(57)【要約】【課題】簡便かつ効率的なＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンの製造方法、並びにそのための手段を提供する。【解決手段】バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)、又はエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物に由来するＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを用いてＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンを選択的脱アシル化し、Ｌ−ホモセリンを得る。さらにＬ−ホモセリンを脱水環化してＬ−ホモセリンラクトンを得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンにＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ又はＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ含有物を作用させることを特徴とする、Ｌ−ホモセリン又はその塩の製造方法。
【請求項２】
ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンにＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ又はＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ含有物を作用させて得られたＬ−ホモセリン又はその塩を脱水環化することを特徴とする、Ｌ−ホモセリンラクトンの製造方法。
【請求項３】
ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンがＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼがバルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)、又はエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物に由来するＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
【請求項５】
バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)、又はエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物を培地に培養し、菌体若しくは培養物からＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを採取することを特徴とする、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの製造方法。
【請求項６】
バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)、及びエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物のうちのいずれか一種以上の微生物から得られたＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼあるいはＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ含有物を含有することを特徴とする、Ｎ-アシル−Ｌ−ホモセリンの脱アシル化剤。
【請求項７】
以下の酵素学的性質を有することを特徴とする、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ。
（ａ）作用：Ｌ−Ｎ−ホルミルホモセリンをＬ−ホモセリンに加水分解する。
（ｂ）基質特異性：Ｌ−Ｎ−アセチルホモセリン、Ｌ−Ｎ−アセチルアラニン、Ｌ−Ｎ−アセチルグルタミン酸にも弱く作用する。Ｄ−ホルミルホモセリン、Ｄ−アセチルホモセリン、ＤＬ−Ｎ−アセチルフェニルアラニンおよびＤＬ−Ｎ−アセチルペニシラミンには作用しない。
（ｃ）至適温度：５５〜６５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ８〜９
（ｅ）温度安定性：〜５０℃
（ｆ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８．５
（ｇ）分子量：ベックマン・ウルトラスフェロゲル  ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約８４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて３７，０００
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農薬・医薬品中間体として有用な光学活性なＬ−ホモセリン又はその等価体であるＬ−ホモセリンラクトンの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−ホモセリンは、ラジカルスカベンジャーである、Ｌ−Ｏ−カフェオイルホモセリンなどの薬剤の構成要素であり、これらの薬剤を量産する際の原料として使用される。また、Ｌ−ホモセリンはアミノ酸であるため、医薬・健康分野において大量かつ安価な供給が望まれている。
光学活性なＬ−ホモセリンの製造としては、発酵法が報告されているが（非特許文献１）、実用化には至っていない。また、Ｌ−ホモセリンラクトンの製造法として、優先晶出法（非特許文献２）等が知られているが、産物の鏡像体過剰率が明らかにされていない上に、操作が煩雑であり、工業的には適当ではない。
このように、現在、光学活性なＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンを簡便に、且つ、工業的に製造する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】鮫島広年、奈良高、藤田忠三、木下祝郎、農芸化学会誌、第34巻第750〜754頁、1960年
【非特許文献２】Shiraiwa,T.et  al.,Chem.Pharm.Bull.,第44巻第2322〜2325頁,1996年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、簡便かつ効率的なＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンの製造方法、並びにそのための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ラセミ体のホモセリンあるいはホモセリンラクトンは、安価に入手できる。このラセミ体のホモセリンあるいはホモセリンラクトンを簡便に光学分割できるならば、Ｌ−ホモセリンを簡便に得られる。
アミノ酸の光学分割法としては、一旦ラセミ体のアミノ酸をＮ−アシル化した後、立体選択的なアシラーゼでどちらかの鏡像体を脱アシルする方法が取られる。しかし、Ｎ−アシルホモセリンに作用するアシラーゼは知られていない。また、既知のアシラーゼについても、Ｎ−アシルホモセリンに対する活性は報告されていない。
【０００６】
このような実情に鑑み、本発明者は、前記課題を解決するため、Ｌ−Ｎ−アシルホモセリンを立体選択的に脱アシルするアシラーゼを生産する微生物を探索した結果、バルクホルデリア属、ペニシリウム属およびエルウニア属に属する微生物の中にそのようなアシラーゼを生産する微生物を見出し、それを用いることにより、ラセミ体ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン中のＬ−体だけを脱アシル化し、光学活性なＬ−ホモセリンを簡便に取得し得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンにＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ又はＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ含有物を作用させることを特徴とする、Ｌ−ホモセリン又はその塩の製造方法。
（２）ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンにＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ又はＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ含有物を作用させて得られたＬ−ホモセリン又はその塩を脱水環化することを特徴とする、Ｌ−ホモセリンラクトンの製造方法。
（３）ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンがＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンであることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼがバルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)、又はエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物に由来するＬ−Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼであることを特徴とする、 上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法。
（５）バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)又はエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物を培地に培養し、菌体若しくは培養物からＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを採取することを特徴とする、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの製造方法。
（６）バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)、及びエルウニア・サイプリペディ（Erwinia  cypripedii）に属する微生物のうちのいずれか一種以上の微生物から得られたＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼあるいはＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ含有物を含有することを特徴とする、Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンの脱アシル化剤。
（７）以下の酵素学的性質を有することを特徴とする、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ。
（ａ）作用：Ｌ−Ｎ−ホルミルホモセリンをＬ−ホモセリンに加水分解する。
（ｂ）基質特異性：Ｌ−Ｎ−アセチルホモセリン、Ｌ−Ｎ−アセチルアラニン、Ｌ−Ｎ−アセチルグルタミン酸にも弱く作用する。Ｄ−ホルミルホモセリン、Ｄ−アセチルホモセリン、Ｌ−Ｎ−アセチルフェニルアラニンおよびＤＬ−Ｎ−アセチルペニシラミンには作用しない。
（ｃ）至適温度：５５〜６５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ８〜９
（ｅ）温度安定性：〜５０℃
（ｆ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８．５
（ｇ）分子量：ベックマン・ウルトラスフェロゲル  ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約８４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて３７，０００
【発明の効果】
【０００８】
本発明におけるバルクホルデリア・テラ、ペニシリウム・シンプリシシマム、ペニシリウム・グラブラム、エルウニア・サイプリペディに由来のＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン中のＬ−体（Ｌ−Ｎ−アシルホモセリン）のみを立体選択的に脱アシル化する能力を有し、その酵素活性は極めて高い。したがって、このアシラーゼを利用して、安価なＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンから医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＬ−ホモセリンあるいはＬ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンからＬ−ホモセリンあるいはＬ−ホモセリンラクトンを製造するために使用するＬ−アシラーゼは、立体選択的なＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼであり、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンのうちＬ−体（Ｌ−Ｎ−アシルホモセリン）のみを脱アシル化する酵素である。該Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、バルクホルデリア属あるいはペニシリウム属又はエルウニア属に属する微生物由来のものであり、該微生物をより具体的に示すと、例えば、バルクホルデリア・テラ、ペニシリウム・シンプリシシマム、ペニシリウム・グラブラム、エルウニア・サイプリペディに属する微生物が挙げられる。
【００１０】
これらの微生物のうち、代表的な菌株としては、バルクホルデリア・テラ３０８Ｂ、ペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆ、ペニシリウム・グラブラム４６３Ｆ及びエルウニア・サイプリペディ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）が挙げられる。
これらの菌株は、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ生産菌の探索の結果、土壌から新に分離されたり、保存菌株から見出されたものである。
これらのうち、エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）の菌学的性質は、特許公報（特許第３９２８０４６号）に記載の通りである。その他の微生物の菌学的性質は、実施例１に示すとおりである。
本発明に係る微生物は、後述する微生物の菌学的性質を指標として、土壌、河川水、湖沼水、汚泥などから、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性に基づき、平板分離法や集積培養法などのスクリーニングを行うことにより得ることができる。
【００１１】
なお、上記バルクホルデリア・テラ３０８Ｂ、ペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆ及び、ペニシリウム・グラブラム４６３Ｆは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００９年１１月１７日付で寄託され、それぞれ順に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７１、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８６９、及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７０が与えられている。
【００１２】
本発明におけるＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの生産菌株としては、上記のバルクホルデリア・テラ３０８Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７１）、ペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８６９）、ペニシリウム・グラブラム４６３Ｆ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７０）及び、エルウニア・サイプリペディ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）が好ましいが、これらの誘導株も同様に好ましい。「誘導株」とは、上記菌株から天然に又は化学的若しくは物理的処理によって誘導される菌株であって、依然としてＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを生産する能力を保持あるいは向上した菌株を指す。微生物は、その培養条件（例えば培地組成、温度など）や、化学的若しくは物理的処理（例えばガンマ線照射など）によって変異が誘発されることが知られている。本発明においては、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを生産する能力を保持する限り、そのような誘導株も好ましく用いることができる。
【００１３】
ある菌株がＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを生産する能力は、例えば実施例１に記載のように、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンに菌体抽出物あるいはパーミアブル菌体を作用させ、反応液中のＤ−ホモセリン含量及びＬ−ホモセリン含量を測定することによって簡便に確認することができる。
本発明に係る微生物は、立体選択的なＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを生産する。したがって、該酵素を用いて、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン中のＬ−体のみを脱アシルし、Ｌ−ホモセリンを簡便かつ効率的に取得することができる。また、このようにして得たＬ−ホモセリン又はその塩をＬ−ホモセリンラクトンに脱水環化することによって、Ｌ−ホモセリンラクトンを効率的に製造することができる。
【００１４】
本発明においては、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン又はその塩を、上述したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼあるいは該酵素を生産する微生物の菌体、あるいはその培養物等の該酵素含有物と接触させることで、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン又はその塩中のＬ−Ｎ−アシルホモセリン又はその塩を選択的に脱アシル化されることにより、Ｌ−ホモセリン又はその塩を製造することができる。
このＬ−ホモセリン又はその塩の製造においては、前述した微生物のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができ、また、１種又は複数種の微生物から抽出されたＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを混合使用してもよい。
【００１５】
微生物を培養するには、通常の培養条件を用いて上記微生物を培養すればよく、例えば、培地として、炭素源、窒素源、無機塩類を含有する培地を用いて、各種培養条件を用いて培養を行うことができる。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びアルファ澱粉等の炭水化物などを用いることができる。具体例としては、例えば、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等が挙げられる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー又は大豆若しくは大豆粕等の抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物を用いることができる。そして、無機塩類としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄等の鉄イオン含有化合物、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、塩化ナトリウム等のナトリウム塩を用いることができる。また培地は、固体培地及び液体培地のいずれも使用することができる。
【００１６】
培養方法も特に限定されるものではなく、振盪培養、通気撹拌培養、静置培養などの公知の培養方法を用いることができる。ここで、培養の最適条件に関しては、用いる微生物の種類により異なるため、上記培地及び培養方法は用いる微生物に適するものに適宜選択及び調整される。また、温度、ｐＨ、培養期間等のその他の培養条件も、微生物が生育し、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性を生産し得る条件であれば適宜選択されて培養が行われることが好ましい。例えば、培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をｐＨ３〜９の範囲、好ましくはｐＨ５〜８に調整し、温度１０〜５０℃の範囲、好ましくは２０〜３０℃で実施し、通常１〜１５日間培養するのが望ましい。
【００１７】
本発明におけるＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン又はその塩の選択的脱アシル化においては、上記微生物由来のＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを含有するものであれば使用でき、例えば、上記微生物菌体、菌体破砕物等の菌体処理物、あるいは培養物、培養処理物を使用することができるが、例えば微生物の菌体そのままの形態、これらの菌体あるいはその破砕物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体を保存可能なように凍結又は乾燥した形態で用いてもよく、さらに培養物を濾過、遠心分離して若しくは脱水して得た菌体にパーミアブル化等の処理を行って使用してもよいし、培養物を水等で希釈して使用してもよい。また、微生物の菌体あるいは培養物からＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを抽出して、粗酵素の形態で使用してもよいし、さらに精製したものを使用してもよい。微生物の菌体あるいはその培養物からのＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの抽出法や精製法等の形態にも、何ら限定されない。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調整することができる。
本発明のＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの精製法それ自体公知の酵素精製法を用いることが可能であり、例えば、菌体破砕物から菌体を除去後、硫安分画法等を用いて酵素濃縮後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を適宜組み合わせて行うことができるが、微生物の菌体あるいはその培養物からのＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの抽出法や精製法等の形態には、何ら限定されない。
酵素の精製例として、ペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆ由来のＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを精製し、その酵素学的性質を調べた結果、該酵素は少なくとも以下の性質を有していた。
（ａ）作用：Ｌ−Ｎ−ホルミルホモセリンをＬ−ホモセリンに加水分解する。
（ｂ）基質特異性：Ｌ−Ｎ−アセチルホモセリン、Ｌ−Ｎ−アセチルアラニン、Ｌ−Ｎ−アセチルグルタミン酸にも弱く作用する。Ｄ−ホルミルホモセリン、Ｄ−アセチルホモセリン、ＤＬ−Ｎ−アセチルフェニルアラニンおよびＤＬ−Ｎ−アセチルペニシラミンには作用しない。
（ｃ）至適温度：５５〜６５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ８〜９
（ｅ）温度安定性：〜５０℃
（ｆ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜８．５
（ｇ）分子量：ベックマン・ウルトラスフェロゲル  ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約８４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて３７，０００
【００１８】
使用する微生物の菌体又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの量は、使用する微生物の種類、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。
さらに、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの選択的脱アシル化をさらに効率的に行うために、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼあるいはその含有物に他の追加成分を使用してもよく、そのような追加成分としては、限定するものではないが、硫酸コバルト、塩化亜鉛等の塩類が挙げられる。
本発明における上記選択的脱アシル化によるＬ−ホモセリンの製造においては、上記微生物の菌体、菌体処理物、培養物、培養処理物又はそれから抽出あるいはさらに精製したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンと接触させるが、ここで「接触」とは、例えば、上記Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼあるいは該酵素を含有する菌体、その培養物等の酵素含有物を懸濁液あるいは溶液の形態でＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンと接触させること、あるいは上記Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼあるいは該酵素を含有する菌体を不溶性の担体に固定化したものをＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンと接触させることなどを指す。
【００１９】
好ましい方法の１つは、肉汁培地など適当な培地で前記微生物を培養し、得られた菌体を有機溶剤で処理してパーミアブル菌体とし、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン溶液に懸濁し、震盪又は攪拌する方法である。ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン溶液の組成には何ら限定は無く、必要に応じ、無機塩類やビタミン等を加えてもよい。菌体懸濁液のｐＨや温度等の諸条件は、使用する微生物、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリン含有量、採用する培養方法などによって異なるが、Ｌ−Ｎ−アシルホモセリンが活発に脱アシルされる条件であれば何ら限定されるものではなく、当業者であれば適宜設定することができる。
【００２０】
以上の操作によりＬ−ホモセリンとＤ−Ｎ−アシルホモセリンを含む懸濁液が得られるので、通常の単離・精製方法、例えば遠心分離や濾過、タンパク質又は核酸分解試薬を使用して、微生物菌体及びそれに由来する成分を取り除く。続いて、生成したＬ−ホモセリンとＤ−Ｎ−アシルホモセリンは、イオン交換クロマトグラフィー等により容易に分離できる。更に必要に応じて、再結晶、再沈殿、クロマトグラフィー等の当技術分野で公知の任意の方法を単独で又は組み合わせて用いることによりＬ−ホモセリンを精製することができる。
このようにして製造されるＬ−ホモセリンは、光学純度（鏡像体過剰率）が高い。例えば、Ｌ−ホモセリンの鏡像体過剰率は、約７０％ｅ．ｅ．以上、好ましくは約８０％ｅ．ｅ．以上、より好ましく約９０％ｅ．ｅ．以上、最も好ましくは９５％〜１００％ｅ．ｅ．である。
【００２１】
また、ホモセリンとホモセリンラクトンは平衡混合物として存在し、この平衡は、酸性条件下ではホモセリンラクトン方向に、そしてアルカリ性条件ではホモセリンの方向に傾くことが知られている。したがって、上述のようにして得られたＬ−ホモセリンを酸性条件下での還流などの公知の方法で脱水環化することによって、Ｌ−ホモセリンラクトンを製造することができる。例えば、２規定濃度の塩酸で、２時間の煮沸処理を行うことにより、ホモセリンはホモセリンラクトンに変換することができる。
しかしながら、本製造方法においては、ホモセリンからホモセリンラクトンを製造する公知の方法であれば特に限定されるものではない。
【００２２】
以上のようにして、本発明に係る微生物又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを用いることにより、簡便かつ効率的にＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンを製造できる。
また、本発明のＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ及びその含有物は、Ｌ−Ｎ−アシルホモセリンの脱アシル化剤として有用である。
本分解剤は、前述した微生物の菌体のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて含有することができ、また１種又は複数種の菌体処理物、該微生物の培養物又はその処理物を含有してもよい。さらに、上記各微生物から得たＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを複数混合使用してもよい。
【００２３】
本分解剤の形態は特に限定されず、微生物の菌体そのままの形態、菌体破砕物、これらを溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体を保存可能なように凍結又は乾燥した形態、透過性を増すために微生物菌体を有機溶剤等で処理した形態、更にはこれらを不溶性担体に固定化した形態など、任意の形態をとることができる。また、該菌体を含む培養物、及び抽出あるいはさらに精製したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼについても、同様に任意の形態をとりうる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調整することができる。
また、本分解剤は、他の成分を含んでもよい。他の成分は、微生物の菌体又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの立体選択的Ｌ−Ｎ−アシルホモセリン分解能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、リン酸塩などのｐＨ調整剤、酵母エキスやビオチンなどの賦活剤、カルボキシメチルセルロースや乳糖などの賦形剤等が挙げられる。
【００２４】
また、Ｌ−Ｎ−アシルホモセリンを脱アシル化するための使用量は、使用する微生物又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの種類、Ｌ−Ｎ−アシルホモセリンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。
以下、本説明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１
下記の組成の液体培地を、集積培地とした。
培地：グルコース  ２０．０、ＫＨ２ＰＯ４  ３．０、ＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリン  ２．０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１、ＮａＣｌ  ０．１ｇ／ｌ，ｐＨ７．０
土壌試料０．５ｇを５ｍｌの滅菌水に懸濁し、上澄み０．５ｍｌを集積培地５ｍｌに接種し、３０℃で震盪培養した。菌が増殖し白濁が認められた場合は、集積培地を１．５％の寒天で固形化した平板培地に培養液を適宜希釈した後に塗布し、生じた微生物のコロニーを分離し、分離株を得た。次いで、同じ培地に分離株及び保存菌株を接種し、３０℃で震盪培養した。菌体を集め、ガラスビーズ法で菌体を破砕し、無細胞抽出物を得、粗酵素液とした。粗酵素液のＮ−ホルミルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性を測定し、Ｌ−Ｎ−ホルミルホモセリンだけを脱ホルミルし、Ｌ−ホモセリンを生ぜしめる分離株を選択した。なお、Ｎ−ホルミルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性の測定は、下記の方法に拠った。
【００２６】
［活性測定法］２５ｍＭのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンを含む１２５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）２００μｌと５ｍＭ  ＣｏＳＯ４  ５μｌを混じ、３７℃で３分間加温した後、酵素液４５μｌを加え、反応を開始した。３７℃で３０分間反応後、沸騰水浴上に１分間置き、反応を停止した。遠心により不溶物を除いた後、生成したホモセリンのＤ−体とＬ−体それぞれを光学分割カラム［ダイセル化学工業社製、ＣｒｏｗｎＰａｋ  ＣＲ  （＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで定量した。酵素１Ｕは、上記の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌｅのＬ−ホモセリンを遊離する酵素量とした。
【００２７】
得られた分離株の中から最も高い活性と立体選択性を示した３０８Ｂ株、２０３Ｆ株、４６３Ｆ株を選択した。また、保存菌株では、エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）が、活性を示した。これらの菌株の無細胞抽出物のＮ−ホルミルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性および本酵素活性によりＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンより生成するＬ−ホモセリンの光学純度（鏡像体過剰率）を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2011182778.tif 000002
【００２９】
なお、これらの分離株は、以下の菌学的性質を有する。
（１）バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)３０８Ｂ株の菌学的性質
１．形態：長さ２．０〜３．５μｍ、幅０．７〜０．８μｍの桿菌
２．グラム染色：陰性
３．３％ＫＯＨによる溶菌：陽性
４．アミノペプチターゼ：陽性
５．アルコールデヒドロゲナーゼ：陰性
６．ウレアーゼ：陰性
７．オキシターゼ：陽性
８．カタラーゼ：陽性
９．硝酸塩還元能：陽性
１０．脱窒反応：陰性
１１．４２℃における増殖：陰性
１２．運動性：有り
１３．鞭毛：複数の極鞭毛
１４．ゼラチン加水分解能：陰性
１５．エスクリン加水分解能：陰性
１６．カゼイン加水分解能：陰性
１７．グルコース資化性：陽性
１８．フェニル酢酸資化性：陽性
１９．クエン酸資化性：陰性
２０．リンゴ酸資化性：陽性
２１．マンノース資化性：陽性
２２．マンニトール資化性：陽性
２３．グルコン酸資化性：陽性
２４．マルトース資化性：陰性
２５．トレハロース資化性：陽性
２６．シトラコン酸資化性：陽性
２７．アドニトール資化性：陽性
２８．ｍ−ヒドロキシ安息香酸資化性：陽性
２９．アラビノース資化性：陽性
３０．メサコン酸資化性：陽性
３１．リボース資化性：陽性
３２．Ｎ−アセチルグルコサミン資化性：陽性
３３．トリプタミン資化性：陽性
３４．ラフィノース資化性：陰性
３５．シュークロース資化性：陰性
３６．Ｌ−ヒスチジン資化性：陽性
３７．スベリン酸資化性：陽性
３８．ＤＬ−乳酸資化性：陽性
３９．５−ケトグルコン酸資化性：陽性
４０．２−ヒドロキシ吉草酸資化性：陰性
【００３０】
本菌の脂肪酸組成は、バルクホルデリア属の特徴と一致した。本菌の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列はバルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)と１００％の相同性を示した。本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen）により、バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)と同定された。本菌は、バルクホルデリア・テラ(Burkholderia  terrae)３０８Ｂと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７１として寄託されている。
【００３１】
（２）ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)２０３Ｆ株の菌学的性質
１．生育状態
麦芽エキス寒天培地においてコロニーは、２５℃、７日間で直径２５ｍｍに達する。深いビロード状で緑色。菌糸は、無色。コロニーの裏面は、パールイエローから茶色。滲出液は、認められない。３７℃でも、生育する。
２．形態
分生子柄：直径３μｍ、薄壁、粗面。不規則に分枝し、ラミは部分的に存在。メトレの長さは不等長で、１０〜１６μｍ。フィアライドは長い首を持つフラスコ型で、長さ８〜１０μｍ。
分生子：卵型から球形で、直径３．５μｍ。表面は、滑面から微細な粗面。
本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen）により、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)と同定された。本菌は、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium  simplicissimum)２０３Ｆと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８６９として寄託されている。
（３）ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)４６３Ｆ株の菌学的性質
１．生育状態
麦芽エキス寒天培地においてコロニーは、２５℃で１日当たり約２．５ｍｍ成長する。ビロード状で、緑色。菌糸は、透明。コロニーの裏面は、パールイエローから茶色。ツァペック酵母エキス培地では、透明から黄色の滲出液を生じる。３７℃で生育せず。
２．形態
分生子柄：直径２μｍ、薄壁。滑面であり、細粒を表面に伴わない。ラミ、メトレは、認められない。フィアライドは、短い首を持つフラスコ型で、最大長、１０μｍ。
分生子：球形で直径３μｍ。滑面。
本菌は、ＤＳＭＺ（Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen）により、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)と同定された。本菌は、ペニシリウム・グラブラム(Penicillium  glabrum)４６３Ｆと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８７０して寄託されている。
【００３２】
実施例２
下記の培地でペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆを３０℃で２日間振盪培養した。
培地：コハク酸  ２０．０、ＫＨ２ＰＯ４  ３．０、硫酸アンモニウム  ２．０、酵母エキス  １．０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１、ＮａＣｌ  ０．１ｇ／ｌ，ｐＨ５．０
菌体を濾過により集め、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄した後、４％のイソアミルアルコールを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１０分間激しく振盪した。イソアミルアルコール処理した菌体を濾過により集め、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄し、パーミアブル菌体とした。
【００３３】
１７０ＵのＮ−ホルミルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性を有するパーミアブル菌体、１６０ｍＭのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリン、０．１ｍＭのＣｏＳＯ４および１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を含む反応液３００ｍｌを３０℃で穏やかに振盪した。反応液の一部を取り、光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋ ＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーでその上清を分析し、Ｌ−ホモセリンの増加がプラトー（７８ｍＭ）に達したのを確認した後、反応液から濾過によりパーミアブル菌体を除いた。
【００３４】
濾液を、イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ（ローム・アンド・ハース・ジャパン社）を充填したカラム（内径２６ｍｍ、長さ２００ｍｍ）に供し、水洗の後、０．２Ｍ濃度のアンモニア水で溶出を行った。ホモセリンを含む画分を集め、ｐＨを７．０に調整した後、ロータリーエバポレーターを用いて約２０ｍｌに濃縮した。この濃縮液に対し２５０ｍｌの熱エタノールを攪拌しつつ加え、引き続き攪拌しつつ、室温に一晩放置した。析出物を濾過により集め、エタノールで洗浄後、乾燥させ、１．４ｇのＬ−ホモセリンを得た。即ち、Ｌ−ホモセリンに対するモル収率は、５１％であった。
【００３５】
得られたＬ−ホモセリンを光学分割カラム［ダイセル化学工業社製ＣｒｏｗｎＰａｋＣＲ（＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、９９．３％ｅ．ｅ．以上の光学純度を有していた。またイナートシルＯＤＳ−３カラム（４．６×２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）を用いて、７．５ｍＭの１−ペンタンスルホン酸ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を移動層とする高速液体クロマトグラフィーで、本標品を分析したところ、９７％以上の純度を有することが確認された。
【００３６】
実施例３
実施例２と同様にペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆを培養した。菌体を濾過により集め、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄した後、Ｂｒａｕｎ社製ＭＳＫセルホモゼェナイザーで破砕、遠心後の上清を粗酵素液とした。この粗酵素液に対し硫安を１．７Ｍとなるように加えた。沈殿した夾雑物を遠心により除いた後、１．７Ｍの硫安を含む５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムに供した。吸着された活性画分を、移動相中の硫安濃度を直線的に低下させることにより溶離した。得られた活性画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲルＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムに吸着させ、次いで移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐ１０００カラムに吸着させ、移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させ、部分精製酵素とした。この一連の精製操作によりＮ−ホルミルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、３６０倍に精製された。
【００３７】
この部分精製酵素を用いて、ＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンとＤＬ−Ｎ−アセチルホモセリンに対する活性を比較したところ、ＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンに対する活性を１００％とすると、ＤＬ−Ｎ−アセチルホモセリンには２９％の相対活性が検出された。
尚、活性の測定法は、実施例１に準じた。
【００３８】
実施例４
実施例２と同様の培地でペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆを培養した。菌体を濾過により集め、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄した後、Ｂｒａｕｎ社製ＭＳＫセルホモゼェナイザーで破砕、遠心後の上清を粗酵素液とした。この粗酵素液に対し硫安を１．７Ｍとなるように加えた。沈殿した夾雑物を遠心により除いた後、１．７Ｍの硫安を含む５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムに供した。吸着された活性画分を、移動相中の硫安濃度を直線的に低下させることにより溶離した。得られた活性画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲルＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムに吸着させ、次いで移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐ１０００カラムに吸着させ、移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに吸着させ、移動相中のリン酸濃度を直線的に上げることにより、目的酵素を溶出させた。この一連の精製操作によりＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、４５０倍に精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与えた。本アシラーゼの性質を以下に示す。
【００３９】
（ａ）Ｎ−ホルミルホモセリンに対するＫｍ値は７９．８ｍＭ、Ｖｍａｘ値は３６８Ｕ／ｍｇ。
（ｂ）基質特異性：Ｌ−Ｎ−アセチルホモセリン（２９％）、Ｌ−Ｎ−アセチルアラニン（１３％）、Ｌ−Ｎ−アセチルグルタミン酸（１１％）にも弱く作用する。尚、（）内の数字は、Ｌ−Ｎ−ホルミルホモセリンに対する活性を１００％とした場合の相対活性である。Ｄ−ホルミルホモセリン、Ｄ−アセチルホモセリン、Ｌ−Ｎ−アセチルフェニルアラニンやＤＬ−Ｎ−アセチルペニシラミンには作用しない。
（ｃ）至適温度：５５〜６５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ８〜９
（ｅ）温度安定性：ｐＨ７において５０℃ までの温度に１０分間保っても、９５％以上の活性が残存。
（ｆ）ｐＨ安定性：４℃においてｐＨ６．５から８．５に２４時間保っても９５％以上の活性が残存。
（ｇ）分子量：ベックマン・ウルトラスフェロゲル  ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約８４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて３７，０００。
（ｈ）阻害剤・賦活剤など：ＮｉＳＯ４、２，２”−ビピリジルにより弱程度（＜２０％）、ＭｎＣｌ２、ＡｇＮＯ３、ＥＤＴＡ、Ｎ−ブロモスクシンイミドにより強程度（＞９０％）の阻害を受ける。ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）、ヒドロキシアミンで阻害・賦活されない。ＣｏＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２により、それぞれ、１．９、１．４、１．１倍に賦活される。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により、Ｌ−ホモセリンの簡便な製造法が提供される。この方法を利用して健康補助食品、医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。
【受託番号】
【００４１】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８６９
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７０
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７１
ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５