(57)【要約】【課題】本発明は、癌抗原を含むワクチン組成物に関する。【解決手段】以下の：  サポニン；  非メチル化ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド；  腫瘍関連抗原、腫瘍拒絶抗原、又は腫瘍支持メカニズムに関連する抗原；  モノホスホリル・リピドＡ又は３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ；及び  リポソームである粒子状担体；を含むワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
サポニン；
非メチル化ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド；
腫瘍関連抗原、腫瘍拒絶抗原、又は腫瘍支持メカニズムに関連する抗原；
モノホスホリル・リピドＡ又は３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ；及び
リポソームである粒子状担体；
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、プリン、プリン、Ｃ，Ｇ、ピリミジン、ピリミジンの配列を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ（配列番号１）；ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ（配列番号２）；ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ（配列番号３）；ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号４）；ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ（配列番号５）から成る群から選ばれる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、少なくとも３つのヌクレオチドにより分離された少なくとも２つの非メチル化ＣＧリピートを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、６つのヌクレオチドにより分離されている少なくとも２つの非メチル化ＣＧリピートを含む、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記サポニンがＱｕｉｌ  Ａから誘導される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記Ｑｕｉｌ  Ａ誘導体がＱＳ２１である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記リポソームがコレステロールを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記腫瘍関連抗原、腫瘍拒絶抗原、又は腫瘍支持メカニズムに関連する抗原が、ＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、腫瘍特異的ガングリオシド、前立腺特異的抗原、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ、ＫＳＡ（ＧＡ７３３）、ＰＡＰ、マンマグロビン、ＭＵＣ−１、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、チロシナーゼ、スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＮＹ−ＥＳＯ１、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、ＰＳ１０８、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＨＡＧＥ、自己ペプチド・ホルモン又はＧｎＲＨから選ばれる１以上の抗原である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ワクチン組成物が全身的に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
医薬として使用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
癌の予防又は治療用医薬の製造における、以下の：
サポニン；
免疫刺激性オリゴヌクレオチド；
腫瘍関連抗原、腫瘍拒絶抗原、又は腫瘍支持メカニズムに関連する抗原；
モノホスホリル・リピドＡ又は３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ；及び
リポソームである粒子状担体；
の組合せ物の使用。
【請求項１３】
以下の：
サポニン；
免疫刺激性オリゴヌクレオチド；
腫瘍関連抗原、腫瘍拒絶抗原、又は腫瘍支持メカニズムに関連する抗原；
モノホスホリル・リピドＡ又は３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ；及び
リポソームである粒子状担体；
を混合するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のワクチン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン中に使用される新規アジュバント組成物に関する。特に、本発明のアジュバント組成物は、サポニンと免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、場合によりさらに担体を含む併合物を含む。本発明により、本発明のアジュバント組成物及び少なくとも１の抗原を含むワクチンも提供される。さらに、本発明のアジュバント組成物及びワクチンの製造方法、並びに医薬としてのそれらの使用も提供される。さらに、本発明は、本発明のワクチンの非経口又は粘膜投与による病気にかかり易い又はかかった個体の治療方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（“ＣｐＧ”）を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは全身経路及び粘膜経路により投与されるときアジュバントであるということが、本分野において知られている（WO96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160 (2) : 870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161 (9) : 4463-6）。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシン・ジヌクレオチド・モチーフのための略号である。歴史的には、ＢＣＧのＤＮＡ画分が抗腫瘍効果を発揮することができるということが観察された。さらなる研究において、ＢＣＧ遺伝子配列由来の合成オリゴヌクレオチドが（インビトロ及びインビボの両者において）免疫刺激効果を誘導することができることが示された。上記研究の著者は、中央ＣＧモチーフを含む特定のパリンドローム配列がこの活性を担持すると結論した。免疫刺激におけるこのＣＧモチーフの中心的役割は、Kreig, Nature 374, p546 1995により刊行物中に、その後に明らかにされた。詳細な分析は、このＣＧモチーフが特定の配列文脈内に存在しなければならないこと、そしてこのような配列はバクテリアＤＮＡにおいては一般的であるが脊椎動物ＤＮＡにおいては稀であることが示されている。上記免疫刺激性配列は、しばしば：プリン、プリン、Ｃ，Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであり、ここで、上記ジヌクレオチドＣＧモチーフはメチル化されていないが、他のメチル化されていないＣｐＧ配列は免疫刺激性であることが知られており、そして本発明において使用されうる。
【０００３】
６ヌクレオチドの特定の組合せ物中に、パリンドローム（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）配列が存在する。これらのモチーフのいくつかは、１のモチーフの反復であるか異なるモチーフの組合せであるかを問わず、同一ヌクレオチド内に存在することができる。オリゴヌクレオチドを含有する上記免疫刺激性配列の中の１以上の存在は、（インターフェロンγを産生し、そして細胞毒性活性をもつ）ナチュラル・キラー細胞、及びマクロファージを含む、さまざまな免疫サブセットを活性化することができる（Wooldrige et al Vol 89 (no. 8), 1977）。但し、このコンセンサス配列をもたない他のメチル化されていないＣｐＧ含有配列は今日免疫刺激性であることが示されている。
【０００４】
ＣｐＧは、ワクチンに配合されるとき、一般に、遊離抗体とともに（WO96/02555; McCluskie and Davis 、前掲）とともに遊離溶液中で投与され、又は抗原と共有結合され（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１６２４７）、又は水酸化アルミニウムの如き担体と配合される（（肝炎表面抗原）Davis et al 、前掲；Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95 (26), 15553-8)。
【０００５】
サポニンは、Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins, Phytomedicine vol 2 pp 363-386)中に教示されている。サポニンは、植物及び海洋動物界に広く分布するステロイド又はトリテルペン・グリコシドである。サポニンは、水中コロイド溶液を形成して振とうの間に発泡し、そしてコレステロールを沈澱させることで有名である。サポニンが細胞膜付近にあるとき、それらは、膜が破けることを引き起こす、膜内の多孔様構造を生じさせる。赤血球の溶血は、この現象の一例であり、これは全てではないが特定のサポニンの特性である。
【０００６】
サポニンは、全身的投与のためのワクチン中でのワクチンとして知られている。個々のサポニンのアジュバント及び溶血活性は、本分野において詳しく研究されている（Lacaille-Dubois and Wagner、前掲）。例えば、（南アメリカの木、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina)の樹皮由来の）クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）、及びその画分が、米国特許第５，０５７，５４０号、及び“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2) : 1-55 ；及びＥＰ  ０  ３６２  ２７９  Ｂ１中に記載されている。
【０００７】
Ｑｕｉｌ  Ａの画分を含む、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）といわれる粒子状構造は、溶血性であり、そしてワクチンの製造において使用されてきた（Morein, B., EP 0 109 942 B1)。これらの構造は、アジュバント活性をもつことが報告されている（ＥＰ  ０  １０９  ９４２  Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１）。
【０００８】
溶血性サポニンＱＳ２１とＱＳ１７（Ｑｕｉｌ  ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身的アジュバントとして記載されており、そしてそれらの製法は、米国特許第５，０５７，５４０号、及びＥＰ  ０  ３６２  ２７９  Ｂ１中に開示されている。上記文献中には、全身的ワクチンのための強力なアジュバントとして作用するＱＳ７（Ｑｕｉｌ  Ａの非溶血性画分）の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、さらにKensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437)中に記載されている。ＱＳ２１とポリソルベート又はシクロデキストリンの併合物も知られている（ＷＯ９９／１０００８）。Ｑｕｉｌ  Ａの画分、例えば、ＱＳ２１及びＱＳ７を含む粒子状アジュバント系が、ＷＯ９６／３３７３９、及びＷＯ９６／１１７１１中に記載されている。
【０００９】
全身的ワクチン接種において使用されてきた他のサポニンは、他の植物種、例えば、ジプソフィラ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）及びサポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のものを含む（Bomford et al., Vaccine, 10 (9) : 572-577, 1992)。
【００１０】
サポニンは、粘膜に適用されるワクチン試験において使用されることも知られており、これは、免疫応答の誘導において成功の程度が異なっている。Ｑｕｉｌ−Ａサポニンは、抗原が鼻内に投与されるとき、免疫応答の誘導に対して効果をもたないことが先に示されている（Gizurarson et al. 1994. Vacine Research 3, 23-29）。一方、他の著者は、成功をもって、上記アジュバントを使用している（Maharaj et al., Can. J. Microbiol, 1986, 32 (5) : 414-20; Chavali and Campbell, Immunobiology, 174 (3) : 347-59)。Ｑｕｉｌ  Ａサポニンを含むＩＳＣＯＭｓは、胃内及び鼻内ワクチン配合物中で使用されており、そしてアジュバント活性を示している（McI Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317-322; McI Mowat and Donachie, Immunology Today, 12, 383-385)。
【００１１】
ＱＳ２１，Ｑｕｉｌ  Ａの非毒性画分も、経口又は鼻内アジュバントとして記載されている（Sumino et al., J. Virol., 1998, 72 (6) : 4931-9; WO98/56415）。
【００１２】
鼻内ワクチン接種試験における他のサポニンの使用も記載されている。例えば、ケノポジウム・キノア（Chenopodium quinoa）サポニンは、鼻内ワクチン及び胃内ワクチンの両者中で使用されている（Estrada et al., Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998, 21 (3) : 225-36）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）とサポニンの併合物が極めて強力なアジュバントであるという驚ろくべき発見に関する。従って、サポニンと免疫刺激性オリゴヌクレオチドの併合物を含むアジュバント組成物が提供される。好ましくは、本発明のアジュバントは、担体をさらに含む。本発明の好ましい形態においては、上記アジュバント及びワクチン組成物中のサポニン及びオリゴヌクレオチドは、抗原特異的抗体の誘導においてシナルジスティックであり、そしてＴｈ１−型免疫系に一般に関係する免疫応答の誘導において強力である。従って、上記アジュバント併合物は、疾患の免疫予防のために好適であるだけでなく、驚ろくべきことに、潜伏期の長いウイルス、バクテリア又は寄生生物感染の如き疾患、そしてまた癌の如き慢性障害の免疫治療のためにも好適である。
【００１４】
本発明のアジュバント又はワクチン中での使用のために好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも６以上のヌクレオチドにより分離された２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい態様においては、上記オリゴヌクレオチド中のインターヌクレオチドは、ホスホロジチオエート、又はより好ましくはホスホロチオエート結合である。但し、ホスホジエステルその他のインターヌクレオチド結合であって、混合インターヌクレオチド結合をもつオリゴヌクレオチドを含むものも本発明の範囲内にある。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートの製造方法は、ＵＳ  ５，６６６，１５３、ＵＳ  ５，２７８，３０２、及びＷＯ９５／２６２０４中に記載されている。
【００１５】
好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列をもつ。上記配列は、好ましくは、ホスホロチオエート修飾インターヌクレオチド結合を含む。
【００１６】
オリゴ１（配列番号１）：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ
ＴＴ（ＣｐＧ１８２６）
オリゴ２（配列番号２）：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ
（ＣｐＧ１７５８）
オリゴ３（配列番号３）：ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ
ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ
オリゴ４（配列番号４）：ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ
ＧＴＣ  ＧＴＴ（ＣｐＧ２００６）
オリゴ５（配列番号５）：ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ
ＣＴ（ＣｐＧ１６６８）
他のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、それらがそれに対する取るに足りない欠失又は付加をもつ点で、上記好ましい配列を含みうる。
【００１７】
本発明において使用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、本分野において知られたいずれかの方法により合成されうる（例えば、ＥＰ  ４６８５２０）。便利には、このようなオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を用いて合成されることができる。
【００１８】
本発明において用いられるオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシオリゴヌクレオチドである。好ましい態様においては、上記オリゴヌクレオチド内のインターヌクレオチド結合は、ホスホロジチオエート又はより好ましくはホスホロチオエート結合である。但し、ホスホジエステルも本発明の範囲内にある。異なるインターヌクレオチド結合を含むオリゴヌクレオチド、例えば、混合ホスホロチオエート・ホスホジエステルも企図される。上記オリゴヌクレオチドを安定化させる他のインターヌクレオチド結合も使用されうる。
【００１９】
本発明のアジュバント併合物中で使用されうるサポニンは、米国特許第５，０５７，５４０号及び“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2) : 1-55；及びＥＰ  ０  ３６２２７９  Ｂ１中に記載された、Ｑｕｉｌ  Ａといわれる、Quillaja Saponaria Molina の樹皮由来のものを含む。Ｑｕｉｌ  Ａの特に好ましい画分は、ＱＳ２１，ＱＳ７、及びＱＳ１７である。
【００２０】
β−エスシン（β−Ｅｓｃｉｎ）は、本発明のアジュバント組成物中で使用される他の好ましい溶血性サポニンである。エスシンは、セイヨウトチノキ（horse chestnut tree)、ラテン名：エスキュラス・ヒポカスタナム（Aesculus hippocastanum）の種子中に生じるサポニンの混合物としてthe Merck index (12thed : entry 3737）中に記載されている。その単離は、クロマトグラフィー及び精製（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953))、及びイオン交換樹脂（Erbring et al., US 3,238,190）により記載されている。エスシンα及びβの画分は精製されており、そして生物学的に活性であることが示されている（Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug; 44 (8) : 1454-1464)）。β−エスシン（β−ｅｓｃｉｎ）は、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても知られている。
【００２１】
本発明において使用される他の好ましい溶血性サポニンは、ディギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）である。ディギトニンは、ディギタリス・パープレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の種子由来であり、そしてGisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664；及びRuhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621中に記載される手順に従って精製される、サポニンとしてthe Merck index (12th Edition, entry 3204)中に記載されている。その使用は、コレステロール測定のための臨床試薬として記載されている。
【００２２】
本発明のアジュバント併合物は、上記サポニン又はＣｐＧ、又は両者が粒子状担体と会合されて上記併合物アジュバント活性を高めることができるように、さらに担体を含むことができる。例えば、特に好ましい全身的ワクチンは、担体分子を含む。
【００２３】
本発明のアジュバント併合物中に使用されるＣｐＧは、遊離溶液中にあり、又は粒子状担体、例えば、鉱物塩（例えば、非限定的に、アルミニウム又はカルシウム塩を含む）、リポソーム、ＩＳＣＯＭｓ、エマルジョン（油／水、水／油、水／油／水）、ポリマー（例えば、非限定的に、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリホスファジン、ポリアミノ酸、アルギネート、キトサン）又は微粒子に複合体化されることができる。好ましくは、上記担体はカチオン性である。本発明のワクチンは、上記ＣｐＧ−担体複合体と会合することができ、又は上記ＣｐＧ−担体複合体と会合することができない抗原をさらに含む。この場合、抗原は、遊離の懸濁液であるか又は別個の担体と会合することができる。
【００２４】
本発明の一部を形成するサポニンは、ミセルの形態で別個に存在することができ、又はコレステロール及び脂質と配合されるときＩＳＣＯＭｓ（ＥＰ  ０  １０９  ９４２  Ｂ１）又はリポソーム（ＷＯ９６／３３７３９）の如き大きな次元の構造の形態で存在することができ、又は油／水エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０）の形態で存在することができる。上記サポニンは、好ましくは、金属塩、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムと会合されることができる（ＷＯ９８／１５２８７）。あるいは、上記サポニンは、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）の如き粒子状担体と会合されることができる。上記サポニンは、乾燥状態、例えば粉末において存在することもできる。それらが、ワクチン受容者の粘膜表面に投与されるときの形態における最終配合品は、好ましくは、天然において溶血性である。このサポニンは、直接結合を介してか又は同一の粒子状担体分子との共同相互作用（ｃｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）により上記抗原と物理的に会合されてもされなくてもよい（ＧＢ９８２２７１２．７；ＷＯ９８／１６２４７）。本発明のアジュバント又はワクチン中の上記ＣｐＧ及びサポニンは、それ自体、分離され又は会合されることができる。例えば、上記ＣｐＧ及びサポニンは、遊離懸濁液中にあることができ、又は担体、より好ましくは粒子状担体、例えば、水酸化アルミニウムを介して、又はカチオン・リポソーム又はＩＳＣＯＭにより、会合されることができる。
【００２５】
本発明に係る好ましいアジュバント組合せ物は、油／水エマルジョン又はＤＱを含む群から選ばれる粒子状担体及びＱＳ２１と一緒になって、２つの隣接ＣＧモチーフ間に少なくとも３つ、好ましくは少なくとも６つのヌクレオチドを含む１以上のＣｐＧオリゴヌクレオチドから作られる。最も好ましくは、上記アジュバント組合せ物は、ＱＳ２１、及び油／水エマルジョン又はＤＱを含む群から選ばれる粒子状担体と混合されて、ＣｐＧ２００６（配列番号４）、又はＣｐＧ１７５８（配列番号２）又はＣｐＧ１８２６（配列番号１）を含む。従って、特に好ましいワクチンは、例えば、上記アジュバント組合せ物及び抗原を含む。本発明の好ましいワクチンは、全身経路を通じて個体に投与された後に全身的免疫応答を生成するために使用される。
【００２６】
本発明のアジュバント組合せ物は、全身アジュバント又は粘膜アジュバントの両者として使用されうる。本発明の特別な形態においては、全身的又は非経口経路、例えば、筋中、皮膚内、経皮、皮下、腹腔内又は静血内投与を通じて投与される全身的ワクチンが提供される。好ましい投与経路は、経皮経路を介する、例えば、皮膚パッチによるものである。
【００２７】
本発明の全身的ワクチン調製物は、筋中、腹腔内、皮膚内、経皮、静脈内又は皮下投与により上記ワクチンを投与することにより、疾患にかかり易い又はこれにかかった哺乳動物を保護し又は治療するために使用されることができる。上記ワクチン調製物の全身的投与の方法は、慣用のシリンジ及びニードル、又は固体ワクチンの弾道デリバリーのためにデザインされたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）、又はニードルして圧力液体ジェット・デバイス（ＵＳ  ４，５９６，５５６；ＵＳ  ５，９９３，４１２）、又は経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）を含みうる。本発明は、皮膚に適用される抗原の免疫原性を高めるためにも使用されうる（経皮又は（transdermd or transcutaneous）デリバリーＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。それ故、本発明は、本発明のワクチン又はアジュバント組成物で事前に満たされた全身投与のためのデリバリー・デバイスを提供する。従って、個体における免疫応答を誘導する方法であって、投与及び免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニン、及び担体を含むワクチンを、上記個体に投与することを含み、ここで、上記ワクチンが非経口又は全身的経路を介して投与される、前記方法が提供される。免疫応答を誘導する好ましい方法は、Ｑｕｉｌ  Ａ由来のサポニン、例えば、ＱＳ２１、及び担体、例えば、油／水エマルジョン、コレステロール含有リポソーム又はアルム（ａｌｕｍ）とともに、配列番号１，２，３，４又は５のオリゴヌクレオチドを含むワクチンの投与を含む。
【００２８】
あるいは、本発明のワクチン調製物は、上記ワクチンを、粘膜経路、例えば、経口／栄養補給の又は鼻内経路を介しての投与により、病気にかかり易い又はかかった哺乳動物を保護又は治療するために使用されうる。他の粘膜経路は、膣内及び直腸内である。投与の好ましい粘膜経路は、鼻腔内ワクチン接種といわれる鼻内経路を介するものである。鼻内ワクチン接種方法は本分野において周知であり、免疫化されるべき個体の上咽頭内への上記ワクチンの滴、スプレー、又は乾燥粉砕形態の投与を含む。噴霧され又はエアロゾル化されたワクチン配合物も、本発明の一部を形成する。腸溶配合物、例えば、経口投与のための胃耐性カプセル及び粒剤、直腸又は膣投与のための坐剤も本発明の一部を形成する。
【００２９】
本発明のアジュバント組合せ物は、粘膜ワクチン接種により全身的ワクチン接種を置き換えるために、ヒトにおける適用のために好適な粘膜アジュバントのクラスを表す。本発明の好ましい形態においては、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組合せて、純粋なサポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ、又はその誘導体であってＱＳ２１を含むもの；エスシン；ディギトニン；又はギィプソフィラ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）又はケノポジウム・キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍｕ  ｑｕｉｎｏａ）のサポニンが、全身的免疫応答を達成するための抗原の粘膜投与のためのアジュバントとして使用されうる。
【００３０】
本発明のアジュバント組合せ物は、前記全身的又は粘膜経路を介して投与されることができる、ワクチンの配合物中で使用されうる。好ましくは、上記ワクチンが粘膜投与のために使用されるとき、上記アジュバント組合せ物は、溶血性サポニンを含む。
【００３１】
粘膜投与のためには、本発明の組成物は、好ましくは、溶血性サポニンを含む。本発明の意味においては、溶血性サポニン、又はサポニン調製物は、以下のアッセイを参照して測定されるであろう。
【００３２】
１．モルモットから新鮮血液を、デスクトップ遠心分離機内で３回リン酸緩衝液化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。元の容量まで再懸濁させた後、上記血液をＰＢＳ中でさらに１０倍希釈する。
【００３３】
２．上記血液懸濁液５０μｌを、界面活性剤又はサポニンの２倍希釈物を含むＰＢＳ  ８００μｌに添加する。
【００３４】
３．８時間後、溶血を視覚的に又は上記上清の光学密度を計測することにより、評価する。５７０nmにおいて光を吸収する赤上清の存在は、溶血の存在を示す。
【００３５】
４．上記結果は、溶血がもはや生じない最初のサポニン希釈の濃度として表される。
【００３６】
本発明の目的のためには、上記サポニン・アジュバント調製物は、それが０．１％未満の濃度において赤血球を溶解する場合、溶血性である。参考として、Ｑｕｉｌ  Ａ，ＱＳ２１，ＱＳ７、ディギトニン、及びβ−エスシンの実質的に純粋なサンプルは、上記アッセイにおいて定義されるとき、全て溶血性サポニンである。このような生物学的アッセイの個有の実験バラツキ内で、本発明のサポニンは、好ましくは、約０．５〜０．００００１％の間の、より好ましくは０．０５〜０．００００１％の間の、さらにより好ましくは０．００５〜０．００００１％の間の、そして最も好ましくは０．００１〜０．０００４％の間の溶血活性をもつ。理想的には、上記サポニンは、ＱＳ２１のものと同様の（すなわち、１０倍差異内の）溶血活性をもたなければならない。
【００３７】
本発明のワクチンは、経口投与を介して投与されることもできる。このような場合、医薬として許容される賦形剤は、アルカリ・バッファー、又は腸溶カプセル又は微粒剤を含むこともできる。本発明のワクチンは、膣経路により投与されることもできる。この場合、医薬として許容される賦形剤は、乳化剤、ポリマー、例えば、カルボポール（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標））、膣クリーム及び坐剤の他の知られた安定剤を含むこともできる。本発明のワクチンは、直腸経路により投与されることもできる。この場合、上記賦形剤は、直腸坐剤を形成することが本分野において知られたワックス及びポリマーを含むこともできる。
【００３８】
本発明のアジュバント組合せ物中の２以上のサポニンの調製物も、本発明の一部を形成する。例えば、ＱＳ２１，ＱＳ７，Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスシン、又はディギトニンを含む群から成る少なくとも２つの組合せ物である。さらに、本発明の組成物は、２以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの組合せ物を含みうる。
【００３９】
本発明の類似の態様においては、全身的投与及び粘膜投与の両者のためのＣｐＧ／サポニン組合せ物は、モノホスホリル・リピドＡ及びその非毒性誘導体３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡを含む他のアジュバントとさらに併合されることができる。あるいは、上記サポニン配合物は、キトサン又は他のポリカチオン・ポリマー、ポリ乳酸及びポリラクチド−Ｉ−ポリグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチル・グルコサミン−ベースのポリマー・マトリックス、多糖又は化学的に修飾された多糖から成る粒子、リポソーム及び脂質ベースの粒子、グリセロール・モノエステルから作られた粒子、などから作られるワクチン媒体と併合されることができる。上記サポニンは、粒子状構造、例えば、リポソーム又はＩＳＣＯＭｓを形成するために、コレステロールの存在下で配合されることもできる。さらに、上記サポニンは、ポリオキシエチレン・エーテル又はエステルと一緒になって、非粒子状溶液又は懸濁液、又は粒子状構築、例えば、小ラメラ（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソーム又はＩＳＣＯＭにおいて、配合されることができる。上記サポニンは、賦形剤、例えば、カルボポール（商標）と配合されて、粘度を増加されることもでき、又は粉末賦形剤、例えば、ラクトースとともに、乾燥粉末形態で配合されることができる。
【００４０】
３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡは、Ribi Immunochem, Montanaにより製造された周知のアジュバントである。それは、ＧＢ  ２１２２２０４Ｂ中に教示された方法により調製されうる。３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小さな粒子サイズをもつエマルジョンの形態にある（ＥＰ  ０  ６８９  ４５４  Ｂ１）。特に好ましいアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せ物（ＥＰ  ０  ６７１  ９４８  Ｂ１）、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含む油／水エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０，ＷＯ９８／５６４１４）、又は他の担体と配合された３Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ  ０  ６８９  ４５４  Ｂ１）である。
【００４１】
好ましくは、本発明中のワクチン配合物は、ヒト病原体に対して免疫応答を引き出すことのできる抗原又は抗原組成物を含む。そのような抗原又は抗原組成物は：ＨＩＶ抗原（ｔａｔ，ｎｅｆ，ｇｐ１２０またはｇｐ１６０など）、ヒトヘルペスウイルス抗原（ｇＤまたはその誘導体あるいはＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７などの即時初期タンパク）、サイトメガロウイルス抗原（特にヒトｇＢまたはその誘導体）、ロタウイルス抗原（生減弱ウイルスを含む）、エプスタイン−バーウイルス抗原（ｇｐ３５０又はその誘導体など）、水疱疹ウイルス抗原（ｇｐＩ，ＩＩおよびＩＥ６３など）から、またはＢ型肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎表面抗原又はその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスから、あるいは、他のウイルス性病原体、例えばパラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（プロテインＦおよびＧ又はそれらの誘導体など）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（例えばＨＰＶ６，１１，１６，１８）、フラビウイルス属（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス抗原から、（全生又は失活ウイルス、スプリット・インフルエンザ・ウイルスであって卵又はＭＤＣＫ細胞内で増殖したもの、又は全ｆｌｕウイロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920により記載されたもの）又はその精製された又は組換えタンパク質、例えばＨＡ，ＮＰ，ＮＡ、又はＭタンパク質、又はその組合せ物）、またはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを含むＮａｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．（例えば、夾膜多糖及びそれらのコンジュゲート、トランスフェリン−結合プロテイン、ラクトフェリン結合プロテイン、ＰｉｌＣ、付着因子用）；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ストレプトリジンまたはコリン結合プロテイン）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、プロテインＭ又はその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ；Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても知られている（例えば、高分子量および低分子量付着因子およびインベーシン）Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含むＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．；
【００４２】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えばｐｅｒｔａｃｔｉｎ，ｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ又はその誘導体ｆｉｌａｍｅｎｔｅｏｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ，ｆｉｍｂｒｉａｅ），Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えばＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ，ＢまたはＣ）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ，Ｍ．ｌｅｐｒａｅ，Ｍ．ａｖｉｕｍ，Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを含むＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．；ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ（例えばコロニー形成因子、熱不安定毒素またはその誘導体、熱安定毒素またはその誘導体）、ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．；Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ（例えばコレラ毒素またはその誘導体）を含むＶｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．；Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ，Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉを含むＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（例えばＹｏｐプロテイン）、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ，Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含むＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（例えば毒素、付着因子およびインベーシン）およびＣ．ｃｏｌｉを含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．；Ｓ．ｔｙｐｈｉ，Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ，Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ，Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞毒素）を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍを含むＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．；Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（例えばクロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．；
【００４３】
Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）を含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えばＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ），Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ（例えばＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ），Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（例えば、ＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ），Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（例えばＯｓｐＡ，ＯｓｐＣ，ＤｂｐＡ，ＤｂｐＢ），Ｂ．ｈｅｒｍｓｓｉを含むＢｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．；Ｅ．ｅｑｕｉおよびＨｕｍａｎ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ  Ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓの病原体を含むＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．；Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉを含むＲｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．；Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合プロテイン）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えばＭＯＭＰ、ヘパリン結合プロテイン）、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉを含むＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．；Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含むＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．；Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ（例えば希少な外膜プロテイン）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ，Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含むＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．から誘導され；又はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含むＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（例えばＳＡＧ２，ＳＡＧ３，Ｔｇ３４）を含むＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．；Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａを含むＥｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．；Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉを含むＢａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．；Ｔ．ｃｒｕｚｉを含むＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．；Ｇ．ｌａｍｂｌｉａを含むＧｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．；Ｌ．ｍａｊｏｒを含むＬｅｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．；Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを含むＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．；Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを含むＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．；Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉを含むＳｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ．；などの寄生生物から誘導され；又はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを含むＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．；Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含むＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．などの酵母から誘導される。
【００４４】
Ｍ．チュバーキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のための他の好ましい特異的抗原は、例えば、ＴｂＲａ１２，ＴｂＨ９，ＴｂＲａ３５，Ｔｂ３８−１，Ｅｒｄ１４，ＤＰＶ，ＭＴＩ，ＭＳＬ，ｍＴＴＣ２、及びｈＴＣＣ１である（ＷＯ９９／５１７４８）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのためのタンパク質は、少なくとも２つの、好ましくは３つの、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのポリペプチドがより大きなタンパク質に融合されているような融合タンパク質及びその変異体をも含む。好ましい融合物は、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５，Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ，ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ，Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２，Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ，ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２，ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩを含む（ＷＯ９９／５１７４８）。
【００４５】
クラミジアのための最も好ましい抗原は、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＨＰ）（ＷＯ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ  ３６６４１２）、及び推定膜タンパク質（Ｐｍｐｓ）を含む。ワクチン配合物の他のクラミジア抗原は、ＷＯ９９／２８４７５中に記載された群から選ばれることができる。
【００４６】
好ましいバクテリアのワクチンは、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含むストレプトコッカス種由来の抗原（例えば、夾膜多糖及びそのコンジュゲート、ＰｓａＡ，ＰｓａＡ、ストレプトリジン、コリン結合性タンパク質）、及びタンパク質抗原ニューモリジン（Ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）(Biochem Biophys Acta, 1989, 62, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、及びその突然変異体解毒誘導体（ＷＯ９０／０６９５１；ＷＯ９９／０３８８４）由来の抗原を含む。他の好ましいバクテリア・ワクチンは、Ｈ．インフルエンザエＢ型（例えば、ＰＲＰ及びそのコンジュゲート）、非分類Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含むヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎｓ）、Ｐ５，Ｐ６、プロテインＤ、及びリポプロテインＤ及びフィンブリン（ｆｉｍｂｒｉｎ）及びフィンブリン由来ペプチド（ＵＳ  ５，８４３，４６４）又は多コピー変異体又はその融合タンパク質由来の抗原を含む。
【００４７】
Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は、本分野において周知であり、そしてとりわけ、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−４１４３７４；ＥＰ−Ａ−０３０４５７８、及びＥＰ  １９８−４７４中に記載されたようなＰｒｅＳ１，ＰｒｅＳ２Ｓ抗原を含む。１の好ましい局面においては、本発明のワクチン配合物は、特にＣＨＯ細胞内で発現されるとき、ＨＩＶ−１抗原、ｇｐ１２０を含む。さらなる態様においては、本発明のワクチン配合物は、先に定義したようなｇＤ２ｔを含む。
【００４８】
本発明の好ましい態様においては、請求に係るアジュバントを含有するワクチンは、生殖器いぼの原因であると考えられているヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）由来の抗原（ＨＰＶ６又はＨＰＶ１１その他）、子宮頸癌の原因であるＨＰＶウイルス由来の抗原（ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８その他）を含む。
【００４９】
生殖器いぼ（ｇｅｎｉｔａｌ  ｗａｒｔ）の予防又は治療用ワクチンの特に好ましい形態は、Ｌ１粒子又はキャプソマー（ｃａｐｓｏｍｅｒｓ）、並びにＨＰＶ６及びＨＰＶ１１タンパク質Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１、及びＬ２から選ばれる１以上の抗原を含む融合タンパク質を含む。
【００５０】
融合タンパク質の最も好ましい形態は：ＷＯ９６／２６２７７中に開示されたようなＬ２Ｅ７、及びＧＢ  ９７１７９５３．５（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５）中に開示されたプロテインＤ（１／３）−Ｅ７である。
【００５１】
好ましいＨＰＶ子宮頸感染又は癌の、予防又は治療用ワクチン、組成物は、ＨＰＶ１６又は１８抗原を含むことができる。例えば、Ｌ１又はＬ２抗原モノマー、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）として一緒に提示されるＬ１又はＬ２抗原、又はＶＬＰ又はキャプソマー構造中単独で提示されるＬ１単独タンパク質。このような抗原、ウイルス様粒子及びキャプソマーは、それ自体知られている。例えば、ＷＯ９４／００１５２，ＷＯ９４／２０１３７，ＷＯ９４／０５７９２、及びＷＯ９３／０２１８４を参照のこと。
【００５２】
追加の初期タンパク質は、単独で又は融合タンパク質、例えば、Ｅ７，Ｅ２又は好ましくはＥ５として含まれることができ；この特に好ましい態様は、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を含むＶＬＰを含む（ＷＯ９６／１１２７２）。
【００５３】
特に好ましいＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６からプロテインＤ−Ｅ６又はＥ７融合物を作るため、プロテインＤ担体と融合された初期タンパク質Ｅ６又はＥ７、又はその組合せ物；あるいは、Ｅ６又はＥ７とＬ２との組合せ物を含む（ＷＯ９６／２６２７７）。
【００５４】
あるいは、ＨＰＶ１６又は１８初期タンパク質Ｅ６及びＥ７は、単一分子、好ましくはプロテインＤ−Ｅ６／Ｅ７融合物中に提示されることができる。このようなワクチンは、場合により、ＨＰＶ１８からＥ６タンパク質とＥ７タンパク質のいずれか又は両者を、好ましくは、プロテインＤ−Ｅ６又はプロテインＤ−Ｅ７融合タンパク質又はプロテインＤ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の形態で含むことができる。
【００５５】
本発明のワクチンは、他のＨＰＶ株からの、好ましくは、株ＨＰＶ３１又は３３からの抗原をさらに含むことができる。
【００５６】
本発明のワクチンは、マラリアを引き起こす寄生生物由来の抗原をさらに含む。例えば、プラスモディア・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの好ましい抗原は、ＲＴＳ，Ｓ、及びＴＲＡＰを含む。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のプレＳ２部分の４つのアミノ酸を介して、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（ＣＳ））タンパク質のＣ末端部分の実質的に全てを含むハイブリッド・タンパク質である。その全体構造は、英国特許出願第９１２４３９０．７に基づく優先権を主張するＷＯ９３／１０１５２の下で公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号中に開示されている。酵母内で発現されるとき、ＲＴＳは、リポタンパク質粒子として製造され、そしてＨＢＶからのＳ抗原と同時に発現されるとき、それは、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を製造する。ＴＲＡＰ抗原は、ＷＯ９０／０１４９６の下で公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号中に記載されている。本発明の好ましい態様は、その抗原性調製物が、上記ＲＴＳ，ＳとＴＲＡＰ抗原の組合せ物を含むところのマラリア・ワクチンである。マルチステージ・マラリア・ワクチンの成分となるべき候補であろう他のプラスモディウム抗原は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＭＳＰ１，ＡＭＡ１，ＭＳＰ３，ＥＢＡ，ＧＬＵＲＰ，ＲＡＰ１，ＲＡＰ２、セクエストリン（Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ）、ＰｆＥＭＰ１，Ｐｆ３３２，ＬＳＡ１，ＬＳＡ３，ＳＴＡＲＰ，ＳＡＬＳＡ，ＰｆＥＸＰ１，Ｐｆｓ２５，Ｐｆｓ２８，ＰＦＳ２７／２５，Ｐｆｓ１６，Ｐｆｓ４８／４５，Ｐｆｓ２３０、及びプラスモディウム種におけるそれらのアナログである。
【００５７】
上記配合物は、抗腫瘍抗原を含み、そして癌の免疫療法処理のために有用であることもできる。例えば、上記アジュバントは、腫瘍拒絶抗原、例えば、前立腺、乳房、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓又はメラノーマ癌腫とともに利用される。例示的な抗原は、ＭＡＧＥ１及びＭＡＧＥ３又は他のＭＡＧＥ抗原（メラノーマの治療のためのもの）、ＰＲＡＭＥ，ＢＡＧＥ、又はＧＡＧＥを含む（Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research（寄稿1993)；Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293）。実際、これらの抗原は、広い範囲の腫瘍タイプ、例えば、メラノーマ、肺癌、肉腫、及び膀胱癌において発現されている。他の腫瘍特異的抗原が、本発明のアジュバントと共に使用されるために好適であり、そして非限定的に、腫瘍特異的ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ，ＫＳＡ（ＧＡ７３３），ＰＡＰ、マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）、ＭＵＣ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む。従って、本発明の１の局面においては、本発明に係るアジュバント組成物及び腫瘍拒絶抗原を含むワクチンが提供される。
【００５８】
本発明の特に好ましい局面は、上記ワクチンが腫瘍抗原を含むということであり；このようなワクチンは、驚ろくべきことに、前立腺、乳、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、卵巣又はメラノーマ癌腫の治療において有用である。従って、配合は、腫瘍関連抗原、並びに腫瘍支持メカニズム（例えば、血管形成、腫瘍浸潤）に関連する抗原を含むことができる。さらに、癌の治療におけるワクチンのための特に関連する抗原は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、チロシナーゼ、スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＮＹ−ＥＳＯ１、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、ＰＳ１０８（ＷＯ９８／５０５６７），ＲＡＧＥ，ＬＡＧＥ，ＨＡＧＥ、を含むこともできる。さらに、上記抗原は、多くの癌の治療において、又は免疫弱化（ｉｍｍｕｎｏｃａｓｔｒａｔｉｏｎ）において有用である、全長ゴナドトロフィン（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ）ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ，ＷＯ９５／２０６００）、短い長さ１０アミノ酸のペプチドの如き自己ペプチド・ホルモンであることができる。
【００５９】
本発明の組成物は、ボレリア種由来の抗原を含有するワクチンを配合するために使用されるであろう。例えば、抗原は、核酸、病原体由来抗原又は抗原性調製物、組換えにより製造されたタンパク質又はペプチド、及びキメラ融合タンパク質を含む。特に、上記抗原はＯｓｐＡである。上記ＯｓｐＡは、（Ｌｉｐｏ−ＯｓｐＡ）といわれる宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）による脂質化形態における完全成熟タンパク質又は脂質化されていない誘導体であることができる。このような非脂質化誘導体は、インフルエンザ・ウイルスの非構造タンパク質の最初の８１のＮ末端アミノ酸、及び完全ＯｓｐＡタンパク質、を含む非脂質化ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質を含み、そして他のＭＤＰ−ＯｓｐＡは、３つの追加のＮ−末端アミノ酸を担持するＯｓｐＡの非脂質化形態である。
【００６０】
本発明のワクチンは、アレルギーの予防又は治療のために使用されうる。このようなワクチンは、アレルゲン特異的（例えば、ＤｅｒＰ１）及びアレルゲン非特異的抗原（例えば、ヒトＩｇＥ由来のペプチドであって非限定的にスタンワース・デカペプチド（ｓｔａｎｗｏｒｔｈ  ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）を含むもの（ＥＰ  ０  ４４７  ２３１  Ｂ１））を含むであろう。
【００６１】
本発明のワクチンは、アレルギー、癌又は感染性疾患以外の慢性障害の予防又は治療のために使用されることもできる。このような慢性障害は、アテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病の如き疾患である。
【００６２】
アルツハイマー神経変性疾患にかかり易い又はかかった患者の予防及び治療に関連する抗原は、特に、アミロイド前駆タンパク質のＮ末端３９〜４３アミノ酸断片（Ａβ）及びより小さな断片である。この抗原は、国際特許出願第ＷＯ９９／２７９４４−（Ａｔｈｅｎａ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に開示されている。
【００６３】
各ワクチン投与量中のタンパク質の量は、典型的なワクチン受容者において、有意な、悪い副作用を伴わずに免疫保護応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特異的免疫原が使用されるか、及びどのようにそれが提示されるかに依存して変動するであろう。一般に、各投与量は、１〜１０００μｇのタンパク質、好ましくは１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、最も好ましくは１〜５０μｇを含むであろうと予想される。特別なワクチンの最適量は、ワクチン接種された対象における適当な免疫応答の観察を含む標準的な試験により確かめられることができる。最初のワクチン接種の後、被験体は、適当に間隔をあけて、１又は数回のブースター免疫感作を受容することができる。このようなワクチン配合物は、プライミング又はブースティング・ワクチン接種処方において哺乳動物の粘膜表面に適用されることができ；又はあるいは、全身的に、例えば、経皮、皮下又は筋中経路を介して、投与されることができる。
【００６４】
本発明のアジュバント又はワクチン中のＣｐＧ又は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、一般に少ないが、そのワクチンの配合に依存して、１〜１０００μｇ／投与、好ましくは１〜５００μｇ／投与、そしてより好ましくは１〜１００μｇ／投与の間の範囲にあることができる。
【００６５】
本発明のアジュバント中で使用されるサポニンの量は、１〜１０００μｇ／投与、好ましくは１〜５００μｇ／投与、より好ましくは１〜２５０μｇ／投与、そして最も好ましくは１〜１００μｇ／投与の間の範囲内にあることができる。それ故、ＣｐＧ：サポニンの比（ｗ／ｗ）は、１：１０００〜１０００：１の範囲内、そして典型的には、１：１００〜１００：１の範囲内、そして好ましくは、１：１０〜１：１又は１：１〜１０：１の、そして最も好ましくは１：１，４：１又は１０：１の範囲内にあるであろう。
【００６６】
本発明の配合物は、両予防及び治療目的のために使用されることができる。従って、ウイルス、バクテリア、寄生生物感染、アレルギー、癌その他の非慢性疾患の予防及び治療のためのワクチンの製造におけるサポニン及びＣｐＧ分子の組合せ物の使用が提供される。従って、本発明は、感染性疾患又は癌、又はアレルギー、又は自己免疫疾患にかかり易い又はかかった哺乳動物の治療方法を提供する。本発明のさらなる局面においては、薬物としての使用について本明細書中に記載されるとき、サポニンとＣｐＧを含む、ワクチン又はアジュバント組合せ物が提供される。ワクチン調製物は、一般に、New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978 中に記載されている。
【００６７】
本発明の組成物は、多種多様な源に由来する抗原を含むワクチンを配合するために使用されるであろうと予想される。例えば、抗原は、ヒト、バクテリア、又はウイルスの核酸、病原体由来抗原又は抗原性調製物、宿主由来抗原であって、ＩｇＥ由来のペプチド・例えば、ＩｇＥのヒスタミン放出性デカペプチド（Ｓｔａｎｗａｒｔｈデカペプチドとして知られるもの）を含むもの、組換え製造タンパク質又はペプチド、及びキメラ融合タンパク質を含む。
【００６８】
本発明により、抗原、サポニン、及び免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む全身性ワクチン組成物が提供される。従って、疾患にかかり易い又はかかった個体の全身的経路を通じて本明細書中に実質的に記載するような組成物の投与による上記個体の治療方法が提供される。また、個体が、感染性バクテリア及びウイルス性疾患、寄生生物疾患、前立腺、乳、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、卵巣又はメラノーマ癌；非癌性慢性障害、アレルギー、アルツハイマー、アテローム性動脈硬化症を含む群から選ばれる疾患にかかることを防ぐ方法であって、上記個体の全身的経路を通じて本明細書中に実質的に記載するような組成物の投与を含む前記方法も提供される。
【００６９】
あるいは、本発明により、抗原、及び溶血性サポニンを含む粘膜ワクチン組成物が提供される。従って、疾患にかかり易い又はかかった個体の粘膜表面に本明細書中に実質的に記載したような組成物を投与することにより上記個体を治療する方法が提供される。
【００７０】
さらに、哺乳動物における全身的な抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、上記哺乳動物の粘膜表面に、抗原及び溶血性サポニンを含む組成物を投与することを含む方法が提供される。さらに、ワクチン又はアジュバントの製造方法であって、サポニンを取り込み、そしてＣｐＧ分子を取り込み、そしてそれらを抗原と混合することを含む前記方法も提供される。
【００７１】
本発明の組成物中で使用される好適な医薬として許容される賦形剤の例は、水、リン酸緩衝液化生理食塩水、等張性バッファー溶液を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】鼻腔内ブースティングから１４日後のＯｓｐＡ特異的ＩｇＧ力価。
【図２】鼻腔内ブースティングから１４日後のＯｓｐＡ特異的ＬＡ２力価。
【図３】鼻腔内ブースティングから１４日後の血清Ｆｌｕ株特異的ＩｇＧ力価。
【図４】鼻腔内ブースティングから１４日後の血清Ｆｌｕ株特異的血液凝集阻害（ＨＡＩ）力価。
【図５】マウスにおけるＯｓｐＡ特異的ＬＡ２力価。
【図６】免疫化されたマウスからの脾臓細胞のｇｐ１２０−特異的リンパ球増殖活性。抗原特異的活性は、全４実験群について異なる抗原濃度についてＳＩとして表される。
【図７】免疫化されたマウスからの脾臓細胞のＨＢｓＡｇ−特異的ＣＴＬ活性。エフェクター細胞活性を、Ｐ８１５細胞（白丸）又はＳ−トランスフェクトされたＰ８１５細胞（黒丸）の51Ｃｒ放出を調べることにより評価した。
【図８】免疫化されたマウスにおけるＨＢｓＡｇ−特異的抗体応答。特異的抗体力価（EU／mlとして表す）及びアイソタイプ・プロフィールを、ＥＬＩＳＡテストを用いて評価した。プールされた血清からの値を表中に示す。そしてアイソタイプ分布を図に示す。
【図９Ａ】免疫化されたマウスからの脾臓細胞のＨＢｓＡｇ−及びｇｐ１２０−特異的リンパ球増殖活性。抗原特異的活性を、全４実験群について異なる抗原濃度として表す。
【図９Ｂ】免疫化されたマウスからの脾臓細胞のＨＢｓＡｇ−及びｇｐ１２０−特異的リンパ球増殖活性。抗原特異的活性を、全４実験群について異なる抗原濃度として表す。
【図１０Ａ】免疫化されたマウスからの脾臓細胞のＨＢｓＡｇ−及びｇｐ１２０−特異的ＣＴＬ活性。エフェクター細胞活性を、対照Ｐ８１５細胞（白記号）又はＨＢｓＡｇ又はｇｐ１２０  ＣＴＬエピトープを提示するＰ８１５細胞（黒記号）の51Ｃｒ放出を調べることにより評価した。
【図１０Ｂ】免疫化されたマウスからの脾臓細胞のＨＢｓＡｇ−及びｇｐ１２０−特異的ＣＴＬ活性。エフェクター細胞活性を、対照Ｐ８１５細胞（白記号）又はＨＢｓＡｇ又はｇｐ１２０  ＣＴＬエピトープを提示するＰ８１５細胞（黒記号）の51Ｃｒ放出を調べることにより評価した。
【図１１Ａ】免疫化されたマウスにおけるＧｐ１２０−特異的及びＨｂｓＡｇ特異的抗体応答。特異的抗体力価（μｇ／mlで表す）（図１１Ａ）及びアイソタイプ・プロフィールをＥＬＩＳＡテストを用いて評価した。プールされた血清からの値を表中に示す。そしてアイソタイプ分布を図中に示す。
【図１１Ｂ】ｇｐ１２０−特異的抗体のアイソタイプ・パターンを示す。
【図１２】時間にわたる１０動物の群当りの平均腫瘍成長の評価。
【実施例】
【００７３】
本発明は、以下の実施例により説明されるが、これに限定されるものではない。
【００７４】
実施例１：リポ−ＯｓｐＡに対する全身的抗体の鼻腔内ブースティングのためのＱＳ２１とＣｐＧの使用
本実施例において、我々は、溶解性サポニン、例えば、ＱＳ２１と免疫刺激剤、例えば、ＣｐＧが、シナルジスティックなやり方で、マウスの鼻腔内ブースティング・ワクチン接種に対する全身的免疫学的応答を高めることができたかどうかを調べた。８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当り５動物）を、アルム（ａｌｕｍ）（５０μｇ）上に配合されたリポ−ＯｓｐＡ（１μｇ）で筋中免疫化した。３ヶ月後、このマウスを、Ａ：ＰＢＳ；Ｂ：２０μｇ  ＣｐＧ１００１（ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ，Ｋｒｉｅｇ  １８２６）；Ｃ：５μｇ  ＱＳ２１（Cambridge Biotech, USAから得たもの）；Ｄ：２０μｇ  ＣｐＧ１００１＋５μｇ  ＱＳ２１のいずれかの中に５μｇリポ−ＯｓｐＡを含む１０μｌの溶液（鼻孔当り５μｌ、ピペットにより滴としてデリバリーされる）を（麻酔下で）鼻腔内で；又はＥ；アルム（５０μｇ）上に吸着された１μｇのリポ−ＯｓｐＡの筋肉内注射により、ブーストした。
【００７５】
方法
マウスにおけるＯｓｐＡ−特異的血清ＩｇＧの計測のためのＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃイムノプレートを、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ml  ＯｓｐＡ  ５０μｌ／ウェル（プレートのＢ〜Ｈ列内）で、又はＰＢＳ中５μｇ／ml精製ヤギ抗−マウスＩｇ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）５０μｌ（Ａ列）で、一夜コートする。上記プレートの空いた場所を、飽和バッファー：１％ＢＳＡ、０．１％ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）、及び４％正常ウシ血清（ＮＢＳ）を含むＰＢＳを用いて、ブロックする（１時間、３７℃）。次に、飽和バッファー（ウェル当り５０μｌ）中で希釈され、そして標準曲線として添加されたＩｇＧアイソタイプ混合物の逐次的２倍希釈物（２００ng／mlから出発し、そしてＡ列内に入れられたＳｉｇｍａからのマウス・モノクローナル抗体ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂの混合物）、及び（１／１００希釈から出発し、そしてＢ〜Ｈ列内に入れられた）血清サンプルを、３７℃で１時間３０分の間インキュベートする。次に、上記プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０））で（３回）洗浄する。次に、飽和バッファー中で１／５０００希釈されたビオチニル化ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、３７℃で、１時間３０分の間インキュベートする（５０μｌ／ウェル）。３回の洗浄、その後のストレプトアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加の後、プレートを５回洗浄し、そして顕色バッファー（５０mM  pH４．５クエン酸バッファー中ＯＰＤＡ  ０．４mg／ml（Ｓｉｇｍａ）及びＨ2 Ｏ2   ０．０３％）５０μｌ／ウェルとともに、室温で２０分間インキュベートする。顕色を、５０μｌ／ウェルＨ2 ＳＯ4   ２Ｎの添加により停止する。光学密度を、Ｂｉｏｒａｄ  ３５５０イムノリーダーを用いて４９２nmと６３０nmで読む。抗体力価を、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて４変数計算法により計算する。
【００７６】
リポ−ＯｓｐＡに対する血清ＬＡ２−様抗体力価の計測のための阻害アッセイ
ワクチン受容者における抗体力価を、彼（女）らのＬＡ２−様特異性に関して試験した。ＬＡ２は、バクテリアの表面にあるコンホメーショナルなＯｓｐＡエピトープを認識し、そしてインビトロにおいてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを殺すことができ、そして実験室で培養されたスピロヘータによる感染に対してマウスを保護することができることが示されているネズミのモノクローナル抗体である（Schaible UE et al. 1990. Proc Natl Acad Sci USA 87 : 3768-3772）。さらに、ＬＡ−２  ｍａｂは、殺バクテリア抗体と相関することが示されており、そしてヒト血清についての研究は、（ＥＬＩＳＡにより計測されるとき）合計抗−ＯｓｐＡ  ＩｇＧ力価とＬＡ２力価との間の良い相関をも示している。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃイムノプレートを、ＰＢＳ水で希釈した０．５μｇ／mlリポＯｓｐＡ  ５０μｌ／ウェルで４℃において一夜コートする。空いた場所を、飽和バッファー（１００μｌ／ウェルの飽和バッファー：ＰＢＳ／ＢＳＡ  １％／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％／ＮＢＳ  ４％）で、３７℃において１時間ブロックした。４μｇ／mlから開始するＬＡ２モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）の逐次的２倍希釈物を、標準曲線を作るために、飽和バッファー中で希釈した（ウェル当り５０μｌ）。（１／１０希釈から開始する）ワクチン受容者からの血清サンプルの希釈物も添加し、そして上記プレートを３７℃で２時間インキュベートした。上記プレートを、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ２０（０．１％）で３回のインキュベーションの後に洗浄した。飽和バッファー中で希釈したＬＡ２  ｍＡｂ−ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（１／１０，０００）を、各ウェルに添加し（５０μｌ／ウェル）、そして３７℃で１時間インキュベートした。５回の洗浄後、プレートを、５０μｌ／ウェルの顕色バッファー（５０mM  pH４．５クエン酸バッファー中ＯＰＤＡ  ０．４mg／ml及びＨ2 Ｏ2   ０．０３％）で、（暗所で）室温において２０分間インキュベートする。上記反応及び色の形成を、Ｈ2 ＳＯ4   ２Ｎで停止した。光学密度を、Ｂｉｏｒａｄ  ３５５０イムノリーダーを用いて、４９２nmと６３０nmで読む。ＬＡ２−様Ａｂ力価を、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて４変数計算方法により計算する。ＬＡ２−様抗体力価を、上記標準曲線との比較により測定した。
【００７７】
結果
ＣｐＧとＱＳ２１は、リポ−ＯｓｐＡに対する全身的抗体の鼻腔内ブースティングを有意に改善する。さらに、両アジュバントが併合されるとき、特に、ＬＡ２抗体に関して、上記応答に対するシナルジスティックな効果が明らかに証明される。ＱＳ２１とＣｐＧの存在下で顕出される体液性応答は、非経口的ブースターにより誘導されたものよりも有意に高い。これらの結果を総合すると、上記結果は、溶解性サポニンと免疫刺激剤を併合する鼻腔内配合物の能力をはっきりと示している。
【００７８】
実施例２：インフルエンザ・ウイルスに対する全身的抗体の鼻腔内ブースティングを強化するためのＱＳ２１とＣｐＧのシナルジスティックな組合せ
本実施例において、我々は、溶血性サポニン、例えば、ＱＳ２１（実施例を参照のこと）、及び免疫刺激剤、例えば、ＣｐＧが、失活全インフルエンザ・ウイルスで鼻腔内プライムされたマウスにおける全身的抗体の鼻腔内ブーストをシナルジスティックなやり方で高めることができたかどうかを調べた。
【００７９】
８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当り１０動物）を、ヒトにおいて生じる天然のプライミングを真似るために、β−プロピオラクトン失活３価全インフルエンザ・ウイルス（Ａ／北京／２６２／９５；Ａ／ヨハネスブルグ／３３／９４；Ｂ／パナマ／４５／９０；５μｇＨＡ／株）で鼻腔内プライムした。２８日後、上記マウスを、Ａ：ＰＢＳ；Ｂ：５０μｇ  ＣｐＧ（ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ，Ｋｒｉｅｇ  ２００６）；Ｃ：４．５μｇ  ＱＳ２１（Cambridge Biotech, USAから得られたもの）；Ｄ：５０μｇ  ＣｐＧ＋４．５μｇ  ＱＳ２１のいずれかの中に１．５μｇＨＡ／株の、β−プロピオラクトン失活３価全インフルエンザ・ウイルス（上記プライミング免疫化におけるものと同一のもの）を含む２０μｌの溶液（鼻孔当り１０μｌ、ピペットにより滴としてデリバリーされたもの）で；又は、Ｅ：１．５μｇＨＡ／株の３価スプリット・インフルエンザ・ウイルスの筋中注射（上記プライミング免疫化におけるものと同一の株）により、（麻酔下で）鼻腔内ブーストした。Ｆｌｕ抗原は、ＳＳＤ  ＧｍＢＨ製造者（Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により供給された。
【００８０】
図３と図４は、上記鼻腔内ブースティングから１４日後における、上記血清Ｆｌｕ株特異的ＩｇＧ力価及び血液凝集阻害（ＨＡＩ）力価を示す。
【００８１】
方法
マウスにおける抗−インフルエンザＩｇＧ力価の計測のためのＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃイムノプレートを、ＰＢＳ中に希釈した５０μｌ／ウェルの、１μｇ／mlの全インフルエンザ・ウイルス抗原（プレートのＢ〜Ｈ列内）で、又はＰＢＳ中５μｇ／ml精製ヤギ抗−マウスＩｇ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）５０μｌ（Ａ列）で、一夜コートする。上記プレートの空いた場所を、飽和バッファー：１％ＢＳＡ、０．１％ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）、及び４％正常ウシ血清（ＮＢＳ）を含むＰＢＳを用いて、ブロックする（１時間、３７℃）。次に、飽和バッファー（ウェル当り５０μｌ）中で希釈され、そして標準曲線として添加されたＩｇＧアイソタイプ混合物の逐次的２倍希釈物（２００ng／mlから出発し、そしてＡ列内に入れられたＳｉｇｍａからのマウス・モノクローナル抗体ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂの混合物）、及び（１／１００希釈から出発し、そしてＢ〜Ｈ列内に入れられた）血清サンプルを、３７℃で１時間３０分の間インキュベートする。次に、上記プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０））で（３回）洗浄する。次に、飽和バッファー中で１／５０００希釈されたビオチニル化ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、３７℃で、１時間３０分の間インキュベートする（５０μｌ／ウェル）。３回の洗浄、その後のストレプトアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加の後、プレートを５回洗浄し、そして顕色バッファー（５０mM  pH４．５クエン酸バッファー中ＯＰＤＡ  ０．４mg／ml（Ｓｉｇｍａ）及びＨ2 Ｏ2   ０．０３％）５０μｌ／ウェルとともに、室温で２０分間インキュベートする。顕色を、５０μｌ／ウェルＨ2 ＳＯ4   ２Ｎの添加により停止する。光学密度を、Ｂｉｏｒａｄ  ３５５０イムノリーダーを用いて４９２nmと６３０nmで読む。抗体力価を、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて４変数計算法により計算する。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で失活させた、上記コーティングのために使用された全インフルエンザ・ウイルス（株Ａ／北京／２６２／９５）は、ＳＳＤ  ＧｍＢＨ製造者（Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により供給される。
【００８２】
マウスにおけるＦｌｕ−特異的血清Ａｂｓの血液凝集阻害（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（ＨＡＩ）活性）
血清（２５μｌ）を、室温（ＲＴ）で２０分間、１００μｌのボレート０．５Ｍバッファー（pH９）及び１２５μｌ  Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ−購入カオリン（ｋａｏｌｉｎ）でまず処理する。遠心分離（３０分間、３０００ＲＰＭ又は８６０ｇ）の後、（上記血清の１／１０希釈物に対応する）１００μｌ上清を取り、そして０．５％ニワトリ赤血球とともに４℃で１時間インキュベートする。上清を、３２００ＲＰＭで１０分間の遠心分離の後に集める（９７０ｇ）。両操作を、上記血清中に含まれる天然の血液凝集性因子を除去するために行う。次に、２５μｌの処理された血清を、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレート内の２５μｌ  ＰＢＳ中で希釈する（１／２０から出発する逐次的２倍希釈物）。ＢＰＬ失活全ウイルスを、撹乱下ＲＴにおいて３０分間、４血清凝集ユニットの濃度において（すなわち、赤血球の凝集を引き起こす最後のものよりも４倍低い希釈において）添加する（２５μｌ／ウェル）。次にニワトリの赤血球をＲＴで１時間添加する（２５μｌ／ウェル）。最後に、プレートを、読む前に４℃で一夜保つ。ＨＡＩ力価は、上記ウイルス誘導血液凝集を阻害する最後の血清希釈に対応する。
【００８３】
結果
ＣｐＧとＱＳ２１は、Ｆｌｕ株に対するＩｇＧ又はＨＡＩ抗体の鼻腔内ブースティングを改善しない。しかしながら、両アジュバントが併合されるとき、上記応答に対するシナルジスティックな効果が明らかに証明される。ＱＳ２１とＣｐＧの存在下で顕出されるＨＡＩ応答は、非経口ブースターにより誘導されるものよりもさらに類似する。これらの結果は、溶血性サポニン及び免疫刺激剤を併合する鼻腔内配合物の能力を確認する。それらは、また、いくつかのＣｐＧ配列がこの文脈において効率的であることができるということをも示す（本実施例におけるＫｒｉｅｇ  ２００６、及び実施例３と５におけるＫｒｉｅｇ  １８２６）。
【００８４】
実施例３：リポ−ＯｓｐＡに対する全身的抗体の鼻腔内ブースティングを高めるためのβ−エスシンとＣｐＧのシナルジスティックな併合
我々は本実施例において、ＱＳ２１とＣｐＧの間に観察されるものよりも類似するシナジーが、他の溶血性サポニン（実施例参照）、例えば、β−エスシンとともに観察されることができる可能性を評価する。非溶血性サポニン、グリチルリジン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ  ａｃｉｄ）もテストする。
【００８５】
８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当り６動物）を、アルム（５０μｇ）上に配合されたリポ−ＯｓｐＡ（１μｇ）で筋肉内にプライムした。３ヶ月後、上記マウスを、Ａ：ＰＢＳ；Ｂ：５０μｇ  ＣｐＧ１００１（ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ，Ｋｒｉｅｇ  １８２６）；Ｃ：５μｇ  β−エスシン（Ｓｉｇｍａから購入）；Ｄ：５０μｇ  ＣｐＧ１００１＋５μｇ  β−エスシン；Ｅ：５μｇグリチルリジン酸（Ｓｉｇｍａから購入）；Ｆ：５０μｇ  ＣｐＧ１００１＋５μｇグリチルリジン酸中のいずれかに５μｇリポ−ＯｓｐＡを含む１０μｌの溶液（鼻孔当り５μｌ、ピペットにより滴としてデリバリーされたもの）で、又はＧ：アルム（５０μｇ）上に吸着された１μｇリポ−ＯｓｐＡの筋肉内注射により、（麻酔下で）鼻腔内ブーストした。図５は、上記鼻腔内ブースティングから１４日後のＯｓｐＡ特異的−ＬＡ２力価を示す。
【００８６】
方法
本方法は、実施例１に詳述したものと同じである。
【００８７】
結果
β−エスシンとＣｐＧは、全身的ＬＡ２  Ａｂｓの鼻腔内ブースティングを高めるためにシナルジスティックに作用する。この併合は、非経口ブースターよりも高められたＡｂ応答を顕出する。他方において、このようなシナジーは、グリチルリジン酸とＣｐＧの併合によっては得られない。
【００８８】
上記の結果及び本特許の先の結果を総合すると、シナルジスティックなやり方で免疫応答を強化するＣｐＧ及び異なる溶血性サポニンの能力が示される。
【００８９】
実施例４：ＣｐＧ及び／又はＤＱＳ２１と配合されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＲＴＳ，Ｓ及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０を用いた免疫原性試験
１．実験概要
２つのマウス免疫原性試験を、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）及びＱＳ２１の潜在的な付加的又はシナルジスティックな効果を評価するために行った。マウスの群を、ＣｐＧとＱＳ２１を単独で又は併合して配合されたＲＴＳ，Ｓとｇｐ１２０で免疫化した。これらのアジュバント併合物を、担体Ａｌ（ＯＨ）3 又は油／水（ｏ／ｗ）エマルジョンの存在下でもテストした。
【００９０】
上記配合物の免疫原性を、２つの非経口免疫化の後に検査した。血清を、抗原−特異的抗体の存在について、及び抗体アイソタイプの分布について分析した。細胞仲介免疫応答を評価するために脾臓細胞を使用した。これらの細胞を、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びリンパ球増殖性（リンパ球増殖）細胞の存在についてテストした。
【００９１】
【表１】
2011241222.tif 000002
【００９２】
【表２】
2011241222.tif 000003
【００９３】
２．配合
２．１．実験１
配合方法：
配合物を、各注射の３日前に調製した。必要なとき、ＲＴＳ，Ｓ（１０μｇ）とｇｐ１２０（１０μｇ）を、１００μｇのＡＬ（ＯＨ）3 上に吸着させた。必要なとき、ＭＰＬ（５μｇ）を添加し、そして１０倍濃縮ＰＢＳ  pH７．４とＨ2 Ｏのミックスとして、バッファー添加の３０分前にインキュベートした。但し、それに関してそのバッファーがＰＯ4 ，ＮａＣｌ  １０／１５０  pH６．８であるところのＤＱを含まない群を除く。３０分後、必要な場合、１／５のＱＳ２１／コレステロールの重量比においてリポソームと混合されたＱＳ２１（５μｇ）（ＤＱという）を、上記配合物に添加した。３０分後、上記オリゴとの配合のために、１００μｇのＣｐＧを、保存料として５０μｇ／mlのチオメルサールの添加の３０分前に添加した。
【００９４】
【表３】
2011241222.tif 000004
【００９５】
インキュベーションは全て、撹乱しながら室温で行った。
【００９６】
２．２．実験２
配合方法：
配合を、両注射と同時に行う。１のマウスのための注射の容量は１００μｌである。５０μｇ／mlのチオメルサールを保存料として添加する。
【００９７】
群１：ＲＴＳ，Ｓ（１０μｇ）とｇｐ１２０（１０μｇ）を、等張性のためにＨ2 ＯとＰＢＳ  pH６．８で希釈する。５分後、上記配合物を、ＣｐＧ１８５６（１００μｇ）上に吸着させる。
【００９８】
群２：ＲＴＳ，Ｓ（１０μｇ）とｇｐ１２０（１０μｇ）を、等張性のためにＨ2 ＯとＰＢＳ  pH７．４で希釈する。３０分後、ＲＴＳ，Ｓとｇｐ１２０を、ＤＱ（５μｇ）上に吸着させる。吸着から３０分後、上記配合物をＣｐＧ１８５６（１００μｇ）上に吸着させる。
【００９９】
群３：ＲＴＳ，Ｓ（１０μｇ）とｇｐ１２０（１０μｇ）を、等張性のためにＨ2 ＯとＰＢＳ  pH６．８で希釈する。５分後に、上記配合物を、ｏ／ｗエマルジョン上に吸着させる。吸着から５分後に、上記配合物を、ＣｐＧ（１００μｇ）の添加前にＱＳ２１（５μｇ）上に吸着させる。
【０１００】
３．免疫学的方法
群当り９匹の（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７Ｂ１／６）Ｆ１マウスが、後肢に、２週間の間隔をあけて２回、２×５０μｌのワクチンを受容した。２週間後、抗体応答を評価するために血清を得、そして脾臓細胞を収獲して、細胞−仲介免疫応答を測定した。
【０１０１】
リンパ球増殖分析のために、細胞を、１ml当り２×１０6 の濃度において９６−ウェル丸底マイクロタイター・プレート内で４連で植菌した。細胞を、ＲＴＳ，Ｓ又はｇｐ１２０抗原の異なる濃度の存在下で、抗生物質、グルタミン、及び１％（ｖ／ｖ）正常マウス血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０中で７２又は９６時間培養した。対照細胞を、抗原を伴わずに培養した。次に、上記細胞を、１μＣｉ／ウェルの〔 3Ｈ〕−チミジンで一夜パルスし、収獲し、そして取り込まれた放射能を、ベーターカウンター内で測定した。結果を、１分当りの平均カウント数（ｃｐｍ）として表す。
【０１０２】
ＣＴＬ分析のために、細胞を、１０μｇ／mlの、ＨＢｓＡｇ  ＣＴＬエピトープ（Schirmbeck et al., 1995)に対応する合成ペプチドｐＣＭＩ００３（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ）、又はｇｐ１２０  ＣＴＬエピトープ（Casement et al., 1995)を提示するペプチドｐＣＭＩ００７（ＧＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＡＡＲＫ）の存在下で、６−ウェル・プレート内で７日間培養した。上記培養期間の終わりに、対照細胞とＳ−トランスフェクトＰ８１５細胞を用いて標準的な〔51Ｃｒ〕−放出アッセイにおいてＨＢｓＡｇ−特異的細胞溶解活性について２連で、エフェクター細胞を評価した。Ｇｐ１２０−特異的細胞毒性を、未処理で残ったか又はペプチドｐＣＭＩ００７で１時間パルスされたＰ８１５標的細胞を用いて、測定した。最小及び最大放出を、それぞれ、エフェクター細胞を伴わない標的細胞を用いて、そして３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加により、測定した。結果を、％〔５１Ｃｒ〕−放出（（実験培養物のｃｐｍ−自然放出のｃｐｍ）／（最大放出のｃｐｍ−自然放出のｃｐｍ））として表す。
【０１０３】
プールされた血清の滴定及びアイソタイピングを、ＨｂｓＡｇでコートされたプレートを用いて標準的な酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において行った。血清を１：４００から開始してＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈した。Ｉｇに特異的なビオチニル化第２抗体又はアイソタイプＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ、その後のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン・コンジュゲートを、結合抗体の検出のために使用した。ＥＬＩＳＡ力価を、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによる照会から計算し、そしてＥＬＩＳＡユニット（EU／ml）で表した。Ｇｐ１２０−特異的抗体力価を、ｇｐ１２０タンパク質でコートしたプレートを用いて標準的なＥＬＩＳＡにおいて測定した。血清を、１：１００から開始してＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０／ＢＳＡ中で希釈した。Ｉｇについて特異的なビオチニル化第２抗体又はアイソタイプＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ、その後のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン・コンジュゲートを、結合した抗体の検出のために使用した。力価を、標準的なマウスに関して計算し、そしてμｇ／mlとして表した。
【０１０４】
４．結果
実験１
リンパ球増殖応答の分析は、上記群間でＲＴＳ，Ｓに関して有意差を示さなかった。これに反し、両ＣｐＧとＤＱＳ２１を含む群１と３は、ＣｐＧ又はＤＱ２１単独を含む群よりも良好なｇｐ１２０−特異的リンパ球増殖応答を示した（図６）。
【０１０５】
本実験においては、ＨＢｓＡｇ−特異的ＣＴＬだけが計測された。上記２つのアジュバント成分の中の１だけにより免疫化させた群２及び４と、ＣｐＧとＤＱ２１を受容している群１及び３の間に、ＣＴＬ導入における目立った差異は存在しなかったが、Ａｌ（ＯＨ）3 の存在は、群１におけるＣｐＧとＤＱＳ２１の組合せについて観察されたＣＴＬ活性を低下させた（図７）。しかしながら、ＣｐＧとＤＱＳ２１がＤＱＳ２１単独よりも良好であり、そして上記組合せが、ＣｐＧ単独よりも、Ａｌ（ＯＨ）3 の存在下でより多くのＣＴＬを誘導したという傾向が存在した（図７）。
【０１０６】
上記マウスの体液性免疫応答を、ＨＢｓＡｇ−特異的抗体の存在についてのみ調べた。力価は、約３倍の増加を示した群３を除く全ての群において類似であった。このことは、Ａｌ（ＯＨ）3 の存在下、ＤＱＳ２１とＣｐＧの組合せが、ＣｐＧ単独よりも免疫原性であることを示している（図８）。アイソタイプ分布は、Ａｌ（ＯＨ）3 −含有群３と４について類似していたが、Ａｌ（ＯＨ）3 の存在下では、ＣｐＧとＤＱＳ２１の組合せは、ＤＱＳ単独よりも強いＴH1−様アイソタイプ・パターンを誘導した（図８）。
【０１０７】
実験２
ＲＴＳ，Ｓとｇｐ１２０に特異的なリンパ球増殖応答は、本実験において酷似していた。このデータは、（単独又はｏ／ｗエマルジョンとともにある）ＤＱＳ２１の添加が、両抗原に対するリンパ球増殖応答を高めるということを示している（図９）。
【０１０８】
ＣＴＬ応答を、両ＨＢｓＡｇとｇｐ１２０  ＣＴＬエピトープ・ペプチドを使用して評価した。両ケースにおいて、ＣＴＬは、ＣｐＧ単独での群１の免疫化の後に検出されることができた（図１０）。しかしながら、ＤＱＳ２１の添加は、両抗原についてＣＴＬにおけるかなりの増加をもたらした（図１０）。ｏ／ｗエマルジョンの存在は、ＤＱＳ２１正の効果を中和するか（ｇｐ１２０）又はインビトロ・アッセイのバックグラウンドを増加させた（ＨＢｓＡｇ）。
【０１０９】
ＨＢｓＡｇとｇｐ１２０に対する抗体応答は、ＣｐＧアジュバントへのＤＱＳ２１の添加により高められた（図１１Ａ）。さらなる増加が、ｏ／ｗエマルジョンが上記配合物中に含まれるときに、観察された（図１１Ａ）。ＣｐＧへのＤＱＳ２１の添加は、より顕著なＴH1バイアスの方向に、ｇｐ１２０アイソタイプ特性をシフトさせた（図１１Ｂ）が、ＨＢｓＡｇアイソタイプ特性に対するインパクトは、本実験においてはより目立っていなかった。
【０１１０】
５．結論
ＣｐＧとＤＱＳ２１の組合せにより配合されたＲＴＳ，Ｓとｇｐ１２０による免疫化は、強い抗原特異的免疫応答をもたらす。アジュバント成分ＣｐＧとＤＱＳ２１の組合せは、その単一成分に比較して、
−リンパ球増殖応答を高め、
−ＣＴＬ活性を高め、
−抗体力価及びＴH1アイソタイプ・パターンを強化する。
【０１１１】
実施例５：ＴＣＩ腫瘍モデルにおけるＣｐＧ及び／又はＤＱＳ２１配合物の治療的能力
１．実験デザイン
４群の、１０匹のマウスＣ５７ｂ１／６は、脇腹に０日目に皮下に、１０ｅ６（２００μｌ）ＴＣＩ細胞（Ｅ７発現腫瘍細胞）を受容した。
【０１１２】
次に、マウスは、腫瘍接種後１４及び２１日目に、２回ワクチン接種され、５μｇの配合されたＰＤ１／３Ｅ７  ＨＰＶ１６が足部に注射された。腫瘍増殖を個々に週２回計測した。
【０１１３】
マウスの群：
１．ワクチンなし
２．ＰＤ１／３Ｅ７＋ＣＰＧ（１０μｇ  ＯＤＮ２００６）
３．ＰＤ１／３Ｅ７＋ＤＱＳ２１（０．５μｇ）
４．ＰＤ１／３Ｅ７＋ＣＰＧ＋ＤＱＳ２１
上記腫瘍増殖を、１周間に２回、個々の腫瘍を計測することによりモニターした。
【０１１４】
２．配合
配合を、注射の日に行った。１匹のマウスについての注射の容量は１００μｌであった。必要な場合、ＰＤ１／３Ｅ７（５μｇ）を、等張性のためにＨ2 ＯとＰＢＳ  pH７．４で希釈した。５分後、必要な場合、１／５のＱＳ２１／コレステロール重量比でリポソームと混合されたＱＳ２１（０．５μｇ）（ＤＱという）を、上記配合物に添加した。３０分後、上記オリゴとの配合のために、保存料としての１μｇ／mlのチオメルサールの添加の３０分前に、１０μｇのＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）を添加した。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
３．結果
時間にわたる１０動物の群当りの平均腫瘍成長の評価を図１２に示す。１０ｅ６  ＴＣＩ細胞の腫瘍接種を受容した動物の１００％が、増殖性の腫瘍を進行性に顕出した。
【０１１７】
ワクチン接種されていない動物の７０〜８０％又は、ＤＱＳ２１中のＥ７タンパク質でワクチン接種された動物が、３５日目までに死んだ。
【０１１８】
ＤＱＳ２１中に配合されたＥ７タンパク質による２つのワクチン接種は、腫瘍成長に対してほとんど効果をもっていなかった。反対に、２つのワクチン接種、ＣｐＧアジュバント中の５μｇ  ＰｒｏｔＤ  １／３  Ｅ７  ＨＰＶ１６によるＩＦＰ（１４日目と２１日目）は、上記の樹立された腫瘍の反転を誘導し、そしてマウスを死から保護した：上記マウスの７０〜８０％が３５日目においてさえ生存していた。
【０１１９】
２つの免疫刺激剤ＣＰＧとＤＱＳ２１の組合せは、単独で使用されたＣｐＧを僅かに上廻る有益な効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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