(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトを含む大型動物の脳に刺入しても折れない十分な強度を有し、かつ高感度に脳内物質を測定できる微小電極を提供する。【解決手段】高強度金属針の表面に３〜８％ホウ素原料混入ダイヤモンドが蒸着してなり、直径０．０１〜０．３ｍｍ、長さ０．０２〜２．０ｍｍの微小針状電極部を有する脳内物質測定用電極。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高強度金属針の表面に３〜８％ホウ素原料混入ダイヤモンドが蒸着してなり、直径０．０１〜０．３ｍｍ、長さ０．０２〜２．０ｍｍの微小針状電極部を有することを特徴とする脳内物質測定用電極。
【請求項２】
針状電極部の長さが０．２〜２．０ｍｍである請求項１記載の脳内物質測定用電極。
【請求項３】
高強度金属針の表面に０．５〜２％ホウ素原料混入ダイヤモンドが蒸着し、その表面に３〜８％ホウ素原料混入ダイヤモンドが蒸着している請求項１又は２記載の脳内物質測定用電極。
【請求項４】
微小針状電極部の内部金属の点状露出部分が樹脂の点状塗布により充填されている請求項１〜３のいずれか１項記載の脳内物質測定用電極。
【請求項５】
全長が１０ｃｍ以上であり、先端部の微小電極部以外が樹脂塗布により絶縁されたものである請求項１〜４のいずれか１項記載の脳内物質測定用電極。
【請求項６】
高強度金属がタングステンである請求項１〜５のいずれか１項記載の脳内物質測定用電極。
【請求項７】
脳内物質が脳内アミンである請求項１〜６のいずれか１項記載の脳内物質測定用電極。
【請求項８】
脳内刺入用電極である請求項１〜７のいずれか１項記載の脳内物質測定用電極。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の電極を脳内に刺入し、定電位アンペロメトリー又はサイクリックボルタメトリーにより脳内物質の変動を測定することを特徴とする脳内物質変動の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の脳内に刺入して脳内アミン等の脳内物質の変動等の電気化学的測定に有用な脳内物質測定用電極及びそれを用いた脳内物質変動の測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳内アミン量は、各種中枢神経系疾患に深く関与しており、その変動をモニターすることは疾患の診断だけでなく、疾患や脳内アミンの機能を研究する上で極めて重要である。脳内アミンの測定法としては、脳組織ホモジネート除蛋白液のHPLC解析、マイクロダイアリシス法等があるが、これらの手段では秒単位で変動する被験体の行動に追随した高速では脳内アミン変動を測定できない。一方、微小電極を脳内に刺入又は留置して電気化学的に脳内アミンの変動を測定する手段は、オンタイムで脳内アミン濃度の変動が高速測定できる点で有用である。
【０００３】
脳内アミン測定用の電極としては、脳内に刺入できるカーボンファイバー電極を用いてげっ歯の脳内ドパミンを測定する技術が報告されている（非特許文献１及び２）。しかし、カーボンファイバーは折れやすく、操作上の困難を伴う。また、電極が折れた場合、その断片が脳内に残存してしまい、摘出する方法は無く安全上好ましくない。これに対し、タングステン針の表面に１％ホウ素混入ダイヤモンドを蒸着した電気化学測定用電極が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kawagoe KT, Zimmerman JB, and Wightman RM. Principles of voltammetry and microelectrode surface states. J Neurosci Methods 48: 225-240, 1993.
【非特許文献２】Phillips PE, Stuber GD, Heien ML, Wightman RM, and Carelli RM. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature 422: 614-618, 2003.
【非特許文献３】Suzuki A, Ivandini TA, Yoshimi K, Fujishima A, Oyama G, Nakazato T, Hattori N, Kitazawa S, and Einaga Y. Fabrication, characterization, and application of boron-doped diamond microelectrodes for in vivo dopamine detection. Anal Chem 79: 8608-8615, 2007.
【非特許文献４】Kleiner-Fisman G, Fisman DN, Sime E, Saint-Cyr JA, Lozano AM, Lang AE. Long-term follow up of bilateral deep brain stimulation of the subthalamic nucleus in patients with advanced Parkinson disease. J Neurosurg. 2003 Sep;99(3):489-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、タングステン針の表面に１％ホウ素混入ダイヤモンドを蒸着した微小電極の感度は十分でなく、強い電気刺激により強制的に放出させた脳内アミンの測定には使用できても、生理的な条件での高感度測定が要求される場合に適用できるものではなかった。また、物理的強度とサイズにおいてマウスのような小実験動物に使用できても、サルやヒトのような大きな脳に適用できるものではなかった。
従って本発明の課題は、ヒトを含む大型動物の脳に刺入しても折れない十分な強度を有し、かつ高感度に脳内物質を測定できる微小電極を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、脳内で折れない十分な強度と高感度とを両立すべく種々検討した結果、高強度金属針の表面に高濃度ホウ素混入ダイヤモンドを蒸着し、電極として作用する部分を直径０．０１〜０．３ｍｍ、長さ０．０２〜２．０ｍｍの微小針状とし、それ以外の部分を絶縁部とすれば、大型動物の脳内に刺入しても折れ難く、かつ高感度で脳内物質の測定が可能であり、かつ操作性も良好であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、高強度金属針の表面に３〜８％ホウ素原料混入ダイヤモンドが蒸着してなり、直径０．０１〜０．３ｍｍ、長さ０．０２〜２．０ｍｍの微小針状電極部を有することを特徴とする脳内物質測定用電極を提供するものである。
また、本発明は、上記電極を脳内に刺入し、定電位アンペロメトリー及びサイクリックボルタメトリーにより脳内物質の変動を測定することを特徴とする脳内物質変動の測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の電極は、微小でありながら、高い強度と高い感度を併せ持っており、ヒトを含む哺乳動物の脳内に刺入しても折れることなく、長時間の脳内物質測定を可能とする。従って、本発明の電極は、モノアミン系の障害により社会生活が困難な患者を支援するため、脳内モノアミン変動を日常的にモニターするための医療用電極となり得る。また、大型動物を用いた脳疾患を治療するための薬理学的、生理学的研究に用いるための研究用電極にもなり得る。
【０００９】
うつ病患者の脳内セロトニン変動を医師や家族が知ることができれば、自殺を未然に防ぐことができる。また、パニック障害の患者がモノアミンレベルの上昇を知り職場の同僚に知らせることができれば無理のない社会復帰の助けとなる。近年、脳神経系の治療において、患者脳の直接解剖学的観察を可能としたＭＲＩ診察技術の寄与は計り知れない。さらに、脳内に電極を留置し刺激する脳深部刺激（ＤＢＳ）治療法までも急速に普及している（非特許文献４）。従って、治療効果が明らかであれば、侵襲的脳手術でさえもパーキンソン病患者が喜んで受け入れるという実績が積み上げられつつあり、本発明の電極を用いた脳内記録電極の植え込みも現実的な治療法の一つとなりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明電極先端部の一形態の概略図である。先端部０．５ｍｍを残してガラス絶縁した例（上）、及び先端部１ｍｍを残してカシュー樹脂絶縁した例（下）を示す。
【図２】金属針表面にダイヤモンドを蒸着する工程の概略図である。
【図３】ｉｎ−ｖｉｔｒｏでのドパミン検出試験装置構成の概略図である。
【図４】アンペロメトリー法によるｉｎ−ｖｉｔｒｏでのドパミン検出試験結果である。
【図５】サイクリックボルタメトリー法によるｉｎ−ｖｉｔｒｏでのドパミン検出試験結果である。
【図６】電極部露出部分の長さのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのドパミン検出感度およびノイズに与える影響の試験結果である。
【図７】アンペロメトリー法によるｉｎ−ｖｉｖｏでのドパミン検出試験結果例である。
【図８】実験用ニホンザル頭部にマニピュレーターを設置し全長１５ｃｍに延長したダイヤモンド電極を脳内に刺入した実験の外観を示す。
【図９】アンペロメトリー法によるサル報酬応答の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の電極の電極部は、高強度金属針の表面に３〜８％ホウ素原料混入ダイヤモンドが蒸着してなり、直径０．０１〜０．３ｍｍ、長さ０．０２〜２．０ｍｍの微小針状である。ここで高強度金属としては、タングステン、モリブデンが用いられるが、タングステンが強度、安全性、ダイヤモンド成長の基板となる等の点で特に好ましい。当該高強度金属針の長さは着脱により調節可能で、特に１０〜２０ｃｍ程度に延長可能とすることが電極マニピュレーター操作性の点で好ましい。
【００１２】
本発明の電極の電極部は、上記１０ｃｍ以上の高強度金属針の先端部長さ０．０２〜２．０ｍｍ部分であるのが好ましく、さらに先端部長さ０．２〜２．０ｍｍ部分、特に先端部長さが０．３〜０．７ｍｍ部分であるのが好ましい。なお、高強度金属針の電極部以外の部分は、樹脂により絶縁されているのが好ましい。
【００１３】
本発明の電極円錐形先端部の直径は、脳内への刺入性、測定物質との反応性の点から、０．０１〜０．３ｍｍであり、特に０．１〜０．２ｍｍが好ましい。
【００１４】
本発明の電極は、高強度金属針の先端部長さ０．０２〜２．０ｍｍ部分が高ホウ素原料混入（原料仕込みとして３〜８％ホウ素原料）ダイヤモンドで蒸着されている。原料ホウ素原料混入量が３％未満では、測定感度が十分でない。より好ましいホウ素原料混入率は４〜８％であり、特に好ましくは５％程度である。
【００１５】
高強度金属針の先端部へのホウ素原料混入ダイヤモンドの蒸着処理は、７００〜９００℃で２〜１２時間行えばよい。本発明においては、まずタングステンへの接着性に優れる０．５〜２％低ホウ素原料混入ダイヤモンドで蒸着し、その表面にさらに高感度の３〜８％高ホウ素原料混入ダイヤモンドで蒸着するのが、高強度と高感度の両者を達成するうえで、特に好ましい。タングステン面から電極表面へのホウ素濃度の上昇は二段階、多段階、あるいは連続的でもよい。さらに、まず０．５〜１．５％ホウ素原料混入ダイヤモンドで蒸着し、その表面にさらに４〜６％ホウ素原料混入ダイヤモンドで蒸着するのが特に好ましい。
【００１６】
このような二重、段階的あるいは連続的にホウ素濃度を高めた蒸着処理により、金属表面に均一に高ホウ素混入ダイヤモンドが蒸着できるが、さらに感度を向上させ、正確な測定を可能とするため、内部金属の露出部分を樹脂の点状塗布により充填するのが好ましい。前記蒸着処理により点状に金属が露出することがあり、かかる露出部の樹脂塗布硬化により、点状に絶縁部が生じるが、測定感度は向上する。
【００１７】
本発明電極における電極部以外の部分は、樹脂塗布により絶縁するのが、操作性、測定感度の点で好ましい。絶縁に用いられる樹脂は、特に制限されないが、エポキシ樹脂、カシュー塗料、パリレン樹脂等が好ましい。電極部以外の部分は、前記高強度金属でもよいし、さらに表面を絶縁したステンレス管、銅線を接続して用いてもよい。電極全体の長さは、延長管の着脱により調節可能で、マニピュレーターにおける操作性の点から１０〜２０ｃｍ程度に延長可能であることが好ましい。
【００１８】
本発明の微小電極を用いれば、組織を侵襲することなく、脳内に刺入でき、また脳内に留置もできるため、長時間の脳内物質濃度の変動をモニターできる。即可能な脳内物質としては、ドパミン、ノルアドレナリン、セロトニン等の脳内アミンの他、アスコルビン酸、アデノシンが挙げられる。
【００１９】
測定手段としては、本発明電極を脳内に刺入し、参照電極及び対電極を用いたボルタメトリーにより行うのが好ましい。ここで参照電極及び対電極としては銀塩化銀電極、白金線等が用いられる。さらに本発明においては、非特許文献３においてはパルスボルタメトリー法により測定し５０Ｈｚ１００発という強い刺激に対する応答をようやく検出できるものだったが、アンペロメトリー（図４）およびサイクリックボルタメトリー（図５）を利用することで大幅に感度が高まり、これらの手法では高ホウ素の効果とあいまって４０ｎＭのドパミンすら検出可能となっている。電位を一定にした定電位アンペロメトリーにより測定するのがより好ましい。ここで定電位アンペロメトリーとは、銀塩化銀に対し０．５〜１．０Ｖにダイヤモンド電極を保つことによりドパミンの酸化電流を検出する手法である。定電位アンペロメトリーにより、脳内アミンがより高感度で特に高速で測定できる。パルスボルタメトリー、サイクリックボルタメトリーといった電位を変動させる手法であれば、サンプリング頻度においてアンペロメトリーに劣るが分子を選別して測定するのに有利である。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２１】
実施例１
直径０．３ｍｍ長さ３ｃｍの細いタングステン針表面に５％ホウ素原料混入ダイヤモンド（ＢＤＤ）を蒸着させ、先端部以外を絶縁した（図１）。まずタングステンロッドを針状とするため先端部分を２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）中３Ｖクロノアンペロメトリ（ＣＡ）により電解研磨し、先端経を約１０〜２０μｍ、テーパー角３．８度とした。その後、酸化皮膜を除去するためにフッ化水素（ＨＦ）中に２０分浸漬した。あるいは同様の形態の加工品（有明マテリアル株式会社）を使用した．タングステン表面におけるダイヤモンド層成長を促進するため、ダイヤモンドパウダーをイソプロパノール中で９０分間核付け処理した。針状に成型した金属針を水素プラズマ中に置き、一方で炭素源及びホウ素源を含む溶液を水素ガスによりバブリングすることで気化させ、これを水素プラズマ中に導入することで表面にダイヤモンド層を形成させる。すなわち、作成したタングステン針をプラズマ装置中（ＡＳＴｅＸ  Ｃｏｒｐ．図２）で水素流量３００ｓｓｃｍ、プラズマ出力２５００Ｗ、圧力６０Ｔｏｒｒ、ステージ温度７００〜９００℃にてダイヤモンド層を蒸着した。初め５時間は１％ホウ素仕込み（トリメトキシボラン４．０５ｍＬ／アセトン５０ｍＬ）、続く５時間は５％ホウ素仕込み（トリメトキシボラン１８．５ｍＬ／アセトン４０ｍＬ）で二段生成させた。１％ホウ素時間を短縮した場合はアンペロメトリーに使用可能な電極ができなかった（表１）。ＢＤＤ微小電極を作成した先端１ｍｍ以外をエポキシ樹脂及びカシュー塗料を用いて絶縁し、安定した電気化学センサーとして使用できる形状に成型した（図１）。先端から１．０ｍｍの範囲を除いてエポキシ樹脂（セメダイン１５６５）を塗布し先端を電極として確保した。ダイヤモンド層には多くの場合微小な穴があり、タングステン面が露出して電気化学計測に大きな障害となる。ダイヤモンド剥離部分を実体顕微鏡下に探索し、剥離部分にエポキシ樹脂を点状に塗布し絶縁した。
【００２２】
軸部の絶縁処理は、当初は外径０．７５ｍｍのガラス管にダイヤモンド針を入れて隙間をエポキシ樹脂で封入した（図１上）。さらに細く仕上げるために、ＢＤＤ針をアセトンにて脱脂の後カシュー塗料による絶縁を試み、好成績を得た（図１下）。サル用マニピュレーターにて操作可能な長さを得るために、２４Ｇステンレス管に接続し圧着、全長１５ｃｍに加工したうえで電気的に導通を確保した。タングステン針及びステンレス管軸部にカシュー塗料を塗布し絶縁した。カシュー塗料のみでは脳組織との摩擦が生じる先端部の強度が充分でなく、またエポキシ樹脂は滴状になりやすく長い軸に均一に塗布するのは困難であった（表１）。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
実施例２
ＢＤＤ微小電極は中性燐酸緩衝液（ＰＢＳ）中のドパミンを高感度で検出可能であった（図３、４、５）。銀塩化銀電極を参照電極及び対電極とし、電極を＋６００ｍＶに保持した定電位アンペロメトリーを用いた（図３、４）。図３では、中性燐酸緩衝液（ＰＢＳ）が流れる噴水中に電極を浸漬しポテンショスタット及び記録用コンピュータに接続し電気化学測定を行い、試験化合物を含むＰＢＳ液に流路を切り替えることができる。図３にアンペロメトリー法によるｉｎ−ｖｉｔｒｏでのドパミン検出試験結果を示す。ドパミンを４０、２００、１０００ｎＭ含む液に順次切り替え、測定電流の変動を測定した（図４）。また、反応分子の電位依存性を同定可能なサイクリックボルタメトリー（−０．２Ｖ  ｔｏ  １．５Ｖ、４００Ｖ／ｓ）による検出も可能であった（図５）。図５では、ドパミンを４０、２００、１０００ｎＭ含む液に順次切り替え、測定電流の変動を測定した。
【００２５】
実施例３
同一の微小電極の部分を段階的に絶縁塗装して比較した。
２本の５％ホウ素混入微小電極の結果の平均を表２及び図６に示す。
０．６Ｖ定電位アンペロメトリー及びＦＳＣＶ（−０．２  ｔｏ  １．５Ｖ）により１０００ｎＭドパミンによる振幅のその直前のノイズ標準偏差ＳＤに対する比率をＳ／Ｎ比とした。
良好なＳ／Ｎ比を得るためには長さ０．３ｍｍ以上必要であった反面、電極露出部が長いと流速変動に対するノイズ電流が生じやすい性質が見られた。従って、電極長は０．２〜２．０ｍｍ、特に０．３〜０．７ｍｍが好ましいことがわかった。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
実施例４
脳内での測定が可能であるか検証するために、本電極をマウス脳線条体に刺入し電気刺激によりドパミン放出を生じさせたところ、それをリアルタイムで検出可能であった（図７、表３）。図７では、ドパミン神経路を電気刺激した際の線条体における電流変動を示す。横軸０秒の時点から３０Ｈｚ１２発電気刺激を与えた。表３では、ドパミン神経路（ＭＦＢ）を３０Ｈｚ刺激パルス数による検出電流をＳ／Ｎ比で示し、ダイヤモンド電極アンペロメトリー（ＢＤＤ−ａｍｐｅｒｏ）及び同時に行った従来法カーボンファイバーによるサイクリックボルタメトリー法（ｃｆ−ＦＳＣＶ）と比較した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
実施例５
大型脳における利用を検証するために、サル線条体に刺入し（図８）ジュースを報酬として中脳ドパミン神経を活動せしめたところ（Schultz W.Behavioral dopamine signals.Trends Neurosci. 2007 May;30(5):203-10.）、報酬予告信号後のドパミン放出を検出可能であった（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011152324.tif 000012
【図８】
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【図９】
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