(57)【要約】【課題】細胞の移動および接着を高精度に制御することができ、かつ細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させることができる基板、およびこれを備えた種々の装置を提供する。【解決手段】細胞を接着させるための接着面２１ａを有する接着領域１２と、接着領域１２に隣接して設けられる、細胞の接着を阻害するための阻害領域１３とを備えており、阻害領域１３は、複数の多角柱形状の構造物２２を備えている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を接着させるための接着面を有する接着領域と、
上記接着領域に隣接して設けられる、細胞の接着を阻害するための阻害領域とを備えており、
上記阻害領域は、複数の多角柱形状の構造物を備えていることを特徴とする基板。
【請求項２】
上記構造物は、上記接着面と略同じ高さの頂上面を有することを特徴とする請求項１に記載の基板。
【請求項３】
複数の上記構造物は、上記接着領域と上記阻害領域との境界に沿って、複数の列において配置されていることを特徴とする請求項１または２に記載の基板。
【請求項４】
上記構造物は、四角柱形状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。
【請求項５】
上記構造物の頂上面の一辺の長さは、３μｍ以上２０μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６】
隣接する２つの上記構造物の間隔は、０．５μｍ以上１．５μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の基板。
【請求項７】
上記接着領域と上記阻害領域との境界に隣接して設けられた上記構造物の頂上面における少なくとも１つの角は、上記接着領域に対向していることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の基板。
【請求項８】
シリコン、ガラス、シリコーンゴム、プラスチックおよび金属からなる群より選択されるいずれかにより構成されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の基板。
【請求項９】
上記構造物は、リソグラフィー法を用いて形成されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の基板。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の基板を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の基板を備えており、
上記基板は、上記接着領域を複数備えており、かつ、複数の上記接着領域の各々に細胞が固定されていることを特徴とする細胞チップ。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の基板を用いて細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする培養方法。
【請求項１３】
上記基板は、上記阻害領域に取り囲まれた上記接着領域を複数備えており、
上記培養工程は、複数の上記接着領域の各々において、それぞれ異なる種類の細胞を培養するものであることを特徴とする請求項１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
細胞を接着させるための接着面を有する接着領域と、
上記接着領域に沿って、細胞の接着を阻害するための溝が設けられていることを特徴とする基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を接着させる基板、これを備えた細胞培養装置および細胞チップ、ならびに培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の移動を制御し、かつ細胞を接着させる技術は、医学的、工学的な応用に有用であり、再生医療、組織工学、臨床診断、生物医学実験、抗生物汚染材料の開発などの基盤をなす。また、当該技術は、細胞の移動／接着のメカニズムに対する解明に有用である。
【０００３】
特許文献１には、ナノファイバーを利用した細胞接着基材について記載されている。
【０００４】
非特許文献１には、２次元平面を化学修飾することによって、細胞の接着・非接着領域を作製し、細胞をパターニングする技術が記載されている。非接着領域を形成する物質として、poly-L-lysine-g-poly（ethylene glycol）が記載されている。
【０００５】
非特許文献２には、２次元平面を化学修飾することによって、細胞の接着・非接着領域を作製し、細胞の移動運動を制御する技術が記載されている。
【０００６】
非特許文献３には、側面が疎水性である数十マイクロメートルオーダーのサイズの構造物を利用して、この構造物と構造物との間に空気をトラップして構造物間への細胞の進入を阻むことによって、当該構造物上に細胞をパターニングする技術が記載されている。
【０００７】
非特許文献４には、ファイブロネクチンでコートされたＰＤＭＳ製であり、かつマイクロメートルオーダーのサイズである柱状構造体が集合した領域に対して、繊維芽細胞の進入が抑制されることが記載されている。
【０００８】
非特許文献５には、表面の格子形マイクロテクスチャーの密度勾配および異方性を利用して、細胞の移動運動を制御することによって、標的の領域に細胞を捕集する技術が記載されている。
【０００９】
また、非特許文献６〜８には、溝が設けられた基板が記載されている。これらの溝は、この溝に沿って細胞を並べるためのものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−４４１４９号公報（２００７年２月２２日公開）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Csucs G, Michel R, Lussi JW, Textor M, and Danuser G. (2003) Biomaterials, Vol. 24, pp. 1713-1720.
【非特許文献２】Kumar G, Ho C-C, and Carlos C. C. (2007) Adv. Mater., Vol. 19, pp. 1084-1090.
【非特許文献３】Wang Y, Sims C. E., Marc P., Bechman M. Li G. P., and Allbritton N. L. (2006) Langmuir, Vol. 22, pp. 8257-8262.
【非特許文献４】Lea M. G., Digabel J. L., Richert A. Hersen P. and Ladoux B. (2009) Biophys. J., Vol. 97, pp. 357-368.
【非特許文献５】D.-H. Kim, C.-H. Seo, K Han, K.-W. Kwon, A. Levchenko, and K.-&. Suh, (2009) Adv. Funct. Mater., Vol. 19, pp. 1579-1586.
【非特許文献６】P. CLARK, P. CONNOLLY, A. S. G. CURTIS, J. A. T. DOW and C. D. W. WILKINSON (1990) Development 108, 635-644.
【非特許文献７】Peter M. Stevenson and Athene M. Donald (2009) Langmuir, 25, 367-376.
【非特許文献８】Wen-Ta Su, Yung-Feng Liao, I.-Ming Chu (2007) Micron 38, 278-285.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
細胞の移動を制御し、かつ細胞を接着させる技術は、上述したように様々な分野に有用な技術であるため、幅広く応用可能な技術が必要である。そのために、当該技術は、「細胞の移動を高精度に制御する」ことができ、かつ「細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させる」ことができる必要がある。
【００１３】
「細胞の移動を高精度に制御する」ためには、細胞を接着させない（排除する）領域（以下、「細胞非接着領域」ともいう。）からの細胞の排除と、細胞を接着（適合）させる領域（以下、「細胞接着領域」ともいう。）への細胞の接着とを、高精度に行なうことが重要である。そのために、細胞非接着領域からの排除、および細胞接着領域への接着については、多種類の細胞に対して有効性があるものが求められる。また、細胞非接着領域は、細胞の非特異的な接着を充分に排除できるものが求められる。
【００１４】
また、「細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させる」ためには、細胞接着領域の形、サイズ、配置などを自由に設計できることが重要である。
【００１５】
しかし、従来技術では、これらの両方を達成できる、有効な手段を確立することが困難である。
【００１６】
例えば、非特許文献１に記載された技術では、長時間の培養によって、細かいパターンが崩れてしまい、細胞非接着領域に細胞が非特異的に接着してしまうという問題が生じる。
【００１７】
また、非特許文献２に記載された技術では、表面の化学的性質に対する接着の選択性が低い細胞、移動性が高い細胞などに対しては、細胞接着領域への接着と、細胞非接着領域からの排除とが精度よく行なわれないおそれが高く、多種類の細胞に対する有効性が低いという問題がある。
【００１８】
また、非特許文献３に記載された技術では、細胞よりも大きなサイズの構造物を用いるため、細かい設計ができず、目的、用途等に応じたフレキシビリティがないという問題がある。
【００１９】
また、非特許文献４に記載された柱状構造体が集合した領域は、細胞の進入を完全に排除することができない。また、非特許文献４では、比較的移動性が低い繊維芽細胞を用いているため、より移動性が高い細胞を用いた場合には、その進入を阻む確率がさらに低くなる可能性がある。そのため、これを細胞非接着領域として用いた場合には、細胞の非特異的な接着を充分に排除できない。また、多種類の細胞に対する有効性が低いという問題がある。
【００２０】
また、非特許文献５に記載された技術では、細胞を捕集するための標的の領域（細胞接着領域）以外の領域（細胞非接着領域）から細胞を完全に除去することができないので、細胞の細胞非接着領域への非特異的な接着を充分に排除できない。
【００２１】
また、非特許文献６〜８に記載された基板に設けられた溝によっては、移動性が高い細胞の進入を充分に阻害することはできない。また、これらの技術では、細胞接着領域を自由に設計することができないという問題がある。
【００２２】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その主な目的は、細胞の移動および接着を高精度に制御することができ、かつ細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させることができる基板、およびこれを備えた種々の装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記の課題を解決するために、本発明に係る基板は、細胞を接着させるための接着面を有する接着領域と、上記接着領域に隣接して設けられる、細胞の接着を阻害するための阻害領域とを備えており、上記阻害領域は、複数の多角柱形状の構造物を備えていることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る基板では、上記構造物は、上記接着面と略同じ高さの頂上面を有することが好ましい。
【００２５】
また、本発明に係る基板では、上記構造物は、四角柱形状であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明に係る基板では、複数の上記構造物は、上記接着領域と上記阻害領域との境界に沿って、複数の列において配置されていることが好ましい。
【００２７】
また、本発明に係る基板では、上記構造物の頂上面の一辺の長さは、３μｍ以上２０μｍ以下であることが好ましい。
【００２８】
また、本発明に係る基板では、隣接する２つの上記構造物の間隔は、０．５μｍ以上１．５μｍ以下であることが好ましい。
【００２９】
また、本発明に係る基板では、上記接着領域と上記阻害領域との境界に隣接して設けられた上記構造物の頂上面における少なくとも１つの角は、上記接着領域に対向していることが好ましい。
【００３０】
また、本発明に係る基板では、シリコン、ガラス、シリコーンゴム、プラスチックおよび金属からなる群より選択されるいずれかにより構成されていることが好ましい。
【００３１】
また、本発明に係る基板では、上記構造物は、リソグラフィー法を用いて形成されたものであることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る細胞培養装置は、上述したいずれかの基板を備えていることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る細胞チップは、上述したいずれかの基板を備えており、上記基板は、上記接着領域を複数備えており、かつ、複数の上記接着領域の各々に細胞が固定されていることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係る培養方法は、上述したいずれかの基板を用いて細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る培養方法では、上記基板は、上記阻害領域に取り囲まれた上記接着領域を複数備えており、上記培養工程は、複数の上記接着領域の各々において、それぞれ異なる種類の細胞を培養するものであることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る基板は、細胞を接着させるための接着面を有する接着領域と、上記接着領域に沿って、細胞の接着を阻害するための溝が設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、細胞の移動および接着を高精度に制御することができ、かつ細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させることができる。したがって、細胞のガイディング、捕集、ソーティング、パターニング等を行なうためのデバイス（バイオメディカルデバイス）を提供できるとともに、当該デバイスの精度および設計についての自由度を大幅に向上させることができるので、高性能のバイオメディカルデバイスを提供することが可能になる。このようなデバイスは、再生医療、組織工学、臨床診断、生物医学実験、抗生物汚染材料など、広い範囲に応用して利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明に係る基板の一実施形態を示す図である。
【図２】図１に示す基板における阻害領域の構造を示す図である。
【図３】本発明に係る基板の一実施形態における阻害領域の構成の一変形例を示す図である。
【図４】本発明に係る細胞チップの一実施形態を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態における細胞チップの一変形例を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。
【図９】（ａ）〜（ｂ）は、本発明の一実施形態における細胞チップを製造する方法について説明するための図である。
【図１０】（ａ）〜（ｆ）は、本発明の一実施形態における基板を製造する方法について説明するための図である。
【図１１】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の一実施形態における基板を製造する方法について説明するための図である。
【図１２】本発明に係る細胞培養装置の一実施形態の構成を示す図である。
【図１３】本発明に係る基板の他の実施形態を示す図である。
【図１４】本発明の一実施例における基板の構造物の配置間隔ｂと辺長ａとの関係を表すグラフである。
【図１５】（ａ）〜（ｆ）は、本発明の一実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、１分３０秒後、２分３０秒後、３分３０秒後、４分３０秒後、６分後における顕微鏡画像を表す図である。
【図１６】（ａ）〜（ｆ）は、本発明の他の実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、２分後、４分後、６分後、８分後、９分３０秒後における顕微鏡画像を表す図である。
【図１７】（ａ）〜（ｆ）は、本発明の他の実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、１分３０秒後、３分後、４分３０秒後、６分後、７分３０秒後における顕微鏡画像を表す図である。
【図１８】（ａ）〜（ｃ）は、細胞の進入角を測定する方法を説明するための図である。
【図１９】本発明の他の実施例における基板について、構造物の配置間隔が３μｍである場合の、細胞の進入角と阻害領域による阻害効果との関係を示す図である。
【図２０】（ａ）〜（ｈ）は、本発明の実施例５における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、２分後、４分後、６分後、８分後、１０分後、１２分後、１４分後における顕微鏡画像を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下に、本発明に係る実施形態について説明する。
【００４０】
＜第１実施形態＞
〔基板１〕
まず、本発明に係る基板の一実施形態における基本的な構成について説明する。図１は、本発明に係る基板の一実施形態を示す図である。
【００４１】
図１に示す基板１は、基材１１上に接着領域１２と阻害領域１３とを備えた板である。基板１の材料としては、例えばシリコン、ガラス、シリコーンゴム、プラスチック、金属等が挙げられる。シリコーンゴムとしてはＰＤＭＳ等が挙げられる。また、プラスチックとしてはポリスチレン等が挙げられる。シリコンであれば、微細構造を形成することが容易であるため好ましく、また、電極を設けること、温度制御回路を設けることなどが容易にできるため、培養に用いる基板などに好適である。また、ガラスであれば、透光性であるため好ましい。
【００４２】
接着領域１２は、細胞１００を接着させるための領域であり、接着面２１ａを有する。すなわち、接着領域１２とは、ここでは基材１１上に形成された接着部２１の上面である接着面２１ａ上の領域をさす。接着部２１の材料としては、例えば上述した基板１の材料と同じものを用いることができる。
【００４３】
ここで、細胞が接着領域１２に「接着する」とは、細胞が１つの接着領域１２の接着面２１ａに接触している状態をさし、必ずしも細胞が静止していなくてもよい。すなわち、細胞は、接着面２１ａに接触しながら接着領域１２内を移動している状態であっても、その接着領域１２外に移動しない限り、その接着領域１２に接着しているということとする。
【００４４】
接着面２１ａは、細胞１００を接着させる面であり、ここでは平面である。接着面２１ａは、シリカ（ＳｉＯ２）膜、金（Ａｕ）膜等によって覆われていることが好ましく、ファイブロネクチン（fibronectin）、コラーゲン、poly-L-lysineによってコートされていてもよい。なお、接着面は、特にこれに限らず、細胞が接着し得るものであればよい。
【００４５】
阻害領域１３は、接着領域１２に隣接して設けられ、細胞１００の接着を阻害するための領域である。阻害領域１３は、複数の構造物２２を備えている。構造物２２は、接着領域１２と阻害領域１３との境界に沿って、複数の列を構成するように配置されている。すなわち、構造物２２は、接着領域１２と阻害領域１３との境界に沿って配列された第１の列、当該第１の列に沿って配列された第２の列、当該第２の列に沿って配列された第３の列、というような複数の列を構成している。なお、本実施形態における阻害領域１３は、上述した構成に限らず、構造物が接着領域と阻害領域との境界に沿って１列に配置されていてもよく、２列以上に配置されていてもよい。
【００４６】
また、阻害領域１３は、格子状に設けられた多数の溝を備えた領域と言い換えることもできる。すなわち、複数の構造物２２は、当該多数の溝が設けられることによって形成されるものであり、１つの構造物２２は４つの溝によって四方を囲まれた部材であると言い換えることができる。このように、阻害領域１３は、溝と、複数の構造物２２がそれぞれ有する角とを、それぞれ多数備えたものである。
【００４７】
ここで、阻害領域１３が細胞の接着を「阻害する」とは、阻害領域１３への細胞の進入を抑制し、または阻害領域１３内に存在する細胞を一定時間内に一定以上の確率で阻害領域１３外に移動させることをいう。すなわち、阻害領域１３は、一定時間以上において細胞が留まることが抑制される領域である。
【００４８】
構造物２２は、接着面２１ａと平行な面であって接着面２１ａよりも低い面である基材１１の面上に、垂直方向に形成された、四角柱である。また、構造物２２は、接着面２１ａと略同じ高さの頂上面２２ａを有する。
【００４９】
構造物２２の材料としては、例えば上述した基板１の材料と同じものを用いることができる。また、構造物２２は、ＳｉＯ２膜、Ａｕ膜等によって覆われていてもよいし、構造物２２を構成するシリコン、ガラス、ＰＤＭＳ等が剥き出しになっているものであってもよい。
【００５０】
また、構造物２２の表面には、生体分子（タンパク質、核酸、糖質、脂質等、一般に生体に含まれる分子）、化学物質（例えばアルキルチオール、ポリＬリジン（poly-L-lysine）、ポリＤリジン（poly-D-Lysine）等）、マイクロ・ナノビーズ等が付着されていてもよい。タンパク質としては、ファイブロネクチン（fibronectin）、コラーゲン（collagen）、ラミニン（laminin）等が挙げられる。マイクロ・ナノビーズ等を付着させる方法としては、例えばエレクトロスプレーを用いるデポジション法などが挙げられる。合成高分子、生体高分子（タンパク質等）などをエレクトロスプレーデポジション法によりスプレーすると、スプレー条件に応じて、ナノ粒子、ナノファイバー等を形成させることができる。後述する実施例にて示すように、本実施形態に係る基板１における阻害領域１３は、その表面に、例えば細胞接着を促進する化学物質などがコートされていても、細胞の接着を阻害することができる。
【００５１】
阻害領域１３は、細胞の接着を阻害する阻害率が９０％以上であることが好ましく、１００％であることがより好ましい。阻害領域１３が接着領域１２に隣接して備えられることによって、接着領域１２に存在する細胞が阻害領域１３に進入することを阻害するとともに、阻害領域１３に存在する細胞を速やかに接着領域１２に移動させることができる。したがって、阻害領域１３は、接着領域１２に対する壁（仮想壁）として働き、細胞１００を接着領域１２内に留めておくことができる。
【００５２】
ここで、本明細書において「阻害率」とは、細胞の接着を阻害する割合であり、換言すれば細胞が排除される割合である。阻害領域１３の阻害率は、細胞が阻害領域１３から排除される割合を計測することによって求めることができる。細胞が阻害領域１３から排除されるか否かは、例えば顕微鏡などを用いて細胞を観察し、接着領域１２側から接着領域１２と阻害領域１３との境界に到達した細胞が、所定時間内に向きを変えて接着領域１２内に戻った場合には、細胞は排除されたと判断し、所定時間経過後も阻害領域１３内に留まっていた場合には、細胞は排除されなかったと判断することができる。
【００５３】
上述した構成によれば、基板１は、細胞１００を接着領域１２内に留めておくことができる。したがって、接着領域１２は、例えば細胞１００を培養するための領域、細胞１００を固定するための領域、細胞の移動性等を顕微鏡観察するための領域に用いることができる。
【００５４】
また、接着領域１２は、隣接する阻害領域１３の配置によって、任意のサイズ、形状、配置などに設計することが可能である。例えば接着領域１２は、２つの細胞培養用の接着領域をつなぐゲート、細胞１００が移動するための通路（パス）などの機能を有するものとすることもできる。
【００５５】
なお、本実施形態に係る基板１は、上述した構成に限らず、複数の接着領域を備えていてもよい。これによって、本実施形態は、複数の細胞を複数の接着領域にそれぞれ固定した細胞チップ、複数の接着領域の各々にそれぞれ異なる種類の細胞を培養する共培養用の培養基板などを提供することができる。
【００５６】
阻害領域１３の構造についてさらに詳細に説明する。図２は、図１に示す基板における阻害領域の構造を示す図である。
【００５７】
阻害領域１３における構造物２２の頂上面２２ａは、四角形である場合には、例えば一辺の長さ（辺長）ａが３μｍ以上２０μｍ以下であることが好ましい。また、隣接する２つの構造物２２の間隔（配置間隔）ｂは、接着を阻害したい細胞の大きさ（例えば直径等）より小さいことが好ましく、０．５μｍ以上１．５μｍ以下であることが好ましい。このような構成であることによって、後述する実施例にて示すように、本実施形態に係る基板１は、阻害領域１３への細胞の接着を効率よく阻害することができる。
【００５８】
また、構造物２２の高さｈは、数μｍ以上、数十μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、略２０μｍである。
【００５９】
なお、阻害領域１３に備えられる構造物は、上述した四角柱形状に限らず、四角柱形状以外の多角柱形状であってもよい。また、接着領域１２と阻害領域１３との境界に隣接して設けられた構造物の頂上面における少なくとも１つの角は、接着領域１２に対向していてもよい。これによって、阻害領域１３に対する細胞の接着をより強く阻害できる効果が期待できる。
【００６０】
また、本実施形態においては、構造物２２の頂上面２２ａは、接着面２１ａと略同じ高さであるが、特にこれに限定されない。しかし、構造物２２の頂上面２２ａが接着面２１ａと略同じ高さであれば、阻害領域１３に接着面２１ａよりも高い構造物などが形成されないので、接着領域１２の周囲に接着面２１ａよりも高い障害物がないこととなる。また、接着面２１ａと頂上面２２ａとが略同一平面上に存在する。したがって、接着領域１２への培地の供給、接着領域１２からの培地の排出などを容易に行なうことができるとともに、培地を接着領域１２上の培養細胞に均一に供給することができる。
【００６１】
（阻害領域１３の変形例）
本実施形態における阻害領域１３の変形例について、図３を参照して説明する。図３は、本発明に係る基板の一実施形態における阻害領域の構成の一変形例を示す図である。
【００６２】
図３に示すように、阻害領域１３ａ、１３ｂは、それぞれ接着領域１２と阻害領域１３ａとの境界線に平行に伸びる、幅１５μｍの帯状の領域であり、接着領域１２に隣接して並列に設けられる。すなわち、阻害領域１３ａは接着領域１２に隣接して設けられており、阻害領域１３ｂは、接着領域１２に対して阻害領域１３ａよりも外側に設けられる。なお、阻害領域１３ａと阻害領域１３ｂとの間は接着領域であってもよく、阻害領域１３ａと阻害領域１３ｂとの間の距離は、接着領域１２に接着させる細胞のサイズ以上であることが好ましく、例えば一般の培養細胞であれば数十μｍ以上であることが好ましい。また、当該距離は、略１００μｍ以下であることが好ましい。
【００６３】
このような構成であれば、接着領域１２から阻害領域１３ａ、１３ｂへの細胞１００の進入をより強く阻害できる。例えば、多くの細胞１００は阻害領域１３ａによって進入を阻害されるが、一部の細胞１００が阻害領域１３ａを通過してしまった場合でも、さらに外側に設けられた阻害領域１３ｂによって、その進入が阻害される。したがって、高効率阻害領域１３’を形成させることができる。
【００６４】
本変形例においては、阻害領域１３ａおよび１３ｂは、それぞれ細胞の接着の阻害率が９０％以上１００％以下であることが好ましいが、９０％以上９９％未満であってもよい。阻害領域１３ａおよび１３ｂの阻害率が９０％以上９９％未満である場合でも、上述した構成であれば、高効率阻害領域１３’においては細胞の接着の阻害率を９９％以上にすることが可能になる。
【００６５】
なお、本変形例においては、阻害領域１３ａおよび１３ｂは、幅１５μｍの帯状の領域であるが、特にこの形状、幅には限定されない。阻害領域１３ａおよび１３ｂは、接着領域１２と阻害領域１３ａとの境界線に垂直な方向の幅が、それぞれ排除しようとする細胞の大きさ（例えば直径など）の最大値よりも大きいものであることが好ましい。
【００６６】
〔基板の製造方法〕
次に、本発明に係る基板を製造する方法の一例について説明する。図１０（ａ）〜（ｆ）および図１１（ａ）〜（ｃ）は、本発明の一実施形態における基板を製造する方法について説明するための図である。なお、ここでは、基板の製造方法において、阻害領域１３を形成させる工程について説明するが、当該工程によって同時に接着領域１２をも形成させることが可能である。
【００６７】
阻害領域１３は、以下に説明するように、リソグラフィー法を用いて形成させることができる。ここでは、シリコンを用いて、ＳｉＯ２膜によって覆われている阻害領域１３を形成する場合について説明する。リソグラフィー法を用いることによって、精度よく、シャープなエッジを備えた阻害領域１３を形成させることができる。なお、基板がシリコーンゴム（例えばＰＤＭＳ）などからなる場合には、阻害領域１３は、型を用いた転写によっても形成させることができる。
【００６８】
（阻害領域１３の形成方法１）
阻害領域１３の形成方法１では、図１０（ａ）〜（ｆ）を参照して、１０〜２０μｍの高さの構造物２２を備えた阻害領域１３を形成する場合について説明する。
【００６９】
まず、シリコンウエハ３１にフォトレジスト４１をコーティングする（図１０（ａ））。シリコンウエハ３１としては、例えば６インチなどのものを用いることができ、フォトレジスト４１としては、例えばＡＺ５２１４Ｅ（Ｃｌａｒｉａｎｔ社製）などを用いることができる。
【００７０】
次に、フォトレジスト４１上にフォトマスク４２をのせてバキュームによってコンタクトさせ、その上からＵＶを照射してフォトリソグラフィーを行なう（図１０（ｂ））。その結果、フォトレジスト４１がパターン化される（図１０（ｃ））。
【００７１】
次に、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ：Deep Reactive Ion Etching）によってドライエッチングを行なう（図１０（ｄ））。その後、フォトレジスト４１を取り除き（図１０（ｅ））、ＳｉＯ２膜３２を成膜する（図１０（ｆ））。なお、ＳｉＯ２膜３２によって覆う代わりに、例えばＡｕを析出させてＡｕ膜によって覆ってもよい。
【００７２】
以上の方法によって、複数の構造物２２を備えた阻害領域１３を形成することができる。
【００７３】
（阻害領域１３の形成方法２）
阻害領域１３の形成方法２では、図１１（ａ）〜（ｃ）を参照して、５μｍ以下の高さの構造物２２を備えた阻害領域１３を形成する場合について説明する。
【００７４】
まず、シリコンウエハ３３上にＳｉＯ２膜３４を成膜し、その上にフォトレジスト４３をコーティングする（図１１（ａ））。シリコンウエハ３３およびフォトレジスト４３としては、上述したシリコンウエハ３１およびフォトレジスト４１と同じものを用いることができる。
【００７５】
次に、フォトレジスト４３上にフォトマスク４４をのせてバキュームによってコンタクトさせ、その上からＵＶを照射してフォトリソグラフィーを行なう（図１１（ｂ））。その結果、フォトレジスト４３がパターン化される。
【００７６】
次に、反応性イオンエッチングを行なう（図１０（ｃ））。その後、図示しないが、フォトレジスト４３およびＳｉＯ２膜３４を取り除き、ＳｉＯ２膜を成膜する。
【００７７】
以上の方法によって、複数の構造物２２を備えた阻害領域１３を形成することができる。
【００７８】
〔細胞チップ〕
次に、本発明に係る細胞チップの一実施形態について説明する。図４は、本発明に係る細胞チップの一実施形態を示す図である。なお、本実施形態における細胞チップは、上述した基板１の基本的な構成を備えている。したがって、基板１における構成要素と同様の機能を有する構成要素には同一の番号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００７９】
図４に示す細胞チップ２ａは、基材１１上に、複数の接着領域１２ａ、１２ｂ、１２ｃと、阻害領域１３とを備えたチップである。細胞チップ２ａの材料としては、上述した基板１の材料と同じものを用いることができる。また、細胞チップ２ａとしては、ガラスなどの透明な材料、偏光子としての特性等を有さない材料、などを用いることがより好ましい。これによって、顕微鏡観察を容易にすることができる。
【００８０】
接着領域１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、細胞を接着させるための領域であり、接着面２１ａを有する。接着領域１２ａには多細胞がパターニング（固定）されており、接着領域１２ｂには１細胞がパターニングされている。接着領域１２ａ、１２ｂの各々に固定されている細胞は、それぞれ同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、接着領域１２ｃは、細胞の運動性等を観察するための領域である。
【００８１】
なお、本明細書において「多細胞」とは、２個以上の細胞をさし、例えば複数の単一種類の細胞が高密度に凝集した細胞塊などが挙げられる。
【００８２】
阻害領域１３は、複数の接着領域１２ａ、１２ｂ、１２ｃの間を隔てるように形成されている。したがって、本実施形態における細胞チップ２ａでは、接着領域１２ａ、１２ｂ、１２ｃの各々に接着し、あるいは固定された細胞が、互いに混じることがない。
【００８３】
以上の構成のように、本実施形態に係る細胞チップは、複数の接着領域を備えており、当該複数の接着領域の一部または全てに細胞が固定されている。当該複数の接着領域の各々は、多細胞が固定されたものであってもよいし、１細胞が固定されたものであってもよい。また、当該複数の接着領域のいずれかは、細胞を観察するための領域であってもよい。
【００８４】
次に、本実施形態の変形例について説明する。本実施形態は、以下の各変形例に示すように、市販の生物顕微鏡、プレートリーダー等による各種の検査・測定に用いるためのチップとして利用することができる。
【００８５】
（変形例１）
図５は、本発明の一実施形態における細胞チップの一変形例を示す図である。図５に示す細胞チップ２ｂは、それぞれ異なる形状の複数の接着領域１２ｄ、１２ｅ、１２ｆと、当該接着領域１２ｄ、１２ｅ、１２ｆが形成されていない領域全体に形成された阻害領域１３とを備えている。細胞チップ２ｂの材料としては、細胞チップ２ａと同じものを用いることができる。
【００８６】
複数の接着領域１２ｄ、１２ｅ、１２ｆは、例えば、多細胞がパターニングされた領域、１細胞がパターニングされた領域、細胞を観察するための領域等であってもよい。
【００８７】
なお、本変形例においては、細胞チップ２ｂの表面は２６ｍｍ×７６ｍｍの長方形であるが、特にこの大きさ、形状等に限定されない。
【００８８】
本変形例であれば、本実施形態は、市販の生物顕微鏡等による観察などに用いるためのスライドグラス等としても利用可能である。
【００８９】
（変形例２）
図６は、本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。図６に示す細胞チップ２ｃは、細胞チップ２ｃに形成された複数の凹み部分のそれぞれに、パターン形成領域１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄを備えている。細胞チップ２ｃの材料としては、細胞チップ２ａと同じものを用いることができる。
【００９０】
パターン形成領域１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄは、それぞれ複数の接着領域と阻害領域とのパターンが形成された領域である。パターン形成領域１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄの各々におけるパターンは、それぞれ異なっていてもよいし、同じであってもよい。また、パターン形成領域１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄに形成された接着領域は、例えば、多細胞をパターニングするための領域、１細胞をパターニングするための領域、細胞の運動性等を観察するための領域等に用いられることができ、細胞が固定されていてもよい。
【００９１】
なお、本変形例においては、細胞チップ２ｃは、２６ｍｍ×７６ｍｍの大きさ、および０．１７ｍｍの高さを有する直方体であるが、特にこの大きさ、形状等に限定されない。
【００９２】
本変形例であれば、本実施形態は、市販の生物顕微鏡等による観察などに用いるためのスライドグラス等としても利用可能である。また、底面の厚さがカバーグラスと同程度に薄いため、生物顕微鏡によって底面側から細胞を観察することが可能である。
【００９３】
（変形例３）
図７は、本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。図７に示す細胞チップ２ｄは、丸形状の複数の接着領域１２と、当該接着領域１２が形成されていない領域全体に形成された阻害領域１３とを備えている。細胞チップ２ｄの材料としては、細胞チップ２ａと同じものを用いることができる。
【００９４】
複数の接着領域１２は、それぞれ例えば、多細胞をパターニングするための領域、１細胞をパターニングするための領域、細胞を観察するための領域等であってもよい。また、複数の接着領域１２の各々には、細胞が固定されていてもよい。
【００９５】
なお、本変形例においては、細胞チップ２ｄの表面は直径９０ｍｍの丸形状であるが、特にこの大きさ、形状等には限定されない。たとえば直径３５ｍｍ、６０ｍｍ等であってもよい。
【００９６】
本変形例であれば、本実施形態は、培養用シャーレ、ガラスボトムディッシュ等としても利用可能である。
【００９７】
（変形例４）
図８は、本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。図８に示す細胞チップ２ｅは、丸形状の複数の接着領域１２と、当該接着領域１２が形成されていない領域全体に形成された阻害領域１３とを備えている。細胞チップ２ｅの材料としては、細胞チップ２ａと同じものを用いることができる。
【００９８】
複数の接着領域１２は、細胞チップ２ｅにマトリクス状に配置されている。複数の接着領域１２は、それぞれ例えば、多細胞をパターニングするための領域、１細胞をパターニングするための領域、細胞を観察するための領域等であってもよい。また、複数の接着領域１２の各々には、細胞が固定されていてもよい。
【００９９】
なお、本変形例においては、細胞チップ２ｅの表面は、８６ｍｍ×１２８ｍｍの長方形であるが、特にこの大きさ、形状等には限定されない。また、複数の接着領域１２の数および配置は、特に限定されないが、例えば１つの細胞チップ２ｅに、２×３（６個）、３×４（１２個）、４×６（２４個）、６×８（４８個）、８×１２（９６個）などであってもよい。
【０１００】
本変形例であれば、本実施形態は、市販のプレートリーダー等による各種の検査・測定に用いるためのウェルプレート等としても利用可能である。
【０１０１】
〔細胞チップの製造方法〕
次に、本実施形態における細胞チップの製造方法について説明する。図９（ａ）〜（ｂ）は、本発明の一実施形態における細胞チップを製造する方法について説明するための図である。
【０１０２】
細胞チップ２は、例えば、図９（ａ）〜（ｂ）に示すような漏斗２３を用いて製造することができる。漏斗２３は、細胞チップ２における複数の接着領域１２の各々に対応する、複数の孔が形成されているものである。これらの孔は、対応する接着領域に播種される細胞を通すための孔である。また、漏斗２３は、細胞チップ２と組み合わされることによって、細胞チップ２における阻害領域１３を覆うものである。
【０１０３】
漏斗２３と細胞チップ２とを組み合わせて、漏斗２３の孔を通して、各細胞１００ａ、１００ｂ、１００ｃをそれぞれ目的の接着領域１２に播種する。この方法によれば、細胞が阻害領域１３に広がることを防止することができるので、多数の種類の細胞を、１つの細胞チップ２における複数の接着領域１２の各々に、互いに混ざることなく播種および固定することができる。
【０１０４】
〔細胞培養装置〕
次に、本発明に係る細胞培養装置の一実施形態について説明する。図１２は、本発明に係る細胞培養装置の一実施形態の構成を示す図である。
【０１０５】
図１２に示す細胞培養装置５０は、基板１上において細胞を培養するための装置であり、チャンバー５１と、容器５２、５３と、制御部５４とを備えている。各容器５２、５３は、それぞれ配管５５、５６を介してチャンバー５１に接続されている。配管５５、５６には、それぞれ開閉弁５７、５８が設けられている。また、制御部５４は、少なくとも開閉弁５７、５８に信号線５９によって接続されている。
【０１０６】
チャンバー５１は、基板１を備えている容器である。なお、ここでは、基板１は、接着領域１２に接着した細胞を培養するものである。
【０１０７】
チャンバー５１内では、基板１上において細胞を培養することができる。チャンバー５１には、図示しないが、例えばチャンバー５１内にガスを導入するためのガス導入口、チャンバー５１から外部にガスを排出するためのガス排出口、チャンバー５１内の温度を調節するための温度調節器などが設けられていてもよい。
【０１０８】
容器５２は、チャンバー５１に供給するための培地を貯める容器である。容器５３は、チャンバー５１から排出された培地を貯めるための容器である。開閉弁５７、５８は、その開閉によって、それぞれ配管５５、５６を流れる液体の流量を調節する弁である。制御部５４は、開閉弁５７、５８の開閉を制御する。
【０１０９】
制御部５４は、開閉弁５７を開けることによって、容器５２内の培地をチャンバー５１内に供給する。また、開閉弁５８を開けることによって、チャンバー５１内の培地を容器５３に排出させる。これによって、チャンバー５１内の培地を、別の培地に交換することができる。また、チャンバー５１内に常に新鮮な培地を供給し続けることもできる。
【０１１０】
また、制御部５４は、開閉弁５７、５８を閉じることによって、チャンバー５１を密閉することができる。
【０１１１】
細胞培養装置５０における基板１は、上述したように、接着領域１２の周囲に接着面２１ａよりも高い障害物がなく、また、接着領域１２の接着面２１ａと阻害領域１３の構造物２２の頂上面２２ａとが略同一平面上に存在する。したがって、細胞培養装置５０では、チャンバー５１内の培地を交換することによって、接着領域１２上に接触する培地を容易に交換することができる。
【０１１２】
〔培養方法〕
本発明に係る培養方法について、上述した基板１を用いる場合を例にして説明する。
【０１１３】
本実施形態における培養方法は、基板１を用いて細胞を培養する培養工程を含む。
【０１１４】
培養工程では、基板１の接着領域１２に細胞を接着させて培養する。基板１を用いることによって、接着領域１２内に細胞を留めたまま培養することができる。
【０１１５】
なお、阻害領域１３に取り囲まれた接着領域１２を複数備えている基板を用いてもよい。この場合には、それぞれの接着領域１２に、それぞれ異なる種類の細胞を接着させて培養することによって、共培養してもよい。本実施形態であれば、阻害領域１３によって、それぞれの接着領域１２における細胞が互いに混じることを防ぐことができる。
【０１１６】
〔本実施形態の効果〕
以上の構成によって、本実施形態は、以下の効果を有するものである。また、本実施形態が以下の結果を有することは、後述する各実施例の結果からも強く示唆される。
（１）本実施形態に係る基板は、多種類の細胞に対して有効であり、かつ、細胞の接着を充分に排除できる阻害領域を備えている。
（２）本実施形態に係る基板は、阻害領域を備えることによって、接着領域の形、サイズ、および配置を自由に設計することが可能である。
【０１１７】
これによって、本実施形態は、細胞の移動および接着を高精度に制御することができ、かつ細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させることができるので、優れた精度と高いフレキシビリティとを両立させた手段を提供できるものである。
【０１１８】
本実施形態の阻害領域は、上述した構成によって、マイクロメートルオーダーの微細単位構造を繰り返し配置した微細凹凸表面となっているものであり、細胞の接着を非常に強力に排除する細胞非接着（排除）表面として機能する。本実施形態は、阻害領域の構造によって細胞の接着を阻害するものであるため、表面の化学的性質に対する接着の選択性が低い細胞にも適用することができる。このような阻害領域は、接着領域と自由に組み合わせて使用することが可能である。したがって、任意のサイズ、形状、および配置の接着領域を設計することが可能になる。
【０１１９】
また、本実施形態の阻害領域は、接着領域と組み合わせて配置することによって、細胞の移動および接着を制御するためのデバイスの構成単位となり得る。当該構成単位としては、（１）仮想壁、（２）ゲート、（３）パス、などが挙げられる。これらの構成単位を適切に配置することによって、細胞のガイディング、パターニング、ソーティング、捕集等を行なうためのデバイス（バイオメディカルデバイス）を構築することが可能である。このようなデバイスは、再生医療、組織工学、臨床診断、生物医学実験、抗生物汚染材料など、広い範囲に応用して利用することが可能である。
【０１２０】
＜第２実施形態＞
〔基板６０〕
次に、本発明に係る基板の他の実施形態について説明する。図１３は、本発明に係る基板の他の実施形態を示す図である。
【０１２１】
図１３に示す基板６０は、接着領域６２と溝６３とを備えた板である。
【０１２２】
接着領域６２は、接着面６１ａを有しており、第１実施形態における接着領域１２と同様の機能を有する。接着領域６２の詳細な説明についてはここでは省略する。
【０１２３】
溝６３は、接着領域６２の周囲に沿って設けられており、細胞の接着を阻害するためのものである。溝６３は、接着面６１ａと、溝６３を挟んで接着領域６２に隣接する領域６４との間に１本のみ設けられている。溝６３は、その上への細胞の接着を阻害することによって、溝６３の上を通過するような細胞の移動、例えば接着領域６２と領域６４との間の移動をも阻害するものである。領域６４は、接着面６１ａと略同じ高さの頂上面６４ａを有する領域である。
【０１２４】
溝６３は、直線であってもよいし、曲線であってもよい。また、溝６３は、分岐していてもよい。溝６３の幅は、数μｍであることが好ましく、略１．５μｍであることがより好ましい。また、溝６３の深さは、数μｍ以上、数十μｍ以下であることが好ましく、略２０μｍであることがより好ましい。
【０１２５】
溝６３が接着領域６２に沿って備えられることによって、接着領域６２に存在する細胞は、溝６３上に接着すること、および溝６３上を通過して領域６４に進入することを阻害される。したがって、溝６３は、接着領域６２に対する壁（仮想壁）として働き、細胞を接着領域６２内に留めておくことができる。
【０１２６】
なお、本実施形態に係る基板は、上述した構成に限らず、上記溝６３以外の他の溝をさらに備えていてもよい。他の溝は、溝６３よりも領域６４側に設けられることが好ましい。また、他の溝は、その幅および深さが溝６３と同じであってもよい。また、溝６３に平行に設けられた溝であってもよいし、溝６３とは異なる方向に伸びるように設けられた溝であってもよい。また、溝６３と接していてもよいし、離れていてもよい。他の溝は複数設けられていてもよく、溝６３とともに格子状に設けられていてもよい。
【０１２７】
また、溝６３および複数の他の溝が設けられることによって、領域６４における溝６３および複数の他の溝に囲まれた部分が、１つまたは複数の多角柱形状の構造物となっていてもよい。例えば溝６３および複数の他の溝が格子状に設けられた場合には、領域６４における溝６３および複数の他の溝に囲まれた部分は、格子状に並んだ複数の四角柱形状の構造物となる。すなわち、この場合には、領域６４は、接着面６１ａと略同じ高さの頂上面６４ａを有し、接着領域６２と領域６４との境界に沿って複数の列において配置されている、複数の四角柱形状の構造物を備えることとなる。つまり、溝６３および領域６４は、第１実施形態における基板１の阻害領域１３と同様に構成されることができ、細胞の接着を阻害することが可能な阻害領域とされることができる。なお、このときの領域６４における複数の四角柱形状の構造物における配置間隔とは、上述した溝の幅と等しく、当該構造物の高さとは、溝の深さと等しい。
【０１２８】
このように、溝６３を挟んで接着領域６２に隣接している領域６４は、溝６３とともに、上述した阻害領域１３のような、細胞の接着を阻害するための阻害領域を構成していてもよい。これにより、接着領域６２内の細胞が溝６３を超えて領域６４に進入することをより強く阻害することができ、細胞を接着領域６２内により確実に留めておくことができる。
【０１２９】
すなわち、本実施形態における基板６０は、接着領域６２に沿って設けられる、細胞の接着を阻害するための第１の溝６３が設けられている。第１の溝６３は、接着領域６２に隣接して設けられる、細胞の接着を阻害するための阻害領域に含まれていてもよい。当該阻害領域には、複数の第２の溝が設けられており、第１の溝６３と当該第２の溝とに囲まれた部分が、１つまたは複数の多角柱形状の構造物となっていてもよい。当該構造物は、接着面６１ａと略同じ高さの頂上面６４ａを有していてもよい。また、複数の当該構造物が、接着領域６２と当該阻害領域との境界に沿って、複数の列において配置されていてもよい。当該構造物は、上述した構造物２２のような四角柱形状であってもよい。
【０１３０】
本実施形態における基板６０に対しては、第１実施形態において説明した基板の製造方法を好適に適用できる。また、基板６０は、上述した細胞チップ、細胞チップの製造方法、細胞培養装置、培養方法などに好適に利用でき、第１実施形態における基板１と同様の効果を得ることができる。
【０１３１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３２】
後述する各実施例においては、以下に示すように基板を作製し、その基板における阻害領域の機能について評価した。
【０１３３】
（基板の作製）
上述した基板１および基板６０と同様の構成の基板を作製した。以下、実施形態において説明した部材と同じ機能を有する部材には、同じ部材番号を付すこととし、ここではその詳細な説明を省略する。
【０１３４】
基板１、６０にはシリコンを用いた。まず、シリコンウエハを、パターン化されたフォトレジストにてコートし、深堀り反応性イオンエッチングによってエッチングした。このとき、基板１における構造物２２の高さ、および基板６０における溝６３の深さは２０μｍとした。その後フォトレジストを酸素プラズマアッシング法によって除去した。そして、熱酸化法によって基板１、６０の表面にＳｉＯ２膜を成膜し、または基板１の表面をＡｕ膜によってコートした。
【０１３５】
（細胞、培地および培養方法）
各実施例においては、細胞として、ブラックテトラ（Ｇｙｍｎｏｃｏｒｙｍｂｕｓ  ｔｅｒｎｅｔｚｉ）の鱗上に存在する移動性細胞であるケラトサイト（fish epidermal keratocyte）を用いた。なお、ケラトサイトは移動性の強い細胞であり、非常に速い速度において直線的に運動することが知られている。また、ケラトサイトは、足場の化学的性質に対して接着選択性が低い細胞であることが知られている。
【０１３６】
培地としては、１５％ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した７０％  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（３０％の純水、Ｈｅｐｅｓ入り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【０１３７】
培養方法としては、まず、魚の鱗をピンセットにて抜き取り、体表側を上にして、鱗がほぼ乾燥するまで基板１、６０の接着領域１２、６２に置き、鱗を基板１、６０上に接着させた。その後、培養液を加えて、室温（２２〜２５℃）において６〜１２時間培養した。その結果、ケラトサイトが、鱗から接着領域１２、６２上にシート状に広がった。次に、シート状のケラトサイトを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）により処理して細胞間接着を壊し、単一細胞を得た。培養液を交換した後、基板１を観察用のチャンバーに移した。
【０１３８】
（阻害率の計測）
基板１上のケラトサイトを、反射型顕微鏡（ＭＥＩＪＩ）を用いて２０倍の対物レンズによって観察した。また、デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、一定時間間隔にて顕微鏡画像を観察した。そして、ケラトサイトが、接着領域１２から阻害領域１３との境界に達した後、３分以内に向きを変えて接着領域１２内に戻ってきたときには、阻害領域１３から排除されたと判断した。また、ケラトサイトが、接着領域１２から阻害領域１３との境界に達した後、３分以上阻害領域１３内に留まっていたときには、阻害領域１３から排除されなかったと判断した。その後、阻害領域１３の阻害率を算出した。
【０１３９】
〔実施例１〕
実施例１においては、表面にＳｉＯ２膜を成膜した基板１を用いた。また、本実施例では、構造物２２の頂上面２２ａの辺長ａおよび配置間隔ｂが異なる複数の基板１を作製した。なお、構造物２２の高さｈは、２０μｍとした。
【０１４０】
それぞれの辺長ａおよび配置間隔ｂにおける基板１において、上述したように阻害率を計測した。その結果を以下の表１〜表３に示す。また、図１４は、本発明の一実施例における基板の構造物の配置間隔ｂと辺長ａとの関係を表すグラフである。
【０１４１】
【表１】
2011155865.tif 000003
【０１４２】
【表２】
2011155865.tif 000004
【０１４３】
【表３】
2011155865.tif 000005
【０１４４】
上記表２および図１４に示すように、辺長ａが３μｍ〜７μｍ、配置間隔ｂが１μｍであるときには、ケラトサイトは１００％阻害された。また、上記表１および図１４に示すように、辺長ａが５μｍ、配置間隔ｂが０．５μｍであるときにも、ケラトサイトは１００％阻害された。
【０１４５】
これらの結果から、辺長ａが３μｍ〜７μｍ、配置間隔０．５μｍであるときにも、ケラトサイトが１００％阻害されることが強く示唆される。
【０１４６】
また、辺長ａが１０μ〜２０μｍ、配置間隔ｂが１μｍであるとき（表２）、および辺長ａが３μｍ〜２０μｍ、配置間隔ｂが１．５μｍであるとき（表３）には、ケラトサイトは９０％阻害された。
【０１４７】
したがって、以上の結果から、構造物２２の辺長ａが３μｍ以上２０μｍ以下、および配置間隔ｂが０．５μｍ以上１．５μｍ以下であれば、阻害領域１３への細胞の接着を効率よく阻害できることが示された。
【０１４８】
（顕微鏡観察）
また、構造物２２の辺長ａが５μｍ、配置間隔ｂが１μｍである阻害領域１３を備えた基板１上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図１５（ａ）〜（ｆ）に示す。図１５（ａ）〜（ｆ）は、本発明の一実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、１分３０秒後、２分３０秒後、３分３０秒後、４分３０秒後、６分後における顕微鏡画像を表す図である。
【０１４９】
観察後０分〜１分３０秒において、ケラトサイトは、接着領域１２から阻害領域１３に向かって移動した（図１５（ａ）〜（ｂ））。次に、観察後２分３０秒〜３分３０秒において、ケラトサイトは、その細胞体の一部を接着領域１２内に残して移動を一時的に停止するとともに、その細胞体の形を紡錘形から球形に変化させた（図１５（ｃ）〜（ｄ））。次に、観察後４分３０秒においては、ケラトサイトは、その細胞体を紡錘形に戻すとともに、その仮足とよばれる部位を接着領域１２側に大きく伸展させた（図１５（ｅ））。その後、方向転換し、観察後６分においては、ケラトサイトは、接着領域１２内に戻るように移動した（図１５（ｆ））。
【０１５０】
このような、ケラトサイトの方向転換における、細胞体の変形および接着領域１２側への仮足の伸展は、いずれの観察においても再現性よく見られた。
【０１５１】
以上の結果から、本実施例に係る基板における阻害領域は、細胞の接着を充分に阻害できることが強く示唆された。
【０１５２】
〔実施例２〕
実施例２においては、表面にＡｕ膜をコートした基板１を用いた。また、本実施例では、構造物２２の頂上面２２ａの辺長を５μｍ、配置間隔ｂを２．５μｍ、および高さｈを２０μｍとした。
【０１５３】
（阻害率の計測）
この基板１を用いて、上述した方法によって阻害率を計測した。その結果、実験数６において、阻害率は１００％であった。
【０１５４】
（顕微鏡観察）
また、この基板１上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図１６（ａ）〜（ｆ）に示す。図１６（ａ）〜（ｆ）は、本発明の他の実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、２分後、４分後、６分後、８分後、９分３０秒後における顕微鏡画像を表す図である。
【０１５５】
観察後０分〜２分において、ケラトサイトは、接着領域１２から阻害領域１３に向かってまっすぐ移動した（図１６（ａ）〜（ｂ））。次に、観察後４分〜６分において、ケラトサイトは、その細胞体の一部を接着領域１２内に残して移動を一時的に停止し、細胞体の形を紡錘形から球形に変化させた（図１６（ｃ）〜（ｄ））。次に、観察後８分において、ケラトサイトは、接着領域１２側に仮足を大きく伸展させ始め（図１６（ｅ））、方向転換した後に、観察後９分３０秒において、接着領域１２内に戻るように移動した（図１６（ｆ））。
【０１５６】
以上の結果から、Ａｕ膜をコートした基板においても、阻害領域が細胞の接着を充分に阻害できることが示された。
【０１５７】
〔実施例３〕
実施例３においては、表面にＳｉＯ２膜を成膜した基板１を用いた。また、本実施例では、構造物２２の頂上面２２ａの辺長ａを５μｍ、配置間隔ｂを１μｍ、および高さｈを２０μｍとした。
【０１５８】
この基板１の表面に、以下の方法で、細胞接着を促進する化学物質であるファイブロネクチンをコートした。
【０１５９】
（ファイブロネクチンコート）
Fibronectin（BD Bioscience）をＰＢＳ（−）（Lonza）に溶解し、５０μｇ／ｍｌのファイブロネクチン溶液を作製した。３５ｍｍペトリディッシュに基板１を置いて、５０μｇ／ｍｌのファイブロネクチン溶液を１ｍｌ加え、室温にて１時間静置した。その後基板１を超純水にて３回洗浄し、風乾した。
【０１６０】
（阻害率の計測）
次に、この基板１を用いて、上述した方法によって阻害率を計測した。その結果、実験数１３において、阻害率は１００％であった。
【０１６１】
（顕微鏡観察）
また、この基板１上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図１７（ａ）〜（ｆ）に示す。図１７（ａ）〜（ｆ）は、本発明の他の実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、１分３０秒後、３分後、４分３０秒後、６分後、７分３０秒後における顕微鏡画像を表す図である。
【０１６２】
観察後０分〜１分３０秒において、ケラトサイトは、接着領域１２から阻害領域１３に向かって移動した（図１７（ａ）〜（ｂ））。次に、観察後３分〜４分３０秒において、ケラトサイトは、その細胞体の一部を接着領域１２内に残して移動を一時的に停止し、細胞体の形を紡錘形から球形に変化させた（図１７（ｃ）〜（ｄ））。次に、観察後６分〜７分３０秒において、ケラトサイトは、その細胞体を紡錘形に戻すとともに、接着領域１２側に仮足を大きく伸展させて方向転換し、接着領域１２内に戻るように移動した（図１７（ｅ）〜（ｆ））。
【０１６３】
本実施例において観察されたケラトサイトの細胞体の変形、接着領域１２側への仮足の伸展などは、実施例１において、ファイブロネクチンコートしていない基板上にて観察されたものと同様であった。
【０１６４】
以上の結果から、本実施例に係る基板における阻害領域は、細胞接着を促進する化学物質であるファイブロネクチンをコートした場合においても、移動性の高いケラトサイトの接着を完全に阻害できる構造であることが示された。したがって、本実施例は、表面の化学的性質に対して接着選択性が低い細胞、移動性の強い細胞などに対しても、好適に利用できるものであることが示された。
【０１６５】
〔実施例４〕
実施例４においては、表面にＳｉＯ２膜を成膜した基板１を用いた。本実施例では、構造物２２の頂上面２２ａの辺長ａを５μｍ、および高さｈを２０μｍとした。また、本実施例では、構造物２２の配置間隔ｂを１μｍまたは３μｍとした２種類の基板１を用いた。
【０１６６】
これらの基板１の接着面２１ａ上に接着させた細胞の阻害領域１３に対する進入角（ｄｅｇｒｅｅｓ）と、阻害領域１３による阻害効果との関係を調べた。
【０１６７】
図１８（ａ）〜（ｃ）は、細胞の進入角を測定する方法を説明するための図である。進入角は、以下の方法により測定した。
（１）細胞１００の顕微鏡写真を３０秒毎に撮影した。
（２）接着領域１２と阻害領域１３との境界に細胞１００が接触する直前の顕微鏡写真の２コマまたは３コマを、２値化した。
（３）２値化した画像から、細胞１００の重心を求めた（図１８（ａ））。
（４）最小二乗近似直線を用いて、重心の軌跡をフィットさせた（図１８（ｂ））。
（５）最小二乗近似直線と、接着領域１２および阻害領域１３の境界線とのなす角（０°〜９０°）を計算し、進入角とした（図１８（ｃ））。
【０１６８】
なお、上記（２）および（３）の処理には、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（US National Institute of Health (NIH)）を用いた。また、上記（４）および（５）の処理には、データ解析ソフトウェアＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（Synergy Software）を用いた。
【０１６９】
その結果、構造物２２の配置間隔が１μｍである基板では、全ての進入角においてケラトサイトが阻害された。
【０１７０】
一方、構造物２２の配置間隔が３μｍである基板における、細胞の進入角と阻害領域による阻害効果との関係を図１９に示す。図１９に示すように、ケラトサイトは、阻害領域１３に対して進入角０°〜約５６°にて進入する場合には阻害され、進入角約５９°〜９０°にて進入する場合には阻害されなかった。
【０１７１】
これらの結果から、阻害領域１３における構造物２２の配置間隔が１μｍである場合には、細胞は、いずれの進入角にて進入した場合にも阻害されるが、構造物２２の配置間隔が１μｍより３倍広い３μｍである場合には、進入角が大きいと阻害されにくくなることがわかった。
【０１７２】
〔実施例５〕
実施例５においては、基板６０を用いた。本実施例では、溝６３の幅が１．５μｍ、４μｍまたは２０μｍである基板６０を用いた。
【０１７３】
それぞれの基板６０において、実施例１と同じ方法を用いて、溝６３による阻害率を計測した。その結果を以下の表４に示す。
【０１７４】
【表４】
2011155865.tif 000006
【０１７５】
上記表４に示すように、溝６３の幅が１．５μｍであるときには、ケラトサイトは８８％阻害されたが、溝６３の幅が４μｍであるときには５０％、２０μｍであるときには１８％しか阻害されなかった。
【０１７６】
（顕微鏡観察）
また、溝６３の幅が１．５μｍである基板６０上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図２０（ａ）〜（ｈ）に示す。図２０（ａ）〜（ｈ）は、本発明の実施例５における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から０分後、２分後、４分後、６分後、８分後、１０分後、１２分後、１４分後における顕微鏡画像を表す図である。
【０１７７】
観察後０分〜２分において、ケラトサイトは、接着領域６２から溝６３に向かってまっすぐ移動した（図２０（ａ）〜（ｂ））。次に、観察後４分〜１０分において、ケラトサイトは、その細胞体の一部を接着領域６２内に残して移動を一時的に停止した（図２０（ｃ）〜（ｆ））。次に、観察後１２〜１４分において、ケラトサイトは、接着領域６２側に方向転換した後に、接着領域６２内に戻るように移動した（図２０（ｇ）〜（ｈ））。
【０１７８】
以上の結果から、１本の溝のみでも細胞の接着を充分に阻害できることが示された。
【０１７９】
以上の各実施例により、本発明に係る基板は、細胞の移動を高精度に制御できるものであり、移動性の高い細胞の運動性制御にも好適に利用できることが示された。また、実施例５に示すように１本の溝のみでも細胞の接着を充分に阻害できるが、実施例１〜４のように多数の溝と多数の角とを有する阻害領域を備えていれば、細胞の接着を阻害する効果がより高くなることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明は、細胞の移動および接着を高精度に制御することができ、かつ細胞接着領域を、目的、用途等に柔軟に対応させることができるので、バイオメディカルデバイスなどの構築に有用であり、再生医療、組織工学、臨床診断、生物医学実験、抗生物汚染材料など、広い範囲に利用することが可能である。
【符号の説明】
【０１８１】
１      基板
２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ  細胞チップ
１２、１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、１２ｆ  接着領域
１３、１３ａ、１３ｂ  阻害領域
２１ａ  接着面
２２    構造物
２２ａ  頂上面
５０    細胞培養装置
６０    基板
６１ａ  接着面
６２    接着領域
６３    溝
【図１】
2011155865.tif 000007
【図２】
2011155865.tif 000008
【図３】
2011155865.tif 000009
【図４】
2011155865.tif 000010
【図５】
2011155865.tif 000011
【図６】
2011155865.tif 000012
【図７】
2011155865.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2011155865.tif 000019
【図１４】
2011155865.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
2011155865.tif 000022
【図１５】
2011155865.tif 000023
【図１６】
2011155865.tif 000024
【図１７】
2011155865.tif 000025
【図２０】
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