(57)【要約】【課題】非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘導するためのＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア送達の提供。【解決手段】ＡＳ−オリゴヌクレオチドが、特に、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘導するためにマイクロスフェア形態で送達される。このマイクロスフェアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドをとりこむ。プロセスは、インビボおよびインサイチュでのＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病状態を予防するためにアンチセンスアプローチを使用する工程を包含する。このオリゴヌクレオチドは、主要転写物ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびそれらの組み合わせへ結合するように標的化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
２００４年５月１２日に出願された、仮特許出願シリアル番号６０／５７０，２７３、および２００４年１１月５日に出願された、仮特許出願シリアル番号６０／６２５，４８３。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に、特に、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘導するためのＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア送達に関する。より詳しくは、本発明は、完全に水性の条件を使用して製造されるマイクロスフェア（マイクロスフェアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドをとりこむ）による薬物送達技術に関する。これらのマイクロスフェアは、インビボおよびインサイチュでのＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病状態を予防する、アンチセンスアプローチのために使用される。
【０００３】
（発明の背景）
微粒子、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルは、１ｍｍ未満の直径、より好ましくは１００ミクロン未満の直径を有する、固体または半固体の粒子であり、これらは、種々の材料（合成ポリマー、タンパク質および多糖類が挙げられる）から形成され得る。マイクロスフェアは、多くの異なる用途（主に、分離、診断および薬物送達）において使用されてきた。
【０００４】
多くの異なる技術が、合成ポリマー、天然ポリマー、タンパク質および多糖類から、これらのマイクロスフェアを作製するために使用され得、これらの技術としては、相分離、溶媒エバポレーション、乳化および噴霧乾燥が挙げられる。一般的に、ポリマーは、これらのマイクロスフェアの支持構造を形成し、目的の薬物は、このポリマー構造に取り込まれる。マイクロスフェアの形成のために使用される例示的なポリマーとしては、Ｒｕｉｚに対する特許文献１、Ｒｅｉｄらに対する特許文献２、Ｔｉｃｅらに対する特許文献３、Ｔｉｃｅらに対する特許文献４、Ｔｉｃｅらに対する特許文献５、Ｓｉｎｇｈらに対する特許文献６、Ｂｏｙｅｓらに対する特許文献７、Ｔｉｃｅらに対する特許文献８およびＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対する特許文献９に記載される乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ）のホモポリマーおよびコポリマー；Ｉｌｌｕｍに対する特許文献１０に記載されるテトロニック（ｔｅｔｒｏｎｉｃ）９０８およびポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７のようなブロックコポリマー；ならびに、Ｃｏｈｅｎらに対する特許文献１１に記載されるポリホスファゼンが挙げられる。これらのようなポリマーを使用して作製されるマイクロスフェアは、低い装填効率を示し、そしてしばしば、ポリマー構造へ目的の薬物を、低い割合でしか取り込み得ない。したがって、治療効果を達成するために、相当量のマイクロスフェアが、しばしば投与されねばならない。
【０００５】
球状のビーズまたは粒子が、長年にわたり、生化学者のための道具として市販されている。例えば、ビーズに結合された抗体は、特定のリガンドに特異的な、比較的大型の粒子を生成する。この大型の抗体コーティングされた粒子は、通常、細胞活性化のために、細胞の表面上のレセプターを架橋するために使用され、免疫親和性精製のための固相に結合され、そして、所望の部位へ治療薬を標的する粒子に結合体化された組織特異的抗体または腫瘍特異的抗体を使用して、長期間にわたり、ゆっくり放出される治療薬を送達するために使用され得る。
【０００６】
現在利用可能な微粒子またはビーズの１つの欠点は、これらが、生成するのが困難かつ高価であることである。これらの公知の方法により生成される微粒子は、広範な粒子サイズの分布を有し、しばしば均一性を欠き、そして、活性成分の濃度が高い場合、長期の放出動態を示すことができない。さらに、これらの公知の方法において使用されるポリマーは、微粒子を形成するために、有機溶媒中に溶解される。それゆえ、これらは、有機溶媒を取り扱うように設計される特別な設備において生成されなければならない。これらの有機溶媒は、微粒子内に含まれるタンパク質またはペプチドを変性し得る。残留有機溶媒は、ヒトまたは動物に投与される場合、有毒であり得る。
【０００７】
さらに、利用可能な微粒子は、治療薬を投与するために、通常使用される針のサイズの開口部を通過するのに適合するか、または吸入による投与のために有用であるように十分に小さいサイズであることは稀である。例えば、ポリ乳酸グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）を使用して調製される微粒子は、大型であり、そして凝集する傾向がある。サイズの選択工程（産物の損失をもたらす）は、注射には大きすぎる粒子を除去するために必要である。注射のために適切なサイズであるＰＬＧＡ粒子は、大型の粒子サイズに適応する大口径の針により投与されるべきであるが、この投与は、しばしば、患者に不快感を引き起こす。
【０００８】
一般的に、多くの現在利用可能な微粒子は、水性媒体中のそれらの内容物を放出するように活性化され、それゆえ、早すぎる放出を防止するために凍結乾燥されなければならない。さらに、ＰＬＧＡ系を使用して調製されるような粒子は、侵食と拡散との両方に基づく放出動態を示す。この型のシステムにおいて、薬物のイニシャル・バーストまたは急速な放出が観察される。このバースト効果は、この粒子が投与された患者において、望まれない副作用をもたらし得る。
【０００９】
目標薬物をカプセル化する脂質を使用して調製される微粒子が、公知である。例えば、粒子を形成する複数の水性区画を囲む二重層膜内に並べられる脂質は、Ｓｉｎｉｌ  Ｋｉｍに対する特許文献１２に記載されるような後の送達のために、水溶性の薬物をカプセル化するために使用され得る。これらの粒子は、一般的に１０ミクロンより大きなサイズであり、そして関節内投与、髄腔内投与、皮下投与および硬膜上投与のために設計される。あるいは、リポソームが、小分子の静脈内送達のために使用されてきた。リポソームは、単一または複数のリン脂質とコレステロールとの二重層からなる球状の粒子である。リポソームは、３０ミクロン以上のサイズであり、そして種々の水溶性薬物または脂溶性薬物を輸送し得る。リポソーム技術は、問題（脂質成分の純度、毒性の可能性、小胞の不均一性および安定性、過剰な取り込み、ならびに製造の問題または有効期限の問題が挙げられる）により妨害されている。
【００１０】
医学界のための目的は、糖尿病処置のための動物中の細胞への核酸の送達である。例えば、核酸は、（インビトロ）培養物中の細胞へ比較的効果的に送達され得るが、核酸が動物へ送達される（インビボ）場合には、ヌクレアーゼが、核酸の分解を高い割合でもたらす。
【００１１】
さらに、ヌクレアーゼ消化から核酸を保護するために、核酸送達ビヒクルは、低い毒性を示さねばならず、効率的に細胞により吸収されねばならず、そして明確かつ容易に製造される処方を有さなければならない。臨床試験において示されるように、送達のためのウイルスベクターは、インビボで、非常に有害で、さらに致死的な免疫応答をもたらし得る。さらに、この方法は、インビボで、突然変異誘発効果を有する可能性を有する。異なる処方物（例えば、リポソームまたは陽イオン性脂質複合体）の脂質複合体中に核酸を封入することによる送達は、一般的に、インビボで無効であり、そして中毒作用を有し得る。種々のポリマーまたはペプチドと核酸との複合体は、一貫する結果を示さず、そして、これらの処方物の毒性は、未だに解決されていない。核酸もまた、送達のためのポリマーマトリクス中にカプセル化されたが、これらの場合において、粒子は広範なサイズ範囲を有し、治療適用についての有効性は未だに実証されていない。
【００１２】
それゆえ、核酸送達の問題に取り組む必要性が存在し、マイクロスフェアの開発に対して、そして、マイクロスフェアを作製するための新規の方法に対して、必要性が存在し続けている。マイクロスフェアに関する詳細は、Ｓｃｏｔｔらに対する特許文献１３、Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏらに対する特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６および特許文献１７ならびにＷｏｉｓｚｗｉｌｌｏに対する特許文献１８において見られる。これらおよび本明細書で特定される参考文献は、本明細書において参考として援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，２１３，８１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４１７，９８６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５３０，８４０号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８９７，２６８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０７５，１０９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１０２，８７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３８４，１３３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６０，６１０号明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開第２４８，５３１号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，９０４，４７９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１４９，５４３号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，４２２，１２０号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，４５８，３８７号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，２６８，０５３号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，０９０，９２５号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，９８１，７１９号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，５９９，７１９号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，５７８，７０９号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（本発明の要旨）
本発明にしたがって、樹状細胞に送達されるべきＤＮＡは、マイクロスフェアとして送達される。このような送達アプローチは、マイクロスフェア中の核酸へのヌクレアーゼの接近を防止すると考えられる。ＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフェア送達は、特に、ＮＯＤマウスモデルにおいて、樹状細胞の寛容を誘導するために実行される。マイクロスフェアは、マイクロスフェアがアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを取り込む、水性条件を使用して製造される。これらのマイクロスフェアは、遺伝子発現を阻害し、そしてインビボおよびインサイチュでのＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病状態を予防するために使用される。
【００１５】
本発明の好ましい局面において、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６主要転写物に標的化される、３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドが合成される。そして、このオリゴヌクレオチド混合物の水溶液が調製され、ポリマー溶液と組み合わされる。加工後、このオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアが提供され、そして、これらはＮＯＤマウスに送達される。
【００１６】
本発明のこれらの局面および他の局面、目的、特徴ならびに利点（種々の組み合わせを含む）は、以下の詳細な説明の考察から、明白であり、この考察を通して明確に理解される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
１型糖尿病の処置のためのオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアであって、該オリゴヌクレオチドは、該マイクロスフェアの全重量に基づいて、該マイクロスフェアの約３０重量％と約１００重量％との間を構成し、該マイクロスフェアは、約５０ミクロンを超えない平均粒子サイズを有する、マイクロスフェア。
（項目２）
前記オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６主要転写物ならびにその組み合わせからなる群から選択される主要転写物に結合するように標的化される、項目１に記載のマイクロスフェア。
（項目３）
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３およびその組み合わせからなる群から選択される、項目２に記載のマイクロスフェア。
（項目４）
１型糖尿病を有する個体へ、マイクロスフェアの形態で核酸を送達するためのプロセスであって、該マイクロスフェアの送達のための投与経路は、静脈内、筋内、皮下、局所、皮内、腹腔内、経口、肺、眼、経鼻または直腸からなる群から選択される、プロセス。
（項目５）
項目１に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から非肥満性糖尿病マウスの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目６）
項目２に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から非肥満性糖尿病マウスの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目７）
項目１に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目８）
項目２に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目９）
項目１に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊からヒトの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目１０）
項目２に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊からヒトの膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目１１）
項目１に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊および１型糖尿病の発症から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
（項目１２）
項目２に記載のマイクロスフェアを皮下注射する工程を包含する、自己免疫性の破壊および１型糖尿病の発症から個体の膵臓β細胞を防御するためのプロセス。
【００１７】
この説明の過程で、添付の図面への参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、１型糖尿病での、膵臓のインシュリン産生β細胞の自己免疫性の破壊における樹状細胞の役割の略図である。
【図２】図２は、βガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターの図である。
【図３】図３は、プラスミドＤＮＡマイクロスフェアによる、ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞のトランスフェクションについての証拠を提供する顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、各々ＤＮＡａｓｅへの暴露後の、無防備のプラスミドＤＮＡおよび本発明にしたがう２つのプラスミドＤＮＡマイクロスフェア処方物のアガロース電気泳動ゲルの顕微鏡写真である。
【図５】図５は、４つの異なるプラスミドＤＮＡ処理におけるβガラクトシダーゼ活性の棒グラフである。
【図６】図６は、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リジン  ポリカチオンのマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−オルニチン  ポリカチオンのマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真である。
【図８】図８は、マイクロスフェアに、および３つの主要転写物の送達のための他の手順により処置された、ＮＯＤマウスの３つの群における糖尿病発生率をまとめるプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（好ましい実施形態の説明）
必要とされるように、本発明の詳細な実施形態が、本明細書で開示される；しかしながら開示される実施形態は、本発明の例示であるにすぎず、本発明は種々の形態に具体化され得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書で開示される特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求のための単なる根拠として、そして実質的に任意の適切な様式で本発明を種々に使用するように当業者へ教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。
【００２０】
好ましい実施形態は、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の主要転写物に標的化する、本明細書に記載のアンチセンス（ＡＳ）−オリゴヌクレオチドのマイクロスフェアを処方および注射することにより、自己免疫性インシュリン依存性糖尿病を予防する。これらのオリゴヌクレオチドは、ＮＯＤマウスモデルにおいて、インシュリン産生β細胞の破壊を防止することを試みる、免疫寛容を誘導するように設計される。これらのβ細胞の破壊を導く事象は、図１に示される。これは、どのようにして、ＮＯＤマウスおよびヒトにおいて、膵臓のインシュリン産生β細胞の自己免疫性の破壊により、１型糖尿病が発現するかを示す。臨床的な発症の時点において、ヒトは、１０％〜２０％の残余のβ細胞集団を有する。この残余の集団を残すことは、グルコースレベルを調節するのに適切である、残存インシュリンレベルをもたらし得る。本発明の微粒子は、図１に示されるβ細胞の自己免疫性の破壊を妨害するために提供される。
【００２１】
樹状細胞（ＤＣ）は、あらゆる組織において見られ、そして皮下に高度に濃縮される潜在的な抗原提示細胞となるべく、活性化され得ることが理解される。これらの抗原提示樹状細胞は、特に、リンパ節におけるＴ細胞の活性化を介する免疫応答のきっかけとして作用する。
【００２２】
図２は、ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞をトランスフェクトするために使用され得る、βガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターの図面である。プラスミドＤＮＡマイクロスフェアによる、ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞のトランスフェクションについてのインビトロでの証拠が、βガラクトシダーゼ  ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）基質の添加に応答して青色に染色する細胞により、図３において示される。
【００２３】
図４は、マイクロスフェアの、溶液中のＤＮＡを防御する能力を示す。これは、概して本明細書に記載されるように生成される、プラスミドＤＮＡのマイクロスフェアにより付与されるヌクレアーゼ防御を示す、アガロース電気泳動ゲルである。プラスミドサンプル１、２および３において、無防備（ｎａｋｅｄ）のプラスミドＤＮＡがＤＮＡｓｅに曝された。スメアは、３つのレベルのＤＮＡａｓｅ処理の各々において、プラスミドＤＮＡ分解を示す。粒子１のサンプルおよび粒子２のサンプルにおいて、プラスミドＤＮＡマイクロスフェア処方物がＤＮＡａｓｅに曝された。スメアの欠如は、マイクロスフェア処方物が、プラスミドＤＮＡを分解から保護することを示す。
【００２４】
図５は、４つの異なるプラスミドＤＮＡ処理におけるβガラクトシダーゼ活性について報告する。無防備のプラスミドＤＮＡ処理は、非常に低いレベルを示した。幾分より高いレベルが、送達ビヒクルとしてリポフェクタミン（市販の陽イオン性脂質）を使用するプラスミドＤＮＡ陽イオン性脂質複合体の処理について示される。大幅により高い活性が、図４の粒子１に対応するマイクロスフェア１および図４の粒子２に対応するマイクロスフェア２による、２つのｐＤＮＡマイクロスフェアについて示される。
【００２５】
マウスにおける糖尿病の自己免疫の処置に使用されるマイクロスフェアの作製において、３種のＡＳ−オリゴヌクレオチドが、水溶液に溶解され、そして水溶性ポリマーとポリカチオンとに組み合わされる。この溶液は、代表的に約６０℃〜７０℃でインキュベートされ、約２３℃に冷却される。そして過剰なポリマーが除去される。以下の配列を有する３種のＡＳ−オリゴヌクレオチドを含むと考えられるマイクロスフェアが、形成される：
【００２６】
【化１】
2011256204.tif 000002
ここで星印は、チオエーション（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）を示す。
【００２７】
より詳細には、核酸は、代表的に、約３０重量％と約１００重量％との間のマイクロスフェアを含み、そして約５０ミクロンを超えない平均粒子サイズを有する。代表的に、これらは、以下のように調製される。オリゴヌクレオチド混合物の水溶液は、３つのオリゴヌクレオチド溶液（各々の溶液は、これらの３つの型のうちの１つを含む）からのアリコートを組み合わせることにより調製される。３つの型のオリゴヌクレオチドを含む溶液が調製される。この溶液は、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含む。これらは、約１：１から約４：１のポリカチオン：オリゴヌクレオチドの体積比で、ポリカチオン溶液の１０ｍｇ／ｍｌストック溶液のアリコートと組み合わされる。ポリビニルピロリドンおよび／またはポリエチレングリコールのポリマー溶液が調製され、そして、その他の溶液と組み合わされる。加熱、冷却、遠心分離および複数回の洗浄は、水性の懸濁物を提供し、この懸濁物は、代表的に、凍結および凍結乾燥され、オリゴヌクレオチドとポリカチオンとを含むマイクロスフェアの乾燥粉末を形成する。
【００２８】
本発明にしたがうマイクロスフェアは、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに他の核酸のための実行可能な非ウイルス性の送達手段である。これらは、３Ｔ３線維芽細胞における、βガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡのインビトロ送達を可能にする。マイクロスフェアは、ヌクレアーゼ活性からプラスミドＤＮＡを保護する。高いレベルのβガラクトシダーゼ活性が、マイクロスフェア処方物によるトランスフェクション後に発現される。
【００２９】
目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアは、膵臓のインシュリン産生β細胞の破壊をもたらす自己免疫反応の活性化において重要であることが公知の、表面細胞抗原ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６をダウンレギュレートさせる。このことは、皮下に位置する樹状細胞への皮下注射により達成され得る。ＮＯＤマウス研究は、β細胞の自己免疫性の破壊の有効な予防を実証する。ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドのマイクロスフェアは、インビトロおよびインビボでの、有効なトランスフェクションビヒクルである。樹状細胞は、オリゴヌクレオチドマイクロスフェアを取り込み、表面細胞抗原ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を抑制するようである。このアンチセンス（ａｎｉｔｓｅｎｓｅ）オリゴヌクレオチドマイクロスフェアは、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を有効に予防する。
【００３０】
以下の実施例は、本発明をさらに示すために、本発明の特定の特徴および利点を示す。これらの実施例は、本発明を限定するとも、他の方法により本発明の限定であるともみなされるべきではない。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６主要転写物に標的化される、３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）にあるＤＮＡ合成設備により合成した。ＡＳ−オリゴヌクレオチドの配列は、以下である：
【００３２】
【化２】
2011256204.tif 000003
オリゴヌクレオチド混合物の水溶液を、３つのオリゴヌクレオチド溶液（各々は、１つの型のオリゴヌクレオチドを含んだ）のアリコートを組み合わせることにより調製し、３つの型のオリゴヌクレオチドの１０［ｍｇ／ｍｌ］溶液を生成した。ｄｉＨ２Ｏ中で１０［ｍｇ／ｍｌ］のポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒを調製した（Ｂａｃｈｅｍ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ
Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡによるポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒ  ５０，０００まで）。ポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒを、１：１の体積比で、このオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を、穏やかにボルテックスした。ｐＨ＝５．５でのｌＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）中に、１２．５％のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、４０，０００ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）と１２．５％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、３，３５０ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）とを含む２５％ポリマー溶液を作製した。このポリマー溶液を以下：７５０μ１のＡＳ−オリゴヌクレオチド、０．７５ｍｌのポリ−Ｌ−リジン・ＨＢｒ、３．０ｍｌのＰＥＧ／ＰＶＰのように２：１の体積比で添加し、そして４．５０ｍｌの全容積にした。
【００３３】
このバッチを７０℃で３０分インキュベートし、次に２３℃に冷却した。冷却に際して、この溶液が濁り、そして沈殿が生じた。次いで、この懸濁物を遠心分離し、そして過剰なＰＥＧ／ＰＶＰを除去した。生じたペレットを、脱イオン水でこのペレットを再懸濁することにより洗浄し、次に遠心分離そして上清の除去を行った。この洗浄プロセスを、３回繰り返した。この水性の懸濁物を、凍結および凍結乾燥させて、オリゴヌクレオチドとポリ−Ｌ−リジンとを含有するマイクロスフェアの乾燥粉末を形成した。
【００３４】
図６は、１：１のポリ−Ｌ−リジン：オリゴヌクレオチド比の物質の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。平均粒子サイズ約２．５μｍを有するマイクロスフェア（０．５〜４μｍのサイズ）を作製した。未知物質の沈殿も観察された。ＨＰＬＣによるさらなる研究は、この沈殿が残余のＰＥＧ／ＰＶＰ、大部分はＰＶＰからなることを決定した。
【００３５】
（実施例２）
ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６主要転写物に標的化される、ＡＳ−オリゴヌクレオチドは、実施例１のＡＳ−オリゴヌクレオチド配列であった。このオリゴヌクレオチド混合物の水溶液を、３つのオリゴヌクレオチド溶液（各々は、１つの型のオリゴヌクレオチドを含んだ）のアリコートを組み合わせることにより調製し、３つの型のオリゴヌクレオチドの１０［ｍｇ／ｍｌ］溶液を生成した。オリゴヌクレオチド混合物の溶液を調製した。ｄｉＨ２Ｏ中で５［ｍｇ／ｍｌ］のポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒを調製した（Ｓｉｇｍａによるポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒ  １１，９００（ｖｉｓ））。ポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒを、このオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を、穏やかにボルテックスした。ｐＨ＝５．５での０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）中に、１２．５％のＰＶＰ（４０，０００ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）と１２．５％のＰＥＧ（３，３５０ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）とを含む２５％ポリマー溶液を作製した。このポリマー溶液を添加した。実施例１に記載されるように、インキュベーションとリンスが続いた。１．５ｍｌのＡＳ−オリゴヌクレオチド、１．５ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒ、３．０ｍｌのＰＥＧ／ＰＶＰ、そして全容積、６．０ｍｌを調製した。
【００３６】
図７は、この１：１のポリ−Ｌ−オルニチン：オリゴヌクレオチド比の物質のＳＥＭを示す。平均粒子サイズ約２μｍを有するマイクロスフェア（０．２〜８μｍのサイズ）を作製した。未知物質の沈殿も観察された。さらなるＨＰＬＣ研究は、この沈殿が残余のＰＥＧ／ＰＶＰ、大部分はＰＶＰからなることを証明し得た。
【００３７】
（実施例３）
インビボ研究を、１型真性糖尿病のＮＯＤマウスモデルを使用して実行した。１型糖尿病は、図１に示されるように、膵臓のインシュリン産生β細胞の自己免疫性の破壊により発現する。ＡＳ−オリゴヌクレオチドを、β細胞の自己免疫性の破壊を妨害する試みにおいて、３つの適用により使用した。この目標は、Ｔ細胞の活性化に必要とされる樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ）表面タンパク質をコードするＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６主要転写物を標的化することにより、樹状細胞の機能を妨害することである。低レベルのＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を有する樹状細胞は、インビボにおいて、抑制性の免疫細胞ネットワークを促進することが公知である。これらのカスケードは、インビボにおいて、β細胞に対するＴ細胞の反応低下をもたらし得る。
【００３８】
試験動物の第一群において、樹状細胞を、ＮＯＤマウスの骨髄の前駆体から、生体外で増殖させた。ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６主要転写物を標的化する３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドの組み合わせを、組織培養内の細胞に添加した。インキュベーション後、ＡＳ−オリゴヌクレオチドをトランスフェクトさせた樹状細胞を、５〜８週齢の同系（ｓｙｎｇｅｎｅｔｉｃ）の受容者  （まだ糖尿病ではない）へ注射した。これは、公知の生体外送達アプローチである。
【００３９】
平行して、ＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフェアを、同一齢の他のＮＯＤマウスへ直接注射した。単回の注射を、このように処置した各マウスに対し実行した。別の群のこれらのＮＯＤマウスは、処置せず、コントロールとして扱った。
【００４０】
図８は、コントロール、未処置のＮＯＤマウスが全て、２３週齢までに糖尿病を発症したことを示す。生体外でＡＳ−オリゴヌクレオチドをトランスフェクトされ、そして再注入された樹状細胞の群（ＡＳ−ＯＤＮ  ＤＣ）は、糖尿病の発症の遅延を示し、うち２０％が、グルコースレベルが非糖尿病の範囲内に維持されることを示した「糖尿病を有さない」ままであった。マイクロスフェアをインビボ注射されたＮＯＤマウスのうち、７１％が、４３週において「糖尿病を有さない」ままであった。
【００４１】
記載された本発明の実施形態は、本発明の原理のいくつかの応用の例であることが理解されるべきである。多くの改変が、本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく、当業者によりなされ得る。本明細書に記載される種々の特徴は、任意の組み合わせにおいて使用され得、そして本明細書で具体的に概説される詳細な組み合わせに限定されない。
【数１】
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【数２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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