(57)【要約】【課題】  水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解等が長期間起こらず、タンパク質水溶液を長期間保存した後でも生理活性が持続するタンパク質水溶液の保存方法を提供すること。【解決手段】タンパク質水溶液の保存方法であり、タンパク質（Ａ）の水溶液に、カオトロピック剤（Ｂ）を含有させ、タンパク質水溶液中でのタンパク質のαヘリックス残存率を３０％以下にして保存するタンパク質水溶液の保存方法。さらに、タンパク質（Ａ）が酵素であるタンパク質水溶液の保存方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質水溶液の保存方法であり、タンパク質（Ａ）の水溶液に、カオトロピック剤（Ｂ）を含有させ、タンパク質水溶液中でのタンパク質のαヘリックス残存率を３０％以下にして保存するタンパク質水溶液の保存方法。
【請求項２】
タンパク質（Ａ）が酵素である請求項１に記載のタンパク質水溶液の保存方法。
【請求項３】
タンパク質（Ａ）がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ及びリパーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素である請求項１又は２に記載のタンパク質水溶液の保存方法。
【請求項４】
カオトロピック剤（Ｂ）の含有量がタンパク質水溶液の重量を基準として０．０１〜６０重量％である請求項1〜３のいずれかに記載のタンパク質水溶液の保存方法。
【請求項５】
カオトロピック剤（Ｂ）が、下記一般式（１）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の分子量が６０〜２００である化合物（ｂ）である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質水溶液の保存方法。
【化１】
2011147440.tif 000012
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項６】
化合物（ｂ）がグアニジン塩酸塩である請求項５に記載のタンパク質水溶液の保存方法。
【請求項７】
タンパク質（Ａ）の水溶液に、さらに下記一般式（２）で表される化合物（Ｃ）を含有させる請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質水溶液の保存方法。
【化２】
2011147440.tif 000013
[式中、Ｑは、アルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。]
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質水溶液の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素、抗体、ペプチド等のタンパク質は、洗剤、診断・検査薬、医薬品として広く利用されており、これらの製品においては、製造工程及び保存期間中に生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。タンパク質は水溶液とした場合、凝集や加水分解等により生理活性が長期間維持できない問題がある。そこで、タンパク質の生理活性を低下させずに供給する方法として、精製したタンパク質製剤を供給する方法が採られている。
安定してタンパク質を取り出し精製するための一つの方法として凍結乾燥が一般的に行われている。タンパク質の多くは熱によって失活しやすい性質を有するが、凍結乾燥法では、熱をかけずにタンパク質を安定化することができる。
しかしながら、凍結乾燥法は、脱水により変性するタンパク質には使用できない、及び凍結乾燥工程中に吸湿や酸化による変質が起こりやすい等の難点がある。また、凍結乾燥製剤は、使用時に水溶液として溶解して用いる場合、タンパク質製剤を必要な濃度に調整した水溶液をその都度に調製しなければならないという煩雑さの問題がある。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる技術が公開されている。ウレアーゼパーオキシターゼの水溶液の安定化剤として、グリセリン等の多価アルコールを含有させる技術（特許文献１）、コレステロールオキシターゼを含む水溶液に、牛血清アルブミンやグルコース等の糖類あるいはリジン等のアミノ酸を添加する技術（特許文献２）等が挙げられる。
しかし、これらはいずれも特定のタンパク質を安定化させるための方法であり汎用性があるとは言いがたく、タンパク質の凝集や加水分解等によって生理活性が著しく低下する場合があり、タンパク質水溶液全般に、長期保存中での凝集や加水分解を防ぐことができ、長期間保存した後でも生理活性を維持できるタンパク質水溶液の保存方法はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−７０７９８号公報
【特許文献２】特開平８−１８７０９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、タンパク質水溶液を長期間保存した場合、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐことができる、タンパク質の保存方法を提供することが課題である。特に、タンパク質が生理活性を有する場合には、タンパク質水溶液を長期間保存した後でも生理活性が持続するタンパク質水溶液の保存方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明のタンパク質水溶液の保存方法は、タンパク質（Ａ）およびカオトロピック剤（Ｂ）を含有する水溶液で、水溶液中でのタンパク質のαヘリックス残存率を３０％以下で保存することを要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法は、長期保存中でのタンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐことができる。特に、タンパク質が生理活性を有する場合、長期保存後の生理活性が低下しない。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、タンパク質水溶液の保存方法であって、本発明のタンパク質水溶液の保存方法は、タンパク質（Ａ）の水溶液に、カオトロピック剤（Ｂ）を含有させ、タンパク質水溶液中でのタンパク質のαヘリックス残存率を３０％以下にして保存するタンパク質水溶液の保存方法である。
【０００８】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法において、水溶液中でのタンパク質のαヘリックス残存率は、３０％以下であり、タンパク質水溶液の保存中の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。αヘリックス残存率が３０％を超えると凝集や加水分解を防ぐことが困難となり、保存後の生理活性が悪くなる。
【０００９】
ここで、タンパク質のαへリックス残存率は、タンパク質（Ａ）の水溶液のαヘリックス含有量（αＨ0）と、タンパク質（Ａ）及びカオトロピック剤（Ｂ）を配合したタンパク質水溶液のαヘリックス含有量（αＨ1）の比から計算され、次式で表される。
αヘリックス残存率（％）  ＝  （αＨ1）／（αＨ0）×１００
αへリックス残存率（％）は、例えば円偏光二色性スペクトル（以下、ＣＤスペクトルと略記）を測定することにより算出することができる。αヘリックスは２２２ｎｍ付近に固有のピークを持つので、タンパク質（Ａ）の水溶液と、タンパク質（Ａ）及びカオトロピック剤（Ｂ）を含有する水溶液の２５℃でのＣＤスペクトルを測定し、２２２ｎｍでのタンパク質（Ａ）の水溶液のシグナル強度（Θ0）（単位：ｍｄｅｇ）とタンパク質（Ａ）及びカオトロピック剤（Ｂ）を含有する水溶液のシグナル強度（Θ1）（単位：ｍｄｅｇ）を下記式に当てはめることにより求めることができる。
αへリックス残存率（％）  ＝  （Θ1）／（Θ0）×１００
なお、本発明においてαヘリックス含有量とは、タンパク質水溶液調整直後から１分以上１時間以内で測定するαヘリックス含有量を意味する。
αへリックス残存率は、タンパク質水溶液の重量を基準とするカオトロピック剤（Ｂ）の含有量を調整することで、制御することができる。例えば、カオトロピック剤（Ｂ）の含有量を増やした場合、αヘリックス含有率は低下し、カオトロピック剤（Ｂ）の含有量を減らした場合、αヘリックス含有率は増加する。
【００１０】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法におけるタンパク質（Ａ）としては特に限定されないが、酵素（Ａ１）、医療用タンパク質（Ａ２）、化粧品用タンパク質（Ａ３）、抗体（Ａ４）及びペプチド（Ａ５）等が挙げられる。
【００１１】
酵素（Ａ１）としては、酸化還元酵素｛コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等｝、加水分解酵素｛リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等｝、異性化酵素｛グルコースイソメラーゼ等｝、転移酵素｛アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等｝、合成酵素｛脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等｝及び脱離酵素｛ペクチンリアーゼ等｝等が挙げられる。
【００１２】
医療用タンパク質（Ａ２）としては、タンパク製剤｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝及びワクチン｛Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等｝等が挙げられる。
【００１３】
化粧品用タンパク質（Ａ３）としては、コラーゲン、エラスチン及びシルク抽出物等が挙げられる。
【００１４】
抗体（Ａ４）としては、モノクローナル抗体（抗マウスインフルエンザ抗体等）及びポリクローナル抗体が挙げられる。
【００１５】
ペプチド（Ａ５）としては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド、トリペプチド及びポリペプチド（ポリリシン等）等が挙げられる。
【００１６】
タンパク質（Ａ）のうち、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、酵素（Ａ１）及び医療用タンパク質（Ａ２）が好ましく、さらに好ましくは（Ａ１）である。
【００１７】
本発明において、タンパク質水溶液中のタンパク質（Ａ）の含有量は、タンパク質水溶液の重量を基準として、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、好ましくは１ｐｐｍ〜５０重量％であり、さらに好ましくは１００ｐｐｍ〜２０重量％である。
【００１８】
本発明において、カオトロピック剤（Ｂ）とは蛋白質などの分子構造を変化させる性質を持つ化合物をいう。（Ｂ）は、特に限定するものではなく、公知のエタノールよりカオトロピック性が強いとされているもの（「蛋白質・酵素の基礎実験法」ｐ２２, ２３，南江堂）があげられる。タンパク質を水溶液として保存する際にそのまま保存すると、タンパク質が凝集や加水分解等を起こてしまう問題があり、タンパク質の種類によっては、凝集や加水分解のために生理活性が著しく低下するという問題点があるが、本発明では、（Ｂ）を含有することにより解決できる。
（Ｂ）は、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の分子量が６０〜２００の化合物（ｂ）が好ましい。
【化１】
2011147440.tif 000002
【００１９】
一般式（１）において、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。
【００２０】
一般式（１）で表される化合物の分子量はタンパク質水溶液の保存安定性及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、より好ましくは８０〜２００であり、さらに好ましくは８０〜１００である。
【００２１】
一般式（１）で表される化合物として、具体的にはグアニジン、尿素及びチオ尿素が挙げられる。
【００２２】
一般式（１）で表される化合物の塩としては、塩酸塩、炭酸塩、チオシアン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩及びリン酸塩等が挙げられる。
【００２３】
化合物（ｂ）としては、タンパク質の保存安定性及び凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点で、グアニジンの塩及び尿素が好ましく、さらに好ましくはグアニジンの塩、次にさらに好ましくはグアニジン塩酸塩である。
【００２４】
本発明において、タンパク質水溶液に含まれるカオトロピック剤（Ｂ）の含有量は、タンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、タンパク質水溶液の重量に対し、０．０１〜６０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３０重量％、次にさらに好ましくは０．５〜２０重量％、特に好ましくは１〜１０重量％である。
特に、（Ｂ）がグアニジン塩酸塩の場合、（Ｂ）の含有量はタンパク質水溶液の重量に対し、１〜５重量％が特に好ましく、（Ｂ）が尿素の場合は、３〜１０重量％が特に好ましい。
【００２５】
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれるカオトロピック剤（Ｂ）の含有量は、タンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、タンパク質（Ａ）の重量に対し、１〜１０００重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３００重量％、次にさらに好ましくは２０〜２００重量％である。
【００２６】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法において、タンパク質水溶液には、タンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、さらに下記一般式（２）で表される化合物（Ｃ）を含有することができる。
【００２７】
【化２】
2011147440.tif 000003
【００２８】
一般式（２）中、Ｑはアルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。
【００２９】
Ｑのアルキル基としては炭素数１〜２２のアルキル基が挙げられ、具体的にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、セチル基、ステアリル基及びベヘニル基等が挙げられる。これらのアルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されてもよい。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及び水酸基等が挙げられる。置換基の数は１〜３が好ましく、さらに好ましくは２〜３である。例えばブチル基末端の水素原子２つが１つのアミノ基と１つのカルボキシル基で置換された場合は化合物（Ｃ）はアルギニンをあらわす。
【００３０】
化合物（Ｃ）としては、アルギニン又はその塩（Ｃ−１）、アルギニン誘導体又はその塩（Ｃ−２）及びグアニジン誘導体又はその塩（Ｃ−３）が挙げられる。
【００３１】
アルギニン又はその塩（Ｃ−１）として、アルギニン、アルギニンの無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及びアルギニンの有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００３２】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｃ−２）において、アルギニン誘導体は下記一般式（３）で表されるアルギニンのα−アミノ基若しくはα−カルボキシル基又はこれらの両方の基が置換された誘導体である。
α−アミノ基の置換は、下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）への置換であり、α−カルボキシル基の置換は下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）への置換である。
【００３３】
言い換えると、アルギニン誘導体又はその塩（Ｃ−２）では、α−アミノ基又はα−カルボキシル基の少なくともいずれか一方が置換されている。すなわち、Ｙがアミノ基の場合、Ｚは下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）であり、Ｚがカルボキシル基の場合は、Ｙは下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）である。
【００３４】
【化３】
2011147440.tif 000004
【００３５】
一般式（３）中、Ｙはアミノ基、下記一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）を表す。Ｚは、カルボキシル基、下記一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）を表す。
【００３６】
【化４】
2011147440.tif 000005
【００３７】
一般式（４）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３６の１価の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００３８】
一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）におけるＲ1の炭化水素基としては、炭素数１〜３６の１価の炭化水素基であり、直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基が含まれる。
直鎖の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基及びベヘニル基等が挙げられる。
分岐の脂肪族炭化水素基としては、イソプロピル基及びｔ−ブチル基等が挙げられる。
脂環式炭化水素基としては、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基及びシクロヘキシルメチル基等が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、メチルフェニル基、ベンジル基、フェニルエチル基及びメチルベンジル基等が挙げられる。
これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及び水酸基等が挙げられる。
【００３９】
一般式（４）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）として具体的には、ホルムアミド基、アセチルアミド基、プロピオン酸アミド基、ブチル酸アミド基、ヘキシル酸アミド基、シクロヘキシル酸アミド基、オクチル酸アミド基及びベンゾイルアミド基等が挙げられる。
【００４０】
【化５】
2011147440.tif 000006
【００４１】
一般式（５）中、Ｒ2とＲ3はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はその水素原子の一部が水素原意以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００４２】
一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）において、Ｒ2とＲ3は、Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００４３】
一般式（５）で表されるイミノ基（Ｙ−２）としては、メチルイミノ基等が挙げられる。
【００４４】
【化６】
2011147440.tif 000007
【００４５】
一般式（６）中、Ｒ4は、炭素数１〜３６の炭化水素基又は多価アルコール若しくは糖から１つの水酸基を除いた残基を表す。
この炭化水素基はその水素原子の一部が他の官能基、例えば、水酸基、メトキシル基、エトキシル基、ニトロ基及び／又はヒドロキシフェニル基等で置換されていてもよい。
【００４６】
一般式（６）で表されるエステル基（Ｚ−１）において、Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基は、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれる。
Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはエチル基である。
【００４７】
多価アルコールとしては、２価〜３価のアルコールが含まれ、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
糖としては、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等が挙げられる。
【００４８】
【化７】
2011147440.tif 000008
【００４９】
一般式（７）中、Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００５０】
一般式（７）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）において、Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基としては、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００５１】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｃ−２）がアルギニン誘導体の塩の場合、無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及び有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００５２】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｃ−２）の化合物として具体的に、Ｎ−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩が挙げられる。
【００５３】
グアニジン誘導体又はその塩（Ｃ−３）としては、Ｑを特に限定するものではないが、具体的にアミノグアニジン（−ＮＨ2）、ジシアンジアミド（−ＣＮ）、グアニルチオウレア（−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ2）、ドデシルグアニジン（−Ｃ12Ｈ25）、エチルグアニジン（−Ｃ2Ｈ5）、オクチルグアニジン（−Ｃ8Ｈ17）及びビグアニド（−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）が挙げられる。ここで、（）内はＱの官能基を表す。
【００５４】
これらのうち、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点で好ましくは（Ｃ−１）及び（Ｃ−２）であり、さらに好ましくは、（Ｃ−２）であり、特に好ましいのはＮ−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩である。
【００５５】
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれる化合物（Ｃ）の含有量（重量％）は、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２０、次にさらに好ましくは０．５〜１０である。
本発明において、タンパク質水溶液に含まれる化合物（Ｃ）の含有量は、タンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、タンパク質（Ａ）の重量に対し、１〜１０００重量％含有することが好ましく、さらに好ましくは１０〜８００重量％含有することであり、次にさらに好ましくは５０〜５００重量％含有することである。
【００５６】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法において、タンパク質水溶液は、タンパク質（Ａ）以外にカオトロピック剤（Ｂ）を含有すればよいが、タンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から、カオトロピック剤（Ｂ）及び化合物（Ｃ）を共に含有することが好ましい。
【００５７】
カオトロピック剤（Ｂ）及び化合物（Ｃ）を含有する場合、カオトロピック剤（Ｂ）と化合物（Ｃ）との重量比（（Ｂ）の重量／（Ｃ）の重量）は０．１〜９が好ましく、さらに好ましくは０．２〜８であり、特に好ましくは０．５〜５である。
【００５８】
本発明において、タンパク質水溶液には上記カオトロピック剤（Ｂ）及び化合物（Ｃ）以外に、界面活性剤（Ｄ）、無機塩（Ｅ）、多価アルコール（Ｆ）、糖（Ｇ）及びアルギニン以外のアミノ酸（Ｈ）を併用することができる。
【００５９】
界面活性剤（Ｄ）として、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が含まれ、ポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレン共重合物、ソルビタンアルキルエステルエチレンオキシド付加物、脂肪族アルコールエチレンオキシド付加物、脂肪酸エチレンオキシド付加物及びアルキルアミンエチレンオキシド付加物等が挙げられる。
【００６０】
無機塩（Ｅ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００６１】
多価アルコール（Ｆ）として、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
【００６２】
糖（Ｇ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００６３】
アルギニン以外のアミノ酸（Ｈ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００６４】
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれる界面活性剤（Ｄ）の含有量（重量％）は、タンパク質水溶液の保存安定化及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点からカオトロピック剤（Ｂ）と化合物（Ｃ）の重量合計に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、次にさらに好ましくは０〜２０である。
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれる無機塩（Ｅ）の含有量（重量％）は、タンパク質水溶液の保存安定化及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から（Ｂ）と（Ｃ）の重量合計に対し０〜２０が好ましく、さらに好ましくは０〜１５、次にさらに好ましくは０〜１０である。
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれる多価アルコール（Ｆ）の含有量（重量％）は、タンパク質水溶液の保存安定化及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から（Ｂ）と（Ｃ）の重量合計に対し０〜７０が好ましく、さらに好ましくは０〜６０、次にさらに好ましくは０〜５０である。
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれる糖（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質水溶液の保存安定化及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から（Ｂ）と（Ｃ）の重量合計に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、次にさらに好ましくは０〜２０である。
本発明において、タンパク質水溶液中に含まれるアルギニン以外のアミノ酸（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質水溶液の保存安定化及びタンパク質の凝集や加水分解を防ぐ（特に、タンパク質が生理活性を有する場合、保存後の生理活性を保つ）観点から（Ｂ）と（Ｃ）の重量合計に対し０〜３０が好ましく、さらに好ましくは０〜２０、次にさらに好ましくは０〜１０である。
【００６５】
本発明において、タンパク質水溶液には、保存安定化の効果を損なわない範囲で、緩衝剤を添加してもよい。
【００６６】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法の例を以下に説明するが、タンパク質水溶液の製造は、カオトロピック剤（Ｂ）及び必要により化合物（Ｃ）をそのまま、あるいは水に溶かしてタンパク質水溶液に加えてもよいし、タンパク質を（Ｂ）及び必要により（Ｃ）の水溶液に加えてもよいし、タンパク質と（Ｂ）及び必要により（Ｃ）と水を一緒に混ぜてもよい。
【００６７】
分離精製工程で分離された酵素の水溶液を作成し、保存する場合の一例を以下に挙げる。
１．カオトロピック剤（Ｂ）及び化合物（Ｃ）を水に加え、水溶液を作製する。
２．分離精製後の酵素水溶液を上記水溶液に加え、必要に応じて混合する。
３．２５℃もしくは冷蔵庫で密封保存する。
【００６８】
通常、生理活性があるタンパク質を水溶液として保存した場合、凝集や加水分解等のために生理活性が著しく低下してしまい、タンパク質水溶液の生理活性を長期間維持できない。
しかしながら、本発明のタンパク質水溶液の保存方法は、長期保存中でのタンパク質水溶液中のタンパク質の凝集や加水分解を防ぐことができる。したがって、生理活性があるタンパク質を、本発明のタンパク質水溶液の保存方法で保存した場合、長期的に安定したタンパク質の生理活性を保つことができる。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７０】
＜製造例１＞
Ｎ−α−アセチルアルギニン｛アルギニンアセトアミド、株式会社エムピーバイオジャパン製｝１２．６重量部（０．０５モル部）、メタンスルホン酸１部及びエタノール９２重量部（２モル部）を均一混合し、８０℃で５時間加熱攪拌し、エバポレーターで濃縮後、塩酸（濃度３５重量％）５．２重量部（０．０５モル部）を加え中和した。その後、水から再結晶し、減圧乾燥｛６０℃、２０Ｐａ｝して、化合物（Ｃ）であるＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩を得た。
【００７１】
＜実施例１−１＞
タンパク質（Ａ）としてセルラーゼ５．０ｍｇを、カオトロピック剤（Ｂ）としてグアニジン塩酸塩１０ｍｇを溶解させた５０ミリモル／Ｌトリス緩衝液｛和光純薬工業株式会社製｝（ｐＨ＝７）１．０ｍＬに加えて均一混合し、セルラーゼ水溶液を作製した。
【００７２】
＜実施例１−２〜１−１０＞
実施例１−１において、「セルラーゼ」を表１に記載のタンパク質にそれぞれ変更したこと以外は実施例１−１と同様に行った。
なお、実施例及び比較例の番号の枝番とタンパク質（Ａ）との対応は下記の通りであり、例えば実施例１−２で使用するタンパク質（Ａ）はリパーゼであり、実施例１−３で使用するタンパク質（Ａ）はプロテアーゼである。
枝番  使用するタンパク質（Ａ）
−１  セルラーゼ
−２  リパーゼ
−３  プロテアーゼ
−４  コレステロールオキシダーゼ
−５  グルコースイソメラーゼ
−６  骨形成因子
−７  エリスロポエチン
−８  コラーゲン
−９  抗マウスインフルエンザＡ型抗体
−１０  ポリリシン
【００７３】
実施例２〜２０
実施例１において、タンパク質（Ａ）、カオトロピック剤（Ｂ）及び化合物（Ｃ）を表１に記載の組成及び量にする以外は実施例１と同様に行った。
【００７４】
比較例１〜１２
実施例１において、タンパク質（Ａ）、カオトロピック剤（Ｂ）、化合物（Ｃ）及び安定化剤等を表１に記載の組成及び量にする以外は実施例１と同様に行った。
【００７５】
表１に記載のカオトロピック剤（Ｂ）、化合物（Ｃ）及び従来の安定化剤等は下記のものである。
カオトロピック剤（Ｂ）
（Ｂ１）：グアニジン塩酸塩
（Ｂ２）：尿素
化合物（Ｃ）
（Ｃ１）：Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩
（Ｃ２）：アルギニン塩酸塩
従来の安定化剤等
（１）：グリセリン
（２）：プロピレングリコール
（３）：ウシ血清アルブミン
（４）：トレハロース
（５）：イオン交換水
【００７６】
【表１】
2011147440.tif 000009
【００７７】
なお、上記実施例及び比較例において、タンパク質（Ａ）、カオトロピック剤（Ｂ）及び化合物（Ｃ）は下記の試薬を使用した。
セルラーゼ：和光純薬工業株式会社製
リパーゼ：和光純薬工業株式会社製
プロテアーゼ：和光純薬工業株式会社製
コレステロールオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社製
グルコースイソメラーゼ：和光純薬工業株式会社製
骨形成因子：Ｒ＆Ｄシステムズ社製「ＢＭＰ−２」
エリスロポエチン：和光純薬工業株式会社製
コラーゲン：和光純薬工業株式会社製「ブタコラーゲンＩ」
抗インフルエンザＡ型抗体：タカラバイオ株式会社製「抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体」
ポリリシン：和光純薬工業株式会社製
グアニジン塩酸塩：和光純薬工業株式会社製
尿素：和光純薬工業株式会社製
アルギニン塩酸塩：和光純薬工業株式会社製
【００７８】
実施例１〜２０及び比較例１〜１２で得たタンパク質水溶液について、それぞれタンパク質が同濃度であるがカオトロピック剤（Ｂ）を含んでいないタンパク質水溶液を別途作製し、水溶液作成直後から１分以上１時間以内に、２５℃でのＣＤスペクトルを円二色性分散計（日本分光製）で測定した。αへリックス残存率はＣＤスペクトルの２２２ｎｍにおけるシグナル強度から以下の式で算出した。
αへリックス残存率（％）  ＝  （Θ1）／（Θ0）×１００
ここで、（Θ0）はカオトロピック剤を含んでいないタンパク質水溶液のシグナル強度（単位：ｍｄｅｇ）、（Θ1）は実施例及び比較例のタンパク質溶液のシグナル強度（単位：ｍｄｅｇ）を表す。
αへリックス残存率の評価は、下記の尺度で評価した。
◎：αへリックス残存率が１０％未満
○：αへリックス残存率が１０％〜３０％
×：αへリックス残存率が３０％より大きい
結果を表２にまとめた。
【００７９】
実施例１〜２０及び比較例１〜１２で得たタンパク質水溶液について、２５℃の恒温機内で１ヶ月間密栓保存した。
セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、骨形成因子、エリスロポエチン及び抗マウスインフルエンザＡ型抗体の保存後の水溶液について、凝集や加水分解が防止できたかを、生理活性を測定することにより評価した。保存後の生理活性の保持率を長期保存性とし、表３にまとめた。凝集や加水分解を防止できていれば、長期保存性の値が高くなる。
また、コラーゲン及びポリリシンの保存後の水溶液については、凝集や加水分解等が防止できたかを、保存後のタンパク質水溶液を希釈した後のαへリックス含有量の保持率を測定することにより評価した。保存後のαへリックス含有量の保持率を長期保存性として評価し、表３にまとめた。
実施例のタンパク質水溶液においては、カオトロピック剤（Ｂ）を入れることによりタンパク質の分子構造が変化し、αへリックス含有量が低くなったが、希釈することにより、タンパク質水溶液中のカオトロピック剤（Ｂ）の濃度が希釈されるため、タンパク質の分子構造が戻り、タンパク質が凝集や加水分解等を起こしていない場合、αへリックス含有量がもとの値に戻ると推察される。したがって、コラーゲン及びポリリシンについては、希釈した後のαへリックス含有量の保存率を長期保存性として評価した。凝集や加水分解を防止できていれば、長期保存性の値が高くなる。
【００８０】
【表２】
2011147440.tif 000010
【００８１】
＜セルラーゼの酵素活性（力価）の測定＞
測定試料（実施例及び比較例のセルラーゼ水溶液）２００μＬを、５重量％セルロース懸濁液（セルロース５ｇをｐＨ＝７のトリス緩衝液９５ｇに加え、懸濁させたもの）８００μＬに加えて、３７℃で２時間転倒混和した。上澄み１００μＬをグルコース定量キット液｛和光純薬工業株式会社製「テストワコーＩＩ」｝１００μＬに加えた。直ちに、この測定溶液について、２５℃で、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ社製、サンライズサーモ）で４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を測定し、さらに２５℃で１５分間放置後にもう一度、２５℃で吸光度（Ａ15）を測定し、これらの差（Ａ15−Ａ0）（ΔＡ）を算出した。
【００８２】
一方、ブランクとして、作成した直後の比較例６−１及び比較例１２−１のセルラーゼ水溶液を用いて測定溶液を調製し、上記と同様の測定を行い、吸光度の差（Ａ15−Ａ0）（ΔＡb）を算出し、次式から、「長期保存性」を表す「酵素活性（力価）の保持率」を算出した。なお、実施例及び比較例で、セルラーゼ濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−１の測定値を用いて（△Ａb）を算出し、セルラーゼ濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−１の測定値を用いて（△Ａb）を算出した。
長期保存性（酵素活性の保持率）（％）＝（ΔＡ／ΔＡb）×１００
その結果を表３に示す。
【００８３】
＜リパーゼの酵素活性（力価）の測定＞
測定試料（実施例及び比較例のリパーゼ水溶液）１００μＬを５ｍＬ容の試験管にはかりとり、５０ｍＭトリス緩衝液｛和光純薬工業株式会社製｝（ｐＨ＝７．０）２ｍＬを加え、さらに５μＭのｐ−ニトロフェニルアセテート｛和光純薬工業株式会社製｝１ｍＬを加えた。
この測定溶液調製直後と２５℃で１０分放置後の４００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡ）（トリニトロフェニルアセテートが酵素で分解された生成物の吸収）を分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。ブランクとして、作成した直後の比較例６−２及び比較例１２−２のリパーゼ水溶液を用いて上記と同様にして測定溶液を調製し、吸光度変化（ΔＡb）を測定した。なお、実施例及び比較例で、リパーゼ濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−２の測定値を用いて（△Ａb）を算出し、リパーゼ濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−２の測定値を用いて（△Ａb）を算出した。
リパーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、ｐ−ニトリフェニルアセテートが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
次式から「長期保存性」を表す「酵素活性（力価）の保持率」を算出した。
長期保存性（酵素活性の保持率）（％）＝（ΔＡ／ΔＡb）×１００
その結果を表３に示す。
【００８４】
＜プロテアーゼの酵素活性（力価）の測定＞
測定試料（実施例及び比較例のプロテアーゼ水溶液）１ｍＬを１５ｍＬ容の試験管にはかりとり、０．５％カゼイン｛和光純薬工業株式会社製｝５ｍＬを加え、２５℃で１０分間放置した。その後、５％ＴＣＡ溶液（トリクロロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）をイオン交換水に溶解させたもの）を５ｍＬを加え、２５℃で２０分間放置した。遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製、冷却遠心機３９２２）で２５００ｒｐｍ、２０分間処理し、残った上澄み２ｍＬを別の１５ｍＬ容の試験管に測り取った。この試験管に、０．５Ｍの炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬ、イオン交換水で３倍希釈したフォーリン試薬｛和光純薬工業株式会社製｝１ｍＬを加え、２０分間放置した。
この溶液の６６０ｎｍにおける２５℃での吸光度（Ａ）を、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）を用いて測定し、プロテアーゼの酵素活性を算出した。
ブランクには、作成した直後の比較例６−３及び比較例１２−３のプロテアーゼ水溶液を用いて上記と同様にして測定溶液を調製し、吸光度（Ａb）を測定した。なお、実施例及び比較例で、プロテアーゼ濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−３の測定値を用いて（Ａb）を算出し、プロテアーゼ濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−３の測定値を用いて（Ａb）を算出した。
次式から「長期保存性」を表す「酵素活性（力価）の保持率」を算出した。
長期保存性（酵素活性の保持率）（％）＝（Ａ／Ａb）×１００
その結果を表３に示す。
【００８５】
＜コレステロールオキシダーゼの酵素活性の測定＞
コール酸ナトリウム７８ｍｇ、ノニルフェノールエチレンオキシド付加物｛ユニオンカーバイドアンドプラスチック社製、商品名：トライトンＸ−１００｝９ｍｇ、アミノアンチピリン０．８５ｍｇ、フェノール５．９ｍｇ、ペルオキシダーゼ｛東洋紡績株式会社製｝１５ｕｎｉｔｓ、コレステロール１．０ｍｇ及び５０ミリモル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）３ｍＬを均一混合して、基質溶液を調製した。
【００８６】
ついで、測定試料（実施例及び比較例のコレステロールオキシダーゼ水溶液）１０μＬを基質溶液３ｍＬに加えて、測定溶液を得た。直ちに、この測定溶液について、３０℃で、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で５００ｎｍにおける吸光度（Ｂ0）を測定し、さらに３０℃で５分間放置後にもう一度、３０℃で吸光度（Ｂ5）を測定し、これらの差（Ｂ5−Ｂ0）（ΔＢ）を算出した。
【００８７】
一方、ブランクとして、作成した直後の比較例６−４及び比較例１２−４のコレステロールオキシダーゼ水溶液を用いて測定溶液を調製し、上記と同様にして吸光度変化（Ｂ5−Ｂ0）（ΔＢb）を算出し、次式から「長期保存性」を表す「酵素活性保持率」を算出した。なお、実施例及び比較例で、コレステロールオキシダーゼ濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−４の測定値を用いて（ΔＢb）を算出し、コレステロールオキシダーゼ濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−４の測定値を用いて（ΔＢb）を算出した。
長期保存性（酵素活性保持率）（％）＝（ΔＢ／ΔＢb） ×１００
その結果を表３に示す。
【００８８】
＜グルコースイソメラーゼの場合の酵素活性の測定＞
測定試料（実施例及び比較例のグルコースイソメラーゼ水溶液）１ｍＬを５０ｍＭトリエタノールアミンバッファー（１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．１Ｍキシロースを含有。ｐＨ＝７．５）９ｍＬに加え、３５℃で３時間反応させた。分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）を用いて、反応開始直後の２７８ｎｍにおける３５℃での吸光度（Ｂ0）を測定し、さらに３５℃で３時間放置後にもう一度、３５℃での吸光度（Ｂ3）を測定し、これらの差（Ｂ3−Ｂ0）（ΔＢ）を算出した。異性化によりキシルロースが生成すると、２７８ｎｍの吸収が増大する。
【００８９】
一方、ブランクとして、作成した直後の比較例６−５及び比較例１２−５のグルコースイソメラーゼ水溶液を用いて測定溶液を調製し、上記と同様にして吸光度変化（Ｂ3−Ｂ0）（ΔＢb）を算出し、次式から「長期保存性」を表す「酵素活性保持率」を算出した。なお、実施例及び比較例で、グルコースイソメラーゼ濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−５の測定値を用いて（ΔＢb）を算出し、グルコースイソメラーゼ濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−５の測定値を用いて（ΔＢb）を算出した。
長期保存性（酵素活性保持率）（％）＝（ΔＢ／ΔＢb） ×１００
その結果を表３に示す。
【００９０】
＜骨形成因子（ＢＭＰ）の場合の活性測定＞
骨形成因子（ＢＭＰ）の活性測定は公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２（１９９０）２９５−２９９）と同様に下記の通り行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ品）を２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０重量％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）中で３７℃、１０重量％二酸化炭素条件下培養した。２４穴プレートに１×１０5個のＣ２Ｃ１２細胞を含む培地を注ぎ培養し、３７℃、２４時間後に測定試料（実施例及び比較例の骨形成因子水溶液）を含む新しい前述の培地（骨形成因子の濃度：０．００１重量％）で培地交換した。４日後、細胞処理溶液（０．１Ｍのグリセロール、ｐＨ９．６、１重量％のＮＰ−４０、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化亜鉛を含む）０．２ｍＬをプレートに加え１時間静置した。静置後プレート上の抽出液５０μＬを０．３ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマ社製）を細胞処理溶液に溶解させた溶液１５０μＬに加え、９６穴プレートで３７℃、放置した。加えた直後の４０５ｎｍにおける吸光度（Ｃ0）をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ社製、サンライズサーモ）で測定し、さらに３７℃で３０分間放置後にもう一度、３７℃で吸光度（Ｃ30）を測定し、これらの差（Ｃ30−Ｃ0）（ΔＣ）を算出した。
【００９１】
一方、ブランクとして、作成した直後の比較例６−６及び比較例１２−６の骨形成因子水溶液を用いて調製し、上記と同様にして吸光度変化（Ｃ30−Ｃ0）（ΔＣb）を算出し、次式から「長期保存性」を表す「活性保持率」を算出した。なお、実施例及び比較例で、骨形成因子濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−６の測定値を用いて（ΔＣb）を算出し、骨形成因子濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−６の測定値を用いて（ΔＣb）を算出した。
長期保存性（活性保持率）（％）＝（ΔＣ／ΔＣb） ×１００
その結果を表３に示す。
【００９２】
＜エリスロポエチンの活性測定＞
ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣより入手）をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２×１０5cells/ｍＬに調製し、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。実施例、比較例のエリスロポエチン溶液をそれぞれ１μＬ添加し、５％ＣＯ2、３７℃条件下、２４時間培養し、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所製）溶液を各ウエルに１０μｌずつ添加し、４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ450）をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ社製、サンライズサーモ）で測定し、細胞増殖の程度を調べた。
１ヶ月保存する前の吸光度（Ａ0450）との比で、長期保存率を以下の式で算出した。
長期保存性（活性保持率）（％）＝（Ａ450）／（Ａ0450） ×１００
その結果を表３に示す。
【００９３】
＜コラーゲンの長期保存性評価＞
実施例及び比較例のコラーゲン水溶液を１ヶ月保管したものを、イオン交換水で１００倍希釈した。希釈直後から１分以上１時間以内に、２５℃で円二色性分散計（日本分光製）を用いてＣＤスペクトルを測定し、２２２ｎｍにおけるシグナル強度（Θ2）（単位：ｍｄｅｇ）を求めた。
また、作成した直後の比較例６−８及び比較例１２−８のコラーゲン水溶液を用いて上記と同様にして測定溶液を調製し、２２２ｎｍにおけるシグナル強度（Θ0）を求めた。なお、実施例及び比較例で、コラーゲン濃度が５ｍｇ／ｍＬのものについては比較例６−８のシグナル強度を用い、コラーゲン濃度が５０ｍｇ／ｍＬのものについては比較例１２−８のシグナル強度を用いた。
長期保存性はＣＤスペクトルの２２２ｎｍにおけるシグナル強度から以下の式で算出した。
長期保存性（％）  ＝  （Θ2）／（Θ0）×１００
その結果を表３に示す。
【００９４】
＜抗インフルエンザＡ型抗体の活性測定＞
１ヶ月保管する前後の実施例、比較例の抗インフルエンザＡ型抗体水溶液をインフルエンザ・ウイルス・タイピングセット（タカラバイオ製）に加え、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ0470、Ａ470）をそれぞれマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ社製、サンライズサーモ）で測定し、長期保存性を評価した。
長期保存性（活性保持率）（％）＝（Ａ470）／（Ａ0470） ×１００
その結果を表３に示す。
【００９５】
＜ポリリシンの長期保存性＞
実施例及び比較例のコラーゲン水溶液に変えて実施例及び比較例のポリリシン水溶液を用いる以外はコラーゲンの長期保存性評価と同様に、ポリリシンの長期保存性評価をおこなった。
その結果を表３に示す。
【００９６】
【表３】
2011147440.tif 000011
【００９７】
表２において、実施例のタンパク質水溶液は、カオトロピック剤（Ｂ）を入れることによりタンパク質の分子構造が変化し、αへリックス含有量が低くなった。
上記コラーゲン及びポリリシンの長期保存性評価では、このタンパク質水溶液を希釈することにより、カオトロピック剤（Ｂ）が希釈され、タンパク質の分子構造がもとに戻るため、長期保存の間にタンパク質が凝集や加水分解等を起こしていない場合、αへリックス含有量ももとに戻り、安定化剤として何も添加していない作成直後の比較例（コラーゲンの場合は比較例６−８又は比較例１２−８、ポリリシンの場合は比較例６−１０又は比較例１２−１０）の値に近くなり、長期保存性（％）の値（αへリックス含有量の保存率）が大きくなる。
表３の結果から、実施例のタンパク質水溶液は、長期保存性（％）の値（αへリックス含有量の保存率）が大きく、また、タンパク質水溶液中に沈殿は生じておらず、長期保存の間にタンパク質が凝集や加水分解等を起こしていないことがわかった。
一方、比較例のタンパク質水溶液は、長期保存性（％）の値（αへリックス含有量の保存率）が小さかった。また、比較例のタンパク質水溶液には沈殿が生じていた。このことから、長期保存の間にタンパク質が凝集したことがわかる。
【００９８】
表２の結果から、従来から使用されている安定化剤を用いた比較例１〜５、７〜１１及び安定化剤を使用しない比較例６、１２は、タンパク質水溶液作成直後のタンパク質のαヘリックス残存率が３０％より大きかった。また、表３の結果から、比較例のタンパク質水溶液は、長期保存性の値が小さく、タンパク質水溶液の凝集や加水分解等を防ぐ効果が不十分であり、長期保存した場合に凝集や加水分解等がおこり、生理活性が低下したことがわかった。
一方、表２及び表３の結果から、グアニジン塩酸塩又は尿素等のカオトロピック剤（Ｂ）を使用した実施例のタンパク質水溶液は、タンパク質水溶液作成直後のタンパク質のαヘリックス残存率が３０％より小さかった。また、長期保存した場合、長期保存性の値が大きく、凝集や加水分解等を防ぐことができ、生理活性の保持率が高いことがわかった。さらに、カオトロピック剤（Ｂ）とアルギニン塩酸塩やアルギニン誘導体等の化合物（Ｃ）と併用した実施例は、さらに長期保存性の値が大きく、凝集や加水分解等を防ぐ効果が高いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明のタンパク質水溶液の保存方法は、タンパク質の凝集や加水分解等を防ぎ、生理活性を長期間低下させないので、医薬品、食品、洗剤及び生化学の分野において有効に使用することができる。たとえば、タンパク医薬品液体製剤、酵素液体製剤、工業用酵素水溶液、液体洗剤、飲料、診断薬用の測定試薬、タンパク質の標準液等に使用できる。