(57)【要約】【課題】ゲルを形成するための容器に異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填する工程を有するゲル分離媒体の形成法において、二種類のゲル間の界面が乱れることなく水平となり、しかもゲルの形成が簡便かつ再現性よく行えるゲル分離媒体の形成法を提供する。【解決手段】ゲルを形成するための容器３に、異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填し、二つのゲル間の界面を水平に形成するゲル分離媒体の形成法であって、一種類目のゲル前駆溶液を該容器３に充填した後に、ゲル前駆溶液を構成する溶媒よりも低い沸点を有する溶媒を重層したのち、二種類目のゲル前駆溶液を充填するゲル分離媒体の形成法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルを形成するための容器に、異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填し、二つのゲル間の界面を水平に形成するゲル分離媒体の形成法であって、
一種類目のゲル前駆溶液を該容器に充填した後に、ゲル前駆溶液を構成する溶媒よりも低い沸点を有する溶媒を重層したのち、二種類目のゲル前駆溶液を充填することを特徴とするゲル分離媒体の形成法。
【請求項２】
前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒の沸点が、前記一種類目のゲル前駆溶液を構成する溶媒よりも３０℃以上低いことを特徴とする請求項１に記載のゲル分離媒体の形成法。
【請求項３】
前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒の沸点が７０℃以下であることを特徴とする請求項１に記載のゲル分離媒体の形成法。
【請求項４】
前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒が疎水性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のゲル分離媒体の形成法。
【請求項５】
前記二種類目のゲル前駆溶液の充填の前に、前記溶媒が気化されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のゲル分離媒体の形成法。
【請求項６】
前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に重層される溶媒が、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-ヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタンおよび2,2-ジメチルブタンからなる群から選択された少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のゲル分離媒体の形成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はゲル分離媒体の形成法に関し、例えば、タンパク質分離のための二次元電気泳動に用いる電気泳動用ゲル分離媒体の形成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトが終了した現在では、タンパク質のプロファイリングの研究が盛んに行われている。またそのような研究の分野だけでなく医療などの分野からも、患者のタンパク質の分析から知見を得ることによる、より適切な診断技術が要求されている。
【０００３】
タンパク質を分離するための方法として現在最も有力であるのが二次元電気泳動による分離である。個々のタンパク質が持っている電荷、分子量という二つの性質による分離方法を組み合わせたものである。
【０００４】
タンパク質を分子量により分離する方法として最も多く用いられているものはSDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)と呼ばれ、架橋構造をもったアクリルアミドポリマーによる水性ゲル中に、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)処理により電荷を帯びたタンパク質を導入し、電気泳動させるものである。この際ポリアクリルアミドが架橋構造を有することから分子ふるいとしての効果を持ち、タンパク質は分子量ごとに分離される。
【０００５】
SDS-PAGEにおける分離媒体は一般的に、タンパク質の電気泳動に適した硬度および分子ふるい効果を持たせたポリアクリルアミド水性ゲルからなるゲル(以下「分離ゲル」と称する)と、分離ゲルよりも低濃度のポリアクリルアミド水性ゲルからなるゲル(以下「濃縮ゲル」と称する)との二つで構成されている。この二つのゲルは接触しており、タンパク質は最初に濃縮ゲルに導入され、濃縮ゲルを通った後に分離ゲルに導入される。この際正確な分離を行うにはこの二つのゲルの界面が水平に形成されていることが重要である。
【０００６】
この時用いられるポリアクリルアミド水性ゲルは、アクリルアミドモノマーとＮ,Ｎ'-メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）のような架橋剤、トリスヒドロキシメチルアミノエタン-HCl水溶液などの緩衝溶液、水の混合物に過硫酸アンモニウム、Ｎ,Ｎ,Ｎ'，Ｎ'‐テトラメチルエチレンジアミンのようなラジカル重合開始剤を導入して得られる溶液(ゲル前駆溶液と称する)を、ゲル形成容器に充填し、重合の進行でゲル化させることにより作製される。
【０００７】
このようなポリアクリルアミド水性ゲルによるタンパク質の分離の方法が、臨床の現場などに普及していくためには、再現性や作業の煩雑さの観点から、分析者が利用しやすいカセット状の形成物にあらかじめゲルが形成されているプレキャストゲルカセットなどが再現性よく安価に作成されることが望まれる。
【０００８】
通常SDS-PAGEにおける分離媒体の形成法は、ゲル形成のための容器に分離ゲル前駆体を充填した後その上に、たとえば水を重層溶媒として重層し、重層した水の存在下でゲルを形成させ、その後重層溶媒を取り除き濃縮ゲル前駆溶液を充填すると言った方法(非特許文献１)である。この場合の水の役割はゲル界面を水平に形成し、ラジカル重合を阻害する酸素の接触を防ぐものである。
【０００９】
しかしながら上記の方法で作製したゲルは分離ゲルと濃縮ゲルの界面が好ましい状態で形成されるものの、濃縮ゲル前駆溶液を充填する前に重層した水をカセットを傾けたりスポイトで吸い出すなどして取り除く必要があるために、工程が煩雑であり、また界面を乱さないよう慎重な操作が必要とされる。また重合が進行し十分にゲル化するまでは、重層した水を除去することができず次の工程に進むことができない。こうした問題は自動化が難しく工業的な大量生産を考えた場合不利である。
【００１０】
また分離ゲル前駆溶液を充填した後に、ゲル形成を待たずに濃縮ゲル前駆溶液を充填する方法も考えられる。その場合はゲル作製に要する時間は短くすむものの、分離ゲルと濃縮ゲルの界面の乱れ、混ざりが生じることが予想される。これらのことは大量生産時における生産性、再現性の問題点として懸念される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】タンパク質実験ハンドブック、羊土社、２００３年８月１５日発行、ｐ５８−５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
よって本発明における課題は、ゲルを形成するための容器に異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填する工程を有するゲル分離媒体の形成法において、二種類のゲル間の界面が乱れることなく水平となり、しかもゲルの形成が簡便かつ再現性よく行えるゲル分離媒体の形成法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
請求項１に記載の発明は、ゲルを形成するための容器に、異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填し、二つのゲル間の界面を水平に形成するゲル分離媒体の形成法であって、
一種類目のゲル前駆溶液を該容器に充填した後に、ゲル前駆溶液を構成する溶媒よりも低い沸点を有する溶媒を重層したのち、二種類目のゲル前駆溶液を充填することを特徴とするゲル分離媒体の形成法である。
請求項２に記載の発明は、前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒の沸点が、前記一種類目のゲル前駆溶液を構成する溶媒の沸点よりも３０℃以上低いことを特徴とする請求項１に記載のゲル分離媒体の形成法である。
請求項３に記載の発明は、前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒の沸点が７０℃以下であることを特徴とする請求項１に記載のゲル分離媒体の形成法である。
請求項４に記載の発明は、前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒が疎水性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のゲル分離媒体の形成法である。
請求項５に記載の発明は、前記二種類目のゲル前駆溶液の充填の前に、前記溶媒が気化されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のゲル分離媒体の形成法である。
請求項６に記載の発明は、前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に重層される溶媒が、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-ヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタンおよび2,2-ジメチルブタンからなる群から選択された少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のゲル分離媒体の形成法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のゲル分離媒体の形成法は、一種類目のゲル前駆溶液を該容器に充填した後に、ゲル前駆溶液を構成する溶媒よりも低い沸点を有する溶媒を重層したのち、二種類目のゲル前駆溶液を充填することを特徴としているので、重層した溶媒が気化することでゲル形成のための容器から除去され、従来の水の重層とは異なり特別な重層溶媒の除去作業を行うことなく簡便なゲル作成が可能となる。従って工業的な大量生産を容易にすることができる。さらに、この方法ではゲル界面に特別な力を加える必要がないためゲル界面を傷つけることがない。またこの方法において、重層溶媒の量、沸点、または容器の加熱等により重層溶媒が気化しきるまでの時間を制御できる。このため重合が進行し、ゲルが形成されるまでの時間に合わせて、重層溶媒が存在しているように設定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】(Ａ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの構成部材の図であり、(Ｂ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に使用可能なゲルを形成するための容器は、例えば図１に示されるカセットが挙げられる。図１(Ａ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの構成部材の図であり、(Ｂ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの図である。図１（Ａ）に示すカセットの構成部材は、凹部を有するカセット構成部１とカセット構成部２を適切な手段で接合することにより、図１（Ｂ）に示すようにゲル前駆溶液充填口５が形成されたゲル形成容器３が得られる。バッファー接触口４はシール材により封止したのちに用いる。このシール材はホットメルト性を有するフィルムや、開口部を密封できるような樹脂によるキャップでも良い。
【００１７】
カセット構成部１及びカセット構成部２の材質はゲル形成に問題がなく、また電気泳動に問題がない材質であればよく、好ましくはポリメタクリル酸メチル樹脂などのアクリル系樹脂であるが、その他の樹脂製またはガラス製であっても差し支えない。
【００１８】
以下、充填の仕方について説明する。以下の実施形態１は一種類目のゲル前駆溶液をカセットに充填した後、溶媒を重層し、重層した溶媒が揮発することで除去された後、二種類目のゲル前駆溶液を充填する方法である。
ここで、本発明を電気泳動、たとえばＳＤＳ-ＰＡＧＥに用いる場合、一種類目のゲル前駆溶液は分離ゲル前駆溶液であり、二種類目のゲル前駆溶液は濃縮ゲル前駆溶液である。ゲル化後に、分離ゲル前駆溶液、濃縮ゲル前駆溶液はそれぞれ分離ゲル、濃縮ゲルとなる。
なお、本発明中での液体の沸点に関する記載は１気圧におけるものとする。
【００１９】
実施形態１
図１（Ｂ）に示したカセットに、ゲル前駆溶液充填口５から分離ゲルを充填した後に、一種類目のゲル前駆溶液を構成する溶媒よりも３０℃以上沸点が低い溶媒を重層する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、一種類目のゲル前駆溶液（分離ゲル前駆溶液）及び二種類目のゲル前駆溶液（濃縮ゲル前駆溶液）を構成する溶媒は水であり、その１気圧における沸点は１００℃である。この場合の重層溶媒の沸点は７０℃以下であることが好ましい。具体的にはジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-ヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタンおよび2,2-ジメチルブタンからなる群から選択された少なくとも一種の溶媒を重層する。重層溶媒は複数を混合して用いてもよい。
この際、従来の水を重層溶媒として用いた場合と同様に、一種類目のゲル前駆溶液と重層溶媒の接触部は水平な界面が形成される。本発明において重層溶媒として疎水性の溶媒を用いることにより、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分離ゲル前駆溶液との混合が防止され、良好な界面状態を維持することができる。
【００２０】
その後、一種類目のゲル前駆溶液が十分にゲル化した後に、重層した溶媒を気化することでカセットから除去する。この際の溶媒の気化は、溶媒の自発的な気化、またはカセットを加温する、もしくは減圧環境を作ることで気化させてもよい。重層される溶媒の沸点が、ゲル前駆溶液を構成する溶媒の沸点よりも３０℃以上低ければ、ゲル作製に悪影響なく加温、または減圧により重層溶媒を除去可能でありであり好ましい。
【００２１】
重層溶媒を除去した後、二種類目のゲル前駆溶液を充填する。この方法では従来の水を重層溶媒として使った方法と比較して、重層溶媒をくみ出す、カセットを傾けて溶媒を廃棄する等の除去作業を行うことなく、二種類目のゲル前駆溶液を充填することが可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されない。
【実施例１】
【００２３】
ゲル形成領域の膜厚が１ｍｍで容量が５mlであるゲル形成容器３と同様の構造のカセットに、以下の表１に示す組成を持つ分離ゲル前駆溶液を、ゲル前駆溶液充填口５から充填した後、ゲル前駆溶液充填口５からジエチルエーテル０．４mlを重層した。ジエチルエーテルの沸点は約３５℃である。
【００２４】
表１
アクリルアミド水溶液(固形分濃度30w/v%)：１．３３４ml
（アクリルアミド水溶液の固形分は、アクリルアミドとＢＩＳの重量比が２９．２：０．８である混合物の水溶液である。）
1.5 M Tris-HCl 水溶液(pH 8.8)：１．０００ml
過硫酸アンモニウム水溶液(固形分濃度10w/v%)：０．０４０ml
テトラメチルエチレンジアミン：０．００４ml
蒸留水：１．６２２ml
【００２５】
この際ジエチルエーテルは、分離ゲル前駆溶液と明確に分離しており、また分離ゲル前駆溶液とジエチルエーテルの界面は水平に形成された。ジエチルエーテルは常温において5分程度で視認することはできなくなり、その程度の時間の経過で分離ゲル前駆溶液は濃縮ゲル前駆溶液の充填に問題ない程度の硬度を有していることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上説明したように本発明によれば、ゲルを形成するための容器に異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填する工程を有するゲル分離媒体の形成法において、従来技術よりも二種類のゲル間の界面が乱れることなく水平となり、しかもゲルの形成が簡便かつ再現性よく行える。したがって本発明の方法を利用すれば、例えばタンパク質分離のための研究、もしくは臨床の用途で使用されるプレキャストゲルの作製に有用である。
【符号の説明】
【００２７】
１・・・カセット構成部
２・・・カセット構成部
３・・・ゲル形成容器
４・・・バッファー接触口
５・・・ゲル前駆溶液充填口
【図１】
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