(57)【要約】【課題】高純度のプラスミドＤＮＡを作成及び単離するための装置を提供する【解決手段】本発明に係る装置は、細胞の溶解に用いられる装置であって、細胞懸濁液（（溶液１）を、細胞を溶解させる溶液（溶液２）と迅速に混合させる乱流手段（Ｂ１ａ）と、乱流手段で作成され該乱流手段から流れ込んだ混合液を、実質的に攪拌することなく培養する層流手段（Ｂ１ｂ）とを備えている。また、前記混合液を中性化する溶液（溶液３）を加える手段（Ｍ２）をさらに備えており、層流手段で培養された混合液が、層流手段から溶液３を加える手段に流れ込むように構成されている【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物の作成方法であって、
まず、細胞をアルカリ溶解法によって溶解し、抽出及び濾過によって前記細胞の膜及びゲノムＤＮＡを除去して、プラスミドＤＮＡを含有している細胞抽出物作成するステップと、
その後、１つは三重らせん親和性クロマトグラフィであり、もう１つは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル浸透クロマトグラフィ及び疎水相互作用クロマトグラフィの中から選択される、少なくとも２つのクロマトグラフィを行うステップとを含み、
前記組成物に、約０．０００１％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡ不純物が含まれるようにした方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも２つのクロマトグラフィ・ステップは、
陰イオン交換クロマトグラフィ、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィをその順番で行う３つのステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１のクロマトグラフィ・ステップの前に、溶解物を濾過することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１のクロマトグラフィ・ステップの前に、凝集物を除去することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．０００１％未満のホスト細胞ＲＮＡ不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．０００１％未満のホスト細胞タンパク質不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．０００１％未満のホスト細胞タンパク質不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記組成物に、
約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素、
約０．００００８％未満のホスト細胞タンパク質不純物、
約０．００００８％未満のホスト細胞ＲＮＡ不純物、及び
約０．００００８％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡ不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．００００５％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡ不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、
前記組成物に、約０．００００８％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡ不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記組成物に、
約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素、及び
約０．００００５％未満のホスト細胞タンパク質不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記組成物に、
約０．００００２％未満のホスト細胞ＲＮＡ不純物、及び
約０．００００８％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡ不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記組成物に、
約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素、及び
約０．００００２％未満のホスト細胞ＲＮＡ不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記組成物に、
約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素、及び
約０．００００５％未満のホスト細胞タンパク質不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記組成物に、
０．００００２％以下のホスト細胞ＲＮＡ不純物、及び
０．００００５％以下のホスト細胞タンパク質不純物が含まれるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法であって、
大規模製造へのスケールアップに適していることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法によって作成されたプラスミドＤＮＡ組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
少なくとも１つの、プラスミドＤＮＡを細胞内へ導入するためのポリマーをさらに含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１９に記載のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
薬学的に許容される媒体又は賦形剤をさらに含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項１９に記載のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
注射、静脈注射、筋肉注射、腫瘍内投与、小粒子照射、又は組織への局所適用によって送達するように作成された組成物。
【請求項２３】
請求項１９に記載のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
前記プラスミドＤＮＡは、実質的にスーパーコイル状閉鎖型ＤＮＡの形態であることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
高純度のプラスミドＤＮＡの大規模製造方法であって、
ホスト細胞を含んでいるプラスミドＤＮＡを、連続的な層流でのアルカリ溶解によって溶解するステップと、
結果として得られた抽出物を中和するステップと、
前記抽出物内のプラスミドＤＮＡは、陰イオン交換クロマトグラフィ、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィをその順番に行うことによって単離するステップとを含む方法。
【請求項２５】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡの作成及び精製方法であって、
（ａ）プラスミドＤＮＡを含有している細胞を作成するステップと、
（ｂ）前記細胞を連続的アルカリ溶解法によって前記細胞を破壊して、前記プラスミドＤＮＡ含有細胞の溶解物を作成するステップと、
（ｃ）前記溶解された細胞を沈殿させて濃縮するステップと、
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィを行うステップと、
（ｅ）三重らせん親和性クロマトグラフィを行うステップと、
（ｆ）疎水相互作用クロマトグラフィを行うステップと、
（ｇ）透析濾過及び／又は緩衝液交換を行うステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載の方法であって、
溶液中に存在する精製されたプラスミドＤＮＡには、
約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素、
約０．００００５％未満のホスト細胞タンパク質不純物、
約０．００００２％未満のホスト細胞ＲＮＡ不純物、及び
約０．００００８％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡ不純物が含まれることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２４乃至２７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記溶液を格子状フィルタに通すこと又は深層濾過を行うことによって凝集物を除去する事前のステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２４乃至２７のいずれか１項に記載の方法であって、
最後のクロマトグラフィ・ステップの後に行われる透析濾過ステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、
前記透析濾過ステップによって、医薬品組成物を作成するの使用される最終組成物に適した塩、緩衝液、ｐＨ値が得られることを特徴とする方法。
【請求項３０】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって
ｓｕｂ−ｐｐｍ（＜０．００００１％）のホスト細胞ｇＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物を含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって
ｇＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物を実質的に含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３２】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって
細菌性ホスト染色体ＤＮＡを実質的に含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３３】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．０００１％未満、好ましくは０．００００８％未満の染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項３４】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ＲＮＡを実質的に含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３５】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
約０．０１％未満、０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００２％未満のホスト細胞ＲＮＡ不純物を含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項３６】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞タンパク質不純物を実質的に含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３７】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
約０．０００１％未満、より好ましくは０．００００５％未満のホスト細胞タンパク質不純物を含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項３８】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
内毒素不純物を実質的に含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３９】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素を含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項４０】
請求項３０乃至３９のいずれか１項に記載の医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
実質的にスーパーコイル状のプラスミドＤＮＡを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項４１】
請求項３０乃至３９のいずれか１項に記載の医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物であって、
約９９％以上の閉環状プラスミドＤＮＡを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項４２】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法であって、
殺菌濾過、製剤、及び精製されたプラスミドＤＮＡをガラスビンに充填するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって得られた、精製されたプラスミドＤＮＡが充填されたガラスビン。
【請求項４４】
請求項４３に記載のガラスビンであって、
前記精製されたプラスミドＤＮＡは、ＮＶ１ＦＧＦ指定プラスミドであることを特徴とするバイアル。
【請求項４５】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法であって、
前記１つ以上のクロマトグラフィ・ステップは、
有機、無機又は複合材料から成り、多孔性、超多孔性又は非多孔性であり、クロマトグラフ分離に適しており、ポリ（アルケン・グリコール）、アルケン、アルキン、アレーン又は該固定担体に疎水性を付与する他の分子によって誘導体化された固定床の上で行われることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項１乃至１８又は請求項２４乃至２９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記１つ以上のクロマトグラフィ・ステップは、
置換クロマトグラフィ、疑似移動床クロマトグラフィ、連続床クロマトグラフィ、高速タンパク質液体クロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフとして行われることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項１乃至１８又は請求項２４乃至２９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記疎水相互作用クロマトグラフィは、固定床又は膨張床上で行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の精製方法に関するものである。詳細には、本発明は、高純度のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の作成方法に関し、特に、プラスミド療法に使用される医薬品グレードのプラスミドＤＮＡの作成及び単離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の発展に伴い、特にワクチン及びヒト遺伝子療法の分野では、プラスミド療法が病気治療の効果的な方法であることが明確に示唆されている。しかしながら、臨床的に使用するのに量・質ともに十分なプラスミドＤＮＡを作成することが、この技術における大きな障害となっている。正常遺伝子をヒト細胞内に安全かつ効率的に送達する方法としては、プラスミドＤＮＡを経由させる方法が有望である。プラスミドＤＮＡは、目的とするＤＮＡ配列を挿入することができる、閉環状の細菌性ＤＮＡである。哺乳類の細胞に導入される目的ＤＮＡ配列の例としては、ウイルス感染、癌又は血管形成関連疾患を治療するための、外因性遺伝子、機能遺伝子、突然変異遺伝子、アンチセンス配列、ＲＮＡｉ又はｄｓＲＮＡｉ配列、リボザイムなどがある。ｐＤＮＡはヒト細胞に送達されるとすぐに、挿入されたＤＮＡ配列の複製及びコピー作成を開始する。したがって、研究者達は、プラスミドＤＮＡを、様々な病状を治療すべく目的ＤＮＡ配列をヒト細胞内に送達するための有望な送達手段と見なしている。
【０００３】
治療目的のプラスミド・ベース技術を実施するための研究開発には、大量のプラスミドＤＮＡが必要である。遺伝子療法又は他の臨床応用に使用されるプラスミドＤＮＡは、通常は大腸菌（Escherichia coli：E. coli）などの細菌によって作成されるので、細菌性細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から、或いは細菌性細胞の内毒素及びタンパク質から、プラスミドＤＮＡを効率良く分離する方法が求められている。したがって、細菌性細胞からプラスミドＤＮＡを大量に単離することができる、簡単で、頑強で、拡張可能な精製プロセスの必要性が高まっている。
【０００４】
あらゆるプラスミド精製プロセスにおける重要なステップは、その後ｐＤＮＡが単離される細胞成分を遊離させるための細菌性細胞の溶解を含んでいる。実際には、まず、細胞の再懸濁、細胞の溶解、そして、ホスト不純物の中性化及び沈殿という３つのステップを行う必要がある。細胞の再懸濁は、通常は、手動による攪拌又は磁力攪拌器と、ホモジナイザー又はインペラ混合器を使用して行われ、再懸濁緩衝液中で細胞を再懸濁する。細胞溶解ステップでは、手動攪拌又は磁力攪拌によって、再懸濁細胞を溶解液（希釈されたアルカリ（塩基）及び界面活性剤から成る）と混合させる。そして、溶解を完了させるために、混合物を室温（摂氏２０〜２５度）又は氷上で一定時間（例えば５分間）保持する。上述したように、手動攪拌及び磁力攪拌は、拡張可能ではない。第３のステップでは、ホスト不純物の中性化及び沈殿が行われる。第２のステップで作成された溶解物は、氷にセットする前に溶解物を酸性化するために、通常は、緩やかな攪拌又は磁力攪拌によって冷たい中性溶液と１０〜３０分間混合される。このことにより、高分子量の染色体ＤＮＡ、ホストタンパク質、及び他のホスト分子の変性及び沈殿が容易になる。
【０００５】
一般に、細胞壁は、リゾチームで短時間処理することによって、又はアルカリ性又は酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）処理によって、消化される。また通常は、細菌懸濁液のＲＮＡを分解するために、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）が加えられる。これらの化学的ステップは、小規模での細胞溶解に効果的である。しかしながら、粘性が増加するため、大規模な処理は非常に困難である。
【０００６】
他のシンプルで迅速なプラスミドの作成方法では、まず、細菌をリゾチーム処理し、適切な緩衝液内において約１００℃で２０〜４０秒間沸騰して、プラスミドをＲＮＡの溶液に主要不純物として残したまま、ゲノムＤＮＡ、タンパク質及び破片の不溶性塊を形成する。次に、細胞膜を溶解させるために、ＮａＯＨとドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecylsulfate：SDS）の混合溶液を加える。ＮａＯＨは、ＤＮＡを部分的に変性させ、ＲＮＡと部分的に分解する。ＳＤＳは、膜を溶解し、タンパク質を変性させる。続いて、５Ｎの酢酸カリウム（ｐＨ４．８）を加えることによって、ＳＤＳタンパク質複合体と細胞破片を沈殿させる。この時、ｐＨは、前記操作で使用されるＮａＯＨの中性化と、プラスミドの復元との両方に重要である。その後、遠心分離によって沈殿物を除去すると、上清内に目的とするプラスミドが得られる。しかしながら、この技術は、５リットル未満の細菌発酵には適しているが、大容量の細菌発酵にスケールアップするのには適していない。また、これら一連の操作では、細菌性染色体ＤＮＡが小断片及び凝集体に切断されてプラスミドを汚染するのを避けるために、ゆっくりかつしっかり混合することが求められる。そのため、大規模プロセスで実施するのは困難である。
【０００７】
一般的な他の細胞溶解方法であるアルカリ溶解法では、まず、細菌性細胞の懸濁液（溶液１）をアルカリ溶解液（溶液２）と混合させる。溶液２は、細菌性細胞を溶解させて細胞内物質を遊離させるための界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）と、細胞（特にｇＤＮＡとＲＮＡ）のタンパク質及び核酸を変性させるためのアリカリ（水酸化ナトリウムなど）とから成る。細胞が溶解してＤＮＡが変性するので、溶液の粘性は著しく上昇する。変性後、水酸化ナトリウムを中性化するために、酢酸カリウムなどの酸性溶液（溶液３）を加え、核酸の再生を誘導する。ｇＤＮＡの長断片が不規則に再結合して、ネットワークを形成する。前記ネットワークは、タンパク質、脂質及び他の核酸を封入する綿状の塊として沈殿する。また、ドデシル硫酸のカリウム塩も沈殿し、タンパク質を関連物質と共に取り除く。ｐＤＮＡの２つのストランドは、互いに絡み合い、溶液中に残存する最初のプラスミドを再形成するために、規則的に再結合する。
【０００８】
この溶解方法は、バッチモード、すなわち、容器又はタンクに溶液を連続に加えながら異なる複数の溶液を混合する形態で行っている。しかし、アリカリ溶解液は粘弾性流体なので、操作するのは非常に難しい。そのため、この方法では、異なる複数の溶液を混合させる際に問題が生じる。また、ｇＤＮＡは剪断力によって断片化されるが、断片化されたｇＤＮＡをｐＤＮＡから分離するのは非常に難しいため、流動体への剪断力の作用を回避できる方法が求められている。さらに、大きいｐＤＮＡ（すなわち、１０キロ塩基対よりも大きい）は、混合中に剪断力によるダメージを受けやすい。細胞懸濁液を含んでいる溶液を溶解液と混合させた後、粘弾性的なアルカリ溶解液は中性化溶液と混合される。繰り返すが、溶液の粘弾性特性が原因で、この混合プロセスには問題がある。
【０００９】
さらに、このバッチ溶解プロセスをスケールアップする際には、ＤＮＡの断片化を避けるために剪断力を制限したとしても、異なる流動体を混合する際の効率が問題となる。従来知られているように、断片化ゲノムＤＮＡのクロマトグラフィ挙動は、ｐＤＮＡの場合と非常に類似しているので、ｇＤＮＡを標準的な精製手法で除去するのは、事実上不可能である。以上のように、バッチプロセスによって細菌性細胞を溶解させる際のいくつかの問題点が明らかになった。それらの問題点は、例えば、スケールアップ、回収されたｐＤＮＡの質が悪いこと（断片化されたＤＮＡによる汚染が原因である）、得られるｐＤＮＡの量が比較的少ないことなどである。
【００１０】
バッチ方法とは対照的に、様々な細胞溶解液（cell-lysis solution）を、一連の静的ミキサーを使用して連続的に混合させるいくつかの方法が提案されている。これらの方法では、細胞懸濁液と細胞溶解液は、静的ミキサーに同時に加えられる。第１の静的ミキサーからは、溶解細胞溶液（lysed cell solution）が排出される。排出された溶解細胞溶液は、沈殿剤溶液と共に、第２の静的ミキサーに同時に加えられる。第２の静的ミキサーからは、沈殿した溶解物とプラスミドを含んでいる溶液が排出される。細胞溶解の他の連続モードとしては、貫流式熱交換器（flow-through heat exchanger）を使用して、細胞浮遊液を７０〜１００℃まで加熱する方法がある。熱交換器で細胞を溶解した後、排出流の連続流又は回分式遠心分離を行って、プラスミドＤＮＡを上清に残したまま、細胞破片とゲノムＤＮＡを沈殿させる。
【００１１】
大量の微生物発酵からプラスミドＤＮＡの大規模な単離及び精製を行うためには、改善されたプラスミド作成プロセスを開発する必要がある。
【００１２】
現在、数々の細菌性細胞の溶解方法があるのにも関わらず、混合中における流動体の粘弾性特性及び剪断力に起因する問題に取り組んでいる方法は１つもなない。したがって、本発明は、大規模で、細菌性細胞の懸濁液を大規模に連続アルカリ溶解するための新規な方法であって、剪断力の制限に関して大きな利点が得られる方法を提供する。
【００１３】
治療目的で核酸を人間又は動物に導入するための方法でにおける他の重要なステップは、高純度の医薬品グレードの核酸を作成することである。そのような精製された核酸は、安全、効能及び有効性の薬物品質基準を満たさなければならない。さらに、多数のｇ量のＤＮＡを作成するのに使用できる、拡張可能なプロセスが好ましい。したがって、結果として得られる核酸の安全性や有効性を危うくする、有毒化学物質、突然変異誘発物質、有機溶媒、又は他の試薬を必要としない、又はスケールアップが困難又は不可能ではない、高純度の核酸を作成するプロセスが望ましい。また、患者に投与した際に毒性反応を引き起こす汚染内毒素を含まない核酸を作成することが望ましい。プラスミドＤＮＡは、細胞膜の外側の不可欠な要素である内毒素を高レベルで有するグラム陰性細菌源から精製されるので、汚染内毒素の除去は特に重要である。
【００１４】
細菌発酵からプラスミドＤＮＡを単離及び精製する従来の方法は、小規模又は実験室規模のプラスミド作成に適している。プラスミドを含んでいる細菌性ホスト細胞が破壊された後、酢酸塩の中性化が行われ、ホスト細胞ゲノムＤＮＡの沈殿が生じる。そして、タンパク質は、一般的に、例えば遠心分離によって除去される。液相はプラスミドＤＮＡを含んでいる。プラスミドＤＮＡは、アルコール沈殿された後、様々な形態（スーパーコイル状、ギザギザの環状、線形状）のプラスミドＤＮＡを分離するために、臭化エチジウムの存在下でＣｓＣＩを使用して等密度遠心分離される。残りの臭化エチジウムを除去するために、ブタノールによるさらなる抽出が必要であり、その後アルコールを使用したＤＮＡ沈殿が行われる。その後、ホスト細胞タンパク質を除去するために、さらなる精製ステップが行われる。
【００１５】
これらの現在のプラスミドＤＮＡ単離方法は、いくつかの問題を有している。例えば、大量の可燃性の有機溶媒（エタノール、イソプロパノールなど）及び毒性化学物質（臭化エチジウム、フェノール、クロロホルムなど）を使用する精製方法は、一般的に、プラスミドＤＮＡの大規模な単離及び精製には望ましくない。プラスミドＤＮＡの精製には、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィ、及び、逆相又は陰イオン交換に基づいた様々なクロマトグラフィ方法などの、塩化セシウム遠心分離に対する他の方法を使用することができる。これらの他の方法は、実験室規模の研究材料を少量作成するのには適しているが、一般に、簡単に拡張することはできず、プラスミドＤＮＡを大量に作成することはできない。
【００１６】
しかしながら、前記した化学的分離方法では、分離及び精製プロセスは複雑であり、大量の有機溶剤が必要となる。そのため、廃液の処理などの様々な問題を有している。
【００１７】
化学的分離及び精製方法の他にも、電気泳動によってプラスミドを分離する方法がある。電気泳動方法としては濾紙電気泳動とゲル電気泳動があり、現在はゲル電気泳動が一般的である。しかしながら、電気泳動方法には、分離時間が長い、回収が困難である、サンプルを充填できる量が少ないなどの様々な問題がある。
【００１８】
現在利用可能な２つの形態のプラスミドＤＮＡ分離方法は、イオン交換クロマトグラフィ（Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606(1998), 31-45）、又はサイズ排除クロマトグラフィ（Prazeres, D. M., Biotechnology Techniques Vol.1, No.6, June 1997, p417-420）を利用し、添加剤（ポリエチレングリコール（polyethylene glycol：PEG）など）、界面活性剤、及び他の成分（ヘキサミン・コバルト、スペルミジン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrollidone：PVP）など）と共に使用される。しかし、既知の方法では、スーパーコイル状及び切れ目の入った（nicked）（又は弛緩型（relaxed））のＤＮＡの分離を、効率的に及びコスト効率良く行うことはできない。さらに、多くの既知の方法ではＰＥＧ又は他の添加剤を使用するが、それらを使用すると余分な分離、除去、及び品質管理が必要となり、複雑になって時間及び費用がかかるので、プラスミドＤＮＡの製造には望ましくない。スーパーコイル状及び弛緩型のプラスミドＤＮＡを分離する既知の方法の他の形態では、非常に高価な専用レジンを利用する。前記専用レジンは、処理中、アセトニトリル、エタノール、及び他の成分（例えば、トリエチルアミン、リン酸テトラブチルアンモニウム）などの溶剤を利用する。スーパーコイル状及び弛緩型ＤＮＡを分離する他の方法としては、前記２つの形態のプラスミドＤＮＡをサイズの小さな差に基づいて分離する、サイズ排除クロマトグラフィを使用した方法がある。これらのカラムは比較的長いため、スケールアップに関しては非常に問題があり、大規模製造に使用するのは不可能である。さらに、サイズ排除クロマトグラフィは濃縮されたサンプル溶液を必要とするが、ＤＮＡは高粘性であるため、前記濃縮されたサンプル溶液をプラスミドＤＮＡ溶液から得ることは不可能である。
【００１９】
また、プラスミドＤＮＡ製剤は、細菌性製剤から作成されるため、弛緩型及びスーパーコイルプラスミドＤＮＡの混合物を含んでいることが多い。多くの細菌性ホストから作成された内毒素は炎症反応（プラスミドＤＮＡを受け取ったホストの発熱や敗血症）を引き起こすことが知られているので、多くの場合は内毒素を除去する必要がある（ＦＤＡにより要求されている）。これらの内毒素は、一般に、グラム陰性細菌の外膜の成分であるリポポリサッカリド又はその断片であり、ホスト細胞及びホスト細胞膜又は高分子のＤＮＡ製剤中に存在する。したがって、内毒素の除去は、治療又は予防に使用されるプラスミドＤＮＡの精製における、重要で必須のステップである。プラスミドＤＮＡ溶液からの内毒素の除去は、主に、内毒素が負に帯電していることを利用する。しかしながら、プラスミドＤＮＡも負に帯電しているので、分離は、通常は、それら両方の分子と結合する陰イオン交換樹脂を使用して行われる。陰イオン交換樹脂は、特定の条件下では、たとえ内毒素が結合していたとしても、プラスミドＤＮＡを優先的に溶離する。このような分離では、部分的にしか除去できないため、プラスミドＤＮＡと共に大量の内毒素が溶離する、及び／又は非常に粗末なプラスミドＤＮＡが復元される。
【００２０】
したがって、大量の微生物発酵からプラスミドＤＮＡの大規模な単離及び精製を行うためには、改善されたプラスミド作成プロセスを開発する必要がある。また、大量のプラスミドＤＮＡを、簡単な方法でかつ短時間で分離及び精製するプロセスが求められている。プラスミドの研究及びプラスミド治療にとっては、核酸が、複写可能な状態と同じ構造を保ちながら分離及び精製されることが好ましい。また、不純物の人体への副作用を避けるために、核酸は高純度で分離され精製される必要がある。
【００２１】
前記した従来の方法では、核酸、特にプラスミドＤＮＡを、十分に高い純度、及び、十分に多い量で得ることができないという問題点があった。そこで、本発明は、大量のプラスミドＤＮＡを短時間でかつ非常に高純度で分離可能な、少なくとも２つのクロマトグラフィ・ステップを利用した分離方法を提供することを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】WO 98/00815 (utilization of T [Tee], PasteurMerieux Serums et Vaccins [Sera and Vaccines])
【特許文献２】WO 96/02658, A.L. Lee et al., A Method for Large Scale Plasmid Purification (1996).
【特許文献３】WO 97/23601, N. C. Wan et al., Method for Lysing Cells (1997).
【特許文献４】WO 99/29832, D. S. McNeilly, Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNAsubstantially free of genomic DNA (1999).
【特許文献５】U. S. Patent No. 6,214,568, D. S. McNeilly Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially freeof genomic DNA (2001).
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】H. C. Bimboim and J. Doly, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic Acid Research 7(6):1513-1523 (1979).
【非特許文献２】D. Stephenson, F. Norman and R. H. Cumming, Shear thickening of DNA inSDS lysates Bioseparation 3: 285-289 (1993).
【非特許文献３】M. S. Levy, L.A.S. Ciccolini, S. S.S. Yim, J. T. Tsai, N. Titchener-Hooker, P. Ayazi Shamlou and P. Dunnill, The effects of material properties and fluid flow intensity on plasmid DNA recovery during cell lysis Chemical Engineering Science 54: 3171-3178 (1999).
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、高純度のプラスミドＤＮＡを作成及び単離するための方法を提供する。本発明によって作成及び単離されたプラスミドＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び内毒素などの不純物を、非常に低い濃度でしか含まない。本発明によって作成されるプラスミドＤＮＡの純度は、プラスミド治療に使用するのに十分な値である。
【００２５】
また、本発明は、高純度のプラスミドＤＮＡを作成及び単離するための方法であって、（ａ）細胞懸濁液を、細胞を溶解させる溶液と素早く混合させる乱流手段と、（ｂ）前記（ａ）で作成され、前記乱流手段から流れ込んだ混合液を実質的に攪拌することなく培養する層流手段とを備える装置を使用して細胞溶解を行う方法を提供する。
【００２６】
本発明の他の実施形態では、前記装置は、前記溶解溶液（lysing solution）を中性化する第２の溶液を加える手段をさらに備えており、（ｂ）で培養された混合液が、前記層流手段から前記第２の溶液を加える手段に流れ込むように構成される。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、前記装置は、細胞からプラスミドＤＮＡを単離する方法であって、（ａ）乱流手段によって前記細胞をアルカリ溶解溶液（alkali lysing solution ）と混合させるステップと、（ｂ）酸性溶液を加えることによって、前記アルカリ溶解溶液を中性化するステップとを含む方法に使用される。
【００２８】
本発明は、連続的アルカリ細胞溶解装置（continuous alkaline cell lysis device）であって、アルカリ溶液を細胞懸濁液と反対方向に注入する第１の混合器又は注入器と、前記細胞懸濁液と前記アルカリ溶液との混合液中で乱流を発生させる、小径の第１のチューブと、前記混合液中で層流を発生させる、大径の第２のチューブと、その一端に中性化溶液が注入され、溶解物を回収する第２の混合器又は注入器とを備えた装置を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、不純物を実質的に含んでいない医薬品グレードＤＮＡの高純度プラスミドＤＮＡを作成及び単離する方法を提供する。
【００３０】
また、本発明は、核酸及びプラスミドＤＮＡを単離及び精製する方法を提供する。より詳細には、本発明は、研究及びプラスミド治療に利用可能な、医薬品グレードの核酸及びプラスミドＤＮＡを単離及び精製する方法を提供する。本発明に係る方法によって単離されたプラスミドＤＮＡ製剤に対しては精製ステップが行われる。前記精製ステップは、少なくとも三重らせんクロマトグラフィを含んでおり、さらには陰イオン交換クロマトグラフィ及び疎水相互作用クロマトグラフィを含み得る。
【００３１】
したがって、これらの方法は、その後の陰イオン交換クロマトグラフィ、及び／又は三重らせんクロマトグラフィ、及び／又はさらなる疎水相互作用クロマトグラフィと組み合わせて行う、連続アルカリ溶解ステップを含んでいる。
【００３２】
また、これらの方法は、その後の陰イオン交換クロマトグラフィ、三重らせんクロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィと組み合わせて行う、連続アルカリ溶解ステップを含んでいる。溶解物の濾過や他の凝集物の除去は、最初のクロマトグラフィの前に行う。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のある目的は、ホスト細胞／プラスミドＤＮＡの組み合わせからのプラスミドＤＮＡの生成量を最大限にすることである。
本発明の他の目的は、細菌性ホストＲＮＡを実質的に含まないプラスミドＤＮＡ製剤を作成することである。
本発明の他の目的は、細菌性ホストタンパク質を実質的に含まないプラスミドＤＮＡ製剤を作成することである。
【００３４】
本発明の他の目的は、細菌性ホスト染色体ＤＮＡを実質的に含まないプラスミドＤＮＡ製剤を作成することである。
【００３５】
本発明の他の目的は、細菌性ホスト内毒素を実質的に含まないプラスミドＤＮＡ製剤を作成することである。
【００３６】
本発明の他の目的は、研究及びプラスミド治療に使用できるほど高純度であり、大規模製造へスケールアップすることが可能な、医薬品グレードのプラスミドＤＮＡの作成方法を提供することである。
【００３７】
したがって、本発明は、不純物を実質的に含んでおらず、高純度及び無傷であり、ＤＮＡがベクターバックボーン、治療遺伝子及び関連する調節塩基配列を含んでいる医薬品グレードのプラスミドＤＮＡを提供する。
【００３８】
また、本発明は、安定しており室温で長期間変性せず、研究及び人間の治療に利用可能なプラスミドＤＮＡを保存することができるプラスミドＤＮＡ液剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の連続細胞溶解に使用される装置の概略図である。
【図２】図１の装置に含まれる混合器Ｍ１の概略図である。
【図３】ｇＤＮＡ、ＲＮＡ，タンパク質、内毒素汚染物の精製量を比較した表である。精製方法としては、陰イオン交換クロマトグラフィ（anion exchange chromatography：AEC）の１つのステップによって行う方法、陰イオン交換クロマトグラフィ・三重親和性クロマトグラフィ（triplex helix affinity chromatography：THAC）の２つのステップによって行う方法、そして、陰イオン交換クロマトグラフィ・三重親和性クロマトグラフィ・疎水相互作用クロマトグラフィ（hydrophobic interaction chromatography：HIC）の３つのステップによって行う方法がある。なお、ＮＤ（not detected）は未検出を意味する。
【図４】プラスミドＤＮＡを分離及び精製する様々な方法を比較した表である。それらの方法としては、陰イオン交換クロマトグラフィ（AEC）、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィ（hydroxyapatite chromatography：HAC）、疎水相互作クロマトグラフィ（HIC）、逆相クロマトグラフィ（reversed-phase chromatography：RPC）、サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography：SEC）、三重親和性クロマトグラフィ（THAC）の単独又は組み合わせと、本発明に係る方法がある。この表は、精製されたプラスミドＤＮＡの量を示している。なお、ＮＤ（not detected）は未検出を意味する。
【図５】プラスミドＤＮＡの脱プリン化及び切断割合（nicking rates）（開環状プラスミドの形成）を示すグラフである。（Ａ）は２５℃で保存したときを示し、（Ｂ）は、５℃で保存したときを示す。プラスミドＤＮＡは、最大９０日間保存される。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（定義）
酸性は、ｐＨ７未満の酸のこと、又はその酸を含んでいることである。
【００４１】
アルカリ性は、ｐＨ７より大きいアルカリ又は塩基のこと、又はそのアルカリ又は塩基を含んでいることである。
【００４２】
連続的は、中断されない、中断を含んでいないということである。
【００４３】
ゲノムＤＮＡは、染色体に由来する又は染色体内に存在するＤＮＡを意味する。
【００４４】
層流は、溶液の流れの中で、各粒子が全ての粒子に対して平行に動く流れである。
【００４５】
溶解物は、細胞溶解のプロセスによって生じた物質である。溶解という用語は、溶解物質を含有した溶液を使用した化学的処置によって、緩衝液（すなわち細胞懸濁液）内にある細胞の細胞壁及び／又は細胞膜を破壊する作用を意味する。溶解物質としては、例えば、アルカリ、界面活性剤、有機溶媒、及び酵素がある。好ましい実施形態では、細胞の溶解は、ホスト細胞から無傷プラスミドを遊離させるために行われる。
【００４６】
中性化は、溶液を中性にするために、又は、酸（或いは塩基／アルカリ）が中和反応に耐えられるようにするために行われる。中性化という用語は、溶液を中性化して溶液のｐＨを５から７の間、好ましくは約７、より好ましくはより以前よりも７に近い値にすることを意味する。
【００４７】
ニュートン流体は、剪断応力が速度勾配と比例し、剪断面に対して垂直である流体である。比例定数は、粘度として知られている。ニュートン流体の例としては、液体や気体がある。
【００４８】
非ニュートン流体は、剪断応力が速度勾配のみに比例せず、剪断面に対して垂直ではない液体である。非ニュートン流体の粘度は、明確ではない。非ニュートン流体としては、塑性固体、指数則流体、粘弾性流体（粘性と弾性特性の両方を有している）、及び時間依存性粘度流体などがある。
【００４９】
プラスミドＤＮＡは、その内部に挿入される非内因性ＤＮＡ断片を保持する能力を有する、染色体ではないＤＮＡリングから形成される、小型細胞封入体を意味する。ここでは、プラスミドＤＮＡ、切断された、処理された、又は、非染色体性ＤＮＡからの他の操作がされた、任意の形態のプラスミドＤＮＡである。前記非染色体性ＤＮＡとしては、例えば、切れ目の入った環状のプラスミドＤＮＡ、弛緩型の環状のプラスミドＤＮＡ、スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡ、切断プラスミドＤＮＡ、線状（又は線形）プラスミドＤＮＡ、及び、単鎖プラスミドＤＮＡがある。プラスミドを構成するための方法としては、次の文献「Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）」に開示されているものがある。本発明のいくつかの態様によって後で処理するために、プラスミドＤＮＡを最初に単離するのには、当該技術分野では周知であるプラスミドＤＮＡのミニプレップ（少量調製）方法（Bimboim and Doly, Nucleic Acids Research 7: 1513 (1979)）を使用できる。また、本発明に係る方法によって作成された高純度のサンプルと対比することができる。本発明に係る方法によって作成されたプラスミドＤＮＡは、実質的に閉環状の形態である、又は、約８０％、８５％、９０％、９５％或いは９９％以上が閉環状の形態である。また、ある治療方法では、開環状、線状、又は多重結合形態よりも効果的である、スーパーコイル状の共有結合した形態のｐＤＮＡ（ｃｃｃ）が望ましい。そのため、医薬品グレードのプラスミドＤＮＡは、１つ又は複数の形態のプラスミドから単離又は分離され、実質的に１つ以上の望ましい形態を含む。
【００５０】
本発明の目的のために、流動という用語は、通常はポンプの動作によって、液体が特定の流速（例えば、リットル／分）で混合器（mixer）の中を通って流れることを意味する。混合器中の流速は、溶解、沈殿、及び混合の効率に影響を及ぼすことに留意されたい。
【００５１】
「切れ目の入った（nicked）」又は「弛緩型（relaxed）」のＤＮＡは、スーパーコイル状のＤＮＡではないことを意味する。スーパーコイル状という用語は、当該技術分野では周知である。プラスミドＤＮＡの他の形態も、当該技術分野では周知である。
【００５２】
「汚染不純物」は、ＤＮＡを分離又は単離することが望ましい任意の物質である。汚染不純物としては、これらに限定されないが、ホスト細胞タンパク質、内毒素、ホスト細胞ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなど）、及び／又はホスト細胞ＲＮＡがある。何が汚染不純物と見なされるかは、本発明に係る方法が実施される状況次第であることを留意されたい。汚染不純物は、ホスト細胞由来であってもよいし、そうでなくてもよい。すなわち、ホスト細胞不純物であってもよいし、そうでなくてもよい。
【００５３】
最初の成分（例えばＤＮＡ）の「単離」又は「精製」は、他の成分から前記最初の成分を濃縮することを意味する。望ましい及び／又は得られる精製の範囲は、本明細書中で説明する。
【００５４】
「実質的に含まない」及び「高純度」という用語の定義は、純度が約９５％、又は好ましくは９８．９９％より大きいことである。或いは、汚染物質の含有率が５％未満、又は好ましくは１〜２％未満のことである。
【００５５】
医薬品グレードのＤＮＡは、細胞成分（例えば細胞膜）が約５％以下（好ましくは１〜２％）で含まれるＤＮＡ製剤と定義される。
【００５６】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡは、百万分率（part per million：ppm）が０．０００１％未満（すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．０００１ｍｇ未満）のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質不純物を含むＤＮＡ製剤と定義される。
【００５７】
さらに、本発明は、不純物を実質的に含んでいない、医薬品グレードＤＮＡである、高純度のプラスミドＤＮＡの作成及び単離方法を提供する。本発明に係る方法によって作成及び単離されたプラスミドＤＮＡは、非常に低いレベルの、すなわち百万分率のレベルの染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び内毒素不純物を含んでおり、主に閉環状プラスミドＤＮＡを含んでいる。本発明によって作成されたプラスミドＤＮＡは、研究及びプラスミド治療に使用するのに、また随意的に人間の臨床試験及び人間の遺伝子治療及び臨床試験に使用するのに、十分な純度である。
【００５８】
本発明に係る「医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ」は、本発明に係る方法によって作成されたプラスミドＤＮＡ、及び／又は、少なくとも１つの、後記する純度の「医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ」を含む組成物である。好ましくは、本発明に係る「医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ」の純度は、例えば、下記の２つの定義によって規定される。約０．００００８％未満の染色体又はゲノムＤＮＡ及び約０．００００５％未満のタンパク質不純物、又は、約０．００００８％未満の染色体又はゲノムＤＮＡ及び約０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素。他の純度の組み合わせは、前記定義の値未満に含まれる。当然、医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物に、さらなる成分を追加することができる。染色体又はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、内毒素又はタンパク質のレベルは、プラスミドの細胞作成による汚染物質や他の精製プロセスの汚染物質に関係する。
【００５９】
ここでは、「医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ」は、１ｐｐｍ未満（＜０．０００１％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．０００１ｍｇ未満）のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物を含むＤＮＡ製剤と定義される。
【００６０】
より詳細には、「医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物」は、約０．０１％未満、又は０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００８％未満（＜０．００００８％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００８ｍｇ未満）の染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ製剤を意味する。
【００６１】
また、「医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物」は、約０．０１％未満、又は０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００２％未満（＜０．００００２％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００２ｍｇ未満）のＲＮＡ不純物を含むＤＮＡ製剤を意味する。
【００６２】
また、「医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物」は、約０．０００１％未満、より好ましくは０．００００５％未満（＜０．００００５％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００５ｍｇ未満）のタンパク質不純物を含むＤＮＡ製剤を意味する。
【００６３】
「医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ」は、０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素を含んでいるＤＮＡ製剤である。
【００６４】
医薬品グレードのプラスミドＤＮＡは、本明細書中では、好ましくはその大部分が環状であるＤＮＡ製剤である。より正確には、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以上が閉環状であるＤＮＡ製剤である。
【００６５】
Ｔチューブは、１つ又は複数の管部材からなる、Ｔ字形のチューブである。Ｔチューブは、３つのアームと、それらのアームを連結するセンター部分とからなる。Ｔチューブは、２つの成分（流体）を混合するのに使用される。２つの流体は、それぞれアームの１つに流入し、センター部分で合流し、第３のアームから流出する。混合によって、２つの流動体は溶け合う。
【００６６】
乱流は、流体粒子の不規則でランダムな動作である。流体粒子はメインの流れ方向を横断する。また、流体粒子のある点における速度と方向は不規則に変化する。
【００６７】
粘弾性は、粘性と弾性の両方の性質を併せ持つ流動性である。
【００６８】
本発明は、医薬品グレード・プラスミドＤＮＡを高収率で作成する拡張可能な方法の発見に基づいている。特に、本発明は、ホスト細胞の連続アルカリ溶解による高純度のプラスミドＤＮＡの作成及び精製方法の発見に基づいている。
【００６９】
まず、最初のステップでは、ホスト細胞は指数増殖期の細胞に接種され（すなわちプラスミドＤＮＡによって形質転換され）、テトラサイクリンなどの抗生物質を含有しているＬＢ培地を含んでいるプレート上にこすり付けられる。そして、プレートから採取された単一コロニーは、それぞれ、別々の滅菌したプラスチック製のエルレンマイヤー・フラスコに入れられた２０ｍｌのＬＢ培地（適切な抗生物質であるテトラサイクリンが添加されている）に接種され、振盪培養器によって３７℃で１２〜１６時間培養される。それらの培養物の１つは、その後、２Ｌエルレンマイヤー・フラスコに添加された２００ｍｌの無菌ＬＢ培地に接種するのに使用される。これは、振盪培養器内で、３７℃、２００ｒｐｍで培養され、２つの５Ｌエルレンマイヤー・フラスコに接種するのに使用される。そして、振盪培養器内で、３０℃、２００ｒｐｍで培養され、指数増殖期の中間のときに、発酵容器に接種するのに使用される（５時間後、２ユニット：ＯＤ６００ｎｍで）。
【００７０】
ホスト細胞の培養及び接種は、当該技術分野では公知である。一般的に、ホスト細胞は、多量のプラスミドＤＮＡを持つために、その生物量が高くなるまで培養される。そのためには、２つの異なる方法、すなわち回分発酵法と半回分発酵法を用いることができる。
【００７１】
本発明は、医薬品グレード・プラスミドＤＮＡを高収率で作成する拡張可能な方法の発見に基づいている。特に、本発明は、ホスト細胞の連続アルカリ溶解による高純度のプラスミドＤＮＡの作成及び精製方法の発見に基づいている。
【００７２】
まず、最初のステップでは、ホスト細胞は指数増殖期の細胞に接種され（すなわちプラスミドＤＮＡによって形質転換され）、テトラサイクリンなどの抗生物質を含有しているＬＢ培地を含んでいるプレート上にこすり付けられる。そして、プレートから採取された単一コロニーは、それぞれ、別々の滅菌したプラスチック製のエルレンマイヤー・フラスコに入れられた２０ｍｌのＬＢ培地（適切な抗生物質であるテトラサイクリンが添加されている）に接種され、振盪培養器によって３７℃で１２〜１６時間培養される。それらの培養物の１つは、その後、２Ｌエルレンマイヤー・フラスコに添加された２００ｍｌの無菌ＬＢ培地に接種するのに使用される。これは、振盪培養器内で、３７℃、２００ｒｐｍで培養され、２つの５Ｌエルレンマイヤー・フラスコに接種するのに使用される。そして、振盪培養器内で、３０℃、２００ｒｐｍで培養され、指数増殖期の中間のときに、発酵容器に接種するのに使用される（５時間後、２ユニット：ＯＤ６００ｎｍで）。
【００７３】
ホスト細胞の培養及び接種は、当該技術分野では公知である。一般的に、ホスト細胞は、多量のプラスミドＤＮＡを持つために、その生物量が高くなるまで培養される。そのためには、２つの異なる方法、すなわち回分発酵法と半回分発酵法を用いることができる。
【００７４】
回分発酵法は、生育温度及び使用される炭素源の操作により、成長速度を制御することができる。本明細書中では、「回分発酵法」は、接種時に細胞成長及び培養細胞内に含まれておるプラスミドの作成に必要な栄養素が容器内に過剰に存在している（例えば、従来の栄養素の濃度よりも１０フォルド以上）細胞培養プロセスを意味する。そのため、殺菌した容器に栄養素を追加する必要がない。また、複雑な供給モデル及び方法も必要ない。
【００７５】
本発明に使用できる他のタイプの発酵方法は、半回分（fed-batch）発酵法である。半回分発酵法では、細胞成長速度は、細胞成長中に、培養物への栄養素の追加により制御することができる。本明細書では、「半回分発酵法」は、発酵中に、培養物への代謝産物の追加を注意深くモニタすることにより、成長速度が制御される細胞培養プロセスを意味する。本発明に係る半回分発酵法では、細胞培養のバイオマスは、回分発酵法よりも高くなる。
【００７６】
５０Ｌ調合液に対しての、発酵プロセス及び例示的な追加供給レートについては、後述する。また、他の容積、例えば１０Ｌ、５０Ｌ、又は５００Ｌ以上に対しても、装置のサイズに基づいて、後述するこの例示的な供給レートによって行うことができる。
【００７７】
高リッチ化された回分培地及び半回分培地の発酵は、プラスミドの生成量を最大化するための高密度の細胞を作成するのに適していり、指数増殖する高バイオマスの回収を可能にする。
【００７８】
半回分発酵法は、炭素源としてグルコース又はグリセロールを使用する。発酵は、最初の炭素基質（グルコース）が使い果たされるまで、バッチモードで行われる。この点はＤＯの急激な上昇により分かり、その直後にサンプルのグルコース分析によって確認される。予め用意された供給培地のポンピングが開始される。ポンピング速度は、Curlessらにより作成されたモデル（Bioeng. 38: 1082-1090, 1991）によって決定される（なお、この参照によって本発明に含まれるものとする）。前記モデルは、供給速度の制御を手助けするために設計されている。最初のバッチプロセスでは、非抑制性濃度の基質は、細胞成長によって最大成長速度で消費され、接種後のバイオマスレベルの急激な上昇をもたらす。有毒な代謝物が蓄積するため、培養物はこの速度では成長できない（Fieschio et al. ,"Fermentation Technology Using Recombinant Microorganisms. "In Biotechnology, eds. H. J. Rhem and G. Reed. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b: 117-140, 1989）。モデルは、操作者の設定した成長の半回分相を得るために、フィードバック制御を必要とせずに、対数増殖を継続するための、成長抑制炭素基質の時間ベースの供給速度を計算する。これは、抑制性の異化生成物を形成しないレベルで選択される。そして、高バイオマスを得るのに十分である。
【００７９】
一般的に、回分発酵は、リッチ化された回分培地に存在する高レベル（例えば、従来の濃度よりも４フォルド高い）の先駆物質を使用する。特に、回分培地から抽出される酵母の量は、５ｇ／Ｌ（ＬＢ培地）から２０ｇ／Ｌにエンリッチ化される。このことにより、大量の成長因子及び核酸前駆物質が得られる。前記培地には、有機性窒素として作用する硫酸アンモニウム（５ｇ／Ｌ）が追加される。半回分発酵の供給プロセス中の前駆体物資への追加（硫酸アンモニウムの形態の有機性窒素）は、プラスミドの性質に悪影響を及ぼさないように設計される
【００８０】
本発明に係る方法のある重要な一面は、細胞の溶解である。したがって、本発明は、高純度のプラスミドＤＮＡを作成及び単離する方法を包含している。その方法は、細胞を溶解させるステップを含んでいる。また、その方法は、（ａ）細胞懸濁液（図１の溶液１）を、細胞を溶解させる溶液（第１の溶液）（図１の溶液２）と素早く混合させる乱流手段と、（ｂ）（ａ）で作成され、前記乱流手段から流れ込んだ混合液を実質的に攪拌することなく培養する層流手段とを備えた装置を用いて行われる。
【００８１】
本発明のある実施形態では、前記装置は、前記溶解溶液（lysing solution）を中性化する第２の溶液（図１の溶液３）を加える手段をさらに備えており、（ｂ）で培養された混合液が、前記層流手段から前記第２の溶液を加える手段に流れ込むように構成されている。
【００８２】
また、他の実施形態では、前記装置は、細胞からプラスミドＤＮＡを単離する方法に使用される。その方法は、（ａ）前記乱流手段によって、細胞をアルカリ溶解溶液と混合するステップと、（ｂ）酸性溶液を加えることによって、前記アルカリ溶解溶液を中性化するステップとを含んでいる。
【００８３】
現在、細菌性細胞を溶解させる方法が数多くあるが、どの方法も、混合ステップ中の流動体の粘弾性及び剪断力によって引き起こされる問題を解決していない。本発明の目的の１つは、Ｔチューブを使用して、細胞懸濁液（溶液１）をアルカリ溶液（溶液２）と均一に、かつ粘弾性流体が現れないよう急速に混合させることである。したがって、本発明に係る連続溶解には、剪断力を制限するという大きな利点がある。一般的に、Ｔチューブの直径は、混合流動体の接触時間を長くするために小口径であり、通常は１ｃｍ以下、好ましくは約２〜８ｍｍであり、より好ましくは約６ｍｍである。しかし、その方法では、チューブを通過させることによる混合を利用することはできない。下記の表１は、乱流手段、層流手段、及び乱流手段の各パラメータ（Ｂｌａ、Ｂｌｂ、及びＢ２）の変化と、それに対応する流速（Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３）を示す。
【表１】
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【００８４】
本発明の他の目的は、Ｔチューブの代わりに、細胞を溶解液中に分散させることが可能なチューブを有する混合器又は注入装置を提供することである。したがって、チューブを通過する流動体に対する物理的ストレスは、流動体がタンク内のパドルで攪拌される場合と比べると、大幅に減少する。最初の混合の効率は、この流動体は粘弾性特性をまだ持っておらず、小径のチューブで実現される混合は、非常に効果的であるので、流れている２番目よりも大きい。対照的に、混合にＴチューブが使われる場合と比べると、最初の混合は流動体が急速に粘弾性的になるのを抑えるだけであり、チューブに流れる間に重要な問題を引き起こす。この部分的混合は、細胞の一部だけを溶解させるので、中性化の前にプラスミドの一部のみを遊離させる。
【００８５】
本発明では、溶解中に、相Ｉ及び相ＩＩと名付けられた２つの相が確認される。（Ｉ）細胞の溶解と（ＩＩ）核酸の変性とに対応しているこれら２つの相は、レオロジー的挙動に大きな変化をもたらし、粘弾性的流動体となる。チューブの直径を調節することによって、これら２つの相の要求を満たすことができる。チューブの直径を小さくすれば（Ｂ１ａ）、混合が増大する。これは、相Ｉに使用される構造である。チューブの直径を大きくすれば（Ｂ１ｂ）、混合が減少する。これは、相ＩＩに使用される構造である。
【００８６】
したがって、ここでは、図２に示すＭ１と呼ばれるミキサーを使用する。なお、本発明で細胞懸濁液を分散させるのには、任意のＴ字状の器具を使用することができる。このミキサーによって、溶液１は、効果的に分散するために、１つ以上の小径のオリフィスから、アルカリ溶解液に直交して注入される。前記オリフィスの直径は、図２に示した構造では、約０．５〜２ｍｍ、好ましくは約１ｍｍである。
【００８７】
ミキサーＭ１から流出した混合物は、小径のチューブ（図１参照）を短時間（約２．５秒）で通過する。直径と流速の組み合わせは、乱流を保つために、容易に計算される。それらのパラメータのバリエーションの例を、表１に示す。チューブの径は、すべて、チューブの壁部の厚み自体を含むチューブの外径ではなく、チューブの内径を示している。チューブでのこの短時間の通過時間によって、溶液１及び２の急速な均一化が可能となる。相Ｉでは、溶液１及び２は、まだニュートン流体であると仮定すれば、均一化段階での流れの形態は、乱流である。この第１のチューブの出口では、溶液１及び２は均一化されており、懸濁液中の細胞の溶解が開始される。
【００８８】
均一化された混合物は、その後、第１のチューブよりも直径が大きい第２のチューブ（Ｂ１ｂ）を通過する（図１参照）。この第２のチューブの通過中に、細胞の溶解と、粘弾性流体流動体の形成とが起こる。この段階の間、混合は最小限に抑えられる。そして、ＤＮＡを断片化するであろう剪断力を最小限に抑えるために、乱流をできる限り制限すべく、溶液は「休憩」することが許される。本発明のある実施形態では、細胞溶解と核酸の変性を完全に行うためには、約１〜３分、又は約２分、好ましくは１分２０秒の接触時間で十分である。変性の段階の間は、流動体の流れの形態は層流であり、ＳＤＳ及び水酸化ナトリウムを細胞成分の方へゆっくりと拡散させる。
【００８９】
このようにして、溶解物が得られ、中和溶液３がＭ２と呼ばれるＹミキサーによって混合される。本発明のある実施形態では、Ｙミキサーの内径は、約４〜１５ｍｍ又は約６〜１０ｍｍと、約６ｍｍ又は約１０ｍｍである。小径（約６ｍｍ）のチューブは、Ｙミキサーの出口に位置し、溶液３による溶解物の急速（＜１秒）で効率的な混合を可能にする。その後、中性化された溶液は採集タンクに回収される。中性化の間は、ｐＨの急激な低下により、凝集物の形成が増加する（塊が形成される）。一方、部分的に変性したプラスミドは、非常に素早く復元し、溶液中に残る。綿状の塊は採集タンク内で徐々に沈下し、不純物の大部分が取り除かれる。
【００９０】
図１の概略図は、連続溶解（continuous lysis：CL）システムの一実施形態を示している。連続溶解は、そのままで、又は、他のさらなるプロセスと共に使用される。
【００９１】
本発明に係る方法は、いかなるタイプの細胞（原核細胞でも真核細胞でも）にも、溶解に関するいかなる目的（例えば、その後精製される標的細胞から目的とするプラスミドＤＮＡを遊離させる）に対しても使用することができる。好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、プラスミドを遊離させるために、プラスミドを含有しているホスト細胞を溶解させるのに使用される。
【００９２】
本発明に係る連続的アルカリ溶解ステップのプロセスは、細胞の生物量が定常期に至っていない細胞を増殖させて、指数増殖期（２〜１０乾燥重量／リットル）に至った発酵槽から採取された細胞に対して行われる。連続的アルカリ溶解ステップは、細胞の生物量が高くまで増殖した、しかしこれ以上は指数増殖しない定常期に至った、細胞濃度が約１０〜２００ｇ乾燥重量／リットル（好ましくは、約１２〜６０ｇ乾燥重量／リットル）の発酵槽から採取された細胞に対して行われる。
【００９３】
本発明の他の重要な態様では、高純度のプラスミドＤＮＡ組成物及び医薬品グレードのプラスミドＤＮＡは、複数のクロマトグラフィ・ステップの組み合わせによって作成される・これらのクロマトグラフィ・ステップは、前述した細胞溶解と組み合わせることができる。したがって、本発明は、不純物を実質的に含んでいない医薬品グレードの高純度プラスミドＤＮＡの作成及び単離方法をさらに含む。本発明に係る方法によって作成され単離されたプラスミドＤＮＡは、汚染された染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び内毒素を非常に低いレベル、すなわち百万分率（part per millions：ppm）のレベルでしか含有していない。本発明に係る方法により作成されたプラスミドＤＮＡは、研究やプラスミド治療に利用できるほど高純度である。また、上述したように、本発明に係る医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物は、ある態様では、１つ又はそれ以上の代表的な不純物の（ホスト細胞不純物）の純度レベルによって規定することができる。本発明に係る医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物は、１ｐｐｍ未満（＜０．０００１％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．０００１ｍｇ未満）のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物を含む組成物である。より詳細には、医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、約０．０１％未満、又は０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００８％未満（＜０．００００８％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００８ｍｇ未満）のホスト細胞染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む組成物である。また、医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、約０．０１％未満、又は０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００２％未満（＜０．００００２％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００２ｍｇ未満）のホスト細胞ＲＮＡ不純物を含む組成物である。また、医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、約０．０００１％未満、より好ましくは０．００００５％未満（＜０．００００５％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００５ｍｇ未満）のホスト細胞タンパク質不純物を含む組成物である。また、医薬品グレードのプラスミドＤＮＡは、０．１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素を含む組成物である。特に、上記の純度レベルを、少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ含むことが、本発明に含まれる。したがって、約０．０１％のホスト細胞ゲノムＤＮＡと、約０．００１％のホスト細胞ＲＮＡを含む検出レベルの組成物も本発明に含まれる。より好ましくは、医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物は、約０．００００８％未満のホスト細胞ゲノムＤＮＡと、約０．００００２％未満のホスト細胞ＲＮＡと、約０．００００５％未満のホスト細胞タンパク質とを有する。実際には、本発明に係る医薬品グレードのプラスミドＤＮＡ組成物には、上記した純度レベルの任意の組み合わせを用いることができる。この組成物は、他の薬学的に許容される成分、緩衝液、安定剤、又は、細胞或いは有機体への遺伝子導入（特にプラスミドＤＮＡ導入）を向上させるために組成物を含むことができる。
【００９４】
他の形態では、本発明に係る方法は、少なくとも１つの他のクロマトグラフィの以前又は以後に行われる、三重らせん親和性クロマトグラフィの使用を含む。三重らせん親和性クロマトグラフィは、最終精製ステップ、又は少なくともプラスミド精製スキームの終わりに近いところで行われる。この三重らせん親和性クロマトグラフィは、好ましくは、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ、及びゲル浸透クロマトグラフィ又はサイズ排除クロマトグラフィと組み合わせられる。他の技術としては、ヒドロキシアパタイト（Ｉ型及びＩＩ型）クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、及び親和性クロマトグラフィがある。核酸分離を行う他の任意の親和性クロマトグラフィが使用可能である。陰イオン交換クロマトグラフィ又は１つ以上の他のクロマトグラフィのステップ又は技術は、固定相、置換クロマトグラフィ方法、疑似移動床技術、及び／又は連続的床カラム又はシステムを用いることができる。さらに、任意の１つ以上のステップ又は技術は、高性能クロマトグラフィ技術又はシステムを使用できる。
【００９５】
したがって、本発明に係る方法は精製ステップを含んでおり、該精製ステップは、三重らせん親和性クロマトグラフィのステップを含み、イオン交換クロマトグラフィのステップをさらに含み得る。そして、疎水相互作用クロマトグラフィ又はゲル浸透クロマトグラフィのステップをさらに含み得る。イオン交換クロマトグラフィのステップは、流動層イオン交換クロマトグラフィと、軸方向及び／又は放射状高分解能陰イオン交換クロマトグラフィの両方であり得る。
【００９６】
また、この方法は、その後に行われるイオン交換クロマトグラフィ、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィの各ステップ（この順に行われる）と組み合わせて行われるアルカリ溶解ステップを含んでいる。溶解物の濾過又は他の凝集除去は、第１のクロマトグラフィ・ステップの前に行う。本発明に係るプラスミドＤＮＡの精製方法は、拡張可能であり、大規模製造にスケールアップすることが可能である。
【００９７】
本発明のある実施形態では、ｐＤＮＡを含有している高純度の生成物を得るために、連続溶解にさらなる精製ステップを組み合わせる。例えば、凝集除去（溶解物の濾過、沈殿、遠心分離）、イオン交換クロマトグラフィ（陽イオン交換又は陰イオン交換）、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィの内の少なくとも１つと組み合わせられる。ある実施形態では、連続溶解の後に、イオン交換クロマトグラフィ、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィが、その順番で行われる。他の実施形態では、連続溶解の後に、溶解物の濾過、イオン交換クロマトグラフィ、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィが、その順番で行われる。これらのステップは、今までにないほど高純度なｐＤＮＡを大量に作成できる、正確に拡張可能なプラスミド製造プロセスを可能にする。ホストＤＮＡ及びＲＮＡも、タンパク質も、サブｐｐｍの範囲である。
【００９８】
また、本発明に係る方法は、前述した各ステップに加えて、ＳＥＣ、逆相クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィなどのさらなるステップを含むことができる。
【００９９】
凝集除去は、結果として得られるｐＤＮＡ産物の純度を高めるために用いられる。このステップは、沈殿物質（凝集物）の大部分を除去するのに使用される。凝集除去は、例えば、１〜５ｍｍ（好ましくは約３．５ｍｍ）の格子フィルタによって行う溶解物の濾過ステップと、濾過ステップをさらに向上させるための深層濾過によって行われる。凝集除去の他の方法は、遠心分離又は沈殿によって行われる。
【０１００】
イオン交換クロマトグラフィは、結果として得られるｐＤＮＡ産物の純度を高めるために用いられる。不純物の性質と溶液のｐＨに応じて、陰イオン交換クロマトグラフィが選択される。
【０１０１】
陰イオン交換クロマトグラフィは、結果として得られるｐＤＮＡ産物の純度を高めるために用いられる。陰イオン交換クロマトグラフィは、マイナスに帯電した（又は酸性の）分子を、プラスに帯電した担体に結合させることによって作用する。イオン交換クロマトグラフィを用いることによって、分子の電荷に基づいて、前記分子を分離させることができる。この手法によって、分子群（酸性、塩基性、及び中性の）を容易に分離することができる。段階的な溶離スキームは、初期フラクションに溶離された多くの不純物と、後期フラクションに溶離されたｐＤＮＡと共に使用される。陰イオン交換は、ｐＤＮＡ調合液からタンパク質と内毒素を除去するのにとても効果的である。
【０１０２】
イオン交換クロマトグラフィに関しては、充填剤及びそれの作成方法は、陰イオン交換クロマトグラフィの準備、重合化及び官能化のプロセス、及びプラスミドＤＮＡの溶離及び分離と同様に、当該技術分野では周知である。
【０１０３】
陰イオン交換クロマトグラフィ用の充填剤に使用されるベース物質の合成に用いられる化合物は、ベース物質が合成された後に、疎水性を示す様々な官能基、又は様々なイオン交換基を後反応によって導入できれば、どのような化合物であってもよい。単官能基モノマーの例としては、スチレン、ｏ−ハロメチルスチレン、ｍ−ハロメチルスチレン、ｐ−ハロメチルスチレン、ｏ−ハロアルキルスチレン、ｍ−ハロアルキルスチレン、ｐ−ハロアルキルスチレン、α−メチルスチレン、α−メチル−ｏ−ハロアルキルスチレン、α−メチル−ｍ−ハロアルキルスチレン、α−メチル−ｐ−ハロアルキルスチレン、ｏ−ヒドロキシメチルスチレン、ｍ−ヒドロキシメチルスチレン、ｐ−ヒドロキシメチルスチレンン、ｏ−ヒドロキシアルキルスチレン、ｍ−ヒドロキシアルキルスチレン、ｐ−ヒドロキシアルキルスチレンン、α−メチル−ｏ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｍ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｐ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｏ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｍ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｐ−ヒドロキシアルキルスチレン、メタクリル酸グリシジル、アクリル酸グリシジル、アクリル酸ドロキシエチル、及び酢酸ビニルがある。最も好ましい化合物は、芳香環上に置換されたハロアルキル基、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなど）、及び炭素原子を２〜１５個有する直鎖及び／又は分鎖飽和炭化水素である。多官能性モノマーの例としては、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルトルエン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジメタクリル酸エチレン・グリコール、ジアクリル酸エチレン・グリコール、ジメタクリル酸ジエチレン・グリコール、ジアクリル酸ジエチレン・グリコール、メチレンビスメタクリルアミド、及びメチレンビスアクリルアミドがある。多官能性モノマーの例としては、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルトルエン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジメタクリル酸エチレン・グリコール、ジアクリル酸エチレン・グリコール、ジメタクリル酸ジエチレン・グリコール、ジアクリル酸ジエチレン・グリコール、メチレンビスメタクリルアミド、及び、メチレンビスアクリルアミドがある。
【０１０４】
様々なイオン交換基イオン交換基は、後反応によって導入される。ベース物質の作成の第１のステップでは、よく攪拌した後に、単官能性モノマー及び多官能性モノマーを、適切な割合の、正確に検量された希釈剤及び溶剤で検量する。前記希釈剤及び溶剤は、粒子に形成される微細孔を調節する目的で使用される。前記孔には、正確に検量された重合開始剤が添加される。前記混合液は予め正確に検量した懸濁安定剤が溶解した水溶液に添加され、水中油型懸濁重合される。そして、攪拌することによって目的とするサイズの油滴が形成され、混合溶液を徐々に暖めることによって重合が行われる。単官能性モノマーの多官能性モノマーに対する割合は、ベース物質の粒子が柔らかくなるように、約１モルの単官能性モノマーに対して、約０．０１〜０．２モルの多官能性モノマーである。重合開始剤は、特に限定されず、一般的に使用されるアゾビスタイプ及び／又は過酸化物タイプのものが用いられる。
【０１０５】
懸濁安定剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両親媒性を有するポリマー、又はそれらの混合物などがある。そのような懸濁安定剤は、油滴同士が凝集するのを防止するために使用される。
【０１０６】
プラスミドＤＮＡを精製するためのイオン交換クロマトグラフィ用の充填物資の孔径は、比較的大きいことが好ましく、特に１５００〜４０００オングストロームの範囲であることが好ましい。イオン交換基をベース物質に導入するための表面改質は、当該技術分野では周知である。
【０１０７】
イオン交換クロマトグラフィには、２つのタイプの溶離剤が使用される。第１の溶離剤は低濃度の塩を含んでおり、第２の溶離剤は高濃度の塩を含んでいる。溶離方法は、第１の溶離剤から第２の溶離剤へと段階的に切り替える。そして、勾配溶離方法は、組成物を第１の溶離剤から第２の溶離剤へと連続的に変化させる。イオン交換クロマトグラフィのための前記溶離に一般的に使用される緩衝剤及び塩を用いることができる。低濃度の塩を含んでいる第１の溶離剤としては、緩衝剤の濃度が１０〜５０ｍＭで、ｐＨ値が６〜９の水溶液が特に好ましい。高濃度の塩を含んでいる第２の溶離剤としては、緩衝剤の濃度が０．１〜２Ｍのナトリウム塩が溶離液組成に加えられた水溶液が特に好ましい。ナトリウム塩としては、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムを用いることができる。
【０１０８】
さらに、例えば、大腸菌の溶解物内にあるＤＮＡ分解酵素によるプラスミドの分解を抑制するためのエチレンジアミン４酢酸などの、２価金属イオン用のキレート剤を使用することができる。２価金属イオン用のキレート剤の濃度は、好ましくは、０．１〜１００ｍＭである。
【０１０９】
様々な市販の陰イオン交換マトリックスが本発明での使用に適している。そのような陰イオン交換マトリックスとしては、これらに限定されないが、POROS Anion Exchange Resins、Qiagen、Toso Haas、Sterogene、Spherodex、Nucleopac、及びPharmaciaから入手できるものがある。例えば、カラム（Poros II PI/M, 4.5mm×100）は、初めは、ｐＨ７．５及びＯ．７ＭのＮａＣＩで、２０ｍＭのＢｉｓ／ＴＲＩＳプロパンによって平衡化されている。サンプルは、同じ初めの緩衝材によって、ロードされ洗浄される。約２５カラム体積内の０．５Ｍ〜０．８５Ｍ ＮａＣｌの溶離勾配がその後適用され、破片が回収される。好ましい陰イオン交換マトリックスとしては、Fractogel TMAE HiCapがある。
【０１１０】
また、本発明は、核酸及び／又はプラスミドＤＮＡの分離及び精製方法を提供する。前記方法は、核酸を効率的に取得するために、また、高純度の核酸を大量に取得するために、陰イオン交換クロマトグラフィとトリプルヘリックス親和性クロマトグラフィとを組み合わせて行うステップを含んでいる。
【０１１１】
トリプルヘリックス親和性クロマトグラフィは、特に、米国特許第6,319,672号及び第6,287,762号と、国際特許出願ＷＯ02/77274に説明されている。
【０１１２】
トリプルヘリックス親和性クロマトグラフィは、二本鎖ＤＮＡ内のオリゴヌクレオチド及び標的配列の特有のハイブリダイゼーション（hybridization）に基づいている。前記オリゴヌクレオチドは、次の塩基を含み得る。
【０１１３】
チミン（thymine：Ｔ）。二本鎖ＤＮＡのＡ．Ｔダブレットと共に、トリプレットを形成することができる（Rajagopal et al. , Biochem 28 (1989) 7859）。
【０１１４】
アデニン（adenin：Ａ）。二本鎖ＤＮＡのＡ．Ｔダブレットと共に、トリプレットを形成することができる。
【０１１５】
グアニン（guanine：Ｇ）。二本鎖ＤＮＡのＧ．Ｃダブレットと共に、トリプレットを形成することができる。
【０１１６】
プロトン化されたシトシン（protonated cytosine：Ｃ＋）。二本鎖ＤＮＡのＧ．Ｃダブレットと共に、トリプレットを形成することができる（Rajagopal et al. , loc. cit.）。
【０１１７】
ウラシル（uracil：Ｕ）。Ａ．Ｕ又はＡ．Ｔ塩基対Ｔダブレットと共に、トリプレットを形成することができる。
【０１１８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドはシトシンリッチなホモピリミジン配列を含んでおり、ＤＮＡ内に存在する前記特定配列は、ホモプリン−ホモピリミジン配列である。シトシンの存在により、三重らせん（トリプルへリックス）を持つことができる。三重らせんは、シトシンがプロトン化される酸性ｐＨで安定し、シトシンが中和されるアルカリｐＨで不安定になる。
【０１１９】
ＤＮＡ内にあるオリゴヌクレオチド及び特定配列は、好ましくは、三重らせんの形成を可能にするために相補的である。十分に相補的なオリゴヌクレオチドと特定配列を使用することによって、最大の生産及び最大の選択性が得られる。そのような例としては、オリゴヌクレオチド・ポリ（ＣＴＴ）と特定配列ポリ（ＧＡＡ）がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（ＧＡＧＧ（ＣＴＴ）７）配列（SEQ ID NO：1）を持っている。ＧＡＧＧ塩基は三重らせんを形成しないが、オリゴヌクレオチドが結合腕である配列（ＣＴＴ）７から分離することを可能にする。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的ユニット（ＧＡＡ）を含んでいる特定配列と共に三重らせんを形成することができる。その問題になっている配列は、特に、７、１４又は１７ＧＡＡユニットを含む領域である（詳しくは実施例で後述する）。
【０１２０】
他の特定配列としては、５’−ＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡ−３’配列（SEQ ID NO：２）がある。この配列は、オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡ−３’（SEQ ID NO：３）又は５’−ＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴ−３’（SEQ ID NO：４）と共に三重らせんを形成する。この場合、オリゴヌクレオチドはポリプリン・ストランドに対して逆平行方向に結合する。これらの三重らせんは、Ｍｇ２＋の存在下でのみ安定する（Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363）。
【０１２１】
上述したように、特定配列は、二本鎖ＤＮＡ内に自然に存在する配列、又は後ほど人為的に導入された合成配列である。二本鎖ＤＮＡ（例えば、プラスミドの複製起点又は標識遺伝子）内に自然に存在する配列と共に三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドを使うことが特に好ましい。この点に関しては、配列分析によって、これらのＤＮＡのある領域（特に複製起点）は、ホモプリン−ホモピリミジン領域を持つことができることが知られている。天然のホモプリン−ホモピリミジン領域と共の三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドの合成は、好都合なことに、本発明に係る方法を、未修飾プラスミド（特にｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶタイプなどの市販プラスミド）に適用することを可能にする。
【０１２２】
二本鎖ＤＮＡ内に自然に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列の内で、大腸菌プラスミドＣｏｌＥｌの複製起点に存在している５’−ＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧ−３’配列（SEQ ID NO：５）の全部又は一部を含んでいる配列について説明する。三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣ−３’配列（SEQ ID NO：６）を持っており、二重らせんの２つのストランドと交互に結合する。このことについては、BealとDervanによる「J. Am. Chem. Soc. 1992, 114,4976-4982」、及び、JayasenaとJohnstonによる「Nucleic Acids Res. 1992,20, 5279-5288」に記載されている。また、プラスミドｐＢＲ３２２ βラクタマーゼ遺伝子の５’−ＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧ−３’配列（SEQ ID NO：７）についても言及されている（Duval-Valentin et al. , Proc. Natl.Acad Sci. USA, 1992, 89, 504-508）。
【０１２３】
特定のオリゴヌクレオチドと共に特定のトリプレックス構造を作成するのに適切した標的配列が、プラスミドＣｏｌＥｌの複製起点及びプラスミドｐＣＯＲに存在することが確認されている。ｐＣＯＲプラスミドは、条件付き複製起点のプラスミドであり、特に、ＵＳ２００４／１４２４５２及びＵＳ２００３／１６１８４４に記載されている。ＣｏｌＥｌ由来プラスミドは、プラスミド複製に含まれているＲＮＡ−１１転写物の上流にマップされた、１２−ｍｅｒのホモプリン配列（５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’）（SEQ ID NO：８）を含んでいる（Lacatena et al., 1981, Nature, 294, 623）。この配列は、１２−ｍｅｒの相補的な５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（SEQ ID NO：９）オリゴヌクレオチドと共に、安定した三重らせん構造を形成する。ｐＣＯＲバックボーンは、ｐＣＯＲのγオリジナル・レプリコンのＡ＋Ｔリッチセグメントに位置する１４の非反復塩基（５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’）（SEQ ID NO：１０）のホモプリン・ストレッチ（homopurine stretch）を含んでいる（Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936）。この配列は、１４−ｍｅｒの相補的な５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO：１１）と共に、安定した三重らせん構造を形成する。対応するオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（SEQ ID NO：９）及び５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO：１１）は、ColEl ori又はｐＣＯＲ（ori γ）の複製起点に位置する前記各配列の相補配列を、効果的に及び特異的に標的にする。実際、三重らせんの完全な不安定化によって単一の非標準トリアッド（triad）（Ｔ＊ＧＣ又はＣ＊ＡＴ）が生じる。
【０１２４】
プラスミドの複製起点又は標識遺伝子内に存在する配列と共に三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドは、前記複製起点又は標識遺伝子を含んでいる任意のＤＮＡを精製することができるので、前記オリゴヌクレオチドを使用することは特に好ましい。したがって、プラスミドや二本鎖ＤＮＡの中に人工的な特異配列を組み込むために、プラスミドや二本鎖ＤＮＡを修飾する必要はない。
【０１２５】
また、完全に相補的な配列が好ましいが、親和性の著しい損失をもたらさないという条件付で、ＤＮＡ内に存在するオリゴヌクレオチド配列と配列との間のいくつかの不一致は容認されている。大腸菌βラクタマーゼ遺伝子内に存在する５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧ−３’配列（SEQ ID NO：１２）について説明する。ポリプリン配列をインタラプトするチミンは、第３ストランドのグアニンによって認識され、その結果、２つのＴ＊ＡＴトリプレットが側面に位置した際に安定するＧ＊ＴＡトリプレットを形成する（Kiessling et al., Biochemistry, 1992,31, 2829-2834）。
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列（ＣＣＴ）ｎ、配列（ＣＴ）ｎ、又は配列（ＣＴＴ）ｎを含む（ｎは１から１５の間の整数である）。配列（ＣＴ）ｎ、又は配列（ＣＴＴ）ｎ配列を使用することが特に好ましい。出願人は、実質的に、精製量はオリゴヌクレオチド内に含まれるＣの量によって影響されることを明らかにしている。特に、実施例７に示すように、オリゴヌクレオチドのシトシン含有量が少ないときに、精製量は増加する。また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、（ＣＣＴ）、（ＣＴ）、又は（ＣＴＴ）ユニットと結合できることが理解されよう。
【０１２７】
オリゴヌクレオチドは、天然（未修飾ＤＮＡ天然塩基）又は化学的に修飾されている。特に、オリゴヌクレオチドは好適にはある化学的修飾を有し、自身のヌクレアーゼに対する耐性或いは防御を、又は特定配列に対する親和性を向上させることができる。また、オリゴヌクレオチドは、核酸への抵抗を高める目的で骨格が修飾された、任意の結合された一連のヌクレオシドを意味すると考えられている。可能性のある修飾の内、ＤＮＡと共に三重らせんを形成できるオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート（Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994,22, 3322-3330）や、フォルマセタル（formacetal）又はメチルホスホン酸骨格を有するオリゴヌクレオチドについて言及されている（Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768）。また、ヌクレオチドのアノマーと合成された、ＤＮＡと三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを使用することも可能である（Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760）。骨格の他の修飾としては、ホスホロジアミデート結合がある。例えば、GryaznovとChenによって開示されている、特に安定した三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを与えるＮ３´−Ｐ５´ヌクレオチド間ホスホロジアミデートについて言及されている。（J. Am. Chem. Soc., 1994,116, 3143-3144）骨格の他の修飾の内、２’−Ｏ−メチルリボース、ホスホジエステルなどのリボヌクレオチドの使用について言及されている（Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144）。そして、リンをベースにした骨格は、三重らせんを形成することができるＰＮＡ（peptide nucleic acid：ペプチド核酸）などで、ポリアミド骨格と置換される（Nielsen etal., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481）。あるいは、リンをベースにした骨格は、ＤＮＧ（deoxyribonucleic guanidine：デオキシリボ核のグアニジン、Proc. Natl. Acad．Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101）などで、又は三重らせんを形成するＤＮＡのポリカチオン性の類似物によって置換される。
【０１２８】
また、第３ストランドのチミンを、ＤＮＡに対すオリゴヌクレオチドを向上させる５−ブロモウラシルによって置換することもできる（Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc. , 1989,111, 3059-3061）。また、第３ストランドは、７−デアザ−２´−デオキシキサントシン（Milligan et al. , Nucleic Acids Res., 1993,21, 327-333）、１−（２−デオキシ−ｐ−Ｄ−リボフラノシルアデニン）−３−メチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ワン（Koh and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478）、８−オキソアデニン、２−アミノプリン、２’−Ｏ−メチルプシュードイソチジン（methylpseudoisocytidine）、又は当業者に周知の他の任意の修飾（Sun and Helene, Curr. Opinion Struct.Biol., 1993,3, 345-356を参照されたい）などの非天然塩基を含み得る。
【０１２９】
他の種類のオリゴヌクレオチド修飾は、特に、オリゴヌクレオチドと特定配列との間の相互作用及び／又は親和性を向上させるという目標を持っている。特に、メチル化されたオリゴヌクレオチドは、中性に近いｐＨ範囲（＞５）で特定配列と安定した三重らせんを形成するという注目すべき性質を示す。したがって、従来のオリゴヌクレオチドよりも高いｐＨ値で、すなわち、プラスミドＤＮＡが変性する危険性がより小さいｐＨ値で、作用することが可能である。
【０１３０】
本発明に係る方法で使用されるオリゴヌクレオチドの長さは５から３０の間である。オリゴヌクレオチドの長さが１０塩基よりも大きいものが好適に使用される。オリゴヌクレオチドの長さは、それぞれの場合に、望ましい相互作用の選択性及び安定性に適合するように、当業者によって調節される。
【０１３１】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、任意の公知の手法によって合成される。特に、核酸合成装置を用いて作成される。もちろん、当業者に周知である他の方法を用いることもできる。
【０１３２】
担体に共有結合できるようにするため、オリゴヌクレオチドは通常は官能化される。したがって、５’又は３’位置で、チオール、アミン、又はカルボキシル末端基によって修飾される。特に、チオール、アミン、又はカルボキシル基を付け足すことにより、例えば、オリゴヌクレオチドを、ジスルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シアン又はアルデヒド機能を支持する担体に結合させることができる。これらの結合は、オリゴヌクレオチドと担体との間のジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、又はアミノ結合の確立によって形成される。例えば二官能性結合試薬などの、当業者に周知である他の方法を使用することもできる。
【０１３３】
さらに、結合したオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションを向上させるために、オリゴヌクレオチドは、塩基の「アーム」又は「スペーサ」配列を含んでいることが好ましい。実際に、オリゴヌクレオチドを担体と選択された距離で結合させるためのアームの使用によって、ＤＮＡとの相互作用の状態を向上させることができる。前記アームは、好適には、１〜１８個、好ましくは６又は１２個の（ＣＨ２）基と、カラムへの結合を可能にするアミンを含んでいる炭素線状鎖から構成される。このアームは、オリゴヌクレオチド、又はハイブリダイゼーションを妨げない塩基から成る「スペーサ」のリン酸塩と結合する。したがって、「スペーサ」は、プリン塩基から構成することができる。一例としては、「スペーサ」はＧＡＧＧ配列から構成することができる。アームは、６又は１２個の炭素原子を含んでいる炭素線状鎖から構成することが好ましい。
【０１３４】
三重親和性クロマトグラフィは、ＲＮＡとゲノムＤＮＡを取り除くのに、とても効率的である。これらは、カラムにまとめてプレパックされた官能化されたクロマトグラフィ担体、官能化されたプラスチック表面、又は官能化されたラテックスビーズ、又は磁石などであり得る。クロマトグラフィ担体を使用することが好ましい。使用可能なクロマトグラフィ担体の例としては、アガロース、アクリルアミド或いはデキストラン（又はそれらの派生物。例えば、セファデックス、セファロース、スーパーロースなど）、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）などのポリマー、グラフト化又は非グラフト化シリカなどがある。このクロマトグラフィ・カラムは、拡散又はかん流モードで動作することができる。
【０１３５】
精製量をより向上させるためには、プラスミドＤＮＡに、いくつかの位置がオリゴヌクレオチドによってハイブリダイゼーションされた配列を使用することが非常に有益である。いくつかのハイブリダイゼーション位置の存在は、前記配列とオリゴヌクレオチドとの間の相互作用を実質的に促進し、前記相互作用によって精製量は向上する。したがって、ｎ回繰り返された（ＣＣＴ）、（ＣＴ）又は（ＣＴＴ）モチーフを含んでいるオリゴヌクレオチドに対しては、少なくともｎ個の相補的モチーフを含んでいる、好ましくはｎ＋１個の相補的モチーフを含んでいるＤＮＡ配列を使用することが好ましい。したがって、ｎ＋１個の相補的モチーフを持っている配列には、オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする位置が２つある。有利には、ＤＮＡ配列には、オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする位置を最大１１個含んでいる。すなわち、＋１０個の相補的モチーフを含んでいる。
【０１３６】
本発明に係る方法は、いかなる種類の二本鎖ＤＮＡを精製にも使用することができる。後述するが、例えばプラスミドなどの環状ＤＮＡは、一般的に、１つ又は複数の治療上重要な遺伝子を持っている。このプラスミドもまた、複製基点、標識遺伝子などを持っている。本発明に係る方法は、細胞溶融物に直接適用することができる。この実施形態では、形質転換によって増幅された後、細胞培養されたプラスミドは、細胞を溶融した直後に精製される。また、本発明に係る方法は、溶融物、すなわち細胞溶融物の中和及び遠心分離後に得られる上清を取り除くのに適用される。また、本発明に係る方法は、もちろん、公知の方法により事前に精製された溶液に適用することができる。また、この方法は、異なる配列を持っているＤＮＡを含んでいる混合物から、重要な配列を持っている線状又は環状ＤＮＡを精製することを可能にする。また、本発明に係る方法は、二本鎖ＤＮＡの精製に使用することもできる。
【０１３７】
細胞溶融物には、原核性溶融物と真核性溶融物がある。原核性溶融物としては、細菌、大腸菌、サブチリシン、ネズミチフス菌、又はストレプトマイシンがある。真核性溶融物としては、動物細胞、酵母、菌類などがあり、詳しくは、クルイフェロミケス又はサッカロミケス酵母、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ＮＩＨ３Ｔ３などの細胞がある。
【０１３８】
少なくとも三重親和性クロマトグラフィのステップを含んでいる本発明に係る方法は、高純度のｐＤＮＡ生成物を作成するのに使用される。三重親和性クロマトグラフィでは、オリゴヌクレオチドは、クロマトグラフィ樹脂又は他のマトリックスなどの担体に結合される。その後、サンプルを、結合されたオリゴヌクレオチドと混合される。混合は、例えば、サンプルを、クロマトグラフィ樹脂に結合されたオリゴヌクレオチドを含んでいるクロマトグラフィ・カラムに塗布することにより行う。サンプル内の目的とするプラスミドは、トリプレックスを形成するオリゴヌクレオチドと結合する。オリゴヌクレオチドとプラスミドとの間の結合は、フーグスティーン型結合である。このステップは、ｐＨ５未満、高塩濃度、２０分以上の接触時間で起こり得る。また、洗浄ステップが用いられる。最終的に、オリゴヌクレオチド結合樹脂からプラスミドを溶出するための中性緩衝液内で、シトシンの脱プロトン化が起こる。
【０１３９】
本発明の最も好ましい実施形態では、核酸及び／又はプラスミドＤＮＡの分離及び精製プロセスは、イオン交換クロマトグラフィ、三重らせん親和性クロマトグラフィ、及び疎水相互作用クロマトグラフィを組み合わせたステップを含んでいる。
【０１４０】
疎水相互作用クロマトグラフィは、精製するサンプル内の分子内の疎水性領域を引き付けるのに、基板上に疎水性部分を用いる。これらのＨＩＣ担体は、「クラスタリング」効果によって機能し、これらの分子が会合したとき、共有又はイオン結合が形成又は共有されないことに留意されたい。疎水相互作用クロマトグラフィは、開環プラスミド形態及び／又は他の不純物（ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、内毒素など）を非常に効率良く除去するので、有益である。疎水相互作用クロマトグラフィ用のベース物質の合成、疎水相互作用クロマトグラフィの準備・重合・官能化、及びプラスミドＤＮＡの溶出・分離は、当該技術分野では周知であり、米国特許第6,441,160号に開示されている（この参照により本発明に含まれるものとする）。
【０１４１】
疎水相互作用クロマトグラフィ用の充填物質に使用されるベース物質の合成に用いられる化合物は、ベース物質が合成された後に、疎水性を示す様々な官能基又は様々なイオン交換基を後反応によって導入することができるならば、どのような化合物であってもよい。単官能基モノマーの例としては、スチレン、ｏ−ハロメチルスチレン、ｍ−ハロメチルスチレン、ｐ−ハロメチルスチレン、ｏ−ハロアルキルスチレン、ｍ−ハロアルキルスチレン、ｐ−ハロアルキルスチレン、α−メチルスチレン、α−メチル−ｏ−ハロアルキルスチレン、α−メチル−ｍ−ハロアルキルスチレン、α−メチル−ｐ−ハロアルキルスチレン、ｏ−ヒドロキシメチルスチレン、ｍ−ヒドロキシメチルスチレン、ｐ−ヒドロキシメチルスチレンン、ｏ−ヒドロキシアルキルスチレン、ｍ−ヒドロキシアルキルスチレン、ｐ−ヒドロキシアルキルスチレンン、α−メチル−ｏ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｍ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｐ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｏ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｍ−ヒドロキシアルキルスチレン、α−メチル−ｐ−ヒドロキシアルキルスチレン、メタクリル酸グリシジル、アクリル酸グリシジル、アクリル酸ドロキシエチル、及び、酢酸ビニルがある。最も好ましい化合物は、芳香環上に置換されたハロアルキル基、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなど）、及び炭素原子を２〜１５個有する直鎖及び／又は分鎖飽和炭化水素である。
【０１４２】
多官能性モノマーの例としては、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルトルエン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジメタクリル酸エチレン・グリコール、ジアクリル酸エチレン・グリコール、ジメタクリル酸ジエチレン・グリコール、ジアクリル酸ジエチレン・グリコール、メチレンビスメタクリルアミド、及び、メチレンビスアクリルアミドがある。
【０１４３】
様々な疎水性官能基又は様々なイオン交換基は、後反応によって導入される。ベース物質自身が示す疎水性によって分離するのに望ましい目的生成物に対する、又は塩濃度の変化及びｐＨ値の変化によるベース物質自身の膨張又は収縮に対する影響を最小限に抑えるために、ベース物質は、好ましくは比較的に親水性を持つモノマー（例えば、メタクリル酸グリシジル、アクリル酸グリシジル、アクリル酸ヒドロキシエチル、ヒドロキシメタクリル酸、酢酸ビニル）を用いて作成される。ベース物質の作成は、よく攪拌した後に、単官能性モノマー及び多官能性モノマーを、適切な割合の、正確に検量された希釈剤及び溶剤で検量する第１のステップを含んでいる。前記希釈剤及び溶剤は、粒子に形成され、正確に検量された重合開始剤が添加された微細孔を作成する目的で使用される。前記混合液は予め正確に検量した懸濁安定剤が溶解した水溶液に加えられた後、水中油型懸濁重合される。そして、攪拌することによって目的サイズの油滴が形成され、混合溶液を徐々に暖めることによって重合が行われる。
【０１４４】
単官能性モノマーの多官能性モノマーに対する割合は、約１モルの単官能性モノマーに対して、約０．０１〜０．２モルの多官能性モノマーである。このような割合にすると、柔らかい粒子のベース物質が得られる。硬い粒子のベース物質を得るためには、多官能性モノマーの割合を、約０．０２〜０．５モルに増やす。前記粒子をさらに硬くするためには、多官能性モノマーのみを使用する。
【０１４５】
重合開始剤は、特に限定されず、一般的に使用されるアゾビスタイプ及び／又は過酸化物タイプが用いられる。
【０１４６】
懸濁安定剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両親媒性を有するポリマー、又はそれらの混合物などがある。そのような懸濁安定剤は、油滴同士が凝集するのを防止するために使用される。
【０１４７】
形成された粒子の直径は、一般的に約２〜５００μｍである。形成された粒子の直径は、好ましくは２〜３０μｍであり、より好ましくは約２〜１０μｍである。高純度核酸の大量精製を目指す場合は、粒子の直径は約１０〜１００μｍであり、目的生成物を未精製の原液から分離する際は、粒子の直径は約１００〜５００μｍ、より好ましくは２００〜４００μｍである。粒子直径を調節するために、重合中に攪拌器の回転速度が調整される。小径の粒子が必要な場合は回転数を増加させ、大きい粒子を所望する場合は回転数を減少させる。用いられる希釈剤は形成された粒子の微細孔を作成するのに使用されるので、希釈剤の選択は特に重要である。基本概念では、重合に使用される溶剤の調節は、モノマーにとって貧溶媒である溶剤と、モノマーにとって良溶媒である溶剤とを様々に組み合わせることによって行われる。孔の直径サイズは、分離するように設計された核酸の分子サイズに基づいて適切に選択される。しかし、疎水相互作用クロマトグラフィの充填剤用には、５００〜４０００オングストロームの範囲であることが好ましく、イオン交換クロマトグラフィの充填剤用には、１５００〜４０００オングストロームの範囲であることが好ましい。
【０１４８】
核酸を疎水性の違いによって、好ましくは異なる疎水性を有する充填剤を利用して分離する疎水相互作用クロマトグラフィでは、ベース材料の表面改良が重要である。
【０１４９】
長鎖又は分鎖から選択される疎水基は、２〜２０個の炭素原子を有する飽和炭化水素基又は不飽和炭化水素基を含んでいる。また、芳香環が、炭化水素基中に含まれていることもある。
【０１５０】
疎水基は、次の化学式を有する化合物の中から選択することもできる。
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【０１５１】
ただし、ｎは０から約２０であり、メチレン基は直鎖又は分鎖であり。また、ｍは０から約３であり、炭化水素基は直鎖又は分鎖である。また、ＡはＣ＝Ｏ基又はエーテル基である。ただし、メチレン基は、Ａを介さずに、ベース物質と直接的に結合している。
【０１５２】
疎水基は、繰り返し単位は０〜２０であり、炭素原子が２〜２０個のアルキレン・グリコールのエーテル基をさらに含み得る。そして、ベース材料と反応する官能基の反対端は、そのままに残された、又は炭素原子が１〜４個のアルキル基と結合するＯＨ基である。
【０１５３】
上述した疎水基は、表面を改質するために、単一で又は混合して使用される。
【０１５４】
プラスミドなどの低疎水性には、炭素原子を６〜２０個持っているアルキル基の鎖が好ましい。また、人間及び動物の細胞内の大腸菌及びＲＮＡに由来するＲＮＡなどの高疎水性化合物を分離するのには、炭素原子を２〜１５個持っているアルキル基の長鎖が好ましい。また、人間及び動物の細胞内の大腸菌及びＤＮＡに由来するＤＮＡなどの疎水性が比較的低い化合物を分離するための、炭素原子数が４〜１８のアルキル基が好ましい。
【０１５５】
これらの化合物を分離するためには、前記例に限定されることなく、化合物は表面を改質するために適切なものが選択される。実質的に、充填剤の疎水性の程度は、培地中の塩濃度又は吸着用の溶離剤中の塩濃度に応じて変化する。さらに、充填剤の疎水性の程度は、ベース物質中に導入される基の量に応じて変化する。
【０１５６】
疎水相互作用クロマトグラフィ用のベース物質の孔径は、特に、５００〜４０００オングストロームであることが好ましく、分離する核酸の分子サイズに応じて前記範囲から適切に選択される。一般に、充填剤の核酸保持率及び吸収能力（サンプルを導く）は、孔径に応じて異なるが、分子サイズが大きい核酸に対しては、孔径が大きいベース物質を使用し、分子サイズが小さい核酸に対しては、孔径が小さいベース物質を使用することが好ましい。例えば、スチレンベース物質は、ハロゲン含有化合物及び／又はハロゲン化カルボニル及び触媒（ＦｅＣＩ３、ＳｎＣｌ２、ＡｌＣｌ３など）を使用し、フリーデル・クラフト反応によって、アルキル基の長鎖を含んでいる疎水基と反応し、ベース物質の芳香環に、ジハロゲン化化合物及び／又はアシル化化合物として直接的に加えることが可能である。ベース物質が特にハロゲン基を含んでいる場合、例えば、付加される官能基にＯＨが含まれている化合物（ブタノールなど）を使用して、アルカリ触媒（ＮａＯＨ、ＫＯＨなど）とのウィリアムソン反応を利用する場合、エーテル結合を介して官能基に導入することが可能である。この場合、アミノ基含化合物（ヘキシルアミンなど）に加えたい官能基は、アルカリ触媒（ＮａＯＨ、ＫＯＨなど）を使用し、ジハロゲン酸反応を利用して、加えることが可能である。ベース物質がＯＨ基を含有している場合、逆に、事前に、加えたい官能基にエポキシ基、ハロゲン基、又はハロゲン化カルボニル基を導入する場合は、エーテル又はエステル結合を介して官能基を導入することが可能である。ベース物質がエポキシ基を含有している場合、もし、加えたい官能基に含まれるＯＨ基又はアミノ基を有する化合物と反応させると、エーテル又はアミド結合を介して官能基を導入することができる。さらに、加えたい官能基がハロゲン基を含有している場合は、酸触媒を使用して、エーテル結合を介して官能基を導入することができる。ベース物質に導入される官能基の割合は、分離対象となる生成物の疎水性に影響されるので、限定されるものではないが、一般に、乾燥させたベース物質１ｇに約０．０５〜４０ｍｍｏｌの官能基が加えられる充填物質が適している。表面改質に関しては、ベース物質又は粒子の形成後に、官能基を後反応によって加える方法は、前述したとおりである。表面改質は、同じ方法、すなわち、重合前に加えられた前記官能基を有するモノマーを使用して、ベース物質が重合後に形成される方法によって行われる。
【０１５７】
ベース物質としては、多孔質シリカゲルを用いることもできる。シリカゲルの製造方法は、例えば、「"Latest High-Speed Liquid Chromatography", page 289ff. (written by Toshio Nambara and Nobuo Ikegawa, published by Tokyo Hirokawa Bookstore in 1988)」に開示されている方法に従って製造された粒子上に直接置かれたアルキルトリメトキシシランなどの化合物を使用したシラン結合を含む。エポキシ基含有シラン結合剤を使用したシラン結合の前又は後に、前述した方法によって官能基を加えることができる。導入される官能基の割合は、乾燥させたベース物質１ｇに対して約０．０５〜４．０ｍｍｏｌが適している。
【０１５８】
溶離剤は、疎水相互作用クロマトグラフィの分離又は精製ステップに使用される。一般に、２つのタイプの溶離剤が使用される。第１の溶離剤は高濃度の塩を含んでおり、第２の溶離剤は低濃度の塩を含んでいる。溶離法は、第１の溶離剤から第２の溶離剤へと段階的に切り替える。そして、勾配溶離法は、組成物を第１の溶離剤から第２の溶離剤へと連続的に変化させる。疎水相互作用に一般的に使用される緩衝剤及び塩が用いられる。高濃度の塩を含んでいる溶離剤としては、緩衝剤の濃度が１．０〜４．５Ｍで、ｐＨ値が６〜８の水溶液が特に好ましい。低濃度の塩を含んでいる第２の溶離剤としては、緩衝剤の濃度が０．０１〜０．５Ｍで。ｐＨ値が６〜８の水溶液が特に好ましい。一般的に、塩としては、硫酸アンモニウム及び硫酸ナトリウムを使用することができる。
【０１５９】
疎水相互作用クロマトグラフィのプラスミドＤＮＡ精製ステップは、次々と、弱疎水性の官能基が導入された充填物質を、強疎水性の官能基が導入された充填物質と混合させることにより行われる。実質的に、大腸菌が培養された培地は、様々な疎水性の異なる成分（多糖類、大腸菌ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡプラスミド、及び／又はタンパク質）を大量に含んでいる。また、核酸同士でさえ、疎水性が異なることが知られている。不純物となるタンパク質は、プラスミドよりも疎水性が高い。
【０１６０】
疎水相互作用クロマトグラフィ樹脂は、Fractogelプロピル、Toyopearl、Sourceイソプロピル、又は疎水基を有するその他の樹脂など数多く市販されている。最も好ましい樹脂は、Toyopearlバルク重合培地である。Toyopearlは、物理的及び化学的安定性の高いメタクリル酸ポリマーである。樹脂は、非官能化「ＨＷ」シリーズとして入手可能であり、イオン交換クロマトグラフィ又は疎水相互作用クロマトグラフィ用の界面化学によって誘導体化される。異なる界面化学及び疎水性レベルの特性を有する、４つのタイプのToyopearl HIC樹脂を使用することができる。Toyopearl HIC樹脂の疎水性は、エーテル、フェニル、ブチル及びヘキシルのシリーズを介して増加する。１０００オングストロームの孔径を有する好ましいToyopearl HIC樹脂（Toyopearl HW-65など）の構造を下に示す。
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【０１６１】
上述したToyopearl樹脂の粒子サイズは様々である。Toyopearl 650Cの粒子サイズは約５０〜１５０μｍであり、好ましくは約１００μｍである。Toyopearl 650Mの粒子サイズは約４０〜９０μｍであり、好ましくは約６５μｍである。Toyopearl 650Sの粒子サイズは約２０〜５０μｍであり、好ましくは約３５μｍである。粒子サイズは、分解能力に影響を与えることは周知である。分解能力は、粒子サイズが小さくなるほど向上する。すなわち、分解能力は、Ｓ、Ｍ、Ｃの順に高い。本発明に係る分離及び精製プロセス中のＨＩＣ（疎水相互作用）クロマトグラフィ・ステップに使用されるもっとも好ましいToyopearl樹脂は、Tosoh Bioscienceから市販されているToyopearl 650Sである。
【０１６２】
好ましい実施形態では、さらなる透析濾過ステップが行われる。標準的な市販されている透析濾過物質は、当該技術分野では周知の標準的な方法によって、このプロセスで使用するのに適している。好ましい透析濾過方法は、プラスミドのサイズに応じた、30,000〜50,000の範囲の分画分子量を有する限外濾過膜を使用した透析濾過である。この透析濾過ステップは、その後、緩衝液交換及び濃縮が行われることを可能にする。ステップ１２の溶出は、約２．５〜３．０ｍｇ／ｍＬの標的濃度への接線流濾過作用（膜区画、３０ｋＤａ）によって３〜４フォルドに濃縮される。そして、濃縮物は、透析濾過によって１０容積の食塩水と共に、一定容積で緩衝液交換され、食塩水によって標的プラスミド濃度に調節される。ＮＶ１ＦＧＦ濃度は、濃縮物のサンプルの２６０ｎｍでの吸収度から算出される。ＮＶ１ＦＧＦ溶液は、０．２μｍのカプセルフィルターによって濾過した後、いくつかのアリコートに分けられる。アリコートは、次の処理までの間、容器中で、２〜８℃の涼しい場所で保存される。このことにより、スーパーコイル状のプラスミドの濃度が約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び好ましくは９９％のプラスミドＤＮＡを有する精製された濃縮物を生成する。このプロセスによる全部のプラスミドの回収は、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％及び８０％であり、平均的な回収は６０％である。
【０１６３】
この実施形態では、透析濾過ステップは次の条件に従って行われる。ステップ（ａ）及び（ｂ）は、緩衝装置を使用して行う。
（ｉ）１２．５〜１３．０容積の、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ、１５０ｍＭのＮａＣＩ、ｐＨ７．４（バッファＩ）に対しての第１の透析濾過（ステップａ）、及び
（ｉｉ）ステップａからの残余ガス（retentate）の、３．０〜３．５容積の塩類賦形剤（１５０ｍＭのＮａＣＩ）に対しての第２の透析濾過（ステップｂ）。この好ましい本発明に係る透析濾過ステップは、硫酸アンモニウム及びＥＤＴＡを効率的及び広範囲に除去する。また、この透析濾過ステップの後で、適切な生理学的なＮａＣＩ濃度（約１５０ｍＭ）及び最終的に１ｍＭ以下のＴｒｉｓ濃度（２００μＭ〜１ｍＭ）が得られる。
【０１６４】
この透析濾過ステップを使用して得られるプラスミドＤＮＡ組成物は、塩類賦形剤（ＮａＣＩなど）と、ｐＨ値を７〜７．５に保持又は作成するための適切な濃度のＴｒｉｓ緩衝液を含有している。本発明に係るプラスミドＤＮＡ組成物は、プラスミドＤＮＡは意外なことに５〜２５℃で、長期間、安定した非分解性の形態で保存されるので、特に有益である。
【０１６５】
上述したように、本発明に係る分離方法によれば、従来の方法よりも簡単な操作によって、高純度プラスミドＤＮＡが大量に得られる。
【０１６６】
プラスミドを生成するプロセスは、上述した連続的溶解方法（又は当該技術分野では周知の他の溶解方法）の後に行われる。例えば、プラスミドを含んでいる微生物細胞の貫流加熱溶解（flow-through heat lysis）が使用される。この方法は、国際公開WO96/02658号に開示されている。１０フィート×０．２５インチＯ．Ｄ．ステンレス鋼管から成る特別な熱交換器がコイル中に成形される。コイルは、常時高温の水槽中に完全に浸される。コイルのホールドアップ体積は約５０ｍＬである。温度計及び温度計は入口温度、出口温度、及び水槽温度をそれぞれ測定するのに使用される。生産物の流れは、シリコンチューブを有するMasterflex蠕動ポンプを使用して、加熱コイル中に注入される。コイルから出る細胞溶融物は、浄化するために、その後、Beckman J-21バッジ式遠心分離機によって遠心分離される。遠心分離した後、プラスミドＤＮＡは、本発明に係る精製方法によって精製される。
【０１６７】
他の細胞溶解は、直列に配置された静的ミキサーを使用して行うことができる。実際には、W097/23601に開示されているように、第１の静的ミキサーによって細胞を溶解させ、第２の静的ミキサーによって細胞溶融物を沈殿させる方法を、本発明に係るプラスミドＤＮＡ精製方法の前に細胞を溶解させる他の方法として用いることができる。静的ミキサーを使用して、大量の細胞を穏やかに連続的に溶解させることができる。希釈及び沈殿などの他の機能を実施すべく、他の静的ミキサーは一列に配置される。本発明に係る方法に有用である適切な静的ミキサーとしては、当該技術分野では静的又は固定ミキサーと呼ばれている、本発明のプロセスを行うのに十分な長さを有する任意の貫流装置を使用することができる。例えば、細胞を溶解させる目的では、静的ミキサーでは、ミキサー中を通過する対象細胞を溶解させるために、溶解溶液（lysing solution）と細胞との接触時間は十分な長さである必要がある。好ましい実施形態では、適切な静的ミキサーは、２つの液体を反対方法の旋回流で互いに接触させ、両液体を乱流で混合するらせん内部構造を有している。
【０１６８】
本発明に係るプラスミドＤＮＡの分離及び精製方法は、いかなるタイプのいかなるサイズのベクターの分離及び精製に使用できる。本発明に係る方法により分離される、約３ｋｂのベクターバックボーン、治療遺伝子、及び隣接した調節塩基配列を含有するプラスミドＤＮＡのサイズの範囲は、約５ｋｂ〜約５０ｋｂ、好ましくは約１５ｋｂ〜約５０ｋｂである。したがって、本発明に有用であるベクターバックボーンは、約１０〜５０ｋｂ又はそれ以上の挿入断片を運ぶことができる。挿入断片は、任意の有機体（好ましくは哺乳類のオリジン）に由来するＤＮＡを含み得る。また、挿入断片は、治療タンパク質をエンコードしている遺伝子、調節塩基配列（プロモーター遺伝子など）、ポリアデニル化配列、エンハンサー、遺伝子座調節領域などを含み得る。治療タンパク質をエンコードしている遺伝子はゲノム起源である（そのため、ゲノム機構に反映されるようにエクソンとイントロンを含んでいる）、又は相補的ＤＮＡに由来する。そのようなベクターは、例えば、大量のコピー数の複製物を複製可能なベクターバックボーンがある。ベクターバックボーンは、治療遺伝子を挿入するためのポリリンカー、選択可能なマーカー（例えば、ＳｕｐＰｈｅ ｔＲＮＡ）をエンコードしている遺伝子、テトラサイクリン・カナマイシン耐性遺伝子を持っており、物理的に小さいて安定している。プラスミドのベクターバックボーンは、哺乳類、他の真核性、原核生物又はウイルスのＤＮＡ断片の挿入を有利に可能にし、その結果生成されたプラスミドは生成され、インビボ又はエクスビボのプラスミド治療に使用される。本発明に係る方法によって、コピー数が比較的多いベクター（２０〜４０コピー／細胞から１０００〜２０００コピー／細胞の範囲）を分離して、精製することができる。本発明に係る方法では、例えば、ｐＵＣ複製起点を含んでいるベクターが好ましい。ｐＵＣ複製起点は、プラスミドＤＮＡのより効率的な複製を可能にし、プラスミドのコピー数／細胞を１０倍増にする（例えば、ｐＢＲ３２２オリジン）。好ましくは、US2003/1618445に開示されているような又はｐ複製起点という条件付のプラスミドＤＮＡは、本発明に係る方法によって分離される。その結果、大量のコピー数は、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞タンパク質、及び補因子に対するプラスミドＤＮＡの割合を著しく増加させ、プラスミドの生産率を向上させ、ダウンストリーム精製を容易にする。
【０１６９】
したがって、本発明には、任意のベクター（プラスミドＤＮＡ）を使用できる。代表的なベクターは、これに限定されないが、ＮＶ１ＦＧＦプラスミドを含んでいる。末梢動脈閉塞疾患（peripheral arterial occlusive disease：PAOD）又は末梢動脈閉塞疾患（peripheral arterial disease：PAD）の末期患者の治療に有用な酸性線維芽細胞増殖因子又は線維芽細胞増殖因子タイプＩ（ＦＧＦ−１）をエンコードしているプラスミドであるＮＶ１ＦＧＦは、安全要求事項を満たす。Camerotaら（J Vasc. Surg., 2002,35,5:930-936）は、再建不可能なＰＡＤ末期の、安静時痛と組織壊死という症状を有する５１人の患者に、虚血性の子牛の大腿部に、ＮＶ１ＦＧＦを筋肉注射によって単回又は複数回投与したことを開示している。例えば、経皮酸素圧、ＡＢＩ（Ankle Brachial Index）、TBI（Toe Brachial Index）、痛み評価、及び潰瘍治癒などの様々なパラメータは、その後評価される。ＮＶ１ＦＧＦ投与後の、上腕血圧指数（brachial indexe）の著しい増加は、痛みを和らげ、潰瘍のサイズを小さくし、血流を向上させることが確認された。
【０１７０】
本発明に使用可能なホスト細胞はどのような種類の細菌でもよく、グラム陽性菌（大腸菌など）とグラム陰性菌（ネズミチフス菌などの）両方を含む。また、上述したプラスミドの多数のコピー（例えば、２０〜２００のコピー）を保持可能な細菌を含む。本発明に使用可能な大腸菌のホスト株としては、ＨＢ１０１、ＤＨ１及びＤＨ５αＦ、ＸＡＣ−１及びＸＡＣ−ｌｐｉｒ１１６、ＴＥＸ２及びＴＥＸ２ｐｉｒ４２がある（ＷＯ04/033664）。Ｆプラスミドはプラスミド治療薬と同時に精製されるので、一般的に、Ｆプラスミド又はＦプラスミド派生物（例えばＪＭ１０９）は好ましくない。
【０１７１】
本発明の他の実施形態では、不純物を実質的に含んでいない又は不純物をsub-ppmの範囲でしか含んでいない、高度に純化されたプラスミドＤＮＡを含んでいる組成物（医薬品グレードＤＮＡ）を提供する。本発明に係る医薬品グレードプラスミドＤＮＡは、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物を、sub-ppm（０．０００１％未満。すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．０００１ｍｇ未満）でしか含んでいない。
【０１７２】
前記医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、約０．０１％未満、又は０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００８％未満（＜０．００００８％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００８ｍｇ未満）でしか含んでいない。
【０１７３】
前記医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、ＲＮＡ不純物を、約０．０１％未満、又は０．００１％未満、好ましくは０．０００１％未満、より好ましくは０．００００２％未満（＜０．００００２％、すなわち、プラスミドＤＮＡ１００ｍｇ中で０．００００２ｍｇ未満）でしか含んでいない。
【０１７４】
前記医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、タンパク質不純物を、約０．０００１％未満、より好ましくは０．００００５％未満でしか含んでいない。
【０１７５】
前記医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、内毒素を、０．１ＥＵ／ｍｇ未満でしか含んでいない。
【０１７６】
前記医薬品グレードプラスミドＤＮＡ組成物は、主に環状形状のものを含んでいる。より正確には、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以上の閉環状のプラスミドＤＮＡを含んでいる。
【０１７７】
また、本発明は、長期間安定し室温で分解しない、研究又は人間の治療に使用されるプラスミドＤＮＡの保存に有用なプラスミドＤＮＡ液剤を提供する。
【０１７８】
したがって、本発明に係る安定プラスミドＤＮＡ組成物は、プラスミドＤＮＡと、十分に希釈した緩衝溶液と、生理塩類賦形剤（saline excipient）とを含んでいる。前記緩衝溶液は、前記組成物のｐＨを７から７．５の間で維持するための濃度で存在している。
【０１７９】
前記組成物のｐＨを７から７．５の間で維持することができる緩衝溶液は、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン］又はリジンと、強酸（塩酸など）又は弱酸（マレイン酸、リンゴ酸、酢酸など）とを含んでいる酸／塩基系から成る。或いは、前記緩衝溶液は、ＨＥＰＥＳ［２−（４−（２−ヒドロキシエチル・ピペラジン）−１−イル）エタンスルホン酸］と強塩基（水酸化ナトリウムなど）とを含んでいる酸／塩基システムから成る。また、前記緩衝溶液は、トリス／ＨＣｌ、リジン／ＨＣｌ、トリス／マレイン酸、トリス／リンゴ酸、トリス／酢酸、又は、ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウムから成る。
【０１８０】
好ましくは、ｐＨは、７と７．５の間に保たれる。より好ましくは、ｐＨは、約７．２に保たれる。
【０１８１】
本発明に係る組成物に使用される生理塩類賦形剤の濃度は、好ましくは１００から２００ｍＭの間であり、より好ましくは約１５０ｍＭである。また、生理塩類賦形剤は、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＳＯ２−４、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｎ０３−、Ｍｇ２＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、及びＮＨ４＋から構成することもできる。
【０１８２】
前記緩衝溶液のモル濃度は、限られた期間及び量で、ｐＨ値が７と７．５との間で安定させるように緩衝効果を及ぼすように決定される。したがって、本発明に係る安定して保存されるプラスミドＤＮＡ組成物は、生理塩類賦形剤と緩衝溶液とを含んでいる。前記緩衝溶液の濃度は、前記組成物のｐＨを７と７．５との間に保つために、１ｍＭ以下、好ましくは２５０μＭと１ｍＭとの間、より好ましくは４００μＭと１ｍＭとの間である。
【０１８３】
本発明に係る緩衝系の中では、濃度が４００μＭのトリス緩衝溶液が、特に満足のいく結果が得られ、本発明に係るプラスミド組成物に適している。
【０１８４】
後記する実施例に示すように、本発明に係るプラスミドＤＮＡ組成物は、４℃と室温（例えば２０℃又は２５℃）との両方で優れた安定性を示す。特に、プラスミドＤＮＡ組成物は、４℃又は室温での、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、そして最大１２ヶ月までの長期間の使用に有用である。
【０１８５】
したがって、本発明は、プラスミドＤＮＡと、緩衝溶液と、生理塩類賦形剤とを含んでいる組成物を提供する。前記生理塩類賦形剤は、４℃から２５℃の間でプラスミドＤＮＡを安定した形態で保存するのに十分な濃度で存在している。
【０１８６】
また、本発明は、プラスミドＤＮＡと、緩衝溶液と、生理塩類賦形剤とを含んでいる組成物を提供する。前記緩衝溶液は、４℃から２５℃の間で、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、そして最大１２ヶ月までの長期間、プラスミドＤＮＡを安定した形態で保存するのに十分な濃度で存在している。
【０１８７】
実際、５℃又は室温で長期間保存されるプラスミドＤＮＡは、脱プリン及び開環速度は非常に遅く、１カ月当たり２０％、１５％、１０％、５％、又は１％未満である。
【０１８８】
また、本発明に係る組成物は、例えば、ポリエチレン・グリコール、プルロニック或いはポリソルベート糖、又はアルコールから成る群より選択されるポリマーなどの補助剤をさらに含み得る。
【０１８９】
また、本発明は、組成物内のプラスミドＤＮＡを保存する方法を提供する。前記方法は、（ａ）プラスミドＤＮＡの精製サンプルを作成するステップと、（ｂ）前記プラスミドＤＮＡの精製サンプルを、生理食塩水賦形及び緩衝溶液と混合させるステップとを含んでいる。前記緩衝溶液は、作成された組成物のｐＨを７と７．５の間に保つ役割を果たす。
【０１９０】
また、本発明は、組成物内のプラスミドＤＮＡを２０℃以下で保存する方法を提供する。この方法は、（ａ）プラスミドＤＮＡの精製サンプルを作成するステップと、（ｂ）プラスミドＤＮＡの精製サンプルを、生理塩類賦形剤及び濃度が１ｍＭ以下又は２５０μＭから１ｍＭの間、好ましくは４００μＭの緩衝溶液と混合させるステップと、（ｃ）プラスミドＤＮＡ組成物を約４℃から２０℃の間で保存するステップとを含んでいる。
【実施例】
【０１９１】
クローニング及び分子生物学の一般的な技術。
制限酵素による消化、ゲル電気泳動、大腸菌の形質転換、核酸の沈着などの分子生物学に関する従来の方法は、次の文献に開示されている。「Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York」
【０１９２】
ヌクレオチド配列は、既存の方法であるチェーン・ターミネーション法（Ausubel et al., 1987）によって決定される。
【０１９３】
制限酵素は、米国マサチューセッツ州ベバリーのNew England Biolabsから入手できる。連結反応を実施するために、ＤＮＡ断片を緩衝液中で培養する。前記緩衝液は、Ｔ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰを含んでいる。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドは、シアノエチル基によってβ位置で保護されるホスホラミダイトと化学反応するホスホラミダイトを使用して、製造会社のアドバイスにしたがってBiosearch8600ＤＮＡ自動合成装置によって合成される（Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of, B-cyanoethyl-N, N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.）。
【０１９５】
結紮したＤＮＡ又はそれらの形質転換の有効性が検査されるＤＮＡは、次の株がレンダリングされたコンピーテント（competent）の形質転換に使用される。大腸菌ＤＨ５α［Ｆ／ｅｎｄＡｌ、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡｌ、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡｌ、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｑＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、Φ８Ｏｄｌａｃ（ｌａｃＺΔＭ１５）］（任意のＣｏｌ Ｅ１プラスミドに対して）、又は大腸菌ＸＡＣ−ｐｉｒ（任意のｐＣｏｒ由来プラスミドに対して）
【０１９６】
プラスミドＤＮＡの少量調製は、Kleinら（1980）の方法に従って行われる。
【０１９７】
大腸菌株の培養にはＬＢ培地が使用される（Maniatisら、1982）。菌株は３７℃で培養される。細菌は、適切な抗生剤が追加されたＬＢ培地の皿に蒔かれる。
【０１９８】
≪実施例１≫
流速に対しての直径の調節は、連続溶解システムのコイルのレイノルズ数を計算することにより行う。以下の分析では、流体はニュートン流動すると仮定しているため、下記の表はＢ１に対してのみ有効であり、Ｂ２に対して一部有効である。レイノルズ数の値は、当業者に対して、衝突の仕方を明確にする。ここでは、チューブ内での流動についてのみ取り扱う（水力工学）。
【０１９９】
［１］非ニュートン性流体
産業面で最も一般的に出会う非ニュートン性流体は、BinghamとOstwald de Waeleとの２種類である。この場合、レイノルズ数（Ｒｅ）は次のように計算する。
ＲｅＮは、一般化レイノルズ数である。
ＲｅＮ＝（ｌ／（２ｎ−３））×（ｎ／３ｎ＋ｌ）ｎ×（（ρ×Ｄｎ×ｗ２−ｎ）／ｍ）……（１）
Ｄ：断面の内径（ｍ）
ρ：流体の単位容積質量（ｋｇ／ｍ３）
ｗ：流体の空間速度（ｍ／ｓ）
ｎ：流動作用指数（無次元）
ｍ：流体の一致係数（ｄｙｎ．ｓｎ／ｃｍ２）
なお、ｎ及びｍは、実験的に決定される（レオロジー的挙動の実験によって）
【０２００】
［２］ニュートン性流体
式（１）の第１の部分に関しては、ｎ及びｍはμの関数なので、Ｒｅ＝ｆ（内径、μ、ρ及びｕ）である。
Ｒｅ＝（ｕ×Ｄ×ρ）／μ……（２）
ρ：流体の単位容積質量（ｋｇ／ｍ３）
μ：流体の粘性（Pa.s,及び1mPa.s＝1cP）
Ｄ：断面の内径（ｍ）
ｕ：平均空間速度（ｍ／ｓ）
式（１）でｎ＝１で、式（２）を変形する。
Ｑ＝流速（ｍ３／ｈ）で、Ｓ＝断面の表面領域（ｍ２）で、ｃＰのμが与えられれば、次の式が得られる。
Ｒｅ＝（４×（Ｑ／３６００）×ρ）／（（μ／１０００）×Π×Ｄ）……（３）
【０２０１】
円形の導管では、レイノルズ数が２５００未満の場合は層流であり、イノルズ数が２０００〜５０．０００の場合は水力学的に滑らかな乱流である。境界は意図的におおよそ両方のタイプの性質がその後起こることを決定するのに使用される２０００〜２５００の間であり、選択は事後に決定される。
［３］計算
ｎ及びｍは一般的に知られていないため、傾向を推定するために次の近似値が用いられる。
【０２０２】
ニュートン流体（全ての断面で）
ρ＝１０００ｋｇ／ｍ３（全流体で）
μ＝５ｃＰ（Ｂ１ａ）、４０ｃＰ（Ｂ１ｂ）（我々のデータでは）、２．５ｃＰ（Ｂ２）（我々のデータでは）
【０２０３】
次の計算は、構造１及び構造２と呼ばれる２つの標準的な試験済みのチューブ構造に対して、式（３）を使用して行った（Ｂ１ｂを除く）。
【表２】
2011132249.tif 000006
【０２０４】
これらの構造では、すべての段階で流体は層流であり、複数の溶液は互いに十分に混合しない。
【０２０５】
他のチューブ構造（Ｂ１ｂチューブ以外）では、次の通りである。
【表３】
2011132249.tif 000007
【０２０６】
同様に、Ｂ１及びＢ１ｂチューブの両方が存在する様々なチューブ構造に対して、式（３）を使用して計算を行った。
【表４】
2011132249.tif 000008
【０２０７】
チューブの直径と流速を調節することにより、所定のレイノルズ値が得られることは明らかである。
【０２０８】
当業者であれば、Ｂ２又はＢ１の他の２つの部分（Ｂ１ａ及びＢ１ｂ）における、直径と長さの様々組み合わせを想定できよう。例えば、長さを短くし攪拌を向上させるために、Ｂ１の第１の部分を６ｍｍから３ｍｍに短くすることもできる。また、ｎ及びｍは、流体のレオロジー的挙動の実験から決定され、チューブの適切な特性を決定するのに使用される。
【０２０９】
攪拌の効率に加えて、攪拌の継続期間は、本発明のある実施形態ではコイルの長さを調節することによって調整できる。
【０２１０】
非ニュートン流体では、チューブの直径又は流体の粘性は、式（１）によって決定されるようには見えない（データは示さない）。言い換えれば、Ｂ１ｂ及びＢ２において式（１）を計算に使用するならば、流速を変更するよりも直径を変更する方が効率的だとは思われない。流速が早いほうが望ましいが、直径は流速に応じて変更することができる。
【０２１１】
これらの原則は、攪拌を制限する根拠に用いることができる。また、ＤＮＡの断片化を防ぐためにＢ１ｂ及びＢ２に適用することもできる。
【０２１２】
溶解中は、攪拌はｇＤＮＡが変性しない程度に力強く行われる。Ｂ１の開始部で直径を減少させることによって、攪拌を増大させる（Ｒｅを増加させる）ことが可能となり、溶液２と細胞を十分に混合させることができる。また、細胞が溶解したときは、攪拌と壁に対する摩擦力は減少し、核酸の断片化を防ぐことができる。直径の増加は攪拌を減少させ（Ｒｅを減少させる）、摩擦力を減少させる（粘性を低下させる）ことができる。
Ｍ１：流体の混合
Ｂ１ａ：溶解の開始時における混合の微調整：対流現象（マクロ混合）
Ｂ１ｂ：変性の発生により、プラスの拡散現象を生じる（ミクロ混合）
【０２１３】
従来のレイノルズ数がニュートン流体を持つように、一般的なレイノルズ数が非ニュートン流体と同じ意味を持つと判断される。特に、円形断面の導管における層流形態の境界線は、ＲｅＮ＜２３００である。
【０２１４】
Ｂ２において中性化が行われる。高流量は、力強い攪拌と壁で摩擦力（機械的ストレス）を発生させ、ゲノムＤＮＡの断片化を増大させる。直径の大きいチューブを使用することにより、攪拌（Ｒｅ）と摩擦力（粘性）を減少させることが可能となる。ここでは、十分な攪拌が得るために、直径の小さい（６ｍｍ）のチューブを使用している。中性化された溶解物を激しくかつ素早く攪拌するためには、Ｂ２チューブの直径は小さくするとよいことが分かった。
【０２１５】
≪実施例２≫
ＣＬシステムは、５つのステップに分けることができる。ある特定の実施形態では、次のように行われる。
（１）細胞（溶液１内の）と溶液２を混合する（Ｍ１＋長さ３ｍ、直径６ｍｍのチューブ）。ＳＤＳによって細胞の溶解は開始される。変性しない間は、ＤＮＡが断片化する危険性はない。
（２）溶解の終了、及びｇＤＮＡの変性（長さ１３ｍ、直径１６ｍｍのチューブ）
（３）溶解物と溶液３の混合（Ｍ２＋長さ３ｍ、直径６ｍｍのチューブ）
（４）４℃で中性化された溶解物を回収する。
（５）ｇＤＮＡの大きい断片を氷上におき、４℃で一晩おく。
【０２１６】
連続溶解を行うための条件は次の通りである。
溶液１：ＥＤＴＡ １０ｍＭ、グルコース（Ｇｌｃ）９ｇ／１及びＴｒｉｓＨＣＩ ２５ｍＭ、ｐＨ７．２。
溶液２：ＳＤＳ １％、ＮａＯＨ ０．２Ｎ
溶液３：酢酸２Ｍ、酢酸カリウム３Ｍ
流速 ６０Ｌ／ｈ：溶液１及び溶液２
流速 ９０Ｌ／ｈ：溶液３
細胞は溶液１内に３８．５ｇ／Ｌ含まれる。
溶液１内の細胞は３つのノズルを通過して、反対方向から流れてくる溶液２内に分散される。
ミキサーＭ１は、２つの流体の混合を最適に行うための形状を有している（図２参照）。
ミキサーＭ１の後におけるチューブの最初の部分はＢ１ａであり、次の部分がＢ１ｂである。
Ｂ１ａ：長さ３ｍ、直径６ｍｍ、滞留時間２．５秒
Ｂ１ｂ：長さ１３ｍ、直径１６ｍｍ、滞留時間７７秒
【０２１７】
本発明に係る方法は、効率面での利益、つまり、分散、素早い力強い混合、及び拡散による緩やかな混合を提供する。本発明に係る方法を使用すると、多くの細胞の溶解が増大するため、ｐＤＮＡの復元量が増大する。それらの流体を混合させるときの困難性は、それらの性質、特に粘弾性に起因するため、拡散のアイデアは特に重要である。本発明に係る方法は、剪断力を制限することが可能であり、その結果、ｇＤＮＡの断片化を制限することができる。また、その後のクロマトグラフィ精製中の除去を促進する。
【０２１８】
問題は、４℃に冷却された溶液３との混合である。
【０２１９】
ある実施形態では、本発明に係る方法は、内径が約１０ｍｍのＹ型のミキサーＭ２を使用する。チューブＢ２の部分は、ミキサーＭ２の後に配置される。
Ｂ２：長さ２ｍ、直径６ｍｍ、滞留時間１秒
【０２２０】
下記の表５は、比較テストの結果を示す。表５に示すように、本発明に係る連続溶方法は、バッチ溶解と比べると有利である。
【表５】
2011132249.tif 000009
【０２２１】
≪実施例３≫
カラムは、蠕動ポンプ（＜１ｍｌ／分）に接続されるＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ファルマシア）によって作動される１ｍｌのＨｉＴｒａｐカラムを使用する。５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（ＧＡＧＧ（ＣＴＴ）７）配列（SEQ ID NO：1）の５´端にＮＨ２基を持っている特有のオリゴヌクレオチドを使用する。この実施形態では、緩衝液は次のものを使用する。
結合緩衝液：０．２Ｍ ＮａＨＣ０３、０．５ ＭＮａＣＩ、ｐＨ８．３
緩衝液Ａ：０．５Ｍ エタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣＩ、ｐＨ８．３
緩衝液Ｂ：０．１Ｍ アセテート、０．５Ｍ ＮａＣＩ、ｐＨ４
【０２２２】
カラムは６ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌによって洗浄し、結合緩衝液（１ｍｌ中に５０ｎｍｏｌ）内に希釈されているオリゴヌクレオチドは、その後カラムに塗り付けられ、室温で３０分間置かれる。カラムは、６ｍｌの緩衝液Ａで連続して３回洗浄され、その後６ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄される。したがって、オリゴヌクレオチドは、ＣＯＮＨ結合を介してカラムと共有結合する。カラムはＰＢＳ、０．１％ ＮａＮ３内に４℃で貯蔵され、少なくと４回は使用される。次の２つのオリゴヌクレオチドが合成される。
オリゴヌクレオチド４８１７
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ ＡＡ ＧＡＡＧＡＡＧＧ−３’配列（SEQ ID NO：13）
オリゴヌクレオチド４８１８
５’−ＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧ−３’配列（SEQ ID NO：14）
【０２２３】
これらのオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド化されプラスミド内にクローン化されたときは、上述したように、対応するプラスミド内に、ホモプリン・ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７（SEQ ID NO：15）を導入する。
【０２２４】
これら２つのハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドは、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＢＫＳ＋（Stratagene Cloning System, La Jolla CA）の多数のクローン部位でクローンされる。このために、オリゴヌクレオチドは、以下のようにしてハイブリッド化される。これら２つのオリゴヌクレオチド１μｇを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでいる最終緩衝液４０ｍｌ内に入れる。この混合物は９５℃に加熱され、その後温度がゆっくり下がるように室温におかれる。ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドの混合物ｎｇは、３０ゲル内のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩに消化された２００ｎｇのプラスミドｐＢＫＳ＋（Stratagene Cloning System, La Jolla CA）とライゲーションされる。ライゲーション後、アリコートはＤＨ５αに形質転換される。形質転換された混合物は、アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）及びＸ−ｇａｌ（２０ｍｇ／ｌ）が追加されたＬ培地上に蒔かれる。親プラスミド（ｐＢＫＳ＋）は大腸菌ガラクトシダーゼの断片ωの相補性を容認するのに反して、組み換えクローンは、この培地上に青い着色がないこと示す。６クローンからのプラスミドＤＮＡの少量調製の後、それらは全て、ｐＢＫＳ＋の部位であるＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間に位置するＰｓｔＩ部位の消失を示す。１つのクローンが選択され、対応するプラスミドはｐＸＬ２５６３が指定される。クローン化された配列は、プライマー２０（５’−ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧ−３’（SEQ ID NO:16））を使用してシークエンシングすることにより確認される（Viera J. and J. Messing. 1982）。ｐＵＣプラスミド、挿入突然変異のＭ１３ｍｐ７由来系、プラスミドｐＢＫＳ＋(Stratagene Cloning System, La Jolla CA)用の合成された一般的なプライマー（Gene, 19,259-268）をシークエンシングする。プラスミドｐＸＬ２５６３は、Wizard Megaprepキット（Promega Corp. Madison, WI）によって精製される。このプラスミドＤＮＡは、以下の実施例で使用される。
【０２２５】
プラスミドｐＸＬ２５６３は、プラスミドｐＢＫＳ＋をも含んでいる溶液から、１．１で説明した、オリゴヌクレオチドと結合したＨｉＴｒａｐカラム上に精製される。この精製では、次の緩衝液を使用する。
緩衝液Ｆ：２Ｍ ＮａＣＩ、０．２Ｍアセテート、ｐＨ４．５〜５
緩衝液Ｅ：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
【０２２６】
カラムは、６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄され、プラスミドはカラムに塗り付けられ、室温で２時間培養される（４００μｌの緩衝液Ｆ内の、２０ｕμｇのｐＸＬ２５６３、及び２０μｇのｐＢＫＳ＋）。カラムは１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄され、その後緩衝液Ｅを用いて溶離が行われる。プラスミドは１％アガロースゲル上の電気泳動の後に検出され、臭化エチジウムで染色される。溶液中のプラスミドの割合は、大腸菌上のプラスミドの形質転換活性によって推定される。
【０２２７】
３０％のｐＸＬ２５６３及び７０％のｐＢＫＳ＋の混合から開始して、カラムの出口に１００％のｐＸＬ２５６３を含んでいる溶液が回収される。２６０〜２８０ｎｍのＯＤ割合が１．９〜２．５に上昇することから、本発明に係る方法によって夾雑タンパク質が除去されて、純粋だと推定される。
【０２２８】
≪実施例４≫
オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO：1））のカラムへの結合は、実施例３で説明したようにして行う。結合させるためには、オリゴヌクレオチドの５´端は、６個の炭素原子を含んでいるアームによってスペーサーのリン酸塩と結合されているアミノ基によって修飾される（Modified oligonucleotide Eurogentec SA, Belgium）。プラスミドｐＸＬ２５６３は、Wizard Megaprepキットを使用して精製される。この実施例では、次の緩衝液を使用する。
緩衝液Ｆ：０〜２Ｍ ＮａＣＩ、０．２Ｍアセテート、ｐＨ４．５〜５
緩衝液Ｅ：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
【０２２９】
カラムは、６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄され、４００μｌの緩衝液内に希釈されている１００μｇのプラスミドｐＸＬ２５６３は、カラムに塗り付けられ、室温で２時間培養される。カラムは１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄され、その後、緩衝液Ｅを用いて溶離が行われる。プラスミドは、２６０ｎｍで光学密度を測定することによって、定量化される。
【０２３０】
実施例では、結合は、ＮａＣＩのモル濃度が０〜２Ｍの間で変動する緩衝液（緩衝液Ｆ）内で行われる。ＮａＣＩのモル濃度が低いとき、精製量は減少する。結合緩衝液のｐＨは、４．５〜５の間で変動する。他の基礎ｐＨの溶出緩衝液を使用することも可能である。溶出は、５０ｍＭのホウ酸塩、ｐＨ９、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる緩衝液によって行われる。
【０２３１】
オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO：1））のカラムへの結合は、実施例３で説明したようにして行う。
プラスミドｐＸＬ２５６３は、Wizard Megaprepキット（Promega Corp., Madison, WI）を使用して精製される。この実施例では、次の緩衝液を使用する。
緩衝液Ｆ：０・１Ｍ ＮａＣＩ、０．２Ｍアセテート、ｐＨ５
緩衝液Ｅ：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
【０２３２】
カラムは、６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄され、４００μｌの緩衝液内に希釈されている１００μｇのプラスミドｐＸＬ２５６３は、カラムに塗り付けられ、室温で１時間培養される。カラムは１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄され、その後、緩衝液Ｅを用いて溶離が行われる。プラスミドは、２６０ｎｍで光学密度を測定することによって、定量化される。オリゴヌクレオチド・カラム内を通過する前及び後の、プラスミド試料内に存在するゲノム又は染色体大腸菌ＤＮＡの成分を測定する。ゲノムＤＮＡは、大腸菌内のプライマーを用いて、ＰＣＲによって定量化される。以下の手順では、これらのプライマーの配列は、Debouckらによって開示されている（Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853）。
５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＣ−３’（SEQ ID NO:17）
５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＴＯＴ−３’（SEQ ID NO:18）
【０２３３】
反応媒質としては、２５μｌのＰＣＲ緩衝液（Promega France, Charbonnieres）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＸＴＰ（Pharmacia, Orsay）、０．５μＭプライマー、２０Ｕ／ｍｌ Ｔａｑポリメラーゼ（Promega）がある。
【０２３４】
この反応は、次の配列によって行われる。
【０２３５】
５分、９５℃
【０２３６】
３０回繰り返される、１０秒、９５℃。
３０秒、６０℃
１分、７８℃
【０２３７】
増幅ＤＮＡ断片、長さ１２４塩基対は、 SybrGreen I（Molecular Probes, Eugene, USA）の存在下で、３％アガロースゲル上の電気泳動法により分離される。その後、大腸菌株Ｂ（Sigma, ref D4889）からの超高純度ゲノムＤＮＡシリーズを参照することにより定量化される。
【０２３８】
≪実施例５≫
この実施例では、「ミニプレップ（miniprep）」と呼ばれるスケールでの、細菌培養物のクリアな溶解物からのプラスミドＤＮＡの精製について説明する。一晩培養した、プラスミドｐＸＬ２５６３を含んでいるＤＨＳα株１．５ｍｌの遠心分離を行う。そして、ペレットは、１００μｌの５０ｍＭのグルコース、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の１０ｍＭのＥＤＴＡ内で再懸濁される。２００μｌの０．２ＭのＮａＯＨ、１％のＳＤＳを加える。チューブは混合のため反転される。３Ｍの酢酸カリウム１５０μｌ、ｐＨ５が加えられ、チューブは混合のため反転される。遠心分離の後、上清は回収され、オリゴヌクレオチド・カラムにロードされる（実施例１で説明したように）。結合、洗浄、及び溶離は、実施例３と同様である。１．５ｍｌの培養から約１ｇのプラスミドが回収される。アガロースゲル電気泳動法及び臭化エチジウム染色によって得られた分析されたプラスミドは、スーパーコイル環状ＤＮＡの単結合の形をとる。精製されたプラスミドには、高分子量（染色体）ＤＮＡ又はＲＮＡの痕跡が全く検出されなかった。
【０２３９】
≪実施例６≫
この実施例では、実施例５と同条件下で行う、プラスミドＤＮＡの精製について説明する。プラスミドｐＸＬ２５６３を含んでいるＤＨ５α株の細菌培養物２０ｍｌから始める。細胞ペレットは、１．５ｍｌ、５０ｍＭのグルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解される。溶解は、０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳにより行われ、１．５ｍｌの３Ｍの酢酸カリウムによって中性化される。ＤＮＡは、その後、３ｍｌの２−プロパノールによって沈殿させられる。そして、細胞ペレットは、０．５ｍｌの０．２Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５の０．１ＭのＮａＣｌに溶解される。そして、上記実施例で前述したオリゴヌクレオチド・カラムに装填される。結合、カラムの洗浄、及び溶離は、緩衝液の洗浄以外は、上記の実施例のようにして行う。Ｎａｃｌのモル濃度は、０．１Ｍである。
【０２４０】
アガロースゲル電気泳動法及び臭化エチジウム染色により得られ分析されたプラスミドは、スーパーコイル環状ＤＮＡの単結合の形をとる。精製されたプラスミドには、高分子量（染色体）ＤＮＡ又はＲＮＡの痕跡が全く検出されなかった。制限酵素によるプラスミドの消化により、期待された３キロ塩基の分子量の単結合が得られる。プラスミドとしては、サイトメガロ・ウイルス・プロモーター、発光酵素をコードしている遺伝子、及びプラスミドｐＸＬ２５６３由来のホモプリン・ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７（SEQ ID NO:15）を含んでいるカセットを使用することができる。このプラスミドを含んでいるＤＨ１菌（Maniatisら、1989）は、７リットルの発酵槽内で培養される。クリアな溶解物は、２００グラムの細胞から作成される。前記細胞ペレットは、２Ｌの０．２ＭＮａＯＨ、１％のＳＤＳが加えられた、２リットルのグルコース（２５ｍＭ、ｐＨ６．８、５０ｍＭ）、１０ｍＭのＥＤＴＡに溶解される。溶解物は、１リットルの酢酸カリウム（３Ｍ）を加えることにより中性化さる。透析濾過の後、４ｍｌのこの溶解物は、実施例３で説明した方法によって、オリゴヌクレオチド配列５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO:1）と結合した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳカラムに塗り付けられる。洗浄及び溶離は、上記した実施例で説明したようにして行われる。
【０２４１】
≪実施例７≫
この実施例ではオリゴヌクレオチドを支持するメチル化シトシンについて説明する。次のオリゴヌクレオチド配列が使用される。
５’−ＧＡＧＧＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＣＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴ−３’（SEQ ID NO:19）。
【０２４２】
このオリゴヌクレオチド配列は、５’端でＮＨ２基を保持する。ＭｅＣ＝５−メチルシトシン。このオリゴヌクレオチドは、実施例１の条件下で、ｐＨ５の結合緩衝液プラスミドｐＸＬ２５６３が精製されることを可能にする（そのため、プラスミドが分解する危険性は減少する）。
【０２４３】
≪実施例８≫
上記した実施例では、使用されるオリゴヌクレオチドは、６個の炭素原子を有するアームを介してリン酸塩と結合したアミノ基（ＮＨ２−（ＣＨ２）６）によって、５´端末側終端で修飾されている。オリゴヌクレオチドの結合及び通過（カラムへの）は、緩衝液Ｆ（２ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのアセテート、ｐＨ４．５）を使用してｍ実施例３で説明したようにして行われる。このオリゴヌクレオチドは、よりよい精製量を得ることを可能にする。同じ条件では、６個の炭素原子を有するオリゴヌクレオチドの精製量は４５％程度なのに対して、このオリゴヌクレオチドの精製量は５３％である。
【０２４４】
≪実施例９≫
実施例３で説明されたクローン手法の後、他の２つのプラスミドをキャリーするホモプリンン・ホモピリミジン配列が構成される。（ＧＧＡ）１６（SEQ ID NO:20）配列を含むプラスミドｐＸＬ２７２５と、（ＧＡ）２５（SEQ ID NO:21）配列を含むプラスミドｐＸＬ２７２６である。プラスミドｐＸＬ２５６３に類似するプラスミドｐＸＬ２７２５及びｐＸＬ２７２６は、次のオリゴヌクレオチドのペアを使用して、実施例３で説明されたクローン手法によって構成される。
５９８６：５’−ＧＡＴＣＣ（ＧＡ）２５ＧＧＧ−３’（SEQ ID NO:22）
５９８７：５’−ＡＡＴＴＣＣＣ（ＴＣ）２５Ｇ−３’（SEQ ID NO:23）
５９８１：５’−ＧＡＴＣＣ（ＧＧＡ）１７ＧＧ−３’（SEQ ID NO:24）
５９８２：５’−ＡＡＴＴ（ＣＣＴ）１７ＣＣＧ−３’（SEQ ID NO:25）
【０２４５】
オリゴヌクレオチドのペア５９８６と５９８７は、オリゴヌクレオチドのクローン作成によって、ｐＢＫＳ＋（Stratagene Cloning System, La Jolla CA）のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位で、プラスミドｐＸＬ２７２６を構成するのに使用される。また、オリゴヌクレオチド５９８１と５９８２は、プラスミドｐＸＬ２７２５を構成するのに使用される。プラスミドｐＸＬ２５６３の構成には、同じ実験条件が用いられ、オリゴヌクレオチドのペアが替わるだけである。同様に、クローン配列は、プラスミドのシークエンシングにより確認される。このことにより、プラスミドｐＸＬ２７２５は、１７回繰り返されるＧＧＡ配列の代わりに、目的とする配列に対して、修飾を保持するように見える。ＧＧＡＧＡ（ＧＧＡ）１５（SEQ ID NO:26）。
【０２４６】
≪実施例１０≫
これらのホモプリン配列と共に３重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは、実施例１で説明した方法によって、ＨｉＴｒａｐカラムと結合する。プラスミドｐＸＬ２７２５の精製には、５’−ＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ−３’（SEQ ID NO:27）配列のオリゴヌクレオチドが使用される。また、プラスミドｐＸＬ２７２６の精製には、５’−ＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’（SEQ ID NO:28）配列のオリゴヌクレオチドが使用される。したがって、実施例２で説明した方法によって、次の緩衝液を使用して、プラスミドを精製できる２つのカラムが得られる。
緩衝液Ｆ：２ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのアセテート、ｐＨ４．５
緩衝液Ｅ：１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ９、０．５ｍＭのＥＤＴＡ
得られる精製量は、ｐＸＬ２７２７及びｐＸＬ２７２６は、それぞれ、２３％と３１％である。
【０２４７】
≪実施例１１≫
この実施例では、プラスミド内に存在する特定配列の長さが精製量へ及ぼす影響について説明する。本発明に係る組成物の活性を実証するために、これらの実験で使用されるレポーター遺伝子は、発光酵素（luciferase：Luc）をコードしている遺伝子である。プラスミドｐＸＬ２６２１は、６６１−ｂｐのサイトメガロ・ウイルス（cytomegalovirus：CMV）プロモーター遺伝子を含んでいるカセットを含んでいる。前記ＣＭＶプロモーター遺伝子は、遺伝子の上流でクローン化された制限酵素ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって開裂させることにより、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen Corp., San Diego, CA）から抽出される（ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位で、ベクターｐＧＬ塩基性Vector（Promega Corp., Madison, WI）内に）。このプラスミドは、分子生物学における標準的な手法を使用して作成される。
【０２４８】
プラスミドｐＸＬ２７２７−１及びｐＸＬ２７２７−２は、以下の方法で作成される。
【０２４９】
２マイクログラムのプラスミドｐＸＬ２６２１は、ＢａｍＨＩによって線形化される。前記酵素は、６５℃で１０分間培養される。同時に、オリゴヌクレオチド６００６及び６００８は、既述したように、プラスミドｐＸＬ２５６３を作成するためにハイブリッドされる。
６００６：５’−ＧＡＴＣＴ（ＧＡＡ）１７ＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴ−３’（SEQ ID NO:29）
６００８：５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧ（ＴＴＣ）１７Ａ−３’（SEQ ID NO:30）
【０２５０】
このハイブリッド混合物は、プラスミドｐＸＬ２６２１のＢａｍＨＩ終端でクローン化される。そして、ＤＨＳαに形質転換した後、組み換えクローンは、ＰｓｔＩ制限酵素分析によって識別される（オリゴヌクレオチドはＰｓｔＩ部位を導入するため）。２つのクローンが選択され、クローン化断片のヌクレオチド配列は、シークエンシング反応プライマーであるプライマー（６２８２、５’−ＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧ−３’（SEQ ID NO:31））を使用して確認される（Viera J. and J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259-268）。
【０２５１】
第１のクローン（ｐＸＬ２７２７−１）は、１０回繰り返されるＧＡＡ配列を含んでいる。第２のクローン（ｐＸＬ２７２７−２）は、５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＧ（ＧＡＡ）７ＧＧＡＡＧＡＧＡＡ−３’（SEQ ID NO:32）配列を含んでいる。
【０２５２】
実施例３で説明したようなものであり、オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO:1）と結合するカラムが使用される。
【０２５３】
プラスミドｐＸＬ２７２７−１は、１４回繰り返されるＧＡＡ配列を含んでいる。上述した７回しか繰り返されない対応するハイブリッド形成配列を含んでいるオリゴヌクレオチドは、そのため、８つの異なる位置でプラスミドによってハイブリッド化される。一方、プラスミドｐＸＬ２７２７−２は、ハイブリッド化配列（ＧＡＡ）７（SEQ ID NO:36）を持っている（カラムに結合されるオリゴヌクレオチドの長さと同じ長さである）。オリゴヌクレオチドは、そのため、ｐＸＬ２７２７−２の１つの位置でのみハイブリッド化される。
【０２５４】
この実験は実施例４で説明したものと同一であり、次の緩衝液を使用する。
緩衝液Ｆ：２Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ アセテート、ｐＨ４．５
緩衝液Ｅ：１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
【０２５５】
精製量は、プラスミドｐＸＬ２７２７−１は２９％、ｐＸＬ２７２７−２は１９％である。
【０２５６】
細胞は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞が使用される。実験の前日に２４ウエル培養プレートに接種される（５０，０００細胞／ウエルで）。プラスミドは１５０ｍＭのＮａＣＩ内に希釈され、リポフェクタント（lipofectant）ＲＰＲ１１５３３５と混合される。リポフェクタント正電荷／ＤＮＡ負電荷の割合は６である。混合物は渦巻き、室温で１０分間そのままにされる。そしてウシ胎仔血清以外の媒体で希釈され、培養ウエルあたり１μｇのＤＮＡの割合で細胞に加えられる。３７℃で２時間後、１０％量／ウシ胎仔血清の量が加えられ、細胞は、５％のＣＯ２の存在下で、３７℃で４８時間培養される。細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、ルシフェラーゼ活性が測定される。前記測定は、Lumat LB9501照度計（EG and G Berthold, Evry）を使用して行われる（Promega kit, Promega Corp. Madison, WI）。実施例８．２で説明した方法で精製したプラスミドｐＸＬ２７２７−ｌは、Wizard Megaprepキット（Promega Corp. Madison, WI）を使用して精製したプラスミドと比べると、２倍のトランスフェクション量が得られる。
【０２５７】
≪実施例１２≫
この実施例は、三重らせん親和性クロマトグラフィを使用した、ｐＣＯＲ由来プラスミドの精製について説明する。この方法によって、核酸不純物（特にホストゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ）を従来のクロマトグラフィ方法では達成できなかったレベルにまで除去できることができる。
【０２５８】
三重らせん親和性ゲルは、クロマトグラフィ・マトリックスのSephacryl S-1000 SF（Amersham-Pharmacia Biotech）により合成される。Sephacryl S-1000は、まずは、０．２Ｍ酢酸ナトリウム内のｍ過ヨウ素酸塩ナトリウム（３ｍＭ、室温、１時間）によって活性化される。そして、オリゴヌクレオチドは、その５’−ＮＨ２端末部分を介して、活性化されたマトリックスのアルデヒド基と結合する。前記結合は、タンパク質の結合において前述したように、アスコルビン酸の存在下で、還元的アミノ化によって行われる（Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 1986,93, 83-88）。これらの実験に使用されるホモピリミジン・オリゴヌクレオチド（from Eurogentec, HPLC-purified）は、ｐＣＯＲプラスミドの複製起点（oriγ）に存在する１４ｍｅｒの短いホモプリン配列（５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’）（SEQ ID NO:10）に対して相互補完的である配列を持っている（Soubrier etal., Gene Therapy, 1999,6,1482-1488）。上述したように、ホモピリミジン・オリゴヌクレオチド配列は、５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO:11）である。
【０２５９】
次のプラスミドはクロマトグラフにかけられる。ｐＸＬ３２９６（トランス遺伝子を持たないｐＣＯＲ、２．０ｋｐｂ）、ｐＸＬ３１７９（ｐＣＯＲ−ＦＧＦ、２．４ｋｐｂ）、ｐＸＬ３５７９（ｐＣＯＲ−ＶＥＧＦＢ、２．５ｋｂｐ）、ｐＸＬ３６７８（ｐＣＯＲ−ＡＦＰ、３．７ｋｂｐ）、ｐＸＬ３２２７（ｐＣＯＲ−ｌａｃＺ、５．４ｋｂｐ）、及びｐＸＬ３３９７（ｐＣＯＲ−Ｂｄｅｌｅｔｅｄ  ＦＶＩＩＩ、６．６ｋｂｐ）。これら全てのプラスミドは、実施例４で説明したようにして、クリアな溶解物から２つの陰イオン交換クロマトグラフィによって精製される。ＣｓＣｌ内で超遠心分離法によって精製されるプラスミドｐＢＫＳ＋(pBluescript II KS + from Stratagene)、ＣｏｌＥｌ由来プラスミドについても検討される。使用される全てのプラスミドは、トポロジー状態でスーパーコイル状である（＞９５％）。
【０２６０】
各プラスミドＤＮＡ精製実験は、２ＭのＮａＣＩ６ｍｌ、０．２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．０）内の３００μｇのプラスミドが、上述したオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO:11）を含んでいる親和性カラムに、流速３０ｃｍ／ｈでロードされる。カラムを同じ緩衝液５容積で洗浄した後、結合したプラスミドを１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）によって溶出させる。そして、ＵＶ（２６０ｎｍ）及びイオン交換クロマトグラフィ（Millipore Gen-Pakカラムを有する、(Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37)によって測定する。回収された断片から復元されたプラスミドは、ｐＸＬ３２９６は２０７μｇ、ｐＸＬ３１７９は１９６μｇ、ｐＸＬ３５７９は１９２μｇ、ｐＸＬ３６７８は１３９μｇ、ｐＸＬ３２２７は９７μｇ、ｐＸＬ３３９７は７９μｇである。
【０２６１】
ＰＢＫＳがカラム上でクロマトグラフにかけられた際は、結合しているプラスミドは検出されなかった（＜３μｇ）。このことは、オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（SEQ ID NO:11）は、ｐＣＯＲ（ｏｒｉγ）内に存在する相補的な１４ｍｅｒ配列５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’（SEQ ID NO:10）と共に三重らせん構造を形成するが、ｐＢＫＳ内に存在する近縁種である５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’（SEQ ID NO:8）とは三重らせん構造を形成しないことを示している。このことは、単一の非標準的トライアッド（triad）（この場合はＴ＊ＧＣ）の導入によって、三重らせん構造は完全に不安定化することを示している。
【０２６２】
対照では、ｐＸＬ３１７９が、厳密に同条件で合成された（ただしオリゴヌクレオチドはない）ブランクカラム上でクロマトグラフにかけられた際は、プラスミド結合が観察されなかった（＜１μｇ）。
【０２６３】
ここに示した条件で、前記親和性精製を行うことにより、ｐＸＬ３２９６作成時の、ホストゲノムＤＮＡによる汚染濃度は、２．６％から０．０７％に減少した。同様に、同じ親和性カラムによってクロマトグラフした際は、ｐＸＬ３１７９作成時の、ホストＤＮＡによる汚染濃度は、０．５％から０．０８％に減少した。
【０２６４】
≪実施例１３≫
この実施例は、三重らせん親和性クロマトグラフィを使用した、ＣｏｌＥｌ由来プラスミドの精製について説明する。この方法によって、核酸不純物（特にホストゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ）を従来のクロマトグラフィ方法では達成できなかったレベルにまで除去できることができる。
【０２６５】
三重らせん親和性ゲルは、前述した実施例で説明したように、５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’(SEQ ID NO:9)配列を有するオリゴヌクレオチドを過ヨウ素酸塩が酸化されたSephacryl S-1000 SFと結合させることにより合成される。
【０２６６】
プラスミドｐＸＬ３２９６（トランス遺伝子を持たないｐＣＯＲ）及びｐＢＫＳ、ＣｏｌＥｌ由来プラスミドは、実施例９の条件で、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（SEQ ID NO:9）を含んでいる１ｍｌのカラム上でクロマトグラフされる。回収された断片から復元されたプラスミドは、ｐＢＫＳは１７５μｇ、ｐＸＬ３２９６は＜１μｇである。このことは、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（SEQ ID NO:9）は、ｐＢＫＳ内に存在する相補的な１２ｍｅｒの配列（５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’）（SEQ ID NO:8）と共に安定した三重らせん構造を形成するが、ｐＣＯＲ内に存在する近縁種である１２ｍｅｒの配列５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’（SEQ ID NO:8）とは三重らせん構造を形成しないことを示している。このことは、単一の非標準的トライアッド（triad）（この場合はＣ＊ＡＴ）の導入によって、三重らせん構造は完全に不安定化することを示している。
【０２６７】
≪実施例１４≫
以下の方法によって、種培養をErlenrneyerフラスコ内（unbaffled）で作成する。機能細胞バンクは、シード割合０．２％（ｖ／ｖ）で、Ｍ９ｍｏｄＧ５培地を含んでいるErlenrneyerフラスコ内に接種される。この株は、ロータリーシェーカー内で、２２０ｒｐｍ、３７℃±１、１８±２時間でグルコースを使い果たすまで培養される。その結果、２００ｍｌの種培養が得られる。前記培養の光学濃度はＡ６００約２〜３であると予想される。
【０２６８】
その後、第１の発酵槽での前培養が行われる。種培養は、Ｍ９ｍｏｄＧ５培地を含んでいるプレ発酵槽へ無菌で移動され、０．２％（ｖ／ｖ）のシードレート（seed rate）で、エアレーション及び攪拌しながら培養される。ｐＯ２は、４０％以上の飽和状態に保たれる。培養物は、１６時間後グルコースが消費されたら回収される。その結果、３０リットルのプレ培養物が得られる。前記培養物の光学濃度は、Ａ６００、約２〜３と予想される。
【０２６９】
その後第２の発酵槽でメインの培養物が作成される。３０リットルのプレ培養物が、シードレートが１０％（ｖ／ｖ）以上になるように、２７０リットルの殺菌されたＦｍｏｄＧ２培地を含んでいる発酵槽に、無菌で移動される。培養は、あるバイオマスにすべく、バッチモードで開始される。グルコース供給は、約４時間後に最初の糖が消費されたらすぐに開始される。エアレーション、攪拌、ｐＯ２
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（４０％）、ｐＨ（６．９±１）、温度（３７±１℃）、及びグルコース供給は、成長速度が０．０９ｈ−１に近くなるように制御される。培養物は、供給した約３５時間後に終了する。その結果、約４００リットルの培養物が得られる。前記培養物の光学濃度は、Ａ６００、約１００と予想される。
【０２７０】
細胞回収と呼ばれる第１の分離ステップが行われる。バイオマスは、ディスク・スタック（disk stack）遠心分離によって回収される。培養液は、使用済みの培養培地を除去するために３〜４フォルドに濃縮され、４００リットルの殺菌されたＳ１緩衝液内で継続的に再懸濁される。その結果、約５００リトルの調整前のバイオマスが得られる。ＤＣＷ＝２５±５ｇ／Ｌ。
【０２７１】
濃縮ステップと呼ばれる第２の分離ステップが行われる。Ｓ１緩衝液内での再懸濁／均一化の後、濃縮されたスラリーを生成するために、細胞はセパレーターによって再び処理される。その結果、約６０〜８０リットルの洗浄及び濃縮されたスラリーが得られる。ＤＣＷ＝１５０±３０ｇ／Ｌ、ｐＤＮＡ＝３００±６０ｍｇ／Ｌ。
【０２７２】
その後、凍結ステップが行われる。前記スラリーは、20-LFlexboyTMバッグに無菌で移される（バッグの容量の５０％を満たす）。そして、その後、−２０±５℃で冷凍される（さらなる後処理プロセスを行う前に）。その結果、冷凍バイオマスが得られる。ｐＤＮＡ＝３００±６０ｍｇ／Ｌ、スーパーコイル状形態＞９５％
【０２７３】
その後、細胞解凍ステップが行われる。冷凍されたバッグは、２０℃に暖められ、前記細胞スラリーは、４０ｇ／Ｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭＴｒｉｓ塩酸塩、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭグルコースに希釈される。そして、懸濁液は、細胞溶解前に２０℃で１時間攪拌される。その結果、バイオマススラリーは解凍される。ｐＨ＝８．０±０．２。
【０２７４】
このステップの間の温度は約２０℃である。
【０２７５】
その後、アルカリ溶解ステップが行われる。細胞溶解ステップは、希釈された細胞懸濁液は、０．２ＮのＮａＯＨ、３５ｍＭのＳＤＳ（溶液Ｓ２）と共に、インラインミキサーを介してポンピングされる。その後、コイル・チューブ内で、連続的接触ステップが行われる。連続的接触ステップにより、完全な細胞溶解とゲノムＤＮＡ及びタンパク質の変性とが確実に行われる。溶解された細胞の溶液は、冷却された攪拌層で回収される前に、冷却された３Ｍの酢酸カリウム−２Ｎ酢酸の溶液３（Ｓ３）とインラインで混合される。溶液３を加えることにより、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及びＫＤＳが沈殿する。
【０２７６】
その後、溶解物の濾過が行われる。中性化された溶解物は、その後、攪拌することなく、５±３℃で２〜２４時間培養される。そして、沈殿物資（綿状の相）の大半を除去するために、３〜５ｍｍのグリッドフィルタで濾過される。その後、濾過ステップをさらに向上させるための深層濾過が行われる。その結果、スーパーコイル状のプラスミドの濃度が９０％以上であるクリアな溶解物が得られる。
【０２７７】
その後、陰イオン交換クロマトグラフィが行われる。透明な溶解溶液は、目的とする伝導値５０ｍＳ／ｃｍとなるように精製水で希釈される。そして２層フィルタ（３μｍ〜０．８μｍ）によって濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィ・カラムにロードされる。カラムは、１１．０Ｌ Fractogel（Ｒ）TMAE HiCap（Ｍ）レジン（Merck;#1.10316.5000）が充填された３００ｍｍのものが使用される。透明な溶解溶液はカラムにロードされ、ＮａＣｌ勾配ステップを使用して溶離が行われる。カラムに結合した汚染物質の大部分は、約６１ｍＳ／ｃｍで、ＮａＣｌ溶液によって溶離する。そして、プラスミドＤＮＡは、約７２ｍＳ／ｃｍで、ＮａＣｌ溶液によって溶離する。その結果、陰イオン交換クロマトグラフィ溶出液は、高濃度のプラスミドＤＮＡを有する。
【０２７８】
その後、三重親和性クロマトグラフィが行われる。陰イオン交換クロマトグラフィ・カラムから溶出された溶出液は、約０．５容積の、４．８ＭのＮａＣｌを含んでいる５００ｍＭ酢酸ナトリウムによって希釈され、２ＭのＮａＣｌを含んでいる５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）によって平衡化された三重親和性クロマトグラフィ・カラムに送り出される。カラムの直径は３００ｍｍであり、１０．０ＬのTHAC SephacrylTM S-1000ゲル（Amersham Biosciences;Piscataway,NJ）を含んでいる。そして、カラムは、１ＭのＮａＣｌ及びＮＶ１ＦＧＦを含んでいる５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で洗浄され、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含んでいる１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）によって溶出される。その結果、三重親和性クロマトグラフィ溶出液は、高濃度のプラスミドを有する。
【０２７９】
その後、疎水相互作用クロマトグラフィが行われる。三重親和性クロマトグラフィ・カラムから溶出された溶出液は、３．６容積の溶液、３．８Ｍの硫酸アンモニウムを含んでいるＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）によって希釈される。０．４５μｍのフィルタによって濾過した後、ろ液は、９．０ＬのToyopearl（Ｒ）ブチル−６５０Ｓレジン（TosoH corp.,Grove City,OH）が充填された疎水相互作用カラム（直径３００ｍｍ）に６０ｃｍ／ｈでロードされる。そして、カラムは、硫酸アンモニウム溶液で２４０ｍＳ／ｃｍで洗浄され、ＮＶ１ＦＧＦは硫酸アンモニウム溶液で２２０ｍＳ／ｃｍで溶出される。その結果、ＨＩＣ溶出液には、リラックス形態が含まれない。
【０２８０】
本発明の好ましい実施形態では、さらなる透析濾過ステップが行われる。標準的な市販されている透析濾過材料は、当該技術分野では公知の標準的な方法に従って、このプロセスに使用するのに適している。好ましい透析濾過方法は、分子量がプラスミドのサイズに基づいて３０，０００〜５０．０００の範囲にカットオフされた透析濾過膜を使用した透析濾過である。この透析濾過ステップは、緩衝液交換が可能である、その後濃縮が行われる。ステップ１２の溶出液は、目標濃度が約２．５〜３．０ｍｇ／ｍＬとなるように接線流濾過（膜はカットオフされる、３０ｋＤａ）によって３〜４フォルドに濃縮される。そして濃縮物は、透析濾過によって一定容積（生理食塩水１０容積）で緩衝液交換され、生理食塩水によって目的のプラスミド濃度に調節される。ＮＶ１ＦＧＦの濃度は、濃縮物のサンプルの２６０ｎｍでの吸光度から算出される。ＮＶ１ＦＧＦ溶液は、０．２μｍのカプセルフィルタによって濾過され、次の処理まで、容器内で２〜８℃の涼しい場所で保存される。このことにより、スーパーコイル状のプラスミドの濃度が約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び好ましくは９９％であるプラスミドＤＮＡを有する精製された濃縮物が生成される。このプロセスによる全てのプラスミドの復元は、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、及び８０％
であり、復元の平均値は６０％である。
【０２８１】
≪実施例１５≫
上記した実施例の方法は、イオン交換クロマトグラフィ・ステップ、三重らせん親和性クロマトグラフィ・ステップ、及び、疎水相互作用クロマトグラフィ・ステップを含み、従来の公知の方法よりも、より高純度に精製されたプラスミドＤＮＡを作成することができる。この新規な方法によって作成されたｐＤＮＡは、従来の公知の方法よりも、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び内毒素の含有量が少ない。このことは表６示されている。これらの実験結果は、ＡＥＣ、ＴＨＡＣ、及びＨＩＣは、全ての不純物を除去するために２つのステップを組み合わせた場合と比べると、驚くほど高い精製量を提供することを示している。これらのステップの組み合わせは、他の生物学的物質（タンパク質、内毒素、ＲＮＡ、及びゲノムＤＮＡ）からのプラスミドＤＮＡの分離の有効性に関して、明らかな相互作用を提供する。開環プラスミドの場合も同様である。さらに、相乗作用ステップの組み合わせ、すなわち本発明に係るＡＥＣ／ＴＨＡＣ／ＨＩＣは、高純度の医療グレードのプラスミドＤＮＡを得るためだけではなく、高純度で完全にスーパーコイル化された（８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％以上の）プラスミドＤＮＡを構成することができる。
【０２８２】
≪実施例１６≫
イオン交換クロマトグラフィのステップ、三重らせん親和性クロマトグラフィのステップ、及び、疎水相互作用クロマトグラフィのステップを含む上記の実施例を、従来の公知の方法と比較した。図３に示すように、本発明に係る方法によって作成されるｐＤＮＡは、驚くべきことに、従来の公知の方法によって作成されるｐＤＮＡと比べると、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び内毒素の含有量が著しく少ない（サブｐｐｍの範囲である）。図４に示すように、本発明に係る方法は、最大１０ｇの製品品質が得られることを示す。
【０２８３】
≪実施例１７≫
実施例１４で説明した透析濾過のステップは、次の条件に従って行われる。ステップａ及びステップｂ用の緩衝液が最良の条件を決定するのに使用される
（ｉｉｉ）１２．５〜１３．０量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液Ｉ）に対する透析濾過（ステップａ）
（ｉｖ）３．０〜３．５量の生理食塩水賦形剤（１５０ｍＭ ＮａＣＩ）に対する、上記ステップａの残液（retentate）の第２の透析濾過（ステップｂ）
【０２８４】
本発明に係る他の透析濾過のステップは、硫酸アンモニウム及びＳＤＴＡを効率的に及び広範囲に除去する。また、この透析濾過のステップの後には、適切な標的ＮａＣｌ濃度（約１５０ｍＭ）と、最終的なＴｒｉｓ濃度（４００μＭ〜１ｍＭ）が得られる。プラスミドＤＮＡ組成物の例は、下記の表６に示す。
【表６】
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【０２８５】
≪実施例１８≫
ＬＳ０６と呼ばれるプラスミドＤＮＡ ＮＶ１ＦＧＦ ＡＰＩ（有効薬剤成分）の技術上のバッチは、実施例１７で説明した透析濾過方法によって、実施例１３に従って製造される。溶出液は、まず、約２ｍｇＡＰＩ／ｍＬで、約１３容積の緩衝液Ｉに対して透析濾過される。そして、その結果得られる残液（retentate）は、３容積の生理食塩水賦形剤に対して透析濾過される。最終的な残液は、その後、０．２μｍフイルタによって濾過され、１ｍｇ／ｍＬに調整される。最終的なＡＰＩ（ｐＨ７．２４）は、ＤＰ製造まで、Duranガラス瓶に５℃で保存される
【０２８６】
Duranガラス瓶（ＡＰＩ）、同様に製剤製造に使用される８ｍＬのガラス瓶に保存されていたＬＳ０６のサンプルに対して、安定性の試験が行われた。９０日後、＋５℃では、すべてのサンプルで脱プリン化及び開環はほとんど検出されなかった（０．３％）。９０日後、＋２５℃でも、同様に、ＬＳ０６サンプルの脱プリン化及び開環の割合は極めて低かった（＜１％／月）。
【０２８７】
この実験により、ｐＨ値が７〜７．５に保たれる本発明に係る組成物では、プラスミドＤＮＡ ＮＶ１ＦＧＦの安定性は、非常に安定的であることが実証される。脱プリン反応のレート及びプラスミドが切断されるレートは、一般的に、２５℃のときに協力促進される。本出願には、プラスミドＤＮＡが、ＲＴでさえ、非分解形態で長期間安定に保たれることを示している
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月10日(2011.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ｇＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物の含有率が、ｓｕｂ−ｐｐｍ（＜０．００００１％）であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ｇＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質不純物を含まないことを特徴とする組成物。
【請求項３】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって
細菌性ホスト染色体ＤＮＡを含まないことを特徴とする組成物。
【請求項４】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの含有率が、０．０１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの含有率が、０．００１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項６】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの含有率が、０．０００１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
染色体ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの含有率が、０．００００８％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ＲＮＡを含まないことを特徴とする組成物。
【請求項９】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ＲＮＡ不純物の含有率が、０．０１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ＲＮＡ不純物の含有率が、０．００１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ＲＮＡ不純物の含有率が、０．０００１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞ＲＮＡ不純物の含有率が、０．００００２％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞タンパク質不純物を含まないことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞タンパク質不純物の含有率が、０．０００１％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
ホスト細胞タンパク質不純物の含有率が、０．００００５％未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
内毒素不純物を含まないことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
内毒素不純物の含有率が、０．１ＥＵ／ｍｇ未満であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の医薬品用のプラスミドＤＮＡ組成物であって、
９９％以上の閉環状プラスミドＤＮＡを含んでいることを特徴とする組成物。