(57)【要約】【課題】抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングし得る融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子、及び高効率かつ高感度な抗原ペプチドのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】磁性細菌由来の磁気微粒子と、前記磁気微粒子上に存在する磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結された、ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子と、を備えた融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子、並びに、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させること、前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出すること、を含む抗原ペプチドのスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性細菌由来の磁気微粒子と、
前記磁気微粒子上に存在する磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と、
前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結された、ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子と、
を備えた融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子。
【請求項２】
前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合ＭＨＣ分子とが、第二のリンカーペプチドを介して連結された請求項１に記載の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させること、
前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出すること、
を含む抗原ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項４】
更に、前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮することを含む請求項３に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項５】
前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に融合ＭＨＣ分子内にジスルフィド結合を形成させる処理をされたものである請求項３又は請求項４に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項６】
前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に洗浄されたものである請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項７】
前記抗原ペプチドが癌抗原ペプチドである請求項３から請求項６のいずれか１項に記載の抗原ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項８】
磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡと、
ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡと、
を含む組換えベクター。
【請求項９】
更に、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合ＭＨＣ分子とを連結する第二のリンカーペプチドをコードするＤＮＡを含む請求項８に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載の組換えベクターを含む磁性細菌の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子、抗原ペプチドのスクリーニング方法、組換えベクター、及び磁性細菌の形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は１９８１年以来、日本人の死亡原因の第一位である。今後も患者数が増加することが予測されており、より有効な治療方法と診断方法の開発が求められている。
現在、癌の治療方法として免疫療法の開発が進められている。免疫療法の代表的な例として、ペプチドワクチン療法が挙げられる。
【０００３】
ペプチドワクチン療法とは、腫瘍細胞に特異的または過剰に発現するタンパク質由来のペプチド（癌抗原ペプチド）をワクチンとして用いる治療方法である。癌抗原ペプチドを用いて、腫瘍細胞に特異的な免疫細胞を誘導し腫瘍細胞を攻撃させる。
免疫機構の開始点として重要な役割を担っているのが、ＭＨＣ／抗原ペプチド複合体である。Ｔ細胞は細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して抗原提示細胞表面または腫瘍細胞表面のＭＨＣ／抗原ペプチド複合体を認識することで機能を発揮する。したがって、ペプチドワクチン療法の開発のためには、簡便にかつ高効率で癌抗原ペプチドを同定することが重要である。
【０００４】
ＭＨＣ（major histocompatibility complex、主要組織適合遺伝子複合体）はクラスＩとクラスＩＩの二種類に大別され、発現する細胞や抗原提示の機構が異なる。抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ上に提示されるペプチドが１８０種類、ＭＨＣクラスＩＩ上に提示されるペプチドが７５種類同定されている。現在ではＭＨＣ上に提示される抗原ペプチドの配列を抗原タンパク質中から予測するアルゴリズムが開発され、抗原ペプチドの同定に応用されている（非特許文献１及び２参照）。
【０００５】
現在、アルゴリズムを使って同定されたＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドについて、ペプチドワクチン療法の臨床試験が行われている。しかし、臨床有効率は数％に留まり治療方法としては不十分であるとされている。さらには、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）だけでなくヘルパーＴ細胞も刺激することができるワクチンのデザインが求められており、ＭＨＣクラスＩＩ結合性抗原ペプチドのワクチンへの利用が考えられている。
したがって、ＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチド、並びにＭＨＣクラスＩＩ結合性抗原ペプチドを、新たに数多く同定することが求められている。
【０００６】
また、現行の抗原ペプチド同定法においてよく採用される工程の一つとして、組換えＭＨＣタンパク質によるペプチドスクリーニングがある（非特許文献３参照）。しかしながら、ＭＨＣはα鎖とβ鎖から構成される巨大な構造をとることから組換え発現が難しいという問題がある。さらに、複数のジスルフィド結合を有しているためユニット間の構造を正しく構築することが困難であったり凝集が起こりやすいことから、本来の機能を有した可溶性の組換えタンパク質の生産が難しい。
上記の問題を解決する一手法として、α鎖とβ鎖を別々のプラスミドに導入して発現させる方法が大腸菌において報告されている（非特許文献４参照）。しかしながら、その手順は煩雑であり多くの時間を要するという問題がある。
【０００７】
ところで、磁性細菌は、粒径５０〜１００ｎｍ程度の磁性細菌粒子を生成し、菌体内に保持することが知られている。磁性細菌粒子は脂質二重膜で覆われており、この膜中に存在する膜タンパク質をアンカー分子として用いて、様々な機能性タンパク質を磁性細菌粒子上へディスプレイする技術が確立されている（非特許文献５及び６、特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−７５１０３号公報
【特許文献２】特開２００６−３１４３１４号公報
【特許文献３】特開２００８−２７３９２６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Pharmacol Sci 2007;105:299-316
【非特許文献２】Cancer Immunol Immunother 2004;53:196-203
【非特許文献３】J Mol Biol 2004;340:81-95
【非特許文献４】Immunome Res 2009;5:2
【非特許文献５】Appl Environ Microbiol 2004;70:2880-5
【非特許文献６】Anal Chim Acta 2008;626:71-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングし得る融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子、及び高効率かつ高感度な抗原ペプチドのスクリーニング方法を提供することである。更には、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の製造に用い得る組換えベクター、及びそれを含む磁性細菌の形質転換体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様は、磁性細菌由来の磁気微粒子と、前記磁気微粒子上に存在する磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結された、ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子と、を備えた融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子である。
【００１２】
本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合ＭＨＣ分子とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。
【００１３】
本発明の第二の態様は、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させること、前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出すること、
を含む抗原ペプチドのスクリーニング方法である。
【００１４】
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、更に、前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮することを含んでもよい。
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に融合ＭＨＣ分子内にジスルフィド結合を形成させる処理をされたものであることが好ましい。また、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に洗浄されたものであることが好ましい。
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、癌抗原ペプチドのスクリーニングに好適である。
【００１５】
本発明の第三の態様は、磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡと、ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡと、を含む組換えベクターである。
【００１６】
本発明の組換えベクターは、更に、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合ＭＨＣ分子とを連結する第二のリンカーペプチドをコードするＤＮＡを含むものが好ましい。
【００１７】
本発明の第四の態様は、前記組換えベクターを含む磁性細菌の形質転換体である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングし得る融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子、及び高効率かつ高感度な抗原ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。更には、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の製造に用い得る組換えベクター、及びそれを含む磁性細菌の形質転換体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例１の発現用プラスミドの概念図である。
【図２】本発明の実施例２の発現用プラスミドの概念図である。
【図３】本発明の実施例４のウエスタンブロットの写真である。
【図４】本発明の実施例４のウエスタンブロットの写真である。
【図５】本発明の実施例９のＮａｎｏ−ＬＣ／ＭＳの解析結果である。
【図６】本発明の実施例１４のＮａｎｏ−ＬＣ／ＭＳの解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子＞
本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、磁性細菌由来の磁気微粒子と、前記磁気微粒子上に存在する磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結された、ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子と、を備えたものである。
かかる構成とすることにより、抗原ペプチドと可逆的に結合及び解離することが可能な融合ＭＨＣ分子の特性と、磁気誘導可能な磁気微粒子の特性とを利用して、抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングし得る融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を提供することができる。
本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合ＭＨＣ分子とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。
【００２１】
本発明において、「抗原ペプチド結合能」とは、前記融合ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合部位が、α鎖とβ鎖とを有する天然型ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合部位と同等の立体構造を保持することによって抗原ペプチドを結合する能力をいう。
【００２２】
本明細書において、ＭＨＣ分子、融合ＭＨＣ分子、又は融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドとの「結合」とは、抗原ペプチドが、ＭＨＣ分子、融合ＭＨＣ分子、又は融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に、天然型ＭＨＣ分子におけるのと同等程度に保持されていることをいう。
【００２３】
（融合ＭＨＣ分子）
天然型のＭＨＣ分子はα鎖とβ鎖のヘテロダイマーであるが、本発明における融合ＭＨＣ分子は、ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片とＭＨＣ分子のβ鎖またはその断片との間に、第一のリンカーペプチドが配置された融合タンパク質である。
なお、本明細書において「融合タンパク質」とは、２以上のタンパク質またはその断片が連結されている、天然には見出されないタンパク質をいう。融合タンパク質は、それぞれのタンパク質またはその断片をコードする遺伝子をインフレームで連結させて、組換え的に発現させることにより製造することができる。
【００２４】
本発明における融合ＭＨＣ分子としては、抗原ペプチドとの結合能を有する限り、任意の天然型ＭＨＣを基に構成されたものでよい。本発明における融合ＭＨＣ分子は、抗原ペプチドとの結合能を有する限り、α鎖の一部、及び／又はβ鎖の一部を欠いていてもよく、抗原ペプチドとの結合性や、磁性細菌内で発現させた場合の発現効率の観点から、適宜設計され得る。具体的には、ペプチド結合領域及びペプチド結合領域の構造保持に必要な領域を含む細胞外ドメインを保存し、それ以外のドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン）を欠損させたＭＨＣを用い得る。このような融合ＭＨＣ分子は、当業者が通常行う手順に従って遺伝子組換え技術により作製することができる。
【００２５】
本発明における融合ＭＨＣ分子を構成する基となる天然型ＭＨＣの種類は、スクリーニング対象となる抗原ペプチドの種類に応じて選択される。例えば、内在性抗原由来の抗原ペプチドをスクリーニングするためには、ＭＨＣクラスＩが選択され、外来性抗原由来の抗原ペプチドをスクリーニングするためには、ＭＨＣクラスＩＩが選択される。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞に認識され得る抗原ペプチドをスクリーニングするためには、ＭＨＣクラスＩが選択され、ＣＤ４＋Ｔ細胞に認識され得る抗原ペプチドをスクリーニングするためには、ＭＨＣクラスＩＩが選択される。
【００２６】
本発明における融合ＭＨＣ分子を構成する基となる天然型ＭＨＣとしては、ヒト由来に限らず、各種脊椎動物由来を用い得る。ヒトへの臨床適用の観点からは、ヒト免疫機構を活性化し得る抗原ペプチドをスクリーニングするためにヒトＭＨＣを選択し得る。
ヒトＭＨＣはヒト白血球抗原（human leukocyte antigen：ＨＬＡ）と呼ばれ、ＭＨＣクラスＩにはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの３種類が存在し、ＭＨＣクラスＩＩにはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱの３種類が存在する。ＨＬＡは個人間、人種間で多型性に富み、日本人に多い遺伝子型としては、ＭＨＣクラスＩとして、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２等、ＭＨＣクラスＩＩとして、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１等が知られており、本発明においてはこれらが好適に選択され得る。
【００２７】
本発明における融合ＭＨＣ分子は、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片との間に、第一のリンカーペプチドが配置された融合タンパク質である。
第一のリンカーペプチドは、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片との間に配置されていればよく、第一のリンカーペプチドのＮ末端側に、α鎖またはその断片、β鎖またはその断片のいずれが配置されていてもよい。即ち、α鎖またはその断片のＣ末端とβ鎖またはその断片のＮ末端とが第一のリンカーペプチドを介して連結されていてもよく、β鎖またはその断片のＣ末端とα鎖またはその断片のＮ末端とが第一のリンカーペプチドを介して連結されていてもよい。この際、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片とは、抗原ペプチドとの結合性や磁性細菌内での発現効率の観点から、既述のように適宜設計され得る。
【００２８】
前記第一のリンカーペプチドの長さは、特に制限されないが、融合ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合活性の観点から、５〜５０個のアミノ酸残基から構成されることが好ましい。アミノ酸残基が５個以上であると、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片とから形成される抗原ペプチド結合部位が、適切な立体構造で配置され得ると推測され、融合ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合活性がより向上する。アミノ酸残基が５０個以下であると、リンカー内での高次構造が形成されにくいため、融合ＭＨＣ分子全体の構造形成が障害されにくいと推測され、融合ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合活性がより向上する。アミノ酸残基数は、融合ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合活性の観点から、１０〜３０個程度がより好ましく、１５〜２５個程度が更に好ましい。
【００２９】
第一のリンカーペプチドのアミノ酸配列は任意の配列でよい。第一のリンカーペプチドは、複数のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を１ユニットとし、当該１ユニットのアミノ酸配列が繰り返して配列されるリンカーペプチドであることが好ましい。１ユニット内のペプチド配列は、５つのアミノ酸の配列で構成されることが好ましいが、これに制限されるものではない。
【００３０】
第一のリンカーペプチドを構成するアミノ酸は、特に制限はないが、融合ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合活性の観点から、好ましくは、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）である。ペプチドを構成するアミノ酸がグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）であると、アミノ酸自体の大きさが小さく、リンカー内での高次構造が形成されにくいため、融合ＭＨＣ分子全体の構造形成の障害にならないと推測される。
具体的には、グリシンを４つ、次いで、セリンを１つ並べて配列した（Ｇ４Ｓ）を１ユニットとしたペプチドから構成されるリンカーペプチドが好ましいが、ここで、１ユニット内の５つのアミノ酸の配列は制限されるものでない。つまり、１ユニット内において、４つのグリシンと１つのセリンによる配列に関しては、任意に配されてよい。
【００３１】
また、第一のリンカーペプチドとしては、上記の４つのグリシンと１つのセリンのアミノ酸配列により構成される１ユニットが繰り返し配列されたリンカーペプチド（以下、「(Ｇ４Ｓ)ｎポリペプチド」または「ＧＳリンカー」という）が好ましい。ここで、当該１ユニットの繰り返し数（ｎ）には特に制限がなく任意の数でよいが、本発明においては、１回〜１０回程度の繰り返し数とすることができ、２回〜６回程度が好ましく、３回〜５回程度がより好ましい。
【００３２】
第一のリンカーペプチドは、本発明においては、上記(Ｇ４Ｓ)ｎポリペプチドが好ましく、特には、１ユニットの（Ｇ４Ｓ）が３回〜５回繰り返す、(Ｇ４Ｓ)３ポリペプチド、(Ｇ４Ｓ)４ポリペプチド、(Ｇ４Ｓ)５ポリペプチドが好ましい。また、本発明においては、配列番号１により表されるアミノ酸配列のポリペプチドが好ましい。
【００３３】
本発明における融合ＭＨＣ分子は、抗原ペプチドとの結合能を有する限りにおいて、ＭＨＣのペプチド結合領域及びペプチド結合領域の構造保持に必要な領域を含む細胞外ドメインを保存し、それ以外のドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン）を欠損させたものが好ましく、α鎖またはその断片とβ鎖またはその断片とが(Ｇ４Ｓ)３ポリペプチドを介して連結されたものが好ましい。
【００３４】
（磁性細菌由来の磁気微粒子）
本発明において「磁性細菌」とは、体内に、磁気微粒子（磁性細菌粒子、ＢａｃＭＰｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ともいう）を蓄積する能力を有する細菌である。例えば、Magnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８，ＡＴＣＣ７００２６４）、ＭＳ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＡＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５６）、ＭＳＲ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６１）、ＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６１７）等のマグネトスピリラム種の磁性細菌、Desulfovibrio sp. ＲＳ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２８３）等のデサルフォビブリオ種の磁性細菌を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
これらの磁性細菌は、粒径５０〜１００ｎｍ程度の磁気微粒子が１０〜２０個程度チェーン状に連なった構造をしており、厚さ約２〜４ｎｍの有機膜で覆われている。また、磁性細菌によって合成されるＢａｃＭＰｓの形態としては、八面体形、六角柱、弾丸状などの形状があり、これらの形態は種特異的であることが観察されている。
ＡＭＢ−１が合成するＢａｃＭＰｓは、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）からなる磁気微粒子であり、単磁区構造を持つ強磁性体であるため、弱い磁界に対しても強く反応することから、水溶液中で効率的に磁気による濃縮が行える。また、ＢａｃＭＰｓは、脂質膜（脂質二重膜）を本来的に備える。この脂質二重膜を有するため、ＢａｃＭＰｓは強磁性体でありながら水溶液中での分散性にも優れている。
前記脂質膜は、例えば界面活性剤を用いた処理等により、ＢａｃＭＰｓから除去することができる。また、前記脂質膜を構成する脂質を、脂質以外の分子（ポリマー等）に交換することもできる。本発明においては、ＢａｃＭＰｓは、前記脂質膜が除去されたものでもよく、前記脂質膜を構成する脂質が脂質以外の分子に交換されたものでもよい。脂質と交換可能なポリマーとしては、ブロック共重合体やリン脂質極性基を有するポリマー等が挙げられ、ブロック共重合体としては例えば、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡからなるブロック共重合体、リン脂質極性基を有するポリマーとしては例えば、ＭＰＣポリマーが挙げられる。
【００３５】
本発明における「磁気微粒子」とは、磁気応答性（磁界に対する感応性）を有する微粒子を意味し、外部磁界が存在するとき、磁界により磁化する、あるいは磁石に吸着するなどの磁界に対する感応を示す微粒子を指す。
【００３６】
前記磁気微粒子の形状としては、特に制限されないが、球状、楕円体状、粒状、直方体状、立方体状等の多面体状を好ましく例示することができる。前記磁気微粒子の大きさとしては、特に制限されず、磁性細菌から得られる磁気微粒子の大きさでよい。
【００３７】
（磁気微粒子膜タンパク質またはその断片）
本発明において「磁気微粒子膜タンパク質」とは、前記脂質膜（磁気微粒子膜ともいう）に本来的に存在し得るタンパク質をいう。磁気微粒子膜タンパク質またはその断片は、前記脂質膜を除去しても、或いは前記脂質膜を構成する脂質を脂質以外の分子に交換しても、磁気微粒子上に存在し得る。本発明においては、磁気微粒子上に磁気微粒子膜タンパク質またはその断片が存在すれば、前記脂質膜はなくてもよい。磁気微粒子膜タンパク質またはその断片が磁気微粒子上に安定して存在し得、融合ＭＨＣ分子が磁気微粒子上に安定して存在し得る観点からは、磁気微粒子は前記脂質膜を備えることが好ましい。
本発明においては、磁気微粒子上に磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片が存在し、当該磁気微粒子膜タンパク質の全部又は一部に、融合ＭＨＣ分子が連結されている。磁気微粒子膜タンパク質の全部又は一部が融合ＭＨＣ分子を磁気微粒子にアンカリングし、融合ＭＨＣ分子を磁気微粒子表面に効率的に局在させることができる。
【００３８】
磁気微粒子膜タンパク質としては、例えば、マグネトスピリラム種の磁性細菌に由来するものとして、Ｍｍｓ５、Ｍｍｓ６、Ｍｍｓ７、Ｍｍｓ１３、Ｍｍｓ１６等があり、これらをコードするＤＮＡの塩基配列はアクセス番号ＡＢ０９６０８１及びＡＢ０９６０８２としてＤＤＢＪやＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。
【００３９】
本発明における磁気微粒子膜タンパク質としては、磁気微粒子膜に高発現し得るＭｍｓ１３、Ｍｍｓ６、Ｍｍｓ１６、Ｍｍｓ２４等が好ましい。これらの中でも、特開２００６−７５１０３号公報に記載のＭｍｓ１３がより好ましい。
Ｍｍｓ１３のアミノ酸配列は知られている（J Biol Chem 2003;278:8745-50）。Ｍｍｓ１３は１２４アミノ酸からなる膜２回貫通型タンパク質であり、Ｎ末端およびＣ末端が磁性細菌の脂質膜表面にあると考えられている。Ｍｍｓ１３の全領域を含む融合タンパク質は、磁気微粒子上に存在することが可能である。また、Ｍｍｓ１３のＣ末端側の膜貫通ドメインでない領域はなくてもよく、当該領域を欠いたＭｍｓ１３を含む融合タンパク質も、磁気微粒子上に存在することが可能である。
【００４０】
（第二のリンカーペプチド）
本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、前記融合ＭＨＣ分子と前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。より具体的には、磁気微粒子膜タンパク質またはその断片のＣ末端と、融合ＭＨＣ分子のＮ末端とが、第二のリンカーペプチドを介して連結されたものが好ましい。融合ＭＨＣ分子が第二のリンカーペプチドを介して磁気微粒子膜タンパク質またはその断片に連結されていることで、磁気微粒子表面への各種分子や細胞の非特異的な吸着を低減することができ、抗原ペプチドのスクリーニング効率を向上させることができる。
【００４１】
第二のリンカーペプチドは、少なくとも５０アミノ酸残基から構成されることが好ましい。少なくとも５０アミノ酸残基から構成されることで、磁気微粒子表面への各種分子や細胞の非特異的な吸着を低減することができ、抗原ペプチドのスクリーニング効率を向上させることができる。
【００４２】
第二のリンカーペプチドのアミノ酸配列は任意の配列でよく、好ましくは、主として非電荷極性アミノ酸から構成される。
第二のリンカーペプチドは、複数のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を１ユニットとし、当該１ユニットのアミノ酸配列が繰り返して配列されるポリペプチドであることが好ましい。１ユニット内のペプチド配列は、５つのアミノ酸の配列で構成されることが好ましいが、これに制限されるものではない。
【００４３】
第二のリンカーペプチドを構成するアミノ酸は、非電荷極性アミノ酸が好ましく、非電荷極性アミノ酸としては、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）及びセリン（Ｓ）から任意に選択されるが、好ましくは、アスパラギン、グルタミン及びセリンからなる群から２つ以上選択される。非電荷極性アミノ酸は親水性アミノ酸でもあり、第二のリンカーペプチドを主として非電荷極性アミノ酸で構成することで、第二のリンカーペプチドを親水性とすることができる。
【００４４】
より好ましくは、第二のリンカーペプチドは、具体的には、第１の種類のアミノ酸（例えば、アスパラギン）を４つ、次いで、第２の種類のアミノ酸（例えば、セリン）を１つ並べて配列した（Ｎ４Ｓ）を１ユニットとしたペプチドから構成されるポリペプチドが好ましいが、ここで、１ユニット内の５つのアミノ酸の配列は制限されるものでない。つまり、１ユニット内において、４つの第１種アミノ酸（アスパラギン）と１つの第２種アミノ酸（セリン）による配列に関しては、任意に配されてよい。
上記では例として、アスパラギンとセリンを選択した場合を説明したが、１ユニットの配列はアスパラギン、グルタミン、トレオニン、チロシン及びセリンから任意に選択した組合せからなるアミノ酸配列が可能である。
【００４５】
また、第二のリンカーペプチドとしては、上記の４つのアスパラギンと１つのセリンのアミノ酸配列より構成される１ユニットが繰り返し配列されたポリペプチド（以下、「(Ｎ４Ｓ)ｎポリペプチド」または「ＮＳリンカー」という）が好ましい。特に、アスパラギンは、ポリペプチドの親水性と立体障害性の付与の観点から好ましく、セリンは、ポリペプチドに構造上のフレキシビリティを付与することができる。ここで、当該１ユニットの繰り返し数（ｎ）には特に制限がなく任意の値をとり得るが、本発明においては、少なくとも数回、好ましくは１０回程度以上、特に２０回程度の繰り返しが好ましい。
【００４６】
本発明においては、上記(Ｎ４Ｓ)ｎポリペプチドが好ましく、特には、１ユニットの（Ｎ４Ｓ）が２０回繰り返す、(Ｎ４Ｓ)２０ポリペプチドが好ましい。また、本発明においては、配列番号４により表されるアミノ酸配列のポリペプチドが好ましい。
【００４７】
第二のリンカーペプチドは、そのアミノ酸配列内に、プロテアーゼによる消化部位となる配列を設けてもよい。プロテアーゼにより認識され切断される部位を有するように第二のリンカーペプチドを設計することで、プロテアーゼを用いて第二のリンカーペプチドを切断し、融合ＭＨＣ分子を含む融合タンパク質を、前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片から切り離し単離することが可能となる。プロテアーゼとしては、例えば、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、カテプシン等を挙げることができる。
この場合、第二のリンカーペプチド内において、プロテアーゼによる消化部位となる配列を設ける位置としては、特に制限されない。例えば、融合ＭＨＣ分子に比較的長めのＮＳリンカーが付いた融合タンパク質を単離しようとする場合には、第二のリンカーペプチドは、（Ｎ４Ｓ）ユニットを０回〜数回繰返した後にプロテアーゼの認識配列を有し、更に（Ｎ４Ｓ）ユニットを１０回程度以上、好ましくは１５回〜２０回程度繰り返す態様が好ましい。
また、融合ＭＨＣ分子にＮＳリンカーが付かない、若しくは比較的短いＮＳリンカーが付いた融合タンパク質を単離しようとする場合には、第二のリンカーペプチドは、（Ｎ４Ｓ）ユニットを１０回程度以上、好ましくは１５回〜２０回程度繰り返した後にプロテアーゼの認識配列を有し、更に（Ｎ４Ｓ）ユニットを０回〜数回繰り返す態様が好ましい。
【００４８】
本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、磁性細菌由来の磁気微粒子上にＭｍｓ１３を有し、Ｍｍｓ１３と融合ＭＨＣ分子とが(Ｎ４Ｓ)２０ポリペプチドを介して連結されたものが好ましく、Ｍｍｓ１３のＣ末端と融合ＭＨＣ分子のＮ末端とが(Ｎ４Ｓ)２０ポリペプチドを介して連結されたものがより好ましい。
【００４９】
（融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の製造方法）
本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を製造する方法は、特に制限されないが、磁性細菌を用いて製造することができる。具体的には、少なくとも下記の工程を含む製造方法とし得る。即ち、磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質又はその断片と抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子とが連結された融合タンパク質を磁性細菌内で発現させる発現工程と、磁性細菌から磁気微粒子を単離する単離工程とを含む製造方法である。
【００５０】
前記発現工程は、好ましくは、磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と融合ＭＨＣ分子とが、第二のリンカーペプチドを介して連結された融合タンパク質を発現させる工程とする。
より詳細には、これら融合タンパク質を磁性細菌内で合成するためのＤＮＡを作製し、当該ＤＮＡを公知の遺伝子技術によってプラスミドなどのベクターに導入し、組換えベクターを得る。この得られた組換えベクターを、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の公知の導入技術によって、前記融合タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる磁性細菌に導入し、磁性細菌の形質転換体を得る。そして、当該磁性細菌を公知の培養技術により培養することによって、前記融合タンパク質を磁性細菌内で発現させることができる。
【００５１】
前記組換えベクターは、少なくとも、（ｉ）磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ、（ｉｉ）ＭＨＣ分子のα鎖またはその断片および、β鎖またはその断片ならびに、これらの間に配置された第一のリンカーペプチドを含む抗原ペプチド結合能を有する融合ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ、を含む。好ましくは、上記（ｉ）（ｉｉ）は、５’側から（ｉ）（ｉｉ）の順で配置される。
前記組換えベクターは、更に、（ｉｉｉ）前記磁気微粒子膜タンパク質またはその断片と前記融合ＭＨＣ分子とを連結する第二のリンカーペプチドをコードするＤＮＡを含み、５’側から（ｉ）（ｉｉｉ）（ｉｉ）の順で配置された態様が好ましい。
ここで、融合ＭＨＣ分子、磁性細菌由来の磁気微粒子膜タンパク質またはその断片、及び第二のリンカーペプチドの詳細及び好ましい態様は、既述のとおりである。
ＤＮＡの塩基配列は、磁性細菌内での発現をより容易にするため、磁性細菌で多用されるコドン使用頻度に基づいて作成されることが好ましい。例えば、磁性細菌としてMagnetospirllum magneticum ＡＭＢ−１のコドン使用頻度データベースを参照する。
【００５２】
前記（ｉｉ）の融合ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡとしては、そのＤＮＡがコードするタンパク質が抗原ペプチド結合能を有する限り特に制限されないが、例えば、以下のＤＮＡが好ましく挙げられる。
ＭＨＣクラスＩ由来の融合ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡとしては、下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）が好ましいＤＮＡの具体例として挙げられる。
（ａ）配列番号７の塩基配列、配列番号２の塩基配列、及び配列番号８の塩基配列がこの順に配置されてなるＤＮＡ、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡがコードするアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
ＭＨＣクラスＩＩ由来の融合ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡとしては、下記の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）が好ましいＤＮＡの具体例として挙げられる。
（ｄ）配列番号９の塩基配列、配列番号３の塩基配列、及び配列番号１０の塩基配列がこの順に配置されてなるＤＮＡ、
（ｅ）前記（ｄ）のＤＮＡがコードするアミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、抗原ペプチド結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００５３】
なお、本明細書で「１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された」というときの欠失等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が抗原ペプチド結合能を有する範囲であればよく、例えば、１〜９個程度であり、抗原ペプチド結合能の観点からは少ない方がよく、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜４個程度である。
本明細書における「ストリンジェントな条件下」とは、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６５℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
本明細書において「相同性」を具体的な数値として示す場合、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（ＮＣＢＩ、又はAltschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）を用いた配列比較で決定することができる。
【００５４】
前記ベクターとしては、例えば、特開平８−２２８７８２号公報に記載のｐＲＫ４１５、特開平１１−２８５３８７号公報に記載のｐＭＳ−Ｔ１またはその誘導体を好適に用いることができる。
前記ベクターは、磁気微粒子膜タンパク質をコードするＤＮＡのプロモーター領域の配列（プロモーター配列）を搭載することが好ましい。このプロモーター配列は、例えば、特開２００６−７５１０３号公報、特開２００６−３１４３１４号公報等に記載されている。これらの中でも、高転写活性を有するＰｍｍｓ１６プロモーター、Ｐｍｓｐ１プロモーター、Ｐｍｓｐ３プロモーターを好適に用いることができる。
また、前記ベクターは、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子など）を含んでよい。
【００５５】
前記単離工程は、公知の手法に従って、磁性細菌の培養物から融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を採集する工程とする。例えば、培養された菌体を破砕又は溶菌した後、遠心分離にかけることで又は磁気を利用して、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を単離することが可能である。
【００５６】
＜抗原ペプチドのスクリーニング方法＞
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させること、前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出すること、を含む。
かかる構成とすることにより、抗原ペプチドを高効率かつ高感度でスクリーニングすることができる。
【００５７】
融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と抗原ペプチドを含む試料とを接触させる方法としては、特に制限されず、例えば、適切なバッファー中で、室温（２０〜２６℃）にて３０分〜１０時間程度インキュベートすることによって行われる。このとき、前記試料に融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を添加してもよく、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を含む溶液に前記試料を投入してもよい。
【００５８】
前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子から、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出する方法としては、特に制限されない。例えば、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子がおかれた環境、具体的には融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を含む溶液の塩濃度やｐＨを調整することで、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合した抗原ペプチドを解離させて抽出することができる。
抽出した抗原ペプチドについては、公知の解析技術により、分子量、アミノ酸配列、立体構造等を同定することが可能である。
【００５９】
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、更に、前記接触後の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮することを含んで構成し得る。融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を構成する磁気微粒子が磁気応答性を有することを利用して、磁気により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を濃縮することが可能であり、抗原ペプチドのスクリーニング効率を向上させることができる。
融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮する方法としては、特に制限されず任意の方法でよい。具体的な方法としては、実施例に記載の方法が挙げられる。
【００６０】
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法においては、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に、融合ＭＨＣ分子内にジスルフィド結合を形成させる処理をされたものであることが好ましい。融合ＭＨＣ分子内にジスルフィド結合を形成させる処理（以下、「ジスルフィド結合形成処理」ともいう）をされた融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を、前記試料と接触させることで、抗原ペプチドとの結合能が向上し、スクリーニング効率をより上げることができる。これは、前記ジスルフィド結合形成処理により、融合ＭＨＣ分子内にそのアミノ酸配列に基づくジスルフィド結合が形成され、融合ＭＨＣ分子がより適切な立体構造をとって安定化することによると推測されるが、特定の理論に拘束されるものではない。
【００６１】
前記ジスルフィド結合形成処理としては、特に制限されず、例えば酸化処理が挙げられる。酸化処理により、融合ＭＨＣ分子内のＳＨ基が酸化されてジスルフィド結合が形成され得る。
前記酸化処理の方法としては、特に制限されず、融合ＭＨＣ分子内にジスルフィド結合を形成させ得る公知のいかなる方法でもよい。例えば、適切な濃度の還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとを含むバッファー中で、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子をインキュベートする方法が好ましく挙げられる。当該方法においては、還元型グルタチオンの濃度としては、１〜５ｍＭが好ましく、酸化型グルタチオンの濃度としては、０．０１〜０．５ｍＭが好ましい。より好ましくは、還元型グルタチオンの濃度を５ｍＭとし、酸化型グルタチオンの濃度を０．５ｍＭとする。インキュベートの温度及び時間は特に制限されないが、４℃又は室温（２０〜２６℃）にて３０分〜１０時間程度としてよい。
上記の還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとを含むバッファー中でインキュベートする方法は、例えば、Methods in Molecular Biology 2009;524:383-405に記載されており、具体的な方法としては、実施例に記載の方法が挙げられる。
【００６２】
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法においては、前記融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子が、前記試料と接触させる前に洗浄されたものであることが好ましい。洗浄された融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を用いることで、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出する際に、抗原ペプチド以外の非特異的に抽出される分子を低減することができ、抗原ペプチドのスクリーニング効率をより上げることができる。
洗浄方法としては、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子から融合ＭＨＣ分子を失わせない限りにおいて特に制限されない。例えば、前記接触により融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子に結合したペプチドを抗原ペプチドとして抽出する際に用い得る抽出用の緩衝液の中で、室温にて静置又は緩やかに撹拌することで洗浄する方法が挙げられる。
上記の緩衝液としては、例えば酸性の緩衝液、より具体的には、０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ程度、好ましくは０．１〜０．１５ｍｏｌ／Ｌ程度のクエン酸を含有するｐＨ３程度のリン酸緩衝液を例示することができる。
【００６３】
前記ジスルフィド結合形成処理と、前記洗浄とは、いずれを先に行ってもよいが、前記洗浄を先に行うことが好ましい。前記ジスルフィド結合形成処理と、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子と試料とを接触させることとの間に他の処理を入れないことで、前記ジスルフィド結合形成処理によってより適切な立体構造をとった融合ＭＨＣ分子がその構造を保持したまま、抗原ペプチドと接触することができると推測され、抗原ペプチドのスクリーニング効率をより上げることができる。
【００６４】
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法における試料としては、特に制限されず、天然物でも人工合成物でもよく、例えば、各種の動物または植物由来の試料、培養細胞由来の試料、菌、細菌またはウイルス由来の試料などが挙げられる。これらの試料は、そのまま使用しても、精製して用いてもよく、又は必要に応じて適切な溶媒に懸濁されるか、若しくは適宜希釈されて用いられ得る。
【００６５】
本発明の抗原ペプチドのスクリーニング方法は、癌抗原ペプチドのスクリーニングに好適に用いることができる。癌抗原ペプチドをスクリーニングする場合、前記試料としては、血清等のヒト全血由来の試料、癌細胞の破砕液等の癌患者由来の試料、癌細胞の培養上清が例示される。
【００６６】
癌としては、例えば、肺癌、気管及び気管支癌、口腔上皮癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、肝臓及び肝内胆管癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、脳腫瘍、悪性黒色腫（メラノーマ）、皮膚癌等の上皮細胞などが悪性化した癌や腫瘍、筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫等の支持組織を構成する細胞である筋肉や骨が悪性化した癌や腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫等の造血細胞由来の癌や腫瘍等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００６７】
本発明によれば、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を用いて抗原ペプチドをスクリーニングするためのキットが提供され得る。この抗原ペプチドスクリーニング用のキットは、少なくとも、本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を含み、抗原ペプチドと結合した融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を磁気を利用して濃縮するための手段を含み得る。融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の形態で提供されてもよく、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の作製に供する組換えベクター又は磁性細菌の形質転換体を含む発現系の形態で提供されてもよい。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は適宜、蒸留水または蒸留水をMilliQ Lab（日本ミリポア）で処理した純水を用いた。
画像解析は、画像解析ソフトウェアAqua cosmos（浜松ホトニクス）を用いて行った。
Ｎ末端ビオチン標識ペプチドは、株式会社ベックスに合成を依頼し、その他のペプチドは、Gl Biochem (Shanghai) Ltd.に合成を依頼した。これまでのＭＨＣに関する研究で、ペプチドのＮ末端をビオチン化してもＭＨＣ−ペプチド間の結合を妨げないことが示されており（J Cell Biol 2004;119:531-42）、本実施例では、ペプチドのＮ末端に下記のビオチン化Ｃ６リンカーを連結したペプチドを使用した。
【００６９】
【化１】
2011182702.tif 000002
【００７０】
（実施例１）
＜融合ＭＨＣクラスＩ分子発現用プラスミドの構築と磁性細菌の形質転換＞
Ｍｍｓ１３と、ＮＳリンカーと、ＨＬＡ−Ａ２４（実際には、ＨＬＡ−Ａ２４のβ鎖とα鎖とがＧＳリンカーを介して連結された融合タンパク質）とを、この順番に融合させた融合タンパク質（以下、「Ｍｍｓ１３−ＮＳ linker−ＨＬＡ−Ａ２４融合タンパク質」という）の発現用プラスミドｐＵＭ１３ＬＡ２４（図１参照）を、以下のようにして構築した。なお、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子は、日本人に認められるＭＨＣクラスＩ型遺伝子の中で、最も多く見られる遺伝子である。
【００７１】
ＮＳリンカー（(Ｎ４Ｓ)１８＋ＬＶＰＲＧＳ＋(Ｎ４Ｓ)）（配列番号５）をコードする遺伝子（３０３ｂｐ）（配列番号６）を含むプラスミド（ｐＵＣ１８(100)）（TAKARA BIO社に遺伝子合成を発注）から制限酵素ＳｓｐＩを用いてＮＳリンカー遺伝子を切り出し、Ｍｍｓ１３遺伝子を含むプラスミドｐＵＭＰ１６Ｍ１３のＳｓｐＩサイトに導入し、プラスミドｐＵＭ１３Ｌ(100)を構築した。
ｐＵＭＧＰ１６Ｍ１３は、ＳｓｐＩ消化したｐＵＭＧにＰｍｍｓ１６プロモーター、及びその下流にｍｍｓ１３遺伝子を含むＰＣＲ産物をライゲーションしたプラスミドである（Appl Environ Microbiol 2006;72:465-71, Methodのconstruction of expression vectorsを参照）。なお、ｐＵＭＰ１６Ｍ１３は、アンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００７２】
次に、ＨＬＡ−Ａ２４のβ鎖遺伝子（配列番号７）とα鎖遺伝子（配列番号８）とが、ＧＳリンカー（(Ｇ４Ｓ)３）（配列番号１）をコードする遺伝子（４５ｂｐ）（配列番号２）を介して連結され、更にその３’末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１１）をコードする遺伝子（配列番号１２）が連結された融合遺伝子（末尾には更にストップコドンｔｇａが付加されている）（ＭＢＬ社に遺伝子合成を発注）を、ｐＵＭ１３Ｌ(100)のＮＳリンカー遺伝子の下流に導入し、プラスミドｐＵＭ１３ＬＡ２４を構築した。
遺伝子組換えの際に用いる大腸菌は、Ｔｏｐ１０ (インビトロジェン) を用いた。
【００７３】
ＮＳリンカー（(Ｎ４Ｓ)１８＋ＬＶＰＲＧＳ＋(Ｎ４Ｓ)）内のアミノ酸（ＬＶＰＲＧＳ）は、トロンビンの消化部位である。本実施例においては、ＮＳリンカー内に、ＨＬＡ−Ａ２４の回収を予定してトロンビンの認識部位を設けたが、ＮＳリンカーは４つのアスパラギンと１つのセリンの１ユニットを２０回繰り返したポリペプチド（(Ｎ４Ｓ)２０ポリペプチド）とすることができる。
【００７４】
上記で得られたｐＵＭ１３ＬＡ２４を、磁性細菌ＡＭＢ−１にエレクトロポレーションにて導入し、形質転換体を得た。
【００７５】
（実施例２）
＜融合ＭＨＣクラスＩＩ分子発現用プラスミドの構築と磁性細菌の形質転換＞
Ｍｍｓ１３と、ＮＳリンカーと、ＨＬＡ−ＤＲ４（実際には、ＨＬＡ−ＤＲ４のα鎖とβ鎖とがＧＳリンカーを介して連結された融合タンパク質）とを、この順番に融合させた融合タンパク質（以下、「Ｍｍｓ１３−ＮＳ linker−ＨＬＡ−ＤＲ４融合タンパク質」という）の発現用プラスミドｐＵＭ１３ＬＤＲ４（図２参照）を、以下のようにして構築した。なお、ＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子は、日本人に認められるＭＨＣクラスＩＩ型遺伝子の中で、最も多く見られる遺伝子である。
【００７６】
まず、実施例１と同様にしてプラスミドｐＵＭ１３Ｌ(100)を構築した。
次に、ＨＬＡ−ＤＲ４のα鎖遺伝子（配列番号９）とβ鎖遺伝子（配列番号１０）とが、ＧＳリンカー（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号３）を介して連結され、更にその３’末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（配列番号１１）をコードする遺伝子（配列番号１３）が連結された融合遺伝子（末尾には更にストップコドンｔｇａが付加されている）（ＭＢＬ社に遺伝子合成を発注）を、ｐＵＭ１３Ｌ(100)のＮＳリンカー遺伝子の下流に導入し、プラスミドｐＵＭ１３ＬＤＲ４を構築した。
遺伝子組換えの際に用いる大腸菌は、Ｔｏｐ１０ (インビトロジェン) を用いた。
【００７７】
本実施例においては、実施例１と同様、ＮＳリンカー内に、ＨＬＡ−ＤＲ４の回収を予定してトロンビンの認識部位を設けたが、ＮＳリンカーは４つのアスパラギンと１つのセリンの１ユニットを２０回繰り返したポリペプチド（(Ｎ４Ｓ)２０ポリペプチド）とすることができる。
【００７８】
上記で得られたｐＵＭ１３ＬＤＲ４を、磁性細菌ＡＭＢ−１にエレクトロポレーションにて導入し、形質転換体を得た。
【００７９】
（実施例３）
＜磁性細菌を用いた融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の作製＞
実施例１及び２で得られた磁性細菌ＡＭＢ−１の各形質転換体のプレカルチャーを、それぞれ１０ＬのＭＳＧＭ（magnetic spirillum growth medium）（J Bacteriol 1979;140:720-9）に植菌し（プレカルチャー／ＭＳＧＭ＝１／１０００（ｖ／ｖ））、室温（２４〜２６℃）にて約５〜７日間、静置培養した。植菌時には、ＭＳＧＭをアルゴンガスでバブリング（ｐＵＭ１３ＬＡ２４の場合は５〜１０分間、ｐＵＭ１３ＬＤＲ４の場合は３０〜４０分間）することにより微好気状態を形成した。なお、ＭＳＧＭにはアンピシリンを添加した（５．０μｇ／ｍｌ）。
【００８０】
融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の磁性細菌からの分離は、Tanakaらの方法（Anal Chem 2000;72:3518-22）に準じて行った。即ち、静置培養して得られた培養物を遠心分離し（９０００Ｇ、４℃、１０分）、磁性細菌の菌体を集菌した。この菌体をＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に懸濁し、フレンチプレス（有限会社大岳製作所、５５０１Ｍ）を用いて１５００ｋｇ／ｃｍ２の圧力で３回破砕処理した。
この菌体破砕液をガラス容器に移し、ガラス容器の外側にＮｄ−Ｆｅ−Ｂ（ネオジウム−鉄−ボロン）磁石を設置することにより、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を集積させ、菌体破砕液の上清を除去した（以下、磁石を用いた集積物と上清との分離を「磁気分離」という）。ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え懸濁した後に磁気分離することを１０回繰り返し、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の洗浄を行った。洗浄した融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子は、ＰＢＳ緩衝液に懸濁し、４℃で保存した。
以上のようにして、Ｍｍｓ１３−ＮＳ linker−ＨＬＡ−Ａ２４融合タンパク質を連結した磁気微粒子（以下、単に「ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子」という）、及びＭｍｓ１３−ＮＳ linker−ＨＬＡ−ＤＲ４融合タンパク質を連結した磁気微粒子（以下、単に「ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子」という）を得た。
【００８１】
以下、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子の質量を言う場合、当該質量は、融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を適量のＰＢＳに分散させ吸光度（６６０ｎｍ）を測定し、検量線により乾燥質量に換算した値である。
【００８２】
（実施例４）
＜磁気微粒子上のＭＨＣの発現評価＞
実施例３で得られたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子１．０ｍｇ、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子８．０ｍｇに、１％ＳＤＳ溶液をそれぞれ３０μｌ、２５μｌ添加した。それぞれをVoltexミキサー及び超音波により撹拌しながら煮沸した（１００℃、２０〜３０分）。次いで、磁気分離により上清を回収し各サンプルとした。各サンプルに３×ＳＤＳサンプルバッファーを加え（ＨＬＡ−Ａ２４のサンプルには１５μｌ、ＨＬＡ−ＤＲ４のサンプルには１２．５μｌ）、５分間煮沸後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド濃度１２．５％）を行った。続いて、泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜へセミドライ法で転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に対し、ＦＬＡＧ配列に対するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識マウス由来抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマ アルドリッチ ジャパン）（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ−Ｔ）（ＨＬＡ−Ａ２４のサンプルには１５ｍｌ、ＨＬＡ−ＤＲ４のサンプルには１０ｍｌ）を反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳ−Ｔによる１０分間の洗浄を３回繰り返した後、基質としてNBT/BCIP-Blue Liquid Substrate（ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）を加え発色させた。
【００８３】
ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子についての結果を図３に、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子についての結果を図４に示す。図３及び４において、Ｍはマーカーのレーン、１は融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子のサンプルのレーン、２は野生型の磁性細菌ＡＭＢ−１から得た磁気微粒子のサンプルのレーンである。
Ｍｍｓ１３−ＮＳ linker−ＨＬＡ−Ａ２４融合タンパク質は７５ｋＤａであり、当該サイズにバンドが確認された。Ｍｍｓ１３−ＮＳ linker−ＨＬＡ−ＤＲ４融合タンパク質は７４ｋＤａであり、当該サイズにバンドが確認された。本結果により、磁気微粒子上へのＨＬＡ−Ａ２４の発現、及びＨＬＡ−ＤＲ４の発現が確認された。
【００８４】
（実施例５）
＜ＥＬＩＳＡによる磁気微粒子上のＭＨＣクラスＩの発現評価＞
実施例３で得られたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子１００μｇに、ＡＬＰ標識マウス由来抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体１００μｌ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、３０分室温で反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し（２００μｌ×３回）、磁気微粒子の懸濁液５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。５０μｌのルミホス５３０（Lumigen PPD, 4-Methyoxy-4(3-phosphatephenyl) spiro[1, 2-dioxeteane-3, 2’adamantine]disodium salt、３．３ ×１０−４Ｍ)（和光純薬）を加え２分間室温で反応させた後、発光プレートリーダー（Lucy2 luminescence reader、アロカ）を用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表１に示す。
【００８５】
【表１】
2011182702.tif 000003
【００８６】
表１に示すとおり、野生型の磁気微粒子１００μｇ当たりの発光強度が１５７ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃであるのに対し、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子１００μｇ当たりの発光強度は９９３ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃであった。ＦＬＡＧ−ｔａｇはＨＬＡ−Ａ２４のＣ末端部位に存在することから、実施例３で得られたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子上において、ＨＬＡ−Ａ２４融合タンパク質のＣ末端が磁気微粒子表面に局在していることが確認された。
【００８７】
（実施例６）
＜融合ＭＨＣクラスＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ビオチン標識癌抗原ペプチドを用いたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子の結合能評価］
実施例３で得られたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子１００μｇに、ＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを１ｍｌ加え、４℃で３時間反応させた。癌抗原ペプチドとしては、ＭＡＧＥ１ペプチド（ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ）（配列番号１４）、ＣＤＣ２７ペプチド（ＦＳＷＡＭＤＬＤＰＫＧＡ）（配列番号１５）を用いた。
反応後、ＰＢＳで洗浄し（２００μｌ×３回）、ＡＬＰ標識ストレプトアビジン（Roche、ＰＢＳで１０００倍希釈）１ｍｌを加え、室温で３０分間反応させた。次いで、ＰＢＳで洗浄し（２００μｌ×３回）、５０μｌのＰＢＳに懸濁したものをサンプルとした。９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、５０μｌのルミホス５３０を加え２分間室温で反応させた後、前記発光プレートリーダーを用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表２に示す。
【００８８】
ここで用いたＭＡＧＥ１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４への結合が報告されている癌抗原ペプチドである（Int J Cancer 1999;80:169-72）。ＣＤＣ２７ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩへの結合が報告されている癌抗原ペプチドである（Science 1999;284:1351-4）。
【００８９】
【表２】
2011182702.tif 000004
【００９０】
表２に示すとおり、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子をＣＤＣ２７ペプチドと反応させた場合には、野生型の磁気微粒子と同程度にほとんど発光が見られなかった。ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子をＭＡＧＥ１ペプチドと反応させた場合には、強い発光強度が観察された。このことから、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子は、ＭＨＣクラスＩタイプの癌抗原ペプチド結合能を有することが確認された。
【００９１】
（実施例７）
＜融合ＭＨＣクラスＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［グルタチオン処理によるＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子の結合能の変化の評価］
実施例６において、ビオチン標識ペプチドの調製に用いたＰＢＳを、５ｍＭ還元型グルタチオンと０．５ｍＭ酸化型グルタチオンを含むＰＢＳに代え、癌抗原ペプチドとして、ＭＡＧＥ１ペプチド（配列番号１４）、ＣＤＣ２７ペプチド（配列番号１５）、及びＣＭＶｐｐ６５ペプチド（ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ）（配列番号１６）を用いた以外は実施例６と同様にして、発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表３に示す。
なお、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４への結合が報告されている癌抗原ペプチドである（Immunol Lett 2004;95:199-205）。
【００９２】
【表３】
2011182702.tif 000005
【００９３】
表３に示すとおり、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子は、ＭＡＧＥ１ペプチド及びＣＭＶｐｐ６５ペプチドと反応させた場合に強い発光強度を示すことから、ＭＨＣクラスＩタイプの癌抗原ペプチド結合能を有することが確認された。
また、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子は、グルタチオンを含むＰＢＳで処理した場合に発光強度が増大することから、酸化条件においてＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子と癌抗原ペプチドとの結合量が増大することが確認された。このことから、ＨＬＡ−Ａ２４に存在するシステイン間のジスルフィド結合が酸化条件において強化され、癌抗原ペプチドとの結合能が向上したことが示唆された。
【００９４】
（実施例８）
＜融合ＭＨＣクラスＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ＥＬＩＳＡによるペプチド結合時のＨＬＡ−Ａ２４の構造評価］
実施例３で得られたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子１００μｇに、ＰＢＳ又は５ｍＭ還元型グルタチオンと０．５ｍＭ酸化型グルタチオンを含むＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに調製した癌抗原ペプチドを１ｍｌ加え、４℃で３時間反応させた。癌抗原ペプチドとしては、ＭＡＧＥ１ペプチド（配列番号１４）、ＣＤＣ２７ペプチド（配列番号１５）、及びＣＬＣＡ２ペプチド（ＬＬＧＮＣＬＰＴＶ）（配列番号１７）を用いた。
反応後、ＰＢＳで洗浄し（２００μｌ×３回）、一次抗体としてマウス由来抗ＨＬＡ−ＡＢＣモノクローナル抗体（Ｗ６／３２）５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）を加え、室温で３０分反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し（２００μｌ×３回）、２次抗体としてＡＬＰ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン）５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）を加え、室温で３０分反応させた。その後ＰＢＳで洗浄し（２００μｌ×３回）、５０μｌのＰＢＳに懸濁しサンプルとした。９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、５０μｌのルミホス５３０を加え２分間室温で反応させた後、前記マイクロプレートリーダーを用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表４に示す。
【００９５】
なお、ＣＬＣＡ２ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４と同じＭＨＣクラスＩに属するＨＬＡ−Ａ２へ結合する癌抗原ペプチドとして同定されている（J Immunol 2002;169:540-7）。
マウス由来抗ＨＬＡ−ＡＢＣモノクローナル抗体Ｗ６／３２は、抗原ペプチドと複合体を形成し、立体構造が保たれたＨＬＡにのみ特異的に結合することが報告されている（Cell 1978;14:9-20）。
【００９６】
【表４】
2011182702.tif 000006
【００９７】
表４に示すとおり、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子をＰＢＳで調製した抗原ペプチドと反応させた場合には、ペプチド無添加の場合と同程度の弱い発光強度であった。一方、グルタチオンを含むＰＢＳで調製したＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチド（ＭＡＧＥ１ペプチド、ＣＬＣＡ２ペプチド）と反応させた場合には、高い発光強度が観察された。このことから、磁気微粒子上に発現しているＨＬＡ−Ａ２４は、ＨＬＡ−Ａ２４内に存在するシステイン間のジスルフィド結合が酸化条件において強化され、マウス由来抗ＨＬＡ−ＡＢＣ モノクローナル抗体（Ｗ６／３２）が認識可能な構造を形成したことが示唆された。ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子上のＨＬＡ−Ａ２４は、ヒト細胞上に発現した天然型ＨＬＡ−Ａ２４と同様の構造をとってＭＨＣクラスＩ結合性の抗原ペプチドに結合していることが示唆された。
【００９８】
（実施例９）
＜融合ＭＨＣクラスＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ＨＬＡ−Ａ２４結合性抗原ペプチドのスクリーニング］
実施例３で得られたＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子１ｍｇに、クエン酸バッファー（０．０６ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１３ｍｏｌ／Ｌ クエン酸、ｐＨ３．０）５０μｌを加え３０分間室温でインキュベートすることで、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子を洗浄した。その後、磁気分離により上清を取り除き、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子を回収した。
洗浄したＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子に、ＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに調製したＭＡＧＥ１ペプチド（配列番号１４）とＣＤＣ２７ペプチド（配列番号１５）とを１：１の割合又は１：１０の割合で混合したペプチド溶液をそれぞれ１ｍｌずつ加え、４℃で３時間反応させた。反応後、磁気分離により上清を取り除き、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子を回収した。次いで、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子に前記クエン酸バッファー５０μｌを加え、３０分間室温でインキュベートした。磁気分離により上清を回収し、上清を下記のＡ溶液で１０倍希釈し、上清中に含まれたペプチドをＮａｎｏ−ＬＣ／ＭＳにより解析した。結果を図５に示す。
【００９９】
Ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳ解析において、固定相はＡ溶液（２％アセトン、０．１％ギ酸）、移動相はＢ溶液（８０％アセトン、０．１％ギ酸）を用いた。Ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳ解析装置は、direct nanoflow LC system（DiNa; KYA Technologies, Tokyo, Japan）とESI IT Mass spectrometer（LCQ-DECA XP; Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA）を用いた。カラムはＣ１８逆相カラム（C18 Trap Column; 1 mm in length; id, 0.5 mm; C18 Separation Column; 50 mm in length; id, 0.1 mm）を用いた。ＬＣによる分離は下記の条件で行った。各分析の前にはＡ溶液で１０分以上カラムの平衡化を行った。そして、サンプルを注入した後、Ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳをInjection モードに切り替え、Ａ溶液を１０分流してから解析を開始した。カラムにより分離されたペプチド溶液は直接質量分析計に導入し分析した。
・温度：室温
・流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
・勾配：Ａ溶液；１００％；２．１分、Ｂ溶液；０−８％ Linear Gradient；３分、Ｂ溶液；８−４５％Linear Gradient；３０分、Ｂ溶液；４５−１００％ Linear Gradient；５分、Ｂ溶液；１００％；１０分、Ａ溶液；１００％；２０分
・計測時間：７０分
【０１００】
ＭＡＧＥ１ペプチドは、分子量１４８９．７９である。また、ＭＡＧＥ１ペプチドには塩基性のアミノ酸であるリシンとヒスチジンが１つずつ含まれるため、２つのプロトンが付加されやすく、上記解析により観察されるピークとしては２価イオンのピークが予測される。
図５に示すとおり、ペプチド混合比を１：１にした場合には、ＭＡＧＥ１ペプチドに相当するｍ／ｚ １４８９．５９に最も強いピークが検出された。また、ペプチド混合比を１：１０にした場合には、ＭＡＧＥ１ペプチドに２つプロトンが付加された際の質量電荷比に相当するｍ／ｚ ７４５．６２に最も強いピークが検出された。
このことから、ＨＬＡ−Ａ２４連結磁気微粒子を用いることで抗原ペプチドを濃縮して抽出することができ、Ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳ等により抗原ペプチドの同定が可能であることが示された。
【０１０１】
（実施例１０）
＜融合ＭＨＣクラスＩＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ビオチン標識ペプチドを用いた試料濃度およびアッセイ時間の評価］
使用するビオチン標識ペプチドはＤＭＳＯ溶液で５ｍＭに調節後、ＰＢＳで各濃度に調節して使用した。
実施例３で得られたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子１００μｇに、ＰＢＳで０〜６０μＭ（０、１２．５、２５、５０、及び６０μＭ）に調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを１００μｌ加え、９０分間室温で反応させた。ポジティブコントロールのペプチドとしては、ＣＬＩＰペプチド（ＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ）（配列番号１８）、及びネガティブコントロールのペプチドとしては、ＨＥＲ２ペプチド（ＴＹＬＰＴＮＡＳＬ）（配列番号１９）を用いた。
その後ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、ＡＬＰ標識ストレプトアビジン（ＰＢＳで１０００倍希釈）１００μｌを加え、３０分間室温で反応させた。次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し（１５０μｌ×２回）、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌに懸濁させてサンプルとした。９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、５０μｌのルミホス５３０を加え５分間室温で反応させた後、前記発光プレートリーダーを用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表５に示す。
【０１０２】
また、実施例３で得られたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子１００μｇに、ＰＢＳで５０μＭに調製したビオチン標識ＣＬＩＰペプチド（配列番号１８）を１００μｌ加え、室温で０〜６時間（０、１、３、５、及び６時間）反応させた。それぞれの反応時間経過後に、上記と同様の方法でＡＬＰ標識ストレプトアビジンを加え反応させ、発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）の測定を行った。発光強度の解析結果を表６に示す。
【０１０３】
ここで用いたＣＬＩＰは、ＭＨＣクラスＩＩが細胞内で生成される過程で、抗原結合部位であるαユニットとβユニット間に結合しているペプチドとして同定されている（Nature 1992;358:764-8）。ＨＥＲ２ペプチドは、ＭＨＣクラスＩに属するＨＬＡ−Ａに結合する癌抗原ペプチドである（Blood 2002;99:3717-24）。
【０１０４】
【表５】
2011182702.tif 000007
【０１０５】
【表６】
2011182702.tif 000008
【０１０６】
表５に示すとおり、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子をＣＬＩＰペプチドと反応させた場合、ＨＥＲ２ペプチドと反応させた場合に比較し、最大約４倍の発光強度を示した。このことから、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子は、ＭＨＣクラスＩＩ上に提示される抗原ペプチドに結合することが確認された。
表６に示すとおり、ペプチド反応時間を検討した結果、反応時間５時間で最大量のペプチドの結合が見られた。
【０１０７】
（実施例１１）
＜融合ＭＨＣクラスＩＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ビオチン標識癌抗原ペプチドを用いたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子の結合能評価］
実施例３で得られたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子１００μｇに、ＰＢＳで５０μＭに調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを１００μｌ加え、９０分間室温で反応させた。癌抗原ペプチドとしては、ＨＥＲ２ペプチド（配列番号１９）、ＮＹ−ＥＳＯ−１  １１９−１４３ペプチド（ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲ）（配列番号２０）、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド（ＦＦＰＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬＱＬ）（配列番号２１）を用いた。
その後ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、ＡＬＰ標識ストレプトアビジン（ＰＢＳで１０００倍希釈）１００μｌを加え、３０分間室温で反応させた。次いで、ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにバッファーに交換後、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌに懸濁したものをサンプルとした。９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、５０μｌのルミホス５３０を加え５分間室温で反応させた後、前記発光プレートリーダーを用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表７に示す。
【０１０８】
なお、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド（Cancer Res 2001;61:4773-8）と、ＮＹ−ＥＳＯ−１ １１９−１４３ペプチド（Cancer Res 2000;60:4946-52）は、ＨＬＡ−ＤＲ４への結合が報告されている癌抗原ペプチドである。
【０１０９】
【表７】
2011182702.tif 000009
【０１１０】
表７に示すとおり、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子をＨＥＲ２ペプチドと反応させた場合には、ペプチド無添加の場合と同様にほとんど発光が見られなかった。ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチドと反応させた場合、及びＮＹ−ＥＳＯ−１  １１９−１４３ペプチドと反応させた場合には、強い発光強度が観察された。このことから、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子は、ＭＨＣクラスＩＩタイプの癌抗原ペプチド結合能を有することが確認された。
【０１１１】
（実施例１２）
＜融合ＭＨＣクラスＩＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ＥＬＩＳＡによるペプチド結合時のＨＬＡ−ＤＲ４の構造評価］
実施例３で得られたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子１００μｇに、ＰＢＳで５０μＭに調製した癌抗原ペプチドを１００μｌ加え、９０分間室温で反応させた。癌抗原ペプチドとしては、ＨＥＲ２ペプチド（配列番号１９）、ＮＹ−ＥＳＯ−１ １１９−１４３ペプチド（配列番号２０）、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド（配列番号２１）を用いた。
その後、一次抗体としてＰＢＳに懸濁したマウス由来抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ２４３（Biodesign International）１００μｌを加え、室温で３０分反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、２次抗体としてＡＬＰ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン）１００μｌを加え、室温で３０分反応させた。その後ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、５０μｌのＰＢＳに懸濁しサンプルとした。９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、５０μｌのルミホス５３０を加え５分間室温で反応させた後、前記マイクロプレートリーダーを用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表８に示す。
【０１１２】
なお、ＭＨＣクラスＩＩは、α鎖とβ鎖の間のペプチド結合領域に抗原ペプチドが結合することで複合体構造 (αβヘテロダイマー) が保持されることが知られている。抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ２４３は、抗原提示状態のＨＬＡ−ＤＲ／ペプチド複合体に対して特異的に結合することが報告されている（J Biol Chem 1995;270:971-7）。
【０１１３】
【表８】
2011182702.tif 000010
【０１１４】
表８に示すとおり、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子をＨＥＲ２ペプチドと反応させた場合は、ペプチド無添加の場合と同程度の弱い発光強度であったことから、Ｌ２４３と結合していないことがわかった。一方、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチドと反応させた場合、及びＮＹ−ＥＳＯ−１  １１９−１４３ペプチドと反応させた場合には、強い発光強度が観察されたことから、Ｌ２４３と結合していることがわかった。このことから、磁気微粒子上に発現しているＨＬＡ−ＤＲ４は、天然型のＨＬＡ−ＤＲと同様の構造をとって抗原ペプチドを提示していることが示唆された。
【０１１５】
（実施例１３）
＜融合ＭＨＣクラスＩＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ビオチン標識癌抗原ペプチドを用いたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子の抗原特異的結合能の評価］
実施例３で得られたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子２００μｇに、ＰＢＳで５０μＭに調製したビオチン標識癌抗原ペプチドを１００μｌ加え、９０分間室温で反応させた。癌抗原ペプチドとしては、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド（配列番号２１）、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１５８ペプチド（ＦＦＰＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬ）（配列番号２２）、及びＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１５６ペプチド（ＦＦＰＶＩＦＳＫＡＳＳ）（配列番号２３）を用いた。
その後ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、ＡＬＰ標識ストレプトアビジン（ＰＢＳで１０００倍希釈）１００μｌを加え、３０分間室温で反応させた。その後ＰＢＳで洗浄し（１００μｌ×３回）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにバッファーに交換後、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌに懸濁したものをサンプルとした。９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、５０μｌのルミホス５３０を加え５分間室温で反応させた後、前記マイクロプレートリーダーを用いて発光強度（ｋｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ）を測定した。結果を表９に示す。
【０１１６】
ここで用いたＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１５６ペプチド、及びＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１５８ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド配列中のＭＨＣ結合部位と考えられるアミノ酸を含むペプチドである。
【０１１７】
【表９】
2011182702.tif 000011
【０１１８】
表９に示すとおり、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子をＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチドと反応させた場合に、最も強い発光強度が観察され、続いてＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１５８ペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１５６ペプチドの順に強い発光強度が観察された。これは、ＭＡＧＥ−Ａ３の抗原ペプチドを同定する際に検討されたＴ細胞活性化の実験結果（Cancer Res 2001;61:4773-8）と相関している。このことから、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子を用いて、抗原ペプチドのＭＨＣクラスＩＩに対する結合特性を評価できることが示された。
【０１１９】
（実施例１４）
＜融合ＭＨＣクラスＩＩ分子連結磁気微粒子の機能評価＞
［ＨＬＡ−ＤＲ４結合性抗原ペプチドのスクリーニング］
実施例３で得られたＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子１ｍｇに、ＰＢＳで５０μＭに調製したＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド（配列番号２１）を１００μｌ加え、９０分間室温で反応させた。反応後、磁気分離により上清を取り除き、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子を回収した。次いで、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子にクエン酸バッファー（０．０６ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１３ｍｏｌ／Ｌ クエン酸、ｐＨ３．０）５０μｌを加え、３０分間室温でインキュベートした。磁気分離により上清を回収し、上清中に含まれたペプチドを、実施例９と同様にしてＮａｎｏ−ＬＣ／ＭＳにより解析した。結果を図６に示す。
【０１２０】
図６に示すとおり、ＭＡＧＥ−Ａ３ １４６−１６０ペプチド（分子量１６７０．９８）に２つプロトンが付加された際の質量電荷比に相当するｍ／ｚ ８３６．２３に最も強いピークが検出された。このことから、ＨＬＡ−ＤＲ４連結磁気微粒子を用いることで抗原ペプチドを濃縮して抽出することができ、Ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳ等により抗原ペプチドの同定が可能であることが示された。
【０１２１】
実施例の結果が示すとおり、融合ＭＨＣクラスＩ分子連結磁気微粒子を用いれば、ＭＨＣクラスＩに結合性のある抗原ペプチドのスクリーニングが高効率かつ高感度でできる。融合ＭＨＣクラスＩＩ分子連結磁気微粒子を用いれば、ＭＨＣクラスＩＩに結合性のある抗原ペプチドのスクリーニングが高効率かつ高感度でできる。
よって、本発明の融合ＭＨＣ分子連結磁気微粒子を用いることにより、高効率かつ高感度な抗原ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。
【図１】
2011182702.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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