、例えば、細胞膜を挟んだ細胞内部と外部との生体情報分子の拡散状態を同時に計測したり、ＦＣＣＳ法やＣＦＣＡ法による分析を行ったりすることが可能となり、生体システムの機能解明に資することができる。また、観察試料溶液３３には、励起光が１点に集光されないので、第１実施の形態の場合と同様に、観察試料溶液３３内の細胞への影響を最小限に抑えられる効果もある。
【００４９】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第１実施の形態において、観察試料溶液１４を透過照明するように構成してもよい。同様に、第２実施の形態において、観察試料溶液３３を落射照明するように構成してもよい。この場合は、例えば、図２の構成において、蛍光分離フィルタ３５に代えて、蛍光と励起光とを分離するダイクロイックミラーを、第１マイクロレンズアレイ３４と第２マイクロレンズアレイ３６との間の光路に対して４５度傾斜させて配置し、このダイクロイックミラーにより平行光束の照明光（励起光）を反射させて、第１マイクロレンズアレイ３４を経て観察試料溶液３３を落射照明する。そして、第１マイクロレンズアレイ３４で捕集される蛍光を、ダイクロイックミラーを透過させて第２マイクロレンズアレイ３６により、対応する光ファイバ３７に入射させる。また、第２実施の形態において、第１マイクロレンズアレイ３４を構成する複数のマイクロレンズのうち、適宜のマイクロレンズの焦点距離を異ならせて、観察試料溶液３３の深さ方向（光軸方向）に異なる微小領域の蛍光を検出することもできる。
【符号の説明】
【００５０】
１１  レーザ光源
１３  対物レンズ
１４  観察試料溶液
１６  結像レンズ
１７  光電増幅器
１９  マイクロチャンネルプレート
２１  光ファイバ
２２  光検出器
３１  照明ランプ
３２  コリメータレンズ
３３  観察試料溶液
３４  第１マイクロレンズアレイ
３６  第２マイクロレンズアレイ
３７  光ファイバ
３８  光検出器
【図１】
2011179912.tif 000007
【図２】
2011179912.tif 000008
【図３】
2011179912.tif 000009
【図４】
2011179912.tif 000010