(57)【要約】【課題】現存するＰＶ感染の治療方法および治療用ワクチンを提供すること。【解決手段】ＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびＰＶ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰから成る群より選択されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｅタンパク質を含まない、現存するＰＶ感染の治療方法および治療用ワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
現存するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を治療するための治療用ワクチンであって、ＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびＰＶ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰから成る群より選択されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｅタンパク質を含まない、前記ワクチン。
【請求項２】
ＰＶ感染が上皮病変の存在によって特徴付けられる、請求項１記載の治療用ワクチン。
【請求項３】
上皮病変が、皮膚および粘膜表面の手掌いぼ、足底いぼ、肛門性器いぼ、および扁平いぼ、ＣＩＮ、ウマ類肉腫ならびに複製型または増殖型ＰＶ感染から成る群より選択される、請求項２に記載の治療用ワクチン。
【請求項４】
ＰＶ感染が、ＨＰＶ６，１１，３４，３９，４１〜４４または５１〜５５に起因する性器いぼである、請求項３に記載の治療用ワクチン。
【請求項５】
性器いぼがＨＰＶ６またはＨＰＶ１１に起因するものである、請求項４に記載の治療用ワクチン。
【請求項６】
ＶＬＰが、ＰＶＬ１遺伝子を適当なベクターにクローニングし、前記ベクターにより形質導入された細胞内でＬ１遺伝子を発現することにより生産されたものである、請求項１に記載の治療用ワクチン。
【請求項７】
ＶＬＰが、ＰＶ Ｌ１およびＬ２遺伝子を適当なベクターにクローニングし、前記ベクターにより形質導入された細胞内でＬ１およびＬ２遺伝子を発現することにより生産されたものである、請求項１に記載の治療用ワクチン。
【請求項８】
Ｌ１遺伝子またはＬ１遺伝子とＬ２遺伝子とをフランキング配列を有する発現ベクターに挿入して遺伝子構成物が形成され、得られる組換えＤＮＡが野生型バキュロウイルスＤＮＡと共に許容株化細胞に同時導入される、請求項６または７に記載の治療用ワクチン。
【請求項９】
株化細胞がＳｆ９昆虫細胞であり、発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである請求項８に記載の治療用ワクチン。
【請求項１０】
株化細胞が、原核細胞株である請求項９に記載の治療用ワクチン。
【請求項１１】
一投与量として０．５〜２０μｇのＰＶ ＶＬＰを含む請求項１記載の治療用ワクチン。
【請求項１２】
一投与量として１〜１０μｇのＰＶ ＶＬＰを含む請求項１１記載の治療用ワクチン。
【請求項１３】
アジュバントを含まない、請求項１に記載の治療用ワクチン。
【請求項１４】
８〜１６週間の期間にわたり３〜６回投与するための、請求項１に記載の治療用ワクチン。
【請求項１５】
２〜４週間の期間にわたり３〜６回投与するための、請求項１に記載の治療用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパピローマウイルス感染の治療方法およびパピローマウイルス感染の治療用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により肛門性器が感染すると、外方増殖性いぼまたは扁平いぼが生じ、いくつかの遺伝子型感染は、肛門性器がんに先立つ原因としても受け入れられている。性器いぼに対する現在の治療様式は一般に破壊的なものであり、外科手術、焼灼、レーザー手術、および、例えば、ボイテナー（Ｂｅｕｔｎｅｒ）ら、１９９７年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０２ ２８〜３７に記載されているような焼灼化学物質が含まれる。外方増殖性いぼの破壊的治療の後、３０〜７０％で変動する治療の高い失敗率と疾患の再発率が生じ、このことがバラッソ アール（Ｂａｒｒａｓｏ，Ｒ）、１９９８年、Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｏｃｏｌ．１８ Ｓ７０−Ｓ７１で論じられている。バウウェス（Ｂｏｕｗｅｓ）ら、１９９７年、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５ ４２７−４３７に言及されているように、いぼは、免疫抑制した患者では長い間持続すると共に頻繁に再発する。これは、病変の治癒における免疫系役割を示唆している。局所免疫の役割は、インターフェロン（フレーザー アイ エイチ（Ｆｒａｚｅｒ，Ｉ．Ｈ．）とマクミラン エヌ エー（ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｎ．Ａ．）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ（スチュアート−ハリス（Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓ編、Ｒ．＆Ｐｅｎｎｙ、Ｒ．Ｗ．）７９−９１（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ，ロンドン，１９９７年）に記載）および免疫亢進薬であるイミクイモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（ボイテナーら、１９９８年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４２ ７８９−７９４に記載）の局所適用の治療の部分的有効性によってさらに支持される。主としていくつかのパピローマウイルス（ＰＶ）遺伝子型ががんと関係するという理由から、ＨＰＶ感染に対する免疫予防法が提唱され、ハインズ（Ｈｉｎｅｓ）ら、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １１ ５７−６１、ハーゲンシー エム イー（Ｈａｇｅｎｓｅｅ Ｍ．Ｅ．）、１９９７年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｅｄ． １４ ５５５−５５６で議論されている。
【０００３】
真核生物発現系でＰＶキャプシドタンパク質Ｌ１またはＬ１とＬ２タンパク質を発現させると、同タンパク質がパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）に組み込まれる。パピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）については、チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、１９９１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５ ２５１−２５７；カーンバウアー（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ）ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９ １２１８０−１２１８４およびローゼ（Ｒｏｓｅ）ら、１９９３年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７ １９３６−１９４４に記載されており、天然ウイルスと形態学的および免疫学的に類似している。適切な型を組換えＶＬＰｓにより免疫化すると、ブライトバード（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９ ３９５９−３９６３、カーンバウアーら、１９９６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１９ ３７−４４およびスツィッヒ（Ｓｕｚｉｃｈ）ら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ １１５５３−１１５５７に記載されているようにインビボでのウシ、イヌ、ワタオウサギへのパピローマウイルスの攻撃に対する有効な予防となる。また、保護は抗体力価と相関し、抗体によって変化し得る（ブライトバードら，１９９５年、前掲）。
【０００４】
ＰＶ ＶＬＰｓが高い力価の中和用抗血清を誘導する能力を有するためにＰＶＶＬＰｓが伝染性乳頭腫症に対して適していることが既に知られていることを明らかにした、米国特許第５４３７９５１号についても参照がなされ得る。上記文献で与えられた適切な被験者の例は、（ｉ）乳頭腫いぼに感受性のあるウシ科動物、（ｉｉ）非性器型のＨＰＶ感染に対するすべてのヒトおよび（ｉｉｉ）性器型のＨＰＶ感染に対して性的に活性なヒトである。
【０００５】
米国特許第５４３７９５１号は、Ｌ１とＬ２キャプシドタンパク質を通常発現している生産性ＰＶ病変に対して予防的ワクチン接種が有効であることも明らかにしている。そのような病変は咽頭乳頭腫症のいぼのような良性感染で起こり得る。この文献では、有効量の組換えＬ１キャプシドタンパク質をＰＶ感染の恐れのある個体に投与することにより、良性および悪性の両方のＰＶ疾患に対する保護免疫が誘起され得ることも立証した。キャプシドタンパク質を含むワクチンは、従来の免疫化プロトコルに従って腸管外または局所に直接投与することが可能である。
【０００６】
従って、カーンバウアーら，１９９６年，前掲、ブライトバードら，１９９５年，前掲、およびスツィッヒら，１９９５年，前掲と同様、米国特許第５４３７９５１号は、ＰＶ ＶＬＰｓを含有するワクチンを乳頭腫いぼの感染の予防に使用することが可能であることが周知であることを示す多くの参考文献の代表である。
【０００７】
不完全フロイントアジュバント中にＢＰＶ Ｌ１−Ｌ２ ＶＬＰｓを含有するワクチンによる、確立したいぼを有するウシの免疫化が、そのような予防用のワクチンに使用するほどには有効でないことを確かめた、カーンバウアーら、１９９６、前掲についても参照がなされ得る。
【０００８】
グリーンストーン（Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅ）ら，１９９８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５ １８００−１８０５に記載されているように、ＰＶ ＶＬＰｓはＨＰＶ感染防止用の予防ワクチンの有望な候補である一方で、ビリオンキャプシドタンパク質が感染上皮または頸管癌腫の増殖中の細胞には見られないという理由から、ＰＶ ＶＬＰｓが治療効果を有する可能性は非常に低い。この文献において、キメラＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７ ＶＬＰｓのマウスへの注入により、マウスがアジュバントを欠いた場合でも腫瘍の攻撃から保護されることも見出された。しかしながら、ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰｓはこれについては有効でなかった。これは、腫瘍がＥ７生成腫瘍である、予期しない結果ではなかった。
【０００９】
同様な結果が、ペン（Ｐｅｎｇ）ら，１９９８年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０１４０−１５７でも見出されており、ＨＰＶ Ｌ１から形成し、単一ＨＰＶ１６ Ｅ７細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープと単一ＨＩＶ ｇｐ １６０ＣＴＬエピトープとを組み込んだハイブリッドまたはキメラＶＬＰｓが、免疫化の際に強いＣＴＬ応答を誘導した。
【００１０】
ワタオウサギのパピローマウイルス感染を治療するための治療用ワクチン開発の研究について報告した、国際出願第ＷＯ９８／２８００３号にも参照がなされ得る。そのデータは、Ｅタンパク質が有効な治療用ワクチンの重要な成分であるという前提を支持している。
【００１１】
治療用ＰＶワクチンの調合に種々のＥタンパク質が必要であるというこの確信は、ＨＰＶアルヒドロゲルに吸収させたＬ２Ｅ７に基づくＨＰＶ６性器いぼに対する臨床試験につながった。（トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）ら、１９９９年、ＴＡ−ＧＷ、つまり性器いぼの治療用の組換えＨＨＰＶ５ Ｌ２Ｅ７ワクチンのフェーズ１安全性および抗原性（Ｐｈａｓｅ １ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＡ−ＧＷ， ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ５ Ｌ２Ｅ７ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆｇｅｎｉｔａｌ ｗａｒｔｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ １７４０−４９）。
【００１２】
興味深いことに、ほとんどのワクチン試験では種々のアジュバントを製剤成分として組み込んでいたにもかかわらず、その重要性については決定されていない。この問題については、シャームベック（Ｓｈｉｒｍｂｅｃｋ）ら，１９９６年，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９ １１１−１１９を参照するとよいが、この文献は、１００ｎｇ〜１μｇの天然Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ＶＬＰｓをアジュバントなしで注入すると、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬ応答を初回刺激し、そのようなＶＬＰｓが免疫原となり得ることを立証することも示した。
【００１３】
期せずして、性器いぼを含めた現存するＰＶ感染の治療がＥタンパク質またはアジュバントを欠いたＰＶ ＶＬＰｓ含有ワクチンによって達成されることを、ここで本願の発明者は確認した。特にグリーンストーンら，１９９８年，前掲およびカーンバウワーら，１９９６年，前掲の上記文献で出された知見に照らすと、これは二重に驚くべきことである。キーンバウワーら，１９９６年，前掲およびペンら、１９９８年、前掲も、アジュバントを伴わない予防ＰＶワクチンの使用が有効であり得るけれども、この結論はキメラＶＬＰｓにのみ当てはまり得ることを立証している。シャームベックら、１９９８年、前掲は、アジュバントを欠いたＨＢｓＡｇは免疫原性であるが、上述の他の文献と関連するＰＶ ＶＬＰｓには同様な結論が当てはまらない可能性があることを立証している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、使用の際に有効な現存するＰＶ感染の治療方法を提供することにある。それゆえ、本発明は、ＰＶ Ｌ１ ＶＬＰｓおよびＰＶ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰｓから成る群より選択されたＰＶ ＶＬＰｓを、ＰＶ感染に罹患している患者に投与する工程から成る、現存するＰＶ感染の治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を治療するための治療用ワクチンであって、ＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびＰＶ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰから成る群より選択されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｅタンパク質を含まない、前記ワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】最終用量のＶＬＰワクチンの３週間後と、１０μｇのＨＰＶ６ｂＶＬＰの皮内注射の４８時間後に１人の免疫被験者から収集した、ＨＰＶ ＶＬＰに対するＤＴＨ反応に由来する生検材料の免疫組織化学分析。ＣＤ３＋ｖｅ Ｔ細胞（茶）およびＣＤ８＋ｅｖ Ｔ細胞（赤）
【図１Ｂ】最終用量のＶＬＰワクチンの３週間後と、１０μｇのＨＰＶ６ｂＶＬＰの皮内注射の４８時間後に１人の免疫被験者から収集した、ＨＰＶ ＶＬＰに対するＤＴＨ反応に由来する生検材料の免疫組織化学分析。ＣＤ３＋ｖｅ Ｔ細胞（茶）およびＤＲ＋ｅｖ Ｔ細胞（赤）
【図２Ａ】ＨＰＶ６ｂキャプシドタンパク質に対する抗体を、組換えバキュロウイルスで調製したＶＬＰを用いたＥＬＩＳＡアッセイにより１：１００血清希釈で測定した。免疫処置の直前（斜線）と２０週目（黒）での被験者からの結果を示す。
【図２Ｂ】ＨＰＶ１６Ｌ１キャプシドタンパク質に対する抗体を、組換えバキュロウイルスで調製したＶＬＰを用いたＥＬＩＳＡアッセイにより１：１００血清希釈で測定した。免疫処置の直前（斜線）と２０週目（黒）での被験者からの結果を示す。
【図２Ｃ】ＨＰＶ６ｂ ＶＬＰで免疫された被験者の２週目でのＨＰＶ６ｂ ＶＬＰ特異的ＩｇＧ反応性の増加を、初期ＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰ特異的反応性の関数としてプロットした。異なる記号は、投与したＶＬＰ用量を示す。
【図２Ｄ】ＨＰＶ６ｂ ＶＬＰで免疫された被験者の２０週目でのＨＰＶ６ｂ ＶＬＰ特異的反応性の増加を、初期ＨＰＶ６ｂＬ１ＶＬＰ特異的反応性の関数としてプロットした。異なる記号は、投与したＶＬＰ用量を示す。白記号は、正確に３回の免疫処置を受けた被験者を示し、黒記号は、３回を超える免疫処置を受けた被験者である。異なる記号は、免疫処置あたりの投与した用量を示す。
【図２Ｅ】様々な血清とＨＰＶ６ｂおよびＨＰＶ１１との反応性の相関。免疫前の血清を丸として示し、２０週目の血清を四角として示す。
【図３Ａ】ＨＰＶ ＶＬＰで免疫された被験者の、いぼ除去までの時間のＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ解析。すべての試験参加者の結果。
【図３Ｂ】ＨＰＶ ＶＬＰで免疫された被験者の、いぼ除去までの時間のＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ解析。投与したワクチン用量で分類された試験参加者の結果。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法は、６，１１，３４，３９，４１〜４４および５１〜５５型ＨＰＶに起因する性器いぼに特に適用可能である。治療に特に適したいぼは、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１に起因するものである。
【００１８】
好ましくは、ＰＶ感染は上皮病変であり、より好ましくは、手掌いぼ、足底いぼ、肛門性器いぼ、および扁平いぼ、ＣＩＮ、ウマ類肉腫または複製型または増殖型ＰＶ感染から成る群より選択された病変である。
【００１９】
好ましくは治療の進行中、現存する患者は自身の感染の原因をチェックされ、これに関してＰＶ型決定に対する生検が行われ得る。適切には、ＰＶ型決定は当業者に周知の抗体または核酸に基づく技術によって行われる。好ましくはＰＶ型決定はＰＣＲ等の核酸増幅技術によって行われる。
【００２０】
適切なＶＬＰｓは当該技術分野においてよく知られている例えばキ（Ｑｉ）ら、１９９６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１６ ３５〜４５に報告されているような標準的方法によって製造し得る。そのような標準的方法が、国際出願出願公開第ＷＯ９３／０２１８４号、オーストラリア特許第６８３２２０号、ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）ら、１９９５年１２月、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７４３〜７７５３、米国特許第５４３７９５１号、米国特許第５７４４１４２号、ローゼ（Ｒｏｓｅ）ら、１９９３年、前掲、カーンバウアーら、１９９３年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６７（１２） ６９２９〜６９３６、サセガワ（Ｓａｓｅｇａｗａ）ら、１９９５年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０６ １２６〜１３５、ならびにシラー（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ）とローデン（Ｒｏｄｅｎ）、１９９５年、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｏｒｔ ６（５）１２１〜１２６に記載されている。
【００２１】
以上の開示はあくまで例として言及したものであり、ＶＬＰｓが様々な方法によってＬ１（またはＬ１とＬ２）を基本的に適当なベクターに入れてクローニングし、該ベクターにより形質導入された真核細胞内でそのようなタンパク質に対する高次構造的な対応コーディング配列を発現することにより生産され得ることを明らかにしている。続いてすべてのキャプシドタンパク質コーディング配列が発現される。従って、実質的にすべてのキャプシドコーディング配列がクローニングされる。酵母細胞も必要であれば使用することができるが、昆虫細胞が好ましい宿主細胞である。
【００２２】
同様に、発現タンパク質が自己集合してＶＬＰｓになると仮定して、Ｌ１タンパク質またはＬ１とＬ２タンパク質を発現させるためにＶＬＰｓ他の真核生物系および真核生物系を使用することが可能である。
【００２３】
好ましくはバキュロウイルスの発現系を使用し、その際、Ｌ１遺伝子またはＬ１とＬ２遺伝子をフランキングバキュロウイルス配列を有するバキュロウイルス発現ベクターに挿入して遺伝子構成物を形成し、その組換えＤＮＡは野生型バキュロウイルスと共にＳｆ９昆虫細胞に同時導入する。
【００２４】
ヒト患者をアジュバントなしでＨＰＶ６ｂ ＶＬＰｓにより治療した以下の実験のセクションを参照する。しかしながら、国際出願出願公開第ＷＯ９３／０２１６４号から、Ｌ１ ＯＲＦがどの公知の場合でも一様に保存されており、そのため本発明がすべてのＰＶ型へ広く適用されることは明らかである。この結論を支持する論が以下の参考文献に示されている。
【００２５】
（ａ）カール シー ベーカー（Ｃａｒｌ Ｃ． Ｂａｋｅｒ）付録Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ＧｅｎｏｍｅｓＴｈｅ Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄｉａｅ： 第２巻、ｔｈｅ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ編集者 エヌ ピー ザルズマン（Ｎ．Ｐ． Ｓａｌｚｍａｎ）とおよびピー エム ハウレー（Ｐ．Ｍ． Ｈｏｗｌｅｙ）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）
【００２６】
（ｂ）トーマス アール ブローカー（Ｔｈｏｍａｓ Ｒ． Ｂｒｏｋｅｒ）、１９８７年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ １４（２）３２９〜３４８
【００２７】
（ｃ）イサベル ギリ（Ｉｓａｂｅｌｌｅ Ｇｉｒｉ）とオリビア ダノス（Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｄａｎｏｓ）、１９８６年、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｓ： ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、２ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ２２２７〜２３２
【００２８】
（ｄ）ズリヤネン ケー（Ｓｙｒｊａｎｅｎ）らの総説、Ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９８７年
【００２９】
ＰＶ ＶＬＰｓが食塩水、水、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を含めた任意の適当な生理学的賦形剤に溶解可能であるということは理解されるであろう。ＰＶ ＶＬＰｓの適切な濃度は０．５〜２０μｇ、より好ましくは１〜１０μｇである。投与量は、８〜１６週間、より好ましくは２〜４週間の期間にわたり３〜６回であり得る。
【００３０】
本発明の別の態様において、また、実験のセクションの所に以下に立証するように、ＨＰＶ６、詳しくはＨＰＶ６ｂ ＶＬＰｓによる免疫化が、ＨＰＶ１１とは交差反応するがＨＰＶ１６とは交差反応しないような免疫応答を与えることも明らかである。従って、ＨＰＶ６ＶＬＰｓによる免疫化は、ＨＰＶ１１感染に対する保護を提供し、その逆も同じである。すなわち、ＨＰＶ１１ＶＬＰｓによる免疫化はＨＰＶ６感染に対する保護を提供し得る。免疫化プロトコルにおいて、上述したのと同様なＶＬＰｓの濃度または投与量が採用され、任意の生理学的賦形剤の効用を利用することができる。
いかなる便利な投与経路を採用してもよいが、腸管外投与、特に筋内投与が好ましい。
【００３１】
本発明の例示的実施態様を以下にまとめる。
（１）ＰＶ Ｌ１ ＶＬＰｓおよびＰＶ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰｓから成る群より選択されたＰＶ ＶＬＰｓを、ＰＶ感染に罹患している患者に投与する工程から成る、現存するパピローマウイルス（ＰＶ）感染の治療方法。
（２）ＰＶ感染が上皮病変の存在によって特徴付けられる（１）に記載の治療方法。
（３）上皮病変が、皮膚および粘膜表面の手掌いぼ、足底いぼ、肛門性器いぼ、および扁平いぼ、ＣＩＮ、ウマ類肉腫ならびに複製型または増殖型ＰＶ感染から成る群より選択される（２）に記載の治療方法。
（４）ＰＶ感染が、ＨＰＶ６，１１，３４，３９，４１〜４４および５１〜５５に起因する性器いぼである（３）に記載の治療方法。
（５）性器いぼがＨＰＶ６およびＨＰＶ１１に起因するものである（４）に記載の治療方法。
（６）ＶＬＰｓを、ＰＶＬ１遺伝子を適当なベクターにいれてクローニングし、前記ベクターにより形質導入された真核細胞内でＬ１に対する高次構造的な対応コーディング配列を発現することにより生産する（１）（５）のいずれかに記載の治療方法。
（７）ＶＬＰｓを、ＰＶＬ１およびＬ２遺伝子を適当なベクターに入れてクローニングし、ベクターにより形質導入された真核細胞内でＬ１およびＬ２に対する高次構造的な対応コーディング配列を発現することにより生産する（１）〜（５）のいずれかに記載の治療方法。
（８）Ｌ１遺伝子またはＬ１とＬ２遺伝子をフランキング配列を有する発現ベクターに挿入して遺伝子構成物を形成し、結果として得られる組換えＤＮＡを野生型バキュロウイルスＤＮＡと共に許容的株化細胞中に同時導入する（６）または（７）に記載の方法。
（９）株化細胞がＳｆ９昆虫細胞であり、発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである請求項６または７に記載の方法。
（１０）株化細胞が、原核細胞の株化細胞である請求項８に記載の方法。
（１１）患者に投与するＰＶ ＶＬＰｓ濃度が０．５〜２０μｇである（１）〜（１０）のいずれかに記載の治療方法。
（１２）前記濃度が１〜１０μｇである（１１）に記載の方法。
（１３）ＶＬＰｓがアジュバントを除くものである（１）に記載の治療方法。
（１３）ＰＶ ＶＬＰｓの投与量が、８〜１６週間の期間にわたり３〜６回である（１１）または（１２）に記載の治療方法。
（１４）ＰＶ ＶＬＰｓの投与量が、２〜４週間の期間にわたり３〜６回である（１１）に記載の治療方法。
（１５）患者へのＨＰＶ６ ＶＬＰｓの投与によるＨＰＶ１１感染に対する免疫化方法。
（１６）ＨＰＶ６ｂ ＶＬＰｓが患者に投与される請求項１５に記載の方法。
（１７）ＨＰＶ６ ＶＬＰｓの濃度が０．５〜２０μｇである（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）ＨＰＶ６ ＶＬＰｓの濃度が１〜１０μｇである（１７）に記載の方法。
（１９）ＨＰＶ６ ＶＬＰｓの投与量が、８〜１６週間の期間にわたり３〜６回である（１７）または（１８）に記載の方法。
（２０）ＨＰＶ６ ＶＬＰｓの投与量が、２〜４週間の期間にわたり３〜６回である（１７）または（１８）に記載の方法。
（２１）患者へのＨＰＶ１１ ＶＬＰｓの投与によるＨＰＶ６感染に対する免疫化方法。
（２２）ＨＰＶ１１ ＶＬＰｓの濃度が０．５〜２０μｇである（２１）に記載の免疫化方法。
（２３）ＨＰＶ１１ ＶＬＰｓの濃度が１〜１０μｇである（２２）に記載の免疫化方法。
（２４）ＨＰＶ１１ ＶＬＰｓの投与量が、８〜１６週間の期間にわたり３〜６回である（２２）または（２３）に記載の免疫化方法。
（２５）ＨＰＶ１１ ＶＬＰｓの投与量が、２〜４週間の期間にわたり３〜６回である（２２）または（２３）に記載の免疫化方法。
（２６）ＰＶ感染に罹患している患者に、アジュバントなしでＰＶ ＶＬＰｓを投与する工程から成る現存するＰＶ感染の治療方法。
（２７）ＰＶ ＶＬＰｓがキメラである（２７）に記載の治療方法。
（２８）ＰＶ ＶＬＰｓがＥタンパク質から成る（２６）に記載の治療方法。
（２９）ＰＶ ＶＬＰｓがアジュバントを含む（１）に記載の治療方法。
（３０）アジュバントが細胞性応答を誘導するアジュバントである（２９）に記載の治療方法。
（３１）アジュバントが、
ｉ）リピドＡとその誘導体、
ii）キラヤサポニンとその誘導体、
iii）ミコバクテリアとその構成要素または誘導体、および
iv）ＩＬ１２、ＧＭＣＳＦ、他のＴｈ１誘導サイトカイン、ならびに
v）酸化マンナンとその類似体
から成る群より選択される（３０）に記載の治療方法。
【実施例１】
【００３２】
材料と方法
患者
承諾している被験者（すなわち全部で３６人）を、本臨床試験のために募集した。このような被験者は健康であり、性器いぼを有していた。被験者はまた１６歳から５５歳であり、少なくとも１つの目に見える外陰部のいぼを有していた。被験者は免疫処置前４週間いぼを治療せず、免疫療法の間、他の治療を差し控えることに同意した。性器いぼ疾患の期間と前治療歴を記録したが、疾患の期間と、前局所治療の種類ついて患者らの中であいまいな点があったために、参加適性を決定する要因として使用しなかった。この４週間のうちに、いぼを治療したことがある場合、医療管理を受けている全身性疾患を有している場合、治療を必要とする他の活動性性交渉感染症があった場合、または治療を必要とする子宮頚部形成異常がＰＡＰスメア上で検出された場合に、患者を除外した。内部の性器いぼは参加に対する禁忌ではなかった。ＰＣＲによるＨＰＶタイピングのために、募集時に代表的ないぼの生検材料を採取した。いぼはすべて、ＰＣＲによりＨＰＶ６ｂ／１１陽性であった。本試験時でのセンチネル研究において５症例のＨＩＶ感染しか検出されなかったので、本試験ではＨＩＶ−１試験を日常的に行わなかった。最初のいぼ提示と、適当な患者への初回ワクチン投与の間の平均期間は１週間であった。年齢が患者らと一致し、性器いぼの病歴がない関係する研究所スタッフからも、ＨＰＶ ＶＬＰ抗体研究用の血液を入手した。
【００３３】
ワクチン材料の生成
ＶＬＰを、好適な実験実施条件下で、キ（Ｑｉ）ら，１９９６年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１６ ３５−４５に以前に記載されたＨＰＶ６ｂＬ１組換えバキュロウイルス（Ｌ１ｒＢＶ）を用いて生成した。ＳＦ９００−ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中のＳＦ９細胞培養物に、ＭＯＩ１０でＬ１ｒＢＶを感染させた。４８時間後、培養物を回収し、細胞ペレットをプールし、イムノブロットによりＬ１について、電子顕微鏡によりＶＬＰについてアッセイし、さらに使用するまで−８０℃で凍結した。融解した細胞ペレットを、不連続ショ糖勾配遠心分離および連続塩化セシウム勾配遠心分離によりさらに精製し、キら，１９９６年，前掲およびパークス（Ｐａｒｋ）ら，１９９３年，Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４５ ３０３−３１８に以前に記載されたようにＶＬＰ含有量についてアッセイした。次いで、ゲル分析によりＨＰＶ６ｂＬ１が８０％を超え、ＥＭにおいて実質的に完全なウイルス粒子（ＶＬＰ）を含んでいた密度１．２６〜１．３０ｇ／ｃｍ3の材料を、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝化０．９％ＮａＣｌ（ＰＢＳ）に対して徹底的に透析し、５０μｇタンパク質／１００μｌでガラスバイアルにアリコートした。これらのバイアルの１０％の無作為標本を、無菌性、発熱性、およびウサギにおける異常毒性についての試験にかけた。材料は無菌であり、発熱物質陰性であり、毒性は観察されなかった。本試験の終わりに、生成物安定性を確認するために、細胞溶解物プールを調製した１年後に、バイアルをイムノブロットおよび電子顕微鏡によりＶＬＰ含有量について調べた。
【００３４】
免疫処置
被験者を２週間毎に調べ、いぼを診察ごとに検査し、通常、いぼの写真を撮影した。膣および子宮頸を可視化するコルポスコピーを診察ごとに行った。０、４、および８週目に、患者らを、アジュバントを用いずにＨＰＶ ＶＬＰ（１、５、または１０μｇ）で筋肉内に免疫した。最初、用量の割り当ては連続的であり、最初の５人の患者には１μｇを与え、次の５人には５μｇを与え、次の５人には１０μｇを与えた。その後、１０μｇ、５μｇ、または１μｇを交替に与えるように、患者らを割り当てた。いぼが１２週目までに消えていなかったら、さらなるＶＬＰ免疫処置を１２週目に行い、いぼが消えなかったら、さらなるＶＬＰ免疫処置を１６週目および２０週目に行った。４人の被験者（２×５μｇ；２×１０μｇ）が４回の免疫処置を受け、２人の被験者（１×５μｇ；１×１０μｇ）が５回の免疫処置を受け、６人の被験者（１×１μｇ；２×５μｇ；３×１０μｇ）が６回の免疫処置を受けた。最初に１μｇを与え、その用量で１０週目までに消散もＶＬＰに対するＤＴＨも発現しなかった１人の患者に、さらに３回の１０μｇのワクチン接種を行い、この患者のデータを１０μｇ処置群と共に分析した。その他の場合は、与えた追加免疫処置は、最初に与えたものと同じＶＬＰ用量の免疫処置あった。有効な被験者（ｎ＝３４）を２０週目での結果について評価し、被験者が少なくとも３回の免疫処置を受け、この時点で診察された場合に評価可能として分類した。
【００３５】
安全性および毒性
１０μｇのＶＬＰを与えた５人の患者のコホートを、初回免疫処置の前に、ならびに初回免疫処置後３日、１、２、４、８、１２週目に、通常の血液学（ＦＢＥ、白血球分画）試験と生化学（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、総タンパク質量、アルブミン、グロブリン、グルコース、尿素、クレアチニン、尿酸）試験について試験した。被験者からの試料を、１２チャンネル自動化学分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＸ４）および６チャンネルＣｏｕｌｔｅｒ血液学（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｔ−５４０）分析装置により試験した。
【００３６】
全被験者を各ワクチン接種後の副作用について観察し、診察ごとに、診察と診察との間に経験した不都合な出来事（ワクチン接種部位またはいぼ部位での局所的な不快感と、発熱、悪寒、筋肉痛、頭痛、および皮膚障害を含む全身症状を含む）について尋ねた。
【００３７】
ＶＬＰ抗体
試験開始前と試験を通して２週間ごとに、ＥＬＩＳＡによるＶＬＰ特異的抗体アッセイのために血清を収集した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ＰＢＳに溶解したＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、またはＨＰＶ１６ ＶＬＰ（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、一晩静置し、脱脂粉乳でブロックした。試験血清および対照血清を１：１００希釈で添加し、結合を、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）またはＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ，Ａ，Ｍ（Ｓｉｌｅｎｉｕｓ）により検出した。その都度、各血清と脱脂粉乳との平均反応性（０．００１〜０．１１３の範囲（平均０．０３２））を引いた。比較のために、血清の完全セットを一回のアッセイで試験し、その血清セットの３回独立したアッセイを行い、非常に相関する結果を収めた（ｒ2＞０．９５）。
【００３８】
ＤＴＨ試験
ＶＬＰワクチン材料を、ＤＴＨ試験用の抗原として使用した。ＤＴＨ試験を、最初３回の免疫処置後に３２人の被験者に対して行い、抗体試験プロトコールは１０〜１２週目に完了した。２０μｌ（１０μｇ）のＶＬＰ懸濁液を、前腕の掌側で皮内に送達した。４８時間で、生検材料を、０（硬化なし）、１（１〜３ｍｍの硬化（ｄｕｒａｔｉｏｎ）），２（４〜１０ｍｍの硬化）、および３（＞１０の硬化）として目視によりスコア付けした。２８人の被験者に対して、ＤＴＨ部位の生検を、１％リグノカイン局所麻酔下での３ｍｍパンチ生検を用いて行った。生検材料を、中性緩衝化ホルマリンで固定し、Ｐｅｔｔｉｔら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９ ３６８１−３６９１に以前に記載されたように、通常のＨ＋Ｅ切片用および免疫組織化学用に処理した。
【００３９】
免疫組織化学
中性緩衝化ホルマリンで固定し、通常どおりに処理し、パラフィンに包埋した生検材料の切片を脱パラフィンし、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液を用いて高温抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）（１２１℃，１０分）にかけた。ＣＤ１ａ／ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ／ＣＤ６８、ＣＤ３／ＣＤ６８、ＣＤ３／ＣＤ８、ＣＤ６８／ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３／ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ３／ＣＤ２０の組み合わせによる二重免疫染色を行った。ＴＢＳ（ｐＨ７．６）に溶解した１０％ブタ血清／１０％ＦＢＳによる１時間のブロッキングの後、切片を、ウェットチャンバー内において室温で６０分間、一次抗体：マウス抗ヒトＣＤ１ａ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，クローンＢＬ−６，前希釈）、ウサギ抗ヒトＣＤ３（１：２５０）、ならびにすべて１：５０に希釈したマウス抗ヒトＣＤ８（クローンＣ８／１４４Ｂ）、ＣＤ６８（クローンＰＧ−Ｍ１）、ＨＬＡ−ＤＲ（クローンＴＡＬ−１Ｂ５）、およびＣＤ２０（クローンＬ２６）（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とインキュベートした。切片を、ビオチン化ウサギ抗マウス二次抗体またはビオチン化ブタ抗ウサギ（１：２００）二次抗体と、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）（１：３００）で処理した。二重免疫染色のために、切片を、第２の一次抗体の後に、その対応する第２のビオチン化二次抗体でさらに処理した。ストレプトアビジンＡＢＣ／アルカリホスファターゼ結合体（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、第２の抗体を標識した。その後に、ＤＡＢ（茶）およびファストレッド（赤）を使用する基質色原体キット（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で発色させることにより、第１および第２の抗体が証明された。切片を、マイヤーヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００４０】
統計解析
一変量解析および多変量解析を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０（Ｓｔａｔｓｏｆｔ，Ｏｋ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて行った。
結果
ワクチン接種および有害反応
前記のように、３６人の被験者を本試験に募集した。３４人の被験者が、３回以上、１、５、または１０μｇのＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰで免疫処置され、２０週目での評価（表１）にも参加した。被験者の大多数は２ヶ月以上いぼを有し（表２）、以前に少なくとも１回、いぼを焼灼器で治療したことがあった。注射に関連する直後の不快感を超える局所有害反応も損傷性全身有害反応も観察されず、免疫処置後に（評価可能またはその他の）被験者により報告もされなかった。生化学的分析および血液学的分析はすべて、各診察時に局所参考範囲内であり、経時的に変化する傾向はなかった。治癒しているいぼを有する患者では、治癒しているいぼにおける特定の局所反応は観察も報告もされず、免疫された被験者では、性器いぼの自発的治癒について一般に記載されるように、いぼは局所炎症なく治癒するように見えた。３回以上免疫され、２０週目の追跡診察に参加した３３人の被験者を、ワクチンに対する免疫応答および結果について評価可能であるとみなした。
【００４１】
ＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰに対するＤＴＨ
ＶＬＰ特異的ＤＴＨを、第２または第３の免疫処置後、様々な時間での単回ＶＬＰ皮内注射を用いて測定した。主に、ＤＴＨ皮膚試験の免疫効果を避けるために、免疫処置を開始する前にＤＴＨを試験しなかった。ＶＬＰ用量または免疫処置後の時間にかかわらず、患者の大多数に２＋から３＋の臨床ＤＴＨ応答があり、全患者に、いくらかの目に見える応答があった。２８人の被験者に対して、ＤＴＨ反応物の生検を３ｍｍパンチ生検を用いて行い、組織分析にかけた（５個の生検材料に対する詳細な免疫組織化学的評価を含む）。リンパ球および単球の浸潤を含む代表的なＤＴＨ反応が血管周囲および皮下に観察された（図１Ａ、１Ｂ）。このように評価された５個の生検材料の浸潤物は、ＣＤ１ａ＋ｖｅランゲルハンス細胞、ＣＤ４およびＣＤ８＋ｖｅ Ｔ細胞、ならびにＤＲ＋ｖｅマクロファージを含んでいた。血管周囲および皮下の炎症浸潤物の程度、関与する血管の数、ならびに非リンパ炎症細胞（好酸球を含む）の存在に従ってＤＴＨ反応を組織学的に評価するために、５ポイントスケールを使用した。生検材料の大多数は高いスコアを付け、ＤＴＨスコアは、ＶＬＰの用量または免疫処置の数と独立していた。
【００４２】
特に、ＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞は、表皮、まれに真皮に見られ、ＨＬＡ−ＤＡを共発現しているＣＤ１ａ＋ｖｅもあった。血管周囲の単核炎症浸潤物は主にＣＤ３＋Ｔ細胞からなり、ＣＤ６８＋マクロファージといくらかのＣＤ２０＋Ｂ細胞もあった。ＣＤ３＋Ｔ細胞の約８〜１０％はＣＤ８＋であった。非常に多くのＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ３＋がＴ細胞を活性化し、真皮とさらに深い組織で証明できるＣＤ６８＋／ＤＲ＋マクロファージもあった。
【００４３】
ＶＬＰ抗体
免疫処置前に、ＨＰＶ６ｂに対する有意な血清反応性（プールされた「正常」血清の平均から３Ｓ．Ｄ．を超えるＯＤ反応性として定義された）が３２人の試験被験者のうち９人で観察され、ＨＰＶ１６に対する反応性が２人の被験者で観察された（図２Ａおよび２Ｂ）。対照に、ＨＰＶ６ｂに対する血清反応性が３８人の対照被験者のうち０人で測定可能であり、ＨＰＶ１６ ＶＬＰに対する抗体が３８人の対照被験者のうち２人で観察された。免疫処置後のＨＰＶ６ｂに対する反応性が、試験被験者の１人だけを除く全員において増加した（図２Ｄ）。平均増加は、０．１９０ＯＤユニット＋／−Ｓ．Ｄ．０．１１０であった。２０週目の、ＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰとのＶＬＰ特異的反応性の増加は、１μｇ（０．０８５＋／−０．０２２）用量を与えた被験者より、５μｇ（０．２２７＋／−０．０２８）および１０μｇ（０．２２０＋／−０．０３５）のＶＬＰ用量を与えた被験者で高く、３回の免疫処置を受けた被験者（０．２０９＋／−０．０２１，ｎ＝１３）より、３回を超える免疫処置を受けた被験者（０．２４２＋／−０．０４２，ｎ＝１１）（５μｇまたは１０μｇを与えた）において有意ではないが高かった。初回ＶＬＰ免疫処置の２週間後、ＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰ特異的ＩｇＧ抗体力価の最も大きな増加が、最初に弱くＨＰＶ６ｂＬ１に反応する血清を用いた被験者において観察された。このことは、これらの被験者が、既にＨＰＶ６ｂに対する初回刺激を受けていたことを示唆している（図２Ｃ）。ＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰに対するＩｇＧ抗体の最終レベルが、ＶＬＰ特異的抗体の初期レベルにより予測された（ｒ2＝０．５３；ｐ＝０．００５）。しかしながら、３回の免疫処置後に観察されたＶＬＰ反応性の増加は、初期ＶＬＰ反応性と有意に相関しなかった（図２Ｃ）。血清を、他のＨＰＶタイプのＶＬＰとの反応性について試験した。３２の血清において、免疫処置後のＨＰＶ１６ｂＬ１ ＶＬＰ反応性の増加は見られなかった（平均増加０．００９＋／−Ｓ．Ｄ．０．０４３）。ＨＰＶ１１Ｌ１ ＶＬＰに対する反応性について試験した（最初にＨＰＶ６ｂに反応したか、または免疫処置後にＨＰＶ６ｂに対する反応性を獲得した）１１人の被験者のうち、１０人が、ＨＰＶ１１Ｌ１ ＶＬＰに対する同様の大きさの反応性を獲得した（ｒ2＝０．７５）（図２Ｅ）。
【００４４】
臨床結果
本試験の１つの目的は、ＶＬＰに基づく予防ワクチンの使用が、既存のＨＰＶ感染の経過に悪影響を及ぼすかを明らかにすることである。２０週間にわたる本試験（図３Ａ）での目に見えるいぼ疾患の完全治癒率は、３３人の評価可能な患者のうち２５人（７６％）であり、結果データを、ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏｔｒｅａｔにより分析した場合、３６人の被験者のうち２５人（６９％）であった。２０週で疾患が残っている評価可能な８人の被験者のうち５人に、実質的な部分治癒があった（＞５０％のいぼ除去）。９ヶ月までのさらなる追跡試験にわたって、完全に除去した被験者は疾患を再発せず、さらに２人の被験者では、１人は破壊治療後に、１人は自発的に完全な治癒があった。５μｇおよび１０μｇ用量のワクチンを与えた評価可能な被験者での、いぼの治癒は似ていたが（図３Ｂ）、１μｇを与えた患者での治癒は、免疫処置後さらに早く起こった。
【００４５】
本試験開始時の１〜１５個のいぼの数と、観察期間中のいぼの消散は、いぼが少ない被験者では共通であった（表２）。本試験中にいぼを消散した被験者には、開始時に平均３．８個のいぼがあったが、非消散者には平均６．８個のいぼがあった（ＡＮＯＶＡ；消散の予測変数としての、いぼ数についてＦ＝６．０７。１ｄ．ｆ．；ｐ＝０．０１９）。開始時のいぼ面積は２５〜９５０ｍｍ2であった。本試験中にいぼを除去しなかった被験者での開始時の平均いぼ面積は５２０ｍｍ2＋／−１２０であったが、いぼを除去した被験者での平均面積は２６０ｍｍ2＋／−４７ｍｍであった。（Ｆ＝５．８４；ｄ．ｆ．＝１；ｐ＝０．０２）。多変量解析により、異なる投与量群間のいぼの数と大きさの差（表１）が、その群間で観察された除去率の差を説明する可能性があることが分かった。開始時のいぼ数は、治癒までの時間の予測変数でもなく、初期ＶＬＰ特異的抗体力価の予測変数でもなかった。報告された、免疫療法開始前のいぼ期間は１〜２０ヶ月であり、中央値は２ヶ月であった。いぼ疾患の前期間は、疾患の結果（Ｆ＝０．３２；１ｄ．ｆ．，ｐ＝０．５７）、治癒までの時間、初期ＶＬＰ特異的抗体力価（Ｆ＝０．８９；４ｄ．ｆ．；ｐ＝０．４７）の予測変数でなかった。３３人の被験者のうち１５人は、ジアテルミーによる前破壊治療を受けていた。前治療は、結果、治癒までの時間、試験開始時の抗体力価を予測しなかった。患者の年齢は１８歳〜５６歳（平均３３歳）であり、女性は２７人、男性は６人であった。年齢も性別も、いぼの治癒も治癒までの時間も有意に予測しなかった。
【００４６】
免疫と結果との相関
いぼ治癒と、ＶＬＰ免疫処置に対する応答との相関を探した。既存のＶＬＰ特異的抗体のレベルまたは存在あるいはＤＴＨ反応の大きさと、いぼの最終的な結果または治癒までの時間とには相関がなかった（表３）。免疫処置後の抗体増加の大きさと結果には負の相関があった。これは、いぼを消散しなかった被験者をさらに免疫したが、与えたワクチン用量数が観察された抗体増加の大きさを予測しなかったので、臨床試験デザインを反映しているのかもしれない。
【００４７】
結論
本研究では、７６％のＨＰＶ６ｂ ＶＬＰ免疫化被験者において２０週間にわたってＨＰＶ６ｂ＋ｖｅ性器いぼの退行を観察した。対照的に、公表されている性器いぼ治療試験のコントロール群における同じ期間にわたる性器いぼの退行率は０〜２９％（図３Ａ）の範囲である。従って、ＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰ投与は、ＨＰＶ６ｂ関連いぼの自然な治癒プロセスに悪影響を及ぼさないだけでなく、そのような治療が治癒を加速させ得るという良好な証拠もある。細胞炎症性浸潤物、特に、コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１０２ ７６８−７７４に記載されたＩＬ−１２分泌Ｔ細胞の存在は、性器いぼの治癒プロセスと関連し、細胞性免疫の欠如が退行の不足と関連する。この観察は、他のウイルス感染に関するかぎりでの、いぼの退行における細胞性免疫の重要な役割を示唆している。いぼにはＬ１を含むＰＶウイルスキャプシドタンパク質が発現している。検知可能なＬ１タンパク質はいぼの表皮のうちのより表面側の層に限定されてはいるが、おそらくサコロウスキー（Ｓａｋｏｌｏｗｓｋｉ）ら、１９９８、７２１５０４−１５１５に記載されているようにｍＲＮＡが不安定である結果として、検知できないほどに少量のＬ１を発現している細胞でもデュ ブルイン（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ）ら，１９９８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５０ ３７１−３７６に記載のＬ１特異的Ｔ細胞媒介性溶解を受ける。従って、いぼの深い層の細胞に発現しているＬ１の量が少量であっても、複製型のＨＰＶ感染したいぼの基底付近のケラチン生成細胞をＴ細胞媒介性溶解に感作するのに十分である。アジュバントを伴わない動物へのＶＬＰｓの投与により、ペンら，１９９８年，前掲、およびグリーンストーンら，１９９８年，前掲に記載されているように、ＶＬＰｓ特異的細胞毒Ｔ細胞が誘導される。ＶＬＰ免疫治療は、ヒトいぼの持続を許容する複製型のＨＰＶ感染した基底付近のケラチン生成細胞を溶解させる、ＰＶタンパク質特異的ＣＴＬを誘導することにより、性器いぼの結果を変化させ得る。
【００４８】
ヒトにおける感染を減小させる免疫エフェクターとしてのＣＴＬの役割を確認したシング（Ｓｉｎｇ）ら，１９９７年，Ｂｌｏｏｄ ８９ １９７８〜１９８６年およびウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら，１９９５年，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３ １０３８−１０４４に示すように、ウイルス特異的細胞毒リンパ球（ＣＴＬ）を用いたＣＭＶおよびＥＢＶ感染の受動特異的免疫治療法は、そのようなウイルスに対して有効な自然免疫応答を開始することができない免疫抑制された被験者にとっての有効な免疫治療法である。細胞性免疫を誘導するための免疫化は、単純疱疹ウイルスとヒト免疫不全ウイルスのアクティブな特異的免疫治療法として提案されているが、フェーズ１試験は、これまで、今回の免疫治療プログラムにより誘導された免疫応答の性質により、臨床上の恩恵を立証するのに失敗している。自然に起こるパピローマウイルス感染は、おそらくパピローマウイルスが局所的免疫化を行わずに細胞増殖を引き起こすため、免疫原性に乏しく、フレーザー アイ エイチ（Ｆｒａｚｅｒ，Ｉ．Ｈ．）、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８ ４８４−４９１に示されているように表面層のみに感染する。従って、ＶＬＰｓを用いたＰＶ感染に対する特異的治療法は、本研究で明らかに示されたように、感染により誘導された免疫応答よりも良好な臨床上の結果を与えると期待され得る。それゆえ、パピローマウイルス感染は、ヒトでの有効な細胞性免疫両方を生成するように設計された新しいワクチン送達システムの有効性研究の良好な候補である。
【００４９】
ＶＬＰ特異的抗体による中和から逃れたＨＰＶに感染した任意の細胞を除くために、いぼの免疫療法の役割に加えて、ＨＰＶタンパク質に対する細胞性免疫の誘導は、ＨＰＶ予防ワクチンにおける望ましい特徴である。本発明の性器いぼに罹患した被験者におけるＤＴＨのＶＬＰｓへの立証では、アジュバントなしでマウスに投与したＶＬＰｓが、グリーンストーンら，１９９８年，前掲、ペンら，１９９８年，前掲、およびデュパイ（Ｄｕｐｕｙ）ら，１９９７年，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２２ ２１９−２２５に記載されているように特異的ＣＴＬを含めた細胞性免疫応答を誘導する能力を維持している。細胞性免疫を刺激するアジュバントの選択的使用が治療用ワクチンの有効性をさらに高めるかどうかは未だ決定されていない。ＤＴＨ試験自体では免疫が誘導され、ＶＬＰｓの投与は、非免疫化マウスの耳に局所的応答を誘導していないので（データ図示せず）、免疫前ＤＴＨ試験は本研究では行われず、ＨＰＶ６Ｌ１特異的ＤＴＨが免疫化の結果であるという結論は除外される。しかしながら、少数の被験者のみがＨＰＶＶＬＰｓに対する既存の抗体を有しており、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら，１９９６年，Ｊ．ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４ ９２７−９３６に記載のようにコーホート研究においてＨＰＶ１６感染の獲得とＨＰＶ６特異的抗体の外観との間で立証された６ヶ月の中央遅延時間を維持している。従って、本研究のＤＴＨ反応性は、一般に免疫化の結果として獲得されたものである可能性が高い。
【００５０】
本研究では、３回の免疫化の後での大多数の免疫性のない被験者と、１回の免疫化後での免疫被験者の一部に、ＶＬＰｓ特異的抗体力価の有意な増大が観察された。従って、ＨＰＶ感染による患者へのＶＬＰｓの投与は、自然感染の経過の免疫原と同じエピトープに対して明らかに免疫を誘導する。アジュバントの有無にかかわらず、１μｇ以下のＶＬＰｓは、ブライトバードら，１９９５年，前掲、カーンバウアー，１９９６年，前掲およびクリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら，１９９４年，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０ ９６０−９６５に記載されているように、マウス、ウサギ、イヌ、ウシで非常に免疫原性が高い。マウスランゲルハンス細胞（ＬＣ）は、プライス（Ｐｒｉｃｅ）ら，１９９７年，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６ １７２５−１７３５に記載され、パピローマウイルスに対する候補レセプター分子としてエバンダー（Ｅｖａｎｄｅｒ）ら、１９９７年，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１ ２４４９−２４５６に最近記載されたような、α６β１インテグリンを発現し得る。これは、ＬＣによるＰＶ ＶＬＰｓの直接の取り込みがアジュバントなしでの免疫原性を説明し得ることを示唆している。
【００５１】
ＨＰＶ６ｂ ＶＬＰｓの投与はＨＰＶ１１と交差反応するがＨＰＶ１６とは交差反応しない体液性免疫応答を生じた。これにより、ＶＬＰによる免疫化が、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら，１９９４年，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６ ３３−５４、クリステンセンら，１９９４年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５ ３２９−３５５およびローゼら，１９９４年，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５ ２４４５〜２４４９、クリステンセンら，１９９４年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５ ３２９−３５５に記載されているように、自然感染の後で説明されるような関連が近いＰＶ型間での交差反応性を有すると共により遠い型間の交差反応性を欠いた抗体を誘導することが確認された。この観察はパピローマウイルス予防ワクチンにとって重要である。
【００５２】
本願のデータはＨＰＶＬ１ ＶＬＰｓがＨＰＶ感染に対する治療用ワクチンの良好な候補であるという考えを支持している。
本発明の別の実施形態において、ＰＶ感染に罹患している患者にＰＶ ＶＬＰｓを投与する工程から成る現存するＰＶ感染の治療方法が与えられる。そのようなＶＬＰｓには、タンパク質Ｅ成分を含むキメラＶＬＰｓが含まれ得る。
【００５３】
さらなる実施形態において、アジュバントの存在下でＰＶ感染に罹患している患者にＰＶ ＶＬＰｓを投与する工程から成る現存するＰＶ感染の治療方法が与えられ得る。この特定の実施形態において、アジュバントは好ましくは、細胞性応答を誘導し、（１）脂質とその誘導体、（２）キラヤサポニンとその誘導体、（３）ミコバクテリアとその構成要素または誘導体、（４）ＩＬ１２、ＧＭＣＳＦ、他のＴｈ１誘導サイトカイン、および（５）酸化マンナンとその類似体から成る群から選択される。
【００５４】
【表１】
2011037902.tif 000002
2011037902.tif 000003
【表２】
2011037902.tif 000004
【表３】
2011037902.tif 000005
説明
表３
A 方法のセクションに記載のように０から３にスコア付けした。
B ＥＬＩＳＡにおいてＨＰＶ６ｂ ＶＬＰに対して試験した１：１００希釈血清のＯＤユニット
【図１Ａ】
2011037902.tif 000006
【図１Ｂ】
2011037902.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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