(57)【要約】【課題】ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）タンパク質の有効なインヒビターである、ＪＮＫタンパク質に結合し、ＪＮＫ発現細胞においてＪＮＫ媒介効果を阻害する細胞透過性ペプチドを提供すること。【解決手段】本発明は、細胞におけるＪＮＫの活性化と関連する病態生理学を処置する方法を含む。例えば、標的細胞は、例えば、培養動物細胞、ヒト細胞または微生物であり得る。送達は、キメラペプチドが、診断目的、予防目的または治療目的に使用され個体にキメラペプチドを投与することによりインビボで行われ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、プロテインキナーゼインヒビター、そしてより詳細には、プロテインキナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼのインヒビターに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、マイトゲン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化グループのメンバーである。これらのキナーゼは細胞の増殖および細胞の分化の制御、そしてより一般的には、環境刺激への細胞の応答に関連している。ＪＮＫシグナルの伝達経路は、細胞表面のレセプターのいくつかの分類における約束により、環境ストレスに応答して活性化される。これらのレセプターとして、サイトカインレセプター、セルペンチンレセプター、およびレセプターチロシンキナーゼが挙げられ得る。哺乳動物細胞において、ＪＮＫは、オンコジーンの形質転換として、このような生物学的プロセスおよび環境ストレスに対する適応応答を媒介することに関係している。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟および分化を含む免疫反応を調節すること、同様に免疫系による破壊として同定される細胞におけるプログラムされた細胞死をもたらすことに関連している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、ＪＮＫタンパク質の有効なインヒビターであるペプチドの発見に部分的に基いている。ＪＮＫペプチドインヒビターとして本明細書中で言及されるこのペプチドは、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の下流の細胞増殖の効果を減少する。
【０００４】
従って、本発明は新規のＪＮＫインヒビターペプチド、および所望の細胞位置に存在するペプチドを方向付けるために使用し得る輸送ペプチドと結合したＪＮＫペプチドインヒビターを含むキメラペプチドを含む。輸送配列は、原形質膜を横切るペプチドの輸送の方向付けに使用され得る。あるいは、またはさらに、輸送ペプチドは、核のような所望の細胞内位置へのペプチドの方向付けに使用され得る。
【０００５】
ＪＮＫインヒビターペプチドはＬ−アミノ酸のポリマーとして存在し得る。あるいは、そのペプチドは、Ｄ−アミノ酸のポリマーとして存在し得る。
【０００６】
また、本発明は、ＪＮＫ結合ペプチド、ならびにＪＮＫ結合ペプチドを特異的に認識する抗体を含む薬学的組成物を含む。
【０００７】
本発明はまた、細胞中のＪＮＫキナーゼの発現を阻害する方法を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、細胞におけるＪＮＫの活性化と関連する病態生理学を処置する方法を含む。例えば、標的細胞は、例えば、培養動物細胞、ヒト細胞または微生物であり得る。送達は、キメラペプチドが、診断目的、予防目的または治療目的に使用され個体にキメラペプチドを投与することによりインビボで行われ得る。標的化細胞は、インビボの細胞、すなわち生きている動物もしくはヒトの器官もしくは組織を含む細胞、または生きている動物もしくはヒト中に見出される微生物、であり得る。
【０００９】
本発明により提供される利点としては、ＪＮＫインヒビターペプチドは小さく、そして大量かつ高純度で容易に産生され得ることが挙げられる。インヒビターペプチドはまた、細胞内消化、および弱い免疫原に対して耐性である。従って、ペプチドはＪＮＫの発現の阻害が所望されるインビトロおよびインビボでの適用に良好に適する。
【００１０】
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての用語および化学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料は、本発明の実行または試験に利用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。全ての刊行物、特許出願、特許および本明細書中で言及される他の参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。コンフリクトの場合には、定義を含む本明細書を調節する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のみであり、限定されることは意図されない。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
本発明により、例えば、以下が提供される。
（項目１）  ２８０アミノ酸長未満のペプチドであって、ここで該ペプチドが配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
（項目２）  項目１に記載のペプチドであって、ここで該ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
（項目３）  項目１に記載のペプチドであって、ここで該ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
（項目４）  項目１に記載のペプチドであって、ここで該ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
（項目５）  項目１に記載のペプチドであって、ここで該ペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
（項目６）  上記ペプチドが５０アミノ酸長未満である、項目１に記載のペプチド。
（項目７）  上記ペプチドがｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に結合する、項目１のペプチド。
（項目８）  上記ペプチドが、ＪＮＫ発現細胞に存在する場合、該ペプチドが、少なくとも１つのＪＮＫ標的化転写因子の活性化を阻害する、項目１に記載のペプチド。
（項目９）  上記ＪＮＫ標的化転写因子が、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１からなる群より選択される、項目８に記載のペプチド。
（項目１０）  上記ペプチドが、ＪＮＫ発現細胞中に存在する場合、該ペプチドが、ＪＮＫ効果を変える、項目１に記載のペプチド。
（項目１１）  項目１０に記載のペプチドであって、ここで、上記ＪＮＫ誘導効果が、再狭窄、腫瘍形成形質転換、免疫細胞の成熟および分化、炎症誘発性サイトカイン、放射線治療において使用されるイオン化放射、紫外線光、フリーラジカル、ＤＮＡ損傷因子、化学療法薬剤、虚血、再灌流、低酸素症、低体温症、過温症、アポトーシスおよびストレス性刺激に対する応答からなる群より選択される、ペプチド。
（項目１２）  共有結合によって連結された第１のドメインおよび第２のドメインを含むキメラペプチドであって、該第１のドメインが輸送配列を含み、そして該第２のドメインがＪＮＫインヒビター配列を含む、キメラペプチド。
（項目１３）  上記輸送配列が、配列番号９または１０のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載のペプチド。
（項目１４）  上記輸送配列が、上記ペプチドの細胞性取り込みを増大させる、項目１２に記載のペプチド。
（項目１５）  上記輸送配列が、上記ペプチドの核局在化を指向する、項目１２に記載のペプチド。
（項目１６）  上記輸送配列が、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を含む、項目１２に記載のペプチド。
（項目１７）  上記ＪＮＫインヒビター配列が：
（ａ）２８０アミノ酸長未満であり；そして
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、
項目１２に記載のペプチド。
（項目１８）  上記ＪＮＫインヒビター配列が、ＪＮＫに結合する、項目１２に記載のペプチド。
（項目１９）  上記ＪＮＫインヒビター配列が、少なくとも１つのＪＮＫ標的化転写因子の活性化を阻害する、項目１２に記載のペプチド。
（項目２０）  ＪＮＫ標的化転写因子が、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１からなる群より選択される、項目１９に記載のペプチド。
（項目２１）  上記ＪＮＫインヒビター配列が、ＪＮＫ発現細胞中に導入される場合、ＪＮＫ誘導効果を変える、項目１２に記載のペプチド。
（項目２２）  項目２１に記載のペプチドであって、ここで、上記ＪＮＫ誘導効果が、再狭窄、腫瘍形成形質転換、免疫細胞の成熟および分化、炎症誘発性サイトカイン、放射線治療において使用されるイオン化放射、紫外線光、フリーラジカル、ＤＮＡ損傷因子、化学療法薬剤、虚血、再灌流、低酸素症、低体温症、過温症、アポトーシスならびにストレス性刺激に対する応答からなる群より選択される、ペプチド。
（項目２３）  項目１に記載のペプチドをコードする単離された核酸。
（項目２４）  項目２３に記載の核酸を含むベクター。
（項目２５）  項目２４に記載のベクターを含む細胞。
（項目２６）  項目１に記載のペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
（項目２７）  項目２３に記載の核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
（項目２８）  項目１に記載のペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
（項目２９）  項目２８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
（項目３０）  被験体においてＪＮＫの活性化に関連する病態生理学を処置する方法であって、該方法が、該被験体に細胞透過性生物活性ペプチドを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドが細胞内ＪＮＫシグナル伝達を妨げる、方法。
（項目３１）  上記ペプチドが、配列番号１〜１８からなる群より選択される任意の１つのアミノ酸配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  上記ペプチドが、少なくとも１つのＪＮＫ標的化転写因子の活性化をブロックする、項目３０に記載の方法。
（項目３３）  上記ＪＮＫ標的化転写因子が、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１からなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）  上記ＪＮＫ標的化転写因子が、ｃ−Ｊｕｎである、項目３２に記載の方法。
（項目３５）  項目３０に記載の方法であって、ここで上記病態生理学が、再狭窄、腫瘍形成形質転換、免疫細胞の成熟および分化、炎症誘発性サイトカイン、放射線治療において使用されるイオン化放射、紫外線光、フリーラジカル、ＤＮＡ損傷因子、化学療法薬剤、虚血、再灌流、低酸素症、低体温症、過温症、アポトーシスおよびストレス性刺激に対する応答からなる群より選択される、方法。
（項目３６）  上記投与が、腹腔内、鼻内、静脈内、経口およびパッチ送達からなる群より選択される任意の１つの投与経路によって送達される、項目３０に記載の方法。
（項目３７）  ペプチドを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）本発明のペプチドの発現をもたらす条件下で項目２５に記載の核酸を含む細胞を培養する工程；および
（ｂ）発現したペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、示された転写因子における保存されたＪＢＤドメイン領域のアラインメントを示す図である。
【図２】図２は、一般的なＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドのアラインメントを示す図である。
【図３】図３は、２８０個すべてのアミノ酸のＪＢＤドメインと比較した最小の２３個のアミノ酸長さのＩＢ１のＪＢＤドメインによるβ−細胞死の阻害を示すヒストグラムである。
【図４】図４は、組換えＪＮＫのリン酸化に対するＴＡＴペプチド、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの影響を示す図である。パネルＡは、組換えＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１のインビトロでのリン酸化の阻害を示す。パネルＢは、パネルＡに類似の用量応答実験を示す。
【図５】図５は、組換えＪＮＫによるリン酸化のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ阻害を示すヒストグラムである。パネルＡは、ＭＫＫ４存在下での、組換えＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１のリン酸化のインビトロにおけるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ阻害を示す。パネルＢは、ＭＫＫ７を用いる類似の用量応答実験を示す。
【図６】図６は、活性化されたＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害を示す図である。
【図７】図７は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドによるＩＬ−１β誘導膵臓β−細胞死の短期の阻害を示すヒストグラムである。
【図８】図８は、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドによるＩＬ−１β誘導膵臓β−細胞死の短期の阻害を示すヒストグラムである。
【図９】図９は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−Ｉβ誘導膵臓β細胞死の長期の阻害を示すヒストグラムである。
【図１０】図１０は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによる照射誘導ヒト結腸癌ＷｉＤｒ細胞死の阻害を示すヒストグラムである。
【図１１】図１１は、Ｌ−ＴＡＴペプチド、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＪＮＫキナーゼ活性の調節の図である。
【図１２】図１２は、マウスにおけるＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの保護効果を示すグラフである。パネルＡは、重量に対する照射の効果を示す。パネルＢは、脳浮腫（ｏｅｄｅｍｕｓ）および紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍｕｓ）状態に対する照射の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞透過性のペプチドの発見に一部基き、このペプチドは、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化されたシグナル伝達経路を阻害する。これらのペプチドは、ＪＮＫインヒビターペプチドとして本明細書中でいわれる。さらに、本発見は、ＪＮＫシグナルと関連する病態生理学を処置するための方法および薬学的組成物を提供する。
【００１４】
ＪＮＫインヒビターペプチドは、種々のインスリン結合（ＩＢ）タンパク質におけるｋＪＮＫ結合ドメイン間の配列アラインメントを調べることにより同定された。このアラインメントの結果は、図１Ａ〜１Ｃに示される。図１Ａは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−ＪｕｎおよびＡＴＦ２のＪＢＤ間の最も高い相同性の領域を示す。パネルＢは、ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。完全に保存された残基は、アスタリスクで示され、一方ＧＦＰ−ＪＢＤ23Mutベクター中でＡｌａに変更された残基は、白丸
で示される。図１Ｃは、ＪＮＫインヒビターペプチドドメインおよび輸送ドメインを含むキメラタンパク質のアミノ酸配列を示す。示される例において、輸送ドメインはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、そしてＪＮＫインヒビターペプチドはＩＢ１ポリペプチドに由来する。ヒト、マウス、およびラットの配列はパネルＢおよびパネルＣにいおいて同一である。
【００１５】
ＩＢ１（配列番号１７）、ＩＢ２（配列番号１８）、ｃ−Ｊｕｎ（配列番号１９）およびＡＴＦ２（配列番号２０）のＪＮＫ結合ドメイン間の配列の比較は、部分的に保存された８アミノ酸配列（図１Ａ）を明らかにした。ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤの比較はさらに、２つの配列間で高度に保存された７個のアミノ酸および３個のアミノ酸の２つのブロックを明らかにした。これらの２つのブロックは、ＩＢ１（配列番号１）中の２３個のアミノ酸のペプチド配列およびＩＢ２（配列番号２）中の２１個のアミノ酸のペプチド配列内に含まれる。
【００１６】
本発明のＪＮＫインヒビターペプチドは、ＪＮＫ活性の阻害が所望される任意の状況において使用され得る。これは、インビトロでの適用、エキソビボ、およびインビボでの適用を含み得る。ＪＮＫおよびその全てのアイソフォームは、病理学的状態の発達および確立または経路に関与し、またはＪＮＫペプチドは、このような病理学的状態の発生を予防または阻害するために使用され得る。これは疾患の予防および処置ならびに治療的作用に対する二次的な状態の予防および処置を含む。例えば、本発明のペプチドを使用して、例えば、糖尿病、電離放射線、および免疫応答（自己免疫疾患を含む）、虚血／再灌流傷害、心臓および心臓血管肥大、およびいくつかの癌（例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換）を処置または予防し得る。
【００１７】
このペプチドはまた、活性なＪＮＫポリペプチドの存在下で発現が増加する遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。これらの遺伝子および遺伝子産物としては、例えば、炎症誘発性のサイトカインが挙げられる。このようなサイトカインは、全ての形態の炎症、自己炎症、免疫および自己免疫疾患、退行性疾患、筋傷害、心筋症、および移植片拒絶において見出される。
【００１８】
本明細書中で記載されるＪＮＫインヒビターペプチドはまた、例えば、心筋肥大および動脈硬化損傷を含む低血圧症により誘導される病理学的状態における細胞の剪断応力、ならびに血管の分岐における剪断応力など；放射線治療およびＵＶ照射において使用される場合の電離放射線；フリーラジカル；ＤＮＡ有害剤（化学療法薬を含む）；オンコジーン形質転換；虚血および再灌流障害；低酸素症；ならびに低体温症および過温症に関与する効果を処置または予防するために使用され得る。
【００１９】
本発明により提供されるポリヌクレオチドは、分析、特徴付け、または治療的使用のための組換えペプチドを発現するため；組織（ここでは、対応するペプチドが優先的に発現される（構成的であるか、または組織の分化もしくは発生の特定の段階であるかのいずれか、または疾患状態における））のマーカーとして使用され得る。核酸の他の使用として、例えば、ゲル電気泳動ベースの核酸分析における分子量マーカーが挙げられる。
【００２０】
本明細書中で開示されるＪＮＫインヒビターペプチドは、表１に提示される。この表は、ＪＮＫインヒビターペプチドの名前ならびにその配列の識別番号、長さ、およびアミノ酸配列を表す。
【００２１】
【表１】
2011155990.tif 000002
（ＪＮＫインヒビターペプチド）
ひとつの局面において、本発明は、ＪＮＫインヒビターペプチドを提供する。用語「ペプチド」は、特定の長さを意味しない。いくつかの実施形態において、ＪＮＫインヒビターペプチドは、２８０個アミノ酸未満であり、例えば、１５０、１００、７５、５０、３５または２５個アミノ酸長以下である。種々の実施形態において、ＪＮＫ結合インヒビターペプチドは配列番号１〜６の１以上のアミノ酸配列を含む。ひとつの実施形態において、ＪＮＫインヒビターペプチドは、ＪＮＫに結合する。別の実施形態において、このペプチドは、少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子（例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２またはＥｌｋ１）の活性化を阻害する。
【００２２】
ＪＮＫインヒビターペプチドの例としては、配列ＮＨ2−ＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ
ＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を（全てまたは部分的に）含む。別の実施形態において、このペプチドは、配列ＮＨ2−ＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡ
ＱＤＳ−ＣＯＯＨ（配列番号２）を含む。
【００２３】
ＪＮＫインヒビターペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両方の組み合わせのポリマー重合体であり得る。例えば、種々の実施形態において、このペプチドは、Ｄレトロインベルソペプチド（Ｄｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である。用語「レトロインベルソ異性体」とは、配列の方向が逆であり、そして各アミノ酸残基のキラリティーが逆である直線状のペプチド異性体を言う。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、７４４〜７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６９２〜６９３（１９９４）を参照のこと。Ｄ−エナンチオマーおよび逆の合成を組み合わせの最終結果は、各アミド結合においてカルボニル基およびアミノ基の位置が置換され、一方、各α炭素で側鎖基の位置が保存される。他に特に示さない限り、本発明の所定の任意のＬ−アミノ酸配列は、対応するネイティブのＬ−アミノ酸配列に対して逆の配列を合成することによりＤレトロインベルソペプチドに作製され得ることが予想される。
【００２４】
１つの実施形態において、Ｄレトロインベルソペプチドは、配列ＮＨ2−ＴＤＱＳＲＰ
ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ−ＣＯＯＨ（配列番号３）を有する。別の実施形態において、Ｄレトロインベルソペプチドは、配列ＮＨ2−ＳＤＱＡＧＬＴＴＬＲＬＴＴＰ
ＲＨＫＨＰＥＥ−ＣＯＯＨ（配列番号４）を有する。ＤレトロインベルソＴＡＴ−ＩＢペプチドが種々の有用な性質を有することが予想外にも見出された。例えば、Ｄ−ＴＡＴペプチドおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドは、Ｌ−ＴＡＴペプチドおよびＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同じくらい効率的に細胞に入り、そしてＤ−ＴＡＴペプチドおよびＤＴＡＴ−ＩＢペプチドは、対応するＬ−ペプチドよりもより安定である。さらに、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、ＪＮＫを阻害する効率においてＬ−ＴＡＴ−ＩＢよりも約１０から２０倍低いが、インビボでこれらは約５０倍以上安定である。最後に、以下にさらに考察されるように、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドは、インターロイキン−１で処理され、そして電離放射された細胞をアポトーシスから保護する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明によるＪＮＫインヒビターペプチドは、アミノ酸配列ＮＨ2−Ｘn−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／Ｔ−Ｘn−ＣＯＯＨ（配列番号５、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢの１７〜４２残基、配列番号１３、図２に示される）を含む。本明細書中で使用される場合、Ｘnは残基の長さが０であるか、もしくは配列番号１〜２（好
ましくは、１と７の間のアミノ酸長のストレッチ）由来のペプチド残基の隣接するストレッチであるか、または１０、２０、３０、もしくはそれ以上のアミノ酸長であり得る。単一残基は、一般的な配列においてＳｅｒまたはＴｈｒのいずれかであり得るＳ／Ｔにより表される。さらなる実施形態において、一般的なＩＢペプチドは、配列ＮＨ2−Ｘn−Ｓ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘn−ＣＯＯＨ（配列番号６、およびＬ−ＴＡＴ
−ＩＢの１７〜４２残基、配列番号１６、図２に示される）を有するＤレトロインベルソペプチドであり得る。
【００２６】
ＪＮＫインヒビターペプチドは、当該分野で周知の方法（例えば、化学合成、以下に考察される一般的な工学技術）により得られ、または産生され得る。例えば、所望の領域もしくはドメインを含むＪＮＫインヒビターペプチドの一部と一致するペプチドか、またはインビトロで所望の活性を媒介するペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用により合成され得る。
【００２７】
候補的なＪＮＫインヒビターペプチドはまた、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定するために使用され得る親水性分析（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４〜３８２８を参照のこと）により分析され得、従って実験操作（例えば、結合実験、抗体合成）のための物質の設計において助けとなる。二次構造分析はまた、特定の構造的モチーフを確立するＪＮＫインヒビターペプチドの領域を同定するために行われ得る（例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：２２２〜２２３を参照のこと）。操作、翻訳、二次構造の予想、親水性および疎水性プロファイル、オープンリーディングフレームの予想およびプロッティング、ならびに配列の相同性の決定は、当該分野で利用可能なコンピューターソフトプログラムを使用して達成され得る。構造分析の他の方法として、例えば、Ｘ線結晶解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７〜１３を参照のこと））；質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９７．Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）が挙げられ、そしてコンピュータモデリング（例えば、ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ、編、１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）もまた使用され得る。
【００２８】
本発明はさらにＬ型アミノ酸を有するＪＮＫ結合ペプチド（例えば、表１に記載されたこれらのＬ−ペプチド、ならびにこれらの配列の相補体）をコードする核酸に関する。ＪＮＫインヒビターペプチドをコードする核酸の適切な供給源はヒトＩＢ１核酸（およびコードされたタンパク質配列）（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号ＡＦ０７４０９１およびＡＡＤ２０４４３として利用可能）を含む。他の供給源としては、ラットＩＢ１核酸が挙げられ、そしてタンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１０８９５９およびＡＡＤ２２５５４３に示され、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。ヒトＩＢ２核酸およびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２１８７７８に示され、これもまた、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２９】
ＪＮＫインヒビターペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、配列の３’−および５−末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、および／またはｃＤＮＡもしくは所定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するゲノムライブラリーからのクローニングにより）により得られ得る。
【００３０】
１以上のＪＮＫインヒビターペプチドの組換え体の発現のために、ペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部分を含む核酸が、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、異種（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモータでない）である。あるいは、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、遺伝子および／またはそれらの隣接する領域についてネイティブなプロモーターにより供給され得る。
【００３１】
種々の宿主ベクター系は、ペプチドをコードする配列を発現するために利用され得る。これらは以下を含むが、限定ではない：（ｉ）ワクシニアウィルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含む酵母または（ｉｖ）バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌。利用される宿主細胞系により、多数の適する転写エレメントおよび翻訳エレメントの任意の１つが使用され得る。
【００３２】
発現ベクター中のプロモーター／エンハンサー配列は、本発明において提供される植物、動物、昆虫、または真菌の調節配列を利用し得る。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメントは、酵母および他の真菌（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼプロモータ、アルカリホスファターゼプロモータ）から使用され得る。あるいは、またはさらに、これらは動物の転写調節領域、例えば、（ｉ）膵臓のβ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎら、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５〜１２２を参照のこと）；（ｉｉ）リンパの細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４．Ｃｅｌｌ  ３８：６４７〜６５８を参照のこと）；（ｉｉｉ）肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒｔら、１９８７．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １：２６８〜２７６を参照のこと）；（ｉｖ）脳稀突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（例えば、Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７．Ｃｅｌｌ  ４８：７０３〜７１２を参照のこと）；および（ｖ）視床下部中で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Ｍａｓｏｎら、１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８）などが挙げられ得る。
【００３３】
発現ベクターまたはそれらの誘導体としては、例えば、ヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）；プラスミドベクターおよびコスミドベクターが挙げられる。
【００３４】
宿主細胞株は、挿入された目的の配列の発現を調節するか、または所望される特定の手段において、この配列によりコードされる発現されたペプチドを改変するか、もしくは処理するか選択され得る。さらに、特定のプロモータ由来の発現は、選択された宿主細胞株における特定のインデューサーの存在下で増強され得る；従って、一般的に設計されたペプチドの発現の制御を容易にする。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳プロセスおよび翻訳後のプロセスならびに発現されたペプチドの改変（例えば、グリコシル化、リン酸化など）に対する特定の特徴付けられたメカニズムを有する。従って、適切な細胞株または宿主系は、外来のペプチドの所望される改変およびプロセスが達成されたことを保証するために選択され得る。例えば、細菌系でのペプチド発現は、グリコシル化されていないコアペプチドを産生するために使用され得る；一方、哺乳動物細胞での発現は、異種のペプチドの「ネイディブ」グリコシル化を保証する。
【００３５】
本発明はまた、ＪＮＫインヒビターペプチドの誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび変異体、ならびにこれらのペプチドをコードする核酸を含む。核酸に関しては、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログが、少なくとも６個の（隣接する）核酸配列として規定され、そしてこれらは特異的なハイブリダイゼーションをさせるに十分な長さを有する。アミノ酸に関して、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログは少なくとも４個の（隣接する）アミノ酸配列として規定され、エピトープに特異的な認識をさせるに十分な長さである。
【００３６】
フラグメントの長さは、ＪＮＫインヒビターペプチドまたは同じものをコードする核酸が由来する対応する全長の核酸またはポリペプチドの長さ未満である。誘導体およびアナログは、誘導体またはアナログが改変された核酸または改変されたアミノ酸を含む場合、全長でもあり得るし、全長以外であり得る。ＪＮＫインヒビターペプチドの誘導体またはアナログとしては、例えば、同一の大きさのアミノ酸配列に対する同一性、または当該分野で公知のコンピュータホモロジープログラムによりなされた配列において整列した配列と比較した場合に、種々の実施形態において、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％まで実質的にこのペプチドと相同である領域を含む分子が挙げられる。例えば、配列の同一性は、デフォルトのパラメーターを有する配列分析ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋｅａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）により測定され得る。
【００３７】
参照配列との同一性が１００％未満であるポリペプチド配列の場合において、非同一の配置が好まれるが、参照配列に対して保存的置換である必要はない。保存的置換の代表として以下の群での置換が挙げられる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；そしてフェニルアラニンおよびチロシン。従って、本発明は、ペプチドが対応する親配列を有するタンパク質との相同性（例えば、配列、機能、および免疫原性の性質または他の機能において）を残すような変異がなされた配列を有するペプチドを含む。例えば、このような変異体は、保存的なアミノ酸の変化（例えば、類似の分子の広範な性質のアミノ酸間の変化）を含む変異体であり得る。例えば、脂肪族群であるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン中での相互変化は、保存的であると考えられ得る。しばしば、これらの１つに対するグリシンの置換はまた、保存的であると考えられ得る。他の保存的な相互変化としては、以下：脂肪族群中でアスパラギン酸およびグルタミン酸；アミド群中でアスパラギンおよびグルタミン；ヒドロキシル群中でのセリンおよびスレオニン；芳香族群中でフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；塩基群中でリジン、アルギニンおよびヒスチジン；そして硫黄を含む群中でメチオニンおよびシステインの相互変化が挙げられる。しばしば、メチオニンおよびロイシン群中での置換もまた、保存的であると考えられ得る。好ましい保存的な置換群として、アスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；およびロイシン−アルギニンが挙げられる。
【００３８】
特定のポリペプチドが、規定された長さの参照ポリペプチドに対する前記特定の同一性パーセントを有すると言われる、同一性パーセントは参照ペプチドに対するものである。従って、１００個のアミノ酸長さである参照ポリペプチドに５０％相同であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０個のアミノ酸長さの部分と完全に同一である５０個のアミノ酸のポリペプチドであり得る。それはまた、その全体の長さにわたって参照ポリペプチドと５０％相同である１００個のアミノ酸長さのポリペプチドであり得た。当然ながら他のポリペプチドは同じ基準を満たす。
【００３９】
本発明はまた、開示されたポリヌクレオチドまたはペプチドの対立遺伝子の変異体を含む；これは、天然に存在する別の形態の単離されたポリヌクレオチドであり、これはまたこのポリヌクレオチドによりコードされたペプチドと同一であり、相同的であり、または関連のあるペプチドをコードする。あるいは、天然には存在しない改変体は、変異誘発技術または直接的な合成により産生され得る。
【００４０】
開示されたポリヌクレオチドおよびペプチドの種ホモログがまた、本発明により提供される。「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、これらの必須の性質は残すポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一般的に、改変体は、全体的に非常に近似しており、多くの領域において本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。この改変体は、コード領域、非コード領域、または両者において変化を含み得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、タンパク質が輸送の性質を保有したままで、変化した配列は、全体的なアミノ酸配列が伸長されるように挿入を含む。さらに、変化した配列は、タンパク質が輸送の性質を保有しているままで全体的なアミノ酸配列を短くするランダムな内部欠損または設計された内部欠損を含み得る。
【００４２】
この変更された配列は、さらにまたあるいは、ＪＮＫインヒビターペプチドが誘導されるポリペプチドまたはペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドの適切な鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。改変ペプチドは、本明細書中に記載されるアッセイを使用してＪＮＫ結合およびＪＮＫ媒介活性の調節について試験され得る。「ストリンジェントな条件」は、配列依存であり、そして異なる環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されるイオン強度およびｐＨで特異的配列に対する熱的融点（ＴM）よりも約５℃低いくな
るように選択され得る。このＴMは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下）である。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７で少なくとも約０．０２モル濃度であり、そして温度が少なくとも約６０℃である条件である。他の因子は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（中でも、塩基組成および相補鎖のサイズを含む）、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチングの程度に影響を及ぼし得るので、パラメーターの組み合わせは、他のどの絶対的な程度より重要である。
【００４３】
高いストリンジェンシーとしては、例えば以下が挙げられ得る：工程１：ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡから構成される緩衝液中で８時間、一晩、６５℃で前処理する。工程２：フィルターを、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡおよび５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐ標識されたプローブを添加した上の前ハイブリダイゼーション混合物中で４８時間、６５℃でハイブリダイズする。工程３：フィルターを、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＰＶＰ、０．０１％  Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％  ＢＳＡを含む溶液中で３７℃で、１時間洗浄する。これに続いて、５０℃にて４５分間０．１×ＳＳＣで洗浄する。工程４：フィルターを、オートラジオグラフする。使用され得る高いストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．を参照のこと。
【００４４】
穏やかなストリンジェンシー条件としては、以下が挙げられ得る；工程１：ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡを含む溶液中で６時間、５５℃で前処理する。工程２：フィルターを、５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐ標識されたプローブを添加した同じ溶液中で１８〜２０時間、５５℃でハイブリダイズする。工程３：フィルターを、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で３７℃で、１時間洗浄し、次いで１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で６０℃で３０分間２回洗浄する。工程４：フィルターを、乾燥ブロットし、そしてオートラジオグラフィーに曝す。使用され得る穏やかなストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．を参照のこと。
【００４５】
低いストリンジェンシーとしては、以下が挙げられ得る：工程１：ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＰＶＰ、０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ、１％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡを含む溶液中で６時間、４０℃で前処理する。工程２：フィルターを、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡ、１０％（重量／容積）硫酸デキストランおよび５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐ標識されたプローブを添加した同じ溶液中で１８〜２０
時間、４０℃でハイブリダイズする。工程３：フィルターを、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で１．５時間、５５℃で洗浄する。この洗浄溶液を、新鮮な溶液と取り替え、さらに１．５時間、６０℃でインキュベートする。工程４：フィルターを、乾燥ブロットし、そしてオートラジオグラフィーに曝す。必要な場合、フィルターを、６５〜６８℃で三回洗浄し、そしてフィルムに再度曝す。使用され得る低いストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションために使用されるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．を参照のこと。
【００４６】
（ＪＮＫインヒビタードメインおよび輸送ドメインを含むキメラペプチド）
別の局面において、本発明は、第１のドメインおよび第２のドメインを含むキメラペプチドを提供する。第１のドメインは、輸送配列を含むが、第２のドメインは、第１のドメインに共有結合（例えば、ペプチド結合）で連結されたＪＮＫインヒビター配列を含む。第１のドメインおよび第２のドメインは、ペプチドにおいて任意の順序で生じ得、そしてこのペプチドは、各ドメインを１つ以上含み得る。
【００４７】
輸送配列は、その配列が存在するペプチドを所望の細胞目的地に指向するアミノ酸の任意の配列である。従って、輸送配列は、形質膜を横切って（例えば、細胞外から）、形質膜を介して、そして細胞質内にペプチドを指向し得る。あるいは、またはさらに、輸送配列は、細胞中の所望の場所（例えば、核、リボソーム、ＥＲ、リソソーム、もしくはペルオキシソーム）へペプチドを指向し得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、輸送ペプチドは、公知の膜転座配列由来である。例えば、輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質の配列を含み得る。このタンパク質は、例えば、米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に記載されており、それぞれ、参考として本明細書に援用される。ＪＮＫインヒビターペプチドは、ＴＡＴタンパク質を構成する完全な８６アミノ酸のいくつかまたは全てに連結され得る。例えば、細胞内への取り込みおよび必要に応じて細胞核内へ取り込みを示す、８６アミノ酸よりも少ないＴＡＴタンパク質の機能的に有効なフラグメントまたは部分は、使用され得る。１つの実施形態において、フラグメントは、ＴＡＴ残基４８〜５７を含むペプチド（例えば、ＮＨ2−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（配列番号７）または一般的なＴＡＴ配列ＮＨ2−Ｘn−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−  Ｘn−ＣＯＯＨ（配列番号９））を含む。細胞内への流入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドは、公知の技術を使用してさらに規定され得る。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ８６：７３９７−７４０１（１９８９）を参照のこと。
【００４９】
ＴＡＴ配列は、ＪＮＫインヒビター配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結され得る。２つのプロリン残基のちょうつがいは、ＴＡＴとＪＮＫインヒビターペプチドとの間に付加されて、完全な融合ペプチドを形成する。例えば、Ｌ−アミノ酸融合ペプチドは、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド（配列番号１１）、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（配列番号１２）、または一般的なＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド（配列番号１３）であり得る。Ｄ−レトロ−インベルソ融合ペプチドは、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド（配列番号１４）、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（配列番号１５）、または一般的なＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド（配列番号１６）であり得る。ＴＡＴペプチドは、配列ＮＨ2−Ｘn−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘn−ＣＯＯＨ（配列番号１０）を有するＤ−レトロ−インベルソペプチドであり得る。配列番号５〜６、９〜１０、１３および１６において、「Ｘ」残基の数は、示された１つに限定されず、上に記載のように変更し得る。
【００５０】
輸送配列は、ＴＡＴ配列に存在する単一（すなわち連続）アミノ酸配列であり得る。あるいは、ＴＡＴタンパク質に存在する２つ以上のアミノ酸配列であり得るが、天然に存在するタンパク質においては他のアミノ酸配列によって分離される。本明細書中で使用する場合、ＴＡＴタンパク質は、天然に存在するＴＡＴタンパク質、またはその機能的に等価なタンパク質または機能的に等価なそれらのフラグメント（ペプチド）のアミノ酸配列と同じ天然に存在するアミノ酸配列を含む。このような機能的に等価なタンパク質または機能的に等価なフラグメントは、天然に存在するＴＡＴタンパク質の細胞内へのおよび細胞核内への取り込み活性と実質的に同様の活性を有する。ＴＡＴタンパク質は、天然に存在する供給源から得られ得るか、または遺伝子工学技術または化学合成を使用して生成され得る。
【００５１】
天然に存在するＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、天然に存在するＴＡＴタンパク質に存在する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失および／または置換によって改変され、改変ＴＡＴタンパク質を生成し得る（本明細書中ではＴＡＴタンパク質ともいわれる）。増加したまたは減少した安定性を有する改変ＴＡＴタンパク質またはＴＡＴペプチドアナログは、公知の技術を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＴタンパク質またはペプチドは、天然に存在するＴＡＴタンパク質またはそれらの部分のアミノ酸配列と実質的に同様のアミノ酸配列を同一ではないが、含む。さらに、コレステロールまたは他の脂質誘導体が、ＴＡＴタンパク質に添加され、増加した膜溶解性を有する改変ＴＡＴを生成し得る。
【００５２】
ＴＡＴタンパク質の改変体は、ＴＡＴ−ＪＮＫインヒビターペプチドの細胞内の局在化を調節するように設計され得る。外因的に添加する場合、このような改変体は、細胞に入るＴＡＴの能力が、保持される（すなわち、細胞への改変ＴＡＴタンパク質またはペプチドの取り込みが、天然に存在するＨＩＶ  ＴＡＴの取り込みと実質的に同様である）ように設計される。例えば、核局在化に重要であると考えられた基礎領域の変化（例えば、ＤａｎｇおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８０１９−１８０２３（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１１８１−１１８７（１９８９）；Ｒｕｂｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．６３：１−８（１９８９）を参照のこと）は、ＴＡＴの（従ってＪＮＫインヒビターペプチドの）細胞質位置選定または部分的細胞質位置選定を生じ得る。あるいは、細胞質または任意の他の成分もしくは画分（例えば、小胞体、ミトコンドリア、グルーム（ｇｌｏｏｍ）体、リソソーム体）を結合する配列は、細胞質または任意の他の画分においてＴＡＴおよびＪＮＫインヒビターペプチドを保持し、ＴＡＴおよびＪＮＫインヒビターペプチドの取り込みに対する調節を与えるために、ＴＡＴへ導入され得る。
【００５３】
輸送ペプチドについての他の供給源として、例えばＶＰ２２（例えば、ＷＯ９７／０５２６５；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−２３３（１９９７）に記載される）または非ウイルス性タンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１−１０６９５（１９９２））が挙げられる。
【００５４】
ＪＮＫインヒビター配列および輸送配列は、当該分野で公知の任意の適切な様式において化学的カップリングによって連結され得る。多くの公知の化学架橋方法は、非特異的である、すなわち、この方法は、輸送ポリペプチドまたは積荷（ｃａｒｇｏ）高分子上の任意の特定の部位への結合部分を指向しない。結果として、非特異的架橋薬剤の使用は、機能的部位を攻撃するか、または活性部位を立体的にブロックし得、結合体化タンパク質を生物学的に不活性にする。
【００５５】
カップリング特異性を増加させる１つの方法は、架橋されるべきポリペプチドの１つあるいは両方において１回のみまたは２、３回見出される官能基への直接的な化学カップリングである。例えば、多くのタンパク質において、チオール基を含む唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、２、３回だけ現れる。例えばまた、ポリペプチドが、リジン残基を含まない場合、１級アミンに対する特異的な架橋試薬は、このポリペプチドのアミノ末端に対して選択性である。カップリング特異性を増加させるこのアプローチの成功した利用は、ポリペプチドが、分子の生物学的活性の損失無しに変化され得る分子の領域において適切にまれなでかつ反応性の残基を有することを必要とする。
【００５６】
システイン残基が、架橋反応におけるポリペプチド配列の関与が別な方法で生物学的活性を妨げそうなポリペプチド配列の部分に存在する場合、システイン残基は、置換され得る。システイン残基が置換される場合、ポリペプチド折り畳みにおいて生じる変化を最小にすることは、典型的に望ましい。置換が、化学的および立体的にシステインと同様の場合、ポリペプチド折り畳みにおける変化は、最小となる。これらの理由から、セリンは、システインの置換として好ましい。以下の実施例に示すように、システイン残基は、架橋の目的でポリペプチドのアミノ酸配列に導入され得る。システイン残基が導入される場合、アミノ末端もしくはカルボキシ末端で、またはアミノ末端の近くもしくはカルボキシ末端の近くでの導入は、好ましい。従来の方法は、目的のポリペプチドが化学合成または組換えＤＮＡの発現のどちらによって生成されようと、このようなアミノ酸配列改変について利用可能である。
【００５７】
２つの成分のカップリングは、カップリング剤又は結合体化剤を介して達成され得る。利用され得るいくつかの分子間架橋試薬がある（例えば、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４、ｐｐ．３９−４３．を参照のこと）。これらの試薬の中には、例えば、Ｊ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（共に、スルフヒドリル基に対して高い特異性であり、そして非可逆的結合を形成する。）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１個の炭素メチレン架橋を有する他のこのような薬剤（スルフヒドリル基に対して相対的に特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ基およびチロシン基と不可逆的結合を形成する）がある。この目的に使用する他の架橋試薬としては、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基およびフェノール基と不可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に対して特異的である）；フェノールー１，４−ジスルホニルクロライド（アミノ基と主に反応する）；ヘキサメチレンジイソシアナートまたはジイソチオシアナート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアナート（アミノ基と主に反応する）；グルタルアルデヒド（いくつかの異なる側鎖と反応する）およびディスジアゾベンジジン（チロシンおよびヒスチジンと主として反応する）が挙げられる。
【００５８】
架橋試薬は、ホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であり得る、すなわち、同じ反応をうける二つの官能基を有する。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、穏やかな条件下（ｐＨ６．５〜７．７）でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含む。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖で連結される。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチドの不可逆的架橋に有用である。
【００５９】
架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であり得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は、２つの異なる官能基（例えば、それぞれ遊離アミンおよび遊離チオールを有する２つのタンパク質を架橋するアミン反応性基およびチオール反応性基）を有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）（ＭＢＳの伸長鎖アナログ）である、これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、そしてチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００６０】
架橋試薬はしばしば、水に対して低い溶解性を有する。スルホネート基などの親水性部分は、架橋試薬に付加され、その水溶解性を改善し得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性について改変された架橋試薬の例である。
【００６１】
多くの架橋試薬は、細胞性条件下で基本的に切断不可能な結合体を生じる。しかし、いくつかの架橋試薬は、細胞性条件下で切断可能な共有結合（ジスルフィドなど）を含む。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）（「ＤＳＰ」）、およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断可能架橋剤である。切断可能架橋試薬の使用は、積荷部分を、標的細胞への送達後に輸送ポリペプチドから分離し得る。直接ジスルフィド結合もまた、有用であり得る。
【００６２】
多くの架橋試薬（上記のものを含む）は、市販されている。それらの使用についての詳細な指示は、市販の供給源から容易に入手可能である。タンパク質架橋および結合体化調製物についての概説参考文献は以下である：Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）。
【００６３】
化学架橋は、スペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、分子間の可撓性を提供するか、または結合体化した部分の間の分子間距離を調整し、そしてそれにより、生物学的活性の保持を補助し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸を含むポリペプチド部分の形態であり得る（例えば、プロリン）。あるいは、スペーサーアームは、架橋剤（例えば、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，ｃａｔ．Ｎｏ．２１６５１  Ｈ）の部分であり得る。
【００６４】
あるいは、キメラペプチドは、輸送配列およびＪＮＫインヒビター配列を含む融合ペプチドとして生成され得、これは、公知の適切な宿主細胞において簡便に発現され得る。融合ペプチドは、本明細書において記載されるように、上記のような標準的な組換えＤＮＡ技術に類似する方法で、またはそれに容易に適合可能な方法で形成および使用され得る。
【００６５】
（ＪＮＫインヒビターペプチドに対して特異的な抗体の生成）
ＪＮＫインヒビターペプチド（ＪＮＫインヒビターペプチド（例えば、表１に示されるアミノ酸配列を含むペプチド）を含むキメラペプチドを含む）は、ペプチドまたはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログと同様に、免疫原として利用されて、これらのペプチド成分を免疫特異的に結合する抗体が生成され得る。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。特定の実施形態において、ヒトペプチドに対する抗体が開示される。別の特定の実施形態において、ＪＮＫインヒビターペプチドのフラグメントは、抗体産生の免疫原として使用され得る。当該分野において公知の種々の手順は、ＪＮＫインヒビターペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生成のために使用され得る。
【００６６】
ポリクローナル抗体の生成のために、種々の宿主動物は、ネイティブペプチドまたはその合成改変体、あるいはそれらの誘導体の注射により免疫され得る。種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増強し得、そしてそれらには以下が挙げられるがそれらに限定されない：フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性化物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノールなど）およびヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）。
【００６７】
ＪＮＫインヒビターペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対して指向されるモノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により、抗体分子の生成を提供する任意の技術が利用され得る。そのような技術としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ハイブリドーマ技術（以下を参照のこと：Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（以下を参照のこと：Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術  （以下を参照のこと：Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用  （以下を参照のこと：Ｃｏｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）またはヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルスをインビトロで形質転換すること（以下を参照のこと：Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）により生成され得る。
【００６８】
本発明に従って、技術は、ＪＮＫインヒビターペプチドに特異的な単鎖抗体の産生のために適合され得る（例えば、以下を参照のこと：米国特許第４，９４６，７７８号）。さらに、方法論は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合されて（例えば、以下を参照のこと：Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）、ＪＮＫインヒビターペプチドまたはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野において周知の技術により「ヒト化」され得る。例えば、以下を参照のこと：米国特許第５，２２５，５３９号。ＪＮＫインヒビターペプチドに対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下を含む、当該分野において公知の技術によって生成され得る：例えば、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理により生成されるＦａｂフラグメント；および（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【００６９】
１つの実施形態において、所望の特異性を有する抗体のスクリーニングについての方法論としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および当該分野において公知の他の免疫学的に媒介される技術。特定の実施形態において、ＪＮＫインヒビターの特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、そのようなどメインを有するＪＮＫインヒビターペプチドのフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易になる。ＪＮＫペプチド、または誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログのフラグメント内のドメインに対して特異的である抗体もまた本明細書において提供される。
【００７０】
抗ＪＮＫインヒビターペプチド抗体は、ＪＮＫインヒビターペプチドの局在化および／または定量に関連する分野内で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のペプチドのレベルを測定するにおける使用のため、診断方法における使用のため、ペプチドを画像化するにおける使用のためなど）。所定の実施形態において、抗体由来の結合ドメインを含む、ＪＮＫインヒビターペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体は、薬理学的に活性な化合物（本明細書において「治療剤」（「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」）と以下で呼ぶ）として利用される。
【００７１】
（所望されないＪＮＫ活性を伴う障害を処置または予防する方法）
本発明において含まれるのはまた、被験体に、生物学的に活性な治療化合物（本明細書において「治療剤」（「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」）と以下で呼ぶ）を投与することによって、被験体におけるＪＮＫ活性に伴う細胞増殖障害を処置する方法である。その被験体は、例えば、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）であり得る。
【００７２】
治療剤としては、以下が挙げられる：例えば、（ｉ）ＪＮＫインヒビターペプチドならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログの任意の１つ以上；（ｉｉ）ＪＮＫインヒビターペプチドに対して指向される抗体；（ｉｉｉ）ＪＮＫインヒビターペプチドならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログ）をコードする核酸；（ｉｖ）ＪＮＫインヒビターペプチドをコードする配列に対するアンチセンス核酸、ならびに（ｖ）モジュレーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）。
【００７３】
用語「治療的に有効」とは、例えば、使用されるインヒビターペプチド、の量がＪＮＫに関連する障害を改善するに十分な量であることを意味する。用語「細胞増殖障害」とは、周囲の組織とは、形態学的および機能的に異なるようにしばしばみえる、悪性の細胞集団および非悪性細胞集団をいう。例えば、この方法は、ＪＮＫの活性化がしばしば実証された種々の器官系の悪性疾患を処置するにおいて有用であり得る（例えば、肺、乳房（胸部）、リンパ系、胃腸、および生殖尿管ならびに腺癌（以下のような悪性疾患を含む：結腸癌、腎細胞がん、前立腺癌、肺の非小細胞がん、小腸の癌および食道癌）。ＪＮＫの活性化を明らかに必要とする、Ｂｃｒ−Ａｂ１オンコジーン形質転換を伴う癌もまた包含される。
【００７４】
この方法はまた、非悪性または免疫学的に関連する細胞増殖疾患（例えば、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性心疾患、透析後症候群、白血病、慢性関節リウマチ、後天性免疫不全症候群、敗血性ショックおよび他の型の急性炎症、ならびに脂質組織球増殖症を処置するにおいて有用である。特に好ましくは、免疫病理障害である。本質的には、ＪＮＫキナーゼ活性に病因学的に関連する任意の障害が処置を受け入れると考えられる。
【００７５】
処置としては、ＪＮＫキナーゼ活性を調節する試薬の投与が挙げられる。用語「調節」は、それが過剰発現されるときの、ＪＮＫの発現の抑制を含む。それはまた、配列番号１〜６および配列番号１１〜１６の任意の１つ以上のペプチドを、細胞における天然のｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＮＦＡＴ４の結合部位の競合インヒビターとして使用することによる、例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２またはＮＦＡＴ４のリン酸化の抑制を含む。従って、また、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２またはＮＦＡＴから作製される転写因子とその関連するパートナーとの、ヘテロマーまたはホモマー複合体（例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２およびｃ−ｆｏｓから作製されるＡＰ−１複合体）の抑制が包含される。細胞増殖障害がＪＮＫ過剰発現に関連するとき、そのような抑制性ＪＮＫインヒビターペプチドは、細胞に導入され得る。いくつかの場合において、「調節」は、例えば、ＪＮＫに対するＩＢペプチドの結合をブロックし、それによりＩＢ関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を予防する、ＩＢペプチド特異的な抗体の使用による、ＪＮＫ発現の増加を包含し得る。
【００７６】
本発明のＪＮＫインヒビター、ペプチド、融合ペプチドおよび核酸は、薬学的組成物中で処方され得る。これらの組成物は、上記の物質のひとつに加えて、薬学的に受容可能な賦型剤、キャリア、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、そして活性成分の効力に干渉すべきではない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し得る（例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内またはパッチ経路）。
【００７７】
経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、散剤または液体形態であり得る。錠剤は、固形キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含み得る。液状薬学的組成物は、概して、液体キャリア（例えば、水、石油、動物油、植物油、鉱油または合成油）を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖溶液もしくはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）もまた含まれ得る。
【００７８】
静脈内、皮膚または皮下の注射、あるいは罹患部位への注射のために、活性成分は、非経口的に受容可能な水溶液の形態であり、これは、発熱物質を含まず、そして適切なｐＨ、等張性および安定性を有する。関連分野の当業者は、例えば、等張性ビヒクル（例えば、食塩注射（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液）を用いて適切な溶液を調製し得る。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加物もまた、必要に応じて含まれ得る。
【００７９】
それがポリペプチド分子であれ、ペプチド分子であれ、核酸分子であれ、個体に与えられるべき、本発明に従う、他の薬学的に有用な化合物は、投与は、好ましくは、「予防有効量」または「治療有効量」（症例にもより得るが、予防は、治療とも考えられ得る）であり、これは、個体に対して利益を示すに十分である。実際に投与される量ならびに投与の速度および時間経過は、処置される性質および重症度に依存する。処置の処方（例えば、投薬量の決定など）は、一般医および他の医師の責任において行われ、そして代表的には、処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与の方法および実施者に公知のたの因子を考慮する。上記の技術およびプロトコルの例は、以下に見出される：ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０。
【００８０】
あるいは、標的化治療を使用して、抗体または細胞特異的リガンドのような標的化系の使用により、特定の型の細胞により特異的な活性因子を送達し得る。標的化は、種々の理由で所望され得る：例えば、その因子が、受容不可能なくらいに毒性である場合、またはそれが別の方法で高すぎる投薬量を必要とする場合、またはそれがそうでなければ標的化に侵入し得ない場合。
【００８１】
これらの因子を直接投与する代わりに、それらは、例えばウイルスベクター（ＶＤＥＰＴ技術の改変、以下を参照のこと）においてその細胞に導入されたコード遺伝子からの発現により標的細胞において生成され得る。このベクターは、処置されるべき特定の細胞に対して標的化され得るか、またはそれは、調節エレメントを含み得、これは、標的細胞によっておおかれ少なかれ選択的にスイッチオンされる。
【００８２】
あるいは、この因子は、処置されるべき細胞においてまたはそこへと標的化される、活性化因子によって活性化形態へと変換するために、前駆体の形態で投与され得る。この型のアプローチは、ときに、ＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られ、前者は、活性化因子を、細胞特異的抗体への結合体化により細胞へと標的化する工程を包含し、他方後者は、ウイルスベクターにおけるコードＤＮＡからの発現によってベクター中で活性化因子（例えば、ＪＮＫインヒビターペプチド）を生成する工程を包含する（例えば、以下を参照のこと：ＥＰ−Ａ−４１５７３１およびＷＯ  ９０／０７９３６）。
【００８３】
本発明の特定の実施形態において、核酸は、ＪＮＫインヒビターペプチドをコードする配列、またはその機能的な誘導体を含み、投与されて、遺伝子治療による活性化されたＪＮＫシグナル伝達経路を調節する。より特定の実施形態において、核酸またはＪＮＫインヒビターペプチドをコードする核酸、あるいはその機能的誘導体は、遺伝子治療により投与される。本発明のこの密使形態において、その核酸は、そのコードされたペプチドを生成し、これはついで疾患または障害の機能を調節することによって、治療効果を発揮するように作用する。当該分野において利用可能な遺伝子治療に関連する任意の方法論が本発明の実施において使用され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：４８８−５０５。
【００８４】
好ましい実施形態において、治療剤は、ＩＢ関連ペプチド、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログの任意の１つ以上を、適切な宿主中で発現する発現ベクターの部分である核酸を含む。特定の実施形態において、このような核酸は、ＪＮＫインヒビターペプチドのコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有する。このプロモーターは、誘導性または構成的であり得、そして必要に応じて組織特異性であり得る。別の特定の実施形態において、コード配列（および任意の他の所望される配列にゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域が隣接し、それにより核酸の染色体内の発現を提供する核酸分子が使用される。例えば、以下を参照のこと：Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５。
【００８５】
治療剤核酸の患者への送達は、直接（すなわち、核酸または核酸含有ベクターへの直接の暴露）または間接的（すなわち、細胞はまず核酸でインビトロで形質転換され、ついで患者へと移植される）のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、それぞれ、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療として知られる。本発明の特定の実施形態において、核酸は、インビボで直接投与され、ここで発現されて、コードされる産物が生成される。これは、以下を含む、当該分野において公知の多数の方法のいずれかにより達成され得る：例えば、核酸を適切な核酸発現ベクターの部分として構築する工程、およびこれを、それが細胞内に存在するように投与する工程（例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染；以下を参照のこと：米国特許第４，９８０，２８６号）；裸のＤＮＡの直接注射；微粒子ボンバードメント（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（登録商標）；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）；脂質での核酸のコーティング；関連する細胞表面レセプター／トランスフェクト剤の使用；リポソーム、微粒子または微小カプセル中へのカプセル化；核へ侵入することが知られるペプチドとともにそれを投与すること；またはレセプター媒介エンドサイトーシスの素因があるリガンドとともにそれを投与すること（例えば、以下を参照のこと：Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９−４４３２）（これは、目的のレセプターを特異的に発現する細胞型を「標的化」するために使用され得る）など）。  
【００８６】
本発明の実施における遺伝子治療のさらなるアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウイルス感染などのような方法によって遺伝子をインビトロで組織培養物に移す工程を包含する。一般に、この移す方法としては、選択マーカーの細胞への同時移入が挙げられる。ついで、この細胞を選択圧の下に置き（例えば、抗生物質耐性）、移入された遺伝子を取り込んで、発現しつつある細胞の単離を容易にする。ついで、これらの細胞を、患者に送達する。特定の実施形態において、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸は、当該分野において公知の任意の方法によって細胞に導入される。この方法には、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含むウイルスもしくはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、およびその移入によってレシピエントの細胞の必要な発達および生理的機能が破壊されないことを確実にする類似の方法論が挙げられる。例えば、以下を参照のこと：Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，１９９３．Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９−６１８。選択された技術は、細胞へ核酸を安定に移入することを提供し、その結果、核酸は、その細胞によって発現され得る。好ましくは、移入される核酸は、その細胞子孫によって遺伝され得、そして発現され得る。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態において、得られた組換え細胞は、当該分野において公知の種々の方法によって患者に送達され得る。これらの方法には、例えば、内皮細胞の注入（例えば、皮下）、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として患者に適用すること、および組換え血球（例えば、造血幹細胞または始原細胞）を静脈内注射することが挙げられる。使用が企図される細胞の全量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして当業者によって決定され得る。
【００８８】
核酸が遺伝子治療の目的で導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、そして異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）、異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｃ）、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）または自己（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。細胞型としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：分化された細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞および血球）、または幹細胞（特に、肺性心筋細胞、肝幹細胞（国際特許公開ＷＯ  ９４／０８５９８）、神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５）、造血幹細胞または始原細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られた細胞）。好ましい実施形態において、遺伝子治療に利用される細胞は、患者にとって自己である。
【００８９】
（免疫アッセイ）
本発明のペプチドおよび抗体は、アッセイ（例えば、免疫アッセイ）において利用されて、ＪＮＫもしくはＪＮＫインヒビターペプチドの異常レベルによって特徴付けられる状態、疾患および障害を診断（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）、診断（ｄｉａｇｎｏｓｅ）、またはモニターをし得るか、またはそれらの処置をモニターし得る。「異常レベル」とは、身体の罹患していない部分から、またはその障害を有しない被験体からの類似のサンプルにおいて存在するレベルに比較してサンプルにおいて増加または減少したレベルを意味する。免疫アッセイは、免疫特異的な結合が生じ得る条件で抗体と患者に由来するサンプルとを接触させる工程、、およびついでその抗体による任意の免疫特異的結合の量を検出または測定する工程を包含する方法によって行われ得る。特定の実施形態において、ＪＮＫインヒビターペプチドに対して特異的な抗体を使用して、ＪＮＫまたはＪＮＫインヒビターの存在について、患者からの組織または血清のサンプルを分析し得る。ここで、異常レベルのＪＮＫまたはＪＮＫインヒビターペプチドは、罹患した状態の指標である。利用され得る免疫アッセイとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集素アッセイ、蛍光免疫アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、およびプロテインＡ免疫アッセイなどのような競合アッセイ系および非競合アッセイ系。
【００９０】
（キット）
本発明は、抗ＪＮＫインヒビターペプチド抗体、および必要に応じて標識された、抗体に対する結合パートナーを含む１つ以上の容器を備える、診断用途または治療用途のキットをさらに提供する。抗体に取り込まれた標識としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、呈色部分、または放射性部分。別の特定の実施形態において、ＪＮＫインヒビターペプチドをコードするかまたは代替的に相補的である改変されたかまたは改変されていない核酸、および必要に応じてその標識された、その核酸に対する結合パートナーを含む、１つ以上の容器を含む、診断用途のためのキットもまた提供される。代替の特定の実施形態において、そのキットは、１つ以上の容器中に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、以下を参照のこと：Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０．ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、リガーゼ連鎖反応、サイクリックプローブ反応など、または当該分野で公知の他の方法のための増幅プライマーとして働き得る、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、各々は６−３０ヌクレオチド長）を含み得る。このキットは、必要に応じて、診断標準またはアッセイにおけるコントロールとして使用するために、精製されたＪＮＫインヒビターペプチドまたはその核酸の所定の量をさらに含み得る。
【００９１】
本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態によってその範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書において記載されるものの本発明の種々の改変は、上記の説明および添付の図面から当業者には明白である。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入る。
【００９２】
種々の文献が本明細書において引用されており、その開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【００９３】
（実施例１：ＪＮＫインヒビターペプチドの同定)
ＪＮＫとの効率的な相互作用のために重要なアミノ酸配列を、公知のＪＢＤ間の配列アラインメントにより同定した。ＩＢ１（配列番号１７）、ＩＢ２（配列番号１８）、ｃ−Ｊｕｎ（配列番号１９）、およびＡＴＦ２（配列番号２０）のＪＢＤ間の配列比較は、弱く保存された８アミノ酸配列を規定した（図１Ａ）。ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤは、ＪＮＫとの結合においてｃ−ＪｕｎもしくはＡＴＦ２より約１００倍効率的であるので（Ｄｉｃｋｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：６９３（１９９７）、ＩＢ１とＩＢ２との間で保存された残基が、最大結合を付与するために重要でなければならないことが推論された。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤ間の比較は、２つの配列間で高度に保存されている７および３つのアミノ酸の２つのブロックを規定した。これらの２つのブロックは、ＩＢ１（配列番号１）内の２３アミノ酸およびＩＢ２（配列番号２）内の２１アミノ酸のペプチド配列内に含まれている。これらの配列は、図１Ｂに示され、ＩＢ２配列内のダッシュは、保存された残基をアラインするための配列内のギャップを示す。
【００９４】
（実施例２：ＪＮＫインヒビター融合タンパク質の調製）
ＪＮＫインヒビター融合タンパク質を、ＪＢＤ23のＣ末端またはＩＢ２（ＪＢＤ２１）のＪＢＤ由来の２１アミノ酸配列を、ＨＩＶ−ＴＡＴ48-57（Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０（１９９７））由来のＮ末端１０アミノ酸長キャリアペプチドへ、２つのプロリン残基からなるスペーサーを介して、共有結合することにより合成した。このスペーサーを、可撓性を最大とするために、そして所望でない二次構造の変化を防止するために、使用した。図１Ｃに示されるように、これらの調製物を、Ｌ−ＴＡＴ（配列番号７）、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１１）、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ２（配列番号２）と、それぞれ命名した。全てのＤレトロインベルソペプチドＴＡＴ融合ペプチドもまた合成し、そしてＤ−ＴＡＴ（配列番号８）およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１４）と、それぞれ命名した。全てのＤおよびＬペプチドを古典的なＦモック合成により生成し、そして質量分析によりさらに分析した。それらを、ＨＰＬＣにより最終的に精製した。プロリンスペーサーの効果を決定するために、２つのプロリンを有するもの、２つのプロリンを有さないものという２つのタイプのＴＡＴペプチドを生成した。その２つのプロリンの付加は、ＴＡＴペプチドの細胞内への侵入または細胞内での局在化を改変するようではなかった。
【００９５】
保存されたアミノ酸残基を示す一般的なペプチドは、図２に示される。「Ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。所定のペプチドにおけるＸの数は、示されるものに限定されるわけではなく、変化しうる。一般配列のより詳細な記載については、上記を参照のこと。
【００９６】
（実施例３：ＪＢＤ23によるβ細胞死の阻害）
次いで、ＪＮＫの生物学的活性に対するＩＢ１の２３アミノ酸長のＪＢＤ配列の効果を研究した。２３アミノ酸の配列を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ−ＪＢＤ23構築物）のＮ末端に結合し、そしてこの構築物の、ＩＬ−１βにより誘導される膵臓β細胞アポトーシスに対する効果を評価した。図３を参照のこと。アポトーシスのこの態様は、以前にＪＢＤ1-280でのトランスフェクションによってブロックされることが示されたのに対し
て、ＥＲＫ１／２またはｐ３８の特異的インヒビターは、保護しなかった。Ａｍｍｅｎｄｒｕｐら（前出）を参照のこと。
【００９７】
２３アミノ酸配列（ＪＢＤ23；図１Ｂ）および完全に保存された領域で変異した配列（ＪＢＤ23mut）に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手）のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に直接挿入した。インスリンが産生するβＴＣ−３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリン、および２ｍＭ  グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。インスリンを産生するβＲＣ−３細胞を、示されたベクターでトランスフェクトし、そしてＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）を細胞培養培地に添加した。アポトーシス細胞の数を、ＩＬ−１βを添加した４８時間後に、倒立蛍光顕微鏡を使用して計算した。細胞質の「小胞形成」の特徴により、アポトーシス細胞を正常細胞から区別し、２日後に計数した。
【００９８】
図３に示されるように、ＧＦＰはコントロールとして使用したグリーン蛍光タンパク質発現ベクターであり；ＪＢＤ２３は、ＩＢ１のＪＢＤ由来の２３アミノ酸の配列に結合したキメラＧＦＰを発現するベクターであり；ＪＢＤ２３Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ２３と同じベクターであるが、ＪＢＤは、図１Ｂに示される４つの保存された残基で変異されている；ＪＢＤ２８０は完全なＪＢＤ（アミノ酸１-２８０）に結合したＧＦＰベクターで
ある。ＧＦＰ−ＪＢＤ23を発現する構築物は、ＪＢＤ1-280と同様に効率的に、ＩＬ−１
βが誘導する膵臓β細胞アポトーシスを防止した（図３、ＪＢＤ２８０／ＩＬ−１に比較してのＪＢＤ２３／ＩＬ−１）。さらなるコントロールとして、完全に保存されたＩＢ１残基で変異された配列は、アポトーシスを防止する能力が非常に減少されていた（図３、ＪＢＤ２３Ｍｕｔ／ＩＬ−１）。
【００９９】
（実施例４：ＴＡＴ−ＩＢ１およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの細胞内移入）
ＴＡＴ、ＴＡＴ−ＩＢ１、およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド」）のＬおよびＤ立体異性体形態の細胞へ侵入する能力を評価した。
【０１００】
Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ２、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド（それぞれ配列番号７、８、１１、１２、および１４）を、フルオレセインに結合体化したグリシン残基のＮ末端への付加により標識した。標識したペプチド（１μＭ）を、βＴＣ−３細胞培養に添加し、これを実施例３に記載されるように維持した。所定の時間に、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして氷冷メタノールアセトン（１：１）中で５分間固定し、その後、蛍光顕微鏡下で検査した。蛍光標識したＢＳＡ（１μＭ、１２モル／モルＢＳＡ）をコントロールとして使用した。結果は、全ての上記の蛍光標識したペプチドが、細胞培養中に一旦添加されると、効率的にかつ迅速に（５分未満で）細胞に侵入したことを実証した。反対に、蛍光標識したウシ血清アルブミン（１μＭ  ＢＳＡ、１２モル  フルオレセイン／モルＢＳＡ）は、細胞に侵入しなかった。
【０１０１】
時間経過の研究は、Ｌ立体異性体ペプチドについての蛍光シグナルの強度が、２４時間後に、７０％減少したことを示した。４８時間において、シグナルはほとんどか全く存在しなかった。対照的に、Ｄ−ＴＡＴ、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、細胞内で非常に安定であった。これら全てのＤレトロインベルソペプチド由来の蛍光シグナルは、１週間後にもなお非常に強力であり、そしてそのシグナルは、処置の２週間後にわずかに少し減少したに過ぎなかった。
【０１０２】
（実施例５：ｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１リン酸化のインビトロでの阻害）
その標的転写因子のＪＮＫ媒介リン酸化に対するペプチドの効果を、インビトロで研究した。組換えおよび非活性化ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３を、転写および翻訳ウサギ網状赤血球溶解物キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生成し、そしてｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１を単独または基質としてのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させて用いた固相キナーゼアッセイにおいて使用した。用量応答研究を、Ｌ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１、またはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（０〜２５μＭ）を、反応緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ酢酸、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ｐ−グリセロホスフェート、１ｍＭ  ジチオスレイトール）において２０分間、組換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、またはＪＮＫ３キナーゼと混合した。次いで、そのキナーゼ反応物を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５μＣｉ33Ｐ−γーｄＡＴＰおよび１μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（アミノ酸１〜９６）またはＧＳＴ−ＥＬＫ１（アミノ酸３０７〜４２８）の添加により開始した。ＧＳＴ融合タンパク質を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。１０μＬのグルタチオンアガロースビーズもまた、その混合物に添加した。次いで、反応生成物を、変性１０％ポリアクリルアミドゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥し、そして引き続いてＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に暴露した。ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のほとんど完全な阻害が、２．５μＭ程度のＴＡＴ−ＩＢペプチドの用量で観察された。しかし、顕著な例外は、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ阻害が存在しないことであった。全体として、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、それらの標的転写因子のＥｌｋ１のＪＮＫファミリーのリン酸化を阻害するにおいて、わずかにＴＡＴ−ＩＢ２に対して優れているようであった（図４Ａを参照のこと）。
【０１０３】
組換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３によるＧＳＴ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜７３）のリン酸化を阻害するＤ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド（０〜２５０μＭ用量研究）の能力は、上記のように分析された。全体として、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１よりも約１０〜２０倍非効率的なレベルで、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ媒介リン酸化を減少させた（図４Ｂを参照のこと）。
【０１０４】
（実施例６：活性化ＪＮＫによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害）
ストレス性刺激によって活性化されるＪＮＫに対するＬ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１、またはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの効果を、ＪＮＫをＵＶ光照射したＨｅＬａ細胞またはＩＬ−１β処理したβＴＣ細胞から引きおろすために、ＧＳＴ−Ｊｕｎを使用して評価した。βＴＣ細胞を、以下に記載のように培養した。ＨｅＬａを、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および２ｍＭ  グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地において培養した。細胞抽出調製物のために使用する１時間前に、βＴＣ細胞を、上記のようにＩＬ−１βで活性化した一方、ＨｅＬａ細胞を、ＵＶ光（２０Ｊ／ｍ2）によって活性化した。細胞抽出物を、コントロール、ＵＶ光照射ＨｅＬａ細胞、およびＩＬ−１β処置βＴＣ−３細胞から、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  βグリセロホスフェート、１ｍＭ  ジチオスレイトール）中の細胞培養物を引っかき取ることによって調製した。細片を、ＳＳ３４  Ｂｅｃｋｍａｎローター中での１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって除去した。１００μｇの抽出物を、１時間、室温で１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１-８９）および１０μＬのグルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。引っかき用緩衝液での４回の洗浄の後、そのビーズをＬ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１またはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（２５μＭ）を補充した同じ緩衝液中で２０分間再懸濁した。次いで、キナーゼ反応を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５μＣｉの33Ｐ−γ−ｄＡＴＰの添加により開始し、そして３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって変性１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを乾燥し、そして引き続いてＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に暴露した。ＴＡＴ−ＩＢペプチドは、効率的に、これらの実験において、活性化ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を防止した（図６を参照のこと）。
（実施例７：ＴＡＴ−ＩＢペプチドによるｃ−ＪＵＮリン酸化のインビボ阻害）
細胞透過性ペプチドがインビボでＪＮＫシグナリングをブロックし得るかどうかを決定するため、本発明者らは異種ＧＡＬ４系を使用した。ＨｅＬａ細胞（上記のように培養）を、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに連結したｃ−Ｊｕｎ（アミノ酸１−８９）の活性化ドメインを含むＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に５×ＧＡＬ−ＬＵＣレセプターベクターで同時トランスフェクトした。ＪＮＫの活性化を、直ぐ上流のキナーゼＭＫＫ４およびＭＫＫ７（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３（１９９９）を参照）を発現するベクターの同時トランスフェクションにより達成した。簡潔には、３×１０5細胞を、製品の指示書に従ってＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、３.５ｃｍディッシュにおいて、プラスミドでトランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊうｎを含む実験には、２０ｎｇのプラスミドを、１μｇのレセプタープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および０.５μｇのＭＫＫ４発現プラスミドもしくはＭＫＫ７発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、細胞培地を交換し、そしてＴＡＴ、ＴＡＴ−ＩＢ１およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（１μＭ）を加えた。ルシフェラーゼ活性を、１６時間後に、タンパク質含量に対して正規化した後でＰｒｏｍｅｇａの「Ｄｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」を使用して測定した。図５に示されるように、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの添加が、共に、ＪＮＫのＭＫＫ４媒介活性化後およびＭＫＫ７媒介活性化後のｃ−Ｊｕｎ活性化をブロックした。ＨｅＬａ細胞はＪＮＫ１イソフォームおよびＪＮＫ２イソフォームの両方を発現するがＪＮＫ３は発現しないので、本発明者らは細胞をＪＮＫ３でトランスフェクトした。再び、２つのＴＡＴ−ＩＢペプチドはｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２媒介活性化を阻害した。
【０１０５】
（実施例８：ＴＡＴ−ＩＢペプチドによるＩＬ−１β誘導膵臓β細胞死の阻害）
本発明者らは、ＩＬ−１βにより誘発される膵臓β細胞アポトーシスの促進に対するＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドの効果を調べた。βＴＣ−３細胞培養物を、３０分間１μＭのＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドのいずれかと共に、続いて１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βと共にインキュベートした。ペプチド（１μＭ）の第２の添加を２４時間後に行った。アポトーシス細胞を、ＩＬ−１βとの２日間のインキュベーション後に、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（赤く染色された細胞が死細胞である）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青く染色された細胞が、インタクトな形質膜を有する細胞である）核染色を使用して計数した。図５に示されるように、ＴＡＴ−ＩＢペプチドの添加により、ＩＬ−１βの存在下で２日間培養されたβＴＣ−３細胞のＩＬ−１β誘導アポトーシスが阻害された。
【０１０６】
ＩＬ−１β誘導細胞死の長期阻害を、βＴＣ−３細胞を上記のように（ペプチドおよびＩＬ−１βとの細胞のインキュベーションを１２日間持続したことを除いて）処理することにより調べた。さらなるペプチド（１μｇ）を各日添加し、そしてさらなるＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）を１日おきに添加した。ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、これらの条件においてアポトーシスに対して強力な保護を付与する。まとめると、これらの実験により、ＴＡＴ−ＩＢペプチドは、細胞運命に対するＪＮＫシグナリングの効果を妨げ得る、生物学的に活性な分子であることが確立される。
【０１０７】
（実施例９：ペプチドの合成）
本発明のペプチドは、天然のタンパク質分解を妨げるために逆に合成された全Ｄ体アミノ酸ペプチド（すなわち、全Ｄレトロ−インベルソペプチド）であり得る。本発明の全Ｄレトロ−インベルソペプチドは、ネイティブのペプチドと同様な機能的特性を有するペプチドを提供する。ここで、成分アミノ酸の側鎖はネイティブペプチドのアラインメントに対応するが、プロテアーゼ耐性骨格を保持する。
【０１０８】
本発明のレトロ−インベルソペプチドは、Ｄ体アミノ酸を使用して、レトロ−インベルソペプチドアナログ中のアミノ酸の配列が、モデルとして働く選択されたペプチド中の配列と正確に反対であるように、アミノ酸をペプチド鎖に付着することによって合成されるアナログである。例示のため、天然に存在するＴＡＴタンパク質（Ｌ体アミノ酸から生成）は、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７）を有し、このペプチドのレトロ−インベルソペプチドアナログ（Ｄ体アミノ酸から生成）は、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（配列番号８）を有する。Ｄ体アミノ酸の鎖を合成してレトロ−インベルソペプチドを生成する手順は、当該分野において公知である（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）；Ｇｕｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，２０３０−２０３９（１９９６）を参照）。具体的には、レトロ−ペプチドを、古典的なＦ−モック合成により作製し、質量分析によりさらに分析する。これらを最終的にＨＰＬＣにより精製した。
【０１０９】
ネイティブなペプチドの生来の問題は、天然プロテアーゼによる分解および生来の免疫原性であるので、本発明のヘテロ２価化合物またはヘテロ多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ−インベルソ異性体」を含むように調製される。したがって、ペプチドを天然のタンパク質分解から保護することは、半減期を延長させることおよびそのペプチドを能動的に破壊することを狙う免疫応答の程度を減少させることの両方により、その特定のヘテロ２価化合物またはヘテロ多価化合物の有効性を増大させる。
【０１１０】
（実施例１０：全Ｄレトロ−インベルソＩＢペプチドの長期生物学的活性）
ペプチドヘテロ結合体を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢレトロ−インベルソについて、ネイティブのＬ体アミノ酸アナログと比較する場合、実施例５に示すように、ネイティブなプロテアーゼによる破壊からのＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドの保護に起因して、長期生物学的活性が予測される。
【０１１１】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１β誘導膵臓β細胞死の阻害を分析した。図１０に示すように、示されたペプチド（１μＭ）を単回添加し、次いでＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加して、βＴＣ−３細胞を上記のように３０分間インキュベートした。次いで、ＩＬ−１βとの２日間のインキュベーションの後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ＩｏｄｉｄｅおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色を使用して、アポトーシス細胞を計数した。最小１,０００細胞を、各実験について計数した。平均の標準誤差（ＳＭＥ）を示す（ｎ＝５）。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドは、ＩＬ−１誘導アポトーシスを、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様な程度まで減少させた（図５と図１０を比較）。
【０１１２】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１β誘導細胞死の長期阻害もまた分析した。示されたペプチド（１μＭ）を単回添加し、次いでＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、続いてサイトカインを１日おきに、βＴＣ−３細胞を上記のように３０分間インキュベートした。次いで、ＩＬ−１βとの１５日間のインキュベーションの後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ＩｏｄｉｄｅおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色を使用して、アポトーシス細胞を計数した。Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの単回添加は、長期保護を付与しないことに注意すべきである。最小１,０００細胞を、各実験について計数した。平均の標準誤差
（ＳＭＥ）を示す（ｎ＝５）。結果を図９に示す。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢは、長期（１５日）保護を付与し得たが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１は長期保護を付与しなかった。
【０１１３】
（実施例１１：ＴＡＴ−ＩＢペプチドによる照射誘導膵臓β細胞死の阻害）
ＪＮＫはまた電離放射線による活性化される。ＴＡＴ−ＩＢペプチドが照射誘導ＪＮＫ損傷に対して保護を提供するかどうかを決定するため、図１０に示されるように、「ＷｉＤｒ」細胞に、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１またはＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド（照射の３０分前に１μＭを添加）の存在下または非存在下で照射した（３０Ｇｙ）。コントロール細胞（ＣＴＲＬ）は照射しなかった。細胞を、４８時間後に、上記のように、ＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色により分析した。ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは共に、このヒト結腸ガン細胞株において照射誘導アポトーシスを妨げ得た。
【０１１４】
（実施例１２：ＴＡＴ−ＩＢペプチドによる電離放射線に対する放射線防護）
ＴＡＴ−ＩＢペプチドの放射線防護効果を決定するため、Ｃ５７  Ｂｌ／６マウス（２〜３ヶ月齢）に、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＲＴ２５０  Ｒ線を、０.７４Ｇｙ／分の線量率（１７ｍＡ、０.５ｍｍ  Ｃｕフィルター）で照射した。照射の３０分前に、動物に、ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドのいずれか（１ｍＭ溶液３０μｌ）をｉ．ｐ．注射した。簡潔には、マウスに以下のとおり照射した：マウスを小さなプラスチック箱に、頭が外に出るように横たえて入れる。動物を背中が照射装置の下になるように置き、首を小さなプラスチックトンネル中に固定して頭部を正確な位置に維持した。体部を鉛で保護した。照射前は、マウスを標準的なペレットマウス飼料で飼育したが、照射後は、マウスを、毎日新しくした半液状飼料で飼育した。
【０１１５】
次いで、口唇粘膜の反応を、
Ｐａｒｋｉｎｓら（Ｐａｒｋｉｎｓら、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１：１６５−１７３，１９８３）により開発されたスコア付けシステムに従って、２人の独立した観察者によりスコア付けした。ここで、紅斑の状態ならびに浮腫、剥離および滲出の存在について値を見積もった。さらに、紅斑／浮腫の状態の各記録の前に動物の体重を測定した。
【０１１６】
図１２Ａは照射後のマウスの体重を示す。そのマウスの最初の体重を１００とし、それに対する値を報告した。ＣＴＲＬ：３０μｌの生理食塩水を注射したコントロールマウス。報告した各値について、ｎ＝２。Ｓ.Ｄ.をしめす。ｘ軸の値は日数。
【０１１７】
図１２Ｂは照射後の紅斑／浮腫のスコア付けを示す。図１２Ａと同じマウスの腹側口唇の浮腫および紅斑の状態を定量化した。報告した各値について、ｎ＝２。ｘ軸の値は日数。
【０１１８】
これらの実験の結果は、ＴＡＴ−ＩＢペプチドが電離放射線に関連する体重損失および紅斑／浮腫に対して保護し得ることを示す。
【０１１９】
（実施例１３：Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＪＮＫ転写因子の抑制）
ＡＰ−１二重化標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’）を用いてゲルシフト法を行った。ＨｅＬａ細胞核抽出物を、示されるように、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで１時間処理したかまたは処理しなかった。ＴＡＴペプチドおよびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドを、ＴＮＦ−αの３０分前に添加した。特定のＡＰ−１  ＤＮＡ複合体ゲルの部分（非標識特異的および非特異的競合物との競合実験により示される）のみを示す。Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＴＮＦ−αの存在下でＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の形成を減少させる（図１１を参照）。
【０１２０】
（等価物）
本発明の特定の実施形態の上記詳細な説明から、独特な細胞透過生物活性ペプチドが記載されていることが明らかであるはずである。特定の実施形態が本明細書で詳細に開示されているが、これは、例示を目的としただけで、本願発明の範囲を限定す意図はない。特に、種々の置換、変更、および改変が、本発明に対して、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることは、本発明者らにより企図されている。
【図１】
2011155990.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2011155990000001.app
【外国語明細書】
2011155990000001.pdf