(57)【要約】【課題】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（Ｈ−２）で示されるポリペプチドと同じくらい、ヒト歯根膜細胞の細胞分化活性を示すことができる新規なポリペプチドを提供する。また、このような新規なポリペプチドや該ポリペプチドからなるタンパク質を有効成分とすることで、歯根膜などの歯周組織を効果的に回復することのできる歯周組織再生剤をも提供する。【解決手段】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（Ｈ−２’）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド。このポリペプチドは、ヒトのシースリンのＮ末端側からプロテアーゼにより分解生成したヒトエナメルシースプロテインのＣ末端側ペプチドから合成されることが好ましい。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
【請求項２】
ヒトのシースリンのＮ末端側からプロテアーゼにより分解生成したヒトエナメルシースプロテインのＣ末端側ペプチドから合成されることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドからなるタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリペプチド、あるいは、請求項３に記載のタンパク質を有効成分とする歯周組織再生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト歯根膜細胞の細胞分化活性、すなわち歯根膜再生能などを有するエナメルシースプロテインを導くポリペプチドに関する。
また、本発明は、このようなポリペプチドや該ポリペプチドからなるタンパク質を有効成分とすることで、歯根膜などの歯周組織を効果的に回復することのできる歯周組織再生剤に関する。
【０００２】
本明細書では、アミノ酸配列または塩基配列をＳＥＱ ＩＤ ナンバーで表す。
また、本明細書において、「タンパク質」という用語は、タンパク性セグメントを意味し、それは約１５０個以上の連続したアミノ酸からなり、遺伝子によりコードされたアミノ酸が７０％以上含まれるものを言う。また、「ポリペプチド」という用語は、約３〜１５０個までの連続したアミノ酸からなるタンパク性セグメントを意味する。
【背景技術】
【０００３】
歯と歯周組織の模式図（図１）に示すように、歯周組織の再生では、歯の根の発育をなぞるように、最初にコラーゲン繊維束が埋め込まれたセメント質の再生（Cementum Regeneration、以下「ＣＲ」と記すことがある）が起こり、次に歯根膜再生と歯槽骨再生が起こるといわれている。
エナメル質の形成に関わる作用のあるエナメルタンパク質が、歯周組織の誘導・再生にも関わっていることが明らかになって以来、該エナメルタンパク質の調製物（商業的には、ブタのエナメル質基質由来物（Enamel Matrix Derivatives）を主成分とし、登録商標「EMDOGAINTM」として市販されている）が、歯周病治療における歯根膜再生に臨床的に使われてきている。
【０００４】
しかし、このようなエナメルタンパク質の調製物は多成分系（25kDaアメロゲニン、89kDaエナメリン、65kDaシースリンの３種のタンパク質で主に構成されている）であるゆえ、それらの生理活性のメカニズムやそれらに関わる分子などが完全には解明されておらず、実際の治療時に歯根膜再生が必ずしも期待されるレベルの結果に達しないケースが少なくなかった。加えて、現在、ブタの幼若エナメル質基質からの抽出物が使われているので、薬剤の調製前に加熱されてはいるが、Ｅ型ウイルスあるいは未同定ウイルスの感染の危険性もある。
その後の研究にて、上記３種のタンパク質のうち、（アメロゲニンやエナメリンではなく）シースリンのみが、頬側裂開型骨欠損のイヌを使った動物実験にて、セメント質と歯根膜の再生能を示し、またヒト歯根膜細胞を使った培養系実験にて、ヒト歯根膜細胞の分化活性を促進したことからが明らかとなり、歯周組織の再生に作用しないタンパク質をマルチに含んでいるブタ由来のエナメルタンパク質をそのまま歯周病治療に使用するには、多大な改良の余地が生じてきている。
【０００５】
上記シースリンは、エナメル芽細胞から分泌されると直ちに、Ｎ末端から由来する17kDaのエナメルシースプロテイン（Enamel Sheath Protein、以下「ＥＳＰ」と記すことがある）、分子の中央から由来する25kDaの酸性タンパク質、Ｃ末端から由来する19kDaのカルシウム結合性タンパク質の３つのセグメントに分解される。
これまでに、それら３つのセグメントのうち、17kDaのＥＳＰが、歯の発育中、エナメル小柱鞘（シース）の構築に関与していて、ヒトやブタのシースリンのＮ末端側からプロテアーゼによる一回の切断によって生成する産物であることが明らかになっている。すなわち、前記65kDaのシースリンは、17kDaＥＳＰの親タンパクであり、17kDaＥＳＰと比較すると歯周組織再生に直接関わる箇所以外の部分を含んでいる可能性があり、その全てのアミノ酸配列（ブタの場合は４２１個、ヒトの場合は４４７個）が必ずしも歯周組織の再生に必要ではない。
【０００６】
本発明者らは、先に、ブタのシースリンを構成する４２１個のアミノ酸配列のうち「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示される１７０個のアミノ酸配列」と、ヒトのシースリンを構成する４４７個のアミノ酸配列のうち「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示される１９６個のアミノ酸配列」が、より歯周組織再生作用の強い部位を包含していることを見出し（特許文献１参照）、
続いて、これら２つの１７０個以上で構成されるアミノ酸配列を元にして、３〜６６個程度の短いポリペプチドを合成することで、それらアミノ酸配列のうち、実際にどの部位が、ヒト歯根膜（Human PerioDontal Ligament、以下「ＨＰＤＬ」と記すことがある）細胞の細胞分化活性を最も促進するのかを検討してきた（特許文献２参照）。
【０００７】
上記特許文献２には、本発明者らが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３４で示される様々な短いポリペプチドについて検討をした結果、ヒト由来のものでは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが、特に、ＨＰＤＬ細胞のアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase、以下「ＡＬＰ」と記すことがある）活性を増強させることが記載されている（なお、ＡＬＰ活性は、細胞培養システムにおいて、骨芽細胞系細胞の細胞分化の標準マーカーとされている。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１４３１６５号公報
【特許文献２】特表２００８−５３４６７４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Dent Res 2003; 82: 982-986
【非特許文献２】J Dent Res 2002; 81: 103-108
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、臨床の現場では、歯周組織再生剤の有効成分として、少量塗布するのみで、速やかに、かつ優れた歯周組織の再生作用を発揮し、かつ歯周組織の再生に直接関与するタンパク質以外の余分なタンパク質を含まないものの開発が常に望まれている。
具体的には、例えば、歯周組織再生に関与しない余分なタンパク質がもたらす副作用、ウイルス感染の危険性などが極力少ない歯周組織再生剤の開発が強く要望されている。
【００１１】
本発明は、このような要望を受け、前述のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるポリペプチドと同じくらい、ヒト歯根膜細胞の細胞分化活性を示すことができる新規なポリペプチドの提供を課題とする。また、本発明は、このような新規なポリペプチドや該ポリペプチドからなるタンパク質を有効成分とすることで、歯根膜などの歯周組織を効果的に回復することのできる歯周組織再生剤の提供をも課題とする。
なお、本発明において歯周組織とは、セメント質、歯根膜、歯肉、歯槽骨などを意味する（前述の図１参照）。したがって、本発明の歯周組織再生剤は、それらの組織を再生するという目的を有するものであるが、主にセメント質、歯根膜の再生作用に特に優れ、その他の歯周組織については二次的な再生作用を有するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、ヒトの歯のエナメル質（厚さが約２．０〜２．５ｍｍ程度）の試料を調製することは不可能に近いので、歯の主成分である象牙質の象牙芽細胞がエナメル芽細胞と同じようにエナメルタンパク質を発現していることに着目し、矯正治療で抜いたヒトの小臼歯から象牙芽細胞を試料として調製した。
次いで、該象牙芽細胞からシースリンのｍＲＮＡをクローニングすることで、データベースを元に塩基配列を決めたところ、前述のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の１５４番目のＧｌｙというアミノ酸が欠けていることを見出し、さらなる検討を重ねた結果、
その欠けている部分を含んだポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の１５４番目のＧｌｙが欠けた状態のポリペプチド）が、前述のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるポリペプチドと同じくらいの歯根膜細胞の分化活性を示すことがわかり、本発明に至った。
【００１３】
本発明は、このような知見をもとになし得たものであり、以下を要旨とする。
（１）１５４番目のＧｌｙのないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（２）ヒトのシースリンのＮ末端側からプロテアーゼにより分解生成したヒトエナメルシースプロテインのＣ末端側ペプチドから合成されることを特徴とする前記（１）に記載のポリペプチド。
（３）前記（１）または（２）に記載のポリペプチドからなるタンパク質。
（４）前記（１）または（２）に記載のポリペプチド、あるいは、前記（３）に記載のタンパク質を有効成分とする歯周組織再生剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）で示されるポリペプチドは、特許文献１，２に記載のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）で示されるポリペプチドと同等の歯根膜再生能を発現でき、しかも、これら公知のポリペプチドよりもアミノ酸が１ヶ少ないので人工的（化学的）により合成しやすいという優れた効果を有する。
本発明の歯周組織再生剤は、このようなポリペプチドまたは該ポリペプチドからなるタンパク質を有効成分とするので、少量塗布するのみで、速やかに、かつ優れた歯周組織の再生作用を発揮できるうえ、歯周組織再生に関与しない余分なタンパク質がもたらす副作用、ブタ由来のタンパク抽出物がもたらすウイルス感染の危険性などの虞がないものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】歯と歯周組織の名称を説明する模式図である。
【図２】ブタとヒトのエナメルシースプロテイン（ＥＳＰ）のアミノ酸配列である。
【図３】１α-２５ジヒドロキシ-ビタミンＤ３（ＶＤ）添加の有無によるＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ誘導活性の違いを示したグラフである。（Ａ）は、ＴＧＦ-β１の、ＶＤ添加の有無によるＨＰＤＬ細胞におけるＡＬＰ活性の違いを示し、（Ｂ）は、合成ＥＳＰペプチドであるH-1、H-2、H-3、H-4、H-5のＶＤを添加した時のＨＰＤＬ細胞におけるＡＬＰ活性、（Ｃ）は、それら合成ＥＳＰペプチドのＶＤを添加しない時のＨＰＤＬ細胞におけるＡＬＰ活性を示す。
【図４】ＴＧＦ-β１、ＢＭＰ-２、合成ＥＳＰペプチドによるＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ誘導活性を示したグラフである。
【図５】ＴＧＦ-β１、合成ＥＳＰペプチドH-2のＡＬＰ誘導活性におけるＴＧＦ-β１受容体阻害剤（ＳＢ）を加えた際の影響を示すグラフである。（Ａ）がＴＧＦ-β１のＡＬＰ誘導活性、（Ｂ）がH-2のＡＬＰ誘導活性を示す。
【図６】H-2ペプチドとＴＧＦ-β１の石灰化活性を調べた結果であり、（Ａ）が、アリザリンレッドＳで染色した写真、（Ｂ）が、測定したカルシウム量(ng/cm2)を示す。
【図７】（Ａ）が骨シアロタンパク遺伝子の発現、(Ｂ）がオステオカルシン遺伝子の発現、（Ｃ）がオステオポンチン遺伝子の発現、についてそれぞれライトサイクラーを使った半定量的ＰＣＲの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列を含有する。
図２に、ブタとヒトのエナメルシースプロテイン（ＥＳＰ）のアミノ酸配列を示す（影をつけてある部分は、オルタネイティブ（選択的）スプライシングの結果、得られる部位を表している）。図２中「ｐ」は、ブタＥＳＰ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、「ｈ」は、データベースによって得られたヒトＥＳＰ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、「ｈ'」は、象牙芽細胞の試料から得られたｃＤＮＡ配列から決定されたヒトＥＳＰ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５は、図２に示す「ｈ'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）」の中の１４４〜１５６段目に相当する１３個のアミノ酸配列（SDKPPKPELPVDF）を指す。
【００１７】
図２からも明らかなように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６は、１９５個のアミノ酸からなるので、特許文献１，２に記載の１９６個のアミノ酸からなるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１よりアミノ酸が１個少ない。そして、１３個のアミノ酸からなるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の中の１４４〜１５７段目に相当する１４個のアミノ酸からなるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１よりアミノ酸が１個少ない。
すなわち、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）で示されるポリペプチドは、特許文献１，２に記載のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）で示されるポリペプチドよりも、それぞれアミノ酸が１ヶずつ少ないので、人工的（化学的）により合成しやすいという優れた効果を有する。
【００１８】
なお、図２（図中、「ｈ」の１６５〜１９０段目、「ｈ’」の１６４〜１８９段目）に示すように、ヒトＥＳＰのアミノ酸配列は、Ｃ末端側の近く（後ろ）に、エクソン８と９に相当する２６残基分、余分にペプチドをもっている。これら余分なペプチドに相当するエクソンは、ブタを含めて他の哺乳動物には見られないが、ヒトのＤＮＡ上ではエクソン７の２つの重複から由来している。また、ＡＭＢＮ（アメロブラスチン）エクソン７にＧｌｙ154に相当するＧＡＧコドンを持っている人達がいる。すなわち、ヒトＥＳＰを発現するポリペプチドとしては、１５４番目のＧｌｙが欠損した配列のもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）と、そのＧｌｙを含む配列のもの(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１)との変異がある。
【００１９】
本発明では、上記ポリペプチドを、定法に基づき化学的に合成する（例えば、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを有するプラスミドを用いてリコンビナントタンパク質として調製する、など）こともできるし、ヒトのシースリンのＮ末端側からプロテアーゼにより分解生成したヒトエナメルシースプロテインのＣ末端側ペプチドから合成してもよい。
【００２０】
また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるタンパク質も提供する。
タンパク質は、基本的に一つのアミノ酸配列からなりたっているが、そのような一つのアミノ酸配列は、幾つかの追加アミノ酸残基、たとえば、１〜約１００個程度の追加残基を伴って存在することもある。
この追加のアミノ酸残基(連続してエンコードしている配列)とは、自然にポリペプチドと関連しているもの、あるいはヘテロなアミノ酸残基/ペプチド配列のようなものである。そのようなタンパク質は、幾つかの追加アミノ酸残基を持ち得るし、あるいは数百またはそれ以上の追加アミノ酸残基を含み得る。
【００２１】
本発明の歯周組織再生剤は、以上のようなポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドからなるタンパク質を有効成分とする。
このとき、ポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドからなるタンパク質（以下、便宜的に「本発明によるエナメルシースプロテイン」と呼ぶことがある）は、前述したアメロゲニンやエナメリンなどを会合していてもよく、これらを会合した複合体の方が優れた歯周組織再生作用を発揮することもある。
【００２２】
本発明によるエナメルシースプロテインは、本発明の歯周組織再生剤１００ｍｇに、有効成分として、０．００１〜３ｍｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇ程度含有させることにより、歯周組織の再生作用を十分に発揮することができる。
有効成分の量が上記未満では、歯周組織の再生作用が十分に得られないことがあり、上記より多いと、効果が飽和しているにもかかわらず、コストが高くなり経済的に不利となる。
【００２３】
なお、製剤化する際、本発明によるエナメルシースプロテインについては、必要に応じて、それらの中に含まれるプロテアーゼを失活させ、個体が有するウイルスなどの感染を防ぐため、滅菌処理を行うことが好ましい。必要以上に高温、長時間の滅菌処理を行うと、有効成分となるエナメルシースプロテインが変性して失活する虞があるので、一般的には６０〜１００℃程度において、１０〜６０分程度の滅菌処理を行うとよい。
本発明によるエナメルシースプロテインは、本発明の歯周組織再生剤の有効成分であって、エナメル質形成に関わる作用を有することはもちろんであるが、優れた歯周組織再生作用を有するため、主に歯周病などの歯科系疾患を治療した後に、除去した歯周組織を再生することを目的とした治療薬として用いることができ、ブラッシングによる歯肉の退縮や、治療した際に用いた義歯による歯根露出などに対処して歯周組織を再生することを目的とする治療薬として用いることもできるほか、インプラント表面を構成するバイオマテリアルなどとしても用いることができる。
【００２４】
本発明によるエナメルシースプロテインは、そのまま用いたり、純水などに溶解して用いたりしても構わないが、口内に入れても差し障りのないものであって、高い粘度を有するＰＧＡ（プロピレングリコールアルギン酸塩）やヒアルロン酸などに溶解させて用いると、塗布したい部位に保持され定着しやすくなる。また、上記のような用途に用いやすくするために、有効成分であるエナメルシースプロテインのほかに、抗炎症剤、増量剤、香料、細胞成長増殖因子（ＴＧＦ）や骨形成因子（ＢＭＰ）などの増殖因子などを添加して歯周組織再生剤としてもよい。
また、本発明の歯周組織再生剤を用いる治療と、ＧＴＲ法などの治療とを組み合わせることにより、さらに効果的に歯周組織再生作用を得ることも期待できる。
【実施例】
【００２５】
〔材料と方法〕
ヒトエナメルシースプロテイン（ＥＳＰ）のＣ末端側アミノ酸配列を元に合成したペプチドで、それらのＨＰＤＬ細胞の培養時のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の増進と石灰化能を調べた。
【００２６】
〔ヒトＥＳＰ配列の決定〕
セメント質の再生（ＣＲ）活性を示すリコンビナントエナメルシースプロテインあるいは生理活性ペプチドはヒト象牙芽細胞から調製したヒトシースリン(アメロブラスチン)ｃＤＮＡを元にして作成することが出来る（非特許文献１参照）。
ヒト象牙芽細胞は、非特許文献２に記載の方法で、矯正治療のために抜去された健康な小臼歯から得られた。新鮮抜去歯は長軸方向に"骨のみ"で割り、ピンセットで歯髄を除去後、象牙前質の表面に残存している象牙芽細胞をはがした。象牙芽細胞には、アメロゲニン、エナメリン、シースリン、エナメリシン（MMP-20）、（プロテアーゼである）KLK4などが発現しているので、総ＲＮＡをStratagene Total RNA Miniprep Kitとそのプロトコル(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を使って調製した。
【００２７】
ｃＤＮＡは、Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads(Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)を使って合成された。ヒトエナメルシースプロテインのＰＣＲプライマーはGenBank databaseにある塩基配列を元にデザインした。２つのプライマーペアは5'-TGAAGGACCTGATACTGATCC (ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７)と 5'-TGATTTGCTCCAAAAGGCACG (ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８)で、増幅産物は７１８ｂｐであった。
【００２８】
〔合成ペプチド〕
ヒトとブタのＥＳＰのＣ末端側ペプチドの配列を元に幾つかのポリペプチドを合成した。それらの配列を表１に示す。
表１中、P-1ペプチドは、以前の研究でブタの合成ＥＳＰペプチドの中で最もＡＬＰ誘導活性が高かったので、コントロールとして用いた。
【００２９】
【表１】
2011225519.tif 000003
【００３０】
〔ＨＰＤＬ細胞とＳＴ２細胞の細胞培養〕
正常な人の歯根膜細胞を、
・１０％の子牛血清(FBS, Asahi Technoglass, Chiba, Japan)、
・１α-２５ジヒドロキシ-ビタミンＤ3(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)のあるなしのどちらか、
・１％の抗菌剤(１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧと１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン; Gibco BRL, Grand Island, N.Y., USA)、
を含むα-minimal essential medium (α-ＭＥＭ)中、５％炭酸ガスを含み湿潤にした条件下、３７℃で培養した。
マウス骨髄細胞由来の骨芽細胞様細胞であるＳＴ２細胞(Riken Cell Bank, Tsukuba, Japan)についても、上記歯根膜細胞と同様の条件で培養した。
【００３１】
〔アルカリホスファターゼ活性の分析〕
上記の条件で培養したＨＰＤＬ細胞とＳＴ２細胞とを用いた細胞培養システムにて、表１に示すブタの合成ペプチド１個とヒトの合成ペプチド１１個のＡＬＰ誘導活性を、下記するように分析した。
ポジティブコントロールとしては、リコンビナント成長因子である「骨誘導因子-２（以下、「ＢＭＰ-２」と表記する：TECHNE Co., ＭＮ, USA)１μｇ／ｍＬ」と「トランスフォーミング成長因子-β１(以下、「ＴＧＦ-β１」と表記する：R&D Systems, Inc., ＭＮ, USA)０．５あるいは１ｎｇ／ｍＬ」とを使用した。
【００３２】
ＨＰＤＬ細胞については、まず、９６穴プレートを使い、１つのウェル（well）に約５×１０５個ずつ播種し、２４時間インキュベーションした。その後、培地を、１０ｎＭの１α-２５ジヒドロキシ-ビタミンＤ３（以下、「ＶＤ」と略すことがある）を含み、純水に溶かした合成ぺプチドかポジティブコントロール（成長因子）のどちらかを含むα-ＭＥＭ培地に交換した。
９６時間のインキュベーション後、細胞を、リン酸バッファーである生理食塩水にて１回洗い、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含み、基質として１０ｍＭ p-ニトロフェニルリン酸を含む１００ｍＭ 2-amino-2methel-1,3-propanediol-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１０．０）中で、１０分間、３７℃でインキュベーションして、そのＡＬＰ活性を測定した。このとき、０．２Ｍ ＮａＯＨを加えて反応をストップさせてから、４０５ｎｍの吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。なお、合成ペプチドをこれらＨＰＤＬ細胞培養システムに添加するときの濃度は２５あるいは５０μｇ／ｍＬとし、また、ＴＧＦ-β１受容体阻害剤（SB431542, 10μＭ）も、合成ペプチドのＡＬＰ誘導活性に対する影響を調べるために、これらＨＰＤＬ細胞培養システムに添加された。
【００３３】
図３に、１α-２５ジヒドロキシ-ビタミンＤ３（ＶＤ）のあるなしでヒト歯根膜(ＨＰＤＬ）細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）誘導活性の違いを示す。
図３（Ａ）は、トランスフォーミング成長因子-β１(ＴＧＦ-β１)の、ＶＤのあるなしでＨＰＤＬ細胞におけるＡＬＰ活性を示す。図３（Ａ）に示すように、ＴＧＦ-β１は、ＶＤを添加した時、用量依存的にＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性を上昇させた。
図３（Ｂ）は、合成ＥＳＰペプチドであるH-1、H-2、H-3、H-4、H-5(表１に示すとおり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＮＯ：１、ＮＯ：２、ＮＯ：４、ＮＯ：５)の、ＶＤを加えた時のＨＰＤＬ細胞におけるＡＬＰ活性を示す。
図３（Ｃ）は、合成ＥＳＰペプチド（H-1からH-5）の、ＶＤを加えない時のＨＰＤＬ細胞におけるＡＬＰ活性を示す。
【００３４】
図３に示すように、ＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性のレベルは、合成ＥＳＰペプチド、ＴＧＦ-β１を加えた細胞培養システムのいずれにおいても、ＶＤを加えると増強することがわかった。
【００３５】
図４に、合成ＥＳＰペプチドと、ポジティブコントロールであるＴＧＦ-β１、ＢＭＰ-２によるＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ誘導活性を示す。
図４に示すように、合成ペプチドのH-2（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１)とH-2'(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）は他の合成ペプチドに比べて最も高い活性であった。図４のデータは、５つの培養結果の平均（means±SEM）を表している。＊は、H-2に対しての有意差(p<0.01)を表す。全て、10ｎＭ ＶＤを加えた培養システムであり、合成ペプチドは５０μｇ／ｍＬの濃度で、ＴＧＦ-β１は１ｎｇ／ｍＬの濃度で調べた。
また、ＶＤを添加した細胞培養システムであったにも拘らず、ＢＭＰ-２のＡＬＰ活性のレベルでは増強が見られなかった。
【００３６】
図３，４から、複数の合成ペプチドが、ＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性を誘導したことがわかったが、ＴＧＦ-β１よりは高い濃度が必要だったし、ＡＬＰ活性はＴＧＦ-β１のそれよりどれも高くならなかった。
また、図４に示すように、H-2ペプチドは、ヒトの合成ペプチドとP-1ペプチドの中では最も高いＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ誘導活性を持っていた。H-2ペプチドより小さいサイズのペプチドは、H-2'ペプチドを除いてどれも活性が低かった。
【００３７】
図５に、ＴＧＦ-β１及び合成ペプチドH-2（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１)のＡＬＰ誘導活性におけるＴＧＦ-β１受容体阻害剤（SB431542（以下、「ＳＢ」と略すことがある）を加えた際の影響を示す。ＨＰＤＬ細胞は１０ｎＭ ＶＤを加えて培養した。ＳＢは１０μＭの濃度にて加え、ＴＧＦ-β１は０〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で調べた。
図５（Ａ）に示すように、ＴＧＦ-β１の阻害剤であるSB431542によって、ＴＧＦ-β１のＡＬＰ誘導活性は顕著に阻害されたが、図５（Ｂ）に示すように、合成ペプチドH-2に反応して上昇したＨＰＤＬ細胞のＡＬＰ誘導活性はＳＢを添加しても阻害されず、その影響を受けなかった。これは、合成ペプチドの細胞分化活性が、ＴＧＦ-β１受容体とは別の受容体を経て誘導されることを示唆している。
【００３８】
なお、結果を図示してはいないが、ＳＴ２細胞のＡＬＰ活性は、ＢＭＰ-２で増強され、ＴＧＦ-β１では増強されず、どの合成ペプチドでも増強されなかった。
【００３９】
〔ＴＧＦ-β１と合成ペプチドH-2の石灰化活性〕
リコンビナントＴＧＦ-β１と合成ペプチドH-2（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）について、ＨＰＤＬ細胞の石灰化活性を、下記するように分析した。合成ペプチドH-2はＡＬＰ誘導活性が、どの合成ペプチドよりも高かったので、該ペプチドの石灰化活性を調べることにした。
HPDL細胞を、６穴プレートにそれぞれ１×１０５個ずつ播き、２４時間培養した。その後、その培地を、５０μＭアスコルビン酸、１０ｍＭ β-グリセロリン酸、１０ｎＭ １α-２５ジヒドロキシ-ビタミンＤ３(分化培地)、試料（ＴＧＦ-β１：１ｎｇ／ｍＬ、H-2：２５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ含む成長培地に交換した。
培地を７２時間ごとに交換しながら、細胞を２８日間培養し、培地を捨て、アリザリンレッドＳ染色とカルシウム量とで、石灰化活性を調べた。
【００４０】
〔分析方法〕
アリザリンレッドＳ染色のために、２８日間培養した細胞を１００％メタノールで固定し、１０分間アリザリンレッドＳで染色した。アリザリンレッドＳの染色液は１％のアリザリンレッドＳ（sodium alizarin sulfonate：Sigma）を純水に溶かし、０．１Ｎアンモニア水でpH６．４に調製したものである。
カルシウム量を測るためには、細胞部分を０．５Ｎ塩酸に溶解させた。その溶液についてCalcium C-test kit(Wako Pure Chemical Industries Ltd, Osaka、Japan)で反応させ、５７０ｎｍの吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。ヒトエナメルシースプロテインに相当するｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列はALF DNA zSequencer(Pharmacia, LKB ALF, Sweden)で決定した。
【００４１】
図６に、H-2ペプチドとＴＧＦ-β１の石灰化活性の結果を示す。図６中の「Cont」は、試料（ＴＧＦ-β１やH-2）が一切添加されていないコントロールを示す。
図６（Ａ）が、アリザリンレッドＳで染色した写真であり、図６（Ｂ）が、測定したカルシウム量(ng/cm２)である。
【００４２】
図６（Ａ），（Ｂ）に示すように、H-2ペプチドは、コントロール（これも石灰化する）よりも石灰化を誘導することがわかったが、その誘導レベルは、ポジティブコントロールであるＴＧＦ-β１のそれよりは低かった。
【００４３】
〔ライトサイクラーを使った半定量的ＰＣＲ〕
ＨＰＤＬ細胞の分化の状態と関係する石灰化組織マーカーであるオステオポンチン、オステオカルシン、骨シアロタンパクの発現について、石灰化を誘導する培地の中でのＨＰＤＬ細胞の４日間、１４日間、２８日間の培養から得られる全ｍＲＮＡを用いて、調べた。
【００４４】
培養したＨＰＤＬ細胞からRNAzolTM B（Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を使って全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは４〜２１日間培養したＨＰＤＬ細胞の３μｇの全ＲＮＡからoligo-dTプライマーと You-primed First-Strand Beads Kit(Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)を使ってプロトコル通りに合成した。ＰＣＲプライマーはヒトのｍＲＮＡ配列を元に合成した。プライマーペアは以下のとおりである；
オステオポンチン：5’-TGACCTCTGTGAAAACAGCGT-3’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５) と5’-TGTACATTGTGAAGCTG TGAA-3’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６) (３０１ｂｐ)、
オステオカルシン：5’-TTGTGTCCAAGCAGGAGGGCA-3’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７) と5’-ACATCCATAGGGCTGG GAGGT-3’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８) (３０４ｂｐ)、
骨シアロタンパク：5’-GCAGAAGTGGATGAAAACGA-3’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９) と5’-TGGTGGTAGTATTCTGACCA-3’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０) (４４８ｂｐ)。
プライマーセットはglyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ｍＲＮＡをコントロールとして増幅した。
ｃＤＮＡは、DNA master SYBR Green I kitとライトサイクラー(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)を使って定法どおりに調製された。各々のｍＲＮＡの相対量はＰＣＲ産物の半分量を使って調べられ、またこれらはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対比較によって修正された。
【００４５】
図７に、ライトサイクラーを使った半定量的ＰＣＲの測定結果を示す。
図７（Ａ）がＨＰＤＬ細胞の骨シアロタンパク遺伝子、図７(Ｂ）がオステオカルシン遺伝子、図７（Ｃ）がオステオポンチン遺伝子、の発現について、それぞれ「４Ｃ」の値に比較して示している。
「４Ｃ」は、４日間培養したコントロール、
「４Ｔ」は、ＴＧＦ-β１で４日間培養、
「４Ｈ」は、H-2で４日間培養、
「１４Ｃ」は、１４日間培養したコントロール、
「１４Ｔ」は、ＴＧＦ-β１で１４日間培養、
「１４Ｈ」は、H-2で１４日間培養、
「２８Ｃ」は、２８日間培養したコントロール、
「２８Ｔ」は、ＴＧＦ-β１で２８日間培養、
「２８Ｈ」は、H-2で２８日間培養、をそれぞれ表している。
ＴＧＦ-β１は１ｎｇ／ｍＬの濃度で、H-2ペプチドは25μｇ／ｍＬの濃度で調べた。
【００４６】
図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、コントロールにおいても、ＴＧＦ-β１あるいはH-2を添加したケースにおいても、骨シアロタンパク遺伝子、オステオカルシン遺伝子、オステオポンチン遺伝子の全てが発現し、培養している間（発現量が）上昇した。
H-2ペプチドを添加した時のそれらの発現は、ＴＧＦ-β１のそれに非常に近いものがあり、コントロール値に比べて、それら骨シアロタンパク遺伝子、オステオカルシン遺伝子、オステオポンチン遺伝子の発現を促進することを示した。
【００４７】
〔統計分析〕
本実施例における全ての値は平均（the means±SEM）を取った。統計処理はStudent's unpaired t-testを使って決定し、p<0.05を持って有意差ありとした。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のポリペプチド、あるいは、タンパク質を有効成分とする歯周組織再生剤は、優れた歯周組織再生作用を有する。
したがって、主に歯周病などの歯科系疾患を治療した後に、除去した歯周組織を再生することを目的とした治療薬、ブラッシングによる歯肉の退縮や、治療した際に用いた義歯による歯根露出などに対処して歯周組織を再生することを目的とする治療薬、インプラント表面を構成するバイオマテリアルなどとしても用いることができる。
また、本発明の歯周組織再生剤を用いる治療と、ＧＴＲ法などの治療とを組み合わせることにより、さらに効果的に歯周組織再生作用を得ることも期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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