(57)【要約】【課題】  本発明は、セリシン本来の機能性を高度に維持しつつ、疎水性が高められたセリシン、および、その製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  以下の性質を有する、疎水性が高められたセリシン：（１）アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を１５モル％以上含み、（２）重量平均分子量が１，０００〜７０，０００であり、かつ、（３）０．１重量％水溶液の表面張力が６０ｍＮ／ｍ以下である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質を有する、疎水性が高められたセリシン：
（１）アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を１５モル％以上含み、
（２）重量平均分子量が１，０００〜７０，０００であり、かつ、
（３）０．１重量％水溶液の表面張力が６０ｍＮ／ｍ以下である。
【請求項２】
７０重量％エタノールに対する溶解度が３ｇ／１００ｇ以上である、請求項１に記載の疎水性が高められたセリシン。
【請求項３】
８０重量％エタノールに対する溶解度が２ｇ／１００ｇ以上である、請求項１または２に記載の疎水性が高められたセリシン。
【請求項４】
有機溶剤系または油脂性の組成物に配合して用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の疎水性が高められたセリシン。
【請求項５】
請求項１に記載の疎水性が高められたセリシンの製造方法であって、
繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られたセリシンと、
有機溶剤と水との混合溶媒であって、有機溶剤の割合が７０重量％以上である混合溶媒とを混合し、
前記混合溶媒に可溶な画分のみを回収する
ことを含んでなる、製造方法。
【請求項６】
有機溶剤がエタノールである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
混合溶媒における有機溶剤の割合が８０〜９５重量％である、請求項５または６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性が高められたセリシンおよびその製造方法に関する。詳しくは、絹タンパク質セリシンから特定の条件下にて選択的に得られたセリシンであって、セリシン本来の機能性を損なうことなく疎水性を高めることにより、優れた皮膚浸透性を備えたセリシン、および、その製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリシンとは、繭糸に含まれる天然の絹タンパク質の１種である。セリシンはそのアミノ酸組成において、セリンを約３０モル％と高い割合で含むため、親水性が高く、水に溶け易い。
【０００３】
セリシンについては、これまでに、保湿作用、抗酸化作用、皮膚炎症防止作用、コラーゲン産生促進作用、細胞賦活作用、紫外線防御作用など、種々の作用効果を有することが報告され、その優れた機能性および生体適合性から、食品、化粧品、医薬品など、各種分野への応用が期待されている。
【０００４】
このようなセリシンの優れた機能性を、生体に対しより有効に作用させるには、例えば、化粧品などの皮膚外用剤に配合して用いる場合、セリシンが十分な皮膚浸透性を備えていることが重要である。セリシンなどの皮膚外用剤成分が皮膚に浸透するには、皮膚表面を覆う皮脂膜を透過して、角層（角質層）に浸透する必要がある。しかしながら、皮脂膜は、主としてトリグリセライド、ワックスエステル、スクワレンなどの疎水性成分から構成されるため、疎水性が高い。また、角質細胞の細胞間隙には、スフィンゴ脂質、コレステロールなどの疎水性成分が存在している。そのため、親水性が高く、疎水性が低いセリシンが皮膚に浸透するのは容易でない。したがって、セリシンの疎水性を高めて皮脂膜となじみやすくすることで、皮膚親和性を高め、もって、皮膚浸透性を高めることが求められている。
【０００５】
また、セリシンの疎水性が高まることにより、有機溶剤系や油脂性の組成物（例えば、クリーム、軟膏、除光液などの形態の皮膚外用剤）に対するセリシンの配合が容易になるという効果も期待できる。従来、セリシンは、その高い親水性から有機溶剤や油脂類にはほとんど溶けず、これらを基剤とする組成物に配合するには界面活性剤の使用が不可欠で、製剤化上の制約を受けてきた。これに対し、セリシンの疎水性が高まることにより、有機溶剤系や油脂性の組成物に対するセリシンの配合が容易になる結果、応用範囲が拡大されるというわけである。
【０００６】
タンパク質の疎水性を高める方法としては、アシル化やアルキル化などの化学修飾により、タンパク質のヒドロキシ基やアミノ基の一部を置き換える方法が一般的である。セリシンについても例外でなく、例えば、特許文献１には、セリシンを非水溶媒中でリパーゼを用いて有機酸と反応させることにより、アシル化セリシンを得る方法が記載されており、得られたアシル化セリシンは、乳化性、油滴界面への吸着性、保湿性に優れ、食品や化粧品用の乳化剤、界面活性剤、調湿剤として有用であることが記載されている。
【０００７】
また、特許文献２には、Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ反応に準拠した反応により、具体的には、セリシン溶液にアルカリ条件下で脂肪族カルボン酸エステルを滴下して反応させることにより、セリシンアシル化合物を得る方法が記載されており、得られたセリシンアシル化合物は、水に不溶である一方、種々の有機溶剤や液状油に可溶であり、化粧料への配合が容易で、セリシンアシル化合物を配合した化粧料は、湿潤・エモリエント効果の持続性に特に優れていることが記載されている。
【０００８】
しかしながら、これらの方法は、反応時間が長く、操作が複雑である上、収率も低い。また、セリシンの構造が変化してしまうため、セリシンが本来持ち合わせていた種々の機能性が損なわれたり、あるいは、失われたりする可能性がある。特に、特許文献２に記載のものは水に不溶であることから、セリシン本来の優れた性質である、水に対する高い親和性が失われている。その結果、ヒューメクタント（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、すなわち、親水性の保湿剤としての効果も失われると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−５２０６６号公報
【特許文献２】特開昭６１−１１８３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、セリシン本来の機能性を高度に維持しつつ、疎水性が高められたセリシン、および、その製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは今般、繭糸に含まれるセリシンを加水分解させて得た加水分解セリシン（以下、単に「セリシン」または「分画前のセリシン」という場合がある）から、高濃度の有機溶剤（有機溶剤と水との混合溶媒であって、有機溶剤の割合が７０重量％以上であるもの）に可溶な画分のみを選択的に回収して得た特定のセリシンが、アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を特定の高い割合で含み、疎水性が有意に高められていることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の性質を有する、疎水性が高められたセリシンである：
（１）アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を１５モル％以上含み、
（２）重量平均分子量が１，０００〜７０，０００であり、かつ、
（３）０．１重量％水溶液の表面張力が６０ｍＮ／ｍ以下である。
【００１３】
前記疎水性が高められたセリシンの、７０重量％エタノールに対する溶解度は３ｇ／１００ｇ以上であることが好ましい。
また、８０重量％エタノールに対する溶解度は２ｇ／１００ｇであることが好ましい。
前記疎水性が高められたセリシンは、有機溶剤系または油脂性の組成物に好ましく配合して用いられる。
【００１４】
また、本発明の別態様によれば、前記疎水性が高められたセリシンの製造方法であって、
繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、
得られたセリシンと、
有機溶剤と水との混合溶媒であって、有機溶剤の割合が７０重量％以上である混合溶媒とを混合し、
前記混合溶媒に可溶な画分のみを回収する
ことを含んでなる、製造方法が提供される。
【００１５】
前記製造方法において、有機溶剤は、エタノールであることが好ましい。
また、混合溶媒における有機溶剤の割合は、８０〜９５重量％であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によるセリシンは、セリシン本来の機能性を高度に維持しつつ、疎水性が有意に高められている。したがって、セリシンの応用範囲を、水系の組成物のみならず、有機溶剤系や油脂性の組成物にまで拡大することができる。また、優れた皮膚浸透性を備えるため、セリシンの優れた機能性を、皮膚に対しより有効に作用させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】セリシンを皮膚に塗布し、拭き取ってからの放置時間と、角層水分量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による疎水性が高められたセリシン（以下、「疎水化セリシン」という場合がある）は、前記したように、アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を１５モル％以上含み、重量平均分子量が１，０００〜７０，０００であり、かつ、その０．１重量％水溶液の表面張力が６０ｍＮ／ｍ以下であるという性質を有するものである。
【００１９】
本発明による疎水化セリシンは、繭糸から抽出したセリシン（後述するように多様なセリシン分子を含む）に分画処理を施すことにより、前記特定の疎水化セリシンを選択的に調製したものである。
【００２０】
本発明による疎水化セリシンは、アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を１５モル％以上、好ましくは１７モル％以上、より好ましくは２０モル％以上含んでなる。含有量が１５モル％未満であると、所望の疎水性を備えず、分画前のセリシンと比較して優位性が認められない虞がある。
【００２１】
ここで、疎水性アミノ酸とは、側鎖に非極性基を持つアミノ酸を言う。具体的には、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンを挙げることができる。なお、トリプトファンも疎水性アミノ酸に分類されるが、セリシンにはほとんど存在しないことから無視して差し支えない。
【００２２】
また、所望の疎水性とは、０．１重量％水溶液の表面張力が６０ｍＮ／ｍ以下となる程度の疎水性であり、さらには、高濃度の有機溶剤、例えば、７０重量％エタノールに可溶な程度の疎水性、そしてさらには、皮膚浸透性の向上が認められる程度の疎水性をいう。
【００２３】
アミノ酸組成は、例えば、高速液体クロマトグラフアミノ酸分析システムＬＣ１０Ａ（株式会社島津製作所製）を用い、ＯＰＡ法により分析することができる。
【００２４】
本発明による疎水化セリシンは、重量平均分子量が１，０００〜７０，０００であり、好ましくは１，０００〜５０，０００である。重量平均分子量が１，０００未満であると、セリシン本来の機能性が十分に発揮されない虞がある。重量平均分子量が７０，０００を超えると、水および高濃度の有機溶剤に対する溶解度が低下し、例えば、皮膚外用剤に配合した場合の製剤安定性が低下したり、皮膚浸透性が低下したりする虞がある。
【００２５】
重量平均分子量は、例えば、高速液体クロマトグラフＬＣ９Ａ（株式会社島津製作所製）を用い、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００２６】
本発明による疎水化セリシンは、分画前のセリシンと比較して遜色のない水溶性を示す程度の親水性を維持しつつ、疎水性が有意に高められている。疎水化の程度は、例えば、水溶液の表面張力を指標として表すことができる。本発明による疎水化セリシンは、その０．１重量％水溶液の表面張力が６０ｍＮ／ｍ以下であり、好ましくは５５ｍＮ／ｍ以下である。表面張力が６０ｍＮ／ｍを超えると、分画前のセリシンと比較して優位性が認められない虞がある。
【００２７】
なお、本明細書において表面張力は、液温が２０℃である場合の表面張力であるものとする。このとき、水の表面張力は７２ｍＮ／ｍである。すなわち、疎水化セリシンは、表面張力を低下させる作用を有する。
【００２８】
表面張力は、例えば、接触角・表面張力測定装置ＦＴＡ１０００（Ｆｉｒｓｔ  ｔｅｎ  ａｎｇｓｔｒｏｍｓ社製）を用い、ペンダントドロップ法により測定することができる。
【００２９】
本発明による疎水化セリシンは、分画前のセリシンと同様、水に易溶であり、水溶液として安定な性状を保つことができる。加えて、高濃度の有機溶剤、例えば、７０重量％エタノールにも可溶であり、混合溶液として安定な性状を保つことができる。したがって、有機溶剤系や油脂性の組成物に対するセリシンの配合が容易になり、セリシンの応用範囲を拡大することができる。このとき、界面活性剤の使用は必須でなく、また、乳化製剤の安定化を目的に界面活性剤を使用する場合にあっても、分画前のセリシンと比較して、界面活性剤の使用量を低減したり、界面活性能力がより低く、したがって、皮膚刺激性がより低い界面活性剤に置き換えたりすることができる。もちろん、水系の組成物に対しても、分画前のセリシンと同様、容易に配合することができる。
【００３０】
本発明による疎水化セリシンを、水との混合溶媒の形で可溶な有機溶剤は、特に限定されるものでなく、配合する組成物の用途や安全性、安定性を考慮し、適宜選択すればよい。例えば、化粧品などの皮膚外用剤に配合する場合に用いられる有機溶剤としては、エタノール、イソプロパノールなどが好ましい。
【００３１】
本明細書において、「高濃度の有機溶剤に可溶」とは、高濃度の有機溶剤に対する溶解度が、１ｇ／１００ｇ以上であることをいうものとする。本発明による疎水化セリシンの高濃度の有機溶剤に対する溶解度が１ｇ／１００ｇ以上であることにより、有機溶剤系や油脂性の組成物に対し、所望量のセリシンを配合することが容易になる。
【００３２】
本発明による疎水化セリシンの高濃度の有機溶剤に対する溶解度は、有機溶剤の種類や割合はもちろん、疎水化セリシンにおける疎水性アミノ酸の含有量、重量平均分子量などによって異なる。例えば、７０重量％エタノールに対する溶解度は、３ｇ／１００ｇ以上であることが好ましく、より好ましくは５ｇ／１００ｇ以上である。上限は特に限定されないが、セリシン本来の親水性を維持していることから、２０ｇ／１００ｇ程度である。また、８０重量％エタノールに対する溶解度は、２ｇ／１００ｇ以上であることが好ましく、より好ましくは３ｇ／１００ｇ以上であり、上限は２０ｇ／１００ｇ程度である。
【００３３】
本発明による疎水化セリシンは、分画前のセリシンと比較して、顕著に優れた皮膚浸透性を具備する。その理由は、前記したように、皮脂膜や角質層との親和性が増すためである。したがって、例えば、化粧品などの皮膚外用剤に配合して用いる場合、セリシンの優れた機能性を、皮膚に対しより有効に作用させることができる。
【００３４】
本発明による疎水化セリシンは、例えば、次のようにして調製することができる。
はじめに、繭糸からセリシンを抽出する。
セリシンは、水を用いて繭糸から抽出することができる。例えば、蚕繭や生糸など、繭糸を含んでなる原料を熱水に浸漬して処理することにより、原料中のセリシンを加水分解させて水中に溶出させることができる。このとき、必要に応じて、酸、アルカリまたは酵素を併用してもよい。
【００３５】
繭糸に含まれるセリシンには、分子量が異なるいくつかの分子種があることが知られている。例えば、特開２００２−１２８６９１号公報によれば、分子量が約４０万、約２５万、約２０万、約３万５千のセリシンが確認されている。また、セリシン分子が互いに水素結合し、見かけの分子量を増している場合もある。さらに、酸、アルカリまたは酵素を併用して繭糸に含まれるセリシンを加水分解させたものは、多様な分子種を含む混合物である。
【００３６】
抽出液に含まれるセリシンの分子量は特に限定されないが、この段階で、重量平均分子量がおおよそ１，０００〜７０，０００となるように調整しておくとよい。具体的には、抽出温度や時間、併用する剤の種類や濃度などの条件を制御することにより可能である。
【００３７】
抽出液に含まれるセリシンは、アミノ酸組成として疎水性アミノ酸を、通常、約８〜１４モル％含むものである。
【００３８】
次いで、公知の方法により、抽出液を分離精製し、セリシンを含む水溶液を得る。
さらに、必要に応じて、公知の方法により、水溶液を濃縮してもよいし、乾燥してセリシンを固体化してもよい。
【００３９】
次いで、得られたセリシンから、目的とする疎水化セリシンを分画する。分画は、セリシンと、高濃度の有機溶剤（有機溶剤と水との混合溶媒であって、有機溶剤の割合が最終的に７０重量％以上であるもの）とを混合し、高濃度の有機溶剤に可溶な画分のみを回収することにより行うことができる。このとき、固体化したセリシンを用いる場合には、セリシンと水とを混合し、水溶液とした後、有機溶剤と混合してもよいし、セリシンを固体のまま、高濃度の有機溶剤と混合してもよく、さらには、セリシンと有機溶剤とを混合した後、水と混合してもよい。すなわち、分画処理に供するセリシンは、固体であっても水溶液であってもよく、前記抽出液を分離精製して得られる水溶液や、その濃縮液を、乾燥することなく用いることもできる。ただし、収率の点からは、濃度管理の容易な固体セリシンを出発材料とすることが好ましい。
【００４０】
分画処理に用いられる有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリコール、メチルペンタンジオールなどのアルコール類や、アセトン、ジオキサンなどを挙げることができる。なかでも、使用性、安全性、コストの点から、エタノールを用いることが好ましい。
【００４１】
有機溶剤の最終割合は、有機溶剤と水との総量（すなわち、セリシンを除く）に対して、７０重量％以上であることが求められ、好ましくは８０重量％以上である。最終濃度が７０重量％未満であると、所望の疎水性を備えたセリシンを得ることができない虞がある。上限は特に限定されないが、収率の点からは、９５重量％以下であることが好ましい。
【００４２】
高濃度の有機溶剤と混合するセリシンの割合は特に限定されないが、より効率よく目的とする疎水化セリシンを得るためには、高濃度の有機溶剤に対する溶解量が飽和となるよう混合することが好ましく、沈殿が認められる量のセリシンを混合することが好ましい。ただし、沈殿は回収されることなく、通常、除去廃棄されるため、沈殿があまりにも多いようでは、収率が低下し、かえって効率的でない。
【００４３】
次いで、セリシンを混合した高濃度の有機溶剤（すなわち、セリシンと有機溶剤と水との混合液）を室温以下、好ましくは−８０〜−２０℃で、２時間以上静置する。この過程で、目的とする疎水化セリシンが高濃度の有機溶剤に完全に溶解し、目的外のセリシンは沈殿する。このとき、室温を超える温度条件で静置すると、溶解度が上昇し、目的外のセリシンも溶解するため、所望の疎水性を備えたセリシンを得ることができない虞がある。
【００４４】
次いで、セリシンと有機溶剤と水との混合液から、上清（目的とする疎水化セリシンが溶解している）を分離、回収する。分離方法は特に限定されるものでなく、公知の方法、例えば、遠心分離や濾過などを、１種単独で、または２種組み合わせて用いればよい。
【００４５】
次いで、公知の方法により、上清から有機溶剤を除去し、目的とする疎水化セリシンの水溶液を得る。
さらに、必要に応じて、公知の方法により、水溶液を濃縮してもよいし、乾燥して疎水化セリシンを固体化してもよい。
【００４６】
さらに、必要に応じて、疎水化セリシンの重量平均分子量が１，０００〜７０，０００となるように、分画処理を施すことができる。分画方法は特に限定されるものでなく、公知の方法、例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、透析、逆相クロマトグラフィー、逆浸透、限外濾過、超遠心分離などを、１種単独で、または２種以上組み合わせて用いればよい。なお、分子量の分画処理は、いずれの段階で行ってもよい。
【００４７】
かくして、本発明による疎水化セリシンを得ることができる。
【００４８】
よって、本発明の別態様によれば、本発明による疎水化セリシンの製造方法であって、繭糸から水を用いてセリシンを抽出し、得られたセリシンと、高濃度の有機溶剤（有機溶剤と水との混合溶媒であって、有機溶剤の割合が７０重量％以上であるもの）とを混合し、高濃度の有機溶剤に可溶な画分のみを回収することを含んでなる、製造方法が提供される。
【００４９】
本発明による製造方法は、アシル化やアルキル化などの化学修飾に依らないため、セリシン本来の機能性を損なうことなく、セリシンの疎水性を高めることができる。
【実施例】
【００５０】
本発明を以下の例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５１】
１．セリシンの製造
（１）セリシンＡ（分画前、比較例）
家蚕の切り繭２００ｇを水洗した後、蒸留水１ｋｇに浸漬し、炭酸ナトリウム８ｇを添加した。この条件で繭を１時間煮沸し、セリシンの抽出と加水分解を行った。
次いで、得られた抽出液にクエン酸を添加して中和した。次いで、抽出液を１０℃の低温室に１５時間静置し、不溶物を沈殿させた。次いで、遠心機Ｈ−５０１ＦＲ（株式会社コクサン製）を用いて２０℃、６，０００ｒｐｍの条件にて１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。次いで、回収した上清を平均孔径０．２μｍのセルロース膜を用いて濾過し、膜透過画分約２００ｇを回収した。
回収した膜透過画分を凍結乾燥して、セリシン（セリシンＡとする）の粉末５２．３４ｇを得た。
【００５２】
（２）セリシンＢ（８０重量％エタノールに可溶なセリシン、本発明）
前記セリシンＡの粉末１０ｇを蒸留水４０ｇに溶解させて、セリシンＡの水溶液を調製した。このセリシンＡの水溶液にエタノール１６０ｇを添加し（エタノールと水との総量に対するエタノールの割合：８０重量％、エタノールと水との総量に対するセリシンＡの割合：５重量％）、室温で約１０分間撹拌した後、−３０℃で２時間静置した。
次いで、遠心機Ｈ−５０１ＦＲ（株式会社コクサン製）を用いて２０℃、６，０００ｒｐｍの条件にて２０分間遠心分離を行い、上清を回収した。次いで、回収した上清を平均孔径０．２μｍのセルロース膜を用いて濾過し、膜透過画分約２００ｇを回収した。
次いで、膜透過画分に含まれているエタノールを減圧エバポレーターにより除去し、得られた溶液を凍結乾燥して、８０重量％エタノールに可溶なセリシン（セリシンＢとする）の粉末１．４３ｇを得た。
【００５３】
（３）セリシンＣ（８０重量％エタノールに不溶なセリシン、比較例）
前記（２）において、上清を回収して残る沈殿約８．５ｇを回収した。次いで、回収した沈殿を水１００ｇに溶解させた後、僅かに含まれているエタノールを減圧エバポレーターにより除去し、得られた溶液を凍結乾燥して、８０重量％エタノールに不溶なセリシン（セリシンＣとする）の粉末６．７１ｇを得た。
【００５４】
２．セリシンの物性評価
セリシンＡ〜Ｃについて以下の物性を評価した。
【００５５】
（１）重量平均分子量
ゲル濾過クロマトグラフィーにより、重量平均分子量を測定した。測定機器としてＬＣ９Ａ（株式会社島津製作所製）を用い、カラムとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  １０／３０（ファルマシア社製）を用いた。溶離液には０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、流速０．７ｍＬ／分、カラム温度２５℃、ペプチド検出波長２７５ｎｍの条件で測定した。分子量マーカーには、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＭＷ（ＧＥヘルスケア社製）とＡｐｒｏｔｉｎｉｎ（シグマアルドリッチ社製）を併せて使用した。
結果は、表１に示される通りであった。
【００５６】
（２）アミノ酸組成
セリシンを塩酸で加水分解処理した後、高速液体クロマトグラフィーにより、アミノ酸組成を測定した。測定機器としてＬＣ１０Ａ（株式会社島津製作所製）を用い、カラムとしてｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ａｍｉｎｏ−Ｎａ（株式会社島津製作所製）を用い、ＯＰＡ法により検出した。
結果は、表１に示される通りであった。
表中、酸性アミノ酸とはアスパラギン酸、グルタミン酸をさし、塩基性アミノ酸とはヒスチジン、アルギニン、リジンをさし、極性アミノ酸とはセリン、スレオニン、グリシン、チロシン、システインをさし、疎水性アミノ酸とは、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンをさす。
セリシンＢは、セリシンＡやセリシンＣと比較して、疎水性アミノ酸の割合が高いことが確認された。
【００５７】
（３）逆相クロマトグラフィーによる溶出挙動
逆相クロマトグラフィーによる溶出挙動を解析することにより、疎水性を評価した。逆相クロマトグラフィーによる分離では、疎水性が高い物質ほどカラムに対する親和性が強く、溶出時間が長くなる。
測定機器としてＬＣ１０Ａ（株式会社島津製作所製）を用い、カラムとして、ＭＥＲＣＫ  Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＨＰＬＣ−Ｓａｕｌｅ  ＲＰ−１８ｅ  １００−４．６（メルク社製）を用いた。溶離液には２０容量％アセトニトリルを用い、流速１ｍＬ／分、検出波長２７５ｎｍの条件で測定した。試験溶液には、溶離液に対し、セリシンを０．１重量％となるように溶解させたものを用いた。
結果は、表１に示される通りであった。
セリシンＢは、セリシンＡやセリシンＣと比較して、疎水性が高いことが確認された。
【００５８】
（４）各種溶媒に対する溶解性
蒸留水、７０重量％エタノール、８０重量％エタノール、エタノール、５０重量％アセトン、７０重量％アセトン、ジメチルスルホキシド、グリセリン、ブチレングリコールに対する溶解性を評価した。
それぞれの溶媒１ｇに対し、セリシンを１０ｍｇ添加し、撹拌後、６０℃で１時間加温した。次いで、遠心機Ｍ１５０−ＩＶ（株式会社佐久間製作所製）を用いて室温、１６，０００ｒｐｍの条件にて５分間遠心分離を行い、不溶物を沈殿させた。沈殿の有無および量を目視にて確認し、下記の基準に従って判定した。
○：沈殿なし
×：少量の沈殿あり
××：多量の沈殿あり
結果は、表１に示される通りであった。
セリシンＢは、セリシンＡやセリシンＣと比較して、高濃度の有機溶剤に対する溶解性が高いことが確認された。
また、セリシンＢの７０重量％エタノールおよび８０重量％エタノールに対する溶解度を同様の方法で求めたところ、７０重量％エタノールに対する溶解度は７．５ｇ／１００ｇであり、８０重量％エタノールに対する溶解度は４．５ｇ／１００ｇであった。
【００５９】
（５）表面張力および接触角の低下作用
接触角・表面張力測定装置ＦＴＡ１０００（Ｆｉｒｓｔ  ｔｅｎ  ａｎｇｓｔｒｏｍｓ社製）を用い、ペンダントドロップ法により、セリシン水溶液の表面張力および接触角を測定した。
表面張力は、２０ゲージの針を用いて５μＬの液滴を作成し、１０秒間静置後画像を撮影し、画像処理にてその表面張力を算出した。接触角は、同様に液滴を作成後、ポリエステルフィルム  ルミラーＴタイプ（株式会社東レ製）に液滴を接触させて半円の液滴を作成し、１０秒間静置後画像を撮影し、画像処理にてその接触角を測定した。試験溶液には、超純水に対し、セリシンを０．１重量％となるよう溶解させたものを用いた。なお、超純水の表面張力は液温２０℃にて７２．７５ｍＮ／ｍであり、接触角は７７．７°であった。
結果は、表１に示される通りであった。
セリシンＢは、セリシンＡやセリシンＣと比較して、両親媒性の性質が上昇したことから、表面張力を低下させる作用が高くなり、接触角が小さくなることが確認された。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
３．セリシンの皮膚浸透性および水分保持力
健常なパネラーに対し以下の試験を行い、皮膚浸透性を評価した。試験溶液には、蒸留水に対し、セリシンＡおよびＢをそれぞれ０．５重量％となるように溶解させたものを用いた。
前腕内側を石鹸で洗浄した後、室温２５℃、湿度４０％の環境下で１５分間以上馴化させた。次いで、試験溶液１０μＬを前腕内側に塗布した。１分後にコットンで拭き取り、その直後から、１５、３０、４５、６０秒後の角層水分量を、ＳＫＩＣＯＮ−２００（ＩＢＳ社製）を用いて測定した。
結果は、図１に示される通りであった。
セリシンＢは、セリシンＡと比較して拭き取り直後の角層水分量が高く、皮膚浸透性に優れることが確認された。また、拭き取り６０秒後の角層水分量がセリシンＡと比較して同等、またはそれ以上であることが確認された。つまり、セリシンＢは、セリシンが本来持ち合わせている水に対する親和性を失っていないものと考えられる。また、セリシンＢがセリシンＡと比較して、角層への即時給水力に優れているのは、疎水性が高められた結果、皮膚親和性および皮膚浸透性が高められたことによるものと考えられる。
【００６２】
以上の結果から明らかなように、本発明による疎水化セリシン（すなわち、セリシンＢ）は、分画前のセリシン（すなわち、セリシンＡ）と比較し、疎水性が有意に高く、異なる物性を有するものであった。また、セリシン本来の親水性を高度に維持しつつ、優れた皮膚浸透性を備えたものであった。
【図１】
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