(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有する新規なポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。【解決手段】ヒト由来の腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有する新規なポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸分子。また、それらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した該ポリペプチドを含むキメラ分子、該ポリペプチドに結合する抗体、及び該ポリペプチドを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：３のアミノ酸残基１〜２９９の配列を含むＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、配列番号：１又はその相補鎖の核酸配列を含む請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、配列番号：１の核酸配列のヌクレオチド１−９００を含む請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３９０６のｃＤＮＡ（ＤＮＡ９８８５３）にコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項５】
ＡＴＣＣ寄託番号２０３９０６のｃＤＮＡ（ＤＮＡ９８８５３）にコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜Ｘの配列を含むＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなり、ＸがＦｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１３１−１４１のいずれかである単離された核酸。
【請求項７】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２９９を含むＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに緊縮性の条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ配列；
（ｃ）遺伝暗号の縮重により（ａ）のＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ
からなる群からのＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項９】
当該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。    
【請求項１１】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が大腸菌細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が酵母菌細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載の宿主細胞を、前記ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から前記ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを回収することを含んでなるＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの製造方法。
【請求項１５】
Ｆｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２９９を含んでなる単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチド。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ受託番号２０３９０６（ＤＮＡ９８８５３）として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされる単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｆｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜Ｘを含んでなり、ＸがＦｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１３１−１４１のいずれかである単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜Ｘを含んでなり、ＸがＦｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１３１−１４１のいずれかであるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド；及び
（ｂ）（ａ）の断片であり、前記断片が生物学的に活性なポリペプチドである断片
からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチド。
【請求項１９】
異種アミノ酸配列に融合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項２０】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１９に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項１９に記載のキメラ分子。
【請求項２２】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
請求項１５に記載の単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドと担体とを含んでなる組成物。
【請求項２５】
前記担体が製薬的に許容可能な担体である請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜２９７の配列を含むＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項２７】
前記ＤＮＡが、配列番号：４又はその相補鎖の核酸配列を含む請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
前記ＤＮＡが、配列番号：４の核酸配列のヌクレオチド１-８９４を含む請求項２６に記載の核酸。
【請求項２９】
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３９０７のｃＤＮＡ（ＤＮＡ１０１８４８）にコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項３０】
ＡＴＣＣ寄託番号２０３９０７のｃＤＮＡ（ＤＮＡ１０１８４８）にコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜Ｘの配列を含むＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなり、ＸがＦｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１３１−１４１のいずれかである単離された核酸。
【請求項３２】
（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜２９７を含むＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡに緊縮性の条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ配列；
（ｃ）遺伝暗号の縮重により（ａ）のＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ
からなる群からのＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項３３】
請求項２６に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項３４】
当該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。    
【請求項３６】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記細胞が大腸菌細胞である請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記細胞が酵母菌細胞である請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３５に記載の宿主細胞を、前記ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から前記ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを回収することを含んでなるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの製造方法。
【請求項４０】
Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜２９７を含んでなる単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド。
【請求項４１】
ＡＴＣＣ受託番号２０３９０７（ＤＮＡ１０１８４８）として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされる単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド。
【請求項４２】
Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜Ｘを含んでなり、ＸがＦｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１３１−１４１のいずれかである単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド。
【請求項４３】
（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜Ｘを含んでなり、ＸがＦｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１３１−１４１のいずれかであるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド；及び
（ｂ）（ａ）の断片であり、前記断片が生物学的に活性なポリペプチドである断片
からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド。
【請求項４４】
異種アミノ酸配列に融合したＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項４５】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項４４に記載のキメラ分子。
【請求項４６】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項４４に記載のキメラ分子。
【請求項４７】
ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項４８】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
請求項４０に記載の単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドと担体とを含んでなる組成物。
【請求項５０】
前記担体が製薬的に許容可能な担体である請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
哺乳動物細胞を有効量のＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに暴露することを含んでなる哺乳動物細胞におけるアポトーシスを変調させる方法。
【請求項５２】
哺乳動物細胞を有効量のＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに暴露することを含んでなる哺乳動物細胞におけるＮＦ-ＫＢ活性化を変調させる方法。
【請求項５３】
哺乳動物細胞を有効量のＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに暴露することを含んでなる哺乳動物細胞における炎症誘発又は自己免疫反応を変調させる方法。
【請求項５４】
哺乳動物細胞を有効量のＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドアンタゴニストに暴露することを含んでなる哺乳動物細胞におけるＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドの生物学的活性を阻害又は中和する方法。
【請求項５５】
ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８レセプターイムノアドヘシンを含む前記ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドアンタゴニストである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
イムノグロブリンのＦｃ領域に融合させたＤＮＡ１０１８４８細胞外ドメイン配列を含む前記ＤＮＡ１０１８４８レセプターイムノアドヘシンである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリキシアルキレンを含んでなる群から選択される非タンパク質性ポリマーに結合されたＤＮＡ１０１８４８を含む前記ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドアンタゴニストである請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
異種アミノ酸配列に結合されたＤＮＡ１０１８４８レセプターポリペプチド又はＤＮＡ９８８５３レセプターポリペプチドを含む前記ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドアンタゴニストである請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記異種配列がエピトープタグ配列である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記異種配列がロイシンジッパー配列である請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ＤＮＡ１０１８４８レセプター抗体及びＤＮＡ９８８５３レセプター抗体によって構成される群から選択された抗体を含む前記ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドアンタゴニストである請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、新規なＤＮＡの同定及び単離、並びに、ここに「ＤＮＡ９８８５３」ポリペプチド及び「ＤＮＡ１０１８４８」ポリペプチと命名する腫瘍壊死因子レセプターに相同性を有する新規ポリペプチドの組換体の生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物における細胞数のコントロールは、一部は細胞増殖と細胞死のバランスにより決定されると考えられている。壊死性細胞死と称されることもある細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特徴付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barr等, Bio/Technology, 12：487-493 (1994); Steller等, Science, 267: 1445-1449 (1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itoh等, Cell, 66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、ヘルペスウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している［Thompson, Science, 267：1456-1462(1995)］。アポトーシス細胞死のレベルの増加は、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側方硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、再生不良性貧血、心筋梗塞、発作、再灌流障害、及び毒素誘発肝疾患を含む様々な他の病理学的状態を伴う［Thompson, 上掲］。
【０００３】
アポトーシス性細胞死には、典型的には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の断片化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Raff, Nature, 356：397-400(1992)；Steller, 上掲;  Sachs等, Blood, 82：15(1993)］。例えば、それらは、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunaga等, Nature, 356：314-317(1992)］。また、幾つかの同定された発癌遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサーは、ｐ５３と同様に、アポトーシスの誘発においてある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている［Thompson, 上掲］。
【０００４】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β（「ＬＴ-β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＬＩとも称される）、Ａｐｏ-３リガンド（ＴＷＥＡＫとも称される）、ＥＤＡ及びＥＤＡ-Ａ２が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995); Pitti等, J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996); Wiley等, Immunity, 3: 673-682 (1995); Browning等, Cell, 72: 847-856 (1993); Armitage等, Nature, 357: 80-82 (1992), 1997年1月16日発行のWO 97/01633; 1997年7月17日発行のWO 97/25428参照；Marsters等, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheportiche等, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Bayes等, Human Molecular Genetics, 7:1661-1669(1998)；Kere等, Nature Genetics, 13:409-416(1996)］。これらの分子の中でも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ-２リガンド(TRAIL)及びＡｐｏ-３リガンド（ＴＷＥＡＫ）は、アポトーシス性細胞死に含まれていることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性の死を誘発することが報告されている［Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtry等, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。ゼング(Zheng)等は、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジティブＴ細胞の刺激後アポトーシスに含まれることを報告している［Zheng等, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者らは、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠落に関与していることを報告している［Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。
【０００５】
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子(各々ｌｐｒ及びｇｌｄと呼称される)における変異が幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン欠落の調節においてある役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6：279-289(1994)； Nagata等, Science, 267：1449-1456(1995)］。また、Ａｐｏ-１リガンドは、ＣＤ４-ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球において刺激後アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammer等, 上掲； Nagata等, 上掲］。Ａｐｏ-１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yonehara等, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。
【０００６】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応の誘発は、それらが特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohman等, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたEP417,563］、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscher等, Cell, 61：351(1990)；Schall等, Cell, 61：361(1990)；Smith等, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。双方のＴＮＦレセプター遺伝子には広範な多型性が付随している［例えば、Takao等, Immunogenetics, 37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分は、可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Y等, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。可溶性の組換体ＴＮＦレセプターのクローニングがヘイル(Hale)等により報告されている［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１〜４と呼称される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schall等, 上掲；Loetscher等, 上掲；Smith等, 上掲；Nophar等, 上掲；Kohno等, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Banner等, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)等により記載されている。
【０００８】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnson等, Cell, 47：545(1986)；Radeke等, Nature, 325: 593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic等, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet等, EMBO J., 9:1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66: 233-243 (1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Upton等, Virology, 160：20-29(1987)；Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Upton等, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：159-163(1991)］又はこのドメインにおける５-アミノ酸の挿入［Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合に殆ど又は全く影響を持たないことが示されている［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲは、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含み、それはＮＧＦ結合に関与しない［Peetre, C.等, Eur. J. Hematol.,41：414-419(1988)；Seckinger, P.等, J. Biol. Chem., 264：11966-11973(1989)；Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１には見られない。
【０００９】
今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、リンホトキシン-αを除き、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーの殆どのレセプターはＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【００１０】
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定された。これら新たに同定されたＴＮＦＲファミリーのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテゲリン(osteoprotegerin)（ＯＰＧ）を含む［Brojatsch等, Cell, 87: 845-855 (1996); Montgomery等, Cell, 87: 427-436 (1996); Marsters等, J. Biol. Chem., 272: 14029-14032 (1997); Simonet等, Cell, 89, 309-319 (1997)］。他の知られたＴＮＦＲ様分子とは異なり、上掲のシモネット(Simonet)等は、ＯＰＧが疎水性膜貫通配列を含まないと報告している。
【００１１】
さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーの新規なメンバーがマウスにおいて同定され、レセプターは、「糖質コルチコイド誘発腫瘍壊死因子レセプターファミリー関連遺伝子」に対して「ＧＩＴＲ」と命名された［Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216-6221 (1997)］。マウスＧＩＴＲレセプターは２２８アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質であり、胸腺、脾臓及びリンパ節からの正常マウスＴリンパ球において発現される。マウスＧＩＴＲレセプターの発現は、抗-ＣＤ３抗体、ＣｏｎＡ又はホルボール１２-ミリステート１３-アセテートでの活性化の際にＴリンパ球で誘発される。筆者は、ＧＩＴＲレセプターがＴ細胞レセプター媒介細胞死の調節に関与していると考えている。
【００１２】
マースターズ(Marsters)等、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復においてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ている、Ａｐｏ-３と称されるヒトのポリペプチド全長天然配列を開示している［Marsters等,Curr. Biol., 6：1669(1996)も参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ-３は、ＤＲ３、ｗｓｌ-１、ＴＲＡＭＰ及びＬＡＲＤとも称されている［Chinnaiyan等, Science, 274：990(1996)；Kitson等, Nature, 384：372(1996)；Bodmer等, Immunity, 6：79(1997)；Screaton等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4615-4619(1997) ］。
【００１３】
パン(Pan)等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させることにできる細胞内死亡ドメインを含むと報告された。パン等は、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られるリガンドのレセプターであると考えられることを開示している。
シェリダン(Sheridan)等, Science, 277: 818-821 (1997)及びパン等, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対するレセプターと思われる他の分子が記載されている。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-２，ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれる［Screaton等, Curr. Biol., 7:693-696(1997)；Walczak等, EMBO J., 16:5386-5387(1997)；Wu等, Nature Genetics, 17:141-143(1997)］）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞内死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。
さらに他の細胞質死ドメインを含むレセプターであるＤＲ６が最近同定された［Pan等, FEBS Letters, 431:351-356(1998)］。４つの予想される細胞外ドメイン及び細胞質死ドメインの他に、ＤＲ６は細胞質領域におけるプロリンに富む領域とオーバーラップするような予想されるロイシンジッパー配列を含むと考えられている。プロリンに富むモチーフはsrc相同性-３領域と結合する配列に類似しており、それは多くの細胞内シグナル伝達分子に見出されるものである。
最近同定されたレセプターのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達分子というよりはむしろ、阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ，ＬＩＴ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；Sheridan等, Science, 277: 818-821 (1997)；McFarlane等, J. Biol. Chem., 272:25417-25420(1997)；Schneider等, FEBS Letters, 416:329-334(1997)；Degli-Esposti等, J. Exp. Med., 186:1165-1170(1997)；及びMongkolsapaya等, J. Immunol., 160:3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marsters等, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Pan等, FEBS Letters, 424:41-45(1998)；Degli-Esposti等, Immunity, 7:813-820(1997)］が含まれ両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［Simonet等、上掲］及びＤＣＲ３［Pitti等, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプター類の概説については、Ashkenazi等, Science, 281:1305-1308(1998)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；及び上掲のGruss及びDowerを参照されたい。
【００１４】
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な要素−活性化因子、阻害剤及びエフェクターを含み；線虫(C. elegans)において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-９及びＣｅｄ-３によりコードされている［Steller, Science, 267：1445(1995)；Chinnaiyan等, Science, 275：1122-1126(1997); Wnag等, Cell, 90: 1-20 (1997)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ(ＣＤ９５)は、アポトーシス性細胞死を活性化し得る［Chinnaiyan及びDixit, Current Biology, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell, 85：781-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を媒介することも知られている［Tartaglia等, Cell, 74：845-853(1993)；Hsu等, Cell, 84：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ＩＣＤ)での相同性を共有する［Tartaglia, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997)］。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節するいくつかの後生動物タンパク質、すなわちＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Cleaveland及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。
【００１５】
リガンド結合及びレセプター集団化に際して、ＴＮＦＲ１及びＣＤ９５はＦＡＤＤを死亡誘導シグナル伝達複合体に補充すると考えられる。ＣＤ９５はＦＡＤＤに直接結合するが、ＴＮＦＲ１はＦＡＤＤにＴＲＡＤＤを介して間接的に結合するとされている［Chinnaiyan等, Cell, 81: 505-512 (1995); Boldin等, J. Biol. Chem., 270: 387-391 (1995); Hsu等, 上掲; Chinnaiyan等, J. Biol. Chem., 271: 4961-4965 (1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３-関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ（カスパーゼ８）を死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプタータンパク質として提供されると報告されている［Boldin等, Cell, 85: 803-815 (1996); Muzio等, Cell, 85: 817-827 (1996)］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、インターロイキン-１β変換酵素（ＩＣＥ）及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを作動させるトリガーであることがわかり、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実行させ得る［Fraser及びEvan, 上掲］。
【００１６】
プログラムされた細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害され得る［Ray等, Cell, 69：597-604(1992)；Tewari等, Cell, 81：801-809(1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を阻害し得ることが示されている［Enari等, Nature, 375：78-81(1995)；Tewari等, J. Biol. Chem., 270：3255-3260(1995)］。
【００１７】
テワリ(Tewari)等により最近概説されているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含有する二量体転写因子のファミリーの原型である［Verma等, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκＢ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。
このようなシグナル伝達経路の最近の他の総説として、例えばAshkenazi等, Science, 281:1305-1308(1998)及びNagata, Cell, 88:355-365(1997)を参照のこと。
【００１８】
（発明の概要）
本出願人は、上記腫瘍壊死因子レセプタータンパク質に所定の配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定し、当該ポリペプチドは本出願において「ＤＮＡ９８８５３」ポリペプチド及び「ＤＮＡ１０１８４８」ポリペプチドと命名される。
一実施態様では、本発明は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子を提供する。特定の態様では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２９９、又は１〜１３６を有するＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、又はそのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高い緊縮性条件下で安定に結合したままである。単離された核酸配列は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする核酸配列を含む1999年4月6日にＡＴＣＣ２０３９０６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物を含んでもよい。
【００１９】
他の実施態様では、本発明はＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。また、そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。さらに、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの製造方法も提供され、宿主細胞をＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを提供し、一実施態様ではＦｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２９９を含むアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様は、Ｆｉｇ２（配列番号：３）に示したアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３６を含む単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの細胞外ドメイン配列、又はその断片に係る。場合によっては、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、1999年4月6日にＡＴＣＣ２０３９０６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされるポリペプチドの発現によって得られ又は得られうる。
【００２０】
他の実施態様では、本発明は異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又は細胞外ドメイン配列又はその他の断片を含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明はＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はその細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
さらなる実施態様では、本発明はＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる診断又は治療方法を提供する。
【００２１】
一実施態様では、本発明は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子を提供する。特定の態様では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜２９７、又は１〜１３６を有するＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、又はそのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高い緊縮性条件下で安定に結合したままである。単離された核酸配列は、ＤＮＡ１０１８４８をコードする核酸配列を含む1999年4月6日にＡＴＣＣ２０３９０７として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物を含んでもよい。
【００２２】
他の実施態様では、本発明はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。また、そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。さらに、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの製造方法も提供され、宿主細胞をＤＮＡ１０１８４８の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＤＮＡ１０１８４８を回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを提供し、一実施態様ではＦｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１〜２９７を含むアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様は、Ｆｉｇ４（配列番号：６）に示したアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３６を含む単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの細胞外ドメイン配列、又はその断片に係る。場合によっては、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、1999年4月6日にＡＴＣＣ２０３９０７として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされるポリペプチドの発現によって得られ又は得られうる。
【００２３】
他の実施態様では、本発明は異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又は細胞外ドメイン配列又はその他の断片を含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はその細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
さらなる実施態様では、本発明はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる診断又は治療方法を提供する。
【００２４】
驚くべきことに、出願人はＥＤＡ-Ａ２と称するＴＮＡファミリーリガンドがＤＮＡ１０１８４８レセプターに結合することを見出した。従って、本発明は、これらＴＮＦ関連リガンド及びレセプターのアンタゴニスト又はアゴニストの新規使用方法を提供する。ここに記載されているアンタゴニスト及びアゴニストは、他の事柄において、インビトロ、インサイツ、インビボにおける哺乳動物細胞の診断又は治療、もしくはＥＤＡ-Ａ２の存在（又は非存在）と関連したは病理学的な状態に対する用途が見出される。
本使用方法には、ＥＤＡ-Ａ２の発現及び/又は活性の増加又は増強に、関連し又は起因する哺乳動物の病理学的な状態又は疾患を治療する方法が含まれる。治療方法においては、ＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストがそのような病理学的な状態又は疾患に罹っている哺乳動物に投与されてもよい。本発明において使用が考慮されるＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストには、ＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３レセプターに対する抗体以外にＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３レセプターイムノアドヘシンが含まれ、これらは好適には個々のレセプター結合又はＥＤＡ-Ａ２による活性を阻害又は減少させる。さらに使用が考慮されるＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストには、ＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３レセプターに対するリガンドの結合を阻害し又は減少させることができる抗ＥＤＡ-Ａ２抗体が含まれる。さらに、アンタゴニスト分子には、共有結合的に修飾された形態、もしくはＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３を含む融合タンパク質が含まれる。例えば、このようなアンタゴニストは、ペグ化（pegylated）ＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３、もしくはエピトープタグやロイシンジッパーのような異種配列と融合させたＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３が含まれる。
【００２５】
本発明の他の実施態様において、ＥＤＡ-Ａ２とＤＮＡ１０１８４８又はＤＮＡ９８８５３間における相互作用を阻害し、中和するＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストの使用に対する方法が提供されている。例えば、本発明はＥＤＡ-Ａ２リガンドの活性を減少させ、中和させ、阻害するのに効果的な量の一又は複数のＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストに対して哺乳動物細胞を曝す事を含む方法を提供する。細胞は、培養細胞又は哺乳類、例を挙げるならば、例えば免疫関連疾患又は癌に罹患している哺乳類の細胞である。従って、本発明には免疫関連疾患や癌のような病理学的な状態に罹っている哺乳動物を治療する方法が含まれ、ここに開示するように一又は複数のＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストを投与することを含む。
本発明はまた一又は複数のＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストを含んでなる組成物を提供する。場合によっては、本発明の組成物は製薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。
【００２６】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用されるときの「ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド」という用語には、天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及びＤＮＡ９８８５３ポリペプチド変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離され、あるいは組換え又は合成法により調製されうる。
「天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド」は、天然由来のＤＮＡ９８８５３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド」という用語には、特に、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの自然に生じる切断、可溶性又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列又は可溶性形態)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、Ｆｉｇ２(配列番号：３)のアミノ酸１〜２９９を含有する成熟又は全長天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドである。本発明の他の実施態様において、天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドタンパク質の細胞外ドメインでもあるが、全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの予想される膜貫通ドメインはＦｉｇ２（配列番号：３）に示されるアミノ酸配列１３７-１５８を含有する。従って、本発明のさらなる実施態様は、Ｆｉｇ２（配列番号：３）に示されるアミノ酸配列１-１３６を含有するポリペプチドに対して指向されている。あるいは、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０３９０６として１９９９年４月６日に寄託されたベクターＤＮＡ９８８５３のｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドを発現させることにより得られ又は得られうる。
【００２７】
「ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド細胞外ドメイン」又は「ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドＥＣＤ」は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの型を意味する。通常、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。場合によっては、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドＥＣＤは、Ｆｉｇ２(配列番号：３)のアミノ酸残基１〜１３６を含む。一又は複数のアミノ酸Ｎ-又はＣ-末端から欠失してされている全長もしくはＥＣＤの欠失変異又はフラグメントが含まれる。好適には、そのような欠失変異もしくはフラグメントはここで記載されるような所望の活性を有する。当業者には、本発明のＤＮＡ９８８５３ポリペプチドについて同定された膜貫通ドメインが、この分野におけるその種の疎水性ドメインの同定に日常的に用いられる基準に従って同定されることを理解するであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変動するが、最も可能性が高いのは、ここに特に述べたドメインのいずれかの末端における約５アミノ酸以下である。従って、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドＥＣＤは、場合によってはＦｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸１からＸを含み、ここでＸはＦｉｇ２（配列番号：３）のアミノ酸残基１３１〜１４１の任意の一つである。
【００２８】
「ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド変異体」とは、全長天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに対してＦｉｇ２（配列番号：３）に示されている推定アミノ酸配列又はＤＮＡ９８８５３ポリペプチドＥＣＤ配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義するＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを意味する。このようなＤＮＡ９８８５３ポリペプチド変異体には、例えば、Ｆｉｇ２(配列番号：３)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加され、もしくは欠失されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドが含まれる。通常、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド変異体は、Ｆｉｇ２(配列番号：３)のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、なお一層より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００２９】
ここで使用されるときの「ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド」という用語には、天然のＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド配列及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。
「天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド」は、天然由来のＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド」という用語には、特に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの自然に生じる切断、可溶性又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列又は可溶性形態)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、Ｆｉｇ４(配列番号：６)のアミノ酸１〜２９７を含有する成熟又は全長天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドである。本発明の他の実施態様において、天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドタンパク質の細胞外ドメインでもあるが、全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドタンパク質の予想される膜貫通ドメインはＦｉｇ４（配列番号：６）に示されるアミノ酸配列１３７-１５８を含有する。従って、本発明のさらなる実施態様は、Ｆｉｇ４（配列番号：６）に示されるアミノ酸配列１-１３６を含有するポリペプチドに対して指向されている。あるいは、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０３９０７として１９９９年４月６日に寄託されたベクターＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドを発現させることにより得られ又は得られうる。
【００３０】
「ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド細胞外ドメイン」又は「ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドＥＣＤ」は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの型を意味する。通常、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドＥＣＤは、そのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。場合によっては、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドＥＣＤは、Ｆｉｇ４(配列番号：６)のアミノ酸残基１〜１３６を含む。一又は複数のアミノ酸Ｎ-又はＣ-末端から欠失してされている全長もしくはＥＣＤの欠失変異又はフラグメントが含まれる。好適には、そのような欠失変異もしくはフラグメントはここで記載されるような所望の活性を有する。当業者には、本発明のＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドについて同定された膜貫通ドメインが、この分野におけるその種の疎水性ドメインの同定に日常的に用いられる基準に従って同定されることを理解するであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変動するが、最も可能性が高いのは、ここに特に述べたドメインのいずれかの末端における約５アミノ酸以下である。従って、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドＥＣＤは、場合によってはＦｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸１からＸを含み、ここでＸはＦｉｇ４（配列番号：６）のアミノ酸残基１３１〜１４１の任意の一つである。
【００３１】
「ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド変異体」とは、全長天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対してＦｉｇ４（配列番号：６）に示されている推定アミノ酸配列又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドＥＣＤ配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義するＤＮＡ１０１８４８を意味する。このようなＤＮＡ１０１８４８変異体には、例えば、Ｆｉｇ４(配列番号：６)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加され、もしくは欠失されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドが含まれる。通常、ＤＮＡ１０１８４８変異体は、Ｆｉｇ４(配列番号：６)のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、なお一層より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を有している。
【００３２】
ここで同定されるポリペプチドアミノ酸配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合に、アミノ酸残基、例えば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。配列アラインメントを行い及び配列同一性の決定をする方法は、当該技術の分野に属する者にとって公知であり、過度の実験を行うことなく達成でき、同一性値の計算は的確に得られる。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の方法、例えばＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウェア 、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２［Altschul等, Meth. Enzym., 266:460-480(1996)］、ＡＬＩＧＮ-２［Genentech, Incにより著され.,及び, U.S. Copyriht office により１９９１年１２月１０日に出願された］、ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。さらに、コンピュータープログラム中の初期設定パラメータを使用することでアラインメントを行うことができる。
【００３３】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得る又は幾つかの他の試薬により同定され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００３４】
「単離された」とは、ここで開示される種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され及び分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、典型的にはポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様(proteinaceous)又は非タンパク質様(nonproteinaceous)の溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(２)クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一となるまで精製される。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３５】
「単離された」ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸分子は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され分離された核酸分子である。単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある場合にＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸分子を含む。
【００３６】
「単離された」ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸分子は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され分離された核酸分子である。単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある場合にＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸分子を含む。
【００３７】
「ＥＤＡ-Ａ２」又は「ＥＤＡ-Ａ２リガンド」は、ＴＮＦ関連分子と称される、例えばBayes等, Human Molecular Genetics, 7:1661-1669(1998)に記述されいる。ここで使用されるときの「ＥＤＡ-Ａ２」又は「ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチド」という用語には、「天然配列ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチド」及び「ＥＤＡ-Ａ２変異体」が含まれる。「ＥＤＡ-Ａ２」は、Bayes等、上掲に示されているポリペプチド配列及びその変異体を含む核酸分子、並びにBayes等、上掲に開示されている天然配列ＥＤＡ-Ａ２の生物学的活性（好ましくは、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８レセプターと結合する能力）を有する上述のフラグメント配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドに与えられた命名である。ＥＤＡ-Ａ２の生物学的に活性のある変異体は、Bayes等、上掲により記述されている天然ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチド配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％、のアミノ酸配列同一性を有している。「天然配列」ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドは、天然由来のＥＤＡ-Ａ２と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチド」という用語には、特に、自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。出願人は、Bayes等、上掲によって開示されたリガンドのＥＤＡ-Ａ１型は、出願人によるＤＮＡ１０１８４８-ｈＦｃ構築物（本構築物は以下の実施例において記載してある）には結合しないことを見出し、従って、特別のリガンドのＥＤＡ-Ａ１型は本定義の目的に対する生物学的に活性のある変異体ではないかもしれないと考えられている。
【００３８】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３９】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に配置されているときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現されるなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合しており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて翻訳枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００４０】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗-ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、特に単一の抗-ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体組成物、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。
【００４１】
ここで意図している「活性」又は「活性な」は、天然に存在し天然に産するＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持している形態、天然に存在し天然に産するＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持している形態、を称する。そのような活性には、ＥＤＡ-Ａ２リガンドと結合する能力の他に、哺乳動物細胞において例えば、（作用的あるいは拮抗的方法のいずれかで）アポトーシス、炎症誘発性又は自己免疫性反応を変調させることが含まれる。作用的活性には活性を刺激し又は亢進する能力が含まれる一方、拮抗的活性には活性を阻止、抑制あるいは中和する能力が含まれる。
【００４２】
ここで使用される「イムノアドヘシン」なる語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）と、免疫グロブリンの定常領域のエフェクター機能とを組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外の（即ち、「異種的な」）所望の結合特異性を有するアドヘシンのアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、もしくはＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００４３】
「アンタゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドの、インビトロ、インサイツ、インビボにおける一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＥＤＡ-Ａ２のそのような生物学的活性の例には、文献においてさらに報告されているもの以外に、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８との結合、及びＮＦ-ＫＢの活性化を含む。
【００４４】
「ＥＤＡ-Ａ２のアンタゴニスト」は、ＥＤＡ-Ａ２の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和するが任意の分子に適用するが、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８の細胞外ドメイン配列、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８レセプターイムノアドヘシン、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８レセプター融合タンパク質、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８レセプターの共有結合的に修飾された形体、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８の変異体、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８レセプター抗体の可溶性型に限定されない。ＥＤＡ-Ａ２のアンタゴニスト分子が、ＥＤＡ-Ａ２の生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和するかどうか決定するために、アンタゴニスト分子の、例えば、ＥＤＡ-Ａ２のＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８との結合、もしくはＮＦ-κＢのそれぞれのリガンドによる活性化に対する効果を測定するためにアッセイが行われる。そのようなアッセイは、公知のインビトロ、インビボ形式、例えば、ＤＮＡ１０１８４８を発現する形質移入細胞において行われてもよい。好適には、ここで記載される方法において用いられるＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストは、少なくともＥＤＡ-Ａ２活性の一つの型を阻害し中和する能力があり、その能力は、場合によっては、ここで記載されるようなアッセによって決定される。または、ＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストは、実施例において記述されているような結合アッセイにおいて、ネガティブコントロールの分子と比較してＥＤＡ-Ａ２のＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８との結合を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％減少又は阻害する能力である。
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
【００４５】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば全てこの分野で知られている細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法により決定及び測定することができる。
【００４６】
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００４７】
「免疫関連疾患」とは、哺乳動物の免疫系の構成成分が哺乳動物において病的な状態をを引き起こし、仲介し、または寄与するような疾患を意味する。また、免疫反応の促進又は処置が、疾患の進行に対して改善的な効果を有するような疾患をも含む。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症誘発性疾患、非免疫媒介炎症誘発性疾患、感染性疾患、および免疫不全性疾患が含まれる。免疫関連炎症誘発性疾患の例として、そのいくつかは免疫又はＴ細胞媒介であり、全身性エリトマトーデス、間接リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患、（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、特発性脱髄性多発神経障害、Guillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害のような中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス）のような肝胆道疾患、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症誘発性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン疾患）のような炎症誘発性及び線維性肺疾患、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性ヒス疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、喘息のようなアレルギー性疾患、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、好酸球性肺炎のような肺の免疫学的疾患、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患である。感染性疾患にはエイズ（ＨＩＶ感染）、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、細菌性感染症、真菌性感染症、原生動物感染症、寄生虫感染症が含まれる。
【００４８】
ここで用いられる「自己免疫性疾患」という用語は、広く、一般的な意味で用いられ、正常又は健康な組織の破壊が個々の哺乳動物の彼もしくは彼女自身の組織成分に対する体液性又は細胞内免疫反応から発症する哺乳動物における疾患又は状態のことをいう。例としては、限定されるものではないが、エリトマトーデス、甲状腺炎、リウマチ性関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症誘発性腸疾患（ＩＢＤ）である。
【００４９】
ここで用いられる「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射活性アイソトープ（例えばＩ131，Ｉ125，Ｙ90，Ｒｅ186，）、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物又は動物起源、又はそれらのフラグメントの酵素的に活性な毒素のようなものを含むことが意図されている。
【００５０】
「化学治療薬」は、治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol(商品名), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxotere(商品名), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ＣＰＴ-１１、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第4,675,187号）、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である
【００５１】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ、インビボにおいて細胞の成長を阻害する化合物又は組成物のことを称する。従って、成長阻害剤の例には、Ｓ期の遺伝子を過発現させる細胞の割合を著しく減少させるようなものである。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の時点において)、例えばＧ１停止及びＭ相停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、トポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ相停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００５２】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のような糖タンパク質；副甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；マレリアン(mullerian)阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−６、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＡＬ−１あるいは他のｅｐｈ受容体ファミリーのリガンド等の神経因子あるいは神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αあるいはＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、 ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、 ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等のインターロイキン（ＩＬ）；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書において、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００５３】
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００５４】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＤＮＡ９８８５３と称されるポリペプチドをコードする、新たに同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラム（初期設定パラメータ）を用いて、本出願人は、腫瘍壊死因子レセプターファミリーの幾つかのメンバーとある程度のアミノ酸同一性を有することを見いだした。従って、本出願において開示されるＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、腫瘍壊死因子レセプターファミリーポリペプチドの新規に同定されたメンバーである。
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドによるＮＦ-κＢの活性化は、哺乳動物細胞におけるアポトーシス、炎症誘発性及び自己免疫性反応を変調することにおける、本タンパク質の機能を示唆する。例えば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドイムノアドヘシン分子（例えば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドＥＣＤ-Ｉｇ構築物）がＮＦ-κＢの活性化をアンタゴニスト的な様式で阻害するために使用され得ることも考慮することができる。
【００５５】
Ｂ．全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドと称されるポリペプチドをコードする、新たに同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラム（初期設定パラメータ）を用いて、本出願人は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの一部が、腫瘍壊死因子レセプターファミリーの幾つかのメンバーとある程度の配列同一性を有することを見いだした。従って、本出願において開示されるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、腫瘍壊死因子レセプターファミリーポリペプチドの新規に同定されたメンバーである。
ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのｍＲＮＡの発現は幾つかの細胞及び組織で観察された。Ｆｉｇ７に示す通り、相対的に高い発現レベルのＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのｍＲＮＡの発現レベルが、２つの腫瘍細胞系、肺癌腫Ａ５４９及びメラノーマＧ３６１において検出された。相対的に弱い発現レベルが、前立腺、精巣、卵巣、甲状腺、脊髄、副腎組織において見出された。興味深いことに、胃の組織においてより小さな転写産物が相対的に高い発現レベルで存在していた。
ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドによるＮＦ-ＫＢの活性化は、哺乳動物細胞におけるアポトーシス、炎症誘発性及び自己免疫性反応を変調することにおける、本タンパク質の機能を示唆する。例えば、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドイムノアドヘシン分子（例えば、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドＥＣＤ-Ｉｇ構築物）がＮＦ-ＫＢの活性化をアンタゴニスト的な様式で阻害するために使用され得ることも考慮することができる。
ここで記載されるように、出願人はＥＤＡ-Ａ２がＤＮＡ１０１８４８レセプターに対するリガンドとして働くことを見出した。従って、ＡＤＡ-Ａ２アンタゴニストの使用に対する様々な方法が記載される。ＤＮＡ９８８５３及びＤＮＡ１０１８４８レセプター間の配列同一性において比較的高い割合（好適には、それら各々のＥＣＤ領域において完全（１００％）な配列同一））が得られると、ここで記載される拮抗的ＤＮＡ１０１８４８構築物と同様にＤＮＡ９８８５３の構築物がＥＤＡ-Ａ２アンタゴニストとして利用でき得る
【００５６】
Ｃ．ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの変異体
ここに記載する全長天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに加えて、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド変異体も調製できると考えられる。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド変異体は、ＤＮＡをコードするＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又は望まれるＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの合成により調製できる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数又は位置の変化又は膜固着特性の変更等のＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得ることを認めるであろう。
天然全長配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はここに記載するＤＮＡ９８８５３の種々のドメインにおける変異は、例えば、保存的又は非保存的突然変異についての、例えば米国特許第5,364,934号に記載された、任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドと比較してＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらす、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする１又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、少なくとも１つのアミノ酸の、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの１又は複数のドメインの他の任意のアミノ酸による置換による。
【００５７】
同様に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド変異体も調製できると考えられる。ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド変異体は、ＤＮＡ１０１８４８核酸配列に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又は望まれるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの合成により調製できる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数又は位置の変化又は膜固着特性の変更等のＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得ることを認めるであろう。
天然全長配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はここに記載するＤＮＡ１０１８４８の種々のドメインにおける変異は、例えば、保存的又は非保存的突然変異についての、例えば米国特許第5,364,934号に記載された、任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、天然配列ＤＮＡ１０１８４８と比較してＤＮＡ１０１８４８のアミノ酸配列の変化をもたらす、ＤＮＡ１０１８４８をコードする１又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、少なくとも１つのアミノ酸の、ＤＮＡ１０１８４８の１又は複数のドメインの他の任意のアミノ酸による置換による。
【００５８】
望ましい活性に悪影響を及ぼすことなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失するかを決定する指針は、ポリペプチド配列を相同の周知のタンパク質分子と比較し、高い相同性の領域内でなされたアミノ酸配列変化の数を最小にすることにより見出しうる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的特性を持つ他のアミノ酸で置換えた結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲としてもよい。許容される変異は、配列におけるアミノ酸の体系的な挿入、欠失又は置換作成、及び得られた変異体の下記の実施例に記載する任意のインビトロアッセイにおける活性についての試験によって決定されうる。
【００５９】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位指向性）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発などのこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の周知の技術が、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１０８４８ポリペプチドをコードする変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
【００６０】
また、近接配列に沿った１又は複数のアミノ酸を同定するためにスキャニングアミノ酸分析も用いることができる。中でも好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さく中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、典型的にはこれらの群の中で好ましいスキャニングアミノ酸であるのは、それがベータ-炭素を越える側鎖を持たず、変異体の主鎖構造を変えにくいと思われるからである。また、アラニンも、最もありふれたアミノ酸であるため、典型的には好ましい。さらに、それは隠れた及び露出した位置の両方にしばしば見られる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freemann & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が適切な量の変異体を生じないならば、異性体(isoteric)アミノ酸が用いられる。
【００６１】
Ｄ．ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８の修飾
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。
共有結合的修飾の一型は、ＤＮＡ９８８５３の標的化されたアミノ酸残基を、ＤＮＡ９８８５３の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。同様に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、その選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基を有する標的化されたアミノ酸残基において修飾され得る。
二官能性試薬での誘導体化が、例えばＤＮＡ９８８５３を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＤＮＡ９８８５３抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００６２】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００６３】
本発明の範囲内に含まれるＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＤＮＡ９８８５３に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失、天然配列ＤＮＡ１０１８４８に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失、天然配列ＤＮＡ９８８５３に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加、及び／又は天然配列ＤＮＡ９８８５３に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加、を意味する。
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更を伴うこともある。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＤＮＡ９８８５３、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＤＮＡ１０１８４８（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＤＮＡ９８８５３アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。同様に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい
【００６４】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【００６５】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００６６】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリぺプチドの、種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００６７】
また、本発明のＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＤＮＡ９８８５３ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価の形態には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。特に、キメラ分子は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と融合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのＥＣＤを含んでもよい。
【００６８】
イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。レセプターイムノアドヘシンは、全長ポリペプチドの他に細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列又はＥＣＤ配列フラグメントを含むレセプターの可溶性型のような、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８の様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８と抗体又は抗体の特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、レセプターポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
【００６９】
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ＥＣＤ))を免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合されるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(ｂ)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【００７０】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＧグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される：
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ；
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ,ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,ＶＬＣＬ-ＡＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ,又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ,又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【００７１】
また、本発明のＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価の形態には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。特に、キメラ分子は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と融合したＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのＥＣＤを含んでもよい。
【００７２】
種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は、この分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ-ｈｉｓ-ｇｌｙ）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255: 192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)］を含む。
【００７３】
また、本発明のＤＮＡ９８８５３は、ロイシンジッパーに融合したＤＮＡ９８８５３を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。同様に、本発明のＤＮＡ１０１８４８は、ロイシンジッパーに融合したＤＮＡ１０１８４８を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。種々のロイシンジッパーがこの分野で記載されている。例えば、Landschulz等, Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe等, FEBS Letters, 344: 1991 (1994)参照。ＤＮＡ９８８５３に融合したロイシンジッパーの使用は、溶液中での可溶性ＤＮＡ９８８５３に二量体化又は三量体化を助けるのに望ましく、ＤＮＡ１０１８４８に融合したロイシンジッパーの使用は、溶液中での可溶性ＤＮＡ１０１８４８に二量体化又は三量体化を助けるのに望ましい。当業者は、ロイシンジッパーがＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド分子のＮ-又はＣ-末端の何れかに融合しうることを認めるであろう。
【００７４】
Ｅ．ポリペプチドの調製
１．  ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、ＤＮＡ９８８５３核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養してＤＮＡ９８８５３を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＤＮＡ９８８５３を調製することができると考えられる。例えば、ＤＮＡ９８８５３配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって製造してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動化によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動化合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＤＮＡ９８８５３の種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＤＮＡ９８８５３を製造してもよい。
【００７５】
２．  ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、ＤＮＡ１０１８４８核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養してＤＮＡ１０１８４８を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＤＮＡ１０１８４８を調製することができると考えられる。例えば、ＤＮＡ１０１８４８配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって、上述のように製造してもよい。ＤＮＡ１０１８４８の種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＤＮＡ１０１８４８を製造してもよい。
【００７６】
３．  ＤＮＡ９８８５３又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＤＮＡ９８８５３をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ９８８５３ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＤＮＡ９８８５３ＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＤＮＡ９８８５３コード遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
同様に、ＤＮＡ１０１８４８をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ１０１８４８ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＤＮＡ１０１８４８ＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＤＮＡ１０１８４８コード遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
【００７７】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＤＮＡ９８８５３に対する抗体、ＤＮＡ１０１８４８に対する抗体、又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているような標準的な手順を使用して実施することができる。ＤＮＡ９８８５３をコードする遺伝子又はＤＮＡ１０１８４８をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００７８】
以下の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載する。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高い厳密性を含むハイブリッド形成条件は、Sambrookら, 上掲に提供されている。
【００７９】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公的データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、同一性を測定するのに様々なアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
【００８０】
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００８１】
４．  宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞は、ここに記載したＤＮＡ９８８５３生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換される。または、宿主細胞は、ここに記載したＤＮＡ１０１８４８生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換される。宿主細胞はプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
【００８２】
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際公開第89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336: 348-352 (1988)を参照のこと。
【００８３】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、グラム陰性又はグラム陽性生物体などの真正細菌、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５ ７７２（ATCC53,635）が公に利用可能である。
【００８４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＤＮＡ９８８５３をコードするベクター又はＤＮＡ１０１８４８をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア(Saccharomyces cerevisiae)は、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
【００８５】
グリコシル化ＤＮＡ９８８５３又はグリコシル化ＤＮＡ１０１８４８の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の技量の範囲内にある。
【００８６】
５．  複製可能なベクターの選択及び使用
ＤＮＡ９８８５３をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローン化(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分は、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの形成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【００８７】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＤＮＡ９８８５３のコード化ＤＮＡの一部であり、又はそれは、ベクターに挿入されるＤＮＡ１０１８４８のコード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のＥＰ 362,179)、又は1990年11月15日に発行された国際公開第90/13646号に記載されているシグナルであってよい。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００８８】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【００８９】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質あるいは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンに耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、バシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼを供給するタンパク質をコードする。
【００９０】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282: 39 (1979)；Kingsmanら, Gene, 7: 141 (1979)；Tschemperら, Gene, 10: 157 (1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85: 12 (1977)］。
【００９１】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸配列に作用可能に結合してｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。多種の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に適したプロモーターは、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275: 615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281: 544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776］、及びｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００９２】
酵母宿主と共に用いるのに好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17: 4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００９３】
成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターである他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝を伴う分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素がある。酵母での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００９４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、このようなプロモーターは宿主細胞系に適合し得る場合に限られる。
【００９５】
より高等の真核生物による本発明のＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動エレメントである。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインシュリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＤＮＡ９８８５３コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００９６】
また、真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、ときには３'の非翻訳領域から通常取得できる。これらの領域は、ＤＮＡ９８８５３をコードしているｍＲＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【００９７】
組換え脊椎動物細胞培養でのＤＮＡ９８８５３の合成への適応化するのに適切な他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００９８】
６．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いるてもよい。次いで、抗体を標識してアッセイを実施することができるが、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００９９】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定してもよい。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに対して、天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１００】
７．ポリペプチドの精製
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの形態は、培養培地又は宿主細胞の溶解液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【０１０１】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。以下の手順は適切な精製手順の例である：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような狭雑物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された、この分野で知られた多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの性質に依存する。
【０１０２】
Ｆ．ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの用途
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリッド形成プローブとして、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成においての使用を含む、分子生物学における種々の用途を有している。また、ＤＮＡ９８８５３コード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの調製にも有用であろう。同様に、ＤＮＡ１０１８４８コード化核酸も、ここに記載される組換え技術によるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの調製にも有用であろう
【０１０３】
全長配列ＤＮＡ９８８５３（配列番号：１）又は全長配列ＤＮＡ９８８５３（配列番号：３）ポリペプチド、又はそれらの一部は、全長配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド遺伝子、又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのヌクレオチド配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの天然発生変異体又は他の種からのＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリのためのハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、配列番号：１のＤＮＡ１０１８４８核酸配列又は天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコードＤＮＡのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いて、ＤＮＡ９８８５３遺伝子のコード領域を単離することを含む。
【０１０４】
同様に、全長配列ＤＮＡ１０１８４８（配列番号：４）又は全長配列ＤＮＡ１０１８４８（配列番号：６）ポリペプチド、又はそれらの一部は、全長配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド遺伝子、又はＦｉｇ４（配列番号：６）に開示されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのヌクレオチド配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの天然発生変異体又は他の種からのＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリのためのハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、Ｆｉｇ３に示される配列番号：４のＤＮＡ１０１８４８核酸配列又は天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコードＤＮＡのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するための周知のＤＮＡ配列を用いて、ＤＮＡ１０１８４８遺伝子のコード領域を単離することを含む。
【０１０５】
ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＤＮＡ９８８５３遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、又はＤＮＡ１０１８４８遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。
【０１０６】
また、プローブは、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド配列又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド配列に極めて関連性の高い配列を同定するため、配列プールを調製するためのＰＣＲ技術において用いられることもある。
また、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする核酸配列は、そのポリペプチドをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体標識に対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１０７】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドがレセプターとして機能する場合）、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは、結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。同様に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドがレセプターとして機能する場合）、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。
そのような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に関与するタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは相関性のリガンド（類）を単離するために使用することができる。スクリーニングアッセイは、天然ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド、天然ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又は天然ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのレセプター又は天然ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのレセプターの生物活性を模倣するリード化合物を発見するために設計できる。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、それらを小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考えられる小分子には、合成有機又は無機化合物が含まれる。アッセイは、当該分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１０８】
また、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＤＮＡ９８８５３をコードするｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＤＮＡ９８８５３をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列は、ＤＮＡ９８８５３をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。他の実施態様では、ＤＮＡ１０１８４８をコードするｃＤＮＡ又は、確立された技術によりＤＮＡ１０１８４８をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列は、ＤＮＡ１０１８４８をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。
【０１０９】
トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば、米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及び/又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。場合によっては、胚段階で動物の生殖系列に導入されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの態様に従えば、動物を試薬で治療し、その導入遺伝子を有する未治療の動物に比べて病理的状態の発症率が低くければ、その病理的状態に対する治療的処置の可能性が示されている。
【０１１０】
あるいは、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＤＮＡ９８８５３ポリペプチド「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＤＮＡ９８８５３をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローン化に使用できる。ＤＮＡ９８８５３をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。
同様に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＤＮＡ１０１８４８をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローン化に使用できる。ＤＮＡ１０１８４８をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。
【０１１１】
典型的には、「ノックアウト動物」を構築する場合、ベクターは数キロベースの無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞系に(例えばエレクトロポレーション等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69: 915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性育成動物に移植し、胚を期間をおいて「ノックアウト」動物につくりあげる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術により同定され、動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させるのに利用することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理的状態に対する防御能力及びＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドが存在しないことによるその病理的状態の発達によって特徴付けられる。
【０１１２】
ここにおいて、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、本発明に従って、インビボにおいてそのようなポリペプチドを発現させることにより利用することができ、これはしばしば遺伝子治療と称される。
インビボ及びエキソビボ的に、患者の細胞に核酸（場合によってはベクターに組み込まれている）を導入することへのアプローチの方法には２つの主な方法がある。インビボにおいて導入するために、核酸は、通常はポリペプチドが必要とされる部位において、直接的に患者へ注射される。例えば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化核酸は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの合成部位、もしくは、明らかならば、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド生物学的活性が必要とされる部位に注射されであろう。例えば、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化核酸は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの合成部位、もしくは、明らかならば、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド生物学的活性が必要とされる部位に注射されであろう。エキソビボにおける治療においては、患者の細胞が取り除かれ、これら単離された細胞に核酸が導入され、修飾された細胞は、直接もしくは、例えば、患者へ移植される多孔質の膜にカプセル化されて投与される（例えば、米国特許第4,892,538号及び,第5,283,187号を参照のこと）。
【０１１３】
生存細胞に核酸を導入するために知られた種々の技術がある。これらの技術は、核酸がインビトロで培養された細胞に導入されるか又は対象とする宿主の細胞においてインビボで導入されるかに依存する。インビトロで哺乳動物細胞に核酸を移行するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質移入、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。形質移入には、自己複製能が無い組換体ウィルス（好ましくはレトロウィルス）粒子と細胞レセプターとの相互作用、その後、粒子によって細胞へ核酸が導入されることが含まれる。
【０１１４】
現在インビボ遺伝子移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）での形質移入を含む。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルス、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つのプロモーター／エンハンサー又は位置決定因子、あるいは選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を制御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする遺伝子又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする遺伝子の存在下で転写されたとき、それに作用可能に結合し、翻訳開始配列として機能する核酸分子を含む。このようなベクター作成物はまた、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及びポジティブ及びネガティブストランドプライマー結合部位を含む（これらがウイルスベクターに既に存在しない場合）。さらに、これらのベクターは、典型的には、それらが配置される宿主細胞からＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのための天然シグナル配列である。場合によっては、ベクター作成物は、ポリアデニル化並びに一又は複数の制限部位を指向するシグナル及び翻訳終結配列も含む。例として、このようなベクターは典型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルスの他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマーを用いることもできる。
【０１１５】
幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、即ち標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
【０１１６】
好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第5,681,746号に見出される。
【０１１７】
生物学的な活性、例えば公知の腫瘍壊死因子レセプターの活性に関連するような活性を有する本発明のＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、治療の目的においてインビボで、及びインビトロにおいて用いることができる。
【０１１８】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの治療のための組成物は、適切な純度を有する所望の分子と混合することにより、場合によっては許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed, Oslo A編集, (1980) ）と共に、凍結乾燥標品又は水溶液の状態で調製される。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１９】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びプロピレングリコールである。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状、及び除放性製剤を含む。ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、典型的にはそのような媒体中に約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
【０１２０】
インビボ投与に用いられるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成されるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。
治療用ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えばEP 257,956参照）。
【０１２１】
また、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは持続放出製剤の形態で投与することもできる。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)に記載されたようなポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer等, 上掲）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotＴＭ（乳酸−ブリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。
【０１２２】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド（又はそれらに対する抗体）の治療的有効量は、当然のことながら、対照とする療法（例えば、アポトーシス、自己免疫性又は炎症誘発性反応の変調）、治療すべき病理学的状態、投与方法、治療に用いられる化合物の型、包含される任意の同時治療、患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、医学的履歴などの要因によって変化し、それは担当する医師の技量の範囲内で良好に決定される。従って、治療者は、最大の治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要がある。
上記の指針では、有効投与量は、一般的に約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０１２３】
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、筋肉内、脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所又は吸入経路による注射又は注入、あるいは持続放出系による。またＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与され、局所的並びに全身に治療効果を発揮する。
疾患を治療するＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの有効性は、活性剤を、その目的のために有効な他の薬剤を、同じ組成物中又は別の組成物として、順次又は混合して投与することにより向上させてもよい。このような薬剤の例は、細胞毒性、化学治療薬、又は成長阻害剤、及び放射線治療（照射の包含又は放射性物質の投与）を含む。
ＰＲＯ３６４ポリペプチドと組み合わせて投与される治療薬の有効量は、医師の裁量である。投与用量決定及び調節は、治療すべき状態の最大のマネジメントを達成するためになされる。
上述の多様な治療上の方法及び組成物が、ここで記載されるＥＤＡ-Ａ２の使用に対しても同様に用いられてもよい。
【０１２４】
Ｇ．抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及び/又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体
本発明は、さらに抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体及び抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる
１．ポリクローナル抗体
本発明における抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体及び抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び望ましいならばアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により哺乳動物に注射する。抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体について、免疫化剤は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体について、免疫化剤は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択され得る。
【０１２５】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体又は抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256: 495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するか又は生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体について、免疫化剤は、典型的にはＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体について、免疫化剤は、典型的にはＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれる場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の成長を阻止する。
【０１２６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫系であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのサルク・インスティチュート・セル・ディストリビューション・センター（Salk Institute Cell Distribution Center）やバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０１２７】
次いでハイブリドーマ細胞を培養する培地を、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合アッセイによって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１２８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程を経てサブクローン化し、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボの腹水で成長させることもできる。
【０１２９】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から単離又は精製されうる。
【０１３０】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法により(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されれば、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4816567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに換えて置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに換えて置換し、キメラ二価抗体を産生することができる。
【０１３１】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている日常的技術を使用して達成できる。
【０１３２】
３．ヒト化抗体
本発明の抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体及び抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２あるいは抗体の他の抗原結合性サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含み、それは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１３３】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによる、ウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って本質的に行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(U.S. Patent No.4,816,567)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾つかのＣＤＲ残基及びことによっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３４】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)］。
【０１３５】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
【０１３６】
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において公知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305: 537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に組み合わせるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日発行のWO93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１３７】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有するのが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
【０１３８】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合体抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合体抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化させるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために(WO91/00360; WO92/200373; EP 03089)提案されている。これらの抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより免疫毒素を作成することができる。この目的のために好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【０１３９】
Ｈ．抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体及び抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体の用途
本発明の抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体及び抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体は様々な有用性を有している。抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体又は抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、上述の投与技術及び方法を用いて、診断において使用される。例えば、抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体及び抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体は、対応するポリペプチドの診断アッセイ、例えば特定細胞、組織、又は血清でのその発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接のいずれかで検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
【０１４０】
また、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製すべきＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを含む試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＤＮＡ９８８５３ポリペプチド以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１４１】
また、抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製すべきＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【０１４２】
Ｉ．製造品
ここに記載した疾患の診断又は治療に有用なＤＮＡ９８８５３ポリペプチド、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド又はそれらの抗体を含むキットのような製造品は、少なくとも１つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効か組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はＰＲＯ３６４又はその抗体である。容器上又は添付されるラベルには、組成物が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【０１４３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１４４】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明に従い使用した。次の実施例及び明細書全体を通してＡＴＣＣ受託番号により特定している細胞の供給源は、バージニア州、マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。
【０１４５】
実施例１
ヒトＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ｆｉｇ９（Incyte Pharmaceuticals LIFESEQTM デーベースより）に示すインサイトクローン５０９  １５１１Ｈ（配列番号：７）に基づいて、対象とする配列を含んでいるｃＤＮＡライブラリーを同定するために、オリゴヌクレオチドがＰＣＲによって合成された。これらのオリゴヌクレオチドは次の通りであった：
正方向プライマー
５'GAGGGGGCTGGGTGAGATGTG ３'（509-1）（配列番号：８）
逆方向プライマー
５'TGCTTTTGTACCTGCGAGGAGG ３'（509-4AS）（配列番号：９）
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに対する全長コード化配列を単離するために、逆ロングＰＣＲを行った（Ｆｉｇ６）。ＰＣＲプライマーは通常２０から３０ヌクレオチドの範囲にある。逆ロングＰＣＲにおいて、プライマー対は、５‘から３‘方向で、お互いに離れる方向を向くようにデザインされた。
ＤＮＡ９８８５３をクローニングするための逆ロングＰＣＲ対が合成された：
プライマー１（左側プライマー）
５'ｐCATGGTGGGAAGGCCGGTAACG ３'（509-P5）（配列番号：１０）
プライマー２（右側プライマー）
５'ｐGATTGCCAAGAAAATGAGTACTGGGACC ３'（509-P6）（配列番号：１１）
この逆ロングＰＣＲ反応において、鋳型はプラスミドｃＤＮＡライブラリーである。その結果、ＰＣＲ産物は両端に目的の挿入配列を有し、真中にベクターの全配列を含んでいる。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ混合物は鋳型のプラスミドのみを切断するＤｐｎＩで処理し、続いてライブラリーのクローニングベクターのサイズより大きなＰＣＲ産物をアガロースゲルにより精製した。逆ロングＰＣＲで用いたプライマーは５'-リン酸化型であるので、精製産物はその後自己連結され、大腸菌コンピテント細胞に形質移入された。コロニーは、５‘ベクタープライマーとより長い５‘配列を持つクローンを同定するための適当な遺伝子特異的なプライマーによりスクリーンされた。陽性クローンから調製されたプラスミドは配列確認された。必要ならば、前回得られた新規配列に基づいてさらに５'側の配列を得るために、本過程が繰り返され得る。
逆ロングＰＣＲの目的は対象の遺伝子の完全配列を得ることである。
その後、全長コード化配列を含むクローンは、通常のＰＣＲによって得た。
ＤＮＡ９８８５３の全長コード化領域をクローン化するために使用されたプライマーは、合成により得た：
正方向プライマー
５'GGAGGATCGATACCATGGATTGCCAAGAAAATGAG ３'（Cla-MD-509）（配列番号：１２）
逆方向プライマー
５'GGAGGAGCGGCCGCTTAAGGGCTGGGAACTTCAAAGGGCAC ３'（509.TAA.not）（配列番号：１３）
クローニングの目的のために、Cla Iサイト及びNot Iサイトが正方向プライマー及び逆方向プライマー中に含まれていた。
ＰＣＲ産物の正確さを保証するために、独立のＰＣＲ反応が行われ、いくつかのクローン産物が配列確認された。
上述のように単離されたＤＮＡ配列は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列（ここでは、ＤＮＡ９８８５３-１７３９と称する）及び、それに由来するＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのタンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ９８８５３の全長ヌクレオチド配列はＦｉｇ１（配列番号：１）に示してある。クローンＤＮＡ９８８５３-１７３９は、ＡＴＣＣに寄託され寄託番号２０３９０６が与えられた。クローンＤＮＡ９８８５３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４-６に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置９０１−９０３に見かけの停止コドンを持つ（Ｆｉｇ１）。予測されるポリペプチド前駆体は２９９アミノ酸長である（Ｆｉｇ２）。Ｆｉｇ２に示した全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドタンパク質は分子量約３．３キロダルトンでｐＩが約４．７２と見積もられた。潜在的なＮ-グリコシル化部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸７４〜アミノ酸７７の間に存在する。潜在的なＮ-ミリストイル化部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸２４〜アミノ酸２９の間に存在する。潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸１２３〜アミノ酸１２６、アミノ酸１８５〜アミノ酸１８８、アミノ酸２００〜アミノ酸２０３、アミノ酸２５２〜アミノ酸２５５、アミノ酸２５７〜アミノ酸２６０、アミノ酸２７１〜アミノ酸２７４、及びアミノ酸２８３〜アミノ酸２８６の間に存在する。潜在的な膜貫通部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸１３７〜アミノ酸１５８の間に存在する。現在のところ、当該ポリペプチドにはシグナル配列は含まれていないと考えられる。
全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドアミノ酸配列の分析により、その一部が腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有することが示唆されており、このころからＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新規メンバーであることが示されている。ＴＮＦＲファミリーに特徴的な３つの見かけ上の細胞外システインリッチドメイン［Naismith及びSprang, Trends Biochem. Sci., 23:74-79(1998)を参照のこと］が存在し、それらの最初の２つのＣＲＤｓは６つのシステインを持つ一方で、３番目のＣＲＤは４つのシステインを持つ。
【０１４６】
実施例２
ヒトＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ｆｉｇ９（Incyte Pharmaceuticals LIFESEQTM デーベースより）に示すインサイトクローン５０９  １５１１Ｈ（配列番号：７）に基づいて、対象とする配列を含んでいるｃＤＮＡライブラリーを同定するために、オリゴヌクレオチドがＰＣＲによって合成された。これらのオリゴヌクレオチドは：
正方向プライマー
５'GAGGGGGCTGGGTGAGATGTG ３'（509-1）（配列番号：８）
逆方向プライマー
５'TGCTTTTGTACCTGCGAGGAGG ３'（509-4AS）（配列番号：９）
ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対する全長コード化配列を単離するために、逆ロングＰＣＲを行った（Ｆｉｇ６）。ＰＣＲプライマーは通常２０から３０ヌクレオチドの範囲にある。逆ロングＰＣＲにおいて、プライマー対は、５'から３'方向で、お互いに離れる方向を向くようにデザインされた。
ＤＮＡ１０１８４８をクローニングするための逆ロングＰＣＲ対が合成された：
プライマー１（左側プライマー）
５'ｐCATGGTGGGAAGGCCGGTAACG ３'（509-P5）（配列番号：１０）
プライマー２（右側プライマー）
５'ｐGATTGCCAAGAAAATGAGTACTGGGACC ３'（509-P6）（配列番号：１１）
この逆ロングＰＣＲ反応において、鋳型はプラスミドｃＤＮＡライブラリーである。その結果、ＰＣＲ産物は両端に目的の挿入配列を有し、真中にベクターの全配列を含んでいる。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ混合物は鋳型のプラスミドのみを切断するＤｐｎＩで処理し、続いてライブラリーのクローニングベクターのサイズより大きなＰＣＲ産物をアガロースゲルにより精製した。逆ロングＰＣＲで用いたプライマーは５‘-リン酸化型であるので、精製産物はその後セルフライゲーションされ、大腸菌コンピテント細胞に形質移入された。コロニーは、５‘ベクタープライマーとより長い５‘配列を持つクローンを同定するための適当な遺伝子特異的なプライマーによりスクリーンされた。陽性クローンから調製されたプラスミドは配列確認された。必要ならば、前回得られた新規配列に基づいてさらに５‘側の配列を得るために、本過程が繰り返され得る。
逆ロングＰＣＲの目的は対象の遺伝子の完全配列を得ることである。
その後、全長コード化配列を含むクローンは、通常のＰＣＲによって得た。
ＤＮＡ１０１８４８の全長コード化領域をクローン化するために使用されたプライマーは、合成により得た：
正方向プライマー
５'GGAGGATCGATACCATGGATTGCCAAGAAAATGAG ３'（Cla-MD-509）（配列番号：１２）
逆方向プライマー
５'GGAGGAGCGGCCGCTTAAGGGCTGGGAACTTCAAAGGGCAC ３'（509.TAA.not）（配列番号：１３）
クローニングの目的のために、Cla Iサイト及びNot Iサイトが正方向プライマー及び逆方向プライマー中に含まれていた。
ＰＣＲ産物の正確さを保証するために、独立のＰＣＲ反応が行われ、いくつかのクローン産物が配列確認された。
上述のように単離されたＤＮＡ配列は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列（ここでは、ＤＮＡ１０１８４８-１７３９と称する）及び、それに由来するＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのタンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ１０１８４８の全長ヌクレオチド配列はＦｉｇ３（配列番号：４）に示してある。クローンＤＮＡ１０１８４８-１７３９は、ＡＴＣＣに寄託され寄託番号２０３９０７が与えられた。クローンＤＮＡ１０１８４８は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４-６に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置８９５−８９７に見かけの停止コドンを持つ（Ｆｉｇ３）。予測されるポリペプチド前駆体は２９７アミノ酸長である（Ｆｉｇ４）。Ｆｉｇ４に示した全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドタンパク質は分子量約３．２８キロダルトンでｐＩが約４．７２と見積もられた。潜在的なＮ-グリコシル化部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸７４〜アミノ酸７７の間に存在する。潜在的なＮ-ミリストイル化部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸２４〜アミノ酸２９の間に存在する。潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位が、Ｆｉｇ２に示されるアミノ酸配列上アミノ酸１２３〜アミノ酸１２６、アミノ酸１８５〜アミノ酸１８８、アミノ酸２００〜アミノ酸２０３、アミノ酸２５２〜アミノ酸２５５、アミノ酸２５７〜アミノ酸２６０、アミノ酸２７１〜アミノ酸２７４、及びアミノ酸２８３〜アミノ酸２８６の間に存在する。潜在的な膜貫通部位が、Ｆｉｇ４に示されるアミノ酸配列上アミノ酸１３７〜アミノ酸１５８の間に存在する。現在のところ、当該ポリペプチドにはシグナル配列は含まれていないと考えられる。
全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドアミノ酸配列の分析により、その一部が腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有することが示唆されており、このころからＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新規メンバーであることが示されている。ＴＮＦＲファミリーに特徴的な３つの見かけ上の細胞外システインリッチドメイン［Naismith及びSprang, Trends Biochem. Sci., 23:74-79(1998)］が存在し、それらの最初の２つのＣＲＤｓは６つのシステインを持つ一方で、３番目のＣＲＤは４つのシステインを持つ。
【０１４７】
ＤＮＡ１０１８４８が実際に膜貫通であることをさらに示すために、ＤＮＡ１０１８４８のエピトープタグ発現プラスミドの２つのバージョンが、ｐＲＫ５Ｂ（実施例１１を参照のこと）中に構築され、一つはＮ端Ｆｌａｇタグ（Ｆｌａｇ-ＤＮＡ１０１８４８）で、他方はＣ端Ｆｌａｇタグ（Ｆｌａｇ-ＤＮＡ１０１８４８）である。いずれかのコンストラクト（リポフェクチン試薬を用いる：Ｇｉｂｃｏ-ＢＲＬ）により形質移入されたＭＣＦ-７細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｍ２抗Ｆｌａｇ抗体（シグマ）により、ＰＢＳ中0.5%トリトンＸ-１００により膜透過性にした場合としない場合とで免疫染色を行った。Ｆｉｇ１０に示すように、膜透過性にしない場合（Ｆｉｇ１０Ａ及び１０Ｂ）、Ｍ２抗体による細胞表面染色はＦｌａｇ-ＤＮＡ１０１８４８を形質移入した細胞でのみ観られ、ＤＮＡ１０１８４８-Ｆｌａｇでは観られなかった。細胞を抗Ｆｌａｇで免疫染色する前に膜透過性にした場合、両タイプのコンストラクトにおいて同程度の発現が観察された（Ｆｉｇ１０Ｃ及び１０Ｄ）。本実験により、明らかにＤＮＡ１０１８４８がＮ端領域を細胞外に、Ｃ端領域を細胞内にして細胞表面タンパク質として発現されていることが示された。従って、ＤＮＡ１０１８４８はタイプＩＩＩの膜透過性タンパク質である。
【０１４８】
実施例３
ハイブリダイゼーションプローブとしてのＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡの使用
以下の方法は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。
全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡ（Ｆｉｇ１、配列番号：１に示す通り）又はそのフラグメントは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種ＤＮＡ（ＤＮＡ９８８５３の自然発生変異体など）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。同様に、全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡ（Ｆｉｇ３、配列番号：４に示す通り）又はそのフラグメントは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種ＤＮＡ（ＤＮＡ１０１８４８の自然発生変異体など）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードする遺伝子由来の放射標識プローブ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードする遺伝子由来の放射標識プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード溶液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
全長天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ又は全長天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１４９】
実施例４
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの大腸菌における発現
本実施例は、大腸菌中で組換体発現によるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド形体及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド形体の調製を示す。
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの発現に関しては、全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）又はフラグメント又はその変異体は、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅した。ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現に関しては、全長ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号：４）又はフラグメント又はその変異体は、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅した。
プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で設計され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、polyhisリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化配列領域又はＤＮＡ１０１８４８コード化配列領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、選択した大腸菌のSambrook等, 上掲に記載された方法を用いた形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離した。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【０１５０】
実施例５
哺乳動物細胞におけるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド形体の調製を例示する。
発現ベクターとして、ベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いてＤＮＡ９８８５３コード化ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターをｐＲＫ５−ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドと呼ぶ。場合によっては、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いてＤＮＡ１０１８４８コード化ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターをｐＲＫ５−ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドと呼ぶ。
【０１５１】
一実施態様では、選択される宿主細胞を２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化させた。約１０μｇのｐＲＫ５−ＤＮＡ９８８５３ＤＮＡを約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982)］］と混合し、５００μｌの１ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。場合によっては、約１０μｇのｐＲＫ５−ＤＮＡ１０１８４８ＤＮＡを約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982)］］と混合し、５００μｌの１ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴状で添加し、２５?で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７?で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、ＰＢＳ中２０％グリセロールの２ｍｌを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１５２】
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに負荷した。処理したゲルを乾燥させ、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの存在を明らかにするのに選択された時間に渡ってフィルムに暴露しうる。形質移入した細胞を含む培地は、さらなるインキュベーション（無血清培地）を施し、培地を選択したバイオアッセイで試験してもよい。
【０１５３】
それに換わる技術において、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入されうる。２９３細胞をスピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＤＮＡ９８８５３ＤＮＡを添加又は７００μｇのｐＲＫ５−ＤＮＡ１０１８４８ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮してＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。発現されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製できる。
【０１５４】
他の実施態様では、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドはＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドベクター又はｐＲＫ５−ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドベクターは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの周知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入できる。上記のように、細胞培地をインキュベートし、その培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニンなどの放射性標識を含む培地で置換することができる。所望のポリペプチドの存在を測定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む培地を濃縮し、任意の選択した方法で精製することができる。
【０１５５】
また、エピトープタグＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はピトープタグＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを宿主ＣＨＯ細胞で発現させることもできる。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡはｐＲＫ５ベクターからサブクローン化される。サブクローン挿入物にＰＣＲを施して、ポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合させてバキュロウイルス発現ベクターとすることができる。ポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡ挿入物又はポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲなどの選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローン化できる。最後に、ＳＶ４０誘導ベクターでＣＨＯ細胞を（上記のように）形質移入できる。標識化を上記のように実施して発現を検証してもよい。次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む培養培地を濃縮し、Ｎｉ２＋-キレート親和性クロマトグラフィといった任意の選択した方法で精製することができる。
【０１５６】
実施例６
酵母菌でのＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌におけるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを形成する。対象となるＤＮＡ９８８５３をコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターをコードするＤＮＡを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＤＮＡ９８８５３の細胞内発現を制御する。分泌のために、ＤＮＡ９８８５３をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともに、選択したプラスミドにクローン化することができる。
場合によっては、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを形成する。対象となるＤＮＡ１０１８４８をコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターをコードするＤＮＡを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＤＮＡ１０１８４８の細胞内発現を制御する。分泌のために、ＤＮＡ１０１８４８をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともに、選択したプラスミドにクローン化することができる。
【０１５７】
酵母菌株ＡＢ１１０などの酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、次いでクマシーブルー染色でのゲル染色により分析することができる。
【０１５８】
次いで、組換体ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１５９】
実施例７
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現
以下の方法は、昆虫細胞におけるＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの組換体発現を記載する。
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８コード化ＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ９８８５３ポリペプチドコード化ＤＮＡの所定部分（細胞外ドメインをコードする配列等）が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。場合によっては、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡ又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドコード化ＤＮＡの所定部分（細胞外ドメインをコードする配列等）が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、フランキングの（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、これらの選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローン化される。
【０１６０】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより生成される。２８?で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているようにして実施した。
【０１６１】
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はポリ-ｈｉｓタグＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362: 175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、非特異的に結合したタンパク質を溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に抱合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＨｉｓ１０−タグＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む分画をプールし、添加バッファーで透析した。
【０１６２】
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドはの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィを含む周知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１６３】
実施例８
ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及び/又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例はＤＮＡ９８８５３ポリペプチド及び/又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は当該分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられる免疫原は、精製ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド、精製ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを含む融合タンパク質、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換体ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドを発現する細胞、及び細胞表面に組換体ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０１６４】
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化し、皮下又は腹膜内に１−１００マイクログラムで注入したＤＮＡ９８８５３ポリペプチド免疫原又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射でまた追加免疫してもよい。抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド抗体又は抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血によって血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１６５】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの最後の静脈内注射の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ １５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択したマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、それをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
【０１６６】
ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに対する反応性又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は当該分野の技量の範囲内である。
【０１６７】
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹膜内注入し、抗ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドモノクローナル抗体又は抗ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成できる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１６８】
実施例９
ヒト細胞及び組織におけるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのｍＲＮＡの発現を検出するためのアッセイ
ノザンブロッティングは当該技術の分野の当業者に周知の通常の方法に従って行なわれた。簡単には、ヒトポリＡ＋ＲＮＡの正常組織ブロットマ又は腫瘍細胞系ブロット（クロンテック）は、製造者の指示に従ってハイブリダイズ化された。３２Ｐ-標識プローブはＤＮＡ１０１８４８（配列番号：４）の４７８-９０３のヌクレオチドに相当するＤＮＡ断片を用いて調製した。Ｆｉｇ７に示すように、相対的に高い発現レベルが２つのヒト腫瘍細胞系、肺癌腫Ａ５４９及びメラノーマＧ３６１において検出された。相対的に弱い発現レベルで前立腺、精巣、卵巣、甲状腺、脊髄、及び副腎組織においても認められた。興味深いことに、より小さい転写産物が胃において相対的に高い発現レベルで存在していた。
【０１６９】
実施例１０
ＮＦ-ＫＢの活性化
Ｅ-セレクチン遺伝子からのＮＦ-κＢ応答配列を含むプロモーターに制御されるレポーター遺伝子の発現を分析することにより、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドがＮＦ-κＢを活性化させるか否かを決定するためのアッセイを行った。
ヒト２９３細胞（２ｘ１０５）（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００マイクログラム／ｍｌペニシリン、及び１００マイクログラムのストレプトマイシンを添加したＨＧ-ＤＭＥＭ中に保持）を０．５マイクログラムのホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３．ＥＬＡＭ．ｔｋ［Yang等, Nature, 395: 284-288 (1998)］及び０．０５マイクログラムのRenillaルシフェラーゼレポータープラスミド（内部形質移入対照物として）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びにＤＮＡ９８８５３ポリペプチド又はＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドについて示した付加的発現ベクター（上記）、及びキャリアプラスミドｐＲＫ５Ｄでリン酸カルシウム形質移入により一過的に形質移入し、形質移入の間で一定のＤＮＡを維持した。２４時間後、形質移入細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）に推奨されたように検定した。活性（３つのウェルの平均）を、ホタルルシフェラーゼ活性をRenillaルシフェラーゼの活性で除すことにより形質移入効率の相違について規格化し、付加した発現ベクターが無い場合に見られる活性に相対する活性として表現した。
【０１７０】
Ｆｉｇ８Ａに示すように、ＦｌａｇタグＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの過剰発現は有意なレポーター遺伝子活性化をもたらした。同様の活性が、ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドに対しても観察された（データは示さず）。
以下の実験では、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのみが使用された。
ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドシグナル伝達の潜在的メディエータを試験するために、ＴＮＦ-アルファ、ＩＬ-１、又はＬＰｓ-ＴｏｌｌによるＮＦ-ＫＢ活性化の経路に含まれる或る種の細胞内シグナル伝達分子のドミナントネガティブ変異体を試験した。
２９３細胞を、ｐＧＬ３．ＥＬＡＭ．ｔｋ及び発現ベクターで（上記のように）一過的に形質移入した。さらに、以下のドミナントネガティブ形態をコードする哺乳動物発現ベクターＴＲＡＦ２-ＤＮ（ａａ８７−５０１）；ＴＲＡＦ６−ＤＮ（アミノ酸２８９−５２２）；及びＮＩＫ-ＤＮ［Cao等, Science, 271: 1128-1131 (1996); Malinin等, Nature, 385: 540-544 (1997); Muzio等, Science, 278: 1612-1615 (1997); Rothe等, Science, 269: 1424-1427 (1995); Ting等, EMBO J., 15: 6189-6196 (1996); Wesche等, Immunity, 7: 837-847 (1997)に記載］で細胞を形質移入した。ルシフェラーゼ活性は上述のように発現させて測定した。
【０１７１】
結果をＦｉｇ８Ｂに示す。ＴＮＦ-アルファ（Malinin等, Nature, 385: 540-544 (1997)）、ＩＬ-１（Malinin等, 上掲）、及びＬＰｓ-Ｔｏｌｌ（Yang等, Nature, 395: 284-288 (1998)）のドミナントインヒビターとして作用するＮＩＫのキナーゼ不活性変異体の同時形質移入は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドを介するＮＦ-ＫＢ活性化を実質的に阻害した。また、Ｎ末端を欠失したドミナントネガティブＴＲＡＦ-２又はドミナントネガティブＴｒａｆ-６（Rothe等, Sience, 269: 1424-1427 (1995); Rothe等, Cell: 78: 681-692 (1994)）もＮＦ-ＫＢ活性化を減弱させた（Ｆｉｇ８Ｃ）。従って、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドは、主としてＴＮＦＲ-２及びＴＮＦＲ-６を介してＮＦ-ＫＢを活性化するようである。
【０１７２】
実施例１１
ＤＮＡ１０１８４８レセプターに対するリガンドの同定
ここでは「ＡＰ-ＥＤＡ-Ａ２」と呼ぶキメラ分子はアミノ酸２４１-３８９（Bayes等、上掲）を含むＥＤＡ-Ａ２ポリペプチドのＮ末端に融合させたヒト胎盤性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を用いて調製した。ＡＰは鋳型としてｐＡＰｔａｇ−５（Genehunter Corporation）を用いてＰＣＲ増幅により得、発現ベクター、ｐＣＭＶ-１  Ｆｌａｇ（シグマ）に、ＥＤＡ-Ａ２のＮ末端にＡＰを有するように融合、クローン化した。ＡＰ-ＥＤＡ-Ａ２はヒト胎児性腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ）に一過的に形質移入（リポフェクタミン試薬を使用；Ｇｉｂｃｏ-ＢＲＬ）し、発現させた。ＡＰ-ＴＮＦ-α（Penica等,  下掲）及びＡＰ-ＴＡＬＬ-１（アミノ酸配列１３６-２８５；国際公開第ＷＯ９８/１８９２１、１９９８年５月7日公開に開示；Moore等, Science, 285:260-263(1999)）は同様に調製した。形質移入２９３細胞の条件培地はろ過（0.45ミクロン）し、20mM Hepes(pH7.0)及び1mM アジ化ナトリウムを含む緩衝液中、４℃で保存し、引き続き、細胞染色法に使用した。さらに、ＥＤＡ-Ａ２のＮ端Ｆｌａｇタグ形体はｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇベクターに構築された。このＦｌａｇタグＥＤＡ-Ａ２の３量体化を促進するために、ロイシンジッパー配列［Science, 262:1401-1407(1993)］の３量体がＦｌａｇタグとＥＤＡ-Ａ２（アミノ酸１７９-３８９を含む；Bayes等、上掲）の間にに挿入され、この構築物はＦｌａｇ-ＬＺＰ-ＥＤＡ-Ａ２を称した。また、ＦｌａｇタグＥＤＡ-Ａ２の他の形体はＥＤＡ-Ａ２のアミノ酸１７９-３８９をｐＣＭＶ-１  Ｆｌａｇベクターにクローニングすることにより作成され、Ｆｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２と称した。Ｆｌａｇ-ＬＺＰ-ＥＤＡ-Ａ２又はＦｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２はＭ２-アガロースゲル（シグマ）により対応する発現プラスミドを形質移入した２９３細胞の無血清培地から精製した。Ｆｌａｇ-ＴＡＬＬ-１（アミノ酸配列１３６-２８５；国際公開第ＷＯ９８/１８９２１、１９９８年５月7日公開に開示；Moore等, Science, 285:260-263(1999)）は同様な方法で作成した。
【０１７３】
ＤＮＡ１０１８４８レセプターに対する潜在的なリガンドを同定するために、ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ）がＴＮＦファミリーの幾つかのリガンドの膜結合型により一過的に形質移入された（リポフェクタミン試薬による）。調べたリガンドは、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＬＬ-１、４-１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＬＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ-Ａ２、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ-α及びＡｐｏ２Ｌ/ＴＲＡＩＬであった。
ヒトＴＮＦ-αはｐＲＫ５Ｂベクター（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）にクローン化された。細胞表面におけるＴＮＦ-αの検出には、Ｆｌａｇタグがアミノ酸７０と７１の間に挿入された（使用したアミノ酸番号付けはPennica等, Nature, 312:724-729(1981)に掲載の配列に従った）。ＴＡＬＬ-１（アミノ酸配列７５-２８５；国際公開第ＷＯ９８/１８９２１、１９９８年５月7日公開に開示；Moore等, Science, 285:260-263(1999)）、４-１ＢＢＬ（アミノ酸配列５９-２５４； Goodwin等, Eur.J.Immunol.,, 23:2631-2641(1993)）、ＣＤ２７リガンド（アミノ酸配列４０-１９３； Goodwin等,Ｃｅｌｌ, 73:447-456(1993)）、ＣＤ３０リガンド（アミノ酸配列６１-２３４； Smith等, Ｃｅｌｌ, 73:1349-1360(1993)）、ＲＡＮＫＬ（アミノ酸配列７１-３１７；国際公開第ＷＯ９８/２８４２６を参照のこと）、Ａｐｏ２リガンド（アミノ酸配列４０-２８１；国際公開第ＷＯ９７/２５４３８参照のこと）、Ａｐｏ３リガンド（アミノ酸配列４６-２４９；国際公開第ＷＯ９９/１９４９０参照のこと）は、それぞれＢａｍＨＩ部位にクローン化された。この結果、ＴＮＦ-αからの細胞内及び膜貫通領域を持ち、様々なリガンドの細胞外領域を持つキメラリガンドが作製された。ＡＰＲＩＬ（Hahne等, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)）については、Ｆｌａｇタグのない全長ｃＤＮＡクローンが使用された。
【０１７４】
幾つかのリガンドで形質移入されたＣＯＳ７（ＡＴＣＣ）細胞はＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃ又はＴＮＦＲ１-ｈＦｃ（下記に構築物を記載）と5%のヤギ血清を含んだＰＢＳ中、１mg/mlで１時間インキュベートさせた。次いで、細胞をＰＲＳで３回洗浄したのち、ＰＢＳ中4%パラホルムアルデヒドで固定した。細胞染色は、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体（Jackson Labs, １：２００希釈で使用）で反応させたのち、Ｃｙ-３ストレプタビジン（Jackson Labs, １：２００希釈で使用）で視覚化した。調べられた全てのリガンドのうち、ＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃのみがＥＤＡ-Ａ２を形質移入した細胞に結合した。Ｆｉｇ１１に示すように、ＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃはＥＤＡ-Ａ２を形質移入した細胞に結合したが、ＴＮＦ-Ｆｃは結合しなかった。
可溶性ＥＤＡ-Ａ２のＤＮＡ１０１８４８細胞膜結合型への結合を示すために、ＣＯＳ７細胞は１mgのＤＮＡ１０１８４８（ｐＲＫ５Ｂにクローン化されたもの）又は空のプラスミドベクター（ｐＲＫ５Ｂ）で形質移入した。形質移入１８-２４時間後、細胞はＡＰ-ＥＤＡ-Ａ２；ＡＰ-ＴＮＦ-α；又はＡＰ-ＴＡＬＬ-１を含む条件培地と１時間、室温でインキュベートし、Taltaglia等, Cell, 83:1263-1271(1995)に記載されているようにインサイツでアルカリホスファターゼ活性にて染色した。Ｆｉｇ１２に示すように、ＡＰ-ＥＤＡ-Ａ２は、ＤＮＡ１０１８４８を形質移入した細胞に特異的に結合したが、ＡＰ-ＴＮＦ-α又はＡＰ-ＴＡＬＬ-１は結合しなかった。
【０１７５】
可溶性ＥＤＡ-Ａ２のＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃへの結合を示すため、１μgの精製したＦｌａｇ-ＬＺＰ-ＥＤＡ-Ａ２又はＦｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２を、ＤＮＡ１０１８４８（ＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃ）又はＴＮＦＲ１-ｈＦｃのＥＣＤとＩｇＧ１-Ｆｃ融合体を含む１μgの精製したヒトイムノアドヘシンと、４℃で一晩二組インキュベートした。ＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃイムノアドヘシンはAshkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539(1991)に記載の方法により調製した。イムノアドヘシン構築物はヒトＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのアミノ酸２-１５４のにより構成された（Ｆｉｇ４参照）。ＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ構築物は、異種性のシグナル配列（ｐＣＭＶ-１Ｆｌａｇ（シグマ）のプレ- プロ  トリプシンのアミノ酸１-１７）を用いてＣＨＯ細胞中で発現させ、ＤＮＡ１０１８４８配列の下流にヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコード化させた後、プロテインＡのアフィニチィークロマトグラフィーにより精製した。ＴＮＦＲ１-ｈＦｃ構築物はAshkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539(1991)に記載の方法により調製した。アミノ酸１-１６９を含むヒトＴＮＦＲＳＦ１９-ｈＦｃ（Hu等, Genomics, 62:103-107(1999)）は、ＴＮＦＲ１-ｈＦｃと同様に調製された。リガンド-レセプター複合体は、プロテインＡアガロース（Repligen）に結合されたレセプターイムノアドヘシンによる免疫沈降された。その後、免疫沈降物は抗ＦｌａｇＭ２ｍＡｂ（シグマ）を用いたウェスタンブロットにより分析された。
Ｆｌａｇ-ＬＺＰ-ＥＤＡ-Ａ２又はＦｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２は、ＤＮＡ１０１８４８-ｈＦｃに結合するが、ＴＮＦＲ１-ｈＦｃ又はＴＮＦＲＳＦ１９-ｈＦｃは結合しないことをデータは示している（Ｆｉｇ１３）。
【０１７６】
実施例１２
ＤＮＡ１０１８４８とＥＤＡ-Ａ２との相互作用は、ＮＦ-κＢを活性化する。
２９３細胞（ＡＴＣＣ）は形質移入の２４時間前に１Ｘ１０５細胞/ウェルになるように１２ウェルプレートにまき、0.25μgのＥＬＡＭ-ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、25ngのｐＲＬ-ＴＫ（Promega）及び表示し量の各発現構築物（Ｆｉｇ１４を参照のこと）で形質移入した。形質移入された全ＤＮＡ量は空のｐＲＫ５Ｂを補充することで1μgの一定量に保たれた（実施例１１参照のこと）。いくつかのアッセイウェルについては、Ｆｌａｇタグリガンド（実施例１１に記載したように調製）が形質移入４時間後に表示の濃度で添加された。他のアッセイウェルにおいて、細胞は全長ＥＤＡ-Ａ２又はＴＡＬＬ-１（国際公開第ＷＯ９８/１８９２１、１９９８年５月7日公開に開示；Moore等, Science, 285:260-263(1999)に開示のの配列）と共に形質移入された。細胞は形質移入後２０-２４時間後に回収し、デュアル-ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega）を用いたレポーター遺伝子の活性を決定した。低いレベル（0.1ngのように）でＤＮＡ１０１８４８のみが発現されている時には、ＮＦ-ＫＢの最小の活性化しか観察されなかった。しかし、Ｆｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２の添加又は全長ＥＤＡ-Ａ２の共形質移入によりＮＦ-ＫＢの活性化は顕著に増強された（Ｆｉｇ１４）。
未形質移入の２９３Ｅ（Invitrogen）細胞を、Ｆｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２（0.2μg/ml）で処理しても、ＮＦ-ＫＢ経路の活性化が起きた（Ｆｉｇ１５Ａ参照のこと）。これにつては、抗-リン酸化-ＩＫＢａ抗体（New England BioLabs）を用いたウェスタンブロットにより測定された。20μg/mlのＤＮＡ１０１８４８-ＥＣＤ-ｈＦｃ（実施例１１を参照のこと）とプレインキュベートすると、Ｆｌａｇ-ＥＤＡ-Ａ２により誘導されるＩＫＢａのリン酸化が消失した（Ｆｉｇ１５Ｂ）。これらの結果はＤＮＡ１０１８４８とＥＤＡ-Ａ２の相互作用による一つの生理的な帰結がＮＦ-ＫＢの活性化であることを示唆する。
【０１７７】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）, 10801 ユニバーシティ通り、マナッサス、バージニア州 アメリカ合衆国に寄託した：
材料              ATCC寄託番号   寄託日
DNA  98853-1739     203906            1999年4月6日
DNA 101848-1739     203907            1999年4月6日
【０１７８】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
【０１７９】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０１８０】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドｃＤＮＡ（ヌクレオチド１−９０３）の核酸配列（配列番号：１）（及びその相補的配列（配列番号：２））を示す。また、下線が付されている１０〜１２６番目のヌクレオチド、１３３〜２５２番目のヌクレオチド及び２５９〜３５７番目のヌクレオチドによってコードされるシステインに富む３つの繰り返し配列の位置を示す。タンパク質の予想される膜貫通ドメインは図において４０９〜４７４番目のヌクレオチドによりコードされる。
【図２】Ｆｉｇ１に示した核酸配列のヌクレオチド１−９００に由来するアミノ酸配列（配列番号：３）を示す図である。潜在的な膜貫通ドメインは図のアミノ酸１３７と１５８の間（それらを含む）に存在する。
【図３】天然配列ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドｃＤＮＡ（ヌクレオチド１−８９７）の核酸配列（配列番号：４）（及びその相補的配列（配列番号：５））を示す。また、下線が付されている１０〜１２６番目のヌクレオチド、１３３〜２５２番目のヌクレオチド及び２５９〜３５７番目のヌクレオチドによってコードされるシステインに富む３つの繰り返し配列の位置を示す。タンパク質の予想される膜貫通ドメインは図において４０９〜４７４番目のヌクレオチドによりコードされる。
【図４】Ｆｉｇ３に示した核酸配列のヌクレオチド１−８９４に由来するアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。潜在的な膜貫通ドメインは図のアミノ酸１３７と１５８の間（それらを含む）に存在する。
【図５】ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチド（配列番号：６）のアミノ酸配列とＤＮＡ９８８５３ポリペプチド（配列番号：３）のアミノ酸配列との比較整列配列を示す。比較整列配列は、ＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドにおける２つのアミノ酸のギャップを除いた配列同一性を示す。
【図６】ＤＮＡ９８８５３及びＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドに対する全長のコード化配列を単離するために行われた、新規な逆ロングＰＣＲ法の模式図を示す。
【図７】幾つかのヒトの細胞系列及び組織におけるＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドの発現レベルを示すノザンプロットを示す。
【図８】ＮＦ-ＫＢの活性化を測定するためのＤＮＡ１０１８４８ポリペプチドのアッセイ結果を示す。これらのアッセにより、Ｅ-セレクチン遺伝子のＮＦ-ＫＢ応答性エレメントを含むプロモーターにより誘導されるレポーター遺伝子の発現が分析される。
【図９】インサイトクローン５０９ １５１１Ｈ（配列番号：７）の核酸配列を示す。
【図１０】Ｆｉｇ１０Ａ-１０Ｄは、ＤＮＡ１０１８４８レセプターの膜貫通性を決定するためにＭＣＦ-７（ＤＮＡ１０１８４８のＮ末端もしくはＣ末端Ｆｌａｇコンストラクトを有する形質移入細胞）の免疫染色アッセイの結果を示す。
【図１１】ＤＮＡ１０１８４８がＥＤＡ-Ａ２に対するレセプターであるかどうかを決定するために、ＣＯＳ７形質移入細胞（様々なＴＮＦ関連リガンドによる）の免疫染色アッセイの結果を示す。
【図１２】Ｆｉｇ１２Ａ-１２Ｄは、ＣＯＳ７細胞（ＤＮＡ１０１８４８又は未挿入のベクターによって形質移入された）のインサイツアッセイの結果を示す。結果は、ＡＰ-ＥＤＡ-Ａ２はＤＮＡ１０１８４８で形質移入された細胞に結合するが、ＡＰ-ＴＮＦ-α又はＡＰ-ＴＡＬＬ-１は結合しないことを示している。
【図１３】Ｆｌａｇタグを結合させた型のＥＤＡ-Ａ２が、ＤＮＡ１０１８４８に特異的に結合するかとうかを決定するためのウェスタンブロットの結果を示す。
【図１４】Ｆｉｇ１４Ａ-１４Ｂは、ＮＦ-ＫＢの活性化を決定するためのＤＮＡ１０１８４８及びＥＤＡ-Ａ２のアッセイ結果を図示する。
【図１５】Ｆｉｇ１５Ａ-１５Ｂは、ＤＮＡ１０１８４８及びＥＤＡ-Ａ２のＮＦ-ＫＢ活性化への効果を示すウェスタンブロットの結果を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月3日(2011.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：３のアミノ酸残基１〜２９９の配列を含むＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【外国語明細書】
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