(57)【要約】【課題】酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法、並びに前記糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法に用いられるバイオマス原料の処理方法を提供すること。【解決手段】（ａ）バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより、改質バイオマス原料を得る工程、（ｂ）該改質バイオマス原料を、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）で酵素糖化する工程、を含むことを特徴とするバイオマス原料の処理方法である。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより、改質バイオマス原料を得る工程、
（ｂ）該改質バイオマス原料を、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）で酵素糖化する工程、
を含むことを特徴とするバイオマス原料の処理方法。
【請求項２】
バイオマス原料が、セルロースＩ型を含む請求項１に記載のバイオマス原料の処理方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、超臨界アンモニア流体で処理することを含む請求項１から２のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法。
【請求項４】
改質バイオマス原料とセロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）とが加水分解反応を行う表面密度が０．９以下のとき、該セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）１分子あたりの加水分解速度が１分間に５回以上である請求項１から３のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法により糖を得ることを特徴とする糖の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項７】
請求項５の記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させて乳酸を得ることを特徴とする乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス原料の処理方法、並びに糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策の一環で、化石燃料の代替燃料として、植物資源から生産されるバイオエタノールが着目されてきている。
【０００３】
従来、バイオエタノールの原料としては、主にサトウキビなどの糖質や、穀物などのデンプン質が用いられていたが、これらの原料は、食物や飼料としても利用可能なものが多いため、各原料を用いたバイオエタノールの生産量を増加させると、食料や飼料の供給に影響を及ぼすことが懸念される。
【０００４】
一方、樹木や草、廃棄物などは、食料生産と競合しないため、エネルギー利用に有用なバイオマス原料である。
植物に由来するセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分として含む。前記セルロースは、グルコースがβ−１，４−グルコシド結合して直鎖状に形成されている繊維状の多糖類であり、植物の細胞壁を構成する主要な成分である。前記ヘミセルロースは、前記セルロースと共に植物の細胞壁などを構成する多糖類である。前記リグニンは、ヒドロキシフェニルプロパンを基本単位として重合した高分子物質である。これらの中でも、前記セルロースは、地球上で最も存在量の多い天然高分子である。
そこで、近年、木質バイオマスや草本バイオマスなどのセルロースを含む原料を糖化し、各種燃料や化学原料として利用しようとする試みが広く行われている。
【０００５】
バイオマス原料からのエタノールの製造は、例えば、収集したバイオマス原料を糖化工程において糖に分解した後、発酵工程において酵母などの微生物を用いてエタノールに変換することにより行うことができる。
セルロース系バイオマスから糖を抽出するための糖化工程は、植物体内に高分子で存在しているセルロースと、ヘミセルロースとを可溶化すると同時に、グルコースなどの単糖類に分解する必要がある。糖化方法としては、従来、濃硫酸や濃塩酸などの強酸を用いて行われることが多かったが、環境負荷低減の観点から、これらの強酸の使用は避けることが望まれている。
【０００６】
そこで、近年、濃硫酸や濃塩酸などの強酸による糖化に代わる手段として酵素を用いたバイオマス原料の糖化が広く研究されている。
酵素による糖化は、環境負荷低減、生成物の選択性、及び反応条件の穏和さの観点から望ましい手段であるが、セルロース系バイオマスの糖化に用いられる酵素は、既に実用化されているデンプンの酵素糖化に必要なアミラーゼ添加量と比較して、セルロースを糖化するために必要なセルラーゼの添加量が著しく多いことから、糖変換コストの増大が問題となっている。
【０００７】
また、この酵素糖化のためには、酵素を作用させ易くする目的から、予めバイオマス原料に対して前処理を行うことが必要となる。このバイオマス原料の前処理方法として様々な方法が知られているが、これらの中でも、希硫酸、加圧熱水などによる蒸煮処理などが一般的である（特許文献１〜４参照）。しかしながら、前述したように硫酸の使用は好ましくない。また、バイオマス原料にこれらの前処理を行い、得られた処理物を酵素糖化に供する場合では、所望の程度の酵素糖化効率を得るためには該前処理を多段で行う必要があることや、２００℃以上の高温にしなければならないことなどの点で問題である。
バイオマス原料を物理的手段により微細に粉砕することにより、化学的、生物化学的反応性が向上することも知られているが、粉砕のみにより充分な酵素糖化効率を得ようとすると、粉砕工程に多大なエネルギーを要し、経済合理性を失うおそれがある点で問題である。
更に、バイオマス原料をアンモニアあるいは有機アミンを用いて前処理することにより、その化学的、生物化学的反応性が向上することが知られている（特許文献５参照）が、前記前処理されたバイオマスであっても、その酵素糖化効率は未だ充分とはいえない点で問題である。
【０００８】
したがって、より酵素糖化効率を高めることのできる酵素糖化技術の開発、及び前記酵素糖化に適したバイオマス原料の前処理技術の開発が、未だ望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−０７５００７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０５５号公報
【特許文献３】特開２００２−５４１３５５号公報
【特許文献４】特開２００２−１５９９５４号公報
【特許文献５】欧州特許公開第７７２８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法、並びに前記糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法に用いられるバイオマス原料の処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、天然型セルロースであるセルロースＩ型を含むバイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより得られる改質バイオマス原料を、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を用いて酵素糖化することにより酵素糖化を効率的に行うことができ、したがって、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を格段に向上させることができるという知見である。
【００１２】
なお、本発明者らは以前に、天然型セルロースであるセルロースＩ型よりも低い結晶密度を有するセルロース（例えばセルロースＩＩＩＩ型）を酵素糖化の対象物として用いることにより、酵素糖化を効率的に行うことができること、及びセルロースＩ型を含むバイオマス原料を、アンモニア、特に超臨界アンモニアで処理することにより、セルロースＩＩＩＩ型を含む酵素糖化用セルロースを効率的に得ることができることを特許出願している（特開２００８−１６１１２５号公報参照。）。
【００１３】
バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理した後に、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を用いて酵素糖化することにより、バイオマス原料の酵素糖化効率を格段に向上させることができることは、従来知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００１４】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  （ａ）バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより、改質バイオマス原料を得る工程、（ｂ）該改質バイオマス原料を、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）で酵素糖化する工程、を含むことを特徴とするバイオマス原料の処理方法である。
＜２＞  バイオマス原料が、セルロースＩ型を含む前記＜１＞に記載のバイオマス原料の処理方法である。
＜３＞  バイオマス原料が、木質バイオマスである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法である。
＜４＞  工程（ａ）が、超臨界アンモニア流体で処理することを含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法である。
＜５＞  改質バイオマス原料とセロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）とが加水分解反応を行う表面密度が０．９以下のとき、該セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）１分子あたりの加水分解速度が１分間に５回以上である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法である。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のバイオマス原料の処理方法により糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
＜７＞  前記＜６＞に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法である。
＜８＞  前記＜６＞に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させて乳酸を得ることを特徴とする乳酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法、並びに前記糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法に用いられるバイオマス原料の処理方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＰｃＣｅｌ６Ａと、セルロースＩＩＩＩとの反応液中のセロビオース濃度の経時変化を示した図である。
【図２】図２は、ＴｒＣｅｌ７Ａと、セルロースＩＩＩＩとの反応液中のセロビオース濃度の経時変化を示した図である。
【図３】図３は、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解、及びＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解における、それぞれの反応液中のセロビオース生成量と、反応表面密度との関係を示した図である。
【図４】図４は、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解、及びＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解における、それぞれの吸着酵素１分子あたりの加水分解速度と、反応表面密度との関係を示した図である。
【図５】図５は、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応における、加水分解反応中のそれぞれのセルロースに吸着したＰｃＣｅｌ６Ａ量又はＴｒＣｅｌ７Ａ量を示した図である。
【図６】図６は、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、及びＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応における、それぞれの反応液中のセロビオース濃度の経時変化を示した図である。
【図７】図７は、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応、及びＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応におけるセロビオース生成速度を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（バイオマス原料の処理方法）
本発明のバイオマス原料の処理方法は、（ａ）バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより、改質バイオマス原料を得る工程、（ｂ）該改質バイオマス原料を、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）で酵素糖化する工程、を含み、必要に応じて、更にその他の処理を含む。
【００１８】
＜工程（ａ）＞
前記工程（ａ）は、バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより、改質バイオマス原料を得る工程である。
【００１９】
−バイオマス原料−
前記バイオマス原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、セルロースＩ型を含むバイオマス原料が好ましい。
前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、農業や林業などの生産活動に伴う残渣として得られる「廃棄物系バイオマス」や、エネルギーなどを得る目的で意図的に栽培して得られる「資源作物系バイオマス」などを使用することができる。
前記「廃棄物系バイオマス」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、廃建材、間伐材、稲わら、麦わら、もみ殻、サトウキビバガスなどが挙げられる。
また、前記「資源作物系バイオマス」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サトウキビ、トウモロコシなどの食物としても栽培される糖質乃至デンプン系作物、及びセルロース類の利用を目的として栽培されるユーカリ、ポプラ、アカシア、ヤナギ、スギ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ミスカンサス、ススキなどが挙げられる。
【００２０】
前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料は、木を原料とした「木質バイオマス」、草を原料とした「草本バイオマス」などにも分類される。本発明においては、木質バイオマス及び草本バイオマス共に使用することができるが、本発明の効果がより顕著に得られるとの観点から、セルロース含有量の多いバイオマスが好ましく使用される。
【００２１】
前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料としては、前記したような各種バイオマスから精製などを行うことにより得られたセルロースＩ型そのものであってもよい。
また、前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。なお、天然型セルロースであるセルロースＩ型は、セルロースＩα型とセルロースＩβ型とに分類されるが、前記バイオマス原料に含まれるセルロースＩ型としては、これらのいずれであってもよく、またこれらの両者であってもよい。
【００２２】
前記バイオマス原料の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、収集されたものをそのまま使用してもよく、裁断、粉砕などにより適宜ある程度以下の大きさにしてから使用してもよい。
【００２３】
−アンモニアを含む処理剤−
前記アンモニアを含む処理剤としては、少なくともアンモニアを含有していれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、必要に応じて、更にその他の化合物を含有する。
【００２４】
前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記アンモニアを含む処理剤で処理することにより、バイオマス原料中のセルロースＩ型の少なくとも一部が、より酵素糖化効率の高いセルロースＩＩＩＩ型へと変態する。
前記アンモニアとしては、特に制限はなく、目標とする糖化率、消費エネルギーなどを勘案し、それぞれに適した条件での処理を適宜選択することができ、例えば、液相、気相、亜臨界状態、超臨界状態などが挙げられるが、超臨界状態が、前記変態効率を向上する観点から好ましい。
【００２５】
−−超臨界アンモニア流体による処理−−
前記超臨界アンモニア流体を用いて処理する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料と、アンモニアとをオートクレーブなどの反応器内に導入し、前記反応器内を加熱加圧して、アンモニアを超臨界状態にすることにより行うことができる。
【００２６】
前記処理において、前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料としては、収集されたものをそのまま使用してもよいが、ある程度小さくしてから使用することが、処理に必要なエネルギーを抑えることができる点で望ましい。
前記バイオマス原料のサイズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、５ｍｍ径以下が好ましく、１ｍｍ径以下がより好ましく、０．１ｍｍ径以下が更に好ましい。前記サイズが５ｍｍ径を超えると、処理が不十分となることがある。一方、前記サイズが前記更に好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用するアンモニアの容量を少なくできるなどの点で有利である。
【００２７】
前記アンモニアを含む処理剤で処理を行う際の、前記アンモニアの使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料１ｇに対して、１０ｍｇ〜３００ｇが好ましく、１００ｍｇ〜１５０ｇがより好ましく、１ｇ〜５０ｇが更に好ましい。
前記アンモニアの使用量が、前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料１ｇに対して１０ｍｇ未満であると処理が不十分となることがあり、３００ｇを超えると処理の効率が悪くなることがある。一方、その使用量が前記更に好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用する処理剤の量を少なくできるなどの点で有利である。
前記処理温度及び処理圧力としては、特に制限はなく、アンモニアが超臨界状態となる
範囲内で、目的に応じて適宜選択することができるが、０ＭＰａ〜１２．５ＭＰａが好ましい。
前記アンモニアを含む処理剤で処理を行う処理温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、−３５℃〜１４０℃が好ましい。
【００２８】
前記アンモニアを含む処理剤で処理を行う時間としては、特に制限はなく、用いる前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料の量、前記処理圧力、前記処理温度などに応じ、所望の程度のセルロースＩ型からセルロースＩＩＩＩ型への変態が進行する範囲内で適宜選択することができるが、５分間〜１０時間が好ましく、１０分間〜５時間がより好ましく、３０分間〜２時間が更に好ましい。
前記処理時間が、５分間未満であると所望の程度のセルロースＩ型からセルロースＩＩＩＩ型への変態が進行しないことがあり、１０時間を超えるとそれ以上セルロースＩ型からセルロースＩＩＩＩ型への変態は進行せず、全体として非効率となることがある。一方、前記処理時間が、前記より好ましい範囲内であると、効率よく、セルロースＩ型からセルロースＩＩＩＩ型への変態を進行させることができる点で有利である。
【００２９】
−−その他の化合物−−
前記アンモニアを含む処理剤中のその他の化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二酸化炭素、窒素、エチレン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、フェノール、ジオキサン、キシレン、アセトン、クロロホルム、四塩化炭素、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノールなどが挙げられる。
なお、前記その他の化合物としては、水は使用しないことが好ましい。前記水を使用すると、得られたセルロースＩＩＩＩ型が、セルロースＩ型に戻ってしまう場合がある。
前記その他の化合物の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
−改質バイオマス原料−
前記改質バイオマス原料は、前記アンモニアを含む処理剤で処理を行うことにより得ることができる。
本願における「改質バイオマス原料」とは、セルロースＩ型を含むバイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤により処理したものを意味するが、バイオマス原料中に含まれるセルロースＩ型の少なくとも一部がセルロースＩＩＩＩ型へと変態したものであることが好ましい。前記セルロースＩＩＩＩ型は、前記セルロースＩ型より結晶密度の低いセルロースである。前記セルロースＩＩＩＩ型は、その結晶密度の低さから、酵素が作用し易い点で有利である。
また、前記改質バイオマス原料は、前記処理により前記バイオマス原料に含まれるヘミセルロースが改質され、より酵素が作用し易い状態へと変化しているため、酵素糖化効率を向上させることが可能となる。
【００３１】
前記改質バイオマス原料中の前記セルロースＩＩＩＩ型の割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記セルロースＩＩＩＩ型が多い程、優れた酵素糖化効率が得られる点で好ましい。
また、前記改質バイオマス原料は、前記セルロースＩＩＩＩ型以外にも、例えば、セルロースＩ型（セルロースＩα型、セルロースＩβ型）や、その他の成分、例えば、ヘミセルロース、リグニンなどが含まれていてもよい。ただし、酵素糖化の効率向上の観点から、ヘミセルロース、リグニンは含まれない、あるいはその含有量が少ないことが好ましい。
【００３２】
前記改質バイオマス原料において、前記セルロースＩ型の少なくとも一部が前記セルロースＩＩＩＩ型へと変換されたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｘ線回折、ＦＴ−ＩＲ、固体ＮＭＲなどにより確認することができる。
【００３３】
なお、前記改質バイオマス原料において、セルロースは、その分子構造の間に他の化合物を有していてもよい。例えば、改質バイオマス原料は、前記したように、天然型セルロースであるセルロースＩ型を含むバイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより得ることができるが、その処理工程で生成するセルロースと、アンモニアとの複合体（以下、「セルロース・アンモニア複合体」と称することがある。）の状態であってもよい。しかしながら、前記セルロース・アンモニア複合体は、酵素糖化時におけるｐＨの調整が困難であり、また、水の作用を受けることによりセルロースＩ型に戻ってしまう性質を有することなどから、酵素糖化時には、前記セルロース・アンモニア複合体からアンモニアを除去した状態の改質バイオマス原料を使用することが好ましい。
【００３４】
したがって、前記アンモニアによる処理の後には、前記セルロース・アンモニア複合体から、アンモニアを除去する除去工程を設けることが好ましい。
前記アンモニアの除去方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アンモニアによる処理後、得られた前記セルロース・アンモニア複合体を含む改質バイオマス原料を、メタノール、エタノール、アセトンなどで洗浄する方法、減圧乾燥する方法、処理剤の沸点以上の温度で乾燥させる方法などが挙げられる。これらの中でも、アンモニアの沸点以上の温度（例えば、常温〜５０℃）で、常圧又は減圧下にて乾燥させる方法が、有機溶媒を使用せず、安全性に優れる点で好ましい。
【００３５】
＜工程（ｂ）＞
前記工程（ｂ）は、前記改質バイオマス原料を、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）で酵素糖化する工程である。
【００３６】
−セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）−
前記酵素糖化は、セルラーゼによって行われる。前記セルラーゼとは、セルロースを加水分解する酵素の総称で、大きく分けて、セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオヒドロラーゼ、結晶セルロースは分解できないが、非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ、及びセロビオースや短い鎖（セロオリゴ糖）の末端からグルコースを生成するエキソ型のβ−グルコシダーゼの３種が存在し、更にそれぞれに多種類の酵素が存在する。
前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）は、前記エキソ型のセロビオヒドロラーゼの一種であり、セルロースを構成するβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素である。
【００３７】
前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細菌、子嚢菌、担子菌などが挙げられる。
前記細菌としては、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を産生できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルロモナス  フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、サーモビフィダ  フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）などが挙げられる。
前記子嚢菌としては、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を産生できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔ．  ｖｉｒｉｄｅ）フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ  グリセア（Ｈ．  ｇｒｉｓｅａ）、ケトミウム  サーモフィラム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス  エメルソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）などが挙げられる。
前記担子菌としては、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を産生できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、担子菌門  ハラタケ亜門に属する担子菌が好ましく、担子菌門  ハラタケ亜門  ハラタケ綱に属する担子菌がより好ましく、担子菌門  ハラタケ亜門  ハラタケ綱  コウヤクタケ目に属する担子菌が更に好ましく、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が特に好ましい。
【００３８】
前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記担子菌を培養し、ＮＣＢＩなどのデータベースより入手した前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の遺伝子配列を用いてクローニングすることにより、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の組換体タンパク質を得る方法が好ましい。また、市販品を用いることもできる。
【００３９】
前記担子菌の培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地を用いた固体培養方法、液体培地を用いた液体培養方法などが挙げられる。これらの中でも、液体培養方法が、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を多く製造できる点で好ましい。
前記液体培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルロースを含有するＫｒｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ培地（Ｋｒｅｍｅｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｗｏｏｄ．，  １９９２，  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ａｎ  Ｆｅ（ＩＩＩ）  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｆｌａｖｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ２．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２０５：１３３−１３８．）などが挙げられる。
【００４０】
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃〜４５℃が好ましく、３０℃〜４０℃がより好ましく、３７℃が更に好ましい。前記培養の温度が２０℃未満であると、担子菌の生育が遅くなることがあり、４５℃を超えると担子菌が成育しないことがある。一方、前記培養の温度が前記更に好ましい範囲であると、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を効率よく製造できる点で有利である。
【００４１】
前記培養の日数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１日〜３０日が好ましく、２日〜１４日がより好ましく、３日〜７日が更に好ましい。前記培養の日数が１日未満であると、担子菌数が少なく、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の製造量が少ないことがあり、３０日を超えると、死菌となる担子菌数が多くなったり、製造されたセロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）が分解されてしまうことがある。一方、前記培養の日数が前記更に好ましい範囲であると、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を効率よく製造できる点で有利である。
【００４２】
−−酵素糖化−−
前記酵素糖化の際の前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、改質バイオマス原料１ｇに対して、１ｍｇ〜１，０００ｍｇが好ましく、２ｍｇ〜５００ｍｇがより好ましく、５ｍｇ〜２００ｍｇが更に好ましい。前記酵素の使用量が、前記酵素糖化用原料１ｇに対して１ｍｇ未満であると酵素糖化が不十分となることがあり、１，０００ｍｇを超えると酵素使用量が増大し効率が悪くなる。一方、前記酵素の使用量が、前記更に好ましい範囲内であると酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４３】
前記酵素糖化の際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０℃〜７０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましく、３０℃〜５０℃が更に好ましい。前記温度が、１０℃未満であると酵素糖化が十分に進行しないことがあり、７０℃を超えると酵素が失活することがある。一方、前記温度が、前記更に好ましい範囲内であると酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４４】
前記酵素糖化の際のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、２〜８が好ましく、３〜７がより好ましく、４〜６が更に好ましい。前記ｐＨが、２未満又は８を超えると酵素が失活することがある。一方、前記ｐＨが、前記更に好ましい範囲内であると酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４５】
なお、前記酵素の加水分解速度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記改質バイオマス原料と、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）とが加水分解反応を行う表面密度が０．９以下のとき、該セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）１分子あたりの加水分解速度が１分間に５回以上であることが好ましい。
【００４６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バイオマス原料を裁断、粉砕する工程、前記改質バイオマス原料を粉砕する工程などが挙げられる。
【００４７】
−バイオマス原料を裁断、粉砕する工程−
前記アンモニアを含む処理剤による処理において、前記セルロースＩ型を含むバイオマス原料が、予め裁断、粉砕されていると、アンモニアを含む処理剤による処理が効率的に進行する点で好ましい。また、後述する改質バイオマス原料の粉砕の際に、より微細な、酵素糖化効率に優れる微粉末状の改質バイオマス原料を効率的に得ることができる点でも好ましい。
前記裁断、粉砕に用いる機器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウィレーミル、カッターミル、ハンマーミル、ピンミルなどが挙げられる。
【００４８】
−改質バイオマス原料を粉砕する工程−
前記工程（ｂ）において、改質バイオマス原料が予め粉砕されていると、より酵素糖化効率を向上させることができる点で有好ましい。
前記改質バイオマス原料の粉砕を行う方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平臼、遊星型ボールミル、振動ボールミル、ビーズミル、ジェットミルなどの粉砕機を用いて行うことができる。これらの中でも、前記粉砕機としては、微細な、酵素糖化効率に優れる微粉末状の酵素糖化用原料を、比較的低エネルギーにて得ることができる点で、平臼が好ましい。
前記粉砕を行う条件としては、特に限定されず、粉砕機の種類、改質バイオマス原料の種類、得ようとする粉砕物の平均粒径などによって適宜選択することができる。
【００４９】
（糖の製造方法）
本発明の糖の製造方法は、前述した本発明のバイオマス原料の処理方法により糖を得ること（糖取得工程）を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００５０】
＜糖取得工程＞
前記糖取得工程は、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を用いて、バイオマス原料から糖を得る工程であり、必要に応じて、更にその他のセルラーゼを用いることができる。
【００５１】
−バイオマス原料−
前記バイオマス原料としては、前述した改質バイオマス原料を用いることが好ましく、前記改質バイオマス原料は、粉砕された状態であることが、酵素糖化効率を向上させることができる点でより好ましい。
【００５２】
−セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）−
前記糖取得工程における、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の使用量、反応温度、ｐＨ、反応時間などについては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
−その他のセルラーゼ−
前記その他のセルラーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のＣｅｌ４５Ａなどが挙げられる。
前記その他のセルラーゼを更に使用する場合、該セルラーゼの使用量としては、特に制限はなく、改質バイオマス原料の量や前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）の添加量などに応じて適宜選択することができるが、前記セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）と、前記セルラーゼとの比が、１００：１〜１：１００が好ましく、１０：１〜１：１０がより好ましく、２：１〜１：２が更に好ましい。
【００５４】
前記糖取得工程により、例えば、セルロース由来の糖であるグルコースを含む糖液を得ることができる。また、前記糖取得工程により得られた糖液は、好ましくはヘミセルロース由来の糖をも含む。前記へミセルロース由来の糖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キシロース、アラビノースといった五炭糖や、グルコース、ガラクトース、マンノースといった六炭糖などが挙げられる。
【００５５】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記糖液を、後述する発酵工程に適切となるようなｐＨに調整する工程などが挙げられる。
【００５６】
＜用途＞
前記糖液は、例えば、後述する本発明のエタノールの製造方法にそのまま供してもよいし、以下のようなその他の工程を経て、後述する本発明のエタノールの製造方法に供してもよい。
【００５７】
（エタノールの製造方法）
本発明のエタノールの製造方法は、前述した本発明の糖の製造方法により得られた糖を発酵させて、エタノールを得る工程（発酵工程）を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００５８】
＜発酵工程（アルコール発酵工程）＞
前記エタノールの製造方法において、前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記糖を含む溶液に酵母などのアルコール発酵微生物を添加して、アルコール発酵を行わせる方法が好ましい。
【００５９】
−酵母−
前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロマイセス属酵母などが挙げられる。なお、前記酵母は、天然酵母であってもよいし、遺伝子組換酵母であってもよい。前記エタノール発酵微生物の具体的な例としては、サッカロマイセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロマイセス  フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス  ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス  ルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア  スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア  パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、パチソレン  タンノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、カンジダ  グラビラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ｇｌａｂｒａｔａ）などの酵母又はこれらの遺伝子組換体、ザイモモナズ  モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、サイモバクター  パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）、クロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ），クロストリジウム  ルジュングダーリ（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）などの細菌又はこれらの遺伝子組換体を用いることが出来る。
【００６０】
前記発酵の際の、前記酵母の使用量、発酵温度、ｐＨ、発酵時間などについては、特に制限はなく、例えば、アルコール発酵に供する糖の量、使用する酵母の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００６１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記発酵工程により得られたエタノールを分離精製する工程などが挙げられる。前記分離精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蒸留などが挙げられる。
【００６２】
＜用途＞
前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノールなどとして好適に利用可能である。前記エタノールは前記バイオマス原料から得ることができるので、前記バイオマス原料となる植物を生産できる限りは再生産が可能であり、また、前記植物は栽培時に大気中の二酸化炭素を吸収するため、前記エタノールを燃焼させて二酸化炭素が発生したとしても、大気中の二酸化炭素濃度を増加させることにはならない。したがって、前記エタノールは、地球温暖化防止に望ましいエネルギー源ということができる。また、このようなエタノールは、近年特に、ガソリンに混合し、環境に優しい自動車燃料として使用することが期待されている。
【００６３】
本発明の糖の製造方法により得られる糖を前記エタノールを産生する酵母などに代えて、それぞれ目的とするアルコール類を産生する微生物を使用して発酵せしめることにより、エタノール以外のアルコール類を製造することもできる。例えば、アセトン・ブタノール菌を使用した発酵を行うことにより、ブタノールを製造することができる。
【００６４】
（乳酸の製造方法）
本発明の乳酸の製造方法は、前述した本発明の糖の製造方法により得られた糖を発酵させて、乳酸を得る工程（発酵工程）を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００６５】
＜発酵工程（乳酸発酵工程）＞
前記乳酸の製造方法において、前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記糖を含む溶液に乳酸菌などの乳酸発酵微生物を添加して、乳酸発酵を行わせる方法が好ましい。
【００６６】
−乳酸菌−
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラクトバチルス  マニホティヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトコッカス  サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などが挙げられる。なお、前記乳酸菌は、天然の乳酸菌であってもよいし、遺伝子組換乳酸菌であってもよい。
【００６７】
前記発酵の際の、前記乳酸菌の使用量、発酵温度、ｐＨ、発酵時間などについては、特に制限はなく、例えば、乳酸発酵に供する糖の量、使用する乳酸菌の種類などに応じて、適宜選択することができる。
【００６８】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記発酵工程により得られた乳酸を分離精製する工程などが挙げられる。前記分離精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６９】
＜用途＞
前記乳酸の製造方法により得られた乳酸は、例えば、化学的に重合させて、ポリ乳酸を製造することに好適に利用可能である。現在は、トウモロコシなどのデンプンから製造されることが多い乳酸を、食料には供し得ないセルロースを含むバイオマス原料から生産可能になることが望ましく、前記乳酸の製造方法によれば、このようなセルロースを含むバイオマス原料からの効率的なポリ乳酸の製造を可能とすることができる。
【００７０】
本発明の糖の製造方法により得られる糖を、前記乳酸菌に代えて、それぞれ目的とする有機酸を産生する微生物を使用して発酵せしめることにより、乳酸以外の有機酸、例えば、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸などを製造することもできる。
【実施例】
【００７１】
以下に本発明の実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７２】
（実施例１〜６）
＜Ｃｅｌ６Ａによるバイオマス原料の処理＞
−工程（ａ）−
後述する方法により、バイオマス原料を、アンモニアを含む処理剤で処理することにより、改質バイオマス原料を得た。
【００７３】
−−バイオマス原料−−
緑藻のシオグサ細胞壁（セルロースＩα型／Ｉβ型＝７：３）をバイオマス原料として用いた。
セルロースの精製は、５．０質量％水酸化カリウム水溶液中にて室温で一晩浸漬させる処理と、ｐＨ４．９の酢酸緩衝液で緩衝した０．３質量％ＮａＣｌＯ２水溶液中にて８０℃で３時間処理する操作とを３回繰り返して行った。精製後、水洗し、凍結乾燥して保存した（以下、「セルロースＩα」と称することがある。）。
前記セルロースＩαは、後述するセルロースＩＩＩＩを含む改質バイオマス原料の調製に用いた。
【００７４】
−−超臨界アンモニア流体処理（セルロースＩＩＩＩを含む改質バイオマス原料の調製）−−
前記セルロースＩαを、以下の操作により、超臨界状態のアンモニアによる処理に供した。
３０ｍＬ容ポータブルリアクターに、前記シオグサ２００ｍｇを入れ、ドライアイス入りのメタノールバスで−１３℃に冷却した。このリアクターにアンモニアガスを０．５ＭＰａの定圧で３０分間流入し、試料を完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分間程放置した。次いで、１４０℃のオイルバス中にて１時間処理した。このとき、リアクター中の圧力はゆっくりと上昇して、２０分間後に１３ＭＰａに達し、その後は一定であった（アンモニアの臨界温度Ｔｃ＝４０５．６Ｋ、臨界圧力Ｐｃ＝１１．２８ＭＰａ）。前記処理後、リアクターをオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリークした。前記処理後のセルロースをメタノールで洗浄し、乾燥させることにより、セルロースＩＩＩＩ型を含む改質バイオマス原料を得た（以下、「セルロースＩＩＩＩ」と称することがある。）。
【００７５】
−工程（ｂ）−
後述する方法で製造したセロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ）を用い、前記改質バイオマス原料（セルロースＩＩＩＩ）を酵素糖化する（糖取得工程）ことにより糖を得た。
【００７６】
−−組換Ｃｅｌ６Ａの製造−−
ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｃｅｌ６Ａの組換体タンパク質（以下、「ＰｃＣｅｌ６Ａ」と称することがある。）を、以下の方法で製造した。
【００７７】
−−−Ｃｅｌ６Ａ遺伝子のクローニング−−−
ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｋ−３株を、２質量％セルロース（ＣＦ１１；Ｗｈａｔｍａｎ社製）を含有するＫｒｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ培地（Ｋｒｅｍｅｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｗｏｏｄ．，  １９９２，  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ａｎ  Ｆｅ（ＩＩＩ）  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｆｌａｖｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ２．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２０５：１３３−１３８．）で、Ｈａｂｕ，  Ｎ．，  Ｋ．  Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ｍ．  Ｓａｍｅｊｉｍａ，  Ｂ．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｅ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ．，  １９９７，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２６：９８の記載に基づいて、３日間培養した。
【００７８】
前記培養後の培養液をろ過し、ガラス繊維濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ（登録商標）  ＧＡ−１００；東洋濾紙（株）製）を用いて菌糸体を分離した。次いで、分離した菌糸体を液体窒素で凍結し、ＩＳＯＧＥＮ（（株）ニッポンジーン製）を用いて、製造者のマニュアルに基づいて、全ＲＮＡを約２００ｍｇ抽出した。
前記抽出された全ＲＮＡ  １μｇから、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＴＭ）−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（タカラバイオ（株）製）を用いてｍＲＮＡを精製した。
次いで、前記ｍＲＮＡから、逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ；東洋紡績（株）製）と、３’ＲＡＣＥアダプタープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを用いて、製造者のマニュアルに基づいて、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。
【００７９】
ＮＣＢＩデータベース上にあるファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）由来Ｃｅｌ６Ａ遺伝子（ＡＡＢ３２９４２）（配列番号：１）をもとに、以下のプライマーを設計した。
プライマー：
ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ：ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＣＧＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号：２）（配列中、「ＧＡＡＴＴＣＣ」は制限酵素ＥｃｏＲＩ切断配列）
ＰｃＣｅｌ６Ａ−ＮｏｔＩ−Ｒ：ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＣ（配列番号：３）（配列中、「ＧＣＧＧＣＣＧＣ」は制限酵素ＮｏｔＩ切断配列）
【００８０】
上記プライマーと、ポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ２；東洋紡績（株）製）とを用い、前記のように調製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う（９４℃、２分間を１サイクル、９８℃、１０秒間・６８℃、１分３０秒間を２５サイクル、４℃で終了）ことで、ＰｃＣｅｌ６Ａの成熟体タンパク質をコードする遺伝子（２１番アミノ酸以降）を得た。
上記で得られたＰＣＲ産物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）  ＴＯＰＯ（登録商標）  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）とを用いてクローン化した。
【００８１】
−−−組換ベクター（発現ベクター）の作製−−−
ミニプレップを行って調製したＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子を含むＴＯＰＯベクター、及び酵母発現用ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＮｏｔＩ（タカラバイオ（株）製）によって切断し、得られたフラグメントをアガロース電気泳動で分離した後、ゲル抽出により前記フラグメントを得た。
制限酵素処理されたｐＰＩＣＺαＡと、ＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子とを、それぞれ２０ｎｇ用い、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ（株）製）によってライゲーションし、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）を用いてクローン化した。ミニプレップを行って調製したＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子を含む酵母発現用ベクターｐＰＩＣＺαＡ（以下、「ｐＰＩＣＺαＡ／ＰｃＣｅｌ６Ａ」と称することがある。）から、Ｓｔｅ１３シグナル切断サイトを切除するために、以下のプライマーを設計し、ｐＰＩＣＺαＡ／ＰｃＣｅｌ６Ａを鋳型としてＰＣＲを行った（９４℃、２分間を１サイクル、９８℃、１０秒間・６８℃、１分３０秒間を１５サイクル、４℃で終了）。
プライマー：
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｋｅｘ２−Ｆ：ＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号：４）
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｋｅｘ２−Ｒ：ＣＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＣ（配列番号：５）
【００８２】
前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅された遺伝子断片を、制限酵素ＤｐｎＩによって処理し、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ（株）製）を用いてクローン化した。
【００８３】
−−−形質転換体の作製−−−
前記ミニプレップにより得られた、Ｓｔｅ１３シグナル切断サイトを切除したｐＰＩＣＺαＡ／ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓｔｅ（−）を、制限酵素ＢｓｔＸＩ（タカラバイオ（株）製）によって直鎖化し、エレクトロポレーション法によって酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ−７１Ｈ）株に導入した。形質転換体の選抜は、抗生物質（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性を指標に行った。
【００８４】
−−−形質転換酵母の培養−−−
上述の形質転換体を、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含むＹＰＧ培地（１質量％イースト  エクストラクト、２質量％ポリペプトン、１質量％グリセロール）１０ｍＬで３０℃、３００ｒｐｍの条件により、往復振とう培養器で２４時間培養した後、２００ｍＬのＹＰＧ培地の入った三角フラスコに接種し、回転振とう培養器（３０℃、１５０ｒｐｍ）で更に２４時間培養した。遠心分離（３，０００ｇ、１０分）によって菌体を回収した後、５０ｍＬのＹＰＭ培地（１質量％イースト  エクストラクト、２質量％ポリペプトン、１質量％メタノール）に菌体を移し、２４時間ごとに終濃度１質量％となるようにメタノールを加えながら、更に回転振とう培養器（２６．５℃、１５０ｒｐｍ）で９６時間培養した。遠心分離（３，０００ｇ、１０分）によって得られた培養上清を粗酵素液とした。
【００８５】
−−−ＰｃＣｅｌ６Ａの製造及び精製−−−
前述のようにして得られた粗酵素液に、硫酸アンモニウムを７０質量％飽和となるように加え、遠心分離（１５，０００ｇ、３０分）によって沈殿を回収した。前記沈殿を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させた。
１Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓカラム（２６ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）を用いて、前記溶液を分画した。得られたＰｃＣｅｌ６Ａは、３００ｍＬの逆勾配で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）へ溶出した。
その後、前記ＰｃＣｅｌ６Ａを含む分画を集め、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して平衡化した。次いで、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ  カラム（９ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）に前記平衡化したＰｃＣｅｌ６Ａを含む溶液を加えた。ＰｃＣｅｌ６Ａは、０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウム１００ｍＬの直線勾配でカラムから溶出した。
得られたＰｃＣｅｌ６Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２質量％ポリアクリルアミドゲル）で、単一のバンドを与えた。また、得られたＰｃＣｅｌ６ＡのＮ末端のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１  ｃＬｃ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により確認した。
その結果、形質転換酵母で得られたＰｃＣｅｌ６ＡのＮ末端アミノ酸配列は、ＱＡＳＥＷＧＱＣＧＧＩＧ（配列番号：６）であり、担子菌ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）由来のＣｅｌ６Ａと同じであることが認められた。
精製したＰｃＣｅｌ６Ａは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に緩衝液交換し、以下の糖取得工程に用いた。
【００８６】
−−糖取得工程、及び糖の定量−−
前記セルロースＩＩＩＩを、終濃度が０．１質量％となるように５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中に添加した。次いで、前記ＰｃＣｅｌ６Ａを、下記表１に従って添加し、３０℃にて最大３６０分間反応させた。
反応終了後、反応液を５分間遠心分離（×１５，０００ｇ）して反応を停止した後に得られた上澄みを、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（６０／４０〜５０／５０、体積／体積）の直線勾配で、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（昭和電工（株）製）で分離した。前記分離された糖の量は、重合度（ＤＰ）＝２〜７のセロオリゴ糖（生化学工業（株）製）を標準として用いて定量した。なお、ＨＰＬＣの装置は、Ｃｏｒｏｎａ（登録商標）  Ｃｈａｇｅｄ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＬＣ−２０００（日本分光（株）製）を使用した。
【００８７】
【表１】
2011000071.tif 000003
【００８８】
図１に、ＰｃＣｅｌ６Ａと、超臨界アンモニア処理をしたシオグサ由来セルロース（セルロースＩＩＩＩ）との反応液中のセロビオース濃度（μＭ）の経時変化を示す。
図１中、「■」はＰｃＣｅｌ６Ａが０．２５μＭの場合（実施例１）を示し、
「●」はＰｃＣｅｌ６Ａが０．５μＭの場合（実施例２）を示し、
「▲」はＰｃＣｅｌ６Ａが１．０μＭの場合（実施例３）を示し、
「□」はＰｃＣｅｌ６Ａが２．０μＭの場合（実施例４）を示し、
「○」はＰｃＣｅｌ６Ａが４．０μＭの場合（実施例５）を示し、
「△」はＰｃＣｅｌ６Ａが８．０μＭの場合（実施例６）を示す。
【００８９】
（比較例１〜６）
＜Ｃｅｌ７Ａによるバイオマス原料の処理＞
前記工程（ａ）で得られた改質バイオマス原料（セルロースＩＩＩＩ）を、下記の方法により精製したセロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７Ａ）を用いて酵素糖化し、得られた糖の定量を行った。
【００９０】
−Ｃｅｌ７Ａの精製−
前記トリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）  Ｃｅｌ７Ａ（以下、「ＴｒＣｅｌ７Ａ」と称することがある。）は、セルラーゼ製剤（セルクラスト、ノボザイム社製）より、カラムクロマトグラフィーにより精製した。
即ち、セルラーゼ製剤を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して平衡化した。次いで、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ  カラム（９ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）に前記平衡化したＴｒＣｅｌ７Ａを含む溶液を加えた。ＴｒＣｅｌ７Ａは、０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウム１００ｍＬの直線勾配でカラムから溶出した。
その後、前記ＴｒＣｅｌ７Ａを含む分画を集め、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に対して平衡化した。次いで、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓカラム（２６ｍｍ×１２０ｍｍ、東ソー（株）製）を用いて、前記溶液を分画した。得られたＴｒＣｅｌ７Ａは、３００ｍＬの逆勾配で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）へ溶出した。
精製したＴｒＣｅｌ７Ａは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、以下の糖取得工程に用いた。
【００９１】
−糖の製造、及び糖の定量−
前記セルロースＩＩＩＩを、終濃度が０．１質量％となるように５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中に添加した。次いで、前記ＴｒＣｅｌ７Ａを、下記表２に従って添加し、３０℃にて最大３６０分間反応させた。
反応終了後、反応液を５分間遠心分離（×１５，０００ｇ）して反応を停止した後に得られた上澄みを、実施例１〜６と同様の方法で定量した。
【００９２】
【表２】
2011000071.tif 000004
【００９３】
図２に、ＴｒＣｅｌ７Ａと、超臨界アンモニア処理をしたシオグサ由来セルロース（セルロースＩＩＩＩ）との反応液中のセロビオース濃度（μＭ）の経時変化を示す。
図２中、「■」はＴｒＣｅｌ７Ａが０．２５μＭの場合（比較例１）を示し、
「●」はＴｒＣｅｌ７Ａが０．５μＭの場合（比較例２）を示し、
「▲」はＴｒＣｅｌ７Ａが１．０μＭの場合（比較例３）を示し、
「□」はＴｒＣｅｌ７Ａが２．０μＭの場合（比較例４）を示し、
「○」はＴｒＣｅｌ７Ａが４．０μＭの場合（比較例５）を示し、
「△」はＴｒＣｅｌ７Ａが８．０μＭの場合（比較例６）を示す。
【００９４】
図１（実施例１〜６）及び図２（比較例１〜６）より、セルロースＩＩＩＩを、ＰｃＣｅｌ６Ａを用いて加水分解した場合（実施例１〜６）も、ＴｒＣｅｌ７Ａを用いて加水分解した場合（比較例１〜６）も、酵素濃度依存的に加水分解産物（セロビオース）の量が増加した。しかしながら、セロビオース生成量は、ＴｒＣｅｌ７Ａを用いて加水分解した場合と比較して、ＰｃＣｅｌ６Ａを用いて加水分解した場合の方が、顕著に多かった。また、ＰｃＣｅｌ６Ａを用いて加水分解した場合は、ＴｒＣｅｌ７Ａを用いて加水分解した場合と比較して反応速度も速かった。
【００９５】
（実施例３、及び比較例３、７〜８）
＜ＰｃＣｅｌ６Ａ及びＴｒＣｅｌ７ＡによるセルロースＩα及びセルロースＩＩＩＩの糖化＞
−セロビオース生成速度及び吸着酵素１分子あたりの加水分解速度の検討−
ＰｃＣｅｌ６Ａと、ＴｒＣｅｌ７Ａとのセルロースの糖化効率を比較するため、実施例３及び比較例３と同様の方法でセルロースＩＩＩＩの糖化を行なった。
また、ＰｃＣｅｌ６Ａ及びＴｒＣｅｌ７ＡによるセルロースＩαの糖化効率を検討するため、セルロースＩＩＩＩをセルロースＩαに変えた以外は、実施例３及び比較例３と同様の方法でセルロースＩαの糖化を行なった。
即ち、セルロースＩα又はセルロースＩＩＩＩを、下記表３に従って終濃度が０．１質量％となるように５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中に添加した。次いで、実施例１〜６で調製したＰｃＣｅｌ６Ａ  １．０μＭ又は比較例１〜６で調製したＴｒＣｅｌ７Ａ  １．０μＭを、下記表３に従って添加し、３０℃にて最大３６０分間反応させた。
反応終了後、反応液を５分間遠心分離（×１５，０００ｇ）して反応を停止した後に得られた上澄みを、実施例１〜６と同様の方法で定量し、セロビオース生成量（図３）、及び基質（セルロースＩα又はセルロースＩＩＩＩ）に吸着した酵素１分子あたりの加水分解速度（図４）を求めた。
【００９６】
【表３】
2011000071.tif 000005
【００９７】
図３は、ＰｃＣｅｌ６ＡとセルロースＩＩＩＩ（以下「ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩ」と称することがある）との加水分解反応（実施例３）、ＴｒＣｅｌ７ＡとセルロースＩＩＩＩ（以下「ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩ」と称することがある）との加水分解反応（比較例３）、ＰｃＣｅｌ６ＡとセルロースＩα（以下「ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩα）」と称することがある）との加水分解反応（比較例７）、及びＴｒＣｅｌ７ＡとセルロースＩα（以下「ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩα」と称することがある）（比較例８）との加水分解反応における、それぞれの反応液中のセロビオースの生成量（μＭ／分間）と、反応表面密度（ρ）との関係を示す。
図３中、「●」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）を示し、
「○」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）を示し、
「■」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）を示し、
「□」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）を示す。
【００９８】
図４は、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）、及びＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）における、それぞれの吸着酵素１分子あたりの加水分解速度（ｍｉｎ−１）と、反応表面密度（ρ）との関係を示す。
図４中、「●」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）を示し、
「○」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）を示し、
「■」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）を示し、
「□」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）を示す。
【００９９】
図３より、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例３）及びＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）では、いずれもほとんどセロビオースの生成は認められなかった。ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）はセロビオースの生成は認められたものの、その生成速度は遅かった。一方、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）によるセロビオースの生成速度は、比較例３、７〜８と比較して顕著に速かった。
【０１００】
図４は、セロビオースの生成量の向上が、単に加水分解反応を行うセルロースＩＩＩＩの反応表面密度が広がったことによるものではないことを確認するため、基質（セルロースＩα又はセルロースＩＩＩＩ）に吸着した酵素１分子あたりの加水分解速度を求めたグラフである。図４より、セルロースＩＩＩＩの反応表面密度が０．４のとき、ＴｒＣｅｌ７Ａ  １分子あたりの加水分解速度が１分間に２．５回であった（比較例３）のに対し、ＰｃＣｅｌ６Ａ  １分子あたりの加水分解速度は１分間あたり１１．５回であった（実施例３）。これらの結果より、ＰｃＣｅｌ６Ａでは、酵素１分子あたりの加水分解速度が顕著に速いことが認められた。
【０１０１】
−酵素量の定量−
前記ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）、及びＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）において、それぞれ反応中にセルロースＩＩＩＩ又はセルロースＩαに吸着したＰｃＣｅｌ６Ａ又はＴｒＣｅｌ７Ａの量を、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー製）で分離し、定量した。緩衝液は、Ａ：２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、Ｂ：２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）＋０．５Ｍ塩化ナトリウムを用い、Ａ／Ｂ＝１００／０（体積／体積）を５分間、Ａ／Ｂ＝１００／０〜４０／６０（体積／体積）の直線勾配で１０分間、Ａ／Ｂ＝０／１００（体積／体積）を５分間で分離した。なお、タンパク質定量用のＨＰＬＣ装置は、可視紫外検出器（ＵＶ−２０７５）を用いたＬＣ−２０００（日本分光（株）製）を使用した。
図５は、反応液中の遊離タンパク質量濃度（μＭ）と、吸着酵素量（ｎｍｏｌ／ｍｇ−セルロース）との関係を示す。
図５中、「●」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応後のＰｃＣｅｌ６Ａ量（実施例３）を示し、
「○」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応後のＴｒＣｅｌ７Ａ量（比較例３）を示し、
「■」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応後のＰｃＣｅｌ６Ａ量（比較例７）の場合を示す。
「□」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応後のＴｒＣｅｌ７Ａ量（比較例８）を示す。
【０１０２】
図５より、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）で吸着したＰｃＣｅｌ６Ａ量及びＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）で吸着したＴｒＣｅｌ７Ａ量は同程度であり、その酵素量は少なかった。
一方、図３より、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）は、セロビオース生成速度が速かったにも関わらず、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）で吸着したＰｃＣｅｌ６Ａ量は、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）で吸着したＴｒＣｅｌ７Ａ量と比較して顕著に少なかった。
これらの結果より、ＰｃＣｅｌ６ＡをセルロースＩＩＩＩと反応させた場合は、吸着したＰｃＣｅｌ６Ａの酵素１分子あたりの活性が上昇していると考えられる。
【０１０３】
（実施例３、７、及び比較例７〜１１）
＜ＰｃＣｅｌ６ＡとＰｃＣｅｌ４５Ａとの相乗効果＞
酵素としては、ＰｃＣｅｌ６Ａと、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させた組換ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｃｅｌ４５Ａとを用い、基質としては、実施例１〜６のセルロースＩＩＩＩ及びセルロースＩαのいずれかを用いた場合の加水分解生成物について調べ、ＰｃＣｅｌ６ＡとＰｃＣｅｌ４５Ａとの相乗効果を以下のようにして試験した。
【０１０４】
−組換ＰｃＣｅｌ４５Ａの製造−
ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）  Ｃｅｌ４５Ａの組換体タンパク質（以下、「ＰｃＣｅｌ４５Ａ」と称することがある。）を、以下の方法で製造した。
【０１０５】
−−ＰｃＣｅｌ４５Ａ遺伝子のクローニング−−
ＮＣＢＩデータベース上にあるファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）由来Ｃｅｌ４５Ａ遺伝子（ＡＢ３７８５０４）をもとに、以下のプライマー（Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ１、Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ２）を設計した。また、リバースプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）は、以下の配列を用いた。
プライマー：
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ１：ＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＴＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧ（配列番号：７）
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−Ｆ２：ＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧ（配列番号：８）
リバースプライマー：Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）
【０１０６】
上記プライマーを用い、ＰｃＣｅｌ６Ａと同様に調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い（９４℃、２分間を１サイクル、９８℃、１０秒間・６８℃、１分３０秒間を２５サイクル、４℃で終了）、前記ＰｃＣｅｌ４５Ａをコードする領域と３’非翻訳領域をＰＣＲによって増幅した。
【０１０７】
また、５’非翻訳領域の塩基配列は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（トレードマーク）  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、以下の遺伝子特異的プライマーとを用いて増幅した（９４℃、２分間を１サイクル、９８℃、１０秒間・７０℃、３０秒間を５サイクル、９８℃、１０秒間・６８℃、３０秒間を５サイクル、９８℃、１０秒間・６６℃、３０秒間・６８℃、３０秒間を２０サイクル、４℃で終了）。
得られたＰＣＲ産物は、前記ＰｃＣｅｌ６Ａと同様の方法でクローン化した。
プライマー：
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−５’−Ｒ１：ＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣ（配列番号：９）
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−５’−Ｒ２：ＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴ（配列番号：１０）
【０１０８】
−−組換ベクター（発現ベクター）の作製−−
ＰｃＣｅｌ４５Ａの成熟体の塩基配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
オリゴヌクレオチドプライマー
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−ＸｈｏＩ−Ｆ：ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧ（配列番号：１１）
Ｐｃｃｅｌ４５Ａ−ＮｏｔＩ−Ｒ：ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号：１２）
【０１０９】
ＰｃＣｅｌ４５Ａ遺伝子を含むＴＯＰＯベクターを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドプライマーと、ポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓとを用いてＰＣＲを行い（９４℃、２分間を１サイクル、９８℃、１０秒間・６８℃、３０秒間を２０サイクル、４℃で終了）、発現ベクターに挿入するＤＮＡ断片を増幅した。
前記増幅したＤＮＡ断片を酵母の発現ベクターｐＰＩＣＺαのＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位に挿入し、組換ベクター（発現ベクター）を得た。
【０１１０】
−−形質転換体の作製−−
上記で得られた発現ベクター約５μｇを、Ｂｐｕ１１０２Ｉ（タカラバイオ（株）製）を用いて、直鎖化した。次いで、エレクトロポレーションにより、酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓＫＭ７１Ｈ株）へ、前記直鎖化した組換ベクターを導入した後、形質転換体の選別を行った。前記エレクトロポレーション、及び形質転換体の選別は、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（トレードマーク）  Ｐｉｃｈｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマニュアルに基づいて行った。これにより、前記発現ベクターにより形質転換された形質転換体を得た。
【０１１１】
−−形質転換酵母の培養−−
上述の形質転換体を、実施例１〜６と同様の方法で培養し、遠心分離（３，０００ｇ、１０分）によって得られた培養上清を粗酵素液とした。
【０１１２】
−ＰｃＣｅｌ４５Ａの製造及び精製−
前述のようにして得られた粗酵素液を、実施例１〜６と同様の方法で精製した。
得られたＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサーにより確認した。
その結果、形質転換酵母で得られたＰｃＣｅｌ４５ＡのＮ末端アミノ酸配列は、ＡＴＧＧＹＶＱＱＡＴ（配列番号：１３）であり、担子菌ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）で得られた天然のものと同じであることが認められた。
ＰｃＣｅｌ４５Ａは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に緩衝液交換し、以下の相乗効果試験に用いた。
【０１１３】
−相乗効果試験−
前記セルロースＩα又は前記セルロースＩＩＩＩを、下記表４に従って終濃度が０．１質量％となるように５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）２５０μＬ中に添加した。次いで、実施例１〜６で調製したＰｃＣｅｌ６Ａ、比較例１〜６で調製したＴｒＣｅｌ７Ａ、及びＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａのいずれかを添加し、３０℃にて最大３６０分間反応させた。なお、前記ＰｃＣｅｌ６Ａ及びＴｒＣｅｌ７Ａの終濃度は、それぞれ１．０μＭ、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋Ｃｅｌ４５Ａの全酵素濃度は２．０μＭ（ＰｃＣｅｌ６Ａ  １．０μＭに、Ｃｅｌ４５Ａ１．０μＭを添加して調製した）で行った。
反応終了後、反応液を５分間遠心分離（×１５，０００ｇ）して反応を停止した後に得られた上澄みを、実施例１〜６と同様の方法で分析した。
【０１１４】
【表４】
2011000071.tif 000006
【０１１５】
図６は、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）、及びＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５ＡとセルロースＩＩＩＩ（以下「ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩ」と称することがある）の加水分解反応（実施例７）における、反応液中のセロビオース濃度（μＭ）の経時変化を示す。
図６中、「■」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）を示し、
「▲」はＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）を示し、
「●」はＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）を示し、
「◆」はＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例７）を示す。
なお、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）、ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例９）、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例１０）、及びＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例１１）は、反応液中のセロビオース濃度（μＭ）が低い、若しくはセロビオースが生成していないため、図６には示していない。
【０１１６】
図７は、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例８）、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例７）、ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例９）、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例１０）、ＴｒＣｅｌ７Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例３）、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）、ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例１１）、及びＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例７）の、それぞれの加水分解反応におけるセロビオース生成速度（μＭ／分間）を示す。
【０１１７】
図６より、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例７）では、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）と比較して、セロビオースが多く得られた。
また、図７より、ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（比較例１１）ではセロビオースの生成は全く認められなかったが、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例７）におけるセロビオース生成速度は、ＰｃＣｅｌ６Ａ−セルロースＩＩＩＩの加水分解反応（実施例３）におけるセロビオース生成速度と比較して顕著に早かった。一方、ＰｃＣｅｌ６Ａ＋ＰｃＣｅｌ４５Ａ−セルロースＩαの加水分解反応（比較例１０）におけるセロビオースの生成速度は遅かった。
これらの結果から、ＰｃＣｅｌ６Ａは、他のセルラーゼと併用するとセルロースＩＩＩＩの分解に関し、相乗効果を有することが認められた。ＰｃＣｅｌ４５Ａは、ＰｃＣｅｌ６Ａの活性を増強すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の、バイオマス原料の処理方法、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法によれば、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を格段に向上させることができる。
したがって、本発明の、バイオマス原料の処理方法、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法は、近年注目されている、環境に優しい燃料を産出することを目的としたバイオマス原料からのエタノール製造に、また環境に優しい生分解性プラスチックの製造などに好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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