(57)【要約】【課題】抗腫瘍特性を有する、パクリタキセルとアルブミンとのナノ粒子を作製する方法を提供すること。【解決手段】粉末状パクリタキセルをクロロホルムと共にアルブミン水溶液に加えることによって得られる混合物を、高圧均質化処理にかける。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクリタキセルおよびアルブミンを含む０℃〜４０℃の温度の水性混合物を、９０００〜４００００ｐｓｉの高圧での均質化処理にかけてナノエマルジョンを調製し、該ナノエマルジョンを−２０℃〜−８０℃で凍結し、最後に＋２０℃から＋３５℃の温度に加熱することによって凍結乾燥する方法において、前記水性混合物は、無菌条件において、前記アルブミン２％〜３％（ｗ／ｖ）を無菌の水に溶解し、次いで前記アルブミン溶液に無菌クロロホルム２％〜４％（ｖ／ｖ）を加え、さらに無菌の粉末状パクリタキセルを、溶液中に存在するアルブミンに対して５．４重量％〜２０．０重量％の量加えることによって得られたものであることを特徴とする、パクリタキセルおよびヒト血清アルブミンのナノ粒子からなる無菌の凍結乾燥粉末を作製する方法。
【請求項２】
前記アルブミン溶液に加えられる、無菌の粉末状パクリタキセルの量が、アルブミンに対して５．６重量％〜１９．４重量％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルブミン溶液に、パクリタキセルを加える前に、少なくとも１種の生体適合性の酸を、粉末状ナノ粒子の復元した注射用水性混合物のｐＨを５．４〜５．８にするのに十分な量加えることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸の量が、前記復元した水性溶液のｐＨを５．５〜５．７にする量であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酸が、ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、酢酸、生体適合性の有機酸および無機酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記酸が、クエン酸であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍組成物を得るのに使用しうる、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびアルブミンのナノ粒子を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パクリタキセルは、重要な抗腫瘍作用を持つ、文献でよく知られた天然物質である。これは水溶性が低いため、ヒトへの投与が困難であり、この理由のために、その注射を可能にするための様々なシステムが開発されている。
【０００３】
このシステムの１つにおいては、パクリタキセルを、生体適合性があり、かつパクリタキセルと結合して、それと共に、公知の超音波処理、高圧均質化、およびミクロ流動化技術によって、注射可能なエマルジョンを形成する能力の高いヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と組み合わせる（Ａｌｌｅｍａｎｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、３９（５）、１７３〜１９１頁、１９９３年）。
【０００４】
これらの成分をベースにし、上記超音波処理および高圧均質化の技術を用いて、米国企業のＶｉｖｏＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．は、パクリタキセルとＨＳＡを含む製剤ＣＡＰＸＯＬ（登録商標）を開発した。
【０００５】
米国特許第５，４３９，６８６号、米国特許第５，４９８，４２１号、米国特許第５，５６０，９３３号およびこれに対応するＷＯ９４／１８９５４において、ＶｉｖｏＲｘは、超音波処理技術を用いて調製され、平均粒子サイズ（ＭＰＳ）が１０ミクロン未満の粒子の、パクリタキセルとＨＳＡの微細粒子を、特許請求をしている。これらの特許に記載の調製方法は、工業的規模で使用することはできず、さらに、こうして得られた微細粒子のＭＰＳは大きすぎて、患者に投与するのには適さず使用できない。
【０００６】
前記ＶｉｖｏＲｘは、このことをよく承知しており、次に米国特許第５，９１６，５９６号、米国特許第６，０９６，３３１号と、ＷＯ９８／１４１７４およびＷＯ９９／００１１３において、ＭＰＳ＜０．２ミクロンの凍結乾燥粉末を無菌の水性０．９％ＮａＣｌ溶液で復元（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）して得た、パクリタキセルおよびＨＳＡの無菌のナノエマルジョンについて記述し、特許請求した。この引用した特許に記載のように、高圧均質化を用いて得られたこれらのナノエマルジョンは、高い安定性を有すると記述されている。ここで、「安定性」という用語は、ＭＰＳが経時的に一定であること、およびナノ粒子の沈殿が起きないことの両者を意味する（米国特許第６，０９６，３３１号、実施例１１）。
【０００７】
上記ＶｉｖｏＲｘの特許（米国特許第５，９１６，５９６号の実施例１、５、および６参照）の教示によると、先ずパクリタキセルの溶液およびＨＳＡを含む水性溶液を別々に調製し、次いで、この両相を混ぜ合わせ、得られた混合物を９０００〜４００００ｐｓｉの高圧で室温（０℃〜＋４０℃）で均質化処理にかける。
【０００８】
溶媒を蒸発させ、無菌のフィルター（０．２２ミクロン）でろ過した後、この混合物を−２０℃から−８０℃に冷凍し、最後に＋２０℃から＋３５℃の温度に加熱することによって冷凍乾燥して、抗腫瘍特性を有する注射用製剤を調製するのに使用し得る粉末を得る。
【０００９】
したがって、（一方はパクリタキセルを含み、他方はＨＳＡを含む）２つの別々の相を調製して、次いでそれを高圧均質化する前に混ぜ合わせる必要がある。このため、少なくとも２個の別々の反応器の使用と、２つの別々の溶液のそれぞれ適切な混合を伴う調製とを、すべて無菌条件下で実施する必要があり、高いプラントコスト、混合作業を完了させるための長い時間、および（均質化処理の最後の）ロータベーパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）による溶媒蒸発、それに続く無菌フィルターによるろ過を伴い、結果として総収率が低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，４３９，６８６号
【特許文献２】米国特許第５，４９８，４２１号
【特許文献３】米国特許第５，５６０，９３３号
【特許文献４】国際公開第９４／１８９５４号
【特許文献５】米国特許第５，９１６，５９６号
【特許文献６】米国特許第６，０９６，３３１号
【特許文献７】国際公開第９８／１４１７４号
【特許文献８】国際公開第９９／００１１３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｌｌｅｍａｎｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、３９（５）、１７３〜１９１頁、１９９３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の主な目的は、均質化処理にかけるための、パクリタキセルおよびＨＳＡを含む液体混合物を形成するのに単一の反応器を使用することでよく、また公知技術より短時間かつ低コストで完了させることができる、パクリタキセルおよびＨＳＡのナノ粒子の無菌の凍結乾燥粉末を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記ならびにその他の目的は、パクリタキセルおよびアルブミンを含む水性混合物を、０℃〜４０℃の温度で９０００〜４００００ｐｓｉの高圧での均質化処理にかけてナノエマルジョンを調製し、該ナノエマルジョンを−２０℃〜−８０℃で凍結し、最後に＋２０℃から＋３５℃の温度に加熱することによって凍結乾燥する方法において、前記水性混合物は、無菌条件において、前記アルブミンを無菌の水に濃度２％〜３％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、次いで前記アルブミン溶液にクロロホルム２％〜４％（ｖ／ｖ）を加え、さらに無菌の粉末状パクリタキセルを、溶液中に存在するアルブミンの重量に対して５．４重量％〜２０．０重量％の量加えることによって得られたものであることを特徴とする方法によって達成することができる。液体混合物に加えられる無菌の粉末状パクリタキセルの量は、好ましくはアルブミンに対して５．６重量％〜１９．４重量％である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本プロセス中で、パクリタキセルを無菌の粉末状で使用すると、プラント自体およびプロセスが、公知技術と比較して大幅に簡易化され、均質化処理の前に様々な成分の混合を完了させるのに要する時間がかなり短縮されるだけでなく、最終的な収量が改善され、また所望の無菌の凍結乾燥粉末を得るために順守すべき条件が簡素化されることが、重要な注目点である。
【００１５】
上述のように操作することによって、パクリタキセルおよびＨＳＡのナノ粒子の混合によって形成された粉末が得られるが、それは、前述の先行特許に記載の、より複雑で手間と費用のかかる方法によって得られるものとまったく同様または同一のものである。
【００１６】
これらの混合物を、Ａｖｅｓｔｉｎホモジナイザーで、米国特許第５，９１６，５９６号で推奨されている圧力範囲内で処理した場合、ｐＨ＝６．７のナノエマルジョンが得られる。これは前記特許中に記載のロータベーパー中で蒸発させた場合、ＭＰＳが約０．２ミクロン（蒸発後のＭＰＳの増加が＞０．０２ミクロン）のナノエマルジョンをもたらすが、これは注射用の生理的溶液製剤中で安定性が劣り（ＭＰＳが約０．０５ミクロン増加し、約１２時間で沈降の傾向）、かつこれを滅菌するための０．２２ミクロンフィルターでのろ過が困難であり、このフィルターは容易に目詰まりし、パクリタキセルの収率は非常に低い値（３０％以下まで）に減少する。
【００１７】
上記に定義した本発明の方法、および先行特許による方法の両方の方法によって調製した生成物は、米国特許第５，９１６，５９６号および米国特許第６，０９６，３３１号に記載のとおりに凍結乾燥をし、復元した場合、その安定性（米国特許第６，０９６，３３１号の実施例１１の教示により評価した）は、許容されるものではあるが、決して２４時間は超えなかった。
【００１８】
驚くべきことには、少なくとも１種の生体適合性の酸を、（粉末状パクリタキセルをこれに加える前の）ＨＳＡを含む液体混合物に、粉末状ナノ粒子の復元された注射用水性混合物のｐＨを５．４〜５．８（好ましくは、５．５〜５．７）にするのに十分な量加えると、凍結乾燥され、復元された注射形態の混合物の安定性は、かなり向上して２４時間を超すことが分かった。
【００１９】
前述の酸の添加も本発明の一部を形成する。
【００２０】
好ましくは、前記酸は、ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、酢酸、生体適合性の有機酸および無機酸からなる群から選択されるが、クエン酸が最も好ましい。
【００２１】
本発明の特徴を明らかにするために、いくつかの非限定的な実施例を以下に記載する。そのいくつかは、生理的なｐＨの液体混合物を用い、またいくつかは酸性化して、前記の酸を使用した結果の違いを強調するものである。
【実施例】
【００２２】
実施例１
ｐＨ６．７の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈する。
【００２３】
前記溶液４１．４ｍｌを、強力に攪拌しながら無菌のクロロホルム１．２５ｍｌ、および無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）７３．６ｍｇ（溶液中のアルブミンに対して５．９重量％）と混合し、次いで、この混合物を高圧ホモジナイザー（適当に滅菌した）中で、ナノエマルジョン（ＭＰＳが約０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを真空下で、蒸発させて溶媒を除去し、冷凍し、無菌条件下で４８時間凍結乾燥する。
【００２４】
得られたパクリタキセル４．６０％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．４８６ミクロン、ｐＨ＝６．７であり、安定性が＜１２時間である。
【００２５】
得られた生成物は、米国特許第５，９１６，５９６号の実施例１で使用された方法によって調製されたものと同じ特性を有していた。
【００２６】
実施例２
ｐＨ６．７の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で２％（ｗ／ｖ）に希釈する。
【００２７】
前記溶液４９．０ｍｌを、無菌のクロロホルム１．０ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）７２．５ｍｇ（アルブミンに対して７．４％）と混合し、次いで、この混合物を高圧ホモジナイザー（適当に滅菌した）中で、ナノエマルジョン（ＭＰＳが約０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを真空下で蒸発させて溶媒を除去し、無菌フィルター（０．２ミクロン）でろ過し、冷凍し、無菌条件下で４８時間凍結乾燥する。
【００２８】
得られたパクリタキセル０．６０％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．２５ミクロン、ｐＨ＝６．７であり、安定性が＜１２時間である。
【００２９】
実施例３
ｐＨ６．７の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈する。
【００３０】
前記溶液４６．７ｍｌを、無菌のＣＨＣｌ３１．４０ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）１０８．５ｍｇ（アルブミンに対して７．７％）と混合し、次いで、この混合物を高圧ホモジナイザー（適当に滅菌した）中で、ナノエマルジョン（ＭＰＳが約０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを真空下で蒸発させて溶媒を除去し、無菌フィルター（０．２ミクロン）でろ過し、冷凍し、無菌条件下で４８時間凍結乾燥する。
【００３１】
得られたパクリタキセル０．７７％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．１２ミクロン、ｐＨ＝６．７であり、安定性が＜１２時間である。
【００３２】
既に最初の説明の部分で述べたように、ろ過によりパクリタキセルのかなりの損失が生じた（凍結乾燥した粉末はパクリタキセルを、実施例２の５．２％の代わりに、０．５５％含む）。これによりＭＰＳが＜０．２ミクロンの製剤が可能になった。
【００３３】
実施例４
ｐＨ６．７の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈する。
【００３４】
前記溶液２９．１ｍｌを、無菌のＣＨＣＬ３０．９０ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）６７．０ｍｇ（アルブミンに対して７．７％）と混合し、次いで、この混合物を高圧ホモジナイザー（適当に滅菌した）中で、ナノエマルジョン（ＭＰＳが約０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを真空下で蒸発させて溶媒を除去し、無菌フィルター（０．２ミクロン）でろ過し、冷凍し、無菌条件下で４８時間凍結乾燥する。
【００３５】
得られたパクリタキセル０．７０％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が１．５ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．２５ミクロン、ｐＨ＝６．７であり、安定性が＜１２時間である。
【００３６】
得られた生成物は、米国特許第５，９１６，５９６号の実施例５で使用された方法で調製されたものと同じ特性を有していた。
【００３７】
実施例５
ｐＨ６．７の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で２．５％（ｗ／ｖ）に希釈し、クロロホルム（１％ｖ／ｖ）で前もって飽和させた。
【００３８】
前記溶液４８．５ｍｌを、無菌のＣＨＣＬ３１．０ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）７５ｍｇ（アルブミンに対して６．２％）と混合し、次いで、この混合物を高圧ホモジナイザー（適当に滅菌した）中で、ナノエマルジョン（ＭＰＳが約０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを真空下で蒸発させて溶媒を除去し、無菌フィルター（０．２ミクロン）でろ過し、冷凍し、無菌条件下で４８時間凍結乾燥する。
【００３９】
得られたパクリタキセル０．７０％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２．２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．１８ミクロン、ｐＨ＝６．７であり、安定性が＜１２時間である。
【００４０】
この場合においても再び、実施例３の最後に述べた観察結果が当てはまる。
【００４１】
実施例６
ｐＨ５．６の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈し、このｐＨを、アルブミン中に存在するいくらかの塩基性基と塩を生成する１Ｍ  ＨＣｌで５．６に補正する。
【００４２】
前もって滅菌した、前記溶液５７ｍｌを、無菌のクロロホルム１．４０ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）１０８ｍｇ（アルブミンに対して６．３％）と少なくとも３０分間激しく攪拌しながら混合する。
【００４３】
この混合物をホモジナイザー（適当に滅菌した）中で高圧（９０００〜４００００ｐｓｉ）で、ナノエマルジョン（ＭＰＳ＜０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを−８０℃に急速に冷凍し、温度を＋３０℃にまで上げながら、無菌条件下で５５時間凍結乾燥させる。
【００４４】
得られたパクリタキセル４．８３％（ｗ／ｗ）および水４％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．１７５ミクロン、ｐＨ＝５．６であり、安定性が＞２４時間である。
【００４５】
塩酸の代わりにリン酸を用いることによって同等の結果が得られる。
【００４６】
実施例７
ｐＨ５．４の製剤の調製
ＦＤＡ仕様に従った注射可能な水性の２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈し、このｐＨを、アルブミン中に存在するいくらかの塩基性基と塩を生成するクエン酸で５．４に補正する。
【００４７】
前もって滅菌した、前記溶液５０ｍｌを、無菌のクロロホルム１．２３ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）９８ｍｇ（アルブミンに対して６．５％）と少なくとも４０分間激しく攪拌しながら混合する。
【００４８】
この混合物をホモジナイザー（適当に滅菌した）中で高圧（９０００〜４００００ｐｓｉ）で、ナノエマルジョン（ＭＰＳ＜０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを−３０℃に急速に冷凍し、温度を＋３５℃にまで上げながら、無菌条件下で５７時間凍結乾燥させる。
【００４９】
得られたパクリタキセル４．８０％（ｗ／ｗ）と水３．８％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．１９ミクロン、ｐＨ＝５．４であり、安定性が＞２４時間である。
【００５０】
クエン酸の代わりに、酢酸を用いることによって同等の結果が得られる。
【００５１】
実施例８
ｐＨ５．５の製剤の調製
ＦＤＡ仕様に従った注射可能な水性の２５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈し、このｐＨを、アルブミン中に存在するいくらかの塩基性基と塩を生成する無菌のクエン酸で５．５に補正する。
【００５２】
前記溶液３７ｍｌを、無菌のクロロホルム０．９１ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）７１ｍｇ（アルブミンに対して６．４％）と少なくとも４０分間激しく攪拌しながら混合し、その後、この混合物を５〜８℃に冷却する。
【００５３】
この混合物をホモジナイザー（適当に滅菌した）中で高圧（９０００〜４００００ｐｓｉ）で、ナノエマルジョン（ＭＰＳ＜０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを−８０℃に急速に冷凍し、温度を＋３０℃にまで上げながら、無菌条件下で５８時間凍結乾燥させる。
【００５４】
得られたパクリタキセル４．７０％（ｗ／ｗ）および水４．５％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．１８５ミクロン、ｐＨ＝５．５であり、安定性が＞２４時間である。
【００５５】
実施例９
ｐＨ５．５の製剤の調製
ＦＤＡ仕様（ｐＨ＝６．９±０．５）に従った注射可能な水性の２０％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ溶液を、無菌の脱塩水で３％（ｗ／ｖ）に希釈し、このｐＨを、アルブミン中に存在するいくらかの塩基性基と塩を生成するクエン酸で５．５に補正する。
【００５６】
前記溶液１１０ｍｌを、無菌のＣＨＣｌ３４．１０ｍｌおよび無菌の粉末状パクリタキセル（力価＞９９％）６３９ｍｇ（アルブミンに対して１９．４％）と混合し、次いで、この混合物を高圧ホモジナイザー（適当に滅菌した）中で、ナノエマルジョン（ＭＰＳ約０．２ミクロン）が得られるまで処理し、これを無菌フィルター（０．２ミクロン）でろ過し、真空下で蒸発させて溶媒を除去し、冷凍し、無菌条件下で４８時間凍結乾燥する。
【００５７】
得られたパクリタキセル１０．８％（ｗ／ｗ）を含む粉末を、パクリタキセルの濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、０．９％ＮａＣｌ水溶液で復元する。得られた製剤は、ＭＰＳが０．１５ミクロンであり、安定性が＞２４時間である。
【外国語明細書】
2011132253000001.pdf