(57)【要約】      （修正有）【課題】新規植物多糖体合成遺伝子およびこのような遺伝子によってコードされるポリペプチドが提供される。【解決手段】遺伝子およびポリヌクレオチド配列は、多糖体合成および植物表現型の制御に有用である。そのうえ、これらの遺伝子は、植物多糖体合成遺伝子の発現プロファイリングのために有用である。特に、ユーカリ属およびマツ属から単離された細胞周期ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列であり、作成されたトランスジェニック植物の表現型が、リグニン品質、リグニン構造、木材組成物、木材の外観、木材密度、木材強度、木材硬度、その他から選択される特性を示す。【選択図】図１
2011097941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
SEQ ID NO:1〜12、14〜58、60〜62、64〜70、72〜75、77〜83、85〜86、88〜91、93〜119、121〜130、132〜148、150〜156、158〜191、193〜207、209〜218、220〜221、223〜231、233〜237、およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜76、78〜103、106、108〜113、116〜121、124〜125、128〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、208〜213、および215〜234、ならびにこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜58、60〜62、64〜70、72〜75、78〜83、85〜86、88〜91、93〜103、106、108〜113、116〜119、121、124〜125、128〜130、132〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、209〜213、215〜218、220〜221、223〜231、および233〜234、ならびにこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、ユーカリ属（Eucalyptus）またはマツ属（Pinus）の種の野生型植物において発現される遺伝子に含まれる配列を有する、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
変異体が、SEQ ID NO:1〜237のいずれか1つに対して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、または60%以上の配列同一性を有する、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
変異体が、SEQ ID NO:261〜497のいずれか1つに対して60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、かつ、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、SEQ ID NO:1〜237のいずれか1つによってコードされるタンパク質の活性を有する、請求項7記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体のいずれか1つの配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むDNA構築物。
【請求項１０】
プロモーターをさらに含み、プロモーターとポリヌクレオチドとは作動可能に連結されている、請求項9記載のDNA構築物。
【請求項１１】
プロモーターが、構成的プロモーター、強力なプロモーター、誘導性プロモーター、調節可能なプロモーター、時間的に調節される（temporally regulated）プロモーター、および組織指向性（tissue-preferred）プロモーターからなる群より選択される、請求項10記載のDNA構築物。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、RNA転写物をコードする、請求項9記載のDNA構築物。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、プロモーターに対してセンスまたはアンチセンスの配向である、請求項12記載のDNA構築物。
【請求項１４】
RNA転写物が、1〜237からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドのRNA干渉を誘導する、請求項12記載のDNA構築物。
【請求項１５】
請求項9記載のDNA構築物で形質転換された植物細胞。
【請求項１６】
請求項15記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１７】
植物の表現型が、DNA構築物で形質転換されなかった同じ種の植物の表現型とは異なる、請求項16記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
トランスジェニック植物において異なる表現型が、以下からなる群より選択される、請求項17記載のトランスジェニック植物：リグニン品質、リグニン構造、木材組成物、木材の外観、木材密度、木材強度、木材硬度（wood stiffness）、セルロース重合、線維寸法、内腔サイズ、その他の植物成分、植物細胞分裂、植物細胞発生、単位領域あたりの細胞数、細胞サイズ、細胞形態、細胞壁組成物、木材形成率、木材の美的外観、幹の欠陥の形成、平均ミクロフィブリル角度、S2細胞壁層の幅、成長率、枝の栄養発生に対する根の根形成比の割合、葉面積指数、および葉形。
【請求項１９】
植物が木本植物である、請求項16記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
植物が樹木である、請求項19記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
植物がユーカリ属またはマツ属の種である、請求項20記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
植物が、DNA構築物で形質転換されなかった同一種の植物と比較して、以下からなる群より選択される1つまたは複数の特徴を示す、請求項16記載のトランスジェニック植物：増大された乾燥耐性、除草剤耐性、減少または増大された丈、減少または増加した枝分かれ、増強された寒冷および凍結耐性、改善された生長力、増強された色、増強された健康および栄養的な特徴、改善された貯蔵、増強された収率、増強された耐塩性、腐食に対する増強された木材の耐性、真菌病に対する増強された耐性、害虫に対する改変された誘引性、増強された重金属耐性、増大された耐病性、増大された昆虫耐性、増大された水ストレス耐性、増強された甘味、改善された肌目、減少されたリン酸含量、増大された発芽、増大された微量栄養素の取り込み、改善されたデンプン組成、改善された花の寿命、新規樹脂の産生、および新規タンパク質またはペプチドの産生。
【請求項２３】
植物が、DNA構築物で形質転換されなかった同一種の植物と比較して、以下からなる群より選択される1つまたは複数の特徴を示す、請求項16記載のトランスジェニック植物：減少された未成熟期間、増大された未成熟期間、あて材（reaction wood）を形成する傾向、自己離層形成する枝、促進された生殖発生、または遅延された生殖発生。
【請求項２４】
SEQ ID NO:261〜497のいずれか1つから選択されるポリペプチドの触媒ドメインまたは基質結合ドメインをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO:261〜497のいずれか1つから選択される該ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
SEQ ID NO:1〜237のいずれかの配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むDNA構築物により植物細胞を形質転換する段階；および、植物の成長を促進する条件下で形質転換された植物細胞を培養する段階を含む、形質転換された植物を作製する方法。
【請求項２６】
DNA構築物がプロモーターをさらに含み、ポリヌクレオチドおよびプロモーターが作動可能に連結されている、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つのポリヌクレオチドが、以下からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項25記載の方法：サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質。
【請求項２８】
植物細胞が、植物外植片組織内に位置する、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
トランスジェニック植物が、DNA構築物で形質転換されなかった同一種の植物とは異なる表現型を呈する、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
トランスジェニック植物において異なる表現型が、以下からなる群より選択される、請求項25記載の方法：リグニン品質、リグニン構造、木材組成物、木材の外観、木材密度、木材強度、木材硬度、セルロース重合、線維寸法、内腔サイズ、その他の植物成分、植物細胞分裂、植物細胞発生、単位領域あたりの細胞数、細胞サイズ、細胞形態、細胞壁組成物、木材形成率、木材の美的外観、幹の欠陥の形成、平均ミクロフィブリル角度、S2細胞壁層の幅、成長率、枝の栄養発生に対する根の根形成比の割合、葉面積指数、および葉形。
【請求項３１】
トランスジェニック植物が、DNA構築物で形質転換されなかった同一種の植物と比較して、以下からなる群より選択される1つまたは複数の特徴を示す、請求項25記載の方法：増大された乾燥耐性、除草剤耐性、減少または増大された丈、減少または増大した枝分かれ、増強された寒冷および凍結耐性、改善された生長力、増強された色、増強された健康および栄養的な特徴、改善された貯蔵、増強された収率、増強された耐塩性、腐食に対する増強された木材の耐性、真菌病に対する増強された耐性、害虫に対する改変された誘引性、増強された重金属耐性、増大された耐病性、増大された昆虫耐性、増大された水ストレス耐性、増強された甘味、改善された肌目、減少されたリン酸含量、増大された発芽、増大された微量栄養素の取り込み、改善されたデンプン組成、改善された花の寿命、新規樹脂の産生、および新規タンパク質またはペプチドの産生。
【請求項３２】
請求項9記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック樹木から得られる木材。
【請求項３３】
請求項9記載のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック樹木から得られる木材パルプ。
【請求項３４】
DNA構築物が、SEQ ID NO:261〜497のいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項33記載の木材パルプ。
【請求項３５】
SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むDNA構築物により植物を形質転換する段階；植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物を培養する段階；ならびに、植物から木材を得る段階を含む、木材を作製する方法。
【請求項３６】
SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むDNA構築物により植物を形質転換する段階；植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物を培養する段階；および、植物から木材パルプを得る段階を含む、木材パルプを作製する方法。
【請求項３７】
請求項1記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
SEQ ID NO:261〜497からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
SEQ ID NO:1〜237のいずれか1つによってコードされるポリペプチドの、植物における発現を改変する段階を含む、植物の植物表現型を改変する方法。
【請求項４０】
発現が、アップレギュレーションされるか、ダウンレギュレーションされるか、サイレンシングされるか、または発生的に調節される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
植物表現型が以下からなる群より選択される、請求項39記載の方法：リグニン品質、リグニン品質、リグニン構造、木材組成物、木材の外観、木材密度、木材強度、木材硬度、セルロース重合、線維寸法、内腔サイズ、その他の植物成分、植物細胞分裂、植物細胞発生、単位領域あたりの細胞数、細胞サイズ、細胞形態、細胞壁組成物、木材形成率、木材の美的外観、幹の欠陥の形成、平均ミクロフィブリル角度、S2細胞壁層の幅、成長率、枝の栄養発生に対する根の根形成比の割合、葉面積指数、および葉形。
【請求項４２】
植物が、DNA構築物で形質転換されなかった同一種の植物と比較して、以下からなる群より選択される1つまたは複数の特徴を示す、請求項39記載の方法：増大された乾燥耐性、除草剤耐性、減少または増大された丈、減少または増大した枝分かれ、増強された寒冷および凍結耐性、改善された生長力、増強された色、増強された健康および栄養的な特徴、改善された貯蔵、増強された収率、増強された耐塩性、腐食に対する増強された木材の耐性、真菌病に対する増強された耐性、害虫に対する改変された誘引性、増強された重金属耐性、増大された耐病性、増大された昆虫耐性、増大された水ストレス耐性、増強された甘味、改善された肌目、減少されたリン酸含量、増大された発芽、増大された微量栄養素の取り込み、改善されたデンプン組成、改善された花の寿命、新規樹脂の産生、および新規タンパク質またはペプチドの産生。
【請求項４３】
SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４４】
約100未満のヌクレオチド塩基からなる、請求項43記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
以下の段階を含む、2つの異なる試料中の遺伝子発現を相関させる方法：第1の試料においてSEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第2の試料において1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の試料における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の試料における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1の試料と第2の試料との間の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルの相違を相関させる段階。
【請求項４６】
第1の試料および第2の試料が、それぞれ異なるタイプの植物組織に由来する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
第1の試料および第2の試料が同一の組織に由来し、かつ第1の試料および第2の試料が、それぞれ同一年の異なる季節の間に収穫される、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
第1の試料および第2の試料が、発生の異なる段階の植物から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
以下の段階を含む、1つまたは複数の遺伝子の植物における遺伝子発現レベルに対して植物表現型の所有を相関させる方法：表現型を有する第1の植物において、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；表現型を欠いている第2の植物において、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の植物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の植物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1の植物と第2の植物との間における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルの相違を、表現型の所有と相関させる段階。
【請求項５０】
細胞周期の第1の段階の第1の植物細胞において、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；細胞周期の第2の異なる段階の第2の植物細胞において、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の植物細胞における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の植物細胞における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1または第2の細胞周期の段階に対して、第1と第2の試料間の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルにおける相違を相関させる段階、を含む遺伝子発現を細胞周期の段階に相関させる方法。
【請求項５１】
第1および第2の試料の両方が、維管束組織、頂端分裂組織、維管束形成層、木部、師部、根、花、球果、果実、および種子からなる群より選択される植物組織から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
第1の試料および第2の試料の植物組織が、それぞれ異なるタイプの組織から得られる、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
第1および第2の試料が、それぞれ発育の異なる段階の植物組織から得られる、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
第1および第2の試料が、それぞれ細胞周期の異なる段階の植物細胞から得られる、請求項45記載の方法。
【請求項５５】
第1および第2の植物または植物細胞の両方が、ユーカリ属およびマツ属種から選択される同じ種のものである、請求項49または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項５６】
第1および第2の植物または植物細胞が、ユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）またはラジアータマツ（Pinus radiata）から選択される種のものである、請求項49または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項５７】
検出する段階が、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる1つまたは複数のポリヌクレオチドを使用して行われる、請求項45、49、または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項５８】
検出する段階が、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列によってコードされる遺伝子産物に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる1つまたは複数のポリヌクレオチドを使用して行われる、請求項45、49、または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項５９】
検出する段階が、標識された核酸に対するハイブリダイゼーションによって行われる、請求項45、49、または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項６０】
1つまたは複数ポリヌクレオチドが、検出可能な標識で標識されている、請求項56記載の方法。
【請求項６１】
1つまたは複数のポリヌクレオチドの少なくとも1つが、1つまたは複数の遺伝子のうちの1つの3'非翻訳領域にハイブリダイズされる、請求項57記載の方法。
【請求項６２】
1つまたは複数のポリヌクレオチドの少なくとも1つが、1つまたは複数の遺伝子のうちの1つの3'非翻訳領域にハイブリダイズされる、請求項58記載の方法。
【請求項６３】
1つまたは複数ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項57記載の方法。
【請求項６４】
1つまたは複数ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６５】
1つまたは複数のポリヌクレオチドが、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項57記載の方法。
【請求項６６】
1つまたは複数のポリヌクレオチドが、DNAおよびRNAからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６７】
検出する段階の前に、第1および第2の植物または植物細胞の1つもしくは複数の遺伝子を増幅する段階をさらに含む、請求項45、49、または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項６８】
検出する段階の前に、第1および第2の植物または植物細胞の1つもしくは複数の遺伝子を検出可能な標識で標識する段階をさらに含む、請求項45、49、または50のいずれか1項記載の方法。
【請求項６９】
2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子の発現を検出するための組み合わせであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズすることができる組み合わせ。
【請求項７０】
2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子の発現を検出するための組み合わせであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列によってコードされる遺伝子産物にハイブリダイズすることができる組み合わせ。
【請求項７１】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列の異なる1つにハイブリダイズする、請求項69記載の組み合わせ。
【請求項７２】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列の異なる1つによってコードされるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項70記載の組み合わせ。
【請求項７３】
2つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列の3'非翻訳領域にハイブリダイズする、請求項69記載の組み合わせ。
【請求項７４】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列の3'非翻訳領域に対して相補的である核酸配列にハイブリダイズする、請求項70記載の組み合わせ。
【請求項７５】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、約100ヌクレオチド未満の塩基を含む、請求項69または70のいずれか1項記載の組み合わせ。
【請求項７６】
2つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項69記載の組み合わせ。
【請求項７７】
2つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項70記載の組み合わせ。
【請求項７８】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子にハイブリダイズする、請求項69記載の組み合わせ。
【請求項７９】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子によってコードされる核酸配列にハイブリダイズする、請求項70記載の組み合わせ。
【請求項８０】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、タンパク質の異なる1つをコードする遺伝子にハイブリダイズする、請求項78記載の組み合わせ。
【請求項８１】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、タンパク質の異なる1つをコードする遺伝子によってコードされる核酸配列にハイブリダイズする、請求項79記載の組み合わせ。
【請求項８２】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、異なる遺伝子にハイブリダイズする、請求項78記載の組み合わせ。
【請求項８３】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、異なる遺伝子によってコードされる核酸配列にハイブリダイズする、請求項79記載の組み合わせ。
【請求項８４】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのうちの約2〜約5000から構成される、請求項69または70のいずれか1項記載の組み合わせ。
【請求項８５】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、検出可能な標識で標識されている、請求項69または70いずれか1項記載の組み合わせ。
【請求項８６】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、固体支持体上の独特の位置を占有する、該固体支持体上に提供された請求項69〜85のいずれか1項記載の組み合わせを含むマイクロアレイ。
【請求項８７】
それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる2つ以上のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階；および、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする関心対象の1つまたは複数の遺伝子を検出する段階、を含む、試料中の1つまたは複数の遺伝子を検出するための方法。
【請求項８８】
それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子によってコードされる核酸配列に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる2つ以上のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階；および、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする1つまたは複数の核酸配列を検出する段階、を含む、試料中の1つまたは複数の遺伝子によってコードされる1つまたは複数の核酸配列を検出するための方法。
【請求項８９】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列の異なる1つを含む遺伝子にハイブリダイズする、請求項87記載の方法。
【請求項９０】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列の異なる1つを含む遺伝子によってコードされる核酸配列にハイブリダイズする、請求項88記載の方法。
【請求項９１】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子の3'非翻訳の領域にハイブリダイズする、請求項87記載の方法。
【請求項９２】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子の3'非翻訳の領域に対する相補的である核酸配列にハイブリダイズする、請求項88記載の方法。
【請求項９３】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、約100ヌクレオチド未満の塩基を含む、請求項87または88のいずれか1項記載の方法。
【請求項９４】
2つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項87記載の方法。
【請求項９５】
2つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項88記載の方法。
【請求項９６】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子にハイブリダイズする、請求項87記載の方法。
【請求項９７】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子によってコードされる核酸配列にハイブリダイズする、請求項88記載の方法。
【請求項９８】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、タンパク質の異なる1つをコードする遺伝子にハイブリダイズする、請求項96記載の方法。
【請求項９９】
2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、タンパク質の異なる1つをコードする遺伝子によってコードされる核酸配列にハイブリダイズする、請求項97記載の方法。
【請求項１００】
2つ以上のオリゴヌクレオチドが固体支持体上に提供され、2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、固体支持体上の独特の位置を占有する、請求項87または88のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０１】
固体支持体が、2つ以上のオリゴヌクレオチドのうちの約2〜約5000から構成される、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
接触段階の前に、試料中の1つもしくは複数の遺伝子または核酸配列を増幅する段階をさらに含む、請求項87または88のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０３】
接触段階の前に、検出可能な標識と試料中の1つもしくは複数の遺伝子または核酸配列を標識する段階をさらに含む、請求項87または88のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０４】
ヌクレオチド・ハイブリダイゼーション反応のための1つもしくは複数の緩衝液または試薬と共に、請求項86記載のマイクロアレイを含む、遺伝子発現を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、植物細胞周期遺伝子およびこのような遺伝子によってコードされるポリペプチド、ならびに植物細胞周期を調節するためのこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の使用の分野に関する。本発明は、特にユーカリ属（Eucalyptus）およびマツ属（Pinus）から単離された細胞周期ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、ならびにこれらに関連した配列を提供する。
【０００２】
関連出願の説明
本出願は、2003年12月30日に出願された米国仮出願第60/533,036号に対する優先権を主張し、その全体が具体的に本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細胞増殖および分裂は、種々の遺伝子のセットの時間的発現によって制御されており、分裂細胞を細胞周期の種々の相を介して進行させることができる。植物における連続した増殖および器官形成（organogesis）には、細胞周期機構の正確な機能が必要である。植物発育は、細胞分裂速度およびパターンに直接影響を受け、また温度、栄養素利用能、光、その他などの環境要因による影響を受ける。Gastal and Nelon, Plant Physiol. 105：191-7 （1994）, Ben-Haj-Sahal and Tardieu, Plant Physiol. 109：861-7 （1995）,および Sacks et al., Plant Physiol. 114：519-27 （1997） を参照されたい。植物発育および表現型は、細胞周期と関係があり、細胞周期に関与する遺伝子の発現を変更することは、植物発育を修飾し、および植物表現型を変更する有用な方法であり得る。
【０００４】
細胞周期が、増殖速度、環境キューに対する反応、および生じる植物表現型を含む植物発育を駆動するので、細胞周期遺伝子の発現を変更する能力は、極めて強力である。植物細胞周期および細胞周期遺伝子発現の変化と関連する表現型の制御は、維管束形成層において、とりわけ木材の特性、特に、挽材および木材パルプの特性を変化させるために特に適用がある。たとえば、細胞周期遺伝子発現を変更することによって行うことができる木材パルプに対しての改善は、増大または減少されたリグニンおよびセルロース含量、ならびに変更された細胞の長さ、直径、および内腔直径を含む。また、植物細胞周期、特に形成層細胞周期（すなわち、細胞分裂の速度および角度）を操作することにより、増大された寸法安定性、増大された抗張力、増大された抗剪強度、増大された圧縮強度、増大された耐衝撃性、増大された剛性、増大または減少された硬度、減少された螺旋性、減少された収縮、ならびに重量、密度、および比重に関する望ましい特徴を有するより良好な挽材を設計することができる。
【０００５】
A.細胞周期遺伝子およびタンパク質
1. サイクリン依存性プロテインキナーゼ。
細胞周期を介した進行は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）によって、主に調節される。CDKは、真核生物のセリン／スレオニンプロテインキナーゼの保存されたファミリーであり、活性のためにサイクリンサブユニットとのヘテロ二量体形成が必要である。総説については、たとえばJoubes et al., Plant Mol. Biol. 43：607-20 （2000）, Stals and Inze, Trends Plant Sci. 6：359-64 （2001）, および John et al., Protoplasma 216：119-42 （2001）を参照されたい。
【０００６】
CDKの5つのサブクラスがあり、それぞれが、異なるサイクリン結合コンセンサス配列を有する。CDK A型では、サイクリン結合コンセンサス配列は、PSTAIRE.Idである。CDK B-1、B-2、およびC型のサイクリン結合コンセンサス配列は、それぞれPPTTLRE、PPTALRE、およびPITAIREである。Joubes et al, Plant Physiol, 126：1403-15 （2001）。
【０００７】
細胞周期の進行は、部分には、CDK活性の変化によって指揮される。CDK活性は、生合成およびタンパク質分解の速度を変更することによる、個々のサイクリンの存在量の変化など、多くの異なる細胞周期タンパク質成分によって調整される。サイクリン濃度の変動により、CDK活性に相応した変動が生じる。DNA複製は、CDK活性の増加によって開始されるので、サイクリン蓄積は、特に細胞周期のG1期を終了するのに重要である。
【０００８】
また、CDKの活性化には、CDK活性化キナーゼ（CAK）によるCDKのT-ループのスレオニン残基のリン酸化が必要である。Umeda et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 97：13396-400 （2000）。サイクリンHは、CAKの調節サブユニットであることが、Yamaguchi et al., Plant J. 24： 11-20（2000）によって示唆された。CDK活性は、CDK調節サブユニットである細胞周期制御に関与する小さな（70〜100AA）タンパク質との相互作用によってさらに調節される。
【０００９】
分化、老化、またはアポトーシスにコミットするためには、細胞が細胞周期を出なければならない。この過程は、CDK活性のダウンレギュレーションを含む。CDK阻害剤（CKI）は、細胞周期の制御および発育のために重要な低分子タンパク質である。CKIは、化学量論的にCDKと結合し、CDKの活性をダウンレギュレートする。
【００１０】
シロイヌナズナから同定された最初の植物CKIであるICK1の多くの生化学的性質は、公知である。Wang et al., Nature 386：451-2 （1997）、Wang et al., Plant J. 24： 613-23 （2000）。ICK1は、多くの組織型では低レベルに発現されており、細胞が細胞周期に入ることができる前に、ICK1の閾値レベルを越えていなければならない。Wang et al., Plant J. 24： 613-23 （2000）。ICK1は、植物生長調整剤アブシシン酸（ABA）によって誘導され、DNA複製をブロックすることによって細胞分裂を阻害する。ICK1の発現が増大するときに、対応するCdc2様H1ヒストン活性の減少がある。ICK1は、インビトロでサイクリンC2c2aおよびCycD3と結合することが示されており、欠失実験により、これらの2つが相互作用するための異なるドメイン領域が同定された。
【００１１】
CDK調節タンパク質またはこれらのサブユニットの発現を変更すると、植物表現型の変化を生じることが公知である。シロイヌナズナCDK調節サブユニットであるCKS1Atの過剰発現により、葉サイズ、根増殖速度、および成長点サイズの減少を生じた。さらに、CKS1 Atの過剰発現により、細胞周期の進行の阻害を生じ、細胞周期のG1およびG2期の期間を延長した。
【００１２】
2. サイクリン
サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）酵素のポジティブ調節サブユニットであり、CDK活性のために必要とされる。Fowler et al., Mol. Biotech. 10, 123, 126。サイクリンとCDKとの複合体は、細胞周期を介した移行の時間的制御をもたらす。サイクリンは、特異的CDK活性の空間的な制御をもたらし、細胞骨、紡錐体、隔膜形成体、核膜、および染色体格を差動的にターゲットすることを示唆する証拠がある。
【００１３】
植物サイクリンは、5つの主要な群：A、B、C、D、およびHに分類されている。Renaudin et al., Plant Mol. Biol. 32：1003-18（1996）およびYamaguchi et al., （前記2000）。サイクリンは、有糸分裂サイクリン（AおよびB）およびG1サイクリンに分けることができる。
【００１４】
有糸分裂サイクリンは、リジンリッチ領域に隣接して、破壊ボックス（destruction box）と呼ばれるN末端領域に位置するコンセンサス配列（R-x-x-L-x-x-I-x-N）を有する。破壊ボックスおよびリジンリッチ領域は、有糸分裂の間に、有糸分裂サイクリンをユビキチン依存性タンパク質分解の標的にする。Stals、前記361にて、およびFowler、前記126にて。Aサイクリンに対してBサイクリンにおける破壊ボックスは、わずかに異なり、この相違がAサイクリンに対してBサイクリンの分解にわずかに異なるタイミングを生じることが考えられる。Fowler、前記126にて。A型サイクリンは、細胞周期のS期、G2期、および初期M期の間に蓄積するが、一方B型サイクリンは、後期G2期および初期M期の間に蓄積する。Mironov et al., Plant Cell 11： 509-22 （1999）。植物ではA型サイクリンの3つの亜群が公知であるが、動物では1つだけが公知である。サイクリンA1（cycA1；zm；1トウモロコシ（Zea cans）由来）は、細胞質分裂の間に、微小管を含む隔膜形成体にて最も濃縮されている。サイクリンA2の発現は、根のオーキシンによって、および茎頂のサイトカイニンによってアップレギュレートされる。Abrahams et al., Biochim. Biophys. Acta 28：1-2 （2001）。
【００１５】
5つの亜群が公知であるD型サイクリンは、成長因子および栄養素に応答してG1期を介した進行を制御すると考えられている。Riou-Khamlichi et al., Mol. Cell Biol, 20： 4513-21 （2000）。たとえば、D型サイクリンの発現は、ショ糖曝露の30分後のcycD2 mRNAの増加、およびショ糖曝露の4時間後のcycD3の増加によって示されるように、ショ糖によってアップレギュレートされる。このタイミングは、それぞれ初期G1期および後期G1期に対応する。Cockcroft et al., Nature 405： 575-9（2000）。さらに、シロイヌナズナでは、D3サイクリンがブラシノステロイドであるエピ-ブラシノライドによってアップレギュレートされることが示された。
【００１６】
サイクリンD2タンパク質は、CDKAと結合して活性な複合体を生じ、これが網膜芽細胞腫関連タンパク質（Rb）を結合してリン酸化する。この過程は、活発に増殖している組織で見いだされ、これが後期G1および初期S期の間に重要な機能を担うことを示唆する。3つの異なるD3型サイクリンが、トマト果実発育の間に活性である。これらのタンパク質は、全て網膜芽細胞腫結合モチーフおよびPEST破壊モチーフを含む。これらのD3サイクリンの空間的および時間的発現には相違があり、果実発育の間に異なる役割が推測される。
【００１７】
サイクリンDの過剰発現は、全体の増殖速度を増大することが示された。タバコにおけるサイクリンD2の過剰発現は、G1期を短くする原因を増大し、より速い速度の細胞サイクリングを生じる。
【００１８】
CおよびH型サイクリンは、ポプラ（ポプラス・トレムラ×トレムロイデス（Populus tremula x tremuloides）およびコメ（イネ（Oryza sativa））において特徴づけられたが、これらの正確な機能は、いまだ不明である。ペプチド配列保存の程度がより少ない推定上のサイクリンも同定された。たとえば、シロイヌナズナCycJ18は、サイクリンボックスドメインを通して相同体と20%の同一性だけを有する。CycJ18は、主に稚苗において発現される。シロイヌナズナF3O9.13タンパク質も、サイクリン・ファミリーに対して類似性を有する。
【００１９】
3.ヒストンアセチルトランスフェラーゼ／デアセチルトランスフェラーゼ
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HA）およびヒストンデアセチルトランスフェラーゼ（HAD）は、ヒストンのアセチル化の正味レベルを制御する。ヒストンアセチル化および脱アセチル化は、DNA結合転写活性化因子、その他のクロマチン修飾酵素、またはヌクレオソームを置換することができる多サブユニット再造形クロマチンに対するヌクレオソームDNAのアクセスしやすさを変化させて遺伝子発現に対してこれらの調整効果を及ぼすと考えられる。Lusser et al., Nucleic Acids Res. 27：4427-35 （1999）。従って、一般に、HDAは、遺伝子発現の抑制に関与し、一方HAは、遺伝子活性化に関連がある。
【００２０】
HAは、コアヒストンのアミノ末端近くでクラスター形成している保存されたリジン残基のεアミノ基のアセチル化に効果を及ぼし、遺伝子発現をアップレギュレートする。
【００２１】
HDAは、ヌクレオソームのコアヒストンからアセチル基を除去する。HDA基には多数のファミリー・メンバーがあるが、これらの多くは、進化を通じて保存される。Lechner et al., Biochim Biophys Acta 5：181-8 （1996）。HDAは、クロマチン凝集を容易にする多タンパク質複合体の一部として機能する。
【００２２】
HDAおよびHAは、ヌクレオソームの非常に異なったアセチル化パターンを認識する。種々のタイプのHDAが、ゲノムの特定の領域で相互作用して、遺伝子サイレンシングに影響を及ぼすと考えられる。
【００２３】
Schultz et al., Genes Dev. 15：428-43 （2001）は、クルッペル結合ボックスZnフィンガータンパク質（Kruppel-associated-box zinc finger proteins：KRAB-ZFP）のスーパーファミリーが、ヌクレオソーム再造形、および転写抑制のために必要とされる協同ユニットを形成するための、PHD（植物ホメオドメイン）およびコリプレッサKAP-1のブロモドメインを経たヒストン脱アセチル化複合体に関連があることを証明した。トウモロコシHDAC（HD2）は、その他の真核生物HDACに対して配列相同性を有さず、その代わりにペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ（PPIases）に対する配列類似性を含むことが同定された。
【００２４】
ヒストン脱アセチルによる妨害効果は、たとえば、Tian and Chen, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 98： 200-5 （2001）において論議されている。
【００２５】
4. ペプチジルプロリルシス-トランスイソメラーゼ
ペプチジルプロリルイソメラーゼ（たとえば、ペプチジルプロリルシス-トランスイソメラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、PPIase、ロタマーゼ（rotamase）、シクロフィリン）は、プロリン残基におけるシスおよびトランス高次構造間のペプチド結合の相互変換を触媒する。Sheldon and Venis, Biochem J. 315： 965-70 （1996）。この相互変換は、タンパク質折り畳みの律速段階であると考えられる。PPIaseは、動物、真菌、細菌、および植物に存在するタンパク質の保存されたファミリーに属する。PPIaseは、環境ストレスに対する応答、カルシウムシグナル、転写抑制、細胞周期制御、その他を含む多数の反応に関係する。Viaud, et al., Plant Cell 14： 917-30 （2002）。
【００２６】
5.網膜芽細胞腫関連タンパク質
網膜芽細胞種（Rb）関連タンパク質は、G1期を介した、およびS期への細胞周期の進行を調節すると推定される。Xie et al., EMBO J. 15： 4900-8 （1996） および Ach et al., Mol. Cell Biol. 17： 5077-86 （1997）。
【００２７】
Rbは、哺乳類系において特徴づけられているが、G1期進行およびS期移行の制御におけるRb関連タンパク質の役割は、植物では十分に特徴づけられていない。しかし、RB関連タンパク質は、サイクリン、WD40タンパク質などの細胞周期制御に関与する種々のその他の細胞のタンパク質とのその会合を介して機能することが公知である。Soni et al., Plant. Cell. 7：85-103 （1995）;Grafi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93：8962 （1996）；Ach et al., Plant Cell 9：1595-606 （1997）；Umen and Goodenough, Genes Dev. 15：1652-61 （2001）；Mariconti et al., J. Biol. Chem. 277：9911-9 （2002）。
【００２８】
6. WD40リピートタンパク質
WD40は、多くの種々のタンパク質-タンパク相互作用に関与する共通の繰り返しモチーフである。WD40ドメインは、シグナル伝達、プレmRNAプロセシング、および細胞骨格構築においてアダプター／調節モジュールを含む多種多様な機能を有するタンパク質において見いだされる。Goh et al., Eur. J. Biochem. 267： 434-49 （2000）。
【００２９】
WD40ドメインは、40残基の長さであり、典型的にはN末端由来のGHジペプチド11〜24残基およびC末端にWDジペプチドを含む。Id。GHジペプチドとWDジペプチドとの間には、タンパク質が安定に、または可逆的に結合することができる安定なプラットフォームとして役立つ保存されたコアが位置する。コアは、いくつかの翼をもったプロペラ様の構造を形成する。それぞれの翼は、四本鎖逆平行βシートで構成される。それぞれのWD40配列リピートは、1つの翼の最初の3つの鎖を形成し、最後の鎖は次の翼にある。最後のC末端WD40リピートは、最初のWD40リピートの翼構造を完成させ、閉じた環上プロペラ構造を生じる。プロペラの上面および底面の残基は、その他のタンパク質および／または小さなリガンドとの相互作用を調整することが提唱される。
【００３０】
酵母における研究では、WD40モチーフを含むCdc20が、有糸分裂サイクリンのタンパク質分解のために必要とされることを証明した。この過程は、後期促進複合体（anaphase-promoting complex：APC）またはサイクロソーム（cyclosome）と呼ばれるユビキチン-タンパク質リガーゼによって媒介される。26Sのプロテアソームによるユビキチン結合およびタンパク質分解に続いて、細胞は、染色体を分離して、有糸分裂から出ることができる。また、Cdc20は、破壊ボックスドメインを含む。
【００３１】
7. WEE1様タンパク質
WEE1は、サイクリン依存性キナーゼの活性を制御する。WEE1自体は、セリン／スレオニンキナーゼである。Sorrell et al., Planta 215：518-22 （2002）。これらのプロテインキナーゼの酵素活性は、時にC末端の自己調節末端における可逆性の高次構造上の変化と組み合わせて、触媒ドメインの活性化セグメントにおける特定の残基のリン酸化によって制御される。この過程は、真核生物において、真菌から動物および植物まで保存されている。同様に、種々の生物体由来のWEE1タンパク質間にも高度な相同性がある。たとえば、ヒトとトウモロコシWEE1タンパク質のプロテインキナーゼ・ドメインとの間に50%の同一性がある。
【００３２】
WEE1の発現は、活発に分化している組織においてのみ生じることが示されており、有糸分裂のネガティブ制御因子として作用することによって細胞分裂を阻害すると考えられる。WEE1は、有糸分裂の発生前に細胞質で活性化されたサイクリンB1と複合体を形成したCDC2から核を保護することによって、G2からMへの移行を防げると考えられる。たとえば、分裂酵母におけるAtWEE1（シロイヌナズナ由来）およびZmWEE1（トウモロコシ由来）の過剰発現は、細胞分裂を阻害して細長い細胞を生じる。Sun et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U S A 96： 4180-5 （1999）。
【００３３】
B.植物発育における発現プロファイリングおよびマイクロアレイ解析。
植物表現型の多重遺伝子制御により、表現型決定を担う遺伝子を決定する際に問題点がある。植物の表現型に寄与する遺伝子および遺伝子発現の相違を同定するための1つの主な障害は、一握りの遺伝子よりも多くの発現を並行して研究することが困難なことである。遺伝子の発現および植物の表現型に寄与する遺伝子の相互関係を同定し、ならびに理解する際のもう一つの問題点は、植物が示す環境要因に対する高度な感受性である。
【００３４】
ゲノム全体の発現プロファイリングを使用して、最近の進歩がもたらされた。特に、DNAマイクロアレイの使用は、単一の実験で多数の遺伝子の発現を検査するために有用であった。発育上および環境上の刺激に対する植物遺伝子応答のいくつかの研究は、発現プロファイリングを使用して行われた。たとえば、イチゴの果実成熟の間の遺伝子発現、Aharoni et al., Plant Physiol. 129：1019-1031 （2002）、シロイヌナズナ（Arabodopsis）における損傷反応、Cheong et al., Plant Physiol. 129：661-7 （2002）、シロイヌナズナ（Arabodopsis）における病原体反応、Schenk et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 97：11655-60 （2000）、およびダイズにおけるオーキシン反応、Thibaud-Nissen et al., Plant Physiol. 132：118を研究するために、マイクロアレイ解析が使用された。Whetten et al., Plant Mol. Biol. 47：275-91（2001）は、cDNAプローブを使用するパイヌス・テエダL.（Pinus taeda L.）における細胞壁生合成遺伝子の発現プロファイリングを開示する。Whetten et al.は、分化していると成熟した次生木部との間で差動的に発現される遺伝子を検査した。さらに、遺伝子発現に対する一定の環境刺激の効果を決定するために、圧縮材における遺伝子発現を正常な木材と比較した。検査した2300個のうちの156個のエレメントが、差動的発現を示した。前記Whetten, 285。成熟木材に対する未成熟木材の比較では、188個のエレメントが差動的に発現されることを示した。Id. at 286。
【００３５】
発現プロファイリング、特に、DNAマイクロアレイは、ゲノム全体の発現解析のための便利なツールを提供するが、これらの使用は、完全なゲノム配列または大規模なcDNAコレクションが利用できる生物体に限定されていた。Hertzberg et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 98：14732-7（2001a）、Hertzberg et al., Plant J., 25：585（2001b）を参照されたい。たとえば、Whetten前記は、「この興味深い問題のより完全な解析は、マツおよびポプラESTのより大規模なセットの完成を待ちたい」旨を述べている。Whetten et al. 286。さらに、cDNAまたはESTプローブを含むマイクロアレイは、遺伝子間の配列類似性のために同じファミリーの遺伝子を区別することができない可能性がある。すなわち、cDNAまたはESTは、マイクロアレイ・プローブとして使用するときに、同じファミリーの複数の遺伝子に結合するかもしれない。
【００３６】
より望ましい表現型を有する植物を産するために遺伝子発現を操作する方法は、様々なタイプの植物組織において、植物発育の異なる段階での、および異なる環境キューによる刺激による細胞周期遺伝子発現のより優れた理解によって容易にされるであろう。植物の構築および農業経済学的に重要な特徴を制御する能力は、細胞周期遺伝子発現がどのように植物組織の形成に効果を有し、どのように植物成長と細胞周期が結びつけられるかのより優れた理解によって改善されると考えられる。発現が植物の発育の間に変化し得る多数の遺伝子の中で、ごく一部分だけが、植物発育の任意の所与の段階の間に表現型変化に作用する可能性が高い。
【発明の概要】
【００３７】
従って、植物細胞周期の間の発現における変化を決定する際に有用なツールおよび方法の需要がある。また、このような方法に有用なポリヌクレオチドの需要がある。細胞周期遺伝子発現の変化を表現型または植物発育の段階に対して相関することができる方法のさらなる需要がある。植物表現型に影響し、かつ所望の表現型を得るために操作することができる細胞周期遺伝子および遺伝子産物を同定する方法のさらなる需要がある。
【００３８】
一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体のいずれか1つの配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むDNA構築物を提供する。
【００４０】
本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含むDNA構築物で形質転換された植物細胞である。
【００４１】
本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含むDNA構築物で形質転換された植物細胞を含む、トランスジェニック植物である。
【００４２】
本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:261〜497のいずれか1つから選択されるポリペプチドの触媒ドメインまたは基質結合ドメインをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO:261〜497のいずれか1つから選択される該ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４３】
本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:1〜237のいずれかの配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むDNA構築物で植物細胞を形質転換する段階、および植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物細胞を培養する段階を含む、形質転換された植物を作製する方法である。
【００４４】
もう一つの局面において、本発明は、トランスジェニック樹木から得られる木材を提供する。
【００４５】
さらなる局面において、本発明は、本発明のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック樹木から得られる木材パルプを提供する。
【００４６】
本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むDNA構築物で植物を形質転換する段階；植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物を培養する段階；および、植物から木材を得る段階を含む、木材を作製する方法である。
【００４７】
本発明は、さらに、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むDNA構築物で植物を形質転換する段階；植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物を培養する段階；および植物から木材パルプを得る段階を含む、木材パルプを作製する方法を提供する。
【００４８】
もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００４９】
また、本発明は、261〜497からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００５０】
本発明は、SEQ ID NO:1〜237のいずれか1つによってコードされるポリペプチドの植物における発現を変更することを含む、植物の植物表現型を変更する方法をさらに提供する。
【００５１】
もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:471〜697からなる群より選択される核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００５２】
本発明の局面は、第1の試料においてSEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第2の試料において1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の試料における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の試料における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1と第2の試料との間の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルの相違を相関させる段階を含む、2つの異なる試料中の遺伝子発現を相関させる方法である。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、表現型を有する第1の植物において、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；表現型を欠いている第2の植物において、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の植物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の植物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、表現型を有する第1と第2の植物との間の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルの相違を相関させる段階を含む、1つまたは複数の遺伝子の植物における遺伝子発現レベルに対して植物表現型の所有を相関させる方法である。
【００５４】
さらなる局面において、本発明は、細胞周期の第1の段階の第1の植物細胞において、SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；細胞周期の第2の異なる段階の第2の植物細胞において、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の植物細胞における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の植物細胞における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1および第2の細胞周期の段階に対して、第1と第2の試料間の1つまたは複数遺伝子の発現レベルにおける相違を相関させる段階を含む、遺伝子発現を細胞周期の段階に相関させる方法を提供する。
【００５５】
本発明の局面は、2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子の発現を検出するための組み合わせであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズすることができる組み合わせである。
【００５６】
本発明のもう一つの局面は、2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子の発現を検出するための組み合わせであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列によってコードされる核酸配列にハイブリダイズすることができる組み合わせである。
【００５７】
本発明は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズすることができるか、またはそれぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列によってコードされる核酸配列にハイブリダイズすることができる2つ以上オリゴヌクレオチドを含み、2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、固体支持体上の独特の位置を占有する、1つまたは複数遺伝子の発現を検出するための組み合わせを含むマイクロアレイをさらに提供する。
【００５８】
もう一つの局面において、本発明は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる2つ以上のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階；および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする関心対象の1つまたは複数の遺伝子を検出する段階を含む、試料中の1つまたは複数の遺伝子を検出するための方法を提供する。
【００５９】
また、本発明は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜237からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子によってコードされる核酸配列に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる2つ以上のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階；および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする1つまたは複数の核酸配列を検出する段階を含む、試料中の1つまたは複数の遺伝子によってコードされる1つまたは複数の核酸配列を検出するための方法を提供する。
【００６０】
本発明は、ヌクレオチド・ハイブリダイゼーション反応のための1つもしくは複数の緩衝液または試薬と共に、本発明のマイクロアレイを含む、遺伝子発現を検出するためのキットを提供する。
【００６１】
本発明のその他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。しかし、詳細な説明は、一方で、本発明の好ましい態様を示し、例示目的のみで、限定されるわけではない目的で示されることが理解されるはずである。本発明の精神および範囲内の種々の変更ならびに修飾は、詳細な説明から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】例示的マイクロアレイ・サンプリング・パラメータ。
【図２】pWVK202のためのプラスミド地図。
【図３】pGrowth14のためのプラスミド地図。
【図４】pGrowth15のためのプラスミド地図。
【図５】pGrowth16のためのプラスミド地図。
【図６】pGrowth18のためのプラスミド地図。
【図７】pGrowth19のためのプラスミド地図。
【図８】pGrowth20のためのプラスミド地図。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
詳細な説明
本発明者らは、表現型に寄与する多重遺伝子の因子を同定するために、および植物表現型に影響を及ぼすように遺伝子発現を操作するために有用な新規の単離された細胞周期遺伝子ならびにポリヌクレオチドを発見した。これらの遺伝子は、商業的に重要な林業属のマツおよびユーカリに由来し、かつ植物細胞周期に関与し、少なくとも部分的に、剛性、強度、密度、繊維寸法、粗さ、セルロースおよびリグニン含量、および抽出物含量などの商業木材に重要な表現型の特徴を表す役割を担う。一般的に言って、遺伝子およびポリヌクレオチドは、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、もしくはWD40リピートタンパク質、またはこれらの触媒ドメイン、または同じ機能を有するポリペプチドであることができるタンパク質をコードし、本発明は、このようなタンパク質およびポリペプチドをさらに含む。
【００６４】
操作のためにターゲットするための細胞周期遺伝子配列を選択するための本発明の方法により、より優れたデザインおよびより高度に操作された表現型をもつトランスジェニック植物の制御が可能となるであろう。商業的に重要な林業種において、植物構築および農業経済学に重要な特徴を制御する能力は、どの遺伝子がどの表現型に影響を及ぼし、どの遺伝子が細胞周期のどの段階への移行に影響を及ぼし、どの遺伝子が植物発育のどの段階において活性であり、およびどの遺伝子が細胞周期または植物発育の所与の時点においてどの組織に発現されているかなどの本方法から得られる情報によって改善されるであろう。
【００６５】
別に示されない限り、全ての技術的および科学用語は、共通の技術的な使用にかなう様式で本明細書に使用される。一般に、細胞培養、分子遺伝学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションを含む本明細書の命名法および記載されている検査法は、それぞれ周知であり、当該技術分野において共通に使用される。組換え核酸法、オリゴヌクレオチド合成、細胞培養、組織培養、形質転換、トランスフェクション、形質導入、分析化学、有機合成化学、化学合成、化学分析、ならびに薬学的製剤およびデリバリーのためには、標準的技術が使用される。一般に、酵素反応ならびに精製および／または単離段階は、製造者の説明書に従って行われる。反対に指示がないときは、問題の技術および手順は、たとえば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 2d ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1989）に開示された従来の方法論に従って行われる。本発明に関連する特定の科学的方法は、以下にさらに詳細に論議してある。しかし、この考察は、例のみとして提供され、本発明の方法が行うことができる様式を限定しない。
【００６６】
A.植物細胞周期遺伝子およびタンパク質
1. 細胞周期遺伝子、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド配列
本発明の一つの局面は、新規植物細胞周期遺伝子およびこのような遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本明細書に使用される、「植物細胞周期遺伝子」という用語は、植物細胞周期の間に機能するタンパク質をコードする遺伝子をいい、「植物細胞周期タンパク質」という用語は、植物細胞周期の間に機能するタンパク質をいう。サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質を含む植物細胞周期タンパク質において、いくつかの公知のファミリーがある。それぞれの遺伝子およびタンパク質ファミリーの間には、有意な配列相同性があるが、それぞれのファミリーのそれぞれのメンバーは、異なる生化学的性質を示すことができ、これらの遺伝子の少なくとも1つの発現を変更することにより、異なる植物表現型を生じさせることができる。
【００６７】
本発明は、新規植物細胞周期遺伝子およびポリヌクレオチドならびに新規細胞周期タンパク質およびポリペプチドを提供する。本発明の一つの態様によれば、新規の植物細胞周期遺伝子は、マツ属またはユーカリ属の種の野生型植物に発現されるものと同じである。本発明の例示的な新規植物細胞周期遺伝子配列は、表9および10に記載してあり、それぞれユーカリプタス・グランディス（Eucalyptus grandis）配列およびラジアータマツ（Pinus radiata）配列を示す。また、対応する遺伝子産物、すなわちオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドは、表14、15、および16の一覧表に記載してある。APPENDIX1の配列表は、本発明のこれらの局面の配列を提供する。
【００６８】
本発明の配列は、細胞周期活性を有し、上で論議した細胞周期ファミリーのタンパク質などの細胞周期において活性であるタンパク質をコードする。以下でさらに詳細に論議したとおり、細胞周期遺伝子およびポリヌクレオチドの発現の操作、またはコードされたタンパク質およびポリペプチドの活性の操作により、同種の野生型植物の表現型と異なる所望の表現型をもつトランスジェニック植物を生じることができる。
【００６９】
本明細書の全体を通じて、細胞周期遺伝子産物についての言及がなされる。本明細書に使用される「細胞周期遺伝子産物」は、細胞周期遺伝子によってコードされる産物であり、RNAなどのヌクレオチド産物、ならびにタンパク質およびポリペプチドなどのアミノ酸産物の両方を含む。本発明の特異的な細胞周期遺伝子の例は、SEQ ID NO:1〜237を含む。本発明の特定の細胞周期遺伝子産物の例は、SEQ ID NO:1〜237のいずれか一つによってコードされる産物を含む。また、本明細書において、細胞周期タンパク質および細胞周期ポリペプチドについての言及がなされる。本発明の特定の細胞周期タンパク質およびポリペプチドの例は、SEQ ID NO:1〜237のいずれかによってコードされるポリペプチドまたはSEQ ID NO:261〜497のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の一つの局面は、これらの細胞周期遺伝子および細胞周期遺伝子産物のサブセット、すなわち、SEQ ID NO:1〜12、14〜58、60〜62、64〜70、72〜75、77〜83、85〜86、88〜91、93〜119、121〜130、132〜148、150〜156、158〜191、193〜207、209〜218、220〜221、223〜231、233〜237、これらのそれぞれの保存的変異体（その用語は下記に定義されたとおり）、ならびにこれらによりコードされるヌクレオチドおよびアミノ酸産物に向けられる。本発明のもう一つの局面は、細胞周期遺伝子および細胞周期遺伝子産物のサブセット、すなわち、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜76、78〜103、106、108〜113、116〜121、124〜125、128〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、208〜213、および215〜234、これらのそれぞれの保存的変異体、ならびにこれらによりコードされるヌクレオチドおよびアミノ酸産物に向けられる。本発明のさらなる局面は、細胞周期遺伝子および細胞周期遺伝子産物のサブセット、すなわち、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜58、60〜62、64〜70、72〜75、78〜83、85〜86、88〜91、93〜103、106、108〜113、116〜119、121、124〜125、128〜130、132〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、209〜213、215〜218、220〜221、223〜231、および233〜234、これらのそれぞれの保存的変異体、ならびにこれらによりコードされるヌクレオチドおよびアミノ酸産物に向けられる。
【００７０】
また、本発明は、明細書に開示されたヌクレオチド配列に対して相補的である配列、逆配列、または逆相補的なものを含む。
【００７１】
また、本発明は、本明細書に開示された配列の保存的変異体を含む。本明細書に使用される「変異体」という用語は、変異体であるものの参照配列から1つもしくは複数のヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列をいう。
【００７２】
従って、一つの局面では、本発明は、保存的変異体ポリヌクレオチドを含む。本明細書に使用される「保存的変異体ポリヌクレオチド」という用語は、ストリンジェントな条件下で、相当する条件下で保存的変異体がその変異体である参照遺伝子に対して結合するオリゴヌクレオチドプローブに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。従って、たとえば、SEQ ID NO:1の保存的変異体は、ストリンジェント条件下で、相当する条件下でSEQ ID NO:1に対して結合するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。本発明の一つの局面は、これらのそれぞれの参照配列に対して少なくとも約75%の配列同一性を示す保存的変異体ポリヌクレオチドを提供する。
【００７３】
「配列同一性」は、当技術分野において認識される意味を有し、公開された技術を使用して算出することができる。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed.（Oxford University Press, 1988）、BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, ed.（Academic Press, 1993）、COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin & Griffin, eds., （Humana Press, 1994）、SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed., Academic Press （1987）、SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov & Devereux, eds. （Macmillan Stockton Press, 1991）、およびCarillo & Lipton, SIAM J. Applied Math. 48： 1073 （1988）を参照されたい。2つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般に使用される方法は、GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Bishop, ed., （Academic Press, 1994）、およびCarillo & Lipton, 前記に開示されたものを含むが、これらに限定されるわけではない。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラムにおいて体系化される。2つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、GCGプログラム・パッケージを含むが、これに限定されるわけではない（Devereux et al., Nucleic Acids Research 12： 387 （1984））、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul et al., J. Mol. Biol. 215：403 （1990））、およびFASTDB（Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6： 237 （1990））。
【００７４】
本発明は、SEQ ID NO:1〜237のいずれか1つに対して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、または60%以上の配列同一性を有する保存的変異体ポリヌクレオチドを含む。このような変異体において、変異体と参照配列との間の相違は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置に、または個々の参照配列内の、または参照配列内の1つもしくは複数の隣接する群のヌクレオチド内のいずれかに散在されてこれらの末端位置間のどこでも生じることができる。
【００７５】
本発明によって想定され、および含まれるさらなる保存的変異体ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜237のポリヌクレオチド配列、または合計総配列長の10%未満の欠失および／または挿入の結果としてのこれらの相補物、逆相補物、もしくは逆配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７６】
また、本発明は、SEQ ID NO:1〜237に対してこれらの一次構造（配列）に高度な類似性を共有することに加えて、以下の特徴の少なくとも1つを有する保存的変異体ポリヌクレオチドを含む：（i）これらは細胞周期において参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同じ機能的特性を実質的に有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームもしくは部分的なオープンリーディングフレームを含むか、または（ii）これらは、共通してヌクレオチド・ドメインもしくはコードされるタンパク質ドメインを有する。本発明は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の酵素もしくは生物活性または結合特性を有するタンパク質をコードするSEQ ID NO:1〜237の保存的変異体を含む。このような保存的変異体は、これらが参照ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の酵素的または結合活性を有するという点において、機能的変異体である。
【００７７】
本発明によれば、ポリヌクレオチド変異体は、たとえば、米国特許第6,500,639号、第6,500,617号、第6,436,675号、第6,379,964号、第6,352,859号、第6,335,198号、第6,326,204号、および第6,287,862号に記載されているものなどの「混合された遺伝子（shuffled gene）」を含むことができる。また、本発明のヌクレオチド配列の変異体は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,132,970号に開示されたように、修飾されたポリヌクレオチドであることができる。
【００７８】
一つの態様によれば、本発明は、以下のファミリーのうちの1つに由来する細胞周期タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する：サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、またはWD40リピートタンパク質。SEQ ID NO:1〜237は、このようなポリヌクレオチドの例を提供する。
【００７９】
もう一つの態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜237のいずれかによってコードされるポリペプチドの、またはSEQ ID NO:261〜497のいずれかを含むポリペプチドの触媒ドメインもしくはタンパク質結合ドメインをコードする。本発明の細胞周期タンパク質の触媒のおよびタンパク質結合ドメインは、当技術分野において公知である。これらのタンパク質の保存配列は、項目1〜195において、下線、太字、および／またはイタリック体テキストとして示してある。
【００８０】
また、本発明は、上で論議した配列とは異なるが、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるものと同じであるポリペプチドをコードする保存的変異体ポリヌクレオチドを含む。また、本発明は、保存的変異体として、コードされるポリペプチド配列のアミノ酸配列に影響を及ぼさないか、またはコードされるポリペプチド配列における保存的置換を生じる置換の結果として、上で論議したポリヌクレオチド配列とは異なる配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００８１】
また、本発明は、SEQ ID NO:1〜237のいずれかを含むポリヌクレオチド、または上で議論したこれらの保存的変異体によってコードされる単離されたポリペプチドを含む。また、本発明は、SEQ ID NO:261〜497および495-497を含むポリペプチドならびにこれらのポリペプチドの保存的変異体を含む。本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:261〜272、274〜318、320〜322、324〜330、332〜335、337〜343、345〜346、348〜351、353〜379、381〜390、392〜408、410〜416、418〜451、453〜467、469〜478、480〜481、483〜491、および493〜494、ならびにこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを含む。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:261〜272、274、276〜286、289、290〜297、300〜301、303〜345、347〜363、366、368〜373、376〜381、384〜385、388〜407、410〜412、414〜415、420〜422、424〜432、434、437〜443、445〜451、453〜457、460〜464、468〜473、および475〜494、ならびにこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを含む。本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:261〜272、274、276〜286、290〜297、300〜301、303〜318、320〜322、324〜330、332〜335、337〜343、345、348〜351、353〜363、366、368〜373、376〜381、384〜385、388〜390、392〜407、410〜412、414〜415、421〜422、424〜432、434、437〜443、445〜451、453〜457、460〜464、469〜473、475〜478、480〜481、483〜491、および493〜494、ならびにこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを含む。
【００８２】
本発明によれば、変異体ポリペプチドまたはタンパク質は、1つもしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換によって変更されたアミノ酸配列をいう。
【００８３】
本発明は、保存的変異体ポリペプチドを含む。本明細書に使用される「保存的変異体ポリペプチド」という用語は、その保存的変異体であるタンパク質と同様の構造的、化学的、または生物学的特性を有するポリペプチドをいう。どのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失することができるかを決定する際のガイダンスは、Vector NTI Suite（InforMax, MD）ソフトウェアなどの当技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。本発明の一つの態様において、保存的変異体ポリペプチドは、これらのそれぞれの参照配列に対して少なくとも約75%の配列同一性を示す。
【００８４】
保存的変異体タンパク質は、ポリペプチドの「アイソフォーム」または「類似体」を含む。ポリペプチド・アイソフォームおよび類似体は、同じ物理的および生理的特性、ならびに同じ生物学的機能を有するが、そのアミノ酸配列が1つもしくは複数のアミノ酸だけ異なるか、またはその配列が非天然のアミノ酸を含むタンパク質をいう。
【００８５】
合計して総配列長の10%未満のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失の結果としてSEQ ID NO:261〜497のポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、本発明によって想定され、かつ包含される。
【００８６】
本発明の一つの局面は、下記に記載されているものなどの1つまたは複数の適切なアッセイ法によって決定されるものとして、細胞周期において同じ機能を有する保存的変異体ポリペプチドを提供する。本発明は、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、およびWD40リピートタンパク質の生物活性を有するものなどの細胞周期タンパク質として機能し、したがって、植物における細胞周期を調整することができる変種ポリペプチドを含む。上で議論したように、本発明は、細胞周期タンパク質として機能するポリペプチドをコードする変異体ポリヌクレオチドを含む。
【００８７】
細胞周期タンパク質の活性および物性は、技術分野において公知の任意の方法を使用して検査することができる。以下のアッセイ法の例は、網羅的ではなく、細胞周期タンパク質変異体の活性を検査し、およびタンパク質特徴を区別する際にいくらかのガイダンスを提供することが含まれる。
【００８８】
CDK活性は、Yamaguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100：8019 （2003）に記載されているようにロスコビチン（roscovitine）を使用して評価することができる。CDKヒストンキナーゼ活性は、Joubes et al., Plant Physiol. 121：857（1999）に記載されているようにCDKによるヒストンH1リン酸化を検出するためのオートラジオグラフィーを使用してアッセイすることができる。
【００８９】
CKI活性は、Zhou et al., Planta. 6：604（2003）に記載されている方法のバリエーションを使用してアッセイすることができる。改変法は、インビボにおけるCKIとサイクリンとの相互作用を同定するために、同時形質転換または引き続く形質転換を使用することができる。たとえば、最初の形質転換において、マツ組織を米国特許出願公開第2002/0100083号に記載されている方法を使用して形質転換し、ジェネティシン選択を使用してcycD3およびcdc2a相同体を有するトランスジェニック植物を得ることができる。第二の形質転換は、米国仮出願第60/476,189号に記載されているように、選択可能マーカーとしてα-メチルトリプトファンを使用して行い、ICK1相同体を有する形質転換体を得ることができる。ジェネティシンおよびα-メチルトリプトファンの両方で増殖することができる組織は、ICK1相同体とcycD3およびcdc2a相同体とを含む。CKI活性は、cycD3およびcdc2a相同体を有する形質転換体の表現型を、ICK1相同体とcycD3およびcdc2a相同体とを有する形質転換体と比較することによって決定する。
【００９０】
ヒストンデアセチラーゼ活性は、Tian et al., Genetics 165：399 （2003）に記載されているようにシロイヌナズナ変異体の相補性によって評価することができる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性は、Balasubramanyam et al. J. Biol. Chem. 278：19134 （2003）に記載されているようにアナカルト酸（anacardic acid）を使用してアッセイすることができる。また、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、Bhat et al., Plant J. 33：455 （2003）に記載されているようにトリコスタチンA処置した植物系統を使用してアッセイすることができる。また、Bhat et al.,前記に記載されている植物系統を使用し、Rossi et al., Plant Mol. Biol. 51： 401 （2003）に記載されている共沈法を使用して、網膜芽細胞腫関連タンパク質をアッセイすることができる。
【００９１】
ペプチジル-プロリルイソメラーゼは、Edvardsson et al., FEBS Lett. 542：137 （2003）に記載されているようにアッセイすることができる。WD40タンパク質は、WD40モチーフの保有、ならびにこれらがcdc2と相互作用する能力に基づいて評価することができる。WEE-1は、当技術分野において公知の任意のキナーゼ活性アッセイ法を使用してアッセイすることができる。
【００９２】
2. 細胞周期遺伝子、ポリヌクレオチド、およびポリペプチド配列を使用する方法
本発明は、植物細胞周期遺伝子およびこれらの保存的変異体を使用する方法を提供する。本発明は、植物細胞周期遺伝子および／または以下を含む目的（しかし、限定されるわけではない）のための遺伝子産物の発現を変更するための方法、ならびに構築物を含む：（i）細胞周期の間の機能および植物表現型に対する最終的な効果を調査すること、ならびに（ii）植物表現型の変化を生じさせること。たとえば、本発明は、1つまたは複数の植物細胞周期遺伝子の発現を変更することによって、木材品質、線維発症、細胞壁多糖体含量、果実成熟、ならびに植物成長および収量を修飾するための方法およびツールを含む。
【００９３】
本発明は、上記した細胞周期遺伝子および変異体のいずれかの発現を変更する方法を含む。従って、たとえば、本発明は、ユーカリ属またはマツ属の種の野生型植物のゲノムに存在する細胞周期遺伝子の発現を変更することを含む。一つの態様において、細胞周期遺伝子は、上で議論したように、SEQ ID NO:1〜237から、SEQ ID NO:1〜12、14〜58、60〜62、64〜70、72〜75、77〜83、85〜86、88〜91、93〜119、121〜130、132〜148、150〜156、158〜191、193〜207、209〜218、220〜221、223〜231、および233〜237を含むこれらのサブセットから、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜76、78〜103、106、108〜113、116〜121、124〜125、128〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、208〜213、および215〜234を含むこれらのサブセットから、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜58、60〜62、64〜70、72〜75、78〜83、85〜86、88〜91、93〜103、106、108〜113、116〜119、121、124〜125、128〜130、132〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、209〜213、215〜218、220〜221、223〜231、および233〜234を含むこれらのサブセットから選択されるヌクレオチド配列、またはこれらの保存的変異体から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
遺伝子発現を変更するために本発明に従って使用することができる技術は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：（i）遺伝子産物を過剰発現すること、（ii）遺伝子のmRNA転写物を破壊するなどの遺伝子の転写物を破壊すること；（iii）遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能を破壊すること、または（iv）遺伝子自体を破壊すること。遺伝子産物の過剰発現、アンチセンスRNAの使用、リボザイム、および二重鎖RNA干渉（dsRNAi）の使用は、遺伝子の機能効果を発見するための、および同種の野生型植物から異なる表現型をもつ植物を作製するための有益な技術である。
【００９５】
標的遺伝子の過剰発現は、たいてい遺伝子またはcDNAを発現ベクターにクローン化すること、およびベクターを受容細胞に導入することによって達成される。または、過剰発現は、ゲノム内にある遺伝子の発現を駆動するための外来性プロモーターを細胞に導入することによって達成することができる。次いで、遺伝子を過剰発現するように形質転換された植物を、遺伝子を過剰発現するように形質転換されなかった植物と比較することによって、細胞機能、生化学的および／または生理学的特性に対する所与の遺伝子の過剰発現の効果を評価することができる。
【００９６】
アンチセンスRNA、リボザイム、およびdsRNAi技術は、典型的には遺伝子のRNA転写物、通常mRNAをターゲットする。アンチセンスRNA技術は、細胞内の特定のmRNAにおいて見いだされる配列に対して相補的か、もしくはアンチセンスであるRNA分子（またはRNA誘導体）を細胞内に発現すること、または導入することを含む。mRNAと会合することによって、アンチセンスRNAは、コードされた遺伝子産物の翻訳を阻害することができる。特定の植物遺伝子の発現を減少させ、または阻害するためのアンチセンス技術の使用は、たとえば欧州特許公開第271988号、Smith et al., Nature, 334：724-726 （1988）；Smith et. al., Plant Mol. Biol., 14：369-379 （1990）に記載されている。
【００９７】
リボザイムは、触媒のドメインと特定のmRNAに対する相補配列の両方を有するRNAである。リボザイムは、mRNA（リボザイムの相補ドメインを介して）と結合すること、および次いで触媒ドメインを使用してメッセージを切断する（分解する）ことによって機能する。
【００９８】
RNA干渉（RNAi）は、標的遺伝子自体の新規の転写率を変化することなく、定常状態レベルの特定のmRNAを、転写され、通常は完全にプロセスされたmRNAの配列特異的分解によって減少させるという転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）調節過程を含む。RNAi技術は、たとえば、Elibashir, et al., Methods Enzymol. 26： 199 （2002）； McManus & Sharp, Nature Rev. Genetics 3： 737 （2002）；PCT出願国際公開公報第01/75164号； Martinez et al., Cell 110：563 （2002）； Elbashir et al., 前記； Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12：735 （2002）； Tuschl et al., Nat. Biotechnol. 20：446 （2002）； Tuschl, Chembiochem. 2： 239 （2001）； Harborth et al., J. Cell Sci. 114： 4557 （2001）； et al., EMBO J. 20：6877 （2001）； Lagos-Quintana et al., Science. 294： 8538 （2001）； Hutvagner et al., Ioc cit, 834； Elbashir et al., Nature. 411:494 （2001）において論議される。
【００９９】
本発明は、SEQ ID NO:1〜235のポリヌクレオチドまたは上で議論した保存的変異体などのこれらの保存的変異体の少なくとも1つを含むDNA構築物を提供する。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、本発明のDNA構築物を作製することができる。たとえば、Sambrook et al., 前記を参照されたい。
【０１００】
本発明は、任意にプロモーターを含むDNA構築物を含む。当技術分野において公知の任意の適切なプロモーターを使用することができる。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび／またはその他の転写調節エレメントに結合する核酸、好ましくはDNAである。任意のプロモーターと同様に、本発明のプロモーターにより、DNAもしくはRNAの転写を容易にし、または制御して、プロモーターに作動可能に連結された核酸分子からmRNA分子を産生する。RNAは、タンパク質もしくはポリペプチドをコードすることができ、またはアンチセンスRNA分子もしくはRNAiに有用な分子をコードすることができる。本発明において有用なプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制御されるプロモーター、および組織優先（tissue-preferred）プロモーターを含む。
【０１０１】
有用な構成的植物プロモーターの例は：大部分の植物組織において構成的高レベル発現を与えるカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター（Odel et al. Nature 313：810 （1985））；ノパリン・シンターゼ・プロモーター（An et al. Plant Physiol. 88：547 （1988））；およびオクトピン・シンターゼ・プロモーター（Fromm et al., Plant Cell 1：977 （1989））を含む。CaMV 35Sプロモーターは、一般に構成的プロモーターと称されるが、いくつかの組織優先が見られたことに留意されたい。CaMV 35Sの使用は、本発明における使用の間に任意の組織優先を示すかもしれないが、本発明によって構想される。
【０１０２】
誘導性プロモーターは、環境的、ホルモン的、または化学的シグナルに応答して遺伝子発現を制御する。ホルモン誘導性プロモーターの例は、オーキシン誘導性プロモーター（Baumann et al. Plant Cell 11：323-334 （1999））、サイトカイニン誘導性プロモーター（Guevara-Garcia, Plant Mol. Biol. 38：743-753 （1998））、およびジベレリン応答性プロモーター（Shi et al. Plant Mol. Biol. 38：1053-1060 （1998））を含む。さらに、熱、光、傷、病原体耐性、およびジャスモン酸メチルまたはサリチル酸などの化学物質に応答するプロモーターを本発明のDNA構築物および方法に使用することもできる。
【０１０３】
組織優先プロモーターにより、一定の植物組織において本発明のポリヌクレオチドを優先発現（preferred expression）することができる。また、組織優先プロモーターは、一定の植物組織においてアンチセンスRNAまたはsiRNAの発現を指揮するために有用であり、上で議論したようにターゲットされる遺伝子の発現を阻害し、または完全にブロックするために有用であり得る。本明細書に使用される維管束植物組織は、木部、師部、または維管束形成層組織をいう。その他の好ましい組織は、頂端分裂組織、根、種子、および花を含む。一つの局面において、本発明の組織優先プロモーターは、「木部優先」、「形成層優先」、または「師部優先」であり、それぞれ木部、形成層、または師部において作動可能に連結された核酸配列の発現を優先的に指揮する。もう一つの局面において、本発明のDNA構築物は、木部、形成層、または師部に組織特異的であるプロモーターであって、木部、形成層、または師部においてのみ活性なプロモーターを含む。
【０１０４】
維管束優先プロモーターは、木部、師部、もしくは形成層組織のいずれかにおいて、または3つの組織型のうちの少なくとも2つにおいて優先して活性である。維管束特異的なプロモーターは、木部、師部、または形成層のいずれかにおいて、または3つのうちの少なくとも2つにおいて特異的に活性である。言い換えると、プロモーターは、植物の木部、形成層、または師部組織において活性なだけである。しかし、植物における溶質移行のために、組織に特異的にまたは優先して発現される産物は、発現が生じた後に植物の他の場所に見いだされ得ることに留意されたい。
【０１０５】
もう一つの態様において、プロモーターは、時間的制御下にあり、この場合、プロモーターが発現を開始する能力が、細胞周期の段階または植物発育の段階などの要因にリンクされる。たとえば、サイクリンD2遺伝子のプロモーターは、G1および初期S期のみの間に発現し得るし、特定のサイクリン遺伝子のプロモーターは、発育中の実生の一次維管束極内においてのみ発現し得る。
【０１０６】
加えて、特定の細胞周期遺伝子のプロモーターが、二次的維管束構造を発達して形成層内にのみ発現されてもよい。形成層内において、特定の細胞周期遺伝子プロモーターが、幹において、または根においてのみ発現されてもよい。さらに、細胞周期プロモーターは、春（早材形成のために）においてのみ、または夏においてのみ発現されてもよい。
【０１０７】
プロモーターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されてもよい。本文脈において使用されるように、「作動可能に連結された」とは、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御するようにプロモーターに対して構造遺伝子をコードするポリヌクレオチドを連結することをいう。所望のポリヌクレオチドがタンパク質産物をコードする配列を含む場合、コード領域は、プロモーターおよびターミネーターに対してなど、調節エレメントに対して作動可能に連結させて、所望のポリヌクレオチドによってコードされる関連したメッセンジャーRNA転写物および／またはタンパク質産物の発現をもたらすことができる。この場合、ポリヌクレオチドは、プロモーターおよび、任意にターミネーター配列に対して5'-3'の向きで作動可能に連結される。
【０１０８】
または、本発明は、その転写が、植物細胞における内因性細胞周期遺伝子の発現に影響を及ぼす二次構造を形成することができる核酸を産生する「アンチセンス」の向きにポリヌクレオチドを含むDNA構築物を提供する。もう一つのバリエーションにおいて、DNA構築物は、転写によりポリヌクレオチドが結合する細胞周期遺伝子のRNA干渉を開始する二重鎖RNA産物を産生するポリヌクレオチドを含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、左右のt-DNA辺縁配列がポリヌクレオチドに隣接するか、または両側にあるように、t-DNA内に配置することができる。
【０１０９】
本発明は、上で論議したポリヌクレオチドの任意の1つまたは複数を含むDNA構築物を含むことが理解される。従って、たとえば、構築物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多くのポリヌクレオチドを含むt-DNAを含んでもよい。
【０１１０】
また、本発明は、1つまたは複数の調節エレメントを含むプロモーターを含むDNA構築物を含む。また、本発明は、プロモーターと別の調節エレメントを含むDNA構築物を含む。調節エレメントは、プロモーター領域に多くの重要な特徴を与える。いくつかのエレメントは、作動可能に連結された核酸の転写の割合を増強する転写因子に結合する。その他のエレメントは、転写活性を阻害するリプレッサーに結合する。プロモーター活性に対する転写因子の効果により、プロモーター活性が高いか、または低いかどうか、すなわちプロモーターが、「強い」かまたは「弱い」かどうかを決定することができる。
【０１１１】
本発明のDNA構築物は、形質転換された植物細胞または植物を同定し、選択する際に有用な選択可能なマーカーとして役立つヌクレオチド配列を含むことができる。このようなマーカーの例は、カナマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（nptII）遺伝子（Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199：183-188 （1985））を含むが、これらに限定されるわけではない。nptII遺伝子を発現している細胞は、カナマイシンまたはG418などの適切な抗生物質を使用して選択することができる。その他の一般に使用される選択可能なマーカーは、グリフォセート耐性を与える変異体EPSPシンターゼ遺伝子（Hinchee et at., Bio／Technology 6：915-922 （1988））；およびイミダゾリノンまたはスルホニルウレア耐性を与える変異体アセト乳酸塩シンターゼ遺伝子（ALS）を含む（欧州特許出願第154,204号, 1985）。
【０１１２】
また、本発明は、上で論議したDNA構築物を含むベクターを含む。ベクターは、特定の宿主細胞のために複製開始点（レプリコン）を含むことができる。種々の原核生物のレプリコンが当業者に公知であり、原核生物宿主細胞において直接自律増殖および組換え分子の維持を指揮するように機能する。
【０１１３】
一つの態様において、本発明は、米国特許出願第60/476,222号に記載されたpWVR8またはGleave Plant MOl. Biol, 20：1203-27 (1992)に記載されたpART27を利用する。
【０１１４】
また、本発明は、本発明のDNA構築物で形質転換された宿主細胞を提供する。本明細書に使用される宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドが発現される細胞をいう。従って、宿主細胞は、個々の細胞、細胞培養、または生物体の一部の細胞であることができる。また、宿主細胞は、胚、胚乳、精子もしくは卵子、または受精卵の一部であることができる。一つの態様において、宿主細胞は、植物細胞である。
【０１１５】
本発明は、さらに、本発明のDNA構築物を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明は、被子植物または裸子植物であるトランスジェニック植物を含む。本発明のDNA構築物は、種々の植物、単子葉類（たとえば、草、トウモロコシ、穀物、カラスムギ、コムギ、およびオオムギ）、双子葉類（たとえば、シロイヌナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）の両方、ならびに裸子植物（たとえば、ヨーロッパアカマツ；Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996を参照されたい）、ホワイトスプルース（Ellis et al., Biotechnology 11：84-89, 1993）、およびカラマツ（Huang et al., In Vitro Cell 27：201-207, 1991）を形質転換するために使用することができる。
【０１１６】
また、植物は、芝草、コムギ、トウモロコシ、米、テンサイ、ジャガイモ、トマト、レタス、ニンジン、イチゴ、カッサバ、サツマイモ、ゼラニウム、ダイズ、および様々な形態の木本を含む。木本は、パームオーク、マツ、カエデ、モミ、リンゴ、イチジク、プラムおよびアカシアなどの樹木を含む。また、木本は、バラおよびブドウのつるを含む。
【０１１７】
一つの態様において、本発明のDNA構築物は、木本、すなわち幹が多年間生きて、木質組織の付加によって各年直径を増大する樹木または潅木を形質転換するために使用される。本発明は、ユーカリプタス・グランディスおよびそのハイブリッド、ならびにタエダマツからなる群より選択される植物などの商業的林産業において重要性のあるユーカリおよびマツ種を含む植物を形質転換する方法、ならびに形質転換された植物、およびこれに由来する木材および木材パルプを含む。適切な植物のその他の例は、パイヌス・バンクシアナ（Pinus banksiana）、パイヌス・ブルチア（Pinus brutia）、パイヌス・カリバエ（Pinus caribaea）、パイヌス・クラウサ（Pinus clausa）、パイヌス・コントルタ（Pinus contorta）、パイヌス・コウルテリ（Pinus coulteri）、パイヌス・エチナタ（Pinus echinata）、パイヌス・エルダリカ（Pinus eldarica）、パイヌス・エリオチ（Pinus ellioti）、パイヌス・ジェフレイ（Pinus jeffreyi）、パイヌス・ラムベルチアナ（Pinus lambertiana）、パイヌス・マソニアナ（Pinus massoniana）、パイヌス・モンチコラ（Pinus monticola）、パイヌス・ニグラ（Pinus nigra）、パイヌス・パルストリス（Pinus palustris）、パイヌス・ピナステル（Pinus pinaster）、パイヌス・ポンデローサ（Pinus ponderosa）、ラジアータマツ(Pinus radiata)、パイヌス・レシノサ（Pinus resinosa）、パイヌス・リギダ（Pinus rigida）、パイヌス・セロチナ（Pinus serotina）、ストローブマツ（Pinus strobus）、パイヌス・シルベストリス（Pinus sylvestris）、タエダマツ（Pinus taeda）、パイヌス・ビルギニアナ（Pinus virginiana）、アビエス・アマビリス（Abies amabilis）、アビエス・バルサメア（Abies balsamea）、アビエス・コンコロル（Abies concolor）、アビエス・グランディス（Abies grandis）、アビエス・ラシオカルパ（Abies lasiocarpa）、アビエス・マグニフィカ（Abies magnifica）、アビエス・プロセラ（Abies procera）、カメシパレス・ラウソニオナ（Chamaecyparis lawsoniona）、カメシパレス・ノオトカテンシス（Chamaecyparis nootkatensis）、カメシパレス・シオイデス（Chamaecyparis thyoides）、ユニペルス・ビルギニアナ（Juniperus virginiana）、ラリキス・デシヂュア（Larix decidua）、ラリキス・ラリシナ（Larix laricina）、ラリキス・レプトレピス（Larix leptolepis）、ラリキス・オクシデンタリス（Larix occidentalis）、ラリキス・シベリカ（Larix siberica）、リボセドラス・デクレンス（Libocedrus decurrens）、ピセア・アビエス（Picea abies）、ピセア・エンゲルマニ（Picea engelmanni）、ピセア・グラウカ（Picea glauca）、ピセア・マリアナ（Picea mariana）、ピセア・プンゲンス（Picea pungens）、ピセア・ルベンス（Picea rubens）、ピセア・シシェンシス（Picea sitchensis）、プソイドツガ・メンジエシ（Pseudotsuga menziesii）、セコイア・ギガンテア（Sequoia giggantea）、セコイア・センペルビレンス（Sequoia sempervirens）、タキソジウム・ジスチカム（Taxodium distichum）、ツガ・カナデンシス（Tsuga canadensis）、ツガ・ヘテロフィラ（Tsuga heterophylla）、ツガ・メルテンシアナ（Tsuga mertensiana）、ツジャ・オシデンタリス（Thuja occidentalis）、ツジャ・プリカタ（Thuja plicata）、ユーカリプタス・アルバ（Eucalyptus alba）、ユーカリプタス・バンクロフチ（Eucalyptus bancroftii）、ユーカリプタス・ボトリオイデス（Eucalyptus botryoides）、ユーカリプタス・ブリッジシアナ（Eucalyptus bridgesiana）、ユーカリプタス・カロフィラ（Eucalyptus calophylla）、ユーカリプタス・カマヂュレンシス（Eucalyptus camaldulensis）、ユーカリプタス・シトリオドラ（Eucalyptus citriodora）、ユーカリプタス・クラドカリクス（Eucalyptus cladocalyx）、ユーカリプタス・コッキフェラ（Eucalyptus coccifera）、ユーカリプタス・クルチシ（Eucalyptus curtisii）、ユーカリプタス・ダルリンプレアナ（Eucalyptus dalrympleana）、ユーカリプタス・デグルプタ（Eucalyptus deglupta）、ユーカリプタス・デラガテンシス（Eucalyptus delagatensis）、ユーカリプタス・ジベルシカラー（Eucalyptus diversicolor）、ユーカリプタス・ヂュニイ（Eucalyptus dunnii）、ユーカリプタス・フィチフォリア（Eucalyptus ficifolia）、ユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）、ユーカリプタス・ゴンフォセファラ（Eucalyptus gomphocephala）、ユーカリプタス・グニイ（Eucalyptus gunnii）、ユーカリプタス・ヘンリイ（Eucalyptus henryi）、ユーカリプタス・レボピネア（Eucalyptus laevopinea）、ユーカリプタス・マカルスリ（Eucalyptus macarthurii）、ユーカリプタス・マクロリンカ（Eucalyptus macrorhyncha）、ユーカリプタス・マクラタ（Eucalyptus maculata）、ユーカリプタス・マルギナタ（Eucalyptus marginata）、ユーカリプタス・メガカルパ（Eucalyptus megacarpa）、ユーカリプタス・メリオドラ（Eucalyptus melliodora）、ユーカリプタス・ニコリイ（Eucalyptus nicholii）、ユーカリプタス・ニテンス（Eucalyptus nitens）、ユーカリプタス・ノバ-アンゼリカ（Eucalyptus nova-angelica）、ユーカリプタス・オブリクア（Eucalyptus obliqua）、ユーカリプタス・オクシデンタリス（Eucalyptus occidentalis）、ユーカリプタス・オブツシフロラ（Eucalyptus obtusiflora）、ユーカリプタス・オレアデス（Eucalyptus oreades）、ユーカリプタス・パウシフロラ（Eucalyptus pauciflora）、ユーカリプタス・ポリブラクタ（Eucalyptus polybractea）、ユーカリプタス・レグナンス（Eucalyptus regnans）、ユーカリプタス・レシニフェラ（Eucalyptus resinifera）、ユーカリプタス・ロブスタ（Eucalyptus robusta）、ユーカリプタス・ルディス（Eucalyptus rudis）、ユーカリプタス・サリグナ（Eucalyptus saligna）、ユーカリプタス・シデロキシロン（Eucalyptus sideroxylon）、ユーカリプタス・スツアルチアナ（Eucalyptus stuartiana）、ユーカリプタス・テレチコルニス（Eucalyptus tereticornis）、ユーカリプタス・トレリアナ（Eucalyptus torelliana）、ユーカリプタス・ウルニゲラ（Eucalyptus urnigera）、ユーカリプタス・ウロフィラ（Eucalyptus urophylla）、ユーカリプタス・ヴィミナリス（Eucalyptus viminalis）、ユーカリプタス・ヴィリディス（viridis）、ユーカリプタス・ワンドゥー（Eucalyptus wandoo）、およびユーカリプタス・ユーマンニ（Eucalyptus youmanni）からなる群より選択されるものを含む。
【０１１８】
また、本明細書に使用される「植物」という用語は、植物の果実、種子、花、球花等を含むことが企図される。本発明の形質転換された植物は、アグロバクテリウムなどを介して、DNA構築物が直接植物内に導入されたことを意味する形質転換体を指すことができ、または植物は、トランスフェクトされた植物の子孫であることができる。第二世代またはその後の世代の植物は、有性生殖、すなわち受精によって作製することができる。さらに、植物は、配偶体（単相体段階）または胞子体（二倍体段階）であることができる。
【０１１９】
また、本明細書に使用される「植物組織」という用語は、植物細胞を含む植物の任意の部分を包含する。植物細胞は、懸濁培養液、カルス、胚、生長領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、種子、および小胞子を含む。植物組織は、液体もしくは固体培養において、または土壌もしくはポット内の適切な媒体、温室、または農地において成長させることができる。また、本明細書に使用される「植物組織」という用語は、有性生殖的に、または無性生殖的に生じたかどうかにかかわらず、植物、種子、子孫、またはムカゴのクローン、および切穂または種子などのこれらの任意の子孫をいう。
【０１２０】
本発明の一つの局面に従って、本発明のDNA構築物で形質転換されたトランスジェニック植物は、DNA構築物で形質転換されなかった植物とは異なる表現型を有する。
【０１２１】
本明細書に使用される「表現型」は、本発明に従って、植物の少なくとも1つの植物細胞のゲノム内に、本発明の1つもしくは複数のDNA構築物を組み込むことによって変更することができる植物の識別特徴または特徴をいう。DNA構築物は、形質転換された植物細胞または全体として植物の遺伝的、分子的、生化学的、生理的、形態学的、もしくは農学的特徴または特性のいくつかの任意の1つもしくは複数を修飾することによって形質転換された植物の表現型に変化を与えることができる。
【０１２２】
一つの態様において、本発明のDNA構築物での植物の形質転換により、増大された乾燥耐性、除草剤耐性、減少または増大された丈、減少または増大した枝分かれ、増強された寒冷および凍結耐性、改善された生長力、増強された色、増強された健康および栄養的な特徴、改善された貯蔵、増強された収率、増強された耐塩性、増強された腐食に対する木材の耐性、増強された真菌症に対する耐性、改変された害虫に対する誘引性、増強された重金属耐性、増大された耐病性、増大された昆虫耐性、増大された水ストレス耐性、増強された甘味、改善された肌目、減少されたリン酸含量、増大された発芽、増大された微量栄養素の取り込み、改善されたデンプン組成、改善された花の寿命、新規樹脂の産生、および新規タンパク質またはペプチドの産生を含むが、これらに限定されるわけではない、いずれか1つまたは複数の表現型を得ることができる。
【０１２３】
もう一つの態様において、影響を受ける表現型は、DNA構築物で形質転換されなかった同じ種の植物と比較して、以下の特徴の1つまたは複数を含む：あて材を形成する傾向、減少した未成熟期間、増大された未成熟期間、自己離層形成によって脱落する枝、促進された生殖発生、または遅延された生殖発生。
【０１２４】
さらなる態様において、トランスジェニック植物において異なる表現型は、以下の1つまたは複数を含む：リグニン品質、リグニン構造、木材組成物、木材の外観、木材密度、木材強度、木材硬度（wood stiffness）、セルロース重合、繊維寸法、内腔サイズ、その他の植物成分、植物細胞分裂、植物細胞発育、単位領域あたりの細胞の数、細胞サイズ、細胞形態、細胞壁組成、木材形成率、木材の美的外観、幹の欠陥の形成、平均ミクロフィブリル角度、S2細胞壁層の幅、成長率、枝の栄養発生に対する根の根形成比の割合、葉面積指数、および葉形。
【０１２５】
表現型は、任意の適切な手段によって評価することができる。植物は、これらの一般的形態に基づいて評価することができる。トランスジェニック植物は、肉眼で観察することができ、重さを量り、およびこれらの高さを測定することができる。植物は、植物組織、すなわち、師部および形成層の個々の層を単離することによって検査することができ、これは、分裂組織細胞、初期膨張、後期膨張、二次壁形成、および後期細胞成熟にさらに区分される。たとえば、Hertzberg、前記を参照されたい。また、植物は、顕微鏡分析または化学分析を使用して評価することができる。
【０１２６】
顕微鏡分析は、細胞型、発育段階、ならびに組織および細胞による染色液取り込みを検査することを含む。木材パルプ繊維の繊維壁厚およびミクロフィブリル角度などの繊維形態は、たとえば、顕微鏡伝達エリプソメトリーを使用して観察することができる。Ye and Sundstrom, Tappi J., 80：181 （1997）を参照されたい。湿った木材および立っている樹木の木材強度、密度、および木目勾配は、多変量解析と連動して可視および近赤外線スペクトル・データを測定して決定することができる。米国特許出願公開第2002/0107644号および第2002/0113212号を参照されたい。内腔サイズは、走査型電子顕微鏡を使用して測定することができる。リグニン構造および化学特性は、Marita et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. I 2939（2001）に記載された核磁気共鳴分光法を使用して観察することができる。
【０１２７】
リグニン、セルロース、炭水化物、およびその他の植物抽出物の生化学特性は、分光光度法、蛍光分光学法、HPLC、質量分析法、および組織染色法を含む公知の任意の標準的な分析法によって評価することができる。
【０１２８】
本明細書に使用される「形質転換」は、核酸が植物細胞のゲノム内に挿入されるプロセスをいう。このような挿入は、植物細胞への安定な導入および子孫への伝達を含む。また、形質転換は、生じる形質転換体が核酸を一過性に発現する核酸の一過性挿入をいう。形質転換は、当技術分野において周知の種々の方法を使用して天然または人工の条件下で起こすことができる。形質転換は、アグロバクテリウム属を媒介した形質転換プロトコル、ウイルス感染、ウィスカー、電気穿孔法、微量注入、ポリエチレングリコール処理、熱ショック、リポフェクション、および微粒子銃を含む、原核生物または真核生物宿主細胞内へ核酸配列を挿入するための任意の公知の方法によって達成することができる。また、形質転換は、たとえばSvab et al., Proc. Natl Acad. Sci. 87：8526-30 （1990）に記載されたように葉緑体形質転換を使用して達成することができる。
【０１２９】
本発明の一つの態様によれば、ユーカリ属の形質転換は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第60/476,222号（前記）に記載されているように行われる。もう一つの態様によれば、マツ属の形質転換は、米国特許出願公開第2002/0100083号に記載されている方法を使用して達成される。
【０１３０】
本発明のもう一つの局面は、本発明のDNA構築物で形質転換された植物から木材を得る、および／または木材パルプを作製する方法を提供する。トランスジェニック植物を産生する方法は、上に提供されており、当技術分野において公知である。形質転換された植物は、任意の適切な条件下で培養し、または成長させることができる。たとえば、マツは、米国特許出願公開第2002/0100083号に記載されたように培養し、および成長させることができる。ユーカリ属は、たとえば、Rydelius, et al., GROWING EUCALYPTUS FOR PULP AND ENERGY, presented at the Mechanization in Short Rotation, Intensive Culture Forestry Conference, Mobile, AL, 1994のとおりに培養し、および成長させることができる。木材および木材パルプは、当技術分野において公知の任意の手段によって植物から得ることができる。
【０１３１】
上記のように、本発明に従って得られた木材または木材パルプは、リグニン組成、リグニン構造、木材組成、セルロース重合、繊維寸法、その他の植物成分に対する繊維の比率、植物細胞分裂、植物細胞発育、単位領域あたりの細胞の数、細胞サイズ、細胞形態、細胞壁組成、木材形成率、木材の美的外観、幹の欠陥の形成、成長率、枝の栄養発生に対する根の根形成比の割合、葉面積指数、および葉形を含むが、これらに限定されるわけではない任意の1つまたは複数の改善された特徴を示してもよく、増大または減少されたリグニン含量、化学的処理に対するリグニンの増大されたアクセスしやすさ、リグニンの改善された反応性、増大または減少されたセルロース含量、増大された寸法安定性、増大された抗張力、増大された抗剪強度、増大された圧縮強度、増大された耐衝撃性、増大された剛性、増大または減少された硬度、減少された螺旋度、減少された収縮、ならびに重量、密度、および比重の相違を含む。
【０１３２】
B.細胞周期遺伝子の発現プロファイリング
また、本発明は、細胞周期遺伝子の発現プロファイリングを行うための方法およびツールを提供する。発現プロファイリングは、遺伝子が転写され、または翻訳されるかどうかを決定するため、異なる組織における特定の遺伝子について転写物レベルを比較するため、遺伝子タイピング、DNAコピー数を推定するため、血統の同一性を決定するため、mRNA崩壊速度を測定するため、タンパク質結合部位を同定するため、遺伝子産物の細胞下局在を決定するため、表現型またはその他の現象に対して遺伝子発現を相関させるため、および特定の遺伝子の操作のその他の遺伝子に対する効果を決定するために有用である。発現プロファイリングは、複雑な多重遺伝子イベントにおける遺伝子発現を同定するために特に有用である。この理由のために、発現プロファイリングは、遺伝子発現を植物表現型および植物組織の形成に対して、ならびにこれらの相互接続を細胞周期に対して相関するのに有用である。
【０１３３】
植物のゲノムの遺伝子の少しの画分だけが、所与の組織試料において所与の時期に発現され、発現された遺伝子の全てが植物表現型に影響を及ぼす可能性があるというわけでない。関心対象の表現型に影響を及ぼすことができる遺伝子を同定するために、本発明は、たとえば、細胞周期の所与の時点における遺伝子発現プロファイル、植物発育の所与の時点における遺伝子発現プロファイル、および所与の組織試料における遺伝子発現プロファイルを決定するための方法、ならびにツールを提供する。また、本発明は、植物表現型を変更するためにその発現を操作することができる細胞周期遺伝子を同定するための方法およびツールを提供する。これらの方法を支持するように、本発明は、また、同じファミリーの異なる遺伝子の発現を区別する方法およびツールを提供する。
【０１３４】
本明細書に使用される「遺伝子発現」は、DNA配列のRNA配列への転写、続くRNAのタンパク質への翻訳のプロセスを指し、これは、翻訳後プロセシングを受けてもよく、または受けていなくてもよい。従って、細胞周期段階および／または発育段階と遺伝子発現との関係は、RNAまたはタンパク質のレベルで定量的または定性的変化を検出することによって観察することができる。本明細書に使用される「生物活性」という用語は、酵素活性を含むタンパク質遺伝子産物の活性を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３５】
本発明は、これらの発現プロファイリング法に有用なオリゴヌクレオチドを提供する。それぞれのオリゴヌクレオチドは、細胞周期遺伝子または遺伝子産物に対して所与の条件のセット下でハイブリダイズすることができる。本発明の一つの局面において、それぞれのオリゴヌクレオチドが、異なる細胞周期遺伝子産物に対して所与の条件のセット下でハイブリダイズする、複数のオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドの例は、SEQ ID NO:471〜697を含む。SEQ ID NO:471〜697の各々のオリゴは、SEQ ID NO:1〜237うちの1つの異なる遺伝子産物に対して標準状態下でハイブリダイズする。本発明のオリゴヌクレオチドは、任意の上記の方法において、1つまたは複数の細胞周期遺伝子の発現を決定する際に有用である。
【０１３６】
1.細胞、組織、核酸、およびタンパク質試料
本発明の方法に使用される試料は、植物組織に由来してもよい。適切な植物組織は、体細胞胚、花粉、葉、幹、カルス、走根、マイクロチューバ、シュート、木部、雄円錐体、花粉球果、維管束組織、頂端分裂組織、維管束形成層、木部、根、花、および種子を含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１３７】
本発明によれば、「植物組織」は、本明細書において上に記載されたとおりに使用される。植物組織は、前記記載された任意の植物型または種から得ることができる。
【０１３８】
本発明の一つの局面によれば、試料は、細胞周期の異なる段階の植物組織から、異なる発育段階の植物組織から、年（たとえば、春対夏）の種々の時期の植物組織から、異なる環境条件（たとえば、光および温度のバリエーション）に供される植物組織から、および／または異なるタイプの植物組織および細胞から得ることができる。一つの態様によれば、植物組織は、成熟の種々の段階の間に、および年の異なる季節の間に得られる。たとえば、植物組織は、幹の分裂細胞、分化している木部、初期発育中の木材細胞、分化した春材細胞、および分化した夏材細胞から収集することができる。もう一つの例として、発育中の木材を有する植物から得られた試料中の遺伝子発現を、発育中の木材を有さない植物から得られた試料中の遺伝子発現と比較することができる。
【０１３９】
分化している木部は、圧縮材、側材（side-wood）、および正常な垂直木部から得られる試料を含む。マツおよびユーカリから発現プロファイリングのための試料を得る方法は、公知である。たとえば、Allona et al, Proc. Nat’l Acad. Sci. 95：9693-8 （1998）およびWhetton et al., Plant Mol. Biol. 47：275-91、ならびにKirst et al., INT'L UNION OF FORESTRY RESARCH ORGANIZATION BIENNIAL CONFERENCE, S6.8 （June 2003, Umea, Sweden）を参照されたい。
【０１４０】
本発明の一つの態様において、一つの型の組織における遺伝子発現を、異なる型の組織の遺伝子発現と、または異なる発育段階の同一型の組織における遺伝子発現と比較する。また、遺伝子発現は、年（異なる季節）の間の種々の時期に試料採取した1つの型の組織において比較することができる。たとえば、未成熟次生木部における遺伝子発現を成熟した次生木部における遺伝子発現と比較することができる。同様に、形成層における遺伝子発現を木部における遺伝子発現と比較することができる。さらに、頂端分裂組織における遺伝子発現を形成層における遺伝子発現と比較することができる。
【０１４１】
代わりの態様において、遺伝子発現の相違は、細胞周期の間に成長する異なる組織由来の細胞として決定される。この方法では、異なる組織由来の細胞を同調させ、これらの遺伝子発現のプロフィールを作る。試料の細胞周期の段階に同調させる方法は、公知である。これらの方法は、たとえば、寒冷順化、光周期、およびアフィディコリンを含む。たとえば、Nagata et al., Int. Rev. Cytol. 132： 1-30 （1992）, Breyne and Zabeau, Curr.Opin. Plant Biol. 4： 136-42, 140 （2001）を参照されたい。試料を細胞周期の特定の段階の間に得て、その試料の遺伝子発現を細胞周期の異なる段階の間に得られる試料と比較する。たとえば、組織は、有糸分裂、G1、G0、S、およびG2などの任意の細胞周期の相において調べることができる。特に、G1、G2、および中期チェックポイントでの遺伝子発現の変化を調べることができる。
【０１４２】
本発明のもう一つの態様において、試料は、試料がその表現型を有さない同じ種の植物から得られる試料と比較されるという点で、特異的な表現型および遺伝子発現を有する植物から得られる。たとえば、試料は、速い成長率を呈する植物から得ることができ、遺伝子発現は、正常か、または緩徐な成長率を呈する植物から得られる試料のものと比較することができる。このような比較によって同定される差動的に発現される遺伝子を増殖速度と相関させることができ、従って、増殖速度を操作するために有用である。
【０１４３】
さらなる態様において、試料は、クローンとして繁殖された植物から得られる。一つの態様において、クローンとして繁殖される植物は、マツ属またはユーカリ属種のものである。同じ遺伝子型からの個体ラミートを年の異なる時期に犠牲にすることができる。従って、任意の遺伝子型に対して、季節の初めと季節終わりに、少なくとも2本の遺伝的に同一の樹木を犠牲にすることができる。各々のこれらの樹木は、未成熟試料（頂部）から成熟（底部）試料に分けることができる。さらに、組織試料は、たとえば、師部から木部に、少なくとも5層に剥がして分けることができる。各々のこれらの試料は、表現型および遺伝子発現について評価することができる。項目196を参照されたい。
【０１４４】
細胞成分は、ハイブリダイゼーションアッセイ法、酵素アッセイ法、リガンド結合アッセイ法、または生物活性アッセイ法などの解析技術を妨害するかもしれないが、このような細胞成分から遺伝子産物を単離することが望ましいであろう。核酸およびアミノ酸遺伝子産物を含む遺伝子産物は、当技術分野において公知の任意の方法によって細胞断片または可溶化液から単離することができる。
【０１４５】
本発明に従って使用される核酸は、任意の利用できる方法もしくは処理によって、またはこれらが当技術分野に公知になるその他の処理によって調製することができる。核酸を単離するための従来技術は、たとえば、Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY： HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, chapter 3 （Elsevier Press, 1993）, Berger and Kimmel, Methods Enzymol. 152：1 （1987）、およびGIBCO BRL & LIFE TECHNOLOGIES TRIZOL RNA ISOLATION PROTOCOL, Form No. 3786 （2000）において詳述されている。マツおよびユーカリから核酸試料を調製し、ポリヌクレオチドをシーケンシングするための技術は、公知である。たとえば、Allona et al.,前記、およびWhetton et al.,前記、ならびに米国特許出願第60/476,222号を参照されたい。
【０１４６】
適切な核酸試料は、任意の型の細胞周期遺伝子の転写物に由来する核酸、すなわち、RNAもしくはこれらの部分列、またはmRNAがテンプレートとして役立つ細胞周期遺伝子から転写された核酸を含むことができる。適切な核酸は、転写物から逆転写されたcDNA、そのcDNAから転写されたRNA、cDNAから増幅されたDNA、および増幅されたDNAから転写されたRNAを含む。このような産物または誘導産物の検出は、試料中の転写物の有無を表す。従って、適切な試料は、遺伝子または遺伝子の転写物、転写物から逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたcRNA、遺伝子から増幅されたDNA、および増幅されたDNAから転写されたRNAを含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書に使用される「転写物」のカテゴリーは、プレmRNA新生転写物、転写物プロセシング中間体、ならびにこれらの成熟mRNAおよび分解産物を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４７】
本発明を実施するために全種類の転写物をモニターする必要はない。たとえば、本発明の発現プロファイリング法は、成熟mRNAレベルだけなどの転写物の1つの型だけを検出して行うことができる。
【０１４８】
本発明の一つの局面において、染色体DNAまたはcDNAライブラリー（たとえば、総細胞mRNAから合成された蛍光標識されたcDNAを含む）は、当技術分野において認識された方法に従ってハイブリダイゼーション法に使用するために調製される。Sambrook et al.,前記を参照されたい。
【０１４９】
本発明のもう一つの局面において、mRNAは、たとえばMessage Ampキット（Ambion）を使用して増幅される。さらなる局面において、mRNAは、検出可能な標識で標識される。たとえば、mRNAは、CyDye（Amersham Biosciences）などの蛍光性発色団で標識することができる。
【０１５０】
いくつかの適用において、ハイブリダイゼーション技術の使用前に、ホモジネートもしくは可溶化液中に存在することが多いRNaseを阻害または破壊することが望ましい。ヌクレアーゼを阻害または破壊する方法は、周知である。本発明の一つの態様において、細胞または組織は、ヌクレアーゼを阻害するために、カオトロピック試薬の存在下においてホモジナイズされる。もう一つの態様において、RNaseは、加熱処理、続くプロテイナーゼ処理によって阻害または破壊される。
【０１５１】
タンパク質試料は、当技術分野において公知の任意の手段によって得ることができる。本発明の方法に有用なタンパク質試料は、粗細胞可溶化物および粗組織ホモジネートを含む。または、タンパク質試料は、精製することができる。当技術分野において周知の種々のタンパク質精製法をMarshak et al., STRATEGIES FOR PROTEIN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION： A LABORATORY COURSE MANUAL （Cold Spring Harbor Laboratory Press 1996）にて見いだすことができる。
【０１５２】
2.遺伝子発現レベルの検出
遺伝子発現レベルを検出することを含む本発明の方法のために、遺伝子発現を観察するための任意の方法を限定されることなく使用することができる。このような方法は、従来の核酸ハイブリダイゼーション技術、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）に基づいた方法、およびタンパク質定量を含む。本発明は、固体支持体に基づいたアッセイ・フォーマットを使用する検出方法、ならびに溶液に基づいたアッセイ・フォーマットを使用するものを含む。
【０１５３】
発現レベルの絶対測定を行う必要はないが、これらを行うこともできる。本発明は、試料間の発現レベルの相違を比較することを含む方法を含む。発現レベルの比較は、視覚的もしくは手動ですることができ、またはたとえば光学的な検出手段を使用して、自動化すること、および機械によって行うことことができる。Subrahmanyam et al., Blood. 97：2457 （2001）；Prashar et al., Methods Enzymol. 303：258 （1999）。遺伝子の差動的発現を解析するためのハードウェアおよびソフトウェアを利用し、本発明を実施する際に使用することができる。たとえば、Gen Stat Software and Gene Express（登録商標） GX Explorer（商標） Training Manual, 前記； Baxevanis & Francis-Ouellette,前記を参照されたい。
【０１５４】
本発明の一つの態様によれば、核酸ハイブリダイゼーション技術は、遺伝子発現を観察するために使用される。例示的なハイブリダイゼーション技術は、ノーザンブロット法、サザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション、およびS1ヌクレアーゼ保護アッセイ法を含む。
【０１５５】
核酸ハイブリダイゼーションは、典型的には、プローブが相補性塩基対形成を介してその相補核酸と安定なハイブリッド・二重鎖を形成することができる条件下で、オリゴヌクレオチド・プローブと核酸を含む試料とを接触させることを含む。たとえば、PCT出願国際公開公報第99/32660号；Berger & Kimmel, Methods Enzymol. 152：1 （1987）を参照されたい。次いで、ハイブリッド・二重鎖を形成しない核酸を洗い流してハイブリダイズした核酸を残し、典型的には、付着された検出可能な標識の検出を介して検出する。検出可能な標識は、プローブに、または核酸試料に存在することができる。一つの態様において、試料中の核酸は、植物組織に存在するmRNA転写物を表す検出可能な程度に標識されたポリヌクレオチドである（たとえば、cDNAライブラリー）。検出可能な標識は、一般に、放射性または蛍光性標識であるが、検出することができる任意の標識を使用することができる。標識は、例えば、国際公開公報第99/32660号、前記に記載されたいくつかのアプローチをすることによって組み込むことができる。一つの局面において、RNAは、アミノアリル-UTPならびに遊離のUTPの付加と共にMessage Ampキット（Ambion）を使用して増幅することができる。増幅されたRNAに組み込まれるアミノアリル基は、CyDye（Amersham Biosciences）などの蛍光性発色団と反応を起こすことができる。
【０１５６】
核酸の二重鎖は、温度を増大すること、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を低下させることによって不安定化される。低いストリンジェンシー条件下（たとえば、低温および／または高塩）では、アニールされた配列が完全に相補でない場合でさえも、ハイブリッド・二重鎖（たとえば、DNA：DNA、RNA：RNA、またはRNA：DNA）を形成すると考えられる。従って、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで減少される。逆に、より高いストリンジェンシーでは（たとえば、より高い温度および／またはより低い塩および／または不安定化試薬の存在下において）、ハイブリダイゼーションは、ほとんどミスマッチが許容されない。
【０１５７】
典型的には、短いプローブ（たとえば、10〜50ヌクレオチド塩基）のストリンジェントな条件は、塩濃度がpH 7.0〜8.3で少なくとも約0.01〜1.0Mであり、温度が少なくとも約30℃であるものである。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定薬を添加することで達成することができる。
【０１５８】
いくつかの状況下では、ハイブリダイゼーションを保証するために、低いストリンジェンシー条件、たとえば37℃、6×SSPE-T（0.9M NaCl、60mM NaH2PO4、pH 7.6、6mM EDTA、0.005% トリトン）でハイブリダイゼーションを行うことが望ましい。次いで、その後の洗浄をより高いストリンジェンシー（たとえば、37℃で1×SSPE-T）で行い、ミスマッチのハイブリッド二重鎖を除去することができる。所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が得られるまで、連続した洗浄をますます高いストリンジェンシーで（たとえば、37℃〜50℃で0.25×SSPE-T程度に下げて）行うことができる。
【０１５９】
一般に、ハイブリダイゼーションのための標準的条件は、ストリンジェンシー（ハイブリダイゼーション特異性）とシグナル強度との間で折り合う。従って、本発明の一つの態様において、ハイブリダイズされた核酸を連続的により高いストリンジェンシー条件で洗浄し、それぞれの洗浄の間に読み込む。このように作製されるデータセットの解析により、ハイブリダイゼーション・パターンが目に見えて変更されずに、かつ関心対象の特定のオリゴヌクレオチド・プローブのための十分なシグナルを提供する洗浄ストリンジェンシーが明らかになる。たとえば、最終洗浄は、一貫した結果を生じ、かつ背景強度の約10%よりも大きいシグナル強度を提供する最高のストリンジェンシーのものを選択してもよい。
【０１６０】
a.オリゴヌクレオチド・プローブ
本発明に使用される核酸ハイブリダイゼーション技術に有用なオリゴヌクレオチド・プローブは、1つまたは複数の型の化学結合を介して、通常は水素結合形成を経た相補的塩基対形成を介して相補配列の核酸に結合することができる。プローブは、天然の塩基（すなわち、A、G、U、C、またはT）または修飾塩基（7-デアザグアノシン、イノシン、その他）を含むことができる。加えて、プローブのヌクレオチド塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結することができる。従って、プローブは、ホスホジエステル結合ではなく、構成塩基がペプチド結合によって連結されたペプチド核酸であることができる。
【０１６１】
オリゴヌクレオチド・プローブは、当技術分野において公知の任意の手段によって調製することができる。本発明において有用なプローブは、SEQ ID NO:1〜237の1つなどの細胞周期遺伝子のヌクレオチド産物にハイブリダイズすることができる。本発明において有用なプローブは、SEQ ID NO:1〜237に開示されたヌクレオチド配列を使用して作製することができる。本発明は、少なくともSEQ ID NO:1〜237のいずれか一つの対応する隣接する配列の2、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、または100個のヌクレオチド断片を有するオリゴヌクレオチド・プローブを含む。本発明は、2、1、0.5、0.1、または長さ0.05 kbよりも少ないオリゴヌクレオチドを含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、60ヌクレオチドの長さである。
【０１６２】
オリゴヌクレオチド・プローブは、当技術分野において公知の任意の手段によってデザインすることができる。たとえば、Li and Stormo, Bioinformatics 17： 1067-76 （2001）を参照されたい。オリゴヌクレオチド・プローブのデザインは、ソフトウェアを使用して行うことができる。例示的なソフトウェアは、Array Designer、Gene Scan、およびProbe Selectを含む。定義された核酸配列に対して相補的なプローブは、化学的に合成すること、制限酵素を使用するより長いヌクレオチドから作製すること、またはポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）などの技術を使用して得ることができる。PCR法は、周知であり、たとえばInnis et al eds., PCR PROTOCOLS： A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press Inc. San Diego, Calif. （1990）に記載されている。プローブは、たとえば放射性、ビオチン化、または蛍光性タグで標識することができる。至適には、試料中の核酸が標識され、プローブは標識されない。上記方法によって作製されるオリゴヌクレオチド・プローブは、溶液または固体支持体に基づいた方法に使用することができる。
【０１６３】
本発明は、コード領域の産物または細胞周期遺伝子の3'非翻訳領域（3'UTR）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド・プローブを含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、SEQ ID NO:1〜237のいずれか一つの3'UTRにハイブリダイズする。3'UTRは、一般に、同じファミリーのメンバー間でさえも、遺伝子の独特の領域である。従って、3'UTRの産物にハイブリダイズすることができるプローブは、遺伝子のコード領域が高度に相同的である可能性が高い場合に、ファミリー内の個々の遺伝子の発現を区別するために有用であり得る。これにより、それぞれが一義的に単一遺伝子に対して結合することができる複数のオリゴヌクレオチドのメンバーとして使用されるオリゴヌクレオチド・プローブをデザインすることができる。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、SEQ ID NO:471〜697のいずれか一つを含む。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、SEQ ID NO:471〜697のいずれか一つからなる。
【０１６４】
b.オリゴヌクレオチド・アレイ法
本発明の一つの態様は、SEQ ID NO:1〜237の遺伝子などの、1つまたは複数の細胞周期遺伝子の発現レベルを検出するために、2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを組み合わせて使用する。この態様の一つの局面において、2つ以上の異なる遺伝子の発現レベルが検出される。2つ以上の遺伝子は、上で論議した同一の、または異なる細胞周期遺伝子ファミリーに由来してもよい。各々の2つ以上のオリゴヌクレオチドは、遺伝子の異なる一つにハイブリダイズしてもよい。
【０１６５】
本発明の一つの態様は、そのそれぞれが、SEQ ID NO:1〜237によって提供される遺伝子の転写物に由来するポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズする2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。もう一つの態様は、少なくともその1つがSEQ ID NO:471〜697の核酸配列を含む2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。もう一つの態様は、少なくともその1つがSEQ ID NO:471〜697からなる2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。
【０１６６】
オリゴヌクレオチド・プローブは、約15〜約60ヌクレオチド塩基を含む約60〜約100ヌクレオチド塩基など、約5〜約60、または約5〜約500ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。
【０１６７】
本発明の一つの態様は、遺伝子発現を検出するために、固体支持体に基づいたオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法を使用する。本発明を実施するために適した固体支持体に基づいた方法は、周知であり、たとえば、PCT出願国際公開公報第95/11755号； Huber et al., Anal. Biochem. 299： 24 （2001）； Meiyanto et al., Biotechniques. 31： 406 （2001）； Relogio et al., Nucleic Acids Res. 30：e51 （2002）に記載されている。オリゴヌクレオチドが共有結合または非共有結合で結合することができる任意の固体の表面を使用することができる。このような固体支持体は、フィルター、塩化ビニル・ディッシュ、シリコン、またはガラスに基づいたチップ、その他を含む。
【０１６８】
一つの態様は、オリゴヌクレオチド・アレイ、すなわちマイクロアレイを使用し、これは、多くの遺伝子または遺伝子産物の発現を同時に観察するために使用することができる。オリゴヌクレオチド・アレイは、固体支持体上に提供される2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを含み、それぞれのプローブは、支持体上の固有の位置を占有する。それぞれのプローブの位置は、予め決定されていてもよく、その結果、所与の位置における検出可能なシグナルの検出により、正体が公知のオリゴヌクレオチド・プローブに対するハイブリダイゼーションを示す。それぞれの所定の位置は、複数のプローブの分子を含むことができるが、所定の位置のそれぞれの分子は、同一の配列を有する。このような所定の位置は、フィーチャー（feature）と呼ばれる。たとえば、単一の固体支持体上のこのようなフィーチャーのうちの2、10、100、1,000、2,000、または5,000以上に由来することができる。一つの態様において、それぞれのオリゴヌクレオチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、または少なくとも10回、アレイの独特の位置に位置する。
【０１６９】
遺伝子発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ・アレイは、たとえば、Lockhart et al., Nat'l Biotech. 14： 1675 （1996）、McGall et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93： 13555 （1996）、およびHughes et al., Nature Biotechnol. 19：342 （2001）に記載されている従来技術に従って製作し、使用することができる。種々のオリゴヌクレオチド・アレイ・デザインが、本発明の実施のために適している。
【０１７０】
一つの態様において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、それぞれが特定の組織型に発現される異なる遺伝子にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドを含む。たとえば、組織は、発育中の木材であることができる。
【０１７１】
一つの態様において、植物から得られた核酸試料は、増幅すること、および任意に検出可能な標識で標識することができる。このような目的に適した任意の核酸増幅方法および任意の検出可能な標識を使用することができる。たとえば、増幅反応は、たとえば「アンチセンス」RNAまたは「aRNA」（試料組織から抽出されたRNAに対する核酸配列に相補的）を生じるAmbionのMessageAmpを使用して行うことができる。RNAは、任意にCyDye蛍光標識を使用して標識することができる。増幅段階の間に、生じるaRNAにaaUTPが組み込まれる。CyDye蛍光標識は、非酵素反応においてaaUTPsに結合される。増幅およびラベリング段階の後、標識された増幅されたアンチセンスRNAを沈殿して、適切な緩衝液で洗浄し、次いで純度をアッセイする。たとえば、純度は、ナノドロップ（NanoDrop）分光光度計を使用してアッセイすることができる。次いで、核酸試料を、固体基質（「マイクロアレイ・スライド」）に付着されたオリゴヌクレオチド・アレイ、試料中に存在する可能性のある関心対象の核酸にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド試料プローブと接触させる。接触段階は、関心対象の核酸とアレイ上に存在するオリゴヌクレオチド・プローブとの間でハイブリダイゼーションを生じることができる条件下で行われる。次いで、非特異的に結合した核酸を除去するためにアレイを洗浄し、固体基質上のオリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズされたままである標識分子からシグナルを検出する。検出段階は、使用する標識の型に適した任意の方法を使用して達成することができる。たとえば、検出段階は、レーザースキャナーおよび検出器を使用して達成することができる。たとえば、マイクロアレイ・スライド上のシグナルの位置を解析するために、任意にGenePix Proソフトウェアを使用するAxonスキャナーを使用することができる。
【０１７２】
1つまたは複数のマイクロアレイ・スライドからのデータは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって解析することができる。
【０１７３】
マイクロアレイ技術を含む本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド・プローブは、PCRを使用して作製することができる。プローブを作製する際に使用されるPCRプライマーは、たとえばSEQ ID NO:1〜237の配列に基づいて、細胞周期遺伝子に独特の断片（すなわち、標準的なハイブリダイゼーション条件下でSEQ ID NO:1〜237のいずれか一つの1つのポリヌクレオチドだけにハイブリダイズする断片）の増幅を生じるように選択される。コンピュータプログラムは、必要とされる特異性および最適なハイブリダイゼーション特性をもつプライマーのデザインに有用である。たとえば、Li and Stormo, 前記は、1075ページにおいて、完全な遺伝子配列、ならびに同時に探索されるその他の遺伝子配列に基づいて最適のオリゴヌクレオチド・プローブを選択するProbe Selectを使用してプローブを選択する方法について論議する。
【０１７４】
一つの態様において、オリゴヌクレオチド対照プローブも使用される。例示的な対照プローブは、本明細書において（1）規準化対照、（2）発現レベル対照、および（3）ネガティブ対照と称される3つのカテゴリーの少なくとも1つに入れることができる。マイクロアレイ法では、これらの対照プローブの1つまたは複数が、本発明の細胞周期遺伝子関連性オリゴヌクレオチドと共にアレイ上に提供されてもよい。
【０１７５】
規準化対照により、色素バイアス、組織バイアス、塵、スライドの不規則、不体裁なスライドスポット、その他を補正する。規準化対照は、スクリーニングされる核酸試料に添加された標識された参照オリゴヌクレオチドもしくはその他の核酸配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドまたはその他の核酸プローブである。規準化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、読出効率、およびアレイ間で完全なハイブリダイゼーションのシグナルに変化を生じさせ得るその他の因子のバリエーションに対する対照を提供する。一つの態様において、方法に使用される他の全てのプローブから読んだシグナル（たとえば、蛍光強度または放射能）は対照プローブからのシグナルによって分けられ、これにより測定値を規準化する。
【０１７６】
実質的に、いずれのプローブも、規準化対照として役立ち得る。しかし、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成およびプローブ長により変化する。好ましい規準化プローブは、使用されるその他のプローブの平均長を反映するように選択されるが、これらは、全長範囲をカバーするように選択することもできる。さらに、正常化対照は、使用されるその他のプローブの平均塩基組成を反映するように選択することができる。一つの態様において、1つまたは少数の規準化プローブだけを使用して、これらが十分にハイブリダイズして（すなわち、二次構造を形成することなく）、かついずれの試験プローブにもマッチしないように選択される。一つの態様において、規準化対照は、哺乳類遺伝子である。
【０１７７】
発現レベル対照プローブは、生体試料中に存在する構成的に発現された遺伝子と特異的にハイブリダイズする。実質的に、いずれの構成的に発現された遺伝子も、発現レベル対照プローブのための適切な標的を提供する。典型的には、対照プローブは、一定の光合成遺伝子を含むが、それらに限定されるわけではない、構成的に発現された「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に対する相補配列を有する。
【０１７８】
「ネガティブ対照」プローブは、試験オリゴヌクレオチド（すなわち、本発明の細胞周期遺伝子関連オリゴヌクレオチド）、規準化対照、または発現対照のいずれに対しても相補的でない。一つの態様において、ネガティブ対照は、試料中の任意のその他の配列に対して相補的でない哺乳類遺伝子である。
【０１７９】
「バックグラウンド」および「バックグラウンド・シグナル強度」という用語は、非特異的結合または標識された標的核酸（すなわち、生体試料に存在するmRNA）とオリゴヌクレオチド・アレイの成分との間のその他の相互作用によって生じるハイブリダイゼーション・シグナルをいう。また、バックグラウンド・シグナルは、アレイ成分それ自体の内部蛍光によって生じ得る。
【０１８０】
単一のバックグラウンド・シグナルを全てのアレイに対して算出することができ、または異なるバックグラウンド・シグナルをそれぞれの標的核酸に対して算出することができる。一つの態様において、バックグラウンドは、使用されるオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも5〜10パーセントに対するか、または異なるバックグラウンド・シグナルをそれぞれの標的遺伝子に対して算出する場合は、それぞれの遺伝子についてプローブの少なくとも5〜10パーセントに対する平均ハイブリダイゼーション・シグナル強度として、算出される。特定の細胞周期遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド・プローブが、十分にハイブリダイズして、それゆえに特異的に標的配列と結合するように見える場合、バックグラウンド・シグナルの算出にこれらを使用するべきではない。または、バックグラウンドは、試料中に見いだされるいずれの配列に対しても相補的ではないプローブ（たとえば、逆のセンスの核酸に対する、または試料中に見いだされない遺伝子に対するプローブ）に対するハイブリダイゼーションによって生じた平均ハイブリダイゼーション・シグナル強度として算出することができる。マイクロアレイ法において、バックグラウンドは、全く何らのオリゴヌクレオチド・プローブも無いアレイの領域によって生じる平均シグナル強度として算出することができる。
【０１８１】
c.PCRに基づいた方法
もう一つの態様において、PCRに基づいた方法は、遺伝子発現を検出するために使用される。これらの方法は、リアルタイムおよび端点定量的逆転写酵素を媒介したポリメラーゼ連鎖反応法（Q-RTPCR）を含む、逆転写酵素を媒介したポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）を含む。これらの方法は、当技術分野において周知である。たとえば、定量的PCR法は、たとえば、Applied BiosystemsおよびStratagene（登録商標）によって商業的に入手可能であるキットおよび方法を使用して行うことができる。また、Kochanowski, QUANTITATIVE PCR PROTOCOLS （Humana Press, 1999）； Innis et al.,前記； Vandesompele et al., Genome Biol. 3： RESEARCH0034 （2002）； Stein, Cell Mol. Life Sci. 59： 1235 （2002）を参照されたい。
【０１８２】
また、遺伝子発現は、Q-RTPCRを使用して溶液中で観察することができる。Q-RTPCRは、PCR産物の増幅の間に比例的に産生される蛍光シグナルの検出に依存する。Innis et al., 前記を参照されたい。従来のPCR法のように、この技術は、関心対照のDNA領域の逆の鎖および隣接する領域にハイブリダイズする、典型的には15〜30塩基のPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。さらに、プローブ（たとえば、TaqMan（登録商標）, Applied Biosystems）は、PCR技術において伝統的に使用されるフォワード（forward）とリバース（reverse）・プライマーとの間の標的配列に対してハイブリダイズするようにデザインされている。プローブは、5'末端が6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）および失活剤フルオロフォア様6-カルボキシ-テトラメチルローダミン（TAMRA）などのリポーター・フルオロフォアで標識されている。プローブが無傷である限り、蛍光エネルギー移動が生じて、クエンチング・フルオロフォアによるリポーター・フルオロフォアの蛍光発光の吸収を生じる。しかし、Taqポリメラーゼは、プライマーを延長するので、Taqの5'から3へのヌクレアーゼ活性によりプローブを分解し、リポーター・フルオロフォアを放出する。増幅サイクルの間に検出される蛍光シグナルの増加は、それぞれのサイクルにおいて産生される産物の量に比例する。
【０１８３】
フォワードおよびリバース増幅プライマー、ならびに内部ハイブリダイゼーション・プローブは、標的遺伝子の転写物に由来する1つのヌクレオチドと特異的かつ一義的にハイブリダイズするようにデザインされる。一つの態様において、プライマーおよびプローブ配列のための選択基準には、TaqMan（登録商標）の要求に対応するために、ヌクレオチド含量およびサイズに関する制約を組み入れる。
【０１８４】
SYBR Green（登録商標）は、上で議論したTaqman（登録商標）型アッセイ法に代わるプローブのないQ-RTPCRとして使用することができる。ABI PRISM（登録商標） 7900 SEQUENCE DETECTION SYSTEM USER GUIDE APPLIED BIOSYSTEMS, chap. 1-8, App. A- F.（2002）。
【０１８５】
装置により、PCR増幅の間の蛍光放出強度の変化を測定する。測定は、「リアルタイム」で、すなわち増幅産物が反応に蓄積するにつれてなされる。プローブ消化によって生じる蛍光の変化を測定するために、その他の方法を使用することができる。たとえば、蛍光偏光法により、分子反転頻度に基づいて大分子と小分子との間を区別することができる（たとえば、米国特許第5,593,867号を参照されたい）。
【０１８６】
d.タンパク質検出法
タンパク質は、免疫学的方法、酵素アッセイ法、およびタンパク質アレイ／プロテオミクス技術を含む当技術分野において公知の任意の手段によって観察することができる。
【０１８７】
翻訳状態の測定は、いくつかのタンパク質法に従って行うことができる。たとえば、タンパク質全のゲノムモニタリング--「プロテオーム」--を、固定された、SEQ ID NO:261〜497のいずれかのアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:1〜237の遺伝子によってコードされるタンパク質またはこれらの保存的変異体を有する複数のタンパク質に特異的な、好ましくはモノクローナル抗体を結合部位に含むマイクロアレイを構築することにより、行うことができる。Wildt et al., Nature Biotechnol. 18： 989 （2000）を参照されたい。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するのための方法は、Harlow & Lane, ANTIBODIES： A LABORATORY MANUAL （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に記載されたとおりに、周知である。
【０１８８】
または、タンパク質は、二次元ゲル電気泳動系によって分離することができる。二次元ゲル電気泳動は、当技術分野において周知であり、典型的には、第一次元に沿って等電点電気泳動を、続いて第二次元に沿ってSDS-PAGE電気泳動法をすることを含む。たとえば、Hames et al,, GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS： A PRACTICAL APPROACH （IRL Press, 1990）を参照されたい。生じるエレクトロフェログラムは、質量分析の技術、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングおよび免疫ブロット分析、ならびに内部およびN末端マイクロシークエンシングを含む多くの技術によって解析することができる。
【０１８９】
3.表現型および組織発育に対する遺伝子発現の相関
上で議論したように、本発明は、植物表現型に対して遺伝子発現を相関させるための方法およびツールを提供する。遺伝子発現を関心対象の表現型を有する植物において検査して、表現型を有しないか、または異なる表現型を有する植物と比較してもよい。このような表現型は、増大された乾燥耐性、除草剤耐性、減少または増大された丈、減少または増大した枝分かれ、増強された寒冷および凍結耐性、改善された生長力、増強された色、増強された健康および栄養的な特徴、改善された貯蔵、増強された収率、増強された耐塩性、増強された腐食に対する木材の耐性、増強された真菌症に対する耐性、改変された害虫に対する誘引性、増強された重金属耐性、増大された耐病性、増大された昆虫耐性、増大された水ストレス耐性、増強された甘味、改善された肌目、減少されたリン酸含量、増大された発芽、増大された微量栄養素の取り込み、改善されたデンプン組成、改善された花の寿命、新規樹脂の産生、および新規タンパク質またはペプチドの産生を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１９０】
もう一つの態様において、表現型は、以下の特徴の1つまたは複数を含む：あて材を形成する傾向、減少された未成熟期間、増大された未成熟期間、自己離層形成によって脱落する枝、促進された生殖発生、または遅延された生殖発生。
【０１９１】
さらなる態様において、比較する植物において異なる表現型は、以下の1つまたは複数を含む：リグニン品質、リグニン構造、木材組成物、木材外観、木材密度、木材強度、木材硬度、セルロース重合、繊維寸法、内腔サイズ、その他の植物成分、植物細胞分裂、植物細胞発育、単位領域あたりの細胞の数、細胞サイズ、細胞形態、細胞壁組成、木材形成率、木材の美的外観、幹の欠陥の形成、平均ミクロフィブリル角度、S2細胞壁層の幅、成長率、枝の栄養発生に対する根の根形成比率の割合、葉面積指数、および葉形。
【０１９２】
表現型は、上で議論したように任意の適切な手段によって評価することができる。
【０１９３】
さらなる態様において、遺伝子発現は、細胞周期の所与の位置、植物発育における所与の位置、および所与の組織試料に相関させることができる。植物組織は、細胞周期の異なる段階にて、異なる発育時期の植物組織から、年の種々の時期（たとえば、春対夏）の植物組織から、異なる環境条件（たとえば、光および温度のバリエーション）を受ける植物組織から、および／または植物組織および細胞の異なる型から調べることができる。一つの態様によれば、植物組織は、成熟の種々の段階の間に、および年の異なる季節の間に得られる。たとえば、植物組織は、幹の分裂細胞、分化している木部、初期発育中の木材細胞、分化した春材細胞、分化した晩材細胞から収集することができる。
【０１９４】
本発明の精神または範囲から逸脱することなく、種々の修正およびバリエーションを本発明の方法および組成物において行うことができることが当業者に明らかである。従って、本発明は、本発明の修飾およびバリエーションを包含することが企図されるが、これらが添付の請求の範囲およびこれらの均等の範囲内になることを条件とする。
【０１９５】
以下の実施例は、本発明を例示するために示される。しかし、本発明は、これらの実施例に記載されている特定の条件または詳細に限定されるわけではないことが理解されるはずである。明細書を通じて、米国特許を含む公的に利用できる文書についての任意のおよび全ての参照は、具体的にこれらの全体が参照として組み入れられる。
【実施例】
【０１９６】
実施例1
実施例1は、針葉樹針、木部、形成層、および師部から得られるRNAのために特に有用であるRNA抽出ならびに精製のための手順を例証する。
【０１９７】
組織は、針葉樹針、木部、形成層、または師部から得られる。組織は、液体窒素で凍結して粉砕する。総RNAをコンサート植物RNA試薬（Invitrogen）を使用して抽出する。生じるRNA試料をフェノール：クロロホルム中に抽出して、DNaseで処理する。次いで、RNAを65℃で2分間インキュベートし、続いて4℃で30分間遠心分離する。遠心分離に続いて、混入物を除去するためにRNAを少なくとも10回フェノールに抽出する。
【０１９８】
RNAは、RNeasyカラム（Qiagen）を使用してさらにきれいにする。精製したRNAはRibo Green試薬（Molecular Probes）を使用して定量し、ゲル電気泳動法によって純度を評価する。
【０１９９】
次いで、RNAをMessage Amp（Ambion）を使用して増幅する。アミノアリル-UTPおよび遊離UTPを4：1アミノアリル-UTP対UTPの比率で精製したRNAのインビトロ転写に添加する。アミノアリル-UTPは、これが転写されるについれて新たなRNA鎖に組み入れられる。次いで、アミノアリル基をCy色素と反応させ、RNAで使用するために改変したAmersham法を使用して、生じる増幅されたRNAに対して比色標識を付着させる。取り込まれない色素をエタノール沈殿によって除去する。標識されたRNAを分光光度によって定量する（NanoDrop）。標識されたRNAを、Hughes et al., Nature Biotechnol. 19：342 （2001）に記載されたとおりに95℃まで加熱することによって断片化する。
【０２００】
実施例2
実施例2は、ラジアータマツにおいて木材発育のために重要な細胞周期遺伝子をどのように決定することができ、マイクロアレイに使用するために、これらの遺伝子に一義的に結合するオリゴヌクレオチドをどのようにデザインし、合成することができるかを例証する。
【０２０１】
種ラジアータマツのマツの木は、天然の光条件下で生長させる。組織試料は、たとえばSterky et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 95：13330 （1998）に記載されたとおりに調製される。特に、組織試料は、5メートルの高さを有する木質樹木から収集する。木質樹木の組織試料は、幹の形成層領域を通って接線方向切片をとることによって調製する。幹は、未成熟（頂部）から成熟（底部）の範囲の切片に水平に切断する。発育の段階によって分けた幹切片は、師部、分化している師部、形成層、分化している木部、発育している木部、および成熟した木部の切片に剥離することによって5層にさらに分ける。また、葉、芽、シュート、および根を含む組織試料は、種ラジアータマツの実生から調製する。
【０２０２】
RNAを単離し、実施例1またはSterky et al., 前記に記載されたように、ESTを作製した。発育している木材を含む試料に由来するESTの核酸配列を、植物細胞周期に関与することが公知の遺伝子の核酸配列と比較する。また、発育している木材を含まない試料からのESTを、植物細胞周期に関与することが公知の遺伝子の配列と比較する。インシリコでのハイブリダイゼーション解析は、BLAST（NCBI）を使用して行う。発育中の木材を含む試料から作製したESTに対してインシリコでハイブリダイゼーションを示すが、発育中の木材を含んでいない試料からのESTに対してハイブリダイズしない、公知の細胞周期遺伝子の中からの配列を、さらなる検査のために選択する。
【０２０３】
木材優先発現を示す遺伝子に対してハイブリダイズする配列を含むcDNAクローンを、分子生物学の技術分野における周知の技術を使用してcDNAライブラリーから選択する。配列情報を使用して、それぞれのオリゴヌクレオチドがライブラリー内の1つのcDNA配列のみに対して特異的であるようにオリゴヌクレオチドをデザインする。オリゴヌクレオチド配列は、表14に提供してある。Li and Stormo, 前記の方法を使用して、またはArrayDesigner、GeneScan、およびProbeSelectなどのソフトウェアを使用して、60merオリゴヌクレオチド・プローブをデザインする。
【０２０４】
次いで、オリゴヌクレオチドをHughes et al., Nature Biotechnol. 19：324（2002）に記載されているか、またはKane et al., Nucleic Acids Res. 28：4552 （2000）に記載されているとおりにインサイチューで合成し、5'アミノリンカーを使用して活性化されたガラススライド（Sigma-Genosis, The Woodlands, TX）に貼り付ける。スライド上のそれぞれのオリゴヌクレオチドの位置は、公知である。
【０２０５】
実施例3
実施例3は、ユーカリプタス・グランディスにおいて木材発育のために重要な細胞周期遺伝子をどのように決定することができ、マイクロアレイに使用するために、これらの遺伝子に一義的に結合するオリゴヌクレオチドをどのようにデザインし、合成することができるかを例証する。
【０２０６】
ユーカリプタス・グランディス種のユーカリ樹木は、天然の光条件下で生長させる。組織試料は、たとえばSterky et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 95：13330 （1998）に記載されたとおりに調製する。特に、組織試料は、5メートルの高さを有する木質樹木から収集する。木質樹木の組織試料は、幹の形成層領域を介して接線方向切片をとることによって調製する。幹は、未成熟（頂部）から成熟（底部）の範囲の切片に水平に切断する。発育の段階によって分けた幹切片は、師部、分化している師部、形成層、分化している木部、発育している木部、および成熟した木部の切片に剥離することによって5層にさらに分ける。また、葉、芽、シュート、および根を含む組織試料は、種ラジアータマツの実生から調製する。
【０２０７】
RNAを単離し、実施例1またはSterky et al., 前記に記載されたように、ESTを作製した。発育中の木材を含む試料に由来するESTの核酸配列を、植物細胞周期に関与することが公知の遺伝子の核酸配列と比較する。また、発育している木材を含まない試料からのESTを、植物細胞周期に関与することが公知の遺伝子の配列と比較する。インシリコでのハイブリダイゼーション解析は、たとえばAudic and Claverie, Genome Res. 7： 986 （1997）に記載されているように行う。発育中の木材を含む試料から作製したESTに対してインシリコでハイブリダイゼーションを示すが、発育中の木材を含んでいない試料からのESTに対してハイブリダイズしない、公知の細胞周期遺伝子の中からの配列を、さらなる検査のために選択する。
【０２０８】
木材優先発現を示す遺伝子に対してハイブリダイズする配列を含むcDNAクローンを、分子生物学の技術分野における周知の技術を使用してcDNAライブラリーから選択する。配列情報を使用して、それぞれのオリゴヌクレオチドがライブラリー内の1つのcDNA配列のみに対して特異的であるようにオリゴヌクレオチドをデザインする。オリゴヌクレオチド配列は、表14に提供してある。Li and Stormo, 前記の方法を使用して、またはArrayDesigner、GeneScan、およびProbeSelectなどのソフトウェアを使用して、60merオリゴヌクレオチド・プローブをデザインする。
【０２０９】
次いで、オリゴヌクレオチドをHughes et al., Nature Biotechnol. 19：324（2002）に記載されているか、またはKane et al., Nucleic Acids Res. 28：4552 （2000）に記載されているとおりにインサイチューで合成し、5'アミノリンカーを使用して活性化されたガラススライド（Sigma-Genosus, The Woodlands, TX）に貼り付ける。スライド上のそれぞれのオリゴヌクレオチドの位置は、公知である。
【０２１０】
実施例4
実施例4は、実施例2と同様に調製したオリゴヌクレオチド・マイクロアレイを使用して、木材形成に重要であるラジアータマツ細胞周期遺伝子の発現を検出する方法を例証する。これは、成熟相師部（P）、形成層（C）、形成層の下に見いだされる膨脹している木部（X1）および同じ生長輪においてより深くで見いだされ、分化し、かつ木質化している木部（X2）から調製したaRNA試料を使用して行ったバランスのとれた不完全ブロック計画実験の実施例である。この実施例では、細胞周期遺伝子発現を4つの試料、すなわち、P、C、X1、およびX2間で比較する。
【０２１１】
夏に、ラジアータマツ種の植物を倒して、主茎の樹皮を穏やかに直ちに引き離して、師部および木部を暴露させる。次いで、液体窒素の別々の容器内に、師部および木部を小刀で剥がす。液体窒素の別々の容器内に、樹木からの針状葉（葉）および芽を小刀で剥がす。RNAは、その後、実施例1に記載されているように冷凍組織試料から単離する。等マイクログラム量の総RNAを、製造業者の説明書に従ってRNeasyミニ・カラム（Qiagen, Valencia, CA）を使用してそれぞれの試料から精製する。
【０２１２】
増幅反応をP、C、X1、およびX2組織試料のそれぞれについて行う。増幅反応は、AmbioのMessageAmpキット、T7に基づいた増幅手順を使用して、製造業者の説明書したがって（増幅段階の間に標識されたaaUTPを試薬混合物に添加することを除く）行う。aaUTPは、この段階の間に形成される、生じるアンチセンスRNAに取り込まれる。CyDye蛍光標識を、実施例1に記載されているように非酵素反応でaaUTPsに結合する。標識された増幅アンチセンスRNAを沈殿し、洗浄し、次いでNanoDrop分光光度計を使用して純度をアッセイする。P、C、X1、およびX2組織試料から単離されたRNAに対応する、これらの標識されたアンチセンスRNAは、P、C、X1、およびX2試料と称する試料核酸を構成する。
【０２１３】
公知の核酸の規準化対照試料を、シグナルの定量化のために、500、200、100、50、25、および10pg/μlの段階希釈でそれぞれの試料に添加する。また、ハウスキーピング遺伝子などのマツの全ての組織における発現を示す特異的遺伝子に対応するポジティブ対照を植物試料に添加する。
【０２１４】
4つのマイクロアレイのそれぞれを、125μLのP、C、X1、およびX2と共に、カバーガラス下で42℃において16〜18時間インキュベートする。アレイを1×SSC、0.1% SDS中で10分間、および次に、0.1×SSC,0.1% SDS中で10分間洗浄し、乾燥させる。
【０２１５】
アレイ・スライドを、Axonレーザースキャナーを使用して走査し、GenePix Proソフトウェアを使用して解析する。GenStat SASまたはSpotfireソフトウェアを使用して、マイクロアレイ・スライドからのデータをマイクロアレイ・データ分析に供する。孤立値を除き、それぞれのデータセットについてのレシオメーター・データを、差動的色素バイアスおよび空間効果を補正するために適用される立方スプラインフィットを使用する全体的規準化を使用して規準化する。第二の変換を行って、対照シグナル比率を平均のlog2=0（すなわち、1：1比率）にフィットさせる。次いで、規準化されたデータを分散分析に供する。
【０２１６】
マイクロアレイ・スライド上の任意の所与の位置のそれぞれのシグナルについての平均シグナル強度をP、C、X1、およびX2試料マイクロアレイ・スライドの3つのそれぞれについて決定する。平均シグナル／プローブ位置を、平均を算出するために使用されなかった試料スライド上の同じ位置におけるシグナルと比較する。たとえば、所与の位置の平均シグナルをP、C、およびX1について決定し、X2マイクロアレイ・スライドにおける位置をP、C、およびX1平均シグナル値と比較する。
【０２１７】
表1は、その他の3つの試料の平均シグナルと比較した任意の1つの試料で、2倍以上のシグナルを有する遺伝子を示す。
【０２１８】
（表１）
2011097941.tif 000003
P=師部
C=形成層
X1 =木部層-1 
X2 =木部層-2
PvCX12 =師部標的対形成層、木部層1、木部層2標的についての平均シグナルの比
【０２１９】
データは、WD40リピートタンパク質Aが、発育中の木部層におけるよりも形成層において高度に発現されていないWD40リピートタンパク質をコードし、一方、WD40リピートタンパク質Bが、その他の組織においてよりも師部においてより高度に発現されているWD40リピートタンパク質をコードすることを示す。
【０２２０】
次いで、シグナルデータをRT-PCRで検証して、プローブ内の独特のオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子の標的組織における遺伝子発現を確認する。
【０２２１】
実施例5
実施例5は、密度、剛性、強度、枝間の距離、および旋回木理などの農業経済学的に重要な木材表現型と細胞周期遺伝子発現を相関させることができる方法を証明する。
【０２２２】
成熟したクローンとして繁殖するマツを優れた増殖特性および重要な真菌症耐性に関して、公知の親樹木の子孫の中から選択する。樹皮を接線断面から除いて、胸の高さの第5年輪の平均木材密度、木材の剛性および強度、ならびに旋回木理について樹木を検査する。また、樹木を、これらの高さ、主要な枝間の平均距離、樹冠サイズ、およびフォーキング（forking）によって特徴づける。
【０２２３】
密度、剛性、強度、枝間の距離、旋回木理、およびこれらの特徴に影響を及ぼす任意の遺伝子にリンクされる可能性のあるその他の特徴に影響を及ぼす主要遺伝子を分離する実生ファミリーを得るために、共通の親ではない樹木を、これらが密度、剛性、強度、枝間の距離、および旋回木理基準に関して互いから最も広範なバリエーションを示すことを基準にして、特定の交配種を選択する。こうして、高密度、主要枝間の低平均距離、および高旋回木理を示すプラス樹木由来の花粉を、最低の密度、最高の主要枝間平均距離、および最低の旋回木理を示す選択の中の無関係なプラス樹木由来の球果を受粉するために使用する。「プラス樹木」は、たとえば、高密度を示すプラス樹木由来の花粉を、高密度を示す別のプラス樹木から発生する球果を受粉するために使用し、および低い主要枝間平均距離を示す樹木由来のの花粉を、低い主要枝間の平均距離を示す別のプラス樹木から発生する球果を受粉するために使用するように、交雑される点に留意することが有用である。
【０２２４】
種子をこれらの制御された受粉から収集し、親の同一性がそれぞれの種子について維持されるように育てて、それぞれの遺伝子型が複数のラミートによって表されるように、栄養繁殖のために使用する。栄養繁殖は、微細繁殖、生け垣で囲うこと、または小束切断を使用して達成される。それぞれの遺伝子型のいくつかのラミートを貯蔵し、一方でそれぞれの遺伝子型の植物ムカゴを地面定植の確立のために十分なサイズに成長させる。遺伝子型により、複製デザイン（replicated design）に整列させて、1日の温度および雨量が測定され、かつ記録される圃場条件下で成長させる。
【０２２５】
樹木を種々の年齢にて測定し、密度、剛性、強度、枝間距離、旋回木理、およびこれらの特徴に影響を及ぼす任意の遺伝子にリンクされ得る任意のその他の観察可能な特徴の発現、ならびに分離を決定する。試料を、セルロース含量、リグニン含量、セルロースミクロフィブリル角度、密度、強度、剛性、仮導管形態、環幅等の特徴づけのために収集する。また、実施例4にて説明したように、遺伝子発現について試料を検査する。それぞれの遺伝子型のラミートを、これらの特徴についての年齢：年齢相関を確立するために、異なる年齢で同じ遺伝子型のラミートと比較する。
【０２２６】
実施例6
実施例6は、実施例4と同様に調製したマイクロアレイを使用して、どのように、植物発生の段階、ならびに光および季節などの環境条件への反応を、細胞周期遺伝子発現に相関させることができるかを証明する。特に、木材密度と関係する遺伝子発現の変化を検査する。
【０２２７】
3つの異なるクローンに繁殖されたユーカリプタス.グランディス・ハイブリッド遺伝子型の樹木を、1日の温度および雨量を測定する気象観測所を持つ場所で成長させる。春およびその後の夏の間に、3つの異なる遺伝子型の遺伝的に同一のラミートを、最初に、植物の未成熟および成熟部分の樹皮特徴を示すのに十分な分解能での写真撮影を使用して南北方向マークとともに撮影し、次いで実施例4と同様に倒す。樹木の年齢は、定植記録によって決定し、年輪のカウントによって確認する。各々のこれらの樹木において、成熟木材は、胸の高さ以下の樹木の最も外側の環として定義され、未成熟木材は、胸の高さ以上の樹木の最奥の環として定義される。それぞれの樹木は、以下のとおりに扇形に切る：
NM-北側 成熟
SM-南側 成熟
NT-北側 過渡期
ST-南側 過渡期
NJ-北側 未成熟
SJ-南側 未成熟
【０２２８】
組織は、植物樹幹から、ならびに未成熟および成熟形態の葉から収集する。試料は、植物形態学的および生化学的特性、ならびに遺伝子発現解析を含む表現型解析のために同時に調製する。それぞれの領域を採取した箇所の樹木の高さおよび直径を記録し、化学的アッセイのために樹木の基部から土壌試料を採取する。遺伝子発現解析のために調製した試料は、重量を量り、マイクロアレイ実験に使用するためのRNA試料をその後に調製するために、液体窒素に入れる。組織は、以下の通りに意味する：
P-師部
C-形成層
X1-膨張している木部
X2-分化し、木質化している木部
【０２２９】
樹幹の各々の領域からの接線および放射状切片の薄いスライスを、解剖学的調査および木材発育時期の確認のためにRuzin, Plant Microtechnique and Microscopy, Oxford University Press, Inc., New York, NY （1999）に記載されたように固定する。ミクロフィブリル角度を木材の種々発育段階において、たとえばユーカリプタス・グランディスの未成熟、過渡期、および成熟期において検査する。検査されるその他の特徴は、導管要素に対する繊維の比およびそれぞれの領域の放射組織である。加えて、試料は、繊維形態、内腔サイズ、およびS2（最も厚い）細胞壁層の幅などの未成熟と成熟した木材との間、ならびに春材と夏材との間で変化する特徴について検査する。試料は、木材アッセイ法の当業者に周知の技術を使用して、第5年輪の密度の測定および弾性係数の決定について検査する。たとえば、Wang, et al., Non-destructive Evaluations of Trees, EXPERIMENTAL TECHNIQUES, pp. 28-30 （2000）を参照されたい。
【０２３０】
生化学的分析については、各々の収穫試料から50グラムを凍結乾燥し、単糖、アミノ酸、脂質、その他の抽出物、リグニン、およびセルロースの質について植物生化学の当業者に周知の生化学的アッセイ法を使用して解析する。たとえば、Pettersen & Schwandt, J. Wood Chem. & Technol. 11：495 （1991）を参照されたい。
【０２３１】
本実施例では、比較のために選択した表現型は、高密度木材、平均密度木材、および低密度木材である。春および夏に収集した樹木からの核酸試料を、実施例3に記載したように調製する。ハイブリダイゼーションおよびデータ分析による遺伝子発現プロファイリングは、上記のとおりに行う。
【０２３２】
同様の技術およびクローン繁殖された固体を使用して、細胞周期遺伝子発現を検査することができ、これを強度、剛性、および螺旋性などのその他の複雑な木材特徴に関連させる。
【０２３３】
実施例7
実施例7は、本発明のオリゴヌクレオチド・プローブが細胞周期遺伝子のファミリー間の高度に相同的なメンバーを区別する能力を証明する。アレイ上の特定のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより、調査したその他の遺伝子型において観察されるよりも高い密度の木材を有する遺伝子型において強く発現される独特のWD40遺伝子を同定する。また、WD40遺伝子は、未成熟木材におけるよりも成熟した木材において、より強く、かつ春材におけるよりも夏材においてより強く発現される。この遺伝子は、葉または芽において高レベルで発現されることは見いだされていない。
【０２３４】
遺伝子発現パターンは、RT-PCRによって確認する。この遺伝子（推定上の「密度関連」遺伝子）を固定放射切片のインシチューハイブリダイゼイションのために使用する。密度関連WD40遺伝子は、木部が主に、ほとんど導管成分ではなく、ほとんど木部放射組織細胞ではない線維で構成される幹の領域の維管束形成層に最も強くハイブリダイズする。
【０２３５】
これらの結果は、WD40遺伝子産物が、頂端または葉において重要であり得るものなどの軸の細胞分裂ではなく、形成層において生じ、かつ直径の成長を生じる放射状細胞分裂において機能することを示唆する。遺伝子に存在する高度に保存された領域は、同様の触媒機能を有する酵素をコードするが、軸または放射状分裂において作用する遺伝子と、それとの混同を生じるので、このような遺伝子は、cDNAマイクロアレイまたはその他の従来のハイブリダイゼーション手段によって同定するのが困難である。さらに、細胞分裂におけるこの遺伝子産物の機能を示唆する配列類似性に基づいた注釈、ならびにRT-PCRおよびインシリコ・ハイブリダイゼーションによって確認されるこのマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション・パターンの観察から、この遺伝子産物は、特に、次生木部を発育する際に線維の細胞分裂パターンを導くように機能して、その結果、この遺伝子のより高い発現により、導管成分または光線産生と比較してより優れた線維産生を生じる。繊維含有率は、基礎的密度の変異の少なくとも10%の原因である主成分解析（PCA）変数と相関される。
【０２３６】
実施例8
実施例8は、どのように、本発明のオリゴヌクレオチド・プローブの使用を、相同遺伝子のファミリーの中から、ある木材「密度関連」WD40リピートタンパク質遺伝子およびそのプロモーターを同定するために使用することができるかを証明する。さらに、本実施例は、どのように、本方法を使用して同定されたプロモーター配列が、同じ種の野生型植物と比較して、その他の硬材種を形質転換して増大された直径成長速度を生じさせるために使用されるかを証明する。
【０２３７】
プロモーター領域を含む5'フランキング配列を単離するために、WD40遺伝子の配列を使用して、ゲノム・ウォーカー・ライブラリーをプローブする。次いで、プロモーター領域をβ‐グルクロニダーゼ・リポーター遺伝子に作動可能に連結して、米国特許出願第60/476,222号に記載されている方法を使用して、ユーカリ属に形質転換するためのバイナリーベクターにクローン化する。次いで、再生したトランスジェニック・タバコおよびユーカリ属植物を区分して、X-glucを使用して染色し、マイクロアレイ・データにより、導管成分または木部放射組織よりも多くの線維を発生する幹の部分のみにおいて、高度に形成層特異的な発現が可能なプロモーターが単離されることを証明する。
【０２３８】
分子生物学の当業者に周知の技術を使用し、次いでプロモーターを細胞分裂促進遺伝子に作動可能に連結し、細胞分裂促進遺伝子が常に維管束形成層におけるよりも強く発現されるように、この構築物をモミジバフウおよびハコヤナギなどの硬材植物に形質転換するためのバイナリーベクターに配置する。これにより、対照硬材植物と比較して、トランスジェニック硬材植物において増大された直径成長速度を生じる。
実施例9
【０２３９】
実施例9は、どのように密度関連ポリペプチを組織優先プロモーターに連結して、マツに発現させ、増大された木材密度をもつ植物を生じさせることができるかを証明する。
【０２４０】
早春の間により高度に発現される密度関連ポリペプチドを実施例7に記載されている方法によって同定する。プロモーターに作動可能に連結された密度関連ポリペプチドを有するDNA構築物を適切なバイナリーベクター内に配置して、Connett et al.,（米国特許出願第09/973088号および第09/973089号）に記載された方法を使用してマツに形質転換する。マツ植物をConnett et al.,前記に記載したとおりに形質転換し、トランスジェニック・マツ植物を、森林定植を確立するために使用する。密度関連DNA構築物で形質転換されていない対照マツ植物と比較して、トランスジェニック・マツ植物において、春材（早材）においてすら密度の増大が観察される。
【０２４１】
実施例10
分子生物学の当業者に周知の技術を用いて、実施例7 において単離された推定上の密度関連遺伝子の配列をアルファルファから単離されたゲノムDNAにおいて解析する。これにより、アルファルファの相同分子種の同定が可能に成り、次いでその配列を、RNAiノックアウト構築物を作製するために使用する。次いで、この構築物をアルファルファに形質転換する。たとえば、Austin et al.,. Euphytica 85, 381 (1995）を参照されたい。再生されたトランスジェニック植物は、より低い繊維含有率および木部における放射組織細胞含量の増大を示す。このような特性は、消化性（digestability）を改善して、同じ種の野生型アルファルファと比較して、このアルファルファを供給されたウシにおいてより高い増殖速度を生じる。
【０２４２】
実施例11
実施例11は、どのように、遺伝子発現解析を使用して望ましい表現型を有する成熟植物体に存在する遺伝子変異体を見いだすことができるかを証明する。このような変異体の有無は、成熟植物体の表現型を予測するために使用することができ、実生段階で植物をスクリーニングすることができる。本実施例は、ユーカリを使用するが、本明細書に使用される方法は、マツおよびその他の樹木種のための育種プログラムにも有用である。
【０２４３】
推定上の密度関連遺伝子の配列を使用して、以前の実施例に記載したとおりに密度が異なるユーカリ属から単離されたゲノムDNAをプローブする。異なる木材表現型の非トランスジェニック的に産生されたユーカリ属ハイブリッドを検査する。1つのハイブリッドは、高い木材密度を示し、もう一つのハイブリッドは、より低い木材密度を示す。コード領域の3'位の分子マーカーにより、より低密度の遺伝子変異体から高密度の遺伝子変異体を区別することが見いだされる。
【０２４４】
この分子マーカーにより、樹木がまだ実生段階である間に、樹木栽培家は可能性の高い密度プロファイリングについて非トランスジェニック・ユーカリ属ハイブリッドをアッセイすることができるが、マーカーの非存在下では、樹木栽培家は、樹木が成長するまで、収穫年齢での密度を確実に予測することができる前の複数年の間待たなければならない。これにより、高価な選別作業および結果として生じる間引年齢での浸食なく、実生段階で最高の樹木の選択的なアウトプラント（outplanting）が可能になる。この分子マーカーは、どの親が高密度異系交配子孫を生じるかについて決定するための繁殖プログラムにおいてさらに有用である。
【０２４５】
より高い、またはより低い木材密度の非トランスジェニック・ユーカリ属ハイブリッド樹木において頻繁に見られる変異体に対応しない遺伝子のコード領域の3'部分に見いだされる分子マーカーも、有用である。これらのマーカーは、繁殖プログラムにおいて、および造林地において、同一性追跡に使用するために、ユーカリ属の種々の遺伝子型からフィンガープリントをとるために有用であることが見いだされる。
【０２４６】
実施例12
本実施例は、商業的木材において重要である表現型の特徴、すなわち木材外観、剛性、強度、密度、繊維寸法、粗さ、セルロースおよびリグニン含量、抽出物含量などに寄与する遺伝子発現相違を同定するためのマイクロアレイをについて記載する。
【０２４７】
実施例2〜4のように、発育している木部、形成層、師部、葉、芽、根、およびその他の組織からのRNAの収集および単離するために、商業的に重要な木製品を生ずる属の木質の樹木（この場合マツ属およびユーカリ属において）を種々の部位から、および年の種々の時期に倒す。また、同じ属の実生から、RNAを単離する。
【０２４８】
全てのコンティグを、発育している木材を含む試料から単離されるRNAから作製されるESTおよび発育している木材を含まない種々の組織のRNAから作製されるESTの配列の両方と比較する。インシリコにおいて、主に発育している木材を含む試料から単離されるRNAから作製されるESTに対して、発育している木材を含んでいない試料から単離されるRNAから作製されるESTに対するよりも多くのハイブリダイゼーションを示すESTを含むコンティグにより、発育している木材に特に発現される可能性のある新規の遺伝子に相当することが決定される。次いで、これらのコンティグをパブリックドメイン配列に対してBLAST検索するために使用する。インシリコにおいて、公知の遺伝子または「仮定的タンパク質」だけを有すると注釈がついている遺伝子に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズしないこれらのコンティグを次の段階のために選択する。これらのコンティグは、木材優先発現を示すと考えられる推定上の新規の遺伝子である。
【０２４９】
木材優先発現を示す推定上の新規の遺伝子にハイブリダイズする配列を含む最も長いcDNAクローンを、分子生物学の当業者に周知の技術を使用してcDNAライブラリーから選択する。cDNAをシーケンスして、可能であれば、全長遺伝子-コード配列を非翻訳隣接配列ととともに得る。それぞれのオリゴヌクレオチド・プローブが、同じ属の樹木または実生だけから単離されたRNAから作製されたESTにおいて表される1つの配列だけに、高いストリンジェンシーでハイブリダイズするように、45〜80ヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）のひと配列を、木材優先発現を示す推定上の新規遺伝子の各々の配列から選択する。
【０２５０】
次いで、オリゴマーを化学的に合成して、実施例3に記載したように、マイクロアレイ・スライド上に配置する。それぞれのオリゴマーは、木材優先発現を示す推定上の新規遺伝子の特定の配列に対応し、およびその配列が、同じ属の樹木または実生から単離されたRNAから作製されたESTに表される他の遺伝子に対応しない。
【０２５１】
試料調整およびハイブリダイゼーションは、実施例4のとおりに行う。シグナルの存在は、保存された機能的ドメインまたは共通の進化歴のために、cDNAとの類似点を含む可能性のある多くの遺伝子のいずれかではなく、特定の遺伝子の発現の有意な証拠を表すので、本実施例で使用される技術は、cDNAプローブを使用するマイクロアレイの使用よりも有効である。従って、同じファミリーのものなどの、相同遺伝子群を区別することが可能性であるが、表現型の決定の際には異なる機能を有してもよい。
【０２５２】
従って、実施例4の方法を使用して得たハイブリダイゼーション・データにより、使用者が、同定することができる推定上の新規遺伝子のうちのいずれが、公知の遺伝子と協調した発現のパターン、特定の発生的役割と一致した発現のパターン、および／または遺伝子が有益な方法で発現を駆動するプロモーターを有することを示唆する発現のパターンを実際に有するかを同定することができる。
【０２５３】
本方法を使用して得られたハイブリダイゼーション・データは、たとえば発育している春材（早材）において最低のセルロースミクロフィブリル角度をもつ仮導管に特異的な発現パターンを示す推定上の新規の遺伝子を同定するために使用することができる。また、この遺伝子のプロモーターは、実施例8におけるように単離して、実施例9におけるように晩材（夏材）と関係することが示された遺伝子に作動可能に連結することができる。この構築物を含むトランスジェニック・マツ植物は、実施例9の方法を使用して作製し、次いで、これらの植物の春材が、より高いミクロフィブリル角度、より高い密度、より小さな平均内腔サイズ、その他などの晩材のいくつかの特徴を示すことが示される。
【０２５４】
実施例13
実施例13は、増大された植物バイオマスのための、細胞周期遺伝子に機能的に連結された形成層特異的プロモーターの使用を証明する。
【０２５５】
形成層特異的細胞周期転写物は、実施例4に記載したように、種々の第2の維管束（vasculature）層のアレイ解析を経て同定される。これらの転写物に対応する遺伝子に連結された候補プロモーターは、たとえば、BD クローンテック・ゲノム・ウォーカー・キット（Clontech GenomeWalker Kit）を使用してマツ・ゲノムDNAからクローン化し、形成層特異性／選択についてのリポーターアッセイによりトランスジェニック・タバコにおいて試験する。第2の木部細胞分裂に関与する細胞周期遺伝子を過剰発現する木部特異的プロモーターを木材バイオマスを増大するために使用する。直列型の木部特異的プロモーターを構築して、細胞周期遺伝子ORFを駆動させる。候補細胞周期遺伝子の転写物レベルの押し上げにより、増大された木部バイオマス表現型を生じる。
【０２５６】
実施例14
ユーカリプタス・グランディス由来cDNAクローンの単離および特徴付け
ユーカリプタス・グランディスcDNA発現ライブラリーは、成熟したシュート芽、早材師部、花組織、葉組織（2つの独立したライブラリ）、細根、構造根、木部、または早材木部から調製し、以下のとおりに構築して、スクリーニングした。
【０２５７】
総RNAは、Chang et al.（Plant Molecular Biology Reporter 11：113-116 （1993）のプロトコルを使用して植物組織から抽出した。mRNAは、Poly （A） Quik mRNA Isolation Kit（Stratagene, La Jolla, CA）またはDynal Beads Oligo（dT）25（Dynal, Skogen, Norway）のいずれかを使用して、総RNA標品から単離した。cDNA発現ライブラリーは、逆転写酵素合成によって精製したmRNAから構築して、続いて、製造業者のプロトコルを使用することによって、ZAP Express cDNA Synthesis Kit（Stratagene）を使用して生じるcDNAクローンをラムダZAPに挿入した。生じるcDNAは、ライブラリーに応じて5μLのライゲーション反応からのアリコート（1〜5αL）を使用して、Gigapack II Packaging Extract（Stratagene）を使用してパッケージした。ライブラリーの質量削除（Mass excision）は、ExAssistヘルパーファージ（Stratagene）と共にXL1-Blue MRF'細胞およびXLOLR細胞（Stratagene）を使用して行った。削除されたファージミドをNZYブロス（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）で希釈し、X-galおよびイソプロピルチオ-β-ガラクトシド（IPTG）を含むLB-カナマイシン寒天プレート上にまいた。
【０２５８】
まいて、DNAミニプレップのために選択したコロニーのうち、99%がシーケンシングのための適切な挿入物を含んだ。ポジティブ・コロニーを、カナマイシンを含むNZYブロス中で培養し、cDNAをアルカリ溶解およびポリエチレングリコール（PEG）沈澱によって精製した。1%のアガロースゲルを使用して、染色体混入のためのシーケンシング・テンプレートをスクリーニングした。色素プライマー配列は、製造業者のプロトコルに従ってTurbo Catalyst 800 machine（Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA）を使用して調製した。
【０２５９】
陽性クローンのDNA配列は、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Prism 377 シーケンサーを使用して得た。cDNAクローンは、最初に5'末端から、および場合によっては、3'末端からもシーケンスした。いくつかのクローンについては、内部配列は、pBK-CMVに差動的サイズ変更したサブクローンのライブラリーを得るエキソヌクレアーゼ III欠失解析を使用するか、または関心対象の遺伝子の領域を同定するようにデザインした遺伝子特異的なプライマーを使用する直接シーケンシングによるか、いずれかで得た。
【０２６０】
決定されたcDNA配列は、コンピュータ・アルゴリズムFASTAおよび／またはBLASTNを使用してEMBLデータベースの公知の配列と比較した。冗長配列の複数の整列を、信頼できるコンセンサス配列を構築するために使用した。その他の植物種由来の公知の配列に対する類似性に基づいて、単離されたポリヌクレオチド配列が、本明細書に詳述したとおりの転写因子をコードすることが同定された。ポリヌクレオチド配列に対応する予測されるポリペプチド配列も、その中に示してある。
【０２６１】
実施例15
ラジアータマツ由来のcDNAクローンの単離および特徴付け
ラジアータマツcDNA発現ライブラリー（シュート芽組織、懸濁培養細胞、早材師部（2つの独立したライブラリー）、密繖花序成長点組織、雄性円錐体、根（未知の系統）、細根、構造根、雌性円錐体、球果原基、雌性受容性球果、および木部（2つの独立したライブラリー）のいずれかから調製した）を構築し、実施例14において上記したとおりにスクリーニングした。
【０２６２】
ポジティブクローンのDNA配列を、フォワードおよびリバース・プライマーを使用して、Perkin Elmer／Applied Biosystems Division Prism 377シーケンサーで得て、決定した配列を、記のとおりにデータベースの公知の配列と比較した。
【０２６３】
その他の植物種由来の公知の配列に対する類似性に基づいて、単離されたポリヌクレオチド配列が、本明細書に詳述したような転写因子をコードすることが同定された。また、ポリヌクレオチド配列に対応する予測されるポリペプチド配列も、その中に示してある。
【０２６４】
実施例16
5'RACE単離
cDNAライブラリーの部分的cDNA配列のさらなる5'または3'配列を同定するために、SMART RACE cDNA増幅キット（Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif.）を使用してcDNA末端の5'および3'の迅速増幅（RACE）を行った。一般に、本方法は、最初にポリ（A）mRNAを単離することを必要とし、第1および第2鎖cDNA合成を行って二本鎖のcDNAを生じさせて、cDNA末端を平滑末端化し、次いでSMART RACEで結合させる。アダプターがライゲートしたds cDNAのライブラリーを形成するためのcDNAに対するアダプター。遺伝子特異的プライマーは、5'および3'RACE反応の両方のためのアダプター特異的なプライマーと共に使用するようにデザインした。5'および3'RACE反応を使用して、5'および3'RACE断片を得て、シーケンスし、クローン化した。本過程は、全長遺伝子の5'および3'末端が同定されるまで繰り返してもよい。全長cDNAは、エンドツーエンドPCR（end-to-end PCR）によって遺伝子の5'および3'末端に対して特異的なプライマーを使用するPCRによって作製してもよい。
【０２６５】
たとえば、第1鎖cDNA由来の遺伝子の失った5'領域を増幅するためには、プライマーをテンプレート配列の対向する鎖から、およびテンプレート配列の〜100〜200 bpの領域から5'→3'にデザインした。良好な増幅により、テンプレートの5'末端とPCR産物との間にDNA配列の〜100bpの重複を与えるはずである。
【０２６６】
RNAは、Concert Reagent Protocol（Invitrogen, Carlsbad, CA）ならびに標準的な単離および抽出手順を使用して、4つのマツ組織、すなわち実生、木部、師部、および組織上の根から抽出した。次いで、生じるRNAを10U/μl DNase I（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を使用してDNaseで処理した。100μgのRNAに対して、9μl 10×DNase緩衝液（Invitrogen, Carlsbad, CA）、10μlのRoche DNase I、および90μl Rnaseフリー水を使用した。次いで、RNAを室温で15分間インキュベートし、1/10体積の25mM EDTAを添加した。RNeasyミニ・キット（Qiagen, Venlo, The Netherlands）を製造業者のプロトコルに従ってRNA精製のために使用した。
【０２６７】
cDNAを合成するために、木部、師部、実生、および根から抽出されたRNAを使用し、SMART RACE cDNA増幅キット（Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, CA）を製造業者のプロトコルに従って行った。RACE PCRについては、4つの組織型からのcDNAを合わせた。PCRのためのマスター混合物は、木部、師部、根、および実生組織からの同量のcDNAを合わせることによって作製した。PCR反応は、96穴のPCRプレートにおいて行い、1μのプライマー希釈プレートからのプライマーを対応するウェル位置にまいた（10mM）。49μlのマスター混合物をプライマーと共にPCRプレートにアリコートをとった。熱サイクリングは、以下のパラメーターでGeneAmp 9700（Applied Biosystems, Foster City, CA）で開始した：
94℃（5秒）、
72℃（3分）、5サイクル；
94℃（5秒）、
70℃（10秒）、
72℃（3分）、5サイクル；
94℃（5秒）、
68℃（10秒）、
72℃（3分）、25サイクル。
【０２６８】
cDNAを標準的方法に従ってアガロースゲル上で分離した。ゲル断片を切除して、Qiagen 96穴ゲル溶出キットを使用して、製造業者の説明書に従ってゲルから溶出した。
【０２６９】
PCR産物は、以下の詳細に従って96穴プレートにおいて一晩pGEMTeasy（Promega, Madison, WI）にライゲートした：60〜80ngのDNA、5μl 2×迅速ライゲーション緩衝液、0.5μl pGEMTイージー・ベクター、0.1μl DNAリガーゼ、水で10μlに満たして一晩インキュベートした。
【０２７０】
それぞれのクローンを標準的方法に従って大腸菌に形質転換し、DNAを標準的なプロトコルに従って選択した12個のクローンから抽出した。DNA抽出およびDNA品質は、1%のアガロースゲル上で検査した。各々のクローン内の適切なサイズの挿入物の存在は、標準的な検査法に従って、制限エンドヌクレアーゼEcoRIを使用する制限消化、およびゲル電気泳動によって決定した。
【０２７１】
実施例17
EST配列の管理（Curation）
cDNAライブラリーの製作の間に、本来の転写物またはこれらのDNA対応物は、これらが機能的タンパク質をコードするのを防げる特色を有するかもしれない。挿入、欠失、塩基置換、またはスプライスされていないか、または十分にスプライスされていないイントロンがあるかもしれない。このような特色が存在する場合、たいてい、これらを同定することができ、その結果、これらを変化させることができる。同様の管理を、公共データベースの配列に対して相同性を有する他の任意の配列に対しても行うことができる。
【０２７２】
DNA配列の決定後、BLAST解析では、公的に利用できるシロイヌナズナ・ゲノム配列上のシロイヌナズナ遺伝子に関連することを示す。しかし、約240アミノ酸ポリペプチドをコードする代わりに、管理されているコンセンサスは、157アミノ酸残基のみの産物をコードすることが予測され、DNA配列に誤りがあることを示唆している。本当のコード領域をコードするであろうものを同定するために、それぞれのESTの終わりまでのDNA配列を、3つの読み枠のそれぞれに翻訳し、予測された配列をシロイヌナズナ遺伝子のアミノ酸配列と整列させる。ESTの一部分のDNAセグメントは、シロイヌナズナ遺伝子のカルボキシ末端に類似する配列をコードすることが見いだされる。従って、ESTには、スプライスされていないイントロンが存在するようである。
【０２７３】
スプライスされていないイントロンは、関心対象の遺伝子の過剰発現のためのクローン配列の使用に関しては比較的軽微な問題である。cDNAの転写により生じるRNAは、正常なプロセシングを受けてイントロンを除去することが予想され得る。また、アンチセンスおよびRNAi構築物は、関心対象の遺伝子を抑制するように機能することが予想される。その他の場合では、イントロンの正確な端を同定することが望ましく、その結果、これを除去することができる。問題の配列が高度に類似する公表された配列を有するときは、2つの配列を整列させて、配列同一性が低下する位置を同定することにより、イントロンが配列GTで開始し、かつ配列AGで終わるという知識の助けも借りて、イントロンを見いだすことができる。
【０２７４】
高度に類似する配列を入手できないために、イントロンの部位についていくらかの疑いがあるときは、イントロンの位置は、実験的に検証することができる。たとえば、DNAオリゴマーを疑わしいイントロンが位置する領域に隣接して合成することができる。供与源種からのRNA（マツ属またはユーカリ属のいずれか）を単離して、逆転写酵素を使用してcDNAを作成するための鋳型として使用する。次いで、選択したプライマーをPCR反応に使用して、cDNA集団から正しくスプライスされたDNAセグメント（本来のコンセンサスの対応するセグメントよりも小さな約350bpの予測サイズ）を増幅する。次いで、増幅されたセグメントを配列分析に供して、コンセンサス配列と比較して相違を同定する。
【０２７５】
選択的スプライシングイベント（部分的なイントロンが残っているか、またはエキソンの部分的な喪失）が疑われるときも、同じ手順を使用することができる。ESTが、少数の塩基の挿入または欠失などの小さな変化を有するときは、EST配列のコンピュータ解析により、間違ったサイズの翻訳産物が予測されるとき、または明らかなフレームシフトがある場合に、その位置をさらに示すことができる。真の配列の確認を、上記のとおりのプライマーの合成、新たなcDNAの産生、およびPCR増幅によって行う。
【０２７６】
実施例18
細胞周期遺伝子を含む構築物をもつポプラス・デルトイデス（Populus deltoides）の形質転換
【０２７７】
前述の実施例に記載し、および下記の表2に示したように作製した構築物を、それぞれの標準的技術によってアグロバクテリウム属培養液に播種する。
【０２７８】
表2では、実施例17に記載した構築のためのプラスミド、遺伝子、およびGenesis ID番号を特定する。
【０２７９】
（表２）
2011097941.tif 000004
【０２８０】
ポプラス・デルトイデス母株培養を、2.5μMゼアチンを含むDKW培地（Driver and Kuniyuki,1984, McGranahan et al. 1987、Sigma/Aldrichから市販）で、培養室において、16時間の光周期で維持した。形質転換のために、鋭い小刀刃を使用して、葉柄を母株から無菌的に切除し、4〜6mmの長さに切断し、収穫直後に1μg/ml BAPおよび1μg/ml NAAと共にDKW培地に配置して、暗いグロースチャンバ（28度）内で24時間インキュベートした。
【０２８１】
所望の構築物を含むアグロバクテリウム属培養を、0.8〜1.0Aの間のOD600によって示される対数期まで増殖し、次いで、ペレットにして、Woody Plant Medium塩（Lloyd, G., and McCown, B.,1981. Woody plant medium. Proc. Intern. Plant Prop. Soc. 30： 421、Sigma/Aldrichから市販）、5g／Lグルコース、および0.6g／L MESをpH 5.8にて含む同体積のアグロバクテリウム誘導培地（AIM）に再懸濁し、AIMのmlあたり、1μlのアセトシリンゴンの100mM保存液を添加した。ペレットをボルテックスすることによって再懸濁した。細菌細胞を環境チャンバ内にて28度Cで、この培地中で1時間、100rpmで振盪してインキュベートした。
【０２８２】
誘導期の後、ポプラス・デルトイデス外植片をアグロバクテリウム混合物に15分間曝露した。次いで、外植片を無菌紙タオル上で軽くブロットし、同じ植物培地に交換して、暗がりで18〜20度Cにて培養した。3日の共培養期間の後、外植片を、NAA濃度を0.1μg/mlに減少させ、かつ400mg／Lチメンチンを添加したDKW培地に移して、アグロバクテリウムを根絶させた。
【０２８３】
根絶培地で4日後に、外植片を、チメンチン（400mg／L）ならびに選択薬剤ジェネティシン（50mg／L）を補った同じ培地を含む小さなマゼンタの箱へ移した。外植片を2週ごとに新鮮な選択培地へ移した。選択存在下において成長するカルスを単離し、3週ごとに新鮮な選択培地に二次培養した。カルスを不定芽の産生について観察した。
【０２８４】
不定芽は、通常、形質転換の開始から2月以内に観察された。シュート伸長のために、これらのシュート・クラスターを、NAAを添加しておらず、かつBAP濃度を0.5μg.mlに減少させたDKW培地に、典型的には約14週間移した。細長いシュートを切除し、pH5.8にて、20g/1ショ糖および5g/1活性炭を含むBTM培地（Chalupa, Communicationes Instituti Forestalis Checosloveniae 13： 7-39,1983、Sigma/Aldrichから市販）に移した。下記の表3を参照されたい。
【０２８５】
（表３）ポプラス・デルトイデスのための発根培地
2011097941.tif 000005
【０２８６】
根の発生後、典型的には4週後、トランスジェニック植物を根切断法により温室内で、または11.4μMゼアチンを含むDKW培地での4週間の腋芽誘導を介してインビトロにおいて、繁殖させ、その後、増やしたシュートを分けて、根誘導培地に移した。根付いた植物を、温室および圃場条件における増殖の評価のために、土壌へ移した。
【０２８７】
実施例19
一定のサイクリンDの異所性発現によって媒介される不相応に大きな葉の産生
構築物あたり、ポプラス・デルトイデスの約100個の外植片に、構成的プロモーター（ラジアータマツ・スーパーユビキチン・プロモーター）によって駆動され、維管束において好ましい発現を正常に示す遺伝子を含むpGRW16およびpGRW19で形質転換した。再生により、トランス系統（transline）の多くのラミートの多くでは、対照植物と比較して不相応に大きな葉を有することが観察された。葉は、対照植物のものよりも長く、かつ広かった。
【０２８８】
不相応に大きな葉は、非常に有用な生育能、大きな葉サイズ、およびしたがって高生育能の早期指標となり得る。大きな葉サイズは、葉細胞の数が増大されたか、もしくは葉細胞サイズが増大されたか、または両方の作用であり得る。
【０２８９】
実施例20
サイクリンD遺伝子の異所性発現によって媒介される異常な維管束発達の産生
構築物あたり、ポプラス・デルトイデス約100個の外植片に、pGRW18を形質転換した。この実験から再生された複数のトランスジェニック系統が、非常に独特の多面的表現型を示した。これらのトランスジェニック系統の葉は、葉の全長さの中央脈下の両側に対称的に包まれた。これらの系統の多くの葉柄は、らせん上になっており、多くの場合、葉の右回り方向に360度回転した。幹は、中央近くでいくらかの肥大およびわずかな屈曲を示した。
【０２９０】
これらの表現型を示すトランスジェニック系統TDL002534の1つのラミートを犠牲にして、組織レベルでこれらの異常型を調査した。トルイジンブルーで染色した彎曲葉柄の横断面では、維管束の発達の遅延が明らかになったが、黒い矢印によって示したようにさらなる維管束環が存在した。彎曲葉柄の維管束環内の木部および師部は、発育的に似ており、かつ空間的に正しい位置に置かれているように見えた。直線状および彎曲した葉柄の縦方向切片は、らせん状になる現象の原因を提供し得る。彎曲葉柄は、彎曲の外側の反転がより細長い細胞、およびを葉柄の反対側に圧縮された細胞示した。
【０２９１】
おそらく、最も著明な表現型は、葉で同定された。葉柄と同様に、異常な維管束の発育は、より大きな中央脈に対して横向きの維管束環をさらに形成することを含むことに留意されたい。いくつかの切片では、ほとんど完全に形成された葉脈を、中央脈にすぐ隣接して見ることができる。折りたたみの表現型が強調される全ての例において、この種の葉の配置が表現型と関連した。
【０２９２】
通常は、少数の維管束または単一の中央脈が見られる場所でのさらなる維管束環の発育は、初期の維管束発育のレベルにおける異常な細胞分裂活性を示す。従って、構成的プロモーターではなく、むしろ維管束優先プロモーターの制御下で発現されるこの遺伝子は、後期の維管束発育における細胞分裂を増大し、さらなる木材を作製する際に有用性を有し得る。
【０２９３】
実施例21
本実施例は、どのように、P.ラジアータにおける木材発育に重要なポリヌクレオチドを決定することができるか、およびどのように、一義的にこれらの遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドを、マイクロアレイで使用するためにデザインし、合成することができるかを例証する。
【０２９４】
約16年齢の放任受粉した樹木は、タエダマツについては米国の、およびラジアータマツについてはニュージーランドの造林地栽培場（plantation-grown sites）から選択する。樹木は、春と夏の季節の間に倒して、これらの木材形成の異なる発育時期に関係する遺伝子の発現を比較する。樹木は、個々に倒して、樹幹切片を基部から約1〜2メートルで、かつ有効な樹冠の下の1〜2メートル以内の底部領域から除去する。樹幹の基部末端から除去した切片は、成熟木材を含む。有効な樹冠の下から除去した切片は、未成熟木材を含む。春の季節の間に収集される試料は、早材または春材と名付けられるが、夏の季節の間に収集される試料は、晩材または夏材とみなされる（Larson et al., Gen. Tech. Rep. FPL-GTR-129. Madison, WI： U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Forest Products Laboratory. p. 42）。
【０２９５】
組織を幹切片から単離し、その結果、師部、形成層、発育している木部、成熟木部が除去される。これらの組織は、今年の年輪だけから収集される。いずれの場合においても組織除去のとたんに、核酸およびその他の成分を保存するために、材料を液体窒素に直ちに投げ込む。樹皮は、かみそりの刃でこすることによって、樹皮の内面から除去した切片および師部組織から剥がす。形成層組織は、表面を穏やかに削ることによって剥がした切片の外層から単離する。発育している木部および木質化する木部は、経時的に残りの組織をより強く削ることによって単離する。組織は、RNA抽出およびその後の解析が行われるまで、液体窒素から-70℃で長期保存するための容器に移す。
【０２９６】
実施例22
本実施例は、特に針葉樹針、木部、形成層、および師部から得られたRNAに有用な、RNA抽出および精製のための手順を例証する。
【０２９７】
組織を針葉樹針、木部、形成層、または師部から得る。組織を液体窒素中で凍結し、粉砕する。総RNAをConcert Plant RNA試薬（Invitrogen）を使用して抽出する。生じるRNA試料をフェノール：クロロホルムに抽出し、DNaseで処理する。次いで、RNAを65℃で2時間インキュベートし、続いて4℃で30分間遠心分離する。遠心分離後、混入物を除去するために、RNAを少なくとも10回フェノールに抽出する。
【０２９８】
RNAを、RNeasyカラム（Qiagen）を使用してさらにきれいにする。精製したRNAを、RiboGreen試薬（分子プローブ）を使用して定量し、ゲル電気泳動によって純度を評価する。
【０２９９】
次いで、MessageAmp（Ambion）を使用してRNAを増幅する。アミノアリル-UTPおよび遊離UTPを4：1アミノアリル-UTP-対-UTPの比率で、精製したRNAのインビトロで転写に添加する。アミノアリル-UTPは、鎖が転写されるにつれて新たなRNAに取り込まれる。次いで、アミノ-アリル基をCy色素と反応させて、RNAで使用するために修飾したAmersham法を使用して、生じる増幅されたRNAに比色標識を付着させる。取り込まれない色素をエタノール沈殿によって除去する。標識されたRNAを分光光度的に定量化する（NanoDrop）。標識されたRNAをHughes et al., Nature Biotechnol. 19：342 （2001）に記載されているように95℃に加熱することによって断片化する
【０３００】
実施例23
本実施例は、どのように、P.ラジアータにおける木材発育に重要なポリヌクレオチドを決定することができるか、およびどのように、一義的にこれらの遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドを、マイクロアレイで使用するためにデザインし、合成することができるかを例証する。
【０３０１】
種P.ラジアータのマツの木を天然の光条件下で育てる。組織試料は、たとえば、Sterky et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. 95：13330 （1998）に記載されたとおりに調製する。具体的には、組織試料を5メートルの高さを有する木質樹木から収集する。木質樹木の組織試料は、幹の形成層の領域から接線方向断面を採取することによって調製する。幹は、未成熟（上部）から成熟（底面）範囲の切片に水平に切片にする。発育段階によって分けた幹切片を、師部、分化している師部、形成層、分化している木部、発育中の木部、および成熟した木部の切片に剥がすことによってさらに5層に分ける。また、葉、芽、シュート、および根を含む組織試料を種P.ラジアータの実生から調製する。
【０３０２】
RNAを単離し、ESTを上記実施例またはSterky et al.,前記に記載されているように作製する。発育中の木材を含む試料に由来するESTの核酸配列を、細胞周期に関与することが公知の遺伝子の核酸配列と比較する。また、発育中の木材を含まない試料に由来するESTを、植物細胞周期に関与することが公知の遺伝子の配列と比較する。インシリコ・ハイブリダイゼーション解析は、以下のとおりにBLAST（NCBI）を使用して行う。
【０３０３】
実施例24
ユーカリ属インシリコ・データ
インシリコでの遺伝子発現を使用して、コンセンサスESTライブラリーの一員を決定することができる。それぞれのライブラリーについて、コンセンサスは、任意の組織クラスにおけるESTの数を、1000を掛けたクラスのESTの総数で割ることによって決定される。これらの値は、ライブラリーからのシーケンシングの範囲による偏りのない規準化された値を提供する。生殖、生殖芽、栄養芽、果実、葉、師部、形成層、木部、根、幹、植物樹液、全草ライブラリーを含むいくつかのライブラリーでは、コンセンサス値のために試料をとった。
【０３０４】
以下に示すように、多数の本発明の配列が、維管束優先発現を示し（データベースをランダムに検索した場合、これらの配列によるヒットの50%以上が、発育中の維管束組織から作製されたライブラリーであると考えられる）、したがって、木材関連発育過程に関与する可能性が高い。データを表12に示してある。
【０３０５】
実施例25
マツ属インシリコ・データ
インシリコでの遺伝子発現を使用して、コンセンサスESTライブラリーの一員を決定することができる。それぞれのライブラリーについて、コンセンサスは、任意の組織クラスにおけるESTの数を、1000を掛けたクラスのESTの総数で割ることによって決定される。これらの値は、ライブラリーからのシーケンシングの範囲による偏りのない規準化された値を提供する。生殖、生殖芽、栄養芽、果実、葉、師部、形成層、木部、根、幹、植物樹液、全草ライブラリーを含むいくつかのライブラリーでは、コンセンサス値のために試料をとった。
【０３０６】
以下に示すように、多数の本発明の配列が、維管束優先発現を示し（データベースをランダムに検索した場合、これらの配列によるヒットの50%以上が、発育中の維管束組織から作製されたライブラリーであると考えられる）、したがって、木材関連発育過程に関与する可能性が高い。データを表13に示してある。
【０３０７】
実施例26
インシリコで発育中の木材を含む試料から作製したESTに対してハイブリダイゼーションを示すが、発育中の木材を含んでいない試料からのESTに対してハイブリダイズしない配列を、さらなる検査のために選択する。
【０３０８】
木材優先発現を示す遺伝子にハイブリダイズする配列を含むcDNAクローンを、分子生物学の技術分野の周知技術を使用して、cDNAライブラリーから選択する。配列情報を使用して、それぞれのオリゴヌクレオチドがライブラリーにおける1つのcDNA配列のみに対して特異的であるように、オリゴヌクレオチドをデザインする。オリゴヌクレオチド配列を表14に示してある。60merオリゴヌクレオチドプローブを、LiおよびStormo前記の方法を使用して、またはArrayDesigner、GeneScan、およびProbeSelectなどのソフトウェアを使用してデザインする。
【０３０９】
次いで、オリゴヌクレオチドをHughes et al., Nature Biotechnol. 19： 324 （2002）に記載したか、またはKane et al., Nucleic Acids Res. 28： 4552 （2000）に記載されているように、インサイチューで合成し、5'アミノリンカーを使用して、活性化したガラススライド（Sigma-Genosis, The Woodlands, TX）に貼り付ける。スライド上のそれぞれのオリゴヌクレオチドの位置は、公知である。
【０３１０】
実施例27
本実施例は、上記のとおりに調製したオリゴヌクレオチド・マイクロアレイを使用して、木材形成に重要であるラジアータマツ細胞周期遺伝子の発現を検出する方法を例証する。これは、成熟相師部（P）、形成層（C）、形成層の下に見いだされる膨脹している木部（X1）および同じ生長輪においてより深くで見いだされ、分化し、かつ木質化している木部（X2）から調製したaRNA試料を使用して行ったバランスのとれた不完全ブロック計画実験の実施例である。この実施例では、細胞周期遺伝子発現を4つの試料、すなわち、P、C、X1、およびX2間で比較する。
【０３１１】
夏に、ラジアータマツ種の植物を倒して、主茎の樹皮を穏やかに直ちに引き離して、師部および木部を暴露させる。次いで、液体窒素の別々の容器内に、師部および木部を小刀で剥がす。液体窒素の別々の容器内に、樹木からの針状葉（葉）および芽を小刀で剥がす。RNAは、その後、実施例1に記載されているように冷凍組織試料から単離する。等マイクログラム量の総RNAを、製造業者の説明書に従ってRNeasyミニ・カラム（Qiagen、Valencia、CA）を使用してそれぞれの試料から精製する。
【０３１２】
増幅反応をP、C、XI、およびX2組織試料のそれぞれについて行う。増幅反応は、AmbioのMessageAmpキット、T7に基づいた増幅手順を使用して、製造業者の説明書したがって行う（増幅段階の間に標識されたaaUTPを試薬混合物に添加することを除く）。aaUTPは、この段階の間に形成される、生じるアンチセンスRNAに取り込まれる。CyDye蛍光標識を、実施例1に記載されているように非酵素反応でaaUTPsに結合する。標識された増幅アンチセンスRNAを沈殿し、洗浄し、次いでNanoDrop分光光度計を使用して純度をアッセイする。P、C、X1、およびX2組織試料から単離されたRNAに対応する、これらの標識されたアンチセンスRNAは、P、C、X1、およびX2試料と称する試料核酸を構成する。
【０３１３】
公知の核酸の規準化対照試料を、シグナルの定量化のために、500、200、100、50、25、および10pg／μ1の段階希釈でそれぞれの試料に添加する。また、ハウスキーピング遺伝子などのマツの全ての組織における発現を示す特異的遺伝子に対応するポジティブ対照を植物試料に添加する。
【０３１４】
4つのマイクロアレイのそれぞれを、125μLのP、C、X1、およびX2と共に、カバーガラス下で42℃において16〜18時間インキュベートする。アレイを1×SSC、0.1% SDS中で10分間、および次に、0.1×SSC,0.1% SDS中で10分間洗浄し、乾燥させる。
【０３１５】
アレイ・スライドを、Axonレーザースキャナーを使用して走査し、GenePix Proソフトウェアを使用して解析する。GenStat SASまたはSpotfireソフトウェアを使用して、マイクロアレイ・スライドからのデータをマイクロアレイ・データ分析に供する。孤立値を除き、それぞれのデータセットについてのレシオメーター・データを、差動的色素バイアスおよび空間効果を補正するために適用される立方スプラインフィットを使用する全体的規準化を使用して規準化する。第二の変換を行って、対照シグナル比率を平均のlog2=0（すなわち、1：1比率）にフィットさせる。次いで、規準化されたデータを分散分析に供する。
【０３１６】
マイクロアレイ・スライド上の任意の所与の位置のそれぞれのシグナルについての平均シグナル強度をP、C、X1、およびX2試料マイクロアレイ・スライドの3つのそれぞれについて決定する。平均シグナル／プローブ位置を、平均を算出するために使用されなかった試料スライド上の同じ位置におけるシグナルと比較する。たとえば、所与の位置の平均シグナルをP、C、およびX1について決定し、X2マイクロアレイ・スライドにおける位置をP、C、およびX1平均シグナル値と比較する。
【０３１７】
表5は、その他の3つの試料の平均シグナルと比較した任意の1つの試料で、2倍以上のシグナルを有する遺伝子を示す。
【０３１８】
（表５）
2011097941.tif 000006
P=師部
C=形成層
X1 =木部層-1 
X2 =木部層-2
PvCX12 =師部標的対形成層、木部層1、木部層2標的についての平均シグナルの比
【０３１９】
データは、WD40リピートタンパク質Aが、発育中の木部層におけるよりも形成層において高度に発現されていないWD40リピートタンパク質をコードし、一方、WD40リピートタンパク質Bが、その他の組織においてよりも師部においてより高度に発現されているWD40リピートタンパク質をコードすることを示す。
【０３２０】
次いで、シグナルデータをRT-PCRで検証して、プローブ内の独特のオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子の標的組織における遺伝子発現を確認する。
【０３２１】
実施例28
本実施例は、どのように、複数のマツ種、この場合P.ラジアータおよびタエダマツP.タエダ樹木由来の組織のRNAを、実施例4に記載したP.ラジアータcDNA配列に由来するマイクロアレイを使用して、樹木の未成熟木材および成熟した木材を形成する木材の切片における木材発育に関連した遺伝子発現のパターンの解析のために選択するかを例証する。
【０３２２】
約16年齢の放任受粉した樹木は、タエダマツについては米国の、およびラジアータマツについてはニュージーランドの造林地栽培場から選択する。樹木は、春と夏の季節の間に倒して、これらの木材形成の異なる発育時期に関係する遺伝子の発現を比較する。樹木は、個々に倒して、樹幹切片を基部から約1〜2メートルで、かつ有効な樹冠の下の1〜2メートル以内の底部領域から除去する。樹幹の基部末端から除去した切片は、成熟木材を含む。有効な樹冠の下から除去した切片は、未成熟木材を含む。春の季節の間に収集される試料は、早材または春材と名付けられるが、夏の季節の間に収集される試料は、晩材または夏材とみなされる。Larson et al., Gen. Tech. Rep. FPL-GTR-129. Madison, WI： U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Forest Products Laboratory. p. 42。
【０３２３】
組織を幹切片から単離し、その結果師部、形成層、発育している木部、成熟木部が除去される。これらの組織は、今年の年輪だけから収集される。いずれの場合においても組織除去のとたんに、核酸およびその他の成分を保存するために、材料を液体窒素に直ちに投げ込む。樹皮は、かみそりの刃でこすることによって、樹皮の内面から除去した切片および師部組織から剥がす。形成層組織は、表面を穏やかに削ることによって剥がした切片の外層から単離する。発育している木部および木質化する木部は、経時的に残りの組織をより強く削ることによって単離される。組織は、RNA抽出およびその後の解析が行われるまで、液体窒素から-70℃で長期保存するための容器に移す。
【０３２４】
実施例29
本実施例は、RNA抽出および精製のための、特に種々の木本の組織から得られたRNAに有用な、上記実施例に使用したものに代わる手順、ならびに実施例4に記載されているアレイを使用するハイブリダイゼーションおよびデータ分析のための手順を例証する。
【０３２５】
RNAは、Chang et al., Plant Mol. Biol. Rep. 11：113のプロトコルに従って単離する。DNAは、DNase I （Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して製造業者の推奨に従って除去する。RNA試料の完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, USA）を使用して決定する。
【０３２６】
それぞれの組織からの10μgの総RNAを、公知の方法を使用してcDNAに逆転写する。
【０３２７】
ラジアータマツ師部組織の場合、通常のラベリング法のために十分な量の総RNAを抽出することが困難であり得る。総RNAは、前述したように抽出され、および処理され、100ngの総RNAを、NuGEN（商標）（NuGEN, CA, USA）からのオベーション（商標）・ナノ試料RNA 増幅系（Ovation（商標）Nanosample RNA Amplification system）を使用して増幅する。Ambionによって製造されたものなどの同様の増幅キットを使用してもよい。増幅されたRNAは、cDNAに逆転写して、上記のとおりに標識する。
【０３２８】
ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー洗浄は、42℃で「Methods and Kits for Labeling and Hybridizing cDNA for Microarray Analysis」（前記）についての米国特許出願に記載したとおりのプロトコルを使用して行う。アレイ（スライド）は、ScanArray 4000 Microarray Analysis System（GSI Lumonics, Ottawa, ON, Canada）を使用して走査する。生の、非規準化された強度値は、QUANTARRAYソフトウェア（GSI Lumonics, Ottawa, ON, Canada）を使用して作製する。
【０３２９】
完全平衡、不完全ブロック実験計画法（fully balanced, incomplete block experimental design：Kerr and Churchill, Gen. Res. 123： 123, 2001）を、解析したデータから最大統計的推論ができるアレイ実験をデザインするために使用する。
【０３３０】
遺伝子発現データは、SAS（登録商標）マイクロアレイ解決手段ソフトウェア・パッケージ（Microarray Solution software package：The SAS Institute, Cary, NC, USA）を使用して解析する。次いで、生じるデータをJMP（登録商標）（The SAS Institute, Cary, NC, USA）を使用して視覚化した。
【０３３１】
この実験のために行った解析は、混合モデル仕様での分散分析アプローチである（Wolfinger et al., J. Comp. Biol. 8：625-637）。線形混合モデルの2つの段階が適用される。第1の段階（正常化モデル）は、スライドレベルでの全体的な正常化のために適用される。第2の段階（遺伝子モデル）は、それぞれの遺伝子に対して厳密な統計的推論を行うために適用される。両モデルは、モデル（1）および（2）に述べてある。
log2（Yijkls）=θij+Dk+Sｌ+DSkl+ωijkls（1）
Rijkls（g）=μij（g）+Dk（g）+Sl（g）+DSkl（g）+SSls（g）+εijkls（g）（2）
【０３３２】
Yijklsは、k番の色素をi番の株化細胞に対してj番の処理を適用したl番のスライドにおけるs番目のスポットの強度を表す。θij、Dk、Sｌ、およびDSklは、i番の株化細胞におけるj番の処理の平均効果、k番の色素効果、l番のスライド・ランダム効果、およびl番のスライドにおけるk番の色素のランダム相互作用効果を表す。ωijklsは、確率論的誤差項である。これらがg番の遺伝子に特異的であること以外は、θji、Dk、Sl、およびDSklと同様の役割を表す。Rijkls（g）は、モデル（1）からのg番の遺伝子の残りを表す。μij（g）、Dk（g）、Sl（g）、およびDSkl（g）は、これらがg番の遺伝子に特異的であること以外は、θij、Dk、Sl、およびがDSklと同様の役割を表す。SSls（g）は、g番の遺伝子に対するスライド・ランダム効果によるスポットを表す。εijkls（g）は、確率論的誤差項を表す。全てのランダム項は、それぞれのモデル内において正常に分布され、相互に独立していると想定される。
【０３３３】
上記解析によれば、一定のcDNA（これらのうちのいくつかは、表6に示してある）が、差動的に発現されていることが分かる。
【０３３４】
（表６）
2011097941.tif 000007
【０３３５】
木材発育におけるこれらの特異的な遺伝子の関与は、木材発育の特定の段階に対する遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの関与から推定される。特定の季節および木の幹の位置での切片（師部、形成層、発育している木部、成熟木部）を超えた木材発生の空間群集連続（spatial continuum）、ならびに季節および木の幹の位置の関係は、両方とも木材発育における関連に対する遺伝子発現を関連させるときに考慮される。
【０３３６】
実施例30
本実施例は、密度、剛性、強度、枝間の距離、および旋回木理などの農業経済学的に重要な木材表現型と多糖体遺伝子発現を相関させることができる方法を証明する。
【０３３７】
成熟したクローンとして繁殖するマツを優れた増殖特性および重要な真菌症耐性に関して、公知の親樹木の子孫の中から選択する。樹皮を接線断面から除いて、胸の高さの第5年輪の平均木材密度、木材の剛性および強度、ならびに旋回木理について樹木を検査する。また、樹木を、これらの高さ、主要な枝間の平均距離、樹冠サイズ、およびフォーキングによって特徴づける。
【０３３８】
密度、剛性、強度、枝間の距離、旋回木理、およびこれらの特徴に影響を及ぼす任意の遺伝子にリンクされる可能性のあるその他の特徴に影響を及ぼす主要遺伝子を分離する実生ファミリーを得るために、共通の親ではない樹木を、これらが密度、剛性、強度、枝間の距離、および旋回木理基準に関して互いから最も広範なバリエーションを示すことを基準にして、特定の交配種を選択する。こうして、高密度、主要枝間の低平均距離、および高旋回木理を示すプラス樹木由来の花粉を、最低の密度、最高の主要枝間平均距離、および最低の旋回木理を示す選択の中の無関係なプラス樹木由来の球果を受粉するために使用する。「プラス樹木」は、たとえば、高密度を示すプラス樹木由来の花粉を、高密度を示す別のプラス樹木から発生する球果を受粉するために使用し、および低い主要枝間平均距離を示す樹木由来のの花粉を、低い主要枝間の平均距離を示す別のプラス樹木から発生する球果を受粉するために使用するように、交雑される点に留意することが有用である。
【０３３９】
種子をこれらの制御された受粉から収集し、親の同一性がそれぞれの種子について維持されるように育てて、それぞれの遺伝子型が複数のラミートによって表されるように、栄養繁殖のために使用する。栄養繁殖は、微細繁殖、生け垣で囲うこと、または小束切断を使用して達成される。それぞれの遺伝子型のいくつかのラミートを貯蔵し、一方でそれぞれの遺伝子型の植物ムカゴを地面定植の確立のために十分なサイズに成長させる。遺伝子型により、複製デザインに整列させて、1日の温度および雨量が測定され、かつ記録される圃場条件下で成長させる。
【０３４０】
樹木を種々の年齢で測定し、密度、剛性、強度、枝間距離、旋回木理、およびこれらの特徴に影響を及ぼす任意の遺伝子にリンクされ得る任意のその他の観察可能な特徴に影響を及ぼす遺伝子の発現を決定する。試料を、セルロース含量、リグニン含量、セルロースミクロフィブリル角度、密度、強度、剛性、仮導管形態、環幅等の特徴づけのために収集する。次いで、多岐にわたる硬直および密度、またはその他の特徴を示す樹木の複製した試料から、さもなければ成長の習性ができるだけ同じである遺伝子型から、早材および晩材の発育をアッセイするための春および秋に、RNAを収集する。これらの試料を上記実施例に記載されているのと同様に遺伝子発現について調べる。
【０３４１】
（表７）コンセンサスID情報
2011097941.tif 000008
【０３４２】
それぞれの遺伝子型のラミートを、これらの特徴についての年齢：年齢相関を確立するために、異なる年齢で同じ遺伝子型のラミートと比較する。
【０３４３】
実施例31
実施例8は、どのように、光および季節などの環境条件への反応が、植物表現型を変更し、マイクロアレイを使用する細胞周期遺伝子発現に相関させることができるかを証明する。特に、木材密度と関係する遺伝子発現の変化を検査する。
【０３４４】
3つの異なるクローンに繁殖されたE.グランディス・ハイブリッド遺伝子型の樹木を、1日の温度および雨量を測定する気象観測所を持つ場所で成長させる。春およびその後の夏の間に、3つの異なる遺伝子型の遺伝的に同一のラミートを、最初に植物の未成熟および成熟部分の樹皮特徴を示すのに十分な分解能での写真撮影を使用して南北方向マークと共に撮影し、次いで倒す。樹木の年齢は、定植記録によって決定し、年輪のカウントによって確認する。各々のこれらの樹木において、成熟木材は、胸の高さ以下の樹木の最も外部の環として定義され、未成熟木材は、胸の高さ以上の樹木の最奥の環として定義される。それぞれの樹木は、以下のとおりにそれに応じて扇形に切る：
NM-北側 成熟
SM-南側 成熟
NT-北側 過渡期
ST-南側 過渡期
NJ-北側 未成熟
SJ-南側 未成熟
【０３４５】
組織は、植物樹幹から、ならびに未成熟および成熟形態の葉から収集する。試料は、植物形態学的および生化学的特性、ならびに遺伝子発現解析を含む表現型解析のために同時に調製する。それぞれの領域を採取した箇所の樹木の高さおよび直径を記録し、化学的アッセイのために樹木の基部から土壌試料を採取する。遺伝子発現解析のために調製した試料は、重量を量り、マイクロアレイ実験に使用するためのRNA試料をその後に調製するために、液体窒素に入れる。組織は、以下のとおりを意味する：
P-師部
C-形成層
X1-膨張している木部
X2-分化し、木質化している木部
【０３４６】
樹幹の各々の領域からの接線および放射状切片の薄いスライスを、解剖学的調査および木材発育時期の確認のためにRuzin, Plant Microtechnique and Microscopy, Oxford University Press, Inc., New York, NY （1999）に記載されたように固定する。ミクロフィブリル角度を木材の種々発育段階において、たとえばユーカリプタス・グランディスの未成熟、過渡期、および成熟期において検査する。検査されるその他の特徴は、導管要素に対する繊維の比およびそれぞれの領域の放射組織である。加えて、試料は、繊維形態、内腔サイズ、およびS2（最も厚い）細胞壁層の幅などの未成熟と成熟した木材との間、ならびに春材と夏材との間で変化する特徴について検査する。試料は、木材アッセイ法の当業者に周知の技術を使用して、第5年輪の密度の測定および弾性係数の決定について検査する。たとえば、Wang, et al., Non-destructive Evaluations of Trees, EXPERIMENTAL TECHNIQUES, pp. 28-30 （2000）を参照されたい。
【０３４７】
生化学的分析については、各々の収穫試料から50グラムを凍結乾燥し、単糖、アミノ酸、脂質、その他の抽出物、リグニン、およびセルロースの質について植物生化学の当業者に周知の生化学的アッセイ法を使用して解析する。たとえば、Pettersen & Schwandt, J. Wood Chem. & Technol. 11：495 （1991）を参照されたい。
【０３４８】
本実施例では、比較のために選択した表現型は、高密度木材、平均密度木材、および低密度木材である。春および夏に収集した樹木からの核酸試料を、実施例3に記載したように調製する。ハイブリダイゼーションおよびデータ分析による遺伝子発現プロファイリングは、上記のとおりに行う。
【０３４９】
同様の技術およびクローン繁殖された固体を使用して、細胞周期遺伝子発現を検査することができ、これを強度、剛性、および螺旋性などのその他の複雑な木材特徴に関連させる。
【０３５０】
実施例32
実施例32は、増大された植物バイオマスのための、本出願の遺伝子に機能的に連結された維管束特異的プロモーターの使用を証明する。
【０３５１】
次いで、維管束優先プロモーターを本出願の遺伝子のうちの1つに連結し、樹木種を形質転換するために使用する。形質転換体の木部における候補遺伝子の転写物レベルが押し上げられたことにより、木部バイオマス表現型の増大を生じる。
【０３５２】
もう1つの実施例では、次いで、ArborGenの2003年11月の特許出願のいずれかなどの、維管束優先プロモーターを本出願の遺伝子のうちの1つに由来する配列を含むRNAi構築物に連結し、遺伝子が単離された属の樹木を形質転換するために使用する。形質転換体の木部における候補遺伝子の転写物レベルが減少されたことにより、木部バイオマス表現型の増大を生じる。
【０３５３】
実施例33
ベクターpARB476を以下の段階を使用して開発した。ブルースクリプトベクター（Stratagene、La Jolla、CA）を、KpnlおよびClaI部位にてスーパーユビキチン3'UTRおよび3'ターミネーター配列を付加することによって修飾して、ベクターpARB005（SEQ ID NO:773）を作製した。このベクターに、イントロンと共にP.ラジアータ・スーパーユビキチンプロモーターを付加した。最初に、プロモーター／イントロン配列を、標準的なPCR技術、ならびにSEQ ID NO:774および775のプライマーを使用して、米国特許第番号6,380,459号において同定されるP.ラジアータ・スーパーユビキチン配列から増幅した。次いで、増幅された断片を、XbaIおよびPstI制限消化を使用してpARB005に結合し、ベクターpARB 119（SEQ ID NO:776）を作製した。
【０３５４】
ポプラス・デルトイデスUDBグルコース結合ドメイン遺伝子（特許国際公開公報第0071670号、ptCelA Genbank番号AF072131）は、標準的なPCR技術、ならびに5'プライマーの一部としてATGとClaI部位とを含み、かつ3'プライマーとしてTGAとClaI部位とを含むプライマーを使用して増幅した。次いで、増幅された断片をpARB 119のClaI部位にクローン化して、ベクターpARB476（SEQ ID NO:777）を作製した。
【０３５５】
pARB476からのイントロン：：UDPグルコース結合ドメイン：:3'UTR：nosターミネーターと共にP.ラジアータ・スーパーユビキチン・プロモーターを含むNotIカセットを除去して、pART29のNotI部位にクローン化し、ベクターpARB483を作製した。バイナリーベクターpART29は、nos5’プロモーターの代わりにシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン3（UBQ3）プロモーターを含み、かつlacZ配列のない、修飾されたpART27ベクター（Gleave、Plant Mol. Biol. 20：1203-1207, 1992）である。
【０３５６】
SEQ ID 773
2011097941.tif 000009
【０３５７】
SEQ ID 774
2011097941.tif 000010
【０３５８】
SEQ ID 775
2011097941.tif 000011
【０３５９】
SEQ ID 776
2011097941.tif 000012
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【０３６０】
SEQ ID 777
2011097941.tif 000014
2011097941.tif 000015
2011097941.tif 000016
【０３６１】
（表８）pGrowth情報
2011097941.tif 000017
【０３６２】
growth100プラスミドを作製するために、アクセプター・ベクター（pWVK202）を最初にpARB483a由来のNotI-SUBIN：：UDPGBD：：nos term-NotIカセットをプラスミドpWVK147のNotIに挿入することによって構築した。次に、UDPGBD遺伝子を、PstIおよびClaI制限部位を使用して除去した。制限部位PstI、NheI、AvrII、ScaI、およびClaIを含むポリリンカーをUDPGBD遺伝子の代わりに挿入された。AvrIIおよびNheIは、両方ともSpeIに適合性であり、部位は、Genesisによって提供されるプラスミドにおいて見いだされることが多い。ScaIは、平滑であり、そして任意の断片をブラントにして、次いでアクセプターベクター内のその位置に挿入することができる。プラスミドをGenesisから受け取って、アクセプターベクターpWVK202サブクローニングするためにどの部位が最も適切かについて決定するために解析した。ライゲーションを行った後、生じる産物を広範なダイジェスト解析によって調べて、所望のプラスミドが作製されたことを確認した。
【０３６３】
（表９）ユーカリプタス・グランディス細胞周期遺伝子およびタンパク質
2011097941.tif 000018
2011097941.tif 000019
2011097941.tif 000020
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【０３６４】
（表１０）ラジアータマツ細胞周期遺伝子およびタンパク質
2011097941.tif 000022
2011097941.tif 000023
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【０３６５】
（表１１）本発明のアノテーションされたペプチド配列
2011097941.tif 000025
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【０３６６】
（表１２）ユーカリプタス・インシリコのデータ
2011097941.tif 000074
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2011097941.tif 000080
【０３６７】
表12において、以下の番号1〜12は、以下の組織を表す：1は、芽生生殖細胞であり；2は、芽生栄養細胞であり；3は、形成層であり；4は、果実であり；5は、葉であり；6は、師部であり；7は、生殖細胞であり；8は、根であり；9は、樹液栄養細胞であり；10は、幹であり；11は、全体であり；および12は、木部である。
【０３６８】
（表１３）マツ・インシリコのデータ
2011097941.tif 000081
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2011097941.tif 000090
【０３６９】
表13において、以下の番号1〜12は、以下の組織を表す：1は、芽生生殖細胞であり；2は、芽生栄養細胞であり；3は、形成層であり；4は、果実であり；5は、葉であり；6は、師部であり；7は、生殖細胞であり；8は、根であり；9は、樹液栄養細胞であり；10は、幹であり；11は、全体であり；および12は、木部である。
【０３７０】
（表１４）オリゴ表
2011097941.tif 000091
2011097941.tif 000092
2011097941.tif 000093
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2011097941.tif 000095
2011097941.tif 000096
【０３７１】
（表１５）ペプチド表
2011097941.tif 000097
2011097941.tif 000098
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【０３７２】
（表１６）BLAST配列整列表
2011097941.tif 000156
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【０３７３】
表の一覧
【０３７４】
表1は、その他の3つの試料の平均シグナルと比較した、任意の一つの試料で２倍以上のシグナルを有する遺伝子を示す。
【０３７５】
表2は、実施例17に記載したプラスミド、遺伝子、および構築物のためのGenesis ID番号を同定する。
【０３７６】
表3：ポプラス・デルトイデスのための発根培地。
【０３７７】
表4：pGrowth情報。
【０３７８】
表5は、その他の3つの試料の平均シグナルと比較した、任意の一つの試料で２倍以上のシグナルを有する遺伝子を示す。
【０３７９】
表6：差動的に発現されたcDNA。
【０３８０】
表7：コンセンサスID情報。
【０３８１】
表8：pGrowth情報。
【０３８２】
表9：ユーカリプタス・グランディス細胞周期遺伝子およびタンパク質。
【０３８３】
表10：ラジアータマツ細胞周期遺伝子およびタンパク質。
【０３８４】
表11：本発明のアノテーションされたペプチド配列。
【０３８５】
表12：ユーカリ属のインシリコ・データ。
【０３８６】
表13：マツ属のインシリコ・データ。
【０３８７】
表14：オリゴ表。
【０３８８】
表15：ペプチド表。
【０３８９】
表16：BLAST配列整列表。
【０３９０】
2011097941.tif 000188
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2011097941000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月9日(2010.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1〜237およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
CDKの5つのサブクラスがあり、それぞれが、異なるサイクリン結合コンセンサス配列を有する。CDK A型では、サイクリン結合コンセンサス配列は、PSTAIRE(SEQ ID NO: 778)である。Id。CDK B-1、B-2、およびC型のサイクリン結合コンセンサス配列は、それぞれPPTTLRE(SEQ ID NO: 779)、PPTALRE(SEQ ID NO: 780)、およびPITAIRE(SEQ ID NO: 781)である。Joubes et al, Plant Physiol, 126：1403-15 （2001）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
有糸分裂サイクリンは、リジンリッチ領域に隣接して、破壊ボックス（destruction box）と呼ばれるN末端領域に位置するコンセンサス配列（R-x-x-L-x-x-I-x-N, SEQ ID NO: 782）を有する。破壊ボックスおよびリジンリッチ領域は、有糸分裂の間に、有糸分裂サイクリンをユビキチン依存性タンパク質分解の標的にする。Stals、前記361にて、およびFowler、前記126にて。Aサイクリンに対してBサイクリンにおける破壊ボックスは、わずかに異なり、この相違がAサイクリンに対してBサイクリンの分解にわずかに異なるタイミングを生じることが考えられる。Fowler、前記126にて。A型サイクリンは、細胞周期のS期、G2期、および初期M期の間に蓄積するが、一方B型サイクリンは、後期G2期および初期M期の間に蓄積する。Mironov et al., Plant Cell 11： 509-22 （1999）。植物ではA型サイクリンの3つの亜群が公知であるが、動物では1つだけが公知である。サイクリンA1（cycA1；zm；1トウモロコシ（Zea cans）由来）は、細胞質分裂の間に、微小管を含む隔膜形成体にて最も濃縮されている。サイクリンA2の発現は、根のオーキシンによって、および茎頂のサイトカイニンによってアップレギュレートされる。Abrahams et al., Biochim. Biophys. Acta 28：1-2 （2001）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体のいずれか1つの配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むDNA構築物を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含むDNA構築物で形質転換された植物細胞である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含むDNA構築物で形質転換された植物細胞を含む、トランスジェニック植物である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:261〜520のいずれか1つから選択されるポリペプチドの触媒ドメインまたは基質結合ドメインをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO:261〜520のいずれか1つから選択される該ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:1〜260のいずれかの配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むDNA構築物で植物細胞を形質転換する段階、および植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物細胞を培養する段階を含む、形質転換された植物を作製する方法である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むDNA構築物で植物を形質転換する段階；植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物を培養する段階；および、植物から木材を得る段階を含む、木材を作製する方法である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明は、さらに、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を有するポリヌクレオチドを含むDNA構築物で植物を形質転換する段階；植物の増殖を促進する条件下で形質転換された植物を培養する段階；および植物から木材パルプを得る段階を含む、木材パルプを作製する方法を提供する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
また、本発明は、261〜520からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本発明は、SEQ ID NO:1〜260のいずれか1つによってコードされるポリペプチドの植物における発現を変更することを含む、植物の植物表現型を変更する方法をさらに提供する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:521〜772からなる群より選択される核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明の局面は、第1の試料においてSEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第2の試料において1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の試料における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の試料における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1と第2の試料との間の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルの相違を相関させる段階を含む、2つの異なる試料中の遺伝子発現を相関させる方法である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明のさらなる局面は、表現型を有する第1の植物において、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；表現型を欠いている第2の植物において、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の植物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の植物における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、表現型を有する第1と第2の植物との間の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルの相違を相関させる段階を含む、1つまたは複数の遺伝子の植物における遺伝子発現レベルに対して植物表現型の所有を相関させる方法である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
さらなる局面において、本発明は、細胞周期の第1の段階の第1の植物細胞において、SEQ ID NO:1〜260およびこれらの保存的変異体からなる群より選択される核酸配列によってコードされる産物をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；細胞周期の第2の異なる段階の第2の植物細胞において、1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出する段階；第1の植物細胞における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、第2の植物細胞における1つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する段階；ならびに、第1および第2の細胞周期の段階に対して、第1と第2の試料間の1つまたは複数遺伝子の発現レベルにおける相違を相関させる段階を含む、遺伝子発現を細胞周期の段階に相関させる方法を提供する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本発明の局面は、2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子の発現を検出するための組み合わせであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜260からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズすることができる組み合わせである。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本発明のもう一つの局面は、2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、1つまたは複数の遺伝子の発現を検出するための組み合わせであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜260からなる群より選択される核酸配列によってコードされる核酸配列にハイブリダイズすることができる組み合わせである。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本発明は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜260からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズすることができるか、またはそれぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜260からなる群より選択される核酸配列によってコードされる核酸配列にハイブリダイズすることができる2つ以上オリゴヌクレオチドを含み、2つ以上のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、固体支持体上の独特の位置を占有する、1つまたは複数遺伝子の発現を検出するための組み合わせを含むマイクロアレイをさらに提供する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
もう一つの局面において、本発明は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜260からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる2つ以上のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階；および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする関心対象の1つまたは複数の遺伝子を検出する段階を含む、試料中の1つまたは複数の遺伝子を検出するための方法を提供する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
また、本発明は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:1〜260からなる群より選択される核酸配列を含む遺伝子によってコードされる核酸配列に対して、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる2つ以上のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階；および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする1つまたは複数の核酸配列を検出する段階を含む、試料中の1つまたは複数の遺伝子によってコードされる1つまたは複数の核酸配列を検出するための方法を提供する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本明細書の全体を通じて、細胞周期遺伝子産物についての言及がなされる。本明細書に使用される「細胞周期遺伝子産物」は、細胞周期遺伝子によってコードされる産物であり、RNAなどのヌクレオチド産物、ならびにタンパク質およびポリペプチドなどのアミノ酸産物の両方を含む。本発明の特異的な細胞周期遺伝子の例は、SEQ ID NO:1〜260を含む。本発明の特定の細胞周期遺伝子産物の例は、SEQ ID NO:1〜260のいずれか一つによってコードされる産物を含む。また、本明細書において、細胞周期タンパク質および細胞周期ポリペプチドについての言及がなされる。本発明の特定の細胞周期タンパク質およびポリペプチドの例は、SEQ ID NO:1〜260のいずれかによってコードされるポリペプチドまたはSEQ ID NO:261〜520のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の一つの局面は、これらの細胞周期遺伝子および細胞周期遺伝子産物のサブセット、すなわち、SEQ ID NO:1〜12、14〜58、60〜62、64〜70、72〜75、77〜83、85〜86、88〜91、93〜119、121〜130、132〜148、150〜156、158〜191、193〜207、209〜218、220〜221、223〜231、233〜237、これらのそれぞれの保存的変異体（その用語は下記に定義されたとおり）、ならびにこれらによりコードされるヌクレオチドおよびアミノ酸産物に向けられる。本発明のもう一つの局面は、細胞周期遺伝子および細胞周期遺伝子産物のサブセット、すなわち、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜76、78〜103、106、108〜113、116〜121、124〜125、128〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、208〜213、215〜218、220〜221、223〜231、および233〜234、これらのそれぞれの保存的変異体、ならびにこれらによりコードされるヌクレオチドおよびアミノ酸産物に向けられる。本発明のさらなる局面は、細胞周期遺伝子および細胞周期遺伝子産物のサブセット、すなわち、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜58、60〜62、64〜70、72〜75、78〜83、85〜86、88〜91、93〜103、106、108〜113、116〜119、121、124〜125、128〜130、132〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、209〜213、215〜218、220〜221、223〜231、および233〜234、これらのそれぞれの保存的変異体、ならびにこれらによりコードされるヌクレオチドおよびアミノ酸産物に向けられる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本発明は、SEQ ID NO:1〜260のいずれか1つに対して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、または60%以上の配列同一性を有する保存的変異体ポリヌクレオチドを含む。このような変異体において、変異体と参照配列との間の相違は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置に、または個々の参照配列内の、または参照配列内の1つもしくは複数の隣接する群のヌクレオチド内のいずれかに散在されてこれらの末端位置間のどこでも生じることができる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本発明によって想定され、および含まれるさらなる保存的変異体ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜260のポリヌクレオチド配列、または合計総配列長の10%未満の欠失および／または挿入の結果としてのこれらの相補物、逆相補物、もしくは逆配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
また、本発明は、SEQ ID NO:1〜260に対してこれらの一次構造（配列）に高度な類似性を共有することに加えて、以下の特徴の少なくとも1つを有する保存的変異体ポリヌクレオチドを含む：（i）これらは細胞周期において参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同じ機能的特性を実質的に有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームもしくは部分的なオープンリーディングフレームを含むか、または（ii）これらは、共通してヌクレオチド・ドメインもしくはコードされるタンパク質ドメインを有する。本発明は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の酵素もしくは生物活性または結合特性を有するタンパク質をコードするSEQ ID NO:1〜260の保存的変異体を含む。このような保存的変異体は、これらが参照ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の酵素的または結合活性を有するという点において、機能的変異体である。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
一つの態様によれば、本発明は、以下のファミリーのうちの1つに由来する細胞周期タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する：サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼ、網膜芽細胞腫関連タンパク質、WEE1様タンパク質、またはWD40リピートタンパク質。SEQ ID NO:1〜260は、このようなポリヌクレオチドの例を提供する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
もう一つの態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1〜260のいずれかによってコードされるポリペプチドの、またはSEQ ID NO:261〜520のいずれかを含むポリペプチドの触媒ドメインもしくはタンパク質結合ドメインをコードする。本発明の細胞周期タンパク質の触媒のおよびタンパク質結合ドメインは、当技術分野において公知である。これらのタンパク質の保存配列は、項目1〜248において、下線、太字、および／またはイタリック体テキストとして示してある。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
また、本発明は、SEQ ID NO:1〜260のいずれかを含むポリヌクレオチド、または上で議論したこれらの保存的変異体によってコードされる単離されたポリペプチドを含む。また、本発明は、SEQ ID NO:261〜520を含むポリペプチドならびにこれらのポリペプチドの保存的変異体を含む。本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:261〜272、274〜318、320〜322、324〜330、332〜335、337〜343、345〜346、348〜351、353〜379、381〜390、392〜408、410〜416、418〜451、453〜467、469〜478、480〜481、483〜491、および493〜494、ならびにこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを含む。本発明のさらなる局面は、SEQ ID NO:261〜272、274、276〜286、289、290〜297、300〜301、303〜345、347〜363、366、368〜373、376〜381、384〜385、388〜407、410〜412、414〜415、420〜422、424〜432、434、437〜443、445〜451、453〜457、460〜464、468〜473、および475〜494、ならびにこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを含む。本発明のもう一つの局面は、SEQ ID NO:261〜272、274、276〜286、290〜297、300〜301、303〜318、320〜322、324〜330、332〜335、337〜343、345、348〜351、353〜363、366、368〜373、376〜381、384〜385、388〜390、392〜407、410〜412、414〜415、421〜422、424〜432、434、437〜443、445〜451、453〜457、460〜464、469〜473、475〜478、480〜481、483〜491、および493〜494、ならびにこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを含む。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
合計して総配列長の10%未満のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失の結果としてSEQ ID NO:261〜520のポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、本発明によって想定され、かつ包含される。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明は、上記した細胞周期遺伝子および変異体のいずれかの発現を変更する方法を含む。従って、たとえば、本発明は、ユーカリ属またはマツ属の種の野生型植物のゲノムに存在する細胞周期遺伝子の発現を変更することを含む。一つの態様において、細胞周期遺伝子は、上で議論したように、SEQ ID NO:1〜260から、SEQ ID NO:1〜12、14〜58、60〜62、64〜70、72〜75、77〜83、85〜86、88〜91、93〜119、121〜130、132〜148、150〜156、158〜191、193〜207、209〜218、220〜221、223〜231、および233〜237を含むこれらのサブセットから、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜76、78〜103、106、108〜113、116〜121、124〜125、128〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、208〜213、および215〜234を含むこれらのサブセットから、SEQ ID NO:1〜12、14、16〜26、30〜37、40〜41、43〜58、60〜62、64〜70、72〜75、78〜83、85〜86、88〜91、93〜103、106、108〜113、116〜119、121、124〜125、128〜130、132〜147、150〜152、154〜155、161〜162、164〜172、174、177〜183、185〜191、193〜197、200〜204、209〜213、215〜218、220〜221、223〜231、および233〜234を含むこれらのサブセットから選択されるヌクレオチド配列、またはこれらの保存的変異体から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
本発明は、SEQ ID NO:1〜260のポリヌクレオチドまたは上で議論した保存的変異体などのこれらの保存的変異体の少なくとも1つを含むDNA構築物を提供する。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、本発明のDNA構築物を作製することができる。たとえば、Sambrook et al., 前記を参照されたい。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
本発明は、これらの発現プロファイリング法に有用なオリゴヌクレオチドを提供する。それぞれのオリゴヌクレオチドは、細胞周期遺伝子または遺伝子産物に対して所与の条件のセット下でハイブリダイズすることができる。本発明の一つの局面において、それぞれのオリゴヌクレオチドが、異なる細胞周期遺伝子産物に対して所与の条件のセット下でハイブリダイズする、複数のオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドの例は、SEQ ID NO:521〜772を含む。SEQ ID NO:521〜772の各々のオリゴは、SEQ ID NO:1〜260のうちの1つの異なる遺伝子産物に対して標準状態下でハイブリダイズする。本発明のオリゴヌクレオチドは、任意の上記の方法において、1つまたは複数の細胞周期遺伝子の発現を決定する際に有用である。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
オリゴヌクレオチド・プローブは、当技術分野において公知の任意の手段によって調製することができる。本発明において有用なプローブは、SEQ ID NO:1〜260の1つなどの細胞周期遺伝子のヌクレオチド産物にハイブリダイズすることができる。本発明において有用なプローブは、SEQ ID NO:1〜260に開示されたヌクレオチド配列を使用して作製することができる。本発明は、少なくともSEQ ID NO:1〜260のいずれか一つの対応する隣接する配列の2、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、または100個のヌクレオチド断片を有するオリゴヌクレオチド・プローブを含む。本発明は、2、1、0.5、0.1、または長さ0.05 kbよりも少ないオリゴヌクレオチドを含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、60ヌクレオチドの長さである。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
本発明は、コード領域の産物または細胞周期遺伝子の3'非翻訳領域（3'UTR）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド・プローブを含む。一つの態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、SEQ ID NO:1〜260のいずれか一つの3'UTRにハイブリダイズする。3'UTRは、一般に、同じファミリーのメンバー間でさえも、遺伝子の独特の領域である。従って、3'UTRの産物にハイブリダイズすることができるプローブは、遺伝子のコード領域が高度に相同的である可能性が高い場合に、ファミリー内の個々の遺伝子の発現を区別するために有用であり得る。これにより、それぞれが一義的に単一遺伝子に対して結合することができる複数のオリゴヌクレオチドのメンバーとして使用されるオリゴヌクレオチド・プローブをデザインすることができる。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、SEQ ID NO:521〜772のいずれか一つを含む。もう一つの態様において、オリゴヌクレオチド・プローブは、SEQ ID NO:521〜772のいずれか一つからなる。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
b.オリゴヌクレオチド・アレイ法
本発明の一つの態様は、SEQ ID NO:1〜260の遺伝子などの、1つまたは複数の細胞周期遺伝子の発現レベルを検出するために、2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを組み合わせて使用する。この態様の一つの局面において、2つ以上の異なる遺伝子の発現レベルが検出される。2つ以上の遺伝子は、上で論議した同一の、または異なる細胞周期遺伝子ファミリーに由来してもよい。各々の2つ以上のオリゴヌクレオチドは、遺伝子の異なる一つにハイブリダイズしてもよい。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
本発明の一つの態様は、そのそれぞれが、SEQ ID NO:1〜260によって提供される遺伝子の転写物に由来するポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズする2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。もう一つの態様は、少なくともその1つがSEQ ID NO:521〜772の核酸配列を含む2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。もう一つの態様は、少なくともその1つがSEQ ID NO:521〜772からなる2つ以上のオリゴヌクレオチド・プローブを使用する。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
マイクロアレイ技術を含む本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド・プローブは、PCRを使用して作製することができる。プローブを作製する際に使用されるPCRプライマーは、たとえばSEQ ID NO:1〜260の配列に基づいて、細胞周期遺伝子に独特の断片（すなわち、標準的なハイブリダイゼーション条件下でSEQ ID NO:1〜260のいずれか一つの1つのポリヌクレオチドだけにハイブリダイズする断片）の増幅を生じるように選択される。コンピュータプログラムは、必要とされる特異性および最適なハイブリダイゼーション特性をもつプライマーのデザインに有用である。たとえば、Li and Stormo, 前記は、1075ページにおいて、完全な遺伝子配列、ならびに同時に探索されるその他の遺伝子配列に基づいて最適のオリゴヌクレオチド・プローブを選択するProbe Selectを使用してプローブを選択する方法について論議する。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
翻訳状態の測定は、いくつかのタンパク質法に従って行うことができる。たとえば、タンパク質全のゲノムモニタリング--「プロテオーム」--を、固定された、SEQ ID NO:261〜520のいずれかのアミノ酸配列もしくはSEQ ID NO:1〜260の遺伝子によってコードされるタンパク質またはこれらの保存的変異体を有する複数のタンパク質に特異的な、好ましくはモノクローナル抗体を結合部位に含むマイクロアレイを構築することにより、行うことができる。Wildt et al., Nature Biotechnol. 18： 989 （2000）を参照されたい。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するのための方法は、Harlow & Lane, ANTIBODIES： A LABORATORY MANUAL （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に記載されたとおりに、周知である。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３４】
（表６）
2011097941.tif 000399
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６３】
（表９）ユーカリプタス・グランディス細胞周期遺伝子およびタンパク質
2011097941.tif 000400
2011097941.tif 000401
2011097941.tif 000402
2011097941.tif 000403
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
（表１０）ラジアータマツ細胞周期遺伝子およびタンパク質
2011097941.tif 000404
2011097941.tif 000405
2011097941.tif 000406