(57)【要約】【課題】ＧＡＳ疾患および／または感染症にたいする免疫を付与するための新たな改良された組成物を提供する。【解決手段】本発明は、単独で使用するか、あるいは、別のＧＡＳ抗原、例えば、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７と組み合わせて使用するのに特に好適なＧＡＳ抗原、ＧＡＳ４０を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権が主張される関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号６０／４９１，８２２（２００３年７月３１日出願）および米国特許仮出願番号６０／５４１，５６５（２００４年２月３日出願）の全体を参考として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は免疫学およびワクチン学の分野に属する。特に、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）から得られた複数の抗原、および免疫化におけるそれらの使用法に関する。本明細書に引用される文書は全てその全体を参照することによって本明細書に含める。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ａ群連鎖球菌（「ＧＡＳ，」Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、ヒトに高頻度に見られる病原体で、病気の徴候を呈することなく正常なヒトの５−１５％に存在すると推定されている。一方、宿主の防御機構が危殆に瀕している場合、または、この微生物が悪性の猛威を発揮することが可能となった場合、または、この微生物が脆弱な組織または宿主に導入された場合、急性の感染症が起こる。関連疾患としては、産褥熱、しょう紅熱、丹毒、咽頭炎、インペチゴ、壊死性筋膜炎、筋炎、および連鎖球菌トキシックショック症候群が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＧＡＳは、グラム陽性、胞子非形成球形菌で、通常、細胞が、鎖状に、またはペア状に連結して現れる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは抗生物質で治療が可能ではあるが、病気の発症を阻止するための予防ワクチンが望ましい。長年月をかけてそのようなワクチンの開発へ向けて努力が傾注されている。これまで様々のＧＡＳワクチン法が提案されており、いくつかの方法は現在臨床治験段階にあるが、今日まで、一般大衆にとって利用可能なＧＡＳワクチンは無い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、ＧＡＳ疾患および／または感染症にたいする免疫を付与するための新たな改良された組成物を提供することである。この組成物は、本出願人等によって特定されたＧＡＳ毒性因子のひとつ、特にワクチンとして使用するのに好適なＧＡＳ４０を含むことが好ましい。さらに、この組成物は、２種以上の（例えば、３種以上の）ＧＡＳ抗原の組み合わせに基づく。
【０００６】
（発明の概要）
本出願人等は、免疫化に特に適しており、特に組み合わせて使用するのに適している３０種の抗原からなるＧＡＳ抗原群を発見した。さらに、本出願人等は、単独でも、または、別のＧＡＳ抗原と組み合わせて使用しても、免疫原性に特に優れるＧＡＳ抗原（ＧＡＳ４０）を特定した。
【０００７】
従って、本発明は、ＧＡＳ４０（その断片、または、それと同一の配列を持つポリペプチドを含む）を含む免疫原組成物を提供する。ＧＡＳ４０の好ましい断片は、１個以上のコイルドコイル領域を含む。本発明はさらにＧＡＳ抗原の組み合わせを含む。この組み合わせは、２から１０種のＧＡＳ抗原から成り、ＧＡＳ４０、またはその断片、または、それと同一の配列を持つポリペプチドを含む。組み合わせは、３種、４種、５種、６種、または７種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。組み合わせは、３種、４種、または５種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。
【０００８】
本発明はまた、ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む組成物を含む免疫原組成物を提供する。前記組み合わせは、第１の抗原群の２種から３１種のＧＡＳ抗原から成り、前記第１の抗原群は、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７から成る。これらの抗原を本明細書では「第１の抗原群」と呼ぶ。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３種、４種、または５種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。
【０００９】
ＧＡＳ３９、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１は、特に好ましいＧＡＳ抗原である。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７のいずれか、または両方を含むことが好ましい。組み合わせはＧＡＳ４０を含むことが好ましい。
【００１０】
上記抗原の組み合わせの内のいくつかの代表的例を下記に論じることにする。
【００１１】
ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３種のＧＡＳ抗原から成っていてもよい。これに従い、一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ１１７、および第１の抗原群から選ばれるもう一つのＧＡＳ抗原から成る。好ましい組み合わせは、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ１１７と、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１から成る群から選ばれる第３のＧＡＳ抗原を含む。
【００１２】
別の実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、第１の抗原群から選ばれるさらに２種類のＧＡＳ抗原とから成る。好ましい組み合わせとしては、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１から成る群から選ばれる２種類のＧＡＳ抗原とを含む。別の実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに２種類のＧＡＳ抗原とを含む。
【００１３】
ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる４種のＧＡＳ抗原から成っていてもよい。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに２種類のＧＡＳ抗原とから成る。好ましい組み合わせは、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ１１７、および、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１から成る群から選ばれる２種類のＧＡＳ抗原から成る。
【００１４】
別の実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、第１の抗原群から選ばれる３種類のＧＡＳ抗原とから成る。好ましい組み合わせは、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１から成る群から選ばれるさらに３種類のＧＡＳ抗原とを含む。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに３種類の抗原とから成る。
【００１５】
ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる５種のＧＡＳ抗原から成っていてもよい。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに３種類の抗原とから成る。好ましい組み合わせは、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ１１７と、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１から成る群から選ばれるさらに３種類のＧＡＳ抗原とから成る。
【００１６】
別の実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、第１の抗原群から選ばれるさらに４種類のＧＡＳ抗原とから成る。好ましい組み合わせは、ＧＡＳ４０と、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１から成る群から選ばれるさらに４種類のＧＡＳ抗原とを含む。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに４種類のＧＡＳ抗原とから成る。
【００１７】
ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる８種のＧＡＳ抗原から成ってもよい。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせはＧＡＳ４０と、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに６種のＧＡＳ抗原とから成る。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、第１の抗原群から選ばれるさらに７種のＧＡＳ抗原とから成る。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに７種類のＧＡＳ抗原とから成る。
【００１８】
ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる１０種のＧＡＳ抗原から成ってもよい。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせはＧＡＳ４０と、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに８種のＧＡＳ抗原とから成る。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０と、第１の抗原群から選ばれるさらに９種のＧＡＳ抗原とから成る。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ１１７と、第１の抗原群から選ばれるさらに９種類のＧＡＳ抗原とから成る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む免疫原組成物であって、該組み合わせは２種から１０種のＧＡＳ抗原からなり、該組み合わせは、ＧＡＳ４０を含む、組成物。
（項目２）
上記ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１からなる群から選択される１種以上のＧＡＳ抗原をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
上記ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ１１７を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
上記ＧＡＳ４０抗原は、第１のコイルドコイル領域および第２のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目５）
上記ＧＡＳ４０抗原は、第１のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目６）
上記第１のコイルドコイル領域は、配列番号１２を含むアミノ酸配列を含む、項目５に記載の組成物。
（項目７）
上記ＧＡＳ４０抗原は、第２のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、項目４に記載の組成物。
（項目８）
上記第２のコイルドコイル領域は、ロイシンジッパー領域を含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
上記第２のコイルドコイル領域は、配列番号１３を含むアミノ酸配列を含む、項目７に記載の組成物。
（項目１０）
ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む免疫原組成物であって、該組み合わせは、第１の抗原群の２種から３１種のＧＡＳ抗原からなり、該第１の抗原群は、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７からなる、免疫原組成物。
（項目１１）
上記ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ３９、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１からなる群から選択される、項目１０に記載の免疫原組成物。
（項目１２）
上記ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０およびＧＡＳ１１７を含む、項目１０に記載の免疫原組成物。
（項目１３）
上記組み合わせは、ＧＡＳ４０を含む、項目１０に記載の免疫原組成物。
（項目１４）
上記ＧＡＳ４０は、（ａ）第１のコイルドコイル領域、（ｂ）第２のコイルドコイル領域、または、（ｃ）第１のコイルドコイル領域および第２のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列から選択される、項目１０に記載の免疫原組成物。
（項目１５）
ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む融合構築体であって、該組み合わせは、第１の抗原群の２種から３１種のＧＡＳ抗原からなり、該第１の抗原群は、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７からなる、融合構築体。
（項目１６）
上記組み合わせは、ＧＡＳ４０を含む、項目１５に記載の融合構築体。
（項目１７）
上記組み合わせは、ＧＡＳ４０およびＧＡＳ１１７を含む、項目１５に記載の融合構築体。
（項目１８）
２種以上の抗体の組み合わせを含む組成物であって、該抗体は、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７に対して特異的な抗体を含む抗体に対して特異的な抗体からなる群から選択される、組成物。
（項目１９）
上記組み合わせは、ＧＡＳ４０に対して特異的な抗体を含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
上記ＧＡＳ４０特異的抗体は、ＧＡＳ４０の第１のコイルドコイル領域または第２のコイルドコイル領域に対して特異的である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
連鎖球菌感染に対して感受性である動物において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を治療的または予防的に処置するための方法であって、該方法は、治療量または予防量の項目１から２０のいずれか１項に記載の免疫原組成物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）
項目１から２０のいずれか１項に記載の免疫原組成物を製造する方法。
（項目２３）
項目１から２０のいずれか１項に記載の免疫原組成物を含む第１の成分を含むキット。
（項目２４）
ＧＡＳ４０抗原を含む組成物であって、該抗原は、第１のコイルドコイル領域または第２のコイルドコイル領域を含むアミノ酸配列を含む、組成物。
（項目２５）
上記ＧＡＳ４０抗原は、配列番号１２を含む第１のコイルドコイル領域を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
上記ＧＡＳ４０抗原は、配列番号１３を含む第２のコイルドコイル領域を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）
項目２４から２６のいずれか１項に記載の組成物に対して特異的な抗体。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＧＡＳ４０アミノ酸配列における、リーダーペプチド配列、２個のコイルドコイル配列、ロイシンジッパー配列、および膜貫通配列を特定する。
【図２】図２は、リーダーペプチド配列、２個のコイルドコイル配列、ロイシンジッパー配列、および膜貫通配列を特定するＧＡＳ４０の模式図を示すほか、既知の機能を持つか、またはその機能が予測されている他の連鎖球菌タンパクと低度の相同性しか持たないＧＡＳ４０のコイルドコイル領域を示す。
【図３−１】図３は、特定されたＧＡＳ４０のコイルドコイル領域と、他の連鎖球菌とのＢＬＡＳＴによるアラインメント分析を含む。
【図３−２】図３は、特定されたＧＡＳ４０のコイルドコイル領域と、他の連鎖球菌とのＢＬＡＳＴによるアラインメント分析を含む。
【図３−３】図３は、特定されたＧＡＳ４０のコイルドコイル領域と、他の連鎖球菌とのＢＬＡＳＴによるアラインメント分析を含む。
【図３−４】図３は、特定されたＧＡＳ４０のコイルドコイル領域と、他の連鎖球菌とのＢＬＡＳＴによるアラインメント分析を含む。
【図４−１】図４は、ＧＡＳ４０のアミノ酸配列の予測される二次構造を示す。
【図４−２】図４は、ＧＡＳ４０のアミノ酸配列の予測される二次構造を示す。
【図５−１】図５は、ＧＡＳゲノムにおけるＧＡＳ４０の位置を模式的に示す。また、ＧＡＳ４０を欠失したＧＡＳ突然変位種を示す比較用模式図を含む。これらの模式図にはさらに、ＧＡＳ４０が、トランスポゾン因子による水平転移によって獲得されたとの見通しが立つように詳細が示されている。
【図５−２】図５は、ＧＡＳゲノムにおけるＧＡＳ４０の位置を模式的に示す。また、ＧＡＳ４０を欠失したＧＡＳ突然変位種を示す比較用模式図を含む。これらの模式図にはさらに、ＧＡＳ４０が、トランスポゾン因子による水平転移によって獲得されたとの見通しが立つように詳細が示されている。
【図６】図６は、野生型株におけるＧＡＳ４０の表面露出を示す、ＦＡＣＳの比較分析を示す（ＧＡＳ４０欠失突然変異種には表面露出が無い）。
【図７−１】図７は、ＧＡＳ４０におけるオプソニン食作用のデータを示す（各種発現構築体において）。
【図７−２】図７は、ＧＡＳ４０におけるオプソニン食作用のデータを示す（各種発現構築体において）。
【図８】図８は、本発明のいくつかのＧＡＳ抗原の免疫化および抗原注入データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
上に論じたように、本発明は、ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む組成物を提供する。その組み合わせは、本出願人等が、免疫化に、特に好適であるものとして、特に組み合わせて用いた場合に好適であるものとして特定した抗原群から選択され得る。特に、本発明は、ＧＡＳ４０を含む組成物を含む。
【００２１】
第１の抗原群のＧＡＳ４０および、その他のＧＡＳ抗原を下記にさらに詳細に説明する。少なくとも３種のＧＡＳ種のゲノム配列が一般に入手可能である。Ｍ１ＧＡＳ株のゲノム配列が、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００１）９８（８）：４６５８−４６６３に報告されている。Ｍ３ＧＡＳ株のゲノム配列がＢｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９（１５）：１００７８−１００８３に報告されている。Ｍ１８ＧＡＳ株のゲノム配列がＳｍｏｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９（７）：４６６８−４６７３に報告されている。本発明のＧＡＳ抗原は、Ｍ１，Ｍ３，またはＭ１８ＧＡＳ株のポリペプチドまたはアミノ酸配列を含むことが好ましい。本発明のＧＡＳ抗原は、Ｍ１株のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むことがさらに好ましい。
【００２２】
特定されたＧＡＳ抗原の中でも、ＧＡＳ  Ｍ型およびＧＡＳ分離株の間で変動があるため、本発明に記載されているＧＡＳアミノ酸またはポリヌクレオチド配列には、それらと同一の配列を有するアミノ酸またはポリヌクレオチドが含まれていることが好ましい。好ましいアミノ酸またはポリヌクレオチド配列は、５０％またはそれ以上の同一性を有する（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）。同様に、本発明に記載されているＧＡＳアミノ酸またはポリヌクレオチド配列には、それらの配列の断片（すなわち、ＧＡＳ抗原の免疫学的特性を保持する、またはコードする断片）が含まれていることが好ましい。好ましいアミノ酸断片は、ｎが７またはそれ以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含む。好ましいポリヌクレオチド断片は、ｎが１２またはそれ以上（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である少なくともｎ個の連続するポリヌクレオチドを含む。一つの実施態様では、本発明のアミノ酸またはポリヌクレオチド断片は、他の（非ＧＡＳ）細菌由来のアミノ酸またはポリヌクレオチドとは同一ではない（例えば、当該断片は、他の連鎖球菌の配列と同一ではない）。
【００２３】
（（１）ＧＡＳ４０）
ＧＡＳ４０は、Ｍ１  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１５４５およびＧＩ：１５６７４４４９、Ｍ３  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９７３３、Ｍ１８  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５４０２に一致し、「Ｓｐｙ０２６９」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０１９７」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０２５６」（Ｍ１８）、および「ｐｒｇＡ」とも呼ばれる。ＧＡＳ４０はまた、推定表面排除タンパクとしても特定されている。Ｍ１種のＧＡＳ４０のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、下記の配列番号１および２として配列リストに記載される。
【００２４】
【化１】
2011046725.tif 000002
【００２５】
【化２】
2011046725.tif 000003
本発明に従って使用される好ましいＧＡＳ４０タンパクは、（ａ）配列番号１に対して５０％またはそれ以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１のアミノ酸において、ｎが７またはそれ以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ４０タンパクは、配列番号１の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失するか、および／または、配列番号１のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。
【００２６】
例えば、一つの実施態様では、配列番号１のＮ末端配列における下線部のアミノ酸配列（リーダー配列）は除去される（このＮ末端リーダー配列のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号３および４として配列リストに掲げられる。残りのＧＡＳ４０断片のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号５および６として配列リストに掲げられる）。
【００２７】
もう一つの例として、一つの実施態様では、配列番号１のＣ末端の下線部アミノ酸配列（膜貫通領域）は除去される（この膜貫通領域のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号７および８として配列リストに掲げられる。残りのＧＡＳ４０断片のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号９および１０として配列リストに掲げられる。
）。
【００２８】
他の断片では、タンパクの１個以上のドメインを省略してもよい（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインの省略）。
【００２９】
ＧＡＳ４０内部のドメインに関するさらに詳細な説明図が図１および２に示される。これらの図に示されるように、ＧＡＳ４０（配列番号１）のアミノ酸は、アミノ酸１−２６（例えば配列番号３）内にリーダーペプチド配列、アミノ酸５８−２６１（配列番号１２）内に第１のコイルドコイル、アミノ酸５５６−７３３（配列番号１３）内に第２のコイルドコイル、アミノ酸６７３−７０１（配列番号１４）内にロイシンジッパー領域、および、アミノ酸８５５−８６６（配列番号１１）内に膜貫通領域を含む。図１は、ＧＡＳ４０のアミノ酸配列におけるこれらの領域を示し、一方、図２は、ＧＡＳ４０タンパクの長軸に沿って上記領域を模式的に示す。
【００３０】
ＧＡＳ４０内部に特定されるコイルドコイル領域は、アルファヘリックスコイルを形成していると思われる。こうした構造は、しばしば、例えば、タンパクの異なる領域間、または、二つの別々のタンパクの領域間のオリゴマー形成相互作用に関与する。第２のコイルドコイル領域におけるロイシンジッパーモチーフは、二つのアルファヘリックスの間で特別なオリゴマー相互作用を形成できるように互いに隔てられた一連のロイシン（またはイソロイシン）アミノ酸残基を含む。ロイシンジッパーモチーフでは、繰り返し出てくるロイシン残基同士の間に６個のアミノ酸残基が挟まっていることが好ましい。ロイシンジッパーオリゴマー構造では、アルファヘリックスは、各ヘリックスの一側に配されるロイシン残基間の疎水性相互作用によって結合されていると考えられている。ロイシンジッパーモチーフは、多くの場合ダイマー形成相互作用に関与する。コイルドコイル領域内部のロイシンジッパーモチーフの位置から、ＧＡＳ４０タンパクの当該領域がオリゴマー形成相互作用におそらく関与しているらしいことが分かる。
【００３１】
図２も、ＧＡＳ４０の特定された領域には、既知または予測される二次元構造または表面配置を持つ他の連鎖球菌タンパクとの間に低い相同性しか見られない領域があることを示す。このように低レベルの相同性があるので、何か類似の二次構造、または機能が示されるかも知れない。例えば、第１のコイルドコイル領域を含むＧＡＳ４０のアミノ酸３３から３２４は、連鎖球菌表面タンパクＡ（「ＳｐＡ」）前駆体と呼ばれる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ由来のタンパクのある領域（アミノ酸１１２−３９２）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ２５９９０２７０，配列番号１５）とほぼ２２％の配列相同性を有する。このタンパクは、その連鎖球菌と、哺乳類宿主細胞膜との接着に関与する表面タンパク接着物と考えられる。このＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ  ＳｐＡは、連鎖球菌抗原Ｉ／ＩＩファミリーのタンパク接着物の一員であり、唾液アグルチニン糖タンパク（ｇｐ−３４０）およびＩ型コラーゲンを認識する。ＧＡＳ４０のアミノ酸３３から２５８も、別のＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉタンパク、連鎖球菌表面タンパクＢ前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ２５０５５２２６、配列番号１６）と低レベルの配列相同性（２３％）を示す。
【００３２】
第１のコイルドコイル領域も重複しているＧＡＳ４０の類似領域（アミノ酸４３−２３８）は、表面タンパクｐｓｐＡ前駆体と呼ばれる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパクの領域（アミノ酸４３−２３８）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ２８２３３５、配列番号１７）に対して約２３％の相同性を示す。ｐｓｐＡのアミノ末端ドメインは、連鎖球菌が十分な毒性を示すために必須であると考えられており、これに対してモノクロナール抗体を設けると、連鎖球菌感染からマウスが保護される。ｐｓｐＡドメインは、線維性タンパクに典型的な、約１：１２比の軸形のモノマー型を持つ。このモノマー分子については、配列分析から、アルファヘリックス型のコイルドコイル構造であって、螺旋の中に僅かに数個のループの継ぎ目がある構造であることが示された。
【００３３】
ＧＡＳ４０の第２のコイルドコイル領域は、免疫反応性タンパクＳｅ８９．９と呼ばれる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ由来のタンパクのある領域（アミノ酸５０９−７１７）（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ２３３０３８４，配列番号１８）（Ｓｅ８９．９の全長配列は、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｄａｎｔ．ｇｓｆ．ｄｅからも入手が可能である）とほぼ４６％の配列相同性を有する。このＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉタンパクは、表面露出性と予測されている。これらの連鎖球菌配列のそれぞれとＧＡＳ４０のＢＬＡＳＴによるアラインメント図を図３に示す。
【００３４】
さらに、ＧＡＳ４０の二次元構造の説明図を図４に示す。先ず、図４（ａ）は、ＧＡＳ４０のアミノ酸配列に対してアラインメントさせた二次構造の予測分析を示す。図４において、予測されるアルファヘリックス領域は、前述のコイルドコイル領域にほぼ一致する。図４（ｂ）において、ペアコイル予測を用いて、コイルドコイル候補の位置を予測した。この図では、第１および第２のコイルドコイル領域にほぼ対応する二つのコイルが特定される。図４（ｃ）は、ロイシンジッパー領域を取り出して示したもので、ロイシンジッパーに関与すると考えられるロイシン（またはイソロイシン）アミノ酸残基の規則的な繰り返しを示す。
【００３５】
以上から、ＧＡＳ４０の第１のコイルドコイル領域は、ＧＡＳ４０の全長配列の内Ｎ−末端側半分から選ばれる少なくとも１０個（例えば、少なくとも、１０、１３、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７０、９０、１００以上）の連続したアミノ酸残基を含み、且つ、その配列におけるアミノ酸残基の機能的特徴からアルファヘリックス複合体を形成することが予測されるアミノ酸配列を含む。配列番号１２で、ＧＡＳ４０の好ましい第１のコイルドコイル領域を示す。
【００３６】
ＧＡＳ４０の第２のコイルドコイル領域は、ＧＡＳ４０の全長配列の内Ｃ末端側半分から選ばれる少なくとも１０個（例えば、少なくとも、１０、１３、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７０、９０、１００以上）の連続したアミノ酸残基を含み且つその配列におけるアミノ酸残基の機能的特徴からアルファヘリックス複合体を形成することが予測されるアミノ酸配列を含む。第２のコイルドコイル領域はロイシンジッパーモチーフを含むことが好ましい。配列番号１３で、ＧＡＳ４０の、好ましい第２のコイルドコイル領域を示す。
【００３７】
ＧＡＳ４０のコイルドコイル領域は、ダイマーまたはトリマーのようなオリゴマーの形成に関与していると思われる。このオリゴマーは、ホモマー（オリゴマー形成に与る２個以上のＧＡＳ４０タンパクを含む）であっても、または、ヘテロマー（ＧＡＳ４０とオリゴマー形成した１個以上のさらに別のＧＡＳタンパクを含む）であってもよい。あるいは、第１のコイルドコイル領域および第２のコイルドコイル領域は、ＧＡＳ４０タンパクの内部で相互作用を持って、第１のコイルドコイル領域および第２のコイルドコイル領域の間にオリゴマー反応を形成してもよい。
【００３８】
従って、一つの実施態様において、本発明の組成物は、オリゴマーの形を取るＧＡＳ４０抗原を含む。このオリゴマーは、２個以上のＧＡＳ４０抗原またはその断片を含んでも、あるいは第２のＧＡＳ抗原とオリゴマー形成するＧＡＳ４０またはその断片を含んでもよい。好ましいＧＡＳ４０断片は、第１のコイルドコイル領域および第２のコイルドコイル領域から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む。この好ましいＧＡＳ４０断片は単独で用いてもよいし、または、本発明のように組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
本発明のＧＡＳポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、組み換え発現を促進または最適化するように操作されてもよい。例えば、Ｎ末端のリーダー配列は、タグタンパク、例えば、ポリヒスチジン（「ＨＩＳ」）、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）をコードする配列と交換してもよい。このようなタグタンパクは、発現タンパクの精製、検出、および安定化を促進するために用いることが可能である。ＧＡＳ４０に関するこのような修飾のさまざまな変種が下記に論じられる。このような修飾は、本発明の任意のＧＡＳタンパクに適用してよい。
【００４０】
ＧＳＴとＨＩＳの二つのタグを付けたＧＡＳ４０配列の例は、本明細書では「ＧＳＴ４０ＨＩＳ」と表示される。この構築体は、リーダー配列が除かれ、ＧＳＴタグコード配列がＮ末端に加えられ（例えば、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含むｐＧＥＸＮＮＨベクターを用いて）、ＨＩＳタグコード配列がＣ末端に加えられたＧＡＳ４０配列を含む。ＧＳＴタグの融合領域、ＧＡＳ４０配列、および、ＧＳＴ４０ＨＩＳのＣ末端ＨＩＳタグのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号１９と２０に示す。
【００４１】
あるいは、単一タグ配列を用いてもよい。ＨＩＳタグのみを持つＧＡＳ４０配列の例は、「４０ａ−ＨＩＳ」と表示される。この構築体は、Ｎ末端リーダー配列、および膜貫通配列を含むＣ末端が除かれたＧＡＳ４０配列を含む。この構築体では、ＨＩＳタグ配列はＣ末端に加えられる（例えば、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含むｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）のようなクローニングベクターを用いて）。４０ａ−ＨＩＳのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号２１および２２に示す。
【００４２】
精製タグの付加に加えてさらに、コード配列をより大量に増加したり、組み換え宿主に対するアクセスを向上させたりするなど最適化することによって組み換え発現をやり易くしてもよい。例えば、ポリヌクレオチド配列ＡＧＡは、アルギニンアミノ酸残基をコードするが、アルギニンは、ポリヌクレオチド配列ＣＴＧによってコードすることも可能である。このＣＴＧコドンの方が、Ｅ．ｃｏｌｉの転写酵素によって好まれる。４０ａ−ＨＩＳポリヌクレオチド配列の配列番号２１では、アルギニンをコードするＣ末端のＣＴＧがＣＧＴに置換されている。
【００４３】
次のコドン、すなわち、ＡＧＡ、ＡＧＧおよびＣＧＡは一般にＥ．ｃｏｌｉでの再現性が低い。これらのコドンが、ＧＡＳポリヌクレオチド配列の中に出現している場合、それらは、同じアミノ酸残基をコードする他の二つの代替コドンの内の一つによって置換されてもよい。
【００４４】
「４０ａ−ＲＲ−ＨＩＳ」構築体、配列番号２３および２４では、合計３個のＡＴＧコドンがＣＴＧに置換されて最適化されている。また、最適化されたコドンに下線を施した配列番号２３については下記に示す（追加のコドン最適化を除いては、４０ａ−ＲＲ−ＨＩＳは、４０ａ−ＨＩＳと同じである）。
【００４５】
【化３−１】
2011046725.tif 000004
【００４６】
【化３−２】
2011046725.tif 000005
精製タグ無しでコドン最適化を用いてもよい。構築体「４０ａ−ＲＲ−Ｎａｔ」、配列番号２５および２６はこのような例である。この構築体は、Ｎ末端のリーダー配列とＣ末端の膜貫通配列を含まず、３個のコドン最適化を含むＧＡＳ４０を含む（そしてＨＩＳタグ配列を含まない）。
【００４７】
様々な宿主細胞において、様々な培養条件下で、発現を最適化するために様々のクローニングベクターの使用が可能である。前述の構築体は、ＩＰＴＧ誘発性プロモーターを含むｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。別態様として、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現シャトルベクター、例えば、ｐＳＭ２１４ｇＮＨを用いてもよい。このベクターは、ＩＰＴＧ誘発性プロモーターの代わりに、構成的なプロモーターを使用している。このベクターを用いたＧＡＳ４０構築体の例は、「ＨＩＳ−４０ａ−ＮＨ」と表示され、その配列は配列番号２７と２８に示される。この構築体では、Ｎ−末端リーダー配列とＣ末端膜貫通配列が除かれ、ＨＩＳタグがＮ末端に加えられる。さらに別のＮ末端アミノ酸がクローニングによって導入される。さらに、おそらくＰＣＲ中に生じたものと思われる二つのヌクレオチド変化が示されるが、このどちらの変化もアミノ酸の変化をもたらさない。
【００４８】
さらに別の態様として、ｐＳＭ２１４ｇＣＨシャトルベクターを用いてもよい。このベクターを用いたＧＡＳ４０構築体の例を「ＨＩＳ−４０ａ−ＣＨ」、配列番号２９・３０と表示する。この構築体では、Ｎ−末端リーダー配列とＣ末端膜貫通配列が除かれ、ＨＩＳタグがＣ末端に加えられる。さらに二つのアミノ酸がアミノ末端に導入される。クローニングによって導入される、３個のヌクレオチド変化がＤＮＡ配列に示され、それによるアミノ酸変化が、タンパク配列に示される（アミノ酸ＦからＳ）。
【００４９】
これら別様クローニングベクターについても、コドン最適化を用いることが可能である。ＧＡＳ４０構築体「ＨＩＳ−４０ａ−ＲＲ−ＮＨ」は、３個のコドン最適化部位を含む「ＨＩＳ−４０ａ−ＮＨ」を含む。ＨＩＳ−４０ａ−ＲＲ−ＮＨの配列は、配列番号３１と３２に記載される。
【００５０】
上記から、本発明で使用されるＧＡＳ抗原は、組み換え生産を促進する発現構築体を用い、組み換え技術によって生産してもよい。発現を促進するための好ましい配列修正は、（１）精製タグ配列の付加、および（２）コドン最適化から成る群から選ばれてもよい。
【００５１】
前述したように、本出願人等は、ＧＡＳ４０は、単独であれ、併用であれ、免疫原組成物として使用するのに特に好適なものであると特定した。ＧＡＳ４０を、特に有効なＧＡＳ抗原として用いる用法は、その毒性との関連、表面局在、細菌のオプソニン食作用アッセイおよび免疫誘発実験における、その有効性によって支持される。さらに、この毒性因子がおそらく水平的に獲得されたことから、この抗原がＧＡＳに対して（他の連鎖球菌類と比べて）特異的である可能性が高い。ＧＡＳ４０の抗原特性を支持するさらに別の証拠としては、ＧＡＳ４０の二次元構造内にコイルドコイル領域が特定されること、および、これらの領域が、いくつかの接着タンパクを含めた、他の連鎖球菌の表面タンパクと低レベルの相同性を持つことが挙げられる。
【００５２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓゲノム内におけるＧＡＳ４０の位置を本出願人等が分析したところ、この毒性因子は、進化の過程で、遺伝子の水平伝播の結果ＧＡＳによって獲得されたものらしい。図５Ａは、ＧＡＳゲノム内におけるＧＡＳ４０を示す。ＧＡＳ４０は、５‘末端側では、「プリンオペロンリプレッサー」または「ｐｕｒＲ」と表示される配列の次に来る。３’末端側では、ＧＡＳ４０の次に来るのは、リボソームタンパクをコードする二つの配列、すなわち、「リボソームタンパクＳ１２」または「ｒｐｓＬ」、および「リボソームタンパクＳ７」または「ｒｐｓＧ」と表示される配列である。（これらのフランキング遺伝子のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋの公開資料から入手可能である。（ＰｕｒＲ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ：１５６７４２５０で見ることが可能である。ＲｐｓＬ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ：１５６７４２５０で見ることが可能である。ＲｐｓＧ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＧＩ：１５６７４２５０で見ることが可能である。注目すべきなのは、ｒｐｓＬ配列の起始部に二つの予想プロモーター配列があることである。図５Ｂは、ＧＡＳ４０の大部分が欠失したＧＡＳ突然変異を示す。ＧＡＳ４０配列の残った唯一の部分は、配列番号２のポリヌクレオチド１−９７に相当する。欠失には、ｒｐｓＬプロモーターの内の一つも含まれ、第２のＰ＊が無傷で残った。（模式図の下の水平矢印は、欠失領域を示す）。
【００５３】
図５Ｃは、野生型ＧＡＳ配列のさらに別の詳細を示す。この図では、「ＤＲ」と表示される直接反復配列が、ＧＡＳ４０の５’末端と、３’末端に隣接するところが示される。（ＧＡＳ４０の欠失突然変異の対応配列は、図５Ｄで特定される）。これらの直接反復配列は約８塩基対である。このような塩基対直接反復列の一例が配列番号１３６に示される。細菌ゲノムにおけるこのような配列モチーフは、多くの場合遺伝子の水平伝播を示す。インビボ感染実験から、ＧＡＳ４０欠失突然変異は、野生株よりも数ｌｏｇ分毒性が低いことが示された。（この実験の詳細は、実施例２に提供される。）
【００５４】
側面隣接する直接反復配列と、ＧＡＳ４０に関連する毒性との組み合わせは、ＧＡＳ４０配列が、進化中にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによって水平的に獲得されたものであることを示唆する。注目すべきことは、関連するｐｕｒＲおよびｒｐｓＬは、同類の連鎖球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓに存在するのに、これらの細菌のいずれもＧＡＳ４０相同体を持たないことである（図５Ｅは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌、ＧＢＳ）内におけるｐｕｒＲ、ｒｐｓＬ、およびｒｐｓＧ相同体の位置を模式的に示し、かつ、ＧＢＳ相同体と、ＧＡＳの対応相同体のパーセント相同性を示す。注目すべきなのは、ＧＢＳは、直接反復配列の内の一つしか持っていないことで、ＧＡＳ４０配列の側面隣接する直接反復配列ペアを含まないことである。）。
【００５５】
ＧＡＳ４０の表面位置は、図６に示すＦＡＣＳ図によって示される。（ＦＡＣＳ分析に関連するプロトコールに関する議論は実施例１で提示される）。図６は、野生型ＧＡＳ（ＤＳＭ２０７１と表示、ＧＡＳのＭ２３型）、欠失突然変異（ＤＳＭ２０７１△４０）の両方のＦＡＣＳ図を含む。野生型株における吸収シフトは、ＧＡＳ４０が、抗ＧＡＳ４０抗体によって細菌の表面に認識されたことを示す（ＧＡＳ４０は、欠失突然変異の表面では認識されない）。
【００５６】
ＧＡＳ４０の表面露出は、図７および実施例３に示す細菌オプソニン食作用アッセイによってさらに示される。このアッセイでは、ＧＡＳ株を、免疫前血清と免疫血清、多核球、および補体とインキュベートした。（免疫血清は、表示のＧＡＳタンパクによってマウスを免疫化して生成した）。細菌の食菌作用または増殖は対数として測定した。正のヒストグラムバーは、食作用（すなわち細胞死）を表す。負のヒストグラムバーは細胞増殖を表す。図７に示すように、各ＧＡＳ４０発現タンパクによって生成された免疫血清は、細菌の減少（正のヒストグラムバー）を招く。
【００５７】
ＧＡＳ４０による免疫化誘発実験は、実施例４において詳細に論じられる。この実施例で見られるように、各種構築体を用いて得られるＧＡＳ４０は、成獣マウスにおいて実質的な保護を与える。注目すべきことに、多くのＧＡＳ４０が、ＧＡＳ  Ｍタンパクとほぼ同程度の保護を与えることである。（ＧＡＳ  Ｍタンパクは、極めて免疫原性が高いことが知られているので比較のために用いた。しかしながら、Ｍタンパクは、一般に、適当なＧＡＳワクチン候補とは見なされていない。なぜなら、このタンパクは、ＧＡＳ株の中で大きく変動し、ヒト組織と交差反応性を持つエピトープを有する可能性があるからである。）さらに、ＧＡＳ４０のＮ末端断片もこのモデルにおいて著明な保護を与えた。このＮ末端断片は、ＧＡＳ４０のＮ末端と第１のコイルドコイル領域との重複部からの約２９２個のアミノ酸を含む。「４０Ｎ−ＨＩＳ」（配列番号３３と３４）は、このＧＡＳ４０断片の一例であり、ＧＡＳ４０のコイルドコイル領域とＣ末端ＨＩＳタグとを含む。
【００５８】
（（２）ＧＡＳ１１７）
ＧＡＳ１１７は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１６７９およびＧＩ：１５６７４５７１、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９８５２、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５５７８に対応し、また、「Ｓｐｙ０４４８」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０３１６」（Ｍ３）、および「ＳｐｙＭ１８＿０４９１」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ１１７のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号３５と３６に記載される。
【００５９】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ１１７は、（ａ）配列番号３５に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ１１７タンパクは、配列番号３５の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３５のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号３５のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号３５のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号３７は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００６０】
【化４】
2011046725.tif 000006
（（３）ＧＡＳ１３０）
ＧＡＳ１３０は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１７９４およびＧＩ：１５６７４６７７、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９９５４、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５７０４に対応し、また、「Ｓｐｙ０５９１」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０４１８」（Ｍ３）、および「ＳｐｙＭ１８＿０６６０」（Ｍ１８）とも呼ばれる。ＧＡＳ１３０は、プロテアーゼと特定される可能性がある。Ｍ１株のＧＡＳ１３０のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号３９と４０に記載される。
【００６１】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ１３０は、（ａ）配列番号３９に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号３９のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ１３０タンパクは、配列番号３９の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３９由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３９のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号３９のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００６２】
（（４）ＧＡＳ２７７）
ＧＡＳ２７７は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２９６２およびＧＩ：１５６７５７４２、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１２０６、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６８５２に対応し、また、「Ｓｐｙ１９３９」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１６７０」（Ｍ３）、および「ＳｐｙＭ１８＿２００６」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ２７７のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号４１と４２に記載される。
【００６３】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２７７は、（ａ）配列番号４１に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号４１のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２７７タンパクは、配列番号４１の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４１由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４１のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号４１のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号４１のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号４３は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号４４は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ２７７の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００６４】
【化５】
2011046725.tif 000007
（（５）ＧＡＳ２３６）
ＧＡＳ２３６は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２２６４およびＧＩ：１５６７５１０６、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０３２１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６０７５に対応し、また、「Ｓｐｙ１１２６」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０７８５」（Ｍ３）、および「ＳｐｙＭ１８＿１０８７」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ２３６のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号４５と４６に記載される。
【００６５】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２３６は、（ａ）配列番号４５に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号４５のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２３６タンパクは、配列番号４５の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４５由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４５のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号４５のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号４５のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号４７は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号４８は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ２３６の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００６６】
【化６】
2011046725.tif 000008
（（６）ＧＡＳ３８９）
ＧＡＳ３８９は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２９９６およびＧＩ：１５６７５７７２、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１２３７、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６８８４に対応し、また、「Ｓｐｙ１９８１」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１７０１」（Ｍ３）、および「ＳｐｙＭ１８＿２０４５」（Ｍ１８）および「ｒｅｌＡ」とも呼ばれる。ＧＡＳ３８９はまた、（ｐ）ｐｐＧｐｐ合成酵素と特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ３８９のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号４９と５０に記載される。
【００６７】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ３８９は、（ａ）配列番号４９に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ３８９タンパクは、配列番号４９の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４９由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４９のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号３５のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００６８】
（（７）ＧＡＳ５０４）
ＧＡＳ５０４は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２８０６およびＧＩ：１５６７５６００、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１０６１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６７０８に対応し、また、「Ｓｐｙ１７５１」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１５２５」、「ＳｐｙＭ１８＿１８２３」（Ｍ１８）および「ｆａｂＫ」とも呼ばれる。ＧＡＳ５０４はまた、予想トランス−２−エノイル−ＡＣＰ還元酵素ＩＩと特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ５０４のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号５１と５２に記載される。
【００６９】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ５０４は、（ａ）配列番号５１に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号５１のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ５０４タンパクは、配列番号５１の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５１由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５１のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号５１のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００７０】
（（８）ＧＡＳ５０９）
ＧＡＳ５０９は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２６９２およびＧＩ：１５６７５４９６、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０８９９、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６５４４に対応し、また、「Ｓｐｙ１６１８」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１３６３」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１６２７」（Ｍ１８）および「ｃｙｓＭ」とも呼ばれる。ＧＡＳ５０９はまた、予想Ｏ−アセチルセリンリアーゼと特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ５０９のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号５３と５４に記載される。
【００７１】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ５０９は、（ａ）配列番号５３に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号５３のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ５０９タンパクは、配列番号５３の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５３由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５３のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号５３のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号５３のＣ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号５５は、その除去されたＣ末端アミノ酸配列を含む。配列番号５６は、Ｃ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ５０９の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００７２】
【化７】
2011046725.tif 000009
（（９）ＧＡＳ３６６）
ＧＡＳ３６６は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２６１２、ＧＩ：１５６７５４２４およびＧＩ：３０３１５９７９、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０７１２、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６４７４に対応し、また、「Ｓｐｙ１５２５」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１１７６」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１５４２」（Ｍ１８）および「ｍｕｒＤ」とも呼ばれる。ＧＡＳ３６６はまた、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニン−Ｄ−グルタメート・リガーゼ、またはＤグルタミン酸付加酵素と特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ３６６のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号５７と５８に記載される。
【００７３】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ３６６は、（ａ）配列番号５７に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号５７のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ３６６タンパクは、配列番号５７の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５７由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５７のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号５７のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号５７のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号５９は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号６０は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ３６６の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００７４】
【化８】
2011046725.tif 000010
（（１０）ＧＡＳ１５９）
ＧＡＳ１５９は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２２４４、およびＧＩ：１５６７５０８８、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０３０３、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６０５６に対応し、また、「Ｓｐｙ１１０５」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０７６７」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１０６７」（Ｍ１８）および「ｐｏｔＤ」とも呼ばれる。ＧＡＳ１５９はまた、予想のスペルイジン／プトレシンＡＢＣ輸送体（原形質周辺輸送タンパク）と特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ１５９のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号６１と６２に記載される。
【００７５】
【化９】
2011046725.tif 000011
【００７６】
【化１０】
2011046725.tif 000012
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ１５９は、（ａ）配列番号６１に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号６１のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ１５９タンパクは、配列番号６１の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６１由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６１のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号６１のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号６１のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号６３は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号６４は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ１５９の断片を含む）。別の実施態様で、配列番号６１のＣ末端の下線を施したアミノ酸配列が除去される。（配列番号６５は、Ｃ末端の疎水性領域を含む。配列番号６６は、Ｃ末端の疎水性領域を除去したＧＡＳ１５９の断片を含む。配列番号６７は、Ｎ末端リーダー配列とＣ末端疎水性領域が除かれたＧＡＳ１５９の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００７７】
【化１１】
2011046725.tif 000013
（（１１）ＧＡＳ２１７）
ＧＡＳ２１７は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２０８９およびＧＩ：１５６７４９４５、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０１７４、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５９８７に対応し、また、「Ｓｐｙ０９２５」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０６３８」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０９８２」（Ｍ１８）とも呼ばれる。ＧＡＳ２１７はまた、予想酸化還元酵素と特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ２１７のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号６８と６９に記載される。
【００７８】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２１７は、（ａ）配列番号６８に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２１７タンパクは、配列番号６８の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６８由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６８のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号６８のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００７９】
（（１２）ＧＡＳ３０９）
ＧＡＳ３０９は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１４２６およびＧＩ：１５６７４３４１、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９６３３、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５３６３に対応し、また、「Ｓｐｙ０１２４」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿００９７」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０２０５」（Ｍ１８）、「ｎｒａ」および「ｒｏｆＡ」とも呼ばれる。ＧＡＳ３０９はまた、調整タンパクおよび陰性転写制御因子と特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ３０９のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号７０と７１に記載される。
【００８０】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ３０９は、（ａ）配列番号７０に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号７０のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ３０９タンパクは、配列番号７０の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７０由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７０のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号７０のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００８１】
（（１３）ＧＡＳ３７２）
ＧＡＳ３７２は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２６９８およびＧＩ：１５６７５５０１、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０９０５、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６５００に対応し、また、「Ｓｐｙ１６２５」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１３６９」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１６３４」（Ｍ１８）とも呼ばれる。ＧＡＳ３７２はまた、予想タンパクキナーゼ、または予想真核細胞型セリン／トレオニンキナーゼと特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ３７２のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号７２と７３に記載される。
【００８２】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ３７２は、（ａ）配列番号７２に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号７２のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ３７２タンパクは、配列番号７２の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７２由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７２のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号７２のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００８３】
（（１４）ＧＡＳ０３９）
ＧＡＳ０３９は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１５４２およびＧＩ：１５６７４４４６、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９７３０、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５３９８に対応し、また、「Ｓｐｙ０２６６」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０１９４」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０２５０」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ０３９のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号７４と７５に記載される。
【００８４】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０３９は、（ａ）配列番号７４に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号７４のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０３９タンパクは、配列番号７４の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７４由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７４のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号７４のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００８５】
（（１５）ＧＡＳ０４２）
ＧＡＳ０４２は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１５５９およびＧＩ：１５６７４４６１、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９７４５、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５４１５に対応し、また、「Ｓｐｙ０２８７」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０２０９」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０２７５」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ０４２のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号７６と７７に記載される。
【００８６】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０４２は、（ａ）配列番号７６に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号７６のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０４２タンパクは、配列番号７６の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７６由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７６のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号７６のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００８７】
（（１６）ＧＡＳ０５８）
ＧＡＳ０５８は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１６６３、ＧＩ：１５６７４５５６、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９８４１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５５６７に対応し、また、「Ｓｐｙ０４３０」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０３０５」（Ｍ３）、および「ＳｐｙＭ１８＿０４７７」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ０５８のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号７８と７９に記載される。
【００８８】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０５８は、（ａ）配列番号７８に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号７８のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０５８タンパクは、配列番号７８の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７８由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７８のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号７８のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号７８のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号８０は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号８１は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ０５８の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００８９】
【化１２】
2011046725.tif 000014
（（１７）ＧＡＳ２９０）
ＧＡＳ２９０は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２９７８およびＧＩ：１５６７５７５７、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１２２１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６８６９に対応し、また、「Ｓｐｙ１９５９」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１６８５」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿２０２６」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ２９０のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号８２と８３に記載される。
【００９０】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２９０は、（ａ）配列番号８２に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号８２のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２９０タンパクは、配列番号８２の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８２由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号８２のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号８２のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００９１】
（（１８）ＧＡＳ５１１）
ＧＡＳ５１１は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２７９８およびＧＩ：１５６７５５９２、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１０５３、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６７００に対応し、また、「Ｓｐｙ１７４３」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１５１７」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１８１５」（Ｍ１８）および「ａｃｃＡ」とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ５１１のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号８４と８５に記載される。
【００９２】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ５１１は、（ａ）配列番号８４に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号８４のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ５１１タンパクは、配列番号８４の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８４由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号８４のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号８４のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００９３】
（（１９）ＧＡＳ５３３）
ＧＡＳ５３３は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２９１２およびＧＩ：１５６７５６９６、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１１５７、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６８０４に対応し、また、「Ｓｐｙ１８７７」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１６２１」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１９４２」（Ｍ１８）および「ｇｌｎＡ」とも呼ばれる。ＧＡＳ５３３はまた、予想グルタミン合成酵素として特定される。Ｍ１株のＧＡＳ５３３のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号８６と８７に記載される。
【００９４】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ５３３は、（ａ）配列番号８６に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号８６のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ５３３タンパクは、配列番号８６の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８６由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号８６のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号８６のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００９５】
（（２０）ＧＡＳ５２７）
ＧＡＳ５２７は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２３３２、ＧＩ：１５６７５１６９、およびＧＩ：２４２１１７６４、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０３８１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６１３６に対応し、また、「Ｓｐｙ１２０４」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０８４５」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１１５５」（Ｍ１８）および「ｇｕａＡ」とも呼ばれる。ＧＡＳ５２７はまた、ＧＭＰ合成酵素（グルタメート加水分解性）（グルタメートアミドトランスフェラーゼ）として特定される。Ｍ１株のＧＡＳ５２７のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号８８と８９に記載される。
【００９６】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ５２７は、（ａ）配列番号８８に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号８８のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ５２７タンパクは、配列番号８８の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８８由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号８８のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号８８のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００９７】
（（２１）ＧＡＳ２９４）
ＧＡＳ２９４は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２３０６、ＧＩ：１５６７５１４５、およびＧＩ：２６００６７７３、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０３５７、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６１１１に対応し、また、「Ｓｐｙ１１７３」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０８２１」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１１２５」（Ｍ１８）および「ｇｉｄ」とも呼ばれる。ＧＡＳ２９４はまた、グルコース抑制区画タンパクとして特定される。Ｍ１株のＧＡＳ２９４のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号９０と９１に記載される。
【００９８】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２９４は、（ａ）配列番号９０に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号９０のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２９４タンパクは、配列番号９０の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号９０由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号９０のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号９０のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【００９９】
（（２２）ＧＡＳ２５３）
ＧＡＳ２５３は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２６１１、ＧＩ：１５６７５４２３、およびＧＩ：２１３６２７１６、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０７１１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６４７３に対応し、また、「Ｓｐｙ１５２４」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１１７５」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１５４１」（Ｍ１８）および「ｍｕｒＧ」とも呼ばれる。ＧＡＳ２５３はまた、予想ウンデカプレニル−ＰＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド−ＵＤＰＧｌｃＮＡｃＧｌｃＮＡｃ転移酵素として特定される。Ｍ１株のＧＡＳ２５３のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号９２と９３に記載される。
【０１００】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２５３は、（ａ）配列番号９２に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号９２のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２５３タンパクは、配列番号９２の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号９２由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号９２のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号９２のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１０１】
（（２３）ＧＡＳ５２９）
ＧＡＳ５２９は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２４０３、ＧＩ：１５６７５２３３、およびＧＩ：２１７５９１３２、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０４４６、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６２０３に対応し、また、「Ｓｐｙ１２８０」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０９１０」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１２２８」（Ｍ１８）および「ｇｌｍＳ」とも呼ばれる。ＧＡＳ５２９はまた、予想Ｌ−グルタミン−Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノ基転移酵素（グルコサミン−６−リン酸合成酵素）として特定される。Ｍ１株のＧＡＳ５２９のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号９４と９５に記載される。
【０１０２】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ５２９は、（ａ）配列番号９４に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号９４のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ５２９タンパクは、配列番号９４の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号９４由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号９４のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号９４のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１０３】
（（２４）ＧＡＳ０４５）
ＧＡＳ０４５は、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９７５１、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５４２１に対応し、また、「ＳｐｙＭ３＿０２１５」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿ｏｐｐＡ」（Ｍ１８）、および「ｏｐｐＡ」とも呼ばれる。ＧＡＳ０４５は、オリゴペプチドパーミアーゼとして特定される。Ｍ１株のＧＡＳ０４５のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号９６と９７に記載される。
【０１０４】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０４５は、（ａ）配列番号９６に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号９６のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０４５タンパクは、配列番号９６の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号９６由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号９６のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号９６のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号９６のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号９８は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号９９は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ４５の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１０５】
【化１３】
2011046725.tif 000015
（（２５）ＧＡＳ０９５）
ＧＡＳ０９５は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２７８７およびＧＩ：１５６７５５８２、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１０４２、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６６３４に対応し、また、「Ｓｐｙ１７３３」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１５０６」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１７４１」（Ｍ１８）とも呼ばれる。ＧＡＳ０９５はまた、予測転写調節因子としても特定される。Ｍ１株のＧＡＳ０９５のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列の例が、配列番号１００と１０１に記載される。
【０１０６】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０９５は、（ａ）配列番号１００に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１００のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０９５タンパクは、配列番号１００の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１００由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１００のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１００のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号１００のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号１０２は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号１０３は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ９５の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１０７】
【化１４】
2011046725.tif 000016
（（２６）ＧＡＳ１９３）
ＧＡＳ１９３は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２３０２９、およびＧＩ：１５６７５８０２、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１２６７、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６９１４に対応し、また、「Ｓｐｙ２０２５」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１７３１」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿２０８２」（Ｍ１８）および「ｉｓｐ」とも呼ばれる。ＧＡＳ１９３はまた、免疫原性分泌タンパク前駆物質として特定される。Ｍ１株のＧＡＳ１９３のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１０４と１０５に記載される。
【０１０８】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ１９３は、（ａ）配列番号１０４に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１０４のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ１９３タンパクは、配列番号１０４の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０４由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１０４のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１０４のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１０９】
（（２７）ＧＡＳ１３７）
ＧＡＳ１３７は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１８４２、ＧＩ：１５６７４７２０、およびＧＩ：３０１７３７４８、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９９９８、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５７４９に対応し、また、「Ｓｐｙ０６５２」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０４６２」、「ＳｐｙＭ１８＿０７１３」（Ｍ１８）とも呼ばれる。Ｍ１株のＧＡＳ１３７のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１０６と１０７に記載される。
【０１１０】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ１３７は、（ａ）配列番号１０６に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１０６のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ１３７タンパクは、配列番号１０６の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０６由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１０６のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１０６のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１１１】
（（２８）ＧＡＳ０８４）
ＧＡＳ０８４は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２３９８およびＧＩ：１５６７５２２９、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０４４２、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６１９９に対応し、また、「Ｓｐｙ１２７４」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０９０６」、「ＳｐｙＭ１８＿１２２３」（Ｍ１８）とも呼ばれる。ＧＡＳ０８４はまた、予想アミノ酸ＡＢＣ輸送体／原形質周辺アミノ酸結合タンパクと特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ０８４のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１０８と１０９に記載される。
【０１１２】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０８４は、（ａ）配列番号１０８に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１０８のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０８４タンパクは、配列番号１０８の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０８由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１０８のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１０８のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号１０８のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号１１０は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号１１１は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ８４の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１１３】
【化１５】
2011046725.tif 000017
（（２９）ＧＡＳ３８４）
ＧＡＳ３８４は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２９０８、およびＧＩ：１５６７５６９３、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１１１５４、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６８０１に対応し、また、「Ｓｐｙ１８７４」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿１６１８」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１９３９」（Ｍ１８）とも呼ばれる。ＧＡＳ３８４はまた、予想糖タンパクエンドペプチダーゼとしても特定される。Ｍ１株のＧＡＳ３８４のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１１２と１１３に記載される。
【０１１４】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ３８４は、（ａ）配列番号１１２に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１１２のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ３８４タンパクは、配列番号１１２の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１１２由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１１２のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１１２のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１１５】
（（３０）ＧＡＳ２０２）
ＧＡＳ２０２は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２２４３１、およびＧＩ：１５６７５２５８、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９１０５２７、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４６２９０に対応し、また、「Ｓｐｙ１３０９４」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０９９１」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿１３２１」（Ｍ１８）および「ｄｌｔＤ」とも呼ばれる。ＧＡＳ２０２はまた、予想の膜外タンパクとしても特定される。Ｍ１株のＧＡＳ２０２のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１１４と１１５に記載される。
【０１１６】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ２０２は、（ａ）配列番号１１４に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ２０２タンパクは、配列番号１１４の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１１４由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１１４のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１１４のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１１７】
（（３１）ＧＡＳ０５７）
ＧＡＳ０５７は、Ｍ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３６２１６５５およびＧＩ：１５６７４５４９、Ｍ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１９０９８３４、Ｍ１８、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９７４５５６０に対応し、また、「Ｓｐｙ０４１６」（Ｍ１）、「ＳｐｙＭ３＿０２９８」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０４６４」（Ｍ１８）および「ｐｒｔＳ」とも呼ばれる。ＧＡＳ０５７はまた、予想細胞エンベローププロテイナーゼと特定されている。Ｍ１株のＧＡＳ０５７のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１１６と１１７に記載される。
【０１１８】
本発明に従って用いられる好ましいＧＡＳ０５７は、（ａ）配列番号１１６に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１１６のアミノ酸において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ０５７タンパクは、配列番号１１６の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１１６由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１１６のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１１６のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。例えば、一つの実施態様では、配列番号１１６のＮ末端の下線を施したアミノ酸配列（下記に示す）が除去される。（配列番号１１８は、その除去されたＮ末端アミノ酸配列を含む。配列番号１１９は、Ｎ末端アミノ酸配列を除去したＧＡＳ５７の断片を含む）。別の実施態様で、配列番号１１６のＣ末端の下線を施したアミノ酸配列が除去される。（配列番号１２０は、Ｃ末端の疎水性領域を含む。配列番号１２１は、Ｃ末端の疎水性領域を除去したＧＡＳ５７の断片を含む。配列番号１２２は、Ｎ末端リーダー配列とＣ末端疎水性領域が除かれたＧＡＳ５７の断片を含む）。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１１９】
【化１６】
2011046725.tif 000018
前述のげっ歯類マウスモデルにおける本発明のＧＡＳ抗原による免疫化の代表的実施例を図８にまとめた。第１コラムは、実験で用いたＧＡＳ抗原を特定する。ある場合には、このリストで精製局面が参照される。また、抗原の組み換え発現を促進するために行われたポリヌクレオチド配列に対する修正が、下記の注記と共にチャートに表示される。すなわち、「ａ」は、ＮまたはＣ末端の疎水性領域が除去されたことを示す。ＲＲはコドン最適化を示す。「ＮＨ」および「ＣＨ」は、ＧＡＳ４０構築体例で示したものと同じ発現ベクターに対応する。ｐ値が与えられている場合、チャートの最下部のコントロールのＨＩＳ終止数値に基づいて計算したものである。
【０１２０】
ＧＡＳ４０によって免疫化したマウスは、チャレンジ（抗原注入）に対して実質的に生存率が改善された。１００匹を超えるマウスの集団において、ＧＡＳ４０による免疫化は、５０％を上回る生存率をもたらした。チャートに見られる他のＧＡＳ抗原もある程度の保護をもたらしたが、これは、例えば、ＧＡＳ４０と組み合わせた場合、保護が改善される可能性がある。
【０１２１】
他の既知のＧＡＳ抗原の免疫原性も、第１の抗原群の２種以上のＧＡＳと組み合わせることによって改善されると思われる。このような他の、既知のＧＡＳ抗原は、（１）１種以上のＭ表面タンパクの変種、またはそれらの断片、（２）フィブロネクチン結合タンパク、（３）連鎖球菌ヘム関連タンパク、または（４）ＳａｇＡから成る第２の抗原群を含む。これらの抗原は、本明細書では、「第２の抗原群」と呼ぶ。
【０１２２】
従って、本発明は、ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む免疫原組成物を含む。ただし、前記組み合わせは、第１の抗原群の２から３１種のＧＡＳ抗原、および、第２の抗原群の１、２、３、または４種のＧＡＳ抗原から成る。好ましくは、この組み合わせは、第１の抗原群から選ばれた、３、４、５、６、７、８、９、または１０種のＧＡＳ抗原から成る。組み合わせは、第１の抗原群から選ばれた、３、４、または５種のＧＡＳ抗原から成るのがさらに好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０およびＧＡＳ１１７のどちらか、または両方を含むのが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、Ｍ表面タンパクの１種以上の変種を含むのが好ましい。
【０１２３】
第２の抗原群の各ＧＡＳ抗原についてさらに精しく後述する。
【０１２４】
（（１）Ｍ表面タンパク）
Ｍタンパクは、コロニー形成と食作用に対する耐性と関連するＧＡＳ毒性因子である。Ｍタンパクについては、抗原特異性に基づいて、１００を超える様々なタイプの変種が特定されており、Ｍタンパクは、ＧＡＳにおける抗原性シフトおよび抗原性ドリフトの主要原因であると考えられている。Ｍタンパクも血清のフィブリノーゲンに結合し、補体の、内部のペプチドグリカンに対する結合を阻止する。この活動は、食作用を抑制することによって哺乳類宿主の内部におけるＧＡＳ生存率を高めると考えられている。
【０１２５】
不幸なことに、ＧＡＳ  Ｍタンパクは、哺乳類筋肉および結合組織のものを模倣するいくつかのエピトープを含んでいる。あるＧＡＳ  Ｍタンパクは、リューマチ発症の原因となる。なぜなら、このタンパクは、心筋に類似のエピトープを含んでいるからであり、急性感染後に自己免疫リューマチ性心臓炎（リューマチ熱）をもたらすことがある。
【０１２６】
細菌活性を増大させるが、ヒトの組織と交差反応する可能性は少ない複数のエピトープが、アミノ末端領域において特定され、これらは互いに結合して、直列に連結した約６、７、または８個のＭタンパク断片を含む融合タンパクとなっている。Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（４）：２１７１−２１７７；Ｄａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：１９３−２００；Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１４（１０）：９４４−９４８；ＷＯ０２／０９４８５１、およびＷＯ９４／０６４６５を参照されたい。（これら参考文献に記載される、Ｍタンパク変種、断片、および融合タンパクそれぞれを、特異的に、引用することにより本明細書に含める。）
以上により、本発明の組成物はさらに、ＧＡＳ  Ｍ表面タンパク、または、その断片または誘導体を含んでもよい。１種以上のＧＡＳ  Ｍ表面タンパク断片が、一つの融合タンパクの中で結合している可能性がある。別に、１種以上のＧＡＳ  Ｍ表面タンパク断片が、第１の抗原群のＧＡＳ抗原、またはその断片と組み合わせられる。ＧＡＳ  Ｍタンパクの一つの例が、配列番号１２３として配列リストに記載される。
【０１２７】
本発明において使用されるＧＡＳ  Ｍタンパクは、（ａ）配列番号１２３の既知のＭタンパクに対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１２３の既知のＭタンパクにおいて、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＧＡＳ  Ｍタンパクは、配列番号１２３の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２３のような既知のＭタンパク由来のエピトープを含む。断片は、前述の文献に記載されるものの内の一つであることが好ましい。断片は、１種以上の付加的Ｍタンパク断片と共に融合タンパクの中に構築されるのが好ましい。その他の好ましい断片は、配列番号１２３のような既知のＭタンパクのＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、該ＭタンパクのＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１２８】
（（２）フィブロネクチン結合性タンパク）
ＧＡＳフィブロネクチン結合性タンパク（「ＳｆｂＩ」）は、細菌の、宿主細胞に対する付着を仲介し、細菌の細胞への取り込みを促進し、ヒトＩｇＧのＦｃ断片に結合してＦｃ受容体介在食作用および抗体依存性細胞傷害性を妨げる、多機能細菌タンパクである。マウスのＳｆｂＩおよび「Ｈ１２断片」（ＳｆｂＩ遺伝子の位置１２４０−１８５４によってコードされる）による免疫化がＳｃｈｕｌｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：１９５８−１９６４；Ｓｃｈｕｌｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）６９（１）：６２２−６２５、および  Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９９）１７９：９０１−９０６に論じられている。ＧＡＳ  ＳｆｂＩのアミノ酸配列の一例が、配列番号１２４として配列リストに示される。
【０１２９】
本発明において使用される好ましいＳｆｂＩタンパクは、（ａ）配列番号１２４に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１２４において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳｆｂＩタンパクは、配列番号１２４の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２４由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１２４のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１２４のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１３０】
（（３）連鎖球菌ヘム関連タンパク）
ＧＡＳ連鎖球菌ヘム関連タンパク（「Ｓｈｐ」）は、ＧＡＳ細胞表面タンパクと特定されていた。これは、グラム陰性細菌におけるイオン摂取に関与するＡＢＣ輸送体の相同体をコードする遺伝子と共に転写されると考えられている。Ｓｈｐタンパクは、さらに精しく、Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｅｍｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｄｅ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ，」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（８）：４４９４−４５００に記載されている。Ｓｈｐタンパクの一つの例が、配列番号１２５として配列リストに示される。
【０１３１】
本発明において使用される好ましいＳｈｐタンパクは、（ａ）配列番号１２５に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１２５において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳｈｐタンパクは、配列番号１２５の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２５由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１２５のＣ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する、および／または、配列番号１２５のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）のアミノ酸を欠失する。他の断片は、タンパクの１個以上のドメインを欠失する（例えば、シグナルペプチド、原形質ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインの欠失）。
【０１３２】
（（４）ＳａｇＡ）
ストレプトリシンＳ（ＳＬＳ）、別名「ＳａｇＡ」は、ほとんど全てのＧＡＳコロニーで生産されると考えられている。この細胞溶解性毒素は、血液寒天の上で培養したＧＡＳのコロニーを取り巻くベータ溶血の原因となり、毒性に関連すると考えられている。完全長ＳａｇＡペプチドは、免疫原性が明らかになっていないが、アミノ酸１０−３０の断片（ＳａｇＡ１０−３０）は、中和化抗体を生産するのに使用されている。Ｄａｌｅ  ｅｔ
ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ＳａｇＡ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ，」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｃｔｙ（２００２）７０（４）：２１６６−２１７０を参照されたい。ＳａｇＡ１０−３０のアミノ酸配列を、配列番号１２６として配列リストに示す。
【０１３３】
本発明において使用される好ましいＳａｇＡ１０−３０タンパクは、（ａ）配列番号１２６に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、および／または、（ｂ）配列番号１２６において、ｎが７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０）少なくともｎ個の連続するアミノ酸から成る断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳａｇＡ１０−３０タンパクは、配列番号１２６の変種（例えば、対立遺伝子変種、相同遺伝子、オーソロガス遺伝子、パラロガス遺伝子、突然変異遺伝子）を含む。
【０１３４】
本発明の組成物中に存在してよいＧＡＳ抗原の数には上限がある。本発明の組成物におけるＧＡＳ抗原の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、または３未満である。本発明の組成物におけるＧＡＳ抗原の数は、６未満、５未満、または４未満であることがより好ましい。本発明の組成物におけるＧＡＳ抗原の数は３であることがさらに好ましい。本発明において使用されるＧＡＳ抗原は、その分子が生得的に認められる生物体から単離される、すなわち、分離された、別個のものとされることが好ましい。あるいは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に認められない場合は、他の生物学的巨大分子から十分に遊離されて、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが意図する目的のために使用が可能となることが好ましい。
【０１３５】
（融合タンパク）
本発明で使用されるＧＡＳ抗原は、組成物において、個別のポリペプチドとして存在してもよいが、それらの抗原の内の少なくとも２種類（すなわち、２、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）が、単一ポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として発現される。ハイブリッドポリペプチドによって大きな二つの利点が得られる。先ず、それ自体では、不安定だったり、十分発現しないポリペプチドは、問題を克服する適当なパートナーハイブリッドを加えることによって支援される。第二に、共に抗原的に有効な二つのポリペプチドを生産するのに、ただ１回の発現・精製工程が要求されるだけなので、商業的な製造が簡単化される。
【０１３６】
ハイブリッドポリペプチドは、第１の抗原群から選ばれた２種以上のポリペプチド配列を含む。従って、本発明は、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列を含む組成物であって、前記第１および第２アミノ酸配列は、第１の抗原群のＧＡＳ抗原、またはその断片から選ばれることを特徴とする組成物を含む。ハイブリッドポリペプチドにおける第１および第２アミノ酸配列は、異なるエピトープを含むことが好ましい。
【０１３７】
ハイブリッドポリペプチドは、第１の抗原群から選ばれる１種以上のポリペプチド配列と、第２抗源群から選ばれる１種以上のポリペプチド配列を含んでもよい。従って、本発明は、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列を含む組成物であって、前記第１アミノ酸配列は、第１の抗原群のＧＡＳ抗原またはその断片から選ばれ、前記第２アミノ酸配列は、第２の抗原群のＧＡＳ抗原またはその断片から選ばれることを特徴とする組成物を含む。ハイブリッドポリペプチド中の第１および第２アミノ酸配列は、異なるエピトープを含むことが好ましい。
【０１３８】
２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種のＧＡＳ抗原から得られたアミノ酸配列から成るハイブリッドが好ましい。特に、２、３、４、または５種のＧＡＳ抗原から得られたアミノ酸配列から成るハイブリッドが好ましい。
【０１３９】
単一処方において、様々なハイブリッドポリペプチドを混合してもよい。このような組み合わせでは、一つのＧＡＳ抗原が、一つを超えるハイブリッドポリペプチド、および／または、非ハイブリッドポリペプチド中に存在してもよい。しかしながら、抗原は、ハイブリッドか、非ハイブリッドのいずれかとして存在することが好ましく、その両方として存在するのは好ましくない。
【０１４０】
ハイブリッドペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表すことが可能である。式中、Ｘは、第１の抗原群または第２の抗原群のＧＡＳ抗原またはその断片のアミノ酸配列であり；Ｌは、要すれば任意に用いられるリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、要すれば任意に用いられるＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、要すれば任意に用いられるＣ末端アミノ酸配列であり；かつ、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
【０１４１】
−Ｘ−成分は、野生型でリーダーポリペプチド配列を持つ場合、これは、ハイブリッドタンパクでは含めてもよいし、省略してもよい。ある実施態様では、リーダーペプチドは欠失される。ただし、ハイブリッドタンパクのＮ末端に位置する−Ｘ−成分において、リーダーペプチドＸ１は保持されるが、リーダーペプチドＸ２．．．Ｘｎは省略される。これは、全てのリーダーペプチドを除去し、リーダーペプチドＸ１を成分−Ａ−として使用するというのと等価である。
【０１４２】
｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ例のそれぞれについてリンカーアミノ酸−Ｌ−はあってもなくともよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ，ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ，ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ，ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ等であってもよい。リンカーアミノ酸配列（単複）−Ｌ−は、通常は短い（例えば、２０個以下のアミノ酸、すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。実施例は、クローニングを促進する短いポリペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎを含む、ここにｎ＝２，３，４，５，６，７，８，９，１０以上）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎであって、ｎ＝３、４、５、６、７、８，９、１０以上）を含む。他の適当なリンカーアミノ酸配列は当業者には明白である。有用なリンカーはＧＳＧＧＧＧであり、ＢａｍＨＩ制限部位からＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドが形成され、これは、クローニングと操作を助ける。また、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは、典型的なポリグリシンリンカーである。
【０１４３】
−Ａ−は、要すれば任意に使用されるＮ−末端アミノ酸配列である。これは通常は短い（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。実例としては、タンパクの輸送を指令するリーダー配列、または、クローニングまたは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスジチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上）が挙げられる。他の好適なＮ末端アミノ酸配列は当業者には明白であろう。Ｘ１がそれ自身のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、Ｎ末端メチオニンを与えるオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸を持つ）であることが好ましい。
【０１４４】
−Ｂ−は、要すれば任意に使用されるＣ−末端アミノ酸配列である。これは通常は短い（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。実例としては、タンパクの輸送を指令するリーダー配列、または、クローニングまたは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスジチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上）、または、タンパクの安定を向上させる配列が挙げられる。他の好適なＣ末端アミノ酸配列は当業者には明白である。
【０１４５】
ｎは２または３であることがもっとも好ましい。
【０１４６】
本発明の融合構築体は、２種以上のＧＡＳ抗原の組み合わせを含み、前記組み合わせは、ＧＡＳ４０、または、その断片、または、それに対して同一の配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
【０１４７】
本発明の融合構築体は、ＧＡＳ抗原の組み合わせであって、前記組み合わせは、第１の抗原群に属する２から３１種のＧＡＳ抗原から成り、前記第１の抗原群は、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７から成る。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３種、４種、または５種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。
【０１４８】
ＧＡＳ３９、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ２０２、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ５３３、およびＧＡＳ５１１は、本発明の融合構築体に使用するのに特に好ましいＧＡＳ抗原である。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７のいずれか、または両方を含むことが好ましい。組み合わせはＧＡＳ４０を含むことが好ましい。
【０１４９】
本発明の融合構築体の組み換え発現は、ＧＡＳ抗原単独の発現において記載された同じ方法（前述）によって改善または最適化されてもよい。ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７の融合構築体は下記に例示される。
【０１５０】
第１実施例では、ＧＡＳ１１７は、ＧＡＳ４０ａ−ＲＲに結合される。（前述したように、ＧＡＳ４０ａ−ＲＲは、Ｎ末端リーダー配列とＣ末端膜貫通配列が除去された、コドン最適化ＧＡＳ４０配列である）。この構築体において、ＧＡＳ１１７断片（Ｎ末端リーダー配列は除去されている）は、ＧＡＳ４０配列のＮ末端に配置され、ＨＩＳタグが、ＧＡＳ４０配列のＣ末端に付加される。この構築体は、「１１７−４０ａ−ＲＲ」と表示される。この構築体のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号１２７および１２８として配列リストに示される。
【０１５１】
ＧＡＳ１１７とＧＡＳ４０配列とは、複数グリシン残基を含むリンカー配列によって結合されることが好ましい。例えば、１１７−４０ａ−ＲＲ融合構築体で使用されるリンカーはとして、配列番号１２９（ＹＡＳＧＧＧＳ）のリンカー配列が用いられる。
【０１５２】
第２実施例では、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７配列の相対的位置は交換することが可能である。この、「４０ａ−ＲＲ−１１７」と表示される構築体では、ＧＡＳ４０ａ−ＲＲ配列が、ＧＡＳ１１７のＮ末端に配置され、ＨＩＳタグは、ＧＡＳ１１７配列のＣ末端に付加される。この融合構築体のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号１３０および１３１として配列リストに示される。
【０１５３】
それとは別に、融合構築体は、コドン最適化無しに設計されてもよい。例えば、融合構築体「１１７−４０ａ」のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、配列番号１３２および１３３として配列リストに示される。（コドン最適化が用いられないので、３個の点突然変異がクローニング中に起こったらしく、その内の一つは、保存的アミノ酸変化を含んでいた（グルシンからグリシン）。げっ歯類免疫化モデルでは（前述）、「１１７−４０ａ」による免疫化は、抗原注入に対して最大８０％の生存率をもたらした。
【０１５４】
好ましいＧＡＳ４０融合配列は、１個以上のコイルドコイル領域を含むＧＡＳ４０断片である。例えば、融合構築体は、第１のコイルドコイル領域を含むＧＡＳ４０配列を含んでもよい。「１１７−４０Ｎ」が、このタイプの構築体の一例である。この構築体のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が、配列番号１３２および１３３として配列リストに示される。
【０１５５】
本発明はまた、本発明のハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、この核酸に、「高厳密度」条件下（例えば、６５℃で、０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ液において）でハイブリダイズすることが可能な核酸を提供する。
【０１５６】
本発明のＧＡＳ抗原はまた、ＧＡＳ抗原に対して特異的な抗体を調製するのに使用されてもよい。抗体は、ＧＡＳ４０の第１または第２のコイルドコイル領域に対して特異的であることが好ましい。本発明はまた、ＧＢＳ８０、ＧＡＳ１１７、ＧＡＳ１３０、ＧＡＳ２７７、ＧＡＳ２３６、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ３８９、ＧＡＳ５０４、ＧＡＳ５０９、ＧＡＳ３６６、ＧＡＳ１５９、ＧＡＳ２１７、ＧＡＳ３０９、ＧＡＳ３７２、ＧＡＳ０３９、ＧＡＳ０４２、ＧＡＳ０５８、ＧＡＳ２９０、ＧＡＳ５１１、ＧＡＳ５３３、ＧＡＳ５２７、ＧＡＳ２９４、ＧＡＳ２５３、ＧＡＳ５２９、ＧＡＳ０４５、ＧＡＳ０９５、ＧＡＳ１９３、ＧＡＳ１３７、ＧＡＳ０８４、ＧＡＳ３８４、ＧＡＳ２０２、およびＧＡＳ０５７に対して特異的な抗体から成る群から選ばれる２種以上の抗体の組み合わせの使用を含む。組み合わせは、ＧＡＳ４０、またはその断片に対して特異的な抗体を含むことが好ましい。
【０１５７】
本発明のＧＡＳ特異的抗体は、化学的または物理的手段によって、ＧＡＳポリペプヂトのエピトープに結合、または会合することが可能な１個以上の生物学的成分を含む。本発明の抗体は、ＧＡＳ抗原、好ましくはＧＡＳ８０に特異的に結合する抗体を含む。本発明は、ポリクロナールおよびモノクロナール調製物から得られた抗体を始めとして、下記のものを含む。すなわち、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９、および、米国特許第４，８１６，５６７号を参照；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子（非共有的ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ１９：４０９１−４０９６を参照）；単一鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８５：５８９７−５８８３を参照）；２量体および３量体抗体断片構築体；ミニボディー（例えば、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６；および、１９９４年９月２１日公刊英国特許公報第ＧＢ２，２７６，１６９号を参照）；および、上記抗体から得られる任意の機能的断片であって、元の抗体分子の免疫学的結合特性を保持する断片である。本発明はさらに、通例のものではない過程、例えば、ファージディスプレーによって得られる抗体を含む。
【０１５８】
本発明のＧＡＳ特異的抗体はモノクロナール抗体であることが好ましい。本発明のモノクロナール抗体は、均一な抗体集団を有する抗体組成物を含む。本発明のモノクロナール抗体は、げっ歯類ハイブリドーマを始め、げっ歯類ではなく、ヒトハイブリドーマを用いて得られるヒトモノクロナール抗体から得られてもよい。例えば、Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ７７を参照されたい。
【０１５９】
本発明のポリペプチドは、種々の方法によって（例えば、組み換え発現、細胞培養の精製、化学的合成等）、また、種々の形態において（例えば、天然、融合、非グリコシル化、脂質化等）調製することが可能である。このポリペプチドは、実質的に純粋な形で（すなわち、実質的に他のＧＡＳまたは宿主細胞タンパクを含まない状態）調製されるのが好ましい。
【０１６０】
本発明による核酸は、多くのやり方で調製することが可能であり（例えば、化学的合成、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物体そのものから等）、様々の形態を取ることが可能である（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ等）。この核酸は、実質的に純粋な形で（すなわち、実質的に他のＧＡＳまたは宿主細胞の核酸を含まない状態）調製されるのが好ましい。
【０１６１】
「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびその類縁体、例えば、修飾されたバックボーンを持つもの（例えば、フォスフォロチオエート等）、およびさらにペプチド核酸（ＰＮＡ）等を含む。本発明は、前述の核酸に対して相補的な配列も含む（例えば、アンチセンスまたはプローブ目的のもの等）。
【０１６２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生産する方法であって、本発明の核酸によって形質転換された宿主細胞を、ポリペプチド発現を誘発する条件下で培養する工程を含む方法を提供する。
【０１６３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの少なくとも一部を化学的手段によって合成する工程を含む方法を提供する。
【０１６４】
本発明はまた、本発明の核酸を生産する方法であって、プライマー使用増幅法（例えばＰＣＲ）を用いて核酸を増幅する工程を含む方法を提供する。
【０１６５】
本発明はまた、本発明の核酸を生産する方法であって、該核酸の少なくとも一部を化学的手段によって合成する工程を含む方法を提供する。
【０１６６】
（菌株）
本発明の好ましいポリペプチドは、ＧＡＳのＭ１、Ｍ３、またはＭ１８株に見られるアミノ酸配列を含む。Ｍ１  ＧＡＳ株のゲノム配列は、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ（２００１）９８（８）：４６５８−４６６３に報告されている。Ｍ３  ＧＡＳ株のゲノム配列は、Ｂｅｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ（２００２）９９（１５）：１００７８−１００８３に報告されている。Ｍ１８  ＧＡＳ株のゲノム配列は、Ｓｍｏｏｅｔ
ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ（２００２）９９（７）：４６６８−４６７３に報告されている。
【０１６７】
ハイブリッドポリペプチドを用いる場合、ハイブリッド中の個々の抗原（すなわち、個々の−Ｘ−成分）は、１種以上の株から得られたものであってもよい。ｎ＝２の場合、例えば、Ｘ２は、Ｘ１と同じ株から得られたものであってもよいし、異なる株から得られたものであってもよい。ｎ＝３の場合、株は、（ｉ）Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｉ）Ｘ１＝Ｘ２≠Ｘ３、（ｉｉｉ）Ｘ１≠Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｖ）Ｘ１≠Ｘ２≠Ｘ３、または（ｖ）Ｘ１＝Ｘ３≠Ｘ２であってもよい。
【０１６８】
（精製および組み換え体発現）
本発明のＧＡＳ抗原は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されてもよいし、例えば、異種宿主において組み換え技術によって生産されてもよい。ＧＡＳ抗原は、異種宿主を用いて調製されるのが好ましい。異種宿主は、前核性（例えば、細菌）または真核性であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉが好ましいが、他の好適な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母等が挙げられる。
【０１６９】
ポリペプリチドの組み換え生産は、ＧＡＳ抗原にタグタンパクを加えて、タグタンパクとＧＡＳ抗原を含む融合タンパクとして発現されるようにすることによって促進される。このようなタグタンパクは、発現タンパクの精製、検出、および安定性を向上させる。本発明に使用するのに好適なタグタンパクとしては、ポリアルギニンタグ（Ａｒｇ−タグ）、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン−結合タグ、セルロース−結合ドメイン、ＳＢＰ−タグ、キチン−結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ（ＧＳＴ）、マルトース−結合タンパク、転写終結抗転写因子（ＮｕｓＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシン（ＴｒｘＡ）、およびタンパクジスルフィドイソメラーゼＩ（ＤｓｂＡ）が挙げられる。好ましいタグタンパクはＨｉｓ−タグおよびＧＳＴを含む。タグタンパクの用法に関する詳細な議論をＴｅｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）６０：５２３−５３３に見ることができる。
【０１７０】
精製後、タグタンパクは要すれば任意に発現融合タンパクから取り出し、すなわち、従来技術で既知の特異的に目的に合わせた酵素処理によって取り出してもよい。一般的に使用されるプロテアーゼとしては、エンテロキナーゼ、タバコエッチュウィルス（ＴＥＶ）、トロンビン、およびＸａ因子が挙げられる。
【０１７１】
（免疫原組成物および薬剤）
本発明の組成物は免疫原組成物であることが好ましく、ワクチン組成物であることがより好ましい。組成物のｐＨは、６と８の間、約７であることが好ましい。ｐＨは、バッファーを用いて維持してもよい。組成物は、滅菌性、および／または、発熱物質フリーであってもよい。組成物は、ヒトに対して等張的であってもよい。
【０１７２】
本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防する）、治療的（すなわち、感染を治療する）のどちらであってもよいが、典型的には予防的である。従って、本発明は、連鎖球菌感染に対して感受性を持つ動物においてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの治療的または予防的処置のための方法を含み、該方法は、本発明の免疫原組成物の治療または予防有効量を前記動物に投与することを含む。免疫原組成物は、ＧＡＳ抗原の組み合わせで、第１の抗原群の２から３１種のＧＡＳ抗原から成る組み合わせを含むことが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３種、４種、または５種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７のいずれか、または両方を含むことが好ましい。
【０１７３】
別に、本発明は、ＧＡＳ抗原の組み合わせで、第１の抗原群の２から３１種のＧＡＳ抗原、および、第２の抗原群の１、２、３、または４種のＧＡＳ抗原から成る組み合わせを含む免疫原組成物を含む。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３、４、５、６、７、８、９、または１０種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３、４、または５種のＧＡＳ抗原から成ることがより好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７のいずれか、または両方を含むことが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、Ｍ表面タンパクの１種以上の変種を含むことが好ましい。
【０１７４】
本発明はまた、本発明の組成物を薬剤として提供する。この薬剤は、哺乳動物において免疫反応を誘発することが可能で（すなわち、免疫原組成物）あることが好ましく、ワクチンであることがさらに好ましい。
【０１７５】
本発明はまた、哺乳動物において免疫反応を誘発する薬剤の製造における本発明の組成物の用法を提供する。薬剤はワクチンであることが好ましい。本発明はまた、ＧＡＳ抗原の組み合わせを含む第１組成物を含むキットを提供する。一つの実施態様では、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、第１の抗原群から選ばれた２から３１種のＧＡＳ抗原の混合物から成る。組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３種、４種、または５種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。組み合わせは、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７のいずれか、または両方を含むことが好ましい。
【０１７６】
別の実施態様では、キットは、ＧＡＳ抗原の組み合わせで、第１の抗原群の２から３１種のＧＡＳ抗原、および、第２の抗原群の１、２、３、または４種のＧＡＳ抗原から成る組み合わせを含む第１成分を含む。組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のＧＡＳ抗原から成ることが好ましい。組み合わせは、第１の抗原群から選ばれる３種、４種、または５種のＧＡＳ抗原から成ることがより好ましい。好ましくは、ＧＡＳ抗原の組み合わせは、ＧＡＳ４０とＧＡＳ１１７のいずれか、または両方を含むことが好ましい。ＧＡＳ抗原の組み合わせは、Ｍ表面タンパクの１種以上の変種を含むことが好ましい。
【０１７７】
本発明はまた、本発明の免疫原組成物によってあらかじめ満たされた送達装置を提供する。
【０１７８】
本発明はまた、哺乳動物において免疫反応を惹起する方法であって、本発明の組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。免疫反応は、保護的であって、抗体、および／または、細胞性免疫を含むことが好ましい。方法はブースター反応を惹起してもよい。
【０１７９】
哺乳動物はヒトであることが好ましい。ワクチンが予防用である場合、ヒトは子供（例えば、乳児または幼児）かティーネージャーであることが好ましい。ワクチンが治療用である場合、ヒトはティーネージャーか成人であることが好ましい。子供用のワクチンは、例えば、安全性、用量、免疫原性等を評価するために成人に投与してもよい。
【０１８０】
これらの使用および方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによって引き起こされる病気（例えば、咽頭炎（例えば連鎖球菌咽喉炎）、しょう紅熱、インペチゴ、丹毒、蜂巣炎、敗血症、トキシックショック症候群、壊死性筋膜炎（筋肉侵襲病）、および続発症（例えば、リューマチ熱および急性糸球体腎炎））の予防および／または治療のためである。組成物はまた、他の連鎖球菌に対して有効であってもよい。
【０１８１】
治療処置の有効性をチェックする一つの方法は、本発明の組成物の投与後ＧＡＳ感染を監視することである。予防処置の有効性をチェックする一つの方法は、組成物の投与後本発明の組成物中のＧＡＳ抗原に対する免疫反応を監視することである。
【０１８２】
本発明の組成物は、一般に、直接患者に対して投与される。直接的送達は、非経口的注入（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または、組織の介在空間）によって、または、直腸、経口（例えば、錠剤、噴霧剤）、経膣、局所塗布、経内皮（例えば、ＷＯ９９／２７９６１を参照）、または経外皮（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４およびＷＯ０２／０６４１６２を参照）、鼻腔内（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０を参照）、眼球内、耳腔内、肺またはその他の粘膜投与によって実現される。本発明は、全身性、および／または、粘膜性免疫を誘発するのに使用してもよい。
【０１８３】
投薬処置は、単一用量スケジュール、または、複数投与スケジュールであることが可能である。複数投与は、一次免疫化スケジュールで、および／または、ブースター免疫化スケジュールで用いてもよい。複数投与スケジュールでは、異なる投与は、同じか、または異なるルートから与えてもよい、例えば、非経口的に準備投与し、粘膜にブースト投与してもよいし、粘膜に準備投与し非経口的にブースト投与してもよい。
【０１８４】
本発明の組成物は、様々の形に調製することが可能である。例えば、組成物は、注入用に、溶液または懸濁液として調製してもよい。注入の前に、液性ビヒクル中に溶液または懸濁液とするのに好適な固形も調製することが可能である（例えば、凍結乾燥組成物）。組成物は、局所投与用に、例えば、軟膏、クリーム、または粉末として調製してもよい。組成物は、経口投与用に、例えば、錠剤またはカプセル、噴霧剤として、シロップとして（要すれば任意に風味を付加して）調製してもよい。組成物は、肺投与用に、例えば、微小な粉末または噴霧を用いる吸引剤として調製してもよい。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製してもよい。組成物は、鼻腔、耳腔、または眼球投与用に、例えば、点鼻、点耳、点眼剤として調製されてもよい。組成物は、患者に投与する直前に組み合わされた組成物が再構成されるように設計されたキットの形を取ってもよい。このキットは、溶液の形の１種以上の抗原と、１種以上の凍結乾燥抗原を含んでもよい。ワクチンとして用いられる免疫原組成物は、抗原（単複）の免疫学的有効量を始め、必要に応じてその他の成分を含む。「免疫学的に有効量」とは、その量を、単独投与において、または一連の投与の一部として個人に投与した場合、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康・身体条件、年齢、処置される個体の分類学的範疇（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、個体の免疫系の抗体合成能力、所望の保護の程度、ワクチンの処方、治療する医師の医学的状況の評価、およびその他の関連因子に依存して変動する。この量は、通例の試みによって決定される比較的広範囲に広がることが予想される。
【０１８５】
（組成物のその他の成分）
本発明の組成物は、典型的には、前述の成分の他に、１種以上の「製薬学的に受容可能な担体」を含む。この担体は、それが、組成物を受け取る個体に対して有害な抗体の産生を誘発するものでない限り、どのような担体であってもよい。好適な担体は、通常、大きく、代謝されにくい巨大分子、例えば、タンパク、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）である。このような担体は当業者にはよく知られている。ワクチンはまた希釈剤、例えば、水、生食液、グリセロール等を含んでよい。さらに、補助物質、例えば、潤滑または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等が存在してもよい。製薬学的に受容可能な賦形剤に関する詳細な説明がＧｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において得られる。
【０１８６】
本発明のワクチンは、他の免疫調整剤と共同して投与してもよい。特に、組成物は通常アジュバントを含む。
【０１８７】
さらに好ましいアジュバントとしては、下記に記載するものの内から選ばれる１種以上を含むが、ただしそれらに限定されない。
【０１８８】
（Ａ．ミネラル含有組成物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なミネラル含有組成物は、ミネラルの塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩を含む。本発明は、ミネラル塩を、例えば、ヒドロキシド（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシフォスフェート、オルトフォスフェート）、硫酸塩等（例えば、ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８＆９  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ０−３０６−４４８６７−Ｘを参照）、または、異なるミネラル化合物の混合物であって、化合物は任意の適当な形（例えば、ゲル、結晶、非晶質等）で、好んで吸着される混合物を含む。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方されてもよい。ＷＯ００／２３１０５を参照されたい。
【０１８９】
（Ｂ．オイル乳剤）
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なオイル乳剤として、スクアレン水乳剤、例えばＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を、微小流体器を用いてサブミクロンの粒子にしたもの）が挙げられる。ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい。また、Ｐｏｄｄａ，「Ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ，」Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ  ａｄｕｌｔｓ，」Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７を参照されたい。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウィルス３価サブユニットワクチンのアジュバントとして用いられた。
【０１９０】
組成物において用いるのに特に好適なアジュバントは、サブミクロンの水中油滴乳剤である、本発明において用いるのに好適なサブミクロンの水中油滴乳剤は、要すれば任意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクアレン／水乳剤、例えば、４−５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５−１．０％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエート）、および／または、０．２５−１．０％Ｓｐａｎ８５（商標）（ソルビタントリオレエート）、および、要すれば任意に、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニンー２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシフォスフォリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、例えば、「ＭＦ５９」（国際公報ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４および６，４５１，３２５号、これらの全体を引用することにより本明細書に含める；およびＯｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，「ＭＦ５９―Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，」  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５５  ｐｐ．２７７−２９６）である。ＭＦ５９は、４−５％ｗ／ｖスクアレン（例えば４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（商標）、および、０．５％ｗ／ｖＳｐａｎ８５（商標）、および要すれば任意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含み、これらは、微小流体器、例えば微小流体器モデル１１０Ｙ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ、マサチューセッツ州）を用いてサブミクロンの粒子にしたものを含む。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０−５００μｇ／投与、より好ましくは０−２５０μｇ／投与、もっとも好ましくは０−１００μｇ／投与の量で存在してもよい。本明細書で用いる「ＭＦ５９−０」とは、ＭＴＰ−ＰＥを含まない前述のサブミクロン水中油滴乳剤を指し、一方、ＭＦ５９−ＭＴＰという用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、１回の投与当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。本発明で用いられるもう一つのサブミクロン水中油滴乳剤であるＭＦ６９は、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（商標）、および、０．７５％ｗ／ｖＳｐａｎ８５（商標）、および要すれば任意にＭＴＰ−ＰＥを含む。さらにもう一つのサブミクロン水中油滴乳剤で、ＳＡＦという名前でも知られるＭＦ７５は、１０％ｗ／ｖスクアレン、０．４％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、これらを微小流体器を用いてサブミクロンの粒子にしたものを含む。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰを含むＭＦ７５処方、例えば、１回の投与当たり１００−４００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む処方を示す。組成物において使用されるサブミクロンの水中油滴薬剤、その薬剤および免疫刺激性薬剤、例えば、ムラミルペプチドの製法は、国際公報ＷＯ９０／１４８３７および��国特許第６，２９９，８８４および６，４５１，３２５号に詳細に記載される。
【０１９１】
フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、およびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）も本発明のアジュバントとして使用が可能である。
【０１９２】
（Ｃ．サポニン処方）
サポニン処方も、本発明においてアジュバントとして使用してもよい。サポニンは、広範な植物種の木の皮、葉、幹、根、および場合によって花にも認められるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドから成る異種同士の群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ樹木の皮から得られるサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｌｉｓ（ソープ根）から工業的に採取されている。サポニンアジュバント処方は、精製処方、例えば、ＱＳ２１を始め、脂質処方、例えば、ＩＳＣＯＭを含む。サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＬＣ）、および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製する。これらの技術を用いて特異的な精製分画が特定された。そのような分画としては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ，および、ＱＨ−Ｃが挙げられる。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の製法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方も、ステロール、例えば、コレステロールを含んでもよい（ＷＯ９６／３３７３９を参照）。
【０１９３】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成することが可能である。ＩＳＣＯＭはまた、典型的には、リン脂質、例えば、フォスファチジルエタノールアミンまたはフォスファチジルコリンを含む。ＩＳＣＯＭにおいて任意の既知のサポニンを使用することが可能である。ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ  Ａ，ＱＨＡ、およびＱＨＣの内の１種以上を含むのが好ましい。ＩＳＣＯＭについては、ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１、およびＷＯ９６／３３７３９にさらに詳細に記載される。必要に応じて、上記ＩＳＣＯＭは追加の界面活性剤を欠いていてもよい。ＷＯ００／０７６２１を参照されたい。
【０１９４】
サポニン系アジュバントの開発の総覧が、Ｂａｒｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に見出される。さらにＳｊｏｌａｎｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８を参照されたい。
【０１９５】
（Ｃ．ウィロソームおよびウィルス様粒子（ＶＬＰ））
ウィロソームおよびウィルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明のアジュバントとして使用が可能である。これらの構造体は、一般に、ウィルスから得られた１種以上のタンパクで、要すれば任意にリン脂質と組み合わされた、または処方されたタンパクを含む。この構造体は、一般に、非病原的で、非複製的で、一般に、天然のウィルスゲノムを全く含まない。ウィルスタンパクは、組み換え的に生産されるか、または、全体ウィルスから単離される。ウィロソームまたはＶＬＰに用いるのに好適なウィルスタンパクは、インフルエンザウィルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウィルス（例えば、コアまたはカプシドタンパク）、Ｅ型肝炎ウィルス、麻疹ウィルス、シンドビスウィルス、ロタウィルス、口蹄疫ウィルス、レトロウィルス、ノーウォークウィルス、ヒトパピローマウィルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパクｐ１）から得られるタンパクである。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１、および、Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０にさらに詳細に記載される。ウィロソームについては、さらに、例えば、Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０−Ｂ１６に論じられている。
【０１９６】
（Ｄ．細菌または微生物誘導体）
本発明において使用するのに好適なアジュバントは、細菌性、または微生物性誘導体、例えば、下記を含む。
【０１９７】
（（１）腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体）
このような誘導体としては、モノフォスフォリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５、または６本のアシル化鎖を持つ３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノフォスフォリル脂質Ａの混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノフォスフォリル脂質Ａの好ましい「小型粒子」が、ＥＰ０６８９４５４に開示されている。このような「小型粒子」の３ｄＭＰＬは、十分に小型で、０．２２ミクロン膜でろ過して滅菌可能である（ＥＰ０６８９４５４参照）。その他の、非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノフォスフォリル脂質Ａ模擬体、例えば、アミノアルキルグルコサミドリン酸誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ９：２２７３−２２７８を参照されたい。
【０１９８】
（（２）脂質Ａ誘導体）
脂質Ａ誘導体は、大腸菌から得られた脂質Ａの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４を含む。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１およびＰａｊａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０１９９】
（（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
本発明のアジュバントして好適に使用される免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンが後ろに続く非メチル化シトシンを含み、リン酸結合で結ばれる配列）を含む核酸配列が挙げられる。パリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含む、細菌の２本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが判明している。
【０２００】
ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾体／類縁体、例えば、フォスフォロチオエート修飾体を含むことが可能で、２本鎖であっても、１本鎖であってもよい。要すれば任意に、グアノシンは、類縁体、例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによって置換されてもよい。同様の、可能な置換体の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７およびＷＯ９９／６２９２３を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント作用についてはさらにＫｒｉｅｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号；および米国特許第６，４２９，１９９号に論じられている。
【０２０１】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴに向けられてもよい。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ３）；６５４−６５８を参照されたい。ＣｐＧ配列は、例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫反応を誘発することに特異的であってもよいし、例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮのように、Ｂ細胞反応を誘発するのに特異的であってもよい。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮについては、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５、およびＷＯ０１／９５９３５に論じられている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。
【０２０２】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が、受容体認識のために接近可能となるように構築されることが好ましい。要すれば任意にその３’末端に２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が付着して「イムノマー」を形成してもよい。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ３）；６５４−６５８；Ｂｈａｇａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１、およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０２０３】
（（４）ＡＤＰ−リボシル化毒素、およびその無毒化誘導体）
細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素、およびその無毒化誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いてもよい。タンパクは、大腸菌由来のもの（すなわち、大腸菌の熱に弱い腸内毒素「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）、または、百日咳菌（「ＰＴ」）から得られたものであることが好ましい。無毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素を粘膜性アジュバントとして用いることが、ＷＯ９５／１７２１１に記載され、非経口アジュバントとして用いることがＷＯ９８／４２３７５に記載されている。アジュバントは無毒化ＬＴ突然変異、例えば、ＬＴ−Ｋ６３であることが好ましい。
【０２０４】
（Ｅ．ヒト免疫修飾因子）
本発明においてアジュバントとして使用が好適なヒト免疫修飾因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。
【０２０５】
（Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤）
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明のアジュバントとして使用することが可能である。適当な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸微小球（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）、粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドン、ポリサッカリド、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。キトサンとその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして使用が可能である。例えば、ＷＯ９９／２７９６０。
【０２０６】
（Ｇ．微粒子）
微粒子も、本発明におけるアジュバントとして使用してよい。微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍから約１５０μｍ、より好ましくは約２００ｎｍから約３０μｍ、もっとも好ましくは約５００ｎｍから約１０μｍ）で、生体分解性で無毒な材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシルブチル酸、ポリオルソエステル、ポリアンヒドリド、ポロカプロラクトン等）から形成されるが、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）によるものが好ましく、要すれば任意に、陰性荷電された表面を持つように（例えば、ＳＤＳにより）、または、陽性荷電された表面を持つように（例えば、陽イオン性界面活性剤、例えば、ＣＴＡＢにより）処理される。
【０２０７】
（Ｈ．リポソーム）
アジュバントとして使用するのに好適なリポソーム処方の例が、米国特許第６，０９０，４０６号、米国特許第５，９１６，５８８号、およびＥＰ０６２６１６９に記載される。
【０２０８】
（Ｉ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方）
本発明に使用するのに好適なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテル、およびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。ＷＯ９９／５２５４９。この処方はさらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）を始め、少なくとも一つ追加の、非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル、またはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）を含む。
【０２０９】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、下記の群から選ばれる。すなわち、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルである。
【０２１０】
（Ｊ．ポリフォスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方については、Ａｎｄｒｉａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１−３）：１０９−１１５、およびＰａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ，」Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に記載される。
【０２１１】
（Ｋ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとして好適に使用されるムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシフォスフォリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０２１２】
（Ｌ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして好適に使用されるイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモッドおよびその相同体が挙げられる。これらについては、Ｓｔａｎｌｅｙ，「Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１−５７７、およびＪｏｎｅｓ，「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ，」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８にさらに詳細に記載される。
【０２１３】
本発明は、上に特定したアジュバントの内の一つ以上の局面の組み合わせを含んでもよい。例えば、下記のアジュバント組成物を本発明で用いてもよい：
（１）サポニン、および、水中油滴乳剤（ＷＯ９９／１１２４１）
（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３参照）；
（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意に＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油滴乳剤（欧州特許出願０８３５３１８、０７３５８９８、および０７６１２３１）；
（６）ＳＡＦで、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、これらを微小流体処理してサブミクロン乳剤にしたもの、または、渦流攪拌して比較的大きな粒子径の乳剤にしたもの；
（７）Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）で、２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および、モノフォスフォリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および、細胞壁骨格（ＣＷＳ）、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））から成る群から選ばれる、１種以上の細胞壁成分を含むアジュバントシステム；
（８）１種以上のミネラル塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）；
（９）１種以上のミネラル塩（例えば、アルミニウム塩）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０２１４】
非経口投与には、アルミニウム塩とＭＦ５９が好ましいアジュバントである。好ましい粘膜アジュバントは、突然変異細菌毒素である。
【０２１５】
組成物は抗生物質を含んでもよい。
【０２１６】
（追加抗原）
本発明の組成物はさらに、１種以上の、追加の非ＧＡＳ抗原であって、追加の細菌性、ウィルス性、または、寄生生物性抗原を含む抗原を含んでもよい。
【０２１７】
一つの実施態様では、本発明のＧＡＳ抗原混合物は、小児用ワクチンとして好適に使用されるために、１種以上の、追加の、非ＧＡＳ抗原と組み合わせられてもよい。例えば、ＧＡＳ抗原混合物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｔｅｔａｎｕｓ、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、ＲＳウィルス（「ＲＳＶ」），ポリオ、ハシカ、おたふく風邪、風疹、およびロタウィルスから成る群から選ばれる細菌またはウィルスから得られる１種以上の抗原と組み合わされてもよい。
【０２１８】
別の実施態様では、本発明のＧＡＳ抗原混合物は、高齢者または免疫不全者を保護するように設計されたワクチンに好適に使用される１種以上の追加の、非ＧＡＳ抗原と組み合わせられてもよい。例えば、ＧＡＳ抗原混合物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｅｎｕｍｏｎｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、インフルエンザ、および、パラインフエンザウィルス（「ＰＩＶ」）から成る群から選ばれる細菌またはウィルスから得られる１種以上の抗原と組み合わされてもよい。
【０２１９】
サッカリドまたは炭水化物抗原を用いる場合、抗原は、免疫原性を高めるために担体タンパクに接合されることが好ましい（例えば、Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｌａｎｃｅｔ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ１７Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ２８−３６；Ｂｕｔｔｅｒｙ  ＆  Ｍｏｘｏｎ（２０００）Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃａｎｓ  Ｌｏｎｄ３４：１６３−１６８；Ａｈｍａｄ  ＆  Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ１３：１１３−１３３，ｖｉｉ．Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５６３−５６７；欧州特許第０４７７５０８号；米国特許第５，３０６，４９２号；ＷＯ９８／４２７２１；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ｅｄｓ．Ｃｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）ＩＳＢＮ３８０５５４９３２６、特にｖｏｌ．１０：４８−１１４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８または０１２３４２３３５Ｘ）。好ましい担体タンパクは、細菌毒素またはトキソイド、例えば、ジフテリアまたは破傷風トキソイドである。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドは特に好ましい（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，４５３０７７（Ｊａｎ  ２００２）。その他の担体タンパクとしては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外部膜タンパク（ＥＰ−Ａ−０３７２５０１）、合成ペプチド（ＥＰ−Ａ−０３７８８８１とＥＰ−Ａ−０４２７３４７）、熱ショックタンパク（ＷＯ９３／１７７１２とＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク（ＷＯ９８／５８６６８とＥＰ−Ａ−０４７１１７７）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ由来タンパクＤ（ＷＯ００／５６３６０）、サイトカイン（ＷＯ９１／０１１４６）、リンフォカイン、ホルモン、増殖因子、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから得たトキシンＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、鉄吸収タンパク（ＷＯ０１／７２３３７）等が挙げられる。混合物が、血清グループＡ・Ｃ両方からのカプセル（被膜）のサッカリドを含む場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比（ｗ／ｗ）は１よりも大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）であることが好ましい。同じまたは異なるタイプの担体タンパクに様々のサッカリドを接合することが可能である。必要に応じて適当なリンカーが存在する限り、適当であればどのような接合反応を用いてもよい。
【０２２０】
毒性タンパク抗原は、要すれば、例えば、化学的および／または遺伝学的手段によって百日咳毒素が無毒化されるように、無毒化されてもよい。
【０２２１】
ジフテリア抗原が組成物の中に含められる場合、破傷風抗原と百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原が組成物の中に含められる場合、ジフテリア抗原と百日咳抗原も含めることが好ましい。百日咳抗原が組成物の中に含められる場合、ジフテリア抗原と破傷風抗原も含めることが好ましい。
【０２２２】
組成物における抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、抗原の濃度は、その抗原に対して免疫反応を誘発するのに十分なものである。
【０２２３】
本発明の組成物中にタンパク抗原を用いるやり方の別法として、抗原をコードする核酸を用いてもよい（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｄａｌｇｌｅｉｃｈ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ９：４７１−４８０；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２：４４１−４４７；Ｉｌａｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １：１１６−１２０；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：７２３−７３２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｐｅｒｔｎｅｒ（２０００）Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５：１−７４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６２（４Ｐｔ２）：Ｓ１９０−Ｓ１９３；Ｄａｖｉｓ（１９９９）Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．６６：８４−９０）。本発明の組成物のタンパク成分は、そのタンパクをコードする核酸（ＤＮＡで、例えば、プラスミドの形で）によって置換されてもよい。
【０２２４】
（定義）
「含む」という用語は、「包含する」を始め、「から成る」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物とは、Ｘだけを含んでもよいし、その他の何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでもよい。
【０２２５】
数値ｘに関する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２２６】
二つのアミノ酸配列の間の配列同一性パーセントに関して言及のある場合、それは、それらを軸揃え（アラインメント）した場合、二つの配列を比較した時に同じであるアミノ酸のパーセントである。このアラインメントと相同性または配列同一性パーセントは、従来技術で既知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）の７．７．１８節に記載されるものを用いて確定することが可能である。好ましいアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性探索アルゴリスムによって定められる。このアルゴリスムは、ギャップ開放ペナルティー１２、ギャップ拡張ペナルティー２とし、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスによるアフィンギャップサーチを用いる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性探索プログラムは、Ｓｍｉｔｈ  ＆
Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９に開示されている。同様の配列同一性法を用いて、二つのポリヌクレオチド配列の間の相同性を定めることが可能である。
【０２２７】
下記の実施例は、本発明の組み換えＧＡＳ抗原を調製し、その効力をげっ歯類モデルにおいて試験する一つのやり方を例示するものである。
【実施例】
【０２２８】
（実施例１：本発明の組み換えＧＡＳ抗原の調製と、げっ歯類モデルにおける効力の証明）
第１の抗原群の２種以上のＧＡＳ抗原に対応する組み換えＧＡＳタンパクは下記のように発現される。
【０２２９】
（１．大腸菌発現用ＧＡＳ抗原のクローニング）
選択されたＧＡＳ抗原は、異なる２種類の組み換えタンパクが得られるようにクローンされた。すなわち、（１）カルボキシ末端に６ヒスチジンタグを持つタンパク（Ｇａｓ−Ｈｉｓ）、（２）カルボキシ末端に６ヒスチジンタグ、アミノ末端にＧｓｔを持つタンパク（Ｇｓｔ−Ｇａｓ−Ｈｉｓ）である。（１）型タンパクは、ｐＥＴ２１ｂ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎから入手）にクローンすることによって獲得した。（２）型タンパクは、ｐＧＥＸ−ＮＮＨベクターにクローンすることによって獲得した。このクローニング戦略によって、ＧＡＳゲノムＤＮＡを用いて、選択された遺伝子をＰＣＲによって増幅し、こもＰＣＲ産物の単一酵素消化を実行し、次に、消化産物を両ベクターにおいて同時にクローンすることが可能となった。
【０２３０】
（（ａ）ｐＧＥＸ−ＮＮＨ発現ベクターの構築）
ＤＮＡ合成器ＡＢＩ３９４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から入手した試薬を用いて２カップルの相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。等モルのオリゴペア（各オリゴにつき５０ｎｇ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中で、最終容量５０μｌとして１０分アニールさせ、放置してゆっくりと室温に冷却させた。後述の処理工程によって下記のＤＮＡリンカーが得られる。
【０２３１】
【化１７】
2011046725.tif 000019
プラスミドｐＧＥＸ−ＫＧ（Ｋ．Ｌ．Ｇｕａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄｉｘｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２，２６２（１９９１））をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、１００ｎｇを、２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてリンカー／プラスミドのモル比３：１にて１６℃でリンカーｇｅｘＮＮにライゲートした。ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５に形質転換した後、適正なリンカーを持つｐＧＥＸ−ＮＮプラスミドを含むクローンを、制限酵素分析とＤＮＡ配列決定によって選択した。
【０２３２】
この新規プラスミドｐＧＥＸ−ＮＮをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、リンカーｇｅｘＮＮＨにライゲートした。ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５に形質転換した後、適正なリンカーを持つｐＧＥＸ−ＮＮプラスミドを含むクローンを、制限酵素分析とＤＮＡ配列決定によって選択した。
【０２３３】
（（ｂ）染色体ＤＮＡの調製）
ＧＡＳ  ＳＦ３７０を、ＯＤ６００が０．６−０．８となるまでＴＨＹ培養液にて増殖させ、次に、細菌を遠心し、ライソザイム（１０ｍｇ／ｍｌ）およびムタノリシン（１０Ｕ／μｌ）を含むＴＥＳバッファーに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。細菌懸濁液をＲＮアーゼ、プロテイナーゼＫおよび１０％サルコシル／ＥＤＴＡで処理した後、飽和フェノールおよびフェノール／クロロフォルムによるタンパク抽出を行う。得られた上清を、酢酸ナトリウム／エタノールで沈殿させ、抽出ＤＮＡを遠心にてペレット状とし、Ｔｒｉｓバッファーに懸濁し、−２０℃に保存する。
【０２３４】
（（ｃ）オリゴヌクレオチド設計）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓＳＦ３７０  Ｍ１株の配列を用いて各ＧＡＳ抗原のコード配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。予測されたリーダー配列の直ぐ下流において５’末端増幅プライマー配列を導出することによって、予測されたシグナルペプチドは全て除去した。多くのＧＡＳ抗原において、プライマーの５’尾部は（下記の表１参照）、唯一つの制限酵素認識部位（遺伝子自身の制限パターンに応じてＮｄｅＩ、またはＮｈｅＩ、またはＳｐｅＩ）しか含んでいない。３’プライマー尾部（表１参照）は、ＸｈｏＩ、またはＮｏｔＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む。
【０２３５】
【化１８】
2011046725.tif 000020
（表１：選択されたＧＡＳ抗原をコードする遺伝子を増幅するために使用されたプライマーのオリゴヌクレオチド尾部）
プライマーは、制限酵素認識部位を含むだけでなく、増幅される配列にハイブリダイズするヌクレオチドも含んでいる。ハイブリダイズするヌクレオチドの数は、従来記載されている通りに確定することが可能なプライマーの融解温度に依存する（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３，３７４６−５０（１９８６））。選択されたオリゴの平均融解温度は、ハイブリダイズ領域のみでは５０−５５℃で、全体オリゴでは６５−７５℃である。オリゴは、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓ．ｐ．Ａ．（フィレンツェ、イタリー）から購入した。
【０２３６】
（（ｄ）ＰＣＲ増幅）
標準的ＰＣＲプロトコールは下記の通り。５０ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として用い、各プライマー０．２μＭ、各ｄＮＴＰ２００μＭ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｘＰＣＲバッファーマイナスＭｇ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、および、２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）と混ぜ最終容量を１００μｌとする。各サンプルには２ステップ増幅を行う。最初の５サイクルは、制限酵素尾部を除いたオリゴのハイブリダイゼーション温度で行い、次の２５サイクルは、プライマー全長のハイブリダイゼーション温度に従って行う。標準サイクルは下記の通り。
１サイクル
変性：９４℃、２分
５サイクル
変性：９４℃、３０秒
ハイブリダイゼーション：５１℃、５０秒
伸長：７２℃、１分または２分および４０秒
２５サイクル
変性：９４℃、３０秒
ハイブリダイゼーション：７０℃、５０秒
伸長：７２℃、１分または２分および４０秒
７２℃、７分
４℃。
【０２３７】
２０００ｂｐよりも短いＯＲＦによってコードされるＧＡＳ抗原に対する伸長時間は１分であり、２０００ｂｐよりも長いＯＲＦに対しては４０秒である。増幅は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。
【０２３８】
増幅結果をチェックするために、各ＰＣＲ産物４μｌを１−１．５アガロースゲルに負荷し、増幅断片のサイズを、ＤＮＡ分子量標準（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）と比較した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに負荷し、電気泳動後、目的サイズのバンドをゲルから切り出した。ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、メーカーの指示に従ってアガロースからＤＮＡを精製した。ＤＮＡの最終溶出容量は５０μｌ  ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）である。各精製ＤＮＡの１μｌをアガロースゲルに負荷し、その産物を評価した。
【０２３９】
（（ｅ）ＰＣＲ断片の消化）
精製ＰＣＲ産物１〜２μｇを、３７℃で一晩適当な制限酵素（各酵素６０単位）で、１００μｌの最終容量において適当な制限バッファーを用いて二重消化した。制限酵素および消化バッファーは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒから入手した。消化したＤＮＡの精製（ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）と３０μｌ  ＴＥによる溶出後、１μｌをアガロース電気泳動し、産物を同時泳動の分子量標準（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ，Ｒｏｃｈｅ）と比較して評価した。
【０２４０】
（（ｆ）クローニングベクター（ｐＥＴ２１ｂ＋およびｐＧＥＸ−ＮＮＨ）の消化）
１０μｇのプラスミドを、適当なバッファーの存在下に４００μｌの反応液において各制限酵素１００単位によって３７℃で一晩インキュベートすることによって、二重消化した。１％アガロースで電気泳動後、消化されたベクターに対応するバンドを、ＱｉａｇｅｎのＱｉａｅｘＩＩゲル抽出キットを用いて精製し、ＤＮＡを５０μｌのＴＥで溶出した。ＤＮＡ濃度を、サンプルのＯＤ２６０を測定することによって評価した。
【０２４１】
（（ｇ）ＰＣＲ産物のクローニング）
７５ｎｇの適当に消化され精製されたベクターと、選択された各ＧＡＳ抗原に対応する消化され精製された断片とが、断片／ベクターのモル比１：１を含む最終容量１０−２０μｌにおいて、４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、メーカーの支給するバッファーの存在下にライゲートされた。反応は１６℃にて一晩インキュベートした。
【０２４２】
大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）および大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）の電気反応性細胞の形質転換は、それぞれ、ｐＧＥＸ−ＮＨＨ連結体およびｐＥＴ２１ｂ＋連結体を用いて実行する。形質転換過程は次の通り。１−２μｌのライゲーション反応液を５０μｌの氷冷コンピテント細胞と混ぜ、次に細胞を、遺伝子パルサーの０．１ｃｍ電極キュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に注いだ。メーカーの指示に従ってマイクロパルサー電気穿孔機（Ｂｉｏｒａｄ）において細胞にパルス電流を流した後、細胞を、０．９５ｍｌのＳＯＣ培養液に懸濁し、振盪しながら３７℃で４５分インキュベートした。細胞懸濁液の１００および９００μｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンの寒天ＬＢの別々のプレートに撒き、このプレートを３７℃で一晩インキュベートする。形質転換細胞のスクリーニングはＰＣＲで行う。ランダムに選択した形質転換細胞を取り上げ、ＰＣＲバッファー、４ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、および、適当な順行および逆行オリゴヌクレオチドプライマーを含む３０μｌのＰＣＲ反応混合液に懸濁させた。上記プライマーは、ｐＥＴ２１ｂ＋またはｐＧＥＸ−ＮＮＨベクターのポリリンカーから上流および下流に向かってハイブリダイズ可能なものである。３０サイクルのＰＣＲ後、５μｌの産物を、期待のＰＣＲバンドが得られる陽性クローンを選択するために、アガロースゲル電気泳導分析を行った。ＰＣＲ陽性クローンは、適当な分子量マーカー（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ，Ｒｏｃｈｅ）との比較による評価に従って、ＰＣＲ産物の適正サイズに基づいて選択された。
【０２４３】
（２．タンパク発現）
ＰＣＲ陽性クローンを、３ｍｌＬＢ  １００μｇ／ｍｌアンピシリンに接種し、３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養体の７０μｌを、２ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種し、ｐＥＴクローンのＯＤ６００が０．４−０．８値になるまで、または、ｐＧＥＸクローンのＯＤ６００が０．８−１値になるまで、３７℃で増殖させた。次に、タンパクの発現を、このミニ培養体に１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄチオ−ガラクト−ピラノシド）を加えることによって誘発する。３７℃で３時間インキュベートした後、最終ＯＤ６００をチェックし、培養物を氷上にて冷却する。０．５ｍｌの培養体の遠心後、細胞ペレットを、５０μｌのタンパク負荷サンプルバッファー（６０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５％ｗ／ｖＳＤＳ、１０％ｖ／ｖグリセリン、０．１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、１００ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、１００℃で５分インキュベートする。０．１ＯＤ６００培養体に対応する煮沸サンプルの一容量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマッシーブルー染色によって、誘発されたタンパクバンドの存在を確認した。
【０２４４】
（３．組み換えタンパクの精製）
単一コロニーを、２５ｍｌＬＢ  １００μｇ／ｍｌアンピシリンに接種し、３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養体のを、５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種し、ＯＤ６００が０．４−０．７値になるまで、振盪しながら２５℃で増殖させた。次に、タンパクの発現を、この培養体に１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることによって誘発する。２５℃で３．５時間インキュベートした後、最終ＯＤ６００をチェックし、培養物を氷上にて冷却する。６０００ｒｐｍの遠心後（ＪＡ１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）、細胞ペレットを精製のために処理するか、または−２０℃で凍結した。
【０２４５】
（（ａ）大腸菌から、可溶性Ｈｉｓタグ標識タンパクを精製するための工程）
（１）ペレットを−２０℃から氷浴に移し、１０ｍｌの、５０ｍＭＮａＨＰＯ４バッファー、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０にて再構成し、４０−５０ｍｌの遠心チューブに移し、下記の概説の通りに細胞を破壊する
（２）細胞を、直列洗浄下３回通過させながらフレンチプレスにて破壊する
（３）約３０−４００００ｇにて１５−２０分遠心。ローターＪＡ２５．５０（２１０００ｒｐｍ、１５分）またはＪＡ−２０（１８０００ｒｐｍ、１５分）を使用
（４）ポリプレップカラムを、５０ｍＭリン酸バッファー、３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０を含む１ｍｌの高速キレートセファロース樹脂で平衡させる
（５）遠心ペレットを−２０℃で保存し、上清をカラムに負荷する
（６）流出物を収集する
（７）カラムを、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４ｍｌ）の５０ｍＭリン酸バッファー、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄する
（８）再び、１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、５０ｍＭリン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄する
（９）カラムに結合したタンパクを、４．５ｍｌ（１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ）の２５０ｍＭイミダゾールバッファー、５０ｍＭリン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で溶出し、それぞれ約１．５ｍｌの３種の対応分画を収集する。各チューブに、１５μｌのＤＴＴ２００ｍＭ（最終濃度２ｍＭ）を加える
（１０）最初の２分画のタンパク濃度をブラッドフォード法にて測定し、各サンプルから１０μｇ分液を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析する（注意：サンプルを希釈しすぎた場合、２１μｌ＋７μｌの負荷バッファーを負荷する）
（１１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待ちながら、収集分画を＋４℃で保存する
（１２）免疫化のために、それぞれ１００μｇを０．５ｍｌの４０％グリセロールに溶解させた４−５分液を調製する。希釈バッファーは、前述の溶出バッファー、プラス２ｍＭ  ＤＤＴである。分液を免疫化まで−２０℃で保存する。
【０２４６】
（（ｂ）封入体からのＨｉｓタグ標識タンパクの精製）
精製は事実上下記のプロトコールに従って行った：
（１）５００ｍｌ培養体から、細菌を遠心にて収集する。要すれば、細菌ペレットは−２０℃で保存する。抽出後、各細菌ペレットを１０ｍｌの５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５バッファーに氷浴にて再懸濁する
（２）再懸濁細菌を、フレンチプレスにて２回通過を行わせながら破壊する
（３）３５０００ｘｇで１５分遠心し、ペレットを収集する。ＢｅｃｋｍａｎローターＪＡ２５．５０（２１０００ｒｐｍ、１５分）またはＪＡ−２０（１８０００ｒｐｍ、１５分）を使用する
（４）遠心ペレットを５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）−フォスフィン塩酸、Ｐｉｅｒｃｅ）、６Ｍ塩化グアニジン、ｐＨ８．５に溶解する。マグネットバーにて約１０分攪拌する
（５）前述のように遠心し、上清を収集する
（６）ニッチェルで飽和させた高速キレートセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌを含む、十分な数のポリプレップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを、メーカーの指示に従って調製する。カラムを、５ｍｌのＨ２Ｏで２度洗浄し、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、６Ｍ塩化グアニジン、ｐＨ８．５で平衡させる
（７）工程（５）の上清をカラムに負荷し、５ｍｌの５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、６Ｍ尿素、ｐＨ８．５で洗浄する
（８）カラムを、１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ８．５で洗浄し、最初の５ｍｌを場合によってコントロールとして使用するために脇にどけておく
（９）カラムに結合したタンパクを、４．５ｍｌの２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ８．５で溶出する。３個の１．５ｍｌ分液に溶出バッファーを加え、３種の対応分画を収集する。各分画に、１５μｌのＤＴＴ２００ｍＭ（最終濃度２ｍＭ）を加える
（１０）溶出されたタンパク濃度をブラッドフォード法にて測定し、約１０μｇのタンパク分液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析する
（１１）タンパクを、４０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．３ｍＭ  ＴＣＥＰ，８３．３ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．５に溶解させて−２０℃で保存する。
【０２４７】
（（ｃ）大腸菌から、ＧＳＴ−融合タンパクを精製するための工程）
（１）細菌ペレットを−２０℃から氷浴に移し、７．５ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に懸濁し、そこに、プロテアーゼ阻害剤の混合物（ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，バッファー２５ｍｌ毎に１錠）を加える
（２）４０−５０ｍｌの遠心管に移し、下記の工程に従って超音波処理する
ａ．プローブを、チューブの底から約０．５ｃｍの所に配置する
ｂ．チューブをクランプで塞ぐ
ｃ．チューブを氷浴に浸す
ｄ．超音波装置を下記のようにセットする。タイマー−＞保持、仕事サイクル−＞５５、出力コントロール−＞６
ｅ．１分間１０パルス５サイクルを実行（すなわち、１サイクル＝１０パルス＋約４５’’保持；ｂ．１０パルス＋約４５’’保持；ｃ．１０パルス＋約４５’’保持；ｄ．１０パルス＋約４５’’保持；ｅ．１０パルス＋約４５’’保持）
（３）３０−４００００ｘｇで１５−２０分遠心する。例えば、ＢｅｃｋｍａｎローターＪＡ２５．５０を２１０００ｒｐｍ、１５分使用する
（４）遠心ペレットを−２０℃で保存し、上清を下記のようにクロマトグラフィーカラムに負荷する
（５）ポリプレップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを、０．５ｍｌ（約１ｍｌ懸濁液）のグルタチオン−セファロース４Ｂ樹脂で平衡させ、２ｍｌ（１＋１）Ｈ２Ｏで洗浄し、次に、１０ｍｌ（２＋４＋４）ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄する
（６）上清をカラムに負荷し、流出液は廃棄する
（７）カラムを１０ｍｌ（２＋４＋４）ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄する
（８）カラムに結合したタンパクを、４．５ｍｌの５０ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー、１０ｍＭ還元グルタチオン、ｐＨ８．０にて溶出し、１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌを加え、それぞれ約１．５ｍｌの３種の分画を収集する
（９）最初の２分画のタンパク濃度をブラッドフォード法にて測定し、各サンプルから１０μｇタンパク分液を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析する（注意：サンプルを希釈しすぎた場合、２１μｌ＋７μｌの負荷バッファーを負荷する）
（１０）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待ちながら、収集分画を＋４℃で保存する
（１１）免疫化のために使用が予定されている各タンパクについて、それぞれ１００μｇを０．５ｍｌの４０％グリセロールに溶解させた４−５分液を調製する。希釈バッファーは、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、２ｍＭ  ＤＤＴ、ｐＨ８．０である。分液を免疫化まで−２０℃で保存する。
【０２４８】
（４．ＧＡＳ感染から保護されるげっ歯類モデル）
（（ａ）免疫化プロトコール）
６から７週齢の１０匹のＣＤ１雌マウスから成る群を、２種類以上の、本発明のＧＡＳ抗原で免疫化する（適当な溶液１００μｌ中に懸濁させた、各組み換えＧＡＳ抗原２０μｇ）。各群に対して０、２１、および４５日目に３回投与する。免疫化は、第１回目投与では、タンパクを、等量のフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）と共に、続く２回の投与では、等量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）と共に腹腔内注入することによって行った。各免疫化スキームにおいて、陰性および陽性コントロール群を使用する。
【０２４９】
陰性コントロール群では、マウスを、大腸菌株の全細菌抽出物の処理後に精製カラムから溶出した大腸菌タンパクであって、ｐＥＴ２１ｂベクターか、ｐＧＥＸ−ＮＮＨベクターか（従ってＧＳＴのみを発現している）のどちらかを含んでいるが、クローンされたＧＡＳ  ＯＲＦを含まない大腸菌タンパクによって免疫化する（グループはそれぞれＨｉｓストップまたはＧＳＴストップと表示する）。
【０２５０】
陽性コントロール群では、マウスを、ＧＡＳ  ＳＦ３７０またはＧＡＳ  ＤＳＭ２０７１株のどちらかからクローンされた精製ＧＡＳ  Ｍによって免疫化する（グループはそれぞれ１９２ＳＦおよび１９２ＤＳＭと表示する）。
【０２５１】
各群からプールされた血清を、第１回免疫化の前に、最後の免疫化の２週後に採取する。マウスには約１週後ＧＡＳに感染させる。
【０２５２】
免疫化されたマウスに、選択されたタンパクのクローニングに用いられたものとは異なるＧＡＳ株を用いて感染させる。例えば、ＧＡＳ株は、ドイツ微生物・細胞培養保存収集施設（ＤＳＭＺ）から入手可能なＤＳＭ２０７１Ｍ２３型であってもよい。
【０２５３】
感染実験のために、ＤＳＭ２０７１を、ＯＤ６０００．４となるまで、３７℃でＴＨＹ液体培地で増殖させる。細菌を遠心にてペレット状にし、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、１ｍｌ当たり適当濃度の細菌を得、腹腔内注入によってマウスに投与する。細菌懸濁液の分液を、５個のＴＨＹプレートに撒いて定量した結果から、各マウスに５０から１００個の細菌が投与された。動物を毎日観察し、生存率をチェックする。
【０２５４】
（５．免疫血清の分析）
（（ａ）ＧＡＳ全体タンパク抽出物の調製）
全体タンパク抽出物は、細菌培養体を、ＯＤ６０００．４−０．５となるまで、Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ｐＨ６．８／ムタノリシン（２０単位／ｍｌ）中に３７℃で２時間培養し、次いで、０．２４Ｎ  ＮａＯＨおよび０．９６％β−メルカプトエタノールにおいて氷上で１０分インキュベートする。抽出されたタンパクは、トリクロロ酢酸の添加によって沈殿させ、氷冷アセトンで洗浄し、タンパク負荷バッファーに懸濁する。
【０２５５】
（（ｂ）ウェスタンブロット分析）
ＳＤＳ負荷バッファー（１ｘ：６０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５％ｗ／ｖＳＤＳ、１０％ｖ／ｖグリセリン、０．１％ブロモフェノールブルー、１００ｍＭ  ＤＤＴ）と混合し、９５℃で５分煮沸した全体タンパク抽出物の分液を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレカストゲル（Ｂｉｏｒａｄ）に負荷した。ゲルを、２５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２．５ｍＭグリシン、および０．１％ＳＤＳを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ操作バッファーを用いて移動させる。ゲルを、２００ｍＡで６０分ニトロセルロース膜に電気ブロットする。膜を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）、１０％スクムミルク粉末で６０分でブロックし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％スクムミルク粉末と、血清の適当な希釈液と共に、４℃でインキュベートする。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した後、膜を、１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ接合抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と２時間インキュベートする。このニトロセルロースを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで１０分間で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏｒａｄ）によって現像する。
【０２５６】
（（ｃ）パラフォルムアルデヒド処理ＧＡＳ培養体の調製）
ＯＤ６０００．４−０．５となるまで増殖させた細菌培養体をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ／０．０５％パラフォルムアルデヒド中で４倍に濃縮する。振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした後、処理培養体を４℃で一晩置き、次に、細菌の完全な不活性化を、分液をＴＨＹ血液寒天プレートに撒くことによってコントロールする。
【０２５７】
（（ｄ）パラフォルムアルデヒド処理ＧＡＳ培養体のマウス免疫血清によるＦＡＣＳ分析）
約１０５個のパラフォルムアルデヒド不活性化細菌を、９６ウェルＵ型底プレートにおいて２００μｌのＰＢＳにて洗浄し、４℃で１０分３０００ｇで遠心する。上清は捨て、細菌を２０μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに懸濁する。ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで希釈した、免疫前、または免疫血清のどちらか８０μｌを、最終希釈度が１：１００、１：２５０、または１：５００のいずれかとなるように細菌懸濁液に加え、氷上で３０分インキュベートする。細菌を、１００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡを加えることによって１回洗浄し、４℃で１０分３０００ｇで遠心し、２００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに懸濁し、再び遠心し、１０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ溶液に最終的に１：１００に希釈されるように懸濁する。この抗体は、Ｆ（ａｂ’）２断片、特異的−Ｒ−フィコエリスリン−接合（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，カタログ番号１１５−１１６−０７２）である。この懸濁液を暗所にて氷上で３０分インキュベートする。細菌を１８０μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡを加えて１回洗浄し、４℃で１０分３０００ｇで遠心する。上清は捨て、細菌は、２００μｌのＰＢＳに懸濁する。細菌懸濁液を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州、米国）の細胞計測チェンバー中を通過させて、１０，０００件のデータを得る。データは、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州、米国）を用い、細菌シグナルに対して形態的ドットプロットを引くことによって（前方および側方散乱パラメータを用いて）分析する。次に、ヒストグラムプロットを、細菌の形態領域を想起しながら、蛍光の対数スケールのＦＬ２強度について作成する。
【０２５８】
（実施例２：野生型ＧＡＳ株（ＧＡＳ４０を含む）とＧＡＳ４０欠失突然変異の毒性の比較）
下記の例は、野生型ＧＡＳ株とＧＡＳ４０欠失突然変異の間の毒性の比較を示す。ＧＡＳ４０の大部分が除去されたＧＡＳ突然変異株を標準的方法で調製した。１群当たり１０匹のマウスから成る、いくつかの免疫化群に対し、野生ＧＡＳ株か、突然変異ＧＡＳ株かのいずれかを注入した。下記に示すように、ある濃度範囲の野生型分離株の注入は、マウスの致死をもたらすが、ＧＡＳ△４０突然変異株の注入は致死的ではない。
【０２５９】
【化１９】
2011046725.tif 000021
（実施例３：ＧＡＳ４０構築体の、細菌オプソニン食作用アッセイ）
下記の例は、細菌オプソニン食作用アッセイを用いてＧＡＳ４０の表面露出を証明する。下記のＧＡＳ構築体をアッセイに用いた。なお、それぞれについては上に詳細に記述してある。すなわち、４０ａ−ＣＨ、４０ａ−ＲＲ−ＮＨ、４０ａ−ＲＲ、ＧＳＴ−４０、４０ａ、４０ａと４０ａ−ＮＨである。（図７において「４０ａ」について２度の言及があるが、これらは、異なる日に調製された血清を指す）。
【０２６０】
アッセイは下記のように実行された。
【０２６１】
（１．細菌接種体の調製）
ＧＡＳ細菌をＴＨＹ培養液において、中央対数期（ＯＤ６０００．４）に達するまで３７℃で増殖させる。細菌を、寒冷生食液にて２回洗浄し、ＨＢＳＳ培養液に懸濁する。その際、各株について、使用する細菌の量に応じて容量を調節する。細菌細胞は、使用するまで氷上に維持する。
【０２６２】
（２．ＰＭＮの調製）
ＰＭＮは、健康な志願者のヘパリン添加血液のバフィーコートから調製する。バフィーコートを、デキストラン、ＮａＣｌおよびヘパリン（１：１比）を含む溶液に３０分インキュベートする。インキュベーション後、白血球の豊富な上清を取り出し、清潔なチューブに移し、７００ｇで２０分遠心する。水による短い洗浄を行い赤血球を破壊し、次にＮａＣｌ溶液を加え、適当な塩濃度を回復する。この工程後、細胞を遠心し、適当な濃度でＭＥＭに懸濁する。
【０２６３】
（３．オプソニン食作用アッセイ）
ＧＡＳ株（前述のように調製）を、表示のＧＡＳ抗原（または、コントロールの場合免疫前のもの）による免疫化から得られた、熱不活性化免疫マウス血清、ヒトＰＭＮ、および仔ウサギ補体とインキュベートする。３７℃で１時間のインキュベーション。インキュベーション直前・直後に採取したサンプルをＴＨＹ血液寒天プレートに接種する。食作用は、免疫前血清および免疫血清について、二つの時点におけるコロニー数の差を比較することによって評価する。データは、ｔ＝０時における成長コロニー数の対数−ｔ＝６０時における成長コロニー数の対数で表す。
【０２６４】
アッセイの結果を図７に示す。Ｙ軸は、０時点におけるコロニー数の対数と、６０秒後におけるコロニー数の対数との差を表す：ｌｏｇ（ＣＦＵ＠Ｔ０）−ｌｏｇ（ＣＦＵ＠Ｔ６０’）。増殖がある場合（すなわち、細菌が積極的に殺されなかった場合）、負数（負のバー）が得られる。細菌が殺される場合、正数（正のヒストグラムバー）が得られる。図７に示すように、各ＧＡＳ構築体については、正のヒストグラムバーが記録される。図７の最後の４本の黄色バーは、コントロールを表す。すなわち、Ｂ＝細菌のみ、Ｂ  ＰＭＮ＝細菌＋多形核球、ＢＣ＝細菌＋補体、Ｐ  ＰＭＮ  Ｃ＝細菌＋多形核球＋補体（血清無し）。
【０２６５】
（実施例４：保護に関するげっ歯類マウスモデルにおけるＧＡＳ４０免疫化チャレンジ実験）
ＧＡＳ４０抗原を用いて行った、多数のげっ歯類マウスモデル実験から得られた生存率結果の見本を下記に掲げる。注記は、組み換えＧＡＳ４０抗原を発現するのに用いられた構築体において、発現を促進するためにどこを修飾したかを示す。
【０２６６】
【化２０】
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本発明は、例示のためにのみ説明されたものであること、また、本発明の範囲および精神の中に留まりながら修正が可能であることが理解されよう。
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
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【数３１】
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【数３２】
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【数３３】
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【数３４】
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【数３５】
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【数３６】
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【数３７】
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【数３８】
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【図１】
2011046725.tif 000061
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
2011046725.tif 000068
【図５−１】
2011046725.tif 000069
【図５−２】
2011046725.tif 000070
【図６】
2011046725.tif 000071
【図７−１】
2011046725.tif 000072
【図７−２】
2011046725.tif 000073
【図８】
2011046725.tif 000074
【配列表】
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