(57)【要約】      （修正有）【課題】ＶＥＧＦへの高い結合親和性を有するものを含む、抗ＶＥＧＦ抗体及びその変異体、所望の結合及び他の生物学的活性を有する抗ＶＥＧＦ抗体を生成し選別するためのナイーブライブラリを用いたファージディスプレイライブラリの使用方法、及び研究、診断及び治療的手法での前記抗体の使用方法を提供する。【解決手段】マウスＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害する抗体。
【請求項２】
非変異のヒトＶＥＧＦのＫｄ値の１０倍以内のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ  Ｇ８８Ａ変異体に結合することができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
１０ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ  Ｇ８８Ａ変異体に結合することができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトＶＥＧＦのＧ８８表面積の８０％のみに接触する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
レセプターがＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
レセプターがＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＶＥＧＦレセプター１及びＶＥＧＦレセプター２へのＶＥＧＦの結合を阻害することができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
１０ｎＭ以下のＫｄ値でマウス及びヒトのＶＥＧＦに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
２ｎＭ以下のＫｄ値でマウス及びヒトのＶＥＧＦに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
１．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）の結合速度（Ｋｏｎ）でヒトＶＥＧＦに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
ＶＥＧＦの２０ｓヘリックスに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＶＥＧＦの８０ｓループに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
ＶＥＧＦの２０ｓヘリックス及び８０ｓループに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項１６】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＩ８３を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項１７】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｉ８３及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項１８】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＭ１８を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項１９】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８及びＩ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１及びＹ２５を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２１】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３及びＩ８３を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２２】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｙ２５及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２３】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３及びＣ１０４を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２４】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２５】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６からなる群から選択した残基の何れかの組み合わせを含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２６】
ヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６を含む機能的エピトープを有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体。
【請求項２７】
Ｘ１がＹ又はＦであり；
Ｘ２がＶ又はＡであり；
Ｘ４がＦ又はＹであり；
Ｘ５がＬ又はＡであり；
Ｘ６がＰ又はＡであり；
Ｘ７がＹ又はＦである
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７を有するＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
ＣＤＲ-Ｈ２が、
Ｘ２がＩ又はＶ又は他の疎水性アミノ酸であり；
Ｘ５が任意のアミノ酸残基である
連続したアミノ酸配列ＧＸ２ＴＰＸ５Ｇを含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
ＣＤＲ-Ｈ１が、
Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ２がＹ又はＦであり；
Ｘ３がＷ又はＬである
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＺＩＨを含む、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
図７、２４ないし２９及び３４ないし４３の何れか一に記載の抗体のＣＤＲ-Ｈ３配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
図７、２４ないし２９及び３４ないし４３の何れか一に記載の抗体の配列を有する可変領域を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３２】
図７、２４ないし２９及び３４ないし４３の何れか一に記載の抗体のＣＤＲ-Ｈ１配列、ＣＤＲ-Ｈ２配列及びＣＤＲ-Ｈ３配列を含んでなる抗体。
【請求項３３】
図７、２４ないし２９及び３４ないし４３の何れか一の抗体に記載の配列を有する可変領域を含んでなる抗体。
【請求項３４】
Ｇ６抗体のフレームワーク領域をさらに含んでなる、請求項１ないし１５及び２７ないし３０の何れか一に記載の抗体。
【請求項３５】
（ａ）Ｘ１及びＸ２が任意のアミノ酸であり；
Ｘ３又はＸ４の何れか、又はＸ３とＸ４の両方がＲであり；
Ｘ５がＳ又はＡである、
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｌを有するＣＤＲ-Ｌ１、
（ｂ）Ｘ１がＳ又はＡ又はＧであり；
Ｘ２及びＸ３が任意のアミノ酸残基である、
連続したアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有するＣＤＲ-Ｌ２、
（ｃ）Ｘ１及びＸ２が任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ３がＳ又はＡである、
連続したアミノ酸配列ＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＬを有するＣＤＲ-Ｌ３、
を含んでなる抗体。
【請求項３６】
Ｂ２０−４．１抗体のフレームワーク領域を含んでなる、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
互いに１０倍以内のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ及びマウスＶＥＧＦに結合する、請求項２７ないし３６の何れか一に記載の抗体。
【請求項３８】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３９】
二特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４０】
合成抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４１】
わずか約２ｎＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合することができる合成抗体。
【請求項４２】
Ｋｄ値がわずか約１ｎＭである、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
Ｋｄ値がわずか約５００ｐＭである、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
ｈＶＥＧＦ結合に関して１０倍以内のＫｄ値で非ヒト哺乳動物種のＶＥＧＦに結合することができる、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４５】
非ヒト哺乳動物由来のＶＥＧＦがマウスＶＥＧＦである、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
少なくとも一の溶媒と接触しうる非常に多様化したアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有する少なくとも一の変異型ＣＤＲを含み、該変異型アミノ酸が非ランダムコドンセットによってコードされており、非ランダムセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％が公知の抗体可変ドメイン内の位置の標的アミノ酸である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項４７】
ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択した少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含んでなる重鎖可変ドメインを有する、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４８】
重鎖可変ドメインが変異型ＣＤＲ  Ｈ３を含んでなる、請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQAPGKGLEWVAGITPAGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH
を重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第一重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）として含んでなる、請求項４７に記載の抗体。
【請求項５０】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を軽鎖としてさらに含んでなる、請求項２４に記載の抗体。
【請求項５１】
ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３からなる群から選択した少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含んでなる軽鎖可変ドメインを有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項５２】
以下のアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQGYANPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を軽鎖としてさらに含んでなる、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５３】
ａ）少なくとも一のＣＤＲ内に所望の多様性を有する合成抗体のライブラリを生成し；
ｂ）該ライブラリにｈＶＥＧＦを接触させて、結合体を形成させ；
ｃ）非結合体から結合体を分離して、標的ｈＶＥＧＦから結合体を溶出して、約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の少なくした量の標的ｈＶＥＧＦとともに溶液中で結合体をインキュベートし；
ｄ）最も低い濃度の標的ＶＥＧＦに結合することができ、約５００ｐＭから２ｎＭの親和性を有する結合体を選別する、
合成抗体のライブラリからｈＶＥＧＦ抗体を選別する方法。
【請求項５４】
請求項１ないし５０の何れか一に記載の抗体をコードする単離した核酸。
【請求項５５】
請求項５４に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項５６】
請求項５６に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項５７】
請求項５６に記載の宿主細胞を培養して核酸を発現させることを含む、抗体を産生する工程。
【請求項５８】
宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む、請求項５７に記載の工程。
【請求項５９】
抗体が宿主細胞培養培地から回収する、請求項５８に記載の工程。
【請求項６０】
請求項１ないし５２の何れか一に記載の抗体を治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物の病的な血管新生関連疾患を治療するために前記抗体を使用する方法。
【請求項６１】
疾患が癌である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
癌が、乳癌、大腸癌、非小細胞性肺癌、非ホジキン性リンパ腫（ＮＨＬ）、腎臓癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択したものである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
治療が、同時に又は連続して前記抗体と第二治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
第二治療薬が、抗血管形成剤、抗腫瘍性組成物、化学療法剤及び細胞障害性剤からなる群から選択した作用剤である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
抗血管形成剤が、抗体Ａ４．６．１と同じＶＥＧＦエピトープに結合することができる抗ｈＶＥＧＦ抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
請求項１ないし５１の何れか一に記載のＦａｂ抗体で、炎症性疾患又は免疫系疾患に罹患している又はその発症のリスクがある哺乳動物を治療する工程を含む、前記哺乳動物の治療方法。
【請求項６７】
炎症性疾患又は免疫系疾患が慢性関節リウマチである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｆａｂ抗体がＧ６系列抗体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
Ｆａｂ抗体がＢ２０系列抗体である、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（本出願について）
本出願は、２００３年８月１日に出願の米国特許仮出願第６０／４９１,８７７号；２００３年１１月１日に出願の第６０／５１６,４９５号；２００４年５月１２日に出願の第６０／５７０,９１２号；２００４年５月１３日に出願の第６０／５７１,２３９号；２００４年６月１日に出願の第６０／５７６,３１５号；及び２００４年６月１８日に出願の第６０／５８０,７５７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、概して、抗ＶＥＧＦ選択的ポリペプチド配列、及び研究、治療及び診断の目的に有用な抗体に関する。
【０００３】
（発明の背景）
血管新生とＶＥＧＦ
血管新生は、血管内皮細胞が増殖して、切り取り、再編成して、既存の血管ネットワークから新しい血管を形成する重要な細胞性の現象である。血管供給の発達は正常で病理学的な増殖過程に必須であるという動かぬ証拠がある(Folkman及びKlagsbrun (1987) Science 235:442-447)。酸素と栄養分の運搬、並びに分解産物の除去は、律速段階を多細胞生物に起こる大多数の成長過程の律速の工程の代表である。したがって、通常、胚発生の間の器官発達および分化だけでなく、成人の創傷治癒および生殖機能に、血管コンパートメントが必要であるにもかかわらず十分でないと推測される。
また、血管新生は、限定するものではないが、増殖性網膜症、年齢関連性黄斑変性、腫瘍、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および乾癬を含む様々な疾患の病理発生に関係する。血管新生は、１）プロテアーゼ放出後の局所の発生部位の細胞間マトリックスの低下、２）毛細管内皮細胞の増殖、及び３）血管新生刺激に対する毛細血管の移動からなる過程のカスケードである。Ferraraら. (1992) Endocrine Rev. 13: 18-32。
血管新生の注目すべき生理的及び病理学的重要性を考慮して、この過程を調節することができる因子の解明のために多くの研究がなされてきた。血管新生過程がプロ血管新生分子及び抗血管新生分子間のバランスによって調節され、様々な疾患、特に癌において血管新生過程が狂わされていることが示唆される。Carmeliet及びJain (2000) Nature 407:249-257。
【０００４】
血管内皮細胞の強力なマイトジェンである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は正常及び異常な血管新生の中枢的調節因子として報告されている。Ferrara及びDavis-Smyth (1997)Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543。血管形成プロセスに寄与する他の成長因子と比較して、ＶＥＧＦは血管系内の内皮細胞に対するその高い特異性が特徴的である。最近の証拠は、ＶＥＧＦが胚性脈管形成及び血管新生に必須であることを裏付けている。Carmeliet等(1996) Nature 380:435-439; Ferrara等(1996) Nature 380:439-442。更に、ＶＥＧＦは女性生殖路における周期的血管増殖及び骨成長及び成長板軟骨形成に必要とされる。Ferrara等(1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber等(1999) Nature Med. 5:623-628。
血管新生及び脈管形成における血管形成因子であることに加えて、ＶＥＧＦは多面発現性成長因子として、内皮細胞生存、血管透過性及び血管拡張、単球化学走性及びカルシウム流入のような他の生理学的プロセスにおいて複数の生物学的効果を示す。上掲のFerrara及びDavis-Smyth (1997)。更に、最近の研究では、数種の非内皮細胞型、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞及びシュワン細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。Guerrin等(1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh等(1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell等(1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。
【０００５】
かなりの証拠が病理的血管新生を含む症状又は疾病の進行におけるＶＥＧＦの重要な役割をまた示している。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは検査したヒト腫瘍の大部分で過剰発現している(Berkman等 J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown等 Human Pathol.. 26:86-91 (1995); Brown等 Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern等 Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996);及びDvorak等 Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995))。また、眼液中のＶＥＧＦの濃度は糖尿病及び他の虚血関連網膜症の患者において活発な血管の増殖の存在に強く相関している(Aiello等 N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994))。更に、最近の研究では、ＡＭＤに罹っている患者の脈絡叢新生血管膜中でのＶＥＧＦの局在化が実証されている (Lopez等 Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996))。
【０００６】
病的状態の血管新生の一次調節因子としてのＶＥＧＦを理解することによって、ＶＥＧＦ活性をブロックするための多くの試みが行われている。抑制性抗ＶＥＧＦレセプター抗体、可溶性レセプターコンストラクト、アンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマーおよび低分子量のＶＥＧＦリセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）インヒビターはすべて、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害するために用いることが提唱されている(Siemeisterら. Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248 (1998)。実際、抗ＶＥＧＦ中和抗体はヌードマウス中において様々なヒト腫瘍細胞の成長を抑制し(Kim等 Nature 362:841-844 (1993); Warren等 J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstroem等 Cancer Res. 56:4032-4039 (1996);及びMelnyk等 Cancer Res. 56:921-924 (1996))、虚血性網膜疾患モデルにおいて眼内血管新生も阻害する(Adamis等 Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996))。従って、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はＶＥＧＦ作用の他のインヒビターは固形腫瘍及び様々な眼内血管新生疾患の治療に対する有望な候補である。ＶＥＧＦ分子は腫瘍細胞内で上方制御されるが、そのレセプターは血管内皮細胞が浸潤した腫瘍内で上方制御され、ＶＥＧＦとそのレセプターの発現は血管新生に関与しない正常細胞では低く保たれる。
【０００７】
治療用抗体
組み換えＤＮＡ技術を用いてモノクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体、特に齧歯類由来のものは広く使用されているが、ヒトの治療用途では抗原性であることがよくある。ヒト以外の抗原結合ドメインをヒト定常ドメインに結合した「キメラ」抗体を構築することによってこの問題を解消することが試みられている（Cabilly等, 米国特許第４８１６５６７号）。ヒト定常ドメインのアイソタイプを選択して抗体依存性細胞性障害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞性障害に関与するキメラ抗体をあつらえることができる。抗体の抗原結合機能を分析するため及び、ヒト抗体中での異種性配列の使用を最小限にするために、様々な抗原に対して、実質的により少ない完全なヒト可変ドメインの領域を非ヒト種由来の一致する配列によって置換したヒト化抗体が生成されている。例えば、齧歯類の（ＣＤＲ）残基をヒト抗体の一致するセグメントと置換した。実際には、典型的にヒト化抗体はいくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基と可能であればいくつかのフレームワーク領域（ＦＲ）を齧歯類の抗体の類似部位由来の残基に置き換えるヒト抗体である。Jonesら., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmannら., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら., Science 239:1534-1536 (1988)。
【０００８】
様々なヒト化抗ヒトＶＥＧＦ抗体が成功裏に生成されており、インビトロ及びインビボの両方で著しいｈｕＶＥＧＦ阻害活性を示した。Prestaら. (1997) Cancer Research 57:4593-4599；Chenら. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881。近年、ある特異的ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるアバスチン(Avastin)ＴＭ抗体が、多種の固形腫瘍の治療のためにいくつかの臨床の場で用いられている；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の他の高親和性変異体が、現在、脈絡叢血管新生関連性年齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療のための臨床試験にある。
ヒトに治療用抗体を投与する前に、一般的に抗体の効果及び／又は毒性を評価するために非ヒト哺乳動物で前臨床試験することが望ましい。これらの研究対象となる抗体が解明され、高い潜在能力を持ってマウスや非ヒト霊長類などの宿主動物に対して外因性の標的抗原に反応することが理想である。
【０００９】
ファージディスプレイ
ファージディスプレイ技術は抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成し、選別するための強力なツールである。ファージディスプレイの使用により、タンパク質変異体の大きなライブラリを作製し、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルスコートタンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)；Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリを作製してそのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第5,723,286号、米国特許第5,432, 018号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,427,908号および米国特許第5,498,530号)。
糸状ファージの表面上のペプチドの発現と大腸菌周辺質での機能的抗体断片の発現を証明することは、抗体ファージディスプレイライブラリの開発に重要であった(Smithら., Science (1985), 228:1315；Skerra及びPluckthun, Science (1988), 240:1038)。抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは、ランダムなＤＮＡ配列を挿入したり、関連遺伝子のファミリーをクローニングして単一遺伝子を変更することを含むいくつかの方法で調整していた。ファージディスプレイを用いた抗体又は抗原結合断片を表出させる方法は、米国特許第5,750,373号、同第5,733,743号、同第5,837,242号、同第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,580,717号、及び同第5,658,727号に記載されている。ついで、ライブラリは所望の特性を有する抗体又は抗原結合タンパク質の発現についてスクリーニングする。
【００１０】
ファージディスプレイ技術は、所望の特徴を有する抗体を調製する従来のハイブリドーマおよび組換え体方法に勝るいくつかの効果がある。この技術により、より少ない時間で動物を用いることなく多様な配列を有する抗体の大きなライブラリを作製することができる。ハイブリドーマの調製又はヒト化抗体の調製には、きっと数か月で可能である。加えて、免疫化が必要ないので、ファージ抗体ライブラリは毒性のある抗原又は抗原性が低い抗原について作製することができる(Hogenboom, Immunotechniques (1988), 4:1-20)。また、ファージ抗体ライブラリは、新規の治療用抗体を生成して、同定するために用いることができる。
ファージディスプレイライブラリは、免疫化されたヒト、免疫化されていないヒト、生殖細胞系配列又は未処理のＢ細胞Ｉｇ蓄積からヒト抗体を生成するために用いられた(Barbas & Burton, Trends Biotech (1996), 14:230；Griffithsら., EMBO J. (1994), 13:3245；Vaughanら., Nat. Biotech. (1996), 14:309；Winter EP 0368 684 B1)。未処置、または免疫化されていない、抗原結合ライブラリは種々のリンパ系組織を用いて作製されている。Cambridge Antibody Technology及びMorphosysにより開発されたものなど、いくつかのライブラリが市販されている (Vaughanら., Nature Biotech 14:309 (1996)；Knappikら., J. Mol. Biol. 296:57 (1999))。しかしながら、これらのライブラリ多くは、多様性が制限されている。
【００１１】
高親和性抗体をファージディスプレイライブラリから同定して、単離できることは、治療的用途のための新規の抗体を単離するために重要である。ライブラリからの高親和性抗体の単離は、ライブラリのサイズ、細菌細胞の産生の効率およびライブラリの多様性に依存している。例えば、Knappikら., J. Mol. Biol. (1999), 296:57を参照。ライブラリのサイズは、抗体又は抗原結合タンパク質の不適当な折畳み（ホールディング）および終止コドンの存在による効率的でない産生によって減少する。抗体又は抗原結合ドメインが適切に折り畳まれない場合、細菌細胞での発現は阻害されうる。発現は、可変／定常の境界面の表層、または、選択されたＣＤＲ残基で順に残基を変異させることによって改良することができる。(Dengら., J. Biol. Chem. (1994), 269:9533, Ulrichら., PNAS (1995), 92:11907-11911；Forsbergら., J. Biol. Chem. (1997), 272 : 12430)。抗体ファージライブラリを細菌細胞において作製するとき、フレームワーク領域の配列は適当な折畳みを提供する因子である。
また、抗体又は抗原結合タンパク質の多様なライブラリを作製することは、高親和性抗体の単離に重要である。限定したＣＤＲに多様化を有するライブラリは種々の方法を用いて作製されている。例えば、Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18:989-994を参照。抗原結合に関与することが明らかなことが多いので、ＣＤＲ３領域にいくらか関心がある。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列および構造的立体配座が非常に変化する。
【００１２】
また、各可変重鎖及び可変軽鎖位置の全２０アミノ酸を用いて可変重鎖および可変軽鎖のＣＤＲ領域をランダム化することによって、多様性を生成したものもある。全２０アミノ酸を用いることで変異型抗体の配列に大きな多様性をもたらし、新規な抗体を同定する可能性を増やすと思われた。(Barbas, PNAS 91:3809 (1994)；Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995)；Jackson, J.R., J. Immunology, 154:3310 (1995)及びHawkins, RE, J. Mol. Biology, 226:889 (1992))。
また、天然に生じる抗体のアミノ酸分布を反映させるためにいくつかのＣＤＲのアミノ酸置換の群を制限することによって多様性をつくる試みがあった。Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103; Knappikら., J. Mol. Biol. (1999), 296:57を参照。これらの試みは様々な成功があったが、系統的で定量的方法に適用されなかった。ＣＤＲ領域の多様性をつくる一方で、アミノ酸変異の数を最小にすることに取り組んでいた。
【００１３】
（発明の概要）
本発明は新規な抗体及びポリペプチド配列を提供する。本発明はまた齧歯類ＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して各値の１０倍以内のＫｄ値で結合可能で、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害可能な抗体を提供する。一実施態様によれば、抗体はＧｌｙ８８Ａｌａ（Ｇ８８Ａ）又はＧｌｙ８８Ｓｅｒ（Ｇ８８Ｓ）ヒトＶＥＧＦ変異体に非変異ヒトＶＥＧＦのＫｄ値の１０倍以内のＫｄ値で結合可能である。
本発明はヒトＶＥＧＦ及びマウスＶＥＧＦに対して２５℃で１０ｎＭ以下のＫｄ値で結合可能で、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害可能な抗体を提供する。他の実施態様では、Ｋｄ値は２ｎＭ以下である。他の実施態様によれば、Ｋｄ値は０．１ｎＭ以下である。他の実施態様によれば、本発明の抗体は約１ｎＭ以下又は約５００ｐＭ以下のＫｄでＶＥＧＦに結合する。
本発明はまた１０ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦのＧ８８Ａ及びＧ８８Ｓ変異体の何れか一又は双方に結合可能で、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害可能な抗体を提供する。他の実施態様では、抗体は１０ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦのＧ８８Ａ及びＧ８８Ｓ変異体の何れか一又は双方に結合する。
【００１４】
他の実施態様では、本発明の抗体は１．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）のヒト及び／又はマウスＶＥＧＦへの結合速度（ｋｏｎ）を有する。他の実施態様では、速度は５．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）である。更に他の実施態様では、速度は１０．０以上（１０Ｍ−１Ｓ−１）である。
他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の８０％未満に接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の７０％未満に接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の６０％未満に接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＧ８８の全表面積（Å２）の１％未満に接触する。このような抗体は一般にマウスＶＥＧＦに結合可能である。
ＶＥＧＦへの結合が阻害されるＶＥＧＦレセプターはＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦレセプター２（Ｆｌｔ−２）又は双方のレセプターでありうる。
一実施態様では、本発明の抗体はＶＥＧＦの２０ｓヘリックスに接触する。他の実施態様では、本発明の抗体はＶＥＧＦの８０ｓループに接触する。更に他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦの２０ｓヘリックス及び８０ｓループに接触する。
一実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｃ１０４及びＰ１０６の何れか一つに対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＦ１７、Ｍ１８、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｃ１０４及びＰ１０６に対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＹ２１に対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はＶＥＧＦのＹ２５に対して更なる相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はＭ１８及びＱ８９ヒトＶＥＧＦに対して相対親和性を有するか又は接触可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はヒトＶＥＧＦのＭ１８、Ｙ２１及びＹ２５に対して相対親和性を有するか又は接触可能である。好適な実施態様では、本発明の抗体は上述の実施態様の任意のものの三又はそれ以上の組み合わせを有する。
【００１５】
更なる実施態様では、本発明の抗体はここに記載した機能的エピトープを有する。一実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７を含む。他の実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＩ８３を含む。更なる実施態様では、その機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｉ８３及びＱ８９を含む。一実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７及びＭ１８を含む。更なる実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８及びＩ８９を含む。一実施態様では、本発明に係る抗体の機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１及びＹ２５を含む。更なる実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３及びＩ８３を含む。他の実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｙ２５及びＱ８９を含む。更なる実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含む。更に他の実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含む。本発明に係る抗体の機能的エピトープは、ヒトＶＥＧＦのＦ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｍ８１、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６からなる群から選択される残基の何れかの組み合わせを含みうる。他の実施態様では、機能的エピトープはヒトＶＥＧＦの残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｋ４８、Ｄ６３、Ｌ６６、Ｍ８１、Ｉ８３、Ｈ８６、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｃ１０４及びＰ１０６を含む。
【００１６】
一実施態様では、本発明の抗体は、連続アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号９１５）を含むＣＤＲ-Ｈ３を含んでなり、ここで、
Ｘ１はＹ又はＦであり；
Ｘ２はＶ又はＡであり；
Ｘ４はＦ又はＹであり；
Ｘ５はＬ又はＡであり；
Ｘ６はＰ又はＡであり；
Ｘ７はＹ又はＦである。
他の実施態様では、抗体は連続アミノ酸配列ＧＸ２ＴＰＸ５Ｇ（配列番号１）を有するＣＤＲ-Ｈ２を更に含んでなり、ここで、
Ｘ２はＩ又はＶ又は他の疎水性アミノ酸であり；
Ｘ５は任意のアミノ酸残基である。
更に他の実施態様では、抗体は連続アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＺＩＨ（配列番号２）を有するＣＤＲ-Ｈ１を更に含んでなり、ここで、
Ｘ１は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ２はＹ又はＦであり；
Ｘ３はＷ又はＬである。
【００１７】
好適な一実施態様では、抗体は図７の抗体の何れか一のＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３を更に含む。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ１はおよそ残基２８−３３に位置し、ＣＤＲ-Ｌ２はおよそ残基５０−５５に位置し；ＣＤＲ-Ｌ３はおよそ残基９１−９６に位置する。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｈ１はおよそ残基３０−３３に位置し、ＣＤＲ-Ｈ２はおよそ残基５０−５８に位置し；ＣＤＲ-Ｌ３はおよそ残基９４−１００ａに位置する。好適な一実施態様では、抗体はＧ６抗体、Ｇ６−２３抗体又はＧ６−３１抗体のフレームワーク領域を含む。他の実施態様では、抗体はＧ６抗体、Ｇ６−２３抗体又はＧ６−３１抗体の軽鎖ＣＤＲｓ又は軽鎖可変領域を含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、
（ａ）Ｘ１及びＸ２が任意のアミノ酸であり；
Ｘ３又はＸ４の何れか、又はＸ３とＸ４の両方がＲであり；
Ｘ５がＳ又はＡである、
連続アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｌ（配列番号９１６）を有するＣＤＲ-Ｌ１、
（ｂ）Ｘ１がＳ又はＡ又はＧであり；
Ｘ２及びＸ３が任意のアミノ酸残基である、
連続アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３（配列番号９１７）を有するＣＤＲ-Ｌ２、
（ｃ）Ｘ１及びＸ２が任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ３がＳ又はＡである、
連続したアミノ酸配列ＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＰＬ（配列番号９１８）を有するＣＤＲ-Ｌ３、
を含む抗体である。
【００１８】
好適な実施態様では、抗体はＢ２０−４．１抗体又はＢ２０−４抗体のフレームワーク領域を含む。他の実施態様では、抗体はＢ２０重鎖可変領域のＣＤＲｓ又は可変領域を含む。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ２のＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号９１７）はＸ１ＡＳＸ４ＬＸ６（配列番号９１９）によってコードされており、ここでＸ４とＸ６は任意のアミノ酸である。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｌ１はおよそ残基２８−３３に位置し、ＣＤＲ-Ｌ２はおよそ残基５０−５５に位置しており；ＣＤＲ-Ｌ３はおよそ残基９１−９６に位置している。他の実施態様では、ＣＤＲ-Ｈ１はおよそ残基３０−３３に位置し、ＣＤＲ-Ｈ２はおよそ残基５０−５８に位置しており；ＣＤＲ-Ｌ３はおよそ残基９４−１００ａに位置している。
また考えられるものは、図７、２４−２９及び３４−４３の抗体の何れか一のＣＤＲ-Ｈ３配列を含み、場合によっては図７、２４−２９及び３４−４３の同じ抗体のＣＤＲ-Ｈ２及び／又はＣＤＲ-Ｈ１を更に含む抗体である。また考えられるものは、Ｇ６列抗体、Ｂ２０列抗体、ＹＡＤＳ列抗体及びＹＳ列抗体からなる群から選択される抗体である。更に、本発明の他の抗体は図７、２４−２９及び３４−４３の抗体の何れか一の可変領域を含む抗体である。
好適な一実施態様では、本発明の抗体はハイブリドーマから直接産生するかハイブリドーマ由来の抗体配列から誘導するよりもむしろ組換え法によって合成される。好適な一実施態様では、抗体は約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、又は約５００ｐＭ以下のＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合する。一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体は多重特異性抗体（二重特異性抗体）である。
【００１９】
本発明の更なる実施態様では、高親和性抗ｈＶＥＧＦ抗体はまた非ヒト哺乳動物種由来のＶＥＧＦに、そのｈＶＥＧＦ結合に対するＫｄ値に匹敵するか又は少なくとも１０倍以内のＫｄ値で結合可能である。異種間の高結合親和性を有するそのような抗体は前臨床研究並びに診断及び治療用途に特に有用である。治療用途が意図される幾つかの抗体を標的ヒト抗原として免疫原を使用して産生した。得られた抗体は「種依存性」でありうる；つまりヒト抗原に特異的に結合するが、非ヒト哺乳動物由来の抗原のホモログへの結合はそれほど効果的ではない。これは、特に非ヒト哺乳動物が抗体の前臨床研究が実施されるものである場合に、問題であることがここで分かった。一例は癌治療のための抗ＶＥＧＦ抗体のアバスチン（商標）抗体である。アバスチン（商標）抗体はヒトＶＥＧＦに対して強い結合親和性を有する（つまり１．８ｎＭのＫｄ）が、マウスＶＥＧＦに対する親和性はマウスモデルで実験を行うのに不適であった。
一態様では、抗体はその可変ドメイン内に少なくとも一の変異型ＣＤＲを含む合成抗体であり、ここで変異型ＣＤＲは少なくとも一の溶媒と接触しうる(solvent accessible)高度に多様化したアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有し、該変異型アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされており、非ランダムセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％が既知の抗体可変ドメイン内の位置の標的アミノ酸である。抗体はＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択される少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含んでなる重鎖可変ドメインを有しうる。好ましくは、重鎖可変ドメインは変異型ＣＤＲ  Ｈ３を含む。抗体はまたＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含んでなる軽鎖可変ドメインを有しうる。
【００２０】
他の実施態様では、本発明の抗体は所望の親和性でヒトＶＥＧＦ及び齧歯類ＶＥＧＦに結合するが、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、及びヒトＰ１ＧＦ−２からなる群から選択されるＶＥＧＦ関連ホモログの何れか一又は全てには結合しない。
好適な一実施態様では、本発明の抗体は上述の実施態様の任意のものの三又はそれ以上の組み合わせを有する。他の実施態様では、本発明のＦａｂ抗体はＦａｂ抗体の半減期を増加させる薬剤にコンジュゲートされる。好適な一実施態様では、薬剤は配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷを含むポリペプチドである。好適な実施態様では、本発明の抗体はＰ１ＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｄ又はＶＥＧＦ−Ｂに結合しない。
本発明はまたａ）ＣＤＲｓの少なくとも一に所望の多様性を有する合成抗体のライブラリを生成し；ｂ）該ライブラリにｈＶＥＧＦを接触させて、結合体を形成させ；ｃ）非結合体から結合体を分離して、標的ｈＶＥＧＦから結合体を溶出し、約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の少なくした量の標的ｈＶＥＧＦと共に溶液中で結合体をインキュベートし；ｄ）最も低い濃度の標的ＶＥＧＦに結合することができ、約５００ｐＭから２ｎＭの親和性を有する結合体を選別する、合成抗体のライブラリからｈＶＥＧＦ抗体を選別する方法を提供する。
【００２１】
また考えられるものは、ｈＶＥＧＦ又は非ヒト種のＶＥＧＦ、又は双方に対して改善された結合親和性を有する合成抗体の変異体である。様々な形態の抗体及びその変異体がここで考えられる。例えば、抗体変異体は完全長抗体（例えばヒト免疫グロブリン定常領域を持つ）又は抗体断片（例えばＦａｂ又はＦ(ａｂ')２）でありうる。更に、抗体変異体は、固相に固定化され、及び／又は異種化合物（例えば細胞傷害剤）にコンジュゲートされた検出可能な標識で標識されてもよい。
抗体の診断及び治療用途が考えられる。一診断用途では、本発明は興味あるタンパク質の存在を決定する方法であって、そのタンパク質を含むことが疑われる試料を抗体変異体に暴露し、試料への抗体変異体の結合を決定することを含む方法を提供する。この用途に対して、本発明は抗体変異体とタンパク質を検出するために抗体変異体を使用するための指示書を含んでなるキットを提供する。
【００２２】
本発明は更に抗体をコードする単離核酸；場合によってはベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列に作用可能に結合した、核酸を含んでなるベクター；核酸が発現されるようにこの宿主細胞を培養し、場合によっては、宿主細胞培養物から（例えば宿主細胞培養培地から）抗体変異体を回収することを含む抗体の産生方法を提供する。
本発明はまた抗体と薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含有する組成物を提供する。治療用途のこの組成物は無菌であり凍結乾燥してもよい。また考えられるものはここに記載された適応症を治療する医薬の製造における本発明の抗体又はポリペプチドの使用である。組成物は更に第二の治療剤、例えば化学療法剤、細胞傷害剤又は抗血管新生剤を含有することができる。
【００２３】
本発明は更に有効量の抗体を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物を治療する方法を提供する。該方法によって治療される哺乳動物は非ヒト哺乳動物、例えば前臨床データの収集に好適な霊長類又は齧歯類（例えばマウス又はラット又はウサギ）でありうる。非ヒト哺乳動物は健康でも（例えば毒性学的研究）又は対象の抗体で治療される疾患に罹っていてもよい。一実施態様では、哺乳動物は異常な血管新生（例えば病理的血管新生）を患っているかそれを生じる危険性がある。特定の一実施態様では、疾患は結腸直腸癌、肝細胞癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支肺胞癌腫及び膵癌からなる群から選択される癌である。他の実施態様では、疾患は眼の血管新生によって引き起こされる疾病、例えば糖尿病性失明、網膜症、主に糖尿病性の網膜症、加齢性黄斑変性症及びルベオーシスである。他の実施態様では、治療される哺乳動物は浮腫（例えば脳腫瘍に伴う浮腫、発作に伴う浮腫、又は脳浮腫）を患っているか又はそれを発症する危険がある。他の実施態様では、哺乳動物は関節リウマチ、炎症性腸疾患、難治性腹水症、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、火傷及び膵炎からなる群から選択される疾患又は疾病を患っているか又はそれを発症する危険がある。他の実施態様では、哺乳動物は多嚢胞卵巣症（ＰＯＤ）、子宮内膜症及び子宮筋腫からなる群から選択される泌尿生殖器疾病を患っているか又はそれを発症する危険がある。投与される抗体の量は疾患を治療するための治療的有効量である。用量増大研究では、様々な抗体用量を哺乳動物に投与することができる。他の実施態様では、治療的有効量の抗体がヒト患者にその患者の疾患を治療するために投与される。好適な一実施態様では、ここに記載した炎症又は免疫疾患（例えば関節リウマチ）を治療するのに有用な本発明の抗体はＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体、特に抗体のＧ６列又は抗体のＢ２０列から誘導されるＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体である。ＶＥＧＦの凝集を生じさせずそれ自身も凝集しない抗体、例えばＩｇＧ抗体のＢ２０列は炎症及び免疫疾患を治療するのに特に有用である。従って、そのような抗体は炎症又は免疫疾患を治療するための医薬の製造に使用することができる。ここに記載した疾患又は病気に罹っているか又は罹る危険性のある哺乳動物は、本発明の抗体と同時に、連続して又は併用して第二の治療剤を投与することによって治療することができる。第二の治療剤に加えて、他の治療剤を哺乳動物に投与することができ、又は所望の適応症のための医薬の製造に使用することができることが理解されなければならない。
【００２４】
これらの抗体及びポリペプチドは、ヒト腫瘍が移植されたマウスモデルのような移植非宿主腫瘍の成長における宿主間質細胞の役割を理解するために使用することができる。これらの抗体及びポリペプチドは抗ＶＥＧＦ治療を回避できるヒト腫瘍を、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体での治療後に齧歯類又はウサギ中に移植された腫瘍の成長を観察又はモニターすることによって同定する方法において使用することができる。本発明の抗体及びポリペプチドはまた本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と他の治療剤の併用療法を研究し評価するために使用することができる。本発明の抗体及びポリペプチドは他の疾患におけるＶＥＧＦの役割を、類似の疾患に罹っている動物に投与し疾患の一又は複数の徴候が軽減されるかどうかを決定することにより、研究するために使用することができる。
【００２５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
「抗体」なる用語は、は最も広義に用いられ、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体フラグメントを特に包含する。本発明の「Ｇ6系列ポリペプチド」は、図７、２４−２６および３４−３５の任意の一つのＧ6抗体又はＧ6由来抗体の配列に由来し、本発明の所望の親和性（例えば、２５℃で抗体のＦａｂ型に対して１０ｎＭの以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下）でヒトＶＥＧＦに結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「Ｂ20系列ポリペプチド」は、図２７−２９の任意の一つのＢ20抗体又はＢ20由来抗体の配列由来であり、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＡＤＳ系列ポリペプチド」又は「ＹＡＤＳポリペプチド」は、図３６−４０の任意の一つのＹＡＤＳ抗体の配列由来であり、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＡＤＳ-２系列ポリペプチド」又は「ＹＡＤＳ2ポリペプチド」は、図３６又は図３９のＹＡＤＳ２抗体の配列に由来し、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦに結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＡＤＳ-３系列ポリペプチド」又は「ＹＡＤＳ3ポリペプチド」は、図３６又は図３９のＹＡＤＳ3抗体の配列に由来し、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。本発明の「ＹＳ系列ポリペプチド」又は「ＹＳポリペプチド」は、図４１−４３のＹＳ抗体の配列に由来し、本発明によって所望の親和性でＶＥＧＦと結合する、本発明の抗体を含むポリペプチドである。一好ましい実施態様によれば、Ｇ系列ポリペプチド、Ｂ20系列ポリペプチド、ＹＡＤＳ系列ポリペプチド、ＹＡＤＳ2系列ポリペプチド、ＹＡＤＳ3系列ポリペプチド又はＹＳ系列ポリペプチドは、互いの１０倍以内のＫｄ値でヒト及び非ヒト哺乳動物ＶＥＧＦに結合する。一実施態様によれば、ヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦに対する抗体結合のｋＤ値は、１０ｎＭ以下である。他の実施態様では、抗体は、２ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦと結合する。他の実施態様では、抗体は、1ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＶＥＧＦと結合する。このようなＧ6系列、Ｂ20系列、ＹＡＤＳおよびＹＳ系列ポリペプチドのＶＥＧＦに対する親和性は、例えば、本願明細書において教示されるファージディスプレイ技術などの方法によって改良することができる。
【００２６】
本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991))。抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１），５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987)）を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００２７】
「フレームワーク領域」（以下ＦＲと称す）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【００２８】
本明細書で使われるように、「コドンセット」は所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。標準的なコドン指定形式はＩＵＢコードのそれであり、このコードは当技術分野で公知であり本明細書で記載されている。コドンセットは、一般的に３つのイタリック大文字、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどで表される。ゆえに、本明細書中で用いられる「非ランダムコドンセット」とは、ここに記載のアミノ酸選別の基準を部分的、好ましくは完全に満たす選択アミノ酸をコードするコドンセットを意味する。ある位置の選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知であり、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている（Ｋｎａｐｐｅｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、２９６：５７〜８６頁）；GarrardおよびHenner, Gene(1993), 128:103頁）。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、そうするとは限らないが、例えばクローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００２９】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を確定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲまたはそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を賦与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
【００３０】
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448頁(1993)でさらに詳しく記載されている。
表現「線状抗体」はZapata他, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
【００３１】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得た抗体の特性を表し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって、作ることができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
【００３２】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗-ヒトＩｇＥ抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体のいずれでもあることが可能だが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【００３３】
ここで用いる「抗体変異体」又は「抗体変異体」は、種依存性の抗体のアミノ酸残基の一つ以上が変更された種依存性の抗体のアミノ酸配列変異体を指す。このような変異体は、必然的に種依存性の抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。好ましい実施形態では、抗体変異体は、種依存性の抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有する。ここでは、最大のパーセント配列同一性を得るために、本配列に関する同一性又は類似性は、種依存性の抗体残基と同一（すなわち同じ残基）又は類似（すなわち共通の側鎖の性質に基づく同じ群由来のアミノ酸残基、以下を参照）である候補配列配列を整列し、必要であれば間隙（ギャップ）を入れて、候補配列中のアミノ酸残基の割合として測定したものである。配列同一性又は類似性に影響を及ぼすように、可変ドメインを除く抗体配列、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部伸展のいずれにも、削除又は挿入はない。
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する（例えば、Ghetie, Vら., (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１）。Ｆｃ領域内に置換を有する抗体及び血清半減期が増大した抗体については、WO00/42072 (Presta, L.)、WO 02/060919; Shields, R.L., ら.,  (2001) JBC 276(9):6591-6604；Hinton, P.R., (2004) JBC 279(8):6213-6216)にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、本発明の抗体又は本発明のアミノ酸配列を含む他のポリペプチドをＦｃＲｎレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例としてこのようなポリペプチド配列はＷＯ０１／４５７４６に開示されている。一実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLWを含む。他の実施態様では、本発明によるＦａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
【００３４】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
「血管形成因子又は作用剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞成長、血管の安定化及び／又は脈管形成などを促進する成長因子である。例えば、血管形成因子には、限定するものではないが、例としてＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポイエチン）、エフリン、Ｄｅｌ-１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）及び塩基性（ｂＦＧＦ）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、顆粒性コロニー刺激因子（Ｇ―ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱係数（ＳＦ）、インターロイキン-８（ＩＬ-８）、レプチン、ミドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ-ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子、特にＰＤＧＦ-ＢＢ又はＰＤＧＦＲ-β、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)（ＰＴＮ）、プログラヌリン(Progranulin)、プロリフェリン(Proliferin)、トランスフォーミング成長因子-α（ＴＧＦ-α）、トランスフォーミング成長因子-β（ＴＧＦβ）、腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ-α）、血管内皮性成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）などが含まれる。また、創傷治癒を促進する因子、例として成長ホルモン、インスリン様増殖因子-Ｉ（ＩＧＦ-Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ、及び、そのファミリーメンバー及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。Klagsbrun及びD'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit及びDetmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Toniniら., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)（例えば、公知の血管形成因子を挙げている表１）；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)。
【００３５】
「抗血管形成剤」又は「血管新生（血管形成）インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。抗血管形成剤には、結合して、血管形成因子又はそのレセプターの血管形成活性をブロックする作用剤が含まれることが理解されるであろう。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義したように血管形成剤に対する抗体又はアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ-Ａに対する、または、ＶＥＧＦ―Ａレセプター（例えばＫＤＲレセプター又はＦｌｔ-１レセプター）に対する抗体、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート(Imatinib Mesylate)）などの抗ＰＤＧＦＲインヒビターである。また、抗血管形成剤には、天然の血管形成インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。Klagsbrun及びD'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit及びDetmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)（例えば、悪性黒色腫の抗血管形成治療を記載している表３）；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Toniniら., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)（例えば、公知の抗血管新生因子を記載している表２）；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)（例えば、臨床試験で用いられる抗血管形成剤を記載している表１）を参照。
【００３６】
本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識ＶＥＧＦの存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識Ｆａｂ（１０９）にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートにて結合したＶＥＧＦを捕獲することによってＶＥＧＦに対するＦａｂの溶液結合親和性を測定するアッセイで示されるような(Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、抗体およびＶＥＧＦ分子のＦａｂ型（バージョン）を用いて実行される放射性標識したＶＥＧＦ結合アッセイ（ＲＩＡ）で測定される好ましい一実施態様ものである。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート（Dynex）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％の（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温で２〜５時間（およそ２３℃）、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］ＶＥＧＦ（１０９）を段階希釈した所望のＦａｂ、例えばＦａｂ−１２と混合する(Prestaら., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599)）。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに６５時間かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で１時間インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔγ計測器（Packard）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂをそれぞれ競合結合測定に選択する。他の実施態様によると、〜１００反応単位（ＲＵ）の固定したｈＶＥＧＦ(８−１０９) ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。ヒトＶＥＧＦを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。ヒトＶＥＧＦの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、��光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度のヒトＶＥＧＦ短型（８−１０９）又はマウスＶＥＧＦの存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗ＶＥＧＦ抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００３７】
本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」は、好ましくは、〜１００反応単位（ＲＵ）の固定したｈＶＥＧＦ(８−１０９) ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。ヒトＶＥＧＦを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度のヒトＶＥＧＦ短型（８−１０９）又はマウスＶＥＧＦの存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗ＶＥＧＦ抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００３８】
本発明の「機能的エピトープ」は、抗体の結合に活動的に関与する抗原のアミノ酸残基を意味する。抗原の活動的に関与している残基の何れか一の変異（例えば、アラニン又はホモログ突然変異による野生型ＶＥＧＦの突然変異）により、抗体の相対的な親和性比（ｉｃ５０突然変異ＶＥＧＦ／ＩＣ５０野生型ＶＥＧＦ）が５以上になるように抗体の結合が阻害されるであろう（実施例２を参照）。好ましい実施態様では、溶液結合ファージディスプレイＥＬＩＳＡによって相対的親和性比を測定する。簡潔にいうと、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（ＮＵＮＣ）を２μｇ／ｍｌの濃度の試験すべき抗体を有するＰＢＳにて４℃で一晩コートし、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＴ）にてブロックした。まず、ＰＢＴにて段階希釈したファージディスプレイｈＶＥＧＦアラニン点突然変異体（残基８−１０９型）又は野生型ｈＶＥＧＦ（８−１０９）をＦａｂコートプレート上で室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）にてプレートを洗浄した。結合したファージを、ＰＢＴにて１：５０００に希釈した抗Ｍ１３モノクローナル抗体西洋わさびペルオキシダーゼ(Amersham Pharmacia)コンジュゲートにて検出し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ、Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD)基質にておよそ５分間反応させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４にて消光して、４５０ｎｍの分光光度を読む。ＩＣ５０値（ＩＣ５０，ａｌａ／ＩＣ５０，ｗｔ）は結合親和性における倍数的減少（相対的結合親和性）を表す。
【００３９】
競合的結合アッセイのために、前述のようにMaxisorbイムノプレートをコートし、ブロックして、非標識のＶＥＧＦ（１０９）の段階的な３倍の希釈液をＮｕｎｃプレートにＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファにて作製した。［１２５Ｉ］ＶＥＧＦ（１０９）を添加に続いて、一定濃度の対象とするＦａｂを添加する。対象のＦａｂの最終濃度はそれぞれ１００ｐＭ及び１０ｐＭである。（上記の）インキュベーションの後、結合ＶＥＧＦを捕獲し、前述のように定量化した。解離結合定数、Ｋｄの決定のためにスキャッチャード分析(P. Munsonら, (1980) Anal. Biochem. (1980) 107:220-239)を行うためにコンピュータプログラムを用いて結合データを解析する。
ここで用いられる、「ライブラリ」は、本発明の方法によって配列内に導入する変異型アミノ酸の組合せによって異なる配列をコードする核酸、又は抗体、又は抗体断片（例えば、本発明のポリペプチド）の複数を意味する。
【００４０】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージの粒子表面でコートタンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイの有用さは、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーから対象抗原と高親和性で結合する配列を迅速に、効率的に選別できることにある。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドを特異的結合特性に関してスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩとの融合を通して小さなランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために利用されてきた。WellsおよびLowman, Curr.Opin.Struct.Biol., 3:355-362頁(1992)とその中の引用文献。一価のファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリーが遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の１個または０個のコピーを提示するように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいておりファージミドベクターが使われるが、このベクターはＤＮＡ操作を単純化する。LowmanおよびWells, Methods:A Companion to Methods in Enzymology, 3:205-216頁(1991)。
【００４１】
「ファジミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドはいかなる公知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージでも使用できる。プラスミドは、通常、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子、またはその断片を含むファージミドを含む。
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含んでいて複製ができるバクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４、その他もしくはその誘導体である。
【００４２】
本明細書で使われる「溶媒と接触しうる位置」は抗体源または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変部のアミノ酸残基の位置を指し、それは、この抗体または抗原結合断片の構造、構造アンサンブルおよび／またはモデル化された構造に基づき、溶媒露出が可能かつ／または抗体特異性抗原などの分子との接触が可能と判断されるものである。これらの位置は一般的にはＣＤＲで、またタンパク質の外側に見られる。本明細書で定められるように、抗体または抗原結合断片の溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムのいずれかを使って決定できる。好ましくは、溶媒と接触しうる位置は抗体の三次元モデルからの座標を使い、好ましくはＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム(Accelrys, San Diego, CA)のようなコンピュータプログラムを使って決定される。溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、LeeおよびRichards, J.Mol.Biol.55, 379(1971)、および、Connolly, J.Appl.Cryst.16, 548(1983)）を使用しても決定することができる。溶媒と接触しうる位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、ＳＹＢＹＬ生体高分子モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が含まれる。一般に、また好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約１．４オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒と接触しうる領域の決定法が、Pacios, (1994)「ARVOMOL/CONTOUR:molecular surface areas and volumes on Personal Computers」Comput.Chem.18(4):377-386頁；および同(1995)「Variations of Surface Areas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces of Biomolecules」J.Mol.Model.1:46-53頁に記載されている。
【００４３】
「治療」は治療的処置及び予防又は阻害的処置の両方を意味する。治療が必要なものには、既に疾患に罹患しているもの並びに予防すべき疾患あるものが含まれる。
「疾患」は、抗体を用いて治療することによって利益を得る任意の症状である。例えば、異常な血管形成（過剰、不適切又は制御不能の血管形成）又は血管透過性に罹患しているか、又はそれらに対して予防する必要がある哺乳動物。これには、哺乳動物の問題とする疾患の素因となる病的状態を含む慢性及び急性の疾患又は疾病を包含する。限定するものでなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病およびリンパ系の悪性腫瘍；神経系、神経膠系、星状膠系、視床下部性及び他の腺性、マクロファージ系、上皮性、間質性、胞胚腔系の疾患；及び、炎症性、血管原性及び免疫性の疾患が包含される。
【００４４】
本用語の異常な血管形成は、病的状態又は病的状態を引き起こす状態にあって、新しい血管が過剰に、不十分に又は不適切に（例えば、血管形成の医学的見地から見て望ましくない位置、時期又は発生）成長するときに生じるものである。病的状態又は病的状態を引き起こす状態、例えば、癌、特に血管化固形腫瘍および転移性腫瘍（大腸、肺癌（特に小細胞肺癌）又は前立腺癌を含む）、眼血管新生によって生じる疾患、特に糖尿病性盲目、網膜症、主に糖尿病性網膜症又は年齢誘発性黄斑変性およびルベオーシス；乾癬、乾癬の関節炎、血管芽細胞腫、例えば血管腫；炎症性腎疾患、例えば糸球体腎炎、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症性症候群、糖尿病性ネフロパシ又は高血圧の腎硬化症；様々な炎症性疾患、例えば関節炎、特に慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬(psorsasis)、サルコイドーシス、動脈の血管硬化症及び、移植の後生じる疾患、子宮内膜症又は慢性喘息および７０以上の他の症状を悪化させるのに関与する新しい血管成長がある場合、過剰な、不適切な又は制御できない血管新生が生じる。新しい血管は疾患組織に養分を与え、正常な組織を破壊する。癌の場合、新しい血管によって腫瘍細胞は他の器官の窪み(lodge)及び循環に逃げ得る（腫瘍転移）。病的状態、例えば、冠状動脈疾患、脳卒中および遅発性創傷治癒などの病気で悪化に関与する不適切な血管成長がある場合、不十分な血管新生が生じる。さらに、潰瘍、脳卒中および心臓発作は、天然の治癒に通常必要な血管新生が欠損することから生じうる。本発明は、上記の疾病の発症のリスクがある患者を治療することも包含する。
【００４５】
本発明の抗体又はポリペプチドを投与する候補となる他の患者は、血管結合組織組織の異常な増殖、赤瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット病、血液由来の腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡叢血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ過剰装着、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、細菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹、過粘稠度症候群、カポシ肉腫、白血病、脂質退化、ライム病、重要でない表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染症、近視、眼性新生血管疾患、視覚穴、オスラー-ウェーバー症候群（オスラー-ウェーバー-ランデュ）、骨関節炎、パジェット病、部planitis(pars planitis)、類天ぽうそう、phylectenulosis、多発動脈炎、レーザー治療後合併症、原生動物の感染症、弾性線維性偽性黄色腫、鰭角膜炎シッカ、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児の網膜症、水晶体後繊維増殖、類肉腫、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト(Stargarts)病、スティーブンジョンソン疾患、上部の辺縁角膜炎、梅毒、全身狼瘡、テリアンの周縁退化(Terrien's marginal degeneration)、トキソプラズマ症、外傷、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞ビタミンＡ欠乏およびウェゲナーサルコイドーシス、糖尿病と関連している望ましくない血管新生、寄生虫病、異常な創傷治癒、手術、損傷又は外傷後肥大、体毛成長の抑制、排卵および黄体形成の抑制、移植の阻害及び子宮の胚の発達の阻害にあるもの又は、発症するリスクのあるものである。
【００４６】
抗血管形成治療は、移植片拒絶、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、心嚢貯留液、例として、心外膜炎及び胸水が関連するもの、望ましくない血管透過によって特徴づけられる疾患及び疾患、例えば、脳腫瘍と関連している浮腫、悪性腫瘍と関連している腹水、メイグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心嚢浮腫、胸水、心血管疾患と関連している透過性例えば心筋梗塞および脳卒中などの後の症状の一般的な処置に有用である。
本発明の他の血管新生依存性疾患には、血管線維腫（出血傾向がある異常な血管）、血管新生緑内障（目の血管成長）、動静脈奇形（動脈および静脈間の異常な連通）、結合しない骨折（治癒しない骨折）、アテローム動脈硬化性斑（動脈硬化）、化膿肉芽腫（血管から成る一般的な皮膚病変）、強皮症（結合織病の形）、血管腫（血管から成る腫瘍）、トラコーマ（発展途上国の盲目の主要な原因）、血友病関節、血管粘着力および肥大した瘢痕（異常な瘢痕形成）が含まれる。
【００４７】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ」なる用語は、Leungら. Science, 246:1306 (1989)、及びHouckら. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮成長因子と、関連した１２１-、１８９-、及び２０６-アミノ酸のヒト血管内皮成長因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、非ヒト動物腫、マウス、ラット又は霊長類由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮成長因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含む切断型ポリペプチドを意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「切断した（切断型の）」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７（メチオニン）でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。
【００４８】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ変異体」なる用語は、天然のＶＥＧＦ配列中に一以上の変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを指す。場合によっては、一以上のアミノ酸変異にはアミノ酸置換が含まれる。ここに記載のＶＥＧＦ変異体の省略デザイン（設定）のために、数字は推定される天然のＶＥＧＦのアミノ酸配列の中のアミノ酸残基位置を指すことに注記されたい(Leungら.、上掲、及びHouckら.、上掲による)。
【００４９】
「癌」及び「癌性の」なる用語は、一般的に調節されない細胞成長によって特徴づけられる哺乳動物の生理的条件を指すか又は記載する。癌の例は、これに限定されるものではないが、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれる。より特定の癌の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。治療のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭および農場用動物、人間以外の霊長類、および動物園、スポーツ、又は愛玩用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、などを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。
【００５０】
「抗腫瘍性組成物」なる用語は、少なくとも一つの活性治療的作用剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌を治療する際に有効な組成物を指す。治療的作用剤（抗癌剤）の例には、制限するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害性作用剤、細胞障害性作用剤、放射線療法に用いられる作用剤、抗血管新生作用剤、アポトーシス作用剤、抗チュービュリン作用剤および癌を治療する他の作用剤、例えば、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、表皮の成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼインヒビター）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター（例えばｅｒｌｏｔｉｎｉｂ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ）、血小板由来成長因子インヒビター（例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ））、ＣＯＸ-２インヒビター（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプタの一つ以上と結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２および他の生理活性的で有機化学的作用材などが含まれる。また、その組合せは本発明に含まれる。
【００５１】
本願明細書において用いられる「タグ付加エピトープ」なる用語は、「エピトープタグ」に融合した抗体突然変異体を指す。エピトープタグポリペプチドは、対する抗体が作られうるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが抗体突然変異体の活性を妨げないように十分に短い。また、対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、エピトープタグが特異的であることが好ましい。一般的に、適切なタグポリペプチドは、最低６のアミノ酸残基で、そして、通常約８−５０のアミノ酸残基（好ましくは約９−３０の残基）である。例えば、インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５  (Fieldら. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988))；ｃ-ｍｙｃタグ及び８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、及びその９Ｅ１０抗体(Evanら., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985))；及び、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤ（ｇＤ）タグおよびその抗体(Paborskyら., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990))を含む。ある種の実施形態では、エピトープタグは、ある「サルベージレセプター結合エピトープ」である。
ここで用いられる「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【００５２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；ミトキサントン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン（カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１）（５−ＦＵ及びリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；リューコボリン(leucovorin)（ＬＶ）；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例として、エルロチニブ(erlotinib)（ＴａｒｃｅｖａＴＭ））及び細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５３】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX（登録商標）タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON*トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)及びエスペラミシン(Esperamicins)（米国特許第４６７５１８７号を参照）並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５４】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等（編）, 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００５５】
関節リウマチ治療に、本発明の抗体を以下の薬剤のうちの一またはそれ以上と組み合わせて患者を治療する：ＤＭＡＲＤＳ（疾患変更姓抗リウマチ薬(例として、メトトレキセート)）、ＮＳＡＩまたはＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、HUMIRAＴＭ（アダリムマブ(adalimumab)；Abbott Laboratories）、ARAVA(登録商標)（レフノミド(leflunomide)）、REMICADE(登録商標)（インフリキシマブ(infliximab)；Centocor Inc., of Malvern, Pa）、ENBREL（エターナルセプト(etanercept)；Immunex, WA）、COX-2阻害剤。一般にＲＡに用いられるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロクイン(hydroxycloroquine)、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エターナルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄペニシラミン、ゴールド(Gold)（経口）、ゴールド（筋注）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着である。アダリムマブ(adalimumab)はＴＮＦαに結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブはＴＮＦαに結合するキメラモノクローナル抗体である。エターナルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合するヒト７５ｋＤ(p75)腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部位からなる「免疫吸着」融合タンパク質である。ＲＡの従来治療は、例として“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡ患者を本発明のＣＤ２０抗体をメトトレキセート(MTX)と組み合わせて治療する。ＭＴＸの例示的用量は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／ｗｋである。ＭＴＸは経口および皮下的ににより投与される。
【００５６】
硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病の治療には、本発明の抗体を、例としてRemicadeR (インフリキシマブ； Centocor Inc., of Malvern, Paより)、ENBREL (エターナルセプト；Immunex, WA)と組み合わせて患者を治療する。
ＳＬＥの治療には、高用量副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロスファミド(HDCC)を本発明の抗体と組み合わせて患者を治療することができる。
乾癬治療には、本発明の抗体を局所的治療、例として局所的ステロイド、アンスラリン、カルシポトリエン、およびタザロテン、またはメトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ治療と組み合わせて患者を治療する。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに続いてまたは同時にＣＤ２０結合抗体で治療する。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００５７】
「制御配列」なる表現は、特定の宿主生物で作用可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及び、リボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸が他の核酸配列と機能的な関係にある場合、核酸は「作用可能に連結して」いる。例えば、プレシーケンス(presequence)または分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、そのポリペプチドのＤＮＡと作動可能的に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
ここで用いる、「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は、本明細書では同義で使われ、すべてのそのような呼称は後代を含む。このように、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる用語は、継代数に関係なくそれらに由来する一次対象細胞および培養物を含む。また、故意または偶発的な突然変異により、すべての後代においてＤＮＡの内容が正確に同一であるというわけではないことが理解される。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。異なった呼称を意図する場合は、前後関係から明白となろう。
【００５８】
ＩＩ．発明の実施の形態
合成高親和性抗ＶＥＧＦ抗体
ここでの発明はＶＥＧＦに対して高結合親和性を持つ新規な抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。例示的な抗体産生方法は次のセクションにおいて更に詳細に記載される。
新規な抗ＶＥＧＦ抗体は第一の哺乳動物種から誘導されるＶＥＧＦ抗原を使用して選択される。好ましくは、抗原はヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）である。しかしながら、他の種由来のＶＥＧＦ、例えばマウスＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ）をまた第一標的抗原として使用することもできる。様々な哺乳動物種由来のＶＥＧＦ抗原は天然源から単離することができる。他の実施態様では、抗原は組換え的に又は当該分野で既知の他の合成法を使用して作成される。
選択される抗体は通常は第一のＶＥＧＦ抗原に対して十分に強い結合親和性を有するであろう。例えば、抗体は約５ｎＭ以下、好ましくは約２ｎＭ以下、より好ましくは約５００ｐＭ以下のＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合しうる。抗体親和性は例えば表面プラズモン共鳴ベースアッセイ（例えば実施例に記載したようなＢＩＡコアアッセイ）；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ）によって測定することができる。
【００５９】
また、抗体は、例えば治療剤としてのその効能を評価するために、他の生物学的活性アッセイにかけることができる。このようなアッセイは当該分野において既知であり、標的抗原と抗体の意図される用途に依存する。その例には、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ（以下の実施例に記載）；腫瘍細胞成長阻害アッセイ(例えば、国際公開第８９／０６６９２号に記載されている)；抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)及び補体媒介傷害性(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)；及びアゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開第９５／２７０６２号参照)が含まれる。
対象の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイを実施することができる。別法として、例えばChampe等, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)に記載されているようなエピトープマッピングを実施して抗体が対象のエピトープに結合するかどうかを決定することができる。
【００６０】
新規抗体の種特異性を次に決定する。抗体を選択するために使用される抗原のホモログ（ここでホモログは「第二の哺乳動物種」由来である）に対する抗体の結合親和性は上に記載したもののような技術を使用して評価される。好適な実施態様では、第二の哺乳動物種は抗体が前臨床研究で投与される非ヒト哺乳動物である。従って、第二の哺乳動物種は非ヒト霊長類、例えばアカゲザル、カニクイザル、ヒヒ、チンパンジー及びマカクでありうる。他の実施態様では、第二の哺乳動物種は、例えば齧歯類（例えばマウス又はラット）、ネコ又はイヌでありうる。
種依存性を決定し（改善された性質を持つ抗体変異体を評価；以下を参照）するための本発明の好適な方法は抗体結合親和性を定量することであるが、本発明の他の実施態様では、合成抗体及び抗体変異体の一又は複数の生物学的性質を、結合親和性の定量に加えて、又はその代わりに評価する。例示的なそのような生物学的アッセイは上述の通りである。そのようなアッセイはそれらが抗体の治療効果に関して指標を提供する場合に特に有用である。通常、必ずしもそうではないが、そのようなアッセイにおいて改善された性質を示す抗体はまた向上した結合親和性を有する。従って、選択のアッセイが結合親和性アッセイ以外の生物活性アッセイである本発明の一実施態様では、種依存性抗体は、第一の哺乳動物種からの試薬を使用する対応するアッセイにおけるその生物活性よりも少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍効果が少ない第二の哺乳動物種由来の「材料」（例えば抗原、細胞、組織、器官又は全動物）を使用して「生物活性」を通常は有する。
【００６１】
種依存性抗体はついで種依存性抗体よりも、第二の哺乳動物種由来の抗原に対してより強い結合親和性を有する抗体変異体を産生するように改変される。抗体変異体は好ましくは、抗原に対する種依存性抗体の結合親和性よりも、少なくとも約１０倍強く、好ましくは少なくとも約２０倍強く、より好ましくは少なくとも約５０倍強く、しばしば少なくとも約１００倍又は２００倍強い非ヒト哺乳動物由来抗原に対する結合親和性を有している。所望され又は必要とされる結合親和性の向上は種依存性抗体の初期の結合親和性に依存する。使用されるアッセイが生物活性アッセイである場合、抗体変異体は好ましくは、そのアッセイにおける種依存性抗体の生物活性よりも、少なくとも約１０倍良好で、好ましくは少なくとも約２０倍良好で、より好ましくは少なくとも約５０倍良好で、しばしば少なくとも約１００倍又は２００倍良好な選択アッセイにおける生物活性を有している。
【００６２】
抗体変異体を産生するためには、種依存性抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾（例えば置換）が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾（例えば置換）を種依存性抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの（Amit等, Science 233:747-753 (1986)）；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの（Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（欧州特許第２３９４００Ｂ１号）が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
改変される高頻度可変領域残基は、特に第二の哺乳動物種由来の抗原に対する種依存性抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
【００６３】
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」（Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989)）と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
そのような抗体変異体を産生するための他の手順はファージディスプレイを使用する親和成熟を含む（Hawkins等 J. Mol. Biol. 254:889-896 (1992)及びLowman等 Biochemistry 30(45):10832-10837 (1991)）。簡単に述べると、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を変異させて、各部位に全ての可能なアミノ置換を生じさせる。このようにして産生された抗体変異体は各粒子内に収容されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として繊維状ファージ粒子から一価形式でディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体をついでここに開示されたその生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
【００６４】
本発明はまた修飾するアミノ酸残基を同定するためのより系統的な方法を提供する。この方法によれば、第一の哺乳動物種由来の抗原への結合に関与する種依存性抗体の高頻度可変領域残基及び第二の哺乳動物種由来の抗原のホモログへの結合に関与する高頻度可変領域残基が同定される。これを達成するために、種依存性抗体の高頻度可変領域残基のアラニン-スキャンニングを実施でき、各ａｌａ変異体について第一及び第二哺乳動物種由来の抗原への結合性を試験する。別法では、抗体-抗原複合体のＸ線結晶構造について接触残基並びに回りの残基（実施例に記載）を分析する。それによって、第一の哺乳動物種（例えばヒト）由来の抗原への結合に関与する高頻度可変領域残基と、第二の哺乳動物種（例えば非ヒト哺乳動物）由来の抗原のホモログへの結合に関与するものが同定される。好ましくは、第一の哺乳動物種（例えばヒト）由来の抗原ではなく第二の哺乳動物種（例えば非ヒト哺乳動物）由来の抗原への結合に有意に関与する残基が修飾のための候補として選択される。他の実施態様では、第一及び第二双方の哺乳動物種由来の抗原への結合に有意に関与する残基が選択されて修飾される（以下の実施例参照）。それほど好適ではないまた更なる実施態様では、第二の哺乳動物種ではなく第一の哺乳動物種由来の抗原への結合に関与する残基が選択されて修飾される。そのような修飾はその残基の欠失又はその残基に隣接する一又は複数の残基の挿入を含みうる。しかしながら、通常は、修飾は他のアミノ酸へのその残基の置換を含む。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性（例えば結合親和性）の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【００６５】
好適な置換：
2011046732.tif 000002
【００６６】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
（２）中性の親水性：cys, ser, thr；
（３）酸性：asp, glu；
（４）塩基性：his, lys, arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro;
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される（上を参照）。
【００６７】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、種依存性抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発（例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照）である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、種依存性抗体の高頻度可変領域残基の二又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。例えば、以下の実施例のマウス化抗ＶＥＧＦ抗体変異体は４つの高頻度可変領域置換を有していた。
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は種依存性抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後における種依存性抗体残基と同一（つまり同じ残基）又は類似（つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
【００６８】
抗体変異体の産生後に、種依存性抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを上述のように調製し、第二の哺乳動物種由来の抗原に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。好適な実施態様では、抗体変異体は種依存性抗体に類似する結合親和性で第一の哺乳動物種由来の抗原に結合する能力を保持する。これは、第一の哺乳動物種由来の抗原への結合に関与する高頻度可変領域残基を改変することを避けることにより達成することができる。他の実施態様では、抗体変異体は第一の哺乳動物種由来の抗原に対して有意に改変された結合親和性を有しうる（例えば、その抗原に対する結合親和性は好ましくはより良好であるが、種依存性抗体よりも悪い）。
【００６９】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる（特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン（但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる）への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位に対する）の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。
種依存性であり得、よってここに詳細に記載する技術によっての修飾を必要とする抗体を産生する技術は次の通りである：
【００７０】
Ａ．合成抗体ファージライブラリからの高親和性抗ＶＥＧＦ抗体の産生
本発明はまた独特のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な高親和性抗ＶＥＧＦ抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、ＶＥＧＦ抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば全体の開示を出典明示によりここに取り込む仮米国出願第６０／３８５３３８号（２００２年６月３日出願）及び関連出願に見出すことができる。
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
【００７１】
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一態様では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【００７２】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ（例えば抗ｇＤタグ）の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
【００７３】
標的ＶＥＧＦ抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより（例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して）標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では、ＣＤＲＬ１において次のようにして生じさせられる：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【００７４】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作成される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＶＥＧＦ抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【００７５】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【００７６】
Ｂ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は技術とすぐに入手可能な材料を用いて組み換えて生成することができる。
抗ＶＥＧＦ抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離されるか合成されて、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって）配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【００７７】
（ｉ）シグナル配列成分
この発明の抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【００７８】
（ｉｉ）複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【００７９】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【００８０】
あるいは、ＣＤ２０結合抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００８１】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００８２】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００８３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００８４】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００８５】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００８６】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００８７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００８８】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００８９】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９０】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９１】
（ｉｘ）抗体精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９２】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００９３】
Ｃ．医薬製剤
抗体の治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A. 編 (1980)）、水溶液製剤又は凍結乾燥の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００９４】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが好ましい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【００９５】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【００９６】
Ｄ．本抗体の非治療的な使用
本発明の抗体を親和性精製作用剤として用いてもよい。この過程において、当分野で公知の方法を用いて抗体をセファデックス樹脂又は濾紙などの固相に固定する。固定された抗体は抗原を含む試料に接触させて精製し、その後、精製され、固定した抗体に結合する抗原以外の試料中の実質的に全ての材料を除去するような適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を、他の適切な溶媒、例えば、抗原を抗体から放出させるグリシン緩衝液、ｐＨ５．０によって洗浄する。
また、本発明の抗体は、例えば、特異的な細胞、組織又は血清中の対象とする抗原の発現を検出するための診断検査法に有用であるかもしれない。
【００９７】
診断用の使用のために、一般的に抗体を検出可能な成分で標識するであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる：
（ａ）ラジオアイソトープ、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
（ｂ）希有土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリンおよびテキサス赤のような蛍光性の標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
（ｃ）様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる（例えばｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて）か、またはエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環のオキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【００９８】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆（例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン（ＯＰＤ）又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）色素生産性基質（例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-β-Ｄ-ガラクトシダーゼを有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４,２７５,１４９号および４，３１８，９８０を参照。
【００９９】
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。
本発明の他の実施態様において、抗体は標識する必要がなく、その存在を抗体と結合する標識した抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイに用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０１００】
競合的結合アッセイは、試験サンプルと競争する標識した標準物質の能力に依存して、限定量の抗体の結合について分析するものである。試験サンプル中の抗原の量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。結合する標準物質の量の測定を容易にするために、一般的に、抗体を競合の前か後に不溶化して、標準物質と抗体に結合する分析物質が、標準物質と結合しないで残っている分析物質から都合よく分離するようにする。
サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分又はエピトープに結合することができる、２つの抗体を使用する。サンドイッチアッセイにおいて、分析する試験サンプルは固体支持体に固定される第一の抗体に結合し、その後、第二の抗体が分析物質に結合し、したがって不溶性の３部分からなる複合体を形成する。例として米国特許第４，３７６，１１０号を参照。第二の抗体は、それ自体検出可能な成分で標識するか（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な成分で標識した抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合には、検出可能な成分は酵素である。
【０１０１】
免疫組織化学において、腫瘍サンプルは新鮮なものでも、凍結されたものでも、パラフィン包埋されていても、防腐剤、例えばホルマリンなどで固定されていてもよい。
また、抗体は、インビボ診断検査法に用いられてもよい。通常、腫瘍がイムノシンチグラフィを用いて局所化されるように、抗体を放射性核種（例えば１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓ）又は染料で標識する。
一実施態様において、生物学的サンプル（例えば組織、血液、血清、脊髄液）又は調製された生物学的サンプル中のＶＥＧＦを検出する方法は、試料を本発明の抗体と接触させて、試料中のＶＥＧＦに結合した抗ＶＥＧＦ抗体を観察するかまたは試料中のＶＥＧＦに結合した抗ＶＥＧＦ抗体の量を測定する工程を含みうる。他の実施態様では、対象体（例えばヒト、マウス、ウサギ、ラットなど）中のＶＥＧＦを検出する方法には、対象体に本発明の抗体を投与して、対象体中のＶＥＧＦに結合した抗ＶＥＧＦ抗体を観察するかまたは対象体中のＶＥＧＦに結合した抗ＶＥＧＦ抗体の量を測定する工程が含まれる。
【０１０２】
Ｅ．診断用キット
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち診断検査法を実行するための指示書とともに予め定められた総計でパッケージされ組み合わされた試薬で提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットには、基質と、酵素に必要な補助因子（例えば検出可能な発色基又は蛍光体を提供する基質前駆）が含まれるであろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えばブロックバッファ又は溶解緩衝液）などの他の添加物が含まれうる。様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感受性を最適化する試薬の溶液濃度が得られるように、広範囲に変化していてもよい。特に、溶解して好適な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥として試薬が提供されうる。
【０１０３】
Ｆ．抗体のインビボでの使用
本発明の抗体を哺乳動物を治療するために用いることを考慮する。一実施態様において、抗体を、例えば、臨床前データを得るために、人間以外の哺乳動物に投与する。治療される人間以外の哺乳動物の例には、前臨床研究が行われる人間以外の霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物および他の哺乳動物が含まれる。このような哺乳動物は、抗体で治療される疾患の構築された動物モデルであるか、または対象とする抗体の毒性を研究するために用いてもよい。各々の実施態様において、用量段階的増量研究を哺乳動物で行いうる。抗体が抗ＶＥＧＦ抗体である場合、例えば、固形腫瘍モデルの宿主齧歯動物に投与してもよい。
加えて、または、択一的に、抗体を、ヒト、例えば抗体の投与によって利益を得る疾患又は疾病に罹患している患者を治療するために用いる。抗体で治療することができる症状は多く、異常な血管形成、例えば、過剰な、不適当な又は制御不能な血管新生によって生じるか又は悪化する症状が含まれうる。例えば、このような症状には、結腸直腸癌およびＮＳＣＬＳや前述した他の癌や、慢性関節リウマチや前述した他の炎症性疾患が含まれる。
【０１０４】
以下に示す文献は、リンパ腫およびCLL、その診断、治療および治療効果を評価するための標準的な医療手順について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas.  W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998、van Besien KおよびCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, 1293-1338頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000、およびRai, KおよびPatel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, 1350-1362頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffmanら(editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫または自己免疫関連疾患の治療の効率および成功率を評価するためのパラメータは、適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。以下は、実施例の方法による。
【０１０５】
一実施態様では、本発明の方法及び組成物は、関節リウマチの治療に有用である。RAは多関節の炎症、軟骨の減少、骨侵食により関節の破壊および最終的に関節機能の減退をもたらす特徴がある。加えて、ＲＡは全身性疾患であるため、他の組織、例として肺、眼および骨髄に影響しうる。
初期ＲＡ（すなわち、メトトレキセート（ＭＴＸ）未処理）患者の一次治療および単剤治療、または例としてＭＴＸもしくはシクロフォスファミドと組合せてＶＥＧＦ結合抗体が利用可能である。もしくは、ＤＭＡＲＤおよび／またはＭＴＸ抵抗性患者の二次療法、例としてＭＴＸと組合せて治療に抗体が利用できる。一の好ましい実施態様では、本発明のＶＥＧＦ結合抗体をＤＭＡＲＤおよび／またはＭＴＸ抵抗性の哺乳動物に投与する。抗ＶＥＧＦ抗体は関節傷害の予防と調節、機能傷害の遅延、ＲＡの炎症に伴う痛みの軽減に有用である。ＲＡ治療に用いる多剤での処置の前、後、または同時にＲＡ患者を本発明の抗ＶＥＧＦ抗体で治療する（以下の混合治療参照）。一実施態様では、以前に病気を調整する抗リウマチ薬に失敗した患者および／またはメトトレキセート単独では効果が不十分な患者は本発明の抗ＶＥＧＦ結合抗体で治療する。他の実施態様では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体＋シクロフォスファミド、または本発明の抗ＶＥＧＦ結合抗体＋メトトレキセートを患者に投与する。
【０１０６】
ＲＡの治療効果を評価するある方法は、American College of Rheumatology（ＡＣＲ）診断基準に基づくものであり、圧痛および腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療（例として、治療前の基準）またはプラセボ治療と比較して例としてＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをする。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例として骨の侵食および関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられる鋭Ｘ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中または治療後にHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防または改善の評価をすることができる。ＡＣＲ２０診断基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含む。
１．視覚的類似尺度（ＶＡＳ）による患者の痛み評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、および
５．急性期反応、ＣＲＰまたはＥＳＲ
ＡＣＲ５０および７０も同様に定義する。好ましくは、少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する程度に有効な量の本発明の抗ＶＥＧＦ結合抗体を単独でまたは他の作用剤と組み合わせて、関節リウマチを治療するために患者に投与する。
乾癬性関節炎は特異的で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の関節侵食および関節腔狭小化も同様にシャープ(sharp)スコアにより評価しうる。本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ結合抗体は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候および疾病の症状の減弱に利用可能である。
【０１０７】
本抗体は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によって、投与することができる。
疾患の予防又は治療のために、本抗体の好適な用量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。この治療の進行は従来の技術およびアッセイによって容易にモニターできる。抗ＬＥＡ-１抗体または抗ＩＣＡＭ-１抗体の用量処方例はＷＯ９４／０４１８８に開示されている。癌治療の用量処方および治療用組成物の例は、２００３年５月３０日に提出の米国特許仮出願第６０／４７４４８０号にある。
【０１０８】
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因には、治療する特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々患者の臨床症状、疾患の原因、作用剤の運搬の部位、投与の方法、投与の日程計画および医師が知りうる他の因子が含まれる。投与される抗体の「治療上の有効量」は、このような考慮によって調整されて、疾患又は疾病を予防するか、改善するかまたは、治療するのに必要な最小限度の量である。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。通常、疾患又は疾病の寛解又は治療は、疾患又は疾病と関連する一つ以上の症状又は医学的な問題を少なくすることを伴う。癌の場合、薬剤の治療上の有効量により、以下の一つ以上を達成することができる：癌細胞の数を減少する；腫瘍サイズを減少する；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度減退させるおよび／または停止する）；腫瘍転移を阻害する；ある程度腫瘍成長を阻害する；および／または、ある程度癌と関連する一以上の症状を取り除く。薬剤が、既存の癌細胞の成長を予防したり、および／または殺すのであれば、細胞増殖抑止剤および／または細胞障害能がありうる。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、対象体又は哺乳動物の疾患又は疾病の発症又は再発を予防するために用いることができる。
【０１０９】
Ｇ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器とラベルを具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、試験管等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の活性剤は本抗体である。容器のラベル又は付属物は、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示が明記されるパッケージ挿入物を含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１１０】
ここに全体として組み込まれる文献は、以下の本明細書が優先権を主張する米国特許仮出願である：２００３年８月１日に出願されたＵＳＳＮ６０／４９１，８７７；２００３年１１月１日に出願されたＵＳＳＮ６０／５１６，４９５；２００４年５月１２日に出願されたＵＳＳＮ６０／５７０，９１２；２００４年５月１３日に出願されたＵＳＳＮ６０／５７１，２３９；２００４年６月１日に出願されたＵＳＳＮ  ６０／５７６，３１５；および、２００４年６月１８日に出願されたＵＳＳＮ６０／５８０，７５７。
以下の実施例は本発明の実施を単に例証するためのもので限定するものではない。ここで引用した全ての特許と科学文献の開示は出典明示によりその全体が取り込まれる。 
【実施例】
【０１１１】
合成抗体ファージライブラリの作製
一般的に、２つのタイプの組合せ抗体ライブラリが開発され、元となるレパートリーによって分類された。現在までの大部分のライブラリは、その多様性の供給源として天然のレパートリを用いた「天然の」抗体ライブラリであり、非免疫であるか免疫化された動物又はヒト由来の免疫細胞のメッセージＲＮＡとしての遺伝子を増幅し、ファージディスプレイ又は他のディスプレイ技術（例えばリボソーム又は酵母ディスプレイ）のためにベクターにクローニングしたものである。天然抗体は通常多数のフレームワークを有しており、可変ＣＤＲ配列とともに軽鎖ないし重鎖の組換えによってライブラリの多様性を形成したものである。レパートリがライブラリサイズより全体的に大きいので、ライブラリの性能はライブラリの大きさで決まった(marksら)。一方、合成ライブラリは、多様性が合成ＤＮＡによってライブラリ内に設定及び作製されたライブラリの新規の一技術である。単一又は多数のフレームワークが用いられた。単一のフレームワークライブラリでは、多様性は、多様なＣＤＲループを作成するように設定した合成ＤＮＡの縮重に単に依存する。ライブラリの多様性設定およびサイズは、ライブラリ性能のために重要であり、その性能はライブラリにみられる抗体の親和性によって測定することができる。
我々は、鋳型となる単一のフレームワークによって合成抗体ファージライブラリを構築する方策を開発した。カバットデータベースによる天然抗体レパートリに溶剤を曝すか非常に多様化したＣＤＲループから残基を選択して、テイラーコドンを用いて天然の多様性を模倣することによってランダム化した。また、我々は、天然抗体と抗原との主な結合相互作用に関与することが多い重鎖にランダム化を限定することを調べ、ナイーブ標的に対する結合体を十分見つけることができることが明らかとなった。多様性を限定する理由の一つは、ＤＮＡ縮重と実際のファージライブラリサイズとのギャップをあまり誤差を生じさせず、配列空間を十分な密度に覆うようにするためである。
【０１１２】
第一のライブラリでは、ランダム化した重鎖を有するヒト化4Ｄ5フレームワークおよび単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）の形態の固定された軽鎖がさらに構築された。標的抗原であるマウスＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ）に対して多くの特徴的な結合体が見つかった。
ついで、ＣＤＲ-Ｈ1およびＨ2又は軽鎖の多様性を微調整して、天然の多様性に非常に類似させることによって、及び、ディスプレイのＦａｂ形態のＣＤＲ-Ｈ3の多様性設定を調べることによって、一般的にライブラリは更に改良された。抗体ライブラリの異なる型の具体例については図１を参照。我々は、同程度のサイズのＣＤＲ-Ｈ3の異なる設定を有するライブラリが結果として標準以下のｎＭ親和性でｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦの結合体が生じることを発見した。これらの結合体の親和性は、軽鎖ＣＤＲをランダム化する第二工程によってｐＭ範囲を更に改良することができる。
単一鋳型を用いた合成抗体ライブラリの作製方法と方策の詳細については、米国特許仮出願ＵＳＳＮ６０／３８５，３３８号（２００２年６月３日出願）を参照し、その開示の全体は出典明記により特別に本明細書に組み込まれる。よって、単一フレームワーク鋳型に基づく多様化合成抗体ファージライブラリにおいて、ヒトＶＥＧＦ及びマウスＶＥＧＦの両方に高親和性を有する新規の抗体が明らかとなりうる。
【０１１３】
実施例１  Ｇ６及びＢ２０由来抗体
（ａ）高親和性抗ＶＥＧＦ Ｆａｂクローンの選別
高親和性の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂクローンの選別手順は、固形支持体結合分類及び溶液結合分類の様々な組み合わせからなる。固形支持体分類では、ＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートにコートした５μｇ／ｍｌの標的抗原を用いて抗体ファージライブラリのパンニングを行った。溶液結合分類法では、溶液中で低濃度のビオチン化抗原とともにファージライブラリをインキュベートして、ついでニュートラビジン（２〜５μｇ／ｍｌ）コートの９６ウェルMaxisorpプレートによって捕獲した。低濃度であることによって、より親和性の高い結合体とするためのパンニングの程度をより厳しくすることができる。標的抗原ｍＶＥＧＦに対して、二工程分類方策が開発された。その二工程は、第一工程で、固形支持体選別法によってナイーブライブラリから潜在的な結合体を単離し、続く第二工程で、濃度を低くした標的抗原を用いた連続的な溶液結合法によって親和性の低いものからより親和性の高い結合体を単離することができる。これら結合体を迅速に単離するために、ハイスループットの単一スポット競合的結合ＥＬＩＳＡを用いた。このアッセイに少量のｍＶＥＧＦ（２５ｎＭ）を用いて、３回の分類工程の後に各ライブラリから１６のクローンをスクリーニングして得た。
固形支持体分類法と溶液結合分類法を組み合わせた結果、ＮＮＫライブラリから３つのＦａｂクローン、Ｇ６、Ｂ２９及びＣ３が抗親和性結合体として同定された。そして、５回の分類工程の後に、ライブラリ全体をＧ６クローンが占めていた。興味深いことに、ＮＶＴライブラリ由来のＢ２０は溶液結合分類法のみによって同定された。これは、異なるクローンに対してバイアスをかけた異なる方策の分類方法によってより多くのクローンが同定されうることを示唆している。異なるライブラリを設定して、異なる配列を有するより多くのＶＥＧＦ結合クローンを同定することもできる。まず、異なる配列を有する４つの特有のクローンを２５℃の競合的結合ＥＬＩＳＡを用いてマウス及びヒトのＶＥＧＦに対する結合親和性について特徴づけた。ファージ結合アッセイのＩＣ５０データからその親和性が予測され、Ｇ６は、マウス及びヒトのＶＥＧＦ両方に対して０．５−１ｎＭでＩＣ５０となる最も高い親和性を有する結合体として同定された（図２）。
【０１１４】
（ｂ）活性及び性質
一連のインビトロアッセイを行って、選別した新規の抗ＶＥＧＦ抗体の性質及び活性を調べた。
エピトープブロッキングアッセイ
まず、抗体ファージクローンをＶＥＧＦの考えられる結合エピトープについて調べた。ＫＤＲの完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はＦｌｔ−１（Ｆｌｔ−１Ｄ２）の第二ドメインの何れかを漸増濃度で含む条件下でｍＶＥＧＦコートウェルへのファージクローン（一定濃度）の結合を測定するファージブロッキングアッセイを用いた。ＫＤＲの完全なＥＣＤ又はＦｌｔ−１は７つの免疫グロブリン様ドメインを有し、第２及び第３のドメインを介してＶＥＧＦに結合する。Ｆｌｔ−１の第２ドメイン単独では、公開されている結晶構造ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ複合体に基づいて、ＶＥＧＦ上の公知のエピトープによって２ｎＭのＫｄでＶＥＧＦに結合することができる(Wiesmannら. (1997) Cell 91:695-704)。ＶＥＧＦに結合するＫＤＲ ＥＣＤのＫｄは約５ｎＭである。我々はファージ上の抗体に対するエピトープはレセプターと著しく重複する場合、レセプターの増加とともにファージクローンの結合が減少することが予想された。
大腸菌から発現される精製したＦａｂ（マウス又はヒトのＶＥＧＦ）を用いたタンパク質レベルのレセプターブロッキングアッセイのために、Ｆｌｔ−１ ＥＣＤフラグメント（Ｉｇドメイン１−５）（Ｆｌｔ−１Ｄ１−５）を直接発現するバキュロウイルスをコートしたＶＥＧＦレセプター固定プレート、又はＦｃγ融合としてＫＤＲ ＥＣＤ（Ｉｇドメイン１−７）が存在するＫＤＲ-Ｉｇ融合を発現する２９３細胞を９６ウェルMaxisorpイムノプレートにコートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ(Jackson ImmunoResearch Lab. West Grove, PA)で捕獲して、０．５％ＢＳＡ及び０．０２％Tween20にてブロックした。まず、０．２ｎＭのビオチン化した細菌発現のｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦを０．０５％Tween20(PBST)を有するＰＢＳにて３倍の段階希釈した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、Ｇ６、Ｆａｂ−１２（アバスチンＴＭ抗体のＦａｂ）又はＹ０３１７とともにインキュベートした。室温で１時間インキュベートした後、混合物をＶＥＧＦレセプター固定プレートに移し、１０分間インキュベートした。抗ＶＥＧＦによってブロックされなかったＶＥＧＦ−ＡをＶＥＧＦコートウェルにて捕獲し、ストレプトアビジン-ＨＲＰコンジュゲートによって検出し、前述のようにＴＭＢ基質とともに展開した。
図３に示すように、４つのクローンはＦｌｔ−１Ｄ２とＫＤＲによって異なる程度にブロックされた。このブロッキングアッセイの結果により、これら４つのクローンがレセプター結合エピトープと重なり合っているにもかかわらずＶＥＧＦ上に異なる結合エピトープを有することが示唆された。このブロッキングアッセイでは、抗体クローンの親和性はレセプターによるブロッキングの効果と相関関係はなかった。公知のエピトープを有するファージクローンであるＹ０９５９を対照として用いた。４つの新規のクローンの中で、Ｇ６とＢ２０は、レセプターフラグメントの存在下でｍＶＥＧＦに対する結合が著しく減少するので、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ両方のエピトープと著しく重なり合うエピトープを有することが明らかとなった。ブロッキング効率の違いは小さいが、複数のアッセイと一致していた。Ｇ６又はＢ２０は、Ｆａｂ−１２ないしその変異体、Ｙ０３１７及びＹ０９５９よりもＶＥＧＦ上のレセプターのエピトープと一致したエピトープを有していることが予想される(Muller, Y.A.,ら., (1998) Structure 6:1153-1167)。ゆえに、その結合を確認するため及びエピトープを調べるためにＦａｂタンパク質を生成することを進めた。ｍＶＥＧＦ及びｈＶＥＧＦの両方に高親和性を有するので、Ｇ６を更なる研究のために選択した。
【０１１５】
結合特異性及び中和活性
Ｇ６ Ｆａｂクローンの結合特異性を測定するために、ヒト、マウス、ラット及びウザギのＶＥＧＦ-Ａ１６５並びに、マウス及びヒトの胎盤成長因子（ＰＩＧＦ−２）、ｍＶＥＧＦ-Ｄ及びヒトＶＥＧＦ-Ｂを含むＶＥＧＦホモログを用いてＥＬＩＳＡアッセイを行った。マウス及びヒトの胎盤成長因子（ＰＩＧＦ−２）、マウスＶＥＧＦ-Ｄ、ラットＶＥＧＦ-Ａ及びヒトＶＥＧＦ-ＢはＲ＆Ｄシステムから入手した。試験する抗原を２μｇ／ｍｌの濃度でＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレート上にコートした。漸増濃度のＧ６ Ｆａｂタンパク質との結合をプロテインＧ西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート及び基質によって測定した。例えば、アルカリンフォスファターゼのプロモータ下にＧ６ Ｆａｂ発現プラスミドコンストラクトと分泌リーダー配列ｓｔＩＩを有する大腸菌からＦａｂタンパク質を調製し、プロテインＧ親和性カラムにて精製した。ＶＥＧＦとそのホモログへのＧ６ Ｆａｂ結合を直接ＥＬＩＳＡによって測定した。ＶＥＧＦホモログコートウェル（２μｇ／ｍｌの濃度のＰＢＳ）を０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Tween20にて２５℃でブロックした。漸増濃度のＦａｂをＶＥＧＦホモログコートウェルとともに１時間、２５℃でインキュベートして、ＰＢＴバッファにて希釈した抗ヒトＦａｂ抗体西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートにて測定し、ついでＴＭＢ基質にて展開(develope)した。また、いくつかのタンパク質について溶液結合アッセイを行った。そのアッセイは、漸増濃度のＶＥＧＦホモログとともに０．５ｎＭのＧ６ Ｆａｂを１〜２時間、２５℃でインキュベートして、結合しないＦａｂをｍＶＥＧＦ-Ａコートウェルにて捕獲して、測定した。図４に示すように、Ｇ６ Ｆａｂタンパク質はｍＶＥＧＦ及びｈＶＥＧＦ（それぞれおよそ０．６ｎＭ及び１．４ｎＭ）の両方に等しくよく結合している。さらに、Ｇ６抗体は他のＶＥＧＦホモログには全く結合しないので、非常にＶＥＧＦ特異的である。Ｇ６ Ｆａｂは、ラット及びウサギＶＥＧＦにｍＶＥＧＦに対するのと同じ親和性で結合した（データは示さない）。
【０１１６】
Ｇ６が高い親和性を持ってＶＥＧＦに結合するかだけでなく、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を効果的にブロックするかどうかを試験するために、漸増濃度のＧ６ Ｆａｂクローンの存在下でのＫＤＲへの結合についてｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦの何れかを試験するブロッキングアッセイを行った。また、ｈＶＥＧＦを効果的にブロックするがｍＶＥＧＦに結合することもその活性をブロックすることもない２つの抗ｈＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２（アバスチンＴＭのＦａｂ）とＹ０３１７を対照として用いた。図５に示すように、Ｇ６はＦａｂ−１２又はＹ０３１７と同じ効率でＫＤＲへのｈＶＥＧＦの結合を効果的にブロックした。さらにまた、Ｇ６はＫＤＲに対するｍＶＥＧＦの結合を著しくブロックすることができる。比べてみると、Ｆａｂ−１２もＹ０３１７もｍＶＥＧＦに対するブロック効果を示さない。
ゆえに、本発明の新規の抗ＶＥＧＦ抗体Ｇ６は、ヒト及びマウス種由来のＶＥＧＦに結合してブロックすることができる高親和性抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０１１７】
細胞ベースアッセイ
新規の抗体Ｇ６の結合特異性及びブロッキング活性の更なる試験のために、様々な抗ＶＥＧＦ抗体のヒト又はマウス何れかのＶＥＧＦ誘導細胞増殖をブロックする能力について試験するヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた細胞ベースアッセイを行った。基本的には、９６ウェルの組織培養プレート１ウェル当たりに３０００ＨｕＶＥＣをまき、アッセイ培地（１．５％（ｖ／ｖ）の透析滅菌した胎仔ウシ血清を添加したＦ１２：ＤＭＥＭ  ５０：５０）にて２４時間飢餓状態にした。細胞の成長刺激に用いたＶＥＧＦの濃度は、９０％の最大ＤＮＡ合成が得られるＶＥＧＦの濃度を同定するように始めに滴定して決定した。ついで、一定量のＶＥＧＦ（最終濃度０．１ｎＭ）を含む新鮮アッセイ培地と漸増濃度の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを添加した。２４時間のインキュベーション後、１ウェル当たり０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンにて２４時間刺激を与え、その後９６ウェルフィルタープレートに回収して、ＴｏｐＣｏｕｎｔγ計測器にて計測した。ここで、トリチウム標識したチミジン取り込みによってＤＮＡ合成を測定した。このアッセイでは、Ｆａｂ−１２及びＹ０３１７を抗ＶＥＧＦ抗体の対照として用いた。
図６に示すように、Ｇ６抗体はｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦのＨＵＶＥＣ増殖亢進能力を著しく減少した。ここで、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）実験を対照として行い、アッセイで用いた抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの何れもが宿主細胞に対して非特異的な毒性を示さないことを示した。
【０１１８】
（ｃ）Ｇ６及びＢ２０抗ＶＥＧＦ抗体の親和性向上
２つの新規の抗体クローン、Ｇ６及びＢ２０を更なる結合親和性の向上のために選択した。両クローンはランダム化した重鎖と一定の軽鎖のみを有するライブラリに由来するため、親和性を向上させるために、軽鎖ＣＤＲの様々に選択した残基をランダム化した。細胞表面に曝されたＣＤＲ残基と天然抗体のカバットデータベース内の非常に多様化した残基を選択した。軽鎖の各ＣＤＲ部位において天然の免疫レパートリを模倣したアミノ酸多様性を作製するために個別に設定した縮重コドンを用いた部位特異的突然変異誘発法を用いた（図７）。まず始めに、Maxisorp９６ウェルプレートに固定したｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦにライブラリを添加し、結合体の回復を最大にした後、選別の２つの分離追跡として漸減濃度のビオチン化したｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦを用いて溶液分類を行った。分類の負荷を測定するためにクローンの初期親和性に基づいて、ビオチン化ＶＥＧＦの濃度を選択した。また、ビオチン化ＶＥＧＦとファージライブラリとの初期インキュベーションの後、及び９６ウェルMaxisorpプレートにコートしたニュートラビジンによる捕獲の前に、ファージ結合体を１０００倍以上の非ビオチン化抗原とともに溶液中で異なる温度、異なる時間インキュベーションすることによって選別負荷は増加した。
上記に記載の工程の実施例のように、１ｎＭ親和性を有するＧ６を更なる親和性向上の対象とした。第１回目の分類には、ＶＥＧＦに結合するすべてのクローンを捕獲するために固形支持体法を用い、ついで第２回目の分類には、１ｎＭのＶＥＧＦとともにファージライブラリをインキュベートした。次に、溶液結合法は１ｎＭのビオチン化ｈＶＥＧＦを用いてほとんどの結合体を選別した。捕獲の前に、１μＭの非ビオチン化ｈＶＥＧＦを添加し、室温で１５分間インキュベートし、解離速度の速い結合体を競合させた。ついで、その後の分類（第３回目と第４回目）では、より少ないビオチン化ｈＶＥＧＦ（０．１ｎＭ）を用いて選別し、１００ｎＭの非ビオチン化ｈＶＥＧＦ、３７℃で３０分か又はそれ以上（２時間又は６時間）にて解離速度の高い結合体を競合させ、より解離係数の低い結合体を探すことによって、溶液分類でより大きな選別負荷をかけた。
【０１１９】
ｈＶＥＧＦに対して親和性が低い（ＩＣ５０、〜１５０ｎＭ）ために用いる低ストリンジェント条件を除いて、Ｂ２０クローンを向上するために同じ方策が利用可能である。ｍＶＥＧＦ選別追跡はｈＶＥＧＦで用いたのと同じ手順及び条件に従った。溶出したファージ力価率によって濃縮を算出し、ビオチン化標的を用いずに選別した。分類の後、前述のようにハイスループットの単一スポット競合的結合ＥＬＩＳＡを用いて、向上した親和性のクローンを素早くスクリーニングした。
本アッセイにおいて、少量のｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦ（１０ｎＭ）を用いて、野生型のＧ６及びＢ２０結合体を対照として、Ｇ６ベースのファージライブラリから５１クローンが、Ｂ２０ベースのファージライブラリから１１０クローンがスクリーニングされた。。いくつかの改良型のＧ６クローン（ひとまとめにしてＧ６−ＩＩ変異体とする）が選別され、野生型のクローンのファージＩＣ５０と比較するとヒト及びマウスのＶＥＧＦ両方に対して１００倍以上に結合親和性が著しく向上したことが示唆された（図７）。多くの特有の配列を有するクローンが親和性を向上したことを示し、これは、選択したクローンの重鎖に順応することができる多くの軽鎖があることを示唆する。また、興味深いことにいくつかのクローンの結合特異性が変化することに気づく。これは、軽鎖が抗原との重鎖相互作用を調節し、その特異性を変更することができることを示唆する。クローン配列にみられるように、ほとんどのＧ６−ＩＩクローンはその３つめの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ-Ｌ３）のみがＧ６と異なった。
【０１２０】
親和性及び活性アッセイのためにＦａｂタンパク質又はＩｇＧタンパク質を生成するために、我々は大腸菌又は哺乳動物細胞で発現させるためにＦａｂ発現プラスミドに可変領域をクローニングした（ファージコートタンパク質ｐ３のＣ末端ドメインをコードする配列を欠損し、重鎖第一定常ドメインの終末の停止コドンから約２０ヌクレオチド下流のリボゾーム結合に終末配列を付加することによって変更したファジミドベクター）。記載されているように(Presta, Lら., (1997) Cancer Res 57:4593-4599)、ＡＰ５培地中で３０℃で２４時間、形質転換した３４Ｂ８大腸菌細胞を生育することによってＦａｂタンパク質を生成した。ＩｇＧはプロテインＡカラムによって精製し、ＦａｂはプロテインＧ親和性クロマトグラフィによって精製した。Ｆａｂの生成効率は、一般的に小規模振とうフラスコ生育では５〜１０ｍｇ／Ｌ、発酵層生育では０．５〜３ｇ／Ｌであった。ＩｇＧ産生はクローンごとに多少異なるが１０〜５０ｍｇ／Ｌ小規模培地で非常に高かった。
３つのＧ６−ＩＩ改良型クローンであるＧ６−８、Ｇ６−２３及びＧ６−３１（軽鎖ＣＤＲ内の残基変異については図７を参照のこと）を選択して、親和性測定、レセプターブロッキングアッセイによるエピトープマッピング及びＨｕＶＥＣ成長阻害アッセイでの活性研究のためにＦａｂタンパク質を作製した。抗ｍＶＥＧＦ Ｆａｂの親和性決定のために、我々は、記載されているように(Chen, Y.,ら., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、〜１００反応単位（ＲＵ）の固定したｍＶＥＧＦ又はｈＶＥＧＦ ＣＭ５チップを用いて２５℃及び３７℃でＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを用いた。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。ヒト又はマウスのＶＥＧＦを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１００になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（１００から０．７８ｎＭ又は３ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Tween20（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。
【０１２１】
親和性が向上したＧ６変異体のｋｏｎがＢＩＡコア評価方法において利用できる結合モデルで満足な統計結果が得られなかったので、ファージディスプレイタンパク質を用いる溶液競合結合アッセイを行い、平衡状態でそれらの抗体の相対的親和性を測定した。ファージ上に表出されるＶＥＧＦを平衡状態に達するように段階希釈したＦａｂとともに室温で２０時間インキュベートし、結合していないＶＥＧＦ−ファージを一時的に（１０分）Ｇ６  Ｆａｂにて捕獲し、上記のように抗Ｍ１３−ＨＲＰおよび基質ＴＭＢにて測定した。Ｆａｂをファージ上に表出し、平衡状態（２０時間）に達するように希釈したＶＥＧＦと反応させ（２０時間）、結合していないＦａｂをＶＥＧＦコート９６ウェルプレート上に捕獲し、上記のように測定するという、溶液競合的結合アッセイの第二の形態も行った。２つのＩＣ５０値を平均して、最終的なＩＣ５０として結合親和性を得た。ｍＶＥＧＦに対するＦａｂの結合は、ｍＶＥＧＦを表出するファージの反応物がないため、第二の形態だけで分析した。
初期のＳＰＲ実験から、重大なｋｏｎ改善がある点に気付いた。例えば、我々は、Ｇ６−２３は、ヒト及びマウスのＶＥＧＦの両方に対して２５℃及び３７℃で会合速度が最も著しく向上することと、解離速度がわずかに減少することを明らかにした（図８）。Ｇ６−３１のｋｏｎもまた、Ｇ６と比較して改善された（データは示さない）。更に、溶液競合結合アッセイにより、Ｇ６−２３がｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対してＩＣ５０ ２０ｐＭの高親和性を有する最も親和性が改善されたクローンであることが確認された（図７）。
また、蛍光消光アッセイを行い、より高い親和性Ｇ６系列抗体のｋｏｎ率を決定した。したがって、３つの親和性成熟されたＦａｂ（Ｇ６−８、Ｇ６−２３及びＧ６−３１）はＦａｂタンパク質として精製し、ｍＶＥＧＦのそれらの親和性を会合速度（結合速度、Ｋｏｎ）について溶液中での蛍光消光を用いてＧ６と比較した（表１および図３０ＡおよびＢ）。
【０１２２】
表１
2011046732.tif 000003
【０１２３】
蛍光消光アッセイは、以下の通りに行った。ＦａｂおよびＶＥＧＦの錯体形成時の蛍光強度の変化を用いて、Ｆａｂ−１２変異体及びＶＥＧＦの結合速度決定として、会合速度を決定した (Marvin J.S.及びH.B. Loman (2003) Biochemistry 42:7077-7083)。まず、１００ｎＭ  ＶＥＧＦを２５℃のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に２０ｎＭ  Ｆａｂを含む撹拌したキュベットに加えることによる８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計(Thermo-Spectronic)を用いて、Ｇ６（又は変異体）−ＶＥＧＦ複合体の２８０ｎｍの励起波長での蛍光強度が個々の成分の合計より低いことを確認した。次に、２５℃での蛍光強度の減少率を観察するために、漸増濃度のＶＥＧＦ（１００−４００ｎＭ）をstop-flow (Aviv Instruments)を備えた分光光度計中の等量の４０ｎＭ  Ｆａｂと混合した。各実験について、各濃度ごとに９回測定して、単一の指数曲線にフィットした。ついで、観察された割合を擬一次分析のためにＶＥＧＦ濃度に対してプロットした。傾斜は会合速度である。個々の実験を２ないし３回行い、誤差は５０％以内であった。
【０１２４】
ＳＰＲ法から得た改良型のクローンの推定されるｋｏｎは、溶液ベースの蛍光消光アッセイによる測定値より〜３〜６倍低い反面、ＳＰＲから得た親のＧ６  Ｆａｂのｋｏｎ測定値は統計学的に正常で、蛍光消光アッセイとの違いが１．２倍の範囲内であった。迅速な結合速度測定のためにＢＩＡコア  ＳＰＲ技術を用いると複合的な流速動態による限界が生じる可能性があり、又は、凝集問題がタンパク質に観察されなくても、親クローンと親和性改良型クローン間でのタンパク質動態にいくらか違いがあり得る。蛍光アッセイでは、３つのＦａｂは、Ｇ６−８、Ｇ６−３１又はＧ６−２３についてそれぞれＧ６より６、８又は２０倍向上した結合速度が示された。また、Ｆａｂ−Ｇ６−３１は、解離速度において〜４倍の向上を示し、その結果、Ｆａｂ−Ｇ６−３１（Ｋｄ＝１６ｐＭ）とＦａｂ−Ｇ６−２３（Ｋｄ＝２１ｐＭ）の親和性はＧ６親（Ｋｄ＝９１０ｐＭ）と比較して〜４０〜６０倍改善された。それは、Ｇ６（０．６７ｎＭ）と比較して、Ｇ６−３１（３０ｐＭ）又はＧ６−２３（１０ｐＭ）のＩＣ５０値に２０〜６０倍の改善を示した溶液位相競合アッセイと一致していた。我々は、軽鎖親和性成熟方策を５つの他の重鎖配列に応用して、結合能において１０〜３０倍の改善を観察した（データは示さない）。Ｇ６とは異なり、多くの改良型のクローンは、３つすべての軽鎖ＣＤＲに新規な配列を取り込んだ。したがって、主に会合速度（結合速度又はｋｏｎ）の増加によって、３つのＧ６変異体がヒト及びマウスのＶＥＧＦへの結合能が向上されたことを明らかにした。Ｇ６−２３は最も結合速度が高く、次いでＧ６−８、次いでＧ６−３１が高い。解離速度（off rate又はｋｏｆｆ）は、ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦに対してそれぞれＧ６−２３で２〜３倍、Ｇ６−３１では８又は１３倍の改善であった。Ｆａｂ−１２およびＹ０３１７と比較して、Ｇ６およびＧ６−２３は著しく異なる結合動態であった（図３２）。Ｇ６−２３はＹ０３１７と似たＫｄを有するが、１０６（Ｍ−１ｓ−１）以上の早い結合速度と１〜２×１０−４ｓ−１の中程度の解離速度（off rate又はｋｏｆｆ）の早い動態であり、一方、Ｙ０３１７は３×１０４Ｍ−１ｓ−１）のゆっくりとしたｋｏｎと〜５×１０−６ｓ−１のとてもゆっくりとしたｋｏｆｆを有する（図３２）。
【０１２５】
段階希釈した精製Ｆａｂ又はＩｇＧタンパク質で均衡化したビオチン化タンパク質抗原を用いた溶液競合結合アッセイでは、結合しないビオチン抗原をMaxisorbプレート上にコートした固定化Ｆａｂ又はＩｇＧで捕獲し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰにて検出した。あるいは、Ｆａｂ又はＩｇＧタンパク質を段階希釈したタンパク質抗原にて均衡化し、結合しないＦａｂ又はＩｇＧを固定した抗原で捕獲し、プロテインＡ−ＨＲＰで検出した。
精製したＦａｂを用いたＶＥＧＦレセプターブロッキングアッセイでは、Ｆｌｔ−１ ＥＣＤフラグメント（Ｉｇドメイン１−５）（Ｆｌｔ−１Ｄ１−５）を直接コートすることによって、又は始めにヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ(Jackson ImmunoResearch Lab. West Grove, PA)でコートすることによって、ＶＥＧＦレセプターをプレート上に固定し、次いでＫＤＲ ＥＣＤ（Ｉｇドメイン１−７）が二量体として存在するＫＤＲ-ＩｇＧ融合レセプターにて９６ウェルMaxisorpイムノプレート上で処理した。次いでプレートを０．５％ＢＳＡ及び０．０２％Tween20にてプレートをブロックした。標準以下のナノモル濃度のビオチン化ｈＶＥＧＦ又は０．２ｎＭのｍＶＥＧＦを、ＰＢＳＴ中で３倍の段階希釈した抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ、Ｇ６、Ｇ６−ＩＩ（Ｇ６−８、２３および３１）、Ｆａｂ−１２又はＹ０３１７とともにインキュベーションした。室温で１時間のインキュベーションの後、混合物を固定したＶＥＧＦリセプターを含むプレートに移し、１０分間インキュベートした。抗ＶＥＧＦによってブロックされなかったＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦレセプターコートウェルで捕獲し、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートによって検出し、上記のようにＴＭＢ基質にて展開した。結果は、元のＧ６と比較して、選択されたＧ６−ＩＩ  ＦａｂがｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦのブロッキングアッセイを亢進したことを示した。Ｇ６及びＢ２０ファージディスプレイクローンで強いブロックが観察され、このことから、ＶＥＧＦ上の結合エピトープがレセプターのエピトープと重なり合っていることが示唆される。また、Ｇ６  Ｆａｂは、効率的にＦｌｔ−１  ＥＣＤに対するヒトおよびマウスのＶＥＧＦの結合を効果的にブロックすることを示した（図３１）。相対的に、結合特異性と一致して、Ｆａｂ−１２はレセプターに対するｈＶＥＧＦ結合をブロックするがｍＶＥＧＦ結合はブロックすることができない。ｈＶＥＧＦに対して改善型の親和性を有する（Ｋｄ＝２０ｐＭ）Ｆａｂ−１２変異体であるＹ０３１７は、不注意にもｍＶＥＧＦ  に対していくらか弱い親和性を獲得しており（２５℃で、Ｋｄ  〜３００ｎＭ、Y. Chen及びH. Lowman の未公開結果)、高濃度でｍＶＥＧＦへのわずかなレセプターブロッキング活性を示す。
【０１２６】
血管内皮細胞増殖アッセイ（ＨｕＶＥＣ）のＶＥＧＦ活性の抑制を上記の通りに行った。Ｇ６の様に、Ｇ６−ＩＩは、ヒトおよびマウスのＶＥＧＦによって刺激しされたヒト臍静脈内皮細胞の成長を特異的に抑制するが、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によって刺激された成長は抑制しなかった。ヒトおよびマウスのＶＥＧＦによって刺激された細胞の成長の５０％の阻害に必要とする濃度（ＨｕＶＥＣ  ＩＣ５０）は、３７℃の溶液結合ＥＬＩＳＡアッセイ又はＢＩＡコアで測定される親和性とよく相関した。Ｇ６と比較して、Ｇ６−２３およびＧ６−３１は、ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦによって刺激されたＨｕＶＥＣ成長の阻害において少なくとも１００倍の改善を示した。また、Ｆａｂ−１２およびＹ０３１７  Ｆａｂは、対照として行った同じアッセイにおいても測定した。Ｆａｂ−１２はｍＶＥＧＦに測定可能な結合を示さなかったのに、Ｙ０３１７  Ｆａｂは３５０ｎＭ親和性でｍＶＥＧＦに結合することができた。したがって、予想されるように、Ｙ０３１７およびＦａｂ−１２はｍＶＥＧＦ媒介性のＨＵＶＥＣ成長において抑制効果を全く示さなかった。異なる軽鎖を有する多くのＧ６−ＩＩ変異体の親和性を向上することができ、溶液−結合アッセイによって、ＨｕＶＥＣ細胞アッセイのインヒビターとしての効力が予測できることを示した。
Ｇ６−２３のＶＥＧＦ結合をＧ６並びにＦａｂ−１２のものと比較した。図８に示すように、Ｇ６−２３は、ｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対する結合について著しく改善した結合速度を有する。Ｇ６−２３の解離速度が実質的にＧ６のものと類似である一方で、Ｇ６−２３の全体のＫｄはｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対するＧ６のものより少なくとも約７倍良好である。
【０１２７】
実施例２  Ｇ６及びＧ６−２３抗体上のＶＥＧＦ結合部位のマッピング
ショットガンアラニン及びホモログスキャニングによるＧ６及びＧ６−２３の機能的マッピング
ショットガンアラニン及びホモログスキャニングによるＧ６及びＧ６−２３の機能的マッピングを行い、ｈＶＥＧＦ結合及びＶＥＧＦ結合をさらに改善することができる残基の検索に重要な残基を同定した。我々は、異なるライブラリ中の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ残基がアラニンか又は野生型（アラニンスキャニング）の何れかであるような、又は相同なアミノ酸は又は野生型（ホモログスキャニング）の何れかであるような組合せファージライブラリを作製した。
【０１２８】
ショットガンスキャニングライブラリのための突然変異原性オリゴヌクレオチド
Ｇ６及びＧ６−２３抗体のＣＤＲ残基をランダム化するためのショットガンアラニン（Ａ）及びホモログ（Ｈ）スキャンライブラリの構築の以下の突然変異原性オリゴヌクレオチドは、既に記載したショットガンコドンを用いて設定した(Vajdosら. (2002) J. Mol Biol 320:415-428)。等モルＤＮＡ縮重をＩＵＢコードで表し（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）、縮重コドンを太字で表す。以下のすべてのオリゴヌクレオチドはGenentech DNA synthesis Groupによって生成した。
2011046732.tif 000004
【０１２９】
ショットガンスキャニングライブラリ構築のためのファジミド鋳型ベクター
（Ａ）ファジミドｐＶ３５０−２ｂ
ＥＧＦ関連結合レセプター２（ＥｒｂＢ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するヒト化抗体であるｈ４Ｄ５ Ｆａｂを一価的にＭ１３バクテリオファージの表面上に表出させるために既に用いたもので、重鎖（ｈｃ）の３つすべてのＣＤＲ内に停止コドン（ＴＡＡ）を含む、ファジミドｐＶ３５０−２ｂをＧ６重鎖ショットガンスキャンライブラリの構築の鋳型として用いた。
具体的に、ファジミドｐＶ０３５０−２ｂは、ｐＳ０６４３ファジミドから得た。ファジミドベクターｐＳ０６４３（ｐｈＧＨａｍ−ｇ３としても知られている、例えば米国特許第５，６８８，６６６号、実施例８）は、ｐＢＲ３２２およびｆ１複製開始点、アンピシリン抵抗性遣伝子、大腸菌アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモータ(Bassら, (1990) Proteins 8:309-314)、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の残基１−１９１に融和するｓｔＩＩ分泌シグナル配列をコードする配列、およびＭ１３ファージのタンパク質ＩＩＩのＣ末端残基２６７−４２１をコードする配列（以降はｃＰ3又はｐＩＩＩとする）を含む。また、ｐＳ０６４３ファジミドはｈＧＨの残基１９１以降のＸｂａＩ部位及びアンバー停止コドンを含む。ｓｔＩＩ分泌シグナル配列は、タンパク質を細菌細胞の周辺細胞質に輸出することができる（例えば抗体の軽鎖領域（ＬＣ））。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列をｐＳ０６４３ベクターから取り除き、ｓｔＩＩ分泌シグナルを有するフレームに連結させたヒト化抗Ｈｅｒ２  Ｆａｂフラグメント（「ｈ４Ｄ５」配列）をコードするＮｓｉＩ／ＸｂａＩ核酸フラグメントで置換した（ｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８、この点ではCarterら., (1992) PNAS 89:4285-4289を、又は配列については米国特許第５,８２１,３３７号を参照）。本修飾によってファージに表出されるＦａｂのレベルを増やすことが示されたので、重鎖断片とｃＰ３との間のアンバー停止コドンを取り除いた。
【０１３０】
ｈ４Ｄ５抗体は、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として知られる癌関連抗原を特異的に認識するヒト化抗体である。ｈ４ｄ５配列は、ＰＣＲ産物が５’ＮｓｉＩ部位と３’ＸｂａＩ部位を有するように設定したｈｕｍＡｂ４Ｄ５バージョン８（「ｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８」）配列及びプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって得た(Carterら., (1992) PNAS 89:4285-4289)。ＰＣＲ産物は、ＮｓｉＩおよびＸｂａＩによって切断して、ｐＳ０６４３ファジミドベクターに連結した。ｈ４Ｄ５核酸配列は、主にヒトのコンセンサス配列Ｆａｂフレームワーク内のＨｅｒ−２に特異的なマウスモノクローナル抗体由来の変更したＣＤＲ残基をコードする。具体的には、配列はＶＨの上流のκ軽鎖（ＬＣ領域）およびＣＨ１ドメイン（ＨＣ領域）を含む。抗Ｈｅｒ−２抗体の作製方法および可変ドメイン配列の同一性については、米国特許第５，８２１，３３７号および同第６，０５４，２９７号を参照のこと。ヒト化４Ｄ５（バージョン８）を含むｐＳ０６４３プラスミドもまた変更した。例えば、単純ヘルペスウイルス１型グリコプロテインＤエピトープタグ（ｇＤタグ−ＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＧＧ（配列番号１７）を、部位特異的突然変異を用いてＬＣのＣ末端フレーム内に付加した。ＬＣ下流の停止コドンに続いて、リボソーム結合部位およびｓｔＩＩシグナル配列をコードする核酸分子を、ＨＣ配列のＮ末端に連結した。結果として、ＨＣ配列は、ｐ３のＣ末端ドメイン（ｃＰ３）、Ｍ１３ファージの微量コートタンパクを有するフレーム内にある。したがって、ファージに表出されたＦａｂは、一つのコンストラクトから生じうる。本ＦａｂファジミドベクターをｐＶ０３５０−２ｂと称し、図１に略図を示す。ｐＶ０３５０−２ｂの軽鎖遺伝子を、２、３の他のアミノ酸残基を突然変異させることによって、更に変更した。例えばＡｒｇ６６をＧｌｙに、Ｓ９３をＡｌａにした。
【０１３１】
ファージ上に表出されたＦ（ａｂ）'２を生成するために、ＰＶ０３５０−４ベクターを、カセット突然変異誘発によってＨＣとｃＰ３の間に二量体可能なロイシンジッパーＧＣＮ４配列（ＧＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲＧ）（配列番号１８）を挿入することによってさらに変更した。ＧＣＮ４ロイシンジッパーは、大腸菌周辺細胞質において２組のＬＣ／ＨＣ−ｃＰ３融合ポリペプチドをまとめて、ファージ表面上に二量体を提示する。本Ｆ（ａｂ）'２ファジミドベクターをｐＶ０３５０−４と称し、図１に略図を示す。
Ｇ６−２３重鎖ショットガンライブラリ構築のために、キュンケル突然変異誘発方法(Kunkel ら., (1991) Methods Enzymol 204:125-139))を用いてＧ６−２３  ＣＤＲＬ３配列をｐＶ０３５０−２ｂファジミドに導入することによってファジミドｐＷ０４４８−２を構築した。また、ファジミドｐＷ０４４８−１は、また、Ｇ６の重鎖可変ドメインと軽鎖内の３つすべてのＣＤＲ内に停止コドン（ＴＡＡ）を含むＧ６およびＧ６−２３軽鎖ショットガンスキャニングライブラリの鋳型としてｐＶ０３５０−２ｂから作製した。
【０１３２】
ショットガンスキャニングライブラリの構築
記載したように(Kunkelら, 1991, 上掲)、ファージディスプレイライブラリをキュンケル突然変異誘発法を用いて構築した。全体で８つのライブラリを作製した：ｈｃＡ−Ｇ６、ｈｃＡ−Ｇ６．２３、ｌｃＡ−Ｇ６およびｌｃＡ−Ｇ６．２３は、Ｇ６およびＧ６−２３の重鎖（ｈｃ）又は軽鎖（ｌｃ）のアラニンスキャニングライブラリであった；ｈｃＨ−Ｇ６、ｈｃＨ−Ｇ６．２３、ｌｃＨ−Ｇ６、ｌｃＨ−Ｇ６．２３は、ホモログスキャニングライブラリであった。３つすべての重鎖又は軽鎖のＣＤＲ内にＴＡＡ停止コドンを含む鋳型は、設定された縮重コドンを有する上記の突然変異原性オリゴヌクレオチドによって、突然変異誘発反応の間に同時に修復された。突然変異誘発の後、１０μｇのＤＮＡを大腸菌ＳＳ３２０細胞（〜１０１１細胞）内に電気穿孔法によって導入し(Sidhuら., (2000) Methods Enzymol 328:333-363)、それをＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs)、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよびカナマイシンを添加した２ＹＴ培養液中で３０℃で終夜生育させた。ライブラリサイズは、２〜５×１０９であった。既に記載のように(Sidhuら., 2000、上掲)、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって培養液から濃縮し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。
【０１３３】
ライブラリ分類とスクリーニングアッセイ
タンパク質標的である、ＶＥＧＦ又は抗ｇＤタグ抗体（Genentech research groupsにより提供）を、ＮＵＮＣ(Roskilde, Denmark)９６ウェルMaxisorpイムノプレート上に４℃で終夜固定し、分類前にプレートをウシ血清アルブミン(BSA, Sigma)によって２時間室温にてブロックした。上記の調製物からのファージライブラリ（〜１０１３ファージ／ｍｌ）を、標的コートイムノプレートにて室温で１時間インキュベートして、ファージ結合を促した。次いで、プレートをＰＢＳおよび０．０５％のツイーン２０（ＰＳＴ）バッファで１５回洗浄して、結合したファージを、０．１ＭのＨＣｌによって１５分間溶出して、１．０Ｍのトリス塩基によって中和した。溶出したファージは、次回の選別のために大腸菌ＸＬ１−ブルー（Stratagene）内で増やした。
２回目のパニングから選択さた個々クローンを、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよびＭ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（１：２５００）（Stratagene）を添加した１５０μｌの２ＹＴ培養液とともに９６ウェルプレートにて３７℃で、終夜成長させた。培養液上清を、ファージ競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ファージＥＬＩＳＡ）に直接用いて、プレート上をコートする標的タンパク質に対する機能的なファージディスプレイＧ６又はＧ６−２３  Ｆａｂ変異体結合スクリーニングした(Sidhuら., 2000、上掲)。ＶＥＧＦ抗原及び抗ｇＤタグ抗体の両方に対して陽性ファージＥＬＩＳＡシグナルを示すクローンをＤＮＡ配列分析した。
【０１３４】
ＤＮＡ配列決定及び分析
上記のスクリーニングから得た機能的なクローンを、１００μｌの２ＹＴ培養液および５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを有する９６穴プレートにおいて３７℃で２時間生育させた。少量の培養液上清（１〜２μｌ）をＰＣＲ(GeneAmp（登録商標） PCR System 9700, Applied Biosystems)用の鋳型として用いて、シークエンシングプライマーを用いて軽鎖及び重鎖遺伝子を含むファジミドＤＮＡ断片を増幅し、増幅断片の５’末端にＭ１３（−２１）ユニバーサル配列を加え、これによってシークエンシング反応でのＭ１３フォワードプライマーの使用を容易にした。９６ウェル様式中の増幅されたＤＮＡ断片を、Ｂｉｇ−Ｄｙｅターミネータシークエンシング反応を用いて配列決定し、Genentech DNA sequencing groupによってＡＢＩプリズム３７００  ９６−キャピラリーＤＮＡ分析機(PE Biosystems, Foster City, CA)にて分析した。既に記載したように(Weissら., (2000) PNAS USA 97:8950-8954)、配列をプログラムＳＧＣＯＵＮＴによって分析した。
ＶＥＧＦ抗原に対して各々のライブラリから選別した括弧内に示す数の機能的なクローンを、ＤＮＡ配列分析の対象とした：ｈｃＡ−Ｇ６（１０７）、ｈｃＡ−Ｇ６−２３（１２４）、ｌｃＡ−Ｇ６（１１１）、ｌｃＡ−Ｇ６−２３（１０２）、ｈｃＨ−Ｇ６（１１１）、ｈｃＨ−Ｇ６−２３（１３５）、ｌｃＨ−Ｇ６（１０６）、ｌｃＨ−Ｇ６−２３（９７）。抗ｇＤタグ抗体結合選別から得たクローンについては：ｈｃＡ−Ｇ６（１０８）、ｈｃＡ−Ｇ６−２３（１３０）、ｌｃＡ−Ｇ６（１１６）、ｌｃＡ−Ｇ６−２３（９８）、ｈｃＨ−Ｇ６（１２０）、ｈｃＨ−Ｇ６−２３（１２２）、ｌｃＨ−Ｇ６（１１１）、ｌｃＨ−Ｇ６−２３（１０２）。
【０１３５】
Ｆａｂ  Ｇ６及びＧ６−２３点突然変異体と親和性測定
親和性測定のためにＧ６およびＧ６−２３  Ｆａｂ変異体を生成するために、我々は、大腸菌アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモータを有するファージディスプレイベクターから予め変更したＦａｂ発現プラスミドを用いた(Prestaら., (1997) Cancer Res 57:4593-4599)。各々の点突然変異体は、ＣＤＲ内に点突然変異を有するように設定したオリゴヌクレオチドを用いたキュンケル部位特異的突然変異法(Kunkelら, 1991、上掲)を用いて構築した。突然変異体産生のために、発現プラスミドを３４Ｂ８  大腸菌細胞に形質転換させ、単一コロニーを拾い上げ、２５μｇ／ｍｌカルベニシリンを添加した完全なＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地(Prestaら., 1997、上掲)中で３０℃で２４時間生育させた。発現した組換えタンパク質は、プロテインＧ高トラップカラム(Amersham Pharmacia)にて精製し、２８０ｎｍのＵＶ吸光度を定量した (Prestaら., 1997、上掲)。記載したように、Ｇ６およびＧ６−２３  Ｆａｂ突然変異体の結合能はｈＶＥＧＦディスプレイファージを用いた競合的溶液結合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。各々の点突然変異による野生型ＶＥＧＦファージ結合活性の倍数的減少を、野生型Ｇ６又はＧ６−２３  ＦａｂそれぞれのＩＣ５０でＧ６又はＧ６−２３点突然変異体のＩＣ５０を割ることによって測定した。
【０１３６】
ＦａｂＧ６及びＧ６−２３変異体のＢＩＡＣＯＲＥＴＭ結合分析
結合動態のために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）測定を既に記載のように行った(Karlsson & Falt, (1997) J. Immunol Methods 200:121-133)。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１００になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍に段階希釈したＧ６及びＧ６−２３  Ｆａｂ変異体（０．７ｎＭから１００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Tween20（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcoreＴＭ Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。ファージライブラリの選別によって、重鎖ＣＤＲ２内の２つの残基がアラニン又は相同なアミノ酸であることが好ましいことが明らかとなった：ＨＣ−Ｙ５８はアラニンであることが好ましい、ＨＣ−Ｉ５１はＶＥＧＦに結合するためにはバリンであることが好ましい。したがって、我々はファージライブラリからの発見を確認するために、単一突然変異を有する変異タンパク質Ｆａｂを生成した。図９の上のグラフは、ヒトＶＥＧＦコートチップに対する突然変異体Ｇ６−２３−Ｙ５８Ａ（Ｇ６−２３．１）（５０ｎＭ）結合のＢＩＡコア分析が、既にＧ６と比較して改善した結合速度を有しているＧ６−２３と比較して結合速度を改善したことを示す。下のグラフは、ＶＥＧＦコートチップに対する突然変異体Ｇ６−Ｙ５８Ａ（Ｇ６−１）又はＧ６−Ｉ５１Ｖ（Ｇ６−２）のＢＩＡコア分析を示す。Ｇ６．と比較して、両方とも結合速度が改善した。実際に、二重突然変異体（Ｙ５８Ａ／Ｉ５１Ｖ）は、Ｇ６およびＧ６−２３の結合速度改善に対して付加的な効果があった。
【０１３７】
Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングの結果
Ｇ６およびＧ６−２３抗体のショットガンスキャンの結果は、重鎖ＣＤＲ側鎖がｈＶＥＧＦとの結合相互作用を支配することを示した。Ｇ６  ＦａｂのＸ線結晶構造にマップすると、機能的に重要な残基は共に構造的エピトープの一部を表し、それはｈＶＥＧＦと直接接触する残基によって規定される。ショットガンアラニンスキャンにより、重鎖上の残基Ｙ３２、Ｗ３３、Ｇ５４、Ｖ９６、Ｆ９７、Ｆ９８、Ｌ９９およびＹ１００ａ及び軽鎖上のＹ４９からなる溶媒に露出した峰を含む機能的なエピトープが明らかとなった。興味深いことに、ショットガンホモログスキャンによって明らかとなった機能的に重要な残基の数はかなり少なく、ショットガンアラニンスキャン内で機能的に重要な残基の基の中に包含されていた。これらのホットスポットは、両方のスキャンで重なり合う小さいパッチを構成するＷ３３、Ｇ５４、Ｖ９６、Ｆ９７およびＬ９９であり、これは、相同なアミノ酸置換でさえ破壊的となるほどこの表面が抗原ｈＶＥＧＦと正確に接触していることを示唆している。Ｇ５５は、ホモログスキャンでアラニンのみによって置換されることとそれが非常に破壊的であることから、Ｇ５５もまた、本パッチの範囲内であると思われる。
重鎖の両スキャンによって明らかとなった他の機能的に重要な残基であるＧ５０及びＴ５２は、構造的情報によると内部に埋没しているので、Ｇ６の溶媒に露出した表面の一部ではなく、結合受容性高次構造内に機能的エピトープを保持するために機能的エピトープ内の残基に対して詰め込む(pack)足場(scaffolding)となる側鎖として働く(C. Wiesmann未公開の結果)。Ｇ６のＣＤＲ−Ｈ３のＦ９５に関しては、明らかに、アラニンスキャンでのこの位置でのアラニン置換は破壊的であった；にもかかわらず、この残基はホモログスキャンでのチロシン置換を許容することができる。これは、その役割が抗原結合部位の構造的に完全な状態を維持することにあることを示唆する。これはまた、構造的情報によって確認された。
【０１３８】
Ｙ３２、Ｆ９８およびＹ１００ａについて、構造的情報により、これら表面残基は重要で、ｈＶＥＧＦ結合の際に表面積を覆う全重鎖の３０％に相当することが証明された。これらの残基でのアラニン置換は３０より大きい有意な機能比率（Ｆｗｔ／ｍｕｔ値）となり明らかに破壊的であり、さらに面白いことに、それらは相同的アミノ酸置換（ＴｙｒをＰｈｅに、またその逆も同じ）を許容した。これは、上記の足場残基とは異なり、これらの位置の芳香環がｈＶＥＧＦ抗原との重要な相互作用を成しており、水酸基を加えるかまたは取り除くことはさほど重要でないことが示唆される。
両ショットガンスキャンにより、更なる親和性改善のための重鎖内の新しい突然変異が同定された。それはＩ５１ＶおよびＹ５８Ａであった。この興味深い所見を、Ｆａｂ点突然変異体を生成することを通して検査し、結合活性を競合的ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡコアＴＭにて試験した（図２３および図１８）。Ｉ５１およびＹ５８が構造的エピトープのメンバーでない（C. Wiesmann、未発表の結果）ので、単一又は二突然変異による親和性改善、特に結合速度の改善が、抗原ｈＶＥＧＦとの新たな接触の導入によるものでなく、おそらく抗原結合を受容可能にさせるＣＤＲ−Ｈ２の構造的整合性の最適化を介するものであると思われる。
構造的エピトープによると、Ｇ６軽鎖ＣＤＲ残基は全構造的エピトープ表面の２５％に相当していた（８７８Å２）（C. Wiesmann、未発表の結果）。興味深いことに、両ショットガンスキャニングで機能的重要性を示した残基はＣＤＲ−Ｌ２内でＹ４９のみであり、全構造的エピトープ表面の２％を表す。これは、軽鎖内のほとんどの構造的エピトープ残基はｈＶＥＧＦ抗原との活動的な接触に関与していないことが示唆される。この引き出された情報は、Ｇ６をそもそも単離したファージ上に抗体ライブラリを表出させるために鋳型として用いた４Ｄ５とＧ６軽鎖が同じ配列をいまだに保持しているので、Ｇ６軽鎖は機能的よりも構造的に重要であることを意味する(Carterら, 1992)。
【０１３９】
実施例３  Ｇ６及びＧ６−２３由来抗体
（ａ）選別のためのライブラリ
実施例２に記載のようにショットガンアラニン及びホモログスキャニングライブラリからファージを分類することによって付加的な抗ＶＥＧＦ抗体を得た。具体的には、特定の残基で、スキャンする残基は、アラニンか又は野生型の何れかであるように（アラニンスキャニング）、又は相同なアミノ酸は又は野生型の何れかであるように（ホモログスキャニング）、異なるようにした（図１４Ａ及びＢ）。Ｇ６では、Ｇ６の軽鎖及び重鎖それぞれについてショットガンアラニン及びホモログスキャニングを行い、結果として４つのライブラリを得た。Ｇ６−２３では、Ｇ６−２３軽鎖についてショットガンアラニンとホモログスキャニングを、Ｇ６−２３重鎖についてはショットガンホモログスキャニングを行い、結果として３つのライブラリを得た。Ｇ６−２３ショットガンアラニンスキャニングライブラリを調製しなかったのは、上記で検討したように、Ｇ６−２３は結合に重要な残基のほとんどが重鎖に位置している高親和性の抗体であるからである。重鎖残基をアラニンに置換することは、重鎖アミノ酸残基を切断し、十中八九結合を破壊し、結果として親和性が低い変異体となるであろうことを意味する。
【０１４０】
（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体の選別
第１回目では、選別のためにプレート分類方策を用いた。ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ、Genentech Research Groupsにより提供）を５μｇ／ｍｌで含むウェルにて４℃で終夜インキュベートすることによって、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（ＮＵＮＣ）に固定した。プレートを１％のウシ血清アルブミン(BSA, Sigma)にてブロックし、その後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えてさらに３０分おいた。上記のファージライブラリを〜１Ｅ１３ファージ／ｍｌの濃度でｈＶＥＧＦコートイムノプレートにて撹拌しながら室温で１時間インキュベートし、標的とファージディスプレイＦａｂとを結合させた。結合の後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳにて１５回洗浄した。ウェルを０．１Ｍ  ＨＣｌとともに３０分間インキュベートすることによって結合ファージを溶出した。１．０Ｍのトリス塩基（ｐＨ１１）によって溶出物を中和した。大腸菌ＸＬ１−ブルー（Stratagene）に、溶出したファージおよびＭ１３−Ｋ０７ヘルパーファージ(New England Biolabs)を感染させた。次の選別のためにファージを一晩繁殖させた。
細菌培養物を４℃のＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローターにて８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。ファージは、１／５量のＰＥＧ／ＮａＣｌ添加によって培養液から調製した。氷上に５分間置いた後、培養液を含むファージを、４℃のＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローターにて１０ｋｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を破棄した。残りのファージペレットをＰＢＳに再懸濁して、ペレット不溶物に４℃のＳＳ−３４ローターにて１５ｋｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を新しいチューブへ移し、２６８ｎｍの吸光度を測定することによってファージ濃度を測定した。
【０１４１】
以下の分類工程は、漸増ストリンジェンシーの溶液位相法によって行った。精製したファージを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Pierce）を含むＰＢＳ中でビオチン化ｈＶＥＧＦとともに室温で１時間インキュベートした。superblockにて３〜１０倍に希釈した後、１％ＢＳＡ（Sigma）およびＴｗｅｅｎ２０でブロックしたニュートラビジンコートウェルに混合物を加えた。ｈＶＥＧＦコンジュゲートビオチンは、１０分間で固定されたニュートラビジンに結合した。捕獲後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて１０〜１５回洗浄した。バックグラウンド、すなわちニュートラビジンへのファージ上の特異的結合を調べるため、ビオチン化ｈＶＥＧＦを含まない対照反応物を、コートウェルに加えた。溶液中の抗原濃度の減少、並びにファージ濃度又は温度の上昇によって各工程のストリンジェンシーを上げた。また、洗浄回数を多くすることによってもより高いストリンジェンシー条件が達成される。第３回及び第４回目の分類では、非ビオチン化ｈＶＥＧＦをビオチン-ｈＶＥＧＦおよびライブラリファージの反応混合物に加えて、低親和性結合体から競合させた。捕獲前に１０００倍以上の競合体を加えて３７℃に３０分置くことによって、高親和性結合体の選別の最終工程のストリンジェンシーをさらに強くした。さらに処理時間や捕獲時間によって工程ごとにストリンジェンシーを強くした。
【０１４２】
Ｇ６２３では、ビオチン化ｈＶＥＧＦの開始濃度は、重鎖ショットガンライブラリのためには１ｎＭ、軽鎖ショットガンスキャニングライブラリのためには０．２ｎＭとした。最終工程の濃度がそれぞれ０．５ｎＭおよび０．１ｎＭになるように減らした。Ｇ６では、Ｇ６２３より開始の親和性が低いので、ライブラリ分類は低いストリンジェンシー開始条件で行った；重鎖ライブラリには５ｎＭおよび軽鎖ライブラリには２ｎＭとし、それぞれ最終工程では１．７５ｎＭおよび０．５ｎＭとなるように減らした。
ファージ上で特異的にＦａｂを表出するｈＶＥＧＦの濃縮度を調べるために、９０μｌの大腸菌ＸＬ-ブルー（Stratagene）に、捕獲したライブラリ結合反応物並びにバックグラウンド混合物から溶出したファージ１０μｌを、３７℃で３０分間感染させた。５μｌの培養物をカルベニシリン添加プレートにまき、３７℃で一晩インキュベートした。溶出物中のファージ粒子の数は、各々の溶出物中のコロニー数から算出することができた。最後二回の分類の後、上記のファジミド含有細菌培養物５０μｌをカルベニシリン添加プレートにまき、３７℃で一晩生育させた。こうして得られたクローンをスクリーニングの対象とした。
【０１４３】
（ｃ）単一スポット競合的ＥＬＩＳＡ
高親和性クローンのスクリーニングに、９６ウェル様式のハイスループット単一スポット競合的ＥＬＩＳＡアッセイを行った。両方の抗体のために、最後の２回の選別によって約１００個のクローンを無作為に取り上げ、このアッセイで選別した。ファージミド含有の大腸菌ＸＬ１−ブルークローンを、カルベニシリン及びＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs)を添加した豊富な２ＹＴ培養液４００μｌ中で振とうさせながら３７℃で一晩生育した。各々のクローンの培養物上清を、ｈＶＥＧＦ添加並びにｈＶＥＧＦ無添加０．０５％Ｔｗｅｅｎ20および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにて５倍に希釈した。振とうさせながら室温で１時間インキュベーションした後、８０μｌの反応物をｈＶＥＧＦコートイムノプレートに移して、１０分間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにてプレートを８回洗浄して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ウシ血清アルブミン(Sigma)を添加したＰＢＳにて５０００倍に希釈した１００μｌの抗Ｍ１３抗体西洋ワサビコンジュゲート(New England Biolabs)とともに３０分間インキュベートした。プレートをさらに８回洗浄して、５分間ＴＭＢ基質と反応させた。反応を１．０Ｍ  Ｈ３ＰＯ４にて停止させ、４５０ｎｍの分光光度を読み込んだ。相対親和度を算定するために、ｈＶＥＧＦ非存在下での密度に対するｈＶＥＧＦ存在下での光学的な密度の比を算出した。低い比率により、ファージ上に表出したＦａｂの多くが溶液中のｈＶＥＧＦと結合したことが示唆された。結果として、ほとんどＦａｂは、免疫プレート上の固定されたｈＶＥＧＦと結合することができない。野生型（ＷＴ）のＧ６又はＧ６２３より低い比率を示すクローンを選別し、その上清をＸＬ１−ブルーに用いた。ファジミド含有細菌をカルベニシリンプレート上にまき、配列決定のために３７℃で一晩生育した。
Ｇ６重鎖ライブラリの選別により、分析した３３個のクローンからたった３つの異なる配列が明らかとなった。これは、大部分のＧ６重鎖の変化により結合親和性の低下が起こることが示唆される。さらに、すべての異なる重鎖変異体はホモログスキャンライブラリから得たものである。Ｇ６重鎖残基のアラニン突然変異が結合を劇的に低下させているようである。アミノ酸配列選別の変化に耐えられないことから、Ｇ６重鎖がＶＥＧＦ結合にとって重要な多くの残基を有すると考えられる。単一スポットアッセイの結果を表２にまとめて示す。
【０１４４】
表２
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Ｇ６及びＧ６−２３の単一スポットアッセイの結果。両抗体ライブラリについて同じ選別基準を用いた。しかしながら、ＨＣ変異体はＷＴと比較したときにＬＣ変異体より親和性の改善をあまり示さないことが予測されるので、Ｇ６ＬＣライブラリのためにＧ６ＨＣライブラリと比較して低いカットオフを用いた。重鎖及び軽鎖の変異体のスクリーニング前に、Ｇ６アラニン及びホモログライブラリをプールした。選別したプールからの異なるクローンの数をＤＮＡ配列決定によって決定した。ＬＣ＝軽鎖、ＨＣ＝重鎖、ＷＴ＝野生型、Ｈｏｍ＝ホモログスキャニングライブラリ、Ａｌａ＝アラニンスキャニングライブラリ。
【０１４５】
（ｄ）  ＤＮＡ塩基配列決定および分析
単一スポットスクリーニングから選択されたクローンを、カルベニシリン添加２ＹＴ培養液１００μｌとともに９６ウェルプレートにて２時間生育させた。１μｌの培養物をＰＣＲ(GeneAmp（登録商標） PCR System 9700, Applied Biosystems)の対象とし、、異なるクローンの軽鎖又は重鎖をコード化しているＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応で用いたプライマーは、増幅産物の５’末端にＭ１３ユニバーサル配列が加えられるように設定した。この配列を加えることによって、Ｍ１３フォワードプライマーを続くシークエンシング反応で用いることができる。９６ウェル様式の増幅の後、Ｂｉｇ−Ｄｙｅターミネータシークエンシング反応を用いてGenentech DNA sequencing groupによりＤＮＡ断片の配列決定を行い、ABI Prism 3700 96-キャピラリーＤＮＡ分析器(PE Biosystems, Fosters City, CA)によって分析した。重鎖及び軽鎖の配列を比較し、同一の配列を取り除いた。それらの配列に基づいて、ＩＣ５０測定による親和性決定のためにクローンを選別した。
【０１４６】
（ｅ）  ファージクローンの親和性測定
ファージクローンのＩＣ５０値は競合的ファージＥＬＩＳＡによって測定した。選別したクローンの単一コロニーを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン添加の２ＹＴ培養液５ｍｌ中で５時間生育させた。次いで、培養物をＭ13-Ｋ07ヘルパーファージ(New England Biolabs)にて１時間感染させて、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した２５ｍｌの培養液へ移した。ファージを３７℃で一晩増殖させた。上記のようにファージを精製した後、ファージを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにて段階的に希釈して、ｈＶＥＧＦコートイムノプレート上にインキュベートして、異なるファージ濃度での抗原結合を評価した。〜７０％飽和シグナルが得られるように希釈したファージをＩＣ５０測定アッセイに用いた。ファージを漸増濃度のｈＶＥＧＦとともに３７℃で一晩インキュベートした。結合していないファージをｈＶＥＧＦコートイムノプレート上で１０分間捕獲した。プレートを洗浄して、結合したファージをＭ１３抗体西洋ワサビコンジュゲート(New England Biolabs)にて検出して、既に記載したようにＴＭＢにて反応させた。。固定された抗原に対して５０％のファージ結合阻害を示すｈＶＥＧＦ濃度をＩＣ５０として表した。結合したファージを示すシグナルを、ｈＶＥＧＦ濃度に対してプロットし、データを競合的結合の非線形回帰曲線にフィットさせて、ＩＣ５０を可能にした。
【０１４７】
図３４および３５は、Ｇ６およびＧ６−２３変異体のそれぞれのＩＣ５０値並びに、Ｇ６又はＧ６−２３と比較した配列の変異を示す。Ｇ６プールから、野生型Ｇ６より見かけの親和性がよい多くの結合体が同定された。より親和性が改良された多くのＧ６変異体が、軽鎖ホモログライブラリから得られた（図３４Ａ）。しかしながら、２つのより親和性が高いＧ６変異体が、重鎖ホモログスキャンライブラリから選別された（図３４Ｂ）。
ＩＣ５０値によると、いくつかのＧ６変異体は最高で１００倍の親和性改善を示した。選別されたわずかなＧ６重鎖変異体は、野生型Ｇ６とほんの数残基のみが異なっていた。これらの重鎖突然変異はＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２に位置していた。重鎖の保存された性質と、特にＣＤＲ−Ｈ３により、ｈＶＥＧＦに対するＧ６結合に重要なほとんどの残基がこの領域にあることが確認された。突然変異はＧ６軽鎖変異体により多く存在した。それらが主にＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３領域に位置することは、ＣＤＲ−Ｌ２残基を変化させると親和性が改善する代わりに結合が損なわれることを意味する。ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３内の突然変異が組み合わさると結合に好都合なようであり、野生型と比較して顕著に親和性が改善される。
ＩＣ５０値によると、ほとんどのＧ６２３変異体は、野生型と比較して同程度であるかわずかに低下した結合能を示した（図３５）。最も親和性の高い変異体は、ホモログおよびアラニン軽鎖ショットガンライブラリから得られた。重鎖ショットガンスキャンプールにおいて高親和性結合体が少しだけ同定された。Ｇ６に関しては、重鎖残基は保存されており、調査したクローンの中ではほんのわずかの突然変異しか存在しなかった。また、軽鎖変異体は、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３にほとんどの変化が位置しているＧ６変異体と、類似の変異パターンを示した。
【０１４８】
実施例４  抗ＶＥＧＦ抗体結合部位をマッピングするためのｈＶＥＧＦのアラニンスキャニング
Ｇ６およびＧ６−２３の交差反応性の分子基礎を理解するため、及びそれらの機能的なエピトープをマッピングするために、野生型ｈＶＥＧＦに対するアラニン置換したｈＶＥＧＦ変異体それぞれのＧ６又はＧ６−２３  Ｆａｂの相対的結合親和性を、前述したような(Muller ら., (1997) PNAS USA 94:7192-7197)、ｈＶＥＧＦディスプレイファージＥＬＩＳＡを用いて測定した(Muller ら., (1997) PNAS USA 94:7192-7197)。ｈＶＥＧＦは、キュンケル突然変異誘発方法を用いてＦｌｔ-１、ＫＤＲ、アバスチンＴＭ抗体およびＹ０３１７の結合エピトープの近くに変異を加え、前述したように(Mullerら., (1997) PNAS USA 94:7192-7197)、個々の突然変異体を表出するファージを生成した。溶液結合ファージＥＬＩＳＡを用いて、Ｆａｂ  Ｇ６−２３、Ｇ６−２３上の野生型（ｗｔ）ＶＥＧＦに対する各々のＶＥＧＦ突然変異体の相対的結合親和性を測定した。簡潔にいうと、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（ＮＵＮＣ）を２μｇ／ｍｌの濃度のＧ６又はＧ６−２３  Ｆａｂを有するＰＢＳにて４℃で一晩コートし、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＴ）にて２時間ブロックした。まず、ＰＢＴにて段階希釈したファージディスプレイｈＶＥＧＦ突然変異体をＧ６−Ｆａｂコートプレート上で室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）にてプレートを洗浄した。結合したファージを、ＰＢＴにて１：５０００に希釈した抗Ｍ１３モノクローナル抗体西洋わさびペルオキシダーゼ(Amersham Pharmacia)コンジュゲートにて検出し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD)基質にておよそ５分間反応させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４にて消光して、４５０ｎｍの分光光度を読んだ。結合における倍数的減少を表し、Ｇ６又はＧ６−２３  Ｆａｂと相互作用するためのｈＶＥＧＦの個々の側鎖の活動的寄与率を評価するための相対的ＩＣ５０値（ＩＣ５０，Ａｌａ／ＩＣ５０，ｗｔ）を算出した。
【０１４９】
ＩＣ５０の比率はＧ６Ｆａｂとの相互作用における個々の側鎖の活動的寄与率を表す（図１９）。アラニン突然変異体の一般的なホールディング、特にＧ６結合において有意に減少するものは、既にマッピングされているように（図１９）、ＶＥＧＦ（例えばアバスチンＴＭ抗体、Ｙ０３１７又はＦｌｔ-１）上に異なるエピトープを有する他の分子に対して野生型に近い結合を示すことによって証明された。Ｇ６がハイブリドーマ由来のアバスチンＴＭ抗体と比較して、異なるエピトープを有していたことは明らかである。Ｇ６結合に機能的に重要なすべてのｈＶＥＧＦ残基はヒトおよびマウスのＶＥＧＦの間で保存されているので、ある程度その交差反応性が説明される。一方では、アバスチンＴＭ抗体（Ｆａｂ-１２）およびＹ０３１７のＦａｂは、ｍＶＥＧＦではＳｅｒである残基Ｇｌｙ８８でのアラニン置換に応じてＶＥＧＦへの結合の大部分が損なわれた。ＶＥＧＦ分子上のエピトープを明視化するために、Ｇ６結合に機能的に重要な残基を、Ｇ６に対する相対的親和性に従って、ｈＶＥＧＦ結晶構造の表面上で強調して示した。Ｇ６エピトープはヒトおよびマウスのＶＥＧＦの間で保存されいるパッチに位置しており、活動的に重要な数個の残基（近傍にクラスター化して存在するＰｈｅ１７、Ｔｙｒ２１、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ８３およびＧｌｎ８９）を点在化させていた。これは相互作用「ホットスポット」を有する機能的なエピトープの表れである。
次に我々は、Ｇ６の機能的なエピトープをＦａｂ−１２（Ｙ０３１７と同じ）又はＦｌｔ−１Ｄ２の構造的エピトープ（複合体の結晶構造に基づいて、これらの分子と複合体を形成する際に埋没するＶＥＧＦ残基）と比較した。興味深いことに、ＶＥＧＦ上のＧ６の機能的なエピトープは、Ｆａｂ−１２の構造的エピトープより密接に、Ｆｌｔ−１Ｄ２の構造的エピトープに合致する。更に、残基Ｐｈｅ１７、Ｔｙｒ２１およびＴｙｒ２５が両相互作用にとって活動的に重要であるため、Ｇ６はＶＥＧＦに対するＦｌｔ−１と同じホットスポットを共有している（図１９）。一方、Ｆａｂ-１２又はＹ０３１７は、非保存的な機能的に重要な残基（Ｇｌｙ８８）に集中しており、これがｍＶＥＧＦに対する結合を欠如している理由と思われる。ファージライブラリ由来の抗体であるＧ６がＶＥＧＦレセプターとほとんど同じ形式でＶＥＧＦ上の保存されたエピトープを標的とする一方、ｈＶＥＧＦのハイブリドーマが自己応答性抗マウス抗体を生成しないことが明らかとなった。Ｇ６及びＦａｂ−１２の２つのエピトープ間は十分に重なり合っているが、ｈＶＥＧＦに対するＧ６及びＦａｂ−１２（Ｙ０３１７）の結合は互いに相容れないものである（データは示さない）。
【０１５０】
Ｇ６およびＧ６−２３結合に重要なｈＶＥＧＦ上の部位を比較すると、最も活動的に貢献している残基、２０’ｓヘリックス上のＦ１７、Ｙ２１およびＹ２５、および８０’ｓループ上のＱ８９Ａが、変化を起こしうる結合の際の残基衝突の場合を除いて、同じように存在することが示された（図１９）。例えば、残基Ｙ２１およびＱ８９がアラニンに変化する場合、Ｇ６に対するよりもＧ６−２３に対してより大きな打撃(hit)となった。Ｇ６と比較して、Ｇ６−２３に結合する際にその側鎖の相対的衝撃をわずかながら減少する部位がある。例えばＩ８３、Ｈ８６およびＩ９１Ａ。
親和性改良型Ｇ６−２３には新たな機能的重要な残基はみられず、さらに両抗体中の機能的に重要な残基間に活動的寄与の混合もみられないことは、ｈＶＥＧＦの相同な位置がＧ６又はＧ６−２３との複合体において埋没しているという構造的発見と一致している（構造的データは以下に示す）。ｈＶＥＧＦ構造上の他の穏やかな要因とともにこれらの機能的に重要な残基をマップする場合、その残基はＦｌｔ-１Ｄ２の構造的エピトープ内の隣接するパッチとして現れ、ヒトおよびマウスのＶＥＧＦ間で非常に保存されており、これにより両方の抗体が両方のＶＥＧＦに対して等しく親和性を有していることが説明される。ｈＶＥＧＦ上のＧ６に対する構造的及び機能的エピトープのフットプリントを比較することによって、重鎖ＣＤＲ残基が、アラニン置換が破壊的打撃を与えうるＶＥＧＦ上の位置、例えばｈＶＥＧＦの２０’ｓへリックス及び８０’ｓループと接触するものであり、一方、軽鎖ＣＤＲ残基がその側鎖が機能的に重要でないｈＶＥＧＦの６０’ｓループと接触することが明らかに示された。
【０１５１】
標準以下の最大限の結合シグナル（５０〜７０％）を生じたファージ希釈物を溶液競合アッセイに用いた。そのアッセイは、まずＰＢＴバッファー中の野生型又は変異型のｈＶＥＧＦファージを漸増濃度の競合するＧ６又はＧ６−２３  Ｆａｂとともに室温で１〜２時間インキュベートし、次いで、結合していないファージを捕獲するためにその混合液をＧ６−Ｆａｂコートプレートに移して１５分置き、結合したファージを上記のように検出するものである。競合カーブを、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(Kaleidagraph, Synergy Software)にフィットさせて、固定したＧ６  Ｆａｂにファージが結合するのを５０％抑制する溶液結合工程におけるＧ６又はＧ６−２３  Ｆａｂの濃度として算出されるＩＣ５０値を測定した。野生型ｈＶＥＧＦに対する突然変異体のＩＣ５０比は、結合親和性の相対的な倍数差である。Ｇ６−Ｆａｂコートプレートに対して非常に結合低下を示す突然変異体について、Ｆａｂ１２(Presta, 1997)又はＦｌｔ-１Ｄ１-５を、Ｇ６又はＧ６−２３  Ｆａｂとともにインキュベーションした後、突然変異体ファージを捕獲する被膜として用いた。野生型ＶＥＧＦファージ用に試験したように、Ｇ６、Ｇ６−２３  Ｆａｂ、Ｆａｂ１２、ＦａｂおよびＦｌｔ-１Ｄ１-５に対するｈＶＥＧＦ-ファージの結合は互いに相容れなかった。
【０１５２】
実施例５  結晶学によるＧ６およびＧ６−２３上のＶＥＧＦ結合部位と、ＶＥＧＦ上のＧ６結合部位の構造マッピング
発現、精製結晶化および構造的分析
ヒトＶＥＧＦの残基８−１０９を、前述したように(Christinger, H.W.,ら., (1996). Prot. Struct. Funct.Genet. 26, 353-357)発現させ、再フォールディングさせ、精製した。
Ｇ６  Ｆａｂを大腸菌で発現させ、細胞ペーストをＰＢＳ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦに解かした。混合物をホモジナイズして、マイクロ流動化装置に２回通した。次いで、懸濁液を１２ｋｒｐｍにて６０分間遠心分離した。タンパク質は、予めＰＢＳにて平衡化したプロテインＧカラムに５ｍｌ／分で流した。カラムを、基線までにＰＢＳにて洗浄し、その後０．５８％酢酸によって溶出した。Ｇ６  Ｆａｂを含む分画をプールして、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）ににて平衡化したＳＰ−セファロースカラムに直接流した。タンパク質を、０〜０．２５ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配によって溶出した。
ＳＰ−セファロースカラムから溶出したＧ6をｈＶＥＧＦ8-１０９と混合し、３０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）および０．４ＭのＮａＣｌにて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにてさらに精製した。複合体を含む分画をプールして、濃縮し、結晶化実験に用いた。結晶は、液滴を行う蒸気拡散法を用いて１９℃で生成した。２．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび５％イソプロパノールを含む結晶化バッファに、等量のタンパク質溶液（８ｍｇ／ｍｌタンパク質）を混合した。結晶は３日後に出現し、ａ＝１１７．９Å及びｃ＝２１２．６Åの細胞寸法を有する空間群Ｐ3121に帰属した。これらの結晶形は非対称性単位の１つのＶＥＧＦ二量体と２つのＦａｂ分子を含む１複合体を含有していた。
結晶を母液に浸し、２５％グリセロールを含む人工母液に入れ、液体窒素で瞬時に凍結させた。２．８Åデータセットをビームライン９−１のＳＳＲＬ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅに集積した。データはプログラムＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて圧縮した（Otwinowski, Z. (1993). DENZO. In Data Collection and Processing, L. Sawyer, N. Isaacs, and S. Bailey, eds. (Warrington, UK: 1993）。
【０１５３】
構造分析および分子構造精密化
構造はＶＥＧＦ（ＰＤＢコード1ＦＬＴより入手）、１ＢＪ１の抗体の定常ドメインおよび可変ドメイン（Brookhavenデータベース）の座標、及びプログラムＡＭｏＲｅ (CCP4 1994）を用いて分子置換することによって解析した。モデル設定はプログラムＯで行い、Ｒｅｆｍａｃ (CCP4 1994)で分子構造精密化した。最終的なＲｖａｌｕｅおよびＲｆｒｅｅは、それぞれ１９．８７％および２３．９２％である。
表面積を算出するために、相互作用ＲＥＳＡＲＥＡバージョン３．２：１９９３年８月５日およびＡＲＥＡＩＭＯＬバージョン３．２：１９９５年１２月１９日のプログラムを用いた。これらのプログラムは、CCP4 suite Collaborative Computational Project, Number 4. 1994 （「The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography」 Acta Cryst. D50, 760-763）の一部である。
ＶＥＧＦ（Å２）に埋没される抗ＶＥＧＦ抗体の各々の残基の表面積は、埋没される残基の全表面積の割合と共に以下に示す。また、ＶＥＧＦ（Å２）に埋没されるＶＥＧＦ抗体の各々の残基の表面積を、埋没される残基の全表面積の割合と共に以下に示す。以下のＧ６：ＶＥＧＦ、Ｇ６−２３：ＶＥＧＦ、Ｆａｂ−１２：ＶＥＧＦ、ＹＡＤＳ−１：ＶＥＧＦ及びＹＡＤＳ−２：ＶＥＧＦ複合体の値を参照のこと。全ての場合において、ＶＥＧＦが二量体であるので、（ＶＥＧＦ二量体のうちの）単量体１に属するＶＥＧＦの残基番号は８−１０９であり、（ＶＥＧＦ二量体のうちの）単量体２に属するＶＥＧＦの残基番号は１００８−１１０９である。以下の各表の第１列目は、調べたタンパク質（ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦ抗体の何れか）の残基番号を列挙する（例えば、以下の段落（ａ）では、ＰＨＥ  Ａ  １７はＦ１７を指す、ＬＹＳ  Ａ１０４８はＫ４８を指す；ＭＥＴ  Ａ１０８１はＶＥＧＦのＭＥＴ  ８１を指す）。第２列目は、その残基の埋没した表面（Å２）を列挙する。第３列目は、全残基の表面積の割合として、その残基に対する埋没した表面を列挙する。
【０１５４】
（ａ）ＶＥＧＦ：Ｇ６複合体
表３  Ｇ６と接触するＶＥＧＦの残基
2011046732.tif 000006
ＣＨＡＩＮ  Ａ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：８２５．０（この鎖の１１０４３．０全領域の７．４７％）
【０１５５】
表４  ＶＥＧＦと接触するＧ６の残基
残基１：２１１は軽鎖を指す。残基１００１：１２２３は重鎖を指す。
2011046732.tif 000007
ＣＨＡＩＮ  Ｂ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：８５６．０（この鎖の１９２８０．０全領域の４．４４％）
合計ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：１６８１．０（すべての鎖全体にわたって３０３２３．０全領域の５．５４％）
【０１５６】
（ｂ）ＶＥＧＦ：Ｇ６−２３複合体
表５  Ｇ６−２３と接触するＶＥＧＦの残基
残基８：１０９は単量体１（ＶＥＧＦ二量体のうちの）を指す。残基１００８：１１０９は単量体２（ＶＥＧＦ二量体のうちの）を指す。
2011046732.tif 000008
ＣＨＡＩＮ  Ａ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：８５８．０（この鎖の１１２２３．０全領域の７．６５％）
【０１５７】
表６  ＶＥＧＦと接触するＧ６−２３の残基
残基１：２１１は軽鎖を指す。残基１００１：１２２３は重鎖を指す。
2011046732.tif 000009
ＣＨＡＩＮ  Ｂ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：８５７．０（この鎖の１９５４７．０全領域の４．３８％）
合計ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：１７１５．０（すべての鎖全体にわたって３０７７０．０全領域の５．５７％）
【０１５８】
（ｃ）ＶＥＧＦ：Ｆａｂ−１２
表７  Ｆａｂ−１２と接触するＶＥＧＦの残基（ＰＤＢコード１ｂｊ１）
残基８：１０９は単量体１（ＶＥＧＦ二量体のうちの）を指す。残基１００８：１１０９は単量体２（ＶＥＧＦ二量体のうちの）を指す。
2011046732.tif 000010
ＣＨＡＩＮ  Ａ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：９１７．０（この鎖の１０８９５．０全領域の８．４２％）
【０１５９】
表８  ＶＥＧＦと接触するＦａｂ−１２の残基
残基１：２１１は軽鎖を指す。残基１００１：１２２３は重鎖を指す。
2011046732.tif 000011
ＣＨＡＩＮ  Ｂ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：８３２．０（この鎖の１９４０９．０全領域の４．２９％）
合計ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：１７４９．０（すべての鎖全体にわたって３０３０４．０全領域の５．７７％）
【０１６０】
５Å２以上及び／又は５％以上の埋没した表面積を有する残基は、有意に接触しているとみなした。これらの結果により、互いに接触しているＶＥＧＦ内の領域及び抗体の領域が示される。先に示されたＶＥＧＦ結合に関する機能的データとあわせると、Ｇ６系列の抗体とＢ２０系列の抗体（構造的データは示していない）の共通の性質をみることができた。Ｇ６、Ｇ６−２３およびＢ２０抗体、並びにその他は、Ｆａｂ−１２又はＹ０３１７とは異なり、マウス及びヒトのＶＥＧＦの両方に相対的に高い親和性で結合した（データは示さない）。ヒトＶＥＧＦ  Ｇ８８Ａ又はＧ８８Ｓの突然変異はＶＥＧＦに対するＦａｂ−１２又はＹＯ３１７の結合に非常に影響したのに、Ｇ６系列の抗体およびＢ２０系列の抗体（構造的データは示さない）は相対的に影響を受けなかった。更に、ＶＥＧＦに対するＦａｂ−１２などの抗体の結合により、Ｇ８８の表面積が１００％埋没するのに対して、Ｇ６およびＧ６−２３の結合により、Ｇ８８は６６％未満が埋没するのみであった。したがって、Ｇ８８との部分的な接触は、良好な親和性でマウスおよびヒトのＶＥＧＦを認識する特性を抗体に与えるにもかかわらず、ヒトＶＥＧＦのＧｌｙ８８の表面積が８０％以上埋没するようにヒトＶＥＧＦと接触する抗体は、良好な親和性でマウスおよびヒトＶＥＧＦと結合するようではないと思われる。また、機能的なエピトープマッピングにより、ＶＥＧＦ上のＧ系列の抗体のフットプリントが、ＶＥＧＦの２０’ｓヘリックス（ヒトＶＥＧＦのおよそ残基番号１０−３０）内へ良好に接触するだけでなく、８０’ｓループ内の残基（ヒトＶＥＧＦのおよそ残基８０−９４）に接触するＦａｂ−１２とは異なることが示された。構造的研究結果は、２０ｓヘリックス内のいくつかの残基を突然変異させるとＧ６及びＢ２０系列の抗体の結合が減少するという点で、機能的な研究結果（図１９を参照）とよく相関している。図１９に記載される機能的研究結果は、Ｇ６およびＢ２０系列抗体が、Ａ４．６．１と比較して、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ結合に重要な残基とよく相互に作用していることを示している。
【０１６１】
実施例６  ４アミノ酸の(tetrinomial)多様性ライブラリ
天然のアミノ酸の小さなサブセットが抗原結合表面を生成するために用いることができるかどうかを調べるために、我々は、ヒトレセプターチロシンキナーゼＥｒｂＢ２の細胞外ドメインを認識するヒト化Ｆａｂ４Ｄ５（３０）をベースとした抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）のナイーブ重鎖ファージディスプレイライブラリを構築した(Fendly, B.M.,ら., (1990), Cancer Res. 50: 1550-8)。まず、先に述べたファジミドを、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に二価のＦａｂ４Ｄ５（Ｆａｂ´−ｚｉｐ）を表出するように変更した。Ｆａｂ’−ｚｉｐのコード遺伝子を、Ｍ１３遺伝子−３微量コートタンパク質のＣ末端ドメインに融合させて、ｐｈｏＡプロモータ制御下で発現させた(Lee, V.,ら., (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132)。ファジミドを、軽鎖を単一突然変異させること（Ｒ６６Ｇ）及び、３つすべての重鎖ＣＤＲ内にＴＡＡ停止コドンを挿入させることによって変更した。各々のライブラリ構築のために、前述のように（Sidhu, S.S.ら., (2004) J. Mol. Biol. 338(2): 299-310；Sidhu, SSら., (2000) Methods in Enzymology 328:333-363）、停止コドンの修復と同時に所望の位置への設定した突然変異の導入が起こるように設定したオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発反応に、結果として生じたファジミド（ｐＶ−０１１６ｃ）を「停止鋳型(stop template)」として用いた。
【０１６２】
ａ．ＫＭＴライブラリの構築
ファジミドによってコードされる重鎖ＣＤＲの範囲内の溶媒と接触しうる位置を、４アミノ酸（Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｓ）を均等に生成する単一の型の縮重コドン、ＫＭＴに置換した。２０個の天然のアミノ酸の考えられる４つの組合せの数は非常に多くて徹底的に調べることができないので、我々は２つの基準を満たした組合せを選んだ。第１に、我々は、標準のＤＮＡ合成方法によって読み出されうる組合せに限定した。第２に、我々は小さい残基によって立体配置的柔軟性が与えられ、立体的密集を予防すると推論したので、各々の４アミノ酸セットが少なくとも一つの小アミノ酸（グリシン、セリン又はアラニン）を含むことを確認した。合計１８の位置をランダム化のために選択した：ＣＤＲ−Ｈ１の位置２８および３０−３３；ＣＤＲ−Ｈ２の位置５０、５２、５３、５４、５６および５８；そして、ＣＤＲ−Ｈ３の位置９５−１００ａ。各々の構築したライブラリは、〜１０１０個の異なるメンバーを含み、ゆえに、ライブラリの多様性は理論上の最大の多様性（４１８＝７×１０１０）より約１桁少ないだけであった。ＫＭＴライブラリの名称は用いた縮重コドンに対応する；等モルＤＮＡ縮重はＩＵＢコードで表した（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。
【０１６３】
ｂ．ＫＭＴライブラリの分類及び結合アッセイ
上記のように(Sidhu, S.S.ら., (2004), 上掲；Sidhu, SSら., (2000) Methods in Enzymology 328:333-363)、ナイーブ重鎖ライブラリからのファージは、ヒト血管内皮成長因子（ｈＶＥＧＦ）又は９６ウェルMaxisorpイムノプレート（ＮＵＮＣ）を捕獲抗原として用いた結合選別の工程を繰り返した。結合したファージを０．１ＭのＨＣｌにて１０分間溶出し、溶出液を１．０Ｍのトリス塩基にて中和した。ファージは、Ｍ１３−ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs)とともに大腸菌ＸＬ1-ブルー（Stratagene）で繁殖させた。
３回の選別の後、個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＫＯ７を添加した２ＹＴ培養液５００μｌを含む９６ウェル形式プレートにて生育させた。培養物の上清をファージＥＬＩＳＡに用いて、抗原コートプレートには結合するがＢＳＡコートプレートには結合しない陽性クローンを検出した(Sidhu, S.S.ら., (2004), 上掲)。陽性クローンのＤＮＡ配列分析を行い、ファージ酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて抗原特異的結合について評価した(Sidhu, S.S.ら., (2004), 上掲)。各抗原に対しておよそ１００クローンがスクリーニングされ、各ケースごとに特異的結合クローンを同定した。ＤＮＡ配列決定によって各抗原に対して単離された異なるクローンの数が明らかとなった。少なくとも１のチロシン含有ライブラリが各抗原について成功した。特に、ＫＭＴは４抗原のうち３つに対して成功し、ヒト血管内皮成長因子（ｈＶＥＧＦ）に対して１１の異なるクローンが得られた。
【０１６４】
ｃ．第二ＫＭＴライブラリ−軽鎖多様性
我々は、ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２の多様性は前述と同じであるが、残基９４と１００ｂの間に３〜１５の範囲の残基を挿入することで可能な長さの変異型とさせることによってＣＤＲ−Ｈ３の多様性を増加させた新たなバージョンのＫＭＴライブラリを構築した。全部で、ｈＶＥＧＦに対する結合について選別を繰り返して得たプールしたライブラリは〜１０１０の異なるメンバーの多様性を含んだ。ファージＥＬＩＳＡスクリーニングにより、９３のｈＶＥＧＦ結合体が同定され、ＤＮＡ配列決定によって１５の異なる配列が明らかとなった（図３６）。クローンの多くは６つの挿入残基を有するＣＤＲ−Ｈ３配列を含有していたが、より長い挿入断片を含有した２つのクローンも同定された。異なるクローンについて競合的ファージＥＬＩＳＡを行い(Sidhu, S.S.ら., (2004), 上掲)、１０マイクロモルの範囲での親和性を推定した（データは示さない）。
【０１６５】
ｄ．第二ＫＭＴライブラリから得た異なるクローンの親和性成熟
次に、低親和性の抗ＶＥＧＦクローンの親和性成熟を行って、天然の抗体に匹敵する親和性を有するＦａｂが得られるかどうかを調べた。最終的に、我々は、１２個の溶媒と接触しうる位置を同じ４アミノ酸ＫＭＴコドンに置き換えた軽鎖ライブラリを用いて１５個の重鎖を組み換えた（図３６）。具体的には、以下の軽鎖位置をランダム化した：ＣＤＲ-Ｌ１の位置２８−３２、ＣＤＲ−Ｌ２の位置５０および５３、並びにＣＤＲ−Ｌ３の位置９１−９４および９６。ライブラリは、理論上の考えられる軽鎖多様性（４１２＝２×１０７）を大きく超えた〜１０１０の異なるメンバーを含有した。重鎖配列と上記の軽鎖配列のディスプレイについて選別したファジミドを、３つすべての軽鎖ＣＤＲ内にＴＡＡ停止コドンを導入することによって変更した。結果として得られたファジミドを、停止コドンの修復と所望の変異の導入が行われる突然変異誘発反応において「停止鋳型」として用いた。
軽鎖ライブラリから得たファージを、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン試薬(Pierce)にてビオチン化した１００ｎＭのｈＶＥＧＦとともに、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)、０．５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ(Pierce)中で室温で２時間インキュベートした。ビオチン化ｈＶＥＧＦと結合したファージを、Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレートに固定したニュートラビジン(Pierce)にて５分間捕獲した。前述のように、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて洗浄し、結合したファージを溶出して、更なる選別工程のために繁殖させた。
選別後、個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＫＯ７を添加した２ＹＴ培養液５００μｌを含む９６ウェル形式プレートにて生育させた。培養物の上清をファージＥＬＩＳＡに用いて、抗原コートプレートには結合するがＢＳＡコートプレートには結合しない陽性クローンを検出した(Sidhu, S.S.ら., (2004), 上掲)。陽性クローンのＤＮＡ配列分析を行った。
溶液中のｈＶＥＧＦを高ストリンジェンシー選別に用いた。我々は、２５６個のクローンの配列を決定し、１５のうち９個の重鎖を組み合わせた６４の異なる軽鎖を同定した（図３６の上９配列）。競合的ファージＥＬＩＳＡを用いて、クローンの親和性を推定した(Sidhu, S.S.ら., (2004), 上掲)。そのようなＥＬＩＳＡは以下のように一般的に行われる。ファージクローンを、カルベニシリン及びＫＯ７ヘルパーファージを添加した２ＹＴ培養液４０ｍｌにて３０℃で一晩生育させることによって単一のコロニーから繁殖させた。まず、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿法によって精製したファージをＰＢＳＴにて段階希釈して、抗原コートプレート（ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦ）への結合について試験した。５０〜７０％の飽和シグナルが得られた希釈液を溶液結合アッセイに用いた。そのアッセイは、まず漸増濃度の抗原とともに１〜２時間インキュベートし、次いで、結合していないファージを捕獲するために抗原コートプレートに移して１０〜１５分置く。固定した抗原にファージが結合するのを５０％抑制する溶液結合工程における抗原の濃度として算出されるＩＣ５０値を測定した。最も親和性が高い３つのクローンは、Ｆａｂに変換したＹＡＤＳ１、ＹＡＤＳ２及びＹＡＤＳ３であった。
【０１６６】
ｄ．ＹＡＤＳ１、２及び３Ｆａｂ結合親和性
ＹＡＤＳ１、２及び３を詳細な分析のために遊離したＦａｂタンパク質として精製した。３つのＦａｂの配列を以下に示す。また図３９も参照のこと。
YADS1軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQASYSSVAWYQQKPGKAPKLLIYAASYLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSASPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号19)
YADS1重鎖
MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDIYDDDIHWVRQAPGKGLEWVAYIAPSYGYTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSDASYSYSAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (配列番号20)
YADS2軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSYAYAVAWYQQKPGKAPKLLIYDASYLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSSPDTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号21)
【０１６７】
YADS2重鎖
MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAISDYDIHWVRQAPGKGLEWVADIAPYAGATAYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSYAYYAAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (配列番号22)
YADS3軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQASYYDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASYLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYAPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号23)
YADS3重鎖
MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISDYDIHWVRQAPGKGLEWVAAIAPYSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSYAYYSAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (配列番号24)
【０１６８】
前述のように(Muller, YAら., (1998) Structure 6:1153-1167)、Ｆａｂタンパク質を大腸菌振とうフラスコ培養物から精製した。一般的に、通常、可変ドメインを、大腸菌のＦａｂ発現又は哺乳動物細胞の一時的ＩｇＧ発現のために設定したベクターにクローニングした。Ｆａｂ発現ベクターは、ｃＰ３のコード配列を欠損させ、ＣＨ１の終端に停止コドンから下流のおよそ２０ヌクレオチドの終末配列（ＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴ（配列番号９２０））を加えることによって、ファージディスプレイファジミドから得た。上記のように(Presta, L. G.,ら., (1997) Cancer Res. 57, 4593-4599)、Ｆａｂタンパク質は、形質転換した３４Ｂ８大腸菌細胞をＡＰ５培地にて３０℃で２４時間生育させることによって生成した。Ｆａｂは、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィによって精製した。Ｆａｂの産生効率は、一般的に小規模振とうフラスコ生育では５〜１０ｍｇ／Ｌ、発酵槽生育では０．５〜３ｇ／Ｌであった。
表面プラスモン共鳴に基づく精製Ｆａｂの結合動態学的値を以下に示す。前述のように(Chen , Y.,ら., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881)、ｈＶＥＧＦ８−１０９又はｍＶＥＧＦをＢＩＡコアＴＭ−３０００の〜１００反応単位のＣＭ５チップに固定した。Ｆａｂタンパク質（３〜５００ｎＭ）の階段希釈液を注入して、ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦフローセル上の結合反応は空のフローセル上の反応を減算することによって補正した。動力学解析のために、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを別々にフィッティングした１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルを用いた。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの比率からＫｄ値を算定した。３つすべてのＦａｂは、ｈＶＥＧＦに高親和性をもって結合したが、非常に相同なマウスのＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ、９０％のアミノ酸同一性）にかなりの親和性示すのは２つのみであった。我々は、ＣＤＲに高い配列相同性を呈し、ヒト及びマウスのＶＥＧＦ両方に結合したので、ＹＡＤＳ２およびＹＡＤＳ３が非常に類似のメカニズムによってＶＥＧＦを認識していると推論した。対照的に、非常に異なるＣＤＲ配列を含み、ｍＶＥＧＦを認識しなかったので、ＹＡＤＳ１はおそらく抗原認識様式が特有なのであろう。
【０１６９】
固定したＶＥＧＦに対するＦａｂ結合の動力学的な分析
2011046732.tif 000012
１相互作用の親和性が低いため検出されない値。
【０１７０】
実施例７  ＹＡＤＳ１およびＹＡＤＳ２の結晶化、構造分析および分子構造精密化
我々は、抗原認識の構造的基礎と、そこで、ｈＶＥＧＦとの複合体におけるＹＡＤＳ１およびＹＡＤＳ２の結晶構造について研究した。
ａ．結晶構造解析のためのＦａｂタンパク質調製
１０リットルの大腸菌発酵から全細胞培養液を得た。細胞をＭａｎｔｏｎ―Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーによって溶解した。懸濁液を遠心分離し、上清をプロテインＡ-セファロースカラム(Genentech, Inc.)に流し、カラムを０．１Ｍの酢酸によって溶出した。ｐＨは１．０Ｍのトリス（ｐＨ８．０）にて４．０に合わせ、溶出液をＳＰ-セファロースカラム（Pharmacia）に流した。カラムを平衡化緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５）にて洗浄し、Ｆａｂタンパク質を平衡化バッファのＮａＣｌ勾配によって溶出した。前述のように(Christinger, H.W.,ら., (1996). Prot. Struct. Funct.Genet. 26, 353-357)、ヒトＶＥＧＦの残基８−１０９を発現させ、再フォールディングさせ、精製した。前述のように（Muller, Y.A., (1998)、上掲）、各々のＦａｂとｈＶＥＧＦのレセプタ-結合断片との複合体を形成させ、精製した。
【０１７１】
複合体（ＰＢＳ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ中）をＡ２８０＝１０の光学密度に濃縮した。タンパク質溶液および貯蔵部溶液(reservoir solution)を１：１で含む１０μｌの滴下を用いた蒸気-拡散法により、懸滴実験を行った。ＹＡＤＳ1複合体の貯蔵部溶液は、０．２Ｍ  硫酸アンモニウム、２５％  ＰＥＧ３３５０（ｗ／ｖ）、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５であった。ＹＡＤＳ2複合体の貯蔵部溶液は、１．０Ｍ  塩化リチウム、１０％  ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）、０．１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０であった。１９℃で１〜２週間の後、ＹＡＤＳ１又はＹＡＤＳ2複合体それぞれについて、プレート状又は紡錘状の結晶が生成された。
結晶を、２５％グリセロールを添加した貯蔵部溶液にてインキュベートして、瞬時に凍結させた。ＹＡＤＳ１にはAdvanced Light Source(Berkeley)のビームライン5.0.2で、そして、ＹＡＤＳ２にはStanford Synchrotron Radiation Laboratory (Stanford University)のビームライン９．２で単一の凍結結晶からデータセットを集めた。データは、プログラムＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ を用いて処理した(Otwinowski, Z.M., (1997) Methods Enzymol. 276:307-326)。構造は、プログラムＡＭｏＲｅ (CCP4 (1994) Acta Cryst. D50: 760-763)を用いた分子置換、および既に解析したＦａｂ−ｈＶＥＧＦ複合体（ＰＤＢエントリー１ＢＪ１）の座標によって構造を解析した。プログラムＲＥＦＭＡＣを用いて構造を精密化した（CCP4 (1994)、上掲）。プログラムＯを用いてモデルを手動で調製した (Jomes, T.A.,ら., (1991) Acta Crystallogra A 47 (Pt2): 969-995)。表面積を算出するために、相互作用ＲＥＳＡＲＥＡバージョン３．２：１９９３年８月５日およびＡＲＥＡＩＭＯＬバージョン３．２：１９９５年１２月１９日のプログラムを用いた。これらのプログラムは、CCP4 suite Collaborative Computational Project, Number 4. 1994 （「The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography」 Acta Cryst. D50, 760-763）の一部である。ｈＶＥＧＦとの複合体中のＹＡＤＳ１及びＹＡＤＳ２の結晶構造を解析して、それぞれ２．６５Å及び２．８Åで精密化した（表９）。
【０１７２】
表９  ＹＡＤＳ１及びＹＡＤＳ２  ｈＶＥＧＦ複合体のデータ集積及び精密化統計データ
2011046732.tif 000013
ａ括弧内は解像度範囲外の値。
ｂＲｍｅｒｇｅ＝Σｈｋｌ｜Ｉｈｋｌ−＜Ｉｈｋｌ＞｜／Σｈｋｌ＜Ｉｈｋｌ＞、Ｉｈｋｌは反射ｈｋｌの強度であり、＜Ｉｈｋｌ＞は複数の観測の平均強度である。
ｃＲｗｏｒｋ＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜／ΣＦｏ、ＦｏおよびＦｃはそれぞれ観察された構造要素振幅および計測した構造要素振幅である。Ｒｆｒｅｅは構造精密化に用いられなかった反射のランダムに選択した５％のＲ因子である。
【０１７３】
ＶＥＧＦ（Å２）に埋没される抗ＶＥＧＦ抗体の各々の残基の表面積は、埋没される残基の全表面積の割合と共に以下に示す。また、ＶＥＧＦ（Å２）に埋没されるＶＥＧＦ抗体の各々の残基の表面積を、埋没される残基の全表面積の割合と共に以下に示す。以下のＹＡＤＳ−１：ＶＥＧＦ及びＹＡＤＳ−２：ＶＥＧＦ複合体の値を参照のこと。全ての場合において、ＶＥＧＦが二量体であるので、（ＶＥＧＦ二量体のうちの）単量体１に属するＶＥＧＦの残基番号は８−１０９であり、（ＶＥＧＦ二量体のうちの）単量体２に属するＶＥＧＦの残基番号は１００８−１１０９である。以下の各表の第１列目は、調べたタンパク質（ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦ抗体の何れか）の残基番号を列挙する（例えば、以下の段落（ａ）では、ＴＹＲ  Ａ  ４５はＹ４５を指す、ＬＹＳ  Ａ１０１６はＶＥＧＦのＫ１６を指す）第２列目は、その残基の埋没した表面（Å２）を列挙する。第３列目は、全残基の表面積の割合として、その残基に対する埋没した表面を列挙する。
【０１７４】
（ａ）ＶＥＧＦ：ＹＡＤＳ−１
表１０  ＹＡＤＳ−１と接触するＶＥＧＦの残基
2011046732.tif 000014
ＣＨＡＩＮ  Ａ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：９１２．０（この鎖の１１１７０．０全領域の８．１６％）
合計ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：９１２．０（すべての鎖全体にわたって１１１７０．０全領域の８．１６％）
【０１７５】
（ｂ）ＶＥＧＦ：ＹＡＤＳ−２
表１１  ＹＡＤＳ−２と接触するＶＥＧＦの残基
2011046732.tif 000015
ＣＨＡＩＮ  Ａ  ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：７２５．０（この鎖の１１７４４．０全領域の６．１７％）
合計ＤＩＦＦ−ＡＲＥＡ：７２５．０（すべての鎖全体にわたって１１７４４．０全領域の６．１７％）
【０１７６】
５Å２以上及び／又は５％以上の埋没した表面積を有する残基は、有意に接触しているとみなした。これらの結果により、互いに接触しているＶＥＧＦ内の領域及び抗体の領域が示される。先に示されたＶＥＧＦ結合に関する機能的データとあわせると、Ｇ６系列の抗体ＹＡＤＳ−２及びＹＡＤＳ−３の共通の性質をみることができた。ＶＥＧＦに対するＦａｂ−１２及びＹＡＤＳ−１などの抗体の結合により、Ｇ８８の表面積がそれぞれ１００％及び９５％埋没するのに対して、Ｇ６、Ｇ６−２３及びＹＡＤＳ−２の結合により、Ｇ８８は６６％未満が埋没するのみであった。
Ｆａｂフレームワークは、親のＦａｂ4Ｄ5の構造と比較すると基本的に変化がなかった；ＹＡＤＳ1およびＹＡＤＳ2フレームワークのＣα原子は、それぞれ０．８７および０．５５Åの根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）を有するＦａｂ4Ｄ5と重なった。２つの構造内のｈＶＥＧＦ分子のＣα原子は、８７Ｃα位置の０．７Åのｒｍｓｄで互いによく重なる。３．７Åの最も大きな偏差は残基グルタミン酸６４で起こる。Mullerら., 上掲により示されるように、本残基を含むループは固有の柔軟性を有する。
【０１７７】
両方の複合体において、抗原認識はＣＤＲループとの接触によって完全に媒介された。埋没した表面積に関して、ＹＡＤＳ１は重鎖（４９８Å２）及び軽鎖（４０７Å２）の両方を用いたのに対して、ＹＡＤＳ２は主に重鎖（５４３Å２）とわずかに軽鎖（１５７Å２）を用いた。特に、残基をランダム化したことにより、基本的に表面積のすべてが埋没し（ＹＡＤＳ１およびＹＡＤＳ２はそれぞれ９８％および１００％）さらに、埋没した表面積はほぼすべての側鎖原子に関連した（ＹＡＤＳ１およびＹＡＤＳ２はそれぞれ８２％および８０％）。したがって、側鎖によってほぼ完全に媒介される相互作用を介して抗原結合した両方のＦａｂは、ライブラリにおいてランダム化された位置に存在した。
ｈＶＥＧＦからみれば、ＹＡＤＳ１およびＹＡＤＳ２に結合する構造的エピトープは、互いに、そしてまた、ｈＶＥＧＦレセプターＦｌｔ−１（Ｆｌｔ−１Ｄ２）のドメイン２に結合する構造的エピトープと重なり合っている。ＹＡＤＳ１およびＹＡＤＳ２抗体はインビトロでヒトＶＥＧＦへのＦｌｔの結合を阻害することができ（データは示さない）、また、ヒトＶＥＧＦへのＫＤＲの結合も阻害すると思われる。にもかかわらず、２つのＦａｂの構造的エピトープ間には有意な差がある。特に、ヒト及びマウスのＶＥＧＦ間で異なる１１の残基の中で、残基８８だけはＦａｂと接触するが、本残基が関与する相互作用はｍＶＥＧＦに対するＹＡＤＳ１及びＹＡＤＳ２の親和性の違いに現れる。ＹＡＤＳ２複合体では、Ｇｌｙ８８は部分的に溶媒に曝されており、ＹＡＤＳ１複合体では接触面に完全に埋没している。マウスのＶＥＧＦは、位置８８により大きなセリン残基を含む；ＹＡＤＳ２複合体ではこの置換を確実に適応することができるが、ＹＡＤＳ１モデルでは、埋没したＧｌｙ８８位置へのセリン側鎖の導入により、維持するように複合体に大きな再編成が起こる。
【０１７８】
上述のように、両方のＦａｂは、変化した部位の側鎖をほぼ独占的に伴う接触によって抗原と結合する。合計で、ＹＡＤＳ１及びＹＡＤＳ２のＣＤＲはランダム化したコドン由来の６６の残基を含み、これらの残基はライブラリ設定に用いた４アミノ酸型の間にほぼ等しく分布している。しかしながら、我々が抗原と接触する残基のサブセットを考慮するときに、１６のチロシンが接触残基の５０％を占めるという点で、明確なバイアスがある。実際、ＹＡＤＳ１及びＹＡＤＳ２のＣＤＲでの選択したチロシンのうちのわずかに２つは抗原と接触し、全体のチロシンはｈＶＥＧＦとの複合体形成時に埋没する表面積の７１％に当たる。したがって、基本的に、すべての選択チロシン側鎖は直接抗原認識に関与し、他の選択アミノ酸は外見上は補助的役割をする。
合成抗原結合部位でのチロシンの優位性に反して、埋没した表面積の重元素（非水素）含量の試験により、Ｆａｂ−ｈＶＥＧＦ接触面がｈＶＥＧＦおよびＦｌｔ−１Ｄ２間の接触面と同様に疎水性であることが明らかになった。ｈＶＥＧＦ側からみると、埋没した表面積の重元素組成物は全３つの場合において非常に類似である。それは、主には炭素から成り有意な割合の窒素および酸素を含む。Ｆａｂの埋没した表面積の中で、ライブラリにある鎖は、炭素、酸素及び水素から完全に成るので、窒素原子はほぼ完全に存在しない。にもかかわらず、両方のＦａｂはｈＶＥＧＦへの結合時に多数の酸素原子を埋没し、いずれの場合においても、埋没した表面積での炭素の割合はＦｌｔ−１Ｄ２の埋没した表面積での炭素の割合より少ない。したがって、合成ＣＤＲ中のチロシンの優位性により、芳香族相互作用によって支配された非常に疎水性なＦａｂ−抗原接触面とはならない。これに反して、チロシン残基はｈＶＥＧＦ表面上の多種多様な残基と特異的に接触し、側鎖水酸基および芳香環の両方がこの相互作用に用いられる。
【０１７９】
したがって、我々は正確に定義した合成ライブラリを用いることにより天然の免疫系の複雑さを取り囲んだ。その結果、我々はチロシンが抗原結合部位において果たす特別な役割を調査することができた。我々は、多様性を制限し、フレームワーク領域及びＣＤＲ残基によって形成される固定された足場(scaffold)上に多様な表面を表出させることによってライブラリを作製した。我々の結果により、適切な足場の中で、チロシン側鎖は高親和性抗原認識に必要なほとんどの接触を媒介しうることを劇的に証明した。したがって、天然の抗原結合部位に過剰にチロシンが存在すると、側鎖が抗原との豊富な接触に特によく適したものとなるようである。
また、この仮定はチロシンの化学的性質とも一致している。前述のように、チロシン側鎖は非常に大きく、少数のねじれ角を伴って大きな空間を占め、それは水素結合、疎水的相互作用および正に荷電する基との誘引性の静電的相互作用を形成しうる(Zemlin, M.,ら., (2003) J. Mol. Biol. 334:733-749)。加えて、荷電してないチロシン側鎖により静電反発効果が回避され、そのミッドレンジの親水性によって親水性環境及び疎水性環境の両方に好適に適応する(Zemlin, (2003)、上掲；Ivanov, I.ら., (2002) in The Antibodies, eds. Zanetti, M. & Capra, J. (Taylor & Fancis, London, New York), pp.43-67; Mian, I.S.ら., (1991) J. Mol. Biol. 217:133-151)。
また、アラニン及びセリン残基が直接抗原とあまり接触しないが、それらによって大きなチロシン側鎖が好適に配置するために重要な空間と高次構造柔軟性が与えられたことを我々は明らかにした。したがって、これらの小さな残基は、チロシンと抗原との生産的な接触を容易にする際の補助的機能を果たしているであろう。また、セリンが天然の抗原結合部位で非常に豊富に存在する点と一致していないことに注意する(Mian, (1991)、上掲)。最後に、アスパラギン酸によって媒介される少数の抗原接触により、更にこれらの合成抗原結合部位の化学的多様性を最小化することができることが示唆される。
【０１８０】
実施例８  ＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−Ｂのライブラリから得た抗ＶＥＧＦ抗体
（ａ）ファージディスプレイＦａｂライブラリＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−Ｂの構築
Ｆａｂ重鎖及び遺伝子３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメイン間に挿入したロイシンジッパードメインによって二量体化した二価のＦａｂ分子を表出するように設定した前述のファジミドを用いて、実施例６に記載のように２つのファージディスプレイライブラリ（ＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−Ｂ）を構築した。以下に示す４Ｄ５位置のランダム化を除いて、以下のようにランダム化した：
2011046732.tif 000016
【０１８１】
ライブラリＹＡＤＳ−Ａについて、２つの異なる突然変異誘発反応を行った。第一の反応では、オリゴヌクレオチドＹＡＤＳ−Ｈ１、ＹＡＤＳ−Ｈ２及びＹＡＤＳ−Ｈ３−７を用いてそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３内に多様化を導入した。これによって、４つのアミノ酸チロシン、アラニン、アスパラギン酸及びセリン（ＹＡＤＳ）をコードする縮重コドンが導入された。第二の反応では、オリゴヌクレオチドＹＴＮＳ−Ｈ１、ＹＴＮＳ−Ｈ２及びＹＴＮＳ−Ｈ３−７を用いてそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３に多様化を導入した。これによって、４つのアミノ酸チロシン、スレオニン、アスパラギン及びセリン（ＹＴＮＳ）をコードする縮重コドンが導入された。２つの反応を蓄積した。
ライブラリＹＡＤＳ−Ｂについて、１３の異なる突然変異誘発反応を行った。その反応によって４つのアミノ酸チロシン、アラニン、アスパラギン酸及びセリン（ＹＡＤＳ）をコードする縮重コドンが導入された。それぞれの反応で、オリゴヌクレオチドＹＡＤＳ−Ｈ１及びＹＡＤＳ−Ｈ２を用いてＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２内に多様化を導入した。各反応について、以下のオリゴヌクレオチドの一つを用いて、ＣＤＲ−Ｈ３に多様化を導入した：ＹＡＤＳ−Ｈ３−３、ＹＡＤＳ−Ｈ３−４、ＹＡＤＳ−Ｈ３−５、ＹＡＤＳ−Ｈ３−６、ＹＡＤＳ−Ｈ３−７、ＹＡＤＳ−Ｈ３−８、ＹＡＤＳ−Ｈ３−９、ＹＡＤＳ−Ｈ３−１０、ＹＡＤＳ−Ｈ３−１１、ＹＡＤＳ−Ｈ３−１２、ＹＡＤＳ−Ｈ３−１３、ＹＡＤＳ−Ｈ３−１４又はＹＡＤＳ−Ｈ３−１５。１３の反応を蓄積した。
２つのライブラリについて、蓄積した突然変異誘発反応物を、大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入した(Sidhu ら., 上掲)。形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記のファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。ライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂのサイズはともに７×１０９であった。
【０１８２】
（ｂ）ＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂナイーブライブラリから得た抗ｈＶＥＧＦ特異的抗体の選別
ライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂのファージについて結合選別操作を繰り返して、ｈ-ＶＥＧＦに結合するクローンを濃縮した。この結合選別は既に記載の方法（Sidhuら、上記）に従って行った。
捕獲標的（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、ＢＳＡ(Sigma)で２時間ブロックした。既に記載したように（Sidhuら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記のコートしたイムノプレートにファージ溶液（〜１０１２ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して４回選別操作を行った。個々の選別から得た個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養物上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら、上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレート上のシグナルより標的コートプレート上で少なくとも２０倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈する場合にクローンを特異的結合体とした。
特異的結合体を配列決定し、ライブラリＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−Ｂそれぞれについて配列の異なるクローンを図３７及び３８に示した。図３７の配列はヒトＶＥＧＦ８−１０９で分類して得たものである。図３８の配列はマウスＶＥＧＦで分類して得たものである。
【０１８３】
実施例９  ＹＡＤＳ２のＮＮＫ変異体
（ａ）ＮＮＫコドンによってＹＡＤＳ２抗ＶＥＧＦ抗体の選択した位置をランダム化することによるファージディスプレイＦａｂライブラリの構築
Ｆａｂ重鎖及び遺伝子３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメイン間に挿入したロイシンジッパードメインによって二量体化した二価のＦａｂ分子を表出するように設定した前述のファジミドを用いて、ファージディスプレイＦａｂライブラリを構築した。このベクターはＹＡＤＳ２配列を含む。ヒト化抗体ＹＡＤＳ２可変ドメインをＩＰＴＧ誘引性Ｐｔａｃプロモータのコントロール下で発現させた。
ＹＡＤＳ２の重鎖ＣＤＲ−３内の残基をランダム化してライブラリＮＮＫを構築した。ランダム化する特定の残基は、重鎖の５０、９５、９７、９９、１００及び１００ａである。
各々のランダム化した位置の野生型のコドンを、２０すべての天然のアミノ酸をコードする縮重ＮＮＫコドン（等モル比のＮ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ）で置換した。
既に記載した方法による(Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C. & Wells, J. A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363)、Kunkelの方法 (Kunkel, T. A., Roberts, J. D. & Zakour, R. A., Methods Enzymol.  (1987), 154, 367-382) を用いてライブラリを構築した。Ｆａｂディスプレイベクターの特異な「停止鋳型」バージョンを用いてＮＮＫライブラリを作製した。我々は、重鎖の位置３０、３３、５２、５４、５６、５７、６０、１０２、１０３、１０４、１０７、１０８に挿入されたＴＡＡ停止コドンを有するＹＡＤＳ２  ｆａｂコード遺伝子を持つ鋳型ファジミドを用いた。多様化されるべき位置に縮重ＮＮＫコドンを有する突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ多様性を導入すると同時に、停止コドンを修復した。ＮＮＫ−Ｈ１（ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＣＧＴ）（配列番号２５）、ＮＮＫ−Ｈ２（ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＮＮＫ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＧＴＣ）（配列番号２６）、及び、ＮＮＫ−Ｈ３  （ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＮＮＫ  ＴＣＴ  ＮＮＫ  ＧＣＴ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ）（配列番号２７）と称するオリゴヌクレオチドを用いてＣＤＲ−Ｈ３多様性を導入した。３つすべての重鎖ＣＤＲの変異原性オリゴヌクレオチドが単一の突然変異誘発反応で同時に取り込まれ、その変異原性オリゴヌクレオチドの同時取込みにより、各々の位置での設定した多様性の導入と同時に全てのＴＡＡ停止コドンの修復が起こる。これによって、ホモ二量体化したロイシンジッパーとＰ３Ｃに融合したＦａｂライブラリをコードするオープンリーディングフレームが生成された。オリゴヌクレオチドＮＮＫ−Ｈ１はどの縮重コドンも含んでおらず、ＴＡＡ停止コドンの修正と野生型ＹＡＤＳ２配列の導入のために突然変異誘発反応が加えられていることに注意されたい。
突然変異誘発反応物を、大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入し(Sidhu ら., 上掲)、形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記のファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。各ライブラリは５×１０９以上のの異なるメンバーを含有した。
【０１８４】
（ｂ）ＮＮＫライブラリから得た特異的抗ＶＥＧＦ抗体の選別
ライブラリＮＮＫのファージについて結合選別操作を繰り返して、ヒトＶＥＧＦに結合するクローンを濃縮した。この結合選別は既に記載の方法（Sidhuら、上記）に従って行った。
捕獲標的（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）(Pierce)で２時間ブロックした。既に記載したように（Sidhuら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記のコートしたイムノプレートにファージ溶液（〜１０１２ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
ライブラリーをＶＥＧＦに対して５回選別操作を行った。個々の選別工程から得た個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養物上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら、上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレート上のシグナルと比較して標的コートプレート上で少なくとも１５倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈する場合にクローンを特異的結合体とした。ＶＥＧＦ結合について３〜５回選別した後、個々のクローンをスクリーニングした。
特異的結合体あらわす個々のクローンをＤＮＡ配列分析の対象とし、ランダム化したＣＤＲ位置の配列を図４０に示す。異なるＹＡＤＳ変異体の親和性を「２点競合的ファージＥＬＩＳＡ」を用いて測定した。最も良好な３つのクローンを可溶性Ｆａｂとして生成して、ｈＶＥＧＦに関する親和性について試験した。Chenら., J Mol Biol. (1999), 293(4):865-81に従ってＢＩＡコアデータを得た。簡単に言うと、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００表面プラズモン共鳴システム(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いて測定した会合速度と解離速度の定数から結合親和性を算出した。バイオセンサーチップを、提供者(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を用いてＶＥＧＦの共有結合を活性化した。ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦのバッファを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）に置き換え、およそ３０ｍｇ／ｍｌに希釈した。結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ２００−３００になるように２μＬ／分の流速で一定量のＶＥＧＦを注入した。ブロック試薬として１Ｍのエタノールアミン溶液を注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂを２５℃、１０μｌ／分の流速でＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）に注入した。表面プラスモン共鳴測定から得た平衡解離定数、Ｋｄ値をＫｏｆｆ／Ｋｏｎとして算出した。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭデータは以下に要約する：
【０１８５】
2011046732.tif 000017
【０１８６】
実施例１０  ２アミノ(binomial)酸多様性ライブラリ
（ａ）Ｔｙｒ又はＳｅｒのみにランダム化したＣＤＲ残基を有するファージディスプレイＦａｂライブラリの構築
Ｆａｂ重鎖及び遺伝子３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメイン間に挿入したロイシンジッパードメインによって二量体化した二価のＦａｂ分子を表出するファジミドベクターを用いて、ファージディスプレイＦａｂライブラリを構築した。前述のように、このベクターはＩＰＴＧ誘導性Ｐｔａｃプロモータ制御下にヒト化抗体４Ｄ５可変ドメインを有する。ヒト化抗体４Ｄ５は、主に重鎖及び軽鎖中のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域と、Ｈｅｒ-２に特異的なマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ領域を有する抗体である。抗Ｈｅｒ-２抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同定は、米国特許第５８２１３３７号及び同第６０５４２９７号に示される。
２つのライブラリを構築した。ライブラリＹＳ-Ａは３つすべての重鎖ＣＤＲにランダム化した残基を有するように、一方ライブラリＹＳ-Ｂは３つすべての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲにランダム化した残基を有するように構築した。ランダム化した特定の残基を以下に示す。
【０１８７】
2011046732.tif 000018
【０１８８】
ランダム化した各々の位置の野生型コドンを、等モル比のＴｙｒ及びＳｅｒをコードする縮重ＴＭＴコドン（等モル比のＭ＝Ａ／Ｃ）に置換した。加えて、ＣＤＲＨ３の長さを位置１０１〜１０７の７野生型コドンを異なる数のＴＭＴコドン（ライブラリＹＳ-Ａは７〜２０、ライブラリＹＳ-Ｂは７〜１５）で置換したオリゴヌクレオチドを用いて長さを変えた。加えて、ライブラリＹＳ-ＢのＣＤＲＬ３をランダム化して、５０％のライブラリメンバーが位置９１を欠損し、残りの５０％は位置９１に野生型のＧｌｎ残基を含むようにした。
既に記載の方法(Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C. & Wells, J. A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363)とKunkel法(Kunkel, T. A., Roberts, J. D. & Zakour, R. A., Methods Enzymol.  (1987), 154, 367-382)を用いてライブラリを構築した。Ｆａｂディスプレイベクターの異なる型である「停止鋳型」を用いて、ライブラリＹＳ-Ａ及びＹＳ-Ｂの両方を作製した。重鎖の位置３０、３３、５２、５４、５６、５７、６０、１０２、１０３、１０４、１０７、１０８にＴＡＡ停止コドンを挿入したｐＶ０３５０-４と称するファジミド鋳型を用いた。軽鎖ＣＤＲ３には停止コドンを導入しなかった。多様化させる位置を縮重ＴＭＴコドンで突然変異させたオリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ多様化の導入と停止コドンの修復を同時に行った。両方のライブラリとも、オリゴヌクレオチドＨ１及びＨ２それぞれを用いてＣＤＲ-Ｈ１とＣＤＲ-Ｈ２に多様化を導入した。ＹＳ-Ａは、等モル混合物のオリゴヌクレオチドにてＣＤＲ−Ｈ３を多様化した。ＹＳ−Ｂは、等モル混合物のオリゴヌクレオチドを用いてＣＤＲ-Ｈ３を多様化した。ライブラリＹＳ-Ｂは、等モル混合物のオリゴヌクレオチドを用いてＣＤＲ-Ｌ３を多様化した。ランダム化するすべてのＣＤＲの突然変異オリゴヌクレオチドを単一の突然変異反応に同時に入れて、すべての突然変異オリゴヌクレオチドの同時移入により各々の位置を所望のように多様化すると同時にすべてのＴＡＡ停止コドンを修復させ、ホモ二量体化したロイシンジッパーとＰ３Ｃに融合したＦａｂライブラリメンバーをコードするオープンリーディングフレームを生成した。
突然変異誘発反応物を大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入し(Sidhu ら., 上掲)、形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記ファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。各ライブラリは５×１０９の一致しないメンバーを含有する。
【０１８９】
（ｂ）ナイーブライブラリＹＳ-Ａ及びＹＳ-Ｂからの特異的抗体の選別
ライブラリＹＳ-Ａ又はＹＳ-Ｂのファージについて結合選別操作を繰り返して、対象とする標的に結合するクローンを濃縮した。各ライブラリを用いて標的タンパク質、ヒトＶＥＧＦ８−１０９及びマウスＶＥＧＦを別々に解析した。この結合選別は既に記載の方法（Sidhuら、上記）に従い行った。
捕獲標的（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、Superblock ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）(Pierce)で２時間ブロックした。既に記載したように（Ｓｉｄｈｕら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、Superblock ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記コートしたイムノプレートにファージ溶液（１０１３ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して５回選別操作を行い、各回、Superblock ＴＢＳにてコートした標的タンパク質又は空のウェルの何れかに結合するファージの力価を測定した。空のウェルに結合したファージの力価で割った標的コートウェルに結合したファージの力価を、標的タンパク質に特異的に結合するファージプールを定量化するために用いた濃縮率として定義した；大きな濃縮率は特異性が高い結合であることを表す。濃縮率は、第３、４又は５回目の選別の後に求めた。
【０１９０】
各回の選別から得た個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養液上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら., 上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも１５倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。個々のクローンを、ヒトＶＥＧＦに対する結合について２回選別した後、又は、他の標的タンパク質への結合について５回選別した後にスクリーニングした。これらのデータを用いて特異的な結合体の割合と、各々の標的タンパク質に対する各々のライブラリの結果を算出した。各々のライブラリは各々の標的タンパク質に対して結合体を生産した。
特異的な結合体を表している個々のクローンについてＤＮＡ配列分析行い、ランダム化したＣＤＲ位置の配列を図４１に示す。各々の標的タンパク質について、ランダム化した位置にＴｙｒ又はＳｅｒだけを含んだ特異的な結合体を選択することが可能であったことがわかる（しかしながら、おそらくオリゴヌクレオチド内の不純物のためにライブラリ構築中に生じたと思われる設定していない突然変異がいくつかみられる）。さらに、特異的な結合体の配列は、選択された標的タンパク質に特有のものであった。
【０１９１】
図４１に挙げた２つの結合体（ｈＶＥＧＦ結合体＃３及び＃１８）を、ｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対しての親和性について試験した。ＢＩＡｃｏｒｅデータを、Chenら., J Mol Biol. (1999), 293(4): 865-81に従って得た。簡潔にいうと、ｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対するｈＶＥＧＦ結合体＃３及び＃１８の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００表面プラスモン共鳴系(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いて測定した結合定数及び解離速度定数から算出した。バイオセンサチップは、供給元(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)の指示に従って、Ｎ-エチル-Ｎ´-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を用いてＶＥＧＦの共有結合的結合を活性化した。ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦは、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８にバッファー交換して、およそ３０ｍｇ／ｍｌまで希釈した。等量のＶＥＧＦを、結合したタンパク質のおよそ２００〜３００の応答単位（ＲＵ）に達成するように、２μＬ／分の流速で、注入した。遮断剤として、１Ｍエタノールアミンの溶液を注入した。動態学的な測定のために、２倍の階段希釈をしたＦａｂを２５℃で１０μＬ／分の流速でＰＢＳ／ツイーン緩衝液に注入した（０．０５％のＴｗｅｅｎ20を含むリン酸緩衝食塩水）。平衡解離定数、表面プラスモン共鳴測定値からのＫｄ値をｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭデータを以下に要約した。
【０１９２】
2011046732.tif 000019
【０１９３】
実施例１１  付加的抗ＶＥＧＦ  ＹＳ抗体
ライブラリ構築及び分類。先に述べたように、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に二価のＦａｂ４Ｄ５を表出するように設定したファジミドを用いてライブラリを構築した。オリゴヌクレオチド偏向性突然変異誘発を用いてＣＤＲの位置をＴＭＴ縮重コドンに置換した（同じ割合のＭ＝Ａ／Ｃ）。ランダム化のために選択した位置は以下に示す：
2011046732.tif 000020
【０１９４】
ＣＤＲ−Ｈ３では、位置９５〜１００ａを７〜２０残基（ライブラリＡ）又は７〜１５残基（ライブラリＢ）の範囲の可能な長さのランダムループに置換した。各ライブラリは〜１０１０の異なるメンバーを含むので、実際のライブラリの多様性はライブラリデザインによってコードされる異なる配列の最大数である（４×１０９）。
前述のように(Sidhu, S.S.,ら, (2000) Methods Enzymol. 328:333-363)、ライブラリからのファージは、９６ウェルMaxisorpイムノプレート（ＮＵＮＣ）に固定した抗原を捕獲標的として用いて結合選別の工程を繰り返した。５回の選別工程の後、ファージを９６ウェルフォーマットにて成長させた個々のクローンから産生させ、培養物上清をファージＥＬＩＳＡに用いて、特異的結合クローンを検出した。特異的結合クローンは、同型の抗原に結合するが７つの他のタンパク質には検出可能な結合を示さないＦａｂ−ファージであることを確認した。
【０１９５】
競合的ファージＥＬＩＳＡ。変更したファージＥＬＩＳＡを用いてＦａｂの結合親和性を推定した(Sidhu, (2000)、上掲；Deshayes, K.,ら, (2002) Chem. Biol.  9:495-505)。前述のように、抗体でコートしたプレート上でファージＥＬＩＳＡを行った。ファージディスプレイ抗体フラグメントをＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で段階的に希釈し、結合を測定して、飽和下で〜５０％のシグナルが得られるファージ濃度を決定した。固定した、飽和濃度以下のファージを段階希釈した抗原と２時間予めインキュベートして、移して、抗原でコートしたプレートを分析した。１５分のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体コンジュゲート（１：５０００希釈）(Pharmacia)にて３０分インキュベートした。プレートを洗浄して、ＴＭＢ基質(Kirkegaard and Perry Laboratories)にて反応させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４にて消光して、４５０ｎｍの分光光度を読んだ。固定した抗原にファージが結合するのを５０％抑制する抗原の濃度として定義されるＩＣ５０値として、Ｆａｂの結合親和性を測定した。１８４結合クローンのＤＮＡ配列決定により、図４２に示されるように６３の異なる配列が明らかとなった。興味深いことに、ライブラリＢから得たクローンは、選択されたＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ３配列内で相同性を示す。対照的に、ライブラリＡから得たクローンのＣＤＲ−Ｈ３配列はそれ自身の間で相同性を示すが、ライブラリＢからの配列と非常に異なる。したがって、ＣＤＲ−Ｌ３配列の性質がＣＤＲ−Ｈ３配列の選別に影響して、その結果、２つの異なる種類の抗ｈＶＥＧＦ抗体が２つの異なるライブラリから生じたようである。クローンを競合的ファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、およそ６０ｎＭから５ｍＭ以上の範囲のＩＣ５０値を示した。
【０１９６】
タンパク質精製及び親和性分析。高親和性と思われる３つの抗ｈＶＥＧＦクローン（図４２の上３つの配列）を遊離したＦａｂタンパク質として精製した。前述のように(Muler, Y.A.,ら, (1998) Structure 6:1153-1167)、Ｆａｂタンパク質を大腸菌から精製した。ＹＳ１  Ｆａｂ配列については図４３を参照。精製したＦａｂの結合動態は表面プラズモン共鳴によって研究した。記載されているように(Chen, Y.,ら., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、〜５００反応単位のＣＭ５チップ上に固定したｈＶＥＧＦを用いたＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００を用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって結合動態を測定した。Ｆａｂタンパク質の階段希釈液を注入して、結合反応は空のフローセル上の反応を減算することによって補正した。動力学解析のために、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを全体的にフィッティングした１：１ラングミュアモデルを用いた。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの比率からＫｄ値を算定した。
【０１９７】
2011046732.tif 000021
Ｆａｂ−ＹＳ１がｈＶＥＧＦに対して最も高い親和性を示す（Ｋｄ＝６０ｎＭ）一方、他の２つのＦａｂはより早い解離速度のためにおよそ５倍低い厳密性で結合した。Ｆａｂ−ＹＳ１及びＦａｂ−ＹＳ２は３つの位置が異なるのみで、ゆえに、この３つの違いがＦａｂ−ＹＳ２と比較してＦａｂ−ＹＳ１の親和性改善の原因となる。
【０１９８】
免疫組織化学。次に、我々は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＶＥＧＦをコードする遺伝子で形質転換した哺乳動物細胞中のＶＥＧＦを視覚化するためにタンパク質を用いて、Ｆａｂ−ＹＳ１の特異性を調べた。記載されているように(Peden, A.A.,ら, (2004) J. Cell. Biol. 164:1065-1076)、マウスのＶＥＧＦ-ＧＦＰを発現するヒトＡ６７３細胞を着色して、撮像した。プラスＶＥＧＦパネルにおいて、細胞とインキュベートする前に。Ｆａｂ−ＹＳ１を、５倍量の組換え体ＶＥＧＦとともに５分間プレインキュベーションした。Ｆａｂ−ＹＳ１での免疫組織化学的染色は、ＶＥＧＦ−ＧＦＰ融合からの蛍光シグナルと正確に一致した（データは示さない）。さらに、シグナルは、染色の前にｈＶＥＧＦとともにＦａｂ−ＹＳ１をインキュベートすることによって完全にブロックした。
免疫沈降。また、我々は、内在性ｈＶＥＧＦの免疫沈降を行って、Ｆａｂ−ＹＳ１の結果と、非常に特異的な、天然の抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４．６．１）のものと比較する(Kim, K.J.,ら, (1992) Growth Factors 7:53-64)。Ａ６７３細胞を代謝的に標識し、記載されているように(Kim, K.J.,ら、上掲)、１５μｇの抗ＧＦＰポリクローナル抗体(Clontech)、Ｆａｂ−ＹＳ１又はモノクローナル抗体Ａ４．６．１を用いて、培養物から免疫沈降を行った。免疫複合体を沸騰して溶出し、還元条件下で、１４％のアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって分析した。ゲルを乾燥させて、ホスホイメージプレートに一晩曝した。両抗体は、おそらく変更ｍＲＮＡスプライシングにより生成したｈＶＥＧＦ変異体を表す同一の一群のバンドを免疫沈降した（データは示さない）。合わせて、Ｆａｂ−ＹＳ１が天然抗体と同等の高親和性および特異性でｈＶＥＧＦと結合することも示される。
【０１９９】
実施例１２  抗ＶＥＧＦ抗体のインビボ活性
Ｇ６−２３は新生仔マウス成長および生存を阻害する。出生第１日目の生まれたばかりのマウス（Ｃ５７／ＢＬ６）に、腹膜内投与（ｉ.ｐ.）によりＧ６−２３ＩｇＧ（５０ｍｇ／ｋｇ）又はＦｌｔ−１（１−３）Ｆｃ（５０ｍｇ／ｋｇ）、または好適対照、ｇｐ１２０−Ｆｃ、ＰＢＳを投与する群又は投与しない群を作った。体重を毎日測定し、マウスの生存率を計算した。図１０に示すように、Ｇ６−２３は、ｍＶＥＧＦアンタゴニストとして公知のｍＦｌｔ−１（１−３）Ｆｃと同じように体重を減少させた。さらに、マウス生残率も２群間で同じであった。Ｇ６−２３の結果は特に、ｍＶＥＧＦが生まれたばかりのマウスの成長および生存に必要であるのに対して、ｍＶＥＧＦだけでなく、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）およびＶＥＧＦ−Ｂをブロックすることが知られているので、Ｆｌｔ−１（１−３）Ｆｃの効果の特異性は低いことが有意に示された。
Ｇ６−２３はヌードマウスの異種移植片腫瘍の成長を効果的に阻害する。ヒト大腸−直腸癌細胞株である２つのＫＭ１２およびＳＷ４８０は、まず細胞培養で大きくし、各々の細胞株由来の約１０６の細胞を宿主ヌードマウスに注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３のサイズに達したとき（注射後１週）、Ｇ６−２３又は対照（１０ｍｇ／ｋｇ）を、毎週２回注入した（各群に６匹のヌードマウスを用いた）。腫瘍サイズは抗体投与後１３日目まで測定した。図１１に示すように、Ｇ６−２３は、ＫＭ１２（左のグラフ）およびＳＷ４８０（右側のグラフ）細胞株の腫瘍容量を有意に効果的に減少させた。
【０２００】
ＫＭ１２異種移植片マウスでのｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦの遺伝子発現を調べた。腫瘍および周囲組織の試料を抽出し、Ｔａｇｍａｎを用いて遺伝子発現レベルを定量化した。これらの異種移植片モデルにおいて、ｈＶＥＧＦは移植したヒトＫＭ１２腫瘍細胞に由来したのに対し、ｍＶＥＧＦは周囲の宿主間質細胞に由来した。図１２に示すように、Ｇ６−２３での処理後３日目と１３日目のマウスから得た試料は、対照群と比較してｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦの遺伝子発現レベルが高かった。Ｇ６−２３で処理したマウスは腫瘍成長が減少し、血管分布が非常に減退したのに対し、ｍＶＥＧＦおよびｈＶＥＧＦの発現はともに血管新生の減少に応答して上方制御されたことが示された。また、腫瘍部位で、マウス間質細胞の有意な浸潤があり、その浸潤が腫瘍血管新生へのＶＥＧＦの主要な供与源であることが示された。したがって、ここにおいて記載される異種移植片モデルのような臨床前動物モデルでは、交差反応して、ｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦをともにブロックすることができる抗体が、その有効性を研究するために必要である。
また、マウス（Ｌｅｗｉｓ）肺上皮癌（ＬＬ２）細胞をヌードマウスモデルに用いて、Ｇ６−２３の抑制効果を試験した。約１０６個のＬＬ２細胞を含むマトリゲル製剤を５週齢のベージュヌードマウスの脇腹に皮下投与した。そして、６匹のマウスの１群に１０ｍｇ／ｋｇのＧ６−２３を週２回、１９日間腹腔内投与した。また、他の対照剤（すなわちｍＦｌｔ（１−３）−ＩｇＧ、ｒａｇ−１０）を、６匹マウスの群に処置した。図１３に示すように、Ｇ６−２３は、ｍＶＥＧＦ並びに他の血管形成因子ｍＰｌＧＦやｍＶＥＧＦ−Ｂをブロックする際に多分化能を示すことが知られているｍＦｌｔ（１−３）−ＩｇＧと同等の薬理学的効果で腫瘍成長率を有意に減少させた。また、生理活性Ｇ６−２３の血清レベルも測定した。そのレベル（６２−１２１μｇ／ｍｌ）は抗ＶＥＧＦ抗体を治療学的に中和するための予想される範囲内で良好であることが示された。
【０２０１】
また、ＨＭ−７細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関）を用いてヌードマウスの腫瘍成長阻害を研究した。本研究で用いるＧ６  ＩｇＧ抗体、Ｇ６−３１  ＩｇＧ抗体、アバスチンＴＭ抗体、Ｙ０３１７  ＩｇＧ抗体を発現させ、ＣＨＯ細胞から精製した。ＨＭ−７細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１％グルタミンを添加したＦ１２：ＤＭＥＭ培地にて培養中に維持した細胞を５％ＣＯ２、３７℃で集密になるまで成長させ、回収し、計数して、洗浄し、１ｍｌ当たり２５×１０６細胞濃度で無菌のマトリゲルに再懸濁した。異種移植片を、４〜６週間齢の雌ベージュヌードＸＩＤマウスの背面の脇腹に５×１０６個のＨＭ−７培養細胞を注入することによって成長させた。４８時間後、腫瘍は全てのマウスにおいて触知でき、集団をランダムに選別し（ｎ＝１０）、０日目の対照群とした。残りのマウスは２３群に分け、週２回異なる抗ＶＥＧＦ抗体を注射した。調べた処置群は以下の通りである：Ａ群（ｎ＝１０×１）：対照抗体ＭＡＢ（抗サワギク抗体）、高用量（５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、０．１ｍｌ腹膜内投与マウス。Ｂ群（ｎ＝１０×５）：Ｇ６  ＩｇＧ抗体、同じ用量（０．１、０．２５、０．５、２又は５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、０．１ｍｌ腹膜内投与マウス。Ｃ群（ｎ＝１０×５）：Ｙ０３１７  ＩｇＧ抗体、同じ用量（０．１、０．２５、０．５、２又は５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、０．１ｍｌ腹膜内投与マウス。Ｄ群（ｎ＝１０×５）：アバスチンＴＭ抗体、同じ用量（０．１、０．２５、０．５、２又は５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、０．１ｍ腹膜内投与マウス。Ｅ群（ｎ＝１０×５）：Ｇ６−３１  ＩｇＧ抗体、同じ用量（０．１、０．２５、０．５、２又は５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、０．１ｍｌ腹膜内投与マウス。マウス（ｎ＝１０対照および処置動物）を注射開始後、第４、７、１１、１４、１７および２１日目に屠殺し、腫瘍を切除して、計量した。
Ｇ６、Ｇ６−３１、Ｙ０３１７およびアバスチンＴＭ抗体を投与した場合（ｐ＜０．５）（図３３Ａ−Ｅ）、腫瘍成長の有意な抑制があったことが示された。抗ＶＥＧＦ抗体処置マウスから切除した組織は、対照マウスから切除した腫瘍と比較して、サイズが小さく、血管新生が少なかった。上記のように、アバスチンＴＭ抗体およびＹ０３１７抗体と異なり、Ｇ６およびＧ６−２３抗体は、マウスモデルにおけるヒト結腸直腸腫瘍移植片で上方制御されうるマウス間質ＶＥＧＦを含むヒトＶＥＧＦおよびマウスＶＥＧＦに結合することができる。類似のエピトープに結合するＧ６およびＧ６−３１抗体の活性を直接比較すると、ほとんどのデータ採取点で、Ｇ６−３１抗体であるＶＥＧＦ−Ａにより高い親和性を有する抗体が、腫瘍成長を阻害する性質を亢進したことが示された。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】ファージディスプレイに有用な様々なタイプの抗体断片を概略的に示す。
【図２】鋳型抗体ｈ４Ｄ５及び４つの選択した新規の合成抗体（配列番号９２１−９２８）の重鎖ＣＤＲ内の残基変異を比較する。また、４つの抗体のＶＥＧＦ結合を比較する。
【図３】新規の抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦ結合をブロックするＶＥＧＦレセプター（Ｆｌｔ１−ｄ２及びＫＤＲ）の能力を表す。抗ＶＥＧＦ変異体であるＹ０９５９Ａを対照として用いた。
【図４】Ｇ６抗体がｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦの両方には特異的に結合するが、ＶＥＧＦ関連抗原には結合しないことを示す。
【図５】Ｇ６がＫＤＲレセプターに対するｈＶＥＧＦとｍＶＥＧＦ両方の結合を効率的にブロックすることができることを示す。Ｆａｂ−１２及びＹ０３１７を対照として用いた。
【図６】ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖についてのＧ６の効果を示す。
【図７】高親和性抗ＶＥＧＦ抗体の生成工程と、様々な親和性を改良したＧ６変異体（配列番号４４−８４）に関する残基と結合親和性の表を示す。
【図８】Ｇ６、Ｇ６−２３及びＦａｂ−１２のＶＥＧＦ結合を比較する。ｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦに対する会合速度（結合速度）を時間の経過につれて測定した；算出したＫｏｎ、Ｋｏｆｆ及びＫｄを表に示す。
【図９】Ｇ６とさらに改良したＧ６−２３の変異体のＶＥＧＦ結合速度を比較した。
【図１０】新生仔マウスの体重と生存率に対するＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｇ６−２３及びＦｌｔ１−３Ｆｃ）の効果を示す。
【図１１】異種移植したヒト腫瘍細胞（ＫＭ１２細胞及びＳＷ４８０細胞）によるヌードマウスでの腫瘍の成長に対するＧ６−２３の効果を示す。処置日数に対する腫瘍容積として測定した。
【図１２】Ｇ６−２３の有無の下でのＫＭ１２異種移植性マウスでのＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦとｍＶＥＧＦの両方）発現を示す。
【図１３】異種移植したマウス腫瘍（ＬＬ２）によるヌードマウスでの腫瘍の成長に対するＶＥＧＦアンタゴニスト（Ｇ６−２３及びＦｌｔ１−３Ｆｃ）の効果を示す。処置日数に対する腫瘍容積として測定した。
【図１４Ａ】Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングコドンのために設定したコドンを示す。各スキャンについて、Ｇ６及びＧ６−２３Ｆａｂのアラニンスキャンでは野生型アミノ酸及びアラニン（ｍ１）を、又はホモログスキャンでは類似のアミノ酸（ｍ４）をコードするように重鎖の縮重ショットガンコドンを設定した。ショットガンコドンをＩＵＢコードで表す（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。天然の遺伝子コードのためにいくつかの残基でより多くの置換（ｍ２、ｍ３及びｍ５）が起こった。野生型アラニンの場合、アラニンとグリシンをコードするようにショットガンコドンを設定した。ＣＤＲの各残基をアミノ酸の一文字表記で表し、その後ろにKabatら, 1987の図式に従ってその位置を示す数字を示した。Ｇ６とＧ６−２３の配列が異なる位置を二文字で示した。例えば、Ｑ８９ＫはＧ６ではＧｌｎをＧ６−２３ではＬｙｓである位置８９であることを表す。星印（＊）はアラニンスキャンとホモログスキャンのコドンが共通の置換をコードしていることを表す。
【図１４Ｂ】Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングコドンのために設定したコドンを示す。各スキャンについて、Ｇ６及びＧ６−２３Ｆａｂのアラニンスキャンでは野生型アミノ酸及びアラニン（ｍ１）を、又はホモログスキャンでは類似のアミノ酸（ｍ４）をコードするように軽鎖の縮重ショットガンコドンを設定した。ショットガンコドンをＩＵＢコードで表す（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）。天然の遺伝子コードのためにいくつかの残基でより多くの置換（ｍ２、ｍ３及びｍ５）が起こった。野生型アラニンの場合、アラニンとグリシンをコードするようにショットガンコドンを設定した。ＣＤＲの各残基をアミノ酸の一文字表記で表し、その後ろにKabatら, 1987の図式に従ってその位置を示す数字を示した。Ｇ６とＧ６−２３の配列が異なる位置を二文字で示した。例えば、Ｑ８９ＫはＧ６ではＧｌｎをＧ６−２３ではＬｙｓである位置８９であることを表す。星印（＊）はアラニンスキャンとホモログスキャンのコドンが共通の置換をコードしていることを表す。
【図１５】Ｇ６及びＧ６−２３のショットガンスキャニングライブラリの構築に関する情報を示す。ショットガンスキャニングライブラリによって、Ｇ６及びＧ６−２３の重鎖（ｈｃ）又は軽鎖（ｌｃ）上の示す残基のコドンをアラニン又はホモログの何れかのスキャンショットガンコドンに変異させた（図１４Ａ及びＢ）。実施例１に示すように突然変異原性オリゴヌクレオチドを用いて全部で８個のライブラリを構築した。各ライブラリの理論上の多様性、突然変異原性オリゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸組み合わせの計数は実際に構築したライブラリの多様性の少なくとも１００倍を超えていた。
【図１６Ａ】Ｇ６の重鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６の重鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。標的選別の中であまり変異は見られず、そのｗｔ／ｍｕｔ比についてより低い限定のみを定義することができた；ゆえに、Ｆｗｔ／ｍｕｔ値をより大きな信号として表された。
【図１６Ｂ】Ｇ６−２３の重鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６−２３の重鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６−２３の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。標的選別の中であまり変異は見られず、そのｗｔ／ｍｕｔ比についてより低い限定のみを定義することができた；ゆえに、Ｆｗｔ／ｍｕｔ値をより大きな信号として表された。
【図１７Ａ】Ｇ６の軽鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６の軽鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。
【図１７Ｂ】Ｇ６−２３の軽鎖ショットガンスキャンの結果を示す。ｈＶＥＧＦ（標的選別）又は抗ｇＤタグ抗体（ディスプレイ選別）の何れかに対する結合選別の後に単離したアラニンスキャンライブラリ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）又はホモログスキャンライブラリ（ｍ４及びｍ５）の何れかからの機能的クローンの配列からｗｔ／ｍｕｔ比を算出することによって、Ｇ６−２３の軽鎖ＣＤＲ残基の各変異（図１４Ａ及びＢ）の効果を評価した。ｈＶＥＧＦに対するＧ６−２３の結合親和性に対する各変異の効果を量的に推定するために、各変異部位での機能的割合（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を標的選別のｗｔ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別の比で割ることによって求めた。有害な効果を１．０以上のＦｗｔ／ｍｕｔ値で表し、著しく有害な効果（Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞１０）となる変異を太字で示した。
【図１８】ショットガンスキャニングの機能的値（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）にてＦａｂＧ６及びＧ６−２３の点突然変異のｈＶＥＧＦへの相対的結合活性の比較である。各変異タンパク質のｈＶＥＧＦへの相対的結合活性を、各点突然変異によるｈＶＥＧＦ結合活性の倍数的減少として測定したＩＣ５０、ｍｕｔ／ＩＣ５０、ｗｔ比にて評価した。Ｇ６及びＧ６−２３のＩＣ５０、ｗｔ値はそれぞれ２．５ｎＭ及び２０ｐＭであった。標準偏差を示していない比は偏差が±５％であると推測される。このアッセイに用いたｈＶＥＧＦの最も高い濃度（Ｇ６及びＧ６−２３に対してそれぞれ１μＭ及び０．１μＭ）では阻害が見られなかったので、顕著な有害変異の比は正確に定量できず、ｈＶＥＧＦ結合での倍数減少についてより低い限定（Ｇ６及びＧ６−２３に対してそれぞれ＞４００及び＞５０００）として示されたのみであった。ショットガンスキャニングの機能的値（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）は図１６及び図１７から求めた。両方の突然変異原性スキャニングのＤＤＧｍｕｔ−ｗｔ値は、図２２Ａ及びＢの説明文に示す式を用いて算出した。
【図１９】異なる型の抗ｈＶＥＧＦ抗体又はｈＶＥＧＦレセプターに結合するファージ由来ｈＶＥＧＦ１−１０９単一アラニン変異体についてのファージＥＬＩＳＡによって測定した相対的結合親和性を示す（それぞれ、Ｇ６、Ｇ６−２３とＢ２０−４Ｆａｂ、モノクローナル抗体Ａ４．６．１とレセプターＦｌｔ−１（１−３）、Ｆｌｔ−１Ｄ２とＫＤＲ−Ｉｇ）。抗ｈＶＥＧＦ抗体及びｈＶＥＧＦレセプターの結合親和性に対するｈＶＥＧＦのファージ由来単一アラニン変異体の効果を、ファージＥＬＩＳＡからＩＣ５０,ａｌａ／ＩＤ５０,ｗｔとして算出した相対的ＩＣ５０値として評価した。結合親和性の減少と１０以上の著しい相対的ＩＣ５０値を有する任意の変異体を現す１．０以上の数は白抜きの太字で示した。Ｇ６及びＧ６−２３のＩＣ５０,ｗｔ値はそれぞれ２．５ｎＭ及び２０ｐＭである。標準偏差を示していない比は偏差が±５％であると推測される。ファージＥＬＩＳＡは測定可能なシグナルを生成するためにそのタンパク質標的への変異型ファジミドの実質的結合を必要とするため、非結合体（ＮＢ）は正確に定量することができなかったが、非常に結合親和性が低減されたことが理解されるであろう（１０００ＩＣ５０値より大きい）。星印（＊）は、Ｆａｂ−１２及びｈＶＥＧＦレセプターに対するｈＶＥＧＦのアラニンスキャニングデータがMuller ら, (1997) PNAS USA 94: 7192-7197及びLiら., (2000) Cancer Res. 57:4593-4599からのものであることを表す。
【図２０】ＦａｂＧ６及びＧ６−２３の重鎖ショットガンスキャンの結果を示す。Ｆｗｔ／ｍｕｔ値は、ｈＶＥＧＦへの結合親和性に対するＦａｂＧ６及びＧ６−２３の重鎖ＣＤＲアラニン置換（黒線）又はホモログ置換（白線）の効果を測定したものである。（Ａ）ＦａｂＧ６重鎖のショットガンスキャンデータは図１６Ａから、（Ｂ）ＦａｂＧ６−２３重鎖のショットガンスキャンデータは図１６Ｂからのものである。
【図２１】ＦａｂＧ６及びＧ６−２３の軽鎖ショットガンスキャンの結果を示す。Ｆｗｔ／ｍｕｔ値は、ｈＶＥＧＦへの結合親和性に対するＦａｂＧ６及びＧ６−２３の軽鎖ＣＤＲアラニン置換（黒線）又はホモログ置換（白線）の効果を測定したものである。（Ａ）ＦａｂＧ６軽鎖のショットガンスキャンデータは図１７Ａから、（Ｂ）ＦａｂＧ６−２３軽鎖のショットガンスキャンデータは図１７Ｂからのものである。
【図２２】ＦａｂＧ６及びＧ６−２３ショットガンスキャンのＤＤＧＡｌａ−ｗｔ値を示す。ｈＶＥＧＦの結合親和性に対する（Ａ）ＦａｂＧ６及び（Ｂ）ＦａｂＧ６−２３のＣＤＲアラニン置換の効果を測定したＤＤＧＡｌａ−ｗｔ値は、既に記載のように(Weissら., (2000) PNAS USA 97:8950-8954)、生物物理学的な式を用いて算出し(DDGAla-wt = RTln(Ka,wt/Ka,Ala) = RTln(Fwt/Ala))、Ｆｗｔ／Ａｌａ値は図１６及び１７から得た。
【図２３】ＢＩＡコアチップに固定したｈＶＥＧＦに２５℃の１００ｎＭのＦａｂを注入したsensogramの結果を示す。ＣＤＲ−Ｈ２の位置５８でのアラニン置換によるＧ６変異体の結合速度の改善が実証された。また、ＣＤＲ-Ｈ２の位置５１でのバリン置換を有する変異体についても付加的な結合速度の改善が見られた。この図はGraphPad Prism 4.0 バージョンソフトウェア(http://www.graphpad .com)を用いて作成した。
【図２４】Ｇ６Ｆａｂ軽鎖とＧ６Ｆａｂ重鎖それぞれのアミノ酸配列（配列番号２８−２９）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ及びＣＤＲ３−ＬＣ  又はＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ又はＣＤＲ３−ＨＣの残基を示す。
【図２５】Ｇ６−２３Ｆａｂ軽鎖とＧ６−２３Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列、並びにＧ６−３１及びＧ６−８のＦａｂ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０−３３）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲの位置を示す。
【図２６】Ｇ６−２３．１及びＧ６−２３．２のＦａｂ軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号３４−３６）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲの位置を示す。
【図２７】Ｂ２０Ｆａｂの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号３７−３８）を示す。下線は、カバット番号付けに従ったＣＤＲの位置を示す。
【図２８】Ｂ２０ベースのライブラリ由来のＶＥＧＦの高親和性結合体の概要を示す（配列番号８５−１４０）。
【図２９】Ｂ２０−４及びＢ２０−４．１のＦａｂ軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号３９−４１）を示す。
【図３０】軽鎖ランダム化による抗ｍＶＥＧＦ Ｆａｂ Ｇ６の親和性改善を示す。（Ａ）ｍＶＥＧＦを固定したＢＩＡコアチップに３７℃の５００ｎＭのＦａｂを注入したセンソグラム(sensogram)により解離速度と結合速度の改良が実証された；（Ｂ）蛍光強度の減少率としてＧ６と変異型ＦａｂとｍＶＥＧＦ間の複合体形成の観察速度（Kobs, s-1）を用いたｍＶＥＧＦ（ｎＭ）の濃度に対してプロットし、pseudo-first-order分析に基づく勾配が結合速度（×１０９  Ｍ−１  ｓ−１）である。
【図３１】Ｇ６がＦｌｔ−１レセプターに対するｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦの結合を効果的にブロックすることができることを示す。Ｆａｂ−１２及びＹ０３１７を対照として用いた。
【図３２】ＢＩＡコアを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法又は競合的ＥＬＩＳＡを用いた可溶性結合アッセイ又はＦａｂ−１２及びＹ０３１７を比較として用いた蛍光消光を用いて、２５℃及び３７℃でのＦａｂタンパク質−ヒトＶＥＧＦ又はＦａｂタンパク質−マウスＶＥＧＦの相互作用についての結合速度、解離速度、Ｋｄ値及びＩＣ５０値を示す。「ＮＢ］は非結合体を表す。「ＮＤ」は検出されないことを表す。
【図３３Ａ】０．１ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｂ】０．２５ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｃ】０．５ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｄ】２ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３３Ｅ】５ｍｇ／ｋｇ用量で週２回のＧ６抗体Ｇ６−３１抗体、Ｙ０３１７抗体及びアバスチンＴＭ抗体投与後のヌードマウスでのＨＭ７腫瘍成長の阻害を示す。抗ブタクサ抗体を対照として用いた。
【図３４】配列及びＩＣ５０分析に基づく変異体Ｇ６の（Ａ）軽鎖及び（Ｂ）重鎖の変異体の概要を示す（配列番号３６１−４８８）。野生型のＩＣ５０は異なる実験で得られた値の平均を表す。変異したアミノ酸位置を太字で示す。野生型のＧ６と異なる残基を白抜きで示す。残基は、一文字アミノ酸コードとKabatら, 1987の図式に従った位置を示す数字で示す。
【図３５】配列及びＩＣ５０分析に基づく変異体Ｇ６−２３の（Ａ）軽鎖及び（Ｂ）重鎖の変異体の概要を示す（配列番号１４１−２７２）。野生型のＩＣ５０は異なる実験で得られた値の平均を表す。変異したアミノ酸位置を太字で示す。野生型のＧ６と異なる残基を白抜きで示す。残基は、一文字アミノ酸コードとKabatら, 1987の図式に従った位置を示す数字で示す。
【図３６】ＹＡＤＳ−１、ＹＡＤＳ−２及びＹＡＤＳ−３抗体と他のクローンのアミノ酸配列の一部を示す（配列番号４８９−５６０）。ＹＡＤＳ−ＩＩライブラリから選択した３つのｈＶＥＧＦ結合体の配列を表す。ライブラリ内でランダム化されていない残基を灰色で示す。
【図３７】一群のＹＡＤＳ系列抗体のアミノ酸配列を示す（配列番号２７３−３３２）。ｈＶＥＧＦに対するライブラリＹＡＤＳ−Ａの分類から得た特定のクローンの配列を表す。ライブラリ内でランダム化されていない残基を灰色で示す。
【図３８】一群のＹＡＤＳ系列抗体のアミノ酸配列を示す（配列番号３３３−３６０）。ｈＶＥＧＦに対するライブラリＹＡＤＳ−Ｂの分類から得た特定のクローンの配列を表す。ライブラリ内でランダム化されていない残基を灰色で示す。
【図３９】ＹＡＤＳ２及びＹＡＤＳ３抗体のＦａｂ配列（配列番号１９−２４）を示す。太字の部分は可変領域の残基を表す。下線部分はＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２又はＣＤＲ−Ｈ３のおおよその残基を表す。
【図４０】ＹＡＤＳ２抗体のＮＮＫ変異体（配列番号７２３−７９４）を示す。「ｘ」は停止コドン又は読取り不可能な配列を表す。
【図４１】一群のＹＳ系列抗体のアミノ酸配列を示す（配列番号７９５−９１４）。ライブラリＹＳ−Ａ及びＹＳ−Ｂから得た結合体の配列を表す。
【図４２】ＹＳライブラリの抗ＶＥＧＦ抗体のＣＤＲ配列を示す（配列番号５６１−７２２）。ライブラリＢからクローン１−５２が選別され、ライブラリＡからクローン５３−６３が選別された。左から右へ、カバット番号付けに従って、ＣＤＲ-Ｌ３の段落１−５はそれぞれ位置９１、９２、９３、９４及び９６を表す；ＣＤＲ-Ｈ１の段落１−５は位置２８、３０、３１、３２及び３３を表す；ＣＤＲ-Ｈ２の段落１−６は位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８を表す；ＣＤＲ-Ｈ３の段落１−１５は９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００ａ−ｉを表す。
【図４３】ＹＳ１ Ｆａｂの配列を表す。太字の部分は可変領域の残基を表す（配列番号４２−４３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年11月2日(2010.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスＶＥＧＦ及びヒトＶＥＧＦに対して他より１０倍以内のＫｄ値で結合することができ、ＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合を阻害する抗体。
【外国語明細書】
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