(57)【要約】【課題】ＢＥＡ構造のゼオライトによるリフォールディング法を適用する場合に用いるタンパク質リフォールディング条件設定キットを提供する。【解決手段】ＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤と、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分と、リフォールディング制御因子としてのタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、塩類、タンパク質変性剤、又は金属イオンの１種以上を含む組み合わせと、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管もしくは試験プレートと、を構成要素として含み、同時並行的に、複数の条件による試験を行うことを可能とするタンパク質リフォールディング条件設定キット。【効果】上記リフォールディング条件設定キットを用いることは、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔのタンパク質リフォールディング  スクリーニング手法及びシステムを提供することができる。【選択図】図１
2011046686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の高次構造を整えて活性型にするタンパク質のリフォールディング操作・工程を実施する際に、好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に導き出すことができるタンパク質リフォールディング条件設定キットであって、
タンパク質変性剤により変性状態となって可溶化しているタンパク質を、変性剤中で吸着する担体として機能するＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤を必須構成成分とし、
該ＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤に、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分である、純水成分又はｐＨ調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としてのタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、塩類、タンパク質変性剤、又は金属イオンの１種以上を含む組み合わせから構成され、
更に、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、を構成要素として含み、同時並行的に、複数の条件による試験を行うキット製品であることを特徴とするタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項２】
ＢＥＡ構造ゼオライトの骨格構造が、酸素と、それ以外の１種又は２種以上の元素からなる、あるいは、ケイ素と酸素又はケイ素とアルミニウムと酸素のみからなる、請求項１に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項３】
ＢＥＡ構造ゼオライトが、ＮＨ４＋もしくはＮａ＋フォームにしたゼオライトである、請求項１又は２に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項４】
ＢＥＡ構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状に造粒されている、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項５】
ＢＥＡ構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状で、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化されている、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項６】
ＢＥＡ構造ゼオライトを造粒するための糊料、あるいは、一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化するための糊料が、タンパク質に悪影響を与えない材料である、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項７】
タンパク質変性剤が、塩酸グアニジン、又は尿素である、請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項８】
ｐＨ調整剤が、トリスアミノメタン三塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、又はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−ジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項９】
タンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤が、シスチン、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、又はチオフェノールである、請求項１から８のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項１０】
リフォールディング制御因子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０Ｋ、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ２００）、Ｆｉｃｏｌ１７０、Ｆｉｃｏｌ１４００、アルギニン、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−５００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、ＮＰ−４０、ＳＢ３−１４、ＳＢ１２、ＣＴＡＢ、又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のうちの１種以上により構成される、請求項１から９のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項１１】
分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートが、９６穴マイクロプレート、又はそれ以上の穴数を有するマイクロプレートであり、各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成の溶液が注入されていることにより、同時並行的に複数の条件による試験を行うことができる、請求項１から１０のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項１２】
上記キットが、一連の操作を、自動ないし半自動で行う自動タンパク質リフォールディング条件設定装置である、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【請求項１３】
溶液成分の基本構成成分、ゼオライトが分注もしくは固定されたマイクロプレート、及び操作法を記載した取り扱い説明書を一組のパッケージとして組み合わせた、請求項１から１２のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活操作・工程に使用される試薬・物質・材料等の使用条件を簡便かつ迅速に設定するための、ゼオライトを用いたタンパク質リフォールディング  スクリーニング  メソド（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅ）によるタンパク質リフォールディング  スクリーニング  システム、すなわち、「タンパク質リフォールディング条件設定キット」に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質をリフォールディングさせ、該タンパク質固有の本来機能を賦活・再生させる操作・工程において用いられる試薬・物質・材料等の使用条件について、最適ないし好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に設定することを可能にするタンパク質リフォールディング  スクリーニング  システムとしての「タンパク質リフォールディング条件設定キット」に関するものである。尚、本明細書では、ゼオライトを用いたハイスループットのタンパク質リフォールディング  スクリーニング  メソド及びシステムを、タンパク質リフォールディング条件設定キットと表記することとする。
【０００２】
本発明は、例えば、生化学品、医薬品製造の技術分野において、大腸菌等の遺伝子発現系を利用して生産した高次構造未形成タンパク質を、リフォールディングさせ、該タンパク質の本来の機能・活性を賦活させるための最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定することが可能な新しい高効率のタンパク質リフォールディング  スクリーニング  システムであるタンパク質リフォールディング条件設定キット、及びそれにより設定された条件を利用した新しい機能賦活方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００４】
タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。
【０００５】
これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。
【０００６】
ところが、ヒト等の高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序がなく、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわちアミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。
【０００７】
この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、当然のことながら、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。
【０００８】
この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングについては、盛んに研究され、種々の方法が提案されている。
【０００９】
しかし、それらのほとんどは、バッチによる方法であり、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質、特に、分子量の低い特定タンパク質に対して、偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【００１０】
このような状況下で、本発明者らは、ゼオライト等の無機酸化物によるバイオポリマーの選択吸着現象を研究し（非特許文献１参照）、この過程で、ゼオライトベータへの吸脱着で不活性タンパク質が活性化することを見出し、ゼオライトベータを用いた不活性タンパク質の機能賦活方法（特許文献１−４、及び非特許文献２参照）を開発するに至った。
【００１１】
しかしながら、特許文献１−４、及び非特許文献２に記載の方法は、変性剤により変性状態となって可溶化しているタンパク質を、変性剤中で、ＢＥＡ構造のゼオライトに吸着させた後、変性剤を除去し、洗浄を行った後、ＢＥＡ構造のゼオライトに変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる、リフォールディングバッファーと呼ばれる溶液成分に、多様性が存在し、個別のタンパク質毎に、最適ないし好適条件、すなわち溶液成分の最適ないし好適値が異なるという問題点を有していた。
【００１２】
また、リフォールディングバッファーにおける有効成分には、純水成分の他、ｐＨ調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としての、タンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、多価アルコール、糖アルコール、キレート剤、アルギニン、ＮａＣｌ等の、塩類、タンパク質変性剤、金属イオン等があることが分かっている。しかし、これらの各成分の濃度の違いを含めた、最適ないし好適条件の検討には、極めて多くの手間や時間がかかり、その結果、実際上、検討可能な範囲が大きく限定されるという問題があった。
【００１３】
更には、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤についても、そのケイ素とアルミニウムの比を変化させたり、ＮＨ４＋もしくはＮａ＋フォームにしたゼオライトであるか否かにより、リフォールディングの効率が変化することが明らかとなっており、その最適ないし好適条件の検討にも、極めて手間や時間がかかり、その結果、実際上、検討可能な範囲が大幅に限定されるという問題があった。
【００１４】
このように、ＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法は、有効な手法であり、多種多様なタンパク質のリフォールディング法として適用できる反面、その最適ないし好適条件の検討には、極めて多くの手間や時間がかかることが大きな問題となっていた。
【００１５】
そこで、当技術分野においては、鎖長の長短を問わず、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性の高い、しかも低コストで、高効率、かつスケールアップ容易で、高性能なＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法における最適ないし好適条件を、簡便かつ迅速に設定することができるタンパク質リフォールディング  スクリーニング  システム、すなわちタンパク質リフォールディング条件設定方法ないしキットを開発することが急務の課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００５−２９５３１号公報
【特許文献２】特開２００５−１９２４５２号公報
【特許文献３】特開２００５−２２０１２１号公報
【特許文献４】特開２００５−２８１２６７号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．７（２００１）１５５５−１５６０
【非特許文献２】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３４８（２００６）３０７−３１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の高次構造を整えて、活性なタンパク質とする、ＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法において、そのリフォールディング法の最適ないし好適条件、特に、リフォールディングバッファーの最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定できる、タンパク質リフォールディング  スクリーニング  システムとしてのタンパク質リフォールディング条件設定キットを構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明は、ＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法の最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定することができるタンパク質リフォールディング条件設定キットを提供することを目的とするものである。また、本発明は、鎖長の長短を問わず、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性の高い、しかも低コストで、高効率、かつスケールアップ容易で、高性能なＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法に適用できる、ハイスループットのタンパク質リフォールディング  スクリーニング  システムとしてのタンパク質リフォールディング条件設定技術に関する新技術を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の高次構造を整えて活性型にするタンパク質のリフォールディング操作・工程を実施する際に、好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に導き出すことができるタンパク質リフォールディング条件設定キットであって、
タンパク質変性剤により変性状態となって可溶化しているタンパク質を、変性剤中で吸着する担体として機能するＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤を必須構成成分とし、
該ＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤に、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分である、純水成分又はｐＨ調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としてのタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、塩類、タンパク質変性剤、又は金属イオンの１種以上を含む組み合わせから構成され、
更に、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、を構成要素として含み、同時並行的に、複数の条件による試験を行うキット製品であることを特徴とするタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（２）ＢＥＡ構造ゼオライトの骨格構造が、酸素と、それ以外の１種又は２種以上の元素からなる、あるいは、ケイ素と酸素又はケイ素とアルミニウムと酸素のみからなる、前記（１）に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（３）ＢＥＡ構造ゼオライトが、ＮＨ４＋もしくはＮａ＋フォームにしたゼオライトである、前記（１）又は（２）に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（４）ＢＥＡ構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状に造粒されている、前記（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット
（５）ＢＥＡ構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状で、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化されている、前記（１）から（４）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（６）ＢＥＡ構造ゼオライトを造粒するための糊料、あるいは、一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化するための糊料が、タンパク質に悪影響を与えない材料である、前記（１）から（５）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（７）タンパク質変性剤が、塩酸グアニジン、又は尿素である、前記（１）から（６）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（８）ｐＨ調整剤が、トリスアミノメタン三塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、又はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−ジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、前記（１）から（７）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（９）タンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤が、シスチン、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、又はチオフェノールである、前記（１）から（８）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（１０）リフォールディング制御因子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０Ｋ、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ２００）、Ｆｉｃｏｌ１７０、Ｆｉｃｏｌ１４００、アルギニン、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−５００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、ＮＰ−４０、ＳＢ３−１４、ＳＢ１２、ＣＴＡＢ、又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のうちの１種以上により構成される、前記（１）から（９）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（１１）分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートが、９６穴マイクロプレート、又はそれ以上の穴数を有するマイクロプレートであり、各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成の溶液が注入されていることにより、同時並行的に複数の条件による試験を行うことができる、前記（１）から（１０）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（１２）上記キットが、一連の操作を、自動ないし半自動で行う自動タンパク質リフォールディング条件設定装置である、前記（１）から（１１）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
（１３）溶液成分の基本構成成分、ゼオライトが分注もしくは固定されたマイクロプレート、及び操作法を記載した取り扱い説明書を一組のパッケージとして組み合わせた、前記（１）から（１２）のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【００２１】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者らは、先に、ＢＥＡ構造のゼオライトの吸着性能を利用した汎用性のあるタンパク質リフォールディング手法を開発した（特許文献１−４及び非特許文献２）。本手法には、該手法に関する特許文献及び非特許文献に開示されているように、処理時間が短く、かつ処理方法がタンパク質の違いに依存しないという利点がある。本手法では、アミノ酸鎖を一旦引き延ばしてゼオライトに吸着させ、その後、剥離剤を用いることで、リフォールディングを起こさせる。剥離剤に用いるバッファー組成の調整をするのみで、多様なタンパク質に対応させることが可能であり、このことは、上記特許文献及び非特許文献の開示から自明であるといえる。したがって、本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいても、タンパク質の違いに依存しないという利点があり、タンパク質の種類に制限されることなく、多様なタンパク質に対応させることが可能である。
【００２２】
本手法では、例えば、まず、大腸菌に目的タンパク質を強制発現させると、「発現」（発現ステップ）したタンパク質の大部分が、不溶性の不活性型タンパク質として蓄積される。細胞を破壊した後、遠心分離を行うことにより、不溶性のタンパク質が高純度で「回収」（回収ステップ）される。次に、回収したインクルージョンボディを、タンパク質の変性剤である塩酸グアニジン等を含むバッファーで「可溶化」（可溶化ステップ）し、可溶化したタンパク質を含むタンパク質溶液とＢＥＡ構造のゼオライトを混合し、タンパク質をＢＥＡ構造のゼオライトに「吸着」（吸着ステップ）させる。
【００２３】
ゼオライトは、固体であることから、タンパク質を吸着したゼオライトを、少量のバッファーで「洗浄」（洗浄ステップ）するだけで、簡単に塩酸グアニジン等を除去することができ、最終的に、溶出用の添加剤を含むバッファーと混合する。タンパク質が「溶出」（溶出ステップ）される際に、リフォールディングが起こり、活性のあるタンパク質を得ることができる。図３に、不活性タンパク質のゼオライトによるリフォールディング手順を示す。
【００２４】
この手法に、汎用性を付与するためには、多様なタンパク質に対する適用性の確保が重要である。そこで、本発明では、簡便かつ迅速なリフォールディング条件の設定が行えるスクリーニング手法及びシステムを構築することに成功した。具体的には、溶出用の添加剤を含むバッファーの性状が重要であり、基本成分である、ポリエチレングリコールの濃度やｐＨの設定条件等を簡便かつ迅速に設定できるスクリーニング手法及びシステムを確立した。また、ゼオライト担体をカラム化し、連続処理できるようなスクリーニング手法及びシステムを構築した。本発明は、このようなスクリーニング手法及びシステムにより、タンパク質の機能解明の研究のインフラ技術としての展開、及びタンパク質の大量生産システムの構築を可能とするものである（図４）。
【００２５】
本発明の不活性タンパク質の機能賦活の最適ないし好適条件を探索するタンパク質リフォールディング条件設定キットの対象となるタンパク質は、ＢＥＡ構造のゼオライトによるタンパク質のリフォールディング手法自体が、タンパク質の違いに依存しないという利点があることから、高次構造が整っていない不活性なタンパク質全てであり、一般には、大腸菌等の発現系で得られる立体構造が無秩序なタンパク質、いわゆるインクルージョンボディ、あるいは熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質である。
【００２６】
本発明のキットは、該タンパク質のＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤への吸着・脱離過程で、該タンパク質の立体構造をリフォールディングし、該タンパク質の本来の機能の賦活・付与を行うものである。該リフォールディング剤の能力は、通常、次のような操作で発揮され、換言すれば、次のような操作で、不活性タンパク質の機能賦活が行われる。
【００２７】
まず、該タンパク質を、変性剤を含む溶液に分散溶解し、この後、該リフォールディング剤を含む溶液との混合や、該リフォールディング剤充填カラムへの注入により、該タンパク質を該リフォールディング剤に吸着させ、次いで、該リフォールディング剤から該タンパク質を脱着させる手順で行われる。
【００２８】
該リフォールディング剤に吸着前のタンパク質の分散溶媒としては、一般には、それが大腸菌等の発現系で生産されること、タンパク質は、通常、水溶液中で使われることが多く、失活した場合でも、水溶液中にあることが多いこと、等から、好適には、水が用いられる。
【００２９】
しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該タンパク質と反応を起こさない溶媒、及び該タンパク質の立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独で、あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールや、糖類を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
該タンパク質の吸脱着は、一般には、インクルージョンボディ等の縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、及び／又はタンパク質鎖長中に不本意に生成したＳ−Ｓ結合（架橋）を切断し、もしくは適切な架橋形成をさせるために、ある種のタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤の存在下で行われる。
【００３１】
したがって、本発明のキットは、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤の他、変性剤やｐＨ調整剤を必須構成成分として含み、更には、これらの他、リフォールディング剤からのタンパク質の脱着促進と、リフォールディング後の再インクルージョンボディ化を防ぐためのリフォールディング因子及び／又は界面活性剤、Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤から構成される。
【００３２】
本発明のキット中の変性剤の典型例としては、塩酸グアニジン、尿素が例示される。ｐＨ調整剤の典型例としては、例えば、トリスアミノメタン三塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−ジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等が挙げられる。しかし、これらに制限されるものではなく、同様な作用を持つものであれば同様に使用可能である。
【００３３】
また、本発明のキット中のリフォールディング因子や界面活性剤の典型例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０Ｋ、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ２００）、Ｆｉｃｏｌ１７０、Ｆｉｃｏｌ１４００、アルギニン、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−５００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、ＮＰ−４０、ＳＢ３−１４、ＳＢ１２、ＣＴＡＢ、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではなく、同様な作用を持つものであれば同様に使用可能である。
【００３４】
不本意に生成したＳ−Ｓ架橋を切断し、本来の構造に戻すＳ−Ｓ架橋形成制御剤としては、安価で入手し易いことから、通常は、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン、システイン、あるいはチオフェノールが用いられる。しかし、これらに限定されるものではなく、同様な作用を有するものであれば同様に使用可能である。
【００３５】
タンパク質鎖長が解きほぐれやすい場合や、不本意にＳ−Ｓ架橋が生成しない場合は、当然のことながら、変性剤や界面活性剤、及び／又は防止剤を必ずしも使う必要がなく、これらは、常に必須とは限らず、状況に応じて適宜選択して、キットとして付加的に用いられる。また、キットを構成する成分の量は、それを用いるときの状況に応じて適宜決定される。
【００３６】
本発明のキットは、通常は、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤、塩酸グアニジン（変性剤）及びトリスアミノメタン三塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ調整剤）から構成される。更には、前記リフォールディング因子のタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、多価アルコール、糖アルコール、キレート剤、アルギニン、ＮａＣｌ等の塩類、タンパク質変性剤、金属イオンのうち、必要なものを付加的に追加することができる。
【００３７】
一般に、本キットによる、リフォールディング操作・工程中のタンパク質の脱着過程では、通常、該キット中の試剤、すなわちフォールディング因子や界面活性剤による置換吸着が行われる。しかし、基本的には、該タンパク質の脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができ、これらと置換吸着を併用することもできる。
【００３８】
ところで、置換吸着の際、該タンパク質の脱着を促す物質として、従来から、カラムクロマトグラフィーの溶離では、ハロゲン化アルカリ等の塩が頻繁に用いられており、これらの併用で、顕著な効果が得られる場合がある。また、リフォールディングが完了したタンパク質が、再度、凝集を起こさないようにする効果がある物質として、アルギニンが用いられており、これらの併用で、顕著な効果が得られる場合がある。
【００３９】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットを構成するＢＥＡ構造のゼオライト（通称ゼオライトベータ、Ｚｅｏｒｉｔｅ  Ｂｅｔａ）は、β−ゼオライトとも呼ばれ、典型例として、例えば、通常の市販ＢＥＡ構造ゼオライト、文献の記載（Ｚｅｏｒｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）２０２を参照）に従って、自前で合成・調製したＢＥＡ構造のゼオライト、それらを焼成して得られるＢＥＡ構造のゼオライトが挙げられる。
【００４０】
更に、該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウムがあるＢＥＡ構造のゼオライト、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ＢＥＡ構造ゼオライト、前記アンモニウム含有骨格置換ＢＥＡ構造ゼオライト等が挙げられる。ＢＥＡ構造のゼオライトの骨格構造を持つものであれば、基本的には、該機能・能力を有しており、使用可能であり、該リフォールディング用カラム充填剤及びカラムを構成するＢＥＡ構造のゼオライトとして、その製造方法や性状が特段に限定されるものではない。
【００４１】
しかしながら、本発明のリフォールディング用カラム充填剤及びカラムを構成するＢＥＡ構造のゼオライトの機能・能力は、不活性並びに変性タンパク質の該ゼオライトへの接触、すなわち吸着・脱離で発揮され、この際には、ＢＥＡ構造のゼオライト表面と対象タンパク質との間の親和性が重要となる。
【００４２】
また、該タンパク質の吸着・脱離は、その分散溶媒、分散溶媒中の変性剤や界面活性剤、並びにリフォールディング因子、更には、分散溶媒のｐＨ等で影響される場合が多く、対象とするタンパク質及びそれを含む溶液の成分状況等に応じて、本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットのリフォールディング性能は、それを構成する前述の種々のＢＥＡ構造のゼオライトによって、多少変わることがある。
【００４３】
総じて言えば、アンモニウム類もしくはＮａ＋を含むＢＥＡ構造のゼオライトより構成されるリフォールディング用カラム充填剤は、それを含まないものよりも、高いリフォールディング性能を示す。したがって、該リフォールディング用カラム充填剤及びカラムとしては、アンモニウム類もしくはＮａ＋を含むＢＥＡ構造のゼオライト及びアンモニウム類もしくはＮａ＋を含む骨格置換ＢＥＡ構造ゼオライトで構成されるものが好ましい。
【００４４】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットの、ＢＥＡ構造のゼオライトに含有されるべきアンモニウム類としては、該ゼオライトの有する空間中に留まり易いアンモニウム類、例えば、アンモニウムイオン、アルキル基が、メチル、エチル、プロピル及びブチル等の、モノ、ジ、トリ及びテトラアルキルアンモニウムイオン、更には、５員環、６員環及７員環の脂肪族アミン及び芳香族アミンのアンモニウムイオンが挙げられる。
【００４５】
具体的には、例えば、ピペリジュムイオン、アルキルピペリジュムイオン、ピリジニウムイオン、アルキルピリジウムイオン、アニリンイオン、Ｎ−アルキルアニリンイオン等を挙げることができる。基本的には、ＢＥＡ構造のゼオライトの有する細孔中に入ることが可能なアンモニウム類であれば、いずれでもよく、ここに例示したアンモニウム類に限定されるものではない。
【００４６】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットのＢＥＡ構造のゼオライトの骨格を形成する元素は、一般には、ケイ素と酸素、あるいはケイ素と酸素とアルミニウムであるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したＢＥＡ構造のゼオライト及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ＢＥＡ構造ゼオライトも、基本的には、不活性タンパク質の活性賦活機能を有する。ＢＥＡ構造のゼオライトの骨格ケイ素あるいはアルミニウムと置換可能なものの典型としては、例えば、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム、ジルコニウム、ハフニウム等を挙げることができる。
【００４７】
しかし、これらに留まるものではなく、基本的に、ＢＥＡ構造のゼオライトの構造を破壊しないものであれば、いずれでもよい。また、その置換量に関しても、ＢＥＡ構造のゼオライトの構造を破壊しない量であれば、置換量は、いかなる量でもかまわず、該置換ＢＥＡ構造ゼオライトは、不活性、あるいは変性タンパク質のリフォールディング機能を発揮するタンパク質リフォールディング条件設定キットとなり得る。
【００４８】
このように、ＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法においては、リフォールディング剤としてのＢＥＡ構造のゼオライトにも、また、変性状態でＢＥＡ構造のゼオライトに吸着したタンパク質を溶出するために用いる溶液成分にも、多種多様な条件の設定ができる。これらの最適ないし好適条件設定を、簡便かつ迅速に行うために、本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットは、しばしば大きな利便となる。
【００４９】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいては、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤に、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分に、純水成分の他、ｐＨ調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としてのタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、多価アルコール、糖アルコール、キレート剤、アルギニン、ＮａＣｌ等の、塩類、タンパク質変性剤、金属イオンのうち１種以上を含む組み合わせとする。
【００５０】
更には、その濃度を変更した条件設定の中から、最適ないし好適条件を設定するために、あらかじめ、もしくは評価の前に、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、例えば、９６穴マイクロプレート、もしくはそれ以上の穴数を有するマイクロプレート、もしくはそれに類似又は機能を同じくするものに対し、各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成の溶液を注入することにより、同時並行的に、複数の条件による試験を行うことができる。
【００５１】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいては、キット構成試剤間の反応等、特に問題や支障が起きない場合は、キット構成試剤の幾つかを、あらかじめ合わせておき、一つの試剤としておくこともできる。例を挙げれば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ハロゲン化アルカリ、すなわち、例えば、塩化ナトリウム、リフォールディング因子、すなわち、例えば、ポリエチレングリコールのＰＥＧ２０Ｋ、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ２００のうちの１種及びアルギニンからなる溶液をリフォールディングバッファーとして一纏めにし、本発明のキット構成試剤の一つにすることも可能である。
【００５２】
したがって、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、例えば、９６穴マイクロプレートに注入する、純水成分の他、ｐＨ調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としてのタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤、界面活性剤、多価アルコール、糖アルコール、キレート剤、アルギニン、ＮａＣｌ等の、塩類、タンパク質変性剤、金属イオンのうち１種以上を含む組み合わせとする。更には、その濃度を変更した各種溶液を、あらかじめ用意し、付属させておくことも可能であり、あるいは各成分毎の溶液を所定の作業により混合し、評価の前に準備することも可能である。
【００５３】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいては、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤のケイ素とアルミニウムの比を変化させたり、ＮＨ４＋もしくはＮａ＋フォームにしたゼオライトに変更したりした条件設定で、あらかじめ、もしくは評価の前に条件設定された、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートを用いることが可能である。
【００５４】
例えば、９６穴マイクロプレート、もしくはそれ以上の穴数を有するマイクロプレート、もしくはそれに類似又は機能を同じくするものに対し、各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成のＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤を注入もしくは固定化しておくことにより、同時並行的に、複数の条件による試験を行うことが可能となる。
【００５５】
ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤の、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、例えば、９６穴マイクロプレートへの分注は、比較的効率の悪い操作であることから、あらかじめ各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成のＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤を注入もしくは固定化しておくことが好ましい。
【００５６】
例えば、本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいて用いるＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤が、粒子状に成形され、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに分注されていれば、遠心分離等の操作を行わなくても、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
【００５７】
また、本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいて用いるＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング剤が、粉末状態で、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化されていれば、遠心分離等の操作を行わなくても、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
【００５８】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットの機能を利用して、キットに対する作業を、自動で行うことのできる、自動タンパク質リフォールディング条件設定装置として、利用することも可能である。
【００５９】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットは、利便性ないしは操作性を向上させるために、バッファー類等の溶液成分の基本構成材料と、ゼオライトが既に分注もしくは固定されたマイクロプレート等と、更には、操作法を記載した取り扱い説明書、マニュアル等を、一組のパッケージとした、リフォールディングキット形態で供給し、ハイスループットでリフォールディング条件の最適ないし好適化をすることが可能であり、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング法を簡便に利用することが可能となる（図５）。
【００６０】
本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットは、効率的なＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング法を適用する場合の、最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定することができるため、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング法の有するスケールアップの容易性との相乗効果により、タンパク質の種類を問わず、大量で広範な不活性タンパク質に対しても、それら本来の機能を賦活させることが可能である。
【００６１】
本発明では、例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キット、更には、ＢＥＡ構造のゼオライトからなるリフォールディング法の有するスケールアップの容易性との相乗効果により、高次構造が制御されて、該タンパク質固有の本来の機能が備わったタンパク質を生産する新規の活性タンパク質製造プロセスを提案・確立することができるので、本発明のキット並びに変性タンパク質の機能賦活方法は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとって極めて有用であり、その技術的、経済的効果は計り知れないものがある。
【００６２】
本発明では、不活性タンパク質の機能を賦活する手法として有効なＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法において、試薬・物質・材料等の使用条件を最適ないし好適条件を簡単な操作で迅速に設定することを可能とするものである。本発明は、高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化し失活したタンパク質をリフォールディングさせ、該タンパク質固有の本来機能を賦活・再生させる操作・工程において用いられる試薬・物質・材料等の使用条件を効率的に設定し、最適ないし好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に設定することを可能にするものである。本技術について、後記する表７に、タンパク質リフォールディング技術における従来方法との比較を示す。
【００６３】
従来、大腸菌等の発現系で得られるタンパク質は、一般には、立体構造が無秩序であり、該タンパク質の持つ本来の機能・物性を持たず、活性を示さないという問題があったが、本発明は、上記タンパク質に代表される不活性タンパク質の機能・活性を賦活させるＢＥＡ構造のゼオライトを用いたリフォールディング法における最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定することを可能とする、所定の機能・活性を有するタンパク質へと再生させるための革新的タンパク質製造・生産技術の効率的運用を可能とするものである。
【発明の効果】
【００６４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）広範な不活性タンパク質に対して、それらの本来の機能を賦活させる、ＢＥＡ構造ゼオライト（ゼオライトベータ・β−ゼオライト）によるリフォールディング法を適用する場合の、最適ないし好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に設定するための、ハイスループットのタンパク質リフォールディング  スクリーニング方法及びシステムとしての、リフォールディング条件設定キットを提供することができる。
（２）大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質に対して、それら本来の機能を賦活させるＢＥＡ構造ゼオライトを用いたリフォールディング法を適用する場合の最適ないし好適条件を選定することができる。
（３）インクルージョンボディのタンパク質に対して、ＢＥＡ構造ゼオライトによるリフォールディング法を適用する場合の、最適ないし好適条件を選定することができる。
（４）ＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤のケイ素とアルミニウムの比を変化させたり、ＮＨ４＋もしくはＮａ＋フォームにしたゼオライトに変更することにより、ＢＥＡ構造ゼオライトによるリフォールディング法を適用する際のリフォールディング剤の条件について、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
【００６５】
（５）ＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤に、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分に、純水成分、ｐＨ調整剤の他、リフォールディング制御因子としての含まれる成分について、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
（６）分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、例えば、９６穴マイクロプレート、もしくはそれ以上の穴数を有するマイクロプレート、もしくはそれに類似又は機能を同じくするものの条件について、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
（７）ＢＥＡ構造ゼオライトからなるリフォールディング剤を、粉末状態もしくは粒子状にして、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに分注することで、遠心分離等の操作を省略することができる。
【００６６】
（８）本発明のキットは、作業を、自動で行うことのできる、自動タンパク質リフォールディング条件設定システム及び装置として、利用することができる。
（９）溶液成分の基本構成材料と、ゼオライトが既に分注もしくは固定されたマイクロプレートと、更には、操作法を記載した取り扱い説明書等を一組のパッケージとした形態の、キットを提供することができる。
（１０）ＢＥＡ構造ゼオライトによるリフォールディング法の有するスケールアップの容易性との相乗効果により、タンパク質の種類を問わず、広範な不活性タンパク質に対して、それらの本来の機能を賦活させることができ、高次構造が制御されて、該タンパク質固有の本来の機能が備わったタンパク質を生産する新規の活性タンパク質製造プロセスを確立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】蛍光強度を測定した結果を示す。
【図２】酵素活性を測定した結果を示す。
【図３】不活性タンパク質のゼオライトによるリフォールディング手順の説明図を示す。
【図４】ＢＥＡ構造のゼオライトによるタンパク質リフォールディング条件設定キット及び装置の一例の説明図を示す。
【図５】リフォールディングキットの一例の説明図を示す。
【図６】作成したリフォールディングマトリックスを示す。
【図７】作成したリフォールディングマトリックスを示す。
【図８】作成したリフォールディングマトリックスを示す。
【図９】ゼオライトの種類による影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら制約を受けるものではない。
【実施例１】
【００６９】
本実施例では、９６穴ディープウェルプレートを用いたタンパク質リフォールディング条件設定キットにより、９６通りの条件による、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のリフォールディング条件を調べた。
【００７０】
（１）キットの構成
キットには、９３０ＮＨＡ（東ソー製）；ＮＨ４型（ＮＨ４＋フォーム）であるゼオライトを用いた。このゼオライトが、９６穴ディープウェルプレートの各穴に、３０ｍｇずつ、分注されたものを用意し、これに、９６穴ディープウェルプレート用キャップを付属として用いた。
【００７１】
表１に、検討したリフォールディングに及ぼすバッファー成分について示す。本実施例で用いたタンパク質リフォールディング条件設定キットは、表１に示す各成分の影響を調べるために構築したものである。具体的には、ｐＨ調整剤の違いにより、ｐＨに関しては、６．５，７．５，８．０，８．５の４条件について同時に検討できること、塩類については、ＮａＣｌ  ５００ｍＭの有無について検討できること、添加物については、グリセロール  ２０％（ｖ／ｖ）、塩酸グアニジン  １Ｍのそれぞれについて、その添加の有無について検討できること、を要件として構成した。
【００７２】
また、界面活性剤については、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．２％（ｖ／ｖ）の添加の有無について検討できること、Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤（Ｒｅｄｏｘ  ｒｅａｇｅｎｔ）については、２−メルカプトエタノール  １０ｍＭ、及び、システイン  １０ｍＭ  ＋  シスチン  １ｍＭの添加の有無について、同時に検討することができること、を要件として構成した。
【００７３】
【表１】
2011046686.tif 000003
【００７４】
本実施例で用いた基本的な溶液（バッファー）類の構成は、以下のようにした。
１．変性バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，６Ｍ  塩酸グアニジン，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール
２．洗浄バッファー：１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
【００７５】
３．ｐＨ６．５基本バッファー：１２５ｍＭ  ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．５），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００，１．２５Ｍ  アルギニン、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
４．ｐＨ７．５基本バッファー：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００，１．２５Ｍ  アルギニン、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
【００７６】
５．ｐＨ８．０基本バッファー：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００，１．２５Ｍ  アルギニン、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
６．ｐＨ８．５基本バッファー：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００，１．２５Ｍ  アルギニン、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
【００７７】
塩類、添加物、界面活性剤、Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤の構成は、８Ｍ  塩酸グアニジン、５Ｍ  ＮａＣｌ、６６．７％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２００ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌ、２００ｍＭ  シスチン、１８２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、とした。
【００７８】
（２）使用する器具
使用する器具の構成は、８連ピペット（２０μｌ）、８連ピペット（３００μｌ）、８連ピペット（１２５０μｌ）、１２連ピペット（３００μｌ）、リザーバー、とした。尚、リザーバーは、キットの付属としてセットすることも可能とした。
【００７９】
（３）方法
まず、９６条件のリフォールディングバッファーの準備を行った。以下に示す手順で、リフォールディングバッファー作製用の９６穴ディープウェルプレートに、各種バッファーを分注した。表２に、９６穴マイクロプレートを用いたときの各穴のバッファー成分を示す。以下の手順により、表２に示すような、９６通りの異なる構成のリフォールディングバッファーを準備し、これを用いて、９６通りのリフォールディング条件の同時検討を行った。
【００８０】
【表２】
2011046686.tif 000004
【００８１】
１．  １１０μｌずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
２．  ２２μｌずつのｄｄＨ２Ｏを、１２連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートのＡ，Ｃ，Ｅ，Ｇの列の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
【００８２】
３．  １３８μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，３，４，５，７，９，１０，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
４．  ３３０μｌずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，４，５，７，８，１０，１１行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈに加えた。
【００８３】
５．  ４４０μｌずつの上記３のｐＨ６．５基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μｌ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＡ，Ｂ列の１，２，３，４，５，６行及びＡ，Ｂ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
６．  ４４０μｌずつの上記４のｐＨ７．５基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μｌ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＣ，Ｄ列の１，２，３，４，５，６行及びＣ，Ｄ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
【００８４】
７．  ４４０μｌずつの上記５のｐＨ８．０基本バッファーを、８連ピペットに（１２５０μＬ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＥ，Ｆ列の１，２，３，４，５，６行及びＥ，Ｆ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
８．  ４４０μｌずつの上記６のｐＨ８．５基本バッファーを、８連ピペットに（１２５０μｌ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＧ，Ｈ列の１，２，３，４，５，６行及びＧ，Ｈ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
【００８５】
９．  １１０μｌずつの上記８の５Ｍ  ＮａＣｌを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１０．  ２２μｌずつの上記１０の１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を、１２連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートのＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ列の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０、１１，１２行に加えた。
【００８６】
１１．  １３８μｌずつの上記７の８Ｍ  塩酸グアニジンを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの２，５，８，１１行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１２．  ３３０μｌずつの上記９の６６．７％（ｖ／ｖ）グリセロールを、８連ピペット（１２５０μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの３，６，９，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【００８７】
１３．  ５５μｌずつの上記１１の２００ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの４，５，６，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１４．  ５．５μｌずつの上記１２の２００ｍＭ  シスチンを、８連ピペット（２０μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの４，５，６，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【００８８】
１５．  ６０．５μｌずつの上記１３の１８２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，７，８，９行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈに加えた。
１６．  キャップをして、転倒、混和後、４℃、３０００ｒｐｍにて、１分間遠心した。
【００８９】
次に、評価すべきＧＦＰについては、６Ｍの塩酸グアニジン等で、変性溶解したＧＦＰ溶液を、濃度１ｍｇ／ｍＬで、各９６穴に１ｍＬずつ注入するために、９６ｍＬ以上用意した。ゼオライト３０ｍｇが、各穴に分注され、９６穴ディープウェルプレートの各穴に、１ｍＬの上記１の変性バッファーを加えて、平衡化した。
【００９０】
３，０００ｒｐｍで、５分遠心分離して、上清を捨てた。各穴に、１ｍｇ／ｍＬの変性ＧＦＰを１ｍＬ加え、９６穴ディープウェルプレートに、しっかりとフタをし、上下反転させて、ゼオライトを十分に懸濁した後、ローテーターで、１時間回転させて、ゼオライトにＧＦＰを吸着させた。
【００９１】
９６穴ディープウェルプレートを、３，０００ｒｐｍで、５分遠心分離して、上清を捨て、上記２の洗浄バッファー  １ｍＬで、計５回洗浄し、５回目の洗浄で、上清を除いた後、更に、３，０００ｒｐｍで、１分、遠心分離して、残っている液をできるだけ除いた。この状態で、湿潤したゼオライトと、それに吸着した変性ＧＦＰが残っていることになり、これを、条件検討用の９６穴ディープウェルプレートとした。
【００９２】
先に準備した、９６通りのリフォールディングバッファーの入った、リフォールディングバッファー作製用の９６穴ディープウェルプレートの各穴から、それぞれ、１ｍＬのリフォールディングバッファーを、条件検討用の９６穴ディープウェルプレートに移し替えるように加えた。この操作は、１２連のピペットで、あるいは８連のピペットで行った。各穴に、フタをして、ボルテックスで混合した。４℃で、一晩回転させてリフォールドさせた。３，０００ｒｐｍで、５分、遠心分離して、上清の活性測定を行った。
【００９３】
活性測定は、ＣＯＲＯＮＡ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＳＨ−８０００を用いて、Ｅｘ：４８６ｎｍ，Ｅｍ：５１１ｎｍで、蛍光強度を測定した。可溶性ＧＦＰ溶液を、リフォールディングバッファーで希釈して、０，１．８７５，３．７５，７．５，１５，３０，６０μｇ／ｍＬのときの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。
【００９４】
Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅは、そのまま測定した。活性の高かったｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ、及びｓｔａｎｄａｒｄ（変性ＧＦＰ）を、ＴＣＡ沈澱してから、ＢＣＡ法で、タンパク濃度を測定し、回収率及び活性回復率を算出した。
【００９５】
（４）結果
その結果を、図１に示す。図１は、蛍光強度を測定した結果をまとめたものである。表３に、蛍光強度を測定した数値結果を示す。表４に、活性の高かったＣ１，Ｃ７，Ｅ１，Ｅ４，Ｅ７，Ｅ１０，Ｇ１，Ｇ４，Ｇ７，Ｇ１０，Ｈ３及びＨ９のタンパク濃度を測定し、回収率、及び活性回復率を算出した結果を示す。
【００９６】
【表３】
2011046686.tif 000005
【００９７】
【表４】
2011046686.tif 000006
【００９８】
Ｅ７及びＥ１０の回収率、活性回復率が、最も良好であった。Ｅ７とＥ１０は、条件がほぼ同じであり、Ｅ７のバッファーのＲｅｄｏｘ  ｒｅａｇｅｎｔである２−メルカプトエタノールを、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ／Ｃｙｓｔｉｎｅに変更したものが、Ｅ１０である。
【００９９】
ＧＦＰは、Ｓ−Ｓ結合がないこともあるが、Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤（Ｒｅｄｏｘ  ｒｅａｇｅｎｔ）については、２−メルカプトエタノール  １０ｍＭ、及び、システイン  １０ｍＭ  ＋  シスチン  １ｍＭの効果に差がないことが分かる。ＧＦＰのリフォールディングの最適条件は、以下のとおりであり、回収率は、３８．８％、及び活性回復率は、２６．９％であった。
【０１００】
（ＧＦＰのリフォールディング条件）
ｐＨ８．０
０．５Ｍ  アルギニン
０．５％  ポリエチレングリコール  ２００００
０．５Ｍ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールもしくは、１０ｍＭ  システイン  ＋  １ｍＭ  シスチン
２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
【実施例２】
【０１０１】
本実施例では、９６穴ディープウェルプレートを用いたタンパク質リフォールディング条件設定キットにより、９６通りの条件による、ＧＫ（グルコキナーゼ）のリフォールディング条件を調べた。
【０１０２】
（１）キットの構成
キットには、９３０ＮＨＡ（東ソー製）；ＮＨ４型（ＮＨ４＋フォーム）に固定しているゼオライトを用いた。このゼオライトが、９６穴ディープウェルプレートの各穴に３０ｍｇずつ、分注されたものを用意した。これに、９６穴ディープウェルプレート用キャップを付属としてセットした。
【０１０３】
表５に、検討したリフォールディングに及ぼすバッファー成分について示す。本実施例で用いたタンパク質リフォールディング条件設定キットは、表５に示す各成分の影響を調べるために構築したものである。具体的には、ｐＨ調整剤の違いにより、ｐＨに関しては、６．５，７．５，８．０，８．５の４条件について同時に検討できること、塩類については、ＮａＣｌ  ５００ｍＭの有無について検討できること、添加物については、グリセロール  ２０％（ｖ／ｖ）、塩酸グアニジン  １Ｍのそれぞれについて、その添加の有無が検討できること、を要件として構成した。
【０１０４】
界面活性剤については、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．２％（ｖ／ｖ）の添加の有無について検討できること、Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤（Ｒｅｄｏｘ  ｒｅａｇｅｎｔ）については、ＤＴＴ  １ｍＭ、及び、システイン  １０ｍＭ  ＋  シスチン  １ｍＭの添加の有無について、同時に検討することができること、を要件として構成した。
【０１０５】
【表５】
2011046686.tif 000007
【０１０６】
本実施例で用いる基本的な溶液（バッファー）類の構成は、以下のようにした。
１．変性バッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，６Ｍ塩酸グアニジン，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール
２．洗浄バッファー：１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
【０１０７】
３．ｐＨ６．５基本バッファー：１２５ｍＭ  ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．５），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００、１．２５Ｍ  アルギニン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
４．ｐＨ７．５基本バッファー：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００、１．２５Ｍ  アルギニン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０１０８】
５．ｐＨ８．０基本バッファー：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００、１．２５Ｍ  アルギニン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
６．ｐＨ８．５基本バッファー：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１．２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール２００００、１．２５Ｍ  アルギニン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０１０９】
塩類、添加物、界面活性剤、Ｓ−Ｓ架橋形成制御剤の構成は、８Ｍ  塩酸グアニジン、５Ｍ  ＮａＣｌ、６６．７％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２００ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌ、２００ｍＭ  シスチン、１８．２ｍＭ  ＤＴＴ、とした。
【０１１０】
（２）使用する器具
使用する器具の構成は、８連ピペット（２０μｌ）、８連ピペット（３００μｌ）、８連ピペット（１２５０μｌ）、１２連ピペット（３００μｌ）、リザーバー、とした。尚、リザーバーは、キットの付属としてセットすることも可能とした。
【０１１１】
（３）方法
まず、９６条件のリフォールディングバッファーの準備を行った。以下に示す手順で、リフォールディングバッファー作製用の９６穴ディープウェルプレートに、各種バッファーを分注した。表６に、９６穴マイクロプレートを用いたときの各穴のバッファー成分を示す。この手順により、表６に示すような、９６通りの異なる構成のリフォールディングバッファーが準備され、これを用いて、９６通りのリフォールディング条件の同時検討を行った。
【０１１２】
【表６】
2011046686.tif 000008
【０１１３】
１．  １１０μｌずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
２．  ２２μｌずつのｄｄＨ２Ｏを、１２連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートのＡ，Ｃ，Ｅ，Ｇの列の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
【０１１４】
３．  １３８μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，３，４，５，７，９，１０，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
４．  ３３０μｌずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，４，５，７，８，１０，１１行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈに加えた。
【０１１５】
５．  ４４０μｌずつの上記３のｐＨ６．５基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μｌ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＡ，Ｂ列の１，２，３，４，５，６行及びＡ，Ｂ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
６．  ４４０μｌずつの上記４のｐＨ７．５基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μｌ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＣ，Ｄ列の１，２，３，４，５，６行及びＣ，Ｄ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
【０１１６】
７．  ４４０μｌずつの上記５のｐＨ８．０基本バッファーを、８連ピペットに（１２５０μＬ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＥ，Ｆ列の１，２，３，４，５，６行及びＥ，Ｆ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
８．  ４４０μｌずつの上記６のｐＨ８．５基本バッファーを、８連ピペットに（１２５０μｌ）に６本のチップを付け、９６穴ディープウェルプレートのＧ，Ｈ列の１，２，３，４，５，６行及びＧ，Ｈ列の７，８，９，１０，１１，１２行に加えた。
【０１１７】
９．  １１０μｌずつの上記８の５Ｍ  ＮａＣｌを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１１８】
１０．  ２２μｌずつの上記１０の１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を、１２連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートのＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ列の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０、１１，１２行に加えた。
【０１１９】
１１．  １３８μｌずつの上記７の８Ｍ  塩酸グアニジンを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの２，５，８，１１行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１２．  ３３０μｌずつの上記９の６６．７％（ｖ／ｖ）グリセロールを、８連ピペット（１２５０μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの３，６，９，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１２０】
１３．  ５５μｌずつの上記１１の２００ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの４，５，６，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１４．  ５．５μｌずつの上記１２の２００ｍＭ  シスチンを、８連ピペット（２０μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの４，５，６，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１２１】
１５．  ６０．５μｌずつの上記１３の１８２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを、８連ピペット（３００μｌ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，７，８，９行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈに加えた。
１６．  キャップをして、転倒、混和後、４℃、３０００ｒｐｍにて、１分間遠心した。
【０１２２】
次に、評価すべきＧＫについては、６Ｍの塩酸グアニジン等で変性溶解したＧＫ溶液を、濃度１ｍｇ／ｍＬで、各９６穴に、１ｍＬずつ注入するために、９６ｍＬ以上用意した。ゼオライト３０ｍｇが、各穴に分注され、９６穴ディープウェルプレートの各穴に、１ｍＬの上記１の変性バッファーを加えて、平衡化した。
【０１２３】
３，０００ｒｐｍで、５分遠心分離して、上清を捨てた。各穴に、１ｍｇ／ｍＬの変性ＧＫを１ｍＬ加え、９６穴ディープウェルプレートに、しっかりとフタをし、上下反転させて、ゼオライトを十分に懸濁した後、ローテーターで、１時間回転させて、ゼオライトにＧＫを吸着させた。
【０１２４】
９６穴ディープウェルプレートを、３，０００ｒｐｍで、５分遠心分離して、上清を捨て、上記２の洗浄バッファー  １ｍＬで、計５回洗浄し、５回目の洗浄で、上清を除いた後、更に、３，０００ｒｐｍで、１分遠心して、残っている液をできるだけ除いた。この状態で、湿潤したゼオライトとそれに吸着した変性ＧＫが残っていることになり、これが、条件検討用の９６穴ディープウェルプレートとした。
【０１２５】
先に準備した、９６通りのリフォールディングバッファーの入った、リフォールディングバッファー作製用の９６穴ディープウェルプレートの各穴から、それぞれ、１ｍＬのリフォールディングバッファーを、条件検討用の９６穴ディープウェルプレートに移し替えるように加えた。この操作は、１２連のピペットで、あるいは８連のピペットで行った。各穴に、フタをして、ボルテックスで混合した。４℃で、一晩回転させて、リフォールドさせた。３，０００ｒｐｍで、５分遠心分離して、上清の活性測定を行った。
【０１２６】
活性の測定は、以下の手順によった。まず、Ｄ−グルコースとＡＴＰの混合である反応基質が、ＧＫによりＤ−グルコース６リン酸とＡＤＰになる反応により評価することし、以下のような、活性測定用の基質混合溶液を調製した。
（基質混合溶液）
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０
２ｍＭ  ＡＴＰ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１ｍＭ  ＤＴＴ
５００μＭ  ＮＡＤＰ
５０ｍＭ  Ｄ−グルコース
【０１２７】
引き続き、以下のような手順を行った。
１．リフォールディングしたサンプルを、１０倍希釈した。
２．希釈したサンプルを、コーニング製のＵＶ透過９６穴プレートに分注した。
３．基質混合溶液を、２００μｌずつ、９６穴プレートに分注し、ＣＯＲＯＮＡ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＳＨ−８０００を用いて、ＯＤ３４０を１分ごとに１０分間測った（２４サンプルずつ測った）。
【０１２８】
２４サンプルずつ測る手順は、以下のようにした。１回目（Ａ，Ｂ）（１〜１２）、２回目（Ｃ，Ｄ）（１〜１２）、３回目（Ｅ，Ｆ）（１〜１２）、４回目（Ｇ，Ｈ）（１〜１２）。
４．グラフの傾きを求めて活性を計算した。
【０１２９】
計算式を、以下に示す。
Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｅｎｚｙｍｅ＝（ΔＡ３４０ｎｍ／ｍｉｎ  Ｓａｍｐｌｅ−ΔＡ３４０ｎｍ／ｍｉｎ  Ｂｌａｎｋ）（０．２１ｍＬ）（ｄｆ）／（６．２２）（０．０１）
ここで、６．２２＝Ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ  ｅｘｔｉｎｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ  ａｔ  ３４０ｎｍ、０．０１＝Ｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ）ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｕｓｅｄ、である。
【０１３０】
（４）結果
その結果を、図２に示す。活性が高かったのは、Ｃ２，Ｄ２，Ｅ２，Ｆ２，Ｃ８，Ｄ８，Ｅ８，Ｆ８の条件であることが分かる。
【０１３１】
回収率、活性回復率が、最も良好であったのは、Ｆ８の条件であるが、Ｃ２，Ｄ２，Ｅ２，Ｆ２，Ｃ８，Ｄ８，Ｅ８，Ｆ８の条件の共通項として、変性剤の塩酸グアニジンやＳ−Ｓ架橋形成制御剤の２−メルカプトエタノールが効果が大きいことが分かる。ＧＫのリフォールディングの好適条件は、以下のとおりであり、回収率は５２．０％、及び活性回復率は１７％であった。
【０１３２】
（ＧＫのリフォールディング条件）
ｐＨ８．０
０．５Ｍ  アルギニン
０．５％  ポリエチレングリコール  ２０，０００
０．５Ｍ  ＮａＣｌ
０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０
１Ｍ  塩酸グアニジン
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１ｍＭ  ＤＴＴ
【０１３３】
【表７】
2011046686.tif 000009
【実施例３】
【０１３４】
本実施例では、クレアチンキナーゼのリフォールディングを行った。
（１）クレアチンキナーゼのクローニング、発現
ヒトクレアチンキナーゼ遺伝子を含むＥＳＴクローン（ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：ＭＨＳ１０１１−６０１２８）は、Ｏｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。このＥＳＴクローンを鋳型として、ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて、クレアチンキナーゼ遺伝子を増幅した。なお、プライマーとして、以下の配列のものを用いた。
フォワードプライマー：ａａａａａａＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣ
リバースプライマー：ａａａａａａＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧＧ
【０１３５】
増幅された遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）ベクターに、クローニング後、ＤＮＡ配列を確認した。正しい配列の入ったＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングすることにより、発現クローンを作製した。この発現クローンを、ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【０１３６】
クレアチンキナーゼ発現コンストラクトを、３０ｍＬのＬＢ−１．５％グルコース−１００μｇ／ｍＬアンピシリン培地で、３７℃、１晩培養した。２０ｍＬの前培養液を２Ｌのターボブロス−１．５％グルコース−１００μｇ／ｍＬアンピシリン培地に移し、３７℃で、ＯＤ６００が０．６になるまで培養した。最終濃度が１００μＭになるように、ＩＰＴＧを加え、更に、３７℃で、４．５時間培養した。
【０１３７】
菌体を遠心して集め、更に、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。これを、８０ｍＬの０Ｍイミダゾールバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁し、液体窒素に浸けて、凍結後、−８０℃で保存した。
【０１３８】
（２）クレアチンキナーゼの精製
凍結した菌体を溶解後、以下の試薬を加え、４℃で、３０〜６０分間インキュベートした。
（試薬）
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ                    ８００μＬ
１ｍｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ    ８０μＬ
１Ｍ  ＭｇＣｌ２                        １００μＬ
２Ｕ／μＬ  ＤＮａｓｅＩ                １００μＬ
５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ        ４００μＬ
【０１３９】
ソニケーション後、２８０００×ｇ、４℃で、１５分間遠心して、上清（可溶性画分）と沈殿（インクルージョンボディ）に分けた。
【０１４０】
（３）可溶性画分の精製
可溶性画分を、０．４５μｍフィルターでろ過し、最終濃度が５ｍＭになるように、５００ｍＭイミダゾールバッファー（０Ｍイミダゾールバッファー＋５００ｍＭイミダゾール）を加えた。Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（５ｍＬ）２本を連結したＡＫＴＡ１０Ｓにロードし、５−５００ｍＭのイミダゾール勾配をかけて溶出させた。クレアチンキナーゼのピークフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＦ＝１０，０００）で濃縮後、ＴＢＳで、４℃、１晩透析した。透析サンプルを遠心し、０．４５μｍフィルターでろ過後、タンパク質濃度を測定した。
【０１４１】
（４）変性クレアチンキナーゼの精製
インクルージョンボディを、３０ｍＬの０Ｍイミダゾールバッファー＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で洗浄した。２５ｍＬの変性０Ｍイミダゾールバッファー（０Ｍイミダゾールバッファー＋６Ｍ塩酸グアニジン）を加え、室温で１晩インキュベーションして、変性、溶解させた。１０００００×ｇ、４℃で、４５分間遠心して、不溶性物質を除いた後、０．４５μｍフィルターでろ過した。
【０１４２】
Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（５ｍＬ）２本を連結したＡＫＴＡ１０Ｓにロードし、０−５００ｍＭのイミダゾール勾配をかけて溶出させた。クレアチンキナーゼのピークフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＦ＝１０，０００）で濃縮後、変性０Ｍイミダゾールバッファー＋  ２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで、４℃、１晩透析した。透析サンプルを遠心し、０．４５μｍフィルターでろ過後、タンパク質濃度を測定した。
【０１４３】
（５）リフォールディングの条件検討
リフォールディング条件検討マトリックスを作成し、バッファー条件について検討した。図６に、作成したマトリックスを示す。また、検討したバッファー条件について、以下の表に示した。
【０１４４】
【表８】
2011046686.tif 000010
【０１４５】
（６）試薬
試薬として、以下の試薬を用いた。
（試薬）
Ｚｅｌｏｌｉｔｅ：ＨＳＺ９３０−ＮＨＡ  ３０ｍｇ／ｗｅｌｌ
ｐＨ７．５基本バッファー［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］
ｐＨ８．５基本バッファー［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００，５１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］
【０１４６】
１％  Ｔｗｅｅｎ２０
１Ｍ  ＮＤＳＢ２５６
５Ｍ  塩酸グアニジン（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）
Ｓａｌｔ（３Ｍ  ＮａＣｌ，１Ｍ  ＫＣｌ）
２０ｍＭ  ＤＴＴ
２Ｍアルギニン（Ａｒｇ）（ｐＨ７．５，ｐＨ８．５）
【０１４７】
（７）リフォールディングバッファーの作成
９６穴ディープウェルプレートに、以下のように試薬を作成し、該試薬を分注した。
１）１００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，４行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
２）５００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＡ，Ｄ列に加えた。
【０１４８】
３）２５０μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＡ，Ｂ，Ｃ列に加えた。
４）１００μＬずつのｐＨ７．５基本バッファーを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
【０１４９】
５）１００μＬずつのｐＨ８．５基本バッファーを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの４，５，６行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
６）５００μＬずつの１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＢ，Ｅ列に加えた。
【０１５０】
７）５００μＬずつの１Ｍ  ＮＤＳＢ２５６を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＣ，Ｆ列に加えた。
８）１００μＬずつのＳａｌｔ（３Ｍ  ＮａＣｌ，１Ｍ  ＫＣｌ）を、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの２，５行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
【０１５１】
９）１００μＬずつの５Ｍ塩酸グアニジンを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの３，６行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
１０）２５０μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ７．５）を、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３行のＤ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
【０１５２】
１１）２５０μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ８．５）を、８連ピペット（３００μＬ）を用いて９６穴ディープウェルプレートの４，５，６行のＤ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
１２）５０μＬずつの２０ｍＭ  ＤＴＴを、８連ピペットを用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
【０１５３】
（８）方法
ゼオライト（ＨＳＺ９３０  ＮＨＡ）を、約３０ｍｇずつ、ディープウェルプレートに加えた。５００μＬの変性０Ｍイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。０．３ｍｇの変性クレアチンキナーゼを加え、１時間振盪してゼオライトに吸着させた。ディープウェルプレートを、２１５０×ｇ、４℃で、５分間遠心して、ゼオライトを沈殿させた。
【０１５４】
上清を捨て、１ｍＬの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を加え、ゼオライトを再懸濁した。更に、遠心、再懸濁を６回繰り返すことにより、ゼオライトを洗浄した。遠心して上清を除いた後、０．６ｍＬのリフォールディングバッファーを加え、最懸濁後、４℃で、１晩振盪した。ディープウェルプレートを、２１５０×ｇ、４℃で、５分間遠心してゼオライトを沈殿させ、上清を、新しいディープウェルプレートに移した。回収したサンプルの活性測定及びタンパク質定量を行った。
【０１５５】
（９）活性測定
活性測定は、ＣＫＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いた。リフォールディングしたサンプルを、５μｌずつ、９６穴アッセイプレートに分注した。１５０μＬの基質を分注し、５７０ｎｍの吸光度の変化をプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  ＸＲ、バイオラッド）を用いて測定することにより、活性を求めた。
【０１５６】
（１０）結果
測定結果を以下の表に示す。ｐＨ７．５（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、５００ｍＭアルギニン、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、５００ｍＭ塩酸グアニジンの条件下で、回収率１４％であった。更に、可溶性クレアチンキナーゼと比活性の比較を行ったところ、活性回復率５１．１％であった。
【０１５７】
【表９】
2011046686.tif 000011
【実施例４】
【０１５８】
本実施例では、ＭＭＰ−３のリフォールディングを行った。
（１）ＭＭＰ−３の発現
ヒトＭＭＰ−３発現コンストラクトは、松浦氏（産業技術総合研究所、東北センター）より譲渡されたものを用いた。ＭＭＰ−３発現コンストラクトを３０ｍＬのＬＢ−１．５％グルコース−１００μｇ／ｍＬアンピシリン培地で、３７℃、１晩培養した。２０ｍＬの前培養液を２Ｌのターボブロス−１．５％グルコース−１００μｇ／ｍＬアンピシリン培地に移し、３７℃で、ＯＤ６００が０．６になるまで培養した。最終濃度が１００μＭになるようにＩＰＴＧを加え、更に、３７℃で、４．５時間培養した。
【０１５９】
菌体を遠心して集め、更に、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。８０ｍＬの０Ｍイミダゾールバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁し、液体窒素に浸けて、凍結後、−８０℃で保存した。
【０１６０】
（２）変性ＭＭＰ−３の精製
凍結した菌体を溶解後、以下の試薬を加え、４℃で、３０〜６０分間インキュベートした。
（試薬）
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ                    ８００μＬ
１ｍｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ    ８０μＬ
１Ｍ  ＭｇＣｌ２                        １００μＬ
２Ｕ／μＬ  ＤＮａｓｅＩ                １００μＬ
５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ        ４００μＬ
【０１６１】
ソニケーション後、２８０００×ｇ、４℃で、１５分間遠心して、沈殿（インクルージョンボディ）を得た。インクルージョンボディを、３０ｍＬの０Ｍイミダゾールバッファー＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した。２５ｍＬの変性０Ｍイミダゾールバッファー（０Ｍイミダゾールバッファー＋６Ｍ  塩酸グアニジン）を加え、室温で１晩インキュベーションして、変性、溶解させた。１０００００×ｇ、４℃で、４５分間遠心して、不溶性物質を除いた後、０．４５μｍフィルターでろ過した。
【０１６２】
Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（５ｍＬ）２本を連結したＡＫＴＡ１０Ｓにロードし、０−５００ｍＭのイミダゾール勾配をかけて溶出させた。ピークフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＦ＝１０，０００）で濃縮後、０．１Ｍになるように、ＤＴＴを加えた。変性０Ｍイミダゾールバッファーで、４℃、１晩透析した。透析サンプルを遠心し、０．４５μｍフィルターでろ過後、タンパク質濃度を測定した。
【０１６３】
（３）リフォールディングの条件検討
リフォールディング条件検討マトリックスを作成し、バッファ条件について検討した。図７に、作成したマトリックスを示す。また、検討したバッファー条件について、以下の表に示した
【０１６４】
【表１０】
2011046686.tif 000012
【０１６５】
（４）試薬
試薬として、以下の試薬を用いた。
（試薬）
ゼオライト（ＨＳＺ９３０−ＮＨＡ）３０ｍｇ／ｗｅｌｌ
ｐＨ６．０基本バッファー［５００ｍＭ  ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．５），５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００，５０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  Ｚｎ−Ａｃｅｔａｔｅ］
【０１６６】
ｐＨ７．５基本バッファー［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００，５０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  Ｚｎ−Ａｃｅｔａｔｅ］
ｐＨ８．５基本バッファー［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００，５０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  Ｚｎ−Ａｃｅｔａｔｅ］
【０１６７】
１％  Ｂｒｉｊ−３５
１％  Ｔｗｅｅｎ２０
１Ｍ  ＮＤＳＢ２５６
５Ｍ  塩酸グアニジン（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）
Ｓａｌｔ（３Ｍ  ＮａＣｌ，１Ｍ  ＫＣｌ）
２０ｍＭ  ＤＴＴ
１００ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ），２０ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）
２Ｍアルギニン（Ａｒｇ）（ｐＨ６．０，ｐＨ７．５，ｐＨ８．５）
【０１６８】
（５）リフォールディングバッファーの作成
９６穴ディープウェルプレートに、以下のように試薬を作成し、該試薬を分注した。
１）７５０μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ列に加えた。
２）３７５μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，３，５，７，９，１１行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１６９】
３）１５０μＬずつのｐＨ６．５基本バッファーを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
４）１５０μＬずつのｐＨ７．５基本バッファーを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの５，６，７，８行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１７０】
５）１５０μＬずつのｐＨ８．５基本バッファーを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
６）７５０μＬずつの１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０１１，１２行のＣ，Ｄ列に加えた。
【０１７１】
７）７５０μＬずつの１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｇ−３５を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０１１，１２行のＥ，Ｆ列に加えた。
８）７５０μＬずつの１Ｍ  ＮＤＳＢ２５６を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０１１，１２行のＧ，Ｈ列に加えた。
【０１７２】
９）１５０μＬずつのＳａｌｔ（２．４Ｍ  ＮａＣｌ，０．８Ｍ  ＫＣｌ）を、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｃ，Ｅ，Ｇ列に加えた。
１０）１５０μＬずつの５Ｍ塩酸グアニジンを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ列に加えた。
【０１７３】
１１）３７５μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ６．５）を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの２，４行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１２）３７５μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ７．５）を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの６，８行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１７４】
１３）３７５μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ８．５）を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１０，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１４）７５μＬずつの２０ｍＭ  ＤＴＴを、８連ピペットを用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，５，６，９，１０行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１５）７５μＬずつの１００ｍＭ還元型グルタチオン，２０ｍＭ酸化型グルタチオンを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの３，４，７，８，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１７５】
（６）方法
ゼオライトを、約３０ｍｇずつ、９６穴ディープウェルプレートに加えた。５００μＬの変性０Ｍイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。０．２５ｍｇの変性ＭＭＰ−３を加え、１時間振盪して、ゼオライトに吸着させた。ディープウェルプレートを、２１５０×ｇ、４℃、５分間遠心して、ゼオライトを沈殿させた。
【０１７６】
上清を捨て、１ｍＬの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を加え、ゼオライトを再懸濁した。更に、遠心、再懸濁を６回繰り返すことにより、ゼオライトを洗浄した。遠心して、上清を除いた後、１ｍＬのリフォールディングバッファーを加え、最懸濁後。４℃で１晩振盪した。２１５０×ｇ、４℃で、５分間遠心して、ゼオライトを沈殿させ、上清を、新しいディープウェルプレートに移した。回収したサンプルの活性測定及びタンパク質定量を行った。
【０１７７】
（７）活性測定
活性測定は、４９０  ＭＭＰ−３  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ社）を使用した。キットに付属のＭＭＰ−３  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ５０μＬを、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍＬに加え、アッセイ溶液を作製した。１００μＬずつ、９６穴黒色アッセイプレートに分注した。リフォールディングサンプルを、ｄｄＨ２Ｏで２倍希釈し、そのうち５μＬを加えた。ＳＨ−８０００マイクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社）にて、励起波長３４０ｎｍ、放射波長４９０ｎｍを測定することにより、活性を求めた。
【０１７８】
（８）結果
上記測定結果を、以下の表に示す。ｐＨ８．５（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、５００ｍＭアルギニン，５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  Ｚｎ−ａｃｅｔａｔｅ、０．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５００ｍＭ塩酸グアニジン、５００ｍＭ  ＮＤＳＢ２５６の条件下で、最大活性及び、２１．８％の回収率を得た。また、比活性は、希釈法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｅｎ，１９９４，１３９，ｐ２８１−２８６）によって得られた値と比べて、３．７倍高かった。
【０１７９】
【表１１】
2011046686.tif 000013
【実施例５】
【０１８０】
本実施例では、抗ヒトアルブミン単鎖可変領域断片のリフォールディングを行った。
（１）抗ヒトアルブミン単鎖可変領域断片（ＨＳＡｓｃＦｖ）のクローニング、発現
ヒトアルブミンを認識するマウスＩｇＧ可変部位の遺伝子配列は、文献（Ｐ２０００−１３９４６０Ａ）を参考にした。該文献に示してあるＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列を、リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ×３）でつないだ配列を、大腸菌のコドンに合わせたＤＮＡ配列である人工遺伝子として合成した。なお、人口遺伝子の合成は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼した。
【０１８１】
得られた遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングすることにより、アミノ末端に６×ヒスチジンタグを持つ発現クローンを作製した。この発現クローンを、ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【０１８２】
ＨＳＡｓｃＦｖ発現コンストラクトを、５０ｍＬのＬＢ−１００μｇ／ｍＬカナマイシン培地で、３０℃、１晩培養した。２０ｍＬの前培養液を、２Ｌのターボブロス−１００μｇ／ｍＬカナマイシン培地に移し、３７℃で、ＯＤ６００が０．６になるまで培養した。最終濃度が１ｍＭになるように、ＩＰＴＧを加え、更に、３７℃で、４．５時間培養した。菌体を遠心して集め、更に、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮｈａＣｌ）で洗浄した。８０ｍＬの０Ｍイミダゾールバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁し、液体窒素に浸けて、凍結後、−８０℃で保存した。
【０１８３】
（２）変性ＨＳＡｓｃＦｖの精製
凍結した菌体を溶解後、以下の試薬を加え、４℃で、３０〜６０分間インキュベートした。
（試薬）
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ                    ８００μＬ
１ｍｇ／ｍＬ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ    ８０μＬ
１Ｍ  ＭｇＣｌ２                        １００μＬ
２Ｕ／μＬ  ＤＮａｓｅＩ                １００μＬ
５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ        ４００μＬ
【０１８４】
ソニケーション後、遠心して、沈殿（インクルージョンボディ）を得た。インクルージョンボディを、３０ｍＬの０Ｍイミダゾールバッファー＋０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した。２５ｍＬの変性０Ｍイミダゾールバッファー（０Ｍイミダゾールバッファー＋６Ｍ塩酸グアニジン）を加え、室温で、１晩インキュベーションして溶かした。１０００００×ｇ、４℃で、４５分間遠心して、不溶性物質を除いた後、０．４５μｍフィルターでろ過した。
【０１８５】
Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（５ｍＬ）２本を連結したＡＫＴＡ１０Ｓにロードし、０−５００ｍＭのイミダゾール勾配をかけて溶出させた。ピークフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＦ＝１０，０００）で濃縮した。変性０Ｍイミダゾールバッファー＋２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで、４℃、１晩透析した。透析サンプルを、遠心し、０．４５μｍフィルターでろ過後、タンパク質濃度を測定した。
【０１８６】
（３）リフォールディングの条件検討
リフォールディング条件検討マトリックスを作成し、バッファ条件について検討した。図８に、リフォールディングマトリックスを示す。検討したバッファー条件について、以下の表に示した。
【０１８７】
【表１２】
2011046686.tif 000014
【０１８８】
（４）試薬
試薬として、以下の試薬を用いた。
（試薬）
ゼオライト（ＨＳＺ９３０−ＮＨＡ）５０ｍｇ／ｗｅｌｌ
バッファー組成
ｐＨ６．０基本バッファー［２００ｍＭ  ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．０），２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００］
ｐＨ７．５基本バッファー［２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００］
ｐＨ８．５基本バッファー［２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ２００００］
【０１８９】
４Ｍ  塩酸グアニジン
Ｓａｌｔ（２．４Ｍ  ＮａＣｌ，０．８Ｍ  ＫＣｌ）
８％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１６０ｍＭ  システイン、１６ｍＭ  シスチン
２Ｍ  アルギニン（ｐＨ６．０，ｐＨ７．５，ｐＨ８．５）
【０１９０】
（５）方法
以下に示すように試薬を作成し、９６穴ディープウェルプレートにバッファーを分注した。
１）１００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，５，６，９，１０行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
２）１００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，３，５，７，９，１１行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１９１】
３）２００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、１２連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ列に加えた。
４）４００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｅ，Ｆ列に加えた。
【０１９２】
５）４００μＬずつのｄｄＨ２Ｏを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＡ，Ｃ，Ｅ，Ｇ列に加えた。
６）４００μＬずつのｐＨ６．０基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１９３】
７）４００μＬずつのｐＨ７．５基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの５，６，７，８行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
８）４００μＬずつのｐＨ８．５基本バッファーを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの９，１０，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１９４】
９）１００μＬずつの８％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの３，４，７，８，１１，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１０）２００μＬずつのＳａｌｔ（２．４Ｍ  ＮａＣｌ，０．８Ｍ  ＫＣｌ）を、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１９５】
１１）４００μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ６．０）を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４行のＣ，Ｄ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１２）４００μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ７．５）を、８連ピペット（１２５０μＬを用いて、９６穴ディープウェルプレートの５，６，７，８行のＣ，Ｄ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１９６】
１３）４００μＬずつの２Ｍアルギニン（ｐＨ８．５）を、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの９，１０，１１，１２行のＣ，Ｄ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
１４）４００μＬずつの４Ｍ塩酸グアニジンを、８連ピペット（１２５０μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２行のＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ列に加えた。
【０１９７】
１５）１００μＬずつの１６０ｍＭ  システイン、１６ｍＭ  シスチンを、８連ピペット（３００μＬ）を用いて、９６穴ディープウェルプレートの２，４，６，８，１０，１２行のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ列に加えた。
【０１９８】
（６）方法
ゼオライトを、約５０ｍｇずつ、９６穴ディープウェルプレートに加えた。５００μＬの変性０Ｍイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。０．２ｍｇの変性ＨＳＡｓｃＦｖを加え、１時間、振盪して、ゼオライトに吸着させた。ディープウェルプレートを２１５０×ｇ、４℃で、５分間遠心して、ゼオライトを沈殿させた。
【０１９９】
上清を捨て、１ｍＬの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を加え、ゼオライトを、再懸濁した。更に、遠心、再懸濁を５回繰り返すことにより、ゼオライトを洗浄した。遠心して上清を除いた後、１ｍＬのリフォールディングバッファーを加え、最懸濁後、４℃で、１晩振盪した。２１５０×ｇ、４℃、５分間遠心して、ゼオライトを沈殿させ、上清を新しいディープウェルプレートに移した。回収したサンプルのＥＬＩＳＡ及びタンパク質定量を行った。
【０２００】
（７）活性測定
ＥＬＩＳＡプレートを使用し、以下の試薬を用いた。
ヒト血清アルブミン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）
ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）
抗ヒスタグ抗体ペルオキダーゼコンジュゲート
【０２０１】
ＥＬＩＳＡプレートに、５０μＬの１０μｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを加え、４℃で、１晩結合させた。ＰＢＳでウェルを洗浄後、１００μＬの１％（ｗ／ｖ）ブロックエースを加え、室温で、２時間インキュベートした。５０μＬのリフォールディンさせたＨＳＡｓｃＦｖを０．４％（ｗ／ｖ）ブロックエースで２０倍希釈したものを加え、室温で、１時間、インキュベーションした。ＰＢＳで、ウェルを洗浄後、５０μＬの抗ヒスタグ抗体ペルオキダーゼコンジュゲートを、０．４％（ｗ／ｖ）ブロックエースで、２０００倍希釈したものを加え、室温で、１時間、インキュベートした。
【０２０２】
ＰＢＳで、ウェルを洗浄後、１００μＬの発色液（０．４ｍｇ／ｍＬオルトフェニレジンジアミン、クエン酸−リン酸バッファー、０．３μＬ／ｍＬ過酸化水素）を加え、１０分間発色させた。５０μＬの２Ｍ硫酸を加え、発色を終了させた。プレートリーダー（モデル６８０ＸＬ、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を使用し、波長４９０ｎｍの吸光を測定した。
【０２０３】
（８）結果
上記測定結果を以下の表に示す。ｐＨ８．５（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ），５００ｍＭアルギニン、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ２００００の条件で、最も吸光が高かった。
【０２０４】
【表１３】
2011046686.tif 000015
【０２０５】
（９）ゼオライトの種類による影響
１）使用したゼオライト
使用したゼオライトについて、以下の表に示す。
【０２０６】
【表１４】
2011046686.tif 000016
【０２０７】
２）方法
各種ゼオライトを２０ｍｇずつ、２ｍＬチューブに分注した。５００μＬの変性０Ｍイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。０．２ｍｇの変性ＨＳＡｓｃＦｖを加え、１時間、振盪して、ゼオライトに吸着させた。２１０００×ｇ、２０℃で、１分間、遠心して、ゼオライトを沈殿させた。上清を捨て、１ｍＬの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を加え、ゼオライトを再懸濁した。
【０２０８】
更に、遠心、再懸濁を５回繰り返すことにより、ゼオライトを洗浄した。遠心して上清を除いた後、１ｍＬの最適条件のリフォールディングバッファーを加え、最懸濁後、４℃で、１晩振盪した。２１０００×ｇ、４℃で、１０分間遠心して、ゼオライトを沈殿させ、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。回収したサンプルのＥＬＩＳＡ及びタンパク質定量を行った。
【０２０９】
（１０）結果
その結果を図９に示す。回収率、ＥＬＩＳＡともに、ＣＰ８１１Ｅ−１５０が最大であった。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
以上詳述したように、本発明は、タンパク質の機能賦活・回復方法で用いるタンパク質リフォールディング条件設定キットに係るものであり、本発明により、ＢＥＡ構造ゼオライトによるリフォールディング法を適用する場合の最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定することができ、ＢＥＡ構造のゼオライトによるリフォールディング法の有するスケールアップの容易性との相乗効果により、タンパク質の種類を問わず、大量で、広範な不活性タンパク質に対しても、それらの本来の機能を賦活させることができる。本発明により、封入体としての活性のないタンパク質から、正しい立体構造及び活性を持った活性タンパク質を得るためのタンパク質リフォールディング条件設定キットを提供することができる。また、本発明は、他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性タンパク質のＢＥＡ構造ゼオライトによるリフォールディング法を適用する場合の最適ないし好適条件を簡便かつ迅速に設定することが可能なタンパク質リフォールディング条件設定キットを提供するものとして有用である。
【図６】
2011046686.tif 000017
【図１】
2011046686.tif 000018
【図２】
2011046686.tif 000019
【図３】
2011046686.tif 000020
【図４】
2011046686.tif 000021
【図５】
2011046686.tif 000022
【図７】
2011046686.tif 000023
【図８】
2011046686.tif 000024
【図９】
2011046686.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011046686000001.app