(57)【要約】【課題】個体におけるアデノシンのレベルの増加のため、および長期間にわたるアデノシンレベルの増加を維持するための方法を提供し、それによって、炎症症状、または未処理であると組織炎症が導かれ得る症状を予防または治療する。【解決手段】インターフェロン−ベータをアデノシン一リン酸と組み合わせて含む、多臓器不全の予防または治療のための医薬。多臓器不全は、ａ）組織外傷、ｂ）心筋梗塞もしくは脳卒中、臓器移植もしくは臓器移植以外の外科手術に起因する再灌流傷害、ｃ）癌または癌転移、またはｄ）アレルギー性症状から生じるものを含み、組織外傷、心筋梗塞または脳卒中に起因する再灌流傷害、癌または癌転移、またはアレルギー性症状から生じるものの場合、医薬の投与が、患者が治療を受け次第開始され、臓器移植または臓器移植以外の外科手術に起因する再灌流傷害から生じるものの場合、医薬の投与が臓器移植または外科手術の前に開始される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−ベータをアデノシン一リン酸と組み合わせて含む、多臓器不全の予防または治療のための医薬。
【請求項２】
前記多臓器不全が、
ａ）組織外傷、
ｂ）心筋梗塞もしくは脳卒中、臓器移植もしくは臓器移植以外の外科手術に起因する再灌流傷害、
ｃ）癌または癌転移、または
ｄ）アレルギー性症状
から生じるものである請求項１記載の医薬。
【請求項３】
前記多臓器不全が、組織外傷、心筋梗塞または脳卒中に起因する再灌流傷害、癌または癌転移、またはアレルギー性症状から生じるものであり、前記医薬の投与が、患者が治療を受け次第開始される請求項２記載の医薬。
【請求項４】
前記多臓器不全が臓器移植または臓器移植以外の外科手術に起因する再灌流傷害から生じるものであり、前記医薬の投与が、臓器移植または外科手術の前に開始される請求項２記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体におけるアデノシンレベルの上昇を誘導するための方法、およびアデノシンレベルの上昇によって利益を得る、疾患または疾病の治療または予防に関する。本発明はまた、個体における内皮ＣＤ７３発現をアップ−レギュレートする方法、およびそのようなＣＤ７３アップ−レギュレーションによって利益を得る、疾患または疾病の治療または予防にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を例示するため、とりわけ、実施に関する追加詳細を提供するために本明細書で使用した、刊行物および他の材料が、参考文献にて組込まれる。
【０００３】
リンパ球と内皮細胞との相互作用は、多重段階過程である。血管壁を浸潤し、標的部位に到達可能にするために、循環細胞は、非常に良く制御された接着分子の組を使用する。内皮細胞への接着の増強、およびその後の血管壁の内皮裏層を通した、組織への再循環白血球細胞の移動が、炎症に関する特徴である。さらに、高程度の前−および抗−炎症性サイトカインの放出が、炎症の部位で起こる。これらのサイトカインは、接着分子の発現の強力なレギュレーターである。
【０００４】
ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）は、エクト−酵素活性を有する、７０−ｋＤのグルコシル−ホスファチジル−イノシトール−アンカー細胞表面分子である。ＣＤ７３は、血管内皮上で豊富に、およびヒトリンパ球の特定の亜集団上では低レベルで発現する。ＣＤ７３は、ヌクレオチド−５’−一リン酸（ＡＭＰおよびＩＭＰ）の分解による、アデノシンおよびイノシンのようなヌクレオチドへのプリン救出経路の一部である（１）。アデノシン、つまりＣＤ７３酵素活性のプリンヌクレオシド産物は、細胞表面上の特定のレセプターに結合する。アデノシンは、多くの生理学的および病理学的事象において、役割を果たすと報告されている。現在までに、Ｇタンパク質共役アデノシンレセプターの４つの異なるサブタイプ、Ａ１Ｒ、Ａ２ａＲ、Ａ２ｂＲおよびＡ３Ｒがクローン化されてきた。レセプターの多様性および様々な組織におけるその豊富な局在化によって、アデノシン−アデノシンレセプター相互作用が、種々の生理学的応答を導く。Ａ１およびＡ２レセプターへの結合によって、アデノシンは、内皮へ結合している白血球を制御することによって、炎症の病理学的結果を調節し、Ａ２およびＡ３レセプターへの結合によって、好中球脱顆粒の阻害を介して、抗炎症剤として働く（２）。アデノシンはまた、Ａ３レセプターの活性化を介して、好酸球遊走を減少させもする。５’−ＡＭＰのこの促進効果は、ＣＤ７３仲介であり、細胞内ｃＡＭＰの増加が続く。最近、Ａ２ａレセプターに対する重要な役割が、インビボでの全身性および組織特異的炎症応答の減少において見られた。アデノシンは、心臓および中枢神経虚血の間の細胞傷害を予防する（３〜５）。低酸素症の後、エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性が、プレコンディショニングとして知られる現象によって増加する。これによって、結果として、たとえば心臓低酸素症における梗塞に対する、細胞の抵抗性の増加を導く、多量のアデノシンの放出となる。
【０００５】
現在までに、内皮ＣＤ７３発現および機能の調節に関しては、実際なにも知られていない。しかしながら、炎症においては、インビボで特異的に内皮ＣＤ７３発現を制御する誘導物が分泌されうる。
【０００６】
抗炎症および細胞保護効果を有するアデノシンが、炎症の程度および結果を制御することにおいて、重要な役割を果たすので、本研究は、ＣＤ７３発現の調節、ならびにエクト−５’−ヌクレオチド仲介アデノシン産生の調節に関連する因子を同定するために設計した。
【０００７】
アデノシンそれ自体は、炎症症状を患っているか、または未処置によって、組織炎症が導かれる可能性が非常に高い症状を患っている患者に投与可能である。しかしながら、アデノシンの直接投与による深刻な欠点は、インビボにおけるアデノシンの迅速な消失である。したがって、本研究は、長期間にわたる、アデノシンのレベルの上昇を達成する新規方法を提案する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主な目的は、個体におけるアデノシンのレベルの増加のため、および長期間にわたるアデノシンレベルの増加を維持するための方法を提供し、それによって、炎症症状、または未処理であると組織炎症が導かれ得る症状を予防または治療することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、個体における内皮ＣＤ７３の発現をアップ−レギュレートするための、およびそのようなＣＤ７３アップ−レギュレーションによって利益を得る疾患または障害を予防または治療するための方法であって、アデノシンのレベルの上昇を必要としない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このように、１つの観点によれば、本発明は、個体に、有効量の、ｉ）組換えタンパク質ＣＤ７３、またはii）サイトカインまたは内皮ＣＤ７３発現が誘導可能である他の因子、またはそれらの組み合わせのいずれかを投与することによって、該個体におけるアデノシンのレベルの上昇を誘導する方法に関する。
【００１１】
他の観点によれば、本発明は、個体に有効量の、ｉ）組換えタンパク質ＣＤ７３、またはii）サイトカインまたは内皮ＣＤ７３発現が誘導可能である他の因子、またはそれらの組み合わせのいずれかを投与することによって、該個体におけるアデノシンレベルの上昇を必要とする、またはそれによって利益を得る疾患または障害の予防または治療のための方法に関する。
【００１２】
第三の観点によれば、本発明は、個体に、有効量のサイトカインまたは内皮ＣＤ７３発現を誘導可能な他の因子を投与することによって、該個体における内皮ＣＤ７３発現をアップ−レギュレートする方法に関する。
【００１３】
第四の観点によれば、本発明は、個体に、有効量のサイトカイン、または内皮ＣＤ７３発現が誘導可能な他の因子を投与することによって、該個体における内皮ＣＤ７３発現をアップ−レギュレートすることを必要とする、またはそれによって利益を得る疾患または障害の予防または治療のための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＩＮＦ−αによるＨＵＶＥＣにおけるＣＤ７３表面発現の誘導が、時間および用量量依存性であることを示しているグラフ表現である。パネル（ａ）では、ＨＵＶＥＣを、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−αに指示時間暴露した。（ｂ）ＨＵＶＥＣを、異なる濃度のＩＦＮ−αと共に、７２時間培養した。３〜９回の実験の、ＭＦＩの相対平均±ＳＥＭを示している。コントロールの発現は、各時点での、ＩＦＮ−αなしでのＣＤ７３の発現である。バックグラウンド（陰性コントロール染色）を差し引いている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。
【図２】ＩＦＮ−アルファでのＣＤ７３の誘導が、その分布の変化よりむしろ発現の増加を導くことを示している顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣを、培地中で増殖させるか、または７２時間ＩＮＦ−アルファで誘導し、ＣＤ７３の細胞表面発現を、ＣＤ７３に対するｍＡｂ  ４Ｇ４およびＦＩＴＣ共役抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。（ａ）コントロールＨＵＶＥＣ上でＣＤ７３が、パンケーキ様パターンで細胞表面上で発現している。（ｂ）ＩＦＮ−α誘導の後、ＣＤ７３はより強い強度となるが、表面分布は、コントロールＨＵＶＥＣでのものと同様である。コントロールＨＵＶＥＣ上（ｃ）およびＩＮＦ−α誘導後（ｄ）の陰性コントロール抗体３Ｇ６による染色。本来の倍率、４００×、スケールバー  １０μｍ。
【図３】ＨＵＶＥＣにおける、相対発現ＣＤ７３  ｍＲＮＡのグラフ表現である。ＨＵＶＥＣは、７２時間、ＩＦＮ−アルファと共にまたはなしでインキュベートした。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を、ＴａｑＭａｎにて実施した。図は、コントロールおよびＩＦＮ−アルファ処置細胞間の、ＣＤ７３  ｍＲＮＡの相対発現を表している。標準化を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを用いて実施した。データは、二重で実施した３つの実験の平均値±ＳＥＭ、＊＜０．０５を示す。
【図４】リンパ系ＣＤ７３発現の調節が、内皮細胞のそれとは異なることを示しているグラフである。Ｕ２６６Ｂ１細胞およびＰＢＬを、種々の時間、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−αを含有する、または含有しない培地中で増殖させた。未処理コントロール細胞と比較した場合、指示時間ＩＦＮ−αに暴露した場合、有意な差は、ＰＢＬ（白棒）またはＵ２６６Ｂ１（黒棒）で見られなかった。３〜６実験／時点のＭＦＩの相対平均±ＳＥＭを示す。
【図５】ＩＦＮ処理をする前、および後での、（パネルａ）健康な領域、および（パネルｂ）腫瘍領域由来の、尿膀胱試料の免疫組織化学染色の、半定量的解析の要約である。
【図６】膀胱癌における、ＣＤ７３の発現に対するＩＦＮ−αの効果を示している顕微鏡写真を示す。（ａ）膀胱癌切片は、ＩＦＮ−α処置前に、抗−ＣＤ７３  ｍＡｂ  ４Ｇ４で染色した。血管は、弱く、または中程度ＣＤ７３を発現している。（ｂ）同様の腫瘍が、ＩＦＮ−α処置後、抗−ＣＤ７３  ｍＡｂ  ４Ｇ４で染色された。いくつかの血管は、中程度または多量にＣＤ７３を発現している。（ｃ）陰性コントロール抗体３Ｇ６での染色。ｄ−ｆ、ＩＦＮ−α処置前（ｄ）および後（ｅ）で、ＣＤ７３を発現している腫瘍（ｔ）の例。またこの場合、ＩＦＮ−アルファは、内皮細胞上のＣＤ７３発現を増加させた。（ｆ）陰性コントロール染色。いくつかの血管を、矢印で示している。本来の倍率、１００×、スケールバー  ２０μｍ。
【図７】ＩＦＮ−αが、細胞表面エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性を増加させることを示す。ＨＵＶＥＣ（ａ）およびＰＢＬ（ｂ）を、１０００  Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−αなし（白棒）またはあり（黒棒）で、４８時間前処理した。エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性を、３００μｍｏｌ／Ｌ  ［3Ｈ］ＡＭＰを用いることでアッセイし、縦軸を、１時間あたり１０6細胞による、基質の脱リン酸化のｎｍｏｌとして表現した（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４〜５）。コントロール細胞と比較して*Ｐ＜０．０５。（ｃ）コントロール（黒丸）およびＩＦＮ−α処理ＨＵＶＥＣ（白丸）による［3Ｈ］ＡＭＰ加水分解速度対基質濃度プロット。値は、２つの独立した実験に関する、平均値±ＳＥＭとして表している。速度論的パラメータ類（ＶmaxおよびＫm）を、示された曲線より計算し、文字で要約した。
【図８ａ】ＨＵＶＥＣ単層の浸潤性に対するＩＦＮ−αの効果を示す。ＨＵＶＥＣを、多孔性ポリスチレン膜（０．４μｍの孔径）上に撒き、コンフルエントまで増殖させた。ＨＵＶＥＣを培地中で増殖させ、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−αで、７２時間処理した。ＡＭＰを加えた１５分後、膜機能を、７０ｋＤａ  ＦＩＴＣ−デキストランの、ＨＵＶＥＣ単層を介した、フルオロメーターを備えた下チャンバーへの流束を測定することによって解析した。ＦＩＴＣ−デキストラン流束は１００分まで測定した。値は、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３である。ＩＦＮ−α処理細胞と比較して*Ｐ＜０．０５。
【図８ｂ】ＨＵＶＥＣ単層の浸潤性に対するＩＦＮ−αの効果を示す。コンフルエント単層を、ＦＩＴＣ−デキストランの添加３０分前に、特異的エクト−５’−ヌクレオチダーゼ阻害剤であるＡＭＰＣＰ（１００μＭ）に暴露した。示したデータは、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３である。ＩＦＮ−α処理細胞と比較して*Ｐ＜０．０５。
【図９】ＩＦＮ−βおよび−γでのインキュベーション後の、ヒト臍帯内皮細胞におけるＣＤ７３アップ−レギュレーションを描写している代表的なヒストグラムである。インキュベーションの２０時間の間、ＩＦＮ−βが、２６から５０まで、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を増加させ、一方、インキュベーションの４８時間の間、ＩＦＮ−γは、ＭＦＩを２６から９４までアップ−レギュレートした。Ｘ−軸は、ログスケールの蛍光強度であり、ｙ−軸は細胞の総対数である。
【図１０】アデノシンレベルを調節している代謝経路を示す。アデノシンの形成および分解を導く酵素反応を描写している。アデノシンの量は、１．ＣＤ７３の量をアップレ−ギュレートすること／増加すること、２．さらにＡＭＰを提供すること、３．アデニル酸キナーゼを阻害すること、および４．アデノシンデアミナーゼを阻害すること、またはこれらの組み合わせによって上昇させることができる。
【図１１】ＩＦＮ−ベータおよびＡＭＰ治療なし（Ａ）またはあり（Ｂ）での、多重臓器不全のラットの肺の、ホルマリン固定パラフィン包埋切片の、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一連の可能性あるメディエーターのスクリーニング、およびＩＦＮ−α、βおよびガンマが、ＣＤ７３発現の強力なアクチベーターであるという知見に基づいている。ＩＦＮ−アルファが、より詳細な研究のために選択された。ＩＦＮ−αは、ＰＢＬ上ではなく内皮細胞上でのＣＤ７３発現の、特定の時間および用量依存インビトロアップレギュレーションを示し、よりいっそう重要なことに、インビボで、膀胱癌患者の腫瘍血管におけるＣＤ７３の発現をアップレギュレートした。ＩＦＮ−α誘導後の内皮ＣＤ７３のアップレギュレーションは、内皮細胞におけるバリア機能の増強を導く、５’−ＡＭＰからアデノシンを、酵素的に機能的に産生する。さらに、内皮およびリンパ球ＣＤ７３の制御において、細胞型特異的差異が見られた。
【００１６】
内皮およびリンパ球ＣＤ７３へのＩＦＮ−αの異なる効果の結果は、さらに、ＣＤ７３の発現を調節するための、細胞型間の差異を示す。これに関連し、ＣＤ７３の量は、リンパ球と内皮細胞との間で明らかに変化する、と言うに足る。たった１０〜１５％のリンパ球がＣＤ７３を発現し、この発現レベルは、たとえば、ＣＤ７３に関してすべてが陽性であるＨＵＶＥＣと比較して低い。ＣＤ７３の量および調節における、この型の細胞特異的差違は、リンパ球の適切な挙動に関して基本的であり、そのリンパ球の役割は、存在するアデノシンを活発に脱アミノ化すること、およびリンパ系組織または炎症部位へ遊出することである。反対に、アデノシンは、そのバリア機能を維持するために、内皮細胞にとって必要である。
【００１７】
結論として、本研究は、ＣＤ７３がどのようにして、サイトカイン、とりわけインターフェロンによって、インビトロおよびインビボ両方でアップレギュレートされ得るかを説明する。アデノシンは、その性質において非常に抗炎症性であるので、ＣＤ７３のアップレギュレーションを介した、アデノシンの内因性産生の操作が、たとえば、心臓血管梗塞および脳卒中、臓器移植に関連する再灌流傷害、および種々の組織損傷および外傷のような、有害な炎症症状を治療するための、１つの可能性のある方法である。
【００１８】
定義
本明細書で使用するところの、用語「メディエーター」は、炎症の環境にて効果を有する、任意の可溶性因子を含むことを意味する。本明細書で使用するところの用語「誘導因子」はさらに、特定の分子の発現を増加させ、機能を増強する因子を意味する。
【００１９】
語句「治療（treatment）」または「治療すること（treating）」は、疾患または障害の完全な治癒、ならびに該疾患または障害の改善または緩和を含むことと理解されるであろう。
【００２０】
用語「予防（prevention）」は、前記疾患または障害を発病する個体のリスクを防止、予防ならびに低減することを含むと理解されるであろう。本用語はまた、組織を傷害から防止するために、非常に早期の段階（たとえば手術前、脳卒中および梗塞患者における完全な診断前）で、本発明の方法にしたがって、アデノシンレベルを上昇することによる、組織の前処理を含むとも理解されるであろう。
【００２１】
用語「個体（indivisual）」は、ヒトまたは動物の患者（subject）を言う。
【００２２】
表現「有効量（effective amount）」は、とりわけ、動物またはヒト患者への投与に際し、望む治療的結果を成し遂げるのに充分な、本発明による薬剤の任意の量を含むことを意味する。
【００２３】
語句「アデノシンのレベルの上昇（elevated level of adenosine）」は、本発明にしたがって行なわれた測定なしであろう正常組織と比べて、少なくとも２％高い、好ましくは少なくとも２０％高い、もっとも好ましくは少なくとも３０％高い、アデノシンレベルとして解釈されるべきである。
【００２４】
語句「アデノシンレベルの上昇を必要とするか、またはそれによって利益を得る疾患または障害」は、該疾患または障害の予防または治療が、アデノシンレベルの上昇によって促進されることを意味する。
【００２５】
語句「内皮ＣＤ７３発現をアップ−レギュレートすることを必要とする、またはそれによって利益を得る疾患または障害」は、該疾患または障害の予防または治療が、そのようなアップ−レギュレーションによって促進されることを意味する。
【００２６】
表現「炎症症状（inflammatory condition）」は、個体における組織中の任意に有害で、望まれない炎症応答を含むことを意味し、そこでは、該炎症症状は、組織外傷、心筋梗塞または脳卒中、臓器移植または他の外科手術に起因する再灌流傷害のような急性症状、またはアレルギー性症状、自己免疫疾患および炎症性疾患を含む慢性症状から生じ得る。
【００２７】
組織外傷または再灌流傷害の治療は、本発明において、とりわけ、該外傷または再灌流傷害が未処理のまま残された場合に、とてもおこりやすい炎症症状の予防として理解されるべきである。
【００２８】
好ましい実施態様
個体におけるアデノシンのレベルの上昇が、組換えＣＤ７３タンパク質を投与することによって、またはサイトカインもしくは内皮ＣＤ７３発現を誘導することが可能な他の因子によって、または両治療の組み合わせによって誘導可能であるけれども、多くの場合、サイトカインまたは同様の能力を有する他の因子の使用が好ましい。しかしながら、重度の外傷においては、代替治療として、または追加的治療として、アデノシン産生の増加を迅速に達成するために、組換えＣＤ７３タンパク質の投与が有用であり得る。
【００２９】
本発明で使用されるべき好適な薬剤には、サイトカインまたはＣＤ７３遺伝子の転写を直接的または間接的にアップ−レギュレートする他の因子が含まれる。本発明での使用のための好適なサイトカインは、典型的には、インターフェロンまたはインターロイキンであるが、他の薬剤も使用できる。サイトカインがインターフェロンである場合、インターフェロンは、アルファ−、ベータ−、ガンマ−、オメガ−または任意の他のインターフェロンであり得、前述したインターフェロンの任意のサブタイプであり得る。とりわけ、アルファ−およびベータ−インターフェロンが、本発明での使用に好適であると考えられる。
【００３０】
内皮ＣＤ７３発現を誘導可能な任意のインターロイキンもまた、本発明での使用のために好適である。そのようなインターロイキンの例としては、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＬ−２０をあげることができる。
【００３１】
個体のアデノシンレベルの上昇を必要とするか、または個体のアデノシンレベルの上昇から利益をえる典型的な疾患または障害は、組織外傷；心筋梗塞または脳卒中、臓器移植または他の外科手術に起因する再灌流傷害；癌または癌転移；または前記外傷または再灌流傷害から生じる炎症症状、またはアレルギー性症状、自己免疫疾患および炎症性疾患を含む慢性症状から生じる炎症症状である。そのような慢性症状の例は、関節炎、喘息などのアレルギー性症状、炎症性大腸炎のような炎症性状態、または皮膚、乾癬、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫疾患、Ｉ型およびII型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、クローン病または組織移植による拒絶反応のような炎症状態をあげることができる。
【００３２】
特に好ましい実施態様によれば、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカイン、または両方の投与は、発現の上昇によって、または組換えＣＤ７３タンパク質の直接投与によって得られるＣＤ７３レベルの上昇の結果として産出されるであろうアデノシンの供給源を保護するために、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の投与と組み合わされる。
【００３３】
もう１つの実施態様によれば、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカイン、または両方の投与は、ＡＭＰがアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へ変換するのを防止する、アデニル酸キナーゼ阻害剤の投与と組み合わされる。組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカイン、または両方の、ＡＭＰおよびそのようなアデニル酸キナーゼ阻害剤との混合投与が、とりわけ好ましい。
【００３４】
また他の好ましい実施態様によれば、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカイン、または両方の投与は、アデノシンの分解を防止する、アデノシンデアミナーゼ阻害剤の投与と組み合わされる。これはまたさらに、ＡＭＰの投与と組み合わせることができ、任意には、ＡＭＰがアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へ変換するのを防止する、アデニル酸キナーゼ阻害剤の投与とも組み合わせることができる。
【００３５】
アデノシンレベルを調節する代謝経路を図１０に示す。
【００３６】
他の好ましい実施態様によれば、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカインまたは両方の、任意にはアデノシン一リン酸の投与との組み合わせでの投与は、外傷患者または梗塞または脳卒中患者が治療を受け次第開始する（任意に、最終診断が完全に明確になっていなくても）。この結果、アデノシンレベルを可能な限り急速に増加することができる。外科手術の場合、任意にアデノシン一リン酸の投与との組み合わせでの、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカインまたは両方の投与は、手術の前、たとえば手術の開始１２時間前に開始することが有用であり得る。また、これらの場合では、アデニル酸キナーゼ阻害剤および／またはアデノシンデアミナーゼ阻害剤を、前記薬剤に加えて投与することができる。
【００３７】
治療的有効量、投与経路および剤形
そのような治療を必要とする患者に投与すべき、本発明による成分の治療的有効量は、たとえば、患者の年齢および体重、治療を必要としている正確な症状およびその重症度、および投与経路などの多数の因子に依存し得る。正確な量は、最終的には当業医療者の判断である。したがって、本発明の実施は、任意の用量、他の治療的に有効な薬剤との組み合わせ、経口、局所、吸入または非経口投与のための、医薬処方またはデリバリーシステムが関与しうる。
【００３８】
本発明による薬剤の投与のための量および投与計画は、再潅流傷害、脳卒中、組織移植、外傷、癌または癌転移、または慢性炎症性疾患のような、炎症関連障害を治療する当業者によって簡単に決定することができる。
【００３９】
本発明に基づいて、たとえば皮下、筋肉内、静脈内または経皮で投与された、インターフェロンのようなサイトカイン、または他の因子が、ＣＤ７３のアップレギュレーションを誘導し、したがって、抗炎症性であるアデノシンの局所濃度を増加させることが予想される。これにより、非常に短い半減期を持ち、したがって治療的な使用に関して最適ではない、アデノシンの使用に関する問題が解決される。
【００４０】
サイトカインまたは他の因子は、本発明によれば、好ましくは注入または注射によって投与され得る。血管内注入は、通常、注入バッグまたはボトル内に含まれる非経口溶液を用いて実施され、非経口溶液の投与速度を調整するために、種々のシステムに連結し得る。あるいは、サイトカインまたは他の因子は、本発明によれば、エアロゾルとして投与しうる。
【００４１】
注入または注射のための好ましい処方には、ヒト血清アルブミンのような担体、薬学的に許容し得る塩、リン酸塩のような緩衝液および／または他の薬学的に許容し得る賦形剤が含まれ得る。たとえばサイトカインまたは他の因子のような活性成分は、たとえば１〜５０×１０6  ＩＵ／ｍｌの範囲の量で提供され得る。処方は、好ましくは、投与の前に、水、または注射のために好適な他の溶液の添加によって調製されるように、凍結乾燥粉末の剤形として提供され得る。
【００４２】
インターフェロンのようなサイトカインまたは同様の能力を有する他の因子を、炎症を患っているか、そのリスクのある患者に投与することができる。このような種類の炎症症状は、たとえば脳卒中および心筋梗塞の間の、虚血性再潅流傷害である。また、臓器移植および外傷は、しばしば主要な炎症構成成分と関連付けられる原因である。それらの固有の性質により、様々なサイトカインが、その特異的疾患標的を有し、ベータインターフェロンは、脳卒中および心筋梗塞における虚血性再潅流傷害に対してもっとも好適なインターフェロンであり、一方、アルファ−インターフェロンは、心筋梗塞での選択薬ではない。
【００４３】
組換えＣＤ７３タンパク質を投与する場合、好適な投与経路は、注入または注射であり得る。好適な一日用量は、０．１〜５．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００４４】
アデノシン一リン酸は、皮下、筋肉内、静脈内または経皮的に投与され得る。典型的な一日用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【００４５】
また、任意に使用されるアデニル酸キナーゼ阻害剤またはアデノシンデアミナーゼ阻害剤は、たとえば、皮下、筋肉内、静脈内または経皮的に投与され得る。典型的な一日用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【００４６】
本発明は、以下の非制限的実施例の項目で例示され得る。
【実施例】
【００４７】
詳細に本発明のさらなる記述を与える、以下の実施例では、以下の材料および方法が使用された。
【００４８】
細胞、抗体および試薬。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離し、完全培地中、ゼラチンコート細胞培養フラスコ上で培養した。健康なボランティアからのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Histopague-1077、ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）を用いて単離した。ＰＢＬ、Ｕ２６６Ｂ１細胞株、およびＨＥＣ内皮細胞株（ＥａＨｙ−９２６と同等）を、１０％  ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含む、ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。抗−ＣＤ７３  ｍＡｂ  ４Ｇ４（マウスＩｇＧ１）、抗−ＩＣＡＭ−１  ｍＡｂ  ５Ｃ３（ＩｇＧ１）および陰性コントロール抗体としてニワトリＴ−細胞に対するｍＡｂ  ３Ｇ６（マウスＩｇＧ１）を使用した。α，βメチレンアデノシン５’−二リン酸（ＡＭＰＣＰ）およびアデノシン５’−一リン酸（５’−ＡＭＰ）は、シグマ（シグマ  ケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）からのものである。
【００４９】
誘導および免疫蛍光染色。誘導に関する詳細を、表１に示す。各時点に対して、コントロールフラスコを誘導因子なしにインキュベートした。
【００５０】
３つの異なるプロトコールを、免疫蛍光染色のために使用した。
【００５１】
Ａ）ＣＤ７３の表面発現における、種々の誘導体のパネルの効果を調べるために、免疫蛍光解析を実施した。簡単に記すと、ＨＵＶＥＣを、誘導因子のある状態、またはない状態で処理し、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−トリプシンで分離した。各染色あたり、５×１０5細胞を、ハイブリドーマ上清または精製抗体（最終濃度、１０マイクログラム／ｍｌ）として、飽和濃度のｍＡｂ  ３Ｇ６（陰性コントロール）、４Ｇ４（抗−ＣＤ７３）、および５Ｃ３（抗−ＩＣＡＭ−１）と共に、４℃にて２０分間インキュベートし、２回洗浄した。ついで、細胞を、４℃にて２０分間、５％  ＡＢ−血清を含む１：１００希釈ＦＩＴＣ−共役ヒツジ抗−マウス−ＩｇＧ  ｍＡｂ（シグマ）と共にインキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、１％  パラホルムアルデヒドにて固定した。全てのインキュベーションおよび洗浄は、２％  ＦＣＳおよび１ｍＭ  ＮａＮ３を含む、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で実施した。ついで、蛍光を、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ、ベクトン−ディッキンソン（Becton-Dickinson）、サンノゼ、カリホルニア州）を用いて検出した。コントロールおよび処置細胞間の差を、
【数１】
2011225607.tif 000002
より算出した。
Ｂ）細胞内ＣＤ７３の検出のために、リンパ球を、−２０℃でアセトン中、２分間のインキュベーションによって、免疫蛍光染色前に透過性とした。ついで細胞を、５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、（Ａ）で記述したように、染色し、ＦＡＣＳによって解析した。
Ｃ）ＨＵＶＥＣまたはＰＢＬ上のＣＤ７３の分布を調べるために、細胞をまず、Ａ）でのように染色し、ついで、ガラス−スライド上に、５分間、１０００ＲＰＭで遠心し、ホルムアルデヒドで固定し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（サザン  バイオテクノロジー  アソシエイツ社（Southern Biotechnology Associates Inc.）、バーミンガム、アラバマ州）でマウントした。あるいは、ＨＵＶＥＣ単層を、ゼラチンコートガラススライド上で増殖させ、（Ａ）にて記述したように、飽和濃度のｍＡｂｓとともに細胞をインキュベートすることによって、ＣＤ７３、ＩＣＡＭ−１または陰性コントロールに対して染色し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０）で解析した。
【００５２】
ＣＤ７３  ＲＮＡ解析。ＨＵＶＥＣを、細胞培養フラスコ中でコンフルエントに増殖させ、ＰＢＬは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｇｕｅを用いて誘導の前に単離した。ＨＵＶＥＣおよびＰＢＬ両方の１×１０7細胞を、培養培地中、ＩＦＮアルファ  １０００Ｕ／ｍｌと共にインキュベートした。同数の細胞を、未処理のまま静置した。ＲＮＡを、製造元の取扱説明書にしたがって、ＵｌｔｒａｓｐｅｃＴＭ−ＩＩ  ＲＮＡ単離システム（バイオテックス  ラボラトリーズ社（Biotecx Laboratories, Inc.）、ヒューストン、テキサス州）を用いて単離した。１〜２μｇの総ＲＮＡを、ＤｎａｓｅＩ処理した（増幅グレード（Amplification Grade）、ギブコ  ＢＲＬ、ライフ  テクノロジーズ（Gibco BRL, Life Technologies）、ギャザースブルク（Gathersburg）、メリーランド州）。ｃＤＮＡを、製造元の取扱説明書にしたがって、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ 逆転写酵素（ギブコ  ＢＲＬ、ライフ  テクノロジーズ）を用いて作製した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定の前に、試料をＲｎａｓｅＨ（ギブコＢＲＬ、ライフ  テクノロジーズ）で処理した。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対するプライマーおよびプローブを、内部標準として使用した。ＣＤ７３プライマーおよびプローブを、プライマーエクスプレスコンピュータソフトウェア（ＰＥ  バイオシステムズ（PE Biosystems）、フォスターシティー、カリホルニア州）を用いて設計した。ＣＤ７３プライマー５’ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣＡ３’および５’ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＣＣＡ３’、およびＣＤ７３プローブ５’ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧ３’を使用した（メドプローブ（MedProbe）、セント  ハンスハウゲン（St.Hanshaugen）、ノルウェー）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライド  バイオシステムズ（Apploied Biosystems）、ブランクブルグ（Branchburg）、ニュージャージー）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（アプライド  バイオシステムズ）を用いて実施した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現を、標準化のための参照として使用し、コントロールとＩＦＮ−α処置細胞との間のＣＤ７３  ｍＲＮＡ発現の相対的増加を計算した。
【００５３】
エクト−５’−ヌクレオチダーゼアッセイ。エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性を、先に記述されたように（１９）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。簡単に記すと、標準酵素アッセイは、最終容量１２０μｌ  ＲＰＭＩ  １６４０中、４〜６×１０4分離ＨＵＶＥＣ（または１×１０5リンパ系細胞）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロホスフェート、およびトレーサー［2-3Ｈ］ＡＭＰ（特異的活性１８．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム（Amersham））を有する指示濃度の５’−ＡＭＰを含有した。インキュベーション時間は、変換ＡＭＰの量が、最初に導入した基質の７〜１０％を超過しないように、時間との反応の直線性を保証するように選択した。混合物の一部を、Ａｌｕｇｒａｍ  ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ２５４ＴＬＣシート（マケリー−ナジェル（Macherey-Nagel））に適用し、溶媒として、イソブタノール／イソアミルアルコール／２−エトキシエタノール／アンモニア／Ｈ２０（９：６：１８：９：１５）で分離した。3Ｈ−標識ＡＭＰおよびその脱リン酸化ヌクレオシド誘導体を、ＵＶ光で視覚化し、Ｗａｌｌａｃ−１４０９β−スペクトロメーターを用いて定量した。
【００５４】
浸潤性アッセイ。コンフルエント単層のバリア機能を評価するために、ＨＵＶＥＣを、トランスウェルインサートポリカーボネートフィルター（直径６．５−ｍｍ、孔径０．４−μｍ、コスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）上に播種した（５００００細胞／インサート）。フィルターを、フィブロネクチンで、１〜２時間処置し、内皮細胞を播種する前に風乾した。一般的には、単層を、播種後４〜５日調べた。ＨＵＶＥＣは、単層浸潤性の研究の前に７２時間、ＩＦＮ−α（１００Ｕ／ｍｌ）で誘導するか、またはＩＦＮ−αなしの培養液中で増殖させた。内皮単層を通した輸送を、ＦＩＴＣ−標識デキストラン（５００μｇ／ｍｌ、モル重量  ７００００）の流束を測定することによって評価した。内皮単層を、ＦＩＴＣ−デキストラン輸送の開始前、１５分間、ＡＭＰ（５０μＭ）で前処理した。内皮細胞浸潤性におけるＣＤ７３酵素活性の役割を評価するために、ＦＩＴＣ−デキストランの流束を、エクト−５’−ヌクレオチダーゼの特異的阻害剤、ＡＭＰＣＰ（１００μＭ）の存在下または非存在下で測定した。ある実験では、ＡＭＰＣＰを、輸送がＦＩＴＣ−標識化デキストランを加えることによって開始される３０分前に、上または下チャンバーに添加した。インサートを、１０分、２０分、３０分、４０分および１００分の時点にて、底チャンバー（Ｖｉｓｉｐｌａｔｅ、パーキン  エルマー  ライフ  サイエンシズ（Perkin Elmer Life Sciences））から取り出し、ＦＩＴＣ−標識化デキストランを、励起波長および放出波長として、それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍを用いて、フルオロメーター（ＴＥＣＡＮ  Ｕｌｔｒａ蛍光測定器、テカン（Tecan）、オーストリア）中で、底チャンバーから直接測定した。
【００５５】
統計解析。データは、個々の実験の平均値±ＳＥＭとして表す。統計学的比較は、スチューデントのＴ検定を用いて行ない、Ｐ値＜０．０５を有意とした。速度実験で得られたデータを、ミカエルス−メンテン式を用いるコンピュータ解析にかけ、ＫmおよびＶm値を決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍTM  バージョン３．０、サンディエゴ、カリホルニア州）。
【００５６】
実施例１
内皮細胞上のＣＤ７３発現のアップレギュレーション
本研究は、ＣＤ７３発現またはＣＤ７３に基づくエクト−５’−ヌクレオチダーゼ酵素活性の、強力なレギュレーターを見つけるために設計した。つまり、内皮細胞を、広い範囲の、公知の種々な分子の誘導因子に暴露した（表１）。誘導因子は、たとえばインターフェロンおよびＬＰＳである。インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）の存在によって、２０〜２４時間の誘導後、＞２００Ｕ／ｍｌの用量で、ＨＵＶＥＣ上のＣＤ７３発現にて、明らかなアップレギュレーションが導かれた（図１および９）。
【００５７】
本実施例は、ＣＤ７３発現が、インターフェロンにて、内皮細胞上でアップレギュレートされることを示している。ＩＦＮ−αは、臨床医薬品で非常に広く使用されているので、その効果をさらに詳細に評価した。
【００５８】
【表１】
2011225607.tif 000003
【００５９】
実施例２
ＩＦＮ−αによるアップレギュレーションの時間および用量依存性
実際、全ての活性化されていないＨＵＶＥＣが、ＦＡＣＳによって解析した場合、その表面にＣＤ７３を有する。したがって、細胞表面上のＣＤ７３分子の発現の増加を測定するために、ＨＵＶＥＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を解析した。
【００６０】
ＩＦＮ−αアップレギュレーションの速度論をさらに研究するために、ＨＵＶＥＣのコンフルエント単層を、指示した時間の間、異なる用量のＩＦＮ−αを用いてインキュベートした。ＣＤ７３発現は、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−αでの７２時間後、時間依存的にほぼ２倍（９２．４±１１．５％、ｎ＝９）増加した（図１ａ）。ＩＦＮ−αへのＨＵＶＥＣのより長い暴露によっては、ＣＤ７３発現のさらに有意な増加はおこらなかった（データは示していない）。ＣＤ７３アップレギュレーションの同様のパターンが、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γでの誘導後にも見られた（図９）。１０〜１０００Ｕ／ｍｌの範囲の濃度では、１０００Ｕ／ｍｌにて、最も高い強度の増加が観察されたので、ＣＤ７３発現のアップレギュレーションは、用量依存性でもあった（図１ｂ）。
【００６１】
免疫蛍光染色に続く蛍光顕微鏡によって、ＩＦＮ−α処置が、ＨＵＶＥＣ表面上のＣＤ７３の分布または局在化における有意な変化を誘導しないことが明らかになった。かわりに、ＣＤ７３は、細胞表面上で、より強く、しかし同様に分布している（図２）。
【００６２】
本実施例は、時間および用量依存様式にて、ＩＦＮ−αが、内皮ＣＤ７３発現を増加させることを示している。
【００６３】
実施例３
ＣＤ７３  ＲＮＡ発現におけるＩＦＮ−αの効果
つぎに、ＣＤ７３発現の増加が、ＣＤ７３  ＲＮＡ発現の増加によって仲介されるかどうかを測定した。１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＮＦ−αでのＨＵＶＥＣの７２時間インキュベーション後、ＣＤ７３  ＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨに対する平均化の後、コントロール細胞と比較して、３．４±０．５（相対的発現の平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）であった。
【００６４】
これは、実施例１で観察されたＣＤ７３発現の増加が、実際、ＲＮＡ発現の増加によって仲介されることを確認している。
【００６５】
実施例４
アップレギュレーションの細胞型特異性
内皮およびリンパ系ＣＤ７３は構造が同様であるにもかかわらず、ＩＦＮ−αは、これらの２つの細胞型において、異なる効果を促進する。内皮細胞上のＣＤ７３発現が、ＩＦＮ−α誘導性であることを発見した後、リンパ球上ＣＤ７３もまた、同様の状態にて、同様に振る舞うかどうかを測定した。１０００  Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αは、ＰＢＬ上のＣＤ７３発現を有意に増加はさせなかった（図４）。４８時間までのより長い誘導時間でさえ、リンパ球表面上のＣＤ７３発現においては、小さな変化しか観察されなかった。新鮮に単離されたリンパ球が、培養条件内で、よく生存しないことによりＣＤ７３をアップレギュレートしない可能性を排除するために、ＣＤ７３発現リンパ系細胞株Ｕ２６６Ｂ１もまた、ＩＦＮ−αで処理した。これらもまた、誘導の４８または７２時間後でさえ、そのＣＤ７３発現をアップ−レギュレーションできなかった。むしろ、コントロール細胞と比較して、ＩＦＮ−α処置後、４８時間の時点で、減少がおこった（相対ＭＦＩ  ８２．１±５．６％対１００％、ｎ＝３）（図４）。
【００６６】
細胞内ＣＤ７３タンパク質レベルのアップ−レギュレーションも存在するかどうかを明らかにするために、ＰＢＬおよびＨＵＶＥＣを、ＩＦＮ−α誘導後、免疫蛍光染色の前に、アセトンで浸潤性とした。ＣＤ７３の細胞内発現のアップ−レギュレーションは、ＰＢＬでは観察されなかった。同様の結果が、解析をＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡で実施した場合に得られた。ＨＵＶＥＣにおいて、抗−ＣＤ７３  ｍＡｂでの細胞内染色のわずかな増加が、ＩＦＮ−α誘導後に見られた（データは示していない）。
【００６７】
実施例５
臨床腫瘍試料におけるＣＤ７３発現
ＩＦＮ−αがまた、インビボにて、ＣＤ７３の発現を調節するかどうかを調査するために、表在性内皮膀胱癌由来の組織切片を、ＩＦＮ−α２ｂ処置の前後で採取し、染色し、解析した。
【００６８】
表在性内皮膀胱癌を持つ１２人の患者を、実際の手術前１〜３週間、手術に関して評価した。評価訪問に関して、膀胱の正常領域と、腫瘍とから、生検をとった。患者に、手術１日前に、５０００万ユニットのＩＦＮ−α２ｂ（ＩｎｔｒｏｎＡ、シェーリング−プラウ（Schering-Plough）を与え膀胱にしみこませた。膀胱切除を実施し、患者に、再建手術として、従来の尿管腸吻皮膚合術、腸形成または尿管腸吻膀胱合術を実施した。３人の患者が、手術の前にＩＦＮ−αを受けなかった。これらのうち２人は、手術１日前に、膀胱にしみこませた、１００ｍｇ  エピルビシン（ファーモルビシン（Pharmorubicin）、ファルマシア（Pharmacia））を受け、一人はなにも受けなかった。かれらの腫瘍を、手術前（生検）および後に解析し、コントロールとして使用した。全ての患者が西欧男性であった。患者の特徴を表２に示す。
【００６９】
膀胱試料切片を、液体窒素で、急速凍結し、５μｍ切片に切断した。続いて、切片を、第一抗体として、抗−ＣＤ７３  ｍＡｂ  ４Ｇ４または３Ｇ６（陰性コントロール）で染色し、ペルオキシダーゼ−共役ウサギ抗−マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、グロストラップ（Glostrup）、デンマーク）を、第二段階抗体として使用した。反応を、ＰＢＳ中の３，３’−ジアミノベンジジン  テトラヒドロクロライド（ポリサイエンシス社（Polysciences, Inc.）、ウォリントン（Warrington）、ペンシルベニア州）を加えることによって現像した。全てのインキュベーションは、飽和ｍＡｂ濃度での２０分間であり、続いて、ＰＢＳにて２回洗浄した。陽性血管／顕微鏡視野（×２００）の数を計数し、染色の強度を半定量的に評価した。０〜３の組み合わせスコアを各試料に与えた。スコア０は、陽性血管がない試料であり、スコア３は、炎症扁桃腺と等しい染色の試料である。スコア１および２は、この間の染色パターンをカバーするように調整した。全ての試料を無差別に読んだ。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
２つの腫瘍において、悪性細胞は、ＣＤ７３陽性であり、これはいくつかの上皮細胞もＣＤ７３陽性であるという事実を反映している。ＩＦＮ−αは、コントロール切片における処置前後の発現レベルと比較した場合、インビボにて、コントロールおよび癌血管両方の血管内皮におけるＣＤ７３の明らかなアップ−レギュレーションを産出した（図５）。しかしながら、腫瘍内に存在する少数の正常リンパ球では、ＣＤ７３アップ−レギュレーションは検出されなかった。同様に、腫瘍細胞の発現レベルは、ＣＤ７３に関して陽性であった腫瘍におけるＩＦＮ−α２ｂ処置の間、一定のままであった（図６）。ＩＦＮ−αを受けず、生検および手術それ自身によって引き起こされたＣＤ７３の可能性のあるアップ−レギュレーションを制御するために使用した三人の患者は、そのＣＤ７３発現において、有意な増加を示さなかった（一人の患者は、なんの変化も示さず、２人の患者は、腫瘍組織内の内皮ＣＤ７３発現にて、０．５の増加を示した）。したがって、コントロール患者の平均変化は、０．３であり、処置した患者の平均変化は１．３であった（Ｐ＝０．０２）。
【００７２】
本実験は、あきらかに、臨床的に実現可能な量でのＩＦＮ−α投与の結果として、ヒト患者にて、ＣＤ７３がアップ−レギュレートされることを示している。
【００７３】
実施例６
エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性に対するＩＦＮ−αの効果
ＨＵＶＥＣ上のＣＤ７３発現のＩＦＮ−α誘導増加が、エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性における同時誘導をともなうかどうかを決定するために、［3Ｈ］ＡＭＰの［3Ｈ］アデノシンへの変換の直接測定のための放射化学アッセイを適用した。ＨＵＶＥＣ単層の、ＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍｌ、４８時間）による前処理によって、［3Ｈ］ＡＭＰ加水分解の速度における有意な増加が引き起こされ（図７ａ）、一方で、ＩＦＮ−αによるＰＢＬ処理の後に、酵素活性の有意な活性化は検出されなかった（図７ｂ）。
【００７４】
エクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性の機序をさらに解明するために、コントロールおよびＩＦＮ−処置ＨＵＶＥＣによる、［3Ｈ］ＡＭＰ加水分解の速度論解析を実施し、これらの飽和曲線は、図７ｃに見ることができる。統計解析によって、酵素親和性の改変なしに（Ｋｍ〜５０〜６０μｍｏｌ／Ｌ）、ＩＦＮ−αが、未処理細胞と比較して、５’−ヌクレオチダーゼの最大加水分解速度（Ｖmax）を増加させる（５２５±３０対３５０±２９ｎｍｏｌ／１０6細胞／時間）ことが明らかになった。これらのデータは、ＩＮＦ−αが、内皮表面上の、酵素的に活性な５’−ヌクレオチダーゼ分子の数を増加させるが、反面、酵素触媒部位の構造変化を誘導はしないことを示唆している。
【００７５】
興味深いことに、他のヌクレオチド［3Ｈ］ＡＴＰでの同様のアプローチの使用によっては、ＩＦＮ−αでのＨＵＶＥＣの処理の後、ＡＴＰ−加水分解活性の有意な変化を示さず（データを示していない）、これは、エクト−５’−ヌクレオチダーゼ誘導の特異性を確認している。ＣＤ７３が、継続的にリンパ球から、細胞培養上清へ分泌され、酵素活性を増加させることを確かめるために、ＩＦＮ−α誘導リンパ球および未処理コントロール細胞からの細胞培養培地中の、［3Ｈ］アデノシンへの［3Ｈ］ＡＭＰの変換を解析した。細胞培養培地中の酵素的活性における有意な変化は、コントロールおよびＩＦＮ−α処置間で見られなかった（データは示していない）。
【００７６】
これらの実験は、インターフェロン−αが、内皮細胞におけるエクト−５’−ヌクレオチダーゼ活性を増加させることを示している。
【００７７】
実施例７
ＨＵＶＥＣ膜機能に対するＩＦＮ−αの効果
ＩＦＮ−αアップレギュレートＣＤ７３発現およびアデノシン産出におけるＣＤ７３仲介増加がＨＵＶＥＣ膜機能を調節できるかどうかを調べるために、浸透性インサート壁上で増殖しているコンフルエント内皮単層を介したＦＩＴＣ−標識化デキストランの流束を測定した。試験したすべての時点で、ＦＩＴＣ−デキストランの流束の減少によって示されたように、未処理ＨＵＶＥＣと比較して、３日間ＩＦＮ−α（１００Ｕ／ｍｌ）で処理したＨＵＶＥＣの浸潤性において、有意差（Ｐ＜０．０５）があった（図８ａ）。特異的ＣＤ７３酵素阻害剤、ＡＭＰＣＰでのＨＵＶＥＣ単層の前処理が、ＦＩＴＣ−デキストランの流束の増加によって示されたように、ＩＦＮ−α処置に関連した浸潤性の減少を無効にした（図８ｂ）。
【００７８】
これらの結果は、ＡＭＰの存在下で、ＩＦＮ−αがＨＵＶＥＣ膜機能を増加させることを確認した。ＣＤ７３の発現を増加させることによって、したがって、アデノシンレベル血管浸透性が減少し、組織への炎症細胞の管外遊出の減少が導かれることが、強く示唆された。
【００７９】
インターフェロン類は、タンパク質およびＲＮＡレベル両方にて、リンパ球上ではなく、内皮細胞上での、ＣＤ７３の時間および用量依存的長期アップ−レギュレーションを産出する。さらに、アデノシンのＣＤ７３仲介産生が、内皮細胞上でのＩＦＮ−α処置後に増加し、結果として、これらの細胞の浸潤性が減少する。
【００８０】
実施例８
多重臓器不全における、ＡＭＰおよびＩＦＮ−ベータによるラットの混合治療
モデル：多重臓器不全を、３０分間、腸間膜動脈をクランピングすることによって、ラット（体重：２５０ｇ）に誘導した。その後、再潅流時間は２時間であった。治療群のラットに、動脈のクランピング１８〜２０時間前に、１００００ユニットのＩＦＮ−ベータを、皮下に注射した。実際の実験を通して、動物に、連続静脈内注入として、３ｍｌ生理食塩水内、３７．５ｍｇ  ＡＭＰを与えた。多重臓器不全であるが、治療を受けなかったラットをコントロールとして利用した。実験の最後に、本実験モデルにおける主要な標的器官の１つである、肺の組織を解析した。
【００８１】
結果：治療なしのコントロールラットの肺は、図１１（Ａ）で見ることができるように、肺胞腔の崩壊を示し、一方、ＩＮＦ−ベータおよびＡＭＰを与えたラットは、肺胞腔の明らかな崩壊を示していなかった（Ｂ）。したがって、ＩＮＦ−ベータおよびＡＭＰでの治療によって、多重臓器不全の合併症から保護される。
【００８２】
これらの結果すべてによって、サイトカイン、とりわけインターフェロンが、内皮−白血球微小環境において、ＣＤ７３の適切なインビボレギュレーターであり、したがって、ＣＤ７３−依存アデノシン産生を介して、炎症の程度を制御することにおいて、基本的な役割を有することを示唆している。
【００８３】
本発明の方法は、種々の実施態様の形態で組み込まれ得、そのいくつかが本明細書で開示されていることが理解され得る。他の実施態様が存在し、本発明の精神から逸脱しないことが、当業者に対して明らかであり得る。したがって、記述した実施態様は例示であり、制限として解釈されるべきではない。
【００８４】
［参考文献］
1. Thompson, L.F., Ruedi, J.M., Glass, A., Moldenhauer, G., Moller, P., Low, M.G., Klemens, M.R., Massaia, M., and Lucas, A.H. 1990. Production and characterization of monoclonal antibodies to the glycosyl phosphatidylinositol-anchored lymphocyte differentiation antigen ecto-5′-nucleotidase (CD73). Tissue Antigens 35:9-19.
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5. Linden, J. 2001. Molecular approach to adenosine receptors: receptor-mediated mechanisms of tissue protection. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41:775-787.
【図１】
2011225607.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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