(57)【要約】【課題】本発明の課題は、特定の糖鎖構造を有する糖タンパク質を免疫学的に検出することにより癌を検出する方法である。【解決手段】当該課題は、生体由来の試料と抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを接触させることにより、前記抗体がともにシアリルＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出する手段により解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来の試料と抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを接触させることを含む、癌を検出する方法であって、前記抗体がともにシアリルＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
方法がＥＬＩＳＡ法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌が胃癌又は肺癌である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
試料が腹腔洗浄液由来である、請求項３記載の胃癌を検出する方法。
【請求項５】
肺癌が肺腺癌である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法に用いるための、抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを含む、癌検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来の試料と抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを接触させて、シアリルＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする、癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質及び糖脂質上に存在する糖鎖構造はコアとなるタンパク質や糖鎖の付加部位、糖脂質の種類により、またそれらが存在する細胞種や体液の種類によって異なる。また、癌を含む種々の疾患において、健常者由来の構造とは異なる場合があることが広く知られている。糖鎖の当該特徴に着目し、健常者には存在せず特定の疾患に罹患した患者でのみ見出される糖鎖構造をターゲットとした、いくつかの疾患マーカーが用いられている。
【０００３】
そのうちの一つ、母核糖鎖に属するシアリルＴｎ（以後、「ｓＴｎ」と記載する場合もある）糖鎖抗原は、ＣＡ１９−９やＳＬＸのような従来から臨床応用が進められてきたＩ型又はＩＩ型の基幹構造を有するＮ−グリコシド結合型の糖鎖抗原に比し、より初期段階での糖鎖合成異常に由来する癌関連抗原であり、良性疾患における偽陽性率が低く、癌特異性が高い。ｓＴｎ糖鎖抗原は胃癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、胆道癌等において癌の進行と悪性化に伴い、癌組織での発現が増加するとともに、血清中にも検出されるようになることから、卵巣癌と再発性胃癌の進行癌もしくは再発癌に対する血中癌マーカーの１つとして用いられている。
【０００４】
しかし上記のマーカーは、血中ｓＴｎ濃度がある程度上昇した後でなければｓＴｎを検出することができず、ｓＴｎの検出感度が十分でない。そのため、上記マーカーは、進行癌や再発癌等しか検出できないため、その適用も癌の進行度や再発のモニタリングに限られ、早期癌のスクリーニングには適当でない。さらに、上記マーカーのｓＴｎの検出感度は不十分であるため、癌の進行度や再発のモニタリング等には、ｓＴｎを別種の癌マーカーを含む、異なる診断方法と組み合わせて用いなければ正確な診断ができない。
【０００５】
ｓＴｎはタンパク質のセリン又はトレオニン側鎖に付加される糖鎖構造であり、Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃα→Ｓｅｒ／Ｔｈｒと表記される。ここでＳｉａはシアル酸を、ＧａｌＮＡｃはＮ-アセチルガラクトサミンを、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はトレオニンを表す。Ｏ型糖鎖を有する多数のタンパク質がｓＴｎで修飾されうる。癌の体外診断に用いられているｓＴｎの測定には以下の２通りの方法がある。１つはｓＴｎを認識する２種の異なるモノクローナル抗体Ｂ７２．３及びＣＣ４９を用いて、いわゆるＣＡ７２−４という抗原を定量する、サンドイッチＥＬＩＳＡ法であり、もう１つはｓＴｎを認識するモノクローナル抗体ＴＫＨ２を用いたＲＩＡ固相化競合法である。当該方法は糖鎖であるｓＴｎ部分のみを標的とした検出系であり、ｓＴｎで修飾された多数種の糖タンパク質の混合物を検出していると考えられ、実際に所望の糖タンパク質分子が存在しているかは不明である。
【０００６】
ｓＴｎ糖鎖抗原を癌マーカーとして用いることができる上記の癌のうち、胃癌は日本において癌による死亡原因の上位を占めている。内視鏡検査等の普及により早期の段階での癌の発見と外科的切除によって治癒率は向上してきているものの、依然として再発率が高く、患者の生命予後は不良である。胃癌の再発では胃壁を超えて腹腔内に広がった遊離癌細胞から生ずる腹膜転移が主因を占めている。すなわち腹膜内に遊離癌細胞が検出された場合、高率に腹膜再発を来すことが明らかになっている。この腹膜転移については、手術によって胃癌を切除した患者の予後を予測する目的で、手術時に採取される腹腔洗浄液を用いて腹腔内の遊離胃癌細胞の検出が行われている。加えて、腹膜転移が顕在化する前に抗癌剤による腹腔内化学療法を行うと患者の予後が改善されることが示されつつあることから、高感度かつ迅速に腹腔内遊離胃癌細胞を検出する技術が求められる。従来、腹腔内遊離癌細胞は腹腔洗浄液の細胞沈渣を染色し、癌細胞を顕微鏡下に探す細胞診が行われていたが、感度が低く、検出精度も実施者の熟練にも依存する。また血清中や腹腔洗浄液中の癌マーカーをＥＬＩＳＡ法等によって測定することも行われているが、上記のように感度が十分でなく、正確な診断をすることができない。そこで、これに代わる方法として、腹腔洗浄液の細胞沈渣に対して癌細胞特異的転写産物（メッセンジャーＲＮＡ）を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅・検出することにより高感度に遊離癌細胞を定量的に検出する方法が開発された。しかし、当該方法では、用いる試薬や機器が高価であり、手順も煩雑で時間がかかるという問題があった。
【０００７】
また、ｓＴｎ糖鎖抗原を癌マーカーとして用いることができる上記癌のうち、肺癌は、国内では男性の癌死亡原因のうち、第１位、女性でも胃癌についで第２位である。今後も肺癌患者数は増加する見通しで、２０１５年には、１年間で新たに肺癌を発病する患者数は男性１１万人、女性３万７千人にのぼると予測されている。
【０００８】
肺癌は、組織学的分類によって、小細胞癌と非小細胞癌に分類される。非小細胞癌はわが国では肺癌全体の約８０〜８５％を占める癌であり、さらに腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌に分類される。わが国では、腺癌が最も発生頻度が高く、男性の肺癌では約４０％、女性の肺癌では約７０％以上、原発性肺癌の全体では約半数が腺癌である。
【０００９】
肺腺癌の臨床的診断は、主として、胸部レントゲン検査、シングルスライスＣＴ検査、マルチスライスＣＴ検査等で行うのが一般的である。また、肺腺癌検出方法として、癌マーカーとして公知の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びシアリルＬｅｘ−ｉ抗原（ＳＬＸ）に対する抗体を用いて測定することにより、ヒト肺腺癌を検出する方法がある。しかしながら、当該癌マーカーを検出する診断法では、肺腺癌に対する陽性率が４０〜５０％と低いばかりでなく、肺癌の他の組織型、肺良性疾患及び大腸癌、胃癌、乳癌をはじめとする他の臓器癌においても検出されるため、感度及び臓器特異性の面で適用可能なマーカーとはいえないという課題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】大内憲明  他：癌と化学療法、15巻、2767-2772頁（1988）
【非特許文献２】井村裕夫  他：癌と化学療法、16巻、3213-3219頁（1989）
【非特許文献３】Nakanishi, H, et al. : Int. J. Cancer Vol. 89, pp411-417 (2000)
【非特許文献４】Taylor-Papadimitriou, J, et al. : Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1455, pp301-313 (1999)
【非特許文献５】Werther, J. L., et al. : Int. J. Cancer Vol. 69, pp193-199 (1996)
【非特許文献６】Ohashi, N., et al. : Int. J. Oncol. Vol. 27, pp637-644 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のように、癌の正確な早期診断法及び当該方法を可能にする癌マーカーが望まれていた。さらに、癌の体外診断では、上記のとおり、核酸をＲＴ−ＰＣＲ法により増幅する方法がとられていたが、当該方法は手順が煩雑で、コストと時間がかかるという課題があった。さらに、上記のとおり、従来のｓＴｎ検出法では、検出時期が遅く、検出感度も不十分であるという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＣＡ７２-４値の高い胃癌患者腹腔洗浄液において、ｓＴｎで修飾されたＭＵＣ１糖タンパク質が存在することを見いだした。またｓＴｎ抗原の発現について様々な癌腫を探索する過程で、当該抗原が肺腺癌組織で強く発現することを見出し、ｓＴｎ抗原を発現する当該組織で当該抗原を有する高分子量のタンパク質を検出し、それをＭＵＣ１タンパク質と同定した。以上の結果に基づき、このｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を高感度に検出するため、ｓＴｎを認識する、キャプチャー抗体である抗ｓＴｎ抗体と、ｓＴｎで修飾された糖タンパク質を認識する、検出抗体である抗ＭＵＣ１抗体とを組み合わせたＥＬＩＳＡ試験系を構築し、ｓＴｎで修飾されたＭＵＣ1分子が同定されることを確認した。このようにして、本発明の抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体を用いた、ｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出するための免疫学的方法を確立するに至った。さらに、当該方法を用いると、上記各種癌組織及び体液中の癌の存在を精度よく検出できることも見出し、上記方法が癌を検出することができることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）生体由来の試料と抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを接触させることを含む、癌を検出する方法であって、前記抗体がともにシアリルＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする、前記方法。
（２）方法がＥＬＩＳＡ法である、（１）記載の方法。
（３）癌が胃癌又は肺癌である、（１）又は（２）記載の方法。
（４）試料が腹腔洗浄液由来である、（３）記載の胃癌を検出する方法。
（５）肺癌が肺腺癌である、（３）記載の方法。
（６）（１）記載の方法に用いるための、抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを含む、癌検出試薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、生体由来の試料と抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを接触させることを含む、癌の存在を検出する方法であって、前記抗体がシアリルＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする方法が提供される。本発明の方法は、検出抗体としてｓＴｎを認識する抗体のほかに抗原分子であるＭＵＣ１分子との親和性が高い抗ＭＵＣ１抗体を用いるため、糖鎖抗原であるｓＴｎを認識する抗体のみを用いる方法よりも、感度が高い。よって、本発明の方法は、正確に癌細胞の存在を検出する方法として有用である。さらに、当該検出方法は、高価な試薬や機器が不要で安価であり、検出手順も簡易かつ短時間で結果が得られる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、肺腺癌細胞株を用いてフローサイトメトリーで細胞表面ｓＴｎ発現の検討を行った結果を示す図である。
【図２】図２は、ｓＴｎ合成の責任酵素遺伝子ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを強制発現した胃癌細胞株を用いてフローサイトメトリーを行い、細胞表面ｓＴｎ発現の確認を行った結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、肺腺癌細胞株ライセートを用いた抗ｓＴｎ抗体による免疫沈降実験の結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、肺腺癌細胞株ライセートを用いた抗ｓＴｎ抗体による免疫沈降実験の結果を示す図である。
【図４】図４は、肺腺組織ライセートを用いた抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体による免疫沈降実験の結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、肺癌組織ライセートにおけるｓＴｎ−ＭＵＣ１発現の検討を行った結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、肺癌組織ライセートにおけるｓＴｎ−ＭＵＣ１発現の検討を行った結果を示すグラフである。
【図６】図６は、肺腺癌細胞株の細胞ライセート及び培養上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるｓＴｎ−ＭＵＣ１の検出を行った結果を示す図である。
【図７】図７は、肺癌組織ライセートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるｓＴｎ−ＭＵＣ１の検出を行った結果を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ヒト胃癌細胞株のマウス移植モデルにおけるｓＴｎ発現による腹膜転移の亢進を示す写真である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒト胃癌細胞株のマウス移植モデルにおけるｓＴｎ発現による腹膜転移の亢進と生命予後の悪化を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ｓＴｎ陽性胃癌細胞株ＧＣＩＹ／６Ｌから抗ｓＴｎ抗体を用いた免疫沈降とウェスタンブロッティングによりｓＴｎキャリアタンパク質としてＭＵＣ１を同定した結果を示す写真である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｓＴｎ陽性胃癌細胞株ＧＣＩＹ／６Ｌから抗ＭＵＣ１抗体を用いた免疫沈降とウェスタンブロッティングによりｓＴｎキャリアタンパク質としてＭＵＣ１を同定した結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、免疫沈降とウェスタンブロッティングを用いて、ヒト胃癌組織ライセートにおいてｓＴｎ−ＭＵＣ１が発現していることを示す写真である。
【図１１】図１１は、ＣＡ７２-４陽性ヒト胃癌腹腔洗浄液においてｓＴｎ−ＭＵＣ１が存在していることを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、生体由来の試料と抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを接触させることを含む、癌を検出する方法であって、前記抗体がシアリルＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の癌の検出方法
本発明の癌の検出方法は、癌組織で強く発現するｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を精度よく検出することに関し、具体的には抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体を用いて、当該タンパク質をより感度よく検出することを特徴とする。
【００１８】
（１）本発明のｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質
本発明の方法に関する「ｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質」とは、シアリルＴｎで修飾されたＭＵＣ１糖タンパク質をいう。「ＭＵＣ１糖タンパク質」とは、ＭＵＣ１コアペプチドに、セリン又はトレオニン残基を介して多数のＯ型糖鎖が付加されているムチン性の膜結合型糖タンパク質、又は前記膜結合型糖タンパク質が細胞外部分で切断されて生じた分泌型あるいは可溶化型糖タンパク質である。ＭＵＣ１コアタンパク質遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、ＧＥＮＥＢＡＮＫにアクセッション番号ＮＭ＿００２４５６として登録されている。ＭＵＣ１コアタンパク質はＩ型膜タンパク質であり、短いＮ末端領域、２０アミノ酸の反復配列（ムチンリピート）からなる中央領域、ムチンリピートよりＣ末側の短い細胞外領域、膜貫通領域、細胞質側の短いＣ末端領域からなる。細胞外領域全体にわたって多数のセリンとトレオニンが存在し、特にムチンリピートを構成する２０アミノ酸のうち５アミノ酸がセリンとトレオニンで占められる。少なくともムチンリピート内では５カ所のセリンとトレオニンのほぼ全てにＯ型糖鎖が付加していると報告されている。ムチンリピートの繰り返し回数は著しい多型を示し、２１から１２５回に及ぶ。それゆえその分子量は３００kＤａ以上と長大になる。
【００１９】
正常組織におけるＭＵＣ１コアペプチド上での糖鎖伸張反応は、セリン又はトレオニン側鎖にＧａｌＮＡｃが結合することで開始する。通常、このＧａｌＮＡｃにガラクトース（Ｇａｌ）がβ１-３結合で付加してコア１構造（Ｇａｌβ１-３ＧａｌＮＡｃα-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を形成し、さらにコア１構造にＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１-６結合で付加しコア２構造（Ｇａｌβ１-３（ＧｌｃＮＡｃβ１-６）ＧａｌＮＡｃα-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を形成する。さらにこれら非還元末端のＧａｌやＧｌｃＮＡｃに糖鎖が付加され、長大な糖鎖が形成される。結果として長大な糖鎖を多数有したＭＵＣ１糖タンパク質が生じる。
【００２０】
一方、癌細胞では、前記のＯ型糖鎖合成がしばしば異常を示すことが分かっている。シアリルＴｎ（ｓＴｎ）もそのような癌関連糖鎖抗原の１つとして以前から知られていた。ｓＴｎは、タンパク質のセリン又はトレオニン側鎖に付加される糖鎖構造であり、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基にＳｉａα２→６ＧａｌＮＡｃがα結合している抗原をいい、Ｓｉａα２→６ＧａｌＮＡｃα→Ｓｅｒ／Ｔｈｒで表される。
ここで、Ｓｉａはシアル酸を、ＧａｌＮＡｃはＮ-アセチルガラクトサミンを、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はトレオニンを表す。Ｏ型糖鎖を有する多数のタンパク質がｓＴｎで修飾されうる。ｓＴｎは、より初期段階での糖鎖合成異常に由来する。すなわち、前記コア１構造のＧａｌＮＡｃに対しシアル酸（Ｓｉａ）がα２-６結合で結合している（Ｓｉａa２→６ＧａｌＮＡｃa→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）。しかし、この結合様式は正常組織では見出されない。重要なことは、このシアル酸付加により、当該糖鎖にこれ以上の付加・伸長が起きなくなることであり、結果的にｓＴｎ糖鎖抗原が蓄積する。ｓＴｎ糖鎖抗原は、良性疾患における偽陽性率が低く、癌特異性が高いことを特徴とし、胃癌、膵癌、大腸癌、胆道癌等の消化器癌や卵巣癌、子宮頸癌等で認められ、これらの癌の組織マーカーとして用いられる他、血中癌マーカーの１つとしても用いられる。
【００２１】
本発明者らが同定した上記「シアリルＴｎで修飾されたＭＵＣ１糖タンパク質」とは、ＭＵＣ１糖タンパク質上のＯ型糖鎖の全部又は一部がシアリルＴｎである、癌細胞によって合成されるＭＵＣ１糖タンパク質の一群である。担癌患者においてＭＵＣ１糖タンパク質に対する自己抗体が検出されるとの報告があったが、その作用機序は知られていなかった。発明者らは、シアリルＴｎは２糖からなる短い糖鎖のため、正常組織で合成されるＭＵＣ１糖タンパク質では高密度に存在する長大なＯ型糖鎖によってマスクされていたＭＵＣ１コアペプチドの一部が露出することになるため、シアリルＴｎで修飾されたＭＵＣ１糖タンパク質は強い抗原性を獲得すると考えた。実際に、本発明に関する「シアリルＴｎが修飾されたＭＵＣ１糖タンパク質」は、癌組織で強く発現するため、癌マーカーとして用いることができる。癌については、以下に詳細に説明する。
【００２２】
（２）本発明の抗体
本発明の方法は、抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体を用いることを特徴とする。
本発明において「抗ｓＴｎ抗体」とはｓＴｎ糖鎖抗原に結合し得る抗体分子全体を意味し、「抗ＭＵＣ１抗体」は、種々の糖鎖で修飾されたＭＵＣ１糖タンパク質又は糖鎖修飾を受けていないＭＵＣ１コアタンパク質又はそれらの部分断片に結合し得る抗体分子全体を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。さらに、その断片、すなわち抗原抗体反応活性を有する活性フラグメント、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、組換えＦｖ体、１本鎖Ｆｖも含まれる。
【００２３】
本発明の抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体は公知の方法を用いて調製することができるし、市販されているハイブリドーマを用いて公知の方法に従って作製してもよい。また、本願発明で用いられる抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体は、ｓＴｎ及びＭＵＣ１に対する特異性が確認された抗体であれば、いかなる抗体をも用いうる。
【００２４】
例えば、ポリクローナル抗体を作製するためには、免疫した動物から得られた抗血清中からポリクローナル抗体を作製する方法があげられる。具体的には、ＭＵＣ１糖タンパク質若しくはＭＵＣ１糖タンパク質に修飾されたｓＴｎ又はそれらの部分断片を抗原として用いて動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）を免疫し、最終免疫後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得ればよい。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、１〜１０ｍｇであり、アジュバントの有無によって適宜調節する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられる。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００２５】
モノクローナル抗体を作製するには、当該分野で周知のハイブリドーマ法によって製造することができる。例えば、ＭＵＣ１糖タンパク質若しくはＭＵＣ１糖タンパク質に修飾されたｓＴｎ又はそれらの部分断片を抗原として、哺乳動物を免疫した後に得られる抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞等）とミエローマ細胞（例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１、ＮＳ−Ｉなど）との細胞融合を行い、細胞融合後に目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすればよい。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
【００２６】
本発明における抗体には、ヒト型化又はヒト化されたものも含まれる。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えた哺乳動物を免疫すれば、通常のモノクローナル抗体と同様にして作製することができる。ヒト型化抗体は、定常領域と可変領域の一部がヒト型の抗体であり、可変領域において、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものを、ＣＤＲと呼ばれる相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）はマウス由来のものからなる再構成した抗体である。ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域からＣＤＲをヒト可変領域に移植して、次にこれらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。ヒト型化抗体の作製法は、遺伝子工学的手法により得ることができ、当分野において確立されている。
【００２７】
（３）本発明のタンパク質を特異的に検出する方法
本発明の方法は、ｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出することにより、癌を検出する方法に関する。特異的に検出する方法としては、免疫学的に検出する方法があげられる。免疫学的方法としては、一般に普及している多くの手法があげられ、免疫沈降及びウェスタンブロッティングのほか、競合法、イムノメトリック法、ネフェロメトリー（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ）、サンドイッチ法などが好適に用いられるが、感度及び特異性の見地から、サンドイッチ法がとくに好ましい。サンドイッチ法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ））等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明のｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を免疫学的に検出する方法としては、生体由来の試料を、標識した上記「抗ｓＴｎ抗体」及び「抗ＭＵＣ１抗体」と接触させて、当該試料中に「ｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質」が存在する場合には、当該タンパク質が上記標識抗体と反応することで、その存在を検出する方法や、免疫学的な凝集反応として上記タンパク質の存在を検出する方法もあげられる。
【００２９】
この場合、上記抗体は、適当な化学的又は物理的検出手段により検出可能な標識を有する。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質などが用いられる。標識にとくに酵素を用いた場合は、ＥＬＩＳＡ法と呼ばれ、広く利用されている。また、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなど、酵素として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼなど、放射性同位元素として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなど、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体などがあげられる。
【００３０】
具体的な免疫学的方法として、例えば、免疫沈降及びブロッティングを用いる方法を例示する。すなわち、細胞ライセート又は組織のライセート等の生体由来の試料から免疫沈降物を得て、適当なバッファーを添加してインキュベートすることにより溶出させる。この溶出した免疫沈降物について抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体を用いたウェスタンブロッティングで解析する。この結果、ｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を示す分子量２５０ｋＤａをこえるバンド及びスメアを検出する方法である。
【００３１】
具体的な免疫学的方法として、さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた方法も例示する。すなわち、適当量の抗ｓＴｎモノクローナル抗体と適当量の細胞ライセート又は組織ライセート等の生体由来の試料を反応させた後、抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体を添加してさらに反応させる（１次反応）。その後、さらに、上記反応液に、標識酵素で標識された２次抗体を添加して反応させる（２次反応）。最後に、標識酵素により触媒される発色反応により、上記試料中に存在するｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を検出する方法である。この場合、１次反応において、抗ｓＴｎモノクローナル抗体と抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体とを添加する順序は逆でもよく、当該１次反応と２次反応は逆順序に行ってもよく、同時に行ってもよいし、さらに時間をずらして行ってもよい。また、標識に用いられる標識酵素としては、ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼなどがあげられる。本発明の抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体又は抗原と標識酵素との結合には、ビオチン‐アビジン系を用いてもよい。また、抗原又はモノクローナル抗体を不溶化させてもよく、その場合には、物理的吸着を用いてもよく、あるいは通常タンパク質又は酵素などを不溶化、固定化するために用いられる化学結合を用いる方法を用いることができる。さらに、担体として、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、あるいはガラスなどを用いることもできる。そして、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などを含んでもよい。さらに、検出手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものであればいかなる手段をも用いることができる。
【００３２】
（４）本発明の癌を検出する方法
本発明では、上記の免疫学的方法により得られた検出結果を指標として癌の状態を評価することにより癌を検出することができる。具体的には、（ｉ）生体由来の試料と本発明の抗ｓＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを反応させて、試料中に存在する癌マーカーであるｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質を特異的に検出する工程；及び（ｉｉ）工程（ｉ）の検出結果を、癌と関連付ける工程；を含む癌の検出方法である。
【００３３】
ここで、評価方法としては、例えば、免疫沈降やブロッティングを用いた上記検出方法により、所定のタンパク質の分子量と同一の分子量を有するタンパク質が確認された場合を陽性とし、当該タンパク質が確認されなければ陰性として、癌の状態を評価する方法があげられる。また、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた上記検出方法により検出結果が所定の基準値を超えるものを陽性、所定の基準値以下のものを陰性とし、陽性の場合には、癌を発症している可能性があると判断し、癌の状態を評価する方法があげられる。
【００３４】
癌の状態とは、癌の罹患の有無又はその進行度を意味し、癌発症の有無、癌の進行度、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無等が挙げられる。上記評価に際し、これらの癌の状態は１つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。癌の有無を評価するには、癌に罹患しているか否かを判断する。癌の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価したり、いわゆる早期癌、進行癌を分類して評価したりすることも可能である。癌の転移は、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。再発は、間欠期又は寛解の後に再び癌が現れたか否かにより評価する。
【００３５】
（５）本発明の生体由来の試料
本発明の癌の検出方法には、生体由来の試料を用いることができる。本発明で用いる生体由来の試料としては、体液、組織、細胞、血液、尿及び手術等で採取される液体等があげられるがこれらに限定されない。手術等で採取される液体としては、例えば、腹腔洗浄液や腹水があげられる。腹腔洗浄液とは、手術時に腹腔を洗浄する腹腔洗浄法により得られる液体をいい、洗浄には生理食塩水等が用いられる。腹腔洗浄法には、腹腔内貯留液の有無や性状などを検査するための診断的腹腔洗浄法と消化管穿孔時の腹腔内洗浄、腹腔内細菌の排除及び術中の出血による凝血塊の除去、臓器の乾燥予防などを目的とした治療的腹腔洗浄法などがあげられ、このような方法により得られた液体であれば本発明で用いることができる。特に、胃癌腹腔洗浄液は、従来から、腹腔内の遊離胃癌細胞を検出して胃癌の腹膜転移の有無を検査するために採取されてきた試料である。本発明の方法で用いる生体由来の試料として当該胃癌腹腔洗浄液を用いると、高感度かつ迅速に腹腔内遊離胃癌細胞を検出することができるため、胃癌腹腔洗浄液は本発明の生体由来の試料として好ましい。
【００３６】
（６）本発明の方法で検出できる癌
本発明の方法により検出できる癌の適用部位は特に限定されず、胃癌、肺癌、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、乳癌、食道癌、膵癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫）、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。特に、本発明の方法には、肺癌及び胃癌の検出に適する。ここで、本発明の方法は、肺癌の検出のうち、肺腺癌の検出に好適である。また、本発明の方法は、胃癌の検出のうち、胃癌の検出のほか、胃癌の腹膜転移の検出にも好適である。胃癌の腹膜転移とは、胃壁を超えて腹腔内に広がった遊離癌細胞から生ずる癌で、胃癌の再発の主因である。本発明の方法を胃癌の腹膜転移の検出に用いる場合は、腹腔洗浄液を用いて腹膜播種を検出することにより、癌の予後や再発の有無を早期に診断することできるため、好ましい。
【００３７】
本発明の癌検出試薬
本発明の上記癌を検出する方法には、抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体とを含む、癌検出試薬を用いることができる。
【００３８】
本発明の抗シアリルＴｎ抗体及び抗ＭＵＣ１抗体を免疫学的測定方法に適用する場合、特別の条件、操作などは必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行われ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系が構築できる。
【００３９】
そのためのもっとも簡便かつ効率的に測定を行うことを可能とするのは、上記試薬をキット化することである。そうしたキット化により、通常の検査室又は実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行うことができる。上記の各種検出方法又は治療の判定方法を実施するためのアッセイキットの構成及び形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には上記検体試料について、アッセイ方法を実行し得られた結果を解釈するための使用説明書、反応試薬、反応が行われる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材などから構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器なども含んでもよい。
【００４０】
本発明の「抗ｓＴｎ抗体」及び「抗ＭＵＣ１抗体」を癌検出試薬として用いる場合には、「抗ｓＴｎ抗体」及び「抗ＭＵＣ１抗体」を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。たとえば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。
【００４１】
本検出試薬には、本発明の抗体の他に、抗原固相化マイクロプレート、「ｓＴｎを有するＭＵＣ１糖タンパク質」の標準品（ＳＴＤ）、抗体希釈溶液、ＨＲＰ標識−抗ウサギＩｇＧ抗体、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液などを含めることができる。また、標識酵素として、ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼなどを用いることもできる。さらに、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤なども含めることもできる。
【実施例】
【００４２】
実施例１：ｓＴｎ陽性癌細胞株の探索及び樹立
本実施例は、ｓＴｎ陽性癌細胞株を樹立することを目的とする。
肺腺癌細胞株として、Ａ５４９、ＡＢＣ１、ＥＨＨＡ−９、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、ＮＣＩ−Ｈ１３５５、ＮＣＩ−Ｈ１８１９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＮＣＩ−Ｈ３２５５、ＨＡＬ８、ＨＡＬ２４、ＨＣＣ８２７、ＬＸ−１、ＰＣ−９、及びＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳの１６種類の細胞を用いて以下の実験に供した。
【００４３】
上記細胞は全て、１０％非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ）培地中で３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
【００４４】
培養後の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．５％；ＧＩＢＣＯ）で処置してプレートから剥離した後、遠心分離によって回収した。回収した細胞を約２．０×１０６細胞／ｍｌになるように１％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈し、０．１ｍｌ（〜２．０×１０５細胞）を５ｍｌ試験管に分注した。その後、０．１ｍｌのＢ７２．３産生ハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間染色した。遠心分離して上清を除去した後、１％ＦＣＳを含むＰＢＳで懸濁し、ＡＰＣコンジュゲートされた抗マウスＩｇ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を終濃度１０μg／ｍｌになるように添加し、４℃で１時間染色した。遠心分離して上清を除去した後、１％ＦＣＳを含むＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリー解析に供した。
【００４５】
フローサイトメトリー解析には、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。細胞に６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーの励起光を照射した後、ＡＰＣ由来の蛍光を６５０ｎｍ以上の蛍光検出器で検出した。その結果、図１に示されたように、ＥＨＨＡ−９細胞及びＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で細胞表面ｓＴｎ抗原の発現が高いことが示された。
【００４６】
一方、これまでに樹立され利用可能であった胃癌細胞株にはｓＴｎが発現しているものはなかった。そこで胃癌細胞株の１つで、マーカーとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを有するＧＣＩＹ−ＥＧＦＰに、ｓＴｎ合成の責任酵素であるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの活性型を発現するプラスミドを導入した。フローサイトメトリーでｓＴｎの発現を調べたところ、ｓＴｎ陽性の画分が認められたので、この画分をソートし、ｓＴｎ陽性の亜株（ＧＣＩＹ／６Ｌ）を樹立した（図２）。コントロールとして不活性型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを異所性に発現するｓＴｎ陰性の亜株（ＧＣＩＹ／６Ｓ）を樹立した。
【００４７】
実施例２：肺癌細胞株ライセートを用いた免疫沈降及びウェスタンブロッティング
本実施例は、ｓＴｎ陽性癌細胞株を用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングにより、本発明のタンパク質を解析することを目的とする。
【００４８】
実施例１で細胞表面ｓＴｎ抗原の発現が高いことが示されたＥＨＨＡ−９細胞及びＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を以下の実験に供した。まず、このＥＨＨＡ−９細胞及びＮＣＩ−Ｈ４４１細胞をＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ））で溶解した。タンパク定量後、タンパク質量が１００μｇ／ｍｌになるように細胞ライセートをＲＩＰＡバッファーで希釈し、１ｍｌを１．５ｍｌ試験チューブに分注した。その後、１０μｌのＢ７２．３がコンジュゲートされたセファロースビーズ（〜２．５μｇ抗体／μｌ）を添加し、４℃で終夜インキュベートした。免疫沈降物をＲＩＰＡバッファーで洗浄し、１×ＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００５％ＢＰＢ）で懸濁した後、９５℃で５分間のインキュベーションによって溶出した。
【００４９】
溶出された免疫沈降物について銀染色及びＢ７２．３を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、ＥＨＨＡ−９細胞ライセート由来の免疫沈降物のレーンでは分子量２５０ｋＤａをこえるバンドが検出され、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞ライセート由来の免疫沈降物のレーンでは分子量１６０〜２５０ｋＤａのスメアが検出された（図３Ａ）。
しかしながら、銀染色では、ウェスタンブロッティング解析で得られた分子量のバンド又はスメアに対応するバンド又はスメアを検出することができなかった（図３Ａ）。
【００５０】
これらの結果により、検出されたバンドがムチンタンパク質である可能性が考えられた。そこで、上記の免疫沈降物を利用し、抗ムチン抗体のパネル（抗ＭＵＣ１（ＶＵ４Ｈ５）、抗ＭＵＣ３（Ｍ３．１）、抗ＭＵＣ４（Ｈ−３００）、抗ＭＵＣ５Ｂ（５Ｂ＃１９−２Ｅ）、抗ＭＵＣ７（Ｖ−２０）、抗ＭＵＣ１１（Ｐ−１８）、抗ＭＵＣ１２（Ｃ−２１）、抗ＭＵＣ１３（Ｋ−１３）、抗ＭＵＣ１７（Ｎ−１９）（以上、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ＭＵＣ２（ＣＣＰ５８）（ＺＹＭＥＤ）、及び抗ＭＵＣ５ＡＣ（ＣＨＬ２）（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ））を用いてウェスタンブロッティング解析を行った。
【００５１】
その結果、抗ＭＵＣ１抗体を用いた時にのみ、分子量２５０ｋＤａを越える位置にバンドが検出された（図３Ｂ）。これより、ＭＵＣ１がｓＴｎ抗原のキャリアタンパク質であることが示された。
【００５２】
実施例３：肺腺癌組織を用いた免疫沈降及びウェスタンブロット
本実施例は、癌組織用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングにより、本発明のタンパク質を解析することを目的とする。
【００５３】
本実施例で用いた肺腺癌組織試料（非癌部及び癌部）は、筑波大学病院で肺腺癌の外科的切除手術を受けた患者からインフォームドコンセントを経て得られた試料である。
上記のように得られた肺腺癌組織試料をＲＩＰＡバッファーで溶解した後、１０，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を細胞ライセートとして回収した。タンパク定量後、タンパク質量が１００μｇ／ｍｌになるように細胞ライセートをＲＩＰＡバッファーで希釈し、１ｍＬを１．５ｍｌ試験チューブに分注した。その後、実施例２で記載した１０μｌのＢ７２．３セファロースビーズを添加し、４℃で終夜インキュベートした。免疫沈降物をＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、１×ＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００５％ＢＰＢ）で懸濁した後、９５℃で５分間のインキュベーションで溶出した。溶出した免疫沈降物について、銀染色（図４、Ａ）並びにＢ７２．３及び抗ＭＵＣ１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、図４で示されるように、ＭＵＣ１は癌部でのみ検出され、非癌部では検出されなかった（図４、Ｂ）。一方、抗ＭＵＣ１抗体（クローンＶＵ４Ｈ５，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で免疫沈降し、得られた免疫沈降物を、抗ｓＴｎ抗体を用いて検出した場合にも、癌部でのみ２５０ｋＤａより上の位置に特異的なバンドが得られた（図４、Ｂ）。したがって、この系で検出されるＭＵＣ１が肺腺癌を検出する良好なマーカーとなることが示された。
【００５４】
実施例４：肺癌組織ライセートを用いた免疫沈降及びウェスタンブロット
本実施例は、癌組織ライセートを用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングを行い、本発明のタンパク質を解析することを目的とする。
【００５５】
本実施例で用いる肺癌組織試料（非癌部及び癌部）は全て、東京医科大学病院で肺癌の外科的切除手術を受けた患者からインフォームドコンセントを経て得られた。
上記肺癌組織試料をＲＩＰＡバッファーで溶解した後、１０，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を細胞ライセートとして回収した。タンパク定量後、タンパク質量が１００μｇ／ｍｌになるように細胞ライセートをＲＩＰＡバッファーで希釈し、１ｍｌを１．５ｍｌ試験チューブに分注した。その後、実施例２で記載した１０μｌのＢ７２．３セファロースビーズを添加し、４℃で終夜インキュベートした。免疫沈降物をＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、１×ＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００５％ＢＰＢ）で懸濁した後、９５℃で５分間のインキュベーションで溶出した。溶出した免疫沈降物についてＭＵＣ１抗体を用いたウェスタンブロッティングで解析した。その結果、図５Ａ及びＢで示されるように、肺腺癌３４症例中２９症例（８５．３％）においてＭＵＣ１が検出され（図５Ｂ）、この系で検出されるＭＵＣ１が肺腺癌を検出する良好なマーカーとなることが示された。
【００５６】
実施例５：肺癌細胞株ライセート及び培養上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ
本実施例は、肺癌細胞株ライセート及び培養上清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで肺腺癌の存在を予測することができるか否かの検討を行うことを目的とする。
【００５７】
以下の実験には、ｓＴｎをキャリーするＭＵＣ１を発現する肺腺癌細胞株ＥＨＨＡ９、ｓＴｎは発現するがＭＵＣ１上にＳＴｎがキャリーされない肺腺癌細胞株ＰＣ９／６Ｌ及びｓＴｎを発現しない肺腺癌細胞株ＰＣ９／６Ｓ由来のライセート並びに培養上清を用いた。上記試料を用いて、以下に記載するサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ｓＴｎ−ＭＵＣ１を検出した。
【００５８】
すなわち、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＢ７２．３／抗ｓＴｎモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍｌ、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で終夜反応させた。溶液を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴを添加してブロッキングを行った。ＰＢＳＴで洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌになるようにＲＩＰＡバッファーで希釈された細胞ライセート又は１０倍濃縮した細胞培養上清をそれぞれ１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ビオチン化された抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍｌ、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間反応させた。溶液を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジン溶液（Ｊａｃｋｓｏｎ；２０，０００倍希釈）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ（商標）ＴｕｒｂｏＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を１００μｌ／ウェルで添加し、その後１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ウェルで添加した。最終的にＯＤ４５０ｎｍを測定し、抗原の存在を確認した。
【００５９】
その結果、図６Ａ及び６Ｂで示すように、ｓＴｎ−ＭＵＣ１は、対照細胞株と比較してｓＴｎをキャリーするＭＵＣ１を発現する肺腺癌細胞株由来のライセート及び培養上清でより多く検出された。したがって、本明細書に記載された方法を用いて上記抗原を検出することにより、肺腺癌の存在を予測することができることが示された。
【００６０】
実施例６：肺癌患者組織ライセートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ
本実施例は、肺癌患者組織ライセートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで肺癌の存在を予測することができるか否かの検討を行うことを目的とする。
【００６１】
本実施例で用いる肺癌組織試料（非癌部及び癌部）は全て、東京医科大学病院で肺癌の外科的切除手術を受けた患者からインフォームドコンセントを経て得られた。
以下の実験には、肺腺癌患者の癌部由来の組織ライセート（ＡＤ）、ならびにその他の肺癌患者の癌部又は罹患部由来の組織ライセート（ＳＱ、ＳＣＬＣ、Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を用いた。上記組織ライセートを用いて、以下のように、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてｓＴＮ−ＭＵＣ１を検出及び測定した。
【００６２】
すなわち、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＢ７２．３／抗ｓＴｎモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍｌ、５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で終夜反応させた。溶液を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴを添加してブロッキングを行った。ＰＢＳＴで洗浄した後、１００ｎｇ／ｍｌになるようにＲＩＰＡバッファーで希釈した細胞ライセートを１００μｌ／ウェルで添加して、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ビオチン化した抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍｌ，０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６））を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間反応させた。溶液を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジン溶液（Ｊａｃｋｓｏｎ；２０，０００倍希釈）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ（商標）ＴｕｒｂｏＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を１００μｌ／ウェルで添加し、その後１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ウェルで添加した。最終的にＯＤ４５０ｎｍを測定し、抗原の存在及び量を確認した。
【００６３】
その結果、図７で示すように、ｓＴｎ−ＭＵＣ１は、対照組織ライセートと比較して腺癌組織ライセートでより多く検出された。したがって、本明細書に記載された方法を用いて該抗原を検出することにより、肺腺癌の存在を予測することができることが示された。
【００６４】
実施例７：マウス移植モデルにおけるｓＴｎ発現による腹膜転移の亢進と生命予後の悪化
本実施例は、癌細胞を移植したマウスモデルを用いて、ｓＴｎ発現と癌の腹膜転移及び予後の悪化の相関関係を検討することを目的とする。
【００６５】
本実施例では、実施例１で樹立した、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの活性型を発現するプラスミドが導入されたｓＴｎ陽性の亜株であるＧＣＩＹ／６Ｌ及びコントロールとして不活性型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを異所性に発現するｓＴｎ陰性の亜株であるＧＣＩＹ／６Ｓを用いた。上記株の培養条件等は実施例１に記載のとおりである。
【００６６】
ＧＣＩＹ／６Ｌ及びＧＣＩＹ／６Ｓを培養し、指数関数的に増殖している時点で、ＧＣＩＹ／６Ｌ及びＧＣＩＹ／６Ｓを、トリプシンを用いて培養皿から剥がし、ハンクス液に懸濁した。
【００６７】
２×１０６個の細胞を含む細胞懸濁液をヌードマウスの腹腔にシリンジを用いて注入し、ＳＰＦにて飼育し、経過を観察した。細胞懸濁液注入後、５週目又は７週目に開腹し、注入した癌細胞株をＥＧＦＰの蛍光により観察した。
【００６８】
その結果、５週目の時点では、ｓＴｎ陽性であるＧＣＩＹ／６Ｌの方が、ｓＴｎ陰性のＧＣＩＹ／６Ｓに比べて明らかに腹膜転移が亢進しており（図８Ａ）、取り出した癌の重量も有意に大きかった（図８Ｂ、左）。一方、７週目の時点では、ＧＣＩＹ／６ＬとＧＣＩＹ／６Ｓの間で、腹膜転移の程度に明瞭な差は認められなかった（図８Ａ）。また、移植後のマウスの生命予後を観察したところ、ｓＴｎ陽性であるＧＣＩＹ／６Ｌの方がｓＴｎ陰性のＧＣＩＹ／６Ｓに比べて明らかに短命であった（図８Ｂ、右）。
【００６９】
従ってＧＣＩＹ／６Ｌは活性型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを強制発現した人工的な系ながら、高率に腹膜転移し、生命予後が悪いというヒトにおける胃癌の腹膜再発と共通する性質を有していることが見出された。そこで、この細胞株を用いてｓＴｎキャリアタンパク質を探索することとした。
【００７０】
実施例８：抗ｓＴｎ抗体（Ｂ７２．３）の精製及び固相化
本実施例は、抗ｓＴｎ抗体であるＢ７２．３モノクローナル抗体を精製し、固相化することを目的とする。Ｂ７２．３モノクローナル抗体はｓＴｎに対する特異性が確認されている抗体である。
【００７１】
Ｂ７２．３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ＡＴＣＣより入手）を無血清培地Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ-ＳＦＭ（インビトロジェン）に馴化したのち大量培養し、Ｂ７２．３モノクローナル抗体を含む大量の培養上清を回収した。遠心分離及び濾過により浮遊物を除いた後、ＭＡｂＴｒａｐ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）又はｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を用いてＢ７２．３モノクローナル抗体を精製した。
【００７２】
Ｂ７２．３モノクローナル抗体の固相化にはＣＮＢｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を用いた。精製Ｂ７２．３モノクローナル抗体１ｍｇに対しＣＮＢｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅレジン０．０５ｇの割合で、添付のプロトコールに従って反応させた。これにより、Ｂ７２．３モノクローナル抗体をＳｅｐｈａｒｏｓｅレジンに共有結合を介して結合させた。反応後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅレジンを洗浄し、レジン０．０５ｇあたり２００μｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁し、適量を免疫沈降に用いた。
【００７３】
実施例９：ｓＴｎ陽性ＧＣＩＹ／６ＬからのｓＴｎキャリアタンパク質の免疫沈降とウェスタンブロッティングによる同定
本実施例は、ｓＴｎ陽性ＧＣＩＹ／６Ｌを用いた免疫沈降とウェスタンブロッティングを行い、ｓＴｎキャリアタンパク質を同定することを目的とする。
【００７４】
本実施例では、実施例１で樹立した、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの活性型を発現するプラスミドが導入されたｓＴｎ陽性の亜株であるＧＣＩＹ／６Ｌ及びコントロールとして不活性型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを異所性に発現するｓＴｎ陰性の亜株であるＧＣＩＹ／６Ｓを用いた。上記株の培養条件等は実施例１に記載のとおりである。
【００７５】
上記、ＧＣＩＹ／６Ｌ及びＧＣＩＹ／６Ｓを１０ｃｍ培養皿で８０％コンフルエント程度まで培養し、培養上清（ｓｕｐ、１０ｍｌ）を回収するとともに、細胞が張り付いた培養皿に、プロテアーゼ阻害剤としてｃｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した０．５ｍｌ  ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．３、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を加えて細胞を溶解し、マイクロチューブに移して遠心分離後、上清をライセート（ｌｙｓａｔｅ）として回収した。予めマウスＩｇＧを付けたＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを加えて培養上清及びライセートをプレクリアした後、実施例８で調製した抗ｓＴｎ抗体（Ｂ７２．３）固相化ビーズ１０μｌを加え浸透しながら４℃で一晩インキュベートした。遠心分離を行うことにより回収したビーズをＲＩＰＡバッファーで洗浄した後、１０μｌＳＤＳサンプルバッファーを加えて９８℃で５分間加熱することで、ビーズに結合したタンパク質を溶出した。これを６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、Ｉｍｍｕｎ−ＢｌｏｔＰＶＤＦ膜（バイオラッド）に転写した。転写後のブロットを５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて室温で１時間ブロッキングした後、１次抗体として５０μｇ／ｍｌ程度のＢ７２．３を含むハイブリドーマ培養上清（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加）中で室温、１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳ−Ｔで充分に洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔで２００００倍に希釈したＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ、ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄＦ（ａｂ’）２（ＧＥヘルスケア）を含む２次抗体液中で室温で１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳ−Ｔで充分に洗浄した後、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルケア）による化学発光システムとＸ線フィルムを用いてＢ７２．３に反応するｓＴｎキャリアタンパク質を検出した（図９Ａ）。
【００７６】
その結果、ＧＣＩＹ／６Ｌの培養上清とライセートの両者から、主要なバンドとして２５０ｋＤａを超える分子量を示すバンドと１００ｋＤａから１５０ｋＤａの間の分子量を示すバンドが検出された。
【００７７】
前者のタンパク質が２５０ｋＤａを超える巨大なタンパク質であること及びＢ７２．３がｓＴｎのクラスターを認識すると報告されていることから、次に、このタンパク質がムチンである可能性について検討した。ブロットをストリッピングバッファー（２％ＳＤＳ，１００ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７）中で５０℃、３０分間処理して抗体を外した後、ＴＢＳ−Ｔで２００倍に希釈した抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体（クローンＶＵ４Ｈ５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む１次抗体液中で室温１時間インキュベーションして、十分洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔで２００００倍に希釈したＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ、ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄＦ（ａｂ’）２を含む２次抗体液中で室温で１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳ−Ｔで充分に洗浄した後、前記と同一のシステムで、ＭＵＣ１を検出した。
【００７８】
その結果、Ｂ７２．３で検出された２５０ｋＤａを超えるバンドと同一の位置にシグナルが得られた（図９Ａ）ことが示された。これより、ＭＵＣ１がｓＴｎで修飾されており、抗ｓＴｎ抗体Ｂ７２．３で免疫沈降されることが分かった。
【００７９】
さらに確認のために、ＧＣＩＹ／６Ｌの培養上清とライセートを抗ＭＵＣ１抗体で免疫沈降した。まず、前記同様にプレクリアした後、１μｇ抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体（ＶＵ４Ｈ５）を結合させ固相化したＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ２０μｌを加えて浸透しながら４℃で一晩インキュベートした。以後、前記と同じ方法でブロットを調製し、抗ｓＴｎ抗体Ｂ７２．３に反応するバンドの有無を確認した。
【００８０】
その結果、Ｂ７２．３による免疫沈降−ウェスタンブロット解析で検出された２５０ｋＤａを超えるバンドと全く同一の位置にシグナルが得られた（図９Ｂ）。これより、ＧＣＩＹ／６ＬではＭＵＣ１がｓＴｎで修飾された主要なタンパク質の１つであることが確認された。
【００８１】
実施例１０：ヒト胃癌組織ライセートにおけるｓＴｎ−ＭＵＣ１の発現
本実施例は、ヒト胃癌組織ライセートにおいてｓＴｎ−ＭＵＣ１の存在を確認することを目的とする。
【００８２】
本実施例では、愛知県がんセンター病院においてインフォームドコンセントが得られた患者から採取された胃癌凍結組織を用いた。
すなわち、薄切した胃癌凍結組織（厚さ１６μｍ、面積約１ｃｍ２）４枚をマイクロチューブに移し、プロテアーゼ阻害剤としてｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した０．４ｍｌ  ＲＩＰＡバッファーとガラスビーズを加えて組織を破砕・溶解し、マイクロチューブに移して遠心分離後、上清をライセート（ｌｙｓａｔｅ）として回収した。タンパク質１００μｇを含むライセートを分取し、ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ１５μｌを加えてプレクリアした後、実施例９と同一の方法で、免疫沈降−ウェスタンブロット解析を行った。
【００８３】
その結果、抗ｓＴｎ抗体でＭＵＣ１が免疫沈降され、かつ抗ＭＵＣ１抗体による免疫沈降物にｓＴｎシグナルが認められた（図１０）。これより、実際の胃癌組織においてもｓＴｎで修飾されたＭＵＣ１（ｓＴｎ−ＭＵＣ１）が存在することが明らかになった。
【００８４】
実施例１１：胃癌腹腔洗浄液におけるｓＴｎ−ＭＵＣ１の検出
本実施例は、胃癌腹腔洗浄液においてｓＴｎ−ＭＵＣ１を検出することを目的とする。
本実施例では、愛知県がんセンター病院においてインフォームドコンセントが得られた胃癌患者から採取された腹腔洗浄液を用いた。全ての腹腔洗浄液のＣＡ７２-４濃度をＣＡ７２-４ＥＬＩＳＡキット（ＤＲＧ社製）を用いて測定した。腹膜転移を伴う進行胃癌でＣＡ７２-４濃度が１００Ｕ／ｍｌより大きい腹腔洗浄液３例（高ＣＡ７２-４群）と腹膜転移を伴う進行胃癌でＣＡ７２-４濃度が３０Ｕ／ｍｌより小さい腹腔洗浄液１例（低ＣＡ７２-４）及び腹膜播種を認めない初期癌でＣＡ７２-４陰性の腹腔洗浄液１例（ＣＡ７２-４陰性）に対して、２ｍｇのタンパク質を含む腹腔洗浄液から実施例５と同一の方法でＢ７２．３モノクローナル抗体レジンを用いた免疫沈降を行い、抗ＭＵＣ１抗体（ＶＵ４Ｈ５）を用いてウェスタンブロット解析を行った。
【００８５】
その結果、高ＣＡ７２-４群では２５０ｋＤａを超える分子量を示す領域にＭＵＣ１特異的なバンドが認められた（図１１）。従って、これら高ＣＡ７２-４群の腹腔洗浄液にはｓＴｎで修飾されたＭＵＣ１分子が存在することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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