(57)【要約】【課題】陰イオン交換体を使用して、ＤＮＡからウイルスやタンパク質などの生体分子を効果的かつ選択的に分離する方法の提供。【解決手段】１種以上の生体分子及びＤＮＡを含む試料の精製方法であって、次の工程：該試料を、１種以上のイオン調節剤が随意に１種以上の１価の塩と共に存在した状態で、表面に１種以上の重合第一級アミン又はその共重合体が形成された多孔質基材を備える陰イオン交換体に導入することによって、該試料を精製し；そして、該生体分子を含有しＤＮＡを含まない該精製試料を集めることを含む、前記精製方法を提供する。上記イオン調節剤は、ウイルスやタンパク質のｐＩよりも高いｐＨにおいて、ＤＮＡなどの高荷電種に対するかなりの結合能力を保持するが、ウイルスやタンパク質などの低荷電種に対する結合能力を部分的に又はほとんど全て失うように、第一級アミンの結合能力を改変する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の生体分子及びＤＮＡを含む試料の精製方法であって、次の工程：
該試料を、１種以上のイオン調節剤が随意に１種以上の１価の塩と共に存在した状態で、表面に１種以上の重合第一級アミン又はその共重合体が形成された多孔質基材を備える陰イオン交換体に導入することによって、該試料を精製し；そして、ＤＮＡを含まない生体分子を含有するさらに精製された試料を集めること
を含む、前記精製方法。
【請求項２】
前記１種以上のイオン調節剤が緩衝剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種以上のイオン調節剤が燐酸イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１種以上のイオン調節剤がクエン酸イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１種以上のイオン調節剤がエチレンジアミン四酢酸イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１種以上の１価の塩が塩化ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記基材が微多孔膜を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記膜がポリオレフィンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリオレフィンがポリエチレンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基材が超高分子量ポリエチレン膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記重合体がポリアリルアミン又はプロトン化ポリアリルアミンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記重合体が、ポリアリルアミン又はプロトン化ポリアリルアミンを含有する共重合体又はブロック共重合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記重合体を架橋させる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年４月２０日出願の米国仮出願第６１／３２５，９５４号について優先権を主張する。その開示を引用により本明細書に含める。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、第一級アミンにより核酸からウイルス及び／又はタンパク質を分離することに関する。 
【０００３】
強力な陰イオン交換体、例えば、第四級アンモニウムイオンを基材とするものは、例えば、生体液、特に生物治療製品の溶液などの流体中に存在するエンドトキシン、ウイルス、核酸及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）といった負に荷電した大きな不純物を捕捉するための仕上げ用媒体として、下流の処理で使用されている。従来、陰イオン交換体は、ビーズ形態（例えばＧＥヘルスケア・バイオサイエンスＡＢから入手できるＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））で提供され、使用されてきた。しかしながら、ビーズを主体とする系の処理量の限界により、不純物を効果的に捕捉するのには大きな容量のカラムが必要となる場合が多い。
【０００４】
膜を主体とするクロマトグラフシステム（メンブランソーバーとも呼ばれる）は、対流膜の細孔に直接結合したリガンドを有し、それによって物質移動に及ぼす内部細孔の拡散の影響を最小限に抑えている。さらに、膜細孔径分布がタイトな微多孔膜を効果的な流れ分配器と共に使用すると、軸方向分散が最小化され、しかも全ての作用部位を均一に使用できるようになる。その結果として、メンブランソーバー媒体の物質移動速度は、標準的なビーズ系クロマトグラフィー媒体の物質移動速度よりも一桁大きく、高い効率と高い流量の分離との両方を可能になる。単一膜又はさらには積層膜は、ビーズ系媒体が詰め込まれたカラムと比較して非常に薄いため、クロマトグラフ床に沿って圧力降下の減少が見出され、それにより流量と生産性の増加が可能となる。必要な結合能力は、十分な内部表面積の膜を使用し、非常に大きな直径対高さ比（ｄ／ｈ）の装置構成とすることによって達成される。
【０００５】
適切に設計されたメンブランソーバーは、標準的な分離用ビーズ系樹脂よりも１０〜１００倍良好なクロマトグラフィー効率を有する。その結果、メンブランソーバーで同じ分離レベルを達成するために、１０倍低い床高さを使用することができる。メンブランソーバーについては、１〜５ｍｍの床高さが標準的であるのに対し、ビーズ系のシステムについては１０〜３０ｃｍの床高さが標準的である。大容量メンブランソーバーに必要な最大カラムアスペクト比のためには、装置デザインが極めて重要である。メンブランソーバーに関連する固有の性能の利点を維持するためには、利用可能な膜容量を効率的かつ効果的に利用するのに適切な入口及び出口分配器が必要となる。この用途にとっては、メンブランソーバー技術が理想的である。
【０００６】
メンブランソーバーは、溶液がその細孔中を流れるときに、該溶液の成分のいくつかを除去する（吸着する及び／又は吸収する）ことのできる、非常に多孔質の連続媒体である。メンブランソーバーの特性及び必要な用途でよく機能するその能力は、媒体（骨格）の多孔質構造のみならず溶液にさらされる表面の性質にも依存する。典型的には、多孔質媒体は、まず、水に溶解せず又は水で膨張せず、かつ、許容できる機械的性質を有する重合体から形成される。多孔質媒体は、好ましくは、当該技術分野において周知の相分離方法によって作製された多孔質膜シートである。例えば、Ｚｅｍａｎ  ＬＪ，Ｚｙｄｎｅｙ  ＡＬ，Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１９９６を参照されたい。また、中空繊維及び管膜も許容できる骨格である。形成された多孔質構造の外面又は表面及び内部細孔表面を、必要な吸着性を付与するように改質するには、通常、分離処理工程が必要となる。膜構造は、疎水性重合体から形成される場合が多いので、この表面改質工程の別の目的は、表面を親水性にする又は加湿性にすることでもある。
【０００７】
膜の外面又は表面及び内部細孔表面を改質する多数の方法が存在する。当業者であれば、吸着、プラズマ酸化、その場フリーラジカル重合、グラフト及び被覆を含む典型的な方法が容易に分かるであろう。これらの方法の大部分は、膜表面に単分子層様構造を形成するところ、これらは、大体の場合、親水性にするという目的を達成するものの、依然として許容できる吸着性、例えば吸着物に対する高い能力を付与することができていない。この能力は、所定の媒体容量によって保持され得る吸着物の量（重量）であると定義される。吸着が全て膜表面上で起こる限り、その能力は、膜の表面積によって制限される。それらの性質によって、微多孔膜は、クロマトグラフィービーズと比較して低い表面積を有する。表面積を増大させる方法の一つは、細孔径を減少させることであるが、これは明らかに流量のかなりの損失を招く。例えば、０．６５μｍポリエチレン膜（米国マサチューセッツ州ビルリカのインテグリス社）上でのタンパク質の最大（単分子層）吸着は、表面相互作用の種類にかかわらず、約２０ｍｇ／ｍＬである。これは、例えば、約８０ｍｇ／ｍＬの典型的な容量を有するアガロースクロマトグラフィービーズよりも有意に少ない。
【０００８】
吸着を促進させる表面相互作用の種類は、所定のメンブランソーバー物質を使用する特定の出願によって定義される。例えば、米国同時係属出願第１２/２２１４９６号には、モノクローナル抗体（ＭＡＢ）の溶液からウイルス、核酸、エンドトキシン及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去する高容量高親和性ソーバーが開示されている。これらの不純物は、ＭＡＢよりも低い等電点を有する傾向があるが、これは、所定のｐＨでは、不純物は負に荷電するのに対し、ＭＡＢは正に荷電することを意味する。陰イオン交換体、すなわち、正電荷を有しかつ陰イオンを引き付ける媒体は、これらの不純物を除去するために必要である。第一級、第二級及び第三級アミン並びに第四級アンモニウムイオン塩を含め、多数の化学部分が水溶液中で電荷を有する。アミンは１１よりも低いｐＨでは正に荷電しているのに対し、アンモニウムイオン塩は全てのｐＨで正電荷を保持するため、これらの基は、一般に、それぞれ弱陰イオン交換体及び強陰イオン交換体と呼ばれている。
【０００９】
陰イオン交換膜は、様々な不純物及び汚染物を引き付けて保持する、正に荷電した多数の結合部位を有する。除去できる可能性のある不純物の量は、膜上にあるこれら結合部位の濃度に応じ、また、リガンドの化学的性質（並びにこれらのリガンドの濃度）は、様々な不純物に対する結合の強さ（結合力）に関与する。高い結合力は、不純物、例えば宿主細胞タンパク質の除去を増大させるための重要な特質である。また、結合力（ＳＢ）は、結合した不純物を溶離させるのに必要な溶液のイオン強度にも関連がある。メンブランソーバーのＳＢ（伝導度ユニットで測定、ｍＳ／ｃｍ）は、次の通りに決定される。まず、少量の吸着質溶液をメンブランソーバーに通し、それによりこの吸着質がメンブランソーバーに結合する。次に、このメンブランソーバーを塩化ナトリウムなどの無機塩の増加勾配で溶離させる。吸着質を溶離させるのに必要な溶離液の最小伝導度を記録し、そしてこれをそのメンブランソーバーのＳＢと定義する。ソーバーの結合力を増大させることで、負に荷電した不純物をメンブランソーバーに不可逆的に結合させ、それによって除去効率を有意に向上させることができる。この高い結合力は、ウイルスやＤＮＡといった負に荷電した不純物に非常に高い塩濃度で結合することのできる能力につながる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｅｍａｎ  ＬＪ，Ｚｙｄｎｅｙ  ＡＬ，Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ワクチン産業では、ワクチンに使用されるウイルスやタンパク質は可能な限り純粋であることが必須であるため、核酸（特にＤＮＡ）などの不純物からウイルスを精製することが望ましい。クロマトグラフィーをフロースルーモードで使用してこのような精製を実施するためには、ＤＮＡが膜に結合すると共に、ウイルス／タンパク質が膜を通過することが必要である。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してこれを達成するためには、通常、供給物のｐＨがウイルスやタンパク質のｐＩ（約５．５以下の場合が多い）よりも低くなければならないが、これは、これらの生体分子の不安定化と不活性化をもたらす可能性がある。
【００１２】
これらのことから、媒体を備えるフロースルー陰イオン交換体を使用して、例えばＤＮＡからウイルスやタンパク質を効果的かつ選択的に当該媒体により分離する方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
従来技術の問題は、ポリアリルアミンのような第一級又は第二級アミンリガンドなどの重合体が上部に形成された表面を有する膜を備える陰イオン交換体を使用して、核酸、特に宿主細胞ＤＮＡからウイルス及び他のタンパク質などの生体分子を除去することを提供する本発明によって解決された。微多孔膜の結合能力を、ウイルス又はタンパク質のｐＩよりも高いｐＨで、ＤＮＡなどの高電荷種に対する著しくかつ効果的な結合能力を選択的に保持すると共にウイルスやタンパク質などの荷電種に対してはそれらの結合能力を実質的に全て失うように調節する方法を説明する。その結果として、ウイルス／タンパク質などの生体分子のｐＩよりも高いｐＨでは該生体分子がこの装置を通過すると共にかなりのＤＮＡの結合を維持するように条件を設定することで、ＤＮＡから該生体分子が効果的に除去される。
【００１４】
所定の実施形態では、外部細孔表面及び内部細孔表面の全体は、緩く架橋したヒドロゲルにより形成される。このヒドロゲルの湿った（膨潤した）厚さは、約５０〜１００ｎｍである。重合第一級アミン及び第二級アミン、好ましくは重合体骨格に共有結合した第一級アミンを有する脂肪族重合体、より好ましくは少なくとも１個の脂肪族基、好ましくはメチレン基により重合体骨格に共有結合した第一級アミンを有する脂肪族重合体、の結合能力は、１種以上のイオン調節剤を単独で又は１価の塩と共に含む又はそれ若しくはそれらからなる緩衝液で調節される。
【００１５】
イオン調節剤は、１個よりも多いイオン性基を有し、かつ、膜上の第一級アミン基と強く相互作用し及び／又は生体分子と強く相互作用し、該生体分子が膜表面に結合しないようにすることのできる、及び／又は同様に荷電した２個以上のイオン基又はイオン分子間に弱い若しくは強い架橋を形成することのできる分子であると定義される。これらの分子としては、ホスフェート、スルフェート又はボレートなどの多価イオン又は塩及びシトレート、エチレンジアミン四酢酸、ポリアクリル酸などのポリイオン分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子は、それらの酸、塩基又は塩の形態で使用できる。１価の塩とは、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、沃化ナトリウムなどの単一のイオン化を有する塩のことである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、所定の実施形態に従う吸着体のフロースルー流れでのＦｌｕ−Ａ滴定濃度とＤＮＡ濃度とのグラフである。
【図２】図２は、所定の実施形態に従う吸着体のフロースルー流れでのＦｌｕ−Ａ滴定濃度のグラフである。
【図３】図３は、所定の実施形態に従う吸着体のフロースルー流れでのＤＮＡ濃度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
特定の実施形態の詳細な説明
ここで開示する実施形態は、多孔質の自立型基材上に多孔質重合体が形成された多孔質クロマトグラフィー又は吸着媒体を伴う精製方法に関する。この媒体は、１種以上のイオン調節剤、例えば、様々な濃度のホスフェート、シトレート、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、スクシネート、硫酸アンモニウムイオン、硫酸ナトリウム、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、グルタメート、トリポリホスフェート、ポリアクリル酸などの高分子電解質、スチレンスルホン酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤（単独で又は他の緩衝液中の添加剤として使用される）の存在下で、ウイルスからＤＮＡなどの種を確実に除去するのに適している。
【００１８】
多孔質基材は、この基材の幾何学的又は物理的構造に関連する２つの表面を有する。シートは頂部表面及び底部表面を有し、或いは第１表面及び第２表面を有する。これらは、一般に「面」と呼ばれている。使用中に、流体は、一方の面（表面）から基材を通して他方の面（表面）に流れる。中空繊維及び管膜については、内部表面及び外部表面が存在する。デザイン及び用途に応じて、流れは内部から外部に（又はその逆）に進む。
【００１９】
２つの表面間の厚みの特徴は多孔質である。この多孔質領域は、それらの細孔と関連した表面積を有する。用語「表面」若しくは「表面積」又は同様の用法に関連する混乱を避けるために、本発明者は幾何学的表面を外面若しくは外部表面又は面と呼ぶものとする。細孔に関連する表面積を内部又は多孔質表面積と呼ぶものとする。
【００２０】
多孔質材料は、空隙である細孔と、該材料の物理的具象を構成する固体マトリックスとを備える。例えば、不織布では、ランダムに配向した繊維がマトリックスを構成し、該不織布を形作る。重合体微多孔膜では、相分離重合体がマトリックスを与える。ここで、本発明者は、媒体の表面を被覆する又は覆うことについて議論する。これは、内部表面及び外部表面が、細孔を完全に塞ぐように、すなわち、対流のためにその構造のかなりの割合を保持するように被覆することを意味する。特に、内部表面積について、被覆とは、細孔のかなりの割合を開いた状態に保持しつつ、そのマトリックスを被覆し又は覆うことを意味する。
【００２１】
吸収とは、吸収性材料本体への浸透によって物質を取り込むことをいう。吸着とは、分子がバルク相から吸着性媒体の表面に移動することをいう。収着とは、吸着と吸収の両方を包含する一般的な用語である。同様に、ソーバーとしてここに示される吸着性材料又は吸着装置とは、吸着しかつ吸収する材料又は装置をいう。
【００２２】
多孔質基材は、吸着性ヒドロゲルのための支持骨格としての役割を果たす。この基材は、堅牢でかつ一体型の装置の取り扱い及び製造に適しているはずである。細孔構造は、均一な流量分布、高いフラックス及び高い表面積を提供する。この基材は、繊維、織物、不織布、マット、フェルト若しくは膜などのシート又は１個以上のビーズであることができる。好ましくは、基材は、織物若しくは不織布から形成されたシート又は膜である。
【００２３】
繊維は、任意の長さ、直径のものであってよく、また、中空又は中実であってもよい。これらは、基材として互いに結合してはいないが（とはいえ、被覆の適用後に単一構造に形成され得る）、それぞれ別々の実体である。これらは、中間の長さの糸やモノフィラメントなどの連続長の状態であることができ、或いは、これらは、結晶成長法などにより形成された不織布や織物などの繊維材料を切断し、連続長繊維を個々の断片に切断することによって作られた短い個々の繊維の状態であることができる。
【００２４】
不織布は、繊維又はフィラメントを熱により又は化学的に絡ませることによって互いに結合した別個の繊維から直接作られた平坦な多孔質シートである。典型的には、不織布の製造者は、１〜５００ミクロンの平均流孔径（ＭＦＰ）評価を有する媒体を提供する。不織布について、その多孔質構造は絡み合った繊維であり、そして、多孔性とは、繊維間の曲がりくねった空間をいう。多孔性は、フェルト状繊維についても同様の意味を持つ。好ましい不織布は、米国マサチューセッツ州ローウェルのＦｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ  Ｎｏｎｗｏｖｅｎｓ  ＮＡによるものであり、型式はＦＯ２４６３である。
【００２５】
織物は、たて織及びよこ織を互いに対して所定の角度の規則的なパターン又は織り方で織編することによって製造される。典型的には、横糸は縦糸に対して約９０度の角度である。一般に使用されている別の角度としては、３０、４５、６０及び７５度が挙げられるが、これらに限定されない。繊維の完全性は、製織プロセスによって生じる繊維の機械的連動によって維持される。ドレープ（繊維が複雑な表面に適合する能力）、表面平滑性及び繊維の安定性は、主として、平織り、綾織り、サテン、バスケット織り、絡み織りなどのような織り方により制御される。この場合、基材多孔性は、繊維間の空間であり、そしてさほど曲がりくねっていない性質である。
【００２６】
また、基材は、ガラス、プラスチック、セラミック及び金属を含めた様々な材料からも形成できる。
【００２７】
ホウケイ酸ガラスが好適なガラスの一例である。このものは、繊維又はガラスマットとして成形できる。
【００２８】
さらに一般的なシリケート化学物質やイットリウム、ジルコニア、チタンなどの特殊な化学物質及びそれらのブレンドを主成分とするセラミックを使用することができる。これらは、繊維、マット、フェルト、モノリス又は膜に成形できる。
【００２９】
ステンレススチール、ニッケル、銅、鉄その他の磁性金属及び合金、パラジウム、タングステン、白金などの金属を、焼結ステンレススチール又はニッケルフィルター、編みスクリーン及び不織布マット、織物及びフェルト、例えばステンレススチールウールなどの繊維、焼結シート及び構造物を含めた様々な形態にすることができると考えられる。
【００３０】
好ましい基材は、合成又は天然重合体材料から作られる。この用途にとっては、熱可塑性物質が有用な重合体の部類である。熱可塑性物質としては、ポリオレフィン、例えば、ポリエチレン（超高分子量ポリエチレンを含む）、ポリプロピレン、層状ポリエチレン／ポリプロピレン繊維、ＰＶＤＦ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート及びポリブチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリアミド、ポリメタクリル酸メチルなどのアクリレート、スチレン系重合体及び上記のものの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他の合成材料としては、セルロース、エポキシ、ウレタンなどが挙げられる。
【００３１】
好適な基材としては、微細孔ろ過膜、すなわち約０．１〜約１０μｍの細孔径を有するものが挙げられる。基材材料は、親水性又は疎水性であることができる。親水性基材材料の例としては、多糖類及びポリアミド、並びに表面処理親水性多孔質膜、例えばＤｕｒａｐｏｒｅ（商標）（米国マサチューセッツ州ビルリカのミリポアコーポレイション）が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性材料の例としては、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート及びポリメタクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。多孔質構造は、この基材材料から、当業者に知られている任意の方法、例えば、液相逆転法、温度誘発相分離法、乾式相転換法、トラックエッチ法、延伸法、焼結法、レーザー穴開け法などによって創り出される。本発明の普遍的特質のため、多孔質構造を創り出すために利用可能なあらゆる方法が、メンブランソーバーのための支持骨格を作製するのに好適である。超高分子量ポリエチレンから作られた基材材料が、その機械的性質と、化学安定性と、腐食安定性と、ガンマ安定性との組み合わせのために有用であることが分かった。
【００３２】
重合体は、吸着性ヒドロゲルを形成し、かつ、捕捉されることが望まれる物体を引き付けて保持するのに関与する化学基（結合基）を持つ。或いは、重合体は、結合基を取り込むように容易に変性可能な化学基を保有する。被膜は、不純物を該被膜の深部に捕獲し、吸着能力を向上させることができるように透過性である。好ましい重合体は、重合第一級アミンである。好適な重合第一級アミンの例としては、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリブチルアミン、ポリリシン、それら自体の共重合体及びそれらと他の重合体との共重合体、並びにそれらの各プロトン化された形態が挙げられる。好適な共重合体としては、ビニルアルコール−コ−ビニルアミン、アクリルアミド−コ−アリルアミン、エチレングリコール−コ−アリルアミン及びアリルアミン−コ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが挙げられる。ポリアリルアミン（及び／又はそのプロトン化された形態、例えばポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ））から作られた被膜が特に有用であることが分かった。ＰＡＡは、多数の分子量、通常は１０００〜１５００００の範囲の分子量で市販されており（日東紡績株式会社）、これらの全てをメンブランソーバーを作製するために使用することができる。ＰＡＡ及びＰＡＨは水に容易に溶解する。ＰＡＡ水溶液のｐＨは、約１０〜１２であるのに対し、ＰＡＨ水溶液のｐＨは３〜５である。ＰＡＡ及びＰＡＨは区別なく使用できるが、ただし、最終溶液のｐＨを監視し、そして必要なら、非プロトン化アミノ基が架橋剤との反応のために利用できるように１０よりも高い値に調整しなければならない。
【００３３】
被膜は、典型的には、被覆された又は覆われた基材の全容積の少なくとも約３％、好ましくは基材の全容積の約５％〜約１０％を占める。所定の実施形態では、被膜は、実質的に均一な厚さで基材を覆う。乾燥被膜の好適な厚み範囲は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍである。
【００３４】
当業者であれば、重合体を任意の好適な手段、例えば被覆、グラフト、架橋などにより基材に固定することができること、及び、ここで使用するときに、用語「被覆基材」が、広義には、表面に重合体が形成された任意の基材を包含することを意味することが分かるであろう。
【００３５】
架橋剤は、重合体と反応して該重合体を水に不溶にすることができるため、支持骨格の表面上に保持できる。好適な架橋剤は、被覆用重合体と反応し、かつ、選択された溶媒（好ましくは水）に可溶の２官能性又は多官能性分子である。様々な化学部分、とりわけエポキシド、クロルアルカン、ブロムアルカン及びヨードアルカン、カルボン酸の無水物及びハロゲン化物、アルデヒド、α，β−不飽和エステル、ニトリル、アミド及びケトンが、第一級アミンと反応する。好ましい架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧＥ)である。このものは水に容易に溶解し、迅速で十分な架橋をもたらし、しかも親水性、中性、非毒性で、容易に利用可能である。被覆溶液における架橋剤の使用量は、重合体上及び架橋剤上の反応性基のモル比に基づく。好ましい比率は、約１０〜約１０００、より好ましくは約２０〜約２００、最も好ましくは約３０〜約１００の範囲内にある。架橋剤が多いと、ヒドロゲルを膨張させる能力が妨げられるため収着容量が減少するのに対し、架橋剤が少ないと、架橋が不完全になる、すなわちいくらかの重合体分子が完全に溶解したままになる場合がある。
【００３６】
界面活性剤を使用して、重合体が支持構造の表面全体に均一に広がるのを促進させることができる。好ましい界面活性剤は、非イオン性で、水溶性で、しかもアルカリに安定なものである。フルオロ界面活性剤は、水の表面張力を低下させる顕著な能力を有する。これらの界面活性剤は、イー・アイ・デュポン・ド・ヌムール・アンド・カンパニーがＺｏｎｙｌという商品名で販売しており、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ及びＺｏｎｙｌ  ＦＳＨなどが特に好適である。条件を満たす別の種類の界面活性剤は、ザ・ダウ・ケミカル・カンパニーがＴｒｉｔｏｎ  Ｘという商品名で販売するオクチルフェノールエトキシレートである。当業者であれば、他の界面活性剤も使用できることが分かるであろう。被覆溶液中で使用される界面活性剤の濃度は、通常、ディウェッティング（dewetting）を回避するように溶液の表面張力を低下させるのに必要な最少量である。ディウェッティングとは、最初の延展後に表面上の液体が自発的に数珠状になることと定義される。ディウェッティングは、メンブランソーバーの形成中における非常に望ましくない事象である。というのは、これは、基材の不均一な被覆及び露出をもたらし、それによって湿らすことのできない製品及び収着容量の減少をもたらす場合があるからである。界面活性剤の必要量は、溶液の液滴が作る、多孔質骨格と同一の材料から作られた平面との接触角を測定することによって都合よく決定できる。接触角の劇的な前進及び後退が特に有益である。これらは、液体を溶液の液滴に添加したとき又は該液滴から取り出したときに、それぞれ測定される。ディウェッティングは、０°という後退接触角を得るように溶液を処方する場合に回避できる。
【００３７】
随意に、疎水性表面に容易に吸着する小量の親水性重合体を展着助剤として溶液に添加することができる。ポリビニルアルコールが好ましい重合体であり、これを全溶液容量の約０．０５重量％〜約５重量％の範囲の濃度で使用することができる。
【００３８】
支持用の多孔質構造が重合体の溶液で容易には湿ることができない場合、例えば、疎水性微多孔膜の場合には、溶液に湿潤助剤を添加することができる。この湿潤助剤は、架橋反応に悪影響を及ぼさない、被覆用重合体溶液と相溶性のある任意の有機溶媒であることができる。典型的には、この溶媒は、低級脂肪族アルコールのうちの１種であるが、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル及び他の水混和性溶媒を同様に使用することもできる。添加される有機溶媒の量は、多孔質基材を被覆溶液で即座に湿潤させるのに必要な最小量である。代表的な湿潤助剤としては、メチルアルコール、エチルアルコール及びイソプロピルアルコールが挙げられる。
【００３９】
被覆方法は、被覆溶液によって織物の湿潤を改善させることができる。織物を均一に飽和させ、かつ、疎水性の箇所や領域を残さないように、被覆溶液を制御された態様で織物に押し込むことができる。これは、加えられる押出圧力によって溶液を織物に押し入れるために、例えば、織物に対して押圧されるスロットを介して又は織物にごく接近して溶液を押出すことによって行うことができる。当業者であれば、均質な被膜を生じさせるのに必要な圧力、速度及びスロット形状の条件を決定できるであろう。
【００４０】
被覆基材を形成させるための好ましい方法は、（１）溶液を製造し；（２）この溶液を膜上に塗布し；基材の外部表面から余剰の液体を除去し；（３）膜を乾燥させ；（４）膜を硬化させ；（５）膜をすすぎ、そして乾燥させ；（６）完成した膜を随意にアニールし；そして（７）この膜を随意に酸処理することを含む。より具体的には、好適な重合体及び架橋剤を含有する溶液を製造する。これら２種成分の濃度は、付着した被膜の厚さと膨張の程度を決め、これは同様に膜を通した流量とその収着容量とを決める。重合体及び架橋剤を好適な溶媒、好ましくは水に溶解させる。この溶液は、湿潤助剤、展着助剤及びｐＨ調整剤など他の成分を含有していてもよい。疎水性基材を使用する場合には、溶液の表面張力は、該基材を湿らせる程度に十分に低くなければならない。重合体の水溶液は、通常は疎水性微多孔膜を湿らせないので、この溶液に有機溶媒（湿潤助剤）を添加しなければならないであろう。疎水性膜の表面に被覆剤を均一に広げるのを促進させるために、溶液に界面活性剤を添加することができる。最後に、架橋剤の化学的性質によっては、架橋反応を生じさせるためにｐＨを上昇させることが必要になる場合がある。溶液の成分と典型的な濃度範囲とを以下の表１にまとめる。
【００４１】
【表１】
2011225568.tif 000002
【００４２】
被覆溶液は、基材を該溶液に浸漬し、この基材を溶液から取り出し、そして、過剰の溶液を基材の両面から機械的に、例えば一対のニップロールを使用して除去する（ニップオフ）ことにより、基材上に塗布される。その後、細孔にこの溶液が充填された多孔質基材を乾燥させる。乾燥は、室温での蒸発により実施でき、或いは熱を加えることによって促進できる（約４０〜１１０℃の温度範囲）。この被覆基材を乾燥させた後に、これを架橋剤が重合体と完全に反応できるように数時間から数日間にわたって保持する。随意に、熱を加えることにより架橋を促進させてもよい。その後、基材を多量の溶媒ですすぎ、そして再度乾燥させる。追加の随意工程として、この乾燥したメンブランソーバーを高温（６０〜１２０℃）でアニールしてその流動特性を調節し、そしてこれを０．１Ｍ〜１Ｍの濃度の非酸化性強一塩基酸で処理して被膜中に存在するアミノ基をプロトン化させることを含む。
【００４３】
重合体がＰＡＡの場合、膜の熱処理後にこの重合体における基本的に全てのアミノ基を対応するアンモニウムイオン塩に転化させることが、製品の統一性を確保するのに役立つであろう。水湿潤性が良好であることが重要である。基材は非常に疎水性であり、しかも親水性被膜は非常に緩やかに架橋し、このマトリックスには共有結合していないため、ＰＡＡゲルの側面が多少収縮することが、膜が水で湿潤しなくなる原因となる。一方、ＰＡＡの基本的に全てのアミノ基が対応するアンモニウムイオン塩に転化する場合、乾燥被膜の体積の増加、対イオンによる水の保持力の増大及び荷電重合体の水に対する親和性の強化が、膜をさらに水湿潤性にするのに役立つ。この目的でＰＡＡをプロトン化するために、非毒性で非酸化性の強酸、好ましくはＰＡＡのイオン架橋を阻害するための一塩基酸を使用すべきである。好適な酸としては、塩酸、臭化水素酸、スルファミン酸、メタンスルホン酸、トリクロル酢酸及びトリフルオル酢酸が挙げられる。塩化物は、試料タンパク質溶液中に既に存在しているため、最適な対イオンであると考えられるが、スチールの腐食及び労働安全上の問題が関わるため、塩酸及び／又はその塩を使用する連続方法にとっては実用的でない場合がある。そのため、より好適な酸は、スルファミン酸（Ｈ2Ｎ−ＳＯ2ＯＨ）であり、これは、ＰＡＡのためのプロトン化剤として好ましい。
【００４４】
ＰＡＡをプロトン化させるための好適な方法は、プロトン化酸、好ましくはスルファミン酸の０．１〜０．５Ｍ水溶液（又は湿潤性に乏しい膜に完全に完全に浸透させるために水／アルコール混合液）中に膜を浸漬し、その後すすぎと乾燥を行うことである。得られた膜は、スルファミン酸対イオンを有し、これは、０．５Ｍ水酸化ナトリウム、続いて０．５Ｍ塩化ナトリウムなどの簡単な調整プロトコールを使用することによって容易に変換できる。
【００４５】
このような酸処理により、膜の保存期間安定性が向上し、また、結合力が有意に高くなる。本発明者は、特定の理論に限定しようとするものではないが、ＰＡＡを完全にプロトン化した（酸処理した）状態で乾燥させると、それがＢＳＡを良好に封入することのできる、より広がった「開いた」形態になり、それによりさらに高いイオン強度に到達するまでＢＳＡが放出されないものと考える。酸処理膜のさらなる利点は、ろ過製品に認められた滅菌手順であるγ線照射などのイオン化照射に対する安定性が一層増すことである。
【００４６】
思い通りのメンブランソーバー製品になるかどうかは、３つの重要なパラメーターで決まる。それは、収着容量、フラックス及び結合力である。結合力は、大体の場合、メンブランソーバーの表面上に存在する基の化学的性質によって決まるのに対し、容量とフラックスは、収着層を形成するために使用される手順と重合体及び架橋剤の量とにかなりの影響を受けやすい場合が多い。支持骨格と、精製効率（床高さにより決定される）と、メンブランソーバーの化学的性質との所定の組合せについては、フラックスが大きいと収着容量が小さくなり、フラックスが小さいと収着容量が大きくなる場合がある。
【００４７】
架橋ＰＡＡ膜吸着体の透過性は、高温「硬化」方法によって改善された。軽く架橋したＰＡＡ−ゲルは、かなりの量の水を吸収し、その容量を数桁増加させる能力を有する。この効果は、透過性を低下させる原因となる場合がある。このゲルの特性は、その膨潤が許容できるレベルにまで低下するまで該ゲルを脱水することによって、結合力及びゲル容量を損なうことなく緩和されるように思われる。事実、この硬化方法は、製品の必要に応じて、膜の透過性を調整することができる。好適な硬化温度は約２５〜１２０℃、より好ましくは約８５〜１００℃であり、約６〜７２時間に及ぶ。
【００４８】
γ線照射は、ろ過製品のために広く認められている滅菌手順である。ガンマ滅菌適性は、メンブランソーバーの望ましい特徴である。本発明者は、酸処理メンブランソーバーがイオン化照射に対してさらに大きな安定性を有するという、酸処理メンブランソーバーの驚くべき利点に気付いた。
【００４９】
所定の実施形態に従う実施において、目的のウイルスのみならずＤＮＡなどの不純物をも含有する供給物をイオン調節剤及び１価の塩の存在下で膜吸着体に導入する。好適なイオン調節剤としては、燐酸塩緩衝剤（例えば、燐酸ナトリウム又は燐酸カリウム）、クエン酸塩緩衝剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、スクシネート、硫酸アンモニウムイオン、硫酸ナトリウム、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、グルタメート、トリポリホスフェート、ポリアクリル酸などの高分子電解質、スチレンスルホン酸ナトリウム及びラウリルエーテル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が挙げられる。好適な１価の塩としては、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、臭化ナトリウム、沃化ナトリウム、イミダゾール塩酸塩などが挙げられる。好適なイオン調節剤濃度としては、約２ｍＭ〜約０．５Ｍが挙げられる。好適な１価の塩の濃度としては、約０〜約２Ｍが挙げられる。
【００５０】
次の実施例は、例示の目的でここに含めるものであり、本発明を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００５１】
例１（疎水性ＵＰＥ上のＰＡＡ）
ポリアミン被覆膜の製造
まず、９％ポリアリルアミン（ＰＡＡ、Ｍｗ：１５０００ｇｍ／ｍｏｌ）、０．４％ＰＥＧＤＧＥ（ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、Ｍｗ：５２６ｇｍ／ｍｏｌ）、４％水酸化リチウム、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、８％のポリビニルアルコール溶液（２．５％溶液）を含有するイソプロピルアルコールの２０％水溶液を調製した。これを、パイロット規模の塗布機を使用して０．６５μｍ細孔径を有する疎水性ＵＰＥ（超高密度ポリエチレン）膜のロール上に被覆した。被覆後、この膜を水及びメタノールで抽出して過剰の反応体を除去し、そして温風衝突乾燥器により１２０℃で乾燥させた。その後、この膜を９５℃で１５時間にわたり硬化させ、５％イソプロピルアルコール中５％スルファミン酸で処理し、次いで乾燥させて被膜を安定化させた。このようにして製造された膜を１／２インチ又は１インチのディスクにカットし、８層に積み重ね、入口及び流出口を有するポリエチレン装置に外側被覆し、さらに、フロースルー分離を検討するために使用した。
【００５２】
例２
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ及びトリス緩衝液を使用したＤＮＡからのＢＳＡ（ウイルスモデル）のフロースルー精製
この例示実験では、 移動相として様々な塩化ナトリウム濃度を有するトリス緩衝液と例１で説明したように第一級アミン陰イオン交換体で作製された装置とを使用した、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びニシン精子ＤＮＡのフロースルー回収を説明する。膜吸着体を、例１からの８層の膜（直径１インチ、全膜容量＝〜０．３４ｍＬ）を、入口及び流出口を有するポリエチレン装置に外側被覆することによって作製した。ＢＳＡを、試料中のＤＮＡその他のヌクレオチドから分離することが必要なタンパク質並びにウイルスのモデルとして使用した。ＢＳＡは、良好なウイルスとしての役割も果たす。というのは、ＢＳＡは、これらの生体分子のｐＩに近い〜５のｐＩを有するからである。ニシン精子ＤＮＡは、典型的な供給物中に見出される宿主細胞ＤＮＡ及び他の同様のヌクレオチドのモデルとして使用した。
試験前に、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を、シリンジを使用して１０ｍＬの水で湿らせることにより調製した。続いて、この装置を、水の入ったビーカー中に、流出側を下に向け、シリンジをそれに取り付けた状態で浸漬させた。このシリンジを使用してこの装置を僅かな減圧にして、閉じ込められた気泡を除去した。続いて、この装置をポンプに連結し、そして１５ｍＬの０．５Ｎ  ＮａＯＨでフラッシュし、１５ｍＬのＤＩ水で洗浄し、続いて、各塩濃度の２５ｍＭトリス緩衝液２０ｍＬで予め平衡させた。
シグマ・オールドリッチ社から得られたＢＳＡを、それぞれ０．５Ｍ、０．７Ｍ及び０．９ＭのＮａＣｌを含有するトリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８）の３種の異なる溶液に溶解させて、１．８ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ濃度を有する最終溶液を完成させた。同様に、プロメガ社から得られたニシン精子ＤＮＡを上記塩濃度のトリス緩衝液に溶解させて５０μｇ／ｍＬの濃度の最終溶液を完成させた。ＢＳＡ含有溶液の各およそ１０ｍＬと、ＤＮＡ含有溶液の各３０ｍＬとを、シリンジポンプ（ニュー・エラ・ポンプシステムズ・インク、ＮＥ−１６００）を使用して１ｍＬ／分の流量で６個の異なるＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置（０．３３ｍＬ）に通した。このフロースルー及び供給物中におけるＢＳＡ及びＤＮＡの濃度を、紫外線可視分光光度計（フィッシャー・サイエンティフィック）を使用してそれぞれ２８０ｎｍ及び２６０ｎｍで測定した。
トリス緩衝液を使用してＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を通過させたＢＳＡ及びＤＮＡの回収率を測定する例示実験の結果を以下の表２に示す。
【００５３】
【表２】
2011225568.tif 000003
【００５４】
表２から、上記全ての緩衝液条件下で、ここに開示された実施形態に従う媒体を使用して完全なＤＮＡの除去が達成できることが分かる。しかし、これらの条件のいずれも、タンパク質／ウイルスのモデルであるＢＳＡの１００％回収率は得られなかった。これは、１価の塩の濃度が増加したトリス緩衝液は、このような媒体を使用してウイルスからＤＮＡを分離するための方法として使用できるものの、塩濃度の変更を用いるのみでは、タンパク質/ウイルスの完全な回収を達成することは可能ではない場合があることを示唆する。
【００５５】
例３
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜及び燐酸塩緩衝液を用いたＤＮＡからＢＳＡのフロースルー精製
この例示実験では、第一級アミン陰イオン交換体としてＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置（ミリポア・コーポレーションから商業的に入手できる０．０８ｍＬの使い捨ての膜を主体とする陰イオン交換体）、そして移動相として多価燐酸イオン及び塩化ナトリウム塩を含有する緩衝液を使用した、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びニシン精子ＤＮＡのフロースルー回収を説明する。例２と同様に、ＢＳＡをタンパク質／ウイルスモデルとして使用し、ニシン精子ＤＮＡを宿主細胞ＤＮＡモデルとして使用した。
試験前に、これらのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を例２で説明した方法の通りに湿潤させ、そして脱気した。次いで、これらの装置を自動ＢｉｏＣａｄ  ＦＰＬＣシステム（アプライド・バイオシステムズ）に連結し、そして０．５ＮのＮａＯＨでフラッシュし、水で洗浄し、塩化ナトリウム塩を有する又は有しないナトリウム燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．１）で予め平衡させた。さらに、このＦＰＬＣシステムを、これらの生体分子に対する膜の容量を決定するために、フロースルーモードの装置からのＢＳＡ及びＤＮＡの通過（ブレークスルー）を測定するために使用した。フロースルー工程後に、平衡緩衝液、すなわち１ＭのＮａＣｌ溶液及び０．５ＮのＮａＯＨ溶液で洗浄して、膜に結合した微量のＢＳＡ及びＤＮＡを決定した。
それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ濃度及び２８μｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡ（シグマ・オールドリッチ社）及びＤＮＡ（プロメガ社）の別々の溶液を、様々な量の燐酸ナトリウム又は塩化ナトリウム塩を含有する燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で調製した。これらの溶液を、１０％を超えるＢＳＡ又はＤＮＡの通過がＦＰＬＣシステムのインライン紫外線可視分光光度計によりそれぞれ２８０ｎｍ及び２６０ｎｍで記録されるまで２個の異なるＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置（０．０８ｍＬ）に通した。これらの装置のＢＳＡ及びＤＮＡに関する１０％通過での動的容量を、次の方程式を用いて算出する：
動的容量＝Ｃf×ＶBT／Ｖd
ここで：
Ｃf＝供給物の濃度；
ＶBT＝１０％通過で装置を通過した溶液の容積；及び
Ｖd＝装置の容積
である。
【００５６】
１０％通過（フロースルー）曲線では測定可能な容量が示されなかった場合には、１ＭのＮａＣｌ溶液を使用して装置から溶出された微量の不純物（もしあれば）を使用して装置の容量を推定した。溶出したＢＳＡの濃度は、溶出ピーク下面積を測定し、そして当該面積に相当する全タンパク質量を基準検量線に対して決定し、〜６５％の不可逆結合と仮定することによって算出した。
【００５７】
０．０８ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置及び移動相において燐酸ナトリウムを使用したＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡの容量、回収率及び除去率を測定する例示実験の結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
2011225568.tif 000004
【００５９】
表３から分かるように、第一級アミン膜のＢＳＡ容量は、燐酸塩濃度が増加するに従い劇的に減少するが、ＤＮＡ容量の変化は小さい。２ｍＭ〜５ｍＭの間に、タンパク質回収率の劇的な増加をもたらす燐酸イオンの閾値濃度があるように思われる。このデータから、タンパク質／ウイルスの完全な回収又はそれらの微量の損失を伴うが極めて高い回収は、第一級アミン膜を通る移動相中に１０ｍＭ以上の濃度の燐酸塩を使用するフロースルーモードで達成できることが示唆される。燐酸塩と共に塩化ナトリウム塩を使用すると、ＢＳＡについての膜容量が減少し、かつ、そのＤＮＡに対する結合能力が改善する。さらに、最大ＤＮＡ除去率が達成できる最適ＮａＣｌ濃度があるように思われる。ＮａＣｌを使用すると、生成物をほとんど損失することなく５ｍＭ程度に低い燐酸塩濃度で又はＤＮＡ除去率を向上させる５０ｍＭ程度に高い燐酸塩濃度で第一級アミン膜を使用することが可能になると考えられる。つまり、用途に応じて、燐酸塩濃度及びＮａＣｌ濃度を最適化して大量の供給物を高いタンパク質／ウイルス回収率及びＤＮＡ除去率で処理することが可能になる。この研究から、燐酸ナトリウムなどの多価塩を使用することによって、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどの第一級アミン膜を使用したフロースルーモードで達成できることが示唆される。さらに、塩化ナトリウムなどの１価の塩を使用することで、この分離の性能を改善させることができる。
【００６０】
例４
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜及び燐酸塩緩衝液を使用した宿主ＤＮＡからのインフルエンザウイルスのフロースルー精製
別の例示実験において、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び宿主細胞ＤＮＡの複合供給混合物からのインフルエンザウイルスＡ型（Ｆｌｕ−Ａ）の回収を説明する。インフルエンザＡ型は、〜５．０のｐＩ及びおよそ８０〜１２０ｎｍのサイズを有する脂質エンベロープウイルスである。この研究は、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（第一級アミン）膜を収容した装置に、精製されかつ緩衝液交換されたｆｌｕ供給物を通すことによってフロースルーモードで行った。
ＭＤＣＫ細胞内で増殖させたインフルエンザＡ型ウイルスを含有する供給物を、標準的な手順を用いて調製した。最初に、５０個のＴ１５０フラスコに、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）中１０％培養密度のＭＤＣＫ細胞（メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞）を供給した。２〜３日後、これらの細胞が８０〜９０％培養密度になったら フラスコ中の培地を血清なしのＤＭＥＭに変更し、そして細胞にインフルエンザＡ型／ＷＳ（Ｈ１Ｎ１株）を感染させた（これはＭＤＣＫ細胞内で増殖するのに適した組織培養であった）。次いで、これらのフラスコを完全なＣＰＥ（細胞変性効果）が観察されるまで５％ＣＯ2中で３日にわたり３３℃でインキュベートした。その後、上澄液を２５００ｒｐｍで遠心分離し、０．４５μｍ膜フィルターを通してろ過して細胞残屑を除去し、そしてさらに使用する前に−８０℃で保存した。
この実験の直前に、約４０ｍＬの供給物を４℃で一晩解凍し、次いで１０キロダルトンのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心ろ過装置（ミリポア・コーポレーション）を使用して燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．１）に緩衝液交換した。移動相中における燐酸塩濃度及び塩化ナトリウム濃度は、例３で行った検討に基づいて選択した。次いで、供給物を、容積型ポンプ（Ｍｉｇｈｔｙ−Ｍｉｎｉ，サイエンティフィック・システムズ・インク）を使用して０．０８ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置に１ｍＬ／分の流量で通した。カラムを通した流れを１ｍＬ画分で集め、そして、ｆｌｕ含量及び宿主細胞ＤＮＡ含量について、それぞれ血球凝集素（ＨＡ）アッセイ及びピコグリーンアッセイを使用して２回アッセイした。供給物のインフルエンザウイルス及び宿主細胞ＤＮＡの力価は、それぞれ１０２４０ＨＡＵ／ｍＬ及び１〜１．３μｇ／ｍＬであった。
移動相として燐酸ナトリウム緩衝液を使用して０．０８ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を通過したインフルエンザウイルスＡ型及び宿主細胞ＤＮＡの通過（フロースルー）量を測定する例示実験の結果を図１に示している。
【００６１】
【表４】
2011225568.tif 000005
【００６２】
図１及び表４は、移動相に多価燐酸塩を使用することで、インフルエンザウイルスの完全な回収が可能になると共に、宿主細胞ＤＮＡについてかなりの膜容量を維持することが可能になることを示している。宿主細胞ＤＮＡについての容量は例３で示した単一成分系よりも低いものの、インフルエンザウイルス及び宿主細胞ＤＮＡの通過は、例３のＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡのそれと類似する。これは、ＢＳＡがタンパク質のみならずウイルスの良好なモデルであり、しかもニシン精子ＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡの良好なモデルであることを示唆する。１価の塩の濃度は、さらに高いＤＮＡ除去率及び生成物処理量を達成するようにさらに最適化できる。この研究は、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどの第一級アミン媒体及び燐酸塩などの多価イオンを使用してフロースルーモードで宿主細胞ＤＮＡからウイルスを分離できることを確認するものである。さらに、塩化ナトリウムなどの１価の塩の存在は、この分離の助けとなる。
【００６３】
例５
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用してＤＮＡからＢＳＡをフロースルー精製することを可能にするためトリス緩衝液への添加剤として燐酸塩を使用する
この例示実験では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置（０．０８ｍＬ）及び移動相としてトリス緩衝液を使用したＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡのフロースルー回収を説明する。様々なモル濃度の燐酸ナトリウム及び塩化ナトリウム塩をトリス緩衝液の添加剤として使用し、そして、最終溶液を、１０ＮのＮａＯＨ又は２ＮのＨＣｌ（フィッシャー・サイエンティフィック）を使用してｐＨ８に調整した。この溶液を平衡、ロード及び洗浄緩衝液として使用した。塩条件は、例３で行った検討に基づいて選択した。これらの実験は、例３に記載したのと同様の方法で行った。
０．０８ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置及び添加剤としての多価燐酸イオンを有するトリス緩衝液を使用してＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡの容量、回収率及び除去率を測定する例示実験の結果を表５に示す。
【００６４】
【表５】
2011225568.tif 000006
【００６５】
表５に示すように、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂは、トリス緩衝液中のＢＳＡ及びＤＮＡ容量が非常に高く、結果としてタンパク質の回収率が有意に低い。燐酸ナトリウム塩を添加すると、第一級アミン膜のＢＳＡ容量がほとんどなくなり、９９％を超えるタンパク質回収率が可能になるのに対し、ニシン精子ＤＮＡについての膜容量は維持される。先に検討したように、塩化ナトリウム塩を添加することには、ＤＮＡ除去に影響を及ぼすことなくタンパク質の回収率をさらに改善させるという利点がある。この研究から、緩衝剤として多価塩を使用することに加えて、当該多価塩を、単に、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどの第一級アミン膜を使用してフロースルーモードでＤＮＡからタンパク質やウイルスを精製するための他の緩衝液への添加剤として使用することができることが示唆される。
【００６６】
例６
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用して宿主細胞ＤＮＡからインフルエンザウイルスをフロースルー精製することを可能にするためトリス緩衝液への添加剤として燐酸塩を使用する
この例示実験では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置（０．０８ｍＬ）及び移動相としてトリス緩衝液を使用した宿主細胞ＤＮＡからインフルエンザウイルスＡ型のフロースルー分離を説明する。燐酸ナトリウム及び塩化ナトリウム塩をトリス緩衝液の添加剤として使用し、最終溶液のｐＨを、１０ＮのＮａＯＨ又は２ＮのＨＣｌを使用してｐＨ８に調整した。緩衝液の条件は、例５で行った検討に基づいて選択した。この溶液を平衡緩衝液のみならずロード緩衝液としても使用した。例４に記載したのと同様の方法でウイルスを増殖させ、緩衝液を変更した。また、さらなるフロースルー分離及びアッセイを例４に記載したとおりに行った。供給インフルエンザウイルス及び宿主細胞ＤＮＡの力価は、それぞれ１０２４０ＨＡＵ／ｍＬ及び１〜１．５μｇ／ｍＬであった。
【００６７】
【表６】
2011225568.tif 000007
【００６８】
表６に示されるように、トリス緩衝液では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜は、インフルエンザウイルス容量が非常に高かったが、これは、フロースルーモードで極めて不十分なウイルス回収率をもたらした。しかし、燐酸ナトリウムをトリス緩衝液に添加すると、ウイルスに対する膜容量が完全になくなってウイルスの完全な回収が可能になったと共に、宿主細胞ＤＮＡに対してはかなりの膜容量が依然として保持された。燐酸塩濃度及び／塩化ナトリウム濃度を調節することによる緩衝液条件のさらなる最適化を、この精製のための膜性能を改善させる方法として使用することができる。この研究は、多価塩を既存の緩衝液への添加剤として使用して宿主細胞ＤＮＡからウイルスをフロースルー精製することを可能にすることができるという、例５で行った検討の結果を裏付けるものである。
【００６９】
例７
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用してＤＮＡからＢＳＡをフロースルー精製することを可能にするためトリス緩衝液への添加剤としてクエン酸塩を使用する
この例示実験では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置（０．０８ｍＬ）及び移動相としてトリス緩衝液を使用したＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡのフロースルー回収を説明する。様々なモル濃度のクエン酸塩及び塩化ナトリウム塩をトリス緩衝液の添加剤として使用し、最終溶液をｐＨ８に調整した。この溶液を平衡、ロード及び洗浄緩衝液として使用した。これらの実験は、例３に記載したのと同様の方法で行った。
０．０８ｍＬＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置及び添加剤としてクエン酸を有するトリス緩衝液を使用したＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡの容量、回収率及び除去率を測定する例示実験の結果を表７に示す。
【００７０】
【表７】
2011225568.tif 000008
【００７１】
表７から、トリス緩衝液のクエン酸イオン濃度が低くても、ＢＳＡに対する膜容量はさほど減少しなかったことが分かる。しかし、クエン酸塩濃度を２５ｍＭから５０ｍＭに増加させると、その膜容量に大きな影響があり、しかもＢＳＡ回収率が６２％から９９％を超えるまで改善した。これは、フロースルーモードでタンパク質を完全に回収するのに必要なトリス緩衝液のクエン酸イオンの閾値濃度が存在することを示唆する。この閾値濃度は、イオン調節剤が異なれば変化すると考えられる。さらに、膜のニシンＤＮＡ容量は、クエン酸イオンが存在した方が、燐酸イオンが存在する場合よりもかなり高いことが分かる。したがって、好適なイオン調節剤を選択することは、このタイプの分離のために緩衝液条件を最適化することと共に、検討するために重要な変数だと考えられる。
【００７２】
例８
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用して宿主細胞ＤＮＡからインフルエンザウイルスをフロースルー精製することを可能にするためトリス緩衝液への添加剤としてクエン酸塩を使用する
この例示実験では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置（０．０８ｍＬ）及び移動相としてトリス緩衝液を使用した宿主細胞ＤＮＡからインフルエンザウイルスＡ型のフロースルー分離を説明する。クエン酸塩及び塩化ナトリウム塩をトリス緩衝液の添加剤として使用し、最終溶液のｐＨを、１０ＮのＮａＯＨ又は２ＮのＨＣｌを使用してｐＨ８に調整した。この溶液を平衡緩衝液のみならずロード緩衝液としても使用した。条件は、例７で行った検討結果に基づいて選択した。例４に記載したのと同様の方法でウイルスを増殖させ、緩衝液を変更した。また、さらなるフロースルー分離及びアッセイを例４に記載したとおりに行った。供給インフルエンザウイルス及び宿主細胞ＤＮＡの力価は、それぞれ１０２４０ＨＡＵ／ｍＬ及び１〜１．５μｇ／ｍＬであった。
【００７３】
【表８】
2011225568.tif 000009
【００７４】
表８は、トリス緩衝液の添加剤としてクエン酸イオンを使用すると、インフルエンザウイルス回収率の点で燐酸イオンと同様の効果があることを示している。しかし、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜の宿主細胞ＤＮＡ容量は、トリス緩衝液にクエン酸イオンが存在した方が、燐酸イオンが存在する場合よりもかなり高い。実際に、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂは、クエン酸イオンが存在した方がトリス緩衝液そのものよりも高い容量を有するように思われた。トリス緩衝液についてのＤＮＡ容量の改善は予想外のため、あまりよく分からないが、これは、クエン酸と同等のイオン調節剤が同様の影響を及ぼす可能性があることを示唆するものである。つまり、クエン酸又は同様のイオン調節剤を単独で又は塩化ナトリウムなどの１価の塩と共に既存の緩衝液への添加剤として使用して、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用した宿主細胞ＤＮＡからのウイルスの極めて効率的な精製を成し遂げることができる。
【００７５】
例９
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用してＤＮＡからＢＳＡをフロースルー精製することを可能にするためトリス緩衝液の添加剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用する
この例示実験では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置（０．０８ｍＬ）及び移動相としてトリス緩衝液を使用したＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡのフロースルー回収を説明する。様々なモル濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び塩化ナトリウム塩をトリス緩衝液の添加剤として使用し、最終溶液をｐＨ８に調整した。この溶液を平衡、ロード及び洗浄緩衝液として使用した。これらの実験は、例３で説明したのと同様の方法で行った。
０．０８ｍＬＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置及び添加剤としてＥＤＴＡを有するトリス緩衝液を使用して及びニシン精子ＤＮＡの容量、回収率及び除去率を測定する例示実験の結果を表９に示す。
【００７６】
【表９】
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【００７７】
表９は、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂのＢＳＡ容量及びＤＮＡ容量に及ぼすトリス緩衝液のＥＤＴＡ濃度の増加の影響を示している。１ｍＭ程度に低いＥＤＴＡ濃度ではＣｈｒｏｍａＳｏｒｂのＢＳＡ容量が有意に増加し、タンパク質の高い回収率が可能になる。一方、ＥＤＴＡ濃度が増加すると、まず膜のＤＮＡ容量が減少し、その後該容量が増加する。トリス緩衝液に塩化ナトリウム塩のみを添加すると、ＤＮＡに対する容量が減少する。しかし、ＥＤＴＡが存在すると、膜のＤＮＡ容量は増加する。ＥＤＴＡの存在下でのトリス緩衝液中のＥＤＴＡ又は塩化ナトリウムの上記影響は予想外であり、しかもあまりよく分からない。この研究から、ＥＤＴＡのようなイオン調節剤を使用すると、タンパク質及びウイルスの完全な回収が可能になるだけでなく、ＤＮＡに対する膜容量が改善し、これは同様にさらに大量の供給物を処理することが可能になることが示唆される。この研究から、イオン調節剤を単独で又は１価の塩と共に使用することが、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどの第一級アミン膜を使用したＤＮＡからのタンパク質／ウイルス分離に好都合であることが示唆される。
【００７８】
例１０
ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜を使用して宿主細胞ＤＮＡからインフルエンザウイルスをフロースルー精製することを可能にするためトリス緩衝液の添加剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用する
この例示実験では、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜装置（０．０８ｍＬ）及び移動相としてトリス緩衝液を使用した宿主細胞ＤＮＡからインフルエンザウイルスＡ型のフロースルー分離を説明する。ＥＤＴＡ及び塩化ナトリウム塩をトリス緩衝液の添加剤として使用し、最終溶液のｐＨをｐＨ８に調整した。この溶液を平衡緩衝液のみならずロード緩衝液としても使用した。条件は、例９で行った検討結果に基づいて選択した。例４に記載したのと同様の方法でウイルスを増殖させ、緩衝液を変更した。また、さらなるフロースルー分離及びアッセイを例４に記載したとおりに行った。供給インフルエンザウイルス及び宿主細胞ＤＮＡの力価は、それぞれ１０２４０ＨＡＵ／ｍＬ及び１〜１．５μｇ／ｍＬであった。
移動相としてトリス緩衝液（Ｔ）、１０ｍＭのＥＤＴＡと０．３ＭのＮａＣｌとを含有するトリス緩衝液（ＴＥ１０）及び５０ｍＭのＥＤＴＡと０．３ＭのＮａＣｌとを含有するトリス緩衝液（ＴＥ５０）を使用して０．０８ｍＬのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を通過した宿主細胞タンパク質及び宿主細胞ＤＮＡの混合物中におけるインフルエンザウイルスＡ型の通過量を測定する例示実験の結果を図２に示す.
移動相としてトリス緩衝液（Ｔ）、１０ｍＭのＥＤＴＡと０．３ＭのＮａＣｌとを含有するトリス緩衝液（ＴＥ１０）及び５０ｍＭのＥＤＴＡと０．３ＭのＮａＣｌとを含有するトリス緩衝液（ＴＥ５０）を使用して０．０８ｍＬＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置を通過させたインフルエンザウイルスＡ型及び宿主細胞タンパク質の混合物中における宿主ＤＮＡの通過量を測定する例示実験の結果を図３に示す。
【００７９】
【表１０】
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【００８０】
供給物の利用可能度には限界があるため、トリス緩衝液中に１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する供給物を７ｍＬ及び５０ｍＭのＥＤＴＡを含有する供給物を１５ｍＬしか、これらのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置に通して処理しなかった。図２及び３から分かるように、ＥＤＴＡ濃度がゼロから５０ｍＭに増加すると、インフルエンザウイルスの通過が非常に早い時期に起こる。しかし、ＤＮＡの通過は、ＥＤＴＡが存在してもしなくても同様であるように思われる。つまり、表１０に示すように、ＥＤＴＡ濃度が増加すると、膜のウイルス容量が減少し、回収率が高くなる。膜のＤＮＡ容量は、２つのＥＤＴＡ濃度ではさほど相違しない。ウイルス回収率は、先の例で観察されるようにＥＤＴＡの存在下でのタンパク質の挙動を正確には模倣しないが、依然として、イオン調節剤濃度が増加するとウイルス回収率が改善するという同じ傾向を持つ。添加剤としてＥＤＴＡを使用することによるタンパク質容量とウイルス容量との相違は、ＥＤＴＡによる静電遮蔽機構の相違又はタンパク質、ウイルス及びＥＤＴＡの荷電強度の相違又はＥＤＴＡと第一級アミン膜との相互作用機構の相違によるものであると考えられる。これらの相違の原因にかかわらず、この研究から、ＥＤＴＡは、先に議論した他のイオン調節剤に類似する膜−ウイルス結合に対する抑制効果を有するものであると解釈できることは明らかである。タンパク質回収率に匹敵するウイルス回収率を達成するためには、高いＥＤＴＡ濃度という相違しか要求されない。さらに、塩濃度などの様々な緩衝液条件を使用し、様々な塩、ｐＨ又は添加剤を使用することで、この分離の性能を改善させることができるであろう。用途に応じて、これらの最適化を考慮することが必要である。
【００８１】
例１１
ポリアミングラフトセファロースビーズの製造及びこれらの第一級アミン変性ビーズを使用したＤＮＡからのＢＳＡ及びインフルエンザウイルスの精製
この例では、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）が共有結合したセファロースビーズの合成を例示する。さらに、これらのビーズを使用してＢＳＡ又はインフルエンザウイルス含有溶液からＤＮＡを除去する方法を説明する。２ｇのエポキシセファロース６Ｂ（ＧＥヘルスケア）ビーズを８ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に懸濁し、これに、１０ｍＬの１０％ＰＡＡ（Ｍｗｔ＝３０００）溶液を添加する。この溶液のｐＨを、水酸化ナトリウムを使用して１１に調整し、ビーズを２４時間にわたり穏やかに振盪させてＰＡＡとビーズとを共有結合させることができる。反応後、ビーズを水ですすぎ、そしてさらに使用する前に冷蔵庫内において湿った状態で保存する。１ｍＬのクロマトグラフィーカラムに、それぞれ上記変性ビーズを詰め、そして移動相にイオン調節剤を使用してＢＳＡ含量、インフルエンザ含量及びＤＮＡ容量を試験する。
０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び２８μｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡの溶液を、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ燐酸塩緩衝液で別々に調製する。これらの溶液をＰＡＡ−セファロースのカラムに別々に通す。ＢＳＡ及びＤＮＡに対するＰＡＡ−セファロースビーズの容量を、例３で説明したように、通過（ブレークスルー）曲線を使用して算出する。ＰＡＡ−セファロースビーズは、ＢＳＡ容量を全く有しない又は無視できる程度にしか有しないが、かなりの量のＤＮＡを結合する。これは、ＰＡＡ−セファロースなどのポリアミン固定化媒体を使用して宿主細胞ＤＮＡからタンパク質を精製することができることを示唆する。
【００８２】
インフルエンザ含有供給物の精製は、例４で説明したのと同様の方法で達成される。インフルエンザ含有供給物を、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ燐酸塩緩衝液に緩衝液交換する。この供給物をＰＡＡ−セファロースカラムに通し、そしてフロースルー液を１ｍＬ画分で集める。これらの画分について、血球凝集アッセイ及びＰｉｃｏ−ｇｒｅｅｎアッセイを使用してインフルエンザ含量及びＤＮＡ含量をアッセイする。例４で観察されたように、インフルエンザウイルスは、ＰＡＡ−セファロースビーズに結合することなく又は無視できる程度にしか結合することなくカラムを通過する。一方、かなりの量の宿主細胞ＤＮＡがビーズに結合してフロースルー中のＤＮＡ含量が低下し、それによってフロースルーモードで宿主細胞ＤＮＡからウイルスを精製することが可能になる。同様に、ＥＤＴＡやクエン酸塩などの他のイオン調節剤を使用してＤＮＡからタンパク質及びウイルスを精製することができるであろう。さらに、ＰＡＡ変性ビーズを使用してこの分離を達成するために、イオン調節剤を使用して緩衝液を作ることや、イオン調節剤を他の緩衝液の添加剤として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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