(57)【要約】【課題】煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法、特に、インターフェロンとリバビリンとを実際に投与することなく併用治療の効果を予測する方法を提供することを目的とする。【解決手段】インターフェロンとリバビリンとをＣ型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記Ｃ型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩ２７からなる群より選択される少なくとも１つである、慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンとリバビリンとをＣ型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記Ｃ型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、
前記生体物質が、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩ２７からなる群より選択される少なくとも１つである、
慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法。
【請求項２】
インターフェロンとリバビリンとをＣ型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記Ｃ型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、
前記生体物質が、ＰＳＭＢ１０、ＴＲＡＦ２、ＲＸＲＡ、ＯＡＳＩ、ＩＫＫＧ／ＮＥＭＯ、ＭｙＤ８８、ＩＦＩＴＭ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＲＮＦ１２５、ＢＣＬ３、ＮＦＫＢ２からなる群より選択される少なくとも１つである、
慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発の予測方法。
【請求項３】
前記細胞が肝臓細胞である、請求項１又は２のいずれかに記載の予測方法。
【請求項４】
前記インターフェロンがポリエチレングリコール化インターフェロンである、請求項１から３のいずれかに記載の予測方法。
【請求項５】
配列番号１４、配列番号２１、配列番号３７、配列番号５９、配列番号７４、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１２０、配列番号１３５、配列番号１５０、配列番号１８４、配列番号１９３または配列番号２３４に示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる、慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果又はインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに起因する慢性Ｃ型肝炎に対する、インターフェロン及びリバビリンによる併用治療の効果の予測方法、併用治療後の再発の予測方法、およびその為のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性Ｃ型肝炎（以下、ＣＨと記載することもある）は、フラビウイルス科へパシウイルス属に属するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染することにより起こる疾患であり、現在世界人口の３％以上がこのウイルスに感染している。
Ｃ型肝炎ウイルスは、直径５５〜５７ｎｍの球形をした、約９．５ｋｂの線状１本鎖ＲＮＡをゲノムとして持ち、ウイルスの遺伝子とこれを包んでいるヌクレオカプシド（コア粒子）、そして、これを被う外殻（エンベロープ）の二重構造から成り立っている。
慢性Ｃ型肝炎はかつて非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれていた疾患の１つであり、１９８９年にＣｈｏｏらが患者の血漿をチンパンジーに接種し、その血漿中からウイルス遺伝子をクローニングすることで初めてＣ型肝炎ウイルスが同定された（非特許文献１）。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルスには複数の遺伝子型があり、現在はタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４、５ａ、６ａといった分類がされている。これらの遺伝子型のうち、日本においてはインターフェロンによる治療が効きにくいとされる１ｂ型が７０‐８５％を占める。以降２ａ型が１０‐１５％、２ｂ型が約５％で他の遺伝子型はまれである。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルスは、初感染で劇症化する例はまれであるが、急性肝炎発症後、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値が高値に保たれたままウイルスも持続することにより慢性肝炎に移行する例が多く、無症候性キャリアとなる場合もある。初感染者の約７０％はキャリアとなり慢性化すると報告されている。また、慢性Ｃ型肝炎は自然治癒することはまれであり、患者の３０‐５０％が、感染後２０‐３０年の間に肝硬変を発症する。さらに、肝硬変患者の６０‐８０％が肝癌を発症する。
【０００５】
慢性Ｃ型肝炎の治療法としては以前よりインターフェロンが用いられてきたが、著効率は３０％程度に過ぎなかった。しかしながら近年では、インターフェロンと抗ウイルス薬の１種であるリバビリンとの併用治療が行なわれている。
【０００６】
現在では、インターフェロンにポリエチレングリコールを結合して血中半減期を長くしたポリエチレングリコール化インターフェロンとリバビリンとの併用治療が標準的な治療方法となっている。しかしながら日本人が感染しているＣ型肝炎ウイルスにおいて、一番多い遺伝子型である１ｂ型感染の高ウイルス量症例では、上記の併用治療でもなお、著効例の割合は約５０‐６０％程度であり、約半数の患者に対しては効果が認められない。
さらに、例えば、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ｂとリバビリンとの併用治療の薬剤投与期間は４８〜７２週間にも及び、この間、発熱、頭痛、倦怠感、食欲不振、体の痒み、脱毛、血小板減少等の副作用の頻度も多い。また薬価も高いため、インターフェロンとリバビリンとの併用治療は、患者の身体的、精神的、経済的負担が無視できない。
【０００７】
従って、インターフェロンとリバビリンとの併用治療が有効か否かを治療前に判定することができれば、併用治療が効かない患者に対して、副作用のある治療を避けることができ、また、そのような患者に対しては他の治療方法を施すことが可能になる。
慢性Ｃ型肝炎治療のためのインターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効性判定方法として、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスコア領域中のアミノ酸配列、第７０番目のアルギニンが他のアミノ酸に変異しているか否か及び第９１番目のアミノ酸がメチオニンか否かを調べることが提案されている（特許文献１）。しかしながら、この方法では、ウイルス中の変異しているアミノ酸の同定まで行うことが必要であり、非常に煩雑である。またこの方法では治療後の再発例を予測する事が出来ない。
【０００８】
その他にも、Ｃ型肝炎ウイルスに感染している患者において、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を調べるために、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の前後に、ＡＮＸＡ３、ＰＣＮＡ、ＬＭＮＢ１、ＰＡＫ１、４ＥＢＰ１、ＫＡＲＳ、ＰＳＭＥ２、ＥＮＯ１、ＳＴＡＴ１、ＰＨＢ、ＳＰ−１００、およびＰＰＰ１ＣＢ等からなる特定生体物質の発現レベルを測定し、発現レベルに差異が見出されることをインターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効性を示す指標とする手法が開発されている（特許文献２）。しかしながらこの手法では、治療効果を予測するために、インターフェロンとリバビリンの投与前後で二度の発現レベルの測定が必要であり、作業が煩雑である。また、被験者に直接インターフェロンとリバビリンの投与を行う場合は、重大な副作用の恐れを排除できない。
さらに、以上に挙げた方法は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効例を予測する方法であり、治療による経済的負担、副作用をさけるべく、無効例を積極的に予測する方法ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−４３９８５号公報
【特許文献２】特開２００９−１７８０５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｈｏｏ  ＱＬ、ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２４４、３５９−３６２（１９８９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法については、いまだ報告がなかった。
【００１２】
そこで、本発明は、煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法、特に、インターフェロンとリバビリンとを実際に投与することなく併用治療の効果を予測する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発の有無を予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、いくつかの自然免疫関連遺伝子の発現量を測定することで、治療有効例、再発例、治療無効例を高確率にて判別する方法を開発した。
すなわち、本発明は、インターフェロンとリバビリンとをＣ型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記Ｃ型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩ２７からなる群より選択される少なくとも１つである、慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法である。
【００１４】
また、本発明は、インターフェロンとリバビリンとをＣ型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記Ｃ型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、ＰＳＭＢ１０、ＴＲＡＦ２、ＲＸＲＡ、ＯＡＳＩ、ＩＫＫＧ／ＮＥＭＯ、ＭｙＤ８８、ＩＦＩＴＭ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＲＮＦ１２５、ＢＣＬ３、ＮＦＫＢ２からなる群より選択される少なくとも１つである、慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発の予測方法である。
また、本発明は、配列番号１４、配列番号２１、配列番号３７、配列番号５９、配列番号７４、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１２０、配列番号１３５、配列番号１５０、配列番号１８４、配列番号１９３または配列番号２３４に示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる、慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果又はインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測するためのキットである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の予測方法により、これまで、実際にインターフェロンとリバビリンとを投与してみなければわからなかった併用治療の効果が、投与前の遺伝子発現情報のみを用いて効率よく判定可能となる。また、併用治療後の再発の有無が、投与前の遺伝子発現情報のみを用いて効率よく判定可能となる。このため、煩雑な作業を必要とすることなく、併用治療の効果、併用治療後の再発を予測することができる。
本発明の予測方法により、副作用を回避できる見通しのよい肝炎治療を行うことができる。治療無効例、再発例についても高確率で予測できるため、患者個人の遺伝子情報に応じた治療方法の選択が可能である。例えば治療無効であることが予想される症例であれば副作用の発現を我慢して投与するといったことを避けることができ、再発が予想される症例では、治療期間を延長するといった判断が可能となる。
さらに、併用治療開始前に治療の効果有無が予想できるため、インターフェロン等の高価な医薬を投与して患者や社会に経済的な負担をかけることを避けることもでき、保険、医療の向上や医療費削減に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実験全体の概略を示す図である。
【図２】図２上は、インターフェロンとリバビリンの併用治療効果の予測と実際の診断結果の対応を示す図である。図２下は、併用治療効果のあった症例のうち、再発有無の予測と実際の再発症例の対応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｃ型肝炎ウイルス保因者
本発明で、Ｃ型肝炎ウイルス保因者というときは、遺伝子型で、タイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４、５ａ、または６ａのいずれかのウイルスに感染している対象を示し、遺伝子型を特に限定するものではない。
【００１８】
インターフェロンとリバビリンとの併用治療
インターフェロンとリバビリンの併用治療とは、インターフェロンと共にリバビリンを投与する慢性Ｃ型肝炎の治療方法である。併用治療に用いるインターフェロンの型は特に限定されず、慢性Ｃ型肝炎の治療に用いられるいずれのインターフェロンであってもかまわない。通常、インターフェロンα、特にインターフェロンα２ａとインターフェロンα２ｂが用いられるが、これらに限定されるものではない。また、インターフェロンの血中半減期を長くするために、ポリエチレングリコールを結合させたインターフェロン（ポリエチレングリコール化インターフェロン）を用いることが望ましい。
【００１９】
なお上記の併用治療について、２００９年における慢性Ｃ型肝炎の治療ガイドラインでは、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスにおいては、血清中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ濃度が５．０ＬｏｇＩＵ／ｍＬ、もしくは３００ｆｍｏｌ／Ｌ以上の高ウイルス量の場合、ポリエチレングリコール化インターフェロンα２ａとリバビリン、もしくはポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂとリバビリンとの併用治療を４８週間〜７２週間実施することとされている。血清中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ濃度が５．０ＬｏｇＩＵ／ｍＬ、もしくは３００ｆｍｏｌ／Ｌ未満の低ウイルス量の場合は、ポリエチレングリコール化インターフェロンα２ａを２４週間から４８週間投与することとされている。なお、本発明の方法により効果や再発の有無を予測できる併用治療は、必ずしもこのガイドラインに従った併用治療に限定されるものではなく、他のインターフェロンとリバビリンとの併用治療であってもよい。
【００２０】
治療の効果
実際の治療効果は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後、血液中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ量が検出感度以下になったか否かで判断できる。Ｃ型肝炎ウイルスは、ウイルスに由来するＲＮＡに対してＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ｂＤＮＡ法等を実施することにより検出、定量することができる。検出感度、測定範囲の広さはともにリアルタイムＰＣＲが最も優れているが、治療効果を判断する基準としてのウイルス量の評価方法は特に限定されるものではない。
なお、ここで言う「治療の効果がある」とは、将来、再発する例も含めるものであり、一過的にせよ、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後、血液中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ量が検出感度以下になるものを言う。
【００２１】
従って、本発明における併用治療の効果の予測方法は、併用治療中、併用治療後の全体を通じて、一過的にせよC型肝炎ウイルスのRNA量が検出感度以下になる者であるか、または、全体を通じてC型肝炎ウイルスのRNAが検出され続ける者であるかを予測する方法である。
【００２２】
再発
再発とは、インターフェロンとリバビリンの併用治療により、ウイルスのＲＮＡ量が検出感度以下になるが、併用治療終了後に、ウイルスのＲＮＡが再度検出されることを言う。
【００２３】
従って、本発明における再発の予測方法とは、併用治療によりウイルスのＲＮＡ量が検出感度以下になる者のうち、併用治療終了後にウイルスのＲＮＡが再度検出される者であるか、再度検出されない者であるかを予測する方法である。
【００２４】
細胞
Ｃ型肝炎ウイルス保因者から採取されたものであれば由来する組織はどのようなものであってもかまわない。例えば末梢血由来の細胞や、肝臓由来の細胞（肝臓細胞）が好ましいが、これらのうち感度が良好な肝臓由来の細胞が特に好ましい。
【００２５】
生体物質
生体物質とは生物の体内に存在する化学物質であり、 ここでは生体を構成する基本材料である生体高分子や、それらを元に人工的に合成された生体高分子を指す。複数の生体物質を測定するに際しては、検出方法の経済性や簡便性から、生体物質としてはｍＲＮＡやそれを基に合成、増幅される核酸の量を測定することが好ましいが、種類が少ない場合はタンパク質を測定対象とすることも可能である。
【００２６】
発現レベルを測定する
特定のｍＲＮＡの発現レベルを測定するに際しては、ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ等、特定のタンパク質の発現レベルを測定するに際しては、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法、抗体アレイ等、検出対象となる生体物質に対する特異性のある方法であれば、当業者に公知のさまざまな手法を用いることが可能である。
これら生体物質の発現レベルの測定は、直接測定する以外に、酵素処理によって逆転写や増幅等の改変を行ったものを測定してもよい。
生体物質の発現レベルは、当該生体物質の量と相関のあるシグナルを検出、数値化することで比較可能となる。シグナルはとしては、蛍光物質、放射性物質、酵素等その他当業者に公知のいずれのものでも使用することが可能である。
【００２７】
ＭＸ１
ＭＸ１とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２４６２に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１００に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００２８】
ＩＦＩＴ１
ＩＦＩＴ１とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１５４８に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１３５に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００２９】
ＩＳＧ１５
ＩＳＧ１５とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００５１０１に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１０７に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３０】
ＩＦＩ２７
ＩＦＩ２７とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００５５３２に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１２０に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３１】
ＰＳＭＢ１０
ＰＳＭＢ１０とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２８０１に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１５０に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３２】
ＴＲＡＦ２
ＴＲＡＦ２とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０２１１３８に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号２１に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３３】
ＲＸＲＡ
ＲＸＲＡとは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２９５７に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号２３４に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３４】
ＯＡＳＩ
ＯＡＳＩとは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１６８１６に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１０１に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３５】
ＩＫＫＧ／ＮＥＭＯ
ＩＫＫＧ／ＮＥＭＯとは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１０９９８５７に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号５９に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３６】
ＭｙＤ８８
ＭｙＤ８８とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２４６８に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１４に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３７】
ＩＦＩＴＭ３
ＩＦＩＴＭ３とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０２１０３４に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１１５に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３８】
ＩＬ１０ＲＢ
ＩＬ１０ＲＢとは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０００６２８に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号３７に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００３９】
ＲＮＦ１２５
ＲＮＦ１２５とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１７８３１に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１９３に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００４０】
ＢＣＬ３
ＢＣＬ３とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００５１７８に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号７４に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００４１】
ＮＦＫＢ２
ＮＦＫＢ２とは、ＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２５０２に示されるｍＲＮＡ配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号１８４に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。
【００４２】
予測方法
上記の生体物質の発現レベルを測定した後、それぞれの生体物質の発現レベルが、あらかじめ蓄積されている各群の代表値と比較し、そのうちの何れに近いかなどを検討することで、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測や、治療後の再発可能性を評価することができる。この場合、発現レベルを各群ごとに比較できる手法であればどのような統計的手法を用いてもかまわない。生体物質の発現レベルが各群の代表値の何れに含まれるかを調べるために、当業者に公知の何れのクラスタリング手法を用いることも可能である。
【００４３】
キット
上記の予測を簡易に実施するために、検出方法がより簡易な、以下のようなキットを作成することも可能である。
すなわち、Ｃ型肝炎ウイルス保因者における、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する為のキットとして、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩ２７にそれぞれ由来する塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含んでなる、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を検出する為のキットが提供される。
これらは、代表的には、配列表の配列番号１００、１３５、１０７、１２０に示す塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる、Ｃ型肝炎ウイルス保因者におけるインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を検出する為のキットである。
【００４４】
また、Ｃ型肝炎ウイルス保因者における、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測する為のキットとして、ＰＳＭＢ１０、ＴＲＡＦ２、ＲＸＲＡ、ＯＡＳＩ、ＩＫＫＧ／ＮＥＭＯ、ＭｙＤ８８、ＩＦＩＴＭ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＲＮＦ１２５、ＢＣＬ３、ＮＦＫＢ２にそれぞれ由来する塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含んでなる、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測するためのキットが提供される。
これらは、代表的には、配列表の配列番号１５０、２１、２３４、１０１、５９、１４、１１５、３７、１９３、７４、１８４に示す塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる、Ｃ型肝炎ウイルス保因者におけるインターフェロンとリバビリンとのの併用治療後の再発を予測する為のキットである。
このようなキットに含まれるオリゴヌクレオチドをプローブとして、例えば、ノーザンブロッティング手法を用い、細胞におけるｍＲＮＡの解析を行うことで、細胞中に含まれる対象のＲＮＡ量を簡便に調べることが可能である。
さらに、これらのオリゴヌクレオチドを複数固体支持体上に固定化したＤＮＡマイクロアレイを作成することによって、効率的に検出を行うことも可能である。このようなＤＮＡマイクロアレイには、上記のヌクレオチド以外にも、例えば後述の表１〜７に示すような自然免疫等に関連した複数種類の遺伝子やその他コントロールとなる遺伝子が搭載されていることが望ましい。
【実施例１】
【００４５】
サンプルの準備
自己免疫性肝炎、アルコール性肝障害、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原／抗体もしくは抗ＨＩＶ抗体が検出される患者の何れにもあてはまらないことが確認された患者の中から、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ｂに感染し、過去にインターフェロンによる治療や免疫調節療法を受けたことの無い慢性Ｃ型肝炎患者８７人と、Ｃ型肝炎ウイルスに感染していない脂肪肝患者１０人とを対象とした。
インターフェロンとリバビリンとの併用治療の前に血清中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡをＡｍｐｌｉｃｏｒ−ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ａｓｓａｙ（ロシュ社製）を使用して定量した。また、アスパレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、全ビリルビン、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（γ‐ＧＴＰ）、白血球細胞、血小板、ヘモグロビン、アルブミン量を測定した。
慢性Ｃ型肝炎患者から採取された肝生検標本の組織学的な病期診断はＭｅｔａｖｉｒｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに従って行った。
【００４６】
インターフェロンとリバビリンとの併用治療のプロトコール
慢性Ｃ型肝炎の全ての患者に対し、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社製）及びリバビリン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社製）の併用治療を４８週間行った。ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ｂについては薬剤投与開始時点において体重１キログラム当たり、一週間に１．５μｇ投与し、リバビリンについては製造者が開示する推奨量に従って投与した。
【００４７】
薬剤応答の定義
まず、薬剤投与後４週の時点で血清中にＣ型肝炎ウイルスＲＮＡが検出されなかった患者をＲａｐｉｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＲＶＲ）、それ以外をｎｏｎＲＶＲとして２群に分類した。
次に薬剤投与後１２週の時点で血清中にＣ型肝炎ウイルスＲＮＡが検出されなかった患者をＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ｃＥＶＲ）、薬剤投与後１２週の時点で血清中のＣ型肝炎ウイルスＲＮＡが検出はされるが、その量が薬剤投与前に比較して２桁以上減少した患者をＰａｒｔｉａｌ  ＥＶＲ（ｐＥＶＲ）、それ以外の患者をｎｏｎＥＶＲとして３群に分類した。
【００４８】
併用治療終了後、６ヶ月にわたりＣ型肝炎ウイルスＲＮＡが検出されなかった患者をＳｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＳＶＲ）、併用治療終了時にはＣ型肝炎ウイルスＲＮＡが検出されなかったが、その後再び検出された患者をＲｅｌａｐｓｅ（Ｒ）、併用治療全体を通じてＣ型肝炎ウイルスが検出され続けた患者をＮｏｎ−Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＮＲ）として３群に分類した。
【００４９】
ＲＮＡ抽出
肝臓由来の細胞（肝臓細胞）の一種である、肝生検標本由来の細胞からRNAを抽出することとした。肝生検標本はＲＮＡを抽出するまでＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製）に入れ、−８０℃に保存した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡはｍｉｒＶａｎａ（ＴＭ）ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用し、製造者が開示する説明書に従って抽出した。
【００５０】
ＤＮＡマイクロアレイによる発現量データの取得
三菱レイヨン社製ＤＮＡチップジェノパールを用い、表１〜７に記載の自然免疫関連遺伝子２３７種類（Ｃｈｉｐ１に２００種、Ｃｈｉｐ２に３７種）のオリゴＤＮＡプローブを搭載したＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
【表６】
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【００５７】
【表７】
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【００５８】
肝生検標本から得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、製造者が開示する説明書に従ってビオチン標識及び増幅反応を行った。得られたビオチン標識済みＲＮＡ５μｇを、キットに付属のＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて９４℃にて７分３０秒加熱し、断片化した。
【００５９】
断片化したビオチン標識済みＲＮＡ溶液を、最終的な組成が０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０となるように各種試薬を添加し、１５０μｌのハイブリダイゼーションサンプルとした。
ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーションサンプルを６５℃で１６時間反応させ、その後洗浄液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）により６５℃にて２０分間の洗浄を二回行った。更にＤＮＡマイクロアレイを保存液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ）により６５℃にて１０分間の液置換を行った。
【００６０】
洗浄後のＤＮＡマイクロアレイは、保存液により２μｇ／ｍｌに溶解したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ＫＫ）中に室温で３０分間浸漬し、その後洗浄液にて室温で５分間の洗浄を４回行い、さらに保存液にて５分間の液置換を行った。
【００６１】
Ｃｙ５標識後のＤＮＡマイクロアレイは、専用のＤＮＡマイクロアレイ検出器を用い、０秒から４０秒の複数の露光時間で蛍光を検出し、スポットそれぞれにおいて、当該スポット中に飽和画素を含まない画像のうち、最長の露光時間の画像を用いて蛍光シグナル強度を数値化した。
【００６２】
統計解析の方法
薬剤応答の定義に従って分けられた群間における数値データの解析はスチューデントのｔ検定を用いて統計解析を行った。ＳＶＲ、Ｒ，ＮＲの３グループ間における血清中の各成分等の比較については、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗｉｌｌｉｓ検定もしくはフィッシャーの直接確率検定を用いた。また、何れの検定においても、Ｐ値が０．０５未満の場合において統計的に有意差があるものとみなした。
【００６３】
結果
まず、ＳＶＲ、Ｒ、ＮＲ及び脂肪肝患者の臨床的特徴について、平均値を示した（表８）。
【００６４】
【表８】
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【００６５】
以下の通り、慢性Ｃ型肝炎患者と脂肪肝患者間における特徴的な遺伝子発現パターンを調べた。また、慢性Ｃ型肝炎患者について、併用治療の効果を治療開始４週目、１２週目及び治療終了後に確認し、それぞれの時点におけるＣ型肝炎ウイルスの反応の状態ごとに、特徴的な遺伝子発現パターンを調べた（図１）。
まず、慢性Ｃ型肝炎患者と脂肪肝患者のサンプル間において特徴的に異なる遺伝子発現パターンを調べたところ、５３種類の遺伝子においてシグナル強度平均値に有意差が認められた（表９）。
【００６６】
【表９】
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【００６７】
慢性Ｃ型肝炎患者のうち、ＳＶＲとＮＲのサンプル間では１４種類の遺伝子においてシグナル強度平均値に有意差が認められた（表１０）。
【００６８】
【表１０】
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【００６９】
慢性Ｃ型肝炎患者のうち、ＲＶＲとｎｏｎＲＶＲのサンプル間では４種類の遺伝子に対応したプローブにおいてシグナル強度平均値に有意差が認められた（表１１）。
【００７０】
【表１１】
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【００７１】
慢性Ｃ型肝炎患者のうち、ｃＥＶＲとｎｏｎＥＶＲのサンプル間では１４種類の遺伝子に対応したプローブにおいてシグナル強度平均値に有意差が認められた（表１２）。
【００７２】
【表１２】
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【００７３】
ＬＯＯＣＶ（Ｌｅａｖｅ−Ｏｎｅ−Ｏｕｔ  Ｃｒｏｓｓ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）（Ａｌａｉｎ  Ｄｕｐｕｙ、ｅｔ  ａｌ．，  ＪＮＣＩ．  ９９、１４７−１５７（２００７）を参照）を用いて併用治療による最終的な治療効果の評価を行った。まず、慢性Ｃ型肝炎の全患者から、ＮＲを区別する方法について、二群間分別を用いた効果予測ＬＯＯＣＶを用いて確認したところ、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩ２７を用いて評価した場合、正確性、感度、特異性はそれぞれ８２．８％、７３．９％、８５．９％で判別することが可能あった（表１３上及び図２上）。以上より、これらの遺伝子を用いることで、高い精度でインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測することが可能となった。
また、ＮＲでなかったもののうち、ＳＶＲとＲを区別する方法について、上記と同様に確認したところ、ＰＳＭＢ１０、ＴＲＡＦ２、ＲＸＲＡ、ＯＡＳＩ、ＩＫＫＧ／ＮＥＭＯ、ＭｙＤ８８、ＩＦＩＴＭ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＲＮＦ１２５、ＢＣＬ３、ＮＦＫＢ２を用いて評価した場合に、正確性、感度、特異性はそれぞれ６８．８％、６５．４％、７１．１％で区別することが可能であった（表１３下及び図２下）。以上より、これらの遺伝子を用いることで、高い精度でインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測することが可能となった。
【００７４】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【００７５】
慢性Ｃ型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果や併用治療後の再発を予測することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１〜２３７：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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