(57)【要約】【課題】  副作用が弱く、抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法を提供する。【解決手段】  抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体とは、フェニルアラニルアラニルフェニルアラニルバリンにアントシアニジンの２分子が結合している。Ｎ末は、フェニルアラニンであり、Ｃ末はバリンである。このアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法は、黒豆の粉砕物にブドウ糖、乳酸菌を添加し、発酵させた発酵液をアルファシクロデキストリンにより保護し、プロテアーゼで消化した後、ろ過して得られた残渣をセルラーゼで処理し、エタノールで抽出する工程からなる。抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体は、医薬品、化粧料、日用品などに利用される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒豆の粉砕物にブドウ糖、乳酸菌を添加し、発酵させた発酵液をアルファシクロデキストリンにより保護し、プロテアーゼで消化した後、ろ過して得られた残渣をセルラーゼで処理し、エタノールで抽出する工程からなる下記の式（１）に示した抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法
【化１】
2011088848.tif 000004
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本では化学物質によるアトピー疾患や肌トラブルなどが多発しており、社会的な問題となっている。アトピー疾患の患者は、食事制限や医療的な治療を実施しているものの、完治することはなく、対処的な治療に限られている。
【０００３】
また、アトピー疾患の原因であるアレルゲンも種類が増加しているため、今後も、アトピー、肌トラブルやアレルギーは、増加すると考えられている。
【０００４】
さらに、花粉症やアレルギーも増加しており、患者数は１０００万人を超えていると推定される。
【０００５】
花粉症などのアレルギーやアトピーに対する治療方法は対処療法であり、根本的な治療法はなく、また、化学的な薬剤を使用することにより副作用も懸念されている。そこで、天然由来の抗炎症作用を呈する物質による根本的な治療方法が必要とされている。
【０００６】
天然の黒豆を利用したアレルギーに関する発明として皮膚容態を処置するための組成物及び方法があり、ここでは、炎症後色素沈着を処置する方法において黒豆抽出物が利用されているものの、物質の特定には至っていない（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−４５２２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来から使用している抗炎症剤には副作用が認められる問題点があり、天然物由来の抗炎症剤には作用が明確ではないという問題点がある。
【０００９】
この発明は上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、副作用が弱く、優れた抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体を効率良く製造することができる製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、黒豆の粉砕物にブドウ糖、乳酸菌を添加し、発酵させた発酵液をアルファシクロデキストリンにより保護し、プロテアーゼで消化した後、ろ過して得られた残渣をセルラーゼで処理し、エタノールで抽出する工程からなる抗炎症作用を有する下記の式（１）で示されるアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法に関するものである。
【００１１】
【化１】
2011088848.tif 000002
【発明の効果】
【００１２】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１３】
請求項１に記載の製造方法によれば、効率良くアントシアニジンペプチド誘導体を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、この発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００１５】
ここでいう製造方法とは黒豆の粉砕物にブドウ糖、乳酸菌を添加し、発酵させた発酵液をアルファシクロデキストリンにより保護し、プロテアーゼで消化した後、ろ過して得られた残渣をセルラーゼで処理し、エタノールで抽出する工程からなる抗炎症作用を有する下記の式（１）で示されるアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法である。
【００１６】
【化２】
2011088848.tif 000003
【００１７】
ここでいうアントシアニジンペプチド誘導体とは、アントシアニジンの２分子の間に、テトラペプチドが結合した誘導体である。
【００１８】
テトラペプチドとは、Ｎ末よりフェニルアラニルアラニルフェニルアラニルバリンであり、すなわち、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌである。このテトラペプチドは、ペプチド結合により結合されており、Ｃ末はバリンである。
【００１９】
アントシアニジンとこのテトラペプチドは共有結合により結合している。
【００２０】
フェニルアラニルアラニルフェニルアラニルバリンは、疎水性が高いテトラペプチドであり、アントシアニジンも疎水性があることから、得られるアントシアニジンペプチド誘導体は疎水性が高い。
【００２１】
アントシアニジンペプチド誘導体は、食用油、エタノールに対する溶解性が高いものの、水に対する溶解性は低いという特性を有する。
【００２２】
このアントシアニジンペプチド誘導体は脂溶性が高く、炎症細胞の細胞膜を安定化し、ロイコトリエンの産生を抑制し、さらに、ヒスタミン受容体、ロイコトリエン受容体とプロスタグランジンＥ受容体に結合してこれらケミカルメディエーターの働きを抑制し、炎症作用を抑制する働きがある。
【００２３】
このアントシアニジンペプチド誘導体は特に、ロイコトリエン産生に対して強力な抑制作用を発揮する。
【００２４】
このアントシアニジンペプチド誘導体は医薬品として経口剤又は非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、歯磨き粉等に配合されて利用される。アトピー性皮膚炎、アレルギー、抗炎症剤などとして利用される。
【００２５】
経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。
【００２６】
前記の錠剤は、シェラック又は砂糖で被覆することもできる。また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を含有させることができる。
【００２７】
このアントシアニジンペプチド誘導体を含有する化粧料としては、アトピー用化粧品、シャンプー、クリームなどに用いることができ、さらに、毛髪の育毛剤としても利用することができる。
【００２８】
このアントシアニジンペプチド誘導体の製造方法とは、黒豆の粉砕物にブドウ糖、乳酸菌を添加し、発酵させた発酵液をアルファシクロデキストリンにより保護し、プロテアーゼで消化した後、ろ過して得られた残渣をセルラーゼで処理し、エタノールで抽出する工程からなる製造方法である。
【００２９】
原料として用いる黒豆とは、豆科大豆属の一年草であり、黒豆の豆部分を食用として利用できることから、食用部分を利用することが好ましい。この学名は、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。黒豆の産地は、日本、中国、アメリカ、アジアのいずれでも良い。
【００３０】
原料として用いるブドウ糖はグルコースともいわれる単糖類であり、乳酸菌の生育のための原料である。ブドウ糖は、昭和産業株式会社、サンエイ糖化株式会社などデンプンを利用して精製されるものが好ましい。
【００３１】
原料として用いる乳酸菌は、糖質を代謝して乳酸を生成する細菌類であり、ヨーグルト、乳酸菌飲料、漬け物など食品の発酵に利用されている。乳酸菌には、乳酸桿菌と乳酸球菌のいずれも、用いられる。また、ラクトバシルス属、ビフィドバクテリウム属のいずれでも、用いられる。
【００３２】
このうち、乳酸桿菌であるラクトバシルス  カゼイ、学名Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉである乳酸菌は、発酵能力が高いことから好ましい。乳酸菌は、ビオフェルミン製薬株式会社より入手できる乳酸菌は品質が高いことから好ましい。
【００３３】
原料として用いるアルファシクロデキストリンとは、ブドウ糖が６個環状に結合した環状オリゴ糖である。デンプンを利用して製造される。株式会社ベッカー社、シクロケムなどのアルファシクロデキストリンは品質が高いことから好ましい。
【００３４】
原料として用いるプロテアーゼはタンパク質を分解する酵素であるが、発酵物が中性であることから、中性プロテアーゼが好ましい。
【００３５】
前記の中性プロテアーゼとしては、熱に対する安定性の点から、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＭ、スミチームＦＰ、スミチームＬＰ、デナチームＡＰが好ましく、特に、処理能力が高い点から、天野エンザイム製プロテアーゼＮ、スミチームＬＰがより好ましい。これらのプロテアーゼは、組み合わせて用いることもできる。
【００３６】
原料として用いるセルラーゼは糖質や食物繊維を分解する酵素であり、食品加工に利用される。アマノエンザイム製のセルラーゼＡやセルラーゼＴは品質が高く、安定性が高いことから好ましい。
【００３７】
製造工程において、黒豆の粉砕物１重量に対して、添加するブドウ糖は０．５〜１．５重量が好ましく、乳酸菌は０．００１〜０．０１重量が好ましい。
【００３８】
発酵工程は、清浄な発酵タンクや培養瓶で実施され、水を添加して原材料を添加して、温度４０℃〜５０℃で、発酵時間は１０時間〜４０時間が好ましい。
【００３９】
発酵させた発酵液はアルファシクロデキストリンにより保護される。発酵液１重量に対してアルファシクロデキストリンの添加量は、０．０１〜０．０５重量が好ましく、添加後、十分に混合、攪拌される。
【００４０】
この後、プロテアーゼで消化される。このプロテアーゼの添加量は、発酵液の１重量に対して０．０１〜０．０５重量が好ましく、添加後、十分に混合、攪拌される。これは、加温される。温度３０℃〜５０℃で、発酵時間は４時間〜１０時間が好ましい。
【００４１】
プロテアーゼで消化された後には、残渣及びろ液に分離される。ろ液には、ペプチドと糖質が主体であり、廃棄される。この残渣には、アルファシクロデキストリンにより結合されたアントシアニジンペプチド誘導体が含有されている。
【００４２】
この残渣は、セルラーゼ処理される。残渣１重量に対してセルラーゼは０．００１〜０．０１重量が好ましく、加温される。温度は３０℃〜５０℃が好ましく、加温時間は１時間から６時間が好ましい。
【００４３】
加温された液は、エタノールで処理される。アントシアニジンペプチド誘導体は、疎水性が高いことからエタノールにより抽出される。
【００４４】
セルラーゼ処理液１重量に対してエタノールの添加量が１０〜５０重量であることは、抽出効率が高いことから好ましい。
【００４５】
このエタノール抽出液に、目的とするアントシアニジンペプチド誘導体が含有されている。この抽出液は、液体状態または、エバポレートや真空乾燥機によりエタノールが除去され、粉末として得られる。
【００４６】
前記の還元反応物から、目的とするアントシアニジンペプチド誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【００４７】
分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするアントシアニジンペプチド誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００４８】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００４９】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００５０】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００５１】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００５２】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００５３】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３０倍量が好ましく、３〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３５℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００５４】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００５５】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００５６】
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００５７】
アントシアニジンペプチド誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするアントシアニジンペプチド誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。さらに、乾燥させて粉末化できる。
【００５８】
このようにして得られたアントシアニジンペプチド誘導体は、液体または粉末として得られる。
【００５９】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。
【実施例１】
【００６０】
日本産の黒豆を洗浄後、粉砕機により粉砕した。この黒豆粉砕物１ｋｇを発酵機に添加しこれに精製水１０ｋｇを添加した。これに昭和産業株式会社製のブドウ糖０．８ｋｇを添加して攪拌しつつ、４０℃に加温した。
【００６１】
ビオフェルミン製薬株式会社の乳酸桿菌１０ｇを添加して、２０時間発酵させた。発酵液１０ｋｇを得た。
【００６２】
この発酵液にシクロケム製のアルファシクロデキストリン１００ｇを添加した。室温にて攪拌機により１時間攪拌した。
【００６３】
清浄なステンレス製タンクに移し、アマノエンザイム製プロテアーゼＮ２００ｇを添加して３７℃で、６時間消化させた。これを冷却して吸引濾過機により濾過した。
【００６４】
ろ液を廃棄し、残渣１ｋｇを採取した。残渣を精製水に懸濁し、清浄なタンクに添加した。
【００６５】
この残渣懸濁液に対してアマノエンザイム製のセルラーゼＡ１０ｇを添加し、４０℃に加温し、６時間処理した。
【００６６】
この処理液を冷却後、９５％エタノール１０ｋｇを添加し、室温で、１時間攪拌した。これを吸引濾過機により濾過してろ液を得た。
【００６７】
得られたろ液をエバポレーターによりエタノールを除去し、さらに、真空乾燥機により乾燥し、目的とするアントシアニジンペプチド誘導体３５ｇを得た。
【００６８】
以下に、ＨＰＬＣ及び核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）による抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体の分析について説明する。
（試験例１）
【００６９】
本試験では、抗炎症作用を有するアントシアニジンペプチド誘導体を解析した。すなわち、前記の実施例１で得られた検体１及びタカラバイオにより化学合成したテトラペプチドであるフェニルアラニルアラニルフェニルアラニルバリンについてフォトダイオードアレイ（島津製作所製）を装着したＨＰＬＣに供して解析を行った。
【００７０】
その結果、検体１にはフェニルアラニルアラニルフェニルアラニルバリンのテトラペプチドとアントシアニジン２分子の結合したアントシアニジンペプチド誘導体が確認された。
【００７１】
また、検体１をＣＡＰＣＥＬＬＰＡＣＫＣ１８カラムによるＨＰＬＣを実施した。さらに、ＮＭＲ（バリアン製）による解析の結果、フェニルアラニルアラニルフェニルアラニルバリンと２分子のアントシアニジンが同定された。
【００７２】
以下に、ヒト白血球を用いたロイコトリエン産生抑制に関する試験について説明する。
（試験例２）
【００７３】
３５歳の男性よりヘパリン加血液を採取し、フィコール法により白血球を採取した。これをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）により洗浄し、さらに、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加して懸濁した。
【００７４】
この白血球を３５ｍｍの培養シャーレ（ファルコン製）に播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で１８時間培養した。これにリポポリサッカライド１０ｎｇ、検体１の１ｍｇ／ｍＬを添加して、さらに１８時間培養した。
【００７５】
培養後、上清を採取し、濾過後、得られたろ液についてロイトコリエンＢ４量をＥＬＩＳＡ法（コスモバイオ社製）により定量した。
【００７６】
その結果、検体１を添加した場合、添加しない場合に比して２５％のロイコトリエンＢ４量となり、７５％の抑制が認められた。この結果、検体１には、ロイトコリエン産生の著しい抑制が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の抗炎症作用を示すアントシアニジンペプチド誘導体は、アトピーや炎症性疾患に悩む患者のＱＯＬを改善する。
【００７８】
アントシアニジンペプチド誘導体の製造技術は、化粧品、医療分野、食品業界及び医薬品業界の発展と産業育成に寄与する。