(57)【要約】      （修正有）【課題】第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現が可能な方法および組成物を提供すること。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが高レベルで発現する改変型第ＶＩＩＩ因子を含む核酸およびアミノ酸配列を含む方法および組成物を提供すること。【解決手段】特定の配列に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで当該ポリペプチドが、高レベルの発現によって特徴づけられる、単離されたポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８に示されるポリヌクレオチド配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む改変型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列は、同一条件下で発現された対応するヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較した場合の高レベル発現により特徴付けられるポリペプチドをコードし、
但し、該ポリペプチドは、配列番号１８に示される配列を有さない、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸分子を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項６】
請求項４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項７】
改変型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、
ａ）配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入する工程であって、該配列は、該ポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、同一条件下で発現された対応するヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較した場合の高レベル発現により特徴付けられ、但し、該ポリペプチドは、配列番号１８に示される配列を有さない、工程；および
ｂ）該ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発）
本研究は、国立衛生研究所助成金ＲＯ１  ＨＬ４０９２１によって支援されている。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、組換え分子生物学分野、特に、改変型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固の固有経路の不可欠な構成要素として機能する巨大な（約３００ｋＤａ）糖タンパク質である。これは、Ａ１−Ａ２−Ｂ−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼ばれる一連のドメインを含む。第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの機能は知られておらず、凝集活性を失うことなく欠失することができる。第ＶＩＩＩ因子タンパク質を減少または欠損させる第ＶＩＩＩ因子の遺伝子の変異により、再出血エピソードによって特徴づけられる遺伝病（血友病Ａ）を発症する。血友病Ａの治療には、血漿由来第ＶＩＩＩ因子または組換え第ＶＩＩＩ因子のいずれかの静脈内注入が必要である。
【０００４】
血友病Ａの治療のために組換え第ＶＩＩＩ因子が導入されて以来、第ＶＩＩＩ因子が商業的製造で使用される異種哺乳動物細胞培養系で低レベルでしか発現および回収されないので、需要に応じるために奮闘して供給されている（Ｇａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１１３３）。さらに、血友病Ａ遺伝子治療試験での第ＶＩＩＩ因子レベルは、発現レベルが制限される特徴があることを示す（Ｒｏｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．３４４：１７３５−１７４２）。この問題は重要であるので、第ＶＩＩＩ因子の低発現を克服するために多くの研究努力がなされている。発現を制限するいつかの要因が同定されており、低ｍＲＮＡレベル（Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：２５９−２７２；Ｈｏｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：２４４７−２４５４；Ｋｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：４６９−４７９）、タンパク質シャペロンと非効率的分泌との相互作用（Ｐｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８５３７−８５４４；Ｔａｇｌｉａｖａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１９７３−１９８１；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ３−１４）、およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の非存在下での急速な崩壊（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３５２−６３６２  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１２３３−１２４２）が含まれる。Ｂドメインの欠失により、異種系において第ＶＩＩＩ因子タンパク質産生が増加することが示されている（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：５９３９−５９４２）。ヒト第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失形態（Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７）は、臨床使用が承認されている。
【０００５】
第ＶＩＩＩ因子調節に関するこれらの洞察にもかかわらず、商業的製造（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ３−１４）ならびにｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法（Ｒｏｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７３５−１７４２）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子療法（Ｃｈｕａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１３６３−１３７７）で使用される異種系における発現は、他の組換えタンパク質より非常に少ないままである。第ＶＩＩＩ因子の発現を増大させる方法および組成物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現が可能な方法および組成物を提供する。より詳細には、本発明は、この第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが高レベルで発現する改変型第ＶＩＩＩ因子を含む核酸およびアミノ酸配列を含む方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は、第ＶＩＩＩ因子欠損症（例えば、血友病Ａが含まれる）の治療で適用される。
【０００７】
特に、本発明の１つの実施形態は、高レベル発現によって特徴づけられる、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列が同一なアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含む単離ポリペプチドを提供する。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、配列番号１４、１６、または１８に記載のヌクレオチド配列、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および配列番号１４、１６、または１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列が同一なヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。本発明の核酸分子を含む発現カセット、ベクター、および細胞をさらに提供する。
【０００９】
本発明の核酸分子およびポリペプチドを含む薬学的組成物も提供する。
【００１０】
ポリペプチドの産生方法を提供する。１つの実施形態では、その方法は、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号１４、１６、または１８に記載の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１４、１６、または１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列が同一なヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを含む核酸分子を細胞に移入する工程であって、前記ヌクレオチド配列が、高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする工程と、ヌクレオチド配列を発現させる条件下で前記細胞を培養する工程とを含む。
【００１１】
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現レベルを増加させる方法も提供する。１つの実施形態では、その方法は、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号１４、１６、または１８に記載の配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１４、１６、または１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列が同一なヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを含む核酸分子を細胞に移入する工程であって、前記ヌクレオチド配列が、高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする工程と、ヌクレオチド配列を発現させる条件下で前記細胞を培養する工程とを含む。
【００１２】
第ＶＩＩＩ因子欠損症（例えば、血友病Ａが含まれる）の治療方法も提供する。その方法は、治療有効量のポリペプチドを含む組成物を必要とする被験体に投与する工程であって、前記ポリペプチドが、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列、配列番号１５、１７、または１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列が同一なアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含み、前記ポリペプチドが高レベル発現によって特徴づけられる工程を含む。
【００１３】
他の方法は、治療有効量の核酸分子を含む組成物の必要とする被験体への投与によって第ＶＩＩＩ因子欠損症を治療する工程であって、前記核酸分子が、配列番号１４、１６、または１８に記載のヌクレオチド配列、配列番号１５、１７、または１９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号１４、１６、または１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列が同一なヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを含み、前記核酸分子が、高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする工程を含む。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで当該ポリペプチドが、高レベルの発現によって特徴づけられる、単離されたポリペプチド。
・（項目２）
上記ポリペプチドが、配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたポリペプチド。
・（項目３）
項目１に記載のポリペプチドを含む、組成物。
・（項目４）
項目２に記載のポリペプチドを含む、組成物。
・（項目５）
配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、ここで当該ヌクレオチド配列が、高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
・（項目６）
項目５に記載の単離された核酸分子であって、上記ヌクレオチド配列が、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列；および
ｂ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
・（項目７）
項目５に記載の核酸分子を含むＤＮＡ構築物。
・（項目８）
項目６に記載の核酸分子を含むＤＮＡ構築物。
・（項目９）
項目５に記載の核酸分子を含むベクター。
・（項目１０）
項目６に記載の核酸分子を含むベクター。
・（項目１１）
項目５に記載の核酸分子を含む細胞。
・（項目１２）
項目６に記載の核酸分子を含む細胞。
・（項目１３）
項目９に記載のベクターを含む細胞。
・（項目１４）
項目１０に記載のベクターを含む細胞。
・（項目１５）
ポリペプチドを産生する方法であって、当該方法は、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入する工程であって、ここで当該配列が、当該ポリペプチドをコードし、そして当該ポリペプチドが高発現によって特徴づけられる、工程；および
ｂ）  上記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で当該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
・（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、上記核酸分子が、以下：
ａ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列：
ｂ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
・（項目１７）
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目１５に記載の方法。
・（項目１８）
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目１６の方法。
・（項目１９）
細胞における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現レベルを増加させる方法であって、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を上記細胞に導入する工程であって、当該配列が上記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードし、当該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが高い発現によって特徴づけられる、工程；
ｂ）  上記核酸分子の発現を可能にする条件下で当該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
・（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、上記核酸分子が、以下：
ａ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列；および
ｂ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
・（項目２１）
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目１９の方法。
・（項目２２）
上記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目２０の方法。
・（項目２３）
第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、当該方法は、
当該処置を必要とする被験体に、治療有効量のポリペプチドを含む組成物を投与する工程であって、ここで当該ポリペプチドは、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして当該ポリペプチドが、高レベル発現によって特徴づけられる、工程、を包含する、方法。
・（項目２４）
上記ポリペプチドが配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む、項目２３に記載の方法。
・（項目２５）
第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、当該方法は、当該処置を必要とする被験体に、治療有効量の核酸分子を含む組成物を投与する工程であって、ここで当該核酸分子は、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ここで当該核酸分子が、高レベル発現によって特徴づけられる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、工程、を包含する、方法。
・（項目２６）
項目２５に記載の方法であって、ここで：上記核酸分子が、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列；および
ｂ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｄ−１】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｄ−２】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図１Ｈ】図１Ａ〜１Ｈ。共にヒト（配列番号６）、ブタ（配列番号２）、およびマウス（配列番号８）の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列の整列させたアミノ酸の配列比較を示す図である。
【図２】図２。Ｂドメイン欠失ヒト、ブタ、およびハイブリッドヒト／ブタ第ＶＩＩＩ因子構築物の略図である。Ａ２ドメインとａｐドメインとの間の実線は、リンカー配列を示す。
【図３】図３。組換えＢドメイン欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質（Ｐ／ＯＬと示す）、組換えＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質、および５つの組換えＢドメイン欠失ハイブリッドヒト／ブタ第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＨＰ１、ＨＰ３０、ＨＰ４４、ＨＰ４６、およびＨＰ４７と示す）の異種発現を示すグラフデータである。ＣＯＳ−７細胞（黒塗りのバー）およびベビーハムスター腎臓由来細胞（ＢＭＫ−Ｍ細胞と示す）（斜線のバー）を、各第ＶＩＩＩ因子発現構築物およびルシフェラーゼプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、無血清培地中で２４時間培養した。データは、ＨＳＱと比較して、Ｐ／ＯＬ、ＨＰ４４、ＨＰ４７、およびＨＰ４６の発現が有意に増加したことを示す。対照的に、ＨＰ１およびＨＰ３０の発現はＨＳＱと比較して増加しなかった。
【図４】図４。本明細書中でＨＰ４４／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｄ。本明細書中でＨＰ４４／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｄ。本明細書中でＨＰ４４／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｄ。本明細書中でＨＰ４４／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す図である。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｄ。本明細書中でＨＰ４４／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す図である。
【図６】図６。本明細書中でＨＰ４６／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１７）を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｄ。本明細書中でＨＰ４６／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｄ。本明細書中でＨＰ４６／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｄ。本明細書中でＨＰ４６／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｄ。本明細書中でＨＰ４６／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。
【図８】図８。本明細書中でＨＰ４７／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａ−９Ｄ。本明細書中でＨＰ４７／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ａ−９Ｄ。本明細書中でＨＰ４７／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す図である。
【図９Ｃ】図９Ａ−９Ｄ。本明細書中でＨＰ４７／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す図である。
【図９Ｄ】図９Ａ−９Ｄ。本明細書中でＨＰ４７／ＳＱと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａ−１０Ｄ。ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｄ。ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ａ−１０Ｄ。ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１０Ｄ】図１０Ａ−１０Ｄ。ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａ−１１Ｂ。ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂ。ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す図である。
【図１２】図１２。本発明の１つの可能な第ＶＩＩＩＳＥＰ因子改変体の略図である。ＨＰ６３／ＯＬと示す改変体は、ブタＡ１ドメインならびに約１６９０から約１８０４までおよび約１８１９から約２０１９までのブタアミノ酸を含む部分的ヒト化ａｐ−Ａ３ドメインを含む。
【図１３】図１３。本明細書中でＨＰ６３／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするアミノ酸配列（配列番号２１）を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａ−１４Ｂ。本明細書中でＨＰ６３／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｂ。本明細書中でＨＰ６３／ＯＬと示す第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
概観
本発明は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを高レベルで発現可能な方法および組成物を提供する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、以下の用語Ａ１−Ａ２−Ｂ−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する相同性定義（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ）タンパク質ドメインを含む。本発明は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現を促進する非ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのドメイン内の領域を同定している。より詳細には、ブタおよびヒトの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの両方を高レベル発現させるＡ１およびａｐ−Ａ３領域ならびにその改変体およびフラグメントを含むブタ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの領域を同定した。したがって、本発明は、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを高レベルで発現する改変型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸およびポリペプチド配列を構築するための高レベル発現させる非ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列およびこれらの配列の活性改変体またはフラグメントを使用する方法および組成物を提供する。高レベル発現によって特徴づけられる改変型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、本明細書中で「第ＶＩＩＩＳＥＰ因子」（超発現）（Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）という。
・「高レベル発現」は、同一条件下で発現する対応するヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現レベルと比較した場合にレベルが増加したポリペプチド産生を意図する。ポリペプチドレベルの増加（すなわち、高レベル発現）は、対応するヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現レベルと比較して少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０倍またはそれ以上の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチド発現を含む。あるいは、対応するヒト第ＶＩＩＩ因子と比較した場合に第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の発現レベルが少なくとも１〜２５倍、１〜５倍、５〜１０倍、１０〜１５倍、１５〜２０倍、２０〜２５倍またはそれ以上のポリペプチド発現レベルの増加を含み得る。「高レベル発現」のアッセイ方法は、当該分野で慣用的であり、以下により詳細に概説する。
【００１６】
「対応する」第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、等価なアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを意図する。例えば、Ａ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインを含む改変型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを高レベル発現について試験し、対応ドメインを含むヒトまたはブタの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（すなわち、Ａ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）を使用する。修正第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（すなわち、Ａ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３）のフラグメントを高レベル発現について試験する場合、対応ドメインを有するヒトまたはブタの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（すなわち、Ａ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３）を試験する。
【００１７】
組成物
本発明の組成物は、高レベル発現によって特徴づけられる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。以下にさらに詳細に概説するように、ブタ第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基２０〜３９１）およびブタ第ＶＩＩＩ因子のａｐ−Ａ３ドメイン（配列番号１９のアミノ酸１４５０〜１８２０）は、第ＶＩＩＩ因子を高レベル発現する。したがって、本発明は、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドならびに高レベル発現によって特徴づけられる第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドの活性改変体および活性フラグメントを含む方法および組成物を提供する。
【００１８】
特に、本発明は、配列番号１５、１７、または１９に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列およびその活性フラグメントまたは活性改変体を含む単離核酸分子を提供する。配列番号１４、１６、１８に記載のヌクレオチド配列およびその活性フラグメントまたは活性改変体を含む単離核酸分子も提供する。本明細書中に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列（例えば、配列番号１５、１７、および１９に記載のもの）ならびにその活性フラグメントおよび活性改変体を有するポリペプチドをさらに提供する。
【００１９】
表１は、配列番号１４〜１９に提供する配列の構造のまとめを提供する（表中、下付文字「Ｐ」はブタ第ＶＩＩＩ因子由来のドメインを示し、下付文字「Ｈ」はヒト第ＶＩＩＩ因子由来のドメインを示す）。
【００２０】
表１．配列構造の概要
【００２１】
【表１】
2011015698.tif 000002
本発明は、単離または実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を含む。「単離」または「精製」核酸分子またはタンパク質またはその生物活性部分は、組換え技術によって産生された場合に他の細胞物質や培養培地を実質的に含まないか、化学合成した場合に化学的前駆体や他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に存在する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、単離核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の夾雑タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本発明のタンパク質またはその生物活性部分を組換え産生する場合、好ましくは、化学的前駆体または目的としないタンパク質化学物質が約３０％、２０％、１０％、または５％（重量で）未満である。
【００２２】
開示の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ヌクレオチド配列およびこれによってコードされるタンパク質のフラグメントおよび改変体も本発明に含まれる。「フラグメント」は、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列およびこれによってコードされるタンパク質の一部を意図する。ヌクレオチド配列のフラグメントは、配列番号１５、１７、または１９に記載のポリペプチドの生物活性を保持し、それにより第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現によって特徴づけられるタンパク質フラグメントをコードすることができる。したがって、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約１０、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約２０００ヌクレオチド、約３０００ヌクレオチド、約４０００ヌクレオチド、約５０００ヌクレオチド、約６０００ヌクレオチド、約７０００ヌクレオチド、約８０００ヌクレオチド、および本発明の約９０００ヌクレオチドの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする全長ヌクレオチド配列までの範囲であり得る。
【００２３】
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子タンパク質の生物活性部分をコードする本発明のヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも１２、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００個、または本発明の全長第ＶＩＩＩ因子タンパク質中に存在する全アミノ酸数まで（例えば、配列番号１５、１７、または１９についてそれぞれ１４５７、１４６７、または１４６７アミノ酸）の連続アミノ酸をコードし、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを高レベルで発現する。
【００２４】
「改変体」は、実質的に類似の配列を意図する。ヌクレオチド配列について、保存的改変体には、遺伝コードの縮重のために本発明のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。改変体ヌクレオチド配列には、合成由来のヌクレオチド配列（例えば、部位特異的変異誘発の使用によって作製されているが、依然として高レベル発現によって特徴づけられる第ＶＩＩＩＳＥＰ因子タンパク質をコードするものなど）が含まれる。一般に、本発明の特定のヌクレオチド配列の改変体は、本明細書中に記載の配列アラインメントプログラムによって決定したところ、特定のヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは約９８％、９９％、またはそれ以上の配列が同一である。
【００２５】
「改変体」タンパク質は、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端の１つまたは複数のアミノ酸の欠失（いわゆる、短縮）もしくは付加、タンパク質中の１つまたは複数の部位での１つまたは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、またはタンパク質中の１つまたは複数の部位での１つまたは複数のアミノ酸の置換による配列番号１５、１７、または１９のポリペプチド由来のタンパク質を意図する。本発明に含まれる改変体タンパク質は生物学的に活性であるので（すなわち、配列番号１５、１７、または１９の所望の生物活性を保有し続けている）、これらは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを高レベル発現し続ける。このような改変体は、例えば、遺伝子多型または人為的操作に起因し得る。本発明のポリペプチドの生物活性改変体は、デフォルトパラメーターを使用した本明細書中に記載の配列アラインメントプログラムによって決定したところ、配列番号１５、１７、または１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列が同一である。本発明のタンパク質の生物活性改変体は、本発明のタンパク質とわずか１〜１００、１〜５０、１〜２５、１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０（６〜１０など）アミノ酸残基、わずか５アミノ酸残基、わずか４、３、２アミノ酸残基、またはわずか１アミノ酸残基が異なり得る。
【００２６】
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドの生物活性を、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイすることができる。上記で考察するように、本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドは、高レベル発現によって特徴づけられる。高レベル発現を測定するためのアッセイは当該分野で公知である。例えば、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドの発現レベルを、ウェスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡによって測定することができる。他の方法には、例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する細胞株の３５Ｓ−メチオニンでの標識およびその後の放射性標識第ＶＩＩＩ因子分子の免疫沈降が含まれる。あるいは、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドの発現レベルを、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド活性の測定によってアッセイすることができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子発現の増加を、当該分野で公知の標準的なアッセイ（１段階凝固アッセイまたは２段階活性アッセイが含まれる）を使用した第ＶＩＩＩ因子活性の測定によってアッセイすることができる。例えば、米国特許第６，４５８，５６１号および以下の実施例の項を参照のこと。
【００２７】
簡単に述べれば、凝固アッセイは、第ＶＩＩＩ因子が血友病Ａ患者由来の血漿の凝固時間を短縮する能力に基づく。例えば、１段階アッセイでは、０．１ｍｌの血友病Ａ血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を、水浴中で０．１ｍｌ活性部分トロンボプラスチン試薬（ＡＰＴＴ）（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）および０．０１ｍｌサンプルまたは標準（希釈したクエン酸塩加正常ヒト酸血漿からなる）と３７℃で５分間インキュベートする。インキュベーション後、０．１  ｍｌ  ２０  ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加し、フィブリン凝塊の形成時間を目視によって決定する。第ＶＩＩＩ因子単位を、１ｍｌのクエン酸塩加正常ヒト血漿中の存在量と定義する。
【００２８】
１段階アッセイは、血友病Ａ血漿中で形成されたアクチベーターによる第ＶＩＩＩ因子の内因性活性化に依存するのに対し、２段階アッセイは予め活性化した第ＶＩＩＩ因子の凝血促進薬活性を測定する。２段階アッセイでは、トロンビンと反応した第ＶＩＩＩ因子を含むサンプルを、予備インキュベーションを行った活性化部分トロンボプラスチンとヒト血友病Ａ血漿との混合物に３７℃で５分間添加する。得られた凝固時間を、上記のヒト検量線に基づいて単位／ｍｌに変換する。例えば、米国特許第６，３７６，４６３を参照のこと。
【００２９】
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドを、種々の方法（アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入が含まれる）で変化させることができる。このような操作方法は、一般に、当該分野で公知である。例えば、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子タンパク質のアミノ酸配列改変体を、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異誘発法およびヌクレオチド配列を変化させる方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびこれらで引用された文献を参照のこと。第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の生物活性（すなわち、高レベル発現）に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスを、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（本明細書中で参考として援用される）のモデルに見出すことができる。保存的置換（１つのアミノ酸の類似の特性を有する別のアミノ酸との交換など）が好ましい。あるいは、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子のＡ１およびａｐ−Ａ３ドメイン中のブタアミノ酸数を最小にし、且つ第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の高レベル発現を依然として保持し続ける方法は当該分野で公知であり、例えば、本明細書中に記載の重複伸長のスプライシングなどによる確立された部位特異的変異誘発が含まれる。明らかに、改変体をコードするＤＮＡ中で得られた変異は、読み取り枠の範囲外の配列に置かれてはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補領域を作製しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。
【００３０】
置換、欠失、または挿入の正確な効果をそれらに先だって予想することが困難な場合、当業者は、効果を慣用的なスクリーニングアッセイによって評価することを認識する。すなわち、本明細書中で詳細に考察されている第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現によって活性を評価することができる。
【００３１】
「配列同一性」は、改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の連続セグメントを基準配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と整列させて比較した場合に改変体配列および基準配列内に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が見出されることを意図する。配列アラインメント法および配列間の同一性の決定方法は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照のこと。２つのヌクレオチド配列の最適なアラインメントに関して、改変体ヌクレオチド配列の連続セグメントは、基準ヌクレオチド配列に対してさらなるヌクレオチドを有するか、ヌクレオチオが欠失し得る。同様に、２つのアミノ酸配列の最適なアラインメントを目的として、改変体アミノ酸配列の連続セグメントは、基準アミノ酸配に対してさらなるアミノ酸残基を有するか、アミノ酸残基が欠失し得る。基準ヌクレオチド配列または基準アミノ酸配列との比較で使用される連続セグメントは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含むか、３０、４０、５０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基であり得る。改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中のギャップ包含に関連する配列同一性の増加を、ギャップペナルティの割り当てによって補正することができる。配列アラインメント法は、当該分野で周知である。
【００３２】
２配列間の同一率を、数学アルゴリズムを使用して決定する。詳細には、本発明の目的のために、ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭ座標６２を使用したアフィン６ギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して、アミノ酸配列の同一率を決定する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２−４８９（本明細書中で参考として援用される）に教示されている。あるいは、本発明の目的のために、ギャップオープンペナルティ２５およびギャップ伸長ペナルティ５を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して、ヌクレオチド配列の同一率を決定する。このような配列同一性の決定を、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃのＤｅＣｙｐｈｅｒ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを使用して実施することができる。
【００３３】
アミノ酸同一率を考慮した場合、ポリヌクレオチド機能の性質に影響を与えない保存的アミノ酸置換の結果としていくつかのアミノ酸の位置が異なり得ることがさらに認識される。これらの例では、保存的に置換されたアミノ酸における類似性を計算するために配列同一率を上方に調整することができる。このような調整は当該分野で周知である。例えば、Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００３４】
本発明の配列の改変体は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに高レベル発現を付与するＡ１Ｐおよびａｐ−Ａ３Ｐドメインのアミノ酸残基のみを含む第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードし得る。したがって、高レベル発現を保持することが必要な残基のみが第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチド中で保持されるようにＡ１ＰおよびＡ３Ｐドメインを漸増的にヒト化することができる。このような方法は、当業者に公知であり、以下にもより詳細に考察する。例えば、米国特許第６，３７６，４６３号；同第６，４８，５６３号；同第５，７４４，４６６号；同第５，８８８，９７４号；同第５，６６３，０６０号；同第５，３６４，７７１号；同第５，８５９，２０４号；および同第６，１８０，３７１号（その全てが本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。さらに、ヒト第ＶＩＩＩ因子  Ａ１−Ａ２−Ａ３ドメインの三次元モデルを使用して、ドメインの境界から離れた領域を同定することができることが認識される。当業者は、ヒト化のための標的アミノ酸残基を同定するためにこのモデルを使用することができる。
【００３５】
改変体第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントを、（１）単離血清由来動物サブユニットまたはヒトサブユニット（重鎖または軽鎖）と対応するヒトサブユニットまたは動物サブユニットとの置換；（２）ヒトドメインまたは動物ドメイン（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、およびＣ２）と対応する動物ドメインまたはヒトドメインとの置換；（３）ヒトドメインまたは動物ドメインの一部と動物ドメインまたはヒトドメインの一部との置換；（４）１つまたは複数の固有のヒトまたは動物アミノ酸を含む少なくとも１つの特異的配列と対応する動物またはヒトアミノ酸との置換；または（５）第ＶＩＩＩ因子に対する配列同一性が知られていないアミノ酸配列とヒト、動物、または改変体第ＶＩＩＩ因子中の１つまたは複数の特異的アミノ酸残基を含む少なくとも１つの配列またはそのフラグメントとの置換によって作製することができることが認識される。対応セグメントをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によって各アミノ酸を置換することができる。
【００３６】
第ＶＩＩＩ因子分子では、本明細書中で使用される「ドメイン」は、内部アミノ酸配列の同一性およびトロンビンによるタンパク質分解性切断部位によって定義されるアミノ酸の連続配列である。特に他で明記しない限り、第ＶＩＩＩ因子ドメインは、配列をヒトアミノ酸配列（配列番号６）と整列した場合、以下のアミノ酸残基を含む：Ａ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ｂ、残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列（残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９）は、通常、第ＶＩＩＩ因子軽鎖活性化ペプチドという。第ＶＩＩＩ因子はトロンビンまたは第Ｘａ因子によるタンパク質分解によって活性化されてｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子から解離し、凝血促進機能を有する第ＶＩＩＩ因子を形成する。第ＶＩＩＩａ因子の生物学的機能は、第Ｘ因子活性化に対する第ＩＸａ因子の触媒有効性を桁違いに増加させることである。トロンビン活性化第ＶＩＩＩａ因子は、血小板または単球表面上で第ＩＸａ因子および第Ｘ因子と複合体を形成する１６０ｋＤａのＡ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ヘテロ三量体である。本明細書中で使用される、「部分的ドメイン」は、ドメインの一部を形成するアミノ酸の連続配列である。本明細書中で使用される、ヒトまたは動物（すなわち、マウス、ブタ、イヌなど）第ＶＩＩＩ因子の「サブユニット」は、タンパク質の重鎖および軽鎖である。第ＶＩＩＩ因子の重鎖は、３つのドメイン（Ａ１、Ａ２、およびＢ）を含む。第ＶＩＩＩ因子の軽鎖は、３つのドメイン（Ａ３、Ｃ１、およびＣ２）も含む。本明細書中で使用される、「固有の」アミノ酸残基または配列は、他方の種の第ＶＩＩＩ因子分子中の相同な残基または配列と異なる一方の種の第ＶＩＩＩ因子分子中のアミノ酸配列または残基をいう。本明細書中で使用される、「哺乳動物第ＶＩＩＩ因子」には、他で明記しない限り、任意の非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子が含まれる。本明細書中で使用される、「動物」は、ブタおよび他の非ヒト哺乳動物をいう。
【００３７】
最新情報では、Ｂドメインは阻害エピトープを含まず、且つ第ＶＩＩＩ因子機能に対する効果も知られていないので、本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子変異体は、Ｂドメインまたはその一部を有し得る。さらに、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子改変体はまた、ブタまたはヒトの第Ｖ因子由来のＢドメインを有するＶＩＩＩ因子Ｂドメインを有し得る。例えば、米国特許５，００４，８０３号を参照のこと。本明細書中で使用される、「無Ｂドメイン（Ｂ−ｄｏｍａｉｎｌｅｓｓ）」改変体第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントは、Ｂドメインを欠く本明細書中に記載の改変体第ＶＩＩＩＳＥＰ因子構築物またはその一部の任意の１つをいう。
【００３８】
当業者は、確立された変異誘発技術によって動物またはヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの各サブユニット、ドメイン、または連続部分をクローン化し、対応するヒトまたはブタのサブユニット、ドメイン、またはドメインの一部と置換し、それにより第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントが得られる技術を承知している。例えば、Ｌｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１２）：８６３９−８６４１は、従来の制限部位を使用したヒトドメインのブタＡ２ドメインへの置換技術を記載している。一方の種の第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ領域と他方の種の第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡとの他の置換方法には、Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：２７０−２７９に記載の重複伸長（「ＳＯＥ」）によるスプライシングが含まれる。
【００３９】
ＤＮＡ構築物およびベクター
第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドまたはその活性改変体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を、ＤＮＡ構築物に含めることができる。ＤＮＡ構築物は、所望の細胞型で第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドの発現を駆動するウイルスおよび哺乳動物供給源由来の種々のエンハンサー／プロモーターを含み得る。ＤＮＡ構築物は、３’調節配列ならびにＤＮＡのサブクローニングおよび収率を促進する核酸配列をさらに含み得る。
【００４０】
転写プロモーターおよび（所望ならば）転写エンハンサーエレメントを、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの核酸配列に作動可能に連結させる。「プロモーター」は、核酸配列の直接転写に十分な最小ＤＮＡ配列と定義する。「転写エンハンサーエレメント」は、隣接遺伝子の転写を刺激する調節ＤＮＡ配列をいう。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列を、プロモーター配列に作動可能に連結される。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照のこと。
【００４１】
「作動可能に連結された」は、調節プロモーターと第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列との間の機能的連結を意図する。機能的連結により、適切な転写アクチベータータンパク質が存在する場合に第ＶＩＩＩ因子の遺伝子を発現する。
【００４２】
したがって、ＤＮＡ構築物は、天然または外来であり得るプロモーターを含み得る。「外来」は、天然の生物中で見出されない配列を意味する。さらに、転写調節エレメントは、第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列に異種であり得る。「異種」は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする配列の上流に天然に見出されない任意のヌクレオチド配列を意図する。プロモーターは、天然の配列または合成配列であり得る。さらに、プロモーターは、構成性に活性であるか、組織特異的であるか、誘導性であり得る。組織特異的プロモーターを所与の組織中で活性化し、それにより活性化された組織中で遺伝子産物が発現する。
【００４３】
哺乳動物細胞での使用のために、プロモーターはウイルス由来であり得る。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびアデノウイルス２に由来する。アデノウイルスの主要な後期プロモーターであるので、ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターが有用である。さらに、調節配列が宿主細胞系に適合する場合、所望の遺伝子配列と正常に会合するプロモーターまたは調節配列を使用することもでき、しばしばこれが好ましい。
【００４４】
一定の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列の細胞への移入を、ＤＮＡ構築物中のマーカーの包含によってインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で同定することができる。マーカーにより、遺伝的に形質転換された細胞を同定可能に変化させることができる。薬物選択マーカーには、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールが含まれる。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの酵素または免疫学的マーカーを使用することができる。選択マーカーのさらなる例は、当該分野で周知である。
【００４５】
本発明の方法で使用するＤＮＡ構築物のデザインのための複数の変更形態を想定することができることが認識される。例えば、相同または部位特異的組換え系（すなわち、ＣｒｅまたはＦＬＰ組換え系）を使用した第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入のための構築物をデザインすることができる。
【００４６】
ＤＮＡ構築物は、宿主細胞に同時移入すべき少なくとも１つのさらなる遺伝子も含み得る。
【００４７】
本発明のヌクレオチド配列を、発現ベクターに含めることができる。「発現ベクター」は、所望の宿主細胞で自律複製するか宿主細胞ゲノムに組み込む能力を有し、且つ、例えば、適切な部位に適切な方向でベクター配列に挿入されたコードＤＮＡを発現させる一定の周知の性質も有するしばしば環状構造のＤＮＡエレメントである。このような特徴には、コードＤＮＡならびにエンハンサーおよびポリアデニル化部位などの他のＤＮＡエレメント（全て当該分野で周知）の転写開始を指示するための１つまたは複数のプロモーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４８】
他のベクター（プラスミドベクターおよび真核生物ウイルスベクターの両方が含まれる）を使用して、当業者の好みおよび判断に依存して、真核細胞中で組換え遺伝子構築物を発現することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６を参照のこと）。例えば、多数のウイルスベクターが当該分野で公知であり、例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアデノウイルスが含まれる。細胞への遺伝子の移入に有用な他のウイルスには、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルス（カナリア痘瘡ウイルスなど）が含まれるが、これらに限定されない。複製欠損ウイルス粒子の産生方法およびウイルスゲノムの操作方法は周知である。例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５、および米国特許第５，８８２，８７７号（アデノウイルス）；米国特許第５，１３９，９４１号（アデノ随伴ウイルス）；米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，６８１，７４６号、およびＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１７：５８１（レトロウイルス）（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。したがって、当該分野の知識を考慮すると、第ＶＩＩＩ因子配列の細胞への移入で使用するためのウイルスベクターを容易に構築することができる。他のベクターおよび発現系（細菌、酵母、および昆虫細胞系が含まれる）を使用することができるが、グリコシル化が異なるかこれを欠くので好ましくない。
【００４９】
本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、培養および組換え哺乳動物タンパク質発現で一般的に使用されている種々の細胞中で発現することができる。特に、多数のげっ歯類細胞株が巨大タンパク質の発現のための特に有用な宿主であることが見出されている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．から利用可能な好ましい細胞株には、慣用的な手順および培地を使用して培養されるベビーハムスター腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらなる目的の細胞には、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１３８、ＣＯＳ−７、およびＭＤＣＫ細胞株などの脊椎動物細胞が含まれ得る。他の適切な発現系については、ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６  ａｎｄ  １７  ｏｆ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照のこと。
【００５０】
発現および単離の方法
本発明のＤＮＡ構築物を、標準的な方法によって細胞（原核細胞または真核細胞）に移入することができる。本明細書中で使用される、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞にＤＮＡを移入するための認識された種々の技術をいうことを意図する。このような方法には、例えば、トランスフェクション（リポソーム−ポリブレン、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、または速度駆動微粒子銃（「遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）」）が含まれる。このような技術は、当業者に周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎａｕａｌ（２  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。あるいは、遺伝子送達体中のＤＮＡ構築物を送達させる系を使用することができる。遺伝子送達体は、ウイルス的または化学的であり得る。種々のウイルス遺伝子送達体を本発明で使用することができる。一般に、ウイルスベクターは、天然に存在するウイルス由来のウイルス粒子から構成される。天然に存在するウイルスを、複製欠損してさらなる感染性ウイルスが産生されないように遺伝的に改変されている。ウイルスベクターはまた、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現することができるＤＮＡ構築物を含む。
【００５１】
第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物を、非ウイルス遺伝子送達体によって細胞に投与することもできる。このような化学的遺伝子送達体には、例えば、ＤＮＡ−リポソーム複合体処方物またはＲＮＡ−リポソーム複合体処方物または裸のＤＮＡが含まれる。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１、米国特許第．５，８４４，１０７，米国特許第．５，１０８，９２１、およびＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：４２５５−４２５９（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５２】
第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドまたはその改変体もしくフラグメントの細胞への移入方法により、細胞ゲノムに安定に組み込まれるか、エピソームで一過性発現し得ることが認識される。
【００５３】
本明細書中で定義される、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡの「発現産物」は、基準ＤＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳前または翻訳後修飾（グリコシル化およびタンパク質分解性切断などが含まれるが、これらに限定されない）の特徴を有する適切な宿主細胞中の基準ＤＮＡの発現から得た産物である。このような修飾が起こり、宿主細胞の型および他の要因に依存して幾らか異なり、凝血促進活性を保持した産物の分子イソ型を得ることができることが当該分野で公知である。例えば、Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９２７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５４】
１つの実施形態では、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントをコードするｃＤＮＡを、ＲｅＮｅｏなどの哺乳動物発現ベクターに挿入する。ＣＯＳ−７細胞における第ＶＩＩＩＳＥＰ因子を含むＲｅＮｅｏ発現ベクター中の一過性発現によって第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の予備的特徴づけを行う。活性第ＶＩＩＩＳＥＰ因子タンパク質が発現するかどうかを決定することができる。当該分野で慣用的な方法（リポソーム媒介トランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＴＭ），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）など）を使用してベビーハムスター腎臓細胞などの培養細胞を安定にトランスフェクトするために、発現ベクター構築物をさらに使用する。第ＶＩＩＩＳＥＰ因子タンパク質の発現を、例えば、配列決定、ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確認することができる。
【００５５】
タンパク質を安定に発現するトランスフェクション細胞が維持された培養培地中の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を、沈殿、ペレット化、洗浄、および適切な緩衝液への再懸濁を行うことができ、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子タンパク質またはその改変体もしくはフラグメントを標準的な技術（例えば、モノクローナル抗Ａ２−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を使用したイムノアフィニティクロマトグラフィ）によって精製する。
【００５６】
本明細書中で使用される、「融合タンパク質」、「融合第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメント」は、第１のタンパク質のコード配列を、例えば、その一部の異なる遺伝子由来の第２のタンパク質のコード配列への融合によって大規模に変化させて融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子を産生するハイブリッド遺伝子産物である。
【００５７】
さらなる実施形態では、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントを、例えば、安定性、分泌、検出、または単離などを強化するタンパク質またはペプチドをコードする配列が第ＶＩＩＩ因子コード配列に隣接した位置に挿入された組換え分子から融合タンパク質として発現する。例えば、哺乳動物宿主細胞での第ＶＩＩＩ因子を産生するための組換えＤＮＡ法およびヒト第ＶＩＩＩ因子の精製方法を開示した米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびＢＨＫＣ（ベビーハムスター腎臓細胞）におけるヒト第ＶＩＩＩ因子の発現が報告されている。融合タンパク質調製における相同または異種発現調節配列（例えば、プロモーター、オペレーター、およびレギュレーターが含まれる）の確立された使用プロトコールは当該分野で公知であり、慣用的に使用されている。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ，（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。発現はＢドメイン部分の包含によって強化されることがさらに留意される。特に、「ＳＱ」と呼ばれるＢドメイン部分の包含（Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９２７（本明細書中で参考として援用される））により好ましい発現が得られる。「ＳＱ」構築物は、ＢドメインのＮ末端の５アミノ酸およびＢドメインのＣ末端の９アミノ酸以外の全てヒトＢドメインを欠く。
【００５８】
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントを再構成法によって調製することができることがさらに認識される。この実施形態では、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントを、血小板由来の第ＶＩＩＩ因子のサブユニット、ドメイン、またはドメインの連続部分の単離およびその後の本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドを産生するための再構築および精製によって作製する。あるいは、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントを、組換えＤＮＡ法およびその後の再構築および精製によって作製することができる。
【００５９】
より詳細には、組換え法による第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の調製方法を、ヒトおよび動物の第ＶＩＩＩ因子のサブユニット（重鎖および軽鎖）の単離およびその後の重鎖および軽鎖の組換え、またはヒト軽鎖および動物重鎖の組換えを含むＦａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６１９７；およびＬｏｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０４５１によって報告された手順の修正手順によって実施することができる。
【００６０】
ヒトおよび動物の各サブユニットの単離は、軽鎖／重鎖二量体の解離を含む。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でのカルシウムのキレート化およびその後のｍｏｎｏＳ（商標）ＨＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）によってこれを実施する。ハイブリッドヒト／動物第ＶＩＩＩ因子分子を、カルシウムの存在下で単離サブユニットから再構築する。ハイブリッドヒト軽鎖／動物重鎖または動物軽鎖／ヒト重鎖第ＶＩＩＩ因子をＬｏｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｌｏｏｄ  ７１：１３７−１４３および米国特許第６，３７６，４６３号（共に本明細書中で参考として援用される）などに記載のブタ第ＶＩＩＩ因子の単離手順によるｍｏｎｏＳ（商標）ＨＰＬＣにより未反応重鎖から単離する。
【００６１】
診断アッセイ
本明細書中で使用される、「診断アッセイ」には、いくつかの様式で薬物療法の選択を補助するための試験サンプル中に存在する特定の抗体を検出および／または定量するために抗原−抗体相互作用を使用するアッセイが含まれる。当業者に公知の多数のこのようなアッセイが存在する。しかし、本明細書中で使用される、「第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ＤＮＡまたはその改変体もしくはフラグメントおよびこれらから発現するタンパク質」の全体または一部を別の公知のアッセイにおいて対応する試薬に置換することができ、それにより、修正アッセイを使用して第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を検出および／または定量することができる。アッセイは、これらの試薬、ヒトもしくは動物の第ＶＩＩＩ因子またはハイブリッドヒト／動物第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を検出するための公知のアッセイを修正する第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ＤＮＡ、その改変体もしくはフラグメントまたはこれらから発現されるタンパク質を使用する。本明細書中で使用される、「第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはこのタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むその改変体もしくはフラグメント」を診断試薬として使用することができる。
【００６２】
第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントのＤＮＡまたはアミノ酸配列を、ヒトまたは動物第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体の検出のための診断試薬としてアッセイで使用することができる（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損患者の血清および体液のサンプル）。これらの抗体アッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫ブロット、放射性免疫アッセイ、免疫拡散アッセイ、および第ＶＩＩＩ因子の生物活性のアッセイ（例えば、凝固アッセイによる）などのアッセイが含まれる。使用することができる第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントには、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイおよび抗凝固アッセイが含まれる。これらの試薬の調製技術およびその使用方法は、当業者に公知である。例えば、患者の血清サンプル中の阻害抗体の検出のための免疫アッセイは、試験サンプルと少なくとも１つの抗原部位を含む十分量（サンプル中で阻害抗体との検出可能な複合体の形成に十分な量）の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子との反応を含み得る。
【００６３】
核酸およびアミノ酸プローブを、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ＤＮＡもしくはタンパク質分子またはそのフラグメントもしくは改変体の配列に基づいて調製することができる。いくつかの実施形態では、これらを市販されている色素標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、または放射性標識を使用して標識することができる。アミノ酸プローブを使用して、例えば、ヒト、動物、またはハイブリッドヒト／動物第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビターの存在が疑われる血清または他の体液をスクリーニングすることができる。患者中のインヒビターの標識を定量し、健常なコントロールと比較することができ、例えば、これを使用して第ＶＩＩＩ因子欠損症患者を第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその活性フラグメントもしくは改変体で治療することができるかどうかを決定することができる。例えば、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする際の調査のためにｃＤＮＡプローブが、使用され得る。
【００６４】
薬学的組成物
本発明は、さらに、本発明の高レベル発現第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントをコードする核酸分子およびポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。このような組成物は、本発明の核酸およびポリペプチドを単独かＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（本明細書中で参考として援用される）に記載の公知の方法によって調製した適切な薬学的安定化化合物、送達賦形剤、および／またはキャリア賦形剤と組み合わせてを含み得る。
【００６５】
１つの実施形態では、静脈内注入用の好ましいキャリアまたは送達賦形剤は、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水である。
【００６６】
別の実施形態では、適切な安定化化合物、送達賦形剤、およびキャリア賦形剤には、アルブミンなどの他のヒトまたは動物タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
リン脂質小胞またはリポソーム懸濁液も薬学的に許容可能なキャリアまたは送達小胞として使用することができる。当業者に公知の方法にしたがってこれらを調製することができ、第ＶＩＩＩ因子は負電荷のリン脂質膜に結合するので、例えば、ホスファチジルセリン−ホスファチジルコリンもしくは他のリン脂質成分または共に表面を負電荷にする界面活性剤を含み得る。その後蒸発する無機溶媒への適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）の溶解およびコンテナ表面上の乾燥脂質薄膜を残すことによってリポソームを調製することができる。次いで、本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の水溶液を、コンテナに導入する。次いで、コンテナを手で回転させて脂質物質をコンテナの端から遊離させ、脂質凝集体を分散させ、それによりリポソーム懸濁液を形成する。
【００６８】
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子分子を、他の適切な安定化化合物、送達賦形剤、および／またはキャリア賦形剤（ビタミンＫ依存性凝固因子、組織因子、およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷｆ）、または第ＶＩＩＩ因子結合部位を含むｖＷｆのフラグメント、およびスクロースなどの多糖が含まれる）と組み合わせることができる。
【００６９】
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子分子を、レトロウイルスベクターなどの送達手段を使用した遺伝子療法によって送達することもできる。この方法は、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子欠損症患者に直接移植するか第ＶＩＩＩＳＥＰ因子に透過性を示すが細胞に不透過性を示す移植可能デバイスに入れ、その後移植するヒト細胞への本発明の所望の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組み込みからなる。
【００７０】
１つの実施形態では、方法はレトロウイルス媒介遺伝子導入である。この方法では、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変レトロウイルスのゲノムにクローン化する。細胞によって発現されるウイルス機構によって宿主細胞のゲノムに遺伝子を挿入する。ウイルスを産生せず、宿主へのウイルス感染を回避するようにレトロウイルスベクターを改変する。この治療型の一般的原理は当業者に公知であり、文献（Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２９：８１２−８２０）に概説されている。
【００７１】
ポリペプチド分子の半減期および半減期を増加させるためにｖＷｆに結合させた本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子ポリペプチドを保存することができる。さらに、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の凍結乾燥により、ｖＷｆの存在下での活性分子の収率を改良することができる。販売者によって使用されている現在のヒトおよび動物の第ＶＩＩＩ因子の保存方法を、組換え第ＶＩＩＩ因子の保存に使用することができる。これらの方法は、（１）部分精製状態の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の凍結乾燥（さらに精製することなく注入される第ＶＩＩＩ因子「濃縮物」として）、（２）第ＶＩＩＩ因子を安定化させるアルブミンの存在下でのＺｉｍｍｅｒｍａｎ法および凍結乾燥による第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の免疫親和性精製、（３）アルブミンの存在下での組換え第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の凍結乾燥を含む。
【００７２】
さらに、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、４℃の０．６Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、および５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ６．０）中で保存することができる。ポリペプチドを、最小の活性の喪失でこれらの緩衝液中で凍結して保存し、融解することもできる。
【００７３】
治療方法
第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントおよび改変体を使用して、阻害抗体を有するか有さない血友病および阻害抗体の発生によって第ＶＩＩＩ因子を欠損した患者における第ＶＩＩＩ因子に起因する制御不可能な出血（例えば、動脈内出血、頭蓋内出血、または胃腸出血）を治療することができる。活性物質を静脈内投与することが好ましい。
【００７４】
本明細書中で使用される、「第ＶＩＩＩ因子欠損症」には、欠陥第ＶＩＩＩ因子の産生、第ＶＩＩＩ因子の不適切な産生もしくは非産生、またはインヒビターによる第ＶＩＩＩ因子の部分的もしくは完全な阻害によって生じる凝固活性の欠損が含まれる。血友病Ａは、Ｘ染色体連鎖遺伝子の欠陥およびコードされる第ＶＩＩＩ因子タンパク質の非存在または欠損に起因する第ＶＩＩＩ因子欠損型である。
【００７５】
さらに、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントおよび改変体を、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子を産生するように遺伝子操作した細胞の移植または上記の細胞を含むデバイスの体内移植によって投与することができる。
【００７６】
１つの実施形態では、単独または安定剤、送達賦形剤、および／またはキャリアと組み合わせた第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントおよび改変体の薬学的組成物を、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子で使用した同一の手順にしたがって患者に静脈内注入する。
【００７７】
このような治療を必要とする患者に投与しなければならない第ＶＩＩＩＳＥＰ因子組成物またはその改変体もしくはフラグメントの治療用量は、第ＶＩＩＩ因子欠損症の重症度によって変化する。一般に、投薬レベルを、頻度、継続期間、ならびに各患者の出血エピソードの重症度および持続時間に調和する単位で調整する。したがって、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントを、標準的な凝固アッセイによって測定したところ、出血を停止させるための治療有効量のハイブリッドを患者に送達するのに十分な量で薬学的に許容可能なキャリア、送達賦形剤、または安定剤に含める。
【００７８】
本明細書中で使用される、「比活性」は、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固欠陥を補正する活性をいう。ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固時間を正常なヒトの血漿の凝固時間と比較する標準的なアッセイにおいて、１ｍｇの総第ＶＩＩＩ因子タンパク質あたりの凝固活性単位で比活性を測定する。１単位の第ＶＩＩＩ因子活性は、１ｍｌの正常なヒト血漿中に含まれる活性である。アッセイでは、凝固形成時間が短いほどアッセイされた第ＶＩＩＩ因子の活性が高い。第ＶＩＩＩ因子またはその改変体もしくはフラグメントの比活性は、血漿由来または組換えヒト第ＶＩＩＩ因子の比活性より低いか、同等であるか、高くなり得る。
【００７９】
第ＶＩＩＩ因子は、血友病Ａ個体由来の血漿の凝固欠陥を補正する正常な血漿中に存在する物質と古典的に定義する。精製および部分精製形態の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の凝固薬のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）活性を使用して、ヒト患者への注入のための第ＶＩＩＩ因子の用量を計算し、これは患者の血漿から回収した活性およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）出血欠陥の補正の信頼できる指標である。Ｌｕｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：４５３−４５９；Ｐｉｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ７９：３８９−３９７；およびＢｒｉｎｋｈｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：８７５２−８７５５によってインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での新規の第ＶＩＩＩ因子分子の標準的なアッセイとイヌ注入モデルまたはヒト患者におけるその挙動との間の矛盾は報告されていない。
【００８０】
血漿中の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子の増加は、治療効果を得るのに十分である。「治療効果」は、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子分子の投与前の被験体で認められる凝固活性を超える患者の血漿中の血液凝固活性の増加と定義する。標準的な血液凝固アッセイでは、凝固形成時間が短いほどアッセイされる第ＶＩＩＩ因子の活性が高い。少なくとも１％またはそれ以上の第ＶＩＩＩ因子欠損血漿中の第ＶＩＩＩ因子の増加が治療的に有利である。
【００８１】
通常、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントの投与による患者で達成されるべき所望の血漿第ＶＩＩＩ因子レベルは、正常レベルの３０〜１００％の範囲である。第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントもしくは改変体の１つの投与様式では、組成物を、約５〜５０単位／ｋｇ体重の範囲、より好ましくは１０〜５０単位／ｋｇ体重の範囲、最も好ましくは２０〜４０単位／ｋｇ体重の範囲の好ましい投薬量で静脈内注射し、投与間隔は、約８〜２４時間の範囲であり（重症血友病）、治療継続日数は、１〜１０日間の範囲または出血エピソードが解消するまでである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．Ｃｈ．１５３，１４５３−１４７４（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。インヒビターを有する患者は、より大量の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはその改変体もしくはフラグメントを必要とし得るか、患者はより少量の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントもしくは改変体を必要とし得る。ヒトまたはブタの第ＶＩＩＩ因子での治療の場合、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはフラグメントもしくは改変体の注入量を、１段階第ＶＩＩＩ因子凝固アッセイによって決定し、選択された例では、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）回収率を注入後の患者の血漿中の第ＶＩＩＩ因子の測定によって決定する。組成物を投与または監督する者の個別の要求および専門的判断によって任意の特定の被験体のための特定の投薬計画を長期的に調整すべきであり、本明細書中に記載の濃度範囲は例示のみを目的とし、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実務を制限することを意図しないと理解すべきである。
【００８２】
治療は、必要に応じて、組成物の単回静脈内投与形態または長期間にわたる定期的または連続的投与形態をとることができる。あるいは、第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントもしくは改変体を、種々の時間間隔で１回または数回の投与でリポソームと共に皮下または経口投与することができる。
【００８３】
第ＶＩＩＩＳＥＰ因子またはそのフラグメントもしくは改変体を使用して、ヒト第ＶＩＩＩ因子に対する抗体が産生された血友病患者における第ＶＩＩＩ因子欠損症に起因する制御不可能な出血を治療することもできる。
【実施例】
【００８４】
実験
実施例１
第ＶＩＩＩ因子の配列の特徴
ブタおよびヒトの第ＶＩＩＩ因子を、２つのサブユニットタンパク質として血漿から単離する。重鎖および軽鎖として公知のサブユニットを共にカルシウムまたは他の２価の金属イオンを必要とする非共有結合によって保持する。第ＶＩＩＩ因子の重鎖は、共有結合した３つのドメイン（Ａ１、Ａ２、およびＢ）を含む。第ＶＩＩＩ因子の軽鎖は、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２と呼ばれる３つのドメインを含む。Ｂドメインの生物学的機能は知られておらず、第ＶＩＩＩ因子の任意の測定可能なパラメーターを有意に変化させることなくタンパク質分解または組換えＤＮＡ技術によって除去するか部分的に除去することができる。ヒト組換え第ＶＩＩＩ因子は、血漿第ＶＩＩＩ因子と類似の構造および機能を有するが、哺乳動物細胞で発現しない場合にグリコシル化されない。ヒトおよびブタの活性化第ＶＩＩＩ因子（「第ＶＩＩＩａ因子」）は、Ａ１ドメインとＡ２ドメインとの間の重鎖の切断に起因する３つのサブユニットを有する。この構造を、Ａ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と示す。
【００８５】
シグナルペプチドコード領域、Ａ１、Ｂ、軽鎖活性ペプチド領域Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインに対応するブタ第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す。ブタｃＤＮＡの翻訳を、配列番号２に示す。
【００８６】
全長ブタ第ＶＩＩＩ因子の推定アミノ酸配列（配列番号２）と、公開されているヒト配列（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３０−３３７）（配列番号６）およびマウス配列（Ｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ｓｕｐｒａ）（配列番号８）を、翻訳後修飾部位、タンパク質分解的切断部位、および他の高分子による認識部位と共に図１Ａ〜１Ｈに示す。
【００８７】
潜在的なＮ結合グリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ（Ｘはプロリンではない））が図１Ａ〜１Ｈで認められる。以下の８つの保存Ｎ結合グリコシル化部位が存在する：Ａ１ドメイン中に１個、Ａ２ドメイン中に１個、Ｂドメイン中に４個、Ａ３ドメイン中に１個、Ｃ１ドメイン中に１個。１９ＡおよびＣドメインのシステインは保存されているのに対して、Ｂドメインのシステインは異なる。第ＶＩＩＩ因子中の７個のジスルフィド結合のうちの６個は、第Ｖ因子およびセルロプラスミン中の相同部位で見出され、両Ｃドメインジスルフィド結合は第Ｖ因子中に見出される（ＭｃＭｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．４：７４０−７４６）。ヒト第ＶＩＩＩ因子は、３４６位、７１８位、７１９位、７２３位、１６６４位、および１６８０位に硫酸化チロシンを含む（Ｐｉｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：３３１５−３３２５；Ｍｉｃｈｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２００９５−２０１０２）。これらの残基は、マウス第ＶＩＩＩ因子およびブタ第ＶＩＩＩ因子で保存されているが（図１）、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムではヒト第ＶＩＩＩ因子中のＴｙｒ３４６に対応するマウスチロシンをアラインメントすることができなかった。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの種々のドメインのエピトープを、図１に概説する。
【００８８】
実施例２
まとめ
ヒト第ＶＩＩＩ因子の発現レベルは、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での異種発現系での他の凝固タンパク質レベルよりも有意に低い。組換えヒト第ＶＩＩＩ因子の低レベル発現は、組換えタンパク注入および遺伝子治療プロトコールを使用した血友病Ａの治療を制限していた。しかし、組換えＢドメイン欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で組換えＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子よりも１０〜１４倍のレベルで発現する。この性質に必要なブタ第ＶＩＩＩ因子の配列を同定するために、ヒト配列が対応するブタ配列に置換されたＢドメイン欠失ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを産生した。これらのｃＤＮＡを、ＣＯＳ−７細胞に一過性にトランスフェクトするか、ＢＨＫ由来の細胞に安定にトランスフェクトし、細胞外液（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｄｉａ）への第ＶＩＩＩ因子の発現を１段階凝固アッセイによって測定した。１）ブタ第ＶＩＩＩ因子のＡ１、Ａ２、およびＡ３ドメイン並びにヒト第ＶＩＩＩ因子のＣ１およびＣ２ドメインまたは２）ブタ第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ３ドメインおよびヒト第ＶＩＩＩ因子のＡ２、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含むヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡにより、ブタ第ＶＩＩＩ因子と類似の第ＶＩＩＩ因子発現レベルが証明された。高レベル発現が証明されたヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子分子は、血友病Ａの静脈内注入治療または体細胞遺伝子治療のための第ＶＩＩＩ因子産生の改良に有益であり得る。
【００８９】
材料
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ：Ｆ１２、無血清ＡＩＭ  Ｖ培養培地、リポフェクチン、リポフェクタミン２０００、およびゲネチシンを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＢＨＫ−Ｍ細胞と呼ばれるベビーハムスター腎臓由来細胞（Ｆｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１６５４−１６６０）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  のＤｒ．Ｒｏｓｓ  Ｍａｃｇｉｌｌｉｖｒａｙから譲渡された。ＲＬ−ＣＭＶベクターおよびＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用してトランスフェクション効率について一過性トランスフェクションを制御した。クエン酸加第ＶＩＩＩ因子欠損血漿およびプールしたクエン酸加正常ヒト血漿（ＦＡＣＴ）を、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ｋａｎｓ．）から購入した。活性化部分トロンボプラスチン試薬（ａＰＴＴ）を、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．）から購入した。オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ブルーセルを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から購入した。
【００９０】
第ＶＩＩＩ因子発現ベクターの構築
本研究における全ての第ＶＩＩＩ因子発現ベクターは、ＲｅＮｅｏ哺乳動物発現プラスミド中に含まれていた（Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７）。第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡインサートは、内因性第ＶＩＩＩ因子５’−ＵＴＲ配列を欠き、１８０５ｎｔのヒト第ＶＩＩＩ因子３’−ＵＴＲの最初の７４９ｎｔを含む。
【００９１】
以前に記載のように（Ｄｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）、ＨＳＱと呼ばれる（ｄｅｓｉｇｎｅｄ）ヒトＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（図２）を、哺乳動物発現ベクターＲｅＮｅｏへのヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのクローニングによって作製した。ＨＳＱ  ｃＤＮＡは、Ａ２ドメインとａｐドメインとの間のＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号９）リンカー配列をコードする。このリンカーは、ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎフリンによる細胞内タンパク質分解プロセシングのＲＨＱＲ（配列番号１０）認識配列を含む（Ｓｅｉｄａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６０２−６０７）。この切断事象は、一本鎖第ＶＩＩＩ因子をヘテロ二量体に変換する（Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７）。ヘテロ二量体第ＶＩＩＩ因子を、第ＶＩＩＩ因子の生理学的形態と見なす（Ｆａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ  ５９：５９４−６００）。
【００９２】
以前に記載のように（Ｄｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）、ブタ第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのＢドメイン欠失形態を、ＲｅＮｅｏにライゲーションした。Ｐ／ＯＬと呼ばれるｃＤＮＡ（図２）は、ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ認識のためにＡ２ドメインとａｐドメインとの間のブタ由来リンカー配列ＳＦＡＱＮＳＲＰＰＳＡＳＡＰＫＰＰＶＬＲＲＨＱＲ（配列番号１１）をコードする。
【００９３】
以前に記載のように（Ｌｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８６３９−８６４１）、ブタＡ２ドメインおよびヒトＡ１、ａｐ−Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含むＨＰ１と呼ばれる無Ｂドメイン（Ｂ−ｄｏｍａｉｎｌｅｓｓ）ハイブリッドヒト／ブタ第ＶＩＩＩ因子分子を調製した。ヒト由来リンカー配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号９）をコードするｃＤＮＡを、スプライシング・バイ・オーバーラップ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ）伸長（ＳＯＥ）変異誘発によってＨＰ１のＡ２ドメインとａｐドメインとの間に挿入して（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０−２７９）、ＨＰ１／ＳＱを得た（図２）。
【００９４】
以前に記載のように（Ｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：５５７−５６１）、ブタａｐ−Ａ３ドメインおよびヒトＡ１、Ａ２、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含むＨＰ３０を調製した。ブタ由来のリンカー配列ＳＦＡＱＮＳＲＰＰＳＡＳＡＰＫＰＰＶＬＲＲＨＱＲ（配列番号１１）をコードするｃＤＮＡを、ＳＯＥ変異誘発によってＨＰ３０のＡ２ドメインとａｐドメインとの間に挿入して、ＨＰ３０／ＯＬ（図２）を得た。
【００９５】
ブタＡ１、Ａ２、ａｐ−Ａ３ドメイン、ブタ由来のリンカー配列ＳＦＡＱＮＳＲＰＰＳＡＳＡＰＫＰＰＶＬＲＲＨＱＲ（配列番号１１）、ならびにヒトＣ１およびＣ２ドメインを含むＨＰ４４／ＯＬ（図２）を、以下のように調製した。Ｐ／ＯＬ  ＲｅＮｅｏをＡｖｒＩＩで消化し、Ａ１、Ａ２、およびＲｅＮｅｏ配列を含むフラグメントをゲル精製した。ＨＰ３０／ＯＬをＡｖｒＩＩで消化し、ブタａｐ−Ａ３配列ならびにヒトＣ１およびＣ２配列を含むフラグメントをゲル精製した。以前に記載のように（Ｈｅａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：３７０１−３７０９）に、産物のライゲーション、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１細胞の形質転換、およびプラスミド精製を行った。
【００９６】
ブタＡ１ドメインおよびヒトＡ２、ａｐ−Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメイン、ならびにヒトＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号１１）リンカー配列を含むＨＰ４６／ＳＱ（図２）を、ＳＯＥ変異誘発によって調製した。ＲｅＮｅｏ中のＰ／ＯＬおよびＲｅＮｅｏ中のＨＳＱを、第１ラウンドのＳＯＥ反応におけるテンプレートとして使用した。Ｐ／ＯＬ反応における５’プライマーは、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡに対して５’のＲｅＮｅｏ配列と相補的であった。３’プライマーは、ブタＡ１ドメインに隣接していた。ＨＳＱ反応における５’プライマーは、第１の反応で使用した３’プライマーと部分的に相補的であった。３’プライマーは、ヒトＡ２配列に相補的であった。第１ラウンドの反応由来の産物のゲル精製後、第２のＳＯＥ反応を行って、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡインサートに対して５’のＲｅＮｅｏ、ブタＡ１ドメイン、およびヒトＡ２ドメインの一部を含む産物を得た。この産物のＲｅＮｅｏと第ＶＩＩＩ因子インサートとの連結点をＸｈｏＩで消化し、ヒトＡ２ドメインをＭｌｕＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＭｌｕＩ消化ＨＳＱ／ＲｅＮｅｏにライゲーションした。上記のように、得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ブルーセルでの形質転換によって増幅した。
【００９７】
ブタＡ１、ａｐ−Ａ３ドメイン、ブタ由来のリンカー配列ＳＦＡＱＮＳＲＰＰＳＡＳＡＰＫＰＰＶＬＲＲＨＱＲ（配列番号１１）、ならびにヒトＡ２、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含むＨＰ４７／ＯＬ（図２）を以下のように調製した。ＲｅＮｅｏ中のＨＰ４６／ＳＱを、第ＶＩＩＩ因子インサートに対して５側であり、且つＡ２−ａｐ連結点でＲｅＮｅｏ配列中のプラスミドを切断するＡｖｒＩＩで消化した。Ａ１およびＡ２ドメインを含むフラグメントをゲル精製し、ＡｖｒＩＩ消化によって産生されたＲｅＮｅｏ中のＨＰ３０／ＯＬのフラグメントにライゲーションした。
【００９８】
ＳＯＥ変異誘発によって産生された配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９９】
ＣＯＳ−７細胞由来の第ＶＩＩＩ因子の一過性発現
１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１ｍｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２を含む２ｃｍ２ウェル中で、ＣＯＳ−７細胞を７０〜８０％コンフルエントまで増殖させた。リポフェクチン２０００を使用した質量比２０００：１の第ＶＩＩＩ因子プラスミド：ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで２回リンスし、０．５ｍｌの無血清ＡＩＭＶ培地を各ウェルに添加した。下記のように、細胞を２４時間培養し、その後馴化培地を回収し、第ＶＩＩＩ因子活性を測定した。
【０１００】
ベビーハムスター腎臓由来（ＢＨＫ−Ｍ）細胞由来の第ＶＩＩＩ因子の安定な発現  第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを含むＲｅＮｅｏプラスミドと共にリポフェクチンを使用してＢＨＫ−Ｍ細胞をトランスフェクトし、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５００μｇ／ｍｌゲネチシンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２の存在下で１０日間培養した。ＲｅＮｅｏベクターは、抗生物質ゲネチシン耐性のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。２４〜７２時間のゲネチシン耐性クローンを、第ＶＩＩＩ因子産生についてスクリーニングした。最高レベルの第ＶＩＩＩ因子活性を示した各ｃＤＮＡ構築物由来のクローンを、７５ｃｍ２フラスコに移して９０〜９５％コンフルエントに増殖させ、２５ｍｌの無血清ＡＩＭＶ培地と交換した。２４時間後、馴化培地を２５ｍｌの新鮮な無血清培地ＡＩＭ  Ｖと置換し、さらに２４時間培養した。各時点由来の回収培地を、下記のように第ＶＩＩＩ因子活性についてアッセイした。
【０１０１】
第ＶＩＩＩ因子アッセイ
ＳＴ  ａｒｔ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した１段階凝固アッセイによって、第ＶＩＩＩ因子活性を測定した。５μｌのサンプルまたは標準を５０μｌ第ＶＩＩＩ因子欠損血漿に添加し、その後５０μｌのａＰＴＴ試薬を添加し、３７℃で３分間インキュベートした。５０μｌの２０ｍＭのＣａＣｌ２を添加して反応を開始し、フィブリン凝塊形成に必要な時間を粘度的に測定した。プールした正常なヒト血漿の数種の希釈物を使用して検量線を作成し、血漿希釈物の逆数の対数に対する凝固時間の直線回帰分析に供した。第ＶＩＩＩ因子活性の決定のために、サンプルを、検量線の範囲内の濃度までＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で希釈した。
【０１０２】
結果
高レベル発現を付与するブタ第ＶＩＩＩ因子中の領域を同定するために、図２に示すヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子分子を構築し、ＣＯＳ−７細胞およびＢＨＫ−Ｍ細胞におけるその発現レベルを測定した。ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション後、発現プラスミドはゲノムＤＮＡに組み込まないが、エピソームＤＮＡとして一過性に存在する。ＣＯＳ−７細胞由来の発現レベルは、細胞集団の平均である。図３は、４連でトランスフェクトしたＣＯＳ−７ウェルの結果を示す。ＨＳＱと比較して、Ｐ／ＯＬ、ＨＰ４４、ＨＰ４７、およびＨＰ４６の発現が有意に増加する。対照的に、ＨＰ１およびＨＰ３０の発現はＨＳＱと比較して増加しなかった。
【０１０３】
ＢＨＫ−Ｍ細胞由来の第ＶＩＩＩ因子の発現は、ＣＯＳ−７細胞の結果と一致した。ＢＨＫ−Ｍ細胞のトランスフェクション後、ゲノムに安定に組み込まれたプラスミドＤＮＡを含むクローンを抗生物質ゲネチシンを使用して選択した。プラスミド中に含まれるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含まない細胞は、ゲネチシンの存在下で生存しない。図２に記載の構築物でのＢＨＫ−Ｍ細胞のトランスフェクションに起因する約５０％のクローンは、検出可能レベルの第ＶＩＩＩ因子を発現しなかった（データ示さず）。これは、ＨＳＱおよびＰ／ＯＬを使用した以前の結果（Ｄｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）と一致し、第ＶＩＩＩ因子発現自体がゲネチシン選択で選択されないことによると予想される。第ＶＩＩＩ因子産生クローンの平均発現レベルは、ＨＳＱと比較してＰ／ＯＬ、ＨＰ４４、ＨＰ４７、およびＨＰ４６で有意に高いが、ＨＰ１およびＨＰ３０構築物ではそうではなかった（データ示さず）。各第ＶＩＩＩ因子構築物について、最高レベルの第ＶＩＩＩ因子を産生するクローンを拡大し、無血清ＡＩＭ  Ｖ培地と交換した。上記結果と一致して、ＨＰ４４、ＨＰ４７、およびＨＰ４６の第ＶＩＩＩ因子レベルはＰ／ＯＬに類似するが、ＨＰ１およびＨＰ３０ではそうではなかった（図３）。
【０１０４】
図３は、組換えブタ第ＶＩＩＩ因子ＯＬおよび組換えヒト第ＶＩＩＩ因子ＳＱの異種発現を示す。実験手順に記載のように、ＣＯＳ−７細胞（実線）を各第ＶＩＩＩ因子発現構築物およびルシフェラーゼプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、無血清培地中で２４時間培養した。１段階凝固アッセイによって、馴化培地を第ＶＩＩＩ因子活性についてアッセイした。培地回収後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。平均ＨＳＱレベルに正規化した第ＶＩＩＩ因子活性：ルシフェラーゼ活性比（各サンプルについてのトランスフェクション細胞の４つのウェルの平均＋／−標準偏差）としてデータを示す。示したデータは、３つの異なるＣＯＳ−７細胞培養を含む代表的実験である。ＢＨＫ−Ｍ細胞細胞（斜線のバー）を、各第ＶＩＩＩ因子発現構築物でトランスフェクトし、安定な導入遺伝子の組み込みについて選択した。各構築物の最多産生クローンを、７５ｃｍ２フラスコに分注し、９０％を超えるコンフルエントに成長させ、ＰＢＳで２回リンスし、無血清培地中で２４時間培養した。２４時間後、培地を回収し、第ＶＩＩＩ因子活性についてアッセイした。ＨＳＱ発現との比較データを示し、ＢＨＫ−Ｍ細胞において２．８単位／１０６細胞／２４時間であった。
【０１０５】
考察
組換えＢドメイン欠失ブタ第ＶＩＩＩ因子は、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子よりも１４倍までのレベルで発現する（Ｄｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）。このレベルは、第ＶＩＩＩ因子発現の以前に公開された報告よりも実質的に高い（表２）。高発現現象の機構は確立されなかった。しかし、Ｐ／ＯＬおよびＨＳＱ発現カセットは内因性第ＶＩＩＩ因子５’ＵＴＲ配列を含まない一方で、共にヒト第ＶＩＩＩ因子３’ＵＴＲの（１８０５ｎｔのうちの）最初の７４９ｎｔを含むので、高レベル発現は翻訳配列中のヒトとブタとのＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の相違に起因する。さらに、ＢＨＫ−Ｍ細胞におけるＰ／ＯＬおよびＨＳＱのｍＲＮＡレベルが相違しないので、この効果は翻訳後レベルで起こる（Ｄｏｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）。
【０１０６】
表ＩＩ．第ＶＩＩＩ因子発現についての以前の報告
【０１０７】
【表２】
2011015698.tif 000003
ａ単位／ｍｌ／２４時間
ｂ単位／１０６細胞／２４時間
ｃチャイニーズハムスター卵巣。
【０１０８】
実施例３
本発明の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子配列の改変体を作製した。例えば、ＨＰ６３／ＯＬの第ＶＩＩＩＳＥＰ因子を作製することができる。図１２〜１４を参照のこと。
【０１０９】
阻害抗体によって認識される以下の２つの主なヒト第ＶＩＩＩ因子エピトープを同定した：残基４８４〜５０８を境界とするセグメント中のＡ２ドメイン（Ｈｅａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５０５−１４５０９）および残基２１８１〜２２５２を境界とするセグメント中のＣ２ドメイン（Ｈｅａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：３７０１−３７０９およびＢａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：１６９−１７４（その全てが本明細書中で参考として援用される））。配列の番号づけには、標準的な慣習にしたがった全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子を参照する（Ｖｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３７−３４２）。軽鎖活性化ペプチドａｐ（Ｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：５５７−５６１）および残基１８０４〜１８１９を境界とする領域中のＡ３ドメイン（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：１３６−１４２）を認識する抗体も同定されているが、これらはあまり一般的ではない（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：３６６３−３６７１）。他のエピトープが時折同定されるが、これらは例外と見なされる。
【０１１０】
ヒトＡ２、ａｐ、およびＣ２ドメイン、ヒト配列１８０４〜１８１９ならびに約１６９０から１８０３までおよび約１８２０から２０１９まで由来のブタＡ１ドメインおよびブタＡ３配列を含むように種々の第ＶＩＩＩＳＥＰ因子を作製することができる。この第ＶＩＩＩＳＥＰ因子改変体をＨＰ６３として図１２に示す。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列を、配列番号２０および２１に示す。このような分子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原特性を有する超発現物（ｓｕｐｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ）であると予想される。ＨＰ６３改変体の高レベル発現活性を測定するためのアッセイを本明細書中に開示する。
【０１１１】
表ＩＩＩ  配列表
【０１１２】
【表３】
2011015698.tif 000004
添付の図面を参照して本発明を上に記載しているが、本発明の実施形態を幾らかは示すが全部は示していない。実際、これらの発明を多数の異なる形態で実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、この開示が法的必要条件を満たすようにこれらの実施形態を記載している。全体を通して、類似の数字は、類似の要素を示す。
【０１１３】
上記説明および添付の図面に示す教示の利点を有する本明細書中に記載の多数の修正形態および他の実施形態をこれらの発明に属する当業者は認識する。したがって、本発明は開示の特定の実施形態に制限されず、修正形態および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図すると理解すべきである。本明細書中で特定の用語を使用しているが、これらは一般的且つ説明的意味のみで使用し、本発明の制限を目的としない。
【０１１４】
明細書中に記載の全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各刊行物が具体的且つ個別に参考として援用されることを示す場合と同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。
（配列表）
【表１−１】
2011015698.tif 000005
【表１−２】
2011015698.tif 000006
【表１−３】
2011015698.tif 000007
【表１−４】
2011015698.tif 000008
【表１−５】
2011015698.tif 000009
【表１−６】
2011015698.tif 000010
【表１−７】
2011015698.tif 000011
【表１−８】
2011015698.tif 000012
【表１−９】
2011015698.tif 000013
【表１−１０】
2011015698.tif 000014
【表１−１１】
2011015698.tif 000015
【表１−１２】
2011015698.tif 000016
【表１−１３】
2011015698.tif 000017
【表１−１４】
2011015698.tif 000018
【表１−１５】
2011015698.tif 000019
【表１−１６】
2011015698.tif 000020
【表１−１７】
2011015698.tif 000021
【表１−１８】
2011015698.tif 000022
【表１−１９】
2011015698.tif 000023
【表１−２０】
2011015698.tif 000024
【表１−２１】
2011015698.tif 000025
【表１−２２】
2011015698.tif 000026
【表１−２３】
2011015698.tif 000027
【表１−２４】
2011015698.tif 000028
【表１−２５】
2011015698.tif 000029
【表１−２６】
2011015698.tif 000030
【表１−２７】
2011015698.tif 000031
【表１−２８】
2011015698.tif 000032
【表１−２９】
2011015698.tif 000033
【表１−３０】
2011015698.tif 000034
【表１−３１】
2011015698.tif 000035
【表１−３２】
2011015698.tif 000036
【表１−３３】
2011015698.tif 000037
【表１−３４】
2011015698.tif 000038
【表１−３５】
2011015698.tif 000039
【表１−３６】
2011015698.tif 000040
【表１−３７】
2011015698.tif 000041
【表１−３８】
2011015698.tif 000042
【表１−３９】
2011015698.tif 000043
【表１−４０】
2011015698.tif 000044
【表１−４１】
2011015698.tif 000045
【表１−４２】
2011015698.tif 000046
【図１Ａ】
2011015698.tif 000047
【図１Ｂ】
2011015698.tif 000048
【図１Ｃ】
2011015698.tif 000049
【図１Ｄ−１】
2011015698.tif 000050
【図１Ｄ−２】
2011015698.tif 000051
【図１Ｅ】
2011015698.tif 000052
【図１Ｆ】
2011015698.tif 000053
【図１Ｇ】
2011015698.tif 000054
【図１Ｈ】
2011015698.tif 000055
【図２】
2011015698.tif 000056
【図３】
2011015698.tif 000057
【図４】
2011015698.tif 000058
【図５Ａ】
2011015698.tif 000059
【図５Ｂ】
2011015698.tif 000060
【図５Ｃ】
2011015698.tif 000061
【図５Ｄ】
2011015698.tif 000062
【図６】
2011015698.tif 000063
【図７Ａ】
2011015698.tif 000064
【図７Ｂ】
2011015698.tif 000065
【図７Ｃ】
2011015698.tif 000066
【図７Ｄ】
2011015698.tif 000067
【図８】
2011015698.tif 000068
【図９Ａ】
2011015698.tif 000069
【図９Ｂ】
2011015698.tif 000070
【図９Ｃ】
2011015698.tif 000071
【図９Ｄ】
2011015698.tif 000072
【図１０Ａ】
2011015698.tif 000073
【図１０Ｂ】
2011015698.tif 000074
【図１０Ｃ】
2011015698.tif 000075
【図１０Ｄ】
2011015698.tif 000076
【図１１Ａ】
2011015698.tif 000077
【図１１Ｂ】
2011015698.tif 000078
【図１２】
2011015698.tif 000079
【図１３】
2011015698.tif 000080
【図１４Ａ】
2011015698.tif 000081
【図１４Ｂ】
2011015698.tif 000082