(57)【要約】【課題】  セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する、新たな糖化促進剤、糖化処理剤ならびにそれを用いたバイオマスの糖化処理方法の提供を目的とする。【解決手段】  ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を発現する菌体の培養上清を、セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤として使用する。前記培養上清を含む糖化促進剤の共存下で、セルラーゼを用いて前記バイオマスを処理すれば、セルラーゼ単独での糖化処理よりも、前記バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロース含有量を低減し、糖化を促進することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤であって、
ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を発現する菌体の培養上清を含むことを特徴とする糖化促進剤。
【請求項２】
前記ｆａｅ遺伝子が、ｆａｅＡ遺伝子、ｆａｅＢ遺伝子およびｆａｅＣ遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１記載の糖化促進剤。
【請求項３】
前記ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来である、請求項１または２記載の糖化促進剤。
【請求項４】
前記ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来である、請求項３記載の糖化促進剤。
【請求項５】
前記菌体が、前記ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を有する発現ベクターが導入された形質転換体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の糖化促進剤。
【請求項６】
前記菌体が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である、請求項１から５のいずれか一項に記載の糖化促進剤。
【請求項７】
前記菌体が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである、請求項６記載の糖化促進剤。
【請求項８】
バイオマスの糖化処理に使用するための糖化処理剤であって、
セルラーゼと、請求項１から７のいずれか一項に記載の糖化促進剤とを含むことを特徴とする糖化処理剤。
【請求項９】
バイオマスの糖化処理方法であって、
請求項１から７のいずれか一項に記載の糖化促進剤の共存下、前記バイオマスをセルラーゼで処理することを特徴とする糖化処理方法。
【請求項１０】
前記バイオマスが、リグノセルロース系バイオマスである、請求項９記載の糖化処理方法。
【請求項１１】
前記バイオマスが、バイオマス原料を加圧熱水で前処理することにより得られた前処理済みバイオマスである、請求項９または１０記載の糖化処理方法。
【請求項１２】
セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤であって、
配列番号８〜１４の少なくともいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質を含むことを特徴とする糖化促進剤。
【請求項１３】
バイオマスの糖化処理に使用するための糖化処理剤であって、
セルラーゼと、請求項１２記載の糖化促進剤とを含むことを特徴とする糖化処理剤。
【請求項１４】
バイオマスの糖化処理方法であって、
請求項１２記載の糖化促進剤の共存下、前記バイオマスをセルラーゼで処理することを特徴とする糖化処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスの糖化促進剤、糖化処理剤およびそれを用いた糖化処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油資源の減少に伴い、近年、バイオマスを糖化処理して、エタノール等を製造し、新たなエネルギー源を供給することが盛んに試みられている。しかしながら、デンプンを含む、トウモロコシ等の植物の実等は、食料としての利用が重要であることから、非食用である、トウモロコシの皮等の廃棄物や木材等を、セルロース系バイオマスとして有効利用することが重要視されている。
【０００３】
木材等のバイオマスは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含むため、通常は、酸、アルカリまたはセルラーゼ等の糖化酵素を用いて加水分解を行い、ポリマーからオリゴ糖へ、さらには単糖へ変換した後、微生物等を用いた発酵等により、前記糖からエタノール等の燃料アルコールまたは有機酸等の化成品原料への変換が行われる。近年、前述のような、酸およびアルカリによる糖化は、環境汚染を伴うことから、酵素を用いた糖化が、世界的に要求されている。しかしながら、主力酵素となるセルラーゼ剤による単一処理のみでは、セルロース・ヘミセルロースの糖化効率を上げるには、多量の酵素が必要となる。例えば、糖化効率を９０％から９９％に上げる場合、一般に、糖化効率９０％時に必要な酵素量を１とすると、糖化効率９９％時には１０の酵素量が必要と言われている。特に、セルロース系バイオマスは、セルロース分子同士の結合によって粘性が高くなるが、僅か１０％程度の糖化効率の向上によって劇的に粘性が下がり、その結果、発酵工程等の負担を大幅に減少できると言われている。そこで、セルラーゼと他の酵素との併用による、糖化効率の向上およびセルラーゼ量の低減が試みられているが、未だ十分な効率が得られていない（特許文献１、非特許文献１）。このことは、糖化処理コストを上昇させ、セルロース系バイオマスから、エタノール等の燃料アルコールおよび有機酸等の化成品原料の生産を実用化するにあったての障害となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kumagaiら、Characteristic  of  Hydrothermal  Decomposition  and  Saccharification  of  Various  Lignocellulosic  Biomass  and  Enzymatic  Saccarification  of  the  Obtained  Hydrothermal-Residue．  Journal  of  the  Japan  Institute  of  Energy,  86,  712-717(2007)
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１１−５００４６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する、新たな糖化促進剤、糖化処理剤ならびにそれを用いたバイオマスの糖化処理方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の第１の糖化促進剤は、セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤であって、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を発現する菌体の培養上清を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の第１の糖化処理剤は、バイオマスの糖化処理に使用するための糖化処理剤であって、セルラーゼと、本発明の第１の糖化促進剤とを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の第１の糖化処理方法は、バイオマスの糖化処理方法であって、本発明の第１の糖化促進剤の共存下、前記バイオマスをセルラーゼで処理することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の第２の糖化促進剤は、セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤であって、配列番号８〜１４の少なくともいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の第２の糖化処理剤は、バイオマスの糖化処理に使用するための糖化処理剤であって、セルラーゼと、本発明の第２の糖化促進剤とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の第２の糖化処理方法は、バイオマスの糖化処理方法であって、本発明の第２の糖化促進剤の共存下、前記バイオマスをセルラーゼで処理することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、セルラーゼ単独での糖化処理よりも、優れた効率でバイオマスの糖化を行うことができる。このため、木材やその廃棄物等をバイオマスとして有効利用し、エネルギー資源および化成品等を提供できることから、極めて有用といえる。また、本発明によれば、例えば、糖化処理に用いるセルラーゼ量を低減できるため、発酵等の後工程で重要となる、バイオマスの糖化処理のコストを低減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施例において使用した発現ベクターの構成を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜第１の形態＞
本発明の第１の糖化促進剤は、前述のように、セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤であって、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を発現する菌体の培養上清を含むことを特徴とする。
【００１６】
前記菌体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属であることが好ましく、より好ましくは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。
【００１７】
前記ｘｙｎＲ遺伝子は、キシラナーゼ遺伝子の発現を正に制御する転写制御因子の遺伝子であり、ｘｌｎＲともいう。前記ｘｙｎＲ遺伝子の由来は、特に制限されないが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来が好ましく、中でも、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来が好ましい。
【００１８】
前記ｆａｅ遺伝子は、フェルラ酸エステラーゼ遺伝子である。前記ｆａｅ遺伝子は、例えば、ｆａｅＡ遺伝子、ｆａｅＢ遺伝子およびｆａｅＣ遺伝子等のサブファミリーを有している。前記ｆａｅ遺伝子としては、例えば、ｆａｅＡ遺伝子、ｆａｅＢ遺伝子およびｆａｅＣ遺伝子のいずれでもよく、中でも、ｆａｅＡ遺伝子が好ましい。前記ｆａｅ遺伝子の由来は、特に制限されないが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来が好ましく、中でも、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来が好ましい。
【００１９】
本発明において、前記菌体は、例えば、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子のいずれか一方を発現してもよいし、両方を発現してもよい。
【００２０】
前記菌体は、例えば、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を有する発現ベクターが導入された形質転換体であることが好ましい。このように、前記発現ベクターを宿主に導入した形質転換体によれば、例えば、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を過剰発現することが可能である。本発明において、以下、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子を挿入するベクターを、発現ベクターといい、前記発現ベクターに、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を挿入したものを、組換え発現ベクターという。
【００２１】
前記発現ベクターに挿入する遺伝子は、例えば、クローニングした天然の核酸でもよいし、遺伝子増幅法により増幅させた核酸でもよいし、合成した核酸であってもよい。また、前記核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡがあげられ、この他に、例えば、ＰＮＡ等の人工核酸であってもよい。
【００２２】
前記宿主は、特に限定されず、例えば、形質転換が可能な生細胞があげられる。前記生細胞としては、例えば、菌類、昆虫、高等動物等の真核生物、真正細菌や古細菌等の原核生物があげられる。前記菌類としては、例えば、糸状菌や酵母等の真菌類があげられる。前記糸状菌としては、特に限定されないが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔａｅ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属等があげられる。中でも、例えば、糸状菌が好ましく、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属が好ましい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属としては、特に制限されないが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ等があげられ、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。前記生細胞としては、この他に、例えば、酵母細胞があげられ、具体例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母を含むメタノール資化性酵母等があげられる。前記真正細菌としては、例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等があげられる。前記昆虫としては、例えば、Ｓｆ９細胞等の昆虫培養細胞等、カイコ等の虫体等があげられる。前記高等動物としては、例えば、ヒトを含む脊椎動物等由来の培養細胞等、脊椎動物等の個体等があげられる。
【００２３】
前記発現ベクターは、前記ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を挿入できればよく、その他の構成等は何ら制限されない。前記組換え発現ベクターは、例えば、従来公知のベクターを発現ベクターとして、これに、前述のｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子の少なくとも一方を挿入することにより製造できる。前記発現ベクターは、特に限定されず、例えば、前記組換え発現ベクターを導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。前記発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターとしては、例えば、ｐＩＳＩ（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８１，  ７１１−７１９，  （２００８）．）、ＹＩｐ５、ＹＥｐ２４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，  １９３−２００，  （１９９１）．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＨＳＧ２９８／２９９、ｐＨＳＧ３９６／８等の市販のプラスミドベクター等があげられる。中でも、宿主が糸状菌の場合は、例えば、ｐＩＳＩ（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８１，  ７１１−７１９，  （２００８）．）、ｐＵＣ系プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ１８／１９等）等の宿主当りのプラスミドのコピー数が高いものが好ましい。また、前記宿主が酵母の場合は、例えば、ＹＩｐ５、ＹＥｐ２４等が好ましい。また、前記宿主が大腸菌の場合は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等が好ましい。また、前記宿主が高等動物の場合は、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，  １９３−２００，  （１９９１）．）等が好ましい。前記ウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター；ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等があげられる。中でも、前記宿主が昆虫の場合は、例えば、バキュロウイルスの一種であるＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ベクター等が好ましい。これらのベクターには、例えば、従来公知の方法に基づいて、挿入遺伝子を発現可能なように挿入できる。
【００２４】
前記発現ベクターは、さらに、前記挿入した遺伝子の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。これらの調節配列は、例えば、ベクター、宿主、目的タンパク質等の種類に応じて、適宜設定できる。また、前記調節配列には、例えば、所望の宿主で調節配列として機能しうる配列が含まれ、改変を加えた改良型の調節配列等も含まれる。前記プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば、宿主が糸状菌の場合、ｓｏｄＭ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ａｍｙＣ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１  ｔａｎｎａｓｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２Ａ、ｓｍａｌｌ  ｖ−ＡＴＰａｓｅ、ｃｒｕｃｉｆｏｒｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ａｃｔｉｎ遺伝子を制御するプロモーターおよびこれらの改変プロモーター等があげられる。前記宿主が酵母の場合は、例えば、ＰＨＯ５、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＡＤＨ１、ＧＡＬ、ＳＥＤ１等があげられ、前記宿主が高等動物の場合は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ−４０、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等由来のプロモーター、筋βアクチンプロモーター等の構成プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターや調節性プロモーターがあげられる。前記ターミネーターとしては、特に制限されないが、例えば、ｇｌａＢターミネーター（Ｇｅｎｅ  ２０７，  １２７−１３４，  （１９９８）．）、ａｍｙＡターミネーター（Ｇｅｎｅ  ８４，  ３１９−３２７，  （１９８９）．）等があげられる。前記調節配列は、例えば、従来公知の方法に基づいて、前記遺伝子の発現を機能的に調節できる部位に配置または結合させればよい。
【００２５】
また、前記発現ベクターは、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーをコードする配列（選択マーカー遺伝子）を有してもよい。これらの選択マーカーは、例えば、ベクター、宿主等の種類に応じて、適宜設定できる。前記選択マーカー遺伝子としては、例えば、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｌｅｕＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ等の変異型ＧＦＰ、ＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ等があげられる。宿主が糸状菌の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｌｅｕＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子およびカルボキシン耐性遺伝子等が好ましく、より好ましくは、ｎｉａＤである。また、前記宿主が酵母の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、シクロヘキシミド耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子等が好ましい。前記宿主が大腸菌の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が好ましい。前記宿主が高等動物の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等が好ましい。
【００２６】
前記組換え発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、特に制限されず、例えば、発現ベクター、宿主等の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法の具体例としては、例えば、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター等を用いた感染導入法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等があげられる。中でも、宿主が糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いた感染導入法等があげられるが、プロトプラスト法等が好ましい。また、前記宿主が酵母である場合は、例えば、酢酸リチウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等が好ましい。前記宿主が大腸菌である場合、例えば、Ｈａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法等が好ましい。前記宿主が昆虫である場合、例えば、前述のＡｃＮＰＶベクター等を用いた感染導入法等が好ましい。前記宿主が高等動物細胞である場合、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、前述のようなウイルスベクター等を用いた感染導入法等が好ましい。
【００２７】
本発明の第１の糖化促進剤において、前記培養上清の製造方法は、特に制限されず、例えば、ｘｙｎＲ遺伝子およびｆａｅ遺伝子のいずれか一方を発現する菌体の培養により得られる。前記培養上清は、例えば、菌体の培養液そのものでもよいし、前記培養液から培養菌体および不溶物を除去した液体画分であってもよい。前記液体画分は、例えば、前記培養液を遠心処理して得られる上清でもよいし、前記培養液をろ過して得られるろ液であってもよい。また、前記液体画分は、例えば、前記不溶物等を除去した前記ろ液または上清等の精製画分であってもよい。前記精製方法は、例えば、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施できる。
【００２８】
前記菌体の培養条件は、特に制限されず、前記菌体の種類に応じて適宜決定できる。また、前記菌体が、前記組換え発現ベクターを導入した形質転換体の場合は、例えば、宿主および発現ベクターの種類に応じて適宜決定できる。具体例として、前記菌体がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の場合、培地は、例えば、ＧＰＹ培地、ＤＰＹ培地、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）を含む培地およびこれらの濃縮培地が好ましい。前記培地の成分としては、例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩等があげられる。前記培地は、例えば、使用する形質転換体の生育を促進するために、ビタミン、アミノ酸等を含んでもよい。前記培地のｐＨは、例えば、約３〜８であり、約５〜７が好ましい。培養温度は、例えば、約１０〜５０℃であり、好ましくは、約２５〜４０℃であり、培養期間は、例えば、１〜１５日間であり、好ましくは、３〜７日間である。前記培養は、例えば、好気的条件下で行うことが好ましい。培養法としては、例えば、振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００２９】
なお、本発明の第１の糖化促進剤は、前記培養上清を含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されず、例えば、さらに、他の成分を含んでもよい。前記他の成分としては、特に制限されない。また、前記培養上清の形態は、制限されず、例えば、液体であっても、固体であってもよい。固体の場合、例えば、培養上清を乾燥させた、前記培養上清成分を含む乾燥物があげられる。本発明の第１の糖化促進剤の形態も、特に制限されず、例えば、液体であっても、粉末または錠剤等の固体であってもよい。
【００３０】
つぎに、本発明の第１の糖化処理剤は、前述のように、バイオマスの糖化処理に使用するための糖化処理剤であって、セルラーゼと、前記本発明の第１の糖化促進剤とを含むことを特徴とする。本発明の第１の糖化処理剤は、前記セルラーゼと、前記第１の糖化促進剤とを含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の第１の糖化処理剤は、例えば、さらに、他の成分を含んでもよい。前記他の成分としては、例えば、糖類、糖アルコール類、有機酸、界面活性剤等の酵素安定剤等があげられる。前記糖類としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タロース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース等の単糖類、ラクトース、サッカロース、マルトース、トレハロース、イソマルトース、セロビオース等の二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等の三糖以上のオリゴ糖、イヌリン、アミロース、アミロペクチン、デキストリン、プルラン等の水溶性の中性多糖等があげられる。前記糖アルコール類としては、例えば、グルシトール、マンニトール、イノシトール、キシリトール等があげられる。前記有機酸としては、例えば、グルコン酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、酢酸およびこれらのナトリウム塩またはカリウム塩等があげられる。前記界面活性剤としては、例えば、オクチルグリコシド、オクチルチオグリコシド等のアルキルグリコシド、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸等のコール酸類、コール酸類のナトリウム塩またはカリウム塩、ポリエチレングリコールエーテル類、ポリオキシエチレングリコールエーテル類、ラウロイルザルコシン、ラウロイルザルコシン塩類、ラウリル硫酸、ラウリル硫酸塩等があげられる。
【００３１】
つぎに、本発明の第１の糖化処理方法は、バイオマスの糖化処理方法であって、前記本発明の第１の糖化促進剤の共存下、前記バイオマスをセルラーゼで処理することを特徴とする。本発明は、前記第１の糖化促進剤の共存下で、セルラーゼ処理することが特徴であり、その他の構成や条件は、何ら制限されない。
【００３２】
前記セルラーゼとしては、特に制限されず、市販の各種セルラーゼが使用できる。中でも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のセルラーゼが好ましく、より好ましくは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼである。
【００３３】
前記バイオマスとは、一般に、化石燃料を除く、生物由来の有機資源を意味する。前記バイオマスとしては、例えば、リグニン、セルロースおよびヘミセルロースを含むリグノセルロース系バイオマスが使用でき、具体例としては、例えば、木材、稲わら、スイッチグラス、トウモロコシ、さとうきび、竹およびパルプ、ならびに、これらの廃棄物（例えば、コーンストーバー、バガス等）等の草本系および木質系のバイオマス原料があげられる。
【００３４】
また、前記バイオマスは、例えば、前記バイオマス原料を前処理して得られた前処理済みバイオマスであってもよい。前記前処理の方法としては、例えば、前記バイオマス原料を加圧熱水で処理する熱水処理があげられる。前記熱水処理の条件は、特に制限されないが、例えば、Kumagaiらの文献（Characteristic  of  Hydrothermal  Decomposition  and  Saccharification  of  Various  Lignocellulosic  Biomass  and  Enzymatic  Saccarification  of  the  Obtained  Hydrothermal-Residue.  Journal  of  the  Japan  Institute  of  Energy,  86,  712-717(2007)）、特開２００９−１８３８０６号公報、特開２００９−１２４９７３号公報、特開２００６−１３６２６３号公報等の方法により行うことができる。
【００３５】
前記前処理済みバイオマスは、例えば、リグニン含有量５〜２５ｗ／ｖ％、ホロセルロース含有量７５〜９５ｗ／ｖ％である。また、前記ホロセルロースにおけるセルロースとヘミセルロースの含有量は、例えば、ホロセルロースを１００ｗ／ｖ％として、セルロース含有量６０〜９０ｗ／ｖ％、ヘミセルロース含有量１０〜４０ｗ／ｖ％である。
【００３６】
つぎに、本発明の第１の糖化処理方法について、一例をあげて説明する。
【００３７】
まず、前記バイオマス原料を加圧熱水で処理した前記前処理済みバイオマスと、前記第１の糖化促進剤と、セルラーゼとを含む反応液を準備する。前記反応液は、例えば、溶媒に、前記前処理済みバイオマスと、前記第１の糖化促進剤と、前記セルラーゼとを添加して調製することが好ましい。前記溶媒としては、例えば、水および緩衝液等があげられ、塩、酸、アルカリおよびイオン性物質等を添加してもよい。前記反応液において、各成分の添加量は、特に制限されない。具体例として、前記前処理済みバイオマス（乾燥重量）は、例えば、１〜５０ｗ／ｖ％であり、好ましくは１０〜３０ｗ／ｖ％である。前記反応液において、前記第１の糖化促進剤の含有量は、例えば、前記培養上清が０．０１〜５０ｖ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜１０ｖ／ｖ％である。前記反応液において、前記セルラーゼの含有量は、例えば、０．０１〜５０ＦＰＵ／ｍＬであり、好ましくは０．１〜１０ＦＰＵ／ｍＬである。
【００３８】
そして、前記反応液において、セルラーゼによる触媒反応を行う。前記反応条件は、特に制限されず、例えば、セルラーゼの種類に応じて適宜決定できる。具体例として、反応温度は、例えば、１５〜９０℃であり、好ましくは２５〜６０℃であり、反応時間は、例えば、０．５〜１２０時間であり、好ましくは８〜７２時間である。
【００３９】
このような糖化処理によって、例えば、第１の糖化促進剤を併用せずにセルラーゼのみで処理を行った場合の非可溶化ホロセルロース率を、例えば、さらに、その３０〜７０％減の値にまで低下できる。
【００４０】
＜第２の形態＞
本発明の第２の糖化促進剤は、前述のように、セルラーゼによるバイオマスの糖化処理を促進する糖化促進剤であって、配列番号８〜１４の少なくともいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質を含むことを特徴とする。なお、本発明の第２の糖化促進剤は、特に示さない限り、前記本発明の第１の糖化促進剤と同様である。
【００４１】
本発明の第２の糖化促進剤は、例えば、前記配列番号８〜１４で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質のうち、いずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。配列番号８および９で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質は、それぞれペクチナーゼであり、配列番号１０〜１４で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質は、それぞれヘミセルラーゼであり、キシラナーゼ活性を有する。
【００４２】
二種類以上の前記タンパク質を併用する場合、その組み合わせは、特に制限されないが、例えば、配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質とを併用することが好ましい。また、前記配列番号１０〜１４で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質のうち、いずれか二種類以上を併用してもよく、好ましくは、全てを併用することが好ましい。前記配列番号８および配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質の少なくとも一種類と、前記配列番号１０〜１４で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質の少なくとも一種類とを併用してもよい。
【００４３】
前記各配列番号で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、前記アミノ酸配列をコドンにおきかえた塩基配列からなるＤＮＡを準備し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写および翻訳によって、生成することもできる。また、以下に示すように、例えば、各種菌体から、単離することもできる。具体的には、配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＭＳ１９５７から、配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ＳＣＴＣＣ  ４００２６４から、配列番号１０〜１４で表わされる各アミノ酸配列からなるタンパク質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８から、それぞれ単離できる。
【００４４】
また、市販品を使用することもでき、前記配列番号８および配列番号９の少なくとも一方で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質としては、例えば、商品名ペクチナーゼＧアマノ（天野エンザイム社）が使用でき、前記配列番号１０〜１４の少なくともいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質としては、例えば、商品名ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム社）を使用できる。
【００４５】
つぎに、本発明の第２の糖化処理剤は、前述のように、バイオマスの糖化処理に使用するための糖化処理剤であって、セルラーゼと、前記本発明の第２の糖化促進剤とを含むことを特徴とする。なお、本発明の第２の糖化処理剤は、特に示さない限り、前記本発明の第１の糖化処理剤と同様である。
【００４６】
本発明の第２の糖化処理剤は、前記セルラーゼと、前記第２の糖化促進剤とを含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の第２の糖化処理剤は、例えば、さらに、他の成分を含んでもよく、糖類、糖アルコール類、有機酸、界面活性剤等の酵素安定剤があげられる。前記糖類としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タロース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース等の単糖類、ラクトース、サッカロース、マルトース、トレハロース、イソマルトース、セロビオース等の二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等の三糖以上のオリゴ糖、イヌリン、アミロース、アミロペクチン、デキストリン、プルラン等の水溶性の中性多糖等があげられる。前記糖アルコール類としては、例えば、グルシトール、マンニトール、イノシトール、キシリトール等があげられる。前記有機酸としては、例えば、グルコン酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、酢酸、これらのナトリウム塩またはカリウム塩等があげられる。前記界面活性剤としては、例えば、オクチルグリコシド、オクチルチオグリコシド等のアルキルグリコシド、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸等のコール酸類、コール酸類のナトリウム塩またはカリウム塩、ポリエチレングリコールエーテル類、ポリオキシエチレングリコールエーテル類、ラウロイルザルコシン、ラウロイルザルコシン塩類、ラウリル硫酸、ラウリル硫酸塩等があげられる。
【００４７】
つぎに、本発明の第２の糖化処理方法は、バイオマスの糖化処理方法であって、前記本発明の第２の糖化促進剤の共存下、前記バイオマスをセルラーゼで処理することを特徴とする。なお、本発明の第２の糖化処理方法は、特に示さない限り、前記本発明の第１の糖化処理方法と同様である。本発明は、前記第２の糖化促進剤の共存下で、セルラーゼ処理することが特徴であり、その他の構成や条件は、何ら制限されない。
【００４８】
つぎに、本発明の第２の糖化処理方法について、一例をあげて説明する。
【００４９】
まず、前記バイオマス原料を加圧熱水で処理した前記前処理済みバイオマスと、前記第２の糖化促進剤と、セルラーゼとを含む反応液を準備する。前記反応液は、例えば、溶媒に、前記バイオマスと、前記第２の糖化促進剤と、前記セルラーゼとを添加して調製することが好ましい、前記溶媒としては、例えば、水および緩衝液等があげられ、塩、酸、アルカリおよびイオン性物質等を添加してもよい。前記反応液において、各成分の添加量は、特に制限されないが、前記前処理済みバイオマス（乾燥重量）は、例えば、１〜５０ｗ／ｖ％であり、好ましくは、１０〜３０ｗ／ｖ％である。前記第２の糖化促進剤がヘミセルラーゼを含む場合、前記反応液における前記ヘミセルラーゼの含有量は、例えば、キシラナーゼ分解活性（天野法）として、１〜１０，０００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、１０〜３，０００Ｕ/ｍＬである。また、前記第２の糖化促進剤がペクチナーゼを含む場合、前記反応液における前記ペクチナーゼの含有量は、例えば、Ｅｎｄｏ-ＰＧ活性（天野法）として、０．０１〜１０００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、０．１〜３０Ｕ/ｍＬである。また、前記反応液における前記セルラーゼの含有量は、例えば、０．０１〜５０ＦＰＵ／ｍＬであり、好ましくは０．１〜２０ＦＰＵ／ｍＬである。
【００５０】
そして、前記反応液において、セルラーゼによる触媒反応を行う。前記反応条件は、特に制限されず、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはペクチナーゼの種類に応じて適宜決定できる。具体例として、反応温度は、例えば、１５〜９０℃であり、好ましくは２５〜６０℃であり、反応時間は、例えば、０．５〜１８０時間であり、好ましくは８〜７２時間である。
【００５１】
このような糖化処理によって、例えば、前記第２の糖化促進剤を併用せずにセルラーゼのみで処理を行った場合よりも、非可溶化ホロセルロース率を、例えば、その４０〜８０％減の値にまで低下できる。
【実施例】
【００５２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００５３】
組換え発現ベクターの構築
ｐＵＣ１１８プラスミドを基本骨格として、目的遺伝子を過剰発現する発現ベクター（ｐＬＨＧ）を作製した。この発現ベクターの構造の概略を図１に示す。前記図１に示すように、前記発現ベクターは、プロモーターとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のヘモリシンプロモーター（ｈｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、配列番号１）、ターミネーターとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のｇｌａＢターミネーター（ｇｌａＢ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、配列番号２）、選択マーカーとして、ｌｅｕＡ遺伝子配列（ｌｅｕＡ、配列番号３）を有する構造とした。そして、前記発現ベクターにおける、前記プロモーターとターミネーターとの間に、後述する目的遺伝子を、リガーゼ処理により平滑末端で挿入し、組み換え発現ベクターを作製した。
【００５４】
宿主株の形質転換および培養
宿主株は、ロイシン要求性変異株であるβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ｌｅｕ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２００７９）を使用した。
【００５５】
プロトプラスト法により、前記ロイシン要求性変異株に前記組換え発現ベクターを導入し、１．５ｗ／ｖ％の寒天を含む下記組成の培地Ａで形質転換株を選択した。選択した形質転換株の胞子を０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０水溶液に懸濁した。そして、下記組成の培地Ｂ、培地Ｃまたは培地Ｄ１００ｍＬを入れた坂口フラスコ（５００ｍｌ）に、前記懸濁液を１．０×１０６ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬとなるように無菌的に植菌した。前記坂口フラスコを、１５０回／分、振幅５０ｍｍ、３０℃の条件で２４〜２４０時間インキュベートして、培養を行った。この培養液を遠心して、上清を回収し、これを、実施例のサンプルとして使用した。また、前記目的遺伝子を挿入していない前記発現ベクターを使用して、同様に、上清を回収した。これを比較例のサンプルとして使用した。
【００５６】
（培地Ａ）
１．５ｗ／ｖ％  精製寒天（ナカライテスク）
２ｗ／ｖ％  グルコース
０．３ｗ／ｖ％  ＮａＮＯ３
０．１ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４
０．０５ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２ｗ／ｖ％  ＫＣｌ
０．００１ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３
０．８ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ
（培地Ｂ）
２ｗ／ｖ％  グルコース
１ｗ／ｖ％  ポリペプトン
０．５ｗ／ｖ％  イーストエキス
（培地Ｃ）
２ｗ／ｖ％  Ｂｉｒｃｈ由来キシラン
（商品名  Ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ、シグマ社）
１ｗ／ｖ％  ポリペプトン
（培地Ｄ）
２ｗ／ｖ％  Ｏａｔ由来キシラン
（商品名  Ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  ｏａｔ  ｓｐｅｌｔｓ、シグマ社）
１ｗ／ｖ％  ポリペプトン
０．５ｗ／ｖ％  イーストエキス
【００５７】
前処理済みバイオマス
バイオマス原料１（兵庫県産の稲ワラ）、バイオマス原料２（沖縄産のバガス）、バイオマス原料３（北海道産のコーンストーバーおよびアメリカ産等のスイッチグラス等のソフトバイオマス）に、それぞれ加圧熱水処理を施した、リグノセルロースを主成分とする前処理済みバイオマス１、前処理済みバイオマス２および前処理済みバイオマス３を使用した。前記前処理済みバイオマス１は、ホロセルロース含有量１５．４ｗ／ｖ％、リグニン含有量５．１ｗ／ｖ％であり、前記ホロセルロースは、セルロース含有量８２．９ｗ／ｖ％、ヘミセルロース含有量１７．１ｗ／ｖ％であった。前記前処理済みバイオマス２は、ホロセルロース含有量１９．１ｗ／ｖ％、リグニン含有量８．２ｗ／ｖ％であり、前記ホロセルロースは、セルロース含有量７３．１ｗ／ｖ％、ヘミセルロース含有量２６．９ｗ／ｖ％であった。前記前処理済みバイオマス３は、ホロセルロース含有量１７．３ｗ／ｖ％、リグニン含有量６．８ｗ／ｖ％であり、前記ホロセルロースは、セルロース含有量７８．３ｗ／ｖ％、ヘミセルロース含有量２１．７ｗ／ｖ％であった。
【００５８】
［実施例１］
前記目的遺伝子として配列番号４に示すＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｘｙｎＲ遺伝子を挿入した発現ベクターを使用して、前述のように、実施例のサンプルを調製した。また、前記ｘｙｎＲ遺伝子を挿入していない前記発現ベクターを用いて、前述のように、比較例のサンプルを調製した。前記各サンプルを用いて、下記組成の反応液（約１０００μＬ）を調製した。下記組成において、セルラーゼは、市販のセルラーゼ（商品名セルラーゼＧＣ２２０、ジェネンコア社、１６０ＦＰＵ／ｍＬ）、ｘｙｎＲ（＋）（Ｂｉｒｃｈ）は、Ｂｉｒｃｈ由来キシランを含む前記培地Ｃを使用して得られたｘｙＲ遺伝子を発現させた実施例サンプル、ｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）は、Ｏａｔ由来キシランを含む前記培地Ｄを使用して得られた、ｘｙｎＲ遺伝子を発現させた実施例サンプル、ｘｙｎＲ（−）（Ｂｉｒｃｈ）は、Ｂｉｒｃｈ由来キシランを含む前記培地Ｃを使用して得られた、ｘｙＲ遺伝子を発現させていない比較例サンプル、ｘｙｎＲ（−）（Ｏａｔ）は、Ｏａｔ由来キシランを含む前記培地Ｄを使用して得られたｘｙｎＲ遺伝子を発現させていない比較例サンプル、ＡｃＯＮａは、酢酸ナトリウム水溶液である（以下、同様）。そして、前記反応液について、３７℃、７２時間、５００回転／ｍｉｎの条件で攪拌を行った後、前記各反応液について、ワイズ法によりホロセルロース（ホモセルロースおよびヘミセルロースの合計）量を測定した。セルラーゼ無添加およびサンプル無添加の比較例１−１のホロセルロース量を１００％として、各反応液について、ホロセルロースの残存率を算出した。これらの結果を、下記表１にあわせて示す。
【００５９】
【表１】
2011155933.tif 000002
【００６０】
前記表１に示すように、セルラーゼ単独の比較例１−２（残存率３４．８％）と比べ、セルラーゼと、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｂｉｒｃｈ）またはｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）とを併用した実施例１−１および１−２では、それぞれ、残存率を、３２．５％および２５．３％にまで減少できた。このように、ｘｙｎＲ遺伝子を発現させた培養液上清のサンプルによって、糖化が促進されたことから、これらのサンプルは、糖化促進剤として有用であることがわかった。また、バイオマスの可溶化においては、エタノール発酵および蒸留工程を考慮し、ホロセルロース残存率を３０％以下とすることが重要視されている。このため、特に、実施例１−２で使用したサンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）、すなわち、Ｏａｔ由来キシラン存在下でｘｙｎＲ遺伝子を過剰反応させた糖化促進剤は、セルラーゼとの併用によって、ホロセルロース残存率を３０％以下に実現できることから、セルラーゼとの併用効果に極めて優れると言える。また、前記糖化促進剤ｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）を用いた実施例１−２は、１０倍量のセルラーゼを使用した比較例１−３と同等の残存率を示した。最終製品がバイオエタノールの場合、一般に、セルラーゼは、バイオマス可溶化におけるコストの約５０％を占めると言われる。このため、前記糖化促進剤ｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）を用いれば、セルラーゼの使用量を１０分の１に低減できることから、計算上、生産コストを５５％まで低減可能である。さらに、セルラーゼ単独でありｘｙｎＲ未発現の比較例１−４（残存率３８．１％）および比較例１−５（３９．５％）と比べても、前記実施例１−１および１−２は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００６１】
［実施例２］
本例では、前処理済みバイオマスとして、前記前処理済みバイオマス２を用いた以外は、実施例１と同様にして、ホロセルロース残存率を算出した。この結果を、下記表２にあわせて示す。
【００６２】
【表２】
2011155933.tif 000003
【００６３】
前記表２に示すように、セルラーゼ単独の比較例２−２（残存率３４．２％）と比べて、セルラーゼと、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｂｉｒｃｈ）またはｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）とを併用した実施例２−１および２−２では、それぞれ、残存率を、３０％以下、すなわち、２６．１％および２９．４％にまで減少できた。また、実施例２−２で使用したサンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｂｉｒｃｈ）、すなわち、Ｂｉｒｃｈ由来キシラン存在下でｘｙｎＲ遺伝子を過剰反応させた糖化促進剤は、セルラーゼとの併用によって、１０倍量のセルラーゼを使用した比較例２−３と同等の残存率を示した。さらに、セルラーゼ単独でありｘｙｎＲ未発現の比較例２−４（残存率３３．１％）および比較例２−５（３２．５％）と比べても、前記実施例２−１および２−２は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００６４】
［実施例３］
本例では、前処理済みバイオマスとして、前記前処理済みバイオマス２を用いた以外は、実施例１と同様にして、ホロセルロース残存率を算出した。この結果を、下記表３にあわせて示す。
【００６５】
【表３】
2011155933.tif 000004
【００６６】
前記表３に示すように、セルラーゼ単独の比較例３−２（残存率３２．１％）と比べて、セルラーゼと、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｂｉｒｃｈ）またはｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）とを併用した実施例３−１および３−２では、それぞれ、残存率を、３０％以下、すなわち、２９．１％および２５．４％にまで減少できた。また、特に、実施例３−２で使用したサンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）は、セルラーゼとの併用によって、１０倍量のセルラーゼを使用した比較例３−３と同等の残存率を示した。さらに、セルラーゼ単独でありｘｙｎＲ未発現の比較例３−４（残存率３２．５％）および比較例３−５（３３．１％）と比べても、前記実施例３−１および３−２は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００６７】
［実施例４］
本例では、下記表４の反応液（約１５０μＬ）を用い、前記反応液の攪拌速度を２５００回転／ｍｉｎとした以外は、実施例１と同様にして、ホロセルロース残存率を算出した。この結果を、下記表４にあわせて示す。
【００６８】
【表４】
2011155933.tif 000005
【００６９】
前記表４に示すように、セルラーゼ単独の比較例４−２（残存率３４．１％）と比べて、セルラーゼと、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｂｉｒｃｈ）またはｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）とを併用した実施例４−１および４−２では、それぞれ、残存率を、３０％以下、すなわち、２９．３％および２８．４％にまで減少できた。また、特に、実施例４−２のサンプルｘｙｎＲ（＋）（Ｏａｔ）は、セルラーゼとの併用によって、１０倍量のセルラーゼを使用した比較例４−３と同等の残存率を示した。さらに、セルラーゼ単独でありｘｙｎＲ未発現の比較例４−４（残存率３４．５％）および比較例４−５（３５．１％）と比べても、前記実施例４−１および４−２は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｘｙｎＲ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００７０】
［実施例５］
前記目的遺伝子として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのフェルラ酸エステラーゼ遺伝子（ｆａｅ遺伝子）を挿入した発現ベクターを準備した。前記ｆａｅ遺伝子は、配列番号５に示すｆａｅＡ遺伝子、配列番号６に示すｆａｅＢ遺伝子および配列番号７に示すｆａｅＣ遺伝子の完全長配列を挿入した。そして、これらの発現ベクターを使用し、培地として前記培地Ｂを使用して、前述のようにして、実施例のサンプルを調製した。また、前記ｆａｅ遺伝子を挿入していない前記発現ベクターを用いて、前述のように、比較例のサンプルを調製した。前記各サンプルを用いて、下記組成の反応液（約１０００μＬ）を調製した。下記組成において、セルラーゼは、市販のセルラーゼ（商品名セルラーゼＧＣ２２０、ジェネンコア社、１６０ＦＰＵ／ｍＬ）、ｆａｅＡ（＋）、ｆａｅＢ（＋）およびｆａｅＣ（＋）は、それぞれ、ｆａｅＡ遺伝子、ｆａｅＢ遺伝子およびｆａｅＣを発現させた実施例サンプル、ｆａｅ（−）は、いずれのｆａｅ遺伝子も発現させていない比較例サンプル、ＡｃＯＮａは、酢酸ナトリウム水溶液である（以下、同様）。そして、前記反応液について、前記実施例１と同様にして、ホロセルロース量を測定した。セルラーゼおよびサンプル無添加の比較例５−１のホロセルロース量を１００％として、各反応液について、ホロセルロースの残存率を算出した。この結果を、下記表５にあわせて示す。
【００７１】
【表５】
2011155933.tif 000006
【００７２】
前記表５に示すように、セルラーゼ単独の比較例５−２（残存率３４．２％）と比べて、セルラーゼと、各種ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｆａｅＡ（＋）またはｆａｅＣ（＋）とを併用した実施例５−１および５−２では、それぞれ、残存率を、２９．２％、３４．４％および３１．６％にまで減少できた。このように、ｆａｅ遺伝子を発現させた培養液上清のサンプルによって、糖化が促進されたことから、これらのサンプルは、糖化促進剤として有用であることがわかった。また、前述のように、バイオマスの可溶化においては、ホロセルロース残存率を３０％以下とすることが重要視されている。このため、特に、実施例５−１で使用したサンプルｆａｅＡ（＋）、すなわち、ｆａｅＡ遺伝子を過剰反応させた糖化促進剤は、セルラーゼとの併用によって、ホロセルロース残存率を３０％以下に実現できることから、セルラーゼとの併用効果に極めて優れると言える。また、前記糖化促進剤ｆａｅＡ（＋）を用いた実施例５−１は、３倍量のセルラーゼを使用した比較例５−３と同等の残存率を示した。最終製品がバイオエタノールの場合、前述のように、セルラーゼは、バイオマス可溶化におけるコストの約５０％を占めると言われる。このため、前記糖化促進剤ｆａｅＡ（＋）を用いれば、セルラーゼの使用量を３分の１に低減できることから、計算上、生産コストを６６．７％まで低減可能である。さらに、セルラーゼ単独でありｆａｅ未発現の比較例５−４（残存率３４．５％）と比べても、前記実施例５−１および５−２は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００７３】
［実施例６］
本例では、前処理済みバイオマスとして、前記前処理済みバイオマス２を用いた以外は、実施例５と同様にして、ホロセルロース残存率を算出した。この結果を、下記表６にあわせて示す。
【００７４】
【表６】
2011155933.tif 000007
【００７５】
前記表６に示すように、セルラーゼ単独の比較例６−２（残存率３４．８％）と比べて、セルラーゼと、各種ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｆａｅＡ（＋）、ｆａｅＢ（＋）またはｆａｅＣ（＋）とを併用した実施例６−１、６−２および６−３では、それぞれ、残存率を、２９．８％、３２．３％および２９．３％にまで減少できた。前記糖化促進剤ｆａｅＣ（＋）を用いた実施例６−３は、３倍量のセルラーゼを使用した比較例６−３と同等の残存率を示した。さらに、セルラーゼ単独でありｆａｅ未発現の比較例６−４（残存率３４．５％）と比べても、前記実施例６−１、６−２および６−３は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００７６】
［実施例７］
本例では、前処理済みバイオマスとして、前記前処理済みバイオマス３を用いた以外は、実施例５と同様にして、ホロセルロース残存率を算出した。この結果を、下記表７にあわせて示す。
【００７７】
【表７】
2011155933.tif 000008
【００７８】
前記表７に示すように、セルラーゼ単独の比較例７−２（残存率３２．３％）と比べて、セルラーゼと、各種ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｆａｅＡ（＋）、ｆａｅＢ（＋）またはｆａｅＣ（＋）とを併用した実施例７−１、７−２および７−３では、それぞれ、残存率を、３０．８％、２９．３％および２９．８％にまで減少できた。前記糖化促進剤ｆａｅＢ（＋）を用いた実施例７−２は、１．５倍量のセルラーゼを使用した比較例７−３と同等の残存率を示した。さらに、セルラーゼ単独でありｆａｅ未発現の比較例７−４（残存率３２．９％）と比べても、前記実施例７−１、７−２および７−３は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００７９】
［実施例８］
本例では、下記表８の反応液（約１５０μＬ）を用い、前記反応液の攪拌速度を２５００回転／ｍｉｎとした以外は、実施例５と同様にして、ホロセルロース残存率を算出した。この結果を、下記表８にあわせて示す。
【００８０】
【表８】
2011155933.tif 000009
【００８１】
前記表８に示すように、セルラーゼ単独の比較例８−２（残存率３３．９％）と比べて、セルラーゼと、各種ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた実施例サンプルｆａｅＡ（＋）、ｆａｅＢ（＋）またはｆａｅＣ（＋）とを併用した実施例８−１、８−２および８−３では、それぞれ、残存率を、２９．３％、３３．４％および２９．８％にまで減少できた。前記糖化促進剤ｆａｅＡ（＋）を用いた実施例８−１は、３倍量のセルラーゼを使用した比較例８−３と同等の残存率を示した。さらに、セルラーゼ単独でありｆａｅ未発現の比較例８−４（残存率３４．５％）と比べても、前記実施例８−１、８−２および８−３は、それぞれ、残存率を低減できた。このことから、ｆａｅ遺伝子を過剰発現させた培養上清によって、糖化が促進されていることが明らかとなった。
【００８２】
［実施例９］
下記表９および表１０に示す組成の反応液（約１０００μＬ）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、ホロセルロース量を測定し、セルラーゼ無添加の比較例９−１のホロセルロース量を１００％として、各反応液について、ホロセルロースの残存率を算出した。この結果を、下記表１０にあわせて示す。
【００８３】
下記表９および表１０において、ペクチナーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のペクチナーゼ（商品名：ペクチナーゼＧアマノ、天野エンザイム社）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５）で希釈した１０ｗ／ｖ％ペクチナーゼ（１０倍希釈）、１ｗ／ｖ％ペクチナーゼ（１００倍希釈）、０．１ｗ／ｖ％ペクチナーゼ（１０００倍希釈）を使用した。前記ペクチナーゼＧアマノは、天野法によるＥｎｄｏ-ＰＧａｓｅ値が、１２００Ｕ／ｇ以上であった。また、下記表９および表１０において、ヘミセルラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のヘミセルラーゼ（商品名：ヘミセルラーゼ「アマノ」９０、天野エンザイム社）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５）で希釈した１０ｗ／ｖ％ヘミセルラーゼ（１０倍希釈）、１ｗ／ｖ％ヘミセルラーゼ（１００倍希釈）、０．１ｗ／ｖ％ヘミセルラーゼ（１０００倍希釈）を使用した。前記ヘミセルラーゼＧアマノは、天野法によるキシラーゼ力が、９００００Ｕ／ｇ以上であった。下記表９において、セルラーゼは、セルラーゼＧＣ２２０（商品名、ジェネンコア社、１６０ＦＰＵ／ｍＬ）である。なお、表１０におけるペクチナーゼおよびヘミセルラーゼの濃度は、反応液中の最終濃度である。
【００８４】
【表９】
2011155933.tif 000010
【００８５】
【表１０】
2011155933.tif 000011
【００８６】
前記表１０に示すように、実施例９−１、９−２および９−３では、ペクチナーゼとセルラーゼとを併用することによって、セルラーゼ単独の比較例９−２における残存率３４．１％を、さらに、２４．８％、２６．５％および３３．５％にまで減少できた。また、実施例９−１は、１０倍量のセルラーゼを用いた比較例９−３の残存率２５．２％と同等であった。また、前記表１０に示すように、実施例９−４、９−５および９−６では、ヘミセルラーゼとセルラーゼとを併用することによって、セルラーゼ単独の比較例９−２における残存率３４．１％を、さらに、２３．９％、２５．９％および３１．９％にまで減少できた。また、１０倍量のセルラーゼを用いた比較例９−３の残存率２５．２％に比べて、実施例９−４は、残存率が低くなり、実施例９−５は、同等の残存率を示した。
【００８７】
また、前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来ヘミセルラーゼアマノ９０および前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のペクチナーゼＧアマノおよびに含まれる酵素タンパク質について、、ＬＣ−ＭＳＭＳ解析に供し、得られたイオンピークのパターンをＭＡＳＣＯＴ解析ならびにＮＣＢＩデータベース解析することにより、同定を行った。
【００８８】
その結果、前記ヘミセルラーゼアマノ９０は、主要な２種類のタンパク質として、配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と、配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質とを含むことがわかった。配列番号８で表わされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＥＵ＿８４８３０４に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＭＳ１９５７  ｅｎｄｏ−１，４−ｂｅｔａ−ｘｙｌａｎａｓｅ  Ａのアミノ酸配列と相同であった。また、配列番号９で表わされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＦＪ７７２０９０に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ＳＣＴＣＣ  ４００２６４  ｘｙｌａｎａｓｅ  Ｂのアミノ酸配列と相同であった。
【００８９】
また、前記ペクチナーゼＧアマノは、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことがわかった。配列番号１０で表わされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＸＭ＿００１４０２４４１に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８  ｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｐｌｙＡのアミノ酸配列と相同であり、配列番号１１に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＸＭ＿００１３８９８８９に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８  ｐｅｃｔｉｎ  ｌｙａｓｅ  ｐｅｌＢのアミノ酸配列と相同であり、配列番号１２に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＸＭ＿００１３９７９６３に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８  ｅｎｄｏ−ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ  ｐｇａＡのアミノ酸配列と相同であり、配列番号１３に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＸＭ＿００１３９９５９１に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８  ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ  ｐｇａＢのアミノ酸配列と相同であり、配列番号１４に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＸＭ＿００１３９０４６９に登録されている、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８  ｐｅｃｔｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｐｍｅＡのアミノ酸配列と相同であった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上のように、本発明によれば、セルラーゼ単独での糖化処理よりも、優れた効率でバイオマスの糖化を行うことができる。このため、木材やその廃棄物等をバイオマスとして有効利用し、エネルギー資源および化成品等を提供できることから、極めて有用といえる。また、本発明によれば、例えば、糖化処理に用いるセルラーゼ量を低減できるため、発酵等の後工程で重要となる、バイオマスの糖化処理のコストを下げることができる。
【図１】
2011155933.tif 000012
【配列表】
2011155933000001.app