(57)【要約】【課題】抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための製薬組成物を提供すること。【解決手段】製薬組成物は、マンノースを含む炭水化物ポリマーと抗原とを有する複合体と、マンノース受容体保有抗原提示細胞と、を含み、炭水化物ポリマーは遊離のアルデヒド基を含む完全に酸化された炭水化物ポリマーである。また、同製薬組成物は、動物に投与する前に、マンノース受容体保有抗原提示細胞がインビトロ又はイクスビボにて前記複合体をパルス適用される。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において、抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための製薬組成物であって、
前記組成物は、マンノースを含む炭水化物ポリマーと、抗原と、を有する複合体と、マンノース受容体保有抗原提示細胞と、を含み、
前記炭水化物ポリマーは遊離のアルデヒド基を含む完全に酸化された炭水化物ポリマーであり、
前記動物に投与する前に、前記マンノース受容体保有抗原提示細胞は、インビトロ又はイクスビボにて前記複合体をパルス適用される、製薬組成物。
【請求項２】
前記マンノース受容体保有抗原提示細胞は、末梢血白血球、骨髄、幹細胞、腹腔細胞、脾臓、肺およびリンパ節からなる群から選択される細胞集団に由来する請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項３】
前記マンノース受容体保有抗原提示細胞は、マクロファージ細胞及び樹状細胞からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項４】
前記マンノース受容体保有抗原提示細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群から選択される分子を発現する請求項１乃至３のいずれか一項に記載の製薬組成物。
【請求項５】
前記マンノース受容体保有抗原提示細胞は、サイトカイン及びビタミンからなる群から選択される１以上の生体応答調節剤と接触された細胞を含み、前記細胞は、同細胞による炭水化物受容体の発現を誘導するのに効果的な条件にて接触される、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の製薬組成物。
【請求項６】
前記生体応答調節剤は、抗原提示細胞においてマンノース受容体の発現を誘導する、請求項５に記載の製薬組成物。
【請求項７】
前記生体応答調節剤は、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、ビタミンＤ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αからなる群から選択される請求項５又は６に記載の製薬組成物。
【請求項８】
前記抗原は、ムチンポリペプチド、ムチンポリペプチドの１以上の反復サブユニット、または抗原フラグメントであり、前記フラグメントは、少なくとも５個のアミノ酸の反復サブユニットを含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の製薬組成物。
【請求項９】
前記ムチンはヒトムチンである、請求項８に記載の製薬組成物。
【請求項１０】
前記抗原は、ヒトムチンの反復サブユニットの２乃至８０のコピーを含む請求項９に記載の製薬組成物。
【請求項１１】
前記抗原の前記１以上の反復サブユニットは融合ポリペプチドの部分を含む請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の製薬組成物。
【請求項１２】
動物の抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための医薬品の製造において有効量の組成物を使用する方法であって、
前記組成物は、マンノースを含む炭水化物ポリマーと抗原とを有する複合体と、マンノース受容体保有抗原提示細胞と、を含み、前記炭水化物ポリマーは遊離のアルデヒド基を含む完全に酸化された炭水化物ポリマーであり、かつ前記動物に投与する前に、前記マンノース受容体保有抗原提示細胞は、インビトロ又はイクスビボにて前記複合体をパルス適用される、組成物、を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭水化物化合物を用いてＴ細胞活性を調節するための生産物および方法に関する。本発明の生産物は、特に、マンノース受容体保有細胞および抗原に結合された酸化マンノースに関し、該生産物はクラスＩＭＨＣ抗原提示を高めることができる。
【背景技術】
【０００２】
癌は現代社会において、死亡や重大障害の主要な原因となっている。癌は若者、老人、男性、女性を苦しめ、あらゆる人種の人々が癌にかかる可能性があるが、子供の癌には、おそらく小児白血病などの例外はあるものの比較的希である。西洋社会において、結腸および肺の癌は主要な病気となっている。女性では、乳癌が最も一般的な癌の形態である。
【０００３】
多くの癌にはヒトムチンの過剰産生が伴う。ムチンは、多くの上皮細胞および腫瘍によって産生される、約１００キロダルトン（ｋＤ）を越える高度にグリコシル化されたタンパク質である（非特許文献１）。癌細胞上に見られるムチンは、いくつかのムチンが炭水化物被覆に欠損を有し、その結果タンパク質コアが露出しているというように、正常な上皮細胞上で見られるムチンとはいくつかの点で異なっている（非特許文献２）。ヒトのムチンには、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ６およびＭＵＣ７と呼ばれる７つの型が知られている（非特許文献３乃至６）。ＭＵＣ１は、最も至るところで見られる。様々なムチンのどれもが非常に類似した性質、すなわちそれらは貫膜糖タンパク質であり、いずれもセリン、スレオニンおよびプロリン含量の高い不定数の反復アミノ酸配列を有するという性質を有している。変異的にグリコシル化されたムチン（非グリコシル化またはグリコシル化欠失のいずれか）の過剰産生が、乳房、卵巣、膵臓、結腸、肺、前立腺の腫瘍、および他の分泌組織の腫瘍に特徴的にみられる。ヒトムチンＭＵＣ１〜ＭＵＣ７のそれぞれのタンパク質コアのコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列が、クローン化および特徴付けされ、不定数の特殊なアミノ酸モチーフ（ＶＮＴＲモチーフとして知られている）の反復からなる、反復性の高い中央部分を含むことが発見されている。例示として、ＭＵＣ１は、４０〜８０の縦一列に配列した２０アミノ酸モチーフの複製物または反復物を含む反復性の高い中央部分によって分離された、固有のアミノおよびカルボキシル末端配列から構成される。ＭＵＣ１〜ＭＵＣ７のＶＮＴＲモチーフは、以下に列挙する通りである。
ＭＵＣ１    ＶＮＴＲ−ＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴ（配列番号１）
ＭＵＣ２    ＶＮＴＲ−ＰＴＴＴＰＩＳＴＴＴＭＶＴＰＴＰＴＧＴＱＴ（配列番号２）
ＭＵＣ３    ＶＮＴＲ−ＨＳＴＰＳＦＴＳＳＩＴＴＴＥＴＴＳ（配列番号３）
ＭＵＣ４    ＶＮＴＲ−ＴＳＳＡＳＴＧＨＡＴＰＬＰＶＴＤ（配列番号４）
ＭＵＣ５    ＶＮＴＲ−ＰＴＴＳＴＴＳＡ（４９４塩基対挿入配列−８アミノ酸縦列反復）
ＭＵＣ６    ＶＮＴＲ−１６９アミノ酸反復単位（配列番号５）
ＭＵＣ７    ＶＮＴＲ−ＴＴＡＡＰＰＴＰＰＡＴＴＰＡＰＰＳＳＳＡＰＰＥ（配列番号６）
ＭＵＣ６の反復サブユニットは１６９個のアミノ酸から構成されるが、現時点においては、この反復単位のアミノ酸配列は完全には特徴付けされていない。ＭＵＣ７の配列は、最近になって発表された（上記非特許文献６）。
【０００４】
フィン（Ｆｉｎｎ）とその同僚達は、乳癌（非特許文献７及び８）、膵臓癌、卵巣および他の腫瘍に罹患した患者のリンパ節の中に、ヒトムチンと反応する細胞障害性リンパ球が存在することを実証した。ＭＵＣ１ペプチドに対する抗体は、ＭＵＣ１および標的細胞に対するこれらの細胞障害性Ｔリンパ球の活性を阻害することができる（上記非特許文献７および上記非特許文献８）。最近では、ネズミの肺癌に対する細胞障害性リンパ球についての報告もなされている（非特許文献９）。
【０００５】
腫瘍除去に関連する外科手術は患者に外傷を与え、たいていは外観を傷つけ、費用もかかる。外科的処置に代えて、もしくは外科的処置と組み合わせて行うことのできる、腫瘍治療のために確立された化学的治療および照射方法は、大抵の場合、衰弱をもたらすとともに重大な副作用を随伴する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１２８２０−１２８２３，１９８８
【非特許文献２】Ｈａｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：８７２−８８３，１９８９
【非特許文献３】Ｍａｒｊｏｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６５：５５７３−５５７８，１９９０
【非特許文献４】Ｃｒｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５５：６５１−６５２，１９８７
【非特許文献５】Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４：２９３−３０９，１９９４
【非特許文献６】Ｂｏｂｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２０５６３−２０５６  ９，１９９３
【非特許文献７】Ｂａｒｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：７１５９−７１６３，１９８９
【非特許文献８】Ｊｅｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，ｐｐ．３２１−３２８，１９９０
【非特許文献９】Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：６７−７１，１９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、腫瘍の予防／治療のための免疫調節組成物および方法が緊急に必要とされている。
癌を治療するための新しい組成物および方法が緊急に必要とされている。同様に、他の病状、たとえばＩ型アレルギー、マラリア、ＨＩＶ、虫歯、インフルエンザ、コレラ、口蹄疫、髄膜炎、リーシュマニア感染、百日咳、狂犬病、連鎖球菌感染、呼吸感染、麻疹、ライム病、結核、細菌性髄膜炎、帯状ヘルペス、風疹、肝炎、疱疹、Ａ型肝炎、ポリオ、性病／トラコーマ、Ｂ型肝炎、一般的な感冒、頸部癌、髄膜炎／肺炎、水痘、痘瘡、および肺炎／ＰＵＯ（原因不明熱）などの治療のための代替の組成物および方法が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、動物において、抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための製薬組成物であって、同組成物は、マンノースを含む炭水化物ポリマーと、抗原と、を有する複合体と、マンノース受容体保有抗原提示細胞と、を含み、同炭水化物ポリマーは遊離のアルデヒド基を含む完全に酸化された炭水化物ポリマーであり、動物に投与する前に、マンノース受容体保有抗原提示細胞は、インビトロ又はイクスビボにて同複合体をパルス適用される、製薬組成物、を提供する。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の製薬組成物において、マンノース受容体保有抗原提示細胞は、末梢血白血球、骨髄、幹細胞、腹腔細胞、脾臓、肺およびリンパ節からなる群から選択される細胞集団に由来する、ことをその要旨とする。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の製薬組成物において、マンノース受容体保有抗原提示細胞は、マクロファージ細胞及び樹状細胞からなる群から選択される、ことをその要旨とする。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の製薬組成物において、マンノース受容体保有抗原提示細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群から選択される分子を発現する、ことをその要旨とする。
【００１２】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の製薬組成物において、マンノース受容体保有抗原提示細胞は、サイトカイン及びビタミンからなる群から選択される１以上の生体応答調節剤と接触された細胞を含み、同細胞は、当該細胞による炭水化物受容体の発現を誘導するのに効果的な条件にて接触される、ことをその要旨とする。
【００１３】
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の製薬組成物において、生体応答調節剤は、抗原提示細胞においてマンノース受容体の発現を誘導する、ことをその要旨とする。
請求項７に記載の発明は、請求項５又は６に記載の製薬組成物において、生体応答調節剤は、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、ビタミンＤ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンドおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αからなる群から選択される、ことをその要旨とする。
【００１４】
請求項８に記載の発明は、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の製薬組成物において、抗原は、ムチンポリペプチド、ムチンポリペプチドの１以上の反復サブユニット、または抗原フラグメントであり、前記フラグメントは、少なくとも５個のアミノ酸の反復サブユニットを含む、ことをその要旨とする。
【００１５】
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の製薬組成物において、ムチンはヒトムチンである、ことをその要旨とする。
請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の製薬組成物において、抗原は、ヒトムチンの反復サブユニットの２乃至８０のコピーを含む、ことをその要旨とする。
【００１６】
請求項１１に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の製薬組成物において、抗原の１以上の反復サブユニットは融合ポリペプチドの部分を含む、ことをその要旨とする。
【００１７】
請求項１２に記載の発明は、動物の抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための医薬品の製造において有効量の組成物を使用する方法であって、同組成物は、マンノースを含む炭水化物ポリマーと抗原とを有する複合体と、マンノース受容体保有抗原提示細胞と、を含み、炭水化物ポリマーは遊離のアルデヒド基を含む完全に酸化された炭水化物ポリマーであり、かつ動物に投与する前に、マンノース受容体保有抗原提示細胞がインビトロ又はイクスビボにて複合体をパルス適用される、組成物、を使用する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、動物におけるＴリンパ球（Ｔ細胞）応答を調節することができ、これにより、病気の発生を治療または緩和することのできる免疫調節組成物を提供する。本発明は、抗原を、クラスＩ分子による提示のためにクラスＩＭＨＣ経路に送達し、これにより細胞障害性Ｔリンパ球およびＴ１（すなわちＴＨ１）サイトカイン、たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびγ−インターフェロンなどの産生を誘導することによってＴ細胞応答を調節するので、有益である。本発明は、本発明の抗原：炭水化物ポリマー複合体の取り込みを、該複合体の抗原と反応するＴ細胞を活性化することのできる、細胞上のマンノース受容体を誘導することにより高めて、Ｔ細胞応答を調節するという点で特に有益である。さらに、本発明は、たとえばムチンなどの抗原が、動物内の抗原に対抗するか交差反応する天然に存在する抗体によって捕捉されるのを防止するように、本発明の抗原、たとえばムチン：炭水化物ポリマー複合体を動物に投与することができるので、特に有益である。さらに本発明の免疫調節組成物は、動物への投与に対して実質的に無毒であるという利点を有しているので、動物への許容性が大きい。
【００１９】
本発明の１実施形態は、単離されたマンノース受容体保有細胞と、抗原、および完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースから成る複合体とを含む免疫調節組成物を含む。好ましい抗原としては、腫瘍、ウイルス、真菌、原生動物または細菌の抗原が含まれる。好ましい酸化マンノースは、アルデヒドを有する炭水化物ポリマーを含む。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、免疫調節マンノース受容体保有細胞集団を含む組成物を含み、該集団は、免疫調節マンノース受容体保有細胞集団を生産するのに効果的な条件下でマンノース受容体保有細胞を培養することによって得ることができ、該条件は抗原送達培地（ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｄｉｕｍ）を含む。好ましい抗原送達培地は、抗原と、完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースとから成る複合体を含む。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、免疫調節マンノース受容体保有細胞集団を含み、免疫調節マンノース受容体保有細胞集団は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法によって得ることができる。（ａ）インビトロにおいて、マンノース受容体保有細胞を１つ以上の生体応答調節剤とともに培養し、強化マンノース受容体保有細胞集団を生産させる。（ｂ）強化マンノース受容体保有細胞集団を、抗原と、完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースとから成る複合体とともにインキュベートし、免疫調節マンノース受容体保有細胞集団を得る。好ましい生体応答調節剤としては、サイトカインおよびビタミンが含まれる。
【００２２】
本発明は、単離されたマンノース受容体保有細胞と、抗原、および完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースから成る複合体とを含む抗原送達ベヒクルをも含む。好ましい抗原としては、ムチンが含まれる。
【００２３】
本発明は、免疫調節マンノース受容体保有細胞を含む集団を得るための方法であって、マンノース受容体保有細胞に対して強化された細胞集団を、免疫調節マンノース受容体保有細胞を得るのに効果的な条件下で培養することを含み、該条件は抗原送達培地を含むことを特徴とする方法をも含む。好ましくは、上記方法は、マンノース受容体保有細胞に対して強化された細胞集団を、培養工程に先だって１つ以上の生体応答調節剤の存在下でインキュベートすることを含む。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、免疫応答を誘導する方法であって、レシピエント動物に対して、マンノース受容体保有細胞と、抗原、および完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースから成る複合体とを含む免疫調節組成物を有効量投与することを含む方法を含む。
【００２５】
本発明は、抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、単離されたマンノース受容体保有細胞を、抗原、および完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースから成る複合体と接触させることと、該接触後の細胞を動物に投与することとを含む方法をも含む。
【００２６】
さらに本発明には、抗原、および完全に酸化されたマンノースおよび／またはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースを含むマンノースから成る複合体に接触させたマンノース受容体保有細胞を動物に投与することによって、動物に抗原を送達するための方法が含まれ、該方法において、マンノース受容体保有細胞は、Ｔ細胞からの応答が誘引されるように、Ｔ細胞に対する抗原を提示することができる。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、アルデヒド基を有する部分的に還元された炭水化物を含む炭水化物ポリマーに結合された抗原を含む化合物である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、動物において抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための製薬組成物であって、マンノースを含む炭水化物ポリマーと抗原とを有する複合体と、マンノース受容体保有抗原提示細胞と、を含み、炭水化物ポリマーは遊離のアルデヒド基を含む完全に酸化された炭水化物ポリマーであり、かつ動物に投与する前に、マンノース受容体保有抗原提示細胞がインビトロ又はイクスビボにて複合体をパルス適用される、製薬組成物、が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】異なる形のマンノースポリマーをパルス適用した腹膜滲出細胞を用いて、１回のインビトロ免疫化を行った場合と、３回のインビボ免疫化を行った場合とで得られたＣＴＬｐ度数の比較図。
【図２】Ｔ細胞応答を誘導するのに必要とされる抗原提示マンノース受容体保有細胞の最小数を示した図。
【図３】酸化ＭＵＣ１、酸化マンナン融合タンパク質、あるいは緩衝液のみをパルス適用した、腹膜滲出抗原提示マンノース受容体保有細胞によって免疫化されたマウスにおける腫瘍成長を示した図。
【図４】ＧＭ−ＣＳＦまたはγ−インターフェロンで処理され、酸化マンナン融合タンパク質をパルス適用した、抗原提示マンノース受容体保有細胞を含む、腹膜滲出細胞を用いた場合のＣＴＬｐ度数を示した図。
【図５】酸化マンナン融合タンパク質で免疫化した、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ遺伝子をノックアウトしたマウスのＣＴＬｐ度数を示した図。
【図６】酸化マンナン融合タンパク質の注射前にＧＭ−ＣＳＦを注射したマウスにおけるＣＴＬｐ度数を示した図。
【図７】酸化マンナン融合タンパク質をパルス適用したマクロファージの半同種異系および同種異系レシピエントにおけるＣＴＬｐ度数を示した図。
【図８】Ｇａｌａ（１，３）Ｇａｌ−細胞系およびＧａｌａ（１，３）Ｇａｌ＋細胞系における、ＭＵＣ１とガラクトースとの間の交差反応のＦＡＣＳ分析結果を示した図。
【図９】酸化マンナン融合タンパク質で免疫化したＧａｌ  ｏ／ｏマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスから分離した血清中の抗ＭＵＣ１ペプチド抗体の検出結果を示した図。
【図１０】酸化マンナン融合タンパク質、もしくは酸化マンナン融合タンパク質をパルス適用したマクロファージで免疫化したＧａｌ  ｏ／ｏマウスから分離した血清中の抗ＭＵＣ１ペプチド抗体の検出結果を示した図。
【図１１】ｏｘ−Ｍ−ＦＰを注射した正常なマウスと、ｇａｌ  ｏ／ｏ血清と混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰを注射した正常なマウスとの間のＣＴＬｐ度数の差を示した図。
【図１２】ｏｘ−Ｍ−ＳＩＩＮＦＥＫＬを与えたマクロファージ細胞で免疫化したマウスと、ｇａｌ  ｏ／ｏ血清と混合したｏｘ−Ｍ−ＳＩＩＮＦＥＫＬを与えたマクロファージ細胞で免疫化したマウスとの間のＣＴＬｐ度数の差を示した図。
【図１３】正常なマウスの血清またはＧａｌ  ｏ／ｏマウスから分離した血清のいずれかの存在下における、マクロファージおよび酸化マンナン融合タンパク質で免疫化した、正常なマウスとＧａｌ  ｏ／ｏマウスとの間のＣＴＬｐ度数の差を示した図。
【図１４】マンナンへのＭＵＣ１融合タンパク質の結合を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、免疫調節の影響を受けやすい動物において、病気の発生を治療または緩和するための生産物および方法を提供する。特に、本発明の生産物は、炭水化物受容体保有細胞と、抗原および酸化炭水化物から成る複合体とを含む免疫調節組成物を含む。
【００３１】
本発明の１実施形態は、単離された炭水化物受容体保有細胞と、抗原および酸化炭水化物から成る複合体とを含む免疫調節組成物である。本明細書中で用いる「酸化炭水化物」という用語は、完全に（すなわち全体的に）酸化された炭水化物、あるいはアルデヒドを有する部分的に還元された炭水化物（以下で詳細に説明する）を示しうる。本発明の他の実施形態は、抗原および酸化炭水化物から成る複合体に接触させた受容体保有細胞である。本発明によれば、「炭水化物受容体保有細胞と、抗原および酸化炭水化物から成る複合体」または「抗原および酸化炭水化物から成る複合体に接触させた炭水化物受容体保有細胞」を含む組成物という場合、以下の（１）〜（５）の１つ以上を含意し得る。（１）複合体が細胞に結合していない状態の複合体と受容体保有細胞との混合物、（２）複合体が細胞に結合しているが内在化されていない状態の複合体と受容体保有細胞との混合物、（３）複合体が内在化された状態の受容体保有細胞、（４）複合体が内在化され、プロセシングを受けた状態の受容体保有細胞、および／または、（５）複合体が内在化され、プロセシングを受け、提示された状態の受容体保有細胞。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」で示される実体は、１つ以上の実体のことをいい、たとえば「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」という場合には、１つ以上の化合物のことを指すことを注記しておく。そのようなものとして、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つの」という用語も、本明細書中で互換的に使用されることがある。「単離された」という用語は、それ自身の自然の環境から移転された、細胞、ポリペプチドまたはペプチドなどの実体のことをいう。これに関して、「単離された」という用語は、その実体が精製された程度を反映するものではない。本明細書中で用いる「炭水化物受容体保有細胞」とは、細胞表面上の炭水化物に特異的に結合する受容体（すなわち、タンパク質）を含むか、あるいは炭水化物受容体を発現することの可能なあらゆる種類の細胞のことをいう。本明細書中で用いる炭水化物受容体とは、当業者周知の炭水化物受容体のことをいう。炭水化物受容体保有細胞は、様々な濃度の炭水化物受容体保有細胞を含む細胞集団の一部でもあり得ることを注記しておく。したがって、炭水化物受容体保有細胞の集団には、少なくとも１つの炭水化物受容体保有細胞を含む細胞集団が含まれる。あるいは、炭水化物受容体保有細胞の集団は、炭水化物受容体保有細胞の純粋集団から成るものであってもよい（すなわち、１００％炭水化物受容体保有細胞）。好ましくは、炭水化物受容体保有細胞の集団は、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９５％の炭水化物受容体保有細胞を含む。炭水化物受容体保有細胞の集団の相対純度は、炭水化物受容体保有細胞の起源に左右されうることに注目することは当業者の知識の範囲である。本明細書中で用いる「炭水化物受容体保有細胞の強化集団」とは、炭水化物受容体保有細胞（すなわち、炭水化物受容体を有するか、ある���はこれを発現可能な細胞）ではない細胞が集団から除去されるように処理された細胞集団のことをいう。本明細書中で用いる「増加炭水化物受容体保有細胞集団」とは、炭水化物受容体を保有する細胞の数、および／または細胞上の炭水化物受容体の数が、処理前の集団内の細胞に比べて増加するように処理された細胞の集団のことをいう。炭水化物受容体保有細胞は、たとえば、血液、骨髄、リンパ節、または気管支洗浄からの細胞集団内において、当該技術分野における標準的な方法を用いて強化することができる。そのような方法としては、パニング、白血球伝達（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）または増殖強化法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。炭水化物受容体保有細胞の集団を増加する方法について、ここで詳細に説明する。
【００３２】
本発明で使用される適切な炭水化物受容体保有細胞には、動物から単離された細胞、または、組織培養に適合させ、インビトロにおいて増殖させた細胞が含まれる。本明細書中で用いる「インビトロ」という用語は、動物外部で行われる方法のことをいう。「イクス  ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）」という用語は、動物外部において、動物（すなわちドナー動物）の一部分（たとえば、組織、細胞および体液）に対して行われ、該部分を動物（すなわちレシピエント動物）の同じ一部分に戻すことが意図された方法のことをいう。レシピエント動物は、ドナー動物と同一の動物である必要はない。本発明の好ましい炭水化物受容体保有細胞は、骨髄、末梢血液白血球、肺胞マクロファージ、幹細胞、腫瘍細胞、および／または、間質細胞から得られる。細胞は、細胞の起源に応じた当該技術分野において知られる標準的な方法を用いて、動物から単離することができる。より好ましい炭水化物受容体保有細胞には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して強化した細胞が含まれる。適切な抗原提示細胞には、Ｔ細胞に対する抗原を提示することによって、Ｔ細胞応答を誘引することのできる細胞が含まれる。免疫応答の部分は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）による抗原提示によって調節される。ＭＨＣは、抗原に由来するペプチド断片と結合して、Ｔ細胞表面上のＴ細胞レセプターによって認識される複合体を形成し、その結果、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞認識の現象を引き起こす。「Ｔ細胞応答」とは、ＭＨＣによって提示された抗原およびペプチド複合体に対する、Ｔ細胞の応答のことをいう。Ｔ細胞による応答は、天然のＴ細胞などを用いてのＴ細胞の活性化、あるいはすでに活性化されているＴ細胞を用いてのＴ細胞刺激を含んでいてもよい。「細胞媒介性免疫応答」とは、Ｔ細胞の活性化および／または刺激を含む免疫応答のことをいう。本発明によれば、本発明の複合体または組成物は、Ｔ細胞、特に抗原特異的Ｔ細胞を活性化および／または刺激することによってＴ細胞応答を誘引することができる。好ましい抗原提示細胞には、樹状細胞、単球、マクロファージ、およびＢリンパ球（Ｂ細胞）が含まれるが、マクロファージおよび単球細胞がより好ましい。さらに好ましい炭水化物受容体保有細胞には、マンノース受容体保有細胞、すなわち、マンノース受容体を有する細胞が含まれる。本明細書中で用いられる「受容体担持」細胞および受容体陽性細胞は、互換的に使用されるものとする。本発明のさらに好ましい炭水化物受容体保有細胞には、Ｆ４／８０，抗ＭＡＣ−１抗体、抗マンノース受容体抗体、ＮＬＤＣ−１４５、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ６８抗体、抗ＣＤ８０抗体または抗ＣＤ８６抗体を含む抗体に特異的に結合する細胞を強化した細胞が含まれる。
【００３３】
好ましくは、本発明の炭水化物受容体保有細胞は、免疫調節組成物の目的とするレシピエントである動物、あるいは目的とするレシピエントにＭＨＣ適合された動物、たとえば、血縁関係のないドナーまたは当該動物の親戚、好ましくは当該動物の兄弟姉妹を起源とするものである。好ましい炭水化物受容体保有細胞は、本発明の免疫調節組成物の目的とするレシピエントである動物から得られたものである。
【００３４】
１実施形態において、本発明の炭水化物受容体保有細胞には、炭水化物受容体を発現することのできる細胞上の炭水化物に対する、受容体の発現を誘導できる化合物に接触させた炭水化物受容体保有細胞が含まれる。炭水化物受容体の発現を誘導するために用いられる適切な化合物には、サイトカインなどの生体応答調節剤が含まれる。本発明の好ましい生体応答調節剤には、単球、マクロファージおよび／または樹状細胞上の炭水化物受容体の発現を誘導することができるあらゆる化合物が含まれる。より好ましい生体応答調節剤には、サイトカインおよびビタミンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。細胞表面上の炭水化物受容体の数を増加させるために有用な好ましいサイトカインには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、γ−インターフェロン、Ｆｌｔ−３リガンド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、および／または、インターロイキン−６（ＩＬ−６）が含まれ、これらに限定されるわけではないが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３がより好ましい。本発明で使用される好ましいビタミンには、ビタミンＤが含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００３５】
本発明によれば、炭水化物受容体保有細胞は、該炭水化物受容体保有細胞を動物から取り除く前若しくは後に、生体応答調節剤と接触させることができる。これに関して、生体応答調節剤は、インビボにおいて細胞上の炭水化物受容体を誘導するのに適した条件下で動物に投与することができる。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明の炭水化物受容体保有細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＴＮＦγおよび／またはビタミンＤを含む調剤に接触させた、単球、マクロファージおよび／または樹状細胞の細胞集団を含む。
【００３７】
本発明の１実施形態は、免疫調節炭水化物受容体保有細胞を含む細胞集団を得るための方法であって、該方法は、炭水化物受容体保有細胞を強化した細胞集団を、免疫調節炭水化物受容体保有細胞を得るのに効果的な条件下で培養する工程を含み、前記条件は抗原送達培地を含む。抗原送達培地は、本発明の複合体、好ましくは抗原および酸化炭水化物から成る複合体を含む。抗原送達培地の追加成分としては、本明細書の実施例の中で開示する適当な細胞培養培地および当業者周知のものが含まれる。炭水化物受容体保有細胞に対して強化した細胞集団の培養方法は、本明細書の実施例の中に開示されている。好ましくは、培養工程は約１日間〜約１２日間、より好ましくは約３日間〜約１０日間、さらに好ましくは約５日間〜約７日間かけて行われるが、約５日間がさらに好ましい。
【００３８】
本発明はまた、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む方法によって得られる免疫調節炭水化物受容体保有細胞集団を含む。（ａ）インビトロにおいて、１つ以上の生体応答調節剤とともに炭水化物受容体保有細胞を培養し、増加炭水化物受容体保有細胞集団を生産させる。（ｂ）前記増加炭水化物受容体保有細胞集団を、抗原および酸化炭水化物から成る複合体とともにインキュベートし、免疫調節炭水化物受容体保有細胞集団を得る。好ましくは、培養の工程は、約１時間〜約６時間、より好ましくは約２時間〜約４時間、さらに好ましくは３時間かけて行われる。本方法によって得られる好ましい炭水化物受容体保有細胞には、マンノース受容体保有細胞が含まれる。
【００３９】
本発明によれば、抗原としてはポリペプチドまたはペプチドが含まれる。本発明の抗原は、細胞性または体液性の免疫応答に至る一連の事象を開始させる。特に、本発明の抗原には、ＭＨＣに関連してＴ細胞に対して提示されるものが含まれる。本発明で使用される適切な抗原には、ポリペプチドおよびペプチドが含まれる。抗原を含むポリペプチドは、ペプチド合成、タンパク質精製、あるいは宿主細胞中でのポリペプチドの発現などの、周知の方法によって製造することができる。ペプチド合成は約１００個までのアミノ酸（たとえばＭＵＣ１の５つの反復サブユニット）を含むポリペプチドに対して使用することができる。一般に、約２０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドに対しての好ましい製造手段は、宿主細胞、好ましくは原核宿主細胞、より好ましくは細菌宿主細胞内での組み換え発現である。しかしながら、前述のように真核系も使用することができる。宿主細胞中における組換え型タンパク質の発現方法は、十分に確立されており、たとえば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによる、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（コールドスプリンハーバー出版、コールドスプリングハーバー、１９８９年）を参照されたい。
【００４０】
本発明によれば、本発明のペプチドは単離されたペプチドである。単離されたペプチドとは、自身の天然の環境におかれていないペプチドのことをいう。本発明の単離ペプチドは、その天然の起源から得るか、完全な長さのタンパク質またはより大きなタンパク質断片からタンパク質分解によって製造するか、組み換えＤＮＡ技術を用いて製造するか、あるいは標準的な化学的ペプチド合成法を用いて合成するかのいずれかによって得ることができる。
【００４１】
本発明に関する限り、抗原は、ウイルス、微生物もしくは植物に由来する自己抗原または抗原性ペプチド、あるいは、ウイルス、微生物または植物に由来する自己抗原または抗原性ペプチドの全長内の少なくとも５個のアミノ酸から成るアミノ酸サブユニットであってもよい。本発明の抗原は、（上述のように）互いに結合された１つより多くの、５個以上のアミノ酸で構成されるサブユニットから成るものであってもよい。これらの結合されたサブユニットは、上述した範囲内の同一起源または異なる起源に由来するものであり得る。本発明の抗原性ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合することができる。
【００４２】
本発明の組成物に使用するのに適した抗原の例としては、以下のものが含まれる。腫瘍抗原：これにはＣＥＡ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒＢ２、メランＡ、ＭＡＧＥ抗原、ｎｍ２３、ＢＲＡＣＡ１、ＢＲＡＣＡ２などが含まれるが、それらに限定されるわけではない；花粉、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＩＶ）コア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ２タンパク質；熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｉｃｉｐａｒｕｍ）周辺スポロゾイトタンパク質；ＨＩＶ−ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパク質；連鎖球菌表面タンパク質抗原；インフルエンザ核タンパク質；血球凝集素ノイラミニダーゼ表面感染；ＴｃｐＡピリンサブユニット；ＶＰ１タンパク質；ＬＭＣＶ核タンパク質；レーシュマニア主要表面糖タンパク質（ｇｐ６３）；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒｔｕｓｓｉｓ）表面タンパク質；狂犬病ウイルスＧタンパク質；連鎖球菌Ｍタンパク質；呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＦまたはＧタンパク質；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０または核抗原３Ａ、血球凝集素、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）外表タンパク質（Ｏｓｐ）Ａ、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３８ｋＤａリポタンパク質またはＡｇ８５、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）クラスＩ外部タンパク質；水痘ウイルスＩＥ６２およびｇｐＩ、風疹ウイルスキャプシドタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルスプレＳ１抗原、Ｉ型単純疱疹ウイルス糖タンパク質ＧまたはｇｐＤまたはＣＰ２７、マリーバレー脳炎ウイルスＥ糖タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスＶＰ１、ポリオウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３、トラコーマクラミジア表面タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープ抗原プレＳ２、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）キャプシド、腫瘍遺伝子Ｅ６およびＥ７からの乳頭腫ウイルスペプチド、リステリア属表面タンパク質、水痘ウイルスエンベロープタンパク質、ワクシニアウイルスエンベロープタンパク質、ブルセラ属表面タンパク質、１つ以上の上記抗原の組み合わせ、５個以上のアミノ酸長からなる前記抗原のアミノ酸サブユニット、または１つ以上のそのようなアミノ酸サブユニットの組み合せである。
【００４３】
本発明の抗原は、全細胞またはその細胞下画分から構成されてもよい。そのような細胞または細胞下画分は、あらゆる腫瘍のタイプまたは他の起源に由来するものであってもよい。全細胞または細胞下画分を得ることのできる癌の種類の例としては、乳癌、肺癌、膵臓癌および結腸癌、ならびに黒色腫が挙げられる。腫瘍から得られる特異的抗原のいくつかの他の例としては、黒色腫特異的抗原（たとえば、ＭＡＧＥ系抗原）、結腸および他の癌に由来する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、あるいは実際にはあらゆる腫瘍から抽出された抗原が挙げられる。
【００４４】
本発明は、上で列挙したいずれか１つ以上の抗原を含み、特に、ヒトムチンＭＵＣ１〜ＭＵＣ７のうちのいずれか１つ以上を含み、これらのヒトムチンはすべて、上述のように、セリン、スレオニンおよびプロリン含量の高い反復アミノ酸配列から成る反復性の高い中央部分を含んでいる。特に、本発明の組成物は、ヒトムチンポリペプチド（正常な対立遺伝子変形に伴う不定数の反復を含む）を含んでいてもよいし、あるいは、１つ以上のヒトムチン反復配列、好ましくは２〜８０回、より好ましくは２〜２０回、さらに好ましくは２〜１０回のヒトムチンの反復サブユニットを含んでいてもよい。ヒトムチンおよびそのサブユニットは、好ましくはグリコシル化されていないか、あるいは、癌細胞上に見られる、炭水化物被覆が欠失してタンパク質コアが露出したムチンに対する免疫応答を誘発させるように変異的にグリコシル化されている。ヒトムチンＭＵＣ１を使用するのが特に好ましいが、本発明はあらゆる抗原の使用、特にヒトムチンＭＵＣ１〜ＭＵＣ７の使用にも拡張されることが明確に理解される。便宜上、これから先はＭＵＣという語を、ヒトムチンＭＵＣ１〜ＭＵＣ７およびそれらのサブユニットのいずれかを指すために用いる。これから先、ヒトムチンのみを取り扱うが、本発明は上述したような他の抗原のいずれにも同等に関連することに留意すべきである。
【００４５】
ＭＵＣの断片は炭水化物ポリマーに結合されていてもよい。これらの断片は炭水化物に結合可能な分子ＭＵＣのいずれの部分を含んでもよい。ＭＵＣ分子の断片には、ＭＵＣ分子の天然に存在する配列、および／または、ＭＵＣ分子に由来する配列の断片であって、クラスＩＭＨＣ分子へのＭＵＣ分子の結合性を高めるように修飾された断片が含まれる。ＭＨＣ分子を模擬する方法には、ペプチド合成や組み換えＤＮＡ技術などの、当該技術分野において周知の方法が含まれる。好ましいＭＵＣ分子の断片は、ＭＵＣ分子のペプチドを含む。好ましいＭＵＣ分子のペプチドは、約５〜約２０個のアミノ酸から成る。好ましいＭＵＣ分子の断片は、非ＶＮＴＲまたはＶＮＴＲ領域を含む。より好ましいＭＵＣ分子の断片には、ＡＰＤＴＲ（配列番号７）、ＡＰＤＴＲＰＡＰＧ（配列番号８）、ＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号９）などを含むアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。説明の便宜上、これらの断片もまたＭＵＣの定義の中に含める。同様に、少なくとも５個のアミノ酸から成る他の抗原断片もまた、炭水化物ポリマーに結合させることができる。
【００４６】
本発明の特定の抗原は、組み換え宿主細胞中での融合タンパク質の産生における発現と精製を容易化するために、融合タンパク質の一部を構成してもよい。融合タンパク質の非抗原部分は、一般に融合ポリペプチドのアミノ末端領域に出現し、カルボキシ末端配列が抗原配列を含んでいる。融合タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または他のタンパク質あるいはその一部であって、特に産生される融合タンパク質を精製するための、タンパク質の結合能または他の親和性を利用したアフィニティー精製を可能にするタンパク質から選択することができる。タンパク質は、担体タンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれに融合されていてもよい。融合タンパク質の性質は、該融合タンパク質が産生されるベクター系に依存すると考えられる。細菌の発現ベクターの一例としてはｐＧＥＸがあり、このｐＧＥＸは、目的の遺伝子を該ベクターに挿入してサブクローニングすることにより、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと目的のタンパク質とから成る融合タンパク質を産生する。目的のタンパク質を備えた融合タンパク質をもたらす他のベクター系の例は、上記サンブロックらの文献の中に記載されており、該文献全体を引用として本明細書に含める。これらは包含または分離されることができるが、包含される場合には「担体」機能を有すると考えられる。
【００４７】
タンパク質または融合タンパク質は、多くの原核性（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））または真核性（バキュロウイルス、ＣＨＯ細胞、コス細胞または酵母）の発現系において発現させることができる。これらの系のいくつか、たとえばバキュロウイルスまたは酵母においては、グリコシル化モチーフをタンパク質または融合タンパク質に導入することにより、マンノースに富むグリコシル化が十分に達成され、マンノースに富む炭水化物ポリマーと化学的に結合させる必要性を無くすことができる。これらの新規な融合タンパク質は、穏やかな過ヨウ素酸酸化を行って使用してもよいし、行わずに使用してもよい。
【００４８】
１実施形態において、本発明の抗原は炭水化物ポリマーに結合されている。炭水化物ポリマー内の反復モノマー単位の数は重要ではないが、一般に炭水化物ポリマーは、少なくとも２０個のモノマー単位、好ましくは１００個以上のモノマー単位、より好ましくは１０００個以上のモノマー単位、さらに好ましくは１００００個以上のモノマー単位を含む。炭水化物ポリマーは、様々な分子量の多糖鎖の混合物であり得る。本発明の組成物の炭水化物部分は、たとえば、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、ラムノース、６−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、２−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−キシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、イズロネート、グルロネート、マンヌロネート、メチルガラクツロネート、α−Ｄ−ガラクトピラノース−６−スルフェート、フルクトース、およびα−アベクオース、それらの配座異性体および立体異性体を含むポリマー、あるいは、２個以上の異なるモノマー単位で構成される炭水化物などの、あらゆる炭水化物ポリマーを含むことができる。本発明のより好ましい炭水化物ポリマーは、マンノースを含む。より好ましい炭水化物ポリマーはマンノースポリマーである。さらに好ましい炭水化物ポリマーは、完全に酸化されたマンノース、および／または、アルデヒドを有する部分的に還元されたマンノースのポリマーである。
【００４９】
好ましい炭水化物は、炭水化物が部分的に還元されるように処理された酸化炭水化物から成る。より好ましい炭水化物は、炭水化物のアルデヒド基が実質的に還元されずに、シッフ塩基が優先的に還元されるように処理された酸化炭水化物から成る。本発明による炭水化物を部分的に還元するための適切な試薬には、水素化シアノホウ素ナトリウムが含まれるが、これに限定されるわけではない。本発明による炭水化物を部分的に還元するのに適した他の試薬は当業者にとって明らかであり、本願に包含されることが理解される。酸化炭水化物をシアノホウ化水素ナトリウムで処理することにより、たとえば、アルデヒド基を保持したまま、シッフ塩基などの他の基を還元することができる。理論と結び付けられてはいないが、本発明の発明者は、本発明の酸化炭水化物の露出および／または遊離したアルデヒド基が、おそらくはエンドソームやリソソームから細胞質への抗原の取り込み、放出、あるいは漏出を変化させることにより、本発明の炭水化物および抗原複合体の送達に重要な役割を果たしていると確信している。好ましい実施形態において、酸化炭水化物は、遊離のアルデヒドを実質的に含む炭水化物ポリマーの酸化されたマンノース単位を含む。本発明の炭水化物ポリマーには、完全に酸化されたマンノース、あるいはアルデヒドを有する部分的に還元されたマンナンが含まれ得ることを注記しておく。炭水化物は、天然の起源から精製してもよいし、あるいは従来の方法に従って合成してもよい。炭水化物は多くの供給業者から市販されている。
【００５０】
抗原は、多糖および単糖の誘導体化および反応に関する炭水化物化学の分野において周知の標準的な方法に従って、炭水化物ポリマーに結合させてもよい。炭水化物は、過ヨウ素酸塩、たとえば過ヨウ素酸ナトリウムなどの従来の酸化剤を用いて酸化してポリアルデヒドとし、これを直接抗原（ＭＵＣ１の反復サブユニットなど）と反応させるようにしてもよく、この反応においては、タンパク質鎖上のアミノ官能基（リシンのε−アミノ基など）が、シッフ塩基を形成するアルデヒド基と反応する（図１４参照）。多糖鎖はまず最初に臭化シアンで活性化し、この活性化された多糖をジアミンと反応させ、次に抗原と結合させて複合体を形成させるようにしてもよい。この複合体はその後、任意に酸化してもよい。炭水化物およびポリペプチドは、炭水化物とポリペプチドとを架橋するために、二機能試薬を用いて誘導体化してもよい。一般に用いられる架橋試薬には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、たとえば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオン酸塩）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二価性イミドエステル、および、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二価性マレイミドが含まれる。メチル−３［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導化試薬は、光の存在により架橋を形成することのできる光活性化中間体を生み出すことができる。酸化炭水化物は、抗原のヒドラジン誘導体と反応させて複合体を形成するようにしてもよい。あるいは、炭水化物は、酸化後に所望の複合体を与えるカルボニルジイミダゾールなどの試薬と反応させてもよい。そのような複合体形成と酸化の方法については、たとえば、１９９４年１２月２３日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９４／００７８９（ＷＯ９５／１８１４５）の中で以前に検討されており、この文献はその全体を参照により本明細書中に包含する。本発明による炭水化物の複合体化と酸化の他の方法は、当業者にとって明らかであるだろうし、これらも本願に包含されるものであることを注記しておく。
【００５１】
炭水化物への抗体の結合は、炭水化物上のいずれか若しくはすべての官能基を反応基に変換し、その後、該炭水化物上の反応基をポリペプチド上の反応基と反応させることを含む。炭水化物ポリマーは、ヒドロキシル基を豊富に有し、いくつかの例においては、カルボキシル基（イズロネートなどにおいて）、エステル基（メチルガラクツロネートなどにおいて）などで満たされる。これらの基は、標準的な化学的手順に従って活性化することができる。たとえば、ヒドロキシル基は、ヨウ化水素、臭化水素、および塩化水素などのハロゲン化水素と反応させて反応性ハロゲン化多糖を与えることができる。ヒドロキシル基は、トリハロゲン化リン、活性金属（ナトリウムエトキシド、アルミニウムイソプロポキシド、およびカリウム第三ブトキシドなど）によって活性化するか、あるいは（塩化トシルまたは酢酸などの基によって）エステル化することにより、続いてポリペプチド上の反応基と反応して１つ以上の結合を形成することのできる反応基を形成することもできる。ヒドロキシル基以外の炭水化物上の他の官能基は、当該技術分野において周知の手順に従って活性化し、反応基を与えることができる。
【００５２】
本発明の１実施形態において、マンノース受容体担持マクロファージおよび／または単球細胞に対して強化された細胞集団と、ヒトムチンポリペプチド、該ポリペプチドの１つ以上の反復もしくは非反復サブユニット、あるいは反復もしくは非反復サブユニットの断片と、酸化マンノースから成る炭水化物ポリマーとの間で形成される複合体と含む免疫調節組成物が提供される。特に、上記免疫調節組成物は、複合体に結合される前にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＴＮＦγおよび／またはビタミンＤと接触させた、マンノース受容体担持マクロファージおよび／または単球細胞に対して強化された細胞集団を含んでいる。
【００５３】
本発明の免疫調節組成物は、薬剤学的に許容可能な担体中で調製することができる。そのような担体の例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンク溶液、および他の水性の生理的に平衡な塩溶液が含まれる。不揮発油、ゴマ油、オレイン酸エチル、あるいはトリグリセリドなどの非水性賦形剤も使用することができる。他の有用な製剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、あるいはデキストランなどの増粘剤を含む懸濁剤が含まれる。補形剤は、少量の添加剤、たとえば等張性および化学的安定性を高める物質などを含んでいてもよい。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびトリス緩衝液が含まれ、保存剤の例としては、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的な製剤は、液体の注射可能な医薬品、あるいは注射用に適当な液体に懸濁液または溶液として溶解可能な固体のいずれかであり得る。したがって非液体製剤においては、担体はデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤などを含み、これに無菌の水または生理食塩水を投与前に添加することが可能である。
【００５４】
本発明の薬剤学的に許容可能な担体は、さらにアジュバントや伝達賦形剤などの免疫増強剤をさらに含んでいてもよい。アジュバントは典型的には、特異的抗原に対する動物の免疫応答を全体的に増強する物質である。適切なアジュバントとしては、動物、特にヒトに投与することのできるアジュバントが含まれる。本発明の免疫調節組成物と併用される好ましいアジュバントには、アルミニウムをベースとした塩、カルシウムをベースとした塩、シリカ、γ−インターフェロン、ＩＬ−１２、および他の市販のアジュバントが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５５】
他の態様において、本発明の免疫調節組成物は、患者に対して、様々な病状に対する予防または治療を施すために投与される。特に、本発明の免疫調節組成物は、異常細胞の増殖を治療または予防するのに有用である。本明細書中で用いる異常細胞とは、異常増殖、発生、死といった異常な生物学的機能を呈した細胞のことをいう。本発明の異常細胞には、好ましくは癌細胞、感染物質（すなわち病原体）および異常増殖性成長をみせる非癌細胞（たとえば、類肉腫症、肉芽腫症または乳頭腫）に感染した細胞、ならびに癌細胞および感染細胞に感染した非癌細胞が含まれる。癌細胞の増殖には、乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺などの分泌組織の腫瘍の増殖が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５６】
上記のようにして予防することのできる他のいくつかの病状としては、Ｉ型アレルギー、マラリア、ＨＩＶ、虫歯、インフルエンザ、コレラ、口蹄疫、髄膜炎、リーシュマニア感染、百日咳、狂犬病、連鎖球菌感染、呼吸感染、麻疹、ライム病、結核、細菌性髄膜炎、帯状ヘルペス、風疹、肝炎、疱疹、Ａ型肝炎、ポリオ、性病／トラコーマ、Ｂ型肝炎、一般的な感冒、頸部癌、髄膜炎／肺炎、水痘、痘瘡、および肺炎／ＰＵＯ（原因不明熱）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５７】
分泌組織の腫瘍形成を予防するために、動物を本発明の免疫調節組成物で免疫化してもよい。あるいは、腫瘍に罹った動物を、腫瘍治療のための治療計画の一部として、本発明の免疫調節組成物で免疫化してもよい。例示として、女性の乳癌予防のために、女性に対して思春期前または後に、本発明の免疫調節組成物で免疫してもよいし、１回以上の注射を、好ましくは最初の免疫化後、数ヶ月から数年の間隔を空けて、１回以上のブースター注射を受けさせるようにしてもよい。１つの免疫化計画として、女性に対して本発明の組成物で免疫化を行った後、適当な間隔を空けてブースター免疫化を受けさせるようにしてもよい。その後のブースター免疫化は一定の間隔で行う。免疫化の経路は、従来のヒトワクチン投与の場合と何ら違いはない。したがって、本発明の免疫調節組成物は、皮下、筋肉内、経口、静脈内などの様式で投与することができる。
【００５８】
動物に送達される本発明の組成物の量は、臨界量あるいは限界量ではない。本発明の組成物の有効量は、抗原成分に対する免疫応答を刺激するような量である。送達される組成物の量は、動物の免疫状態（患者が免疫抑制されているか、あるいは免疫刺激されているかに依存）、担当医または獣医師の判断、あるいは、化合物が病状を予防または治療のいずれを行う治療薬として用いられるのかに従って変わる。適切な一回投与量は、適切な期間にわたって１回または数回投与した場合に、動物に対して特定の病気の予防または治療を行うことができる投与量である。たとえば、動物が、本発明の組成物中、約１０５個〜約１０１３個の細胞、より好ましくは本発明の組成物中、約１０６個〜約１０１２個、さらに好ましくは約１０７個〜約１０１１個の細胞を受け取るようにすることができる。
【００５９】
上述のように、本発明の組成物は、免疫応答を増強するサイトカインや他の化合物などのアジュバントと共に動物に投与してもよい。例示として、本発明の組成物と共に投与してもよいそのような増強化合物には、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦαまたはβ、γまたはα−インターフェロン、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８のいずれか、あるいは他のサイトカインのうちの１つ以上が含まれる。これらの増強化合物は、本発明の組成物と同時に動物に投与されてもよいし、任意に多成分投与剤形の一部として投与されてもよい。あるいは、本発明の増強化合物と組成物とは、本発明の免疫調節組成物の投与後、異なる期間をおいて投与するようにしてもよい。
【００６０】
本発明の他の態様において、動物に本発明の免疫調節組成物を投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導するための方法が提供される。動物に本発明の免疫調節組成物を投与することにより、特に抗原成分と反応する細胞に対して細胞障害性を呈する、活性化されたＴ細胞の高い細胞性応答が誘起される。例示として、動物をムチンまたは他の腫瘍抗原決定基を発現する腫瘍に対して免疫化することができる。本発明の潜在的利益は、本発明の組成物が、ムチンまたは他の抗原決定基を発現している腫瘍細胞を殺す細胞障害性Ｔ細胞の細胞性免疫応答を誘起することができるため、動物に対して腫瘍の成長前に癌予防を行うことができるという事実から生じるものである。本発明は、腺癌などの分泌組織の腫瘍、より詳細には、乳房、卵巣、結腸、肺、前立腺などの腫瘍に対する免疫化に特に適用できる。
【００６１】
本発明の１実施形態は、動物における免疫応答を誘導するための方法を含み、該方法は、動物に、マンノース受容体保有細胞と、抗原および酸化マンノースから成る複合体とを含む免疫調節組成物を有効量投与することを含む。本発明の免疫調節組成物の有効量は、本明細書中に記載の病気を予防または治療することのできる量を含む。
【００６２】
本発明で使用される動物には、ヒト、家畜動物および食用動物が含まれるが、これらに限定されることはなく、ヒトまたはサルがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
本発明の他の実施形態は、動物において癌に対する免疫応答を誘導する方法に関し、該方法は、動物に、炭水化物受容体保有細胞と、抗原および酸化炭水化物から成る複合体とを含む免疫調節組成物を有効量投与することを含む。本方法で用いられる好ましい炭水化物はマンノースである。本明細書中で開示されるあらゆる抗原が本方法での使用に適している。好ましい抗原は、ムチンポリペプチドを含む。
【００６３】
本発明の組成物は、癌根絶のための総合的治療の一部として、あるいは単独で投与することができる。総合的治療の一部として投与される場合には、本発明の組成物は、他の治療形態の前、最中もしくは後に投与することができる。たとえば、本発明の組成物は、癌に罹っている動物に対して、癌化した細胞を切除する外科手術の前または後のいずれに投与してもよい。同様に、本発明の組成物は、腫瘍刺激を伴う化学的治療または照射計画の前または後に投与することができる。好ましくは、本発明の組成物は、動物の免疫系が完全である時に、細胞媒介性免疫応答を動物内で誘導することができるように投与される。このように、本発明の組成物は、動物の免疫除去治療の後に投与するのには適していない。本発明の免疫調節組成物を、腫瘍を有する動物に投与する場合、好ましくは組成物は腫瘍の主要部位かまたはその周囲に投与される。
【００６４】
好ましい実施形態において、免疫応答を誘導する方法は、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む。（ａ）マンノース受容体保有細胞集団を動物から単離する。（ｂ）細胞を１つ以上の生体応答調節剤と接触させて、増加マンノース受容体保有細胞集団を得る。（ｃ）増加マンノース受容体保有細胞集団を、抗原および酸化マンノースから成る複合体に結合させ、免疫調節マンノース受容体保有細胞集団を得る。（ｄ）免疫調節マンノース受容体保有細胞集団を動物に投与して、免疫応答を誘導する。本実施形態で使用される好ましいサイトカインおよびビタミンは、本明細書中に開示されている。
【００６５】
さらに他の態様において、本発明は、ヒトムチンポリペプチド、該ポリペプチドの１つ以上の反復サブユニット、もしくは前記反復サブユニットの断片と、炭水化物ポリマーとの間の複合体を含む化合物を、腺癌、特に乳癌の治療において使用することに関する。
【００６６】
本明細書中に記載した発明は、ヒトムチンＭＵＣ１に限定されるものではない。本発明は明らかに、癌細胞によって発現される他のムチンの使用、ならびに、多糖に結合されると、主要細胞に対して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘起するために用いることのできる他の抗原の使用にも適用され、該化合物は、腫瘍形成を予防するワクチンにおいて使用してもよいし、癌の治療、および／または前述のような他の病状の治療または予防のために使用してもよい。様々な病気および病状に対応する抗原であって、それに対する免疫応答の誘引が望まれる抗原は技術上周知であり、そのような抗原も本発明の範囲に同等に含まれる。
【００６７】
本発明はまた、抗原に結合する先在抗体（すなわち自然抗体）を有する動物に、本発明の抗原を送達する方法も含み、該方法によって、抗原に対する細胞性免疫応答が誘引される。本発明の方法の利点の１つは、目的の抗原に結合することができ、細胞性免疫応答よりも抗体応答を優先的に誘導するであろう天然に存在する抗体（すなわち自然抗体）が、複合体に結合するのを阻止できることである。たとえば抗原がムチンの場合、ヒトはムチンペプチドに結合する大量の循環性の天然に存在する抗体を有している。これらの天然に存在する抗体の特異性の殆どは、ガラクトースエピトープに抗して誘導されるものであるが、これらの抗体はムチンペプチドと交差反応する。したがって、患者がマンナン：ムチン複合体によって免疫化される場合、おそらくは抗体が複合体に結合し、該複合体が適切な抗原提示経路に到達して細胞性免疫応答（たとえばＣＴＬ応答）を誘導するのを阻止すると考えられる。したがって、本発明の方法は、炭水化物受容体保有細胞をイクスビボにおいて抗原：炭水化物複合体と結合させることにより、本発明の治療用組成物を動物に投与する際の循環性の交差反応する抗体を排除して、体液性（抗体）応答の優先的誘導を克服するものである。患者に導入される場合には、細胞性免疫応答、および特にＣＴＬおよび／またはＴ１（ＴＨ１）応答が、目的の抗原の抗原性ペプチドを提示する細胞によって優先的に誘導される。本方法は、抗原および酸化炭水化物から成る複合体に接触させた炭水化物受容体保有細胞を、動物に投与する工程を含み、この工程において、炭水化物受容体保有細胞は、Ｔ細胞からの応答が誘引されるようにＴ細胞に対する抗原を提示することができる。本方法で用いられる好ましい抗原はムチンである。本方法で用いられる好ましい炭水化物はマンノースである。
【００６８】
以下の実施例は説明を目的としたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【００６９】
この実施例では、インビボでマンノース受容体を標的にすると、Ｔ１細胞免疫応答が起こることを述べる。
Ａ．腹腔滲出細胞のマンナン−ＭＵＣ１へのインビトロ曝露
腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を以下のように調製した。マウスを屠殺し、１０ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を腹腔内に注射し、穏やかにマッサージし、腹腔滲出細胞を収集した。付着ＰＥＣは、組織培養プレート中に約２×１０６／ｍｌのＰＥＣを取り、約３７℃で約１６乃至約２４時間培養することにより調製した。非付着ＰＥＣ細胞をピペットで取り除き、付着ＰＥＣ細胞を以下に説明する研究に用いた。
【００７０】
ＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）マウスから得た約４×１０６のＰＥＣ細胞は、約１６乃至約２４時間の付着後、２０μｇ／ｍｌの酸化−マンナン−ＭＵＣ１融合タンパク質（ｏｘ−Ｍ−ＦＰ；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１０１２８−１０１３２，１９９５ａ、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：５０８９−５０９４，１９９５ｂに詳述）、還元−マンナン−ＭＵＣ１融合タンパク質（ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰ）、または無処理ＭＵＣ１融合タンパク質（ＦＰ；グルチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させた５つのＶＮＴＲ反復配列を含む１０５アミノ酸ペプチドを含む。詳細は、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７：７１３−７２０，１９９３）もしくはマンナン−ｏｘ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｍ−ＧＳＴ；詳細は、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、前掲の文献、１９９３に述べられている）により感作させた。感作させた細胞の各群を、腹腔内注射によりＤＢＡ／２マウスへ移入した。
【００７１】
その後、マウスの細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答試験を、ＣＴＬ前駆体（ＣＴＬｐ）度数を以下のように測定することにより行った。ＣＴＬｐ度数は、１０％ウシ胎児血清と、５ｍＭの合成ＭＵＣ１ペプチド（２つのＶＮＴＲ反復配列から成る；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、前掲の文献１９９５ａに述べられている）と、約１０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２とを含むダルベッコ変法イーグル培地において、約２５μｇ／ｍｌの投与量のマイトマイシンＣで約１乃至約１．５時間処理した約２乃至約５×１０５のＤＢＡ／２刺激脾細胞と共に、Ｕ底マイクロタイタートレイ中で細胞を培養することにより、少なくとも６通りのエフェクター細胞投与の最小で３２の複製を用いて決定した。７日後、各ミクロ培養の細胞毒性について、１００μｌの培地を約１０４ ５１Ｃｒ−標識ＭＵＣ１＋Ｐ８１５腫瘍標的細胞（ヒトＭＵＣ１をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたＢ８１５細胞；フランス、ストラスブールのトランスジーン、Ｂ．アクレス（Ａｃｒｅｓ）博士から提供）を含む１００ｍｌの標的細胞懸濁液と置換することにより、分析した。培養物が細胞障害活性を有する細胞を備えていることは、単独で培養されるか、あるいはＭＵＣ１合成ペプチドは含まず刺激細胞および組換えＩＬ−２と共に培養されるかした応答細胞に添加される、約１０４の標的細胞から得られた平均同位体放出より５１Ｃｒ放出が約３標準偏差高いことにより同定した。直線スケールで表される応答細胞の投与量と、対数スケールで表される陰性ウェルの度数との間には直線関係が存在した。ＣＴＬｐ度数は、３７％の陰性ウェルを生成するのに必要とされる応答細胞投与量の逆数として決定した。
【００７２】
図１について参照する。この結果から、Ｏｘ−Ｍ−ＦＰをインビトロでパルス適用（ｐｕｌｓｅ）したＰＥＣによる１回の免疫後に得られたＣＴＬｐ度数は、Ｏｘ−Ｍ−ＦＰの無細胞タンパク質型の３回のインビボ免疫後に得られたＣＴＬｐとほぼ同じ（１／７，０００）であることが示された。インビトロでｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはＦＰを適用したＰＥＣの１回の注入では、それぞれ、１／２８，０００および１／２９，６００のＣＴＬｐ度数が発生した。ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはＦＰのいずれかの３回の腹腔内注射では、それぞれ、１／８９，０００および１／８７，５００のＣＴＬｐ度数が得られた。Ｍ−ＧＳＴで感作された細胞では１／８００，０００の度数が得られた。全ての場合において、応答はＭＵＣ１特異であった。というのは、トランスフェクトされていないＰ８１５標的細胞は溶解されなかったからである。まとめて考えると、これらの結果は、融合タンパク質の複数回注入によるか、あるいはインビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したＰＥＣの１回の注入により加えられたｏｘ−Ｍ−ＦＰによりＣＴＬ応答が刺激され、この応答は、いずれかの経路により加えられたｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはＦＰによる応答よりも高いことを示す。ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰ上にマンノースが存在しても、インビボで融合タンパク質として運搬される場合には、（無処理ＦＰに比べ）選択的な利点はない。しかしながら、これらのタンパク質をインビトロでＰＥＣに適用し、その後、これらの細胞を免疫化に使用することにより、ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰあるいはＦＰをマンノース受容体への標的とすることは、それらの融合タンパク質を注入するよりも（両方に対する度数は約１／８０，０００）、ＣＴＬｐの誘導に効果的であった（両方に対する度数は約１／２８，０００）。このように、インビトロで、Ｏｘ−Ｍ−ＦＰをＰＥＣに適用する（およびこれによりマンノース受容体に対する標的とする）と、インビトロでｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはＦＰをＰＥＣに適用するよりも良好なＣＴＬ応答が得られる。さらに、ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはＦＰではなく、融合タンパク質Ｏｘ−Ｍ−ＦＰの注入により、ＣＴＬｐ度数が向上する。最後に、ＰＥＣにｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはＦＰをインビトロで適用すると、これらのタンパク質のインビボ注入に比べ、ＣＴＬｐの生成が向上する。
【００７３】
図２について参照する。この図は、インビトロ感作ＰＥＣの注入数に関する投与量応答を示したものであり、これにより、ＣＴＬｐ度数を向上させるのに必要なＰＥＣの最小数は１０４細胞であることが示された。１０４細胞では、ＣＴＬｐ度数１／１０，２００が得られたが、これは４００倍の細胞を用いて得られたもの（４×１０６細胞；ＣＴＬｐ度数は１／４，０００）と実質的に差異がない。このように、移入したＰＥＣの数が１０４を超えると、ＣＴＬｐ度数は移入した細胞の数に対して投与量依存性を示さず、ＣＴＬｐ度数は１０４〜４×１０６細胞の範囲で同様であった。１０３細胞を移入した場合、ＣＴＬｐ度数は１／４４，０００まで落ちた。
【００７４】
Ｂ．インビトロで適用させたＰＥＣで免疫したマウスは腫瘍の攻撃から防御された
腫瘍の攻撃に対して感作ＰＥＣが防御応答を誘発する可能性を調べるために、５匹のＤＢＡ／２マウスの群に、ｏｘ−Ｍ−ＦＰ、またはｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したＰＥＣ、もしくはパルス処理していないＰＥＣを１回注入し、その後、５×１０６  ＭＵＣ１＋Ｐ８１５細胞で攻撃した。図３を参照する。これらの結果から、ｏｘ−Ｍ−ＦＰで感作されたＰＥＣを用いて免疫した５匹のマウスのいずれにおいても検出可能な腫瘍の成長はないことが示唆された。逆に、ｏｘ−Ｍ−ＦＰで１回免疫した５匹のマウスのうち３匹で腫瘍が発現し、未処理ＰＥＣで１回免疫した５匹のマウスのうち５匹で腫瘍が発現した。
【００７５】
このように、マウスの腹腔由来のＰＥＣであって、インビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰと共に培養させたＰＥＣは、養子免疫伝達後、効率よくＭＵＣ１抗原を処理すると共に提示し、高い度数のＣＴＬを生成させ、その後の腫瘍の攻撃に対し防御する。
【００７６】
Ｃ．還元および酸化Ｍ−ＦＰの結合研究
異なるマンナン型の、様々な種類の組織、細胞系、細胞および受容体への結合について分析するために実験を行った。この結合試験の結果を表１にまとめて示す。
【００７７】
【表１】
2011046723.tif 000003
１．細胞系
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、シグマ社、ミズーリ州セントルイス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手可能；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、前掲の文献、１９９５ａに詳述）と共役した還元マンナンまたは酸化マンナンのいずれかを、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、前掲の文献、１９９５ａに一般的に述べられている方法を用いて様々な種類の細胞と共に混合した。ＦＩＴＣ−共役還元マンナンおよびＦＩＴＣ−共役酸化マンナンのいずれも、以下の細胞系には結合しなかった：３Ｔ３（線維芽細胞）細胞、Ｐ８１５（肥満細胞腫）細胞、ＮＳ１およびスルタン（Ｂ細胞系）細胞、ＥＬ−４細胞、ＲＭＡ細胞、Ｅ３細胞およびＣＥＭ（Ｔ細胞系）細胞、ＭＭ２００（メラノーマ）細胞、ＣＯＳ細胞およびＢＨＫ（腎細胞系）細胞。ＦＩＴＣ−共役還元およびＦＩＴＣ−共役酸化マンナンのいずれも、Ｊ７７４細胞（マクロファージ細胞系、Ｐ．リシアルジ−キャスタグノーリ（Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ−Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ）博士（ミラノ、イタリア）から供与）には結合した。樹状細胞系であるＤ２ＳＣ／１への結合は、酸化−マンナン−ＦＩＴＣでは陰性であり、還元−マンナン−ＦＩＴＣでは非常に弱かった（表１）。
【００７８】
ＦＩＴＣと共役させた酸化あるいは還元マンノースのＪ７７４細胞への結合を阻害する炭水化物を用いて、阻害試験を行った。酸化マンナン−ＦＩＴＣのＪ７７４細胞への結合はマンナン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルグルコサミンにより阻害された。一方、還元マンナン−ＦＩＴＣの結合は、マンナン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルガラクトサミンにより阻害された。他の糖（グルコース、Ｄ−フコースおよびガラクトース）は阻害しなかった（表１）。上記の糖がＦＩＴＣ共役マンナン型の結合を阻害することができるということは、それらがマンノース受容体へ結合することを暗示する。
【００７９】
２．組織
還元および酸化マンナン−ＦＩＴＣをマウスの腹腔内に注入し、１時間後、器官を４％パラホルムアルデヒドで固定し、標準方法を用いて共焦顕微鏡により分析した。酸化および還元材料はいずれも、肝臓内、脾臓内、赤色脾髄内で観察された。肝臓では、クッパー細胞に富む洞様血管の周りが染色された。脾臓では、白髄の周りが染色された。赤色脾髄では、周辺帯マクロファージと共に染色された。結果はまとめて表１に示す。
【００８０】
３．受容体
マンノース受容体をコードする核酸分子をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰまたはｏｘ−Ｍ−ＦＰと共に、Ｍ−ＦＰがマンノース受容体に結合することができるような条件下で混合した。マンノース受容体へのＭ−ＦＰの結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより受容体へ結合したＭ−ＦＰを分離し、ゲル上に分離したタンパク質をブロッティングし、マンノース受容体に特異的に結合する抗体を用いてウエスターンブロットによりバンドを分解することにより、確認した。この結果、ｒｅｄ−Ｍ−ＦＰおよびｏｘ−Ｍ−ＦＰのいずれもが、マンノース受容体に結合することが示唆された。
【００８１】
４．ＰＥＣの特徴付け
マクロファージおよび樹状細胞を規定するために使用される細胞表面マーカーはＦ４／８０、３３Ｄ１およびＮＬＤＣ−１４５とした。マクロファージはＦ４／８０＋３３Ｄ１−と分類し、樹状細胞はＦ４／８０−３３Ｄ１＋と分類した。付着ＰＥＣは以下のようにフローサイトメトリにより分析した。付着ＰＥＣは標準的な技術を用いて、Ｆ４／８０抗体（ラット抗マウスモノクローナル抗体、これはマクロファージを検出するが樹状細胞は検出しない；Ａｕｓｔｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：８０５−８１２，１９８１およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５４：１６８−１７９，１９８１に記載）；３３Ｄ１抗体（ラット抗マウスモノクローナル抗体、これはマウス樹状細胞と反応するがマクロファージとは反応しない；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５７：６１３−６２７，１９８３に記載）；およびＮＬＤＣ−１４５抗体（ラット抗マウスモノクローナル抗体、これは樹状細胞上のＤＥＣ−２０５分子を検出する、ＤＥＣ−２０５分子はマクロファージには存在しない；Ｓｗｉｇｇａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：３０２−１１，１９９５に記載。クリストチャーチ病院、ニュージーランド、クライストチャーチのデレク  ハート博士から供与）のいずれかにより染色した。染色した細胞は標準方法を用いてフローサイトメトリにより識別した。血清学的研究のために、約１００μｌの各抗体を約２×１０５のＰＥＣ細胞に添加し、約１時間、約４℃でインキュベートした。細胞を３回、約．５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ−共役ヒツジ（Ｆａｂ’）２抗マウス免疫グロブリン（シレナス社、オーストラリア（Ｓｉｌｅｎｕｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手可能）の１：５０希釈液を約１００μｌ、各サンプルに添加し、約４５分間、約４℃でインキュベートした。細胞を再び洗浄し、その後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリにより分析した。
【００８２】
結果をまとめて表２に示す。これらの結果から、付着ＰＥＣの約７５％がＦ４／８０＋であり、約３０％がＮＬＤＣ−１４５＋であり、約３３％が３３Ｄ１＋であることが示唆された。付着ＰＥＣの約５％が二重に陽性であった（Ｆ４／８０＋３３Ｄ１＋）。
【００８３】
【表２】
2011046723.tif 000004
付着ＰＥＣの１つの集団をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて２つの集団に分離した。１つの集団（マクロファージに富む）は約８０％のＦ４／８０＋と、約１３％の３３Ｄ１＋と、約１４％のＦ４／８０−３３Ｄ１−とより構成された。第２の集団（樹状細胞に富む）は、約３％のＦ４／８０＋と、約８５％の３３Ｄ１＋と、約３％のＦ４／８０−３３Ｄ１−とを含んだ（表２を参照のこと）。これらの２つの集団を誘導するために使用した方法は以下の通りである。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−４５０）をヒツジ抗ラットＩｇＧに対する抗体で被覆し、２つのラットモノクローナル抗体であるＦ４／８０または３３Ｄ１のいずれかと、３時間、４℃で混合した。これらの処理Ｄｙｎａｂｅａｄｓを別々に１０７ＰＥＣ細胞に添加し、３０分間、４℃で混合した。抗体により被覆されたＤｙｎａｂｅａｄｓに結合した細胞は、磁石を用いて除去し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合しなかった細胞は、更なる試験のために収集した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合しなかったこれらの細胞のサンプルについて、Ｆ４／８０または３３Ｄ１抗体と結合することができるか、フローサイトメトリにより試験した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合しなかった細胞の残りはその後、ｏｘ−Ｍ−ＦＰと共に、１６時間乃至２４時間インキュベートし、セクションＡ（次の実施例を参照のこと）において上述の方法を用いて、同系マウスの腹腔内への養子免疫伝達を行った。
【００８４】
すぐ上に述べたマクロファージ（３３Ｄ１−）および樹状細胞（Ｆ４／８０−）に富んだ集団についてさらに、マンナン−ＦＩＴＣ、酸化マンナン−ＦＩＴＣまたは還元マンナン−ＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリによりマンノース受容体の発現に関する特徴付けを行った。各ＦＩＴＣ複合体を約１００μｌ、約２×１０５のマクロファージまたは樹状細胞強化集団に添加し、約１時間、約４℃でインキュベートした。細胞を３回、約．５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。細胞について、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリにより分析した。表２を参照すると、Ｆ４／８０＋３３Ｄ１−集団内の約４６％の細胞がマンナン−ＦＩＴＣで染色され、この集団内の細胞の５８％がマンナン−ＦＩＴＣおよびＦ４／８０抗体の両方に結合した。Ｆ４／８０＋３３Ｄ１−集団はマンナン−ＦＩＴＣと結合しなかった（５％以下、これはＰＢＳを受け取ったサンプル中の陽性細胞の数であった）。Ｆ４／８０＋集団の約５２％が還元−Ｍ−ＦＩＴＣで染色された（この集団内の６５％の細胞が還元−マンナン−ＦＩＴＣおよびＦ４／８０抗体の両方と結合した）。また、３３Ｄ１＋細胞集団は還元−マンナン−ＦＩＴＣとは結合しなかった。Ｆ４／８０＋集団の約７０％が酸化−Ｍ−ＦＩＴＣで染色され、この集団内の５８％の細胞が、酸化−マンナン−ＦＩＴＣおよびＦ４／８０抗体の両方と結合した。また、３３Ｄ１＋細胞集団は酸化−マンナン−ＦＩＴＣとは結合しなかった。このように、マンナンの両方の型（還元および酸化）がマクロファージには結合するが、樹状細胞には結合せず、酸化材料の結合が最も良好であった。
【００８５】
５．ＰＥＣ集団におけるマクロファージおよび樹状細胞の好ましい役割の決定
ＰＥＣはセクションＤにおいて説明したように、Ｆ４／８０または３３Ｄ１抗体と、ダイナビードとを用いて、８０％のＦ４／８０＋３３Ｄ１−マクロファージ強化細胞および８５％のＦ４／８０−３３Ｄ１＋樹状細胞のいずれかを含む２つの集団に分離した。分離したマクロファージ（Ｍａｃ）と樹状細胞（ＤＣ）の集団は、約２０μｇのＭ−ＦＰと共にインビトロで、約１６乃至２４時間、別々に培養した。未分割ＰＥＣ集団を同様に培養した。その後、細胞集団を別々のマウスに腹腔内注射し、ＭＵＣ１特異ＣＴＬｐ度数を、セクションＡで一般的に説明した方法を用いて決定した。
【００８６】
【表３】
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表３を参照する。この結果から、１０６のインビトロにおいてパルス適用したＰＥＣの注射により、１／１１，０００のＣＴＬｐ度数が生じることが示唆された。同様に、６×１０５適用マクロファージは１／１５，０００のＣＴＬｐ度数を生じ、２×１０５樹状細胞は１／６４，０００のＣＴＬｐ度数を生じた。このように、マンノース受容体陽性のＦ４／８０＋マクロファージが、ＣＴＬｐ度数の増加に対する主な原因となった。マンノース受容体陰性である樹状細胞のＣＴＬｐ度数の増加への有効性はより低かった。
【００８７】
上記実験において、注射したマクロファージ（６×１０５）の数は注射した樹状細胞（２×１０５）の数とは異なった。続いて、同じ投与量（２×１０５）の各細胞型を用いて比較を行った。マクロファージ集団と樹状細胞集団とは、すぐ上で説明したように調製し、マウスに注射した。約２×１０５のマクロファージおよび約２×１０５の樹状細胞を別々のマウスに注射し、ＭＵＣ１特異ＣＴＬｐ度数を決定した。マクロファージの注射により１／１３，０００のＣＴＬｐ度数が得られ、一方、樹状細胞の注射により１／６５，０００のＣＴＬｐ度数が得られた（表３を参照のこと）。このように、マクロファージは、マウスがインビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用した細胞を受け取ると、高いＣＴＬｐ度数を発生させる主なエフェクター細胞である。
【００８８】
ＭＵＣ１抗原提示における樹状細胞の役割もまた、１６乃至２４時間、インビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用した約１０６のＪ７７４細胞を用いて１回ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することにより決定した。Ｊ７７４細胞により１／３３，０００のＣＴＬｐ度数が得られた（表３を参照）。ＢＡＬＢ／ｃマウスはまた、１６乃至２４時間、ｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したＤ２ＳＣ／１細胞（樹状細胞系）を用いて１回免疫した。Ｄ２ＳＣ／１細胞の注射により、１３０，０００／１のＣＴＬｐ度数が得られた（表３を参照）。これらのことから、ｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したマクロファージの方が、ｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用した樹状細胞よりも、ＣＴＬｐ度数の増加について有効であることが示される。
【００８９】
６．ｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したＰＥＣを用いて生じた免疫応答に関するＧＭ−ＣＳＦの効果
ＰＥＣをマウスから単離し、プラスチックに付着させ、酸化−Ｍ−ＦＰ（ｏｘ−Ｍ−ＦＰ）を適用し、ＧＭ−ＣＳＦ（約１０ｎｇ／ｍｌ）またはγインターフェロンと共に、約３時間インビトロでインキュベートした。いくつかの細胞はサイトカインの不在下で、ｏｘ−Ｍ−ＦＰと共に約３時間インキュベートした。図４を参照する。その後、細胞は特定の実験を受けていない別々のマウスに移入された。ＧＭ−ＣＳＦ処理細胞の移入により、１／２，５００のＣＴＬｐ度数が得られた。無処理細胞の移入により、１／７，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。逆に、γインターフェロンで処理した細胞の移入により、１／９，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。
【００９０】
別の試験では、ＰＥＣをマウスから単離し、プラスチックに付着させ、ｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用した。パルス適用細胞をその後、ＧＭ−ＣＳＦ  ｏ／ｏ  マウス（同族組換えにより生成したＧＭ−ＣＳＦ欠失マウス；アシュレイ  ダン博士から入手）、Ｇ−ＣＳＦ  ｏ／ｏ  マウス（同族組換えにより生成したＧ−ＣＳＦ欠失マウス；アシュレイ  ダン博士から入手）または野生型マウスのいずれかに注射した。このプロセスを繰り返し、各マウスに対し合計３回の注射を行った。図５を参照する。この結果から、野生型マウスから単離したＰＥＣの移入により、野生型マウスでは１／８，０００、Ｇ−ＣＳＦ  ｏ／ｏ  マウスでは１／１６，０００、ＧＳ−ＣＳＦ  ｏ／ｏ  マウスでは１／３２，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。ＧＭ−ＣＳＦ  ｏ／ｏ  マウスをさらにＭ−ＦＰで免疫し、また、ＧＭ−ＣＳＦを与えた。このマウスにおけるＣＴＬｐ度数は１／１６，０００まで増加した。このように、インビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したＰＥＣに対するＣＴＬｐ応答は、部分的にＧＭ−ＣＳＦに依存し、ＧＭ−ＣＳＦにより増大させることができる。
【００９１】
別の試験において、組換えＧＭ−ＣＳＦを１日に当たり１μｇ、２，３，４，５または６日間、野生型マウスの腹腔内に注射した。マウスからＰＥＣを単離し、Ｆ４／８０または３３Ｄ抗体および標準方法を用いて計数および染色した。染色した細胞はその後、標準方法を用いてフローサイトメトリにより検出した。マウス１匹当たり、約１０６の存在するＰＥＣ細胞を１日（１回の注射）後に単離した。約９．６×１０６のマクロファージ（Ｆ４／８０＋細胞）が２日（２回の注射）後に得られ、約１．２×１０７のマクロファージが３日（３回の注射）後に得られ、約２×１０７のマクロファージが４から６日（４回から６回の注射）後に得られた。４日後のＧＭ−ＣＳＦ注射が、最も多くの数のマクロファージを単離するには最適である。１つのグループのマウスにはその後、１日につき１μｇの組換えＧＭ−ＣＳＦを４日間注射した。５日目に、ｏｘ−Ｍ−ＦＰを１回だけ、これらのマウスおよびＧＭ−ＳＣＦで処理していないマウスのグループに注射した。図６を参照する。ＧＭ−ＣＳＦで処理し、その後１回のｏｘ−Ｍ−ＦＰ注射を受けたマウスは１／９，９００のＣＴＬｐ度数を有した。ＧＭ−ＣＳＦを受けなかったが、１回のｏｘ−Ｍ−ＦＰの注射を受けたマウスでは、１／４５，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。このように、Ｏｘ−Ｍ−ＦＰタンパク質の注射に対するＣＴＬｐ応答はＧＭ−ＣＳＦの投与により向上させることができる。
【００９２】
７．マウスにおける半同種異系マクロファージの伝達
ＤＢＡ／２マウスから単離したマクロファージに、上述したようにｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用するか、あるいは適用しなかった。２つの細胞集団はその後、別々にＤＢＡ／２、Ｃ５７ＢＬ／６あるいは（ＤＢＡ／２×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスのいずれかに注射した。図７を参照する。パルス適用マクロファージをＤＢＡ／２マウスに注射すると、１／８，０００のＣＴＬｐ度数が得られ、適用マクロファージをＣ５７ＢＬ／６マウスに注射すると、１／２２０，０００のＣＴＬｐ度数が得られ、適用したマクロファージを（ＤＢＡ／２×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスに注射すると、１／１０，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。非パルス適用マクロファージを注射したマウスでは、ＣＴＬｐ度数は＜１／１０６であった。ＰＥＣを（ＤＢＡ／２×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスから単離し、ｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用した後、それをＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／２マウスのいずれかに注射することを除き、直前に述べたのと同じ方法を繰り返した。（ＤＢＡ／２×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスからのｏｘ−Ｍ−Ｐパルス適用ＰＥＣを、Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／２マウスのいずれかに移入させると、高いＣＴＬｐ度数が得られた。このように免疫応答は半同種異系的に伝達され得る（すなわち、１つのハプロタイプが共有される場合）。
【００９３】
ひとまとめにして考えると、セクションＡからセクションＧまでにおいて説明した結果から、ｏｘ−Ｍ−ＦＰと共にマクロファージ細胞を培養し、その細胞を同系マウスに養子免疫伝達させると、ＭＵＣ１に対する特異的ＣＴＬ応答が誘発されることが示唆された。さらに、酸化−Ｍ−ＦＰを適用したマクロファージによる１回の免疫化が、ＭＵＣ１＋腫瘍からの保護につながった。インビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したマクロファージを用いた１回の免疫により、ＣＴＬｐが増加し、ｏｘ−Ｍ−ＦＰ融合タンパク質を用いた３回の免疫で与えられるＣＴＬｐと等価になる。このように、インビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用することによりマンノース受容体を標的とすると、Ｔ１細胞免疫応答が起こる。
【実施例２】
【００９４】
この実施例では、還元剤であるホウ化水素ナトリウムとシアノホウ化水素ナトリウムとの比較について述べる。
Ｏｘ−Ｍ−ＦＰは実施例１で説明したように調製した。３つの異なるサンプルを以下のように調製した。ｏｘ−Ｍ−ＦＰの一部を０．５ｍｇ／ｍｌのホウ化水素ナトリウムと結合させて、シッフ塩基およびアルデヒドを還元した。ｏｘ−Ｍ−ＦＰの別の一部分を０．５ｍｇ／ｍｌのシアノホウ化水素ナトリウムと結合させ、優先的にシッフ塩基だけを還元させた。第３の部分は未処理のままとした。３つのサンプルをそれぞれ５μｇ、別々のマウスに注射した。細胞障害性Ｔ細胞度数（ＣＴＬｐ）を、実施例１において一般的に説明した方法を用いて決定した。
【００９５】
結果から、シアノホウ化水素ナトリウムで処理したｏｘ−Ｍ−ＦＰにより誘導されたＣＴＬｐ度数は１／１０，３００であることが示唆された。ホウ化水素ナトリウムで処理したｏｘ−Ｍ−ＦＰにより誘導されたＣＴＬｐ度数は１／７９，５００であった。未処理ｏｘ−Ｍ−ＦＰにより誘導されたＣＴＬｐ度数は１／１４，５７５であった。まとめて考えると、これらの結果により、ｏｘ−Ｍ−ＦＰ上のアルデヒド基がＣＴＬｐ誘導には重要であることが示唆された。
【実施例３】
【００９６】
この実施例では、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびビタミンＤと共に末梢血液の単核細胞を培養する効果について述べる。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、標準方法を用いて、正常なヒトドナーから単離した。新しく単離したＰＢＭＣは、無血清のＡＩＭ−Ｖ培地中の標準６−ウェル組織培養プレートのウェルで、ウェル毎に、２ｍｌの培地当たり１０×１０６の濃度で、２時間培養した。インキュベーション工程後、非付着細胞をウェルから除去した。１ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび５０ｎＭのビタミンＤを含む約２ｍｌの新しい無血清ＡＩＭ−Ｖ培地を各ウェルに添加した。細胞は２、４および７日間インキュベートした。
【００９７】
それぞれ予め決めた時点で、細胞を収集し、マンノース受容体の発現、および単球、マクロファージならびに樹状細胞を識別する細胞表面標識について分析した。発現は実施例１で一般的に説明した方法を用いてＦＡＣＳ分析により決定した。ＦＡＣＳ分析では以下の試薬を用いた：フルオレセイン共役（ＦＩＴＣ）酸化マンナン（ｏｘ−Ｍ−ＦＩＴＣ；実施例１で述べた）；フィコエリトリン（ＰＥ）共役ＣＤ１１ｂ、ＰＥ共役ＣＤ１１ｃ、ＰＥ共役ＣＤ１４、ＦＩＴＣ共役ＣＤ６８、ＦＩＴＣ共役ＣＤ８０、ＰＥ共役ＣＤ８６およびＰＥ共役ＣＤ５４。
【００９８】
ＦＡＣＳ分析の結果を以下の表４に示す。
【００９９】
【表４】
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最大数のマンノース受容体陽性細胞は、インキュベーション４日の２日の培養の後に生成された。これは、細胞活性化標識を表すＣＤ５４、ＣＤ８０およびＣＤ８６保持細胞における増加とよく相関する。
【実施例４】
【０１００】
この実施例では、ＭＵＣ１に対する抗体およびＧａｌａ（１，３）Ｇａｌ抗体の結合がそれぞれ、Ｇａｌａ（１，３）ＧａｌおよびＭＵＣ１との交差反応することについて述べる。
【０１０１】
いくつかのマウスにおいて、Ｇａｌａ（１，３）ＧａｌまたはＭＵＣ１に特異的に結合する抗体の存在について分析した。正常なマウス、同系組換えによりＧａｌ遺伝子を欠失させたマウス（ｇａｌ  ｏ／ｏマウス）、および約５μｇのＭＵＣ１ペプチドにより３回腹腔内に投与して免疫したマウスのいずれかから血清を得た。これらの血清中のＭＵＣ１に結合する抗体の存在を、それらの抗体がＭＵＣ１を発現する（ＢＴ−２０細胞またはＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞）かまたは発現しない（ＭＥ２７２またはＲＭＡ細胞）細胞系に結合する能力を調べることにより決定した。抗体のこれらの細胞への結合は実施例１で一般的に説明した方法を用いてＦＡＣＳ分析により決定した。
【０１０２】
図８を参照する。正常マウスからの血清はどの細胞系にも結合しなかった。ＭＵＣ１に対して作製された抗血清は、ＢＴ−２０細胞（図８のパネルＡ）およびＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞（図８のパネルＣ）に結合するが、ＭＥ２７２（図８のパネルＢ）およびＲＭＡ細胞（図８のパネルＤ）には結合しない抗体を含有した。
【０１０３】
ＢＴ−２０細胞およびＭＥ２７２細胞はＧａｌａ（１，３）Ｇａｌを発現しないが、ＲＭＡ−ＭＵＣ１およびＲＭＡ細胞はＧａｌａ（１，３）Ｇａｌを発現する。ｇａｌ  ｏ／ｏマウスの血清はガラクトースに対する自然抗体を含み、これは、ＢＴ−２０細胞（ＭＵＣ−ｇａｌ＋細胞；図８のパネルＡ）およびＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞（ＭＵＣ＋ｇａｌ＋細胞；図８のパネルＣ）との反応性により示された。ＲＭＡ細胞（ＭＵＣ−ｇａｌ＋；図８のパネルＤ）では弱く、ＭＥ２７２細胞（ＭＵＣ−ｇａｌ−）は陰性であった。ｇａｌ  ｏ／ｏマウスの血清は、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞により強く結合する抗体を含んでいた。ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞はＭＵＣ１の発現によってのみ、ＲＭＡ細胞と異なる。
【０１０４】
まとめて考えると、これらの結果から、ＲＭＡ細胞によるＭＵＣ１の発現、およびＢＴ−２０細胞上でのＭＵＣ１の発現が、ｇａｌ  ｏ／ｏマウス中に存在する抗−ｇａｌ抗体との反応性を与えることが示唆された。このように、ｇａｌ  ｏ／ｏマウスで自然に生じる抗体はＭＵＣ１と反応し、ＭＵＣ１に対して作製された抗体はＧａｌａ（１，３）Ｇａｌと反応した。
【実施例５】
【０１０５】
この実施例では、Ｇａｌａ（１，３）Ｇａｌを発現する動物はＧａｌａ（１，３）Ｇａｌに対する自然に生じる抗体を有していないこと、酸化マンナン−ＭＵＣ１で免疫するとＭＵＣ１に結合する抗体を産出しないことを述べる。
【０１０６】
約５μｇのｏｘ−Ｍ−ＦＰ（実施例１に記載）を用いた動物の多重免疫を週１回の間隔で、以下の部位に行った：マウスの腹腔内；ウサギおよびニワトリの筋内；ヒトおよびサル。免疫した動物から得た血清について、以下の方法を用いて酵素結合免疫収着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＭＵＣ１に対する抗体の存在を調べた。標準マイクロタイタープレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の１０μｇ／ｍｌＭＵＣ１ペプチド（実施例１に記載）溶液で、約１６時間、４℃でコートした。非結合ペプチドをプレートから除去した。プレートを標準方法を用いて洗浄した。その後、プレートをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の２％ｗ／ｖ溶液で、約２時間、約４℃でコートした。非結合分をプレートから除去し、標準方法を用いてプレートの洗浄を行った。マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒト、サル血清の約５０μｌの様々な希釈液をコートプレート上の別々のウェルに添加し、約２時間室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、非結合抗体を除去した。各種の動物由来の、プレートに結合した抗体の存在は、２次抗体を用いて検出した。２次抗体としては、マウス抗体を検出するためのヒツジ抗マウス抗体、ウサギ抗体を検出するための抗ウサギ抗体、ニワトリ抗体を検出するための抗ニワトリ抗体、ヒト抗体を検出するための抗ヒト抗体、サル抗体を検出するための抗サル抗体が挙げられる。これらの抗体をプレートに添加し、プレートを約１時間、室温でインキュベートした。プレートに結合した２次抗体の存在は、約ｐＨ４で、０．０３％２，２’−アジノ−ジ（３）−エチルベンズチアゾリンスルホン酸（アマーシャム、イギリス所在（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）から入手可能）および０．０２％過酸化水素の約０．１Ｍのクエン酸緩衝液５０μｌを用いて検出した。反応は約１０乃至約１５分間、室温で行い、その後、ＥＬＩＳＡ読み取り装置を用いて、４０５ｎｍでの吸光度の読み取りを行った。
【０１０７】
図９を参照する。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｏｘ−Ｍ−ＦＰによる免疫では、マイクロタイタープレート上に固定したＭＵＣ１に結合する抗体の検出可能な産出は誘導されなかった。逆に、ｇａｌ  ｏ／ｏマウスのｏｘ−Ｍ−ＦＰによる免疫では、ＭＵＣ１に結合する抗体が高い滴定濃度、約１０−４希釈で産出された。ｇａｌ  ｏ／ｏマウス中に存在するｇａｌに対する自然に生じる抗体は、溶液中の完全なＭＵＣ１またはＭＵＣ１融合タンパク質と反応するが、マイクロタイタープレート上に固定されたＭＵＣ１の合成ペプチドとは反応しない。これから、ｇａｌ  ｏ／ｏマウスからの免疫前の血清と固定ＭＵＣ１ペプチドとの反応性が欠如していることが示唆された（図９）。さらに、Ｇａｌａ（１，３）Ｇａｌに対して陰性のいくつかの他の動物において、ｏｘ−Ｍ−ＦＰに結合する抗体の高滴定量が示された（表５を参照）。Ｇａｌａ（１，３）Ｇａｌに対し陰性であるウサギは、ＭＵＣ１に結合する抗体を産出しなかった。このように、Ｇａｌａ（１，３）Ｇａｌに対し陽性ではあるがガラクトースに結合する予め存在する抗体を有さない動物（すなわち、マウスおよびウサギ）は、ｏｘ−Ｍ−ＦＰによる免疫に伴う抗ＭＵＣ１抗体を産出しなかった。対照的に、ガラクトースに対し陰性である動物（すなわち、ヒト、サル、ニワトリおよびｇａｌ  ｏ／ｏマウス）は、ｏｘ−Ｍ−ＦＰによる免疫に応答して、抗−ＭＵＣ１抗体を産出した。
【０１０８】
【表５】
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【実施例６】
【０１０９】
この実施例では、Ｇａｌａ（１，３）Ｇａｌに対し陽性である動物は、マンナン−ＭＵＣ１による免疫に応答して、抗体ではなくＣＴＬｐを産出することについて述べる。
正常マウスおよびｇａｌ  ｏ／ｏマウスにｏｘ−Ｍ−ＦＰを注射し、得られたＣＴＬｐ度数を実施例１で一般的に説明した方法を用いて測定した。図１１を参照する。正常マウスにｏｘ−Ｍ−ＦＰを１回または３回注射すると、それぞれ、１／７０，０００または１／１０，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。同様にｇａｌ  ｏ／ｏマウスに注射すると、１回の注射で１／２０，０００の、３回の注射で１／６０，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。正常マウスおよびｇａｌ  ｏ／ｏマウスにはまた、同様に、卵白アルブミンから導いた対照標準ペプチドを注射した。ｏｘ−Ｍ−ＦＰを用いた時に観察された正常マウスとｇａｌ  ｏ／ｏマウスにおけるＣＴＬｐ度数の違いは、卵白アルブミンエピトープを用いた時には観察されなかった。図１２を参照する。マンナン結合卵白アルブミンペプチドを用いた正常マウスあるいはｇａｌ  ｏ／ｏマウスを３回免疫し、それぞれ、１／１０，０００および１／１２，０００のＣＴＬｐ度数を得た。ゆえに、ｇａｌ  ｏ／ｏマウスにおけるＣＴｌｐ度数応答の減小はＭＵＣ１に独特のものであり、ｇａｌ  ｏ／ｏマウスは他の抗原に対するＣＴＬｐ応答を開始することができた。これらの結果から、ｏｘ−Ｍ−ＦＰ免疫に対するＣＴＬｐ度数応答はｇａｌ  ｏ／ｏマウスに比べ正常マウスにおいて大きいことが示唆された。これらの結果は実施例５において説明した抗体産出結果に反するものである。
【０１１０】
別の試験において、マウスについてすぐ上で説明したのと同様の方法により、サルをｏｘ−Ｍ−ＦＰで免疫した。表５を参照する。ｏｘ−Ｍ−ＦＰで免疫したサルは抗体応答を示したが、ＣＴＬｐ応答は示さなかった。この結果は、ｇａｌ  ｏ／ｏマウスを用いて得られた結果と同様である。
【０１１１】
このように、ＣＴＬｐが測定できる種においては、ガラクトースに対する予め存在する抗体がないこととｏｘ−Ｍ−ＦＰを用いた免疫によるＣＴＬｐ応答の向上との間には相関がある。
【実施例７】
【０１１２】
この実施例では、ガラクトースに対する抗体が、動物の免疫前にｏｘ−Ｍ−ＦＰと混合されるとＣＴＬｐの出現を減小させることについて述べる。
正常マウスに、ｏｘ−Ｍ−ＦＰまたは抗ガラクトース抗体を含むｇａｌ  ｏ／ｏ血清と共に混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰのいずれかを１回あるいは３回注射した。実施例１で一般的に説明した方法を用いて、免疫したマウスに対し、ＣＴＬｐ度数を求めた。図１１について説明する。１回の注射を受けたマウスでは、ｏｘ−Ｍ−ＦＰで免疫すると１／６２，０００のＣＴＬｐ度数が、ｇａｌ  ｏ／ｏ血清と混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰで免疫すると１／２７５，０００のＣＴＬｐ度数が得られた。同様に、３回注射したマウスに対しては、ＣＴＬｐ度数は、ｏｘ−Ｍ−ＦＰで１／８，０００、ｇａｌ  ｏ／ｏ血清と混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰで１／５９，０００であった。このように、ｏｘ−Ｍ−ＦＰに抗−ガラクトース抗体を添加すると、正常マウスにおけるＣＴＬｐ度数の生成はｇａｌ  ｏ／ｏマウスにおいて観察されるレベルまで制限された。さらに、正常マウスに、ｇａｌ  ｏ／ｏ血清と共に混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰを注射すると、かなりの抗体が産出された（表５を参照）。
【実施例８】
【０１１３】
この実施例では、インビトロでｏｘ−Ｍ−ＦＰを適用したマクロファージ細胞による正常マウスおよびｇａｌ  ｏ／ｏマウスの免疫と、そのようなマウスにおける抗体ではなくＣＴＬｐの産出とについて述べる。
【０１１４】
マクロファージ細胞は実施例１で一般的に説明した方法を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスから得た。マクロファージ細胞には、実施例１で一般的に説明した方法を用いて、ｏｘ−Ｍ−ＦＰまたはｇａｌ  ｏ／ｏ血清と混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰのいずれかを一晩中、パルス適用した。正常マウスおよびｇａｌ  ｏ／ｏマウスは実施例１で一般的に説明した適用マクロファージ細胞で免疫した。
【０１１５】
図１３を参照する。パルス適用したマクロファージによるｇａｌ  ｏ／ｏマウスの免疫では、ＣＴＬｐは正常マウスと本質的に等価なレベルまで誘導された（それぞれ、１／１１，５００および１／８，０００）が、検出可能な抗体応答は誘導されなかった（図１０を参照のこと）。ｇａｌ  ｏ／ｏ血清と混合したｏｘ−Ｍ−ＦＰをパルス適用したマクロファージを用いたマウスの免疫では、強いＣＴＬｐ応答は誘導されなかった。
【０１１６】
本発明の様々な実施の形態において詳細に説明してきたが、これらの実施の形態の変更および改良は当業者であれば可能であることは明らかであろう。しかしながら、このような変更および改良は特許請求の範囲に記載されるように本発明の範囲内にあることを明白に理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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