(57)【要約】【課題】（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの工業的な製造方法を提供する。【解決手段】１，１，１−トリフルオロアセトンにHansenula polymorpha、Pichia anomala、Candida parapsilosis、Candida mycoderma、Pichia naganishii、Candida saitoana、Cryptococcus curvatus、Saturnospora dispora、Saccharomyces bayanus、及びPichia membranaefaciensからなる群より選ばれる少なくとも１種の微生物を作用させることにより、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを高い光学純度で収率良く製造することができる。本発明の製造方法は、自然界から見出された微生物を天然の状態で作用させるため、形質転換体等を用いる時の問題点が回避でき、工業的な実施が容易である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［１］で表される１，１，１−トリフルオロアセトン
【化１】
2011182787.tif 000008
に自然界から見出された微生物を天然の状態で作用させることにより、式［２］で表される（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール
【化２】
2011182787.tif 000009
を得る製造方法であって、係る微生物としてハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・マイコデルマ（Candida mycoderma）、ピキア・ナガニシィ（Pichia naganishii）、キャンディダ・サイトアナ（Candida saitoana）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、サターノスポラ・ディスポラ（Saturnospora dispora）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、及びピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）からなる群より選ばれる少なくとも１種の微生物を用いることを特徴とする、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【請求項２】
微生物が、以下に示す受託番号を有することを特徴とする、請求項１に記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【表１】
2011182787.tif 000010
【請求項３】
微生物の密度を１０7〜１０11ｃｆｕ／ｍｌとなる様に自然界から見出された微生物の天然の状態の懸濁液を調製し、調製後の該懸濁液に１，１，１−トリフルオロアセトンを、該アセトンの濃度が０．０５〜３％（ｗ／ｖ）となる様に添加することを特徴とする、請求項１又は２に記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【請求項４】
反応温度が２０〜３０℃の範囲で行うことを特徴とする、請求項１乃至３の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【請求項５】
反応時のｐＨを６．０〜９．０の範囲で行うことを特徴とする、請求項１乃至４の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【請求項６】
還元反応に利用される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを微生物自身の脱水素酵素で再生し、外部から新たに補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えないことを特徴とする、請求項１乃至５の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【請求項７】
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生における脱水素酵素の基質としてグルコースを用いることを特徴とする、請求項１乃至６の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬中間体として重要な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの工業的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールは、種々の医農薬中間体として重要な化合物である。これまでに化学触媒を用いる方法とは別に、１，１，１−トリフルオロアセトンに微生物の酵素を作用させて（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールに還元する生物学的な方法が検討されてきた。例えば、特許文献１では、９９％ｅｅ以上のエナンチオマー過剰率を持つ（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、アルコールデヒドロゲナーゼを用いた１，１，１−トリフルオロアセトンのエナンチオ選択的な還元により製造する方法が、特許文献２では、市販の乾燥パン酵母により１，１，１−トリフルオロアセトンを還元することで、９３〜９９％ｅｅの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造する方法が、特許文献３では、アルコール脱水素酵素、カルボニル還元酵素等の酵素を機能的に発現する微生物、もしくは形質転換体、又はそれらの処理物を１，１，１−トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法が開示されている。
【０００３】
一方、非特許文献１では、乾燥パン酵母を用いて、１，１，１−トリフルオロアセトンを還元することにより（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが約８０％ｅｅの光学純度で得られることが、非特許文献２では、アルコール脱水素酵素を用いて１，１，１−トリフルオロアセトンを還元することにより、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得る製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００７／０５４４１１号
【特許文献２】国際公開２００７／００６６５０号
【特許文献３】国際公開２００７／１４２２１０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ.Ｂｕｃｃｉｅｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ., Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１１巻，８９７−８９９頁，１９８３年
【非特許文献２】Ｔ.Ｃ.Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｏｇｇｉ Ｓｕｐｐｌ，４３−４５頁，２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１、特許文献３、非特許文献２の方法は、微生物に特定の遺伝子を導入した形質転換体を用いることで、高い光学純度の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得ている。しかしながら、形質転換体は遺伝子が無作為に導入されることから予期せぬ形質を伴うこともあり、それに由来する産物が不純物として製品に混入する危険性や、自然界に拡散された場合、野生動植物への影響も懸念されることから、安全性の立証や、該微生物の拡散を防止するための特別な設備が必要となり、実施が必ずしも容易ではなかった。
【０００７】
特許文献２の方法は、市販の乾燥パン酵母を用いることから自前の培養設備を必要とせず、簡便に微生物を入手することができる。しかしながら、反応には基質に対して１０倍量の微生物を必要とするため、所望の還元反応の効率が高いとは言い難く、多量の廃棄物も問題であった。また、目的物を高い光学純度で得るには、微生物の加熱処理が必要となり、大量規模でのスケールを想定した場合には、要求される微妙な温度調整が非常に困難であり、工業的に採用し難い方法であった。
【０００８】
非特許文献１の方法は、光学純度が約８０％ｅｅと低く、さらに基質に対して３００倍量以上の微生物が必要であり、実用性と生産性の観点から採用し難い方法であった。
【０００９】
本発明の課題は、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを経済的に且つ簡便に、工業的規模で製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意検討した結果、１，１，１−トリフルオロアセトンに特定の微生物を作用させることにより、工業的に採用可能な生産量で（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを高い光学純度で収率良く製造できる方法を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明では、以下の［発明１］〜［発明７］に記載する発明を提供する。
【００１２】
［発明１］
式［１］で表される１，１，１−トリフルオロアセトン
【化１】
2011182787.tif 000002
【００１３】
に自然界から見出された微生物を天然の状態で作用させることにより、式［２］で表される（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール
【化２】
2011182787.tif 000003
【００１４】
を得る製造方法であって、係る微生物としてハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・マイコデルマ（Candida mycoderma）、ピキア・ナガニシィ（Pichia naganishii）、キャンディダ・サイトアナ（Candida saitoana）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、サターノスポラ・ディスポラ（Saturnospora dispora）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、及びピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）からなる群より選ばれる少なくとも１種の微生物を用いることを特徴とする、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００１５】
［発明２］
微生物が、以下に示す受託番号を有することを特徴とする、発明１に記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【表１】
2011182787.tif 000004
【００１６】
［発明３］
微生物の密度を１０7〜１０11ｃｆｕ／ｍｌとなる様に自然界から見出された微生物の天然の状態の懸濁液を調製し、調製後の該懸濁液に１，１，１−トリフルオロアセトンを、該アセトンの濃度が０．０５〜３％（ｗ／ｖ）となる様に添加することを特徴とする、発明１又は２に記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００１７】
［発明４］
反応温度が２０〜３０℃の範囲で行うことを特徴とする、発明１乃至３の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００１８】
［発明５］
反応時のｐＨを６．０〜９．０の範囲で行うことを特徴とする、発明１乃至４の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００１９】
［発明６］
還元反応に利用される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを微生物自身の脱水素酵素で再生し、外部から新たに補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えないことを特徴とする、発明１乃至５の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００２０】
［発明７］
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生における脱水素酵素の基質としてグルコースを用いることを特徴とする、発明１乃至６の何れかに記載の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００２１】
前述した様に、１，１，１−トリフルオロアセトンに微生物を作用させて還元し、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得る製造方法は従来から広く知られているが、高い光学純度を得るためには形質転換体の利用や、微生物の加熱処理が必要であり、また反応時には大量の微生物が必要な場合もあり、工業的な製造方法として採用し難いものであった。そこで本発明者らは、生来高い光学純度で１，１，１−トリフルオロアセトンを（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールへと還元する能力を持つ特定の微生物（「菌体」とも言う。）を自然界から見出された微生物より選抜し、１０6〜１０12ｃｆｕ／ｍｌの密度に調製した該微生物の天然の状態の懸濁液に１，１，１−トリフルオロアセトンの濃度が０．０１〜５％（ｗ／ｖ）となる様に添加し、反応温度５〜４０℃、ｐＨ４．０〜１０．０で反応させることにより、高い光学純度の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、簡便に且つ工業的スケールで製造できることを新たに見出した。また、本発明では、還元反応に利用される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを微生物自身の脱水素酵素で再生できるため、外部から新たに補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加える必要がなく、好ましい態様の１つである（当然、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えて反応を行うこともできる）。
【００２２】
ここで言う「自然界から見出された微生物」とは、形質転換等の遺伝子操作が施されていない菌体を指し、各種微生物寄託機関に保存されている野生株のことを言う。また、「天然の状態」とは、培養した微生物をそのまま使用することを指し、微生物を破砕して酵素を分離する操作や、加熱処理や化学薬剤処理等の菌体処理を行わないことを言う。
【００２３】
ここでは、微生物の密度及び１，１，１−トリフルオロアセトンを特定の濃度に設定することで、１回の製造バッチ当たりの生産量が従来技術に比べて格段に向上し、大量規模で且つ経済的に製造し得ると言う、大変有用な知見を得た。
【００２４】
本発明においては、１，１，１−トリフルオロアセトンの濃度は、該微生物の懸濁液中の該アセトンの濃度（ｗ／ｖ）のことを意味し（還元された生成物の濃度は考慮されない（除外される））、反応全体を通しての該アセトンの添加総量を規定するものではない。
【００２５】
また、詳細は後述するが、グルコースを特定の濃度に設定して添加することで、反応が円滑に進行すると言う、好ましい知見も得た。
【００２６】
本発明の様に、生来高い光学純度で目的物を与える微生物を自然界から見出された微生物より選抜し、培養した菌体をそのまま反応に用い、且つ特定の密度範囲に調製した菌体の懸濁液に対して、１，１，１−トリフルオロアセトンを特定の濃度範囲で反応させることにより、高い光学純度（〜１００％ｅｅ）の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、工業的なスケールで製造できる知見は従来全く知られていなかった。
【発明の効果】
【００２７】
医農薬中間体として重要な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、工業的に簡便に且つ効率良く製造することができる。
【００２８】
本発明で用いる微生物は、１，１，１−トリフルオロアセトンのカルボニル基を水酸基へと立体選択的に効率良く還元し得るものであり、基質である１，１，１−トリフルオロアセトンを反応に適した濃度で添加する方法を考案することにより、工業的な生産が難しかった（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを高い光学純度で且つ高い生産性で提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、本発明について詳細に説明する。本発明で用いる１，１，１−トリフルオロアセトンは、公知の化合物であり、従来技術を基に当業者が適宜調製しても良いし、市販されているものを用いても良い。
【００３０】
本発明において、１，１，１−トリフルオロアセトンは、化合物そのもの自体は当然、それ以外に水または炭素数１から４のアルコールとの付加物も同等に用いることができる。前述の反応条件を採用することで、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得ることのできる微生物は、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・マイコデルマ（Candida mycoderma）、ピキア・ナガニシィ（Pichia naganishii）、キャンディダ・サイトアナ（Candida saitoana）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、サターノスポラ・ディスポラ（Saturnospora dispora）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、及びピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、好ましくはハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、サターノスポラ・ディスポラ（Saturnospora dispora）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、より好ましくはハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又はピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）である。
【００３１】
これらの微生物については、それぞれ以下に示す受託番号を得て、各種機関に寄託されている。なお、これらの微生物は一般に市販されているものであり、当業者が容易に入手できる。
【表２】
2011182787.tif 000005
【００３２】
前記微生物の培養には、通常、微生物の培養に用いられる栄養成分を含む培地（固体培地または液体培地）が使用できるが、水溶性である１，１，１−トリフルオロアセトンの還元反応を行う場合には、液体培地が好ましい。培地は、炭素源としてグルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、シュークロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、デキストロース等の糖類、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、グリセロール等のアルコール類、クエン酸、グルタミン酸、リンゴ酸等の有機酸類が、そして窒素源としてアンモニウム塩、ペプトン、ポリペプトン、カザミノ酸、尿素、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。さらに、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等の他の無機塩等の栄養源が適宜添加できる。
【００３３】
これらの炭素源、窒素源、無機塩の内、炭素源については微生物が十分に増殖する量且つ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜８０ｇ、好ましくは１０〜４０ｇ加える。窒素源についても同様で、微生物が十分に増殖する量かつ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜６０ｇ、好ましくは１０〜５０ｇ、栄養源としての無機塩については微生物の増殖に必要な元素を加える必要があるが、高い濃度の場合には増殖が阻害されるため、通常、培地１Ｌに対して０．００１〜１０ｇ加える。なお、これらは微生物に応じて複数の種類を組み合わせて使用することができる。
【００３４】
培地におけるｐＨは微生物の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０で行う。培養における温度範囲は微生物の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行う。培養中は培地に空気を通気する必要があり、好ましくは０．３〜４ｖｖｍ（「ｖｖｍ」は１分間当たりの培地体積に対する通気量を意味する。ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）、より好ましくは０．５〜２ｖｖｍで行う。酸素の要求量が多い微生物に対しては、酸素発生器等を用いて、酸素濃度を高めた空気を通気しても良い。また、試験管やフラスコ等の任意の通気量を設定し難い器具については、該器具の容積に対して培地量を２０％以下に設定し、綿栓やシリコン栓等の通気栓を取り付ければ良い。培養を円滑に進めるためには培地を攪拌することが好ましく、発酵槽の場合には該装置の攪拌能力の好ましくは１０〜１００％、より好ましくは２０〜９０％で行う。一方、試験管やフラスコ等の小規模な器具の場合には振盪機を用いて行うのが良く、好ましくは５０〜３００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜２５０ｒｐｍで行う。培養時間は微生物の増殖が収束する時間であれば良く、６〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間で行う。
【００３５】
基質である１，１，１−トリフルオロアセトンに前記微生物を作用させるには、通常、微生物を培養した懸濁液をそのまま反応に使用することができる。培養中に生じる成分が還元反応に悪影響を与える場合には、遠心分離等の操作で培養液から菌体を１度単離し、得られた菌体（湿菌体）を用いて再び懸濁液を調製して反応に使用しても良い。
【００３６】
反応を効率的に進めるには、これらの懸濁液中の菌体の密度を高める必要があるが、密度が高過ぎると自己溶解酵素の産生や終末代謝産物の蓄積等により反応が阻害される場合があり、通常１０6〜１０12ｃｆｕ／ｍｌ（「ｃｆｕ」は寒天培地上に形成されるコロニーの数を意味する、ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）、好ましくは１０7〜１０11ｃｆｕ／ｍｌ、より好ましくは１０8〜１０10ｃｆｕ／ｍｌで行う。
【００３７】
これらの懸濁液への１，１，１−トリフルオロアセトンの添加において、該アセトンの濃度は還元反応が円滑に進み且つ微生物の生存に悪影響を与えない濃度を維持する必要があり、例えば、５％（ｗ／ｖ）より高い濃度では微生物が死滅したり、光学純度が低下することがあるため、この数値以下の濃度、すなわち、通常０．０１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜３％（ｗ／ｖ）で行う。該アセトン濃度算出の容量の根拠は、例えば、実施例１では蒸気滅菌前の試験管に分注した培養液量を、実施例３では培養後の微生物の懸濁液総量を目安として考えれば良い。また、該懸濁液への１，１，１−トリフルオロアセトンの添加方法については、還元反応をモニタリングしながら好ましい範囲を維持する様に、逐次的に添加するのが好ましい。また、１，１，１−トリフルオロアセトンの添加総量については、生成物の蓄積により反応が収束する濃度があるため、微生物に応じて好適な範囲を調整する必要があるが、これらの懸濁液に対して０．１〜３０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．２〜２０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
【００３８】
反応温度は選抜した微生物の酵素反応に好適な範囲を維持する必要があり、通常５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃で行う。また、反応時のｐＨも選抜した微生物の酵素反応に好適な範囲を維持する必要があり、通常４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０で行う。
【００３９】
懸濁液が静置状態にあると微生物が沈降して反応効率が低下するため、反応時は懸濁液を攪拌しながら行う。また、微生物の呼吸に必要な酸素を供給するために通気を行う必要があるが、通気量が多過ぎる場合には１，１，１−トリフルオロアセトンおよび（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが系外に気体として飛散するため、好ましくは０．３ｖｖｍ以下、より好ましくは０．１ｖｖｍ以下で行う。反応時間は目的物の生成具合によって決定され、通常６〜３１２時間で行う。
【００４０】
本発明では、還元反応に利用される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（水素供与体）は微生物が持つ脱水素酵素を利用して補酵素ＮＡＤ（Ｐ）より再生されるため、懸濁液にグルコースを別途存在させて還元反応を行うのが好ましく、ここではグルコース以外の糖類やアルコール類も使用可能であり、例えば、微生物の培養の箇所で述べた、炭素源として記載した糖類やアルコール類が使用可能である。グルコースは、菌体の懸濁液に直接添加しても良いし、基質である１，１，１−トリフルオロアセトンと予め混合して懸濁液に添加しても良い。補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは市販されているものを別途加えて還元反応を行うことも可能であるが、非常に高価なため経済的ではない。
【００４１】
本発明者らは、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを外部から新たに加えずに微生物自身により再生させることで、１菌体当たりの還元回数が増え、経済的に且つ高い生産性で目的物を製造できるといった、大変好ましい知見を得た。微生物自身が細胞中に保有している補酵素NAD（P）Hをそのまま還元反応に用い、反応後に生じるNAD（P）を微生物自身の脱水素酵素により補酵素NAD（P）Hに再生させることが可能である。なお、ここで言う「補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを外部から新たに加えずに」とは、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量が、培養液に対して１μｍｏｌ／Ｌ未満の状態のことを指し、０．１μｍｏｌ／Ｌ未満がより好ましい（但し、菌体が保有する補酵素を除く）。
【００４２】
このように、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを反応系内に意図的に添加することなく目的物を製造する態様が、「補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを微生物自身の脱水素酵素で再生し、外部から新たに補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えない」典型であり、極めて好ましい。
【００４３】
ここで添加するグルコースについては、反応を阻害しない量で添加する必要があり、懸濁液における濃度を０．１〜１０％（ｗ／ｖ）に維持する様に添加するのが好ましい。例えば、後述の実施例４に示す様に、糖濃度センサーが付いた濃度制御装置等を用いて、反応系内のグルコース濃度を常に２％に保ちながら反応を行うことは、反応が円滑に進行することからも、本発明における特に好ましい態様の１つである。
【００４４】
本発明の方法は、１，１，１−トリフルオロアセトンから（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールへ変換する際に、工業的な製造方法を目的とし、好適な反応条件を採用することで、大量に製造することが可能である。
【００４５】
なお、本発明ではＳ体のアルコール、すなわち（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、実用的にも採用できる光学純度として、８５％ｅｅ以上、特に好ましくは９８％ｅｅ以上で得ることができる。
【００４６】
生成した（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを反応終了液から回収するには、有機合成における一般的な単離方法が採用できる。反応終了後、有機溶媒による抽出等の通常の後処理操作を行うことにより、粗生成物を得ることができる。特に、反応終了液または必要に応じて菌体を取り除いた後の濾洗液を直接、蒸留に付すことで簡便に且つ収率良く回収することができる。得られた粗生成物は、必要に応じて、脱水、活性炭、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行うことができる。また、得られた生成物の光学純度をより高めるための操作を行うことも可能である。
【００４７】
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
［１，１，１−トリフルオロアセトンに対する反応性の調査（スクリーニング）結果］
イオン交換水１０００ｍｌ、グルコース１０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．４ｃｍ×１８ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。
【００４９】
これらの液体培地に表３で示す微生物を接種して２８℃で２４時間振とう培養し、１．０×１０9〜５．０×１０9ｃｆｕ／ｍｌの範囲の懸濁液を調製した。各菌体懸濁液に１，１，１−トリフルオロアセトンを０．５％（２５μｌ）、１Ｍグルコースを２５０μｌ添加してさらに２８℃で２４時間振とう培養を行い反応させた。反応後、各反応液に酢酸ｎ−ブチルを加えて混合後、遠心分離により酢酸ｎ−ブチル層の分離を行った。得られた酢酸ｎ−ブチル層を後述する分析条件により生成物の光学純度を測定し、表３に示した。
【表３】
2011182787.tif 000006
【００５０】
この様に、Hansenula polymorpha NBRC0799、Saturnospora dispora NBRC0035、Candida saitoana NBRC0380、Cryptococcus curvatus NBRC1159、Saccharomyces bayanus NBRC0676、Pichia membranaefaciens NBRC0128を用いた場合、何れも（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが高いエナンチオマー過剰率で生成していることが確認できた。
【００５１】
［分析条件］
光学純度の分析はガスクロマトグラフィー法により行った。ガスクロマトグラフィーのカラムにはＢＧＢ社製のＢＧＢ−１７４（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ）を用い、キャリアガスはヘリウム、圧力は１００ｋＰａ、カラム温度は６０〜８５℃（１℃／ｍｉｎ）〜１１０℃（５℃／ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールのそれぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｒ体が２２．１ｍｉｎ、Ｓ体が２３．９ｍｉｎであった。
【実施例２】
【００５２】
［１，１，１−トリフルオロアセトンに対する反応性の調査（スクリーニング）結果］
イオン交換水１０００ｍｌ、グルコース１０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇの組成からなる液体培地を調製（ｐＨ ６．５）し、試験管（φ１．４ｃｍ×１８ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で２０分間の蒸気滅菌を行った。
【００５３】
これらの液体培地に表４で示す微生物を接種して３０℃で２４時間振とう培養し、１．０×１０9〜５．０×１０9ｃｆｕ／ｍｌの範囲の懸濁液を調製した。各菌体懸濁液に１，１，１−トリフルオロアセトンを５％（２５０μl）、２０％グルコース水溶液を２５０μｌ添加してさらに３０℃で２４時間振とう培養を行い反応させた。反応後、各反応液に酢酸ｎ−ブチルを加えて２回抽出し、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＢＧＢ社製ＢＧＢ−１７４（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ））により生成物の光学純度を測定し、表４に示した。
【００５４】
一方、本実施例に示す条件で調製した菌体懸濁液に対して、グルコースを加えない他は上記と同様の反応操作を別途行い、前述の分析方法により生成物の光学純度を測定し、表４に併せて示した。
【表４】
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【００５５】
この様に、Pichia anomala NBRC0120、Hansenula polymorpha NBRC0799、Candida parapsilosis NBRC0708、Candida mycoderma NBRC1247、Pichia naganishii NBRC1670を用いた場合も、何れも（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが高いエナンチオマー過剰率で生成していることが確認できた。
【００５６】
次に、実施例１及び実施例２に記載した微生物の内、光学純度が高く且つ高い収率で目的物を与えるハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha NBRC0799）を用い、１，１，１−トリフルオロアセトンの菌体懸濁液に対する総量がそれぞれ２％（ｗ／ｖ）（実施例３）、５％（ｗ／ｖ）（実施例４）となる様に、該アセトンを添加した反応結果を以下に示す。
【実施例３】
【００５７】
［（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造（２％（ｗ／ｖ））］
イオン交換水２０００ｍｌ、グルコース４０g、ペプトン２０g、酵母エキス１２g、麦芽エキス１２g、リン酸二水素カリウム１２ｇ、リン酸水素二カリウム８ｇの組成からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの発酵槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で６０分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に同様の組成の１００ｍｌで前培養を行ったHansenula polymorpha NBRC0799の１．４×１０9ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液を８０ｍｌ接種し、２８℃、通気１ｖｖｍ、攪拌５００ｒｐｍで２４時間培養し、１．７×１０9ｃｆｕ／ｍｌ（湿菌重として４１ｇ／Ｌ）の懸濁液を調製した。この
時のｐＨの調整はアンモニア水を用いて行い、６．５に調整した。培養終了後、通気を０．１ｖｖｍ、攪拌を５０ｒｐｍに変更し、別容器に準備した２００ｍｌのイオン交換水に１，１，１−トリフルオロアセトン５０．０８ｇ、グルコース９０ｇを溶解させたものを菌体懸濁液にペリスタポンプを用いて逐次的に添加した。微生物による基質の還元は２４時間おきにモニタリングし、７８時間後に収率が７９．１％となっていることを確認した。この反応液を３Ｌの三角フラスコに回収し、２０℃で５日間静置して追加反応を行った。５日後の収率は９１．４％であった。
【００５８】
反応終了後の反応液から生成した１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを回収するため、蒸留を行った。留出液を３４４ｍｌ回収し、19Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により４４．７２ｇの１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが含まれていることが判明した。前述の分析条件により光学純度を測定し、９８．７％ｅｅ（Ｓ体）であることを確認した。
【実施例４】
【００５９】
［（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造（５％（ｗ／ｖ））］
イオン交換水２０００ ｍｌ、グルコース６０ｇ、ペプトン３０ｇ、酵母エキス５０ｇ、リン酸二水素カリウム４．８ｇ、リン酸水素二カリウム２．５ｇの組成からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの発酵槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で６０分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に同様の組成の１００ｍｌで前培養を行ったHansenula polymorpha NBRC0799の２．０×１０9ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液を８０ｍｌ接種し、２８℃、通気１ｖｖｍ、攪拌５００ｒｐｍで２４時間培養し、４．３×１０9ｃｆｕ／ｍｌ（湿菌重として８６ｇ／Ｌ）の懸濁液を調製した。この時のｐＨの調整はアンモニア水を用いて行い、６．５に調整した。培養終了後、通気を０．１ｖｖｍ、攪拌を５０ｒｐｍに変更し、別容器に準備した３００ｍｌのイオン交換水に１，１，１−トリフルオロアセトン１２５．２ｇ、グルコース２００ｇを溶解させたものをオンラインの糖濃度センサー（オンラインバイオセンサ ＢＦ−４１０、（株）バイオット製）を用いて、グルコース濃度を２％に維持する様にコンピュータプログラムで自動的に懸濁液に添加した。微生物による基質の還元は２４時間おきにモニタリングし、１６８時間後に収率が９４．９％となっていることを確認して反応を終了した。
【００６０】
反応終了後の反応液から生成した１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを回収するため、蒸留を行った。留出液を１８８ｍｌ回収し、19Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により１０９．２ｇの１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが含まれていることが判明した。前述の分析条件により光学純度を測定し、９８．７％ｅｅ（Ｓ体）であることを確認した。
【実施例５】
【００６１】
［（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造（５％（ｗ／ｖ））、１０００Ｌスケール］
前々培養として、水２００ ｍｌ、グルコース６ｇ、ペプトン３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸二水素カリウム０．４８ｇ、リン酸水素二カリウム０．２５ｇの組成からなる液体培地を調製し、容量５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコに分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地にHansenula polymorpha NBRC0799の冷凍保存種菌を２ｍｌ接種し、ロータリーシェーカーを用いて２８℃、１６０ｒｐｍで７２時間の培養を行い、１．６×１０9ｃｆｕ／ｍｌの菌体懸濁液を調製した。
【００６２】
前培養として、同様の組成比で調製した５０００ｍｌの液体培地を容量１０Lの発酵槽（（株）丸菱バイオエンジ製）に張り込み１２１℃で６０分間の蒸気滅菌を行った。これに前々培養にて調製した菌体懸濁液を１８０ｍｌ接種し、２８℃、通気１ｖｖｍ、攪拌２５０ｒｐｍで２７時間培養し、１．２×１０9ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液を調製した。培養中のｐＨの調整はアンモニア水を用いて行い、６．５に調整した。
【００６３】
本培養を行う１０００L発酵槽は小松川化工機製の通気攪拌型培養装置を用いた。培養槽に水３７０Lを張り込み、酵母エキス９ｋｇ、ペプトン６ｋｇ、リン酸二水素カリウム０．９６ｋｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｋｇを溶解させ、１２１℃で６０分間の蒸気滅菌を行った。これに別容器にて調製した水３０L、含水結晶グルコース１３ｋｇのグルコース溶液を投入し、前培養にて調整した菌体懸濁液を５０００ｍｌ接種し、２８℃、通気１００L／min、攪拌２００ｒｐｍで２４時間培養を行った。培養終了後の２．７×１０9ｃｆｕ／ｍｌに増殖した菌体懸濁液に、通気を２０L／min、攪拌を５０ｒｐｍに変更し、別容器に準備した５６．５ｋｇのイオン交換水に１，１，１−トリフルオロアセトン２５ｋｇ、含水結晶グルコース４３．５kｇを溶解させた水溶液を、適宜糖濃度を測定しながらグルコース濃度が２％を維持する様に添加した。微生物による基質の還元は２４時間おきにモニタリングし、１６８時間後に変換率が９１．４％となっていることを確認して反応を終了した。培養及び反応時のpＨはアンモニア水を用いて６．５に調整した。
【００６４】
反応終了後の反応液を19Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により分析したところ１３ｋｇの１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが含まれていることが判明した。前述の分析条件により光学純度を測定し、９７．４％ｅｅ（Ｓ体）であることを確認した。