(57)【要約】【課題】相乗的に抗アレルギー効果（花粉症などのアレルギー症状を抑える効果）を有する乳酸菌由来の組成物、該組成物を含有する食品やペットフードなどを提供すること。【解決手段】ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株、ＫＴ−２３株又はＫＴ−２５株の菌体と、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属及びペディオコッカス属等に属する他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０、好ましくは９９：１〜７５：２５の割合で含有する、抗アレルギー作用を有する組成物を調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物と、他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で含有することを特徴とする抗アレルギー作用を有する組成物。
【請求項２】
菌体量換算で、９９：１〜７５：２５の割合で含有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
他の乳酸菌が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、 エンテロコッカス（Enterococcus）属及びペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌からなる群から選ばれる１又は２以上の乳酸菌であることを特徴とする請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス属の乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・ブルガリカス（L.bulgaricus）、ラクトバチルス・ラムノーサス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantrum）からなる群から選ばれる１又は２以上の乳酸菌であることを特徴とする請求項３記載の組成物。
【請求項５】
死菌が、緩衝液中で加熱処理した菌体であることを特徴とする請求項１〜４記載の組成物。
【請求項６】
菌体処理物が、乳酸菌由来のペプチドグリカンであることを特徴とする請求項１〜４記載の組成物。
【請求項７】
抗アレルギー作用が、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生能を促進する作用であることを特徴とする請求項１〜６記載の組成物。
【請求項８】
抗アレルギー作用が、ＩＬ−１２ｐ７０産生能を促進する作用であることを特徴とする請求項１〜７記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有する医薬品。
【請求項１０】
請求項１〜８記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有する飲食品又はサプリメント。
【請求項１１】
請求項１〜８記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有するペットフード又はペット用サプリメント。
【請求項１２】
請求項１〜８記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有する飼料。
【請求項１３】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えた抗アレルギー作用を有する組成物の製造方法。
（ａ）ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物を調製する工程；
（ｂ）他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物を調製する工程；
（ｃ）工程（ａ）で調製された生菌、死菌又はその菌体処理物と、工程（ｂ）で調製された生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で配合する工程；
【請求項１４】
ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物と、他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で含有する組成物を、抗アレルギー剤の調製に使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種以上の特定の乳酸菌を利用した、相乗的に抗アレルギー作用を有する組成物やその製造方法、前記組成物を含有する医薬品、食品、サプリメント、飼料等に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞やＴ細胞などの増殖や働きを調節するサイトカインを産生し、免疫システムを制御するＴ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）とされ、そのサイトカインの産生パターンから、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）と２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）との二種類に分類され、Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γ、ＩＬ−２などを産生して細胞性免疫を活性化し、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５などを産生し、液性免疫を活性化することが知られている。いわゆる免疫バランスとは一般に、このＴｈ１細胞とＴｈ２細胞との間のバランスを指し、例えば患者のアレルギー状態を示す指標などとして広く利用されている。
【０００３】
アレルギーとは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが崩れてＴｈ２側に異常に偏ると、本来は無害である外来抗原に対して免疫系が過剰に反応することにより、花粉症や鼻炎、皮膚炎などのアレルギー諸症状が発症する疾患であり、反応機序の違いによりＩ型からIV型の４つの型に分類される。日本では、ダニ、埃などのハウスダストによる通年性アレルギー性鼻炎やスギ花粉などによる季節性アレルギー性鼻炎に代表されるＩ型アレルギー患者数の増加が顕著であり、今後も更なる患者の増加が懸念されている。
【０００４】
Ｉ型アレルギーは、主に抗原と結合したＩｇＥにより肥満細胞が刺激され、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターを放出することにより発症するアレルギーである。体内に侵入した花粉やハウスダストは抗原と認識され、それらに対する特異的ＩｇＥ抗体が産生される。特異的ＩｇＥ抗体は、マスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃレセプターに結合して感作された状態となる。その後、抗原が再び体内に侵入すると、抗原はＩｇＥ抗体と結合し、抗原−抗体複合体が形成されて脱顆粒を引き起こし、顆粒中のヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質が放出され、これらの作用がアレルギー症状となって現れる。
【０００５】
こうしたアレルギー症状に対して用いられる薬物としては、抗ヒスタミン剤、ロイコトリエン拮抗薬、トロンボキサン拮抗薬、Ｔｈ２サイトカイン阻害薬、メディエーター遊離抑制剤、ステロイド薬などがある。しかしながら、例えば抗ヒスタミン剤は副作用として眠気や口渇が出ることがあり、ロイコトリエン拮抗薬の副作用としては血球減少や胃腸障害、メディエーター遊離抑制剤の副作用としては胃腸障害や膀胱炎様症状等が知られるなど、これらの薬物は必ずしも安全であるとはいえない。
【０００６】
こうした背景のもと、近年では、免疫バランスを調節し、抗アレルギー作用を有する乳酸菌が安全性が高い抗アレルギー素材として注目されている。例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（L. buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（L. delbrueckii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・ケフィア（L. kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei）、ラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophillus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・プランタラム（L. plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（L. raffinolactis）、ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis）、ロイコノストック・メセンテロイデス（L. mesenteroides）、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）から選ばれる乳酸菌の菌体を有効成分とするＩｇＥ抗体産生抑制剤（特許文献１参照）や、ヒト由来のビフィズス菌、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）を有効成分とする抗アレルギー剤（特許文献２参照）や、ヒトの腸内細菌群より分離された乳酸菌、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）（ＡＤ１０１株）、ラクトバシルス・ロイテリー（L. reuteri）（ＡＤ０００２株）の菌体を有効成分とする、ヒスタミン遊離抑制効果を有するＩ型アレルギー抑制剤（特許文献３参照）や、ラクトバチルス・パラカゼイを有効成分として含有する抗アレルギー機能を有する飲食品（特許文献４参照）が報告されている。
【０００７】
また、ラクトバチルス・デルブルエキイ（L. delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィラス（L. acidophilus）、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトコッカス・ラクティス及びストレプトコッカス・サーモフィラス（S. thermophilus）からなる群から選ばれる３〜８種の乳酸菌とサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）との混合培養物又は該混合培養物に由来する混合菌体若しくは培養上清を含有する免疫促進用組成物（特許文献５参照）や、腸管免疫または１型ヘルパーＴ細胞を賦活させる乳酸菌エンテロコッカス・フェシウムを含んでなる、抗食物アレルギー剤（特許文献６，特許文献７参照）や、有胞子乳酸菌であるバチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）を有効成分とする抗アレルギー剤（特許文献８参照）や、植物由来のラクトバチルス属に属する乳酸菌、植物由来のロイコノストック属に属する乳酸菌、及び植物由来のペディオコッカス属に属する乳酸菌のうち少なくとも１以上の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物を有効成分とする抗アレルギー剤（特許文献９参照）や、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（L. lactis subsp. lactis）、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（L. lactis subsp. cremoris）からなる複数種の乳酸菌の菌体又は菌体成分を含有してなるインターフェロンガンマ発現誘導作用を有する発酵乳（特許文献１０参照）や、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を有効成分とする抗アレルギー剤（特許文献１１参照）が報告されている。
【０００８】
そしてまた、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有するペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）（特許文献１２参照）や、免疫調節作用を有することを特徴とするストレプトコッカス・サーモフィルス乳酸菌（特許文献１３参照）や、免疫賦活作用・抗アレルギー作用を有するラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）およびラクトバチルス・サリバリウスから選択される乳酸菌（特許文献１４参照）や、免疫細胞を刺激して抗アレルギーのサイトカイン濃度を分泌するラクトバチルス・アシドフィラスＰＭ−Ａ０００２、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバシルス・ジョンソニイ（L. johnsonii）、ラクトバチルスアシドフィラスＰＭ−Ａ００１３（特許文献１５参照）や、高いＩｇＥ抗体産生抑制作用を有し、抗アレルギー作用をもつロイコノストック・メセンテロイデスに属する乳酸菌を有効成分として含有する抗アレルギー剤（特許文献１６参照）や、ラクトバチルス・ブルガリクス（L. bulgaricus）、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・アシドフィルス又はその細胞表層若しくは粗ペプチドグリカンからなる花粉アレルギー症状の改善剤（特許文献１７参照）や、ラクトバチルス・パラカゼイの菌体とビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体とを含有する免疫バランス調節用組成物（特許文献１８参照）や、免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有するラクトバチルス・ブレビス（特許文献１９参照）や、ラクトバチルス・デルブリッキー、エンテロコッカス・デュランス（E. durans） 、ロイコノストック・メセントロイデス（L. mesenteroides）を含有する抗アレルギー用組成物（特許文献２０参照）や、ラクトバチルス・クリスパタス（L. crispatus）を含有する抗アレルギー用組成物（特許文献２１参照）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平９−２９５９号公報
【特許文献２】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献３】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献４】特開２００５−１３７３５７号公報
【特許文献５】特開２００５−６８０９２号公報
【特許文献６】特開２００６−６７８８１号公報
【特許文献７】特開２００６−１０４１０７号公報
【特許文献８】特開２００７−５５９８６号公報
【特許文献９】特開２００７−７０２４９号公報
【特許文献１０】特開２００７−１１７０３１号公報
【特許文献１１】特開２００７−１２６３６５号公報
【特許文献１２】特開２００８−５４５５６号公報
【特許文献１３】特開２００８−６１５１２号公報
【特許文献１４】特開２００８−９９６３２号公報
【特許文献１５】特開２００８−１６９１９８号公報
【特許文献１６】特開２００８−２３１０９４号公報
【特許文献１７】特開２００８−２５５０８４号公報
【特許文献１８】特開２００９−５７３４６号公報
【特許文献１９】特開２００９−１１２２３２号公報
【特許文献２０】特開２００９−１４２２６６号公報
【特許文献２１】特開２００９−２０９１３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、相乗的に抗アレルギー効果（花粉症などのアレルギー症状を抑える効果）を有する乳酸菌由来の組成物、該組成物を含有する食品やペットフードなどを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
アレルギー症状を抑えるには、免疫バランスを「Ｔｈ１型」優位に誘導することが有効であり、一般的に、乳酸菌は「Ｔｈ１型」優位に誘導する活性をもつといわれている。本発明者らが見いだした「Ｔｈ１型」優位に誘導する活性を有する乳酸菌ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）における前記活性をより優れたものとするために鋭意研究した結果、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株の菌体と、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriumu）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、 エンテロコッカス（Enterococcus）属及びペディオコッカス（Pediococcus）属等に属する他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、特定の割合で用いることにより、Ｔｈ１型細胞あるいはＴｈ１型細胞から分泌されるサイトカインの量が相乗的に増加することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物と、他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で含有することを特徴とする抗アレルギー作用を有する組成物や、（２）菌体量換算で、９９：１〜７５：２５の割合で含有することを特徴とする前記（１）記載の組成物や、（３）他の乳酸菌が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、 エンテロコッカス（Enterococcus）属及びペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌からなる群から選ばれる１又は２以上の乳酸菌であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の組成物や、（４）ラクトバチルス属の乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・ブルガリカス（L.bulgaricus）、ラクトバチルス・ラムノーサス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantrum）からなる群から選ばれる１又は２以上の乳酸菌であることを特徴とする前記（３）記載の組成物や、（５）死菌が、緩衝液中で加熱処理した菌体であることを特徴とする前記（１）〜（４）記載の組成物や、（６）菌体処理物が、乳酸菌由来のペプチドグリカンであることを特徴とする前記（１）〜（４）記載の組成物や、（７）抗アレルギー作用が、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生能を促進する作用であることを特徴とする前記（１）〜（６）記載の組成物や、（８）抗アレルギー作用が、ＩＬ−１２ｐ７０産生能を促進する作用であることを特徴とする前記（１）〜（７）記載の組成物に関する。
【００１３】
また本発明は、（９）前記（１）〜（８）記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有する医薬品や、（１０）前記（１）〜（８）記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有する飲食品又はサプリメントや、（１１）前記（１）〜（８）記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有するペットフード又はペット用サプリメントや、（１２）前記（１）〜（８）記載の抗アレルギー作用を有する組成物を含有する飼料や、（１３）工程（ａ）〜（ｃ）：（ａ）ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物を調製する工程；（ｂ）他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物を調製する工程；（ｃ）工程（ａ）で調製された生菌、死菌又はその菌体処理物と、工程（ｂ）で調製された生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で配合する工程；を備えた抗アレルギー作用を有する組成物の製造方法や、（１４）ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物と、他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で含有する組成物を、抗アレルギー剤の調製に使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、相乗的に抗アレルギー効果を有する乳酸菌由来の組成物、該組成物を含有する医薬品、食品やサプリメントや、ペットフードやペット用サプリメントや飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株の添加量を検証した実験結果を示す図である。ＫＴ−１１株１％＋ラクトバチルス・プランタラム９９％の割合でも抗アレルギーの相乗効果が認められ、ＫＴ−１１株を７５〜９９％添加したときに相乗効果が顕著に認められた。
【図２】ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株と種々の乳酸菌による相乗効果を検証した実験結果を示す図である。数種の乳酸菌をそれぞれ単体で添加した場合とＫＴ−１１株と併用した場合とを比較し、ＫＴ−１１株が他の乳酸菌の抗アレルギー効果を相乗的に高める（Ｔｈ１型細胞数が相乗的に増加する）ことを検証した。
【図３】ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株と乳酸菌菌体処理物（ペプチドグリカン）との併用効果を検証した実験結果を示す図である。ＫＴ−１１株の死菌体と、ラクトバチルス・アシドフィルス由来のペプチドグリカンとを併用した場合も抗アレルギー効果が相乗的に高まることを検証した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗アレルギー作用を有する組成物（抗アレルギー用組成物）としては、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７：平成１９年１２月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８：平成１９年１２月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９：平成１９年１２月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物と、他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で含有する組成物であれば特に制限されず、また本発明の抗アレルギー作用を有する組成物の製造方法としては、（ａ）ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物を調製する工程;（ｂ）他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物を調製する工程;（ｃ）工程（ａ）で調製された生菌、死菌又はその菌体処理物と、工程（ｂ）で調製された生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で配合する工程; を備えた方法であれば特に制限されず、また本発明の使用方法としては、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５８）及びラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５９）から選ばれる１又は２以上の菌株の生菌、死菌又はその菌体処理物と、他の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物とを、菌体量換算で、９９：１〜５０：５０の割合で含有する組成物を、抗アレルギー剤の調製に使用する方法であれば特に制限されないが、菌体量換算で、９９：１〜７５：２５の割合、中でも７５：２５の割合で含有する組成物が、特に優れた抗アレルギー作用における相乗効果を奏する点で好ましい。ここで、菌体量換算とは、乳酸菌の培養液の遠心分離後の湿菌体質量や、その湿菌体を乾燥させた乾燥菌体質量当たりに換算することを意味する。
【００１７】
上記抗アレルギー作用としては、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生能を促進する作用や、ＩＬ−１２ｐ７０産生能を促進する作用や、インターロイキン４（ＩＬ−４）産生能を抑制する作用や、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）産生能を抑制する作用などを挙げることができ、アレルギーとしては、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、アレルギー性蕁麻疹等のアレルギー疾患を挙げることができる。
【００１８】
上記の他の乳酸菌としては、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属、 エンテロコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属等に属する乳酸菌を好適に例示することができ、これら乳酸菌は１種又は２種以上用いることができる。上記ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・クリスパタス（但し、ＫＴ−１１株、ＫＴ−２３株、ＫＴ−２５株は除く）、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ケフィア等を例示することができる。上記ビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム等を例示することができる。上記ロイコノストック属に属する乳酸菌としては、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス等を例示することができる。上記エンテロコッカス属に属する乳酸菌としては、エンテロコッカス・フェーカリス、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・フェシウム等を例示することができる。上記ペディオコッカス属に属する乳酸菌としては、ペディオコッカス・ペントサセウス等を例示することができる。上記ラクトコッカス属に属する乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス等を例示することができる。上記ストレプトコッカス属に属する乳酸菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス等を例示することができる。
【００１９】
本発明における乳酸菌は、生菌、死菌又はその菌体処理物の形態で使用することができる。上記生菌、死菌又はその菌体処理物としては、乳酸菌の培養液や、乳酸菌の培養液の遠心分離後の湿菌体やその洗浄物やその凍結乾燥粉末、加熱死菌体、乾燥死菌体、菌体壁等の菌体破砕物や菌体溶解物などを例示することができ、緩衝液中で加熱処理した死菌体や、菌体を凍結乾燥処理した後に緩衝液中で加熱処理した死菌体や、乳酸菌由来のペプチドグリカンをより好適に例示することができる。
【００２０】
上記本発明の抗アレルギー作用を有する組成物は、医薬品、飲食品又はサプリメント、ペットフード又はペット用サプリメント、飼料等に有利に用いることができる。本発明の抗アレルギー用組成物をアレルギー疾患の予防・治療用の医薬品やサプリメントとして用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これらに加えて、公知の抗アレルギー剤と併用することができる。これら予防・治療薬等の医薬品は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、経口的に投与することが好ましい。投与量は、予防か治療かの投与目的、骨疾患の種類や重篤度、患者の年齢等に応じて適宜選定することができる。
【００２１】
また、本発明の抗アレルギー用組成物を添加した、アレルギーの予防・治療に用いられる食品や食品素材の種類としては特に制限されず、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。これら食品や食品素材には、公知の抗アレルギー剤を併用してもよい。
【００２２】
また、本発明の抗アレルギー用組成物を配合した飼料としては、ブタ、ウシ、ニワトリ等の家畜・家禽や、イヌ、ネコ等のペット、養殖魚介類の飼育等に有利に用いることができ、かかる飼料には、公知の抗アレルギー剤を併用してもよい。
【００２３】
以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明の技術的範囲は実施例の記載内容に制限されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（添加比率の違いによる抗アレルギー効果の相乗作用）
添加比率の違いによるラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５７）の抗アレルギー効果の相乗作用について以下に示す。
【００２５】
［菌体試料液の調製］
ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株またはラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９ＴをＭＲＳ液体培地にそれぞれ接種し、３７℃、２４時間培養した。培養後、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）で菌体を回収し、蒸留水で３回洗浄した。洗浄した菌体は凍結乾燥処理後、滅菌０．１５Ｍ塩化ナトリウム−０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）に懸濁して熱処理（６５℃、３０分間）したものを菌体試料液とした。
【００２６】
［パイエル板細胞懸濁液の調製と培養］  
６週齢オスのＣ３Ｈ／ＨｅＮ系マウスから腸管パイエル板を摘出し、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で細胞を懸濁した。同上の培地で２回遠心洗浄（４℃、１，３００ｒｐｍ、１５分間）した後、生細胞数が１．０×１０６個／ｍＬになるようにパイエル板細胞懸濁液を調製した。
【００２７】
上記で調製したパイエル板細胞懸濁液１ｍＬを各穴に分注した４８穴平底マイクロプレートに、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株とラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９Ｔの最終添加濃度が合計１０μｇ／ｍＬになるように配合比率を変えて調製した菌体試料液１００μＬを各穴に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。
【００２８】
［ＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数の変化］
培養したパイエル板細胞懸濁液を、１ｍＭＥＤＴＡ、５％ＦＢＳを含むHank’s Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）で遠心洗浄（４℃、１２，０００ｒｐｍ、３秒間）した。洗浄したパイエル板細胞１．０×１０６個を活性化培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にブレフェルジンＡ２０μｇ／ｍＬ、イオノマイシン２μｇ／ｍＬおよびフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート２０ｎｇ／ｍＬを含む）１ｍＬに懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養し、細胞内にサイトカインを産生および蓄積させた。
【００２９】
培養したパイエル板細胞をＨＢＳＳで遠心洗浄（４℃、１２，０００ｒｐｍ、３秒間）した後、ビオチン標識抗マウスＣＤ４抗体を１μＬ添加し、４℃で１５分間反応させた。さらに、ストレプトアビジン−ＰＥ／Ｃｙ５を１μＬ添加して４℃、遮光下で１５分間放置した。反応液をＨＢＳＳで洗浄（４℃、１，２０００ｒｐｍ、３秒間）後、IntraPrep Reagent１を１００μＬ加え、室温遮光下で１５分間放置して細胞を固定化した。ＨＢＳＳで洗浄（４℃、１２，０００ｒｐｍ、３秒間）後、IntraPrep Reagent２を１００μＬ加え、室温遮光下で１５分間反応させて膜透過処理を行った。次いで、Ｔｈ１サイトカインの１つであるＩＦＮ−γを測定するため、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体を１μＬ加え、室温遮光下で１５分間放置した後、再度ＨＢＳＳで遠心洗浄（４℃、１２，０００ｒｐｍ、３秒間）した。洗浄後、Guava Personal Cell Function Analyzer（Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ）を用いて、パイエル板細胞中のＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数（ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋細胞数）の測定を行った。
【００３０】
図１は、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株とラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９Ｔを各割合で添加した時のパイエル板細胞中におけるＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数の相対値を示したものである。ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株：ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９Ｔの比が０：１００のときのＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数を１００％とした。ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株：ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９Ｔの比が０：１００または１００：０の時のＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数相対値と比べて、その比が９９：１、９０：１０、７５：２５の時にＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数相対値は顕著に高まった。このことから、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株とラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９Ｔを、９９：１〜５０：５０、特に９９：１〜７５：２５の割合で添加すると、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株の抗アレルギー作用の相乗効果が得られるものと考えられる。
【実施例２】
【００３１】
（抗アレルギー効果の相乗作用の優位性）
ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株の抗アレルギー効果の相乗作用について以下に示す。
【００３２】
［菌体試料液の調製］
表１に示す供試菌を実施例１と同様の方法でそれぞれ調製し、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株と各供試菌を７５：２５の割合で混合して菌体試料液とした。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
［パイエル板細胞懸濁液の調製と培養およびＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数の変化］
パイエル板細胞懸濁液の調製と培養は実施例１と同様の方法で調製後、パイエル板細胞懸濁液１ｍＬを各穴に分注した４８穴平底マイクロプレートに、各濃度に調製した菌体試料液１００μＬを各穴に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。ＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数の変化を実施例１と同様の方法で測定した。
【００３５】
図２は、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株と各供試菌を添加したときのパイエル板細胞中におけるＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数を相対値で示したものである。ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株を７．５μｇ／ｍＬのみ添加した時のＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数を１００％とした。ＩＦＮ−γ産生ヘルパーＴ細胞数相対値は、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株のみ、あるいは供試菌株のみを添加した場合と比べて、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１と供試菌を両方添加した場合において、いずれも顕著に高かった。このことから、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１は、従来の乳酸菌より抗アレルギー効果が高いことが示された。
【実施例３】
【００３６】
［菌体試料液の調製］
表１に示す供試菌を実施例１と同様の方法でそれぞれ調製し、菌体試料液とした。
【００３７】
［マウスマクロファージ様株化細胞の培養］
マウスマクロファージ様株化細胞であるＪ７７４．１細胞は、５％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁後、滅菌プラスチックシャーレ内で３７℃、５％ＣＯ２存在下でコンフルの状態まで培養したものを用いた。１×１０６個／ｍＬに調製したＪ７７４．１細胞懸濁液１ｍＬを分注した４８穴平底マイクロプレートに、最終濃度が０または１μｇ／ｍＬに調製したラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株の菌体試料液とＰＢＳに溶解させた市販のラクトバチルス・アシドフィルス由来のペプチドグリカン溶液（和光純薬工業株式会社製「ペプチドグリカンタイプII」）をそれぞれ１００μＬずつを各穴に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。培養後、４℃、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、培養上清液を回収した。
【００３８】
［ＩＬ−１２ｐ７０産生量］
培養上清液中のＩＬ−１２ｐ７０量は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。すなわち、１００μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−１２ｐ７０抗体と４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）１００μＬを９６穴マイクロプレートの各穴に分注し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、０．４％ＢＳＡを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液３００μＬを加え、２５℃で１２０分間静置した。再びＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、０．４％ＢＳＡと２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むＰＢＳ−Ｔで最適な倍率に希釈した培養上清液１００μＬを各穴に分注し、２５℃で１２０分間反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、２％ＰＶＰを含むＰＢＳ−Ｔで最適な倍率に希釈したビオチン標識抗マウスＩＬ−１２ｐ７０抗体溶液１００μＬを各ウェルに分注し、２５℃で６０分間反応させた。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、２％ＰＶＰを含むＰＢＳ−Ｔで最適な倍率に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン溶液１００μＬを各穴に分注し、２５℃で３０分間反応させた。ＴＭＢ溶液１００μＬを各穴に分注し、完全に遮光して２５℃で３０分間反応させた後、４Ｎ硫酸１００μＬを各穴に分注して反応を停止させ、直ちにＢｉｏ−Ｒａｄモデル５５０マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお，ＩＬ−１２ｐ７０量は既知濃度のＩＬ−１２ｐ７０から得たスタンダード曲線より算出した。
【００３９】
図３は、市販乳酸菌ペプチドグリカンを添加して培養したＪ７７４．１細胞の培養液上清中のＴｈ１サイトカインであるＩＬ−１２ｐ７０量を示したものである。結果の有意性は、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株無添加の時のＩＬ−１２ｐ７０量を基準として、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株を添加した場合をスチューデントのＴ検定より判定した。市販乳酸菌ペプチドグリカンを１０および１００μｇ／ｍＬを添加して培養したＪ７７４．１細胞の培養液上清中のＩＬ−１２ｐ７０量は、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株無添加の場合と比べて、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株を添加した時に有意に増加した。このことから、ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１株は、乳酸菌の主要細胞壁成分であるペプチドグリカンの抗アレルギー作用を相乗的に高めることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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