(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＡＶ標的配列の精製、増幅及び検出に有用な核酸オリゴマーの提供。【解決手段】本オリゴマー又はオリゴマーの組合せをキット配置に含め、ＨＡＶ配列を増幅する及び／又は検出するための他のオリゴマー及び／又は他の試薬を含める。ＨＡＶ核酸を試料中の他の成分より精製する工程、ＨＡＶ  ＲＮＡ標的配列又はそれより作製されるｃＤＮＡを、インビトロ核酸ポリメラーゼと増幅オリゴマーのあらゆる組合せを用いて増幅して増幅産物を生成する工程及び、増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程を用いる、試料中のＨＡＶを検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第１のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第２のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つの配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記組合せ。
【請求項２】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１５６からなる群より選択される、第１のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項３】
配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項４】
配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第３のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項５】
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９、および配列番号１５０からなる群より選択される、第４のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項６】
配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１、および配列番号１６２からなる群より選択される、第５のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項７】
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８からなる群より選択される、第６のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項８】
請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、ここで該少なくとも１つの捕捉オリゴマーが（ｉ）配列番号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列は配列番号８〜１４からなる群より選択される、組合せ
【請求項９】
請求項８の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列番号２、３、および４からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列は配列番号９、１０、および１１からなる群より選択される、組合せ。
【請求項１０】
配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１〜１２４、および配列番号１２６〜１３０からなる群より選択される少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項１１】
請求項１に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せを含むキット。
【請求項１２】
試料中のＨＡＶの存在を検出する方法であって：
ＨＡＶを含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；
選択ＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅反応を用いて、精製したＨＡＶ核酸又はそれから作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列を増幅して、選択ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程であって、
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第１のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第２のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つの配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記工程；並びに
増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程
とを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、ここで精製工程が、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと試料を接触させ、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列番号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列が配列番号８〜１４からなる群より選択され、そしてここで該捕捉プローブオリゴマーがＨＡＶ  ＲＮＡ中の配列に特異的にハイブリダイズしてＨＡＶ  ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成して、そしてＨＡＶ  ＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
増幅工程が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１５６からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１５】
増幅工程が、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第３のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第３のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１６】
増幅工程が、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第４のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１７】
増幅工程が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号１５０からなる群より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１８】
増幅工程が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２からなる群より選択される、第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第６のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第６のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１９】
増幅工程が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より選択される、第７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第７のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；そしてここで検出工程は、第７のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトウイルスの診断検出に関し、具体的には、インビトロ核酸増幅と増幅配列の検出を用いてヒトＡ型肝炎ウイルスの配列を検出するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、発熱、疲労、吐気、腹痛、下痢、食欲喪失及び黄疸を含む諸症状が２ヶ月未満現れる場合がある肝炎の１つの形態の原因物質である。ＨＡＶに感染した約１０％〜１５％は、感染後６〜９ヶ月に長期化又は再発性の症状がある。症候性と無症候性の感染後には、抗ＨＡＶ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の個々の産生に基づくＨＡＶの免疫が続く。
【０００３】
ＨＡＶ感染症の発症率は、ＨＡＶへのワクチン接種（例えば、不活性化ＨＡＶを用いることによる）が１９９０年代後半以来広範に用いられた世界の諸地域では劇的に減少したが、衛生状態不良な非免疫集団では、例えば、地震の後に、一過性でも、ＨＡＶ感染症の大流行（人口１００，０００につき７００より多い症例）が発生し得る。ＨＡＶは、被感染者の糞便中に流れて、通常、糞−口経路で伝播する。共同体全体の大発生は、ＨＡＶに感染した食物取扱者により調理中の食物が汚染される場合、又は、流通システムにおける生育、収穫、包装、又は加工の間に食材が汚染されて生じる食物媒介性の伝播で生じる場合がある。伝播はまた、ＨＡＶ汚染された血清、血液製剤、又は輸血や注射薬の使用等の汚染針との接触から生じる場合がある。ＨＡＶ感染のリスクがあるヒトとしては、ＨＡＶ被感染者と生活しているか又は性的接触がある人々、凝固因子障害（例、血友病）又は慢性肝疾患の人々、Ａ型肝炎が蔓延している国々へ旅行する人々、男性と性的交渉をもつ男性、非合法薬の使用者及びＡ型肝炎が高率な（例えば、人口１００，０００につき＞２０症例）地域で生活する子供があげられる。
【０００４】
ＨＡＶは、約７．５ｋｂの（＋）鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する２７ｎｍのＲＮＡウイルス（ピコルナウイルス）であり、世界中で単一の血清型が見出されている。ＨＡＶは、感染症の急性期で肝臓で複製し、胆汁中に排泄されて糞便中に流出する（１０８個のウイルス／ｍｌまで）。潜伏期間は、通常、症状が現れるまでの２〜６週間である。Ａ型肝炎の診断は、症状や他の臨床特徴（例えば、血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇）では他の種類のウイルス肝炎から識別できない。典型的には、Ａ型肝炎の診断は、抗ＨＡＶ免疫グロブリン（Ｉｇ）が存在すると陽性の結果となる血清学的検査で確認する。一般に、抗ＨＡＶ  ＩｇＭは、症状の発症の５〜１０日前に存在しているが、ほとんどの患者で６ヶ月以降までは検出できないのに対し、抗ＨＡＶ  ＩｇＧは、感染早期に出現し、個体が生存している期間に検出できる。ＨＡＶ  ＲＮＡは、感染急性期で、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅と核酸配列決定等の核酸検査法を用いて、大部分の人々の血液及び大便から検出できるので、共同体全体の感染症を追跡するＨＡＶの遺伝的関連性を同定するために用いられてきた（Dato et al., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003, 52(47): 1155-57; LaPorte et al., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003, 52(24): 565-67）。しかしながら、これらの方法は、一般的には、診断目的には用いられていない。
【０００５】
米国では、毎年約１００人がＡ型肝炎による急性肝不全で死亡する（死亡率約０．０１５％）。非致命的なＡ型肝炎症例でも、患者の入院、外来受診及び労働日数の損失の費用を含む、ＨＡＶ感染症に関連してかなりの費用がかかる。Ａ型肝炎大発生に関する公衆衛生の費用としては、被感染者又は感染源（例、汚染された水又は食物）を特定して曝された人々に曝露から２週間以内に免疫グロブリンを投与することがあげられる。特に、共同体全体で大発生した場合では、感染リスクの認知に起因する、かなりの心理的コストと経済損失が生じる可能性がある。汚染された食物及び水でＨＡＶが比較的伝播しやすいことや、Ａ型肝炎に関連する罹病率のため、ＨＡＶは生物テロに用いる病原体となりうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生物試料や環境試料中のＨＡＶの存在を正確に検出する必要がある。ＨＡＶ被感染個体を迅速に診断する必要がある。例えば、免疫グロブリンが有効であるためには、ＨＡＶ曝露の２週間以内にヒトへ投与しなければならず、肝炎症状の食物取扱者を速やかに評価して、ＨＡＶ陽性源を公衆衛生当局へ報告する迅速で正確なアッセイが必要である。水や食物等の汚染材料の使用又は消費から生じる共同体全体の大発生又は大流行を防ぐために、上記の材料に存在するＨＡＶを検出する必要がある。また、例えば、輸血やヒト体液に由来する諸因子の製造に用いる血液又は血清等の医学的処置に用い得る製品のＨＡＶ汚染を検出する必要もある。
【０００７】
本発明は、試料中のＨＡＶ核酸の存在を検出する核酸検査法に用いるオリゴヌクレオチド配列を開示して、上記のニーズに応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明としては、ＨＡＶ標的配列の精製、増幅及び検出に有用な核酸オリゴマーがあげられる。本オリゴマー又はオリゴマーの組合せをキット形態に含めてもよく、その実施態様としては、ＨＡＶ配列を増幅する及び／又は検出するための他のオリゴマー及び／又は他の試薬があげられる。本発明としては、ＨＡＶ核酸を試料中の他の成分より精製する工程、ＨＡＶ  ＲＮＡ標的配列又はそれより作製されるｃＤＮＡを、インビトロ核酸ポリメラーゼと本明細書に記載の増幅オリゴマーのあらゆる組合せを用いて増幅し、増幅産物を生成する工程及び、増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程を用いる、試料中のＨＡＶを検出する方法があげられる。１つの実施態様としては、ＨＡＶ  ＲＮＡ標的領域に特異的にハイブリダイズし、他の試料成分から分離されるＨＡＶ  ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体を形成する配列を含む少なくとも１つの捕捉オリゴマーを用いて、ＨＡＶ核酸を精製する。
【０００９】
本発明の１つの態様としては、ＨＡＶ標的領域を増幅するのに特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せがあり、それには：第１のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１３９又は配列番号１４０の配列を含む配列番号１３８の配列に含まれる約２３〜２６ｎｔのオリゴマー、又は配列番号１４２〜１４６の少なくとも１つの配列を含有する配列番号１４１の配列に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさのオリゴマー、又は配列番号２１〜２７のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５０〜５３ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第２のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか又は少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３１又は配列番号３２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９、又は配列番号１６０の配列を含有する配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３３のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、又は配列番号４１又は配列番号４２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；並びに、第７のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５の配列のいずれか１つを含む配列番号１５１の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６６〜配列番号１６８の配列のいずれか１つを含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む。第１のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５より選択される。第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号１５６より選択される。第３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１及び配列番号より選択される、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７より選択される。第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号１５０より選択される。第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２より選択される。第７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８より選択される。他の好ましい実施態様としては、配列番号１〜１４より選択される少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーがさらにあげられる。なお他の実施態様としては、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１〜配列番号１２４及び配列番号１２６〜配列番号１３０より選択される少なくとも１つの検出プローブオリゴマーがさらにあげられる。オリゴマーの組合せの好ましい実施態様としては、選択ＨＡＶ標的領域を増幅するのに特異的な少なくとも２つのオリゴマーと、選択ＨＡＶ領域を増幅するのに特異的な選択された２つのオリゴマーの間に位置する、ＨＡＶゲノム配列に含まれる配列に特異的である少なくとも１つの検出プローブオリゴマーあげられる。そのようなオリゴマーの組合せの好ましい実施態様をキットと共に包装することができ、これには、ＨＡＶ  ＲＮＡを試料より精製することに用いる試薬及び／又はインビトロ核酸増幅���用いる試薬及び／又は検出プローブオリゴマーから検出可能シグナルを産生することに用いる試薬等他の試薬をさらに含有できる。
【００１０】
本発明の他の態様は、試料中のＨＡＶの存在を検出する方法であり、それには、ＨＡＶを含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；第１のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１３９又は配列番号１４０の配列を含む配列番号１３８の配列に含まれる約２３〜２６ｎｔのオリゴマー、又は配列番号１４２〜１４６の少なくとも１つの配列を含有する配列番号１４１の配列に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさのオリゴマー、又は配列番号２１〜２７のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５０〜５３ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第２のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか又は少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３１又は配列番号３２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９、又は配列番号１６０の配列を含有する配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３３のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、又は配列番号４１又は配列番号４２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；並びに第７のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５の配列のいずれか１つを含む配列番号１５１の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６６〜配列番号１６８の配列のいずれか１つを含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、選択ＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅反応を用いて、精製したＨＡＶ核酸又はそれより作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列を増幅して、選択ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程；並びに増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程を含む。精製工程における好ましい実施態様は、ＨＡＶ  ＲＮＡ中の配列に特異的にハイブリダイズする、配列番号１〜１４���いずれか１つに含まれる配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと試料を接触させてＨＡＶ  ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成して、ＨＡＶ  ＲＮＡを含有する該ハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する。第１のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５より選択される、第１のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを使用し；その後、第１のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号１５６より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第３のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１及び配列番号１４８より選択される、第３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第３のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第４のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７より選択される、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号１５０より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第６のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２より選択される、第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第６のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第７のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より選択される、第７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第７のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明としては、ＨＡＶに汚染されるおそれがある、ヒト由来の生物試料（例、糞便、血液、血清、唾液、又は尿）、環境試料（例、水、土壌）、又は他の材料（例、食物）であり得る試料に存在するＨＡＶを検出する方法があげられる。本方法は、ＨＡＶゲノムの領域をインビトロで増幅し、本増幅核酸中の配列へ特異的に結合するプローブを用いて本増幅核酸を検出し、ＨＡＶ核酸配列の存在を検出することに基づく。本方法の１つの実施態様としては、ＨＡＶゲノムの領域を増幅する工程の前に、ＨＡＶ核酸を試料から単離又は精製する工程があげられる。本実施態様は、好ましくは、増幅するＨＡＶゲノムの領域の外側の、ＨＡＶゲノム中の配列へ特異的に結合する捕捉オリゴマーを用いて、捕捉オリゴマーと結合したＨＡＶ  ＲＮＡから作られた複合体を、捕捉オリゴマーも結合する粒子等の捕捉支持体を用いて他の試料成分から分離してＨＡＶゲノムＲＮＡを単離する。ＨＡＶゲノム配列の一部を増幅することは、ＨＡＶ  ＲＮＡ又は相補配列へ特異的に結合する１以上の増幅オリゴマーと、増幅オリゴマーを他のコピーの合成のためのプライマーとして用いてＨＡＶゲノム配列又は相補配列の一部の他のコピーを作製するためのインビトロ酵素合成を用いる。好ましい実施態様は、定温増幅反応を用いて、ＨＡＶゲノム配列の一部の他のコピーを作製することである。その後、本増幅核酸へ１以上のプローブオリゴマーを特異的に結合させて、増幅配列へ結合したプローブオリゴマーより生じるシグナルを検出して増幅ＨＡＶ配列を検出する。増幅ＨＡＶ配列へ結合したプローブオリゴマーから生じるシグナルを検出すると試料中のＨＡＶの存在が示される。上記の方法は、ＨＡＶ感染症をヒトで診断するために用いる生物試料、汚染源の使用又は消費に起因するＨＡＶの拡散を防ぐためのＨＡＶで汚染された環境試料等の多様な試料中でＨＡＶの存在を検出するのに有用である。上記の方法はまた、ヒトの体液試料について、血清又は血漿等中のＨＡＶの存在を試験して、輸血又は治療因子の製造でヒト体液を用いることに起因するその後のＨＡＶ感染症を防ぐのに有用である。本発明の方法は、ヒトの組織又は臓器についてＨＡＶの存在をスクリーニングして、移植治療においてそれらを用いないようにすることにも有用である。このように、上記の方法は、ヒト組織に由来するヒトの試料又は製品におけるＨＡＶ汚染を検出するのに特に重要である。
【００１２】
本発明としては、ＨＡＶ  ＲＮＡ又はＨＡＶ  ＲＮＡに由来する核酸（例、ＨＡＶ  ＲＮＡより作製されるｃＤＮＡ又は増幅配列）に特異的にハイブリダイズするオリゴマー等の核酸組成物があげられる。そのような組成物の１つには、ＨＡＶ  ＲＮＡに特異的にハイブリダイズして、このハイブリダイズしたＨＡＶ  ＲＮＡを捕捉支持体（捕捉されたＨＡＶ  ＲＮＡを他の試料成分から分離できるようにする）に付けて、試料等の複雑な混合物からＨＡＶ  ＲＮＡを精製するために用いる捕捉オリゴマーがあげられる。そのような捕捉オリゴマーを用いる精製の方法を、一般に標的捕捉といい、ここではＨＡＶ  ＲＮＡが特異的な標的核酸である。本発明の他のオリゴマーは、核酸増幅オリゴマーである（プライマーという場合もある）。他の実施態様としては、ＨＡＶ  ＲＮＡ又は増幅ＨＡＶ核酸配列に特異的にハイブリダイズして、ＨＡＶ特異配列の存在を検出するシグナルを提供する、プローブオリゴマーがあげられる。これらの核酸配列は、ＨＡＶ特異配列を捕捉、増幅及び検出するのに有用なため、試料中のＨＡＶの存在を検出するため共に機能する。
【００１３】
試料としては、ＨＡＶを含有する可能性があるあらゆる液体、又はＨＡＶを含有するか又は表面に有する場合がある固形物があげられる。試料としては、例えば、水等の環境源、ヒトの体液又は汚物等の生物源及び食品、包装材料、又は食品加工に用いる他の成分由来のものがあげられる。生物試料には、ＨＡＶ又はＨＡＶ核酸を含有し得る、生きているか死んだヒト由来のあらゆる組織又は材料があげられ、例えば、唾液、血液、血漿、血清、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、又は他の体液、組織又は材料があげられる。試料は、標準法を用いてその物理状態を物理的又は機械的に破壊して処理し、ＨＡＶ粒子又はＨＡＶ  ＲＮＡを水溶液又は溶媒へ放出させることもできる。
【００１４】
核酸としては、骨格構造で結合された、少なくとも２つ、好ましくは１０以上の塩基から構成されるＤＮＡ若しくはその類似体、ＲＮＡ若しくはその類似体、又は混合ＤＮＡ−ＲＮＡポリマー又はオリゴマーがあげられる。ＤＮＡとＲＮＡは、共通の塩基（ＤＮＡでは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ、そしてＲＮＡでは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）から構成され得るが、塩基類似体（例、イノシン）と非塩基位置（即ち、１以上の位置でヌクレオチドを欠くホスホジエステル骨格、例えば、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）も本用語に含まれる。ポリマーが数百又は数千の長さのヌクレオチドであり得るのに対し、オリゴマーは、一般に１０００以下の結合ヌクレオチドの核酸を意味し、しばしば２〜約１００の結合ヌクレオチドが含まれる。一般に、オリゴマーは、下限が約１０塩基で上限が約１５０塩基の範囲の大きさ、好ましくは、約１５〜約７０塩基の範囲の大きさが該当する。オリゴマーは、天然に存在する生物源から精製できるが、好ましくは、いかなる様々な周知の酵素法又は化学法をも用いてインビトロで合成する（例、Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymol., 154: 287）。
【００１５】
「核酸骨格」は、当該技術分野で公知の基又は結合（Eschenmoser, 1999, Science 284: 2118-2124）、例えば、糖−ホスホジエステル結合、２’−Ｏ−メチル結合、ＤＮＡ中のグアニジンリンカー（「ＤＮＧ」）、Ｓ−メチルチオ尿素リンカー、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ポリアミド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）等のアミド骨格修飾物、ホスホロチオエート結合、ホスホン酸エステル核酸結合、ピラノシルオリゴヌクレオチド結合、ビシクロ及びトリシクロ核酸結合、ホルムアセタール及び３’−チオホルムアセタール結合、モルホリノ結合又は天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合の他の修飾物又はこれらの組合せをいう（Majlessi et al., 1998, Nucl. Acid Res. 26(9): 2224-2229; Dempcy et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097-6101; Browne et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7051-7055; Arya & Bruice, 1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 6619-6620; Reynolds et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24(22): 4584-4591; Gryaznov & Chen, 1994, Am. Chem. Soc. 116: 3143-3144; Chaturvedi et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24(12): 2318-2323; Hyrup & Nielsen, 1996, Bioorg. & Med. Chem. 4: 5-23; Hydig-Hielsen et al., ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／３２３０５：Mesmaekerら, Syn. Lett., Nov. 1997: 1287-1290; Peyman et al., 1996, Angew. Chem.. Int. Ed. Engl. 35(22): 2636-2638; Aerschot et al., 1995, Angew. Chem.. Int. Ed. Engl. 34(12): 1338-1339; Koshkin et al., 1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 13252-13253; Steffens & Leumann, 1997, J. Am. Chem. Soc. 119: 11548-11549; Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58: 2983-2991; Summerton & Weller, 1997, Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 7: 187-195; Stirchak et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17(15): 6129-6141）。核酸骨格としては、同じオリゴマー又はポリマーの結合の混合物（例、鎖中１以上の糖−ホスホジエステル結合と１以上の２’−Ｏ−メチル結合）があっても、鎖全体で同じ結合（例、全て２’−Ｏ−メチル、又は全てアミド修飾の結合）があってもよい。
【００１６】
「標的」、「標的配列」、又は「標的核酸」は、例えば、標準的な相補塩基対合を用いて他の核酸が結合する大きな配列（例、１０００ｎｔより大きい）又はより大きな核酸内のより小さな配列を意味する場合がある。標的核酸は、天然の又は合成して作製された、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。例えば、標的は、ＨＡＶゲノム等の比較的大きな核酸でも、あるいは標的は、ＨＡＶ  ＲＮＡに含まれるより小さなサブ配列、その相補体、又はそれから作製される増幅産物でもよく、オリゴマー中の他の配列に特異的に結合する。当業者であれば、標的核酸がどのような形態でも、例えばセンス又はアンチセンス（＋又は−）鎖で存在しうることを理解するであろう。
【００１７】
「相補的な核酸」(又は、核酸相補性)とは、官能基の配向により、例えばＡとＴ又はＵ塩基の間、そしてＣとＧ塩基の間の水素結合により、対向する鎖中の塩基配列に結合する核酸の一方の鎖の塩基配列を意味する。「実質的に相補的な」とは、一方の鎖の塩基配列が対向する鎖の塩基配列に対して全て又は完全には相補的でないが、２つの鎖の塩基間に十分な結合がおこり、ある一連の条件（例えば、水溶液中の塩濃度、又は温度）で安定したハイブリダイズ複合体を形成することを意味する。そのような条件は、その塩基配列と、ハイブリダイズした鎖の５０％が変性する融解温度（Ｔｍ）を決定するための当業者に公知の標準的数理計算を用いて、又は定型的な方法を用いて経験的にＴｍを決定して予測できる（例えば、Sambrook et al.,（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989）の 9.50-51、11.46-49、11.55-57 を参照）。
【００１８】
「ハイブリダイゼーション条件」とは、１つの核酸鎖が相補的な鎖相互作用により第２の核酸鎖に結合してハイブリダイゼーション複合体を産生する、累積的な環境を意味する。そのような条件としては、例えば、温度、化学成分、核酸を含有する水溶液及び／又は有機溶液の化合物（例、塩類、緩衝剤、キレート剤、有機化合物）の濃度があげられる。インキュベーション時間や反応チャンバの容量といった他の因子も、当業者に周知のハイブリダイゼーション条件の一因となる場合がある（例えば、Sambrook et al., 同上、1.90-1.91、9.47-9.51、11.47-11.57 を参照）。
【００１９】
「標識」とは、検出可能か又は、例えば、シグナルを産生する反応を触媒して検出できる応答を直接的又は間接的におこす分子部分をいう。標識としては、発光部分（例えば、蛍光性、生物発光性、又は化学発光性の化合物）、放射性同位体、結合対メンバー（例、ビオチン及びアビジン又はストレプタビジン）、酵素又は酵素基質、反応基又は例えば、色素や検出可能な色をもたらす粒子等の発色団があげられる。検出可能な応答又はシグナルは、例えば、光、色、放射性崩壊放射、電気シグナル、磁場又は消光又は混濁等のシグナル妨害等の標識の存在を示すあらゆる認知可能又は測定可能な出力である。
【００２０】
「固定化オリゴマー又はプローブ」とは、捕捉支持体マトリックスへ共有的又は非共有的に結合又は付着するオリゴマーを意味し、標的核酸を含有する捕捉ハイブリッドを捕捉支持体へ結合させる手段を提供する。好ましい固定化プローブは、標的核酸へ直接的又は間接的に結合して、結合した標的核酸を非結合の試料材料から分離することを促進するオリゴマーである。１つの実施態様では、ハイブリダイゼーション複合体で標的と固定化プローブを結合させる捕捉プローブを介して、標的を固定化プローブに間接的に結合させる（米国特許第６，１１０，６７８及び６，２８０，９５２号、Weisburgらを参照）。例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン及び磁気材料より作製されるマトリックス又は粒子等のあらゆる多様な支持体が用いられる。磁力を加えて溶液から容易に回収され得る相対的に均一な大きさの単分散性磁気球体は、支持体の好ましい実施態様である。
【００２１】
「捕捉オリゴマー又はプローブ」とは、即ち、標的配列へ結合する標的特異部分と捕捉プローブを固定化プローブへ付ける部分を用いて、標的核酸と固定化プローブを結合する。１つの実施態様では、両方の付着が相補塩基配列のハイブリダイゼーション、即ち、捕捉プローブの標的相補配列と標的配列のハイブリダイゼーションと、捕捉プローブの他の部分の固定化プローブの相補配列へのハイブリダイゼーションに起因する。他の実施態様では、当該技術分野で周知の特異結合対メンバー（例、ビオチン及びアビジン又はストレプタビジン）を用いて１以上の付着が起こり得る。捕捉プローブを用いる組成物及び方法は公知である（米国特許第６，１１０，６７８号）。
【００２２】
「分離すること」又は「精製すること」とは、試料の１以上の成分を他の試料成分から取り出すことを意味する。試料成分としては、タンパク質、炭水化物、脂質及び他の化合物等の材料をあげてもよい。一般に水溶液相中の核酸があげられる。好ましくは、核酸を分離するか又は精製して、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、なおより好ましくは、少なくとも約９５％の核酸が他の試料成分から取り出される。
【００２３】
増幅オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、標的核酸又はその相補配列へハイブリダイズして、核酸のインビトロ合成のプライマーとしての目的を果たすことにより核酸増幅反応に関わるオリゴマーをいう。増幅オリゴマーは、プロモータープライマーというオリゴマーでＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列等の他の機能配列を含有できる。一般に、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（又はその相補鎖）に相補的な、少なくとも約１０の連続塩基、好ましくは少なくとも約１２の連続塩基を含有する。本連続塩基は、増幅オリゴマーへ結合する配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合ＤＮＡ−ＲＮＡでもよく、場合によっては、修飾されたヌクレオチド又は骨格結合を含んでいてもよい。
【００２４】
プライマーは、鋳型核酸にハイブリダイズして、酵素により触媒される重合化反応において伸長され得る末端（通常、３’）を有するオリゴヌクレオチドをいう。プライマーの５’領域は、例えば、標的配列にない５’プロモーター配列を含むプロモータープライマー中等のように、標的核酸に相補的でなくてもよい。当業者であれば、プロモータープライマーがそのプロモーター配列から独立したプライマーとして（即ち、プロモーター配列の有無に関わらず）機能し得ること、そしてどの増幅オリゴマーも５’プロモーター配列を含むように修飾し、それによりプロモータープライマーとして機能し得ることを理解するであろう。
【００２５】
「増幅」は、標的配列、その相補体、又はそれらの断片のコピーを多数入手するためのあらゆる公知の手順をいう。断片の増幅は、完全な標的核酸配列又はその相補体よりも小さいものを含有する増幅核酸の産生、例えば、完全なＨＡＶゲノムの一部の増幅等をいう。完全な標的の断片又は一部の増幅は、標的核酸の内部位置にハイブリダイズして、重合化を開始する増幅オリゴマーを用いることに起因する。公知の増幅法としては、例えば、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＰ）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）があげられる。レプリカーゼ仲介増幅は、自己複製するＲＮＡ分子と、ＱＢ−レプリカーゼ等のレプリカーゼを用いる（例えば、米国特許第４，７８６，６００号、Krameら）。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、多重プライマー及び熱サイクリングを用いて、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの２つの相補鎖のコピーを多数合成する（例、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，８００，１５９号、Mullisら）。ＬＣＲは、少なくとも４つの異なるオリゴマーを用いて、ハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性の多重サイクルを用いて標的とその相補鎖を増幅する（例、米国特許第５，４２７，９３０号、Biekenmeyerら及び５，４９４，８１０号、Baranyら）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用いるが、本エンドヌクレアーゼは、標的配列を含むヘミ修飾化ＤＮＡ二重鎖の１つの鎖に切れ目を入れて、一連のプライマー伸長及び鎖置換の工程を続ける（例、米国特許第５，４２２，２５２号、Walkerら）。転写仲介性又は転写結合性の増幅反応は、ポリメラーゼを用いて定温で循環し、検出可能な増幅産物となる転写産物の他のコピーを産生できる転写産物を作製する特異的なＲＮＡポリメラーゼの機能的なプライマーを含有する、標的への相補鎖を二本鎖の形態で作製する。
【００２６】
転写仲介又は転写結合性の増幅は、ＲＮＡポリメラーゼを用いた、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリブヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸及びプロモータープライマーを用いて、場合によっては、１以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい定温反応で核酸鋳型より多数のＲＮＡ転写産物を生成する。上記の増幅の方法と反応条件は、すでに詳しく記載されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号及び５，５５４，５１６号、Kacianら、米国特許第５，４３７，９９０号、Burgら、ＰＣＴ番号ＷＯ８８／０１３０２及びＷＯ／１０３１５、Gingerasら、米国特許第５，１３０，２３８号、Malekら、米国特許第４，８６８，１０５号及び５，１２４，２４６号、Urdeaらを参照）。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様は、転写仲介増幅（米国特許第５，３９９，４９１及び５，５５４，５１６号に記載のＴＭＡ）を用いる。しかしながら、当業者であれば、本明細書に記載の方法及びオリゴヌクレオチドプライマーを、ポリメラーゼを用いてプライマーを合成的に伸長させるあらゆる核酸増幅法と共に適用できることは明らかであろう。
【００２８】
「検出プローブ」は、特異的な標的配列へ結合するオリゴマーであり、結合によって、標的配列の存在を示す検出可能シグナルを直接的又は間接的に産生する。検出プローブは、プローブが標的へ結合して生じる電気インパルス等の検出可能シグナルを産生するために標識する必要はない。標識化プローブは、標識へ直接的又は間接的に結合したオリゴマーから構成される。標識化プローブを作製する及び／又は用いる方法は周知である（例、Sambrookら、同上、第10章；米国特許第６，３６１，９４５号、Beckerら;５，６５８，７３７号、Nelsonら;５，６５６，２０７号、Woodheadら;５，５４７，８４２号、Hoganら;５，２８３，１７４号、Arnoldら;４，５８１，３３３号、Kourilskyら；及び５，７３１，１４８号、Beckerら）。検出プローブとしては、合成リンカー（米国特許第５，５８５，４８１号及び５，６３９，６０４号、Arnoldら）と、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物等の化学発光標識（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６５６，２０７号及び５，６５８，７３７号）があげられる。
【００２９】
「同種（homogeneous）検出可能標識」は、標識が標的へ結合しているか又は非結合であるかに依存する同種の態様で検出され得る標識である。即ち、同種反応における標識の検出は、シグナルが検出される混合物から標識の非結合体を物理的に分離しなくてもよい。当業者であれば、均質な反応が、溶液中でも、アレイ、バイオチップ、又は遺伝子チップ上等の支持体上でも起こり得ることを理解するであろう。同種検出可能標識とその検出条件は周知である（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、５，６５６，２０７号及び５，６５８，７３７号）。
【００３０】
「から本質的になる」とは、本発明の基本的で新規の特性を実質的に変えない他の成分（複数）、組成物（複数）、又は方法工程（複数）を、本発明の組成物、キット、又は方法に含めうることをいう。本特性としては、本明細書に記載した捕捉プローブ、増幅プライマー及び検出プローブの組合せを用いて、１ｍｌにつき２５〜３０コピーのＨＡＶを含有する試料について少なくとも８０％の感度で試料中のＨＡＶ核酸の存在を特異的に検出する能力があげられる。本明細書に記載の核酸オリゴマーとインビトロの方法を用いて、試料中に存在するＨＡＶの検出の特異性及び／又は感度に実質的に影響を及ぼすいかなる成分（複数）、組成物（複数）、又は方法工程（複数）も、本用語には該当しない。
【００３１】
他に定義しなければ、本明細書に用いる全ての科学及び技術用語は、通常当業者が理解するのと同じ意味である。本明細書で用いる用語の定義の多くは、例えば、「Dictionary of Microbiology and Molecular Biology」第２版（Singleton et al., 1994, ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク）、「The Encyclopedia of Molecular Biology」（Kendrew, Ed., 1994, Blackwell Science 社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、又はThe Harper Collins Dictionary of Biology」（Hale and Marham, 1991, Harper Perennial, ニューヨーク州ニューヨーク）から提供される。他に言及しなければ、本明細書で利用又は考慮する技術は、当業者に周知の標準的方法論である。実施例をあげて好ましい実施態様を例示する。
【００３２】
本発明としては、試料中のＨＡＶ核酸を検出するための組成物（核酸増幅オリゴマー、検出プローブ及び場合によっては捕捉オリゴマー）と方法があげられる。本明細書に開示するオリゴマーとしての使用に適した配列を選択するために、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０５６４〜ＡＢ０２０５６９）で利用可能な異なる単離物のゲノム配列、部分配列及び相補配列を含む、公知のＨＡＶゲノム配列（Beneduce, et al., 1995, Virus Res. 36(2-3): 299-309；Fujiwara, et al., 2001, J. Hepatol. 35(1): 112-119；Hu et al., 2002, Acta Virol. 46(3): 153-157）を、同一又は類似の配列の領域を適合させて並置し、周知技術を用いて並置した配列を比較した。配列比較はアルゴリズムを用いれば容易となり得るが、当業者であれば、そのような比較をマニュアルで目視で容易に実施できる。比較配列間で配列変異が比較的少ないＨＡＶ配列の部分を、本明細書に記載の捕捉、増幅及び検出工程での使用に適した合成オリゴマーを設計するための基礎として選択した。オリゴマー配列を選択する場合、ＧＣ含量や予測される二次構造（例、ヘアピンターン又は分子内対合）の相対存在度といった、他の周知の配列特性も考慮した。
【００３３】
上記の解析に基づいて、ヌクレオチド２００、３７００、４７００、５７００、５８００、６０００及び７０００付近のＨＡＶゲノムの領域を増幅ＨＡＶ配列の検出に見込みがありそうな標的領域として選択した。各領域について、他の試料成分から、増幅オリゴマーとして、そしてプローブ配列として精製するために試料からＨＡＶ  ＲＮＡを捕捉するのに用いるためのオリゴマーを設計した。標的領域の好ましい実施態様としては、ＨＡＶゲノムの０〜３０５ｎｔ、４７１４〜４７６５ｎｔ、５４９５〜５７８８ｎｔ、５７８８〜６０６９ｎｔ及び６９５２〜７４１３ｎｔの部分である。
【００３４】
一般に、捕捉オリゴマー配列には、標的領域付近の配列に特異的に結合して増幅される配列と、標的を含むハイブリダイゼーション複合体を、例えば固定化オリゴマーへのハイブリダイゼーションにより固形支持体へ付ける場合に用いる「テール」領域を含む（例、米国特許第６，１１０，６７８号）。好ましい捕捉オリゴマーとしては、配列番号１〜１７に示す、ＨＡＶ  ＲＮＡ配列に特異的に結合する標的特異配列と、共有結合したテール配列（例、ｄＴ３ｄＡ３０）があげられる。当業者であれば、捕捉オリゴマー（配列番号８〜１４）の標的特異部分又はそのＲＮＡ同等物がそれを固定化プローブへ結合させるいかなる部分（例えば、なるテール配列、又はビオチン又はアビジン等の結合対のメンバー）にも結合できることを理解するであろう。いかなる骨格も、捕捉オリゴマーの塩基配列を結合させることができる。ある実施態様としては、捕捉オリゴマーの標的特異部分の２’−Ｏ−メチル結合と、テール部分の標準のＤＮＡ結合を用いる。ポリヌクレオチドテール配列は、固定化プローブの配列に相補的であればいかなる配列でもよく、配列長は概ね約５〜５０残基であり、好ましくは、固定化ホモポリマー配列（例、Ｇ１５）に対して相補的な、約１０〜約４０残基（例えば、Ｃ１０〜Ｃ４０）の範囲の実質的にホモポリマーの配列である。
【００３５】
プライマー配列は、標的やその相補配列に結合しない他の配列を含有し得るにもかかわらず、ＨＡＶ  ＲＮＡ標的配列又は相補鎖に特異的に結合して増幅される標的配列の側面に位置する。プライマーは、プロモータープライマーでもよく、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（配列番号１９）等の５’プロモーター配列を含んでもよい。プロモータープライマーの実施態様としては、配列番号２０〜２９があげられる。ＨＡＶ特異的プライマーの他の実施態様としては、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号１３２〜１３５）等の補助（ancillary）配列があげられる。当業者であれば、プライマーの標的特異配列が、付着プロモーター又は補助配列の有無にかかわらず、様々なインビトロ増幅条件においてプライマーとしての目的を果たすことを理解できるであろう。ＨＡＶゲノムの標的領域（例えば、ヌクレオチド部分２００、３７００、４７００、５７００、５８００、６０００及び７０００付近）の配列のために増幅オリゴマーを設計した。当業者であれば、上記の数字が近傍にあるＨＡＶ標的領域のみを意味し、オリゴマーが１より多い標的領域のアッセイにおいて機能できることを理解することができる。即ち、上記のオリゴマーは、本発明の好ましい実施態様を群分けするための手近な（shorthand）参照として提供される標的領域数を同定して機能的に制限されるわけではない。増幅オリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、相補ＤＮＡ又はＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡ配列として合成しても、１以上の非標準的な核酸骨格結合を含みうる。例えば、配列番号１０６のオリゴマーは、残基１〜４ではＲＮＡ塩基と２’−Ｏ−メチル結合で、他の残基では標準のＤＮＡ塩基及び結合で合成した。
【００３６】
第１のＨＡＶ標的領域（２００位付近）への増幅オリゴマーとしては、配列番号１３８の配列に含まれる約２３〜２６ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１３９又は配列番号１４９の配列があげられる。本オリゴマーの実施態様としては、配列番号５１〜配列番号５７があげられる。本領域へのプロモータープライマーの実施態様としては、約５０〜５３ｎｔの範囲の大きさの配列番号２１〜２７の標的特異部分があげられる。本標的領域の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４１に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１４２〜１４６のいずれか１の配列があげられる。本標的領域のための増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号１５〜１８、２０〜２７、５０〜５７及び８０〜８５のものがあげられる。
【００３７】
第２のＨＡＶ標的領域（３７００位付近）への増幅オリゴマーとしては、配列番号６０又は配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１５６の配列があげられる。本領域に対する本標的特異部分を含み、約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実施態様としては、配列番号２９〜３２があげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様には、配列番号２８〜３０、５８〜６０及び８６〜８８があげられる。
【００３８】
第３のＨＡＶ標的領域（４７００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４７に含まれ、少なくとも配列番号１４８の配列を含むか、又は配列番号１５７に含まれ、少なくとも配列番号１５８の配列を含む、約２４〜３０ｎｔの範囲の大きさのものがあげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号３１、３２、６２、６８、８９、９０及び９１があげられ、本うち配列番号３１と配列番号３２は、標的特異配列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
【００３９】
第４のＨＡＶ標的領域（５７００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる、約１８〜２７ｎｔの範囲の大きさのものがあげられる。本オリゴマーの実施態様としては、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９及び配列番号１６０のいずれか１つを含有するものがあげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号３３、６３及び９２〜９７があげられ、このうち配列番号３３は、標的特異配列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
【００４０】
第５のＨＡＶ標的領域（５８００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４９に含まれる約１９〜３１ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、かつ少なくとも配列番号１５０の配列があげられる。本標的特異部分を含む、約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実施態様としては、配列番号３４〜４０があげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの他の実施態様としては、配列番号６４〜７０及び９７があげられる。
【００４１】
第６のＨＡＶ標的領域（６０００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号１６１に含まれる約２４〜２８ｎｔのものがあげられ、かつ配列番号１６２の配列があげられる。本標的領域のための増幅オリゴマーの実施態様には、配列番号４１、４２、７１、７２、９８、９９及び１０１があげられ、このうち配列番号４１及び４２は、標的特異配列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
【００４２】
第７のＨＡＶ標的領域（７０００位付近）への増幅オリゴマーとしては、配列番号１５１に含まれる約２０〜３０ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５の配列のいずれか１つがあげられる。本標的領域のための増幅オリゴマーの他の実施態様としては、配列番号１６３があげられ、少なくとも配列番号１６４の配列があげられる。他の実施態様としては、配列番号１６５に含まれ、少なくとも配列番号１６６〜１６８の配列のいずれか１つを含む増幅オリゴマーである。本領域へのＨＡＶ標的特異部分を含む、約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実施態様は、配列番号４３〜４９である。本領域への増幅オリゴマーの他の実施態様としては、配列番号７３〜７９及び１０２〜１０８があげられる。
【００４３】
増幅するＨＡＶ配列にハイブリダイズしてそれを検出するようなオリゴマーを設計したが、それには、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２２、１２３，１２４及び１２６〜１３０の検出プローブがあげられる。当業者であれば、用いる増幅オリゴマーの組合せで決定される、増幅する配列の内部に含まれる配列にハイブリダイズするように検出プローブを選択できることを理解するであろう。検出プローブオリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡポリマーとして合成でき、２’−Ｏ−メチル結合等の代わりの骨格結合を含んでよい。例えば、配列番号１０９、１１１、１１７、１１９、１２１、１２２、１２８及び１３０のオリゴマーは２’−Ｏ−メチル結合で合成して、配列番号１２４及び１２７のオリゴマーは第２残基から３’末端残基までを２’−Ｏ−メチル結合で混合ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドとして合成した。検出プローブの好ましい実施態様としては、付着した化学発光標識、好ましくはアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物があり（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６３９，６０４号、５，５８５，４８１号及び５，６５６，７４４号）、これは、好ましい実施態様において、非ヌクレオチドリンカーによりプローブに付く（米国特許第５，５８５，４８１号、５，６５６，７４４号及び５，６３９，６０４号、特に、第１０欄第６行〜第１１欄第３行及び実施例８）。本プローブオリゴマーの実施態様としては、公知の方法を用いて、配列番号１１９、１２１及び１２４では残基９と１０の間、配列番号１１５、１１７、１２６、１２７及び１２８では残基１０と１１の間、配列番号１０９、１１１、１２３、１２４及び１３０では残基１１と１２の間、配列番号１１３，１２２及び１２９では残基１２と１３の間、そして配列番号１２２では残基１３と１４の間に、ＡＥ化合物で標識した。プローブオリゴマーは、相補オリゴマー配列とのハイブリダイゼーションにより、Ｔｍを決定するための標準的な方法及び／又はハイブリダイゼーション複合体におけるアクリジニウムエステルのディファレンシャル加水分解を用いて試験して特性を決定した（詳細は米国特許第５，２８３，１７４号に記載）。例えば、ハイブリダイゼーションは、配列番号１０９及び配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６、配列番号１１７及び配列番号１１８、配列番号１１９及び配列番号１２０、配列番号１２４及び配列番号１２５、配列番号１２８及び配列番号１００及び配列番号１３０及び配列番号１３１の配列の相補対を用いて実施した。ハイブリダイゼーション試験は、配列番号１２４と配列番号１３７、配列番号１２９と配列番号１３６等の他の相補配列を用いて実施することができる。
【００４４】
本発明の組成物としては、ＨＡＶ核酸配列を検出するためのキットがあげられる。本キットとしては、ＨＡＶ核酸配列をインビトロで増幅するためのプライマーとして機能する、本明細書に開示する増幅オリゴマーがあげられる。キットの例示としては、ＨＡＶ  ＲＮＡゲノムの標的領域中の配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする第１の増幅オリゴマーと、標的領域中の他のＨＡＶ配列に特異的にハイブリダイズする第２の増幅オリゴマーがあげられ、好ましくは、１つがＨＡＶ  ＲＮＡゲノム配列に相補的である。キットの実施態様としては、本明細書に記載するようなプライマー及びプロモータープライマーの組合せである増幅オリゴマーがあげられる。キットは、キットのために選択されるプライマーの標的領域の増幅ＨＡＶ配列を検出するための検出プローブとしての目的を果たす１以上のオリゴマーも含有しうる。プローブオリゴマーを含む実施態様のキットとしては、本明細書に記載するプローブオリゴマーに直接的又は間接的に付着する標識があげられ、検出プローブ配列の１以上を用いる。キットは、標的ＨＡＶ  ＲＮＡを試料から精製するための捕捉オリゴマーとして機能するオリゴマーも含有しうる。本明細書に記載する捕捉オリゴマーの実施態様としては、共有結合したテール配列、又は標的捕捉に用いる他の結合部分を含有しうる。本明細書に記載の方法を実施するのに有用なキットも本発明に含まれ、好ましい実施態様としては、本明細書に記載等の少なくとも２つの増幅オリゴマーがあげられ、インビトロ増幅を実施するための、例えば、酵素、塩溶液及び核酸合成基質化合物等の試薬もあげられる。本明細書に記載のオリゴマーは、多様な異なる実施態様に包装でき、当業者であれば、本発明には多くの異なるキット配置を含むと理解するであろう。例えば、キットには、ＨＡＶゲノムの唯１つの標的領域のための増幅オリゴマーが含まれても、多数の標的領域のための増幅オリゴマーが含まれてもよい。当業者であれば、検出プローブを含むキットとして、キットの増幅オリゴマーにより増幅される配列に結合するプローブがあげられることを理解するであろう。即ち、キットの増幅オリゴマー及び検出プローブオリゴマーの選択は意図する標的領域に関連する。
【００４５】
試料中のＨＡＶ核酸を検出するアッセイの実施態様としては、捕捉オリゴマーを用いてＨＡＶ標的核酸を試料より捕捉する工程、捕捉されたＨＡＶ核酸の領域を、少なくとも２つのプライマーの組合せを用いて増幅する工程及び増幅ＨＡＶ配列を、それを検出プローブオリゴマーと特異的にハイブリダイズさせることによって検出して、増幅ＨＡＶ配列へ結合したプローブより生じるシグナルを検出する工程があげられる。好ましい実施態様は、転写関連又は転写仲介性の増幅反応を用いる。増幅核酸又はプローブのいずれか一方を標識しても、両方を非標識にしてもよく、検出可能シグナルは、そのプローブと増幅核酸のハイブリダイゼーションより生じる電気インパルスのように、ハイブリダイゼーション複合体と関連した間接的な標識又は応答により生じる。
【００４６】
捕捉工程は、好ましくは、ＨＡＶ標的配列に特異的にハイブリダイズする標的特異配列（例えば、配列番号８〜１４）と、本ハイブリダイズした標的核酸を他の試料成分から分離できる部分を含む捕捉オリゴマーを用いる。捕捉工程は、上記のように（米国特許第６，１１０，６７８号）、テール部分の固定化プローブへのハイブリダイゼーションにより、標的核酸が他の試料成分から分離できる部分として機能する、例えば配列番号１〜７等のテール部分も含む捕捉オリゴマーを用いてもよい。好ましい実施態様は、捕捉オリゴマーの相補テール配列にハイブリダイズする共有結合又は固定化したポリｄＴオリゴマーのある、単分散性（即ち、サイズにおいて±約５％の均質性）の磁気球体である指示体を用いる。少なくとも標的核酸と捕捉オリゴマーを含み、好ましくは、固定化プローブも含むハイブリダイゼーション複合体は、標準的な物理的分離方法（例、磁力の適用、濾過、又は遠心分離）を用いて他の試料成分から分離し、捕捉した標的核酸は、１回以上洗浄して、標的核酸を他の試料成分からさらに精製できる。例えば、ハイブリダイゼーション複合体において標的核酸が付着した粒子を、本複合体を維持する洗浄溶液において１回以上懸濁させてから、上記のように、洗浄溶液から複合体が付着した粒子を回収する。
【００４７】
捕捉されたＨＡＶ標的配列を増幅することは、例えば、配列番号６６及び配列番号９５、又はそれらの相補配列が側面にあるＨＡＶ配列等の増幅する配列の側面にある少なくとも２つのプライマーを用いるインビトロ増幅反応を用いる。１つの実施態様は、転写結合増幅反応を用いて、実質的に定温条件において多数のＲＮＡコピーの配列を作製する（上記した米国特許第５，３９９，４９１号及び５，５５４，５１６号）。転写結合増幅は、２種類のプロモーター（１つは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有するプロモータープライマー）、酵素（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）、並びに、溶液状態の適切な塩及び緩衝剤を用いて、核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写産物を生成する。簡潔には、プロモータープライマーを標的ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズさせて、逆転写酵素によるプロモータープライマーの３’端からの伸長により第１鎖ｃＤＮＡを作製して、生じるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中の鋳型鎖を、ＲＮアーゼＨ活性を用いて分解する。本ｃＤＮＡへ第２のプライマーが結合して、第２のプライマーの端から逆転写酵素により他のＤＮＡ鎖を合成して、ＲＮＡポリメラーゼが結合する機能性プロモーター配列がある二本鎖ＤＮＡを作製する。多数のＲＮＡ転写産物（「アンプリコン」）が転写され、各々が上記のような新たな複製ラウンドの鋳型になり得ることから、多量の一本鎖増幅配列が産生される（例えば、単一の鋳型から約１００〜３，０００の転写産物）。転写結合増幅反応を用いる本発明の実施態様は、プロモータープライマー（配列番号２０〜４９）を他のプライマー（配列番号１５〜１８、８０〜９９及び１０１〜１０８）とともに用いて、検出のために選択ＨＡＶ配列を増幅する。
【００４８】
検出工程は、増幅ＨＡＶ配列へ特異的に結合する少なくとも１つのプローブを用いる。実施態様は、検出プローブの増幅ＨＡＶ配列への結合を検出するために、あらゆる公知の検出法（例、放射活性、蛍光、酵素、比色、電気、又は発光シグナルの検出）を用いてよく、この検出されるシグナルが試料中のＨＡＶの存在を示す。プローブオリゴマーの実施態様（配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２２〜１２４、１２６〜１３０）としては、非標識であっても、多種のいかなる公知の標識を用いて標識してもよい。好ましい実施態様としては、非結合の検出プローブを混合物から除去しない同種の検出反応において検出工程を実施する。同種の検出反応に用いるプローブオリゴマーの実施態様は、好ましくは、上記で詳細した（米国特許第５，２８３，１７４号、５，６５６，７４４号及び５，６５８，７３７号）ように検出される化学発光シグナルを産生する多種のＡＥ化合物の１つで標識する。
【００４９】
一般に、好ましいアッセイ実施態様としては、以下の工程が含まれる。ＨＡＶ含有試料をもたらし、標準実験法を用いてこれを調製して、ＨＡＶを含有する実質的に水性の溶液又は懸濁液を作製してよい。本試料溶液又は懸濁液のアリコート（０．５ｍｌ）を等量（０．４〜０．５ｍｌ）の標的捕捉試薬、即ち、１以上の捕捉オリゴマー（４ピコモル／反応）、捕捉オリゴマーの一部へ相補的な固定化プローブが付いた磁気粒子及び塩化合物を含有する溶液と混合して、ハイブリダイゼーション条件をもたらす。標的捕捉試薬としては、好ましくは、ＨＡＶ粒子を崩壊させてＨＡＶ  ＲＮＡを捕捉オリゴマーとのハイブリダイゼーションのために放出させる、界面活性剤又は他のカオトロピック剤があげられる。本混合物を、捕捉オリゴマーの標的特異部分のＨＡＶ標的配列へのハイブリダイゼーションさせるために６０℃で２０〜３０分、その後、捕捉オリゴマーと固定化プローブの結合させるために室温で２０〜３０分間インキュベートする。反応容器の外側へ約１０分間磁場をかけて、ＨＡＶ  ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体が付いた粒子を分離して、他の試料成分を含有する溶液相を吸引除去する。ハイブリダイゼーション複合体の付いた粒子を洗浄するために、それらを１ｍｌの洗浄緩衝液に懸濁し、実質的に上記のように溶液から分離して本溶液を除去する。精製されたＨＡＶ  ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体の付いた粒子を、増幅試薬（緩衝剤、塩、ｄＸＴＰ及びＸＴＰ基質）と増幅オリゴマーの組合せ（プロモータープライマー及びプライマーの組合せ、各々３〜３０ピコモル、概して１５ピコモル）を含有する溶液と混合して、オイル（０．２ｍｌの濾過済みシリコンオイル）で覆って蒸発を防ぎ、６０℃で１０分間、その後４２℃で１０分間インキュベートしてから、酵素（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）を加えて、本混合物を４２℃で６０分間インキュベートする。検出には、この増幅された反応混合物を少なくとも１つのアクリジニウム標識された検出プローブオリゴマーとともにインキュベートして、ルミノメーター（例、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｌｅａｄｅｒ（登録商標）、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の標準的な方法を用いて検出できるように、２百万以下の最大の検出可能シグナル（相対発光量、又はＲＬＵ）を提供する。ハイブリダイゼーション溶液中の増幅された反応混合物の非希釈又は希釈アリコートと検出プローブを混合し、６０℃で２０分間インキュベートして、増幅された標的配列にプローブオリゴマーがハイブリダイゼーションできるようにする。その後、選択試薬（例、塩基）を用いて非結合プローブ上の標識を加水分解して、６０℃で１０分間インキュベートし、続けて検出試薬（例、Ｈ２Ｏ２）を加えて化学発光を産生し、ｐＨの中和（例えば、酸の添加による）を続けて、ルミノメーターで化学発光シグナル（ＲＬＵ）を（例えば、１〜５秒）検出する。
【００５０】
上記の方法における使用への捕捉オリゴマー、増幅オリゴマー及び検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡポリマーを生成する標準的な方法を用いて合成できる。本オリゴマーには、標準又は修飾結合及び／又は天然に存在するヌクレオシド（Ａ、Ｔ又はＵ、Ｇ、Ｃ）、類似体（例、イノシン）、又は合成プリン及びピリミジン誘導体（例、Ｐ又はＫ塩基）を含めることができる（Lin & Brown, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 10373-83; Lin & Brown, 1992, Nucl. Acids Res. 20: 5149-52）。
【００５１】
本発明の一般原理は、本発明のいくつかの実施態様を記載する以下の実施例を参照すればより完全に理解することができる。本実施例に記載する具体的な成分に加えて、一般に、以下に記載する実験では、以下の試薬を使用した。標的捕捉試薬は、７９０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，６８０ｍＭ  ＬｉＯＨ，１０％（ｖ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ），２３０ｍＭコハク酸、０．０３％（ｖ／ｖ）消泡剤、ポリｄＴ１４が共有結合した１００μｇ／ｍｌ磁気粒子（１ミクロンのＳｅｒａ−ＭａｇＴＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ社、インディアナ州インディアナポリス）及び１以上の捕捉オリゴマー（４００μｌにつき各４ピコモル）で構成される。洗浄緩衝液は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，６．５ｍＭ  ＮａＯＨ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．１％  ＳＤＳ，０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン，０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベンよりｐＨ７．５から構成される。増幅試薬は、１１．６ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基，１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２２．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２３．３ｍＭ  ＫＣｌ，３．３３％グリセロール，０．０５ｍＭ酢酸亜鉛，０．６６５ｍＭ  ｄＡＴＰ，０．６６５ｍＭ  ｄＣＴＰ，０．６６５ｍＭ  ｄＧＴＰ，０．６６５ｍＭ  ｄＴＴＰ，５．３２ｍＭ  ＡＴＰ，５．３２ｍＭ  ＣＴＰ，５．３２ｍＭ  ＧＴＰ，及び５．３２ｍＭ  ＵＴＰよりｐＨ７で構成される。酵素試薬は、１４０Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ，２２４ＲＴＵ／μｌのＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ），１６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，７０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２０％（ｖ／ｖ）グリセロール，１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２，１５０ｍＭトレハロースよりｐＨ７で構成された。（酵素単位は、典型的には、Ｔ７プロモーターを含有するＤＮＡ鋳型を用いて、３７℃で１時間で１ナノモルのＡＴＰをＲＮＡへ取り込むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを１Ｕとし、１ＵのＭＭＬＶ−ＲＴは、２００〜４００μＭのオリゴｄＴプライマーとポリＡ鋳型を用いて３７℃で１０分で１ナノモルのｄＴＴＰを取り込む）。プローブ試薬は、１００ｍＭコハク酸，２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ，２３０ｍＭ  ＬｉＯＨ，１５ｍＭ  Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２，１．２ｍＭ  ＬｉＣｌ，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍＭ  ＥＧＴＡ，３％（ｖ／ｖ）エタノールより構成し、ＬｉＯＨでｐＨ４．７へ調整した。選択試薬は、６００ｍＭホウ酸，１８２ｍＭ  ＮａＯＨ，１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）よりｐＨ８．５で構成される。検出試薬は、１ｍＭ硝酸と３２ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含有する検出試薬Ｉと、１．５Ｍ  ＮａＯＨである検出試薬ＩＩ（ｐＨを中和する）であった（詳細は、米国特許第５，２８３，１７４号を参照）。
【実施例１】
【００５２】
検出プローブの特定
標準のホスホロアミダイト化学（Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymol., 154: 287）を用いて配列番号１０９、１１１、１１３、１１９、１２３、１２６及び１３０のオリゴマーを合成して、周知の方法（米国特許第５，１８５，４３９号及び５，２８３，１７４号）を用いてリンカーを介してアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識を付け、定型のクロマトグラフィー法（例、ＨＰＬＣ）を用いてプローブを精製した。プローブは、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１２３及び配列番号１３０では残基１１と１２の間、配列番号１１３では残基１２と１３の間、配列番号１２６では残基１０と１１の間、そして配列番号１１９では残基９と１０の間にＡＥ標識した。本プローブオリゴマーを特定するために、プローブの予測Ｔｍより低温で、各々を相補的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡオリゴマー（例えば、配列番号１１０と配列番号１０９、配列番号１１２と配列番号１１１、配列番号１１４と配列番号１１３、配列番号１２０と配列番号１１９、そして配列番号１３１と配列番号１３０）とハイブリダイズさせてから、標準的な方法を用いてＴｍを実験的に決定した。非結合プローブ中のＡＥと比較した、相補的なオリゴマーにハイブリダイズしたプローブ中のＡＥ標識のディファレンシャル加水分解も、標準的な方法（米国特許第５，２８３，１７４号を参照）を用いて実験的に決定した。簡潔には、非結合プローブ中の標識の半分の加水分解に必要な時間と比較した、シグナルの半分がハイブリッドでのＡＥ加水分解により失われるのに必要な時間の比を決定した。Ｔｍは、配列番号１０９、１１１、１１３、１１９及び１３０のオリゴマーでは、相補的なＤＮＡへハイブリダイズする場合、５９℃〜６６℃の範囲であり、配列番号１０９、１１１、１２３、１２６及び１３０のオリゴマーでは、相補的なＲＮＡへハイブリダイズする場合、７６℃〜８１℃の範囲であった。ディファレンシャル加水分解の比は、配列番号１０９、１１１、１１３、１１９及び１３０のプローブでは、相補的なＤＮＡへハイブリダイズする場合、１２〜２５の範囲であり、ディファレンシャル加水分解の比は、配列番号１０９、１１１、１２３、１２６及び１３０のプローブでは、相補的なＲＮＡへハイブリダイズする場合、１８〜１０４の範囲であった。別に、残基９と１０の間で標識した配列番号１２１、残基１３と１４の間で標識した配列番号１２２、残基９と１０の間で標識した配列番号１２４、そして残基１１と１２の間で標識した配列番号１３０のプローブで、同様のハイブリダイゼーション及びディファレンシャル加水分解試験を実施すると、プローブを相補的なＲＮＡへハイブリダイズさせる場合、ディファレンシャル加水分解比は、４３〜１９０の範囲であった。上記の結果は、これら合成プローブオリゴマーの全てがその相補的な標的配列に特異的にハイブリダイズして、増幅ＨＡＶ配列を特異的に検出するのに有用な検出可能シグナルを産生することを示した。
【実施例２】
【００５３】
試料からのＨＡＶ  ＲＮＡの精製
標準のホスホロアミダイト化学を用いて合成して、標準的な方法を用いて精製した配列番号１〜７の捕捉オリゴマーについて、ヒト血漿試料中のウイルスから放出されるＨＡＶ  ＲＮＡを捕捉する能力を試験した。ＨＡＶ粒子を正常なヒト血漿（０．５ｍｌ）へ公知の濃度で加えて試料を作製し、ＨＡＶ（例えば、各反応につき５００〜１０００）を含有する試料を等量の、各捕捉オリゴマーを個別に（４ピコモル／反応）、そしてポリｄＴ磁気粒子を含有する標的捕捉試薬と混合した。本混合物を６０℃で３０分間、その後室温で３０分間インキュベートして、ＨＡＶ  ＲＮＡを粒子へ捕捉するハイブリダイゼーション複合体を形成した。容器の外側へ磁場を１０分間かけて、捕捉したＨＡＶ  ＲＮＡが付いた磁気粒子を分離してから、溶液相を吸引して他の試料成分を除去して、ハイブリダイゼーション複合体の付いた粒子を連続して２回洗浄し、各々、１ｍｌの洗浄緩衝液を室温で用いて、洗浄溶液を粒子の外へ吸引した。その後、実施例１に記載のように、ハイブリダイゼーション複合体の付いた粒子を、標識された検出プローブを含有するプローブ試薬（０．１ｍｌ）に懸濁させて、６０℃で２０分間インキュベートし、選択試薬（０．２ｍｌ）の添加、混合及び６０℃で１０分間のインキュベーションを続けた。化学発光シグナルの産生及び検出は、実質的に上記のように、２００μｌの検出試薬Ｉを加え、インキュベーション及び２００μｌの検出試薬ＩＩを加えて混合物のｐＨ中和、そしてルミノメーターを用いてＲＬＵを測定して実施した。試験した捕捉オリゴマーの全てについて、バックグラウンド（ＨＡＶを含有しない同様の試料のＲＬＵ）より有意に高い陽性シグナルを検出して、試料中のＨＡＶ  ＲＮＡの存在を検出した。本アッセイでは、捕捉オリゴマーの間の性能に有意差がほとんど示されなかった。
【実施例３】
【００５４】
ＨＡＶ配列の増幅及び検出
正常ヒト血漿中のＨＡＶ試料を実質的に実施例２に記載のように調製して、ＨＡＶゲノムの選択した標的領域を増幅して検出するアッセイのために様々な捕捉オリゴマーの組合せを用いてＨＡＶ  ＲＮＡを捕捉した。本ゲノムの０〜３０５残基の標的領域については捕捉工程で配列番号２、３及び４を使用した。ゲノムの４７１４〜４７６５残基の標的領域については捕捉工程で配列番号４、５、６及び７を使用した。ゲノムの５４９５〜５７８８残基の標的領域については捕捉工程で配列番号１及び６を使用した。ゲノムの５７８８〜６０６９残基の標的領域については捕捉工程で配列番号２を使用した。ゲノムの６９５２〜７４１３残基の標的領域については捕捉工程で配列番号１、４、５及び７を使用した。捕捉工程は実質的に実施例２に記載のように実施した。
【００５５】
ＨＡＶゲノム中の異なる標的領域のプライマーとして機能する増幅オリゴマーの様々な組合せを含む、実質的に上記の反応物中で、捕捉したＨＡＶ  ＲＮＡを増幅した。標的領域を増幅するために用いるプライマーは、以下の通りであった：０〜３０５残基領域については配列番号１６及び配列番号２２、４７１４〜４７６５残基領域については配列番号８９及び配列番号３２、５４９５〜５７８８残基領域については配列番号９２及び配列番号３３、５７８８〜６０６９残基領域については配列番号９４及び配列番号３７、そして６９５２〜７４１３残基領域については配列番号１０８及び配列番号４６。増幅反応は、いずれも実質的に上記と同様に実施した。即ち、標的捕捉工程由来のＨＡＶ  ＲＮＡが付いた粒子を、増幅試薬と上記の増幅オリゴマーの個別の組合せ（一般的には各々１５ピコモル）と共に混合して、シリコンオイル（０．２ｍｌ）で覆って蒸発を防ぎ、６０℃で１０分間、その後４２℃で１０分間インキュベートした。酵素試薬（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）を加えて、本増幅反応物を４２℃で６０分間インキュベートした。
【００５６】
検出では、増幅領域に含有する配列に特異的にハイブリダイズする標識した検出プローブオリゴマーと共に本増幅混合物をインキュベートした。これには、０〜３０５残基領域として配列番号１０９又は配列番号１１１、４７１４〜４７６５残基領域として配列番号１１５、５４９５〜５７８８残基領域として配列番号１１７、５７８８〜６０６９残基領域として配列番号１２１及び／又は配列番号１２２、そして６９５２〜７４１３残基領域として配列番号１２９又は配列番号１３０が含まれていた。プローブは、プローブ試薬中に、ハイブリダイズした標識化プローブより２百万以下のＲＬＵの最大検出可能シグナルを産生する標識化プローブの比活性に基づいてすでに決定した量を提供した。本プローブと増幅配列をプローブ試薬中で５５〜６０℃でインキュベートして、実質的に実施例１及び２に記載のように、ハイブリダイズしたプローブから化学発光シグナルを産生させて検出した。捕捉されたＨＡＶ  ＲＮＡと共に試験したプライマー組合せの全てで、増幅アッセイの感度は、試料中に存在する４００〜１０００コピーのＨＡＶ  ＲＮＡを検出した。
【００５７】
上記の試験で使用した捕捉オリゴマー、増幅オリゴマー及び検出プローブの組合せを表１に概略要約する。
表１：試料中のＨＡＶを試験するためのオリゴマーの組合せ
【００５８】
【表１】
2011182795.tif 000002
【００５９】
ＨＡＶ含有試料とは別に、異なる捕捉オリゴマー（配列番号１、２、３、４、５、６及び７）を用いて同様の実験を実施し、ここでは、標的捕捉工程を、各アッセイ条件について９回の反復で実質的に上記に記載のように実施した。これらの試験の全てで、標的領域はＨＡＶの残基５７８８〜６０６９であり、これについて配列番号３６及び配列番号９６の同じ増幅オリゴマーを、上記のように実施して捕捉したＨＡＶ  ＲＮＡとともに増幅反応で用いて、上記のように、ハイブリダイズした検出プローブ（残基１１と１２の間にＡＥで標識した、配列番号１２３又は１２４）からの化学発光を測定して増幅産物を検出した。上記のアッセイの結果（９回の反復での平均ＲＬＵ）を表２に示す。
【００６０】
表２：残基５７８８〜６０６９の標的領域の増幅及び検出
【００６１】
【表２】
2011182795.tif 000003
【００６２】
上記の結果は、捕捉オリゴマーの全てが、試料中のＨＡＶの存在を示すために増幅及び検出されるのに十分なほどＨＡＶ  ＲＮＡを試料から精製したことを示す。
【実施例４】
【００６３】
血漿試料中のＨＡＶの検出
本実施例は、ＨＡＶ陽性血漿試料中のＨＡＶ核酸を検出したアッセイを用いる。試料を調製するために、ヒト血漿中のＨＡＶの市販ストックをＨＡＶ陰性血漿へ希釈して、２５、３０、１００、３００及び５００ＨＡＶコピー／ｍｌの試料を得た；陰性対照は、ＨＡＶなしの血漿であった。各アッセイでは、２０回の反復試料で実施して、捕捉オリゴマーの配列番号４（６．５ピコモル／反応）及び配列番号５（１．３ピコモル／反応）を含有する０．４ｍｌの標的捕捉試薬と０．５ｍｌの試料を混合して、標的捕捉工程は、６０℃で２０分のインキュベーションを用いること以外は、実質的に実施例３に記載のように実施した。各アッセイで、ＨＡＶ  ＲＮＡに結合した配列番号４及び５の捕捉オリゴマーを含むハイブリダイゼーション複合体が付いた洗浄済みの磁気粒子を、増幅オリゴマーを（配列番号３６は１３ピコモル／反応で、配列番号９６は２０ピコモル／反応で）含有する７５μｌの増幅試薬を含有する増幅反応物に使用した。上記のように、各混合物をオイル層で覆い、６０℃で１０分インキュベートし、酵素試薬（２５μｌ）を加えて、本混合物を４１．５℃で６０分間インキュベートして、ＨＡＶ標的配列を増幅できるようにした。増幅した配列は、２−メチル−ＡＥ標識化検出プローブを（配列番号１２１及び１２２、各々２５μｌのプローブ試薬中０．００７〜０．１３ピコモル／反応で）用いて、これを増幅ＨＡＶ配列へのプローブのハイブリダイゼーションのために６０℃で１５分間インキュベートして検出した。その後、２５０μｌの選択試薬を加えて、本混合物を６０℃で１０分インキュベートして、非結合プローブ上の標識を加水分解し、上記のように検出試薬Ｉ及びＩＩを用いて検出を実施し、化学発光（ＲＬＵ）を産生して、ルミノメーター（ＬＥＡＤＥＲＴＭＨＭ  Ｐｌｕｓ，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社）で測定した。本結果は、本アッセイが、２５ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約８０〜１００％、３０ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約９０〜１００％、１００ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約９８〜１００％、そして３００及び５００ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で１００％の感度であることを示した。陰性対照（ＨＡＶを含有しない）では、陽性結果が検出されなかった。上記の結果は、本アッセイが臨床試料中のＨＡＶを１ｍｌの試料につき約２５コピーのＨＡＶの感度で検出することを示す。 
【実施例５】
【００６４】
同一試料中のＨＡＶ  ＲＮＡと他のウイルス標的の検出
本アッセイには、実質的に実施例１〜４に記載のＨＡＶを検出する標的捕捉、増幅及び検出の工程が含まれ、本試料中の他の標的、ヒトパルボウイルスＢ１９を捕捉、増幅及び検出するための他のオリゴマーを含む。ＨＡＶを検出するための捕捉オリゴマーは配列番号４及び５であり、増幅オリゴマーは配列番号３６及び９６であり、そして検出プローブは配列番号１２１及び１２２であり、実質的に実施例４に記載のように用いた。パルボウイルスＢ１９の核酸を検出するには、パルボウイルスＢ１９を検出するための既報のアッセイ（米国特許公開公報番号ＵＳ−２００３−０１２４５７８−Ａ１）と同様に、配列番号１６９の捕捉プローブ、配列番号１７０及び１７１の増幅オリゴマー、残基５と６の間で標識した配列番号１７３と残基９と１０の間で標識した配列番号１７４の検出プローブを用いる。既知量のＨＡＶ及びパルボウイルスＢ１９が含まれるように０．５ｍｌの正常ヒト血漿の試料を調製し、捕捉オリゴマー（配列番号４、５及び１６９）を含有する０．４ｍｌの標的捕捉試薬と混合する。実質的に実施例２に記載のように標的捕捉工程を実施して、上記のＨＡＶ特異的及びパルボウイルス特異的な増幅オリゴマーを用いること以外は、実質的に実施例３及び４に記載のように、精製したウイルス標的を同じ増幅反応混合物中で増幅させる。ウイルス標的配列の増幅に続き、検出工程は、上記のようなＨＡＶ特異的プローブとパルボウイルス特異的プローブを用いるが、異なるウイルス標的のプローブは異なるＡＥ化合物で標識して、ディファレンシャル速度論を用いて、検出工程において異なるシグナルの検出を可能にする（米国特許第５，６５８，７３７号に記載）。本アッセイにおいて、ＨＡＶとパルボウイルス１９のいずれの核酸も、両方の標的を含有する試料中に検出される。ＨＡＶの検出のアッセイの感度は約２５コピー／ｍｌであり、即ち、２５、３０、１００、３００及び５００コピーのＨＡＶを１ｍｌに含有する試料の８０％〜１００％で陽性シグナルを検出する。試料中のパルボウイルスＢ１９の検出のアッセイ感度は１５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）程度低く、即ち、１５０ＩＵ／ｍｌを含有する試料の２０％〜４０％で陽性シグナルを検出する。本アッセイは、４００以上のパルボウイルスＢ１９  ＩＵ／ｍｌを信頼し得るほどに検出する、即ち、４００、６００、８００、１６００及び３０００ＩＵ／ｍｌを含有する試料で７０％〜１００％の陽性検出である。上記の結果は、ＨＡＶと（やはり特異的に検出される）他のウイルス、パルボウイルスＢ１９が試料に含まれる場合にもＨＡＶ核酸が特異的に検出されることを示す。
【配列表】
2011182795000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月26日(2011.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第２のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第７のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つの配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記組合せ。
【請求項２】
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１５６からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項３】
配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第３のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項４】
配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第４のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項５】
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９、および配列番号１５０からなる群より選択される、第５のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項６】
配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１、および配列番号１６２からなる群より選択される、第６のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項７】
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８からなる群より選択される、第７のＨＡＶ標的領域のための請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項８】
請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、ここで該少なくとも１つの捕捉オリゴマーが（ｉ）配列番号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列は配列番号８〜１４からなる群より選択される、組合せ
【請求項９】
請求項８の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列番号２、３、および４からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列は配列番号９、１０、および１１からなる群より選択される、組合せ。
【請求項１０】
配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１〜１２４、および配列番号１２６〜１３０からなる群より選択される少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、請求項１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
【請求項１１】
請求項１に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せを含むキット。
【請求項１２】
試料中のＨＡＶの存在を検出する方法であって：
ＨＡＶを含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；
選択ＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅反応を用いて、精製したＨＡＶ核酸又はそれから作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列を増幅して、選択ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程であって、
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第２のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２のＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第７のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つの配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記工程；並びに
増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程
とを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、ここで精製工程が、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと試料を接触させ、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列番号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列が配列番号８〜１４からなる群より選択され、そしてここで該捕捉プローブオリゴマーがＨＡＶ  ＲＮＡ中の配列に特異的にハイブリダイズしてＨＡＶ  ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成して、そしてＨＡＶ  ＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
増幅工程が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、および配列番号１５６からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１５】
増幅工程が、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第３のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第３のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１６】
増幅工程が、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第４のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１７】
増幅工程が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号１５０からなる群より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１８】
増幅工程が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２からなる群より選択される、第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第６のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第６のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。
【請求項１９】
増幅工程が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より選択される、第７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第７のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；そしてここで検出工程は、第７のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、請求項１２の方法。