(57)【要約】【課題】マイクロプレートのウェル内に注入する試料溶液の量が僅かなものであっても、吸光度の感度を高めて正確な測定値を得ることの出来るマイクロプレート用アダプターを提供する。【解決手段】複数のウェルが配列されたマイクロプレートに用いるマイクロプレート用アダプターにおいて、前記ウェルに挿入するための内部に貫通孔を持つ挿入部と、前記貫通孔の一方の側に前記貫通孔を覆うように配置した光学的に透明な天板と、前記天板と挿入部との間に設けられた前記貫通孔と連通する排出口と、前記排出口に接続するオーバーフローチャンバとから成るウェルモジュールを持ち、前記挿入部を前記ウェルに対応するように前記ウェルモジュールを列状に連結したマイクロプレート用アダプター。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルが配列されたマイクロプレートに用いるマイクロプレート用アダプターにおいて、
前記ウェルに挿入するための内部に貫通孔を持つ挿入部と、
前記貫通孔の一方の側に前記貫通孔を覆うように配置した光学的に透明な天板と、
前記天板と挿入部との間に設けられた前記貫通孔と連通する排出口と、
前記排出口に接続するオーバーフローチャンバとから成るウェルモジュールを持ち、
前記挿入部を前記ウェルに対応するように前記ウェルモジュールを列状に連結したマイクロプレート用アダプター。
【請求項２】
前記ウェルモジュールの挿入部の先端には、前記マイクロプレート用アダプターと前記マイクロプレートとを接続するときの位置決めをおこなう位置決め面とを備える請求項１に記載のマイクロプレート用アダプター。
【請求項３】
前記貫通孔と前記排出口との接続部が、Ｒ面で滑らかに形成されている請求項１に記載のマイクロプレート用アダプター。
【請求項４】
前記挿入部の外径が、前記ウェルの内径よりも小さい請求項１に記載のマイクロプレート用アダプター。
【請求項５】
前記挿入部の前記ウェルに挿入する挿入長さが、前記ウェルの深さより大きい請求項１に記載のマイクロプレート用アダプター。
【請求項６】
前記貫通孔の内壁は、光を反射しない色である請求項１に記載のマイクロプレート用アダプター。
【請求項７】
前記天板が光の透過率が９０％以上である材料で構成される請求項３に記載のマイクロプレート用アダプター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロプレート内に充填された溶液の吸光度を測定する際に用いるマイクロプレート用アダプターに関するものであり、特に試料の濃度を特定するＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を用いた発色測定に好適に利用できるものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫分析の代表的なものとしてＥＬＩＳＡ法がある。一般的なＥＬＩＳＡ法では抗体−抗原反応を用いたサンドイッチ法が実施される。サンドイッチ法は試料となる特定の抗原（蛋白質、ペプチド）と、抗原を特異的に結合するように作製された抗体と、測定のための標識剤を標識した抗体が用いられる。標識剤は測定原理の種類によって異なる。発色法であれば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスフォターゼなどが、発光法であればルシフェラーゼが、電気化学発光法であればルテニウム錯体、アクリジニウム誘導体などが標識剤として用いられる。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法の一般的な手順としては、まず抗体を物理化学的な吸着反応により、測定容器に固定化し、その後固定化していない抗体を洗浄液にて洗浄する。次にノイズとなる不必要な物理化学吸着による標識抗体などの物理化学的な非特異吸着を抑えるため、ブロッキングと呼ばれる操作を行う。実際には、スキムミルク、牛血清アルブミンやゼラチンといった蛋白質の中から、用いた抗原、抗体の反応に影響を及ぼさない蛋白質溶液で抗体が結合している部分以外を覆うように吸着させる。このように準備された測定容器に対して抗原を含む溶液（一般的にはこれが試料と呼ばれる）を加え抗原抗体反応を起こさせる。次に標識剤を標識した抗体溶液を分注し測定容器−抗体−抗原−標識抗体の複合体を形成し、種々の測定法を用いて測定することで試料である抗原の量を測定する。
【０００４】
発色法の標識剤として用いられる西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰ）は、３、３’、５、５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｉｄｅｎｅ（以下、ＴＭＢ）などの発色液と反応することで、ＨＲＰ濃度に比例したに発色反応を起こす。一定時間の後、塩酸や硫酸などの停止液を加えることで発色反応が停止する。上述したＥＬＩＳＡ法後に発色させた溶液は、試料濃度に依存した発色量を有する。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ法を用いた発色法では、発色後の試料溶液の吸光法を利用して吸光度をシグナルとして得ることができる。吸光度とは、試料溶液に光を透過させ、その入射光強度と透過光強度の比を常用対数で表した数値である。入射光をＴ０、透過光をＴ１、吸光係数をα、試料溶液の距離Ｌとしたとき、ランバート・ベールの法則として表されるｌｏｇ（Ｔ１／Ｔ０）＝−αＬの式より、溶液の濃度と溶液の厚さに比例する。
【０００６】
濃度未知の試料の濃度を定量するためには、さらに、未知の試料と同様のウェルおよび測定プロトコルで、複数の濃度の異なる濃度既知の試料の吸光度を得る。その結果より吸光度と濃度の相関を表す検量線を作成し、その検量線上に濃度未知の試料の吸光度を照らし合わせることにより、試料の濃度を定量する手段がとられている。
【０００７】
ＥＬＩＳＡ法で用いられる測定容器としては、マイクロプレート、チューブ、磁気ビーズなどの種類がある。特に、マイクロプレートは一度に多くの試料を分析できるように多くのウェルを持つので、広く使用されている。このようなマイクロプレートには、９６個のウェルを有する９６ウェルマイクロプレートや、３８４個のウェルを有する３８４ウェルマイクロプレートがある。また、マイクロプレートの外形やウェル間ピッチなどの寸法は、事実上標準化されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０００−５１３８１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記従来の構成では、正確な吸光度を得るためには、ウェルの容積一杯に満たす量の試料溶液が必要であり、僅かな試料溶液では吸光度の感度が低く正確な測定値が得られないという課題を有していた。
【００１０】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、マイクロプレートのウェル内に注入する試料溶液の量が僅かなものであっても、吸光度の感度を高めて正確な測定値を得ることの出来るマイクロプレート用アダプターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記従来の課題を解決するために、本発明のマイクロプレート用アダプターは、複数のウェルが配列されたマイクロプレートに用いるマイクロプレート用アダプターにおいて、前記ウェルに挿入するための内部に貫通孔を持つ挿入部と、前記貫通孔の一方の側に前記貫通孔を覆うように配置した光学的に透明な天板と、前記天板と挿入部との間に設けられた前記貫通孔と連通する排出口と、前記排出口に接続するオーバーフローチャンバとから成るウェルモジュールを持ち、前記挿入部を前記ウェルに対応するように前記ウェルモジュールを列状に連結したことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のマイクロプレート用アダプターによれば、既存のマイクロプレートに装着するだけで、少ない量の試料溶液の吸光度を増加できるので、試料濃度の検出感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のマイクロプレートおよびマイクロプレート用アダプターの全体図
【図２】（ａ）本発明のマイクロプレート用アダプターの斜視図（ｂ）本発明のマイクロプレートモジュールの断面図（ｃ）本発明のウェルモジュール２０１のＡ−Ａ’方向の断面図
【図３】マイクロプレートを使った吸光度測定の条件を示す図
【図４】本発明のマイクロプレート用アダプターの効果を示す図
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明のマイクロプレート用アダプターの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
（実施の形態１）
図１を用いて、本発明の実施の形態１でのマイクロプレート用アダプターを説明する。図１（ａ）に、マイクロプレート１０１の斜視図を示す。このマイクロプレート１０１は、８連ストリップ１０２とプレート１０３との二つの部材から出来ており、８連ストリップ１０２は、図のように８個のウェル１０４が一列に連結されており、その両端にフレーム面１０５とを持っている。フレーム面１０５は、８連ストリップ１０２とプレート１０３との位置決めに用いる。ウェル１０４は、その内部に試料溶液を収納するための凹部であり、上部が開放された円筒形状である。本実施例では、ウェル１０４の最上部の内径を７ｍｍ、底部１０６の内径を６．５ｍｍ、その肉厚を約１ｍｍとした。また、その材質は透明のＰＰ（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、あるいはＰＥ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）などが良い。また、測定光がウェル１０４の内部を透過できれば良いので、底板１０６が透明であればウェルの外周面１０７の色は黒など透明でなくても良い。
【００１５】
プレート１０３は、嵌め込み部１０８と、プレート１０３から構成される。嵌め込み部１０８は、８連ストリップ１０２を嵌め込むためのもので、プレート１０３上に１２個設けられている。本実施例では、フレーム１０９の外形を１２７ｍｍ×８５ｍｍ、高さを１５ｍｍとした。このプレート１０３には、ウェル１０４内に試料溶液が充填された８連ストリップ１０２を設置して、吸光度を測定する為の汎用吸光度計などに使用することができる。図１（ｂ）に、本発明のマイクロプレート用アダプター１０９を示す。これを、後述するように８連ストリップ１０２の上方から挿入して使用する。
【００１６】
図２（ａ）は、本発明の実施例１におけるマイクロプレート用アダプターを上方から見た斜視図である。図に示すように、マイクロプレート用アダプター１０９は、８連ストリップ１０２のウェル１０４に対応するように、ウェルモジュール２０１が配置されている。ウェルモジュール２０１は、本体２０２で連結され、その上部に貫通孔２０５を塞ぐように天板２０３が配置されている。この部位には、図２（ｃ）で述べるように、貫通孔２０５との間に僅かな隙間を設け貫通孔２０５内部の余分な試料溶液を排出するための排出口が設けられている。本体２０２の材質は、黒色のＰＯＭ（Ｐｏｌｙａｃｅｔａｌ）であるが、他のプラスチック、および金属、ガラス等であっても良いが、天板２０３は入射光の強度を損なわないガラスやＰＭＭＡなどの透過率の高い材料でないといけない。
【００１７】
図２（ｂ）は、本発明のマイクロプレート用アダプターを底面側から見た斜視図である。挿入部２０４は８連ストリップ１０２のウェル１０４に挿入するための挿入部であり、挿入部の先端には位置決め面２０８と導入口２０６とが設けられている。導入口２０６には、貫通孔２０５が設けられている。導入口２０６の周縁部は、試料溶液を貫通孔２０５に導入する時に気泡が混入しないように１ｍｍのアール形状をしている。また、導入口２０６の先端はテーパ形状をしており、本実施例では、先端のテーパを１°とし、導入口２０６の外径をφ６．５ｍｍとした。位置決め面２０８は、導入口２０６の底部であり、ウェルモジュール２０１を８連ストリップ１０２のウェル１０４に挿入した際に位置決め面２０８とウェル１０４が接触することで、ウェルモジュール２０１とウェル１０４との位置関係を拘束する。また、ウェルモジュール２０１の高さを１１ｍｍとし、貫通孔２０５は、内径φ２．８ｍｍ、天板２０３までの距離１３．３ｍｍの貫通穴とした。これは、マイクロプレート用アダプターを挿入する８連ストリップ１０２の寸法に合わせて適宜、設計すればよい。
【００１８】
図２（ｃ）に、一つのウェルモジュール２０１のＡ−Ａ’方向の断面図を示す。本体２０２の内部には、導入口２０６から天板２０３に向かう貫通孔２０５があり、天板２０３と本体２０２には僅かの隙間を設けた排出口２０７によりオーバーフローチャンバ２０９と連通している。排出口２０７と貫通孔２０５との接続部には、試料溶液を貫通孔２０５に排出する時の気泡の混入を防ぐため、１ｍｍのアール形状が付けられている。また、貫通孔２０５の内面は光の散乱を避ける為、平滑で、かつ黒色であることが望ましい。オーバーフローチャンバ２０９は、排出口２０７から排出された試料溶液を貯留するためのチャンバであり、本実施例では、容量を５０ｕｌとした。天板２０３は、耐薬品性の高い紫外線硬化樹脂などの接着剤を用いて、貫通孔２０５の最上部に接着されている。導入口２０６からである。
【００１９】
本発明の第１の形態における有効性を確認する為に、上述したマイクロプレートおよびマイクロプレート用アダプターを使用して、以下のような実験を行った。図３にマイクロプレートを使った吸光度測定の条件を示す。
【００２０】
図３（ａ）は、マイクロプレート用アダプターを使用しない、すなわち、従来の技術を使用した測定条件を示す。図３（ａ）において、８連ストリップ１０２のウェル１０４内に充填された試料溶液が２００ｕｌのとき、試料溶液の高さ（装着前）３０１は、５．６ｍｍであった。この状態で、汎用の吸光度計にセットし、ウェル１０４の上下に発光面３０２、受光面３０３を配置する。こうして測定された受光面３０３による吸光度の測定結果を従来例とした。
【００２１】
図３（ｂ）は、マイクロプレートに本願発明のマイクロプレート用アダプターを装着した図である。マイクロプレート用アダプター１０９の挿入部２０４を、マイクロプレート用アダプター１０９を位置決め面２０８がマイクロプレートのウェル１０４の底部１０６に接触するまで挿入する。すると、ウェル１０４内の試料溶液は、マイクロプレート用アダプター１０９の導入口２０６を介して貫通孔２０５に充填される。もし、ウェル１０４内に充填された試料溶液が貫通孔２０５の体積よりも多ければ、余分な試料溶液は排出口２０７を通してオーバーフローチャンバ２０９に貯留される。このように、マイクロプレートにマイクロプレート用アダプター１０９を装着した状態で、測定された受光面３０３による吸光度の測定結果を実施例とした。
【００２２】
吸光度測定に用いる試料には、ＥＰＳＯＮ製インクジェットプリンター用インク（型番：ＩＣＹ５０）を用い、これを蒸留水で希釈したものを試料溶液とした。マイクロプレートには、Ｎｕｎｃ製９６穴マイクロプレート（型番：４６９９５７）を用い、このウェルに、試料溶液を各２００μlずつ注入した。その後、ウェル内の試料溶液の吸光度を、バイオテック社製全自動比色計（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｉｎｉ  ＮＪ−２３００）により測定した。測定波長６２０ｎｍと測定波長４２０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定し、両者の差分を本実施例での吸光度とした。この測定を、従来例と実施例とで、合計１６０ウェル分（８ウェル×４列×５回）行った。
【００２３】
以上の様にして測定した従来例と実施例における１６０ウェル分の吸光度の平均とＣＶとを表１に示す。また、平均値を図４にグラフ化した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１及び図４に示した実験結果より、同濃度の試料溶液において、従来例のシグナル（吸光度）０．６３と比較して、実施例のシグナルは１．５５と、約２．５倍高い値を示している。これは本発明による実施例が、試料溶液の高さを増加させることで、従来例に比べて高いシグナルが得られたことを示している。
【００２６】
また、従来例の４．７％に対して実施例である本発明のＣＶは、２．２％と２．５％良化していた。これは本発明のマイクロプレート用アダプターを使用すると、マイクロプレートのウェル内部の試料溶液の高さを揃えることが出来るので、従来例に比べて測定の精度が向上したことを示している。
【００２７】
以上のように、本発明のマイクロプレート用アダプターを使用すると、ウェル１０４にウェル１０４の内径よりも細い貫通孔２０５を有するマイクロプレート用アダプター１０９を装着することにより、少ない試料溶液でも、得られる吸光度を約２．５倍上昇させることができる。  
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明にかかるマイクロプレート用アダプターは、マイクロプレートのウェル内に充填された試料溶液の容量を増加させることなく溶液の厚みを増加させ、得られる吸光度を上昇させることにより、試料濃度の検出感度を向上させることができる機能を有し、マイクロプレート内に充填された溶液の吸光度を測定する際に有用である。
【００２９】
本発明にかかるマイクロプレート用アダプターは、マイクロプレートのウェル内に充填された試料溶液の容量を増加させることなく溶液の厚みを増加させ、得られる吸光度を上昇させることにより、試料濃度の検出感度を向上が必要な試料の濃度を特定するＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を用いた発色測定等の用途にも適用できる。
【符号の説明】
【００３０】
１０１  マイクロプレート
１０２  ８連ストリップ
１０３  プレート
１０４  ウェル
１０５  フレーム面
１０６  底板
１０７  外周面
１０８  嵌め込み部
１０９  マイクロプレート用アダプター
２０１  ウェルモジュール
２０２  本体
２０３  天板
２０４  挿入部
２０５  貫通孔
２０６  導入口
２０７  排出口
２０８  位置決め面
２０９  オーバーフローチャンバ
３０１  試料溶液の高さ（装着前）
３０２  発光面
３０３  受光面
３０４  試料溶液の高さ（装着後）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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