(57)【要約】【課題】酵母を用いたＬ−オルニチンの製造方法の提供。【解決手段】（１）Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母を含む原料を混合した時の反応液（Ａ）のｐＨが８以上であるＬ−オルニチン製造方法。（２）Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母のみを原料として混合した時の反応液（Ｂ）のｐＨが８以上であるＬ−オルニチン製造方法。（３）前記反応液（Ｂ）がさらにウレアーゼを有するＬ−オルニチン製造方法。（４）前記反応液（Ｂ）がさらに糖類を有するＬ−オルニチンの製造方法。（５）前記反応液（Ｂ）がさらに２価の金属塩を有するＬ−オルニチンの製造方法。（６）Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、下記添加剤（Ｚ）、および酵母のみを原料として混合した時の反応液（Ｆ）のｐＨが８以上であるＬ−オルニチンの製造方法。添加剤（Ｚ）は、ウレアーゼ、糖類、および２価の金属塩から選択される１種又は２種以上。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母を含む原料を原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら４つの原料を含む原料を混合した時の反応液（Ａ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法。
【請求項２】
前記反応液（Ａ）がウレアーゼを含むことを特徴とする請求項１記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項３】
前記反応液（Ａ）が糖類を含むことを特徴とする請求項１または２記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項４】
前記反応液（Ａ）が、２価の金属塩を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項５】
Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら４つの原料を混合した時の反応液（Ｂ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法。
【請求項６】
Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、ウレアーゼ、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｃ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法。
【請求項７】
Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、糖類、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｄ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法。
【請求項８】
Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、２価の金属塩、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｅ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法。
【請求項９】
Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、下記添加剤（Ｚ）、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｆ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法。
添加剤（Ｚ）は、ウレアーゼ、糖類、および２価の金属塩から選択される１種又は２種以上である。
【請求項１０】
前記反応液（Ａ）〜（Ｆ）の温度が２０〜６０℃の範囲であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項１１】
前記酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項１２】
前記酵母が、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項１３】
前記酵母が、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する酵母を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＬ−オルニチン製造方法。
【請求項１４】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＦ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０２８）を含むことを特徴とする請求項１１記載のＬ−オルニチン製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母を用いたＬ−オルニチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−オルニチンは、栄養補助食品、医薬品用途等に有用なアミノ酸である。
微生物による従来のＬ−オルニチン製造方法としては、酵母を用いる製造方法（特許文献１〜２）、細菌を用いる製造方法（特許文献３〜５）が知られている。従来のいずれの製造方法も、その微生物が増殖するための栄養培地を含有する培養液中に、Ｌ−オルニチンを生成させる方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５２−１４３２８８号公報
【特許文献２】特公昭５７−１８４６９号公報
【特許文献３】特開昭５７−１６６９６号公報
【特許文献４】特開昭６１−１１９１９４号公報
【特許文献５】特開平２−２８３２９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のＬ−オルニチン製造方法を用いた場合、前記培養液はマルトエキスや硫安、大豆蛋白酸加水分解液等の窒素源、ビオチンやサイアミン塩酸塩等のビタミン類を含むので、これらの夾雑物を除去して目的物質であるＬ−オルニチンを精製するための煩雑な処理が必要である。
また、従来のＬ−オルニチン製造方法に使用される微生物は、例えば、アルギニン要求性、シトルリン要求性の変異株であり、その変異株を培養液中で増殖させながら、該培養液中にＬ−オルニチンを蓄積せしめる方法である。しかしながら、前記微生物の増殖と並行してＬ−オルニチンの合成および蓄積が起こるので効率が悪く、目的物質であるＬ−オルニチンの生産量が低く留まる問題がある。
今日ではＬ−オルニチンの栄養補助食品や医薬品用途としての需要も高まっており、微生物によるＬ−オルニチンの製造方法において、より簡便に精製することができる状態でＬ−オルニチンを効率よく生成できる方法が求められている。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、酵母を用いたＬ−オルニチンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一の態様は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母を含む原料を原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら４つの原料を含む原料を混合した時の反応液（Ａ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法である。
【０００６】
本発明の第二の態様は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら４つの原料を混合した時の反応液（Ｂ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法である。
本発明の第三の態様は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、ウレアーゼ、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｃ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法である。
本発明の第四の態様は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、糖類、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｄ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法である。
本発明の第五の態様は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、２価の金属塩、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｅ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法である。
本発明の第六の態様は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、下記添加剤（Ｚ）、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｆ）のｐＨが８以上であることを特徴とするＬ−オルニチン製造方法である。添加剤（Ｚ）は、ウレアーゼ、糖類、および２価の金属塩から選択される１種又は２種以上である。
【０００７】
本明細書および本特許請求の範囲において、特に断りがない限り、アルギニン、オルニチン等のアミノ酸は全てＬ体であるものとする。また、「糖類」とは、単糖類、少糖類、多糖類を包含するものとする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡易に精製できる状態で効率よくＬ−オルニチンを製造することができる方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各ｐＨに調整した培養液におけるＮＦ−１株の増殖曲線
【図２】ＮＦ−１株によるＬ−オルニチン生成反応中の菌体の生存状態の写真
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪Ｌ−オルニチンの製造方法≫
本発明の第一の態様であるＬ−オルニチンの製造方法は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母を含む原料を原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら４つの原料を含む原料を混合した時の反応液（Ａ）のｐＨが８以上であることを特徴とする。
かかるＬ−オルニチンの製造方法においては、前記反応液（Ａ）に含まれる原料であるＬ−アルギニンが酵母菌体内に取り込まれて反応が起き、目的生成物であるＬ−オルニチンが酵母菌体外に排出されることによって、反応液（Ａ）中に効率よく生成することができる。この際、尿素が副生成物として生成する。
前記Ｌ−オルニチンの製造方法において、目的物質であるＬ−オルニチンは反応液（Ａ）中に溶解した状態で生成されるので、酵母菌体を破砕して煩雑な精製処理を行う必要が無い。また、前記反応液（Ａ）には酵母生育のための栄養成分（窒素源やビタミン類等）を含まなくてよいので、目的生成物であるＬ−オルニチンを得るために、反応終了時には夾雑物となる前記栄養成分を除去するための煩雑な処理を行う必要が無い。すなわち、反応終了時に前記反応液（Ａ）に含まれる、Ｌ−オルニチン以外の主な成分は、酵母、Ｌ−アルギニン、および尿素であり、これらは後述する方法によって比較的簡単に分離・除去できる。よって当該Ｌ−オルニチン製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、反応液（Ａ）のｐＨは８以上である。該反応液（Ａ）のｐＨを、酵母の増殖に適したｐＨ（ｐＨ３〜７）よりも高いｐＨとすることによって、酵母の増殖を抑制し、Ｌ−オルニチンを従来方法よりも効率よく生産することができる。この理由として、酵母の増殖抑制に伴って酵母の正常な代謝が抑制されることにより、酵母内がＬ−オルニチンの合成に適した環境になること、また、酵母の増殖を抑制することにより、反応原料であるＬ−アルギニンが酵母増殖のための窒素源として消費されなくなること等が考えられる。
【００１１】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、反応液（Ａ）を構成する溶媒としては、本発明の効果を阻害せず、アルギニンを溶解できるものであれば、特に制限されないが、含水溶媒であることが好ましく、水であることが最も好ましい。
【００１２】
前記溶媒に溶解するアルギニンの濃度は、特に制限されないが、反応効率の観点から、５０〜６００ｍＭが好ましく、１００〜３００ｍＭがより好ましい。
【００１３】
前記反応液（Ａ）を構成するｐＨ調整剤としては、本発明の効果を阻害しないものであれば特に制限されない。例えば、水溶液のｐＨを調整するために一般に用いられる水酸化ナトリウム、塩化水素等が好ましいものとして挙げられる。
前記反応液（Ａ）のｐＨをｐＨ８以上に調整する方法としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液を滴下することで所望のｐＨに調整することができる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、反応液（Ａ）を構成する前記４つの原料を混合した反応開始時のｐＨとしてはｐＨ８．０〜１２．０が好ましく、ｐＨ８．５〜１１．５がより好ましく、ｐＨ８．５〜１１．０がさらに好ましく、ｐＨ９．０〜１０．５が特に好ましく、ｐＨ９．５〜１０．５が最も好ましい。当該ｐＨの範囲とすることで、目的生成物であるＬ−オルニチンを効率よく生成することができる。
【００１４】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法で使用することのできる酵母としては、ｐＨ８以上の前記反応液（Ａ）に溶解したＬ−アルギニンに接触して、該Ｌ−アルギニンからＬ−オルニチンを生成するものであれば特に制限されず、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）に属する酵母が好ましいものとして挙げられる。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母としては、サッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母が好ましい。
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母としては、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）に属する酵母が好ましい。
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する酵母としては、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）に属する酵母が好ましい。
これらの酵母の中でも、本発明者らが日本国茨城沖の海水から単離した海洋酵母であるサッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＦ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０２８）が最も好ましい。該ＮＦ−１株の生理・生化学的および遺伝学的性質の詳細は後述する。
本発明のＬ−オルニチン製造方法に使用する酵母としては、前記酵母の群から選ばれる少なくとも１種を用いることが好ましく、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記酵母は市販のものを用いてもよいし、常法により培養したものを用いてもよい。
【００１５】
前記反応液（Ａ）中の酵母の濃度としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されないが、Ｌ−オルニチン生成量の増加と酵母の使用量の増加とのバランスの観点から、１．０〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましく、１．５〜１０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、２．０〜５．０％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。なお、当該酵母の水分含量は約７５％（ｗ／ｗ）である。
【００１６】
前記Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母の４つの原料を含む原料を混合した時のｐＨが８以上に調整された反応液（Ａ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
【００１７】
本発明のＬ−オルニチン製造方法において、前記反応液（Ａ）にウレアーゼ（尿素分解酵素）を含むことが好ましい。ウレアーゼを含むことにより、Ｌ−オルニチン生成反応時の副生成物である尿素を二酸化炭素とアンモニアとに分解することができ、後述するように、反応液（Ａ）からＬ−オルニチンを簡便な精製によって得られるので好ましい。また、前記ウレアーゼを含むことによって反応液（Ａ）における当該尿素の濃度を低く保つことは、当該酵母の生理状態の悪化（例えば生存率の低下等）を低減すると考えられるので好ましい。
前記ウレアーゼの含有量としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、好ましくは１０〜１００ｐｐｍである。下限値以上とすることによって、ウレアーゼを含有することによる効果を充分に得ることができ、上限値以下とすることで尿素分解量とウレアーゼ含有量とのバランスを取ることができる。
【００１８】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ａ）に糖類を含有することが好ましい。糖類を含有することにより、Ｌ−オルニチンの生成量を増加させることができる。その理由としては、前記糖類が当該酵母内部の呼吸等の代謝系を活性化させることが一因として考えられる。
前記糖類としては、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば単糖類、二糖類が好ましく、グルコース、フルクトース、スクロースがより好ましく、グルコースがさらに好ましい。
前記反応液（Ａ）が含有する糖類は、前記糖類の群から選ばれる少なくとも１種を用いることが好ましく、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記糖類の前記反応液（Ａ）の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、好ましくは０．１〜８．０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）であり、最も好ましくは０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）である。下限値以上とすることによって、糖類を含有することによる効果を充分に得ることができ、上限値以下とすることで反応液（Ａ）に含まれる他の成分とのバランスを取ることができる。
【００１９】
本発明のＬ−オルニチン製造方法において、前記反応液（Ａ）に２価の金属塩を含有することが好ましい。２価の金属塩を含有することにより、Ｌ−オルニチンの生成量を増加させることができる。その理由としては、前記２価の金属塩が、Ｌ−オルニチン生成反応中の当該酵母内部の呼吸等の代謝系を活性化させることが一因として考えられる。
前記２価の金属塩における２価金属イオン（カチオン）は、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋が好ましいものとして挙げられ、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋がより好ましいものとして挙げられる。
また、前記２価の金属塩におけるアニオンは、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば、塩素イオン（Ｃｌ−）等が好ましいものとして挙げられる。
本発明において、前記２価の金属塩は、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば、前記２価金属イオンの群から選ばれる１種と前記アニオンとを組み合わせたイオン性化合物が挙げられ、より具体的には、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化鉄等が好ましいものとして挙げられる。
本発明において、前記２価の金属塩は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、前記２価の金属塩の反応液（Ａ）中の濃度としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、好ましくは１〜１００ｐｐｍであり、より好ましくは５〜５０ｐｐｍである。下限値以上とすることによって、２価の金属塩によるＬ−オルニチン生成量を増加させる効果を充分に得ることができ、上限値以下とすることでＬ−オルニチン生成の増加量と２価の金属塩の量とのバランスを取ることができる。
【００２０】
本発明のＬ−オルニチン製造方法では、本発明の効果を損なわない限りにおいて、前記ウレアーゼ、糖類、および２価の金属塩以外の成分を反応液（Ａ）に添加してもよい。
【００２１】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ａ）の温度、すなわち反応温度としては、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは２５〜５０℃であり、さらに好ましくは３０〜４５℃であり、特に好ましくは３０〜４０℃である。前記範囲内であると、Ｌ−オルニチン生成を効率よく行うことができる。その理由としては、前記範囲内の温度が、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが考えられる。
【００２２】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、当該反応時間としては、反応が進行すれば特に制限されないが、多くの場合、１時間以上、好ましくは１２〜１２０時間程度である。
反応の進行および終了は、例えばアミノ酸分析装置等を用いた常法によって判断することができる。
【００２３】
反応終了後に前記反応液（Ａ）中に生成されたＬ−オルニチンを単離する方法としては、公知の精製方法で行うことができ、例えば、特開昭５２−１４３２８８、特公昭５７−１８４６９に記載の菌体沈殿、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、およびＬ−オルニチン結晶化により行うことができる。
前記陽イオン交換カラムクロマトグラフィーの具体的な方法としては、菌体を除去した反応液（Ａ）のｐＨを２．５に調節し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）で緩衝化したＮａ型の強酸性イオン交換樹脂ダウエックス（ダウケミカル社製）カラムに前記ｐＨ２．５の反応液（Ａ）を通じてＬ−オルニチンを吸着させ、当該カラムを前記クエン酸緩衝液で洗浄して夾雑物を除去した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で当該Ｌ−オルニチンを溶出して精製する方法が例示できる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、酵母生育のための栄養成分である窒素源やビタミン類等を含まなくてよいので、反応終了時の反応液（Ａ）中の主な夾雑物は、酵母、尿素、および未反応のＬ−アルギニンである。当該酵母の除去は、前記公知の方法と同様に菌体を沈殿させる方法、または反応液（Ａ）を濾別する方法によって行うことができる。また当該尿素および未反応のＬ−アルギニンの除去は、前記公知のクロマトグラフィー等の常法によって行うことができる。通常、当該クロマトグラフィーでは、前記栄養成分を含有した夾雑物の多い試料を対象とした場合、得られるＬ−オルニチンの精製度および収率は低くなる。そのため、目的物であるＬ−オルニチンの精製度を高めるためには煩雑な処理が必要となる。一方、本発明のＬ−オルニチン製造方法では、当該酵母菌体を除去した後の反応液（Ａ）において、前述の尿素および未反応のＬ−アルギニンが主な夾雑物であり、これらは前記栄養成分を除く場合と比べて容易である。
また、前記反応液（Ａ）に前記ウレアーゼを添加した場合には、当該尿素は二酸化炭素とアンモニアに分解される。前記二酸化炭素およびアンモニアの除去は、当該反応液（Ａ）を脱気する方法で行うことができる。当該ウレアーゼは前記クロマトグラフィー等の常法によって除くことができる。
また、前記反応液（Ａ）に前記糖類、前記２価の金属塩を添加した場合でも、それらは前記クロマトグラフィー等の常法によって除くことができる。
当該クロマトグラフィーによって精製した後に、さらに、常法によって再結晶を繰り返すことで極めて高純度なＬ−オルニチンを得ることができる。
【００２４】
前述したように、反応終了後の前記反応液（Ａ）中には、Ｌ−オルニチン、酵母、およびＬ−アルギニンが含まれる。前記Ｌ−オルニチンおよびＬ−アルギニンは、食品素材としても有用なアミノ酸である。また、前記酵母も、栄養価の高い食品素材である。したがって、反応終了後の前記反応液（Ａ）は、その溶液自体が、食品素材として有用である。
【００２５】
本発明の第二の態様であるＬ−オルニチンの製造方法は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら４つの原料を混合した時の反応液（Ｂ）のｐＨが８以上であることを特徴とする。
かかるＬ−オルニチンの製造方法においては、前記反応液（Ｂ）を構成するＬ−アルギニンが酵母菌体内に取り込まれて反応が起き、目的生成物であるＬ−オルニチンが酵母菌体外に排出されることによって、反応液（Ｂ）中に効率よく生成することができる。この際、尿素が副生成物として生成する。
前記Ｌ−オルニチンの製造方法において、目的物質であるＬ−オルニチンは反応液（Ｂ）中に溶解した状態で生成されるので、酵母菌体を破砕して煩雑な精製処理を行う必要が無い。また、前記反応液（Ｂ）には酵母生育のための栄養成分（窒素源やビタミン類等）を含まないので、目的生成物であるＬ−オルニチンを得るために、反応終了時には夾雑物となる前記栄養成分を除去するための煩雑な処理を行う必要が無い。すなわち、反応終了時に前記反応液（Ｂ）に含まれる、Ｌ−オルニチン以外の主な成分は、酵母、Ｌ−アルギニン、および尿素であり、これらは後述する方法によって比較的簡単に分離・除去できる。よって本発明のＬ−オルニチンの製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、反応液（Ｂ）のｐＨは８以上である。該反応液（Ｂ）のｐＨを、酵母の増殖に適したｐＨ（ｐＨ３〜７）よりも高いｐＨとすることによって、酵母の増殖を抑制し、Ｌ−オルニチンを従来方法よりも効率よく生産することができる。この理由として、酵母の増殖抑制に伴って酵母の正常な代謝が抑制されることにより、酵母内がＬ−オルニチンの合成に適した環境になること、また、酵母の増殖を抑制することにより、反応原料であるＬ−アルギニンが酵母増殖のための窒素源として消費されなくなること等が考えられる。
【００２６】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、反応液（Ｂ）を構成する溶媒としては、本発明の効果を阻害せず、アルギニンを溶解できるものであれば、特に制限されないが、含水溶媒であることが好ましく、水であることが最も好ましい。
【００２７】
前記溶媒に溶解するアルギニンの濃度は、特に制限されないが、反応効率の観点から、５０〜６００ｍＭが好ましく、１００〜３００ｍＭがより好ましい。
【００２８】
前記反応液（Ｂ）を構成するｐＨ調整剤としては、本発明の効果を阻害しないものであれば特に制限されない。例えば、水溶液のｐＨを調整するために一般に用いられる水酸化ナトリウム、塩化水素等が好ましいものとして挙げられる。
前記反応液（Ｂ）のｐＨをｐＨ８以上に調整する方法としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液を滴下することで所望のｐＨに調整することができる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、反応液（Ｂ）を構成する前記４つの原料を混合した反応開始時のｐＨとしては、ｐＨ８．０〜１２．０が好ましく、ｐＨ８．５〜１１．５がより好ましく、ｐＨ８．５〜１１．０がさらに好ましく、ｐＨ９．０〜１０．５が特に好ましく、ｐＨ９．５〜１０．５が最も好ましい。当該ｐＨの範囲とすることで、目的生成物であるＬ−オルニチンを効率よく生成することができる。
【００２９】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法で使用することのできる酵母としては、ｐＨ８以上の前記反応液（Ｂ）に溶解したＬ−アルギニンに接触して、該Ｌ−アルギニンからＬ−オルニチンを生成するものであれば特に制限されず、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）に属する酵母が好ましいものとして挙げられる。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母としては、サッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母が好ましい。
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母としては、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）に属する酵母が好ましい。
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する酵母としては、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）に属する酵母が好ましい。
これらの酵母の中でも、本発明者らが日本国茨城沖の海水から単離した海洋酵母であるサッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＦ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０２８）が最も好ましい。該ＮＦ−１株の生理・生化学的および遺伝学的性質の詳細は後述する。
本発明のＬ−オルニチン製造方法に使用する酵母としては、前記酵母の群から選ばれる少なくとも１種を用いることが好ましく、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記酵母は市販のものを用いてもよいし、常法により培養したものを用いてもよい。
【００３０】
前記反応液（Ｂ）中の酵母の濃度としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されないが、Ｌ−オルニチン生成量の増加と酵母の使用量の増加とのバランスの観点から、１．０〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましく、１．５〜１０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、２．０〜５．０％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。なお、当該酵母の水分含量は約７５％（ｗ／ｗ）である。
【００３１】
前記Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、および酵母の４つの原料を混合した時のｐＨが８以上に調整された反応液（Ｂ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
【００３２】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ｂ）の温度、すなわち反応温度としては、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは２５〜５０℃であり、さらに好ましくは３０〜４５℃であり、特に好ましくは３０〜４０℃である。前記範囲内であると、Ｌ−オルニチン生成を効率よく行うことができる。その理由としては、前記範囲内の温度が、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが考えられる。
【００３３】
当該Ｌ−オルニチンの製造方法において、当該反応時間としては、反応が進行すれば特に制限されないが、多くの場合、１時間以上、好ましくは１２〜１２０時間程度である。
反応の進行および終了は、例えばアミノ酸分析装置等を用いた常法によって判断することができる。
【００３４】
反応終了後に前記反応液（Ｂ）中に生成されたＬ−オルニチンを単離する方法としては、公知の精製方法で行うことができ、例えば、特開昭５２−１４３２８８、特公昭５７−１８４６９に記載の菌体沈殿、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、およびＬ−オルニチン結晶化により行うことができる。
前記陽イオン交換カラムクロマトグラフィーの具体的な方法としては、菌体を除去した反応液（Ｂ）のｐＨを２．５に調節し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）で緩衝化したＮａ型の強酸性イオン交換樹脂ダウエックス（ダウケミカル社製）カラムに前記ｐＨ２．５の反応液（Ｂ）を通じてＬ−オルニチンを吸着させ、当該カラムを前記クエン酸緩衝液で洗浄して夾雑物を除去した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で当該Ｌ−オルニチンを溶出して精製する方法が例示できる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、酵母生育のための栄養成分である窒素源やビタミン類等を含まないので、反応終了時の反応液（Ｂ）中の主な夾雑物は、酵母、尿素、および未反応のＬ−アルギニンである。当該酵母の除去は、前記公知の方法と同様に菌体を沈殿させる方法、または反応液（Ｂ）を濾別する方法によって行うことができる。また当該尿素および未反応のＬ−アルギニンの除去は、前記公知のクロマトグラフィー等の常法によって行うことができる。通常、当該クロマトグラフィーでは、前記栄養成分を含有した夾雑物の多い試料を対象とした場合、得られるＬ−オルニチンの精製度および収率は低くなる。そのため、目的物であるＬ−オルニチンの精製度を高めるためには煩雑な処理が必要となる。一方、本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、当該酵母菌体を除去した後の反応液（Ｂ）において、前述の尿素および未反応のアルギニンが主な夾雑物であり、これらは前記栄養成分を除く場合と比べて容易である。
当該クロマトグラフィーによって精製した後に、さらに、常法によって再結晶を繰り返すことで極めて高純度なＬ−オルニチンを得ることができる。
【００３５】
前述したように、反応終了後の前記反応液（Ｂ）中には、Ｌ−オルニチン、酵母、尿素、およびＬ−アルギニンが含まれる。前記Ｌ−オルニチンおよびＬ−アルギニンは、食品素材としても有用なアミノ酸である。また、前記酵母も、栄養価の高い食品素材である。したがって、反応終了後の前記反応液（Ｂ）は、その溶液自体が、食品素材として有用である。
【００３６】
本発明の第三の態様であるＬ−オルニチンの製造方法は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、ウレアーゼ、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｃ）のｐＨが８以上であることを特徴とする。
かかるＬ−オルニチンの製造方法においては、前記反応液（Ｃ）を構成するＬ−アルギニンが酵母菌体内に取り込まれて反応が起き、目的生成物であるＬ−オルニチンが酵母菌体外に排出されることによって、反応液（Ｃ）中に効率よく生成することができる。この際、尿素が副生成物として生成する。
前記Ｌ−オルニチンの製造方法において、目的物質であるＬ−オルニチンは反応液（Ｃ）中に溶解した状態で生成されるので、酵母菌体を破砕して煩雑な精製処理を行う必要が無い。また、前記反応液（Ｃ）には酵母生育のための栄養成分（窒素源やビタミン類等）を含まないので、目的生成物であるＬ−オルニチンを得るために、反応終了時には夾雑物となる前記栄養成分を除去するための煩雑な処理を行う必要が無い。すなわち、反応終了時に前記反応液（Ｃ）に含まれる、Ｌ−オルニチン以外の主な成分は、酵母、およびＬ−アルギニンである。
前記副生成物である尿素は、反応液（Ｃ）を構成するウレアーゼによって、二酸化炭素とアンモニアとに分解することができ、前記二酸化炭素およびアンモニアは後述の方法で容易に分離・除去することができる。
また、反応終了後のＬ−オルニチン以外の主な成分である酵母、Ｌ−アルギニンは、前述の反応液（Ｂ）の場合と同様の方法によって、比較的簡単に分離・除去できる。よって当該Ｌ−オルニチンの製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、反応液（Ｃ）のｐＨは８以上である。該反応液（Ｃ）のｐＨを、酵母の増殖に適したｐＨ（ｐＨ３〜７）よりも高いｐＨとすることによって、酵母の増殖を抑制し、Ｌ−オルニチンを従来方法よりも効率よく生産することができる。この理由として、酵母の増殖抑制に伴って酵母の正常な代謝が抑制されることにより、酵母内がＬ−オルニチンの合成に適した環境になること、また、酵母の増殖を抑制することにより、反応原料であるＬ−アルギニンが酵母増殖のための窒素源として消費されなくなること等が考えられる。
【００３７】
前記反応液（Ｃ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明は、前記反応液（Ｂ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明と同様である。また、前記反応液（Ｃ）における酵母についての説明は、前記反応液（Ｂ）における酵母についての説明と同様である。
また、前記反応液（Ｃ）をｐＨ８以上に調整する方法は、前記反応液（Ｂ）をｐＨ８以上に調整する方法と同様に行うことができる。
当該ｐＨ８以上に調整した反応液（Ｃ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
前記Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、ウレアーゼおよび酵母の５つの原料を混合した時のｐＨが８以上に調整された反応液（Ｃ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
【００３８】
前記反応液（Ｃ）を構成するウレアーゼ（尿素分解酵素）は、Ｌ−オルニチン生成反応時の副生成物である尿素を二酸化炭素とアンモニアとに分解することができるものである。ウレアーゼの尿素分解によって生じる二酸化炭素とアンモニアは、Ｌ−オルニチン生成反応終了後に反応液（Ｃ）を脱気することによって、反応液（Ｃ）から後述する簡便な方法で除去でき、反応液（Ｃ）中のＬ−オルニチンを簡便な精製によって得ることができる。
前記方法は公知のアンモニア除去方法で行うことができ、例えば、反応液（Ｃ）のｐＨを上げてアルカリ性とした後、加温し、減圧する方法が好ましい方法として挙げられる。また、反応液（Ｃ）中のウレアーゼは、Ｌ−オルニチン生成反応終了後に、前記クロマトグラフィー等の常法によって除去することができる。
前記ウレアーゼの反応液（Ｃ）中の濃度としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、好ましくは１０〜１００ｐｐｍである。下限値以上とすることによって、ウレアーゼの尿素分解反応による効果を充分に得ることができ、上限値以下とすることで尿素分解量とウレアーゼ量とのバランスを取ることができる。
【００３９】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ｃ）の温度、すなわち反応温度としては、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは２５〜５０℃であり、さらに好ましくは３０〜４５℃であり、特に好ましくは３０〜４０℃である。前記範囲内であると、Ｌ−オルニチン生成を効率よく行うことができる。その理由としては、前記範囲内の温度が、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが考えられる。
【００４０】
当該Ｌ−オルニチンの製造方法における反応時間としては、反応が進行すれば特に制限されないが、多くの場合、１時間以上、好ましくは１２〜１２０時間程度である。
反応の進行および終了は、例えばアミノ酸分析装置等を用いた常法によって判断することができる。
【００４１】
前述したように、反応終了後の前記反応液（Ｃ）中には、Ｌ−オルニチン、酵母、ウレアーゼ、およびＬ−アルギニンが含まれる。前記Ｌ−オルニチンおよびＬ−アルギニンは、食品素材としても有用なアミノ酸である。また、前記酵母も、栄養価の高い食品素材である。したがって、反応終了後の前記反応液（Ｃ）は、その溶液自体が、食品素材として有用である。
【００４２】
本発明の第四の態様であるＬ−オルニチンの製造方法は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、糖類、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｄ）のｐＨが８以上であることを特徴とする。
かかるＬ−オルニチン製造方法においては、前記反応液（Ｄ）を構成するＬ−アルギニンが酵母菌体内に取り込まれて反応が起き、目的生成物であるＬ−オルニチンが酵母菌体外に排出されることによって、反応液（Ｄ）中に効率よく生成することができる。この際、尿素が副生成物として生成する。
前記Ｌ−オルニチンの製造方法において、目的物質であるＬ−オルニチンは反応液（Ｄ）中に溶解した状態で生成されるので、酵母菌体を破砕して煩雑な精製処理を行う必要が無い。また、前記反応液（Ｄ）には酵母生育のための栄養成分（窒素源やビタミン類等）を含まないので、目的生成物であるＬ−オルニチンを得るために、反応終了時には夾雑物となる前記栄養成分を除去するための煩雑な処理を行う必要が無い。すなわち、反応終了時に前記反応液（Ｄ）に含まれる、Ｌ−オルニチン以外の主な成分は、酵母、Ｌ−アルギニン、および尿素であり、これらは前述の反応液（Ｂ）の場合と同様の方法によって比較的簡単に分離・除去できる。また、Ｌ−オルニチン生成反応終了後に、前記反応液（Ｄ）を構成する糖類を除去する方法は前記クロマトグラフィー等の常法によって簡便に除くことができる。よって、本発明のＬ−オルニチンの製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
また、反応液（Ｄ）を構成する糖類は、当該Ｌ−オルニチン生成反応の効率を高めて、前記反応液（Ｄ）中に生成するＬ−オルニチンの量を増加させることができる。その理由としては、前記糖類が、Ｌ−オルニチン生成反応中の当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが一因として考えられる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、反応液（Ｄ）のｐＨは８以上である。該反応液（Ｄ）のｐＨを、酵母の増殖に適したｐＨ（ｐＨ３〜７）よりも高いｐＨとすることによって、酵母の増殖を抑制し、Ｌ−オルニチンを従来方法よりも効率よく生産することができる。この理由として、酵母の増殖抑制に伴って酵母の正常な代謝が抑制されることにより、酵母内がＬ−オルニチンの合成に適した環境になること、また、酵母の増殖を抑制することにより、反応原料であるＬ−アルギニンが酵母増殖のための窒素源として消費されなくなること等が考えられる。
【００４３】
前記反応液（Ｄ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明は、前記反応液（Ｂ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明と同様である。また、前記反応液（Ｄ）における酵母についての説明は、前記反応液（Ｂ）における酵母についての説明と同様である。
また、前記反応液（Ｄ）をｐＨ８以上に調整する方法は、前記反応液（Ｂ）をｐＨ８以上に調整する方法と同様に行うことができる。
前記Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、糖類および酵母の５つの原料を混合した時のｐＨが８以上に調整された反応液（Ｄ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
【００４４】
前記反応液（Ｄ）を構成する糖類は、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば単糖類、二糖類が好ましく、グルコース、フルクトース、スクロースがより好ましく、グルコースがさらに好ましい。
前記反応液（Ｄ）を構成する糖類としては、前記糖類の群から選ばれる少なくとも１種を用いることが好ましく、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記糖類の前記反応液（Ｄ）中の濃度としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、好ましくは０．１〜８．０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）であり、最も好ましくは０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）である。下限値以上とすることによって、糖類によるＬ−オルニチン生成量を増加させる効果を充分に得ることができ、上限値以下とすることで反応液（Ｄ）に含まれる他の成分とのバランスを取ることができる。
【００４５】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ｄ）の温度、すなわち反応温度としては、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは２５〜５０℃であり、さらに好ましくは３０〜４５℃であり、特に好ましくは３０〜４０℃である。前記範囲内であると、Ｌ−オルニチン生成を効率よく行うことができる。その理由としては、前記範囲内の温度が、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが考えられる。
【００４６】
当該Ｌ−オルニチンの製造方法における反応時間としては、反応が進行すれば特に制限されないが、多くの場合、１時間以上、好ましくは１２〜１２０時間程度である。
反応の進行および終了は、例えばアミノ酸分析装置等を用いた常法によって判断することができる。
【００４７】
前述したように、反応終了後の前記反応液（Ｄ）中には、Ｌ−オルニチン、酵母、糖類、およびＬ−アルギニンが含まれる。前記Ｌ−オルニチンおよびＬ−アルギニンは、食品素材としても有用なアミノ酸である。また、前記酵母も、栄養価の高い食品素材である。さらに、糖類も食品素材として有用である。したがって、反応終了後の前記反応液（Ｄ）は、その溶液自体が、食品素材として有用である。
【００４８】
本発明の第五の態様であるＬ−オルニチンの製造方法は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、２価の金属塩、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｅ）のｐＨが８以上であることを特徴とする。
かかるＬ−オルニチンの製造方法においては、前記反応液（Ｅ）を構成するＬ−アルギニンが酵母菌体内に取り込まれて反応が起き、目的生成物であるＬ−オルニチンが酵母菌体外に排出されることによって、反応液（Ｅ）中に効率よく生成することができる。この際、尿素が副生成物として生成する。
前記Ｌ−オルニチンの製造方法において、目的物質であるＬ−オルニチンは反応液（Ｅ）中に溶解した状態で生成されるので、酵母菌体を破砕して煩雑な精製処理を行う必要が無い。また、前記反応液（Ｅ）には酵母生育のための栄養成分（窒素源やビタミン類等）を含まないので、目的生成物であるＬ−オルニチンを得るために、反応終了時には夾雑物となる前記栄養成分を除去するための煩雑な処理を行う必要が無い。すなわち、反応終了時に前記反応液（Ｅ）に含まれる、Ｌ−オルニチン以外の主な成分は、酵母、Ｌ−アルギニン、および尿素であり、これらは前述の反応液（Ｂ）の場合と同様の方法によって比較的簡単に分離・除去できる。また、Ｌ−オルニチン生成反応終了後に、前記反応液（Ｅ）を構成する２価の金属塩を除去する方法は前記クロマトグラフィー等の常法によって簡便に除くことができる。よって当該Ｌ−オルニチンの製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
また、反応液（Ｅ）を構成する２価の金属塩は、当該Ｌ−オルニチン生成反応の効率を高めて、前記反応液（Ｅ）中に生成するＬ−オルニチンの量を増加させることができる。その理由としては、前記２価の金属塩が、Ｌ−オルニチン生成反応中の当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが一因として考えられる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、反応液（Ｅ）のｐＨは８以上である。該反応液（Ｅ）のｐＨを、酵母の増殖に適したｐＨ（ｐＨ３〜７）よりも高いｐＨとすることによって、酵母の増殖を抑制し、Ｌ−オルニチンを従来方法よりも効率よく生産することができる。この理由として、酵母の増殖抑制に伴って酵母の正常な代謝が抑制されることにより、酵母内がＬ−オルニチンの合成に適した環境になること、また、酵母の増殖を抑制することにより、反応原料であるＬ−アルギニンが酵母増殖のための窒素源として消費されなくなること等が考えられる。
【００４９】
前記反応液（Ｅ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明は、前記反応液（Ｂ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明と同様である。また、前記反応液（Ｅ）における酵母についての説明は、前記反応液（Ｂ）における酵母についての説明と同様である。
また、前記反応液（Ｅ）をｐＨ８以上に調整する方法は、前記反応液（Ｂ）をｐＨ８以上に調整する方法と同様に行うことができる。
前記Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、２価の金属塩、および酵母の５つの原料を混合した時のｐＨが８以上に調整された反応液（Ｅ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
【００５０】
前記反応液（Ｅ）を構成する２価の金属塩における２価金属イオン（カチオン）は、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋が好ましいものとして挙げられ、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋がより好ましいものとして挙げられる。
また、前記反応液（Ｅ）を構成する２価の金属塩におけるアニオンは、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば、塩素イオン（Ｃｌ−）等が好ましいものとして挙げられる。
本発明において、前記反応液（Ｅ）を構成する２価の金属塩は、本発明の効果を損なわないものであれば特に制限されないが、例えば、前記２価金属イオンの群から選ばれる１種と前記アニオンとを組み合わせたイオン性化合物が挙げられ、より具体的には、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化鉄等が好ましいものとして挙げられる。
本発明において、前記反応液（Ｅ）を構成する２価の金属塩は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、前記２価の金属塩の反応液（Ｅ）中の濃度としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、好ましくは１〜１００ｐｐｍであり、より好ましくは５〜５０ｐｐｍである。下限値以上とすることによって、２価の金属塩によるＬ−オルニチン生成量を増加させる効果を充分に得ることができ、上限値以下とすることでＬ−オルニチン生成の増加量と２価の金属塩の量とのバランスを取ることができる。
【００５１】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ｅ）の温度、すなわち反応温度としては、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは２５〜５０℃であり、さらに好ましくは３０〜４５℃であり、特に好ましくは３０〜４０℃である。前記範囲内であると、Ｌ−オルニチン生成を効率よく行うことができる。その理由としては、前記範囲内の温度が、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが考えられる。
【００５２】
当該Ｌ−オルニチンの製造方法における反応時間としては、反応が進行すれば特に制限されないが、多くの場合、１時間以上、好ましくは１２〜１２０時間程度である。
反応の進行および終了は、例えばアミノ酸分析装置等を用いた常法によって判断することができる。
【００５３】
前述したように、反応終了後の前記反応液（Ｅ）中には、Ｌ−オルニチン、酵母、２価の金属塩、およびＬ−アルギニンが含まれる。前記Ｌ−オルニチンおよびＬ−アルギニンは、食品素材としても有用なアミノ酸である。また、前記酵母も、栄養価の高い食品素材である。したがって、反応終了後の前記反応液（Ｅ）は、その溶液自体が、食品素材として有用である。
【００５４】
本発明の第六の態様であるＬ−オルニチンの製造方法は、Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、下記添加剤（Ｚ）、および酵母のみを原料とするＬ−オルニチン製造方法であって、これら５つの原料を混合した時の反応液（Ｆ）のｐＨが８以上であることを特徴とする。添加剤（Ｚ）は、ウレアーゼ、糖類、および２価の金属塩から選択される１種又は２種以上である。
かかるＬ−オルニチンの製造方法においては、前記反応液（Ｆ）を構成するＬ−アルギニンが酵母菌体内に取り込まれて反応が起き、目的生成物であるＬ−オルニチンが酵母菌体外に排出されることによって、反応液（Ｆ）中に効率よく生成することができる。この際、尿素が副生成物として生成する。
前記Ｌ−オルニチンの製造方法において、目的物質であるＬ−オルニチンは反応液（Ｆ）中に溶解した状態で生成されるので、酵母菌体を破砕して煩雑な精製処理を行う必要が無い。また、前記反応液（Ｆ）には酵母生育のための栄養成分（窒素源やビタミン類等）を含まないので、目的生成物であるＬ−オルニチンを得るために、反応終了時には夾雑物となる前記栄養成分を除去するための煩雑な処理を行う必要が無い。すなわち、反応終了時に前記反応液（Ｆ）に含まれる、Ｌ−オルニチン以外の主な成分は、酵母、Ｌ−アルギニン、および尿素であり、これらは前述の反応液（Ｂ）の場合と同様の方法によって比較的簡単に分離・除去できる。よって当該Ｌ−オルニチン製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
前記反応液（Ｆ）を構成する前記添加物（Ｚ）がウレアーゼを含む場合は、前記副生成物である尿素は、当該ウレアーゼによって、二酸化炭素とアンモニアとに分解することができ、前記二酸化炭素およびアンモニアは前述の反応液（Ｃ）の場合と同様の方法で容易に分離・除去することができる。また、前記反応液（Ｆ）中のウレアーゼは、Ｌ−オルニチン生成反応終了後に、前記クロマトグラフィー等の常法によって除去することができる。よって前記添加物（Ｚ）がウレアーゼを含むことによって、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
前記反応液（Ｆ）を構成する前記添加物（Ｚ）が糖類および／または２価の金属塩を含む場合は、当該Ｌ−オルニチン生成反応の効率を高めて、前記反応液（Ｆ）中に生成するＬ−オルニチンの量を増加させることができる。その理由としては、前記糖類および／または２価の金属塩が、Ｌ−オルニチン生成反応中の当該酵母内部の呼吸等の代謝系を活性化させ、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが一因として考えられる。
また、前記添加物（Ｚ）としての前記糖類および／または２価の金属塩は、Ｌ−オルニチン生成反応終了後に、前記クロマトグラフィー等の常法によって、前記反応液（Ｆ）から簡便に除去することができる。よって当該Ｌ−オルニチン製造方法においては、煩雑な精製処理を行うことなく目的生成物であるＬ−オルニチンを得ることができる。
本発明のＬ−オルニチンの製造方法では、反応液（Ｆ）のｐＨは８以上である。該反応液（Ｆ）のｐＨを、酵母の増殖に適したｐＨ（ｐＨ３〜７）よりも高いｐＨとすることによって、酵母の増殖を抑制し、Ｌ−オルニチンを従来方法よりも効率よく生産することができる。この理由として、酵母の増殖抑制に伴って酵母の正常な代謝が抑制されることにより、酵母内がＬ−オルニチンの合成に適した環境になること、また、酵母の増殖を抑制することにより、反応原料であるＬ−アルギニンが酵母増殖のための窒素源として消費されなくなること等が考えられる。
【００５５】
前記反応液（Ｆ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明は、前記反応液（Ｂ）におけるＬ−アルギニン、ｐＨ調整剤、および溶媒についての説明と同様である。また、前記反応液（Ｆ）における酵母についての説明は、前記反応液（Ｂ）における酵母についての説明と同様である。
また、前記反応液（Ｆ）をｐＨ８以上に調整する方法は、前記反応液（Ｂ）をｐＨ８以上に調整する方法と同様に行うことができる。
前記Ｌ−アルギニン、ｐＨ調整剤、溶媒、添加剤（Ｚ）、および酵母の５つの原料を混合した時のｐＨが８以上に調整された反応液（Ｆ）において、前記酵母とＬ−アルギニンとが接触することにより、反応原料であるＬ−アルギニンから目的物質であるＬ−オルニチンを生成する反応が開始される。
【００５６】
前記添加物（Ｚ）は、ウレアーゼ、糖類、または２価の金属塩から選択される１種又は２種以上である。
当該ウレアーゼについての説明は、前記反応液（Ｃ）におけるウレアーゼについての説明と同様であり、当該糖類についての説明は、前記反応液（Ｄ）における糖類についての説明と同様であり、当該２価の金属塩についての説明は、前記反応液（Ｅ）における２価の金属塩についての説明と同様である。
前記添加物（Ｚ）として、ウレアーゼ、糖類、および２価の金属塩から１種又は２種以上を選択する際の組み合せとしては、任意の組み合せが可能である。
【００５７】
本発明のＬ−オルニチンの製造方法において、前記反応液（Ｆ）の温度、すなわち反応温度としては、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、好ましくは２０〜６０℃であり、より好ましくは２５〜５０℃であり、さらに好ましくは３０〜４５℃であり、特に好ましくは３０〜４０℃である。前記範囲内であると、Ｌ−オルニチン生成を効率よく行うことができる。その理由としては、前記範囲内の温度が、当該酵母のＬ−オルニチンの生成に関連する代謝活動等を活性化することが考えられる。
【００５８】
当該Ｌ−オルニチンの製造方法における反応時間としては、反応が進行すれば特に制限されないが、多くの場合、１時間以上、好ましくは１２〜１２０時間程度である。
反応の進行および終了は、例えばアミノ酸分析装置等を用いた常法によって判断することができる。
【００５９】
前述したように、反応終了後の前記反応液（Ｆ）中には、Ｌ−オルニチン、酵母、添加物（Ｚ）、およびＬ−アルギニンが含まれる。前記Ｌ−オルニチンおよびＬ−アルギニンは、食品素材としても有用なアミノ酸である。また、前記酵母も、栄養価の高い食品素材である。したがって、反応終了後の前記反応液（Ｆ）は、その溶液自体が、食品素材として有用である。
【００６０】
≪Ｌ−オルニチン生産能を有する海洋酵母≫
サッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＦ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０２８）は、前記反応液（Ａ）〜（Ｆ）において、Ｌ−アルギニンと接触することによってＬ−オルニチンを産生しうる海洋酵母である。
前記ＮＦ−１株は、本発明者らが日本国茨城沖の海洋から単離した海洋酵母であり、日本国つくば市東１丁目１番地中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターへ寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０２８の受託番号が付与された。
前記ＮＦ−１株の菌学的性質、生理・生化学的性質、および遺伝学的な性質は以下の通りである。
前記ＮＦ−１株の菌学的性質を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2011015641.tif 000002
【００６２】
前記ＮＦ−１株の生理・生化学的性質として、各種炭素源に対する発酵性を表２に示す。
【００６３】
【表２】
2011015641.tif 000003
【００６４】
前記ＮＦ−１株の生理・生化学的性質として、各種炭素源に対する資化性を表３に示す。
【００６５】
【表３】
2011015641.tif 000004
【００６６】
前記ＮＦ−１株の生理・生化学的性質として、各種窒素源に対する資化性を表４に示す。
【００６７】
【表４】
2011015641.tif 000005
【００６８】
表２〜４において、「＋」は陽性を意味し、「−」は陰性を意味する。
【００６９】
表１に示した「菌の形態」および「胞子」は、ＹＰＤ培地で培養したＮＦ−１株を顕微鏡で観察した結果である。
なお、表１の性質の観察に用いたＹＰＤ培地の内容は次の通りである；
ＹＰＤ培地｛グルコース２．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン２．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキスパウダー１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）、寒天２．０％（ｗ／ｖ）、溶媒は滅菌蒸留水｝。
表１に示した「コロニー形態」は、上記のＹＰＤ培地で培養した菌体を目視にて観察した結果である。
表２に示した各種炭素源に対する発酵性の分析は、次の方法で行った。
６．７％濃度のＹＮＢ溶液（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ；Ｄｉｆｃｏ社製）１ｍｌを添加し、ダラム管を１本入れた２０ｍｌ容の試験管を１４本用意した。つぎに、各試験管ごとに異なる炭素源を１種含むように、表２に示す１４種類の炭素源のうち１種を５０ｍＭ濃度で添加し、蒸留水で１０ｍｌに定容した。各試験管にさらにＮＦ−１株を菌数約２．５×１０６になるように植菌してから、２５℃の恒温槽に一ヶ月置いた。この期間に、ダラム管に気泡が見られた場合に、その試験管中の当該炭素源に対して前記ＮＦ−１株の発酵性があると判定した。
表３に示した各種炭素源に対する資化性の分析は、各試験管にダラム管を入れない以外は、前記各種炭素源に対する発酵性の分析と同様の方法で行った。当該一ヶ月の期間中に、試験管中の培養液が白く濁り変化した場合に、当該炭素源に対して前記ＮＦ−１株の資化性があると判定した。
表４に示した各種窒素源に対する資化性の分析は、次の方法で行った。
１１．７％濃度のＹＣＢ溶液（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ；Ｄｉｆｃｏ社製）１ｍｌを添加した２０ｍｌ容の試験管を１０本用意した。つぎに、各試験管ごとに異なる窒素源を１種含むように、表４に示す１０種類の窒素源のうち１種を５０ｍＭ濃度で添加し、蒸留水で１０ｍｌに定容した。各試験管にさらに、ＮＦ−１株を菌数約２．５×１０６になるように植菌してから、２５℃の恒温槽に一ヶ月置いた。この期間に、試験管中の培養液が白く濁り変化した場合に、当該窒素源に対して前記ＮＦ−１株の資化性があると判定した。
【００７０】
前記ＮＦ−１株の遺伝学的性質として、前記ＮＦ−１株のリボソームのＩＴＳ−５．８Ｓ領域のｒＤＮＡ配列を解析した結果を配列表の配列番号１に示す。前記ＤＮＡ配列解析は、前記ＮＦ−１株の生菌体から常法によってゲノムＤＮＡ成分を抽出して行った。
【００７１】
以上の表１〜４および配列表に示した前記ＮＦ−１株の菌学的性質、生理・生化学的性質、およびＩＴＳ−５．８Ｓ領域のｒＤＮＡ配列解析の結果によって、前記ＮＦ−１株はサッカロミセス・セレビシュ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であると推定された。
【００７２】
前記ＮＦ−１株とサッカロミセス・セレビシュの公知の酵母株との生理・生化学的性質の差異を表５に示す。
【００７３】
【表５】
2011015641.tif 000006
【００７４】
表５において、「＋」は陽性を意味し、「−」は陰性を意味する。
なお、表５における「酵母（Ａ株）」は市販のパン酵母（商品名:レギュラーイースト;オリエンタル酵母工業株式会社製）であり、「酵母（Ｂ株）」は市販の海洋酵母（商品名：イースト・Ｍ；三共株式会社製）である。
また、表５における発酵性および資化生試験は、前述の試験方法と同様に行った。
【００７５】
前記ＮＦ−１株の培養方法としては、サッカロミセス属に属する酵母が必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩などを含有する液状の栄養培地（ｐＨ３〜７）に植菌して、温度約３０℃にて好気的条件で培養すればよい。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７７】
［参考例１：酵母菌体（ＮＦ−１株）の増殖培養］
＜前培養＞
５００ｍｌ容三角フラスコに２００ｍｌのＹＰＤ液体培地｛グルコース２．０％（ｗ／ｖ）、ポリぺプトン２．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキスパウダー１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）｝を投入し、１２１℃で、１５分間加熱滅菌した。その液体培地の温度を３０℃まで冷却してから、希塩酸と希アルカリを用いて培養液のｐＨを５．０に調整した。その後、ＹＰＤ寒天培地で培養した新鮮な酵母菌体（ＮＦ−１株）の一白金耳を接種し、２５℃において１８時間振とう培養後、これを前培養液として本培養に供した。
＜本培養＞
１０リットル容ジャーファーメンターに７リットルのＹＰＤ液体培地（組成は前培養と同じ）を投入し、１２１℃で、６０分間加熱滅菌した。その液体培地の温度を３０℃まで冷却してから、希塩酸と希アルカリを用いて培養液のｐＨを５．０に調整した。その後、前記の前培養液２００ｍｌを当該液体培地に注入し、２５℃において攪拌しながら４８時間通気培養した。つぎに当該培養液を遠心分離して菌体を沈殿させ、上澄みの培養液を除いた。つづいて当該菌体を滅菌蒸留水によって充分に洗浄した後、再度遠心分離して酵母菌体を集菌した。以上の処理によって、ＮＦ−１株の培養菌体２４０ｇ｛水分７４．５％（ｗ／ｗ）｝が得られた。
この菌体をＮＦ−１菌体として、下記の各種試験例及び実施例に供した。
【００７８】
［参考例２：異なるｐＨの培地におけるＮＦ−１株の増殖の比較］
ｐＨ３〜１１の範囲でｐＨを１刻みで調整したＹＰＤ液体培地を用いて、前記ＮＦ−１株を培養し、その生育とｐＨの関係を調べた。
ｐＨ３〜８の緩衝液としては、０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液と０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム水溶液とを目的のｐＨの緩衝液を得られる比率で混合した溶液を使用した。ｐＨ９〜１０の緩衝液としては、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液と０．２Ｍグリシン水溶液とを目的のｐＨの緩衝液を得られる比率で混合した溶液を使用した。ｐＨ１１の緩衝液としては、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液と０．５Ｍリン酸水素二ナトリウム水溶液とを目的のｐＨの緩衝液を得られる比率で混合した溶液を使用した。
ＹＰＤ液体培地（グルコース２．０％（ｗ／ｖ）、ポリぺプトン２．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキスパウダー１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））は、目的のｐＨごとに前記各緩衝液を用いて調製し、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌したものを使用した。
前記各ｐＨに調整したＹＰＤ液体培地１０ｍｌを、９本の滅菌済み２０ｍｌ容Ｌ型試験管にそれぞれ分注し、参考例１で得たＮＦ−１菌体の懸濁水３０μｌ（約２×１０６菌数）を接種した。これらの試験管を２５℃において３０ｒｍｐで振とうしながら７２時間培養した。この培養期間において、１時間ごとに各Ｌ型試験管中の培養液の濁度（ＯＤ６６０）を測定した。その結果を図１に示す。
【００７９】
図１に示した各ｐＨに調整した培養液におけるＮＦ−１株の増殖曲線から、当該ＮＦ−１株はｐＨ３〜６では増殖が速く、ｐＨ７〜８では増殖がかなり抑制され、ｐＨ９〜１１ではほとんど増殖しないことが確認できた。
【００８０】
［実施例１〜６、比較例１］
１００ｍＭのＬ−アルギニン水溶液にウレアーゼを２０ｐｐｍ添加し、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコ６個に５０ｍｌずつ分注した。つぎに参考例１で得られたＮＦ−１菌体を０〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度となるようにそれぞれ加えて菌体を均一に分散させた後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。これらの三角フラスコを３５℃にて１２０ｒｐｍで振とうしながら７２時間反応させた。
その後、８５℃の加熱処理を１５分間行って酵母を失活させて反応を停止し、遠心分離によって菌体を除去した。各三角フラスコの上清液に蒸留水を加えて６２．５ｍｌに定容し、上清に生成されたＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表６に示す。
【００８１】
【表６】
2011015641.tif 000007
【００８２】
表６に示した実施例１〜６および比較例１の結果から、ＮＦ−１菌体を０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で用いることによって効率よくＬ−オルニチンが生成できることを確認した。
【００８３】
［実施例７〜１１、比較例２］
Ｌ−アルギニン水溶液の濃度を０〜５００ｍＭの範囲で変更した以外は、実施例３と同様の方法でＬ−オルニチンを生成した。
その結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】
2011015641.tif 000008
【００８５】
表７に示した実施例７〜１１および比較例２の結果から、５０〜５００ｍＭのアルギニン濃度で効率よくＬ−オルニチンが生成できることを確認した。
【００８６】
［実施例１２〜１５、比較例３〜７］
参考例２で使用した前記ｐＨ３〜１１の各緩衝液をそれぞれ用いて、１００ｍＭのＬ−アルギニン溶液を調製し、さらにウレアーゼを２０ｐｐｍ添加してから、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコ９個に各ｐＨの前記ろ過滅菌溶液を５０ｍｌずつ分注した。つぎに参考例１で得られたＮＦ−１菌体を２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で各三角フラスコに加えて菌体を均一に分散し、３５℃にて１２０ｒｐｍで振とうしながら７２時間反応させた。
その後、８５℃の加熱処理を１５分間行って酵母を失活させて反応を停止し、遠心分離によって菌体を除去した。各三角フラスコの上清液に蒸留水を加えて６２．５ｍｌに定容し、上清に生成されたＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表８に示す。
【００８７】
【表８】
2011015641.tif 000009
【００８８】
表８に示した実施例１２〜１５および比較例３〜７の結果から、ｐＨ８．０以上で効率よくＬ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【００８９】
［実施例１６〜１９］
前記糖類であるグルコース、フルクトース、またはスクロースを１．０％（ｗ／ｖ）濃度で加えてからｐＨを１０．５に調整した以外は、実施例３と同様の方法でＬ−オルニチンを生成した。
その結果を表９に示す。
【００９０】
【表９】
2011015641.tif 000010
【００９１】
表９に示した実施例１６〜１９の結果から、反応液中に糖類を添加することによって、さらに効率よくＬ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【００９２】
［実施例２０〜２４］
グルコースの添加濃度を０〜５．０％（ｗ／ｖ）の範囲で変更した以外は、実施例１６と同様の方法でＬ−オルニチンを生成した。
その結果を表１０に示す。
【００９３】
【表１０】
2011015641.tif 000011
【００９４】
表１０に示した実施例２０〜２４および実施例１６の結果から、反応液中に０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）の濃度でグルコースを添加することによって、さらに効率よくＬ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【００９５】
［実施例２５〜２７］
２価の金属塩として、塩化マグネシウム、塩化マンガン、または塩化鉄（ＩＩ）を添加し、当該２価の金属塩の濃度を１０ｐｐｍとしてから、各反応液のｐＨを１０．５に調整した以外は、実施例１１と同様の方法でＬ−オルニチンを生成した。その結果を表１１に示す。
【００９６】
【表１１】
2011015641.tif 000012
【００９７】
表１１に示した実施例２５〜２７および実施例１１の結果から、反応液中に２価の金属塩を含むことによって、より効率よくＬ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【００９８】
［実施例２８〜３１］
参考例１と同様の方法で下記酵母の各菌体を得て、前記ＮＦ−１菌体に代えてそれらの各菌体を使用し、Ｌ−アルギニン濃度を５０ｍＭに変更した以外は、実施例５と同様の方法でＬ−オルニチンを生成した。
その結果を表１２に示す。
【００９９】
【表１２】
2011015641.tif 000013
【０１００】
表１２中の各酵母菌体（Ｉ）〜（ＩＶ）の記号はそれぞれ以下のものを示す。
菌体 (I)：前記ＮＦ−１株
菌体 (II)：サッカロミセス・セルビシュに属するパン酵母：前記「酵母（Ａ株）」 
菌体 (III)：サッカロミセス・セルビシュに属する海洋酵母：前記「酵母（Ｂ株）」
菌体 (IV)：カンジダ・ユティリスに属する酵母：ＮＢＲＣ−１０７０７の寄託番号で前記特許生物寄託センターへ寄託されている酵母
【０１０１】
表１２に示した実施例２８〜３１の結果から、サッカロミセス属、カンジダ属の各酵母菌体を用いることによって、Ｌ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【０１０２】
［実施例３２〜４３］（Ｌ−オルニチン生成におよぼす反応温度の影響）
５０ｍＭのＬ−アルギニン水溶液のｐＨを０．５ＮのＮａＯＨでｐＨ１０．５に調節した後、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌し、滅菌した２０ｍｌ容Ｌ型試験管１２本に１０ｍｌずつ分注した。つぎに前記各試験管へ参考例１で得られたＮＦ−１菌体０．５ｇ（５．０％（ｗ／ｖ））を加え、さらにウレアーゼを２０ｐｐｍ添加した後、２０〜６０℃の各温度設定にて３０ｒｐｍで振とうしながら７２時間反応させた。その後、８５℃、１５分間の加熱処理で酵母を失活させて反応を停止し、遠心分離によって菌体を除去した。各試験管の上清液を蒸留水で１２．５ｍｌに定容し、生成されたＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表１３に示す。
【０１０３】
【表１３】
2011015641.tif 000014
【０１０４】
表１３に示した実施例３２〜４３の結果から、反応温度２０〜６０℃の範囲内でＬ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【０１０５】
［実施例４４］
１００ｍＭのＬ−アルギニン水溶液にウレアーゼを１０ｐｐｍ添加し、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、無菌の１０リットル容ジャーファーメンターに４０００ｍｌ注入した。つぎに参考例１で得られたＮＦ−１菌体２００ｇ（５．０％（ｗ／ｖ））を加えて菌体を均一に分散させた後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。この反応液を３５℃にて攪拌しながら７２時間反応させた。
前記反応期間において、反応開始後２４時間、４８時間、および７２時間で、反応液１００ｍｌを取り出し、８５℃の加熱処理を１５分間行って酵母を失活させて反応を停止し、遠心分離によって菌体を除去した。その上清液に蒸留水を加えて１００ｍｌに定容し、上清に生成されたＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表１４に示す。
【０１０６】
【表１４】
2011015641.tif 000015
【０１０７】
表１４に示した実施例４４の結果から、反応開始後２４〜７２時間で効率よくＬ−オルニチンが生成されることを確認できた。
【０１０８】
［実施例４５］
まず、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）に属する酵母ＭＲ−１株（前記特許生物寄託センターに「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１３４」の寄託番号で寄託済み；特願２００４−３３３６７１号公報に記載の酵母）を用いて、前記参考例１と同様の方法で本培養を行い、当該ＭＲ−１菌体２７４．３ｇ（水分含量約７６．５％）を得た。
つぎに、３％（ｗ／ｖ）のＬ−アルギニン水溶液（１７２ｍＭ）を０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、無菌の１０リットル容ジャーファーメンターに４０００ｍｌ注入した。つづいて、前記ＭＲ−１菌体２００ｇ（５．０％（ｗ／ｖ））を加えて菌体を均一に分散させた後、ＭｎＣｌ２を３０ｐｐｍ添加し、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。この反応液を３５℃にて攪拌しながら４８時間反応させた。
その後、遠心分離によって菌体を除去した。その上清液に蒸留水を加えて４０００ｍｌに定容し、上清液に生成されたＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。
つぎに、前記上清液にウレアーゼを２０ｐｐｍ添加し、６０℃において当該尿素分解反応を２時間行った。つづいて、８５℃の加熱処理を３０分間行ってウレアーゼを失活させて反応を停止し、遠心分離によって不溶物を除去した。
さらに、前記上清液（４０００ｍｌ）をｐＨ８．５に調整した後、７５℃にて加熱しながらエバポレーターを用いて、約７５ｔｏｒｒ（約９９９９．１５Ｐａ）にて減圧濃縮して、濃縮上清液（８００ｍｌ）を得た。前記濃縮上清液に含まれる尿素およびアンモニアを測定した。これらの結果を表１５に示す。
【０１０９】
【表１５】
2011015641.tif 000016
【０１１０】
表１５に示した実施例４５の結果から、ピキア属の酵母菌体を用いることによって、Ｌ−オルニチンが生成されることを確認できた。また、反応液中に含まれる尿素をウレアーゼによって分解除去し得ること、反応液中に含まれるアンモニアを脱気処理によって除去し得ることも確認できた。
【０１１１】
［実施例４６］
１００ｍＭのＬ−アルギニン水溶液にウレアーゼを１０ｐｐｍ添加し、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコ２個に５０ｍｌずつ分注した（以後、それぞれ、フラスコ（イ）、フラスコ（ロ）という。）。つぎに参考例１で得られたＮＦ−１菌体を５％（ｗ／ｖ）の濃度となるようにそれぞれ加えて菌体を均一に分散させた後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。これらの三角フラスコを３５℃にて１２０ｒｐｍで振とうしながら２４時間反応させた。
反応開始２４時間後に、フラスコ（イ）中の反応液を回収して遠心分離（６０００Ｇ、１５分間）し、沈殿した酵母菌体を除いて上清のみを回収した。その上清を、さらに０．４５μｍの無菌フィルターを用いて完全に酵母菌体を除いた反応液（以後、反応液イ’という。）を得た。微量の反応液イ’を分取し、実施例１〜６と同じ希釈率となるように蒸留水を加えて、反応液イ’中に含まれるＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表１６に示す。
また、微量を分取した後の反応液イ’を別の滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコに入れて、３５℃にて１２０ｒｐｍで２４時間振とうした後、反応液イ”として得た。当該反応液イ”中のＬ−オルニチン量の測定も、前記反応液イ’の場合と同様に行った。その結果を表１６に併記する。
一方、反応開始２４時間後に、微量のフラスコ（ロ）中の反応液を分取して、反応液ロ’として回収し、８５℃の加熱処理を１５分間行って酵母を失活させて反応を停止して、遠心分離によって菌体を除去した後、実施例１〜６と同じ希釈率となるように蒸留水を加えて、反応液ロ’中に含まれるＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表１６に併記する。
また、微量を分取した後のフラスコ（ロ）中の反応液を、３５℃にて１２０ｒｐｍで２４時間振とうした後、反応液ロ”として得た。当該反応液ロ”中のＬ−オルニチン量の測定も、前記実施例１〜６と同様の方法で行った。その結果を表１６に併記する。
なお、前記反応液イ’を０．２ｍｌ分取してＹＰＤ培地のシャーレに塗布し、２５℃にて５日間培養したところ、当該培地上に全くコロニーが形成されなかった。すなわち、前記反応液イ’中には酵母菌体が全く含まれないことを確かめた。一方、前記反応液ロ’を同様にＹＰＤ培地に塗布して培養したところ、当該培地上に多数のコロニーが形成された。すなわち、前記反応液ロ’中には多数の生きた酵母菌体が含まれることを確かめた。
【０１１２】
【表１６】
2011015641.tif 000017
【０１１３】
［実施例４７］
１００ｍＭのＬ−アルギニン水溶液にウレアーゼを１０ｐｐｍ添加し、さらにグルコースを１．０％（ｗ／ｖ）濃度で添加して、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコ２個に５０ｍｌずつ分注した（以後、それぞれ、フラスコ（ハ）、フラスコ（ニ）という。）。つぎに参考例１で得られたＮＦ−１菌体を５％（ｗ／ｖ）の濃度となるようにそれぞれ加えて菌体を均一に分散させた後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。これらの三角フラスコを３５℃にて１２０ｒｐｍで振とうしながら２４時間反応させた。
反応開始２４時間後に、フラスコ（ハ）中の反応液を回収して遠心分離（６０００Ｇ、１５分間）し、沈殿した酵母菌体を除いて上清のみを回収した。その上清を、さらに０．４５μｍの無菌フィルターを用いて完全に酵母菌体を除いた反応液（以後、反応液ハ’という。）を得た。微量の反応液ハ’を分取し、実施例１〜６と同じ希釈率となるように蒸留水を加えて、反応液ハ’中に含まれるＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表１７に示す。
また、微量を分取した後の反応液ハ’を別の滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコに入れて、３５℃にて１２０ｒｐｍで２４時間振とうした後、反応液ハ”として得た。当該反応液ハ”中のＬ−オルニチン量の測定も、前記反応液ハ’の場合と同様に行った。その結果を表１７に併記する。
一方、反応開始２４時間後に、微量のフラスコ（ニ）中の反応液を分取して、反応液ニ’として回収し、８５℃の加熱処理を１５分間行って酵母を失活させて反応を停止して、遠心分離によって菌体を除去した後、実施例１〜６と同じ希釈率となるように蒸留水を加えて、反応液ニ’中に含まれるＬ−オルニチンの量を全自動アミノ酸分析装置ＪＬＣ−５００／Ｖ（日本電子株式会社製）によって測定した。その結果を表１７に併記する。
また、微量を分取した後のフラスコ（ニ）中の反応液を、３５℃にて１２０ｒｐｍで２４時間振とうした後、反応液ニ”として得た。当該反応液ニ”中のＬ−オルニチン量の測定も、前記実施例１〜６と同様の方法で行った。その結果を表１７に併記する。
なお、前記反応液ハ’を０．２ｍｌ分取してＹＰＤ培地のシャーレに塗布し、２５℃にて５日間培養したところ、当該培地上に全くコロニーが形成されなかった。すなわち、前記反応液ハ’中には酵母菌体が全く含まれないことを確かめた。一方、前記反応液ニ’を同様にＹＰＤ培地に塗布して培養したところ、当該培地上に多数のコロニーが形成された。すなわち、前記反応液ニ’中には多数の生きた酵母菌体が含まれることを確かめた。
【０１１４】
【表１７】
2011015641.tif 000018
【０１１５】
実施例４６および４７の結果から、酵母菌体を保留した反応液ロ”及び反応液ニ”では(反応液ロ’及び反応液ニ’とそれぞれ比較すると)反応開始２４時間以降も同条件で２4時間維持されたことでさらにＬ−オルニチンの濃度が増加したと考えられる。その一方で、反応開始２４時間後に酵母菌体を除いた後も同条件で２４時間維持した反応液イ”及び反応液ハ”では(反応液イ’及び反応液ハ’とそれぞれ比較すると)Ｌ−オルニチンの濃度が酵母菌体を除いた後は増加していないと考えられた。要するに、酵母菌体を除いた反応液では、Ｌ−オルニチンの合成が行われないことを確認できた。すなわち、本発明のＬ−オルニチン製造方法において、Ｌ−アルギニンを原料としたＬ−オルニチン生成反応は、反応液中の酵母菌体（ＮＦ−１株）内で行われることを確認できた。
【０１１６】
［実施例４８］
１００ｍＭのＬ−アルギニン水溶液にグルコースを１．０％（ｗ／ｖ）濃度で添加し、０．４５μｍの無菌フィルターを用いてろ過滅菌した後、滅菌した２００ｍｌ容三角フラスコに５０ｍｌを分注した。つぎに参考例１で得られたＮＦ−１菌体を５％（ｗ／ｖ）の濃度となるように加えて菌体を均一に分散させた後、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。この三角フラスコを３５℃にて１２０ｒｐｍで振とうしながら、７２時間反応させた。この間、反応開始時、および反応開始後２４、４８、７２時間において、反応液から０．２ｍｌを分取し、それぞれをＹＰＤ培地のシャーレに塗布して２５℃にて５日間培養したところ、図２に示すように、当該培地上にコロニーが形成された。
【０１１７】
実施例４８の結果から、本発明のＬ−オルニチン製造方法において、当該Ｌ−オルニチン生成反応の経過と共に、当該酵母の生存率が低下することを確認できた。
【０１１８】
実施例４８の結果を実施例４７の結果と併せて考察すると、当該Ｌ−オルニチン生成反応は生きた酵母菌体（ＮＦ−１株）内で起きていると考えられる。
さらに、反応液が糖類を含むことによって酵母の生存率が高まると考えられ、この場合、当該Ｌ−オルニチン生成量は向上する（実施例１６〜１９）ことからも、当該Ｌ−オルニチン生成反応は、生きた酵母菌体内で起きていると考えられる。
【符号の説明】
【０１１９】
「◇」… ｐＨ３の結果，「□」… ｐＨ４の結果，「▲」… ｐＨ５の結果
「×」… ｐＨ６の結果，「＊」… ｐＨ７の結果，「○」… ｐＨ８の結果
「＋」… ｐＨ９の結果，「●」… ｐＨ１０の結果，「△」… ｐＨ１１の結果
【受託番号】
【０１２０】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０２８
【図１】
2011015641.tif 000019
【図２】
2011015641.tif 000020
【配列表】
2011015641000001.app