(57)【要約】【課題】新規物質である光架橋ヘパリ溶媒和ヒドロゲルを提供する。【解決手段】以下の成分Ｂ〜Ｄを含有する溶液を調製した後に凍結させ、得られた凍結物に光を照射してゲル化した後、凍結ゲルを溶融させる方法により得られる光架橋ヘパリ溶媒和ヒドロゲル。  Ｂ：ヘパリン骨格のヘキソサミン（Ｎ−硫酸化グルコサミン若しくはＮ−アセチルグルコサミン）残基の６位水酸基に結合した硫酸基を部分的または完全に除去した６位脱硫酸化ヘパリン誘導体に桂皮酸アミノプロピルが結合している光反応性ヘパリン  Ｃ：ポリエチレングリコール又はエデト酸ナトリウム  Ｄ：Ｂ及びＣ成分を溶解し得る水性溶媒【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の成分Ｂ〜Ｄを含有する溶液を調製した後に凍結させ、得られた凍結物に光を照射してゲル化した後、凍結ゲルを溶融させる方法により得られることを特徴とする光架橋ヘパリ溶媒和ヒドロゲル。
Ｂ：ヘパリン骨格のヘキソサミン（Ｎ−硫酸化グルコサミン若しくはＮ−アセチルグルコサミン）残基の６位水酸基に結合した硫酸基を部分的または完全に除去した６位脱硫酸化ヘパリン誘導体に桂皮酸アミノプロピルが結合している光反応性ヘパリン
Ｃ：ポリエチレングリコール又はエデト酸ナトリウム
Ｄ：Ｂ及びＣ成分を溶解し得る水性溶媒
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞増殖因子（以下、ＦＧＦとも言う）は生体内に存在するヘパリン結合性増殖因子（以下、ＨＢＧＦとも言う）の一種であり、血管新生などの作用を有し、ヘパリンへの親和性を有していることが知られている。ＦＧＦ等のＨＢＧＦは、生体内の様々なタンパク質分解酵素によって速やかに分解されるので、一般にそれらの活性半減期（以下、安定性ともいう。）は短いが、ＨＢＧＦはヘパリンと複合体を形成することによりタンパク質分解酵素に対して抵抗性を獲得するので、安定性が向上する等の実験結果が報告されている。しかし、動物実験などにおいて、単に、ヘパリンとｂ−ＦＧＦを混合投与しただけでは、それらが投与部位から容易に消失してしまう為、十分な効果が期待できなかった。
【０００３】
そこで、投与部位からの消失を防止する為に、近時、ヘパリンと１種類以上のヘパリン以外の多糖類を架橋させた架橋体に成長因子を含有させることによる徐放剤が提案されている（特許文献１）。しかし、斯かる徐放剤は、成長因子を含有する架橋体（基材）に機械的強度を付与したキセロゲルであり、従って、その投与方法は、生体欠損部への貼付法または縫付け法であり、注入法ではない。
【０００４】
ところで、従来より、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧとも言う）に光反応性基を導入し、紫外線などの光の照射により光反応性基を架橋させて得られる光架橋ＧＡＧが報告され、更に、ＧＡＧの種類の他、ゲル、スポンジ等の性状の違いにより種々の光架橋ＧＡＧも報告されている（特許文献２〜５）。しかし、従来、光架橋ＧＡＧにＨＢＧＦを含有させたゲルで、かつ、注入具によってＨＢＧＦを投与したい部位に注入出来る様なゲルは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２３３７８６号公報
【特許文献２】特開平６−０７３１０２号公報
【特許文献３】特開平８−１４３６０４号公報
【特許文献４】特開平９−０８７２３６号公報
【特許文献５】ＷＯ０２／０６０９７１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、その目的は、投与部位におけるＨＢＧＦの安定性を図ってその効果を持続的に発揮させることが出来、しかも、局所投与に最適な形態である注入法が適用し得る、生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決する為に鋭意検討した結果、次の様な知見を得た。すなわち、架橋ヘパリンとヘパリン結合性生理活性分子とを含む溶液を特定条件下に架橋する方法、特に、光反応性基を結合したヘパリンを光架橋させる方法によるならば、従来知られていなかった、注入法が適用し得る粘度を有する架橋ヘパリンゲル組成物が得られ、しかも、架橋ヘパリンゲル組成物によれば、ヘパリン結合性増殖因子の安定化が図られるとの知見を得た。
【０００８】
本発明は、上記の知見に基づき完成されたものであり、関連する複数の一群の発明から成り、その要旨は次の通りである。
【０００９】
本発明の第１の要旨は、少なくとも架橋ヘパリンとヘパリン結合性生理活性分子とを含有し、注入具より押出し可能な粘度を有することを特徴とする生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物に存する。
【００１０】
本発明の第２の要旨は、以下の成分Ａ〜Ｄを含有する溶液を調製した後に凍結させ、得られた凍結物に光を照射してゲル化した後、凍結ゲルを溶融させる方法により得られることを特徴とする注入具より押出し可能な粘度を有する生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物に存する。
【００１１】
Ａ：ヘパリン結合性生理活性分子
Ｂ：光反応性基を結合したヘパリン（以下、「光反応性ヘパリン」とも言う。）
Ｃ：アルコール、界面活性剤およびキレート剤から成る群から選択される何れかの水性溶媒混和性を有する成分
Ｄ：Ａ、Ｂ及びＣ成分を溶解し得る水性溶媒
【００１２】
本発明の第３の要旨は、有効成分として上記の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を含むことを特徴とする医療用製剤に存する。
【００１３】
本発明の第４の要旨は、有効成分として上記の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を含むことを特徴とする局所投与用製剤に存する。
【００１４】
本発明の第５の要旨は、有効成分として上記の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を含むことを特徴とするヘパリン結合性生理活性分子徐放用製剤に存する。
【００１５】
本発明の第６の要旨は、有効成分として上記の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を含むことを特徴とする血管新生促進剤に存する。
【００１６】
本発明の第７の要旨は、有効成分として上記の各製剤または上記の血管新生促進剤を含有することを特徴とする末梢虚血性疾患に有用な治療剤に存する。
【００１７】
本発明の第８の要旨は、ヘパリン結合性生理活性分子を、架橋ヘパリンゲルと共存させることを特徴とするヘパリン結合性生理活性分子の安定化方法に存する。
【００１８】
本発明の第９の要旨は、前記の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を押出し可能な容器に充填させて成ることを特徴とするキットに存する。
【００１９】
本発明の第１０の要旨は、以下の成分Ａ〜Ｄを含有する溶液を調製した後に凍結させ、得られた凍結物に光を照射してゲル化した後、凍結ゲルを溶融させることを特徴とする注入具より押出し可能な粘度を有する生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物の製造方法に存する。
【００２０】
Ａ：ヘパリン結合性生理活性分子
Ｂ：光反応性基を結合したヘパリン
Ｃ：アルコール、界面活性剤およびキレート剤から成る群から選択される何れかの水性溶媒混和性を有する成分
Ｄ：Ａ、Ｂ及びＣ成分を溶解し得る水性溶媒
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、注入具より押出し可能である生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物が提供される。そして、本発明の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物は、投与部位におけるＦＧＦ等のヘパリン結合性生理活性分子の安定的貯留性の向上により、徐放化が可能となり、末梢性虚血性疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ラットにおけるｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨの効果（血管新生）を示すグラフであり、「６ＤＳ−Ｈｅｐ／ｂ−ＦＧＦ」はｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨゲル、「ｂ−ＦＧＦ」はｂ−ＦＧＦ水溶液、「６ＤＳ−Ｈｅｐ」は光架橋６ＤＳＨゲルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。先ず、説明の便宜上、本発明に係る生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物の製造方法について説明する。なお、以下の説明は光反応性基を結合したヘパリンを光架橋反応して得られる光架橋ヘパリンを例示して説明するが、注入具より押し出し可能な粘度を有し、ヘパリン結合性生理活性分子を阻害しないものであれば他の架橋ヘパリンも本発明に適用される。
【００２４】
本発明において、成分Ａとして使用するヘパリン結合性生理活性分子とは、ヘパリン結合性を有するサイトカインや、同様にヘパリン結合性を有し、細胞の増殖促進作用や分化促進作用を持つことが知られている一群のヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）を指す。その例としては、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ミッドカイン（ＭＫ）、インターロイキン８（ＩＬ８）、ビトロネクチン（ＶＮ）、ヘパリン結合性脳細胞分裂誘発因子（ＨＢＢＭ）、ヘパリン結合性神経突起伸長促進因子（ＨＢＮＦ）、ヒト男性ホルモン誘導性増殖因子（ＡＩＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、毛様体神経成長因子（ＣＮＴＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＮＤＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、幹細胞増殖因子（ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）、ＣＸＣケモカイン等が挙げられる。これらの中では、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が好ましく、特に塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）が好ましい。
【００２５】
本発明において、成分Ｂとして使用する光反応性基を結合したヘパリンは、ヘパリンと光反応性架橋基を有する化合物（光反応性物質）とを反応して得られる。
【００２６】
上記の光架橋ヘパリンを製造する際の原料としてのヘパリンとしては、一般に知られているウロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造であるヘパリン骨格を基本骨格として有するものであれば、特に限定されない。例えば、通常、ヘパリンと称される化合物だけでなく、ヘパラン硫酸、ヘパリノイド等のＨＢＧＦ等を含むヘパリン結合性生理活性分子と親和性を有するグリコサミノグリカンも本発明においてはヘパリンに包含される。また、これらに化学修飾など行って得られる誘導体（例えば、硫酸基を結合させた硫酸化誘導体、硫酸基を除去させた脱硫酸化誘導体など）や、天然物から抽出・精製された通常のヘパリンを酵素や硝酸、硫酸、塩酸などで分解し、低分子化したヘパリンも含まれる。
【００２７】
しかし、後述の様に、本発明の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物を医薬用途に使用することを考慮すると、ヘパリンが有する出血傾向を減弱させた又は除去したヘパリン誘導体が好ましい。斯かるヘパリン誘導体としては、例えば、ヘパリンから硫酸基を部分的または完全に除去した脱硫酸化ヘパリン誘導体、ヘパリンを酸化還元反応に付した酸化還元ヘパリン誘導体、ヘパリンを酸化還元反応および脱硫酸化反応に付した酸化還元−脱硫酸化ヘパリン誘導体などが挙げられる。
【００２８】
上記の中では、脱硫酸化ヘパリン誘導体や酸化還元−脱硫酸化ヘパリン誘導体が好ましい。脱硫酸化ヘパリン誘導体としては、ヘパリン骨格のヘキソサミン（Ｎ−硫酸化グルコサミン若しくはＮ−アセチルグルコサミン）残基の６位水酸基に結合した硫酸基を部分的または完全に除去した６位脱硫酸化ヘパリン誘導体（例えば、ＷＯ００／０６６０８号パンフレットに記載のもの）、２位脱硫酸化ヘパリン誘導体（例えば、特開２００３−１１３０９０号公報に記載のもの）、完全脱硫酸化ヘパリン誘導体などが挙げられ、酸化還元−脱硫酸化ヘパリン誘導体としては、特開平１１−３１０６０２号公報に記載されている様な過ヨウ素酸酸化還元−脱硫酸化ヘパリン誘導体などが挙げられる。
【００２９】
なお、上述の様に、これら脱硫酸化ヘパリン誘導体や酸化還元−脱硫酸化ヘパリン誘導体が有する抗凝固活性は、減弱されている。例えば、ヘパリン骨格のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基を部分的又は完全に除去した６位脱硫酸化ヘパリン誘導体における活性化部分トロンボプラスチン時間（以下、「ＡＰＴＴ」とも言う。）は、血漿に最終濃度３０μｇ／ｍＬで当該ヘパリン誘導体を添加して測定した場合に、５０秒以下であり、また、トロンボプラスチン時間（以下、「ＴＴ」とも言う。）は、最終濃度１００μｇ／ｍＬで当該ヘパリン誘導体を添加して測定した場合に、５０秒を超過することがない。
【００３０】
なお、ＡＰＴＴとは、抗凝固活性を示す指標であり下記測定方法により得られる。ラットの下大動脈より３．２重量％クエン酸ナトリウム１容量に対して９容量の割合で血液を採取し、１０００×ｇで１０分間遠心分離して血漿１００μＬを得、これと測定対象となる既知濃度のヘパリン誘導体溶液１００μＬとを測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温し、その後、予め３７℃に保温しておいたアクチン（商品名：三菱ウェルファーマ（株））１００μＬを添加し、更に２分間保温する。次いで、３７℃に保温しておいた０．０２Ｍ塩化カルシウム溶液１００μＬを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置で測定する。
【００３１】
また、ＴＴも、抗凝固活性を示す指標であり、下記測定方法により得られる。上記ＡＰＴＴ測定と同様の方法で調製した血漿１００μＬと既知濃度のヘパリン誘導体水溶液１００μＬとを測定用カップに分注し、３７℃で１分間保温する。その後、予め３７℃で５分間保温しておいたトロンビン（１０Ｕ／ｍＬ：吉富製薬（株）製）１００μＬを添加して凝固を開始させ、凝固時間を血液凝固自動測定装置で測定する。
【００３２】
本発明で使用するヘパリンは、天然物由来でも、化学的に合成したり、遺伝子工学的手法により酵母などの微生物に生産させたものであってもよく、市販のヘパリン、ヘパラン硫酸またはヘパリノイドでも構わない。一般的には、生物材料（小腸、肺、皮膚など）から抽出したものや、抽出後化学修飾させ調製することが可能である。また、ヘパリンの重量平均分子量は、通常１，５００〜３０，０００、好ましくは３，５００〜２５，０００である。
【００３３】
前記の光反応性基は、紫外線などの光照射によって光二量化反応または重合化反応を生じる化合物の残基である限り、特に制限されない。光反応性架橋基を有する光反応性物質の具体例としては、桂皮酸、置換桂皮酸、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン及びこれらの誘導体などが挙げられる。置換桂皮酸としては、例えば、ベンゼン環の何れかの水素がアミノ基に置換された桂皮酸であるアミノ桂皮酸（好ましくはｐ−アミノ桂皮酸）が挙げられ、アクリル酸の誘導体としては、例えば、チオフェンアクリル酸、フリルアクリル酸などが挙げられる。これらの中では、光反応性および安全性の面から、桂皮酸または置換桂皮酸が好ましく、置換桂皮酸としてはアミノ桂皮酸が好ましい。
【００３４】
また、光反応性物質は、光反応性を向上し、光架橋反応を容易にしたり、ヘパリンに光反応性基を導入する反応を容易にするスペーサーを結合していてもよい。スペーサーとしては、炭素数２〜１８の鎖状もしくは環状の炭化水素残基を有する二価または多価官能基の化合物が好ましく、炭素数２〜１８のジアミノアルカン、アミノアルキルアルコール、アミノ酸などが挙げられる。更に、例えば、光反応性物質が桂皮酸の場合は、スペーサーとして炭素数２〜８のアミノアルコールが好ましい。この場合、桂皮酸のカルボキシル基にアミノアルコールがエステル結合またはアミド結合する。特に好ましいスペーサーはｎ−アミノプロパノール又はｎ−アミノブタノールである。
【００３５】
光反応性ヘパリンは、例えば、特開平６−７３１０２号公報、特開平８−１４３６０４号公報、特表平１１−５１２７７８号公報などの公知の方法に準じて調製することが出来る。
【００３６】
更に、本発明においては、成分Ｃとして、アルコール、界面活性剤およびキレート剤から成る群から選択される何れかの水性溶媒混和性を有する成分を使用する。斯かる成分は、従来より、不凍液形成用添加剤として知られた物質である。
【００３７】
本発明においては、成分Ｄとして、前記のヘパリン結合性生理活性分子と光反応性ヘパリン及びアルコール、界面活性剤およびキレート剤から成る群から選択される何れかの水性溶媒混和性を有する成分を溶解し得る水性溶媒を使用する。斯かる水性溶媒は光架橋反応の溶媒として作用し、その種類は水を含んでいる限り特に限定されない。例えば、水、注射用水、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。
【００３８】
すなわち、光反応性基を導入した多糖のゲル化において、代表的なグリコサミノグリカンであるヒアルロン酸と比べると低分子量のヘパリンは、光照射（架橋反応）によるゲル化が極めて困難である。ところが、意外にも、凍結状態での光照射によるならば極めて効率的に光反応性ヘパリンの架橋反応を進めることが出来る。しかしながら、この場合、反応系に上記のアルコール等の水性溶媒混和性成分が存在しないならば、架橋反応によりヘパリンのスポンジが生成し、目的とする光架橋ヘパリンゲルは得られない。ところが、反応系に上記のアルコール等の水性溶媒混和性を有する成分が存在するならばスポンジ化が抑制されてゲルが形成される。その理由は、必ずしも明らかではないが、溶質成分の一部の不凍液化が起こり且つそれが関係しているものと推定される。
【００３９】
上記のアルコール、界面活性剤およびキレート剤としては、従来より、不凍液形成用添加剤として使用されているものを適宜選択することが出来る。水性溶媒混和性を有するアルコールとしては以下の一般式（１）で表されるアルコール、特にポリエチレングリコール類が好ましい。
【００４０】
【化１】
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【００４１】
炭素数１〜１０の鎖状アルキルとしては、メチル、エチル等が、炭素数３〜１０の分岐を有するアルキルとしてはイソプロピル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
【００４２】
上記の様なアルコールとしては、低級アルコール、多価アルコールまたは多糖アルコールが挙げられる。
【００４３】
低級アルコールとしては、炭素数が１〜１０、より好ましくは１〜８のアルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等が例示される。多価アルコールとは、すなわち、分子内に存在するヒドロキシル基が２個以上であるアルコールであり、より好ましくは３個以上のヒドロキシル基を有するアルコールが挙げられる。例えば、エチレングリコール、グリセリンが挙げられ、エチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。また、糖アルコールとしては、鎖状の糖アルコールであっても、環式糖アルコールであっても使用することは可能であるが、鎖状の糖アルコールが好ましい。糖アルコールとしては、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等が好ましく挙げられるが、マンニトール、キシリトール、ソルビトールがより好ましく、マンニトール又はソルビトールが更に好ましく挙げられる。
【００４４】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤またはアニオン界面活性剤が好ましく挙げられ、中でも、非イオン界面活性剤としてはポリエチレングリコールが、アニオン界面活性剤としてはアルキル硫酸塩が挙げられ、特にドデシル硫酸ナトリウムが好ましく挙げられる。
【００４５】
キレート剤としては、クエン酸またはその塩の様なオキシカルボン酸類やエデト酸またはその塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸またはその塩）の様なポリアミノカルボン酸類が挙げられる。
【００４６】
また、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）として、市販の「フィブラスト」（科研製薬株式会社製）を使用する場合は、賦形剤として含有されているエデト酸ナトリウムは、それ自体、水性溶媒混和性を有するキレート剤であり、不凍液形成用添加剤であるから、別途に前述の成分Ｃを使用する必要はない。
【００４７】
先ず、本発明においては、前記の各成分Ａ〜Ｄを含有する溶液を調製する。この場合、各成分の使用割合は次の通りである。成分Ａの濃度は、通常１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、成分Ｂの濃度は、光反応性基の導入率の関係によって適宜選択されるが、通常０．１〜１０重量％であり、０．５〜９重量％がより好ましい。また、成分Ｃの濃度は、通常０．１〜１０重量％であり、０．８〜９重量％がより好ましい。水性溶媒（成分Ｄ）に対する他の各成分の溶解順序などは、適宜に選択することが可能である。
【００４８】
なお、光反応性基の導入率とは、多糖中に存在する「光反応性基を導入可能な官能基」のモル数に対する「導入された光反応性基」のモル数（＝光反応性物質の導入数）の割合を百分率で表示した値である。また、光反応性基を導入可能な多糖の官能基とは、光反応性基およびスペーサーの種類によって異なるが、光反応性基またはスペーサーに含まれるヒドロキシル基を多糖への結合に使用する場合は、多糖中のカルボキシル基が例示され、光反応性基またはスペーサーに含まれるカルボキシル基を多糖への結合に使用する場合は、多糖中のアミノ基やヒドロキシル基が例示され、光反応性架橋基またはスペーサーに含まれるアミノ基を多糖への結合に使用する場合は、多糖のカルボキシル基が例示される。通常のヘパリンにおける光反応性基を導入可能な官能基としては、カルボキシル基やヒドロキシル基が挙げられる。例えば、ヘパリンにおいて光反応性基を導入する官能基としてカルボキシル基を選択した場合の光反応性基の導入率は、ヘパリンが構成二糖単位当たりにカルボキシル基を１個有することに基づき、ヘパリンの構成二糖単位当たりに導入された光反応性基の数を百分率で表した値で示される。また、上記の各成分を混合して調製された溶液において、ヘパリン結合性生理活性分子と光反応性ヘパリンとは単なる物的混合物ではなく、生化学的親和性により複合体を構成している。
【００４９】
次いで、上記の溶液を凍結する。溶液は適当な容器に収容して凍結に供される。この際、光反応性物質として、例えばシンナモイル基（桂皮酸残基）等の、紫外線を吸収して架橋反応を起こす不飽和二重結合を有する化合物を使用する場合は、架橋反応時の溶媒である水によって紫外線が吸収される性質を有する為、紫外線の光路長が１ｃｍ以下となる様な形態を選択するのが好ましい。容器の材質は、光反応性基の架橋反応に必要な波長の光を吸収しない材質であって、その様な光を透過する材質でなければならない。斯かる材質としては、例えば、架橋反応に紫外線が使用される場合は、紫外線吸収率が低いポリプロピレン等の高分子化合物、ガラス（特に石英ガラス又は硬質ガラス）等が挙げられる。凍結条件は、特に制限されず、例えば、液体窒素の様な超低温物質、架橋反応溶液の凍結温度以下に冷却されたアルコール等の冷媒を使用して急激に凍結してもよく、また、一般家庭用冷凍庫を使用して比較的緩やかに凍結してもよい。凍結温度は、通常−１０〜−４０℃、好ましくは−２０〜−３０℃である。
【００５０】
次いで、上記で得られた凍結物に光を照射して架橋反応を行う。照射する光は、光反応性物質に作用し、重合、二量化などの反応を起こさせる限り特に限定はされない。例えば、可視光、紫外線、赤外線、電子線、放射線なども本発明における光に包含される。これらの中では、好ましくは可視光または紫外線であり、更に好ましくは紫外線である。そして、波長としては１８０〜６５０ｎｍが好ましい。例えば、光反応性物質として桂皮酸を使用した場合は、２６０〜３５０ｎｍの紫外線が好ましい。
【００５１】
次いで、本発明においては上記で得られた凍結ゲルを溶融させる。これにより、注入具より押出し可能な粘度を有する生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物が得られる。ここに、ゲルは溶媒和ゲルを意味し、架橋反応時に水性溶媒として水を使用した場合は水和によりヒドロゲルとして得られる。
【００５２】
次に、本発明の生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物（以下、単に組成物と言うことがある。）について説明する。本発明の組成物は例えば上記の様な特定の製造方法で得ることが出来る。そして、本発明の組成物（溶媒和ゲル）は、少なくともヘパリン結合性生理活性分子と光架橋ヘパリンとを含有し、その好ましい態様においては、アルコール、界面活性剤およびキレート剤から成る群から選択される何れかの水性溶媒混和性を有する成分を含有する。
【００５３】
本発明の組成物を構成する光架橋ヘパリンは、ヘパリンに光反応性基を化学的に結合した光反応性ヘパリンに紫外線などの光を照射して当該光反応性基同士を二量体化し、当該ヘパリンを架橋させて得られる光架橋ヘパリンである。なお、斯かる光架橋ヘパリンは、通常は水性溶媒中で溶解しない性質、すなわち不溶性となることが多い。
【００５４】
本発明のゲルの最大の特徴は、注入具より押出し可能な粘度を有する点にある。具体的な粘度は、回転粘度計を使用して２０℃で測定した粘度として、通常１００〜１０，０００ｍＰａ・ｓ、好ましくは５００〜８，０００ｍＰａ・ｓである。なお、上記粘度測定に使用される回転粘度計としては例えば東機産業株式会社製のＥ型回転粘度計が挙げられ、回転ローターとしては標準コーン（Ｗ１°，３４’×Ｒ２４）を使用するのが好適である。また、例えば、本発明のゲルを、室温にて、内径９ｍｍのシリンジに充填し、２３ゲージの注射針から押し出す場合の押し圧（加圧）は２００〜８０００ｇ／ｃｍ２である。
【００５５】
本発明に従い得られるヘパリン結合性生理活性分子を包含する架橋ヘパリンゲル組成物は、ヘパリン結合性生理活性分子が有する作用と、架橋ゲルによりもたらされる作用を利用して、ヘパリン結合性生理活性分子を生体内において持続的に放出する為に利用する医療用製剤として使用することが出来る。
【００５６】
本発明に従い、ヘパリン結合性生理活性分子を包含する光架橋ヘパリンをゲル化することによりヘパリン結合性生理活性分子を長期間安定化させること、及び、生体内で一定期間、ヘパリン結合性生理活性分子の濃度を保てる様に徐放化することが可能となる。つまり、本発明の組成物はヘパリン結合性生理活性分子用徐放製剤として使用することが可能である。
【００５７】
また、注入具より押出し可能なゲルである本発明の組成物は、局所投与が可能であり、治療部位への送達の過程における代謝損失が少なく、治療部位において治療有効濃度を維持でき、非常に有効に効果を得ることが出来る。例えば、ヘパリン結合性生理活性分子としてＦＧＦを含む本発明の組成物を有効成分として含有する血管新生促進剤を虚血部位に局所投与することにより、血管新生を促進し、末梢虚血性難治性疾患を改善することが出来る。
【００５８】
現在、ヘパリンは医薬品（抗血液凝固剤）として一般に使用されており、また、特に上述の様にヘパリンの有する出血活性を減弱または除去したヘパリン誘導体は、抗凝固活性および出血活性が通常のヘパリンに比べ大幅に減弱されている為、この様なヘパリン誘導体を本発明の組成物の原料として使用することにより、本発明の組成物を含む製剤は、医薬、医療用具（機器）等の医療用製剤として生体に投与しても抗凝固活性または出血活性が低いので好ましい。
【００５９】
本発明の組成物の投与剤形や投与方法などは、対象とする疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することが可能であるが、非経口投与が好ましく、具体的には、注入、塗布などが挙げられる。用量については、投与方法、剤形、患者の体重や代謝機能の状態、疾患の状態などに応じて、個別に適宜決定されるべきであり、特に限定されない。
【００６０】
例えば、基本的には調製した製剤が含有する生理活性分子の有効量に基づいて用量は選択されるが、本発明の組成物を血管新生を目的とする製剤または治療剤として使用する場合、含有される生理活性分子として、概ね１日当たり５μｇ〜６０μｇ程度を例示することが出来る。用法としては、基本的には、調製した製剤が含有する生理活性分子の量、病態、血流量の変化により適宜選択することが好ましく、例えば虚血足のすねや太ももに対して１回に数ヶ所から数百ヶ所に分けて少量ずつ投与することが出来る。一方、本発明組成物はゲル状であり投与部位においての安定性が高く、また、包含している生理活性分子を徐放化することも可能であるので、３日〜４週間に１回の投与も可能である。剤型としては、特に限定されず、通常の製剤方法をもって様々な剤型が可能であるが、中でも、本発明の組成物が有する特性を活かした注入剤および注射剤が特に好ましく挙げられる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の諸例で使用した技術用語の定義および測定方法は次の通りである。
【００６２】
（１）光反応性基の導入率の測定方法：
光架橋ヘパリンゲル組成物における光反応性基の導入率は、ヘパリンを構成する繰り返し二糖単位当りに導入された光反応性基の数を百分率で表した値を意味する。導入率の算出に必要なヘパリンの構成二糖単位の量は、検量線を利用したカルバゾール測定法により測定し、光反応性基の量は、検量線を利用した吸光度測定法により測定した。因みに、光反応性基として桂皮酸またはアミノ桂皮酸を使用した場合は測定波長２６９ｎｍにおける吸光度を利用した。
【００６３】
（２）架橋率の測定方法：
架橋率は、１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム１ｍｌで被検物質（光架橋ヘパリンゲル組成物）１ｇを１時間加水分解した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光反応性基由来物（光反応性基の単量体および光反応性基の二量体）を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって解析し、検量線を利用して光反応性基の二量体の量を測定した。そして、上記（１）により測定されたヘパリンに導入された光反応性基に対する二量体となった光反応性基のモル数を百分率（％）により算出した。
【００６４】
実施例１：
（１）ＷＯ００／０６６０８号パンフレットに記載の方法に従い、調製した６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ブタ小腸由来、重量平均分子量：約９０００、以下、６ＤＳＨとも言う。）３ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍｌを加えた。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＨＯＳｕとも言う。）２０５．８ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣＩ・ＨＣｌとも言う。）１７１．４ｍｇ及び桂皮酸アミノプロピル塩酸塩２１６．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させた。その後、塩化ナトリウム（以下、ＮａＣｌとも言う）３ｇを添加し、エタノールを注ぎ込み、析出した沈殿を回収した。回収した沈殿をエタノールで洗浄した後、４０℃で減圧乾燥し、光反応性６ＤＳＨ２．７ｇを得た。光反応性基の導入率は１６．０％であった。
【００６５】
（２）上記（１）で得られた光反応性６ＤＳＨを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた溶液に、塩基性繊維芽細胞増殖因子（以下、ｂ−ＦＧＦとも言う。）を５０μｇ／ｍＬとなる様に加え溶解し、光反応性６ＤＳＨとｂ−ＦＧＦとの複合体を含む反応溶液とした。なお、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）として、市販の「フィブラストスプレー５００」（科研製薬株式会社製、組成：ｂ−ＦＧＦ５００μｇ、エデト酸ナトリウム４６０ｍｇ）を使用した。反応溶液を０．２２μｍのメンブレンフィルター（日本ミリポア株式会社製）で濾過した後、間隙が１ｍｍとなる様に調節したパイレックス（登録商標）板に流し込み、−２０℃雰囲気下で凍結させた。凍結状態を維持したまま８００Ｗ高圧水銀ランプ（オーク製作所製）を使用し、照射光量が５．０Ｊ／ｃｍ２となる様に紫外線照射を行って光架橋反応させた。その後、室温に戻して凍結体を融解させ、ゲル状のｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨゲル組成物を得た。このゲル状物質の架橋率を測定したところ、２４．５％であった。また、回転粘度計を使用し、粘度を測定したところ、１°コーン、２０℃条件下での粘度は３８１０ｍＰａ・ｓであった。
【００６６】
参考例１：
実施例１の（１）で得られた光反応性６ＤＳＨを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解した溶液に、ポリエチレングリコール４００（以下、ＰＥＧ４００とも言う）を重量濃度が４％となる様に溶解させて溶液とした。この溶液を、実施例１の（２）と同様に光架橋反応させた後、室温に戻して凍結体を融解させ、ゲル状の光架橋６ＤＳＨゲルを得た。このゲル状物質の架橋率を測定したところ、１３．４％であった。また、回転粘度計を使用し、粘度を測定したところ、１°コーン、２０℃条件下での粘度は３７００ｍＰａ・ｓであった。
【００６７】
試験例１（紫外線がｂ−ＦＧＦに及ぼす影響）：
実施例１における光架橋反応は紫外線を使用する為、紫外線がｂ−ＦＧＦに及ぼす影響について検討した。４０ｍｇ／ｍＬとなる様に調製したｂ−ＦＧＦ溶液について、１０Ｊ／ｃｍ２の紫外線を照射する前後における、ＨＰＬＣによるピーク面積の変化を測定した。結果、紫外線照射前後でピーク面積が２８％減少することを確認した。実施例１のｂ−ＦＧＦ濃度は試験例１の約１／１０００であり、実施例１の照射光量は試験例１の１／２であることを考慮すると、実施例１の光架橋反応における紫外線のｂ−ＦＧＦに対する影響（分解）は少ないと考えられる。
【００６８】
なお、ＨＰＬＣは、カラムに「ＴＯＳＯＨＯＤＳ−１２０Ｔ」（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）を使用し、溶離液Ａとして０．０１ｎＨＣｌを使用し、溶離液Ｂとしてアセトニトリルを使用し、グラジェント条件はＢ％：２５（０ｍｉｎ）−３１（１５ｍｉｎ）−５５（２５ｍｉｎ）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、測定温度４０℃、検出波長２１４ｎｍで測定を行なった。試料はｂ−ＦＧＦ含有量が約５０ｍｇ／ｍＬとなる様調製したものを使用した。
【００６９】
試験例２（ラットにおけるｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨの効果）：
ＳＤ系雄性ラット（ＳＰＬ、１４週齢、体重約４８０ｇ）８匹を使用し、ケタミン・キシラジン麻酔下で背部を剃毛し、実施例１で得られたｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨゲル、参考例１で得られたｂ−ＦＧＦを含まない光架橋６ＤＳＨゲル、ｂ−ＦＧＦの濃度が５０μｇ／ｍＬであるｂ−ＦＧＦ水溶液の夫々１００μＬを２箇所ずつ計６箇所に皮下注射した。３、６、１０、１５日後に大量の麻酔注射により犠牲死させた後、注射部位の組織を採取し、ヘマトキシリン・エオシン染色により標本作製を行なった後、顕微鏡を使用し、残存ヘパリンゲルの周辺像を選択し、１００倍での視野当りの赤血球を含んだ毛細血管を肉眼で計測した。その結果を血管数グラフとして図１に示した。図中、「６ＤＳ−Ｈｅｐ／ｂ−ＦＧＦ」はｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨゲル、「ｂ−ＦＧＦ」はｂ−ＦＧＦ水溶液、「６ＤＳ−Ｈｅｐ」は光架橋６ＤＳＨゲルを表す。図１に示す様に、ｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨ組成物の投与群では明らかに血管新生を認めた。また、１５日後でも、ｂ−ＦＧＦ含有光架橋６ＤＳＨ組成物の残留が認められた。
【図１】
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