(57)【要約】【課題】機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠く生存可能なブタを提供すること。異種移植または他の生医学的適用において使用するために、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠く、ブタ細胞、ブタ組織、およびブタ器官を提供すること。その細胞表面上にガラクトースα−１，３−ガラクトースエピトープを欠くブタ細胞を選択してスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠く、ブタ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠くブタの産生のための方法であって、
該α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）遺伝子の不活化についてヘテロ接合性である雄のブタを、該α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）遺伝子の不活化についてヘテロ接合性である雌のブタと交配させる工程；
を包含し、
一方または両方のブタは、該α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）遺伝子の対立遺伝子における点変異の存在に起因してヘテロ接合性である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠くブタ同士を交配させて、機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠くブタの集団を生成する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記雄のブタまたは雌のブタのうちの少なくとも一方が、遺伝子標的化事象を介して不活化された少なくとも１つのα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）遺伝子対立遺伝子を含む、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠くブタ同士を交配させて、機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠くブタの集団を生成する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５】
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠く天然に存在しないブタであって、該α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）の少なくとも一方の対立遺伝子が点変異を介して不活性になっている、ブタ。
【請求項６】
請求項５のブタ同士を交配させることにより生成されたブタの集団であって、該集団におけるブタは、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠く、集団。
【請求項７】
請求項６に記載のブタから得られた細胞、組織、または器官であって、該ブタは、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠く、細胞、組織、または器官。
【請求項８】
請求項５に記載のブタであって、前記α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）の少なくとも一方の対立遺伝子が遺伝子標的化事象を介して不活性になっている、ブタ。
【請求項９】
請求項８に記載のブタ同士を交配させることにより生成されたブタの集団であって、該集団におけるブタは、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠く、集団。
【請求項１０】
請求項９に記載のブタから得られた細胞、組織、または器官であって、該ブタは、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠く、細胞、組織、または器官。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年８月２１日に出願した米国特許仮出願番号６０／４０４，７７５に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ブタ動物、ブタ組織、およびブタ器官、ならびにそのような動物、組織、および器官に由来する細胞および細胞株であって、これらは、機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３ＧＴ）のいかなる発現をも欠く。そのような動物、組織、器官、および細胞は、研究および医学的治療（異種移植を含む）において使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
末期臓器不全の患者は、生存のために器官移植を必要とする。臨床的移植における主要な限定要因は、適切なヒトドナーの不足である。過去１０年間にわたり、臓器を待つ患者のリストの大きさは、１９９１年の約３０，０００人から、２００１年の約８０，０００人へと劇的に増加した（情報源：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｏｒｇａｎ  Ｄｏｎｏｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ；Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ’ｓ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｏｒｄ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｓｔｕｄｙ  ｆｒｏｍ  １９９７  ｔｏ  １９９９（３０個の臓器斡旋組織により提供される））。過去１０年間にわたるこの需要増加にも関わらず、臓器提供の数は、不活発なままである（１年間当たり約２０，０００件）。
【０００４】
２００３年７月１７日当時のＵｎｉｔｅｄ  Ｎｅｗｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ（ＵＮＯＳ）によると、米国において臓器移植を待つ８２，２４９人の患者が存在した。具体的な器官についての需要は、以下の通りであった：
【０００５】
【表１００】
2011015697.tif 000002
米国において、すべての人種および民族のバックグラウンドの男性、女性および子供が、毎日平均１７人、寄与される器官の欠如が原因で死んでおり、従って、毎年、６，２００人を越えるアメリカ人が、器官移植を待って死んでいる。より信頼できかつ無限の器官供給源についての需要により、他の動物からの器官の移植（異種移植とも呼ばれる）の可能性について調査が引き起こされた。
【０００６】
ブタは、異種移植片器官の最も可能性がる供給源であると考えられる。ブタの供給は、豊富であり、交配プログラムは、十分に確立されており、その大きさおよび生理は、ヒトに適合する。しかし、異種移植は、それ自体の問題を提示する。最も重要なことは、免疫拒絶である。第１の免疫学的障害物は、「超急性拒絶（ＨＡＲ）」である。ＨＡＲは、外来組織に結合する予め形成された高力価の天然抗体が遍在的に存在することによって定義され得る。これらの天然抗体が、ドナー器官の内皮上の標的エピトープに結合することが、ＨＡＲにおける開始事象であると考えられる。この結合の後、レシピエント血液がドナー器官に還流して数分間以内に、補体活性化、血小板およびフィブリンの沈着が生じる、これらはすべて、レシピエントにおけるその器官の不全を引き起こす（Ｓｔｒａｈａｎら（１９９６）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １，ｅ３４〜４１）。
【０００７】
旧世界のサル、類人猿、およびヒトを除いて、ほとんどの哺乳動物は、その細胞表面上に、糖タンパク質を保有し、この糖タンパク質は、ガラクトースα１，３−ガラクトースを含む（Ｇａｌｉｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５〜１７７６２，１９８８）。ヒトおよび旧世界のサルは、大量に生成される天然に存在する抗αｇａｌ抗体を有する（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４２：６８２〜６８３．１９９３）。これは、ガラクトースα−１，３−ガラクトースを保有する糖タンパク質および糖脂質に特異的に結合する。
【０００８】
対照的に、ガラクトースα−１，３−ガラクトースを含む糖タンパク質は、他の哺乳動物（例えば、ブタ）の細胞上に多量に見出される。哺乳動物における「α−１，３−ＧＴエピトープ」と抗Ｇａｌ抗体（すなわち、ガラクトースα−１，３−ガラクトースを保有する糖タンパク質および糖脂質に結合する抗体）とのこの差次的な分布は、祖先の旧世界の霊長類およびヒトにおいて不活化（すなわち、変異型）α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを有する種について選択した進化プロセスの結果である。従って、ヒトは、α１，３ＧＴの「自然ノックアウト」である。この事象の直接の結果は、異種移植片の拒絶（例えば、最初にＨＡＲを介するヒト中に移植されたブタ器官の拒絶）である。
【０００９】
ブタ異種移植により引き起こされる抗Ｇａｌ体液性応答を排除または調節するために、種々のストラテジーが実施されてきた。そのストラテジーとしては、α−ガラクトシダーゼを用いるエピトープの酵素的除去（Ｓｔｏｎｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３：６４０〜６４５，１９９７）、特異的な抗ｇａｌ抗体除去（Ｙｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３３０−３３７，１９９４）他の糖質部分を用いるエピトープのキャップ化（これは、α−１，３−ＧＴ発現を排除できなかった）（Ｔａｎｅｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３２１：１６４２１−１６４２５，１９９８およびＫｏｉｋｅら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４：１４７−１５３，１９９７）、補体阻害タンパク質の導入（Ｄａｌｍａｓｓｏら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：３１−３５，１９９１，Ｄａｌｍａｓｓｏら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５２：５３０−５３３（１９９１））が挙げられる。Ｃ．Ｃｏｓｔａら（ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １３，１７６２（１９９９））は、Ｈ−トランスフェラーゼトランスジェニックブタにおけるα−１，３−ＧＴの競合阻害は、エピトープの単なる部分減少を生じたことを報告した。同様に、Ｓ．Ｍｉｙａｇａｗａら（Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７６，３９３１０（２００１））は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩトランスジェニックブタにおけるｇａｌエピトープの発現をブロックする試みもまた、ｇａｌエピトープ数の単なる部分的減少を生じ、霊長類レシピエントにおいて移植片生存を有意に拡大することはできなかったことを報告した。
【００１０】
ブタ細胞および生存動物におけるα−１，３−ＧＴ遺伝子座の単一対立遺伝子ノックアウトが、報告されている。Ｄｅｎｎｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：５５９−５６２，２００１）は、ヒツジにおけるα−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子の標的化遺伝子欠失を報告した。Ｈａｒｒｉｓｏｎら（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１４３−１５０，２００２）は、ヘテロ接合性α−１，３−ＧＴノックアウト体細胞ブタ胎仔線維芽細胞の産生を報告した。２００２年に、Ｌａｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１０８９−１０９２，２００２）およびＤａｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５，２００２）は、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子が首尾良く不活化されたブタの産生を報告した。Ｒａｍｓｏｏｎｄａｒら（Ｂｉｏｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃ  ６９，４３７−４４５（２００３）は、ヒトαー１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＨＴ）も発現するヘテロ接合性α−１，３−ＧＴノックアウトブタの産生を報告した。このブタは、ＨＴエピトープおよびα−１，３−ＧＴエピトープの両方を発現した。
【００１１】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／２１７９９および米国特許第５，８２１，１１７号（Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対する）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／２０６６１（Ｂｒｅｓａｔｅｃに対する）；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９５／２８４１２，米国特許第６，１５３，４２８，米国特許第６，４１３，７６９および米国公開番号２００３／００１４７７０（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，Ｉｎｃ．およびＴｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに対する）は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のｃＤＮＡの知見に基づき（そして、ゲノム組織化の知識もゲノム配列の知識も持たずに）、α−１，３−ＧＴネガティブブタ細胞の産生についての考察を提供する。しかし、そのような細胞が、これらの出願の出願日前に実際に産生されたことの証拠は存在せず、それらの実施例は、すべて予言であった。
【００１２】
ヘテロ接合性α−１，３−ＧＴネガティブブタ細胞の首尾良い産生についての最初の公の開示は、Ｌａｋｅ  Ｔａｈｏｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（Ｄａｖｉｄ  Ａｙａｒｅｓ，ら、ＰＰＬ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）において、１９９９年７月に行なわれた。本発明の前に、ホモ接合性α−１，３−ＧＴネガティブブタ細胞の産生を、誰も公開も公に開示もしなかった。さらに、ブタ胚性幹細胞は、今日まで入手できていないので、生きたホモ接合性α−１，３−ＧＴノックアウトブタを調製することを試みるために、α−１，３−ＧＴホモ接合性胚性幹細胞を使用する方法は、存在しなかったし、今も存在しない。
【００１３】
２００３年２月２７日に、Ｓｈａｒｍａら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７５：４３０−４３６（２００３）は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のノックアウトについて接合性である胎仔ブタ線維芽細胞の首尾良い産生を示す報告を公開した。
【００１４】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／５１４２４（ＰＰＬ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに対する）は、核移入のための体細胞の遺伝的改変を記載する。この特許出願は、ブタ体細胞におけるα−１，３−ＧＴ遺伝子の遺伝子破壊と、このα−１，３−ＧＴ遺伝子の少なくとも１コピーを欠くこれらの細胞の核を核移入のためにその後使用することを開示する。
【００１５】
米国特許第６，３３１，６５８（ＣｏｏｐｅｒおよびＫｏｒｅｎに対する）は、シアリルトランスフェラーゼタンパク質またはフコシルトランスフェラーゼタンパク質を発現する遺伝子操作哺乳動物を特許請求するが、その動物を実際に産生したかは何ら確認していない。この特許は、その遺伝子操作哺乳動物が、その哺乳動物の細胞表面上でのガラクトシル化タンパク質の減少を示すと主張する。
【００１６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０３／０５５３０２（Ｔｈｅ  Ｃｕｒａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）は、異種移植において使用するためのヘテロ接合性α−１，３−ＧＴノックアウトミニチュアの産生を確認する。この出願は、概して、破壊されたα−１，３−ＧＴ遺伝子を含むノックアウトブタに関し、そのノックアウトブタにおける機能的α−１，３−ＧＴの発現は、野生型と比較して減少してうる。この出願は、そのブタが異種移植のために有用であるようにするのにどの程度α−１，３−ＧＴが減少されなければならないかに関して、何ら指針を提供しない。さらに、この出願は、その産生されたヘテロ接合性ブタが、機能的α−１，３−ＧＴの減少した発現を示したという証拠を何ら提供しない。さらに、この出願は、α−１，３−ＧＴノックアウトブタと言うが、１匹でも実際に産生したかという証拠も、産生可能であるかという証拠も、この出願中に存在せず、いわんや、得られる子孫が、生存可能であるかも、異種移植のために表現型的に有用であるかも、この出願中に証拠は存在しない。
【００１７】
ガラクトースα−１，３−ガラクトースを含む糖タンパク質の全体的除去は、明らかに、異種移植用ブタ動物の産生のための最良のアプローチである。α−１，３−ＧＴ遺伝子のダブルノックアウト（すなわち、両方のコピーの破壊）が、２つの方法によって作製され得ることが、理論上可能であり、その２つの方法は、１）子孫を産生するために２匹の単一対立遺伝子ノックアウト動物を交配すること（この場合は、メンデルの遺伝学に基づいて、４分の１がダブルノックアウトであるはずであると推定される）、または２）細胞中の第２の対立遺伝子を既存のシングルノックアウトを用いて遺伝子改変することである。実際、これは、ノックアウトブタに関する最初の出願が１９９３年に出願された一方で、最初のホモ接合性α−１，３−ＧＴノックアウトブタが、２００２年７月まで産生されなかった（これが産生されたのは、本発明の作業に基づき、本明細書中に記載された）という事実によって例証されるように、極めて困難であった。
【００１８】
トランスジェニックマウス（ブタではない）は、歴史的には、多くの理由のために、哺乳動物の生理に対する遺伝子改変の効果を研究するための好ましいモデルであった。最も重要な理由の１つは、マウス胚性幹細胞が、利用可能であったのに対して、ブタ胚性幹細胞は、利用可能ではなかったことである。マウスは、基本的研究適用のために理想的な動物である。なぜなら、これは、比較的取扱い易く、迅速に増殖し、そして分子レベルで遺伝子操作し得るからである。研究者は、結腸癌から精神遅滞までに及ぶ種々の遺伝子ベースの疾患の分子病理を研究するために、マウスモデルを使用する。数千匹の遺伝子改変マウスが、今日までに作製された。「Ｍｏｕｓｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ」が、マウスノックアウトおよび古典的変異に関する表現型および遺伝子型の情報の包括的データベースが提供するために、ＢｉｏＭｅｄＮｅｔによって作製された（ｈｔｔｐ  ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｂｍｎ．ｃｏｍ／ｍｋｍｄ；Ｂｒａｎｄｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５［７］：７５８−７６５（１９９５）；；Ｂｒａｎｄｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５［８］：８７３−８８１（１９９５））。このデータベースは、３，０００個を超える独特の遺伝子に関する情報を提供する。これらの遺伝子は、今日までにマウスゲノムにおいて標的化されている。
【００１９】
マウスを用いたこの広範な経験に基づいて、トランスジェニック技術がいくつかの重要な制限を有することが、学ばれた。発生欠損が原因で、遺伝子ノックマウス技術により作製された多くの遺伝子改変マウス（特に、ヌルマウス）は、研究者が実験用モデルを使用する機会を得る前に、胚として死ぬ。そのマウスが生存した場合でさえ、そのマウスは、有意に変化した表現型を発生し得、その表現型により、そのマウスは、重篤に機能不全にされ得るか、変形され得るか、衰弱され得る（Ｐｒａｙ，Ｌｅｓｌｉｅ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １６［１３］：３４（２００２）；Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １４［１５］：３２，（２０００）；Ｂｒａｎｄｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５［６］：６２５−６３４（１９９５）；Ｂｒａｎｄｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５［７］：７５８−７６５（１９９５）；Ｂｒａｎｄｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５［８］：８７３−８８１（１９９５）；ｈｔｔｐ  ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｂｍｎ．ｃｏｍ／ｍｋｍｄ）。さらに、所定の遺伝子がその生物の発生において重要な役割を果たすか否か、従って、その遺伝子の排除により致死的表現型または変化した表現型が生じるか否かを予測することは、そのノックアウトが首尾良く作製されて生存子孫が産生されるまで不可能であることが、学ばれた。
【００２０】
マウスは、機能的α−１，３−ＧＴ発現を排除するように遺伝子改変された。ダブルノックアウトα−１，３−ＧＴマウスが、作製された。そえは、発生上生存可能であり、正常な器官を有する（Ｔｈａｌｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２１４３７−４０（１９９５）；Ｔｅａｒｌｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６１：１３−１９（１９９６），米国特許第５，８４９，９９１号もまた参照のこと）。しかし、これらのマウスにおける２つの表現型異常が、明らかであった。第１に、全てのマウスが、濃い皮質部白内障を発症した。第２に、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子の排除は、そのマウスの発生に有意に影響を与えた。α−１，３−ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性のマウスの交配は、推定メンデル１：２：１比から有意に逸脱した遺伝子型比を生じた（Ｔｅａｒｌｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６１：１３−１９（１９９６））。
【００２１】
ブタは、マウスにおいて見出されるより１００倍〜１０００倍高い、ガラクトースα１，３−ガラクトースを含む一定レベルの細胞表面糖タンパク質を有する（Ｓｈａｒｍａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７５：４３０−４３６（２００３）；Ｇａｌｉｌｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９：１８７−１９０（２０００））。従って、α−１，３−ＧＴ活性は、マウスにおいてよりもブタにおいて、重要でありかつ豊富である。
【００２２】
予測および予言的陳述にも関わらず、本発明の前には、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子の破壊が、致死性であるか、またはブタの発生に影響を与えるかもしくは変化した表現型を生じるか否か、誰も知らなかった（Ａｙａｒｅｓら、Ｇｒａｆｔ  ４（１）  ８０−８５（２００１）；Ｓｈａｒｍａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７５：４３０−４３６（２００３）；Ｐｏｒｔｅｒ  ＆  Ｄａｌｌｍａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４：１２２７−１２３５（１９９７）；Ｇａｌｉｌｉ，Ｕ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８３：５５７−５６３（２００１））。実際、この分野の多くの専門家は、ホモ接合性α−１，３−ＧＴノックアウトブタが、生存可能であるかに関して、いわんや正常の発生するかに関して、深刻な疑問を表明した。そのような問題は、本発明のダブルノックアウトブタが産生されるまで、表された。当時この分野において作業していた人による陳述の例としては、以下が挙げられる。
【００２３】
「豊富に発現されるα−ｇａｌエピトープは、ブタの発生（例えば、細胞間相互作用）において、いくつかの生物学的役割を有し得る。この仮定が正しい場合、ブタは、このエピトープなしでは発生しないかもしれない（Ｇａｌｉｌｉ，Ｕ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８３：５５７−５６３（２００１）」。
【００２４】
「α−ｇａｌについてのノックアウトブタを産生するのができないことは、α−ｇａｌエピトープが、この種において不可欠であることを示唆し得る（Ｇａｌｉｌｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９：１８７−１９０（２０００））」。
【００２５】
「ダブルノックアウトα−ｇａｌマウスは、発生して完全に正常なままであるが、この酵素の欠如が他の動物においてより深刻な結果を有し得る可能性が、存在する。（Ｐｏｒｔｅｒ  ＆  Ｄａｌｌｍａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４：１２２７−１２３５（１９９７））」。
【００２６】
「ＧＴ（−／−）ブタは、生存しないかもしれないことがあり得る。なぜなら、ＧＴ遺伝子は、胚発生のために必須であるからである。この問題に対する回答および異種移植研究に対するＧＴ（−／−）ブタの関連に対する回答は、可能な場合、適切なブタの産生を待たなければならない（Ｓｈａｒｍａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７５：４３０−４３６（２００３））。
【００２７】
「ブタ器官におけるＧａｌエピトープ発現は、マウス器官中より５００倍高いので、αＧＴ活性が、ブタにとって重要であり、かつこれらのブタの発生に影響を与え得る可能性が存在する（Ａｙａｒｅｓら、Ｇｒａｆｔ  ４（１）  ８０−８５（２００１））」。
【００２８】
従って、生存可能なダブルα−１，３−ＧＴノックアウトブタが産生されるまで、当時の当業者に従うと、（ｉ）子孫が生存可能であるか否かも、（ｉｉ）子孫が、ヒト中への移植のためにその器官を使用することが可能である表現型を提示するか否かについても、決定することは可能ではなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
従って、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠く生存可能なブタを提供することが、本発明の目的である。
【００３０】
異種移植または他の生医学的適用において使用するために、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠く、ブタ細胞、ブタ組織、およびブタ器官を提供することが、本発明の別の目的である。
【００３１】
その細胞表面上にガラクトースα−１，３−ガラクトースエピトープを欠くブタ細胞を選択してスクリーニングする方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
（発明の要旨）
本発明は、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる機能的発現をも欠く最初の生存ブタの産生である。本発明の主題は、２００３年にＳｃｉｎｅｃｅ  ｍａｇａｚｉｎｅにおいて完全な論説として報道され（Ｐｈｅｌｐｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：４１１−４１４（２００３））、異種移植における躍進として報道において広範に報告された。
【００３３】
機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠く生存可能なブタ動物が産生され得ることが、初めて証明された。本発明は、ブタにおけるα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方の対立遺伝子の完全な不活化を提供し、それにより、この長期にわたる障害物を克服して異種移植を現実的にした。この遺伝子の発現を排除すると、細胞表面上でのガラクトースα−１，３−ガラクトースエピトープが欠如する。これは、ブタからヒトへの異種移植治療における超急性拒絶を排除する際の、最初の主要な段階を示す。本発明はまた、そのようなブタ動物に由来する器官、組織、および細胞を提供し、これらは、異種移植のために有用である。
【００３４】
本発明の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の対立遺伝子は、不活性にされ、その結果、生じるα−１，３−ＧＴ酵素は、もはや、細胞表面上にガラクトースα−１，３−ガラクトースを生成し得ない。一実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、ＲＮＡへと転写され得るが、タンパク質には翻訳され得ない。別の実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、不活性な短縮形態で転写され得る。そのような短縮型ＲＮＡは、翻訳されないかもしれないし、非機能的タンパク質へと翻訳されるかもしれない。別の実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、その遺伝子の転写が生じない様式で不活化され得る。さらなる実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、転写され得、その後、非機能的タンパク質へと翻訳され得る。
【００３５】
別の実施形態において、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠くブタは、ブタ異種移植において可能な遅延性拒絶機構および慢性拒絶機構を克服することを目的として現在開発中のアプローチのより明快な評価を提供するために有用である。
【００３６】
本発明の一局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の少なくとも一方の対立遺伝子が、遺伝子標的化事象を介して不活化されているブタ動物が、提供される。本発明の別の局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が、遺伝子標的化事象を介して不活化されているブタ動物が、提供される。上記遺伝子は、相同組換えを介して標的化され得る。他の実施形態において、上記遺伝子は、破壊され得る。すなわち、その遺伝コードの一部が変化され得、それにより、その遺伝子のその部分の転写および／または翻訳に影響が与えられ得る。例えば、遺伝子の破壊は、置換技術、欠失（「ノックアウト」）技術、または挿入（「ノックイン」）技術を介して、生じ得る。望ましいタンパク質のさらなる遺伝子、または既存の配列の転写を調節する調節配列が、挿入され得る。
【００３７】
α−１，３−ＧＴ遺伝子の２つの不活性対立遺伝子を保有するブタは、天然には存在しない。そのようなブタが発生する推定頻度は、１０−１０〜１０−１２の範囲であり、未だ同定されていない。
【００３８】
本発明の一局面として、α−１，３−ＧＴ遺伝子の第２の対立遺伝子を、遺伝子標的化事象を介してノックアウトすることを試みたのだが、その第２の対立遺伝子が不活性になる点変異が同定されたことが、驚くべきことに発見された。α−１，３−ＧＴ遺伝子中に点変異を保有するブタは、抗生物質耐性遺伝子を含まず、従って、ヒトでの使用のためにより安全な生成物を生成する能力を有する。従って、本発明の別の局面は、抗生物質耐性遺伝子も他の選択マーカー遺伝子も有さないホモ接合性α−１，３−ＧＴノックアウトである。一実施形態において、この点変異は、遺伝子標的化事象を介して生じ得る。別の実施形態において、この点変異は、天然に存在し得る。さらなる実施形態において、変異は、変異原性因子を介してα−１，３−ＧＴ遺伝子において誘導され得る。
【００３９】
他の具体的実施形態において、この点変異は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ変異であり得る（図２）。他の実施形態において、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも２０個の点変異が存在して、α−１，３−ＧＴ遺伝子を不活性にし得る。他の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも防止する点変異を含むブタが、提供される。具体的な実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子中のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ変異を含むブタが、提供される（図２）。
【００４０】
本発明の別の局面は、ブタ動物であり、このブタ動物において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されており、一方の対立遺伝子は、遺伝子標的化事象により不活化されており、もう一方の対立遺伝子は、点変異により不活化されている。一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されているブタ動物が提供され、一方の対立遺伝子は、遺伝子標的化事象により不活化されており、もう一方の対立遺伝子は、エキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異の存在に起因して不活化されている。具体的実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されているブタ動物が提供され、一方の対立遺伝子は、エキソン９に対して指向された標的化構築物（例えば、図６参照）を介して不活化されており、もう一方の対立遺伝子は、エキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異の存在に起因して不活化されている（図２）。例えば、標的化はまた、エキソン９および／またはエキソン４〜８に対してであり得る。
【００４１】
さらなる実施形態において、一方の対立遺伝子が、遺伝的標的化事象により不活化され、もう一方の対立遺伝子は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異の存在に起因して不活化される。具体的な実施形態において、一方の対立遺伝子が、エキソン９に対して指向された標的化構築物（例えば、図６参照）により不活化され、もう一方の対立遺伝子は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異の存在に起因して不活化される。別の実施形態において、そのようなブタをクローン化する方法は、卵母細胞を除核する工程；その卵母細胞を、機能的α１，３ＧＴの発現を欠くブタ細胞由来のドナー核と融合する工程；およびその核移入誘導胚を、代理母中に移植する工程を包含する。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αα−１，３−ＧＴ）のいかなる発現をも欠く生存可能なブタを産生するための方法を提供し、この方法は、α−１，３−ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性である雄のブタを、α−１，３−ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性である雌のブタと交配させる工程による。一実施形態において、そのブタは、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子の発現を防止するようにその一方の対立遺伝子が遺伝子改変されていることに起因して、ヘテロ接合性である。別の実施形態において、そのブタは、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子における点変異の存在に起因して、ヘテロ接合性である。別の実施形態において、その点変異は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異であり得る。具体的な一実施形態において、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠くブタ動物を産生するための方法が、提供され、この方法において、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇ点変異を含む雄のブタが、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇ点変異を含む雌のブタと交配されるか、あるいはその反対に、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇ点変異を含む雌のブタが、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇ点変異を含む雄のブタと交配される。
【００４３】
本発明の別の局面において、ブタ細胞が、その細胞表面上にガラクトースα−１，３−ガラクトースを発現するか否かを決定するための選択方法が、提供される。一実施形態において、その選択手順は、ガラクトースα−１，３−ガラクトースの発現を欠く細胞について選択するために、細菌毒素に基づき得る。別の実施形態において、細菌毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより産生される毒素Ａ）が、そのような細胞を選択するために使用され得る。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に対する曝露によって、このエピトープをその表面上に示す細胞の球体化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）が生じ得、プレートマトリックスからそれらの細胞が遊離され得る。酵素機能または酵素発現を無能にする標的化遺伝子ノックアウトおよび変異の両方が、この選択方法を使用して検出され得る。ガラクトースα−１，３−ガラクトースの細胞表面発現を欠く細胞（記載される毒素Ａ媒介性選択を使用して同定されるか、または遺伝子不活化の標準的方法（遺伝子標的化を含む）を使用して生成される）は、その後、機能的α−１，３−ＧＴの発現を欠くブタを生成するために使用され得る。
【００４４】
本発明の他の実施形態は、本発明の以下の説明、特許請求の範囲、当該分野で公知の知見を考慮すれば、当業者にとって明らかである。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠く、ブタ。
・（項目２）
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタの、器官。
・（項目３）
腎臓である、項目２に記載の器官。
・（項目４）
肝臓である、項目２に記載の器官。
・（項目５）
心臓である、項目２に記載の器官。
・（項目６）
肺である、項目２に記載の器官。
・（項目７）
膵臓である、項目２に記載の器官。
・（項目８）
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタの、組織。
・（項目９）
軟骨である、項目８に記載の組織。
・（項目１０）
骨である、項目８に記載の組織。
・（項目１１）
脂肪である、項目８に記載の組織。
・（項目１２）
筋肉である、項目８に記載の組織。
・（項目１３）
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタに由来する、細胞または細胞株。
・（項目１４）
膵臓に由来する、項目１３に記載の細胞。
・（項目１５）
ランゲルハンス島細胞である、項目１４に記載の細胞。
・（項目１６）
インスリン分泌細胞である、項目１４に記載の細胞。
・（項目１７）
機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタの産生のための方法であって、
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてヘテロ接合性である雄のブタを、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてヘテロ接合性である雌のブタと交配させる工程；
を包含する、方法。
・（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、一方または両方のブタは、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の一方の対立遺伝子の発現を防止するように当該一方の対立遺伝子が遺伝子改変されていることに起因して、ヘテロ接合性である、方法。
・（項目１９）
項目１７に記載の方法であって、一方または両方のブタは、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の対立遺伝子における点変異の存在に起因して、ヘテロ接合性である、方法。
・（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、上記点変異は、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異である、方法。
・（項目２１）
項目１７に記載の方法であって、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇ点変異を含む雄のブタが、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇ点変異を含む雌のブタと交配される、方法。
・（項目２２）
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損性非ヒト動物を産生するための方法であって、
（ａ）細胞集団を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａに対して曝露する工程；
（ｂ）表面マトリックスから盛り上がる細胞は、当該毒素Ａのレセプター媒介性細胞毒性に起因して当該毒素Ａにより有害に影響されるので、当該細胞を除去する工程；
（ｃ）レセプター媒介性細胞毒性の影響を示さない細胞を増殖させて維持する工程；
（ｄ）これらの毒素Ａ耐性細胞を、適切なレシピエント細胞中への核移植のための核ドナーとして使用する工程；
（ｅ）当該融合した活性化細胞を、雌代理母中に移植する工程；および
（ｆ）ｇａｌα１，３−ｇａｌエピトープの欠損または完全な欠如をその細胞表面において示すクローン化動物を産生する工程；
を包含する、方法。
・（項目２３）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、相同組換えによる一方の対立遺伝子の標的化ノックアウトを介して、上記ｇａｌα１，３対立遺伝子に関してヘテロ接合性にされている、方法。
・（項目２４）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、相同組換えによる両方の対立遺伝子の標的化ノックアウトを介して、上記ｇａｌα１，３対立遺伝子に関してヘテロ接合性にされている、方法。
・（項目２５）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を無能にする単一のｇａｌα１，３対立遺伝子の自然変異を介して、上記ｇａｌα１，３対立遺伝子に関してヘテロ接合性にされている、方法。
・（項目２６）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞は、相同組換えによる一方の対立遺伝子の標的化ノックアウトと第２の対立遺伝子の自然変異とにより作製された、α１，３ｇａｌダブルノックアウトを保有する、方法。
・（項目２７）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞が、上記ｇａｌα１，３対立遺伝子に関してホモ接合性にされており、これは、両方のｇａｌα１，３対立遺伝子の自然変異を介して達成されており、当該自然変異により、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が無能にされている、方法。
・（項目２８）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞は、相同組換えによる一方の対立遺伝子の標的化ノックアウトと、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を無能にする第２の対立遺伝子の自然変異とにより作製された、α１，３ｇａｌダブルノックアウトを保有する、方法。
・（項目２９）
項目２２に記載の方法であって、選択されるべき細胞は、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を無能にする両方の対立遺伝子の誘導性変異を介して、ｇａｌα１，３対立遺伝子に関してホモ接合性にされている、方法。
・（項目３０）
項目２２に記載の方法であって、選択のために使用される上記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａは、精製毒素の形態である、方法。
・（項目３１）
項目２２に記載の方法であって、選択のために使用される上記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａは、培養上清液の形態である、方法。
・（項目３２）
項目２２に記載の方法であって、上記精製毒素は、分散した細胞に適用され、当該分散した細胞は、その後、細胞接着のために適切な容器中でインビトロにて培養される、方法。
・（項目３３）
項目２２に記載の方法であって、上記精製毒素は、接着した細胞に適用される、方法。
・（項目３４）
項目２２に記載の方法であって、上記培養上清液は、分散した非接着細胞に適用され、その後、当該細胞は、細胞接着のために適切な容器中で培養される、方法。
・（項目３５）
項目２２に記載の方法であって、上記培養上清液が、適用される、方法。
・（項目３６）
項目２２に記載の方法であって、上記動物は、ブタである、方法。
・（項目３７）
項目２２に記載の方法であって、変異は、化学的変異、放射線、およびトランスポゾンからなる群より選択される変異原性因子により誘導される、方法。
・（項目３８）
項目２２に記載の方法であって、上記化学的変異は、ＥＭＳ、ＥＮＵ、マスタードガス、およびＩＣＲ１９１からなる群より選択される、方法。
・（項目３９）
項目２２に記載の方法であって、上記放射線は、紫外線、α線、β線、およびγ線からなる群より選択される、方法。
・（項目４０）
ｇａｌα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてのホモ接合性ノックアウトを保有する細胞であって、当該ホモ接合性ノックアウトにおいて、少なくとも一方の対立遺伝子が、ｇａｌα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子において自然変異または自然発生変異を含み、
当該細胞は、
（ａ）細胞集団を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａに対して曝露する工程；
（ｂ）当該毒素Ａのレセプター媒介性細胞毒性に起因して当該毒素Ａにより有害に影響される細胞を除去する工程；および
（ｃ）レセプター媒介性細胞毒性の影響を示さない細胞を増殖させて維持する工程；
を含む方法によって生成される、細胞。
・（項目４１）
項目４０に記載の細胞であって、当該細胞は、ｇａｌα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてのホモ接合性ノックアウトを保有し、当該ホモ接合性ノックアウトにおいて、少なくとも一方の対立遺伝子が、当該α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基４２４位においてチミン→グアニンの塩基置換を含み、これにより、ｇａｌα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質の１４２位において、チロシン→アスパラギン酸のアミノ酸置換が生じる、細胞。
・（項目４２）
項目４０に記載の細胞であって、当該細胞は、ｇａｌα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子についてのホモ接合性ノックアウトを保有し、当該ホモ接合性ノックアウトにおいて、少なくとも一方の対立遺伝子が、当該ｇａｌα−１，３−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子において誘導性変異を含む、細胞。
・（項目４３）
項目２２に記載の方法に従って産生された、動物。
・（項目４４）
項目４０に記載の細胞を核ドナーとして使用する核移入クローニングによって産生された、動物。
・（項目４５）
項目４１に記載の細胞を核ドナーとして使用する核移入クローニングによって産生された、動物。
・（項目４６）
項目４２に記載の細胞を核ドナーとして使用する核移入クローニングによって産生された、動物。
・（項目４７）
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目４２に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
・（項目４８）
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目４３に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
・（項目４９）
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目４４に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
・（項目５０）
レシピエントの細胞、組織または器官についてのインビボもしくはエキソビボでの補充または置換として使用するための、項目４５に記載の動物から得られる細胞、組織、および器官。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、胎仔６８０Ｂ１−４に由来する細胞に対する補体の相対的溶解効果を示すグラフである。
【図２】図２は、毒素Ａにより選択される点変異が存在するα−１，３−ＧＴ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３６１５２参照）のコード領域の短いセグメントを示す。上側の配列は、野生型中に存在する。下側の配列は、２番目の対立遺伝子における点変異に起因する変化を示す。
【図３】図３は、ウシα−１，３−ＧＴのＵＤＰ結合部位の３次元モデルの提示である。チロシン残基（前面、白色）の芳香環は、ＵＤＰのウラシル塩基（グレースケール）の近傍において観察され得る。
【図４】図４は、２００２年７月２５日生まれた、本発明の方法により産生されたホモ接合性α−１，３−ＧＴ欠損性クローンブタの写真である。
【図５】図５は、α−１，３−ＧＴノックアウト（ＫＯ）マウス中の仔ブタ島様細胞クラスター（ＩＣＣ）の注入前後の抗α−１，３−ｇａｌ  ＩｇＭレベルを示すグラフである。各マウスに、４日間にわたる腹腔内注射（１回の注射当たり２００〜５００ＩＣ）を介して、３回の連続ＩＣＣ注射を与えた。野生型（ＷＴ）仔ブタＩＣＣの３つすべてのレシピエントは、抗α−１，３−Ｇａｌ  ＩｇＭ力価の有意な上昇と、その後の、ＩＣＣ移植４週間後のベースラインへの回帰とを示した。α−１，３−ＧＴダブルノックアウト（ＤＫＯ）仔ブタＩＣＣを注射した３匹すべてのマウス由来の血清は、３５日間の観察時間の間に、抗α−１，３−ｇａｌ  ＩｇＭ力価の低いベースライン値を維持した（Ｐｈｅｌｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：４１１〜４１４，２００３、図Ｓ４）。
【図６】図６は、ブタα−１，３−ＧＴ遺伝子座（α−１，３−ＧＴノックアウトベクターにおける５’アームおよび３’アームとして使用し得るα−１，３−ＧＴゲノム配列に対応する）および相同組換え後の標的化遺伝子座の構造の図示である。３’ＰＣＲおよびロングレンジ（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）ＰＣＲのために使用されるプライマーの名前および位置が、短い矢印により示される。短いバーは、α−１，３−ＧＴサザンブロット分析のために使用されるプローブを示す。内因性α−１，３−ＧＴ遺伝子座およびα−１，３−ＧＴ標的化遺伝子座の両方についてのＢｓｔＥＩＩ消化したサザンバンドの推定サイズもまた、示される。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠く生存可能なブタ動物が、産生され得ることを、ここに証明した。本発明は、ブタにおけるα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方の対立遺伝子の完全な不活化を提供し、それにより、この長期にわたる障害物を克服し、異種移植を現実的にする。この遺伝子の発現を排除すると、細胞表面上でのガラクトースα−１，３−ガラクトースエピトープが欠如する。これは、ブタからヒトへの異種移植治療における超急性拒絶を排除する際の、最初の主要な段階を示す。本発明はまた、そのようなブタ動物に由来する器官、組織、および細胞を提供し、これらは、異種移植のために有用である。
・一局面において、本発明は、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠くブタから得られる、ブタの器官、組織および／または精製された細胞もしくは細胞株もしくは実質的な純粋な細胞もしくは細胞株を提供する。別の実施形態において、本発明は、異種移植のために有用な器官または組織を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、異種移植のために有用な細胞または細胞株を提供する。
【００４７】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「動物」（遺伝子改変（または遺伝子変化）動物におけるような）は、任意の非ヒト動物、特に任意の非ヒト哺乳動物（ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））、シカ、ラバ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類および昆虫が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。本発明の一実施形態において、遺伝子改変ブタおよびその産生方法が、提供される。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「器官（臓器）」とは、組織化された構造物であり、これは、１つ以上の組織から構成され得る。「器官（臓器）」とは、１つ以上の具体的な生物学的機能を実施する。器官（臓器）としては、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、甲状腺、および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「組織」とは、細胞と、その細胞を取り囲む細胞間物質とを含む、組織化された構造物である。「組織」は、単独で、または他の細胞もしくは組織と組み合わせて、１つ以上の生物学的機能を実施し得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」、「ブタ動物」、「ブタ（ｐｉｇ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」とは、性別にも、大きさにも、品種にも関わりなく、同じ型の動物を指す一般的な用語である。
【００５１】
（Ｉ．α−１，３−ＧＴ遺伝子の遺伝子標的化）
本発明の一局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子が、遺伝子標的化を介して不活化されている、ブタ動物が提供される。本発明の別の局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が、遺伝子標的化を介して不活化されている、ブタ動物が提供される。一実施形態において、上記遺伝子は、相同組換えを介して標的化され得る。他の実施形態において、上記遺伝子は、破壊され得る。すなわち、その遺伝コードの一部が変化され得、それにより、その遺伝子のその部分の転写および／または翻訳に影響が与えられ得る。例えば、遺伝子の破壊は、置換技術、欠失（「ノックアウト」）技術、または挿入（「ノックイン」）技術を介して、生じ得る。望ましいタンパク質のさらなる遺伝子、または既存の配列の転写を調節する調節配列が、挿入され得る。
【００５２】
本発明の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性になっており、その結果生じるα−１，３−ＧＴ酵素は、もはや、細胞表面上にガラクトースα−１，３−ガラクトースを生成し得ない。一実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、ＲＮＡへと転写され得るが、タンパク質には翻訳され得ない。別の実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、短縮形態で転写され得る。そのような短縮型ＲＮＡは、翻訳されないかもしれないし、非機能的タンパク質へと翻訳されるかもしれない。別の実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、その遺伝子の転写が生じない様式で不活化され得る。さらなる実施形態において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、転写され得、その後、非機能的タンパク質へと翻訳され得る。
【００５３】
α−１，３−ＧＴ遺伝子の２つの不活性対立遺伝子を保有するブタは、天然には存在しない。α−１，３−ＧＴ遺伝子の第２の対立遺伝子を、遺伝子標的化事象を介してノックアウトすることを試みたのだが、その第２の対立遺伝子が機能的α１，３ＧＴを生成するのを防ぐ点変異が同定されたことが、驚くべきことに発見された。
【００５４】
従って、本発明の別の局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子は、少なくとも１つの点変異を介して不活性にされ得る。一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子は、少なくとも１つの点変異を介して不活性にされ得る。別の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子は、少なくとも１つの点変異を介して不活性にされ得る。一実施形態において、この点変異は、遺伝子標的化事象を介して生じ得る。別の実施形態において、この点変異は、天然に存在し得る。さらなる実施形態において、変異は、変異原性因子を介してα−１，３−ＧＴ遺伝子において誘導され得る。
【００５５】
１つの具体的実施形態において、この点変異は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ変異であり得る（図２）。α−１，３−ＧＴ遺伝子中に天然に存在する点変異を保有するブタは、抗生物質耐性遺伝子を含まないα−１，３−ＧＴ欠損ブタの産生を可能にし、従って、ヒトでの使用のためにより安全な生成物を生成する能力を有する。他の実施形態において、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも２０個の点変異が存在して、α−１，３−ＧＴ遺伝子を不活性にし得る。他の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも防止する点変異を含むブタが、提供される。具体的な実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子中のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ変異を含むブタが、提供される（図２）。
【００５６】
本発明の別の局面は、ブタ動物を提供し、このブタ動物において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されており、一方の対立遺伝子は、遺伝子標的化事象により不活化されており、もう一方の対立遺伝子は、変異により不活化されている。一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されているブタ動物が提供され、一方の対立遺伝子は、遺伝子標的化事象により不活化されており、もう一方の対立遺伝子は、エキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異の存在に起因して不活化されている。具体的実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されているブタ動物が提供され、一方の対立遺伝子は、エキソン９に対して指向された標的化構築物（例えば、図６参照）を介して不活化されており、もう一方の対立遺伝子は、エキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇ点変異の存在に起因して不活化されている。
【００５７】
（ブタ細胞の型）
遺伝子改変され得るブタ細胞は、種々の異なる器官および組織から得られ得る。その器官および組織は、例えば、以下であるが、これらに限定されない：皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器官、ならびに胚、胎児もしくは成体動物の全体もしくは一部の分解（disaggregated）調製物。本発明の一実施形態において、ブタ細胞は、以下からなる群（これらに限定されない）より選択され得る：上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、その他の筋細胞、肉芽腫細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血球、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆体細胞、神経幹細胞、始原幹細胞，肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、毛細血管内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップファー細胞、平滑筋細胞、シュヴァン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵臓島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球細胞、白血球細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディヒ細胞、管周細胞、セルトーリ細胞、黄体細胞、子宮頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、卵胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞。
【００５８】
別の一実施形態において、胚性幹細胞が、使用され得る。胚性幹細胞株が、使用され得るか、または胚性幹細胞が、宿主（例えば、ブタ動物）から新たに得られ得る。この細胞は、適切な線維芽細胞フィーダー層において増殖され得るか、または白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖され得る。好ましい実施形態において、上記ブタ細胞は、線維芽細胞であり得る。具体的実施形態において、上記ブタ細胞は、胎児線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、好ましい体細胞型である。なぜなら、この細胞は、発生中の胎児および成体動物から大量に得られ得るからである。これらの細胞は、迅速な倍加時間でインビトロにて容易に増殖され得、そして遺伝子標的化手順において使用するためにクローン的に増殖され得る。
【００５９】
（標的化構築物）
（相同組換え）
相同組換えにより、内因性遺伝子の部位特異的改変が可能になり、従って、新規な変化が、ゲノム中に操作され得る。相同組換えにおいて、入って来るＤＮＡが、実質的に相同なＤＮＡ配列を含むゲノム部位と相互作用してその部位中に組み込む。非相同（「ランダム」または「不法（ｉｌｌｉｃｉｔ）」組み込みにおいて、この入って来るＤＮＡは、そのゲノム中の相同性配列においては見出されないが、多数の可能な位置のうちの１つにおいて、どこででも組み込む。一般に、高等真核細胞を用いる研究により、相同組換えの頻度は、ランダム組み込みの頻度より遥かに小さいことが、明らかになっている。これらの頻度の比率は、「遺伝子標的化」についての直接的関係を有し、これは、相同組換え（すなわち、内因性「標的化ＤＮＡ」と、ゲノム中の対応する「標的ＤＮＡ」との間の組換え）を介する組み込みに依存する。
【００６０】
多数の論文が、哺乳動物細胞における相同組換えの使用を記載する。これらの論文の例示は、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３１５３−３１５７，１９８４；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５：７１４−７２０，１９８５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０−２３４，１９８５；Ｗａｋｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：２０８０−２０８９，１９８５；Ａｙａｒｅｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１１：３７５−３８８，１９８５；Ａｙａｒｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．７：１６５６−１６６２，１９８６；Ｓｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８２０−６８２４，１９８７；Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２，１９８７；Ｎａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３８４５−３８４９，１９８８；ａｎｄ  Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２，１９８８．ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：１４６−１５４，１９８１；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６−５７８，１９８７；ＴｈｏｍａおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２，４９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５６：３１６−３２１，１９８９である。
【００６１】
本発明は、細胞（例えば、上記のブタ細胞）におけるα−１，３−ＧＴ遺伝子を不活化するために相同組換えを使用する。このＤＮＡは、ネイティブ遺伝子の少なくとも１コピー（必要に応じて両方のコピー）中に、機能的α−１，３−ＧＴの発現を防止するように変化が導入された、上記遺伝子の少なくとも一部を特定の遺伝子座に含み得る。この変化は、挿入、欠失、置換、またはその組み合わせであり得る。その変化が、不活化されている遺伝子の１コピーのみに導入される場合、標的遺伝子の単一の非変異コピーを有する細胞が、増幅され、第２の標的化工程に供され得、この第２標的化工程において、上記変化は、第１変化と同じであっても異なっていてもよく、通常は異なり、欠失または置換が関与する場合には、元々導入された変化の少なくとも一部と重複し得る。この第２の標的化工程において、同じ相同性アームを有するが異なる哺乳動物選択マーカーを含む標的化ベクターが、使用され得る。生じる形質転換体は、機能的標的抗原が存在しないことについてスクリーニングされ、そしてその細胞のＤＮＡは、野生型遺伝子が存在しないことを確実にするためにさらにスクリーニングされ得る。あるいは、表現型に関するホモ接合性が、上記変異についてヘテロ接合性である宿主を交配することによって、達成され得る。
【００６２】
（標的化ベクター）
細胞の標的化遺伝子座の改変は、その細胞中にＤＮＡを導入することによって作製され得、そのＤＮＡは、標的遺伝子座に対する相同性を有し、マーカー遺伝子を含み、これにより、組み込まれた構築物を含む細胞の選択が可能になる。この標的ベクター中の相同性ＤＮＡは、標的遺伝子座において染色体ＤＮＡと組換わる。そのマーカー遺伝子は、両側で、相同性ＤＮＡ配列、３’組換えアーム、および５’組換えアームと隣接し得る。標的化ベクターを構築するための方法は、当該分野で、例えば、Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５，２００２；ＷＯ  ００／５１４２４の図６において記載されている。
【００６３】
種々の構築物が、標的遺伝子座における相同組換えのために調製され得る。この構築物は、標的遺伝子座と相同な少なくとも５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、ｌｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐまたは５０ｋｂｐの配列を含み得る。この配列は、ブタα−１，３−ＧＴ遺伝子の任意の連続配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３６１５２，Ｗ００１３０９９２（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎに対する）；ＷＯ０１／１２３５４１（Ａｌｅｘｉｏｎ，Ｉｎｃ．に対する）参照のこと）を含み得る。
【００６４】
種々の考慮事項が、標的ＤＮＡ配列の相同性の程度を決定する際に関与し得、それは例えば、標的遺伝子座の大きさ、配列の利用可能性、標的遺伝子座におけるダブルクロスオーバー事象の相対的効率、および他の配列とその標的配列との類似性である。
【００６５】
その標的化ＤＮＡは、実質的に同系であるＤＮＡが、改変されるべきゲノム中の対応標的配列を伴う望ましい配列改変と隣接している、配列を含み得る。その実質的に同系の配列は、対応標的配列と少なくとも約９５％、少なくとも約９７〜約９８％、少なくとも約９９．０〜約９９．５％、少なくとも約９９．６％〜約９９．９％または少なくとも約１００％同一であり得る（望ましい配列改変を除く）。その標的化ＤＮＡと標的ＤＮＡとは、１００％同一である少なくとも約７５塩基対、少なくとも約１５０塩基対、または少なくとも約５００塩基対のＤＮＡストレッチを好ましくは共有し得る。従って、標的化ＤＮＡは、標的化される細胞株と近縁の細胞に由来し得るか、または標的化ＤＮＡは、標的化される細胞と同じ細胞株もしくは動物の細胞に由来し得る。
【００６６】
そのＤＮＡ構築物は、内因性の標的α−１，３−ＧＴを改変するように設計され得る。その構築物を標的化するための相同性配列は、１つ以上の欠失、挿入、置換、またはそれらの組み合わせを有し得る。その変化は、標的遺伝子の上流配列と読み取り枠で融合した選
択マーカー遺伝子の挿入であり得る。
【００６７】
適切な選択マーカー遺伝子としては、特定の培地基質において増殖する能力を付与する遺伝子（例えば、ｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）またはｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）（これは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）において増殖する能力を付与する）；細菌ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）（これは、ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸、アデニン、およびキサンチン）における増殖を可能にする））が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｏｎｇ，Ｋ−Ｙ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６８２０−６８２４（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ  １６参照のこと。選択マーカーの他の例としては、抗生物質などの化合物に対する耐性を付与する遺伝子、選択された基質において増殖する能力を付与する遺伝子、検出可能なシグナル（例えば、発光）を生成するタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））をコードする遺伝子が挙げられる。広範な種類のそのようなマーカーが、公知であり、かつ利用可能である。それらとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．およびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））；ならびにハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：６８９５−６９１１（１９８３）およびＴｅ  Ｒｉｅｌｅ，Ｈ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６４９−６５１（１９９０））が挙げられる。他の選択マーカー遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン（ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ）、メトトレキサート、ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与する、複数の選択マーカーが利用可能である。
【００６８】
抗生物質耐性遺伝子およびネガティブ選択因子を組み込むための方法には、当業者は精通している（例えば、ＷＯ  ９９／１５６５０；米国特許第６，０８０，５７６号；米国特許第６，１３６，５６６号；Ｎｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３４３−３４９（１９９３）；およびＹｏｓｈｉｄａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４：２７７−２８７（１９９５））を参照のこと）。
【００６９】
（表１：検出可能なシグナルを発する選択マーカー）
【００７０】
【表１−１】
2011015697.tif 000003
【００７１】
【表１−２】
2011015697.tif 000004
【００７２】
【表１−３】
2011015697.tif 000005
【００７３】
【表１−４】
2011015697.tif 000006
【００７４】
【表１−５】
2011015697.tif 000007
選択マーカーの組み合わせもまた、使用され得る。例えば、標的α−１，３−ＧＴに、ｎｅｏ遺伝子（上記で考察されるように、それ自体のプロモーターを含むかまたは含まない）が、α−１，３−ＧＴに対して相同性であるＤＮＡ配列中にクローン化され得る。マーカーの組み合わせを使用するために、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、この遺伝子が標的化ＤＮＡの外側にあるようにクローン化され得る（別の選択マーカーが、望ましい場合には、反対側に配置され得る）。標的化されるべき細胞中にそのＤＮＡ構築物を導入した後、その細胞は、適切な抗生物質上で選択され得る。この特定の場合において、Ｇ４１８およびガンシクロビルに対して耐性である細胞が、ｎｅｏ遺伝子がα−１，３−ＧＴ遺伝子中に組み換えられたがｔｋ遺伝子が失われた相同組換えにより生じた可能性が最も高い。なぜなら、ｔｋ遺伝子は、このダブルクロスオーバーの領域の外側に位置したからである。
【００７５】
欠失は、少なくとも約５０ｂｐであり得、より通常には、少なくとも１００ｂｐ、一般的には、約２０ｋｂｐ以下であり得、その欠失は、通常は、１つ以上のエキソンの一部、１つ以上のイントロンの一部を含む、コード領域の少なくとも一部を含み、そして隣接非コード領域（特に、５’非コード領域（転写調節領域））の一部を含んでも含まなくてもよい。従って、その相同性領域は、上記コード領域を越えて５’非コード領域あるいは３’非コード領域中にまで広がり得る。挿入は、一般的には、１０ｋｂｐを超えず、通常は、５ｋｂｐを超えず、一般的には、少なくとも５０ｂｐであり、より通常には少なくとも２００ｂｐであり得る。
【００７６】
相同性の領域は、変異を含み得、その変異は、標的遺伝子をさらに不活化して、フレームシフトを提供するかもしくは重要なアミノ酸を変化し得るか、またはその変異は、機能不全対立遺伝子を矯正し得るなどである。その変異は、相同性隣接配列の微妙な変化（約５％を超えない）であり得る。遺伝子の変異が望ましい場合、そのマーカー遺伝子は、イントロンまたはエキソン中に挿入され得る。
【００７７】
その構築物は、当該分野で公知である方法に従って調製され得、種々のフラグメントが一緒にされ、適切なベクター中に導入され、クローン化され、分析され、その後、望ましい構築物が達成されるまでさらに操作され得る。種々の改変が、その配列になされて、制限分析、切り出し、プローブの同定などが可能になり得る。サイレント変異が、望ましい場合に導入され得る。種々の段階において、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅、プライマー修復、インビトロ変異誘発などが、使用され得る。
【００７８】
その構築物は、細菌ベクター（原核生物複製系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにより認識可能な起点）を含む）を使用して調製され得、各段階にて、その構築物は、クローン化され分析され得る。マーカー（これは、挿入のために使用されるマーカーと同じであるかまたは異なる）が、使用され得、このマーカーは、標的細胞中に導入する前に除去され得る。一旦、この構築物を含むベクターが完成すると、このベクターは、例えば、細菌配列の欠失、線状化、相同性配列中での短い欠失の導入によって、さらに操作され得る。最終的操作の後、この構築物は、上記細胞中に導入され得る。
【００７９】
本発明は、α−１，３−ＧＴ遺伝子の配列を含む組換え構築物をさらに含む。この構築物は、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含み、そのベクター中に、本発明の配列が、順方向または逆方向に挿入されている。この構築物はまた、上記配列に作動可能に連結された、調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者にとって公知であり、そして市販されている。以下のベクターが、例として提供される。細菌ベクター：ｐＢｓ，ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ），ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，ＰｓｉＸ１７４，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ，ｐＢｓＫＳ，ｐＮＨ８ａ，ｐＮＨ１６ａ，ｐＮＨ１８ａ，ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物ベクター：ｐＷＬｎｅｏ，ｐＳｖ２ｃａｔ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴｌ，ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）  ｐＳＶＫ３，ｐＢＰｖ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）；ウイルス起源ベクター（Ｍ１３ベクター、細菌ファージ１ベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、高コピー数ベクター、低コピー数ベクター、および調節可能なコピー数のベクター、単一宿主において組み合わせて使用するために適合性レプリコンを有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）、ならびに真核生物エピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）。他のベクターとしては、以下が挙げられる：原核生物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ  ＩＩ，ｐＳＬ３０１，ｐＳＥ２８０，ｐＳＥ３８０，ｐＳＥ４２０，ｐＴｒｃＨｉｓＡ，Ｂ，およびＣ；ｐＲＳＥＴ  Ａ，Ｂ，およびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．），ｐＧＥＭＥＸ−ｌ，およびｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．），ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＧＥＸベクター，ｐＥＺＺ１８，ｐＲＩＴ２Ｔ，およびｐＭＣ１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．），ｐＫＫ２３３−２およびｐＫＫ３８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．），およびｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ならびにそれらの改変体および誘導体。他のベクターとしては、以下が挙げられる：真核生物発現ベクター（例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ，ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ，ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ，ｐＳＦＶ，およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＥＵＫ−Ｃｌ，ｐＰＵＲ，ｐＭＡＭ，ｐＭＡＭｎｅｏ，ｐＢＩ１０１，ｐＢＩ１２１，ｐＤＲ２，ｐＣＭＶＥＢＮＡ，およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＳＶＫ３，ｐＳＶＬ，ｐＭＳＧ，ｐＣＨ１１０，およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．），ｐ３’ＳＳ，ｐＸＴｌ，ｐＳＧ５，ｐＰｂａｃ，ｐＭｂａｃ，ｐＭＣｌｎｅｏ，ａｎｄ  ｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．），およびｐＹＥＳ２，ｐＡＣ３６０；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ  Ａ，Ｂ，およびＣ；ｐＶＬ１３９２，ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤＮＡ１，ｐＺｅｏＳＶ，ｐｃＤＮＡ３  ｐＲＥＰ４，ｐＣＥＰ４，およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉ��ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ならびにそれらの改変体および誘導体。使用され得るさらなるベクターとしては、以下が挙げられる：ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ，ｐＳＰＯＲＴ，コスミド、ファージミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＩ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ），ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ，ｐＮＨ１６Ａ，ｐＮＨ１８Ａ，ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＧＥＸ，ｐＴｒｓｆｕｓ，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＥＴ−５，ｐＥＴ−９，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＳＰＯＲＴ１，ｐＳＰＯＲＴ２，ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＴｈｉｏＨｉｓ，ｐＬＥＸ，ｐＴｒｃＨｉｓ，ｐＴｒｃＨｉｓ２，ｐＲＳＥＴ，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２，ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ，ｐｃＤＮＡ３．１（−）  ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ，ｐＳｅｃＴａｇ，ｐＥＢＶＨｉｓ，ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＰＩＣ３．５Ｋ，ｐＡ０８１５，ｐＰＩＣＺ，ＰＰＩＣＺ□，ＰＧＡＰＺ，ＰＧＡＰＺ□，ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２，ｐＭｅｌＢａｃ，ｐＳｉｎＲｅｐ５，ｐＳｉｎＨｉｓ，ｐＩＮＤ，ｐＩＮＤ（ＳＰｌ），ｐＶｇＲＸＲ，ｐｃＤＮＡ２．１，ｐＹＥＳ２，ｐＺＥｒＯｌ．１，ｐＺＥｒＯ−２．１，ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ，ｐＳＥ２８０，ｐＳＥ３８０，ｐＳＥ４２０，ｐＶＬ１３９２，ｐＶＬ１３９３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤＮＡｌ．ｌ，ｐｃＤＮＡｌ．ｌ／Ａｍｐ，ｐｃＤＮＡ３．１，ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ，ｐＳｅ，ＳＶ２，ｐＲｃ／ＣＭＶ２，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐＲＥＰ４，ｐＲＥＰ７，ｐＲＥＰ８，ｐＲＥＰ９，ｐＲＥＰ  １０，ｐＣＥＰ４，ｐＥＢＶＨｉｓ，ｐＣＲ３．１，ｐＣＲ２．１，ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ，およびｐＣＲＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）；□  ＥｘＣｅｌｌ，□  ｇｔｌｌ，ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＧＥＸ−１□Ｔ，ｐＧＥＸ−２Ｔ，ｐＧＥＸ−２ＴＫ，ｐＧＥＸ−４Ｔ−１，ｐＧＥＸ−４Ｔ−２，ｐＧＥＸ−４Ｔ−３，ｐＧＥＸ−３Ｘ，ｐＧＥＸ−５Ｘ−１，ｐＧＥＸ−５Ｘ−２，ｐＧＥＸ−５Ｘ−３，ｐｌｉＺＺ１８，ｐＲＩＴ２Ｔ，ｐＭＣ１８７１，ｐＳＶＫ３，ｐＳＶＬ，ｐＭＳＧ，ｐＣＨ１１０，ｐＫＫ２３２−８，ｐＳＬ１１８０，ｐＮＥＯおよび  ＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから）；ｐＳＣＲＥＥＮ−ｌｂ（＋），ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ），ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２，ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋），ｐＯＣＵＳ−２，ｐＴＡｇ，ｐＥＴ−３２ＬＩＣ，ｐＥＴ−３０ＬＩＣ，ｐＢＡＣ−２ｃｐ  ＬＩＣ，ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ  ＬＩＣ，ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  ＬＩＣ，ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２，□ＳＣＲＥＥＮ−１，□ＢｌｕｅＳＴＡＲ，ｐＥＴ−３ａｂｃｄ，ｐＥＴ−７ａｂｃ，ｐＥＴ９ａｂｃｄ，ｐＥＴ１１ａｂｃｄ，ｐＥＴ１２ａｂｃ，ｐＥＴ−１４ｂ，ｐＥＴ−１５ｂ，ｐＥＴ−１６ｂ，ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ，ｐＥＴ−１９ｂ，ｐＥＴ−２０ｂ（＋），ｐＥ��−２１ａｂｃｄ（＋），ｐＥＴ−２２ｂ（＋），ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋），ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋），ｐＥＴ−２５ｂ（＋），ｐＥＴ−２６ｂ（＋），ｐＥＴ−２７ｂ（＋），ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋），ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋），ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋），ｐＥＴ−３１ｂ（＋），ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋），ｐＥＴ−３３ｂ（＋），ｐＢＡＣ−１，ｐＢＡＣｇｕｓ−１，ｐＢＡＣ４ｘ−１，ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１，ｐＢＡＣ−３ｃｐ，ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ，ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１，ｐｌｇ，Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ，ｐＹＸ，Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ，Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−ＨｙｇおよびＳｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ（Ｎｏｖａｇｅｎから）；ｐＬｅｘＡ，ｐＢ４２ＡＤ，ｐＧＢＴ９，ｐＡＳ２−１，ｐＧＡＤ４２４，ｐＡＣＴ２，ｐＧＡＤ  ＧＬ，ｐＧＡＤ  ＧＨ，ｐＧＡＤ１０，ｐＧｉｌｄａ，ｐＥＺＭ３，ｐＥＧＦＰ，ｐＥＧＦＰ−１，ｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ，ｐＥＢＦＰ，ｐＧＦＰｕｖ，ｐＧＦＰ，ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ，ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ，ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ，ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ，ｐｌＧｇａｌ−Ｂａｓｉｃ，ｐ［ｌｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｐＵｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｐＧｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ，ｐＣＭＶＤ，ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ，ｐＴｅｔ−Ｏｎ，ｐＴＫ−Ｈｙｇ，ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ，ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ，ｐＩＲＥＳｌｎｅｏ，ｐＩＲＥＳｌｈｙｇ，ｐＬＸＳＮ，ｐＬＮＣＸ，ｐＬＡＰＳＮ，ｐＭＡＭｎｅｏ，ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ，ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ，ｐＰＵＲ，ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３，ｐＹＥＸ−Ｓｌ，ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ，ｐＢａｃＰＡＫ８／９，ｐＡｃＵＷ３１，ＢａｃＰＡＫ６，ｐＴｒｉｐｌＥｘ，ｐＲＳ４０４，ｐＲＳ４０５，ｐＲＳ４０６，ｐＲＳ４１３，ｐＲＳ４１４，ｐＲＳ４１５，およびｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから）、ならびにそれらの改変体および誘導体。ツーハイブリッドベクターおよび逆ツーハイブリッドベクター（ｐＰＣ８６，ｐＤＢＬｅｕ，ｐＤＢＴｒｐ，ｐＰＣ９７，ｐ２．５，ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐＬａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、ならびにそれらの改変体または誘導体）もまた、使用され得る。他の任意のプラスミドおよびベクターが、宿主において複製可能でありかつ生存可能である限りにおいては、使用され得る。
【００８０】
上記ＤＮＡ構築物が宿主細胞中に侵入するのを可能にするために使用され得る技術としては、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、核中へのＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、または当業者に公知の他の任意の技術が挙げられる。このＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡであっても、二本鎖ＤＮＡであっても、線状ＤＮＡであっても環状ＤＮＡであっても、弛緩型ＤＮＡであってもスーパーコイル状ＤＮＡであってもよい。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術については、例えば、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ．５２７｜５３７（１９９０）を参照のこと。
【００８１】
具体的な一実施形態において、ヘテロ接合性ノックアウト細胞が、同系ＤＮＡから単離したα−１，３−ＧＴ配列を含むノックアウトベクターを用いて、初代ブタ胎仔線維芽細胞をトランスフェクションすることによって、生成され得る。Ｄａｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：４５１〜４５５）に記載されるように、５’アームは、４．９ｋｂであり得、イントロン８の大きなフラグメントと、エキソン９の５’末端から構成され得る。その３’アームは、エキソン９配列であり得、そしてエキソン９配列を含み得る。そのベクターは、プロモーター捕捉ストラテジーを、例えば、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を使用して組み込んで、Ｎｅｏｒ遺伝子の翻訳を開始し得る（例えば、図６参照）。
【００８２】
（相同組み換えした細胞の選択）
その後、上記細胞は、適切な組換え体を提供する細胞を同定するために、適切に選択された培地中で増殖され得る。α−１，３−ＧＴ遺伝子中に挿入された選択マーカー遺伝子の存在は、宿主ゲノム中への上記標的構築物の組み込みを確立する。その後、望ましい表現型を示す細胞が、相同組み換えまたは非相同組み換えが生じたか否かを確立するために、ＤＮＡを分析するための制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによりさらに分析され得る。これは、上記挿入物のプローブを使用すること、その後、その挿入物に隣接する５’領域および３’領域を、上記構築物の隣接領域を越えて広がるα−１，３−ＧＴ遺伝子の存在について配列決定すること、または欠失の存在（そのような欠失が導入された場合には）を同定することによって、決定され得る。上記構築物内の配列と相補的でありかつ上記構築物の外側および標的遺伝子座にある配列と相補的である、プライマーもまた使用され得る。この様式で、相同組み換えが生じた場合には、相補鎖中に存在するプライマーの両方を有するＤＮＡ二重鎖のみを獲得し得る。上記プライマー配列または予測されるサイズの配列の存在を示すことによって、相同組み換えの発生が、支持される。
【００８３】
相同組み換え事象をスクリーニングするために使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、当該分野で公知である。例えば、ＫｉｍおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３，１９８８；ならびにＪｏｙｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５３−１５６，１９８９．を参照のこと。変異体ポリオーマエンハンサーと、ネオマイシン遺伝子を駆動するためのチミジンキナーゼプロモーターとの特異的組み合わせは、胚性幹細胞およびＥＣ細胞の両方において活性であることが、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（前出），１９８７；ＮｉｃｈｏｌａｓおよびＢｅｒｇ（１９８３）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，Ｓｉｖｅｒ，ＭａｒｔｉｎおよびＳｔｒｉｋｌａｎｄ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（ｐｐ．４６９−４９７）；ならびにＬｉｎｎｅｙおよびＤｏｎｅｒｌｙ，Ｃｅｌｌ  ３５：６９３−６９９，１９８３によって、示された。
【００８４】
第１回の標的化から得られる細胞株は、標的化対立遺伝子についてヘテロ接合性である可能性がある。両方の対立遺伝子が改変されているホモ接合性は、多数の方法で達成され得る。１つのアプローチは、１コピーが改変されている多数の細胞を増殖させること、その後、これらの細胞を、さらにもう１回、異なる選択マーカーを使用する標的化に供することである。あるいは、ホモ接合性は、改変された対立遺伝子についてヘテロ接合性である動物を、伝統的メンデル遺伝学に従って交配することによって、獲得され得る。いくつかの状況において、２つの異なる改変対立遺伝子を有することが、望ましくあり得る。これは、連続回の遺伝子標的化によってか、またはヘテロ接合体（その各々が、望ましい改変対立遺伝子のうちの一方を保有する）を交配することによって、達成され得る。
【００８５】
（α−１，３−ＧＴ遺伝子座において誘導された変異）
他の特定の実施形態において、本発明の方法は、変異原性因子を介する変異の意図的導入を包含する。当該分野で公知であり、本発明における使用のために適切な、変異原性因子の例としては、化学的変異原（例えば、ＤＮＡインターカレート剤、またはＤＮＡ結合化学物質（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、マスタードガス、ＩＣＲ１９１など））（例えば、Ｅ．Ｃ．Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｓｉｅｄｅ，ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ（１９９５）参照）、物理的変異原（例えば、紫外線、放射線、Ｘ線）、生化学的変異原（例えば、制限酵素、ＤＮＡ修復変異原、ＤＮＡ修復インヒビター、およびエラープローンＤＮＡポリメラーゼおよび複製タンパク質）、ならびにトランスポゾン挿入が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法に従って、培養中の細胞が、これらの因子のうちの１つに曝露され得、細胞表面上でのガラクトシダーゼα−１，３−ガラクトースの除去をもたらす任意の変異が、例えば、毒素Ａに対する曝露を介して、選択され得る。
【００８６】
細胞において変異を誘導するための化学的変異原の好ましい用量は、当該分野で公知であるか、または当該分野で公知の変異誘発アッセイを使用して当業者により容易に決定され得る。インビトロでの細胞の化学的変異誘発は、上記細胞を種々の用量の上記変異原性因子で処理すること、および／または上記因子に対する曝露時間を制御することによって、達成され得る。上記変異原性因子の曝露および／または用量を力価測定することによって、意図した目的のために最適な程度の変異誘発を実行し、それによって、各標的細胞において望ましい数の遺伝子を変異させることが、可能である。例えば、有用なＥＮＵ用量は、約１〜約２時間の間に０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．４ｍｇ／ｍｌであり得る。別の例において、有用なＥＭＳ用量は、約１０〜約３０時間の間に、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり得る。さらに、より低用量および高用量、ならびにより長い曝露時間およびより短い曝露時間もまた、望ましい変異頻度を達成するために使用され得る。
【００８７】
（ＩＩ．機能的α−１，３−ＧＴを発現しない細胞の同定）
本発明の別の局面において、ブタ細胞が機能的α−１，３−ＧＴの発現を欠くか否かを決定するための選択方法が、提供される。
【００８８】
一実施形態において、上記選択手順は、機能的α−１，３−ＧＴの発現を欠く細胞を選択するために、細菌毒素に基づき得る。別の実施形態において、上記細菌毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより産生される毒素Ａ）が、細胞表面エピトープのガラクトースα−１，３−ガラクトースを欠く細胞を選択するために使用され得る。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に対する曝露によって、このエピトープをその表面上に示す細胞の球体化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）が生じ得、プレートマトリックスからそれらの細胞が遊離され得る。酵素機能または酵素発現を無能にする標的化遺伝子ノックアウトおよび変異の両方が、この選択方法を使用して検出され得る。ガラクトースα−１，３−ガラクトースエピトープの細胞表面発現を欠く細胞（記載される毒素Ａ媒介性選択を使用して同定されるか、または遺伝子不活化の標準的方法（遺伝子標的化を含む）を使用して生成される）は、その後、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性であるブタを生成するために使用され得る。
【００８９】
一実施形態において、上記選択方法は、α−１，３−ＧＴエピトープの欠如を直接検出し得、これは、その欠如が、相同組み換えによるα−１，３−ＧＴ遺伝子の標的化ノックアウトに起因するか、非機能的酵素または非発現酵素を生じる遺伝子変異に起因するかに関わらない。抗生物質耐性を介する選択は、スクリーニングのために最も一般的に使用されている（上記参照）。この方法は、標的化ベクター上での上記耐性遺伝子の存在を検出し得るが、組み込みが標的化組換え事象であったかまたはランダム組換えであったかは、直接には示さない。特定の技術（例えば、ポリＡおよびプロモーター捕捉技術）は、標的化事象の確率を増加するが、これもまた、望ましい表現型（細胞表面上のｇａｌα−１，３−ｇａｌエピトープが欠損している細胞）が達成されたという直接の証拠は提供しない。さらに、ネガティブな選択形態が、標的化組み込みについて選択するために使用され得る。これらの場合、その細胞に対して致死性の因子の遺伝子が、標的化事象だけが唯一その細胞を死から回避させ得る様式で挿入される。その後、これらの方法により選択された細胞が、遺伝子破壊、ベクター組み込み、そして最終的には、α−１，３−ｇａｌエピトープ欠如についてアッセイされ得る。これらの場合、その選択は、標的化ベクター組み込みが検出されること、および変化した表現型では検出されないことに基づき、標的化ノックアウト（点変異ではない）、遺伝子の再配置もしくは遺伝子短縮、または他のそのような改変だけが、検出され得る。
【００９０】
毒素Ａ（細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより産生される細胞毒素）は、末端糖質のガラクトースα１，３−ガラクトース配列であるｇａｌα１−３ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃに特異的に結合する。このレセプターに対する結合は、細胞上での細胞傷害性効果を媒介し、細胞を形態変化させ、いくつかの場合には、細胞をプレートマトリックスから遊離させる。制御された条件下では、このマーカーを保有しない細胞は、上記毒素により影響されない。従って、一実施形態において、α１，３ｇａｌエピトープが、ｇａｌα−１，３−ＧＴ遺伝子座の標的化ノックアウトまたは遺伝子変異を介して首尾良く除去されたか否かを決定するために、上記エピトープを保有しない細胞が、選択され得る。毒素Ａに対する曝露は、上記エピトープを保有する細胞について毒性であり得、上記遺伝子が首尾良く不活化された細胞についての選択を促進する。従って、本発明の一局面に従って、ｇａｌα１，３遺伝子座においてノックアウトされたかまたは変異された遺伝子改変動物（例えば、ブタ）の産生のための核ドナーとして有用な細胞が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａに対して細胞を曝露することによって、選択される。
【００９１】
毒素Ａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより産生される２つの細胞毒素のうちの１つ）は、種々の細胞型の表面上に見出されるガラクトースα１，３−ガラクトース配列であるｇａｌα１，３−ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮａｃについて高い結合親和性を有する（Ｃｌａｒｋら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５７（１）  ：２１７−２２９，１９８７）。この糖質は、毒素Ａについての機能的レセプターとして作用するようである。なぜなら、このエピトープを細胞表面上に提示する細胞は、このレセプターを欠く細胞よりも毒素Ａの細胞毒性効果に対して感受性であるからである。培養中で毒素Ａに対して曝露された感受性細胞は、おそらくはアクチン脱重合およびその結果生じる細胞骨格完全性の変化に起因して、細胞の球体化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）を示す（Ｋｕｓｈｎａｒｙｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５−１７７６２（１９８８）  ａｎｄ  Ｊｕｓｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１０２６−１０３１，１９９５）。これらの細胞は、その培養物から選択的に除去され得る。なぜなら、これらの細胞は、マトリックスから持ち上がり、懸濁物中で浮遊しており、影響されない細胞が、プレート表面に堅く結合したままになるからである。
【００９２】
毒素Ａに対する細胞の曝露。一実施形態において、付着した細胞は、細胞培養培地の構成成分としての毒素Ａに曝露される。固定した曝露時間の後、毒素Ａを含む培地、および放出された毒素Ａに感受性の細胞が、除去され、プレートが洗浄され、毒素Ａを含まない培地が、補充される。毒素Ａに対する曝露は、一定日数にわたって反復されて、付着した毒素感受性の細胞がプレートから除去され、非感受性細胞が増殖拡大するのが可能になる。精製毒素Ａが、本発明の方法において使用され得る（市販されており、例えば、Ｔｅｃｈｌａｂ  Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｔ３００１，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，ＶＡを参照）。粗製非精製毒素Ａもまた使用され得る（市販されており、例えば、Ｔｅｃｈｌａｂ  Ｉｎｃ．カタログ番号Ｔ５０００またはＴ３０００，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，ＶＡ）。これは、選択のための有効用量を決定するための初期力価測定が必要であり得る。
【００９３】
（血清ベースの選択方法）
別の実施形態において、その選択手順は、補体因子と、ｇａｌα１，３ｇａｌエピトープに対する自然抗体とを含む血清を使用して、実行され得る（例えば、Ｋｏｉｋｅら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４：１４７−１５３，１９９７）。抗Ｇａｌ抗体を含むヒトまたは非ヒト霊長類由来の血清に対して曝露すると、ｇａｌα１，３ｇａｌエピトープを示す細胞における特異的抗体結合および補体活性化に起因して、細胞溶解が引き起こされ得る。従って、α−１，３−ＧＴが欠損した細胞は、生きたままであり、従って、選択され得る。
【００９４】
（機能的α−１，３ＧＴの発現を欠くブタ細胞のさらなる特徴付け）
機能的α−１，３ＧＴの発現を欠くと考えられるブタ細胞は、さらに特徴付けられ得る。そのような特徴付けは、以下の技術（ＰＣＲ分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、特異的レクチン結合アッセイ、および／または配列決定分析が挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。
【００９５】
当該分野で記載されるようなＰＣＲ分析（例えば、Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４３１−４５５）が、標的化ベクターの組み込みを決定するために使用され得る。一実施形態において、増幅因子（ａｍｐｌｉｍｅｒ）は、抗生物質耐性遺伝子を起点とし得、そしてそのベクター配列の外側にある領域へと広がり得る。サザン分析（例えば、Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４３１−４５５参照）もまた、遺伝子座中での大きな改変（例えば、α−１，３ＧＴ遺伝子座中への標的化ベクターの組み込み）を特徴付けるために使用され得る。これに対して、ノーザン分析は、それらの対立遺伝子の各々から生成される転写物を特徴付けるために使用され得る。
【００９６】
特異的レクチン結合（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ由来のＧＳＬ  ＩＢ４レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）（このレクチンは、糖質部分ｇａｌα１，３ｇａｌに特異的に結合する）を使用する）と、結合のＦＡＣＳ（蛍光抗体細胞選別）分析とによって、α１，３ｇａｌエピトープが細胞上に存在するか否かを決定し得る。この型の分析は、その細胞への蛍光標識ＧＳＬ−ＩＢ４レクチンの添加、およびその後の細胞選別を包含する。
【００９７】
さらに、上記ＲＮＡ転写物から生成されるｃＤＮＡの配列決定分析もまた、α１，３−ＧＴ対立遺伝子におけるあらゆる変異の正確な位置を決定するために使用され得る。
【００９８】
（ＩＩＩ．ブタ動物の生産）
なお別の局面において、本発明は、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性にされた生きたブタを生産するための方法を提供する。一実施形態において、そのブタは、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性にされたブタ細胞に由来するドナー核を用いてクローニングすることによって生産される。一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子は、遺伝的標的化事象を介して不活性化される。別の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子は、点変異の存在に起因して不活性化される。別の実施形態において、一方の対立遺伝子は、遺伝的標的化事象によって不活性化される一方で、他方の対立遺伝子は、点変異によって不活性化される。さらなる実施形態において、一方の対立遺伝子は、遺伝的標的化事象によって不活性化され、他方の対立遺伝子は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴからＧへの点変異の存在に起因して不活性化される。特定の実施形態において、一方の対立遺伝子は、エキソン９に指向される標的化構築物を介して不活性化され（図６）、他方の対立遺伝子は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴからＧへの点変異の存在に起因して不活性化される。別の実施形態において、このようなブタをクローニングする方法は、以下の工程を包含する：卵母細胞から除核する工程、その卵母細胞と、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されたブタ細胞に由来するドナー核とを融合する工程、およびその核移入によって得られた胚を、代理母に移植する工程。
【００９９】
あるいは、胚性幹細胞（次いで、この胚性幹細胞は、子孫を生産するために使用され得る）におけるα−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化することによって、機能的α−１，３−ＧＴのいかなる発現をも欠く生存可能なブタを生産するための方法が提供される。
【０１００】
遺伝子改変された動物は、直接接合子を改変することによって作出され得る。哺乳動物に関しては、その改変された接合子は、次いで、出産のときまでその動物を妊娠し続けることができる偽妊娠雌の子宮に導入され得る。例えば、α−１，３−ＧＴ遺伝子を欠いた完全な動物が望ましい場合、その動物に由来する胚性幹細胞が、標的化され得、後に、その改変された細胞をキメラ動物へと成長させるために、胚盤胞に導入され得る。胚性幹細胞に関しては、胚性幹細胞株または新たに得られた幹細胞のいずれかが使用され得る。
【０１０１】
本発明の適切な実施形態において、全能細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。胚盤胞からのＥＳ細胞の単離、ＥＳ細胞株の樹立およびそれらのその後の培養は、例えば、Ｄｏｅｔｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７：２７−４５（１９８５）；Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  ６９：９１５−９２６（１９９２）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．「Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）；Ｗｕｒｓｔ  ａｎｄ  Ｊｏｙｎｅｒ，「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；Ｈｏｇｅｎら，「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｙ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）；およびＷａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：７４１−７４４（１９９２）に記載されるような従来の方法によって行われる。本発明の別の適切な実施形態において、その全能細胞は、胚性生殖（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ）（ＥＧ）細胞である。胚性生殖細胞は、ＥＳ細胞に機能的に等しい（すなわち、それらは、インビトロで培養およびトランスフェクトされ得、次いで、キメラの体細胞系列および生殖細胞系列に寄与する（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６１：６２６−６２８（１９９４）））、未分化細胞である。ＥＧ細胞は、増殖因子：白血病阻害因子、ｓｔｅｅｌ因子および塩基性線維芽細胞増殖因子の組み合わせとの、始原生殖細胞、配偶子の先祖の培養によって、誘導される（Ｍａｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１−８４７（１９９２）；Ｒｅｓｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５５０−５５１（１９９２））。ＥＧ細胞の培養は、Ｄｏｎｏｖａｎら，「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」，Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ編，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９７）、およびそこに引用されている本来の文献において記載される方法を使用して実行され得る。
【０１０２】
本発明において使用するための四倍体胚盤胞は、天然の配偶子生成および発生によって、または二細胞胚の電気融合による公知の方法よって得られ得、その後、例えば、Ｊａｍｅｓら、Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．Ｃａｍｂ．６０：１８５−１９４（１９９２）；Ｎａｇｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）；またはＫｕｂｉａｋ  ａｎｄ  Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５７：５６１−５６６（１９８５）によって記載されるように培養され得る。
【０１０３】
胚盤胞へのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の導入は、当該分野において公知の方法によって行われ得る。本発明の目的に適した方法は、Ｗａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２４３７−２４５０（１９９１）によって記載されるマイクロインジェクション法である。
【０１０４】
あるいは、改変胚性幹細胞によって、トランスジェニック動物が生産され得る。その遺伝子改変された胚性幹細胞は、胚盤胞に注入され得、次いで、従来の技術に従って、雌宿主哺乳動物において分娩される。ヘテロ接合性子孫は、次いで、ＰＣＲまたはサザンブロッティングのような技術を使用して、標的遺伝子座の部位における改変の存在についてスクリーニングされ得る。同じ種の野生型宿主と交配した後に、得られたキメラ子孫を、次いで、ホモ接合性宿主を達成するために交雑させ得る。
【０１０５】
胚性幹細胞を標的化ベクターで形質転換して、α−１，３−ＧＴ遺伝子を改変した後に、その細胞を、適切な培地（例えば、ウシ胎仔血清で強化したＤＭＥＭ）中のフィーダー層上にプレーティングし得る。その構築物を含む細胞を、選択培地を使用することによって、コロニーが増殖するに十分な時間後に検出し得、コロニーは、拾い上げられ得、相同組換えの存在について分析され得る。構築物配列内にあるプライマーおよび構築物配列を含まないが標的遺伝子座にあるプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を使用し得る。相同組換えを示すコロニーが、次いで、胚操作および胚盤胞注入のために使用され得る。胚盤胞を、過排卵雌から獲得し得る。その胚性幹細胞を次いで、トリプシン処理し得、その改変細胞を、胚盤胞を含む小滴に添加し得る。その改変胚性幹細胞のうちの少なくとも１つが、胚盤胞の胞胚腔に注入され得る。注入後、その胚盤胞のうちの少なくとも１つを、偽妊娠雌の各子宮角に戻し得る。雌を、次いで、出産時まで経過させ、得られた同腹仔を、その構築物を有する変異細胞についてスクリーニングする。その胚盤胞を、形質転換ＥＳ細胞からの異なる血統について選択する。胚盤胞およびＥＳ細胞の異なる表現型を提供することによって、キメラ子孫を、容易に検出し得、次いで、遺伝子型決定を行って、改変α−１，３−ＧＴ遺伝子の存在についてプローブし得る。
【０１０６】
（クローニングされたトランスジェニック子孫を生産するための体細胞核移入）
本発明は、体細胞核移入を介して、機能的α−１，３−ＧＴ遺伝子を欠くブタをクローニングするための方法を提供する。一般に、そのブタは、以下の工程を包含する核移入プロセスによって生産され得る：ドナー核の供給源として使用される所望の分化したブタ細胞を得る工程；ブタから卵母細胞を得る工程；その卵母細胞から除核する工程；その所望の分化した細胞または細胞核を、その除核した卵母細胞に移入して（例えば、融合または注入によって）、ＮＴユニットを形成する工程；得られたＮＴユニットを活性化させる工程；およびその培養ＮＴユニットを宿主ブタに移入して、よって、そのＮＴユニットを、胎仔へと発生させる工程。
【０１０７】
核移入技術または核翻訳技術は、当該分野で公知である（Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５；Ｐｏｌｅｊａｅｖａら  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０（２０００）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ  Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；ＷＯ９４／２６８８４；ＷＯ９４／２４２７４、およびＷＯ９０／０３４３２、米国特許第４，９４４，３８４号および同第５，０５７，４２０号）。
【０１０８】
ドナー細胞核（これは、α−１，３−ＧＴ遺伝子を変化させるように改変されている）は、レシピエントブタ卵母細胞に移される。この方法の使用は、特定のドナー細胞型に制限されない。そのドナー細胞は、本明細書中に記載されるとおりであり得る。例えば、例えば、Ｗｉｌｍｕｔら  Ｎａｔｕｒｅ  ３８５  ８１０（１９９７）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０  ６４−６６（１９９６）；Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５，２００２またはＣｉｂｅｌｌｉら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０  １２５６−１２５８（１９９８）もまた参照のこと。正常核型の細胞全て（核移入において成功裏に使用され得る胚性細胞、胎仔体細胞および成体体細胞を含む）を、使用し得る。胎仔線維芽細胞は、ドナー細胞の特に有用なクラスである。一般に、核移入の適切な方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４３  １８１（１９９５）、Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５、Ｐｏｌｅｊａｅｖａら  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０（２０００）、Ｃｏｌｌａｓら  Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８  ２６４−２６７（１９９４）、Ｋｅｅｆｅｒら  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０  ９３５−９３９（１９９４）、Ｓｉｍｓら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６１４３−６１４７（１９９３）、ＷＯ−Ａ−９４２６８８４、ＷＯ−Ａ−９４２４２７４、ＷＯ−Ａ−９８０７８４１、ＷＯ−Ａ−９００３４３２、米国特許第４，９９４，３８４号および同第５，０５７，４２０号に記載される。分化ドナー細胞または少なくとも部分的に分化したソナー細胞もまた、使用され得る。ドナー細胞はまた、培養され得るが、必ずしも培養されなくてもよく、休止性であり得る。休止性核ドナー細胞は、休止期に入るように誘導され得るか、またはインビボで休止状態にある細胞である。先行技術の方法はまた、クローニング手順において胚細胞型を使用した（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６８，１９９６）およびＳｔｉｃｅら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２０  ５４：１００−１１０，１９９６）。
【０１０９】
体細胞性核ドナー細胞は、種々の異なる器官および組織（例えば、皮膚、間葉、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、子宮、生殖器官が挙げられるが、これらに限定されない）、および胚、胎仔または成体動物の全てまたは一部の分解調製物から獲得され得る。本発明の適切な実施形態において、核ドナー細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞、他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌ）、表皮細胞または内皮細胞からなる群より選択される。別の実施形態において、その核ドナー細胞は、胚性幹細胞である。好ましい実施形態において、線維芽細胞は、ドナー細胞として使用され得る。
【０１１０】
本発明の別の実施形態において、本発明の核ドナー細胞は、動物の生殖細胞である。胚、胎仔、または成体の段階における動物種のあらゆる生殖細胞が、核ドナー細胞として使用され得る。適切な実施形態において、その核ドナー細胞は、胚性生殖細胞である。
【０１１１】
核ドナー細胞は、アクセプター細胞との協調を確実にするために、細胞周期（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｓ、Ｍ）のいずれかの段階において停止され得る。当該分野で公知のあらゆる方法が、その細胞周期段階を操作するために使用され得る。細胞周期段階を制御する方法としては、培養細胞の接触阻害によって誘導されるＧ０休止、血清または他の必須栄養素の除去によって誘導されるＧ０休止、老化によって誘導されるＧ０休止、特定の増殖因子の添加によって誘導されるＧ０休止；物理的または化学的手段（例えば、熱ショック、高比重圧（ｈｙｐｅｒｂａｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、または化学物質、ホルモン、増殖因子もしくは他の物質での他の処置）によって誘導されるＧ０休止またはＧ１休止；複製手順の何らかの点を妨害する化学薬剤での処置を介するＳ期制御；蛍光活性化セルソーティング、有糸分裂させないこと（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｈａｋｅ  ｏｆｆ）、微小管破壊剤または有糸分裂の進行を混乱させる任意の化学物質での処理（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ，．「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）もまた参照のこと）を使用する選択を介するＭ期制御が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
卵母細胞の単離のための方法は、当該分野において周知である。本質的には、これは、卵母細胞をブタの卵巣または生殖管から単離する工程を包含し得る。ブタ卵母細胞の容易に入手可能な供給源は、屠殺場にあるものである。遺伝子操作、核移入およびクローニングのような技術の組み合わせについて、卵母細胞は、一般に、これらの細胞が、核移入のためのレシピエント細胞として使用され得る前、およびこれらの細胞が、精子細胞により授精されて胚へと発生し得る前に、インビトロで成熟されなければならない。このプロセスは、一般に、哺乳動物卵巣（例えば、屠殺場で得たウシ卵巣）から未成熟（前期Ｉ）卵母細胞を収集し、授精または除核前に、卵母細胞が中期ＩＩ段階（この段階は、ウシ卵母細胞の場合では、一般に、吸引してから約１８時間後〜約２４時間後に起こる）に達するまで、その卵母細胞を成熟培地中で成熟させることを要する。この期間は、「成熟期間」として公知である。特定の実施形態において、その卵母細胞は、未経産若年性雌ブタ（ｇｉｌｔ）から得られる。「未経産若年性雌ブタ（ｇｉｌｔ）」とは、子孫を以前に生んだことのない雌ブタである。他の実施形態において、その卵母細胞は、成熟雌ブタ（ｓｏｗ）から得られる。「成熟雌ブタ（ｓｏｗ）」とは、子孫を以前に生んだことのある雌ブタである。
【０１１３】
中期ＩＩ段階卵母細胞は、レシピエント卵母細胞であり得、この段階で、その卵母細胞は、授精している精子がするように、その導入される核を処置するために十分に「活性化」され得るか、または活性化されていると考えられる。インビボで成熟した中期ＩＩ段階卵母細胞は、核移入技術において成功裏に使用されてきた。本質的には、成熟中期ＩＩ卵母細胞は、発情期が開始して、またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンを注射してから３５時間後〜４８時間後もしくは３９時間後〜４１時間後に、非過排卵ブタまたは過排卵ブタのいずれかから、外科手術により収集され得る。
【０１１４】
約１０〜４０時間の範囲、好ましくは、約１６〜１８時間の範囲の固定した時間の成熟期間の後、その卵母細胞から除核し得る。除核前、その卵母細胞が取り出され得、卵丘細胞を除去する前に、適切な培地（例えば、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭ）中に入れられ得る。剥がされた卵母細胞は、次いで、極体についてスクリーニングされ得、その選択された中期ＩＩ卵母細胞（極体の存在によって決定される）は、次いで、核移入のために使用される。除核は、次に行われる。
【０１１５】
除核は、米国特許第４，９９４，３８４号に記載されるような公知の方法によって行われ得る。例えば、中期ＩＩ卵母細胞は、すぐに除核するためにＨＥＣＭ（必要に応じて、７．５ｍｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む）に入れられるか、または適切な培地（例えば、胚培養培地（例えば、ＣＲ１ａａ＋１０％発情ウシ血清））中に入れられるかのいずれかであり得、次いで、除核され得、好ましくは、２４時間後を超えず、より好ましくは、１６〜１８時間後を超えない。
【０１１６】
除核は、極体および隣接する細胞質を除去するために、マイクロピペットを使用して顕微手術下で行われ得る。その卵母細胞は、次いで、成功裏に除核されたものを同定するためにスクリーニングされ得る。その卵母細胞をスクリーニングする１つの方法は、卵母細胞をＨＥＣＭ中１ｍｇ／ｍｌの３３３４２  Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で染色し、次いで、その卵母細胞を、１０秒未満の間に、紫外線照射下で見ることである。成功裏に除核された卵母細胞は、次いで、適切な培養培地（例えば、ＣＲ１ａａ＋１０％血清）中に入れられ得る。
【０１１７】
その除核された卵母細胞と同じ種の単一の哺乳動物細胞を、次いで、ＮＴユニットを生成するために使用される除核卵母細胞の卵黄周囲腔に移入し得る。その哺乳動物細胞およびその除核卵母細胞を使用して、当該分野で公知の方法に従って、ＮＴユニットを生成し得る。例えば、その細胞を、電気融合により融合し得る。電気融合は、形質膜の一過性の破損を引き起こすに十分な電気のパルスを提供することにより達成される。その形質膜の破損は、非常に短時間である。なぜなら、その膜は、急激に再形成するからである。従って、２つの隣接する膜が破損するように誘導され、再形成の際に、その脂質二重層が混ざる場合、小さなチャネルが、その２つの細胞の間に開き得る。このような小さな開口部の熱力学的不安定性に起因して、その２つの細胞は、１つになるまで、その開口部は大きくなる。例えば、Ｐｒａｔｈｅｒらによる米国特許第４，９９７，３８４号を参照のこと。種々の電気融合培地（例えば、スクロース、マンニトール、ソルビトールおよびリン酸緩衝化溶液を含む）が使用され得る。融合はまた、融合形成性因子（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）としてセンダイウイルスを使用して行われ得る（Ｇｒａｈａｍ，Ｗｉｓｔｅｒ  Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．，９，１９，１９６９）。また、その核は、エレクトロポレーション融合を使用することよりむしろ、その卵母細胞に直接注入され得る。例えば、Ｃｏｌｌａｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）を参照のこと。融合後、得られた融合したＮＴユニットは、活性化されるまで、適切な培地（例えば、ＣＲ１ａａ培地）に入れられる。代表的には、活性化は、融合して、直後に、例えば、２４時間後、約４時間後〜約９時間後、または必要に応じて、１時間後〜２時間後にもたらされ得る。好ましい実施形態において、活性化は、融合して少なくとも１時間後、成熟して４０時間後〜４１時間後に起こる。
【０１１８】
そのＮＴユニットは、公知の方法により活性化され得る。このような方法は、例えば、本質的に、そのＮＴユニットに冷温ショックまたは実際に冷たい温度のショックを適用することによって、生理学的温度未満でそのＮＴユニットを培養する工程を包含する。これは、そのＮＴユニットを室温（これは、胚が通常曝される生理学的温度条件より低温である）にて培養することによって、最も簡便に行われ得る。あるいは、活性化は、既知の活性化剤の適用によって達成され得る。例えば、授精の間の精子による卵母細胞への進入は、融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）卵母細胞を活性化して、核移入後により多数の生存性の妊娠および多数の遺伝的に同一の子ウシを得ることが示された。また、電気ショックおよび化学物質ショックのような処理は、融合後にＮＴ胚を活性化するために使用され得る。例えば、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈらに対する米国特許第５，４９６，７２０号を参照のこと。さらに、活性化は、卵母細胞における二価カチオンのレベルを同時にまたは連続的に増大させ、その卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化を減少することによってもたらされ得る。これは、一般に、二価カチオン（例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウム）を、例えば、イオノフォア（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）の形態で、卵母細胞細胞質へ導入することによりもたらされ得る。二価カチオンレベルを増大させる他の方法は、電気ショックの使用、エタノールでの処理、およびケージ化（ｃａｇｅｄ）キレート剤での処理を包含する。リン酸化は、公知の方法（例えば、キナーゼインヒビター（例えば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンのようなセリン−スレオニンキナーゼインヒビター）の添加）によって減少され得る。あるいは、細胞タンパク質のリン酸化は、ホスファターゼ（例えば、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂ）を卵母細胞に導入することによって阻害され得る。
【０１１９】
その活性化されたＮＴユニットまたは「融合胚」は、次いで、細胞コロニーが生成されるまで、適切なインビトロ培養培地中で培養され得る。胚の培養および成熟に適した培養培地は、当該分野で周知である。胚の培養および維持のために使用され得る公知の培地の例としては、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０＋１０％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎仔血清、タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、イーグル培地およびホイットン培地が挙げられ、１つの具体例において、その活性化ＮＴユニットは、５％  ＣＯ２の加湿雰囲気中、約３８．６℃にて１時間〜４時間にわたってＮＣＳＵ−２３培地で培養され得る。
【０１２０】
その後、その培養ＮＴユニットは、洗浄され得、次いで、好ましくは、適切なコンフルエントフィーダー層を含むウェルプレートに含まれる適切な培地中に入れられ得る。適切なフィーダー層としては、例示として、線維芽細胞および上皮細胞が挙げられる。そのＮＴユニットは、ＮＴユニットが、レシピエント雌への移入に適したサイズに達するまで、または細胞コロニーを生成するために使用され得る細胞を得るために、フィーダー層上で培養される。好ましくは、これらのＮＴユニットは、少なくとも約２個〜約４００個の細胞、約４個〜約１２８個の細胞、または少なくとも約５０個の細胞になるまで培養され得る。
【０１２１】
活性化ＮＴユニットは、次いで、雌ブタの卵管に移入され得る（胚移入）。一実施形態において、その雌ブタは、発情同期化レシピエント未経産若年性雌ブタであり得る。交配した未経産若年性雌ブタ（大型の白色／デュロック／ランドレース）（２８０−４００ｌｂｓ）を使用し得る。その未経産若年性雌ブタは、飼料に混合した１８〜２０ｍｇのＲｅｇｕ−Ｍａｔｅ（Ａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔ，Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）を経口投与することにより、レシピエント動物と同期化され得る。Ｒｅｇｕ−Ｍａｔｅは、連続１４日間与えられ得る。１０００ユニットのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ，Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）を、次いで、最後のＲｅｇｕ−Ｍａｔｅ処置から約１０５時間に筋肉内（ｉ．ｍ．）投与し得る。胚移入を、次いで、ｈＣＧ注射の約２２〜２６時間後に行い得る。一実施形態において、その妊娠は、出産時まで維持され得、生きた子孫の出産がもたらされ得る。別の実施形態において、その妊娠は、初期に終了され得、胚細胞が採取され得る。
【０１２２】
（所望のホモ接合性ノックアウト動物のための交配）
別の局面において、本発明は、機能的α−１，３−ＧＴのあらゆる発現を欠いた生きたブタ（このブタは、α−１，３−ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性の雄ブタと、α−１，３−ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性の雌ブタとを交配することによって提供される）を生産するための方法を提供する。一実施形態において、そのブタは、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子の、その対立遺伝子の発現を防止するような遺伝的改変に起因して、ヘテロ接合性である。別の実施形態において、そのブタは、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子における点変異の存在に起因して、ヘテロ接合性である。別の実施形態において、その点変異は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇの点変異であり得る。１つの具体的実施形態において、機能的α−１，３−ＧＴのあらゆる発現を欠くブタ動物を生成する方法が提供され、ここでα−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇの点変異を含む雄ブタが、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇの点変異を含む雌ブタと交配される。
【０１２３】
一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子におけるダブルノックアウトを有するドナー細胞からの核移入により生産された、性的に成熟した動物が交配され得、それらの子孫が、ホモ接合性ノックアウトについて試験され得る。これらのホモ接合性ノックアウト動物は、次いで、より多くの動物を生産するために交配され得る。
【０１２４】
別の実施形態において、性的に成熟したダブルノックアウト動物に由来する卵母細胞は、２つの遺伝的に異なるブタ系統に由来する野生型精子を使用してインビトロで授精させられ得、その胚は、適切な代理母に移植され得る。これらの交配により得られた子孫は、ノックアウトの存在について試験され得る。例えば、それらは、ｃＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ、毒素Ａ感受性および／またはレクチン結合によって試験され得る。次いで、性的成熟度において、これらの同腹仔の各々から動物は、適合され得る。
【０１２５】
本発明のこの局面に従う特定の方法において、妊娠は、初期に終了され得る。よって、胎仔線維芽細胞が、単離され得、さらに、表現型によりおよび／または遺伝子型により特徴付けられる。α−１，３−ＧＴ遺伝子の発現を欠く線維芽細胞は、次いで、本明細書中に記載される方法に従う核移入のために使用されて（Ｄａｉらもまた参照のこと）、所望のダブルノックアウトを有する複数の妊娠および子孫がもたらされる。
【０１２６】
（ＩＶ．遺伝子改変されたブタ動物の型）
本発明の一局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子が、遺伝子標的化事象を介して不活性化されるブタ動物が、提供される。本発明の別の局面において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が遺伝子標的化事象を介して不活性化されているブタ動物が提供される。一実施形態において、その遺伝子は、相同組換えを介して標的化され得る。他の実施形態において、その遺伝子は破壊され得る。すなわち、遺伝コードの一部が変化され得、それによって、その遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳が影響を受け得る。例えば、遺伝子の破壊は、置換、欠失（「ノックアウト」）または挿入（「ノックイン」）の技術を通じて起こり得る。望ましいタンパク質のためのさらなる遺伝子または存在する配列の転写を調節する調節配列が、挿入され得る。
【０１２７】
α−１，３−ＧＴ遺伝子の２つの不活性対立遺伝子を有するブタは、天然には存在しない。驚くべきことに、α−１，３−ＧＴ遺伝子の第２の対立遺伝子を、遺伝子標的化事象を通じてノックアウトしようと試みる間に、第２の対立遺伝子を不活性にする点変異を同定したことが発見された。
【０１２８】
従って、本発明の別の局面において、そのα−１，３−ＧＴ遺伝子は、少なくとも１つの点変異によって不活性にされ得る。一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子は、少なくとも１つの点変異によって不活性にされ得る。別の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子は、少なくとも１つの点変異によって不活性にされ得る。一実施形態において、この点変異は、遺伝子標的化事象を介して起こり得る。別の実施形態において、この点変異は、天然に存在し得る。特定の実施形態において、その点変異は、α−１，３−ＧＴ遺伝子のエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇの変異であり得る（図２）。α−１，３−ＧＴ遺伝子において天然に存在する点変異を有するブタは、抗生物質耐性遺伝子がない、α１，３−ＧＴ欠損性ブタの生産を可能にし、従って、ヒト用途のためのより安全な製品を生成する能力を有する。別の実施形態において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個または少なくとも２０個の点変異が、α−１，３−ＧＴ遺伝子を不活性にするために存在し得る。一実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が、機能的α１，３−ＧＴのあらゆる発現を防止する点変異を含むブタが、提供される。特定の実施形態において、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子におけるエキソン９の２番目の塩基においてＴ→Ｇの変異を含む（図２）ブタが提供される。
【０１２９】
本発明の別の局面は、一方の対立遺伝子が遺伝子標的化事象によって不活性化され、他方の対立遺伝子が天然に存在する点変異によって不活性化された、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されたブタ動物が提供される。一実施形態において、一方の対立遺伝子が遺伝子標的化事象によって不活性化され、他方の対立遺伝子がエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇの点変異の存在に起因して不活性化された、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されたブタ動物が提供される。特定の実施形態において、一方の対立遺伝子がエキソン９に指向される標的化構築物を介して不活性化され（図６）、他方の対立遺伝子がエキソン９の２番目の塩基におけるＴ→Ｇの点変異の存在に起因して不活性化された、α−１，３−ＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されたブタ動物が提供される。
【０１３０】
（Ｖ．ブタの器官、組織、細胞および細胞株）
本発明は、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている生存ブタを最初に提供する。本発明はまた、異物移植のために有用である、このようなブタ由来の器官、組織、および細胞を提供する。
【０１３１】
１つの実施形態では、本発明は、機能的α１，３ＧＴのあらゆる発現を欠くブタから得られる、ブタの器官、組織および／または精製細胞もしくは精製細胞株もしくは実質的に純粋な細胞もしくは細胞株を提供する。
【０１３２】
１つの実施形態では、本発明は、異物移植のために有用である器官を提供する。制限されずに：脳、心臓、肺、腺、脳、眼、胃、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛、爪、耳、鼻、口、唇、歯ぐき、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、幽門、甲状腺、胸腺、副腎（腎上体）、骨、軟骨、腱、靭帯、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精液、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節およびリンパ管を含む、任意のブタ器官が用いられ得る。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、異物移植のために有用である組織を提供する。制限されずに：上皮、連結組織、血液、骨、軟骨、筋肉、神経、腺様（ａｄｅｎｏｉｄ）組織、脂肪組織、疎性結合組織、骨、褐色脂肪組織、海綿骨組織、筋肉、軟骨組織、海綿（ｃａｖｅｒｎｏｕｓ）組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、肉様組織、弾性組織、上皮、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン状組織、肉芽組織、腸関連リンパ、ハラー脈管、硬性造血組織、未分化組織、間質、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系、間葉組織、中腎性組織、粘液様結合組織、多房性脂肪組織、骨髄、軟組織鼻点、腎発生組織、結節組織、骨様組織、骨形成組織、骨状組織、歯根尖周囲組織、細網組織、網状組織、ゴム状組織、骨格筋、平滑筋、および皮下組織を含む任意のブタ組織が用いられ得る。
【０１３４】
さらなる実施形態では、本発明は、機能的α１，３ＧＴの発現を欠くブタ動物からの細胞および細胞株を提供する。１つの実施形態では、これらの細胞または細胞株は、異物移植のために用いられ得る。制限されずに：上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、その他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、上皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、膵臓インシュリン分泌細胞、膵臓α２細胞、膵臓β細胞、膵臓α１細胞、血液細胞、血液前駆体細胞、骨細胞、骨前駆体細胞、神経幹細胞、始原幹細胞，肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、毛細血管内皮細胞、線維芽細胞、肝臓星状細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クップファー細胞、平滑筋細胞、シュヴァン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵臓島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球細胞、白血球細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディヒ細胞、管周細胞、セルトーリ細胞、黄体細胞、子宮頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、卵胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱細胞、ドーパミン作動性細胞（ｄｏｐａｍｉｅｒｇｉｃ  ｃｅｌｌ）、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ドーパミン作動性細胞、胎児性細胞、線維芽細胞および胎児線維芽細胞を含む任意のブタ組織または器官からの細胞が用いられ得る。特定の実施形態では、機能的α−１，３−ＧＴの発現を欠くブタ由来の膵臓細胞（制限されずにランゲンルハンス島細胞、インスリン分泌細胞、α−２、β細胞、α−１細胞を含む）が、提供される。
【０１３５】
生細胞を剥離させた組織を含む生育不能な誘導体は、これらの組織誘導体を酵素的または化学的に処理することによって、移植における使用前に架橋または他の化学的処置を介してさらに加工され得る。好ましい実施形態では、その誘導体は、種々の組織（皮膚、泌尿器、膀胱または器官粘膜下組織を含む）由来の細胞外マトリクスを含む。また、医療デバイスとして、心臓弁および他の生育不能な組織を含むように生存組織を剥離された腱、関節および骨も提供される。
【０１３６】
（治療的用途）
細胞は、広範な方法で順番に宿主に投与され得る。好ましい投与様式は、坐薬経由、経皮経由、鼻腔スプレー経由、外科的移植片経由、内部外科的塗擦経由、輸液ポンプ経由、またはカテーテル経由を含む、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮内投与、硬膜外投与、脊髄内投与、胸骨内投与、関節内投与、滑液包内投与、くも膜下（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、動脈内投与、心臓内投与、筋内投与、鼻腔内投与、皮下投与、眼窩内投与、嚢内投与、局所投与、経皮貼布投与、直腸経由投与、膣投与または尿道投与である。１つの実施形態では、薬剤およびキャリアは、徐放処方物（直接的な組織注射、またはボーラス、移植物、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子もしくはナノスフェア）で投与される。
【０１３７】
開示した細胞の注入によって処置され得る障害としては、正常な血球の産生および成熟の機能不全から生じる疾患（すなわち、再生不良性貧血および低増殖性幹細胞障害）；造血性器官における腫瘍性の悪性疾患（例えば、白血病およびリンパ腫）；非造血器官の広域性悪性固形腫瘍；自己免疫性状態；および遺伝的障害が挙げられるが、これらに限定されない。このような障害としては、正常な血球の産生および成熟の機能不全から生じる疾患（薬物、放射線、または注入、特発に起因する、低増殖性幹細胞障害、再生不良性貧血、汎血球減少症、顆粒球減少症、血小板減少症、赤血球形成不全、ブラックファン−ダイアモンド症候群を含む）；造血性悪性腫瘍（急性リンパ芽球性（リンパ球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性悪性骨髄硬化症、多発性骨髄腫、真性赤血球増加症、特発性骨髄化生、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む）；悪性の固形腫瘍（悪性黒色腫、胃の癌、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、精巣癌、グリア芽腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、リンパ腫）を有する患者における免疫抑制；自己免疫疾患（リウマチ様関節炎、Ｉ型糖尿病、慢性肝炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスを含む）；遺伝的（先天性）障害（貧血、家族性形成不全、ファンコーニ症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏症、ホルムアミノトランスフェラーゼ欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、先天性異常赤血球産生症候群Ｉ〜ＩＶ、シュバッハマン−ダイアモンド症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏症、ホルムアミドトランスフェラーゼ欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天性楕円赤血球症、先天性口唇状赤血球症、先天性Ｒｈ陰性疾患、発作性夜間血色素尿症、Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）改変体１、Ｇ６ＰＤ改変体２、Ｇ６ＰＤ改変体３、ピルビン酸キナーゼ欠乏症、先天性エリスロポエチン感受性、欠乏症、鎌状赤血球疾患および鎌状赤血球形成傾向、サラセミアα、サラセミアβ、サラセミアγ、ｍｅｔ−色素血症、免疫の先天性障害、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、不全リンパ球症候群、イオノフォア反応性複合免疫不全、キャップ形成異常を有する複合免疫不全、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠乏症、顆粒球アクチン欠乏症、乳児顆粒球減少症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、コストマン症候群、網様発育不全、先天性白血球機能不全症候群を含む）；および他の障害（例えば、骨粗鬆症、骨髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全、一次的免疫欠損もしくは二次的免疫欠損を引き起こす感染性障害、細菌感染、（例えば、ブルセラ症、リステリア症、結核、ハンセン病）、寄生虫感染（例えば、マラリア、リーシュマニア症）、真菌感染、加齢に関連する種々の障害に起因する不均衡なリンパ球セットおよび障害性の免疫機能に関連する障害、食細胞障害、コストマン無顆粒球、慢性肉芽腫症、チェディアック−東症候群、好中球アクチン欠乏症、好中球膜ＧＰ−１８０欠乏症、代謝性蓄積症、ムコ多糖類、ムコリピドーシス、および免疫機構、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、α１−アンチリプシン���乏症など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
疾患または病理としては、神経変性疾患、肝変性疾患、神経変性疾患、脊髄損傷、頭部外傷もしくは頭部手術、および組織変性、器官変性もしくは腺変性を生じるウイルス感染などが挙げられる。このような神経変性疾患としては、ＡＩＤＳ痴呆複合症；脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、および急性トランスフェラーゼ脊髄炎）；錐体外路系障害および小脳障害（例えば、脊髄系の病変）；脳幹神経節の障害または小脳障害；多動性運動障害（例えば、ハンチントン舞踏病および老年舞踏病）；薬物誘導性運動障害（例えば、ＣＮＳドーパミンレセプターをブロックする薬物によって誘導される障害）；低運動性運動障害（例えば、パーキンソン病）；進行性核上麻痺；小脳の構造病変；脊髄小脳変性（例えば、脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調、小脳皮質変性、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、およびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性障害（例えば、Ｒｕｆｓｕｍ病、無β−リポ蛋白血症、運動失調、毛細管拡張症））；およびミトコンドリア多系統障害；脱髄性核障害（例えば、多発性硬化症、急性横断脊髄炎）；および運動単位の障害（例えば、神経性筋萎縮（前角細胞変性（例えば、筋萎縮性側索硬化症、乳児筋萎縮および若年性脊髄性筋萎縮）））；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レヴィー小体病；レヴィー体型の老人性痴呆症；パーキンソン病；ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎ハレルフォルデン−シュパッツ病；およびボクサー痴呆が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら（編）（１９８７）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、第１５版、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｒａｈｗａｙ，ＮＪを参照のこと。
【０１３９】
本発明は、以下の実施例でさらに詳細に記載される。以下に提供される実施例は、例示的なものだけに過ぎないことが意図され、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１：α−１，３−ＧＴ遺伝子がヘテロ接合性であるブタ細胞の産生）
（初代ブタ胎児線維芽細胞の単離およびトランスフェクション）
胎児線維芽細胞（ＰＣＦＦ４−１〜ＰＣＦＦ４−１０）を、妊娠の３３日目に同じ妊娠の１０の胎児から単離した。頭および内臓を除去した後、胎児をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で洗浄し、２０ｍｌのＨＢＳＳ中に配置し、そして小手術用ハサミで刻んだ。組織をペレット化し、そして５０ｍｌのチューブに、胎児あたり４０ｍｌのＤＭＥＭおよび１００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中に再懸濁した。チューブを、振盪水浴中、３７℃で４０分間インキュベートした。消化された組織を、３〜４分間沈降させ、そして細胞が豊富な上清液を、新たな５０ｍｌチューブに移し、そしてペレット化した。細胞を、次いで、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１×非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭの４０ｍｌ中に再懸濁し、１０ｃｍディッシュ中に播種した。すべての細胞を、集密に到達する際に凍結保存した。ＳＬＡ−１細胞〜ＳＬＡ−１０細胞を、妊娠２８日の１０の胎児から単離した。胎児は、過剰の熱を生成しないように湾曲した手術用鉗子をゆっくりと用い、６０メッシュの金属スクリーンを通してすりつぶした。細胞懸濁液を、次いで、ペレット化し、そして１０％ＦＣＳ、１×非必須アミノ酸、２ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、および１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤＭＥＭの３０ｍｌ中に再懸濁した。細胞を、１０ｃｍディッシュ中に接種し、１〜３日培養し、そして凍結保存した。トランスフェクションには、１０μｇの線状化ベクターＤＮＡを、エレクトロポーレーションにより、２百万の細胞中に導入した。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトされた細胞を、４８ウェルプレート中に、ウェルあたり２，０００細胞の密度で接種し、そして２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択した。
【０１４１】
（ノックアウトベクター構築）
２つのα−１，３−ＧＴノックアウトベクターｐＲＬ６５４およびｐＰＬ６５７を、２つの初代ブタ胎児線維芽細胞ＳＬＡ１−１０細胞およびＰＣＦＦ４−２細胞の同系ＤＮＡから構築した。イントロン８およびエキソン９の大部分を含む６．８ｋｂのα−１，３−ＧＴゲノムフラグメントを、ＳＬＡ１−１０細胞およびＰＣＦＦ４−２細胞の精製ＤＮＡから、それぞれ、ＰＣＲによって生成した。エキソン９の５’末端にある唯一のＥｃｏＲＶ部位を、ＳａｌＩ部位に変換し、そして１．８ｋｂのＩＲＥＳ−ｎｅｏ−ポリＡフラグメントをこのＳａｌＩ部位中に挿入した。ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）は、ｎｅｏタンパク質の翻訳開始部位として機能する。従って、両ベクターは、４．９ｋｂの５’組換えアーム、および１．９ｋｂ  ３’組換えアームを有している（図６）。
【０１４２】
（３’ＰＣＲおよびロングレンジＰＣＲ）
およそ１，０００の細胞を、５μｌの胚性溶解緩衝液中（ＥＬＢ）（４０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．９、０．９％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．９％  ＮＰ４０、０．４ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）中に懸濁して、１５分間に亘って６５℃に亘ってインキュベートし、それら細胞を溶解して、１０分間に亘って９５℃で加熱して、プロテイナーゼＫを不活性化した。３’ＰＣＲ分析のために、フラグメントを、反応体積２５μｌ中で、以下のパラメータを用いてＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して増幅した：９４℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で２分間を３５サイクル。ＬＲ−ＰＣＲのために、フラグメントを、反応体積５０μｌ中で以下のパラメータを用いてＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｖｅｒａ／Ｔａｋａｒａ）を使用して増幅した：９４℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で１０分間（１サイクルごとに＋２０秒間）を３０サイクルした後に、６８℃で７分間の最終１サイクル。精製したＤＮＡについて３’ＰＣＲおよびＬＲ−ＰＣＲの条件は、同じであるが、但し、１μｌの精製ＤＮＡ（３０μｇ／ｍｌ）を、４μｌ  ＥＬＢと混合した。
【０１４３】
（細胞サンプルのサザンブロット分析）
およそ１０６細胞を、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｓａｒｃｏｓｙｌ、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）中で一晩、６０℃で溶解し、そのＤＮＡをエタノールで沈殿させた。次いで、このＤＮＡを、ＢｓｔＥＩＩで消化して、１％アガロースゲル上で分離した。電気泳動の後で、そのＤＮＡを、ナイロンメンブレンに移して、３’末端ジゴキシゲニン標識プローブで調べた。化学発光基質システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてバンドを検出した。
【０１４４】
（結果）
抗生物質（Ｇ４１８）耐性コロニーを、ｎｅｏ４４２ＳおよびαＧＴＥ９Ａ２と順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用する３’ＰＣＲによってスクリーニングした。Ｎｅｏ４４２Ｓは、ｎｅｏ遺伝子の３’末端に存在しており、そして、αＧＴＥ９Ａ２は、３’組換えアームの外側に位置づけられる配列中のエキソン９の３’末端に存在する（図６）。したがって、α１，３ＧＴ遺伝子座における首尾良い標的化を介してのみ、予測された２．４ｋｂ  ＰＣＲ産物を取得された。４つの異なる細胞株における総数にして７つのトランスフェクションから、１１０５個のＧ４１８耐性コロニーが精選され、そのうちの１００（９％）が、その最初の３’ＰＣＲスクリーン（範囲２．５〜１２％）におけるα１，３ＧＴ遺伝子破壊についてポジティブであった。以下のコロニー、６５７Ａ−Ａ８、６５７Ａ−Ｉ６、および６５７Ａ−Ｉ１１は、予測された２．４ｋｂのバンド示し、他方、コントロールのＰＣＦＦ４−６および別のＧ４１８耐性コロニーである６５７Ａ−Ｐ６は、ネガティブであった。３’ＰＣＲポジティブコロニーの各々の一部分を、ＮＴ実験におけるその後の使用のために、数個の小さなアリコートで、直ぐに凍結し、他方、残りの細胞を、ロングレンジＰＣＲ（ＬＲ−ＰＣＲ）およびサザンブロット分析のために増殖させた。
【０１４５】
組換え接合部を検出するためのＰＣＲ分析またはｍＲＮＡ分析（ＲＴ−ＰＣＲ）は、擬陽性の結果を生成し得るので、ロングレンジＰＣＲ（これは、標的化領域全体を包含する）を実施した。このＬＲ−ＰＣＲは、７．４ｋｂのα１，３ＧＴゲノム配列のエキソン８からエキソン９の末端までに及び、両方のプライマー（ａＧＴＥ８ＳおよびａＧＴＥ９Ａ２）は、組換え領域の外側に位置づけられる（図２）。このコントロールＰＣＦＦ４−６細胞、および３’ＰＣＲネイティブコロニーである、６５７Ａ−Ｐ６は、野生型のα１，３ＧＴ遺伝子座由来の内因性７．４ｋｂバンドのみを示す。対照的に、３’ＰＣＲポジティブコロニーのうちの３つ、すなわち、６５７Ａ−Ａ８、６５７Ａ−Ｉ６  および６５７Ａ−Ｉ１は、７．４ｋｂの内因性バンド、および新規の９．２ｋｂのバンドの両方を示した。この９，２ｋｂというサイズは、α１，３ＧＴ遺伝子座への１．８ｋｂのＩＲＥＳ−ｎｅｏカセットの標的化挿入として予測される。
【０１４６】
ＬＲ−ＰＣＲポジティブコロニーのうちのおよそ半分（１７／３０）を、サザンブロット分析のために十分な数の細胞（１×１０６細胞）を産生するように首尾よく増殖した。それらのコロニーが、α１，３ＧＴ遺伝子座でのノックアウトについてヘテロ接合性であり、したがって、これらが、α１，３ＧＴ遺伝子の、１つの正常な非改変遺伝子コピーおよび１つの破壊された遺伝子コピーを有していることが理解される。ＢｓｔＥＩＩ消化を用いると、α１，３ＧＴノックアウト細胞は、以下の２つのバンドを示す：内因性α１，３ＧＴ対立遺伝子について予測されるサイズである１つの７ｋｂバンド、およびα１，３ＧＴ遺伝子座でのＩＲＥＳ−ｎｅｏ配列の挿入の特徴である９ｋｂバンド（図２）。１７個の全てのＬＲ−ＰＣＲポジティブコロニーは、そのノックアウトについてサザン分析することによって確認された。同じメンブレンを、ｎｅｏについて特異的な配列を用いて再度、調べ、そして、その９ｋｂのバンドが、ｎｅｏプローブを用いて検出され、したがって、破壊されたα１，３ＧＴ遺伝子座におけるＩＲＥＳ−ｎｅｏカセットの標的化した挿入を確認した。
【０１４７】
（実施例２）
（α１，３ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性であるブタ細胞の産生）
ヘテロ接合性のα１，３ＧＴノックアウト胎仔線維芽細胞（６５７Ａ−Ｉ１１  １−６）を、上述のように妊娠３２日目に単離した（Ｄａｉら．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：  ４５１  （２００２）を参照のこと）。ＡＴＧ（開始コドン）標的化α１，３ＧＴノックアウトベクター（このベクターはまた、ｎｅｏ遺伝子を含む）を、α１，３ＧＴ遺伝子の第２対立遺伝子をノックアウトするように構築した（ｐＰＬ６８０）。これらの細胞を、ｐＰＬ６８０を用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトして、精製したＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ（上述）を有するα１，３ＧＴネガティブ表現形について選択した。
【０１４８】
（実施例３：）
（α１，３ＧＴ遺伝子についてヘテロ接合性であるブタ細胞についてのＣ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａを用いる選択）
（毒素Ａ細胞毒性曲線）
ブタ細胞（ＰＣＦＦ４−６）を、１０倍連続希釈した毒素Ａ（０．００００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）に１時間〜一晩曝露した。細胞を、２４ウェルプレート中で培養して、３７℃で１時間に亘ってまたは一晩、この毒素とともにインキュベートした。この曝露の結果を、表２で詳細に示した。明らかに、１μｇ／ｍｌを上回る毒素Ａに対する１時間の曝露によって、９０％を超える細胞に対して細胞毒性効果を生じた。したがって、１μｇ／ｍｌでのまたはそれよりも僅かに濃い濃度の毒素Ａを、遺伝的に改変された細胞の選択について選んだ。
【０１４９】
【表２】
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ｇａｌ  α１，３ＧＴ遺伝子の１つの対立遺伝子における以前に同定された標的化ノックアウトを含むブタ胚（Ｉ−１１：１−６）（Ｄａｉら）に由来する、ばらばらにした細胞を、エレクトロポレーションによって１０μｇの線形ベクターＤＮＡ（プロモーターｔｒａｐ）を用いてトランスフェクションした。４８時間後に、それらの細胞を、１ウェル当たり２０００細胞の密度で４８ウェルプレートに播種し、そして、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いて選択した。トランスフェクションの５日後に、培地を、ウェルから取り出し、そして、培養培地（２．８ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦおよび２０％  ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ高グルコース）中の２μｇ／ｍｌの毒素Ａで入れ替えた。細胞を３７℃で２時間に亘って毒素Ａの選択効果まで曝露した。この毒素Ａ含有培地を、プレート表面から放出された影響を受けたあらゆる細胞とともに取り出し、残りの細胞を新しい培地で洗浄し、そして、毒素Ａを含まない培地で置き換えた。１０日後に、細胞を、３７℃で２時間に亘って培地中で１．３μｇ／ｍｌの毒素Ａに再度曝露した。この培地、毒素Ａ、および溶液中のあらゆる細胞を取り除き、残った細胞を洗浄し、そして、その培地を入れ替えた。
【０１５０】
トランスフェクションの１６日後に、毒素Ａ非感受性を示す単一のコロニー（６８０Ｂ１と呼ぶ）を、回収して、ＤＮＡ分析およびレクチン染色のために一部分を送った。ＤＮＡ分析によって、その毒素Ａ非感受性は、第２の標的ベクターの組み込みに起因しないが、しかし、それらの細胞は、ＧＳＬ  ＩＢ−４レクチンで染色されないことが示された。このことは、その遺伝子座の機能的ノックアウトが生じていることを示している。これらの６８０Ｂ１ダブルノックアウト細胞を、５レシピエントに対する核移行のために使用して、そのうち３つが妊娠した。これらの妊娠個体のうちの２体は、１ヶ月で自然流産した。その残りの妊娠個体に由来する４つの胎仔を、妊娠第３９日目で回収して、それらの細胞をばらばらにして、組織培地に播種した。これらの胎仔細胞（６８０Ｂ１−１、６８０Ｂ１−２、６８０Ｂ１−３、６８０Ｂ１−４）を、３７℃で１時間に亘って、１μｇ／ｍｌの毒素Ａに曝露し、その後、培地を取り除いて、細胞を洗浄し、そして、毒素Ａのない培地で置換した。
【０１５１】
胎仔１、２、および４は、毒素Ａに影響されおらず、他方で、胎仔３に由来する細胞のほとんどが球状に丸くなっていた。このことは、この胚が、毒素Ａの細胞毒性効果に対して感受性があることを示した。
【０１５２】
胎仔１、２および４は、ＦＡＣＳ分析（表３を参照）によると、ＧＳ  ＩＢ４レクチンに結合せず、他方、胎仔３は、レクチンに結合した。このことによって、胎仔１、２、および４は、この特定のレクチンにとって特異的であるエピトープα１，３  ｇａｌを保持していないことを示唆する。
【０１５３】
【表３】
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補体固定アッセイを、４体の胎仔すべてに由来する細胞について実行した。この補体溶解アッセイを、αｇａｌ発現の欠如についてのバイオアッセイとして展開した。ヒト血清は、α−ｇａｌに対する高レベルの予め形成された抗体ならびに補体調節タンパク質（Ｃ３経路）の完全なポートフォリオを含む。細胞の表面においてα−ｇａｌが存在していると、抗α−ｇａｌ抗体が結合する場合に、補体カスケードを活性化して、そして、補体媒介性細胞溶解を生じる。α−ｇａｌネガティブ細胞は、補体媒介性溶解に対して耐性である。これらの３つの別個の試験において、Ｂ１細胞およびコントロールブタ細胞を、ヒト血清＋補体に曝露し、そして、アッセイを、α−ｇａｌ誘導性補体媒介性細胞溶解に対する感受性または耐性を評価するために実施した。このアッセイを、Ｂ１−１細胞、Ｂ１−２細胞およびＢ１−４細胞、ならびに、ヘテロ接合性ＧＴ  ＫＯ（ノックアウト）細胞（Ｂ１−３、ｇａｌポジティブ）を用いて、そして、コントロールとして野生型α−ｇａｌ（＋）ＰＣＦＦ４−６ブタ細胞を使用して、実施した。細胞を、３つの処置のうちの１つに対して曝露した。２つのネガティブコントロールである、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および熱不活性化ヒト血清（ＨＩＡ−ＨＳ）は、いかなる機能性補体タンパク質も含まず、したがって、いかなる有意な細胞溶解をも引き起こすとは予測されなかった。第３の処置である非熱不活性化ヒト血清（ＮＨＳ）は、機能性ヒト補体ならびに抗ｇａｌ特異的抗体を含み、したがって、ガラクトースα１，３ガラクトースをそれらの細胞表面上に有する細胞を溶解すると予測された。
【０１５４】
図１に示される結果は、Ｂ１−１細胞、Ｂ−２細胞およびＢ１−４細胞がヒト補体媒介性溶解に対して耐性であり、他方、Ｂ１−３細胞（α１，３Ｇａｌポジティブである）は、いまだに、野生型のＰＣＦＦ４−６細胞がそうであるように、ヒト血漿に対して感受性であることを、明らかに示す。
【０１５５】
全ての胎仔からのｃＤＮＡの配列決定結果は、胎仔１、２、および４が、第２のα１，３ＧＴ対立遺伝子における点変異（機能的不全である酵素を生じ得る変化）を含むこと（図２を参照のこと）を示す。この変異は、そのコード領域のｂｐ４２４において、具体的には、α１，３ＧＴ（ＧＧＴＡ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３６１５２）のエキソン９の第２塩基対において、チミン残基からグアニン残基への変換（アミノ酸（ａａ）１４２におけるチロシンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換が起こる）として生じた。
【０１５６】
これは重要な変換である。なぜなら、親水性アミノ酸であるこのチロシンは、α１，３ＧＴのＵＤＰ結合部位における重要な成分であるからである（図３）。ウシα１，３ＧＴタンパク質の結晶構造分析によって、このチロシンは、その酵素の触媒性ドメインの中心であることが示され、このチロシンが、ＵＤＰ−Ｇａｌ結合に関与することが示された（Ｇａｓｔｉｎｅｌ  ｅｔ．  ａｌ．  ，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０  （４）：  ６３８−６４９，  ２００１）。したがって、アスパラギン酸（親水性アミノ酸）へのチロシン（疎水性アミノ酸）からの変化によって、（実際に観察されたように）αＧＴ機能の破壊が生じると予測された。
【０１５７】
変異したｃＤＮＡが機能的αＧＴタンパク質を生成しないことを確認するために、４つ全ての細胞の第２の対立遺伝子からのｃＤＮＡを、発現ベクターにクローニングし、このＧＴ発現ベクターをヒト線維芽細胞（ＨｅＬａ細胞）および霊長類であるアカゲザル細胞にトランスフェクトした。ヒトおよび旧世界ザルは、機能的α１，３ＧＴ遺伝子を欠くので、そのＨｅＬａ細胞は、レクチン結合実験によってアッセイされるように、それらの細胞表面にα１，３ガラクトースを有さない。ＨｅＬａ細胞およびサル細胞は、Ｂ１−１、Ｂ１−２およびＢ１−４細胞から得られたｃＤＮＡでトランスフェクトされた場合に、ＩＢ４−レクチン染色によって、なおα１，３Ｇａｌ陰性であったが、Ｂ１−３に由来するｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞およびアカゲザル細胞が、機能的α１，３ＧＴ転写物を生成し、その後α１，３Ｇａｌ陽性であったことが、結果から示された。明らかに、（チロシンの代わりに）アスパラギン酸変異を有する細胞は、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼを生成することができない。
【０１５８】
（実施例４：核ドナーとしてホモ接合性α１，３ＧＴ欠損胎仔線維芽細胞を使用するクローン化ブタの生産）
核移入のための細胞の調製。ドナー細胞を、上記に一般的に記載されるように、α１，３ＧＴ欠損性についてホモ接合性の細胞を生成するために遺伝子操作した。核移入を、核ドナー（本明細書中上記で詳細に記載されるように生成した）として毒素Ａ（トキシンＡ）選択ブタ線維芽細胞を使用する、当該分野で周知の方法によって行った（Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５，２００２；およびＰｏｌｅｊａｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０，２０００を参照のこと）。
【０１５９】
（胚移入および得られた生存仔の出産）
生きたα−１，３−ＧＴ  ｄＫＯ（ダブルノックアウト）ブタを核移入により生産しようとする最初の試みにおいて、合計１６個の胚移入を、遺伝子操作したドナー細胞を用いて行った。９頭の最初の妊娠が樹立されたが、妊娠７５日目を超えると、２頭しか残らなかった。５頭の子ブタが２００２年７月２５日に生まれた。１頭のブタは産まれて直ぐに死亡し、さらに４頭は、生きたまま産まれ、正常に見えた（図４）。
・（実施例５）
（ホモ接合性α１，３ＧＴノックアウトブタの分析）
尾部線維芽細胞および臍組織切片標本を、全５匹のダブルノックアウト仔ブタから得、先に記載したようにＧＳ−ＩＢ４レクチンを用いて染色した。染色は観察されなかった。このことは、これらの動物からの組織表面におけるガラクトースα１，３ガラクトースエピトープの完全な欠失を示す（データは示さず）。死亡した仔ブタ（７６１−１）から単離した大動脈内皮細胞および筋肉線維芽細胞および尾部線維芽細胞は、ＧＳ−ＩＢ４レクチン染色はネガティブだった。仔ブタ７６１−１からの筋肉繊維芽細胞のＦＡＣＳ分析もまた、ＧＳ−ＩＢ４結合についてネガティブな結果を示した。肝臓、腎臓、脾臓、皮膚、小腸、筋肉、脳、心臓、膵臓、肺、大動脈、舌、臍、および尾部の組織切片を、仔ブタ７６１−１から取得した。これらは、全て、ＧＳ−ＩＢ４染色でネガティブであった。このことは、検出可能な細胞表面α１，３Ｇａｌエピトープの完全な欠如を示している。（Ｐｈｅｌｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：  ４１１−４１４，２００３  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｆｉｇｕｒｅ  Ｓ３）。
【０１６０】
本発明者らは、α１，３ＧＴ−ノックアウトマウスを用いてインビボ免疫原性試験を実施した。本発明者らは、仔ブタ７６１−１の膵臓から単離した島様細胞クラスター（ＩＣＣ）を、α１，３ＧＴ−ノックアウトマウスに腹腔内注射した。本発者らは、コントロールとして新生の野生型仔ブタからのＩＣＣを使用した。図５に示されるように、α１，３Ｇａｌに対する免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の力価の増加は、α１，３ＧＴ  ＤＫＯ（ダブルノックアウト）仔ブタからのＩＣＣを注射した後のα１，３ＧＴノックアウトマウスでは観察されなかった。対照的に、野生型仔ブタＩＣＣを注射したマウスではＩｇＭ力価の有意な増加が観察された（Ｐｈｅｌｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：  ４１１−４１４，２００３、図Ｓ４に含める）。この結果は、ＤＫＯ（ダブルノックアウト）仔ブタ細胞がいかなるα１，３Ｇａｌエピトープも生成しないことを明らかに実証する。
【０１６１】
全５匹の仔ブタから得たＤＮＡの配列決定によって、これらの動物をクローン化するために使用した６８０Ｂ１−２細胞において観察されるように、ＧＧＴＡ１遺伝子のｂｐ４２４での変異の存在が確認された（図２）。
【０１６２】
これは、α−ＧＴ  ｄＫＯ（ダブルノックアウト）ブタの同腹仔の最初に成功した生成であるので、ｄＫＯ（ダブルノックアウト）仔ブタからの２匹の生じた同腹仔が、核移入によって生成された。１つの場合（同腹仔６６２）、核ドナー細胞としてｄＫＯ（ダブルノックアウト）胎仔線維芽細胞を用いた。同腹仔６６０を、核ドナーとして同腹仔７６１のメンバー由来の尾部線維芽細胞を用いる核移入によって生成した。これらの出生を、表４にまとめた。
【０１６３】
【表４】
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（実施例６）  （ダブルノックアウト（ＤＫＯ）ブタの小集団（ｍｉｎｉｈｅｒｄ）を確立するためのヘテロ接合性α１，３ＧＴシングルノックアウト（ＳＫＯ）雄性ブタおよび雌性ブタの交配（ｂｒｅｅｄｉｎｇ））
サザンブロットで確認したクローン化ＧＴ−ＳＫＯ雌性ブタ計２９匹、およびサザンブロットで確認したＧＴ−ＳＫＯ雄性ブタ計２５匹が、現在まで生まれた。これらの雄性および雌性のヘテロ接合性（単一遺伝子α１、３ＧＴ  ノックアウトブタ）を、自然交配および人工受精（ＡＩ）によって繁殖させ、前臨床試験およびヒト臨床試験において使用するためのＤＫＯブタ集団を生成した。本発明者らは、１３同腹仔から１６匹のα，３−ＧＴ  ＤＫＯ  仔ブタを生成した。
・本発明は、実施形態を参照して記載されている。本明細書中に記載される一般的な発明の他の実施形態およびその改変は、当業者にとって明らかであり、そしてそれらはすべて、本発明の範囲内にあると見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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