(57)【要約】【課題】全血試料の核酸を増幅するための前処理であって、遠心分離処理を行うことなく、夾雑物を簡単に凝固させ得る方法、及び、全血試料中の核酸を簡便に効率良く増幅させることができる核酸増幅方法の提供。【解決手段】全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、 (ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、 (ｂ)工程（ａ）において希釈された全血試料を熱処理する工程と、を有することを特徴とする全血試料の前処理方法、及び、前記記載の全血試料の前処理方法を用いて前処理された処理液を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、
(ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、
(ｂ)工程（ａ）において希釈された全血試料を熱処理する工程と、
を有することを特徴とする全血試料の前処理方法。  
【請求項２】
前記多価陽イオンが、アルカリ土類金属イオン又はアルミニウムイオンであることを特徴とする請求項１記載の全血試料の前処理方法。
【請求項３】
前記多価陽イオンが、アルミニウムイオン又は鉄イオンであることを特徴とする請求項１記載の全血試料の前処理方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０〜１００℃であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の全血試料の前処理方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０〜９０℃であることを特徴とする請求項１又は２記載の全血試料の前処理方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の全血試料の前処理方法を用いて前処理された処理液を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遠心分離処理を行うことなく、簡便に、全血試料の核酸を増幅するための前処理を行うための方法、及び該方法により前処理された全血試料を用いて核酸増幅を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学技術や分子生物学の進歩に伴い、試料中に含まれる核酸の解析は、学術研究の分野のみならず、医療分野においても広く行われるようになってきている。例えば、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断のために、生体試料中のゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸の解析が行われている。通常は、生体試料中に含まれる核酸は微量であるため、解析対象となる標的核酸を増幅することにより解析が行われることが多い。
生体試料中には、タンパク質をはじめとする様々な物質が含まれているが、これらの物質は、核酸増幅反応の阻害要因となり得る。特にタンパク質には、核酸分解活性や、核酸増幅に用いられる酵素等の阻害活性を有するものが多く、高精度かつ高感度に標的核酸を増幅するためには、生体試料中のタンパク質の失活や除去を行うことが好ましい。このため、通常、核酸抽出等の前処理がなされた生体試料を用いて核酸増幅は行われる。
【０００３】
このような前処理方法については、種々の方法が開示されている。例えば、シリカゲル粒子カラムを用いた抽出法等がある。ここで、シリカゲル粒子カラムを用いた抽出法とは、（ａ）生体試料に界面活性剤を添加して細胞を溶解し、プロテイナーゼＫでタンパク質を消化する、（ｂ）該消化処理後の生体試料をシリカゲル粒子カラムに通すことにより、核酸をシリカゲル粒子に吸着させる、（ｃ）その後、溶出液を用いてカラムから核酸を溶出することにより、核酸を抽出する、という方法である。このシリカゲル粒子カラムを用いた方法は、市販のキット等により広く用いられており、シリカゲル粒子を磁性粒子とした核酸抽出用全自動機も市販されている。このシリカゲル粒子カラムを用いて精製する市販のキットは、簡便であり、かつ非常に純度の高い核酸を得ることができるため、血液を使った遺伝子検査等において広く使用されている。しかしながら、シリカゲル粒子カラムは高価であり、非常にコストがかかるという問題がある。
【０００４】
また、核酸を含有する生体試料から、核酸以外の夾雑物、特に、核酸増幅反応等の酵素反応を阻害する物質を除去する方法として、例えば、（１）核酸含有サンプルから少なくとも一つの夾雑物を除去するための方法であって、（ａ）前記核酸含有サンプルを少なくとも一つの凝集剤と接触させて凝集剤沈殿物を形成する工程；および、（ｂ）前記凝集剤沈殿物から前記核酸を分離する工程、を含む方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。当該方法では、工程（ｂ）の後に前記核酸を精製または単離することを含んでいてもよく、核酸含有サンプルを、前記凝集剤と接触される前に分解、変性または破壊する工程を含んでいてもよい。なお、当該凝集剤としては、陽イオン性化学物質、陰イオン性化学物質、両イオン性化学物質、非帯電性化学物質、またはこれらの組合せが挙げられている。その他、（２）土壌から、土壌に含まれる細菌のＤＮＡを抽出する方法として、アルミニウムイオンや３価鉄イオンを用いて前処理を行い、核酸抽出を行うことにより、土壌由来の阻害物質を除去する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
これに対して、より安価な方法として、単に生体試料を煮沸処理し、生体試料中のタンパク質等の夾雑物を凝固させ、核酸と分離させるボイリング法がある（例えば、非特許文献１参照。）。このボイリング法を応用した方法として、例えば、（３）全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、(i)全血試料を希釈する工程と、(ii)希釈された全血試料を熱処理する工程と、(iii)熱処理後の試料を遠心分離する工程とを含む前処理方法等がある（例えば、特許文献２参照。）。血液のように、夾雑物が多く、核酸含量が微量である生体試料では、ボイリング法のように単に煮沸処理するだけでは、得られる核酸の精度が不十分であり、正確な検査が困難な場合が多いが、上記（３）の方法のように、夾雑物を凝固させた後に遠心分離処理することにより、核酸増幅反応を阻害する物質等を効率よく除去することができ、より正確な検査をすることが可能となる。
【特許文献１】特表２００８−５０００６６号公報
【特許文献２】特開２００６−１８７２２１号公報
【非特許文献１】ブレイド（Braid）、外２名、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Journal of Microbiological Methods）、２００３年、第５２巻、ｐ３８９〜３９３
【非特許文献２】蛋白質核酸酵素、共立出版、１９９６年、第４１巻、第５号、ｐ４５３〜４５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
臨床検査等のように多検体を処理する場合には、作業効率の点から、検査工程が少なく、かつ特殊な装置を要さないことが好ましい。また、各工程の操作が簡便であれば、検査を自動化しやすく、より好ましい。しかしながら、上記（１）や（２）の方法では、工程数が多く、作業が煩雑であり、作業効率が十分ではない、という問題がある。また、上記（３）の方法は、上記（１）や（２）の方法よりも工程数が少ないものの、遠心分離処理を含む方法であるため、操作が煩雑であるという問題がある。また、遠心分離操作を含む工程を自動化する場合には、装置の構成が複雑になり、装置コストが高くなるという問題もある。
【０００７】
本発明は、全血試料の核酸を増幅するための前処理であって、遠心分離処理を行うことなく、夾雑物を簡単に凝固させ得る方法、及び、全血試料中の核酸を簡便に効率良く増幅させることができる核酸増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、全血試料を、マグネシウムイオン等の多価の陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈することにより、タンパク質等の夾雑物を簡単に不活性化させることができること、及び、得られた処理液は、遠心分離処理することなく、核酸増幅反応の供することができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）  全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、 (ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、 (ｂ)工程（ａ）において希釈された全血試料を熱処理する工程と、を有することを特徴とする全血試料の前処理方法、
（２）  前記多価陽イオンが、アルカリ土類金属イオン又はアルミニウムイオンであることを特徴とする前記（１）記載の全血試料の前処理方法、
（３）  前記多価陽イオンが、アルミニウムイオン又は鉄イオンであることを特徴とする前記（１）記載の全血試料の前処理方法、
（４）  前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０〜１００℃であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の全血試料の前処理方法、
（５）  前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０〜９０℃であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の全血試料の前処理方法、
（６）  前記（１）〜（５）のいずれか記載の全血試料の前処理方法を用いて前処理された処理液を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法、
を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の全血試料の前処理方法により、遠心分離処理をすることなく、簡便に、全血試料中の夾雑物を不活性化させることができる。このため、本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液を用いることにより、核酸増幅を高精度かつ効率的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の全血試料の前処理方法に供される全血試料は、動物から採取された全血であればよい。例えば、ヒト由来の全血試料であってもよく、マウスやウサギ、モルモット等の実験動物由来の全血試料であってもよく、ウシ、ウマ、ブタ、トリ等の家畜由来の全血試料であってもよい。また、採血直後の全血試料であってもよく、保存後の全血試料であってもよい。保存後の全血試料を用いる場合、保存条件は特に限定されるものではなく、室温保存されたものであってもよく、冷蔵や冷凍保存されたものであってもよい。
【００１２】
本発明の全血試料の前処理方法は、(ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、(ｂ)希釈された全血試料を熱処理する工程と、を有することを特徴とする。このように、全血試料に多価陽イオンを添加して熱処理することにより、白血球の破裂等により、白血球中に含まれている核酸が溶液中に抽出されるとともに、タンパク質等の夾雑物を効率よく不活性化させることができる。これは、熱処理により変性したタンパク質と、多価陽イオンとが、キレート反応を起こすため、凝集が生じるためと推察される。すなわち、試料を煮沸処理することにより細胞を破壊してタンパク質を変性し、核酸を抽出するボイリング法とは異なり、キレート反応によりタンパク質を凝集させるため、脂質や糖類等のタンパク質以外の夾雑物も巻き込んで凝集物が形成される結果、より効果的に夾雑物を不活性化させることができると推察される。
以下、工程ごとに説明する。
【００１３】
まず、工程（ａ）として、全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する。ここで、希釈倍率が小さすぎる場合には、最終的に得られる処理液が形成された凝集物でほぼ埋め尽くされてしまい、核酸増幅反応に用いるために十分量の処理液が回収しにくくなるおそれがある。一方、希釈倍率が高すぎる場合には、得られた処理液中の核酸濃度が低くなりすぎるおそれがある。核酸濃度が低くなりすぎると、核酸増幅反応の反応液へ供される処理液量が多くなり、結果、核酸増幅反応の反応スケールが大きくなり、コストが高くなる可能性がある。希釈倍率が２〜１００倍、好ましくは、４〜６４倍であれば、量と核酸濃度の双方の点から、核酸増幅反応に好ましい処理液を回収することができる。さらに、希釈倍率が１６〜３２倍であれば、不活性化された夾雑物による沈殿量を十分に少なくすることができ、得られた処理液を核酸増幅反応に供する場合に、反応溶液への不溶物の持ち込みを抑えることができる。このため、前処理から核酸増幅反応までの一連の工程を自動化装置を用い手行う場合には、希釈倍率を１６〜３２倍とすることが好ましい。
【００１４】
工程（ａ）において用いられる希釈溶媒に含まれる多価陽イオンは、処理液が供される核酸増幅反応の反応液に持ち込まれた場合に、沈殿等を生じさせないものであれば、特に限定されるものではないが、２価又は３価の陽イオンであることが好ましい。また、金属イオンであってもよく、バリウムイオン等の非金属イオンであってもよい。排液処理の点からは、重金属イオン以外の多価陽イオンであることが好ましい。本発明においては、多価陽イオンとして、アルカリ土類金属イオン、アルミニウムイオン、又は鉄イオンであることが好ましく、マグネシウムイオン、アルミニウムイオン、又は３価鉄イオンであることがより好ましい。全血試料中の夾雑物をより効果的に不活性化させることができるためである。
【００１５】
希釈溶媒に含まれる多価陽イオンの濃度は、全血試料に含まれている夾雑物を不活性化させるために十分な量であり、かつ、処理液が供される核酸増幅反応を阻害しない濃度であれば、特に限定されるものではなく、多価陽イオンの種類、希釈溶媒の種類、全血試料の希釈倍率、核酸増幅反応へ持ち込まれる量、及び核酸増幅反応の種類等を考慮して、適宜決定することができる。一般的には、希釈溶媒に含まれる多価陽イオンの濃度が高いほど、キレート反応の効率がよい。このため、例えば、希釈倍率が１０倍以上である場合には、希釈溶媒の多価陽イオン濃度が１μＭ以上であれば、十分に全血試料中の夾雑物を不活性化させることができる。
【００１６】
希釈溶媒の多価陽イオン濃度の上限は、用いられる多価陽イオンが、アルミニウムイオン等の核酸増幅反応に特段の影響を及ぼさない種類のイオンである場合には、特に限定されるものではない。例えば、多価陽イオンとしてアルミニウムイオンを用いた場合には、希釈溶媒のアルミニウムイオン濃度が１μＭ以上であることが好ましく、１μＭ〜５０ｍＭであることがより好ましく、２５μＭ〜２０ｍＭであることがさらに好ましい。一方、多価陽イオンとして２価鉄イオン等の２価の金属イオンを用いた場合には、１μＭ〜２．５ｍＭであることが好ましく、１μＭ〜０．５ｍＭであることがより好ましい。また、多価陽イオンとして３価鉄イオンを用いた場合には、１μＭ〜５ｍＭであることが好ましく、１μＭ〜２．５ｍＭであることがより好ましく、０．５〜２．５ｍＭであることがさらに好ましい。
【００１７】
一方、多価陽イオンが、マグネシウムイオン等のように核酸増幅反応に影響を及ぼす可能性があるイオンである場合には、核酸増幅反応へ持ち込まれる量等を考慮して、核酸増幅反応に対する影響を抑えつつ、効率よくキレート反応を生じさせ得る濃度範囲を適宜決定することができる。希釈溶媒の多価陽イオン濃度が高すぎると、核酸増幅反応が阻害されるおそれがあり、逆に低すぎるとキレート反応効率が低く、夾雑物の不活性化効率が低下し、核酸増幅反応が阻害されるためである。例えば、希釈溶媒の多価陽イオンがマグネシウムイオンであり、希釈倍率が１０倍以上であり、核酸増幅反応へ持ち込まれる処理液量が、核酸増幅反応の反応液の最終容量の１０分の１以下程度である場合には、多価陽イオン濃度が１μＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは２５μＭ〜１２５μＭであれば、核酸増幅反応に対する影響を抑えつつ、効率よく夾雑物を不活性化することができる。
【００１８】
工程（ａ）において用いられる希釈溶媒の種類は、処理液が供される核酸増幅反応を阻害しない溶媒であれば特に限定されるものではなく、水や、一般的に生体試料の調製や核酸解析等に使用されるバッファー等に、多価陽イオンを添加したものを用いることができる。該バッファーとしては、例えば、トリスバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。また、希釈溶媒には、処理液が供される核酸増幅反応を阻害しない限度で、界面活性剤や有機溶媒等を添加してもよい。
【００１９】
その後、工程（ｂ）として、工程（ａ）において希釈された全血試料（希釈済全血試料）を熱処理する。熱処理の温度は、全血試料中の夾雑物を不活性化し得る温度であれば、特に限定されるものではないが、煮沸処理（１００℃）以下であることが好ましい。特に、キレート反応により夾雑物を不活性化させるため、熱処理の温度は、煮沸処理（１００℃）よりも比較的低めの温度で熱処理することがより好ましい。例えば、本発明の全血試料の前処理方法においては、熱処理温度を、５０〜１００℃とすることが好ましく、５０〜９０℃とすることがより好ましく、６５〜９０℃とすることがさらに好ましく、８０〜９０℃とすることが特に好ましい。
【００２０】
該熱処理の時間は、熱処理の温度や希釈済全血試料の量等を考慮して、適宜決定することができる。熱処理温度が８０〜９０℃のように比較的高い場合には、熱処理温度が５０〜７０℃のように比較的低い場合よりも短時間の処理時間でよい。例えば、熱処理温度が８０℃以上である場合には、熱処理時間は１０分間以内であることが好ましく、２．５分間以内であることがより好ましく、１分間以内であることがさらに好ましい。また、該熱処理の時間は、所定の熱処理温度において希釈済全血試料を保持する時間のみならず、加温工程の時間も含まれる。この加温工程においても、夾雑物の不活性化は進行するためである。例えば、工程（ａ）を室温で行った後、工程（ｂ）の熱処理を８０℃以上で行う場合には、８０℃まで加温する工程に、一般的には数秒〜数十秒間を要する。このため、希釈済全血試料の温度が８０℃に達した時点で熱処理を終了してもよい。
【００２１】
該熱処理により、全血試料中の夾雑物は不活性化され、凝集する。この凝集により得られる凝集物は、煮沸処理により変性したタンパク質による凝集物に比べて非常に強固であるため、例えば、遠心分離処理した場合には、沈殿物の容積が小さくなり、より多くの上清を得ることができる。
【００２２】
本発明の全血試料の前処理方法により全血試料を処理して得られる処理液は、夾雑物が不活性化された核酸抽出液であるため、本発明の全血試料の前処理方法は、全血試料を用いた核酸解析の前処理として好適である。また、処理液中の不活性化された夾雑物が核酸増幅反応の反応溶液中に持ち込まれたとしても、核酸増幅反応を良好に行うことができることから、本発明の全血試料の前処理方法は、特に核酸増幅反応を用いた核酸解析のための前処理方法として特に好適である。本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液中の不活性化された夾雑物（凝集物）が、核酸増幅反応を阻害しない理由は明らかではないが、キレート反応による凝集物は、煮沸処理により変性したタンパク質による凝集物に比べて非常に強固であるためと推察される。
【００２３】
本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液は、他の核酸試料と同様に、核酸増幅反応等の核酸解析に供されることができる。該処理液が供される核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法等がある。本発明においては、特にＰＣＲ法であることが好ましい。なお、これらの手法は、核酸として本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液を用いる以外は、一般的な反応条件により行うことができる。
【００２４】
上述したように、該処理液中の不活性化された夾雑物は、核酸増幅反応をほとんど阻害しない。このため、これらの核酸増幅反応の反応溶液に、該処理液を、夾雑物による凝集物の持ち込みを気にすることなく添加することができる。また、キレート反応により得られる凝集物は、その強い凝集力により容積が小さくなり、沈殿し易い。このため、例えば、核酸増幅反応後の解析操作等の点から、凝集物の持ち込みを抑制したい場合には、工程（ｂ）による熱処理後、室温程度まで液温を低下させ静置することにより、凝集物を沈澱させ、この処理液の上層部分から回収した処理液を反応溶液に添加することにより、凝集物の持ち込み量を簡便に低下させることができる。
【００２５】
また、例えば、アルミニウムイオンや３価鉄イオン等の３価陽イオンを用いた場合に得られる凝集物は、マグネシウムイオンや２価鉄イオン等の２価陽イオンを用いた場合に得られる凝集物よりも、核酸増幅反応への阻害効果が小さい。このため、３価陽イオンを用いた場合のほうが、２価陽イオンを用いた場合よりも、核酸増幅反応の反応溶液への夾雑物の持ち込み量を考慮することなく、簡便に熱処理後の処理液を核酸増幅反応へ供することができる。これは、多価陽イオンとしては、より価数の高いほうが、凝集能力が高く効率よく夾雑物を不活性化することができるためと推察される。
【００２６】
このように、本発明の全血試料の前処理方法は、従来の前処理方法とは異なり、得られた処理液から遠心分離処理により凝集物を除去する工程を省いた場合であっても、核酸解析に好適な処理液を得ることができる。このため、本発明の全血試料の前処理方法は、複雑な遠心分離処理部を設けることなく、溶液添加部と温度制御部を備えた装置を用いて、全工程を自動化することも容易である。さらに、市販のＰＣＲ装置等の温度制御部を備えた核酸増幅反応装置に、溶液分注装置を備えた簡単な構成の装置により、前処理工程から核酸増幅反応までの一連の工程を全自動化することも容易である。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
多価陽イオンとして、濃度の異なるマグネシウムイオンを用いて、本発明の全血試料の前処理方法によりヒトから採取した全血を前処理し、ＰＣＲを行い、解析対象である遺伝子の増幅産物を得た。ヒトのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＶＫＯＲＣ）のサブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）遺伝子及びヒトの肝チトクロームＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０：ＣＹＰ）２Ｃ９遺伝子を解析対象の遺伝子とした。
まず、全血５μＬを、硫酸マグネシウム濃度が異なるにがり液（硫酸マグネシウム、和光純薬工業社製）１５５μＬで希釈し（稀釈倍率が３２倍）、それぞれ混合した。にがり液中の硫酸マグネシウム濃度は１．８８ｍＭ〜７．３μＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、７０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
これらの処理液を鋳型とし、表１記載のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。なお、これらのプライマーを用いることにより、８２ｂｐのＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物、１４４ｂｐのＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅産物が、それぞれ得られる。
【００２９】
【表１】
2011097828.tif 000002
【００３０】
具体的には、２μＬの処理液に、最終濃度が、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭの硫酸マグネシウム、１０μＬのヒトゲノム検体（２０ｎｇ／μＬ）、０．３μＭの各プライマー、及び０．９μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡績社製）となるようにそれぞれ添加し、ｍｉｌｌｉＱ水を加え、全量３６μＬの反応溶液を調製した。なお、処理液に代えて、表１記載のプライマーを用いて、ＶＫＯＲＣ１遺伝子及びＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物が得られることが確認されているヒト抽出ゲノム１０ｎｇ（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団が提供しているヒューマンサイエンス研修資源バンクより非連結匿名化された状態で入手）を用いたものをＰＣＲのポジティブコントロールとし、等量のｍｉｌｌｉＱ水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
これらの反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後の反応溶液を、８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色することにより、目的のＣＹＰ２Ｃ９増幅産物（８２ｂｐ）及びＶＫＯＲＣ１増幅産物（１４４ｂｐ）が増幅されているか否かを確認した。
【００３１】
図１はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１〜９には、表２記載の硫酸マグネシウム濃度のにがり液を用いて前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン１０にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を図２に示す。
【００３２】
【表２】
2011097828.tif 000003
【００３３】
この結果、前処理に用いるにがり液中のマグネシウムイオンの濃度が７．３μＭ〜０．４６９ｍＭであるレーン３〜９において、レーン１０と同様にＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が検出された。特に、マグネシウムイオンの濃度が０．０２９〜０．１１７ｍＭであるレーン５〜７において、両増幅産物をバランスよく得ることができた。一方、レーン１ではＣＹＰ２Ｃ９増幅産物のみが、レーン２ではＶＫＯＲＣ１増幅産物のみが検出された。
これらの結果から、本発明の全血試料の前処理方法により処理された処理液は、遠心分離処理を行うことなく核酸増幅反応の供し得ることが明らかである。なお、一般的には、ＰＣＲ等のポリメラーゼを用いる核酸増幅反応のための前処理には、マグネシウムイオンを含有する液は用いない。ポリメラーゼ反応におけるマグネシウムイオン濃度は最適値があることがよく知られており、検体からのマグネシウム持込を避ける必要があるためである。にもかかわらず、本発明においては、マグネシウムイオン含有液を用いた場合でも、良好に前処理を行うことができた。
【００３４】
［実施例２］
前処理における熱処理温度の影響を調べた。
具体的には、前処理に用いたにがり液の硫酸マグネシウム濃度を０．１１７ｍＭとし、熱処理の温度を５０℃〜９０℃とした以外は、実施例１と同様にして、全血試料を前処理し、該前処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
図３はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１〜５には、表３記載の熱処理温度で前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン６にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を図４に示す。
【００３５】
【表３】
2011097828.tif 000004
【００３６】
この結果、全てのレーンにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が十分な強度で検出され、いずれもマルチプレックス増幅ができた。特に、前処理における熱処理温度を８０℃〜９０℃とした場合には、非特異増幅も少なくすることができた。シグナル強度も高く、非特異増幅も少なかったことから、本実施例においては、熱処理の温度は８０℃が最も適切であった。
【００３７】
［実施例３］
前処理における熱処理時間の影響を調べた。
具体的には、前処理に用いたにがり液の硫酸マグネシウム濃度を０．１１７ｍＭとし、熱処理の温度を８０℃とし、８０℃に達した後の加熱保持時間を０〜１０分間とした以外は、実施例１と同様にして、全血試料を前処理し、該前処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
図５はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１〜５には、表４記載の加熱保持時間で前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン６にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を表４及び図６に示す。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
この結果、全てのレーンにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が十分な強度で検出され、いずれもマルチプレックス増幅ができた。特に、前処理における加熱保持時間が０分間の場合（加熱して８０℃になってすぐに２５℃とした場合）には、最も増幅産物量が多く得られた。
【００４０】
［実施例４］
前処理における全血の稀釈倍率の影響を調べた。
まず、前処理に用いたにがり液の硫酸マグネシウム濃度を０．１１７ｍＭとし、５μＬの全血に対する稀釈倍率を４〜６４倍とし、熱処理の温度を８０℃とし、８０℃に達した後の加熱保持時間を０分間とした以外は、実施例１と同様にして、全血試料を前処理し、該前処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
図７はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１〜５には、表５記載の稀釈倍率で前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン６にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を図８に示す。
【００４１】
【表５】
2011097828.tif 000006
【００４２】
この結果、全てのレーンにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が検出され、いずれもマルチプレックス増幅ができた。特に、希釈倍率が４〜３２倍であったレーン２〜５では、両増幅産物が十分な強度で検出することができた。
一方、図９は、前処理後に得られた処理液の状態を観察した図である。希釈倍率が４倍及び８倍の場合には、前処理後に得られた処理液中に、多量の沈澱（血液変性物）が生じていた。このため、自動化装置に適用する場合には、沈殿量の少なく、かつ十分量の増幅産物が得られる１６〜３２倍の稀釈倍率で行うことが好ましい。
【００４３】
［実施例５］
多価陽イオンとして、アルミニウムイオンを用いて、本発明の全血試料の前処理方法によりヒトから採取した全血１０検体を前処理し、ＰＣＲを行い、解析対象である遺伝子の増幅産物を得た。解析対象の遺伝子は、実施例１と同様に、ＶＫＯＲＣ１遺伝子及びＣＹＰ２Ｃ９遺伝子とした。
まず、各全血６．２５μＬを、硫酸アルミニウム水溶液（硫酸アルミニウム、和光純薬工業社製）４３．７５μＬで希釈し、それぞれ混合した。これらの希釈液中の硫酸アルミニウム濃度は１０ｍＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、８０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
実施例１と同様にして、これらの処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
図１０はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１〜１０には、全血１０検体から得られた処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン１１にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）を、レーン１２にはネガティブコントロール（ｍｉｌｌｉＱ水を添加したもの）を、それぞれ流した。この結果、検体による増幅量の差が見られたものの、いずれの検体においても、マルチプレックスＰＣＲによって両遺伝子が検出できた。
【００４４】
［実施例６］
多価陽イオンとして、２価鉄イオンと３価鉄イオンを用いて、多価陽イオンの価数による影響を観察した。
具体的には、全血６．２５μＬを、濃度が異なる塩化第一鉄水溶液（ＦｅＣｌ２、和光純薬工業社製）４３．７５μＬ、又は塩化第二鉄水溶液（ＦｅＣｌ３、和光純薬工業社製）４３．７５μＬで希釈し、それぞれ混合した。これらの希釈液中の塩化第一鉄又は塩化第二鉄の濃度は０．５〜５０ｍＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、８０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
実施例１と同様にして、これらの処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
図１１はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１〜６には、表６記載の塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２）濃度の塩化第一鉄水溶液を用いて前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン９〜１４には、表７記載の塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）濃度の塩化第二鉄水溶液を用いて前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン７及び１５にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）を、レーン８及び１６にはネガティブコントロール（ｍｉｌｌｉＱ水を添加したもの）を、それぞれ流した。この結果、二価の鉄イオン（ＦｅＣｌ２）を用いた場合も、三価の鉄イオン（ＦｅＣｌ３）を用いた場合も、マルチプレックスＰＣＲによって両遺伝子が検出できた。特に、二価の鉄イオンを用いた場合よりも、三価の鉄イオンを用いた場合の方が、増幅産物量が多い傾向が観察された。塩化第二鉄水溶液を用いた場合には、希釈液中の三価の鉄イオン濃度が、２．５〜０．５ｍＭ、特に２．５ｍＭの場合に、ＰＣＲ増幅が非常に良好であることが分かった。
【００４５】
【表６】
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【００４６】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の全血試料の前処理方法を用いることにより、遠心分離処理をすることなく、簡便に、核酸解析、特に核酸増幅反応に好適な核酸試料を調製することができるため、特に多検体の遺伝子解析を行うような臨床検査等の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
【図２】実施例１において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。
【図３】実施例２において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
【図４】実施例２において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。
【図５】実施例３において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
【図６】実施例３において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。
【図７】実施例４において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
【図８】実施例４において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。
【図９】実施例４において、前処理後に得られた処理液の状態を観察した図である。
【図１０】実施例５において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
【図１１】実施例６において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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