(57)【要約】【課題】ブルーベリー苗木のＰＡＣ含有量を露地栽培の成木に近い量に増やし、苗木の周年収穫を可能にする栽培方法を提供する。【解決手段】ブルーベリーの苗木の栽培には、マイクロプロパゲーションにより増殖された多芽体由来のシュートから挿し穂を採取する。採取された挿し穂をセルトレーに挿し木し、人工気象機内の高湿度雰囲気、蛍光灯及び／又はＬＥＤで光照射下し挿し穂から発根を誘導し、漸次湿度を常湿まで低減して発根後の苗木を育苗する。育苗した苗木を実質的閉鎖環境内で蛍光灯及び／又はＬＥＤで光照射下し生育させる。さらに本発明では、生育された苗木に蛍光灯及び／又はＬＥＤで光照射下しＰＡＣ含量を増やすことにより高含量のＰＡＣを含む苗木を生産する。これにより、露地栽培のブルーベリー成木の葉におけるＰＡＣ含量に近い高含量のＰＡＣを含む苗木での周年複数回収穫を可能にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルーベリーの苗木に、ＰＡＣ増量照射として蛍光灯及び／又はＬＥＤからなる光照射し、苗木に含まれるＰＡＣ含量を増やすブルーベリーの栽培方法。
【請求項２】
苗木がマイクロプロパゲーションにより増殖された多芽体由来である請求項１の方法。
【請求項３】
下記段階からなる請求項１又は２の方法。
（１）多芽体のシュートから挿し穂を採取し、採取された挿し穂をセルトレーに挿し木し、人工気象機内の高湿度雰囲気、光照射下で挿し穂から発根を誘導し、漸次湿度を常湿まで低減して発根後の苗木を順化する育苗段階
（２）順化した苗木を実質的な閉鎖環境内、光照射下で生育させる生育段階
（３）生育された苗木のＰＡＣ含量を光照射下で増やすＰＡＣ増量段階
【請求項４】
育苗段階における光照射が、蛍光灯及び／又はＬＥＤによる間欠照射であり、照射時の照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、該間欠照射が明期と暗期の等時間の少なくとも１回の繰り返しであり、照射期間が３０〜６０日である請求項３の方法。
【請求項５】
生育段階での光照射が蛍光灯及び／又はＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。照射期間が少なくとも２０日間である請求項３の方法。
【請求項６】
ＰＡＣ増量段階での光照射が蛍光灯及び／又はＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が６０〜３００μｍｏｌ・ｍ・−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間である請求項３の方法。
【請求項７】
ＰＡＣ増量段階での光照射がＬＥＤの単独であり、該ＬＥＤが青色もしくは赤色の単独又はそれらの組み合わせである請求項６の方法。
【請求項８】
ＬＥＤの青色照射が、照射強度１００〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日である請求項７の方法。
【請求項９】
ＬＥＤの赤色照射が、照射強度６０〜９０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日である請求項７の方法。
【請求項１０】
育苗段階での光照射が蛍光灯による１２時間毎の間欠照射であり、照射強度が３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が３０〜６０日間の照射であり、生育段階での光照射が蛍光灯による連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が２０〜３０日間の照射であり、ＰＡＣ増量段階での光照射が蛍光灯及び赤色ＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が６０〜２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間の照射である請求項３の方法。
【請求項１１】
育苗段階での光照射が蛍光灯による１２時間毎の間欠照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が３０〜６０日間の照射であり、生育段階での光照射が蛍光灯による連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が２０〜３０日間の照射であり、ＰＡＣ増量段階での光照射が、蛍光灯及び青色ＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が１００〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間の照射である請求項３の方法。
【請求項１２】
ブルーベリーがラビットアイブルーベリーである請求項１〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
ラビットアイブルーベリーが「くにさと３５号」である請求項１２の方法。
【請求項１４】
遺伝子Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ、及びＡＮＲからなる群から選ばれた少なくともひとつの発現の強弱を指標として、光照射条件を選択する請求項１の方法。
【請求項１５】
ＰＡＣ増量した枝葉を収穫した苗木を生育段階に戻し、再び生育した枝葉のＰＡＣ含有量を増やし収穫を繰り返すブルーベリーの栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ブルーベリーの栽培方法、特にマイクロプロパゲーションにより増殖したブルーベリー苗木のプロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」と言う。）含量を増やすブルーベリーの栽培方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ブルーベリー葉の生理活性に関しては、特許文献１、２、３、４により知られている。例えば、特許文献１は、ブルーベリー葉が肝ガン細胞および白血病細胞の増殖を抑制し、ガンの改善に有効であることを開示している。特許文献２は、ブルーベリー葉の加工処理物がＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と言う。）の産生を抑制することを開示している。非特許文献１によれば、このブルーベリー葉の抗ＨＣＶ活性有効成分はＰＡＣであることが記載されている。特許文献３では、ブルーベリー葉の経口摂取により前ガン病変から肝ガンへの進展を抑制することが開示されている。同様に、特許文献４では、ブルーベリー葉の経口摂取により肝臓への脂肪蓄積も抑制することが開示されている。これらのブルーベリー葉の生理活性成分のうち、少なくとも抗ＨＣＶ活性成分がＰＡＣであることは、非特許文献１に開示されている。【０００３】  ブルーベリーのマイクロプロパゲーションに関しては、特許文献５および６が知られている。しかし、特許文献５および６所載のマイクロプロパゲーションは、単に露地に移植する苗木を増やすための技術であって、比較的高含量のＰＡＣを含む苗木の生産、収穫を目指す栽培方法に関する示唆はない。【０００４】  例えば、特許文献５のマイクロプロバゲーション栽培法では、ブルーベリーの腋芽（葉腋に分化している芽）を植物成長調節物質（以下、「ＰＧＲ」という。）添加培地で無菌培養して多芽体を誘導する。次いで、同一組成培地に分割移植して、無菌下増殖を繰り返し、増殖した多芽体をＰＧＲ無添加培地に移植して、無菌下で芽の伸張を誘導する。この伸張した芽（シュート）から挿し穂をとり、セルトレーに挿し木して、非無菌下で発根誘導する。発根後は、引き続き培養室内環境で順化し、さらに外気環境で順化している。また、特許文献６のマイクロプロバゲーション栽培方法では、スノキ属植物、例えばブルーベリーの茎頂点組織片をＰＧＲ添加培地に着床し、密閉状態で組織培養して多芽体を得る。得られた多芽体を気密状態から開放状態へと容器の換気を制御しながら、無菌または減菌下で増殖と健苗化を行う。健苗化された多芽体シュートから、一定長の挿し穂を採取、セルトレーに移植して、培養室環境で発根を誘導する。発根した苗木は、外気環境で本格的に順化する。特許文献６の特徴は、多芽体増殖工程の後段で、無菌または減菌下開放環境に移行し、健苗化を行う点にあり、これによって、発根誘導工程までの効率化と健全な苗の生育をはかり、発根、順化工程への移行を容易にしている。【０００５】  一方、光の強制照射によって、ポリフェノールやアントシアニンを増やすことに関しては、ブルーベリーとは異なる植物で、非特許文献２及び非特許文献３が知られている。非特許文献２では、ブロッコリースプラウト中のポリフェノール含量に及ぼすＬＥＤ照射の影響が記載されている。また、非特許文献３によれば、幼植物期のアカジソにおけるアントシアニン生成向上への青色ＬＥＤと蛍光灯の同時照射効果も知られている。しかし、これらの文献ではＰＡＣの増量に関しての言及は見られない。また、非特許文献２及び３で対象とする植物は、本発明の栽培方法が対象とするブルーベリーとは、科レベルで異なる���物であり、これらの非特許文献に記載の方法をブルーベリーに適用したとしても、本願発明が提供する、ＰＡＣを選択的に増加させる栽培方法を見出すことは容易ではない。【０００６】  植物において、ＰＡＣ又はその前駆体の産生に関与する種々の遺伝子、フラバノン３−ハイドロキシラーゼ（以下Ｆ３Ｈと言う。）、ロイコアントシアニジンオキシゲナーセ（以下ＬＤＯＸと言う。）、ジハイドロフラボノール４−レダクターゼ（以下ＤＦＲと言う。）、ロイコアントシアニジンリダクターゼ（以下ＬＡＲと言う。）及びアントシアニジンリダクターゼ（以下ＡＮＲと言う。）等も、非特許文献４に開示されている。しかし、ブルーベリーの光照射による人工栽培において、光照射と葉のＰＡＣ産生に関与する遺伝子についての言及はない。尚、本発明者の知見では、ＬＡＲについて遺伝子学的に異なる２種のタイプ、ＬＡＲ１及びＬＡＲ２が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２２９２９
【特許文献２】特開２００７−１１９３９８
【特許文献３】特開２００８−１７４４７９
【特許文献４】特開２００８−１８９６３１
【特許文献５】特開２００３−３０４７６５
【特許文献６】特開２００８−２２０２４２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ  Ｌｅａｖｅｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４：２１１６５−２１１７６（２００９）
【非特許文献２】前田智雄ら「ブロッコリースプラウトの生育およびポリフェノール含量に及ぼす補光光質の影響」植物環境工学２０［２］８３−８９（２００８）
【非特許文献３】岩井万祐子ら「幼植物期のアカジソにおけるアントシアニン生成向上への青色ＬＥＤと蛍光灯の同時照射効果」植物環境工学２１［２］５１−５８（２００９）
【非特許文献４】Ｊｏｃｈｅｎ  Ｂｏｇｓ．ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶｖＭＹＢＰＡ１  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｆｒｕｉｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ  ２００７，Ｖｏｌ．１４３，ｐｐ．１３４７−１３６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明は、マイクロプロパゲーションによって増殖したブルーベリー苗木のＰＡＣ含量を増やすブルーベリーの栽培方法を提供することを目的としている。【００１０】  また本発明は、露地栽培の成木の葉に近いＰＡＣ含有量を苗木段階で得ることにより、早期収穫・周年複数回収穫を可能にしたブルーベリーの栽培方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意研究を重ねた結果、ブルーベリー苗木に特定条件下で光を照射することにより、露地栽培のブルーベリー成木の葉におけるＰＡＣ含量に近い高含量のＰＡＣを含む苗木の生産ができることを見出し、本発明に至った。【００１２】    前記知見に基づく本発明は、以下の態様を含むことを特徴としている。
項１：ブルーベリーの苗木に、ＰＡＣ増量照射として蛍光灯及び／又はＬＥＤからなる光照射し、苗木に含まれるＰＡＣ含量を増やすブルーベリーの栽培方法。
項２：苗木がマイクロプロパゲーションにより増殖された多芽体由来である項１の方法。
項３：下記段階からなる項１又は２の方法。
（１）多芽体のシュートから挿し穂を採取し、採取された挿し穂をセルトレーに挿し木し、人工気象機内の高湿度雰囲気、光照射下で挿し穂から発根を誘導し、漸次湿度を常湿まで低減して発根後の苗木を順化する育苗段階
（２）順化した苗木を実質的な閉鎖環境内、光照射下で生育させる生育段階
（３）生育された苗木のＰＡＣ含量を光照射下で増やすＰＡＣ増量段階
項４：育苗段階における光照射が、蛍光灯及び／又はＬＥＤによる間欠照射であり、照射時の照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、該間欠照射が明期と暗期の等時間の少なくとも１回の繰り返しであり、照射期間が３０〜６０日である項３の方法。
項５：生育段階での光照射が蛍光灯及び／又はＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。照射期間が少なくとも２０日間である項３の方法。
項６：ＰＡＣ増量段階での光照射が蛍光灯及び／又はＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が６０〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間である項３の方法。
項７：ＰＡＣ増量段階での光照射がＬＥＤの単独であり、該ＬＥＤが青色もしくは赤色の単独又はそれらの組み合わせである項６の方法。
項８：ＬＥＤの青色照射が、照射強度１００〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日である項７の方法。
項９：ＬＥＤの赤色照射が、照射強度６０〜９０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日である項７の方法。
項１０：育苗段階での光照射が蛍光灯による１２時間毎の間欠照射であり、照射強度が３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が３０〜６０日間の照射であり、生育段階での光照射が蛍光灯による連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が２０〜３０日間の照射であり、ＰＡＣ増量段階での光照射が蛍光灯及び赤色ＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が６０〜２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間の照射である項３の方法。
項１１：育苗段階での光照射が蛍光灯による１２時間毎の間欠照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が３０〜６０日間の照射であり、生育段階での光照射が蛍光灯による連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が２０〜３０日間の照射であり、ＰＡＣ増量段階での光照射が、蛍光灯及び青色ＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が１００〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間の照射である項３の方法。
項１２：ブルーベリーがラビットアイブルーベリーである項１〜１１のいずれかの方法。
項１３：ラビットアイブルーベリーが「くにさと３５号」である項１２の方法。
項１４：遺伝子Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ、及びＡＮＲからなる群から選ばれた少なくともひとつの発現の強弱を指標として、光照射条件を選択する請求項１の方法。
項１５：ＰＡＣ増量した枝葉を収穫した苗木を生育段階に戻し、再び生育した枝葉のＰＡＣ含有量を増やし収穫を繰り返すブルーベリーの栽培方法。【００１３】  以下本発明において下記用語は、以下の意味で用いる。
１．育苗段階：増殖された多芽体から採取した挿し穂を培養土に挿し木して、発根を誘導し、発根した苗木を順化する段階である。
２．生育段階：育苗した苗木に蛍光灯および／またはＬＥＤを照射し、苗木に生育する段階である。
３．ＰＡＣ増量段階：生育した苗木に蛍光灯および／またはＬＥＤを照射し、苗木のＰＡＣ含有量を増やす段階である。
【発明の効果】
【００１４】  本発明によれば、下記の効果または利点がある。
（１）光照射、特にＰＡＣ増量照射により、図７（Ｂ）と図９（Ｂ）に示すように露地栽培の成木の葉に近い高ＰＡＣ含量のブルーベリーの苗木が得られる。
（２）マイクロプロパゲーションで増殖された苗木を使用して、人工栽培することにより、２〜３ヵ月の短周期で、高ＰＡＣ含有苗木を収穫できる。
（３）人工的な閉鎖環境での栽培により、天候等に支配されないので、安定した周年収穫が可能となる。
（４）実質的な閉鎖環境での栽培により、露地栽培とは異なり、収穫したブルーベリー苗木に残留農薬や病原菌による汚染がない。
（５）また、ＰＡＣの産生に関与する特定の遺伝子発現の強弱を指標として、好適な光照射条件を容易に設計できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】  本発明のブルーベリーの栽培方法を示す流れ図である。
【図２】  セルトレーに移植直後のブルーベリー苗木を示す写真である。
【図３】  育苗照射により発根したブルーベリー苗木を示す写真である。
【図４】  ＰＡＣ増量照射直前のブルーベリー苗木を示す写真である。
【図５】  人工気象機におけるＰＡＣ増量照射を示す写真である。
【図６】  収穫直前のブルーベリー苗木を示す写真である。
【図７】  一定の光照射条件下で栽培したブルーベリー苗木及び露地栽培のブルーベリー成木中の生理活性成分の測定結果を示すグラフで、（Ａ）総ポリフェノール含量の測定結果、（Ｂ）総ＰＡＣ含量の測定結果である。
【図８】  一定の光照射条件下で栽培したブルーベリー苗木中の総アントシアニン含量の測定結果を示すグラフである。
【図９】  図７及び図８とは異なる光照射条件下で栽培したブルーベリー苗木及び露地栽培のブルーベリー成木中の生理活性成分の測定結果を示すグラフで、（Ａ）総ポリフェノール含量の測定結果、（Ｂ）総ＰＡＣ含量の測定結果である。
【図１０】  図７及び図８とは異なる光照射条件下で栽培したブルーベリー苗木中の総アントシアニン含量の測定結果を示すグラフである。
【図１１】  図７（Ｂ）と図８のデータを経時的にプロットしたグラフである。
【図１２】  ＰＡＣ又はその前駆体を含むＰＡＣ産生経路に関与する代表的な遺伝子を示すブロック図である。
【図１３】  一定の光照射条件下で栽培したブルーベリー葉における図１２に示す遺伝子発現の強弱の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】    本発明の栽培方法が対象とする植物はブルーベリーである。ブルーベリーは、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）植物である。スノキ属植物は、さらに１０の節に分類される。このうち、果実が利用されているのは、ビルベリー、クランベリー、コケモモ、及びブルーベリー等を含むサイアノコカスセツ節、ミルティルス節、オキゾコカスセツ節、ビテスーイディア節、バクシニウム節の４つの節である。
ブルーベリーは、このスノキ属のサイアノコカス節（Ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属するアメリカ原産の落葉性もしくは常緑性の低木または半高木果樹である。ブルーベリーには多くの種があり、大別して６種からなるが、果樹園芸上重要なのは下記の３種である。
（１）ハイブッシュブルーベリー（Ｈｉｇｈｂｕｓｈ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ，Ｖ．ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ  Ｌ．）：オニール、シャープブルー、ジョージアジェム、フローダブルー、レベレイ、スパルタン、ダロウ、デューク、バークレイ、ハリソン等
（２）ラビットアイブルーベリー（Ｒａｂｂｉｔｅｙｅ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ，Ｖ．ａｓｈｅｉ  Ｒｅａｄｅ）：ウッダード、ガーデンブルー、ティフブルー、ホームベル、マイヤー等。
（３）ローブッシュブルーベリー（Ｌｏｗｂｕｓｈ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ，Ｖ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ  Ａｉｔｏｎ，Ｖ．ｍｙｒｔｉｌｌｏｉｄｅｓ  Ｍｉｃｈａｕｘ）：チグネクト、ブロンズウィック、ブロミドン等。
【００１７】  ブルーベリーは、もともと２０世紀の初頭以降、アメリカ農務省あるいは州立大学によって野生種から改良されたものである。品種改良は、栽培が容易であり、果実が大きくて甘い、などの観点から良品種とされ、主に生果生産を目標として進められてきた。今日では、世界各国で栽培されている。本発明に使用するブルーベリーは、その種類、由来、原産地等、特に制限するものではない。
【００１８】  好適な品種としては、南方系のラビットアイ、中でもレッドパールや本発明者等による新品種「くにさと３５号」（「種苗法」品種登録出願番号；第２３４３３号）の枝葉にはＰＡＣ含量が高く、本発明の苗木に適している。例えば、図７（Ｂ）における特定の光照射条件では、「くにさと３５号」の苗木は、露地栽培の成木のブルーベリー葉並みの高総ＰＡＣ含量を示している。またレッドパールの苗木も、図９（Ｂ）に示すように、総ＰＡＣ含量は露地栽培の成木並みである。注目すべきは、図７（Ｂ）及び図９（Ｂ）において、ブルーベリーの主要品種であるハイブッシュ系のバークレイに比べ、南方系のラビットアイがいずれも高い総ＰＡＣ量を示すことである。
【００１９】  次に図面に従って、本発明の好適な実施の形態を詳述する。図１は、本発明のブルーベリーの栽培方法の段階（ステップ；Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ６）を示す。このうち、Ｓ１及びＳ２は本発明の前段階で、Ｓ３〜Ｓ６が本発明の段階である。
（１）多芽体誘導段階（Ｓ１）：
Ｓ１は、ブルーベリーの多芽体を誘導する段階である。本発明で「多芽体」とは、芽数が概ね１０以上のものをいう。Ｓ１では、ブルーベリーの茎頂部の組織片を、糖類、ＰＧＲ、及び支持体を含む培地で組織培養する。
【００２０】  組織培養に使用する基本培地には、植物の組織培養に広く用いられるＷｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ培地（ＷＰ培地）、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）、もしくはこれらの培地の組み合わせ、またはその組成を改変した培地を挙げることができる。好適にはＭＳ培地とＷＰ培地とを組み合わせたＭＷ培地（ＭＳ培地１：ＷＰ培地１）を用いる。
【００２１】  基本培地には、糖類、ＰＧＲ、及び支持体を添加する。糖類としては、蔗糖、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース及びソルビトールなどの糖、ならびにマルトースやマンニトール等の糖アルコールを挙げることができる。これらの糖は、単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
【００２２】  ＰＧＲには、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、２，４−シクロフェノキシ酢酸（ＣＰＡ）、インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）、ベンゾフラン−３−酢酸（ＢＦＡ）、フェニル酢酸（ＰＡ）、及びこれらの誘導体等のオーキシン類；並びに、ベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン、２−イソペンテニルアデニン（２ＩＰ）、（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル尿素（４ＰＵ）等のサイトカイニン類を挙げることができる。これらは単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。好ましくはゼアチンを用いる。
【００２３】  支持体は、培地を固相化する上で必要な成分である。通常、固形培地に使用される基剤、例えば寒天やゲランガムなどのゲル化剤を用いる。寒天の使用が一般的である。
【００２４】  これらの成分の培地中の濃度は、ブルーベリーの種によっても異なるので一概に特定できないが、例えば、ＭＷ培地を用いる場合、糖類（好ましくは蔗糖）の濃度として１〜１０重量％、好ましくは２〜３重量％；ＰＧＲ（好ましくはゼアチン）の濃度として１〜１０ｍｇ・Ｌ−１、好ましくは２〜５ｍｇ・Ｌ−１；支持体（好ましくは寒天）の濃度として０．８〜２重量％、好ましくは０．８〜１．０重量％である。これらの割合は、糖類、ＰＧＲまたは支持体をそれぞれ２種以上組み合わせて使用する場合には、それらの総量を意味する。
【００２５】  さらに、これらの培地には、他の成分として、カビの発生を防止するため、ＰＰＭ（Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク株式会社製、商標名）のごとき抗生物質を配合することもできる。ＰＰＭの濃度は、培地の０．１〜０．５重量％、好ましくは０．１〜０．３重量％程度である。培地は、滅菌処理し、無菌状態で使用する。
【００２６】  茎頂培養は、人工気象機のような厳密にコントロールされた気密閉鎖系、無菌条件下で行う。具体的には、容器内の滅菌状態で調製された培地に、ブルーベリーの茎頂部の組織片を接植し、人工気象機内で多芽体の発生を誘導する。
【００２７】  茎頂部の組織片には、圃場で生育したブルーベリーの例えば１年生枝から採取し、滅菌処理したものを用いる。滅菌処理法に特に制限はない。例えば、流水と超純水で洗浄後、５％程度の次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬し、次いで滅菌蒸留水で洗浄する。茎頂培養は、温度２０〜２５℃、湿度は１００％ＲＨ、明期１２〜１６時間、暗期８〜１２時間の範囲で、明期と暗期を２４時間内で交互に実施するのが望ましい。明期において用いる照明の光量子数は、特に制限はないが、通常照射強度５〜２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の範囲内で調整する。培養は、芽数が概ね１０程度になるまで行う。その期間は、ブルーベリーの種によって多少異なるので特定はできないが、通常２〜５ヶ月程度である。
【００２８】（２）多芽体の増殖段階（Ｓ２）：
Ｓ２は、Ｓ１で得た多芽体を増殖する段階である。Ｓ２では、Ｓ１で得られた多芽体を培地に分割接植し、培養する。分割接植では、多芽体を０．５〜０．２ｇになるように２〜１０個程度に株分けし、これを培地に接植する。必要に応じて、この段階を数度繰り返す。
【００２９】  培養には、Ｓ１で用いた培地と同一の基本培地を用いることができるが、培地には、抗生物質は添加しないのが好ましい。糖類は、必ずしも必要ではなく、０（無添加）〜１０重量％の範囲で用いる。糖類としては蔗糖が好ましい。ＰＧＲもＳ１で用いるものを使用することができる。好ましくはゼアチン、カイネチン、２ＩＰ及びＢＡからなる群から選ばれる少なくとも１種を、総量として０．１〜１０ｍｇ・Ｌ−１の割合で用いる。より好ましくは、ゼアチンの単独使用、特に２〜５ｍｇ・Ｌ−１の割合での使用が効果的である。支持体としても、Ｓ１で用いられるものを使用することができる。好適には、寒天を０．８〜２重量％程度の割合で用いる。
【００３０】  Ｓ２において分割移植された株は、移植当初には、Ｓ１と同様に気密状態、無菌条件下で培養されるが、培養初期から終期にわたり、容器内の空気の置換が、気密状態から一定の開放状態へと、段階的あるいは連続的に増加するように換気を制御しながら培養することが好ましい。より具体的には、分割移植による増殖を繰り返すことにより、多芽体が培養環境になれて一定の速度で増殖するようになる段階までは無菌の気密状態とし、増殖最終段階で換気を開始し、次いで一定期間、通常約１ヶ月程度換気条件下で培養する。すなわち、Ｓ２の多芽体増殖工程は、分割移植による増殖を２〜３回程度繰り返す。「増殖段階」における培養は、前述する多芽体誘導工程（Ｓ１）と同様に、無菌条件下、気密状態で行われることが望ましい。
【００３１】  本工程の培養は、ほぼ同一の条件で行うことができる。具体的には、温度条件として２０〜２５℃、照明条件として照射強度２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射時間１２〜１６時間の範囲を挙げることができる。なお、制限されないが、「増殖段階」には、多芽体を増殖させ、次いで増殖した培養環境になれて一定の速度で増殖するようになるまでの期間を要する。かかる期間としては、制限されないが、通常約２ヶ月程度を挙げることができる。
【００３２】（３）育苗段階（Ｓ３）：
Ｓ３では、Ｓ２で増殖された多芽体から挿し穂を採取し、培養土に挿し木して発根を誘導し、順化する段階である。この挿し穂は、露地栽培のブルーベリー成木から採取してもよい。
【００３３】  例えば、Ｓ２で増殖化された多芽体のシュートから挿し穂を採取し、この挿し穂を図２に示すようにセルトレーの培養土に挿し木して、人工気象機内に移し、発根を誘導する。シュートの長さが２０〜８０ｍｍ時点で採取して、更に１０〜２０ｍｍに切断して挿し穂する。
【００３４】  培養土としては、当業界で使用される一般の培養土を用いることができる。例えば、一般に培養土としてピートモスを挙げることができるが、これとゼオライト、鹿沼土、ボラ土、軽石、バーミキュライトまたはパーライト等の多孔性物質を適宜組み合わせて用いてもよい。さらに、木粉、おがくず、腐葉土、または繊維状組成物と粘土鉱物を配合することもできる。好ましい培養土としては、ピートモスとシラスの混合物を挙げることができる。かかる培養土の混合比は、シラスを全量の１０〜７０容量％程度混合するのが好適である。培養土に変えてロックウールを挙げることもできる。
【００３５】  発根を促進するために、インドール酪酸（ＩＢＡ）またはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）等のオーキシン類をシュートの基部に塗布してもよい。濃度は、１００〜１０００ｍｇ・Ｌ−１が望ましい。
【００３６】  人工気象機内の温度は１５〜２５℃が好適である。１５℃未満では、発根・生育が遅く、２５℃を超えると、熱障害により発根前に枯れるおそれがある。湿度管理は、挿し穂して発根が不十分な状態の間は重要である。湿度は、７０％ＲＨ以上の高湿度に維持管理する。７０％未満では、枯れるおそれがある。調整方法としては、セルトレーの下部に常時水を入れておき、間欠的に上から噴霧する。湿度を一定条件に保つために、セルトレーを簡単なプラスチック製の蓋のようなもので覆ったり、又はミスト装置で調整したりしても良い。
【００３７】  この段階の光照射は、弱い挿し穂への光熱による損傷を避けるための間欠照射である。光源は、蛍光灯及び／又はＬＥＤである。蛍光灯の場合であれば、明期の照射強度は２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の範囲が適切である。間欠照射期間は明期１２〜１６時間、暗期８〜１２時間の範囲内で、適宜交互に繰り返せばよい。間欠通し照射期間は３０〜６０日間である。ＬＥＤは、蛍光灯に比べて発熱量が低く、挿し穂への熱障害は少ない。
【００３８】  発根は、挿し穂を挿し木して１４日程度で始まり、３０〜６０日間で根がプラグトレーの穴の中で回った状態になる。図３は、Ｓ３で得られた苗木の発根状態を示す。
【００３９】  大部分の挿し穂が発根し、図３に示すような苗木に生育したら、セルトレーの蓋の開閉をするなどして、発根誘導時期の高湿度状態から常湿の３０〜６０％ＲＨ程度まで下げて、苗木を次工程の環境へと順応させる。湿度の急激な変化は好ましくないため、湿度低下は少なくとも１６時間程度かけて漸次行う。この順化段階の温度は、発根誘導期間と同様１５〜２５℃である。照射は、発根誘導時と実質的に同一である。順化に要する期間は１〜５日程度である。
【００４０】（４）生育段階（Ｓ４）；
Ｓ４は、Ｓ３で順化された苗木を生育し、生重量を増やす段階である。Ｓ４では、実験的にはＳ３に引き続き人工気象機内で実施してもよいが、産業的にはハウスや植物工場のような露地とは異なる実質的閉鎖環境で行うのが望ましい。
【００４１】Ｓ４の段階での温度は１５〜２５℃、湿度は３０〜６０％ＲＨである。光照射は、光源が蛍光灯及び／又はＬＥＤの連続照射となり、蛍光灯とＬＥＤでは多少異なるが、照射強度が３０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間が少なくとも２０日間である。上限は技術的に特定する必要はないが６０日程度が妥当である。照射期間後の生重量は、Ｓ３段階の生重量に比して約２倍増となっている。
【００４２】（５）ＰＡＣ増量段階（Ｓ５）；
Ｓ５は、Ｓ４で得られた苗木のＰＡＣ含有量を増やす本発明のもっとも特徴的な光照射段階である。図４は、ＰＡＣ増量段階直前の苗木の状態を示す。苗木の長さは５０〜１２０ｍｍ程度である。図５は、人工気象機による光照射の状況を示しているが、温度、湿度、光照射条件等を適正に管理できれば、人工気象機以外のハウスや植物工場のような実質的閉鎖環境の場に移すのが大量生産には適している。
【００４３】  Ｓ５での温度及び湿度は、いずれもＳ４と略同等でよく、温度は１５〜２５℃、湿度は３０〜６０％ＲＨの範囲内である。
【００４４】  Ｓ５での光照射の光源は、蛍光灯及び／又はＬＥＤによる連続照射である。照射強度は６０〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１範囲、照射期間は少なくとも４日間である。４日以上の光照射により、ＰＡＣ含量及びＰＡＣ含量割合を増加させることができる。照射期間の上限は技術的に特定する必要はないが、照射期間を４〜１２日間程度にすれば、早期収穫が可能となる。光照射にＬＥＤを使用する場合、ＬＥＤは青色もしくは赤色の単独又はそれらの組み合わせでもあってもよい。ＬＥＤの青色照射にあっては、照射強度１００〜３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の範囲が好適である。ＬＥＤの赤色照射にあっては、照射強度６０〜９０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の範囲が好適である。照射条件が変わっても照射期間は４〜１２日間程度でよい。
【００４５】  一般にＬＥＤの使用は、消費電力が低く、発熱量も少ないため、空調にかかるコストを低減できる利点がある。加えて、発熱量が低いため、至近距離からの光照射でも、苗木に熱障害がおこらず、植物体の光利用効率が高い。また後述の通り、ＬＥＤにより特定の光を照射することで、ＰＡＣ含量及びＰＡＣ含量割合を顕著に増加させることができる。
【００４６】  本発明の特徴であるＳ３、Ｓ４及びＳ５における光照射の好適な組み合わせを、以下に例示する。
（１）育苗段階Ｓ３での光照射は、蛍光灯のみによる１２時間毎の明暗間欠照射で、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が３０〜６０日間の照射である。生育段階Ｓ４での光照射は、蛍光灯のみよる連続照射で、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が２０〜３０日間の照射である。ＰＡＣ増量段階Ｓ５での光照射は、蛍光灯及び赤色ＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が１２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間の照射である。
（２）育苗段階での光照射は、蛍光灯による１２時間毎の明暗間欠照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が３０〜６０日間の照射である。生育段階での光照射は、蛍光灯による連続照射であり、照射強度が２０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が２０〜３０日間の照射である。ＰＡＣ増量段階での光照射は、蛍光灯及び青色ＬＥＤによる連続照射であり、照射強度が３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で、照射期間が４〜１２日間の照射である。
【００４７】  注目すべきは、Ｓ５での照射効果である。詳細は実施例の考察に譲るが、概して言えることは、図７（Ｂ）及び図９（Ｂ）に示すように、Ｓ４までの光照射では、苗木の総ＰＡＣ含量はあまり増えず、Ｓ５の短期間の照射で初めて露地栽培のブルーベリー成木の葉に近い総ＰＡＣ含量に達していることである。また、アントシアニン含量は図１０に示すように、蛍光灯と青色ＬＥＤの併用の場合顕著に増量する。蛍光灯と赤色ＬＥＤの併用又は青色ＬＥＤ単独では増量効果が確認される程度である。この結果は、総アントシアニンに占めるＰＡＣ含量の割合が、増加することを意味する。
【００４８】  光照射によるＰＡＣとアントシアニンの増量の効果においては、図１１に示すように経時的変化が異なる。総ＰＡＣ含量は照射期間に応じて増加するが、総アントシアニン含量は５日頃から減少に転じる。この結果は、本発明の光照射を望ましくは５日以上行うと、ＰＡＣの増量が選択的に増えることを意味する。
【００４９】  さらに、図１２に示すＰＡＣの産生に関与する遺伝子発現は、図１３から明らかなように光照射を反映して強弱を示し、そのうちの少なくともＦ３Ｈ、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ及びＡＮＲは、強制的な光照射をしない比較例▲１▼に比し、特定の光照射条件を反映して明らかに強くなっている。このことから、逆に人工気象機内でのブルーベリー苗に対するテスト照射条件下での遺伝子発現が強くなることを指標として、ブルーベリー葉からのＰＡＣ取得のためのブルーベリー人工栽培工場等での好適な照射条件のプレスクリーニングが可能である。
【００５０】（６）収穫段階（Ｓ６）；
Ｓ６は、Ｓ５でＰＡＣ含量が増えたブルーベリー苗木の収穫段階である。図６は、収穫直前の苗木の状態を示す。苗木全長は、５０〜１５０ｍｍ程度である。
【００５１】  この段階の苗木の上部を枝葉ともに切り取って、ＰＡＣ抽出の原料に用いることができる。ブルーベリーの枝葉には優れた生理活性を示すＰＡＣが存在していることは、既述の通りである。本発明では苗木で収穫段階を迎えるため、小枝が混入しても差し支えなく、露地栽培の成木の葉の収穫に比べると、収穫作業は極めて効率的である。枝葉を収穫した後の苗木は、再度Ｓ４の生成過程に戻し、生重量を増やすことができる。Ｓ４〜Ｓ６の周期を６０日程度とすると、全段階を実質的な閉鎖環境内で行うため、枝葉を年５〜６回収穫できる。この点も、収穫が年１回の露地栽培に比べて有利である。
【００５２】  以下、実験例および実施例を挙げて本発明を説明する。ただし、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、特に記載のない限り、「％」とは「重量％」を、「部」とは「重量部」を意味するものとする。
【００５３】材料及び機器：
ラビットアイブルーベリー（Ｖ．ａｓｈｅｉ  Ｒｅａｄｅ）の培養苗と成葉およびハイブッシュブルーベリー（Ｖ．ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ  Ｌ．）の培養苗を供試した。
【００５４】  光源として昼白色蛍光灯（メロウ  ５Ｎ  ＦＬＲ４０Ｓ−ＥＸ−ＮＭ３６−Ｈ  東芝）、青色ＬＥＤ（パネル  ＬＥＤ  ＬＥＤ−Ｂ型  東京理化器械株式会社  ピーク波長  ４７０ｎｍ）、赤色ＬＥＤ（パネル  ＬＥＤ  ＬＥＤ−Ｒ型  東京理化器械株式会社  ピーク波長  ６６０ｎｍ）を使用した。
【００５５】  植物体の生育には、植物インキュベーター（ＣＦＨ−４０５  株式会社トミー精工）を用いた。
【００５６】測定法
１．ブルーベリー苗木の総ポリフェノール含量
８０％（ｖ／ｖ）メタノールで、凍結乾燥物からポリフェノールを抽出した。ポリフェノール含量は、フォーリン−チオカルト法（柚木崎千鶴子ら「県内産農産物の抗酸化活性」、宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告［４８］９１−９８（２００３））で測定した。測定値は、生重量あたりの没食子酸相当量で算出した。
【００５７】２．ブルーベリー苗木の総ＰＡＣ含量
９９℃の熱水で、凍結乾燥物からＰＡＣを抽出した。ＰＡＣ含量は、４−ジメチルアミノシンナムアルデヒド（ＤＭＡＣＡ）法（Ｌｉ，Ｙ．−Ｇ．ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ＤＭ  ＡＣＡ−ＨＣｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｌｏａｔ  Ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  Ｆｏｒａｇｅ  Ｌｅｇｕｍｅｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ７０：８９−１０１（１９９６））で測定した。測定値は、生重量あたりのカテキン相当量で算出した。
【００５８】３．ブルーベリー苗木の総アントシアニン含量
終濃度が０．１Ｎになるように塩酸を添加した９５％（ｖ／ｖ）エタノールで、凍結乾燥物からアントシアニンを抽出した。アントシアニン含量の測定はＨＰＬＣで行った（Ｂａｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ，ａｇｌｙｃｏｎｓ，ａｎｄ  ａｇｌｙｃｏｎ−ｓｕｇａｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒｕｉｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｉｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２：８５９−８６４（１９８７））。測定値は、生重量あたりのシアニジン３−グルコシド相当量で算出した。
【００５９】５．遺伝子発現の測定
ブルーベリーのポリフェノール生合成系を調べるため、ポリフェノール生合成遺伝子、Ｆ３Ｈ、ＬＤＯＸ、ＤＦＲ、ＬＡＲ１、ＬＡＲ２及びＡＮＲの６つの遺伝子の発現解析を行った。
ブルーベリーポリフェノール生合成遺伝子のうちＦ３Ｈ及びＬＤＯＸは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡサブトラクションキット（クロンテック社製）を用いて単離した。ＤＦＲ、ＡＮＲは、ブルーベリー以外の生物においてそれぞれの遺伝子で相同性の高い領域に、以下の塩基配列を持った特異的なプライマーをそれぞれ２種類作製した。
ＤＦＲ
ＤＦＲ−Ｆ１：ＧＴＮＴＳＹＧＴＢＡＣＮＧＧＤＧＧＮＮＣＮＧＧＮＴＷＹ
ＤＦＲ−Ｒ１：ＨＴＣＤＡＹＲＧＣＮＣＣＮＮＢＲＷＡＣＡＴＮＴＣＹＴＹ
ＡＮＲ
ＡＮＲ−Ｆ１：ＡＡＧＲＭＶＧＣＤＴＧＹＧＴＢＲＴＨＧＧＹＧＧＭＡＣＹ
ＡＮＲ−Ｒ１：ＣＣＣＣＴＴＤＧＹＳＴＴＳＡＷＲＴＡＹＴＣＹＡＳＡＳＷ
ＬＡＲ
ＬＡＲ−Ｆ１：ＧＧＷＫＣＭＷＣＹＧＧＫＴＴＹＡＴＮＧＧＢＭＲＧＴＴＹ
ＬＡＲ−Ｒ１：ＶＴＹＡＡＧＲＣＡＹＴＣＮＴＣＮＡＨＧＳＷＹＣＫＲＡＡ
2011182790.tif 000003
用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、それぞれの遺伝子に特異的な塩基配列を増幅して単離した。また、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（クロンテック社製）を用いてＲａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）−ＰＣＲを行い、それぞれの遺伝子の５´末端および３´末端を単離した。単離した遺伝子の塩基配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３５００ｘＬジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で解読した。解読した遺伝子の機能は、日本ＤＮＡデータバンクのＢｌａｓｔによる相同性検索により推定した。
解読した配列をもとにブルーベリーポリフェノール生合成遺伝子にそれぞれ特異的なプライマーを２種類ずつ作製し、後述の発現解析に用いた。
培養苗のポリフェノール生合成遺伝子の発現を調べるため、改良したＣｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）法（布施ら「ブルーベリー葉における効率的なＲＮＡ抽出法の開発」第５１回植物生理学会年会要旨集  ２８２頁  ２０１０年）により培養苗からＲＮＡを抽出した。
2011182790.tif 000004
写酵素（インビトロジェン社製）を用い、抽出したＲＮＡから、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。合成したｃＤＮＡに対し、それぞれの遺伝子に以下の塩基配列を持った特異的なプライマーを２種類作製した。
Ｆ３Ｈ
Ｃ７４−Ｆ６：ＡＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣ
Ｃ７４−Ｒ７：ＡＴＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＴＡＡＧＣＡ
ＬＤＯＸ
Ｃ６８−Ｆ６：ＡＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ
Ｃ６８−Ｒ４：ＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＧＴＴＡＴＧＣＣ
ＤＦＲ
ＤＦＲ−Ｆ８：ＣＧＡＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣ
ＤＦＲ−Ｒ８：ＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＧＣＡＴ
ＡＮＲ
ＡＮＲ−Ｆ６：ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣ
ＡＮＲ−Ｒ６：ＡＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣ
ＬＡＲ１
ＬＡＲ１−Ｆ３：ＡＴＧＡＣＧＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧ
ＬＡＲ１−Ｒ１：ＧＣＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＣＡＴ
ＬＡＲ２
ＬＡＲ２−Ｆ４：ＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＡ
ＬＡＲ２−Ｒ２：ＧＣＣＡＣＧＴＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＡ
2011182790.tif 000005
を行い、それぞれの遺伝子に特異的な塩基配列を増幅した。増幅した産物を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで５０Ｖで９０分の電気泳動を行い、特異的産物を分離し、臭化エチジウムで染色後、紫外線照射により蛍光を発光させ、その強さで発現強度を推定した。発現強度の解析は、解析ソフトＩｍａｇｅＪ  １．４３ｕ（アメリカ国立衛生研究所）にて行った。
【実施例１】
【００６０】１．ブルーベリーの育苗段階（Ｓ３）
ブルーベリーには「レッドパール」を用いた。培養土にはピートモスとボラ土を１：１で混合した土を充填した幅２８ｃｍ、奥行き２８ｃｍ、高さ６ｃｍの１００穴セルトレイに、特許文献６に基づき作製した挿し穂を移植した。１日に１度挿し穂全体がぬれる程度に霧状の水を与え、セルトレーの上には、光が当たるように透明な蓋を置き、中の挿し穂が乾燥しないようにし、気温２５℃の人工気象機内に置いた。１日のうち、１２時間は、３０〜５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の昼白色蛍光灯の照射を行い、残り１２時間は暗所に置き６０日間間欠照射した。挿し穂には、ホルモン剤塗布などの特別な処理は行わなかった。１４日程度で挿し穂に発根が起こり、挿し穂から６０日後に健全な苗木を確認できた。育苗後は蓋を少し開けておき、２日かけて徐々に外気と同じ湿度にまで下げ、最後は蓋をはずして順化を行った。【００６１】２．苗木の生育段階（Ｓ４）
前工程で得た苗木に対し、気温２５℃の人工気象機内で、昼白色蛍光灯を用い、照射強度３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間２０日間、２４時間連続照射した。
３．苗木のＰＡＣ増量段階（Ｓ５）
前工程で得た生育苗木に対し、気温２５℃の人工気象機内で、昼白色蛍光灯を用い、照射強度１７０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間１〜１０日間、２４時間連続照射した。図７及び図８に示すようにＰＡＣ増量段階照射開始から１，３，５，１０日目にサンプルを採取し、凍結乾燥し、冷凍保存した。
４．有効成分の測定
前段階の凍結乾燥試料を用い、前述の方法により、総ポリフェノール含量、総ＰＡＣ含量、及び総アントシアニン含量を測定した。結果を図７及び図８に示す。
【実施例２】
【００６２】  ブルーベリーとして「くにさと３５号」を用い、ＰＡＣ増量照射を昼白色蛍光灯で照射強度１７０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間１０日間、２４時間連続照射した。それ以外は、実施例１と同じ方法によった。結果を図７及び図８に示す。
【実施例３】
【００６３】  ブルーベリーとして「バークレイ」を用い、ＰＡＣ増量照射を昼白色蛍光灯で照射強度１７０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間１０日間、２４時間連続照射した。それ以外は、実施例１と同じ方法によった。結果を図７及び図８に示す。
【実施例４】
【００６４】  ブルーベリーとして「レッドパール」を用い、ＰＡＣ増量照射を昼白色蛍光灯３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１とＬＥＤ（青又は赤）の組み合わせで行った。青色ＬＥＤは照射強度３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間５日間と１０日間、２４時間連続照射した。赤色ＬＥＤは照射強度９０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間１０日間、２４時間連続照射した。それ以外は、実施例１と同じ方法によった。結果を図９及び図１０に示す。
【実施例５】
【００６５】  ブルーベリーとして「レッドパール」を用い、ＰＡＣ増量照射を青色ＬＥＤで照射強度３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間１０日間、２４時間連続照射した。それ以外は、実施例１と同じ方法によった。結果を図９及び図１０に示す。
【実施例６】
【００６６】  ブルーベリーとして「バークレイ」を用い、ＰＡＣ増量照射を青色ＬＥＤで照射強度３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、照射期間１０日間、２４時間連続照射した。それ以外は、実施例１と同じ方法によった。結果を図９及び図１０に示す。【００６７】  図７（Ａ）が示すように、総ポリフェノール含量は、苗木にＰＡＣ増量照射を１０日間行った場合に最も多くなり、その量は、生重量１ｇ当たり７４ｍｇであった。露地栽培の成木と比較すると、６月収穫葉の７９％、９月収穫葉の５６％の含量に達した。【００６８】  図７（Ｂ）が示すように、総ＰＡＣ含量も、苗木にＰＡＣ増量照射を１０日間行った場合に最も多くなり、その量は、生重量１ｇ当たり６．０ｍｇであった。露地栽培の成木と比較すると、６月収穫葉の１５３％、９月収穫葉の７５％の含量に達した。また５日程度の照射でも、ほぼ露地栽培の成木に匹敵する量の総ＰＡＣが得られた。試験番号１、２のように、生育照射のみでは十分なＰＡＣ量は得られなかった。このことから、５から１０日程度の照射で、ＰＡＣが十分に含まれた苗木の収穫が可能である。「くにさと３５号」の苗木の総ＰＡＣ含量は、生重量１ｇ当たり８．２ｍｇという、非常に高い値となった。この結果から、「くにさと３５号」は、本発明の栽培方法に適した品種であると考えられる。一方、ハイブッシュブルーベリーの１種である「バークレイ」の苗木では、ラビットアイブルーベリー苗木ほどのＰＡＣ含量を得ることはできなかった。【００６９】  図８が示すように、総アントシアニン含量は、ＰＡＣ増量照射開始から５日目に最も多くなり、５日目以降は減少した。理由は定かでないが、本発明の光照射によれば、ＰＡＣが選択的に増加することが明らかになった。【００７０】  以上のことから、光照射条件の変動によるプロアントシニジン含量の変化は、アントシアニン含量の変化と全く異なる挙動を示すため、ＰＡＣ高含有ブルーベリー苗木の生育には、今回見出された照射条件で照射する栽培方法が有効である。【００７１】  図９（Ａ）が示すように、総ポリフェノール含量は、ラビットアイブルーベリー苗木に、３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色蛍光灯に加え、３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１のＬＥＤ青色光を１０日間照射した場合に最も多くなり、その量は、生重量１ｇ当たり５６ｍｇであった。露地栽培の成木と比較すると、６月収穫葉の６０％、９月収穫葉の４３％の含量であった。総ポリフェノール含量は、露地栽培の成木ほどの量は得られなかった。【００７２】  図９（Ｂ）が示すように、総ＰＡＣ含量は、培養苗に、３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１のＬＥＤ青色光のみを１０日間照射した場合に最も多くなり、その量は、生重量１ｇ当たり６．６ｍｇであった。露地で生育したものと比較すると、６月収穫葉の１６９％、９月収穫葉の８３％の含量であった。また３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色蛍光灯の光に加え、３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１のＬＥＤ青色光を１０日間照射した場合も、同程度のＰＡＣが含まれていた。３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１白色蛍光灯の光に加え、９０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１のＬＥＤ赤色光を１０日間照射した場合や、３０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の白色蛍光灯の光に加え、３００��ｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１のＬＥＤ青色光を５日間照射した場合でも、６月収穫葉以上のＰＡＣ含量が確認された。【００７３】  図１０が示すように、総アントシアニン含量は、ＬＥＤ照射を５日行ったものよりも、１０日間行ったものの方が減少し、図８と同様の傾向が見られた。【００７４】  以上のことから、昼白色蛍光灯だけの場合、ＬＥＤ光と昼白色蛍光灯を同時に照射した場合、およびＬＥＤ光だけの場合、いずれの場合でも、５から１０日間短期間照射することで、ブルーベリー苗木のＰＡＣ含量を露地栽培の成木並みにすることが可能であることが分かった。ＬＥＤ光を利用した場合、総ポリフェノール含量は白色蛍光灯の方が増加するが、ＰＡＣ含量の増加量はほとんど差がなく、ポリフェノール中に占めるＰＡＣの割合をより高めることができると考えられる。【００７５】  ハイブッシュブルーベリーの１種である「バークレイ」の苗木で、２０日間の生育後、３００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１のＬＥＤ青色光のみを１０日間照射する試験を行ってみたが、ラビットアイブルーベリーほどのＰＡＣ含量を得ることはできなかった。【００７６】  一方、図１２のＰＡＣ又はその前駆体の産生に関与する遺伝子のうち、Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ及びＡＮＲは、図１３に示すように、強制的な光照射を行わない光照射のテスト番号１に比して、遺伝子の発現が強くなっている。すなわち、Ｆ３Ｈの発現強度は、テスト番号２及び６における光照射条件でテスト番号１を大きく上回っている。同様に、ＤＦＲの発現はテスト番号２、３、６、９において強くなり、ＬＤＯＸの発現はテスト番号２、３、６、９で強くなり、ＡＮＲの発現はテスト番号２、３、４、９で強くなっている。しかし、同じＰＡＣ又はその前駆体の産生に関与する遺伝子でも、ＬＡＲ１及びＬＡＲ２の発現強度は光照射条件を反映しない。【００７７】  ブルーベリー葉由来のＰＡＣは、特許文献１から明らかなように、カテキンよりエピカテキンを基本骨格としたものの割合が高い。本発明においても、図１３に示すように、図１２におけるエピカテキンルートに関与するＬＤＯＸ及びＡＮＲの発現は強くなっているが、カテキンルートのＬＡＲの発現は強くなっていない。このことは、本発明における遺伝子発現が強くなっていることと、ブルーベリー葉由来のＰＡＣのエピカテキンの割合が高くなっていることに対応していることを示唆している。【００７８】  また、図７（Ｂ）と図１３から分かるように、Ｓ５：ＰＡＣ増量照射条件開始後、１日でＦ３Ｈ、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ及びＡＮＲの発現が強くなり、５日で総ＰＡＣ含量が増加している。かかる遺伝子発現と光照射条件の対応から、遺伝子Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ及び／またはＡＮＲの少なくともひとつの発現が強くなっていることを指標として、好適な光照射条件を選定することができる。あるいは、採取したブルーベリー葉の総ポリフェノールの測定と併用又はこれに代えて、これらの遺伝子発現の強弱を測定し、ブルーベリー葉のＰＡＣ取得を目的としたブルーベリーの人工栽培における光照射条件の適否をプレスクリーニングする指標とすることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】  本発明は、植物工場での栽培に利用可能である。生産物は、サプリメントの製造、サラダやお菓子、飲料などへの添加物として利用可能である。また本発明の光照射下におけるＰＡＣの産生に関与する遺伝子は、ＰＡＣ産生量の多いブルーベリーの育種にも利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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