(57)【要約】      （修正有）【課題】高い蛍光性と耐褪色性を有する蛍光プローブ、高感度かつ定量精度の高い標的分子の検出方法、および免疫グロブリン誘導体、を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で表される蛍光プローブ。（一般式（１）中、Ｄ１は蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）2011022016.tif 000021【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されることを特徴とする蛍光プローブ。
【化１】
2011022016.tif 000015
（（一般式（１）中、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）
【化２】
2011022016.tif 000016
（一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。））
【請求項２】
Ｌ１が親水性の連結基であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
ｎが２以上８以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
下記一般式（１）で表される蛍光プローブの蛍光を検出する手段を有することを特徴とする標的分子の検出方法。
【化３】
2011022016.tif 000017
（（一般式（１）中、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）
【化４】
2011022016.tif 000018
（一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。））
【請求項５】
前記蛍光を検出する手段が表面プラズモン共鳴励起蛍光法であることを特徴とする請求項４に記載の標的分子の検出方法。
【請求項６】
前記標的分子が生体分子であることを特徴とする請求項４または５に記載の標的分子の検出方法。
【請求項７】
前記一般式（１）で表される蛍光プローブが免疫グロブリン誘導体に結合し、生体分子を検出することを特徴とする請求項６に記載の標的分子の検出方法。
【請求項８】
下記一般式（１）で表される蛍光プローブを結合させ含有させたことを特徴とする免疫グロブリン誘導体。
【化５】
2011022016.tif 000019
（（一般式（１）中、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）
【化６】
2011022016.tif 000020
（一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。））
【請求項９】
Ｌ１が親水性の連結基であることを特徴とする請求項８に記載の免疫グロブリン誘導体。
【請求項１０】
ｎが２以上８以下であることを特徴とする請求項８または９に記載の免疫グロブリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光プローブ、標的分子の検出方法、および免疫グロブリン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤のスクリーニングや金属イオン、生体分子の検出など、標的分子を検出する手段として蛍光プローブを作用させその蛍光を検出する手段が知られている。特に生体分子の検出には蛍光プローブが用いられることが多く、夾雑物の持つ自家蛍光を避ける為に長波長で励起できる蛍光プローブが求められている。長波長で励起可能な蛍光プローブとしてはシアニン色素類が普及しているが、褪色しやすいという問題があった。
【０００３】
また標的分子の相互作用を調べる方法や標的分子を検出する方法として、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下「ＳＰＲ」とも記す。）を使用した分光分析法が知られている。例えば、特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。
【０００４】
また、下記特許文献２、３、及び５には、表面プラズモン共鳴を用いた２次元イメージング装置が開示され、特許文献４には、表面プラズモン共鳴測定、及び発生した蛍光が生じる第２のプラズモン共鳴を用いた表面プラズモン蛍光顕微鏡が開示され、特許文献６にはプラズモン共鳴蛍光を用いた生体分子相互作用検出装置及び検出方法が開示されている。
【０００５】
これら表面プラズモン共鳴励起蛍光法では、金属基板上に担体や生体分子捕捉物質等を介して固定された蛍光物質に対し、表面プラズモン共鳴によって生じた増強励起光が照射され、発する蛍光を検出する。この方法は伝播励起光を用いた一般的な蛍光分析法に比べ、局所的に強い励起エネルギーを与えることができる優れた方法であるが、それがゆえに得られる蛍光量のばらつきが大きくなり、定量精度が低下するという問題を孕んでいた。
【０００６】
また強いエネルギーを与えることによる色素の褪色が、感度および定量精度の低下を引き起こすという問題があり、これについても改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献３】特開２００２−１１６１４９号公報
【特許文献４】特開２００４−１５６９１１号公報
【特許文献５】特開２００４−２７１３３７号公報
【特許文献６】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、本発明の目的は、高い蛍光性と耐褪色性を有する蛍光プローブ、高感度かつ定量精度の高い標的分子の検出方法、および免疫グロブリン誘導体、を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記目的は、下記の構成により達成される。
【００１０】
１．下記一般式（１）で表されることを特徴とする蛍光プローブ。
【００１１】
【化１】
2011022016.tif 000002
【００１２】
（（一般式（１）中、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）
【００１３】
【化２】
2011022016.tif 000003
【００１４】
（一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。））
２．Ｌ１が親水性の連結基であることを特徴とする前記１に記載の蛍光プローブ。
【００１５】
３．ｎが２以上８以下であることを特徴とする前記１または２に記載の蛍光プローブ。
【００１６】
４．下記一般式（１）で表される蛍光プローブの蛍光を検出する手段を有することを特徴とする標的分子の検出方法。
【００１７】
【化３】
2011022016.tif 000004
【００１８】
（（一般式（１）中、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）
【００１９】
【化４】
2011022016.tif 000005
【００２０】
（一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。））
５．前記蛍光を検出する手段が表面プラズモン共鳴励起蛍光法であることを特徴とする前記４に記載の標的分子の検出方法。
【００２１】
６．前記標的分子が生体分子であることを特徴とする前記４または５に記載の標的分子の検出方法。
【００２２】
７．前記一般式（１）で表される蛍光プローブが免疫グロブリン誘導体に結合し、生体分子を検出することを特徴とする前記６に記載の標的分子の検出方法。
【００２３】
８．下記一般式（１）で表される蛍光プローブを結合させ含有させたことを特徴とする免疫グロブリン誘導体。
【００２４】
【化５】
2011022016.tif 000006
【００２５】
（（一般式（１）中、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。）
【００２６】
【化６】
2011022016.tif 000007
【００２７】
（一般式（２）中、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。））
９．Ｌ１が親水性の連結基であることを特徴とする前記８に記載の免疫グロブリン誘導体。
【００２８】
１０．ｎが２以上８以下であることを特徴とする前記８または９に記載の免疫グロブリン誘導体。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、高い蛍光性と耐褪色性を有する蛍光プローブ、高感度かつ定量精度の高い標的分子の検出方法、および免疫グロブリン誘導体、を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の生体分子検出方法に用いる生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】本実施の生体分子検出方法に用いる生体分子検出装置で使用される検出部の構成の一例を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
〔一般式（１）の蛍光プローブ〕
本発明の一般式（１）の蛍光プローブについて説明する。
【００３２】
前記一般式（１）において、Ｄ１は下記一般式（２）で表される蛍光性の置換基を表し、Ｌ１は単結合または２価の連結基を表し、ｎは１〜３２の自然数を表し、Ｌ２はｎが１の場合単結合を表し、ｎが２以上の場合（ｎ＋１）価の連結基を表す。Ａ１は縮合反応性あるいは付加反応性の置換基を表す。
【００３３】
一般式（２）において、Ｒ１〜Ｒ７は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｒ８、Ｒ９は各々独立に、ハロゲン原子または置換基を表し、Ｘ１、Ｘ２は各々独立に、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０を表し、Ｒ１０は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つは単結合を表し、一般式（１）中のＬ１に連結している。
【００３４】
一般式（２）において、Ｒ１〜Ｒ９で表される置換基としては、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、２−メチルペンチル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基、１−プロピルブチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、イソオクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基、イソデシル基、ウンデシル基、ドデシル基等）、シクロアルキル基（例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等）、アルケニル基（例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、ブテニル基、２−ブテニル基、アリル基等）、シクロアルケニル基（シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロオクタジエニル基等）、アルキニル基（例えば、アセチレニル基、プロピニル基、ブチニル基、プロパルギル基等）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ピレニル基、ペンタセニル基等）、ヘテロ環基（例えば、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、キナゾリル基、フタラジニル基、ピロリル基、２−キノリル基、１−イソキノリル基等の芳香族ヘテロ環基、例えば、ピロリジニル基、イミダゾリジニル基、モルホリニル基、オキサゾリジニル基、２−テトラヒドロフラニル基、２−テトラヒドロチエニル基、２−テトラヒドロピラニル基、３−テトラヒドロピラニル基等の非芳香族ヘテロ環基）、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルコキシ基（例えば前述のアルキル基と酸素原子を組み合わせてできるアルコキシ基）、アリールオキシ基（アリール基としては前述のアリール基として挙げたものと同義）、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基（ヘテロ環としては前述のヘテロ環基として挙げたものと同義）、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基（アルコキシ部位は前述のアルコキシ基と同義）、アリールオキシカルボニルオキシ基（アリール部位は前述のアリール基と同義）、アミノ基、アルキルおよびアリールアミノ基（アルキル部位、アリール部位としてはそれぞれ前述のアルキル基、アリール基として挙げたものと同義）、アニリノ基、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基（アルコキシ部位は前述のアルコキシ基と同義）、アリールオキシカルボニルアミノ基（アリール部位は前述のアリール基として挙げたものと同義）、スルファモイルアミノ基、アルキルおよびアリールスルホニルアミノ基（アルキル部位、アリール部位としてはそれぞれ前述のアルキル基、アリール基として挙げたものと同義）、メルカプト基、アルキルチオ基（アルキル部位は前述したアルキル基と同義）、アリールチオ基（アリール基部位は前述のアリール基として挙げたものと同義）、ヘテロ環チオ基（ヘテロ環としては前述のヘテロ環基として挙げたものと同義）、スルファモイル基、スルホ基、アルキルおよびアリールスルフィニル基、アルキルおよびアリールスルホニル基（アルキル部位、アリール部位としてはそれぞれ前述のアルキル基、アリール基として挙げたものと同義）、アシル基、アリールオキシカルボニル基（アリール部位は前述のアリール基として挙げたものと同義）、アルコキシカルボニル基（アルコキシ部位は前述のアルコキシ基と同義）、カルバモイル基、アリールおよびヘテロ環アゾ基（アリール部位、ヘテロ環部位は前述のアリール基、ヘテロ環基と同義）、イミド基、シリル基、ヒドラジノ基、ウレイド基、ボロン酸基、ホスファト基、スルファト基、ホスホノ基、その他の公知の置換基が挙げられる。
【００３５】
これらの基は更に同義の置換基やハロゲン原子によって置換されていてもよい。これはオリゴエチレングリコール基やオリゴプロピレングリコール基のような繰り返し置換されているものを含む。Ｒ１〜Ｒ９はそれぞれ同一であっても異なっていても良い。また上記の置換基が酸性基あるいは塩基性基である場合、イオンとなって塩を作っていても良い。
【００３６】
Ｘ１およびＸ２とはＯ、ＳまたはＮＲ１０のいずれかであり、Ｒ１０とはＲ１〜Ｒ９と同義の置換基である。Ｘ１、Ｘ２は同一であっても異なっていても良く、いずれもＮＲ１０である場合には、複数のＲ１０は同一であっても異なっていても良い。Ｘ１およびＸ２はＯであることが好ましい。
【００３７】
一般式（１）において、Ｌ１で表される２価の連結基の例としては、−Ｏ−基、−Ｓ−基、−ＣＯ−基、−ＣＳ−基、−ＳＯ−基、−ＳＯ２−基、−ＮＨ−基、−ＮＲ１０−（Ｒ１０は前述の置換基）及び下記の基、及びこれらの基を複数組み合わせてできる基を挙げることができる。
メチレン基［−ＣＨ２−］、
エチリデン基［＞ＣＨＣＨ３］、
イソプロピリデン［＞Ｃ（ＣＨ３）２］、
１，２−エチレン基［−ＣＨ２ＣＨ２−］、
１，２−プロピレン基［−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−］、
１，３−プロパンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−］、
２，２−ジメチル−１，３−プロパンジイル基［−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−］、
２，２−ジメトキシ−１，３−プロパンジイル基［−ＣＨ２Ｃ（ＯＣＨ３）２ＣＨ２−］、
２，２−ジメトキシメチル−１，３−プロパンジイル基［−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＣＨ３）２ＣＨ２−］、
１−メチル−１，３−プロパンジイル基［−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−］、
１，４−ブタンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−］、
１，５−ペンタンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−］、
オキシジエチレン基［−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−］、
チオジエチレン基［−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−］、
３−オキソチオジエチレン基［−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯＣＨ２ＣＨ２−］、
３，３−ジオキソチオジエチレン基［−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−］、
１，４−ジメチル−３−オキサ−１，５−ペンタンジイル基［−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−］、
３−オキソペンタンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２−］、
１，５−ジオキソ−３−オキサペンタンジイル基［−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−］、
４−オキサ−１，７−ヘプタンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−］、
３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−］、
１，４，７−トリメチル−３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジイル基
［−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−］、
５，５−ジメチル−３，７−ジオキサ−１，９−ノナンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−］、
５，５−ジメトキシ−３，７−ジオキサ−１，９−ノナンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ（ＯＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−］、
５，５−ジメトキシメチル−３，７−ジオキサ−１，９−ノナンジイル基
［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−］、
４，７−ジオキソ−３，８−ジオキサ−１，１０−デカンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＨ２−］、
３，８−ジオキソ−４，７−ジオキサ−１，１０−デカンジイル基［−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−］、
１，３−シクロペンタンジイル基［−１，３−Ｃ５Ｈ８−］、
１，２−シクロヘキサンジイル基［−１，２−Ｃ６Ｈ１０−］、
１，３−シクロヘキサンジイル基［−１，３−Ｃ６Ｈ１０−］、
１，４−シクロヘキサンジイル基［−１，４−Ｃ６Ｈ１０−］、
２，５−テトラヒドロフランジイル基［２，５−Ｃ４Ｈ６Ｏ−］
ｐ−フェニレン基［−ｐ−Ｃ６Ｈ４−］、
ｍ−フェニレン基［−ｍ−Ｃ６Ｈ４−］、
α，α′−ｏ−キシリレン基［−ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−］、
α，α′−ｍ−キシリレン基［−ｍ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−］、
α，α′−ｐ−キシリレン基［−ｐ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−］、
フラン−２，５−ジイル−ビスメチレン基［２，５−ＣＨ２−Ｃ４Ｈ２Ｏ−ＣＨ２−］、
チオフェン−２，５−ジイル−ビスメチレン基［２，５−ＣＨ２−Ｃ４Ｈ２Ｓ−ＣＨ２−］、
イソプロピリデンビス−ｐ−フェニレン基［−ｐ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（ＣＨ３）２−ｐ−Ｃ６Ｈ４−］。
【００３８】
Ｌ１は親水性基であることが好ましく、例えばスルホ基、スルファト基、ホスホノ基、ホスファト基で置換された連結基やオリゴエチレングリコールやオリゴプロピレングリコール構造を有する連結基が好ましく挙げられ、好ましくはオリゴエチレングリコール構造あるいはオリゴプロピレングリコール構造を有する連結基である。より好ましくはオリゴエチレングリコール構造を有する連結基である。さらにオリゴエチレングリコール構造が、エチレングリコールユニットが２〜５０ユニット連なった構造であることが好ましく、４〜３０ユニット連なった構造であることが好ましく、１０〜２５ユニット連なった構造であることが好ましい。
【００３９】
ｎは自然数であり、１〜１６であることが好ましく、２〜８であることがより好ましい。
【００４０】
Ｌ２で表される（ｎ＋１）価の連結基としては、Ｌ１の２価の連結基から水素原子を（ｎ−１）個取り除き結合手とした基、あるいはＲ１〜Ｒ１０と同義の置換基から水素原子をｎ個取り除き結合手とした基が挙げられる。
【００４１】
Ａ１で表される縮合反応性あるいは付加反応性の置換基とは、異なる分子と縮合反応あるいは付加反応を起こす前駆体となる置換基である。
【００４２】
縮合反応性あるいは付加反応性の置換基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、スクシンイミジル基、マレイミド基、ヒドロキシ基、アルケニル基、アルキニル基などが挙げられる。これらは他の分子のアミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、ヒドロキシ基等と反応することで、アミド結合、エステル結合、チオールエステル結合、スルフィド結合などの結合を形成する。結合を形成する為の反応は標識反応として当該業者に広く知られており、それら公知の方法に従えばよい。
【００４３】
以下に、一般式（１）で表される蛍光プローブの具体例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【００４４】
【化７】
2011022016.tif 000008
【００４５】
【化８】
2011022016.tif 000009
【００４６】
【化９】
2011022016.tif 000010
【００４７】
【化１０】
2011022016.tif 000011
【００４８】
本発明の蛍光プローブは一般的なＢＯＤＩＰＹ合成法であるＬｉｎｄｓｅｙ法（アルデヒド誘導体とピロールとを酸触媒を用いて縮合させる方法）やアルデヒド誘導体の代わりに酸無水物誘導体を用いる方法、またＬｉｅｂｅｓｋｉｎｄ−Ｓｒｏｇｌ反応（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，  １２２，  １１２６０−１１２６１）を用いて合成することが可能である。
【００４９】
例えばＫＭＦ−７は下記ルートに従い合成できる。
【００５０】
（合成例）
（ＫＭＦ−７の合成）
（合成経路）
【００５１】
【化１１】
2011022016.tif 000012
【００５２】
（２の合成）
１（１７ｍｍｏｌ）、７（６７ｍｍｏｌ）を３００ｍｌのドライエタノールに溶解し、０℃で攪拌した。次にナトリウムエトキシド（２０質量％、エタノール溶液、６７ｍｍｏｌ）を滴下し、２ｈ攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、得られた沈殿をろ取し、洗浄、乾燥した。これをトルエン（６０ｍｌ）に再溶解し、２ｈ加熱還流した。溶媒を除去し、再結晶後、カラムクロマトグラフィーにより精製し、２（７ｍｍｏｌ）を得た。
【００５３】
（３の合成）
２（５ｍｍｏｌ）をエタノール（５０ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＨ（７５ｍｍｏｌ）と水（２２．５ｍｌ）から調製した水溶液を混合、１ｈ加熱還流した。液を塩酸で酸性にして、得られた固体をろ取し、洗浄乾燥を経て、３（４．５ｍｍｏｌ）を得た。
【００５４】
（４〜６の合成）
３（２ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（３ｍｌ）に溶解し、５０℃で１０ｍｉｎ攪拌し、４を合成した。さらに８を加え８０℃で１．５ｈ攪拌した。冷却後、氷水で冷やした重曹水に反応液を流し込み、得られた沈殿をろ取洗浄乾燥し、５を得た。クロロホルム（２５ｍｌ）を加えて攪拌し、ＢＦ３エーテル錯体（０．５ｍｌ）、トリエチルアミン（０．３ｍｌ）を添加した後、８０℃で３０ｍｉｎ攪拌した。反応液を濃縮、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６（ＫＭＦ−７）（０．５ｍｍｏｌ）を得た。
【００５５】
一般式（１）の蛍光プローブを結合させ含有させることで、さまざまな分子を蛍光法によって検出することが可能であるが、この方法は生体分子の検出方法として適している。生体分子を検出する為には、一般式（１）の蛍光プローブを、生体分子を特異的に認識して吸着する物質（Ｆ）（「生体分子捕捉物質」あるいは「被検体捕捉物質」ともいう。例えば抗原に対する抗体（免疫グロブリン）等が挙げられる。）に結合して用いることが好ましい。生体分子捕捉物質（Ｆ）に蛍光プローブを結合し、生体分子と相互作用させて、その蛍光を測定することによって標的分子である生体分子の検出が可能となる。
【００５６】
標的分子である生体分子としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖あるいはこれらの分解物等が挙げられる。「生体分子捕捉物質」としては、これらを特異的に認識し捕捉することのできる相補的なＤＮＡやＲＮＡ、免疫グロブリン（抗体とも表す）、レクチン、あるいはインプリントポリマー等が挙げられる。
【００５７】
本発明において生体分子捕捉物質は免疫グロブリン誘導体が好ましい。免疫グロブリン誘導体とは免疫グロブリン、免疫グロブリンの化学修飾体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメントなどである。
【００５８】
生体分子を捕捉する方法としては、従来公知のアッセイに従えばよく、文献：バイオ検査薬の開発（株式会社シーエムシー出版）、バイオ診断薬の開発・評価と企業（株式会社シーエムシー出版）やその引用文献、イムノアッセイ講義（ＷＥＢ情報、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｂａｙａｇｉ．ｃｏ．ｊｐ／ＩＡ−ＬＥＣＵＴＵＲＲＥ／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）等が参考になる。本発明においては、イムノアッセイが好ましい。
【００５９】
例えば、後述する検出層に用いるセンサー基板として金基板を選び、サンドイッチイムノアッセイを行う場合には、金基板にカルボキシル基やアミノ基等の反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有するアルカンチオールを作用させてＳＡＭ膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：「自己組織化単分子膜」ともいう。）を形成し、これに適宜ポリマー等を介し、一次抗体を作用させ固定化する。また、一次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接金基板上に固定化し、その上に一次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。このようにして構成した検出層に抗原を含む溶液を流すことで、固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対し、さらに標識した二次抗体を含む溶液を作用させることで捕捉された抗原を標識することができる。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから該固定化した一次抗体に作用させてもよい。
〔標的分子の検出方法〕
本発明の標的分子の検出方法は一般式（１）の蛍光プローブを、直接あるいは間接的に標的分子に作用させ、蛍光プローブの蛍光を検出することで、標的分子を検出するものである。蛍光を検出する手段としては、蛍光光度計や蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダ、表面プラズモン共鳴励起蛍光法など公知の蛍光検出手段が利用可能である。
【００６０】
本発明の蛍光プローブは、表面プラズモン共鳴励起蛍光法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＳＰＦＳ」とも記す。）を利用した標的分子の検出に好適であり、これを例にとって標的分子の検出方法について説明する。
【００６１】
表面プラズモン共鳴励起蛍光法の一般的なプロトコルを以下に示す。この方法は、プリズム（Ａ）と、プリズム表面の金属薄膜及び被検体検出層を有する被検体検出手段（Ｂ）と、レーザー発生手段（Ｃ）と、第１及び第２光検出手段（Ｄ、Ｅ）とを備えた装置を用い、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光の反射強度を第１光検出手段（Ｄ）で検出し、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光によって薄膜裏面に生じるプラズモン光によって励起された蛍光分子が出力する蛍光を、第２光検出手段（Ｅ）で検出する、という手順で行われる。
【００６２】
次にプラズモン光の特性について以下に説明する。
【００６３】
プラズモン光は、レーザー光が金属薄膜に対し全反射条件で照射されたときに、第１光検出手段（Ｄ）によって検出される反射光の強度が減衰する入射角領域で薄膜裏面に発生し、その強度はレーザー光の入射角度に依存して変動する。反射光強度の減衰が最大となるときのレーザー光入射角度を第１の入射角度とすると、その近傍でプラズモン光の強度が最大となるが、厳密にはプラズモン光の強度が最大となるときのレーザー光の入射角度（第２の入射角度）は、第１の入射角度よりわずかに低角度となる。この理論値の算出にあたっては、文献：Ｔ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｓｕｒｆａｃｅ−ｐｌａｓｍｏｎ  ｆｉｅｌｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ  １７１（２０００）１１５−１３０やその引用文献等を参考にして算出することができる。
【００６４】
プラズモン光は近接場光であり、その電場強度は金属薄膜からの距離が離れるほど減衰するという特性を有しており、また蛍光分子が金属薄膜のごく近傍に位置する場合、金属薄膜へと励起エネルギーの遷移が起きる。
〔標的分子検出装置〕
以下、本発明に係る標的分子検出装置の構成例について生体分子を検出する場合を例にとって示すが、本発明はこれに限定されない。
【００６５】
図１は、本発明の実施の形態に係る生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。本実施の形態に係る生体分子検出装置は、プリズム１と、プリズム１の上に形成された、検出対象の生体分子（以下「被検体」と記す。）を含む試料を保持する被検体検出部（以下「検出部」と記す。）２と、レーザー発生装置３と、レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌの光路上に配置された偏光板４１、絞り４２、シャッタ４３、回転ミラー４４及びレンズ４５で構成される光制御部４と、光検出手段である第１及び第２ＣＣＤカメラ５、６と、第１及び第２フィルター７、８と、を備えている。
【００６６】
図２は、プリズム１の上に形成される検出部２の構成の一例を示す断面図である。プリズム１には、高屈折率の４５度直角プリズムを用いることができる。検出部２は、プリズム１の表面にスパッター法あるいは蒸着法により３０〜６０ｎｍ（望ましくは４０〜６０ｎｍ、より望ましくは４３〜５３ｎｍ）の厚さに形成された金薄膜２１と、金薄膜２１表面上にスペーサ２３によって周囲を囲まれて形成された、抗原と反応させる抗体を含む被検体検出層（以下「検出層」ともいう。）２４と、石英基板２５と、これらを固定する固定具２２と、を備えている。ここで、スペーサ２３、検出層２４及び石英基板２５によって、バッファ空間２７が形成されており、石英基板２５には貫通孔によって流路２６ａ、２６ｂが形成されている。流路２６ａ、２６ｂは、試料溶液をバッファ空間２７に注入するために使用され、例えば、試料溶液を、流路２６ａからチューブ（図示せず。）を介してバッファ空間２７に注入し、流路２６ｂから別のチューブ（図示せず。）を介してバッファ空間２７から排出させる。検出層２４には、抗体を結合させ含有させたＳＡＭ膜や高分子材料を用いることができる。抗体はＳＡＭ膜や高分子材料の一方の端部に結合されており、ＳＡＭ膜や高分子材料の他方の端部は、直接若しくは間接に金薄膜２１表面に固定されている。高分子材料は複数種類が介在していてもよい。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、以下「ＰＥＧ」と記す。）やＭＰＣポリマー（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを前駆体とするポリマー）等が挙げられる。これは用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。
【００６７】
第１ＣＣＤカメラ５は、金薄膜による反射レーザー光を観測するためのものであり、第１フィルター７を介して反射レーザー光を受光可能な位置に配置されている。一方、第２ＣＣＤカメラ６は、検出層２４に含まれている蛍光分子からの蛍光を検出するためのものであり、観測波長に適した蛍光用高感度ＣＣＤカメラと第２フィルター８とが、検出部２の上方に設置されている。ここで、第１ＣＣＤカメラ５は、少なくとも反射光強度を測定することができればよく、２次元撮像ができなくてもよく、フォトダイオードであってもよい。
【００６８】
レーザー発生装置３には、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを使用することができる。また、回転ミラー４４は、ミラーの角度を変更することが可能であり、レーザー光Ｌの金薄膜２１への入射角θを、例えば、θ＝２８〜６２（度の範囲で変化させることができる。なお、図１において、レーザー光Ｌが通過するプリズム表面での光路の屈曲は省略している。
【００６９】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌは、偏光板４１によってＰ偏光され、絞り４２を通過し、シャッタ４３が開いている間、回転ミラー４４、レンズ４５及びプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射され、その反射光が、レンズ４５及びフィルター７を介して第１ＣＣＤカメラ５で測定される。また、検出層２４内の蛍光分子からの蛍光は、第２ＣＣＤカメラ６で測定される。
【００７０】
〔生体分子の検出方法の詳細な説明〕
次に、本生体分子の検出装置を用いた生体分子の検出方法を、具体例を挙げて説明するが本発明はこれに限定されない。
【００７１】
まず検出部２のバッファ空間２７に、ＰＢＳ緩衝液（燐酸緩衝液ｐＨ＝７．２）を注入する。
【００７２】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌを、回転ミラー４４のミラー表面の角度を固定し、上記のようにプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射させ、その反射光を第１ＣＣＤカメラ５で測定し、反射強度を記録する。周知のように、偏光板４１を介してＰ偏光されたレーザー光Ｌは、金薄膜２１中の電子振動とカップリングしてＳＰＲ現象を生じた場合、反射光の強度が減少する。この反射光の強度が最低値になるように回転ミラーの角度を調整する（ここからプラズモン光が最大となる入射角となるようにミラー角度を変更しても構わない。）。
【００７３】
バッファ空間２７中の検出層２４には予め抗体を固定しておき、これに対する抗原を含む溶液を流した後、本発明の蛍光プローブを結合含有させた二次抗体を含む溶液等を流す。
【００７４】
これによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるプラズモン光によって、検出層２４内の蛍光分子が励起され、蛍光を発生する。
【００７５】
発生した蛍光を、検出部２の上方に位置する第２ＣＣＤカメラ６で測定、即ち２次元撮像する。得られた２次元画像における各画素の輝度が、検出層上の各場所での蛍光強度に対応する。
【００７６】
以上のように、第２ＣＣＤカメラ６による蛍光強度の測定によって、検出層２４に注入した溶液中の抗原を検出することができる。
【００７７】
なお、プリズム表面に形成される薄膜は、金薄膜に限定されず、その他の金属（銀等）や、金属酸化物（ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ａｇ２Ｏ等）の薄膜であってもよい。
【００７８】
また、上記では、流路を有する石英基板及びスペーサを備えた検出部を説明したが、これに限定されない。金薄膜表面上に被検体検出層が形成され、被検体の生体分子を保持することができる構造であればよい。
【００７９】
また、上記では１つの検出層を備える場合を説明したが、金薄膜上に、異なる抗体を含む複数の検出層をアレイ状に配列して検出部を形成してもよい。
【００８０】
また、上記においては、１種類の蛍光分子を用いる場合を説明したが、これに限定されず、複数種類の抗体と、抗体の種類毎に、蛍光波長の異なる蛍光分子を結合させ含有させて検出部を形成してもよい。この場合、ＳＰＲ測定及びＳＰＦＳ測定は、蛍光分子の種類に応じた波長の異なる複数のレーザー光あるいは各種フィルターを挿入したランプを用いて行う。
【００８１】
また、第一光検出手段はＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長のレーザー光を測定可能なものであればよい。例えばフォトダイオード等を用いることができる。同様に第２光検出手段も、上記したＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長の蛍光を測定可能なものであればよい。例えば光電子増倍管等を用いてもよい。
【００８２】
照射する光源としては直進性のある形で光線を取り出せる光源であればよく、半導体レーザーでもＬＥＤでもランプでも構わない。
【００８３】
照射光を走査する方法としては、回転ミラーに限定されず、光源そのものをステージコントローラー等で走査させてもかまわない。
【００８４】
プリズムの形状としては、９０度の三角プリズムに限定されず、６０度の三角プリズムや半円柱のプリズムを用いてもよい。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００８６】
実施例１
＜抗体修飾＞
（比較の標識抗体溶液の調製）
抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、比較の蛍光プローブＣｙ５（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｉｏｎａｌ  ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ（ＧＥヘルスケア社製））を０．５ｍｇ、ＰＢＳ緩衝液を５ｍｌ混合、２時間反応を行うことで、比較の蛍光色素を含む比較の蛍光プローブが結合された比較の標識抗体溶液（比較の蛍光標識抗体のＰＢＳ緩衝液）を得た。これをスピンカラムによって精製し、アッセイに用いた。
【００８７】
【化１２】
2011022016.tif 000013
【００８８】
（本発明の標識抗体溶液の調製）
ＷＳＣ（Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、即ち、１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を１０ｍｇ、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を５ｍｇ、本発明の蛍光プローブＫＭＦ−１〜ＫＭＦ−１２をそれぞれ０．５μｍｏｌ、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）１ｍｌを混合し、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）４０μｌをＰＢＳ緩衝液５ｍｌで希釈した溶液に加え、２時間反応を行うことで、本発明の蛍光色素（一般式（２））を含む本発明の蛍光プローブが結合された本発明の標識抗体溶液（本発明の蛍光標識抗体のＰＢＳ緩衝液）をそれぞれ得た。これをスピンカラムによって精製し、アッセイに用いた。
【００８９】
（蛍光強度の評価）
標識抗体溶液をＰＢＳ緩衝液で希釈して０．５ｎＭに調製し、蛍光強度（励起光６３３ｎｍ）を測定した。蛍光強度は比較の標識抗体溶液を１として計算し、１．２倍以上であるものを◎、１．２倍未満から１倍であるものを○、１倍未満であるものを×とした。
【００９０】
結果を表１に示す。
【００９１】
＜表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した免疫測定＞
（検出部の作製）
図２に示したように、プリズム１として、高屈折率の４５度直角プリズムであるＳＣＨＯＴＴ  ＧＬＡＳＳ社製のＬａＳＦＮ９（屈折率ｎ＝１．８５）を用い、その底面にスパッター法により膜厚約４８ｎｍの金薄膜２１を形成し、流路２６ａ、２６ｂが形成された石英基板２５を、厚さ２ｍｍのシリコンゴムのスペーサ２３で挟んで金薄膜２１の上に設置した。これに、ポンプを用いて、ＰＢＳ緩衝液（りん酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）を注入した。このときのセル容積はおよそ１６０μｌであった。
【００９２】
次にＨＳ−（ＣＨ２）１０−ＣＯＯＨの０．５ｍＭ・ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液をポンプにより、石英基板２５を形成した段階の検出部に注入して１夜放置し、金薄膜２１の表面に自己組織化膜を形成させた。
【００９３】
＜サンプルの測定＞
レーザーは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いた。
【００９４】
前述のとおりに検出部の作製を行った後に、第１ＣＣＤに照射される反射光強度が最小となるようにレーザー入射光角度を調整して、第２ＣＣＤを用いて上方から検出部のレーザー照射範囲中心部の０．２ｍｍ角を観察し、このときの第２ＣＣＤのカウント値を０点として調整した。
【００９５】
その後、検出部にＮ−ヒドロキシスクシンイミドが２５ｍＭ、ＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が５０ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を注入し３０分作用させた後、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）５μｇ／ｍｌを注入し、３０分作用させた。その後１％ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液（１質量％牛血清アルブミン−ＰＢＳ緩衝液）を４０分作用させ、ブロッキングを行ったのち、ＰＢＳ緩衝液を注入し３０分洗浄した。
【００９６】
次に、抗原としてのＡＦＰ−ＰＢＳ緩衝液（α−フェトプロテイン、１００ｎｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを循環させながら３０分間反応させ、後、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）で５分洗浄した後、標識抗体溶液（表１に記載の種類、８．５μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを循環させながら２０分作用させた。その後ＰＢＳ緩衝液にて洗浄し、１０分後第２ＣＣＤから観察したときのカウント値を計測した。またこの時点から５分間のカウント値の最大値と最小値の差を算出し、アッセイシグナルに対してのばらつきを観測した。
【００９７】
次にアッセイシグナルを観測した時点から３０分後の第２ＣＣＤのカウント値を計測した。これにより３０分露光し続けた時の有効な色素の残存率を算出した。
【００９８】
結果を表１に示す。
【００９９】
【表１】
2011022016.tif 000014
【０１００】
表１から明らかなように、本発明を用いることで１つの生体分子当たりの蛍光強度を大幅に上げることができ、また測定値のばらつきも抑制できる。つまり従来の表面プラズモン共鳴励起蛍光法（ＳＰＦＳ法）に比べて高感度、高精度に生体分子の検出を行うことが可能となった。また本発明を用いることでプラズモン光による励起条件下でも、従来の標識に比べ、有効な色素の残存率を向上させることが出来た。
【符号の説明】
【０１０１】
１  プリズム
２  被検体検出部
３  レーザー発生装置
４  光制御部
５  第１ＣＣＤカメラ
６  第２ＣＣＤカメラ
７  第１フィルター
８  第２フィルター
２１  金薄膜
２２  固定具
２３  スペーサ
２４  被検体検出層
２５  石英基板
２６ａ、２６ｂ  流路
２７  バッファ空間
４１  偏光板
４２  絞り
４３  シャッタ
４４  回転ミラー
４５  レンズ
【図１】
2011022016.tif 000022
【図２】
2011022016.tif 000023