(57)【要約】【課題】ターゲットDNAを特異的に増幅する方法を提供する。【解決手段】両末端にオーバーハングを有し、前記ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を二本鎖DNAからなり前記オーバーハングにそれぞれ相補的な塩基配列を有する相補的オーバーハングを有する環化アダプターによる環状化を経て少なくも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含む二本鎖環状DNAを調製し、前記第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプライマーと、前記第１のDNA鎖の相補鎖の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーと、を用いて前記第１のDNA鎖及びその相補鎖を増幅するようにする。こうすることで、ダーゲットDNAを高い特異性と増幅性により増幅できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットDNAを増幅する方法であって、
両末端にオーバーハングを有し、前記ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を調製する工程と、
前記二本鎖DNA断片を二本鎖DNAからなり前記オーバーハングにそれぞれ相補的な塩基配列を有する相補的オーバーハングを有する環化アダプターによる環状化を経て少なくも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含む二本鎖環状DNAを調製する工程と、
前記第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプライマーと、前記第１のDNA鎖の相補鎖の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーと、を用いて前記第１のDNA鎖及びその相補鎖を増幅する工程と、
を備える、方法。
【請求項２】
前記増幅工程は、前記第１のDNA鎖の相補鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有する前記第２のプライマーを用いる工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のプライマーは、前記第１のDNA鎖の相補鎖中の前記環化アダプターに由来する塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有するプライマーである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記二本鎖環状DNA調製工程は、前記第1のDNA鎖と相補的であり、かつ一つのギャップを有する一本鎖DNA鎖である第２のDNA鎖とを有する前記二本鎖環状DNAを調製する工程であり、
前記増幅工程は、前記第２のDNA鎖の前記ギャップにおいて露出された３’末端から前記第２のDNA鎖の増幅を開始するステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ギャップは０塩基以上のギャップである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記環化アダプターは、ステム（二本鎖）を形成する第１のステムと当該第１のステムの一方の末端に１塩基以上の長さのギャップを形成するための追加の塩基配列と二重鎖DNA断片の一方のオーバーハングと相補的でかつ同じ長さの塩基配列とを有する第１の相補的オーバーハングとを有する第１のアダプター鎖と、前記ステムを形成する第２のステムと当該第２のステムの一方の末端に二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングと相補的でかつ同じ長さの塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングとを有する第２のアダプター鎖と、を備える、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記増幅工程は、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて実施する工程である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記増幅工程は、前記二本鎖環状DNAを変性することなく実施する工程である、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記増幅工程は、超分岐ローリングサークル増幅工程である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記オーバーハングは前記ターゲットDNAを含む前記二本鎖DNA断片に特異的な配列を有し、前記環化アダプターの前記相補的オーバーハングは前記オーバーハングに相補的な塩基配列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖DNA断片調製工程は、前記ターゲットDNAを含む試料を５塩基以上のオーバーハングを有する断片が生成可能な制限酵素で処理する工程である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖DNA断片調製工程は、２００ｂｐ以上３０００ｂｐ以下の前記二本鎖DNA断片を調製する工程である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ターゲットDNAを検出する方法であって、
両末端にオーバーハングを有し、前記ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を調製する工程と、
前記二本鎖DNA断片を二本鎖DNAからなり前記オーバーハングにそれぞれ相補的な塩基配列を有する相補的オーバーハングを有する環化アダプターによる環状化を経て少なくも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含む二本鎖環状DNAを調製する工程と、
前記第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプライマーと、前記第１のDNA鎖の相補鎖の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーと、を用いて前記第１のDNA鎖及びその相補鎖を増幅する工程と、
前記増幅工程での増幅産物を検出する工程と、
を備える、方法。
【請求項１４】
ターゲットDNAを増幅又は検出するキットであって、
両末端に５塩基以上のオーバーハングを有する二本鎖DNA断片を生成可能な制限酵素と、
二本鎖DNAであって、ステムと、該ステムの一方のDNA鎖から一方に延び前記二本鎖DNA断片の一方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第１の相補的オーバーハングと、前記ステムの他方のDNA鎖から他方に延び前記二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングと、を備える環化アダプターと、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットＤＮＡの増幅方法に関し、特に、ターゲットDNAを高い特異性で増幅する方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの増幅方法には、例えば、ＰＣＲ（Poymerase Chain Reaction）、ＲＣＡ(Rolling Circle Amplification)、ＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplification)、ＳＭＡＰ（Smart amplification process）等のDNAの特定の一部の配列のみを増幅する方法と、ＬＭＰ、ＭＤＡ等の全ての配列が増幅できるＷＧＡ法とがある。特異的ＤＮＡ増幅方法は、主として特定のＤＮＡ検出や、遺伝子操作に用いられている。
【０００３】
ＰＣＲ法は最も広く普及しているDNA増幅法であり、各種分野において不可欠な技術である。また、ＲＣＡ法（非特許文献１）は、環状化したDNAを効率的に増幅することができる。自然界におけるλファージなどの複製機構を模倣したＲＣＡ法により得られる増幅産物は、環状ＤＮＡの一周分のＤＮＡ配列が反復した直鎖状の一本鎖ＤＮＡであり、プライマーを用いて１０3倍までの増幅が可能である。更に第２のプライマーを加えて１０9倍以上増幅できるＨＲＣＡ（Hyperbranched RCA）法も開発されている。このＨＲＣＡ法の特徴は、恒温（３０℃〜６５℃）のままでDNAの増幅を行う点である。さらに、標的DNAと特異的にハイブリダイズする100mer程度のプローブが標的DNAと特異的にハイブリダイズしたときにライゲーションにより環状化し、この環状化DNAを増幅するＬ−ＲＣＡ（Ligation-RCA）法が開発されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＬＡＭＰ法（非特許文献３）及びＳＭＡＰ法も、恒温でＤＮＡを特異的に増幅することができる。これらの方法は短時間でＤＮＡ試料、プライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを混合し、検出までの工程をワンステップで行うため、特定の遺伝子の有無を効率的に判定することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dean et al., Genome Res 11(6):1095-1099(2001)
【非特許文献２】Lizardi et al. Nature genetics volume 19, 1998
【非特許文献３】Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N. and Hase., (2000), Nucleic Acid Res., 28 (12) : e63
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＰＣＲ法は、６０℃〜９５℃の範囲で加熱・冷却を繰り返す高度の温度調節装置を要するため、エネルギー消費量が多く、コストも高い。また、二重鎖DNAの変性とハイブリダイゼーションとを繰り返すため、特に、テンプレートDNAの濃度が低い場合には、非特異的な増幅もしばしば発生する。さらに、多数の特定のDNA領域を同時に増幅することも困難である。また、ＲＣＡ及びＨＲＣＡを用いて、検出対象となるような特定のＤＮＡを環状化して増幅するものではなく、Ｌ−ＲＣＡ法は、あくまで１００塩基前後のプローブを環状化するものであり、一旦非特異的な環状化が生じてしまえば、非特異的な増幅が起こりやすいという問題があった。加えて、検出・増幅特異性はライゲーションに依存しているほか、比較的短い標的配列には有効であるが長いDNAを標的とするとトポロジー的な拘束により増幅効率が低下し、さらに標的配列に応じた温度制御をしなければ、非特異的増幅が生じてしまっていた。
【０００７】
さらに、ＬＡＭＰ法やＳＭＡＰ法では、プライマーの設計が困難であり、非特異的な増幅が生じやすいという欠点があった。
【０００８】
以上のように、現状において、検出対象となるような特定のDNAを非特異的な増幅を効果的に抑制して増幅することは困難であった。また、温度制御のほか煩雑な操作も必要であった。
【０００９】
そこで、本発明は、非特異的な増幅を効果的に抑制して高い特異性と増幅性でターゲットDNAを増幅できるターゲットDNAの増幅方法及びその利用を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ターゲットDNAの増幅に際し、ターゲットDNA自体を環状化して二本鎖環状DNAとし、この一方のDNA鎖を鋳型としてこの相補鎖を増幅し、さらにこの相補鎖中のターゲットDNAの特異的配列を利用して前記一方の鎖を増幅することで、効果的にバックグラウンドを抑制し、しかも高効率にターゲットDNAを増幅できるという知見を得た。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
本明細書の開示によれば、ターゲットDNAを増幅する方法であって、両末端にオーバーハングを有し、前記ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を調製する工程と、前記二本鎖DNA断片を二本鎖DNAからなり前記オーバーハングにそれぞれ相補的な塩基配列を有する相補的オーバーハングを有する環化アダプターによる環状化を経て少なくも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含む二本鎖環状DNAを調製する工程と、前記第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプライマーと、前記第１のDNA鎖の相補鎖の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーと、を用いて前記第１のDNA鎖及びその相補鎖を増幅する工程と、
を備える、方法が提供される。
【００１２】
この増幅方法においては、前記増幅工程は、前記第１のDNA鎖の相補鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有する前記第２のプライマーを用いる工程であることが好ましい。また、前記第２のプライマーは、前記第１のDNA鎖の相補鎖中の前記環化アダプターに由来する塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有するプライマーとすることができる。前記二本鎖環状DNA調製工程は、前記第1のDNA鎖と相補的であり、かつ少なくとも一つのギャップを有する一本鎖DNA鎖である第２のDNA鎖とを有する前記二本鎖環状DNAを調製する工程であり、前記増幅工程は、前記第２のDNA鎖の前記ギャップにおいて露出された３’末端から前記第２のDNA鎖の増幅を開始するステップを含むことができる。前記ギャップは０塩基以上であればよいが、１塩基以上であることが好ましい。
【００１３】
この増幅方法において、前記環化アダプターは、ステム（二本鎖）を形成する第１のステムと当該第１のステムの一方の末端に１塩基以上の長さのギャップを形成するための追加の塩基配列と二重鎖DNA断片の一方のオーバーハングと相補的でかつ同じ長さの塩基配列とを有する第１の相補的オーバーハングとを有する第１のアダプター鎖と、前記ステムを形成する第２のステムと当該第２のステムの一方の末端に二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングと相補的でかつ同じ長さの塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングとを有する第２のアダプター鎖と、を備えることができる。
【００１４】
この増幅方法において、前記増幅工程は、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて実施する工程とすることができる。また、前記増幅工程は、前記二本鎖環状DNAを変性することなく実施する工程とすることができる。さらに、前記増幅工程は、超分岐ローリングサークル増幅工程とすることができる。
【００１５】
この増幅方法において、前記オーバーハングは前記ターゲットDNAを含む前記二本鎖DNA断片に特異的な配列を有し、前記環化アダプターの前記相補的オーバーハングは前記オーバーハングに相補的な塩基配列を有することができる。さらに、前記二本鎖DNA断片調製工程は、前記ターゲットDNAを含む試料を５塩基以上のオーバーハングを有する断片を生成可能な制限酵素で処理する工程とすることができる。さらにまた、前記二本鎖DNA断片調製工程は、１００ｂｐ以上５０００ｂｐ以下の前記二本鎖DNA断片を調製する工程とすることができる。
【００１６】
本明細書の開示によれば、ターゲットDNAを検出する方法であって、両末端にオーバーハングを有し、前記ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を調製する工程と、前記二本鎖DNA断片を二本鎖DNAからなり前記オーバーハングにそれぞれ相補的な塩基配列を有する相補的オーバーハングを有する環化アダプターによる環状化を経て少なくも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含む二本鎖環状DNAを調製する工程と、前記第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプライマーと、前記第１のDNA鎖の相補鎖の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーと、を用いて前記第１のDNA鎖及びその相補鎖を増幅する工程と、前記増幅工程での増幅産物を検出する工程と、を備える、方法が提供される。
【００１７】
。
本明細書の開示の開示によれば、ターゲットDNAを増幅又は検出するキットであって、両末端に５塩基以上のオーバーハングを有する二本鎖DNA断片を生成可能な制限酵素と、二本鎖DNAであって、ステムと、該ステムの一方のDNA鎖から一方に延び前記二本鎖DNA断片の一方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第１の相補的オーバーハングと、前記ステムの他方のDNA鎖から他方に延び前記二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングと、を備える環化アダプターと、を含む、キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の概要の一例を示す図である。
【図２】実施例１で調製するターゲットDNA、アダプター及びプライマーの配列設計を示す図である。
【図３】実施例１において360塩基対のターゲットDNAに対して、増幅したDNAの泳動結果を示す図である。（ａ）は、ターゲットDNA濃度を0.05pM〜5pMの範囲で変化させたときの増幅産物の泳動結果を示し、（ｂ）は、ヒトゲノムDNAの混在下でのターゲットDNAの増幅産物、ターゲットDNAのみの増幅産物及びヒトゲノムのみの増幅産物の各泳動結果を対比する図である。
【図４】実施例２〜５において、861塩基対のターゲットDNA及び242塩基対のターゲットDNAに対して、増幅したDNAの泳動結果を示す図である。レーン１は861塩基対のターゲットDNAの増幅産物の泳動結果であり、レーン２は242塩基対のターゲットDNAの増幅産物の泳動結果であり、レーン３は149塩基対（GAP4mer）のターゲットDNAの増幅産物の泳動結果であり、レーン４は149塩基対（GAP19mer）のターゲットDNAの増幅産物の泳動結果であり、レーン５は1525塩基対のターゲットDNAの増幅産物の泳動結果である。
【図５】実施例１〜５において得られた増幅産物の制限酵素TspRIによる分解産物の電気泳動結果を示す図である。レーン０は、実施例１（360 bpのターゲットDNAの増幅産物）のTspRI分解産物の泳動結果であり、レーン１は実施例２（861 bpのターゲットDNAの増幅産物）のTspRI分解産物の泳動結果であり、レーン２は実施例２（242 bpのターゲットDNAの増幅産物）のTspRI分解産物の泳動結果であり、レーン３は実施例３（149 bpのターゲットDNAの増幅産物）のTspRI分解産物の泳動結果であり、レーン４は実施例５（1525 bpのターゲットDNAの増幅産物）のTspRI分解産物の泳動結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ターゲットDNAの増幅方法及びその利用に関する。本明細書の開示のターゲットDNAの増幅方法の概要の一例を図１に示す。本明細書の開示によれば、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を環化アダプターを利用して環状化して、少なくとも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含む二本鎖環状DNAを調製し、第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列に相補的な塩基配列を有する第１のプライマーを用いて増幅工程を実施してその相補鎖を増幅することができる。さらに、その相補鎖中の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーを用いる増幅工程の実施により、第１のDNA鎖を増幅することができる。すなわち、第１のDNA鎖中にターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列がある場合に限り、第１のDNA鎖及びその相補鎖の増幅が効率的に反復して行われる。
このように、本明細書の開示の増幅方法によれば、環状の第１のDNA鎖にターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列がある場合においてのみ、ターゲットDNAの増幅が増強されることになる。このため、バックグラウンドをよく抑制して高効率にターゲットDNAを増幅できる。
【００２０】
さらに、本明細書の開示によれば、第１のDNA鎖の相補鎖中のターゲットDNAに関連つけられる第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーを用いることで、さらに高い特異性でターゲットDNAを増幅することができる。例えば、第２の塩基配列としては、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片に特異的にハイブリダイズして環化する環化アダプター中の塩基配列を選択することができる。
【００２１】
以下、本明細書の開示のターゲットDNAの増幅方法及びその利用の各種実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。図１は、本明細書の開示のターゲットDNAの増幅方法の概要の一例及び当該増幅方法におけるターゲットDNA、二本鎖DNA断片、環化アダプター、二本鎖環状DNA、プライマー及び増幅形態等を示す図である。
【００２２】
（ターゲットDNAの増幅方法）
本明細書の開示のターゲットDNAの増幅方法は、ターゲットDNAを増幅する方法である。すなわち、ターゲットDNAの複製物を生産する方法である。ここで複製物とは、ターゲットDNAの塩基配列と同一配列のDNAを含むものをいい、ターゲットDNAは複製物の一部であってもよい。本明細書の開示の増幅方法によれば、複製物を、通常、ターゲットDNAを含む二本鎖DNAとして取得することができる。
【００２３】
（ターゲットDNA）
本明細書の開示の増幅方法が増幅対象とするターゲットDNAは、実質的な増幅対象となる二本鎖DNA断片の全体を意図するものでなく、その一部であってもよい。また、その全体であってもよい。ターゲットDNAは、二本鎖DNAであってもよいし、一本鎖DNAであってもよい。ターゲットDNAの由来も特に問わない。また、その長さも特に限定しないが、制限酵素による頻度や増幅効率等を考慮すると、３０００ｂｐ以下程度とすることができる。また、ターゲットの長さの下限も特に限定しないが、ターゲットDNAに特異的な増幅を考慮すると、その長さの下限は、プライマーがハイブリダイズしてDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応が進行する長さであることが好ましく、制限酵素による切断を考慮すると、ターゲットDNAは３０ｂｐ程度以上であればよく、２００ｂｐ以上であってもよい。
【００２４】
（二本鎖DNA断片の調製工程）
本工程は、両末端にオーバーハングを有し、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を調製する工程とすることができる。この工程によれば、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を調製することにより、後段の工程でターゲットDNAを二本鎖環状DNAの一部に含めることができる。この結果、ターゲットDNAの実質的な増幅をターゲットDNA特異的な配列に基づいて実現及び増強できることになる。
【００２５】
（二本鎖DNA断片）
本明細書の開示の増幅方法における二本鎖DNA断片は、ターゲットDNAを含んで両末端にオーバーハングを有することができる。ターゲットDNAの領域は特に限定しない。二本鎖DNA断片の一部であっても全体であってもよい。したがって、ターゲットDNAの領域が両末端又は一方の末端のオーバーハングの全体又はその一部に及んでいてもよい。
【００２６】
オーバーハングは、好ましくは５塩基以上である。５塩基以上であると、環化の効率及び二本鎖DNA断片の環化時において二本鎖DNA断片と環化アダプターとの特異性の高いハイブリダイズを確保しやすくなる。オーバーハングは、通常、制限酵素による切断によって形成されるが、この場合オーバーハングには、１又は２以上の任意塩基部位を含んでいることが好ましい。ターゲットDNAを含んだ二本鎖DNAのオーバーハングが当該断片に特異的な塩基が許容されるため、当該断片に特異的なオーバーハングを得ることができる。また、オーバーハングには、制限酵素の認識配列を含んでいてもよい。
【００２７】
二本鎖DNA断片の長さは、制限酵素の認識部位の頻度や増幅効率等を考慮すると、100bp以上5000bp以下程度であることが好ましい。100bp以上であれば、ギャップを長くすることで、環状化することが可能であるからである。また、例えば、大腸菌DNA（4640 kb）の制限酵素TspRIによる切断断片の塩基長は、100 bp以下が約2%、100-3000 bpが96%以上、3000−5000 bpが約1.5%、5000 bp以上がほとんどなし、というように、100bpから5000bpにほとんどの断片が集中する傾向があるからである。より好ましくは、200bp以上3000bp以下程度である。
【００２８】
（二本鎖DNA断片の調製方法）
二本鎖DNA断片は、例えば、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を、粘着性末端を生じる１種又は２種以上の制限酵素で処理することによって得ることができる。制限酵素処理によって得られる粘着性末端が、二本鎖DNA断片のオーバーハングに相当する。制限酵素は１種のみを用いてよいし、２種以上を用いてもよい。ターゲットDNAを含んで適当な長さの二本鎖DNA断片となるような制限酵素又はその組み合わせが選択される。さらには、特異性の高いオーバーハングが生成されるかどうか等も考慮して選択される。
【００２９】
制限酵素としては、二本鎖DNA断片において好ましいオーバーハングを生成するものであることが好ましい。こうした制限酵素としては、例えば、５塩基以上のオーバーハングを生成する制限酵素が挙げられる。具体的には、Hga I （5塩基のオーバーハング）、Bae I （5塩基のオーバーハング）、Hin4 I （5塩基のオーバーハング）、Alo I （5塩基のオーバーハング）、Bsp24 I （5塩基のオーバーハング）、Hae IV （5塩基と6塩基のオーバーハング）、Cje I （6塩基のオーバーハング）、CjeP I （6塩基のオーバーハング）及びTspRI （9塩基のオーバーハング）が挙げられる。なかでも、６塩基以上のオーバーハングを生成する制限酵素が好ましく、より好ましくは９塩基のオーバーハングを生成する制限酵素である。
【００３０】
制限酵素が生成するオーバーハングは、１又は２以上の任意塩基部位を含むことが好ましい。既に説明したように、任意塩基部位を含むことで、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を高い特異性で環化できるようになる。２以上の任意の塩基は連続していてもよく１又は２以上の特定の塩基を介して配列していてもよい。任意の塩基は好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上である。例えば、Hga Iの場合は、５塩基のオーバーハングはNNNNNであり、二本鎖DNA断片に形成されるオーバーハングは当該二本鎖DNA断片に特異的な５つの連続した塩基からなる配列を有することになる。こうした特異的なオーバーハングに相補的な環化アダプターを用いることでターゲットDNAの増幅の特異性が向上する。
【００３１】
制限酵素の認識部位を構成する塩基数は特に限定しないが、ターゲットＤＮＡの長さ等を考慮して決定できる。認識部位を構成する塩基数が多い場合には、認識部位の存在頻度が低くなり長い二本鎖DNA断片が形成され、当該塩基数が少ない場合には、認識部位の存在頻度が高くなり短い二本鎖DNA断片が形成されるようになる。例えば、認識部位の構成塩基数が４塩基以上６塩基以下程度（典型的には５塩基）であると、増幅効率等の関係から好ましい長さの二本鎖DNA断片を得ることができる。例えば、TspRIの場合、CACTG又はCAGTGの配列があれば、切断ができる。TspRIの切断サイトは、平均的には、400−500塩基程度に一箇所であると考えられる。制限酵素の認識部位は、オーバーハング中にあってもよいし、オーバーハング以外にあってもよい。
【００３２】
（二本鎖環状DNAの調製工程）
二本鎖環状DNAの調製工程は、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を環化アダプターを利用した環状化を経て、少なくも一つの一本鎖環状DNAを含む二本鎖環状DNAを調製する工程とすることができる。二本鎖環状DNAは、少なくとも一つの一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖を含んでいる。一本鎖環状DNA鎖とは、完全な環状のDNA鎖を意味している。後段の増幅工程では、この第１のDNA鎖を鋳型にこの相補鎖を増幅することで、ターゲットDNAを特異的かつ高効率に増幅できる。二本鎖環状DNAの他方のDNA鎖は、一本鎖環状DNAである第1のDNA鎖と相補的であり、かつ一つのギャップ（不連続部位）を有する一本鎖DNA鎖である第２のDNA鎖であることが好ましい。こうしたギャップを備えることで、二本鎖環状DNAの形態を採っていても、高温で変性して一本鎖DNA鎖にしなくとも増幅工程を実施できる。
【００３３】
二本鎖環状DNAが第２のDNA鎖を有するとき、ギャップは、後述する環化アダプターの末端と第２のDNA鎖の末端との間に位置されることが好ましい。ギャップは、後段の増幅工程で第１のDNA鎖の相補鎖の複製開始部位ともなり、環化アダプターの近傍であれば、ギャップを形成しやすく環状化した二本鎖DNA断片を特異的に増幅しやすいからである。ギャップは、環化アダプターの５’末端と第２のDNA鎖の３’末端との間に位置であってもよいし、環化アダプターの３’末端と第２のDNA鎖の５’末端との間に位置であってもよい。
【００３４】
ギャップの大きさ（塩基数）は、特に限定しないで、０塩基（ニック）であってもよいし、１塩基以上であってもよい。DNAの二重螺旋は10.5塩基前後で一ピッチであるので、100bp以上200bp以下の比較的短い断片の場合、ギャップの塩基数10.5の整数倍（105、115、126など）でなければ、連結する際にStressが生じ、連結の効率が悪くなる傾向があるが、300 bp以上であれば、その制限がなくなり、どの長さのDNA断片でも効率良く環状化できる（Du Q, Vologodskaia M, Kuhn H, Frank-Kamenetskii M, and Vologodskii A. "Gapped DNA and cyclization of short DNA fragments" Biophys. J. 88, 4137-4145 (2005).）。
【００３５】
（環化アダプター）
二本鎖環状DNAを調製するには、環化アダプターを用いることができる。図１に示すように、環化アダプターの一例は、全体として二本鎖のステムと、これらのステムから反対方向にそれぞれ延びるオーバーハングを有している。すなわち、環化アダプターは、二本鎖DNAであって、ステムと、該ステムの一方のDNA鎖から一方に延び前記二本鎖DNA断片の一方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第１の相補的オーバーハングと、前記ステムの他方のDNA鎖から他方に延び前記二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングとを備えることができる。環化アダプターと二本鎖DNA断片と環化アダプターとをそれぞれ相補的なオーバーハングでハイブリダイズさせ、DNAリガーゼで連結することにより、二本鎖環状DNA（閉環状DNA）を得ることができる。
【００３６】
環化アダプターを用いてギャップを有しない完全な環状の第１のDNA鎖とギャップを有する第２のDNA鎖とを有する二本鎖環状DNAを得るには、調製した二本鎖閉環状DNAをニッカーゼで処理することにより一方のDNA鎖にニックを形成させて、第１のDNA鎖と０塩基のギャップを有する第２のDNA鎖を有する開環状DNAとすることができる。例えば、予め、ニッカーゼの認識配列を導入した環化アダプターを用いて環状化しておき、連結後にニッカーゼで処理する方法が挙げられる。また、ターゲットDNA中にニッカーゼの認識配列がある場合には、それを利用して０塩基ギャップ（ニック）を形成してもよい。ニッカーゼとしては、例えば、N.Alw I（認識配列：5’-GGATCNNNNN*N-3’/3’-CCTAGNNNNN-5、 *はCutする位置を示す。以下同じ。）、N.BstNB I（5’-GGATCNNNNN*N-3’/3’-CCTAGNNNNN-5’）、N.BbvC IA（5’-GC*TGAGG-3’/3’-CGACTCC-5’）及びN.BbvC IB（5’-GC*TCAGC-3’/3’-GGAGTCG-5’）が挙げられる。さらには、リガーゼで連結されないように、特定の５’末端を脱リン酸化した環化アダプターを準備して環化を行ってもよい。
【００３７】
二本鎖環状DNAの調製工程は、T4 DNAリガーゼ等のDNAリガーゼを用いて１０℃以上３７℃以下程度の室温で行うことが好ましい。なお、ニッカーゼを用いてニックを形成する場合には、予めDNAリガーゼを失活しておくことが好ましい。
【００３８】
また、ギャップを有しない完全な環状の第１のDNA鎖と１塩基以上のギャップを有する第２のDNA鎖とを有する二本鎖環状DNAを得るには、ギャップを形成可能に構築した環化アダプターを用いることができる。その場合、環化アダプターは、二本鎖ステムを形成する第１のステムと当該第１のステムの一方の末端に１塩基以上の長さのギャップを形成するための追加の塩基配列と二重鎖DNA断片の一方のオーバーハングと相補的でかつ同じ長さの塩基配列とを有する第１の相補的オーバーハングとを有する第１のアダプター鎖と、前記ステムを形成する第２のステムと当該第２のステムの一方の末端に二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングと相補的でかつ同じ長さの塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングとを備えることができる。この環化アダプターにおいて第１のアダプター鎖は第１のDNA鎖に組み込まれ、第２のアダプター鎖は第２のDNA鎖に組み込まれるようにそれぞれ相補的オーバーハングが形成されている。
【００３９】
かかる環化アダプターにおける追加の塩基配列は、ギャップの塩基数の長さに対応しており、例えば、ギャップが１塩基〜４塩基の場合、１塩基〜４塩基の長さとなる。図１に示すように、このようなDNA領域を、第１のアダプター鎖のオーバーハングの末端の反対側、すなわち、ステム寄りに備えることができる。この結果、第２のアダプター鎖の第２のステムの露出された末端（図１では５’末端）と二重鎖DNA断片のオーバーハングの末端（図１では３’末端）との間にギャップが形成されることになる。増幅工程では、ギャップに露出される第２のDNA鎖の３’末端からDNA鎖の伸長が開始されるのが好ましい。
【００４０】
環化アダプターは、さらに第２のアダプター鎖の第２の相補的オーバーハングの末端から適数個の塩基を除去されていてもよい。こうすることで、環化時に、二本鎖DNA断片の第２のDNA鎖と環化アダプターの第２のアダプター鎖の相補的オーバーハングとがDNAリガーゼによって連結されなくなる。この結果、追加のギャップが二本鎖環状DNAの第２のDNA鎖に形成されることになる。このギャップがあることで、二本鎖DNA断片を調製するのに用いた制限酵素の認識部位の再形成を回避して、当該制限酵素による切断を回避することができる。すなわち、二本鎖DNA断片の準備工程で用いた制限酵素の除去操作を省くことができる。この追加のギャップの大きさは、１塩基以上で、二本鎖DNA断片と環化アダプターのアニールを妨げない範囲で設定できる。
【００４１】
既に説明したように、制限酵素の認識部位及び／又は切断部位の塩基配列に任意塩基を含むなどの理由により、二重鎖DNA断片のオーバーハングが高い特異性を有する場合には、環化アダプターによる環状化自体がターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片に特異性の高いものとなり、後段の増幅工程における特異的なターゲットDNAの増幅に寄与することになる。
【００４２】
環化アダプターの相補的オーバーハング以外の領域、例えば、ステムは、後段の増幅工程で使用する第２のプライマーをハイブリダイズさせるターゲットDNAに関連付けられる配列を含んでいてもよい。こうすることで、第２のプライマーは、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片に特異的な、すなわち、ターゲットDNAに関連付けられる第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有することができるといえる。この結果、後段の増幅工程で、生じうる意図しない増幅産物（二本鎖DNA断片のセルフライゲーション産物や意図しない環化アダプターとのライゲーション産物）とのハイブリダイズが抑制されるとともに、より高い特異性でターゲットDNAを増幅できるようになる。
【００４３】
また、環化アダプターのステム等には、必要に応じ機能的な塩基配列のDNA領域を有していてもよい。例えば、増幅工程後に実施する可能性のあるシークエンシング、転写反応、形質転換、細胞内増幅などに利用可能な塩基配列のDNA領域が挙げられる。例えば、シークエンシング用プライマー配列を使用すれば、後段の増幅工程で増幅した産物を直接シークエンスできる。
【００４４】
（ターゲットDNAの増幅工程）
ターゲットDNAの増幅工程は、第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプライマーと、前記第１のDNA鎖の相補鎖の一部に相補的な塩基配列を有する第２のプライマーと、を用いて前記第１のDNA鎖及びその相補鎖を増幅する工程とすることができる。この増幅工程によれば、第１のDNA鎖中にターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列があるときには、第１のプライマーによって第１のDNA鎖の相補鎖が増幅される。さらに、第１のDNA鎖の相補鎖中の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する第１のプライマーによって、第１のDNA鎖が増幅される。すなわち、第１のDNA鎖にターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列があれば、第１のDNA鎖とその相補鎖との増幅が増強される。
【００４５】
（プライマー）
第１のプライマーは、第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列に相補的な塩基配列を有している。第１のプライマーは、第１のDNA鎖をターゲットDNAに特異的にその相補鎖を増幅するためのプライマーである。こうした第１のプライマーを用いることで、ターゲットDNAに関連付けられる第１のDNA鎖の相補鎖を特異的に増幅できる、第１の塩基配列としては、例えば、ターゲットDNAに見出される特異的な塩基配列に相補的な配列とすることができる。こうした特異的な配列及び第１の塩基配列は、適切なプログラムを用いることで適宜決定することができる。第１のプライマーの長さは特に限定しないが、好ましくは８塩基以上２０塩基程度である。
【００４６】
第２のプライマーは、第１のDNA鎖の相補鎖（第２のDNA鎖である場合もある）の一部に相補的な塩基配列を有している。第２のプライマーは、第１のDNA鎖を増幅するためのプライマーである。こうした第２のプライマーを用いることで、第１のDNA鎖の相補鎖が増幅されたときには、それに応じて第１のDNA鎖が増幅されることになる。
【００４７】
こうした第１のプライマーと第２のプライマーとによって、ターゲットDNAが特異的に増幅されることになる。
【００４８】
第２のプライマーは、第１のDNA鎖の相補鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有していてもよい。こうした第２のプライマーを用いることで、さらに一層高い特異性でターゲットDNAを増幅できるようになる。こうした第２の塩基配列としては、前記相補鎖中に見出すことのできる、ターゲットDNA特異的な配列であってもよいが、例えば、相補鎖中の環化アダプターに由来する配列することもできる。既に説明したように、制限酵素の選択等により、二本鎖DNA断片のオーバーハングには、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片に特異的な配列とすることができる。こうした場合、このようなオーバーハングに特異的にハイブリダイズして環化する環化アダプター中の塩基配列を第２の塩基配列として選択することで、第１の塩基配列に基づく特異性に加え、特異的な環化を引き起こす第２の塩基配列に基づく特異性を付加して一層特異的にターゲットDNAを増幅することができるようになる。これらの結果、バックグラウンドを効果的に低減できる。さらに、環化アダプター中に第２の塩基配列を設定することで、増幅工程で生じた意図しない増幅産物（二本鎖DNA断片のセルフライゲーション産物や意図しない環化アダプターとのライゲーション産物）に基づく第１のDNA鎖の増幅が回避される。また、環化アダプター中の塩基配列を第２の塩基配列とすることで、第１の塩基配列以外にターゲットに有効に関連付けられる高い特異性の塩基配列が見出せない場合であっても、第２の塩基配列を容易にかつ高い自由度で設定することができる。こうした第２の塩基配列は、例えば、環化アダプターのステムの一部又は全部とすることができる。例えば、ギャップに露出される第２のDNA鎖の５'末端側（第２のアダプター鎖の５’末端側）の塩基配列とすることができる。第２のプライマーの長さは特に限定しないが、好ましくは８塩基以上２０塩基程度である。
【００４９】
これらのプライマーの３’末端は、Phi29 DNA polymerase等の鎖置換型DNAポリメラーゼの３’‐エキソヌクレアーゼ活性で分解しないように、リン酸ジエステルをリン酸チオエステルに修飾することができる。
【００５０】
増幅工程は、二本鎖環状DNA中の第１のDNA鎖に対して実施されればよく、各種態様で開始し、進行させることができる。第１の方法は、二本鎖環状DNAを変性させて第１のDNA鎖を単環状のDNA鎖として取得した上で、この単環状の第１のDNA鎖に対して増幅工程を実施する方法がある。この方法では、第１のDNA鎖中の第１の塩基配列に対して第１のプライマーがハイブリダイズすることで、第１のDNA鎖の相補鎖の増幅が開始される。その後、増幅された相補鎖に対して第２のプライマーがハイブリダイズして第１のDNA鎖の増幅が開始される。こうして、第１のDNA鎖と第２のDNA鎖が繰り返し増幅される。
【００５１】
また、第２の方法は、開環状二本鎖環状DNAに対して、直接増幅工程を実施する態様である。すなわち、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いることで、ギャップを有する第２のDNA鎖の３’末端から第２のDNA鎖の伸長・増幅が開始される。この方法によれば、二本鎖DNAをアニールさせる必要がないため、一定温度で増幅反応を実施できる。第２のDNA鎖の伸長反応に伴い、鎖置換型DNAポリメラーゼによって第２のDNA鎖の５’末端と第１のDNA鎖との対合が解かれていき、さらに第２のDNA鎖の伸長が進行することになる。こうして増幅された第２のDNA鎖に対して、第２のプライマーがハイブリダイズし、第１のDNA鎖が伸長し増幅される。そして、新生された第１のDNA鎖に対して第１のプライマーがハイブリダイズして第２のDNA鎖が増幅される。こうして、第１のDNA鎖と第２のDNA鎖が繰り返し増幅される。
【００５２】
なお、閉環状二本鎖DNAの場合でも、第１のDNA鎖以外の鎖のDNA鎖にニックを形成するなどすることで事後的に第２のDNA鎖を形成して、開環状二本鎖DNAを取得して、第２の方法による増幅工程を実施できる。
【００５３】
増幅工程は、好ましくは、上記第１の方法及び第２の方法においては、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて行う。こうすることで、第２のDNA鎖が鋳型となる第１のDNA鎖に対合している状態であっても、第１のDNA鎖の相補鎖を増幅できる。すなわち、２０℃〜５０℃程度の常温の一定温度で反応させることができる。このような鎖置換型DNAポリメラーゼとしては、Phi29DNAポリメラーゼ、Klenow Fragment DNA Polymerase I、Klenow Fragment 3¢(R)5¢ exo-M-MuLV Reverse Transcriptase、Vent (exo-) DNA polymerase等が挙げられる。
【００５４】
増幅工程は、ローリングサークル型増幅工程とすることができる。すなわち、第１のDNA鎖又は第２のDNA鎖がタンデムに連結した多量体（コンカテマー）が形成されるような条件で実施することが好ましい。例えば、鎖置換型DNAポリメラーゼを用い、第１のDNA鎖の相補鎖（第２のDNA鎖）をタンデムに連続的に備える一本鎖の多量体が増幅産物として生成するようにすることができる。こうすることで、タンデムに配列された各相補鎖に第２のプローブがハイブリダイズし、各相補鎖につき第１のDNA鎖が増幅されることになる。さらにこの第１のDNA鎖に第１のプライマーが特異的にハイブリダイズしてさらにその相補鎖が増幅される。このような超分岐ローリングサークル型増幅工程の結果、第１のDNA鎖とその相補鎖（第２のDNA鎖）の連続的かつ指数関数的な増幅が可能となり、第１のDNA鎖と第２のDNA鎖との二重鎖のコンカテマーを効率的に形成することができる。
【００５５】
以上説明した本明細書の開示の増幅方法によれば、増幅工程における環状の第１のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列を利用してその相補鎖を増幅することで、ターゲットDNA増幅の特異性が確保されている。さらに、鋳型を環状の第１のDNA鎖とすることで連続的にその相補鎖の増幅が可能となっており、特異性と増幅性とが確保された方法となっている。
【００５６】
また、本明細書の開示の増幅方法においては、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を環状化して、これを増幅する。これにより、ターゲットにハイブリダイズして環状化させたプローブを増幅するよりも、より直接的により特異的にターゲットDNAを増幅することができる。
【００５７】
また、本明細書の開示の増幅方法によれば、第２のDNA鎖中のターゲットDNAに関連付けられる第２の塩基配列を利用することで、一層特異的にターゲットDNAを増幅することができるようになる。特に、本増幅方法においては、二本鎖DNA断片のオーバーハングに特異的な環化アダプターを用いることで二本鎖環状DNAを選択的に形成することができる。そして、第２の塩基配列を、第２のDNA鎖の環化アダプター中の配列に設定することができる。
【００５８】
このように、本明細書の開示の増幅方法は、ターゲットDNAに関連付けられる第１の塩基配列に基づく選択性によってターゲットDNAの特異的な増幅が確保されるのに加え、環状化の際のオーバーハング中のターゲットDNAに関連付けられた第２の塩基配列等によってもターゲットDNAの特異的な増幅が確保されうる。この結果、バックグラウンドの増幅を効果的に抑制することができる。特に、増幅工程をローリングサイクル型増幅、好ましくは超分岐ローリングサイクル型増幅で実施することで少量のターゲットDNAを高度に増幅することができる。
【００５９】
また、本明細書の開示の増幅方法において、開環状二本鎖DNAを調製し、鎖置換型DNAポリメラーゼを利用して増幅工程を実施することで、変性のための加熱を要せずしかも、常温範囲の一定温度で増幅工程を実施することができる。本明細書の開示の増幅方法によれば、特異的増幅をかかる温度条件で実施することがバックグラウンドの低減にも寄与しているほか、エネルギーコストや装置コストの低減並びに再現性の向上に寄与していると考えられる。
【００６０】
さらに、本明細書の開示の増幅方法によれば、二本鎖環状DNAの調製工程後の反応液をそのまま精製することなく増幅工程に用いることができる。増幅工程を、環状化した二本鎖DNA断片中の第１の塩基配列に基づいて高い特異性でかつ高い増幅性で実施できるからである。増幅工程を、第２のDNA鎖中の第２の塩基配列に基づいて実施することでさらに高い特異性と増幅性を確保できる。このようにして、高い特異性と増幅性とで増幅工程を実施できる結果、増幅工程後の反応液をそのまま精製することなく検出工程に供することもできる。
【００６１】
（ターゲットDNAの検出方法）
本明細書の開示のターゲットDNAの検出方法は、上記二本鎖DNA断片調製工程と、上記二本鎖環状DNA調製工程と、上記増幅工程と、に加えて、上記増幅工程での増幅産物の検出工程と、を備えることができる。本明細書の開示の検出方法によれば、ターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片の高度に特異的な増幅産物を検出することで、高い特異性及び高い感度でターゲットDNAを検出することができる。
【００６２】
本明細書の開示の検出方法の検出工程における、増幅産物の検出方法は特に限定されない。一般的なDNAの検出方法である、電気泳動、増幅産物のプローブ（通常のプローブ他、モレキュラービーコン型プローブを含む）による検出等が挙げられる。プローブは例えば、アレイ等のように固相に結合されていてもよい。また、プローブは、蛍光等のシグナル物質によるシグナル化を伴うものであってもよい。また、こうした検出工程は、増幅工程後の増幅産物のみに対して行うことに限定するものではなく、増幅工程中の増幅産物に対してリアルタイムに実施することもできる。さらに、一端を化学修飾（例えば、５’末端にアミノ基を導入する。）等した環化アダプターを、固相上に固定しておき、二本鎖DNA断片を供給して環化してもよいし、また、環化後の二本鎖環状DNAを固相に固定化して、増幅工程を実施することで、そのまま固相上で蛍光標識したプローブ等を用いて検出工程を行うことができる。
【００６３】
（ターゲットDNAの増幅・検出キット）
本明細書の開示のターゲットDNAの増幅・検出キットは、両末端に５塩基以上のオーバーハングを有する二本鎖DNA断片を形成可能な制限酵素と、二本鎖DNAであって、ステムと、該ステムの一方のDNA鎖から一方に延び前記二本鎖DNA断片の一方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第１の相補的オーバーハングと、前記ステムの他方のDNA鎖から他方に延び前記二本鎖DNA断片の他方のオーバーハングに相補的な塩基配列を有する第２の相補的オーバーハングとを備える、環化アダプターと、を含む、キットが提供される。このキットによれば、ターゲットDNAを含む可能性のある試料DNAを制限酵素で処理して二本鎖DNA断片を調製し、さらにこの二本鎖DNA断片と環化アダプターとを環状化することができる。ターゲットDNAを含む二本鎖環状DNAは、一本鎖環状DNA鎖である第１のDNA鎖と、前記第１のDNA鎖と相補的であって、一つのギャップ（不連続部位）を有する一本鎖DNA鎖である第２のDNA鎖とを有する開環状DNAである。この二本鎖環状DNAは、RCA法及びHRCA法などによる増幅方法によって高い特異性でターゲットDNAを含む二本鎖DNA断片を増幅できる。
【００６４】
本明細書の開示のキットにおいては、二本鎖DNA断片と環化アダプターとをライゲーションするためのT4DNAリガーゼなどのDNAリガーゼを含んでいてもよい。さらに、ライゲーションにより生成した二本鎖環状DNAをRCA法により増幅するための第１のプライマー及び第２のプライマーを含んでいてもよい。第１のプライマーは、二本鎖環状DNAの第１のDNA鎖における環化アダプターに由来する塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーである。また、第２のプライマーは、第１のプライマーによって増幅される前記第１のDNA鎖の相補鎖中のターゲットDNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマーである。こうしたプライマーは、好ましくは８塩基以上２０塩基程度である。さらにまた、本明細書の開示のキットは、RCA法等にもちいるのに好ましいDNAポリメラーゼ、典型的には鎖置換型DNAポリメラーゼを含んでいてもよい。
【００６５】
（二本鎖環状DNAの調製方法等）
本明細書の開示によれば、上記の各種実施形態に基づいて、前記二本鎖DNA断片調製工程と、前記二本鎖環状DNAの調製工程と、前記増幅工程と、を備える、ターゲットDNAの増幅産物の生産方法も提供される。また、同様に、本明細書の開示によれば、前記二本鎖DNA断片調製工程と、前記二本鎖環状DNAの調製工程と、を備える二本鎖環状DNAの生産方法も提供される。この方法によれば、ターゲットDNAを含み、RCA法等に供するのに好適な二本鎖環状DNAを提供することができる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を、具体例をあげて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
（360bpのターゲットDNA（GAP4mer）の特異的な増幅）
図２に、本実施例における工程の概略を示す。以下、適宜図面を参照しながら説明する。
【００６８】
１．ターゲットDNA（増幅対象DNA）の調製
本実施例では、Plasmid pQBI T7-GFP (５１１５bp)の位置１８８２-２２４１にある３６０塩基対の配列を増幅対象、すなわち、ターゲットDNAとした。ターゲットDNAは、このプラスミドを制限酵素TspRIで切断して、約３６０塩基対で両末端に９塩基分のオーバーハングを持つ二本鎖DNA断片を得た。図２にこの二本鎖DNA断片の構造を示す。なお、制限酵素TspRIによる切断は、反応媒体（５０mM NaOAc、２０mM Tris-OAc、１０mM Mg(OAc)2、ｐＨ７．９（２５℃））中、６５℃で２時間行った。
【００６９】
２．ライゲーションによる二本鎖環状DNAの調製
２−１．アダプターの調製
アダプターは、図２に示すように、９塩基のオーバーハングと１３塩基のオーバーハングとを持つ二本鎖DNAとした。二本鎖DNAであるアダプターを形成するアダプターＳ１、アダプターＳｃの配列（配列番号１、２）は以下のとおりであった。アダプターのステムは配列解析用のユニバーサルプライマー配列（M13/pUC sequencing primer (-20)）を持っている。長さ30塩基対のアダプター（配列番号１）の５’末端にリン酸化している。アダプターを構成するDNAはそれぞれ化学合成により取得した。
アダプターS1： 5’-CAGGAAACAGCTATGACTATTCGCAGTGGG-3’（配列番号１）
アダプターSc: 5’-GTCATAGCTGTTTCCTGGTCAGTGGG-3’（配列番号２）
【００７０】
２−２．二本鎖環状DNAの調製
１．で調製したターゲットDNAを含む溶液の一部とアダプターとを、反応媒体（10 mM MgCl2、50 mM Tris-HCl、1 mM ATP、 10 mM Dithiothreitol、 pH 7.5（25℃)）中で、DNA T4 リガーゼを用いて２５℃で２時間反応させることで、４塩基のギャップを持つ二本鎖環状DNAを取得した。得られた二本鎖環状DNAの概要を図２に示す。
【００７１】
３．Phi29 DNA ポリメラーゼによるHRCA（Hyper-branched Rolling Circling Amplification）の実施
３−１．HRCA用プライマーの調製
HRCAに用いる２種類のプライマーＬ、プライマーＲの配列（配列番号３、４）は以下のとおりであった。プライマーＬは、アダプターＳｃの一部に相補的な配列を有している。また、プライマーＲは、ターゲットDNA中の特定配列に相補的な配列を有している。これらのプライマーは化学合成により取得した。プライマーＬの３’末端にPhi29 DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性で分解しないように修飾してある。
プライマーL: 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号３）
プライマーR: 5’-CATGCAAATGCTGAATG -3’（配列番号４）
【００７２】
３−２．HRCAの実施
２．で取得した二本鎖環状DNAを含む溶液の一部を、反応媒体（50 mM Tris-HCl, ｐＨ７．５（２５℃）,１０mM MgCl2, １０mM (NH4)2SO4, ４mM Dithiothreitol）中、Phi29 DNA ポリメラーゼ及びプライマーＬ，Ｒを用いて３０℃で１６時間反応させ、ＨＲＣＡを実施した。二本鎖環状DNAのギャップの３’末端からPhi29 DNA ポリメラーゼによるギャップを有するDNA鎖の伸長が開始され、ギャップ鎖の増幅の進行に伴い、プライマーＬがギャップ鎖にハイブリダイズし、ギャップを有しない非ギャップ鎖の伸張が開始され、その後、非ギャップ鎖にプライマーＲがハイブリダイズし、さらにギャップ鎖の増幅が開始されることになる。
【００７３】
なお、以上の２−２．及び３−２．のステップでは、直前の反応液の一部を精製することなくそのまま用いたが、精製することを排除するものではない。例えば、１−２．のステップを実施後に、TspRIを失活すれば感度の向上は可能である。
【００７４】
以上のように、DNAの切断、アダプターとの連結、HRCAによる増幅を行い、増幅したDNAを電気泳動により分析した。結果を、図３に示す。
【００７５】
その結果、図３（ａ）に示すように、増幅時（HRCA）濃度が0.05 pM （1μl中30000分子）という非常に低いターゲットDNA濃度においても、広い範囲の長さにわたって増幅産物を確認できた。なお、本実施例では、DNA検出方法としてエチジウムブロマイド染色で行ったが、さらに高感度のDNA検出法を使用すれば、更に低い濃度でのターゲットDNAでも増幅できる。さらに、増幅産物を再び制限酵素TspRIにより切断すると、増幅前のターゲットDNAである360 bpの断片が得られたので、ターゲットDNAのみが増幅されたことを確認できた（図５レーン０参照）。
【００７６】
さらに、図３（ｂ）に示すように、プラスミドに替えてターゲットDNAを含まないヒトゲノムDNA（制限酵素TspRI の切断部位は存在する。）を８０ｎｇ（プラスミド量（１６ｎｇ）の５倍）を加える場合は、全くDNAの増幅が確認されなかったので、本増幅方法が配列特異的であることがわかった。また、ヒトゲノムDNA（１μｇ／ｍｌ）とプラスミドとが同時に存在する場合でもDNAの増幅が確認されたので、本増幅方法が高い実用性を有することがわかった。
【実施例２】
【００７７】
（860 bpと242 bpのターゲットDNA（GAP4mer）の特異的な同時増幅）
本実施例では、実施例１で用いたPlasmid pQBI T7-GFP (5115 bp) の位置1021−1881にある861塩基対及び位置2888-3129にある242塩基対をそれぞれ増幅対象、すなわち、ターゲットDNA（２種類）とし、実施例１と同様にして、二本鎖DNAを調製した。この配列に対し、アダプターとプライマーを設計し、増幅を行った。また、861塩基対のターゲットDNAに対しては、以下の配列のアダプターとプライマーとをそれぞれ準備した（配列番号５〜８）。長さ30塩基対のアダプター（配列番号５）の５’末端にリン酸化している。すべてのプライマーの3’末端の二つのリン酸ジエステルはエキソヌクレアーゼ活性で分解しないように修飾してある。
アダプター：
5’-CAGGAAACAGCTATGACTATTCCCACTGAC-3’（配列番号５）
5’-GTCATAGCTGTTTCCTGTCCAGTGAA-3’（配列番号６）
プライマー：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号７）
5’-AAGTGGAAGCGGCGATG-3’（配列番号８）
【００７８】
242塩基対のターゲットDNAについては、以下の配列のアダプターとプライマーとをそれぞれ準備した（配列番号９〜１２）。長さ30塩基対のアダプター（配列番号９）の５’末端にリン酸化している。すべてのPrimerの3’末端の二つのリン酸ジエステルはエキソヌクレアーゼ活性で分解しないように修飾してある。
アダプター：
5’-CAGGAAACAGCTATGACTATTGTCAGTGAG-3’（配列番号９）
5’-GTCATAGCTGTTTCCTGGTCACTGGT-3’（配列番号１０）
プライマー：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１１）
5’-CACAGATGCGTAAGGAG -3’（配列番号１２）
【００７９】
これら2種類のターゲットDNAにつき、実施例１と同様にして二本鎖環状DNAを調製し、Phi29 DNA ポリメラーゼによるHRCAを実施した。結果を図４に示す。図４のレーン１は861塩基対のターゲットDNAの電気泳動結果を示し、レーン２は242塩基対のターゲットDNAの電気泳動結果を示す。
【００８０】
図４に示すように、レーン１及び２において、いずれもターゲットDNAの増幅産物が観察されることから、これら２種類のターゲットDNAが高効率に増幅されたことがわかった。また、図５のレーン１、２に示すように、増幅産物を再び制限酵素TspRIにより切断すると、増幅前のターゲットDNAである860 bpと242 bp の断片が得られたので、ターゲットDNAのみが増幅されたことを確認できた。
【実施例３】
【００８１】
（149 bp（Gap 4 mer）のターゲットDNAの特異的な増幅）
本実施例では、実施例１で用いたPlasmid pQBI T7-GFP (5115 bp) の位置3920-4068にある149塩基対をそれぞれ増幅対象、すなわち、ターゲットDNAとし、実施例１と同様にして、二本鎖DNAを調製した。この配列に対し、アダプターとプライマーを以下の通り設計し（配列番号１３〜１６）、増幅を行った。長さ30塩基対のアダプター（配列番号１３）の５’末端にリン酸化している。すべてのプライマーの3’末端の二つのリン酸ジエステルはエキソヌクレアーゼ活性で分解しないように修飾してある。
アダプター：
5’- CAGGAAACAGCTATGACTATTCTCACTGAT-3’（配列番号１３）
5’-GTCATAGCTGTTTCCTGCTCAGTGGA-3（配列番号１４）
プライマー：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１５）
5’-CTGACAGTTACCAATGC-3’（配列番号１６）
【００８２】
このターゲットDNAにつき、実施例１と同様にして二本鎖環状DNAを調製し、Phi29 DNA ポリメラーゼによるHRCAを実施した。結果を図４に併せて示す。図４のレーン３は149塩基対のターゲットDNAの電気泳動結果を示す。図４から明らかなように、レーン３で、ターゲットDNAの増幅産物が観察されることから、このターゲットDNAが高効率に増幅されたことがわかった。また、図５のレーン３に示すように、増幅産物を再び制限酵素TspRIにより切断すると、増幅前のターゲットDNAである149 bp の断片が得られたので、ターゲットDNAのみが増幅されたことを確認できた。
【実施例４】
【００８３】
（149 bp（Gap ２０mer）のターゲットDNAの特異的な増幅）
本実施例では、実施例１で用いたPlasmid pQBI T7-GFP (5115 bp) の位置3920-4068にある149塩基対をそれぞれ増幅対象、すなわち、ターゲットDNAとし、実施例１と同様にして、二本鎖DNAを調製した。この配列に対し、アダプターとプライマーを以下の通り設計し（配列番号１７〜２０）、増幅を行った。長さ46塩基対のアダプター（配列番号１７）の５’末端にリン酸化している。すべてのプライマーの3’末端の二つのリン酸ジエステルはエキソヌクレアーゼ活性で分解しないように修飾してある。
アダプター：
5’-CAGGAAACAGCTATGACTATTCTTTTTTTTTTTTTTTCTCACTGAT-3’（配列番号１７）
5’-GTCATAGCTGTTTCCTGCTCAGTGGA-3（配列番号１８）
プライマー：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号１９）
5’-CTGACAGTTACCAATGC-3’（配列番号２０）
【００８４】
このターゲットDNAにつき、実施例１と同様にして二本鎖環状DNAを調製し、Phi29 DNA ポリメラーゼによるHRCAを実施した。結果を図４に併せて示す。図４のレーン４は149塩基対のターゲットDNA（Gap 19mer）の電気泳動結果を示す。図４から明らかなように、レーン４で、ターゲットDNAの増幅産物が観察されることから、このターゲットDNAが高効率に増幅されたことがわかった。本実施例で明らかなように、１５０塩基対程度のターゲットDNAにつきギャップ１９塩基程度であっても、高効率な増幅が可能であることがわかった。
【実施例５】
【００８５】
（1525 bp（Gap 4 mer）のターゲットDNAの特異的な増幅）
本実施例では、実施例１で用いたPlasmid pQBI T7-GFP (5115 bp) の位置4548-957にある1525塩基対をそれぞれ増幅対象、すなわち、ターゲットDNAとし、実施例１と同様にして、二本鎖DNAを調製した。この配列に対し、アダプターとプライマーを以下の通り設計し（配列番号２１〜２４）、増幅を行った。長さ30塩基対のアダプター（配列番号２１）の５’末端にリン酸化している。すべてのプライマーの3’末端の二つのリン酸ジエステルはエキソヌクレアーゼ活性で分解しないように修飾してある。
アダプター：
5’-CAGGAAACAGCTATGACTATTGTCAGTGGA-3’（配列番号２１）
5’-GTCATAGCTGTTTCCTGAGCACTGCA-3’（配列番号２２）
プライマー：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’（配列番号２３）
5’-TGTGGCGGGTCTTGAAG-3’（配列番号２４）
【００８６】
このターゲットDNAにつき、実施例１と同様にして二本鎖環状DNAを調製し、Phi29 DNA ポリメラーゼによるHRCAを実施した。結果を図４に併せて示す。図４のレーン５は149塩基対のターゲットDNA（Gap 19mer）の電気泳動結果を示す。図４から明らかなように、レーン５で、ターゲットDNAの増幅産物が観察されることから、このターゲットDNAが高効率に増幅されたことがわかった。また、図５のレーン４に示すように、増幅産物を再び制限酵素TspRIにより切断すると、増幅前のターゲットDNAである1525 bp の断片が得られたので、ターゲットDNAのみが増幅されたことを確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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