(57)【要約】      （修正有）【課題】活性エストロゲン化合物の混合物を有する組成物を提供する。【解決手段】エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物中には、天然から得られたウマ抱合エストロゲン製品に存在する不純物が存在せず、前記混合物は抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み、抱合エストロンの塩と、抱合エクイリンの塩との合計量の割合は、７０ないし９５重量％であり、抱合エストロンの塩に対する抱合エクイリンの塩の存在割合は、０．２５ないし０．７５である、前記組成物。該組成物を含む血管運動症状、萎縮性膣炎、骨粗鬆症等の処置のための医薬品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物は、化学的に純粋な形で存在し、前記混合物は抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須なエストロゲン化合物を含む、前記組成物。
【請求項２】
塩がナトリウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抱合体がスルフェートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６
−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェートおよび６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩をナトリウム塩とした請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
組成物は、図２のクロマトグラフにより示される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
抱合エストロンの塩は、抱合エストロゲンの標識内容量の第一比率で存在し、抱合エクイリンの塩は、抱合エストロゲンの標識内容量の第二比率で存在し、第一および第二の比率の合計は、約７０ないし約９５％であり、第一比率に対する第二比率の比は、約０．２５ないし約０．７５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
混合物は、約４０から約７５％の抱合エストロンの塩；
約１５から約４０％の抱合エクイリンの塩；
約２から約１０％の抱合Δ8,9−デヒドロエステロンの塩；
約２から約１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
約１０から約２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；および
約０．５から約５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
組成物はさらに、少なくとも１つの追加の医薬的に活性な成分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの追加の医薬的に活性な成分は、アンドロゲン、プロゲスチン、カルシウム塩、並びにビタミンＤおよびその誘導体からなる群から選択する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記エストロゲン化合物の少なくとも１つは、合成エストロゲン化合物であり、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須なエストロゲン化合物を含む、前記組成物。
【請求項１２】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェートおよび６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩がナトリウム塩である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
混合物は、約４０から約７５％の抱合エストロンの塩；
約１５から約４０％の抱合エクイリンの塩；
約２から約１０％の抱合Δ8,9−デヒドロエストロンの塩；
約２から約１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
約１０から約２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；および
約０．５から約５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含み、抱合エストロンの塩および抱合エクイリンの塩の比率の合計は、標識内容量の約７０ないし約９５％であり、抱合エクイリンの塩の比率と、抱合エストロンの塩の比率の比は、約０．２５ないし約０．７５である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物は、化学的に純粋な形で存在し、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須エストロゲン化合物を含む、前記組成物。
【請求項１６】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩はナトリウム塩である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
混合物は、約４０から約７５％の抱合エストロンの塩；
約１５から約４０％の抱合エクイリンの塩；
約２から約１０％の抱合Δ8,9−デヒドロエストロンの塩；
約２から約１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
約１０から約２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；および
約０．５から約５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含み、抱合エストロンの塩および抱合エクイリンの塩の比率の合計は、標識内容量の約７０ないし約９５％であり、抱合エクイリンの塩の比率と、抱合エストロンの塩の比率の比は、約０．２５ないし約０．７５である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物、前記混合物は、化学的に純粋な形で存在し、前記混合物は、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須エストロゲン化合物を含む；および、アンドロゲン、プロゲスチン、カルシウム塩、並びにビタミンＤおよびその誘導体からなる群から選択した少なくとも１つの追加の医薬的に活性な成分を含む、組成物。
【請求項２０】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ8,9−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
１７α−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ8,9−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩がナトリウム塩である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
混合物は、約４０から約７５％の抱合エストロンの塩；
約１５から約４０％の抱合エクイリンの塩；
約２から約１０％の抱合Δ8,9−デヒドロエストロンの塩；
約２から約１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
約１０から約２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；および
約０．５から約５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含み、抱合エストロンの塩および抱合エクイリンの塩の比率の合計は、抱合エストロゲンの標識内容量の約７０ないし約９５％であり、抱合エクイリンの塩の比率と、抱合エストロンの塩の比率の比は、約０．２５ないし約０．７５である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物は、化学的に純粋な形で存在し、前記混合物は、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニンおよび抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み、前記混合物は、図１のクロマトグラフにより示される薬物製品に存在する同じ必須エストロゲン化合物を含む、前記組成物。
【請求項２４】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンの化学的に純粋な形として存在し、前記混合物は、図２のクロマトグラフにより示される、前記組成物。
【請求項２５】
処置の必要な哺乳動物を処置する方法であって、前記方法は、有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
連続的または断続的に、有効量の請求項１に記載の組成物を投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物は、血管運動症状の処置を必要とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物は、萎縮性膣炎の処置を必要とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物は、骨粗鬆症の処置を必要とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
抱合エストロゲンを含む溶液を調製し、前記溶液は、
分析すべきエストロゲン化合物を含む混合物；および
約０．１％ないし約３０％（有機部分の容量で）のプロトン性溶媒および約７０％ないし約１００％（有機部分の容量で）の極性非プロトン性溶媒を含む有機部分；および
水性部分を含む移動相を含み；そして、ＨＰＬＣシステムを使用して抱合エストロゲン溶液を分析する段階を含む、抱合エストロゲン構成成分を分析する方法。
【請求項３１】
エストロゲン化合物を含む混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
プロトン性溶媒は、低級アルキルアルコールを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
低級アルキルアルコールはメタノールである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
極性非プロトン性溶媒は低級アルキルニトリルを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
低級アルキルニトリルはアセトニトリルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
移動相は、約６５ないし約８０％の水性部分および約２０ないし約３５％の有機部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
水性部分は、ｐＨが約２．５ないし約３．５である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
有機部分は、イオン対形成物質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
イオン対形成物質は、約０．５ないし約２ｍＭの濃度を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
イオン対形成物質は、水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
水性部分はイオン対形成物質を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
イオン対形成物質は、約０．５ないし約２ｍＭの濃度を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
イオン対形成物質は水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
分析段階はさらに、抱合エストロゲン物質の分離構成成分の少なくとも１つを分取する段階を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
分取段階は、マルチチャンネルフラクションコレクターを利用する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＨＰＬＣシステムはカラムを含み、分析段階は、約１５ないし約３５℃のカラム温度で行なう、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、エストロゲン活性を示す医薬組成物と、それを投与および製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抱合エストロゲンを含む医薬製剤（例えば、ペンシルバニア州フィラデルフィアのＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔラボラトリーズにより商業的に入手可能であるプレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ））は、長年、閉経、萎縮性膣炎、骨粗鬆症、性腺機能低下症、性腺摘除、または原発性卵巣不全による低エストロゲン血症、転移性疾患をもつ選択した人における乳癌、および進行したアンドロゲン依存的な前立腺癌に関連した、中程度から重度の血管運動症状に使用されてきた。
【０００３】
プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）は、妊馬の尿から得られた材料の平均組成に相当するようにブレンドされた水溶性エストロゲンスルフェートのナトリウム塩として存在する、天然源から専ら得られるエストロゲン混合物を含むことが知られている。プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）は、妊馬の尿から得られるので、この尿の収集に使用する方法が近年議論されている。動物活動家は、前記の疾患の処置においてそれが有用でありそうであるにも関わらず、これらの方法に抗議し、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）に対して禁止を要求し始めている。プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）は、一般に、多くのエストロゲン化合物を含むと考えられている。しかし、プレマリン（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）を特徴づ
けるための過去数十年間におよぶ数多くの試みにも関わらず、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）に存在する必須エストロゲン化合物は依然として謎である。
【０００４】
プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）に存在する必須エストロゲン化合物を含む、合成抱合エストロゲン製剤を得ることが望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
本発明によると、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）に存在する必須エストロゲン化合物が初めて決定された。これらの必須エストロゲン化合物は、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩からなると決定された。前記の１０個の化合物のスルフェート抱合体のナトリウム塩は、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）のエストロゲン成分として列挙されているが、今まで、前記の１０個の化合物が、プレマリン（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）に存在する唯一の必須エストロゲン化合物であることは知られていなかった。この知識がなかったので、これまで、プレマリン
（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）に存在する同じ必須エストロゲン化合物を含む、エストロゲン化合物の化学的に純粋または合成の混合物を製剤化することは不可能であった。
【０００６】
１つの側面において、本発明は、組成物を提供する。該組成物は、エストロゲン化合物の混合物を含む。該混合物は化学的に純粋な形で存在し得る。該混合物は、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み得る。混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須エストロゲン化合物を含み得る。
【０００７】
本発明の実施形態によると、混合物は、エストロンスルフェート、エクイリンスルフェート、Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート、１７α−エストラジオールスルフェート、１７α−ジヒドロエクイリンスルフェート、１７β−ジヒドロエクイリンスルフェート、１７β−エストラジオールスルフェート、エクイレニンスルフェート、１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェートの塩を含み得る。
【０００８】
本発明の他の実施形態によると、混合物は、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンのナトリウム塩を含み得る。
【０００９】
本発明のさらに他の実施形態によると、混合物は、エストロンスルフェート、エクイリンスルフェート、Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート、１７α−エストラジオールスルフェート、１７α−ジヒドロエクイリンスルフェート、１７β−ジヒドロエクイリンスルフェート、１７β−エストラジオールスルフェート、エクイレニンスルフェート、１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェートのナトリウム塩を含み得る。
【００１０】
別の態様において、本発明は、処置の必要な哺乳動物の処置法を提供する。該方法は、有効量の組成物の投与を含む。本発明の組成物によって対処する処置例は、血管運動症状、萎縮性膣炎、および骨粗鬆症を含む。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、抱合エストロゲン構成成分の分析法を提供する。該方法は、抱合エストロゲンを含む溶液を調製し、ＨＰＬＣシステムを使用して抱合エストロゲン溶液を分析する段階を含む。抱合エストロゲン溶液は、抱合エストロゲンの混合物、並びに、有機部分の容量にして約０．１％ないし約３０％のプロトン性溶媒および有機部分の容量にして約７０％ないし約１００％の極性非プロトン性溶媒を含む有機部分および水性希釈剤を有する移動相を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、従来技術に記載のプレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）のクロマトグラムである。
【図２】図２は、本発明に記載の抱合エストロゲン組成物の実施形態のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、本明細書で以下に示した好ましい実施形態に関してより詳細に記載する。
【００１４】
本発明は、ここで、本明細書に示した実施形態に関して記載する。これらの実施形態は、本発明を説明するものであり、特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、組成物に関する。該組成物は、エストロゲン化合物の混合物を含む。該混合物は、化学的に純粋な形で存在し、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含む。該混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在するのと同じ必須エストロゲン化合物を含む。必須エストロゲン化合物の全部を、混合物の一部として合わせ得る。別法として、必須エストロゲン化合物の一部を、混合物の一部として合わせ得、これらまたは他の化合物のいくらかまたは全部を、ある程度分解すると、天然
から得られたウマ抱合エストロゲンに存在するのと同じ必須エストロゲン化合物を含む混合物が得られる。
【００１６】
本発明の目的では、「天然から得られたウマ抱合エストロゲン」は、天然源から専ら得られ、妊馬の尿から得られた材料の平均組成に相当するようにブレンドされたエストロゲン混合物を含む、薬物製品（すなわちプレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ））として定義し得る。「必須エストロゲン化合物」は、一貫し制御されており（すなわちロット間で＋／−５０％未満の変動）、エストロゲン化合物の混合物の重量にして＞０．１％の濃度で存在し、意味あるエストロゲン活性を有する可能性を有する化学構造を有する（すなわち、フェノール性Ａ環（３位の炭素で）およびＤ環の１７位にβ−ヒドロキシルまたはケトン基を有する（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの治療薬の薬理学的基礎、１４１２（第９版、１９９６））、エストロゲン化合物として定義し得る。本明細書に使用したような、「化学的に純粋な形」は、天然から得られたウマ抱合エストロゲン製品に存在する不純物が実質的にない、より好ましくは、インジカン、硫酸ベンジルアルコール、馬尿酸、安息香酸、およびクレアチニンが実質的にないことを意味する。
【００１７】
本発明により、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する必須エストロゲン化合物が、今回初めて決定された。これらの必須エストロゲン化合物は、以下の１０個の化合物、その抱合体の塩、またはその混合物からなる。エストロン；エクイリン；Δ8,9−デヒドロエストロン；１７α−エストラジオール；１７α−ジヒドロエクイリン；１７β−ジヒドロエクイリン；１７β−エストラジオール；エクイレニン；１７α−ジヒドロエクイレニン；および１７β−ジヒドロエクイレニン。好ましくは、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する必須エストロゲン化合物は、エストロン；エクイリン；Δ8,9−デヒドロエストロン；１７α−エストラジオール；１７α−ジヒドロエクイリン；１７β−ジヒドロエクイリン；１７β−エストラジオール；エクイレニン；１７α−ジヒドロエクイレニン；および１７β−ジヒドロエクイレニンの抱合体のナトリウム塩
からなる。より好ましくは、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する必須エストロゲン化合物は、エストロンスルフェート；エクイリンスルフェート；Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート；１７α−エストラジオールスルフェート；１７α−ジヒドロエクイリンスルフェート；１７β−ジヒドロエクイリンスルフェート；１７β−エストラジオールスルフェート；エクイレニンスルフェート；１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート；および１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェートのナトリウム塩からなる。
【００１８】
本発明の組成物において、エストロゲン化合物は、エストロゲンケトンおよびその対応する１７α−および１７β−ヒドロキシ誘導体を含むがこれに限定されない、種々の形で存在し得る。例えば、エストロゲン化合物は、エストロン、１７α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、エクイリン、１７α−ジヒドロエクイリン、１７β−ジヒドロエクイリン、エクイレニン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、Δ8,9−デヒドロエストロン、１７αΔ8,9−デヒドロエストラジオール、１７βΔ8,9−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨエクイレニン、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、および６−ＯＨ１７βジヒドロエクイレニンを含み得る。エストロゲン化合物は、抱合エストロゲンとしても存在し得る。抱合体は、グルクロニドおよびスルフェートを含むがこれに限定されない、当業者により理解される種々の抱合体であり
得る。最も好ましい抱合体はスルフェートである。エストロゲン化合物は、抱合エストロゲンの塩として存在し得る。塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、およびアミン塩、例えばピペラジン塩を含むがこれに限定されない、当業者により理解される種々の塩であり得る。最も好ましい塩はナトリウム塩である。合成エストロゲン化合物は、天然源以外の起源に由来またはそれから得られたものとして定義し得る。
【００１９】
該混合物は、好ましくは、約４０から約７５％のエストロン化合物、約１５から約４０％のエクイリン化合物、約２から約１０％のΔ8,9−デヒドロエストロン化合物、約２から約１０％の１７α−エストラジオール化合物、約１０から約２０％の１７α−ジヒドロエクイリン化合物、約０．５から約５％の１７β−ジヒドロエクイリン化合物を含む。該混合物は、好ましくはさらに、約０．０５から約３．５％の１７α−ジヒドロエクイレニン化合物、約０．０５から約３％の１７β−ジヒドロエクイレニン化合物、約０．０５から約６％のエクイレニン化合物、約０．０５から約２．５％の１７β−エストラジオール化合物を含む。エストロゲン化合物は好ましくは、抱合化合物の塩として、最も好ましくはエストロゲンスルフェートのナトリウム塩として存在する。
【００２０】
エストロン化合物およびエクイリン化合物の合計％は、好ましくは、約７０から約９５％、より好ましくは約７５％から約９５％の範囲である。エクイリン化合物の％とエストロン化合物の％の比は、好ましくは、約０．２５から約０．７５、より好ましくは約０．３から約０．７、最も好ましくは約０．３５から約０．６５である。本明細書に使用したように、エストロゲン化合物の混合物を記載する場合、％は、抱合エストロゲンの標識内容量に基づいた重量％を意味すると理解する。
【００２１】
エストロゲン化合物および／またはその混合物は、ニュージャージー州モントヴィル所在Ｂｅｒｌｉｃｈｅｍ社；イリノイ州シカゴ所在Ｏｒｇａｎｉｃｓ／Ｌａｇｒａｎｇｅ；およびイリノイ州シカゴ所在Ｄｉｏｓｙｎｔｈ社を含む種々の業者から商業的に入手できる。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つの追加の医薬活性成分を含み得る。追加の活性成分の例は、アンドロゲン、プロゲスチン、カルシウム塩、並びにビタミンＤおよびその誘導体、例えばカルシトリオールを含むがこれに限定されない。アンドロゲンの例は、メチルテストステロン；フルオキシメステロン；オキサンドロロン；オキシメトロン；スタノゾロール；７α−メチル−１９−ノルテストステロン；テストステロン；テストステロンシピオネート；エナント酸テストステロン；プロピオン酸テストステロン；ダナゾール；５α−アンドロスタン−３α−オール−１６−オン；５α−アンドロスタン−３β，１６β−ジオール；５α−アンドロスタン−３β，１６α−ジオール；および５α−アンドロスタン−３β，１７α−ジオールを含むがこれに限定されない。プロゲスチンの例は、Ｐｌｕｎｋｅｔｔらの米国特許第３６，２４７号に示し、
その開示のその全体を本明細書に取込む。例は、デソゲストレル；ジドロゲステロン；エチノジオールジアセテート；メドロキシプロゲステロンアセテート；レボノルゲストレル；メドロキシプロゲステロンアセテート；ヒドロキシプロゲステロンカプロエート；ノルエチンドロン；酢酸ノルエチンドロン；ノルエチノドレル；アリルエストレノール；１９−ノルエストステロン；リノエストレノール；酢酸キンゲスタノール；メドロゲストン；ノルゲストリエノン；ジメチステロン；エチステロン；酢酸シプロテロン；酢酸クロルマジノン；酢酸メゲストロール；ノルゲスチメート；ノルゲストレル；デソゲストレル；トリメゲストン；ゲストデン；酢酸ノメゲストレル；プロゲステロン；５α−プレグナン−３β，２０α−ジオールスルフェート；５α−プレグナン−３β，２０β−ジオールスルフェート；５α−プレグナン−３β−オール−２０−オン；１６，α−プレグネ
ン−３β−オール−２０−オン；および４−プレグネン−２０β−オール−３−オン−２０−スルフェートを含むがこれに限定されない。カルシウム塩は、カルシウムの有機酸塩、例えばクエン酸カルシウム、乳酸カルシウム、フマル酸カルシウム、酢酸カルシウム、およびグリセロリン酸カルシウム、並びに、無機塩、例えば塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムおよび硝酸カルシウムを含み得るがこれに限定されない。
【００２３】
医薬的に許容可能な塩、溶媒、水和物および多形は、本発明の組成物に使用した活性成分のいずれかから形成し得る。本発明はまた、本明細書に定義した組成物が、既知の医薬的に許容される製剤と組合せて種々の量で含まれている、実施形態を包含する。例えば、本発明の組成物は、ペンシルバニア州フィラデルフィアのＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔラボラトリーズにより商業的に入手できる、種々の既知のエストロゲン含有薬物製品、例えばプレマリン（登録商標）に取り込み得る。本発明の組成物はまた、Ｐｌｕｎｋｅｔｔらの米国特許第３６，２４７号に記載のような連続的エストロゲン−プロゲストゲン療法措置の一部として使用し得、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔラボラトリーズにより入手できるプレンプロ（登録商標）およびプレンフェース（登録商標）として商業的に存在し、この開示
のその全体を明細書の記載の一部として本明細書に取込む。
【００２４】
本発明の活性エストロゲン化合物の好ましい混合物は、図２のクロマトグラムにより示し得る。
【００２５】
本発明はまた、本発明の組成物および少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤（その選択は、当業者には公知である）を含む、医薬的に許容される薬物製品を包含する。薬物製品製剤は、錠剤；発泡錠；丸剤；散剤；エリキシル；懸濁液；乳剤；液剤；シロップ；軟および硬ゼラチンカプセル；経皮パッチ；局所ゲル；クリーム等；坐剤；無菌注射溶液；および無菌梱包散剤の形であり得る。
【００２６】
ある実施形態において、薬物製品は、経口投与に適し得る、固体医薬組成物で存在する。本発明に記載の固体組成物を形成し、賦形剤と混合し得るか、賦形剤により希釈し得るか、または、カプセル、サシェ剤、錠剤、紙、または他の容器の形であり得る担体内に封入し得る。賦形剤が希釈剤の働きをする場合、それは、組成物のベヒクル、担体、または媒体として作用する、固体、半固体、または液体材料であり得る。
【００２７】
種々の適切な賦形剤が当業者により理解され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  １９、２４０４〜２４０６項（２０００）に見出し得、２４０４〜２４０６項の開示のその全体を本明細書に取込む。例えば、薬物製品製剤は、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などの潤滑剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、微結晶セルロース、セルロース、メチルセルロース、およびシロップ；固化防止剤、例えばケイ酸カルシウム；コーティング剤、例えばメタクリレートおよびシェラック；防腐剤、例えばメチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート；甘味剤；または芳香剤を含み得る。ポリオール、緩衝液および不活性充填剤も使用し得る。ポリオールの例は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、マルトース、グルコース、ラクトース、デキストロース等を含むがこれに限定されない。適切な緩衝液は、リン酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸等を包含するがこれに限定されない。使用し得る他の不活性充填剤は、当分野で公知であり、種々の投与形の製造に有用なものを包含する。所望であれば、固体製剤は、かさ増量剤および／または造粒剤等の他の成分も含み得る。本発明の薬物製品は、当分野で公知の手順を使用することにより、患者に投与した後に、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供するように製剤化し得る。
【００２８】
経口投与用の投与単位を形成するために、本発明の組成物を、固体の粉状の担体、例えばラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体またはゼラチンと、並びに、減摩剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびポリエチレングリコールワックスと混合し得る。その後、混合物を錠剤に圧縮し得る。経口使用の錠剤はまた、以下の方法でも調製し得るが、他の技術も使用し得る。固体物質は粉砕またはふるいにかけて、所望の粒子サイズとし、結合剤をホモジナイズし、適切な溶媒に懸濁する。活性成分および補助剤を、結合剤の溶液と混合する。得られた混合物を加湿して、均一な懸濁液を形成する。加湿により、典型的には、粒子は僅かに凝集し、得られた塊を、所望のサイズを有するステンレス鋼ふるいを通して押し付ける。その後、混合物の層を、所望の粒子サイズおよび稠度を達成するために、決められた時間、制御乾燥ユニット中で乾燥する。乾燥混合物の顆粒をふるいにかけ、全ての粉末を除去する。この混合物に、崩壊剤、減摩剤、および抗粘着剤を加える。最後に、混合物を、適切な穿孔機を有する機械を使用して押し付けて錠剤とし、切断して、所望の錠剤サイズを得る。機械の操作パラメータは、当業者が選択し得る。
【００２９】
コーティング錠剤を所望する場合、上記の調製したコアを、濃縮糖溶液（アラビアガム、ゼラチン、タルク、二酸化チタンを含み得る）で、または、揮発性有機溶媒または溶媒混合物中に溶解したラッカーでコーティングし得る。さらに、コーティングは、分散メチルセルロース、分散エチルセルロース、分散メタクリレートまたはその混合物を含むがこれに限定されない種々の賦形剤を使用して、水性または非水性媒体中で実施し得る。このコーティングに、種々のダイを加えて、異なる活性化合物をもつ、または、存在する活性化合物の量の異なる錠剤を識別し得る。さらに、活性成分をコーティングに加え得る。特定の実施形態において、活性成分は、持続放出コーティング層を含む１つ以上の層により囲まれるコアに存在し得る。
【００３０】
カプセルが活性成分と植物油の混合物を含む、軟ゼラチンカプセルを調製し得る。硬ゼラチンカプセルは、固体で粉状の担体、例えばラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、馬鈴薯デンプン、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロース誘導体またはゼラチンと組合せて、活性成分の顆粒を含み得る。
【００３１】
１つの好ましい実施形態において、製剤は、以下の不活性成分と共に、本明細書に示したような本発明の組成物を含む、経口投与錠剤形である：リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、カルナウバろう、セルロース、モノオレイン酸グリセリル、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、医薬上塗り、ポリエチレングリコール、ステアリン酸、スクロース、および二酸化チタン。該成分は、ペンシルバニア州フィラデルフィアのＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔラボラトリーズにより商業的に入手できる、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）に存在するものと類似した量で存在し得る。本発明の活性成分を使用した錠剤は、０．３ｍｇ、０．６２５ｍｇ、および１．２５ｍｇのプレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）の錠剤に類似した賦形剤を含み得る。
【００３２】
経口投与用の液体調製物は、シロップまたは懸濁液、例えば、活性成分、糖、および、エタノール、水、グリセロール、およびプロピレングリコールの混合物を含む溶液の形で、調製し得る。所望であれば、該液体調製物は、着色剤、芳香剤、およびサッカリンを含み得る。カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤も使用し得る。
【００３３】
上記の製剤を非経口投与に使用する場合には、該製剤は、水性無菌注射溶液、非水性注射溶液、水性および非水性注射溶液の混合物、または、本発明の組成物を含む復元用の乾燥無菌凍結乾燥ケークを含み得る。水性注射溶液を調製する場合、組成物は、水溶性の医薬的に許容される塩として存在し得る。非経口調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および、製剤を、目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る。水性および非水性無菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得る。製剤は、単位投与用または複数回投与用の容器、例えば封をしたアンプルおよびバイアルで提示し得る。即時注射溶液および懸濁液は、前記した種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製し得る。
【００３４】
好ましい実施形態において、本発明の薬物製品は、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびシメチコンも含む無菌の凍結乾燥ケーク中に、所定の量（例えば２５ｍｇ）の組成物を含む、注射溶液の形である。上記の成分を含む溶液のｐＨは、適切な物質（例えば水酸化ナトリウムまたは塩酸）を使用して調整し得る。復元は、既知の方法に従って、例えば、無菌水中２％のベンジルアルコールを含む無菌希釈液（５ｍＬ）を使用して実施し得る。好ましい注射可能な溶液は、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔラボラトリーズから商業的に入手できるプレマリン（登録商標）静注用に類似している。
【００３５】
組成物はまた、局所投与（例えば膣クリーム）に適するように製剤化し得る。これらの製剤は、当業者に既知の種々の賦形剤を含み得る。適切な賦形剤は、セチルエステルワックス、セチルアルコール、白蝋、モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸プロピレングリコール、ステアリン酸メチル、ベンジルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、鉱油、水、カルボマー、エチルアルコール、アクリル酸粘着剤、ポリイソブチレン粘着剤、およびシリコン粘着剤を含むがこれに限定されない。
【００３６】
好ましい実施形態において、薬物製品は、非液化基剤に存在する本明細書に示したような組成物を含む膣クリームの形である。非液化基剤は、例えばセチルエステルワックス、セチルアルコール、白蝋、モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸プロピレングリコール、ステアリン酸メチル、ベンジルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、および鉱油などの種々の不活性成分を含み得る。このような組成物は、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔラボラトリーズから商業的に入手できるプレマリン（登録商標）膣クリームと同じように製剤化し得る。
【００３７】
直腸投与用の投与単位は、中性脂肪基剤と共に混合物中に組成物を含み得る坐剤の形で調製し得るか、または、植物油またはパラフィン油と共に混合物中に活性物質を含むゼラチン−直腸カプセルの形で調製し得る。
【００３８】
別の側面において、本発明は、処置の必要な哺乳動物（例えばヒト）の処置法に関する。該方法は、有効量の本明細書に定義したような組成物を、処置に必要な哺乳動物に投与することを含む。該方法は、血管運動症状：萎縮性膣炎；骨粗鬆症；性腺機能低下症、性腺摘除、または原発性卵巣不全による低エストロゲン血症；転移性疾患をもつ選択した人における乳癌；進行したアンドロゲン依存的な前立腺癌；異常な子宮出血；および外陰萎縮症を含むがこれに限定されない、多くの処置に使用し得る。投与は、１回以上の短い期間または処置クール（すなわち短期間の使用）で行なう、循環式であり得る。別法として、投与は、より長い期間（すなわち長期での使用）行なう、連続的であり得る。長期使用の一例は、閉経開始から死亡までである。循環的および連続的投与は、断続的でも非断続的でもよい。非断続的投与は、１日に１回以上行なうので、処置に切れ目はない。断続的投与は、毎日以外の様式で行い、例えば、３週間毎日処置し、その後の１週間は処置しないことを含む、反復処置クールで行なう。
【００３９】
別の側面において、本発明は、エストロゲン化合物を含む混合物を分析する方法に関する。該方法は、エストロゲン化合物を含む溶液を調製し、ＨＰＬＣシステムを使用してエストロゲン含有溶液を分析する段階を含む。分析するエストロゲン化合物は、好ましくは、抱合エストロゲン化合物の混合物を含む。より好ましくは、混合物は、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）または本発明の組成物中に存在する。
【００４０】
エストロゲン含有溶液は移動相を含む。移動相は、有機部分、水性部分、および１つ以上の希釈剤を含み得る。好ましくは、有機部分および水性部分は希釈剤として作用する。エストロゲン含有溶液は、種々の方法で調製し得る。エストロゲン化合物の混合物を最初に、有機部分、水性部分、または両方と混合し、その後、得られた有機部分を得られた水性部分と混合し得る。別法として、有機部分および水性部分を最初に一緒に混合し、移動相を形成し、その後、エストロゲン化合物の混合物を移動相と混合する。エストロゲン化合物の混合物は、好ましくは、最初に、有機部分と混合し、その後、得られた有機部分を、水性部分と混合する。移動相は、好ましくは、約５５ないし約９０％、より好ましくは約６５ないし８０％、最も好ましくは約７０ないし約７５％の水性部分を含む。移動相はまた、好ましくは、約１０ないし約４５％、より好ましくは約２０ないし約３５％、最も好ましくは約２５ないし約３０％の有機部分を含み、ここでの有機または水性部分の％は、移動相の容量％として測定する。移動相のｐＨは、好ましくは、約２．５ないし約７、より好ましくは約２．５ないし３．５、最も好ましくは約２．８ないし約３．２である。
【００４１】
有機部分は、約０ないし約３０％のプロトン性溶媒および約７０ないし約１００％の極性非プロトン性溶媒を含み得、ここでの％は、有機希釈剤の容量％である。有機部分は好ましくは、約５ないし約２５％のプロトン性溶媒および約７５ないし約９５％の極性非プロトン性溶媒を含み、より好ましくは、約１０ないし約２０％のプロトン性溶媒および約８０ないし約９０％の極性非プロトン性溶媒を含み、最も好ましくは、約１０ないし約１５％のプロトン性溶媒および約８５ないし約９０％の極性非プロトン性溶媒を含む。プロトン性溶媒は好ましくは低級アルキルアルコールを含み、より好ましくはメタノールである。極性非プロトン性溶媒は好ましくは、低級アルキルニトリルを含み、より好ましくはアセトニトリルである。
【００４２】
有機部分はまた、イオン対形成物質を含み得る。イオン対形成物質は、好ましくは、約０．５ないし約２ミリモル／リットルの有機部分（ｍＭ）、より好ましくは約０．５ないし約１．５ｍＭ、最も好ましくは約０．５ないし約１．０ｍＭの濃度を有する。イオン対形成物質は、好ましくは、水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムであるが、他の物質も使用し得、これは当業者により理解される。有機部分はまた、緩衝塩、酸および塩基を含むがこれに限定されない、当業者に公知の種々の成分も含み得る。
【００４３】
水性部分は、イオン対形成物質を含み得る。水性部分は好ましくは、約０．５ないし約２ミリモル／リットルの水性部分（ｍＭ）のイオン対形成物質濃度を有する。より好ましくは、水性部分は、約０．５ないし約１．５ｍＭ、最も好ましくは約０．５ないし約１．０ｍＭのイオン対形成物質濃度を有する。イオン対形成物質は、好ましくは、水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムであるが、他の物質も使用し得、これは当業者により理解される。水性部分は、好ましくは約２．５ないし約７、より好ましくは約２．５ないし３．５、最も好ましくは約２．８ないし約３．２のｐＨを有する。水性部分はまた、緩衝塩、酸および塩基を含むがこれに限定されない、当業者に公知の種々の成分を含み得る。好ましくは緩衝塩はリン酸塩である。
【００４４】
分析段階は、当業者に公知のＨＰＬＣシステムを使用して実施し得る。ＨＰＬＣシステムは、好ましくは、逆相カラムを含み得る。カラムは、長さおよび内径を有する。カラムの長さは、約５ないし約１００ｃｍであり得る。カラムの長さは、好ましくは約５ないし約３０ｃｍ、より好ましくは約１０ないし約２０ｃｍ、最も好ましくは１５ｃｍである。カラムの内径は、約２ないし約１００ｍｍであり得、好ましくは約３ないし約５０ｍｍ、より好ましくは約３ないし約２０ｍｍ、最も好ましくは約３ないし約１０ｍｍである。カラムは好ましくは、アルキルをベースとした固定相で充填する。アルキルをベースとした固定相は、好ましくはＣ18固定相である。固定相の粒子サイズは好ましくは約２ないし約２０μｍであり、より好ましくは約２ないし約１０μｍである。
【００４５】
ＨＰＬＣシステムは、１つ以上の適切な検出器を含み得る。検出器は、好ましくは、蛍光および紫外線（ＵＶ）検出器を含む。ＵＶ検出器は、好ましくはダイオードアレイを含む。ＵＶ検出器は、好ましくは約１９０ないし約４００ナノメーター（ｎｍ）、より好ましくは２００ないし３００ｎｍの波長で検出する。蛍光検出器は好ましくは、約２５０ないし約３１０ｎｍ、より好ましくは約２６０ないし約３００ｎｍ、最も好ましくは約２７０ないし約２９０ｎｍの励起を有する。蛍光検出器は好ましくは、約３００ないし約３２０ｎｍおよび約３９５ないし４１５ｎｍ、より好ましくは約３０５ないし約３１５ｎｍおよび約４００ないし約４１０ｎｍの発光を示す。
【００４６】
ＨＰＬＣシステムは、カラム流速およびカラム温度を含む、特定の操作パラメータを有し得る。カラム流速は、好ましくは、約０．１ないし約１０ミリリットル／分（ｍＬ／分）、より好ましくは約２ないし約５ｍＬ／分、最も好ましくは約３ｍＬ／分である。カラム温度は、好ましくは、約１０ないし約３５℃、より好ましくは約１５ないし約３０℃、最も好ましくは約２５℃であり得る。前記のパラメータが好ましくあり得るが、他のパラメータも使用し得、これは当業者により理解される。
【００４７】
分析段階は、さらに、目的のピークを収集する段階を含み得、好ましくは、目的のピークの分取段階を含む。分取段階は、好ましくは、マルチチャンネルフラクションコレクターを使用して実施する。
【００４８】
本発明の方法は、天然から得られたウマ抱合エストロゲン（すなわちプレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ））を特徴づける方法の一部として実施し得、その必須エストロゲン化合物を決定し得る。プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）を特徴づける方法は、ここで、以下の実施例に記載する。実施例では、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「ｍＭ」はミリモル／リットルを意味し、「Ｍ」はモル／リットルを意味し、「Å」はオングストロームを意味し、「μｍ」は、マイクロメーターを意味し、「ｎｍ」はナノメーターを意味し、「ｍｍ」はミリメーターを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍ／ｚ」は質量と荷電の比を意味し、「（Ｍ＋Ｈ）+」は、プロトン化親イオン（質量分析）を意味し、「（Ｍ−Ｈ）」は
、親イオン（質量分析）を意味する。これらの実施例は、本発明を説明するために提供し、特許請求の範囲により示したような本発明を限定するものではない。
【００４９】
［実施例１−−プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）の特徴づけ］
Ｉ．必須エストロゲン化合物として化合物を特徴づけるための基準
２つの基本的な基準を、この分析において、必須エストロゲン化合物を決定するための基礎として使用した。第一に、任意の特定の成分のロット間の一貫性は、製造プロセスにおけるその成分の制御および／またはその安定性を反映する。エストロゲン化合物を、そのそれぞれのロット間の変動により必須エストロゲン化合物としての考慮することから排除するための保守的なアプローチを行なった。±５０％のばらつきを有する成分のみを排除した。
【００５０】
第二の基準は、最も重要であり得る：活性成分の可能性があると割当てるのは、エストロゲン性の定義を必要とする。エストロゲン性を定義する構造−機能アプローチを行なった。Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎの治療薬の薬理学的基礎（第９版、１９９６、１４１２項）によると、エストロゲン活性は、フェノール性Ａ環（炭素３位）およびＤ環の１７位におけるβ−ヒドロキシルまたはケトン基の存在により制御される。参考文献は、「フェノール性Ａ環は、エストロゲン受容体への選択的で高親和的な結合に関与する、基本的な構造的特徴である。フェノール性Ａ環の大半のアルキル置換基は、該結合を損なうが、ＣおよびＤ環上の置換基は耐容性であり得る」と記述する。全ての既知のエストロゲンは、このフェノール性Ａ環の存在により識別され、これは、可能性あるエストロゲン化合物に対して独特な分光的特徴を付与する。この化学的および／または分光的アプローチの使用は、エストロゲン性の可能性を割り当てる上で、前記した他の方法よりも、保存的な方法を提供する。例えば、生物学的アッセイは、組織特異的応答と、特異的エストロゲンの代謝活性化または分解の差異を反映するアッセイ系の差異により、矛盾した結果をもたらした。エストロゲン受容体結合アッセイは、相対的エストロゲン性の妥当な指標として提案されている。しかし、少なくとも２つの受容体サブタイプの存在により、これらのアッセイの解釈は複雑化している。最後に、動物試験（例えばげっ歯類）も、ヒトのエストロゲン性をあまり良好に予測しなかった。それ故、化学的／分光学的戦略をこの分析に採用した。
【００５１】
ＩＩ．実験的試験の要約
Ａ．装置および設備
１．ＨＰＬＣクロマトグラフィー手順
ａ．ＨＰ１１００ＨＰＬＣクロマトグラフィーシステム
ｂ．ＨＰ１１００ダイオードアレイ検出器
ｃ．ＨＰ１１００  ４級ＨＰＬＣポンプ
ｄ．島津、モデルＲＦ−５５１、蛍光検出器
ｅ．５''グラインダーおよび３''パックを有するＡＡＩ可変スピード摩砕器
（Ｗｈｉｔｔｌｅらの米国特許第５，７３３，１７３号）
【００５２】
２．分取、精製、および結晶化
ａ．ＩＳＣＯ  Ｆｏｘｙ  Ｊｒ．、１０チャンネルフラクションコレクター
ｂ．Ｂuｃｈｉ、モデルＲ−１２４回転エバポレーター
ｃ．ＳＰＥカートリッジ、Ｃ18、バリアン
ｄ．ＳＰＥカートリッジ、ＳＣＸイオン交換、バリアン
【００５３】
３．分極光学顕微鏡
ａ．明治、モデルＥＭＺ−ＴＲ、交差分極レンズを有する立体顕微鏡
ｂ．オリンパス、モデルＢＨ−２、交差分極レンズを有する複合顕微鏡
【００５４】
４．質量分析
ａ．電子衝撃／質量分析法（ＥＩ−ＭＳ）
（１）  装置：ＶＧ分析ＺＡＢ２−ＳＥ
（２）  源温度：２００℃
（３）  電子電圧：７０ｅＶ
（４）  試料プローブ：固体プローブ
（５）  プローブ温度：２８０℃
【００５５】
ｂ．液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）
（１）  真空脱ガス器を有するＨＰ１１００バイナリーポンプ
（２）  溶媒Ａ：０．１％の水性ＴＦＡ
（３）  溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む、ＡＣＮ：水（９：１）ｖ／ｖ
（４）  勾配：１５％Ｂを、３５分間で、４０％Ｂに上昇する。
（５）  流速：０．２５ｍＬ／分
（６）  固定相：Ｃ18カラム
（７）  カラム温度：３５℃
（８）  検出器：可変波長ＵＶ、２２０ｎｍ
（９）  ＭＳ装置：ＶＧＢｉｏＱ三連四重極質量分析計
（１０）  操作モード：陽性エレクトロスプレーイオン化（＋ＥＳＩ）モード
（１１）  源温度：８０℃
【００５６】
ｃ．高速原子衝撃（ＦＡＢ−ＭＳ）
（１）  装置：ＶＧ分析ＺＡＢ２−ＳＥ
（２）  試料投入：セシウムイオン銃
（３）  データシステム：ＰＤＰ１１／７３を有するＶＧ分析１１−２５０Ｊ
【００５７】
ｄ．エレクトロスプレー質料分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）
（１）  装置：四重極分析器を有するＶＧバイオテックバイオ−Ｑ
（２）  操作モード：陰イオン直接注入
（３）  注射容量：３０μＬ／分
【００５８】
ｅ．エレクトロスプレーＭＳ／ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）
（１）  装置：ＶＧクアットロＩＩバイオ−Ｑ三連四重極分析器
（２）  衝突ガス：アルゴン
（３）  試料アリコート：５０μＬ
（４）  溶出溶媒：５０％水性ＡＣＮ
（５）  流速：１０μＬ／分
【００５９】
ｆ．高分解能質量分析計（ＨＲ−ＭＳ）
（１）  装置：ＶＧ分析ＺＡＢ２−ＳＥ
（２）  試料投入：セシウムイオン銃
（３）  データシステム：ＰＤＰ１１／７３を有するＶＧ分析１１−２５０Ｊ
（４）  Ｘ線回折単結晶解析
【００６０】
５．  Ｘ線回折単結晶解析
ａ．ノニウスＣＡＤ４、モデル５８６、自動単結晶回折計
ｂ．ＣｕＸ線管、微細焦点、（λ＝１．５４１８Å）
ｃ．無作為配向写真付着、ポラロイド、モデル５７−３
ｄ．ＥＸＰＲＥＳＳデータ収集ソフトウェア
ｅ．ＭＯＬＥＮデータ解釈ソフトウェア
【００６１】
６．走査型電子顕微鏡／エネルギー分散型Ｘ線分析（ＳＥＭ／ＥＤＸ）
ａ．日立ＳＥＭ、モデルＳ−３２００Ｎ
ｂ．Ｋｅｖｅｘ  ＥＤＸ
【００６２】
Ｂ．化学物質、試薬および分析材料
１．化学物質および試薬
ａ．アセトニトリル（ＡＣＮ）、ＨＰＬＣ等級
ｂ．メタノール（ＭｅＯＨ）、ＨＰＬＣ等級
ｃ．エタノール、無水
ｄ．逆浸透水
ｅ．トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ＨＰＬＣ等級
ｆ．水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）、０．４Ｍ、試薬等級
ｇ．テトラメチルホスホニウムクロリド、試薬等級
ｈ．リン酸一カリウム、ＡＲ等級
ｉ．窒素ガス、ゼロ等級
ｊ．リン酸
ｋ．塩酸
【００６３】
２．分析試料
ａ．種々のプレマリン（登録商標）ロットを、以下の表１に詳述する。
【表１】
2011256181.tif 000002
【００６４】
３．分析標準物質
ａ．抱合エストロゲン基準標準物質（９成分）、Ｏｒｇａｎｉｃｓ／ＬａＧｒａｎｇｅ社（ＯＬＧ）
ｂ．抱合エストロゲン基準標準物質（１０成分）、ＯＬＧ
ｃ．エストロン、ＥＳＰ
ｄ．エクイリン、ＵＳＰ
ｅ．１７α−ジヒドロエクイリン、ＵＳＰ
ｆ．エストロンスルフェート、ナトリウム塩、ＯＬＧ
ｈ．１７α−エストラジオールスルフェート、ナトリウム塩、ＯＬＧ
ｉ．１７α−ジヒドロエクイリンスルフェート、ナトリウム塩、ＯＬＧ
ｊ．Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート、ＴＲＩＳとのナトリウム塩、ＯＬＧ
【００６５】
４．関連標準物質／試料
ａ．１，３，５（１０），６−エストラテトラエン−３，１７β−ジオール、リサーチ・プラス
ｂ．３−インドキシルスルフェート、カリウム塩（インジカン）、シグマ
ｃ．馬尿酸、ＡＣＲＯＳ
ｄ．ｏ−メチル馬尿酸、ＡＣＲＯＳ
ｅ．ｍ−メチル馬尿酸、ＡＣＲＯＳ
ｆ．ｐ−メチル馬尿酸、ＡＣＲＯＳ
ｇ．ｄ，ｌ−マンデル酸、ＡＣＲＯＳ
ｈ．クレアチニン、ＡＣＲＯＳ
ｉ．安息香酸、ナトリウム塩、ケム・サービス
ｊ．４−ピコリン、アルドリッチ
ｋ．尿酸、ＡＣＲＯＳ
ｌ．Ｄ−グルクロン酸、アルドリッチ
ｍ．バイオプテリン、アルドリッチ
ｎ．４−ピリドキシン酸、アルドリッチ
ｏ．インドール、シグマ
ｐ．エクオール、フルカ
ｑ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１７β−ジオール−３，１７−ジスルフェート二ナトリウム、リサーチ・プラス
ｒ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１７β−ジオール−１７−スルフェートナトリウム、リサーチ・プラス
ｓ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１７β−トリオール、リサーチ・プラス
ｔ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７−オン−２−メチルエーテル、リサーチ・プラス
ｕ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１７β−トリオール−２−メチルエーテル、リサーチ・プラス
ｖ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３−オール−１７−オン−３−メチルエーテル、リサーチ・プラス
ｗ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１７β−ジオール−３−メチルエーテル、リサーチ・プラス
ｘ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１７β−トリオール−２，３−ジメチルエーテル、リサーチ・プラス
ｙ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１６α，１７α−トリオール、リサーチ・プラス
ｚ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１６α，１７β−トリオール、リサーチ・プラス
ａａ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１６α，１７β−トリオール−３−スルフェートナトリウム、リサーチ・プラス
ｂｂ．１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１６α，１７β−トリオール−１６，１７−ジスルフェート二ナトリウム、リサーチ・プラス
ｃｃ．１，３，５（１０），６−エストラテトラエン−３−オール−１７−オン、リサーチ・プラス
ｄｄ．５α−アンドロスタン−３β，１６α−ジオール、リサーチ・プラス
ｅｅ．５α−アンドロスタン−３β，１６β−ジオール、リサーチ・プラス
ｆｆ．５α−アンドロスタン−３β，１７α−ジオール、リサーチ・プラス
ｇｇ．５α−アンドロスタン−３β−オール−１６−オン、リサーチ・プラス
ｈｈ．５α−アンドロスタン−３α−オール−１７−オン−３−スルフェートナトリウム、リサーチ・プラス
ｉｉ．５α−プレグナン−３β，２０α−ジオール、リサーチ・プラス
ｊｊ．５α−プレグナン−３β，２０β−ジオール、リサーチ・プラス
ｋｋ．５α−プレグナン−３β−オール−２０−オン、リサーチ・プラス
ｌｌ．４−プレグナン−２０β−オール−３−オン、リサーチ・プラス
ｍｍ．１６，５α−プレグナン−３β−オール−２０−オン、リサーチ・プラス
【００６６】
Ｃ．方法
１．ＨＰＬＣクロマトグラフィーアッセイ法
約０．０３ｍｇ／ｍＬの抱合エストロゲン薬物物質を含む標準溶液を、以下のように調製し得る。適切な量を秤量して、２００ｍＬの溶液となる。この量を、６１ｍＬの有機希釈剤に溶かし、１０分間機械的に振盪する。約１００ｍＬの水性希釈剤を加え、１０分間機械的に振盪する。水性希釈剤を用いて希釈して増量し、よく混合する。０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して溶液の一部をろ過する。
【００６７】
メタノール中０．２ｍｇ／ｍＬのエストロン、エクイリンおよび１７α−ジヒドロエクイリンの遊離ストックステロイド溶液を、各遊離エストロゲンについて調製し得る。
【００６８】
約０．０３ｍｇ／ｍＬの１０成分の抱合エストロゲン基準標準物質および約０．００６ｍｇ／ｍＬの各１７α−ジヒドロエクイリン、エクイリンおよびエストロンを、標準溶液として含む分解溶液を、調製し得る。好ましくは、１００ｍＬの容量の分解溶液を、標準溶液として、調製し、混合し、ろ過する。
【００６９】
リン酸緩衝溶液を調製し得る。リン酸緩衝溶液は、好ましくは、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液である。
【００７０】
２７７：０．９の容量比でリン酸緩衝液および０．４ＭのＴＢＡＨの溶液を含む水性希釈剤を調製し得る。溶液のｐＨは、リン酸を用いて３．０±０．１に調整し得る。
【００７１】
２６．５：４の容量比を有するアセトニトリルおよびメタノールの溶液を含む有機希釈剤を調製し得る。
【００７２】
移動相は、３０．５：６９．５の容量比を有する有機希釈剤および水性希釈剤の溶液を混合することにより調製し得る。
【００７３】
分析する試料を調製し得る。第一に、錠剤を、水中で１０〜２０個の錠剤を洗浄し、外コーティングを除去し、その後、それらを窒素パージ下で風で乾燥することにより調製する。その後、錠剤を、乳鉢および乳棒または４５０ＲＰＭで１分間ＡＡＩ摩砕器を使用して粉砕して微細粉末とする。その後、粉砕した錠剤を、移動相と混合し、抱合エストロゲンを含む移動相を形成する。
【００７４】
例えば、０．６２５ｍｇの錠剤を分析する場合、重量の等しい１０個の錠剤を、２００ｍＬの容量測定フラスコに入れる。次に、６１ｍＬの有機希釈剤をフラスコに加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。その後、約１００ｍＬの水性希釈剤をフラスコに加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。その後、得られた溶液を、水性希釈剤で希釈して増量し、混合する。溶液の一部を、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過する。
【００７５】
別の例として、１．２５ｍｇの錠剤を分析する場合、重量の等しい１０個の錠剤を、４００ｍＬの容量測定フラスコに入れる。次に、１２２ｍＬの有機希釈剤をフラスコに加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。その後、約２００ｍＬの水性希釈剤をフラスコに加え、フラスコを再び一度１０分間機械的に振盪する。その後、得られた溶液を、水性希釈剤を用いて希釈して増量し、混合する。溶液の一部を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過する。
【００７６】
２５ｍｇの静注用凍結乾燥ケークを分析したい場合、バイアルを開封し、約５ｍＬの移動相をバイアルに加える。その後、バイアルを簡潔に、ケークが眼でみて溶解するまで振盪する。溶液を、２００ｍＬの容量測定フラスコに定量的に移し、移動相を用いて希釈して増量し、混合する。５．０ｍＬのこの溶液を、１０ｍＬの容量測定フラスコにピペッティングし、移動相を用いて希釈して増量し、よく混合する。
【００７７】
このクロマトグラフィー解析では、３μｍで、１５．０ｃｍ×４．６ｍｍのＣ18カラムを具備したカラムヒーターおよび２２０ｎｍにおける検出用の適切なＵＶ検出器およびダイオードアレイを有するＨＰＬＣシステムを使用した。流速は１．５ｍＬ／分に設定し、カラム温度は２５℃に設定した。
【００７８】
クロマトグラフィー手順の例は、以下の通りである：１００μＬの分解溶液および希釈剤ブランクを、別々に、クロマトグラフに注入した。ブランク注射液中のどの既知のエストロゲンピークについても、相対的保持時間（ＲＲＴ）での干渉は全く観察されなかった。等量の標準溶液および試料調製物を、別々に、クロマトグラフィーシステムに注入した。各ピークを、１０個の既知のエストロゲンピークに対するピーク面積応答に基づいて統合および評価した。
【００７９】
上記の手順を使用して、従来技術の図１に示した、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）のクロマトグラムを得た。類似手順を使用して、図２で示した本発明のクロマトグラムを得た。図１および２では、標識ピークは以下の通りである：１７β−ジヒドロエクイレニン（１０，２０）；１７β−ジヒドロエクイリンスルフェート（１１，２１）；１７α−ジヒドロエクイレニン（１２，２２）；１７β−エストラジオールスルフェート（１３，２３）；１７α−ジヒドロエクイリン（１４，２４）；１７α−エストラジオールスルフェート（１５，２５）；エクイレニンスルフェート（１６，２６）；Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェートおよびエクイリンスルフェート（１７，２７）；およびエストロンスルフェート（１８，２８）。
【００８０】
２．抱合エストロゲン構成成分の分取のための半調製用ＨＰＬＣシステム  勾配分離の増強により、フラクションコレクターをＨＰＬＣシステムに加えて、上記のクロマトグラフィー走行の個々のピークまたは区分を分離および保持できる。半調製用ＨＰＬＣ法は、移動相Ａおよび移動相Ｂを使用した。移動相Ａは、０．９ｍＭのＴＢＡＨおよび０．０７５％の１２．１Ｎ  ＨＣｌを含む水相であり、全ての％は、移動相Ａの容量による。移動相Ｂは、０．９ｍＭのＴＢＡＨ、１３．１％のＭｅＯＨ、８６．９％のＡＣＮおよび０．０７５％の１２．１Ｎ  ＨＣｌを含む有機相であり、全ての％は、移動相Ｂの容量による。
【００８１】
解析する試料を調製し得る。最初に、約１００〜２００錠剤を、水中で洗浄し、外コーティングを除去し、その後、窒素パージ下で風で乾燥する。その後、錠剤をＡＡＩ摩砕器で１分間４５０ＲＰＭで粉砕する。０．３１ｍｇ／ｍＬの濃度の抱合エストロゲンを有する溶液を、上記の分析標準溶液と同様に調製し得る。例えば、重量の等しい１００個の１．２５ｍｇの錠剤を、４００ｍＬの容量測定フラスコに入れる。１２２ｍＬの有機希釈剤をフラスコに加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。その後、約２００ｍＬの水性希釈剤をフラスコに加え、フラスコを再度、１０分間機械的に振盪する。その後、得られた溶液を、水性希釈剤を用いて希釈して増量し、混合する。溶液の一部を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過する。
【００８２】
この半調製用クロマトグラフィー分析では、７μｍで１５．０ｃｍ×７．８ｍｍのＣ18カラムを具備したカラムヒーターおよび２２０ｎｍにおける検出用の適切なＵＶ検出器およびダイオードアレイを有するＨＰ１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。流速は３．０ｍＬ／分に設定し、カラム温度は２５℃に設定した。勾配プロファイルを以下に列挙する。
【表２】
2011256181.tif 000003
【００８３】
クロマトグラフィー手順の例は、以下の通りである。１．０〜１．５ｍＬの試料を、複数回、クロマトグラフィーシステムに注入し、目的のピークを、マルチチャンネルフラクションコレクターを使用して分取した。分析手順に対するピーク実体の交差（ｃｒｏｓｓ  ｏｖｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅａｋ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、ピークの動きを追跡するために、ダイオードアレイ比較を使用して実施した。一旦、全画分を収集すると、各画分を、適切なイオン交換カラムに通し、イオン対形成物質を除去した。画分を、回転エバポレーターを使用して真空下で適切な容量まで濃縮し、結晶の成長のために側らに配置するか、または同定用の他の手段により分析を実施する。
【００８４】
ＩＩＩ．プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）中の必須エスト
ロゲン化合物の特徴づけ
＜プレマリン（登録商標）ロット選択＞
プレマリンを適切に特徴づけるために、種々のロットを検査し、製品のばらつきを調べた。ロット間および国間の一貫性並びに時間の経過した試料に基づいた安定性の評価の可能な、プレマリン（登録商標）錠剤の個々のロットを無作為に選択した。上記の表１は、これらのパラメータを調べるためのロットの選択を詳述する。プレマリン（登録商標）系列に関する製品モノグラフに基づいて、２つの他の製品を、プレマリン（登録商標）錠剤に加えて、抱合エストロゲンＵＳＰを使用して製造する。これらは、プレマリン（登録商標）膣クリームおよびプレマリン（登録商標）静注（ＩＶ）である。プレマリン（登録商標）静注ロットも検査して、プレマリン（登録商標）錠剤から観察されたピークが、抱合エストロゲンＵＳＰに由来することを確実にした。検査したプレマリン（登録商標）静注
ロットは、上記の表１に含める。
【００８５】
選択した錠剤ロットにより、プレマリン（登録商標）ロットを、種々の国起源で、最も一般的な錠剤強度の、３年間の有効期限をもつロットを保証した１．２５ｍｇの錠剤の古い試料と、直接比較できる。これらの試料から、プレマリン（登録商標）の成分の特徴づけを、上記のＨＰＬＣクロマトグラフィーアッセイにより各個々のピークを詳しく調べることにより実施した。検査したロットにおいて０．１％より高い一定したレベルで存在する成分は、必須エストロゲン化合物の可能性があるとして調査することを考えた。一貫性は、化合物が可能性ある必須エストロゲン化合物であるかどうかを決定する場合の要素の１つであり、現在のプレマリン（登録商標）ロットに見られる量の±５０％未満の変動として定義した。
【００８６】
＜特徴づけ−ＨＰＬＣ戦略およびスキーム＞
この特徴づけは、９成分エンデバー合成抱合エストロゲン薬物製品（ノースカロライナ州ウィルミントンのエンデバー・ファーマシューティカルズから入手可能）の定量に有効なＨＰＬＣクロマトグラフィー法を使用することにより始めた。該方法を僅かに修飾して、プレマリン（登録商標）成分の分離を最適化した。この方法は、上記のＨＰＬＣクロマトグラフィーアッセイ法である。この報告で考察した全ての個々のピークは、基準ピークであるエストロンスルフェートに基づいて、相対保持時間（ＲＲＴ）により同定する。
【００８７】
種々の錠剤ロットからの試料をＨＰＬＣにより分析し、重層して差異を比較した。最初に重層検査した時に、全てのクロマトグラムは眼で見ると類似していた。種々のロット間の類似性により、単一のロット（Ｌｏｔ７ＰＦＣ２）を選択でき、特徴づけを可視化できた。
【００８８】
プレマリン（登録商標）錠剤の製剤に関する発表された情報に基づいて、１５個の異なる賦形剤、６個の異なるダイ成分、および移動相ブランクを注入し、無傷錠剤から得られたクロマトグラムに対する、保持時間およびダイオードアレイ分析により比較した。これらのクロマトグラムから、プレマリン（登録商標）に見られるピークに対応する１つのピークが判明した。移動相ブランクは、プレマリン（登録商標）の形状およびサイズにおいて同じピークと一致する、ＲＲＴ０．０６９でピークを示した。移動相ピークおよびプレマリン（登録商標）に見られるピークのダイオードアレイスペクトルの重層により、ピークは同じであることが確認された。
【００８９】
１０個のＵＳＰ列挙エストロゲン硫酸ナトリウム成分（以下の表２に列挙）の同定は、クロマトグラムシステムへの適切な分析標準物質の注入により実施した。得られたピークは、相対保持時間およびダイオードアレイスペクトルの比較により、プレマリン（登録商標）クロマトグラムに一致していた。
【表３】
2011256181.tif 000004
試験した錠剤ロットのクロマトグラムから、約７６個のピークが、２２０ｎｍにおけるＵＶ検出により見られる。これらのピークの中で、１つは、移動相ブランクに由来することが示され、９個のピークは１０個の既知成分に由来する。完全な基線分離は、エクイリン硫酸ナトリウムおよびΔ8,9−デヒドロエストロン硫酸ナトリウムでは、この方法を用いて達成されなかった。これらの化合物は、Ｂ環中の二重結合の位置のみが異なる構造的異性体である。この分析のためにカラムに注入した濃度では、これらのピークは合体する。これらのピークは、実施例２に下記したＨＰＬＣアッセイ法を使用して分離した。１０個の既知のエストロゲン硫酸ナトリウム成分の全ピーク面積に対して、≦０．１％ピーク面積の３２個の他のピークが存在する。
【００９０】
＜関連化合物の考察＞
各硫酸化ケトンは、対応する硫酸化１７α−および１７β−ヒドロキシ誘導体を有し得；その後、これらの各々を加水分解して、非硫酸化種を形成できる。これにより、各々の基本的ケトン環構造には計６個の可能な類似体が得られる。硫酸化ケトンにより示される４個の既知の基本的環構造が存在する：エストロン、エクイリン、エクイレニン、およびΔ8,9−デヒドロエストロン。それ故、これにより、２４個までの関連化合物が生じる可能性がある。
【００９１】
以前の定性ＨＰＬＣ法の確証研究では、３つの非硫酸化関連物質（１７α−ジヒドロエクイリン、エクイリンおよびエストロン）の真のＵＳＰ標準物質を注入して、その保持特徴を証明した。さらに３つの非硫酸化種（β−エストラジオール、エクイレニンおよび１７β−ジヒドロエクイレニン）は、１，３，５（１０），６−エストラテトラエン−３，１７β−ジオール標準物質であることが判明し、その溶出順およびスペクトル特性により同定した。ケトンおよびジオール形の１０個の既知の硫酸化および６個の非硫酸化種のＲＲＴ値の比を調べて、パターンを評価した。表３は、種々の硫酸化および非硫酸化種のＲＲＴ値の関係の既知の比を示す。
【表４】
2011256181.tif 000005
【００９２】
ＲＲＴ値の比に基づいて、論理的な相関を展開し、これを使用して、ＲＲＴに基づきピークの位置を予測した。未知のピークに関するこの予測ＲＲＴから、ダイオードアレイおよび蛍光スペクトルを使用して、既知の関連化合物のスペクトル特徴と比較するため、予測ＲＲＴの近くのピークを調べた。
【００９３】
＜蛍光およびＵＶ吸収スペクトルの考察＞
薬物物質の分析プロファイル（Ｋ．Ｆｌｏｒｅｙ編、アカデミックプレス、ＮＹ、１９８３、２３１〜２５７頁）の第１２号は、エストロンの蛍光挙動を詳述する。エストロンは、２８０ｎｍで励起した場合、フェノール性発色団発光により３０７ｎｍでの鋭い蛍光ピーク、および、約４１０ｎｍで第二の幅広いピークを示す。エストロゲン活性およびエストロゲン受容体への結合は、フェノール性Ａ環の存在を必要とするので（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、１９９６、１４１２頁）、種々のピークの分光学的検査により、エストロゲン性の効力に関連した構造特徴を有する成分を同定できる。蛍光検出器を、直列でクロマトグラフィーシステムに導入し、励起および発光波長を最適化して、プレマリン（登録商標）での３１２ｎｍおよび４０５ｎｍでのクロマトグラフィーピークのシグナルを増強した。２つの蛍光クロマトグラムを、ＵＶクロマトグラムに重層することを使用して、可能性あるエストロゲン成分のスペクトル特徴のピークを調べた。１０個のＵＳＰにより規定されたエストロゲン硫酸ナトリウムは全部、３１２ｎｍで蛍光発光を示し、大半は４０５ｎｍでも発光を示す。これらのスペクトル重層から、ＵＶ吸収は検出できなかった、特定の保持時間における発光波長の一方または両方において、蛍光発光を示す、１１個の追加のピークが観察された。この検出可能なＵＶ吸収の欠如は、より大きなピークとの重複、または、約０．０１％以上のＵＶ吸収の欠如によるものであった。定量可能なＵＶピークは存在しなかったので、これらの１１個のピークは、≦０．１％ピーク面積と考え、ＲＲＴ値は、周囲のピークのＲＲＴ値に基づいて推定した。これによりピークの総数は８７となり、重要でないピークの数は、４３まで、≦０．１％だけ排除され
た。
【００９４】
蛍光スペクトル情報はまた、クロマトグラフィーピークのスクリーニングおよびそれらを非エストロゲン性として排除する、プレマリン（登録商標）の特徴づけに使用できる。ピークが、２つの波長の１つにおいて蛍光を示さない場合、それらは、特異的エストロゲン受容体結合に関与する必要なフェノール性Ａ環の欠如により、非エストロゲン性と考えた。蛍光を発しない計２２個のピークが存在した。これらのピークの８個は＞０．１％であり、これらの１つは、移動相ピークと同定した。それ故、プレマリン（登録商標）に存在する７個の非エストロゲン性ピーク＞０．１％（０．１０２、０．１２１、０．１９８、０．４４１、０．６４７、０．７０５、および１．０４５のＲＲＴ値）は、この基準により、非エストロゲン性と同定した。
【００９５】
全ての既知の天然エストロゲンが、共通して、隣接している縮合Ｂ環系の飽和度は可変である、Ａ環の３位に、フェノール性官能基を有する。ＵＶスペクトル特徴は、このフェノール性発色団により制御され、シフトは、共役度に応じて起こり得る。基本的なフェノール性発色団は、約２１０ｎｍにおいて芳香族π→π*Ｅ2バンドの助色団ＵＶ極大値、および、約２７０ｎｍにおいてπ→π*Ｂバンドの極大値を示す。これらの極大値は、付着基の飽和度に応じて、波長および強度の両方においてシフトできる。あるピークに関するこれらのＵＶバンドの非存在は、フェノール性化学部分の非存在を示し、従って、成分のエストロゲン効力の非存在を示す。
【００９６】
０．１％以上のピークのダイオードアレイスペクトルを調べる場合、エストロゲンに特徴的なダイオードアレイスペクトルを示さない、計８個のピークが判明した０．０７４、０．１０２、０．１７０、０．３２１、０．３７６、０．４４１、０．４５０、および０．７０５のＲＲＴ値）。これらの８個の中で、また、蛍光スペクトルに基づいて３つが非エストロゲン性であると判明した（０．１０２、０．４４１および０．７０５のＲＲＴ値）。
【００９７】
１０個のＵＳＰにより規定される抱合エストロゲンは、両方のケトンに存在するエストロン、エクイリン、およびエクイレニンの硫酸化形、および、１７αおよび１７β−ヒドロキシ形からなり、最初の９つの成分および第１０としてΔ8,9−デヒドロエストロンスルフェートが得られる。エストロン、エクイリン、およびエクイレニンの３つの硫酸化形のダイオードアレイスペクトルの重層を調製した。各セットのダイオードアレイスペクトルは全部、類似のスペクトル特徴を示した。これ、および、Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェートの２つの硫酸化ジオールの予測したＲＲＴ値に基づいて、予測ピーク（０．４６６および０．６２５のＲＲＴ値）を、ダイオードアレイおよび蛍光スペクトルの両方により調べ、期待したように硫酸化ジオールに対応することが判明した。これにより、プレマリン（登録商標）に存在する硫酸化エストロゲンの数は１２となる。
【００９８】
これらの１２個の硫酸化化合物の各々はまた、代謝または加水分解による分解を受けて、化合物を脱スルホン化できる。非硫酸化エストロン、エクイリン、１７α−ジヒドロエクイリン、１７β−エストラジオール、１７β−ジヒドロエクイレニンおよびエクイレニンの試料は、非硫酸化形の存在についてプレマリン（登録商標）を調べるのに有効である。これらの６つの試料の各々のダイオードアレイスペクトルを、対応する硫酸化ケトンスペクトルと比較した。重層を調べることにより、唯１つの芳香族環が存在する（環Ａ）、エストロンおよびエクイリンをベースとした系では、約５ｎｍ分、ＵＶスペクトル極大値が、より長い波長へと、対応して深色（赤）シフトした。このシフトは、スルフェートの消失による、芳香族π→π*遷移の電子密度のシフトにより得る。２つの縮合芳香族環が存在する（環ＡおよびＢ）、エクイレニンをベースとした系では、約２ｎｍ分、ＵＶスペクトル極大値の、より短い波長への、浅色（青）シフトが観察された。このシフトは、存在するより延長した抱合芳香族系、並びに、スルフェート群の消失により得る。
【００９９】
Δ8,9−デヒドロエストロンの化学構造およびＲＲＴ予測に基づいて、プレマリン（登録商標）を、非硫酸化Δ8,9−デヒドロエストロンピークについて調べた。８，９位での二重結合の位置により、エストロンおよびエクイリンに存在するよりも延長されているがエクイレニンよりは短い抱合が可能となり得、よってＵＶシフトは、その間のどこかであると予測され、シフトはほとんどまたは全く観察されなかった。予測領域を、非硫酸化Δ8,9−デヒドロエストロンについて調べ、ピークが１．５８９のＲＲＴ値で見られ、これは、実質的にＵＶシフトの全くない、期待されるダイオードアレイスペクトルと一致した。
【０１００】
＜プレマリン（登録商標）ピークの解明＞
残りの５つの非硫酸化ピークは、ＵＶ吸収がほとんどまたは全くない領域、または、別の大きなピークが存在する領域に存在すると予測された。これにより、ダイオードアレイスペクトルの比較が妨害されたが、予測した各ＲＲＴ値において、蛍光スペクトルは、割り当てに一致した発光を示し、非硫酸化成分の各レベルは、≦０．１％であった。これらの数学的パターン予測およびスペクトル分析は、４つの既知の硫酸化ケトンの全２４個の誘導体と符合した。
【０１０１】
判明した２４個の同定したピークの中の１０個が≦０．１％であった。これは、３３個の他の重要でないピークを残し、これは≦０．１％であるので排除できる。
【０１０２】
この時点で、このプロセスは、プレマリン（登録商標）に検出された８７個のピークの５６個を説明する。ピークの検査により、１３個のピークが≦０．５％であり、７個が＞０．５かつ≦１．０％であり、５個が＞１．０かつ≦２．０％であり、僅か６個が＞２．０％である。これらの３１個のピークに蛍光およびダイオードアレイ分光学的データを使用して、エストロゲン性化合物に特徴的なスペクトルを示さなかった１２個のピークが観察される。しかし、０．１９８のＲＲＴでのピーク（これは１０％以下で観察された）をさらに、比較的高いレベルで存在するので、エストロゲン性の証拠がないにも関わらず調べた。
【０１０３】
＜調査用の残りのピーク＞
２０個の未知のピーク（０．１９８のＲＲＴにおけるピークを含む）を、注意深い検査および特徴づけのために選択した。これらの中で、７個のピークが＜０．５％であり、それらの４個が＞０．５かつ≦１．０％であり、４個が＞１．０かつ≦２．０％であり、僅か５個が＞２．０％である。
【０１０４】
２０個の残りのピークは、重要な未知のピークの大半が、クロマトグラムの最初の７から８分（約０．４５０までのＲＲＴ）に存在することを実証した。このＲＲＴを超えて、僅か４つの未知のピークしか存在しない：１つはＲＲＴ０．５１５（１．３〜１．５％）；第二はＲＲＴ０．６０１（約１．０％）；第三はＲＴ０．７３８（０．２〜０．３％）；そして第四はＲＲＴ０．９７１（１．４〜１．７％）。クロマトグラム中の目的のちょうど２０個の未知のピークの強調により、５つの主なピークが、最初の４分間で見られることが示される。これらの５つのピークは、未知のピークの全ピーク面積％を占め、全ての未知のピーク面積の９０％以上に相当し、抱合エストロゲンＵＳＰに列挙した１０個の活性なエストロゲン成分の全ピーク面積にほぼ等しい。
【０１０５】
焦点を、２０個の未知のピークに、そして主に、未知のピーク面積の９０％を含む５つの主なピークに向けて、これらの各ピークの分離、単離、および精製のための方法および技術を開発した。最初の４分間の走行におけるピークの重複のために、半調製用カラムを使用した新規な勾配ＨＰＬＣを開発して、カラム添加量および主なピークの分離を増加した。上記の半調製用ＨＰＬＣ法では、カラムに添加する試料は、分析レベルの５０〜７５倍増加し、目的の個々のピークは全て、他の主なピークから完全に分離した。最初の４分間のクロマトグラムにおけるより大きなピーク実体を、勾配に対するゆっくりとした変化によりモニタリングし、ダイオードアレイ分析により確認した。目的の５つの主なピークは、ピーク１、４、６、７および８として同定し、それぞれ以前のＲＲＴ値０．０５６、
０．０９２、０．１４２、０．１８５および０．１９８に対応した。新規な勾配法を使用して、ピークの溶出順およびＲＲＴ値は有意に変化し、よって、これらの５つのピークは、そのＲＲＴ値ではなく、むしろその割り当てられた識別番号を使用して言及する。
【０１０６】
最初のＨＰＬＣ法を使用して、移動相のイオン対形成濃度を変化させて、保持時間のシフトおよびピークの溶出順の変化を調べた。可変の移動相条件下でのピークおよびその挙動に関するその研究により、ピークの実体に関するいくつかの暫定的な情報が得られた。ピーク６、７および９のような、イオン対形成濃度の増加につれて、有意により長い保持時間へとシフトしたピークは、硫酸化種であると考えられ得る。ピーク１、２、３、４、５および８のような、保持時間の変化をほとんどまたは全く示さないピークは、硫酸化されていないと考えられ得る
。
【０１０７】
＜主な未知のピークの分離および単離＞
勾配分離の増強により、フラクションコレクターをシステムに加えて、クロマトグラフィー走行の個々のピークおよび区分を分離および保持できる。５つの主な未知の個々のピーク（ピーク１、４、６、７および８）、並びに、小さなピーク２、５および９を、上記の半調製用ＨＰＬＣ法を使用して、分取によりプレマリン（登録商標）から単離した。ピーク３は、ピーク４からあまり良好に分離されず、ピーク９は後の走行のみで分取された。画分を、ＳＣＸイオン交換Ｓｅｐ−Ｐａｋに通し、イオン対形成物質を除去し、さらに各ピーク画分を精製した。得られた溶液を、水酸化アンモニウムで中和し、その後、回転エバポレーターにより乾燥させた。回収フラスコ中に残った大量の物質は主に、移動相緩衝液および所望の化合物から構成された。この固体混合物から、化合物を抽出し、さらに精製して、単結晶Ｘ線解析、ＳＥＭ／ＥＤＸ、質料分析法、および他の手段により調査および可能な同定を行なった。これらの各抽出物質を再度回転エバポレーターにより乾燥すると、得られた物質は、乾燥した固体物質ではなく、むしろ黄色がかった粘性油状物となる傾向があった。ＬＣ−ＭＳを使用した後の実験に基づき、黄色がかった粘性油状物は、クロマトグラムの基線を上げ、各画分に混入している、ＨＰＬＣ解析中に漏出したプレマリン（登録商標）製剤中のポリエチレングリコールおよび他の賦形剤の存在により引き起こされると決定された。この粘性物質により、結晶化および最終的な画分の精製は妨害された。
【０１０８】
＜未知のピークの特徴づけ＞
各画分の異なる化学的性質により、調査法は変化した。ピーク６および７は、硫酸化されていると考えられ、最初に考察する。ピーク４および８は、非硫酸化カルボン酸であるようであり、次に、これも硫酸化されていないようであるピーク１を調べた。調査の経過で、複数回の分取および精製を実施した。各ピークの以下の個々の概要は、複数の個々の走行および実験を示す。
【０１０９】
＜ピーク６の調査＞
フラクションコレクターからの最初のピーク６の画分は、無色から淡い黄色であった全ての他の画分と異なり、明るい青色であった。ピーク６は、エタノールを使用して、緩衝液と化合物の乾燥回転エバポレーターから抽出した。その後、この溶液を、回転エバポレーターで濃縮し、暗い黄色の粘性油状物を生成した。この黄色の油状物を、回転エバポレーター真空器から除去すると、急速に色が変化し始めた。黄色から、赤色へ、紫色へ、青へ、数分以内に変化し、数日間または数週間後に褐色に変化した。着色した画分のＨＰＬＣクロマトグラフィーにより、クロマトグラム中のピーク６は、依然として変化していないことが確認された。色の変化は、ピーク６に存在するいくらかの少数派の成分の空気酸化のようであった。黄色の油状物を単離し、乾燥窒素ガス下に保存すると、色の変化はほとんどまたは全く観察されなかった。この画分の一部を側に置き、結晶化を試み、一部をＬＣ−ＭＳ解析用にした。
【０１１０】
多種多様の技術を使用した結晶化の試みは、単結晶解析のための、ピーク６の結晶を作成する上であまり成功しなかった。透明な結晶が、遅い蒸発を使用して青い溶液から成長したが、良好に形成されず、双晶で見出された。これらの結晶は、正方晶Ｉ格子および僅か３９０．４Åの容積を有するようであった。この容積サイズは、エストロゲン／ステロイドには小さすぎ、これらの単塩であることが示唆される。双晶のようではない、より良好な結晶を選択し、Ｘ線解析を再度開始した。再度見られた単位セルは、セル定数ａ＝７．４５９（４）Å、ｃ＝７．０１３（４）Å、および容積３９０．２（３）Å3を有する、正方晶Ｉ格子であった。これらのパラメータにより、単塩が示唆された。データセットを集め、空間群１２２番（１４ｂａｒ２ｄ）を、系統的欠如に基づいて選択した。Ｚ＝４では、構造は、Ｒ因子８．９および１２．４％に改良し、ここでの物質の実体は、鉱物構造（ＫＨ2ＰＯ4）であると決定された。ＩＣＤＤ（回折データ国際センター）データベースとの比較により、構築物（カード番号３５−０８０７）は、我々の解析で見られた単位セルおよび空間群に一致することが示される。この化合物は、我々のＨＰＬＣ移動相に使用した緩衝液であり、プレマリン（登録商標）錠剤の一部とは考えなかった。
【０１１１】
ＬＣ−ＭＳ解析中のクロマトグラフィーＵＶ解析により、この画分において、１つの大きなピークおよび３つの小さなピークが示された。主なピークは、陰イオンＦＡＢ−ＭＳ下で走行し、ｍ／ｚ２１２において、単一で弱い試料に関連した分子イオン（Ｍ−Ｈ）-が示された。陽イオンＦＡＢは、有意な試料に関連したピークを全く示さなかった。陰イオンＥＳＩ−ＭＳは、ＦＡＢ−ＭＳデータに一致したｍ／ｚ２１２において、強力な分子イオン（Ｍ−Ｈ）-を示した。陰イオンＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルはまた、２１２ｍ／ｚにおいて親イオンを確認した。このスペクトルは、ＳＯ3-断片に一致した８０ｍ／ｚにおけるイオンおよび非硫酸化分子イオンに一致する１３２ｍ／ｚにおけるイオンを含む、多くの娘イオンを示した。これらの結果は全部、２１３Ｄａの分子量およびスルフェート部分の存在に一致する。
【０１１２】
質量分析データにより、ピーク６の構造は、メルクインデックスによると哺乳動物の尿中に存在する、インジカン（代謝インジカン）の構造であることが示唆される。インジカンのカリウム塩の真正の標準物質はシグマから購入し、移動相に溶かし、勾配ＨＰＬＣシステムに注入した。標準物質およびプレマリン（登録商標）注射液のクロマトグラムおよびダイオードアレイスペクトルの重層により、ピークに関する保持時間の一致および同一なダイオードアレイスペクトルが示され、ピーク６の実体をインジカンとして確認する。
【０１１３】
＜ピーク７の調査＞
ピーク７は、エタノールを使用した緩衝液および化合物の混合物の乾燥回転エバポレーターにより抽出した。その後、この溶液を回転エバポレーターで濃縮し、黄色の粘性油状物を生成した。この画分を一部を側に置き、結晶化を試み、ＬＣ−ＭＳ解析用とした。
【０１１４】
多種多様な技術を使用した結晶化の試みにより、単結晶解析により調べるための、ピーク７由来の数個の結晶が得られた。これらの最初のものは、遅い蒸発を使用して黄色の溶液から成長した大きな透明な結晶であった。大きな結晶の一片を切り出し、Ｘ線解析のために０．４ｍｍのガラスキャピラリーにのせた。結晶は非常に強く回折し、セル定数ａ＝１０．０６３（２）Å、ｂ＝１０．１９４（１）Å、ｃ＝１２．０８０（２）Å、α＝７８．７９（１）゜、β＝８８．５７（１）゜、γ＝７７．２１（１）゜、およびＶ＝１１８５．１（４）Å3をもつ正方晶格子を与えた。理論で固めるつもりはないが、Ｚ＝２に基づいて、かかる容積サイズにより、約３２個の非水素原子が非対称単位で存在することが示唆される。データセットを集め、フィリップのゼロモーメントデータ試験に基づいて中心外のようであった。構造分解を、空間群１番（Ｐ１）を使用して試みた。構造を分解し、Ｒ因子５．９および７．２％に改良し、ここでの物質の実体は、ｔｅｒｔ−ブチルアミンの二リン酸塩であると決定された。この時点で、構造解析の完了は停止した。なぜならこの化合物は、移動相イオン対形成物質とリン酸緩衝液の相互作用から形成され、従って重要ではないと推定されたからである。データ分解の前に、ＳＥＭ／ＥＤＸ解析を、この結晶の一片を使用して実施し、結晶中に正常な有機成分（Ｃ、ＮおよびＯ）以外にはリン原子のみを示した。
【０１１５】
黄色の立方形の結晶も、ピーク７を含む黄色の溶液から成長した。約０．１２×０．１２×０．１２ｍｍのこれらの１つを選択し、ガラス繊維の末端にのせた。この場合、結晶はよく回折し、立方Ｆ格子ａ＝１２．８５３（３）Åおよび容積１２３．３Å3を生じた。Ｆ中心立方では、これは、単塩を超えるに十分に大きな容積ではないと考えられる。ＩＣＤＤデータベースの探索により、この単位セルを用いて２つの同型構造が判明した。両方共、空間群２２５番（Ｆｍ３ｂａｒｍ）であり、一般式［Ｎ（ＣＨ3）4］2ＭＣｌ6で示され、ここでのＭ＝Ｓｎ（ＩＶ）、またはＺｒ（ＩＶ）である。ＳＥＭ／ＥＤＸ解析は、期待したように塩素を示したが、金属イオンとして存在する銅または亜鉛が判明した。これは、有機金属塩であると決定され、プレマリン（登録商標）のエストロゲン成分であるとは考えられない。
【０１１６】
粘性の黄色の油状物を、メタ−ニトロベンジルアルコールマトリックスに溶かし、陽イオンＦＡＢ−ＭＳ下で走行し、これは、ｍ／ｚ２４２において主な分子イオン（Ｍ＋Ｈ）+を生じた。このピークの強度は、分子組成を作成するためのＨＲ−ＭＳ解析、および、断片化パターンを研究するためのＥＩ−ＭＳを行なうに十分であった。ＨＲ−ＭＳを使用し、正確な分子量２４２．２８４１を得た。その質量に基づいて、分子組成は、Ｃ16Ｈ36Ｎであると決定された。強いＥＩ−ＭＳスペクトルが、２８０℃付近で比較的高いプローブ温度でのみ達成され、ｍ／ｚ１００、１４２および１８５において強力なシグナルを示した。ライブラリーマッチを実施し、これはｔｅｒｔ−ブチルアミンであることが示され、これはＨＲ−ＭＳの結果と一致する。これは、分取中に移動相中でイオン対形成物質として使用した。
【０１１７】
ＬＣ−ＭＳ解析中のクロマトグラフィーＵＶ解析は、この画分において、１つの大きなピークおよび１つの小さなピークを示す。主なピークは、陰イオンＦＡＢ−ＭＳ下で走行し、ｍ／ｚ１８７において単一の試料に関連した（Ｍ−Ｈ）-分子イオンを示した。陽イオンＦＡＢは、有意な試料に関連したピークは全く示さなかった。陰イオンＥＳＩ−ＭＳは、ＦＡＢ−ＭＳデータに一致した、ｍ／ｚ１８７において主な分子イオン（Ｍ−Ｈ）-を示した。陰イオンＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルはまた１８７ｍ／ｚにおいて親イオンを確認した。このスペクトルは、ＳＯ3-断片に一致した８０ｍ／ｚにおけるイオン、および、非硫酸化分子イオンに一致した１０７ｍ／ｚにおけるイオンを含む、多くの主な娘イオンを示した。ｍ／ｚ９２におけるイオンは、トルエンの断片に一致する。これらの結果
は全部、分子量１８８Ｄａおよびスルフェート部分の存在に一致する。このピークの画分をＬＣ−ＭＳから集め、ＨＰＬＣにより確認した。画分を、勾配ＨＰＬＣシステムで走行し、プレマリン（登録商標）クロマトグラム中のピーク７の保持時間に一致して純粋であることが示された。２つのピークのダイオードアレイの重層は同一のようであり、ピーク７の実体を確認する。
【０１１８】
質量スペクトルデータは、ピーク７の分子式がＣ7Ｈ8ＳＯ4であることを示す。このピークは、スルフェートおよび芳香族環を含み、これは、硫酸化ベンジルアルコールまたはクレゾールの構造を生じる。これらの化合物の真正の標準物質は市販で入手できず、よって、確認としてのＨＰＬＣシステムにおける直接注入は、可能ではなかった。ピーク７の最も可能性の高い化学構造は、硫酸化ベンジルアルコールである。
【０１１９】
＜ピーク４の調査＞
ピーク４は、エタノールを使用した緩衝液と化合物の混合物の乾燥回転エバポレーターから抽出した。この溶液を、回転エバポレーターで濃縮し、黄色の粘性油状物を生成した。この画分の一部を側に置き、物質を特徴づける他の物理試験に使用するために、結晶化を試みた。
【０１２０】
結晶化は、遅い蒸発を含む多種多様の技術を使用して試みた。寸法０．０８×０．０２×０．５０ｍｍの黄色の針様の結晶を単離し、Ｘ線解析のために０．２ｍｍのガラスキャピラリーにのせた。結晶を近くで検査すると、黄色は、油状物の薄いフィルムコーティングによるものであることが判明し、結晶は無色のようであった。黄色のフィルムはそれ自体結晶ではなかったので、フィルムの除去は、結晶を損ない得、無傷のフィルムで結晶を解析した。結晶はよく回折し、セル定数ａ＝８．８９２１（９）Å、ｂ＝９．１１６５（４）Å、ｃ＝１０．５７４８（７）Å、および容積８５７．２（２）Åの斜方晶系Ｐ格子を与えた。これはここでも非常に小さな容積であり、中心および中心外セルでは、それぞれ約６および１２個の非水素原子の構造を与えるのみである。データセットを集め、系統学的欠如に基づいて、中心外空間群１９番（Ｐ２I２I２I）を選択した。理論で固めるつもりはないが、Ｚ＝４では構造はＲ因子３．５および４．３％に規定した。結晶の実体は、メルクインデックスにより、草食動物の尿中に見出される、馬尿酸（Ｃ9Ｈ9ＮＯ3）と決定した。ＩＣＤＤの探索により、この空間群および単位セルを用いて、馬尿酸（カード番号３０−１７４８）の構造が判明した。馬尿酸の真正の標準物質はＡＣＲＯＳから得、移動相に溶かし、上記の半調製法に記載した勾配ＨＰＬＣシステムに注入した。標準物質およびプレマリン（登録商標）の注入液のクロマトグラムおよびダイオードアレイスペクトルの重層は、ピークに関して、保持時間の一致および同一のダイオードアレイスペクトルを示し、ピーク４の実体を馬尿酸と確認した。
【０１２１】
＜ピーク８の調査＞
ピーク８は、エタノールを使用して、緩衝液と化合物の混合物の乾燥回転エバポレーターから抽出した。その後、この溶液を回転エバポレーターで濃縮し、黄色の粘性油状物を得た。この画分の一部を側に置き、ＬＣ−ＭＳ解析にかけるために結晶化を試みた。
【０１２２】
多種多様の技術を使用した結晶化により、単結晶解析により調べるための、ピーク８由来の数個の結晶を生成した。これらの最初のものは青−緑のプリズムであった。結晶を選択し、Ｘ線解析のためにガラス繊維上にのせた。結晶はよく回折し、セル定数ａ＝７．５９６０（７）Å、ｃ＝７．９６９８（１０）Å、および容積４５９．９（１）Å3をもつ正方晶Ｐ格子が得られた。Ｚ＝８に基づいて、この容積サイズは、非対称単位中の約３または４個の非水素原子を示唆する。従って、この分子は、最も可能性の高いのは単塩であるか、または、内部対称を有すると考えられる。ＩＣＤＤデータベースの探索により、この単位セルは、（ＮＨ4）2ＣｕＣｌ4・２Ｈ2Ｏ（カード番号２５−０００３）の構造に対応し、これは、Ｚ＝２および単位セルａ＝７．５９Å、およびｃ＝７．９７Åをもつ空間群１３６番（Ｐ４2／ｍｍ）にあった。メルクインデックスによると、塩化銅アンモニウム（ＩＩ）は、塩化アンモニウムおよび塩化銅（ＩＩ）の溶液の蒸発から形成され、二水和物形は、青から青−緑の正方晶の菱面十面体結晶である。精製中、画分を、水酸化アンモニウムで中和し、遅い蒸発により形成し、これは、画分がおそらく、塩化銅（ＩＩ）（これは反応してこれらの結晶を蒸発時に形成する）を含んでいることを示す。これ全部に基づき、Ｘ線構造分解は完了しなかった。ＳＥＭ／ＥＤＸ解析を結晶に実施し、結晶中の銅および塩化物の存在を確認した。
【０１２３】
透明な針様のプレートも、ピーク８を含む黄色の溶液から成長した。これらの１つを選択し、Ｘ線による検査のために、ガラス繊維にのせた。結晶は強く回折し、セル定数ａ＝６．２７７９（６）Å、ｂ＝１５．２００８（１６）Å、ｃ＝５．６７６２（６）Å、β＝１１４．０９５（９）゜および容積４９４．５（２）Å3をもつ単斜Ｃ格子を与えた。Ｚ＝８に基づいて、この容積サイズにより、非対称単位中の僅か約３または４個の非水素原子が示唆される。従って、分子は単塩であるか、または、内部対称を有すると考えられる。データセットを集め、データの系統学的欠如に基づいて空間群５番（Ｃ２）で分解する。Ｚ＝４で、構造は、Ｒ因子６．８および７．０％に改良され、ここでの物質の実体は、鉱物石膏（ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ）であると決定された。ＩＣＤＤデータベースとの比較により、石膏（カード番号２１−０８１６）は、我々の解析で見られた単一セルおよび格子に一致することが示される。ＳＥＭ／ＥＤＸ解析を結晶で走行し、結晶中でのカルシウム、硫黄、および酸素の存在が示された。石膏をプレマリン（登録商標）の製造における賦形剤として使用し、ここでのその検出により、前記で考察したクロマトグラフィー分析中におけるＨＰＬＣカラムによる賦形剤の保持および連続的漏出が実証される。
【０１２４】
黄色の針様の結晶が、ピーク８を含む溶液から成長した。結晶を選択し、Ｘ線解析のためにガラス繊維にのせた。結晶はよく回折し、セル定数ａ＝１８．４８３（５）Å、ｂ＝１１．５３６（１）Å、ｃ＝１１．４４０（２）Å、および容積２４３９（１）Å3をもつ斜方晶Ｐ格子を与えた。容積に基づいて、分子は、中心外空間群である場合、非対称単位に約３３個の非水素原子を、中心である場合、約１６から１７個の非水素原子を含むと考えられる。ＩＣＤＤデータベースの探索により、類似のセル定数をもつ構造は判明しなかった。データセットを集め、系統学的欠如に基づいて、空間群５１番（Ｐｎｎａ）を選択した。構造は、Ｒ因子６．８および７．７％に改良し、分子は特別な位置（２倍軸）に座し、よって、分子の僅か半分しか判明および改良する必要はないことが判明した。最終
構造は、一般式［ＮＢｕ4］［ＭＣｌ4］の３級ブチルアミンであることが示され、ここでのＭは＋３酸化状態の第一列遷移元素であり、おそらくＦｅである。この複合体は、移動相イオン対形成物質と金属塩の相互作用から形成したようである。これは目的の化合物ではないので、構造描写はこの時点では停止しなかった。
【０１２５】
ＬＣ−ＭＳ解析中のクロマトグラフィーＵＶ解析は、この画分について単一の大きなピークを示す。しかし、この場合、クロマトグラムを通じて記録したＥＳＩ−ＭＳデータの調査により、ＵＶ応答に割り当てることのできる有意なイオンは全く判明しなかった。全体の走行を通じて多くの弱いシグナルが検出されたが、これらは重合エトキシレート（ＰＥＧ賦形剤由来）であり、主なＵＶピークとは一致しなかった。ＬＣ−ＭＳにおけるこの単一の主なピークは、陰イオンＦＡＢ−ＭＳ下で走行し、ｍ／ｚ３７７において、可能性ある非常に弱い、試料に関連した分子イオン（Ｍ−Ｈ）-を示した。陽イオンＦＡＢは、ｍ／ｚ４０１において、弱い試料に関連した分子イオン（Ｍ＋Ｎａ）+を示した。陰イオンＥＳＩ−ＭＳは、ｍ／ｚ３７７において、ＦＡＢ−ＭＳ解析で示されたものを含む、高いバックグラウンドをもつ弱い応答を示した。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる解析は
可能ではなかった。なぜなら、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより分子イオンは判明しなかったからである。これらの研究の結論により、分子量３７８Ｄａが示された。さらなる解析を実施して、これらの結果のいずれかを確認および確証した。ＭＳ解析の感度を向上するために、単一のピークを、ＬＣ−ＭＳから集め、それをその後の解析に使用するために凍結乾燥して濃縮した。陰イオンＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ３７１において、可能な分子イオン（Ｍ−Ｈ）-を示した。陽イオンＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ５０３において可能な分子イオン（Ｍ＋Ｈ）+および、ｍ／ｚ５２５、５４１および６３５においてそれぞれ対応するナトリウム、カリウム、およびセシウム付加物を示した。しかし、この断片を用いた以前のＭＳ研究により、上記の付加物は、製剤由来の重合エトキシレー
トに原因があることが示された。陰イオンＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルは、親イオン（ｍ／ｚ３７１）で得られ、硫酸化部分に一致するｍ／ｚ８０および９７でのみ娘イオンを示した。これらの結果により、分子量３７２Ｄａの硫酸化種が示唆される。この結果はある程度疑問であった。なぜなら、以前のＨＰＬＣ解析により、このピークは非硫酸化であり、試料はＭＳ法に対して本質的に僅かな応答しか生じないことが示されているからである。他の少数の不純物の存在は、実際に、ピーク８に結合または遮蔽し得る。
【０１２６】
ＨＰＬＣ解析からの以前のイオン対形成実験およびダイオードアレイスペクトル情報に基づいて、ピーク８は、芳香族カルボン酸であると疑われた。この情報を使用して、特定の保持時間およびダイオードアレイに一致する有機カルボン酸を見出すことを試みた。安息香酸、ナトリウム塩は、ケム・サービスから容易に入手でき、ＨＰＬＣにより解析した。安息香酸およびプレマリン（登録商標）のクロマトグラムおよびダイオードアレイスペクトルの重層により、ピークに関して、ピーク形状および保持時間の一致、および、同一なダイオードアレイスペクトルが示され、ピーク８の実体を安息香酸と確認した。メルク・インデックスによると、安息香酸は、脊椎動物の尿に存在する。
【０１２７】
＜ピーク１の調査＞
ピーク１は、エタノールを使用して、緩衝液および化合物の混合物の乾燥回転エバポレーターから抽出した。その後、この溶液を回転エバポレーターで濃縮して、黄色の粘性油状物を得た。この画分の一部を側に置き、物質を特徴づけるための他の物理試験に使用するために、結晶化を試みた。
【０１２８】
上記したようなプレマリン（登録商標）中の馬尿酸（ピーク４）を発見および特徴づけた後、尿中に存在することが知られている他の有機化合物を評価するための研究を実施した。メチル馬尿酸（ｏ−、ｍ−およびｐ−）、マンデル酸、およびクレアチニンを、クロマトグラフィーシステムに注入した。勿論、クレアチニンは、プレマリン（登録商標）に検出されたピークに適合するピークを与えた。メルク・インデックスによると、クレアチニンは尿の通常の構成成分である。標準物質およびプレマリン（登録商標）の注射液のクロマトグラムおよびダイオードアレイスペクトルの重層により、ピークに関する、保持時間の一致、および、同一なダイオードアレイスペクトルが示され、ピーク１の実体をクレアチニンと確認した。
【０１２９】
＜他のピークの調査＞
ピーク９は、エタノールを使用して乾燥回転エバポレーターで混合物から抽出し、回転エバポレーターで濃縮すると、黄色の粘性油状物が得られた。これを側に置き結晶化し、数日後、寸法０．０１×０．０４×０．０６ｍｍの単一の小さな透明なプレートが形成された。その後、Ｘ線解析のためにガラス繊維にのせた。結晶はよく回折し、探索により、セル定数ａ＝１１．２７３（１）Å、ｂ＝１１．１６８（２）Å、ｃ＝８．５５６（１）Å、β＝１０１．２４（１）゜および容積１０５６．５（５）Å3をもつ単斜Ｐ格子が生じた。容積に基づいて、中心空間群は、非対称単位における約１４個の非水素原子を示唆し、一方、中心外空間群は、約２８個の原子を示唆する。ＩＣＤＤデータベースの探索により、類似のセル定数を用いて全く構造は判明しなかった。データセットを集め、系統学
的欠如に基づいて、中心空間群１４番（Ｐ２1／ｃ）を選択した。Ｚ＝２では、構造は、Ｒ因子４．２および４．２％に改良した。分子は内部対称を有し、空間的位置（反転の中心）に座し、従って、構造中の原子の僅か半分が形成および改良される必要があった。最終構造は、八面体銅（ＩＩ）複合体の構造であると示された。複合体は、八面体のキャップを占有する窒素原子を通して配位した２つの有機分子（：Ｎ＝Ｃ（ＣＨ3）−Ｃ6Ｈ4−ＳＯ3）との、八面体の平面配置における、４つの水分子を示した。物質の実体を確認するために、結晶を移動相に溶かし、ＨＰＬＣシステムに注入した。生じたピークの保持時間は、ピーク９の保持時間に近くなく、これは、銅複合体が、おそらく、いくつかの銅（ＩＩ）塩および有機部分からの結晶化中に形成されることを示す。ピーク９は、配位されていない硫酸化有機部分であり得る。
【０１３０】
＜追加の調査＞
Ｗｙｅｔｈ−ＡｙｅｒｓｔによりＦＤＡに提出された組成物の情報は（１９９７年１月１４日、２月１３日、および３月２４日付の手紙）、米国情報公開法（ＦＯＩＡ）を介して得た。これらのデータは、存在するステロイド成分を決定するために、酸で加水分解した［ジオキサン中１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）］抱合エストロゲン、ＵＳＰに対するＧＣ解析により作成した。抱合エストロゲンＵＳＰは、１７個の硫酸エストロゲン、３つのプロゲスチン、４つの硫酸プロゲスチンおよび４つのアンドロゲンの混合物であると報告された。１０個のＵＳＰにより規定される硫酸化エストロゲンに加えて、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔは以下の存在を報告した。
【０１３１】
７つのエストロゲン
１．１７α−ジヒドロ−Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート、ナトリウム塩
２．１７β−ジヒドロ−Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート、ナトリウム塩
３．１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７−オン−３−スルフェート、ナトリウム塩
４．１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７−オン−２−メチルエーテル−３−スルフェート、ナトリウム塩
５．５，７，９（１０）−エストラトリエン−３β，１７β−ジオール−３−スルフェート、ナトリウム塩
６．５，７，９（１０）−エストラトリエン−３β−オール−１７−オン−３−スルフェート、ナトリウム塩
７．５（１０），７−エストラジエン−３β−オール−１７−オン−３−スルフェート、ナトリウム塩
【０１３２】
７つのプロゲスチン
１．５α−プレグナン−３β，２０β−ジオール−３−スルフェート、ナトリウム塩
２．５α−プレグナン−３β，２０β−ジオール−２０−スルフェート、ナトリウム塩
３．５α−プレグナン−３β−オール−２０−オン
４．５α−プレグナン−３β，２０β−ジオール−ジスルフェート、二ナトリウム塩
５．５α−プレグ−１６−ネン−３β−オール−２０−オン
６．５α−プレグナン−３β，１６α，２０β−トリオール
７．プレグ−４−ネン−２０−オール−３−オン−２０−スルフェート、ナトリウム塩
【０１３３】
および４つのアンドロゲン
１．５α−アンドロスタン−３β−オール−１６−オン
２．５α−アンドロスタン−３β，１６α−ジオール
３．５α−アンドロスタン−３β，１６β−ジオール
４．５α−アンドロスタン−３β，１７α−ジオール
【０１３４】
これらのデータは驚くべきものであった。なぜなら、疎水性プロゲスチンおよびアンドロゲン化合物は、ウマ尿の水溶性抽出物に存在するとは考えられないからである。プロゲスチンおよびアンドロゲンは、定義によると、水溶性エストロゲンではないが、利用可能な試料および関連化合物は、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔデータを実証するために、定量的標準物質として使用するために得た。表４は、この調査のために購入した化合物の作表を列挙する。
【表５】
2011256181.tif 000006
【０１３５】
Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェートの１７α−および１７β−ヒドロキシ誘導体（エストロゲン１番および２番）の存在が確認され、上記している。  エストロゲン３番の評価は、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１７β−トリオールの注入を使用して実施した。この注入は、９．９４５分における単一のピーク含む、ＨＰＬＣクロマトグラムを示した。同じ走行由来のプレマリン（登録商標）と比較した場合、このピークは、０．５８４のＲＲＴ値を生じ、プレマリン（登録商標）注入には検出されなかった。上記のＲＲＴ関係に基づいて、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７β−トリオールの硫酸化１７−オン誘導体である、エストロゲン３番（１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７−オン−３−硫酸ナトリウム）は、ＲＲＴが０．５３３であると予測された。この領域を調べると、非同定ピークが、ＲＲＴ値０．５１５に存在した。ＲＲＴが０．５１５のピークのダイオードアレイスペクトルの重層により、芳香族フェノール環の２位における添加−ＯＨ置換基により、期待される深色シフトをもつ類似のダイオードアレイスペクトルが判明した。ダイオードアレイスペクトルを、非硫酸化２，３，１７β−トリオールと比較した場合、エストロンの脱スルホン化に見られたものと類似した小さな深色シフトが観察された。これらのデータは、ＲＲＴ値が０．５１５におけるピークの実体は、エストロンの既知の酸化代謝物の１つである、化合物１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７−オン−３−スルフェート（エストロゲン３番）であるという証拠を提示した。この化合物上に存在するフェノールＡ環置換は、エストロゲン受容体への結合を損ねることが
知られ；この化合物は、エストロゲン活性に有意に寄与するとは考えられない。
【０１３６】
エストロゲン４番の真正の標準物質は商業的に入手できないが、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３−ジオール−１７−オン−２−メチルエーテル（エストロゲン４番の非硫酸化誘導体）の標準物質を注入し、プレマリン（登録商標）中のエストロゲン４番の存在の可能性を評価した。３７．６５２分での標準物質の保持時間と、同じ走行に由来するプレマリン（登録商標）注射液のそれとの比較により、ＲＲＴ値２．１７１が得られた。１．２４１のエストロゲン４番の予測ＲＲＴ値は、非硫酸化エストロン（ＲＲＴ＝１．７５０）と非硫酸化標準物質（ＲＲＴ＝２．１７１）のＲＲＴ関係の比較から、そしてエストロンスルフェートピーク（ＲＲＴ＝１．０００）に対する比に関して得た。プレマリン（登録商標）クロマトグラムのこの領域を調べる場合、０．１％より高いピーク
は検出されなかった。これらの結果により、エストロゲン４番はプレマリン（登録商標）には存在しないことが示される。エストロゲン４番は、フェノール性Ａ環置換基を含み、これは、エストロゲン３番と同様に、エストロゲン受容体への結合を除去することが知られている。これらのエストロゲンの存在または非存在は、抱合エストロゲンＵＳＰにおけるエストロゲン活性に有意に貢献しない。
【０１３７】
Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔにより報告された最後の３つのエストロゲン（５〜７番）に関する関連化合物の試料は、商業的に入手できなかった。これらの３つの化合物は、エストロゲン活性に必要な基本的な構造寄与因子（フェノールＡ環）を欠失している。３つ全ての化合物が、飽和Ａ環および種々の不飽和度のＢ環を含む。真正標準物質がなければ、これらの化合物の予測および位置づけは困難である。逆相ＨＰＬＣシステムでの疎水性相互作用の一般的な知識に基づいて、エストロゲン５〜７番は、硫酸エストロン後の領域に存在すると考えられる。しかし、この領域は、０．１％より高い非同定ピークを示さない。移動相の有機レベルを、保持時間を短縮し、任意の後期溶出ピークを鋭くする試みで増加させた場合でさえ、追加のピークは全く検出されなかった。エストロゲン７番のピークは、ＧＣ酸加水分解実験から存在すると報告されたＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔの量に基づいて観察された。その報告では、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔは、１０個のエストロゲンが、約１３．３重量％の薬物物質を構成し、エストロゲン７番（エストラジエン）は、存在する第四番目に大きいエストロゲンであることを主張した。この大きさのピークは、存在する場合には、クロマトグラフィー法により検出されている。これらの非エストロゲン化合物の存在または非存在は、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲンＵＳＰ）のエストロゲン活性に衝撃を及ぼすとは考えられない。
【０１３８】
１つを除く全てのＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔの報告したプロゲスチンおよびアンドロゲンに関する真正の標準物質または誘導体は商業的に入手可能であった。これらの１１個の報告されたステロイドの中で、プロゲスチン３番および５番およびアンドロゲン１番、２番、３番の真正標準物質が得られた。プロゲスチン１番、２番、４番および７番は、非硫酸化誘導体として得られ、アンドロゲン４番は、報告された化合物の１７β−誘導体として得られた。これらの１０個の標準物質の注入から検出されたピークは、どのピークとも一致しないか、または、誘導体の場合、プレマリン（登録商標）中のどの予測ピークとも一致しなかった。しかし、これらの化合物は、少ない発色団を有し化学的に非常に疎水性であり、ＨＰＬＣクロマトグラフィーシステムは、長い保持時間では非常に幅広いピーク
として出現し、それらを正確に検出する能力は制限される。
【０１３９】
クロマトグラフィーを向上するために、移動相の有機部分を増やし、これにより、保持時間は短縮し、ピークは鋭くなった。新規ＨＰＬＣ法の開発において、プロゲスチン３番および５番並びにアンドロゲン１番の真正標準物質は、最強の発色団を有し、使用に選択した。購入した商業的な標準物質の品質を確認するために、プロゲスチン３番およびアンドロゲン３番の実体は、単結晶Ｘ線回折により確証された。両方の化合物の結晶が成長し、中心外空間群４番（Ｐ２1）において結晶化が見出された。各化合物は、非対称単位に２つの独特な分子を有する単位セルを含んだ。構造は改良し、化合物の実体を確認した。プロゲスチン５番は、ＨＰＬＣを使用して、有機物質：水性物質の４０：６０の比まで移動相の組成を変化することにより調べた。標準物質は、プレマリン（登録商標）中に約１％レベルを示すように調製し、約４５．８５分の保持時間において小さな別個のピークとして観察された。同じ条件下で、このクロマトグラムを、プレマリン（登録商標）錠剤注射液と重層する検査により、プレマリン（登録商標）に対応するピークは判明しなかった。プロゲスチン３番は、ＨＰＬＣを使用して、２０５ｎｍでのＵＶ検出を変化し、移動相組成を有機物質：水性物質５０：５０の比に変化することにより調べた。標準物質は、プレマリン（登録商標）中約１％レベルを提示するように調製し、約１５．１１分の保持時間において小さな別個のピークとして観察された。同じ条件下で、このクロマトグラムを、プレマリン（登録商標）錠剤注射液と重層する検査により、プレマリン（登録商標）に対応するピークは判明しなかった。同様に、アンドロゲン１番を、ＨＰＬＣを使用して、２０５ｎｍでのＵＶ検出を変化し、移動相を有機物質：水性物質４０：６０の比
に変化することにより調べた。標準物質は、プレマリン（登録商標）中約１％レベルを提示するように調製し、そのレベルでは別個のピークは全く検出されなかった。標準物質レベルは５％まで増加し、ここでは約１５．２４分の保持時間で小さな別個のピークとして観察された。同じ条件下で、このクロマトグラムを、プレマリン（登録商標）錠剤注射液と重層することより、同じ保持時間において、プレマリン（登録商標）に対応するピークは判明しなかったが、領域における他のピークにより、絶対的な検出は困難となった。これらの結果に基づいて、試験した化合物は、プレマリン（登録商標）錠剤注射液中に検出されないようであった。
【０１４０】
インターネット上での利用可能な文献の探索およびＣＤ−ＲＯＭでのメルク・インデックス（第１２版）のキーワード探索を行ない、尿中に存在する既知の化学成分に関する入手可能な情報を再調査した。さらに、疑われ化学的に類似したステロイドをベースとした化合物の化学カタログを探索した。これらの探索に見られそれから商業的に入手可能な任意の化合物を購入し、上記のＨＰＬＣクロマトグラフィーアッセイ法を使用して調べた。化合物をプレマリン（登録商標）と比較して、特定のＲＲＴにおける成分の存在について点検し、一致が見出された場合、ダイオードアレイスペクトルを重層し、調べた。注入したステロイドピークも使用して、抱合エストロゲンについて展開したパターンに基づいて、関連化合物（硫酸化、対、非硫酸化、ケトン、対、ヒドロキシル等）の予測領域を調べた。上記の表４および表５は、調べた化合物の広範なリストのいくらかを列挙する。
【表６】
2011256181.tif 000007
【０１４１】
既知の抱合エストロゲンと比較した、これらの化合物の注射液の保持時間およびダイオードアレイスペクトルは、ステロイド環系に対する置換の効果に関する知識を発展するのに重要であった。しかし、試験した化合物またはその予測誘導体はどれも、プレマリン（登録商標）に存在するピークに良好な一致を示さなかった。
【０１４２】
エストリオール（１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１６α，１７β−トリオール）（これは、メルク・インデックスによると、通常、尿中の圧倒的なエストロゲン代謝物である）が存在すると考えられた。硫酸化および非硫酸化形のエストリオールの両方を、ＨＰＬＣシステムに注入した。クロマトグラム中の試料ピークは、硫酸化および非硫酸化形についてＲＲＴ値０．１２１および０．１７４において、プレマリン（登録商標）の未知の保持時間とよく一致した。しかし、ダイオードアレイスペクトルを重層した場合、２つのピークの対はどちらも、同じ成分ではなく、硫酸エストリオールおよびエストリオールは、プレマリン（登録商標）錠剤に存在しないと決定された。
【０１４３】
＜プレマリン（登録商標）錠剤のピーク調査の要約＞
集めたピーク画分の調査により、ＨＰＬＣクロマトグラフィー走行中、プレマリン（登録商標）錠剤は、連続的に賦形剤および無機金属塩を系に漏出し、基線の増加を引き起こすようであることが判明した。ポリエチレングリコールおよびワックスなどの賦形剤は、個々のピーク溶液を、黄色の粘性油状物とし、分析研究および構造実体の解明をより困難なものとする。しかし、５つ最大のピークの特徴づけが完了し、尿中に存在することが知られる単純な有機化合物であることが判明した。関連試料および標準物質に関する追加の文献探索および研究により、ＲＲＴ０．５１５でのピークの特徴づけが可能となった。これにより、０．１％より高くて未同定であるのは僅か１４個のピークであった。これらの中で、７個は≦０．５％であり、４個は＞０．５かつ≦１．０％であり、僅か３個が＞１
．０かつ≦２．０％である。
【０１４４】
＜プレマリン（登録商標）静注の調査＞
３つの現在のプレマリン（登録商標）静注ロットも、プレマリン（登録商標）錠剤に使用したのと同じＨＰＬＣ法により調べた。プレマリン（登録商標）静注を選択した。なぜなら、プレマリン（登録商標）錠剤と同じ抱合エストロゲンＵＳＰの薬物物質を含むが、錠剤試料でクロマトグラフィーにおいて漏出問題を引き起こした賦形剤は含まないからである。クロマトグラムを調べて、製品ごとの抱合エストロゲンＵＳＰの薬物物質の一貫性を調査した。３つのプレマリン（登録商標）静注ロットは、上記のＨＰＬＣクロマトグラフィーアッセイ法により調べた。３つのロットは、類似したクロマトグラフィーパターンを与えた。しかし、静注ロットの１つを、プレマリン（登録商標）錠剤ロットと重層することにより、最初の７分間に観察されるピークパターンに実質的な差異が示された。錠剤
クロマトグラムに観察された大きなピークはどれも、抱合エストロゲンＵＳＰの成分を示さない。プレマリン（登録商標）静注（ロット３９８０２２６）の最新のロットは、１０個のＵＳＰにより規定された抱合エストロゲンに加えて、＞０．１％の１５個のピークを含んでいた。プレマリン（登録商標）静注のクロマトグラム由来のピークの実体は、プレマリン（登録商標）錠剤のクロマトグラム由来の対応するＲＲＴピークと、ダイオードアレイスペクトルの比較により確認した。未同定プレマリン（登録商標）錠剤ピークと全てのプレマリン（登録商標）静注ピークの比較により、以前には同定または解明されていない、１５個のピークの僅か６個が判明した（ＲＲＴ値は、０．２６８、０．２８４、０．３３８、０．３８７、０．６０１、および０．７３８）。２つの製品におけるこれらの６つのピークのレベルの検査により、これらの全ての未知の成分のレベルは、制御
した成分に期待される５０％変動基準を超えて変化することが判明した。これらの不定な非制御ピークの解明により、プレマリン（登録商標）には特徴づけられていないピークは残らない。それ故、プレマリン（登録商標）中の必須エストロゲン化合物は、抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ8,9−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩と決定された。
【０１４５】
［実施例２−−ＨＰＬＣアッセイ法］
Ａ．装置および設備
１．分離Ａ用の温度制御カラム区分または均等物を装備したＨＰ１１００ＨＰＬＣシステム
２．分離Ｂ用の可変波長ＵＶ検出器を有するＨＰＬＣシステム
３．適切な分析バランスおよびミクロバランス
４．適切なｐＨメーター
５．ミリポアの０．４５μｍのＨＶＬＰ４５ｍｍのメンブランフィルター
６．１μｍのプレフィルターを有するチタン０．４５μｍのＰＴＦＥフィルター
７．ＳｕｐｅｌｃｏＣ18、３μｍの粒子サイズ、１５ｃｍ×４．６ｍｍのカラム
８．ＳｕｐｅｌｃｏＣ18、３μｍの粒子サイズ、２０ｃｍ×４．６ｍｍのカラム
【０１４６】
Ｂ．試薬、標準物質および媒体
１．試験し標準純度を割り当てた、１０−成分抱合エストロゲン薬物物質
２．エストロン基準標準物質ＵＳＰまたはクライアントが特定
３．エクイリン基準標準物質ＵＳＰまたはクライアントが特定
４．１７α−ジヒドロエクイリン基準標準物質ＵＳＰまたはクライアントが特定
５．リン酸一カリウム、試薬等級
６．逆浸透水または均等物
７．８５％リン酸、試薬等級
８．アセトニトリル、ＨＰＬＣ等級
９．メタノール、ＨＰＬＣ等級
１０．適切なｐＨ緩衝液
１１．水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）、０．４Ｍ±０．０２Ｍ（水性）滴定剤、試薬等級
【０１４７】
Ｃ．示唆される試料サイズ
各試料１０個の錠剤
【０１４８】
Ｄ．溶液の調製
これらのクロマトグラフィー法は、移動相の組成に感受性であり得るので、希釈剤および移動相の調製中に注意を払うと、分析は向上し得る。
【０１４９】
５０ｍＭリン酸緩衝溶液を、約４０．８ｇのリン酸一カリウムを６０００ｍＬの水に溶かし、ＨＶＬＰ０．４５μｍフィルターを通して得られた溶液をろ過することにより調製し得る。
【０１５０】
容量比２４．５：４．５のアセトニトリルとメタノールの溶液を含む有機希釈剤を、１２２５ｍＬのアセトニトリルおよび２２５ｍＬのメタノールを合わせ、よく混合し、溶液を室温に平衡化することにより調製し得る。
【０１５１】
容量比７１：０．７のリン酸緩衝液および０．４ＭのＴＢＡＨ溶液を含む水性希釈剤を、３５５０ｍＬのリン酸緩衝液および８．５ｍＬの０．４ＭのＴＢＡＨ溶液を合わせ、よく混合することにより調製し得る。
【０１５２】
分離Ａの移動相は、容量比２９：７１の有機希釈剤および水性希釈剤の溶液を含む。この移動相は、１１６０ｍＬの有機希釈剤および２８４０ｍＬの水性希釈剤を合わせ、よく混合し、そして得られた溶液を脱気することにより調製し得る。
【０１５３】
分離Ｂの移動相は、容量比６：３８：５６：０．４のアセトニトリル、メタノール、リン酸緩衝液、および０．４ＭのＴＢＡＨ溶液の溶液を含む。この移動相は、２２４０ｍＬのリン酸緩衝液を、１６ｍＬの０．４ＭのＴＢＡＨ溶液と最初に合わせ、得られた溶液のｐＨを、８５％リン酸を用いて３．０±０．１に調整することにより調製し得る。この混合物に、２４０ｍＬのアセトニトリルおよび１５２０ｍＬのメタノールを加える。その後、得られた溶液をよく混合し、脱気する。
【０１５４】
ブランクな注射溶液を、試料の調製に使用した同じ希釈剤を使用して調製し得る。ブランク注射溶液は、２９ｍＬの有機希釈剤を、１００ｍＬの容量測定フラスコに加え、有機希釈剤を、水性希釈剤を用いて希釈して増量し、よく混合することにより調製し得る。
【０１５５】
Ｅ．標準物質の調製
約０．０３ｍｇ／ｍＬの抱合エストロゲンを含む標準物質の溶液を、約１６０ｍｇの１０成分抱合エストロゲン薬物物質（ラベルクレイム３７．５μｇ／ｍｇ）を秤量し、秤量した薬物物質を２００ｍＬの容量測定フラスコに移すことにより調製し得る。１００ｍＬの容量の移動相Ａをフラスコに加え、フラスコを１５分間機械的に振盪する。その後、得られた溶液を移動相Ａを用いて希釈して増量し、よく混合する。標準物質溶液は、周囲温度で１３日間安定であり得る。この溶液の一部を、１μｍのプレフィルターをもつ０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、最初の３ｍＬを廃棄する。
【０１５６】
移動相Ａに抱合エストロゲン約０．０４８μｇ／ｍＬの溶液（全抱合エストロゲンに比べて０．１％ラベルクレイムに等価）を含む感受性溶液Ａを調製し得る。２．０ｍＬの容量の標準調製物を、１００ｍＬの容量測定フラスコにピペッティングする。その後、標準溶液を、移動相Ａを用いて希釈して増量し、よく混合する。その後、２．０ｍＬの得られた溶液を、２５ｍＬの容量測定フラスコにピペッティングし、移動相Ａを用いて希釈して増量し、よく混合する。感受性溶液Ａは、周囲条件で４日間安定であり得る。
【０１５７】
エストロンＲＳ、エクイリンＲＳ、および１７α−ジヒドロエクイリンＲＳの０．２ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を含む、ストック遊離ステロイド溶液を、約１０ｍｇの１７α−ジヒドロエクイリン、エクイリンおよびエストロンを秤量し、これらを５０ｍＬの容量測定フラスコに定量的に移すことにより調製し得る。フラスコをメタノールを用いて約半分の容量まで充填する。その後、フラスコを固体が溶けるまで（約１５分間）超音波処理する。溶液を室温まで冷却し、その後、メタノールで希釈して増量し、よく混合する。ストック遊離ステロイド溶液は、目的のピークの定量プロファイルが維持される全期間を通じて適していると考えられ得る。それは好ましくは冷蔵庫に保存する。
【０１５８】
約０．０３ｍｇ／ｍＬの１０成分抱合エストロゲンおよび約０．００６ｍｇ／ｍＬの各１７α−ジヒドロエクイリン、エクイリンおよびエストロンを含む分解溶液を、約８０ｍｇの１０成分抱合エストロン薬物物質（ラベルクレイム３７．５μｇ／ｍｇ）を秤量し、得られた溶液を１００ｍＬの容量測定フラスコに移すことにより調製し得る。その後、５０ｍＬの容量の移動相Ａをフラスコに加え、フラスコを１５分間機械的に振盪する。３．０ｍＬのストック遊離ステロイド溶液をフラスコに加える。得られた溶液を、移動相Ａで希釈して増量し、よく混合する。溶液の一部を、１μｍのプレフィルターを有する０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、最初の３ｍＬを廃棄する。分解溶液は好ましくは、定量目的ではない。それは好ましくは冷蔵庫に保存し、目的のピークの定量プロファイルが維持される全期間を通じて使用に適している。
【０１５９】
Ｆ．試料調製
分析すべき試料を調製し得る。プレマリン（登録商標）錠剤では、約１０〜０個の錠剤を水中で洗浄し、外コーティングを除去し、その後、窒素パージ下で風で乾燥した。その後、錠剤を１分間４５０ＲＰＭで摩砕器で粉砕する。
【０１６０】
０．３ｍｇの錠剤を使用して試料溶液を調製する場合、１０個の錠剤（プレマリン（登録商標）では、１０個の平均錠剤重量（ＡＴＷ）に等価な洗浄および粉砕錠剤の量）を、１００ｍＬの容量測定フラスコに入れる。２９ｍＬの容量の有機希釈剤を加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。約５０ｍＬの水性希釈剤を得られた溶液に加え、フラスコを再度１０分間機械的に振盪する。その後、得られた溶液を水性希釈剤で希釈して増量し、混合する。溶液の一部を、１μｍのプレフィルターを有する０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、最初の３ｍＬを廃棄する。蒸発を防ぐために、ろ液は好ましくは、注射用バイアルに迅速に入れる。
【０１６１】
０．６２５ｍｇの錠剤を使用して試料溶液を調製する場合、１０個の錠剤（プレマリン（登録商標）では、１０個の平均錠剤重量（ＡＴＷ）に等価な洗浄および粉砕錠剤の量）を２００ｍＬの容量測定フラスコに入れる。５８ｍＬの容量の有機希釈剤をフラスコに加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。約１００ｍＬの水性希釈剤を得られた溶液に加え、フラスコを一度再度１０分間機械的に振盪する。得られた溶液を水性希釈剤で希釈して増量し、混合する。溶液の一部を、１μｍのプレフィルターを有する０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、最初の３ｍＬを廃棄する。
【０１６２】
試料溶液を１．２５ｍｇの錠剤を使用して調製する場合、１０個の錠剤（プレマリン（登録商標）では、１０個の平均錠剤重量（ＡＴＷ）の洗浄および粉砕錠剤の量）を、４００ｍＬの容量測定フラスコに入れる。１１６ｍＬの容量の有機希釈剤をフラスコに加え、フラスコを１０分間機械的に振盪する。その後、約２００ｍＬの水性希釈剤を、得られた溶液に加え、フラスコを一度再度１０分間機械的に振盪する。得られた溶液を、水性希釈剤で希釈して増量し、混合する。溶液の一部を、１μｍのプレフィルターを有する０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、最初の３ｍＬを廃棄する。蒸発を防ぐために、ろ液は好ましくは、注射用バイアルに迅速に入れる。錠剤用の試料溶液は、周囲条件で３７時間まで安定であると考えられ得る。
【０１６３】
Ｇ．装置条件
＜分離Ａ＞
カラム：ＳｕｐｅｌｃｏＣ18、３μｍの粒子サイズ、１５ｃｍ×４．６ｍｍ
カラム温度：１７℃、カラム冷却器で維持する
検出：ＵＶ、２２０ｎｍ
移動相：移動相Ａ
流速：１．５ｍＬ／分
平衡時間：流速１．５ｍＬ／分で最初の注入前に３０分間
注入容量：１２０μＬ（シートキャピラリー４００μＬを、オートサンプラーに加えて、１００μＬ以上を注入しなければならない）
定量：ピーク面積
およその走行時間：標準物質−４５分間；分解−５５分間；試料−６５分間
【表７】
2011256181.tif 000008
【０１６４】
＜分離Ｂ＞
カラム：ＳｕｐｅｌｃｏＣ18、３μｍの粒子サイズ、２０ｃｍ×４．６ｍｍ
カラム温度：３０℃、カラムヒーターで維持
検出：ＵＶ、２２０ｎｍ
移動相：移動相Ｂ
流速：１．０ｍＬ／分
平衡時間：流速１．０ｍＬ／分で最初の注入前に３０分間
注入容量：４０μＬ
定量：ピーク面積
およその走行時間：試料／標準物質−４５分間；分解−７０分間
【表８】
2011256181.tif 000009
【０１６５】
クロマトグラフィー手順の例は以下の通りである。等量の標準物質および試料調製物を、所望のＨＰＬＣシステムに注入する。クロマトグラフィー分離Ｂを、エクイリンスルフェートおよびΔ8,9−デヒドロエストロンスルフェートピークの同定および定量に使用する。クロマトグラフィー分離Ｂを、残りのエストロゲンおよび未知の不純物のピークの同定および定量に使用する。
【０１６６】
［実施例３−−移動相の頑健さ−分離Ａ］
実施例２に上記した分離Ａの移動相の頑健さを、移動相組成への僅かに自由な変化をなすことにより調べた。メタノールの量に対する（＋／−１％の絶対値）、水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）に対する（＋／−１０％絶対値）、緩衝液ｐＨに対する（＋／−０．２単位）、および緩衝液の濃度に対する（＋／−１０％）、移動相中のアセトニトリルの量の変動に対する（＋／−１％）を実施した。実施例２に上記した分離溶液の１回の注入、および、実施例２に上記した０．３ｍｇの製剤の試料調製物の３回の複製の注射を、異なる移動相組成を使用して作成した。さらに、０．３ｍｇの製剤（ロット００５３２−００６）のプラセボ溶液および２つの分解試料溶液（ロット００４８４−０６６、５分間３％過酸化水素で処理し、８０℃で２４時間加熱する）の注射液を、異なる各移動相組成を使用して作成した。以下を計算し、以下の表８に報告する。
１．１７α−エストラジオールスルフェート（ＡＥＤＳ）とエクイレニンスルフェート（ＥＱＮＳ）の間の分離
２．エクイレニンスルフェート／Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェート（ＥＱＤ８）とエストロンスルフェート（ＥＳＴＳ）の間の分離
３．エストロンスルフェート（ＥＳＴＳ）と１７α−ジヒドロエクイリン（ＡＤＨＥ）の間の分離
４．１７α−ジヒドロエクイリンスルフェート（ＡＤＨＥＳ）と三回の試料注
射由来のＥＳＴＳの相対標準偏差率（ＲＳＤ）
５．試料注射液におけるＡＤＨＥＳおよびＥＳＴＳの平均テーリング因子
【０１６７】
ＴＢＡＨ変動についての全ての分離必要条件（すなわち、ピーク間の分離、テーリング因子、および複数回の注射の再現性）、緩衝液の濃度の変動およびｐＨの変動は一致した。
【０１６８】
２４．５％のアセトニトリルを含む移動相を使用した分離溶液の注射のために、ＡＥＳＤＳおよびＥＱＮＳの間の分離は、分離必要条件を満たさないが；しかし、試験手順により、この分離を向上するための、カラム温度の変動が可能となる。２０から１７℃に温度を低下することにより、分離は向上し、分離必要条件に合致した。２６．５％アセトニトリルを含む移動相を使用した分離溶液の注入のために、ＡＤＨＥＮＳピーク上のＢＥＳＤＳピークの肩は明確ではなく；それ故、２６％のアセトニトリルを含む新規な移動相を調製し、肩は明確に見えた。
【０１６９】
３％メタノールを含む移動相を使用した分離溶液の注入のために、ＥＳＴＳとＡＤＨＥの間の分離は、分離必要条件に合致しなかった。試験手順により、移動相の水酸化テトラブチルアンモニウム濃度を低下させて、ＥＳＴＳとＡＤＨＥの間の分離を向上できる。移動相１リットル毎に、アセトニトリル：メタノール：水（２５．５：３：７１．５）の組成を有する１００ｍＬの溶液を加えた。この調整後、全ての分離必要条件が合致した。５％メタノールを含む移動相を使用した分離溶液の注入のために、全ての分離必要条件が合致した。
【０１７０】
異なる移動相組成を使用したプラセボ溶液の注射は、クロマトグラムの差異を示さなかった。２つの分解試料溶液の注入は、抱合エストロゲンと干渉したピークを示さなかった。
【０１７１】
該方法は、列挙した範囲内で頑強であることが示された。しかし、移動相は、メタノール、アセトニトリルおよび水酸化テトラブチルアンモニウムの変動に感受性であることが示された。従って、移動相を調製する場合には注意すべきである。研究により、調整は、分離の向上に適した移動相に行ない得ることが示される。
【０１７２】
【表９】
2011256181.tif 000010
【０１７３】
［実施例４−−移動相の頑強さ−分離Ｂ］
実施例２に上記した分離Ｂに関する移動相の頑強さ試験を実施して、移動相の小さな変動の効果を評価した。移動相組成に行なった変動を以下の表９に概略を示す。分解溶液の１回の注射を行ない、Δ8,9−デヒドロエストロンスルフェートとエクイリンスルフェート（Ｄ８９ＤＳ／ＥＱＵＳ）ピーク、および、エクイリンスルフェートと１７β−エストラジオール（ＥＱＵＳ／ＢＥＳＤＳ）ピークの間の分解をモニタリングした。次に、０．６２５ｍｇの製剤（ロット００４２６−０５６、ＦＤＬ／ＡＡＳＩ）の試料溶液の２回の注射を、各移動相を使用して解析した。全ての分離必要条件（すなわち、ピーク間の分解、テーリング因子、および複数回の注射の再現性）が合致した。該方法は、試験した条件内では頑強であったが、得られたクロマトグラフィーの感受性により移動相調製に注意を払うべきである。
【０１７４】
【表１０】
2011256181.tif 000011
【０１７５】
数十年におよぶ数多くの試みにも関わらず、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン、ＵＳＰ）の必須エストロゲン化合物は、これまで、決定されていない。本発明の分析法を使用して、初めて、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）に存在する必須エストロゲン化合物を決定し得る。プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）に存在する必須エストロゲン化合物を意外にも決定することができたので、本発明の組成物および薬物製品は、初めて、合成エストロゲン化合物の混合物を提供し、ここでの混合物は、プレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）に存在する同じ必須エストロゲン化合物を含む。従って、本発明の組成物および薬物製品は、天然から得られたプレマリン（登録商標）（抱合エストロゲン錠剤、ＵＳＰ）の合成代替
物を提供し得る。これは、疾病および病態、例えば、閉経、萎縮性膣炎、骨粗鬆症、性腺機能低下症、性腺摘除、または原発性卵巣不全による低エストロゲン血症、転移性疾患をもつ選択した人における乳癌、および進行したアンドロゲン依存的な前立腺癌に関連した重度の血管運動症状に有用な薬物製品を依然として提供しつつ、動物には残酷であると知覚されるものを減少または排除し得る。
【０１７６】
本発明は、本明細書に、その好ましい実施形態を参照して記載した。これらの実施形態は本発明を限定するものではないが、説明の目的のために示す。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定される。
【図１】
2011256181.tif 000012
【図２】
2011256181.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月23日(2011.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物中には、天然から得られたウマ抱合エストロゲン製品に存在する不純物が存在せず、前記混合物は抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ８，９−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須なエストロゲン化合物を含み、
抱合エストロンの塩と、抱合エクイリンの塩との合計量の割合は、７０ないし９５重量％であり、抱合エストロンの塩に対する抱合エクイリンの塩の存在割合は、０．２５ないし０．７５である、前記組成物。
【請求項２】
塩がナトリウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抱合体がスルフェートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ８，９−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ８，９−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１７α−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェートおよび６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩をナトリウム塩とした請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
混合物は、４０から７５％の抱合エストロンの塩；
１５から４０％の抱合エクイリンの塩；
２から１０％の抱合Δ８，９−デヒドロエステロンの塩；
２から１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
１０から２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；および
０．５から５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物はさらに、少なくとも１つの追加の医薬的に活性な成分を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの追加の医薬的に活性な成分は、アンドロゲン、プロゲスチン、カルシウム塩、並びにビタミンＤおよびその誘導体からなる群から選択する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記エストロゲン化合物の少なくとも１つは、合成エストロゲン化合物であり、前記混合物中には天然から得られたウマ抱合エストロゲン製品に存在する不純物が存在せず、前記混合物は抱合エストロン、抱合エクイリン、抱合Δ８，９−デヒドロエストロン、抱合１７α−エストラジオール、抱合１７α−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−ジヒドロエクイリン、抱合１７β−エストラジオール、抱合エクイレニン、抱合１７α−ジヒドロエクイレニン、および抱合１７β−ジヒドロエクイレニンの塩を含み、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須なエストロゲン化合物を含み、前記混合物は、
４０から７５％の抱合エストロンの塩；
１５から４０％の抱合エクイリンの塩；
２から１０％の抱合Δ８，９−デヒドロエストロンの塩；
２から１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
１０から２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；
および０．５から５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含み、
抱合エストロンの塩と、抱合エクイリンの塩との合計量の割合は、７０ないし９５重量％であり、抱合エストロンの塩に対する抱合エクイリンの塩の存在割合は、０．２５ないし０．７５である、前記組成物。
【請求項１０】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ８，９−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ８，９−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
１７α−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェートおよび６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩がナトリウム塩である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
エストロゲン化合物の混合物を含む組成物であって、前記混合物中には天然から得られたウマ抱合エストロゲン製品に存在する不純物が存在せず、前記混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンに存在する同じ必須エストロゲン化合物を含み、前記混合物は、
４０から７５％の抱合エストロンの塩；
１５から４０％の抱合エクイリンの塩；
２から１０％の抱合Δ８，９−デヒドロエストロンの塩；
２から１０％の抱合１７α−エストラジオールの塩；
１０から２０％の抱合１７α−ジヒドロエクイリンの塩；および
０．５から５％の抱合１７β−ジヒドロエクイリンの塩を含み、
抱合エストロンの塩と、抱合エクイリンの塩との合計量の割合は、７０ないし９５重量％であり、抱合エストロンの塩に対する抱合エクイリンの塩の存在割合は、０．２５ないし０．７５である、前記組成物。
【請求項１３】
混合物はさらに、エクイレニン、１７β−ジヒドロエクイレニン、１７β−ジヒドロエクイリン、１７α−ジヒドロエクイレニン、１７β−エストラジオール、１７α−ジヒドロエクイリン、１７α−エストラジオール、エクイリン、Δ８，９−デヒドロエストロン、エストロン、１７α−Δ８，９−デヒドロエストラジオール、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオール、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニン、６−ＯＨエクイレニン、および、１７αΔ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、６−ＯＨ１７β−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩からなる群から選択した少なくとも１つの化合物を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
１７α−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、１７β−Δ８，９−デヒドロエストラジオールスルフェート、６−ＯＨ１７α−ジヒドロエクイレニンスルフェート、および６−ＯＨエクイレニンスルフェートの塩はナトリウム塩である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
インジカン、硫酸ベンジルアルコール、馬尿酸、安息香酸、およびクレアチニンを含まない、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の組成物の使用であって、エストロゲン化合物を投与することによって処置することができる状態にある、処置の必要な哺乳動物の処置のための医薬の調製のための使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、前記哺乳動物の処置が、前記医薬を連続的または断続的に、投与すること含む、使用。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の使用であって、前記哺乳動物は、血管運動症状の処置を必要とする、使用。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の使用であって、前記哺乳動物は、萎縮性膣炎の処置を必要とする、使用。
【請求項２０】
請求項１６または１７に記載の使用であって、前記前記哺乳動物は、骨粗鬆症の処置を必要とする、使用。
【請求項２１】
抱合エストロゲンを含む溶液を調製し、前記溶液は、
分析すべきエストロゲン化合物を含む混合物；および
０．１％ないし３０％（有機部分の容量で）のプロトン性溶媒および７０％ないし１００％（有機部分の容量で）の極性非プロトン性溶媒を含む有機部分；および
水性部分を含む移動相を含み；ここで、前記有機部分は、イオン対形成物質を含み；そして、ＨＰＬＣシステムを使用して抱合エストロゲン溶液を分析する段階を含む、抱合エストロゲン構成成分を分析する方法。
【請求項２２】
エストロゲン化合物を含む混合物は、天然から得られたウマ抱合エストロゲンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロトン性溶媒は、低級アルキルアルコールを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
低級アルキルアルコールはメタノールである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
極性非プロトン性溶媒は低級アルキルニトリルを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
低級アルキルニトリルはアセトニトリルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
移動相は、６５ないし８０％の水性部分および２０ないし３５％の有機部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
水性部分は、ｐＨが２．５ないし３．５である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
イオン対形成物質は、０．５ないし２ｍＭの濃度を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
イオン対形成物質は、水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
水性部分はイオン対形成物質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
イオン対形成物質は、０．５ないし２ｍＭの濃度を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
イオン対形成物質は水酸化ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
分析段階はさらに、抱合エストロゲン物質の分離構成成分の少なくとも１つを分取する段階を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
分取段階は、マルチチャンネルフラクションコレクターを利用する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＰＬＣシステムはカラムを含み、分析段階は、１５ないし３５℃のカラム温度で行なう、請求項３５に記載の方法。
【外国語明細書】
2011256181.tif 000014
2011256181.tif 000015
2011256181.tif 000016
2011256181.tif 000017
2011256181.tif 000018
2011256181.tif 000019
2011256181.tif 000020
2011256181.tif 000021
2011256181.tif 000022
2011256181.tif 000023
2011256181.tif 000024
2011256181.tif 000025
2011256181.tif 000026
2011256181.tif 000027
2011256181.tif 000028
2011256181.tif 000029
2011256181.tif 000030
2011256181.tif 000031
2011256181.tif 000032
2011256181.tif 000033
2011256181.tif 000034
2011256181.tif 000035
2011256181.tif 000036
2011256181.tif 000037
2011256181.tif 000038
2011256181.tif 000039
2011256181.tif 000040
2011256181.tif 000041
2011256181.tif 000042
2011256181.tif 000043
2011256181.tif 000044
2011256181.tif 000045
2011256181.tif 000046
2011256181.tif 000047
2011256181.tif 000048
2011256181.tif 000049
2011256181.tif 000050
2011256181.tif 000051
2011256181.tif 000052
2011256181.tif 000053
2011256181.tif 000054
2011256181.tif 000055
2011256181.tif 000056
2011256181.tif 000057
2011256181.tif 000058
2011256181.tif 000059
2011256181.tif 000060
2011256181.tif 000061
2011256181.tif 000062
2011256181.tif 000063
2011256181.tif 000064
2011256181.tif 000065
2011256181.tif 000066
2011256181.tif 000067
2011256181.tif 000068
2011256181.tif 000069
2011256181.tif 000070
2011256181.tif 000071
2011256181.tif 000072
2011256181.tif 000073
2011256181.tif 000074
2011256181.tif 000075
2011256181.tif 000076
2011256181.tif 000077
2011256181.tif 000078
2011256181.tif 000079
2011256181.tif 000080
2011256181.tif 000081
2011256181.tif 000082