(57)【要約】【課題】  細胞接着分子及び補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスを使用して、メラノーマ細胞を含む悪性腫瘍のような異常細胞を殺滅する方法を提供する。【解決手段】  哺乳動物中の異常細胞を処置する方法であって、前記異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記哺乳動物に投与することを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物中の異常細胞を処置する方法であって、前記異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスが異常細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞接着分子の発現が、正常な表現型を示す正常な前記細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞接着分子の発現が、前記異常細胞が見いだされる周囲組織の細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスがＣＡＶ−１３、ＣＡＶ−１５、ＣＡＶ−１８およびＣＡＶ−２１からなる群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが組換えウイルスである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異常細胞が皮膚の悪性腫瘍、前立腺癌、胃癌、乳癌および大腸癌からなる群より選択される悪性腫瘍の細胞である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが静脈内、腫瘍内、腹腔内もしくは筋肉内投与されるか、または局所外用によって投与される請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが注射によって投与される請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスが接種物１ｍｌあたり約１×１０２プラーク形成単位を超える投与量で患者に投与される請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスが接種物１ｍｌあたり約１×１０２〜１×１０１０プラーク形成単位の投与量で患者に投与される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者中のメラノーマを処置する方法であって、メラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記細胞接着分子が免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子を認識する請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスがＣＡＶ−１３、ＣＡＶ−１５、ＣＡＶ−１８およびＣＡＶ−２１からなる群より選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスが静脈内、腫瘍内、腹腔内もしくは筋肉内投与されるか、または局所外用によって投与される請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスが注射によって投与される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスが接種物１ｍｌあたり約１×１０２プラーク形成単位を超える投与量で患者に投与される請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスが接種物１ｍｌあたり約１×１０２〜１×１０１０プラーク形成単位の投与量で患者に投与される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
異常細胞がウイルス誘発細胞死に対して感受性であるかどうかを決定するために異常細胞をスクリーニングする方法であって、
（ａ）異常細胞を用意する工程、
（ｂ）前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記細胞に加える工程、
（ｃ）前記ウイルスの存在下に前記異常細胞をある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｄ）ウイルスが異常細胞の少なくとも一部に感染してその死を引き起したかどうかを決定する工程、
を含む方法。
【請求項３４】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスが異常細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞接着分子の発現が、正常な表現型を示す正常な前記細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞接着分子の発現が、前記異常細胞が見いだされる周囲組織の細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記異常細胞が皮膚の悪性腫瘍、前立腺癌、胃癌、乳癌および大腸癌からなる群より選択される悪性腫瘍の細胞である請求項３３〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
メラノーマ細胞がウイルス誘発細胞死に対して感受性であるかどうかを決定するためにメラノーマ細胞をスクリーニングする方法であって、
（ａ）メラノーマ細胞を用意する工程、
（ｂ）前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記メラノーマ細胞に加える工程、
（ｃ）前記ウイルスの存在下に前記メラノーマ細胞をある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｄ）前記ウイルスが前記メラノーマ細胞の少なくとも一部に感染してその死を引き起したかどうかを決定する工程、
を含む方法。
【請求項４６】
前記細胞接着分子が免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスがメラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子を認識する請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
異常細胞に感染してその死を引き起す能力に関してウイルスをスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスを選択する工程、
（ｂ）選択した前記ウイルスを、異常細胞の試料と共に、ある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｃ）選択した前記ウイルスが前記異常細胞の少なくとも一部の死を引き起すかどうかを決定する工程、
を含む方法。
【請求項５６】
前記異常細胞に感染してその死を引き起すウイルスの能力を、別の細胞試料を使って工程（ｂ）および（ｃ）に付した異なる前記ウイルスの能力と比較する工程をさらに含む請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために細胞接着分子を認識する請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞接着分子の発現が、正常な表現型を示す正常な前記細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記異常細胞が皮膚の悪性腫瘍、前立腺癌、胃癌、乳癌および大腸癌からなる群より選択される悪性腫瘍の細胞である請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
メラノーマ細胞に感染してその死を引き起す能力に関してウイルスをスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスを選択する工程、
（ｂ）選択した前記ウイルスを、前記メラノーマ細胞の試料と共に、ある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｃ）選択した前記ウイルスが前記メラノーマ細胞の少なくとも一部の死を引き起すかどうかを決定する工程、
を含む方法。
【請求項６８】
前記メラノーマ細胞に感染してその死を引き起すウイルスの能力を、別の細胞試料を使って工程（ｂ）および（ｃ）に付した異なる前記ウイルスの能力と比較する工程をさらに含む請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記細胞接着分子が免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスと、医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項７９】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために細胞接着分子を認識する請求項７８または７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
前記ウイルスが異常細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記細胞接着分子の発現が、正常な表現型を示す正常な前記細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８７】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項８７に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
前記異常細胞が皮膚の悪性腫瘍、前立腺癌、胃癌、乳癌および大腸癌からなる群より選択される悪性腫瘍の細胞である請求項７８〜８８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
メラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスと、医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項９１】
前記細胞接着分子が免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項９０または９１に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
前記ウイルスがメラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子を認識する請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項９５に記載の医薬組成物。
【請求項９７】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項９０〜９６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９８】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項９０〜９７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項９８に記載の医薬組成物。
【請求項１００】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項９９に記載の医薬組成物。
【請求項１０１】
前記ウイルスがＣＡＶ−１３、ＣＡＶ−１５、ＣＡＶ−１８およびＣＡＶ−２１からなる群より選択される請求項１００に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
請求項７８〜１０１のいずれか一項に定義した医薬組成物が皮膚と接触するように含浸されている、患者の皮膚上に保持される送達手段。
【請求項１０３】
パッチ、パッド、ワッドまたは包帯を含む請求項１０２に記載の送達手段。
【請求項１０４】
患者の皮膚に粘着することによって前記医薬組成物を皮膚と接触した状態に保つようになっている請求項１０２または１０３に記載の送達手段。
【請求項１０５】
異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの、異常細胞処置用医薬の製造における使用。
【請求項１０６】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するためにＩＣＡＭ−１を認識する請求項１０５に記載の使用。
【請求項１０７】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項１０５または１０６に記載の使用。
【請求項１０８】
前記ウイルスが前記異常細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項１０５に記載の使用。
【請求項１０９】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項１０７または１０８に記載の使用。
【請求項１１０】
前記細胞接着分子の発現が、正常な表現型を示す悪性でない前記細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項１０５〜１０７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１１】
前記細胞接着分子の発現が、前記異常細胞が見いだされる周囲組織の細胞と比較して、異常細胞では上方制御される請求項１０５〜１０７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１２】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項１０５〜１１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１３】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項１０５〜１１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１４】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１５】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項１１４に記載の使用。
【請求項１１６】
前記ウイルスがＣＡＶ−１３、ＣＡＶ−１５、ＣＡＶ−１８およびＣＡＶ−２１からなる群より選択される請求項１１５に記載の使用。
【請求項１１７】
前記異常細胞が皮膚の悪性腫瘍、前立腺癌、胃癌、乳癌および大腸癌からなる群より選択される悪性腫瘍の細胞である請求項１０５〜１１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１８】
メラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの、メラノーマ処置用医薬の製造における使用。
【請求項１１９】
前記細胞接着分子が免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである請求項１１８に記載の使用。
【請求項１２０】
前記細胞接着分子がＩＣＡＭ−１である請求項１１８または１１９に記載の使用。
【請求項１２１】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子を認識する請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２２】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子と補体調節タンパク質の両方を認識する請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２３】
前記ウイルスが前記メラノーマ細胞に感染するために補体調節タンパク質を認識する請求項１１８に記載の使用。
【請求項１２４】
前記補体調節タンパク質がＤＡＦである請求項１２２または１２３に記載の使用。
【請求項１２５】
前記ウイルスが動物ＲＮＡウイルスである請求項１１８〜１２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２６】
前記ウイルスがピコルナウイルス科の一種である請求項１１８〜１２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２７】
前記ウイルスがエンテロウイルスである請求項１２５または１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
前記ウイルスがコクサッキーウイルスである請求項１２７に記載の使用。
【請求項１２９】
前記ウイルスがＣＡＶ−１３、ＣＡＶ−１５、ＣＡＶ−１８およびＣＡＶ−２１からなる群より選択される請求項１２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスを利用した異常細胞の殺滅に関する。また、細胞が前記ウイルスによる処置に対して感受性であるかどうかを確認するためにそれらの細胞をスクリーニングする方法ならびに前記ウイルスを組み込んだ医薬組成物についても記述する。本発明には獣医学的用途があり、ヒト医学分野にも幅広く応用できる。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマは人口母集団における罹病率の主原因である。オーストラリアはメラノーマの罹病率が世界中で最も高い。メラノーマは侵襲性皮膚癌であり、オーストラリアでは男性でも女性でも３番目に多い癌である。オーストラリア人の３０人に１人は何らかの型のメラノーマを持ち、オーストラリアだけで年間１０００人を超える人々の死因になっている。早期に発見された場合、ほとんどの型のメラノーマは効果的に処置することができる。しかし、さらに進行したメラノーマの管理は成功率が低く、集中的な研究分野になっている。この研究分野の主な目標は、良性および悪性メラノサイト腫瘍中で弁別的に発現される分子の同定である。このような分子は診断に利用することができ、抗癌治療のターゲットとして利用することもできる（Ｋａｇｅｓｈｉｔａ  Ｔ．ら；１９９３）。
【０００３】
細胞性炎症相互作用に決定的な役割を果たす細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）はメラノーマプログレッション抗原として一般に認められている。メラノーマにおけるＩＣＡＭ−１の表面発現は、悪性メラノーマプログレッションと高い相関関係にあることが証明されている（Ｋｒａｕｓ  Ａ．ら；１９９７およびＭｏｒａｎｄｉｎｉ  Ｒ．ら；１９９８）。
【０００４】
ＩＣＡＭ−１は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーで、インテグリン白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ）およびＭａｃ（ＣＤ１１ｂ）の対レセプターであり、またヒトライノウイルスの９０％にとって細胞接着分子でもある（Ｓｔｕａｎｔｏｎ  Ｄ．Ｅ．ら；１９８９）。またＩＣＡＭ−１は、ライノウイルス感染の発生だけでなく、熱帯熱マラリア原虫感染や、喘息、慢性気管支炎および嚢胞性線維症の悪化にも重要な役割を果たす。最近、悪性メラノーマの表面では相補的調節タンパク質（特にＤＡＦと呼ばれる崩壊促進因子）が上方制御されると報告されている（Ｃｈｅｕｎｇ  ＮＫら；１９９８）。
【０００５】
自らの複製過程によって悪性腫瘍の溶解を誘発する能力を持つウイルスは腫瘍細胞溶解性ウイルスと呼ばれ、腫瘍細胞溶解性ウイルスを用いて悪性腫瘍を処置する試みがなされている（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  Ｊ；１９９９）。ほとんどの腫瘍細胞溶解性ウイルスは同じ種または細胞系統での増殖を必要とする。ウイルスによる細胞の感染には、ウイルスキャプシドの脱外被に続く細胞内での複製をもたらすまたはそれらと同時に起こる細胞への付着および取り込みが必要である（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．ら著「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク）、１９７４年、第２版）。
【０００６】
殺癌細胞能力が評価された腫瘍細胞溶解性ウイルスには、ＨｅＬａ子宮頚癌細胞株で腫瘍細胞溶解活性を示したアデノウイルスサブタイプＥｇｙｐｔ１０１ウイルス、胃癌、子宮癌および皮膚癌を処置するためのムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、卵巣癌を処置するためのインフルエンザウイルス、例えば子宮頚癌を処置するためのアデノウイルスなどがある（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  Ｊ；１９９９）。また、アデノウイルスおよび弱毒化ポリオウイルス組換え体は悪性神経膠腫細胞の処置に役立ちうること（Ａｌｅｍａｎｙ  Ｒら，１９９９；Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ  Ｓ．Ｓ．，１９９６）、およびレトロウイルスは活性化されたＲａｓシグナリング経路を持つヒトＵ８７膠芽腫細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞で溶解能力を示すこと（Ｃｏｆｆｅｙ  Ｍ．Ｃ．ら，１９９８；Ｓｔｒｏｎｇ  Ｊ．Ｅ．ら，１９９８）も、他の報文によって示されている。
【０００７】
さらに、臨床試験ではメラノーマ（ＩＩ期）患者の処置にワクシニア腫瘍細胞溶解物が使われている（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  Ｊ．，１９９９）。改変型非神経毒性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）も、頭蓋内メラノーマを含む脳腫瘍および皮下ヒトメラノーマの処置に有望であると報告されている（Ｒａｎｄａｚｚｏ  Ｂ．Ｒ．，１９９７）。また、アデノウイルス感染は、植物ミトトキシンサポリンによる殺メラノーマ細胞を増進させると報告されている（Ｓａｔｙａｍｏｏｒｔｈｙ  Ｋ．，１９９７）。
【０００８】
アデノウイルスによって認識されるターゲット細胞上のレセプターはアデノウイルスのタイプによって異なる。すなわち、アデノウイルスサブグループＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは例えばＣＡＲレセプターを認識するが、アデノウイルス５型（サブグループＣ）、アデノウイルス２型（サブグループＣ）およびアデノウイルス９型（サブグループＤ）は、それぞれクラスＩＩ主要組織適合分子、αｍβ２およびαｖインテグリンを認識する。ＣＡＲレセプターはメラノーマ細胞株上に発現することが知られている（Ｈｅｍｍｉ  Ｓ．ら，１９９８）。ヘパラン硫酸は単純ヘルペス１型および２型ならびにヒトヘルペスウイルス７、アデノ随伴ウイルス２型によって認識される。ヒトヘルペスウイルス７のレセプターはＣＤ４であり、エプスタインバーウイルスは補体レセプターＣｒ２（ＣＤ２１）を認識する。ポリオウイルス１型および２型は細胞接着のためにポリオウイルスレセプター（Ｐｖｒ）を認識し、レトロウイルスはシアル酸を認識する。Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスは細胞接着のためにシアル酸Ｎ−アセチルノイラミン酸を認識する。これに対し、Ｃ型インフルエンザウイルスはシアル酸９−Ｏ−アセチルノイラミン酸を認識する。ワクシニアウイルスは上皮増殖因子レセプターとヘパラン硫酸の両方を認識する。コクサッキーウイルスＡ１３、Ａ１５、Ａ１８およびＡ２１はＩＣＡＭ−１と補体調節タンパク質ＤＡＦ（ＣＤ５５）を認識する（例えばＳｈａｆｒｅｎ  Ｄ．Ｒ．ら，１９９７を参照されたい）。ＤＡＦはエンテロウイルス７０によっても認識される。例えばＦｌｉｎｔ  ＳＪら著「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ」（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（ワシントン）、２０００年）を参照されたい。
【０００９】
転移性腫瘍の伝播は、調節された組織崩壊と共役した一連の接着／脱接着事象を伴う病的過程である。細胞外マトリックスへの接着と細胞マトリックスを介した遊走は腫瘍の浸潤にとって不可欠であることが知られている。細胞外接着分子の最も大きいファミリーはインテグリンファミリーであり（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｊ．Ｆ．およびＨａｒｔ  Ｉ．Ｒ．，１９９６）、αｖβ群のインテグリンは様々な細胞タイプ上に発現することが明らかにされている。例えばαｖβ１は神経芽細胞腫、メラノーマおよび骨肉腫細胞上に発現し、αｖβ３はメラノーマ、膠芽腫および腎癌細胞上に発現し、αｖβ５はαｖβ８と同様にメラノーマ細胞上に発現する（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｊ．Ｆ．およびＨａｒｔ  Ｉ．Ｒ．，１９９６）。
【００１０】
悪性腫瘍の処置は進歩したが、それでも、メラノーマを含む癌の処置は重要な研究課題であり、既存の治療方法に代わる方法が今なお必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ウイルスおよび前記ウイルスが細胞に感染するために利用する細胞発現マーカーの認識／相互作用を使って異常細胞の有意な死滅を達成することができるという驚くべき発見に基づいている。
【００１２】
一側面として、哺乳動物中の異常細胞を処置する方法であって、前記異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明において「異常細胞」という用語は最も広義に、悪性細胞、成長に何らかの異常を示す細胞、ならびに同じ細胞タイプで正常な表現型を示す対応する正常細胞と比較して細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方の発現が異常に上方制御されている細胞を、その細胞が癌細胞であっても癌細胞でなくても、またその細胞の増殖速度が異常であっても異常でなくても包含すると解釈すべきである。したがってこの用語は前新生物細胞、新生物細胞、および最終的に癌細胞に発達してもしなくてもよい非癌細胞を包含する。異常な成長としては、例えば良性腫瘍または悪性腫瘍が挙げられる。典型的には異常細胞は悪性細胞であり、通常はメラノーマ細胞だろう。
【００１４】
一般に、細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方の発現は、異常細胞が見いだされる周囲組織と比較して上方制御されるだろう。
【００１５】
それゆえウイルスは、細胞上の細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方と接触する可能性が高いために、通例、異常細胞に優先的に感染するだろう。したがって上記ウイルスは、異常細胞を効果的にターゲットとするために使用することができる。
【００１６】
もう一つの側面として、本発明は、哺乳動物中のメラノーマを処置する方法であって、前記メラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
上記ウイルスは、細胞をスクリーニングして、例えばその細胞を採取した患者の処置にそのウイルスが適しているかどうか、またはそのウイルスを必要としない他の処置プロトコールの方がその哺乳動物にとって有益であるかどうかを確かめるために使用することもできる。逆に、当該哺乳動物の処置に最も適したウイルスを選択するために、当該患者から採取した細胞の試料を使って様々なウイルスをスクリーニングすることもできる。
【００１８】
したがって本発明は、もう一つの側面として、異常細胞がウイルス誘発細胞死に対して感受性であるかどうかを決定するために異常細胞をスクリーニングする方法であって、
（ａ）異常細胞を用意する工程、
（ｂ）前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記細胞に加える工程、
（ｃ）前記ウイルスの存在下に前記異常細胞をある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｄ）前記ウイルスが前記異常細胞の少なくとも一部に感染してその死を引き起したかどうかを決定する工程、
を含む方法を提供する。
【００１９】
さらなる一側面として、本発明は、メラノーマ細胞がウイルス誘発細胞死に対して感受性であるかどうかを決定するためにメラノーマ細胞をスクリーニングする方法であって、
（ａ）メラノーマ細胞を用意する工程、
（ｂ）前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの有効量を、前記細胞に加える工程、
（ｃ）前記ウイルスの存在下に前記メラノーマ細胞をある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｄ）前記ウイルスが前記メラノーマ細胞の少なくとも一部に感染してその死を引き起したかどうかを決定する工程、
を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法に使用するウイルスは、与えられたウイルスが細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を発現させる異常細胞に感染してその死を引き起す能力をもつかどうかを試験することによって、選択することができる。特にこの試験では、各ウイルスをそれぞれ異常細胞の試料と共にインキュベートし、感染の結果として細胞が殺されるかどうかを決定することによって、多数の異なるウイルスをスクリーニングすることができる。
【００２１】
したがって本発明は、もう一つの側面として、ウイルスが異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するかどうかを試験する方法を提供する。
【００２２】
さらにもう一つの側面として、本発明は、ウイルスがメラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するかどうかを試験する方法を提供する。
【００２３】
さらにもう一つの側面として、本発明は、異常細胞に感染してその死を引き起す能力に関してウイルスをスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスを選択する工程、
（ｂ）選択した前記ウイルスを、前記異常細胞の試料と共に、ある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｃ）選択した前記ウイルスが前記異常細胞の少なくとも一部の死を引き起すかどうかを決定する工程、
を含む方法を提供する。
【００２４】
もう一つの側面として、本発明は、メラノーマ細胞に感染してその死を引き起す能力に関してウイルスをスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスを選択する工程、
（ｂ）選択した前記ウイルスを、前記メラノーマ細胞の試料と共に、ある期間にわたってインキュベートする工程、および
（ｃ）選択した前記ウイルスが前記メラノーマ細胞の少なくとも一部の死を引き起すかどうかを決定する工程、
を含む方法を提供する。
【００２５】
本方法はさらに、前記細胞に感染してその死を引き起す選択したウイルスの能力を、別の細胞試料を使って工程（ｂ）および（ｃ）に付した別のウイルスの能力と比較する工程を含んでもよい。
【００２６】
ウイルスの感染に続く細胞の死は、ウイルスの細胞内複製による細胞の溶解またはおそらくは細胞性カスパーゼの活性化の結果として起こる感染誘発性アポトーシスによる細胞の溶解に起因するのだろう。
【００２７】
溶解が起こると、感染細胞の細胞質ゾル内容物が破裂した形質膜から溢流し、異常細胞に対する免疫応答を誘発することができる抗原が放出されうる。それゆえ、本発明の方法による哺乳動物中の異常細胞の処置は、前記異常細胞に対する前記哺乳動物の免疫性を増強することになりうる。
【００２８】
したがって本発明は、もう一つの側面として、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、前記哺乳動物中の異常細胞をウイルスに感染させることにより、それらの細胞の死および溶解を引き起して、前記免疫応答を生じさせるための抗原をそこから放出させることを含み、前記ウイルスは前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識する方法を提供する。
【００２９】
さらにもう一つの側面として、本発明は、哺乳動物においてメラノーマ細胞に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記哺乳動物中の前記メラノーマ細胞をウイルスに感染させることにより、それらの細胞の死および溶解を引き起して、前記免疫応答を生じさせるための抗原をそこから放出させることを含み、前記ウイルスは前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識する方法を提供する。
【００３０】
一般に上記ウイルスは本発明方法用の医薬組成物の形で提供されるだろう。したがって本発明は、さらにもう一つの側面として、異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスと、医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
さらにもう一つの側面として、本発明は、メラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスと、医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
もう一つの側面として、本発明方法における上記医薬組成物の使用を提供する。
【００３３】
さらにもう一つの側面として、本発明は、異常細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記異常細胞に感染するために免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの細胞接着分子を認識するウイルスの、悪性細胞処置用医薬の製造における使用を提供する。
【００３４】
もう一つの側面として、本発明は、メラノーマ細胞に感染することによってそれらの細胞の死を引き起す能力を持ち、かつ前記メラノーマ細胞に感染するために細胞接着分子および補体調節タンパク質の少なくとも一方を認識するウイルスの、メラノーマ処置用医薬の製造における使用を提供する。
【００３５】
さらに、哺乳動物への前記ウイルスの送達を容易にするために前記哺乳動物の皮膚上に保持される送達手段であって、使用に際して本送達手段を哺乳動物の前記皮膚上に保持したときに本発明の医薬組成物が皮膚と接触するように含浸されている送達手段を提供する。一般に本送達手段は、所望の処置部位に、皮膚を覆った状態で保持することができるようになっているだろう。
【００３６】
上記ウイルスは好ましくは細胞接着分子および補体調節タンパク質の両方に結合するかまたは他の形で関係する能力を持つだろう。補体調節タンパク質は通常は細胞接着分子と複合体を形成するか、または細胞接着分子と空間的に密接な関係を持つだろう。補体調節タンパク質は好ましくは崩壊促進因子（ＤＡＦ）だろう。
【００３７】
細胞接着分子は、Ｖ−ＣＡＭ−１ならびに細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであることが好ましい。細胞接着分子はＩＣＡＭ−１であることが好ましい。
【００３８】
通常、上記ウイルスは動物ＲＮＡウイルスであり、典型的には二十面体キャプシドと一本鎖ＲＮＡゲノムとを持つ非エンベロープＲＮＡウイルスだろう。
【００３９】
ウイルスは、好ましくは、ピコルナウイルス科の一種であるだろう。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーは多数の細胞外ドメインを持ち、ウイルスは免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー分子のＮ末端に最も近い一番外側のドメインと望ましく相互作用するだろう。ウイルスは、好ましくはエンテロウイルス属に由来し、最も好ましくはコクサッキーウイルスだろう。コクサッキーウイルスはヒトエンテロウイルスであり、ほとんどのエンテロウイルス感染は、このウイルス群のもっと毒性の強いメンバーでさえ、臨床症状をほとんどまたは全く引き起さない。例えばＣＡＶ２１感染は風邪および乳幼児下痢症の発症と関連する。
【００４０】
したがって本発明は、もう一つの側面として、哺乳動物中の異常細胞を処置する方法であって、前記哺乳動物に有効量のコクサッキーウイルスを投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
さらにもう一つの側面として、本発明は、哺乳動物中のメラノーマを処置する方法であって、前記哺乳動物に有効量のコクサッキーウイルスを投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
コクサッキーウイルスは典型的にはコクサッキーＡ群ウイルスだろう。また、通常は、コクサッキーウイルス血清型１〜２４（ＣＡＶ１〜２４）からなる群より選択され、最も好ましくはＣＡＶ１３、ＣＡＶ１５、ＣＡＶ１８およびＣＡＶ２１より選択されるだろう。
【００４３】
ウイルスは通常、一般的な動物ウイルスであるが、本発明はこれに限定されず、異常細胞に感染してそれらの死を引き起す能力を持つように操作された組換えウイルス、または細胞に感染して感染後に細胞の死を引き起す能力が強化されるように他の形で改変を施したウイルスを利用してもよい。例えばウイルスはαｖβ３、αｖβ５またはαｖβ６などの他の細胞接着分子を認識するように改変することができる。
【００４４】
さらにまた、同じウイルスを異なる処置クール中に哺乳動物に投与してよい。しかし好ましくは、先に投与したウイルスに対する何らかの免疫応答の潜在的影響を避けるためまたは軽減するために、異なる処置クールには異なるウイルスを使用する。ウイルスは例えば患者に局所投与、腫瘍内投与、全身投与することができる。
【００４５】
哺乳動物は悪性腫瘍に苦しんでいて処置を必要としている任意の哺乳動物であってよい。哺乳動物は好ましくはヒトだろう。
【００４６】
本発明の方法は通常の癌処置に対する補助処置として、または他の治療的処置を伴わない処置として使用することができる。特に本発明の方法は、通常の処置が適切でないか実用的でない場合、または異常細胞の切除により患者が容認しかねる瘢痕または傷が残る可能性がある場合（特に患者の顔、例えば患者の鼻または唇などからの切除）に利用することができる。もう一つの選択肢として、異常細胞切除の前および／または直後に、ウイルスを投与することもできる。
【００４７】
したがって本方法は、初期悪性腫瘍の診断後でも後期悪性腫瘍の診断後でも使用することができ、かつ外科手術前に細胞を殺し外科手術後に残存細胞を殺すためにも応用することができる代替的な治療的処置になる。
【００４８】
本明細書に記載するプロトコールを使用すれば、当業者は容易に、本発明方法での使用に適したウイルスを選択し、どの異常細胞がそれらの細胞の死をもたらす感染に対して感受性であるかを決定することができるだろう。異常細胞としては、例えば前立腺癌細胞、乳癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、神経膠腫細胞、皮膚癌細胞または他の悪性細胞を挙げることができる。
【００４９】
本発明の方法は皮膚の悪性腫瘍またはメラノーマなどの皮膚から転移した悪性腫瘍の処置にとりわけ適している。
【００５０】
文脈上明らかに異なる判断をすべき場合を除いて、本明細書および特許請求の範囲では、「〜を含む」などの用語は排他的または網羅的ではなく非排他的に、すなわち「〜を含むが、それらに限らない」という意味に解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
以下、好ましい態様の例をいくつか挙げて、本発明をさらに説明する。
【図１】図１はメラノーマ細胞上の表面ＩＣＡＭ−１発現の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す図である。ＩＣＡＭ−１発現（白い矢印）が黒っぽい細胞染色によって示されている。
【図２】図２はメラノーマ細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５によるＩＣＡＭ−１およびＤＡＦ発現の相対レベルを示す図である。
【図３】図３は様々な感染後時間におけるコクサッキーウイルスＡ２１による２つのヒトメラノーマ細胞株の細胞溶解性感染を示す図である。
【図４】図４はヌードマウス中で誘導した原発性メラノーマから得たヒトメラノーマ細胞の様々な用量のコクサッキーウイルスＡ２１による細胞溶解性感染を示す図である。
【図５】図５は胸壁メラノーマから得た懸濁および付着悪性腫瘍細胞調製物のコクサッキーウイルスＡ２１による細胞溶解性感染（感染後２０時間）を示す図である。
【図６】図６の（Ａ）は、６個のヒトメラノーマ細胞株のコクサッキーウイルスＡ２１による細胞溶解性感染（感染後２３時間）を示す図である。（Ｂ）はヒトメラノーマ細胞表面のＤＡＦ（黒っぽい線）とＩＣＡＭ−１（明るい線）のフローサイトメトリー解析の結果を示す図である。
【図７】図７は代表的ヒトエンテロウイルスによる様々な腫瘍細胞株の細胞溶解性感染を示す図である。
【図８】図８はリンパ節から得たヒトメラノーマ生検材料のヒトエンテロウイルス（コクサッキーウイルスＡ２１およびＢ３）による細胞溶解性感染を示す図である。
【図９】図９は選択されたコクサッキーウイルスによる前立腺癌細胞の細胞溶解性感染を示す図である。
【図１０】図１０は非メラノーマ細胞には感染することなくメラノーマ細胞を特異的に溶解することによって破壊するＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５の能力を示す図である。
【図１１】図１１はＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにＣＡＶ２１感染細胞を皮下投与することによってヒトメラノーマ腫瘍形成が阻害されることを示す図である。
【図１２】図１２はＣＡＶ２１による既成Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８メラノーマの腫瘍内処置の結果を示すグラフである。
【図１３】図１３はＣＡＶ１５による既成Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８メラノーマの腫瘍内処置の結果を示すグラフである。
【図１４】図１４はＰＢＳ（左側の腫瘍）およびＣＡＶ１５（右側の腫瘍）と共に接種した３５日後のＳｋ−Ｍｅｌ−２８腫瘍を示す図である。
【図１５】図１５はＣＡＶ２１による既成ＭＥ４４０５メラノーマの腫瘍内処置の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
あるウイルスがある腫瘍の細胞に感染してそれらの死を引き起す能力を持つかどうかを決定するには、通常の技術を使って腫瘍から生検材料を採取し、細胞の調製物を調製した後、（ｉ）ウイルス受容体細胞表面発現を確認し、（ｉｉ）それらの細胞をウイルスにばく露し、所定の培養期間（典型的には約２日であるが、これは使用するウイルスによって変動しうる）にわたって、感染および細胞死に関してそれらの細胞を監視することができる。この方法では、調製した悪性細胞を少しずつ使って、多数のウイルスを同時にスクリーニングすることができ、より高度の感染性と細胞死を示すウイルスを選択して、前記生検材料を採取した処置対象に投与することができる。同様に、様々な供給源から採取した生検材料から調製した様々な悪性細胞調製物を特定のウイルスを使ってアッセイに使用してもよい。生検材料は一個体の様々な部位から採取してもよいし、多数の個体から採取してもよい。
【００５３】
本明細書に記載する方法で使用されるウイルスは、望ましくは、受容者に臨床症状をほとんど引き起さないか、または極わずかな臨床症状しか引き起さないだろう。そのようなウイルスは当業者によく知られている供給業者から容易に入手することができ、本方法での有効性については上述した方法でスクリーニングすることができる。望ましくは、ウイルスは通常は、コクサッキーＡ群ウイルスから選択されるだろう。ＣＡＶ２１は好ましく、ＣＡＶ２１（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）は特に好ましい（Ｓｉｃｋｌｅｓ  Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １０２：７４２；Ｓｈａｆｒｅｎ  Ｄ．ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  １９９７，７１：４７３６；Ｈｕｇｈｅｓら，Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  １９８９，７０：２９４３；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｎ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，１９６１，１０７：６３）。ＣＡＶ２１（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国バージニア州２０１１０−２２０９マナッサス、ユニバーシティーブールバード１０８０１）から受託番号ＶＲ−８５０として入手することができる。
【００５４】
与えられたウイルスが悪性細胞に感染してその死を引き起す能力を持つかどうかを簡単にスクリーニングする目的には、生検材料から単離された初代悪性細胞ではなく悪性細胞株を使用することができる。
【００５５】
典型的にはＩＣＡＭ−１および補体調節タンパク質ＤＡＦの少なくとも一方を認識するウイルスが使用されるだろう。ＤＡＦはメラノーマ細胞上に発現することの他に（Ｃｈｅｕｎｇ  Ｎ．Ｋ．ら；１９９８）、生体内原位置の大腸腺癌細胞上およびヒト大腸腺癌細胞株ＨＴ２９上での発現が上方制御されることも示されている。ＤＡＦの発現は、補体による損傷に対する細胞の耐性を増進すると考えられているので、腫瘍エスケープの機序であることが考えられる（Ｂｊφｒｇｅ  Ｌ．ら；１９９６）。
【００５６】
上方制御されたＩＣＡＭ−１の発現は、胃癌および腺腫細胞（Ｎａｓｕ  Ｒ．，１９９６；Ｋｏｙａｍａ  Ｓ．，１９９２）、前立腺癌細胞（Ｒｏｋｈｌｉｎ  Ｏ．Ｗ．およびＣｏｈｅｎ  Ｍ．Ｂ．，１９９５）ならびにヒト乳癌細胞（Ｓｇａｇｉｕｓ  Ｍ．Ｋ．，１９９６）を含む様々な悪性細胞タイプで報告されている。乳癌細胞上にはＩＣＡＭ−１と共にＶ−ＣＡＭ１が発現されることも、研究によって示されている（Ｒｅｇｉｄｏｒ  Ｐ．Ａ．ら；１９９８）。またＩＣＡＭ−１は、髄様癌細胞（Ｂａｃｕｓｓ  Ｓ．Ｓ．ら；１９９４）、骨髄腫細胞（Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｄ．Ｇ．ら；１９９９）および甲状腺癌細胞上に発現することも知られている。ＩＣＡＭ−１陽性染色は乳糖腺癌などの原発腫瘍ならびに脳、肝臓および副腎からの転移性腫瘍でも報告されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｅａｌ  Ｊ．Ｍ；１９９６）。
【００５７】
メラノーマなどの皮膚上に生じる腫瘍はウイルスによる処置のとりわけ好適な候補である。メラノーマがリンパ節、肺または他の器官に転移している場合は、処置を施すために外科手術によってそれらの部位を露出する際に、上述のように、これらの部位および／または周囲組織にウイルスを投与することができる。
【００５８】
選択したウイルスは、好ましくは、ウイルスによる感染を受けうる腫瘍の領域が最大になるように、悪性腫瘍上の多数の部位に直接注射されるだろう。通常、腫瘍を取り囲む組織は、その組織中に悪性細胞が存在する可能性を考えて、注射または他の方法により、ウイルスで処置されるだろう。比較的進行するまで腫瘍が検出されない場合は、腫瘍自体を外科的に切除した後、ウイルスを注射することができる。
【００５９】
ウイルスは、悪性腫瘍に直接注射するのではなく、腫瘍に送達されるように腫瘍部位に隣接する位置で受容者の血流中に静脈内注射することによって全身投与してもよい。同様にウイルスは、適当であると考えられる場合は、皮下、腹腔内、または例えば筋肉内に投与してもよい。しかし一般的には、ウイルスに特異的な抗体が存在することによって上記のような他のウイルス送達法の効力が低下する可能性を考えると、腫瘍への直接注射が好ましい。
【００６０】
ウイルスは、単独でまたは腫瘍中へのウイルスの直接注射と組み合わせて、腫瘍に局所外用してもよい。この場合、ウイルスは、処置すべき皮膚上の悪性腫瘍部位に押しつけられる送達手段であって、ウイルスによる悪性細胞の感染が可能なようにウイルスの完全性を維持するのに適した医薬的に許容できる担体が含浸された送達手段を使って適用することができる。この送達手段は、処置すべき領域にウイルスを局在化させておくのに適した例えばパッチ、パッド、ワッド（ｗａｄ）、包帯などの形状を取ることができる。典型的には、前記送達手段は、パッチを皮膚に貼り付けることによって所望の位置にパッチを保持して接種物を患者の皮膚と接触させておくために下面外縁部に接着剤が塗布されているパッチだろう。
【００６１】
一般的には、悪性腫瘍および／または周囲組織に１または複数の小さい切開を施して、ウイルスがそこに進入するための部位が設けられるだろう。
【００６２】
ウイルスを受容者に接種するために使用される運搬媒体は生理食塩水などの液体であるか、適当と考えられる従来から知られている他の任意の媒体、例えば医薬用途および処置部位へのウイルスの投与に適した市販のゲルなどであることができる。
【００６３】
接種物は一般的には接種物１ｍｌにつき約１×１０２〜約１×１０１０プラーク形成単位を含むだろう。接種物は好ましくは接触物１ｍｌにつき約１×１０５プラーク形成単位以上を含むだろう。主治医または外科医は、患者の全身状態、悪性腫瘍の段階と位置、ウイルスで処置すべき領域の総サイズと分布を考慮し、一般に認められた医療に従って、患者に投与される接種物の量を容易に決定することができる。典型的には、患者は初回量のウイルスで処置された後、適切な期間にわたって監視され、次に、ウイルスの初回投与に対する患者の応答および初回処置がもたらすウイルス感染と悪性細胞死の程度などといった因子に応じて、その患者にさらにウイルスを投与するという決定を下す。
【００６４】
個体は、望ましくは、ある期間にわたって所定の間隔で、ウイルスによって処置されるだろう。間隔は毎日または２４時間〜７２時間以上の範囲でそれぞれの状況に合わせて決定することができる。先に投与したウイルスに対する何らかの免疫応答の影響を回避するためまたは最小限にするために、毎回同じウイルスまたは異なるウイルスを投与することができ、１回の処置クールは主治医の決定に応じて１〜２週間以上に及ぶことができる。最も好ましくは、当該哺乳動物が過去にばく露されたことのないウイルス、または当該哺乳動物は比較的軽微な免疫応答しか生じないと標準的技術で決定されるようなウイルスが投与されるだろう。
【００６５】
本発明の方法には容易に入手できる既知ウイルスを好適に使用することができるが、通常の技術を使って改変または操作されたウイルスも利用することができる。例えば、追加の細胞接着分子を細胞レセプターとして利用するようにウイルスを改変することができる。例えばコクサッキーウイルスＡ２１は、コクサッキーＡ９（ＣＡＶ−９）の場合と同様にペプチドモチーフ「ＲＧＤ」がウイルスキャプシド表面に発現するように、部位特異的突然変異導入法を使って改変することができる。ＲＧＤモチーフは全てのαｖインテグリンヘテロ二量体によって認識される。このキャプシド改変により、ウイルスは、例えばインテグリンαｖβ３（これは悪性メラノーマ病巣の表面でＩＣＡＭ−１と一緒に上方制御されることが示されている細胞接着分子である（Ｎａｔａｌｉ  Ｐ．Ｇ．；１９９７））を結合することができるようになり、その結果、インテグリン分子との相互作用または続いて起こるＩＣＡＭ−１との相互作用によるウイルスの取り込みが増大する。あるいは、Ｅ−セレクチンなどのセレクチンを認識するようにウイルスを改変することもできる。
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
【００６７】
実施例１
１．１  細胞株
ＩＣＡＭ−１を発現する横紋筋肉腫細胞（ＲＤ−ＩＣＡＭ−１）、ＨｅＬａ−Ｂ細胞およびヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５）の連続培養物は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で維持した。２つのメラノーマ細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５は、モナッシュ大学生化学分子生物学部（オーストラリア国ビクトリア州）のＲａｌｐｈ博士およびロイヤルニューカッスル病院癌研究部門（オーストラリア国ニューサウスウェールズ州ニューカッスル・デビッドマディソンビルディング４階）のＰｅｔｅｒ  Ｈｅｒｓｅｙ博士からそれぞれ入手した。細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８は、化学療法剤に耐性であることが見いだされた転移性メラノーマ細胞株である（５６）。メラノーマ細胞培養ＭＥ４４０５は原発性メラノーマ病巣の標本から樹立された（６９）。これら２つのメラノーマ細胞株は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで維持した。横紋筋肉腫細胞（ＲＤ）、異数性ヒト胚細胞株、およびＨｅＬａ−Ｂ細胞、ヒト扁平上皮細胞由来の異数性細胞クローンは、フェアフィールド病院腸呼吸器研究所（オーストラリア国ビクトリア州メルボルン）から入手した。免疫グロブリンスーパーファミリー分子ＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡをＲＤ細胞に安定にトランスフェクトしたＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞株は別途記載されている（Ｓｈａｆｒｅｎ  ＤＲら；１９９７）。ヒト肺線維芽細胞由来のＭＲＣ５細胞はＢｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（米国）から入手した。
【００６８】
１．２  ウイルス
ＣＡＶ２１（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株）、ＣＡＶ１５（Ｇ−９）およびＣＶＢ３（Ｎａｎｃｙ）の株はＭａｒｇｅｒｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ（オーストラリア国ビクトリア州メルボルン、フェアフィールド病院胃呼吸器研究所）から入手した。
【００６９】
１．３  ウイルス増殖
標準的方法に従ってＲＤ−ＩＣＡＭ−１培養（８０〜９５％コンフルエント）を１０４ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のコクサッキーウイルスＡ株に感染させた。完全な細胞変性効果が観察されるまで（２日以内）、感染細胞を３７℃でインキュベートした。次に細胞を−８０℃で凍結し融解して、残っている細胞内ウイルス粒子を放出させた。１０００×ｇで５分間の遠心分離により、ウイルス含有培地から細胞片を除去し、５００μｌずつに分けて−８０℃で保存した。ＣＶＢ３は上記の同じ方法によりＨｅＬａ−Ｂ細胞中で増殖させた。
【００７０】
１．４  モノクローナル抗体（ＭＡｂ）
ＤＡＦの第３ＳＣＲを認識するＭＡｂ  ＩＨ４（２４）は、オースチン研究所（オーストラリア国ビクトリア州メルボルン）のＢ．Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士からもらった。ＭＡｂ  ＷＥＨＩ−ＣＡＭはＩＣＡＭ−１の第１ドメインを認識する抗体であり（Ｂｅｒｅｎｄｔ  ＡＲら；１９９２）、ウォルター・アンド・イライザホール研究所（オーストラリア国ビクトリア州メルボルン）のＡ．Ｂｏｙｄ博士によって提供された。
【００７１】
１．５  フローサイトメトリー解析
液量１００μｌ中の細胞（１×１０６）を１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに希釈したＭａｂ  ＩＨ４またはＭａｂ  ＷＥＨＩ−ＣＡＭと共に氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞を５．０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１０００×ｇで５分間ペレット化し、ＰＢＳに希釈したフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｓｉｌｅｎｕｓ社（オーストラリア、メルボルン））１００μｌに再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳに再懸濁して、ＦＡＣＳｔａｒアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（オーストラリア、シドニー））による解析を行った。
【００７２】
１．６  比色法による感染力アッセイ
ＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５のウイルス保存液を、１％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭに、１０倍ずつ段階希釈した。９６ウェルプレート中のＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞単層をウイルスの段階希釈液１００μｌと共に３７℃で４８時間インキュベートした。細胞の生存を定量するために、単層を１００μｌのクリスタルバイオレット／メタノール溶液（ＰＢＳ中の５％ｗ／ｖクリスタルバイオレット、１０％ｖ／ｖメタノール、１０％ｖ／ｖホルムアルデヒド溶液）と共にインキュベートし、蒸留水で洗浄した。波長５４０ｎｍのマルチスキャン酵素結合免疫吸着検定プレートリーダーでプレートを読みとった。５０％終点力価を計算し（Ｒｅｅｄ  ＬＪおよびＭｕｅｎｃｈ  ＨＡ；１９３８）、１ミリリットルあたりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として表した。吸光度がウイルスなしの対照の３標準偏差未満である場合は、そのウェルを陽性と記録した。ＣＡＶ２１のＴＣＩＤ５０は２．７×１０４単位／ｍｌと決定され、ＣＡＶ１５のＴＣＩＤ５０は１．６×１０４単位／ｍｌと決定された。
【００７３】
１．７  ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの表面発現
メラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５の表面におけるＩＣＡＭ−１およびＤＡＦ発現の相対レベルを、フローサイトメトリー解析によって決定した。結果を図２に示す。
【００７４】
図からわかるように、フローサイトメトリー解析により、２つのメラノーマ細胞株の表面では、同程度の高レベルなＩＣＡＭ−１発現とＤＡＦ発現が明らかになった。転移性メラノーマに由来するさらに６つのメラノーマ細胞株も高レベルのＩＣＡＭ−１とＤＡＦを発現させた（非掲載データ）。試験した全ての転移性メラノーマ細胞に高レベルのＩＣＡＭ−１発現が見いだされたことは、インビボでのＩＣＡＭ−１発現レベルの増加が転移能の増加と相関することを示すいくつかの報文を裏付けるものである（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＰら：１９８８；Ｋａｇｅｓｈｉｔａ  Ｔら：１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ  ＢＥおよびＷｅｌｃｈ  ＤＲ：１９９０；Ｎａｔａｌｉｅ  ＰＧら：１９９７）。
【００７５】
実施例２
２．１  ＣＡＶ２１によるメラノーマ細胞株の感染
２つの培養適応メラノーマ細胞株ＭｉｌｌｅｒおよびＭＭ２００の単層を、実施例１で調製したＣＡＶ２１に、感染多重度１．０で１時間感染させた後、接種物を除去し、細胞を培養培地（１％ウシ胎仔血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）中、３７℃で２４時間インキュベートした。図３に示す結果は、ＣＡＶ２１が感染後（ＰＩ）５時間で早くも両細胞株の有意な細胞病理学的変化を誘導し、ＰＩ９時間までに全メラノーマ細胞のほとんど完全な死滅を誘導できたことを示している。
【００７６】
実施例３
３．１  原発性メラノーマから得られたメラノーマ細胞のＣＡＶ２１による感染
先にＭＥ４４０５株のヒトメラノーマ細胞を通常の方法で皮下に接種しておいたヌードマウスから取り出した原発性メラノーマから得られた細胞は、図４に示すように、１メラノーマ細胞あたり０．００５  ＣＡＶ２１粒子のばく露率（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｒａｔｅ）でも、ＣＡＶ２１による感染および殺滅を著しく受けやすかった。
【００７７】
実施例４
４．１  組織生検材料から単離されたメラノーマ細胞のＣＡＶ２１による感染
メラノーマ細胞を、原発性胸壁メラノーマの新鮮な生検材料から、「スピリング（ｓｐｉｌｌｉｎｇ）」法とコラーゲン−トリプシンおよびＤＮアーゼ消化によって単離した。簡単に述べると、生検材料を１０ｍｌ注射器のプランジャでほぐすことによって、細胞をメラノーマ生検材料から遊離させた。得られたメラノーマ細胞懸濁液をフィコール−ハイパック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（スウェーデン国ウプサラ））勾配で精製した。ヒト線維芽細胞に対するモノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＳ５１６Ｘ、ＳｅｒａＬａｂ社）と白血球共通抗原に対するモノクローナル抗体（ＣＤ４５、カタログ番号１７−０８０４−３、Ａｍｒａｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（オーストラリア国ビクトリア州））でコーティングされたＤｙｎａｌビーズと混合することによって、混入している線維芽細胞と白血球を除去した。
【００７８】
次に、１×１０６細胞を２４穴組織培養プレートに入れ、実施例１で調製した約１×１０５プラーク形成単位のＣＡＶ２１を接種した。３７℃で２０時間インキュベートした後、ヨウ化プロピジウム染色と検鏡により、細胞を細胞死について評価した。
【００７９】
図５は、付着および懸濁原発性メラノーマ細胞が、ＣＡＶ２１感染の結果として、２０時間のインキュベーション期間中に、どちらも効率よく殺されたことを示している。
【００８０】
実施例５
５．１  ＣＡＶ２１感染に対して感受性を示すメラノーマ細胞でのＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの発現
メラノーマ細胞がＣＡＶ２１による感染とその結果起こる死滅に高い感受性を持つことを確認するために、原発性ヒトメラノーマに由来するさらに６つのヒトメラノーマ細胞株を実施例１で調製したＣＡＶ２１に感染させた。
【００８１】
図６（Ａ）は、１株（ＭＥ１０５）を除く全てのメラノーマ細胞株がＣＡＶ２１感染の結果として２３時間のインキュベーション期間中に死滅したことを示している。
【００８２】
悪性メラノーマ細胞表面のＩＣＡＭ−１とＤＡＦの高レベル発現を確認するために、各細胞株の細胞をＭａｂ  ＩＨ４およびＭａｂ  ＷＥＨＩ−ＣＡＭで処理した。抗ＤＡＦおよび抗ＩＣＡＭ−１  Ｍａｂの結合は、上述のようにフローサイトメトリー解析によって検出した。図６（Ｂ）に示す蛍光ヒストグラムは、ＭＥ１０５細胞株を除いて、調べた全メラノーマ細胞株の表面にＤＡＦとＩＣＡＭ−１の高レベルに発現することを裏付けている。ＤＡＦおよびＩＣＡＭ−１発現の欠如は、その細胞株をＣＡＶ２１感染に対して抵抗性にした。
【００８３】
実施例６
６．１  ＩＣＡＭ−１を発現するメラノーマ細胞の選択的感染
ＩＣＡＭ−１発現ヒトメラノーマ細胞のＣＡＶ２１感染の選択性を強調するために、メラノーマ細胞株ＭＭ２００の単層に、約１×１０５プラーク形成単位のＣＡＶ２１、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）、エコーウイルス７型（Ｅ７）またはコクサッキーウイルスＢ１（ＣＶＢ１）を、それぞれ２４穴組織培養プレートのウェル中、３７℃で１時間接種した。次にウイルス接種物を除去し、細胞単層をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１．０％ウシ胎仔血清を含む１．０ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに加え、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。細胞の生存を定量するために、単層をクリスタルバイオレット／メタノール溶液と共にインキュベートし、蒸留水で洗浄し、１００倍の顕微鏡で調べた。
【００８４】
図７は、４８時間のインキュベーション期間後に、ＣＡＶ２１だけがＭＭ２００メラノーマ細胞に感染したのに対し、ＣＶＢ１、ＣＶＢ３およびＥ７感染と死滅が明白な横紋筋肉腫細胞（ＲＤ）ではその逆であったことを示している。ＲＤ細胞はＤＡＦを発現させるが、ＩＣＡＭ−１を発現させない。しかしＲＤ細胞の表面にＩＣＡＭ−１を発現させると、それらはＣＶＡ２１による感染と死滅に高い感受性を示すようになる。
【００８５】
実施例７
７．１  ＣＡＶ２１によるメラノーマ生検材料の感染
固形ヒトメラノーマリンパ節生検材料の切片を２４穴組織培養プレートのウェルに入れ、模擬感染させるか、約１×１０５プラーク形成単位のＣＡＶ２１またはＣＶＢ３にばく露した。
【００８６】
図８の結果は、ＣＡＶ２１感染により、当該ウイルスで処理されたメラノーマ生検材料の外辺部に重度の組織破壊が起こったが、模擬感染およびＣＶＢ３感染した生検材料では検出できるウイルス膜破壊は観察されなかったことを示している。
【００８７】
実施例８
８．１  ＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５によるヒトメラノーマ細胞の細胞溶解性感染
ヒトメラノーマ細胞株に対するＣＡＶ１５およびＣＡＶ２１の腫瘍細胞溶解能をアッセイするために、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８細胞とＭＥ４４０５細胞を平底９６穴マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に１ウェルあたり３×１０４細胞の密度で播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後、培養培地を除去して、適当なウイルス段階希釈液を含む最終液量１００μｌの新しい培地と置き換えた。保存ウイルス調製物を１０−１から１０−７まで段階希釈した。ウイルス接種の後、プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、細胞の生存を上述のようにクリスタルバイオレット染色によって検出した。
【００８８】
３つの細胞株ＲＤ−ＩＣＡＭ−１、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５は全て、ＣＡＶ２１とＣＡＶ１５による細胞溶解性感染に対して許容性であることがわかった。４８時間のインキュベーション期間後に、ウイルスなしの対照はウイルス誘発性ＣＰＥの徴候を何も示さなかったが、１０−１および１０−２の希釈率では全ての細胞培養に著しい細胞溶解が観察された。さらに高いウイルス希釈率では、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８細胞は、ＭＥ４４０５およびＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞株と比較してウイルス溶解に対する許容性が高いことがわかった。
【００８９】
ＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５の総腫瘍細胞溶解能は対照ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞と比べてメラノーマ細胞株の方が高かった。どの細胞タイプも同じぐらいのレベルのＩＣＡＭ−１を発現させるが、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞でのＤＡＦ発現はメラノーマ細胞よりも有意に低く（図２参照）、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞へのＤＡＦによるウイルス付着が少ない理由になっている。ＤＡＦは、多くのコクサッキーウイルスにとって低親和性隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）分子であり、ウイルス粒子の捕捉を補助し、よって細胞の感染性を補助することが、先に明らかにされている（Ｌｅａ  ＳＭら；１９９８）。メラノーマ細胞株にはＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞よりも高レベルのＤＡＦ発現が存在するので、ＩＣＡＭ−１受容体にウイルスが接近する可能性が増し、よって感染および細胞溶解のレベルが増大する。
【００９０】
８．２  コクサッキーウイルスによるヒト前立腺癌細胞の細胞溶解性感染
ヒト前立腺癌細胞株ＣＰ３（ＩＣＡＭ−１を発現させる）の細胞を平底９６穴マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社）に３×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、上記実施例８．１に記述したように、細胞をインキュベートした後、上記実施例ＣＡＶ１３、ＣＡＶ１５、ＣＡＶ２１およびコクサッキーウイルスＢ群ウイルスＣＶＢ３の段階希釈液で処理した。ＰＣ３細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（米国バージニア州マナッサス）から受託番号ＣＲＬ−１４３５として入手することができる。
【００９１】
図９に示すように、ＰＣ３細胞はＣＡＶ１５による細胞溶解性感染に対して著しく許容性だった。ＣＡＶ１３およびＣＡＶ２１でも著しい細胞溶解性感染が観察された。
【００９２】
８．３  ヒトメラノーマ細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５におけるＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５の選択的複製
メラノーマ細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５に対するＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５の選択性を、インビトロ特異性アッセイ法で調べた。
【００９３】
滅菌細胞培養インサートを使って、標準的な６穴組織培養プレートのウェルを分割した。細胞培養インサートの内部でＳｋ−Ｍｅｌ−２８細胞またはＭＥ４４０５細胞を生育させ、細胞培養インサートの周りでＭＲＣ５またはＲＤ細胞を生育させた。細胞が付着したら、細胞培養インサートを各ウェルから取り除いて、細胞培養培地が共培養を均等に覆うようにした。両細胞集団の外辺部が融合したら、共培養物をＰＢＳで２回洗浄し、次に５００μｌのＰＢＳまたは保存ウイルス（１０５  ＴＣＩＤ５０）を３７℃で１時間接種した。３７℃でインキュベートした後、１％ＦＣＳを含む新しいＤＭＥＭを各ウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で４８時間インキュベートした。細胞単層を光学顕微鏡によって、ウイルス誘発性ＣＰＥの徴候についてモニターした後、各ウェルを３ｍｌのクリスタルバイオレット溶液で染色して、ウイルスによる細胞溶解性感染からの細胞の生残を検出した。周囲の非メラノーマ細胞に感染することなくメラノーマ細胞を特異的に溶解によって破壊するＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５ウイルスの能力を図１０に示す。
【００９４】
図からわかるように、ＣＡＶ２１またはＣＡＶ１５で処理した各ウェルの内側のメラノーマ細胞培養物はウイルスによって完全に破壊されたが、細胞に進入するためのレセプターとしてＩＣＡＭ−１を使用しないＣＶＢ３ウイルスによる影響は受けなかった。ＣＶＢ３は細胞への進入にコクサッキーおよびアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）を利用する（１０）。ＭＲＣ５細胞はＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５による細胞溶解性感染には抵抗性であるように見えた。これらの細胞はヒト肺線維芽細胞培養物に由来し、ＩＣＡＭ−１を低レベルにしか発現しない（未公表データ）。このデータは、迅速かつ効果的なターゲット細胞の細胞溶解性感染が、ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの高レベル発現を助長したことを示している。ＩＣＡＭ−１を発現しないＲＤ細胞はＣＡＶ２１感染またはＣＡＶ１５感染によって破壊されなかった。さらに、上記の結果は、ウイルス感染したレセプター保有細胞と直接接触したレセプター陰性細胞へのＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５の伝播が、あったとしても極めてわずかに過ぎないことを示している。
【００９５】
実施例９
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使った一連の動物ばく露実験により、インビボの既成メラノーマ腫瘍の細胞溶解性感染を評価した。
【００９６】
９．１  ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるメラノーマ異種移植片の成長
全ての動物実験は、ニューカッスル大学動物実験倫理委員会が承認したガイドラインに基づいて実施した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは動物実験施設（オーストラリア国ニューサウスウェールズ州ニューカッスル・デビッドマディソンビルディング５階）にある病原体フリーの飼育器で飼育した。
【００９７】
Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８細胞およびＭＥ４４０５細胞は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで生育した。細胞を収集し、ＤＭＥＭで２回洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁した。懸濁液の細胞濃度を血球計数器で決定し、細胞の生存力をトリパンブルー染色によって評価した。＞９５％が生存可能な細胞調製物だけを異種移植に使用した。異種移植に先立って、ロンプン／ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ）注射によって動物を麻酔した。動物を監視し腫瘍成長を測定するために、動物を３％イソフルオランで麻酔した。
【００９８】
腫瘍細胞は麻酔した４〜６週齢の雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側腹部に異種移植した。異種移植片腫瘍成長は毎日観察し、様々な間隔でキャリパスを用いて測定し、全ての測定値を５週間にわたってミリメートルの単位で記録した。腫瘍体積の推定値は既知の方法を使って計算した（Ｄａｖｉｅｓ  ＣＤら；１９９７）。
【００９９】
９．２  皮下ウイルス送達
１５匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使った予備実験で、エクスビボ感染細胞によるウイルスの局所皮下送達を、腫瘍成長の阻害について評価した。対照群のマウス（ｎ＝５）にはＳｋ−Ｍｅｌ−２８細胞（１×１０７）を、上下両方の側腹部の個々の部位に皮下注射した。ＣＡＶ２１群（ｎ＝５）には１×１０７個のＳｋ−Ｍｅｌ−２８細胞を上側腹部に注射すると共に、室温にて１０４  ＴＣＩＤ５０のＣＡＶ２１と共にエクスビボで１時間プレインキュベートしておいたＳｋ−Ｍｅｌ−２８細胞（１×１０７）も注射した。ＣＡＶ１５群（ｎ＝５）は、下側腹部に施した第２の注射が１０４  ＴＣＩＤ５０のＣＡＶ１５と共にインキュベートしておいたＳｋ−Ｍｅｌ−２８細胞（１×１０７）を含む点を除いて、ＣＡＶ２１群と同じように処置した。注射の４週間後に、対照群の一匹を屠殺したところ、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８細胞（１×１０７）の注射部位２カ所に対応する２つの腫瘍塊が個別に存在することが明らかになった。これに対し、ＣＡＶ２１群の一匹には、非感染細胞注射部位にもウイルス感染細胞注射部位にも検出できる腫瘍形成はなかった（図１１）。剖検では、対照群の残りのメンバーは全て２つの独立したメラノーマ異種移植片腫瘍成長物を持つことが明らかになったが、ＣＡＶ２１群の残りのメンバー（注射後１７週間）はどちらの注射部位にも検出可能な腫瘍成長を示さなかった。ＣＡＶ１５群のマウスは注射後４週間の時点で腫瘍形成を示さなかった。
【０１００】
９．３  腫瘍内ウイルス送達
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス２０匹の上側腹部にＳｋ−Ｍｅｌ−２８細胞（１×１０７）を注射した。腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ３に達したら、動物を無作為に５匹ずつの群に分割し、独立したケージで飼育した。マウス群にはそれぞれ１０３．２または１０４．２  ＴＣＩＤ５０の用量を含む１００μｌの活性ＣＡＶ２１またはＣＡＶ１５を腫瘍内注射した。残りの動物には１００μｌのＰＢＳを異種移植片中に直接注射した。ウイルスおよび他の病原体が個々のケージ内に確実に保たれるように、異なる処置群は個別の通気口を持つケージで陰圧下に飼育した。
【０１０１】
それぞれ１０３．２または１０−４．２  ＴＣＩＤ５０のＣＡＶ２１またはＣＡＶ１５の用量は、注射後１４日の時点で既成Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８腫瘍を持つ動物で有意な腫瘍減少をもたらすのに十分だった。腫瘍組織量の減少傾向はその後、１４〜２１日間続いた。注射後３０〜３５日の時点で検出可能な腫瘍は観察されなかった（図１２および１３参照）。ＣＡＶ２１処置群とＰＢＳ処置対照群の間で観察された相違は統計的に有意だった（Ｐ＝０．００２３、ｔ検定）。Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８腫瘍を持ちＣＡＶ２１を注射された動物はＣＡＶ２１疾患の臨床徴候を何も示さなかった。メラノーマ腫瘍組織量を劇的に減少させるＣＡＶ１５の能力を図１４に示す。注射後３５日の時点で、ＰＢＳで処置したメラノーマ異種移植片は体積が約２０３７ｍｍ３だったが、ＣＡＶ１５処置腫瘍は約２ｍｍ３だった（Ｐ＝０．０５３、ｔ検定）。図示したＣＡＶ１５処置腫瘍は、ほとんどが残存している結合組織からなる。
【０１０２】
９．４  ＭＥ４４０５異種移植片へのＣＡＶ２１の腫瘍内送達
このウイルスの抗腫瘍治療能力をさらに裏付けるために、別のメラノーマ（ＭＥ４４０５）異種移植片へのＣＡＶ２１の腫瘍内送達を試みた。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス１５匹の側腹部の一カ所にＭＥ４４０５細胞（５×１０６）を皮下注射した。腫瘍体積が約５００ｍｍ３に達したら、動物を無作為に５匹ずつの群に分割し、独立したケージで飼育した。５匹の動物には１０３．２  ＴＣＩＤ５０の用量を含む１００μｌの活性ＣＡＶ２１を腫瘍内注射し、５匹のマウスには１００μｌのＰＢＳを異種移植片中に直接注射し、残りの５匹には何も処置しなかった。図１５に示すように、ＣＡＶ２１の腫瘍内投与は、たとえば初期注射前腫瘍体積が上で使用したものより５倍大きかったとしても、注射後２５日以内にＭＥ４４０５細胞の腫瘍成長を著しく減少させることができた。ＭＥ４４０５異種移植片は、対照群における有意に速い腫瘍成長速度から推定されるように、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８腫瘍よりも侵襲性であることが観察された。
【０１０３】
ＭＥ４４０５細胞株は、成長速度が遅くＭＥ４４０５腫瘍ほどには血管性でないＳｋ−Ｍｅｌ−２８腫瘍と比較して、高度に血管性の侵襲的腫瘍を生成した。
【０１０４】
Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８異種移植片を持つマウスとは対照的に、ＭＥ４４０５腫瘍を持つ動物にＣＡＶ２１を注入すると、疾患の徴候が多少観察され、最も顕著な徴候は前後両肢の一過性の衰弱だった。位置異常は観察されなかった。
【０１０５】
９．５  結果の考察
この研究は、ＣＡＶ１３、ＣＡＶ１５およびＣＡＶ２１が悪性細胞株を細胞溶解的に破壊する能力を持つことを実証するものである。
【０１０６】
具体的に述べると、メラノーマ細胞のＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５感染のインビトロ解析は、これら２つのウイルスが、ＩＣＡＭ−１とＤＡＦの発現の結果として、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８およびＭＥ４４０５細胞株に選択的に感染できると同時に、それぞれのコクサッキーウイルスが前立腺癌株ＰＣ３の細胞に感染してその死を引き起すことができたことを明らかにしている。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側腹部で生育したヒトメラノーマ細胞株の異種移植片へのＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５の腫瘍内注射により、ＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５は悪性メラノーマに対して治療的用途を持つことがわかる。これらの２つのウイルスのいずれかを既成のメラノーマ腫瘍に直接注射すると、対照動物と比較して腫瘍成長が抑制され、有意な腫瘍退縮が起こり、場合によっては完全な腫瘍破壊が起こった。さらに、エクスビボでウイルスに感染させた細胞の送達は腫瘍成長の完全な阻害をもたらし、エクスビボＣＡＶ２１感染メラノーマ細胞が局所腫瘍成長を阻害するのに十分なウイルスを送達できることを示した。また、最初の腫瘍攻撃位置から離れた領域への感染細胞の皮下注射により、ウイルスは全身的に移動できることがわかる。
【０１０７】
ＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５感染症の発生は主に無症候性であるか、またはせいぜい軽微な倦怠感が現れるぐらいである。ＣＡＶ２１のＣｏｅ株は、アメリカ合衆国の食品医薬品局（ＦＤＡ）により、ＣＡＶ２１に対する特異的抗ウイルス剤の臨床評価を行うための生投与が認証された（９０）。ＣＡＶ２１およびＣＡＶ１５に対する特異的抗ウイルス剤が最近開発されたことで、薬物介入によるウイルス感染の管理という安全対策が加わることになる。
【０１０８】
以上、好ましい態様をいくつか挙げて本発明を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく数多くの変更態様が考えられることは、当業者には理解されるだろう。
【０１０９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年5月31日(2011.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着分子ＩＣＡＭ−１を認識するヒトピコルナウイルスの、哺乳動物中のＩＣＡＭ−１を発現する癌細胞を処置するために哺乳動物に投与するための医薬であって、かくして細胞の少なくとも一部がヒトピコルナウイルスによって殺される医薬の製造における使用。
【請求項２】
癌細胞が、（ｉ）気道の細胞以外の細胞または気道から転移した細胞；（ｉｉ）メラノーマ細胞；（ｉｉｉ）前立腺癌細胞；（ｉｖ）乳癌細胞；（ｖ）皮膚癌細胞；（ｖｉ）胃癌細胞；（ｖｉｉ）大腸癌細胞；（ｖｉｉｉ）結腸直腸癌細胞；（ｉｘ）神経膠腫細胞および（ｘ）他の悪性細胞からなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ヒトピコルナウイルスがＩＣＡＭ−１および補体調節タンパク質ＤＡＦを認識する請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
癌細胞が、周囲組織の非癌性細胞と比較してＩＣＡＭ−１の上昇した発現を示す請求項１に記載の使用。
【請求項５】
癌細胞がＩＣＡＭ−１およびＤＡＦを発現する請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ヒトピコルナウイルスが、ヒトエンテロウイルスである請求項１に記載の使用。
【請求項７】
ヒトピコルナウイルスがコクサッキーＡ群ウイルスである請求項１に記載の使用。
【請求項８】
コクサッキーＡ群ウイルスがＣＡＶ１３，ＣＡＶ１５，ＣＡＶ１８およびＣＡＶ２１からなる群から選択される請求項７に記載の使用。
【請求項９】
哺乳動物がヒト被験者である請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ヒトピコルナウイルスが静脈内、腫瘍内、腹腔内もしくは筋肉内投与されるか、または局所外用によって投与される請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ヒトピコルナウイルスが１ｍｌ当たり少なくとも約１×１０２プラーク形成単位の投与量で投与される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ヒトピコルナウイルスが１ｍｌ当たり約１×１０２〜１×１０１０プラーク形成単位の投与量で投与される請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＩＣＡＭ−１を認識するヒトピコルナウイルスであって細胞接着分子ＩＣＡＭ−１を発現する癌細胞の少なくとも一部を殺すことができるヒトピコルナウイルスと、医薬的に許容できる担体とを含む、細胞接着分子ＩＣＡＭ−１を発現する癌細胞の存在と関連した病気の処置において哺乳動物に投与するための医薬組成物。
【請求項１４】
癌細胞が、（ｉ）気道の細胞以外の細胞または気道から転移した細胞；（ｉｉ）メラノーマ細胞；（ｉｉｉ）前立腺癌細胞；（ｉｖ）乳癌細胞；（ｖ）皮膚癌細胞；（ｖｉ）胃癌細胞；（ｖｉｉ）大腸癌細胞；（ｖｉｉｉ）結腸直腸癌細胞；（ｉｘ）神経膠腫細胞および（ｘ）他の悪性細胞からなる群から選択される請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトピコルナウイルスがＩＣＡＭ−１および補体調節タンパク質ＤＡＦを認識する請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
癌細胞が、周囲組織の非癌性細胞と比較してＩＣＡＭ−１の上昇した発現を示す請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ヒトピコルナウイルスが、ヒトエンテロウイルスである請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ヒトピコルナウイルスがコクサッキーＡ群ウイルスである請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
コクサッキーＡ群ウイルスがＣＡＶ１３，ＣＡＶ１５，ＣＡＶ１８およびＣＡＶ２１からなる群から選択される請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ウイルスが１ｍｌ当たり少なくとも１×１０２プラーク形成単位の投与量で投与されるように処方される請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか一項に定義した医薬組成物を哺乳動物の皮膚に送達するための送達システムであって、前記送達システムが前記組成物で含浸されておりかつウイルスを皮膚と接触させるために哺乳動物の皮膚に対して保持されるように適合されている送達システム。
【請求項２２】
パッチ、パッド、ワッドまたは包帯を含む請求項２１に記載の送達システム。
【請求項２３】
哺乳動物の皮膚に粘着することによって医薬組成物を皮膚と接触した状態に保つようになっている請求項２１または２２に記載の送達システム。