(57)【要約】【課題】繰り返し利用可能なイソプロピルアルコールを生産するイソプロピルアルコール生産微生物及び、この微生物を用いたイソプロピルアルコール生産方法を提供する。【解決手段】本発明は、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化され、かつイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの酵素の活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する耐酸性のイソプロピルアルコール生産酵母及びこれを用いてイソプロピルアルコールを生産する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化され、かつイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの酵素の活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する耐酸性のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項２】
前記酵母がサッカロマイシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項３】
前記遺伝子改変体が、宿主のコドン使用頻度に基づいて改変された遺伝子改変体である請求項１又は請求項２のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項４】
前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群におけるそれぞれの酵素をコードする酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌、エシェリヒア属細菌、アセタブラリア属酵母又はサッカロマイシス属酵母よりなる群から選ばれた酵素遺伝子に由来するものである請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項５】
前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子が、クロストリジウム属細菌に由来するものである請求項４記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項６】
前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群におけるそれぞれの酵素をコードする酵素遺伝子の発現が増強されている請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項７】
さらに、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの酵素の活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
【請求項８】
前記遺伝子改変体を含む前記イソプロピルアルコール生産酵素群におけるそれぞれの酵素をコードする酵素遺伝子のいずれかが、下記のアミノ酸コドン使用頻度の少なくとも１つを満たすものである請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のイソプロピルアルコール生産微生物：
（１）  アラニンをコードしているコドン［ＧＣＴ：ＧＣＣ：ＧＣＡ：ＧＣＧ］の比が［３５以上４５以下：１５以上２５以下：２５以上４０以下：０以上１５以下］、
（２）  アスパラギンをコードしているコドン［ＡＡＴ：ＡＡＣ］の比が［４５以上７０以下：３０以上５５以下］、
（３）  システインをコードしているコドン［ＴＧＴ：ＴＧＣ］の比が［５０以上８０以下：２０以上５０以下］、
（４）  グリシンをコードしているコドン［ＧＧＴ：ＧＧＣ：ＧＧＡ：ＧＧＧ］の比が［４５以上５５以下：１５以上２５以下：１０以上２５以下：０以上１５以下］、
（５）  グルタミン酸をコードしているコドン［ＧＡＡ：ＧＡＧ］の比が［６０以上７５以下：２５以上４０以下］、
（６）  イソロイシンをコードしているコドン［ＡＴＴ：ＡＴＣ：ＡＴＡ］の比が［４５以上６０以下：２０以上３０以下：２０以上３０以下］、
（７）  ロイシンをコードしているコドン［ＴＴＡ：ＴＴＧ：ＣＴＴ：ＣＴＣ：ＣＴＡ：ＣＴＧ］の比が［２５以上４０以下：２５以上４０以下：５以上１５以下：０：１０以上１５以下：５以上１５以下］、
（８）  フェニルアラニンをコードしているコドン［ＴＴＴ：ＴＴＣ］の比が［５５以上７５以下：２５以上４５以下］。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のイソプロピルアルコール生産酵母を用いてイソプロピルアルコールを生産するイソプロピルアルコール生産方法。
【請求項１０】
イソプロピルアルコールを生産する前又は後に、前記イソプロピルアルコール生産酵母を、ｐＨ４以下の酸処理することを含む請求項９に記載のイソプロピルアルコール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール生産酵母及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。
【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する菌は既に知られている（特許文献１、２及び３公報参照）。中でも、特許文献１に記載の大腸菌はグルコースを原料としてイソプロピルアルコールを高生産することが可能であり、イソプロピルアルコールの工業生産用生体触媒として優れている。
【０００４】
微生物などの培養による物質生産方法である発酵法は主としてバッチ発酵法と連続発酵法に分類することができる。バッチ発酵法では短時間に培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。時間の経過と共に発酵培養液中の生産物の濃度が高くなり、生産物の阻害等の影響により生産性や収率が低下してしまうため、長時間にわたり安定的かつ高収率、高い生産性を保つのは困難である。
【０００５】
これに対して、連続発酵法では微生物を分離膜等で濾過し、濾液から生産物を回収し、また濾過された微生物を発酵培養液に保持、または還流させることにより、長時間にわたり、安定した高い物質生産性を得ることができることが報告されている（特許文献４参照）。
【０００６】
一方で、微生物を連続的に培養する際には雑菌汚染をいかに防ぐかが重要になる。また、微生物を雑菌汚染から防ぐ方法としては例えば濾過滅菌や高温処理といった様々な方法がある。バッチ発酵法及び連続発酵法において培養が長時間に渡れば、雑菌汚染のリスクが上昇する。
【０００７】
このような観点から、微生物を回収し、リサイクルすることができれば更に長時間に渡り物質生産をすることが可能となる。しかしながら、大腸菌、Clostridium butanoiacetonicus G.V、又はクロストリジウム属細菌では雑菌汚染に弱いことが知られている。このように、リサイクルに適したイソプロピルアルコールを醗酵生産する微生物は未だ見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開２００９／００８３７７号パンフレット
【特許文献２】中国特許出願公開第ＣＮ１０４３９５６Ａ
【特許文献３】特開昭６１−６７４９３号公報
【特許文献４】特開２００７−２５２３６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、既存のイソプロピルアルコール生産菌は連続的にイソプロピルアルコールを工業的に生産する上で問題があった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、繰り返し利用可能なイソプロピルアルコールを生産する微生物、この微生物を用いたイソプロピルアルコール生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］  イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化され、かつイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの酵素の活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する耐酸性のイソプロピルアルコール生産酵母。
［２］  前記酵母がサッカロマイシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である［１］記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
［３］  前記遺伝子改変体が、宿主のコドン使用頻度に基づいて改変された遺伝子改変体である［１］又は［２］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
［４］  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群におけるそれぞれの酵素をコードする酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌、エシェリヒア属細菌、アセタブラリア属酵母又はサッカロマイシス属酵母よりなる群から選ばれた酵素遺伝子に由来するものである［１］から［３］のいずれか１に記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
［５］  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子が、クロストリジウム属細菌に由来するものである［４］記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
［６］  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群におけるそれぞれの酵素をコードする酵素遺伝子の発現が増強されている［１］から［５］のいずれか１に記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
［７］  さらに、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの酵素の活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する［１］から［６］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産酵母。
［８］前記遺伝子改変体を含む前記イソプロピルアルコール生産酵素群におけるそれぞれの酵素をコードする酵素遺伝子のいずれかが、下記のアミノ酸コドン使用頻度の少なくとも１つを満たすものである［１］から［７］のいずれか１に記載のイソプロピルアルコール生産微生物：
（１）  アラニンをコードしているコドン［ＧＣＴ：ＧＣＣ：ＧＣＡ：ＧＣＧ］の比が［３５以上４５以下：１５以上２５以下：２５以上４０以下：０以上１５以下］、
（２）  アスパラギンをコードしているコドン［ＡＡＴ：ＡＡＣ］の比が［４５以上７０以下：３０以上５５以下］、
（３）  システインをコードしているコドン［ＴＧＴ：ＴＧＣ］の比が［５０以上８０以下：２０以上５０以下］、
（４）  グリシンをコードしているコドン［ＧＧＴ：ＧＧＣ：ＧＧＡ：ＧＧＧ］の比が［４５以上５５以下：１５以上２５以下：１０以上２５以下：０以上１５以下］、
（５）  グルタミン酸をコードしているコドン［ＧＡＡ：ＧＡＧ］の比が［６０以上７５以下：２５以上４０以下］、
（６）  イソロイシンをコードしているコドン［ＡＴＴ：ＡＴＣ：ＡＴＡ］の比が［４５以上６０以下：２０以上３０以下：２０以上３０以下］、
（７）  ロイシンをコードしているコドン［ＴＴＡ：ＴＴＧ：ＣＴＴ：ＣＴＣ：ＣＴＡ：ＣＴＧ］の比が［２５以上４０以下：２５以上４０以下：５以上１５以下：０：１０以上１５以下：５以上１５以下］、
（８）  フェニルアラニンをコードしているコドン［ＴＴＴ：ＴＴＣ］の比が［５５以上７５以下：２５以上４５以下］。
［９］  ［１］から［８］のいずれか１に記載のイソプロピルアルコール生産酵母を用いてイソプロピルアルコールを生産するイソプロピルアルコール生産方法。
［１０］  イソプロピルアルコールを生産する前又は後に、前記イソプロピルアルコール生産酵母を、ｐＨ４以下の酸処理することを含む［９］に記載のイソプロピルアルコール生産方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、繰り返し利用可能なイソプロピルアルコールを生産するイソプロピルアルコール生産酵母及び、この酵母を用いたイソプロピルアルコール生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のイソプロピルアルコール生産酵母は、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼからなるイソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化され、かつイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する耐酸性のイソプロピルアルコール生産酵母である。
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産酵母を用いてイソプロピルアルコールを生産することを含むものである。
【００１３】
本発明のイソプロピルアルコール生産酵母は、耐酸性の酵母である。また、上記のイソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化され、且つ該酵素群より選択された少なくとも１つの酵素をコードする酵素遺伝子が、遺伝子改変体として導入されているので、本来的にイソプロピルアルコール生産能を有しない酵母種であっても、イソプロピルアルコール生産が可能である。さらに本発明のイソプロピルアルコール生産酵母は、耐酸性を備えるため、酸処理によって雑菌汚染を防ぎ、再利用可能である。
【００１４】
本明細書における活性の「付与」又は「強化」とは、菌体外から宿主へ導入された遺伝子に基づいて当該宿主での酵素遺伝子（由来を問わず）の発現量が増大することを意味し、酵素をコードする遺伝子を宿主酵母の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主酵母がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたもの、或いは当該酵素遺伝子のリプレッサー活性を低減化又は不活化することの結果として当該酵素活性を強化させることを含む。
【００１５】
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のイソプロピルアルコール生産酵母となる当該酵母を意味する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
以下、本発明について説明する。
【００１６】
［イソプロピルアルコール生産酵母］
本発明のイソプロピルアルコール生産酵母は、上記イソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化され、かつイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの活性が、遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する耐酸性のイソプロピルアルコール生産酵母である。
【００１７】
本発明における宿主としては、耐酸性のある酵母である。
本発明において「耐酸性」とは、再利用処理に用いる酸に対して、イソプロピルアルコールの生産能が失われない程度に抵抗性を有することを意味する。具体的にはｐＨ４以下のｐＨ条件下で、イソプロピルアルコールの生産能が消失しない酵母が包含される。
【００１８】
このような宿主酵母とは、特に、サッカロマイシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌、シゾサッカロマイシス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌、ピケア属（Ｐｉｃｈｉａ）菌等が例示される。中でも酸処理への抵抗性の高さ及びアルコールへの耐性の観点から、利便性が高く、工業的な使用の実績が豊富なサッカロマイシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：出芽酵母）が好適に使用される。
【００１９】
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）等のバチルス属細菌、アセタブラリア・アセタブラム（Ａｃｅｔａｂｕｌａｒｉａ  ａｃｅｔａｂｕｌｕｍ）等のアセタブラリア属由来のものが挙げられる。
【００２０】
本発明の宿主酵母に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２１】
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
【００２２】
本発明の宿主酵母に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２３】
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
【００２４】
本発明の宿主酵母に導入されるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２５】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、サッカロマイシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）等のズーグロア属細菌、リゾビウム種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
【００２６】
本発明の宿主酵母に導入されるチオラーゼをコードする遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、サッカロマイシス・セレビシエ等の酵母、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、サッカロマイシス・セレビシエ、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２７】
このうち、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性がクロストリジウム属細菌由来もしくはエシェリヒア属細菌由来であり、及びチオラーゼ活性がサッカロマイシス属菌由来である場合又は、これら４種類の酵素がいずれもクロストリジム属細菌由来である場合が、更に好ましい。
【００２８】
また宿主酵母によって異なるが、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼからなる群より選択された少なくとも１つの酵素の活性が、導入遺伝子に由来するものであり、チオラーゼの活性が内在性遺伝子の発現増強に由来するものであることが、イソプロピルアルコールの生産能の観点から好ましい。
【００２９】
なかでも本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、エシェリヒア・コリ又はサッカロマイシス・セレビシエのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、チオラーゼが、サッカロマイシス・セレビシエ、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来であり、及びチオラーゼ活性がサッカロマイシス・セレビシエ由来であることが特に好ましい。
【００３０】
本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、エシェリヒア・コリ、サッカロマイシス・セレビシエ由来のものであることが酵素活性の観点から好ましい。
【００３１】
本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母では、上記イソプロピルアルコール生産酵素のうち、少なくともイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの酵素の活性が、遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する。
本発明において「遺伝子改変体」とは、当該酵素遺伝子の塩基配列に、欠失、置換、付加等の改変を加えたものすべてが含まれる。具体的には、当該酵素遺伝子の塩基配列のうち、コドンのみに変更を加え、当該コドンのみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものや、当該酵素遺伝子のプロモーター領域のみに変更を加え、当該プロモーター領域のみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものなどが挙げられる。
改変される酵素遺伝子は、宿主本来の遺伝子であってもよく、多種の酵母由来の酵素遺伝子であってもよい。
またイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子のみが、遺伝子改変されていてもよく、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ以外の酵素をコードする酵素遺伝子も同時に遺伝子改変されていてもよい。具体的には、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素遺伝子のコドン、及び、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする酵素遺伝子のコドンが改変されているものや、チオラーゼをコードする酵素遺伝子のプロモーター領域、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素遺伝子のコドン、及び、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする酵素遺伝子のコドンが改変されているものなどが挙げられる。
【００３２】
遺伝子改変体としては、遺伝子改変の結果、宿主に対して対応する酵素の酵素活性が付与され又は強化されるものであれば、どのような改変を加えてもよい。
好ましくは、遺伝子改変体は、酵母のコドン使用頻度に基づいて使用コドンを改変した改変体遺伝子である。このような遺伝子改変体とすることにより、本来的にイソプロピルアルコール生産能を有しない酵母であっても、イソプロピルアルコールを生産することができる。
【００３３】
本発明において使用コドンを改変するとは、アミノ酸配列を規定する遺伝子配列上において、各アミノ酸に対応する３塩基の並びであるコドンを改変することを意味する。コドン改変ではアミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを改変することを意味している。
例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、エシェリヒア・コリでは、コドン使用頻度が例えば宿主を酵母とした場合、宿主とは大きく異なっている。
【００３４】
表１に示したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの配列を比較したところ、アラニンをコードしているコドンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧである。イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ配列では、ＧＣＡを５０％の使用頻度、ＧＣＣを０％の使用頻度であるが、導入する宿主に合わせてＧＣＣ、ＧＣＡの比を２２：２６〜３０にすることで、宿主内のＧＣＡの使用頻度の偏りを防ぐことができ、宿主内での酵素の発現量を上昇させることができる。
【００３５】
本発明における代表的なアミノ酸のコドン使用頻度を表１から表６に示す。表では一つのコドンにより規定されているアミノ酸は除いた。表１はイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＩＰＡｄｈ）のコドン使用頻度（オリジナル）、本発明におけるコドン改変後のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ（＃１  配列番号３５、＃２  配列番号５２）のコドン使用頻度、表２はアセト酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）のコドン使用頻度（オリジナル）、本発明におけるコドン改変後のアセト酢酸デカルボキシラーゼ（配列番号５８）のコドン使用頻度、表３から表６はＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢ、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ）のコドン使用頻度（オリジナル）、本発明におけるコドン改変後のＣｏＡトランスフェラーゼ（改変ｃｔｆＡ  配列番号６２、改変ｃｔｆＢ  配列番号６６、改変ａｔｏＤ  配列番号７０、改変ａｔｏＡ  配列番号７４）のコドン使用頻度を表す。
【００３６】
本発明においては、これらを考慮し、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼのコドンの偏りをなくすためのコドン改変を行うことが好ましい。さらに好ましいアミノ酸の使用頻度（％）を以下に示す。ただし、全配列の該当アミノ酸の数が２以下のときは除いた。
参考に用いたコドン使用頻度は財団法人かずさＤＮＡ研究所のデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎに記載されているサッカロマイシス・セレビシエのデータを用いた。データ上ではＲＮＡ上のウラシル（Ｕ）で表記してあるが、本文中ではＤＮＡ配列に習い、チミジン（Ｔ）として表記した。データ中の各コドン使用頻度を各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を合計し、その値を１００とし、各アミノ酸のコドンに対応する使用頻度を算出した。例としてリジンの使用頻度を記載する。データ上のリジンをコードするコドンの使用頻度はＡＡＡ：ＡＡＧ＝４１．９：３０．８となっている。リジンをコードする各コドンの使用頻度（％）はＡＡＡ：ＡＡＧ＝４１．９／（４１．９＋３０．８）ｘ１００：３０．８／（４１．９＋３０．８）＝５７．６：４２．４と算出した。以上の計算をすべてのアミノ酸に対応するコドンにつき算出し、算出したサッカロマイシス・セレビシエのコドン使用頻度（％）を理想値とした。
【００３７】
アラニンのコドンＧＣＴ：ＧＣＣ：ＧＣＡ：ＧＣＧの使用頻度を３５以上４５以下：１５以上２５以下：２５以上４０以下：０以上１５以下へ改変することが好ましい。アスパラギンのコドンＡＡＴ：ＡＡＣの使用頻度を４５以上７０以下：３０以上５５以下へ改変することが好ましい。グリシンのコドンＧＧＴ：ＧＧＣ：ＧＧＡ：ＧＧＧの使用頻度を４５以上５５以下：１５以上２５以下：１０以上２５以下：０以上１５以下へ改変することが好ましい。グルタミン酸のコドンＧＡＡ：ＧＡＧの使用頻度を６０以上７５以下：２５以上４０以下へ改変することが好ましい。システインのコドンＴＧＴ：ＴＧＣの使用頻度を５０以上８０以下：２０以上５０以下へ改変することが好ましい。イソロイシンのコドンＡＴＴ：ＡＴＣ：ＡＴＡの使用頻度を４５以上６０以下：２０以上３０以下：２０以上３０以下へ改変することが好ましい。ロイシンのコドンＴＴＡ：ＴＴＧ：ＣＴＴ：ＣＴＣ：ＣＴＡ：ＣＴＧの使用頻度を２５以上４０以下：２５以上４０以下：５以上１５以下：０：１０以上１５以下：５以上１５以下へ改変することが好ましい。リジンのコドンＡＡＡ：ＡＡＧの使用頻度を５０以上６５以下：３５以上５０以下へ改変することが好ましい。フェニルアラニンのコドンＴＴＴ：ＴＴＣの使用頻度を５５以上７５以下：２５以上４５以下へ改変することが好ましい。プロリンのコドンＣＣＴ：ＣＣＣ：ＣＣＡ：ＣＣＧの使用頻度を３０以上４０以下：１０以上４０以下：３５以上５０以下：０以上１５以下へ改変することが好ましい。チロシンのコドンＴＡＴ：ＴＡＣの使用頻度を５５以上７０以下：３０以上４５以下へ改変することが好ましい。バリンのコドンＧＴＴ：ＧＴＣ：ＧＴＡ：ＧＴＧの使用頻度を４０以上５０以下：１５以上２５以下：１５以上２５以下：１５以上２０以下へ改変することが好ましい。
より好ましいものの組み合わせ
【００３８】
これらのアミノ酸についての使用コドンの使用頻度については、各表のそれぞれについて、いずれか１つのアミノ酸について満たされていればよく、２つ以上のアミノ酸について満たされていることがより好ましく、下記のアミノ酸のすべてについて満たされていることが最も好ましい。このような遺伝子改変体を使用することによって、イソプロピルアルコール生産酵素群の活性が付与又は強化されることにより、宿主内での酵素の発現量を上昇させることができ、結果として、宿主内での酵素の濃度を高くすることできる。
【００３９】
【表１】
2011097929.tif 000002
【００４０】
【表２】
2011097929.tif 000003
【００４１】
【表３】
2011097929.tif 000004
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
【表６】
2011097929.tif 000007
【００４５】
本発明におけるこれらの酵素の活性の付与又は強化は、細胞外から細胞内へ遺伝子改変体を導入したり、宿主酵母がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化したり、又は、他のプロモーターと置換したりする等によって実現することができるが、これらの方法に限定されるものではない。
また、本発明において、酵素の活性が付与又は強化されるとは、当該酵素をコードする酵素遺伝子のコピー数が増加すること、各酵素の活性を公知の方法により測定した場合に活性が上昇すること、宿主内での酵素の発現量が上昇していること、又は、宿主内での酵素の濃度が上昇していること等が挙げられる。
【００４６】
酵素活性を付与又は強化する方法としては、例えば、それら４種類の酵素をコードする酵素遺伝子を、遺伝子組換え技術を用いて宿主酵母の細胞外から細胞内に導入することにより行う方法等が挙げられる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。細胞外から細胞内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ    Ｃｈａｉｎ    Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，    Ｊ．，    ｅｔ．ａｌ．，    ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。
【００４７】
プロモーター活性を強化するため又は酵素遺伝子を強発現させるために用いられるプロモーターとしては、宿主酵母中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターなどの、宿主酵母に由来するプロモーターが用いられる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのように、外来のプロモーターを用いてもよい。これらは用いる酵素の由来や種類によって適宜選択することができる。
【００４８】
例えば宿主酵母由来のチオラーゼの活性を強化するためには、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよいが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等からなる群の例示プロモーターから１つ以上を適宜選択することができる。また、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等のプロモーターは、宿主酵母由来のチオラーゼのプロモーターと置換するために用いることができる。
【００４９】
これらのプロモーターは、対象となる酵素遺伝子が発現可能となるように、通常の方法に従って宿主酵母細胞へ導入すればよく、例えば、対象となる酵素遺伝子と同一のベクターに連結し、酵素遺伝子と共に宿主細胞へ導入すればよい。
【００５０】
本発明のイソプロピルアルコール生産酵母としては、再利用効率及びイソプロピルアルコールの生産能の観点から酵母を宿主とし、酵母のコドン使用頻度に基づいて、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子の使用コドンを改変した改変体遺伝子を導入したイソプロピルアルコール生産酵母であることが好ましい。
さらに、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素遺伝子の使用コドン、及び、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする酵素遺伝子の使用コドンが改変されているものがより好ましく、チオラーゼをコードする酵素遺伝子のプロモーター領域、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする酵素遺伝子の使用コドン、及び、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする酵素遺伝子の使用コドンが改変されているものなどが最も好ましい。
【００５１】
［イソプロピルアルコールの生産方法］
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、上述した本発明のイソプロピルアルコール生産酵母を用いてイソプロピルアルコールを生産することを含む。
これにより、本発明によれば、酵母を酸で処理することにより連続的にイソプロピルアルコールを生産することができる。
【００５２】
イソプロピルアルコール生産酵母を用いてイソプロピルアルコールを生産するには、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母を、植物由来原料と接触させればよい。植物由来原料とは、植物から得られる炭素源であり、酵母が代謝し、イソプロピルアルコールに変換しうるものであれば特に限定はされない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、酵母が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
【００５３】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、シュークロース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物やセルロース加水分解物などが例示できる。更には植物油由来のグリセリンや脂肪酸も、本発明における炭素源に該当する。
本発明における植物由来原料としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等を好ましく用いることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
【００５４】
本発明のイソプロピルアルコール生産酵母は、これらの植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成する能力を有するものであればよく、例えば培養によって植物由来原料を資化し、一定時間後に培養液中にイソプロピルアルコールを分泌する。
即ち、本発明にイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産酵母と植物由来原料とを含む混合物中でイソプロピルアルコール生産酵母を培養すること（培養工程）と、培養液からイソプロピルアルコールを精製すること（精製工程）を含む。
【００５５】
イソプロピルアルコールの生産方法における混合物は、酵母類の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とするものであればよく、イソプロピルアルコール生産酵母の種類に応じて通常用いられる培地であればいずれでも使用することができる。
このような基本培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。
【００５６】
窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、硝酸体窒素、アンモニアガス、アンモニア水、蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。
有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
【００５７】
混合物中の植物由来原料の量は、その種類や混合物に含まれるイソプロピルアルコール生産酵母の活性及び数によって異なるが、一般に、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、酵母の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、酵母の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
【００５８】
また、通常酵母の培地に添加される他の添加成分、例えば抗生物質等を、通常用いられる量で含むものであってもよい。なお、反応時の発泡を抑制するために消泡剤を適量添加することが好ましい。
本発明に使用される培地としては、水性媒体を基本とする液体培地や、寒天等の固相を基本とする固体培地を挙げることができるが、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。液体培地を構成する水性媒体としては、蒸留水、緩衝液等、通常用いられるものを使用することができる。
【００５９】
本発明の本培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でｐＨ２．６〜９、好ましくはｐＨ２．６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。
【００６０】
精製工程では、培養液中のイソプロピルアルコールが回収される。培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離、抽出等、通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。
【００６１】
なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産酵母を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産酵母の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
【００６２】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産酵母及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産酵母を培養する培養工程を含む。
この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産酵母を培養する（通気培養）。
なお、培養工程は、混合物全体を攪拌しながら行うことが好ましい。これにより、イソプロピルアルコール生産酵母と植物由来原料との混合が良好に行われると共に、混合物中に供給された気体が混合物全体に効率よく行き渡るようにすることができる。
【００６３】
培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産酵母の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまでであり、好ましくは１０時間以上であればよく、イソプロピルアルコール生産酵母の活性が低下した後も酸処理を行うことにより更に継続させることができる。また、植物由来原料の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができる。
【００６４】
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、培養工程の前又は、イソプロピルアルコールの回収工程の後に、イソプロピルアルコール生産酵母を、ｐＨ４以下の酸処理することを含むことが好ましい。
この酸処理によって、イソプロピルアルコール生産酵母を洗浄し、ウイルス感染等を防止することができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産酵母は、酸耐性であるので、この酸処理によってイソプロピルアルコールの生産能が失われず、その後に生産用培地で培養することによって、イソプロピルアルコールを繰り返し生産する。この結果、一度使用したイソプロピルアルコール生産酵母を再利用（リサイクル）することが可能となる。
【００６５】
本発明のイソプロピルアルコール生産酵母のリサイクルのための酸処理では、汚染防止の観点からｐＨ４以下の酸、さらにはｐＨ２．６〜３．４の酸であることがさらに好ましい。
酸処理は、一般に、イソプロピルアルコール生産酵母が含有する培養液に、感染予防に有効なｐＨに必要な量の酸を添加すればよく、添加量は、用いられる酸の種類、培地のｐＨ、イソプロピルアルコール生産酵母の数等により適宜設定される。
酸としては、無機酸、有機酸、その組み合わせ、またはそれらの緩衝液などを用いることができ、たとえば、無機酸としては硫酸、塩酸、リン酸、有機酸としては、クエン酸、フタル酸、コハク酸、酢酸、その他グリシンなどが必要に応じて適宜使用できる。
【００６６】
酸処理は、イソプロピルアルコールを回収した後であってもよく、イソプロピルアルコールを生産する前であってもよい。イソプロピルアルコールの生産前の場合には、処理後のイソプロピルアルコール生産酵母を単離、洗浄してから、生産用培地へ移すことが好ましい。
処理時間は、６時間以上であればよく、汚染防止と菌体保持の観点から６時間以上数日程度とすることが好ましい。
【実施例】
【００６７】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。
［実施例１］
＜クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
クロストリジウム属細菌のイソプロピルアルコール生成酵素４種のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００１４３７に記載のゲノム配列の相補鎖３００５９６３〜３００７３６４に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ７２８３１に、アセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１５７３０７に記載されている。さらにこれら４種の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｚ２５４７９の塩基配列情報において、１１３−６１２に記されているサッカロマイシス・セレビシエ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（以下ＡＤＨ１と呼ぶ）のプロモーター配列を、ターミネーターの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ２６３４７の塩基配列情報において、５８１−７８０に記されているサッカロマイシス・セレビシエ由来のチトクロムＣ（以下ＣＹＣ１と呼ぶ）ターミネーター配列を使用することができる。
【００６８】
チオラーゼ遺伝子を取得するために、クロストリジウム・アセトブチリカム（ＡＴＣＣ８２４）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＡＧＣＴＡ（配列番号１）、及びＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＴＡＴ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株（ＡＴＣＣ  ２６７８６）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号３）、及びＴＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴＴＧＴ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＴＡＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号５）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた３つのＤＮＡフラグメントをＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号３）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、制限酵素ＸｂａＩで消化することでＡＤＨ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．９ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。
【００６９】
ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子Ａ（ｃｔｆＡ）を取得するために、クロストリジウム・アセトブチリカムのゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴ（配列番号７）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡ（配列番号８）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号９）、及びＡＡＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号１０）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた２つのＤＮＡフラグメントをＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号９）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡ（配列番号８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．２ｋｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼＡフラグメントを得た。
【００７０】
またＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子Ｂ（ｃｔｆＢ）を取得するために、クロストリジウム・アセトブチリカムのゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧ（配列番号１１）、及びＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＴＧＴＣＴＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＡＧ（配列番号１２）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＴＡ（配列番号１３）、及びＣＴＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号１４）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１５）、及びＴＡＴＣＡＡＧＴＣＴＡＧＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＴＴＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号１７）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた４つのＤＮＡフラグメントをＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１５）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーター、ＡＤＨ１ターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．６ｋｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼＢフラグメントを得た。
【００７１】
上記のＣｏＡトランスフェラーゼＡフラグメント及びＣｏＡトランスフェラーゼＢフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＣＴＦＡＢを回収した。
【００７２】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、クロストリジウム・アセトブチリカムのゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡ（配列番号１８）、及びＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＣ（配列番号１９）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＴＡＡＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号２１）によりＰＣＲ法で増幅し、ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号２２）、及びＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号２３）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた４つのＤＮＡフラグメントをＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号２３）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することでＡＤＨ１プロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．６ｋｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。
【００７３】
なお、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４）、サッカロマイシス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０株  ＡＴＣＣ  ２６７８６）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【００７４】
更に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、クロストリジウム・ベイジェリンキ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号２４）、及びＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＡＡ（配列番号２５）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＣＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号２６）によりＰＣＲ法で増幅し、ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号２７）、及びＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号２８）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた３つのＤＮＡフラグメントをＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号２８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することでＡＤＨ１アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ＣＹＣ１ターミネーターをコードするＤＮＡ配列を含む約２．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。
【００７５】
なお、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３）は細胞・微生物バンクであるＶＴＴカルチャーコレクションより入手することができる。
【００７６】
上記のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメント、ｐＣＴＦＡＢフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントと、プラスミドｐＹＥｐｌａｃＮＡＴ（ＹＥｐｌａｃ１９５のマーカー遺伝子領域にＰＣＲにて増幅したＣｌｏｎｅＮａｔ１遺伝子を組み込んだプラスミド）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ（Ｄｉｆｃｏ  ２４４５２０）寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ（Ｄｉｆｃｏ  ２４４６２０）液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡ−ＣＴＦＡＢを回収した。ＣｌｏｎｅＮａｔ１遺伝子はＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，  Ａ．Ｌ．  ｅｔ．ａｌ．  （１９９９）  Ｙｅａｓｔ  １５，１５４１−１５５３などに記載されている。なお、ＹＥｐｌａｃ１９５（ＡＴＣＣ  ８７５８９）は細胞・微生物バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【００７７】
上記のチオラーゼフラグメントと、プラスミドｐＹＥｐｌａｃＫＡＮ（ＹＥｐｌａｃ１９５のマーカー遺伝子領域にＰＣＲにて増幅したｋａｎＭＸ４遺伝子を組み込んだプラスミド）を制限酵素ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＴＨＩを回収した。ｋａｎＭＸ４遺伝子はＷａｃｈ，  Ａ．  ｅｔ．ａｌ．  （１９９４）  Ｙｅａｓｔ  １０，  １７９３−１８０８などに記載されている。
【００７８】
上記のアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントと、プラスミドｐＴＨＩを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＤＣ−ＴＨＩを回収した。
上記プラスミドｐＩＰＡ−ＣＴＦＡＢとｐＡＤＣ−ＴＨＩをサッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株に形質転換し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ  ２４２７２０）寒天プレートで、３０℃で二晩培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体［ｐＩＰＡ−ＣＴＦＡＢとｐＡＤＣ−ＴＨＩ／Ｘ２１８０株］を得た。
【００７９】
［実施例２］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡ−ＣＴＦＡＢとｐＡＤＣ−ＴＨＩ／Ｘ２１８０株］によるイソプロピルアルコール生産（比較例）＞
前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ培養液を５ｍＬ入れ、実施例１において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡ−ＣＴＦＡＢとｐＡＤＣ−ＴＨＩ／Ｘ２１８０株］を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。
また同様の培地組成並びに培養条件でサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＹＥｐｌａｃＮＡＴとＹＥｐｌａｃＫＡＮ／Ｘ２１８０株］を振とう培養した。
【００８０】
各々の前培養液全量を、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を４０ｍＬ入れた１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。培養開始９６時間後、１５０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。
サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡ−ＣＴＦＡＢとｐＡＤＣ−ＴＨＩ／Ｘ２１８０株］、サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＹＥｐｌａｃＮＡＴとＹＥｐｌａｃＫＡＮ／Ｘ２１８０株］において、イソプロピルアルコールの蓄積はなかった。
【００８１】
［実施例３］
＜サッカロマイシス・セレビシエ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
サッカロマイシス・セレビシエのチオラーゼ、エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、サッカロマイシス・セレビシエのチオラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＥＦ０５９４４７に記載されている。エシェリヒア・コリのチオラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２４１３１〜２３２５３１５に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２７８１に記載されている。
【００８２】
これらと共に実施例１記載のクロストリジウム属細菌由来のチオラーゼ遺伝子、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。これら４種の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＦＪ４１５２２６の塩基配列情報において、１２１−７８１に記されているサッカロマイシス・セレビシエ由来のホスホグリセレートキナーゼ（以下ＰＧＫ１と呼ぶ）のプロモーター配列を、ターミネーターの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ５９７２０の塩基配列情報において、１３８９９１−１３９２７２に記されているサッカロマイシス・セレビシエ由来のＰＧＫ１ターミネーター配列を使用することができる。
【００８３】
ＰＧＫ１プロモーターを取得するためサッカロマイシス・セレビシエ  Ｓ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ  ２６１０８）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＣ（配列番号２９）、及びＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡ（配列番号３０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩで消化することで約７００ｂｐのＰＧＫ１プロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。また、マルチクローニングサイトを挿入するためＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴ（配列番号３１）、及びＴＴＴＴＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣ（配列番号３２）をアニーリングし、得られたフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌIIで消化することで約５０ｂｐのマルチクローニングサイトにあたるＤＮＡ配列を得た。さらに、ＰＧＫ１ターミネーターを取得するためサッカロマイシス・セレビシエ  Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴ（配列番号３３）、及びＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＧＡＡＣＧＣＡＧＡ（配列番号３４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢｇｌII、ＮｏｔＩで消化することで約３００ｂｐのＰＧＫ１プロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。
【００８４】
得られた３つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＲＳ４０２＋２μｍ、ｐＲＳ４０３＋２μｍ、ｐＲＳ４０４＋２μｍ、ｐＲＳ４０５＋２μｍ、ｐＲＳ４０６＋２μｍ（Ｉｓｈｉｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｖｏｌ．１４５，  Ｎｏ．６，  ｐ．７０１−７０８，  （２００９）をそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＫ４２２（ＡＤＥ２）、ｐＧＫ４２３（ＨＩＳ３）、ｐＧＫ４２４（ＴＲＰ１）、ｐＧＫ２４５（ＬＥＵ２）、ｐＧＫ４２６（ＵＲＡ３）を回収した。
【００８５】
２μｍはＫａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｖｏｌ．４４，  ｐ．７５９−７６５，  （１９９６）に記載されている２μｍを用いており、ｐＲＳ４０２＋２μｍ、ｐＲＳ４０３＋２μｍ、ｐＲＳ４０４＋２μｍ、ｐＲＳ４０５＋２μｍ、ｐＲＳ４０６＋２μｍの詳細はＩｓｈｉｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｖｏｌ．１４５，  Ｎｏ．６，  ｐ．７０１−７０８，  （２００９）に記載されている。プラスミドｐＲＳ４０２（ＡＴＣＣ  ８７４７７）、ｐＲＳ４０３（ＡＴＣＣ  ８７５１４）、ｐＲＳ４０４（ＡＴＣＣ  ８７５１５）、ｐＲＳ４０５（ＡＴＣＣ  ８７５１６）、ｐＲＳ４０６（ＡＴＣＣ  ８７５１７）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【００８６】
コドン改変したクロストリジウム・ベイジェリンキのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号３５）を作成した。配列を以下に記す。
ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＡＧＧＣＣＴＣＴＴＧＣＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＴＴＡＡＧＧＡＣＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＴＡＧＣＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＧＣＧＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＣＧＧＧＣＡＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＧＡＴＡＡＴＴＡＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＴＴＴＡＣＴＴＡＴＡＣＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＣＣＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＡＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＴＴＡＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＧＴＡＴＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＡＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴ
なお、コドン改変したクロストリジウム・ベイジェリンキのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号３５のうち、７番目の塩基から１０６２番目の塩基によってコードされている。配列番号３５のうち、１０６０番の塩基から１０６２番の塩基（ＴＧＡ）は終止コドンである。また、最初と最後のそれぞれ６塩基は、酵素をコードしていない。
上記のＤＮＡフラグメントを挿入しているベクターを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌIIで消化することで約１．１ｋｂｐのコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２６を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡｃ１を回収した。
【００８７】
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＧＴＧＣＧＧＴＡ（配列番号３６）、及びＧＧＧＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡＴ（配列番号３７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＸｍａＩで消化することで約１．２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２２を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｍａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＴＯＢを回収した。
【００８８】
サッカロマイシス・セレビシエ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためサッカロマイシス・セレビシエ  Ｓ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ  ２６１０８）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴ（配列番号３８）、及びＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡ（配列番号３９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＸｍａＩで消化することで約１．３ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２２を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｍａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＥＲＧ１０を回収した。
【００８９】
クロストリジウム・アセトブチリカム由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためクロストリジウム・アセトブチリカム（ＡＴＣＣ８２４）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＧＡＴＧＴＡＧＴＡＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号４０）、及びＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＧＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号４１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＸｍａＩで消化することで約１．２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。
得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２２を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｍａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＴＨＩ２を回収した。
【００９０】
エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  ４７０７６）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＣＧＴ（配列番号４２）、及びＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＣＣＧＴＴＧＣＧＴＡＴＴＣＡＧＡＴＣ（配列番号４３）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２３を制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＴＯＡを回収した。
【００９１】
さらにエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣ（配列番号４４）、及びＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＧ（配列番号４５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２４を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。
得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＴＯＤを回収した。
【００９２】
クロストリジウム菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためクロストリジウム・アセトブチリカム株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＣＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＡＴ（配列番号４６）、及びＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴ（配列番号４７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼＡサブユニットフラグメントを得た。
得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２３を制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＣＴＦＡを回収した。
【００９３】
さらにクロストリジウム・アセトブチリカムのゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＧＡＡＡＧＡＡ（配列番号４８）、及びＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＡＧＴＴＣＡＴＴＧＧＡ（配列番号４９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼＢサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２４を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＣＴＦＢを回収した。
【００９４】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、クロストリジウム・アセトブチリカムのゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴ（配列番号５０）、及びＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣ（配列番号５１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２５を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＤＣを回収した。
【００９５】
コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むｐＩＰＡｃ１、アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むｐＡｄｃ、エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＡＴＯＤ及びｐＡＴＯＡ、クロストリジウム菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＣＴＦＡ及びｐＣＴＦＢ、サッカロマイシス・セレビシエ由来のチオラーゼ遺伝子を含むｐＥＲＧ１０、エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を含むｐＡＴＯＢ、クロストリジウム菌由来のチオラーゼ遺伝子を含むｐＴＨＩをサッカロマイシス・セレビシエＹＰＨ４９９株に形質転換し、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン、ウラシルを含まないＳＤ培養液（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｉｆｃｏ  ２３９２１０、２％  グルコース、０．００４％  リジン）寒天プレートで、３０℃で二晩培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＣＴＦＡ  ｐＣＴＦＢ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＣＴＦＡ  ｐＣＴＦＢ  ｐＡＴＯＢ／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＡＴＯＢ／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＣＴＦＡ  ｐＣＴＦＢ  ｐＥＲＧ１０／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＥＲＧ１０／ＹＰＨ４９９株］を得た。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  ４７０７６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ    ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｓ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ  ２６１０８）、サッカロマイシス・セレビシエ  ＹＰＨ４９９株（ＡＴＣＣ  ２０４６７９）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【００９６】
［実施例４］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＣＴＦＡ  ｐＣＴＦＢ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＣＴＦＡ  ｐＣＴＦＢ  ｐＡＴＯＢ／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＡＴＯＢ／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＣＴＦＡ  ｐＣＴＦＢ  ｐＥＲＧ１０／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ１  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＥＲＧ１０／ＹＰＨ４９９株］によるイソプロピルアルコール生産＞
前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にアデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン、ウラシルを含まないＳＤ培養液を５ｍＬ入れ、実施例３において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ  ｐＡｄｃ  ｐｃｔｆＡ  ｐｃｔｆＢ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ  ｐＡｄｃ  ｐａｔｏＡ  ｐａｔｏＤ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ  ｐＡｄｃ  ｐｃｔｆＡ  ｐｃｔｆＢ  ｐａｔｏＢ／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ  ｐＡｄｃ  ｐａｔｏＡ  ｐａｔｏＤ  ｐａｔｏＢ／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ  ｐＡｄｃ  ｐｃｔｆＡ  ｐｃｔｆＢ  ｐＥＲＧ１０／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ  ｐＡｄｃ  ｐａｔｏＡ  ｐａｔｏＤ  ｐＥＲＧ１０／ＹＰＨ４９９株］を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。また同様の培地組成並びに培養条件でサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＧＫ４２２，４２３，４２４，４２５，ｐＧＫ４２６／ＹＰＨ４９９株］を振とう培養した。各々の前培養液全量を、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン、ウラシルを含まないＳＤ培養液を４０ｍＬ入れた１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。培養開始９６時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＧＣ−ＭＳで定法に従って測定した。結果を表７に示す。
サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＧＫ４２２，４２３，４２４，４２５，ｐＧＫ４２６／ＹＰＨ４９９株］において、イソプロピルアルコールの蓄積はなかった。これにより、酵母においてコドン改変ＩＰＡｄｈを用いたことにより初めて酵母においてイソプロピルアルコールを生産可能であることが分かった。
【００９７】
【表７】
2011097929.tif 000008
【００９８】
［実施例５］
＜サッカロマイシス・セレビシエ由来チオラーゼ遺伝子、コドン改変エシェリヒア・コリ型ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、コドン改変クロストリジウム属細菌型ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、コドン改変クロストリジウム属細菌型イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
【００９９】
コドン改変したクロストリジウム・ベイジェリンキのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号５２）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＴＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＧＴＡＴＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＴＴＧＧＣＣＧＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＴＴＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＧＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＣＣＧＧＴＡＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＴＴＴＧＣＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＴＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＣＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＡＣＴＡＡＴＡＣＣＡＣＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＡＡＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＣＴＡＣＡＡＴＣＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＧＴＡＧＴＧＡＴＣＴＴＡＴＡＡ
なお、コドン改変したクロストリジウム・ベイジェリンキのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号５２によってコードされている。
【０１００】
上記のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴ  ＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＴＴＧＧ（配列番号５３）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＣＡＣＴＡＣＧＧＣＴＴＴＡ（配列番号５４）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＣＣＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号５５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られた２つのＤＮＡフラグメントをＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＣＡＣＴＡＣＧＧＣＴＴＴＡ（配列番号５４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化することでＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約２．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号５６）、及びＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号５７）によりＰＣＲ法で増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化することでチトクロムＣターミネーターをコードするＤＮＡ配列を得た。
得られた２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＵＣ１１９−ＩＰＡｃ２を回収した。
【０１０１】
コドン改変したクロストリジウム・アセトブチリカムのアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号５８）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＴＡＧＡＧＡＡＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＡＴＧＣＡＴＴＧＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＣＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＴＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＴＴＡＣＣＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＧＧＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＴＴＴＧＴＡＧＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＡＣＧＡＴＧＧＴＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＡＴＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＣＡＴＧＡＧＧＣＴＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＣＡＡＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＡＧＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＣＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＴＡＡ
なお、コドン改変したクロストリジウム・アセトブチリカムのアセト酢酸デカルボキシラーゼは、配列番号５８によってコードされている。
【０１０２】
上記のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡ（配列番号５９）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＡＴＡ（配列番号６０）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号６１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られた２つのＤＮＡフラグメントをＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号２０）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＡＴＡ（配列番号６０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化することでアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約２．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号５６）、及びＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号２３）によりＰＣＲ法で増幅した。
得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化することでチトクロムＣターミネーターをコードするＤＮＡ配列を得た。得られた２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＹＥｐｌａｃＫＡＮを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＤＣｃを回収した。
【０１０３】
コドン改変したクロストリジウム・アセトブチリカムのＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆＡ）を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号６２）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＣＧＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＡＴＡＴＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＴＡＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＧＴＴＡＧＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣＣＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＧＴＣＡＴＡＧＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＧＴＴＡＧＣＴＧＣＧＡＡＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＧＧＧＡＧＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＡＡ
なお、コドン改変したクロストリジウム・アセトブチリカムのＣｏＡトランスフェラーゼフラグメント（コドン改変ｃｔｆＡ）は、配列番号６２によってコードされている。
【０１０４】
上記のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴ（配列番号６３）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡ（配列番号６４）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号９）、及びＡＡＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号６５）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた２つのＤＮＡフラグメントをＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号９）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡ（配列番号６４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．２ｋｂｐのコドン改変クロストリジウムＣｏＡトランスフェラーゼフラグメント（コドン改変ｃｔｆＡ）を得た。
【０１０５】
コドン改変したクロストリジウム・アセトブチリカムのＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆＢ）を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号６６）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＴＣＣＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＴＧＴＡＧＴＣＡＡＴＧＣＣＧＧＡＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＡＣＧＧＣＡＣＡＴＴＴＴＴＣＧＡＴＡＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＧＴＡＣＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＡＡＴＴＧＴＡＡＣＡＧＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＧＡＧＧＴＴＡＴＴＡＡＣＧＡＴＧＧＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＡＡＣＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＴＧＡ
なお、コドン改変したクロストリジウム・アセトブチリカムのＣｏＡトランスフェラーゼフラグメント（コドン改変ｃｔｆＢ）は、配列番号６６によってコードされている。
【０１０６】
上記のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣ（配列番号６７）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＡＧ（配列番号６８）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＴＡ（配列番号１３）、及びＧＣＴＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号６９）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１５）、及びＴＡＴＣＡＡＧＴＣＴＡＧＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られた３つのＤＮＡフラグメントをＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１５）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＡＧ（配列番号６８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素Ｓａｌ及びＢａｍＨＩで消化し、ＡＤＨ１ターミネーター、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．４ｋｂｐのコドン改変されたクロストリジウムＣｏＡトランスフェラーゼＢフラグメント（コドン改変ｃｔｆＢ）を得た。
【０１０７】
ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号５６）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化することでＣＹＣ１ターミネーターをコードするＤＮＡ配列を得た。
【０１０８】
上記のコドン改変クロストリジウムＣｏＡトランスフェラーゼＡフラグメント及びコドン改変クロストリジウムＣｏＡトランスフェラーゼＢフラグメント、ＣＹＣ１ターミネーターと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＣＴＦＡＢｃを回収した。
【０１０９】
コドン改変したエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ）を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号７０）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＣＴＴＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＴＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡＧＡＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＧＣＡＴＡＧＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＣＧＴＴＡＡＴＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＡＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＴＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＴＡＡＴＣＧＡＡＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＣＡＣＣＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＡＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＴＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＴＡＧＣＴＣＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＴＧＣＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＣＣＴＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＡＴＡＡＣＧＴＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＧＴＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＡＴＣＧＡＣＣＡＣＡＴＴＡＴＣＧＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡ
なお、コドン改変したエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼフラグメント（コドン改変ａｔｏＤ）は、配列番号７０によってコードされている。
【０１１０】
上記のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴ（配列番号７１）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣ（配列番号７２）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号９）、及びＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号７３）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた２つのＤＮＡフラグメントをＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号９）、及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣ（配列番号７２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．２ｋｂｐのコドン改変クロストリジウムＣｏＡトランスフェラーゼＡフラグメント（コドン改変ａｔｏＤ）を得た。
【０１１１】
コドン改変したエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＡ）を取得するために、ＤＮＡ合成により作成した以下のＤＮＡフラグメント（配列番号７４）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＴＡＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＴＴＡＣＣＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＣＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＣＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＡＡＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＧＴＧＴＴＧＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＡＡＧＴＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＡＣＴＧＧＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＧＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ
なお、コドン改変したエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼフラグメント（コドン改変ａｔｏＡ）は、配列番号７４によってコードされている。
【０１１２】
上記のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＧ（配列番号７５）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＣＧＴ（配列番号７６）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧＡＴＡ（配列番号１３）、及びＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号７７）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１５）、及びＴＡＴＣＡＡＧＴＣＴＡＧＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られた３つのＤＮＡフラグメントをＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡ（配列番号１５）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＣＧＴ（配列番号７６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素Ｓａｌ及びＢａｍＨＩで消化し、ＡＤＨ１ターミネーター、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．４ｋｂｐのコドン改変エシェリヒア・コリＣｏＡトランスフェラーゼフラグメント（コドン改変ａｔｏＡ）を得た。
【０１１３】
ＣＹＣ１ターミネーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴ（配列番号５６）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化することでＣＹＣ１ターミネーターをコードするＤＮＡ配列を得た。
【０１１４】
上記のコドン改変エシェリヒア・コリＣｏＡトランスフェラーゼＡフラグメント及びコドン改変エシェリヒア・コリＣｏＡトランスフェラーゼＢフラグメント、チトクロムＣターミネーターと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＴＯＤＡｃを回収した。
【０１１５】
サッカロマイシス・セレビシエ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためサッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧ（配列番号７８）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＴＡＧ（配列番号７９）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号３）、及びＣＡＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号８０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られた２つのＤＮＡフラグメントをＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号３）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＴＡＧ（配列番号７９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。
【０１１６】
上記のＡＤＨ１プロモーターとチオラーゼフラグメント、ＣＹＣ１ターミネーターと、プラスミドｐＹＥｐｌａｃＫＡＮを制限酵素ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＥＲＧ１０−２を回収した。
【０１１７】
上記のコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントと、プラスミドｐＥＲＧ１０−２を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０を回収した。
【０１１８】
上記のコドン改変イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントとプラスミドｐＹＥｐｌａｃＮＡＴを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡｃ２を回収した。
【０１１９】
プラスミドｐＡＴＯＤＡｃを制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントとプラスミドＩＰＡｃ２を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃを回収した。
【０１２０】
プラスミドｐｃｔｆＡＢｍを制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントとプラスミドｐＩＰＡｃ２を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃを回収した。
【０１２１】
コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、コドン改変したクロストリジウム菌ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃ、コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃ、コドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、サッカロマイシス・セレビシエ由来のチオラーゼ遺伝子を含むｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０をサッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株に形質転換し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ寒天プレートで、３０℃で二晩培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体［ｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃ  ｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡ  ｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］を得た。
【０１２２】
［実施例６］
＜サッカロマイシス・セレビシエ由来チオラーゼ遺伝子ゲノム強化株の構築＞
サッカロマイシス・セレビシエ由来のチオラーゼ遺伝子（ＥＲＧ１０）の上流領域を取得するためサッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧ（配列番号７８）、及びＣＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣ（配列番号８１）によりＰＣＲ法で増幅し、チオラーゼ遺伝子のプロモーターを取得するためＴＴＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＣＧ（配列番号８２）、及びＧＣＣＴＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＧＴＣＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴ（配列番号８３）によりＰＣＲ法で増幅し、ＡＤＨ１プロモーターを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号８４）、及びＣＡＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴ（配列番号８０）によりＰＣＲ法で増幅し、オロチディン５−リン酸デカルボキシラーゼを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＴＡＣＡＧＡＴＴＡＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＧＧＣ（配列番号８５）、及びＧＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＴＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８６）によりＰＣＲ法で増幅した。得られた４つのＤＮＡフラグメントをＴＴＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＣＧ（配列番号８２）、及びＣＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣ（配列番号８１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＰｒｏｍｅｇａ  ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙプラスミド上に導入し、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からチオラーゼプロモーター、オロチディン５−リン酸デカルボキシラーゼ、ＡＤＨ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約２．９ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＥＲＧ１０−ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＥＲＧ１０を回収した。
【０１２３】
変異型オロチディン５−リン酸デカルボキシラーゼを取得するために、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｗ３０３−１Ａ（ＡＴＣＣ  ２０１２３８）株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＧＴＴＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＧＧＣ（配列番号８７）、及びＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８８）によりＰＣＲ法で増幅し、サッカロマイシス・セレビシエ  Ｘ２１８０株に形質転換し、ＦＯＡ(７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｉｆｃｏ、２％  グルコース、０．００５％  ウラシル、０．１％  ５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）寒天プレートで、３０℃で四晩培養することにより、サッカロマイシス・セレビシエ  ウラシル感受性Ｘ２１８０株を得た。これらの方法は、Ａｍｂｅｒｇ，  Ｄ．Ｃ．，  ｅｔ．ａｌ．，  ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００５  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されている。
なおサッカロマイシス・セレビシエ  Ｗ３０３−１Ａ株（ＡＴＣＣ  ２０１２３８）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【０１２４】
上記プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＥＲＧ１０−ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＥＲＧ１０を制限酵素ＮｏｔＩにて切断したフラグメントをサッカロマイシス・セレビシエ  ウラシル感受性Ｘ２１８０株に形質転換し、ウラシルを除いたＳＤ培養液（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｉｆｃｏ  ２３９２１０、２％  グルコース）寒天プレートで、３０℃で二晩培養することにより、ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株を得た。
【０１２５】
実施例５で作成したプラスミドｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃをサッカロマイシス・セレビシエＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株に形質転換し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ寒天プレートで、３０℃で二晩培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］を得た。
【０１２６】
［実施例７］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］によるイソプロピルアルコール生産＞
前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を５ｍＬ入れ、実施例５において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、実施例６において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。また同様の培地組成並びに培養条件でサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＹＥｐｌａｃＮＡＴとＹＥｐｌａｃＫＡＮ／Ｘ２１８０株］を振とう培養した。各々の前培養液全量を、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を４０ｍＬ入れた１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。培養開始９６時間後、１５０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表８に示す。
サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＹＥｐｌａｃＮＡＴとＹＥｐｌａｃＫＡＮ／Ｘ２１８０株］において、イソプロピルアルコールの蓄積はなかった。これにより、コドン改変アセト酢酸デカルボビキシラーゼ、コドン改変ＣｏＡトランスフェラーゼを用いることにより、より高いイソプロピルアルコール生産が可能となることがわかった。また、ＣｏＡトランスフェラーゼはコドン改変ｃｔｆよりもコドン改変ａｔｏＤＡの方が酵母におけるイソプロピルアルコール生産においてより好ましいことが分かった。さらに酵母内在性のチオラーゼＥＲＧ１０をゲノム上で強化することにより、より高いイソプロピルアルコール生産ができることが分かった。
【０１２７】
【表８】
2011097929.tif 000009
【０１２８】
［実施例８］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株］によるイソプロピルアルコール生産と酸処理後の細胞生存率＞
前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を５ｍＬ入れ、実施例６において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。前培養液ＯＤ６００  Ａｂｓ４（４×１０７個）相当の細胞を、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を４０ｍＬ入れた１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。
コントロールとしてＷＯ２００９／００８３７７記載のエシェリヒア・コリ ｐＩａａａ／Ｂ株を前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液５ｍＬに植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。前培養液ＯＤ６６０  Ａｂｓ０．４（４×１０７個）の細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、グルコース２ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を４０ｍＬ入れた１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。
【０１２９】
培養開始９６時間後の菌体培養液の一部を、遠心操作によって菌体を除いた後、得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。コントロールとして培養開始７２時間後のエシェリヒア・コリ ｐＩａａａ／Ｂ株菌体培養液の一部を、遠心操作によって菌体を除いた後、イソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］培養液中のイソプロピルアルコールの濃度は３２ｍｇ／Ｌ、エシェリヒア・コリ ｐＩａａａ／Ｂ株培養液中のイソプロピルアルコールの濃度は２．６５ｇ／Ｌを示した。
【０１３０】
さらに残りの培養開始９６時間後、ＯＤ６００  Ａｂｓ１０（１×１０８個）相当の細胞を含むサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］培養液、もしくは培養開始７２時間後、ＯＤ６６０  Ａｂｓ１（１×１０８個）相当の細胞を含むエシェリヒア・コリ ｐＩａａａ／Ｂ株培養液をサンプリングし、遠心操作により培養液を除いた後にそれぞれｐＨ７のクエン酸―リン酸バッファー、ｐＨ５．４のクエン酸―リン酸バッファー、ｐＨ３．８のクエン酸―リン酸バッファー、ｐＨ３．４のクエン酸―リン酸バッファー、ｐＨ３のクエン酸―リン酸バッファー、ｐＨ２．６のクエン酸―リン酸バッファーで一度洗ったのちに洗浄に使ったものと同じｐＨのクエン酸―リン酸バッファー  ４ｍＬ中にて２５℃、２４時間静かに反応させた。サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］を反応させたサンプルの一部をＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地にて希釈し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ寒天プレート上に植菌した。３０℃で二晩培養し、コロニー数を数え、細胞生存率を測定した。また、コントロールとしてエシェリヒア・コリ ｐＩａａａ／Ｂ株を反応させたサンプルの一部をＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液にて希釈し、アンピシリン１００μｇを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレート上に植菌した。３０℃で一晩培養し、コロニー数を数え、細胞生存率を測定した。結果を表９に示す。
これにより、ｐＨ３以下の酸にて処理することにより、サッカロマイシス・セレビシエを生存させ、エシェリヒア・コリを死滅させることができることがわかった。
【０１３１】
【表９】
2011097929.tif 000010
【０１３２】
［実施例９］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］、エシェリヒア・コリｐＩａａａ／Ｂ株］における酸処理後のリサイクル検討＞
実施例８にてクエン酸―リン酸バッファー反応させたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］のサンプルの残りをＹＰＤ培養液にて洗浄し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地２０ｍＬに懸濁し、１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。またコントロールとしてクエン酸―リン酸バッファー反応させたエシェリヒア・コリ ｐＩａａａ／Ｂ株のサンプルの残りをＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液にて洗浄し、アンピシリン１００μｇを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液２０ｍＬに懸濁し、１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。
【０１３３】
培養開始７２時間後の菌体培養液の一部を、遠心操作によって菌体を除いた後、得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ−ＥＲＧ１０／Ｘ２１８０株］培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。コントロールとして培養開始４７時間後のエシェリヒア・コリ  ｐＩａａａ／Ｂ株菌体培養液の一部を、遠心操作によって菌体を除いた後、イソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表１０に示す。
これにより、サッカロマイシス・セレビシエではｐＨ２．６以上の酸で処理後においてもイソプロピルアルコールを生産できることが分かった。また、ｐＨは３以上であることが望ましいことも分かった。エシェリヒア・コリにおいてはｐＨ３．８、５．４の酸処理後もイソプロピルアルコールを生産できることが分かった。
【０１３４】
【表１０】
2011097929.tif 000011
【０１３５】
［実施例１０］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］によるイソプロピルアルコール生産と酸処理後の細胞生存率＞
実施例７において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］を実施例８と同じ培養操作を行い、培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］培養液中のイソプロピルアルコールの濃度は５７ｍｇ／Ｌを示した。
【０１３６】
さらに残りの培養開始９６時間後、ＯＤ６００  Ａｂｓ１０（１×１０８個）相当の細胞を含むサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］培養液を実施例８と同じくクエン酸―リン酸バッファーで処理を行い、コロニー数を数え、細胞生存率を測定した。結果を表１１に示す。
これにより、ｐＨ３以下の酸にて処理することにより、サッカロマイシス・セレビシエを生存させることができることがわかった。
【０１３７】
【表１１】
2011097929.tif 000012
【０１３８】
［実施例１１］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＣＴＦＡＢｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］における酸処理後のリサイクル検討＞
実施例１０にてクエン酸―リン酸バッファー反応させたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］のサンプルの残りをＹＰＤ培養液にて洗浄し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地２０ｍＬに懸濁し、１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。
【０１３９】
培養開始９６時間後の菌体培養液の一部を、遠心操作によって菌体を除いた後、得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／ＥＲＧ１０ゲノム強化Ｘ２１８０株］培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表１２に示す。
これにより、サッカロマイシス・セレビシエではｐＨ５．４以下の酸で処理した方がｐＨ７で処理したものよりも酸処理後の生産性が高いことが分かった。
【０１４０】
【表１２】
2011097929.tif 000013
【０１４１】
［実施例１２］
＜コドン改変クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、配列番号５２のＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＴＴ（配列番号８９）、及びＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＣＡＣＴＡＣＧＧＣＴＴ（配列番号９０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２６を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社    ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡｃ３を回収した。
【０１４２】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（コドン改変なし）を取得するために、クロストリジウム・ベイジェリンキ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴ（配列番号９１）、及びＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴ（配列番号９２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＫ４２６を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｇｌIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡ２を回収した。
【０１４３】
実施例３で作成したクロストリジウム菌由来のチオラーゼ遺伝子を含むｐＴＨＩ２、および実施例３で作成したエシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むコドン非改変型ｐＡＴＯＤ及びｐＡＴＯＡ、実施例３で作成したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むｐＡＤＣ、およびコドン改変型イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むｐＩＰＡｃ３、またはコドン非改変型ｐＩＰＡをサッカロマイシス・セレビシエＹＰＨ４９９株に形質転換し、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン、ウラシルを含まないＳＤ培養液寒天プレートで、３０℃で培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体［ｐＩＰＡ２  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ３  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡｃ２  ｐＡＴＯＤｃ２  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］を得た。
【０１４４】
前培養として１３ｍＬ容量のガラス試験管にアデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン、ウラシルを含まないＳＤ培養液を５ｍＬ入れ、実施例１０において得られたサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡ２  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡ  ｐＡＴＯＤ  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］、［ｐＩＰＡｃ３  ｐＡＤＣ  ｐＡＴＯＡｃ２  ｐＡＴＯＤｃ２  ｐＴＨＩ２／ＹＰＨ４９９株］を植菌し、三晩、培養温度３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養を行った。菌体を遠心分離で回収・洗浄後、新しいアデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン、ウラシルを含まないＳＤ培養液５ｍＬに懸濁し、培養を行った。培養は攪拌速度１５０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。培養開始２４時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＧＣ−ＭＳで定法に従って測定した。結果を表１３に示す。
これにより、酵母において、少なくともコドン改変したＩＰＡｄｈを用いることにより、イソプロピルアルコールを生産することが可能となることが明らかとなった。
【０１４５】
【表１３】
2011097929.tif 000014
【０１４６】
［比較例１］
＜サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／Ｘ２１８０株］によるイソプロピルアルコール生産＞
プラスミドｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃをサッカロマイシス・セレビシエＸ２１８０株に形質転換し、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ寒天プレートで、３０℃で二晩培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／Ｘ２１８０株］を得た。
【０１４７】
前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を５ｍＬ入れ、サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ＡＴＯＤＡｃとｐＡＤＣｃ／Ｘ２１８０株］を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。また同様の培地組成並びに培養条件でサッカロマイシス・セレビシエ［ｐＹＥｐｌａｃＮＡＴとＹＥｐｌａｃＫＡＮ／Ｘ２１８０株］を振とう培養した。各々の前培養液全量を、ジェネティシン  ２００μｇ／ｍＬ、ノアセオスリシン  ２００μｇ／ｍＬを含むＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ液体培地を４０ｍＬ入れた１００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３０℃で行った。培養開始９６時間後、１５０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＩＰＡｃ２−ａｔｏＤＡｃとｐＡＤＣｃ／Ｘ２１８０株］、サッカロマイシス・セレビシエ［ｐＹＥｐｌａｃＮＡＴとＹＥｐｌａｃＫＡＮ／Ｘ２１８０株］において、イソプロピルアルコールの蓄積はなかった。
【０１４８】
実施例１、２、３、４、１２の結果から、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母は、イソプロピルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列におけるコドンを最適化することによって初めてイソプロピルアルコールを生産することが可能である。
さらに実施例５、６、７の結果から、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母は、ゲノムのプロモーター配列を強化等ゲノム上に遺伝子を挿入、強化することによりさらに高い生産性を得ることが可能である。さらに本発明に用いたＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼもゲノム上に挿入することにより高い生産性を示すことが予想される。
【０１４９】
実施例８、９、１０の結果から、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母は、酸により洗浄することで繰り返し菌体を使用することができる。さらに実施例８の結果からｐＨ３のクエン酸―リン酸バッファー中ではエシェリヒア・コリは生存できない。それに対し、実施例８、９の結果からｐＨ３、ｐＨ２．６のクエン酸―リン酸バッファー処理後でもサッカロマイシス・セレビシエはイソプロピルアルコールを生産することが可能であり、サッカロマイシス・セレビシエは強酸による殺菌が可能であると考えられる。
これらのことから、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母は植物由来イソプロピルアルコール生産の実用化において従来技術と比べて格段に優れているといえる。
【０１５０】
実施例１１の結果から、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産酵母は、ｐＨ５．４以下の酸で洗浄することにより、ｐＨ７の酸で洗うよりもリサイクル時に生産性を高めることができる。このことは強酸による殺菌により、リサイクル時に殺菌だけでなくさらに生産性を高めることができると考えられる。
【０１５１】
実施例４、７、１２、比較例１の結果から、本発明によって得られる酵母は、ＣｏＡトランスフェラーゼの活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの活性のみでなく、本来酵母のゲノムに存在するチオラーゼ遺伝子でコードされる酵素の活性も付与しなければイソプロピルアルコールを生産しないことがわかる。
【０１５２】
以上のように、本発明によれば、酸処理を行うことで、再使用可能であり、イソプロアルコールを連続的に生産することができる。
【配列表】
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