(57)【要約】【課題】高分子タンパク質構造物を提供すること。【解決手段】本発明により、トリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２のＨＡタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４０４６２６）、ＮＡタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４０４６２９）、Ｍ１タンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７８６４６タンパク質）、Ｍ２タンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２５５３６３）およびＮＰタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２５５７４２）を含む高分子タンパク質構造物、ならびにヒトインフルエンザウイルスＡ型Ｈ３Ｎ２のＨＡ配列コード（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３１１４６６）およびＮＡ配列コード（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２９１４０３）を含む高分子タンパク質構造物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科の１属である（総説について、ＭｕｒｐｈｙおよびＷｅｂｓｔｅｒ、１９９６を参照のこと）。Ａ、ＢおよびＣと命名された３種のサブタイプのインフルエンザウイルスが存在する。そのインフルエンザビリオンは、分節されたマイナスセンスＲＮＡゲノムを含有する。インフルエンザビリオンは、以下のタンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ），マトリックス（Ｍ１），プロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２），核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、および非構造タンパク質２（ＮＳ２）を含む。上記ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２は、膜結合型タンパク質であり、一方ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２は、ヌクレオキャプシド関連タンパク質である。上記ＮＳ１は、ビリオン粒子と関連しないが、インフルエンザ感染細胞に特異的である、唯一の非構造タンパク質である。上記Ｍ１タンパク質は、インフルエンザ粒子に最も豊富に存在するタンパク質である。上記ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、エンベロープ糖タンパク質であり、そのウイルス粒子が細胞へ付着し、そして侵入する役割を果たし、ウイルス中和および防御免疫のための主要抗原エピトープの供給源である。ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の両方は、予防的インフルエンザワクチンにとって最も重要な成分であると考えられる。
【０００２】
インフルエンザウイルス感染は、ビリオン表面のＨＡタンパク質が、シアル酸含有細胞性レセプター（糖タンパク質および糖脂質）に付着することにより開始される。上記ＮＡタンパク質は、シアル酸レセプターのプロセシングを媒介し、細胞の中へのウイルスの侵入は、ＨＡ依存性レセプター媒介エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを含有する内部に吸収したエンドソームの酸性制限下において、上記ＨＡ２タンパク質は、立体配座の変化を受け、これによりウイルスと細胞膜との融合およびウイルス脱コート化、およびヌクレオキャプシド関連リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）からのＭ１タンパク質のＭ２介在性放出がもたらされる。このＭ１タンパク質は、ウイルスＲＮＡ合成のために細胞核に移動する。ＨＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス感染性を中和することにより、ウイルス感染を予防し、一方ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス複製の早期段階に対する効果を媒介する。
【０００３】
不活性化インフルエンザＡウイルスワクチンおよび不活性化インフルエンザＢウイルスワクチンは、現在非経口投与について許諾されている。これらの３価のワクチンは、胚含有鶏卵の尿膜腔において産生され、沈降速度ゾーン遠心分離法（ｒａｔｅ  ｚｏｎａｌ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）またはカラムクロマトグラフィーにより精製され、そしてホルマリンまたはβ−プロピオラクトンにより不活性化され、問題の年にヒト集団の間に広まるインフルエンザウイルスＡ型およびインフルエンザウイルスＢ型の２株のブレンドとして処方される。市販されるインフルエンザワクチンは、全ウイルス（ＷＶ）またはサブビリオン（ＳＶ；分割または精製された表面抗原）ウイルスワクチンである。上記ＷＶワクチンは、インタクトな不活性化ビリオンを含有する。トリ−ｎ−ブチルリン酸（Ｆｌｕ−Ｓｈｉｅｌｄ、Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅ）のような溶媒で処理されたＳＶワクチンは、ほとんど全ての上記ウイルス構造タンパク質およびいくらかの上記ウイルスエンベロープを含有する。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｆｌｕｚｏｎｅ、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ；Ｆｌｕｖｉｒｉｎ、Ｅｖａｎｓ）で溶解されたＳＶワクチンは、ＨＡモノマー、ＮＡおよびＮＰの凝集体を主に含有するが、残量の他のウイルス構造タンパク質が存在する。潜在的な低温適合弱毒化生インフルエンザウイルスワクチン（ＦｌｕＭｉｓｔ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）が、５〜１７歳の健常な青少年および１８〜４９歳の健常な成人における能動免疫およびインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防のために指示される鼻内送達ワクチンとして商業使用に市販されることが、ＦＤＡにより最近承認された。
【０００４】
いくつかの組換え産物が、組換えインフルエンザワクチン候補として開発されてきた。これらのアプローチは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９９；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、１９９９；Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６）、ウイルスベクター（Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、１９９９）およびＤＮＡワクチン構築物（Ｏｌｓｅｎら、１９９７）のを使用するこれらのタンパク質発現を含む、インフルエンザＡ型  ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現、産生および精製に焦点が当てられていた。
【０００５】
Ｃｒａｗｆｏｒｄら（１９９９）は、バキュロウイルス感染昆虫細胞において発現したインフルエンザＨＡは、トリインフルエンザサブタイプＨ５およびトリインフルエンザサブタイプＨ７に起因する致死的なインフルエンザ疾患を予防する能力があることを例証した。同時に、別のグループは、バキュロウイルスにより発現されたインフルエンザＨＡタンパク質およびインフルエンザＮＡタンパク質は、動物において従来のワクチンで誘導される免疫応答より優れた免疫応答を誘導することを例証した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９９）。ウマインフルエンザウイルスのバキュロウイルス発現ヘマグルチニンの免疫原性および有効性が、相同的なＤＮＡワクチン候補（Ｏｌｓｅｎら、１９９７）と比較された。合わせて考えると、そのデータは、インフルエンザウイルスチャレンジに対する高度な防御が、種々の実験手法および異なる動物モデルを使用して、組換えＨＡタンパク質または組換えＮＡタンパク質により誘導され得ることを例証した。
【０００６】
Ｌａｋｅｙら（１９９６）は、バキュロウイルス誘導インフルエンザＨＡワクチンは、第Ｉ相用量拡大安全性試験研究においてヒトボランティアにおいてよく寛容され、そして免疫原性もあったことを示した。しかしながらＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質を含む数回のインフルエンザワクチンをワクチン投与されたヒトボランティアにおけるいくつかの臨床部位で行われた第２相試験の結果は、上記の組換えサブユニットタンパク質ワクチンは、防御免疫を誘発しなかったことを示した［Ｇ．Ｓｍｉｔｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍ．Ｐｅｒｄｕｅ、ＵＳＤＡ、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ］。これらの結果は、感染性ビリオンのＨＡペプロマーおよびＮＡペプロマーの表面に提示された立体配座エピトープが、抗体中和および防御免疫の誘発に重要であることを示した。
【０００７】
組換えインフルエンザワクチン候補中に他のインフルエンザタンパク質を含めることに関して、多くの研究がなされ、それにはインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）を単独でか、またはＭ１タンパク質と組合せて含む実験（Ｕｌｍｅｒら，１９９３；Ｕｌｍｅｒら，１９９８；Ｚｈｏｕら，１９９５；Ｔｓｕｉら、１９９８）が挙げられる。これらのワクチン候補は、準不変の内部ビリオンタンパク質から鋼製、主に細胞性（ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞およびＣＤ８＋記憶Ｔ細胞）の広いスペクトル範囲の免疫原性を誘発した。これらの実験は、ＤＮＡまたはウイルス遺伝子ベクターの使用を含んだ。比較的大量の注入されたＤＮＡが必要であった。それは低用量のＤＮＡを使用した実験からの結果がほとんどまたはまったく防御を示さなかった（Ｃｈｅｎら、１９９８）からである。ここで、さらに前臨床研究および臨床研究が、インフルエンザＮＰおよびＭ１を含むそのようなＤＮＡベースのアプローチが、安全であるか、有効であるかそして持続的であるかについて評価するために必要とされ得る。
【０００８】
最近、インフルエンザについてのより有効なワクチンを開発する試みにおいて、粒子タンパク質がインフルエンザＭ２タンパク質エピトープのキャリアとして使用された。Ｍ２ベースのワクチンの開発の論理的根拠は、動物研究において、インフルエンザに対する防御免疫がＭ２タンパク質により誘発された（Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎら、１９９５）、ことである。Ｎｅｉｒｙｎｃｋら（１９９９）は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）とのアミノ末端融合相手として２３アミノ酸長のＭ２膜貫通ドメインを使用して、ＨＢｃＡｇキャプシド様粒子の表面に、Ｍ２エピトープを露出させた。しかしながら、完全長Ｍ２タンパク質およびＭ２−ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰの両方が、マウスにおいて検出可能な抗体および防御を誘導したという事実にもかかわらず、将来のインフルエンザワクチンは、上記Ｍ２タンパク質のみが、ベースとなることはなさそうであった。というのは、上記Ｍ２タンパク質が、１つのビリオン当たり低いコピー数で存在し、弱い抗原性であり、遊離するインフルエンザビリオンに結合する抗体を誘発できなかったし、細胞レセプターにウイルスが付着することを遮断（ウイルス中和）できなかったからである。
【０００９】
以前の研究が、表面インフルエンザ糖タンパク質であるＨＡおよびＮＡが、インフルエンザウイルスに対して防御免疫を誘発する主要な標的であり、そしてＭ１がインフルエンザに対する細胞性免疫の保存的標的を提供することを示したので、新しいワクチン候補は、これらのウイルス抗原を、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）のようなタンパク質高分子粒子として含み得る。さらにこれらのインフルエンザ抗原を有する粒子は、多系統のインフルエンザウイルスに対して中和抗体を誘発する立体配座エピトープを提示し得る。
【００１０】
いくつかの研究は、組換えインフルエンザタンパク質が、哺乳動物の発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用して細胞培養においてＶＬＰへ自己会合し得ることを例証した（Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら、１９９９；Ｎｅｕｍａｎｎら、２０００；ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ、２００１）。Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら（１９９９）は、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成がウイルスタンパク質の発現レベルにより依存することを例証した。Ｎｅｕｍａｎｎら（２０００）は、専らクローン化ｃＤＮＡから感染性インフルエンザウイルス様粒子を生成させる哺乳動物発現プラスミドベースの系を確立した。ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ（２００１）は、共発現するＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２遺伝子を組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。これらの研究は、インフルエンザビリオンタンパク質が、真核細胞において共発現するときに自己会合し得ることを例証した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明によると、トリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２のＨＡタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４０４６２６）、ＮＡタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４０４６２９）、Ｍ１タンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７８６４６タンパク質）、Ｍ２タンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２５５３６３）およびＮＰタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２５５７４２）を含む高分子タンパク質構造物、ならびにヒトインフルエンザウイルスＡ型Ｈ３Ｎ２のＨＡ配列コード（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３１１４６６）およびＮＡ配列コード（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２９１４０３）を含む高分子タンパク質構造物が提供される。これらのインフルエンザウイルス遺伝子をコードするゲノムＲＮＡは、インフルエンザウイルス単離物から、またはインフルエンザ感染生物体の組織から単離され得る。同じまたは異なる株あるいは型のインフルエンザウイルス由来のこれらコード配列の各々は、発現ベクター内で転写プロモーターの下流にクローン化されそして細胞において発現される。
【００１２】
このように本発明は、（ａ）第１インフルエンザウイルスＭ１タンパク質および（ｂ）付加的構造タンパク質を含む、高分子タンパク質構造物を提供し、この付加的構造タンパク質は、第２またはそれより多くのインフルエンザウイルスＭ１タンパク質を含み得る、付加的構造タンパク質；第１、第２またはそれ以降のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質；第１、第２またはそれ以降のインフルエンザウイルスＮＡタンパク質；第１、第２またはそれ以降のインフルエンザウイルスＭ２タンパク質を含み得る。もし付加的構造タンパク質が、第２またはそれ以降のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質由来でない場合、上記グループの両方または全てのメンバー、例えば、第１および第２インフルエンザＭ２ウイルスタンパク質が含まれる。そのように、機能的インフルエンザタンパク質構造物が提供され、本発明の方法により産生されるインフルエンザウイルス構造タンパク質から本質的になるその構造物には、サブウイルス粒子、ＶＬＰまたはキャプソメア構造物、あるいはそれらの一部、ワクチン、多価ワクチンおよびそれらの混合物が含まれる。特に好ましい実施形態では、上記インフルエンザ高分子タンパク質構造物としては、野生型ウイルスに由来する合成断片としてクローン化されたインフルエンザウイルス遺伝子の発現産物であるインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質，ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質が挙げられる。
【００１３】
上記高分子タンパク質構造物はまた、付加的構造タンパク質、例えば核タンパク質（ＮＰ）インフルエンザウイルス以外の種由来の膜タンパク質および非インフルエンザ供給源に由来する膜タンパク質を含み得、それらは鳥類起源または哺乳動物起源に由来し、そしてサブタイプＡインフルエンザウイルスおよびサブタイプＢインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプに由来するものである。本発明は、キメラの高分子タンパク質構造物を含み得、それは、インフルエンザウイルスによって産生されない１部分を有する少なくとも１つのタンパク質の１部分を含む。
【００１４】
インフルエンザの予防は、宿主細胞において組換え構築物から自己会合し得る高分子タンパク質構造物を提供することにより達成され得る。本発明の高分子タンパク質構造物は、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質上に立体配座エピトープ（防御的である中和抗体を誘発する）を提示する、同型または異型のウイルス様粒子（ＶＬＰ）へ自己会合する能力を有する。上記組成物は、ワクチン組成物であって、キャリアもしくは希釈剤および／またはアジュバンドを含有する。機能的インフルエンザＶＬＰは、１以上の株または型のインフルエンザウイルスに対する中和抗体を、その機能的インフルエンザＶＬＰが１以上のウイルス株または型に由来するＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質を含有するかどうかに依存して、誘発する。上記ワクチンは、野生型インフルエンザウイルスタンパク質であるインフルエンザウイルスタンパク質を含み得る。好ましくは、インフルエンザＶＬＰ、またはその１部分を含有する上記構造タンパク質は、種々の株の野生型インフルエンザウイルスに由来し得る。上記インフルエンザワクチンは、１以上の株または型のインフルエンザウイルスに対する防御免疫を誘発するために、ヒトまたは動物に投与され得る。
【００１５】
本発明の高分子タンパク質構造物は、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
【００１６】
本発明は、インフルエンザウイルスに由来するＭ１、ＨＡおよび少なくとも１種の構造タンパク質を含む、インフルエンザ構造遺伝子をコードする組換え構築物を構築することにより、インフルエンザに由来するＶＬＰを産生する方法を提供する。組換え構築物は、組換えバキュロウイルスで適切な宿主細胞をトランスフェクトし、感染させまたは形質転換するために使用される。上記宿主細胞は、インフルエンザウイルスに由来するＭ１、ＨＡおよび少なくとも１種の構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、そして上記ＶＬＰが宿主細胞において形成される。機能的インフルエンザＶＬＰを含有する感染細胞培地が収穫され、そして上記ＶＬＰが精製される。本発明はまた、第２インフルエンザタンパク質をコードする第２組換え構築物で、宿主細胞を共トランスフェクトし、共感染させまたは共形質転換し、それにより上記ＶＬＰ内に第２インフルエンザタンパク質を取り込む、付加的な工程を特徴とする。そのような構造タンパク質（ＮＡ、Ｍ２およびＮＰを含む）は、インフルエンザウイルスに由来し得、そして少なくとも１つの構造タンパク質は、鳥類起源または哺乳動物起源に由来する。上記構造タンパク質は、サブタイプＡおよびサブタイプＢのインフルエンザウイルス由来であり得る。本発明によると、宿主細胞は、真核細胞であり得る。さらに、上記ＶＬＰは、キメラＶＬＰであり得る。
【００１７】
本発明はまた、宿主細胞へインフルエンザウイルス遺伝子をコードする組換え構築物を導入し、そして細胞において機能的な同型ＶＬＰまたは異型ＶＬＰへの組換えインフルエンザウイルスタンパク質の自己会合を可能にすることにより、インフルエンザＶＬＰを含有する薬物物質を処方する方法を特徴とする。上記インフルエンザＶＬＰは、単離され、精製され、そして薬物物質が上記インフルエンザＶＬＰを含有するように処方される。上記薬物物質は、さらにアジュバンドを含み得る。さらに本発明は、インフルエンザＶＬＰを含有する薬物物質と脂質小胞（すなわち非イオン性脂質小胞）とを混合することにより、薬物製品を処方する方法を提供する。このように、機能的な同型または異型のＶＬＰは、感染細胞に由来するエンベロープ粒子として出芽し得る。出芽したインフルエンザＶＬＰは、単離され得、そして超遠心またはカラムクロマトグラフィーにより薬物物質として精製され得、そして単独か、またはＮｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）（Ｎｏｖａｖａｘ、Ｉｎｃ．の製品）のようなアジュバンドと共に、ワクチンのような薬物製品として処方され得る。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、免疫効果を高める。これは、米国特許第４，９１１，９２８号（本明細書に参考として援用される）に、さらに記載されている。
【００１８】
本発明は、脊椎動物におけるインフルエンザウイルス感染に対する体液性免疫を検出する方法であって、インフルエンザウイルス高分子構造物の少なくとも１つの立体配座エピトープを有する抗体検出有効量のインフルエンザウイルスタンパク質を含む試験試薬を提供することによる、方法を提供する。上記試験試薬は、インフルエンザウイルス感染について試験される脊椎動物からの体液サンプルと接触させられる。サンプル中に含有されるインフルエンザウイルス特異抗体は、インフルエンザウイルス高分子構造の立体配座エピトープに結合して抗原−抗体複合体を形成するようにさせられる。上記複合体は、非結合複合体から分離され、そして検出可能に標識された免疫グロブリン結合薬剤と接触させられる。上記複合体に結合している、検出可能に標識された免疫グロブリン結合薬剤の量が、決定される。
【００１９】
インフルエンザウイルスは、ウイルスに感染している疑いのある動物またはヒトからの標本において、抗体を提供することにより検出され得、その抗体は、検出可能なシグナルを生成する標識を有するか、または検出可能に標識された試薬に結合され、インフルエンザウイルス粒子の少なくとも１つの立体配座エピトープに対する特異性を有する。上記標本は、抗体と接触させられ、そして上記抗体は上記インフルエンザウイルスへ結合が可能となる。標本中のインフルエンザウイルスの存在は、検出可能な標識により決定される。
【００２０】
本発明は、脊椎動物に本発明の有効量の組成物を投与することにより処置、予防および防御的免疫応答を発生させる方法を提供する。
あるいは、上記インフルエンザＶＬＰ薬物物質は、インフルエンザウイルス構造研究および臨床診断アッセイに使用される実験試薬として処方され得る。本発明はまた、有効量の本発明の組成物を投与することによりインフルエンザウイルスを処置するキットおよび使用法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
高分子タンパク質構造物であって、
（ａ）第１インフルエンザウイルスＭ１タンパク質および
（ｂ）付加的構造タンパク質
を含み、該付加的構造タンパク質は、
（ｉ）第２インフルエンザウイルスＭ１タンパク質；
（ｉｉ）（ａ）第１インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、
（ｂ）第１インフルエンザウイルスＨＡタンパク質；
（ｉｉｉ）（ａ）第１インフルエンザウイルスＮＡタンパク質、
（ｂ）第２インフルエンザウイルスＮＡタンパク質；および
（ｉｖ）（ａ）第１インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、
（ｂ）第２インフルエンザウイルスＭ２タンパク質；
からなる群より選択され、
ここで該付加的構造タンパク質が、サブグループ（ｉ）からではない場合、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のうちの少なくとも１つのサブグループの両方のメンバーが含まれる、高分子タンパク質構造物。
（項目２）
前記高分子タンパク質構造物が、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、キャプソメア構造物またはそれらの部分、ワクチン、多価ワクチンおよびその混合物からなる群より選択される、項目１に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目３）
前記付加的構造タンパク質が、非インフルエンザウイルスより以外の株由来の核タンパク質（ＮＰ）および膜タンパク質からなる群より選択される、項目１に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目４）
前記付加的構造タンパク質が、非インフルエンザ源由来の膜タンパク質である、項目３に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目５）
前記タンパク質構造物が、宿主細胞において組換え構築物から自己会合する、項目１に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目６）
少なくとも１つの構造タンパク質が、鳥類起源または哺乳動物起源に由来する、項目１に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目７）
前記構造タンパク質が、異なるサブタイプのインフルエンザウイルスに由来する、項目１に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目８）
前記インフルエンザウイルスのサブタイプが、サブタイプＡのインフルエンザウイルスおよびサブタイプＢのインフルエンザウイルスからなる群より選択される、項目７に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目９）
前記インフルエンザウイルスが、野生型インフルエンザウイルスを含む、項目７に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目１０）
前記高分子タンパク質構造物が、異型のウイルス様粒子（ＶＰＬ）へと自己会合する能力を有する、少なくとも１つの構造タンパク質を含む、項目１に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目１１）
少なくとも１つのタンパク質の部分が、インフルエンザウイルスにより産生されない部分を有するキメラタンパク質構造物を含む、項目２に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目１２）
項目２に記載の高分子タンパク質構造物とキャリアまたは希釈剤とを含む、組成物。
（項目１３）
アジュバントをさらに含む、項目１２記載の組成物。
（項目１４）
前記構造物が、ヘマグルチニン活性を示す組成物から選択される、項目２に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目１５）
前記構造物が、ノイラミニダーゼ活性を示す組成物から選択される、項目２に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目１６）
インフルエンザウイルス中和抗体を誘導するインフルエンザＶＬＰの立体配座エピトープを含む、項目２に記載の高分子タンパク質構造物。
（項目１７）
項目１６に記載のタンパク質構造物とキャリアまたは希釈剤とを含む、ワクチン組成物。
（項目１８）
インフルエンザ由来のＶＬＰを産生する方法であって、該方法は、
（ａ）インフルエンザ構造遺伝子をコードする構築物を構築する工程であって、組換えバキュロウイルスが、Ｍ１、ＨＡおよびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つの第１構造タンパク質をコードする、工程；
（ｂ）適切な宿主細胞を該組換えバキュロウイルスでトランスフェクトするか、感染させるかまたは形質転換し、該宿主細胞を、Ｍ１、ＨＡ、およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程；
（ｃ）該宿主細胞においてＶＬＰの形成を可能にする工程；
（ｄ）機能性インフルエンザＶＬＰを含有する感染細胞培地を収穫する工程；ならびに
（ｅ）該ＶＬＰを精製する工程
を包含する、方法。
（項目１９）
インフルエンザウイルス由来の構造タンパク質が、ＮＡ、Ｍ２およびＮＰからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
少なくとも１つの構造タンパク質が、鳥類起源または哺乳動物起源に由来する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記構造タンパク質が、サブタイプＡのインフルエンザウイルスおよびサブタイプＢのインフルエンザウイルスからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記宿主細胞が、真核細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記ＶＬＰが、キメラＶＬＰを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
項目１８に記載の方法であって、該方法は、
（ａ）前記宿主細胞を、第２インフルエンザタンパク質をコードする第２組換え構築物で共トランスフェクトするか、共感染させるかまたは共形質転換、それにより該第２インフルエンザタンパク質が前記ＶＬＰ内に取り込まれる、工程
をさらに包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
インフルエンザＶＬＰを含有する薬物物質を処方する方法であって、該方法は、
（ａ）インフルエンザウイルス遺伝子をコードする組換え構築物を宿主細胞中に導入する工程；
（ｂ）細胞において機能的な同型ＶＬＰまたは異型ＶＬＰへの組換えインフルエンザウイルスタンパク質の自己会合を可能にする工程；
（ｃ）インフルエンザＶＬＰを単離しそして精製する工程；および
（ｄ）該インフルエンザＶＬＰを含有する薬物物質を処方する工程
を包含する、方法。
（項目２６）
前記薬物物質が、アジュバンドをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
薬物製品を処方する方法であって、該方法は、インフルエンザＶＬＰを含有する項目２５に記載の薬物物質と脂質小胞とを混合する工程を包含する、方法。
（項目２８）
前記脂質小胞が、非イオン性脂質小胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
脊椎動物におけるインフルエンザウイルス感染に対する体液性免疫を検出する方法であって、該方法は
（ａ）インフルエンザウイルス高分子構造物の少なくとも１つの立体配座エピトープを有する抗体検出有効量のインフルエンザウイルスタンパク質を含む、試験試薬を提供する工程；
（ｂ）該試験試薬と、インフルエンザウイルス感染に関して試験する脊椎動物由来の体液サンプルとを接触させる工程；
（ｃ）該サンプル中に含まれるインフルエンザウイルス特異抗体を、インフルエンザウイルス高分子構造物の立体配座エピトープに結合させ抗原抗体複合体を形成させることを可能にする工程；
（ｄ）非結合複合体から、該複合体を分離する工程；
（ｅ）該複合体を、検出可能に標識された免疫グロブリン結合薬剤と接触させる工程；および
（ｆ）該複合体に結合した該検出可能に標識された免疫グロブリン結合薬剤の量を決定する工程
を包含する、方法。  
（項目３０）
該ウイルスに感染したことが疑わしい動物またはヒトに由来する標本において、インフルエンザウイルスを検出する方法であって、該方法は、
（ａ）該インフルエンザウイルスの粒子の少なくとも１つの立体配座エピトープに対して特異性を有する抗体を提供する工程であって、該抗体は検出可能なシグナルを産生する標識を有するか、または検出可能に標識された試薬に結合されている；
（ｂ）該標本を該抗体と接触させる工程；
（ｃ）該抗体を、該インフルエンザウイルスに結合することを可能にする工程；および
（ｄ）該検出可能な標識により該標本中に存在するインフルエンザウイルスの存在を決定する工程
を包含する、方法。
（項目３１）
有効量の項目１３に記載の組成物を脊椎動物に投与する工程を包含する、処置方法。
（項目３２）
有効量の項目１７に記載のワクチン処方物を脊椎動物に投与する工程を包含する、インフルエンザを予防する方法。
（項目３３）
項目１３に記載の組成物を投与することを包含する、防御免疫応答を提供する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ）のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスマトリックスタンパク質遺伝子Ｍ１（Ｍ１）のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびＭ１タンパク質の発現のための組換えバキュロウイルスの構築物のための転移ベクターを示す。図４Ａは、個々の遺伝子の発現のための転移ベクターを示し、そして図４Ｂは、上記遺伝子の多重発現のための転移ベクターを示す。
【図５】図５は、Ｓｆ−９Ｓ細胞における、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびＭ１タンパク質の発現を示す。
【図６】図６は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰのショ糖密度勾配法による精製を示す。
【図７】図７は、インフルエンザウイルスタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーによる検出を示す。ウェスタンブロット分析に使用された抗体は以下の通りである：（Ａ）ウサギ抗Ｈ９Ｎ２；（ｂ）マウス抗Ｍ１  ｍＡｂ；および（Ｃ）マウス抗ＢＡＣｇｐ６４。
【図８】図８は、サブウイルス粒子、ＶＬＰおよびＶＬＰ複合体を含む、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）タンパク質の電子顕微鏡による検出を示す。
【図９】図９は、精製されたトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰの血球凝集反応活性を示す。
【図１０】図１０は、精製されたトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰのノイラミニダーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、マウスにおける、精製されたトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰを用いた組換えインフルエンザの免疫原性研究のための免疫および採血スケジュールを示す。
【図１２】図１２は、組換えインフルエンザＨ９Ｎ２  ＶＬＰで免疫したマウスにおける免疫原性研究の結果を示す。図１２Ａは、トリインフルエンザウイルスＡ型／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９由来のＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、およびＭ１タンパク質を含む組換えＶＬＰで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清を示す。図１２Ｂは、不活性化されたトリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２で免疫されたニュージランド白ウサギからの血清を、不活性化されたトリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２（レーン１およびレーン３）または低温適合トリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２（レーン２およびレーン４）を含有するウェスタンブロットと反応させたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用される場合、用語「バキュロウイルス」とは、バキュロウイルス科としてもまた知られており、エンベロープを有する節足動物のＤＮＡウイルスの一族を指しそのメンバーは、挿入細胞培養において組換えタンパク質を産生する発現ベクターとして使用され得る。そのビリオンは、環状スーパーコイルの２本鎖ＤＮＡの分子（Ｍｒ５４ｘ１０６〜１５４ｘ１０６）を含有する、１以上の桿状ヌクレオキャプシドを含有する。ベクターとして使用される上記ウイルスは、一般にＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。導入遺伝子の発現は、感染細胞においてウイルスが包埋される大核封入体のポリヘドリンタンパク質成分の発現を通常制御する強力なプロモーターの調節下である。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「由来する」とは、起源または供給源をいい、天然に存在する分子、組換え分子、未精製分子または精製された分子を含み得る。本発明のタンパク質および分子は、インフルエンザに由来し得るか、または非インフルエンザ分子であり得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「第１」インフルエンザウイルスタンパク質、即ち第１インフルエンザウイルスＭ１タンパク質とは、インフルエンザウイルスの特定の株に由来するＭ１、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２のようなタンパク質をいう。第１インフルエンザウイルスの株または型は、第２インフルエンザウイルスタンパク質の株または型と異なる。このように、「第２」インフルエンザウイルスタンパク質、即ち第２インフルエンザウイルスＭ１タンパク質とは、第１インフルエンザウイルスタンパク質とは異なる、第２のインフルエンザウイルス株由来である、Ｍ１、ＨＡ、ＮＡおよびＭ２のようなタンパク質をいう。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「ヘマグルチニン活性」とは、ＨＡ含有タンパク質、ＶＬＰまたはその部分が、赤血球に結合し、そしてそれで凝集する能力をいう。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「ノイラミニダーゼ活性」とは、ＮＡ含有タンパク質，ＶＬＰまたはその部分の、フェチュインのようなタンパク質を含む基質由来のシアル酸残基を切断する酵素活性をいう。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「異型の」とは、ウイルスの１以上の異なる型または株をいう。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「同型の」とは、ウイルスの１つの型または株をいう。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「高分子タンパク質構造物」とは、１以上のタンパク質の構築物または配列をいう。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「多価」ワクチンとは、インフルエンザウイルスの複数の型または株に対するワクチンをいう。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「非インフルエンザ」とは、インフルエンザウイルス由来でないタンパク質または分子をいう。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン」とは、病原体に対して抗体の形成または免疫を誘導するのに使用される、死んだ病原体調製物または弱体化した病原体、あるいは誘導された抗原決定基をいう。ワクチンは、疾患（例えば、インフルエンザウイルスが原因となるインフルエンザ）に対する免疫を提供するために与えられる。本発明は、免疫原性であり防御を提供するワクチン組成物を提供する。
【００３３】
インフルエンザは、最適な条件下では６０〜８０％有効である、特定の不活性化されたウイルスワクチンの利用可能性にもかかわらず、広範な公衆衛生上の問題のままである。これらのワクチンが有効である場合、病気は、ウイルス感染を防ぐことにより通常避けられる。ワクチンの失敗は、蓄積した抗原性の差異（抗原シフトおよび抗原ドリフト）の結果として起こり得る。例えば、トリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２は、ブタにおいてヒトインフルエンザウイルスＡ型Ｓｙｄｎｅｙ／９７  Ｈ３Ｎ２と共循環し、そして遺伝子の再組合せおよび流行潜在能力を有するヒトインフルエンザウイルスの新株の出現を引き起こした（Ｐｅｉｒｉｓら、２００１）。そのような抗原シフトの場合、現在のワクチンは適切な防御を提供する可能性がない。
【００３４】
インフルエンザウイルスプログラムの不足の別の理由は、現在のワクチンに誘発される免疫の持続性が比較的短いことである。さらにインフルエンザ制御尺度の不正確さが、小児、高齢者および卵成分に対するアレルギーを有するヒトにおけるワクチン反応原生および副作用が原因である、現在のワクチンの制限された使用を反映している。卵成分は、商業的に許諾された不活性化ウイルスインフルエンザワクチンの製造で使用されている。
【００３５】
さらに、不活性化インフルエンザウイルスワクチンは、中和抗体を誘発しそして疾患に対する防御において主要な役割を果たす、改変型のＨＡおよびＮＡの立体配座エピトープが欠けていたり、または含有する。このように、不活性化ウイルスワクチンおよびいくつかの組換えモノマーインフルエンザサブユニットタンパク質ワクチンは、不適切な防御を送達する。一方で、キャプソメア、サブウイルス粒子および／またはＶＬＰのような高分子タンパク質構造物は、立体配座エピトープ（最適なワクチン免疫原性に有利である）を提示する、複数の天然のタンパク質コピーを含む。
【００３６】
本発明は、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子を、１つのバキュロウイルス発現ベクターに単独でまたは直列にクローニングすること、およびバキュロウイルス感染昆虫細胞において、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む機能的かつ免疫原性のある同型高分子タンパク質構造物へと自己会合する組換えインフルエンザ構造タンパク質を含む、インフルエンザワクチン候補または試薬の産生について記載する。
【００３７】
本発明は、ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９４（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、Ｍ１遺伝子、Ｍ２遺伝子およびＮＰ遺伝子をバキュロウイルス発現ベクターにクローニングし、そしてバキュロウイルス感染昆虫細胞において、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰのような機能的かつ免疫原性のある同型高分子タンパク質構造物へと自己会合するインフルエンザ構造タンパク質を含む、インフルエンザワクチン候補または試薬の産生を、さらに特徴とする。
【００３８】
さらに本発明は、ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９４（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＨＡ遺伝子ならびにトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、およびＭ１遺伝子を１つのバキュロウイルス発現ベクターに直列にクローニングし、そしてバキュロウイルス感染昆虫細胞において、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む機能的かつ免疫原性のある異型高分子タンパク質構造物へと自己会合するインフルエンザ構造タンパク質を含む、インフルエンザワクチン候補または試薬の産生を記載する。
【００３９】
本発明は、以下の実施例でさらに説明される。この実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。本出願の全体を通じて引用される全ての参考文献、特許、公開特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【００４０】
（具体的な実施例）
（実施例１）
（材料および方法）
トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、およびＭ１遺伝子を、バキュロウイルスｂａｃｍｉｄ発現系を使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ−９Ｓ細胞株；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０４７）において発現した。上記ＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子を、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスから単離されたＲＮＡを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成した（図１、図２および図３）。逆転写およびＰＣＲのために、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスのＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子に特異なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（表１）。これらの遺伝子のｃＤＮＡコピーを、細菌サブクローニングベクターであるｐＣＲ２．１ＴＯＰＯへ最初にクロ−ニングした。得られた３種のｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベースのプラスミドから、上記のＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子をバキュロウイルス転移ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、３種のｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミド（それぞれこれらのインフルエンザウイルス遺伝子を発現するｐＨＡ、ｐＮＡおよびｐＭ１）を得た。次いで、単一のｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミドｐＨＡＭを、別個のポリへドリンプロモーターの下流に、ＨＡ遺伝子およびＭ１遺伝子の両方を、各々コードするよう構築した（図４）。上記ｐＮＡプラスミド内に隣接する５’および３’領域を有するＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した（配列番号１）（図１）。同時に、上記の隣接領域を有するＨＡ遺伝子およびＭ１遺伝子のヌクレオチド配列をまた、ｐＨＡＭプラスミドを使用して決定した（配列番号２および３）（図２および３）。
【００４１】
最後に、上記ＨＡ発現カセットおよびＭ１発現カセットの両方をコードするｐＨＡＭプラスミド由来の制限ＤＮＡ断片を、ｐＮＡプラスミドにクロ−にングした。トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子をコードするプラスミドｐＮＡＨＡＭを得た（図４）。
【００４２】
プラスミドｐＮＡＨＡＭを、ゲノムに、別個のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流にそれぞれ組込まれたインフルエンザウイルスＮＡ遺伝子、ＨＡ遺伝子およびＭ１遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを構築するために使用した。許容Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞を得られた組換えバキュロウイルスで感染させると、そのような組換えバキュロウイルスで感染させた各々のＳｆ−９Ｓ細胞において、これら３種のインフルエンザ遺伝子の共発現が得られた。
【００４３】
（結果）
感染Ｓｆ−９Ｓ細胞における発現産物を、感染後（ｐ．ｉ．）７２時間目で、ＨＡ特異抗体およびＭ１特異抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、クーマシーブルータンパク質染色およびウェスタン免疫ブロット分析により特性分析をした（図５）。ウェスタン免疫ブロット分析をインフルエンザウイルスＡ型／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）（ＣＤＣ、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）に対して惹起させたウサギ抗体またはインフルエンザＭ１タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＵＫ）を使用して実施した。予想される分子量（それぞれ６４ｋｄ、６０ｋｄおよび３１ｋｄ）の上記ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質を、ウェスタン免疫ブロット分析により検出した。このアッセイで検出したＨＡタンパク質の量と比較して、上記ＮＡタンパク質は、インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスに対するウサギ血清との反応性がより低かった。検出可能なＮＡタンパク質の量に対する説明としては、上記ＨＡタンパク質と比較して、組換えバキュロウイルスで感染させたＳｆ−９Ｓ細胞からのＮＡタンパク質の発現量が低いこと、ウェスタン免疫ブロットアッセイにおける変性条件下でのこの血清との上記ＮＡの反応性がより低かったこと（膜結合のゲル電気泳動の間での重要なＮＡエピトープの消失に起因する）、ＨＡ抗体と比較してＮＡ抗体のより低いアビディティーまたは上記血清中においてＮＡ抗体の存在量がより低いことが挙げられた。
【００４４】
Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスに感染させたＳｆ−９Ｓ細胞からの培養培地をまた、インフルエンザタンパク質について調べた。上記清澄にした培養上清を、サブウイルス粒子、ＶＬＰ、ＶＬＰの複合体のようなインフルエンザウイルスの高分子タンパク質複合体およびおそらくインフルエンザＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質を含む他の自己会合粒子を濃縮するために２７，０００ｒｐｍで超遠心分離に供した。ペレット化したタンパク質産物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）に再懸濁し、不連続２０〜６０％のショ糖段階勾配法で、超遠心分離によりさらに精製した。ショ糖勾配からの画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタン免疫ブロット分析および電子顕微鏡により分析した。
【００４５】
予想される分子量のインフルエンザＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質を、クーマシーブルー染色およびウェスタン免疫ブロット分析により、多くのショ糖密度勾配画分の中に検出した（図６）。このことは、感染Ｓｆ−９Ｓ細胞由来のインフルエンザウイルスタンパク質が、キャプソメア、サブウイルス粒子、ＶＬＰおよび／またはＶＬＰ複合体のような高分子量の複合体の状態で凝集していることを示唆した。上記ＮＡタンパク質は、クーマシーブルー染色とウェスタン免疫ブロット分析とでは一貫せずに検出されたが、ウェスタン免疫ブロット分析において変性ＮＡタンパク質を認識するウサギ抗インフルエンザ血清が、能力がないことに起因したようであり、ノイラミニダーゼ酵素活性アッセイにおいて一致して検出された（図１０）。
【００４６】
高分子ＶＬＰの存在を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより確認した。インフルエンザウイルスタンパク質を含有するショ糖密度勾配画分からのアリコートを、質量に基づく分画のためにＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムにローディングした。そのカラムを、見かけの分子量がそれぞれ２，０００，０００ダルトン；２０，０００ダルトン；および１，３５７ダルトンを有するデキストランブルー２０００、デキストランイエローおよびビタミンＢ１２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で較正し、カラムのボイドボリュームを決定した。予想されたように、高分子インフルエンザウイルスタンパク質は、カラムのボイドボリューム内で移動したが、これはウイルス粒子のように高分子タンパク質に特徴的であった。画分をウェスタン免疫ブロット分析で分析し、インフルエンザウイルスタンパク質およびバキュロウイルスタンパク質を検出した。例えば、Ｍ１タンパク質を、ボイドボリューム画分において検出したが、この画分はまたバキュロウイルスタンパク質もまた含有した（図７）。
【００４７】
ショ糖勾配画分中のインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質の形態学を、電子顕微鏡で明らかにした。陰性染色電子顕微鏡については、２つのショ糖密度勾配画分からのインフルエンザタンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、２％グルタルアルデヒドで固定した。陰性染色サンプルの電子顕微鏡試験は、両方の画分における高分子タンパク質複合体またはＶＬＰの存在を明らかにした。これらのＶＬＰは、直径約６０ｎｍおよび直径約８０ｎｍを含む、異なるサイズならびに形状（球状）を示した。両方の型の粒子のより大きな複合体をまた、桿状粒子と共に検出した（図８）。観察した全ての高分子構造物は、その表面に突起物（ペプロマー）を有し、それはインフルエンザウイルスに特徴的である。８０ｎｍ粒子のサイズおよび外観は、野生型インフルエンザウイルス粒子と類似していたので、これらの構造は、ＶＬＰを示しているようであった。そのＶＬＰは、粒子構成、構造、三角分割数、対称性および他の特性を含む、野生型インフルエンザビリオンに対して明確な類似性を有する。約６０ｎｍのより小さい粒子は、形態学的にも構造的にもＶＬＰとは異なるサブウイルス粒子を示し得る。異なるサイズおよび形態の組換え高分子タンパク質の類似した現象はまた、他のウイルスに関して報告された。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えコア抗原（ＨＢｃＡｇ）は、異なるサイズの粒子を形成し、それは異なる構造ならびに、三角分割数（それぞれ、Ｔ＝４およびＴ＝３）を有する（Ｃｒｏｗｔｈｅｒら、１９９４）。
【００４８】
精製されたインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＶＬＰの機能的性質を特徴づけるために、サンプルを血球凝集反応アッセイ（図９）およびノイラミニダーゼ酵素アッセイ（図１０）において試験した。血球凝集反応アッセイについては、精製インフルエンザＶＬＰの２倍希釈物を、０．６％モルモット赤血球と混合し、４℃において、１時間または１６時間インキュベーションした。血球凝集反応の程度を視覚的に調べ、そして赤血球を凝集する能力がある組換えインフルエンザタンパク質の最高希釈倍率を決定し記録した（図９）。再び、ショ糖密度勾配からの多くの画分は、血球凝集反応活性を示し、そしてそれはインフルエンザタンパク質の複数の高分子形態およびモノマー形態が存在することを示唆した。検出された最高力価は、１：４０００である。対照実験において、野生型インフルエンザＡ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇウイルスは、１：２０００の力価を示した。血球凝集反応アッセイで、インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質からなる組換えＶＬＰが、機能的に活性であることを明らかにした。これは、ＶＬＰ内でのＨＡサブユニットタンパク質の会合、立体配座およびフォールディングが、野生型インフルエンザウイルスのそれと類似するかまたは同一であることを示唆した。
【００４９】
さらに、ノイラミニダーゼ酵素アッセイを、精製したＨ９Ｎ２  ＶＬＰのサンプルについて実施した。ショ糖密度勾配画分におけるノイラミニダーゼ活性の量を、基質としてフェチュインを使用して決定した。ノイラミニダーゼアッセイにおいて、ノイラミニダーゼは、基質分子からシアル酸を切断し、シアル酸を測定のために遊離させる。亜ヒ酸塩試薬を、酵素活性を停止させるのに添加した。遊離したシアル酸の量を、遊離シアル酸の量に比例するピンク色を生じるチオバルビツール酸で化学的に決定した。色（発色団）の量を、波長５４９ｎｍで分光光度的に測定した。この方法を用いて、ノイラミニダーゼ活性を、インフルエンザＶＬＰを含有するショ糖勾配画分において例証した（図１０）。予想されたように、上記活性を、２つのピーク画分を含むいくつかの画分において観察した。陽性対照として、野生型インフルエンザウイルスを使用した。野生型インフルエンザイウイルスは、精製したインフルエンザＶＬＰと匹敵するノイラミニダーゼ酵素活性を示した。これらの知見は、タンパク質立体配座に関するＨＡ結果を確証し、そしてインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスの精製したＶＬＰが、野生型インフルエンザウイルスと機能的に類似していることを示唆した。
【００５０】
上記分析およびアッセイからの結果は、インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質の発現が、バキュロウイルス感染昆虫細胞由来の機能的ＶＬＰの自己会合および輸送に十分であることを示した。これらのインフルエンザＶＬＰは、自己会合インフルエンザ構造タンパク質を示し、そして野生型インフルエンザウイルスと類似する機能的および生化学的な性質を示したのでこれらのインフルエンザＶＬＰは、有効なインフルエンザワクチンに必要な表面エピトープを含む、重要な構造的立体配座を保存した。
【００５１】
（実施例２：トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９ウイルス遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニング）
組換えインフルエンザウイルスタンパク質の産生を指向することができる合成核酸配列を提供することが、本発明の目的である。そのような合成核酸配列を、インフルエンザウイルスから単離されたインフルエンザウイルスの天然ゲノムＲＮＡを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。この適用のために、核酸配列とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはそのタンパク質をコードするいかなる合成改変体をもいう。
【００５２】
トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスは、Ｋ／Ｓｕｂｂａｒａｏ博士（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ）により提供された。ウイルスゲノムＲＮＡを、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｌｅｖｅｌ  ３（ＢＳＬ３）封じ込め条件下で、ＣＤＣで、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して、酸フェノールＲＮＡ抽出法により単離した。上記ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ分子を、ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した逆転写、およびＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質ならびにＭ１タンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびＴａｑＩＤＮＡポリメラーゼ（ＩｎＶｉｔｏｒｇｅｎ）を使用したＰＣＲにより、得た（表１）。上記ＰＣＲ断片を、細菌サブクローニングベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）へＥｃｏ  ＲＩ部位の間に、クロ−ニングし、ＨＡクローン、ＮＡクローンおよびＭ１  ｃＤＮＡクローンを含有する３種の組換えプラスミドを得た。
【００５３】
（実施例３：ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９４（Ｈ３Ｎ２）ウイルス遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニング）
インフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９４（Ｈ３Ｎ２）ウイルスは、Ｍ．Ｍａｓｓａｒｅ博士（Ｎｏｖａｖａｘ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ウイルスゲノムＲＮＡを、ＢＳＬ２封じ込め条件下で、Ｎｏｖａｖａｘ、  Ｉｎｃ．においてＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、酸フェノール抽出法により単離した。上記ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ分子を、逆転写、ならびにＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質およびＮＰタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより、得た（表２）。上記ＰＣＲ断片を、細菌サブクローニングベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯのＥｃｏ  ＲＩ部位の間に、クロ−ニングし、ＨＡクローン、ＮＡクローン、Ｍ１クローン、Ｍ２クローンおよびＮＰ  ｃＤＮＡクローンを含有する５種の組換えプラスミドを得た。
【００５４】
（実施例４：トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９ウイルスｃＤＮＡのバキュロウイルス転移ベクターへのクローニング）
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベースプラスミドから、ＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子またはＭ１遺伝子を、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）遺伝子座内のＴｎ７  ａｔｔ部位であって、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流、かつポリアデニル化シグナル配列の上流にｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルス転移ベクター（ＩｎＶｉｔｏｒｇｅｎ）中にサブクローニングした。上記ウイルス遺伝子を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。ＨＡ遺伝子については，ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＨＡ由来のＢａｍ  ＨＩ−Ｋｐｎ  Ｉ  ＤＮＡ断片を、Ｂａｍ  ＨＩ−Ｋｐｎ  Ｉ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。ＮＡ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＮＡ由来のＥｃｏ  ＲＩ  ＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ  ＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。Ｍ１遺伝子に関しては、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−Ｍ１からのＥｃｏ  ＲＩ  ＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ  ＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細菌（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を、これらのＤＮＡ連結反応で形質転換し、形質転換されたコロニーが得られ、そして細菌クローンが単離された。得られたｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミドであるｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡ、およびｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ１を、アガロースゲル上で、制限酵素マッピング（図４Ａ）により特性分析した。クローン化された遺伝子の図１〜３に示されるヌクレオチド配列を、自動化されたＤＮＡ配列決定により決定した。ＤＮＡ配列分析は、クローン化されたインフルエンザＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列［インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のＮＡ遺伝子、ＨＡ遺伝子およびＭ１遺伝子（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４０４６２９、ＡＪ４０４６２６およびＡＪ２７８６４６）］と同一であったことを示した。
【００５５】
（実施例５：ヒトインフルエンザＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９４ウイルスｃＤＮＡのバキュロウイルス転移ベクターへのクローニング）
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベースプラスミドから、ＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、Ｍ１遺伝子、Ｍ２遺伝子またはＮＰ遺伝子を、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）遺伝子座内のＴｎ７  ａｔｔ部位であって、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流、かつポリアデニル化シグナル配列の上流においてｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルス転移ベクターにサブクローニングした。ウイルス遺伝子をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。ＨＡ遺伝子については，ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＨＡ３由来のＢａｍ  ＨＩ−Ｋｐｎ  Ｉ  ＤＮＡ断片を、Ｂａｍ  ＨＩ−Ｋｐｎ  Ｉ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。ＮＡ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＮＡ由来のＥｃｏ  ＲＩ  ＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ  ＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。Ｍ１遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＭ１由来のＥｃｏ  ＲＩ  ＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ  ＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。Ｍ２遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＭ２由来のＥｃｏ  ＲＩ  ＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ  ＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。ＮＰ遺伝子については、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ｈＮＰ由来のＥｃｏ  ＲＩ  ＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ  ＲＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドＤＮＡに挿入した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細菌を、これらのＤＮＡ連結反応で形質転換し、形質転換されたコロニーが得られ、そして細菌クローンが単離された。得られたｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミドであるｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＨＡ３、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＮＡ２、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＭ１、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ｈＭ２およびｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ｈＮＰを、アガロースゲル上で、制限酵素マッピングにより特性分析した。クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列を、自動化されたＤＮＡ配列決定により決定した。ＤＮＡ配列分析は、クローン化されたインフルエンザＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、Ｍ１遺伝子、Ｍ２遺伝子およびＮＰ遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列と同一であることを示した。
【００５６】
（実施例６：複数のトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９ウイルス遺伝子をコードする多重遺伝子バキュロウイルス転移ベクターの構築）
複数のインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ウイルス遺伝子を発現するｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのｂａｃｍｉｄ転移ベクターを構築するために、最初にＭ１遺伝子を含有するｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ１プラスミド由来のＳｎａ  ＢＩ−Ｈｐａ  Ｉ  ＤＮＡ断片をｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡのＨｐａ  Ｉ部位へクローン化した。この結果、独立した発現カセット内に別個のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現するＨＡ遺伝子およびＭ１遺伝子の両方をコードするｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡＭプラスミドが得られた。
【００５７】
最終的には、ＨＡ発現カセットおよびＭ１発現カセットを含有するｐＦａｓｔＢａｃ１−ＨＡＭ由来のＳｎａ  ＢＩ−Ａｖｒ  ＩＩ  ＤＮＡ断片を、Ｈｐａ  Ｉ−Ａｖｒ  ＩＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃＩ−ＮＡプラスミドＤＮＡに転移した。この結果、ＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子の発現のための３種の独立した発現カセットをコードし、別個のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現されるプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡＨＡＭが得られた（図４Ｂ）。
【００５８】
別の実施例で、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ｈＨＡ３（実施例５を参照のこと）由来のＨ３遺伝子を異型インフルエンザＶＬＰの発現および産生のための第４のインフルエンザウイルス遺伝子として、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１−ＮＡＨＡＭにクローン化した。
【００５９】
（実施例７：昆虫細胞において、トリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９ウイルスのＮＡ遺伝子、ＨＡ遺伝子およびＭ１遺伝子をコードする多重組換えバキュロウイルスの生成）
上記で得られた多重ｂａｃｍｉｄ転移ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡＨＡＭを、昆虫細胞において発現させるためのトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＭ１遺伝子をコードする多重組換えバキュロウイルスを生成するために、使用した。組換えｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０ＢＡＣ細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれているｐＦａｓｔＢａｃ１−ＮＡＨＡＭ  ＤＮＡおよびＡｃＭＮＰＣバキュロウイルスゲノムとの間のポリヘドリン配列およびＴｎ７  ａｔｔ  ＤＮＡ配列における部位特異的組換えにより産生した（図４Ｂ）。組換えｂａｃｍｉｄＤＮＡを、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐプラスミドＤＮＡ法により単離し、カチオン性脂質ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳｆ−９Ｓ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションに続き、組換えバキュロウイルスを単離し、プラークを精製し、そしてＳｆ−９Ｓ昆虫細胞において増幅した。ウイルスストックをＳｆ−９Ｓ昆虫細胞において調製し、トリインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子産物、ＮＡ遺伝子産物およびＭ１遺伝子産物の発現を特性分析した。得られた組換えバキュロウイルスを、ｂＮＡＨＡＭ−Ｈ９Ｎ２と命名した。
【００６０】
（実施例８：昆虫細胞におけるトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９タンパク質の発現）
無血清培地（ＨｙＱ  ＳＦＭ、ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｏｇｄｅｎ、ＵＴ）中で２８℃にて振盪フラスコにおいて懸濁培養物として維持されたＳｆ−９Ｓ昆虫細胞を、細胞密度２ｘ１０６細胞／ｍｌで、組換えバキュロウイルス、ｂＮＡＨＡＭ−Ｈ９Ｎ２で、感染多重度（ＭＯＩ）３ｐｆｕ／細胞で、感染させた。上記ウイルス感染を、インフルエンザタンパク質の発現が可能なように７２時間続けた。感染昆虫細胞におけるトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン免疫ブロット分析により確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、還元および変性条件下で４〜１２％直線勾配ＮｕＰＡＧＥゲル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）で実施した。ウェスタン免疫ブロット分析における一次抗体は、ＣＤＣから得られたトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）に対して惹起されたポリクローナルウサギ抗血清、およびインフルエンザＭ１タンパク質に対するモノクローナルマウス抗血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）であった。ウェスタン免疫ブロット分析のための２次抗体は、ウサギまたはマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対して惹起されたアルカリホスファターゼ結合体化ヤギＩｇＧ抗血清（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）であった。これらの分析の結果（図５）は、ＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質が、バキュロウイルス感染昆虫細胞において発現されることを示した。
【００６１】
（実施例９：組換えトリインフルエンザＨ９Ｎ２ウイルス様粒子および高分子タンパク質複合体の精製）
インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）ＨＡ、ＮＡおよびＭ１遺伝子産物を発現する組換えバキュロウイルスｂＮＡＨＡＭ−Ｈ９Ｎ２で感染したＳｆ−９Ｓ昆虫細胞からの培養上清（２００ｍｌ）を、低速遠心分離により、収穫した。培養上清とはＳｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ超高速遠心分離機で、ＧＳ−３ローターを使用して、１０，０００ｘ  ｇおよび４℃で、１時間の遠心分離により清澄化した。ウイルスおよびＶＬＰを、Ｓｏｒｖａｌ  ＴＨ−６４１スイングローターを使用して、Ｓｏｒｖａｌ
ＯＤＴ−６５超遠心分離機における２７，０００ｒｐｍおよび４℃で３時間の遠心分離により、清澄にした培養上清から単離した。上記ウイルスペレットを１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、２０〜６０％（重量／容量）の不連続ショ糖段階勾配にローディングし、Ｓｏｒｖａｌ  ＴＨ−６４１ローターを使用して、Ｓｏｒｖａｌ  ＯＴＤ−６５超遠心分離機で、２７，０００ｒｐｍ、４℃で１６時間、遠心分離をして溶解した。画分（０．５ｍｌ）を、ショ糖勾配の上部から収集した。
【００６２】
ショ糖勾配画分におけるインフルエンザタンパク質を、上記の実施例６で記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン免疫ブロット分析により分析した。上記ＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質は、ウェスタン免疫ブロット分析で示されるように、同じショ糖勾配画分（図６）に見出され、それはＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質が高分子タンパク質複合体として会合していることを示唆した。ＨＡタンパク質およびＭ１タンパク質はまた、ショ糖勾配の全体にわたる画分で見出されており、それはこれらの組換えウイルスタンパク質が、異なる密度および組成の高分子タンパク質複合体と会合していることを示唆した。
【００６３】
（実施例１０：組換えトリインフルエンザＨ９Ｎ２  ＶＬＰおよびタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーによる分析）
ＶＬＰおよびモノマータンパク質のようなタンパク質高分子は、それらの質量サイズおよび形状の基づいてゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーカラム上で、別々に移動する。ショ糖勾配画分からの組換えインフルエンザタンパク質が、モノマータンパク質であるかＶＬＰのような高分子タンパク質複合体であるかを決定するために、樹脂床容量１４ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を有するクロマトグラフィーカラム（７ｍｍ  ｘ  １４０ｍｍ）を調製した。サイズ排除カラムをＰＢＳで平衡化し、見かけ分子量が、それぞれ２，０００，０００；２０，０００；および１，３５７であるデキストランブルー２０００、デキストランイエローおよびビタミンＢ１２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で較正し、カラムのボイドボリュームを確認した。デキストランブルー２０００は、そのボイドボリューム（６ｍｌ画分）でカラムから溶出した。予想されたように、組換えインフルエンザタンパク質複合体もまた、そのボイドボリューム（６ｍｌ）でカラムから溶出した。この結果は、ＶＬＰのような高分子量の高分子タンパク質複合体に特徴的であった。カラム画分におけるウイルスタンパク質を、実施例６で上記されたようにウェスタン免疫ブロット分析により検出した。上記Ｍ１タンパク質を、ボイドボリューム画分で検出した（図７）。予想されたように、バキュロウイルスタンパク質もまたそのボイドボリューム中にあった。
【００６４】
（実施例１１：組換えインフルエンザＶＬＰの電子顕微鏡検査法）
ショ糖勾配で単離され、組換えトリインフルエンザタンパク質を含有する高分子タンパク質複合体が、インフルエンザビリオンと類似する形態を有するか否かを決定するために、陰性染色サンプルの電子顕微鏡試験を実施した。組換えトリインフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）タンパク質複合体を濃縮し、そして実施例７に記載されているように不連続ショ糖勾配上での超遠心分離により培養上清から精製した。ショ糖勾配画分のアリコートを、ｐＨ７．２のＰＢＳ中２％グルタルアルデヒドで処理し、新たな放出されたプラスチック／カーボンコートされたグリッドに吸収させ、蒸留水で洗浄した。上記サンプルを２％リンタングステン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で染色し、透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を使用して観察した。２つのショ糖勾配画分からの組換えトリインフルエンザＨ９Ｎ２タンパク質複合体の陰性染色サンプルの電子顕微鏡写真は、２つのショ糖勾配画分からの球状粒子および桿状粒子を示した（図８）。上記粒子は、異なるサイズ（６０および８０ｎｍ）および形態を有する。両方の型の粒子の、より大きな複合体ならびに桿状粒子もまた検出された（図８）。観察された全てのタンパク質複合体構造物は、インフルエンザウイルスのＨＡペプロマーおよびＮＡペプロマーに類似するスパイク様表面突起を示した。上記８０ｎｍ粒子の野生型インフルエンザウイルス粒子のサイズおよび外観に類似していたので、これらの構造は、おそらくエンベロープインフルエンザＶＬＰを示していた。ほぼ６０ｎｍの小さい方の粒子は、上記のＶＬＰとは形態学的にも構造的にも異なるサブウイルス粒子を、おそらく示した。
【００６５】
（実施例１２：血球凝集反応アッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的な特性の分析）
精製したインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質が、インフルエンザウイルスに特徴的な血球凝集反応活性およびノイラミニダーゼ活性のような機能的特性を有するか否かを決定するために、精製されたインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質を、血球凝集反応アッセイおよびノイラミニダーゼアッセイについて試験した。
【００６６】
血球凝集反応アッセイに関しては、インフルエンザＶＬＰまたは陽性対照野生型インフルエンザウイルスＡ型を含むショ糖勾配画分の一連の２倍希釈を、調製した。ついでそれらを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０．６％モルモット赤血球と混合し、４℃で１〜１６時間インキュベートした。陰性対照として、ＰＢＳを使用した。血球凝集反応の程度とは、視覚的に決定されモルモット赤血球を凝集させることができる画分の最高希釈倍率を決定した（図９）。精製したインフルエンザＶＬＰおよびタンパク質について観察された最高血球凝集反応力価は、１：４０００であった。これは、１：２０００であった野生型インフルエンザ対照により示された力価より高かった。
【００６７】
（実施例１３：ノイラミニダーゼアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特性の分析）
インフルエンザＶＬＰ含有ショ糖勾配画分におけるノイラミニダーゼ活性の量を、ノイラミニダーゼアッセイにより決定した。このアッセイにおいて、ＮＡ（酵素）は、基質（フェチュイン）に作用し、そしてシアル酸を遊離させた。酵素活性を停止させるために、亜ヒ酸塩試薬を添加した。遊離したシアル酸の量を、遊離のシアル酸の量に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸で化学的に決定した。色（発色団）の量を、波長５９４ｎｍで、分光光学計において測定した。図８に示されるデータは、ショ糖勾配のＶＬＰ含有画分によリ、顕著な量のシアル酸が産生され、そしてこれらの画分が血球凝集反応活性を示す画分に対応することを示した。
【００６８】
（実施例１４：機能的同型組換えインフルエンザＨ９Ｎ２  ＶＬＰによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫）
組換えインフルエンザＶＬＰの免疫原性を、マウスを免疫して、次いで免疫血清のウェスタンブロット分析により確認した。トリインフルエンザウイルスＡ型／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９由来のＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質およびＭ１タンパク質を含みショ糖勾配で精製された組換えＶＬＰ（１μｇ／注射）を、０日目と２８日目に十匹（１０）の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの三角筋部に皮下接種した（図１１）。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を、五匹（５）のマウスに陰性対照として投与した。それらのマウスの眼窩上腔から、−１日目（予備採血）、２７日目（１次採血）および５４日目（２次採血）に採血した。一晩凝固させそして遠心分離した後、血液サンプルから血清を収集した。
【００６９】
ウェスタンブロット分析については、２００ｎｇの不活性化トリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２または低温適合トリインフルエンザウイルスＡ型Ｈ９Ｎ２、およびＳｅｅ
Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２予備染色タンパク質標準（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を、変性し（９５℃、５分）そして還元条件下（１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、ＭＥＳ緩衝液中４％〜１２％ポリアクリルアミド勾配ＮｕＰＡＧＥゲル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）上で、１７２ボルトで、ブロモフェノールブルー追跡用色素が消失するまで電気泳動にかけた。タンパク質ゲルについては、電気泳動されたタンパク質を、コロイド状クーマシーブルー試薬（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することにより可視化した。タンパク質を、標準的ウェスタンブロット手順により、メタノール中でゲルからニトロセルロース膜へ転写した。ＶＬＰ免疫マウスからの血清および不活性化したトリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２で免疫したウサギからの血清（陽性対照血清）を、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）中で１：２５および１：１００にそれぞれ希釈して、１次抗体として使用した。タンパク質結合膜（５％カゼインでブロックした）を、一次抗体と室温で６０分間、一定に振盪しながら、反応させた。Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩溶液で一次抗体膜を洗浄した後、２次抗血清［ヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体（１：１０，０００）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体（１：１０，０００）］を、上記膜と６０分間反応させた。２次抗体膜を、Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水溶液で洗浄した後に、膜上の抗体結合タンパク質を、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のような発色性基質で発色させて可視化した。
【００７０】
ウェスタンブロット分析の結果（図１２）は、ウイルスＨＡタンパク質およびウイルスＭ１タンパク質（それぞれ、７５ｋｄおよび３０ｋｄ）と同様の分子量を有するタンパク質が、陽性対照血清（図１２Ｂ）および組換えインフルエンザＨ９Ｎ２  ＶＬＰで免疫されたマウスからの血清（図１２Ａ）へ結合したことであった。これらの結果は、組換えインフルエンザＨ９Ｎ２  ＶＬＰ単独が、投与経路によりマウスにおいて免疫原性であることを示した。
【００７１】
以下の参考文献は、本明細書に参考として援用される：
【００７２】
【化１】
2011046715.tif 000002
【００７３】
【化２】
2011046715.tif 000003
【００７４】
【化３】
2011046715.tif 000004
（他の実施形態）
当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは慣用的にすぎない実験しか使用せずに、確認し得る。そのような等価物は、特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
【００７５】
【表１】
2011046715.tif 000005
【００７６】
【表２】
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【００７７】
（配列表）
【表３−１】
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【表３−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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