(57)【要約】 【課題】  食品としての利用にも許容できる、安全性の高いコレステロール抑制剤を提供すること。【解決手段】  ポリ−γ−グルタミン酸をコレステロール抑制剤の成分として作用させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−γ−グルタミン酸を有効成分として含有することを特徴とするコレステロール抑制剤。
【請求項２】
高コレステロール血症の治療用又は予防用であることを特徴とする請求項１に記載のコレステロール抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のコレステロール抑制剤と、医薬的に許容可能な担体とを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
ポリ−γ−グルタミン酸を有効成分として含有することを特徴とするコレステロール抑制用組成物。
【請求項５】
ポリ−γ−グルタミン酸を１０ｍｇ〜５ｇ含有することを特徴とするコレステロール抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸（以下「γ−ＰＧＡ」とも呼ぶ。）を有効成分として含有するコレステロール抑制剤、及びその医薬又は飲食品への用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の生活は運動不足に加え食生活が欧米化し、高コレステロール血症が高頻度に認められるようになった。本症の存在は動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性心疾患等の重篤な循環器疾患を引き起こす原因になり、これらの疾患の予防及び治療には血中コレステロール抑制剤が有効である事が明らかにされている。
【０００３】
食餌由来のコレステロールならびに食餌摂取に伴い胆嚢から排泄された内因性コレステロールは、胆汁酸、モノグリセリド、脂肪酸の混合ミセルの中に取り込まれ、空腸吸収上皮細胞絨毛に存在するコレステロールトランスポーター（Niemann-Pick C1 Like 1：NPC1L1）により取り込まれる。その後、空腸吸収上皮細胞内でcholesterol acyl transferase  によってエステル化を受け、コレステロールエステルという形で血中に移行する。食餌摂取によって恒常的にコレステロールを過剰に摂取する状況では、血中のLDLコレステロール値が上昇し、高血圧症や、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患の発症につながる危険性の高いことが指摘されている。
【０００４】
血中コレステロールを抑制する薬剤としては、肝臓でのコレステロール合成系に作用する薬剤（スタチン等）や胆汁酸の再吸収を抑制する薬剤（陰イオン交換樹脂系）のほか、最近ではコレステロールの吸収を抑えるNPC1L1阻害剤（ezetimibe；SCH58235）、も開発されている。
【０００５】
一方、腸管内でミネラルの可溶化能を持ち、ミネラルの吸収を促進する物質として、納豆の粘質物の主成分であるポリ−γ−グルタミン酸がある。ポリ−γ−グルタミン酸はその分子内に多数存在するカルボキシル基の作用により、ミネラル可溶化能を有する。さらにまた、γ結合により結合しているため、小腸内に存在する消化酵素により分解されず、腸管内でも活性を保持していると考えられている。このポリ−γ−グルタミン酸は、飼料として用いた場合に、ミネラルの吸収を促進すると共に体脂肪の蓄積量を減少させることが報告されている（例えば、特許文献１参照）が、その作用機構やヒトでの効果については明らかではない。
【０００６】
また分子量が１０，０００〜１００，０００の酸性ポリアミノ酸類などを薬理的有効量として含有する経口高脂血症治療剤が知られており、酸性ポリアミノ酸としてα―ポリグルタミン酸の記載もある（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０９−２８３０９号公報
【特許文献２】特開昭５２−２８９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高コレステロール血症のおそれがある対象者は非常に多いため、これより誘発される動脈硬化症や虚血性心疾患といった疾患を予防する上でも、食餌性コレステロールの吸収を阻害することによって血中コレステロール値を低減させることは非常に重要である。しかし、現在用いられている医薬品のほとんどは副作用の発現が不可避である。本発明は、食品としての利用にも許容できる、安全性の高いコレステロール抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、高コレステロール食にて飼育したモデル動物を用いて、ポリ−γ−グルタミン酸を投与したときの血中ならびに臓器における各種成分を解析していたところ、このようなモデル動物の血中ならびに肝臓におけるコレステロールの上昇がポリ−γ−グルタミン酸の投与によって抑止されること、この作用がコレステロールの吸収抑制に基づくことを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
なお、ポリ−γ−グルタミン酸が脂肪の吸収を抑えることが見出された（「脂肪吸収阻害剤」特願２００７−３３２３６３）。しかしながら、これは中性脂肪の消化に必須酵素である、膵リパーゼを抑えることに基づくことが記載されている。コレステロールの吸収に、膵リパーゼは影響しないので、この知見からはポリ−γ−グルタミン酸のコレステロール抑制作用を容易に説明することはできない。
また特許文献２（「経口高脂血症治療剤」、特開昭５２−２８９４７号）」はα−ポリグルタミン酸がコレステロール抑制を示すことを記載しているが、これはＬ-グルタミン酸がα結合によってポリマー化したものを示している。一方、本願発明は納豆由来の主にＤ−グルタミン酸をγ結合によってポリマー化されたポリ−γ−グルタミン酸に関するものである。
特許文献２に記載のα-ポリグルタミン酸はα位のカルボキシル基がアミノ基と重合してポリマーの主鎖を形成する。α−ポリグルタミン酸は天然に存在しておらず、化学合成により得られる。グルタミン酸はカルボキシル基を２個有するため、化学合成的に重合しようとすると分岐が生じる可能性が高く、分岐を含まない高分子を合成することが極めて困難で、合成できたとしてもそのコストが高く、工業的に使用することが極めて困難である。従って、α−ポリグルタミン酸は試薬として市販され、各種研究に使用されているが、現状、工業的な利用はほとんどされていない。
それに対し、ポリ−γ−グルタミン酸は前述のとおり、天然高分子であり、基質特異性の高い酵素により合成されるため、分子構造は直鎖状である。さらに先の記載のとおり、γ-結合のため消化酵素で分解されないと考えられている。このポリ−γ−グルタミン酸はαタイプのものと全く別の物質であり、反応性や性質・機能は全く異なる。
【００１０】
すなわち、本発明のコレステロール抑制剤やコレステロール抑制用組成物やコレステロール抑制方法は、ポリ−γ−グルタミン酸を有効成分として含有することを特徴とする。１つの実施形態において、当該コレステロール抑制剤は、高コレステロール血症、又はそのおそれがある対象者に投与することが好ましい。すなわち、高コレステロール血症の治療剤や予防剤として使用することができる。また、コレステロール分の多い食事に際し、ポリ−γ−グルタミン酸を、食前２時間から食後４時間の間に経口投与することがさらに好ましい。
【００１１】
本発明の他の観点において、上記コレステロール抑制剤を含有することを特徴とする医薬組成物又は飲食品組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のコレステロール抑制剤は、医薬品又は飲食品組成物として使用することにより、コレステロールの吸収を抑制する必要のある対象者、特に、高コレステロール血症の対象者にとってこれらを予防又は改善するうえで有用である。また、正常人においても、血中コレステロールの上昇が気になる対象者用の保健機能食品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウスγ―PGA長期飲水投与の血漿総コレステロール濃度の推移を示すグラフである。データは平均値±標準偏差で示した（ｎ＝8、＊＊ｐ＜０．０１（対照群との比較））。
【図２】マウスγ―PGA長期飲水投与の肝臓脂質量や肝臓中のトリグリセライド、遊離脂肪酸、コレステロール値を示すグラフである。データは平均値±標準偏差で示した（ｎ＝８、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（対照群との比較））。
【図３】マウスγ―PGA長期飲水投与の血漿総コレステロール濃度の推移を示すグラフである。データは平均値±標準偏差で示した（ｎ＝8、＊＊ ｐ＜０．０１（対照群との比較））。
【図４】マウスγ―PGA長期飲水投与の肝臓脂質量や肝臓中のトリグリセライド、遊離脂肪酸、コレステロール値を示すグラフである。データは平均値±標準偏差で示した（ｎ＝８、＊＊ｐ＜０．０１（対照群との比較））。
【図５】マウスγ―PGA長期飲水投与の一日乾燥糞重量、糞中の総脂質量、トリグリセライド、遊離脂肪酸、コレステロール、中性ステロール、総胆汁酸量を示すグラフである。データは平均値±標準偏差で示した（ｎ＝８、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対照群との比較））。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるコレステロール吸収阻害作用とは、主に腸管内からの脂質の吸収を抑制することによって、血中コレステロールのバランスの崩れを改善する作用をいう。特に、コレステロールの吸収を抑制することで、高コレステロール血症の治療、改善、及び発症を抑制ないし遅らせることをいう。また、「高コレステロール血症」とは、ヒトでは一般的に、血中の総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ、ＬＤＬコレステロール値１４０ｍｇ/ｄＬ以上の対象者をいう。１９９７年に実施された国民栄養調査では高コレステロール血症と診断された男性は２７％、女性は３３％であるといわれている。
【００１５】
本発明に用いられるγ−ＰＧＡは納豆の粘質物中のγ−ＰＧＡを抽出、精製して用いてもよく、納豆菌等のバチルス属の菌体外に分泌するγ−ＰＧＡを抽出、精製して用いてもよい。また、純度が高いものでもよいが、必ずしも純度が高い必要はなく、納豆の粘質物中の、あるいは納豆菌の分泌物であるレバン等の他の物質を含んでいても何ら支障がない。
【００１６】
本発明に用いられるγ−ＰＧＡの平均分子量には、その有効性の観点からは特に制限はなく、通常納豆あるいは納豆菌から分離した場合の重量平均分子量３０００〜３００万の範囲のγ−ＰＧＡを用いることができる。なお、分子量が低いと溶液保存中に分解されやすく、また分子量が高すぎると水溶液の粘度が高すぎて取り扱いが困難となる。従って、医薬組成物や飲食品組成物としての取り扱いの観点から１万〜１００万のγ−ＰＧＡを用いるのが好ましい。なお、γ−ＰＧＡの重量平均分子量は、例えば、光散乱法により測定される。このとき、例えば測定波長６３３ｎｍ、上記波長におけるｄｎ／ｄｃ（屈折率の濃度増分、溶媒１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．６）及び０．３ＭのＮａＣｌ）は、０．１９１である。
【００１７】
γ−ＰＧＡを構成するグルタミン酸は一般的にＤ体とＬ体の両方を含み、菌体あるいは培地の組成により、そのＤ／Ｌ比は変動すると言われている。例えば、特開平３−４７０８７号公報に示されるγ−ＰＧＡはＬ体のグルタミン酸が９０％以上占めるとされている。本発明に用いられるγ−ＰＧＡのＤ／Ｌ比には制限がなく、どのＤ／Ｌ比のγ−ＰＧＡも使用することが出来る。なお、納豆に含まれるγ−ＰＧＡは約８０％のＤ体を含むといわれている。
【００１８】
特定の分子量のγ−ＰＧＡを生成するには、当該分子量より大きいγ−ＰＧＡを酸あるいはγ結合を分解する細菌あるいは臓器由来の酵素により低分子化する方法と、納豆菌等の培養により当該分子量のγ−ＰＧＡを分泌させる方法があるが、そのどちらのγ−ＰＧＡを用いてもよい。
【００１９】
γ−ＰＧＡは一般にナトリウム塩として得られるが、他の医薬的に許容可能か、若しくは可食性の塩、又は遊離のγ−ＰＧＡを用いても何ら影響しない。
【００２０】
本発明のγ−ＰＧＡを有効成分とするコレステロール抑制剤は、これを含有する組成物とすることで、高コレステロール血症の予防、治療及び／又は改善のための、医薬用、動物薬用または飲食用組成物として利用することができる。また、それらの形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品などの飲食品、あるいはＯＴＣなど容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品、動物薬品などとして利用できる。本明細書において「予防」とは、高コレステロール血症を完全に又は部分的に防止することであり、「治療」とは、高コレステロール血症の防止とともに、これらの疾病に起因する悪影響の部分的又は完全な治癒を含む。
【００２１】
本発明のγ−ＰＧＡを有効成分とするコレステロール抑制剤や、これを含有する組成物は、そのまま直接摂取することもできる。また、公知の担体や助剤などの添加剤を使用して、カプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することもできる。また、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類やカルシウム、鉄などのミネラルを添加、併用して用いることもできる。特にγ−ＰＧＡにはミネラル吸収促進作用があることから、これらと併用することが好ましい。本発明のコレステロール抑制剤の投与対象には高コレステロールを予防又は改善する必要のある対象者が含まれるが、肥満を防止するための食事制限にはカルシウムや鉄の吸収低下による骨粗しょう症や貧血といった副作用が伴うことが多い。従って、本発明のコレステロール抑制剤は、カルシウムや鉄などのミネラルを含有させることでコレステロール低下剤としても有用である。
【００２２】
これらの成型剤における本発明のコレステロール抑制剤の含有量は、好ましくは０．１〜１００重量％、より好ましくは１０〜９０重量％である。さらに、飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、はんぺんなどの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類；パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品など、すべての飲食物に使用することができる。
【００２３】
医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、医薬的に許容される他の担体、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。医薬部外品として用いる場合は、必要に応じて他の添加剤などを添加して、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに使用することができ、局所的に用いることもできる。
【００２４】
本発明のコレステロール抑制剤の投与方法は、本発明のコレステロール抑制剤の効果を有効に発揮することを目的として、ヒトにおいて一回の食事摂取につき、γ−ＰＧＡの量に換算して１０ｍｇから５ｇの投与量となるように、投与することを特徴とする。好ましくはコレステロールの多い食事とともに１００ｍｇから１ｇである。１０ｍｇ以下のγ−ＰＧＡ投与では十分なコレステロール抑制作用を示すことができず好ましくない。また、５ｇ以上のγ−ＰＧＡを摂取するのは、摂取量が大量であるため摂取することが負担となり、クオリティオブライフを低下させることに繋がるため好ましくない。また、本発明のコレステロール抑制剤の摂取方法は、食事前、食事中、あるいは、食事後に実施しても構わない。ただし、食事における脂質の吸収を適度に阻害するためには、食事前２時間程度、好ましくは１時間程度前から遅くとも食事後４時間以内、好ましくは２時間以内、もっとも好ましくは１時間以内に実施することが好ましい。
【実施例】
【００２５】
［実施例１］高コレステロール食負荷マウスへのγ−ＰＧＡの飲水投与試験（１）
日本チャールズリバーより搬入された7週齢の雄C57BL6を1週間予備飼育した後、対照群とγ−ＰＧＡ群の２群（各群８匹）に分けた。餌はリサーチダイエット社の４％(w/w)脂肪、１．２５％(w/w)高コレステロール食（D１２１０４）を与え、対照群には水を、γ―PGA群には２．５％γ―PGAを自由飲水摂取させ、4週間飼育した。一週間に一回眼窩静脈叢より採血を行い、同血液から血漿を分離し、富士ドライケム（富士フィルム製）にて総コレステロール値を測定した。投与開始4週間目に一晩絶食下で肝臓を摘出し、肝臓内の脂質をＦｌｏｃｈ法により抽出し肝臓中のトリグリセライド、総コレステロール、遊離脂肪酸の値をテストワコーキット（和光純薬製）にて測定した。試験結果は平均値±標準偏差で図１、２に示した。各群間の有意差検定はｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ法により行い、有意水準は危険率５％以下とした。
【００２６】
図１に示したように、γ−ＰＧＡを飲水で与えた群は、血漿中コレステロール値が有意に抑制されることが分かった。さらに図２に示したようにγ―ＰＧＡを飲水で与えた群は、肝臓中のコレステロール値が有意に低下する事が分かった。
【００２７】
［実施例２］高コレステロール食負荷マウスへのγ−ＰＧＡの飲水投与試験（２）
日本チャールズリバーより搬入された7週齢の雄C57BL6を1週間予備飼育した後、対照群とγ―PGA群の２群（各群８匹）に分けた。餌はリサーチダイエット社の２０％(w/w)脂肪、１．２５％(w/w)コレステロール食（D１２１０８）を与え、対照群には水を、γ―PGA群には２．５％γ―PGAを自由飲水摂取させ、4週間飼育した。一週間に一回眼窩静脈叢より採血を行い、同血液から血漿を分離し、富士ドライケム（富士フィルム製）にて総コレステロール値を測定した。投与開始３−４週間目において糞を採取、４週間目に一晩絶食下、肝臓を摘出、肝臓内の脂質をＦｌｏｃｈ法により抽出し肝臓中のトリグリセライド、総コレステロール、遊離脂肪酸の値をテストワコーキット（和光純薬製）にて測定した。採取した糞の脂質量はソックスレー（ACTAC社）を用いて脂質を抽出しトリグリセライド、遊離脂肪酸の値をテストワコーキット（和光純薬製）にて測定した。コレステロール含有量はガスクロマトグラフィー（Agilent technology）を用いて測定した。また糞中総胆汁酸量はアルコール抽出を行い、総胆汁酸の値をテストワコーキット（和光純薬製）にて測定した。試験結果は平均値±標準偏差で図３、４、５に示した。群間の有意差検定はｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ法により行い、有意水準は危険率５％以下とした。
【００２８】
図３に示したように、γ−ＰＧＡを飲水で与えた群は、血漿中コレステロール値が有意に低下することが分かった。図４に示したようにγ―ＰＧＡを飲水で与えた群は、肝臓中のコレステロール値が有意に低下する事が分かった。図５で示したように糞中のコレステロール排泄量がγ―ＰＧＡ投与で有意に増加した。さらにγ−PGAは糞中の胆汁酸量を抑制した。胆汁酸を吸着することでコレステロール低下作用をもつコレスチラミンは対照に比べて糞中コレステロール増加とともに胆汁酸が増加することが報告されている（非特許文献、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．２００５、９４、３３１−３３７）ので、γ−ＰＧＡは胆汁酸吸着ではなくコレステロールの吸収を抑制することでコレステロール低下作用を示していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のコレステロール抑制剤は、安全性が高く、優れたコレステロール抑制効果を有している。従って、健康食品や保健機能食品などの飲食品、又は医薬品への使用に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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