(57)【要約】【課題】天然原料から誘導された産物に伴っている不都合な点を有さない生来の細胞環境の重要な特徴を模倣する細胞環境の創生を可能にすること。【解決手段】本発明は（ａ）自己集合を媒介する第１のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして未修飾形態で存在する場合には自己集合して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの；（ｂ）単離された形態で自己集合しない第２のアミノ酸；を含む自己集合ペプチドに関する。本発明の特定の実施形態においては、第２のアミノ酸ドメインは生物学的に活性なペプチドモチーフ、例えば天然に存在するタンパク質中に存在するペプチドモチーフ、または生体分子との相互作用のための標的部位を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は参照により本明細書に組み込まれる発明者としてＥｌｓａ  Ｇｅｎｏｖｅ，Ｃａｒｌｏｓ  ＳｅｍｉｎｏおよびＳｈｕｇｕａｎｇ  Ｚｈａｎｇを列挙した２００４年６月２４日出願の「修飾を組み込んだ自己集合ペプチドおよびその使用方法」と題された出願の一部継続出願である（Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍａｉｌ  Ｌａｂｅｌ  Ｎｏ．ＥＶ４１６２２６２９４ＵＳ、Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ０４９２６１１−０５７４−ＭＩＴ１０１５４，ＵＳＳＮ登録予定）。本出願は参照により本明細書に組み込まれる２００３年６月２５日出願の米国暫定出願６０／４８２，２６１の優先権を主張する。
【０００２】
（政府の支援）
合衆国政府は本発明の開発において利用される補助金を提供している。特にＮＳＦアワード番号９８４３３４２の下に全米科学財団のエンジニアリングリサーチセンタープログラムが本発明の開発を支援している。合衆国政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）はタンパク質および多糖類の両方を含む巨大分子の多様なセットよりなり、これらは細胞が生体内において存在する３次元の環境を形成し、細胞間の空隙充填物を構成している。ＥＣＭはまた組織化されて基底層または基底膜として知られるシート様の層となる。身体の多くの領域にいおいて、基底膜は上皮細胞の層または管の下部に位置（例えば内脾細胞ライニング血管）するか、または、筋肉細胞のような種々の型の個々の細胞を包囲して細胞層を相互から、または隣接する結合組織から隔たらせている場合が多い。
【０００４】
ＥＣＭは主に、局所的に分泌されて組立られ細胞層および組織の物理的構造を安定化させ支持している足場となる分子よりなる。しかしながら、単に細胞の結合のための不活性な物質であるであるよりはむしろ、ＥＣＭは生物学的情報に富んだ環境を構成する。ＥＣＭおよびそれに関連する（例えば局所的に分泌されるか、または何らかの別の場所から特定の部位に輸送される）種々の生体分子が細胞の挙動および表現型の多くの特徴に大きく影響することにより、遊走および増殖のような過程を調節し、細胞の発生および分化に影響し、そして細胞の形状および機能に作用していることがわかっている。ＥＣＭの構造もその内部にある細胞により影響を受ける。即ち、細胞−ＥＣＭ相互作用は生命にとって重要であることは明らかである。
【０００５】
有用な生物学的情報の大量のものがガラスまたはプラスチックのような伝統的な組織培養基体の上での細胞の成育に対して実施された実験から収集されているが、生来の細胞の環境をより正確に反映している培養系および材料を開発することに対する関心が増大している。このような材料は、細胞培養のためのみならず、組織修復および組織工学のため、例えば細胞、組織および／または人工臓器の生育のため、または、生体分子の製造のための細胞系バイオリアクター中における使用のためにも用途を有している。
【０００６】
このような系を開発するために行われた多くのこれまでの研究では動物原料から得られたタンパク質およびペプチドのような材料の使用が行われていた。しかしながら、これらの材料は合成材料と比較して多くの不都合な点を有している。例えば、これらは疾患の伝染の危険性を高める。滅菌条件とされているもとで採取された場合であっても、汚染の危険性は高い。動物原料を使用する場合、材料をその後ヒト身体内に、例えば人工臓器中の成分として組織修復のために導入すれば、免疫原性の問題が生じる。さらにまた、材料の種々の調製品が一貫して再現性のある組成を有することは困難である場合がある。天然原料から単離した材料の既知成分に関して一貫性を達成することが可能である場合も、細胞の特性に影響する可能性がある未知の、おそらくは未同定の成分が確実に排除されるようにすることは困難または不可能である。さらにまた、これらの天然産物を採取、処理および／または再構成する過程において、これらは損傷を受けるか分解する可能性があり、従って潜在的にそれらが生来の細胞環境を複製する信頼性は低下する。
【０００７】
ＥＣＭにより提供される環境を模倣する材料の開発の別の方法は、組み換えＤＮＡ手法により種々のＥＣＭ成分を生成することである。例えば、ＥＣＭタンパク質をコードする発言構築物は、原核細胞または真核細胞に導入することができ、分泌タンパク質の場合、興味あるタンパク質は細胞または培地より精製することができる。タンパク質はインビトロにて所望の比率で組み合わせることができる。疾病伝播の可能性の減少が起こり得るため、この取り組みもまた、いくつかの不利点を抱える。例えば純粋に合成の過程ではなく生物学的にタンパク質を製造する場合は、培養系由来の未確認の成分が高度に精製された調製品中にも存在する可能性が残存する。さらに、精製は時間と費用を要し、タンパク質の分解または変性をもたらす場合がある。
【０００８】
生来のＥＣＭは大部分がタンパク質およびプロテオグリカンよりなるが、種々の合成の非アミノ酸系の重合体に基づいた細胞培養および組織工学の材料の開発に多大な研究が投じられている。例えば脂肪族炭化水素は種々の組織工学用途に広範に使用されている。一般的に使用されている完全に合成の材料には、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）、（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）およびこれらのものや他のものの種々の共重合体が包含される。しかしながら、これらの材料も多くの不都合な点を有している。例えばこれらは数十ミクロンのオーダーの直径を有する繊維を形成し、これは生来のＥＣＭ中に存在する繊維の直系よりはるかに大きい。さらにまた、このような材料から形成されたマトリックス内に細胞を導入するために必要とされる方法は細胞の生存性のための生理学的要件と容易には合致しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
即ち、天然原料から誘導された産物に伴っている不都合な点を有さない生来の細胞環境の重要な特徴を模倣する細胞環境の創生を可能にする細胞培養および組織工学の目的のための合成の組成物および材料がなお必要とされている。例えば生来のＥＣＭ成分により与えられるものに近似した生物学的に関連する刺激を細胞に提供する材料を開発することが望ましい。身体への移植を行う用途のためには、免疫または炎症応答の惹起が全く無いか最小限である組成物および材料および身体内で分解される組成物および材料の特別な必要性が存続している。さらにまた、所望な態様において細胞の特性および機能に影響する組成物および材料の必要性が当該分野で存続している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は特にこのような必要性を意図している。本発明は自己集合ではない別のドメインを取り込むことにより自己集合ペプチドを修飾することができるがなお自己集合部分の組立を可能できるという発見を包含する。別のドメインは得られるペプチドに対して種々の特性を付与できる。好ましくは得られるペプチドは自己集合してナノ繊維を形成し、そして好ましくは巨視的構造を形成する。ペプチドの自己集合により形成される物質は特に細胞培養、組織工学および組織修復の分野において広範な用途を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
自己集合ペプチドであって、以下：
（ａ）自己集合を媒介する第１のアミノ酸ドメインであって、ここで該ドメインは、相補的であり、構造的に適合性があり、そして未修飾形態で存在する場合には自己集合して巨視的構造となる、交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含む、アミノ酸ドメイン；
（ｂ）単離された形態で自己集合しない第２のアミノ酸ドメイン；
を含む、ペプチド。
（項目２）
前記第２のアミノ酸ドメインが、生物学的に活性なペプチドモチーフまたは生体分子との相互作用のための標的部位を含む、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目３）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、天然に存在するタンパク質中に見出される、項目２に記載の自己集合ペプチド。
（項目４）
前記天然に存在するタンパク質が、細胞外マトリックスの成分である、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目５）
前記天然に存在するタンパク質が、基底膜の成分である、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目６）
前記天然に存在するタンパク質が、ラミニン鎖、コラーゲン鎖およびニドジェンからなる群より選択される、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目７）
前記第２のアミノ酸ドメインの配列が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７からなる群より選択される配列を含む、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目８）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、前記自己集合ペプチド中に存在する場合、または該モチーフが天然に見出されるタンパク質内に存在する場合に、細胞の連結、細胞の接着または細胞の展開を増大させる、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目９）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、前記自己集合ペプチド中に存在する場合、または該モチーフが天然に見出されるタンパク質内に存在する場合に、細胞の増殖を増大または低減する、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目１０）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、前記自己集合ペプチド中に存在する場合、または該モチーフが天然に見出されるタンパク質内に存在する場合に、細胞の遊走を誘導する、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目１１）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、前記自己集合ペプチド中に存在する場合、または該モチーフが天然に見出されるタンパク質内に存在する場合に、軸索の新芽形成または突起伸長を誘導する、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目１２）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、前記自己集合ペプチド中に存在する場合、または該モチーフが天然に見出されるタンパク質内に存在する場合に、細胞外マトリックス成分の細胞による発現または分泌を誘導する、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目１３）
前記生物学的に活性なペプチドモチーフが、細胞の分化または機能的活性を増強する、項目３に記載の自己集合ペプチド。
（項目１４）
前記第１および第２のアミノ酸ドメインが、ペプチド結合により結合している、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目１５）
前記第１および第２のアミノ酸ドメインが、相互に共有結合的または非共有結合的に交差結合している、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目１６）
前記生体分子が、天然に存在するタンパク質中に見出される、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目１７）
前記生体分子が、前記細胞外マトリックスの成分である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目１８）
前記生体分子が、前記基底膜の成分である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目１９）
前記生体分子が、ラミニン鎖、コラーゲン鎖およびニドジェンからなる群より選択される、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２０）
前記標的部位が、前記生体分子への結合を媒介する部位である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２１）
前記標的部位が、前記生体分子により切断される部位である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２２）
前記生体分子が、抗体である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２３）
前記生体分子が、抗体ではない、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２４）
前記第１のアミノ酸ドメインが、複数のＲＡＤＡペプチドサブユニットを含む、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２５）
前記第１のアミノ酸ドメインが、ＲＡＤＡ１６−Ｉペプチドを含む、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２６）
前記第２のアミノ酸ドメインが、単離された形態で存在する場合は自己集合しないが、前記ペプチドが自己集合して巨視的構造を形成するように前記第１のアミノ酸ドメインの集合を可能にする、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２７）
前記第２のアミノ酸ドメインが、単離された形態で存在する場合は自己集合しないが、前記ペプチドが自己集合してナノ繊維を形成するように前記第１のアミノ酸ドメインの集合を可能とする、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２８）
前記ペプチドが、溶液中の唯一のペプチドとして存在する場合に自己集合する、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目２９）
前記ペプチドが、溶液中の唯一のペプチドとして存在する場合には自己集合しないが、第２のアミノ酸ドメインを含まない未修飾の自己集合ペプチドを含む溶液内に存在する場合には自己集合する、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目３０）
前記ペプチドが、直鎖である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目３１）
前記ペプチドが、分枝鎖である、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目３２）
前記第１および第２のアミノ酸ドメインを結合させるリンカードメインをさらに含む、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目３３）
前記リンカードメインが、１つ以上のグリシン残基を含む、項目３２に記載の自己集合ペプチド。
（項目３４）
前記ペプチドが、自己集合してヒドロゲルを形成する、項目１に記載の自己集合ペプチド。
（項目３５）
第３のアミノ酸ドメインをさらに含む項目１に記載の自己集合ペプチドであって、該第３のアミノ酸ドメインが、以下：
（ａ）自己集合を媒介する第１のアミノ酸ドメインであって、ここで該ドメインは、相補的であり、構造的に適合性があり、そして自己集合して巨視的構造となる、交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含む、アミノ酸ドメイン；または、
（ｂ）単離された形態では自己集合しないが、ペプチドが集合して巨視的構造を形成するように該第１のアミノ酸ドメインの集合を可能とする、第２のアミノ酸ドメイン；
のいずれかを含む、ペプチド。
（項目３６）
前記ペプチドが、生物学的に活性なペプチドモチーフ、または生体分子との相互作用のための標的部位を含むアミノ酸ドメインが自己集合を媒介する２つのアミノ酸ドメインの間に位置する直鎖ペプチドを含み、該自己集合を媒介するドメインが、相補的であり、構造的に適合性であり、そして自己集合してβ−シート構造となる、交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含む、項目３５に記載の自己集合ペプチド。
（項目３７）
項目１に記載の自己集合ペプチドの自己集合により形成される、骨格。
（項目３８）
前記骨格の表面に結合するか、または、該骨格内にカプセル化された複数の細胞をさらに含む、項目３７に記載の骨格。
（項目３９）
前記細胞が、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹上細胞または前述の細胞型のいずれかの前駆体からなる群より選択される、項目３８に記載の骨格。
（項目４０）
前記骨格が３次元である、項目３７に記載の骨格。
（項目４１）
身体内の部位に項目３８に記載の骨格を導入する工程を包含する、被験体を処置する方法。
（項目４２）
身体上または身体内の部位に項目３７に記載の骨格を導入する工程を包含する、被験体を処置する方法。
（項目４３）
項目３７に記載の骨格に細胞を接触させる工程、および、細胞培養に適した条件下で、一定期間該骨格を維持する工程を包含する、細胞培養方法。
（項目４４）
前記細胞が、前記骨格の表面で培養される、項目３７に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞が、三次元に配置された骨格の内部にカプセル化される、項目３７に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞が、前記骨格内に実質的に均一に分布している、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞が、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹上細胞または前述の細胞型のいずれかの前駆体からなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
身体上または身体内の部位に項目１に記載の自己集合ペプチドを含む組成物を導入する工程を包含する、被験体を処置する方法であって、該組成物が集合誘導イオンを実質的に含まず、そして、身体の内部で集合して巨視的構造を形成する、方法。
（項目４９）
組成物であって、以下：
（ｉ）相補的であり、構造的に適合性があり、そして自己集合してβ−シート構造となる、交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含む第１の自己集合ペプチドであって、該ペプチドは、細胞の結合または生存性に対する該ペプチドの適合性を、アミノ酸ドメインを欠いている以外は同一のペプチドの適合性と比較して、低減するアミノ酸ドメインを含まない、ペプチド；および、
（ｉｉ）項目１に記載の自己集合ペプチドを含む第２の自己集合ペプチド；
の混合物を含有する、組成物。
（項目５０）
前記第１のペプチドが、相補的であり、構造的に適合性があり、そして自己集合してβ−シート構造となる、交互する疎水性および親水性のアミノ酸から本質的になる、項目４９に記載の組成物。
（項目５１）
前記第１および第２のペプチドが、約１：１の比で存在する、項目４９に記載の組成物。
（項目５２）
前記第１および第２のペプチドが、約５：１の比で存在する、項目４９に記載の組成物。
（項目５３）
前記第１および第２のペプチドが、約９：１の比で存在する、項目４９に記載の組成物。
（項目５４）
前記第１のペプチド、前記第２のペプチドまたは両方が、複数のＲＡＤＡペプチドサブユニットを含む、項目４９に記載の組成物。
（項目５５）
前記第１のペプチド、前記第２のペプチドまたは両方が、ＲＡＤＡ１６−Ｉペプチドを含む、項目４９に記載の組成物。
（項目５６）
培養キットであって、以下：
（ａ）項目４９に記載の組成物；
（ｂ）巨視的構造へのペプチドの自己集合を開始するための取扱説明書；および、
（ｃ）細胞の集団、細胞または組織の培養培地、所定量の成長因子、所定量のイオンまたはその塩、細胞培養用の自己集合ペプチドの調製のための取扱説明書、ペプチドヒドロゲル構造の上または内部において細胞を培養するための取扱説明書、被験体に該自己集合ペプチドを導入するための取扱説明書、細胞培養を実施し得る容器、該ペプチドを溶解し得る液体、シリンジ、ペプチドの自己集合を開始するためのイオンまたはその塩、および、一種以上の成長因子または分化因子からなる群より選択される少なくとも１つの要素、
を備える、培養キット。
（項目５７）
項目４９に記載の自己集合ペプチドの自己集合により形成される、骨格。
（項目５８）
前記骨格の表面に結合するか、または、該骨格内にカプセル化された複数の細胞をさらに含む、項目５７に記載の骨格。
（項目５９）
前記細胞が、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹上細胞または前述の細胞型のいずれかの前駆体からなる群より選択される、項目５８に記載の骨格。
（項目６０）
身体内の部位に項目５８に記載の骨格を導入する工程を包含する、被験体を処置する、方法。
（項目６１）
身体上または身体内の部位に項目５７に記載の骨格を導入する工程を包含する、被験体を処置する、方法。
（項目６２）
項目５７に記載の骨格に細胞を接触させる工程、および、細胞培養に適する条件下で、一定期間該骨格を維持する工程を包含する、細胞培養方法。
（項目６３）
前記細胞が、前記骨格の表面で培養される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記細胞が、三次元に配置された骨格の内部にカプセル化される、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記細胞が、前記骨格内に実質的に均一に分布している、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記細胞が、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹上細胞または前述の細胞型のいずれかの前駆体からなる群より選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６７）
身体上または身体内の部位に項目４９に記載の組成物を導入する工程を包含する、被験体を処置する方法であって、該組成物が集合誘導イオンを実質的に含有しない、方法。
（項目６８）
前記ペプチドが、自己集合して身体内の巨視的構造となる、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
キットであって、以下：
（ａ）項目１に記載の自己集合ペプチド；
（ｂ）巨視的構造への該ペプチドの自己集合を開始するための取扱説明書；および、
（ｃ）細胞の集団、細胞または組織の培養培地、所定量の成長因子、所定量のイオンまたはその塩、細胞培養用の自己集合ペプチドの調製のための取扱説明書、ペプチドヒドロゲル構造の上または内部において細胞を培養するための取扱説明書、被験体に該自己集合ペプチドを導入するための取扱説明書、細胞培養を実施し得る容器、該ペプチドを溶解し得る液体、シリンジ、ペプチドの自己集合を開始するためのイオンまたはその塩、および、
一種以上の成長因子または分化因子からなる群より選択される少なくとも１つの要素、
を備える、キット。
【００１１】
１つの特徴において、本発明は（ａ）自己集合を媒介する第１のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして未修飾形態で存在する場合には自己集合して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの；および、（ｂ）単離された形態で自己集合しない第２のアミノ酸；を含む自己集合ペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態においては、第２のアミノ酸ドメインは生物学的に活性なペプチドモチーフ、例えば天然に存在するタンパク質中に存在するペプチドモチーフ、または生体分子との相互作用のための標的部位を含む。本発明の特定の実施形態においては、天然に存在するタンパク質は細胞外マトリックスの成分、例えば基底膜の成分である。
【００１２】
本発明はさらに、自己集合ペプチドを含む足場、細胞培養、組織工学および組織修復等のために足場を使用する方法、および、アミノ酸ドメインを選択する方法を提供する。
【００１３】
本出願は種々の特許および出版物を参考にしている。これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。さらにまた、以下の出版物：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｃｉｅｎｃｅおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、全てＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．，２００２年７月の版；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｒｕｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２０００；Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．，Ｌａｎｅ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．，（ｅｄｓ．），  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９９８；  Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，  Ｓｈｉｒｌｅｙ  Ａｙａｄ，  Ｒａｙ  Ｂｏｏｄ−Ｈａｎｄｆｏｒｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９８；Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，  Ａｎｃｈｏｒ，  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ），  Ｔｈｏｍａｓ  Ｋｒｅｉｓ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ｖａｌｅ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９９；Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ａ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｌｏｔｚｅ，  Ａｎｇｕｓ  Ｗ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｌｏｔｚｅ  Ｍ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １０ｔｈＥｄ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  ２００１；Ｋａｔｚｕｎｇ  Ｂ．（ｅｄ．）  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ；８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２１，２０００）；およびＫａｎｄｅｌ，Ｅ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｈ．，Ｊｅｓｓｅｌｌ，  Ｔ．Ｍ．，（ｅｄｓ．），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  ２０００、も参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合は、明細書を優先する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＲＡＤ１６−ＩＩペプチドヒドロゲルの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。低倍率では足場はフェルト様である（Ａ〜Ｃ）。高倍率では構造中の相互に織り込まれたナノ繊維が観察される（Ｄ〜Ｆ）。
【図２】未修飾の自己集合ペプチドの自己集合の提案される分子モデルを示す（この場合はＲＡＤＡ（配列番号４）ペプチド、ＲＡＤ１６−ＩＩ）を示す。アラニンがペプチドの一方において重複疎水性相互作用を形成する。アルギニンおよびアスパルテートは他方において相補イオン結合を形成する。これらのイオン性自己相補的ペプチドは分子の自己集合行うことができる。
【図３Ａ】ペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（上）および自身のＮ末端においてＹＩＧＳＲ（配列番号３３）を含むように修飾されたペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（下）を示す分子モデルを示す。分子モデルはＣＨＡＲＭＮ（Ｂｒｏｏｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３）を用いて構築し、ＶＭＤ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を用いて可視化した。
【図３Ｂ】９：１の比でペプチドＲＡＤ１６−ＩおよびペプチドＹＩＧＳＲ（配列番号３３）よりなる混合物から得られた自己集合ペプチドナノ繊維の二重β−シートテープを示す分子モデルである。ナノ繊維テープから伸長する配列ＹＩＧＳＲ（配列番号３３）に留意する。
【図３Ｃ】もとのペプチドのアミノ末端から伸長する生物活性ペプチドモチーフ（赤線）を含むようにペプチドの一部が修飾されている特有のペプチドヒドロゲルネットワーク（黒線）の模式図である。クローズアップ：積載された自己集合ペプチドのナノ繊維（黒線）および配列の１つのアミノ末端における生物活性ペプチドモチーフの伸長した配列（赤線）。
【図３Ｄ】修飾された自己集合ペプチドについて種々の可能な配置を示す。ドメインＡは自己集合ペプチドドメインを示す。ドメインＢは修飾ペプチドドメインを示す。図に示される通り、修飾ドメインは自己集合ドメインのＮおよび／またはＣ末端に存在してよく、或いは、自己集合ドメイン２つの間に存在してよい（縮尺不定）。
【図４】円偏光二色性（ＣＤ）によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示す。グラフは添加イオン非存在下における水中の２５ｍＭペプチド溶液のＣＤスペクトルを示す。
【図５Ａ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図５Ｂ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図５Ｃ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図５Ｄ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図５Ｅ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図５Ｆ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図５Ｇ】原子力顕微鏡によるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＡＡＳ、ＹＩＧ、ＰＤＳ、ＲＹＶ、ＫＡＦおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示し、ＫＡＦを除く全ペプチドによるナノ繊維の形成を明らかにしている。
【図６】レオロジーによるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＹＩＧ、ＲＹＶおよびＴＡＧの物理化学的特性化を示す。プロットは０．０１の固定歪におけるペプチド足場に対する動的周波数掃引試験を示す。Ｇ’（蓄積基準）は物質の弾性特性を示し、Ｇ’’（損失基準）はその粘性特性を示す。
【図７】レオロジーによるペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、ＹＩＧ、ＲＹＶおよびＴＡＧの別の物理化学的特性化を示す。プロットは１０ｒａｄ／ｓの固定周波数におけるペプチド足場に対する動的時間掃引試験を示す。Ｇ’（蓄積基準）は物質の弾性特性を示し、Ｇ’’（損失基準）はその粘性特性を示す。
【図８】血管の構造の単純化された模式図である。
【図９】（Ａ）ＲＡＤ１６−Ｉ；（Ｂ）ＡＡＳ；（Ｃ）ＹＩＧ；（Ｄ）ＰＤＳ；（Ｅ）ＲＹＶ；（Ｆ）ＫＡＦ；（Ｇ）ＴＡＧに対するヒト大動脈内皮細胞の位相差顕微鏡画像を示す。全ペプチドは１００％とした（無混合）。
【図１０】（Ａ）ＲＡＤ１６−Ｉ；および（Ｂ）ＹＩＧ；（Ｃ）ＲＹＶ；（Ｄ）ＴＡＧの９：１ブレンド物に対するＨＡＥＣ炭層形成の位相差顕微鏡画像である。
【図１１】ペプチド足場（Ａ）ＲＡＤ１６−Ｉ；（Ｂ）ＹＩＧ；（Ｃ）ＲＹＶ；（Ｄ）ＴＡＧに対して播種したＨＡＥＣの位相差顕微鏡画像、および（Ｅ）ＲＡＤ１６−Ｉ；（Ｆ）ＹＩＧ；（Ｇ）ＲＹＶ；（Ｈ）ＴＡＧのＤｉ−Ａｃ−ＬＤＬを用いた蛍光染色（赤、ＬＤＬ取り込みの指標）およびＤＡＰＩ核染色（青）を示す。下パネル中の各画像は真上の相当する画像と同じ細胞視野を示す。ＲＡＤ１６−Ｉは１００％で存在しており；他のペプチド足場はＲＡＤ１６−Ｉ：修飾ペプチドの９：１ブレンド物から形成した。
【図１２】ＲＡＤ１６−Ｉペプチド足場上またはＲＡＤ１６−Ｉと種々の修飾ペプチドの各々との９：１（ｖ／ｖ）ブレンド物から形成したペプチド足場上の細胞増殖を相当する可溶性ペプチド（ＳＰ）モチーフの非存在下または存在下において測定した競合試験のデータを示す。純粋なＲＡＤ１６−Ｉ足場上に生育する細胞培養物に添加するための可溶性ペプチドとしてはＹＩＧＳＲ（配列番号３３）を使用した。従来の組織培養プレート上に生育させた細胞との比較を示す。ＲＡＤ１６−Ｉ、対照ペプチド足場；ＲＡＤ１６−ＩとＳＰ、対照ペプチド足場と可溶性ペプチドＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ）；ＹＩＧ、ペプチド足場ＹＩＧ；ＹＩＧ＋ＳＰ、ペプチド足場ＹＩＧと可溶性ペプチドＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ；ＲＹＶ、ペプチド足場ＲＹＶ；ＲＹＶ＋ＳＰ、ＲＹＶペプチド足場と可溶性ペプチドＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）（４００μＭ）；ＴＡＧ、ペプチド足場ＴＡＧ；ＴＡＧ＋ＳＰ、ペプチド足場ＴＡＧと可溶性ペプチドＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）（４００μＭ）。プレート、従来の組織培養プレート、可溶性ペプチド非存在。
【図１３】可溶性ペプチド（ＳＰ）の非存在下または存在下に種々のペプチド足場上に播種したＨＡＥＣの細胞の生存性を示す。ＲＡＤ１６−Ｉは１００％で存在しており；他のペプチド足場はＲＡＤ１６−Ｉ：修飾ペプチドの９：１ブレンド物から形成した。ＲＡＤ１６−Ｉ、対照ペプチド足場；ＲＡＤ１６−Ｉ＋ＳＰ、対照ペプチド足場と可溶性ペプチドＹＩＧＳＲ（４００μＭ）；ＹＩＧ、ペプチド足場ＹＩＧ；ＹＩＧ＋ＳＰ、ペプチド足場ＹＩＧと可溶性ペプチドＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ）；ＲＹＶ、ペプチド足場ＲＹＶ；ＲＹＶ＋ＳＰ、ＲＹＶペプチド足場と可溶性ペプチドＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）（４００μＭ）；ＴＡＧ、ペプチド足場ＴＡＧ；ＴＡＧ＋ＳＰ、ペプチド足場ＴＡＧと可溶性ペプチドＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）（４００μＭ）。
【図１４】ペプチドの修飾に相当する可溶性ペプチドの非存在下（−）および存在下（＋）における種々のペプチド足場上または対照プレート上において培養されたＨＡＥＣによる（Ａ）ラミニン−１γ鎖および（Ｂ）コラーゲンＩの生産のウエスタンブロット分析を示す。ＲＡＤ１６−Ｉは１００％で存在しており；他のペプチド足場はＲＡＤ１６−Ｉ：修飾ペプチドの９：１ブレンド物から形成した。
【図１５】種々のペプチド足場および対照プレート上に培養したＨＡＥＣの酸化窒素（ＮＯ）の生産を示す。ＲＡＤ１６−Ｉは１００％で存在しており；他のペプチド足場はＲＡＤ１６−Ｉ：修飾ペプチドの９：１ブレンド物から形成した。
【図１６】種々のゲル系上に培養されたヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の単層形成の比較を示す。コラーゲンＩゲル（Ａ）、マトリゲル（Ｃ）、１００％ペプチド足場ＲＡＤ１６−Ｉ（Ｅ）、９０％ＲＡＤ１６−Ｉ／１０％（ｖ／ｖ）ＹＩＧブレンド（Ｇ）、９０％ＲＡＤ１６−Ｉ／１０％（ｖ／ｖ）ＴＡＧブレンド（Ｉ）、および、９０％ＲＡＤ１６−Ｉ／１０％（ｖ／ｖ）ＲＹＶブレンド（Ｊ）上に播種されたＨＡＥＣの位相差顕微鏡画像。Ａ（Ｂ）、Ｃ（Ｄ）、Ｅ（Ｆ）、Ｇ（Ｈ）、Ｉ（Ｊ）、Ｋ（Ｌ）についてアクチン繊維（黄色）および核（青）をそれぞれ検出するためのＴＲＩＴＣファロイジンおよびＤＡＰＩによる蛍光染色。位相差顕微鏡画像はアクチン／ＤＡＰＩ染色でも観察された典型的なコブルストーン状単層を示す。
【図１７】可溶性ペプチド（ＳＰ）モチーフを有する種々のペプチド足場上のＨＡＥＣの生育を測定する競合試験の結果を示す棒グラフである。細胞は可溶性ペプチド（ＳＰ）モチーフの存在下または非存在下において種々のペプチド足場組成物上で３日間培養した。ＲＡＤ１６−Ｉ、対照ペプチド足場１００％；ＲＡＤ１６−Ｉ＋ＳＰＹＩＧ、対照ペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ）；ＲＡＤ１６−Ｉ＋ＳＰＹＩＧ、対照ペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）（４００μＭ）；ＲＡＤ１６−Ｉ＋ＳＰＴＡＧ、対照ペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）（４００μＭ）；ＹＩＧ、ＲＡＤ１６−Ｉ９０％／ＹＩＧペプチド１０％（ｖ／ｖ）のブレンド；ＹＩＧ＋ＳＰＹＩＧ、ＹＩＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ）；ＹＩＧ＋ＳＰＹＩＧ、ＹＩＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）（４００μＭ）；ＹＩＧ＋ＳＰＴＡＧ、ＹＩＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）（４００μＭ）；ＲＹＶ、ＲＡＤ１６−Ｉ９０％／ＲＹＶペプチド１０％（ｖ／ｖ）のブレンド；ＲＹＶ＋ＳＰＲＹＶ、ＲＹＶペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ）；ＲＹＶ＋ＳＰＲＹＶ、ＲＹＶペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）（４００μＭ）；ＲＹＶ＋ＳＰＴＡＧ、ＹＩＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）（４００μＭ）；ＴＡＧ、ＲＡＤ１６−Ｉ９０％／ＴＡＧペプチド１０％（ｖ／ｖ）のブレンド；ＴＡＧ＋ＳＰＴＡＧ、ＴＡＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＹＩＧＳＲ（配列番号３３）（４００μＭ）；ＴＡＧ＋ＳＰＴＡＧ、ＴＡＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）（４００μＭ）；ＴＡＧ＋ＳＰＴＡＧ、ＴＡＧペプチド足場と可溶性ペプチドモチーフＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）（４００μＭ）。
【図１８】直線部分を確立するためにＲＡＤ１６−Ｉ上で実施した動的歪掃引を示す。
【図１９】ＰＢＳの添加の前（Ａ）および後（Ｂ）のＲＡＤ１６−Ｉに関する動的周波数掃引試験の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の特定の実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の定義を本発明を理解する際に使用する。
アミノ酸ドメイン：「アミノ酸ドメイン」とはペプチド結合により連結されたアミノ酸少なくとも２個の隣接する重合体を意味する。ドメインはペプチド結合１つ以上により別のアミノ酸またはアミノ酸ドメインに連結されていてよい。アミノ酸ドメインはペプチドのＮ末端またはＣ末端においてアミノ酸少なくとも２個を構成できるか、またはペプチドの中央のアミノ酸少なくとも２個を構成できる。
【００１６】
抗体：一般的に「抗体」という用語は免疫グロブリンを指し、これは本発明の種々の実施形態において天然であるか、または、完全または部分的に合成により製造されていてよい。抗体は天然の原料（例えばげっ歯類、ウサギ、ニワトリ（または卵）から、抗原または抗原をコードするコンストラクトで免疫化されている動物から精製したもの）から部分的に誘導されるか、または、完全に合成により製造されてよい。抗体は多くの免疫グロブリンのクラス、例えばヒトのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの何れかであってよい。抗体はＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（１鎖可変）のフラグメントまたは抗原構築部位を保有している他のフラグメント、または組み換え製造されたｓｃＦｖフラグメント、例えば組み換え製造フラグメントであってよい。例えばＡｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０−７６５，２００２およびその参考文献を参照できる。好ましい抗体、抗体フラグメント、および／または抗原結合部位を含むタンパク質ドメインは例えばファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５，１９９４）、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．，ａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：４９３７−４９４２，１９９７）等のような手法を用いてインビトロで発生および／または選択してよい。本発明の種々の実施形態において、抗体は例えばげっ歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合させることによりげっ歯類抗体の特異性を温存させた「ヒト化」抗体である。ヒト起源のドメインはこれが人間内で最初に合成されるという意味においてヒトを直接の起源とする必要は無い。むしろ、「ヒト」ドメインは自身のゲノムがヒトの免疫グロブリン遺伝子を取り込んでいるげっ歯類において発生させてよい。例えばＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９を参照できる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。
【００１７】
約：本明細書においては、「約」という用語は測定値または数が示された数字の１０％まで何れかの方向に偏っていてよいことを意味する。
【００１８】
生物学的に活性なペプチドモチーフ：「生物学的に活性なペプチドモチーフ」とは適切な細胞型において細胞がペプチドと接触している場合に表現型の応答または変化を誘導するペプチドである。ペプチドは単離された形態またはより大型のポリペプチドまたは他の分子の部分として存在してよい。ペプチドが応答を示す能力は例えばペプチドの非存在下（例えばより大型のポリペプチド内に通常通り存在する場合にペプチドを突然変異または除去することによる）における関連のパラメーターを比較することにより測定してよい。本発明の種々の実施形態において、好ましい表現型の応答または変化は例えば細胞の展開、結合、接着、増殖、ＥＣＭ分子の分泌の増強、または、特定の分化した細胞型に特徴的な表現型の発現を包含する。
【００１９】
生体分子：本明細書においては、「生体分子」とは生命体中に存在する分子に典型的な特徴を有するタンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物または核酸のような分子を指す。生体分子は天然に存在するか、または、人工（自然界に存在せず、自然界に存在する分子と同一ではない）であってよい。例えば人間の精神的過程から生じ、自然界に存在しない配列または修飾を有するタンパク質は人工生体分子とみなされる。
【００２０】
化学走性物質とは本明細書においては、物質が存在する部位に向かって細胞を収集する能力を有するその物質を指す。そのような細胞は例えば組織の形成または修復に寄与する（例えば成長因子を提供することによる）か、または免疫応答に寄与する能力を有する。
【００２１】
相補的：「相補的」とは巨視的足場の繊維における隣接するペプチドから生じる親水性の残基の間のイオンまたは水素結合の相互作用を形成する能力を有することを意味する。ペプチド中の各親水性残基は隣接するペプチド上の親水性の残基と、水素結合するか、またはイオン対形成するか、または、溶媒に曝露される。対形成はまたファンデルワールス力が関与するものであってよい。
【００２２】
内皮細胞：「内皮細胞」という用語は当該分野で通常受け入れられている意味を与えられるものであり、即ち心臓、血管（毛細管を含む）およびリンパ管の空洞の内張りとなる細胞の最内層である。「内皮」および「血管内皮」という用語も本明細書においては互換的に使用する。
【００２３】
単離された：本明細書においては、「単離された」とは、１）自然界において通常伴っている成分の少なくとも一部から分離され；２）人間の作業が関与する工程により調製または精製され；および／または３）自然界に存在しないことを意味する。
【００２４】
等浸透圧溶質：「等浸透圧溶質」とは形成される溶液（等浸透圧溶液）が、１分間超、好ましくは５分間超、さらに好ましくは１０分間超、さらに好ましくは少なくとも１時間超の期間に渡り、細胞の生存性に適合する浸透圧または浸透性を有するように水溶液中に溶解された非イオン化化合物を意味する。一般的に好ましい等浸透圧溶液は細胞の細胞外または細胞内の環境（例えば組織培養用の培地、対象内等）の浸透圧に近似した浸透圧を有する。例えば等浸透圧溶液は２９０±１０ｍｏｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ内の浸透圧を有してよい。好ましい等浸透圧溶質は炭水化物、例えば単糖類または２糖類を包含する。好ましい炭水化物の例はスクロース、グルコース、ガラクトース、フラクトース、リボース、マンノース、アラビノースおよびキシロースを包含する。さらに別の好ましい等浸透圧溶質はグリセロール、例えば５〜２０％（ｖ／ｖ）グリセロールのグリセロール水溶液である。
【００２５】
巨視的：「巨視的」とは、１０倍以下の倍率下で目視可能であるために十分大型の寸法を有することを意味する。本発明の好ましい実施形態においては、巨視的構造は裸眼で目視可能である。巨視的構造は透明であってよく、そして２次元または３次元であってよい。二次元の場合、本発明の特定の実施形態においては、分子の単層より多いもの、例えば分子２層、３層またはこれ以上を包含する。典型的には、各寸法は少なくとも１０μｍの大きさである。特定の実施形態においては、少なくとも２次元は少なくとも１００μｍ、または少なくとも１０００μｍの大きさである。多くの場合、少なくとも２次元は少なくとも１〜１０ｍｍの大きさ、１０〜１００ｍｍの大きさまたはそれ以上である。該当する寸法は、例えば長さ、幅、深さ、広さ、高さ、半径、直径、円周であってよく、或は球、円筒、立方体等のような規則的な２または３次元の形状を有さない構造の場合は上記した何れかの近似値であってよい。他の該当する寸法も使用してよい。
【００２６】
マーカー：「マーカー」とは特定の細胞型、組織型、発生学的起源、分化状態または生理学的または代謝的な状態を示すか、または、特定の罹患または生理学的状態（例えば癌、清浄、形成不全）を示すか発見する、何れかの遺伝子または遺伝子産物（例えばタンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ）であってよい。マーカー遺伝子の発現水準または無発現は、検査対象である細胞または組織が特定の細胞型または組織型のものであるか、または特定の発生学的起源、分化状態、生理学的状態または代謝状態を有することを示すものであってよい。マーカー遺伝子の発現水準または無発現は、患者、臓器、組織または細胞の特定の生理学的または罹患状態を示すものであってよい。好ましくは発現または無発現はノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、配列決定、免疫化学、イムノブロッティング、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡマイクロアレイまたはメンブレンアレイ、タンパク質マイクロアレイ分析、質量分析等のような標準的な手法を用いて測定してよい。本発明の特定の実施形態においては、マーカー遺伝子の発現水準は定量可能である。種々のマーカーの発現はまた機能的試験により測定できる。例えばチトクロームＰ４５０遺伝子の発現（例えば肝細胞中）はＰ４５０タンパク質の存在に特徴的な反応を行う（例えば特定の基質を代謝する）細胞または細胞溶解物の能力を測定することにより評価できる。
【００２７】
特定の細胞型を示すか識別する他のマーカーもまた使用してよい。例えば、特定の化合物の生産または取り込みをマーカーとして使用してよい。例えばＬＤＬの取り込みまたは酸化窒素の生産は内皮細胞のために有用なマーカーである。マーカーについては後にさらに考察する。
【００２８】
マイクロファイバー：本明細書においては、「マイクロファイバー」という用語はマイクロスケールの寸法の直径を有する繊維である。典型的にはマイクロスケール繊維は１０００μｍ以下、５００μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、２０μｍ以下、１０〜２０μｍ、５〜１０μｍの直径を有する。
【００２９】
マイクロスケール：本明細書においては、「マイクロスケール」とは一般的にマイクロメーターの単位で表示されることがより好都合である寸法を有する構造を指す。例えば「マイクロスケール構造」という用語は約５００μｍ以下、約１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２０〜５０μｍ、約１０〜２０μｍ、約５〜１０μｍ、または１〜５μｍの寸法を有する構造を指す。当業者の知る通り、このような構造の長さはミリメートルに至る場合があるが、大部分の寸法はマイクロメートルの範囲内にある。
【００３０】
ナノスケール：本明細書においては、「ナノスケール」という用語は一般的にナノスケール単位で表示されることが最も好都合である寸法を有する構造を指す。例えば「ナノスケール構造」または「ナノスケール足場」という用語は約１μｍ以下、例えば約５００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約２０〜５０ｎｍ、約１０〜２０ｎｍ、約５〜１０ｎｍ、または１〜５ｎｍ、約１ｎｍ、または０．１〜１ｎｍの寸法を有する構造を指す。範囲は両端を含む。該当する寸法は、例えば長さ、幅、深さ、広さ、高さ、半径、直径、円周であってよく、或は球、円筒、立方体等のような規則的な２または３次元の形状を有さない構造の場合は上記した何れかの近似値であってよい。構造の形状に応じて構造がナノスケール構造であるかどうかを決定するために他の該当する寸法を使用してもよい。当業者の知る通り、ナノスケール構造の寸法の１つ以上はナノメーター範囲に無くてもよい。例えばこのような構造の長さはミクロンの範囲以上に至ってもよい。しかしながら、一般的には大部分の寸法がナノメートルの範囲内にある。
【００３１】
ナノ繊維：本明細書においては、「ナノ繊維」という用語はナノスケールの寸法の直径を有する繊維を指す。典型的にはナノスケール繊維は５００ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の実施形態によれば、ナノ繊維は１００ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は５０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は２０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は１０〜２０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は５〜１０ｎｍ以下の直径を有する。本発明の特定の別の実施形態によればナノ繊維は５ｎｍ未満の直径を有する。範囲は両端を含む。
【００３２】
ナノスケール環境足場：「ナノスケール環境足場」という用語はナノ繊維を含む足場を指す。本発明の特定の実施形態においては足場を構成する繊維の少なくとも５０％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては足場を構成する繊維の少なくとも７５％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては足場を構成する繊維の少なくとも９０％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては足場を構成する繊維の少なくとも９５％がナノ繊維である。本発明の特定の実施形態においては足場を構成する繊維の少なくとも９９％がナノ繊維である。当然ながら、足場は非繊維の構成成分、例えば水、イオン、成長および／または分化を誘導する薬剤、例えば成長因子、治療薬または他の成分も含んでよく、これらは足場において溶液であり得、そして／または足場に結合され得る。
【００３３】
天然に存在する：本明細書においては、、「天然に存在する」とは自然界に存在することを意味する。ナノ繊維生体分子は、一般的に、自然界に存在する生物により合成され、そして、人間の作業により修飾されないか、または、そのような分子の分解産物である。人間の作業が関与する工程（例えば生命体が関与しない化学合成を介するか、または、人間の作業により操作された生命体またはそのような生命体の子孫が関与する工程を介する）により合成されるが、自然界に存在する生物により合成され、人間の作業により修飾されていない分子と同一である分子もまた天然に存在する分子とみなされる。
【００３４】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質：本発明によれば、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸少なくとも２つの糸状物を含む。ペプチドは一般的に約２〜２００アミノ酸、より典型的には約６〜６４アミノ酸の糸状物となる。典型的には自己集合ペプチドの自己集合部分は約８〜２４、多くの場合約１２〜２０または１６〜２０アミノ酸である。ペプチドは個々のペプチドまたはペプチドの集合体を指す。本発明のペプチドは典型的にはわずか１つの天然のアミノ酸を含有するが、当該分野で知られている非天然のアミノ酸（即ち自然界には存在しないがポリペプチド鎖内に取り込まれることができる化合物；例えばＵＲＬがｗｗｗ．ｃｃｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／〜ｄａｄｇｒｐ／Ｕｎｎａｔｓｔｒｕｃｔ．ｇｉｆであるウエブサイトを参照でき、これは機能的イオンチャンネル内に良好に取りこまれた非天然のアミノ酸の構造を表示している）および／またはアミノ酸類縁体も代替としてよい。特に、Ｄアミノ酸を使用してよい。さらにまた、本発明の種々の実施形態において、本発明のペプチド中のアミノ酸の１つ以上は例えばアシル基、炭水化物基、炭水化物鎖、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションまたは官能性付与のためのリンカー等のような化学的実体を付加することにより改変または誘導体化してよい。本発明の特定の実施形態においては、ペプチドは分枝鎖であり、その場合、各々がペプチド結合により連結されたアミノ酸少なくとも３個よりなるアミノ酸重合体少なくとも２つを含むが、２アミノ酸重合体そのものはペプチド結合によって連結されていない。
【００３５】
増殖剤および有糸分裂促進剤は本明細書においては互換的に使用し、細胞の増殖を増強する物質の能力を指す。
【００３６】
プロテアーゼは本明細書においては、ペプチドおよびタンパク質のフラグメントを発生する等にタンパク質分子中のアミノ酸を連結しているペプチド結合を切断するタンパク質切断酵素である。プロテアーゼおよびプロテアーゼファミリーの大きな収集物が発見されており、これらのプロテアーゼが標的タンパク質を切断する特異的な部位も当該分野で知られている。一部の例示されるプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（例えばマトリメタロプロテアーゼ）、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼ等を包含する。
【００３７】
再生：一般的に本発明の種々の実施形態において、組織の再生は、新しい組織（これは細胞または細胞の部分の何れかを意味する）の生成を含む傷害または変性または分解の過程よりも前の組織の状態の解剖学的または機能的な復元の何れかの特徴を含む。本発明の特定の実施形態においては新しい組織の生成は既存の細胞の成長も含む。例えば、内皮細胞の場合は、再生は新しい血管の形成または既存の血管の伸長または成長を包含する。ニューロンの場合は、再生は軸索または他のニューロン突起の成長を包含する。このような突起は細胞体から直接生じたものであってよく、或は、傷害により切断または損傷を受けた突起の伸長であってよい。新しい組織は以前に存在していた組織を置き換えてよい。本発明の特定の実施形態においては、新しい組織の生成は既存の細胞の分裂を包含する。
【００３８】
修復：一般的に本発明の種々の実施態様において、組織修復は損傷または変性の前の組織の状態の解剖学的または機能的な復元の何れかの特徴を含む。例えばこれは傷害により分離された組織の部分の間の物理的連続性の復元を包含する。好ましくは、物理的連続性のこのような復元は、傷害の前には存在しなかった型の組織、例えば瘢痕組織の明らかな分離を行わない組織の部分の再付加または再連結を包含する。即ち修復は、組織の欠陥の充足を包含し、これは瘢痕組織の形成によるのではなく例えば欠陥により分離された組織の部分の再付加による、および／または、損傷または変性に付された型の新しい組織の生育によるものである。修復は例えば新しい組織の生育または発生を包含するが必須ではない。即ち、再生は修復の１つの特徴とみなしてよいが、修復は新しい組織の生育の証拠を伴うことなく起こりえる。
【００３９】
イオンを実質的に非含有の溶液：「イオンを実質的に非含有の溶液」とはイオン（またはその塩）が全く添加されていないか、イオン（またはその塩）の濃度が０．０１または０．００１ｍＭ未満である溶液を意味する。
【００４０】
低分子：本明細書においては、「低分子」という用語は比較的小さい分子量を有し、そしてタンパク質、ポリペプチドまたは核酸ではない天然に存在する、または人工的に創生（例えば化学合成による）された有機の化合物を指す。典型的には、低分子は約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。さらにまた、低分子は典型的には複数の炭素−炭素結合を有する。
【００４１】
特異的結合：本明細書においては、「特異的結合」という用語は標的分子（例えば標的ペプチド）および結合分子と称される場合のある２つの分子の間の物理的会合を指す。相互作用は典型的には結合分子により認識される標的ドメインのような標的分子の特定の構造的特長の存在に依存している。標的分子は結合分子により認識される標的ドメインより完全になるものであってよい。例えば結合分子が標的ドメインＡを含有する標的分子に特異的である場合、遊離の標識されたＡおよびそれに特異的な結合分子の両方を含有する反応系中の、標的ドメインＡを含むポリペプチドの存在、または、遊離の未標識の標的ドメインの存在は、結合分子に結合する標識されたＡの量を低減する。特異性は絶対的でなくてもよいが、一般的には結合が行われる観点のものを指す。何れかの所定の用途において適切な性能を示すための十分な程度の特異性を有する標的ドメインおよび結合分子を当業者は選択できる。特異性は標的分子に対する結合分子の親和性ｖｓ他の標的、例えば競合物質に対する結合分子の親和性のような、別の因子の観点において評価してよい。１つ以上の観点において結合分子の特異性が明らかになった後、これを他の、好ましくは同様の観点において特にその特異性を再評価することなく使用してよい。
【００４２】
本発明の観点における好ましい結合分子は細胞表面に存在するタンパク質、細胞外環境中で身体内に存在するタンパク質（例えば細胞外マトリックスタンパク質、分泌された、または細胞表面のタンパク質、例えばプロテアーゼ、成長因子および血液中を循環するタンパク質）を包含する。本発明の特定の実施形態においては、結合分子は抗体である。自己集合ペプチドと結合分子の間の相互作用の観点においては、本発明の特定の実施形態によれば、結合分子は、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも２倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも５倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも１０倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも５０倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。本発明の特定の実施形態によれば、それが細胞外環境内で身体内に存在する他のペプチドまたはポリペプチドとよりも少なくとも１００倍強力に標的分子と結合する場合に、特異的結合を示す。結合は結合の強度および特異性の程度のような特性が分子双方の特徴に依存している２分子間の相互作用が関与する過程であるため、何れかの分子は標的分子として、または、結合分子と指定されてよいとみなされる。
【００４３】
構造的に適合性がある：「構造的に適合性がある」とは構造の形成を可能にする十分一定のペプチド内距離を維持することができることを意味する。本発明の特定の実施形態においては、ペプチド内距離は４，３、２または１オングストローム未満である。ペプチド内距離のより大きい変動は十分な安定化力が存在すれば構造の形成を妨げない。この距離は分子モデリングに基づくか、または、以前に報告されている単純化された操作法（米国特許５，６７０，４８３）に基づいて計算してよい。この方法においては、ペプチド内距離は対の各アミノ酸の側鎖上の未分枝鎖の原子の数の合計を考慮して計算される。例えばリジン−グルタミン酸のイオン対のペプチド内距離は５＋４＝９原子であり、そして、グルタミン−グルタミンの水素結合対の距離は４＋４＝８原子である。原子当たり３オングストロームの変換ファクターを用いれば、リジン−グルタミン酸対およびグルタミン−グルタミン対（例えば９ｖｓ８原子）を有するペプチドのペプチド内距離の変動は３オングストロームである。
【００４４】
被験体：被験体という用語は本明細書においては、例えば実験、診断および／または治療目的のために薬剤を送達するべき個体を指す。好ましい被験体は哺乳類、特に家畜哺乳類（例えばイヌ、ネコ等）、霊長類またはヒトである。
【００４５】
実質的に均一に分布した：一般的に、ペプチド足場封入細胞の場合においては、「実質的に均一に分布した」という表現は細胞の大部分が相互に概ね等距離であることを指す。例えば、ある特定の時点（例えば足場形成直後）において、足場に封入されている細胞の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％の集団の中心が、最も近接した細胞（即ち集団中心が最も近接している細胞）の集団の中心から、５００、１００、５０，２０、１０または１μＭ未満変動する距離分だけ離れている場合に、実質的に均一に分布しているとみなされる。或は、細胞はある特定の時点において足場が等しい容量を有する連続した区分（例えば立方体）に分割された場合に、その区分の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％について、自らの中心が足場の所定の容量内に含有される細胞の数が、その集団の中心がそのような容量内に含有される細胞の平均数と、細胞の平均数の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満だけ異なる場合に、実質的に均一に分布しているとみなされる。細胞が実質的に均一に分布している足場はこの特性を長時間温存するか、または、細胞が初期には実質的に均一に分布していなかった足場中で、細胞が最終的には実質的に均一に分布するようになる。
【００４６】
治療用の分子、化合物または薬剤：「治療用の分子、化合物または薬剤」とは、それを必要とする被験体に投与した場合に、疾患または望ましくない臨床状態の１つ以上を緩解し、疾患または臨床状態の重症度を低減し、疾患または望ましくない臨床状態の発生を防止するかその可能性を低減するか、または、被験体への単なる一般的栄養支援とは異なる態様において組織修復または再生を促進するような何れかの型の分子または分子の組み合わせである。治療用の分子は一般的には有効量、即ち臨床的に意味のある結果を達成するために十分な量で投与する。治療分子は低分子、生体分子等であることができる。例えばＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  ＧｌｉｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  Ｅｄ．，およびＫａｔｚｕｎｇ，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙを参照できる。
【００４７】
三次元の配置：「三次元の配置」とは三次元に存在することを意味する。三次元の配置を有する細胞は同じ単層内の全部分ではない。本明細書においては、単層は封入された細胞の平均直径に等しい厚みを有糸、そして封入された細胞少なくとも１つを含むペプチド足場を横断する断面である。細胞の平均直径は細胞体の平均直径を測定することにより決定してよい。封入された細胞は細胞の容量の少なくとも５１％が単層内に含有される場合に単層の部分とみなされる。好ましくは足場形成直後は、単層少なくとも１つは封入された細胞７５、５０、２５、２０、１５、１０、５または１％（好適度の順）未満を含有する。より好ましくは、足場形成直後は封入細胞の７５、５０、２５、２０、１５、１０、５または１％（好適度の順）未満が同じ単層の部分である。
【００４８】
（ＩＩ．総覧）
新しい生物学的材料、特に細胞の成育、分化および生物学的機能に関する許容性物質として機能する生物学的に適合性のある材料の開発は、医療技術の進歩のため、および、細胞の生物学的特性を理解するために、広範な意味を有する。本発明は完全に合成の物質に典型的に備わっている利点を保有し、なおかつ天然原料に由来する物質の特定の望ましい特徴も保有している組成物を製造することが可能であるという認識を包含する。組成物は例えば細胞培養または組織工学、組織再生および／または修復を含む目的のため；および／または治療薬のような生物学的に活性な分子のための送達剤として、インビトロまたはインビボの何れかで使用できる。
【００４９】
イオン性または極性の自己相補性のペプチドの自己集合を介して作成される生物学的に意味のある物質のクラスは以前に報告されている（例えばＺｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，３３３４−３３３８，１９９３；Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１６，１３８５−１３９３，１９９５；米国特許５，９５５，３４３および５，６７０，４８３参照）。ペプチドは相補的であり構造上適合性を有する。それらは荷電された残基が交互する正電荷および負電荷を含むことができる交互する親水性および疎水性のアミノ酸の反復単位を含む。一般的に、これらのペプチドは十分な濃度のイオン（例えば１価のカチオン）への曝露により自己集合して種々の巨視的構造となり、これにより安定な巨視的多孔性マトリックスを形成する。マトリックスは種々の物理的形態、例えばリボン、テープ様構造、２次元または３次元の足場等を形成できると推測される。好ましいマトリックスは典型的には直径１０〜２０ｎｍまたは１０〜３０ｎｍの規則正しく相互に織り込まれたフィラメントよりなり、直径（または他の該当する大きさ）５０〜１００ｎｍのオーダーの孔径を有する。物質は典型的には約９９％以上の水分含有量を有するヒドロゲルである。ペプチドの特定のものは自己集合を起こして極めて高度に水和したナノ繊維を形成する（例えば９９．５〜９９．９％（１〜５ｍｇ／ｍｌ）水）。ヒドロゲルはこのように極めて高い水分含有量を有するため、細胞はマトリックスの上または内部において培養された場合に自由に遊走でき、細胞相互の接触が生じる。このような環境はまたタンパク質およびシグナリング分子を含む低分子の拡散を可能にする。さらにまた、ヒドロゲルの特定のものは低い弾性率を有する。特に理論に制約されないが、低い弾性率は細胞−細胞の連絡を促進する。ヒドロゲルの性質は細胞培養および／または組織工学または修復のために研究さている多くの合成材料のものとは対照的であることが示唆されている。例えば、これらの材料の多くはマイクロファイバーを含み、そしてはるかに大きい孔径を有し、細胞およびその自然の環境との比較によれば適切な縮尺にはない環境を呈している。さらにまた、ヒドロゲルはゲル形成過程において細胞を播種および／または包埋する予備形成された構造ではなく、細胞を封入するように形成される。
【００５０】
これらの材料の重要な特徴はそれらの特性および機械的強度が種々のペプチドパラメーターの操作により制御できることである（Ｃａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ａ，Ｃａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。例えば、ゲルの硬度はペプチド濃度と共に大きく上昇することがわかっている。ペプチドの配列、特徴および特性、および、自己集合によりそれら如陸也；形成される構造は次のセクションでさらに考察する。
【００５１】
本発明者等および他の研究者等は、これらのペプチドの自己集合により作成される構造は、細胞を構造の表面上で培養した場合に細胞の連結、生存性および生育を支援する能力があることを明らかにしている。さらにまたＲＡＤ１６−Ｉ（ＡｃＮ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ２）（配列番号４６）により形成されるペプチド構造はニューロンをその表面上で生育させた場合にニューライトの派生および機能的に活性なシナプスの形成のための基板として機能することが可能であった（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ペプチドゲルは内皮細胞の連結、遊走、増殖およびキャピラリー様構造の形成および少なくとも３週間の期間の生存を支援することがわかっている（ＷＯ２００３０９６９７２参照）。コラーゲンまたはフィブリンゲルまたはマトリゲルのようなインビトロの血管形成の試験のために使用されている他の三次元の基板とは対照的に、この血管形成応答は外部より供給された血管形成因子の非存在下において、そして、アポトーシスまたはタンパク質分解性ゲル分解の顕著な兆候を伴うことなく、観察された。
【００５２】
さらにまた、細胞はペプチドヒドロゲル内部に封入され、これにより細胞はペプチド足場内の三次元の配置内におかれること、および、細胞はそのように封入されると生存性および機能を維持することが明らかになった（係争中の２００１年２月６日出願の「組織細胞のペプチド足場封入およびその使用」と題された米国特許出願ＵＳＳＮ０９／７７８，２００、「ペプチドヒドロゲル内の肝細胞リプログラミングおよびその使用」と題されたＵＳＳＮ１０／１９６，９４２参照）。さらにまたＫＬＤ１２（ＡｃＮ−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ＣＯＮＨ２）（配列番号４７）の自己集合により形成されるヒドロゲル構造内に封入された軟骨細胞はその形態を保持しており、プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンに富んだ軟骨様の機械的に着旺盛のＥＣＭを発生し、安定した軟骨細胞の表現型を示していた（Ｋｉｓｉｄａｙ，ｅｔａｌ．，２００２）。ＲＡＤ１６−Ｉの自己集合により作成されたペプチド足場内に封入された肝前駆細胞は肝細胞の表現型を示すマーカーを発現した（Ｓｅｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。このような結果は、自己集合ペプチドゲルにより与えられるナノスケールの環境が細胞型の多様なセットの機能的活性を増強し、細胞の指令および分化した細胞の表現型の発現を可能にすることを示している。
【００５３】
細胞、組織工学等のための適当な環境を得るための研究においてこれまで使用されていた多くの天然および人工の材料とは異なり、本発明の材料はマイクロスケールではなくナノスケールで細胞と相互作用する。材料は種々の他の材料に典型的なマイクロファイバーではなくナノ繊維により形成される。特に理論に制約されないが、繊維のサイズが小さいことおよび／または材料の開放織込み構造が、細胞の成育のための独特の利点を与える態様において細胞の突起の伸長を促進し、栄養物質、老廃物等の拡散を可能にすると考えられる。材料を含むナノ繊維は弱い相互作用の分子の力により相補的な状態で自己集合の間に秩序付けられる。しかしながら、それらは特定の用途のためには好ましい無秩序の状態であってもよい。換言すれば、繊維は秩序のある内部構造を有していてよいが、それらは相互に対する方向性または整列性を欠いていてもよい。例えば、繊維は相互に実質的に平行でなくてもよい。
【００５４】
後に記載する通り、本発明者等は今回、意外にも、自己集合のための構造的要件に必ずしも合致しない別のアミノ酸ドメイン（これは本明細書においては、少なくとも３アミノ酸の長さであればペプチドドメインとも称する）を取り込むことにより前記した自己集合ペプチドを広範に修飾することが、自己集合して巨視的構造を形成するという修飾ペプチドの能力を排除することなく可能であることを発見した。例えば、自己集合ペプチドは、例えば生物学的に活性なペプチドモチーフまたは結合分子との相互作用のための標的部位であることができる、非自己集合アミノ酸ドメインを取り込むように修飾することができる。得られるペプチドは自己集合ペプチドドメインおよび非自己集合アミノ酸ドメインを含む。非自己集合アミノ酸ドメインとは、後のセクションＩＩＩにおいて記載する原則に従って設計された未修飾の自己集合ペプチドの自己集合をもたらす条件下（例えばイオン濃度、ペプチド濃度、ｐＨ、温度）において、単離されたペプチドとして存在する場合（即ち未修飾のすぁペプチドに連結されていない場合）に自己集合しないアミノ酸ドメインを意味する。「自己集合しない」とはアミノ酸ドメインまたはペプチドがナノフィラメントまたはナノ繊維を形成しないか、巨視的構造を形成しないか、または、典型的にはβシート、ナノ繊維または巨視的構造の何れかを形成しないことを意味する。
【００５５】
以下のセクションは本発明に従って修飾できる自己集合ペプチドおよび自己集合の過程および／または組み立てられた構造の特徴を制御する方法を記載する。その後のセクションは本発明の方法および組成物、本発明の修飾された自己集合ペプチドから形成された特徴を特性化する方法、細胞の表現型を評価するため、および、修飾のために使用されるアミノ酸ドメインを選択するための方法等を、詳述する。
【００５６】
（ＩＩＩ．自己集合ペプチド、それより作成した構造、および使用方法）
（Ａ．ペプチド配列および巨視的構造）
以前に記載された未修飾の自己集合ペプチドは、相補的であり構造的に適合性がある分子のファミリーを含んでいる。ペプチドおよびその特性は米国特許５，９５５、３４３および５，６７０，４８３、「組織細胞のペプチド足場封入およびその使用」と題された２００１年２月６日出願の同時係争中の米国特許出願０９／７７８２００およびその他の文献に記載されている。これらの物質は種々の交互するパターンにおける親水性および疎水性のアミノ酸の反復単位よりなる。
【００５７】
このクラスの第１の分子、ＥＡＫ１６−ＩＩ（ＡＥＡＥＡＫＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫ、Ａ、アラニン、Ｅ、グルタミン、および、Ｋ、リジン、配列番号１８）、即ち１６アミノ酸ペプチドは、左利きＺ−ＤＮＡへの結合により最初に特徴付けられたコウボタンパク質ズオチン（ｚｕｏｔｉｎ）内のセグメントとして発見された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。このペプチドに基づいて、アミノ酸配列を変化させ、周期的パターンに従うことにより、多数の自己集合イオン性自己相補ペプチドが系統的に設計されている。好ましいペプチドは溶液（例えば水溶液）中で規則的な二次構造、例えばβシート構造であると推測される。これはペプチドが２つの異なる表面、即ち１つは親水性であり、もう１つは疎水性であるものを含み、そして親水性の表面上に規則的な反復を有する相補イオン結合を形成するためと考えられている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ペプチドの側鎖は２面、即ち荷電されたイオン側鎖を有する極性面および例えばアラニンまたは他の疎水性基を有する非極性の面に分配される。これらのイオン側鎖は正荷電および負荷電のアミノ酸残基が相補イオン対を形成できるという点において相互に自己相補である。従ってこれらのペプチドはイオン性の自己相補ペプチドと称される。
【００５８】
相補イオン側鎖は数種類の基準、即ち基準Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ等および混合基準に分類されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。イオン性の残基が１正荷電および１負荷電の残基を交互させている（−＋−＋−＋−＋）場合、ペプチドは「基準Ｉ」と記載され；イオン性残基が２正荷電および２負荷電の残基を交互させている（−−＋＋−−＋＋）場合、ペプチドは「基準ＩＩ」と記載され；イオン性残基が４正荷電および２負荷電の残基を交互させている（−−−−＋＋＋＋）場合、ペプチドは「基準ＩＶ」と記載される。上記した基準に合致するペプチドは本明細書においては未修飾の自己集合ペプチドと称することにより、これらを上記した基準に合致せず、自己集合でないペプチドドメインを含む本発明の自己集合ペプチドと区別する。
【００５９】
多くの基準ＩおよびＩＩの自己相補ペプチド、例えばＥＡＫＡ１６−Ｉ（配列番号６）、ＲＡＤＡ１６−Ｉ（配列番号１）、ＲＡＥＡ１６−Ｉ（配列番号８）およびＫＡＤＡ１６−Ｉ（配列番号１０）は以前に分析されている（表１）。これらのペプチドはまたＲＡＤ１６−Ｉ、ＲＡＥ１６−Ｉ、ＫＡＤ１６−Ｉ等とも称されている（即ち４アミノ酸モジュールの最後のアミノ酸は略記においては省略されえる）。１６アミノ酸を含有する基準ＩＶイオン性自己相補ペプチド、例えばＥＡＫ１６−ＩＶ、ＫＡＥ１６−ＩＶ、ＤＡＲ１６−ＩＶおよびＲＡＤ１６−ＩＶもまた検討されている。これらの自己集合ペプチドにおける荷電された残基が上記した全体的パターンを変化させること無く適切に置換されれば（例えば正荷電のリジンが正荷電のアルギニンと置き換えられ、そして、負荷電のグルタメートが負荷電のアスパルテートと置き換えられる）、自己集合の過程に対して本質的に影響はない。しかしながら、正荷電された残基であるリジンおよびアルギニンが負荷電の残基、例えばアスパルテートおよびグルタメートと置き換えられれば、ペプチドはもはや自己集合して巨視的構造を形成できなくなるが、それらはなお塩の存在下にβ−シート構造を形成できる。
【００６０】
水素結合を形成するアスパラギンおよびグルタミンのような他の親水性残基を荷電された残基の代替として、またはこれに追加してペプチド内に取り込んでよい。ペプチド内のアラニンがより疎水性の残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンに変更されれば、これらのペプチドは自己集合して増強された強度を有するペプチドマトリックスを形成する傾向が大きくなる。上記したペプチドと同様の組成および長さを有する一部のペプチドはβ−シートではなくアルファヘリックスおよびランダムコイルを形成する。このようなペプチドは典型的には巨視的構造を形成しないが、構造形成が絶対的に排除されるわけではない。即ち、自己相補製に加えて、他の要因、例えばペプチドの長さ、分子間の相互作用の程度およびスタッガードアレイを形成する能力が巨視的構造の形成にとって重要であると考えれられる。
【００６１】
本発明の特定の実施形態においてはアシル基（ＲＣＯ−、式中Ｒは有機性の基）、例えばアセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）のような基または残基をペプチドのＮ末端に存在させることにより、さもなくば存在するかもしれない超過の正電荷中和する（例えばＮ末端アミノ酸の側鎖から生じるのではない電荷）を中和する。同様に、アミン基（ＮＨ２）のような基を用いることにより、さもなくばＣ末端に存在するかもしれない超過の正電荷（例えばＣ末端アミノ酸の側鎖から生じるのではない電荷）を中和してよく、即ち、Ｃ末端をアミド（−ＣＯＮＨ２）に変換する。特に理論に制約されないが、末端のＮおよびＣの分子上の電荷の中和は自己集合を促進する場合がある。他の適当な基は当業者が選択できる。
【００６２】
種々の条件下において、例えば水性のペプチド溶液への１価のカチオンの天下または１価のカチオンを含有する溶液へのペプチド溶液の導入により、ペプチドは自己集合して巨視的構造を形成する。自己集合の前に、ペプチドは１価のイオン（例えばカチオン）を実質的に含まない、または、そのようなイオンを低濃度のみ、例えば１０、５、１、０．５または０．１ｍＭ未満含有する溶液中に溶解してよい。自己集合はペプチド溶液へのイオン性溶質の添加により、または、ｐＨの変化により、開始または実質的に加速してよい。例えば５ｍＭ〜５Ｍの濃度のＮａＣｌはペプチドの組立を誘導し、数分以内に巨視的構造が形成される。より低濃度のＮａＣｌも組立を誘導するが、より低速度である。ペプチドの特定のものは有意な濃度のイオンの非存在下、ｐＨに依存する過程においても自己集合することができる。例えばペプチドの特定のものは約３．０のｐＨでは溶液中に残存するが、ｐＨを上昇させると自己集合する場合がある。
【００６３】
或は、自己集合は、イオンを含有する溶液、例えば標準的なリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、組織培養培地、または生理学的な液体、例えば血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）等にペプチドを導入することにより開始してよい。即ちペプチドはインビボの位置において自己集合できる。好ましいイオンは１価のカチオン、例えばＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣｓ＋である。好ましくはイオンの濃度は実質的に加速された自己集合を誘導するためには少なくとも５、１０、２０または５０ｍＭである。特定のペプチド配列および／または濃度および望ましい組立速度に基づいて、当業者は好ましいイオン濃度を選択できる。一般的に、得られる構造の強度はイオンの非存在下またはより低いイオン濃度における強度と比較してイオンの存在下で上昇する（ただしイオン濃度の上昇が強度上昇をもたらさないプラトーに達する場合がある）。
【００６４】
上記したとおり、好ましいペプチドは自己集合してナノ繊維のネットワークを形成し、１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で水に溶解した場合に９９％より高値の水分含有量のヒドロゲルをもたらす（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｋｉｓｉｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。図１は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で測定した場合の代表的ペプチド、ＲＡＤ１６−ＩＩ（ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ、Ｒ、アルギニン、Ａ、アラニン、Ｄ、アスパラギン酸）（配列番号４）ヒドロゲルの構造を示す。これよりわかる通り、材料は自己集合して〜５０−１００ｎｍの直径の包囲部を形成する〜１０−２０ｎｍの相互に織り込まれた繊維となっている。ナノ繊維ネットワークはヒドロゲルの形成を起こし、好ましくは裸眼で観察でき、３次元であるサイズの巨視的構造を創生する。
【００６５】
巨視的構造を形成するペプチドは８〜２００アミノ酸、８〜６４アミノ酸、８〜３６アミノ酸、または、８〜１６アミノ酸を含有する。１２〜１６アミノ酸の長さを典型的に使用する。自己集合の前のペプチドの濃度は例えば．０１（．１ｍｇ／ｍｌ）〜９９．９９％（９９９．９ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることができる。より好ましくは、自己集合の前のペプチドの濃度は特に細胞培養および／または治療用途のためには．１（１ｍｇ／ｍｌ）〜１０％（１００ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることができる。本発明の特定の実施形態においては自己集合の前のペプチドの濃度は．１（１ｍｇ／ｍｌ）〜５％（５０ｍｇ／ｍｌ）、または．５（５ｍｇ／ｍｌ）〜５％（５０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることができる。本発明の特定の実施形態においては自己集合の前のペプチドの濃度は約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、または約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００６６】
所望により、ペプチド足場は予め決められた形状または容量となるように形成してよい。所望の幾何学的特長または寸法を有する足場を形成するためには、水性のペプチド溶液を所定の形状を有する成型金型内に入れ、そして本明細書に記載したとおりイオンを添加することにより足場へのペプチドの自己集合を誘導する。或は、金型内への溶液の投入の直前にペプチド溶液にイオンを添加してよいが、ただし、実質的に組立が起こる前に金型内に溶液を入れるように留意しなければならない。得られる材料の特徴、組立に必要な時間、および巨視的ペプチド足場の幾何学的特長および寸法は、適用されるペプチド溶液の濃度および量、足場の組立を誘導するために使用されるイオンの濃度、ｐＨ、特定の自己集合ペプチドの配列、および、成型装置の寸法を含むパラメーターにより左右される。ペプチド足場または足場が身体内に移植される場合は、形状は意図される移植部位に基づいて選択してよい。足場は本発明の種々の実施形態に応じて、薄層、例えば従来の組織培養の底面のコーティングまたは溶液中の浮遊物として存在してよい。層は数ミクロンの厚み、例えば１０ミクロン、１０〜５０ミクロン、５０〜１００ミクロン、１００〜２００ミクロンであることができる。層は複数のβシート層を含んでよい。
【００６７】
自己集合ナノスケール足場は様々な程度の硬度または弾性を有するように形成することができる。ペプチド足場は標準的なコーン−プレートレオメーターで測定した場合、典型的には低い弾性率を有し、例えば１〜１０ｋＰａの範囲である。このような低い値は細胞の収縮の結果としての足場の変形を可能にし、この変形は細胞−細胞の連絡のための手段を提供する。足場の硬度はペプチド配列の変化、ペプチド濃度の変化およびペプチド長の変化を含む種々の手法により制御できる。高度を増大させるための他の方法も用いてよく、例えばビオチン分子をペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に連結するか、または、アミノ末端とカルボキシ末端の間に連結させて後にこれらを交差結合してよい。
【００６８】
（表１．代表的な自己集合ペプチド）
【００６９】
【表１−１】
2011046741.tif 000002
【００７０】
【表１−２】
2011046741.tif 000003
Ｎ／Ａは適用せずを意味する。
＊これらのペプチドはＮａＣｌを含有する溶液中でインキュベートするとβシートを形成するが、それらは自己集合して巨視的構造を形成するとは観察されていない。
【００７１】
ペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸またはこれらの組み合わせを含んでよい。Ｌアミノ酸が足場に存在する場合は、分解により、例えば培養中の細胞により、または宿主組織中の細胞により再使用してよいアミノ酸が生成する。本発明の特定の実施形態におけるペプチドの塩基性の単量体サブユニットは身体内で天然に存在するＬアミノ酸であるという事実は、多くの他の生体適合性の物質から化合物のこのクラスを差別化しており、特有の利点を与えるものである。ペプチドは化学合成されるか天然物または組み換え原料から精製してよく、そして、ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端を保護しても保護しなくてもよい。ペプチド足場は相互に相補であり構造的に適合性を有するペプチドの異なる分子種１つ以上から形成してよい。ミスマッチ対を含有するペプチド、例えば隣接するペプチドに由来する２つの同様に荷電した残基の反発性の対形成もまた、反発力がペプチド間の相互作用を安定化させることにより支配されれば構造を形成してよい。ペプチド足場はまた、本明細書においては、ペプチドヒドロゲルまたはペプチドヒドロゲル足場とも称してよい。
【００７２】
ペプチド、例えば交差結合されることのできるペプチドおよび本発明の修飾された自己集合ペプチドは標準的なｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成してよく、そして高速液体クロマトグラフィーを用いて精製してよい。ペプチド足場の形成は本明細書に記載する通り、イオンまたはその塩の添加により開始してよい。芳香族側鎖を有する疎水性残基はＵＶ照射への曝露により交差結合してよい。交差結合の程度はＵＶ光への曝露の所定の時間および所定のペプチド濃度により厳密に制御してよい。交差結合の程度は光分散、ゲル濾過または走査電子顕微鏡により、標準的な方法を用いて測定してよい。さらにまた、交差結合の程度はまたプロテアーゼによる消化の後の構造のＨＰＬＣまたは質量スペクトル分析により調べてもよい。材料の強度は交差結合の前後に測定してよい。
【００７３】
（Ｂ．細胞培養および封入）
未修飾の自己集合ペプチドまたは本発明の修飾された自己集合ペプチドの何れかから形成されたペプチドヒドロゲルは細胞および組織を培養するために種々の方法において使用してよい。細胞および組織はヒドロゲル構造の表面上で培養できる。特に理論に制約されないが、本発明者等はこのような環境は従来のプラスチックの組織培養皿のような合成の基板上の培養よりも天然の細胞の環境をより綿密に模倣していることを示唆している。ヒドロゲルが三次元の構造を形成する場合は、細胞は構造内に突起を伸長でき、或は、その内部に遊走できる。
【００７４】
細胞はまたヒドロゲル内に封入できる。ペプチド構造内に細胞を封入する場合、ペプチドおよび生細胞を、ペプチドが実質的に自己集合しない条件下、細胞の生存性を支援する適切な濃度で等浸透圧の溶質を有する水溶液中でインキュベートしてよい。本発明の特定の実施形態においては、溶液は１０、５、１または０．１ｍＭ未満の１価カチオン濃度を含有するか、または１価カチオンを実質的に非含有である。溶液はまた他のイオン種、例えば他のカチオンまたはアニオンを１０、５、１または０．１ｍＭ未満含有するか、または実質的に非含有である。十分なイオン（例えば１価のカチオン）を溶液に添加することによりペプチドから巨視的構造、好ましくはβシート巨視的構造への自己集合を開始することにより、細胞は巨視的構造の形成により封入される。封入された細胞は好ましくは三次元配置における巨視的構造内に存在する。溶液は所望の体積または形状の巨視的構造を確立するための寸法を有する所定の形状を有する成型金型内に入れてよい。
【００７５】
本発明の特定の実施形態においては、添加イオンの濃度は少なくとも５、１０、２０または５０ｍＭである。適当なイオンには例えばＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣｓ＋が包含される。一部の実施形態においては、等浸透圧溶質の濃度は以下の範囲：２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭまたは８００〜９００ｍＭの１つに含まれる。適当な等浸透圧溶質は例えば炭水化物、例えばスクロース、マンニトール等である。他の等浸透圧溶質、好ましくは使用濃度において細胞に対して非毒性であるものも使用してよい。自己集合はまたｐＨの変化（例えば低ｐＨから高ｐＨへの上昇）により起こすこともできる。
【００７６】
細胞および生体分子のような薬剤（例えば分化促進剤、増殖剤）、治療用化合物は自己集合の前にペプチド溶液中に導入してよい。次に、自己集合工程により細胞または分子を封入する構造が形成される。構造内の細胞または分子の均一な分布を達成するためには、自己集合の開始前に溶液を十分混合することが望ましい。ペプチド溶液に細胞または薬剤を混合すると即座に自己集合が開始されたり加速されたりすることを回避するためには、実質的に無イオンまたは低濃度のみのイオンを含有する溶液中に細胞または薬剤を維持することが望ましい。このような場合、細胞は好ましくはペプチド溶液との混合の前にスクロースのような等浸透圧溶質中に維持する。ペプチド自体は細胞（例えば細胞ペレット）または薬剤を添加する等浸透圧溶液中に溶解してよい。得られた組成物を混合して細胞および／または薬剤のより均一な分布を達成し、その後、組成物をイオンに曝露する（例えばイオンを組成物に添加するか、または組成物をイオン含有溶液と混合する）。
【００７７】
細胞は、組織培養皿またはスライド、またはコラーゲン、マトリゲル等のような生物学的に誘導された物質でコーティングされている組織培養皿またはスライドのような、それらが従来の基板上で培養されている場合と同様の態様においてペプチドヒドロゲル構造の表面上で培養してよい。一般的に細胞は何れかの所望の水準のコンフルエント状態において培養できる。封入された場合、細胞は好ましくは三次元の配置における巨視的構造内に存在する。細胞の密度は例えば５ｘ１０３／ｍｌ〜５ｘ１０４／ｍｌ、５ｘ１０４／ｍｌ〜５ｘ１０５／ｍｌ、５ｘ１０５／ｍｌ〜５ｘ１０６／ｍｌ、または、５ｘ１０６／ｍｌ〜５ｘ１０７／ｍｌであってよい。他の範囲も使用してよい。培養の条件は生理学的条件に近似することが好ましい。例えば培地のｐＨは生理学的ｐＨに近似するのが好ましく、好ましくはｐＨ６〜８、例えば約７〜７．８、特にｐＨ７．４である。生理学的温度範囲は約３０℃〜４０℃である。哺乳類細胞は好ましくは約３２℃〜約３８℃、例えば約３５℃〜約３７℃の温度で培養する。
【００７８】
細胞は所望の細胞数および密度、細胞の増殖速度および所望の細胞のリプログラミングが起こるために必要な時間に応じて、何れかの適切な時間、ペプチド構造の上または内部で培養してよい。これらのパラメーターは本発明を使用する特定の細胞および目的に応じて変動する。当業者はこれらのパラメーターを変更でき、そしてそうすることの作用を観察することにより、構造の上または内部の培養物中に細胞を維持するための旨適時間を決定できる。本発明の特定の実施形態においては細胞は約３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、５６日間または９０日間培養する。本発明の特定の実施形態においては細胞は１〜３日間、４〜７日間、８〜１４日間、１５〜２１日間、２２〜２８日間、２９〜５６日間、または５７〜９０日間培養する。より長期または短期の培養期間も使用してよい。
【００７９】
好ましくは細胞（表面上で培養またはまたは封入の何れか）の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％が巨視的足場の形成後１、２、４、６週間以上、生存性を示す。別の好ましい実施形態においては、細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または９０％が巨視的足場の形成後１日または１週間、生存性を示す。
【００８０】
一般的に、血管内皮細胞およびその前駆体、骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、骨格筋芽細胞または筋細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、非血管内皮細胞または平滑筋、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、肺細胞、免疫系の細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝細胞または包皮細胞細胞を含む何れの細胞型も本発明に従って培養および／または封入できる。細胞は胚性、胎児性または成体の幹細胞、例えば上記した細胞型のいずれかに分化できる、またはそれを誘導できる幹細胞を包含する。
【００８１】
細胞の原料は、胎児または成熟生物、特に哺乳類または樹立された細胞系統を包含してよい。多くの樹立された細胞系統は当該分野で知られており、その多くがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる（これらの細胞系統を説明する参考文献も呈示しているｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇのＵＲＬのウエブサイト参照）。細胞および細胞系統を考察する場合、「誘導された」という表現は細胞が特定の原料から得られたものであること、または、細胞がその原料から得られた細胞の子孫であることを指す。例えば、肝誘導細胞は肝臓から得られた細胞、または、そのような細胞の子孫または継代物である。「子孫」という用語を本明細書において使用する場合、それは細胞分裂による即時の産物のみならず、後の細胞分裂の産物、即ち特定の細胞の継代物も指すものとする。細胞系統から誘導された細胞はその細胞系統のメンバーであるか、または、その細胞系統のメンバーである細胞の子孫または継代物である。臓器、組織、個体、細胞系統等より誘導された細胞はそれが得られた後にインビトロで修飾してよい。そのような細胞はなおもとの原料より誘導されたものとみなされる。
【００８２】
細胞を単離する方法は当該分野で知られている。個体から採取された細胞は培地中での増殖期間を設けるか、設けることなく使用してよい。或は、細胞は安定な細胞系統として培地中で増殖させてある細胞を使用してよい。本発明の特定の実施形態においては、例えば特定の治療用途（後述参照）においては、細胞は自系であるが、本発明の別の実施形態においては細胞は同種異系または異種である。非自系の細胞を使用する場合は、細胞を種々の方法で処理した後に身体内に導入することにより被験体による免疫系の応答の可能性を低減するか、または、その範囲を低減する。このような処理は例えばＰＣＴ／ＵＳ００／２０１２９に記載されているように細胞の表面上の抗原を修飾、マスキングまたは排除することを包含する。
【００８３】
本発明の特定の実施形態においては、細胞を被験体、例えば患者から採取し、そしてクローン細胞系統をこれらの細胞の１つ以上から誘導する。クローン系統は限界希釈によるプレーティングまたは単細胞ソーティングにより得てよい。クローン細胞系統を得るための方法は当該分野でよく知られており、例えばＰｕｃｋ、Ｔ．Ｔ．およびＭａｒｃｕｓ，Ｐ．Ｉ．，Ｊ．（１９５６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０３，６５３；Ｎｉａｓ，Ａ．Ｈ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｊｔｈａ，Ｌ．Ｇ．（１９６５）「Ｃｌｏｎｅ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃ．Ｖ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，ｅｄ．（Ｄｒ．Ｗ．Ｊｕｎｋ  Ｐｕｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびＬｅｏｎｇ，Ｐ．−Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｓ．（１９８５）「Ｖａｒｉａｎｃｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ  ａｔ  ４
ｇｅｎｅ  ｌｏｃｉ」，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１５０（１−２）：４０３−１０に記載されている。細胞系統から得た細胞を本発明の実施において使用する。特定の患者の治療を意図する場合は、マッチしたドナーから得た細胞を好都合に使用してよい。個体から単離され細胞系統として維持されている細胞は本発明の実施において使用する前に標準的な細胞培養手法を含む何れかの適切な手法に従って培養してよい。
【００８４】
細胞を遺伝子的に改変した後に本発明において使用することが望ましい場合がある。外因性の遺伝子物質を細胞に導入するための多くの方法が当該分野で知られている（例えばＰＣＴ／ＵＳ００／２０１２９参照）。このような方法は典型的には、核酸分子（例えばＤＮＡ）のような遺伝子物質を細胞内に導入することを包含し、ここでその核酸分子は細胞により発現されるべき産物をコードするものである。産物は例えば成長因子、他の遺伝子産物の発現を誘導する転写因子等のようなリプログラミング剤であることができる。本発明の特定の実施形態においては、細胞に選択可能なマーカーを導入することが望ましい。本発明の特定の実施形態においては、選択可能なマーカー（例えば薬剤耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子）または検出可能なマーカー（例えばＧＦＰ）をコードする遺伝子を組織特異的プロモーターの制御下に導入することが望ましい。次に検出可能なマーカーは、細胞またはその子孫がその組織に特徴的な特定の細胞の直系の経路に沿って分化、脱分化または相互分化したかどうかを調べる手段として使用してよい。マーカーはまた、免疫学的な方法、ＦＡＣＳ等、または当該分野でよく知られた別の方法を用いて、特定の経路に沿って分化、脱分化または相互分化した細胞を単離する手段として使用してよい。多くの選択可能および検出可能なマーカーが当該分野で知られている。さらに組織特異的、臓器特異的および直系特異的なプロモーターが知られている。遺伝子は当該分野で多くが知られている構成または誘導プロモーターの何れかの制御下に導入してよい。
【００８５】
細胞を培養または細胞を封入している足場は細胞の表現型に影響する種々の環境条件に付してよい。例えば足場はＥＣＭ成分の改変された合成をもたらす種々の明確化された、または予め設定された機械的な応力、例えば剪断応力、圧縮方法等に付してよい。例えばインビトロで培養された細胞によるタンパク質の分泌は流動、例えば脈流により改変することができる。ネイティブの関節軟骨内、および、組織工学コンストラクト内の細胞は複数の調節経路を経由して機械的刺激に応答する。このような刺激は改変された細胞内および細胞間のシグナリング、転写水準の改変、タンパク質翻訳、翻訳後修飾および細胞内および細胞外の巨大分子の合成をもたらす（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００８６】
（ＩＶ．修飾された自己集合ペプチドおよびその自己集合により形成される構造）
（Ａ．アミノ酸ドメインの付加による自己集合ペプチドの修飾）
予め識別された自己集合ペプチドは上記したとおりその自己集合を可能にする特定の構造的条件に合致する。これらの条件はペプチドの自己集合の理論的研究および多くの異なるペプチドの自己集合の挙動またはその欠如の実験的観察の両方に合致している。しかしながら、修飾を有するペプチドが自己集合する能力を排除することなく、上記した構造的条件に沿わないアミノ酸ドメインの添加によりペプチドが大きく修飾される可能性はこれまで検討されていない。
【００８７】
本発明者等は自己集合ペプチドが、前記したペプチド（基準Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ等）が自己集合する条件化（例えばイオン強度、ペプチド濃度、ｐＨ、温度）で単離された形態で存在する場合には自己集合しないアミノ酸ドメインの付加により自己集合ペプチドが修飾できるという予測できない柔軟性を発見した。さらにまた、本発明の好ましい実施形態においては、非自己集合アミノ酸ドメインの付加は修飾されたペプチドが自己集合して例えばナノ繊維、巨視的構造または両方の形成することを妨げない。好ましくは、修飾されたペプチドは自己集合してナノ繊維よりなる巨視的構造を形成する。得られる構造は未修飾のペプチドの自己集合から得られる構造よりも強度および／または安定性が小さいが、実施例に示すとおり目視による観察および／またはレオロジー実験によれば、ゲルの形成が起こることが確認される。即ち修飾されたペプチドを本明細書に記載した種々の目的のために使用してよい。本発明の目的のためには、上記したセクションに記載した構造的側面を有し、そのような特徴を欠いた部分を含まない自己集合ペプチドは、未修飾の自己集合ペプチドと称する。（未修飾の自己集合ペプチドはペプチドへのアミノ酸の付加を包含しない上記した多くの方法のいずれかにおいて改変してよい。このように改変された自己集合ペプチドは本明細書における用語の意味内では「修飾された」とは称さず、むしろ「改変された」または「誘導体化された」と称する。）本発明の修飾された自己集合ペプチドは天然に存在する分子とは異なり、即ちそれらは天然には存在しないが、本発明のペプチドのアミノ酸ドメインの１つ以上は天然に存在する分子内に存在してよい。従ってこれらは「単離された」または「合成された」ものとみなされ、ペプチドの全体的配列が人間の介入無く天然に存在することはないことを意味する。
【００８８】
未修飾の自己集合ペプチドを含むアミノ酸ドメインおよび未修飾の自己集合ペプチドの構造的側面の１つ以上を欠いており、そのため未修飾の自己集合ペプチドの自己集合をもたらすような条件下で自己集合してナノ繊維を形成したり、または巨視的構造を形成することのない第２のアミノ酸ドメインを包含するペプチドは、それが未修飾の自己集合ペプチドの自己集合をもたらすような条件下で自己集合（例えばナノ繊維、巨視的構造または好ましくは両方を形成）することが可能であれば、「修飾された自己集合ペプチド」と称する。一般的に修飾された自己集合ペプチドは第２のアミノ酸ドメインを含まないが同じ自己集合部分を有する特定の未修飾の自己集合ペプチドに相当することになる。本発明の特定の実施形態においては、修飾された自己集合ペプチドの自己集合が起こる条件は、相当する未修飾の自己集合ペプチドが組み立てられる条件と同様である。本発明の別の実施形態においては、修飾された自己集合ペプチドの自己集合が起こる条件は相当する未修飾の自己集合ペプチドが組み立てられる条件とは異なる。この場合、修飾された自己集合ペプチドのの自己集合のための条件は異なる（非相当の）未修飾の自己集合ペプチドが自己集合する条件と同様である。
【００８９】
即ち本発明の修飾された自己集合ペプチドは（ａ）自己集合を媒介する第１のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして自己集合して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの；および（ｂ）単離された形態（即ち上記した未修飾の自己集合ペプチドの組立をもたらす条件下において溶液中で唯一のペプチドとして存在する場合）で自己集合しない第２のアミノ酸を含む。好ましくは第２のアミノ酸ドメインはペプチドが組み立てられてナノ繊維および／または巨視的構造を形成するように第１のアミノ酸ドメインの組立を可能にする。本発明の好ましい実施形態においては、ペプチドはβシートを形成する。
【００９０】
本発明の特定の実施形態においてはアミノ酸ドメインは少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸以上、例えば１５または１６アミノ酸、２０アミノ酸等である。しかしながら、自己集合を過剰に妨害しないように第２のアミノ酸ドメインの長さを制限することが一般的には望ましい。例えば第２のアミノ酸ドメインの長さを２０アミノ酸以下、１６アミノ酸以下、１２アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、８アミノ酸以下等に制限することが好ましい場合がある。ペプチドの自己集合および非自己集合部分のアミノ酸の特定の比率を維持することが望ましい場合がある。例えば本発明の特定の実施形態においては非自己集合ドメインはペプチドのアミノ酸の総数の５０％以下を構成することが望ましい場合がある。
【００９１】
自己集合部分は長さが１２アミノ酸以上、例えば１６アミノ酸以上であることが望ましい場合がある。特に非自己集合ドメインが２つの自己集合ドメインの間に存在する場合、非自己集合ドメインにフランキングする自己集合ドメインの各々は長さが８アミノ酸超、例えば１２アミノ酸、１６アミノ酸等であることが望ましい場合がある。特に理論に制約されないが、ＮまたはＣ末端ではなく自己集合部分の間に非自己集合ドメインを含むことは自己集合を妨害しやすいこともありえる。さらにまた、２つの自己集合部分の間に含有されれば、モチーフが培養環境中に存在する細胞および／またはタンパク質のような分子と自由に相互作用する機会が減少すると考えられる。即ち、種々の理由から、非自己集合部分はそれを２つの自己集合部分の間に挿入するよりもＮまたはＣ末端に付加することが好ましい場合がある。
【００９２】
図３Ａは代表的な自己集合ペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（上）およびそのＮ末端において非自己集合アミノ酸ドメイン（ＹＩＧＳＲ；配列番号３３）を含むように修飾されたペプチドＲＡＤ１６−Ｉ（下）を示す分子モデルである。図３Ｄは本発明による修飾された自己集合ペプチドの可能な配置の種々のものを示している。ドメインＡは自己集合アミノ酸ドメインである。ドメインＢは非自己集合アミノ酸ドメイン（修飾ドメイン）を示す。図に示す通り、修飾ドメインは自己集合ドメインのＮおよび／またはＣ末端に存在してよく、或は、２つの自己集合ドメインの間に存在してよい。
【００９３】
アミノ酸ドメインはアミノ酸１つ以上または異なる分子実体であってよいリンカーまたは架橋を介して連結されてよい。リンカーは非自己集合ドメイン（例えば後に記載する生物学的に活性なペプチドモチーフ）が巨視的構造の端部または表面から伸長できるようにしてよい。特に理論に制約されないが、これはペプチド構造の上または内部で培養された細胞との活性モチーフの相互作用を促進すると考えられる。グリシン（Ｇ）残基１つ以上、例えば１、２、３、４、５個等のグリシンよりなるリンカードメインを使用してよい。グリシンはそれが小型であり非極性の側鎖を有するため、自己集合に対する実質的干渉の可能性を最小限にするために好ましい。アラニンおよび非極性側鎖を有する他のアミノ酸も使用できる。
【００９４】
実施例に記載した修飾されたペプチドは線状の鎖を与える伸長ペプチドの固相合成により作成されているが、修飾モチーフが側鎖にコンジュゲートまたは交差結合されるような変法も本発明に包含される。このようなコンジュゲーションまたは交差結合を行うための方法は当該分野でよく知られている。例えばシステイン残基（またはイオウ原子を含むように修飾された何れかのアミノ酸）を含有するペプチドをジスルフィド結合の形成によりイオウ原子を含有する第２のペプチドにカップリングすることができる。即ち、一般的に修飾された自己集合ペプチドはペプチド結合により連結されたアミノ酸の単一の線状の重合体（好ましい構造）であってよく、または、アミノ酸の２つの重合体（各々がペプチド結合で連結されたアミノ酸の重合体）が共有結合的、または非共有結合的（例えばビオチン−アビジン相互作用による）に相互に連結されている分枝鎖の構造をとることもできる。
【００９５】
交差結合法の例はαアミノ基およびεアミノ基を介して主にカップリングする基たるアルデヒド法、マレイミド−スルフィドリルカップリング化学（例えばマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）法）および過ヨウ素酸酸化法を包含する。さらに多くの交差結合剤が知られている。例示される交差結合剤は例えばカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨＳ−ＡＳＡ）、２塩酸ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルズベリミデート（ＤＭＳ）、３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）等を包含する。コンジュゲーション法および交差結合剤に関する別の情報は一般的にはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ，ＰＯＢｏｘ３３３７，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ，４３２１０の雑誌Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照できる。またＵＲＬがｗｗｗ．ｐｉｒｅｃｅｎｔ．ｃｏｍを有するウエブサイトで入手可能であり、本来は１９９４〜９５のＰｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇにおいて公開された「Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙおよびそこで引用される参考文献、およびＷｏｎｇ  ＳＳ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１も参照できる。２官能性の交差結合剤は反応性の基２個を有し、これにより標的基２個を共有結合する手段を提供する。化学交差結合試薬中の反応性の基は典型的にはスクシンイミジル基、マレイミドおよびヨードアセトアミドを含む官能基のクラスに属する。ヘテロコンジュゲートを形成するための多くの一般的なスキームでは通常は２または３段階の反応手順による１つの生体分子上のアミン基の第２の生体分子上のチオール基ヘの間接的カップリングを行う。チオールの高い反応性および大部分の生体分子中においてそれが比較的稀であることは、チオール基を化学交差結合の制御のための良好な標的としている。何れの分子もチオール基を含有しない場合は、数種のチオール化方法の１つを用いて１つ以上を導入できる。次にチオール含有の生体分子をヘテロ２官能性交差結合剤、例えばスクシンイミジルエステルおよびマレイミドまたはヨードアセトアミドの何れかの両方を含有する試薬を用いてアミン含有生体分子と反応させてよい。アミン−カルボン酸およびチオール−カルボン酸の交差結合も使用してよい。例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を生体分子と反応させることにより通常は分子内またはタンパク質複合体のサブユニットの間に「ゼロ長」の交差結合を形成することができる。この化学操作においては交差結合剤は最終生成物中に取り込まれない。
【００９６】
数種の方法がチオールを生体分子に導入するために使用でき、例えば内在性のジスルフィドの還元並びにアミン、アルデヒドまたはカルボン酸の基のチオール基ヘの変換が挙げられる。タンパク質中のシステインのジスルフィド交差結合はジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはトリス−（２−シアノエチル）ホスフィンにより還元してシステイン残基とすることができる。アミンはスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応、次いでＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いた３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルコンジュゲートの還元により間接的にチオール化することができる。アミンはスクシニミジルアセチルチオアセテートとの反応、次いで５０ｍＭヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いてほぼ中性のｐＨにおいてアセチル基を除去することにより間接的にチオール化できる。チオール非含有タンパク質内のトリプトファン残基は酸化してメルカプトトリプトファンとし、次にこれをヨードアセトアミドまたはマレイミドにより修飾することができる。
【００９７】
（Ｂ．ペプチド混合物）
本発明は種々の比において本発明の修飾された自己集合ペプチド１つ以上に未修飾の自己集合ペプチド１つ以上を混合することができること、および、未修飾および修飾された自己集合ペプチドの両方を含む巨視的構造がこのような混合物から形成できることの認識を包含している。得られる構造は均質な自己集合ペプチド（即ち１００％単一のペプチド）の自己集合により形成される構造と比較して特定の好都合な側面を有している。例えば上記したとおり、修飾された自己集合ペプチドは相当する未修飾のペプチドから形成される構造よりも弱い巨視的構造をもたらす場合があり、即ち、それらはゲル性の低い特徴を有する場合がある。しかしながら、修飾されたペプチドは所望の細胞表現型を誘導してよく、所望に応じて細胞の挙動を改変してよく、ＥＣＭ分子の結合を所望に応じて改変するなどしてよい。未修飾および修飾された自己集合ペプチドの複合物（ブレンド物とも称する）から形成される巨視的構造は未修飾のペプチドの自己集合により形成された巨視的構造のものに似た機械的特性を有する場合があるが、細胞の挙動、表現方等に所望の態様で影響する能力を保有している。さらにまた修飾された自己集合ペプチドのみよりなるペプチド足場は細胞への作用の観点から旨適未満である場合がある。例えば、ゲル内の各ペプチドが修飾されている場合、得られる生物学的に活性なペプチドモチーフの濃度は所望よりも高値となり、実際は細胞の連結、増殖等を抑制するか、または、細胞に対して毒性となる場合がある。
【００９８】
一般的に、形成すべき巨視的足場の所望の性質に応じて、広範な種類の未修飾ペプチドの修飾ペプチドに対する比を使用することができる。例えば未修飾ペプチドの修飾すべきペプチドに対する比は１００：１、５０：１、２５：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００等であることができる。これらの比は例示を目的として記載しており、限定を意図していない。実施例に記載する通り、９：１の比を多くのペプチドと共に試験した。ペプチドをモル基準または重量、ペプチド溶液の容基等を基準として混合することができる。ペプチドは乾燥形態で混合し、その後、混合ペプチド溶液を形成する。或は、各ペプチドを溶解し、そして得られた溶液を混合してもよい。本発明はまた種々の修飾された自己集合ペプチドの所望の側面を組み合わせた巨視的構造が作成されるように未修飾の自己集合ペプチドの添加を行うか行うことなく、複数の修飾された自己集合ペプチドを混合することも包含する。種々の修飾された自己集合ペプチドは、同じ天然に存在するタンパク質に由来するか、または、異なるタンパク質に由来する異なるアミノ酸ドメイン、または完全に人工のアミノ酸ドメイン等を含有してよい。
【００９９】
本発明の特定の実施形態においては修飾された自己集合ペプチドは相当する未修飾ペプチドの組立をもたらすような条件下において溶液中の唯一のペプチドとして存在する場合には自己集合しないが、未修飾の自己集合ペプチドと組み合わせて存在する場合にはそのようなペプチドと共に自己集合する。自己集合により未修飾ペプチドと修飾ペプチドの両方の混合物、例えば主に未修飾のペプチドを含有する、好ましくは巨視的構造を形成するナノ繊維よりなる組成物が得られる。或は、組成物は何れの修飾ペプチドも含有しない一部のナノ繊維を含有するが、他のナノ繊維はそのようなペプチドを含有していてよい。理論に制約されないが、発明者等は一般的に、修飾されたペプチドのみが存在する状況と比較して、修飾ペプチドの濃度が低いほど得られる混合物がナノ繊維および／または巨視的構造を形成する可能性が高くなり、そして得られる構造が強力になると示唆している。
【０１００】
図３ＢはペプチドＲＡＤ１６−Ｉおよびアミノ酸ドメインＹＩＧＳＲ（配列番号３３）によりＮ末端において伸長された修飾ＲＡＤ１６−Ｉペプチドの９：１ブレンド物（ｗ／ｗに基づいて等しい濃度において溶解したペプチドの容量比に基づく）よりなる混合物の自己集合により形成された自己集合ペプチドナノ繊維の二重βシートテープを示す分子モデルを示す。ナノ繊維テープから伸長している配列番号ＹＩＧＳＲ（配列番号３３）に留意する。一般的に、修飾アミノ酸ドメインはペプチドの組立の側面端部から（例えばナノ繊維または巨視的構造）、または、表面から伸長してよい。他の配置も可能である。
【０１０１】
図３Ｃはもとのペプチドのアミノ末端から伸長する生物活性ペプチドモチーフ（赤線）を含むようにペプチドの一部が修飾されている包括的なペプチドヒドロゲルネットワーク（黒線）の模式図である。クローズアップ：積載された自己集合ペプチドのナノ繊維（黒線）および配列の１つのアミノ末端における生物活性ペプチドモチーフの伸長した配列（赤線）。
【０１０２】
（Ｖ．修飾された自己集合ペプチドにおいて使用するためのアミノ酸ドメイン）
一般的に広範な種類の異なるアミノ酸ドメインの何れも未修飾の自己集合ペプチドに付加してよいが、ただし、追加されたドメインの存在が自己集合（ナノ繊維、巨視的構造、または好ましくは両方の形成）を妨げてはならない。追加のドメインは得られるペプチドに対して多くの望ましい特性の何れかを付与してよい。例えば追加のドメインは生物学的な活性を媒介してよく、例えばペプチドの自己集合により形成される足場に接触した細胞の挙動に影響してよい。追加のドメインは天然に存在するまたは人工の生体分子、例えばＥＣＭタンパク質、細胞表面の分子、抗体等のいずれかに結合してよい。追加のドメインは金属、イオン等のような無機の物質に結合してよい。
【０１０３】
追加ドメインの存在は、ペプチドの自己集合により生成される巨視的構造の材料特性（例えば強度、弾性等）を、未修飾の自己集合により生成される巨視的構造の特性と比較して、改変する場合がある。即ち、非自己集合ドメインを含むように自己集合ペプチドを修飾することにより、巨視的構造の材料特性をユーザーの必要性に応じて調節することができる。例えば、身体内に移植するためには、移植の部位および／または移植片が交換すべき組織（例えば骨、結合組織、軟組織、例えば筋肉、眼の組織、固形臓器組織等）に応じて、異なる材料特性を有する材料を使用することが望ましい場合がある。以下のセクションは未修飾の自己集合ペプチドに付加することができる例示的アミノ酸ドメインおよびその選択方法の非限定的な説明である。
【０１０４】
（Ａ．生物学的に活性なペプチドモチーフ）
既に発見された自己集合ペプチドを修飾するという試みは、細胞の基底膜により与えられる微小環境の重要な側面を再生する完全に合成の物質を生成したいという要望により部分的には惹起されている。細胞の基底膜はラミニン、コラーゲンおよびプロテオグリカンにより主に構成される三次元のネットワークである。基底膜は上皮細胞のシートおよびチューブに伏在し、そして筋肉細胞、脂肪細胞およびシュワン細胞のような種々の型の個々の細胞を包囲している。特定の位置（例えば肺、腎臓の糸球体）においては、基底膜は細胞のシートを分離し、フィルターとして機能する。電子顕微鏡可視化の下においては、基底膜は２つの異なる層、即ち基底膜上に静置した細胞の基底原形質膜に隣接する電子透過性の層、および、その下部の電子緻密層を含むように観察できる。基底膜はまたより下部の層を伏在する結合組織に結合させる第３の層を含む場合がある（Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ
ａｌ．，上記参考文献）。
【０１０５】
構造成分としての重要性、細胞の連結の支援、および、種々の細胞、組織および臓器を分離する障壁として機能することのほかに、細胞に対してそれと相互作用する指示的な微小環境を与え、その機能をモジュレートする。細胞の極性、代謝、分化および遊走は基底膜によりモジュレートされる細胞機能の特徴の一部である。さらに、基底膜の分子は原形質膜および細胞内分子の構造的組織化に寄与することができる。基底膜分子はまた相互に相互作用する。
【０１０６】
細胞機能のモジュレーションにおけるＥＣＭの役割は、血管および心室が下部の筋肉層から内皮細胞を分離する基底膜の最上部に位置する内側の内皮細胞を含んでいる血管系の範囲において特に興味深いものである。基底膜は血管形成のような過程において重要な役割を果たすと考えられており、そしてその一体性は適切な血管の機能を維持するために重要である。内皮細胞の層および／または伏在する基底膜の損傷または変化はアテローム性動脈硬化症のような種々の疾患の過程において中心的役割を果たしていると考えられる。
【０１０７】
基底膜のタンパク質内に存在する短ペプチドは細胞の連結、増殖、分化および遊走を含む重要な生物学的機能の種々に関与するものとして発見されている（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９８７、Ｋｌｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｋｏｌｉａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｋｕｂｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ
ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。身体内の異なるＥＣＭ分子の間の結合またはＥＣＭ分子と非ＥＣＭ分子との間の結合を媒介するペプチド配列もまた発見されている。以下のセクションはこのようなペプチドモチーフを含有および／または相互作用する種々の基底膜分子の特徴を説明するものであり、そして血管系、内皮細胞および内皮基底膜の該当する特徴をさらに詳述するものである。
【０１０８】
ラミニン−１。ラミニンはα、βおよびγ鎖を含有するヘテロ３量体のタンパク質ファミリーを示す。ラミニンは主に基底膜に位置するが、間葉コンパートメントにも存在する。ラミニニンは支質マトリックスおよび上皮、内皮、筋肉および神経細胞の間の物理的結合を創生する。現在まで、少なくとも１１種のラミニンのアイソフォーム（α、βおよびγ鎖の種々の組み合わせ）が発見されている。これら全てに共通なものは、ヘテロ３量体の組み立てにおいて中心的役割を果たすコイルドコイルドメインである。ラミニン−１が胚盤胞期よりも前のマウスの発生において生産される最早期のラミニンであり、臓器形成の間の上皮組織に寄与している（Ｄｚｉａｄｅｋ＆Ｔｉｍｐｌ，１９８５；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ラミニン−１（Ｍｒ＝９００，０００）はα１、β１およびγ１サブユニットから形成され、これらが組み立てられて十字架様の構造になる（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。これはニドジェンと複合体を形成し、準６角形のパターンおよび３次元の構造を有するネットワークをもたらす。複合体の形成はカルシウム、温度および濃度の態様において起こる（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ＆Ｃｈｅｎｇ，１９９３）。
【０１０９】
ラミニン−１は体輻相互作用または異なるアイソフォームの間の双方を含む重要な相互作用多数に関与している。これはまた細胞膜受容体を介したタンパク質複合体と細胞膜の間に架橋を形成する細胞外マトリックスの他のタンパク質と相互作用するか、或は、数種のインテグリンおよび非インテグリンの受容体を介して細胞と直接相互作用する（Ｋｒｅｉｓ＆Ｖａｌｅ，１９９９）。ラミニン−１に帰属する重要な生物学的機能には、細胞接着、細胞遊走、細胞分化および増殖の促進、ニューライト派生の増強、細胞形状の調節、および、種々の細胞型の細胞極性の樹立が包含される（Ｍａｒｔｉｎ＆Ｔｉｍｐｌ，１９８７，Ｔｉｍｐｌ，１９８０，Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｅｎｇｅｌ，１９９２）。
【０１１０】
ラミニン−１の種々の生物学的活性はタンパク質分解フラグメント、組み換えフラグメントまたはサブユニットおよび短合成ペプチドを用いて特性化されている（Ｙａｍａｄａ＆Ｋｌｅｉｎｍａｎ，１９９２，Ｙａｍａｄａ，１９９１，表２）。例えば、ラミニンのα鎖から誘導した配列ＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号３１）はＰＣ１２細胞によるニューライト伸長の活性を促進した（Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。さらに、この配列（下線）を含むペプチドＣＳＲＡＲＫＱＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号３２）はヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）によるマトリゲルのマトリックスの分解を誘導し、そしてザイモグラム分析によれば基底膜のリモデリングおよび／または分解における中心的酵素であるコラゲナーゼＩＶ活性が示された（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０１１１】
β１鎖に位置する配列ＹＩＧＳＲ（配列番号３３）、ＰＤＳＧＲ（配列番号３４）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）は細胞の接着を促進し、そしてさらに、ＹＩＧＳＲ（配列番号３３）は細胞の遊走およびヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管形成を促進した（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｋｕｂｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ラミニンγ１鎖に由来する配列ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ（配列番号３６）もまたＨＵＶＥＣの接着と管形成、並びにニューロン細胞の接着およびニューライトの派生を促進し、ラミニン−１が異なるドメインを介して種々の細胞受容体と特異的に相互作用していることが示唆される（Ｎｏｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｏｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１１２】
コラーゲンＩＶ。コラーゲン性のタンパク質はその主要機能としての構造的役割を有する細胞外マトリックスタンパク質のスーパーファミリーを構成している。全てのコラーゲンは三重螺旋のコンホーメーションを有するドメインを有する。このようなドメインは各々が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎの反復配列モチーフを含有する３サブユニット（α鎖）から形成される。
【０１１３】
コラーゲンＩＶは基底膜の主要コラーゲン性成分であり、ラミニン、ニドジェンおよびヘパランスルフェートプロテオグリカンを含む他の基底膜成分との相互作用が関与するネットワーク構造を形成する（Ｋｒｅｉｓ＆Ｖａｌｅ，１９９９）。コラーゲン分子は２α１（ＩＶ）鎖および１α２（ＩＶ）鎖よりなる。コラーゲンＩＶは直接の低親和性相互作用によりラミニンを介して間接的に（Ｙｕｃｈｅｎｃｏ＆Ｏ’Ｒｅａｒ，１９９４，Ｃｈａｒｏｎｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、または、ラミニンに堅固に結合する約１５０Ｋｄａの糖タンパク質であるニドジェンにより媒介される強力な結合により（Ｐａｕｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｏｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、細胞と相互作用すると考えられており、コラーゲンＩＶに対する結合部位も有している（Ｔｉｍｐｌ，１９９６）。ＩＶ型コラーゲンはまたヘパリンおよびヘパランスルフェートプロテオグリカンとも結合する（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ＆Ｏ’Ｒｅａｒ，１９９４，Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｋｏｌｉａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。
【０１１４】
多くの細胞型がＩＶ型コラーゲンに接着し、その内部のペプチド配列は特定の生物学的活性を有する。例えばペプチドＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）は用量依存的にヘパリンおよび未損傷のＩＶ型コラーゲンに特異的に結合することがわかっており（Ｋｏｌｉａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、そしてさらに、同ペプチドはまたウシ大動脈内皮細胞の接着および展開を促進できる（Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ペプチド配列はまたＩＶ型コラーゲンマトリックスの組立を、両者が溶液中に共存してインキュベートされる場合に抑制している。即ちこのＩＶ型コラーゲン誘導ペプチド配列の役割は多様であり、マトリックスの組立、ヘパリン結合および細胞付着に影響している（Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０１１５】
ニドジェン。ニドジェン（以前は文献中でエンタクチンと称せられていた）は５６残基の１モジュール（ＬＥ）によりラミニン−１γ鎖に結合する１ポリペプチド鎖よりなる（Ｐｏｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ニドジェンはまた別のエピトープを介してＩＶ型コラーゲンと相互作用し、基底膜においてラミニン−１とＩＶ型コラーゲンとの間のリンカー分子として機能すると考えられている。さらに、ニドジェンはインテグリン分子を介した細胞連結部位として機能するＲＧＤ配列を含有している（Ｔｉｍｐｌ，１９８９）。
【０１１６】
プロテオグリカン。プロテオグリカンは細胞の表面を含む種々の位置、細胞内嚢胞の内部に存在するタンパク質のセットであり、細胞外マトリックスに取り込まれる。それらは共通の翻訳後の修飾、多糖類の特殊な型、グリコサミノグリカンのファミリーの存在により定義されて分類される。プロテオグリカンは１〜数１００個のグリコサミノグリカン鎖を担持した小型または大型のポリペプチド鎖（１０〜４００ｋＤａ）よりなることができるコアタンパク質を含む巨大分子の多様なセットである。プロテオグリカンは多くの知られた活性を有している。中でも、他の細胞外マトリックスタンパク質と結合することにより細胞−細胞および細胞−マトリックスの相互作用を調節することがわかっている。細胞外マトリックスの組立および構造を調節し、そして保存および放出のコンパートメントとしての細胞外マトリックス内に拡散性分子を固定化する（Ｋｒｅｉｓ＆Ｖａｌｅ，１９９９）。
【０１１７】
別の基底膜成分。上記したタンパク質のほかに、多くの他のタンパク質が基底膜中に存在し、意味のある役割を果たしている。それらにはパーレカン、アグリン、Ｂ−４０／ＳＰＡＲＣ、フィビュリン−１、フィビュリン−２が包含される（Ｔｉｍｐｌ  １９９６，およびその参考文献）。これらに関連する多くのタンパク質も発見されている。
【０１１８】
血管系およびＥＣＭ。血管内皮細胞は全身循環と軟組織との間の界面を与え、そして炎症、凝固および脂血を含む重要な過程に関与している。血管内皮細胞もまたアテローム性動脈硬化症〜糖尿病性腎症に渡る多様なセットの病的状態において役割を果たしている。既存の血管の伸長および／または既存の血管からの新血管の形成（血管形成）は組織の修復および再生並びに胚の発生において本質的な役割を果たしている。一般的に、これらの過程には栄養および酸素を供給し老廃物を細胞から除去する三次元の血管ネットワークの形成が含まれる。血管形成は過去２０年に渡り集中的な研究の対象となっている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，２０００，Ｈａｎ＆Ｌｉｕ，１９９９）。
【０１１９】
血管化された三次元の構造の生成は今日では組織工学における主要な課題の１つとなっている（Ｅｉｓｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。細胞はそれらが血液供給の〜１００〜２００μｍ内に位置する場合にのみ栄養の拡散により生存を維持できる（Ｃｏｌｔｏｎ，１９９５）。栄養および酸素が拡散により送達できる皮膚のような薄膜構造を超えた組織工学用途における使用のための人工血管ネットワーク（Ｃａｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）または軟骨のような非血管の組織を創生する方法を開発することが望ましい。
【０１２０】
血管の一般的構造は、薄膜である細胞外マトリックスの基底膜により伏在する平滑筋細胞から分離された細胞の単層を形成するコブルストーン形態を有する平板化された内皮細胞の内張りを含む（図８）。内皮細胞は血小板の接着に反発する負の外部電荷を有し、アンチトロンビンＩＩＩに結合するグリコサミノグリカン並びに内皮細胞の抗凝固および線溶活性を促進する組織プラスミノーゲン活性化物質を生産する。殆どの他の基底膜に共通して、血管の基底膜は主にラミニン−１、ＩＶ型コラーゲン、ニドジェンおよびプロテオグリカンよりなる。内皮細胞の挙動は基底膜との相互作用により影響されることは十分明らかにされている（Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｔａｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｋｕｂｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｋａｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｏｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｏｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍａｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１２１】
内皮細胞の機能。内皮細胞の単層は、特に非血栓形成性の表面を与えることによる血流の促進、代謝産物に対する透過性障壁および輸送界面となること、炎症応答をモジュレートすること、血管平滑筋および心筋の収縮性をモジュレートすること、および、血管の張力および止血を調節することを含む複数の機能を有している（Ｂｏｅｙｎａｅｍｓ＆Ｐｉｒｒｏｔｏｎ，１９９４，Ｃｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１２２】
内皮細胞は継続的に自身の基底膜を生成、分泌およびリモデリングし、そしてまた血管の張力および止血に寄与する血管作用性のオータコイド（Ｇｒｅｅｋ  ａｕｔｏｓ−ｓｅｌｆ  ａｎｄ  ａｋｏｓ−ｒｅｍｅｄｙより）も合成する。酸化窒素（ＮＯ）は最も知られた血管拡張剤の１つである。生物学的な系においては、ＮＯはもう１つの反応生成物Ｌ−シトルリンがあれば酸化窒素シンターゼの作用によりＬ−アルギニンから合成される。別の強力な血管拡張剤および血小板凝集抑制剤はプロスタサイクリン（プロスタグランジンＩ２、ＰＧＩ２とも称する）である。ＰＧＩ２はエイコサノイドのファミリーに属し、プロスタサイクリン合成酵素によりプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）を介してアラキドン酸から形成される。２１アミノ酸ペプチドであるエンドセリン−１（ＥＴ−１）は血管収縮を促進することがわかっている。これらの３物質は（そして恐らくは他のものも）共に血管張力調節物質として機能する。
【０１２３】
健常な内皮の欠如は血栓のような主要な血管の病態に寄与することがわかっている。例えば平滑筋内皮細胞の単層の破壊はアテローム性動脈硬化症のプラーク中に存在する脂質および他の物質の付着により起こる場合があり、そして／またはアテローム性動脈硬化症の患部の発生に寄与している（Ｃｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。内皮細胞のコンフルエントの単層の存在は血栓耐性を改善する場合がある。これはまた擬似内膜過形成のような他の疾患を、例えば平滑筋の収集および／または増殖に寄与する可能性がある生物活性因子を放出する血小板の接着を防止することにより、防止すると考えられる。さらにまた平滑筋内皮細胞単層を形成する能力は血管形成術、カテーテル挿入等のような侵襲性の処置の後の内皮の一体性を回復するために有用である。従って、かなりの作業が現在、インビトロおよびインビボの両方における内皮細胞形成の研究に向けられている。
【０１２４】
多くの研究者等は血管形成における細胞外マトリックスの役割を研究している。このような研究の多くではマトリゲル、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍から得られた基底膜誘導材料またはコラーゲンのような細胞外マトリックス誘導材料に対するＥＣの挙動の観察を行っている（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。管形成のような血管形成の過程は２Ｄおよび３Ｄのシステムの両方において研究されている（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。数種の合成ペプチドとのＥＣの相互作用（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｏｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｏｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）も検討されている。
【０１２５】
インビボに存在する生理学的条件を模倣した環境においてＥＣ細胞を播種することは、ＥＣ細胞を従来の基板上に播種した場合の状況と比較して、上記したもののような種々の血管拡張性および血管収縮性の物質の生産を刺激（Ｇｌｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｕｓｓｅ＆Ｆｌｅｍｉｎｇ，２００３）および／または管形成のような種々の血管形成過程を促進することができる。上記したとおり、未修飾ペプチドの自己集合により形成された足場は多くの点においてインビボの環境を複製する環境を与える。本発明者等は生物学的に活性なペプチドモチーフを取り込むような自己集合ペプチドの修飾はＥＣの細胞外微小環境を模倣する基底膜類縁体として機能するその能力を増強するという仮説を有している。
【０１２６】
実施例において記載する通り、本発明者等は種々の修飾ペプチドを作成し、細胞培養、組織工学または細胞を用いるか用いない治療用途のような目的のために使用される巨視的構造に組立てられるその能力について試験した。意外にも、広範な修飾が足場形成を妨げることなく実施できることがわかった。本発明者等はこれらの新しい生体模倣材料がヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の単層の形成、生育および機能を支援する能力について試験した。多くのペプチドモチーフの添加は修飾ペプチドから形成した足場の存在下で培養した場合にＨＡＥＣの挙動の改変により顕在化される通りペプチドに対して新しい生物学的活性を与えた（実施例２）。足場により細胞に提示されるペプチドモチーフの有効濃度を改変すれば細胞に対する作用が改変されることがわかった。試験したペプチドについては、自己集合ペプチドの一部のみが生物学的に活性なペプチドモチーフを取り込む複合足場が、細胞の機能的活性を増強する観点では好ましいと考えられる。
【０１２７】
本発明者等は修飾された自己集合ペプチドＹＩＧ、ＲＹＶまたはＴＡＧ（実施例２に記載する通り未修飾ペプチドＲＡＤ１６−Ｉとブレンド）を含む足場が未修飾のペプチドから作成した足場上における単層の形成と比較して単層の形成の増大を支援したが、ＨＡＥＣを従来のプラスチック基板上で培養した場合に起こるものよりも広範にＮＯ放出および基底膜成分（ラミニン１およびＩＶ型コラーゲン）の合成も支援したことを発見した。未修飾または修飾ペプチド足場上の細胞の成育および形態特徴はまた、細胞を天然の細胞外マトリックス材料、即ちマトリゲル（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から得られた材料またはＩ型コラーゲンコーティング表面上で培養した場合の細胞の成育および形態特徴と比較した（実施例２）。定性的には、単層の形成、形態特徴および細胞数は修飾ペプチド足場上ではマトリゲルまたはコラーゲン上の外観と同様であるように観察された。ＨＡＥＣはコンフルエントに達し、典型的なコブルストーンの形態特徴を示した（図１６）。これとは対照的に、未修飾ペプチド（ＲＡＤ１６−Ｉ）から形成した足場上で生育させたＨＡＥＣはコンフルエントには達せず、単層内に大型の空隙を示していた（図１６）。
【０１２８】
さらにまた、可溶性ペプチドモチーフとの競合により増殖速度が未修飾ＲＡＤ１６−Ｉペプチドから形成した足場上で観察されたものと同水準にまで低下したことがわかり、培養基板によるペプチドモチーフの提示が有意であったことを示唆していた。図１７の棒グラフに示されるとおり（実施例２参照）、添加された可溶性の生物学的に活性なペプチドの非存在下においては、１００％ＲＡＤ１６−Ｉペプチドから形成したペプチド足場上のＨＡＥＣの増殖はペプチドブレンドから形成した足場上の増殖よりも約２〜２．５倍、有意に低値であった。可溶性の生物学的に活性なペプチドをそのペプチドを含有する足場上で生育させている培養物に添加することにより、ＨＡＥＣの増殖は未修飾ＲＡＤ１６−Ｉ足場上と概ね同様の水準まで低下される。重要な点は、データはまた、ＨＡＥＣを特定の生物学的に活性なアミノ酸ドメインを有するペプチドを含有する足場上で培養した場合、競合は、同じアミノ酸ドメインが可溶性形態で提供された場合に、換言すれば足場を含むナノ繊維上の同じ配列タグと競合することにより、細胞増殖を低減するのみである。
【０１２９】
表２は種々の系において生物学的な活性を有することがわかっている種々のペプチドモチーフをモチーフが天然に存在するタンパク質および観察された生物学的活性と共に示している非限定的な例である。これらのペプチドモチーフの何れも自己集合ペプチドの修飾のための第２のアミノ酸ドメインとして使用できる。これらのペプチドモチーフの特定のものは活性ドメインであると考えられるサブ配列を含んでおり（例えばＩＫＶＡＶ（配列番号４８）は列挙した最初の２つのペプチド内に含有される）、これも使用してよい。これらのモチーフおよび他のものの何れも、修飾されたペプチドを実際に合成し、そして、未修飾ペプチドの自己集合をもたらす条件下において自己集合して例えばβシート、ナノ繊維および／または巨視的構造、好ましくはゲルを形成する能力を調べることにより試験しなければならない。このような試験を実施するための方法は後に記載する通りであり、試験自体は日常的実験以上のものを必要としない。即ち、多様なセットのアミノ酸ドメインを自己集合を妨害することなく前記した自己集合ペプチドに添加できることを示す本明細書の記載は、多くの他の適当なアミノ酸ドメインの識別を支援するものである。即ち、本発明は（ａ）自己集合を媒介する第１のアミノ酸ドメイン、ただしそのドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして未修飾形態で存在する場合には自己集合して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むものであるものを含む自己集合ペプチドを、単離された形態で自己集合しない第２のアミノ酸を添加することにより修飾すること；および（ｂ）得られたペプチドを試験してそれが自己集合するかどうか調べること、を含む自己集合ペプチドの選択方法を提供する。試験は未修飾の自己集合ペプチドの自己集合に適する条件下において実施できる。好ましくは、自己集合してβシート、ナノ繊維および／または巨視的構造になる修飾されたペプチドを選択する。
【０１３０】
（表２．基底膜タンパク質およびその生物学的活性）
【０１３１】
【表２】
2011046741.tif 000004
表２に列挙したものに加えて広範な種類の別のペプチドモチーフの何れかを未修飾の自己集合ペプチドを修飾するための生物学的に活性なペプチドモチーフとして使用できる。モチーフは多様な種類の天然に存在するタンパク質およびペプチド、例えばＥＣＭ成分、細胞接着分子、細胞表面受容体、成長因子、サイトカイン、ケモカイン等の何れかから誘導してよい。ＲＧＤ配列はフィブロネクチン中に存在するプロトタイプの細胞認識配列であり、インテグリンにより認識され細胞の連結を媒介することはよく知られている。ＬＤＶは別のこのようなモチーフである。
【０１３２】
多くの別の生物学的に活性なペプチドが本明細書において引用する種々の参考文献に記載されるとおり発見されている。例えばＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号４９）はラミニン−１（γ鎖）からも誘導される活性ペプチドである（Ｌｅｉｓｉ，Ｐ．，Ｎａｒｖａｎｅｎ，Ａ．，Ｓｏｏｓ，Ｊ．，Ｓａｒｉｏｌａ，Ｈ  ａｎｄ  Ｓｎｏｕｎｏｕ，Ｇ．，（１９８９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４４：１４１−１４８）。配列ＹＶＲＬ（配列番号５０）、ＩＲＶＴＬＮ（配列番号５１）、ＴＴＶＫＹＩＦＲ（配列番号５２）およびＳＩＫＩＲＧＴＹ（配列番号５３）を含むペプチドを包含する細胞結合を媒介する生物学的に活性なペプチドモチーフは、マウスラミニンγ１鎖の配列から誘導された合成ペプチドの系統的スクリーニングにより識別されている（Ｎｏｍｉｚｕ１９９７）。多くの生物学的に活性なペプチドドメインが種々のラミニンα鎖のＮ末端ドメイン中に発見されており、例えばＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号５４）、ＦＱＩＡＹＶＩＶＫＡ（配列番号５５）、ＧＱＬＦＨＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号５６）、ＦＨＶＡＹＶＬＩＫＡ（配列番号５７）およびＬＥＮＧＥＩＶＳＬＶＮＧＲ（配列番号５８）が挙げられる（Ｎｏｍｉｚｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１３３】
ＨＡＶは細胞接着タンパク質Ｎ−カドヘリンから誘導され、そして軸索と関連グリア細胞の間の相互作用を媒介することがわかっている（Ｓｃｈｅｎｓｅ，ＪＣ  ａｎｄ  ＨｕｂｂｅｌｌＪＡ（１９９９），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０：７５−８１）。ＲＥＤＶ（配列番号５９）は内皮細胞上には存在するが血小板上には存在しない内皮細胞インテグリン受容体α４β１に特異的であると考えられているフィブロネクチン由来の接着リガンドである（Ｈｕｂｂｅｌｌ，ＪＡ．，Ｍａｓｓｉａ，Ｓ．Ｐ．，Ｄｅｓａｉ，ＮＰ，Ｄｒｕｍｈｅｌｌｅｒ  ＰＤ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５６８−７２））。ＬＧＴＩＰＧ（配列番号６０）およびＤＧＥＡ（配列番号６１）は細胞接着を媒介することがわかっている別の配列である（Ｙａｍａｄａ，１９９１）。ＧＶＧＶＰ（配列番号６２）はエラスチンにおいて反復形態で存在するドメインであり、細胞接着を媒介する。ＧＶＧＶＡＰ（配列番号６３）は単球を誘引する化学誘引物質である。生物学的に活性なペプチドドメインは特定の種、例えばヒト、マウス、ラットにおいて検出されるタンパク質のバージョン中に識別してよいが、他の種の細胞に関しても同様に生物学的活性を示す場合があり、種々の細胞型および種の細胞を用いて試験できる。ＨＵＶＥＣの連結および／または管形成の試験において活性であったラミニンα１、β１またはγ１鎖から誘導された多数のペプチドが識別されている（Ｍａｌｉｎｄａ  １９９９；Ｐｏｎｃｅ１９９９）。
【０１３４】
生物学的に活性なペプチドモチーフとして使用するための候補ペプチドが本発明のペプチド足場内に取り込まれた場合に細胞過程の多くのうちの何れかに影響する能力について試験してよい。特定の有用な試験は以下に記載する通りである。候補ペプチドの改変されたバージョンもまた未修飾の自己集合ペプチドを修飾するために使用することができ、そしてこれらの改変された候補ペプチドを含む足場を対照として使用することができる。ある範囲の異なるペプチド濃度が試験でき、種々の組み合わせを使用できる。
【０１３５】
ペプチドは多くの基準、例えばＹａｍａｄａ（１９９１）が記載したものに従って生物学的に活性なペプチドモチーフとして識別できる。Ｙａｍａｄａは接着性認識配列の場合の生物学的関連性に関する試験を記載しているが、示された基準はより広範に適用してよい。推定される活性ペプチドモチーフは、担体（例えばＩｇＧ、アルブミン、ビーズ）へのコンジュゲートの後に配列を含有する合成ペプチドが活性をディスプレイすれば、ガラス、プラスチックのような基板上に直接吸着された場合に不活性であっても、それらは基板にコンジュゲートされた場合にも活性をディスプレイするため、生物学的に該当するものとして識別してよい。生物学的に活性なペプチドモチーフの可溶性形態はモチーフが天然に含まれる未損傷のタンパク質の機能を競合的に抑制する場合がある。ペプチド配列の改変はペプチドの機能を排除する場合がある。例えばペプチドが天然に含まれるタンパク質の部位指向性の突然変異誘発または合成ペプチドのアミノ酸置換は生物学的活性を消失させる場合がある。抗ペプチド抗体はモチーフが天然に含まれるタンパク質の機能を排除する場合がある。生物学的に活性なペプチドは、同じ細胞受容体またはペプチドを含有する天然に存在するタンパク質としての天然に存在する生体分子に結合する場合がある。
【０１３６】
上記したもののような天然に存在するタンパク質から配列が誘導されるアミノ酸ドメインの他に、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、ペプチド神経伝達物質、身体内に含まれる他の生物学的に活性なペプチド等に由来するアミノ酸ドメインも使用できる。例えば上記参考文献のＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ  ２００１および上記参考文献のＫａｎｄｅｌ  ２０００を参照できる。
【０１３７】
（Ｂ．生物学的活性に関する試験）
本セクションは候補ペプチドが生物学的に活性なペプチドモチーフを含むかそれよりなることを調べるために使用できる種々の試験を説明する。以下に記載する試験は例示を目的とするのみであり、そして当業者は目的の細胞型および細胞の挙動に応じて、種々の別の試験および本明細書に記載した試験の変法を選択して使用できる。これらの試験のいずれにおいても、可溶性ペプチドを対照として使用できる。ある範囲のペプチド濃度（基板結合、修飾された自己集合ペプチドの部分としての存在の両方、または可溶性形態）を使用してよい。
【０１３８】
さらにまた、細胞の表現型、細胞の生存性または増殖、細胞の表現型および／または細胞の機能的状態または種々の細胞の挙動の種々の指標の何れかを評価および／またはモニタリングすることが望ましい場合がある。当該分野で知られている通り、細胞の生存性、増殖を評価するため、および、細胞の挙動および表現方の種々の特徴を評価するための多くの方法がある。一般的に何れかの適切な方法を使用して本明細書に記載した条件下に細胞を培養することの作用を検査および評価してよい。さらにまた、細胞／ヒドロゲル組立て物の全体的組成および特性に対する細胞の作用をモニタリングしてよい。タンパク質含有量、強度等の側面を調べることができる。
【０１３９】
細胞の生存性および増殖。細胞の生存性は生体染料排出（例えばトリパンブルー排出）を調べることにより評価してよい。細胞分裂は光学顕微鏡で観察してよく、そして有糸分裂像の存在により示される。分裂に伴う細胞数の増大もまた、例えば血球計を用いて計数することにより、観察してよい。細胞の丸型化のような形態学的変化もまた分裂に伴う。ＤＮＡ合成は種々の物質、例えば放射標識ヌクレオチド（例えば３［Ｈ］チミジン）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等のＤＮＡへの取り込みを検出および／または測定することによりモニタリングしてよい。多くの他の試験も使用可能である。例えばＭＴＳ試験によれば、ＭＴＳ試薬（テトラゾリウム塩）を生存細胞に適用した場合、それは４９０ｎｍの発光を伴いながら着色化合物（ホルマザン）に変換される。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ生存性／細胞毒性試験キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｌ−３２２４）のようなキットが広範に使用されている。増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のような細胞の増殖を示すタンパク質に結合する抗体を用いた免疫染色もまた使用できる。アポトーシスを評価するための方法は当該分野でよく知られており、目視による検査、ＴＵＮＥＬ、および、ｍＲＮＡまたはアポトーシスに伴うタンパク質、例えばカスパーゼの測定が包含される。
【０１４０】
細胞の連結。ペプチドの細胞連結促進活性を測定するための好都合な方法は、ペプチドをビーズ（例えばセファロースビーズ）にコンジュゲートし、そして、細胞を官能性付与されたビーズの存在下、可溶性ペプチド添加または無添加でインキュベートすることである。非官能性付与ビーズを対照として使用できる。インキュベーションの後、ＥＤＴＡ含有溶液による処理のような種々の方法を用いて細胞を脱着させ、染色し、そして顕微鏡ＦＡＣＳ等で分析することができる（詳細はＮｏｍｉｚｕ  ２００１参照）。同様の方法を用いて修飾および／または未修飾の自己集合ペプチドを含む足場への細胞の連結を試験することができる（実施例２参照）。
【０１４１】
細胞の形態特徴および展開。細胞の展開には細胞型により異なる多くの形態学的側面が関与している。例えば、ヒト包皮線維芽細胞は典型的には展開時には伸長された多角形の細胞の形状をとり（Ｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９８）、そして組織化されたＦアクチン張線維ネットワークをディスプレイする（後述参照）。細胞の形態特徴は光学顕微鏡で評価でき、そして修飾ｖｓ未修飾の足場上および／または競合する可溶性ペプチドの存在下または非存在下に展開する細胞に特徴的な形態をとる細胞の数を調べることができる。
【０１４２】
細胞足場の組織化。特定のペプチドは細胞の形状および遊走に影響する細胞足場の組織化に作用する。細胞内部のＦアクチン張線維の組織化はローダミンコンジュゲートファロイジン染色により調べることができる（Ｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌ，１９９８）。例えばペプチド足場上に培養した細胞を４％ホルムアルデヒド溶液中に固定し、透過性とし（例えばＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００）、ローダミンコンジュゲートファロジンとともにインキュベートし、再度固定する。次にそれらを例えばエピ蛍光顕微鏡を用いて顕微鏡的に可視化することができる。
【０１４３】
細胞の遊走。本発明の修飾された自己集合ペプチドを含む足場を包含する種々の基板の上またはこれを通過する細胞の遊走を定量するための多くの試験法が使用可能である。例えば、遊走は細胞を基板上、例えば修飾された自己集合ペプチドを含む足場上で、障壁の存在下に培養するフェンススタイル試験を用いて評価できる。障壁の位置を記録する。次に障壁を除去し、細胞を所定時間維持する。所定時間内に障壁を通過する細胞の数を細胞遊走の測定値とする。数値は基板により異なる細胞の増殖を考慮して補正する。上記した方法の変法においては、後に除去する障壁により容器の領域を分離することにより異なる表面２つ以上を含む基板を作成できる。種々の表面への示差的遊走を評価できる。遊走はまた、平滑筋細胞（Ｍａｎｎ  ２００２）およびヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（Ｓａｇｎｅｌｌａ  ２００４）について記載されている通り放射状テフロン（登録商標）フェンス遊走試験を用いて定量することもできる。
【０１４４】
細胞の分化、脱分化および相互分化。これらの特徴は形態特徴を含む多くのパラメーターに基づいて評価できる。細胞の分化、脱分化および相互分化はまたマーカーとして知られている特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在を検出および／または測定することによっても評価してよい。後者の方法は広範に使用されており、多くの異なる細胞型に特徴的な細胞マーカーが識別されている。ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現は当該分野で知られた手法で検出してよい。例えばｍＲＮＡはノーザンブロット、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ等を用いて検出し、定量してよい。タンパク質の発現は免疫ブロッティング分析、免疫蛍光分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ分析等を用いて検出し、定量してよい。このような免疫学的手法はタンパク質に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用してよい。
【０１４５】
マーカーの種類は膨大であり、新しいマーカーが日常的に発見されている。例えばネスチンは神経上皮ニューロン前駆体幹細胞中で発現される中間フィラメントタンパク質であり、その発現はニューロンの成熟と共に低減される（Ｌｅｎｄａｈｌ  １９９０）。ネスチンは未成熟ニューロンのマーカーと考えられ、そしてネスチン陽性細胞はニューロンまたはグリアのいずれかに分化できる。ＮｅｕＮは有糸分裂後の細胞中で発現されるニューロン特異的マーカーである（Ｓａｒｎａｔ  １９９８）。グリアフィブリルアレイ酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は伝統的なグリア星状細胞マーカーである。ベータＩＩＩチュブリンは別のニューロン特異的タンパク質である。ＣＹＰ４５０タンパク質の発現は肝細胞に特徴的である。
【０１４６】
本発明の範囲において特に重要なものは、血管内皮細胞尾を識別するため、および、血管内皮細胞の機能的活性を評価するために使用してよい。フォンビルブランド因子は血管内皮細胞の広範に認識されたマーカーである。血管内皮細胞に関する他のマーカーはＣＤ３１、ＤＣ１０２、ＣＤ１０６およびイソレクチンＢ４を包含する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＫＳ，１９９５；「Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ」Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｙｒｅ．Ｒｏｙ  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ（ｅｄ）．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．１９９６）。本発明の特定の実施形態においては、ペプチド足場は望ましくは血管形成を促進する。血管形成のマーカーは血管形成関連成長因子ＶＥＧＦ、アンジオポエチン１および２、およびそれらの受容体Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ２を包含する（Ｆｅｒｒａｒａ，２００１；Ｇａｌｅ  ａｎｄ  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，１９９９）。これらのマーカーの種々のものに結合する蛍光染料に直接コンジュゲートされたモノクローナル抗体は例えばＤａｋｏ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ等から入手可能である。
【０１４７】
機能的試験はまた細胞の表現型または状態を評価するためにも使用できる。例えば、細胞が特定の細胞型に特徴的な特定の分子の取り込み、生産または分泌を行える、または特定の細胞型に特徴的な酵素的反応を行える能力を評価できる。実施例に記載する通り、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびＮＯの放出は内皮細胞に特徴的である。
【０１４８】
ＥＣＭ成分の生産。ＥＣＭ成分の生産に対する種々の候補となる生物学的に活性なペプチドモチーフ、活性な生体分子、環境パラメーター、例えば機械的力の適用等の影響を評価すること、および／または、そのような成分の生産を経時的にモニタリングすることは特に有利である。このための種々の方法が使用できる。実施例３に記載する通り、ウエスタンブロット（または他の免疫学的方法）を用いてＥＣＭタンパク質の生産を定量できる。組織学的分析のためには、プロテオグリカン成分であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のトルイジンブルー染色を標準的操作法に従って実施できる。コラーゲンの付着は知られた手法を用いて測定できる（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２９７：１４１−１４７，１９９９；Ｄｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｔｈｏｐａｄｅ  ２９：９１−９９，２０００）。細胞外タンパク質の生産は［３Ｈ］−プロリンの培地への添加により測定できる。放射標識プロリンは細胞により取り込まれ、そして新しく合成されるタンパク質中に取り込まれる。放射標識培地中で一定時間（例えば１６〜２４時間）の後、遊離の［３Ｈ］−プロリンを洗浄により除去する。細胞外タンパク質は例えば約６０℃で一夜プロテイナーゼＫ溶液中でインキュベートすることにより消化し、消化タンパク質中に存在する放射能をシンチレーション計数により定量する。プロテオグリカンの生産は［３Ｈ］−プロリンの変わりに［３５Ｓ］−スルフェートを培地に添加する以外は同様に測定できる。ＧＡＧの総蓄積は結合したＤＭＭＢ染料の量の蛍光分析に基づいて測定できる（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６１（１）：１０３−１０８，１９８７）。
【０１４９】
神経系の試験。神経系の組織（例えば神経、グリア細胞）のインビトロの培養、神経系の組織の修復および再生のために有用な材料を開発することは大変興味深いことである。神経組織の機能の指標となる種々のパラメーターを測定できる。例えばニューライトの派生はペプチド足場の上面上で培養した単離細胞、例えばＰＣ１２細胞の顕微鏡観察（および場合によりデジタル画像処理）により評価できる（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。このような細胞もまた封入できる。別の方法は、ニワトリのような動物から摘出した脊髄神経節を封入し、種々の時点において神経節から伸長するニューライトの平均の長さを測定することである（Ｓｃｈｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ，１９９９；Ｓｃｈｅｎｓｅ  ＪＣ，Ｂｌｏｃｈ  Ｊ．，Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  Ｐ．，ａｎｄ  Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：４１５−４１９）。シナプス形成は例えばＨｏｌｍｅｓ，２０００に記載の通り評価することができる。神経伝達物質および神経伝達物質の合成に関与することがわかっている酵素の生産は神経組織の機能的活性を評価する別の手段を与える。
【０１５０】
内皮細胞の新芽形成。大動脈輪をラットのような動物から単離し、一定期間ペプチド足場上で培養して新芽形成させ、その後固定して顕微鏡検査する大動脈輪試験を用いて候補の生物学的に活性なペプチドが血管形成の重要な特徴である内皮細胞新芽形成を誘導する能力を定量することができる（Ｍａｌｉｎｄａ，１９９９）。
【０１５１】
内皮細胞管形成。ペプチド足場の表面上または内部に封入してＥＣを培養した後の細胞の組織化およびキャピラリー様の構造の形成は種々の時点において、例えば播種後２時間、８時間、１２時間、２４時間、３日、１週間および２週間の時点で、ＷＯ２００３０９６９７２に記載の通り相関長を測定することにより定量できる。ヘマトキシリンおよびエオシン染色、Ｍａｓｓｏｎｅ３色、並びにアクチンに関する免疫染色により内皮細胞のクラスターの形成、新芽形成、キャピラリー様構造の形成を目視で評価できるようになる。キャピラリー様構造中の管腔の存在は目視により、および三次元画像化システムを含む自動画像化システムを用いることにより評価することができる。管形成の評価方法は当該分野で知られている（例えばＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１５２】
（Ｃ．生体分子相互作用モチーフ）
細胞の表現型および／または機能に影響する生物学的に活性なペプチドモチーフに加えて、やはり細胞の機能に影響する種々の他の生物学的に関連のあるモチーフを未修飾の自己集合ペプチドを修飾するために使用できる。特に天然に存在するタンパク質、例えば上記したようなＥＣＭの成分（タンパク質、プロテオグリカン、ＧＡＧ等）に結合することがわかっているペプチドモチーフを使用することが望ましい。特定の結合を媒介する多くのペプチドが発見されている。例えばペプチドＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）、ＬＡＧＳＣＬＳＡＲＦＳＴＭ（配列番号６４）およびＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号６５）はＩＶ型コラーゲン中に天然に存在し、ヘパリンン特異的に結合するものとして発見されている（Ｋｏｌｉａｋｏｓ，１９８９）。他のものは結合活性に関する合成ペプチドの系統的スクリーニング、ツーハイブリッドスクリーニング等により識別できる。
【０１５３】
別の例として、タンパク質切断部位を含むアミノ酸ドメインを使用できる。このようなアミノ酸ドメインはまた、切断部位の切断により生物学的に活性なペプチドが放出されるように生物学的に活性なペプチドモチーフを含んでよい。切断はまた例えば全体的な分解速度の改変、および／またはリモデリング、細胞遊走の促進等を行うペプチド足場の物理的特性を改変することができる。この点に関し、修飾ペプチド中の２つの自己集合ドメインの間にアミノ酸ドメインを含むことが望ましい。
【０１５４】
ＥＣＭリモデリング、細胞遊走等に関与するＥＣＭ中に共通して存在するプロテアーゼのための基質として作用できるプロテアーゼの切断部位は、特に有利である。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびＡＤＡＭ（ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーのメンバーを例示できる。ペプチドＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号６６）はＭＭＰファミリーの数種のメンバーのための急速分解基質であり、ウシおよびニワトリのＩ型コラーゲンのα（１）鎖中に存在する配列ＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号６７）から誘導される（Ｎａｇａｓｅ  Ｈ．，Ｆｉｅｌｄｓ  ＧＢ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９６），４０：３３９）。切断は両方の配列の隣接するＧおよびＩ残基の間でおこる。このモチーフは天然に存在するペプチドモチーフの改変を用いてアミノ酸ドメインに対し特定の所望の特性、この場合は分解速度の増大を付与する状況の一例を与えるものである。種々のＭＭＰのため、および、エラスターぜおよび種々のカテプシン（カテプシンＬ、Ｂ、Ｋ）のための別の切断部位が発見されている（ヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメイン中）（Ｆｅｒｒｅｒａｓ，Ｍ，Ｆｅｌｂｏｒ，Ｕ，Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｔ，Ｏｌｓｅｎ，ＢＲ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｉｓｓｅ，Ｊ−Ｍ，（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８６，２４７−５１）。ＬＩＫＭＫＰ（配列番号６８）はプラスミンの機能的基質である（切断はＫとＭの間で起こる）。このような切断部位を取り込んだアミノ酸ドメインまたは他の当該分野で知られたものを使用できる。
【０１５５】
使用してよい別の生体分子相互作用モチーフは抗体に対する結合部位を包含する。ペプチドの自己集合部分を修飾するために使用する小型アミノ酸ドメインは治療用の抗体、標識抗体等を含む広範な抗体の結合のためのエピトープとして機能できる。このような抗体はインビボで自己集合する前に、または、インビボの組立てのために身体内に溶液を導入する前に、ペプチド溶液に添加することができる。或は、抗体は本発明のペプチド足場を導入する被験体中に天然に存在する抗体であることができるか、または、そのような被験体に投与することができる。後者の場合、抗体は足場の部位に局在化させてよく、そこでそれらは治療上有用となり、そして／または分子、例えば治療用分子を足場の部位において送達する。標識された抗体は足場の可視化または足場の分解生成物のモニタリング等を容易にしてよい。
【０１５６】
（Ｄ．無機分子結合ドメイン）
本発明の特定の実施形態においては、無機の原子または分子に結合するアミノ酸ドメインを本発明の自己集合ペプチドの非自己集合部分として使用する。多くのこのようなアミノ酸ドメインが天然に存在するタンパク質中に発見されており、多くの他のものがファージディスプレイ（後述参照）のような種々の選択手法を介して発見されている（Ｓａｒｉｋａｙａ，２００４）。多数の他の無機結合ペプチドが知られている（Ｓａｒｉｋａｙａ，２００４；Ｂｒｏｗｎ  １９９７；Ｗｈａｌｅｙ  ２０００等）。Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ、ＳｉＯ２、ＺｎＯ、ＣｕＯ２、ゼオライト、ＣａＣＯ３、Ｃｒ２Ｏ３、ＦｅＯ３、ＧａＡｓ、ＺｎＳに結合するペプチドが発見されている。このような化合物は重金属、半導体を包含し、そして、特定の結晶構造および表面への選択的結合を示す場合すらある。これらのアミノ酸モチーフを取り込んだペプチドはナノエレクトロニクス、ナノフォトニクスおよびナノマグネティックスのような領域におけるナノテクノロジーにおいて広範に使用される（Ｓａｒｉｋａｙａ，２００４）。このような無機結合ペプチドを含む自己集合ペプチドは自己集合がナノテクノロジーにおける基本的原理であることが広範に知られているため、特に利用性が高い。
【０１５７】
カルシウムまたはリンのような骨中に存在する無機物質に結合するアミノ酸ドメインは組織修復の範囲において特に関連性を有している。ヒドロキシアパタイトの付着の核となるペプチドが発見されている。例えば、アミノ酸配列ＤＤＳおよびＳＤは、例えばデンチン中でＥＣＭに緊密に関連して存在する広範にホスホリル化されるタンパク質であるタンパク質のホスホリンファミリー中に反復単位として存在し、ヒドロキシアパタイトの付着において重要な役割を果たすことが知られている（Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ  ２００１およびその参考文献）。ＤＳＳおよび／またはＳＤの単一または複数の反復を本発明のペプチドにおける非自己集合アミノ酸ドメインとして使用できる。このようなペプチドを含む足場は被験体に移植された場合に生体無機質化を促進する。
【０１５８】
（Ｅ．目的のアミノ酸ドメインの発見）
本発明のペプチドの非自己集合部分として使用してよい別のアミノ酸ドメインを発見するための１つの方法は細胞との相互作用、特定の分子への結合等が考えられる天然に存在するタンパク質の配列から誘導した合成ペプチドを系統的にスクリーニングすることである。この方法は上記したとおり多くの生物学的に活性なペプチドを発見するために使用されている。一般的に、一緒になって配列の全部分または大部分を包含している、場合により重複しているペプチドのセットを、インビトロで合成する。次に細胞または潜在的な結合分子を個々のペプチドと接触させ、そして細胞の応答、結合の程度等を評価する。ペプチドは検出を容易にするために標識することができる。
【０１５９】
一般的に、例えば上記した特定のタンパク質を含む何れかの天然に存在するタンパク質の配列から得られるペプチドをスクリーニングすることができ、生物学的に活性なペプチドモチーフＹＩＧＳＲ（配列番号３３）およびＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号  ３５）を含むラミニン−１および生物学的に活性なペプチドモチーフＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）を有するＩＶ型コラーゲンを例示できる。これらのタンパク質、関連するタンパク質、他の目的のタンパク質（例えば他のＥＣＭタンパク質）、タンパク質をコードする遺伝子等の完全な配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを有するウエブサイト参照）から入手可能なもののような公的データベースにおいて、例えばＥｎｔｒｅｚ検索エンジンを用いながら、当業者は容易に特定することができる。データベースは遺伝子またはタンパク質の名称により、ヌクレオチド配列（例えばＧｅｎＢａｎｋを検索することにより）またはタンパク質配列によるなどして検索できる。例えばＩＶ型コラーゲンをコードする遺伝子は「コラーゲン」の用語を用いてＧｅｎｅデータベースを検索することにより発見することができる。検索結果の代表的で非限定的な部分的セットを付録Ａに示す。結果には目的の候補アミノ酸ドメインを選択するもととなるタンパク質配列へのリンクが含まれる（リンクは除去されている）。付録Ｂは配列番号３３、配列番号３５および配列番号３７の配列を用いてタンパク質配列のデータベースを検索することにより得られた検索結果の非限定的なセットを示し、これらの配列に含まれるタンパク質を識別するアクセッション番号も含まれる。同様であるが同一ではない配列を含むタンパク質が容易に発見できる。
【０１６０】
上記したとおり、目的の他のタンパク質は別のＥＣＭタンパク質、例えば別の基底膜タンパク質を含む。異なる細胞型に対して特に適するペプチド足場は、細胞型が典型的に担持または包含されるＥＣＭ中に存在することがわかっているタンパク質をスクリーニングすることにより作成してよい。例えば異なる細胞型が共通して含まれる基底膜はラミニン、コラーゲン等の異なるアイソフォームを含有する場合がある。アミノ酸ドメインは目的の何れかの細胞型の細胞外環境に存在するタンパク質から選択できる。理論に制約されないが、これらのタンパク質はその細胞型の培養のため、および／または、その型の細胞を含有することがわかっているかその型の細胞を移植または誘引することが望まれる部位において身体内に導入するために好ましいものである。
【０１６１】
即ち、本発明は目的の細胞型に対するペプチド足場の形成のための自己集合ペプチドを設計するための方法を提供し、これは、その細胞型の細胞外環境（例えば細胞型が天然に担持または包含されるＥＣＭまたは基底膜中）に存在する天然に存在するタンパク質に存在するアミノ酸ドメインを発見すること、ペプチドが細胞上に対する生物学的作用を示すかどうか調べるためにこれをスクリーニングすること（ペプチド足場内に存在するか上記した別の態様で細胞の環境中に存在する場合）、修飾された自己集合ペプチドの第２のアミノ酸ドメインとしてアミノ酸ドメインを利用すること、および、修飾された自己集合ペプチドを含む足場が細胞の成育のために良好かどうか、改変された細胞の表面型をもたらすかどうか等を調べるためにこれを試験すること、を包含する。スクリーニング段階は省略することができ、即ち、候補ペプチドは、所望により、生物学的作用についてそれをまず試験することなく、修飾された自己集合ペプチドの部分として直接取り込むことができる。
【０１６２】
別の方法は、ファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイまたはリボソームディスプレイのようなペプチドライブラリを使用するディスプレイ手法を用いることである（Ｓａｒｉｋａｙａ  ２００４およびその参考文献を参照）。ファージディスプレイおよび細胞表面ディスプレイはファージまたは細胞の表面上に天然に存在するキメラタンパク質を使用する。キメラタンパク質は一般的には天然に存在するファージまたは細胞の表面のタンパク質の全てまたは部分、および、ファージまたは細胞により発現される核酸によりコードされるランダムなペプチド配列を含有する第２のドメインを含有する。核酸の部分は典型的には種々の分子生物学の手法のいずれかによりランダム化された後にファージまたは細胞（またはその前駆体）の内部に導入されるか、後に突然変異により改変されることができる。自身の表面上にキメラタンパク質の異なるバージョンを各々が発現しているファージまたは細胞のライブラリを標的（例えばリガンド（固定化されていてよい）または細胞の集団）に接触させる。接触段階の後、キメラタンパク質を発現する弱く結合した細胞またはファージを洗浄除去し、強力に結合しているものを残存させる。工程を反復することにより堅固に結合しているものをリッチ化する（バイオパニング）。指向性の進化を実施する種々の方法も用いることができる。
【０１６３】
有用なアミノ酸ドメインを発見するための別の方法は、既知の生物学的に活性なペプチドモチーフ、結合ペプチド等に対し、例えばアミノ酸１つ以上の置換により、限定された数量の突然変異を行うことである。これは出発配列と比較した場合に進歩した特性を有するペプチドを発見させる。本発明は１、２または３アミノ酸残基により本明細書に記載した配列とは異なる配列を有するアミノ酸ドメインの使用を包含する。
【０１６４】
（ＶＩ．自己集合ペプチドおよびそれを含む組成物の特性化）
本発明の未修飾の自己集合ペプチドまたは修飾された自己集合ペプチドまたはその組成物の何れかにより形成される構造（例えばナノ繊維、巨視的構造、ヒドロゲル）は種々の生物物理学的および工学的な手法を用いて特性化してよい。適当な手法は目視検査、円偏光二色性（ＣＤ）、動的光散乱、フーリエ変換赤外スペクトル分析（ＦＴＩＲ）、レオロージ試験、例えば振動レオメーター観察、原子力顕微鏡観察（ＡＴＭ）、走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を包含する。例えば生物物理学的方法を用いてペプチド足場内のβ−シートの二次構造の程度を測定してよい。さらに、フィラメントおよび孔径、繊維の直径、長さ、弾性および容量区分を走査および透過型電子顕微鏡観察の定量的画像分析を用いて測定してよい。
【０１６５】
ペプチド足場はまた膨潤の程度、足場形成に対するｐＨおよびイオン濃度の影響、種々の条件下での水和の程度、および、引張強度を測定する数種の標準的な機械的試験手法を用いて検査してよい。弾性率のようなパラメーターを測定できる。これらの方法により当業者等は後に記載するペプチドに対する種々の修飾および付加のどれが本発明の方法における使用に適するかを判断できる。実施例１は未修飾のペプチド（ＲＡＤ１６−Ｉ）、ＲＡＤ１６−Ｉの種々の修飾ペプチド誘導体、および、ＲＡＤ１６−Ｉと種々の修飾ペプチド誘導体の複合物から形成した構造（即ちＲＡＤ１６−Ｉおよび修飾ペプチドの両方が存在する溶液から形成した構造）を特性化するために使用した種々の方法を記載している。私用してよい特定の手法の非限定的な説明は後のセクションに記載する。
【０１６６】
例えば本明細書に記載したレオロジー試験を用いて定量的な態様でゲル形成を評価することに加えて、またはそれの代替として、より定量的な評価法、例えば単純な目視的検査を使用できる。ゲル形成の再現性のある評価法は、マイクロ遠沈管のような組成物を含有する容器の側面に材料を攪拌して摺上がらせることによりペーパークリップを用いて組成物をプロービングすることを包含する（Ｓｐｅｒｉｎｄｅ，ＪＣ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ＬＧ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００），３３：５４７６−５４８０）。組成物はそれがペーパークリップを捕獲すればゲル化を起こしたとみなすことができる。それ以上のゲル化またはゲル状態の可逆性は、別のプロービングにより評価できる。それ以上のゲル化はより強固で低粘度の材料をもたらす。
【０１６７】
レオメトリー。レオロジー測定はペプチド足場の粘弾性を試験するために実施できる。例えば試料を振動応力または振動歪に付す振動レオメトリーは、例えば周波数の範囲内で制御された歪において試料を剪断する制御された歪レオメーターを用いて実施できる。使用できる種々のレオメーターは市販されている。レオメトリーの原理およびゲルへのその適用は例えばＣｌａｒｋ，１９８７およびＫａｖａｎａｇｈ＆Ｒｏｓｓ  Ｍｕｒｐｈｙ，１９９８に記載されている。
【０１６８】
一般的にそのような試験の出力はＧ＊、即ち複合基準である。この複合基準は以下の通り定義される。
【０１６９】
Ｇ＊＝Ｇ’＋ｉＧ’’［等式１］
本等式中、Ｇ’は材料の弾性／固体特性を示す蓄積基準である。Ｇ’’は材料の粘性／液体特性を示す損失基準である。
【０１７０】
振動レオメトリーにおいて、粘稠な溶液の場合、複合基準の粘性成分、損失基準（Ｇ’’）は典型的には振動周波数が低減するに従って、そして蓄積基準Ｇ’が低値であれば低下する。ゲルについては、Ｇ’およびＧ’’は振動周波数に対して比較的一定である。例えば本発明の好ましい実施形態においては、動的周波数掃引試験により測定した場合、直線領域の周波数範囲にわたってはｄＧ’／ｄｗおよびｄＧ’’／ｄｗの桁数は２未満、より好ましくは１未満であり、ここでＧ’およびＧ’’はパスカル（Ｐａ）で測定し、ｗはｒａｄ／ｓの周波数を示す。周波数の範囲は例えば０．１〜１ｒａｄ／ｓ、１〜１０ｒａｄ／ｓ等であることができる。本発明の別の好ましい実施形態においては、動的周波数掃引試験により測定した場合、直線領域の周波数範囲にわたってはｄＧ’／ｄｗおよびｄＧ’’／ｄｗの桁数は０．５未満、０．２未満、または０．１未満であり、ここでＧ’およびＧ’’はＰａで測定し、ｗはｒａｄ／ｓの周波数を示す。
【０１７１】
ゲルの場合、Ｇ’は典型的にはゼロより高値である。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の修飾された自己集合ペプチドの自己集合により形成された組成物のＧ’は０．５Ｐａ以上である。本発明の他の好ましい実施形態においては、本発明の修飾された自己集合ペプチドの自己集合により形成された組成物のＧ‘は動的周波数掃引試験を用いて直線領域において測定した場合、１．０Ｐａ以上、５Ｐａ以上、１０Ｐａ以上、１０〜１００Ｐａまたは１００Ｐａ超である。直線領域は得具０．１〜１ｒａｄ／ｓ、１〜１０ｒａｄ／ｓ、または１０〜１００ｒａｄ／ｓであってよい。このような測定を行う場合、動的歪掃引をまず材料に対して実施することにより試験の直線的な粘弾性の領域を設定して動的周波数掃引試験のための固定された歪を選択してよい。この直線的な粘弾性の範囲は一般的には一定の基準Ｇ’およびＧ’’により定義される。この範囲内の歪を選択することは信頼性のある結果を得るために重要である（Ｓｃｈｒａｍｍ，１９９４）。例えば実施例１で試験したペプチド足場の場合は、選択された歪は０．０１（無次元）であり、全ての試験に適用した。
【０１７２】
上記した説明は本発明を限定する意図はなく、単にその特定の実施形態に関するものである。実際、ゲルは「溶液中の是非に関わらず交差結合の相互作用（共有結合または非共有結合）を生じてネットワークを形成する何れかの物質」として定義されており、物質は低応力下において材料の変形の点においてある程度の弾性特性を保持していると理解される（Ｓｃａｌｉｎｇ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｐｉｅｒｒｅ−Ｇｉｌｌｅｓ  ｄｅ  Ｇｅｎｎｅｓ，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９７９））。ヒドロゲルの場合、ネットワークはかなりの量の水を保持している。
【０１７３】
原子力顕微鏡。原子力顕微鏡観察（ＡＦＭ）は試料の表面および試料をスキャンするために使用される顕微鏡の鋭利な先端の相互作用を測定することによりナノメーターの尺度まで表面構造の分解を可能にする技術である。ＡＦＭは小さい一定の力を維持しながら試料表面を通過して可撓性のカンチレバーの末端上の鋭利な先端を走査することを包含する。走査の動作は試料に対してラスタパターンで先端を走査する（または先端に対して試料を走査する）圧電気管スキャナにより実施する。先端−試料の相互作用は典型的にはスプリット光ダイオード検出器内のカンチレバーの背部にレーザーを反射させることによりモニタリングされる。光検出器の出力電圧の差を検出することによりカンチレバーの偏向または振動振幅の変化を測定できる。
【０１７４】
最も一般的に使用されている操作様式は２種類、即ち接触モードＡＦＭおよびＴａｐｐｉｎｇＭｏｄｅＴＭＡＦＭであり、これは空気中または液体の環境において実施される。接触様式ＡＦＭは先端と試料の間の反発力を測定することにより操作される（Ｂｉｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。機器は先端に僅かに接触する。ＴａｐｐｉｎｇＭｏｄｅＴＭＡＦＭにおいては、画像は吸引力の測定から誘導され、先端は試料に接触しない。自身の共鳴振動数において振動し、走査の間に表面上を僅かに「タッピング」する。ＴａｐｐｉｎｇＭｏｄｅＴＭＡＦＭは、軟質で壊れやすく接着性の表面において、接触モードのＡＦＭの欠点である損傷を与えることなく測定を可能にすることから、本発明のペプチド足場におけるナノ繊維の形成を評価するために特に適している。
【０１７５】
（ＶＩＩ．治療用途）
本発明の修飾された自己集合ペプチドの自己集合によるか、または、本明細書に記載した修飾または未就職の自己集合ペプチドの組み合わせの自己集合により作成されたペプチド構造は種々の組織の欠陥および疾患を治療するために使用してよい。ペプチドヒドロゲル構造は表面上に生育するか内部に封入されている細胞の有無に関わらず、例えば手術により、または、何れか他の適当な処置を用いて身体内に移植してよい。他の経路、例えば経口、経皮、筋肉内、静脈内および皮下の経路を使用してよい。当業者は適切な送達手法を選択できる。
【０１７６】
ペプチド構造は哺乳類において検出可能な免疫または炎症応答は最小限のみ誘発するか全く誘発しないという利点を有する。さらにまたペプチド構造は食塩水に添加した場合に検出可能な膨潤を示さない。この膨潤がない点は恐らくは構造の高い水分含有量に起因していると考えられる（典型的には＞９９％）。この特性により近隣組織に対し悪い生理学的作用をもたらす調整不可能な構造の膨大の可能性が低減される。
【０１７７】
一般的に本発明の方法および組成物は組織の傷害または損傷が関与する何れかの状況において有用である。このような傷害は手術、外傷、腫瘍、変性疾患または他の疾患または状態の結果として生じる。必ずしもではないが、傷害は細胞の死を伴う。方法および組成物は組織の構造的および／または機能的な一体性を回復するため、すなわち傷害の前に存在していた機能的または構造的な状態に組織を回復させるために有用である。特定の傷害は組織の再生または修復を妨害する物理的障壁を与える場合がある。このような障壁は壊死、空洞化または瘢痕組織の形成の領域を含む。本発明の特定の実施形態においては、傷害の部位において本明細書に記載した材料を導入することは、傷害または障壁の部位に近接する位置から傷害または障壁の部位から隔たった位置までの細胞または組織の成育を可能にする。
【０１７８】
本発明の特定の組成物および方法は臓器の疾患または変性の作用を緩解するため、臓器または他の身体構造への損傷を修復するため、または、臓器または他の身体構造を形成するために使用してよい。このような臓器または身体構造は、例えば、血管組織、脳、神経組織、食道、ファローピウス管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、膀胱、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、子宮および皮膚を包含する。
【０１７９】
一般的に種々の装置を用いて傷害の部位に足場材料を導入してよい。シリンジを用いた送達は１つの好都合な手法である。ペプチドはまた手術部位においてカテーテルによるか直接導入することもできる。本発明の特定の実施形態においては、ペプチドが未組立であるか、最小限にしか組立てられていないペプチド溶液（即ちゲルを形成していない溶液）を身体内に導入する。本発明の別の実施形態においては足場の形成はインビトロで可能であり、そして組立てられた足場を身体内に導入する。
【０１８０】
細胞を封入したペプチド足場は種々の治療目的のために使用してよい。未組立のペプチドおよび細胞をインビトロで混合し、次に、投与後に構造を自己集合させ、細胞をインビボで封入してよい。上記したとおり、本発明の特定の実施形態においては、投与した溶液は１０、５、１．０または０．１ｍＭ未満のイオン（例えばカチオン）を含有するか、実質的にイオン（例えばカチオン）含有であり、そして等浸透圧溶質の濃度は少なくとも５、１５０または３００ｍＭである。１つの実施形態においては、等浸透圧溶質の濃度は以下の範囲、即ち、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭまたは８００〜９００ｍＭの１つに含まれる。適当な等浸透圧溶質は例えば炭水化物、例えばスクロースである。
【０１８１】
上記した細胞型の何れかを使用してよい。即ち血管内皮細胞に加えて、或はその代替として、本発明の組成物は種々の他の細胞型および／またはそのような細胞型の前駆体を包含する。細胞は自系または非自系であってよい。それらは同種異系または非同種異系であってよい。それらはそれらが導入される被験体と同じ種に由来、または異なる種に由来してよい。それらは胎児性または成熟性であってよい。
【０１８２】
本発明の種々の実施形態において、自己集合の前または後に、別の物質１つ以上をペプチド足場に添加する。物質は多くの目的、例えば後述するものの何れかに対応するものである。足場を身体内に移植する場合、生育中の細胞の突起または組織はそれらがペプチド足場に占有されている区域内に伸長または生育するに従って物質と接触する。本発明の特定の実施形態においては物質は例えば拡散により、またはそれが経時的に分解するのに従って足場から放出されることにより、足場から放出される。特定のペプチド配列および／またはペプチド濃度およびパラメーター、例えば交差結合度を選択することにより物質の分解および放出の所望の速度を得てよい。物質は移植の部位またはその近傍において細胞および組織と接触および／または血流中に進入してより遠位まで移動してよい。添加できる物質は、例えば、感染症を治療するか危険性を低下させるための抗生物質または抗カビ剤、腫瘍を治療するための化学療法剤等を包含する。即ち、巨視的構造の原料となったペプチド溶液は治療活性化合物または化学誘引剤を含んでよい。このような化合物の例は、天然または合成の低分子；核酸分子、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する核酸分子（Ｄｏｒｓｅｔｔ  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｉ  ２００４，およびその参考文献）、例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイムまたはプラスミド；ペプチドまたはタンパク質、例えばインテグリンまたは細胞接着分子；タンパク質、例えば抗体等を包含する。
【０１８３】
本発明の特定の実施形態においては、ペプチド溶液またはそれから形成された巨視的構造は分化、脱分化または相互分化を増強または誘発する薬剤、例えば成長因子、例えば欠陥内皮成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、アンジオポエチン１または２、表皮成長因子、神経成長因子、トランスフォーミング増殖因子−α、トランスフォーミング増殖因子−β、腫瘍壊死因子α、血小板誘導成長因子、インスリン様成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、脳誘導神経親和性因子、ケラチノサイト成長因子、骨形態形成タンパク質または軟骨誘導因子を取り込む。成長因子および／または治療薬または化学誘引物質の組み合わせも使用してよい。ペプチドホルモンも使用してよい。天然に存在するペプチドまたは修飾されたバージョン、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドのようなペプチドも使用してよい。
【０１８４】
巨視的構造は細胞周期への再進入を誘導する薬剤を取り込んでよい。このような薬剤は自己集合の開始前にペプチド溶液に、または、電解質溶液に添加してよい。このような場合、薬剤の濃度は組立てられた構造内部では実質的に均質であると考えられる。本発明の特定の実施形態においては、薬剤は細胞の添加の前または後にペプチド構造を共にインキュベートする培地に添加する。培地への添加の後、薬剤の一部は例えば拡散を介してペプチド構造に進入する。この過程は勾配をもたらす。構造の異なる領域の上または内部の細胞は細胞の位置における薬剤の濃度に応じて薬剤への異なる応答を示す。分解を誘発すること、遮蔽すること、発現を低減すること、または、細胞との分子の相互作用をブロックすることによりにより組織の再生または修復に対して抑制的である分子の作用に対抗して作用する物質もまた取り込んでよい。
【０１８５】
成長因子は典型的には約１ｆｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間の濃度において使用される。多くの場合、成長因子は低ナノモル範囲、例えば１〜１０ｎＭの濃度で使用する。本発明の特定の実施形態においては、成長因子は従来技術において典型的に使用されていない、または、正常な条件下ではインビボで典型的には観察されない濃度において使用される。例えば、成長因子は作用をもたらすために典型的に必要な濃度よりも、または、インビボで典型的に存在する濃度よりも、５倍高値、１０倍高値、２０倍高値、１００倍高値等の濃度おいて使用してよい。特定の所望の作用に応じて、特定の薬剤、例えば成長因子の旨適濃度を決定するために滴定実験を実施することができる。因子は精製された形態で、または、血清のような複合的生物学的混合物の成分として添加してよい。
【０１８６】
上記したとおり、組織の修復および再生は成長因子、細胞接着分子、インテグリン等の因子を供給することにより増強できる。このような分子（または他のもの）を提供するための１つの方法は傷害の部位における細胞の送達である。細胞は再生を促進するかそれ以外の態様で再生を可能にする環境の創生に寄与する分子を生産する。種々の前駆細胞も有用である。これらの細胞型の何れかを足場内に取り込んでよい。さらにまた、これらの細胞型（または他のもの）のいずれかは例えば再生促進因子の生産を増大させるように遺伝子的に修飾させた後に足場内に取り込むことができる。
【０１８７】
遺伝子療法の手法を用いて所望の産物をコードする遺伝子の発現を増大させてよい。遺伝子療法は目的の細胞への目的の分子の合成のための鋳型を含む核酸の送達を包含する。核酸（または例えば逆転写により核酸から誘導された核酸）を細胞のゲノム内に取り込ませるか、または、エピソームとして細胞内に永久的に残存させてよい。しかしながら、遺伝子療法はまた核酸が送達される細胞内に一体化または永久的に残存することのない核酸の送達も包含する。このような方法は目的の分子の一時的または一過性の合成を可能にする。
【０１８８】
所望の分子の合成のための鋳型を含む核酸を提供するベクターまたはビヒクルをペプチド足場に取り込ませ、これから、傷害の部位または近傍において細胞によりそれらを取り込ませてよい。好ましくは、核酸は目的の細胞内で発現されるべき遺伝子のコーディング配列を包含し、そしてまた、適切な発現シグナル、例えばプロモーター、ターミネーター等を含むことにより、適切な発現を確保する。本発明の特定の実施形態においては、遺伝子が特定の細胞型の細胞内でのみ発現されるように発現シグナルは細胞型特異的である。
【０１８９】
一般的に、ウィルス性または非ウィルス性のベクターを使用してよい。本発明の特定の実施形態においては、ベクターはニューロンに感染できるウィルスベクターである。例えばヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルスまたはレンチウィルスを使用してよい。細胞への鋳型の送達において未損傷のウィルスを使用することは回避することが好ましい。即ち、ＤＮＡベクターまたは線状ＤＮＡ分子を送達することが好ましい。これらのベクターは必須ではないが長末端反復等のウィルス配列を含んでよい。トランスフェクションに有用な広範な種類の薬剤のいずれかを用いて細胞による核酸の取り込みを増強してよい。このような薬剤は広範なカチオン性重合体および修飾されたカチオン性重合体、脂質等を含む。細胞型特異的なターゲティングリガンド、例えば目的の細胞型の上で発現される分子に特異的に結合するリガンドまたは抗体を遺伝子療法送達剤に結合させることによりその薬剤が特定の細胞型のみに導入されるようにしてよい。一般的に核酸および何れかの適切な遺伝子療法送達剤（例えばカチオン性重合体）を本明細書に記載した方法のいずれかにおいて足場内に取り込んでよい。
【０１９０】
本発明の特定の実施形態においては、治療上望ましい遺伝子の修飾を行ってよい。例えば固体が特定の遺伝子において突然変異を保有している場合、遺伝子療法目的のために前駆細胞内に遺伝子の野生型コピーを導入することが望ましい場合がある。本発明の特定の実施形態においては、特定の受容体、例えば成長因子受容体をコードする遺伝子を導入することにより特定の分化、脱分化または相互分化の能力を付与または増強することが望ましい場合があり、これは成長因子に細胞を応答させることにより行う。
【０１９１】
治療目的のために投与されるべき細胞の数、異なる表現型の細胞の相対的比率、および／またはペプチド構造中の細胞の濃度は治療すべき特定の状態または傷害に対して適宜改変することができる。
【０１９２】
本発明の特定の実施形態においては、例えばペプチド構造の上または内部において増殖および／または分化している血管内皮細胞および／またはその前駆細胞は構造から除去または抽出される。除去または抽出は適当な手段、例えば吸引ピペットを用いた除去、足場の機械的破壊、インビトロでの構造の酵素的分解等により達成してよい。本発明の特定の実施形態においては、選択された方法は細胞の約１０％、細胞の１０％〜２５％、細胞の２５％〜５０％、細胞の５０％〜７５％、または細胞の７５％〜１００％の除去または抽出をもたらす。何れかの好都合な範囲をもたらす方法を選択してよい。選択された方法は細胞を使用する目的、必要な細胞の数等に応じたものである。本発明の特定の実施形態においては、除去または抽出された細胞の生存性は細胞の約１０％、細胞の１０％〜２５％、細胞の２５％〜５０％、細胞の５０％〜７５％、または細胞の７５％〜１００％である。何れかの好都合な範囲をもたらす方法を選択してよい。選択された方法は細胞を使用する目的、必要な細胞の数等に応じたものである。
【０１９３】
抽出された細胞はさらにペプチドヒドロゲル構造の上または内部において、または何れかの他の培養容器中、インビトロで培養してよい。抽出された細胞は適切な経路、例えば静脈内、皮下、経口、経皮、筋肉内または外科的に被験体に投与してよい。投与された細胞は組織、臓器または身体構造、例えば血管組織の不全を有する組織、臓器または身体構造に補給するために使用してよい。投与された細胞はタンパク質、例えば個体が欠損している酵素を供給してよい。投与された細胞を遺伝子的に修飾し、遺伝子療法を送達する手段として使用してよい。
【０１９４】
本発明の自己集合ペプチドは、例えば血管形成術のような処置の後に、傷害の部位において血管の内皮の層の形成を促進するために使用してよい。それらはまた、内皮化を促進するために例えば血管移植片またはステントのような装置のためのコーティング物質として使用してよい。別の方法においては、ペプチドは人工血管のような人工の導管の内面上に層を形成する。内皮細胞は一定期間ペプチドの自己集合により形成された層の上で培養する。細胞はＥＭＣ成分を分泌する。次に細胞を除去すると、細胞により合成されたＥＣＭ分子を含有する未損傷の基底膜層が残る。次に人工の導管を宿主内に移植する。別の方法においては、導管は内皮細胞を除去することなく宿主に委嘱する。
【０１９５】
本発明の自己集合修飾ペプチドおよびそれを含有する構造は例えば末梢神経系における軸索および神経の再生を促進するために神経ガイドとして、またはその内部において使用できる。
【０１９６】
（ＶＩＩＩ．別の実施形態および等価物）
本発明は細胞を培養するため、および／または、被験体の身体内に導入できるペプチド足場を形成するために使用してよいキットを提供する。キットは乾燥または凍結乾燥形態、溶液、または組立または部分的組立の状態で提供してよい本発明の自己集合ペプチド１つ以上を含む。キットはさらに、以下の要素、即ち、細胞の集団、細胞または組織の培養基、所定量の成長因子、所定量のイオンまたはその塩、細胞培養用の自己集合ペプチドの調製のための取扱説明書、ペプチドヒドロゲル構造の上または内部において細胞を培養するため（例えば細胞を封入するため）の取扱説明書、被験体に自己集合ペプチドを導入するための取扱説明書、細胞培養を実施する容器、ペプチドを溶解できる液体、シリンジ、ペプチドの自己集合を開始するためのイオンまたはその塩、成長因子または分化因子の１つ以上、組織培養用の培地、細胞（例えば血管内皮細胞）、対照ペプチド等の１つ以上を含んでよい。別の要素も含んでよい。
【０１９７】
以下に示す代表的な実施例は本発明の説明を容易にすることを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。実際、明細書に記載したものの他に、本発明およびその多くの別の実施形態の種々の変更は、後述する実施例を含む本明細書の全内容および本明細書において引用する学術文献および特許文献から自明なものである。以下の実施例は本発明をその種々の実施形態およびその等価物において実施するために採用できる重要な別の情報、例示および指針を含んでいる。
【実施例】
【０１９８】
（実施例１：ペプチド足場の物理化学的特性化）
（材料および方法）
以下の材料および方法の特定のものは以下の実施例の多くに関連するものである。カタログ番号はカッコ内に示す。
【０１９９】
（一般的試薬）
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩水、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．４（１６６７８９、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，ＩＮ）。
トリプシン：トリプシン−ＥＤＴＡ（２５３００−０５４、ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳ）、０．０５％トリプシン、ＨＢＢＳ中０．５３ｍＭＥＤＴＡ−４Ｎａ、カルシウムおよびマグネシウム非含有、マイコプラズマ試験済み。
ＥＧＭ−２：内皮半規定培地（ＣＣ−３１６２、Ｃａｍｂｒｅｘ，ＭＤ）、ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ゲンタマイシン−アンホテリン、ヘパリンおよび２％ＦＢＳのみ含有。
ＨＡＥＣ：ヒト大動脈内皮細胞（ＣＣ−２５３５、Ｃａｍｂｒｅｘ，ＭＤ）。
トリトンＸ−１００：Ｓｉｇｍａより購入（Ｔ０２８４，ＭＯ）。
タンパク質阻害剤カクテル：完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテルはＲｏｃｈｅより購入（１８３６１５３、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。
ＴＮＥ：緩衝液、１０ｍＭトリス塩基、１ｍＭＥＤＴＡ、２００ｍＭＢＮａＣｌ含有、ｐＨ７．４。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（１０００３０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，ＩＮ）。
【０２００】
ペプチド。本作業において使用した全ペプチドはＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｓｙｎｐｅｐ．ｃｏｍ；Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）から入手した。ペプチドは質量スペクトルによりその分子量を測定し、理論的な分子量と比較することにより同定した（表３）。ペプチドの略記法は本実施例の結果の項の表４に示すとおりである。
【０２０１】
（表３．ペプチド足場のＭＷの予測値および実測値）
【０２０２】
【表３】
2011046741.tif 000005
ペプチドは約２０分間超音波処理（Ａｑｕａｓｏｎｉｃ、５０Ｔ型、ＶＷＲ、ＰＡ）により終濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ）で脱イオン水中に溶解した。ペプチドヒドロゲルの形成は後に記載する通り細胞チャンバーインサートの上面において行った（直径１０ｍｍ、面積０．５ｃｍ２、孔径０．２μｍ、カタログ番号１３６９３５、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＩＬ）。
【０２０３】
円偏光二色性（ＤＣ）。ＣＤスペクトルはＡｖｉｖ２０２スペクトル偏光計を用いて計測した。試料は水でペプチドの保存溶液（０．５％）を希釈して２５μＭの作業濃度とすることにより調製した。試料は光路長０．３ｃｍおよび波長範囲１９５〜２５０ｎｍで石英キュベット中室温で分析した。
【０２０４】
原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）。保存溶液（０．５％）のペプチドを０．０１％（ｗ／ｖ）の作業濃度に希釈した。ＡＦＭ画像はマルチ７５シリコンスキャニングプローブ（ＭＰＰ−２１１００、Ｎａｎｏｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて共鳴周波数７５ＫＨｚ、スプリング定数３Ｎ／ｍ、先端曲率半径＜１０ｎｍおよび２２５μｍで測定した。画像はマルチモードＡＦＭ顕微鏡（ナノスコープＩＩＩａ、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ）をタッピングモードで操作して求めた。典型的な走査パラメーターは、タッピング周波数７５ＫＨｚ、ＲＭＳ振幅、勘合前１〜１．２Ｖ、セットポイント０．７〜０．９Ｖ、積分および比例ゲインそれぞれ０．２〜０．６および０．４〜１．０、および走査速度１．５１Ｈｚとした。
【０２０５】
レオメトリー。レオロジー試験は５０ｍｍの平行プレートＡＲＥＳ歪制御レオメーター（Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＪ）を用いて実施した。試料を２．９ｍＭの終濃度で脱イオン水に溶解し、分析の前日１時間超音波処理した。１ｍｌの容量を下部のプレートにロードし、上部のプレートはギャップサイズ０．４〜０．４５ｍｍに設定した。動的周波数掃引試験は１００〜０．１ｒａｄ／ｓの周波数範囲で実施した。試験の後、ＰＢＳを下部プレートの周囲に添加することによりゲル化を促進した。ペプチドを室温で１０分間ゲル化させた後、試験を再度実施した。動的周波数掃引試験の後、試料の挙動を経時的に試験した。動的時間掃引試験は５分間１０ｒａｄ／ｓで実施した。
【０２０６】
データ分析。標準偏差をデータに関して計算し、グラフのエラーバーとして表示した。
【０２０７】
（結果）
実施例において使用したペプチドは自己集合ペプチドＲＡＤ１６−Ｉを基本とした。ペプチドは種々の生物学的活性を媒介するものとして予め発見されているペプチドモチーフの種々のものを含むように修飾した。ペプチドの物理化学的および構造的な特性は種々の手法を用いて評価した。ペプチドの水溶液中の溶解度を試験した。ペプチドが自己集合してより高次の構造になる能力を調べた。特に、種々の二次構造（例えばβシート）を形成するペプチドの能力は円偏光二色性を用いて測定した。ペプチドが自己集合してナノ繊維となる能力は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて評価した。ゲルの形成は目視観察およびレオロジーにより評価した。
【０２０８】
表４はＲＡＤ１６−Ｉおよび修飾ペプチドに関して観察された物理化学的および構造的な特性を総括したものである。各指定ペプチドの名称を単純化するために、各ペプチドに略号を付した。表中、Ａｃはアセチル基を指し、それが結合しているＮはペプチドのＮ末端を示し、そして配列の部分ではない。ＣはペプチドのＣ末端を示し、配列の部分ではない。ＣＯＮＨ２はＣ末端アミノ酸のカルボン酸基がアミドに変換されていることを示す。結果はさらに後述するとおりである。
【０２０９】
（表４．修飾ペプチドの物理化学的構造的特性）
【０２１０】
【表４−１】
2011046741.tif 000006
【０２１１】
【表４−２】
2011046741.tif 000007
溶解度：全ての配列は不溶性であるＣＳＲを除き１％（ｗ／ｖ、１０ｍｇ／ｍｌ）の濃度で水中に透明なを形成することがわかった。この除外例のペプチドはその後の試験のシリーズでは使用しなかった。
【０２１２】
ゲル形成：１％の各ペプチド溶液を用いてヒドロゲル形成を評価した。２例、即ちＲＡＤ１６−ＩおよびＡＡＳについては室温で一夜放置した後に目視検査により粘度の上昇が観察されたが、それ以外のペプチドについては粘度の上昇を観察するためにより長時間が必要であった。全ての可溶性ペプチドにつき、ゲル形成は等容量のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の添加により容易に観察された。
【０２１３】
円偏光二色性：ＣＤスペクトルはその二次構造を評価するために各ペプチドにつき観察した。二次構造はαヘリックスおよびβシートのようなポリペプチド内部の秩序のある構造を識別するものである。ポリペプチドが規則的な秩序を示さない場合は、構造はランダムコイルである。βシート構造の典型的なスペクトルは２１８ｎｍ近傍に最小モル楕円を示すが、αヘリックスのＣＤスペクトルは２０９および２２２ｎｍにおいて２つの極小を示す（Ｈａｖｅｌ，１９９６）。
【０２１４】
ペプチドの大部分に関するＣＤ試験はβシート構造に典型的なスペクトルを示し、最小モル楕円（ｄｅｇｃｍ２／デシモル）は２１８ｎｍ近傍であった（図４）。観察された二次構造を表４に示す。１つのペプチドＫＡＦはランダムコイル配置であると推定された。他の場合においては、短ペプチド配列の添加により２１８ｎｍにおいてモル楕円の強度の低下が起こった。修飾ペプチドにより推定された構造はＲＡＤ１６−Ｉの構造よりもβシート特徴が小さかった。
【０２１５】
原子間力顕微鏡：原子間力顕微鏡の手法を用いてペプチド足場のとる構造を検討した。ＫＡＦの１つの例外を除き、ナノ繊維の存在が観察された（図５Ａ〜５Ｇ）。図５Ａ〜５Ｇに示すＡＦＭの画像はμｍｘ１μｍのサイズであり、ナノ繊維は約２５ｎｍの厚みであった。このようなナノ繊維が観察されたことは、これらの新しいペプチド配列が細胞培養のための足場として使用するのに適するという仮説を肯定している。特に理論に制約されないが、ＫＡＦが自己集合してナノ繊維にならなかったという事実は、自己相補ペプチドのβシート構造がナノ繊維をもたらすための自己集合の過程の要件であることを示している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。さらにまた本発明者等は配列番号ＫＡＦにより形成されたヒドロゲルはコロイドであると結論した。
【０２１６】
レオロジー：動的歪掃引をまずＲＡＤ１６−Ｉに対して実施し、試験の直線的粘弾性の領域を設定し、そして動的周波数掃引試験のための固定歪を選択した（図１９）。この直線的粘弾性領域は一定の基準、Ｇ’およびＧ’’により定義される。信頼性のある結果を得るためにはこの範囲内で歪を選択することが重要である（Ｓｃｈｒａｍｍ，１９９４）。選択された歪は０．０１（無次元）であり、全ての試験に適用した。
【０２１７】
液体形態においてＲＡＤ１６−Ｉを試験した後、ＰＢＳをプレートの周囲に添加して１０分間ヒドロゲルを形成させ、試験を再度実施した。図１８はこの実験について得られた結果を示す。ＰＢＳ添加前はペプチドＲＡＤ１６−Ｉは既に試験条件下（例えばｐＨ、温度等）においてゲル様の特徴を示していた（Ｇ’＞Ｇ’’および一定基準）が、塩の添加により、両方の基準は増大（〜１０倍）し、ゲル強度の顕著な増大を示していた。
【０２１８】
修飾ペプチドについては、ペプチド溶液へのＰＢＳの添加の後に試験を実施した。全ペプチドのレオロジー測定の結果は図６Ａ〜６Ｇに示す通りである。ＲＡＤ１６−Ｉの場合と同様、Ｇ’はＧ’’より高値であった。プロトタイプの配列、ＲＡＤ１６−Ｉの場合、蓄積基準Ｇ’は２．５ｘ１０３Ｐａに達している（図６Ａ）。ペプチドＡＡＳの数値は約１０倍低値（１．５ｘ１０２Ｐａ）であり、残りの配列については約１００倍低値であった。これらの結果は上記した自己集合ペプチドに特徴的である相補的であり構造的に適合性がある交互する疎水性および親水性のアミノ酸の特徴を保有していないペプチドモチーフの添加は自己集合過程をある程度妨害することを示している。しかしながら、このようなモチーフの添加は一般的に、ペプチドの未修飾部分が自己集合する能力を排除するものではなく、そして即ち、修飾されたペプチド自体も自己集合可能である。しかしながら、修飾されたペプチドにより形成された構造は未修飾のペプチドの自己集合により生じたものよりも弱い。特に理論に制約されないが、この理由はＲＡＤ１６−Ｉのβシート配置の捩れの可能性がある。ゲル挙動がレオメトリー試験により観察されたという事実はゲル形成の目視観察を確認するものである（表４）。
【０２１９】
図７Ａ〜７Ｇにおいて、種々のペプチド配列の経時的挙動を示す。選択された周波数（１０ｒａｄ／ｓ）においては、両方の基準Ｇ’およびＧ’’は時間に対して一定であり、ゲルが安定であることを示していた。
【０２２０】
（実施例２：ペプチド足場上の内皮細胞の生育および単層形成）
（材料および方法）
内皮細胞培養系。ペプチド足場（０．５％ｗ／ｖ）をＲＡＤ１６−Ｉについては１００％ペプチド配列において、または、３種の他の場合（ＹＩＧ、ＲＹＶおよびＴＡＧ）に付き９：１の比（ＲＡＤ１６−Ｉ：ペプチド配列、容量／容量に基づく）でＲＡＤ１６−Ｉと混合して、調製した。各溶液を濾過（０．２μｍ、Ａｃｒｏｄｙｓｃフィルター、４１９２、ＰＡＬＬ，ＭＩ）し、細胞培養チャンバーインサート（１０ｍｍ直径、１３６９３５、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＩＬ）の上面にロード（３０μｌ）し、層を形成させた（平均厚み＝６００μｍ）。リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（６００μｌ）をウェルの底部に添加し、ヒドロゲルの形成を誘導し、そして系を３０分間室温でインキュベートした。ＰＢＳを培地と交換し、次にこれを新しい培地と交換した。足場を５％ＣＯ２下３７℃で細胞培養インキュベーター中、内皮細胞の生育培地（ＥＧＭ−２，Ｃａｍｂｒｅｘ，ＭＤ）と共に１時間インキュベートした。
【０２２１】
その間、標準的な培養条件下に維持しておいた（５〜６継代）ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）（ＣＣ−２５３５、Ｃａｍｂｒｅｘ，ＭＤ）をトリプシンを用いて８０％コンフルエントで収集し、８ｘ１０４個／ｃｍ２の細胞密度で予め形成されたペプチド足場の上面にロードし、５％ＣＯ２下３７℃で細胞培養インキュベーター中、培養した。細胞連結試験を初回細胞ロードの１時間後に実施した。試験を実施するために、被覆培地を除去し、未結合の細胞を血球計を用いて計数した。細胞の計数は、ピペットで吸引吐出することにより足場含有細胞を機械的に破壊し、次に細胞の生存性を評価するためのトリパンブルー（Ｔ９９０６，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）排除試験染色を実施した後に血球計上で細胞を計数することにより行った。一部の実験においては、比較のために、ＥＣを標準的なプロトコルに従ってマトリゲルまたはコラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ、即ち１５％）でコーティング下インサート上で培養した。
【０２２２】
遊離の可溶性ペプチド配列との競合試験。ＨＡＥＣは前述の通り細胞培養インサート中のペプチド足場上で記載した通り培養した。各足場に付き相当する可溶性モチーフ配列、または、足場内に存在しない他のモチーフの１つを終濃度４００μｇ／ｍｌでＨＡＥＣ培養物の培地に添加した。培地の半分は一日おきに交換した。培養第３日の後、培地を除去し、各可溶性ペプチドモチーフ４００μｇ／ｍｌを含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびアスコルビン酸を含有しない新しい培地を添加した。翌日、細胞数を上記した通り評価した。各条件は３連で試験した。
【０２２３】
ペプチド足場からの細胞の単離。別の競合実験のために、表面から細胞を収集するためにゲルを機械的に破壊するのではなく、ゲル表面をまずＭｇ２＋およびＣａ２＋非含有のＰＢＳで穏やかに洗浄した。次に単層を３７℃で２０〜３０分間、トリプシン（０．２５％）およびＶｅｒｓｅｎｅ（Ｎａ４ＥＤＴＡ）の１：１混合物に曝露した。細胞を収集した（通常は９０％超が浮遊しており、ゲル表面になお結合しているものはごく僅かである）。即ちこの手法は、標準的な組織培養プレートから細胞を回収するために典型的に使用されるとおり、０．０５％トリプシン／０．２％ＥＤＴＡをの代替として０．１２５％トリプシン／０．１２５％／０．０１％ＥＤＴＡを使用している。特に理論に制約されないが、ペプチドゲル上で培養された場合、内皮細胞により合成される基底膜物質は増大した付着をもたらし、即ち、ゲルからこれらを分離するためにより多くのトリプシンの使用が必要になる。ＥＤＴＡの濃度は細胞死を最小限にするために低減する。しかしながら、多くの細胞−細胞相互作用にカルシウムが関与し、そしてＥＤＴＡは高い親和性でＣａ２＋に結合するため、ある程度のＥＤＴＡを含有することは重要であると考えられる。
【０２２４】
収集した細胞はトリパンブルー排除法により計数した。生存性は典型的には８５〜９０％の水準であった。
【０２２５】
（結果）
ＨＡＥＣ結合および単層の形成。本試験の１つの特徴は内皮細胞を培養するための合成基底膜類似物として使用される機能性付与された生体ミメティックの足場を得る可能性を検討することであった。従って実験はヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の生育および機能を支援する指令的なマトリックスとしてペプチド足場が作用する能力を評価するために実施した。大動脈内皮細胞は通常は血管（動脈、静脈、毛細血管）および心室の内面を被覆する単層を形成するため、本発明者等は基底膜がインビボで重要な役割を果たす機能である単層の形成をペプチド足場が支援するかどうか調べた。
【０２２６】
第１の実験において、水中のペプチドの０．５％（ｗ／ｖ）溶液にＰＢＳを添加した後にペプチドの自己集合により生成された種々のペプチド足場上に播種された場合にＨＡＥＣが結合して単層を形成する能力を調べた。本試験においては、修飾ペプチドの僅か１種、ＹＩＧのみが単層の形成を支援できたが、単層の形成は細胞を未修飾ＲＡＤ１６−Ｉ足場上で培養した場合にも観察された。他の生物学的に活性なペプチドモチーフを取り込んだペプチドから生成された足場の存在下に培養したＨＡＥＣは死滅するか、点在するクラスターを形成した（図９Ａ〜９Ｇ）。
【０２２７】
生物学的に活性なモチーフを取り込むように修飾されたペプチドから完全になる足場が単層の形成を支援しなかったという事実は、生物学的に活性なモチーフの作用が濃度依存性であることを示唆している。本発明者等はペプチドの１００％においてモチーフが存在することは、細胞にとって高すぎる濃度を提示し、細胞毒性をもたらしたという仮説を考えた。従って本発明者等は生物学的に活性なモチーフを取り込んだペプチドをプロトタイプのＲＡＤ１６−Ｉ配列とブレンドすることにより細胞に提示される生物学的に活性なモチーフの全体的濃度を低減することに決定した。本発明者等は９：１の体積／体積比（ＲＡＤ１６−Ｉ：生物学的に活性なペプチドモチーフを含む修飾ペプチド配列、ペプチドはｗ／ｗ基準で等濃度となるように溶解した）を選択し、未修飾および修飾ペプチドがこの比で存在する溶液からペプチド足場を生成した。ゲルの形成および様相の目視による観察および足場の取り扱いおよび操作中に観察された特徴に基づけば、本発明者等は複合足場の機械的特性はＲＡＤ１６−Ｉより完全になる足場のものと極めて似ていると結論した。この所見は、未修飾ペプチドの修飾ペプチドに対する適切な比を選択することにより足場の機械的特性が調節できることを示している。
【０２２８】
良好な細胞−材料の相互作用を可能にするために、細胞をサブコンフルエント数（〜３０％）で播種した。本発明者等は、ペプチドブレンド物、即ち修飾ペプチドがＹＩＧ、ＲＹＶまたはＴＡＧを取り込んだペプチドから形成した足場３種は単層の形成を容易に支援したことを観察した（表５、図１０Ａ−１０Ｄ）。１時間後、表面へのＨＡＥＣの結合は３種の足場およびＲＡＤ１６−Ｉについて〜１００％であり、材料との細胞の初期の相互作用が官能性付与により影響されないことを示唆していた。本発明者等はこれらの３種の修飾ペプチドおよび未修飾のＲＡＤ１６−Ｉ単独を選択して以降の実験に使用した。
【０２２９】
表５は種々の足場をＨＡＥＣの単層形成を支援する能力について試験した場合に得られた結果を総括したものである。
【０２３０】
（表５．ペプチド足場上のＨＡＥＣ単層形成）
【０２３１】
【表５−１】
2011046741.tif 000008
【０２３２】
【表５−２】
2011046741.tif 000009
別の実験において、ＲＡＤ１６−Ｉ（１００％）およびＲＡＤ１６−Ｉ：ＹＩＧ、ＲＡＤ１６−Ｉ：ＲＹＶおよびＲＡＤ１６−Ｉ：ＴＡＧ９：１ブレンド足場上の内皮単層形成をマトリゲルおよびコラーゲンコーティング基板上の単層形成と比較した。図１６Ａ〜図１６Ｌは培養３日後の種々の異なるゲル系上のＨＡＥＣ単層形成を示している。図はコラーゲンＩゲル（Ａ）、マトリゲル（Ｃ）１００％ペプチド足場ＲＡＤ１６−Ｉ（Ｅ）、９０％ＲＡＤ１６−Ｉ／１０％（ｖ／ｖ）ＹＩＧブレンド（Ｇ）、９０％ＲＡＤ１６−Ｉ／１０％（ｖ／ｖ）ＴＡＧブレンド（Ｉ）、および、９０％ＲＡＤ１６−Ｉ／１０％（ｖ／ｖ）ＲＹＶブレンド（Ｊ）上に播種されたＨＡＥＣの位相差顕微鏡画像を示している。Ａ（Ｂ）、Ｃ（Ｄ）、Ｅ（Ｆ）、Ｇ（Ｈ）、Ｉ（Ｊ）、Ｋ（Ｌ）についてアクチン繊維（黄色）および核（青）をそれぞれ検出するためのＴＲＩＴＣファロイジンおよびＤＡＰＩによる蛍光染色。位相差顕微鏡画像はアクチン／ＤＡＰＩ染色でも観察された典型的なコブルストーン状単層を示す。図に示されている通り、３種の被験ペプチドブレンド物よりなる足場上に培養したＨＡＥＣは培養３日でコブルストーンの表現型を有するコンフルエントの単層を発生することができ、これはマトリゲルおよびコラーゲンＩゲルで観察されたものと同様であった。定量的には単層の形成、形態特徴および細胞数は修飾ペプチド足場上ではマトリゲルまたはコラーゲン上の外観と同様であるように観察された。しかしながら、１００％ＲＡＤ１６−Ｉ足場上で観察されたコブルストーン形態特徴はブレンド足場またはマトリゲルまたはコラーゲンＩ上よりも低値であった。
【０２３３】
ＨＡＥＣ増殖速度。各足場表面上のＨＡＥＣの増殖速度を分析するために、細胞をサブコンフルエント（〜３０％）の条件下に再度播種し、細胞を成育させた。培養３日後、増殖速度はＲＡＤ１６−Ｉ対照に対して修飾ペプチドを含有する足場上では２〜３倍増大していた（図１２）。増殖速度のこの劇的な変化は修飾表面上のコンフルエント単層の形成を加速させ、細胞がモチーフ修飾物質を感知して応答することを示唆している。
【０２３４】
この考えを確認するために、遊離のペプチドモチーフを用いた競合試験を実施することにより修飾ペプチド足場との細胞表面の相互作用を特異的にブロックすることを試みた。全ての場合において、相当する足場（即ちＲＡＤ１６−Ｉ：修飾ペプチドの９：１複合物よりなる足場）の培地に添加した可溶性ペプチドＹＩＧＳＲ（配列番号３３）、ＲＹＶＶＬＰＲ（配列番号３５）およびＴＡＧＳＣＬＲＫＦＳＴＭ（配列番号３７）はＲＡＤ１６−Ｉ足場上で観察されたものと同水準まで増殖速度を低減し、細胞が３種の修飾足場の各々に存在する機能的配列を細胞が特異的に認識したことを示唆している（図１２）。有意義な点は、細胞は配列がナノ繊維に物理的に結合している場合にのみバイオミメティックのマトリックスを介して指令されていたことである。特に理論に制約されないが、機械的シグナリング伝導の事象はＨＡＥＣの増殖速度の調節に関与している可能性がある。試験した全ての場合において、細胞密度は従来の組織培養プレート上に培養されたＨＡＥＣの密度より遥かに低値であり、プラスチックプレート上の増殖と比較して足場上に細胞を培養した場合のほうが細胞増殖が低減されることを示唆している。しかしながら、足場上に生育している細胞の数は足場からの細胞回収に関わる困難のために過小評価されている。さらにまた、増殖速度の低下は内皮細胞の機能のマーカーの測定により明らかな通り、足場上のより分化した機能的状態の発生とは矛盾していない（後述参照）。増殖速度および機能的状態は共にバイオミメティック培養材料が内皮細胞培養のための有用な基板として機能する能力を評価する点において重要なパラメーターである。
【０２３５】
別の競合試験。相当する生物学的に活性なペプチドまたは異なる生物学的に活性なペプチドの何れかの存在下または非存在下において、ＲＡＤ１６−Ｉ足場またはＲＡＤ１６−ＩとＹＩＧ、ＴＡＧまたはＲＹＶの９：１（ｖ／ｖ）ブレンドの何れかの上でＨＡＥＣを培養する別の実験を行った。細胞は、足場の機械的破壊を行わない上記の進歩した単離手法を用いて採取し、これにより細胞の回収率を最大限とした。データは図１７に定量的に示す。棒グラフに示されるとおり、可溶性の生物学的に活性なペプチドを添加しない場合は、１００％ＲＡＤ１６−Ｉペプチドから作成したペプチド足場上のＨＡＥＣの増殖はペプチドブレンドから作成した足場上の増殖よりも約２〜２．５倍の有意な低値となった。可溶性の生物学的に活性なペプチドをそのペプチドを含有する足場上で生育している培養物に添加すると、未修飾のＲＡＤ１６−Ｉ足場上とほぼ同水準までＨＡＥＣの増殖が低下する。重要な点は、データはまたＨＡＥＣを特定の生物学的に活性なアミノ酸ドメインを有するペプチドを含有する足場上で培養した場合には、競合は、可溶性形態で同じアミノ酸ドメインを提供した場合に、換言すれば、足場を含むナノ繊維上の同じ配列タグと競合することにより、細胞増殖を低減するのみである。残念なことに、マトリックスまたはコラーゲンＩのゲルからは、結合の堅固さのため、細胞の１０％超を回収することはほぼ不可能であり、従ってマトリゲルまたはコラーゲンＩ上のＨＡＥＣ増殖をブレンド足場上の増殖と定量的に比較することは不可能であった。しかしながら、定量的増殖はこれらの条件でほぼ等しいと考えられた。
【０２３６】
（実施例３：ペプチド足場上に培養した内皮細胞の機能的特徴）
（材料および方法）
ＮＯ放出の測定。酸化窒素（ＮＯ）の放出はＧｒｅｉｓｓ法により窒素酸化物（ＮＯｘ）を測定することにより調べた。慨すれば、培地を培養第３日後にウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはアスコルビン酸を含有しない新しい培地と交換した。翌日、市販のキット（４８２７０２、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を用いて、製造元の説明書に従って培地を検査することによりＮＯ放出を分析した。各条件を３連で試験した。
【０２３７】
ＬＤＬ取り込み染色。９６穴のディッシュ内に組立た足場上に培養した細胞を用いて細胞染色を行った。足場はウェル中にペプチド溶液をいれ、培地を添加して足場形成を開始することにより組立てた。細胞は１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインド−カルボサイアニンパークロレート（ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ，ＢＴ−９０２，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．ＭＡ）で標識したアセチル化低密度リポタンパク質８μｇ／ｍｌを含有する培地を用いて４時間インキュベートした。この時点で細胞を２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１時間固定し、０．１％トリトン−Ｘで１０分間透過性化し、そしてブロッキング溶液（ＰＢＳ中、２０％ウシ胎児結成、０．１％トリトン−Ｘ１００および１％ジメチルスルホキシド）で１時間ブロックした。ＤＡＰＩ染色（２塩酸４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｄ−１３０６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）を用いて細胞の核を可視化した。試料を５分間ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌＤＡＰＩと共にインキュベートし、そしてＮｉｋｏｎ
Ｅｐｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡ＴＥ３００の下で分析した。
【０２３８】
ウエスタンブロット。各培養条件につき採取したＨＡＥＣを計数し、２％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤のカクテル（１８３６１５３、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ，Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する試料緩衝液（ＮＰ０００７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で溶解することによりタンパク質分解を回避した。細胞溶解物はＭＯＰＳ緩衝液（ＮＰ０３０１、ＭＰ０００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中の１０％ＰＡＧＥ系上で泳動させ、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ＬＣ２００２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に移行させ、ウエスタンブロットを行った。慨すればメンブレンをＰＢＳ中２％ＢＳＡおよび０．１％トリトン−Ｘ１００でブロックした。２種の一次抗体、即ちマウスモノクローナルＩｇＧ１抗ヒトラミニンγ１［ラミニンＢ２鎖］（１μｇ／ｍｌ、Ｂ１９２０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）およびマウスモノクローナルＩｇＧ１抗ヒトＩＶ型コラーゲン［７Ｓドメイン］（２μｇ／ｍｌ、ＭＡＢ３３２６、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）を使用した。二次抗体、即ちヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（１：５０００希釈、ｓｃ−２３０２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）を用いてケミルミネセンス（ｓｃ−２０４８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）による検出を行った。タンパク質のバンドはＸ線フィルム（Ｂｉｏｍａｘ  Ｆｉｌｍ，Ｋｏｄａｋ，ＮＹ）に曝露することにより可視化した。
【０２３９】
（結果）
図１１Ａ〜１１ＨはＨＡＥＣによる低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込みおよびＤＡＰＩ染色を示す。ＬＤＬは血管内皮細胞のマーカーとして一般的に使用されており、細胞がその血管内皮の表現型を修飾ペプチド足場上で保持していることを確認するものである。ＤＡＰＩ染色は細胞の核を可視化するために使用した。
【０２４０】
酸化窒素放出。ＨＡＥＣによる酸化窒素（ＮＯ）の放出は細胞培養上澄み中の窒素酸化物（ＮＯｘ）を測定することにより調べた。このパラメーターはまた種々のペプチドナノ繊維足場上に培養したＨＡＥＣの内皮細胞活性を推定するものでもある。これらの足場培養は、機能性ペプチドＲＹＶを除き、ＮＯ放出を促進した（図１５）。ここでもまた、ペプチドヒドロゲル材料は一般的に内皮細胞の培養にとって良好な基板であることが示唆された。しかしなお、ペプチド足場ＲＡＤ１６−Ｉ、ＹＩＧおよびＴＡＧの間にはＮＯ放出にほとんど差が無かった。この場合機能性付与は内皮細胞の表現型のこの特定の側面において重大な役割を果たしていない可能性があり、そして、ペプチド足場ＲＹＶがＮＯ放出を抑制することも示唆している。
【０２４１】
基底膜成分の生産。重要な機能的試験は、細胞が自身の基底膜成分に付着する能力を測定することにより各足場上の内皮細胞の活性を試験するためにＨＡＥＣによるラミニン１およびＩＶ型コラーゲンの生産を特性化することよりなるものであった。一般的に未修飾ＲＡＤ１６−Ｉペプチドから作成した足場を含む試験した全条件について従来の２Ｄ組織培養プレートと比較してラミニン１およびＩＶ型コラーゲンの付着の有意な増強が観察された（図１４Ａおよび１４Ｂ）。興味深いことに、ラミニン１（β２鎖）の唯一のバンドが観察されたのに対し、ＩＶ型コラーゲンについてはより低分子量の２バンドが観察され、コラーゲン分子が試験した培養条件下で部分的に分解されたが、ラミニン分子は未損傷のままであったことを示唆している。これらの結果は、ＩＶ型コラーゲン成分のみの部分的分解により示される通り、付着した基底膜成分が選択的にリモデリングを起こしていることを示唆している。
【０２４２】
【化１】
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【０２４３】
【化２】
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【０２４４】
【化３】
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【０２４５】
【化４】
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【０２４６】
【化５】
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【０２４７】
【化６】
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【０２４８】
【化７】
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【０２４９】
【化８】
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【０２５０】
【化９】
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【０２５１】
【化１０】
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【０２５２】
【化１１】
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【０２５３】
【化１２】
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【０２５４】
【化１３】
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【０２５５】
【化１４】
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【０２５６】
【化１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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