(57)【要約】【課題】被観察物中の一部の層の分布を短時間で検出する。【解決手段】本発明の観察装置を例示する一態様は、低コヒーレンス光源から射出した光束を２つに分岐する分岐手段と、分岐手段により分岐された２つの光束の一方を被観察物（２０）へ上面側から入射させると共に、２つの光束の他方を被観察物へ下面側から入射させる照明手段（１５ｔ〜１８ｔ、１５ｂ〜１８ｂ）と、２つの光束の光路長差がゼロとなる面（ＢＰ）を被観察物中に配する光路設定手段と、２つの光束で照明された被観察物の像を検出する画像検出手段（１８ｔ、１７ｔ、２１、２２）とを備える。【選択図】    図２
2011022063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低コヒーレンス光源から射出した光束を２つに分岐する分岐手段と、
前記分岐手段により分岐された２つの光束の一方を被観察物へ上面側から入射させると共に、前記２つの光束の他方を前記被観察物へ下面側から入射させる照明手段と、
前記２つの光束の光路長差がゼロとなる面を前記被観察物中に配する光路設定手段と、
前記２つの光束で照明された前記被観察物の像を検出する画像検出手段と、
を備えたことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の観察装置において、
前記２つの光束の光路長差がゼロとなる面で前記被観察物をその深さ方向にかけて走査しながら、前記画像検出手段を繰り返し駆動することにより、複数の画像データを取得する制御手段と、
前記制御手段が取得した複数の画像データに基づき前記被観察物の三次元分布を算出する演算手段と、
を更に備えたことを特徴とする観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の観察装置において、
前記制御手段は、
前記被観察物をその深さ方向にかけて移動させることにより前記走査を行う
ことを特徴とする観察装置。
【請求項４】
請求項２に記載の観察装置において、
前記制御手段は、
前記２つの光束のうち少なくとも一方の光路長を変化させることにより前記走査を行う
ことを特徴とする観察装置。
【請求項５】
請求項２〜請求項４の何れか一項に記載の観察装置において、
前記制御手段は、
前記走査の走査位置に応じて、前記光路長差がゼロとなる面と前記画像検出手段の検出面との間のピント調節を行う
ことを特徴とする観察装置。
【請求項６】
請求項２〜請求項５の何れか一項に記載の観察装置において、
前記画像検出手段は、
前記被観察物中の蛍光分子が発する蛍光の強度を検出し、
前記被観察物へ入射する前記２つの光束は、
前記被観察物中の蛍光分子を励起するものであり、
前記２つの光束の波長帯域は、
前記画像検出手段の検出波長帯域に重複しない範囲でなるべく広く設定される
ことを特徴とする観察装置。
【請求項７】
請求項６に記載の観察装置において、
前記演算手段は、
前記走査の走査位置に対する前記複数の画像データの変化波形からキャリア成分を除去することにより、前記被観察物中の蛍光強度の三次元分布を算出する
ことを特徴とする観察装置。
【請求項８】
請求項２〜請求項５の何れか一項に記載の観察装置において、
前記演算手段は、
前記走査の走査位置に対する前記複数の画像データの変化波形からキャリア成分を除去することにより、前記被観察物中の反射光強度の三次元分布を算出する
ことを特徴とする観察装置。
【請求項９】
低コヒーレンス光源から射出した光束を２つに分岐する分岐手順と、
前記分岐手順で分岐された２つの光束の一方を被観察物へ上面側から入射させると共に、前記２つの光束の他方を前記被観察物へ下面側から入射させる照明手順と、
前記２つの光束の光路長差がゼロとなる面を前記被観察物中に配する光路設定手順と、
前記２つの光束で照明された前記被観察物の像を検出する画像検出手順と、
を含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の観察方法において、
前記２つの光束の光路長差がゼロとなる面で前記被観察物をその深さ方向にかけて走査しながら、前記画像検出手順を繰り返し実行することにより、複数の画像データを取得する制御手順と、
前記制御手順で取得した複数の画像データに基づき前記被観察物の三次元分布を算出する演算手順と、
を更に含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の観察方法において、
前記制御手順では、
前記被観察物をその深さ方向にかけて移動させることにより前記走査を行う
ことを特徴とする観察方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の観察方法において、
前記制御手順では、
前記２つの光束のうち少なくとも一方の光路長を変化させることにより前記走査を行う
ことを特徴とする観察方法。
【請求項１３】
請求項１０〜請求項１２の何れか一項に記載の観察方法において、
前記制御手順では、
前記走査の走査位置に応じて、前記光路長差がゼロとなる面と前記前記画像検出手順の検出面との間のピント調節を行う
ことを特徴とする観察方法。
【請求項１４】
請求項１０〜請求項１３の何れかに記載の観察方法において、
前記画像検出手順では、
前記被観察物中の蛍光分子が発する蛍光の強度を検出し、
前記被観察物へ入射する前記２つの光束は、
前記被観察物中の蛍光分子を励起するものであり、
前記２つの光束の波長帯域は、
前記画像検出手順の検出波長帯域に重複しない範囲でなるべく広く設定される
ことを特徴とする観察方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の観察方法において、
前記演算手順では、
前記走査の走査位置に対する前記複数の画像データの変化波形からキャリア成分を除去することにより、前記被観察物中の蛍光強度の三次元分布を算出する
ことを特徴とする観察方法。
【請求項１６】
請求項１０〜請求項１３の何れか一項に記載の観察方法において、
前記演算手順では、
前記走査の走査位置に対する前記複数の画像データの変化波形からキャリア成分を除去することにより、前記被観察物中の反射光強度の三次元分布を算出する
ことを特徴とする観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被観察物の深さ方向に分解能を有した観察装置及び観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の深さ方向に分解能を有した顕微鏡として蛍光共焦点顕微鏡が広く用いられている（特許文献１等を参照）。蛍光共焦点顕微鏡は、蛍光分子によって予め標識された細胞試料中の特定の層に向けて励起光を集光し、その集光点と共役位置に配置されたピンホールを介してその集光点で発生した蛍光を検出するものである。その集光点の深さをずらしながら検出を繰り返えせば、試料の深さ方向の蛍光強度分布が既知となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−５２１４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、蛍光共焦点顕微鏡では蛍光強度の検出を試料内のポイント毎に行う必要があるので、試料の特定の層の蛍光強度分布を観察したい場合には、励起光の集光点でその層を二次元走査する必要があった。
【０００５】
そこで本発明は、被観察物中の一部の層の分布を短時間で検出可能な観察装置及び観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の観察装置を例示する一態様は、低コヒーレンス光源から射出した光束を２つに分岐する分岐手段と、前記分岐手段により分岐された２つの光束の一方を被観察物へ上面側から入射させると共に、前記２つの光束の他方を前記被観察物へ下面側から入射させる照明手段と、前記２つの光束の光路長差がゼロとなる面を前記被観察物中に配する光路設定手段と、前記２つの光束で照明された前記被観察物の像を検出する画像検出手段とを備える。
【０００７】
本発明の観察方法を例示する一態様は、低コヒーレンス光源から射出した光束を２つに分岐する分岐手順と、前記分岐手順で分岐された２つの光束の一方を被観察物へ上面側から入射させると共に、前記２つの光束の他方を前記被観察物へ下面側から入射させる照明手順と、前記２つの光束の光路長差がゼロとなる面を前記被観察物中に配する光路設定手順と、前記２つの光束で照明された前記被観察物の像を検出する画像検出手順とを含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、被観察物中の一部の層の分布を短時間で検出可能な観察装置及び観察方法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第１実施形態の顕微鏡装置の概略構成図（光ファイバの上流側）である。
【図２】第１実施形態の顕微鏡装置の概略構成図（光ファイバの下流側）である。
【図３】蛍光分子の特性を説明する図である。
【図４】励起フィルタ１２及びバリアフィルタ２１の特性を説明する図である。
【図５】第１実施形態の装置固有の励起スペクトルを示す図である。
【図６】第１実施形態における蛍光強度の光軸方向の走査波形を示す図である。
【図７】第１実施形態のコントローラの動作フローチャートである。
【図８】透過型ステージＯＳの走査位置ｄを説明する図である。
【図９】画素番号ｉに対応する画素の信号波形を示す図である。
【図１０】ステップS１６を説明する図である。
【図１１】復元された信号波形を示す図である。
【図１２】第２実施形態の顕微鏡装置の概略構成図（光ファイバの上流側）である。
【図１３】第２実施形態の顕微鏡装置の概略構成図（光ファイバの下流側）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、生物試料の蛍光強度の三次元分布を観察する顕微鏡装置の実施形態である。なお、この生物試料は、蛍光分子で予め標識されているものとする。
【００１１】
先ず、装置の構成を説明する。図１、図２は、本実施形態の顕微鏡装置の概略構成図である。図１、図２に示すとおり、本実施形態の顕微鏡装置には、白色光源１０、コリメートレンズ１１、励起フィルタ１２、ビームスプリッタ１３、ミラーＭ１〜Ｍ９、ミラーステージＭＳ、コレクタレンズ１４ｔ、１４ｂ、光ファイバ１５ｔ、１５ｂ、コリメートレンズ１６ｔ、１６ｂ、対物レンズ１８ｔ、１８ｂ、ビームスプリッタ１７ｔ、１７ｂ、試料２０を支持する透過型ステージＯＳ、バリアフィルタ２１、２次元画像検出器２２が備えられる。
【００１２】
白色光源１０から射出した光束は、コリメートレンズ１１及び励起フィルタ１２を介してビームスプリッタ１３へ入射する。ビームスプリッタ１３へ入射した光束は、第１光路Ｒ１を進行する光束と、第２光路Ｒ２を進行する光束との２つの光束に分岐する。
【００１３】
第１光路Ｒ１を進行する光束は、ミラーＭ１〜Ｍ４を順に反射した後にコレクタレンズ１４ｔへ入射し、光ファイバ１５ｔの入射端へ入射する。第２光路Ｒ２を進行する光束は、ミラーＭ５〜Ｍ９を順に反射した後にコレクタレンズ１４ｂへ入射し、光ファイバ１５ｂの入射端へ入射する。
【００１４】
第１光路Ｒ１において互いに隣接した位置に配置されたミラーＭ２、Ｍ３は、共通のミラーステージＭＳによって支持されている。ミラーステージＭＳが矢印の方向へ駆動されると、第１光路Ｒ１の光路長が伸縮するので、第１光路Ｒ１と第２光路Ｒ２との光路長差が調節される。
【００１５】
光ファイバ１５ｔは、偏波面保存型のシングルモードファイバであり、光ファイバ１５ｂも、光ファイバ１５ｔと同じ仕様の光ファイバである。光ファイバ１５ｔの入射端へ入射した光束は、光ファイバ１５ｔの出射端から射出し、光ファイバ１５ｂの入射端へ入射した光束は、光ファイバ１５ｂの出射端から射出する。
【００１６】
光ファイバ１５ｔの出射端から射出した光束は、コリメートレンズ１６ｔ、ビームスプリッタ１７ｔ、対物レンズ１８ｔを順に経て平面波となり、上面側から試料２０へ入射する。光ファイバ１５ｂの出射端から射出した光束は、コリメートレンズ１６ｂ、ビームスプリッタ１７ｂ、対物レンズ１８ｂを順に経て平面波となり、下面側から試料２０へ入射する。なお、対物レンズ１８ｔ、１８ｂは、互いに同じ仕様の顕微鏡対物レンズ（ここでは、有限遠方補正系の顕微鏡対物レンズ）である。
【００１７】
ここで、図１に示したミラーステージＭＳの位置は、試料２０の上面側及び下面側から個別に入射する２つの光束の光路長差が、透過型ステージＯＳの近傍に予め定められた面ＢＰにて略ゼロになるように予め調整される。以下、ミラーステージＭＳの位置は調整後に固定され、面ＢＰの位置も調整後に固定されたものとみなす。この面ＢＰが、本装置の観察対象面となる。以下、この面ＢＰを、「基準面ＢＰ」と称す。
【００１８】
前述したとおり光源１０として白色光源を使用した場合、試料２０へ上側から入射する光束と下側から入射する光束が干渉するのは、基準面ＢＰ（及びその近傍の面）である。よって、試料２０は、基準面ＢＰ上で強度がピークとなるような定在波干渉光束で照明されることになる（定在波干渉光束の詳細は後述。）。
【００１９】
試料２０に含まれる蛍光分子のうち、定在波干渉光束で照明された蛍光分子は励起され、蛍光を発する。その蛍光は、対物レンズ１８ｔを通過し、ビームスプリッタ１７ｔで反射し、バリアフィルタ２１を通過し、２次元画像検出器２２上に試料２０の蛍光像を形成する。
【００２０】
２次元画像検出器２２の撮像面は、対物レンズ１８ｔに関して基準面ＢＰと共役な面に配置される。２次元画像検出器２２は、その撮像面上に形成された蛍光像を撮像して画像データを取得し、不図示のコントローラへ出力する。
【００２１】
不図示のコントローラは、光源１０、透過型ステージＯＳ、２次元画像検出器２２などを駆動する制御部としての機能と、２次元画像検出器２２が取得した画像データを解析する演算部としての機能とを有する。例えば、コントローラは、光源１０をオンした状態で、透過型ステージＯＳを光軸方向へ駆動する。これによって、試料２０が基準面ＢＰにより深さ方向（光軸方向）に走査される。また、コントローラは、この走査中に２次元画像検出器２２を繰り返し駆動し、複数フレーム分の画像データを取り込む。さらにコントローラは、取り込んだ複数の画像データをコントローラ内部のメモリ（ＲＡＭなど）へ逐次に格納し、それらの画像データの信号波形（走査位置−画素値の変化カーブ）を解析する。また、コントローラは、解析結果などの必要な情報を適切なタイミングで不図示のモニタへ表示する。
【００２２】
次に、各部の特性を説明する。図３は、本実施形態の蛍光分子の特性を説明する図である。図３に示すとおり、本実施形態では、蛍光分子として、励起スペクトルの波長域が比較的広いものが使用される。この蛍光分子の励起スペクトルの中心波長は５００ｎｍであり、蛍光分子の蛍光スペクトルの中心波長は６１０ｎｍであり、蛍光分子の励起スペクトルの長波長側と蛍光分子の蛍光スペクトルの短波長側とは、波長５５０ｎｍの近傍でクロスしている。
【００２３】
図４は、励起フィルタ１２及びバリアフィルタ２１の特性を説明する図である。図４に示すとおり、励起フィルタ１２の透過波長帯域は、蛍光分子の励起スペクトルの主要部（中心波長５００ｎｍ及びその近傍波長）をカバーし、バリアフィルタ２１の透過波長帯域は、蛍光分子の蛍光スペクトルの主要部（中心波長６１０ｎｍ及びその近傍波長）をカバーしている。
【００２４】
ここで、本装置では、試料２０を照明する光束のスペクトルの波長帯域と、蛍光分子の励起スペクトルの波長帯域との重複範囲が広いほど、本装置の深さ方向の分解能が高くなり、２次元画像検出器２２が検出可能な光の波長帯域と、蛍光分子の蛍光スペクトルの波長帯域との重複範囲が広いほど、画像データのＳＮ比が高くなる。
【００２５】
そこで、励起フィルタ１２の透過波長帯域は、バリアフィルタ２１の透過波長帯域に重複しない範囲でなるべく広く確保され、励起フィルタ１２の透過波長帯域の上端値とバリアフィルタ２１の透過波長帯域の下端値とは、ＳＮ比と分解能とのバランスを考慮して適切に設定されることが望ましい。例えば、図４に示す例では、励起フィルタ１２の透過波長帯域の上端値を５５０ｎｍ、バリアフィルタ２１の透過波長帯域の下端値を５８５ｎｍとした。
【００２６】
図５は、本実施形態の顕微鏡装置に固有の励起スペクトル（装置固有の励起スペクトル）を示す図である。ここで、装置固有の励起スペクトルは、試料２０を照明する光束のスペクトルと、蛍光分子の励起スペクトルとの掛け算で定義されるものとする（なお、試料２０を照明する光束のスペクトルは、光源１０の発光スペクトルと励起フィルタの透過スペクトルとの掛け算で定義される。）。図５に示すとおり本実施形態では、装置固有の励起スペクトルを、中心波長５００ｎｍ、半値全幅が５０ｎｍのガウス型スペクトルとする。
【００２７】
試料２０中の蛍光分子は、試料２０中に生起した定在波干渉光束によって励起される。装置固有の励起スペクトルの形状が図５で説明した形状であった場合、試料２０の走査によって変位する、或る１つの点状の蛍光分子の光軸方向の位置と、その蛍光分子から放射される蛍光強度との関係（＝蛍光強度の光軸方向の走査波形）は、図６に示すとおりになる。なお、ここでは、試料２０の屈折率を１．３と仮定した。図６に示すとおり、蛍光強度の光軸方向の走査波形は、比較的高い周波数で変調されており、この走査波形のエンベロープがピークをとるのは、点状の蛍光分子の光軸方向の位置が基準面ＢＰ上に合致したときである。なお、本実施形態では装置固有の励起スペクトルをガウス型としたので（図５参照）、基準面ＢＰから外れた面にサブピーク（余計なピーク）が発生することは無い。
【００２８】
したがって、本実施形態では、試料２０を照明する照明光束を試料２０中の特定の層に限局させたのと同等の効果が得られる。
【００２９】
また、本装置の深さ方向の分解能（観察対象となる層の厚さ）は、図６に示す走査波形のエンベロープのピークの半値幅によって決まり、その半値幅が狭いほど、分解能は高くなる。図６に示した例によると、分解能は約１．６μｍとなる。
【００３０】
次に、コントローラの動作を説明する。図７は、コントローラの動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。
【００３１】
ステップＳ１１：コントローラは、透過型ステージＯＳの光軸方向の位置（走査位置ｄ）を初期値に設定する。走査位置ｄの初期値は、図８（Ａ）に示すとおり、基準面ＢＰが試料２０の最上面の近傍に位置するような値（ここでは−１５μｍ）である。なお、ここでは、試料２０の厚さを３０μｍ未満と仮定し、走査位置ｄの値を−１５μｍから＋１５μｍへと変化させると、図８（Ａ）→図８（Ｂ）→図８（Ｃ）のとおり試料２０の最上面近傍から試料２０の最下面近傍までが基準面ＢＰで走査されるものと仮定する。
【００３２】
ステップＳ１２：コントローラは、光源１０をオンすると共に、透過型ステージＯＳのプラス側への移動を開始する。これによって、基準面ＢＰによる試料２０の深さ方向の走査が開始される。なお、ここでは、透過型ステージＯＳの移動速度は一定であると仮定する。また、コントローラは、この走査を開始するのと同時に、２次元画像検出器２２の連続駆動を開始する。なお、ここでは、２次元画像検出器２２のフレームレートは一定であると仮定する。２次元画像検出器２２の連続駆動が開始されると、コントローラは、２次元画像検出器２２が連続して取得する画像データを順次に取り込み、それらの画像データを、各々の取得時における透過型ステージＯＳの走査位置ｄの値に対応付けてから、メモリ（ＲＡＭなど）へ格納する。
【００３３】
ステップＳ１３：コントローラは、透過型ステージＯＳの走査位置ｄが最終値（ここでは＋１５μｍ）に達したか否かを判別し、達していなかった場合には、走査及び画像データの取得を継続し、達していた場合には、光源１０をオフし、走査及び画像データの取得を終了する。なお、ここでは、透過型ステージＯＳの走査位置ｄが初期値（−１５μｍ）から最終値（＋１５μｍ）になるまでの期間に取得された画像データの数を「６２４」と仮定する。この場合、連続する２つの画像データ間の走査位置ｄのずれ（走査ピッチ）は、約４８ｎｍとなる。
【００３４】
ステップＳ１４：コントローラは、画素番号ｉを初期値（１）に設定する。
【００３５】
ステップＳ１５：コントローラは、メモリに格納された１２０個の画像データを読み出し、それらの画像データの中から、現在の画素番号ｉに対応する画素の信号波形を参照する。この信号波形は、図９に示すとおり、走査位置ｄに対する画素値（信号強度）の変化カーブである。この信号波形のうち、振幅の大きくなっている走査位置ｄが蛍光分子の存在していた位置を示しており、その振幅の大きさは、その蛍光分子の蛍光強度を示している。本ステップにおけるコントローラは、この信号波形をフーリエ変換し、各次数のフーリエスペクトル（図１０（Ａ））を求める。
【００３６】
ステップＳ１６：コントローラは、フーリエスペクトル（図１０（Ａ））から＋１次フーリエスペクトルを抽出し、その＋１次フーリエスペクトルを原点へシフトさせる（図１０（Ｂ））。これによって、信号波形に含まれていたキャリア成分が除去されたことになる。
【００３７】
ステップＳ１７：コントローラは、シフト後のフーリエスペクトルを逆フーリエ変換することにより、キャリア成分の除去された信号波形を復元する。なお、図９に示した信号波形から復元される信号波形は、図１１に示すとおりである。復元された信号波形は、試料２０上で画素番号ｉの画素に対応する位置の深さ方向の蛍光強度分布を示す。コントローラは、復元された信号波形を、画素番号ｉの画素に関する蛍光強度のＺ分布情報としてメモリに格納し、画素番号ｉの画素に関する解析を終了する。
【００３８】
ステップＳ１８：コントローラは、画素番号ｉが最終値に達したか否かを判別し、達していなかった場合にはステップＳ１９へ移行し、達していた場合にはステップＳ２０へ移行する。
【００３９】
ステップＳ１９：コントローラは、画素番号ｉをインクリメントし、ステップＳ１５へ戻る。
【００４０】
ステップＳ２０：コントローラは、メモリに格納された全ての画素に関する蛍光強度のＺ分布情報を読み出し、試料２０における蛍光強度の三次元分布情報を作成すると共に、その三次元分布情報を可視化するための画像データを作成する。
【００４１】
ステップＳ２１：コントローラは、ステップＳ２０で作成した画像データをモニタへ表示し、フローを終了する。なお、コントローラは、ステップＳ２０で作成した三次元分布情報を必要に応じて長期保存用のメモリ（ＨＤＤなど）へ保存する。
【００４２】
以上、本実施形態の顕微鏡装置では、波長帯域の広い２つの光束（低コヒーレンスな２つの光束）の光路長差がゼロとなる面（基準面ＢＰ）を試料２０中に配するので、照明光束を試料２０中の特定の層に限局させたのと同等の効果が得られる。したがって、集光された照明光でその層を二次元走査しなくとも、その層の蛍光強度分布情報を画像データとして一括に取得することができる。
【００４３】
また、本実施形態のコントローラは、基準面ＢＰで試料２０を深さ方向にかけて走査するので、層状の照明領域で試料２０を走査したのと同等の効果が得られる。
【００４４】
また、本実施形態のコントローラは、基準面ＢＰで試料２０を走査するために透過型ステージＯＳを利用するので、その走査を確実かつ高精度に行うことができる。
【００４５】
また、本実施形態のコントローラは、走査中に２次元画像検出器２２に対して画像データを繰り返し取得させ、取得された複数の画像データに基づき試料２０の蛍光強度の三次元分布を算出する。したがって、本実施形態では、蛍光強度の三次元分布を既知とするために必要な走査は、試料２０の深さ方向への走査のみである。
【００４６】
また、本実施形態の試料２０は、蛍光分子で標識された生物試料であり、バリアフィルタ２１の透過波長帯域は、その蛍光分子の蛍光スペクトルの少なくとも中心波長をカバーし、励起フィルタ１２の透過波長帯域は、その蛍光分子の励起スペクトルの少なくとも中心波長をカバーし、バリアフィルタ２１の透過波長帯域に重複しない範囲でなるべく広く設定されるので、画像データのＳＮ比を保ちつつ、本装置の深さ方向の分解能を最高に高めることができる。
【００４７】
また、本実施形態のコントローラは、複数の画像データの信号波形からキャリア成分を除去するので、定在波干渉光束の干渉パターンに依存しない正確な観察が可能である。
【００４８】
なお、本実施形態において、試料２０が厚い場合（トータルの走査距離が長い場合）には、透過型ステージＯＳの移動ピッチ及び２次元画像検出器２２のフレームレートが共に一定であったとしても、走査ピッチが一定になるとは限らない。なぜなら、試料２０を照明する２つの光束のうち、一方の光束の媒質長（光束が通過する試料２０の厚さ）は走査が進むにつれて徐々に長くなるのに対し、他方の光束の媒質長は走査が進むにつれて徐々に短くなるので、走査距離が長いと基準面ＢＰの絶対的な位置がずれてしまうからである。さらに媒質長の差が大きくなると、媒質の屈折率分散の影響によるピーク位置のずれも無視できなくなる。
【００４９】
よって、その場合、コントローラは、試料２０の屈折率分散を予め記憶し、走査ピッチが均等になるよう、透過型ステージＯＳの移動ピッチ又は２次元画像検出器２２のフレームレートを走査位置に応じて補正するとよい。或いは、コントローラは、走査ピッチの不均一性を許容し、その代わりに、ステップＳ２０で算出した三次元分布のＺ座標を補正してもよい。
【００５０】
また、本実施形態では、基準面ＢＰで試料２０を走査するために試料２０を移動させたが、試料２０を移動させる代わりに、基準面ＢＰ自体を変位させてもよい。この場合、透過型ステージＯＳを駆動する代わりにミラーステージＭＳを駆動すればよい。
【００５１】
さらに、本実施形態では、基準面ＢＰと２次元画像検出器２２との共役関係が維持されるよう、試料２０又は基準面ＢＰの変位に応じて２次元画像検出器２２を変位させる（ピント調節する）ことが望ましい。或いは、２次元画像検出器２２を変位させる代わりに、２次元画像検出器２２とビームスプリッタ１７ｔとの間にリレー光学系を挿入し、かつそのリレー光学系の少なくとも一部のレンズを光軸方向に変位させてもよい。
【００５２】
また、本実施形態では、装置固有の励起スペクトル（図５）のタイプをガウス型としたが、非ガウス型としてもよい。但し、その場合には、基準面ＢＰから外れた面にサブピーク（余計なピーク）が発生する可能性があるので、その場合には、そのサブピークが信号波形に与えた影響を演算によって除去することが望ましい。
【００５３】
また、本実施形態では、励起フィルタ１２の配置先を光源１０とビームスプリッタ１３との間（図１参照）としたが、コリメートレンズ１６ｔとビームスプリッタ１７ｔとの間、及びコリメートレンズ１６ｂとビームスプリッタ１７ｂとの間のそれぞれとしてもよい。
【００５４】
また、本実施形態では、試料２０へ入射させるべき照明光と２次元画像検出器２２へ入射させるべき検出光とを分離する機能を、励起フィルタとバリアフィルタとの組み合わせに対して付与したが、その機能の一部又は全部をビームスプリッタ１７ｔ、１７ｂに振り分けてもよい。その場合は、ビームスプリッタの代わりにダイクロイックミラーを使用することになる。
【００５５】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態の装置を無染色の生物試料の観察へ応用する場合の実施形態である。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。
【００５６】
図１２、図１３は、本実施形態の顕微鏡装置の概略構成図である。図１２、図１３に示すとおり、本実施形態の顕微鏡装置は、第１実施形態の顕微鏡装置において、励起フィルタ１２、バリアフィルタ２１を省略したものに相当する。
【００５７】
また、本実施形態の試料２０は、第１実施形態の試料２０と同様に生物試料であるが、染色の有無は問わない。通常、このような試料２０が照明されると、試料２０中の屈折率分布などに応じて散乱光が発生する。
【００５８】
したがって、本実施形態の２次元画像検出器２０が検出するのは、上面側から試料２０へ入射した光束に応じて試料２０で発生した散乱光（反射散乱光）と、下面側から試料２０へ入射して散乱せずに透過した光束（透過ゼロ次光）とである。
【００５９】
但し、試料２０で発生した散乱光のうち、その透過ゼロ次光と干渉できるのは、基準面ＢＰ（及びその近傍）で発生した散乱光のみである。
【００６０】
よって、本実施形態においても、照明光束を試料２０中の特定の層に限局させたのと同等の効果が得られる。
【００６１】
なお、本実施形態における信号波形の解析も、第１実施形態の信号波形の解析と同様である。
【００６２】
また、第１実施形態の装置における励起フィルタ１２及びバリアフィルタ２１の各々を挿脱可能とすれば、第１実施形態の観察方法と第２実施形態の観察方法との間で観察方法の切り換えが可能な装置を構成することができる。この装置によれば、蛍光強度の三次元分布情報と反射光強度の三次元分布情報との双方を同一試料から容易に得ることができる。
【符号の説明】
【００６３】
１０…白色光源、１１…コリメートレンズ、１２…励起フィルタ、１３…ビームスプリッタ、Ｍ１〜Ｍ９…ミラー、ＭＳ…ミラーステージ、１４ｔ、１４ｂ…コレクタレンズ、１５ｔ、１５ｂ…光ファイバ、１６ｔ、１６ｂ…コリメートレンズ、１８ｔ、１８ｂ…顕微鏡対物レンズ、１７ｔ、１７ｂ…ビームスプリッタ、２０…試料、ＯＳ…透過型ステージ、２１…バリアフィルタ、２２…２次元画像検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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