(57)【要約】【課題】被験体において免疫応答を発生させること。【解決手段】本発明は、種々の細胞型（哺乳動物、昆虫および植物の細胞を含むが、これらに限定されない）におけるＨＩＶポリペプチドの効率的な発現に関する。ＨＩＶ  Ｇａｇ含有ポリペプチドをコードする合成発現カセットが記載され、ＤＮＡ免疫、パッケージング細胞株の作製、およびＥｎｖ含有タンパク質、ｔａｔ含有タンパク質またはＧａｇ含有タンパク質の生成を含む適用における発現カセットの使用もまた記載される。本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法、ならびにＶＬＰの使用（抗原提示のためのビヒクルおよびＶＬＰが投与される被験体における免疫応答の刺激が挙げられるが、これらに限定されない）を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
ＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、ｐｒｏｔポリペプチド、逆転写酵素、Ｅｎｖポリペプチドまたはｔａｔ含有ポリペプチド）をコードする合成発現カセットを記載し、同様に発現カセットの用途も記載する。本発明は、種々の細胞型におけるＨＩＶポリペプチドの効率的な発現に関する。さらに、本発明は、ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ＶＬＰ）を産生する方法、ならびにＶＬＰの用途およびオリゴマーエンベロープタンパク質の高レベル発現を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代の医療が直面する最大の健康上の脅威の１つとして認識されている。この疾患に対する治療法はまだ存在しない。
【０００３】
１９８３〜１９８４年に、３つのグループが、独立して、ＡＩＤＳの疑わしい病因を同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８〜８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，Ｅｓｓｅｘ＆Ｇｒｏｓｓ、編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  １：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：４９７〜５００；Ｌｅｖｙら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：８４０〜８４２を参照のこと。これらの単離体は、様々に、リンパ節症関連ウイルス（ＬＡＶ）、ＩＩＩ型ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれた。これらの単離体の全ては、同じウイルスの系統であり、そして後に、総称的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と名付けられた。ＡＩＤＳを生じるウイルスに関連する単離体とともに、この元来ＨＩＶと呼ばれる系統は、現在ＨＩＶ−１と名付けられ、そして関連するウイルスは、ＨＩＶ−２と呼ばれる。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：６６２〜６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：３４３〜３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：６９１〜６９５を参照のこと。
【０００４】
ＨＩＶウイルスに関して、大量の情報が集められているが、現在まで効果的なワクチンはまだ同定されていない。ＨＩＶによりコードされるｅｎｖ、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｔａｔ遺伝子産物を含む、ワクチン開発のいくつかの標的が調査されている。
【０００５】
Ｈａａｓら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（３）：３１５〜３２４、１９９６）は、ＨＩＶ−１による選択的コドンの使用が、ウイルスタンパク質の実質的な画分の合成の効率の悪さの原因であるらしいことを示唆した。Ａｎｄｒｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７〜１５０３、１９８８）は、最適化コドン用法で合成ｇｐ１２０を使用するＤＮＡワクチン接種により惹起された増大した免疫応答を記載した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２〜４９０３、１９９７）は、Ｇａｇのコード配列番号およびＧａｇ−プロテアーゼコード配列内に配置された阻害性（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）の不活性化を考察している。
【０００６】
ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、ウイルス様粒子のアセンブリに必須である。ＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質は、アセンブリ、粒子放出後のビリオン成熟、およびウイルス複製における早期進入後工程を含む、ウイルスの生存サイクルの多くの段階に関与する。ＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質の役割は、多数ありかつ複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：１〜１５、１９９８）。
【０００７】
Ｗｏｌｆら、（１９９６年１０月３日公開、ＰＣＴ国際出願、ＷＯ  ９６／３０５２３；１９９１年１０月２日公開、欧州特許出願、公開番号０  ４４９  １１６  Ａｌ）は、非感染性レトロウイルス様粒子キャリアとして作用するためのＨＩＶ−１の変化したｐｒ５５  Ｇａｇの使用（特に、免疫学的に重要なエピトープの提示のための）を記載している。Ｗａｎｇら、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：５２４〜５３４、１９９４）は、ＨＩＶ
Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をビリオンへとアセンブリすることを研究するためのシステムを記載している。彼らは、ＨＩＶ  Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコードする配列の構築、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質の存在下でのこのような配列の発現、およびこれらのタンパク質のウイルス粒子へのアセンブリを記載している。
【０００８】
近年、Ｓｈｉｖｅｒら（１９９８年８月１３日公開、ＰＣＴ  国際出願、ＷＯ  ９８／３４６４０）は、ＨＩＶ  ＧａｇおよびＨＩＶＧａｇの改変体をコードする合成ＤＮＡ分子を生成するための変更したＨＩＶ−１（ＣＡＭ１）Ｇａｇコード配列を記載した。この合成分子のコドンは、予定された宿主細胞により好まれた。
【０００９】
ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、約１６０ｋＤの糖タンパク質（ｇｐ１６０）である。宿主細胞のウイルス感染中、ｇｐ１６０は、宿主細胞プロテアーゼにより切断され、ｇｐ１２０および必須膜タンパク質ｇｐ４１を形成する。このｇｐ４１部分は、ビリオンの膜障壁に固定される（そして架橋する）るが、ｇｐ１２０セグメントは、周囲の環境に突出する。ｇｐ１２０とｇｐ４１との間には共有結合は存在しないので、遊離のｇｐ１２０は、ビリオンおよび感染細胞の表面から放出される。
【００１０】
Ｈａａｓら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（３）：３１５〜３２４、１９９６）は、ＨＩＶ−１による選択的コドン用法が、ウイルスタンパク質の実質的な画分の合成が不十分であることの原因であるらしいことを示唆した。Ａｎｄｒｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７〜１５０３、１９８８）は、最適化コドン用法で合成ｇｐ１２０を使用するＤＮＡワクチン接種により惹起された増大した免疫応答を記載した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチド、ｔａｔポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、ｐｒｏｔポリペプチド、逆転写酵素、またはＧａｇ含有ポリペプチドの改善された発現、およびウイルス様粒子の産生に関する。
例えば、本発明は、以下を提供する。
（項目１）  ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ここで、該Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２０として示される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目２）  ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の発現カセットであって、ここで該Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号９として示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目３）  項目１に記載の発現カセットであって、ここで、ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドを含むポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４として示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目４）  前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目５）  項目４に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５、配列番号７８および配列番号７９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目６）  前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶ逆転写酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目７）  項目６に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目８）  前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶ  ｔａｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の発現カセット。
（項目９）  項目８に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８および配列番号８９からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目１０）  項目１に記載の発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号６として示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目１１）  項目１に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＩＶポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、（ｉ）該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４として示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、そして（ｉｉ）該配列が逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変されている、発現カセット。
（項目１２）  前記ポリヌクレオチド配列が、Ｔヘルパー細胞およびＣＴＬエピトープを保つ、項目１１に記載の発現カセット。
（項目１３）  項目１に記載の発現カセットであって、ここで前記ポリヌクレオチド配列が、ＨＣＶコアポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号７として示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目１４）  ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ここで該Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号７１（図５８）または配列番号７２（図５９）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
（項目１５）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、Ｖ１領域に隣接する配列を含むが、該Ｖ１領域自体に欠失を有する、項目１４に記載の発現カセット。
（項目１６）  前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号６５（図５２  ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１）として示される配列を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（項目１７）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、Ｖ２領域に隣接する配列を含むが、該Ｖ２領域自体に欠失を有する、項目１４に記載の発現カセット。
（項目１８）  前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号６０（図４７）および配列番号６６（図５３）からなる群より選択される、項目１７に記載の発現カセット。
（項目１９）  項目１７に記載の発現カセットであって、ここで前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号３４（図２０）；配列番号３７（図２４）；配列番号４０（図２７）；配列番号４３（図３０）；配列番号４６（図３３）；配列番号４９（図３６）および配列番号７６（図６４）からなる群より選択される、発現カセット。（項目２０）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、Ｖ１／Ｖ２領域に隣接する配列を含むが、該Ｖ１／Ｖ２領域自体において欠失を有する、項目１４のいずれかに記載の発現カセット。（項目２１）  項目２０に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５９（図４６）；配列番号６１（図４８）；配列番号６７（図５４）および配列番号７５（図６３）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目２２）  項目２０に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号３５（図２１）；配列番号３８（図２５０）；配列番号４１（図２８）；配列番号４４（図３１）；配列番号４７（図３４）および配列番号５０（図３７）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目２３）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１４０ポリペプチドのｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を妨げる、変異した切断部位を有する、項目１４に記載の発現カセット。
（項目２４）  項目２３に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５７（図４４）；配列番号６１（図４８）および配列番号６３（図５０）；からなる群より選択される、発現カセット。
（項目２５）  項目２３に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号３９（図２６）；配列番号４０（図２７）；配列番号４１（図２８）；配列番号４２（図２９）；配列番号４３（図３０）；配列番号４４（図３１）；配列番号４５（図３２）；配列番号４６（図３３）；配列番号４７（図３４）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目２６）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドから誘導されたポリペプチドを含む、項目１４に記載の発現カセット。
（項目２７）  項目２６に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号６４（図５１）；配列番号６５（図５２）；配列番号６６（図５３）；配列番号６７（図５４）；配列番号６８（図５５）；配列番号７５（図６３）および配列番号７３（図６１）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目２８）  項目２６に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号４８（図３５）；配列番号４９（図３６）；配列番号５０（図３７）；配列番号７６（図６４）および配列番号７４（図６２）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目２９）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドから誘導されたポリペプチドを含む、項目１４に記載の発現カセット。
（項目３０）  項目２９に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５６（図４３）；配列番号５７（図４４）；配列番号５８（図４５）；配列番号５９（図４６）；配列番号６０（図４７）；配列番号６１（図４８）；配列番号６２（図４９）および配列番号６３（図５０）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目３１）  項目２９に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号３６（図２３）；配列番号３７（図２４）；配列番号３８（図２５）；配列番号３９（図２６）；配列番号４０（図２７）；配列番号４１（図２８）；配列番号４２（図２９）；配列番号４３（図３０）；配列番号４４（図３１）；配列番号４５（図３２）；配列番号４６（図３３）および配列番号４７（図３４）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目３２）  前記Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドから誘導されたポリペプチドを含む、項目１４に記載の発現カセット。
（項目３３）  項目３２に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５４（図４１）および配列番号５５（図４２）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目３４）  項目３２に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号３３（図１９）；配列番号３４（図２０）および配列番号３５（図２１）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目３５）  項目１４に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号５５（図４２）；配列番号６２（図４９）；配列番号６３（図５０）および配列番号６８（図５５）からなる群より選択される、発現カセット。
（項目３６）  選択された宿主細胞中で使用するための組換え発現系であって、項目１〜３５のいずれかに記載の発現カセットを含み、そしてここで、前記ポリヌクレオチド配列が、該選択された宿主細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、組換え発現系。
（項目３７）  項目３６に記載の組換え発現系であって、前記制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からなる群より選択される、組換え発現系。
（項目３８）  前記転写プロモーターが、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒ、およびメタロチオネインからなる群より選択される、項目３６に記載の組換え発現系。
（項目３９）  項目１〜３５のいずれかに記載の発現カセットを含む細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が、前記選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞。
（項目４０）  前記細胞が哺乳動物細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目４１）  前記細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される、項目４０に記載の細胞。
（項目４２）  前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目４１に記載の細胞。
（項目４３）  前記細胞が、昆虫細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目４４）  前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ５）またはＳｆ９昆虫細胞のいずれかである、項目４３に記載の細胞。
（項目４５）  前記細胞が、細菌細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目４６）  前記細胞が、酵母細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目４７）  前記細胞が、植物細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目４８）  前記細胞が、抗原提示細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目４９）  前記リンパ様細胞が、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびこれらの前駆細胞からなる群より選択される、項目４８に記載の細胞。（項目５０）  前記細胞が、初代細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目５１）  前記細胞が、不死化細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目５２）  前記細胞が、腫瘍由来細胞である、項目３９に記載の細胞。
（項目５３）  ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチド配列を含むポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドを生成するための条件下で項目３９に記載の細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。
（項目５４）  ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成するための方法であって、該方法は、該ＶＬＰを生成するための条件下で項目３９に記載の細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。
（項目５５）  ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の組成物を生成するための方法であって、該方法は、（ａ）該ＶＬＰを生成するための条件下で項目３９に記載の細胞をインキュベートする工程；および（ｂ）該ＶＬＰを実質的に精製して、ＶＬＰの組成物を生成する工程、を包含する、方法。
（項目５６）  項目１〜３５のいずれかに記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトした適切な宿主細胞を含む、レンチウイルスベクターをパッケージングするために有用な細胞株であって、そしてここで、前記ポリヌクレオチド配列が、該宿主細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞株。
（項目５７）  適切な宿主細胞が、項目１〜１３のいずれかに記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされている、項目５６に記載の細胞株。
（項目５８）  適切な宿主細胞が、項目１〜３に記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされている、項目５６に記載の細胞株。
（項目５９）  適切な宿主細胞が、項目１４〜３５に記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされている、項目５６に記載の細胞株。
（項目６０）  哺乳動物被験体において使用するための遺伝子送達ベクターであって、ここで該ベクターが、項目１〜３５のいずれかに記載の発現カセットを含み、そしてここで前記ポリヌクレオチド配列が、該被験体における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、遺伝子送達ベクター。
（項目６１）  被験体のＤＮＡ免疫の方法であって、該方法は、項目６０に記載の遺伝子送達ベクターを、該被験体における前記発現カセットの発現と適合性の条件下で、該被験体に導入する工程を包含する、方法。
（項目６２）  前記遺伝子送達ベクターが非ウイルスベクターである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）  前記ベクターが粒子状キャリアを用いて送達される、項目６１に記載の方法。
（項目６４）  前記ベクターが金粒子またはタングステン粒子上にコートされ、そして、該コートされた粒子が、遺伝子銃を用いて前記被験体に送達される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）  前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）  前記ベクターがウイルスベクターである、項目６１に記載の方法。
（項目６７）  前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、項目６６に記載の方法。
（項目６８）  前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）  前記被験体が哺乳動物である、項目６１に記載の方法。
（項目７０）  前記哺乳動物がヒトである、項目６９に記載の方法。
（項目７１）  被験体において免疫応答を生成させる方法であって、該方法は、該被験体の細胞を、項目６０に記載の遺伝子送達ベクターで、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリペプチドの生成を可能にする条件下で、トランスフェクトし、それによって、該ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する工程、を包含する、方法。
（項目７２）  前記ベクターが非ウイルスベクターである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）  前記ベクターが粒子状キャリアを用いて送達される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）  前記ベクターが金粒子またはタングステン粒子上にコートされ、そして、該コートされた粒子が、遺伝子銃を用いて前記脊椎動物の細胞に送達される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）  前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化される、項目７３に記載の方法。
（項目７６）  前記ベクターがウイルスベクターである、項目７１に記載の方法。
（項目７７）  前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、項目７６に記載の方法。
（項目７８）  前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）  前記被験体が哺乳動物である、項目７１に記載の方法。
（項目８０）  前記哺乳動物がヒトである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）  前記トランスフェクションがエキソビボで行われ、前記トランスフェクトされた細胞が前記被験体に再導入される、項目７１に記載の方法。
（項目８２）  前記トランスフェクションが前記被験体においてインビボで行われる、項目７１に記載の方法。
（項目８３）  前記免疫応答が体液性免疫応答である、項目７１に記載の方法。
（項目８４）  前記免疫応答が細胞性免疫応答である、項目７１に記載の方法。
（項目８５）  アルファウイルスベクター構築物を含む遺伝子送達ベクターであって、ここで、該アルファウイルス構築物は、項目１〜３５のいずれかに記載の発現カセットを含む、遺伝子送達ベクター。
（項目８６）  前記アルファウイルスベクター構築物がｃＤＮＡベクター構築物である、項目８５に記載の遺伝子送達ベクター。
（項目８７）  前記アルファウイルスが組換えアルファウイルス粒子調製物を含む、項目８５に記載の遺伝子送達ベクター。
（項目８８）  前記ベクターが、真核生物層状ベクター開始系を含む、項目８５に記載のアルファウイルスベクター。
（項目８９）  被験体において免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、該被験体において免疫応答を刺激するのに有効な量の、項目８５〜８８のいずれかに記載の遺伝子送達ベクターを投与する工程を包含する、方法。
（項目９０）  前記遺伝子送達ベクターが、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、皮内、経皮、膣内、直腸内、経口または静脈内に投与される、項目８９に記載の方法。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、発現カセットを包含する。この発現カセットは、配列番号２０として示される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、このＧａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号９または配列番号４に示される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。この発現カセットは、ＨＩＶプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、以下；配列番号５、配列番号７８、および配列番号７９からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列）をさらに含み得る。この発現カセットは、ＨＩＶの逆転写酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、以下；配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、および配列番号８４からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）を、さらに含み得る。この発現カセットは、ＨＩＶのｔａｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、以下；配列番号８７、配列番号８８、および配列番号８９からなる群より選択される配列）を、さらに含み得る。この発現カセットは、ＨＩＶのポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号６として示される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）を、さらに含み得る。この発現カセットは、ＨＩＶのポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。ここで、（ｉ）このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４として示される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を、含み、そして（ｉｉ）ここでこの配列は、逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変される。上記の発現カセットは、Ｔヘルパー細胞およびＣＴＬエピトープを保存し得る。この発現カセットは、ＨＣＶのコアポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号７として示される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列）を、さらに含み得る。
【００１３】
別の局面において、本発明は、ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。ここでこのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７１（図５８）または配列番号７２（図５９）に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、このＥｎｖ発現カセットは、Ｖ１領域に隣接するが、Ｖ１領域自体には欠失を有する配列（例えば、配列番号６５（図５２、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１）として示される配列）を含む。特定の実施形態において、Ｅｎｖ発現カセットは、Ｖ２領域に隣接するが、Ｖ２領域自体には欠失を有する配列（例えば、配列番号６０（図４７）；配列番号６６（図５３）；配列番号３４（図２０）；配列番号３７（図２４）；配列番号４０（図２７）；配列番号４３（図３０）；配列番号４６（図３３）；配列番号７６（図６４）および配列番号４９（図３６）において示される配列）を含む。特定の実施形態において、Ｅｎｖ発現カセットは、Ｖ１／Ｖ２領域に隣接するがＶ１／Ｖ２領域自体には欠失を有する配列（例えば、配列番号５９（図４６）；配列番号６１（図４８）；配列番号６７（図５４）；配列番号７５（図６３）；配列番号３５（図２１）；配列番号３８（図２５）；配列番号４１（図２８）；配列番号４４（図３１）；配列番号４７（図３４）および配列番号５０（図３７））を含む。Ｅｎｖコード発現カセットはまた、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへのｇｐ１４０ポリペプチドの切断を妨げる変異した切断部位（例えば、配列番号５７（図４４）；配列番号６１（図４８）；配列番号６３（図５０）；配列番号３９（図２６）；配列番号４０（図２７）；配列番号４１（図２８）；配列番号４２（図２９）；配列番号４３（図３０）；配列番号４４（図３１）；配列番号４５（図３２）；配列番号４６（図３３）；および配列番号４７（図３４））を含み得る。Ｅｎｖ発現カセットは、ｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１６０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド（例えば、配列番号６４（図５１）；配列番号６５（図５２）；配列番号６６（図５３）；配列番号６７（図５４）；配列番号６８（図５５）；配列番号７５（図６３）；配列番号７３（図６１）；配列番号４８（図３５）；配列番号４９（図３６）；配列番号５０（図３７）；配列番号７６（図６４）；および配列番号７４（図６２））を含み得る。Ｅｎｖ発現カセットは、ｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１４０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド（例えば、配列番号５６（図４３）；配列番号５７（図４４）；配列番号５８（図４５）；配列番号５９（図４６）；配列番号６０（図４７）；配列番号６１（図４８）；配列番号６２（図４９）；配列番号６３（図５０）；配列番号３６（図２３）；配列番号３７（図２４）；配列番号３８（図２５）；配列番号３９（図２６）；配列番号４０（図２７）；配列番号４１（図２８）；配列番号４２（図２９）；配列番号４３（図３０）；配列番号４４（図３１）；配列番号４５（図３２）；配列番号４６（図３３）；および配列番号４７（図３４））を含み得る。Ｅ��ｖ発現カセットはまた、ｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドまたはｇｐ１２０  Ｅｎｖポリペプチドに由来するポリペプチド（例えば、配列番号５４（図４１）；配列番号５５（図４２）；配列番号３３（図１９）；配列番号３４（図２０）；および配列番号３５（図２１））を含み得る。Ｅｎｖ発現カセットは、系統ＳＦ１６２またはＵＳ４に対して、残基１２８〜約１９４に対応するアミノ酸を欠くＥｎｖポリペプチド（例えば、配列番号５５（図４２）；配列番号６２（図４９）；配列番号６３（図５０）；および配列番号６８（図５５））を含み得る。
【００１４】
別の局面では、本発明は、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含する。この系は、選択された宿主細胞における発現に適合した制御エレメントに作動可能に連結した、本明細書中に記載の１つ以上の発現カセットを含む。この発現カセットは、１つまたは複数のベクター上に含まれ得、そして同じまたは異なるプロモーターを用い得る。例示的な制御エレメントは、転写プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒ、およびメタロチオネイン）、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終止配列を含む。
【００１５】
別の局面においては、本発明は、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含する。この系は、選択された宿主細胞における発現に適合した制御エレメントに作動可能に連結した、本明細書中に記載の任意の１つの発現カセットを含む。例示的なコントロールエレメントとしては、転写プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＭＭＬＶ−ＬＴＲ、およびメタロチオネイン）、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終止配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
なお別の局面では、本発明は、細胞における発現に適合した制御エレメントに
作動可能に連結した、本明細書中に記載の１つ以上の発現カセットを含む細胞を包含する。この細胞は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、またはＣＨＯ細胞）、インセクト細胞（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ５）またはＳｆ９）、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、抗原提示細胞（例えば、初代の不死化されたかまたは腫瘍由来のリンパ細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞））であり得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ＨＩＶの、ｐｒｏｔ、ｐｏｌ、逆転写酵素、Ｅｎｖ、またはＴａｔを含有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを産生するための方法を包含する。この方法は、このポリペプチドを産生するための条件下で、本明細書に記載の１つ以上の発現カセットを含む細胞をインキュベートする工程を包含する。
【００１８】
なお別の局面では、本発明は、免疫学的応答を生成するための組成物を含む。この組成物は、本明細書に記載の１つ以上の発現カセットを含む。特定の実施形態において、この組成物はまた、アジュバントを含む。
【００１９】
なおさらなる局面において、本発明は、被験体において免疫応答を生成する方法を包含する。この方法は、本明細書に記載の１つ以上の発現カセットを含む組成物を、被験体におけるこの発現カセットの発現に適した条件下で、この被験体に導入する工程を包含する。特定の実施形態では、この発現カセットは、遺伝子送達ベクターを用いて導入される。１つより多い発現カセットが、１つ以上の遺伝子送達ベクターを用いて導入され得る。
【００２０】
なお別の局面において、本発明は、ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む精製されたポリヌクレオチドを含む。ここで、このＥｎｖポリペプチドをコードするこのポリヌクレオチド配列は、配列番号７１（図５８）または配列番号７２（図５９）に少なくとも９０％配列同一性を有する配列を含む。さらなる例示的な精製されたポリヌクレオチド配列が上記に提示された。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術、またはそれらの組み合わせにより生成され得る。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、ＨＩＶＧａｇポリペプチド配列を含むポリペプチドを産生するための方法を包含する。ここでこの方法は、ポリペプチドの産生のための条件下で、目的の発現カセットを含む任意の上記の細胞をインキュベートする工程を包含する。
【００２３】
本発明はさらにＶＬＰを産生するための条件下で、目的の発現カセットを含有する任意の上記の細胞をインキュベートする工程を包含する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の組成物を産生するための方法を包含する。ここでは、目的の発現カセットを含有する任意の上記の細胞を、ＶＬＰの産生のための条件下でインキュベートし、そしてＶＬＰは、実質的に精製され、ＶＬＰの組成物を生成する。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の発現カセットを用いて、パッケージング細胞株を生成する。例えば、レンチウイルスベクターをパッケージングするために有用な細胞株は、本発明の発現カセットを含有する発現ベクターを有する適切な宿主細胞を包含する。ここでこのポリヌクレオチド配列は、宿主細胞における発現に適した制御エレメントに作動可能に連結される。好ましい実施形態において、このような宿主細胞は、ＨＩＶポリメラーゼポリペプチドまたはそれに由来するポリペプチド（例えば、ここでこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６として示される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む）を有する１つ以上の発現カセットでトランスフェクトされ得る。さらに、ＨＩＶポリメラーゼポリペプチドは、逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変され得る。このようなポリヌクレオチド配列は、例えば、ワクチン適用において用いられる場合、Ｔヘルパー細胞およびＣＴＬエピトープを保存し得る。さらに、このポリヌクレオチド配列はまた、他のポリペプチドを含み得る。さらに、さらなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（その発現がパッケージング細胞株機能のために有用である）がまた、利用され得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、被験体に用いるための遺伝子送達ベクターまたはワクチンベクターを含む。ここで、このベクターは、被験体において用いるのに適切な遺伝子送達ベクターであり、そして本発明の１つ以上の発現カセットのいずれかを含む。ここで、目的のポリヌクレオチド配列は、被験体における発現に適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。このような遺伝子送達ベクターは、被験体のＤＮＡ免疫の方法において、例えば、被験体における発現カセットの発現に適合性である条件下で、遺伝子送達ベクターを被験体に導入することによって用いられ得る。本発明の実施において有用な遺伝子送達ベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：非ウイルスベクター、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、特定のキャリア（ここで、このベクターは、ポリ乳酸コ−グリコリド（ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）粒子、金粒子またはタングステン粒子でコートされ、例えば、コートされた粒子は、遺伝子銃を用いて被験体細胞に送達され得る）、リポソーム調製物、およびウイルスベクター（例えば、アルファウイルス属、ポックスウイルス属、およびワクシニアウイルス属由来のベクター、ならびにレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含むが、これに限定されない））。アルファウイルス由来のベクターとしては、例えば、アルファウイルスｃＤＮＡ構築物、組換えアルファウイルス粒子調製物、および真核生物層状（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始系（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が挙げられる。１つの実施形態において、被験体は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物であり、そしてさらなる実施形態において、被験体はヒトである。
【００２７】
本発明はさらに、被験体において免疫応答を発生させる方法を含む。ここで、被験体の細胞は、上記の遺伝子送達ベクター（例えば、アルファウイルス構築物；アルファウイルスｃＤＮＡ構築物；真核生物細胞層状ベクター開始系（例えば、適切な真核生物細胞層状ベクター開始系の記載に関する、米国特許第５，８１４，４８２号を参照のこと）、アルファウイルス粒子調製物；など）のいずれかを用いて、選択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチド（すなわち、本発明の任意の発現カセットによりコードされる）の産生を可能にする条件下でトランスフェクトされ、それにより、ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入される。あるいは、またはさらに、この細胞は、被験体にインビトロでトランスフェクトされ得る。免疫応答は、体液性および／または細胞媒介性（細胞性）であり得る。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、精製したポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、精製したポリヌクレオチドは、配列番号２０として示される配列に少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列、およびその相補鎖を含む。別の実施形態において、精製したポリヌクレオチドは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ここで、このポリヌクレオチド配列は、配列番号２０として示される配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列、およびその相補鎖を含む。なお別の実施形態は、精製したポリヌクレオチドは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ここで、このポリヌクレオチド配列は、配列番号９として示される配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列、およびその相補鎖を含む。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、以下の配列の１つに少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む：配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、およびその相補鎖。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術、またはその組換えにより産生され得る。
本発明のこれらの実施形態または他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すれば当業者に容易に見出される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ネイティブのＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇタンパク質コード配列の不活化部位の位置を示す。
【図２】図２は、ネイティブのＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇプロテアーゼタンパク質コード配列の不活化部位の位置を示す。
【図３】図３は、ウイルス様粒子の電子顕微鏡写真を示す。図３Ａは、合成ＨＩＶ−１SF2ｇａｇ構築物を用いてトランスフェクトされるＣＯＳ−７細胞中の未成熟ｐ５５Ｇａｇウイルス様粒子を示す。他方、図３Ｂは、改変型ＨＩＶ−１SF2ｇａｇプロテアーゼ構築物（ＧＰ２、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）７０）を用いてトランスフェクトした細胞中の成熟ＶＬＰ（矢印）および非成熟ＶＬＰを示す。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後、２４時間（ｇａｇ）、または４８時間（ｇａｇプロテアーゼ）で固定し、そして引き続き電子顕微鏡（拡大率１００，０００倍）により分析した。ベクター（ｐＣＭＶＫｍ２）単独を用いてトランスフェクトした細胞は、陰性コントロールとなる（データ示さず）。
【図４】図４は、８〜１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動された一連の画分由来のサンプル、かつクーマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）ブルー染色により可視化された生じたバンドの画像を示す。結果は、ネイティブのｐ５５  Ｇａｇ  ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、約１．１７ｇ／ｍｌにピークを有する１．１５〜１．１９ｇ／ｍｌの範囲のショ糖勾配でバンドを形成したことを示す。
【図５】図５は、図４に類似した画像を示す。ここで、この分析は、合成Ｇａｇ発現カセットにより産生されたＧａｇＶＬＰを用いて行った。
【図６】図６は、ネイティブのＧａｇおよび改変型のＧａｇをコードする２つのバキュロウイルス発現カセットから得られたいくつかの調製物由来の精製したＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇの総量の比較を示す。
【図７Ａ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｂ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｃ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｄ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｅ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｆ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｇ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｈ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｉ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図７Ｊ】図７は、以下を含む本発明の改変型コード配列の整列を示す：合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセット（配列番号５）、および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）。共通領域（配列番号９）は、１位〜１２６２位にわたる。
【図８】図８は、８〜１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動された一連の画分由来の野生型Ｇａｇ−ＨＣＶコア発現サンプル、かつクーマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色により可視化された生じたバンドの画像を示す。
【図９】図９は、図８に示されるゲルのウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図１０】図１０は、図９に示される結果に類似した結果を示す。図１０における結果は、主なＨＣＶコア−特異的反応性が、７２，０００ｋＤのおよその分子量に移動することを示す。これは、Ｇａｇ−ＨＣＶコアキメラタンパク質の予想された分子量と一致する。
【図１１】図１１は、不安定型ヒトｍＲＮＡ（ヒトＩＦＮγ  ｍＲＮＡ；図１１Ａ）、野生型ＨＩＶ  ＧａｇネイティブＲＮＡ（図１１Ｂ）、安定型ヒトｍＲＮＡ（ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ；図１１Ｃ）、および合成ＨＩＶＧａｇ  ＲＮＡ（図１１Ｄ）に対応するｃＤＮＡのＡＴ含有量（％）の比較を示す。
【図１２Ａ】図１２は、ネイティブＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇポリメラーゼ配列の不活化部位の位置を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、ネイティブＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇポリメラーゼ配列の不活化部位の位置を示す。
【図１２Ｃ】図１２は、ネイティブＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇポリメラーゼ配列の不活化部位の位置を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒのベクター地図を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ｐＣＭＶＩＩＩベクターの地図を示す。
【図１４】図１４は、ｐＣＭＶ−ＬＩＮＫのベクター地図を示す。
【図１５】図１５は、以下の形態のＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドの間の関連性を示す模式図を示す：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、およびｇｐ４１。
【図１６】図１６は、ＳＦ１６２由来の野生型ｇｐ１２０のヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
【図１７】図１７は、ＳＦ１６２由来の野生型ｇｐ１４０のヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。
【図１８】図１８は、ＳＦ１６２由来の野生型ｇｐ１６０のヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。
【図１９】図１９は、ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す。
【図２０】図２０は、ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す。
【図２１】図２１は、ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す。
【図２２−１】図２２は、ＩＦＮγ（図２Ｃおよび図２Ｇ）；ネイティブのｇｐ１６０  Ｅｎｖ  ＵＳ４およびＳＦ１６２（それぞれ、図２Ａおよび図２Ｅ）；ＧＡＰＤＨ（図２Ｄおよび図２Ｈ）；ならびにＵＳ４およびＳＦ１６２についての合成ｇｐ１６０  Ｅｎｖ（それぞれ、図２Ｂおよび図２Ｆ）についての配列の長さにわたるＡ−Ｔ含有量の％を示す。
【図２２−２】図２２は、ＩＦＮγ（図２Ｃおよび図２Ｇ）；ネイティブのｇｐ１６０  Ｅｎｖ  ＵＳ４およびＳＦ１６２（それぞれ、図２Ａおよび図２Ｅ）；ＧＡＰＤＨ（図２Ｄおよび図２Ｈ）；ならびにＵＳ４およびＳＦ１６２についての合成ｇｐ１６０  Ｅｎｖ（それぞれ、図２Ｂおよび図２Ｆ）についての配列の長さにわたるＡ−Ｔ含有量の％を示す。
【図２３】図２３は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す。
【図２４】図２４は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３７）を示す。
【図２５】図２５は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。
【図２６】図２６は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＳＦ１６２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す。
【図２７】図２７は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４０）を示す。
【図２８】図２８は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４１）を示す。
【図２９】図２９は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す。
【図３０】図３０は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４３）を示す。
【図３１】図３１は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す。
【図３２】図３２は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ８．ｍｏｄＳＦ１６２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す。
【図３３】図３３は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ８．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す。
【図３４】図３４は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４７）を示す。
【図３５】図３５は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す。
【図３６】図３６は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号４９）を示す。
【図３７】図３７は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す。
【図３８】図３８は、ＵＳ４由来の野生型ｇｐ１２０のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。
【図３９】図３９は、ＵＳ４由来の野生型ｇｐ１４０のヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。
【図４０Ａ】図４０は、ＵＳ４由来の野生型ｇｐ１６０のヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す。
【図４０Ｂ】図４０は、ＵＳ４由来の野生型ｇｐ１６０のヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す。
【図４１】図４１は、ｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す。
【図４２】図４２は、ｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌ  １２８−１９４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５５）を示す。
【図４３】図４３は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。
【図４４】図４４は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＵＳ４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５７）を示す。
【図４５】図４５は、ｇｐ１４０．ＴＭ．ｍｏｄＵＳ４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５８）を示す。
【図４６】図４６は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号５９）を示す。
【図４７】図４７は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６０）を示す。
【図４８】図４８は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６１）を示す。
【図４９】図４９は、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌ  １２８−１９４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６２）を示す。
【図５０】図５０は、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌ  １２８−１９４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す。
【図５１】図５１は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６４）を示す。
【図５２】図５２は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６５）を示す。
【図５３】図５３は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６６）を示す。
【図５４】図５４は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６７）を示す。
【図５５】図５５は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌ  １２８−１９４と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示す。
【図５６】図５６は、野生型ＵＳ４由来のＥｎｖの共通領域のヌクレオチド配列（配列番号６９）を示す。
【図５７】図５７は、野生型ＳＦ１６２由来のＥｎｖの共通領域のヌクレオチド配列（配列番号７０）を示す。
【図５８】図５８は、ＵＳ４由来のＥｎｖの共通領域に対応する合成配列のヌクレオチド配列（配列番号７１）を示す。
【図５９】図５９は、ＳＦ１６２由来のＥｎｖの共通領域に対応する合成配列のヌクレオチド配列（配列番号７２）を示す。
【図６０】図６０は、Ｅｎｖポリペプチド精製ストラテジーの略図を示す。
【図６１Ａ】図６１は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７３）を示す。
【図６１Ｂ】図６１は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７３）を示す。
【図６２Ａ】図６２は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７４）を示す。
【図６２Ｂ】図６２は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７４）を示す。
【図６３Ａ】図６３は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７５）を示す。
【図６３Ｂ】図６３は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７５）を示す。
【図６４Ａ】図６４は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７６）を示す。
【図６４Ｂ】図６４は、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２．Ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２と名付けた２シストロン構築物のヌクレオチド配列（配列番号７６）を示す。
【図６５】図６５は、以下の配列をコードするポリペプチドを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真を示す：図６５Ａ、ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；  図６５Ｂ、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４；図６５Ｃ、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２．ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２（２シストロンＥｎｖおよびＧａｇ）；図６５Ｄおよび６５Ｅ、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；および図６５Ｆ、ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２。
【図６６−１】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−３】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−４】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−５】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−６】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−７】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−８】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−９】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１０】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１１】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１２】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１３】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１４】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１５】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１６】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１７】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１８】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−１９】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２０】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２１】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２２】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２３】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２４】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２５】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２６】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２７】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２８】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−２９】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−３０】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−３１】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６６−３２】図６６は、合成Ｅｎｖ発現カセットの各群について規定される共通領域を含む、本発明の選択された改変型コード配列の整列を示す。図６６Ａは、改変型ＳＦ１６２配列の整列を示す。図６６Ｂは、改変型ＵＳ４配列の整列を示す。これらの配列についての配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）を表１Ａおよび表１Ｂに示す。
【図６７】図６７は、２つのアカゲザルのマカク（Ｈ４４５、黒丸を有する線；およびＪ４０８、白丸を有する線）において得られた（抗体を結合する）ＥＬＩＳＡ力価を示す。ｙ軸は終点のｇｐ１４０  ＥＬＩＳＡ力価であり、そしてｘ軸は免疫後の週を示す。０、４、および８週目の破線は、ＤＮＡ免疫を示す。２７週目の交互の破線／点線は、ＤＮＡおよびタンパク質の追加免疫を示す。
【図６８】図６８は、ＳＦ２由来のＧａｇ逆転写酵素の野生型のヌクレオチド配列（配列番号７７）を示す。
【図６９】図６９は、ＧＰ１と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号７８）を示す。
【図７０】図７０は、ＧＰ２と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号７９）を示す。
【図７１Ａ】図７１は、ＦＳ（＋）．ｐｒｏｔｉｎａｃｔ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８０）を示す。ＦＳ（＋）は、ＧａｇＰｏｌコード配列におけるフレームシフトが存在することを示す。
【図７１Ｂ】図７１は、ＦＳ（＋）．ｐｒｏｔｉｎａｃｔ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８０）を示す。ＦＳ（＋）は、ＧａｇＰｏｌコード配列におけるフレームシフトが存在することを示す。
【図７２Ａ】図７２は、ＦＳ（＋）．ｐｒｏｔｉｎａｃｔ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭＷＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８１）を示す。
【図７２Ｂ】図７２は、ＦＳ（＋）．ｐｒｏｔｉｎａｃｔ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭＷＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８１）を示す。
【図７３Ａ】図７３は、ＦＳ（−）．ｐｒｏｔｍｏｄ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示す。ＦＳ（−）は、ＧａｇＰｏｌコード配列におけるフレームシフトが存在しないことを示す。
【図７３Ｂ】図７３は、ＦＳ（−）．ｐｒｏｔｍｏｄ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示す。ＦＳ（−）は、ＧａｇＰｏｌコード配列におけるフレームシフトが存在しないことを示す。
【図７４Ａ】図７４は、ＦＳ（−）．ｐｒｏｔｍｏｄ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭＷＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。
【図７４Ｂ】図７４は、ＦＳ（−）．ｐｒｏｔｍｏｄ．ＲＴｏｐｔ．ＹＭＷＭ．と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。
【図７５Ａ】図７５は、ＦＳ（−）．ｐｒｏｔｍｏｄ．ＲＴｏｐｔ（＋）と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８４）を示す。
【図７５Ｂ】図７５は、ＦＳ（−）．ｐｒｏｔｍｏｄ．ＲＴｏｐｔ（＋）と名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８４）を示す。
【図７６】図７６は、単離ＳＦ１６２由来の野生型Ｔａｔのヌクレオチド配列（配列番号８５）を示す。
【図７７】図７７は、Ｔａｔポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８６）を示す。
【図７８】図７８は、Ｔａｔ．ＳＦ１６２．ｏｐｔ．と名付けた合成Ｔａｔ構築物のヌクレオチド配列（配列番号８７）を示す。
【図７９】図７９は、ｔａｔ．ｃｙｓ２２．ＳＦ１６２．ｏｐｔ．と名付けた合成Ｔａｔ構築物のヌクレオチド配列（配列番号８８）を示す。この構築物は、ｔａｔポリペプチドをコードする。ここで、野生型Ｔａｔポリペプチドの２２位のシステイン残基は、グリシン残基に置換される。
【図８０−１】図８０は、Ｇａｇ．ｍｏｄ．ＳＦ２、ＧＰ１（配列番号７８）、およびＧＰ２（配列番号７９）と名付けた構築物のヌクレオチド配列の整列を示す。
【図８０−２】図８０は、Ｇａｇ．ｍｏｄ．ＳＦ２、ＧＰ１（配列番号７８）、およびＧＰ２（配列番号７９）と名付けた構築物のヌクレオチド配列の整列を示す。
【図８０−３】図８０は、Ｇａｇ．ｍｏｄ．ＳＦ２、ＧＰ１（配列番号７８）、およびＧＰ２（配列番号７９）と名付けた構築物のヌクレオチド配列の整列を示す。
【図８０−４】図８０は、Ｇａｇ．ｍｏｄ．ＳＦ２、ＧＰ１（配列番号７８）、およびＧＰ２（配列番号７９）と名付けた構築物のヌクレオチド配列の整列を示す。
【図８０−５】図８０は、Ｇａｇ．ｍｏｄ．ＳＦ２、ＧＰ１（配列番号７８）、およびＧＰ２（配列番号７９）と名付けた構築物のヌクレオチド配列の整列を示す。
【図８１】図８１は、このｔａｔタンパク質のアミノ末端をコードする、ｔａｔａｍｉｎｏＳＦ１６２．ｏｐｔと名付けた構築物のヌクレオチド配列（配列番号８９）を示す。システイン２２残基をコードするコドンに下線を付す。
【図８２】図８２は、ｔａｔ．ｃｙｓ２２．ＳＦ１６２．ｏｐｔ（配列番号８８）と名付けた構築物によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号９０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に言及しなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を、当該分野の範囲内で、使用する。そのような技術は、文献において充分説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ
Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ、（Ｒｅａｍら編．、１９９８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（Ｎｅｗｔｏｎ＆Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を参照のこと。
本明細書および添付の特許請求の版において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が、そうでないことを明確に示さない限り、その複数形を包含する。従って、例えば、「ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ」との参照は、２以上のそのような因子の混合物を包含する。
【００３２】
（１．定義）
本発明を記載するにおいて、以下の用語を使用し、そして、以下に示すように定義されることを意図する。
【００３３】
「合成」配列とは、本明細書において使用される場合、Ｅｎｖコードポリヌクレオチド、ｔａｔコードポリヌクレオチドまたはＧａｇコードポリヌクレオチドをいう。それらの発現は、本明細書において記載されるように、例えば、コドン置換、欠失、置換および／または阻害配列の不活化によって、最適化される。「野生型」または「ネイティブ」の配列とは、本明細書において使用される場合、それらが天然において見出されるのと本質的に同様なポリペプチドコード配列をいう。例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２単離体において見出されるようなＧａｇコード配列またはＨＩＶ−１ＳＦ１６２もしくはＨＩＶ１ＵＳ４において見出されるＥｎｖコード配列。
【００３４】
本明細書において使用される用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは、非複製性のウイルスシェル（以下にさらに考察するようないくつかのウイルスのうちのいくつかに由来する）をいう。ＶＬＰは、概して、１つ以上のウイルスタンパク質（例えば、以下であるがそれらに限定されない：キャプシドタンパク質、コートタンパク質、シェルタンパク質、表面タンパク質および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質またはそれらに由来する粒子形成ポリペプチド）から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系においてそのタンパク質の組換え発現の際に自然に形成し得る。具体的なＶＬＰを生成するための方法が当該分野において知られており、そして以下により詳細に記載される。ウイルスタンパク質の組換え発現に続くＶＬＰの存在は、当該分野において公知の従来技術（例えば、電子顕微鏡、生物物理学的特徴付けなど）を用いて検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５−１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３−４５０５を参照のこと。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離により単離され得るか、そして／または特徴的な密度バンド形成により同定され得る（例えば、実施例７）。あるいは、低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が問題のＶＬＰ調製物のガラス状水性サンプルにおいて行われ得、そして画像が、適切な曝露条件下で記録され得る。
【００３５】
粒子ウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」は、全長のウイルスタンパク質、およびそのフラグメントもしくは内部欠失を有するウイルスタンパク質であって、ＶＬＰ形成に有利な条件下でＶＬＰを形成する能力を有するものを意味する。従って、このポリペプチドは、全長配列、フラグメント、短縮型および部分の配列、ならびにその参照分子のアナログおよび前駆体を含み得る。従って、この用語は、そのポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を保持さえすれば、その配列に対する欠失、付加および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然の改変体を含む。なぜなら、コートタンパク質における改変がウイルス単離体の間にしばしば生じるからである。この用語はまた、そのタンパク質がＶＬＰを形成する能力を保持する限り、その参照タンパク質において天然ｉは生じない欠失、付加および置換を包含する。好ましい置換は、天然において保存的である置換である。すなわち、その側鎖において関連があるアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。具体的には、アミノ酸は、一般に４つのファミリーに分割される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、ときに、芳香族アミノ酸と分類される。
【００３６】
「抗原」とは、１つ以上のエピトープ（直鎖状、立体配座的、またはその両方）を含む分子であって、宿主の免疫系を刺激して、体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答をおこすものをいう。この用語は、用語「免疫原」と互換的に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５つのアミノ酸を含むが、３〜４アミノ酸ほどの小ささであり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えばＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７と約１５との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２または１５のアミノ酸）を含む。用語「抗原」とは、サブユニット抗原（すなわち、その抗原が天然に随伴する生物全体から分離され、そして別個にある抗原）、および殺傷され、減弱化され、または不活化された細菌、ウイルス、真菌、寄生動物または他の微生物の両方を意味する。抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメントのような抗体、および抗原または抗原性決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープもまた、本明細書において使用されるように抗原の定義のもとに入る。同様に、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用におけるような、インビボの抗原または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドヌクレオチドもまた、本明細書における抗原の定義に包含される。
【００３７】
本発明の目的のために、抗原は、以下により詳細に記載されるように、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生動物および真菌のいずれかに由来し得る。この用語はまた、任意の種々の腫瘍抗原を意図する。
【００３８】
さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、そのタンパク質が本明細書で記載されるように、免疫応答を惹起する能力を維持する限りにおいて、そのネイティブ配列に対して欠失、付加および置換のような改変（一般的に、天然で保存的である）を包含するタンパク質をいう。これらの改変は、部位指向的変異誘発によるように意図的であり得るが、または抗原を産生する宿主の変異によるように、事故的であり得る。
【００３９】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物において存在する抗原に対する、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の、被験体における発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいう。他方、「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的な応答を包含する。ＣＴＬは、腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と会合して提示され、そして細胞の表面に発現されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊、または細胞の溶解を誘導および進行させることを助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を包含する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面におけるＭＨＣ分子と会合してペプチド抗原を表示する細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激すること、およびその活性に焦点を充てることを助けるように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来の白血球）によって産生される、サイトカイン、ケモカインおよび他のこのような分子の産生をいう。
【００４０】
細胞性免疫応答を惹起する組成物またはワクチンは、細胞表面にＭＨＣ分子と会合しての抗原の提示によって脊椎動物被験体を感作するよう作用し得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面において抗原を提示する細胞においてかまたはその付近に指向される。さらに、抗原特異的なＴリンパ球が、免疫された宿主の将来の保護を可能にするように生成され得る。
【００４１】
特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞障害性細胞アッセイ、または感作された被験体におけるその抗原についてのＴリンパ球をアッセイすることによるような、多数のアッセイによって決定され得る、そのようなアッセイは当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法としては、Ｔ細胞集団、またはエピトープ特異的なＴｓａｉｂｏｕの測定による、細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌の測定を包含する（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ａ．Ｊ．、ａｎｄ  Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７−１３７１，１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｍ．Ｇ．、ｅｔ  ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ、Ａ．、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７により概説される）。
【００４２】
従って、本明細書において使用されるような免疫学的応答は、ＣＴＬの生成および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性の免疫応答を惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果の１つ以上を包含し得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／または目的の組成物もしくはワクチンにおいて存在する抗原（単数または複数）に対して指向されたサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、および／または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して免疫された宿主に対する保護を提供するように作用し得る。そのような応答は、当該分野で周知の、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００４３】
「免疫学的組成物」は、抗原性分子を含む組成物である。ここで、この組成物の被験体への投与は、目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の、被験体における発達をもたらす。
【００４４】
「サブユニットワクチン」とは、ウイルス、細菌または真菌のような目的の病原体からの抗原に由来するか、または相同である、１つ以上の選択された抗原を含むが、すべての抗原は含まないワクチン組成物を意味する。そのような組成物は、インタクトな病原細胞もしくは病原性粒子、またはそのような細胞または粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、サブユニットワクチンは、その病原体またはそのアナログから少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチドから調製され得る。従って、そのサブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成生成を含み得る。
【００４５】
「実質的に精製された」とは、一般に、物質が存在するサンプルの大部分の割合をその物質が含むような、物質（化合物、ポリヌクレオチド、蛋白質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）の単離をいう。代表的には、サンプルにおいて、実質的に精製された成分は、そのサンプルの、５０％、好ましくは８０％−８５％、より好ましくは９０〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術としては、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈降が挙げられる。
【００４６】
「コード配列」、すなわち選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節配列（または制御エレメント）の制御下に配置されるとき、インビボで転写（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドへと翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端での終始コドンによって決定される。コード配列としては、以下が挙げられ得るがそれらに限定されない：ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえも。転写終結配列がコード配列の３’側に配置され得る。
【００４７】
代表的な「制御エレメント」には、以下が挙げられるがそれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（転写終結コドンの３’に配置される）、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に配置される）、および翻訳終結配列。例えば、ＭｃＣａｕｇｈａｎら（１９９５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２：５４３１−５４３５；Ｋｏｃｈｅｔｏｖら（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．４４０：３５１−３５５を参照のこと。
【００４８】
「核酸分子」としては以下が挙げられるが、それらに限定されない：原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえも。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの、任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含する。
【００４９】
「作動可能に連結される」とは、エレメントの配置をいう。ここで、そのように記載された成分は、その通常の機能を実施するように配置される。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在するときに、そのコード配列の配列を実行し得る。このプロモーターは、それがその発現を指向するように機能する限りにおいて、そのコード配列と連続的である必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳されないが、なおも転写される配列が、プロモーターとコード配列との間に存在し得、そしてそのコード配列およびそのプロモーター配列は、なおも、そのコード配列に作動可能に連結されている、とみなされ得る。
【００５０】
「組換え（体）」とは、本明細書において使用されるとき、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドは、その起源もしくは操作のために、以下の通りである：（１）天然に随伴するポリヌクレオチドの全部または一部が随伴しないか；そして／または（２）天然に連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドが連結されている。用語「組換え」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用されると、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養（物）」、および単細胞生物性の存在として原核生物の微生物もしくは真核生物細胞株を示す、他のそのような用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターもしくは他のトランスファーＤＮＡについてのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用された細胞をいい、そしてトランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親の細胞の子孫は、偶然もしくは意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学的またはゲノムもしくは全ＤＮＡにおいてもとの親のものと完全に同一であるとは限らないかもしれない。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列のような関連する特性によって特徴づけられるほどに親と十分に類似している、その親の細胞の子孫は、この定義が意図する子孫において包含されており、そして上記の用語によって網羅される。
【００５１】
アミノ酸配列の「類似性」を決定するための技術は、当該分野において周知である。一般に、「類似性」とは、適切な位置での２つ以上のポリペプチドの、正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。ここで、アミノ酸は、同一であるか、または荷電もしくは疎水性のような、類似する化学的特性および／または物理的特性を有する。次いで、いわゆる「％類似性」が、比較されるポリペプチド配列の間で決定され得る。核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術もまた、当該分野において周知であり、そしてその遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること（通常、ｃＤＮＡ中間体を介する）およびそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれを、第二のアミノ酸配列を比較することを包含する。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、それぞれ、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の、正確な対応性をいう。
【００５２】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、その「％同一性」を決定することによって比較され得る。２つ以上のアミノ酸配列は、同様に、その「％同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列の％同一性は、核酸もしくはペプチドの配列に拘わらず、一般に、２つの整列された配列の間の正確な適合度を、その短い方の配列の長さで除し、そして１００を乗じた数として記載される。核酸配列についての適切な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムを、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５  補遺３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡによって開発されたスコアリング行列を用いて拡張して、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化して、ペプチド配列とともに使用し得る。核酸およびペプチドの配列についてのこのアルゴリズムの実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、そのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにおいて、提供される。この方法についてのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において記載されている。配列の間の％同一性または類似性を算出するための、他の等価に適切なプログラムは、一般に、当該分野において公知である。
【００５３】
例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の％同一性は、デフォルトスコアリング表および６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いて、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。本発明の状況に置いて％同一性を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このプログラムは、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって配布されている。このパッケージスイートから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用され得る。ここで、デフォルトパラメータがこのスコアリング表について使用される（例えば、ギャップオープンペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）は１２，ギャップエクステンションペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）は１、そしてギャップ（ｇａｐ）は６）。生成されたデータから、「マッチ（Ｍａｔｃｈ）」値は、「配列同一性」を反映する。配列の間の％同一性または％類似性を算出するための他の適切なプログラムは当該分野において一般に公知であり（例えば、整列プログラム）、これはまた、デフォルトパラメータを用いて使用され得る。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見いだされ得るｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５４】
当業者は、上記のプログラムにおいて所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを用意に決定し得る。例えば、検索パラメータは、問題の配列の大きさに基づいて変動し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘの連続したヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを包含する。ここで、（ｉ）Ｘの連続したヌクレオチドは、本明細書において記載された配列のいずれかに由来する、Ｙの連続したヌクレオチドと少なくとも約５０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸはＹと等価であり、そして（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチド以上、かつ、５０００までのヌクレオチドであり、好ましくは、８ヌクレオチド以上、かつ、５０００までのヌクレオチドであり、より好ましくは、１０〜１２ヌクレオチド以上、かつ、５０００までのヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは、１５〜２０ヌクレオチド以上、かつ、本明細書に記載される前兆配列に存在するヌクレオチドの数までである（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照のこと）。これは、上記の範囲に入る全ての整数値を包含する。
【００５５】
本発明の合成発現カセット（および精製されたポリヌクレオチド）は、本発明
の配列をクエリ配列として用いる場合に、本明細書において開示される合成発現カセット配列に対して（例えば、表１Ａおよび１Ｂにおいて提示される配列に対して）、約８０％〜約１００％、８０〜８５％を超え、好ましくは９０〜９２％を超え、より好ましくは９５％を超え、そして最も好ましくは９８％の配列（これらの記載される範囲内に入るすべての整数値を包含する）同一性を有する、関連するポリヌクレオチド配列を包含する。
【００５６】
２つの核酸フラグメントは、本明細書において記載されるように、「選択的にハイブリダイズ」するとみなされる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が、標的分子に対してハイブリダイズすることを、少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価され得る（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。そのようなアッセイは、選択制の程度を変更させることによって実施され得る（例えば、低度から高度のストリンジェンシーへと変更する条件を用いる）。低ストリジェンシーの条件が使用される場合、非特異的な結合の非存在は、非特異的な結合事象の非存在下で、その二次プローブはその標的にはハイブリダイズしないように部分的な程度の配列同一性さえも欠如する二次プローブ（例えば、その標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価され得る。。
【００５７】
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する場合、核酸は標的核酸配列に対して相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切案条件の選択により、そのプローブおよびその標的配列は、「選択的にハイブリダイズ」するか、または互いに結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」のもとで標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的に、約１０〜１４ヌクレオチド長で、その選択された核酸プローブに対して少なくとも約７０％配列同一性を有するヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、約１０〜１４ヌクレオチド長で、その選択された核酸プローブの配列に対して約９０〜９５％の配列同一性を有する標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／標的のハイブリダイゼーションに対して有用なハイブリダイゼーション条件（ここで、そのプローブおよび標的は、特定の程度の配列同一性を有する）は、当該分野において公知のように、決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、編者Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００５８】
ストリンジェンシー条件に関して、多数の等価な条件を使用して、部分的なストリンジェンシーを確立し得ることは周知であり、これは例えば、以下の因子を変動させることによる：プローブおよび標的の配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液の成分の濃度、そのハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアルデヒド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメータ、ならびに洗浄条件の変更。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野における標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。）。
【００５９】
第一のポリヌクレオチドは、それが、第二のポリヌクレオチドの領域と同じかまたは実質的に同じ塩基対配列を有するとき、またはそれが上記の配列同一性を示すときに、その第二のポリヌクレオチドに「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」。
【００６０】
第一のポリペプチドは、それが、（ｉ）第二のポリヌクレオチドに由来する第一のポリヌクレオチドによってコードされるか、または（ｉｉ）上記の第二のポリペプチドに対して配列同一性を示すときに、その第二のポリペプチドに「由来する」。
【００６１】
一般に、ウイルスポリペプチドは、それが、（ｉ）そのウイルスのポリヌクレオチド（ウイルスポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされるか、または（ｉｉ）上記のように、そのウイルスの特定のポリペプチドに対して配列同一性を示すときに、そのウイルスの特定のポリペプチド（ウイルスポリペプチド）に「由来する」。
【００６２】
「に（よって）コードされる（ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ）」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。ここで、そのポリペプチド配列またはその一部は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドからの、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてさらにより好ましくは、１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。また、その配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に識別可能であるポリペプチド配列も含まれる。
【００６３】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントであって、そのポリヌクレオチドに天然に随伴するタンパク質を実質的に含まない、例えば少なくとも約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満、を含むものをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、以下を包含する：そのポリヌクレオチドを含む細胞の、カオトロピック剤での破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈降での、そのポリヌクレオチドおよびタンパク質の分離。
【００６４】
「核酸免疫」とは、１つの抗原、複数の抗原、１つのエピトープまたは複数のエピトープのインビボ発現のための、１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。その核酸分子は、例えば、注射、吸入、経口、経鼻および粘膜での投与によってレシピエント被検体へ直接導入され得るか、またはその宿主から取り出された細胞へエキソビボ出導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、その被検体に再導入され、そこで、その核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答がマウントされ得る。
【００６５】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを、宿主細胞へと信頼性よく挿入するための方法または系に対していう。そのような方法は、組み込まれずに移入されたＤＮＡの一過的な発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製および発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された遺伝的物質の組み込みを生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、アルファウイルス、天然痘ウイルスおよびワクシニアウイルスに由来するベクター。免疫に使用されるときには、そのような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと称され得る。
【００６６】
「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、免疫系の細胞が媒介する分野の部分を構成する、抗体非産生リンパ球である。Ｔ細胞は、骨髄から、胸腺ホルモンの指向のもとで成熟プロセスを受ける胸腺へと移動する未熟なリンパ球から生じる。ここで、成熟リンパ球は、迅速に分割して増加して、非常に大多数になる。成熟中のＴ細胞は、それらが特定の抗原を認識し、そして結合する能力に基づいて免疫適格になる。免疫適格Ｔ細胞の活性化は、リンパ球の表面レセプターに抗原が結合するときに惹起される。
【００６７】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために使用される。細胞は、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたときに、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当該分野において一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ａｎｄ  Ｃｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。そのような技術を用いて、１つ以上の外来Ｄな部分を適切な宿主細胞へと導入し得る。この用語は、その遺伝的物質の安定なおよび一過的の両方の取り込みをいい、そしてペプチド連結されたＤＮＡおよび抗体連結されたＤＮＡを包含する。
【００６８】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させ得る（例えば、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子キャリアおよびりっぽそーむ）。代表的な「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向し得、そして遺伝子配列を標的細胞へと移入し得る任意の核酸構築物を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００６９】
「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の標的細胞への移入によって、その細胞は、通常の細胞には比較的非毒性である化合物または組成物に対して感受性になる。Ｍｏｏｌｔｅｎ、Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７。自殺遺伝子の例としては、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシジチンキナーゼ（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（５）：５６７−５７３）および細菌酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：７１３−７２０）が挙げられる。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的非毒性のプロ薬物であるガンシクロビル（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１）、シトシンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシトシン（細菌シトシンデアミナーゼ）に対して感受性になっている。Ｃｕｌｖｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１５５０−１５５２、Ｈｕｂｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８３０２−８３０６。
【００７０】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、遺伝子移入ベクターに包含されるヌクレオチド配列であって、治療的活性を有しないが、遺伝子移入ベクターの、より単純な調製、製造、特徴付けまたは試験を可能にするために含まれるものをいう。
【００７１】
「特異的結合剤（因子）」とは、分子の特異的結合対メンバーをいう。ここで、その分子の一方は、第二の分子に対して、化学的手段および／または物理的手段を通じて特異的に結合する。特異的結合剤の１つの例は、選択された抗原に対して指向される抗体である。
【００７２】
「被検（験）体」とは、脊椎動物亜門の任意のメンバーを意味し、これは、以下を包含するがそれらに限定されない：ヒトおよびその他の霊長類（非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサルの種を含む）；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシ）；家庭用哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（齧歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモット））；鳥類（家庭用、野生および遊技のための鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類鳥類、アヒル、ガチョウなど））。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体および新生の個体の両方が網羅されることが意図される。上記の系は、上記の任意の脊椎動物種において使用することが意図される。なぜなら、これらの脊椎動物のすべての免疫系が同様に機能するからである。
【００７３】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的または他の様式で所望されなくはない物質を意味する。すなわち、この物質は、所望されない生物学的効果を何ら起こすことも、それが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式において相互作用することもなく、処方物または組成物中で個体に投与され得る。
【００７４】
「生理的ｐＨ」または「生理的範囲のｐＨ」とは、ほぼ７．２〜８．０（両端含む）の範囲、より代表的には約７．２〜８．０（両端含む）の範囲のｐＨを意味する。
【００７５】
本明細書で用いられる「処置」とは、以下のいずれかをいう（Ｉ）伝統的なワクチンにおけるように、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または除去、および（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的または完全な除去。処置は、予防的（感染の前）または治療的（感染後）に行われ得る。
【００７６】
「レンチウイルスベクター」および「組換えレンチウイルスベクター」は、レンチウイルスとして知られるレトロウイルスのサブセットに由来する。レンチウイルスベクターとは、目的の核酸分子を有し、そして特定の実施形態においてはその発現を指向し得る核酸構築物をいう。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは位置規定エレメント、あるいは他の手段による遺伝子発現を制御する他のエレメント（例えば、代替スプライシング、核ＲＮＡ輸送、メッセンジャーの転写後改変、またはタンパク質の翻訳後改変を制御するもの）を包含する。そのようなベクター構築物はまた、使用されるレンチウイルスベクターに対して適切な、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその部分、ならびに＋および−鎖プライマー結合部位を包含する（これらが、レトロウイルスベクターにはそれまでには存在していない場合）。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー（例えば、Ｎｅｏ、ＴＫ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、またはＤＨＦＲ）ならびに翻訳終結配列を包含し得る。例えば、そのようなベクターは、代表的に、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその部分を包含する。
【００７７】
「レンチウイルスベクター粒子」とは、本発明において利用されるときに、目的の少なくとも１つの遺伝子を有するレンチウイルスをいう。このレトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。組換えレンチウイルスは、感染すると、その遺伝的物質（ＲＮＡ）をＤＮＡへと逆転写し得、そしてこの遺伝的物質を、宿主細胞のＤＮＡへと組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスのエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、アンホ（ａｍｐｈｏ）またはＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、またはキメラエンベロープを有し得る。
【００７８】
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に対して作動可能に連結されるプロモーターを含む。他の制御エレメントもまた存在し得る。本明細書において記載される発現ベクターは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの成分に加えて、そのプラスミド構築物はまた、細菌の複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖として存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、複数のクローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（ＳＶ４０またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。
【００７９】
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウイルスベクターを欠如する感染性組換えレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）の産生に必要なそれらのエレメントを含む細胞をいう。代表的に、そのようなパッケージング細胞は、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのタンパク質をコードするタンパク質を発現し得る、１つ以上の発現カセットを含む。
【００８０】
「プロデューサー細胞」または「ベクタープロデューサー細胞」とは、組換えレトロウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。
【００８１】
（２．発明の実施の形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物またはプロセスのパラメータには限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、当然ながら、そのようなものは、変動し得るからである。本明細書において使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのみに存在し、そして限定を意図しないこともまた理解されるべきである。
【００８２】
本明細書において記載される方法および物質に類似するかまたは等価である、多数の方法および物質が本発明の実施において使用され得るが、好ましい物質およぶ方法が本明細書において使用される。
【００８３】
（２．１  合成発現カセット）
（２．１．１  ＨＩＶ−１  ＧＡＧ核酸コード配列の改変）
本発明の１つの局面は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質コード配列、および対応する野生型配列よりも改善された発現を有する、関連配列の生成である。本発明の例示的な実施形態は、ＨＩＶ−１SF2株から入手されるＧａｇタンパク質野生型配列を改変するために
例示される（配列番号１；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ，Ｒ．、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６８６）：４８４−４９２，１９８５；Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．、ら米国特許第５，１５６，９４９号、１９９２年１０月２０日発行；Ｌｕｃｉｗ、Ｐ．Ａ．、ら、米国特許第５，６８８，６８８号、１９９７年１１月１８日）。他のＨＩＶ改変体から得られたＧａｇ配列は、本明細書の教示に従って同様の様式で操作される。そのような他の改変体としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：単離体ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１SF170、ＨＩＶLAV，ＨＩＶLAI，ＨＩＶMN，ＨＩＶ−１CM235、、ＨＩＶ−１US4、多様な亜型由来の他のＨＩＶ−１株（例えば、サブタイプＡ〜
Ｇ、およびＯ）、ＨＩＶ−２株および多様な亜型（例えば、ＨＩＶ−２UC1およびＨＩＶ
−２UC2）、およびサル免疫不全ウイルスＳＩＶ）．（これらおよび他の関連するウイル
スの説明について、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）から得られるＧａｇタンパク質コード配列；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆｉｅｌｄｓ、ＢＮ、ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと）。
【００８４】
まず、ＨＩＶ−１コドン使用パターンを改変し、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子に見いだされるコドン使用と同じにさせた（実施例１）。ＨＩＶコドン使用は、コドントリプレットのヌクレオチドＡまたはＴの高含量を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用の効果は、ＤＮＡ配列において高度のＡＴ含量であり、これは、ｍＲＮＡの減少した翻訳能力および不安定性をもたらす。比較すると、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。Ｇａｇコード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用と同じに改変された。図１１において（実施例１）、公知の不安定のｍＲＮＡおよび公知の安定のｍＲＮＡについてのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列のＡ−Ｔ％含量が、本発明のネイティブＨＩＶ−１SF2  Ｇａｇ  ｃＤＮ
Ａおよび合成のＧａｇ  ｃＤＮＡ配列のＡ−Ｔ％含量と比較される。本発明の支持において実施される実験は、合成Ｇａｇ配列が、ネイティブＧａｇ配列よりも、高いレベルのタンパク質生成（実施例を参照のこと）し得たことを示した。図１１において示されるデータは、この増加された生成の１つの理由ががネイティブＧａｇコード配列に対応するｍＲＮＡに対して合成Ｇａｇコード配列に対応するｍＲＮＡの安定性の増加であることを示唆する。
【００８５】
第二に、Ｇａｇコード配列のコード配列内に配置された阻害（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）が存在する（実施例１）。ＲＲＥは、ＨＩＶがコードするＲｅｖタンパク質と相互作用して、ＩＮＳの発現を下方調節する効果を克服する第二のＲＮＡ構造である。ＰＲＥおよびＲｅｖの翻訳後活性化機構を克服するために、不安定性エレメントは、コードされるタンパク質の読み枠を変更しなかった複数の点変異を導入することによって不活化された。図１は、もとのＳＦ２  Ｇａｇ配列、ＩＮＳ配列の位置、およびＩＮＳ配列に施されてその効果を減少させる改変を示す。得られる改変されたコード配列は、合成Ｇａｇ発現カセットとして提示される（配列番号４）。
【００８６】
Ｇａｇポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株において野生型コード配列（および他の型の細胞株（昆虫細胞を含むがそれらに限定されない））よりも改善された発現を生じた。さらに、その配列の発現は、これらの細胞株（以下を参照のこと）によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生を生じた。同様なＧａｇポリペプチドコード配列は、以下を含むがそれらに限定されないような他の改変体を含む種々の単離体（科、亜型、株など）から得られ得る：以下の単離体から得られたＧａｇポリペプチドコード配列：ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１SF170、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、Ｈ
ＩＶMN、ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−ｌUS4、多様な亜型由来の他のＨＩＶ−１株（例えば、亜型Ａ〜ＧおよびＯ）、ＨＩＶ−２株および多様な亜型（例えば、ＨＩＶ−２UClおよ
びＨＩＶ−２UC2）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。（例えば、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編．１９９１；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆｉｅｌｄｓ、ＢＮ、ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと）。これらの改変体に由来するＧａｇポリペプチドコード配列は、本明細書の教示に従うことによって、哺乳動物における改善された発現のための最適化および試験され得る（実施例、特に実施例１を参照のこと）。
【００８７】
（２．１．２  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ核酸コード配列を含む配列のさらなる改変）
本発明の支持において実施される実験は、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｈａｖｅ  ｓｈｏｗｎ  ｔｈａｔ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−逆転写酵素およびＧａｇポリメラーゼの配列の類似の改変もまた、そのポリタンパク質の発現の改善、およびそのように改変されたコード配列から産生されるポリペプチドによって形成されるＶＬＰの産生を生じる。
【００８８】
Ｇａｇ−プロテアーゼ配列（野生型、配列番号２；改変型、配列番号５、７８、７９）について、コドン使用における変化は、−１フレームシフトの上流の領域に限定されていた（図２）。さらに、Ｇａｇプロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に配置される阻害（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）もまた変更された（図２に示す）。改変されたＧａｇプロテアーゼ配列をコードする例示的な構築物（これは、−１フレームシフトを含む）は、配列番号７８および７９に示されるものを包含する（図６９および７０）。これらは、以下である：ＧＰ１（配列番号７８）（ここでは、プロテアーゼ領域をまた、コドン最適化され、そしてＩＮＳ不活化した）、ならびにＧＰ２（配列番号７９）（ここでは、そのプロテアーゼ領域をＩＮＳ不活化にのみ供した。
【００８９】
他のＧａｇ含有配列（例えば、Ｇａｇポリメラーゼ配列（野生型、配列番号３；改変型、配列番号６）またはＧａｇ逆転写酵素（野生型、配列番号７７；改変型、配列番号８０〜８４））について、コドン使用における変化は、Ｇａｇプロテアーゼ配列についての変化に類似する。Ｇａｇ−Ｐｏｌコード配列におけるフレームシフトを含むそれらの発現カセットは、「ＦＳ（＋）」（配列番号８０および８１、図７１および７２）と称するが、他方で、名称「ＦＳ（−）」（配列番号８２、８３および８４、図７３、７４および７５）は、このコード配列において利用されるフレームシフトが存在しないことを示す。
【００９０】
ＨＩＶ関連配列を含むポリタンパク質に加えて、本発明の種々のＧａｇ−、Ｇａｇ−ｐｒｏｔ、Ｇａｇ−ｐｏｌ、Ｇａｇ逆転写酵素をコードする配列は、免疫原性が所望される他のポリペプチドに融合され得る（これは、キメラポリペプチドを作製する）。そのようなキメラタンパク質の例は、改善された発現Ｇａｇコード配列の、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質への連結である。この場合において、ＨＣＶコアをコードする配列は、ＨＩＶ−Ｇａｇコード配列とインフレームに配列され、配列番号７として提示されるＧａｇ／ＨＣＶコアコード配列を生じる（野生型配列は、配列番号８として提示される）。
【００９１】
本発明の実施において有用なさらなる配列としては以下が挙げられるが、それらに限定されない：ウイルスエピトープ／抗原をコードする配列（以下を包含するがそれらに限定されない：ＨＣＶ抗原（例えば、Ｅ１、Ｅ２；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．、ら、米国特許第５，７１４，５９６号、１９９８年２月３日発行；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｍ．．、ら、米国特許第５，７１２，０８８号、１９９８年１月２７日；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｍ．．、ら、米国特許第５，６８３，８６４号、１９９７年１１月４日発行；Ｗｅｉｎｅｒ、Ａ．Ｊ．、ら、米国特許第５，７２８，５２０号、１９９８年３月１７日発行；Ｗｅｉｎｅｒ、Ａ．Ｊ．、ら、米国特許第５，７６６，８４５号、１９９８年６月１６日発行；Ｗｅｉｎｅｒ、Ａ．Ｊ．、ら，米国特許第５，６７０，１５２号、１９９７年９月２３日発行）、ＨＩＶ抗原（例えば、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよび／またはｅｎｖに由来する）；ならびに腫瘍の抗原／エピトープをコードする配列。さらなる配列は、以下に記載される。また、Ｇａｇおよび他のコード配列の、互いに対する方向における改変もまた、以下に記載される。
【００９２】
Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−逆転写酵素および／またはＧａｇ−ポリメラーゼのポリペプチドをコードする配列は、以下を含むがそれらに限定されない任意のＨＩＶ単離体（異なる科、亜型および株）から得られ得る：ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶSFl62、ＨＩＶｕｓ４、ＨＩＶcm235、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN）（例えば、Ｍｙ
ｅｒｓらＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９７，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。合成発現カセットは、そのようなコード配列を出発材料として、本明細書の教示に従って（例えば、実施例１を参照のこと）用いて生成され得る。さらに、本発明の合成発現カセットは、本明細書において開示される合成発現カセット（例えば、配列番号４；配列番号５；配列番号６；および配列番号２０、Ｇａｇ主要相同性領域（Ｇａｇ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｉｏｎ））に対して、７５％を超え、好ましくは８０〜８５％を超え、より好ましくは９０〜９５％を超え、そして最も好ましくは９８％を超える配列同一性（またはこれらの範囲内の任意の整数値）を有する、関連するＧａｇポリペプチドをコードする配列を包含する。
【００９３】
（２．１．３  ＨＩＶ−１  ＧＡＧおよび関連ポリペプチドをコードする合成配列の発現）
本発明のいくつかの合成Ｇａｇコード配列（発現カセット）を、多数のこと成る発現ベクター中にクローニングして（実施例１）、ＶＬＰの発現および産生のレベルを評価した。２つの改変された合成コード配列を、合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）および合成Ｇａｇ−プロテアーゼ発現カセット（配列番号７８および７９）を提示する。他の合成Ｇａｇコードタンパク質が提示される（例えば、配列番号８０〜８４として）。Ｇａｇコードポリペプチドについての合成ＤＮＡフラグメント（例えば、Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｇａｇ−逆転写酵素）を、実施例１に記載される発現ベクター（一過性発現ベクター、ＣＭＶプロモーターベースの哺乳動物ベクター、およびバキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクターを含む）中にクローニングした。対応する野生型配列を、同じベクター中にクローニングした。
【００９４】
次いで、これらのベクターを、いくつかの異なる細胞型（種々の哺乳動物細胞（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ細胞株、例えば、ＡＴＣＣから入手可能）を含む）中にトランスフェクトした。細胞株を、適切な条件下で培養し、そして上清中でのｐ２４（Ｇａｇ）発現のレベルを評価した（実施例２）。これらのアッセイの結果は、合成Ｇａｇコード配列の発現が、対応する野生型配列よりも顕著に高かったことを実証した（実施例２；表２）。
【００９５】
さらに、ウエスタンブロット分析によって、合成Ｇａｇ発現カセットを含む細胞が、予測される５５ｋＤｐ５５）タンパク質を、ネイティブ発現カセットを含む細胞よりも、１細胞あたりより高い濃度で産生したことを示した。Ｇａｇ  ｐ５５タンパク質は、細胞溶解物および上清の両方において見られた。産生レベルは、本発明の合成Ｇａｇ発現カセットでトランスフェクトされた細胞についての細胞上清において顕著により高かった。本発明の支持において実施される実験は、合成Ｇａｇタンパク質発現カセットを含む細胞が、野生型発現カセットを含む細胞よりも、１細胞あたりの比較的高い濃度で予測されるＧａｇタンパク質を賛成したことを示唆する。
【００９６】
合成Ｇａｇ発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清の分画は、それが、ｐ５５タンパク質およびＶＬＰの両方が、野生型Ｇａｇ配列によりも優勢な産生を提供することを示した（実施例６および７）。
【００９７】
これらのＧａｇ含有ポリペプチドの哺乳動物細胞株における効率よい発現は、以下の利益を提供する：Ｇａｇポリペプチドは、バキュロウイルス夾雑物を含まない；ＦＤＡによって承認された確立された方法によって産生；純度の増加；収率の増加（ネイティブコード配列に比較して）；ならびに本発明の構築物を用いて得られる発現の増加の非存在において実施可能ではないＣＨＯまたは他の哺乳動物細胞において、Ｇａｇ含有ポリペプチドを産生する新規の方法。例示的な哺乳動物細胞株としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／ｃｌｏｎｅ８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、ミエローマ細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）およびＣＥＭＸ１７４。このような細胞株は、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である。
【００９８】
本発明の合成Ｇａｇ発現カセットはまた、昆虫細胞へとトランスフェクトされるときに、発現およびＶＬＰの産生の高レベルを実証した（実施例７）。さらに、より高レベルの総タンパク質収率に加えて、合成ｐ５５発現されたＧａｇからの最終産物は、一過的に、ネイティブｐ５５発現されたＧａｇからの最終精製産物よりも少ない夾雑するバキュロウイルスタンパク質を含んだ。
【００９９】
さらに、本発明の合成Ｇａｇ発現カセットはまた、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ、Ｐ．、米国特許第ＲＥ３５，７４９、１９９８年３月１７日発行に記載されるようなベクターを用いる）へと形質転換され、そして一過的に発現される公募ベクターへと導入された。
【０１００】
実施例に記載される哺乳動物および昆虫のベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは、選択された発現制御エレメントを用いて種々の発現ベクターへと組み込まれ得る。任意の所定の細胞型について適切なベクターおよび制御エレメントは、当業者によって、本明細書の教示および当該分野における発現ベクターについての情報に鑑みて、選択され得る。
【０１０１】
例えば、合成Ｇａｇ発現カセットは、所望のコード配列に作動可能に連結される制御エレメントを含むベクター中に挿入され得る。これは、選択される細胞型中の遺伝子の発現を可能にする。例えば、とりわけ、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーターは、イントロンＡを含み得る）、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲ（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ＦＩＶ−ＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーター）もまた、哺乳動物発現についての使用を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終結コドンの３’側に位置する。好ましくは、コード配列の５’側に位置する、翻訳の開始の最適化のための配列もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化のシグナルの例としては、以下が挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載されるようなＳＶ４０からの配列、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列。スプライスドナーおよびアクセプターの部位を含むイントロンもまた、本発明の使用のための構築物中に設計され得る（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【０１０２】
エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増加するための本明細書において使用され得る。例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１において記載される）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター）（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載される）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載される）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列において含まれるエレメント）（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【０１０３】
所望される合成Ｇａｇポリペプチドコード配列は、任意の数の市販のベクターにクローン化され、適切な宿主系においてポリペプチドの発現を発生し得る。これらの系として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：バキュロウイルス発現｛Ｒｅｉｌｌｙ、Ｐ．Ｒ．ら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ｝、ワクシニア発現｛Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ら、”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ”Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら、米国特許第５，１３５，８５５号、１９９２年８月４日発行｝、バクテリア中の発現｛Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ  ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ｝、酵母中の発現｛Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．米国特許第ＲＥ３５，７４９号，１９９８年３月１７日発行；Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号、１９９７年５月１３日発行；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．ら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ、Ｍ．Ａ．ら、Ｙｅａｓｔ  ８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１）｝、哺乳動物細胞中の発現｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒｏｕｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３、Ｌａｕ、Ｙ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、”Ｓｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、５３７−５６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９１））、および植物細胞中の発現｛植物クローンベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｈｏｏｄ、Ｅ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ、Ｒ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎら、”Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”、およびｏｔｈｅｒｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ３：１−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．ら、２４９−２６５頁、およびｏｔｈｅｒｓ  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．ら、編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｑ、Ｗｉｅｎ、Ａｕｓｔｒｉａ（１９８７）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ、Ｇｕｒｂａｃｈａｎ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８；Ｈｅｎｒｙ、Ｒ．Ｊ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ、１９９７｝。
【０１０４】
本発明において、例えば実施例１に記載されたＣＭＶプロモーター含有ベクター（適切な宿主のコード領域の発現を可能にするコード配列および発現調節エレメントを含む）のような発現ベクターも含まれる。この調節エレメントとして、一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳および転写終止配列、ならびにベクター中への挿入を導入するための開始部位が挙げられる。翻訳調節エレメントはＭ．Ｋｏｚａｋによって検討されてきた（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ７（８）：５６３−５７４、１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７６（９）：８１５−８２１、１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８（２）：２２９−２４１、１９８９；Ｋｏｚａｋ，ＭおよびＳｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６０：３６０−３７５，１９７９）。
【０１０５】
酵母系における発現は、商業的産生の利点を有する。ワクシニアおよびＣＨＯ細胞株による組換えタンパク質産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルス発現は、以下に挙げる幾つかの利点を有する：（ｉ）その広範な宿主範囲；（ｉｉ）正確な転写改変後の組換えタンパク質の、プロセシング、折りたたみ、輸送、分泌、および構築；（ｉｉｉ）比較的可溶な組換えタンパク質の高いレベルの発現；および（ｉｖ）外来性ＤＮＡを収容するための大容量。
【０１０６】
合成Ｇａｇコード発現カセット由来の組換え発現ポリペプチドは、典型的に溶解された細胞または培養培地から単離される。精製は、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分別、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む当該分野で公知の方法によって実施され得る。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、例えばＧａｇ抗原に基づいて発生される抗体を使用して採用され得る。
【０１０７】
哺乳動物細胞を使用する本発明のＧａｇ含有タンパク質を発現する利点として以下が挙げられるが、これらに限定されない：スケールアップ産生のための高度に確立されたプロトコール；ＶＬＰを産生するための能力；細胞株が優れた製造プロセス（ＧＭＰ）標準を満たすように適切であること；哺乳動物のための培養条件が当該分野において公知であること。
【０１０８】
（２．１．４  ＨＩＶ−１  ＥＮＶ核酸コード配列の改変）
本発明の１局面は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質コード配列、および対応する野生型配列に対して改良された発現を有する関連配列の発生である。本発明の例示的な実施形態として、本明細書中において、ＨＩＶ−１サブタイプＢ株ＨＩＶ−１ＵＳ４およびＨＩＶ−１ＳＦ１６２から得られるＥｎｖタンパク質野生型配列を改変することが例示される（Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９７、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。他のＨＩＶ変異体から得られるＥｎｖ配列は、本明細書の教示に従う同様の様式で操作され得る。このような他の変異体として、章２．２．１において前述されたもの、およびワールドワイドウェブ（インターネット）（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｉｖＤＢ３／ｐｕｂｌｉｃ／ｗｄｂ／ｓｓａｍｐｕｂｌｉｃおよびｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）で公開されたものが挙げられる。
【０１０９】
第１に、ＨＩＶ−１コドン使用パターンは、得られる核酸コード配列が高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドン使用に匹敵するように改変された（実施例１）。このＨＩＶコドン使用は、コドン−トリプレットの高含量のヌクレオチドＡまたはＴを反映する。このＨＩＶ−１コドン使用の効果は、ｍＲＮＡの減少した翻訳能力および不安定性を生じるＤＮＡ配列における高いＡＴ含量である。対照的に、高度に発現されたヒトコドンはヌクレオチドＧまたはＣを好む。Ｅｎｖコード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されたコドン使用に匹敵するように改変された。本発明の支持下で実施された実験は、合成Ｅｎｖ配列が天然Ｅｎｖ配列に対してより高いレベルのタンパク質産生（実施例を参照のこと）を可能にすることを示した。この増加した産生の１つの理由は、天然Ｅｎｖコード配列に対応するｍＲＮＡに対する、合成Ｅｎｖコード配列に対応するｍＲＮＡの安定性の増加であリ得る。
【０１１０】
Ｅｎｖポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株の野生型コード配列に対する改良された発現を生じた。同様のＥｎｖポリペプチドコード配列は、種々の単離体（ファミリー、サブタイプなど）から得られ得る。これらの変異体由来のＥｎｖポリペプチドコード配列は、本明細書の教示に従うことによって哺乳動物における改良された発現に対して最適化され得、そして試験され得る（実施例、特に実施例２を参照のこと）。
【０１１１】
（２．１．５  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ核酸コード配列のさらなる改変）
タンパク質含有ＨＩＶ関連配列に加えて、本発明のＥｎｖコード配列は、他のポリペプチドに融合され得る（キメラポリペプチドを作製する）。さらに、Ｅｎｖおよび他のコード配列の配向におけるバリエーションが互いに対して考慮される。さらに、本発明のＨＩＶタンパク質コードカセットは、１つのベクターまたは複数のベクターを使用して共発現され得る。さらに、ポリタンパク質（ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）が同じまたは異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。
【０１１２】
Ｅｎｖポリペプチドコード配列は、任意のＨＩＶ単離体（異なるファミリー、サブタイプ、および株）から得られ得、このＨＩＶ単離体として、ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩ
ＶUS4、ＨＩＶCM235、ＨＩＶSF162、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMNが挙げられるが、
これらに限定されない（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９７、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。合成発現カセットは、本発明の教示（例えば、実施例１を参照のこと）に従うことによって、出発物質としてこのようなコード配列を使用して発生され得る。さらに、本発明の合成発現カセット（および精製されたポリヌクレオチド）は、本発明の配列が照会配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用される場合、本明細書中に開示された合成発現カセット配列（例えば、配列番号：７１−７２；および／または表１Ａおよび１Ｂに表される配列）に対して、９０％より大きい、好ましくは９２％より大きい、より好ましくは９５％より大きい、そして最も好ましくは９８％より大きい配列同一性を有する関連Ｅｎｖポリペプチドコード配列を含む。
【０１１３】
（２．１．６  合成配列コードＨＩＶ−１  Ｅｎｖおよび関連ポリペプチドの発現）
本発明の幾つかの合成Ｅｎｖコード配列（発現カセット）は、多くの異なる発現ベクターにクローンされ（実施例１）、Ｅｎｖポリペプチドの発現および産生のレベルを評価する。改変された合成コード配列は、合成Ｅｎｖ発現カセットとして表される（実施例１、例えば表１Ａおよび１Ｂ）。Ｅｎｖのための合成ＤＮＡフラグメントは、実施例１および上記の章２．１．３に記載される真核生物発現ベクター（一過性発現ベクターおよびＣＭＶプロモーターをベースとする哺乳動物ベクターを含む）にクローンされた。対応する野生型配列が同じベクターにクローンされた。
【０１１４】
次いで、これらのベクターは幾つかの異なる細胞型にトランスフェクトされ、これらの細胞型は、種々の哺乳動物細胞株（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ、例えばＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃから入手可能な細胞株）を含む。この細胞株は、適切な条件下で培養され、上清中のｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０Ｅｎｖ発現のレベルが評価された（実施例２）。Ｅｎｖポリペプチドとして、例えば、天然ｇｐ１６０、オリゴマーｇｐ１４０、モノマーｇｐ１２０ならびにこれらのポリペプチドの改変された配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイの結果は、合成Ｅｎｖコード配列の発現が対応する野生型配列より有意に高いことを実証した（実施例２；表３および４）。
【０１１５】
さらに、ウエスタンブロット分析は、合成Ｅｎｖ発現カセットを含む細胞が天然発現カセットを含む細胞より１細胞あたりの高い濃度で、予想されたタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０）を産生したことを示した。このＥｎｖタンパク質は、細胞溶解液および上清の両方に見られた。産生のレベルは、野生型と比べて、本発明の合成Ｅｎｖ発現カセットでトランスフェクトされた細胞の細胞上清においてより有意に高かった。
【０１１６】
合成Ｅｎｖ発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清の画分は、それが、野生型Ｅｎｖ配列に対してＥｎｖタンパク質のより優れた産生を提供することを示した（実施例２および３）。
【０１１７】
哺乳動物細胞株におけるこれらのＥｎｖ含有ポリペプチドの効率的な発現は、以下の利点を提供する：このＥｎｖポリペプチドがバキュロウイルスまたの他のウイルス夾雑物を含まないこと；ＦＤＡによって承認された確立された方法による産生；増加した純度；より高い収率（天然コード配列に対して）；および本発明の構築物を使用して得られた増加した発現の非存在下において実行可能性の低いＣＨＯ細胞におけるＥｎｖ含有ポリペプチドを産生する新規な方法。
【０１１８】
例示的な細胞株（例えば、哺乳動物、酵母、昆虫など）は、Ｇａｇ含有構築物について章２．１．３で前述したものを含む。さらに、任意の所与の細胞型のための適切なベクターおよび調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）は、本発明の教示および発現ベクターに関する当該分野において公知の情報の観点で、当業者によって、章２．１．３に前述されるように、選択され得る。さらに、合成Ｅｎｖコード発現カセット由来の組換え発現ポリペプチドは、Ｇａｇコード発現カセットについて前述されたように、典型的に単離され、そして溶解された細胞または培養培地から精製される。例示的な精製は、実施例４に記載され、そして図６０に示される。
【０１１９】
（２．１．７  ＨＩＶ−１  ＴＡＴ  核酸コード配列の改変）
本発明の別の局面は、ＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質コード配列、および対応する野生型配列に対して改良された発現を有する関連配列の発生である。本発明の例示的な実施形態として、本明細書中において、上記のようなＳＦ１６２から得られたｔａｔ野生型ヌクレオチド配列（配列番号：８５、図７６）を改変することが挙げられる。例示的な合成ｔａｔ構築物は、配列番号：８７（これは、系統ＳＦ１６２由来の完全長ｔａｔポリペプチドをコードする構築物を示す）；配列番号：８８（これは、システイン残基を２２位で変化させるｔａｔポリペプチドをコードするｔａｔ構築物を示す）；および配列番号：８９（これは、系統ＳＦ１６２由来のｔａｔポリペプチドのアミノ末端部分をコードするｔａｔ構築物を示す）に示される。ｔａｔタンパク質のアミノ部分は、免疫応答を誘導する多くのエピトープを含む。さらに、さらなる改変は、例えばバリン残基、アラニン残基またはグリシン残基（配列番号：８８および８９、図７９および８１）による２２位におけるシステイン残基の置換または欠失を含む。例えば、Ｃａｐｕｔｏら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：２３５を参照のこと。図８１（これは、ｔａｔポリペプチドのアミノ末端部分をコードするｔａｔ構築物を示す）において、システイン残基をコードするヌクレオチド（ヌクレオチド６４−６６）に下線が引かれる。適切な構築物の設計および構築は、本明細書の教示を使用して容易に行われ得る。Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｐｒｏｔおよびＥｎｖのように、ポリペプチドコード配列は種々の単離体から得られる（ファミリー、サブタイプなど）。
【０１２０】
ｔａｔポリペプチドコード配列の改変は、多くの細胞株（例えば、哺乳動物、酵母、細菌細胞および昆虫細胞）における野生型コード配列に対する改良された発現を生じる。これらの変異体由来のｔａｔポリペプチドコード配列は、本明細書の教示に従うことによって哺乳動物での改良された発現のために最適化され得、そして試験され得る（実施例、特に実施例２を参照のこと）。
【０１２１】
本明細書中に記載される本発明の異なる実施形態の種々の形態が組み合わせられ得る。例えば、ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチド配列から誘導され得、このポリヌクレオチド配列として、Ｇａｇポリペプチド、Ｅｎｖポリペプチド、ポリメラーゼポリペプチド、プロテアーゼポリペプチド、ｔａｔポリペプチド、および逆転写酵素ポリペプチドのためのコード配列が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のポリヌクレオチドコード配列は、典型的に各ポリペプチドに対する各コード配列がＩＲＥＳ配列によって先行される多重シストロン発現カセットに組み合わせられ得る。
【０１２２】
（２．２  ウイルス様粒子の産生およびパッケージング細胞株を形成するための本発明の構築物の使用）
ヒト免疫欠損ウイルス型−１（ＨＩＶ−１）の群特異的な抗原（Ｇａｇ）は、出芽によって種々の真核細胞から放出される非感染ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合する（Ｆｒｅｅｄ、Ｅ．Ｏ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５１：１−１５、１９９８によって検討される）。本発明の合成発現カセットは、種々の異なる細胞株（哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、ＨＩＶ−Ｇａｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生のための効率的な手段を提供する。
【０１２３】
ウイルス粒子は、宿主の免疫系に対して、捕捉されたまたは会合した抗原の適切な提示のためのマトリックスとして使用され得る。例えば、米国特許第４，７２２，８４０号は、異種ポリペプチドに融合されたウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の粒子形成フラグメント）由来の構造タンパク質の粒子形成フラグメントからなるハイブリッド粒子について記載する。Ｔｉｎｄｌｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２００：５４７−５５７は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型１６Ｅ７形質転換タンパク質のエピトープを含有するキメラＨＢＶコア抗原粒子の産生および使用について記載する。
【０１２４】
Ａｄａｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：６８−７０は、酵母におけるハイブリッドＨＩＶｇｐ１２０：Ｔｙ  ＶＬＰの組換え産生（Ｂｒｏｗｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）１９８：４７７−４８８）、ヒトパルボウイルスＢ１９のＶＰ２タンパク質およびヒト単純ヘルペスウイルス１型およびマウス肝炎ウイルスＡ５９由来のエピトープからなるキメラタンパク質の産生について記載する。Ｗａｇｎｅｒら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２００：１６２−１７５、Ｂｒａｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９５）５１：１５３−１６８；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２２０：１２８−１４０）およびＷｏｌｆら（１９９１年１０月２日に公開されたＥＰ０４４９  １１６  Ａ１；１９９６年１０月３日に公開されたＷＯ９６／３０５２３）は、キメラＨＩＶ−１ｐ５５Ｇａｇ粒子の構築について記載する。米国特許第５，５０３，８３３号は、治療薬剤を被包し送達するためのロタウイルスＶＰ６球体の使用について記載する。
【０１２５】
（２．２．１  本発明の合成発現カセットを用いるＶＬＰ産生）
本発明を支持して実施した実験は、本発明の合成発現カセットが、ネイティブコード配列に対して、タンパク質およびＶＬＰの両方の優れた産生を提供することを示した（実施例７および１５）。さらに、ＶＬＰ産生の電子顕微鏡評価（実施例６および１５、図３Ａ〜Ｂおよび６５Ａ〜Ｆ）は、予期されたサイズの遊離のおよび発芽する未熟ウイルス粒子が、合成発現カセットを含む細胞によって産生されたことを示した。
【０１２６】
ウイルス様粒子の産生のために、ネイティブコード配列よりむしろ、本発明の合成発現カセットを用いることが、いくつかの利点を提供する。第一に、ＶＬＰは、増大された量で産生され得、これによりＶＬＰの単離および精製をより容易にする。第二に、ＶＬＰは、合成発現カセットを用いて種々の細胞タイプにおいて産生され得る。特に、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）が、ＶＬＰ産生のために使用され得る。ＣＨＯ細胞を用いる産生は、以下を提供する：（ｉ）ＶＬＰ形成；（ｉｉ）正確なミリスチル化および発芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞混入物（例えば、昆虫ウイルスおよび／または細胞）がないこと；および（ｉｖ）精製の容易さ。本発明の合成発現カセットは、また、哺乳動物細胞株以外の細胞タイプにおいて増強された発現のために有用である。例えば、合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクターによる昆虫細胞の感染は、（野生型コード配列に比較して）より高いレベルの全タンパク質収量、およびより高いレベルのＶＬＰ産生を生じた。さらに、バキュロウイルス−Ｇａｇ合成発現カセットに感染した昆虫細胞からの最終産物は、一貫して、野生型コード配列が用いられたときの最終産物より低い量の混入昆虫タンパク質を含んだ（実施例）。
【０１２７】
ＶＬＰは、目的の粒子形成ポリペプチドが、適切な宿主細胞において組換え発現される場合に自発的に形成し得る。従って、好都合には、本発明の合成発現カセットを用いて産生されたＶＬＰは、組換え技術を用いて調製される。以下で議論するように、本発明の合成発現カセットをコードするＧａｇポリペプチドは、目的の他のポリペプチドコード配列を含み得る（例えば、Ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶポリメラーゼ、ＨＣＶコア；実施例１を参照のこと）。このような合成発現カセットの発現は、目的のポリペプチドと同様に、合成発現カセットの産物を含むＶＬＰを生じる。
【０１２８】
一旦所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列が単離されるか、または合成されると、それらは、任意の適切なベクターまたは発現用レプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターは、当業者に周知であり、そして、適切なクローニングベクターの選択は、選択事項である。一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出またはＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。次いで、ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。適切な組換え発現系は、細菌、哺乳動物、バキュロウイルス／昆虫、ワクシニア、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、アルファウイルス（例えば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ））、哺乳動物、酵母、およびＸｅｎｏｐｕｓ発現系（これらは、当業者に周知である）を包含するが、これらに限定されない。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア、シンドビス、昆虫および酵母系である。
【０１２９】
例えば、多数の哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死化細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウスミエローマ（ＳＢ２０）、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ならびに他の細胞であるが、これらに限定されない）を包含する。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）は、現在の発現構築物との使用を見出す。本発明において有用な酵母宿主は、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを包含する。バキュロウイルス発現系と使用するための昆虫細胞は、とりわけ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉを包含する。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．  １５５５  （１９８７）を参照のこと。真菌宿主は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを包含する。
【０１３０】
真核細胞における粒子の産生のために、ウイルスベクターが使用され得る（例えば、ポックス科のウイルス（ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む）に由来のベクター）。さらに、ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系（Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）  ６７：  ４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  （１９９３）  ７４：  １１０３−１１１３に記載）もまた、本発明との使用を見出す。この系において、まず細胞に、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体をインビトロで感染させる。このポリメラーゼは、それが、Ｔ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写するので、見事な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のＤＮＡでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されたポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いで、このＲＮＡは、宿主翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。あるいは、Ｔ７は、「前駆体（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」系におけるように精製タンパク質または酵素として付加され得る（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０）。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルの一過性の細胞質産生を提供する。
【０１３１】
選択された発現系および宿主に依存して、ＶＬＰＳは、粒子形成ポリペプチドが発現され、そしてＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより産生される。適切な増殖条件の選択は、当業者の範囲内である。ＶＬＰが細胞内で形成される場合、この細胞は、化学的手段、物理的手段、または機械的手段を用いて破壊される。これらの手段は、細胞を溶解するが、なおＶＬＰを実質的に無傷のままとする。このような方法は、当業者に公知であり、そして、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ，編、１９９０）に記載されている。
【０１３２】
次いで、粒子は、それらの完全性を保持する方法（例えば、密度勾配遠心分離（例えば、スクロース勾配）、ＰＥＧ沈降、ペレット化など（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−２９３６を参照のこと）、ならびに標準的な精製方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む）を用いて単離されるか（または実質的に精製される）。
【０１３３】
本発明の合成発現カセットを含む細胞により産生されたＶＬＰは、被験体に投与された場合に免疫応答を惹起するために使用され得る。本発明の１つの利点は、ＶＬＰが、以前には可能でなかったレベルで、合成発現カセットを有する哺乳動物細胞によって産生され得ることである。上述したように、ＶＬＰは、Ｇａｇポリペプチドに加えて、種々の抗原を含み得る（例えば、Ｅｎｖ、ｔａｔ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｇａｇ−ＨＣＶコア）。本発明の合成発現カセットを用いて産生された精製ＶＬＰは、通常ワクチン組成物の形態で、脊椎動物被験体に投与され得る。混合ワクチンもまた使用され得る。ここで、このようなワクチンは、例えば、ＨＩＶもしくは他の生物由来の他のサブユニットタンパク質（例えば、ｅｎｖ）またはこのような抗原をコードする遺伝子送達ワクチンを含有する。投与は、単独または他の抗原と共に処方されたＶＬＰを用いて行い得る。さらに、ＶＬＰは、ＤＮＡ免疫（以下を参照のこと）の合成発現カセットの送達および／または他のワクチンの送達の前、これと同時、またはこれに続いて投与され得る。また、ＶＬＰ投与部位は、投与される他のワクチン組成物と同じであっても、異なってもよい。遺伝子送達は、多数の方法によって達成され得る。このような方法には、ＤＮＡ、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターでの免疫化を包含するが、これらに限定されない。
【０１３４】
ＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調整剤などを含み得る。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を惹起するのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、慣用の試験によって決定され得る比較的広い範囲にあり、そして、一般に、抗原当たりのＶＬＰが約０．１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは、約１μｇ〜約３００μｇの桁の量である。
【０１３５】
必要に応じて、組成物を受容する固体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘発しない分子であるキャリアが、存在する。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。粒子状キャリアの例は、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来のキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知である）由来の微粒子を包含する。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ  ＪＰら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ
ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原は、細菌トキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなど由来のトキソイド、ならびにＥ．ｃｏｌｉ由来の毒素）と結合体化され得る。
【０１３６】
このようなアジュバントは、以下を包含するが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（「明礬」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型乳濁液濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴わない）、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へと処方されたＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）；（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM））を含むＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α、１−β  Ｒａｎｔｅｓなど））；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）のような細菌ＡＤＰ−リボース化毒素の無毒化変異体（詳細には、ＬＴ−Ｋ６３（６３位で野生型アミノ酸がリジンに置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（７２位で野生型アミノ酸がアルギニンに置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９位で野生型アミノ酸がセリンに置換されている）、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９位で野生型アミノ酸がリジンに、そして１２９位で野生型アミノ酸がグリシンに置換されている））（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；および（７）その組成物の効力を強化するための免疫刺激薬剤として作用する他の物質。
【０１３７】
ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
【０１３８】
ＶＬＰ組成物での投薬量処置は、単一投薬スケジュールまたは複数回投薬スケジュールであり得る。複数回投薬スケジュールは、ワクチン接種の主要な経過が１〜１０の別個の投薬であり得、続いて、他の投与が、免疫応答を維持および／または増強するために選択された次の時間間隔（例えば、第二の投薬のために１〜４ヶ月）与えられ、そして必要であれば、数ヵ月後に続く投薬を行うスケジュールである。投薬レジメはまた、少なくとも部分的には、様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）の効力、用いられるワクチン送達、被験体の必要性によって決定され、そして担当医の判断に依存する。
【０１３９】
疾患の防止が望まれる場合（例えば、症状、再発、疾患進行の減少）、一般に、抗原保有ＶＬＰが、目的の病原体による最初の感染前に投与される。処置が望まれる場合（例えば、症状または再発の減少）、一般に、ＶＬＰ組成物が、最初の感染に続いて投与される。
【０１４０】
（２．２．２  パッケージング細胞株を作出するための本発明の合成発現カセットの使用）
多数のウイルスベース系が、哺乳動物宿主細胞のための遺伝子導入ベクターとして使用するために開発されてきた。例えば、レトロウイルス（特に、レンチウイルスベクター）は、遺伝子送達系のための好都合なプラットホームを提供する。目的のコード配列（例えば、遺伝子治療適用に有用な配列）は、遺伝子送達ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子においてパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そしてインビボまたはエキソビボで被験体の細胞に送達され得る。例えば、以下を含む多数のレトロウイルス系が記載されている：米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５；  Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＳＡ  ９０：８０３３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２；ＧＢ  ２２００６５１；ＥＰ  ０４１５７３１；ＥＰ  ０３４５２４２；ＷＯ
８９／０２４６８；ＷＯ  ８９／０５３４９；ＷＯ  ８９／０９２７１；ＷＯ  ９０／０２８０６；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｕ．Ｓ．５，２１９，７４０；Ｕ．Ｓ．４，４０５，７１２；Ｕ．Ｓ．４，８６１，７１９；Ｕ．Ｓ．４，９８０，２８９およびＵ．Ｓ．４，７７７，１２７；  米国特許出願第０７／８００，９２１号；ならびにＶｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ  （１９８３）  Ｃｅｌｌ  ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１；６３４９；ならびにＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １。
【０１４１】
遺伝子治療適用に有用な配列は、以下を包含するが、これらに限定されない。第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（それらの誘導体および欠失を含む）（国際公開番号ＷＯ  ９６／２１０３５、ＷＯ  ９７／０３１９３、ＷＯ  ９７／０３１９４、ＷＯ  ９７／０３１９５、およびＷＯ  ９７／０３１９１）。第ＩＸ因子ｃＤＮＡ（Ｋｕｒａｃｈｉら（１９８２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：６４６１−６４６４）。第Ｖ因子ｃＤＮＡは、ｐＭＴ２−Ｖから得られ得る（Ｊｅｎｎｙ  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ４８４６，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号（Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．）４０５１５）。全長第Ｖ因子ｃＤＮＡ、またはそれらのＢドメイン欠失もしくはＢドメイン置換が使用され得る。第Ｖ因子のＢドメイン欠失は、Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６：  ３０２６およびＫａｎｅ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：  ６７６２によって報告されたものを包含する。抗トロンビンＩＩＩ  ｃＤＮＡ（Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋ（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８３８９，  Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５７２２４／５７２２５）。プロテインＣコード化ｃＤＮＡ（Ｆｏｓｔｅｒ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４７６６；Ｂｅｃｋｍａｎｎ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：５２３３）。プロトロンビンｃＤＮＡは、公開されたベクター（Ｄｅｇｅｎ（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：  ２０８７）の制限酵素消化によって得られ得る。内皮細胞表面タンパク質、トロンボモジュリンは、トロンビンによるプロテインＣの正常な活性化に必要な補因子である。可溶性組換え体形態は、記載されている（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２６０２；Ｊａｃｋｍａｎ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４２５；Ｓｈｉｒａｉ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３：２８１；Ｗｅｎ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：４３５０；Ｓｕｚｕｋｉ（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８９１，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６１３４８，６１３４９）。
【０１４２】
欠陥遺伝子の遺伝により引き起こされる多くの遺伝子疾患は、正常な遺伝子産物の産生不全を生じる。例えば、サラセミア、フェニルケトン尿症、レッシュ−ナイハン症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、血友病Ａおよび血友病Ｂ、嚢胞性線維症、ダッチェンヌ筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、遺伝性気腫（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）および家族性高コレステロール血（Ｍｕｌｌｉｇａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６；Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８；Ｆｒｉｅｄｍａｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５）。遺伝子疾患は、遺伝子産物の不在を生じ得るが、内分泌障害（例えば、糖尿病および下垂体低下）は、遺伝子が、適切なホルモンインスリンおよびヒト成長ホルモンのそれぞれを十分なレベルで生成できないことにより引き起こされる。
【０１４３】
１つの局面では、本発明の構築物および方法を使用する遺伝子治療は、Ｔ細胞内への通常の組換え遺伝子の導入を包含し、その結果、新たなタンパク質または喪失しているタンパク質が、患者へのその導入または再導入の後に、そのＴ細胞によって産生される。多くの遺伝的疾患が、遺伝子治療を用いる処置に選択されており、これには、アデニンデアミナーゼ欠損、嚢胞性線維症、α1−アンチトリプシン欠損、ゴシェ症候群が挙げられる。
非遺伝的疾患も同様である。
【０１４４】
詳細には、ゴシェ症候群は、酵素グルコセレブロシダーゼの欠損によって特徴付けられる遺伝的障害である。この酵素の欠損は、身体内のすべての細胞のリソソームにおけるグルコセレブロシドの蓄積を導く。概説として、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：７９４（１９９２）およびＳｃｒｉｖｅｒら、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第６版、第２巻、１６７７頁を参照のこと。従って、グルコセレブロシダーゼを発現する遺伝子移入ベクターが、この障害の処置における使用のために構築され得る。同様に、ラクターゼをコードする遺伝子移入ベクターが、遺伝性乳糖不耐症の処置において使用され得、ＡＤを発現する遺伝子移入ベクターが、ＡＤＡ欠損の処置のために使用され得、そしてα1−アンチトリプシンをコードする遺伝子移入ベク
ターが、α1−アンチトリプシン欠損の処置のために使用され得る。遺伝的疾患の遺伝子
治療処置の概要については、Ｌｅｄｌｅｙ，Ｆ．Ｄ．（１９８７）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１０：１５７−１７４、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．（１９８７年１１月）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、第６８−８４頁、および「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ａ  Ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」と表題付けられた国際公開番号ＷＯ９５／２７５１２号を参照のこと。
【０１４５】
本発明のなおさらなる実施形態において、遺伝子移入ベクター内に組込まれ得るヌクレオチド配列としては、酵素欠損障害と関連したタンパク質（例えば、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（例えば、米国特許第５，２４０，８４６号およびＬａｒｒｉｃｋら（１９９１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）（米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと））；増殖因子、または増殖因子のアゴニストもしくはアンタゴニスト（Ｂａｎｄａｒａら（１９９２）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１：２２７）；ｐ５３、Ｒｂ、またはＣ−ＣＡＭＩのような１つ以上の癌抑制遺伝子（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：２８３１）；生物体の免疫系を調節する分子（例えば、ＨＬＡ分子）（Ｎａｂｅｌら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１３０７）；リボザイム（Ｌａｒｓｓｏｎら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１９：１６１）；ペプチド核酸（Ｈｉｒｓｈｍａｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．４４：３４７）；アンチセンス分子（Ｂｏｒｄｉｅｒら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９３８３）（これは、異常なタンパク質または外来のタンパク質（例えば、ＨＩＶタンパク質または広範な種々のオンコジーン（例えば、ｐ５３））の発現または合成をダウンレギュレートするために使用され得る（Ｈｅｓｋｅｔｈ、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）））；ＨＩＶ感染を処置するために使用される生物薬剤またはアンチセンス分子（例えば、ｐ２４のインヒビター）（Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５００４）；あるいは、逆転写酵素（Ｂｏｒｄｉｅｒ（前出）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
治療目的の他のタンパク質が、本発明の方法を使用して、遺伝子移入ベクターによってインビボで発現され得る。例えば、組織因子抑制タンパク質（ＴＦＰＩ）の持続性インビボ発現は、敗血症およびＤＩＣを含む状態の処置のため、ならびに再灌流障害の予防の際に有用である（国際公開番号ＷＯ９３／２４１４３、ＷＯ９３／２５２３０、およびＷＯ９６／０６６３７を参照のこと）。ＴＦＰＩの種々の形態をコードする核酸配列が、例えば、米国特許第４，９６６，８５２号；同第５，１０６，８３３号；および同第５，４６６，７８３号に記載される様に獲得され得、そして本明細書中に記載の遺伝子移入ベクターに組込まれ得る。
【０１４７】
エリトロポイエチン（ＥＰＯ）およびレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）もまた、本発明の方法に従って遺伝的に改変されたＴ細胞からインビボで発現され得る。例えば、ＥＰＯは、種々の障害（貧血を含む）の遺伝子治療処置において有用である（「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｅｍｉａ」と表題付けられた国際公開番号ＷＯ９５／１３３７６を参照のこと）。本発明の方法によるレプチンの持続性送達は、肥満症の処置において有用である。レプチン遺伝子および肥満症の処置におけるその使用の概要については、国際公開番号ＷＯ９６／０５３０９を参照のこと。
【０１４８】
種々の他の障害もまた、本発明の方法によって処置され得る。例えば、遺伝的に改変されたＴ細胞からのアポリポタンパク質Ｅまたはアポリポタンパク質Ａの持続性インビボ全身性産生が、高脂血症の処置のために使用され得る（Ｂｒｅｓｌｏｗら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：３６５を参照のこと）。アンギオテンシンレセプターインヒビター（Ｇｏｏｄｆｒｉｅｎｄら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１４６９）の持続性産生が、本明細書中に記載の方法によって提供され得る。なおさらなる例として、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）の長期のインビボ全身性産生は、種々の腫瘍の処置において有用である（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：６８９を参照のこと）。
【０１４９】
他の実施形態では、遺伝子移入ベクターは、サイトカインまたは他の免疫調節分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブなＩＬ−２またはγ−インターフェロンをコードする核酸配列が、それぞれ、米国特許第４，７３８，９２７号および同第５，３２６，８５９号に記載のように獲得され得、一方で、これらのタンパク質の有用なムテインは、米国特許第４，８５３，３３２号に記載のように獲得され得る。ｍＣＳＦの短形態および長形態をコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，８４７，２０１号および同第４，８７９，２２７号に記載のように獲得され得る。本発明の特定の局面では、サイトカインまたは免疫調節遺伝子を発現するレトロウイルスベクターが、本明細書中（例えば、本発明のパッケージング細胞株を使用する）および「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」と表題付けられた国際出願番号ＰＣＴ  ＵＳ  ９４／０２９５１に記載のように生成され得る。
【０１５０】
本明細書における使用のために適切な免疫調節分子の例としては、以下が挙げられる：ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：２９０−２９８、Ｗｅｂｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３、Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４、および米国特許第４，７３８，９２７号）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５７：５０３−５１２、Ｇｏｌｕｍｂｅｋら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７１３−７１６および米国特許第５，０１７，６９１号）；ＩＬ−５およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１および国際公開番号ＷＯ９０／０６３７０）；ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、Ｓｕｍｍｅｒ  １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；αインターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら（１９９１）、Ｄｒｕｇｓ  ４２：７４９−７６５、米国特許第４，８９２，７４３号および同第４，９６６，８４３号、国際公開番号ＷＯ８５／０２８６２、Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６−３２０、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４、Ｔｗｕら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２０４６−２０５０、およびＦａｋｔｏｒら（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｒｅｄｆｏｒｄら（１９９１）Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００８２０１５、Ｗａｔａｎａｂｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９４５６−９４６０、Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：７８２０−７８２５、Ｍａｉｏら（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２、ならびに米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開番号ＷＯ８５／０４１８８）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：９４２−９５１）；ＣＤ３（Ｋｒｉｓｓａｎｅｎら（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：２５８−２６６）；ＩＣＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５１２−５１４、Ｓｉｍｍｏｎｓら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：６２４−６２７）；ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３（Ｗａｌｌｎｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９２３−９３２）；ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１−．３、β2−マク
ログロブリン（Ｐａｒｎｅｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２２５３−２２５７）；カルネキシンのようなシャペロン；ならびにＭＨＣ連結輸送体タンパク質またはそのアナログ（Ｐｏｗｉｓら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：５２８−５３１）。免疫調節因子はまた、これらの分子に対するアゴニスト、アンタゴニスト、またはリガンドであり得る。例えば、レセプターの可溶性形態は、しばしば、これらの型の因子に対するアンタゴニストとして挙動し得、因子自体の変異形態も同様であり得る。
【０１５１】
上記の物質をコードする核酸分子、ならびに本発明における使用のために有益な他の核酸分子は、種々の供給源（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのような寄託機関を含む）または商業的供給源（例えば、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ））から、容易に入手され得る。代表的な例としては、以下が挙げられる：ＢＢＧ  １２（１２７アミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ  ６（これは、γインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号３９６５６（これは、ＴＮＦコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号２０６６３（これは、α−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号３１９０２、同３１９０２、および同３９５１７（これは、β−インターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６７０２４（これは、インターロイキン−１ｂをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号３９４０５、同３９４５２、同３９５１６、同３９６２６、および同３９６７３（これは、インターロイキン−２をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５９３３９、同５９３９８、および同６７３２６（これは、インターロイキン−３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５７５９２（これは、インターロイキン−４をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号５９３９４および同５９３９５（これは、インターロイキン−５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６７１５３（これは、インターロイキン−６をコードする配列を含む）。
【０１５２】
サイトカイン遺伝子または免疫調節遺伝子を含むプラスミド（国際公開番号ＷＯ９４／０２９５１およびＷＯ９６／２１０１５）は、適切な制限酵素を用いて消化され得、そして標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと）を使用して、特定の目的の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを遺伝子移入ベクター内に挿入し得る。
【０１５３】
長期発現に有用である例示的なホルモン、増殖因子および他のタンパク質は、例えば、欧州公開番号０４３７４７８Ｂ１（「Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」と表題）に記載されている。種々のホルモンをコードする核酸配列が使用され得、これには、ヒト成長ホルモン、インスリン、カルシトニン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をコードする核酸配列が挙げられる。種々の異なる形態のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２増殖因子ポリペプチドもまた、当該分野において周知であり、そしてインビボでの長期発現のための遺伝子移入ベクター内に組込まれ得る。例えば、欧州特許第０１２３２２８Ｂ１（１９９３年９月１９日交付のために公開され、「Ｈｙｂｒｉｄ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｔｕｒｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ」と表題）を参照のこと。さらなる例として、異なる形態の線維芽細胞増殖因子の長期インビボ発現もまた、本発明の組成物および方法を使用してもたらされ得る。例えば、異なる線維芽細胞増殖因子の概要については、米国特許第５，４６４，７７４号、同第５，１５５，２１４号および同第４，９９４，５５９号を参照のこと。
【０１５４】
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法（例えば、その遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってか、またはその遺伝子を含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによる）を使用して、入手され得る。例えば、変更された細胞性産物をコードする配列を含むプラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．のような寄託機関または商業的供給業者から入手され得る。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素を用いて消化され得、そして標準的な分子生物学的技術を使用して、そのヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントが、遺伝子移入ベクター内に挿入され得る。
【０１５５】
あるいは、本発明での使用のためのｃＤＮＡ配列は、標準的技術（例えば、フェノール抽出、およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、その配列を発現するかまたは含有する細胞から獲得され得る。例えば、ＤＮＡを獲得および単離するために使用される技術の概要については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡが、オリゴ−ｄＴまたはランダムプライマーを使用して、逆転写酵素で逆転写され得る。次いで、一本鎖ｃＤＮＡが、所望の配列のいずれかの側にある配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅され得る（米国特許第４，６８３，２０２号、同４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号を参照のこと。ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｒｌｉｃｈ（編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９もまた参照のこと）。
【０１５６】
目的のヌクレオチド配列はまた、クローン化されるのではなく、ＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９２  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能））を使用して、合成的に生成され得る。ヌクレオチド配列は、所望される産物の発現のために適切なコドンを用いて設計され得る。完全な配列が、標準的な方法によって調製されたオリゴヌクレオチドを重複させることから構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【０１５７】
本発明の合成的発現カセットは、レトロウイルスベクターでの使用のためのパッケージング細胞株の構築において使用され得る。
【０１５８】
レトロウイルスの１つの型であるマウス白血病ウイルス（すなわち、「ＭＬＶ」）は、遺伝子治療適用のために広範に利用されている（一般的に、Ｍａｎｎら（Ｃｅｌｌ  ３３：１５３、１９９３）、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９、１９８４）、ならびにＭｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２１ｅｒａｐｙ  １：５−１４、１９９０を参照のこと）。
【０１５９】
レンチウイルスベクターは、代表的に、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、目的の１つ以上の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’レンチウイルスＬＴＲを含み、ここでレンチウイルスベクターは、核移行エレメントを含む。核移行エレメントは、目的のコード配列の上流（５’）または下流（３’）のいずれかに位置付けられ得る。特定の実施形態では、核移行エレメントは、ＲＲＥではない。１つの実施形態では、パッケージングシグナルは、伸長した（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）パッケージングシグナルである。他の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであるか、あるいは、ＣＭＶのようなプロモーターである。他の実施形態では、レンチウイルスベクターはさらに、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含む。
【０１６０】
広範な種々のレンチウイルスが、本発明の状況において利用され得、これには、例えば、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、およびＳＩＶからなる群から選択されるレンチウイルスが挙げられる。
【０１６１】
本発明の１つの実施形態では、合成Ｅｎｖおよび／またはＧａｇポリメラーゼ発現カセットが提供される。これは、プロモーターならびに合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列（配列番号６）およびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、またはｖｉｆのうちの少なくとも１つをコードする配列を含み、ここでこのプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼおよびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、またはｖｉｆに作動可能に連結されている。
【０１６２】
本発明のなお別の局面では、本明細書中に記載される任意の発現カセットを含む宿主細胞（例えば、パッケージング細胞株）が提供される。例えば、１つの局面では、合成Ｅｎｖおよび／またはＧａｇポリメラーゼをコードする配列、ならびに核移行エレメントを含む発現カセットを含むパッケージング細胞株が提供され、ここでプロモーターは、Ｅｎｖおよび／またはＧａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されている。パッケージング細胞株はさらに、プロモーター、およびｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープをコードする配列を含み得、ここでこのプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープをコードする配列に作動可能に連結されている。パッケージング細胞株はさらに、１つ以上の任意のｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、またはｖｐｒをコードする配列を含み得る。
【０１６３】
１つの実施形態では、発現カセット（例えば、合成Ｅｎｖ、合成ｔａｔおよび／または合成Ｇａｇポリメラーゼを保有する）は、安定に組み込まれる。パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入に際して、代表的に、ウイルス粒子を産生する。合成発現カセットの発現を調節するプロモーターは、誘導性であり得る。代表的に、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入に際して、複製能を有するウイルスを実質的に含まないウイルス粒子を産生する。
【０１６４】
合成Ｅｎｖ（または、Ｇａｇポリメラーゼ）遺伝子の発現を指向する発現カセット、発現のために最適化されたＧａｇ（またはＥｎｖ）遺伝子の発現を指向する発現カセット（例えば、Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（２）：１４９７−１５０３、１９９８；Ｈａａｓ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（３）：３１５−３２４、１９９６）を含むパッケージング細胞株が提供される。レンチウイルスベクターは、パッケージング細胞株中に導入されて、ベクター粒子を産生する細胞株を生成する。
【０１６５】
上述のように、レンチウイルスベクターは、選択された遺伝子または目的の配列を保有または発現するように設計され得る。レンチウイルスベクターは、広範な種々のレンチウイルスから容易に構築され得る（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。レンチウイルスの代表的な例としては、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、およびＳＩＶが挙げられる。このようなレンチウイルスは、患者の分離菌から、もしくは、より好ましくは、アメリカンタイプカルチャーコレクションのような寄託機関またはコレクションから入手され得るか、または、利用可能な技術を使用して、公知の供給源から単離され得るかのいずれかであり得る。
【０１６６】
レンチウイルス遺伝子送達ベクター（または、ビヒクル）の部分は、異なるウイルスに由来し得る。例えば、所定の組換えレンチウイルスベクターにおいて、ＬＴＲはＨＩＶ由来であり得、パッケージングシグナルはＳＩＶ由来であり得、そして第２鎖合成の起点は、ＨｒＶ−２由来であり得る。レンチウイルスベクター構築物は、５’レンチウイルスＬＴＲ，ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種配列、第２鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲを含み得、ここでこのレンチウイルスベクターは、ＲＲＥではない核移行エレメントを含む。
【０１６７】
簡単には、長い末端反復（「ＬＴＲ」）は、Ｕ５、ＲおよびＵ３と命名された３つのエレメントに細分される。これらのエレメントは、種々のシグナルを含み、これらのシグナルは、例えば、Ｕ３内に配置される、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含むレトロウイルスの生物学的活性に原因がある。ＬＴＲは、いずれかのゲノムの末端での正確な重複に起因して、（ＤＮＡ形態で組み込まれる）プロウイルスで容易に同定され得る。本明細書中で利用されるように、５’ＬＴＲは、５’プロモーターエレメントおよび十分なＬＴＲ配列を含み、ベクターのＤＮＡ形態の逆転写および形成を可能にすると理解されるべきである。３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナル、および十分なＬＴＲ配列を含み、、ベクターのＤＮＡ形態の逆転写および形成を可能にすると理解されるべきである。
【０１６８】
ｔＲＮＡ結合部位および第２鎖ＤＮＡ合成の起点もまた、レトロウイルスが生物学的活性であるのに重要であり、そして当該者によって容易に同定され得る。例えば、レトロウイルスｔＲＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対によってｔＲＮＡ結合に結合し、ウイルス部分にレトロウイルスゲノムで運搬される。次いで、ｔＲＮＡは、逆転写によるＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。ｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲ由来のまさに下流位置に基づいて容易に同定され得る。同様に、第２鎖ＤＮＡ合成の起点は、その名が意味するように、レトロウイルスの第２鎖ＤＮＡ合成のために重要である。ポリプリントラクト（ｐｏｌｙ−ｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）と呼ばれる領域はまた、３’ＬＴＲのまさに下流に位置している。
【０１６９】
５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、ならびに第２鎖ＤＮＡ合成の起点に加えて、組換えレトロウイルスベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、および目的の１以上の遺伝子またはコード配列を含み得る。さらに、レンチウイルスのベクターは、好ましい実施形態においてＲＲＥではない核輸送エレメントを有する。適切な核輸送エレメントの代表的なエレメントは、以下が挙げられる：ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｏｇｅｒｔら、Ｊ  ＶｉｒｏＬ７０，３８３４−３８４３，１９９６）、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｌｉｕ  ＆  Ｍｅｒｔｚ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，９，１７６６−１７８９，１９９５）およびシミアンレトロウイルスタイプＩのゲノム中のエレメント（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６８，７９４４−７９５２，１９９４）。他の潜在的エレメントとしては、ヒストン遺伝子（Ｋｅｄｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８，８３７−８７０，１９７０）、α−インターフェロン遺伝子（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ２８７，４０１−４０８，１９８０）、β−アドレナリン作用性レセプター遺伝子（Ｋｏｉｌｋａら、Ｎａｔｕｒｅ３２９，７５−７９，１９８７）、およびｃ−Ｊｕｎ遺伝子（Ｈａｔｔｏｒｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，９１４８−９１５２，１９８８）のエレメントが挙げられる。
【０１７０】
組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、Ｇａｇ−ポリメラーゼおよびｅｎｖコード配列の両方を欠く。組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、Ｇａｇ−ポリメラーゼまたはｅｎｖ遺伝子に見出される２０未満，好ましくは１５未満、より好ましくは１０未満、そして最も好ましくは８未満の連続的ヌクレオチドを含む。本発明の１つの利点は、合成Ｇａｇ−ポリメラーゼ発現カセット（この発現カセットは、組換えレトロウイルスベクター構築物のためにパッケージング細胞株を構築するために使用され得る）は、野生型のＧａｇ−ポリメラーゼ配列に対してほとんど相同性を有さず、従って、合成配列と野生型配列との間の相同性組換えの可能性をかなり減少するか、または排除する。
【０１７１】
レンチウイルスベクターはまた、目的の１以上の遺伝子または配列の発現を駆動する組織特異的プロモーターを含み得る。例えば、本発明のレンチウイルスベクター粒子は、肝臓特異的プロモーターを含み得、ベクターに含まれる外因性ＤＮＡ配列の肝臓特異的発現の能力を最大にし得る。好ましい肝臓特異的プロモーターとしては、Ｂ型肝炎Ｘ遺伝子プロモーターおよびＢ型肝炎コアタンパク質プロモーターが挙げられる。これらの肝臓特異的プロモーターは、好ましくは、これらのプロモーターの個々のエンハンサーとして使用される。このエンハンサーエレメントは、目的の配列をコードする核酸の５’末端および３’末端のいずれかで連結され得る。Ｂ型肝炎Ｘ遺伝子プロモーターおよびそのエンハンサーは、３３２塩基対ＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩ  ＤＮＡフラグメントとしてウイルスゲノムから得られ得、これには、Ｔｗｕら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６１：３４４８−３４５３，１９８７に記載される方法を利用する。Ｂ型肝炎コアタンパク質プロモーターは、５８４塩基対ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ  ＤＮＡフラグメントとしてウイルスゲノムからえられ得、これには、Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｖｉｒｏｌ  １８９：５９−６６，１９９２に記載される方法を利用する。ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント中の陰性の調節塩基対を除去することが、このフラグメントを挿入する前に必要であり得る。他の肝臓特異的プロモーターとしては、ＥＰ特許公開０  ４１５  ７３１に開示されるようなＡＦＰ（α−胎児タンパク質）遺伝子プロモーターおよびアルブミン遺伝子プロモーター、Ｒｅｔｔｅｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１４６０−１４６４、１９９４に記載されるような−１アンチトリプシン遺伝子プロモーター、フィブリノーゲン遺伝子プロモーター、ＡＰＯ−Ａｌ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌ）遺伝子プロモーター、ならびに例えば、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴおよびグルタミルトランスフェラーゼのような肝臓転移酵素の対するプロモーター遺伝子が挙げられる。また、レンチウイルスベクター粒子中の肝臓特異的プロモーターの使用の記載について、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９０／０７９３６およびＷＯ  ９１／０２８０５を参照のこと。
【０１７２】
レンチウイルスベクター構築物は、目的の１以上の遺伝子を発現させることで産生され得る。これは、ジシストロンカセットまたはオリゴシストロンカセット（例えば、コード配列が８０ヌクレオチド以下に分割される場合（一般に、Ｌｅｖｉｎら、Ｇｅｎｅ  １０８：１６７−１７４、１９９１を参照のこと））の使用によってか、あるいはＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅｓ（「ＩＲＥＳ」）の使用によって達成され得る。
【０１７３】
上記の組換えレトロウイルスベクターの構築に使用するのに適切なパッケージ細胞株は、本明細書中で提供される開示により容易に調製され得る。簡単には、パッケージング細胞株が誘導される親の細胞株は、種々の哺乳動物の細胞株から選択され得、これには、例えば、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、および骨髄腫細胞が挙げられる。
【０１７４】
パッケージ細胞株の産生のために適切な宿主細胞の選択後、１以上の発現カッセットが、細胞株に導入され、欠失されたベクターのトランス成分を補完するかまたは、補充する。
【０１７５】
適切な発現カッセットの代表例は、本明細書中に記載され、そしてこれには、合成Ｅｎｖ、ｔａｔ、Ｇａｇ、合成Ｇａｇプロテアーゼ、合成Ｇａｇ逆転写酵素および合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセットが挙げられる。このカセットは、例えば、Ｅｎｖ、ｔａｔ、またはＧａｇポリメラーゼおよび少なくとも１つのｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆをコードするプロモーターおよび配列を含む。ここで、このプロモーターは、Ｅｎｖ、ｔａｔ、またはＧａｇポリメラーゼおよびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆに作動可能に連結される。上記のように、配列をコードする最適化されたＥｎｖ、Ｇａｇおよび／またはｔａｔはまた、パッケージング細胞株の産生での種々の組み合わせに利用され得る。
【０１７６】
上記の発現カセットを利用すると、広範に種々のパッケージ細胞株が、産生され得る。例えば、１局面において、パッケージ細胞株が提供される。この細胞株は、合成ＨＩＶ（例えば、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、ｔａｔ、Ｇａｇポリメラーゼ、Ｇａｇ逆転写酵素またはＧａｇプロテアーゼ）ポリペプチド、および核輸送エレメントをコードする配列を含む発現カセットを含む。ここで、このプロモーターは、ＨＩＶポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結される。他の局面において、パッケージ細胞株が提供される。この細胞株は、Ｇａｇ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープ（例えば、ＨＩＶ  ｅｎｖ）をコードするプロモーターおよび配列を含む。ここで、このプロモーターは、Ｇａｇ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープをコードする配列に作動可能に連結される。さらなる実施形態において、パッケージング細胞株は、任意の１以上のｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒをコードする配列を含み得る。例えば、パッケージング細胞株は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒ単独のみ、ｎｅｆおよびｖｉｆ、ｎｅｆおよびｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｒ、ｖｉｆおよびｖｐｕ、ｖｉｆおよびｖｐｒ、ｖｐｕおよびｖｐｒ、ｎｅｆ  ｖｉｆおよびｖｐｕ、ｎｅｆ  ｖｉｆおよびｖｐｒ、ｎｅｆ  ｖｐｕおよびｖｐｒ、ｖｖｉｒ  ｖｐｕおよびｖｐｒ、あるいは、ｎｅｆ  ｖｉｆ  ｖｐｕおよびｖｐｒの４つ全てを含み得る。
【０１７７】
１実施形態において、発現カセットは、安定的に組み込まれる。別の実施形態において、レンチウイルスベクターの導入の際に、パッケージング細胞株は、粒子を産生する。さらなる実施形態において、プロモーターが、誘導される。本発明の特定の好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの導入の際に、パッケージング細胞株は、複製適格ウイルスのない粒子を産生する。
【０１７８】
最適なコード配列を含む合成カセットは、選択された細胞株にトランスフェクトされる。（ｉ）代表的に、組み込まれ、安定なＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖコード配列のコピーを運搬し、かつ（ｉｉ）これらのポリペプチドの受容可能なレベルを発現するトランスフェクトされた細胞が、選択される（発現は、先行技術において公知の方法によって、評価され得る（実施例１〜４を参照のこと））。ＶＬＰを産生するための細胞株の能力はまた、変化され得る（実施例６、７および１５）。
【０１７９】
目的の配列は、上記のような適切なウイルスベクターに構築される。次いで、欠損ウイルスは、パッケージ細胞株にトランスフェクトされる。パッケージ細胞株は、ウイルス様粒子を産生するために必要なウイルス機能を提供し、目的の配列を含む欠損ウイルスゲノムをパッケージする。次いで、これらのＶＬＰを単離し、そして例えば、遺伝子送達または遺伝子治療に使用し得る。
【０１８０】
さらに、このようなパッケージング細胞株はまた、ＶＬＰのみを産生するために使用され得、このＶＬＰは、例えば、他の抗原またはワクチン組成物と共に投与するためのアジュバントとして使用され得る。また、パッケージング細胞株におけるポリペプチド（例えば、抗原）をコードする目的の選択配列の同時発現はまた、ＶＬＰ中の／ＶＬＰを有する選択ポリペプチドの捕捉および／または会合を引き起こし得る。
【０１８１】
（２．３  ＤＮＡ免疫法および遺伝子送達）
種々のポリペプチド抗原が、本発明の実施において使用され得る。ポリペプチド抗原は、ＤＮＡ免疫構築物に関与し得、この構築物は、例えば、このポリペプチド抗原のコード配列にインフレームで融合した、本明細書中に記載される任意の合成発現カセットを含むＤＮＡ免疫化構築物に関与し得、ここでこの構築物の発現は、目的の抗原を発現するＶＬＰを生じる。抗原は、種々のウイルス、細菌、真菌、植物、原生動物および他の寄生生物由来であり得る。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の種々のタンパク質（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２  ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ＶＰ１６およびＶＰ２２）のタンパク質；水痘‐帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにＣＭＶ  ｇＢおよびｇＨを含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原、ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原をふくむ）に対する免疫応答を刺激するための用途を見出す（例えば、サイトメガロウイルスの内容物をコードするタンパク質の総説について、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９０）１２５〜１６９頁；ウイルスＨＳＶ−１コード化タンパク質の議論について、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１〜１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２  ｇＢおよびｇＤタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の議論について、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノムにおける配列をコードするタンパク質の同定について、Ｂｅａｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７〜２１１；ＶＺＶの総説について、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９〜１８１６を参照のこと）。
【０１８２】
さらに、肝炎ファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルスを含む）由来の抗原に対する免疫応答がまた、本発明の構築物を使用して刺激され得る。例として、ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルス性タンパク質（Ｅ１（Ｅとしても公知である）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知である）をコードし、このＨＣＶゲノムは、本発明を用いる用途を見出す（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の議論について、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３８８を参照のこと）。ＨＤＶ由来のδ抗原もまた使用され得る（例えば、δ−抗原の議論について、米国特許第５，３８９，５２８号を参照のこと）。
【０１８３】
同様に、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザＡ型のエンベロープ糖タンパクＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生成するために特に関心がもたれる。インフルエンザＡ型の多数のＨＡサブタイプが同定されいる（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１７９：７５９〜７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１８４】
本発明の実施に使用するために特に興味が持たれる他の抗原には、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）由来の抗原およびその抗原由来のポリペプチド、例えば、Ｅ６およびＥ７を含む１つ以上の様々な初期タンパク質；ダニ媒介脳炎ウイルス；およびＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶなどとしても公知である）を含み、これには、抗原（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、Ｇａｇおよび種々の単離体（これには、ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１SF170、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN
、ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4、が挙げられるが、これらに限定されない）由来のｐｏｌ）、多様なサブタイプ（例えば、サブタイプＡ〜ＧおよびＯ）由来の他のＨＩＶ−１鎖、ＨＩＶ−２鎖、ならびに多様なサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２UC1およびＨＩＶ−
２UC2）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌ
ａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ，１９９０，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
【０１８５】
他のウイルス由来のタンパク質はまた、特許請求される方法における用途を見出し、この他のウイルス由来のタンパク質には、以下のファミリーのメンバー由来のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない：ピコナウイルス科（例えば、ピコルナウイルスなど）；カリチウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科、例えば、とりわけ、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２；サル免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）。これらおよび他のウイルスの議論については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９４）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、（Ｆｉｅｌｄｓ、ＢＮ、ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ編、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖａｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を参照のこと。
【０１８６】
特に好ましい細菌性抗原は、ジフテリア、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原状態を生じる生物由来であり、このような抗原には、以下に由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない：ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、髄膜炎菌（髄膜炎菌Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷＩ３５（ＭｅｎＡ、Ｂ，Ｃ、ＹおよびＷＩ３５）を含む）、ヘモフィルスインフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）、およびヘリコバクターピロリ。寄生生物抗原の例には、マラリア、結核およびライム病を引き起こす生物由来のものが挙げられる。
【０１８７】
さらに、本明細書中に記載される方法は、様々な悪性癌を処置するための方法を提供する。例えば、本発明のシステムは、問題としている癌（例えば、活性化癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカー）に対して特異的な特定のタンパク質に対する体液免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を高めるために使用され得る。このような腫瘍抗原には、とりわけ、任意の種々のＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）（ＭＡＧＥ１、２、３、４などを含む）（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年３月）：８２〜８９）；任意の種々のチロシナーゼ；ＭＡＲＴ  １（Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原）、改変体ｒａｓ；改変体ｐ５３；ｐ９７メラノーマ抗原；ＣＥＡ（癌胎児抗原）が挙げられる。
【０１８８】
本発明の合成発現カセットを使用するＤＮＡ免疫法は、有効であることが示されている（実施例８および１０〜１２）。動物を、合成発現カセットおよび野生型発現カセットの両方で免疫化した。プラスミド−ＤＮＡを用いる免疫化の結果は、この合成発現カセットは、ネイティブの発現カセットに比べて明らかに改善された免疫原性を提供することを示した。また、第２のブースト免疫化は、例えば２〜８週後に２次免疫応答を誘導した。さらに、ＣＴＬアッセイの結果は、ＤＮＡ免疫化による細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導に関して、合成発現カセットの増加した効力を示した。
【０１８９】
本発明は、種々の抗原に対する免疫応答を高め、それ故、多くの疾患を処置または予防するために使用され得ることは容易に明らかである。
【０１９０】
（２．３．１  本発明の合成発現カセットの送達）
上記の分子についてコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例えば、ｃＤＮＡおよび遺伝子を発現する細胞由来のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクター由来の遺伝子を誘導することによって）得られ得る。これらの配列は、従来の配列決定技術によって分析され得る。さらに、所望の遺伝子が、標準的技術（例えば、フェノール抽出、およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、これらの遺伝子を含む細胞および組織から直接単離され得る。例えば、ＤＮＡを得、単離しそして配列決定するために使用される技術の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。一旦、配列が分かると、目的の遺伝子がまた、クローン化されるよりむしろ合成的に産生される。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、この配列が発現する意図される宿主に適切なコドンを選択する。完全配列は、標準的な方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全コード配列を構築する。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．、（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６４：４９〜５３を参照のこと。
【０１９１】
次に、所望の抗原をコードする遺伝子配列が、本発明の合成発現カセットを含むベクターに挿入され得る（例えば、種々の例示的な合成発現カセットの構築について実施例１を参照のこと）。抗原は、合成コード配列に挿入され、その結果この組み合わされた配列が発現する場合、それがポリペプチドおよび／または目的の抗原を含むＶＬＰの産生を生じる。挿入は、Ｇａｇコード配列内またはコード配列のいずれかの末端（５’（発現されるポリペプチドのアミノ末端）；または３’（発現されるポリペプチドのカルボキシ末端）−−例えば、実施例１を参照のこと）でなされ得る（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１２７：１１７〜１３７、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：１６２〜１７５、１９９４；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３３８９〜３３９８、１９９５；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｔ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：５２４〜５３４、１９９４；Ｃｈａｚａｌ，Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（１）：１１１〜１２２、１９９４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（６）：３１９１〜３１９８、１９９３；Ｒｅｉｃｉｎ、Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：６４２〜６５０、１９９５）。
【０１９２】
ｐ５５Ｇａｇのコード領域の５０％までが、ウイルス様の粒子への会合および発現効率に影響を与えることなく、欠失され得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３〜９３１７、１９９８；Ｇａｍｉｅｒ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（６）：４６６７〜４６７７、１９９８；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（３）：１７８２〜１７８９，１９９８；Ｗａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：７９５０〜７９５９、１９９８）。本発明の１つの実施形態において、ハイレベルで発現する合成のｐ５５ＧａｇＭｏｄ発現カセットおよびｐ５５ＧａｇＰｒｏｔＭｏｄ発現カセットの免疫原性は、異なる構造のＨＩＶ抗原または非構造的ＨＩＶ抗原、マルチエピトープカセット、あるいはサイトカイン配列の、ｐ５５ＧａｇＭｏｄ配列の欠失領域、変異領域、または短縮型領域への挿入によって増加され得る。本発明の別の実施形態において、ハイレベルで発現する合成Ｅｎｖ発現カセットの免疫原性は、異なる構造のＨＩＶ抗原または非構造的ＨＩＶ抗原、マルチエピトープカセット、あるいはサイトカイン配列の、ｇｐ１２０Ｍｏｄ配列、ｇｐ１４０Ｍｏｄ配列またはｇｐ１６０Ｍｏｄ配列の欠失領域への挿入によって増加され得る。このような欠失は、本発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された、全長の改変されたＥｎｖ配列を使用することに対する、このアプローチの１つの考えられる利点は、より高い発現効率／分泌効率および／または発現産物のより高い免疫原性であり得る。このような欠失は、本発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された、全長のＥｎｖ配列、Ｇａｇ配列、またはＴａｔ配列を使用することに対する、このアプローチの１つの考えられる利点は、より高い発現効率／分泌効率および／または発現産物のより高い免疫原性であり得る。
【０１９３】
配列がＧａｇのアミノ末端に付加される場合（例えば、本発明の合成ｐ５５ＧａｇＭｏｄ発現カセットを使用する場合）、このポリヌクレオチドは、ミリスチン部分をそのＧａｇ含有ポリペプチドに付加するためのシグナルをコードするコード配列（例えば、Ｍｅｔ−Ｇｌｙをコードする配列）を、５’末端に含み得る。
【０１９４】
Ｇａｇ含有ポリペプチド構築物のＶＬＰを形成する能力は、本明細書の教示に従って経験的に決定され得る。
【０１９５】
ＨＩＶポリペプチド／抗原の合成発現カセットは、対象の種においてインビボでの遺伝子の発現を可能にする、コード配列に作動可能に結合された制御エレメントを含む。例えば、哺乳動物細胞の発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターのようなＣＭＶプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような、他の非ウイルス性プロモーターもまた、哺乳動物発現のための使用を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、転写終止コドンに対して３’側に位置される。好ましくは、コード配列に対して５’側に位置される、転写の開始の最適化のための配列もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、に記載されるようなＳＶ４０由来の転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナル、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列由来の転写が挙げられる。
【０１９６】
エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを高めるために、本明細書中において使用され得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、ならびにＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるようなヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
【０１９７】
さらに、例えば目的の複数の抗原／エピトープ（例えば、１つのウイルス単離体または１つより多いウイルス単離体由来）をコードするキメラ抗原をコードする遺伝子配列を含むプラスミドが構築され得る。
【０１９８】
代表的には、抗原をコードする配列は、合成コード配列の前または後に存在し、そしてキメラ転写単位は、目的の抗原および合成Ｇａｇコード配列の両方をコードする、単一のオープンリーディングフレームを有する。あるいは、マルチシストロン性カセット（例えば、二シストロン性カセット）が構築され得、これは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳなどを用いて１つのｍＲＮＡからの複数の抗原の発現を可能にする。最後に、抗原は、１つのプラスミドまたは他のベクター上の独立したプロモーターから離れた転写物上にコードされ得る。
【０１９９】
一旦完成すると、構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して核酸免疫などのために使用される。遺伝子送達の方法は当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物の被験体に直接的に送達され得るか、または、代替的に、被験体由来の細胞にエキソビボで送達され、そしてこの細胞は被験体中に再移植され得る。
【０２００】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物の細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のために都合の良いプラットホームを提供する。選択された配列は、当該分野において公知である技術を用いてベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され得、そしてインビボかまたはエキソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されてきた（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０〜９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５〜１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９〜８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３〜８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２〜１０９）。
【０２０１】
多数のアデノウイルスベクターもまた記載されてきた。宿主ゲノムに組み込むレトロウイスルと異なり、アデノウイルスは、染色体外で存続し、従って挿入変異誘発に伴う危険を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７〜２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１〜５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７〜７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３〜９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１〜５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６〜６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１〜４７６）。
【０２０２】
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のために開発されてきた。ＡＡＶベクターは、当該分野において周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８〜３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３〜８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５〜１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７〜１８７５）。
【０２０３】
本発明のポリヌクレオチドを送達するために有用な別のベクター系は、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら（米国特許第５，６７６，９５０号、１９９７年１０月１４日公布）によって記載される、腸内に（ｅｎｔｅｒｉｃａｌｌｙ）投与される組換えポックスウイルスワクチンである。
【０２０４】
目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための使用を見出す、さらなるウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルスおよび鳥類ウイルスを含む、ポックスファミリーのウイルスに由来するベクターが挙げられる。例示のために、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築され得る。特定の合成Ｇａｇ／抗原コード配列をコードするＤＮＡが、まず適切なベクターに挿入され、その結果、このＤＮＡは、ワクシニアプロモーターおよび隣接するワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接する。次いで、このベクターを使用して細胞をトランスフェクトし、この細胞には、同時にワクシニアに感染される。相同組換えが生じ、ワクシニアプロモーターおよび目的のコード配列をコードする遺伝子を、そのウイルスゲノムに挿入する。得られたＴＫ組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性なウイルスプラークを選ぶことによって選択され得る。
【０２０５】
あるいは、禽痘ウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）はまた、遺伝子を送達するために使用され得る。哺乳動物病原体から免疫原を発現する組換え禽痘ウイルスは、非鳥類種に投与される場合に、防御免疫を付与することが公知である。禽痘ベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、禽痘属のメンバーは、感受性の鳥類種において防御的に複製されるのみであり得、従って、哺乳動物細胞において感染性でないからである。組換え禽痘ウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記のように、遺伝的組換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照のこと。
【０２０６】
分子結合体ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されるアデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用され得る。
【０２０７】
アルファウイルス属のメンバー（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス由来のベクターであるが、これらに限定されない）はまた、本発明のポリヌクレオチドを送達するためのウイルスベクターとしての使用を見出す（例えば、以下の実施例１４に記載されるような、合成Ｇａｇ−ポリペプチドまたは合成Ｅｎｖ−ポリペプチドをコードする発現カセット）。本方法の実施のために有用な、シンドビスウイルス由来のベクターの説明については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開番号ＷＯ９５／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２；ならびにＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．ら、米国特許第５，８４３，７２３号（１９９８年１２月１日発行）、およびＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．、米国特許第５，７８９，２４５号（１９９８年８月４日発行）を参照のこと。
【０２０８】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、宿主細胞において目的のコード配列（例えば、合成Ｇａｇ／ＨＣＶ−コア発現カセット）の誘導可能な一過性の発現を提供するために簡便に使用され得る。この系において、細胞は、まず、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体を用いてインビトロで感染される。このポリメラーゼは、精巧な特異性を提示し、ここで、このポリメラーゼは、単にＴ７プロモーターを保有する鋳型を転写する。感染後、細胞は、Ｔ７プロモーターによって駆動される、目的のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされる。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いで、これは、宿主翻訳機械によってタンパク質へと翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルな一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０２０９】
ワクシニアまたは禽痘ウイルス組換え体を用いる感染に対するか、または他のウイルスベクターを使用する遺伝子の送達に対する代替のアプローチとして、宿主細胞への導入後の高レベルな発現を導く増幅系が、使用され得る。詳細には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのコード領域に先行するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、操作され得る。この鋳型由来のＲＮＡの翻訳は、より多くの鋳型を順番に転写するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを生成する。同時に、発現がＴ７プロモーターの制御下にあるｃＤＮＡが存在する。従って、増幅鋳型ＲＮＡの翻訳から生成されるいくつかのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、所望の遺伝子の転写を導く。いくつかのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが増幅を開始するために必要であるので、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型とともに細胞へ導入されて転写反応をプライムし得る。ポリメラーゼは、タンパク質としてかまたはＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入され得る。Ｔ７合成および細胞を形質転換するためのそれらの使用のさらなる議論については、例えば、国際公開番号ＷＯ９４／２６９１１；ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５−２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１−１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７−２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４−２１２０；ならびに米国特許第５，１３５，８５５号を参照のこと。
【０２１０】
目的の合成発現カセットはまた、ウイルスベクターなしで送達され得る。例えば、合成発現カセットは、被験体またはそれに由来する細胞に送達する前に、リポソームにおいてＤＮＡまたはＲＮＡとしてパッケージングされ得る。脂質被包は、一般に、核酸を安定に結合するかまたは捕獲（ｅｎｔｒａｐ）し、そして保持し得る、リポソームを使用して達成される。脂質調製物に対する濃縮ＤＮＡの比は、変化し得るが、一般におよそ１：１（ｍｇ  ＤＮＡ：マイクロモル  脂質）であるか、または脂質がより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、第１０１巻、５１２−５２７頁を参照のこと。
【０２１１】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性の調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０２１２】
カチオン性リポソームは、容易に利用可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で利用可能である（また、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６を参照のこと）。他の市販の脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して容易に利用可能な材料から調製され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明について、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０２１３】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に利用可能であるか、または、容易に利用可能な材料を使用して容易に調製され得る。このような材料としては、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが挙げられる。これらの材料はまた、適切な比でＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ開始剤量とともに混合され得る。これらの材料を使用するリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。
【０２１４】
リポソームは、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）、または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），第１０１巻，５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【０２１５】
ＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載される調製物と類似の蝸牛殻状脂質調製物において送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号もまた参照のこと。
【０２１６】
目的の合成発現カセット（例えば、実施例１において記載される任意の合成発現カセット）はまた、粒状のキャリアに被包され得るか、粒状のキャリアに吸着され得るか、または粒状のキャリアと会合され得る。このようなキャリアは、免疫系に対する複数コピーの選択された抗原を提示し、そして局所的なリンパ節における抗原の移動、捕獲および保持を促進する。粒子は、専門の（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ）抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）によって取り込まれ得るか、ならびに／または他の機構（例えば、サイトカイン放出の刺激）を通じて抗原提示を増強し得る。粒状のキャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）由来の微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ  ＪＰら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。
【０２１７】
さらに、他の粒子系およびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボ送達のために使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、ならびにこれらの分子の結合体）は、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、珪酸アルミニウム（ベントナイトおよびカオリンを含む）、酸化クロム、珪酸マグネシウム、タルクなど）を使用する沈殿は、本発明の方法との使用を見出す。例えば、遺伝子移入に有用な送達系の総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。ペプチド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、米国特許第５，８３１，００５号、１９９８年１１月３日発行）もまた、本発明の構築物の送達のために使用され得る。
【０２１８】
さらに、粒状のキャリア（例えば、金およびタングステン）を使用する微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達系は、本発明の合成発現カセットを送達するために特に有用である。この粒子は、送達されるべき合成発現カセットを用いてコーティングされ、そして一般に減圧下で、「遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）」からの火薬発射を使用して高速に加速され得る。このような技術の説明、およびそのために有用な装置については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。また、針なし注射系が、使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０２１９】
本発明の合成発現カセットを保有する組換えベクターは、脊椎動物被験体への送達のために組成物中に処方される。これらの組成物は、予防的（感染を予防するため）または治療的（感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。組成物は、「治療的有効量」の目的の遺伝子を含み、その結果、一定量の抗原がインビボで産生され得、その結果、免疫応答が、それが投与される個体において生成される。必要な正確な量は、処置されている被験体；処置されるべき被験体の年齢および一般的状態；被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される防御の程度；処置されている状態の重症度；選択される特定の抗原および投与のその様式などの因子に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療的有効量」は、慣用的な試行を通じて決定され得る比較的広範囲に及ぶ。
【０２２０】
組成物は、一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、界面活性剤など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。免疫原性の、または核酸取り込みおよび／もしくは発現の、特定の促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、ブピバカイン、カルジオトキシン（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）およびスクロースであるが、これらに限定されない）はまた、組成物中に含まれ得るか、あるいは同時投与され得る。
【０２２１】
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接的に投与され得る（例えば、上記のように）か、または、あるいは、上記の方法のような方法を使用して、被験体由来の細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクトアミンおよびＬＴ−１媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチド（対応する抗原を有するか、または有さない）の被包、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられ得る。
【０２２２】
インビボにおける合成発現カセット組成物の直接的な送達は、一般に、上記のように、従来のシリンジ、針なしデバイス（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔ（登録商標））または遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））のいずれかを使用する注射によって、ウイルスベクターを用いてかまたは用いずに達成される。構築物は、皮下に、表皮に、皮内に、筋内に、静脈内に、粘膜内に（例えば、鼻に、直腸に、および膣に）、腹腔内に、または経口的にのいずれかで送達され（例えば、注射され）得る。表皮の細胞へのＤＮＡの送達は、この様式の投与が皮膚関連リンパ細胞への接近を提供し、そしてレシピエントにおけるＤＮＡの一過的な存在を提供する場合に、特に好ましい。他の様式の投与としては、経口摂取および肺投与、坐剤、針なし注射、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）塗布および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）塗布が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよいし、または複数回用量スケジュールであってもよい。
【０２２３】
（２．３．２  本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達）
１つの実施形態において、Ｔ細胞、ならびに関連する細胞型（抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、リンパ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびそれらの前駆細胞）が挙げられるがこれらに限定されない）は、本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達のために使用され得る。Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手順によって末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、付属の（ａｃｃｅｘｓｏｒｙ）細胞およびＢ細胞の除去によってＰＢＬの集団から「濃縮」され得る。特に、Ｔ細胞濃縮は、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を使用する非Ｔ細胞の除去によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定の集団を枯渇するために使用され得る。例えば、抗Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯渇するために使用され得、そして抗ＭａｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇するために使用され得る。
【０２２４】
Ｔ細胞は、さらに、当業者に公知の技術によって、多くの異なる部分集団へと分割され得る。２つの主要な部分集団は、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８のこれらの示差的な発現に基づいて単離され得る。例えば、上記のようなＴ細胞の濃縮後、ＣＤ４+細胞は
、ＣＤ４に特異的な抗体を使用して濃縮され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら、前出を参照のこと）。抗体は、固体支持体（例えば、磁気ビーズ）に結合され得る。逆に、ＣＤ８＋細胞は、（ＣＤ４+細胞を除去するために）ＣＤ４に特異的な抗体の使用によって濃縮され得るか、または固体支持体に結合されたＣＤ８抗体の使用によって単離され得る。ＨＩＶ−１に感染した患者由来のＣＤ４リンパ球は、Ｗｉｌｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８によって記載されるように、形質導入の前または後に、エキソビボで拡大（ｅｘｐａｎｄ）され得る。
【０２２５】
Ｔ細胞の精製の後、当業者に公知の遺伝的改変の種々の方法が、本明細書中に記載されるように構築された非ウイルスに基づく遺伝子移入ベクターまたはウイルスに基づく遺伝子移入ベクターを使用して実施され得る。例えば、１つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞由来の培養物のベクター含有上清を用いる、精製されたＴ細胞集団の形質導入を含む。第２のアプローチは、精製されたＴ細胞とのベクター産生細胞の照射単層の同時培養を含む。第３のアプローチは、類似の同時培養アプローチを含む；しかし、精製されたＴ細胞は、種々のサイトカインとともに予め刺激され、そして照射されたベクター産生細胞との同時培養の前に４８時間培養される。このような形質導入の前の予めの刺激は、有効な遺伝子移入を増大する（Ｎｏｌｔａら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。増殖するためのこれらの培養物の刺激はまた、患者への再注射のために、増加した細胞集団を提供する。同時培養後、Ｔ細胞は、ベクター産生細胞単層から収集され、拡大され、そして液体窒素で凍結される。
【０２２６】
本発明の１つ以上の合成発現カセットを含む、遺伝子移入ベクター（単離されたＴ細胞に対する送達のために適切な制御エレメントと結合される）は、公知の方法を使用してアセンブルされ得る。
【０２２７】
選択マーカーはまた、遺伝子転移ベクターの構築において使用され得る。例えば、この遺伝子転移ベクターで形質導入した哺乳動物細胞に細胞傷害性薬剤に対する耐性を与えるマーカーが使用され得る。この細胞傷害性薬剤は、限定しないが、ネオマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）Ａ、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得る。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシンアナログであるジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｎ）（Ｇ４１８）に対する耐性を与える。
【０２２８】
Ｔ細胞はまた、選択される前に、少なくとも１つの型の増殖因子を含む培地で維持され得る。種々の増殖因子が当該分野で公知であり、これらは、特定の細胞型の増殖を持続させる。このような増殖因子の例は、サイトカインマイトジェン（例えば、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５）であり、これは、リンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の型の細胞は、ホルモンのような他の増殖因子によって刺激され、これらのホルモンとしては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンが挙げられる。特定の細胞集団に適切な増殖因子の選択は、当業者によって容易に達成される。
【０２２９】
例えば、分化した前駆体および幹細胞のような白血球は、種々の増殖因子によって刺激される。より詳細には、活性化ＴHによって産生されそしてマクロファージにより活性化
されたＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは、骨髄性幹細胞を刺激し、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆体、好酸球前駆体、好塩基球前駆体、巨核球、および赤血球前駆体に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１およびＥＰＯのような増殖因子によって調節される。
【０２３０】
次いで、多能性幹細胞は、リンパ系幹細胞、骨髄間質細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞前駆体、胸腺細胞、ＴH細胞、ＴC細胞およびＢ細胞に分化する。この分化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−５のような増殖因子によって調節される。
【０２３１】
顆粒球−単球前駆体は、単球、マクロファージおよび好中球に分化する。このような分化は、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−８によって調節される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。このプロセスは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５によって調節される。
【０２３２】
肥満細胞および好塩基球への好塩基球前駆体の分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−９によって調節される。巨核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＩＬ−６に応答して血小板を産生する。赤血球前駆体細胞は、ＥＰＯに応答して赤血球に分化する。
【０２３３】
従って、ＣＤ３結合剤による活性化の間に、Ｔ細胞はまた、マイトジェン（例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン）と接触され得る。特に好ましい実施形態において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で、Ｔ細胞の集団に添加される。ＣＤ−３結合剤での活性化は、２〜４日間行われ得る。
【０２３４】
一旦適切に活性化されると、Ｔ細胞は、ベクターのＴ細胞へのトランスフェクションを可能にする条件下でＴ細胞を適切な遺伝子転移ベクターと接触させることによって、遺伝的に改変される。遺伝的改変は、Ｔ細胞集団の細胞密度が、約０．１×１０6と５×１０6との間、好ましくは約０．５×１０6と２×１０6との間である場合に行われる。多数の適切なウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子転移ベクターが、本明細書中での使用のために記載されている。
【０２３５】
形質導入後、形質導入した細胞は、公知の技術を使用して、形質導入されていない細胞から選択される。例えば、形質導入に使用される遺伝子転移ベクターが、細胞傷害性薬剤に対する耐性を付与する選択マーカーを含む場合、細胞は、適切な細胞傷害性薬剤と接触され得、それにより、形質導入されていない細胞が、形質導入された細胞から陰性に選択され得る。選択マーカーが細胞表面マーカーである場合、細胞は、特定の細胞表面マーカーに特異的な結合剤と接触され得、それにより形質導入された細胞は、集団から陽性に選択され得る。この選択工程はまた、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）技術を伴い得、例えば、ここでＦＡＣＳは、特定の表面マーカーを含む集団から細胞を選択するために使用される。またはこの選択工程は、標的細胞の捕捉および／またはバックグラウンドの除去についての回収可能な支持として磁性的に応答する粒子の使用を伴い得る。
【０２３６】
より詳細には、形質導入された細胞の陽性選択は、ＦＡＣＳセルソーター（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅTM  ＣＥＬＬ  Ｓｏｒｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して行われ、選択細胞表面マーカーを発現する、形質導入された細胞を選別および収集し得る。形質導入の後に、細胞は、特定の細胞表面マーカーに対して指向される蛍光標識化抗体分子で染色される。各細胞に結合した抗体の量は、細胞を含む液滴をセルソーターに通過させることによって測定され得る。染色された細胞を含む液滴に電磁的電荷を与えることによって、形質導入された細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、陽性に選択された細胞は、滅菌収集容器に収集される。これらの細胞選別手順は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅTM  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌに、第３−１１〜３−２８節および第１０−１〜１０−７節に対する特定の参照とともに、詳細に記載される。
【０２３７】
形質導入された細胞の陽性選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁性分離を使用することによって行われ得る。このような分離技術において、陽性に選択される細胞は、まず、特異的結合剤（例えば、細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬）と接触される。次いで、この細胞は、回収可能な粒子（例えば、磁性的に応答する粒子）と接触され、特異的結合剤（陽性細胞に結合した）を結合する試薬とカップリングされる。次いで、細胞結合剤−粒子複合体は、例えば、磁場を使用して、標識されていない細胞から物理的に分離され得る。磁性的に応答する粒子を使用した場合、標識された細胞は、磁場を使用して容器内に保持され得、一方、陰性細胞は取り除かれる。これらおよび類似の分離手順は、当業者に公知である。
【０２３８】
選択された形質導入された細胞におけるベクターの発現は、当業者に公知の多数のアッセイによって評価され得る。例えば、ウエスタンブロットまたはノーザン分析は、目的の挿入されたヌクレオチド配列の性質に依存して使用され得る。一旦、発現が、選択された合成発現カセットの存在について試験されると、それらは、末梢血流を介して患者に注入するために準備される。
【０２３９】
本発明は、原発性哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝的改変のためのキットを含む。キットは、代表的には、１つ以上の容器に含まれる少なくとも１つの選択マーカーをコードする遺伝子転移ベクターおよび少なくとも１つの合成発現カセット、補助的な試薬またはハードウェア、ならびにキットの使用のための説明書を含む。
【実施例】
【０２４０】
（実施例）
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は、例示の目的のためにのみ提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限することは意図されない。
【０２４１】
使用される数（例えば、量、温度など）に対する正確さを確実にするための試みがなされているが、いくつかの実験誤差および偏差は、もちろん可能であるべきである。
【０２４２】
（実施例１：合成ＧａｇおよびＥｎｖ発現カセットの生成）
（Ａ．ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−逆転写酵素およびＧａｇ−ポリメラーゼ核酸コード配列の改変）
Ｇａｇ（配列番号１）、Ｇａｇ−プロテアーゼ（配列番号２）、Ｇａｇ−ポリメラーゼ（配列番号３）、およびＧａｇ−逆転写酵素（配列番号７７）コード配列を、ＨＩＶ−１ＳＦ２株（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６８６）；４８４−４９２，１９８５；Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．ら、米国特許第５，１５６，９４９号（１９９２年１０月２０日発行）；Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．ら、米国特許第５，６８８，６８８号（１９９７年１１月１８日）から選択した。これらの配列を操作して、それらの遺伝子産物の発現を最大にした。
【０２４３】
第１に、ＨＩＶ−１コドン使用頻度パターンを、得られた核酸コード配列が高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用頻度に適合するように、改変した。このＨＩＶコドン使用頻度は、コドントリプレットのヌクレオチドＡまたはＴの高い含有量を反映する。ＨＩＶ−１コドン使用頻度の効果は、ＲＮＡにおける高いＡＵ含量をもたらすＤＮＡ配列における高いＡＴ含量およびｍＲＮＡの減少した翻訳能力および翻訳不能力である。比較において、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。Ｇａｇコード配列を、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドン使用頻度に適合可能であるように改変した。
【０２４４】
図１１は、不安定なＲＮＡに対する安定なｃＤＮＡについてのＡ−Ｔ含量のパーセントの比較を示す（比較ウインドウサイズ＝５０）。ヒトＩＦＮγ  ｍＲＮＡは、以下のことが知られている：（ｉ）不安定であること、（ｉｉ）短い半減期を有すること、および（ｉｉｉ）高いＡ−Ｕ含量を有すること。ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ）ｍＲＮＡは、（ｉ）安定なＲＮＡであること、および（ｉｉ）低いＡ−Ｕ含量を有すること、が知られている。図１１において、これらの２つの配列のＡ−Ｔ含量のパーセントを、ネイティブのＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇ  ｃＤＮＡのＡ−Ｔ含量のパーセントおよび本発明の合成Ｇａｇ  ｃＤＮＡ配列に対して比較する。図の上部の２つのパネルは、ＩＦＮγおよびネイティブのＧａｇについての配列の長さにわたって、Ａ−Ｔ含量のパーセントを示す。図の下部の２つのパネルは、ＧＡＰＤＨおよび合成Ｇａｇについての配列の長さにわたってＡ−Ｔ含量のパーセントを示す。本発明の支持において行われる実験は、合成Ｇａｇ配列が、ネイティブのＧａｇ配列よりも高いレベルのタンパク質を産生し得た（実施例を参照のこと）ことを示した。図１１におけるデータは、この増加した産生の１つの理由が、ネイティブのＧａｇコード配列に対応するｍＲＮＡに対して合成Ｇａｇコード配列に対応するｍＲＮＡの増加した安定性であり得ることを示唆する。
【０２４５】
第２に、Ｇａｇのコード配列およびＧａｇ−プロテアーゼコード配列内に位置する阻害性（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）が存在する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３，１９９７）。ＲＲＥは、二次ＲＮＡ構造であり、これは、ＨＩＶにコードされるＲｅｖタンパク質と相互作用して、ＩＮＳの発現ダウンレギュレーション効果を克服する。ＲＲＥおよびＲｅｖの転写後活性化機構についての要件を克服するために、そしてＧａｇポリペプチドの非依存性発現を増強するために、ＩＮＳを、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点変異を導入することによって不活化した。図１は、本来のＳＦ２配列、ＩＮＳ配列の位置、およびＩＮＳ配列がそれらの効果を減少するような改変を示す。
【０２４６】
Ｇａｇ−プロテアーゼ配列（野生型、配列番号２；合成、配列番号５、７８および７９）について、コドン使用頻度における変化は、−１のフレームシフトまでの領域に制限され、そしてＧａｇリーディングフレームの末端で再び開始した（図２；図２の小文字で示される領域は、未改変領域である）。さらに、Ｇａｇ−プロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に位置する阻害性（または不安定性）エレメント（ＩＮＳ）も同様に変化させた（図２に示した）。合成コード配列を、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ
Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）によって構築した。
【０２４７】
Ｇａｇ−ポリメラーゼ配列（野生型、配列番号３；合成、配列番号６）およびＧａｇ−逆転写酵素配列（配列番号８０〜８４）の改変は、フレームシフト領域を保存するためにＧａｇ−プロテアーゼについて記載されたのと類似の改変を含む。不活化部位の位置およびこの不活化部位を変更するための配列に対する変化を、ネイティブのＨＩＶ−１SF2 
Ｇａｇポリメラーゼ配列について図１２に示す。
【０２４８】
本発明の１実施形態において、Ｇａｇ−ポリメラーゼ配列の全長ポリメラーゼコード領域は、合成の最適化されたＧａｇ発現カセットによって発現されるウイルス様粒子についてのエピトープの数を増加させるために、合成Ｇａｇ配列内に含まれる。合成ＨＩＶ−１
Ｇａｇ−ポリメラーゼは、潜在的に有害な機能的酵素である逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）を（構造タンパク質およびプロテアーゼに加えて）発現するので、ＲＴおよびＩＮＴの機能を不活化するのに重要である。ＲＴおよびＩＮＴのリーディングフレームにおけるいくらかのインフレームでの欠失が、それらのＲＴおよびＩＮＴの活性に関して触媒非機能性酵素を達成するために生成され得る。
【０２４９】
【数１】
2011172593.tif 000002
さらに、選択されたＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープが、ＲＴコード配列およびＩＮＴコード配列の欠失内のＧａｇ−ポリメラーゼ構築物に付加されて、ＲＴおよびＩＮＴの機能的改変によって欠失された任意のエピトープを置換しそして増強し得る。あるいは、ＲＴおよびＩＮＴから選択されたＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープを含む）は、合成Ｇａｇまたは合成ＧａｇＰｒｏｔカセット（上記）の発現によって形成される最小ＶＬＰに含まれ得る。（公知のＨＩＶ  Ｂ細胞エピトープおよびＨＩＶ  Ｔ細胞エピトープの説明については、ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＴＬ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ，１９８７−１９９７；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．を参照のこと）。
【０２５０】
得られた改変コード配列を、合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号４）、合成Ｇａｇ−プロテアーゼ発現カセット（配列番号５、７８および７９）、および合成Ｇａｇ−ポリメラーゼ発現カセット（配列番号６）として示す。逆転写酵素領域におけるコドンの改変を含む合成発現カセットを、配列番号８０〜８４に示す。選択された配列の整列を、図７に示す。共通領域（Ｇａｇ−共通；配列番号９）は、１位から１２６２位に及ぶ。
【０２５１】
ＧａｇおよびＧａｇ−プロテアーゼについての合成ＤＮＡフラグメントを、以下の発現ベクターにクローニングした：一過性発現アッセイおよびＤＮＡ免疫研究についてはｐＣＭＶＫｍ２（ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡ、続いてウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化シグナルに続いて以下に記載される合成配列についての挿入部位を含む−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ポリリンカー部位が、ｐＣＭＶ結合（図１４、１６４６〜１６９７位のポリリンカー）を生成するためにｐＣＭＶＫｍ２に挿入された点でｐＣＭＶ−結合ベクターとは異なる）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現については、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒ（図１３Ａ）およびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（図１３Ｂに示されるように、ｐＣＭＶＩＩＩとしてもまた公知）；ならびにバキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクターであるｐＡｃＣ１３（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２、１９９０によって記載されるｐＡｃＣ１２に由来した）。
【０２５２】
ベクターｐＣＭＶ結合についての制限地図を、図１４に示す。この図において、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ  ＩＥ  ＥＮＨ／ＰＲＯ）、ウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＧＨ  ｐＡ）、カナマイシン選択マーカー（ｋａｎ）、およびＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）を示す。ポリクローニング部位もまた、この図において、ＣＭＶプロモーター配列の下に示す。
【０２５３】
ベクターｐＥＳＮ２ｄｈｆｒについての制限地図を、図１３Ａに示す。この図において、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ  ｈＣＭＶＩＥ）、ウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＧＨｐＡ）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）、ネオマイシン選択マーカー（Ｎｅｏ）、ＳＶ４０ポリＡ（ＳＶ４０ｐＡ）、アデノウイルス２後期プロモーター（Ａｄ２ＶＬＰ）、およびマウスｄｈｆｒ遺伝子（ｍｕ  ｇｈｆｒ）を示す。ポリクローニング部位もまた、この図において、ＣＭＶプロモーター配列の下に示す。
【０２５４】
簡単には、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（ｐＣＭＶＩＩＩ）の構築は、以下のようであった。ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（リボソーム内部の進入部位）リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）よりＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）にＸｂａ−Ｎｃｏフラグメントとして挿入して、ｐＥＴ−ＥＭＣＶを得た。ｄｈｆｒ遺伝子を、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒからＰＣＲ増幅して、翻訳停止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を得、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを得た。次に、弱毒化したｎｅｏ遺伝子をｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)を得た。次いで、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺伝子の下流に挿入して、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)ＢＧＨｔを得た。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントをｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ(m2)ＢＧＨｔの開裂によって調製した。ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびイントロンＡをＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）からｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に移した。ｐＵＣ１９のベクター骨格をＮｄｅＩからＳａｐＩ部位まで欠失させた。上記のＤＨＦＲカセットを構築物に付加し、その結果、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをＣＭＶプロモーターに続けて配置して、最終構築物を産生した。ベクターはまた、ａｍｐr遺伝子およびＳ
Ｖ４０の複製起点を含んだ。
【０２５５】
合成発現カセットを含む選択されたｐＣＭＶＫｍ２ベクターを以下のように設計した：ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｒｏｔＭｏｄ．ＳＦ２およびｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｏｌＭｏｄ．ＳＦ２、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｒｏｔＭｏｄ．ＳＦ２．ＧＰ１（配列番号７８）およびｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇｐｒｏｔＭｏｄ．ＳＦ２．ＧＰ２（配列番号７９）。他の例示的なＧａｇコード発現カセットを、図において、および配列表として示す。
【０２５６】
（Ｂ．合成発現カセットのＨＩＶ−１  Ｇａｇ／Ｃ型肝炎コアキメラタンパク質核酸コード配列の産生の改変）
ＧａｇおよびＨＣＶコアコード配列の連結を促進するために、ＰＣＲ増幅を使用した。合成ｐ５５Ｇａｇ発現カセットを以下のプライマーとともにＰＣＲの鋳型として使用した：ＧＡＧ５（配列番号１１）およびＰ５５−ＳＡＬ３（配列番号１２）。ＰＣＲ増幅をＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕポリメラーゼを用いて、５５℃で２５サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰＣＲクリーンナップキットを使用して、ヌクレオチドおよびプライマーを含まないようにし、次いでＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩの消化に供した。ＨＣＶコアコード配列に対して、上に概要を示した条件を用いて、以下のプライマーをＨＣＶ鋳型とともに使用した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら、米国特許第５，７１４，５９６号、１９９８年２月３日発行；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら、米国特許第５，７１２，０８８号、１９９８年１月２７日発行；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ら、米国特許第５，６８３，８６４号、１９９７年１１月４日発行；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７２８，５２０号、１９９８年３月１７日発行；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７６６，８４５号、１９９８年６月１６日発行；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，６７０，１５２号、１９９７年９月２３日発行）：ＣＯＲＥＳＡＬ５（配列番号１３）および１７３ＣＯＲＥ（配列番号１４）。精製産物を、ＳａｌＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化した。消化されたＧａｇおよびＨＣＶコアＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化したｐＣＭＶＫｍ２ベクターに連結した。ＳａｌＩ部位でのＰＣＲ産物の連結は、ｐ５５Ｇａｇの最終アミノ酸の、ＨＣＶコアの第２のアミノ酸、セリンへの直接の融合を生じた。コアのアミノ酸１７３はセリンであり、そしてＴＡＧ終末コドンが直ぐに続く。融合クローンの配列を確認した。合成発現カセットを含むｐＣＭＶＫｍ２ベクターを、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄＨＣＶコアとして消化した。
【０２５７】
ｐ５５Ｇａｇ−コア１７３のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをまた、バキュロウイルスの発現のためにＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡｃＣ１３中にクローン化した。ウエスタンブロットにより発現を確認し、そしてショ糖勾配沈降、加えて電子顕微鏡検査を用いて粒子の形成を確認した。（野生型の代わりに）合成Ｇａｇ配列を含むことを除いて上記のクローンを産生するために、以下の工程を行った：ｐＣＭＶＫｍ２改変ｐ５５Ｇａｇを、ＭＳ６５（配列番号１５）プライマーおよびＭＳ６６（配列番号１６）プライマーとともにＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。増幅された領域は、合成Ｇａｇ配列のＣ末端のＢｓｐＨＩおよびＳａｌＩ部位に対応する。増幅産物を、ＢｓｐＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そしてＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＣＭＶ連結、加えてｐＣＭＶ−Ｋｍ−ｐ５５ｍｏｄＧａｇからのＳａｌ／ＢｓｐＨＩフラグメント（改変Ｇａｇのアミノ末端終点を表す）およびｐＣＭＶ−ｐ５５Ｇａｇ−コア１７３からのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントに連結した。その後、Ｔ４平滑末端化ＳａｌＩ部分／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡｃＣ４−ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩに連結し、ｐＡｃＣ４−Ｐ５５ＧａｇＭｏｄ−コア１７３を産生した（配列番号７に示される合成配列を含む）。
【０２５８】
（Ｃ．ＨＩＶ−１  ｐ５５  Ｇａｇの主要な相同性領域（ＭＨＲ）の定義）
ＨＩＶ−１  ｐ５５（Ｇａｇ）の主要な相同性領域（ＭＨＲ）は、Ｇａｇのｐ２４−ＣＡ配列中に位置する。それは、２０アミノ酸の保存されたストレッチ（配列番号１９）である。野生型ＨＩＶ−１SF2Ｇａｇタンパク質における位置は、アミノ酸２８６〜３０５
であり、そしてネイティブなＨＩＶ−１SF2Ｇａｇ  ＤＮＡ配列におけるヌクレオチド８
５６〜９１５の領域にかかる。合成Ｇａｇタンパク質における位置は、アミノ酸２８８〜３０７であり、そして合成Ｇａｇ  ＤＮＡ配列についてはヌクレオチド８６２〜９２１の領域にかかる。合成ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２におけるＭＨＲについてのヌクレオチド配列を、配列番号２０として示す。ＭＨＲのアミノ酸配列における変異または欠損は、粒子産生を激しく障害し得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３−９３１７、１９９８；Ｍａｍｍａｎｏ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（８）４９２７−４９３６、１９９４）。
【０２５９】
ＭＨＲヌクレオチド配列に対する同一性のパーセントは、例えばＭａｃＤＮＡｓｉｓプログラム（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、以下の例示的なパラメータを用いるＨｉｇｇｉｎｓアルゴリズムを使用して決定され得る：ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝５，ｎｏ．ｏｆ  ｔｏｐ  ｄｉａｇｏｎａｌｓ＝５，ｆｉｘｅｄ  ｇａｐ
ｐｅｎａｌｔｙ＝５，ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２，ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ＝５，およびｆｌｏａｔｉｎｇ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０。
【０２６０】
（Ｄ．合成Ｅｎｖ発現カセットの産生）
本発明のＥｎｖコード配列としては、以下のＨＩＶコードポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定はされない：ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０（例えば、ＨＩＶ−１SF2（「ＳＦ２」）のＥｎｖポリペプチドを記載
する米国特許第５，７９２，４５９号を参照のこと）。これらのポリペプチド間の関係を図１５に概要的に示す：（図面において、ポリペプチドを直線として示し、アミノ末端およびカルボキシ末端をｇｐ１６０の線上に示す；白抜きの丸は、オリゴマー形成ドメインを表す；白抜きの四角は、膜貫通架橋ドメイン（ＴＭ）を表す；そして「Ｃ」は、開裂部位の位置を表し、ｇｐ１４０．ｍｕｔにおいて「Ｘ」は、開裂部位が変異し、もはや開裂部位として機能しないことを示す）。ポリペプチドｇｐ１６０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１についてのコード配列を含む。ポリペプチドｇｐ４１は、オリゴマー形成ドメイン（ＯＤ）および膜貫通架橋ドメイン（ＴＭ）を含むいくつかのドメインから構成される。ネイティブなＥｎｖにおいて、オリゴマー形成ドメインは、３つのｇｐ４１ポリペプチドが三量体構造を形成するための非共有結合性の会合のために必要とされる：ｇｐ４１三量体（およびそれ自体）との非供給結合性の相互作用を介して、ｇｐ１２０ポリペプチドはまた、三量体構造に組織化される。開裂部位（単数または複数）は、およそｇｐ１２０についてのポリペプチド配列とｇｐ４１に対応するポリペプチド配列との間に存在する。この開裂部位は、この部位での開裂を妨げるために変異され得る。得られるｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１の膜貫通架橋ドメインが欠損しているｇｐ１６０の短縮された形態に対応する。このｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１部分中のオリゴマー形成ドメインの存在のおかげで単量体およびオリゴマー（すなわち、三量体）の形態の両方で存在し得る。開裂部位が開裂を妨げるために変異され、そしてｇｐ４１の膜貫通部分が欠失した状況において、得られるポリペプチド産物は、「変異された」ｇｐ１４０（例えば、ｇｐ１４０．ｍｕｔ）を示す。当業者に明らかなように、改変部位は、種々の方法で変異され得る。ＳＦ１６２開裂部位におけるネイティブなアミノ酸配列は：ＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ（配列番号２１）であり、ここでＫＡＫＲＲ（配列番号２２）は、「第２」部位と名づけられ、そしてＲＥＫＲ（配列番号２３）は、「第１」部位である。例示的な変異としては、以下の構築物が挙げられる：開裂部位領域においてアミノ酸配列ＡＰＴＫＡＩＳＳＶＶＱＳＥＫＳ（配列番号２４）をコードするｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ｍｏｄＳＦ１６２；開裂部位領域においてアミノ酸配列ＡＰＴＩＡＩＳＳＶＶＱＳＥＫＳ（配列番号２５）をコードするｇｐ１４０．ｍｕｔ８．ｍｏｄＳＦ１６２およびアミノ酸配列ＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＳ（配列番号２６）をコードするｇｐ１４０ｍｕｔ．ｍｏｄＳＦ１６２。変異は、下線で印される。ＵＳ４開裂部位におけるネイティブなアミノ酸配列は：ＡＰＴＱＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ（配列番号２７）であり、ここでＱＡＫＲＲ（配列番号２８）は、「第２」部位と名づけられ、そしてＲＥＫＲ（配列番号２３）「第１」部位である。例示的な変異としては、以下の構築物が挙げられる：開裂部位領域においてアミノ酸配列ＡＰＴＱＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＳ（配列番号２９）をコードするｇｐ１４０．ｍｕｔ７．ＵＳ４。変異は、下線で印される。
【０２６１】
（Ｅ．ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（エンベロープ）核酸コード配列の改変）
本発明の１つの実施形態において、野生型Ｅｎｖコード配列を、ＨＩＶ−１SF162（「
ＳＦ１６２」）株より選択した（Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ
８６：８５７５−８５７９）。これらのＳＦ１６２配列は、以下のようであった：ｇｐ１２０、配列番号３０（図１６）；ｇｐ１４０、配列番号３１（図１７）；およびｇｐ１６０、配列番号３２（図１８）。
【０２６２】
本発明の別の実施形態において、野生型Ｅｎｖコード配列を、ＨＩＶ−ＵＳ４株より選択した（Ｍａｓｃｏｌａら、（１９９４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６９：４８−５４）。これらのＵＳ４配列は、以下のようであった：ｇｐ１２０、配列番号５１（図３８）；ｇｐ１４０、配列番号５２（図３９）；およびｇｐ１６０、配列番号５３（図４０）。
【０２６３】
これらのＥｎｖコード配列を、これらの遺伝子産物の発現を最大化するために操作した。
【０２６４】
第１に、野生型コード配列領域は、１つ以上の以下の方法で改変した。１つの実施形態において、Ｅｎｖの超可変領域（特にＶ１および／またはＶ２）をコードする配列を欠失させる。他の実施形態において、変異をオリゴマーｇｐ１４０のｇｐ１２０モノマーへの酵素学的開裂をなくすためにＥｎｖ中の開裂部位をコードする配列に導入した。（例えば、Ｅａｒｌら、（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６４８−６５２；Ｅａｒｌら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３１−４１を参照のこと）。さらにまた別の実施形態において、超可変領域を欠失して、Ｎ−グリコシル化部位を除去し、そして／あるいは改変部位を変異した。
【０２６５】
第２に、ＨＩＶ−１のコドンの使用パターンを改変し、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子に見い出されるコドンの使用に適合した。ＨＩＶコドンの使用は、コドントリプレット中の高含量のヌクレオチドＡまたはＴを反映する。ＨＩＶ−１のコドンの使用の効果は、減少した翻訳能力およびｍＲＮＡの不安定性を生じるＤＮＡ配列中の高ＡＴ含量である。比較すると、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。Ｅｎｖコード配列を、高度に発現されたヒト遺伝子において見い出されるコドンの使用に適合するように改変した。
【０２６６】
図２２Ａ〜２２Ｈは、安定なＲＮＡ対不安定なＲＮＡのｃＤＮＡについてのＡ−Ｔ含量のパーセントの比較を示す（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ＝５０）。ヒトＩＦＮγ  ｍＲＮＡは、（ｉ）不安定であり、（ｉｉ）短い半減期を有し、そして（ｉｉｉ）高Ａ−Ｕ含量を有することが知られている。ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）ｍＲＮＡは、（ｉ）安定なＲＮＡであり、そして（ｉ）低Ａ−Ｕ含量を有することが知られている。図２２Ａ〜Ｈにおいて、これら２つの配列のＡ−Ｔ含量のパーセントは、（１）ネイティブなＨＩＶ−１  ＵＳ４  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０  ｃＤＮＡ、本発明の合成ＵＳ４  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０  ｃＤＮＡ配列（すなわち、改変されたコドンを有する）；および（２）ネイティブなＨＩＶ−１  ＳＦ１６２
Ｅｎｖ  ｇｐ１６０  ｃＤＮＡ、本発明の合成ＳＦ１６２  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０  ｃＤＮＡ配列（すなわち、改変されたコドンを有する）のＡ−Ｔ含量のパーセントと比較される。図２２Ａ〜Ｈは、ＩＦＮγ（図２２Ｃおよび２２Ｇ）；ネイティブなｇｐ１６０  Ｅｎｖ  ＵＳ４およびＳＦ１６２（それぞれ、図２２Ａおよび図２２Ｅ）；ＧＡＰＤＨ（図２２Ｄおよび２２Ｈ）；およびＵＳ４およびＳＦ１６２に対する合成ｇｐ１６０  Ｅｎｖ（図２２Ｂおよび２２Ｆ）に対する配列の長さにわたるＡ−Ｔ含量のパーセントを示す。本発明を支持して行われた実験は、合成Ｅｎｖ配列が、ネイティブなＥｎｖ配列よりも高レベルのタンパク質の産生が可能であることを示した（実施例を参照のこと）。図２２Ａ〜Ｈにおけるデータは、この上昇した産生に対する１つの理由が、ｍＲＮＡ（合成Ｅｎｖコード配列に対応する）対ｍＲＮＡ（ネイティブなＥｎｖコード配列に対応する）の安定性の増加であることを示唆する。
【０２６７】
本発明の合成コード配列を作製するために、遺伝子カセットを、目的の全体のコード配列を含むように設計した。合成遺伝子カセットを、遺伝子フラグメントを産生するためにオリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅によって構築した。プライマーを、サブクローニングのための便利な制限部位を提供するために選択した。次いで得られたフラグメントを、全体の所望の配列を作製するために連結し、次にそれを適切なベクターにクローン化した。最終の合成配列を（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ消化および分析によってスクリーニングし、（ｉｉ）所望の配列が得られたことを確認するためにＤＮＡ配列決定に供し、そして（ｉｉｉ）発現タンパク質の同一性および完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって確認した（実施例を参考のこと）。合成コード配列をＣｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．においてか、またはＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）によって構築した。
【０２６８】
例示的な改変されたコード配列が、表１Ａおよび１Ｂに、合成Ｅｎｖ発現カセットとして表される。以下の発現カセットは、（ｉ）固有の末端ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩクローニング部位を有し；（ｉｉ）最適な翻訳を促進するためにＫｏｚａｋ配列を含み；（ｉｉｉ）ｔＰＡシグナル配列（細胞膜に対してＥＮＶポリペプチドに方向付けするため、例えば、Ｃｈａｐｍａｎら、ｉｎｆｒａを参照のこと）；（ｉｖ）哺乳類の細胞における発現のために最適なオープンリーディングフレーム；および翻訳停止シグナルコドンを含む。
【０２６９】
【表１Ａ】
2011172593.tif 000003
【０２７０】
【表１Ｂ】
2011172593.tif 000004
上の表に示された配列のアラインメントは、図６６Ａおよび図６６Ｂに示される。
【０２７１】
共通領域（Ｅｖｎ−共通）は、野生型ＵＳ４配列に対して、ヌクレオチド位置１１８６〜ヌクレオチド位置１３２９（配列番号６９、図５６）、および野生型ＳＦ１６２配列に対して、ヌクレオチド位置１１１７〜位置１２６０（配列番号７９、図５７）に伸長する。これらの領域に対応する本発明の合成配列は、合成Ｅｖｎ  ＵＳ４共通領域に対して配列番号７１（図５８）として、および合成Ｅｎｖ  ＳＦ１６２共通領域に対して配列番号７２（図５９）として表される。
【０２７２】
この配列に対するパーセント同一性が、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索アルゴリズム（Ｔｉｍｅ  Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃｌｉｎｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＶ）を使用して決定され得、このアルゴリズムは、以下の例示的なパラメータを有する；重量マトリックス（ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ）＝ｎｕｃ４ｘ４ｈｂ；ギャップオープニングペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、レポーティング閾値（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１；アラインメント閾値（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝２０。
【０２７３】
本発明の異なる実施形態の種々の形態（例えば、構築物）が、組合せられ得る。
【０２７４】
（Ｆ．本発明の合成Ｅｎｖ発現カセットのクローニング）
Ｅｎｖポリペプチドをコードする合成ＤＮＡフラグメントが、典型的に、Ｇａｇ（例えば、ｐＣＭＶＫｍ２／ｐＣＭＶｌｉｎｋ（図４）、ｐＣＭＶ６ａ、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒ（図１３Ａ）、ｐＣＭＶＩＩＩ（図１３Ｂ；あるいは、ｐＣＭＶ−ＰＬ−Ｅ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏベクターとして表される））について、上記の真核生物の発現ベクターにクローニングされた。
【０２７５】
本発明の合成発現カセットを含むｐＣＭＶｌｉｎｋベクターについての例示的な命名は、以下の通りである：
【０２７６】
【数２】
2011172593.tif 000005
（Ｇ．合成ｔａｔ発現カセットの産生）
Ｔａｔコード配列はまた、本明細書の教示に従って改変された。変異体ＳＦ１６２由来のｔａｔをコードする野生型ヌクレオチド配列は、図７６（配列番号８５）に示される。対応する野生型アミノ酸配列は、図７７（配列番号８６）に示される。図８１（配列番号８９）は、ｔａｔタンパク質のアミノ末端をコードするヌクレオチド配列を示し、そしてシステイン−２２をコードするコドンに下線が引かれている。合成ｔａｔポリペプチドをコードする他の例示的な構築物が、図７８および７９に示される（配列番号８７および８８）。１つの実施形態（配列番号８８）において、位置２２のシステイン残基は、グリシンによって置き換えられている。Ｃａｐｕｔｏら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２３５は、この変異が、Ｔａｔのトランス活性化ドメインに影響することを示した。
【０２７７】
本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態が、組合わせられ得る。
【０２７８】
（Ｈ．ベクターの寄託）
以下に示され、本明細書中に記載される選択された例示的な構築物は、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ，９４６６２−８０９７）で寄託され、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に１９９９年１２月２７日に送られた。
【０２７９】
【表２７】
2011172593.tif 000006
（実施例２）
（合成Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＴａｔコード配列についての発現アッセイ）
（Ａ．ＧａｇおよびＧａｇプロテアーゼコード配列）
ＨＩＶ−１ＳＦ２野生型Ｇａｇ配列（配列番号１）およびＧａｇプロテアーゼ配列（配列番号２）を、合成Ｇａｇ配列（配列番号４）およびＧａｇプロテアーゼ配列（配列番号５、７８または７９）をクローン化したベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローン化した。
【０２８０】
ＨＩＶ−１ＳＦ２野生型Ｇａｇ配列および合成Ｇａｇ配列を保持する種々のベクターについての発現効率を以下のように評価した。いくつかの哺乳動物細胞株由来の細胞（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ；すべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９から得た）を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、５４５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中の２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトした。この細胞を、還元型（ｒｅｄｕｃｅｄ）血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で５時間インキュベートした。次いで、この培地を以下のような正常（ｎｏｒｍａｌ）培地で置き換えた：２９３細胞、ＩＭＤＭ、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ＲＤおよびＣＯＳ−７細胞、Ｄ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；およびＣＨＯ細胞、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。細胞を４８時間または６０時間のいずれかでインキュベートした。上清を収穫し、０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、必要に応じて−２０℃で保存した。
【０２８１】
上清を、ＨＩＶコア抗原に対して指向されたマウスモノクローナル抗体でコーティングされた９６ウェルプレートを使用して、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｐ２４アッセイ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、Ｆｌ、ＵＳ）を用いて評価した。ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原は、コーティングされたウェルに結合する。ＨＩＶに対するビオチニル化抗体は、結合ｐ２４抗原を認識する。結合ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼは、ビオチンと反応する。ペルオキシダーゼとＴＭＢ基質との反応から色が現れる。この反応は、４Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の添加によって終結する。色の強度は、サンプル中のＨＩＶｐ２４抗原の量に正比例する。
【０２８２】
これらの発現アッセイの結果は、表２Ａおよび２Ｂに提示される。表２Ａおよび２Ｂは、配列番号５の合成Ｇａｇプロテアーゼ発現カセットを使用して得られたデータを示す。同様な結果を、配列番号７８および７９のＧａｇプロテアーゼ発現カセットを使用して得た。
【０２８３】
【表２ａ】
2011172593.tif 000007
【０２８４】
【表２ｂ】
2011172593.tif 000008
これらのデータは、合成ＧａｇおよびＧａｇプロテアーゼ発現カセットが、種々の細胞株で発現された場合、ネイティブな（ＨＩＶ−１ＳＦ２野生型）配列に対して、それらのタンパク質産物の産生において劇的な増加を提供したことを示した。
【０２８５】
（Ｂ．Ｅｎｖコード配列）
ＨＩＶ−ＳＦ１６２（「ＳＦ１６２」）野生型Ｅｎｖ配列（配列番号１〜３）およびＨＩＶ−ＵＳ４（「ＵＳ４」）野生型Ｅｎｖ配列（配列番号２２〜２４）を、合成Ｅｎｖ配列がクローン化されるベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローン化した。
【０２８６】
ＳＦ１６２およびＵＳ４野生型配列および合成Ｅｎｖ配列を保持する種々のベクターについての発現効率を、細胞溶解物が４０μＬ溶解緩衝液（１．０％ＮＰ４０、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）中で調製し、−２０℃で凍結させ、そして捕獲ＥＬＩＳＡを以下のように実施した。
【０２８７】
捕獲ＥＬＩＳＡについて、硫酸アンモニウムＩｇＧ切断の、ｇｐ１２０ＳＦ２／ｅｎｖ２−３に対するヤギポリクローナル抗体の２５０ｎｇを使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｇ、ＮＹ）の各ウェルをコーティングした。ｇｐ１２０／ＳＦ２タンパク質（ＭＩＤ１６７）の連続希釈物を使用して、トランスフェクション上清および溶解物由来のＵＳ４またはＳＦ１６２  ｇｐ１２０タンパク質の発現を計算する定量曲線を設定した。サンプルを未希釈で、および必要に応じて連続的に２倍希釈でスクリーニングした。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０／ＳＦ２に対するヒトポリクローナル抗体を使用して、結合ｇｐ１２０エンベロープタンパク質を検出し、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ結合体を検出した。基質としてＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用し、そして反応を４Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の添加によって終結させた。この反応を、４５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を測定することによって定量した。色の強度は、サンプル中のＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原の量に正比例した。精製されたＳＦ２  ｇｐ１２０タンパク質を希釈し、そして標準として使用した。
【０２８８】
一過性発現アッセイの結果を、表３および４に提示する。表３は、目的のＥｎｖカセットを保持するｐＣＭＶＫｍ２ベクターを用いてトランスフェクトされた２９３細胞中での一過性発現を示す。表４は、目的のＥｎｖカセットを保持するｐＣＭＶＫｍ２ベクターを用いてトランスフェクトされたＲＤ細胞中で一過性発現を示す。
【０２８９】
【表３】
2011172593.tif 000009
【０２９０】
【表４】
2011172593.tif 000010
これらのデータは、合成Ｅｎｖおよび発現カセットが、種々の細胞株で発現された場合、ネイティブな（ＨＩＶ−１ＳＦ２野生型またはＵＳ４野生型）配列に対して、それらのタンパク質産物の産生において有意な増加を提供したことを示した。
【０２９１】
（Ｃ．ＣＨＯ細胞株Ｅｎｖ発現データ）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、製造業者の指示に従って、Ｍｉｒｕｓ
ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ポリアミントランスフェクション試薬（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）を使用して、合成ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ１４０のタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＥＳＮ２ｄｈｆｒまたはｐＣＭＶＩＩＩベクター骨格）を用いてトランスフェクトし、９６時間インキュベートした。９６時間後、培地を選択培地（２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いた特別なＦ１２）に代え、そして細胞を１：５に分割し、さらに４８時間インキュベートした。培地を、コロニーが形成を始めるまで５〜７日間毎に代え、コロニーが形成を始めた時にコロニーを摘み取り、９６ウェルプレートにプレートし、そしてｇｐ１２０  捕獲ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。陽性クローンを２４ウェルプレートに拡張し、上記のように、捕獲ＥＬＩＳＡによるＥｎｖタンパク質産生のために数時間スクリーニングした。２４ウェルプレート中でコンフルーエンシーを達した後に、陽性クローンをＴ２５フラスク（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に拡張した。これらを、コンフルーエンシーおよび陽性クローンがＴ７５フラスクに拡張された後に、数回スクリーニングした。
【０２９２】
陽性Ｔ７５クローンを、ＬＮ２中で凍結させ、最高の発現クローンを０〜５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）でいくつかの濃度で増幅させ、そして１００ｍｍ培養皿にプレートした。プレートをコロニー形成についてスクリーニングし、そしてすべての陽性クローン（ｃｌｏｓｅｄ）を再び上記のように拡張した。クローンをｇｐ１２０  捕獲ＥＬＩＳＡによって各工程において拡張し、増幅しそしてスクリーニングした。陽性クローンを各メトトキサレートレベルにおいて凍結させた。最高産生クローンを、より大きなバイオリアクターにスケールアップするために、低血清懸濁培養条件に拡張および適合させるために、灌流バイオリアクター（３Ｌ、１００Ｌ）中で増殖した。
【０２９３】
表５および６は、合成ＨＩＶ−ＵＳ４およびＳＦ１６２  Ｅｎｖポリペプチドをコードするカセット（例えば、変異切断部位、改変コドン利用および／または欠失された超可変領域）を保持するｐＣＭＶＩＩＩベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの捕獲ＥＬＩＳＡデータを示す。従って、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０モノマー性、およびｇｐ１４０−オリゴマー性）を発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株が、産生された。
【０２９４】
【表５】
2011172593.tif 000011
【０２９５】
【表６】
2011172593.tif 000012
上記に示された結果は、ＣＨＯ細胞内のＥｎｖポリペプチドの発現を提供する本発明の構築物の能力を実証する。ＣＨＯ細胞を使用するポリペプチドの産生は、以下を提供する：（ｉ）正しいグリコシル化パターンおよびタンパク質コンホメーション（ＭＡＢのパネルに結合することによって決定されるように）；（ｉｉ）ＣＤ４レセプター分子との正しい結合；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞夾雑物の非存在（例えば、昆虫ウイルスおよび／または細胞）；ならびに（ｉｖ）精製の容易性。
【０２９６】
（Ｄ．Ｔａｔコード配列）
ＨＩＶ−ＳＦ１６２（「ＳＦ１６２」）野生型Ｔａｔ（配列番号８５）配列を、合成Ｔａｔ配列をクローン化した（配列番号８７、８８および８９）ベクターと同様の特徴を有する発現ベクターにクローン化した。
【０２９７】
ＳＦ１６２野生型および合成Ｔａｔ配列を有する種々のベクターについての発現効率を、適切な抗ｔａｔ抗体を伴う捕捉ＥＬＩＳＡおよび／またはＣＨＯ細胞アッセイを使用して、ＧａｇおよびＥｎｖについて上記のように本質的に評価した。合成カセットよりコードされるポリペプチドの発現は、野生型に関して改善される。
【０２９８】
（実施例３）
（発現のウエスタンブロット分析）
（Ａ．ＧａｇおよびＧａｇプロテアーゼコード配列）
ヒト２９３細胞を、ネイティブまたは合成Ｇａｇ発現カセットを含むｐＣＭＶ６ａベースのベクターを用いて、実施例２に記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、６０時間、培養した。上清を記載されるように調製した。細胞溶解物を以下のように調製した。細胞を一旦、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて洗浄し、洗剤[０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中１％ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ
．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ｐＨ７．５]を用いて溶解し、そしてその溶解物を新し
いチューブに移した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（プレキャスト（ｐｒｅ−ｃａｓｔ）８−１６％；Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、２０μｌの上清または１２．５μｌの細胞溶解物とともにロードした。タンパク質標準もまた、ロードした（５μｌ、広範なサイズ範囲標準；ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。電気泳動を実施し、そしてタンパク質を、ＢｉｏＲａｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した（製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により推奨される転移緩衝液を使用）。ここで、この転移を、１００ボルトで９０分間、実施した。この膜を、ＨＩＶ−１−陽性ヒト患者血清に曝露し、そしてＯ−フェニレンジアミン二塩化水素化物（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ）を使用して免疫染色した。
【０２９９】
免疫ブロット分析の結果は、合成Ｇａｇ発現カセットを含む細胞が、期待されたｐ５５タンパク質を、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、より高い濃度で産生したことを示した。Ｇａｇ  ｐ５５タンパク質を、細胞溶解物および上清の両方で観察した。産生レベルは、本発明の合成Ｇａｇ発現カセットでトランスフェクトした細胞についての細胞上清において、有意に高かった。本発明の支持において実施された実験は、合成Ｇａｇ−プロット発現カセットを含む細胞が、予期されたＧａｇ−プロットタンパク質を、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、比較的より高い濃度で産生したことを示唆する。
【０３００】
さらに、トランスフェクトされた２９３細胞に由来する上清を、ショ糖勾配に対して分別した。上清のアリコートを、２０％（ｗｔ／ｗｔ）ショ糖溶液が下に敷かれたＰｏｌｙｃｌｅａｒTM超遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）に移し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターにおいて２８，０００ｒｐｍで２時間、遠心分離に供した。生じたペレットをＰＢＳ中に懸濁し、そして２０〜６０％（ｗｔ／ｗｔ）のショ糖勾配上に積み重ね、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ｔｉローターにおいて４０，０００ｒｐｍで２時間、遠心分離に供した。
【０３０１】
次いでこの勾配を、およそ１０×１ｍｌのアリコートに分別した（この勾配の頂部で開始し、２０％で終了）。サンプルをフラクション１〜９から選び、８〜１６％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。フラクション番号４（ピークフラクション）は、Ｇａｇタンパク質ＶＬＰの予期された密度と一致する。２９３／合成Ｇａｇ細胞に由来する上清は、２９３／ネイティブＧａｇ細胞に由来する上清よりもかなり強いｐ５５バンドを与え、そして予期されたように、いずれかの上清において最も高い濃度のｐ５５を、フラクション４において見出した。
【０３０２】
これらの結果は、合成Ｇａｇ発現カセットは、ネイティブなＧａｇコード配列に関して、ｐ５５タンパク質およびＶＬＰの両方のすぐれた産生を提供することを実証する。
【０３０３】
（Ｂ．Ｅｎｖコード配列）
ヒト２９３細胞を、実施例２に記載されるように、ネイティブまたは合成Ｅｎｖ発現カセットを含む、ｐＣＭＶＫｍ２ベースのベクター；ｐＣＭＶｌｉｎｋベースのベクター；ｐＣＭＶＩＩベースのベクターまたはｐＥＳＮ２ベースのベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を４８時間または６０時間培養した。細胞溶解物および上清を記載（実施例２）されるように調製した。手短には、細胞を一旦、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて洗浄して、洗剤[０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中１％ＮＰ４０
（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ｐＨ７．５]を
用いて溶解し、そしてその溶解物を新しいチューブに移した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（プレキャスト８−１６％；Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、２０μｌの上清または１２．５μｌの細胞溶解物とともにロードした。タンパク質分子量標準およびＨＩＶ  ＳＦ２  ｇｐ１２０陽性コントロールタンパク質（５μｌ、広範なサイズ範囲標準；ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）もまた、ロードした。電気泳動を実施し、そしてタンパク質を、ＢｉｏＲａｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した（製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により推奨される転移緩衝液を使用）。ここでこの転移を、１００ボルトで９０分間実施した。次いで、この膜を、ポリクローナルヤギ抗ｇｐ１２０ＳＦ２／ｅｎｖ２−３抗血清に対して反応させ、次いでブタ抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともにインキュベートした。結合を示すバンドを、膜上の褐色沈殿物を沈着させる過酸化水素を有するＤＡＢを添加することにより可視化した。
【０３０４】
免疫ブロット分析の結果は、合成Ｅｎｖ発現カセットを含む細胞は、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、より高い濃度で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおける移動度によって決定される推定分子量の予期されるＥｎｖ  ｇｐタンパク質を産生したことを示した。Ｅｎｖタンパク質を、細胞溶解物および上清の両方で観察した。産生レベルは、本発明の合成Ｅｎｖ発現カセットでトランスフェクトされた細胞についての細胞上清において有意に高かった。
【０３０５】
（Ｃ．Ｔａｔコード配列）
ヒト２９３細胞を、ネイティブまたは合成Ｔａｔ発現カセットを含む種々のベクターを用いて実施例２に記載されるようにトランスフェクトした。細胞を培養し、そして単離されたタンパク質を上記のように分析した。免疫ブロット分析は、合成Ｔａｔ発現カセットを含む細胞は、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、より高い濃度で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおける移動度によって決定される推定分子量の予期されるＴａｔタンパク質を産生したことを示す。
【０３０６】
（実施例４）
（Ｅｎｖポリペプチドの精製）
（Ａ．オリゴマーｇｐ１４０の精製）
オリゴマー  ｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０  ＵＳ４）の精製を、図６０において示されるように本質的に実施した。本明細書中に記載される実験について、ｏ−ｇｐ１４０とは、ネイティブ形態または改変化形態（例えば、発現配列を最適化された、欠失形態、変異形態、短縮形態など）のいずれかにおけるオリゴマーｇｐ１４０をいう。手短には、ＣＨＯ細胞培養から得られた濃縮された（３０〜５０×）上清を、ＤＮＡおよび他の血清タンパク質を除去するアニオン交換（ＤＥＡＥ）カラム上にロードした。溶出した物質を、血清タンパク質には結合するが、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質とは結合しない、セラミックヒドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡＰ）上にロードした。ＤＥＡＥおよびＣＨＡＰからのフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を、残留する任意の血清免疫グロブリンを除去するための予防工程として、プロテインＡカラム上にロードした。フロースルー中のＥｎｖタンパク質を、次いで、レクチングルバンザスナバリス（ｌｅｃｔｉｎ  ｇｌｕｖａｎｔｈｕｓ  ｎａｖａｌｉｓ）（ＧＮＡ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎａｍｅ、ＣＡ）を使用して、捕捉した。ＧＮＡは、例えば、Ｅｎｖのようなマンノースリッチな炭水化物に対して高い親和性を有する。Ｅｎｖタンパク質を、次いで、ＧＮＡ基質とともに溶出させた。他の高度にグリコシル化されたタンパク質を除去するために、カチオン交換カラム（ＳＰ）を使用して、ｇｐ１４０／ｇｐ１２０を精製した。最終工程（ｏ−ｇｐ１４０からｇｐ１２０を分離する）において、ゲルろ過カラムを使用して、モノマーからオリゴマーを分離した。最終産物のサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）およびクロマトグラフィー分析は、このストラテジーが、オリゴマーｇｐ１４０の良好な単離へと導くことを示した。
【０３０７】
（Ｂ．ｇｐ１２０の精製）
ｇｐ１２０の精製を、他のＥｎｖタンパク質について以前に記載されるように、本質的に実施した。手短には、ＣＨＯ細胞培養から得られた濃縮された上清を、ＤＮＡおよび他の血清タンパク質を除去する、アニオン交換（ＤＥＡＥ）カラム上にロードした。溶出した物質を、血清タンパク質に結合するが、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質とは結合しない、セラミックヒドロキシアパタイトカラム（ＣＨＡＰ）上にロードした。ＣＨＡＰカラムに由来するフロースルーを、カチオン交換カラム（ＳＰ）上にロードし、ここでフロースルーを捨て、結合フラクションを、塩を用いて溶出させた。溶出したフラクションを、Ｓｕｐｒｏｓｅ１２／Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｔａｎｄｅｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上にロードし、これより精製されたｇｐ１２０を得た。最終産物のサイジングおよびクロマトグラフィー分析は、このストラテジーが、ｇｐ１２０タンパク質を良好に精製したことを示した。
【０３０８】
（実施例５）
（精製されたＥｎｖポリペプチドの分析）
（Ａ．ｏ−ｇｐ１４０の分析）
ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、その正しいコンホメーションにおいてＣＤ４だけに結合する。従って、上記のように産生され、そして精製されたｏ−ｇｐ１４０  ＵＳ４ポリペプチドのＣＤ４細胞に結合する能力を試験した。ｏ−ｇｐ１４０  ＵＳ４を、１５分間、ＦＩＴＣ標識ＣＤ４と共に室温にてインキュベートして、ＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣを使用するＢｉｏｓｉｌ  ２５０（ＢｉｏＲａｄ）サイズ排除カラム上にロードする。ＣＤ４−ＦＩＴＣは、最も長い溶出時間（２．６７分）を有し、次いで、ＣＤ４−ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０（２．１６７分）である。最も短い溶出時間（１．９分）を、ＣＤ４−ＦＩＴＣ−ｏ−ｇｐ１４０  ＵＳ４について観察し、このことは、予期されるように、ｏ−ｇｐ１４０  ＵＳ４は、ＣＤ４と結合し、カラムに対する溶出時間を減少させる大きな複合体を形成することを示唆する。従って、上記のように産生され、そして精製されたｏ−ｇｐ１４０  ＵＳ４は、正確なサイズおよびコンホメーションを有する。
【０３０９】
さらに、ＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０（上記のように精製された）をまた、ＣＤ４結合部位、ＣＤ４誘導部位、Ｖ３ループおよびオリゴマー特異的ｇｐ４１エピトープに対する公知のエピトープ特異性を有する種々のモノクローナル抗体と結合するその能力について試験した。ｏ−ｇｐ１４０は、これらの抗体と強く結合し、このことは、精製されたタンパク質が、その構造完全性を保持することを示唆する。
【０３１０】
（Ｂ．ｇｐ１２０の分析）
上記のように、ＣＤ４−ＦＩＴＣは、ＨＰＬＣカラムに対する減少した溶出時間によって実証されるように、ｇｐ１２０に結合する。従って、上記の方法により精製されたＵＳ４  ｇｐ１２０は、そのコンホメーション完全性を保持する。さらに、精製されたｇｐ１２０の特性を、ウエスタンブロットについてその完全性および同一性を調べることによって、ならびにタンパク質濃度、ｐＨ、伝導性、エンドトキシンレベル、バイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）などを調べることにより試験し得る。上記のように精製されたＵＳ４  ｇｐ１２０をまた、ＣＤ４結合部位、ＣＤ４誘導部位、Ｖ３ループおよびオリゴマー特異的ｇｐ４１エピトープに対する公知のエピトープ特異性を有する、種々のモノクローナル抗体と結合する能力について試験した。ｇｐ１２０に対するｍＡｂ結合のパターンは、精製されたタンパク質がその構造の完全性を保持すること、例えば、精製されたｇｐ１２０は、オリゴマー特異的ｇｐ４１エピトープを有するｍＡｂと結合しないことを示唆した（予期されるように）。
【０３１１】
（実施例６）
（ＶＬＰ産生の電子顕微鏡的評価）
トランスフェクションする前の日に、電子顕微鏡法のための細胞を、５０％〜７０％コンフルエンスの密度でプレートした。細胞を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（Ｐａｎｖｅｒａ）を使用して、１０μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトし、そして血清還元培地において５時間インキュベートした（実施例２を参照のこと）。次いで、培地を、通常の培地で置換し（実施例２を参照のこと）、そして細胞を１４時間（ＣＯＳ−７）または４０時間（ＣＨＯ）インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回、ＰＢＳで洗浄して、２％グルタルアルデヒドで固定した。電子顕微鏡法を、Ｐｒｏｆ．Ｔ．Ｓ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔ  Ｙｅｎ、Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって実施した。
【０３１２】
電子顕微鏡法を、透過電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  １０ｃ）を使用して実行した。細胞を、オスミウムで前染色し、そして酢酸ウランおよびクエン酸鉛で染色した。倍率は、１００，０００×であった。
【０３１３】
図３Ａおよび３Ｂは、合成Ｇａｇ発現カセット（配列番号５）またはＧａｇプロット発現カセット（配列番号７９）を有するｐＣＭＶＫＭ２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の顕微鏡写真を示す。この図において、予期されるサイズ（１００ｎｍ）の遊離かつ出芽している未成熟ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、Ｇａｇ発現カセットについて観察され（図３Ａ）、そして未成熟ＶＬＰおよび成熟ＶＬＰの両方が、Ｇａｇプロット発現カセットについて観察される（図３Ｂ）。同じベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、同じ発現パターンを有する。ＶＬＰはまた、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ−７細胞の細胞内に見出され得る。
【０３１４】
ネイティブＧａｇ発現カセットおよび合成Ｇａｇ発現カセットを、ヒト２９３細胞をトランスフェクトするために使用する場合、ＶＬＰ産生のそれらの連想されるレベルについて比較した。その比較を、細胞上清の密度勾配超遠心分離法および勾配フラクションのウエスタンブロット分析によって実施した。合成Ｇａｇ構築物を使用した場合に、ＶＬＰの産生において明らかな改善が存在した。
【０３１５】
（実施例７）
（バキュロウイルス系におけるウイルス様粒子の発現）
（Ａ．ネイティブＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇの発現）
ネイティブＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇバキュロウイルスのシャトルベクターを構築するために、プロトタイプＳＦ２  ＨＩＶ  ｐ５５プラスミド（ｐＴＭ１−Ｇａｇ）（Ｓｅｌｂｙ  Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１０）：７８２７−７８３１，１９９７）を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、１．５Ｋｂのフラグメントを抽出し、これを続いてｐＡｃＣ４（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５．１９８８）（ｐＡｃ４３６の誘導体）にサブクローニングした。２μｇのＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ  ｐＡｃＣ４シャトルベクターを、０．５μｇの線状化Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）野生型ウイルスＤＮＡと共に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞に同時トランスフェクトすることにより、組換えバキュロウイルスの作製を達成した（Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，Ａｙｒｅｓ  Ｍ．Ｄ．，およびＰｏｓｓｅｅ  Ｒ．Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１８：５６６７−５６７２，１９９０）。ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇを発現している組換えウイルスの単離を、標準的な技術（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，およびＶ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）に従って行なった。
【０３１６】
ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇの発現を、ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ組換えバキュロウイルスを用いて、感染多重度（ＭＯＩ）１０で感染させた、無血清培地で増殖されたＳｆ９細胞の５００ｍｌ懸濁培養物（Ｍｉａｏｒｅｌｌａ，Ｂ．，Ｄ．Ｉｎｌｏｗ，Ａ．Ｓｈａｕｇｅｒ，およびＤ．Ｈａｒａｎｏ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１５０６−１５１０，１９８８）を使用して達成した。感染の４８時間後、上清を遠心分離により分離し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。次いで、この上清のアリコートを、ＰｏｌｙｃｌｅａｒTM（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）超遠心分離管に移し、２０％（重量／重量）のスクロースを下地にして、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターを使用して２４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけた。
【０３１７】
生じたペレットを、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）に懸濁し、２０〜６０％（重量／重量）スクロース勾配上に重ね、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ｔｉローターを使用して４０，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけた。次いで、この勾配を勾配の上部（２０％スクロース）で始めて、約１２の０．７５ｍｌのアリコートに分けた。各フラクションのサンプルを８〜１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして生じたバンドをｃｏｍｍａｓｉｅ染色の後、視覚化した（図４）。さらなるアリコートを屈折率分析にかけた。
【０３１８】
図４に示される結果は、ｐ５５  Ｇａｇウイルス様粒子が、約１．１７ｇ／ｍｌにピークを有するスクロース密度１．１５〜１．１９ｇ／ｍｌの範囲に、バンド形成するということを示した。このピークのフラクションをプールし、そして第２の２０％スクロースペレット化により濃縮した。生じたペレットを、１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（上記）に懸濁した。Ｂｉｃｉｍｃｈｒｏｍｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により見積もられた全タンパク質の収量は、１．６ｍｇであった。
【０３１９】
（Ｂ．合成ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇの発現）
合成ｐ５５  Ｇａｇ配列を含むバキュロウイルスシャトルベクターを、以下のように構築した。合成ＨＩＶ  ｐ５５発現カセット（実施例１）を、制限酵素ＳａｌＩを用いで消化し、続いてＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いてインキュベーションした。生じたフラグメントを、単離し（ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐTM，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、次いでＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼを用いて消化した。シャトルベクターｐＡｃＣ１３（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２、１９９０）を、ＥｃｏＩを用いる消化により線状化し、続いてＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いてインキュベーションし、次いで単離した（ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐTM）。線状化したベクターをＢａｍＨＩを用いて消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてアガロースゲルでのサイズフラグメンテーションにより単離した。単離された１．５ｋｂのフラグメントを、調製されたｐＡｃＣ１３ベクターと連結させた。生じたクローンを、ｐＡｃＣ１３−Ｍｏｄｉｆ．ｐ５５Ｇａｇと呼んだ。
【０３２０】
合成ＨＩＶ  ｐ５５  ＶＬＰのための発現条件は、ネイティブｐ５５  Ｇａｇの発現条件と、以下のように異なった：５００ｍｌの代りに１リットルの培養体積を使用した；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ５）（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，およびＮｅｒｍｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，９：２５−３０，１９９３）昆虫細胞を、Ｓｆ９昆虫細胞の代りに使用した；そして、１０のＭＯＩの代りに３のＭＯＩであった。本発明を支持して行なわれた実験は、ネイティブｐ５５クローンを有するＳｆ９昆虫細胞とＴｎ５昆虫細胞との間の発現レベルにおいて、明確な差がないということを示した。ＭＯＩについては、ネイティブｐ５５クローンでの経験が、１０のＭＯＩが、より低いＭＯＩよりもＶＬＰのより高い発現（約２倍）を生じるということを示唆した。
【０３２１】
合成ｐ５５  ＶＬＰに使用されたスクロースペレット化およびバンド形成方法は、以下の例外を除いて、ネイティブｐ５５  ＶＬＰに使用された方法（上記）に類似であった：ペレット化したＶＬＰを、１．０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液の代わりに、４ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し；そして単一勾配の代わりに、４つの２０〜６０％のスクロース勾配を使用した。また、高濃度のバンドＶＬＰに起因して、ペレット化によるさらなる濃縮は、必要なかった。４つの勾配全てからのピークフラクションを、ＰＢＳに対して簡単に透析した。バンドＶＬＰのおよその密度は、１．２３〜１．２８ｇ／ｍｌの範囲であった。ＢＣＡにより見積もられた全タンパク質の収量は、４６ｍｇであった。合成ｐ５５のスクロース勾配バンド形成の結果を、図５に示す。
【０３２２】
２つのバキュロウイルス発現カセットから得られたいくつかの調製物から精製されたＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇの全量の比較を、図６に要約した。ネイティブｐ５５からの平均収量は、培養物１リットルにつき３．１６ｍｇ（ｎ＝５、標準偏差（ｓｄ）±１．０７、範囲＝１．８〜４．８ｍｇ／Ｌ）であり、合成ｐ５５からの平均収量は、１０倍より多く、培養物１リットルにつき４４．５ｍｇ（ｎ＝２、ｓｄ＝±６．４）であった。
【０３２３】
より高い全タンパク質収量に加えて、合成ｐ５５発現Ｇａｇ由来の最終産物は、ネイティブｐ５５発現Ｇａｇ由来の最終産物よりも、一貫して少ない量の混入バキュロウイルスタンパク質を含んだ。この差異は、図４および図５の２つのクーマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色ゲルに示され得る。
【０３２４】
（Ｃ．ネイティブＧａｇコアおよび合成Ｇａｇコアの発現）
ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶコア１７３（配列番号８）の発現を、無血清培地中で増殖されたＳｆ９細胞の２．５リットルの懸濁培養物を使用して、達成した（Ｍｉａｏｒｅｌｌａ，Ｂ．，Ｄ．Ｉｎｌｏｗ，Ａ．Ｓｈａｕｇｅｒ，およびＤ．Ｈａｒａｎｏ．１９８８  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１５０６−１５１０）。この細胞をＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶコア１７３組換えバキュロウイルスを用いて感染させた。感染の４８時間後、上清を遠心分離により細胞から分離し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。次いで、上清のアリコートを、３０％（重量／重量）スクロースを含むＰｏｌｙｃｌｅａｒTM（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）超遠心分離管に移し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターおよび超遠心機で２４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけた。
【０３２５】
生じたペレットをＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に懸濁し、そして３０〜６０％（重量／重量）スクロース勾配上に重ね、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ｔｉローターおよび超遠心機で、４０，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけた。次いで、この勾配を勾配の上部（３０％）から始めて約１１×１．０ｍｌのアリコートに分画した。各フラクションを、８〜１６％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして生じたバンドを、クーマシー染色の後に視覚化した。
【０３２６】
アリコートのサブセットをまた、ＨＩＶ  ｐ２４（ＨＩＶ  ｐ５５のサブユニット）に特異的なモノクローナル抗体７６Ｃ．５ＥＧ（Ｓｔｅｉｍｅｒ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５０：２８３−２９０，１９８６）を使用してウエスタンブロット分析にかけた。スクロース勾配からのピークフラクションを、プールし、そして第２の２０％スクロースペレット化により濃縮した。生じたペレットを、１ｍｌの緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液）に懸濁して、そしてＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により見積もられた全タンパク質収量は、約１．０ｍｇであった。
【０３２７】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥからの結果を、図８に示し、そして抗ｐ２４ウエスタンブロット分析の結果を、図９に示す。あわせて考えると、これらの結果は、ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶコア１７３キメラＶＬＰが、ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ  ＶＬＰのスクロース密度と類似するスクロース密度でバンド形成するということ、および約７２，０００ｋｄの分子量に移動した可視タンパク質バンドが、ＨＩＶ  ｐ２４特異的モノクローナル抗体と反応性であるということを示す。約５５，０００ｋｄのさらなる免疫反応性バンドはまた、抗ｐ２４抗体と反応性であることが明らかになり、そしてこれは分解産物でありえる。
【０３２８】
上記の調製由来のアリコートを、ＨＣＶコア特異的抗体（抗ＣＤ２２ウサギ血清）との反応性について試験しなかったが、類似の調製物からの結果を図１０に示す。そしてこの結果は、主要なＨＣＶコア特異的反応性は、キメラタンパク質の推定分子量に一致する約７２，０００ｋｄの分子量に移動するということを示す。
【０３２９】
合成ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １７３（配列番号８）ＶＬＰの発現条件は、ネイティブｐ５５  Ｇａｇの発現条件とは異なり、以下のとおりである：２．５リットルの代わりに１リットルの培養容量を使用し、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｔｎ５）（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．およびＮｅｍｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ．１９９３  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，９：２５−３０）昆虫細胞を、Ｓｆ９昆虫細胞の代わりに使用し、そしてＭＯＩを、１０に代えて３にした。合成ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １７３  ＶＬＰについて用いた、スクロースペレット化およびバンド形成方法は、ネイティブＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １７３  ＶＬＰについて使用した方法と同様であった。しかし、以下の差異を含んだ：ペレット化したＶＬＰを、１．０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液の代わりに１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁し、単一の２０〜６０％のスクロース勾配を使用した。２つのバキュロウイルス発現カセットから得られた複数の調製物由来の精製ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １７３の全量の比較によって、合成ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ／ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １７３カセットを使用する発現の増加が存在することが示された。
【０３３０】
（Ｄ．ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇ  ＶＬＰの富化のための代替的方法）
培地からの精製に加えて、バキュロウイルスにおいて発現された（例えば、本発明の合成発現カセットを使用して）ｐ５５（Ｇａｇタンパク質）もまた、感染された昆虫細胞からウイルス様粒子として精製し得る。例えば、感染の４８時間後、培地および細胞ペレットを遠心分離によって分離し、そして細胞ペレットを、以後の使用まで−７０℃で保存する。処理時に、細胞ペレットを、５容量の低張性の溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））中に懸濁する。必要な場合、次いで、細胞溶解を完全にするために、細胞を８〜１０回ダンス（ｄｏｕｎｃｅ）する。
【０３３１】
次いで、この溶解物を、約１００〜１５００×ｇで２０分間遠心分離する。この上清を、ＵｌｔｒａＣｌｅａｒTM管内にデカントし、２０％（ｗ／ｗ）スクロースで重層し、そしてＳＷ２８バケット中で、２４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離する。得られたペレットを、Ｔｒｉｓ緩衝液（０．１％ＩＧＥＰＡＬ界面活性剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および２５０ユニット／ｍｌのベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を含む、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））中に懸濁し、そして少なくとも３０分間、４℃でインキュベートする。続いて、この懸濁液を、２０〜６０％スクロース勾配に重層し、ＳＷ４１ｔｉローターを使用して、４０，０００ｒｐｍで２０〜２４時間スピンする。
【０３３２】
超遠心分離後、このスクロース勾配を分画し、そしてアリコートを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で泳動して、ピーク画分を同定する。このピーク画分を、ＰＢＳに対して透析し、そしてタンパク質含量を測定する。逆染色した電子顕微鏡写真は、代表的に、出芽ＶＬＰよりも幾分小さい直径（８０〜１２０ｎｍ）の非エンベロープＶＬＰを示す。この様式で調製されたＨＩＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰはまた、マウスにおいてＧａｇ特異的ＣＴＬ応答を生成し得る。
【０３３３】
（実施例８）
（合成Ｇａｇ発現カセットのインビボ免疫原性）
（Ａ．免疫）
合成Ｇａｇ発現カセットの可能な改善された免疫原性を評価するために、マウス研究を実施した。合成Ｇａｇ発現カセットを保有するプラスミドＤＮＡ、ｐＣＭＶＫＭ２を、１００μｌの全量中で以下の最終濃度に希釈した：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇおよび０．０２μｇ。この希釈されたＤＮＡの潜在的な負の希釈効果を克服するために、各サンプル中の全ＤＮＡ濃度を、ベクター（ｐＣＭＶＫＭ２）単独を使用して２０μｇに増加させた。コントロールとして、ネイティブＧａｇ発現カセットのプラスミドＤＮＡを、同じ様式で操作した。４つのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の１２の群を、表７のスケジュールに従って、筋肉内で免疫した（５０μｌ／脚での、前脛骨への筋肉内注射）。
【０３３４】
【表７】
2011172593.tif 000013
群１〜４を、０週目（免疫前）、４週目、６週目、８週目および１２週目で採血した。群５〜１２を、０週目（免疫前）および４週目に採血した。
【０３３５】
（Ｂ．体液性免疫応答）
体液性免疫応答を、免疫後０週間および４週間（群５〜１２）、および、さらにそれぞれ、免疫後６週間および８週間、第２の免疫後２週間および４週間（群１〜４）で、マウス血清の抗ＨＩＶ  Ｇａｇ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）によってチェックした。
【０３３６】
この血清の抗体力価を、抗Ｇａｇ抗体ＥＬＩＳＡによって決定した。手短に言うと、免疫したマウス由来の血清を、ＨＩＶ  ｐ５５  Ｇａｇタンパク質に対する抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１ウェルあたり０．２μｇのＨＩＶ−１SF2  ｐ２４−Ｇａｇタンパク質で一晩コートし、そして４回洗浄し；続い
て、ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希釈マウス血清を添加した。血清を、１／２５希釈で、およびその後の連続的な３倍希釈によって試験した。マイクロタイタープレートを４回洗浄し、そして二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と共にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そして１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を、１ウェルあたりに添加した。各ウェルの吸光度を、１５分後に測定した。報告された力価は、最大の１／２（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ）の吸光度（Ｏ．Ｄ．）を与える血清の希釈度の逆数である。ＥＬＩＳＡの結果を、表８に示す。
【０３３７】
【表８】
2011172593.tif 000014
プラスミドＤＮＡでのマウス免疫の結果は、これらの合成発現カセットが、ネイティブの発現カセットと比較して、免疫原性の明らかな改善を提供することを示す。また、第２の追加免疫は、２週間後の二次的な免疫応答を誘導した（群１〜３）。
【０３３８】
（Ｃ．細胞性免疫応答）
特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度を、ペプチドをパルス（ｐｕｌｓｅ）したＢａｌｂ／ｃマウスＣＤ４細胞の標準的なクロム放出アッセイによって評価した。Ｇａｇ発現ワクシニアウイルスを感染させたＣＤ８細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｖｖＧａｇ）。手短に言うと、脾臓細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を上記のように免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（表８）から得て、これを、培養し、再刺激し、そして記載（Ｄｏｅ，Ｂ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ＡＩＤＳ  １０（７）：７９３−７９４，１９９６）のように、Ｇａｇペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬ活性についてアッセイした。使用したＨＩＶ−１SF2  Ｇａｇペプチドは、ｐ７ｇ（配列番号１０）であ
った。細胞傷害性活性を、標準的な51Ｃｒ放出アッセイにおいて測定した。標的（Ｔ）細胞を、エフェクター（Ｅ）細胞と共に、種々のＥ：Ｔ比で４時間培養し、二連のウェルから得られた平均ｃｐｍを使用して、特異的な51Ｃｒ放出の割合を計算した。結果を表９に示す。
【０３３９】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を、ＨＩＶ  Ｇａｇ  ＤＮＡで免疫したマウスから回収した脾細胞において測定した（エフェクターカラム（表９）を免疫スケジュール（表８）に対して比較する）。Ｇａｇ  ＤＮＡで免疫した動物由来のエフェクター細胞は、Ｇａｇ  ｐ７ｇペプチドをパルスしたＳＶ−ＢＡＬＢ（ＭＨＣ適合）標的細胞の特異的溶解を示し、これは、ＣＴＬ応答を示す。ペプチドをパルスし、そしてＭＨＣ非適合マウス株（ＭＣ５７）から誘導された標的細胞は、溶解されなかった（表９；ＭＣ／ｐ７ｇ）。
【０３４０】
【表９】
2011172593.tif 000015
このＣＴＬアッセイの結果は、ＤＮＡ免疫による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導についての、合成Ｇａｇ発現カセットの能力の増加を示す。
【０３４１】
（実施例９）
（Ｅｎｖポリペプチドでのインビボ免疫）
（Ａ．Ｒａｓ−３ｃアジュバント系におけるＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０の免疫原性研究）
上記のように精製したＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０で免疫したウサギを使用して、研究を行った。また、ＵＳ４  ｇｐ１２０、ＳＦ１６２  ｏ−ｇｐ１４０およびＳＦ１６２  ｇｐ１２０の免疫原性を決定するために、動物において研究が行われている。
【０３４２】
２匹のウサギ（＃１および＃２）を、２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ，Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＴＭ）からなる群由来の１以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ−３ｃ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）中の、５０μｇのＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０で、０週目、４週目、１２週目および２４週目に、筋肉内で免疫した。本明細書中に記載される各実験において、ｏ−ｇｐ１４０は、ネイティブ、変異型および／または改変型であり得る。ＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０タンパク質に対する抗体応答は、ＥＬＩＳＡによって測定される。結果を、表１０に示す。
【０３４３】
【表１０】
2011172593.tif 000016
ＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０タンパク質に対する抗体のアビディティを、漸増濃度のアンモニウムイソチオシアネートでの連続的洗浄を使用する、類似のＥＬＩＳＡ形式で測定した。結果を、表１１に示す。
【０３４４】
【表１１】
2011172593.tif 000017
これらの結果は、ＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０が高度に免疫原性であり、そして１回または２回のみの免疫後に実質的に抗体応答を誘導し得ることを示す。
【０３４５】
（Ｂ．ＭＦ−５９ベースのアジュバントにおけるＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０の免疫原性）
４匹のウサギの群を、３つの異なるＭＦ５９ベースのアジュバント（ＭＦ５９は、国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７に記載され、そして代表的に、５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５を含む）中の、種々の用量のＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０タンパク質で、０週目、４週目、１２週目および２４週目に、筋肉内で免疫した。ＱＨＣは、クイル（ｑｕｉｌｌ）ベースのアジュバント（Ｉｓｃｏｔｅｋ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。結果を、表１２に示す。
【０３４６】
【表１２】
2011172593.tif 000018
従って、アジュバント化された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ｏ−ｇｐ１４０は、抗原特異的抗体を生成した。さらに、これらの抗体は、経時的にアビディティが増加されることが示された。
【０３４７】
（Ｃ．中和抗体）
３回目の免疫後の中和抗体を、Ｔ細胞株適応ウイルス（ＴＣＬＡ）アッセイでＨＩＶ−１  ＳＦ２に対して、および標的細胞としてＣＣＲ５＋  ＣＥＭｘ１７４  ＬＴＲ−ＧＦＰレポーター細胞株、５．２５（Ｎ．Ｌａｎｄａｕ、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡにより提供される）を使用して、ＰＢＭＣ−増殖ＨＩＶ−１改変体ＳＦ２、ＳＦ１６２および１１９に対して測定した。結果を、表１３において示す。
（表１３）ｏ−ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４タンパク質を用いて免疫されたウサギにおける中和抗体応答
【０３４８】
【表１３】
2011172593.tif 000019
*ＴＣＬＡ中和抗体の力価（５０％阻害）。
**決定されない。
#採血前の任意の検出可能な非特異的阻害を差し引いた、１：１０希釈の血清における％
阻害。
【０３４９】
ウサギにおける上記の研究は、ＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０タンパク質は、非常に免疫原性であることを示す。アジュバントと共に投与する場合、このタンパク質は、１回だけまたは２回の免疫後に実質的な抗体応答を誘導し得た。さらに、補強された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ｏ−ｇｐ１４０タンパク質は、連続する免疫後のアビディティを増加する抗原特異的抗体を生成し得、そしてＴ細胞株適応ＨＩＶ−１に対する活性を実質的に中和にし得た。中和活性はまた、ＰＢＭＣ−増殖初期ＨＩＶ株に対して観察され、ＣＣＲ５コレセプター（Ｒ５）−利用単離物（ＳＦ１６２および１１９）を中和する困難を含む。
【０３５０】
（実施例１０）
（合成Ｅｎｖ発現カセットのインビボでの免疫原性）
（Ａ．一般的な免疫方法）
合成Ｅｎｖ発現カセットの免疫原性を評価するため、モルモット、ウサギ、マウス、アカゲザルおよびヒヒを使用した研究を実施した。この研究を、以下のように構築した：ＤＮＡ免疫単独（１回または複数回）；ＤＮＡ免疫に続き、タンパク質免疫（ブースト）；ＤＮＡ免疫に続き、シンドビス粒子免疫；シンドビス
粒子単独による免疫。
【０３５１】
（Ｂ．体液性免疫応答）
体液性免疫応答を、免疫後の種々の時間に、抗ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗体ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）により、免役された動物由来の血清標本において調査した。血清の抗体力価を、上記のように抗Ｅｎｖ抗体ＥＬＩＳＡにより決定した。簡潔には、免疫された動物由来の血清を、ＨＩＶ  ｇｐ１２０またはｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質に対する抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェルを、選択されたＥｎｖタンパク質で一晩コートし、そして４回洗浄し；後に、ブロッキングを、ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、２時間行った。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希釈されたマウス血清を添加した。血清を、１／２５希釈液で、およびその後連続的な３倍希釈により試験した。マイクロタイタープレートを、４回洗浄し、そして二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共にインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、そして１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を、１つのウェルあたり添加した。各々のウェルの吸光度を、１５分後に測定した。最大値の半分である吸光度（Ｏ．Ｄ．）を与える血清の希釈度の逆数として、力価を代表的に報告する。
【０３５２】
（実施例１１）
（合成Ｇａｇ発現カセットを使用したヒヒのＤＮＡ免疫）
（Ａ．ヒヒ）
４頭のヒヒを、１ｍｇのｐＣＭＶＫＭ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２プラスミドＤＮＡ（実施例１）を用いて、四頭の両側に筋内で３回免疫した（０週、４週および８週）。この動物を、各々の免疫後２週間飼育し、そしてｐ２４抗体ＥＬＩＳＡを、単離された血漿を用いて実施した。ＥＬＩＳＡを、２次抗体結合体が、１：５００の希釈度で使用される抗ヒトＩｇＧ、ｇ鎖特異的、ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＤ６３１７８）であることを除き、実施例５に記載されるように本質的に実施した。５０μｇ／ｍｌの酵母抽出物を、ヒヒ中の既存の酵母抗体による非特異的バックグラウンドを減少させるため、血漿サンプルおよび抗体結合体の希釈液に添加した。この抗体の力価の結果を、表１４に示す。
（表１４）
【０３５３】
【表１４】
2011172593.tif 000020
aｗｐｉ＝免疫後の週
b相乗平均抗体の力価
表１４において、採血前の（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）データを、免疫番号０として与え；最初の免疫後２週間で採取された血液についてのデータを、免疫番号１として与え；２回目の免疫後２週間で採取された血液についてのデータを、免疫番号２として与え；そして３回目の免疫後２週間で採取された血液についてのデータを、免疫番号３として与える。
【０３５４】
さらに、ｐ２４抗原に対するリンパ増殖応答もまた、４回目の免疫後２週間（１４週）で、ヒヒ２２１およびヒヒ２２２において観察し、そしてＶＬＰでのブースト後（４４週および７６週）に実質的に増強した。このような増殖の結果は、Ｔヘルパー細胞の機能の誘導を示している。
【０３５５】
（Ｂ．アカゲザル）
マウスおよびヒヒの研究において観察されるコドン改変ｇａｇ発現プラスミドの改善された能力を、アカゲザルにおいて確認した。４頭のアカゲザルのうち４頭は、２回または３回の１ｍｇの用量の改変ｇａｇプラスミドの投与後、検出可能なＧａｇ−特異的ＣＴＬを有した。対照的に、以前の研究で、野生型ＨＩＶ−１SF2Ｇａｇをコードする１ｍｇ用
量のプラスミドＤＮＡを与えられた４頭のヒヒのうちの１頭のみしか、強いＣＴＬ活性を示さず、この活性は、７回の免疫後まで明らかではなかった。改変されたｇａｇプラスミドの能力のさらなる証拠は、４頭のアカゲザルのうち２頭由来のＣＴＬが、３つの重複しないＧａｇペプチドプールと反応する観察であり、これは、３つもの異なるＧａｇペプチドが認識されることを示唆し、そしてＣＴＬ応答がポリクローナルであることを示す。さらなる定量化および特異性研究は、プラスミド免疫アカゲザルにおけるＧａｇに対するＴ細胞応答をさらに特徴化するために進行中である。改変されたｇａｇプラスミドを用いたアカゲザルのＤＮＡ免疫は、有意な免疫抗体応答を生じず、４頭の動物のうち２頭だけが低い力価でセロコンバートした。対照的に、同じ研究で、ｐ５５Ｇａｇタンパク質を用いて免疫された群のアカゲザルの大多数は、セロコンバートし、そして強いＧａｇ特異的抗体力価を有した。これらのデータは、プライム（ｐｒｉｍｅ）ブーストストラテジー（ＤＮＡ−プライムおよびタンパク質−ブースト）が、強いＣＴＬ応答および抗体応答の誘導について非常に期待できるものであり得ることを示唆する。
【０３５６】
つまり、これらの結果は、合成ＧａｇプラスミドＤＮＡが、非ヒト霊長類において免疫原性であることを実証する。野生型ＧａｇプラスミドＤＮＡを用いて同様の実験を行った場合には、このような抗ｐ２４抗体の誘導を、４回の免疫化後では観測しなかった。
【０３５７】
（実施例１２）
（Ｅｎｖ発現カセットおよびポリペプチドを使用した、動物のＤＮＡ免疫化およびタンパク質免疫化）
（Ａ．モルモット）
各々６匹のモルモットを含む群を、ｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ２、ｇｐ１４０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２またはＵＳ４由来Ｅｎｖの配列をコードするｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４をコードするプラスミドＤＮＡで、０、４および１２週間に筋肉内に免疫化した。続いてこの動物を、ＭＦ５９アジュバント中の一回の筋肉内用量のＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＵＳ４タンパク質で１８週間でブーストした。抗ｇｐ１２０  ＳＦ２抗体力価（幾何平均力価）を３回目のＤＮＡ免疫化の２週間後、およびタンパク質でのブーストの２週間後に測定した。結果を表１５に示す。
【０３５８】
【表１５】
2011172593.tif 000021
これらの結果は、免疫応答を生じるための合成構築物の有用性、ならびにＤＮＡ免疫化後の免疫応答を増強するためのタンパク質でのブーストを提供することの利点を実証する。
【０３５９】
（Ｂ．ウサギ）
ウサギを、Ｂｉｏｊｅｃｔニードレスシリンジを使用して、以下の合成ＳＦ１６２ＥｎｖポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡで、筋肉内および内皮に免疫化した。：ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２、ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２、ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＳＦ１６２、ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２、およびｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２。合成Ｅｎｖ発現カセットを保有する約１ｍｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ連結）を、ウサギを免疫化するために使用した。ウサギを、０、４および１２週間に、プラスミドＤＮＡで免疫化した。３回目の免疫化の２週間後、全ての構築物は試験動物において有意な抗体力価を有することが示された。さらに、Ｖ２領域の欠失を含む構築物で免疫化されたウサギは、一般的に、Ｖ２領域を依然として含む伴構築物で免疫化されたウサギと比較して同様の抗体力価を生じた。
【０３６０】
核酸免疫化後、初めの免疫化の２４週間に、ｏ−ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２（０．１ｍｇの精製タンパク質）でタンパク質のブーストを行う。結果を表１６に示す。
【０３６１】
【表１６】
2011172593.tif 000022
全ての構築物は、非常に免疫原性であり、そしてウサギにおける２回の免疫化後のみ、実質的な抗原結合抗体応答を生じる。
【０３６２】
（Ｃ．ヒヒ）
４匹のヒヒの群を０、４、８、１２、２８および４４週間で、異なる形態の合成ＵＳ４
ｇｐ１４０（以下の表を参照のこと）をコードする１ｍｇ用量のＤＮＡで筋肉内に免疫化した。この動物をまた、４４および７６週間で、アジュバントとしてＭＦ５９を使用して、ＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０タンパク質（ｇｐ１４０．ｍｕｔ．ｍｏｄＵＳ９４）で２回ブーストした。結果を表１７に示す。
【０３６３】
【表１７】
2011172593.tif 000023
表１７における結果は、霊長類（例えばヒヒ）における免疫応答を生じる合成構築物の有用性を実証する。さらに、全ての動物は、抗原（Ｅｎｖ抗原）特異的リンパ球増殖性応答の証拠を示した。
【０３６４】
（Ｄ．マカクアカゲザル）
二匹のマカクアカゲザル（Ｈ４４５およびＪ４０８と呼ばれる）を、０、４、８および２８週間に、筋肉内（ＩＭ）および皮内（ＩＤ）経路で、欠失したＶ２領域（ＳＦ１６２．ｇｐ１４０．ｄｅｌＶ２）を有するＳＦ１６２  ｇｐ１４０をコードする１ｍｇのＤＮＡで免疫化した。約１００μｇの、ＳＦ１６２．ｇｐ１４０ｍｕｔ．ｄｅｌＶ２構築物によりコードされるタンパク質をまた、２８週間に、ＩＭ送達によりＭＦ５９中で投与した。
【０３６５】
ＥＬＩＳＡ力価を図６１に示す。中和抗体活性を表１８および表１９に示す。中和抗体活性を、初期のリンパ球または「ＰＢＭＣに基づく」アッセイ中の、種々の初期のＨＩＶ−１単離物に対して決定した（以下の表を参照のこと）。さらに、各々の初期の単離物ためのこの表現型補レセプターの用法を記載する。表において見られ得るように、ＨＩＶ−１初期単離物（すなわち、ＳＦ１２８Ａ、９２ＵＳ６６０、９２ＨＴ５９３、９２ＵＳ６５７、９２ＵＳ７１４、９１ＵＳ０５６、および９１ＵＳ０５４）を含む試験された単離物ごとに、中和抗体を検出した。
【０３６６】
【表１８】
2011172593.tif 000024
【０３６７】
【表１９】
2011172593.tif 000025
リンパ球増殖活性（ＬＰＡ）をまた、これらの動物における抗原性刺激、次いで3Ｈ−
チミジン取り込みにより決定した。これを表２０に示す。実験１を、３回目のＤＮＡ免疫の１４週間後に行い、実験２を、４回目のＤＮＡ免疫の２週間後に、ＤＮＡおよびタンパク質を用いて行った。ｇｐ１２０ＴｈａｉＥ、ｇｐ１２０ＳＦ２およびＵＳ４  ｏ−ｇｐ１４０については、刺激指数（Ｓ．Ｉ．；抗原性刺激ＣＰＭ／バックグラウンドＣＰＭ）を計算するために、適切なバックグラウンド値を使用した。
【０３６８】
【表２０】
2011172593.tif 000026
表２０に示される結果により理解され得るように、ｏ−ｇｐ１４０．ＵＳ４抗原に対するリンパ球増殖応答はまた、両方の実験の時点で、４つの動物すべてにあった。このような増殖結果は、ヘルパーＴ細胞機能の誘導を示す。
【０３６９】
上記で示される結果は、合成ｇｐ１４０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２  ＤＮＡおよびタンパク質が、非ヒト霊長類において免疫原性であることを示す。
【０３７０】
（実施例１３）
（合成ＧａｇまたはＥｎｖ発現カセットを含む組換えシンドビスＲＮＡおよびＤＮＡのインビトロ発現）
（Ａ．合成Ｇａｇ発現カセット）
アルファウイルスベクターにおける合成Ｇａｇ発現カセットの発現効率を評価するために、合成Ｇａｇ発現カセットを、プラスミドＤＮＡに基づくシンドビスウイルスベクターおよび組換えベクター粒子に基づくシンドビスウイルスベクターの両方にサブクローン化した。特に、シンドビスウイルスＲＮＡベクターレプリコンのインビトロ転写のためのｃＤＮＡベクター構築物（ｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）を、プラスミド直線化のためのＰｍｅＩ部位、および異種遺伝子の挿入のためのポリリンカーを含むように改変した。ポリリンカーを、部位ＸｈｏＩ、ＰｍｌＩ、ＡｐａＩ、ＮａｒＩ、ＸｂａＩ、およびＮｏｔＩ部位を含む２つのオリゴヌクレオチド（ＸＰＡＮＸＮＦ、配列番号１７、およびＸＰＡＮＸＮＲ、配列番号１８）を用いて作製した。
【０３７１】
プラスミドｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化してルシフェラーゼ遺伝子挿入物を除去し、クレノウおよびｄＮＴＰを用いて平滑末端化し、そしてＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した。オリゴヌクレオチドを互いにアニールし、そしてプラスミドに結合した。得られた構築物を、ＮｏｔＩおよびＳａｃｌで消化して最小シンドビス３’末端配列およびＡ40トラクトを除去し、そしてＰＫＳＳＩＮ１−ＢＶ（ＷＯ９７／３８０８７）由来の約０．４ｋｂｐのフラグメントと結合した。この０．４ｋｂｐのフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩを用いるｐＫＳＳＩＮ１−ＢＶの消化、ならびにサイズ分画後のアガロースゲルからの精製により得た。このフラグメントは、完全なシンドビスウイルス３’末端、Ａ40トラクトおよび直線化のためのＰｍｅＩ部位を含んだ。この新規なベクター構築物を、ＳＩＮＢＶＥと命名した。
【０３７２】
合成ＨＩＶ  Ｇａｇコード配列を、ＥｃｏＲＩを用いる消化、クレノウおよびｄＮＴＰを用いる平滑末端化、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製、ＳａｌＩを用いる消化、アガロースゲルでのサイズ分画、およびアガロースゲルからのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製によって、親プラスミドから得た。この合成Ｇａｇコードフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰｍｌＩで消化したＳＩＮＢＶＥベクターに結合した。得られたベクターを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製し、そしてＳＩＮＢＶＧａｇと命名した。ベクターＲＮＡレプリコンは、インビトロでＳＩＮＢＶＧａｇから転写され得（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）、そして細胞のトランスフェクトのために直接使用される。あるいは、レプリコンは、欠損ヘルパーＲＮＡとの共トランスフェクトか、または例えば、米国特許第５，８４３，７２３号および５，７８９，２４５号に記載されるようなアルファウイルスパッケージング細胞株を用いることにより、組換えベクター粒子にパッケージングされ得、次いで記載されるようにインビボで投与され得る。
【０３７３】
ＤＮＡに基づくシンドビスウイルスベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）を、ＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化してβガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を除去し、そしてアガロースゲルサイズ分画後にＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製した。ＨＩＶ  Ｇａｇ遺伝子を、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩを用いるＳＩＮＢＶＧａｇの消化、アガロースゲルサイズ分画後のＧａｇ含有フラグメントのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製、ならびに結合により、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌに挿入した。得られた構築物をｐＤＳＩＮ−Ｇａｇと命名し、これはインビボでの投与のために直接使用され得るか、または本明細書中に記載される任意の方法を用いて処方され得る。
【０３７４】
ＢＨＫ細胞および２９３細胞を、組換えシンドビスベクターＲＮＡおよび組換えシンドビスベクターＤＮＡでそれぞれトランスフェクトした。上清および細胞溶解物を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｐ２４捕獲ＥＬＩＳＡを用いて試験した（実施例２）。
【０３７５】
ＢＨＫ細胞を、エレクトロポレーションにより組換えシンドビスＲＮＡでトランスフェクトした。ｐ２４の発現（ｎｇ／ｍｌ）を表２１に示す。表中、ＳＩＮＧａｇ＃１および２は、２連の測定値を示し、そしてＳＩＮβｇａｌは、陰性コントロールを示す。上清および溶解物を、トランスフェクトの２４時間後に収集した。
【０３７６】
【表２１】
2011172593.tif 000027
２９３細胞を、ＬＴ−１（実施例２）を用いて組換えシンドビスＤＮＡでトランスフェクトした。合成ｐＣＭＶＫＭ２ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２を、陽性コントロールとして使用した。上清および溶解物を、トランスフェクトの４８時間後に収集した。ｐ２４の発現（ｎｇ／ｍｌ）を表２２に示す。
【０３７７】
【表２２】
2011172593.tif 000028
表２１および２２に示される結果は、Ｇａｇタンパク質が、合成Ｇａｇ発現カセット（ｐ５５Ｇａｇ．ｍｏｄ）を用いて、ＤＮＡに基づくシンドビスベクター系およびＲＮＡに基づくシンドビスベクター系の両方から、効率的に発現され得ることを示す。
【０３７８】
（Ｂ．合成Ｅｎｖ発現カセット）
アルファウイルスベクターにおける合成Ｅｎｖ発現カセットの発現効率を評価するために、合成Ｅｎｖ発現カセットを、Ｇａｇについて上に記載されるように、プラスミドＤＮＡに基づくシンドビスウイルスベクターおよび組換えベクター粒子に基づくシンドビスウイルスベクターの両方にサブクローン化した。
【０３７９】
合成ＨＩＶ  Ｅｎｖコード配列を、ＳａｌＩおよびＸｂａＩを用いる消化、アガロースゲルでのサイズ分画、ならびにアガロースゲルからのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製により、親プラスミドから得た。合成Ｅｎｖコードフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したＳＩＮＢＶＥベクターに結合した。得られたベクターを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製し、そしてＳＩＮＢＶＥｎｖと命名した。ベクターＲＮＡレプリコンは、インビトロでＳＩＮＢＶＥｎｖから転写され得（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）、そして細胞のトランスフェクトのために直接使用され得る。あるいは、レプリコンは、欠損ヘルパーＲＮＡとの共トランスフェクトによるか、またはアルファウイルスパッケージング細胞株を用いることにより、組換えベクター粒子にパッケージングされ得、そしてＧａｇについて上記に記載されるように投与され得る。
【０３８０】
ＤＮＡに基づくシンドビスウイルスベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）を、ＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化してβガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を除去し、そしてアガロースゲルサイズ分画後にＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製した。ＨＩＶ  Ｅｎｖ遺伝子を、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩを用いるＳＩＮＢＶＥｎｖの消化、アガロースゲルサイズ分画後のＥｎｖ含有フラグメントのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いる精製、ならびに結合により、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌに挿入した。得られた構築物をｐＤＳＩＮ−Ｅｎｖと命名し、これはインビボでの投与のために直接使用され得るか、または本明細書中に記載される任意の方法を用いて処方され得る。
【０３８１】
ＢＨＫ細胞および２９３細胞を、シンドビスベクターＲＮＡおよびシンドビスベクターＤＮＡのそれぞれを用いてトランスフェクトした。この上清および細胞溶解物を、捕獲ＥＬＩＳＡにより試験した。
【０３８２】
ＢＨＫ細胞を、組換えシンドビスＲＮＡを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。Ｅｎｖの発現（ｎｇ／ｍｌでの）を表２３に示す。表において、合成Ｅｎｖ発現カセットを含むシンドビスＲＮＡを示し、そしてβｇａｌは、陰性コントロールを示す。上清および溶解物をトランスフェクションから２４時間後に、収集した。
【０３８３】
【表２３】
2011172593.tif 000029
２９３細胞を、ＬＴ−１媒介トランスフェクション（ＰａｎＶｅｒａ）を使用して、本発明の合成発現カセットおよび陰性コントロールとしてのβｇａｌ配列を含む組換えシンドビスＤＮＡを用いてトランスフェクトした。上清および溶解物を、トランスフェクションから４８時間後に、収集した。Ｅｎｖの発現（ｎｇ／ｍｌでの）を表２４に示す。
【０３８４】
【表２４】
2011172593.tif 000030
表２３および表２４に示された結果は、Ｅｎｖタンパク質が、本発明の合成Ｅｎｖ発現カセットを用いるＤＮＡおよびＲＮＡに基づくシンドビスベクター系の両方から効果的に発現され得ることを実証した。
【０３８５】
（実施例１４）
（Ａ．Ｇａｇ含有ＤＮＡおよび／またはシンドビス粒子を用いるインビボでの免疫化）
ＣＢ６Ｆ１マウスを、表２５に示したようなＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２配列を含むプラスミドＤＮＡおよび／またはシンドビスベクターＲＮＡ含有粒子の各々を用いて、０週間目および４週間目に筋肉注射して免疫化した。動物を、第２の免疫化後の３週間目（第７週間目）にＳＦ２  Ｇａｇを発現する組換えワクチンでチャレンジした。脾臓を、ＣＴＬ活性に対する標準的51Ｃ放出アッセイについて、免疫化し、かつ５日後にチャレンジした動物から取り出した。表２５において示される値は、各群由来の３匹のマウスの脾臓からの結果を示す。表２５において囲まれた値は、ｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２  ＤＮＡおよび／またはシンドビスＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２ウイルス粒子を単独かまたは組み合わせてのいずれかで用いて、免疫化を受けたマウスの全ての群が、抗原特異的ＣＴＬ活性を示すことを示した。
【０３８６】
【表２５】
2011172593.tif 000031
a  ２０μｇ
b  １０7粒子
*  第２の免疫化後の３週間目（第７週）におけるＨＩＶ−１ＳＦ２  Ｇａｇを発現する
組換えワクシニアウイルスを用いるチャレンジ。脾臓を５週間後に取り出す。エキソビボＣＴＬアッセイを、標準的な51Ｃｒ放出アッセイにより実施した。示された値は、群あたりの３つのプールされたマウスの脾臓から得られる。
【０３８７】
（Ｂ．Ｅｎｖ含有ＤＮＡおよび／またはシンドビド粒子を用いるインビボでの免疫化）
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、プラスミドＤＮＡおよび／またはシンドビスイルスＲＮＡ含有粒子（それぞれｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４配列を含む）を用いて（以下の表に示されるように）０週間目および４週間目に筋肉注射により免疫化した。処置レジメンおよび抗体力価を表２６に示す。抗体力価を、プレートを被覆するｇｐ１２０  ＳＦ２タンパク質を用いるＥＬＩＳＡにより決定した。
【０３８８】
【表２６】
2011172593.tif 000032
上記に示されたデータから見られ得るように、全てのマウスは、概して、採血番号２により実質的な免疫学的応答を実証した。Ｅｎｖに関して、最良の結果は、（ｉ）第１の免疫のための５０μｇのｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４  ＤＮＡに続く、５０μｇのｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４  ＤＮＡを用いての第２の免疫か、または（ｉｉ）第１の免疫のための２５μｇのｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４  ＤＮＡに続く、１０7ｐｆｕのシンドビスを用いて
の第２の免疫のいずれかを用いて得られた。
【０３８９】
上記に示された結果は、本発明のＥｎｖタンパク質およびＧａｇタンパク質が、シンドビスベクター系（これは、合成Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０．ｍｏｄＵＳ４）発現カセットまたはＧａｇ発現カセットを含む）を用いて免疫応答を誘導するのに有効であることを実証する。
【０３９０】
（実施例１５）
（モノシストロニック構築物およびビシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構築物としてのＥｎｖおよびＧａｇの同時トランスフェクション）
（ｉ）野生型ＵＳ４  ＥｎｖポリペプチドおよびＳＦ１６２  Ｅｎｖポリペプチド、（ｉｉ）合成ＵＳ４  ＥｎｖポリペプチドおよびＳＦ１６２  Ｅｎｖポリペプチド（ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２、ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２、およびｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２）、ならびに（ｉｉｉ）ＳＦ２ｇａｇポリペプチド（すなわち、ＳＦ２改変体から得られるＧａｇコード配列またはｇａｇＳＦ２に対応する最適化配列−−ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２）をコードするＤＮＡ構築物を調製した。これらのモノシストロニック構築物を、以下の組み合わせを用いる過性トランスフェクションプロトコルにおいて、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした：ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４；ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２；ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；ｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；ならびにｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２単独。
【０３９１】
さらなるいくつかのビシストロニック構築物を、作製した。ここで、ＥｎｖおよびＧａｇのコード配列は、単一のＣＭＶプロモーターの制御下であり、そして二つのコード配列の間に、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７（４５）：３８５−４０２，１９９２；Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，Ｇ．Ｗ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１４：６６０−６６３，１９９５）配列を、Ｅｎｖコード配列の後およびＧａｇコード配列の前に導入した。これらの構築物は、下記の通りであった：ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２（配列番号７３（図６１））；ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳＦ１６２．ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２（配列番号７４（図６２））；ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２．ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２（配列番号７５（図６３））；ならびにｇｐ１６０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２．ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２（配列番号７６（図６４））。
【０３９２】
細胞培養物由来の上清を、０．４５μｍフィルターを通して濾過して、次いで２０％スクロースクッションを通して、ＳＷ２８ローターにおいて２４，０００ｒｐｍ（１４０，０００×ｇ）で２時間、超遠心した。ペレット化した物質を、懸濁して、そして２０〜６０％スクロース勾配に層化して、そしてＳＷ４１Ｔｉローターで４０，０００ｒｐｍ（２８５，０００×ｇ）で２時間スピンした。勾配を、１．０ｍｌサンプルに分画した。合計９〜１０の画分を代表的に、各ＤＮＡトランスフェクション群から収集した。
【０３９３】
この画分を、Ｅｎｖタンパク質およびＧａｇタンパク質の存在について、試験した（全ての画分にわたって）。これらの結果は、適切なタンパク質が、トランスフェクトした細胞において発現されることを実証した（すなわち、Ｅｎｖコード配列が存在する場合、対応するＥｎｖタンパク質が検出され；Ｇａｇコード配列が存在する場合、対応するＧａｇタンパク質が検出された）。
【０３９４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、選択されたスクロース密度の範囲にわたって、存在することが既知であった。キメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、ＥｎｖおよびＧａｇの両方を含む構築物の全ての試験された組み合わせを用いて形成された。「ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２」を用いてトランスフェクトされた細胞から収集された上清において、他の全ての上清においてよりも有意に多いタンパク質が見出された。
【０３９５】
ウエスタンブロット分析もまた、各トランスフェクション由来のスクロース勾配画分で実施された。この結果は、ビシストロニックプラスミドが、モノシストロニックプラスミドでの同時トランスフェクションを用いて得られた量よりも少量のＶＬＰを与えたことを示す。
【０３９６】
これらの細胞株によるキメラＶＬＰの産生を実証するために、以下の電子顕微鏡分析を実施した。
【０３９７】
２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に、１００ｍｍ皿に６０〜７０％コンフルエンスの密度でプレートした。この細胞を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（Ｐａｎｖｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，５４５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中の１０μｇのＤＮＡを用いて、トランスフェクトした。この細胞を、還元血清培地（ｏｐｔｉ−ＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で一晩インキュベートした。この培地を、翌日の朝にＩＭＤＭ中１０％  胎仔ウシ血清、２％  グルタミンで置換して、そして細胞を６５時間インキュベートした。上清および溶解物を、上記のような分析のために収集した（実施例２を参照のこと）。
【０３９８】
固定されたトランスフェクト２９３Ｔ細胞および精製されたＥＮＶ−ＧＡＧ  ＶＬＰを、電子顕微鏡により分析した。この細胞を、以下のように固定した。細胞単層をＰＢＳで２回洗浄して、そして２％グルタルアルデヒドで固定した。精製されたＶＬＰに関して、勾配ピーク画分を収集して、そして２時間、超遠心（２４，０００ｒｐｍ）により濃縮した。電子顕微鏡分析は、Ｔ．Ｓ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔ  Ｙｅｎ教授（Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により実施された。
【０３９９】
電子顕微鏡検を、透過性電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  １０ｃ）を用いて、実施した。この細胞を、オスミウムで前染色して、そして酢酸ウランおよびクエン酸鉛で染色した。免疫染色を行い、ＶＬＰのエンベロープを可視化した。倍率は、１００，０００倍であった。
【０４００】
図６５Ａ〜６５Ｆは、以下の構築物でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真を示す：図６５Ａ、ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；図６５Ｂ、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４；図６５Ｃ、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２．ｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２（ビシストロニックＥｎｖおよびビシストロニックＧａｇ）；図６５Ｄおよび６５Ｅ、ｇｐ１６０．ｍｏｄＵＳ４．ｄｅｌＶ１／Ｖ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２；ならびに図６５Ｆ、ｇｐ１２０．ｍｏｄＳＦ１６２．ｄｅｌＶ２およびｇａｇ．ｍｏｄＳＦ２。図において、Ｅｎｖタンパク質を付加（ｄｅｃｏｒａｔｅ）された推定サイズ（約１００ｎｍ）の遊離かつ出芽した未熟ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が観察される。要するに、構築物を細胞内に同時トランスフェクトする場合、ｇｐ１６０ポリペプチドが、Ｇａｇ  ＶＬＰに取り込まれる。高合成発現由来のＶ欠失Ｅｎｖポリペプチドをコードする構築物を用いる場合、取り込みの効率は、２〜３倍高い。
【０４０１】
本発明の好ましい実施形態が、幾分詳細に記載されているが、明らかな変化が、添付の特許の請求の範囲により規定されるような、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされなけれ得ることが理解される。
［配列表］
【数１】
2011172593.tif 000033
【数２】
2011172593.tif 000034
【数３】
2011172593.tif 000035
【数４】
2011172593.tif 000036
【数５】
2011172593.tif 000037
【数６】
2011172593.tif 000038
【数７】
2011172593.tif 000039
【数８】
2011172593.tif 000040
【数９】
2011172593.tif 000041
【数１０】
2011172593.tif 000042
【数１１】
2011172593.tif 000043
【数１２】
2011172593.tif 000044
【数１３】
2011172593.tif 000045
【数１４】
2011172593.tif 000046
【数１５】
2011172593.tif 000047
【数１６】
2011172593.tif 000048
【数１７】
2011172593.tif 000049
【数１８】
2011172593.tif 000050
【数１９】
2011172593.tif 000051
【数２０】
2011172593.tif 000052
【数２１】
2011172593.tif 000053
【数２２】
2011172593.tif 000054
【数２３】
2011172593.tif 000055
【数２４】
2011172593.tif 000056
【数２５】
2011172593.tif 000057
【数２６】
2011172593.tif 000058
【数２７】
2011172593.tif 000059
【数２８】
2011172593.tif 000060
【数２９】
2011172593.tif 000061
【数３０】
2011172593.tif 000062
【数３１】
2011172593.tif 000063
【数３２】
2011172593.tif 000064
【数３３】
2011172593.tif 000065
【数３４】
2011172593.tif 000066
【数３５】
2011172593.tif 000067
【数３６】
2011172593.tif 000068
【数３７】
2011172593.tif 000069
【数３８】
2011172593.tif 000070
【数３９】
2011172593.tif 000071
【数４０】
2011172593.tif 000072
【数４１】
2011172593.tif 000073
【数４２】
2011172593.tif 000074
【数４３】
2011172593.tif 000075
【数４４】
2011172593.tif 000076
【数４５】
2011172593.tif 000077
【数４６】
2011172593.tif 000078
【数４７】
2011172593.tif 000079
【数４８】
2011172593.tif 000080
【数４９】
2011172593.tif 000081
【数５０】
2011172593.tif 000082
【数５１】
2011172593.tif 000083
【数５２】
2011172593.tif 000084
【数５３】
2011172593.tif 000085
【数５４】
2011172593.tif 000086
【数５５】
2011172593.tif 000087
【数５６】
2011172593.tif 000088
【図１】
2011172593.tif 000089
【図２】
2011172593.tif 000090
【図３】
2011172593.tif 000091
【図４】
2011172593.tif 000092
【図５】
2011172593.tif 000093
【図６】
2011172593.tif 000094
【図７Ａ】
2011172593.tif 000095
【図７Ｂ】
2011172593.tif 000096
【図７Ｃ】
2011172593.tif 000097
【図７Ｄ】
2011172593.tif 000098
【図７Ｅ】
2011172593.tif 000099
【図７Ｆ】
2011172593.tif 000100
【図７Ｇ】
2011172593.tif 000101
【図７Ｈ】
2011172593.tif 000102
【図７Ｉ】
2011172593.tif 000103
【図７Ｊ】
2011172593.tif 000104
【図８】
2011172593.tif 000105
【図９】
2011172593.tif 000106
【図１０】
2011172593.tif 000107
【図１１】
2011172593.tif 000108
【図１２Ａ】
2011172593.tif 000109
【図１２Ｂ】
2011172593.tif 000110
【図１２Ｃ】
2011172593.tif 000111
【図１３Ａ】
2011172593.tif 000112
【図１３Ｂ】
2011172593.tif 000113
【図１４】
2011172593.tif 000114
【図１５】
2011172593.tif 000115
【図１６】
2011172593.tif 000116
【図１７】
2011172593.tif 000117
【図１８】
2011172593.tif 000118
【図１９】
2011172593.tif 000119
【図２０】
2011172593.tif 000120
【図２１】
2011172593.tif 000121
【図２２−１】
2011172593.tif 000122
【図２２−２】
2011172593.tif 000123
【図２３】
2011172593.tif 000124
【図２４】
2011172593.tif 000125
【図２５】
2011172593.tif 000126
【図２６】
2011172593.tif 000127
【図２７】
2011172593.tif 000128
【図２８】
2011172593.tif 000129
【図２９】
2011172593.tif 000130
【図３０】
2011172593.tif 000131
【図３１】
2011172593.tif 000132
【図３２】
2011172593.tif 000133
【図３３】
2011172593.tif 000134
【図３４】
2011172593.tif 000135
【図３５】
2011172593.tif 000136
【図３６】
2011172593.tif 000137
【図３７】
2011172593.tif 000138
【図３８】
2011172593.tif 000139
【図３９】
2011172593.tif 000140
【図４０Ａ】
2011172593.tif 000141
【図４０Ｂ】
2011172593.tif 000142
【図４１】
2011172593.tif 000143
【図４２】
2011172593.tif 000144
【図４３】
2011172593.tif 000145
【図４４】
2011172593.tif 000146
【図４５】
2011172593.tif 000147
【図４６】
2011172593.tif 000148
【図４７】
2011172593.tif 000149
【図４８】
2011172593.tif 000150
【図４９】
2011172593.tif 000151
【図５０】
2011172593.tif 000152
【図５１】
2011172593.tif 000153
【図５２】
2011172593.tif 000154
【図５３】
2011172593.tif 000155
【図５４】
2011172593.tif 000156
【図５５】
2011172593.tif 000157
【図５６】
2011172593.tif 000158
【図５７】
2011172593.tif 000159
【図５８】
2011172593.tif 000160
【図５９】
2011172593.tif 000161
【図６０】
2011172593.tif 000162
【図６１Ａ】
2011172593.tif 000163
【図６１Ｂ】
2011172593.tif 000164
【図６２Ａ】
2011172593.tif 000165
【図６２Ｂ】
2011172593.tif 000166
【図６３Ａ】
2011172593.tif 000167
【図６３Ｂ】
2011172593.tif 000168
【図６４Ａ】
2011172593.tif 000169
【図６４Ｂ】
2011172593.tif 000170
【図６５】
2011172593.tif 000171
【図６６−１】
2011172593.tif 000172
【図６６−２】
2011172593.tif 000173
【図６６−３】
2011172593.tif 000174
【図６６−４】
2011172593.tif 000175
【図６６−５】
2011172593.tif 000176
【図６６−６】
2011172593.tif 000177
【図６６−７】
2011172593.tif 000178
【図６６−８】
2011172593.tif 000179
【図６６−９】
2011172593.tif 000180
【図６６−１０】
2011172593.tif 000181
【図６６−１１】
2011172593.tif 000182
【図６６−１２】
2011172593.tif 000183
【図６６−１３】
2011172593.tif 000184
【図６６−１４】
2011172593.tif 000185
【図６６−１５】
2011172593.tif 000186
【図６６−１６】
2011172593.tif 000187
【図６６−１７】
2011172593.tif 000188
【図６６−１８】
2011172593.tif 000189
【図６６−１９】
2011172593.tif 000190
【図６６−２０】
2011172593.tif 000191
【図６６−２１】
2011172593.tif 000192
【図６６−２２】
2011172593.tif 000193
【図６６−２３】
2011172593.tif 000194
【図６６−２４】
2011172593.tif 000195
【図６６−２５】
2011172593.tif 000196
【図６６−２６】
2011172593.tif 000197
【図６６−２７】
2011172593.tif 000198
【図６６−２８】
2011172593.tif 000199
【図６６−２９】
2011172593.tif 000200
【図６６−３０】
2011172593.tif 000201
【図６６−３１】
2011172593.tif 000202
【図６６−３２】
2011172593.tif 000203
【図６７】
2011172593.tif 000204
【図６８】
2011172593.tif 000205
【図６９】
2011172593.tif 000206
【図７０】
2011172593.tif 000207
【図７１Ａ】
2011172593.tif 000208
【図７１Ｂ】
2011172593.tif 000209
【図７２Ａ】
2011172593.tif 000210
【図７２Ｂ】
2011172593.tif 000211
【図７３Ａ】
2011172593.tif 000212
【図７３Ｂ】
2011172593.tif 000213
【図７４Ａ】
2011172593.tif 000214
【図７４Ｂ】
2011172593.tif 000215
【図７５Ａ】
2011172593.tif 000216
【図７５Ｂ】
2011172593.tif 000217
【図７６】
2011172593.tif 000218
【図７７】
2011172593.tif 000219
【図７８】
2011172593.tif 000220
【図７９】
2011172593.tif 000221
【図８０−１】
2011172593.tif 000222
【図８０−２】
2011172593.tif 000223
【図８０−３】
2011172593.tif 000224
【図８０−４】
2011172593.tif 000225
【図８０−５】
2011172593.tif 000226
【図８１】
2011172593.tif 000227
【図８２】
2011172593.tif 000228
【配列表】
2011172593000001.app
【外国語明細書】
2011172593000001.pdf