(57)【要約】【課題】免疫学の分野、および特に、選択的免疫ダウンレギュレーションと呼ばれる新規のおよび予測されない免疫調節を生成および適用するための手順または手順の組合せを用いる免疫応答系のダウンレギュレーションを含む免疫応答の調節のための新規のプロセスの提供。【解決手段】被験体において感染性細菌性物質に対する選択的免疫ダウンレギュレーションを生成するためのプロセスであって、選択的免疫ダウンレギュレーションを生成し得、かつ該感染性物質の成分またはそのフラグメントを含む試薬または試薬の組合せを該被験体に導入する工程を包含する、プロセス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学の分野、および特に、選択的免疫ダウンレギュレーションと呼ばれる新規のおよび予測されない免疫調節を生成および適用するための手順または手順の組合せを用いる免疫応答系のダウンレギュレーションを含む免疫応答の調節のための新規のプロセスに関する。
【０００２】
本出願に引用されるかまたは同定される全ての特許、特許出願、特許刊行物、科学文献などは、本発明が属する技術分野の状態をより完全に説明するために、本明細書によりその全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
免疫応答は動物およびヒトにおいて必須であるが、これらの応答の特定の所望でない結果が起こり得、そしてしばしば起こる。このような所望でない応答の例の部分的な列挙として、自己免疫疾患、血清病、細胞、組織および器官移植片の拒絶、所望される非天然成分の拒絶、特定の組織の免疫複合体に基づく破壊、アポトーシスまたは細胞死の誘導に基づく組織および細胞破壊、抗イディオタイプ抗体の特定の作用ならびに特定のアナフィラキシー応答が挙げられる。
【０００４】
この問題の１つの局面は、非天然の化合物、タンパク質または他の抗原物質（それらが置かれた被験体中に見出されない）、あるいは被験体の天然の構成成分であるが、いくつかの理由により免疫原性にされたタンパク質または他の抗原物質に対する所望でない免疫応答に向けられている。後者の場合において、これらの特定のタンパク質または他の抗原性物質は、多くの理由により免疫原性にされていたのかもしれない。これらは、新規の抗原決定基を発現するように改変され得る。異所部位の発現が発達され得るか、またはこれらのタンパク質の量さえも改変され、これらを免疫原性にする。
【０００５】
不要の宿主免疫応答が遺伝子治療の過程で起こり得る。免疫応答は、ベクターおよび／
または移入された遺伝子の産物中に存在する抗原に対して指向され得る。一般に、抗原の所望されない生成または提示が、任意のウイルスまたは非ウイルス性遺伝子送達系の使用から生じ得る。このような免疫応答は、トランスジーンの発現の持続時間を短縮し得、そしてこれらの遺伝子を回復するための形質導入の繰り返しを実質的に低減または阻害し得、したがって長期遺伝子治療に対して主要な障害を与える。
【０００６】
免疫応答における依存および信頼性は、必要でありかつ必要とされる一方、特定の免疫学的応答の望ましくない結果を予防または克服するためのストラテジーは、限定されそしてしばしば有効でない。一般に、免疫学的抑制方法および手順は、免疫系の全体的な抑制を導く。回避され得るのであれば、免疫系の全体的抑制により長期の免疫学的抑制が維持されることは、所望ではない。
【０００７】
一般的な免疫抑制とは対照的に、特定の抗原（例えば、アデノウイルス粒子）に対する耐性は、抗原が新生児または胎児に注入される場合に誘導され得る（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ：  ２７１：２６５３６−２６５３４  （１９９６））；  （Ｈａｇｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３：３０５６−６１  （１９９６））。しかし、この手順は、主要な制限を有する。胎児においてまたは誕生後
最初の数日間のみ（成人ではない）有効である。
【０００８】
別の寛容化プロトコルは、可溶性抗原の機能的胸腺への直接注入を含む（Ｈａｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ９８：２６４０−２６４７  （１９９６））。寛容化のこの様式は、成人の被験体には適用可能ではない。なぜなら、このような被験体は、活性な胸腺を欠失しているからである（成人ではない）。
【０００９】
特定の感染は、自己免疫応答を導き得、そこでは感染および／または非感染細胞の両方
が、所望でない免疫応答に供される。このような応答の例は、Ｂ型肝炎感染、ＨＩＶ感染、
およびリウマチ熱である。免疫応答の合併症は、感染のエレメントと混合しているので、現在これらの疾患に対して有効な治癒またはマネジメントストラテジーが存在しない。
【００１０】
さらに、被験体において免疫原性である多くの非天然の化合物（例えば、アデノウイルス）の使用はまた、これらの化合物および試薬に対する被験体の免疫学的応答に起因して限定または阻害される。
【００１１】
免疫学的調節は、試薬、手順、およびプロセスの導入に応答して被験体の免疫系において人為的に誘導される変化である。このような調節は、非天然の化合物に応答して順に起こる体液性または細胞性あるいはその両方である免疫応答に基づき得る。免疫学的調節は、免疫学的応答を広くまたは狭く抑制するために使用され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によって、以下が提供される：
（１）被験体において感染性細菌性物質に対する選択的免疫ダウンレギュレーションを生成するためのプロセスであって、選択的免疫ダウンレギュレーションを生成し得、かつ該感染性物質の成分またはそのフラグメントを含む試薬または試薬の組合せを該被験体に導入する工程を包含する、プロセス。
（２）前記感染性細菌性物質が連鎖球菌を含む、項目１に記載のプロセス。
（３）前記連鎖球菌が、リウマチ熱または糸球体腎炎の原因物質である、項目２に記載のプロセス。
（４）以下の工程を包含する移植プロセス：
ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、および組織適合性因子からなる群より選択されるメンバー
、または任意の前記のものの組合せを含むドナー抗原に対する選択的免疫ダウンレギュレーションをレシピエント被験体において確立する工程；および
該レシピエント被験体に、該ドナー由来の細胞、組織、もしくは器官、またはそれらの成分を導入する工程。
（５）以下の工程を包含する移植プロセス：
レシピエント抗原に対する選択的免疫ダウンレギュレーションをドナーにおいて確立する工程であって、該確立が、該レシピエント由来の細胞、組織、器官、またはそれらの成分を該ドナーに導入し、それにより、細胞、組織、器官、またはそれらの成分を該ドナーに移植する前に、該レシピエント抗原に対する選択的免疫ダウンレギュレーションを該ドナーにおいて確立することによって行われる、工程；および
その後に、該レシピエントに、選択的ダウン免疫レギュレーションを有する該ドナー由来の細胞、組織、器官、またはそれらの成分を移植する工程。
（６）前記レシピエント抗原が、免疫細胞、骨髄細胞、およびＴ細胞、または任意の前記のものの組合せからなる群より選択される、項目５に記載の移植プロセス。
（７）前記レシピエントの細胞、組織、もしくは器官、または成分が、免疫細胞または骨髄細胞またはＴ細胞からなる群より選択される、項目５に記載の移植プロセス。
（８）前記ドナー抗原が、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、および組織適合性因子、または任意の前記のものの組合せからなる群より選択されるメンバーを含む、項目５に記載の移植プロセス。
（９）被験体におけるクローン病を処置するためのプロセスであって、同種間供給源、異種間供給源、および自己供給源、ならびに免疫学的等価物またはこれらの組合せに由来する成分、細胞、組織、または器官を該被験体に導入することにより、炎症性の腸に対する選択的免疫ダウンレギュレーションを該被験体において確立する工程を包含する、プロセス。
（１０）膵臓細胞、インスリンレセプター、脂肪細胞、および肝臓細胞、またはこれらの成分からなる群より選択されるメンバーを含む非インスリンエピトープに対する選択的免疫ダウンレギュレーションを被験体において確立することにより、該被験体において糖尿病を処置する方法であって、該エピトープは、同種間供給源、異種間供給源、および自己供給源、ならびに免疫学的等価物またはそれらの組合せから選択される供給源に由来する、方法。
【００１３】
発明の要旨
選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）および免疫抑制を被験体において生成するための新規のプロセスおよびキットが本発明により提供される。新規のプロセスの中には、成人被験体において遺伝子送達成分に対するＳＩＤＲを生成するためのプロセスがある。ＳＩＤＲは、ＳＩＤＲを生成し得る試薬または試薬の組合せを導入することによって、このような被験体において生成される。
【００１４】
ＳＩＤＲを生成するための他の新規のプロセスおよびキットには、成人被験体が人為的に発現された遺伝子によってチャレンジされる（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）プロセスが含まれる。このよう
な他のプロセスおいて、ＳＩＤＲは、ＳＩＤＲを生成し得る試薬または試薬の組合せを導入することによって生成され、ここで、問題の遺伝子から人為的に発現される産物または産物フラグメントは、このような試薬または試薬の組合せへと処方される。
【００１５】
本発明は、成人被験体においてＳＩＤＲを生成するための新規のプロセスをさらに提供する。このプロセスは、遺伝子送達系およびこのような送達系によって人為的に導入された遺伝子由来の発現産物の両方に指向される。ＳＩＤＲを生成し得る試薬または試薬の組合せが、成人被験体中に導入され、これらの試薬または試薬の組合せは、遺伝子送達系由来の成分、および人為的に導入された遺伝子から発現された産物フラグメントを含む。このような新規のプロセスを行うために有用なキットもまた、本発明によって提供される。
【００１６】
本発明の別の独特な局面は、任意の被験体において広範な種々の感染性物質（細菌、ウイルス、および真菌を含む）に対するＳＩＤＲを生成するためのプロセスに関する。この局面において、試薬または試薬の組合せが被験体に導入され、ここで、この試薬または試薬の組合せはＳＩＤＲを生成し得、そしてこれらは問題の感染性物質（成分またはフラグメント）のいくつかの部分を含む。キットがまた提供され、ここではＳＩＤＲ生成試薬または試薬の組合せが、このプロセスを行うためのエレメントとして処方される。
【００１７】
本発明の別の重要な特徴は、免疫学的寛容性を、任意の被験体（例えば、ヒトのような哺乳動物）において生成するためのプロセスおよびキットに関する。この特徴において、被験体は、１つ以上の免疫調節処置または養生法（このうち少なくとも１つはＳＩＤＲでなければならない）に処置、曝露、または供される。他の処置はまた、ＳＩＤＲであり得るか、または一般的な免疫抑制または抗アポトーシスの形態をとり得る。
【００１８】
本発明はまた、任意の被験体において生物学的機能が可能であるかまたは生物学的機能を妨害し得る、広範に多様な範囲の非細胞性成分に対するＳＩＤＲを、任意の被験体において生成するための新規のプロセスに関する。これらのプロセスにおいて、ＳＩＤＲ能力を有する試薬または試薬の組合せが被験体に導入される。非細胞性成分は、多数でかつ多様であり、例えば、抗体、抗体／抗原複合体、抗体／抗原細胞マトリックス、酵素、抗腫瘍タンパク質、タンパク質阻害剤、レセプター、ホルモン、リガンド、エフェクター、インデューサー、およびこのようなものの組合せを含む。試薬または試薬の組合せは、ちょうど簡単に説明したような新規のプロセスを行うためのキット中に有用に処方され得る。
【００１９】
本発明の別の特徴は、任意の被験体において、天然の抗原または天然の抗原の群に対するＳＩＤＲを生成するためのプロセスに関する。そのようにＳＩＤＲを生成するために、被験体は、２つ以上の別個のかつ異なる免疫調節処置（このうちの１つは以下にさらに詳細に記載されるように経口寛容化でなければならない）を与えられ、またはそれに曝露、処置、もしくは供される。
【００２０】
他の新規のプロセスが、本発明において提供される。１つのこのようなプロセスは、巨大分子または化合物を被験体に投与することによる、被験体における免疫抑制生成に関する。巨大分子または化合物は、それ自体免疫原性であり、またはそれらは、被験体に免疫抑制を提供する能力を有する。この新規なプロセスにおいて、被験体は、巨大分子または化合物に対するＳＩＤＲ状態を得るために処置される。そのようにすることによって、これらの巨大分子または化合物の繰り返しの使用により、免疫応答が実質的にわずかなまたは非常に低減され得る。いくつかの場合には、免疫応答は、全ての意図および目的のために、巨大分子または化合物に関して遮断され得る。
【００２１】
別の新規のプロセスが提供される。そこでは、優性の選択的免疫ダウンレギュレーションを有するドナーから研究下の被験体へと非天然の細胞を移入させることによって、一過性のＳＩＤＲ状態が被験体において得られる。
【００２２】
本発明のさらなる局面において、任意の抗原または抗原の群（天然の抗原、およびドナーから研究下の被験体へ移入された他の抗原を含む）に対するＳＩＤＲを任意の被験体において生成するためのプロセスが提供される。この場合、免疫抑制を生成し得る非天然の化合物または非天然の免疫学的試薬が、被験体に導入される。導入の前または導入の間のいずれかで、または導入の前から導入までの期間および導入を含めてでさえ、被験体（ＳＩＤＲに供されている）は、抗原または抗原の群により曝露またはチャレンジされる。
【００２３】
移植プロセスが、本発明においてまた提供される。この移植プロセスは、ドナーの抗原に供されるレシピエントにおいて、選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、ここでこのような抗原は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、および組織適合性因子からなる群より選択される任意のメンバー、またはそれらの組合せである、工程、および次いでこのレシピエント被験体に、ドナー由来の任意の細胞、組織、器官、またはこれらの成分を導入する工程を包含する。
【００２４】
本発明はまた、移植プロセスを提供する。この移植プロセスは、レシピエントの抗原に対する選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）をドナーにおいて確立する工程を包含し、ここで、このレシピエントの抗原、ＳＩＤＲの確立は、レシピエント由来の任意の細胞、組織、器官、またはそれらの成分をドナーに導入することによって行われる。このようにして、ドナーにおけるレシピエント抗原に対する選択的免疫ダウンレギュレーションが、任意の細胞、組織、器官、またはこれらの成分の、ドナーへの移植の前に確立される。その後、選択的ダウン免疫レギュレーションを有するドナー由来の任意の細胞、組織、器官、またはこれらの成分が、レシピエントに移植され得る。
【００２５】
本発明はさらに、被験体においてクローン病を処置するためのプロセスを提供する。これを行うために、被験体における炎症性の腸に対する選択的免疫ダウンレギュレーションが、自己、非自己、または免疫学的等価物に由来する成分、細胞、組織、または器官を被験体に導入することによって確立される。
【００２６】
本発明の別の提供物は、被験体において非インスリンエピトープに対する選択的免疫ダウンレギュレーションを確立することによって、被験体において糖尿病を処置する方法である。この非インスリンエピトープは、膵臓細胞、インスリンレセプター、脂肪細胞、および肝臓細胞、これらの成分からなる群より選択される任意のメンバーを含む。このようなエピトープは、自己、非自己、または免疫学的等価物に由来する。
本発明のより詳細な説明および実施態様は、以下の本願の詳細な説明および好ましい実施態様の節において、より十分に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、組換えウイルスの２回目の注入後の、経口的寛容化ラット（群Ｂ）およびコントロールラット（群Ｃ２）由来の肝臓標本における、βガラクトシダーゼの発現を示す。
【図２】図２は、組換えウイルスの２回目の注入後の、ラット肝臓におけるヒトＢＵＧＴ１  ＤＮＡの存在の検出からのＰＣＲゲルの結果を示す。
【図３】図３は、組換えウイルスの２回目の注入後の、ヒトＢＵＧＴ１の発現のウエスタンブロット分析である。
【図４】図４は、組換えウイルスの２回目の注入後の、ビリルビンレベルに対する寛容化の効果の結果を示す。
【図５】図５は、組換えウイルスの１回目および２回目の注入後の、寛容化された群Ａ（黒塗りバー）および群Ｃコントロール（白抜きバー）における抗アデノウイルス抗体レベルを示す。
【図６】図６は、寛容化ラット（Ａ）における最小リンパ性浸潤、およびコントロールラット（Ｂ）における重篤な炎症を示す、２回目の注入後２４〜７２時間後に撮影された肝臓生検の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、組換えウイルスの２回目の注入後の、ラット肝臓におけるヒトＢＵＧＴ１  ＤＮＡの存在の検出からのＰＣＲゲルの結果である。
【図８】図８は、組換えウイルスの２回目の注入後の、ヒトＢＵＧＴ１の発現のウエスタンブロット分析である。
【図９】図９は、組換えウイルスの２回目の注入後の、ビリルビンレベルに対する寛容化の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、養子移入後の血清ビリルビンレベルを示すグラフである。
【図１１】図１１は、１回目の注入後のウサギからの肝臓標本における、βガラクトシダーゼ発現についてのカラー顕微鏡写真である。
【図１２】図１２はまた、１回目の注入の３週間後のウサギからの肝臓標本における、βガラクトシダーゼ発現についてのカラー顕微鏡写真である。
【図１３】図１３はまた、２回目の注入後の経口的寛容化ウサギからの肝臓標本における、βガラクトシダーゼ発現についてのカラー顕微鏡写真である。
【図１４】図１４はまた、２回目の注入後の非寛容化コントロールウサギからの肝臓標本における、βガラクトシダーゼ発現についてのカラー顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、特に、被験体の免疫応答システムを特異的にダウンレギュレートし得る新規な免疫調節プロセスを提供する。被験体において所望でないかまたは有害な免疫応答が特異的に抑制される免疫調節へのこの新規なアプローチは、選択的免疫ダウンレギュレーションまたはＳＩＤＲといわれてきた。
【００２９】
本発明は、この独特なＳＩＤＲ状態を生じさせるためのプロセス、キット、および試薬の形態の組成物を提供する。ＳＩＤＲを達成するにあたり、本発明は、新規な生物学的に機能的な非天然の化合物または非天然の細胞性物質の、哺乳動物（ヒト、または成人のヒトを含む）であり得る被験体への導入または取り込みを容易にするための免疫調節手順に頼る。本発明の別の局面は、免疫学的調節によって、感染性物質に対する免疫学的応答をこの感染性物質の増殖相（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ａｓｐｅｃｔ）から切り離す（ｕｎｃｏｕｐｌｅ）ことである。１つの免疫学的抑制アプローチのみによっては、被験体の免疫学的機構の有効な阻害はひとりでには導かれ得ないことは、本発明のさらなる局面および原理である。しかし、このような被験体において、独立しかつ別々の免疫抑制アプローチを組合せることによって、免疫機構の有効な阻害に近づくかまたは達成し得ることが、今回発見された。このような阻害状態において、そして免疫学的刺激（例えば、抗原または抗原群の導入）の存在下において、被験体の免疫機構は、この抗原に関してはもはやナイーブではないが、免疫応答ならびに免疫寛容の両方が起こり始めている。この免疫学的２重性（免疫応答性および免疫寛容）により、被験体は、寛容であることが所望される選択された抗原以外の全ての抗原に対して応答性になることが可能になる。免疫寛容の発達を許す一方で、免疫応答を阻害するに十分な免疫抑制の手順および処置を組み合わせて適用すれば、被験体はＳＩＤＲを発達させる。
【００３０】
いくつかの事例において、免疫機構を基本的に慣らし得る既知の免疫調節では、最適の結果を生じるに十分な所望の免疫学的効果および生物学的効果は生じ得ない。従って、本発明の別の局面は、少なくとも１つの経口的寛容化手順と、２つ以上のこのような免疫調節手順または処置さえも含み得る任意の他の免疫調節手順とを組み合わせることによって、このようなプロセスを改善することである。このような組合わせは、両方とも既知の特異的抗原に指向された２つの独立しかつ別々の選択的免疫ダウンレギュレーション手順の形態をとり得る。例えば、このような２つの選択的免疫ダウンレギュレーション手順は、経口的寛容化および選択的免疫抑制を含み得る。このような手順は、他の免疫調節手順（
例えば、免疫抑制薬、適切なサイトカイン、アジュバント、包合体、またはその組合せ）
の使用をさらに含み得る。
【００３１】
本明細書で使用する「選択的免疫ダウンレギュレーション」（ＳＩＤＲ）は、被験体が、特定の抗原または抗原の対（または他の免疫学的決定基）に対しては寛容（特定の免疫応答の妨害または抑制）を維持している一方で、同時に他の抗原、あるいは他のクラスの抗原または免疫学的決定基に対しては応答性を維持している、被験体の免疫学的状態または生物学的機構である。さらに、このような状態では、ＳＩＤＲは、ＳＩＤＲ状態の終止または終結に導く免疫学的プロセスまたは調節の後で、被験体において維持され得る。
【００３２】
本明細書で使用する用語「優勢」は、免疫ダウンレギュレーションまたはＤＩＤＲと共に用いられるときは、ＳＩＤＲの特定の形態をいう。ＳＩＤＲ状態が新しい被験体において優勢状態として伝達されそして発現され得る場合、次いでこのような状態は、優勢な免疫ダウンレギュレーション（ＤＩＤＲ）状態として定義される。
【００３３】
本明細書で使用する用語「一般的免疫抑制または抑制的」（ＧＩＳ）は、いずれの特定の抗原または抗原の対に対しても特異的ではなく、むしろ無差別、非特異的でかつ一般的である免疫応答の妨害を導き得る免疫調節試薬または手順をいう。このような免疫抑制は、この試薬または手順がそれ自体維持される場合は、一般に維持され得る。このような試薬または手順は、一過性で、反復して、または長期間にわたり投与され得る。
【００３４】
本発明によって提供される新規なプロセスの１つは、成人の被験体において遺伝子送達成分に対して選択的免疫ダウンレギュレーションを生じるためのものである。この新規なプロセスは、選択的免疫ダウンレギュレーションを生じ得る試薬または試薬の組合せを、成人の被験体に導入する工程を包含する。記載したプロセスのさらなる局面において、上記で定義された用語および状態についてＳＩＤＲは優勢であり得る。遺伝子送達成分は、広範な種々の形態（ウイルス（例えばアデノウイルス）および非ウイルス（例えば、タンパク質、リガンド、またはタンパク質様分子を含んでいる任意のタンパク質）を含む）を取り得る。
【００３５】
ＳＩＤＲを生じ得る試薬または試薬の組合せは、遺伝子送達成分の一部またはフラグメントを含み得る。ＳＩＤＲを生じる試薬または試薬の組合せの導入は、当業者に周知の従来の方法論および手順を使用して行われ得る。例えば、試薬または組合せは、被験体に連続的に導入され得るか、または一連の別々の投与で導入され得る。別々の投与は、固定した時間間隔、または場合によっては変化し得る時間間隔で記録され得る。試薬または試薬の組合せを導入するための投与およびプロトコルのさらなる記載については、参考は、Ｏｒａｌ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｗｅｉｎｅｒ  およびＬ．  Ｆ．  Ｍａｙｅｒ編、（１９９６），  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．（その内容は本明細書中に参考として援用される）になされる。
【００３６】
前述のプロセスの別の局面において、１つ以上の抗アポトーシス剤が成人の被験体に投与され得る。アポトーシスは、細胞自殺の進化的に保存された形態をいい、良く記載されている。例えば、Ｗｙｌｌｉｅら、「細胞死：アポトーシスの重要性」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，  第６８巻による総説の論説を参照のこと。また、Ｓａｃｈｓら、Ｂｌｏｏｄ，  ８２：  １５−２１  （１９９３），  Ｋｅｒｒら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２６：  ２３９−２５７  （１９７２）による総説の論説、およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６７：  １４５６−１４６２  （１９９５）によるより最近の総説の論説を参照のこと。前述は全て、本明細書中に参考として援用される。後者の文献は、１４５７頁にいくつかのアポトーシスのインヒビターを提供するので、特に有用である。これらのインヒビターまたは抗アポトーシス剤としては、多数の生理学的インヒビター、ウイルス遺伝子および薬学的物質、現在記載されているプロセスにおいて使用され得るもののいずれかまたは全てが挙げられる。特にアポトーシスについて扱う多数の教科書が、刊行されている。これらには、例えば、ＴｏｍｅｉのＡｐｏｔｏｓｉｓ：  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  第３巻  （１９９１）および第８巻（１９９４）；  ＫｒｏｅｍｅｒのＡｐｏｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｉｎｃ．  （１９９５）；  およびＧｒｅｇｏｒｙのＡｐｏｔｏｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，  （１９９５）が含まれる。前述の総説の論説および教科書の内容は、本明細書中で参考として援用する。このプロセスの特定の局面において、抗アポトーシス剤には、アポトーシス因子に対して指向する抗体またはサイトカイン（リンホカインを含む）に対して指向する抗体が含まれ得る。
【００３７】
このプロセスを行い、そして成人の被献体において遺伝子送達成分に対してＳＩＤＲを生じるために、本発明は、この目的に有用なキットを意図する。このキットは、遺伝子送達成分に対してＳＩＤＲを生じ得る試薬または特定の試薬の組合せを、パッケージングされた組合せまたは容器の中に備える。これらの試薬は、上記に記載されている。緩衝液および説明書は、このキットの他の従来の要素である。
【００３８】
本明細書中に提供されるなお別のプロセスにより、成人の被験体において、人為的に発現された遺伝子（成人の被験体の体内で発現されている遺伝子）に対してＳＩＤＲが生じる。このプロセスにおいて、試薬または試薬の組合せは、目的の遺伝子から発現された産物または産物のフラグメントに基づいて処方される。これらの試薬または試薬の組合せは、このように処方されたときに、成人の被験体においてＳＩＤＲを生じ得る。さらに、成人の被験体に導入される試薬または試薬の組合せそれ自体によって、優勢免疫ダウンレギュレーション（ＤＩＤＲ）が生じ得る。
【００３９】
人為的に発現された遺伝子に関しては、これは被験体に対して天然のものであっても天然のものでなくても良く、そしてウイルス性ではない。このような遺伝子のための送達システムは、ウイルス性（例えば、アデノウイルス）または非ウイルス性であり得る。本発明の他の新規なプロセスの場合、１つ以上の抗アポトーシス剤が被験体に投与され得る。これらの物質には、生理学的インヒビター、ウイルス遺伝子、および薬学的因子、またはその組合せ（上記または随所で記載されるような、アポトーシス因子またはサイトカインに対して指向する抗体）から選択される物質が含まれる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  （１９９５）前出を参照のこと。
【００４０】
本発明はまた、成人の被験体において、人為的に発現された遺伝子に対する選択的免疫ダウンレギュレーションを生じるに有用なキットを提供し、このキットは、成人の被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを生じ得る試薬、ならびに緩衝液およびそれについての説明書を、パッケージングされた組合せまたは容器の中に備える。
【００４１】
本発明によって提供されるなおさらに別の新規なプロセスは、ＳＩＤＲ、すなわち遺伝子送達システムまたはその成分、ならびに人為的に導入された遺伝子の発現による産物の両方に対して、成人の被験体において選択的な免疫ダウンレギュレーションを生じるためのプロセスを生じる。ここで、この遺伝子は、前述の遺伝子送達システムによって成人の被験体に導入されている。このプロセスには、成人の被験体にＳＩＤＲを生じ得る試薬または試薬の組合せを導入する工程が含まれる。試薬または試薬の組合せには、遺伝子送達システムの成分、および問題の遺伝子から発現した産物または産物のフラグメントが含まれる。上記の他の新規なプロセスの場合、このプロセスもまた優勢であり得るか、あるいは試薬または試薬の組合せは、ＤＩＤＲを生じ得る。遺伝子の性質（例えば、天然または非天然、ウイルス性または非ウイルス性）、遺伝子送達システムまたは成分（例えば、ウイルス性または非ウイルス性）、被験体（ヒトのような哺乳動物）、および抗アポトーシス剤（例えば、生理学的インヒビター、ウイルス遺伝子、および薬学的因子または抗体）を投与するさらなる局面は、すべて上述される。
【００４２】
記載したプロセスに関して、本発明はまた、成人の被験体において遺伝子送達された、または成人の被験体に人為的に導入された遺伝子の発現に対してもまたＳＩＤＲを生じるに有用なキットを提供する。このキットは、パッケージングされた組合せまたは容器の中に、（ｉ）選択的免疫ダウンレギュレーションを生じ得る試薬または試薬の組合せ、および（ｉｉ）１つ以上の抗アポトーシス剤、ならびに緩衝液およびその説明書を備える。後者の成分（ｉｉ）は、キットの最適な要素を表し、そして本明細書中上記新規なプロセスの特に好ましい局面のために設計される。
【００４３】
ＳＩＤＲの特に有用な適用には、感染性物質が含まれる。ここで、新規なプロセスは、任意の被験体（例えば、哺乳動物およびヒト）において感染性物質に対してＳＩＤＲを生じ、後者は多数の種々の形態およびタイプ（細菌、ウイルス、および真菌を含む）を想定している。ウイルス性感染性物質について適切な候補の中には、以下の群から選択されるものがある：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、１型および２型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、１型ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）。前述のウイルス性感染性物質のリストは、排除することを意図せず、そして他のものも非常に良く含み得る。
【００４４】
感染性物質またはそのフラグメントは、被験体の細胞マトリクスの中に含まれ得るか、またはこれらは細胞レセプターまたは被験体由来の抗体、あるいはこのような成分（単数または複数）、フラグメント、複合体などに由来する任意の包合体と複合体化され得る。
【００４５】
本明細書中上記の他の新規なプロセスの場合、このプロセスにおけるＳＩＤＲは、優勢であり得るか、または試薬または試薬の組合せは、ＤＩＤＲを生じ得る能力を有し得る。上記のＤＩＤＲについての定義を参照のこと。ＤＩＤＲは、被験体に感染性物質の少なくとも１つの成分またはフラグメント、または感染性物質の成分またはフラグメントを含んでいる細胞さえも投与することによって、もたらされるかまたは得られ得る。
【００４６】
ＳＩＤＲの一般的な原理および有用な適用に従って、ＳＩＤＲの被験体は、病原体に対する種々の化合物または薬物でさらに処置され得る。これらには、任意の抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、および抗真菌化合物が含まれる。抗ウイルス化合物は、以下の群の化合物である：化学治療剤、酵素インヒビター、およびインターフェロン。被験体において所望の効果を生じるに必要な有効量を含んでいるこのような化合物全ての性質、有用性、および供給源、ならびに投与は、当該分野で公知であり、そして本明細書中ではさらに記載しない。
【００４７】
以前に記載された他の新規なプロセスの場合、抗アポトーシス物質が、ＳＩＤＲを生じるプロセスの一部として被験体に投与され得る。さらに、少なくとも１つの免疫調節処置（例えば、一般的な免疫抑制およびＳＩＤＲ）が、このプロセスにおいて使用され得る。
【００４８】
感染性物質に対する記載したプロセスを行うためには、本発明はまた、被験体において感染性物質に対してＳＩＤＲを生じるに有用なキットを提供する。例えば、キットは、パッケージングされた組合せまたは容器の中に、ＳＩＤＲを生じ得る試薬または試薬の組合せを備え、そしてまた、問題の感染性物質の成分またはフラグメントを含む。緩衝液および説明書もまた、このキットに備えられ得る。
【００４９】
本発明の１つの非常に有用な適用は、他の従来の免疫調節処置と組み合わせてＳＩＤＲを使用することである。一般的な免疫抑制手順は、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンまたは他のこのような薬物）、または免疫細胞に対する抗体（例えば、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、ＯＴＫなど）、あるいはサイトカインまたは亜剥離用量の放射線照射）の形態をとる。ＳＩＤＲを導く免疫学的調節には、ＣＤ４またはＣＤ８抗体のような一般的な免疫抑制因子、または他の抗リンパ球抗体との組合せの使用による、特異的な寛容の発達が含まれる。一方で、特定の抗原性免疫抑制性化合物および薬物の連続的な存在下への被験体の曝露が文献に良く記載されている。例えば、ＢｅｎｊａｍｉｎｉのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ，  第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｚｔ，  Ｉｎｃ．  （１９９１）、第１９章「移植免疫学」、３４７〜３６７頁；およびＳｔｉｔｅのＢａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第７版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９１），  第６１章、「免疫抑制療法」、７６６〜７７９頁を参照のこと。この対象に対するより最近の教科書については、ＲｉｃｈのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｍｏｓｂｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  およびＳａｍｔｅｒ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第５版、Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｂｏｓｔｏｎを参照されたい。前述は全て、参考として援用する。
【００５０】
組合せ処置のアプローチの１つの局面として、本発明はまた、被験体において、遺伝子送達成分または被験体において人為的に発現された遺伝子、あるいは遺伝子送達成分およびこの遺伝子から発現した産物の両方に対して、免疫学的寛容を生じるためのプロセスを提供する。ここで、この新規なプロセスにおいて、被験体は、１つ以上の免疫調節処置（
この少なくとも１つは、ＳＩＤＲである）に曝露されるか、処置されるか、あるいは供される。他の処置は、一般的な免疫抑制、抗アポトーシス、およびＳＩＤＲから選択される。従って、別の局面において、２つの免疫調節処置を、記載したプロセスの目的のために展開し得る。例えば、ＳＩＤＲとＧＩＳ、ＳＩＤＲと抗アポトーシスとＳＩＤＲ、ＧＩＳと抗アポトーシスは、全て被験体において免疫学的寛容を生じるために有用に組み合わせ得る。
【００５１】
２つ以上の免疫調節処置を、遺伝子送達成分の投与または人為的に発現された遺伝子の発現の前、あるいはその両方に、投与され得る。あるいは、２つ以上の免疫調節処置を、遺伝子送達成分または人為的に送達された遺伝子の発現の後に投与され得る。あるいは、２つ以上の処置を、遺伝子送達成分または人為的に発現された遺伝子の発現と実質的にまたはほぼ同時に、投与され得る。別の局面において、被験体は、２つ以上の免疫調節処置に同時に曝露され得るか、または被験体は、別々の時点で処置に曝され得る。特定の試薬または薬物の濃度、投与の様式、モニタリング、投与の期間などを含む投与は、臨床的設定において日常的に対応し、そして従って、当業者に公知でかつ利用可能な情報を示す。
【００５２】
本明細書中に上述の他の新規なプロセスの場合、天然のＳＩＤＲ（例えば、優性またはＤＩＤＲ）、遺伝子送達成分（ウイルスまたは非ウイルス）、発現した遺伝子およびそこから発現された産物またはフラグメント（ウイルスまたは非ウイルス）、免疫抑制化合物（コルチコステロイド）、細胞傷害性薬物、シクロスポリンおよび抗リンパ球抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、および抗アポトーシス処置（生理学的インヒビター、ウイルス遺伝子、および薬理学的物質）、ならびに被験体（哺乳動物およびヒト）は、本明細書中に前述の任意の形態をとり得る。前述のプロセスにおいて、遺伝子送達成分は被験体に導入され得ること、および遺伝子は人為的に発現され得ることの両方がまた、注目されるべきである。
【００５３】
このプロセスに関連して、本発明はまた、被験体における、遺伝子送達成分または人為的な発現遺伝子に対するＳＩＤＲを生成するためのキットを提供する。パーッケージされた組合せまたは容器中に、キットは、ＳＩＤＲを生成可能な試薬もしくは試薬の組合せ、および被験体における一般的な免疫抑制、または抗アポトーシス効果、あるいは両方を生じるための少なくとも１つの他の手段を含む。緩衝液および説明書もまた、キットに含まれ得る。
【００５４】
本発明はまた、例えば、骨髄移植系におけるドナー細胞によるレシピエント細胞の拒絶を防ぐために、ドナー（移植におけるドナーの取り扱い）においてレシピエント細胞に対するＳＩＤＲを誘導するためのプロセスに適用可能である。さらに、成体における所望でない免疫応答の特異的な抑制は、本発明を用いて達成され得るかまたはアプローチされ得る。前記のように、これは、種々の手段の単独または組合せのいずれかによって達成され得る。好ましい態様において、ＳＩＤＲは、組換えウイルスベクターによって運ばれる抗原に対する免疫応答を抑制するために用いられ得る。寛容化は、ウイルスベクターの発現の過程の前または間に行われ得るか、または１つ以上のウイルス抗原に対する免疫応答が既に確立された後に行われ得る。
【００５５】
免疫学的寛容性は、標的動物の脾臓または肝門脈にウイルス抗原を直接注入することによって誘導され得る（寛容化）（Ｃａｎｔｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２１５：７４４−４６，  １９６７）。
【００５６】
本発明の無調節（ｉｍｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の方法および組成物に従う免疫学的決定因子は、１つ以上の抗原から構成される。これらの抗原は、被験体に関して、天然または非天然であり得る。それらは、天然または合成、改変または非改変、全体またはそのフラグメントであり得る。フラグメントは、フラグメントとしての合成由来であり得るか、または消化もしくはより大きな要素からフラグメントを作製するための他の改変の手段によるものであり得る。このような抗原（単数または複数）は、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、組織適合性決定因子、リガンド、レセプター、ホルモン、サイトカイン、細胞膜、細胞成分、ウイルス、ウイルス成分、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、細胞全体、組織、または器官を含むがこれに限定されない。抗原は、単一の分子または様々な個々の分子の混合物からなり得る。抗原は、ウイルス表面、細胞表面、膜、マトリックスの状況内で、またはレセプター、リガンド、抗体、または任意の他の結合パートナーとの複合体もしくは抱合体でそれ自身を提示し得る。このような抗原（単数または複数）は、被験体中に単独で、または送達、取り込み、安定性、応答性、もしくは標的化にさらに寄与し得る物質（単数または複数）とともに導入され得る。
【００５７】
本発明のいくつかの適用における抗原は、２つの独立した目的のために被験体に導入される。第１の例において、抗原は、被験体において選択的な免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）の状態を生成するために、適切なプロトコルの手段によってその被験体に導入される。第２の例において、抗原（非天然化合物）は、被験体において生物学的機能を提供するために、その被験体に導入される。ＳＩＤＲを生成するために用いられる抗原（単数または複数）と生物学的機能を有する非天然化合物との間に免疫学的等価性のみが存在し得る（すなわち、構造的にそれらは同一でなくてもよい）ことがさらに理解される。ＳＩＤＲの状態は、被験体において得られることがさらに理解され、ここで、被験体はＳＩＤＲの状態を生成するために用いられる免疫学的決定因子に対して寛容であるだけでなく、免疫学的決定因子を含む他の化合物に対してさらに寛容であり得る。
【００５８】
被験体における非細胞性免疫原性成分に対するＳＩＤＲの生成はまた、本発明の重要な局面である。従って、任意の被験体において、生育不能な免疫原性成分に対するＳＩＤＲを生成するためのプロセスが提供される。この成分は、その生物学的機能自体が可能であるか、または被験体における生物学的機能を妨害し得る。このプロセスにおいて、ＳＩＤＲを生成し得る試薬または試薬の組合せが、被験体に導入される。ＳＩＤＲは、前記のように優性であり得る。非細胞性免疫原性成分は、多数の様々な形態（抗体、抗体／抗原複合体、抗体／抗原細胞マトリックス、酵素、抗腫瘍タンパク質またはタンパク質インヒビター、レセプター、ホルモン、リガンド、エフェクターおよびインデューサー、または任意の前述のものの組合せを含むがこれに限定されない）をとり得る。抗体または抗体／抗原複合体の場合、これらは、天然においては、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。さらに、抗体は、免疫細胞における１つ以上のエピトープであり得る。単に例示する目的で、このようなエピトープは、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＯＴＫ、抗Ｔｈ、またはそれらの組合せを含み得る。免疫応答に関与する分子およびエピトープの議論については、Ｔｈｏｍｓｏｎ’ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９９２）を参照のこと。Ｔｉｌｎｅｙ’ｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  （１９９６）およびＫｕｂｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  （１９９６），第２４章、５７１−５７３頁もまた、参照のこと。両方の教科書は、参考として援用される。なおさらに、抗体は、多数のタンパク質または因子（例えば、アポトーシス因子、リンホカイン、サイトカイニン、および組織適合性因子（ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）、または任意のこのような組合せ）に関し得る。酵素が意図される場合、非細胞性免疫原性成分は、代謝産物または中間体の転換、消費、または分解に関与する代謝酵素を含み得る。このような代謝酵素は、十分に記載され、そして代表的なメンバーとしては、Ｌ−アスパラギナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビンオキシダーゼ、およびアデノシンデアミナーゼ、またはそれらの組合せが挙げられる。前述の酵素ならびに他の代謝酵素および抱合体の記載については、例えば、Ｍａｅｄａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３：１２８−１３９  （１９９２）を参照のこと。この論文は、参考として援用される。
【００５９】
また、本発明によって意図されるのは、非細胞性免疫原性成分を含むＳＩＤＲプロセスを行うためのキットである。キットはパッケージされた組合せまたは容器中に、生物学的機能を誘発し得る非細胞性免疫原性成分に相対してＳＩＤＲを生成し得る試薬または試薬の組合せを含む。
【００６０】
これらのＳＩＤＲ手順は、本発明の手順が特定の抗原に特異的である点で、免疫抑制を誘導するための以前の手順に対して非常に有利である。低分子の免疫サプレッサー（例えば、シクロホスファミド）、およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）またはインターロイキン１２（ＩＬ１２）またはインターロイキン４（ＩＬ４）などのような可溶性因子（Ｌｅｄｅｒｒら、Ｓａｍｔｅｒｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，第５版、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ，  （１９９５），  １２９−１４３頁）の全身的な投与は、免疫応答の特定の局面を抑制するが、上記のストラテジーが有する抗原特異性を欠乏する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  （１９９２），  Ｉｌａｎ  （１９９６）（前出））。
【００６１】
本発明の別の有用な適用は、遺伝子治療に関連する有用性を有する。一般的には、形質導入ウイルスとしてのアデノウイルスの使用は、標的生物における形質導入アデノウイルスの存在が、細胞性および体液性の免疫応答を導くので制限される。ベクター抗原決定因子またはトランスジーン産物において指向される宿主免疫応答は、遺伝子を生存する生物へ移入するための任意のウイルス性または非ウイルス性ベクターの使用を制限する潜在的な問題であり得る。これらのトランスジーンは、抗生物質耐性遺伝子、任意の選択可能なマーカー、または免疫学的に活性な産物を発現する遺伝子を含み得るがこれらに限定されない。ウイルスは、ＨＳＶ、ＨＩＶに基づく系、レトロウイルスに基づく形質導入ウイルス、ＭＭＬＶに基づく系、ＳＶ４０、ポリオーマ、ＨＢＶ、ＥＢＶ、ＶＳＶ、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス、ピコルナウイルス、ならびに動物における形質導入に用いられる他のウイルスを含むがこれに限定されない。
【００６２】
本発明はまた、非ウイルス性遺伝子送達系にまで及ぶ。なぜなら、これらの系がまた、免疫応答を惹起し得るからである。これらの非ウイルス送達系は、リポソーム、種々のカチオン性およびアニオン性脂質送達系、レセプター媒介性エンドサイトーシスを誘導する系、およびＤＮＡまたはＲＮＡ輸送系に基づく核酸の細胞の取り込みを促進する系を含み得るがこれに限定されない。本発明において、ＳＩＤＲおよび／またはＧＩＳプロトコルまたは他の適切な方法による寛容化剤としての抗原性キャリア（融合性ペプチド、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ヒストン、アルブミン、ポリリジン、多糖類、または他の成分からなる）を含む複合体の患者への投与は、可能な反復投与を行うことによって、長期間の遺伝子治療における有用性を見出す。一般的には、本発明は、免疫応答を誘導し得る任意の遺伝子送達のためのヒトまたは動物レシピエントを調製するために用いられ得る。
【００６３】
患者または動物が、既存の抗体、およびそれらに送達されることを所望される特定の抗原に対して指向された細胞傷害性リンパ球を有する場合、本発明は、抗原がアジュバントとして添加される前に、抗体応答の力価、Ｔ細胞媒介免疫応答、または免疫応答の任意の効果（アポトーシス、抗イディオタイプ応答、または何でもを含む）を低下させるために用いられ得る。この手順は、最初の提示に続いて提示される場合の試薬の残存時間（ｄｗｅｌｌ  ｔｉｍｅ）を増加し、また、標的細胞に達する複合体の能力を改善する。
【００６４】
例えば、多くの人々は、生涯の間にときどきアデノウイルス感染を経験し、そして循環における高い力価の抗アデノウイルス抗体を有し得る。これらの人々への組換えアデノウイルスベクターの注入は、有効な量の遺伝物質を、これらの被験体へ移入しないかもしれない。なぜなら、ウイルスは、標的細胞に達する前に中和されるからである。さらに、細胞に達するウイルスは、正常な免疫サーベイランス機構による形質導入した標的細胞の排除または細胞傷害性リンパ球の効果によるウイルスベクターのクリアランスを導く、免疫細胞応答を誘導する。以下の実施例の１つにおいて、動物がアデノウイルスに対して最初に免疫化され、その結果高い力価の抗体が誘導された場合、続くＳＩＤＲプロトコルは、静脈内注入した組換えアデノウイルスが寛容化動物の肝細胞において発現し得る程度まで抗体力価を減少させることが示される。経口寛容化プロトコルは、既存の抗体レベルを減少させ、そして新たな抗体の合成を排除する。そのうちに、抗アデノウイルス抗体の循環レベルは、排除される。
【００６５】
ＳＩＤＲは、形質導入核酸送達系およびトランスフェクション核酸送達系の一過性発現の時間を延長する効果を有する。形質導入アデノウイルスをＳＣＩＤのマウスに注入する場合、４または５カ月間形質導入遺伝子発現を観察することが、以前に示されている（Ｄａｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５：９２：１４０１−１４０５、参考として援用する）。これは、免疫応答性が重篤に制限される動物におけるアデノウイルス形質導入ベクターから予想される発現の長さの測定である。対照的に、アデノウイルスに基づく形質導入ウイルスを有するアデノウイルスに以前に曝露していない免疫学的に機能的な動物への注入後、形質導入遺伝子の発現は、約２カ月間のみ持続する（Ｄａｉ  （１９９５）前出）。従って、免疫応答は、ウイルスの形質導入遺伝子の一過性発現の期間を明らかに短くする。
【００６６】
Ｔ免疫調節細胞（Ｔｓ細胞）は、特定の抗原決定因子または特定のアロタイプもしくはイディオタイプの決定因子の存在のいずれかによって、誘導される。一旦、これらの細胞が誘導されると、宿主生物または適応性の生物の生存期間にわたって再活性化し得る記憶細胞として作用する（Ｈａｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２４：３０４，Ａ  １９９６）。
【００６７】
ＳＩＤＲが、経口寛容化によってもたらされるか、または得られることは決して見過ごされるべきではない。なおより重要なのは、ＳＩＤＲまたはＤＩＤＲはまた、選択的な免疫抑制を通してもたらされ得るという原則または観察である。このような選択的な免疫抑制（ＳＩＳ）は、任意の以下の免疫サプレッサーを含み得る：Ｔ細胞に対する抗体、免疫抑制薬物、およびサイトカインまたはそれらの任意の組合せ。Ｔ細胞に対する抗体は、代表的には、以下から選択され得る：抗ＣＤ４、抗ＣＤ８およびＯＴＫまたはそれらの組合せ。当業者は、選択的免疫抑制およびＴ細胞抗体の前述の簡単な一覧は、例示的でありそして決して徹底的ではないことを当然に理解する。
【００６８】
なお別の局面において、本発明は、被験体において、天然の抗原または天然の抗原群（例えば、自己免疫抗原）に対する選択的な免疫ダウンレギュレーションを生成するためのプロセスを提供する。この場合、プロセスは、被験体を、少なくとも２つの別々の免疫調節処置（このうち少なくとも１つは経口寛容化を含む）に供することを含む。このプロセスの一部として、天然の抗原または天然の抗原群は、被験体の細胞もしくは組織、またはそのフラグメント由来、あるいは抗体と複合体化した被験体の細胞もしくは組織またはフラグメント由来、あるいは任意の前述の部分的消化物由来である。代表的な抗原または抗原群には、コラーゲン、島細胞、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞、膵臓細胞、脾臓細胞、および核酸、またはそれらの組合せから選択されるものがある。抗原または抗原群はまた、細胞または組織（例えば、骨髄）器官または成分またはそれらのフラグメントを含み得る。このようなものは、ドナーの皮膚由来であり得るか、ドナーの皮膚から得られ得る。今記載されたプロセスにおける二番目の処置は、ＳＩＤＲ、ＧＩＳ、または抗アポトーシスを形成するために選択され得る。ＳＩＤＲは、別々の免疫調節処置の両方または全てに用いられ得る。
【００６９】
ちょうど記載したプロセスにおいて、１つ以上のサイトカインが被験体に投与され得るか、あるいは処置は前記のように投与され得る。例えば、別々の免疫調節処置は、単一投薬量または単一投薬量期間で反復して与えられ得るか、あるいは別々の投薬量期間で与えられ得る。さらに、処置は、互いに別々にまたは同時に与えられ得る。あるいは、処置は、投薬期間において部分的に重複して与えられ得る。このプロセスを実行し、そしてこれを特定の場合に適用するにあたって、被験体（哺乳動物およびヒトを含む）は、問題の抗原または抗原群に対して、感受性であり得るかまたはナイーブであり得ることに注意すべきである。本発明に独特な別のプロセスは、任意の被験体において免疫抑制を生じる。この場合、このプロセスは、高分子または化合物を被験体に投与する工程を包含し、ここで、これらの高分子または化合物は、免疫原性であるかまたは免疫抑制を提供し得、その被験体は、上記高分子または化合物に対するＳＩＤＲを得るために予め処置されていた。このことは、実質的にほとんどまたは全く免疫応答を伴うことなく、これらの高分子または化合物の反復使用を可能にする。
【００７０】
本発明は、移植の分野において特に有利である。例えば、特定の抗原に対してＳＩＤＲを被験体に一過性に生じさせるためのプロセスが提供される。このプロセスにおいて、非天然の細胞はドナーから被験体へ移される。ここで、このドナーは優性またはＤＩＤＲを有する。このプロセスの目的のために、被験体は、移入工程の前もしくは間、または移入工程の前および間さえ、免疫抑制され得る。
【００７１】
さらになお別の特徴において、本発明は、抗原または抗原群に対するＳＩＤＲを被験体に生じさせるためのプロセスを提供する。ここで、非天然の化合物または非天然の免疫学的試薬は、被験体に導入されたとき、免疫抑制を生じ得る。導入工程の前もしくは間、または導入工程の前および間、被験体は、問題の抗原または抗原群に曝される。ここで、この被験体は、非天然の化合物または非天然の免疫学的試薬に対するＳＩＤＲを受けている。抗原または抗原群は、被験体に対して天然であり得るか、またはドナーから被験体に移植され得る。ＳＩＤＲは、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＯＴＫを含む本明細書中上記のようなＴ細胞に対する抗体またはそれらの組合せを含み得る。他の薬物または生物学的エフェクター（１つ以上のサイトカインを含む）が、このプロセスと組み合わせて投与され得る。
【００７２】
他の新規なプロセスは、移植に関連する本発明の別の重要な局面として有用であり、そして役立つ。１つのこのような移植プロセスは、（ｉ）ドナー肝臓またはドナー肝臓由来の細胞、および（ｉｉ）ドナー由来の細胞、組織または器官を、レシピエント被験体へ導入する工程を包含する。ここで、移植されたドナー肝臓またはドナー肝臓細胞は、レシピエントによるドナー細胞、組織または器官の拒絶を阻害する。ドナー肝臓由来の細胞は、免疫細胞または樹状細胞を含み得る。ドナー細胞、組織または器官としての例は、腎臓、心臓、肺、膵臓、島細胞、皮膚、骨、または前述の任意のもの由来の細胞もしくは組織から選択されるメンバーである。
【００７３】
さらなる移植プロセスもまた、本発明により提供される。このプロセスにおいて、ＳＩＤＲは、レシピエントにおいてドナー抗原に対して樹立される。次いで、ドナー由来の細胞、組織もしくは器官またはそれらの成分が、レシピエント被験体へ導入される。このプロセスは、レシピエント被験体、ドナー、またはその両方のいずれかに施行され得る他の免疫調節処置で補充され得る。
【００７４】
本発明のさらなる移植プロセスは、ドナー由来の細胞、組織または器官をレシピエント被験体に移植する工程を包含する。このプロセスにおいて、レシピエント被験体は、少なくとも２つの独立した免疫調節処置を受けている。このうち少なくとも１つは、選択的免疫ダウンレギュレーションを含む。ドナー由来のこのような細胞、組織または器官は、骨髄を含み得る。
【００７５】
同種の生体もしくは屍体ドナーに由来する、器官（例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、膵臓、皮膚など）または単離された細胞もしくは細胞クラスター（例えば、肝臓細胞、膵臓島など）あるいは組織の移植は、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン）、アゾチアプリン、シクロホスファミド、特定の細胞傷害性試薬（例えば、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）または抗リンパ球モノクローナル抗体（ＯＫＴ３））など（通常、これらの組合せ）のような薬物での延長された全身化免疫抑制を必要とする。他の種由来の器官または細胞の移植（異種間移植）もまた企図されている。現在、全身性免疫抑制が、同様に、これらの手順に用いられるが、成功は限られている。延長された全身化免疫抑制は、被験体を、広範な種々の生物（細菌、マイコプラズマ、および真菌類を含む）およびウイルスにより感染され易いままにおく。これらの被験体はまた、悪性の腫瘍（例えば、リンパ種）を発症するかなりさらに高い危険にある。全身免疫サプレッサーエレメントに長期間曝す必要性を減少させるかまたは排除するためのストラテジーは、ドナー細胞、組織または器官中の免疫原性エレメントに対する免疫応答の特異的な免疫ダウンレギュレーションを誘導するプロセスと、１つ以上の全身免疫サプレッサーエレメントとの組合せを用いることである。これの１つの例は、レシピエントを同種移植片または異種移植片に対して寛容化するに適切な用量および適切な期間で、ドナー細胞の特定の組織適合性抗原または他の免疫原性成分を経口的に投与することである。これらの抗原は、ドナー細胞（例えば、血液細胞）から得られ得るか、または組換え技術によりインビトロで発現され得る。第２の組合せは、樹状細胞の移植（参考文献：Ｃｌａｒｅ−Ｓａｌｚｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｒｏｏｋｓ，Ｊ．、ｖａｎＨｅｒｌｅ，Ｋ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９０：７４１−７４８）に基づく特異的免疫ダウンレギュレーションに導く２つ以上の別個のプロセス、および上記のドナー物質の経口投与を用いることである。２つ以上の免疫調節剤が用いられ得る。患者を、長期間、免疫抑制剤を服用し続ける必要性から開放することによって、このアプローチは、感染およびリンパ種ならびに免疫抑制剤の他の副作用（例えば、腎毒性）の危険を避ける。
【００７６】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、非固形およびいくつかの固形の器官移植物の主要な合併症である。骨髄移植レシピエントにおいて、ＧＶＨは、罹患および死亡の主要な原因である。現在まで、この障害を処置するために採用される方策のほとんどは、患者の全身化免疫抑制を包含した。Ｔ細胞をドナー骨髄から除去する試みがなされてきたが、これらは、骨髄移植の成功にとって重要である、いわゆる移植片対腫瘍効果（ＧＶＴＥ）を減少させた。
【００７７】
本発明において、レシピエントへ向けられたドナーの特異的免疫ダウンレギュレーションが使用される。すなわち、レシピエントの主要組織適合性および／または他の抗原に対
するドナーの寛容化を用いて、ドナーの免疫細胞をレシピエント細胞物質に寛容にする。ドナー被験体は、ＧＶＨＤに最も一般に関与している種々の組織（例えば、皮膚、腸、および肝臓）から採られたレシピエント細胞物質または膜を食べさせられる。従って、ドナーを、レシピエントに対して免疫学的にダウンレギュレートされる様にすることにより、ＧＶＨは、除去され得るかまたは著しく軽減され得る。移植片対腫瘍効果（ＧＶＴＥ）は、非腫瘍物質とは異なる抗原を提示するレシピエントにおいて腫瘍細胞として減少されるとは予測されない。
【００７８】
移植拒絶を最小化または除去するための別のストラテジーは、肝臓を可能な寛容化器官として使用することである。肝臓が、摂食（ｆｅｅｄ）されたかまたは門脈中に注入された外来抗原に対する寛容性の誘導において役割を有し得ることは以前に示されていた。肝臓細胞の特定の集団（例えば、肝臓樹状細胞）は、外来抗原（同種間移植片関連抗原および異種移植片関連抗原を含む）に対して、選択的に免疫調節を誘導し得る、および／または免疫応答をダウンレギュレートし得る。ドナーの肝臓全体またはドナー由来の肝臓葉は、別の固体または非固体器官の側に移植され、そしてレシピエントに対して寛容性を誘導する。あるいは、ドナーの肝臓由来の細胞は、直接的注入を介して、または門脈もしくは脾臓中への注入を介してレシピエントの肝臓中に注入され、そしてこれはドナー移植物質に対する寛容性を誘導する。この手順は、単独で、または１つ以上の一般的な免疫抑制剤と、もしくは他の特定の免疫ダウンレギュレート剤と共に組み合わせて使用されて、レシピエント被験体中に移植された細胞、組織、または器官の安定性を保証または増強する。
【００７９】
移植において、レシピエントおよびドナーの両方は、特定の免疫ダウンレギュレーションを有し得る。この状態の下では、細胞、組織、および／または器官は、特定の免疫ダウンレギュレーションを通して以前にドナー寛容性にされた被験体に由来し得、そして特定の免疫ダウンレギュレーションにより次にまた耐性にされたレシピエント被験体中に配置される。このプロセスは、拒絶を除去または減少させる。この二重の手順は、移植された細胞、組織、または器官を支持するためのレシピエントの能力を増強するために種々の免疫抑制手順で達成され得る。
【００８０】
本発明のなお別の有用なプロセスは、任意の被験体に寛容性を誘導するプロセスである。寛容性は、第１の被験体へ第２の被験体からの細胞を移入することにより、第１の被験体において誘導される。ここで、ＳＩＤＲは、免疫細胞の移入により第２の被験体において既に確立されている。
【００８１】
寛容化が被験体に与えられていることを確立する必要性がある場合、これは、チャレンジ型のアッセイにより寛容化を直接評価することにより、または寛容性の誘導に関連する何らかの他のパラメーターを測定することにより間接的に、のいずれかで達成され得る。寛容化を評価する例示的な直接的方法は、被験体への抗原のインビボ導入および免疫応答の程度を測定すること（抗原に対する抗体レベルが測定された本発明の教示に記載されるように）、またはエクスビボでいくらかのリンパ球を取り出し、そして抗原刺激に対して応答するそれらの能力または潜在能力を評価することである。抗原チャレンジに対する免疫応答の程度の評価は、当業者に周知の種々の手段により実施され得る。寛容化の誘導は、寛容化が生じた場合に被験体において変化を受ける代理マーカーにより間接的に測定され得る。例示的なマーカーは、ＴＧＦβ１および他のサイトカインのレベルである（Ｈａｎｃｏｃｋら，  （１９９５）  Ａｍ  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １４７：  １１９３−１１９７，  参考として援用される）。
【００８２】
本発明の別の局面では、病原体により引き起こされる疾患の処置において有用であり得る方法が示される。ここで、このような病原体に対する免疫応答は、このような感染の病状において顕著な役割を果たし得る。ウイルス感染に対する免疫応答は、例えば、ウイルス感染細胞を殺傷することまたは適切なサイトカインを放出することにより身体からのウイルスのクリアリング（ｃｌｅａｒｉｎｇ）に作用するＣＴＬ活性に関連する。この応答は、ほとんどのウイルス感染において宿主の利益になるが、宿主に直接何の細胞変性効果も生じないいくつかのウイルスは、免疫応答の結果として、重篤な炎症性疾患を生じ得る。Ｂ型肝炎ウイルスのようなウイルスでは、このウイルスに対する免疫応答は、肝細胞損傷の主因であると考えられている。免疫応答は、亜急性もしくは慢性の肝炎、または急性の肝不全さえも生じるのに充分なほど強力であり得る。これらの全ては、乏しい予後を示す。
【００８３】
ウイルスの直接的効果と、ウイルスに対する応答により生じる間接的効果との間の区別は、ＨＢＶゲノムＤＮＡがラット中に移入されたインビボモデルにおいて実証されてきた（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９２：  １４７０−１４７４  （１９９５））。ラットはＨＢＶ感染に対していつでも感受性であるわけではないが、ラット肝細胞におけるウイルス複製の存在およびウイルス遺伝子の発現により実証されたように、この場合は感染が確立された。また、感染したラットの肝臓は、Ｂ型肝炎感染のヒトの症状と密接に似ている肝細胞損傷の広範囲な徴候を示した。これらは、上昇したレベルのグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（損傷した肝細胞から放出される肝臓酵素）ならびに肝細胞死およびリンパ球による浸潤を示す組織病理学を含んでいた。ラットにおけるこのようなＨＢＶ感染により生じる病状とは対照的に、無胸腺ラットは、このような病状、すなわち、肝細胞損傷の徴候はウイルス血症が存在し、そして正常ラットよりも長く存続していたとしても、全く示さなかった（Ｇｕｉｄｏｔｔｉら，  Ｊ．Ｖｉｒ  ６９：６１５８−６１６９  （１９９５））。
【００８４】
別のアプローチでは、それらの遺伝的相補体の一部としてＨＢＶ  ＤＮＡのコピーを含むトランスジェニックマウスが生成されている（Ｇｕｉｄｏｔｔｉら、１９９５）。これらのマウスは、ＨＢＶ遺伝子産物を媒介および発現するエピソーム複製性ＨＢＶ  ＤＮＡを含み、そしてＨＢＶ遺伝子産物を発現するそして正常な感染において見られるウイルス粒子に類似したウイルス粒子を放出する。だが、進行中の慢性のＨＢＶ感染への類似性にもかかわらず、肝臓は機能的であり、そして何の欠損および損傷の徴候も示さない。
【００８５】
これらの研究は、ＨＢＶ感染に対する免疫応答の非存在が、進行中のＨＢＶ感染の損傷効果を減少させることを示すのに役立つ。
【００８６】
本発明は、それ自身が、生じる病状に対する主要な寄与因子である、免疫応答を引き起こし得る病原体により引き起こされる疾患の処置のための組成物および使用方法を提供する。このような疾患に対して感染に抵抗する免疫学的能力を増強することを試みるための通常実施される治療手順とは対照的に、本発明は、病原体に対する免疫応答を除去または抑制し得る方法の使用による反対のアプローチをとる。従って、本発明は、ＨＢＶに対する寛容化による免疫応答の選択的抑制を提供する。ここで、これは、抗ウイルス免疫応答の誘導に関与するウイルス成分により達成され得る。これらは、表面タンパク質またはウイルスエンベロープ、コアタンパク質、プレＳ１およびプレＳ２タンパク質、ならびに他のウイルスタンパク質を含む。このような化合物は、それらのインタクトな天然の構造として、またはそれらのフラグメントとして提供され得る。ここで、これらは、化学的合成または組換えＤＮＡの方法により生成され得る。このような化合物は、精製形態、部分精製形態、または粗精製形態で提供され得、そしてインタクトな状態または部分的に消化した状態で使用され得る。このような化合物は、他の物質（例えば、さらに複合体化または結合され得るかさもなければ安定性またはより効率的な投与を提供するために改変され得る、アジュバントまたは送達系）と接触して投与され得る。この目的のための他の有用な要素は、死んだウイルスまたは不活化ウイルスを含む。このような化合物または要素は、経口的に、門脈内接種、寛容性の優性な移入などにより投与され得る。本発明の範囲においてまた有用であるのは、免疫系の選択されたセグメントを一時的に抑制する、抗体または他の試薬である。
【００８７】
末期の肝臓疾患をもたらす慢性ＨＢＶ感染は通常、有害な障害であるが、大部分の患者は、インターフェロンのような抗ウイルス剤の恩恵を受けることができない。本発明は、他の治療剤がウイルス感染自体の処置を提供するために使用され得てもされなくてもよいが、免疫系を永久的に抑制し得、それにより、任意の肝細胞損傷を抑止し得る。肝細胞損傷の大部分は免疫応答の結果であり、そしてウイルス自身は細胞変性性でないので、ウイルス血漿は有害ではないはずである。それゆえ、ＨＢＶ感染に関連する病状を除去または有意に抑制するための寛容化は、本質的に、慢性ＨＢＶ患者を、「健常な」キャリアへと形質転換する。感染しているＨＢＶへの「健常な」キャリアの応答は、何らかの主な合併症の発達を伴わずに一生ウイルスを保有するＨＢＶ感染患者の大部分に類似する。これらの症例において、免疫系は、ウイルスをクリアリングし得ず、そして患者はＨＢＶに対して寛容になったと考えられ得る。対照的に、慢性ＨＢＶ患者は、免疫系がウイルスをクリアリングしようとする試みの結果として、ウイルス感染肝細胞および非ウイルス感染肝細胞を損傷する患者である。この症例においてもまた、ウイルスに対して寛容化することによる慢性ＨＢＶ患者の「健常な」ＨＢＶキャリアへの形質転換は、肝細胞損傷を軽減または治癒させし得る。
【００８８】
ＨＢＶに対する寛容化はまた、肝臓同種移植を受けた患者におけるＨＢＶ再発を除去または減少させるために有用であり得る。現在では、ＨＢＶ再発は、ＨＢＶ関連疾患を有する患者における肝臓移植に対する主要な障害である；このような患者における再発率は、移植後の最初の年において２０〜９０％である。感染は、このウイルスの主要な保因者であるようであるＨＢＶ感染骨髄および末梢血リンパ球から生じると考えられる。肝臓移植後のＨＢＶ再発は、通常、免疫媒介されると考えられる重篤な肝臓傷害を伴い、そしてこれは通常、肝機能の迅速な悪化および死をもたらす。
【００８９】
ウイルスによる腫瘍の誘導に関与する正確なメカニズムは未知であるが、これは、肝臓細胞ゲノムへのウイルスの一部の組み込みならびに欠損性抗ウイルス免疫応答の関与を含むようである。従って、ＨＢＶへの免疫応答がウイルスの腫瘍形成性における役割を有する場合、ＨＢＶに対する寛容化は、肝細胞ガンの発達の提示に有用な利益を提供し得る。
【００９０】
本発明は、抗原性特性を有する治療剤のために有用な組成物および使用方法を提供し、ここで、このような物質が望ましくない免疫応答の危険性を伴わずに使用され得る。
【００９１】
外来因子および感染性因子に対する特異的な免疫応答は、健常な被験体の維持に必須でかつ有益の両方であるとして認識される。実際、感染性因子への免疫応答の誘導（ワクチン接種）および感染に直面した有効な免疫応答の促進は、所望されそして推奨される治療的レジメである。しかし、特定の例では、感染性因子に対する免疫応答は、所望されない結果（例えば、自己免疫応答、または感染したかもしくは感染していない細胞および組織の直接的もしくは間接的破壊）を導く。例えば、ＨＩＶ感染、ＨＢＶもしくはＨＣＶ感染、またはリウマチ性心臓疾患の場合、このような所望でない免疫の結果が観察される。このような問題にもかかわらず、感染性因子に対する免疫応答を制限または阻害することは推奨されない。それだけでは、所望でない免疫の結果ならびに感染性因子の脱増殖（ｄｅｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）の両方に取り組む有効な治療的レジメは存在しない。
【００９２】
感染の増殖局面から免疫学的応答を分離し、そして各々のものと独立して取り組むことにより、これらの感染の状態を処置する際に存在する限界（ｌｉｍｉｔｉｏｎ）を克服することは本発明の別の局面である。本発明の教示によれば、被験体（患者）は、所望であるかまたは必要である場合に、病原体に対する適切な化合物（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、またはウイルスタンパク質インヒビターもしくはウイルス複製インヒビターを含む抗ウイルス剤）の使用により感染の増殖局面と取り組む一方で、ＳＩＤＲおよびＧＩＳまたはそれらの組合せの状態を導かれ得る、１つ以上の免疫学的調節プロトコルで処置される。
【００９３】
ＨＩＶ感染は免疫系の破壊について注目されているとはいえ、ＣＤ４＋細胞の喪失が完全にウイルス感染の直接的効果によらないという証拠が存在するが、しかし、ＣＤ４＋細胞枯渇を担う自己免疫成分がまた存在し得る。これは、元々は１９８６年（Ｚｉｅｇｌｅｒ，  Ｊ．Ｌ．およびＳｔｉｔｅｓ，  Ｏ．，  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，  ４１；３０５）に示唆され、そしてこの概念のサポートが蓄積され続けている。例えば、チンパンジーはＨＩＶにより容易に感染され得るが、ヒトにおいて見られるようなＡＩＤＳに進行する徴候は存在しない。ヒトとチンパンジーとのＨＩＶ感染の間で注目されてきた重要な相違は、後者には細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が存在しないことである（Ｚａｒｌｉｎｇら，  （１９９０），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４；  ２９９２−２９９８）。対照的に、ヒトにおける感染は、ヒトおよびチンパンジー由来の非感染ＣＤ４＋細胞を溶解し得るＣＴＬの生成をもたらした。自己抗体のレベルとＣＤ４＋細胞の枯渇レベルとの相関もまた観察されている（本明細書中に参考として援用される、Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｃ．，Ｋｕｋｅｌ，  Ｓ．およびＢａｕｅｒ，  Ｒ．  （１９９３）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９；  ２４８−２５４）。
【００９４】
従って、ウイルス複製をブロックするために治療的手段が用いられるとはいえ、ＣＤ４＋細胞の進行中の破壊を維持する系が存在し得る。このような場合、本発明の教示を適用することにより、治療的利益が達成され得る。１つ以上の免疫調節プロトコルは、ウイルス抗原、または抗体と複合体化したウイルス抗原、または細胞レセプターと複合体化したウイルス抗原、または細胞マトリックス内のウイルス抗原に対するＳＩＤＲまたはＧＩＳ状態を誘導するために患者に投与される。
【００９５】
このような状態の患者は、自己免疫応答の減少、阻害、または除去を示す。患者は、プロテアーゼインヒビターおよび／またはウイルス複製のインヒビターを誘導する抗ＨＩＶレジメで維持される。このようなプロトコルは、適切なサイトカイン（本明細書中に参考として援用される、Ａ．  Ｆａｕｃｉ，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４；  ５２９−５３４により概説される）また
は特異的Ｔ細胞に対して指向される抗体が補充され得た。
【００９６】
ＨＩＶ感染を有する患者では、循環する抗体は、宿主に対して防御を提供しない。さらに、ウイルス抗原および抗原を模倣する抗イディオタイプ抗体の両方は、ＣＤ４＋細胞に結合し得、そしてこれらの細胞の機能を妨害し、そしてそれらのアポトーシスを誘導し得る。ＣＤ４＋レセプターへの結合を担うＨＩＶ粒子の成分は、ウイルスのｇｐ１２０タンパク質である。このタンパク質に基づく、ＨＩＶに応答する抗体を惹起するためのワクチンが作製されている（Ｅｒｏｎら  （１９９６）  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，  ３４８；  １５４７−１５５１）。しかし、疾患の進行において何の効果も見られなかった。
【００９７】
本発明の教示に基づけば、ＨＩＶタンパク質および／もしくは成分、ならびに対応する抗体もしくはレセプター（ＣＤ４）へのその複合体および抱合体、またはこのようなＨＩＶ抗原を含む細胞膜の適切な用量および持続期間での経口投与は、抗体レベルを減少させる。この段階の患者は、自己免疫応答の減少または阻害を実証する。さらに、これらの患者は、改善された免疫能力を示す。ＨＩＶ負荷は、現在入手可能な薬物での同時処置、または遺伝的アンチセンス療法を含む新規な方法により減少する。この手順は、ウイルス抗原に対する体液性応答の間に妨害性抗体を生成する任意のウイルスに一般化され得る。このカテゴリーに入り得るウイルスは、感染に応答する免疫応答を惹起するが、体液性または細胞媒介性免疫応答はウイルスの伝播に対して有効でないようであるウイルスを含む。このタイプの治療のための候補ウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＨＬＴＶ−１を含む。
【００９８】
本実施例では、ウイルスタンパク質（ｇｐ１２０またはそのフラグメント）は、ＨＩＶ抗原への経口寛容化の手段として感染患者に投与される。ウイルスタンパク質の生成方法および経口寛容化プログラムにおけるタンパク質の投与方法の詳細は、本発明の教示および「Ｏｒａｌ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」  Ｈ．Ｌ．  ＷｅｉｎｅｒおよびＬ．Ｆ．  Ｍａｙｅｒ編  （１９９６）  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄａｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．（この内容は、本明細書中に参考として完全に援用される）に記載される。この疾患のこの段階で患者が依然として機能的な免疫系を有する場合、このタンパク質により生成され得る自己免疫応答の上昇を減少させるはずであるウイルス抗原に対する寛容化が存在するはずである。
【００９９】
この二重処置プロトコルは、自己免疫系を休止させ続ける間も、ウイルスの複製および増殖のブロッキングを可能にする。処置の経過の間に患者がＧＩＳ状態にある場合は、有効な抗ウイルス増殖療法の後に、免疫抑制が、免疫系の休止を可能にしながら解放され得る。
【０１００】
本発明の局面は、患者が抗ウイルスプロトコルに維持される間、ＨＩＶが利用可能な標的細胞数をブロックするかまたは減少するための（そのためウイルスが増殖する機会を減少させる）本発明によって教示される免疫学的調節プロトコルを使用することである。方法が、Ｔ４細胞または他のＨＩＶ標的細胞の数またはそれらの生育速度を減少させることによるか、免疫調節プロトコルおよび試薬の使用によるか、またはＣＤ４＋または他の標的細胞レセプターをブロックする（抗ＣＤ４＋および／またはＯＫＴ３および／または抗マクロファージ抗体（例えばＣＤ１４＋）による処置）ことにより免疫系を可逆的にブロックするために使用される場合、ＨＩＶによる感染に利用可能な細胞数は、低下または減少するはずである。これは、抗ウイルス治療剤の影響を増加させる方法を可能にする。
【０１０１】
タンパク質およびポリペプチドのような化合物の投与による種々の疾患を処置するための取り組みは、効果的な治療を提供し得るが、特に、治療的物質が患者に非天然である場合、有用な利点は、治療的物質への免疫応答により減少され得る。本発明は、これらの制限を克服し、そして広範囲なそのような物質の使用への経路を開く。この利点は、そのような化合物による効果的なインビボ処置を提供する手段として、免疫調節の使用により達成される。使用する組成物および方法が、本明細書中で、体内に導入されるそのような治療的物質の一過性または延長した使用のために、要求されない有害な免疫応答の危険を伴わずに提供される。
【０１０２】
本発明の組成物と利用され得る治療的物質は、非天然であり、実用的でなく、免疫学的に認識される可能性を有し、そして生物学的機能を果たし得る。ここでそれらは、合成され得るか、天然であり得るか、クローン化され得るか、改変され得るか、または体内で、間接的または直接的に、細胞内または細胞外のいずれかで、生物学的機能を果たし得るか、または生物学的プロセスを干渉、阻害もしくは増強し得るアナログであり得る。そのような物質は、本明細書中で非天然活性化合物として呼ばれ、酵素、抗体、リガンド、補因子、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、およびアポトーシスを誘導するかまたは阻害する物質などを含む。
【０１０３】
このような非天然活性化合物は、体内で生物学的機能を果たし得るか、または（例えば、遺伝子治療の方法によって）人為的に提供されるそのような生物学的機能を含む１つ以上の生物学的機能を干渉、阻害、または増強し得る。非天然活性化合物は、血友病の特定のタイプにおけるこの欠失している成分を提供し得る非天然ＩＸ因子、ビリルビン濃度を減少するように作用し得る細菌性ビリルビンオキシダーゼ、心筋梗塞の結果として損傷を受けた（ｔｒａｕｍａｔｉｚｅｄ）心臓組織のような組織におけるフリーラジカルを除去し得る非天然スーパーオキシドジスムターゼ、腫瘍内のＬ−アスパガギン（ａｓｐａｇａｇｉｎｅ）を改変し、それによって腫瘍増殖を阻害するＥ．ｃｏｌｉアスパガギナーゼ（ａｓｐａｇａｇｉｎａｓｅ）、ＡＤＡ欠損の処置のためのウシアデノシンデアミナーゼ、ならびに、ポリメラーゼ、インテグラーゼまたは遺伝子送達構築物の成分として役立ち得る他の酵素を含む。
【０１０４】
抗体は、非天然活性化合物として有用であり得、ここでそれらはモノクローナル、ポリクローナルであり得るか、またはそれらはインタクトな天然のタンパク質またはそのフラグメントであり得、そして例えば１つ以上の他の抗体またはタンパク質とのキメラにおけるように改変され得る。非天然活性化合物として有用な抗体は、急性同種間移植片拒絶と戦うために末梢リンパ球を除去し得るＯＫＴ３のようなモノクローナル抗体、およびＨＩＶ感染個体におけるＣＤ４＋細胞の殺傷（ｋｉｌｌｉｎｇ）を制御する手段としてのＣＤ８細胞に対する抗体（米国特許第５，４２４，０６６号）、ならびに皮膚移植片の寛容性の促進に使用され得る抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗Ｔｈｙ、抗ＮＫのような他の抗体を含む（Ｚｈａｏ，  Ｙら，  １９９６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １１：  １２１１−１２１６）。上記の特許および論文の両方が、本明細書中に参考文献として援用される。他の有用な抗体は、ドナーの器官中で組織適合性決定因子をブロックする抗体、特定の組織もしくは器官を認識し、そして結合し、従って放射性画像化のために使用され得る抗体、特定の組織および器官に結合し、そして選択的細胞殺傷を提供するために特定の細胞傷害性物質（例えば、リシン）で改変され得る抗体を含む。
【０１０５】
エストロゲンおよびアンドロゲンのような非天然のホルモンは、アポトーシスの阻害のような有用な機能を提供し得る。非天然のサイトカインまたはリンフォカインは、有用な利点を提供し得る。
【０１０６】
このような非天然活性化合物は、それらの天然の構造またはそのフラグメントにおいて提供され得る。ここでそれらは天然物であり得るかまたは化学的合成もしくは組換えＤＮＡの方法によって生成され得る。非天然活性化合物は、精製、部分精製または粗精製物の形態で提供され得、そしてインタクトまたは部分消化状態で使用され得る。非天然活性化合物は、アジュバントのような他の物質あるいはレシピエント抗体および／もしくはレセプター、または細胞マトリックスとさらに複合体化または抱合化され得る送達系に接触してかあるいは協力して投与され得る。そのような化合物は、体内でのより長い半減期を提供するために改変され得る（Ｍａｅｄａ，  Ｈ．ら，  １９９２  Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ３：１２８−１３９）。非天然活性化合物は、細胞結合を提供するために、ビオチンのようなリガンドで改変され得る（下記実施例７を参照のこと）。
【０１０７】
本発明は、非天然活性化合物の投与を、そのような処置（そのような処置が一過性であろうとまたはそのような処置が延長された期間の間に繰り返し行われようと）の有効性を減少させ得る免疫応答のリスクを伴わずに提供する。従って、本発明は、身体の免疫応答を伴うことなく、これらの非天然活性化合物の効果的な生物学的機能を提供する。これは、本発明で提供される免疫調節（ここでそれは、一過性または短期間の処置における全体的な免疫抑制として使用され得る）および／または延長される処置の間、選択的免疫ダウンレギュレーションによって提供される寛容化によって達成され得る。いくつかの場合において、２つ以上のそのような免疫改変療法の組合せが有利であり得る。このような処置は、非天然活性化合物の投与の経過の前および／または間に適用され得る。従って、例えば、長期間投与の早期段階において非天然活性化合物に対する要求されない免疫応答の進展を妨げるために、処置の前にＳＩＤＲ処置を開始することが望ましくあり得る。あるいは、免疫調節を確立するための先行処置のいずれもしない時は、ＳＩＤＲ処置は、非天然活性化合物の投与と同時に行われ得る。この場合において、処置の初期の段階の間の免疫応答の進展を妨げるために、全体的な免疫抑制は、この期間中に使用され得る。個体が、非天然活性化合物に対する免疫応答を起こす既存の能力を有する場合、ＳＩＤＲはそのような化合物の投与前に開始し得る。あるいは、免疫調節を確立するために先行処置のいずれもしない時は、ＳＩＲＤは、非天然活性化合物の投与と同時に行われ得る。短期間に１回または非常に少ない回の処置が与えられる場合、全体的な免疫抑制は、寛容化の要求なしに有用であり得る。
【０１０８】
例えば、組換えアデノウイルスは、多くの研究者により体細胞性遺伝子治療において使用されている。（Ａｌｉら，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２４：３０４，Ａ  １９９６，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−３８４；  Ｊａｆｆｅら，  １９９２，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：３７２−３７８）。しかし、これらのベクターによって送達
される外来遺伝子の発現は、アデノウイルスのエピソーム性（Ｐｒｅｖｅｃら，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９８９：７０  ４２９−４３４；  Ｈｏｒｗｉｚら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９０：  １６７９−１７２１）および、より重要なことには、宿主の液性および細胞性免疫応答（Ｙａｎｇら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９５：６７：２００４−２０１５）の両方の理由からの限られた持続時間である。上記の論文および書物の全ては、参考として援用される。アデノウイルス感染細胞に対する宿主細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）は、アデノウイルス感染細胞をクリアリングし得、これは最初のウイル
ス注入後のインビボでのトランスジーン発現の持続時間を減少させる。アデノウイルスタンパク質への最初の曝露に応答して現れる中和抗体は、ウイルスの再注入に際して肝細胞への効率的な遺伝子移入を妨げる。
【０１０９】
組換えアデノウイルスは、ウイルスゲノムのＥ１領域への標的遺伝子の挿入によって生成され、従って、これはＥ１遺伝子を破壊し、そしてウイルス複製を不完全にする（Ｇｒａｈａｍら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９１：１０９−１２８）。温度感受性ＤＮＡ結合タンパク質の発現を生じるＥ２ａ領域の変異を含むウイルスの使用によるアデノウイルスベクターをさらに不自由化（ｃｒｉｐｐｌｅ）する試みがなされてきた。しかし、これらの「第２世代」アデノウイルスは、まだ強い抗ウイルス免疫応答を呼び起こし得る（Ｙａｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９４：７：３６２−３６９；  Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９４；  ９１：６１９６−６２００）。従って、注入（ｉｎｐｕｔ）組換えウイルスにおける抗原性負荷（ｌｏａｄ）はこの免疫応答の生成に十分なようである。従って、抗ウイルス免疫応答を調節する他の機構は、探求される必要がある。
【０１１０】
Ｔ細胞またはＴ細胞およびＢ細胞の両方の機能を欠損したヌードマウスおよびＳＣＩＤマウスにおける研究、ならびに、ＦＫ５０６、シクロスポリン、およびシクロホスファミドを含むいくつかの免疫抑制療法の使用は、より長い持続時間の遺伝子発現が、全身性免疫抑制により達成され得ることを示す（Ｈａｎら，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ（ａｂｓｔｒａｃｔ）２５：７３Ａ；  Ｄａｉ（１９９５）前出；  Ｆａｎｇら，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９５：６：１０３９−１０４４）。しかし、ヒトにおけるこれらの方法の適用性は、レシピエントにおいて誘導する全体的免疫抑制状態のために制限される。さらに、これらの方法では、ウイルスに対する既存の中和抗体の存在下で遺伝子を移入しない。
【０１１１】
本明細書中で提供される処置プロセスは、とりわけ自己免疫疾患に関連する徴候の処置に有用である。自己免疫障害の処置のために寛容化を利用する処置は、しばしば寛容化物質が罹患個体から得られるべきであるという必要性により厳しく制限される。現在の手順のさらに頻繁な制限は、腸の自己免疫疾患の処置についてのように、寛容化の先行する樹立による予防的な使用に必要である（Ｓｈａｒｍａｎｏｖ，  Ａ．Ｔ．  ら，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０６（１９９４）Ａ７７２；  Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｍ．Ｆ．ら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８３（１９９６）２６０５−２６１６）。このような予防的処置は、自己免疫応答の重篤度を軽減し得るが、それらは治療的ではなく、従って罹患個体には殆ど利点がない。本明細書中で記載されるように、選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）は、これらの制限を、同種間および異種間の供給源、ならびに自己の供給源に都合よく由来し得る寛容化物質、および罹患個体の処置における治療的使用の両方を提供することにより克服するのに利用され得る。
【０１１２】
また本明細書中に開示されるように、ＳＩＤＲは、ＩＢＤを妨げる手段を提供するために疾患症状がない個体に提供され得、またはそのような処置は、疾患症状の発症もしくは疾患症状の存在と同時に、処置のために治療的に使用され得る。ＳＩＤＲはまた、本願に記載の全身性免疫抑制のような治療の他の形態と組み合わせて使用され得る。
【０１１３】
また本明細書中で提供されるように、このようなＳＩＤＲで利用され得る寛容化物質は、例えば罹患個体、ならびに他の正常もしくは罹患個体由来、屍体組織由来または動物組織由来、または有用な抗原的および／もしくは免疫学的特性を持つ化合物を提供する他の供給源由来を含む多数の供給源より入手され得る。この目的における有用な化合物は、罹患個体または他の個体から、屍体組織からまたは動物組織から由来し得る病的なまたは正常な組織を含む。そのような寛容化物質は、組織全体あるいは（タンパク質、糖タンパク質、ペプチドもしくは糖ペプチドまたはその任意の組合せを粗製形態または精製形態で含む）その抽出物として使用され得る。寛容化物質は、ハプテンの添加によるかおよび／またはタンパク質分解性の処置により改変され得る。このようなタンパク質はまた、合成的または組換えＤＮＡの方法により調製され得る。このような化合物は、経口の経路によるか、注入もしくは胃への注入によるか、または本開示に記載の他の方法により投与され得る。
【０１１４】
本発明の組成物および方法は、消化管の主要な炎症性疾患である潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患の処置のためのＳＩＤＲを提供し得る。マウスにおける研究は、炎症性腸疾患の病状が、ＩＢＤを導く自己免疫プロセスの誘導を担う抗原性化合物（トリニトロベンゼンスルホン酸、ＴＮＢＳ）の経口投与により減少され得ることを示すが、そのような処置は、ＩＢＤの誘導の前に、健常な、病状のない動物に投与された（Ｓｈａｒｍａｎｏｖ，  Ａ．  Ｔ．ら，  １９９４；  Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｍ．Ｆ．ら，  １９９６）。本明細書中に開示されるように、ＳＩＤＲは、処置が、疾患症状の発症時または後に治療的態様で投与される場合、そのような病状の重篤度の顕著な減少を提供し得る。これは、ＩＢＤを担う自己免疫応答に関与する抗原性化合物、または同様の抗原性および／または免疫学的特性を持つ化合物の投与により達成され得る。このような化合物は、経口の経路によるか、注入もしくは胃、回腸への注入によるか、または本明細書に提供されるか、または開示される他の経路全てにより投与され得る。この目的のための有用な寛容化物質は、結腸の組織のような病的または正常な組織を含み、そのような組織は、罹患個体より、または他の正常もしくは罹患個体より、屍体組織または動物組織より由来し得る。
【０１１５】
ＩＢＤ処置のためのＳＩＤＲの使用は、ラットの研究において大腸炎罹患ラットの大腸から抽出されたタンパク質を、大腸炎がトリニトロベンゼンスルホン酸の大腸内への注入により誘導されたラットへ与えることによって実証され得る。そのようなＳＩＤＲが、大腸炎の誘導が与えられるのと同時にラットに投与された場合、症状の顕著な減少が観察された。経口の寛容化を受けていないが大腸炎を誘導するために処置されたコントロールラットと比較して、寛容化ラットは、下痢、潰瘍性大腸炎、腸または腹膜の障害、壁厚および浮腫の大腸炎症状の重篤度における顕著な減少を示した。
【０１１６】
本発明の組成物および方法はまた、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）のような自己免疫疾患の処置を提供する。ＩＤＤＭは、糖尿病状態の進展、進行、および維持において島細胞を破壊するための標的を与える複数の自己抗原（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，  Ｍ．Ａ．およびＭｃＬａｒｅｎ，  Ｎ．Ｋ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９２（１９９３）１６０８−１６１６）の島細胞における存在により特徴づけられる。ＩＤＤＭの症状を減少させるために寛容化する以前の試みは、経口的に投与されたインスリンまたはインスリンフラグメントを利用していた（Ｍａｒｏｎ，  Ｒ．ら，  Ｏｒａｌ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｈ．  ＷｅｉｎｅｒおよびＬ．  Ｍａｙｅｒ編，  ７７８巻、３４６−３５７頁）。ＩＤＤＭを導く自己免疫応答に寄与する島の自己抗原および他の非インスリンエレメントに対してではなく、インスリンに対する寛容化が糖尿病状態の開始および維持におけるこれらのエレメントの必須な役割を無効にする。疾患のプロセスにとって重要である細胞、組織もしくは器官またはそれらの画分もしくは抽出物を利用する直接的なインスリン非依存性手順は、ＩＤＤＭの効果的処置を提供し得る。このような細胞、組織または器官は、自己の供給源より入手し得るが、より都合よく同種間または異種間の供給源より入手し得る。従って、そのような寛容化物質は、脂肪細胞および島細胞を含む膵臓細胞、そのような細胞または組織の抽出物（タンパク質調製物を含む）を含み得る。そのようなタンパク質またはその画分は、シアロ糖脂質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリンレセプター、３８ｋｄ抗原、ウシ血清アルブミン、グルコーストランスポーター、カルボキシペプチダーゼＨ、インスリンレセプターなどを含み得る。
【０１１７】
本明細書中で提供されるＳＩＤＲのための組成物および方法は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の症状を減少または除去し得る。そのような処置のために、レシピエントの主要組織適合性抗原および／または他の抗原に対するドナーの寛容化、レシピエントの細胞材料に対してドナーの免疫細胞を寛容性にし得る。ＧＶＨＤの病状の減少を提供する手段としての免疫寛容のこのような誘導の例は、本明細書中に示される（そのような免疫寛容がマウスにおいてクラスＩＩＭＨＣ抗原を過剰発現しているレシピエントのリンパ球をドナーマウスに与えることによって確立される）。そのようなマウスは、未処理マウスと対照的に、ＧＶＨＤがドナーの脾臓細胞の注入によって誘導される場合、ドナー脾臓細胞への減少した応答を示す（混合リンパ球アッセイにおいて測定した）。本研究はさらに、次に続く実験の章における実施例１１に記載される。
【０１１８】
本発明のさらなる詳細は、β溶血性Ａ群連鎖球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの感染から生じ得るリウマチ性心疾患および糸球体腎炎のような自己免疫状態の処置および予防を提供する。ＳＩＤＲは、心臓障害または腎臓障害を生じる自己免疫応答を減少または除去するために投与され得る。ＳＩＤＲは、インタクトおよび不活化されたＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはその抽出物の形態において自己免疫抗原の投与により提供され得る。他の有用な寛容化物質は、適切な自己免疫抗原を含む屍体または動物組織を含む。上記寛容化物質の投与は、本明細書中の概略されるように、健常な個体におけるＲＨＤおよびＧＮの発症を予防する手段として、または罹患個体を処置するために行われ得る。ＳＩＤＲはまた、抗生物質治療を含む他の態様の処置と組み合わせて使用され得る。
【０１１９】
本発明は、被験体における感染性の細菌性物質への選択的免疫ダウンレギュレーションを生成するためのプロセスを提供する。このプロセスにおいて、試薬または選択的免疫ダウンレギュレーションを生成し得、かつそのような感染性物質の成分またはそのフラグメントを含む試薬の組合せが、被験体に導入され、それによって被験体における選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する。このプロセスでの使用のための好ましい感染性の細菌性物質は、特にリウマチ熱または糸球体腎炎の原因となる連鎖球菌の形態を含む連鎖球菌である。
【０１２０】
本発明の別の重要な局面は、クラスＩ  ＭＨＣ、クラスＩＩ  ＭＨＣ、および組織適合性因子からなる群より選択されるメンバーのいずれかまたは前述のメンバーのいずれかの組合せを含むドナーの抗原に対するレシピエント被験体における選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程を包含する移植プロセスに関する。被験体における選択的免疫ダウンレギュレーションの確立後、ドナー由来の細胞、組織、もしくは器官、またはそれらの成分は、レシピエントへ導入される。
【０１２１】
本発明の別の局面は、ドナーにおけるレシピエントの抗原への選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程を包含する移植プロセスである。選択的免疫ダウンレギュレーションの確立は、レシピエント由来の細胞、組織、器官、またはそれらの成分のいずれかをドナーに導入することによって実行され、それによって細胞、組織、器官、またはそれらの成分のいずれかをドナーへ移植する前に、ドナーにおけるレシピエント抗原に対する選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する。その後、選択的免疫ダウンレギュレーションを有するドナーの細胞、組織、器官、またはそれらの成分は、レシピエントへ移植され得る。レシピエント抗原として、免疫細胞、骨髄細胞およびＴ細胞からなる群より選択されるメンバーのいずれか、または前述のメンバーの任意の組合せが特に有用である。レシピエント細胞、組織もしくは器官、または成分は、例として免疫細胞、骨髄細胞およびＴ細胞からなる群より選択されるこれらのメンバーのいずれかまたはそれらの組合せを含む。
【０１２２】
記載された移植プロセスにおいて、ドナー抗原は、好ましくは、クラスＩ  ＭＨＣ、クラスＩＩ  ＭＨＣ、および組織適合性からなる群より選択されるいずれかのメンバーまたは前述のメンバーのいずれかの任意の組合せを含む。
【０１２３】
本発明はまた、被験体におけるクローン病を処置するためのプロセスを提供する。この処置プロセスにおいて、被験体におけるクローン病を示す炎症性腸に対する選択的免疫ダウンレギュレーションは、本開示の他で説明されるように、被験体に同種間供給源、異種間供給源、および自己の供給源に由来する成分、細胞、組織もしくは器官、または免疫学的等価物を導入することにより確立される。
【０１２４】
本発明の別の重要な局面は、被験体において被験体の非インスリンエピトープへの選択的免疫ダウンレギュレーションを確立することにより糖尿病を処置するプロセスである。そのような、非インスリンエピトープは、膵臓細胞、インスリンレセプター、脂肪細胞、および肝細胞またはそれらの成分からなる群より選択されるメンバーのいずれかを含み得る。これらのエピトープは、本開示の他で説明されるように、同種間供給源、異種間供給源、および自己の供給源、免疫学的等価物に由来する。
【０１２５】
続く実施例は、本発明の種々の局面を説明するために与えられる。これらの包含は、請求の範囲内でより詳細に記載されるような本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。
【０１２６】
好ましい実施態様の詳細な説明
【実施例】
【０１２７】
実施例１  組換えアデノウイルス抗原に対する経口寛容化の確立
外来抗原に対する腸の曝露は、抗原特異的Ｔ細胞のクローン不活化により、または抗原特異的エフェクター細胞の生成を抑制する調節細胞分泌因子の誘導により、抗原特異的寛容性を誘導することが示されてきた（Ｗｅｉｎｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７６２−１０７６５；  Ｖａｎｄｅｎｂａｃｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：８５２−９（１９９４）；  およびＨｉｒａｈａｒａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：６２３８−６２４５（１９９５））。従って、この実施例において、高用量および低用量の寛容化レジメンが使用され、そしてアデノウイルス抗原に対する経口寛容性の誘導が、Ｇｕｎｎラット（肝ビリルビンウリジン−ジホスホグルクロン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ−１（ＢＵＧＴ１）を欠失した株）を使用するモデル系において、宿主の抗アデノウイルス免疫応答を排除するために使用され得ることが実証された。
【０１２８】
動物：同系交配のＧｕｎｎおよび類遺伝子性の正常なＷｉｓｔａｒ  ＲＨＡラットを生育させ、そしてＡｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＭａｒｉｏｎ  Ｂｅｓｓｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＳｐｅｃｉａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅに維持した。ラットを、標準的な研究室食餌で維持し、そして１２時間の明／暗のサイクルに保った。
プラスミド：ｐＪＭ１７が、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ博士（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｃａｎａｄａ）
から好意により提供された。
組換えアデノウイルスの生成：２つの組換えアデノウイルスＡｄ−ｈＢＵＧＴ１およびＡｄ−ＬａｃＺ（それぞれヒトビリルビン−ＵＧＴ１およびＥ．ｃｏｌｉ  ｂ−ガラクトシダーゼを発現する）を、以前に記載された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ（１９９６）前出）ように生成した。簡潔には、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子のためのプロモーターおよびエンハンサー配列、ヒトＢＵＧＴ１またはＥ．ｃｏｌｉ  ｂ−ガラクトシダーゼの構造領域、ならびにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルからなる転写ユニットを、ヒトＡｄ−５のＥ１領域に組換えて、複製欠損「第一世代」アデノウイルスを生成した。大規模の調製のために、組換えアデノウイルスを２９３懸濁細胞上で増殖させ、そして２回の連続的なＣｓＣｌ密度勾配遠心分離により細胞溶解物から精製し、そして３０％グリセロール中で−２０℃で保存した。ウイルスを、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１０％グリセロールを含む等張溶液で、４℃で一晩透析し、使用の前に０．４５μｍフィルターを通しての濾過によって滅菌した（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（１９９０）前出）。
ウイルスタンパク質抽出物の調製および投与：主要アデノウイルス構造タンパク質（主に繊維、ヘキソン、およびペントン）を含むＣｓＣｌ勾配上清を回収し、そしてタンパク質濃度を決定した（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：  ６８２−６９４  （１９６９）；  Ｍａｚｅｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６：  １２６−１３６  （１９６８））。エーテル麻酔下で、ポリエチレンカテーテル（ＰＥ１０）を、中線切開を通じて胃に挿入した。チューブを十二指腸に進ませ、そして胃壁に貼り付けた。カテーテルの他の末端を、皮下トンネルにより頚部の背側で体外に出した。研究の全体にわたり、各ラットを別々の篭に保った。タンパク質抽出物をカテーテルを通じて一日おきに２１日間導入した（全１１用量）。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
ＧｕｎｎラットへのＡｄ−ｈＢＵＧＴ１およびＡｄ−ＬａｃＺ注入：各群が１０匹の動物からなる、Ｇｕｎｎラットの５群を研究した。ＡおよびＢ群には、１日おきに１ｍｇ／ラットの用量でアデノウイルスタンパク質抽出物で給餌され、次いで、１日目および９８日目におけるＡｄ−ｈＢＵＧＴ１（５×１０９ｐｆｕ）の２回注入（Ａ群）、あるいは１日目におけるＡｄ−ｈＢＵＧＴ１、続いて９８日目におけるＡｄ−ＬａｃＺの２回注入（Ｂ群）で給餌したラットが含まれた。２群のラットをコントロールとして使用した：Ｃ群は１ｍｇ／日でウシ血清アルブミンを受け、次いでＡ群（５匹のラット、Ｃ１群）またはＢ群（５匹のラット、Ｃ２群）について記載されたようなウイルス注入を受けた。Ｄ群は、経口タンパク質を全く受けず、そしてＡ群と同様にＡｄ−ｈＢＵＧＴ１で注入された（表１）。寛容性の機構を評価するために、そして抑制細胞の誘導とクローン不活化とを区別するために、Ｅ群のラットを５０ｍｇ／日（５匹のラット）、または１００ｍｇ／日（５匹のラット）のウイルスタンパク質抽出物（高用量レジメン）で給餌し、続いてＡｄ−ｈＢＵＧＴ１で２回注入した。
【０１３１】
免疫寛容性の評価
肝臓組織学：肝炎の程度の評価のために、肝臓生検を、各処置群由来の２匹のラットにおいて２回目の注入の１週間後に行い、そして１０％のホルムアルデヒド中に維持した。次いで、パラフィン切片を、標準的な手順に従ってヘマトキシリン−エオシンで染色した。
切片を、以下のように肝炎についてグレード分けした：グレード０：正常；グレード１：穏やかな、門脈周囲または病巣小葉リンパ球浸潤；グレード２：リンパ球浸潤の小葉への拡大および「断片的壊死」；およびグレード３：「架橋壊死」による小葉構造の崩壊、ならびに門脈から中心、門脈から門脈、および中心から中心領域へのリンパ球浸潤の拡大。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル：肝炎の程度の測定として、ＡＬＴレベルを市販のキット（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を用いて定量化した。
抗アデノウイルス抗体の中和：処置されたラットの血清に存在する抗アデノウイルス中和抗体を、Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１注入を受けた全てのラットにおいて、２８、７８、１１２、および１９６日目に測定した。２９３細胞を９６ウェルプレートに３×１０４／ウェルの濃度で播種し、そして９０％のコンフルエントまで培養した。Ａｄ−ＬａｃＺを細胞培養培地で希釈して、３×１０５ｐｆｕ／１０ｍｌにした。血清サンプルを５５℃で３０分間加熱して不活化し、そして２段階で培地中に希釈した。１００ｍｌの各血清希釈物を組換えウイルスの５×１０５ｐｆｕと混合し、３７℃で９０分間インキュベートし、そしてほとんどコンフルエントな２９３細胞に１０〜１４時間適用した。次いで、血清およびウイルスを含む上清を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地により、１８時間で置換した。
細胞を固定し、そしてｂ−ガラクトシダーゼ発現について染色した。中和抗体の非存在下で、全ての細胞が青色に染色された。各血清サンプルについての中和抗体力価を、細胞の２５％未満が青色に染色される最も高い希釈として報告した。
細胞障害性Ｔリンパ球アッセイ：各群由来の２匹のラットを２８、７８、１１２、および１９６日目に研究した。脾臓を、各時点で各２匹のラットから麻酔下で取り出し、そして動物を再縫合した。組織を、ラバーポリスマンを用いて穏やかに破壊した。赤血球を、ｐＨ７．４で０．１７ＭのＮＨ４Ｃｌを含む溶解緩衝液（１ｍｌ／脾臓）を用いて２分間で除去した。リンパ球をスピン
ダウンし、そして１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地５ｍｌ当たり５×１０７細胞でプレーティングした。次いで、細胞を、組換えアデノウイルスＡｄ−ｈＢＵＧＴ１（１〜１０ｐｆｕ／細胞）で４〜５日間再刺激した。一次肝細胞に感染させ、肝臓のコラゲナーゼ灌流により採集したアデノウイルス（Ｓｅｇｌｅｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９７６）をエフェクターリンパ球のための標的細胞として使用し、そしてＣｈｅｅ培地中の、コラーゲンでコートした６ウェルプレートにプレーティングした（２×１０６細胞／ウェル）。刺激したエフェクター細胞を採集し、計数し、そして一次肝細胞培養物に５０〜１００：１の比で添加し、そして３７℃で５時間インキュベートした。肝細胞溶解物を、培地を採集し、そして以下の改変を有する市販のキット（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＤ）を用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを測定することによって測定した：試薬と試験培地との比を、１０：１から１：１に変更し、そして最初の分光光度読み取り前の反応時間を９０秒にし、続いて３０秒毎に５分まで読みとった。次いで、ＡＬＴレベルを製造者の方式に従って計算し、そして国際単位で表した。バックグラウンドのＡＬＴレベルを、アデノウイルス感染肝細胞およびナイーブなラット由来のリンパ球を含むディッシュの上清におけるＡＬＴレベルの測定により決定した。ＣＴＬ活性を、バックグラウンドレベルを減算した後、６ウェルから平均したＡＬＴのＩＵで示した。
【０１３２】
結果
免疫寛容性の評価
肝臓組織学：２回目の注入の２４〜７２時間後に試験した各群における２匹のラット由来の肝臓生検は、アデノウイルスタンパク質（Ａ群）の腸内投与により寛容化されたレシピエントにおいて、最小の門脈周囲または小葉リンパ球浸潤を示したか、あるいは浸潤を示さなかった。対照的に、重症の炎症応答（グレード３）が、ウイルス注入の前にＢＳＡを与えられたかまたはタンパク質を与えられなかったラット（Ｃ、Ｄ群）、およびアデノウイルス抗原の高用量を受けたラット（Ｅ群）から得た肝臓検体において観察された（データは示さず）。
血清ＡＬＴレベル：アデノウイルスタンパク質で寛容化されたＡ群のラットにおいて、血清ＡＬＴレベルは、３回の各注入後、最少に増大するのみであった（９６〜１１０  ＩＵ；  全ての操作前の正常レベルは６０〜７５  ＩＵであった）。ＢＳＡを受けたかまたはタンパク質を受けていない群（ＣおよびＤ）において、ＡＬＴレベルは１回目の注入後１６８  ＩＵに増大し、そして２回目の注入後２１２  ＩＵに増大した。
中和抗体：Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１の注入後、ＢＳＡを受けたかまたはタンパク質を受けなかったラット（それぞれＣおよびＤ群）において、高力価（＞１：２８１６）抗体が最初の１ヶ月間現れた。対照的に、寛容化ラット（Ａ群）において、中和抗体はレシピエントの８０％において検出不可能であった。残りは、低い抗体力価（＜１：１６）を示した（図５）。低力価抗体を発達させたラットは、検出可能な抗体を有さなかったラットと同様に、Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１の２回目の注入に対して類似の低ビリルビン血症応答を有した。
細胞障害性Ｔリンパ球応答：細胞障害性Ｔ細胞を、アデノウイルス感染ラット肝細胞に対して、本研究を通じて４回試験した。培地中の肝細胞標的から放出されるＡＬＴの量の測定を用いて、ＣＴＬ応答を評価した。培地中のＡＬＴレベルは、全ての寛容化レシピエント（ＡおよびＢ群）において８０  ＩＵ未満であったが、非寛容化ラット（ＢおよびＣ群）においては４５０  ＩＵを超えた。
抗原用量の効果：アデノウイルスタンパク質の用量と寛容性の誘導との間の関係を評価するために、Ｅ群の１０匹のラットに高用量（５０〜１００ｍｇ／日）でウイルスタンパク質を給餌した。これらのラットにおいて、血清ビリルビンレベルおよび胆汁に排出される色素のＨＰＬＣ分析は、２回目の組換えアデノウイルス注入が遺伝子発現または代謝効果を達成しなかったことを示した。この群における抗アデノウイルス免疫応答は、ＢＳＡを投与されたかまたはタンパク質を投与されなかったラット（ＣおよびＤ群）の免疫応答に類似であった。従って、高用量の抗原を用いても寛容性についての証拠は全く観察されなかったが、アデノウイルスタンパク質の低用量給餌の投与は、ヒトＢＵＧＴ１遺伝子を含む組換えアデノウイルスに対する体液性および細胞性の宿主免疫応答を顕著に阻害した。
【０１３３】
高用量の給餌は、抗原応答性Ｔ細胞の不応答または欠失を誘導することが示されており、効果的でないことが見出された。対照的に、低用量給餌のアデノウイルスタンパク質抽出物での経口寛容化は、ヒトＢＵＧＴ１遺伝子を含む組換えアデノウイルスに対する体液性および細胞性の宿主免疫応答を顕著に阻害した。
【０１３４】
実施例２  組換えアデノウイルスに対する経口寛容化は発現時間を延長し、そして再投与を可能にする
実施例１で使用した動物をまた、組換えアデノウイルスからの発現の長さに対する経口寛容化レジメンの効果を評価するために使用した。
【０１３５】
トランスジーン発現の判定
ｂ−ガラクトシダーゼ発現：１回目の注入としてＡｄ−ｈＢＵＧＴ１、そして２回目の注入としてＡｄ−ＬａｃＺを受けた、アデノウイルスタンパク質を予め投与された（Ｂ群）または投与されていない（Ｃ２群）群に由来するＧｕｎｎラットを、肝臓生検した。検体を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｄｕｒｈａｍ，  ＮＣ）中で、ドライアイスで冷却したメチルブタン浴中で凍結させた。凍結させたクリオスタット切片（１０μｍ）を、新たに調製したＰＢＳ中の１％グルタルアルデヒド中で室温で５分間固定した。β−ガラクトシダーゼ活性を、切片を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−ｂ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）染色溶液（５ｍＭ  Ｋ４ＦｅＣＮ、５ｍＭ  Ｋ３ＦｅＣＮ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｌ当たり１ｍｇのＸ−Ｇａｌを含有する）に、３７℃で８〜１５時間浸すことによって検出した。切片をエオシンで手短に対比染色し、次いで脱水し、そしてマウントした。
ＰＣＲを用いるＤＮＡ分析：宿主の肝臓におけるヒトＢＵＧＴ１遺伝子の存在を検出するために、ＤＮＡを、ＲＮａｓｅ処理した組織ホモジネートから抽出した。実験群ＡおよびＥ、ならびにコントロール群Ｃ１およびＤの各々由来の２匹のラットを、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の注入の３日後に試験した。ＤＮＡを、ヒトＢＵＧＴ１遺伝子の独特のエキソン１（ｅｘｏｎ１＊１）の３２１−ｂｐセグメントを増幅するように設計したプライマー（センス：５’  ＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＣＧＴＣＡＧＣＡ  ３’  ｎｔ１４１〜ｎｔ１６０、アンチセンス：５’ＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧ  ３’  ｎｔ４４１〜ｎｔ４６２）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に供した。ＰＣＲ増幅を、以下のプロトコルを用いて行った：９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、および７２℃で１分×３０サイクル。
ヒトＢＵＧＴ１タンパク質の発現：ｈＢＵＧＴ１の発現の決定のために、肝臓検体を、２回目のウイ
ルス注入の５日後に、実験群Ａおよびコントロール群Ｃ１の２匹のラットから得た。組織ホモジネート（２００ｍｇ／ｍｌ）を、モーター駆動性テフロン（登録商標）乳棒を取り付けたガラスホモジナイザーを用いて、０．２５Ｍ  スクロース／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で調製した。イムノブロット分析のために、タンパク質（１００ｍｇ／レーン）を、ＳＤＳポリアクリルアミド（７．５％）ゲル上での電気泳動により分離し、そしてニトロセルロースメンブレンに電気的にブロットした。メンブレンを、ｈＢＵＧＴ１により発現されるＵＧＴイソ型の共通のカルボキシ末端ドメインに対するモノクローナル抗体ＷＰ１でプローブし、続いてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ’ａｂフラグメント二次抗体（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）および基質（Ｐｅｔｅｒｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９３：１６２−１６９  （１９８７）；  Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：４３５０−４３５４  （１９７９））でプローブした。全てのレーンに等量のタンパク質をロードすることは、同一のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてクーマシーブリリアントブルーでタンパク質バンドを染色することによって確実に行われた。ビリルビンに対するＢＵＧＴ１活性についてのアッセイ：酵素アッセイを、１回目の注入の２０日後にＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入を受けた各実験群（Ａ、Ｅ、Ｃ１、およびＤ）からの２匹のラット由来の、および他の全てのラット由来の肝臓検体のホモジネートにおいて、実験終了時に行った。アッセイ方法は、以前に記載されるとおりであり、アグリコンとして８０ｍＭのビリルビンを使用した（Ｔｒｏｔｍａｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２１：  １７５−１８０  （１９８２）；  Ｒｏｙ  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １：  ６２２−６２７（１９８１））。
血清ビリルビンレベルの測定：血清ビリルビンレベルを、ＪｅｎｄｒａｓｉｋおよびＧｒｏｆに従って、実験期間を通じて１０〜１４日毎に全ての群において測定した（Ｔｒｏｔｍａｎ（１９９２）前出）。
胆汁色素分析：選択したラットにおけるビリルビングルクロン酸化の明確な実証のために、胆汁をポリエチレン胆汁管カニューレを通じて採集し、そして胆汁中に分泌されたビリルビングルクロニドを、ｕＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ−１８カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）を用いて、以前に記載されたようにＨＰＬＣにより分析した（Ｒｏｙ  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  （１９８２）  前出）。胆汁を、１ｍｇ／日（Ａ群）、５０ｍｇ／日または１００ｍｇ／日（Ｅ群）でアデノウイルスタン
パク質を受けたか、ＢＳＡ１ｍｇ／日（Ｃ１群）を受けたか、またタンパク質を全く受けていない（Ｄ）実験群からの２匹のラットにおいて、組換えアデノウイルスの１回目および２回目の注入の２０日後に分析した。全ての他のラットについて、実験終結時に胆汁色素分析を行った。
【０１３６】
結果
ｂ−ガラクトシダーゼ活性の発現：組織化学的染色のために、１回目の注入としてＡｄ−ｈＢＵＧＴ１、そして２回目の注入としてＡｄ−ＬａｃＺを受けた、アデノウイルスタンパク質を予め投与された（Ｂ群）かまたは投与されていない（Ｃ２群）Ｇｕｎｎラットの肝臓検体から、Ａｄ−ＬａｃＺ注入の７日後に肝臓生検を行った。生検を各群の２匹のラットで行った。クリオスタット切片（１０ｍｍ）の組織化学的染色は、アデノウイルスタンパク質を投与されたラット（Ｂ群）において、注入後に大多数の肝細胞がｂ−ガラクトシダーゼ活性についてポジティブに染色されるが、ＢＳＡを与えられたラット（Ｃ２群）由来の肝臓において、５％の肝細胞しかポジティブに染色されないことを示した（図１）。
Ｇｕｎｎラットへの組換えアデノウイルス注入後のｈ−ＢＵＧＴ遺伝子の発現
ＰＣＲを用いたＤＮＡ分析：アデノウイルスタンパク質を予め腸内投与された（Ａ群）かまたは投与されていない（Ｃ１およびＤ群）、Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１を受けたＧｕｎｎラットの肝臓中のｈＢＵＧＴ１  ＤＮＡの存在を、２回目のＡｄｈＢＵＧＴ１注入後にＰＣＲによって評価した。３２１ｂｐのＤＮＡフラグメントは、Ａ群からのラットにおいてのみ見出されたが、コントロール群ＣおよびＤの両方はネガティブであった。正常なヒト肝臓および未処置のＧｕｎｎラット由来の肝臓を、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして使用した（図２）。
ヒトＢＵＧＴ１タンパク質の発現：Ａ群およびＣ１群の２匹のラットから、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の５日後に肝臓検体を採集した。ｈＢＵＧＴ１に対応する免疫応答性の５２ｋＤａのバンドが、アデノウイルス抗原の投与後に２回のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の注入を受けたＧｕｎｎラット（Ａ群）において観察されたが、ＢＳＡの腸内投与後にウイルス注入を受けた群（Ｃ群）においては観察されなかった（図３）。正常なヒト肝臓および未処置のＧｕｎラット肝臓を、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして使用した。
インビトロのＢＵＧＴ１活性：ビリルビンに対するＵＧＴ活性は、未処置のＧｕｎｎラットでは検出不可能であった。死体ドナー器官から得た正常なヒト検体のホモジネートにおいて、ＢＵＧＴ１活性は７８±２６ｎｍｏｌ／ｍｇ肝臓重量／分；（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）であった。アデノウイルスタンパク質の腸内投与後にＡｄ−ｈＢＵＧＴ１を受けた２匹のラット（Ａ群）由来の肝臓ホモジネートにおいて、ビリルビンＵＧＴ活性は、１回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の注入の２０日後に８０および８５ｎｍｏｌ／ｍｇ肝臓湿重量／分であり、そして２回目の注入の２０日後に８８±２０ｎｍｏｌ／ｍｇ肝臓湿重量／分（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）であった。ＢＳＡ給餌ラット（Ｃ１およびＤ群）において、ビリルビンＵＧＴ活性は２回目のａｄ−ｈＢＵＧＴ１注入後は検出不可能であった。
血清ビリルビンレベル：ビリルビンレベルを、１０〜１４日毎に測定した。ビリルビンレベルにおける顕著な減少が、アデノウイルスタンパク質の投与によって寛容化したＧｕｎｎラット（Ａ群）における各Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１注入後に起こり、１回目および２回目の注入後、レベルはそれぞれ１．８３および１．７８ｍｇ／ｄｌ程の低さに到達した（図４）。ビリルビンレベルは各注入後３ヶ月にわたって低いままであり、次いで徐々に増大した。対照的に、ＢＳＡ給餌Ｇｕｎｎラット（ＣおよびＤ群）において、１回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入は、血清ビリルビンレベルを４週間のみ２．７３ｍｇ／ｄｌに減少させ、続いて注入前のレベルまで徐々に増大した。続くＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入は、これらの群において血清ビリルビン濃度に対する効果を全く有さなかった。
胆汁色素分析：１回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の注入の２０日後に、Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１処置ラット（Ａ、Ｃ１、Ｄ、およびＥ群）からの２匹のラットより採集した胆汁のＨＰＬＣ分析は、ビリルビンモノおよびジグルクロニドの排出を示した。２つのグルクロニドは、９５％より多い胆汁色素、５％未満の結合していないビリルビンから成った。このプロフィールは、正常なＷｉｓｔａｒラットにおいて見られるプロフィールに類似であった。類似のパターンが、１ｍｇ／日のアデノウイルスタンパク質での腸内投与により寛容化したラット（Ａ群）において、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の２０日後に見られた。ＢＳＡを受けたラット（Ｃ群）、タンパク質を受けなかったラット（Ｄ群）、またはアデノウイルスタンパク質の高用量を受けたラット（５０〜１００ｍｇ／日、Ｅ群）において、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入後の胆汁色素分析は、胆汁中の結合したビリルビンの有為な量を示さなかった。Ａｄ−ＬａｃＺで注入したＧｕｎｎラットは、胆汁中にビリルビングルクロニドを排出しなかった。これらのラット由来の胆汁におけるクロマトグラフィープロフィールは、未処置のＧｕｎｎラットからのプロフィールに類似した。
【０１３７】
考察
経口寛容化は、より長い低ビリルビン血症効果の持続により示されるように、トランスジーンの発現を延長した。しかし、効果は、１回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の１４日から９８日後の間の血清ビリルビンレベルの段階的な増加により示されるように、永久的ではなかった。トランスジーンの効果の類似の減衰が、新生期（ｎｅｗｂｏｒｎ  ｐｅｒｉｏｄ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ（１９９６）前出）の間にウイルスの注入により誘導された組換えアデノウイルスに対する誘導中心的な寛容性の後に見出された。トランスジーン効果の減少は、寛容性の欠失よりも、むしろエピソームアデノウイルスＤＮＡの分解の結果であるようである。なぜなら、この期間中、宿主において抗ＣＴＬ活性が存在しなかったからである。
【０１３８】
結論として、この実施例は、抗ウイルス免疫応答のダウンレギュレーションにおける低用量経口ウイルス抗原投与の効力を示す。さらに、この実施例は、所望の遺伝子産物の活性が減少した後、組換えアデノウイルスが免疫応答を伴わずに再投与され得ることを示す。この方法は、宿主を有用な組換えアデノウイルスに対して寛容化するための臨床的な実施に有用であり、そしてこれらのベクターを用いて遺伝性の代謝疾患のための有効な長期間の遺伝子治療を提供する可能性を開く。
【０１３９】
実施例３  組換えアデノウイルスに対する経口寛容化は安定である
経口寛容化が長期間の寛容性を生じるかどうかを決定するために、Ｇｕｎｎラットを、実施例１に記載のようにアデノウイルスタンパク質の経口投与により寛容化した。寛容化の８ヶ月後、ラットをＡｄ−ｈＢＵＧＴ１で注入した。これは、体液性またはＣＴＬ応答のいずれも生じなかった。これらの結果は、寛容化抗原が存在しない場合でさえ、寛容化が長く続くことを示す。
【０１４０】
実施例４  予め存在する免疫応答に対する経口寛容化の確立
先の実施例は、長期間のアデノウイルス指向遺伝子治療がアデノウイルス抗原の経口投与により組換えアデノウイルスの抗原に対して宿主特異的に寛容化することによって達成され得ることを実証している。これは、全身性の免疫抑制を伴わない長期間のトランスジーン発現を可能にする。アデノウイルスのいくつかの血清型（ほとんどの遺伝子治療ベクターが構築されている血清型である５型アデノウイルスを含む）は、一般にヒトに感染する。従って、多くの成体ヒトは、既存の中和抗体およびアデノウイルスに対する細胞障害性リンパ球を有し、これはこれらのベクターの臨床的な適用に対して障害を提出する（Ｗｅｉｎｅｒ（１９９４）前出；Ｖａｎｄｅｎｂａｃｋ（１９９４）前出）。
【０１４１】
本実施例は、経口寛容化が、宿主の免疫応答の出現を妨げることに加えて、既存の抗アデノウイルス抗体力価および細胞障害性リンパ球応答もまた減少させ得ることを実証する。この結果は、最初に、主要アデノウイルス構造タンパク質の予め免疫されたラットへの腸内投与によって、組換えアデノウイルスの静脈内注入によりトランスジーンの発現が可能となるまで、既存の抗アデノウイルス免疫応答を減少させることが可能であることを実証する。
【０１４２】
寛容化ウイルス投与および免疫学的効果の分析についてのプロトコルの詳細は、実施例１に記載の通りであった。遺伝子発現の評価についてのプロトコルの詳細は、実施例２に記載の通りであった。
ＧｕｎｎラットへのＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入：Ｇｕｎｎラットの３つの群（２つはそれぞれ１０匹の動物からなり（ＡおよびＣ）、そして１つは５匹のラットを有する（Ｂ））を研究した（表１）。全てのラットを、組換えウイルスＡｄ  ｈＢＵＧＴ（５×１０９ｐｆｕ／ラット）で注入し、そして高力価の抗アデノウイルス中和抗体の誘導を下記のように証明した。Ａ群のラットに、１回目のアデノウイルス注入後４０日目に開始して、１０用量のアデノウイルスタンパク質抽出物（１日おきに１ｍｇ）を給餌した。Ｂ群のラットを、１０日目に開始してアデノウイルスタンパク質の５用量で給餌した。Ｃ群のラット（コントロール）は、４０日目に開始してウシ血清アルブミン（１日おきに１ｍｇ）の１０用量を受けた。７２日目に、全ての群のラットにＡｄ−ｈＢＵＧＴ１（５×１０９ｐｆｕ）の２回目の注入を受けさせた。
【０１４３】
【表２】
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【０１４４】
トランスジーン発現の判定
ＰＣＲを用いたＤＮＡ分析：宿主肝臓中のヒトＢＵＧＴ１遺伝子の存在を検出するために、ＤＮＡを、先に実施例２で記載のように、ＲＮａｓｅ処理した組織ホモジネートから抽出した。各群からの２匹のラットを、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の５日後に試験した。ＤＮＡを、実施例２で記載のように、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅に供した。
ヒトＢＵＧＴ１タンパク質の発現：ＢＵＧＴ１の発現を決定するために、肝臓検体を、２回目のウイルス注入の５日後に、実験群ＡおよびＢ、ならびにコントロール群Ｃにおける２匹のラットから採取した。組織ホモジネートを、実施例２に記載のようにプロセスおよび分析した。
血清ビリルビンレベルの決定：血清ビリルビンレベルを、実施例２に記載のように、研究期間を通じて１０〜１４日毎に測定した。
胆汁色素分析：選択したラットにおけるビリルビングルクロン酸化の明確な実証のために、胆汁を、実施例２に記載のように採集および分析した。胆汁を、２回目の注入の１４日後に、各群からの２匹のラットにおいて分析した。
【０１４５】
免疫寛容性の評価
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗アデノウイルス抗体：ＥＬＩＳＡによる抗アデノウイルス抗体の検出を、ウェルあたりＰＢＳ中Ａｄ−ｈＢＵＧＴの１×１０８粒子で９６ウェルプレートをコートすることによって４℃で一晩実施した。ウェルを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＰＢＳ）および１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウムで５回洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックし、再び洗浄し、そして血清（１％  ＢＳＡ中）の段階希釈と３７℃で２時間インキュベートした。ＩｇＧ抗体レベルを、血清の０．１Ｍ  メルカプトエタノールとの３７℃で１時間のインキュベーションの後、測定した。ウェルを洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  ＴＸ）の１：１０００希釈の１００ｍｌと３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを基質（１０４  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）とインキュベートし、そしてＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍを読み取った。ナイーブなＧｕｎｎラット由来の２つのネガティブコントロール血清を、各プレートに含めた。終点力価を、ネガティブコントロールで観察された吸光度よりも少なくとも２倍大きい吸光度を生じた最大希釈の逆数として表した。全ての群からのラットの血清を、１回目の注入後０、１４、７０、９８、および１２８日目に試験した。
肝臓組織学：肝炎の程度を評価するために、１０％のホルムアルデヒド固定肝臓生検を、各群からの２匹のラットにおいて２回目の注入後に１週間実施した。パラフィン切片を、標準的な手順に従ってヘマトキシリン−エオシンで染色した。切片を、以下のように肝炎についてグレード分けした：グレード０：正常；グレード１：穏やかな、門脈周囲または病巣小葉リンパ球浸潤；グレード２：リンパ球浸潤の小葉への拡大および「断片的壊死」；およびグレード３：「架橋壊死」による小葉構造の崩壊、ならびに門脈から中心、門脈から門脈、および中心から中心領域へのリンパ球浸潤の拡大。
細胞障害性リンパ球応答：各群からの２匹のラットを、５０および９８日目において研究した。脾臓を、各時点で各２匹のラットから麻酔下で取り出し、そして動物を再縫合した。その後の分析は実施例に記載の通りであった。
【０１４６】
結果
経口寛容化の効果
抗アデノウイルス抗体：血清ＩｇＧ抗アデノウイルス抗体を、群Ａ、Ｂ、およびＣからの全てのラットにおいて、１回目の注入後、０、１４、７０、９８、および１２６日目にＥＬＩＳＡによって試験した。抗アデノウイルス抗体は、全３群において１回目の注入後に出現し、力価は１４日目に１：２１０のピークに上昇した（図２）。しかし、アデノウイルス抗原の１０用量の腸内投与後（Ａ群）、抗体力価は７０日目に１：２７に減少した（図５、実線）。ＢＳＡ処置したコントロール（Ｃ群）では、抗アデノウイルス抗体力価においてわずかな減少のみ（１：２９）が存在した（図５、白抜きバー）。１回目の注入後７２日目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の２回目の注入後、コントロール群において抗体力価の増大（１：２１４）が存在した。対照的に、組換えアデノウイルスの２回目の注入にもかかわらず、経口寛容化ラット（Ａ群、図５、実線）において抗体力価は段階的に減少した。類似の結果が、アデノウイルスタンパク質の５用量のみを１回目のアデノウイルス注入後１０〜１８日の間に投与した、寛容化したＢ群において見られた（図５には示さず）。２回目のアデノウイルス注入の２６および５４日後、寛容化群と非寛容化群との間の抗体力価における差異は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．００５、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ検定による）。
細胞障害性リンパ球応答：アデノウイルスで感染されたラット肝細胞に対する細胞障害性Ｔ細胞を、研究を通じて２回（１回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の５０日後および９８日後）、ＡおよびＣ群からの２匹のラットにおいて試験した。肝細胞標的から培地に放出されたＡＬＴ活性を用いて、ＣＴＬ応答を定量化した。培地中のＡＬＴレベルは、１回目のウイルス注入の５０日後、Ａ群において４４９および４０９  ＩＵであり、そしてＣ群において４２１および５３１  ＩＵであった。経口寛容化の２６日後、培地中に放出されたＡＬＴ活性は、これらのラットが７２日目にＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の２回目の用量を受けた場合でさえ、Ａ群において１６６および１４２  ＩＵに減少した。ＢＳＡ処置したコントロール群（Ｃ群）において、ＣＴＬ活性は、培地中のＡＬＴ活性に反映されるように、高く持続された（３９９および４７６  ＩＵ）。
肝臓組織学：２回目の注入の２４〜７２時間後に試験した各群の２匹のラット由来の肝臓生検は、Ａ群において、最小の門脈周囲または小葉リンパ球浸潤を示したか、あるいは浸潤を示さなかった。対照的に、重症の炎症応答（グレード３）が、Ｃ群から採取した肝臓検体において観察された（図６）。
【０１４７】
ＧｕｎｎラットへのＡｄ−ｈＢＵＧＴ１の注入後のｈＢＵＧＴ遺伝子発現。
ＰＣＲを用いるＤＮＡ分析：群ＡおよびＢ由来のＧｕｎｎラットの肝臓におけるヒトＢＵＧＴ１  ＤＮＡの存在を、２回目のＡｄｈＢＵＧＴ１注入の後にＰＣＲにより試験した。予期された３２１ｂｐアンプリコンは、群ＡおよびＢ由来のラットにおいてのみ見られたが、コントロール群Ｃはネガティブであった。正常ヒト肝臓および未処置のＧｕｎｎラット由来の肝臓をそれぞれ、ポジティブおよびネガティブコントロールとして使用した（図７）。
ヒトＢＵＧＴ１タンパク質の発現：肝臓標本を、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の５日後に、群Ａ、Ｂ、およびＣの２匹のラットから収集した。ｈＢＵＧＴ１に対応する５２ｋＤａの免疫応答性のバンドを、２回目の注入の後の群ＡおよびＢの処置したＧｕｎｎラットにおいて観察したが、コントロール群Ｃ由来のラットにおいては観察されなかった（図８）。正常ヒト肝臓および未処置Ｇｕｎラット肝臓をそれぞれ、ポジティブおよびネガティブコントロールとして使用した。
血清ビリルビンレベル：ビリルビンレベルを、１０〜１４日毎に測定した。ビリルビンレベルの著しい減少が、群ＡおよびＢにおけるそれぞれのＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入の後に生じた（レベルは、１回目および２回目の注入の後、それぞれ２．２ｍｇ／ｄｌおよび２．７８ｍｇ／ｄｌほどに達した）（図９）。対照的に、非寛容化Ｇｕｎｎラット（群Ｃ）においては、２回目のＡｄ−ｈＢＵＧＴ１注入は、血清ビリルビン濃度に対する影響を有さなかった。胆汁色素分析：Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１の２回目の注入の２０日後の、群Ａ、Ｂ，およびＣの２匹のラットから収集された胆汁のＨＰＬＣ分析により、群ＡおよびＢから回収された胆汁において、ビリルビンモノグルクロナイドおよびジグルクロナイドの排泄が示された。２つのグルクロナイドは、胆汁色素の９５％より多く、非抱合型ビリルビンの５％より少ない割合を占めた。このプロフィールと同様のプロフィールが、正常Ｗｉｓｔｅｒラットにおいて見られた。群Ｃにおいて、２回目の注入の後の胆汁色素分析は、胆汁中で検出される顕著な抱合型ビリルビン排泄を示さなかった。
【０１４８】
本実施例は、アデノウイルスに対する既存の抗体のレベルが、免疫前のラットへの主要なウイルスタンパク質の経口滴下により抑制され得ることを示す。この手順は、頻回（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｒｏｕｎｄ）のトランスジーン発現を伴うウイルスの再投与を可能にした。免疫グロブリンの比較的長い半減期のため、抗体力価の減少は緩徐に生じた。しかし、重要なことには、抗体レベルは、Ａｄ−ｈＢＵＧＴ１の２回目の注入にもかかわらず、寛容化群においては減少し続けた。この知見は、１：２７までの力価の抗体の存在は、アデノウイルスベクターを使用する遺伝子移入を妨害しないことを示す。非寛容化（ＢＳＡ処置した）群におけるウイルスの２回目の投与後の検出可能な代謝的影響の欠如は、２回目の注入から生じた強力で二次的な体液性応答またはＣＴＬ応答が、組換えウイルスまたはウイルス性感染肝細胞を取り除
くことによるトランスジーン発現の減弱を担い得ることを示唆する。
【０１４９】
実施例５．  組換えアデノウイルスに対する経口寛容化は伝達性である
前述の実施例は、組換えアデノウイルスに対する寛容性の誘導を示していたが、被験体において寛容化が行われ得ない場合が存在し得る。例えば、免疫抑制性薬物（例えば、シクロスポリンＡ）の存在は、経口寛容性の誘導を妨げ得ることが以前に示されている（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ａ．  Ｗｈｉｔｃｕｐ，Ｓ．Ｍ．，  Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｒ．Ｂ．およびＧｅｒｙ，Ｉ「Ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９６）３７６−３７８、Ｈ．Ｌ．ＷｅｉｎｅｒおよびＬ．Ｆ．Ｍａｙｅｒ編、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄａｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．、本明細書中で参考として援用する）。おそらく、免疫系のいくつかを抑制された（ｓｈｕｔ  ｄｏｗｎ）他の場合もまた、誘導を抑止し得る。このような状況の下では、ある被験体（ドナー）において経口寛容化を誘導し、次いでこの寛容性を第二の被験体（レシピエント）に移入することが有用であり得る。寛容性の養子移入：寛容化ラット由来の腸管壁リンパ球または脾臓リンパ球が、ナイーブなラットへの移植に際して寛容性を生成し得るかどうか決定するために、実施例１および２からの群ＡおよびＣ１由来のドナーラット（各群由来の２匹のラット）を実験の終わりに屠殺し、そして脾臓または小腸由来のリンパ球の単一の懸濁液を、細胞障害性Ｔリンパ球アッセイのために以前に記載のように調製した。細胞を、移植の直前にＰＢＳ中に再懸濁した。レシピエントラットを、０．５ｍｌＰＢＳ中の５×１０７〜１×１０８ドナー細胞の静脈注入の２４時間前に、６００ｒａｄの全身照射で致死量以下で照射した。合計８匹のラットを調べ、４匹は群Ａドナーラット由来の細胞を受け、そして４匹は群Ｃラット由来の細胞を受けた（各群において、２匹のラットはドナー脾細胞（５×１０８細胞）を受け、２匹は、ドナー腸壁リンパ球（５×１０７細胞）を受けた）。全てのラットを、細胞移植の１日後および９８日後にＡｄ−ｈＢＵＧＴ１で２回注入した。血清ビリルビンレベル、胆汁中に排泄された色素、ならびに抗アデノウイルス細胞性免疫応答および体液性応答を、以前に記載のように決定した。
寛容性の養子移入の評価：本実施例における血清ビリルビンのレベルを、図１０に示す。寛容性の養子移入は、群Ａ由来の脾細胞を受けた２匹のラットにおいてのみ見られた。ＡｄｈＢＵＧＴ１投与の後に、これらのラットは、実施例２に記載の群Ａ由来の寛容化ラットにおいて観察された代謝的影響と類似の影響を示した。さらに、これらのラットの１匹は抗アデノウイルス抗体を発生せず、他方は、低力価の抗体応答のみを備えた。対照的に、非寛容化ドナー由来のリンパ球または寛容化ドナーの腸壁由来のリンパ球を使用した場合、寛容性の養子移入は生じず、そして血清ビリルビンは組換えアデノウイルスの投与前に見られたレベルに戻った。ウイルスの２回目の注入に際して、これらのラットは、ＢＵＧＴ１発現の代謝的証拠を示さなかった。群Ｃのラット由来のレシピエントの細胞において、全てのラットが著しい抗アデノウイルス体液性免疫応答および細胞性応答を発生し、そして全ては注入の６週間以内にトランスジーンの効果を喪失した。
【０１５０】
本実施例は、ある被験体における経口寛容性の誘導は、第二の被験体へ移入され得る状態であることを示す。
【０１５１】
実施例６  ウサギにおける組換えアデノウイルスに対する経口寛容化および非天然トランスジーンに対する寛容性もまた確立されることの証明
以前の実施例において、経口寛容化は、組換えアデノウイルスの安定な発現を提供し、そして寛容化は、このアデノウイルスベクターの再投与後の発現を可能にするに十分であった。しかし、これらの実施例は、被験体としてラットを使用して実施されたが、発現させた遺伝子（ＢＵＧＴ１）は、ヒト供給源由来であるが、天然の生成物に十分に類似し得るので、トランスジーンに対する免疫応答の誘発は存在しなかったのかもしれない。２回目の投与後のＢＵＧＴ１遺伝子発現の非存在は、ベクターのみに対する応答であったのかもしれない。以下の実施例は、ウサギを被験体として使用し、そして１回目および２回目の組換えアデノウイルス投与において使用する遺伝子はＥ．ｃｏｌｉに由来するｌａｃＺであるという点において、以前の実施例とは異なる。
【０１５２】
経口寛容性の誘導および評価のために使用される方法の詳細は、以下の例外を有して、Ｇｕｎｎラットでの以前の実施例についての記載のようである：
ａ）ウサギに、挿管を使用するのではなく経口的に抗原を摂食させる。
ｂ）それらのよりサイズの大きさに従い、寛容化のために使用する抗原の量を比例して増加させた（１ｍｇのかわりに１０ｍｇ）。
経口寛容性の評価：図１１は、アデノウイルスによるウサギの肝細胞への誘導後に、ｌａｃＺ遺伝子の高レベルの発現が存在することを示す。ラットの系において見られるように、これは一過性の効果であり、そして大部分の活性は３週間後に消失した（図１２）。ウサギをＡｄ−ｈＢＵＧＴ１ベクターの経口投与により寛容化する場合、組換えアデノウイルスでの２回目の注入は、ｌａｃＺ遺伝子の効率的な発現を可能にする（図１３）。一方、この寛容化がない場合、２回目の注入は有意なレベルのｂ−ガラクトシダーゼ活性を全く発現し得ない（図１４）。この実施例は、本発明がラットのみに制限されず、他の動物において有効に機能することを実証する。さらに、組換えアデノウイルスの２回目の投与後の、ｌａｃＺの高レベルの発現は、被験体に対して天然でない酵素に対する寛容化が存在したしたことを実証した。
【０１５３】
実施例７
実施例：細胞へのタンパク質分子の送達
ウシ血清アルブミンを、以下の方法により、ビオチンおよびフルオレセインの両方を用いた抱合（ＢＳＡ−ＢＦ）またはフルオレセインのみを用いた抱合（ＢＳＡ−Ｆ）により標識した：
ＢＳＡ−ＢＦ：ＢＳＡ（６８ｍｇ）を、４．８ｍｌの０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）中に溶解した。２ｍｌのＤＭＦ中のビオチン−２１−ＮＨＳエステル（４ｕモル）を滴下し、そして混合物を２時間室温にてインキュベートした。２００ｕｌ  ＤＭＦ中のフルオレセインイソチオシアネート（２ｕモル）を添加し、そして混合物を室温で一晩インキュベートした。混合物をロータリーエバポレーターにおいて乾燥するまでエバポレートし、次いで５ｍｌ  Ｈ２Ｏ中に再溶解し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＧ−２５カラムへアプライした。フルオレセイン化された画分を回収し、そして０℃にて保存した。
ＢＳＡ−Ｆ：これは、ビオチン２１−ＮＨＳを用いる反応を省略する以外は、上記手順により調製した。
【０１５４】
Ｕ９３７細胞を、約１０６／ｍｌまで増殖させ、そして遠心分離し、増殖培地（ＲＰＭＩ）中で洗浄し、３．５ｍｌのＲＰＭＩ中に懸濁し、そして０．８ｍｌを４つの３５ｍｍウェルの各々に置いた。ＢＳＡ−ＢＦおよびＢＳＡ−Ｆ（それぞれ２０ｍｇ／ｍｌの濃度）を、以下のように、２００ｕｌのＲＰＭＩと共に４つのウェルに添加した。
１）  ２０ｕｌ  ＢＳＡ−Ｆ
２）  ５０ｕｌ  ＢＳＡ−Ｆ
３）  ２０ｕｌ  ＢＳＡ−ＢＦ
４）  ５０ｕｌ  ＢＳＡ−ＢＦ
細胞懸濁液を、３７℃で一晩インキュベートした。１ｍｌの細胞懸濁液を、２．０ｍｌのＲＰＭＩに置き、そして５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をデカントし、そして細胞を２００ｕｌのＲＰＭＩ中に再懸濁した。各細胞懸濁液のサンプルを、顕微鏡スライド上に置き、蛍光顕微鏡を使用して試験した。以下のように観察された：
１）  ２０ｕｌ  ＢＳＡ−Ｆ：わずかなバックグラウンドの蛍光に対して、５％より少ない細胞がいくらかの蛍光を示した。
２）  ５０ｕｌ  ＢＳＡ−Ｆ：わずかなバックグラウンドの蛍光に対して、５％より少ない細胞がい
くらかの蛍光を示した。
３）  ２０ｕｌ  ＢＳＡ−ＢＦ：約４０％の細胞が、強い蛍光を示した。
４）  ５０ｕｌ  ＢＳＡ−ＢＦ：約４０％の細胞が、強い蛍光を示した。
【０１５５】
ビオチン化ＢＳＡが細胞に入ったことの証拠を、単一細胞における２つの核の存在により示される有糸分裂が生じていた細胞の観察により提供した。このような細胞は、核に限定された明るい蛍光を示した。
【０１５６】
実施例８  経口寛容化についてのマーカーとしてのＴＧＦ−ｂ１レベル
以下の実施例は、寛容化がＴＧＦ−ｂ１レベルを測定することにより与えられることを証明するための方法を示す。サンプルは、実施例１および２において記載されるラット由来であった。
血清ＴＧＦ−ｂ１レベル：ＴＧＦ−ｂ１レベルを、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用する「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって測定した。血清ＴＧＦ−ｂ１レベルを、各注入後の８日目および１０１日目の各群由来の３匹のラットにおいて測定した。
腸リンパ球および脾細胞により分泌されるＴＧＦ−ｂ１の測定：腸壁リンパ球の抽出のために、小腸を、１０１日目における寛容化群およびコントロール群の各々に由来する２匹のラットから取り出し、そして１５％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中に置いた。腸を、１ｃｍの区分に切断し、培地でフラッシュし、長軸方向に切断することにより開き、そして新鮮培地に移し、ＰＢＳで４回すすぎ、そして１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）（ＤＴＴ）を含むＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを有さない）中に置いた。断片を３７℃にて３０分間撹拌し、そして剥離した（ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ）細胞を、組織断片を固定した後に、ＰＢＳをデカントすることにより収集した。細胞を、ナイロンウールに通し、５分間の遠心分離によりペレット化し、１０ｍｌの４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ中で懸濁し、そして７０％Ｐｅｒｃｏｌｌのクッション上に重層した。次いで、細胞を２０分間６００×ｇで遠心分離し、そして７０％〜４０％境界面の腸壁リンパ球を収集した。
【０１５７】
抗原提示細胞の富化のために、リンパ球を、上記のように脾臓から収集した。次いで、細胞を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む４ｍｌのＲＰＭＩ、ならびに５％ＦＢＳおよび１４．５ｇ％のメトリザミドを含む４ｍｌのＲＰＭＩ中で懸濁した。室温で１８００×ｇでの２０分間の遠心分離の後、マクロファージおよび樹状細胞の富化集団を含む境界面を回収した。
【０１５８】
ＴＧＦ−ｂ１分泌の測定のために、未処置Ｇｕｎｎラット、各注入後８日目および１０１日目における、コントロール群ＣおよびＤ由来のラットならびに寛容化群Ａ由来のラット（各群から２匹のラット）からの腸壁リンパ球または脾臓リンパ球を、組織培養ディッシュ上にプレートし（５×１０８／１０ｃｍプレート）、そして無血清培地において増殖させた。１プレートあたり１×１０６の抗原提示細胞を、活性化抗原として５０ｍｇのアデノウイルスタンパク質抽出物と共に添加した。培養の７２時間後、培地に分泌されたＴＧＦ−ｂ１を、上記のようにＥＬＩＳＡにより定量した。
血清ＴＧＦｂ１濃度およびインビトロでのＴＧＦｂ１分泌の測定：血清ＴＧＦｂ１レベルを、組換えウイルスの注入前に１ｍｇ／日用量のアデノウイルスタンパク質を与えたラット（群Ａ）において、組換えアデノウイルスの各注入の後に、＞１７０ｎｇ／ｍｌまで増加させた。ウイルス注入前にＢＳＡを受けたかまたはタンパク質を受けていないラット（群ＣおよびＤ）において、血清ＴＧＦｂ１レベルは、３０〜３５ｎｇ／ｍｌであった（ｐ＜０．００５）。正常未処置Ｇｕｎｎラットにおけるレベルは、１８〜２６ｎｇ／ｍｌである。
【０１５９】
脾細胞および腸壁リンパ球のアデノウイルス抗原への曝露の後のＴＧＦｂ１レベルの評価についてのインビトロアッセイを、各ウイルス注入後の各群由来の２匹のラットにおいて行った。低レベル（＞４ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦｂ１が、ＢＳＡを投与したかまたはタンパク質を投与していなかったラット（群ＣおよびＤ）由来の脾細胞および腸壁リンパ球培養物の上清において存在した；類似のレベルのＴＧＦｂ１を、寛容化ラット由来の腸壁リンパ球を使用して観察された（正常レベル２．１〜３．６ｎｇ／ｍｌ）。対照的に、アデノウイルスタンパク質を摂食させることにより寛容化したラット（群Ａ）由来の脾細胞は、ウイルスタンパク質への曝露の後に、有意により大量のＴＧＦｂ１（２４〜２６ｎｇ／ｍｌ）を分泌した。
【０１６０】
実施例９  経口寛容化についてのマーカーとしての種々のサイトカインの判定  以下の実施例は、種々のサイトカインのレベルを測定することにより寛容化が与えられたことを証明するための方法を示す。サンプルは、実施例１および２において記載されるラットに由来であった。
ラットサイトカインｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲ：これらのアッセイを、Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各群由来の２匹のラットにおいて１０１日目に実施した。上記のようなウイルス抗原および抗原提示細胞とのリンパ球の培養の後に、細胞を収集し、そしてラットＩＬ−２、４、６、１０、ＩＦＮ−ｇ、およびＴＧＦ−ｂ１についてのｍＲＮＡレベルを、逆転写プライム化（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定した。１ｍｇのＲＮＡを、各サンプルについてのテンプレートとして使用した。ラットグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）についてのアンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、ＲＴ−ＰＣＲについての内部標準として使用した。
ラットサイトカインについてのＲＴ−ＰＣＲの結果：ＲＴ−ＰＣＲを、８日目および１０１日目に、種々の群由来の腸壁リンパ球細胞培養物から抽出されたＲＮＡに対して実施した。ＩＬ−２、４、１０、およびＴＧＦｂ１についてのポジティブなバンドを、アデノウイルスタンパク質投与により寛容化されたラット（群Ａ）由来の脾細胞において見出したが、ＢＳＡを受けたかまたはタンパク質を全く受けていないラット（群ＣまたはＤ）由来の脾細胞においては見出されなかった。寛容化ラット（群Ａ）由来ならびにＢＳＡを受けたかまたはタンパク質を受けていないラット（群ＣまたはＤ）由来の腸壁リンパ球細胞培養物は、これらのサイトカインｍＲＮＡについてネガティブであった。対照的に、ＩＦＮｇは、群Ａの寛容化ラット由来の脾細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによりネガティブであったが、コントロール群ＣおよびＤ由来のラットからの脾細胞において見出された。腸壁リンパ球（ＧＷ）は、非寛容化ラットと類似の結果を示した。ＩＬ６を、全ての試験した群において検出し、そしてこれはおそらく非特異的急性期応答物として振る舞う。
【０１６１】
実施例１０．  大腸炎の処置のための経口寛容化
本実施例において、大腸炎に罹患したラットの大腸から抽出されたタンパク質に対する経口寛容性を生じたラットは、病原（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）の減少を示した。寛容化処置を、大腸炎の誘導と同時に与えた。
方法．大腸炎を、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の腸内設置により誘導した。処置されたラットは、大腸炎誘導の日から始めて１日おきに、病的な大腸から抽出されたタンパク質の５用量の経口投与を受けた。コントロールラットは、同程度の用量のウシ血清アルブミンを受けた。
結果．コントロール非寛容化ラットは、重篤な下痢により明らかにされる重得な大腸炎、ならびに巨視的におよび顕微鏡的に重篤な腸疾患を発症した。大腸タンパク質の摂食は、大腸潰瘍、腸および腹膜癒着、壁厚、ならびに浮腫の程度の著しい減少を伴う下痢の減少により明らかにされる、抗大腸免疫（ａｎｔｉ−ｃｏｌｏｎｉｍｍｕｎｅ）の応答性低下の誘導を可能にした。全大腸壁の中の損傷した大腸の範囲のパーセントにおける著しい減少および大腸重量における減少が存在した。顕微鏡的パラメーターもまた、炎症応答および粘膜潰瘍における著しい減少を示した寛容化動物（ａｎｍｉｍａｌ）において改善された。
【０１６２】
寛容化におけるサプレッサーリンパ球の役割を、寛容化ラット由来のリンパ球がナイーブな動物に寛容性を養子性に移入し得るかどうかを試験することにより評価した。ここで、脾細胞を、ラットの両群から収集し、そして致死量以下で照射した動物に移植した。ＴＮＢＳ誘導大腸炎が、寛容化ラット由来の脾細胞のレシピエントにおいて著しく軽減した。対照的に、非寛容化コントロールラット由来のリンパ球を受けたそれらの動物においては、重篤な疾患が発症した。
【０１６３】
実施例１１．  経口寛容性の誘導を介する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置
ドナーにおけるレシピエント組織への寛容性を誘導する能力は、レシピエントリンパ球の摂食を介して実施され得る。
方法．ＧＶＨＤを誘導するために、ドナー脾臓細胞を、致死量以下に照射したＢＡＬＢ／Ｃマウスへ静脈内に注入した。ドナーマウス（Ｂ１０Ｄ２雄）に、１日おきに１０日間、レシピエントリンパ球から抽出したタンパク質を与えた。細胞を、レシピエントマウス（Ｂａｌｂ／ｃ雌）から末梢血リンパ球を単離することにより調製する。細胞内のタンパク質の定量的判定を、標準的方法を使用して行う。
手順．ドナーマウスに、５用量の抗原を摂食させる。１０匹のコントロールマウスに、ＢＳＡを摂食させる。１２日目（摂食の完了の２日後）において、脾臓を収集し、そしてレシピエントマウスに移植する。マウスを、以下のパラメーターについてモニターする：
ａ）混合リンパ球応答アッセイによる寛容性誘導の決定；
ｂ）皮膚生検および皮膚コラーゲン決定によるＧＶＨＤの誘導；ならびに
ｃ）肝臓および小腸ＧＶＨＤの誘導
多数の明らかな変更が、本発明の上記の詳細な説明および実施例を考慮して、当業者に示唆される。全てのこのような変更は、以下の請求の範囲により規定されるように、本発明の範囲および精神に完全に包含される。
【図１】
2011046753.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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