(57)【要約】【課題】  試料から発生される蛍光量を、従来のような比（レシオ値）ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として定量的に測定する。【解決手段】  試料に励起光を照射し、この試料から発生される蛍光を受光光学系を経由して受光素子により測定する蛍光量測定方法において、国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する励起光を前記試料に照射するステップと、前記試料から発生された蛍光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、前記指定された単位面積当たりの励起光量、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された蛍光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量値として算出するステップと、を備える。【選択図】図１
2011038772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に励起光を照射し、この試料から発生される蛍光を受光光学系を経由して受光素子により測定する蛍光量測定方法において、
国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する励起光を前記試料に照射するステップと、
前記試料から発生された蛍光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、
前記指定された単位面積当たりの励起光量、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された蛍光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量値として算出するステップと、
を備えることを特徴とする蛍光量測定方法。
【請求項２】
試料に照射光を照射し、この試料により吸収を受けた透過光を受光光学系を経由して受光素子により測定する吸収光量測定方法において、
国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する照射光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、
前記照射光を前記試料に照射するステップと、
前記試料により吸収を受けた透過光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、
前記指定された単位面積当たりの照射光量、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された透過光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの吸光量値として算出するステップと、
を備えることを特徴とする吸光量測定方法。
【請求項３】
試料に励起光を照射し、この試料から発生される蛍光を受光光学系を経由して受光素子により測定する蛍光量測定装置において、
国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する励起光を前記試料に照射する光源手段と、
前記試料から発生された蛍光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定する光量計測手段と、
前記指定された単位面積当たりの励起光量、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された蛍光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量値として算出する蛍光量算出手段と、
を備えることを特徴とする蛍光量測定装置。
【請求項４】
試料に照射光を照射し、この試料により吸収を受けた透過光を受光光学系を経由して受光素子により測定する吸収光量測定装置において、
国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する照射光を前記試料に照射する光源手段と、
前記光源手段から出射される照射光および前記試料により吸収を受けた透過光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定する光量計測手段と、
前記指定された単位面積当たりの照射光量、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された透過光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの吸光量値として算出する吸光量算出手段と、
を備えることを特徴とする吸光量測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から発生される蛍光の量や試料により吸収される光の量を測定する蛍光量または吸光量の測定方法および測定装置に関するものである。
【０００２】
さらに詳しくは、蛍光測定のために試料に照射する励起光を、「国家基準にトレーサブルでかつ指定された単位面積当たりの光量」の値に標準化することにより、試料から発生される蛍光量を、従来のような比（レシオ値）ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として定量的に測定するようにした蛍光量測定方法および蛍光量測定装置に関するものである。
【０００３】
同様に、吸光測定における試料への照射光を、「国家基準にトレーサブルでかつ指定された単位面積当たりの光量」の値に標準化することにより、試料で吸収される吸収光量を、従来のような比（レシオ値）ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として定量的に測定する吸光量測定方法および吸光量測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイを読み取る装置として、マイクロアレイスキャナが知られている。マイクロアレイスキャナを用いて、ＤＮＡマイクロアレイにレーザ光を照射し、ＤＮＡマイクロアレイの画像をスキャンしながら取り込むことで、ターゲット分子の蛍光量分布を２次元画像として測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３３３３３３号公報
【特許文献２】特開２００４−１９１２３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記のマイクロアレイスキャナでは、ＤＮＡマイクロアレイにレーザ光を照射し、試料（ターゲット分子）から発生される蛍光をＰＭＴ（光電子増倍管;Photomultiplier）で電流増幅を行いながら測定するために、受光手段のリニアリティや増幅率の安定性に限界があり、試料に照射した励起光量との精度の高い相関を取ることが困難である。そのため、測定された蛍光量は一般に任意単位で表現される。このＰＭＴなどの受光器によって受光され、測定された蛍光量を以降、読取値と呼ぶこととする。
【０００７】
またレーザ光などの励起光等の測定条件に関して校正手段を持たっていないため、蛍光量分布を読み取った２次元画像において、１画面内の相対測定は可能であっても、複数回の測定や機体間の読取値を直接比較することはできない。
【０００８】
また、一般にマイクロアレイスキャナの測定装置には、測定精度や再現性の規定がなく、同一のメーカの同一機種であっても、同じサンプルを測定した時の読取値が同じ値になる保証はない。つまり、本質的な器差が存在する。
【０００９】
当然、異なるメーカ間では、同じように同一のサンプルを測定した時の読取値が同じになる保証はない。つまり、メーカを超えた測定の標準化も困難である。すなわち、電気・機械系における電圧［Ｖ］や長さ［ｍ］などに対応するような、国家基準にトレーサブルな絶対的な単位系は使用されていない。
【００１０】
このため、従来は、比較対象となる標準物質（コントロール物質）をサンプルと同時に測定し、その標準物質とサンプルとの測定値の比を検出するという相対測定法が行われてきた。
【００１１】
しかし、この標準物質を用いる相対測定法には以下のような課題がある。
１ａ）標準物質の流通で測定標準化が制限される。
１ｂ）作業時間や作業コストのアップ、標準物質の不安定さによる測定品質の低下がある。
【００１２】
一方で、励起光など光量が一様な光は、フォトダイオード等で国家基準にトレーサブルに測定されるが、画像ではない０次元の点のデータしか得られない。
【００１３】
これに対して、特開２００４−１９１２３２号公報には、カメラの輝度値を国家基準の光パワー［Ｗ］に校正する方法が開示されている。これによって、撮影した画像の画素ごとに国家基準にトレーサブルな光パワーの光量値が得られる（以下、「画像パワーメータ」と呼ぶ）。つまり、試料の空間分布を測定することができる。
【００１４】
しかし、ここで開示されているのは、受光側の構成だけであり、励起光の具体的な校正方法については記載されていない。また、測定系に関わる計算式は開示されていない。
【００１５】
本発明の目的は、蛍光測定のために試料に照射する励起光を、「国家基準にトレーサブルでかつ指定された単位面積当たりの光量」の値に標準化することにより、試料から発生される蛍光量を、従来のような比（レシオ値）ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として定量的に測定することにある。
【００１６】
同様に、吸光測定において、試料への照射光を、「国家基準にトレーサブルでかつ指定された単位面積当たりの光量」の値に標準化することにより、試料で吸収される吸収光量を、従来のような比（レシオ値）ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として定量的に測定することにある。
【００１７】
これにより具体的には、以下の作用効果を達成することができる。
（１）これまで相対的にしか比較できなかった蛍光量や吸光量の評価を、国家基準にトレーサブルな光量の単位を持つ絶対値で行うことで、複数の測定や測定器の機体間の読取値の直接比較が可能となる。これによって、標準化が可能になる。
（２）装置として一度、サンプルの物質の量と、読取値との関係を決定できれば、「装置の補正のために測定ごとに行う標準物質による検量線作成」なしで、サンプルの測定が可能となる。
（３）受光素子としてカメラを使用することにより、０次元の点の情報だけではなく、２次元のカメラ画像そのものから、画素ごとの光量を得ることができ、同様に画像の画素ごとに国家基準にトレーサブルな光量の単位を持つ絶対値で表示することで、試料の空間分布を定量的に測定することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の蛍光量測定方法は、試料（蛍光分子）に励起光を照射し、この試料から発生される蛍光を受光光学系を経由して受光素子により測定する蛍光量測定方法において、
国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する励起光を前記試料に照射するステップと、
前記試料から発生された蛍光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、
前記指定された単位面積当たりの励起光量、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された蛍光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量値として算出するステップと、を備えることを特徴とする。
【００１９】
この蛍光量測定方法によれば、試料から発生される蛍光量を、従来のように励起光量と蛍光量との比であるレシオ値ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」たとえば、[W/ｍ2]なる単位系の出力値として、定量的に導き出すことができる。
【００２０】
また、本発明の吸光量測定方法は、試料（吸光分子）に照射光を照射し、この試料により吸収を受けた透過光を受光光学系を経由して受光素子により測定する吸収光量測定方法において、
国家基準にトレーサブルでかつ試料面上であらかじめ指定された単位面積当たりの光量値を有する照射光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、
前記照射光を前記試料に照射するステップと、
前記試料により吸収を受けた透過光を前記受光光学系を経由して前記受光素子により測定するステップと、
前記指定された単位面積当たりの照射光量（吸収前の光量値）、前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数に基づいて、前記受光素子により測定された透過光量を演算し、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの吸光量値として算出するステップと、を備えることを特徴とする。
【００２１】
この吸光量測定方法によれば、試料により吸収される光量を、従来のように照射光量と吸光量との比であるレシオ値ではなく、「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」たとえば、[W/ｍ2] なる単位系の出力値として、定量的に導き出すことができる。
【００２２】
このとき、励起光または照射光は、「あらかじめ指定された単位面積当たりの光量値」として事前に設定されている。たとえば、１[W/ｍ2]として設定しておく。また、受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数は装置固有の装置係数である。
【００２３】
一方、蛍光測定では、蛍光物質の量が励起光量と蛍光量との比、吸光測定では、吸光物質の量が照射光量と吸光量との比、で表される。
【００２４】
従って、蛍光測定では、励起光量を標準化することにより、蛍光量を測定するだけで、物質の量に対応した測定を行うことができる。
【００２５】
また、吸光測定では、透過光量を測定し、あらかじめ記憶されている吸収前の照射光量値からこの透過光量を減算すると、今回測定している分子の吸光量を算出することができる。
【００２６】
従って、吸光測定では、照射光量を標準化することにより、透過光量を測定し、あらかじめ記憶されている吸収前の照射光量値を用いて演算するだけで、物質の量に対応した測定を行うことができる。
【００２７】
従来の蛍光測定では、蛍光物質の量が励起光量と蛍光量との比、吸光測定では、吸光物質の量が照射光量と吸光量との比で、無次元数であるので、「国家基準にトレーサブル」な値付けは不可能であった。
【００２８】
しかし、これを励起系と受光系に２分割することで、それぞれ１[W/ｍ2]、X[W/ｍ2]などの「国家基準にトレーサブル」な校正が可能になる。
これが本発明のなかで、器差やメーカや越えた標準化を可能にできる第一のポイントである。
【００２９】
つまり励起光量  または照射光量は、後述するようにそれぞれ「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として光パワーメータ等で精度保証が可能である。
【００３０】
また、受光素子も同様に、光パワーメータ等で精度保証が可能である。
この場合、測定された励起光量が真に１[W/ｍ2]ではない場合でも、蛍光の退色や飽和の問題が起きない範囲であれば、受光された蛍光量の読取値を「標準励起光量」に換算して補正して出力してもよい。
【００３１】
たとえば、蛍光の励起光が５％強い場合、ゼロ点を正確に補正しながら読取値を５％小さくして出力を行う。この場合、励起／蛍光比の「レシオ」が保たれ、読取値は真の「標準励起光量」の場合の「物質の量」と同等の値となるため、読取値の「標準化」において精度内であれば問題は生じない。
【００３２】
このように「標準励起光量」または「標準照射光量」をあらかじめルールとして設定しておくことにより、受光光量に相当する読取値のみで、物質の量に対応した測定値として標準化して扱うことができる。ここが本発明の第２のポイントである。
【００３３】
なお、この場合、標準化した読取値を実際の物質の量である分子数やモル数と直接値付けするかどうか、つまり正確な物質の量の校正まで行うかどうかは、用途によって使い分ければよい。
【００３４】
マイクロアレイスキャナに限らず、一般に蛍光量や吸光量から物質の量（重量）を測定するには、事前に標準物質を用いて検量線を測定しておき、実際のサンプルから得られた光量をその検量線に当てはめることで物質の量の測定が行われている。
【００３５】
このとき、蛍光測定の場合は「励起光量と蛍光量の比」が「蛍光物質の量」に対応し、吸光測定の場合は「照射光量と吸光量との比」が「吸光物質の量」に対応する。
【００３６】
さらに、一般に理学機器では、測定ごとに標準物質で、装置やサンプルの処理などの状態を補正する場合が多い。
【００３７】
たとえば、血液サンプル内のＡ成分を測定する場合に、常に安定して測定できるＢ成分を利用して、その血液が貧血や薬剤で測定に適さないかどうかを判定する。このようにサンプルのばらつきを内部標準物質で補正する場合、標準物質を以降、内部コントロールと呼ぶ。
【００３８】
また、サンプルを増幅やフィルタリング処理する場合、増幅前にサンプルにＣ物質を混合させておき、処理後のＣ物質の量をサンプルと同時に測定することで、途中の処理が正確に行われたかどうかを確認できる。このようにサンプル処理のばらつきを外部標準物質で補正する場合、標準物質を以降、外部コントロールと呼ぶ。
【００３９】
さらに、測定装置に不安定さがある場合、蛍光量の基準物質を用意して、サンプルを測定する前、あるいは後でその蛍光量基準物質の光量を測定し、測定装置の光量を補正する。このように測定装置のばらつきを蛍光量基準物質で補正する場合、標準物質を以降、リファレンス物質と呼ぶ。
【００４０】
以上をまとめると、標準物質には大きく２つの役割があることがわかる。
１）蛍光測定の場合は「励起光量と蛍光量の比」と「蛍光物質の量」、吸光測定の場合は「照射光量と吸光量との比」と「吸光物質の量」、で表される「光量比（レシオ値）」と「物質の量」の対応係数を求めること。
２）サンプル、サンプル処理、または測定装置のばらつきを補正すること。
【００４１】
また、２）の項目はさらに３種類に分けられると考えられる。
２ａ）サンプルのばらつきを内部標準物質で補正する（内部コントロール物質）。
２ｂ）サンプル処理のばらつきを外部標準物質で補正する（外部コントロール物質）。
２ｃ）測定装置の不安定さをリファレンス物質で補正する。
【００４２】
この中で、２ｃ）で示す、「測定装置の不安定さをリファレンス物質で補正する」ということが本発明の課題の一つである。現在の、電気・機械系の計測器では測定ごとにリファレンス物質で補正することは行われていない。リファレンス物質を使うことは、作業時間や作業コストのアップ、リファレンス物質の不安定さによる品質低下、そして測定標準化を困難にする。このためリファレンス物質なしで正確に測定できることが望ましい。
【００４３】
また、たとえサンプルにばらつきがあったり、サンプル処理にばらつきがあるために、内部コントロールや外部コントロールを使用しなくてはならない場合でも、測定器自身が不安定では、そのサンプルのばらつきや、サンプル処理のばらつきを測定することができない。
【００４４】
その場合、前工程であるサンプルの品質管理や、サンプル処理の品質管理、あるいはサンプル処理の工程改善を行うためのデータを得ることができなくなってしまう。
【００４５】
つまり、測定装置を安定させ、リファレンス物質を不要にすることができれば、
３ａ）サンプルのばらつきを内部標準物質を用いて測定できる。これによって、次の段階ではこの測定データをサンプルの品質管理に用いることができるようになる。
３ｂ）サンプル処理のばらつきを外部標準物質を用いて測定できる。これによって、次の段階ではこの測定データをサンプル処理工程の品質管理・工程改善に用いることができるようになる。
３ｃ）サンプルを測定する前、あるいは後で行っていた蛍光量基準物質による測定装置の光量の補正作業が不要となる。
といった効果が期待できる。
【００４６】
本発明では、リファレンス物質を不要にする校正方法を考案することにより、測定装置が安定かどうかを確認可能となる。これによって安定した測定装置が開発可能となり、その安定した測定装置と校正方法により、上記３a〜３ｃの効果を期待できる。
【００４７】
これは、
・前記２ｃ）のリファレンス物質による補正の削減
・前記２ａ）のサンプルばらつき低減により内部標準物質による補正回数・補正量の低減
・前記２ｂ）のサンプル処理のばらつき低減による外部標準物質で補正回数・補正量の低減
を可能にすることを意味する。
【００４８】
また、１）の「光量比（レシオ値）」と「物質の量」の対応係数を求めること、については、後述するように、照射光と吸光量値等を国家基準にトレーサブルなＳＩ単位系の値にすることにより、「光量比（レシオ値）」と「物質の量」の対応係数を、吸光量と吸光係数および装置の各種定数等により理論的に算出することが可能となる。すなわち、各種条件下における物質の吸光係数や装置の各種定数等が測定前にわかれば、測定ごとに「光量比（レシオ値）」と「物質の量」の対応係数を求める必要はない。
【００４９】
一般に、物質の吸光係数は、温度やPHなどで変化しやすい。本来、その場合その新しい条件で一度測定しておけば、以降は再測定する必要はない。従来は、「装置の各種定数」が不安定で変化してしまうため、結局、測定ごとに標準物質による再校正が必要であった。しかし本発明による装置であれば、励起光と受光側はそれぞれ独立して国家基準にトレーサブルに安定して校正することができる。従って、装置の各種定数が安定しているので、新しい条件で一度測定しておけば、精度内である限り再測定する必要は生じない。
【００５０】
これは、
・前記１）の「光量比（レシオ値）」と「物質の量」の対応係数を求める測定の回数の低減
を可能にすることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の蛍光量測定方法を用いて蛍光光量による蛍光分子数分布の測定を行う試料測定装置の光学配置等の構成を示す図。
【図２】カメラの校正手順を示す図。
【図３】カメラで読取られる画像を例示する図。
【図４】励起光の測定についての概念を示す図。
【図５】Cy5-dUTPの実測分子数を示す図。
【図６】励起波長効率の説明図。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、図１〜図６を参照して、本発明による蛍光量の測定方法の実施形態について説明する。
【実施例１】
【００５３】
本実施例では、本発明の蛍光量の測定方法を「蛍光光量による蛍光分子数分布の測定」に適用した例について説明する。
【００５４】
図１は、蛍光測定を行うための試料測定装置の光学配置等の構成を示す図である。
【００５５】
図１に示すように、光源１からの励起光２は、ダイクロイックミラー３により折り返されて試料４の全域を照射する。試料４からの蛍光５はダイクロイックミラー３を透過して受光光学系６に入射し、カメラ７の撮像面に試料４の結像を形成する。また、カメラ７には、後述する一連の処理を実行する演算装置８が接続されている。演算装置８は、理論光量算出手段、光量計測手段、物質の量算出手段、および分子数算出手段として機能する。
【００５６】
本発明の蛍光量測定方法を蛍光による蛍光分子数分布の測定（蛍光測定）に適用する場合、例えば、次の４つのステップを順次実行することで、試料上の蛍光量と、蛍光分子数の空間分布を測定することができる。なお、以下の「測定面積」とは、後述するように、カメラの１画素や１μｍ2など、光軸と直角方向の空間測定の面積としての１単位を示す。
【００５７】
ａ）カメラ係数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]と、実際にサンプルに照射される励起光の単位面積当たりの励起光量[W/m2]を測定し、試料測定装置を準備する。
【００５８】
ｂ）単分子の理論蛍光量[W]の推定
測定対象の蛍光分子のモル吸光係数ε、量子効率、励起波長効率、および励起光量[W/m2]により、「単分子の理論蛍光量[W]」を推定（計算）する。
【００５９】
ｃ）試料の測定面積当たりの蛍光量[W]の測定
実際にサンプルを撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数 [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を測定する。この蛍光量は、国家基準にトレーサブルな値である。
【００６０】
ｄ）測定面積当たりの試料分子数の測定
上記のｃ）の手順により測定された「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を、ｂ）の手順で得られた「単分子の理論蛍光量[W]」で除算することで、「測定面積当たりの試料分子数」を測定（推定）することができる。
【００６１】
以下に蛍光測定の場合の具体的な演算内容を示す。
【００６２】
ａ）カメラ係数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]と、実際にサンプルに照射される励起光の単位面積当たりの励起光量[W/m2]を測定し、試料測定装置を準備する。
【００６３】
ａ１）カメラの校正によるカメラ係数Kcの決定
カメラ係数Kcは、特開２００４−１９１２３２号公報に示されるカメラ固有の校正値で、測定波長によって異なる値となるが、具体的な内容は特開２００４−１９１２３２号公報には開示されていない。カメラ係数Kcは、以下の方法により求められる。図２は、カメラの校正手順を示す図である。
【００６４】
ａ１．１）基準発光源の校正：
光量は、専用の光量測定装置（光パワーメータ）により測定する。
【００６５】
図２（ａ）に示すように、まず、LEDあるいは光パワーや波長が安定化されたレーザ光源等の基準発光源１１を用意し、受光光学系６を通して、国家基準トレーサブルな光パワーメータ１２に、基準発光源の全光量を入射させ、その全光量Is1[W=J/s]を測定する。
【００６６】
ａ１．２）カメラの校正：
次に光パワーメータ１２のみをカメラ７と交換し、同様に受光光学系６を介して基準発光源１１の全光量をカメラ７に入射させる。カメラ７の読取値（階調値）D[LSB]は、入射する光量[W=J/s]と積分時間t[s]に比例する。ここで、階調値Dは、LSB （Least Significant Bit；A/D変換時の最下位桁ビット）の整数倍で表され、ここでは階調値の単位として’LSB’を使用する。たとえば、16bitの全階調値は0〜65535 LSBで表される。なお、階調の単位としては’digit’が使用される場合もある。
【００６７】
上記のように、カメラ７の読取値（階調値）D[LSB]は、入射する光量[W=J/s]と積分時間t[s]に比例するため、階調に飽和がなければ、対応する受光画素全体の合計値D1[LSB]をカメラ７の積分時間t1[s]で除した値は、前記光量Is1[W]と比例することになる。この変換係数をK1とする。
【００６８】
カメラ７は画像取得を目的とするため、全画素は、ほぼ同一の入射光量から階調への変換係数を持つ。この変換係数K１はほぼそのならした平均値である。
【００６９】
したがって、カメラ７に基準発光源像の全光量を入射する場合、カメラ７の入射面全体に平均的に光が入射するように校正作業を行えば、光量のむらがあっても、階調の飽和がなければ、基準発光源からの全体の光量を得ることができる。
【００７０】
このとき、光の当たらない画素は、この校正方法自身が画像を使用していることを活用して、その画像から階調値がゼロの画素を除外することができる。たとえば図２（ｃ）のようにカメラ７のチップ面にビームＡが照射しているときに、Ｂの部分にビームが照射せず階調値がゼロの場合は、このＢの画素群を除外して校正を行う。
【００７１】
また、中央が強く周辺がゼロ階調に近い場合でも、飽和がなければリニアリティの中に入るため、係数はほとんど変わらない。
【００７２】
一般にカメラ７は８〜１６Bit相当の分解能で使用される性能を持っており、各画素の均一性は確保されている。このため最終的な測定精度にも依存するが、数十から数百万画素あるカメラの、たとえば半数以上の画素で上記K1を確認できれば、残りの画素も同一のカメラ係数を持つと考えられる。なお、この光の当たっている画素から、後述する「カメラ７に入射する基準発光源像の面積」S1[m2]を算出する。
【００７３】
また、図２（ｂ）および（ｃ）に示すように、カメラ７の画素７１（受光部ａ）の間に非受光部ｇがある場合でも、同様にカメラ７の入射面全体に平均的に光を入射させることで、非受光部ｇによるロスを変換係数K１の一部として校正することができる。
【００７４】
すなわち、カメラ７の受光面には、画素７１を分離するための非受光部（ギャップ）ｇが画素間に設けられている。校正用のビームはここにも照射される。たとえば図２（ｂ）で実質的に受光部の面積が９０％となってしまう場合、光のロスが生じて最初の光パワーメータによる値との校正に誤りが生じる懸念がある。
【００７５】
しかし、一般に画素の大きさは数μm〜数十μmであるのに対して、ビーム径はチップ面積全域に近い数ｍｍの大きさを持つ。すなわちこの校正方法の場合、校正時のビームは、画素の受光部も非受光部もほぼ均一に照射することになる。これは実際にカメラが被写体を測定する条件に近い。
【００７６】
すなわち、受光部ａと非受光部ｇで決まる受光効率が９０％であるなら、それは画素の持つ光電変換効率に乗じた効率の形で、前記校正時に同時に校正されることになる。すなわち、画素間のギャップ等による非受光部によって生じる光ロスは校正の誤差にならない。
【００７７】
Is1  =  K1×D1/t1    [W=J/s ]
【００７８】
また、基準発光源１１の大きさ（カメラ７に入射する基準発光源像の面積）をS1[m2]と定義すると、単位面積あたりの光量P1は下記により定義できる。
P1＝  Is1/S1  [W/m2]
＝ K1×D1/t1/S1  [LSB/s/m2]
ここでカメラ係数Kcを以下の式で定義する。
Kc= K1/S1  [W・s/m2/LSB]
【００７９】
従って、このKcを用いると、前述の式は
P1＝Kc×D1/t1  [W/m2]
【００８０】
一般化すると、
Px＝Kc×D/t  [W/m2]  ・・・・（１）
【００８１】
ここで、
Kc：カメラ係数  [W・s/m2/LSB]
t：測定時の積算時間  [s]
D：階調値    [LSB]
となる。
【００８２】
この（１）式を用いて、カメラ７の読み取り値から、国家基準にトレーサブルな光量値を得ることができる。このとき、通常の光パワーメータのような単純な[W]の値ではなく、[W/m2]として、値が得られることが重要である。
【００８３】
図３は、カメラで読取られる画像を例示している。図３のような画像が得られた場合、一つの画素に、単位時間あたり何個のフォトンが入って来たかで入射エネルギーである[W]が決まる。このとき、一つの画素の長さx[ｍ]も、光量値を決める大切な要素となっている。
【００８４】
つまり、カメラ係数Kcのうち、[1/m2]は、本測定が、カメラが持つ光量の測定機能だけではなく、画素による「長さ」の測定機能も活用していることを意味している。
【００８５】
なお、後述するように、「光量分布の測定」を行う場合は、必ず「測定面積（画素など）あたりの光量値[W]」という概念を導入する必要がある。その場合は、このカメラ係数Kcにより得られる、[W/m2]  という「照度」に対応する値に、「測定面積」（画素面積など）を掛けることで、実際に１画素に入射するエネルギー[W]を算出することができる。
【００８６】
ａ２）励起光の測定
励起光は、専用の光量測定装置（光パワーメータ）により測定する。
【００８７】
図４は、励起光の測定についての概念を示す図である。この光パワーメータの受光部は、国家基準にトレースされており、その入射部のアパーチャ内に入射した全光量を[W]の単位で測定する。従って、測定光量I0は以下で表される。
【００８８】
I0＝（S0 / Sa ）×Ia  [W]  ・・・・（２）
【００８９】
ここで、
Ia：アパーチャ入射光量 [W]
Sa：アパーチャ面積 [cm2]
である。正確な測定のためには、この励起光の測定領域は、極力測定する領域と一致させた方がよい。
【００９０】
ｂ）単分子の測定面積当たりの理論蛍光量[W]の推定
測定対象の蛍光分子のモル吸光係数ε、量子効率、励起波長効率、および励起光量[W/m2]により、「測定面積当たりの単分子の理論蛍光量[W]」を推定（計算）する。
【００９１】
通常の蛍光測定には十分希薄な溶液を用いるので、この場合の条件はεCL≪１である。
ここで、ε：モル吸光係数、C：基底状態にある蛍光分子のモル濃度、L:試料中の光路長である。
【００９２】
ｂ１）吸光量の推定
Lambert-Beerの法則により吸光量は以下で示される。
【００９３】
ΔＩ＝2.303×103×ε×（I0 / S0）×n0/NA    [W]  ・・・（３）
ここで、
【００９４】
ΔＩ：吸光量  [W]
ε：モル吸光係数[M-1cm-1 = L/mol/cm]  ・・・常用対数用の係数を使用する
I0：励起光量  [W]   @S0
S0：励起面積      [cm2]
ｎ0：励起面積内の蛍光分子数
NA：アボガドロ定数  6.0221415 × 1023
【００９５】
ここで「測定面積」を導入する。測定面積とは、カメラの画素面積や、１μm2単位面積など、分子数を評価したい領域の面積を示す。本測定では、単位として[m2]で表現するが、他の単位でも構わない。
【００９６】
Sm：測定面積  [m2]
本測定における「蛍光分子数nm」とは、この「測定面積Sm」あたりの分子数となる。
【００９７】
nm：測定面積内の蛍光分子数
【００９８】
一方で、単分子あたりの吸光係数ηa[cm2]は以下で表せる。
【００９９】
ηa =2.303×103×ε/ NA  [cm2]
これを(３)式に代入すると、以下となる。
【０１００】
ΔＩ＝ηa×（I0 / S0）×n0  [W]
【０１０１】
「nm個の蛍光分子の測定面積あたりの吸光量ΔＰa[W/m2]」  は、この(３)式のn0をnmで置き換え、測定面積Smで割ることで得られる。
【０１０２】
ΔＰa  =ηa×（I0 / S0）×（nm / Sm）  [W/ m2]
【０１０３】
これは、励起光の照度（I0/S0）[W/cm2]が同じでも、光軸と直角方向の蛍光分子の密度（nm/Sm）、すなわち１[μm2]に一個であるか、あるいは１[m2]に一個であるか、などによって、測定面積当たりの吸光量ΔＰa [W/m2]や蛍光量が変わることを表している。
【０１０４】
このSmがないと、nm=1の場合、励起光を照射している全領域のなかで１分子しか想定していないことになる。その場合、撮像しているカメラのどの画素にその１分子が撮像されるかは保証されない。このため、１画素に入る分子の数で理論的な分子数を定義する必要がある。（１）式で示したように、カメラ係数Kcを用いて算出される光量Pxを[W/m2]で表現したため、この吸光量ΔＰaも[W/m2]で表すことで、最後にnmの演算が容易になる。
【０１０５】
ｂ２）蛍光量の推定
上記の吸光量に、蛍光分子の量子効率等を加味することで、以下の式により理論蛍光量Pf[W/m2]を表すことができる。
Pf=ΔＰa×ηq×ηe×ηt  [W/m2]  
【０１０６】
ここで、
ηq：蛍光分子の量子効率
ηe：蛍光分子の励起波長における励起効率（励起波長効率）・・・図６参照
ηt：受光光学系の蛍光波長透過効率
【０１０７】
測定面積中における単分子の理論蛍光量ISは以下となる。
【０１０８】
IS=（ΔI／n0）×ηq×ηe×ηt  [W] 
=ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）  [W]   ・・・（４）
【０１０９】
ｃ）試料の測定面積当たりの蛍光量[W]の測定
実際にサンプルを撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数 [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を測定する。
【０１１０】
試料からの単位面積あたりの蛍光実測値Pm [W/m2]は、（４）式により、カメラ定数を活用して以下で表せる。
【０１１１】
Pm＝Kc×D/t  [W/m2]
【０１１２】
ここで、[1/m2]は、カメラの画素を用いた２次元空間での距離測定による「単位面積あたりの蛍光量」を表している。
【０１１３】
これを「測定面積あたりの蛍光実測値Im[W]」に換算するには、測定面積Smを乗ずればよい。
【０１１４】
Im＝Kc×D/t  ×Sm  [W]  ・・・（５）
【０１１５】
ここで、
Kc：カメラ係数  [W・s/m2/LSB]
t：測定時の積算時間  [s]
D：階調値  [LSB]
【０１１６】
ｄ）測定面積当たりの試料分子数の測定
上記のｃ）により測定された「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を、ｂ）による「単分子の理論蛍光量[W]」で除算することで、「測定面積当たりの試料分子数」を測定（推定）することができる。
【０１１７】
「測定面積当たりの単分子の理論蛍光量」は（４）式で示され、
Is=ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）  [W]
実測された蛍光量は、（５）式より、
Im＝Kc×D/t  ×Sm  [W]
【０１１８】
従って、推定される蛍光分子数nmは以下のように表せる。
【０１１９】
nm＝Im/ Is
＝（Kc×D/t）  /  （ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）/ Sm）
＝(Kc×D×S0×Sm）/（t×ηa×I0×ηq×ηe×ηt) 
【０１２０】
また、励起光I0[W]の測定値は（２）式
I0＝（S0 / Sa ）×Ia  [W]
を考慮すると、以下となる。
nm＝(Kc×D×Sa×Sm）/(t×ηa×Ia×ηq×ηe×ηt) ・・・（６） 
【０１２１】
なお、測定器のカメラ係数Kcと、透過効率ηtは装置固有のため装置定数 Kiとしてまとめることができる。
Ki＝Kc/ηt
【０１２２】
さらに対象となる蛍光試薬が決定されている場合の係数群と、励起光測定用のアパーチャ面積Saも含めて、蛍光受光係数Kaとしてまとめることができる。
Ka= (Ki×Sa)/( ηa×ηq×ηe)
【０１２３】
この場合、推定される蛍光分子数nmは以下のように簡便に表せる。
nm＝Ka×D×Sm /（Ia×t）
【０１２４】
図５は、蛍光試薬Cy5-dUTP（ＧＥヘルスケア社）の実測分子数を示す図である。ガラス基板上に種々の濃度のCy5付加UTPを円形にスポットし、上記の手順で蛍光測定を行った例を示している。
【０１２５】
本グラフは、CCDカメラでスポット部分の蛍光量を測定し、そこから前述の換算式により算出された分子数を実測分子数として縦軸に、また、横軸は、基板上のスポットの溶液濃度とスポット量、スポット径から算出した、スポットされた蛍光分子数である。このスポットされた蛍光分子数と、実測分子数が同値になる理論値は破線で示している。
【０１２６】
図５によれば、本発明の分子数測定方法を用いることで、理論値と実測値とがよく一致することが判る。
【０１２７】
これまで蛍光量等は、任意単位系による相対的な評価しかできなかったが、本発明によれば、これを以下の２つの試料測定装置固有の定数と、１つの励起（照射）光量測定装置係数にまとめることで、光量[W]の単位を持つ国家基準にトレーサブルな絶対値による光量測定を可能としている。これによって、同一装置の経時的な複数回測定や、異なる測定器の機体間の比較を可能にした。
【０１２８】
試料測定装置固有の２つの定数は、
Kc：カメラ係数、および  ηt：受光光学系の蛍光波長透過効率
であり、励起（照射）光量測定装置の１つの係数は、
Sa：アパーチャ面積（励起光量測定用）
である。
【０１２９】
また、試料からの光量（蛍光、発光、吸光）と励起光量、そして分子の定数により、試料中に存在する分子数を測定面積ごとに測定（推定）できる。
【０１３０】
すなわち、単分子当たりの理論蛍光量は、
IS=ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）  [W]  
として、
【０１３１】
実測された単位面積あたりの蛍光量Pmは、
Pm＝Kc×D/t  [W/m2]    
または、測定面積あたりの蛍光量Imは、
Im＝Kc×D/t  ×Sm   [W]
として、
測定面積（Sm）内の蛍光分子数nmは、
nm＝(Kc×D×Sa×Sm）/(t×ηa×Ia×ηq×ηe×ηt)  
として、それぞれ示される。
【０１３２】
ここで計算に必要な蛍光分子（蛍光試薬）に関する定数は以下の３つである。
ε：モル吸光係数、ηq：蛍光分子の量子効率、ηe：蛍光分子の励起波長における励起波長効率
【０１３３】
また、本発明を２次元画像に適用することにより、０次元の点の情報だけではなく、２次元のカメラ画像そのものから、各画素当たりの光量を得ることができるため、試料上の蛍光分子数の２次元の空間分布を測定することができる。例えば、特開２００４−１９１２３２号公報に開示されたよる方法に本発明を適用することにより、試料上の蛍光分子数の２次元の空間分布を測定できる。
【０１３４】
さらに、通常の顕微鏡やカメラの光学構成に代えて、本発明を共焦点光学系と組み合わせることで、２次元分布だけではなく、３次元の蛍光分子の空間分布を測定することもできる。
【０１３５】
また、蛍光に関する応用例として、以下のものを挙げることができる。
（１）基板上に核酸が固定化されたDNAマイクロアレイで、ハイブリダイゼーションした核酸の蛍光分子数の算出が可能となる。また、ハイブリされるターゲットの核酸分子１つにつき１個の蛍光分子が結合していれば、ハイブリしたターゲット核酸の分子数を知ることができる。
（２）DNAマイクロアレイのハイブリダイゼーション（以下ハイブリとする）後のシグナルを光量[W]に換算することで、異なるプラットフォーム間のハイブリ結果が比較可能となる。
（３）測定基板上にスポットされたプローブ核酸と同数の蛍光分子、または分子あたりの蛍光分子数があらかじめ分かっている核酸分子を基板上に別途固定しておくことで、リファレンスとしてハイブリ効率を知ることができる。これは、特に、蛍光の退色が問題になるときの補正として役に立つ。
（４）培養細胞の、受容体と、リガンドの結合や、細胞内のフィラメント上の蛋白移動、などの反応において、既知の蛍光分子を導入しておくことで、その分子数をカウントすることにより、定量的に細胞内の反応を測定できる。
【実施例２】
【０１３６】
実施例１では、蛍光を扱ったが、吸光量測定にも本発明を適用することができる。
【０１３７】
本発明の吸光量測定方法は、試料の吸光量を、吸光分子に照射光を照射し、前記吸光分子により吸収される光を受光光学系を経由して受光素子によって測定する吸光量測定方法において、
サンプルへ国家基準にトレーサブルでかつサンプル面上であらかじめ指定された特定の単位面積当たりの光量値の照射光を照射するステップと、
サンプルである吸光分子により照射光を吸収するステップと、
前記サンプルにより吸収を受けた透過光が前記受光光学系を経由して前記受光素子によって測定されるステップと、
前記指定された単位面積当たりの照射光量および前記受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数により、前記受光素子により測定された透過光量と、あらかじめ記憶されている吸収前の光量値から、国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの吸光量値として算出するステップと、を備えることを特徴とする。
【０１３８】
この吸光量測定方法によれば、試料により吸収される光量を、照射光量と吸光量との比であるレシオ値ではなく「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」たとえば[W/ｍ2]等として定量的に導き出すことができる。
【０１３９】
このとき、照射光は「あらかじめ指定された特定の単位面積当たりの光量値」として事前に設定してある。たとえば、「標準照射光量」として１[W/ｍ2]等として設定しておく。また、受光光学系の光学係数および前記受光素子の受光係数は装置固有の装置係数である。
【０１４０】
一方、吸光測定では吸光物質の量が照射光量と吸光量との比、で表される。
【０１４１】
従って、吸光測定では透過光量を測定し、あらかじめ記憶されている吸収前の光量値から、この透過光量を減算すると今回測定している分子の吸光量を算出できる。
【０１４２】
従って、吸光測定では照射光量を標準化することにより、透過光量を測定し、あらかじめ記憶されている吸収前の光量値を用いて算出するだけで、物質の量に対応した測定を行うことができる。
ここが本提案のポイントである。
【０１４３】
従来の吸光測定では吸光物質の量が照射光と透過光との比で無次元数であり、「国家基準にトレーサブル」な値付けは不可能であった。
【０１４４】
しかし、これを照射系と受光系に２分割することで、それぞれ１[W/ｍ2]、X[W/ｍ2]などの「国家基準にトレーサブル」な校正が可能になる。
これが本提案のなかで、器差やメーカや越えた標準化を可能にできるポイントである。
【０１４５】
つまり照射光量は、後述するようにそれぞれ「国家基準にトレーサブルな単位面積当たりの光量」として光パワーメータ等で精度保証が可能である。
また、受光素子も同様に、光パワーメータ等で精度保証が可能である。
【０１４６】
以上説明したように、本発明の蛍光量または吸光量測定方法によれば、計測された試料の光量と、算出された理論光量との比に基づいて試料の発光係数εや投入エネルギー効率ηeを、分子数を計測された試料の光量から直接、導き出すことができる。
【０１４７】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、試料の分子数を、分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定方法および分子数測定方法に対し、広く適用することができる。
【符号の説明】
【０１４８】
１      光源
２      励起光
３      ダイクロイックミラー
４      試料
５      蛍光
６      受光光学系
７      カメラ（撮像系）
８      演算装置（理論光量算出手段、光量計測手段、分子数算出手段）
１１    基準発光源
１２    光パワーメータ
【図１】
2011038772.tif 000003
【図２】
2011038772.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2011038772.tif 000007
【図６】
2011038772.tif 000008