(57)【要約】【課題】ｈｂｄ２遺伝子及びｈｂｄ３遺伝子により引き起こされる弱勢を利用して、イネに属する植物個体が弱勢か否かを判定する方法の提供。【解決手段】イネに属する植物が弱勢か否かを判定する方法であって、植物細胞のゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列を調べる工程を有することを特徴とする、イネの弱勢判定方法、イネに属する植物に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターを導入し、形質転換することを特徴とする、弱勢な植物の作製方法、並びに、イネの育種に用いられる親個体を選抜する方法であって、（ａ）候補植物個体のゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列、又は、（ｂ）候補植物個体が、ｈｂｄ３ホモ接合体、Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３ヘテロ接合体、Ｈｂｄ３ホモ接合体のいずれであるか、の少なくともいずれかの結果に基づいて選抜することを特徴とする、親個体の選抜方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネに属する植物が弱勢か否かを判定する方法であって、
植物細胞のゲノム中のＣＫＩ１（ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ Ｉ)遺伝子の塩基配列を調べる工程を有することを特徴とする、イネの弱勢判定方法。
【請求項２】
前記ＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む場合に、前記植物細胞が採取された植物個体、又は前記植物細胞が分化して得られる植物個体は弱勢ではないと判定することを特徴とする、請求項１記載のイネの弱勢判定方法。
【請求項３】
イネに属する植物が弱勢か否かを判定する方法であって、
植物個体又は植物細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量を調べる工程を有することを特徴とする、イネの弱勢判定方法。
【請求項４】
前記植物細胞が、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片とイネ品種ハバタキ由来の染色体断片とを含んでおり、
さらに、前記植物細胞の遺伝子型がｈｂｄ３／ｈｂｄ３であるか否かを調べる工程を有することを特徴とする、請求項１記載のイネの弱勢判定方法。
【請求項５】
ゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列であり、かつ、前記未分化細胞の遺伝子型がｈｂｄ３／ｈｂｄ３である場合に、前記植物細胞が採取された植物個体、又は前記植物細胞が分化して得られる植物個体が弱勢であると判定することを特徴とする、請求項４記載のイネの弱勢判定方法。
【請求項６】
イネに属する植物に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターを導入し、形質転換することを特徴とする、弱勢な植物の作製方法。
【請求項７】
ゲノム中に、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片を含む植物細胞に、前記発現ベクターを導入することを特徴とする、請求項６記載の弱勢な植物の作製方法。
【請求項８】
イネの育種に用いられる親個体を選抜する方法であって、
（ａ）候補植物個体のゲノム中のＣＫＩ１（ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ Ｉ)遺伝子の塩基配列、又は、
（ｂ）候補植物個体が、ｈｂｄ３ホモ接合体、Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３ヘテロ接合体、Ｈｂｄ３ホモ接合体のいずれであるか、
の少なくともいずれかの結果に基づいて選抜することを特徴とする、親個体の選抜方法。
【請求項９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１２記載の発現ベクターが導入された形質転換植物。
【請求項１５】
イネ品種であることを特徴とする、請求項１４記載の形質転換植物。
【請求項１６】
イネ品種コシヒカリ、又はイネ品種コシヒカリ由来の染色体断片を有する植物であることを特徴とする、請求項１４記載の形質転換植物。
【請求項１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターが導入された形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、前記ポリペプチドを回収する工程を有することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネに属する植物個体が弱勢か否かを判定する方法、弱勢な植物の作製方法、並びに、イネの育種に用いられる親個体を選抜する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖隔離は、種間又は種内における遺伝子交換を防止又は制限することにより、種分化に寄与している（非特許文献１６及び４１）。作用機構に基づき、生殖隔離は、２の主要タイプである接合前隔離と接合後隔離とに分類される。この２種のうち、接合前隔離は最も一般的であり、地理的隔離、開花時期の相違、授粉媒介者特異性、花粉管伸長の不適合性等を通して、同種間交配と異種間交配の両方を防止する（非特許文献４６）。これに対して、接合後隔離は、接合体又は雑種が形成された後に起こる。接合後隔離は、しばしば、雑種における胎生期致死、種形成不全、弱勢、不妊等として現れる。この生殖隔離は、種又は集団に遺伝的な不適合をもたらし、動物と植物の両方の種分化に対して、有意に寄与する（非特許文献４２）。
【０００３】
接合後隔離のサブタイプ（非特許文献４６）のうち、雑種不妊と雑種弱勢は（生存力低下又はネクローシスともいう。）、雑種第一世代にみられるが、雑種崩壊は、不妊や弱勢形質を通して、雑種第二代（Ｆ２）及びそれ以降の世代に現れる。生殖隔離の遺伝的メカニズムは、理論的にＢａｔｅｓｏｎ−Ｄｏｂｚｈａｎｓｋｙ−Ｍｕｌｌｅｒ（ＢＤＭ)モデル（非特許文献１８、３９、及び１６）によって説明することができる。このモデルは、異なる種又は集団由来の２又はそれ以上の遺伝子の有害な相互作用が、接合後隔離を引き起こすと仮定している。
【０００４】
これまでに、ＢＤＭ不適合遺伝子の同定や、これらの遺伝子の植物における分子メカニズムの根拠については、ほとんど報告されていない。シロイヌナズナにおいて、重複遺伝子の相補的な欠損が、種間交配の雑種第二世代において胎生期致死を引き起こすことが分かっている（非特許文献１０）。他の２研究では、イネの雑種不妊の原因遺伝子が同定されている（非特許文献１３及び３０）。
【０００５】
弱勢形質は、雑種弱勢と雑種崩壊の両方においてみられ、植物の接合後隔離の一般的なタイプであると考えられている（非特許文献１２）。しかしながら、弱勢形質は、不妊や生存力低下といった他の表現型に比べてあまり注意がはらわれない。シロイヌナズナでは、自己免疫が雑種弱勢に関係していることが報告されている（非特許文献１１及び５）。しかしながら、他の植物では、弱勢形質の発現の生理学的及び分子学的メカニズムは、未だ確立されていない。イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）は、数多くの同種間及び異種間の交配において弱勢がみられているため、この現象を調査して理解するための大きな潜在力を秘めている（非特許文献６、４３、２０、２７、３２、１、及び３６）。
【０００６】
以前に、本発明者らは、コシヒカリとハバタキの雑種第二世代における弱勢形質を含む雑種崩壊について報告した（非特許文献１）。雑種崩壊は、接合後隔離のサブタイプの１つであり、雑種第二世代又はその後代に見られる。遺伝子解析により、この雑種崩壊は、２つの劣性遺伝子、ｈｙｂｒｉｄ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ２(ｈｂｄ２)及びｈｂｄ３によって制御されていることがわかった。親品種（図１ａ）やｈｂｄ２若しくはｈｂｄ３がヘテロ接合体である植物（図１ｂ、ｄ）とは異なり、ハバタキのｈｂｄ２領域由来の染色体断片とコシヒカリのｈｂｄ３領域由来の染色体断片とを有する植物は弱勢形質を示した（図１ｃ）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamamoto E, et al. (2007) Theor Appl Genet 115:187-194
【非特許文献２】Agrawal GK, et al. (2000a) Biochem Biophys Res Commun 274(1):157-165
【非特許文献３】Agrawal GK, et al. (2000b) Biochem Biophys Res Commun 278(2):290-298
【非特許文献４】Agrawal GK, et al. (2003) Plant Physiol Biochem 41(1):81-90
【非特許文献５】Alcazar R, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(1):334-339
【非特許文献６】Amemiya A, et al. (1963) Bull Nat Inst Agric Sci Ser D 10:139-226
【非特許文献７】Axtell MJ, et al. (2003) Cell 112(3):369-377
【非特許文献８】Belkhadir Y, et al. (2004) Plant Cell 16(10):2822-2835
【非特許文献９】Bergelson J, et al. (2001) Science 292(5525):2281-2285
【非特許文献１０】Bikard D, et al. (2009) Science 323(5914):623-626
【非特許文献１１】Bomblies K, et al. (2007) PLoS Biol. 2007 5(9):e236
【非特許文献１２】Bomblies K, et al. (2007) Nat Rev Genet 8(5):382-393
【非特許文献１３】Chen J, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(32):11436-11441
【非特許文献１４】Chisholm ST, et al. (2006) Cell 124(4):803-814
【非特許文献１５】Coaker G, et al. (2005) Science 308(5721):548-550
【非特許文献１６】Coyne JA, et al. (2004) Speciation. Sinauer Associates Sunderland, MA
【非特許文献１７】DeYoung BJ, et al. (2006) Nat Immunol 7(12):1243-1249
【非特許文献１８】Dobzhansky T (1937) Genetics and the Origin of Species. Columbia University Press, New York, NY
【非特許文献１９】Dodds PN, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 103(23):8888-8893
【非特許文献２０】Fukuoka S, et al. (1998) Theor Appl Genet 97:446-449
【非特許文献２１】Fukuoka S, et al. (2005) Rice Genet Newsl 22:29
【非特許文献２２】Gross SD, et al. (1998) Cell Signal 10(10):699-711
【非特許文献２３】Jia Y, et al. (2000) EMBO J 19(15):4004-4014
【非特許文献２４】Jones JD, et.al., (2006) Nature 444(7117):323-329
【非特許文献２５】Knippschild U, et al. (2005) Cell Signal 17(6):675-689
【非特許文献２６】Kojima Y, et al. (2005) Breed Sci 55(4):431-440
【非特許文献２７】Kubo T, et al. (2002) Theor Appl Genet 105:906-911
【非特許文献２８】Liu W, et al. (2003) Plant J 36: 189-202
【非特許文献２９】Lomsadze A, et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):6494-6506
【非特許文献３０】Long Y, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(48):18871-18876
【非特許文献３１】Mackey D, et al. (2002) Cell 108(6):743-754
【非特許文献３２】Matsubara K, et al. (2007) Theor Appl Genet 115(2):179-186
【非特許文献３３】Meyers BC, et al. (2003) Plant Cell 5(4):809-834
【非特許文献３４】Midoh N, et al. (1996) Plant Cell Physiol 37(1):9-18
【非特許文献３５】Mitsuhara I, et al. (2008) Mol Genet Genomics 279(4):415-427
【非特許文献３６】Miura K, et al. (2008) Breed Sci 58(2): 99-105
【非特許文献３７】Mondragon-Palomino M, et al. (2002) Genome Res 12:1305-1315
【非特許文献３８】Mucyn TS, et al. (2006) Plant Cell 18(10):2792-2806
【非特許文献３９】Muller HJ (1942) Biol Symp 6:71-124
【非特許文献４０】Nishimura A, et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(33):11940-11944
【非特許文献４１】Rieseberg LH, et al. (2007) Science 317(5840):910-914
【非特許文献４２】Rieseberg LH, et al. (2006) Nature 440(7083):524-527
【非特許文献４３】Sato YI, et al. (1988) Theor Appl Genet 75:723-724
【非特許文献４４】Schaffrath U, et al. (2000) Eur J Biochem 267(19):5935-5942
【非特許文献４５】Shimono M, et al. (2007) Plant Cell 19(6):2064-2076
【非特許文献４６】Stebbins GL Jr (1950) Variation and Evolution in Plants. Columbia University Press, New York, NY, pp189-250
【非特許文献４７】Tian D, et al. (2003) Nature 423(6935):74-77
【非特許文献４８】van Hulten M, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103(14):5602-5607
【非特許文献４９】Yang S, et al. (2006) Plant Mol Biol 62(1-2):181-193
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまでに、本発明者らによって、コシヒカリとハバタキの雑種において、ｈｂｄ２遺伝子及びｈｂｄ３遺伝子の相互作用によって弱勢形質が引き起こされることは報告されているものの、その分子的及び生理学的メカニズムは未だ明らかにされていない。
【０００９】
本発明は、ｈｂｄ２遺伝子及びｈｂｄ３遺伝子により引き起こされる弱勢を利用して、イネに属する植物個体が弱勢か否かを判定する方法、弱勢な植物の作製方法、並びに、イネの育種に用いられる親個体を選抜する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、ジャポニカ米の品種コシヒカリと、インディカ米の品種ハバタキとの雑種に現れる雑種崩壊の生理的及び分子学的根拠について鋭意研究した結果、ｈｂｄ２遺伝子及びｈｂｄ３遺伝子の詳細なマッピングを行い、ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｉ（ＣＫＩ１)遺伝子がｈｂｄ２の原因遺伝子であること、及び、ｈｂｄ３が植物において病害抵抗性（Ｒ）遺伝子の最も一般的な部類であるＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子クラスターに位置することを見出し、本発明を完成させた。  
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）  イネに属する植物が弱勢か否かを判定する方法であって、
植物細胞のゲノム中のＣＫＩ１（ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ Ｉ)遺伝子の塩基配列を調べる工程を有することを特徴とする、イネの弱勢判定方法、
（２）  前記ＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む場合に、前記植物細胞が採取された植物個体、又は前記植物細胞が分化して得られる植物個体は弱勢ではないと判定することを特徴とする、前記（１）記載のイネの弱勢判定方法、
（３）  イネに属する植物が弱勢か否かを判定する方法であって、
植物個体又は植物細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量を調べる工程を有することを特徴とする、イネの弱勢判定方法、
（４）  前記植物細胞が、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片とイネ品種ハバタキ由来の染色体断片とを含んでおり、
さらに、前記植物細胞の遺伝子型がｈｂｄ３／ｈｂｄ３であるか否かを調べる工程を有することを特徴とする、前記（１）記載のイネの弱勢判定方法、
（５）  ゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列であり、かつ、前記未分化細胞の遺伝子型がｈｂｄ３／ｈｂｄ３である場合に、前記植物細胞が採取された植物個体、又は前記植物細胞が分化して得られる植物個体が弱勢であると判定することを特徴とする、前記（４）記載のイネの弱勢判定方法、
（６）  イネに属する植物に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターを導入し、形質転換することを特徴とする、弱勢な植物の作製方法、
（７）  ゲノム中に、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片を含む植物細胞に、前記発現ベクターを導入することを特徴とする、前記（６）記載の弱勢な植物の作製方法、
（８）  イネの育種に用いられる親個体を選抜する方法であって、
（ａ）候補植物個体のゲノム中のＣＫＩ１（ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ Ｉ)遺伝子の塩基配列、又は、
（ｂ）候補植物個体が、ｈｂｄ３ホモ接合体、Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３ヘテロ接合体、Ｈｂｄ３ホモ接合体のいずれであるか、
の少なくともいずれかの結果に基づいて選抜することを特徴とする、親個体の選抜方法、
（９）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換細胞、
（１０）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（１２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（１３）  前記（１２）記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞、
（１４）  前記（１２）記載の発現ベクターが導入された形質転換植物、
（１５）  イネ品種であることを特徴とする、前記（１４）記載の形質転換植物、
（１６）  イネ品種コシヒカリ、又はイネ品種コシヒカリ由来の染色体断片を有する植物であることを特徴とする、前記（１４）記載の形質転換植物、
（１７）  配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターが導入された形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、前記ポリペプチドを回収する工程を有することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法、
（１８）  配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のイネの弱勢判定方法により、形態等の外観から弱勢か否かが判断できる時期より前に、遺伝子を解析した細胞が採取された個体又は当該細胞から得られた再生体が、弱勢形質を示すか否かを判定することができる。
また、本発明の弱勢な植物の作製方法により、所望のイネ個体に弱勢形質を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コシヒカリ(Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３)、ＮＩＬ−Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、及びＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の形態と遺伝型を示した図である。
【図２】ｈｂｄ２の詳細なマッピングの結果を示した図である。
【図３】ｈｂｄ３の詳細なマッピングの結果を示した図である。
【図４】ｈｂｄ２変異の起源を示した図である。
【図５】参考例１において、コシヒカリにおけるＣＫＩ１の組織特異的な発現を調べるための定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示した図である。
【図６】参考例２において、病原体応答マーカー遺伝子の発現解析の結果を示した図である。
【図７】実施例１において、コシヒカリ(Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３)、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３、及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体におけるＣＫＩ１の組織特異的な発現を調べるための定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示した図である。
【図８】実施例１において、コシヒカリ、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、コシヒカリＣＫＩ１過剰発現体、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体、及び空ベクターを導入した対照植物の形態を示した図である。
【図９】実施例２において、コシヒカリ及びハバタキのゲノムＤＮＡを鋳型とし、各分子マーカーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物のバンドパターンを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
生殖隔離は、かつて異種交配により得られた個体群間において、遺伝子流動を制限し、遺伝的多様性を促進するため、種分化において重要な役割を果たしている（非特許文献４２）。このため、種分化のよりよい理解のためには、生殖隔離に関与する分子学的及び生理学的メカニズムの解明が重要である。例えば、イネでは、雑種崩壊は、同種間交配と異種間交配の両方において一般的に観察される生殖隔離である。接合後の生殖隔離の典型例として、雑種第二代（Ｆ２）及びそれ以降の世代において、不妊や弱勢が現れる。
【００１５】
非特許文献１において報告されているように、ジャポニカ米の品種コシヒカリと、インディカ米の品種ハバタキとの雑種第二代（Ｆ２）において、雑種弱勢が観察される。この雑種弱勢は、ｈｂｄ２とｈｂｄ３の２種の劣性遺伝子により引き起こされることが分かっている。ｈｂｄ２はコシヒカリとハバタキの雑種においてみられる雑種崩壊に関与する劣性遺伝子の１つであり、第２染色体の長腕に位置している。また、ｈｂｄ２と相互作用し、弱勢形質を引き起こす劣性遺伝子ｈｂｄ３は、第１１染色体の長腕にある。
【００１６】
図１に、コシヒカリ(Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３)、ＮＩＬ−Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、及びＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の形態と遺伝型を示す。図中、遺伝型図の水平線はジェノタイピングに用いたマーカーの位置を示す。白抜き領域と斜線部領域は、それぞれ、コシヒカリとハバタキの染色体を示す。スケールバーは１ｍを表す。
【００１７】
図１に示す系統のうち、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３のみが、コシヒカリ（Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）と比べて、弱勢形質を示した。ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３は、コシヒカリの遺伝的背景にハバタキのｈｂｄ２ローカスのホモ接合性アレルを持ち込んだものである。
【００１８】
ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３（図１ｄ）とハバタキ（ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）では、弱勢形質は見られなかった。つまり、ハバタキのゲノムで見つかったその優性遺伝子であるＨｂｄ３は、ｈｂｄ２の有害な効果を抑制する。
【００１９】
このように、弱勢を引き起こす原因遺伝子が、ｈｂｄ２を含むハバタキ由来の染色体断片と、ｈｂｄ３を含むコシヒカリ由来の染色体断片とに、それぞれ存在していることは示唆されるものの、具体的な原因遺伝子は特定されていなかった。そこで、本発明者らは、詳細なマッピングを行うことにより、これらの原因遺伝子の特定を試みた。
【００２０】
＜マッピング方法＞
マッピングには、コシヒカリ及び図１に示す一連の準同質遺伝子系統（ＮＩＬｓ）を用いた。ＮＩＬｓの作製方法及びジェノタイピングに使用した分子マーカーは、非特許文献１の記載に準じて行った。
【００２１】
詳細なマッピングのために、１１，５２０のＮＩＬ−Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の個体と、５，７６０のＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の個体とをそれぞれ解析した。ジェノタイピング及び詳細な組換え体のスクリーニングに用いる各植物個体のゲノムＤＮＡは、ＴＰＳ（Ｔｒｉｓ−Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ−Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）メソッド法により以下のようにして抽出した。まず、ＴＰＳメソッドのために、約２ｃｍ長のイネの葉頂を採取し、Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井機械社製）を用いてＴＰＳバッファー［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＫＣｌ、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］中で粉砕した。遠心分離後、上清を回収し、等量のイソプロピルアルコールを加えた。遠心分離処理によりイソプロピルアルコール不溶性物を回収し、沈殿を７５％エタノール溶液で洗浄した。その後、この沈殿を乾燥させ、ＴＥバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解させた。ジェノタイピングに用いた分子マーカーのプライマーの塩基配列を、表１に示す。
【００２２】
【表１】
2011155966.tif 000002
【００２３】
なお、表１中、「Ｍａｅｋｅｒ  ｔｙｐｅ」の欄の「ＳＴＳ」は、ＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅ）マーカーを、「ｄＣＡＰＳ」はｄＣＡＰＳ（ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカーを示す。いずれも、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型の検出に汎用されているマーカーである。ＳＴＳ法は、配列タグ部位（ＳＴＳ）を増幅するプライマーセット（表１に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーのセット）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無やその塩基対長の相違を利用して、多型を検出する方法である。ｄＣＡＰＳ法は、多型部位を含む領域をＰＣＲにより増幅する際に、使用するプライマーにミスマッチを導入することによって増幅産物内に新たな制限酵素部位を作出し、ＰＣＲ産物が制限酵素により切断されるか否かによって、多型を検出する方法である。
【００２４】
＜ＤＮＡシークエンス解析及び候補領域の遺伝子予測＞
コシヒカリゲノムシークエンス解析は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、製造者による仕様書に従って行った。得られた塩基配列をｍａｑ（http://maq.sourceforge.net/）を用いて統合した。ハバタキの塩基配列では、ｈｂｄ２からＢＡＣクローンＨＡＢ０２７Ｉ１６が単離され、ｈｂｄ３からは、ＢＡＣクローンＨＡＢ０２４Ｐ１２、Ｈａｂａ４０Ｃ０９、及びＨＡＢ０４６Ｊ０５が単離された。ｈｂｄ２及びｈｂｄ３の候補領域における遺伝子予測は、イネゲノム自動アノテーションシステム（http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp/）とＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍ（非特許文献２９）とを用いて行った。
【００２５】
＜ｈｂｄ２の詳細なマッピング＞
図２に、ｈｂｄ２の詳細なマッピングの結果を示した。図２（ａ）は、第２染色体中のｈｂｄ２の位置を示した図であり、図２（ｂ）は、ｈｂｄ２の高分解能連鎖地図である。図２（ｂ）中、両端矢頭の矢印は、ｈｂｄ２の位置を示し、垂直のバーは分子マーカーの位置を示す。分子マーカー間の組換え体の数は、垂直のバーの間に記載した。
１１，５２０のＮＩＬ−Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の個体を用いてｈｂｄ２の詳細なマッピングを行った結果、ｈｂｄ２の候補領域が、ｄｊ１ａ−Ｆ３とｄｊ１ａ−Ｆ７の２つの分子マーカーの間に位置する１７ｋｂの長さにまで狭めることができた（図２ｂ）。
【００２６】
遺伝子予測により、この領域はオープンリーディングフレームが唯一つ同定され、これはＣＫＩ１をコードしていることが分かった。ＣＫＩ１は、ＲＡＰ２遺伝子座中のＯｓ０２ｇ０６２２１００に対応する。ＣＫＩ１は１４のエキソンからなり、４６３アミノ酸をコードしている。ＤＮＡ配列の比較から、このゲノム領域には、コシヒカリとハバタキとの間で多くの変異が存在していることがわかったが、アミノ酸配列の比較から、このファミリーにおいてあまり保存されていない可変ドメイン中の一アミノ酸のみが変化していることがわかった。このアミノ酸置換は可変ドメインに生じており、３５７番目のアミノ酸がコシヒカリではイソロイシンであるが、ハバタキではリジンに変わっている。なお、ハバタキのＣＫＩ１のアミノ酸配列（配列番号１）及びＤＮＡ配列（配列番号３）は、本発明者らにより初めて明らかにされたものである。
【００２７】
図２（ｃ）に、ＣＫＩ１遺伝子の一次構造を模式的に示した。図２（ｃ）中、塗りつぶした箱はコーディング配列を示す。左側の白抜きの箱は５’−ＵＴＲを表し、右側の白抜きの五角形は３’−ＵＴＲを表す。矢印は、ＣＫＩ１タンパク質において一アミノ酸変化が起こっているＳＮＰの位置を示している。また、図２（ｄ）に、ＣＫＩ１遺伝子の一次構造を模式的に示した。図２（ｄ）中、矢印は、一アミノ酸変化の位置を示している。図中に示す一塩基置換により、３５７番目のアミノ酸が、コシヒカリのイソロイシンからハバタキのリジンに変化していた。
【００２８】
後記参考例１に示すように、コシヒカリの様々な組織におけるＣＫＩ１転写レベルを解析するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＣＫＩ１転写は、葉、茎、栄養期茎頂、花及び根において検出された（図５）。他の組織に比べて、葉で最も高い転写レベルがみられた。
【００２９】
次いで、後記実施例１に示すように、様々な遺伝的及び生理学的背景を持つ葉のＣＫＩ１転写レベルを調べた。この解析には、コシヒカリ（Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３ 、及びＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３の葉を用いた。ｈｂｄ２アレルのホモ接合性の植物中のＣＫＩ１転写は、優性のＨｂｄ２アレルのホモ接合性の植物（コシヒカリ）よりも高かったが、その差は有意ではなかった（図７）。同様に、弱勢形質を示す植物（ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）は、正常に成育するＮＩＬ-ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３と比較して、ＣＫＩ１転写レベルに有意な差はなかった（図７）。
【００３０】
ｈｂｄ２は劣性遺伝子であるため、本発明者らはＣＫＩ１がｈｂｄ２の原因遺伝子であることを確認するために、コシヒカリのＣＫＩ１ゲノム領域を、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３のカルスに導入して形質転換し、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の弱勢形質を回復することを試みた。しかしながら、理由はわからないが、アグロバクテリウムを介した形質転換によっては、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３のカルスから全く再生体を得ることができなかった。
【００３１】
そこで、その替わりに、後記実施例１に示すように、コシヒカリとハバタキのＣＫＩ１コーディング配列を含む発現ベクターを作製し、この発現ベクターをコシヒカリのカルスに導入して形質転換し、ＣＫＩ１の過剰発現体を得た。この発現ベクターにおいては、ＣＫＩ１コーディング配列をイネのアクチンプロモーターの下流に配置することにより、このアクチンプロモーターによりＣＫＩ１発現を制御した。ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３のカルスと比べて、コシヒカリのカルスは再生しやすかった。
【００３２】
その結果、コシヒカリ由来のＣＫＩ１（以下、コシヒカリＣＫＩ１）のコーディング配列を含む発現ベクターで形質転換することにより得られたコシヒカリＣＫＩ１過剰発現体は、形質転換前のコシヒカリと同様の生育性を示した。これに対して、ハバタキ由来のＣＫＩ１（以下、ハバタキＣＫＩ１）のコーディング配列を含む発現ベクターで形質転換することにより得られたハバタキＣＫＩ１過剰発現体は、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３と同様に弱勢形質を示した（図７）。実際、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体の形態学的な特徴は、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３とあまり相違がなかった。これらの結果から、コシヒカリの遺伝的背景にハバタキのＣＫＩ１が存在していることにより、弱勢形質が引き起こされることが示唆された。よって、ＣＫＩ１がｈｂｄ２の原因遺伝子であることが確認された。つまり、コシヒカリとハバタキのＣＫＩ１における３５７番目のアミノ酸の一アミノ酸置換が、雑種崩壊の原因変異であると考えられる。
【００３３】
コシヒカリＣＫＩ１過剰発現体は弱勢形質を示さないため、ＣＫＩ１の過剰発現自体による有害効果の可能性は排除された（図７）。しかしながら、この結果は普通ではない。もしも、コシヒカリの遺伝的背景を持つ植物において、ハバタキＣＫＩ１が存在することが有害であるならば、ヘテロ接合体（Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２）は弱勢形質を示すはずである。しかしながら、ｈｂｄ２は完全に劣性遺伝子であり、ＮＩＬ−Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３は正常な成育形質を示す（図１ｂ）。この矛盾は、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体の実験の結果である。一つの説明は、過剰発現体において、コシヒカリＣＫＩ１が完全に過剰発現させたハバタキＣＫＩ１に置き換えられた、というものである。しかしながら、本発明者らは、この説明はありそうにないと考える。というのも、解析により、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体において、相対的なＣＫＩ１転写量は、コシヒカリタイプのＣＫＩ１の１０〜５０％程度であったためである（データ不掲載）。かわりに、弱勢形質は、コシヒカリタイプ又はハバタキタイプのＣＫＩ１の量によって決定されると推定される。おそらく、ｈｂｄ２／ｈｂｄ２は、弱勢形質を引き起こすために十分な量のＣＫＩ１を発現し得る唯一の遺伝型なのだろう。
【００３４】
答えを出すべきもう一つの疑問として、どちらのＣＫＩ１が弱勢形質を決定しているのであろうか、という疑問が挙げられる。もし、ハバタキＣＫＩ１が、機能が欠損したアレルである場合、例えば、キナーゼ活性や基質特異性が失われている場合であって、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体において、正常な機能を有するコシヒカリＣＫＩ１の量が減少しているのであれば、コシヒカリＣＫＩ１量の減少が弱勢形質を決定しているといえる。この仮説を検証するために、本発明者らは、ＣＫＩ１のアンチセンス鎖を過剰発現させることにより、ＣＫＩ１の転写レベルを低下させた形質転換系列を作製した。しかしながら、いずれの形質転換植物においても、異常な形質は何も発見されなかった（データ不掲載）。ＣＫＩ１量の低減が不十分であった可能性は除外できず、ＣＫＩ１の機能欠損変異体を観察する等のさらなる解析が必要とされるものの、コシヒカリＣＫＩ１量は、弱勢形質を決定していないと推定される。さらに、ハバタキＣＫＩ１の量が増えることによってこの弱勢形質が決定されるようであり、本発明者らの実験によっては、これと矛盾する証拠は得られなかった。したがって、本発明者らは、ｈｂｄ２はＣＫＩ１をコードし、可変ドメイン中の一アミノ酸が変化しているｈｂｄ２−ＣＫＩ１の量が増えることが、コシヒカリの遺伝的背景を持つ植物において弱勢形質を引き起こす、と結論した。
【００３５】
＜ｈｂｄ３の詳細なマッピング＞
図３に、ｈｂｄ３の詳細なマッピングの結果を示した。図３（ａ）は、第１１染色体中のｈｂｄ３の位置を示した図であり、図３（ｂ）は、ｈｂｄ３の高分解能連鎖地図である。図３（ｂ）中、両端矢頭の矢印は、ｈｂｄ３の位置を示し、垂直のバーは分子マーカーの位置を示す。分子マーカー間の組換え体の数は、垂直のバーの間に記載した。
５，７６０のＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の個体を用いてｈｂｄ３の詳細なマッピングを行った結果、候補領域が、コシヒカリで１６８．７ｋｂ、ハバタキで１３０．４ｋｂに狭められた（図３ｃ）。ただし、本発明者らは、十分なスケールの形質転換体を得ることが困難であったため、遺伝子の候補領域を、コシヒカリにおいて１６８．７ｋｂ、ハバタキにおいて１３０．４ｋｂにまでしか狭めることができず、詳細なマッピングによっては、ｈｂｄ３の原因遺伝子を同定することができなかった。２つの候補領域のＤＮＡ配列を比較したところ、両配列とも非常に多様であり、その大部分の領域において、類似する配列が見つからなかった。そして、この多様性のために、形質転換体を得ることが困難であったとわかった。
【００３６】
２つの塩基配列の遺伝子予測から、両配列がＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子クラスターを有していることが明らかになった。図３（ｃ）は、コシヒカリとハバタキのｈｂｄ３の候補領域同士を比較した模式図である。図中、「Ｋｏ」はコシヒカリの配列を、「Ｈａ」はハバタキの配列を、それぞれ表す。格子縞の五角形はＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子クラスターを示す。縦縞の五角形は、ＮＢＳドメインのみを含むコーディング配列を示す。横縞の五角形は、ＬＲＲドメインのみを含むコーディング配列を示す。斜線部の五角形は、その他の遺伝子クラスのコーディング配列を示す。白抜きの五角形は、機能未知のタンパク質を示す。黒の五角形は、転移性因子を示す。ＮＢＳ−ＬＲＲに関連する遺伝子は、太線で囲んだ。遺伝子に隣接する５桁の数値は、対応する最新のＲＡＰ２遺伝子座（Ｏｓ１１ｇ０４ＸＸＸＸＸ）である。ＬＯＣは、ＭＳＵ  Ｏｓａ１  Ｒｉｃｅ  Ｌｏｃｉ  ＬＯＣ Ｏｓ１1ｇ２９０００に対応する。２つの配列を繋ぐ網掛け領域は、ＤＮＡ配列に類似性が認められた領域を表している。垂直のバーは分子マーカーの位置を示す。
【００３７】
ＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子クラスターは、しばしば多様な配列が観察されている（非特許文献９）。ＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子は、植物において、病害抵抗性（Ｒ）遺伝子の最も一般的な部類である（非特許文献２４）。ｈｂｄ３の候補領域中にある予測された遺伝子の幾つかは、核酸結合部位（ＮＢＳ）とロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインの両方を含んでいる（図３ｃ、格子縞の５角形）。その一方で、その他の予測された遺伝子は、ＮＢＳ（図３ｃ、縦縞の５角形）又はＬＲＲ（図３ｃ、横縞の５角形）のいずれか一方のみを含んでいた。
【００３８】
ＮＢＳ−ＬＲＲは、病原体による攻撃に応答して、免疫シグナルを誘発する（非特許文献１４及び１７）。シロイヌナズナにおいて、Bomblies ら (非特許文献１１)と Alcazarら (非特許文献５) は、ＮＢＳ−ＬＲＲが雑種弱勢に関与していることを示唆し、弱勢形質において免疫応答シグナルの活性化することを示した。ｈｂｄ３はＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子クラスターに位置しているため、シロイヌナズナの雑種弱勢と同様に、自己免疫応答が弱勢形質に関与していると考えられた。
【００３９】
この仮説を確かめるため、本発明者らは、病原体応答における幾つかの分子マーカー遺伝子の発現解析を行った。具体的には、後記参考例２に示すように、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、コシヒカリ、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体における病原体応答マーカー遺伝子の発現レベルを調べた。病原体応答マーカー遺伝子は、免疫応答シグナルの活性化によって上方制御されることが知られている。
【００４０】
この結果、これらの病原体応答マーカー遺伝子の大部分は、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体では、いかなる病原体にも感染していない状態で、コシヒカリに比べて上方制御されていることがわかった（図６）。加えて、この２つの発現プロファイルは非常に良く似ており、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体は、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３の表現型と、形態学的特徴のみならず、生理学的メカニズムにおいても、全くよく似ていることが示唆された。
【００４１】
これらの結果は、ＮＢＳ−ＬＲＲ（ｓ）がｈｂｄ３の原因遺伝子からなるという仮説を支持する。有意な上方制御が観察されたにもかかわらず、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３とハバタキＣＫＩ１過剰発現体の両方において、これらの遺伝子の発現レベルは、病原体に感染した植物（非特許文献３５）に比べて低かった。よって、雑種崩壊における免疫応答シグナルは、実際の病原体により攻撃された場合よりも低いレベルで活性化されることが示唆された。
【００４２】
活性化された免疫応答シグナルを維持するために必要とされる高い細胞代謝は、植物の生育を抑制することが報告されている（非特許文献４７及び４８）。ＮＢＳ−ＬＲＲは免疫応答を誘発するため、ｈｂｄ２及びｈｂｄ３による雑種崩壊には、免疫応答シグナルが関与していると考えられた。病原体応答マーカー遺伝子の発現解析の結果もこれを裏付ける。雑種の弱勢における自己免疫応答の関与は、既にシロイヌナズナにおいて報告されている（非特許文献１１及び５）。本発明者らの結果は、このメカニズムが、イネにおいても存在することを示唆している。さらに、この種のメカニズムが、植物における弱勢形質による接合後隔離の証明のための大きな可能性があることも暗示される。
【００４３】
すなわち、病原体応答マーカー遺伝子の過剰発現解析により、この雑種崩壊における弱勢形質は、自己免疫応答に起因し得ることが示唆された。これまでのところ、本発明者らによるこの成果は、イネにおける自己免疫応答と接合後隔離との関連を示す初めての証拠である。よって、この結果は、植物における接合後隔離を構築する分子的及び進化学的メカニズムの理解のための新規な知見を提供するものである。
【００４４】
なお、ｈｂｄ３には、その他のクラスの遺伝子も存在していたが、シロイヌナズナの雑種弱勢の原因遺伝子がＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子クラスターに位置していることが、既に２つ報告されていたため、本発明者らは、１又はそれ以上のＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子がｈｂｄ３の原因遺伝子であると推察した。さらに、表現型の類似性（例えば、弱勢）と今回なされた詳細なマッピングの結果の詳細により、本研究の雑種崩壊も、ＮＢＳ−ＬＲＲ（ｓ）によって引き起こされることが示唆された。
【００４５】
一般的に、自己免疫応答を引き起こすＮＢＳ−ＬＲＲ中の変異は、優性となる。しかしながら、コシヒカリにおけるｈｂｄ３は劣性遺伝子であり、ｈｂｄ３がＮＢＳ−ＬＲＲ（ｓ）をコードするという推察と矛盾する。ＲＰＭ１は、シロイヌナズナにおいて最も解析が進んでいるＮＢＳ−ＬＲＲであるが、ＲＰＭ１−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＲＩＮ４）のレベルを減少させた遺伝的背景を持つシロイヌナズナにおいて、量依存的に弱勢形質を引き起こす（非特許文献８）。これにより、ある状況においては、ＮＢＳ−ＬＲＲ（ｓ）により誘発される免疫応答シグナルの活性が、アレルの数に影響されることが示唆される。実際に、ＮＢＳ−ＬＲＲをコードしているシロイヌナズナの雑種弱勢遺伝子ＤＭ１は優性であるが、この遺伝子のホモ接合性アレルは、ヘテロ接合体よりもより強い表現型を引き起こす（非特許文献１１）。それ故、この雑種崩壊において、検出可能な免疫応答を引き起こすためには、ｈｂｄ３中のＮＢＳ−ＬＲＲが、１つ（ヘテロ接合性）ではなく２コピーあることが必要である可能性がある。
【００４６】
この研究の結果から、雑種崩壊に関与するメカニズムとして、おそらく、ｈｂｄ３ローカス中の１又はそれ以上のＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子によって活性化された自己免疫応答がある。ＮＢＳ−ＬＲＲ（ｓ）は、エフェクターにより誘発される免疫システムに関与しており、当該システムにおいて、ＮＢＳ−ＬＲＲが非病原性（Ａｖｒ）タンパク質を認識する（非特許文献１４及び１７）。Ａｖｒタンパク質は、同族のＲ遺伝子が存在しない場合に毒性機能を授ける特殊な病原性エフェクターである。ＮＢＳ−ＬＲＲはＡｖｒタンパク質を直接認識することができ（非特許文献２３及び１９）、間接的に認識することもできる（非特許文献３１、７、１５、及び３８）。間接的な認識メカニズムでは、ＮＢＳ−ＬＲＲは、Ａｖｒタンパク質によって引き起こされた細胞内部にある細胞成分の変化を検出する。
【００４７】
ショウジョウバエ及び酵母においては、ＣＫＩ１ファミリーは細胞周期、形態、サーカディアンリズム、及びシグナル伝達等の多くの細胞機能に関与している（非特許文献２２及び２５）。アンチセンス系統の解析によって、本研究におけるＣＫＩ１は、根伸長及びホルモン感受性に関与していることが報告されている（非特許文献２８）。しかしながら、ＣＫＩ１が免疫応答に関与していることを示唆する証拠はない。
【００４８】
したがって、この雑種崩壊における最も妥当でありそうなメカニズムは、ｈｂｄ２−ＣＫＩ１がＡｖｒタンパク質又はＡｖｒタンパク質によって阻害されるタンパク質のように機能し、ｈｂｄ３中の１又はそれ以上のＮＢＳ−ＬＲＲｓが、直接的又は間接的にｈｂｄ２−ＣＫＩ１を認識し、免疫応答シグナルを誘発する、というものである。
【００４９】
＜ｈｂｄ変異の起源＞
さらに本発明者らは、ｈｂｄ２の原因変異を決定した。世界イネコレクション（非特許文献２６）に登録されている６９の植物を用いて、イネにおけるｈｂｄ２変異の分布を調べた。ｈｂｄ２変異の分布は、各登録植物のｈｂｄ２の変異部位のシークエンス解析により行った。具体的には、各植物から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーペア（５’−ＣＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧ−３’と５’−ＴＣＣＡＧＡＡＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣ−３’）を用いてｈｂｄ２変異部位の増幅を行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析した。Ｐｅｔａ及びＩＲ２６２のＤＮＡサンプルは、親切にも国際イネ研究所より提供していただいた。調べられた６９登録植物のうち、Ｍｉｌｙａｎｇ２３のみがｈｂｄ２の変異を有していた。
【００５０】
ハバタキとＭｉｌｙａｎｇ２３は、いずれも、最近の育種プログラムによって得られたインディカタイプの近代品種である。ハバタキの系図は複雑すぎたため、Ｍｉｌｙａｎｇ２３の系図のみを、ｈｂｄ２の親ドナーを同定するためのさらなる解析において検討した。Ｍｉｌｙａｎｇ２３の祖先親に対して、ｈｂｄ２のジェノタイプを調べた結果を図４に示す。図４（ａ）はＭｉｌｙａｎｇ２３の系図であり、四角で囲われている系統が、ｈｂｄ２変異を有する。また、図４（ａ）のＭｉｌｙａｎｇ２３の系図に含まれている品種及び在来種のリストを図４（ｂ）に示す。図中、「Ｎ．Ａ．」はｈｂｄ２変異の有無を解析していないことを意味する。また、「？」は起源が不明であることを意味する。
【００５１】
この結果、ｈｂｄ２の変異は、インドネシア産のインディカタイプの陸稲であるＰｅｔａから受け継いだことがわかった。ｈｂｄ２変異は、Ｐｅｔａにおいて、有害な効果なしで自然に生じたもののようである。そして、栽培品種内において中立的に保存され、イネ育種プログラムを通して、少数の近代品種に偶然組み込まれたと推察される。
【００５２】
ｈｂｄ２は、現在までのところ、イネの種分化にはあまり影響していなかった。この変異は、おそらく、ある集団において、中立的な動向を通して、予期せぬ好都合な効果又は遺伝的ヒッチハイキングとともに欠失又は固定されたのであろう。よって、雑種崩壊は、ＢＤＭ不適合形成の最初のステップにおいてのみ起こる。
【００５３】
Bomblies と Weigel（非特許文献１２）によって十分に議論されたように、雑種弱勢における自己免疫応答の重要性は、本研究の結果によって支持される。加えて、本発明者らは、幾つかの最近の研究において報告されているように（非特許文献１１及び５）、ＮＢＳ−ＬＲＲｓが雑種弱勢に重要な貢献を果たしていることも示唆した。ＮＢＳ−ＬＲＲは、他の生物種よりも植物において、大きなファミリーを構成しており、イネでは５００（非特許文献４９）、シロイヌナズナではおよそ１５０（非特許文献３３）を数える。加えて、ＮＢＳ−ＬＲＲｓは、多様化淘汰によって、多様化する傾向にある（非特許文献３７及び４９）。これらの条件により、植物のＮＢＳ−ＬＲＲｓは、Ａｖｒタンパク質の他にも、他の集団や種において生産されている遺伝子産物を含む多くの基質を認識していることが示唆される。本発明者らは、ｈｂｄ２の変異のようなささいな変異が、他の個体や種由来の高度に多様化したＮＢＳ−ＬＲＲｓのターゲットとなる可能性があると予測する。したがって、他の遺伝子クラスと比べて、植物のＮＢＳ−ＬＲＲｓは、雑種弱勢を構築し、種分化における進化力となる可能性が高い。雑種弱勢は、イネのみならず（非特許文献６、４３、２０、２１、２７、３２、１、及び３６）、他の植物種においても報告されている（非特許文献１２）。他の植物においてこの現象の原因遺伝子を同定することによって、この仮説の有効性を決定されるだろう。
【００５４】
以上に述べたように、本発明者らによって、ＣＫＩ１遺伝子がｈｂｄ２の原因遺伝子であること、コシヒカリにハバタキＣＫＩ１を過剰発現させることにより、弱勢形質を有する植物個体が得られることが明らかにされた。本発明は、これらの知見に基づきなされたものである。
【００５５】
＜イネの弱勢判定方法＞
本発明のイネの弱勢判定方法は、イネに属する植物が弱勢か否かを判定する方法であって、植物細胞のゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列を調べる工程を有することを特徴とする。判定対象とする植物細胞は、イネの個体から採取したものであってもよく、カルス等の脱分化処理により得られた未分化細胞であってもよく、形質転換処理がなされた細胞であってもよい。
【００５６】
本発明のイネの弱勢判定方法において判定対象とされる植物細胞は、イネに属する植物由来の細胞であれば特に限定されるものではなく、栽培品種であってもよく、在来品種であってもよく、イネに属する植物を親個体とする雑種であってもよい。本発明においては、コシヒカリ又はハバタキの遺伝的背景を有する植物細胞であることが好ましい。このような植物細胞として、例えば、コシヒカリ、ハバタキ、及び種子親と花粉親の少なくともいずれか一方がコシヒカリ若しくはハバタキである雑種又はその後代個体、並びに、これらの植物細胞の形質転換細胞等が挙げられる。
【００５７】
植物細胞のゲノムにおいて、ＣＫＩ１遺伝子が含まれる遺伝子座が、Ｈｂｄ２ホモ接合体（Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２）又はヘテロ接合体（Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２）である場合には、当該植物細胞が採取された植物個体、又は当該植物細胞から得られる再生体は、正常な成育性を示す。これに対して、ｈｂｄ２ホモ接合体（ｈｂｄ２／ｈｂｄ２）である場合には、ｈｂｄ３が含まれる遺伝子座によっては、当該植物細胞が採取された植物個体、又は当該植物細胞から得られる再生体は、弱勢を示す。
【００５８】
具体的には、ゲノムＤＮＡ中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む場合には、弱勢ではない、と判定することができる。一方、両方の染色体において、ゲノムＤＮＡ中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列である場合には、弱勢である可能性があると判定される。ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、ハバタキＣＫＩ１のアミノ酸配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、コシヒカリＣＫＩ１のアミノ酸配列である。
【００５９】
なお、ゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列の測定は、常法により行うことができる。
また、特に、ＣＫＩ１の３６７番目のアミノ酸をコードする領域の塩基配列を解析することが好ましい。
【００６０】
また、判定対象であるイネが形質転換体である場合、ゲノムＤＮＡ中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む場合であっても、十分量のハバタキＣＫＩ１が発現している場合には、弱勢を示す。このため、植物個体又は植物細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ハバタキＣＫＩ１）の発現量を調べることによっても、弱勢か否かを判定することができる。
【００６１】
ハバタキＣＫＩ１の発現量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等の当該技術分野において公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、ハバタキＣＫＩ１と特異的に結合する抗体を用いて、免疫反応を利用して検出することもできる。なお、本発明及び本願明細書において、「ハバタキＣＫＩ１と特異的に結合する抗体」とは、コシヒカリＣＫＩ１に対する結合性よりも、ハバタキＣＫＩ１に対する結合性が有意に高い抗体を意味し、ハバタキＣＫＩ１以外のあらゆる物質と結合しないまでの特異性を要求するものではない。このような抗体は、ハバタキＣＫＩ１の３６７番目のアミノ酸を含む部分ペプチドを抗原として常法により作製することができる。
【００６２】
また、判定対象のイネが、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片とイネ品種ハバタキ由来の染色体断片とを含んでいる場合には、さらに、ｈｂｄ３領域として、ハバタキ由来の染色体断片を有しているか否かを調べることにより、ｈｂｄ２ホモ接合体である場合に、当該植物細胞が採取された植物個体、又は当該植物細胞から得られる再生体が弱勢を示すか否かを判定することができる。
【００６３】
ｈｂｄ３を含む遺伝子座が、Ｈｂｄ３ホモ接合体（Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）又はヘテロ接合体（Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）である場合には、ｈｂｄ２ホモ接合体であったとしても、当該植物細胞が採取された植物個体、又は当該植物細胞から得られる再生体は正常な成育性を示す。これに対して、ｈｂｄ３ホモ接合体（ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）であって、ｈｂｄ２ホモ接合体である場合には、当該植物細胞が採取された植物個体、又は当該植物細胞から得られる再生体は、弱勢を示す。
【００６４】
ｈｂｄ３を含む遺伝子座の遺伝子型は、ｈｂｄ３と連鎖する分子マーカーを用いて調べることができる。このような分子マーカーとしては、例えば、図３（ｂ）及び表１に記載の分子マーカー等が挙げられる。
【００６５】
具体的には、ＳＴＳマーカーを用いる場合には、判定対象のイネから抽出したＤＮＡを鋳型として、各ＳＴＳマーカー特有のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無や得られたＰＣＲ産物の大きさを測定し、コシヒカリ若しくはハバタキから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合の結果と比較する。
【００６６】
後記実施例２において示すように、例えば、分子マーカーｄｊ１ｂ−１１の場合には、コシヒカリから抽出したＤＮＡを鋳型として、表１に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行うと、約２００ｂｐのＰＣＲ産物が得られるのに対して、ハバタキから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合には、約２３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。そこで、判定対象のイネから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合に、約２００ｂｐのＰＣＲ産物が得られた場合には、当該イネはｈｂｄ３ホモ接合体（ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）であり、約２００ｂｐと約２３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた場合には、当該イネはヘテロ接合体（Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）であり、約２３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた場合には、当該イネはＨｂｄ３ホモ接合体（Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）である。
【００６７】
ｄＣＡＰＳマーカーを用いる場合には、判定対象のイネから抽出したＤＮＡを鋳型として、各ｄＣＡＰＳマーカー特有のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物が、特定の制限酵素により切断されるか否かを測定し、コシヒカリ若しくはハバタキから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合の結果と比較する。
【００６８】
分子マーカーｄｊ１ｂ−１２又はｄｊ１ｂ−２０の場合には、表１に記載の各プライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合に、コシヒカリから抽出したＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物は制限酵素Ｈｈａ  Ｉにより切断されるのに対して、ハバタキから抽出したＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物は切断されない。そこで、判定対象のイネから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物が、制限酵素Ｈｈａ  Ｉにより切断された場合には、当該イネはｈｂｄ３ホモ接合体（ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）であり、切断されなかった場合には、当該イネはＨｂｄ３ホモ接合体（Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）又はヘテロ接合体（Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）である。
【００６９】
分子マーカーｄｊ１ｂ−２３の場合には、表１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合に、コシヒカリから抽出したＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物は制限酵素Ｓｍａ  Ｉにより切断されるのに対して、ハバタキから抽出したＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物は切断されない。そこで、判定対象のイネから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物が制限酵素Ｓｍａ  Ｉにより切断された場合には、当該イネはｈｂｄ３ホモ接合体（ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）であり、切断されなかった場合には、当該イネはＨｂｄ３ホモ接合体（Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）又はヘテロ接合体（Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）である。
【００７０】
なお、コシヒカリ由来の染色体断片とハバタキ由来の染色体断片とを含んでいるイネとしては、例えば、コシヒカリとハバタキの雑種及びその後代個体や、コシヒカリの染色体の一部をハバタキ由来の染色体断片で置換した染色体断片置換系統等が挙げられる。
【００７１】
本発明のイネの弱勢判定方法を用いることにより、育苗中（すなわち、圃場に栽培する前）のイネに対して、各植物個体の弱勢を判定することができる。弱勢のイネからは、通常は充分な米が収穫できないため、圃場に栽培したイネの中に弱勢が出てしまうと、栽培場所や労力が無駄になってしまう。弱勢と判定された幼苗を、圃場へ移植する前に取り除くことにより、このような無駄を回避することができる。
【００７２】
＜弱勢な植物の作製方法＞
本発明の弱勢な植物の作製方法は、イネに属する植物に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターを導入し、形質転換することを特徴とする。植物中に、充分量のハバタキＣＫＩ１を発現させることにより、当該植物を弱勢とすることができる。
【００７３】
本発明の弱勢な植物の作製方法において発現ベクターが導入される植物は、本発明のイネの弱勢判定方法と同様に、イネに属する植物であれば特に限定されるものではない。中でも、ゲノム中に、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片を含む植物、又はハバタキの遺伝的背景を有する植物であることが好ましく、コシヒカリの遺伝的背景を有する植物であることがより好ましい。
【００７４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターは、当該ポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを、周知の遺伝子組み換え技術を用いて発現ベクターに組み込むことにより作製することができる。
【００７５】
本発明の弱勢な植物の作製方法において用いられる発現ベクターは、植物細胞において転写が可能なプロモーター配列と、ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を有する発現ベクターであって、植物細胞に導入した場合に、組み込まれたポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物の作製のために通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。該発現ベクターとして、例えば、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。
【００７６】
該発現ベクターは、配列番号１で表されるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組み込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００７７】
本発明において、発現ベクターを用いて形質転換植物を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、アグロバクテリウム法で行うことが好ましい。なお、形質転換植物細胞や形質転換植物は、薬剤耐性等を指標として選抜することができる。また、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。
【００７８】
周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
【００７９】
＜親個体の選抜方法＞
本発明の親個体の選抜方法は、本発明のイネの弱勢判定方法と同様にして親個体の弱勢を判定し、この結果を、育種に用いる親個体の選抜に利用したものである。より具体的には、イネの育種に用いられる親個体を選抜する方法であって、下記（ａ）又は（ｂ）の少なくともいずれかの結果に基づいて選抜することを特徴とする。
（ａ）候補植物個体のゲノム中のＣＫＩ１遺伝子の塩基配列、又は
（ｂ）候補植物個体が、ｈｂｄ３ホモ接合体、Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３ヘテロ接合体、Ｈｂｄ３ホモ接合体のいずれであるか。
【００８０】
遠縁交雑の多くの場合には、生殖隔離により、雑種弱勢が引き起こされる。本発明の親個体の選抜方法においては、親個体中の弱勢に影響する遺伝子を調べ、その結果に基づいて交配の相手個体を選択することにより、遠縁交雑による雑種弱勢の一部を回避することができ、育種の幅を広げる効果が期待できる。
【００８１】
一般的な育種では、まず、固定系統（品種）同士を交配する。各固定系統の個体のｈｂｄ２を含む遺伝子座（ＣＫＩ１遺伝子が含まれる遺伝子座）及びｈｂｄ３を含む遺伝子座の遺伝子型は、次の４つのタイプに分類可能である。
パターン１：Ｈｂｄ２ホモ接合体であり、Ｈｂｄ３ホモ接合体である個体（Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）。
パターン２：Ｈｂｄ２ホモ接合体であり、ｈｂｄ３ホモ接合体である個体（Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）。
パターン３：ｈｂｄ２ホモ接合体であり、Ｈｂｄ３ホモ接合体である個体（ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）。
パターン４：ｈｂｄ２ホモ接合体であり、ｈｂｄ３ホモ接合体である個体（ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）。
【００８２】
パターン４の個体は弱勢であり、固定系統の中には存在しないと仮定した場合には、パターン１〜３の中では６通りの交配が考えられる。具体的には、パターン１の個体同士の交配、パターン２の個体同士の交配、パターン３の個体同士の交配、パターン１の個体とパターン２の個体との交配、パターン１の個体とパターン３の個体との交配、及びパターン２の個体とパターン３の個体との交配である。理論的には、この６通りの交配のうち、パターン２の個体とパターン３の個体との交配では、交配により得られる後代個体において雑種崩壊が起こる。一方で、パターン２の個体とパターン３の個体との交配以外では、雑種崩壊は起こらない。
【００８３】
弱勢遺伝子近傍は確率的に弱勢個体と行動を共にする。このため、弱勢遺伝子近傍に有望な形質が存在していたとしても発見し難く、弱勢遺伝子近傍の遺伝子効果は弱勢形質によって隠されてしまう可能性が高い。本発明の親個体の選抜方法を用いて、パターン２の個体とパターン３の個体との組み合わせ以外の組み合わせを親個体として選択することにより、雑種崩壊に伴う問題を回避することができる。
【００８４】
一方で、親個体として、パターン２の個体とパターン３の個体との組み合わせを選択することにより、雑種第一世代は親個体と同様に正常に成育し、雑種第二世代には、ある一定の確率で弱勢が引き起こされるような品種を育種することもできる。雑種第二世代に弱勢を引き起こすことにより、連続した再生産（コピー）を防止することができる。
【００８５】
また、パターン２の個体とパターン３の個体との交配により得られる雑種集団内の個体同士を交配させて新品種を育成する場合に、例えば、候補植物個体の一方が、ヘテロ接合体（Ｈｂｄ２／ｈｂｄ２）であった場合、他方の親個体として、Ｈｂｄ２ホモ接合体（Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２）を選ぶことにより、雑種第一世代における雑種弱勢を確実に回避することができる。同様に、候補植物個体の一方がｈｂｄ３ホモ接合体であった場合、他方の親個体として、Ｈｂｄ３ホモ接合体（Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）を選ぶことにより、雑種第一世代における雑種弱勢を確実に回避することができる。
【００８６】
本発明の親個体の選抜方法において、親個体の候補植物としては、本発明のイネの弱勢判定方法と同様に、イネに属する植物であれば特に限定されるものではない。中でも、ゲノム中に、イネ品種コシヒカリ由来の染色体断片を含む植物、又はハバタキの遺伝的背景を有する植物であることが好ましく、コシヒカリの遺伝的背景を有する植物であることがより好ましい。
【００８７】
その他、大腸菌や酵母、培養細胞等の汎用されている組換えタンパク質発現系を利用することにより、ハバタキＣＫＩ１やコシヒカリＣＫＩ１の組換えタンパク質を製造することができる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現し得る発現ベクターが導入された形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、前記ポリペプチドを回収する工程により、組換えタンパク質を製造することができる。
【００８８】
発現ベクターへのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組み込み、作製された発現ベクターの宿主細胞への導入、発現させたポリペプチドの回収・精製等は、特に限定されるものではなく、宿主の種類等を考慮して、組換えタンパク質を製造する場合に通常用いられている方法の中から適宜選択して行うことができる。
【実施例】
【００８９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９０】
［参考例１］
定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、コシヒカリの様々な組織におけるＣＫＩ１転写レベルを解析した。
具体的には、まず、コシヒカリの葉、茎、栄養期茎頂、花、繁殖期茎頂、及び根を採取し、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次いで、約１μｇのトータルＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）プライマーとＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、最初のｃＤＮＡ鎖を合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）及びＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて実施した。
この解析のために、線形のスタンダードカーブと指定された転写レベルの対数値に対するサイクル数の閾値とを、各ＰＣＲ産物の希釈系列（１０−１７、１０−１８、１０−１９、及び１０−２０Ｍ）を用いて作成した。次いで、全ての未知サンプルの転写レベルを、スタンダードカーブを用いて決定した。ＵＢＱ１は、ｃＤＮＡ濃度差をノーマライズするための内部標準物質として用いた。定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーペアの塩基配列を、表２に示す。
【００９１】
【表２】
2011155966.tif 000003
【００９２】
図５に、コシヒカリにおけるＣＫＩ１の組織特異的な発現を調べるための定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示した。データは、５回の試行の平均値を表している。バーは、標準偏差（ｍｅａｎｓ±ＳＤ）を表す。ＵＢＱ１は、ノーマライゼーションのための内部標準として用いた。この結果、ＣＫＩ１転写は、葉、茎、栄養期茎頂、花及び根において検出された。他の組織に比べて、葉で最も高い転写レベルがみられた。
【００９３】
［参考例２］
定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、コシヒカリ、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体における病原体応答マーカー遺伝子の発現レベルを調べた。本実験では、病原体応答マーカー遺伝子として、ＰＲ１ａ（非特許文献２参照。）、ＰＲ１ｂ（非特許文献３参照。）、ＰＲ２（非特許文献４５参照。）、ＰＲ４（非特許文献３参照。）、ＧＳＴ−ｕ４（非特許文献４５参照。）、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ４５０（非特許文献４５参照。）、ＰＢＺ１（非特許文献３４参照。）、及びＬｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（非特許文献４４参照。）を用いた。各遺伝子の配列データは、Ｒｉｃｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲＡＰ−ＤＢ)から入手可能である。各病原体応答マーカー遺伝子のｌｏｃｕｓ  ＩＤを図６（ａ）に示す。
具体的には、まず、６枚葉ステージの植物体から採取した４枚の葉から、参考例１と同様にしてトータルＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、表２に記載のプライマーペアを用いて、参考例１と同様にして定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、各病原体応答マーカー遺伝子の転写レベルを調べた。解析結果を図６（ｂ）に示す。図中、「ＨａＣＫＩ１」はハバタキＣＫＩ１過剰発現体を表す。また、バーは、標準偏差（ｍｅａｎｓ±ＳＤ）を表す。ＵＢＱ１は、ノーマライゼーションのための内部標準として用いた。
【００９４】
この結果、いかなる病原体にも感染していない状態で、コシヒカリに比べて、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体では、解析された病原体応答マーカー遺伝子の大部分が上方制御されていた。
【００９５】
病原体応答マーカー遺伝子の過剰発現解析により、この雑種崩壊における弱勢形質は、自己免疫応答に起因し得ることが示唆された。これまでのところ、本研究の成果は、イネにおける自己免疫応答と接合後隔離との関連を示す初めての証拠である。この結果は、植物における接合後隔離を構築する分子的及び進化学的メカニズムの理解のための新規な知見を提供するものである。
【００９６】
［実施例１]
定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、様々な遺伝的及び生理学的背景を持つ葉のＣＫＩ１転写レベル及び弱勢形質の有無を調べた。本解析には、コシヒカリ(Ｈｂｄ２／Ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３)、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３、コシヒカリＣＫＩ１過剰発現体、及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体を用いた。対照として、空ベクターを導入した形質転換細胞を用いた。
まず、以下のようにして、ＣＫＩ１過剰発現体及びハバタキＣＫＩ１過剰発現体を作製した。コーディング配列を、プライマーペア（５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧ−３’と５’−ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡ−３’）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅した。増幅された核酸断片は、ｐＣＲII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込んだ。クローンは塩基配列を解析し、ＰＣＲ中に塩基が置換されなかったことを確認した。クローンの核酸断片は、制限酵素ＸｂａＩ及びＳｍａI（タカラ社製）を用いて切り出し、バイナリーベクターｐＮｉＲ：：ＮｉＲｃＤＮＡ：：ＮｉＲｔに組み込み、このバイナリーベクターを、ニシムラらの方法（非特許文献４０）によりコシヒカリのカルスに形質転換した。両ＣＫＩ1の発現は、ｐＢＩ−Ｈｍ２由来のイネアクチンプロモーターによって制御した。
次いで、各イネの葉を採取し、参考例１と同様にして定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＣＫＩ１の転写レベルを調べた。測定結果を図７に示す。図７中、Ｌ１〜Ｌ７はハバタキＣＫＩ１過剰発現体の結果を示している。また、バーは、標準偏差（ｍｅａｎｓ±ＳＤ）を表す。ＵＢＱ１は、ノーマライゼーションのための内部標準として用いた。
【００９７】
この結果、ｈｂｄ２アレルのホモ接合性の植物中のＣＫＩ１転写は、優性のＨｂｄ２アレルのホモ接合性の植物（コシヒカリ）よりも高かったが、その差は有意ではなかった。同様に、弱勢形質を示す植物（ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）は、正常に成育するＮＩＬ-ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３と比較して、ＣＫＩ１転写レベルに有意な差はなかった。
【００９８】
また、コシヒカリＣＫＩ１過剰発現体では、コシヒカリ、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、及びＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３と比較して、ＣＫＩ１転写が明らかに増加していた（データは図示せず。）。しかしながら、これらの全ては、コシヒカリと類似した正常な表現型を示していた。一方で、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体では、ＣＫＩ１転写レベルが、コシヒカリ、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、及びＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３と比較して、個体差はあるものの、明らかに高かった（図７）。
【００９９】
図８は、コシヒカリ、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３、コシヒカリＣＫＩ１過剰発現体、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体、及び空ベクターを導入した対照植物の形態を示した図（写真）である。スケールバーは１ｍを表す。さらに、表３に、各系統の背丈とひこばえの数を示した。表３中の数値は、各系統の７個体の平均値及び標準偏差（ｍｅａｎｓ±ＳＤ）を示している。また、図８及び表３中、「ＫｏＣＫＩ１」はコシヒカリＣＫＩ１を、「ＨａＣＫＩ１」はハバタキＣＫＩ１を、それぞれ表す。
【０１００】
【表３】
2011155966.tif 000004
【０１０１】
この結果、コシヒカリＣＫＩ１過剰発現体とは異なり、全てのハバタキＣＫＩ１過剰発現体は、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３と同様に弱勢形質を示した。実際、ハバタキＣＫＩ１過剰発現体の形態学的な特徴は、ＮＩＬ−ｈｂｄ２／ｈｂｄ２＋ｈｂｄ３／ｈｂｄ３とあまり相違がなかった（表３）。
これらの結果から、ハバタキＣＫＩ１を過剰発現させることにより、弱勢形質のイネを作製し得ることが明らかである。
【０１０２】
［実施例２]
表１に記載のマーカーのうち、ｄｊ１ｂ−２２、ｄｊ１ｂ−１２、ｄｊ１ｂ−１１、ｄｊ１ｂ−２３、ｄｊ１ｂ−２０、及びｄｊ１ｂ−１５の各分子マーカーを用いることにより、イネ個体中のｈｂｄ３を含む遺伝子座が、Ｈｂｄ３ホモ接合体（Ｈｂｄ３／Ｈｂｄ３）、ヘテロ接合体（Ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）、又はｈｂｄ３ホモ接合体（ｈｂｄ３／ｈｂｄ３）のいずれであるのかを調べ、当該イネ個体の弱勢を判定し得ることを確認した。
【０１０３】
まず、コシヒカリとハバタキから、ＴＰＳメソッド法により、それぞれのゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、約２ｃｍ長のイネの葉頂を採取し、Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井機械社製）を用いてＴＰＳバッファー［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＫＣｌ、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］中で粉砕した。遠心分離後、上清を回収し、等量のイソプロピルアルコールを加えた。遠心分離処理によりイソプロピルアルコール不溶性物を回収し、沈殿を７５％エタノール溶液で洗浄した。その後、この沈殿を乾燥させ、ＴＥバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解させた。
【０１０４】
次いで、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に記載の各分子マーカーのプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけて分離した後、当該アガロースゲルを染色してバンドを検出した。なお、ｄｊ１ｂ−１２マーカー及びｄｊ１ｂ−２０マーカーのプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物は、ＨｈａＩによる制限酵素処理をしたものを、また、ｄｊ１ｂ−２３マーカーのプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物は、ＳｍａＩによる制限酵素処理をしたものを、それぞれアガロース電気泳動にかけた。
【０１０５】
得られたバンドパターンを図９に示す。図９（Ａ）〜（Ｃ）の上図はアガロースゲルの染色像であり、下図は上図のバンドパターンを模式的に示した図である。図中、各マーカーの左レーンがコシヒカリの結果であり、右レーンがハバタキの結果である。また、「Ｍａｒｋｅｒ１」はΦＸ１７４ ＤＮＡ／ＨａｅＩＩＩマーカーを、「Ｍａｒｋｅｒ２」は１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ（１００ｂｐ−９００ｂｐ) マーカーを、それぞれ示す。この結果、いずれの分子マーカーを用いた場合も、コシヒカリのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とハバタキのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とで、得られるＰＣＲ産物の大きさが異なっており、両者を区別することができた。特に、分子マーカーｄｊ１ｂ−１１の場合には、コシヒカリでは約２００ｂｐのＰＣＲ産物が得られるのに対して、ハバタキでは約２３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られていた。また、ｄｊ１ｂ−１２マーカー、ｄｊ１ｂ−２０マーカー、及びｄｊ１ｂ−２３マーカーの場合には、ハバタキのＰＣＲ産物よりもコシヒカリのＰＣＲ産物が小さく、コシヒカリのＰＣＲ産物は各制限酵素により切断されたのに対して。ハバタキのＰＣＲ産物は切断されなかったことが確認された。
これらの結果から、表１に記載のこれらの分子マーカーを用いることにより、イネ個体のｈｂｄ３を含む遺伝子座の遺伝子型を調べられること、調べた結果を当該イネ個体の弱勢の判定に利用できること、が明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明のイネの弱勢判定方法や親個体の選抜方法は、特にイネの育種の分野において利用が可能である。
【図２】
2011155966.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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