(57)【要約】【課題】試料の観察中に照明光の光路のずれを確実に検出する。【解決手段】ハーフミラー４５は、光源１１からの照明光を２つの光に分岐する。ハーフミラー４５を透過した第１の光は、走査ユニット４８により走査され、対物レンズ５１を介して試料２に照射される。試料２から発せられた蛍光は、光電検出素子５４または光電検出素子５７により受光される。ハーフミラー４５により反射された第２の光は、ハーフミラー５８により分岐され、光電検出素子５９，６０により受光される。コンピュータ１８は、光電検出素子５９，６０の第２の光の受光位置に基づいて照明光の光路のずれを検出する。また、コンピュータ１８は、照明光の光路のずれを検出する場合、第１の光が対物レンズ５１を通過しない範囲を走査されるとき、第２の光が所定の光量以上になるように照明光の光量を制御する。本発明は、例えば、共焦点顕微鏡に適用できる。【選択図】図１
2011257616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの照明光を、試料に照射する第１の光と前記照明光の光路のずれを検出するための第２の光に分岐する第１の分岐手段と、
前記第１の分岐手段に入射する前記照明光の光量を制御する光量制御手段と、
前記第１の光を走査する走査手段と、
対物レンズと、
前記対物レンズを介して前記第１の光が照射されることにより前記試料から発せられる観察光を受光する第１の受光手段と、
前記第２の光に基づいて、前記照明光の光路のずれを検出する検出手段と
を備え、
前記光量制御手段は、前記照明光の光路のずれを検出する場合、前記第１の光が前記対物レンズを通過しない範囲を前記走査手段により走査されるとき、前記第２の光が所定の光量以上になるように前記照明光の光量を制御する
ことを特徴とする光走査顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光の光路を調整する調整手段と、
前記照明光の中心軸の位置と前記調整手段の位置との間の関係式を算出する算出手段と、
前記検出手段により検出された前記照明光の光路のずれ、および、前記関係式に基づいて、前記照明光の光路のずれを補正する前記調整手段の位置を求め、前記調整手段を求めた位置に設定する補正手段と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【請求項３】
前記関係式は、前記照明光の中心軸の位置と前記調整手段の位置の一次関数により表される
ことを特徴とする請求項２に記載の光走査顕微鏡。
【請求項４】
前記算出手段は、前記調整手段の２つ以上の異なる位置において、前記検出手段により検出された前記照明光の光路のずれに基づいて、前記関係式を算出する
ことを特徴とする請求項３に記載の光走査顕微鏡。
【請求項５】
前記算出手段は、前記検出手段により検出された前記照明光の光路のずれ、および、そのときの前記調整手段の位置に基づいて、前記関係式を更新する
ことを特徴とする請求項４に記載の光走査顕微鏡。
【請求項６】
前記検出手段は、
前記第２の光を第３の光と第４の光に分岐する第２の分岐手段と、
前記第２の分岐手段から第１の距離の位置に配置され、前記第３の光を受光する第２の受光手段と、
前記第２の分岐手段から前記第１の距離と異なる第２の距離の位置に配置され、前記第４の光を受光する第３の受光手段と、
前記第２の受光手段における前記第３の光の受光位置と、前記第３の受光手段における前記第４の光の受光位置とに基づいて、前記照明光の光路のずれを検出するずれ検出手段と
を備えることを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【請求項７】
前記光量制御手段は、前記照明光の光路のずれを検出しない場合、前記第１の光が観察対象となる範囲の外側を前記走査手段により走査されるとき、前記照明光を消灯させる
ことを特徴とする請求項１に記載の光走査顕微鏡。
【請求項８】
光源からの照明光を、試料に照射する第１の光と前記照明光の光路のずれを検出するための第２の光に分岐する分岐手段と、
前記第１の光を走査する走査手段と、
対物レンズと、
前記対物レンズを介して前記第１の光が照射されることにより前記試料から発せられる観察光を受光する受光手段と
を備える光走査顕微鏡が、
前記照明光の光路のずれを検出する場合、前記第１の光が前記対物レンズを通過しない範囲を前記走査手段により走査されるとき、前記第２の光が所定の光量以上になるように前記照明光の光量を制御する
ことを特徴とする照明制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光走査顕微鏡に関し、特に、照明光の光路のずれを検出できるようにした光走査顕微鏡および照明制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡において、走査ユニットに入射する前の照明光の光路のチルト方向およびシフト方向のずれを２つの光電検出素子を用いて検出し、ミラーを駆動して、照明光の光路のずれを補正する方法について提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１４８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、照明光の光路は、試料の観察中にも、温度および湿度の変化、顕微鏡の振動などの要因により変化し、ずれが生じる。しかしながら、特許文献１では、試料の観察中に照明光の光路のずれを検出する方法について十分検討されていない。
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、試料の観察中に照明光の光路のずれを確実に検出できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面の光走査顕微鏡は、光源からの照明光を、試料に照射する第１の光と前記照明光の光路のずれを検出するための第２の光に分岐する第１の分岐手段と、前記第１の分岐手段に入射する前記照明光の光量を制御する光量制御手段と、前記第１の光を走査する走査手段と、対物レンズと、前記対物レンズを介して前記第１の光が照射されることにより前記試料から発せられる観察光を受光する第１の受光手段と、前記第２の光に基づいて、前記照明光の光路のずれを検出する検出手段とを備え、前記光量制御手段は、前記照明光の光路のずれを検出する場合、前記第１の光が前記対物レンズを通過しない範囲を前記走査手段により走査されるとき、前記第２の光が所定の光量以上になるように前記照明光の光量を制御する。
【０００７】
本発明の一側面の照明制御方法は、光源からの照明光を、試料に照射する第１の光と前記照明光の光路のずれを検出するための第２の光に分岐する分岐手段と、前記第１の光を走査する走査手段と、対物レンズと、前記対物レンズを介して前記第１の光が照射されることにより前記試料から発せられる観察光を受光する受光手段とを備える光走査顕微鏡が、前記照明光の光路のずれを検出する場合、前記第１の光が前記対物レンズを通過しない範囲を前記走査手段により走査されるとき、前記第２の光が所定の光量以上になるように前記照明光の光量を制御する。
【０００８】
本発明の一側面においては、光源からの照明光が、試料に照射する第１の光と照明光の光路のずれを検出するための第２の光に分岐され、照明光の光路のずれを検出する場合、第１の光が対物レンズを通過しない範囲を走査されるとき、第２の光が所定の光量以上になるように照明光の光量が制御される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一側面によれば、試料の観察中に照明光の光路のずれを確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】コンピュータにより実現される機能の構成例を示すブロック図である。
【図３】チルトずれの検出について説明する図である。
【図４】シフトずれの検出について説明する図である。
【図５】照明光の中心軸の位置とアライメントミラーの回転方向の位置との関係の例を示すグラフである。
【図６】照明光の走査範囲の分類の例を示す図である。
【図７】照明光の光量と光電検出素子の受光量の関係の例を示すグラフである。
【図８】従来の照明光の走査方法の例を示す図である。
【図９】本発明の照明光の走査方法の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．実施の形態
２．変形例
【００１２】
＜１．実施の形態＞
［共焦点顕微鏡１の構成例］
図１は、本発明を適用した２光子顕微鏡付き共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。
【００１３】
２光子顕微鏡付き共焦点顕微鏡（以下、単に共焦点顕微鏡という）１は、通常の１光子励起による共焦点観察と、２光子励起法による観察を実現する観察するシステムである。共焦点顕微鏡１は、光源１１、プリチャープユニット１２、入射光学系ユニット１３、アライメントユニット１４、スキャンヘッド１５、顕微鏡１６、制御部１７、コンピュータ１８、表示部１９、駆動部２０、および駆動部２１を含むように構成される。なお、アライメントユニット１４は、スキャンヘッド１５に一体的に連結するように取付けられ、スキャンヘッド１５は、顕微鏡１６に一体的に連結するように取付けられている。
【００１４】
共焦点顕微鏡１では、観察対象の試料２に照射する照明光（励起光）の光源１１として、例えば、２光子励起法が用いられる場合、パルス幅がフェムト秒単位（例えば、１００フェムト秒）の超短パルス光を射出する超短パルスレーザが用いられる。光源１１から出射された照明光は、プリチャープユニット１２により、その群速度に負分散が発生することによってパルス幅が調整され、照明光の光路、波長、光量を調整する入射光学系ユニット１３に入射する。
【００１５】
入射光学系ユニット１３に入射した照明光は、ミラーホルダ４１に把持された全反射ミラー４２により反射され、ＡＯＭ（音響光学素子）４３に入射する。ＡＯＭ４３は、コンピュータ１８の制御の基に、照明光の波長と光量を調整する。ＡＯＭ４３から出射された照明光は、アライメントミラー４４ａ，４４ｂにより反射されて、照明光の光路のずれを検出するためのアライメントユニット１４に入射する。
【００１６】
アライメントユニット１４に入射した照明光は、ハーフミラー４５により２つの光に分岐される。すなわち、照明光の一部がハーフミラー４５により反射され、ハーフミラー５８に入射し、残りがハーフミラー４５を透過し、照明光を走査したり、試料２からの観察光を検出したりするためのスキャンヘッド１５に入射する。
【００１７】
スキャンヘッド１５に入射した照明光は、ビームエキスパンダ４６によりビーム径が拡大され、ダイクロイックミラー４７、走査ユニット４８、およびリレーレンズ４９を介して顕微鏡１６に入射する。
【００１８】
顕微鏡１６に入射した照明光は、顕微鏡１６内のダイクロイックミラー５０および対物レンズ５１を介してステージ５２上に載置された試料２に照射される。
【００１９】
このとき、走査ユニット４８は、ダイクロイックミラー４７から入射した照明光を、図中、左右方向（以下、ｘ軸方向と称する）および奥行き方向（以下、ｙ軸方向と称する）に偏向させることにより、試料２上で照明光を走査させる。試料２に照明光が照射されると、試料２からは観察光となる蛍光が発生し、この蛍光は対物レンズ５１を介してダイクロイックミラー５０に入射する。
【００２０】
２光子励起法の場合、集光点のごく近傍からしか蛍光（観察光）が発生せず、それ自体で高い空間分解能を有するため、ピンホールは不要である。そのため、蛍光をより高い効率で検出するために、試料２になるべく近い位置に検出器を置く構成が可能となる。そのような構成の場合は、ダイクロイックミラー５０は、必要に応じて対物レンズ５１からの蛍光を反射して、集光レンズ５３に入射させる。つまり、ダイクロイックミラー５０は、物理的に移動するようになされており、２光子励起法により試料２から発生した蛍光をそのまま観察するときには、照明光の光路上に配置され、通常の１光子励起法による蛍光を共焦点方式により観察するときには、照明光の光路上には配置されない。
【００２１】
ダイクロイックミラー５０が照明光の光路上に配置されている場合、ダイクロイックミラー５０は、リレーレンズ４９からの照明光を透過させるとともに、試料２からの蛍光を反射して、集光レンズ５３に入射させる。
【００２２】
集光レンズ５３に入射した蛍光は、集光レンズ５３により集光されて光電検出素子５４に受光され、さらに光電検出素子５４により光電変換される。そして光電変換により得られた電気信号は、光電検出素子５４から制御部１７を介してコンピュータ１８に供給される。コンピュータ１８は、制御部１７からの電気信号に基づいて、試料２の画像である観察画像の画像信号を生成して表示部１９に供給し、表示部１９に観察画像を表示させる。
【００２３】
一方、ダイクロイックミラー５０が照明光の光路上に配置されない場合、リレーレンズ４９からの照明光は、対物レンズ５１を介して試料２に照射される。そして、試料２からの蛍光は、照明光の光路を逆方向に通ってダイクロイックミラー４７に入射する。すなわち、試料２から対物レンズ５１に入射した蛍光は、リレーレンズ４９および走査ユニット４８を介してダイクロイックミラー４７に入射する。
【００２４】
ダイクロイックミラー４７は、走査ユニット４８からの蛍光を反射して集光レンズ５５に入射させる。このダイクロイックミラー４７は、照明光の波長の光を透過させて、蛍光の波長の光を反射する。
【００２５】
ダイクロイックミラー４７から集光レンズ５５に入射した蛍光は、集光レンズ５５により集光され、共焦点絞り５６に設けられたピンホールを通って、光電検出素子５７に受光される。そして、光電検出素子５７が受光した蛍光を光電変換することにより得られた電気信号は、光電検出素子５７から制御部１７を介してコンピュータ１８に供給される。コンピュータ１８は、制御部１７からの電気信号に基づいて観察画像の画像信号を生成し、表示部１９に供給する。これにより、表示部１９に観察画像が表示される。
【００２６】
１光子励起法による共焦点観察の場合はこの経路、つまり対物レンズ５１から光電検出素子５７までの経路をとる。また、２光子励起法による観察の場合もピンホールを開放にすることで、この経路による検出が可能である。
【００２７】
一方、アライメントユニット１４内のハーフミラー４５により反射された照明光は、その一部がハーフミラー５８により反射され、光電検出素子５９に入射し、残りがハーフミラー５８を透過して、光電検出素子６０に入射する。すなわち、ハーフミラー５８は、照明光の光路のずれを検出するために、ハーフミラー４５により抽出された照明光を２つの光（光路）に分岐させる。
【００２８】
ここで、光電検出素子５９は、ハーフミラー５８から光電検出素子５９の受光面までの照明光の光路長がＬ１となる位置に配置され、光電検出素子６０は、ハーフミラー５８から光電検出素子６０の受光面までの照明光の光路長が、Ｌ１より長いＬ２となる位置に配置される。また、光電検出素子５９および光電検出素子６０は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Devices）等の撮像素子、ＰＳＤ（Position Sensing Detector）、４分割フォトダイオードなどの受光位置を検出可能な素子とされる。
【００２９】
光電検出素子５９は、ハーフミラー５８からの照明光を受光して光電変換し、光電変換により得られた検出信号Ｄ１をＡ／Ｄ（Analog/Digital）変換器６１に供給する。この検出信号Ｄ１は、受光面上の各位置に入射した光の強度を示す信号であり、Ａ／Ｄ変換器６１によりアナログ信号からデジタル信号に変換された後、制御部１７を介してコンピュータ１８に供給される。
【００３０】
光電検出素子６０は、ハーフミラー５８からの照明光を受光して光電変換し、光電変換により得られた検出信号Ｄ２をＡ／Ｄ変換器６１に供給する。この検出信号Ｄ２は、受光面上の各位置に入射した光の強度を示す信号であり、Ａ／Ｄ変換器６１によりアナログ信号からデジタル信号に変換された後、制御部１７を介してコンピュータ１８に供給される。
【００３１】
コンピュータ１８は、制御部１７からの検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２のデジタル信号に基づいて、光電検出素子５９の受光面上における照明光の受光位置Ｐ１と、光電検出素子６０の受光面上における照明光の受光位置Ｐ２とを検出する。
【００３２】
また、コンピュータ１８は、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光の光路の回転方向（チルト方向）のずれ（以下、チルトずれと称する）の角度および方向（以下、チルト量と称する）を演算処理により求め、駆動部２０に供給する。
【００３３】
さらに、コンピュータ１８は、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光の光路の光軸に垂直な方向（シフト方向）のずれ（以下、シフトずれと称する）の大きさおよび方向（以下、シフト量と称する）を演算処理により求める。また、コンピュータ１８は、照明光のシフトずれを補正するアライメントミラー４４ａ，４４ｂの回転方向の位置を求め、駆動部２１に供給する。
【００３４】
また、コンピュータ１８は、ＡＯＭ４３を制御して、照明光の波長と光量を制御する。
【００３５】
なお、コンピュータ１８が、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を示す画像を表示部１９に表示させたり、演算処理により求められたチルト量およびシフト量を表示部１９に表示させたりするようにしてもよい。
【００３６】
駆動部２０は、コンピュータ１８から供給されたチルト量に基づいて、照明光のチルトずれが打ち消されるように、全反射ミラー４２を駆動する。すなわち、ミラーホルダ４１には、全反射ミラー４２を支持する互いに直交する２つの回転軸が設けられており、ミラーホルダ４１は、駆動部２０の制御に基づいて、それらの回転軸を中心として全反射ミラー４２を回動させる。これにより、照明光の傾きが調整され、チルトずれがなくなるように照明光の光路が補正される。
【００３７】
駆動部２１は、コンピュータ１８から供給された回転方向の位置になるように、アライメントミラー４４ａ，４４ｂを駆動する。すなわち、アライメントミラー４４ａ，４４ｂには、互いに直交する回転軸がそれぞれ設けられており、アライメントミラー４４ａが回転軸を中心に回転することにより、照明光がｘ軸方向に平行移動し、アライメントミラー４４ｂが回転軸を中心に回転することにより、照明光がｙ軸方向に平行移動する。そして、アライメントミラー４４ａ，４４ｂが、コンピュータ１８により求められた回転方向の位置に設定されることにより、照明光のシフトずれが打ち消される。
【００３８】
［コンピュータ１８により実現される機能の構成例］
図２は、コンピュータ１８により実現される機能の一部の構成例を示すブロック図である。コンピュータ１８により、照明制御部１０１を含む機能が実現される。また、照明制御部１０１は、ずれ検出部１１１、算出部１１２、補正部１１３、および、光量制御部１１４を含む機能が実現される。
【００３９】
ずれ検出部１１１は、制御部１７からの検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２のデジタル信号に基づいて、光電検出素子５９の受光面上における照明光の受光位置Ｐ１と、光電検出素子６０の受光面上における照明光の受光位置Ｐ２とを検出する。また、ずれ検出部１１１は、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光のチルトずれおよびシフトずれを検出する。さらに、ずれ検出部１１１は、照明光のチルトずれの角度および方向を示すチルト量を補正部１１３に供給する。また、ずれ検出部１１１は、照明光のシフトずれの大きさおよび方向を示すシフト量を、算出部１１２および補正部１１３に供給する。さらに、ずれ検出部１１１は、照明光の光路のずれを検出するタイミングを光量制御部１１４に通知する。
【００４０】
算出部１１２は、照明光のシフト量、および、アライメントミラー４４ａ，４４ｂの回転方向の位置に基づいて、照明光の中心軸のｘ軸方向の位置とアライメントミラー４４ａの回転方向の位置との関係式（以下、ｘ方向関係式と称する）、および、照明光の中心軸のｙ軸方向の位置とアライメントミラー４４ｂの回転方向の位置との関係式（以下、ｙ方向関係式と称する）を算出する。算出部１１２は、算出したｘ方向関係式およびｙ方向関係式を補正部１１３に供給する。
【００４１】
補正部１１３は、照明光のチルト量を駆動部２０に供給することにより、照明光のチルトずれを補正する。また、補正部１１３は、照明光のシフト量、ｘ方向関係式、および、ｙ方向関係式に基づいて、照明光のシフトずれを補正するアライメントミラー４４ａ，４４ｂの回転方向の位置を求める。さらに、補正部１１３は、求めたアライメントミラー４４ａ，４４ｂの回転方向の位置を駆動部２１に供給することにより、照明光のシフトずれを補正する。また、補正部１１３は、設定したアライメントミラー４４ａ，４４ｂの回転方向の位置を算出部１１２に供給する。
【００４２】
光量制御部１１４は、ＡＯＭ４３を制御して、照明光の光量を制御する。
【００４３】
［照明光の光路のずれの検出方法および補正方法］
次に、共焦点顕微鏡１における照明光のずれの検出方法および補正方法について説明する。
【００４４】
光源１１からハーフミラー４５までの照明光の光路でチルトずれが生じると、図３Ａに示すように、照明光の光路は、照明光が本来通るべき光路である基準光路に対して傾く。なお、図３Ａでは、実線は照明光の基準光路を示しており、点線は照明光の実際の光路を示している。
【００４５】
光電検出素子５９および光電検出素子６０のそれぞれの受光面の中心の位置を、照明光が本来受光されるべき基準位置であるとすると、チルトずれの発生により照明光の光路は基準光路に対して傾く。その結果、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２は、それぞれ基準位置からずれた位置となる。
【００４６】
ここで、光電検出素子５９に入射する照明光と、光電検出素子６０に入射する照明光とは共通光路を有し、ハーフミラー５８において分岐される。したがって、図３Ｂに示すように、光電検出素子５９に入射する照明光の基準光路の延長上に光電検出素子６０が等価配置され、光電検出素子５９に入射した照明光が、そのまま直進し、光電検出素子６０の受光面に到達すると仮想的に考えることができる。
【００４７】
この場合、照明光は、基準光路に対して角度θだけ傾いて、図中、下側から光電検出素子５９の受光面上の受光位置Ｐ１に入射し、その後、光電検出素子６０の受光面上の受光位置Ｐ２に入射する。なお、図３Ｂにおいて、実線は照明光の光路を示しており、点線は基準光路を示している。
【００４８】
ここで、光電検出素子５９から光電検出素子６０までの距離を△Ｌとすると、基準位置から受光位置Ｐ２までの距離と、基準位置から受光位置Ｐ１までの距離との差分△Ｐは、次式（１）で表される。
【００４９】
△Ｐ＝△Ｌ×ｔａｎθ              ・・・（１）
【００５０】
式（１）における距離△Ｌは、ハーフミラー５８から光電検出素子５９までの照明光の光路長Ｌ１と、ハーフミラー５８から光電検出素子６０までの照明光の光路長Ｌ２との差であるから、距離△Ｌは既知の光路長Ｌ１および光路長Ｌ２から求められる。また、差分△Ｐも受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２から求められる。
【００５１】
したがって、光路長Ｌ１、光路長Ｌ２、受光位置Ｐ１、および受光位置Ｐ２から式（１）により、照明光のチルトずれの角度θが求められる。なお、照明光にシフトずれが生じていたとしても、受光位置Ｐ２と受光位置Ｐ１との基準位置からの距離の差分△Ｐは変わらないため、差分△Ｐは、照明光のチルトずれの角度θにより定まる。したがって、照明光のシフトずれの大きさおよび方向によらず、式（１）から角度θが求められる。
【００５２】
ずれ検出部１１１は、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光のチルトずれの方向を求めるとともに、式（１）を計算して、その角度θを求める。補正部１１３は、照明光のチルトずれの角度θおよび方向を示すチルト量を駆動部２０に供給する。
【００５３】
駆動部２０は、補正部１１３から供給されたチルト量に基づいて、全反射ミラー４２を駆動する。すると、ミラーホルダ４１は、駆動部２０の制御に基づいて、照明光のチルトずれの方向とは反対方向に、チルトずれの角度θだけ、つまり角度（−θ）だけ全反射ミラー４２を回動させて、照明光の光路を補正する。これにより、チルトずれが補正され、補正後の照明光の光路にはシフトずれだけが生じている状態となる。
【００５４】
次に、ずれ検出部１１１は、照明光の光路にシフトずれだけが残っている状態において、光電検出素子５９および光電検出素子６０から供給された検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２に基づいて、照明光の受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を検出する。そして、ずれ検出部１１１は、受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２の検出結果から照明光のシフトずれを検出する。
【００５５】
例えば、光源１１からハーフミラー４５までの照明光の光路でシフトずれが生じると、図４Ａに示すように、照明光の光路は基準光路に対して、基準光路と垂直な方向に平行移動する。なお、図４Ａでは、実線は照明光の基準光路を示しており、点線は照明光の実際の光路を示している。
【００５６】
ここで、図４Ｂに示すように、図３Ｂにおける場合と同様に光電検出素子５９に入射する照明光の基準光路の延長上に光電検出素子６０が等価配置され、光電検出素子５９に入射した照明光が、そのまま直進し、光電検出素子６０の受光面に到達すると仮想的に考える。
【００５７】
この場合、照明光は、基準光路と平行に、つまり光電検出素子５９の受光面に対して垂直に、その受光面上の受光位置Ｐ１に入射し、その後、光電検出素子６０の受光面上の受光位置Ｐ２に入射する。なお、図４Ｂにおいて、実線は照明光の光路を示しており、点線は基準光路を示している。
【００５８】
図４Ｂでは、照明光の光路にチルトずれは生じていないので、基準位置から受光位置Ｐ１までの距離と、基準位置から受光位置Ｐ２までの距離とは同じとなり、その距離が照明光のシフト量の大きさとなる。
【００５９】
ずれ検出部１１１は、受光位置Ｐ１（または受光位置Ｐ２）から、図中左右方向（ｘ軸方向）のシフトずれの大きさＳｘ、および、奥行き方向（ｙ軸方向）のシフトずれの大きさＳｙを求める。
【００６０】
図５は、照明光の中心軸のｘ軸方向の位置ＯＰｘ（以下、中心位置ＯＰｘと称する）と、アライメントミラー４４ａの回転方向の位置ＭＰａ（以下、ミラー位置ＭＰａと称する）との関係を示すグラフである。なお、図中、横軸は、ミラー位置ＭＰａを示している。また、縦軸は、基準光路の中心軸を基準とする中心位置ＯＰｘを示している。すなわち、縦軸の値は、照明光のｘ軸方向のシフトずれの大きさＳｘを示し、照明光にｘ軸方向のシフトずれが発生していないとき、縦軸の値は０となる。
【００６１】
さらに、図中、実線で示されるグラフは、時刻ｔ０のときの中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａの関係を示し、点線で示されるグラフは、時刻ｔ１のときの中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａの関係を示し、一点鎖線で示されるグラフは、時刻ｔ２のときの中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａの関係を示す。
【００６２】
図５に示されるように、中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａとの関係式（ｘ方向関係式）は、一次式により近似することができ、例えば、以下の式（２）により表される。
【００６３】
ＭＰａ＝Ａｘ×ＯＰｘ＋Ｂｘ  ・・・（２）
【００６４】
式（２）の傾きＡｘは、実験によりほぼ一定で変化しないことが分かっており、定数と見なすことができる。一方、切片Ｂｘは、照明光の波長、温度、湿度、共焦点顕微鏡１の振動などにより、時間とともに変動する。従って、図５に示されるように、中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａとの関係を表すグラフは、傾きＡｘが一定のまま時間とともに平行移動する。
【００６５】
ここで、各時刻ｔｎ（ｎ＝０，１，２，・・・）におけるｘ方向関係式の算出方法について説明する。なお、時刻ｔ０は、試料２の観察を開始する前の時刻とし、時刻ｔ１以降は、試料２の観察を開始した後の時刻とする。
【００６６】
時刻ｔ０において、補正部１１３は、駆動部２１を介して、２つ以上の異なるミラー位置ＭＰａにアライメントミラー４４ａを設定し、設定したミラー位置ＭＰａを算出部１１２に供給する。また、ずれ検出部１１１は、設定された各ミラー位置ＭＰａにおける照明光のシフト量を検出し、算出部１１２に供給する。算出部１１２は、各ミラー位置ＭＰａにおけるシフト量に基づいて、各ミラー位置ＭＰａにおける照明光のｘ軸方向の中心位置ＯＰｘを求める。そして、算出部１１２は、各ミラー位置ＭＰａにおける中心位置ＯＰｘを式（２）に代入することにより、式（２）の傾きＡｘ、および、時刻ｔ０における切片Ｂｘ０を求める。従って、時刻ｔ０における中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａの関係式（ｘ方向関係式）は、式（３）により表される。
【００６７】
ＭＰａ＝Ａｘ×ＯＰｘ＋Ｂｘ０  ・・・（３）
【００６８】
時刻ｔ１において、ずれ検出部１１１は、照明光のシフト量を検出し、算出部１１２に供給する。算出部１１２は、検出されたシフト量に基づいて、照明光のｘ軸方向の中心位置ＯＰｘ１を求める。また、算出部１１２は、時刻ｔ１におけるアライメントミラー４４ａのミラー位置ＭＰａ１を補正部１１３から取得する。上述したように、式（２）の傾きＡｘは一定と見なすことができるので、算出部１１２は、時刻ｔ１における式（２）の切片Ｂｘ１を、次式（４）により算出する。
【００６９】
Ｂｘ１＝ＭＰａ１−Ａｘ×ＯＰｘ１  ・・・（４）
【００７０】
従って、時刻ｔ１における中心位置ＯＰｘとミラー位置ＭＰａのｘ方向関係式は、次式（５）となる。
【００７１】
ＭＰａ＝Ａｘ×ＯＰｘ＋Ｂｘ１  ・・・（５）
【００７２】
時刻ｔ２以降の切片Ｂｘｎ（ｎ＝２，３，・・・）、および、ｘ方向関係式も、時刻ｔ０の場合と同様にして求めることができる。すなわち、時刻ｔｎにおけるｘ方向関係式は、次式（６）となる。
【００７３】
ＭＰａ＝Ａｘ×ＯＰｘ＋Ｂｘｎ  ・・・（６）
【００７４】
なお、各時刻ｔｎにおけるｙ方向関係式も、ｘ方向関係式と同様の方法により求めることができる。すなわち、照明光の中心軸のｙ軸方向の位置をＯＰｙとし、アライメントミラー４４ｂの回転方向の位置をＭＰｂとすると、時刻ｔｎにおけるｙ方向関係式は、次式（７）となる。
【００７５】
ＭＰｂ＝Ａｙ×ＯＰｙ＋Ｂｙｎ  ・・・（７）
【００７６】
算出部１１２は、算出したｘ方向関係式（式（６））およびｙ方向関係式（式（７））を補正部１１３に供給する。
【００７７】
補正部１１３は、式（６）にＯＰｘ＝０を代入することにより、照明光のｘ軸方向のシフトずれを解消するためのミラー位置ＭＰａを求める。すなわち、照明光のｘ軸方向のシフトずれを解消するためのミラー位置ＭＰａは、式（６）の切片Ｂｘｎとなる。同様に、補正部１１３は、式（７）にＯＰｙ＝０を代入することにより、照明光のｙ軸方向のシフトずれを解消するためのミラー位置ＭＰｂを求める。すなわち、照明光のｙ軸方向のシフトずれを解消するためのミラー位置ＭＰｂは、式（７）の切片Ｂｙｎとなる。
【００７８】
補正部１１３は、求めたアライメントミラー４４ａ，４４ｂの回転方向の位置を駆動部２１に供給する。
【００７９】
駆動部２１は、補正部１１３から供給された回転方向の位置となるように、アライメントミラー４４ａおよびアライメントミラー４４ｂを駆動する。これにより、補正後の照明光の光路は、基準光路と重なった状態、つまり基準光路そのものとなった状態となる。
【００８０】
このようにして、共焦点顕微鏡１では、照明光の光路のずれが検出されて、そのずれがなくなるように照明光の光路が補正される。
【００８１】
なお、算出部１１２から補正部１１３に、ｘ方向関係式およびｙ方向関係式の代わりに、ｘ方向関係式の切片Ｂｘｎおよびｙ方向関係式の切片Ｂｙｎを供給するようにしてもよい。これにより、補正部１１３において、照明光のシフトずれを解消するためのアライメントミラー４４ａ，４４ｂの位置の計算が不要になる。
【００８２】
［照明光の光路のずれを検出するタイミング］
次に、図６乃至図９を参照して、照明光の光路のずれを検出するタイミングについて説明する。
【００８３】
図６は、走査ユニット４８により照明光が走査される範囲を分類した図である。図６に示されるように、照明光の走査範囲は、範囲１５１乃至１５３の３つの範囲に大きく分類される。
【００８４】
いちばん内側の矩形の範囲１５１は、走査ユニット４８により走査された照明光が対物レンズ５１に入射し、対物レンズ５１を介して試料２に照明光が照射される範囲のうち、試料２の観察対象となる範囲である。
【００８５】
範囲１５１の周囲を囲む範囲１５２は、走査ユニット４８により走査された照明光が対物レンズ５１に入射し、対物レンズ５１を介して試料２に照明光が照射される範囲のうち、試料２の観察対象外となる範囲である。
【００８６】
範囲１５２の周囲を囲む範囲１５３は、走査ユニット４８により走査された照明光が、対物レンズ５１に入射しない範囲であり、照明光が試料２に照射されない範囲である。
【００８７】
図７は、照明光の光量と、光電検出素子５９および光電検出素子６０との受光量の関係を示すグラフである。なお、グラフの横軸は、照明光の光量を示し、縦軸は、光電検出素子５９および光電検出素子６０の受光量を示している。この図に示されるように、光電検出素子５９および光電検出素子６０の受光量は、照明光の光量に比例し、照明光の光量が増加すると、光電検出素子５９および光電検出素子６０の受光量も増加する。
【００８８】
ところで、光電検出素子５９および光電検出素子６０において、照明光の受光位置を検出するためには、所定の値以上の受光量が必要である。例えば、図７の例では、斜線で示される範囲１６１の受光量が必要である。
【００８９】
しかしながら、共焦点顕微鏡１では、照明光により与えられる試料２のダメージを小さくするために、照明光の光量を、できる限り観察に必要な最低限の光量に近い値まで絞ることが望ましい。
【００９０】
また、共焦点顕微鏡１では、照明光により与えられる試料２のダメージを小さくするために、試料２の観察対象となる範囲１５１内のみ照明光を照射し、それ以外の範囲には照明光を照射しないようにすることが望ましい。これについて、図８を参照して説明する。
【００９１】
図８は、範囲１５１内のみ照明光を照射し、それ以外の範囲には照明光を照射しないようにした場合の、従来の照明光の走査方法の一例を示している。なお、図内において、実線は照明光を点灯する区間を示し、点線は照明光を消灯する区間を示している。
【００９２】
この例では、照明光は、ラスタスキャン順に走査される。そして、照明光は、各行において、範囲１５１内を走査する区間のみ点灯され、それ以外の区間では消灯される。また、照明光は、行の終端から次に走査する行の先頭に移動する区間でも消灯される。
【００９３】
従って、従来の照明光の走査方法では、試料の観察中、光量が絞られる上に、照明光が短い間隔で点滅するため、光電検出素子５９および光電検出素子６０の受光量が不足し、照明光の受光位置を検出できず、その結果、照明光の光路のずれを検出できないことが想定される。
【００９４】
そこで、共焦点顕微鏡１では、図９に示されるように、１フレーム分の照明光の走査が終わり、いちばん下の行の終端からいちばん上の行の先頭に照明光を走査するときに、照明光が試料２に照射されない範囲１５３内を通過するように照明光を走査する。そして、光量制御部１１４は、ＡＯＭ４３を制御して、照明光が範囲１５３内を通過する間、光電検出素子５９および光電検出素子６０の受光量が受光位置を検出するのに必要な値以上になるように、アライメントユニット１４に入射する照明光の光量を制御する。
【００９５】
これにより、試料２の観察中に、照明光により与えられる試料２のダメージを増やすことなく、照明光の光路のずれを確実に検出し、照明光の光路を確実に補正することができる。
【００９６】
なお、照明光の光路のずれの検出は、例えば、１フレーム毎に行うようにしてもよいし、所定の数のフレーム毎に行うようにしてもよいし、所定の時間毎に行うようにしてもよい。
【００９７】
また、照明光の光路のずれを検出するか否かに関わらず、常に図９に示される経路で照明光を走査するようにしてもよいし、照明光の光路のずれを検出する場合のみ、図９に示される経路で照明光を走査し、それ以外の場合は、図８に示される経路で照明光を走査するようにしてもよい。
【００９８】
さらに、照明光の光路の補正は、例えば、検出された照明光の光路のずれの大きさが所定の閾値以上になったときに行うようにしてもよいし、照明光の光路のずれを検出する度に行うようにしてもよい。
【００９９】
また、ｘ方向関係式およびｙ方向関係式の更新は、例えば、検出された照明光の光路のずれの大きさが所定の閾値以上になったときに行うようにしてもよいし、照明光の光路のずれを検出する度に行うようにしてもよい。
【０１００】
さらに、例えば、フレームの各行または所定の行において、照明光を範囲１５３内まで走査し、範囲１５３内を照明光が通過するときに、照明光の光量を上げ、照明光の光路のずれを検出するようにしてもよい。
【０１０１】
以上のようにして、試料２の観察中に、確実に照明光の光路のずれを検出し、補正することができる。その結果、試料２の所望の部位に充分な光量の照明光を照射することができ、観察画像の画質の劣化を防止するとともに、観察者の所望する試料２の部位の観察画像を得ることができる。
【０１０２】
また、照明光の中心軸調整のためのメンテナンスが不要となるとともに、画像分解能や画像品質などの諸性能の安定した、より信頼性の高い共焦点顕微鏡１を実現することができる。
【０１０３】
＜２．変形例＞
以上の説明では、本発明を共焦点顕微鏡に適用する例を示したが、本発明は、試料上において照明光を走査する他の方式の顕微鏡にも適用することが可能である。なお、走査は、片道だけでなく、往復、自由曲線等も含む。
【０１０４】
また、全反射ミラー４２およびアライメントミラー４４ａ，４４ｂ以外の手段を用いて、照明光の光路を補正するようにしてもよい。なお、アライメントミラー４４ａ，４４ｂとは異なる手段を用いて照明光の光路を補正する場合には、式（６）および式（７）とは異なる関係式を用いて、照明光のシフトずれが補正される。
【０１０５】
さらに、以上においては、チルトずれの補正を行った後、シフトずれを検出する例について説明したが、ずれ検出部１１１が、検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２に基づいて、照明光のチルト量およびシフト量を同時に求めるようにしてもよい。この場合、照明光のチルトずれおよびシフトずれの補正を同時に行うことが可能になる。
【０１０６】
また、照明光の光路のずれを検出するために照明光の一部を抽出するハーフミラー４５は、入射光学系ユニット１３と走査ユニット４８との間の照明光の光路上であれば、どこに配置してもよい。
【０１０７】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明
の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【０１０８】
１  ２光子顕微鏡付き共焦点顕微鏡，  ２  試料，  １１  光源，  １３  入射光学系ユニット，  １４  アライメントユニット，  １５  スキャンヘッド，  １６  顕微鏡，  １８  コンピュータ，  ２０，２１  駆動部，  ４１  ミラーホルダ，  ４２  全反射ミラー，  ４３  ＡＯＭ，  ４４ａ，４４ｂ  アライメントミラー，  ４５  ハーフミラー，  ４８  走査ユニット，  ５１  対物レンズ，  ５４，５７  光電検出素子，  ５８  ハーフミラー，  ５９，６０  光電検出素子，  １０１  照明制御部，  １１１  ずれ検出部，  １１２  算出部，  １１３  補正部，  １１４  光量制御部  
【図１】
2011257616.tif 000003
【図２】
2011257616.tif 000004
【図３】
2011257616.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011257616.tif 000009
【図８】
2011257616.tif 000010
【図９】
2011257616.tif 000011