(57)【要約】      （修正有）【課題】血液細胞を含む試料の中から白血球のタンパク質を簡便にかつ効率よく回収できるようにする。【解決手段】試料液を受け入れる入口２と、入口２に連通する連通路と、連通路内の圧力を調整する圧力調整手段４とを備える。入口２と圧力調整手段４との間に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター９を、連通路が遮断される状態に配置する。入口２は、試料液供給手段13と洗浄液供給手段14と溶解液供給手段15とに選択的に切換え接続可能である。血球を含む試料液をフィルター９に１〜５往復通過させ、試料液中の白血球をフィルター９に捕捉して、フィルター９を洗浄したのち、フィルター９にタンパク質溶解液を通過させて白血球のタンパク質を溶出させる。【選択図】図２
2011088869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球を含む試料液を、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)に吸着若しくは通過させる捕捉工程(S1)と、白血球を捕捉したフィルター(９)に洗浄液を通過させる洗浄工程(S2)と、上記の洗浄したフィルター(９)にタンパク質溶解液を通過させてこのフィルター(９)に捕捉されている白血球のタンパク質をこの溶解液中に溶出させる溶出工程(S3)とを含むことを特徴とする、白血球タンパク質の回収方法。
【請求項２】
上記の捕捉工程(S1)と洗浄工程(S2)は、上記の試料液または洗浄液を０.１ＭＰａ以下の圧力で上記のフィルター(９)に通過させる、請求項１に記載の白血球タンパク質の回収方法。
【請求項３】
上記の捕捉工程(S1)は、上記の試料液を上記のフィルター(９)に１または複数回にわたって往復通過させる、請求項１または請求項２に記載の白血球タンパク質の回収方法。
【請求項４】
上記の洗浄工程(S2)は、上記のフィルター(９)に３往復以内にわたって通過させる、請求項１から３のいずれか１項に記載の白血球タンパク質の回収方法。
【請求項５】
上記のタンパク質溶解液が、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤の有効量を含む溶液である、請求項１から４のいずれか１項に記載の白血球タンパク質の回収方法。
【請求項６】
血球を含む試料液から白血球タンパク質を回収するための回収装置であって、
試料液を受け入れる入口(２)と、この入口(２)に連通している連通路(３)と、この連通路(３)内の圧力を調整する圧力調整手段(４)とを備え、
上記の入口(２)と圧力調整手段(４)との間に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)を、上記の連通路(３)が遮断される状態に配置してあり、
上記の入口(２)は、試料液供給手段(13)と洗浄液供給手段(14)と溶解液供給手段(15)とに、選択的に切換え接続可能であることを特徴とする、白血球タンパク質の回収装置。
【請求項７】
上記の圧力調整手段(４)は、上記のフィルター(９)の入口(２)側とその反対側との間に０.１ＭＰａ以下の差圧を生じさせる、請求項６に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項８】
上記の連通路(３)は液体を貯留できる貯留室(５)を備え、上記のフィルター(９)はこの貯留室(５)と上記の入口(２)との間に配置されている、請求項６または請求項７に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項９】
上記の入口(２)は、さらに廃液部(16)とタンパク質回収容器(17)とに選択的に切換え接続可能である、請求項８に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項１０】
上記の圧力調整手段(４)は、上記の連通路(３)または上記の貯留室(５)内で保密状に進退摺動可能なピストン体からなる、請求項８または請求項９に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項１１】
シリンジの先端に形成された針装着部(６)に上記の入口(２)を開口し、このシリンジの筒体(７)内に上記の貯留室(５)を形成するとともに、この貯留室(５)の先端側に上記のフィルター(９)を配置し、貯留室(５)の後端側に上記のピストン体(４)を配置した、請求項１０に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項１２】
上記のピストン体(４)は、手動により進退可能である、請求項１０または請求項１１に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項１３】
上記の圧力調整手段(４)は駆動手段(18)に連動連結されており、この駆動手段(18)の駆動により上記の連通路(３)内の圧力が制御される、請求項６から１２のいずれか１項に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【請求項１４】
上記の入口(２)と連通路(３)はラブオンナチップ(Lab On a Chip)に形成されており、このラブオンナチップ(21)は上記の圧力調整手段(４)を備える、請求項６に記載の白血球タンパク質の回収装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液細胞を含む試料液から、白血球に含まれるタンパク質を回収する方法、並びにこれに用いる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代になって、ＤＮＡマイクロアレイ技術の進歩により、白血球を中心とした血液細胞における遺伝子発現の変動に関する膨大なデータが蓄積されている。それは血液細胞のタンパク質の分布にも大きな影響を与えており、そのデータの解析は新たな血液診断法の構築において重要な手段となることは間違いない。しかるに現在、各種疾患の治療や診断等に応用されているサンプルは、ほとんど全てが血清成分であり、そこでは分泌型のタンパク質やその酵素触媒によって産生されて血清として放出されている物質を測定している。その理由は、臨床現場で簡便迅速に白血球を中心とした血液細胞に含まれる全タンパク質を分離・抽出する技術が欠如していることにある。
【０００３】
血液試料からの白血球分画技術として従来行われてきたものには、繊維への粘着力を利用する方法、凝固剤を用いて特定血球のみを凝固させて除外する方法、遠心分離で分画する方法などがある。たとえば繊維に単球や顆粒球を付着させれば、リン酸緩衝生理食塩水などにより付着した血球を回収できる。凝集剤や遠心分離により得た白血球分画をナイロンやガラス繊維を詰めたカラムに入れて３７℃に保温し３０分位放置する方法でも白血球が回収できる。あるいは血液にヒドロキシエチルスターチやデキストランなどの赤血球凝集剤を加えて一定時間放置後に上清に残った白血球を採取する方法や、血液を遠心分離して白血球に富む分画(バッフィーコート)を採取する方法、比重１.０７７の液体に血液を重層後、遠心分離を行ない白血球層を回収する密度勾配遠心分離方法なども有用である。繊維に粘着する性質を持つ単球や顆粒球を付着させ、リン酸緩衝生理食塩水などにより洗浄して回収することもできる。
【０００４】
しかし上記の従来法では、大がかりな装置や特殊な技術を必要としたり、多大な時間と手間がかかったりする問題があった。例えば、赤血球凝集剤を用いる方法では洗浄や不純物除去の操作が厄介で手間がかかる。遠心分離法は高価な遠心分離器の設置が必要となるうえ、非常に煩雑な数回の遠心分離操作を必要とするため熟練者でも多大の労力と時間を要するなど、臨床現場では実行困難である。また一般には白血球の繊維への粘着能が弱いので採集される白血球の分布に偏りが生ずるという致命的な欠陥も見逃せない。このため、血液試料から白血球を分画するための、より簡便な方法及び装置が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の技術的課題は上記の問題点を一挙に解消し、血液細胞を含む試料の中から、特殊な技術を要せずに白血球のタンパク質を簡便に且つ効率よく短時間で回収できる白血球タンパク質の回収方法、並びにこれに用いる回収装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、血球を含む試料液を、いわゆる白血球除去フィルターに吸着または通過させ、これを洗浄したのち、タンパク質溶解液を通過させることで白血球タンパク質を簡便に効率よく回収できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成されたものであり、例えば、本発明の実施の形態を示す図１から図９に基づいて説明すると、次のように構成したものである。
【０００７】
即ち本発明１は白血球タンパク質の回収方法に関し、血球を含む試料液を、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)に吸着若しくは通過させる捕捉工程(S1)と、白血球を捕捉したフィルター(９)に洗浄液を通過させる洗浄工程(S2)と、上記の洗浄したフィルター(９)にタンパク質溶解液を通過させてこのフィルター(９)に捕捉されている白血球のタンパク質をこの溶解液中に溶出させる溶出工程(S3)とを含むことを特徴とする。
【０００８】
また、本発明２は白血球タンパク質の回収装置に関し、血球を含む試料液から白血球タンパク質を回収するための回収装置であって、試料液を受け入れる入口(２)と、この入口(２)に連通している連通路(３)と、この連通路(３)内の圧力を調整する圧力調整手段(４)とを備え、上記の入口(２)と圧力調整手段(４)との間に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)を、上記の連通路(３)が遮断される状態に配置してあり、上記の入口(２)は、試料液供給手段(13)と洗浄液供給手段(14)と溶解液供給手段(15)とに、選択的に切換え接続可能であることを特徴とする。
【０００９】
上記のフィルターは、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するものであればよく、特定の寸法や形成材料などに限定されないが、孔径が６〜９μｍの孔を有すると、赤血球は円滑に通過するが白血球は捕捉されるので好ましく、孔径が７〜８μｍであるとさらに好ましい。これらのフィルターは、市販されているものを用いてもよく、具体的にはリューコトラップ(Leukotrap；PALL Co.Ltd.社製、商品名)などを挙げることができる。
【００１０】
上記のフィルターは１枚のみ配置したものであってもよいが、複数枚を積層してあると白血球を効率よく捕捉できて好ましい。但し、積層枚数が増えると血液を通過させる際に高い圧力を必要とするので、その通過圧力で赤血球が破壊されることのないように２０枚程度以下が好ましく、さらに好ましくは１０枚以下に設定され、３〜５枚に設定すると一層好ましい。これらのフィルターは、１枚または複数枚を一対のフィルター保持部材間に挟持するなど、カセット状に構成すると、液体の通過に対しそのフィルターを特定の装着位置を保持でき、白血球を効率よく捕捉できて好ましい。
【００１１】
上記のフィルターは、特定の大きさに限定されないが、例えば直径５〜２０ｍｍ程度のものを用いると、必要とされる試料液が少量で済むうえ、回収装置を簡略に構成できて好ましい。また回収装置を小形化して、例えば１〜数滴の血液を用いる場合などは、このフィルターの面積をさらに小さくすることができるが、小さくし過ぎると白血球を短時間に充分捕捉できなくなる虞があるため、直径が１ｍｍに相当する０.７５ｍｍ２以上の面積を有すると好ましい。
【００１２】
上記の捕捉工程と洗浄工程では、０.１ＭＰａ以下の圧力で上記のフィルターに上記の試料液や洗浄液を通過させると、試料液中の赤血球が破壊されることなくこのフィルターを通過できるので好ましい。具体的には、上記の回収装置において、上記の圧力調整手段により上記のフィルターの入口側とその反対側との間に上記の所定の、例えば０.１ＭＰａ以下の差圧を生じさせると、その差圧で上記のフィルターに試料液や洗浄液を通過させることができる。
【００１３】
上記の捕捉工程(S1)は、上記の試料液を上記のフィルターに１または複数回にわたって往復通過させると、例えば４mLなど、少量の試料液中の白血球を簡単な操作で上記のフィルターに効率よく捕捉できて好ましい。即ち、上記のフィルターに捕捉された白血球は、このフィルターに逆方向の流れを生じても容易に離脱しないと推定される。
【００１４】
一方、上記の洗浄工程(S2)では、上記の洗浄液により、上記のフィルターや回収装置の連通路などに付着している赤血球が除去されるが、この洗浄液を過剰に流通させると、フィルターに捕捉されている白血球も除去される虞がある。このため、上記の洗浄液は、上記のフィルターに３往復以下にわたって往復通過させるのが好ましい。
【００１５】
上記の試料液や洗浄液を上記のフィルターに往復通過させる具体的構造としては、特定の構造に限定されないが、上記の連通路に液体を貯留できる貯留室を形成し、この貯留室と上記の入口との間に上記のフィルターを配置することで構成することができる。この場合、上記の入口は、さらに廃液部とタンパク質回収容器とに選択的に切換え接続可能であると、洗浄後の排液をこの廃液部へ排出でき、また、白血球タンパク質を溶出させたタンパク質溶解液を上記のタンパク質回収容器へ回収することができ、好ましい。
【００１６】
上記の圧力調整手段は、連通路内の圧力を加圧若しくは減圧できるものであればよく、特定の構造のものに限定されない。例えばこの圧力調整手段を、上記の連通路または上記の貯留室内で保密状に進退摺動可能なピストン体から構成すると、この圧力調整手段を簡単に構成できて好ましい。この場合、汎用のシリンジの先端にフィルターを備えた容器の一端を連結するとともに、その容器の他端に試料液供給手段等を接続し、シリンジのピストンを押し引きすることで、試料液を吸引・排出して、容器の内のフィルターに試料液等を往復通過させることができる。しかし、シリンジの先端に形成された針装着部で上記の入口を構成し、このシリンジの筒体内に上記の貯留室を形成するとともに、この貯留室の先端側に上記のフィルターを配置し、貯留室の後端側に上記のピストン体を配置すると、汎用のシリンジの筒体内にフィルターを配置するだけで、上記の回収装置をきわめて簡単に構成できて好ましい。
【００１７】
さらに上記のピストン体は、手動により進退可能に構成してもよく、この場合は回収装置を簡略に構成でき、安価に実施できて好ましい。しかし本発明では、上記の圧力調整手段を駆動手段に連動連結し、この駆動手段の駆動により上記の連通路内の圧力を制御するように構成してもよい。この場合は白血球タンパク質の回収を自動化でき、作業者の負担を軽減できるうえ、一定の操作により白血球タンパク質の回収精度を高めることができて好ましい。
【００１８】
一方、上記の試料液を収容した試料液容器や、洗浄液容器、溶出液容器、廃液容器、タンパク質回収容器等を一体化し、手動や電動で各容器を移動操作できる小形機器として組み立てれば、これらの各容器と上記の回収装置の入口とを切換え可能に接続することで、同時並行で数多く（たとえば１００〜１０００件）の試料液を、簡単な操作で短時間に処理することができる。
【００１９】
さらには１ｍｍ四方のフィルターを使うなどして全システムを超小形化して、一滴(約０.０５ｍＬ)の血液を試料として調製することも可能である。例えば、上記の入口と連通路をラブオンナチップ(Lab On a Chip)に形成するとともに、このラブオンナチップに上記の圧力調整手段を設けると、回収装置を小形にできるうえ、きわめて簡単な操作で素早く回収して、例えば白血球に含まれるウィルス等を簡単に検出でき、好ましい。
【００２０】
なお、上記のタンパク質溶解液は特定の成分に限定されず、例えば、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤の有効量を含む溶液などが用いられる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明方法及び装置によれば、市販されている汎用などの白血球除去フィルターを用いた簡略な装置により、きわめて簡単な操作で、しかも例えば１０分程度等の短時間に、試料液中の白血球を赤血球や血球以外の夾雑物質(夾雑タンパク質など)から実質的に分離して、この捕捉した白血球のタンパク質を溶出させ回収することができる。これにより、例えばインフルエンザに罹病した患者の血液から、すばやくインフルエンザウイルスを検出できるなど、血液検査を迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施形態を示す、白血球タンパク質の回収装置の断面図である。
【図２】第１実施形態の操作手順を示し、図２(Ａ)は補足工程の説明図、図２(Ｂ)は洗浄工程の説明図、図２(Ｃ)は溶出工程の説明図である。
【図３】培養したヒト単球細胞株(MONO-MAC-6)について、１〜１０枚のフィルターを備えた本発明装置により、そのフィルターに２往復通過させた排出分画の解析結果を、フィルターを通過させなかった場合と比較して示す図である。図３(Ａ)は、フィルターに捕捉されなかった細胞数をFACSによりカウントした結果であり(n=4)、図３(Ｂ)は、フィルターに捕捉されなかった細胞から溶出した抽出液5μL（10分の1量）を用い、GAPDHをウエスタンブロット解析により検出した結果であり、図３(Ｃ)は、フィルターに捕捉された細胞から溶出した抽出液16〜18.7μL (20分の1量)を用い、GAPDHをウエスタンブロット解析により検出した結果である。
【図４】ヒト培養単球MONO-MAC-6細胞について、５枚のフィルターを備えた本発明装置により、そのフィルターに１〜5往復させた各排出分画の解析結果を、フィルターを通過させなかった場合と比較して示す図である。図４(Ａ)は、フィルターに捕捉されなかった細胞数をFACSによりカウントした結果であり(n=4)、図４(Ｂ)は、ウエスタンブロット解析により、フィルターに捕捉されなかった細胞から溶出したタンパクからGAPDHを検出した結果であり、図４(Ｃ)は、ウエスタンブロット解析により、フィルターに捕捉された細胞から溶出したタンパクからGAPDHを検出した結果である。
【図５】１〜１０枚のフィルターを備えた本発明装置により、そのフィルターに１往復通過させたヒト血液の血球数カウント結果を、フィルターを通過させなかった場合と比較して示す図である。図５(ａ)は白血球数(WBC)を、図５(ｂ)はリンパ球数(LY#)を、図５(ｃ)は単球数(MO#)を、図５(ｄ)は好中球数(NE#)を、図５(ｅ)は血小板数(PLT)を、図５(ｆ)は赤血球数(RBC)を、それぞれ示す。なお図中、5x5*はフィルターを５枚重ねて吸引・排出を5回繰り返したときの、5回目の排出分画の血球数カウント結果を示す。また、各棒グラフは３本のサンプルを独立に測定して算出した平均値を示す。
【図６】５枚のフィルターを備えた本発明装置により、そのフィルターに１〜５往復通過させた各排出分画の血球数カウント結果を、フィルターを通過させなかった場合と比較して示す図である。図６(ａ)は白血球数(WBC)を、図６(ｂ)はリンパ球数(LY#)を、図６(ｃ)は単球数(MO#)を、図６(ｄ)は好中球数(NE#)を、図６(ｅ)は血小板数(PLT)を、図６(ｆ)は赤血球(RBC)を、それぞれ示す。なお、3b*はPBSによる洗浄を通常の２倍の４往復行った結果である。また、各棒グラフは３本のサンプルを独立に測定して算出した平均値を示す。
【図７】本発明装置を通過したヒト血液細胞のウエスタン解析結果を、フィルターを通過させなかった場合と比較して示す図である。図７(Ａ)は、各フィルターに１往復通過させたヒト血液(４mL)について、そのフィルターに捕捉された細胞から溶出した全抽出液500μLのうち10μL(50分の1量)を用い、GAPDH, FCN1, Erk1/2を検出した結果を示す図である。5x5*は５枚重ねたフィルターに５往復通過させた場合の結果である。図７(Ｂ)は、５枚のフィルターに１〜５往復通過させた各排出分画の全抽出液500μLのうち10μL(50分の1量)を用い、GAPDH, FCN1, Erk1/2を検出した結果を示す図である。3b*はPBSによる洗浄を通常の２倍の４往復行った結果である。レーン７，８は従来法に従い血液(４mL)からフィコールクッションを用いた遠心操作で赤血球を除去して白血球成分を調製し、全抽出液50μL のうち2μL (25分の1量)あるいは10μL (5分の1量)を用い、GAPDHとFCN1を検索した結果である。FCN1は検出できたが、GAPDHは検出できなかった。
【図８】本発明の第２実施形態を示す、白血球タンパク質の回収装置の概略構成図である。
【図９】本発明の第３実施形態を示す、白血球タンパク質の回収装置の概略斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
図１と図２は本発明の第１実施形態を示し、図１は白血球タンパク質の回収装置の断面図であり、図２は白血球タンパク質の回収方法の操作手順を示す概略構成図である。
【００２４】
図１に示すように、この回収装置(１)は、血球を含む試料液から白血球のタンパク質を回収するための装置であり、試料液を受け入れる入口(２)と、この入口(２)に連通する連通路(３)と、この連通路(３)内の圧力を調整する圧力調整手段(４)とを備え、この連通路(３)に貯留室(５)が形成してある。この回収装置(１)は汎用のシリンジを利用して構成してあり、このシリンジの先端部に形成された針装着部(６)に上記の入口(２)が開口され、このシリンジの筒体(７)内に上記の貯留室(５)が形成され、この貯留室(５)内で保密状に且つ進退摺動可能に配置された、上記の圧力調整手段を構成するピストン体(４)が配置してある。
【００２５】
上記の入口(２)とピストン体(４)との間には、上記の貯留室(５)の先端側にフィルターカセット(８)が、上記の連通路(３)を遮断する状態に配置してある。このフィルターカセット(８)は、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)を、一対のフィルター保持部材(10)間に挟持してある。このフィルター(９)は、生化学用フィルターとして公知のフィルター材料を含むものを用いることができる。このような材料としては、例えばニトロセルロース、ポリカーボネート、ポリエステルなどが挙げられるが、これらの材料に限定されるものではない。またこのフィルター(９)は、市販のいわゆる白血球除去フィルターを用いることができ、例えば、具体的にはリューコトラップ(Leukotrap；PALL Co.Ltd.社製、商品名)などを挙げることができる。
【００２６】
上記のフィルター(９)は、例えば直径約１ｃｍなど、上記の貯留室(５)の内径に対応した大きさに形成されており、好ましくは約６〜９μｍの孔径を有し、より好ましくは、約７〜８μｍの孔径を有する。これらの孔径の範囲であれば、目的とする白血球を効率よく捕捉できるうえ、赤血球を捕捉することがなく、また適度な吸引力でスムースに試料液を通過させることができる。なお上記の孔径は、必要に応じて血小板を捕捉できる大きさに設定してもよく、或いは血小板を通過させる大きさに設定してもよい。
【００２７】
上記のフィルター(９)は１枚のみで用いてもよく、或いは例えば２０枚程度以下の複数枚を重ねて用いてもよい。この場合、１０枚以下で用いるのが好ましく、３〜５枚程度を重ねたものがさらに好ましい。これらの枚数の範囲であれば、十分に白血球を捕捉できるとともに、適度な吸引力でスムースに試料液を通過させることができる。
なお、複数枚のフィルター(９)を重ねて用いる場合、各フィルター(９)は実質的に間隙を有さず互いに密着させてもよく、或いはそれらの間に約０．１〜０．５ｍｍの間隙を形成したものであってもよいが、間隙がない方が好ましい。
【００２８】
上記のピストン体(４)は、後方にプランジャー(11)が接続してあり、作業者はこのプランジャー(11)を手動で操作することにより、上記のピストン体(４)を貯留室(５)内で保密状に、フィルター(９)に対し進退摺動させることができる。なお、本発明ではこのプランジャー(11)を駆動装置に連動して、ピストン体(４)を機械的に進退させることも可能である。
【００２９】
次に、図１と図２に基づいて、上記の回収装置を用いる白血球タンパク質の回収方法について説明する。
図１と図２に示すように、上記の入口(２)は、注射針(12)を介し、試料液収容容器(13)と洗浄液収容容器(14)と溶解液収容容器(15)とに選択的に切換え接続可能であり、さらに廃液容器(16)とタンパク質回収容器(17)とに選択的にも切換え接続可能である。
【００３０】
（Ｉ）白血球の捕捉工程
最初に、図２(Ａ)に示す捕捉工程(S1)で、血球を含む試料液が収容された試料液収容容器(13)に、注射針(12)を介して上記の回収装置(１)の入口(２)を接続する。そして上記のプランジャー(11)でピストン体(４)を後退させることにより、貯留室(５)内を減圧して試料液を吸入したのち、ピストン体(４)を前進させることにより、貯留室(５)内を加圧して貯留室(５)内の試料液を試料液収容容器(13)内に排出する。この捕捉工程(S1)の操作により、上記の試料液は上記のフィルター(９)を往復通過し、試料液中の赤血球はこのフィルターを通過するが、白血球はこのフィルター(９)に捕捉される。このとき、試料液は上記の入口(２)を介して貯留室(５)内に出入りするので、この貯留室(５)に他の出口等を設ける必要がなく、回収装置(１)を簡略に構成できるうえ、ピストン体(４)を進退させるという、きわめて簡単な操作で白血球をフィルター(９)に捕捉することができる。
【００３１】
上記の血球を含む試料としては、血液、骨髄液、尿などが挙げられる。１度にこの捕捉工程(S1)に供することができる試料液量は特に制限されないが、少量でも充分な白血球を捕捉できるので、例えば１〜１０mL程度とすればよい。また、ナノサイズの装置を用いる場合は、１〜数滴程度（１滴は２〜１０μl程度）とすることもできる。
【００３２】
上記の回収装置(１)は試料液を吸入し排出するため、この試料液の往動と復動の際に、それぞれ白血球がフィルター(９)に捕捉されるので、少量の試料液から効率よく白血球を捕捉することができる。しかし、本発明においては、試料液は往動や復動のみであってもよく、さらには往復動において、その直前又は直後に１回の「往動」又は「復動」が加わってもよい。
【００３３】
上記の試料液は、フィルター(９)に１往復以上通過させるのが好ましく、２往復以上通過させるのがより好ましい。即ち、上記の貯留室(５)内から注射針(12)を介して試料液収容容器(13)に排出された試料液は、再度、ピストン体(４)の進退移動で貯留室(５)内に吸入されたのち、試料液収容容器(13)に排出される。このピストン体(４)の往復動は、多い方が白血球の捕捉という本発明の目的を達成し易いデータがある(図７のFCN1参照。)ものの、余りに通過回数が多いと試料が泡立ち、扱い難くなるため、通常、上限は５往復程度とされる。
【００３４】
上記のピストン体(４)の進退移動により、上記の貯留室(５)内の圧力が調整されて、上記の試料液がフィルター(９)を通過する際の速度や圧力は、特定の値に限定されないが、フィルター(９)が損傷しない程度であるとともに、フィルター(９)を通過する赤血球が破壊されない程度に設定される。例えば、上記のフィルターカセット(８)を挟んで、上記の貯留室(５)と入口側連通路(３)との間に、０.１ＭＰａ以下での所定の差圧が生じるように設定される。これにより、過剰な圧力による赤血球の破壊が防止され、しかも、試料液がフィルター(９)を円滑に通過できる。
以上の操作により、赤血球やその他の夾雑物の捕捉を抑えて、フィルター(９)に白血球が効率よく捕捉される。
【００３５】
（II）洗浄工程
次いで、図２(Ｂ)に示す洗浄工程(S2)で、上記のピストン体(４)をプランジャー(11)で操作することにより、洗浄液収容容器(14)から注射針(12)を介して洗浄液を貯留室(５)内へ吸引したのち、貯留室(５)内の洗浄液を廃液容器(16)内に排出する。この洗浄工程(S2)の操作により、上記の白血球を捕捉したフィルター(９)に洗浄液が往復通過し、この結果、フィルター(９)をはじめフィルター保持部材(10)、貯留室(５)の内面、ピストン体(４)の前面などに付着した赤血球や、血球以外の夾雑物質が洗浄されて除去される。この洗浄工程(S2)に用いる洗浄液としては、緩衝液、生理食塩水、緩衝液−生理食塩水などが挙げられる。具体的には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。中でも生理食塩水が好ましい。緩衝液はｐＨ７〜８程度に調整したものを用いればよいがｐＨ７.５がより好ましい。
【００３６】
上記のフィルター(９)に対する洗浄液の通過は特定の回数に限定されないが、３往復以下が好ましく、２往復に設定するのがより好ましい。上記範囲であれば、目的とする白血球をフィルター(９)に捕捉した状態で、赤血球などを効果的にフィルター(９)から除去できる。これに対し３往復よりも回数を増やすと、目的とする白血球もフィルター(９)から離脱して除去される虞が生じる。実際、４往復ではフィルター(９)等から赤血球の大半が除かれるものの、白血球タンパク質も大半が失われていた(図５Ｂ，３ｂ＊参照)。
以上の操作により、上記のフィルター(９)に試料中の白血球が選択的にかつ効率よく捕捉されたまま、しかもこのフィルター(９)から赤血球が効率よく除去される。
【００３７】
（III）白血球タンパク質の溶出工程
次いで、図２(Ｃ)に示す溶出工程(S3)で、注射針(12)を介して上記の回収装置(１)の入口(２)を溶解液収容容器(15)に接続する。そして、上記のピストン体(４)をプランジャー(11)で操作することにより、この溶解液収容容器(15)からタンパク質溶解液を貯留室(５)内に吸入したのち、この貯留室(５)内の溶解液をタンパク質回収容器(17)内へ排出する。この溶出工程(S3)の操作により、上記のフィルター(９)にタンパク質溶解液が１往復通過し、このフィルター(９)に捕捉されている白血球の細胞膜が溶解されて、そのタンパク質が溶解液中に溶け出し、タンパク質回収容器(17)内に効率よく回収される。そしてこのタンパク質回収容器(17)は次工程で凍結され、或いは検査工程で上記の回収された白血球タンパク質が検査される。
【００３８】
なお、上記のフィルター(９)に捕捉された白血球のタンパク質は、タンパク質溶解液をこのフィルター(９)に再度往復通過させてさらに多くの白血球タンパク質を回収することも考えられる。しかしこの場合はタンパク質回収容器(17)内に回収される液量が不必要に増えるので、上記の溶出工程(S3)では、タンパク質溶解液を上記のフィルター(９)に１往復のみ通過させるのが好ましい。
【００３９】
上記のタンパク質溶解液は、水溶性タンパク質のみでなく細胞膜や疎水性タンパク質までも溶解させることができる成分を有効量含んでいることが重要である。これらを溶解させることができる成分としては、例えば、界面活性剤が挙げられる。中でも、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤は、Triton X、Pluronic、Tweenなどの商品名で市販されている。界面活性剤のタンパク質溶解液中の濃度は約０.１〜２ｗ/ｖ％が好ましく、約０.５〜１ｗ/ｖ％がより好ましい。
【００４０】
上記のタンパク質溶解液は中性に調整したものを用いればよいが、ｐＨ７.５がより好ましい。また、タンパク質分解阻害剤やタンパク質分解阻害タンパク質を含むことが好ましい。また、塩(ＮａＣｌ)やキレート剤(ＥＤＴＡ)を含むことも好ましい。これらを考慮して、例えばTNETと名付けた以下の組成を持つタンパク質溶解液が特に好ましいものとして挙げられる。ここにTNETは以下の組成を持つ： 10mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 1% TritonX-100, 1mM EDTA(pH8.0), 0.1mg/mL PMSF, 1mM Aprotinin, 0.001mg/mL Leupeptin, 0.001mg/mL pepstatin A, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 10mM β-glycerophosphate。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
最初に、各実施例で行った実験方法と操作について説明する。
(1)細胞培養
MONO-MAC-6をRPMI1640培地へ20%FBS、2mM L-glutamine、1mM sodium pyruvate、10μg/mL human insulin、Penicillin-Streptomycinを添加した培地で37℃、5% CO2インキュベーターで培養した。実験には、10cm dishでLog phaseまで培養したものを使用した。
【００４３】
(2)MONO-MAC-6細胞の解析
ヒト単球系培養細胞であるMONO-MAC-6細胞懸濁液(全量は１０mL：約１x１０７個の細胞数)を、上記のフィルター(１,３,５,７,１０枚)を備えた回収装置(１)でそれぞれ２回ずつ吸引・排出を繰り返し、２回目の排出液を別個に１５mLコニカルチューブ(合計６本)へ移した。なお、上記のフィルターを備えない回収装置(フィルター：０枚)を同様に操作して比較例とした。それぞれのコニカルチューブ内を別個にピペッティングにより混ぜたのち、１５mLコニカルチューブ２本（合計１２本）へ分注した。一方、他の比較例としての未処理群(NT)については、細胞懸濁液(全量は１０mL)をピペッティングにより混ぜた後、１５mLコニカルチューブ２本へ５mLずつ分注した。各群、２本のうち１本は、1000rpm×５min,２５℃で遠心後、上清を除き、PBS５mLを加え、1000rpm×５min,２５℃で遠心後、PBSを除いた。次いで、タンパク質溶解液(TNET)を５０μL加え、ピペッティングにより混ぜた後、２×Sample buffer を５０μL加えた。
【００４４】
ここに、上記のTNETは以下の組成を持つ： 10mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 1% TritonX-100, 1mM EDTA(pH8.0), 0.1mg/mL PMSF, 1mM Aprotinin, 0.001mg/mL Leupeptin, 0.001mg/mL pepstatin A, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 10mM β-glycerophosphate。これらを７分間 煮沸し、−３０℃で保存した。この一部をウエスタン解析に使用した。他の１本については、1000rpm×５min,２５℃で遠心後、上清を除き、CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit(BECTON DICKINSON)に添付されてあるプロトコールに従い、PI (Propidium iodide)染色を行った。FACS (fluorescence activated cell sorting)による解析を行う前に、ナイロンメッシュ(３００μm)で濾過し、このうち１０μLをBuffer Solution ９０μLと混ぜたものを各群４本ずつ用意し、細胞数カウントを４回行って平均値を算出した。また、DNAヒストグラム解析により、細胞のDNA量のピークを確認した。
【００４５】
(3)ウエスタンブロッティング
フィルターに捕捉されなかったMONO-MAC-6細胞からTNETによって溶出したタンパク質を１０μL使用して、１０%SDS-polyacrylamide gelで電気泳動を行い、Immobilon-P Transfer membrane(Millipore)へ転写した。０.０５% Tween-20が入ったTBS(TBST)へSkim milkが５%になるよう溶かしたバッファー(５%Skim milk/TBST)へメンブレンを４℃、一晩浸し、ブロッキングを行った。１次抗体は、室温で３時間反応させ、反応終了後、TBSTで３回洗浄した。２次抗体は室温で１時間３０分反応させた後、TBSTで３回洗浄した。次いで、各メンブレンをWESTERN LIGHTNING Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Science, Inc.)へ浸し、FUJI MEDICAL X-RAY FILM(富士フィルム株式会社)へ感光した。
【００４６】
使用した１次抗体は、５%Skim milk/TBSTで５００倍希釈したanti-GAPDH mouse IgG(final 13μg/mL, Clone#6C5, Fitzgerald)、Can Get Signal Solution 1(TOYOBO)で５００倍希釈したanti-α-Erk1/2ポリクローナル抗体(1:500,Cell Signaling TECHNOLOGY)、５%Skim milk/TBSTで２５０倍希釈したanti-α-FCN1ポリクローナル抗体(final 0.76μg/mL,ATLAS Antibodies)である。２次抗体は、５%Skim milk/TBSTで５００倍希釈したHRP-mouse IgG Fc(Cappel)、Can Get Signal Solution 2(TOYOBO)で１０００倍希釈したHRP-conjugated goat affinity purified antibody to rabbit IgG Fc(final 0.6μg/mL,cappel)、あるいは、５% Skim milk/TBSTで1000倍希釈したHRP-conjugated goat affinity purified antibody to rabbit IgG Fc (final 0.6μg/mL,cappel)を使用した。
【００４７】
(4)血球分布
真空採血管を用い、２mLずつ合計１６本採血した。各群(未処理群(NT)、フィルター０枚、１枚、３枚、５枚、７枚、１０枚)に４mL(２mL×２本)の血液を使用した。まず未処理群(NT)については、血液４mLを転倒混和により混ぜた後、エッペンチューブ３本へ分注し、全自動血球カウンター(コールター Model S-Plus)により血球分布データを３回とって平均値を算出した。また、血液４mLをフィルター(１,３,５,７,１０枚)が入った上記の回収装置およびフィルターを備えない回収装置(フィルター：０枚)でそれぞれ吸引し、１５mLコニカルチューブへ移し、転倒混和により混ぜた後、エッペンチューブ３本へ分注して、血液分布データを各群３回とった。また、吸引・排出を繰り返すことでフィルターへより多くの細胞を捕捉させることができるかどうかを調べるために、フィルター５枚を装着した上記の回収装置で、血液４mLの吸引・排出を５回繰り返したものについても、同様に血球分布データをとった。
【００４８】
(5)フィルターに捕捉された全血液細胞の溶出
フィルターをPBS５mLの吸引・排出を２回繰り返すことで洗浄し、０.５mLのTNETで全タンパク質を溶出した。タンパク質が溶出された溶解液はエッペンチューブ２本へ分注し、一方へは１００% glycerolを最終濃度20%になるように加え、４℃にて回転混濁させて混ぜ、−８０℃で保存した。もう一方へは４×Sample Bufferを加え、７分間煮沸し、−３０℃で保存した。このうち一部、たとえば１０μL(全量の1/35〜1/27)を、ウエスタン解析に使用した。
【実施例１】
【００４９】
ヒト培養単球を用いて２回吸引・排出した場合
マクロファージ由来のヒト培養単球(monocyte)を１０cmシャーレで培養して、同じ数量(１０cmシャーレ１枚分：およそ100万個の細胞)の細胞を準備し、フィルター数を１，３，５，７或いは１０枚を備えたそれぞれの回収装置(１)で吸引したのち排出して、１５mLコニカルチューブに集めてFACS解析とウエスタン解析をした。またフィルターを備えていない回収装置(フィルター：０枚)でも同様に操作してFACS解析とウエスタン解析をした。
【００５０】
FACS解析により、フィルターに捕捉されなかった細胞のDNAヒストグラム解析を行い、各群のDNA量(細胞数)のパターンを比較したところ、図３(Ａ)に示すように、フィルターを通過させない比較例(NT,0枚)に比べて、フィルターを通過させた場合は、フィルターに捕捉されなかった細胞数が少なくなっていた。しかもフィルター数が１〜１０枚と増えるにつれてフィルターに捕捉されなかった細胞数が漸減していた。図３(Ａ)中の右上に示したFACSパターン(５枚フィルター使用の場合)は、使用した細胞が健常に増殖していたことを示している。
【００５１】
また、GAPDH(どの細胞でも発現している解糖系酵素), 及びErk1/2(増殖細胞に発現しているシグナル伝達因子)に対する抗体を用いてウエスタン解析したところ、図３(Ｂ)と図３(Ｃ)に示すようにFACS解析の結果と合致した傾向に従い、フィルター数が１〜１０枚と増えるにつれてバンドの強度(これら抗原タンパク質を反映する)が漸減していた。
【００５２】
一方、フィルターに捕捉された細胞は０.５mlのタンパク質溶解液(TNET)を吸引して溶出し、その一部をウエスタン解析した。その結果、図３(Ｃ)に示すように、フィルター数が１枚や３枚では捕捉されるタンパク質の量は少ないが、５枚以上では上記のいずれの抗原に対しても大差なく十分な量が捕捉されていた。フィルター数が７枚や１０枚の場合は分厚くて細胞吸引・排出が滑らかでないこと、３枚では捕捉されないタンパク質もある可能性を考慮すると、これらの結果はフィルター数５枚が適量であることを示唆すると判断した。
【実施例２】
【００５３】
ヒト培養単球を用いて１〜５回吸引・排出した場合
次に上記の回収装置(１)に備えたフィルター数を５枚に固定して、吸引・排出回数による捕捉量の変動を調べた。FACS解析の結果、図４(Ａ)に示すように、フィルターに捕捉されなかった細胞数は吸引・排出の往復回数が１〜５回と増すにつれて漸減していた。
【００５４】
一方、ウエスタン解析の結果は、たとえばGAPDHについて、図４(Ｂ)に示すように捕捉されなかった分画では回数が増すにつれて漸減していたが、逆に捕捉された分画では、図４(Ｃ)に示すように回数が増すにつれて漸増していた。Erk1/2についても、同様の結果が得られた。手間を惜しまなければフィルターを通過させる回数は多い方が良いことが示唆されるが、回数が増えるにつれて泡がでてタンパク質が変性するなど、何かと不便な現象を生じるので、手作業では５回くらいが限度であると考えられる。ただし、これらの操作を機械化した場合には、回数を増やせるかどうかの検討をする価値があることを示唆している。
【実施例３】
【００５５】
ヒトの血液を用いた場合(血球数カウント)
次にヒトの血液を用いて、フィルター枚数を変えて１回ずつ吸引・排出した場合について調べた。まず、フィルターに捕捉されなかった血球細胞数を、その場で自動血球カウンターにより測定したところ、図５に示すように、WBC(白血球数)、LY#(リンパ球数）、MO#(単球数)、NE#(好中球数)、PLT(血小板数)が、いずれもフィルターの枚数が増えるにつれて漸減していた。すなわちこれらの血液細胞は、上記の回収装置(１)によって捕捉されたことを示唆している。これに対しRBC(赤血球数)については変化がなく、期待通り上記の回収装置(１)は赤血球を素通りさせるという優れた機能を持つことが示唆された。なお、これらの測定値において、標準誤差(SE)は極めて低かった。その他の微量な血液細胞は数値が小さいので信頼のおける測定値は得られなかった。
【００５６】
興味深いことに、フィルター数を５枚装着した回収装置(１)を用いてフィルター通過回数を１往復から５往復に増加させると、フィルター数が１０枚の場合と同等な値が得られた(図５の各グラフの右端の棒グラフ、5x5*参照。)。
そこで次に、フィルター数を５枚に固定して、吸引・排出回数による捕捉量の変動を調べたところ、図６に示すように、３往復まではいくつかの細胞で漸減していたが、それ以上は大差がなかった。図６においても標準誤差(SE)は極めて低かった。一方、４往復以上フィルターを通過させると、血液の場合には引っかかりが生じて吸引・排出動作が重くなり、ピストン体(４)の操作性が低下する。これらの結果から、４往復以上フィルターを通過させることは現実的ではないと判断した。
【実施例４】
【００５７】
ヒトの血液を用いた場合(ウエスタン解析)
次に、上記の結果をウエスタン解析で確認した。まず、図７(Ａ)に示すように、GAPDHについてはフィルター枚数が０枚の比較例にあっても、他と同等な強度のバンドが観察された。これは血液中に大量に存在する赤血球内のGAPDHが、回収装置(１)のフィルター保持部材(10)や貯留室(５)の内面等に残存していたためと考えられる。なぜなら、赤血球以外のヒト血液細胞の一部に存在する補体制御に関わるFCN1は、期待通りフィルター数３枚以上で初めて検出されているからである。
【００５８】
興味深いことにFCN1は、フィルター数が１０枚のとき大量に捕捉されていたが、フィルター数が５枚でも５往復通過させれば、同等な捕捉が実現できていた。そこで、フィルター数を５枚に固定して、フィルター(９)を通過数による捕捉量の変動を調べたところ、図７(Ｂ)に示すように、やはり３回まではバンド強度が漸増していたが、それ以上は大差なかった。
【００５９】
ところで、最初に設定したPBSによる２回の洗浄では赤血球がいくらか残存して排出液が赤い。そこで、排液の赤みがほとんど消えるまで洗浄回数を増加させ、洗浄液を４往復通過させてウエスタン解析したところ、GAPDHのみでなくFCN1も大量に消失した。やはり２回の洗浄が最適であろうと考えられる。
【００６０】
上記の回収装置による捕捉効率を調べるため、通常のフィコールクッションを用いて遠心操作で赤血球を除去して白血球成分を調製する従来の方法と比較した。その結果、従来法では主として赤血球由来のGAPDHは検出できなかった。これは従来法での赤血球の混入は極めて低いことを示す。しかしFCN1量に関しては本発明装置による方法が高い捕捉効率を有していた。実際、従来法での２μＬは血液０.１６ｍＬに相当するが、それより２倍程度強いFCN1バンド強度を示す本発明装置による捕捉されたサンプルは、血液０.０８ｍＬに相当するのである。すなわち本発明装置と方法を用いれば、従来法の４倍量の抽出液が調整できることを意味する。この結果は、その迅速さと簡便さを考慮すると、本発明の回収方法と回収装置が極めて優れた技術であることを示す。
【００６１】
上記の第１実施形態では、上記のピストン体(４)を手作業で進退移動させた。しかし本発明では、このピストン体(４)を機械的に自動制御することも可能である。
即ち、図８に示す第２実施形態では、シリンジを用いた回収装置(１)のピストン体(４)に、駆動装置(18)がプランジャー(11)を介して連動連結してあり、この駆動装置(18)によりピストン体(４)が、貯留室(５)内に装着されたフィルター(９)に対し、機械的に進退移動される。
【００６２】
一方、上記の回収装置(１)の入口(２)に対面させて、容器収容部(19)が設けてある。この容器収容部(19)には、試料液収容容器(13)と、試料液廃棄容器(20)と、洗浄液収容容器(14)と、洗浄液廃棄容器(16)と、溶解液収容容器(15)と、タンパク質回収容器(17)が配置されている。各容器は、この容器収容部(19)内で例えばロータリー状に配置され、互いに移動することで、上記の回収装置(１)の入口(２)に対し、選択的に対面させることができる。
【００６３】
上記の回収装置(１)は、例えばこの回収装置全体を進退させることにより、上記の容器収容部(19)に対し相対的に接近・後退させることが可能である。なお本発明では、容器収容部(19)を進退させることにより、この容器収容部(19)を上記の回収装置(１)に対し相対的に接近・後退させてもよい。上記の白血球タンパク質回収装置(１)の他の構成については、上記の第１実施形態と同様に構成され、同様に作用するので説明を省略する。
【００６４】
次に、上記の回収装置(１)により白血球タンパク質を回収する手順について、図８に基づき説明する。
最初に、容器収容部(19)に収容された試料液収容容器(13)を、上記の回収装置(１)の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させて、注射針(12)をこの試料液収容容器(13)に刺通させ、入口(２)を試料液収容容器(13)に連通させる。そして上記の駆動装置(18)によりピストン体(４)を後退させ、試料液収容容器(13)内の試料液を、回収装置(１)の貯留室(５)内に吸入し、次いで、ピストン体(４)を前進させて、この貯留室(５)内の試料液を試料液収容容器(13)に排出する。この往復動作を所定回数、例えば２〜５往復繰り返したのち、最後の排出の前に回収装置(１)を後退させ、試料液廃棄容器(20)を上記の入口(２)に対面させる。そして回収装置(１)を前進させて注射針(12)を試料液廃棄容器(20)に刺通したのち、ピストン体(４)を前進させて、貯留室(５)内の試料液を試料液廃棄容器(20)に排出する。この試料液の往復動により、試料液に含まれる白血球が上記のフィルター(９)に捕捉される。なお、上記の試料液収容容器(13)は空になっており、後ほど廃棄される。
【００６５】
次に、上記の回収装置(１)を後退させたのち、洗浄液収容容器(14)を上記の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させる。これにより上記の入口(２)が注射針(12)を介して洗浄液収容容器(14)に連通するので、ピストン体(４)を後退させて洗浄液を貯留室(５)内に吸入する。次いで、回収装置(１)を後退させて、洗浄液廃棄容器(16)を上記の入口(２)に対面させたのち、回収装置(１)を前進させて注射針(12)を介して入口(２)を洗浄液廃棄容器(16)に連通させる。そして、ピストン体(４)を前進させて、貯留室(５)内の洗浄液をこの洗浄液廃棄容器(16)内に排出する。この洗浄液の吸入と排出は、例えば２回繰り返すが、この吸入と排出の際に洗浄液がフィルター(９)を通過し、フィルター(９)に付着している赤血球などが除去させる。
【００６６】
次に、上記の回収装置(１)を後退させたのち、溶解液収容容器(15)を上記の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させる。上記の入口(２)が、注射針(12)を介して溶解液収容容器(15)に連通するので、ピストン体(４)を後退させ、タンパク質溶解液をフィルター(９)に通過させて貯留室(５)内に吸入する。これにより、フィルター(９)に捕捉されている白血球の細胞膜が溶解し、そのタンパク質が溶解液中に溶出する。次いで、回収装置(１)を後退させたのち、タンパク質回収容器(17)を上記の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させてこの入口(２)をタンパク質回収容器(17)に連通させる。そして、ピストン体(４)を前進させて、上記のタンパク質が溶出した溶解液を、タンパク質回収容器(17)内に送り出す。その後、上記の回収装置(１)を後退したのち、上記のタンパク質回収容器(17)を容器収容部(19)から取り出し、次工程で冷凍保存し、或いは検査工程で白血球タンパク質を検査する。
【００６７】
図９は本発明の第３実施形態を示す、白血球タンパク質の回収装置の概略構成図である。
この第３実施形態では、回収装置(１)がラブオンナチップ(Lab On a Chip)に形成されており、その表面に入口(２)が開口され、この入口(２)を横断する状態に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)が配置してある。上記の入口(２)は、ラブオンナチップ(21)内に形成された図示しない連通路に連通されており、このラブオンナチップ(21)に設けた圧力調整手段(４)により、この連通路内の圧力を減圧できるように構成してある。
【００６８】
上記の回収装置(１)を用いて血液等の試料液を検査する場合、上記の入口(２)から上記のフィルター(９)上に１滴若しくは数滴の試料液を滴下する。これにより試料液はフィルター(９)に吸着される。次いでこのフィルター(９)に洗浄液を滴下し、上記の圧力調整手段(４)を操作してこの洗浄液を吸引する。その後、上記のフィルター(９)にタンパク質溶解液を滴下して、フィルター(９)に捕捉されている白血球タンパク質をこの溶解液に溶出させ、上記の圧力調整手段(４)を操作してこの溶出液を吸入したのち、このラブオンチップ(21)上でタンパク質等を分析する。
【００６９】
上記のフィルター(９)は、１滴または数滴の試料液から白血球を捕捉できればよく、例えば直径１mm程度の広さがあれば十分であり、従って回収装置全体をきわめて小形に形成することができる。
【００７０】
上記の実施形態で説明白血球タンパク質の回収方法やこれに用いる回収装置は、本発明の技術的思想を具体化するために例示したものであり、各装置の形状や寸法、材質、構造、操作手順などをこの実施形態のものに限定するものではなく、本発明の特許請求の範囲内において種々の変更を加え得るものである。
【００７１】
例えば、上記の第１実施形態や第２実施形態では、シリンジを利用して回収装置を構成したので、安価に実施できるが、本発明ではより適切な専用装置を製作するなどして他の形状に形成したものであってもよい。また上記の実施形態では、圧力調整手段をピストン体で構成したので、簡単な構成で連通路内の圧力を容易に調整できるが、本発明では、例えばエアーポンプなど、他の圧力調整手段を用いることも可能である。この場合、上記の駆動手段として、ポンプを駆動するモータなどが適用される。また上記の第１実施形態や第２実施形態では、注射針を介して上記の入口を試料液供給手段等に連通させたので、簡単な構成で容易に切換え接続できたが、本発明ではチューブや配管など、他の構成により切換え可能に連通させてもよい。さらに、本発明で使用する上記のフィルターの種類や枚数などは、上記の実施形態のものに限定されないことは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明方法及び装置は、臨床検査や実験室において、血球を含む試料から白血球を分離するのに好適に使用できる。
【符号の説明】
【００７３】
１…白血球タンパク質の回収装置
２…入口
３…連通路
４…圧力調整手段(ピストン体)
５…貯留室
６…針装着部
７…筒体
９…フィルター
10…フィルター保持部材
13…試料液供給手段(試料液収容容器)
14…洗浄液供給手段(洗浄液収容容器)
15…溶解液供給手段(溶解液収容容器)
16…廃液部(廃液容器、洗浄液廃棄容器)
17…タンパク質回収容器
18…駆動手段(駆動装置)
21…ラブオンナチップ(Lab On a Chip)
S1…捕捉工程
S2…洗浄工程
S3…溶出工程
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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