(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤の提供。【解決手段】次式2011256118.tif 000003で表せるカルノシン酸を有効成分とするＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤。胃食道逆流症の改善、脂肪組織での血管新生の阻害、結膜炎の改善及びダニアレルギーの改善等に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルノシン酸を有効成分とするＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−８（インターロイキン８）は、白血球の一種である好中球を活性化するサイトカインで、血管内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞等から分泌される。ＩＬ−８は好中球の活性化を行なう他、Ｔリンパ球の走化性誘導等の作用も有する。また、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子）は、感染防御に関係する白血球の一種である顆粒球とマクロファージの増殖を促進する糖蛋白質で、活性化されたＴ細胞や線維芽細胞等から分泌される。ＧＭ−ＣＳＦは、好中球、好酸球、マクロファージの分化増殖を促し、また成熟したそれら細胞には機能亢進の作用を有する。
【０００３】
ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの関与が指摘されている病態は各種報告されており、例えば、脂肪組織での血管新生にＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦが関与していること（非特許文献１）や、結膜炎モデルにおいてＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌が亢進していること（非特許文献２）、さらにダニアレルゲンにより皮膚表皮細胞及び肺上皮細胞からのＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌が亢進すること（非特許文献３及び４）等が報告されている。
また、胃食道逆流症において、食道でＩＬ−８遺伝子の発現が亢進しており、症状の軽減によりその発現は速やかに低下することが報告されている（非特許文献５）。
従って、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現やその作用を抑制することができれば、胃食道逆流症の改善、脂肪組織での血管新生の阻害、結膜炎の改善及びダニアレルギーの改善等に有用であると考えられる。
これまでに、例えば、紫梗抽出分画（特許文献１）、トロンボキサンＡ２拮抗薬であるラマトロバン（特許文献２）等のＩＬ−８産生抑制剤や、ＷＳ−４抗体（特許文献３）等の抗ＩＬ−８抗体製剤が開発されている。
【０００４】
一方、カルノシン酸は、ローズマリーやセージ含有成分の一つとして知られている。カルノシン酸は、例えば、神経細胞の維持に重要な役割を果たす神経成長因子の産生を促進する作用や、抗酸化作用、抗菌作用（非特許文献６）、ヒト繊維芽細胞の過酸化水素への抵抗力を高め、アポトーシスを抑制する作用（非特許文献７）等を有することが報告されている。また、カルノシン酸は、健忘症や認知症、アルツハイマー病に対して治療効果を有することが報告されている（特許文献４）。
しかしながら、これまでにカルノシン酸が表皮細胞におけるＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現に対して与える影響については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−３９４２１号公報
【特許文献２】特開平１１−３２２６００号公報
【特許文献３】特開平１０−１８２４８８号公報
【特許文献４】特開２００６−１９９６６６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１７  （９）．２３６２−２３６８（２００７）
【非特許文献２】Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４４（９）．１６０−１６７（２００８）
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ    １４６（１）．２７−３５（２００８）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ    １６１（７）．３６４５−３６５１（１９９８）
【非特許文献５】日本臨床  ６５巻５号  ８１３−８２１（２００８）
【非特許文献６】Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４  Ｉｓｓｕｅ  ７−８．５０８−５１６（６  Ａｕｇｕｓｔ  ２００７）
【非特許文献７】フレグランスジャーナル，８，５５−６０（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現を抑制する物質の探索をしたところ、カルノシン酸に優れたＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制作用があることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、カルノシン酸を有効成分とするＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤は、優れたＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制作用を有するため、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの生理作用に起因する各種疾病の予防及び／又は治療効果を発揮する医療品、医薬部外品、化粧料、食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】過酸化水素による表皮細胞のＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現量を示す図である。
【図２】カルノシン酸のＩＬ−８発現抑制効果を示す図である。
【図３】カルノシン酸のＧＭ−ＣＳＦ発現抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で用いられるカルノシン酸は、以下の構造を有するフェノール性ジテルペノイドである。
【００１３】
【化１】
2011256118.tif 000002
【００１４】
カルノシン酸は、カルノシン酸を遊離することができる塩、エステルの形態であってもよい。
カルノシン酸は、公知の有機化学合成法（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５８，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０，Ｐａｇｅｓ  ２７−２９）により、また、当該カルノシン酸、又はこの前駆体を含有する天然物やカルス等からの抽出、さらに、必要に応じて有機化学合成法を組み合わせることにより得ることができる。
カルノシン酸又はこの前駆体を含有する天然物若しくはカルスとしては、例えば、ローズマリー、セージ等のシソ科植物等が挙げられる。
また、市販のカルノシン酸を使用することもできる。
【００１５】
上記合成や抽出により得られるカルノシン酸は、医薬品上又は食品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば、粗精製物であってもよく、さらに得られた合成物や抽出物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。
抽出手段としては、例えば水、熱水、アルコール等の極性溶剤又は非極性溶剤を用いて行う溶剤抽出法等が挙げられる。また、精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００１６】
本発明のカルノシン酸は、後記実施例に示すように、表皮細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  試験系においてＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両方の発現を有意に抑制した。本発明者は、細胞障害性の低い特定濃度の過酸化水素負荷によってヒト表皮細胞におけるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現が用量依存的に上昇することを見出した（参考例１）。このことから、当該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  試験系におけるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現抑制作用を指標として、被検物質のＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制効果を評価できると考えられる。
【００１７】
従って、当該カルノシン酸は、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤や、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現やその作用を抑制することに有用性があると考えられる各種疾病、例えば胃食道逆流症の改善剤や、脂肪組織での血管新生の阻害剤、結膜炎の改善剤及びダニアレルギーの改善剤等（以下、「ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等」）として使用でき、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等には、当該カルノシン酸を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００１８】
斯かるＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等は、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制作用や、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現やその作用を抑制することに有用性があると考えられる各種疾病、例えば胃食道逆流症の改善、脂肪組織での血管新生の阻害、結膜炎の改善及びダニアレルギーの改善等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、又は飼料の有効成分として配合して使用することができる。また、当該ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等は、例えばＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現やその作用を抑制することに有用性があると考えられる各種疾病、例えば胃食道逆流症の改善、脂肪組織での血管新生の阻害、結膜炎の改善及びダニアレルギーの改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００１９】
本発明のＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等を、医薬品の有効成分として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００２０】
また、斯かる製剤では、本発明のカルノシン酸と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００２１】
これらの投与形態のうち、経口投与が好ましく、経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の本発明のカルノシン酸の含有量は、通常、製剤全質量の０．０１質量％〜１００質量％であり、好ましくは、０．１質量％〜７０質量％であり、さらに好ましくは、０．５質量％〜５０質量％である。
【００２２】
上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、カルノシン酸として１〜２０００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは５０〜５００ｍｇである。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００２３】
本発明のＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等を、食品の有効成分として用いる場合、その形態は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、およびそれらの原料が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
【００２４】
種々の形態の食品を調製するには、カルノシン酸を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２５】
また、食品中におけるカルノシン酸の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、０．００１〜５０質量％であり、０．００２〜３０質量％が好ましく、０．００５〜１０質量％がより好ましい。
【００２６】
また、本発明のＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制剤等を医薬部外品や化粧料の有効成分として用いる場合は、その形態は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬部外品や化粧料は、本発明のローズマリー及びその抽出物から選ばれる１種以上と、医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００２７】
当該医薬部外品、化粧料中の本発明のカルノシン酸の含有量は、一般的に０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０００１〜１質量％とするのがより好ましい。
【実施例】
【００２８】
参考例１  過酸化水素が表皮細胞のＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現に与える影響
【００２９】
１）方法
表皮角化細胞増殖用培地ＥｐｉＬｉｆｅTM中にヒト表皮細胞（ＮＨＥＫ  （Ｆ）  新生児包皮由来，クラボウ社）を２５００個／ｃｍ2ずつ播種し、３７℃にて細胞密度がサブコンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、５〜１００μＭ  Ｈ2Ｏ2を含む２．０ｍｌ  ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃にて１時間培養した。無処理コントロールは、ＰＢＳ（−）で洗浄後、２．０ｍｌ  ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃にて１時間培養した。
表皮角化細胞増殖用培地ＥｐｉＬｉｆｅTMで洗浄した後、新たに増殖用培地を２．０ｍｌ添加して培養を再開し、６時間後にそれぞれＩＳＯＧＥＮ（和光純薬工業（株））を用いて細胞の総ＲＮＡを回収し、これを鋳型としてスーパースクリプトIIIファーストストランド合成スーパーミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡを用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  をプライマーおよびプローブとしてＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した（使用機器：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００  シークエンスディテクションシステム）。
【００３０】
各試料における遺伝子発現量は標準ｃＤＮＡに対する相対値として表し、更に、内部標準遺伝子としてＲＰＬＰ０遺伝子の相対発現量を測定し、これにより標準化した。なお、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ及びＲＰＬＰ０遺伝子発現量の検討に用いたＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙｓのＩＤはそれぞれＨｓ００１７４９６１＿ｍ１，Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１である。
各ポイントは平均±標準偏差で示した。統計解析は分散分析により行い、その後、Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較検定を用いてコントロールとの比較を行った（＊＊ｐ＜０．０１）。
【００３１】
２）結果
図１から明らかなように、過酸化水素によってヒト表皮細胞におけるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現が上昇した。なお、図１におけるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現変動は、無処理コントロールのＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現量を１００とした場合の相対比（％）として表した。従って、当該過酸化水素負荷条件下の細胞におけるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現抑制作用を指標とすれば、被検物質のＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制効果の評価が可能であると考えられる。
【００３２】
実施例１  カルノシン酸によるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現抑制作用の検討
１）方法
［細胞培養］
細胞培養：培養ヒト表皮細胞（ＮＨＥＫ  （Ｆ）  新生児包皮由来，クラボウ社）を表皮角化細胞増殖用培地ＥｐｉＬｉｆｅTMに増殖添加剤（インスリン  ０．５ｍｌ，ｈＥＧＦ  ０．５ｍｌ，ハイドロコーチゾン  ０．５ｍｌ，抗菌剤  ０．５ｍｌ，ＢＰＥ  ２ｍｌ）を添加したもの（以下、増殖用培地）で培養した。継代には、０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡを用いた。
【００３３】
［過酸化水素処理］
培地を除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後１００μＭ  Ｈ2Ｏ2を含むＰＢＳ（−）を２．０ｍｌ添加して３７℃にて１時間培養した。無処理コントロールは、過酸化水素処理と同様にＰＢＳ（−）で洗浄後ＰＢＳ（−）２．０ｍｌを添加して３７℃にて１時間培養した。
【００３４】
２）評価法
６ｗｅｌｌプレートに表皮細胞を５０００個／ｃｍ2ずつ播種し、２．０ｍｌの増殖用培地中で培養した。細胞密度がサブコンフルエントに達したことを確認した後、サンプルを添加した培地に交換した。サンプル添加培地はカルノシン酸（ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  フナコシ（株））のエタノール溶液を最終濃度１０μＭとなるように増殖用培地に添加して作成した。サンプル添加培地で２４時間培養後、上記の過酸化水素処理を行い、その後細胞培地で洗浄した後、新たに細胞培地を２．０ｍｌ添加して１２時間培養した。サンプルの細胞毒性は細胞の形態を観察し、異常の有無で判定した。なお、溶媒コントロールとしてサンプルの代わりに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を用いた。培養再開後、６時間および１２時間後にそれぞれＩＳＯＧＥＮ（和光純薬工業（株））を用いて細胞の総ＲＮＡを回収し、これを鋳型としてスーパースクリプトIIIファーストストランド合成スーパーミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡを用いてＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  をプライマーおよびプローブとしてＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより比較検討した（使用機器：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  シークエンスディテクションシステム）。各試料における遺伝子発現量は標準ｃＤＮＡに対する相対値として表し、更に、内部標準遺伝子としてＲＰＬＰ０遺伝子の相対発現量を測定し、これにより標準化した。過酸化水素処理によるＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現変動は，無処理コントロールに対する比で表した。ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＲＰＬＰ０遺伝子発現量の検討に用いたＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙｓのＩＤはそれぞれＨｓ００１７４１０３＿ｍ１，Ｈｓ００１７１２６６＿ｍ１，Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１である。
各ポイントは平均±標準偏差で示した。統計解析は分散分析により行い、その後、Ｓｃｈｅｆｆｅ型多重比較検定を用いてコントロールとの比較を行った（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３５】
３）結果
カルノシン酸添加時のＩＬ−８遺伝子発現量及び５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液（溶媒コントロール）添加時のＩＬ−８遺伝子発現量を図２に示す。また、カルノシン酸添加時のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現量及び５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液（溶媒コントロール）添加時のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現量を図３に示す。図２及び３におけるＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現変動は、無処理コントロールのＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現量を１００とした場合の相対比（％）として求めた。
カルノシン酸は、過酸化水素負荷条件下の表皮細胞からのＩＬ−８遺伝子及びＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の両方の発現を有意に抑制した（図２及び３）。このことから、カルノシン酸にはＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦ発現抑制効果があることが確認された。
【図１】
2011256118.tif 000004
【図２】
2011256118.tif 000005
【図３】
2011256118.tif 000006