(57)【要約】      （修正有）【課題】デンプンとのインキュベーション時に加水分解酵素活性が高い、α−アミラーゼのファミリー１３に由来する酵素を提供する。【解決手段】基準酵素に対して１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む単離および／または精製酵素変異型酵素。変異型は、ＣＧＴアーゼまたはマルトース生成α−アミラーゼの修飾によって得ることができる。酵素は、食物またはベーカリー製品などの食品の調製で有用である。機能食品または食料に添加するか添加することができる処方物および例えば酸性化または乳化が必要な広範な種々の製品中に低レベルで使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２３０位、８位、２１位、４７位、９
４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０位、３５
７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒ
ｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリーの他
の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む単離および／ま
たは精製酵素変異型において、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、単離および／または精製
酵素変異型。
【請求項２】
前記酵素変異型が基準酵素に対して２３０位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＣＧＴアーゼナンバリングを使用）またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバ
ー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
任意選択的に、前記酵素変異型が、基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：８
位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２
９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−ア
ミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修
飾をさらに含む、請求項１に記載の酵素変異型。
【請求項３】
前記酵素変異型が基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：
２３０位（前記変異は、２３０Ａ；２３０Ｃ；２３０Ｄ；２３０Ｅ；２３０Ｆ；２３０
Ｇ；２３０Ｈ；２３０Ｉ；２３０Ｋ；２３０Ｌ；２３０Ｍ；２３０Ｎ；２３０Ｐ；２３０
Ｑ；２３０Ｒ；２３０Ｓ；２３０Ｔ；２３０Ｖ；２３０Ｗ；または２３０Ｙのいずれかに
対するものである）、
８位（前記変異は、８Ｃ；８Ｄ；８Ｆ；８Ｉ；８Ｎ；８Ｐ；８Ｓ；８Ｗ；または８Ｙの
いずれかに対するものである）、
２１位（前記変異は、２１Ａ；２１Ｄ；２１Ｆ；２１Ｌ；２１Ｔ；２１Ｖ；２１Ｗ；ま
たは２１Ｙのいずれかに対するものである）、
４７位（前記変異は、４７Ａ；４７Ｃ；４７Ｄ；４７Ｅ；４７Ｆ；４７Ｇ；４７Ｉ；４
７Ｋ；４７Ｑ；４７Ｌ；４７Ｎ；４７Ｐ；４７Ｒ；４７Ｓ；４７Ｔ；４７Ｖ；または４７
Ｗのいずれかに対するものである）、
９４位（前記変異は、９４Ｎまたは９４Ｓのいずれかに対するものである）、
２１５位（前記変異は、２１５Ｉまたは２１５Ｖのいずれかに対するものである）、
２３２位（前記変異は、２３２Ｌのいずれかに対するものである）、
２４５位（前記変異は、２４５Ａまたは２４５Ｔのいずれかに対するものである）、
２５９位（前記変異は、２５９Ａ；２５９Ｅ；２５９Ｆ；２５９Ｉ；または２５９Ｓの
いずれかに対するものである）、
２６３位（前記変異は、２６３Ａのいずれかに対するものである）、
２９９位（前記変異は、２９９Ｄのいずれかに対するものである）、
３２０位（前記変異は、３２０Ｑまたは３２０Ｌのいずれかに対するものである）、
３５７位（前記変異は、３５７Ａまたは３５７Ｔのいずれかに対するものである）、
５１４位（前記変異は、５１４Ａのいずれかに対するものである）、
６３３位（前記変異は、６３３Ａのいずれかに対するものである）、
６５５位（前記変異は、６５５Ｋまたは６５５Ｅのいずれかに対するものである）、
６６０位（前記変異は、６６０Ａまたは６６０Ｖのいずれかに対するものである）、お
よび／または
６７２位（前記変異は、６７２Ａまたは６７２Ｇのいずれかに対するものである）（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−ア
ミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修
飾を含む、請求項１または請求項２に記載の酵素変異型。
【請求項４】
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリー１３のメンバーである、前記請求項のいずれ
か一項に記載の酵素変異型。
【請求項５】
前記酵素変異型が、デンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素より
もエンドアミラーゼ活性が低い、前記請求項のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項６】
前記基準酵素が前駆体酵素である、前記請求項のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項７】
前記基準酵素が野生型酵素である、前記請求項のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項８】
前記基準酵素が、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）
またはマルトース生成α−アミラーゼから誘導可能である（好ましくは誘導される）、前
記請求項のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項９】
前記変異型酵素が、得られた転写産物が前記酵素変異型であるか、前記酵素変異型を含
むように変異されたＤＮＡから調製される、前記請求項のいずれか一項に記載の酵素変異
型。
【請求項１０】
前記基準酵素がマルトース生成α−アミラーゼである、前記請求項のいずれか一項に記
載の酵素変異型。
【請求項１１】
前記基準酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ株、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ株、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ株、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ株、またはＴｈｅｒｍｏａｎ
ａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株であるかこれらから誘導可能である、前記請求項のいずれ
か一項に記載の酵素変異型。
【請求項１２】
前記基準が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株、またはその同族体、変
異体、もしくは変異型であるか、これらから誘導可能である、請求項１〜１１のいずれか
一項に記載の酵素変異型。
【請求項１３】
前記アミノ酸修飾が、少なくともＡ２３０、好ましくは配列番号１に記載のＡ２３０Ｖ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）での修飾で
ある、請求項１２に記載の酵素変異型。
【請求項１４】
前記基準酵素がＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓであるか、これから誘導可能である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１５】
前記基準酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ属であるか、これから誘導可能である、請求項１〜１
１のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１６】
前記基準酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のマルトース生成α−アミラーゼ、またはそ
の同族体、変異体、もしくは変異型であるか、これらから誘導可能である、請求項１５に
記載の酵素変異型。
【請求項１７】
前記酵素変異型が、前駆体酵素Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）、またはその同族体、変異
体、もしくは変異型に由来する、請求項１６に記載の酵素変異型。
【請求項１８】
前記アミノ酸修飾が、少なくともＡ２３０、好ましくは配列番号３に記載のＡ２３０Ｖ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）での修飾で
ある、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１９】
酵素変異型の調製方法において、前記方法は、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレ
オチド配列を発現させる工程を含み、前記酵素変異型が、基準酵素に対して１つまたは複
数の以下の位置：２３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４
５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５
５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバ
リングを使用）、またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置
に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、方法。
【請求項２０】
前記変異ヌクレオチド配列を基準ヌクレオチド配列の変異によって調製する、請求項１
９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異ヌクレオチド配列を調製する工程を含む、請求項１９〜２０のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項２２】
前記基準がＣＧＴアーゼである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記基準が配列番号４または配列番号５である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項２４】
前記基準がマルトース生成α−アミラーゼである、請求項１９〜２１のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項２５】
前記基準が配列番号６である、請求項１９〜２１または請求項２６のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項２６】
前記変異酵素を単離および／または精製する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載
の方法。
【請求項２７】
酵素変異型の調製方法において、前記方法は、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレ
オチド配列を発現させる工程を含み、前記変異ヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列
の変異から得られ、前記基準ヌクレオチド配列が基準酵素をコードし、前記基準酵素がα
−アミラーゼファミリーのメンバーであり、前記酵素変異型がデンプンとのインキュベー
ション時に同一条件下での基準酵素と比較して加水分解酵素活性が低く、前記酵素変異型
が、基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２３０位、８位、２１位、４７位、
９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０位、３
５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリーの
他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、方法。
【請求項２８】
前記基準がα−アミラーゼファミリー１３のメンバーである、請求項２７に記載の方法
。
【請求項２９】
前記変異酵素を単離および／または精製する、請求項２７または２８のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる酵素変異型。
【請求項３１】
請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法によって得られた酵素変異型。
【請求項３２】
前記酵素変異型が請求項２〜１８のいずれか一項で定義されたものである、請求項３０
または３１に記載の酵素変異型。
【請求項３３】
食品調製における請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０
〜３２のいずれか一項に記載の酵素変異型の使用。
【請求項３４】
前記食品がベーカリー製品である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０〜３２のいずれか
一項に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分（ｆｏｏｄ  ｉｎｇｒｅｄ
ｉｅｎｔ）または食料成分（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）と混合する工
程を含む、食品の調製プロセス。
【請求項３６】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０〜３２のいずれか
一項に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分または食料成分と混合する
工程と、その後前記食品をパッケージングする工程とを含む、食品の調製プロセス。
【請求項３７】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０〜３２のいずれか
一項に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分または食料成分と混合する
工程と、前記食品をパッケージングする工程と、その後前記パッケージングされた食品を
食品としてラベリングする工程とを含む、食品の調製プロセス。
【請求項３８】
前記食品がベーカリー製品である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のプロセス
。
【請求項３９】
デンプンを変異酵素と接触させて酵素によりデンプンから１つまたは複数の線状生成物
（ｌｉｎｅａｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を生成する工程と、前記酵素変異型が、請求項１〜１
８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の酵
素変異型であることとを含む、デンプンの処理プロセス。
【請求項４０】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０〜３２のいずれか
一項に記載の酵素変異型をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４１】
請求項４０に記載のヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項４２】
請求項４０に記載のヌクレオチド配列または請求項４１に記載の構築物を含むベクター
。
【請求項４３】
請求項４０に記載のヌクレオチド配列、請求項４１に記載の構築物、または請求項４２
に記載のベクターが組み込まれた宿主細胞。
【請求項４４】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項３０〜３２のいずれか
一項に記載の酵素変異型の調製方法において、請求項４０に記載のヌクレオチド配列、ま
たは請求項４１に記載の構築物、請求項４２に記載のベクター、もしくは請求項４３に記
載の宿主細胞中のヌクレオチド配列を発現する工程と、任意選択的にこれらの発現産物を
単離および／または精製する工程とを含む、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法によって得ることができる酵素変異型。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法によって得られた酵素変異型。
【請求項４７】
食品調製における請求項４５または請求項４６に記載の酵素変異型の使用。
【請求項４８】
前記食品がベーカリー製品である、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
請求項４５または請求項４６に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分
または食料成分と混合する工程を含む、食品の調製プロセス。
【請求項５０】
請求項４５または請求項４６に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分
または食料成分と混合する工程と、その後前記食品をパッケージングする工程とを含む、
食品の調製プロセス。
【請求項５１】
請求項４５または請求項４６に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分
または食料成分と混合する工程と、前記食品をパッケージングする工程と、その後前記パ
ッケージングされた食品を食品としてラベリングする工程とを含む、食品の調製プロセス
。
【請求項５２】
前記食物または食料がベーカリー製品である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載
のプロセス。
【請求項５３】
デンプンを変異酵素と接触させて酵素によりデンプンから１つまたは複数の環状生成物
（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を生成する工程と、前記酵素変異型が、請求項４５ま
たは請求項４６に記載の酵素変異型であることとを含む、デンプンの処理プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾加水分解活性、特に修飾エンド−／エキソアミラーゼ活性を有する酵素
変異型に関する。
【０００２】
１つの態様では、本発明は、エンドアミラーゼ活性が減少し、任意選択的に加水分解活
性が増加した酵素変異型に関する。
【０００３】
別の態様では、本発明は、α−アミラーゼファミリーのメンバーである基準および／ま
たは親酵素と比較して加水分解活性が増加し、且つエンドアミラーゼ活性が減少した変異
酵素、特にシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼに関する。本明細書中のシ
クロデキストリングリコシルトランスフェラーゼは時折ＣＧＴアーゼと呼ばれる。
【０００４】
さらに詳細には、本発明は、α−アミラーゼファミリー１３のメンバーである基準およ
び／または親酵素と比較して加水分解活性が増加し、且つエンドアミラーゼ活性が減少し
た変異酵素（特に、ＣＧＴアーゼ）に関する。
【背景技術】
【０００５】
α−アミラーゼファミリー（すなわち、グリコシド加水分解酵素ファミリー１３）（Ｈ
ｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｇ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７，６３７−６４４）は、デンプンプロセシング酵素の巨大な
ファミリーである。触媒ドメインの（α／β）8−バレル折りたたみ、触媒部位残基、お
よびα保持結合切断機構は、このファミリーで保存されているが（ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｊ
．Ｄ．ａｎｄ  Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ
ｔ．Ｂｉｏｌ．４，８８５−８９２；Ｕｉｔｄｅｈａａｇ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．
，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，４３２−４３６）、生成物
および反応特異性は大きく異なる（Ｋｕｒｉｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．（
１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７，５５７−５６５）。
【０００６】
α−アミラーゼのファミリー１３には、シクロマルトデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼまたはシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ、ＥＣ２
．４．１．１９）としも公知のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼおよび
α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１）などの酵素が含まれる。ＣＧＴアーゼおよびα−アミ
ラーゼは、α−（１，４）−グリコシド結合の加水分解によってデンプンを分解するグリ
コシラーゼの２つのクラスであるが、最初の分解生成物は主にＣＧＴアーゼについては環
状オリゴサッカライド（シクロデキストリンとも呼ばれる）およびα−アミラーゼについ
ては線状オリゴサッカライドである。
【０００７】
ＣＧＴアーゼは、分子内トランスグリコシル化反応を介したデンプンおよび類似の物質
のシクロデキストリンへの分解を触媒し、それによりシクロデキストリン（ＣＤとも呼ば
れる）と呼ばれる種々のサイズの環状α−（１，４）−結合オリゴサッカライドを形成す
ることができる。環状α−（１，４）−結合オリゴサッカライド（シクロデキストリン）
は、線状α−（１，４）−結合オリゴサッカライド基質から形成される。
【０００８】
ＣＧＴアーゼ酵素は５つのドメイン（Ａ〜Ｅ）（ドメインＡおよびＢは触媒ドメインを
構成し、ドメインＥは未処理のデンプン結合に関与するが（Ｐｅｎｎｉｎｇａ，Ｄ．，ｅ
ｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉ．２７１，３２７７７−３２７８４
；Ｏｈｄａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．６６，３０５８−３０６４）、ドメインＣおよびＤの機能は依然として知られ
ていない）からなる。いくつかの糖結合サブサイト（−７〜＋２で標識；図１）を全体に
基質が結合した後、サブサイト−１と＋１との間のα−（１，４）−グリコシル結合が切
断されてドナーサブサイト（−１、−２、−３など）で結合した共有結合性グリコシル酵
素中間体が得られる（Ｕｉｔｄｅｈａａｇ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ
ｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，４３２−４３６）。次の反応ステップでは、受容
体分子が受容体サブサイト＋１で結合し、グリコシル−酵素結合を切断する。
【０００９】
環状化反応では、受容体として共有結合糖の非還元末端を使用してシクロデキストリン
を得る。非常に低い比率で、ＣＧＴアーゼも受容体として水または第２の糖分子を使用し
てそれぞれ加水分解または不均化反応が起こり、それにより線状オリゴサッカライドを形
成することができる。
【００１０】
α−アミラーゼは強力な加水分解酵素であるが、まず第１にＣＧＴアーゼはトランスグ
リコシラーゼである。ＣＧＴアーゼの加水分解活性は、一般に、トランスグリコシル化活
性よりも非常に低い。Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属のＴｈｅｒｍｏａｎａｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓＥＭ１株（ツビウム（Ｔ
ｕｂｉｕｍ））由来のＣＧＴアーゼは、比較的高い加水分解活性を有するにもかかわらず
、α−アミラーゼと比較すると依然として非常に低いことが報告されている（Ｎｏｒｍａ
ｎ  ａｎｄ  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９２，Ｄｅｎｐｕｎ  Ｋａｇａｋｕ，３９：１０
１−１０８；Ｗｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．６１：１２５７−１２６５）。
【００１１】
ＣＧＴアーゼ酵素の加水分解反応およびトランスグリコシル化反応の相対効率を、反応
後半で使用した受容体の性質およびそれによる受容体サブサイトの特性によって決定する
ことが示唆されている。これに関して、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｅｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅ
ａｇｕｅｓは、そのトランスグリコシル化活性が加水分解活性よりも非常に高いので、Ｃ
ＧＴアーゼはグリコシル受容体について明確な優先度を有すると報告している（ｖａｎ  
ｄｅｒ  Ｖｅｅｎ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．２６７，６５８−６６５）。これに関して、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．は、保存
されたＰｈｅ１８４残基およびＰｈｅ２６０残基を含む＋２基質結合サブサイトがトラン
スグリコシル化活性に重要であると報告している（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１
９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：９９２６−９９３６）。さらに、Ｌｅｅｍｈ
ｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、２６０位のアミノ酸側鎖もＣＧＴアーゼの加水分解活性を調節
すると報告している（Ｌｅｅｍｈｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ
ｅｒｓ  ５１４：１８９−１９２）。さらに、彼らは、変異Ｐｈｅ２６０によりＣＧＴア
ーゼをトランスグリコシラーゼからデンプン加水分解酵素に変化させることができると報
告している。
【００１２】
ＵＳ−Ａ−６４８２６２２は、Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）の商標名で市販されている
バチルス由来のマルトース生成α−アミラーゼが、ＣＧＴアーゼといくつかの特徴（配列
相同性およびトランスグリコシル化生成物の形成を含む）を共有していることを開示して
いる。デンプンへの作用時に線状オリゴサッカライドを形成する能力を有するＣＧＴアー
ゼ変異型が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、α−アミラーゼ酵素ファミリーに属する新規の酵素変異型、ならびにそのヌ
クレオチド配列、およびこれを含むか使用する実施形態を提供する。変異型は有用な活性
を有する。
【００１４】
ＣＧＴアーゼナンバリング
本発明の文脈では、ＣＧＴアーゼ酵素中のアミノ酸残基の位置の特定のナンバリングを
使用する。
【００１５】
これに関して、種々の公知のＣＧＴアーゼのアミノ酸配列のアラインメントにより、Ｃ
ＧＴアーゼアミノ酸位置番号を任意のＣＧＴアーゼ酵素中のそのアミノ酸配列が公知の任
意のアミノ酸残基の位置に明確に割り当てることが可能である。
【００１６】
例えば、他の公知のＣＧＴアーゼ番号のアミノ酸配列と整列させたＢａｃｉｌｌｕｓ  
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株から得たＣＧＴアーゼのアミノ酸配列から始まるこのナンバ
リングシステムを使用して、ＣＧＴアーゼ中のアミノ酸残基の位置を明確に示すことが可
能である。
【００１７】
このＣＧＴアーゼナンバリングシステムは、ＷＯ９６／３３２６７，表１，８−３１頁
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株をａと示す）に記載されている。ＷＯ
９６／３３２６７の表１は、関連するＣＧＴアーゼ番号のタンパク質配列も示し、本明細
書中で参考として組み込まれる。
【００１８】
産生されたか本発明によって含まれることが意図される異なるＣＧＴアーゼ変異型の説
明では、参照を容易にするために以下の命名法を採用する（元のアミノ酸／ナンバリング
システムによる位置／置換アミノ酸）。
【００１９】
したがって、２３０位でのアラニンからバリンへの置換を、Ａ２３０Ｖと示す。
【００２０】
複数の変異をスラッシュマーク「／」で分離する（例えば、Ａ２３０Ｖ／Ｔ５１４Ａは
、２３０位および５１４位でそれぞれアラニンをバリンにおよびトレオニンをアラニンに
置換する変異を示す）。
【００２１】
ＣＧＴアーゼナンバリングによる本願中で言及された全位置は、本明細書中に記載のＢ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングをいう。
【００２２】
ナンバリングシステムは、塩基基準点として特定の配列を使用することができるにもか
かわらず、全ての関連する相同配列に適用することもできる。タンパク質間の配列相同性
を、本明細書中に記載の周知のアラインメントプログラムおよびハイブリッド形成技術を
使用して確認することができる。
【００２３】
本発明のいくつかの態様では、１つの変異のみが存在する。本発明の他の態様では、２
つの変異が存在する。本発明の他の態様では、３つの変異が存在する。本発明の他の態様
では、３つを超える変異が存在する。
【００２４】
本発明の広範な態様
アミログルコシダーゼおよびβ−アミラーゼのようなエキソアミラーゼは、事実上常に
非還元末端由来の基質（例えば、デンプン）を切断するのでエンド活性を示さないという
点で完全にエキソ特異性であるのに対して、マルトース生成α−アミラーゼなどの他のア
ミラーゼはデンプン内部を切断し、それにより種々のエキソ特異性を有する。
【００２５】
１つの広範な態様では、本発明は、エキソ特異性が増加した変異酵素に関する。
【００２６】
全加水分解活性とエンド活性との比としてエキソ特異性を測定する。エキソ特異性が増
加した変異型は全加水分解活性が増加し、そして／またはエンド活性が減少するという結
果になるであろう。
【００２７】
別の広範な態様では、本発明は、同一条件下で基準および／または親酵素と比較した場
合に加水分解酵素活性の増加および／またはエンド活性の減少を示す変異α−アミラーゼ
ファミリー酵素を提供する。
【００２８】
さらなる広範な態様では、本発明は、基準および／または親酵素と比較した場合にエキ
ソ特異性が増加した変異α−アミラーゼファミリーメンバー（例えば、変異ＣＧＴアーゼ
または変異マルトース生成α−アミラーゼ）を提供する。
【００２９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００３０】
さらに、適切な宿主細胞中でヌクレオチド配列の発現を調節することができる調節配列
に作動可能に連結された本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。
【００３１】
さらに、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、宿主細胞を所望のポリペプチドをコードする核酸で形質転換
する工程と、前記形質転換細胞を培養する工程と、前記ポリペプチドを発現する工程と、
任意選択的に前記ポリペプチドを精製および／または単離する工程と、任意選択的に所望
の活性についてポリペプチドを試験する工程とを含む、本発明のポリペプチドの作製方法
を提供する。
【００３３】
本発明者らの結果は、これらの変異ポリペプチドがベーキングなどの種々の適用に適切
となる改良された性質を有することを証明する。
【００３４】
ベーキングにおける本発明の変異ポリペプチドの使用も提供する。
【００３５】
デンプンを本発明の変異酵素と接触させて酵素によりデンプンから１つまたは複数の線
状基質（ｌｉｎｅａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を生成する工程と、任意選択的にこれを単
離および／または精製する工程とを含む、デンプンの処理プロセスも提供する。
【００３６】
本発明の特定の態様
本発明のいくつかの特定の態様を、添付の特許請求の範囲に示す。
【００３７】
例えば、本発明の１つの態様によれば、基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置
：２３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位
、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位
、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）
、またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複
数のアミノ酸修飾を含む単離および／または精製酵素変異型において、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、単離および／または精製
酵素変異型を提供する。
【００３８】
基準酵素は、１つまたは複数の対応するアミノ酸修飾を含まない。好ましくは、基準酵
素は、全ての対応するアミノ酸修飾（すなわち、全ての変異型の修飾）を含まない。
【００３９】
あるいは、本発明の１つの態様によれば、基準配列に対して１つまたは複数の以下の位
置：２３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９
位、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０
位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＣＧＴアーゼナンバリングを使
用）、またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置で１つまた
は複数のアミノ酸修飾が異なる単離および／または精製酵素変異型において、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、単離および／または精製
酵素変異型を提供する。
【００４０】
基準酵素は、１つまたは複数の対応するアミノ酸修飾を含まない。好ましくは、基準酵
素は、全ての対応するアミノ酸修飾（すなわち、全ての変異型の修飾）を含まない。
【００４１】
酵素変異型は天然に存在し得る。あるいは、酵素変異型をデノボで調製するか、基準お
よび／または親酵素の修飾によって調製してもよい。
【００４２】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、親酵素から誘導可能な単離および／また
は精製酵素変異型において、前記親酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーであり、
前記酵素変異型が親酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２３０位、８位、２１位
、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３
２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼフ
ァミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での親酵素と比較し
て加水分解酵素活性が高い、単離および／または精製酵素変異型を提供する。
【００４３】
本発明の別態様は、酵素変異型の調製方法において、前記方法は、前記酵素変異型をコ
ードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記酵素変異型が、基準酵素に
対して１つまたは複数の以下の位置：２３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５
位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４
位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメン
バー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、調製方法に関する。
【００４４】
基準酵素は、１つまたは複数の対応するアミノ酸修飾を含まない。好ましくは、基準酵
素は、全ての対応するアミノ酸修飾（すなわち、全ての変異型の修飾）を含まない。
【００４５】
あるいは、本発明の１つの態様によれば、酵素変異型の調製方法において、前記方法は
、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記酵素
変異型が、基準配列に対して１つまたは複数の以下の位置：２３０位、８位、２１位、４
７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０
位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミ
リーの他の相同なメンバー中の同等の位置で１つまたは複数のアミノ酸修飾が異なり、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、調製方法を提供する。
【００４６】
基準酵素は、１つまたは複数の対応するアミノ酸修飾を含まない。好ましくは、基準酵
素は、全ての対応するアミノ酸修飾（すなわち、全ての変異型の修飾）を含まない。
【００４７】
変異ヌクレオチド配列は天然に存在し得る。あるいは、変異ヌクレオチド配列をデノボ
で調製するか、親ヌクレオチド配列酵素の修飾によって調製することができる。
【００４８】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、酵素変異型の調製方法において、前記方
法は、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記
変異ヌクレオチド配列が親ヌクレオチド配列の変異から得られ、前記親ヌクレオチド配列
が親酵素をコードし、前記親酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーであり、前記酵
素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での親酵素と比較して加水分
解酵素活性が高く、前記酵素変異型が、親酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２
３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２
６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６
７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、ま
たはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数の
アミノ酸修飾を含む、調製方法を提供する。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、酵素変異型の調製方法において、前記方法は、前記酵素変
異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記変異ヌクレオチド
配列が基準ヌクレオチド配列の変異から得られ、前記基準ヌクレオチド配列が基準酵素を
コードし、前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーであり、前記酵素変異型
がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較して加水分解酵素
活性が低く、前記酵素変異型が、基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２３０
位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３
位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２
位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、または
α−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミ
ノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、調製方法を提供する。
【００５０】
基準酵素は、１つまたは複数の対応するアミノ酸修飾を含まない。好ましくは、基準酵
素は、全ての対応するアミノ酸修飾（すなわち、全ての変異型の修飾）を含まない。
【００５１】
あるいは、本発明の１つの態様によれば、酵素変異型の調製方法において、前記方法は
、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記変異
ヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列の変異から得られ、前記基準ヌクレオチド配列
が基準酵素をコードし、前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーであり、前
記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較して
加水分解酵素活性が低く、前記酵素変異型が、基準配列に対して１つまたは複数の以下の
位置：２３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５
９位、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６
０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使
用）、またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまた
は複数のアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較
して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、調製方法を提供する。
【００５２】
基準酵素は、１つまたは複数の対応するアミノ酸修飾を含まない。好ましくは、基準酵
素は、全ての対応するアミノ酸修飾（すなわち、全ての変異型の修飾）を含まない。
【００５３】
変異ヌクレオチド配列は天然に存在し得る。あるいは、変異ヌクレオチド配列をデノボ
で調製するか、親ヌクレオチド配列酵素の修飾によって調製することができる。
【００５４】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、酵素変異型の調製方法において、前記方
法は、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記
変異ヌクレオチド配列が親ヌクレオチド配列の変異から得られ、前記親ヌクレオチド配列
が親酵素をコードし、前記親酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーであり、前記酵
素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での親酵素と比較して加水分
解酵素活性が低く、前記酵素変異型が、親酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２
３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２
６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６
７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、ま
たはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数の
アミノ酸修飾を含む、調製方法を提供する。
【００５５】
基準酵素
本明細書中で使用される、用語「基準酵素」は、得られた変異型に近い、好ましくは最
も近い化学構造を有する酵素を意味する。基準酵素は、前駆体酵素（すなわち、実質的に
変異した酵素）であるか、デノボで調製してもよい。基準酵素は、野生型酵素であっても
よい。
【００５６】
本明細書中で使用される、用語「前駆体」は、本発明の方法によって修飾された酵素以
前の酵素を意味する。したがって、前駆体は、本発明の変異誘発によって修飾された酵素
であってもよい。同様に、前駆体は、野生型酵素、変異野生型酵素、または既に変異した
酵素であってもよい。
【００５７】
用語「野生型」は、当業者に理解されている技術用語であり、天然に存在し、且つ変異
体の表現型に対照的な種のほとんどのメンバーに特徴的な表現型を意味する。したがって
、本文脈では、野生型酵素は、関連種のほとんどのメンバーで天然に見出される酵素の形
態である。一般に、関連野生型酵素は、本発明の変異ポリペプチドに対して、配列相同性
に関して最も密接に関連した対応野生型酵素である。
【００５８】
しかし、本発明の変異ポリペプチド産生の基礎として特定の野生型配列を使用する場合
、アミノ酸配列相同性に関してより密接に関連する別の野生型配列の存在と無関係に、こ
れは対応する野生型配列である。
【００５９】
本発明の特定の態様の文脈では、基準酵素の例には、配列番号４、配列番号５、配列番
号６、または図５に示す野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株、サーモ
アネロバクテリウム・サーモスルフリゲンス株（タビウム（Ｔａｂｉｕｍ））、またはＮ
ｏｖａｍｙｌ（登録商標）の配列が含まれる。
【００６０】
基準ヌクレオチド配列
本明細書中で使用される、用語「基準ヌクレオチド配列」は、基準酵素をコードする配
列を意味する。
【００６１】
親酵素
本明細書中で使用される、用語「親酵素」は、得られた変異型に近い、好ましくは最も
近い化学構造を有する酵素を意味する。親酵素は、典型的には、前駆体酵素（すなわち、
実質的に変異した酵素）であり得るか、デノボで調製することができる。親酵素は、野生
型酵素であってもよい。
【００６２】
本明細書中で使用される、用語「前駆体」は、本発明の方法によって修飾された酵素以
前の酵素を意味する。したがって、前駆体は、本発明の変異誘発によって修飾された酵素
であってもよい。同様に、前駆体は、野生型酵素、変異野生型酵素、または既に変異した
酵素であってもよい。
【００６３】
用語「野生型」は、当業者に理解されている技術用語であり、天然に存在し、且つ変異
体の表現型に対照的な種のほとんどのメンバーに特徴的な表現型を意味する。したがって
、本文脈では、野生型酵素は、関連種のほとんどのメンバーで天然に見出される酵素の形
態である。一般に、関連野生型酵素は、本発明の変異ポリペプチドに対して、配列相同性
に関して最も密接に関連した対応野生型酵素である。
【００６４】
しかし、本発明の変異ポリペプチド産生の基礎として特定の野生型配列を使用する場合
、アミノ酸配列相同性に関してより密接に関連する別の野生型配列の存在と無関係に、こ
れは対応する野生型配列である。
【００６５】
本発明の特定の態様の文脈では、親酵素の例には、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、または図５に示す野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株、Ｔｈｅｒ
ｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ株（タビウ
ム（Ｔａｂｉｕｍ））、またはＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）の配列が含まれる。
【００６６】
親ヌクレオチド配列
本明細書中で使用される、用語「親ヌクレオチド配列」は、親酵素をコードする配列を
意味する。
【００６７】
本発明の好ましい態様
本発明の好ましい態様を、本明細書中または特許請求の範囲に示す。
【００６８】
本発明の特に好ましい態様
特に好ましい実施形態では、本発明は、基準および／または親酵素と比較した場合（す
なわち、対比した場合）に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、基準および／または親
酵素と比較して加水分解酵素活性が増加し、且つエンドアミラーゼ活性が減少した変異Ｃ
ＧＴアーゼポリペプチドを提供する。
【００６９】
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、変異ＣＧＴアーゼが任意の１つまたは複数
の本明細書中に列挙されているかＢ．サーキュランス２５１株の配列番号４に示すアミノ
酸残基番号または他の相同なＣＧＴアーゼポリペプチド中のその同等の位置に組み込むよ
うに基準および／または親ＣＧＴアーゼに由来する加水分解酵素活性が増加し、そして／
またはエンドアミラーゼ活性が減少した変異ＣＧＴアーゼポリペプチドを提供する（図５
を参照のこと）。
【００７０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、任意の１つの本明細書中に列挙されてい
るかＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）酵素の配列番号６に示すアミノ酸残基番号または他の相
同なマルトース生成α−アミラーゼポリペプチド中のその同等の位置に１つまたは複数の
アミノ酸修飾を含む、基準および／または親酵素と比較してデンプン加水分解酵素活性が
変化し、且つエンドアミラーゼ活性が変化した変異マルトース生成α−アミラーゼ酵素Ｎ
ｏｖａｍｙｌ（登録商標）を提供する。基準および／または親マルトース生成α−アミラ
ーゼ酵素Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）は、バチルス属から単離され（ＥＰ１２０６９３）
、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，デンマークの市販品である。
【００７１】
好ましくは、修飾はアミノ酸置換である。
【００７２】
好ましくは、これらの置換は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナ
ンバリングを使用したアミノ酸Ａ２３０Ｖ、Ｆ２１Ｌ、Ｒ４７Ｌ、Ｒ４７Ｗ、Ｎ９４Ｓ、
Ｋ２３２Ｌ、Ａ２４５Ｔ、Ｆ２５９Ｅ、Ｆ２５９Ｉ、Ｅ２６４Ａ、Ａ３５７Ｔ、Ｙ６３３
Ａ、および他の相同なポリペプチド中のその等価物から選択される。
【００７３】
好ましくは、これらの置換は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナ
ンバリングを使用した１つまたは複数のＦ２１Ｌ、Ｒ４７Ｌ、Ｒ４７Ｗ、Ｎ９４Ｓ、Ｋ２
３２Ｌ、Ａ２４５Ｔ、Ｆ２５９Ｅ、Ｆ２５９Ｉ、Ｅ２６４Ａ、Ａ３５７Ｔ、Ｙ６３３Ａ、
および他の相同なポリペプチド中のその等価物と組み合わせたアミノ酸Ａ２３０Ｖを含む
複数の置換である。
【００７４】
好ましくは、置換は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリン
グを使用したＦ２５９Ｉおよび他の相同なポリペプチド中のその等価物とのアミノ酸Ａ２
３０Ｖの組み合わせ（すなわち、Ａ２３０Ｖ／Ｆ２５９Ｉ）を含む。
【００７５】
本発明の一般的態様
本発明者らは、ランダム変異誘発技術などの変異誘発技術を使用して、デンプン加水分
解活性が増加し、且つエンドアミラーゼ活性が減少した酵素を生成することができること
を証明するために異なるα−アミラーゼファミリーメンバーを設計し試験した。
【００７６】
したがって、本発明の特定の態様では、本発明者らは、変異誘発技術を使用して、α−
アミラーゼファミリーメンバーをエンドアミラーゼからエキソ作用酵素への変換を成し遂
げた。
【００７７】
特に、本発明者らは、エンド特異性変換度に影響を与え得るファミリー１３α−アミラ
ーゼ中の多数の特定のアミノ酸残基を同定した。
【００７８】
用語「エンド特異性変換」は、ファミリー１３α−アミラーゼ変異型の生化学的特性（
例えば、主に、基準および／または親酵素がエキソ作用酵素として作用するのに完全また
は部分的に影響を受けるエンドアミラーゼ活性）の完全または部分的な変化を意味する。
本発明の変異型の生化学的特性の試験を、実施例に記載のように行うことができる。
【００７９】
非常に好ましい態様として、本発明は、１つまたは複数の以下の位置（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）：２３０位および選択的に１
つまたは複数の２１位、４７位、９４位、２３２位、２４５位、２５９位、２６４位、３
５７位、もしくは６３３位またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中のそ
の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むα−アミラーゼファミリーの酵素変
異型を提供する。本発明はまた、この変異型をコードするポリヌクレオチド配列を提供す
る。
【００８０】
さらに別の非常により好ましい態様では、本発明は、１つまたは複数の以下の位置（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）：２３０位およ
び選択的に１つまたは複数の２１位、４７位、９４位、２３２位、２４５位、２５９位、
２６４位、３５７位、もしくは６３３位または他の相同な酵素中のその同等の位置に１つ
または複数のアミノ酸修飾を含む基準および／または親マルトース生成α−アミラーゼ酵
素（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標））に由来するマルトース生成α−アミラーゼ変異型を提
供する。本発明はまた、この変異型をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００８１】
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
２５１株のナンバリングを使用した１つまたは複数のアミノ酸：２１位、４７位、９４位
、２３２位、２４５位、２５９位、２６４位、３５７位、もしくは６３３位または他の相
同なポリペプチド中のその等価物と組み合わせたアミノ酸２３０に修飾を含む基準および
／または親マルトース生成α−アミラーゼ酵素（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標））に由来す
るマルトース生成α−アミラーゼ変異型を提供する。本発明はまた、この変異型をコード
するポリヌクレオチド配列を提供する。
【００８２】
さらに別のより好ましい態様では、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＣＧＴアーゼナンバリングを使用したアミノ酸２５９（すなわち、２３０／２５９）およ
び他の相同なポリペプチド中のその等価物と組み合わせたアミノ酸２３０に修飾を含む基
準および／または親マルトース生成α−アミラーゼ酵素（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）、
配列番号６）に由来するマルトース生成α−アミラーゼ変異型を提供する。本発明はまた
、この変異型をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００８３】
α−アミラーゼファミリー
α−アミラーゼファミリーは、加水分解酵素（ＥＣ３）、トランスフェラーゼ（ＥＣ２
）、およびイソメラーゼ（ＥＣ５）由来の２７を超える異なる酵素特異性を対象とする。
これらは、全アミノ酸配列相同性（特に、触媒部位）、三次元構造類似性、および触媒部
位の幾何学的性質などの特性に基づいてＧＨ−Ｈ属を形成する３つのグリコシド加水分解
酵素ファミリー１３、７０、および７７に属する（ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  
Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．
４，８８５−８９２；Ｕｉｔｄｅｈａａｇ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）
Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，４３２−４３６）。約１００種の異なる生
物（特に、真菌および細菌）由来のα−アミラーゼファミリーメンバーが報告されている
。
【００８４】
本明細書中で使用される、用語「α−アミラーゼファミリー」は、本明細書中で述べら
れるように、加水分解酵素、トランスフェラーゼ、イソメラーゼなどの酵素の異なるクラ
スおよびタンパク質も含まれるα−アミラーゼタンパク質ファミリーを示すことが意図さ
れる（表および本明細書を参照のこと）。上記用語を、酵素のα−アミラーゼファミリー
に属する特定の酵素クラス（すなわち、加水分解酵素クラス）を示す用語「α−アミラー
ゼ」と区別すべきである。
【００８５】
本発明に関して、ファミリー１３に分類される酵素は特に興味深い。この酵素ファミリ
ーには、特に、トランスフェラーゼ酵素クラス（例えば、シクロデキストリングリコシル
トランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ））および加水分解酵素クラス（例えば、マルトース
生成α−アミラーゼ）が含まれる（表Ａを参照のこと）。
【００８６】
【表１】
2011254828.tif 000002
【００８７】
ＣＧＴアーゼ
非常に好ましい態様では、本発明で使用される基準および／または親ＣＧＴアーゼは、
ＥＣ２．４．１．１９に分類される酵素である。これは、任意の供給源（例えば、バチル
ス、サーモアネロバクター、クレブシエラ、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、
クロストリジウム、ミクロコッカス、およびサーモアネロバクテリウム株が含まれてもよ
いがこれらに限定されない細菌供給源）に由来してもよい。
【００８８】
基準および／または親ＣＧＴアーゼは、好ましくは、１つまたは複数の以下の特徴を有
する。
ｉ）アミノ酸は、配列番号４または５と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０
％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なく
とも９９％の配列が同一であること。
ｉｉ）本明細書中に記載の条件でそれぞれＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５
１株またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇ
ｅｎｅｓ株（タビウム）によって保有されたＣＧＴアーゼをコードする配列番号４または
５のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされるこ
と。
ｉｉｉ）グルコシル受容体について明白な優先度を有し、且つそのトランスグリコシラ
ーゼ活性がその加水分解酵素活性よりも非常に高いこと。
ｉｖ）そのエンドアミラーゼ活性がそのエキソアミラーゼ活性よりも非常に高いこと。
【００８９】
マルトース生成α−アミラーゼ
本発明で使用することができる基準および／または親マルトース生成α−アミラーゼは
、ＥＣ３．２．１．１３３に分類される酵素である。この酵素の触媒活性には基質上に非
還元末端が必要であり、一次酵素活性によりアミロペクチンおよびアミロースがマルトー
スおよび他の線状マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）に分解される。この
酵素はまた、アミロースおよびアミロペクチンをα型のマルトースに加水分解することが
できる。さらに、低レベルで、この酵素はシクロデキストリンと同様にマルトトリオース
も加水分解することができる。
【００９０】
本発明で使用することができる好ましい基準および／または親マルトース生成α−アミ
ラーゼは、ＥＰ１２０６９３に記載のバチルス属からクローン化したアミラーゼ（市販品
ではＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）として公知）である。Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）は、
配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し、バチルス属のＮＣＩＢ１１８３７株によってコ
ードされる。
【００９１】
エンドアミラーゼ
用語「エンドアミラーゼ」は、還元末端（すなわち、内部）からデンプンを分解する有
意な能力を有する酵素を意味する。しかし、酵素はその活性のみを有する必要はなく、他
の活性を保有することができる。典型的には、他の活性には、有意なグリコシルトランス
フェラーゼ活性および／または加水分解酵素活性および／またはエキソアミラーゼ活性が
含まれる。好ましくは、エキソアミラーゼ活性が、存在する場合、グリコシルトランスフ
ェラーゼ活性および／または加水分解酵素活性よりも低い（好ましくは非常に低い）。
【００９２】
エキソアミラーゼ
用語「エキソアミラーゼ」は、非還元末端（すなわち、分子の末端）からデンプンを分
解する有意な能力を有する酵素を意味する。しかし、酵素はその活性のみを有する必要は
なく、他の活性を保有することができる。典型的には、他の活性には、有意なグリコシル
トランスフェラーゼ活性および／または加水分解酵素活性および／またはエンド−アミラ
ーゼ活性が含まれる。好ましくは、エンド−アミラーゼ活性は、存在する場合、グリコシ
ルトランスフェラーゼ活性および／または加水分解酵素活性よりも低い（好ましくは非常
に低い）。
【００９３】
加水分解酵素
用語「加水分解酵素」は、有意なデンプン加水分解活性を有する酵素を意味する。しか
し、酵素はその活性のみを有する必要はなく、他の活性を保有することができる。典型的
には、他の活性には、有意なグリコシルトランスフェラーゼ活性が含まれない。好ましく
は、グリコシルトランスフェラーゼは、存在する場合、加水分解酵素活性よりも低い（好
ましくは非常に低い）。
【００９４】
グリコシルトランスフェラーゼ
用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、有意なデンプングリコシルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素を意味する。しかし、酵素はその活性のみを有する必要はなく、他
の活性を保有することができる。典型的には、他の活性には、有意な加水分解酵素活性が
含まれない。好ましくは、加水分解酵素活性は、存在する場合、グリコシルトランスフェ
ラーゼ活性よりも低い（好ましくは非常に低い）。
【００９５】
アミノ酸
本発明の文脈では、アミノ酸残基について以下の記号および略語を使用する。
Ａ  Ａｌａ  アラニン
Ｂ  Ａｓｔ  アスパルテート
Ｃ  Ｃｙｓ  システイン
Ｄ  Ａｓｐ  アスパラギン酸
Ｅ  Ｇｌｕ  グルタミン酸
Ｆ  Ｐｈｅ  フェニルアラニン
Ｇ  Ｇｌｙ  グリシン
Ｈ  Ｈｉｓ  ヒスチジン
Ｉ  Ｉｌｅ  イソロイシン
Ｋ  Ｌｙｓ  リジン
Ｌ  Ｌｅｕ  ロイシン
Ｍ  Ｍｅｔ  メチオニン
Ｎ  Ａｓｎ  アスパラギン
Ｐ  Ｐｒｏ  プロリン
Ｑ  Ｇｌｎ  グルタミン
Ｒ  Ａｒｇ  アルギニン
Ｓ  Ｓｅｒ  セリン
Ｔ  Ｔｈｒ  トレオニン
Ｖ  Ｖａｌ  バリン
Ｗ  Ｔｒｐ  トリプトファン
Ｙ  Ｔｙｒ  チロシン
Ｚ  Ｇｌｎ  グルタミン
Ｘは、任意の非芳香族アミノ酸である（すなわち、Ｙ、Ｆ、またはＷではない）（他で記
述がない限り）。
【００９６】
アミノ酸配列
本発明はまた、本明細書中に定義の特定の性質を有する変異酵素のアミノ酸配列を含む
。
【００９７】
本明細書中で使用される、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／ま
たは用語「タンパク質」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用
語「ペプチド」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素
」と同義である。
【００９８】
本発明のアミノ酸配列を、適切な供給源から調製／単離することができるか、合成する
ことができるか、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。
【００９９】
本発明の変異酵素を、他の酵素と組み合わせて使用することができる。したがって、本
発明はまた、組み合わせが本発明の変異酵素および本発明の別の酵素であり得る別の酵素
を含む酵素の組み合わせを対象とする。この態様を、以下の節で考察する。
【０１００】
好ましくは、変異酵素は、天然の酵素ではない。これに関して、用語「天然の酵素」は
、その天然の環境下に存在し、その天然のヌクレオチド配列によって発現する全酵素を意
味する。
【０１０１】
変異型
本発明は、新規のα−アミラーゼファミリー変異ポリペプチド（すなわち、天然に見出
されないアミノ酸配列を有するα−アミラーゼファミリー変異型）を提供する。形式上、
本発明のα−アミラーゼファミリー変異型を、基準および／または親酵素の１つまたは複
数の残基の置換、挿入、および／または欠失によって得られた基準および／または親α−
アミラーゼファミリー酵素（本明細書中に定義）の機能誘導体と見なすことができる。例
えば、部位特異的変異誘発および変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発などの
標準的な技術を使用して、ポリペプチド配列を修飾することができる。
【０１０２】
本発明の文脈では、加水分解活性が増加し、且つエンドアミラーゼ活性が減少したα−
アミラーゼファミリー変異型は、基準および／または親酵素と比較した場合に、線状オリ
ゴサッカライドレベルを増加することができるα−アミラーゼファミリー変異型である。
【０１０３】
本発明のα−アミラーゼファミリー変異型では、以下の位置（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリング）に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基を
、置換および／または挿入によって導入した。
【０１０４】
８位（前記変異は、８Ｃ；８Ｄ；８Ｆ；８Ｉ；８Ｎ；８Ｐ；８Ｓ；８Ｗ；または８Ｙの
いずれかに対するものである）、
２１位（前記変異は、２１Ａ；２１Ｄ；２１Ｆ；２１Ｌ；２１Ｔ；２１Ｖ；２１Ｗ；ま
たは２１Ｙのいずれかに対するものである）、
４７位（前記変異は、４７Ａ；４７Ｃ；４７Ｄ；４７Ｅ；４７Ｆ；４７Ｇ；４７Ｉ；４
７Ｋ；４７Ｑ；４７Ｌ；４７Ｎ；４７Ｐ；４７Ｒ；４７Ｓ；４７Ｔ；４７Ｖ；または４７
Ｗのいずれかに対するものである）、
９４位（前記変異は、９４Ｎまたは９４Ｓのいずれかに対するものである）、
２１５位（前記変異は、２１５Ｉまたは２１５Ｖのいずれかに対するものである）、
２３０位（前記変異は、２３０Ａ；２３０Ｃ；２３０Ｄ；２３０Ｅ；２３０Ｆ；２３０
Ｇ；２３０Ｈ；２３０Ｉ；２３０Ｋ；２３０Ｌ；２３０Ｍ；２３０Ｎ；２３０Ｐ；２３０
Ｑ；２３０Ｒ；２３０Ｓ；２３０Ｔ；２３０Ｖ；２３０Ｗ；または２３０Ｙのいずれかに
対するものである）、
２３２位（前記変異は、２３２Ｌのいずれかに対するものである）、
２４５位（前記変異は、２４５Ａまたは２４５Ｔのいずれかに対するものである）、
２５９位（前記変異は、２５９Ａ；２５９Ｅ；２５９Ｆ；２５９Ｉ；または２５９Ｓの
いずれかに対するものである）、
２６３位（前記変異は、２６４Ａのいずれかに対するものである）、
２９９位（前記変異は、２９９Ｄのいずれかに対するものである）、
３２０位（前記変異は、３２０Ｑまたは３２０Ｌのいずれかに対するものである）、
３５７位（前記変異は、３５７Ａまたは３５７Ｔのいずれかに対するものである）、
５１４位（前記変異は、５１４Ａのいずれかに対するものである）、
６３３位（前記変異は、６３３Ａのいずれかに対するものである）、
６５５位（前記変異は、６５５Ｋまたは６５５Ｅのいずれかに対するものである）、
６６０位（前記変異は、６６０Ａまたは６６０Ｖのいずれかに対するものである）、お
よび／または
６７２位（前記変異は、６７２Ａまたは６７２Ｇのいずれかに対するものである）。
【０１０５】
本発明のより好ましいα−アミラーゼファミリー変異型では、以下の位置（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリング）に対応する１つまたは複数のア
ミノ酸残基を、置換および／または挿入によって導入した。
【０１０６】
８位（前記変異は、８Ｓに対するものである）、
２１位（前記変異は、２１Ｌに対するものである）、
４７位（前記変異は、４７Ｑ；４７Ｌ；または４７Ｗのいずれかに対するものである）
、
９４位（前記変異は、９４Ｓに対するものである）、
２１５位（前記変異は、２１５Ｖに対するものである）、
２３０位（前記変異は、２３０Ｖに対するものである）、
２３２位（前記変異は、２３２Ｌに対するものである）、
２４５位（前記変異は、２４５Ｔに対するものである）、
２５９位（前記変異は、２５９Ｅ；２５９Ｉ；または２５９Ｓのいずれかに対するもの
である）、
２６３位（前記変異は、２６３Ａに対するものである）、
２９９位（前記変異は、２９９Ｄに対するものである）、
３２０位（前記変異は、３２０Ｌに対するものである）、
３５７位（前記変異は、３５７Ｔに対するものである）、
５１４位（前記変異は、５１４Ａに対するものである）、
６３３位（前記変異は、６３３Ａに対するものである）、
６５５位（前記変異は、６５５Ｅに対するものである）、
６６０位（前記変異は、６６０Ａに対するものである）、
６７２位（前記変異は、６７２Ｇに対するものである）。
【０１０７】
好ましい実施形態では、変異α−アミラーゼファミリー酵素は、変異マルトース生成α
−アミラーゼ酵素である。したがって、本発明は、置換および／または挿入によって１つ
または複数のアミノ酸修飾が導入された基準および／または親酵素と比較してデンプン加
水分解酵素活性が増加し、そして／またはエンドアミラーゼ活性が減少した変異マルトー
ス生成α−アミラーゼポリペプチドを提供する。
【０１０８】
好ましくは、マルトース生成α−アミラーゼ変異型は、配列番号６に示すバチルスＮＣ
ＩＢ１１８３７株またはその同族体に由来する。
【０１０９】
本発明のα−アミラーゼファミリー変異型は、天然に見出される任意のα−アミラーゼ
ファミリーメンバー酵素に由来し得る。
【０１１０】
好ましくは、修飾すべきα−アミラーゼ配列は、ファミリー１３α−アミラーゼ酵素、
より好ましくは、バチルス株、サーモアネロバクター株、クレブシエラ株、コリネバクテ
リウム株、ブレビバクテリウム株、クロストリジウム株、ミクロコッカス株、またはサー
モアネロバクテリウム株由来のファミリー１３α−アミラーゼの配列である。
【０１１１】
より好ましい実施形態では、本発明のα−アミラーゼ変異型は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａ
ｕｔｏｌｙｔｉｃｕｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ株ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ
種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ株、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ株、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｈｂｅｎｓｉｓ株、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ株、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ株、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ株、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  
ｆｕｎｎｉ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ株、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｌ株、またはＴｈｅ
ｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ株に由来
する。
【０１１２】
本発明のＣＧＴアーゼ変異型がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ株に由来する場
合、置換および／または挿入によって１つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することがで
きる。
【０１１３】
好ましくは、ＣＧＴアーゼ変異型は、配列番号１に示すＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ２５１株またはその同族体に由来する。
【０１１４】
例として、置換および／または挿入によって１つまたは複数のアミノ酸修飾が導入され
たＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株ＣＧＴアーゼ変異型の構築物（例えば
、Ａ２３０Ｖ、Ａ２３０Ｖ／Ｆ２１Ｌ、Ａ２３０Ｖ／Ａ２４５Ｔ／Ａ３５７Ｔ、Ａ２３０
Ｖ／Ｆ２１Ｌ／Ｎ９４Ｓ、Ａ２３０Ｖ／Ｆ２１Ｌ／Ｒ４７Ｗ）を記載する。
【０１１５】
好ましくは、ＣＧＴアーゼ変異型は、配列番号２に示すサーモアネロバクテリウム・サ
ーモスルフリゲンスＥＭ１株（タビウム）またはそのホモログに由来する。例として、置
換および／または挿入によって１つまたは複数のアミノ酸修飾が導入されたサーモアネロ
バクテリウム・サーモスルフリゲンスＥＭ１株（タビウム）ＣＧＴアーゼ変異型の構築物
（例えば、Ａ２３１Ｖ、Ｆ２６０Ｅ、および／またはＡ２３１Ｖ／Ｆ２６０Ｅ）を記載す
る。
【０１１６】
サーモアネロバクテリウム・サーモスルフリゲンスＥＭ１株（タビウム）ＣＧＴアーゼ
のアミノ酸２３１および２６０は、それぞれＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５
１株のアミノ酸２３０および２５９に対応することに留意すべきである（Ｎｏｖａｍｙｌ
（登録商標）とサーモアネロバクテリウム・サーモスルフリゲンス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、およびサーモアネロバクター由来のＣＧＴアーゼとの配列アライン
メントを示す、ＵＳ−６，４８２，６２２を参照のこと（参照を容易にするために、この
アラインメントを図５に再度作製する））。
【０１１７】
したがって、１つまたは複数のアミノ酸残基を含む変異ＣＧＴアーゼは、加水分解酵素
活性が増加し、且つエンドアミラーゼ活性が減少し、無作為な変異誘発によって基準およ
び／または親ＣＧＴアーゼと比較した場合にＣＤに関して線状オリゴサッカライド産生レ
ベルが増加する。
【０１１８】
好ましくは、マルトース生成α−アミラーゼ変異型は、配列番号３に示すバチルス属（
Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標））またはそのホモログに由来する。例として、置換および／
または挿入によって１つまたは複数のアミノ酸修飾が導入されたＮｏｖａｍｙｌ（登録商
標）変異型の構築物（例えば、Ａ２２９Ｖ、Ａ２２９Ｖ／Ｆ１６Ｌ、Ａ２２９Ｖ／Ｋ２４
４Ｔ、および／またはＡ２２９Ｖ／Ｙ２５８Ｘ（Ｘは、任意の非芳香族アミノ酸（すなわ
ち、Ｙ、Ｆ、またはＷではない）である）（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）にしたがったナ
ンバリング））を記載する。
【０１１９】
より好ましくは、マルトース生成α−アミラーゼ変異型はバチルス属に由来し（Ｎｏｖ
ａｍｙｌ（登録商標））、二重置換Ａ２９９Ｖ／Ｙ２５８Ｘ（Ｘは、任意の非芳香族アミ
ノ酸（すなわち、Ｙ、Ｆ、またはＷではない）である）（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）に
したがったナンバリング））を含む。
【０１２０】
Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）のアミノ酸１６、２２９、２４４および２５８は、それぞ
れＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株のアミノ酸２１、２３０、２４５、お
よび２５９に対応することに留意すべきである（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）とＴｈｅｒ
ｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ由来のＣ
ＧＴアーゼとの配列アラインメントを示す、ＵＳ−６，４８２，６２２を参照のこと（参
照を容易にするために、このアラインメントを図５に再度作製する））。
【０１２１】
したがって、１つまたは複数のアミノ酸残基を含む変異Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）は
、トランスグリコシダーゼ活性が変化し、且つ加水分解酵素活性が変化し、変異誘発によ
って基準および／または親Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）と比較した場合にＣＤおよび線状
産生レベルが変化する。
【０１２２】
同一性および相同性
本発明は、本発明の変異酵素の任意のアミノ酸配列またはこのような変異酵素をコード
する任意のヌクレオチド配列のホモログおよび誘導体の使用を含む。本明細書中の用語「
ホモログ」は、変異型のアミノ酸配列および変異型のヌクレオチド配列と一定の相同性を
有する物質を意味する。本明細書中の用語「相同性」は、「同一性」と同等であり得る。
【０１２３】
本発明の文脈では、相同配列を、基準および／または親の配列などの関連比較配列と少
なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一、好ましくは少な
くとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得るアミノ酸配列が含
まれると見なす。典型的には、ホモログは、変異型のアミノ酸配列と同一の活性部位など
を含む。相同性を、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）
とみなすことができるが、本発明の文脈では、配列同一性という点では相同性と表現する
ことが好ましい。
【０１２４】
相同性の比較を、目視によって、またはより通常には容易に利用可能な配列比較プログ
ラムの支援によって行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、
２つまたはそれ以上の配列の間の相同率を計算することができる。
【０１２５】
連続した配列の相同率を計算することができる（すなわち、一方の配列を他方の配列と
整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基
ずつ直接比較する）。これを、「非ギャップ」アラインメントと呼ぶ。典型的には、この
ような非ギャップアラインメントを、比較的少数の残基でのみ行う。
【０１２６】
これは非常に単純且つ一貫した方法であるにもかかわらず、例えば、同一の配列対でな
ければ１つの挿入または欠失以降のアミノ酸残基がアラインメントから除外されることを
考慮できないので、アラインメント全体で行った場合相同率は大きく減少するかもしれな
い。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアに過度にペナルティーを
科すことなく可能な挿入および欠失を考慮する至適アラインメントが得られるようにデザ
インされている。局所相同性を最大にしようとするために配列アラインメントに「ギャッ
プ」を挿入することによってこれを行う。
【０１２７】
しかし、これらのより複雑な方法では、同数の同一のアミノ酸について可能な限り少数
のギャップ（２つの比較配列間でより高い関連性を反映する）を含む配列アラインメント
が多数のギャップを含む配列アラインメントよりも高いスコアが得られるようにアライン
メント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的には、ギ
ャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ中のその後の各残基のペナルティーを
より小さくする「アフィニティーギャップコスト」を使用する。これは、最も一般的に使
用されているギャップスコアリングシステムである。勿論、高いギャップペナルティーに
より、より少ないギャップを含む最適化アラインメントが得られる。ほとんどのアライン
メントプログラムは、ギャップペナルティーを修正可能である。しかし、このような配列
比較ソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、Ｇ
ＣＧ  ウィスコンシン  ベストフィットパッケージを使用した場合、アミノ酸配列のデフ
ォルトギャップペナルティーは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−
４である。
【０１２８】
したがって、最大相同率の計算には、最初にギャップペナルティーを考慮した至適アラ
インメントの作製が必要である。
【０１２９】
好ましくは、本発明の目的のために、ポリペプチド配列比較について以下の設定を使用
したＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ．Ｂ．および  Ｗｕｎｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３−４４５）に記載
の方法にしたがって同一度を決定することができる。ＧＡＰ作製ペナルティー３．０およ
びＧＡＰ伸長ペナルティー０．１。ＧＣＧプログラムパッケージが提供するＧＡＰなどの
公知のコンピュータプログラム（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ａｕｇｕｓｔ  １９９４，Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ５３７１１）によって決定することができる。
【０１３０】
配列比較ができる他のソフトウェアの例には、比較ツールのＢＬＡＳＴパッケージ（Ａ
ｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４thＥｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照のこと）、Ｆ
ＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０
３−４１０）、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツが含まれるが、これらに限定されない。
ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共にオフラインおよびオンライン検索で利用可能である（
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ７−５８から７−６０を参照のこと）
。しかし、いくつかの適用については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するこ
とが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規のツールはまた、タ
ンパク質およびヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９，１７７（１）：１８７−８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０１３１】
最終相同率を同一性に関して測定することができるにもかかわらず、アラインメントプ
ロセス自体は、典型的には、絶対的な対比較に基づかない。その代わり、一般にスコアを
化学的類似性または進化距離に基づいた各対比較に割り当てるスケール変換類似性スコア
行列（ｓｃａｌｅｄ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ）を使用する。
一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（プログラムのＢＬＡ
ＳＴスーツ用のデフォルト行列）である。ＧＣＧ  ウィスコンシンプログラムは、一般に
、公的なデフォルト値または供給されている場合にはカスタムシンボル比較テーブルのい
ずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。いくつ
かの適用については、ＧＣＧパッケージについては公的なデフォルト値を使用し、他のソ
フトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい
。
【０１３２】
あるいは、相同率を、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ
、１９８８，Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７〜２４４）に類似する、アルゴリズムに基づ
いたＤＮＡＳＩＳ（商標）（日立ソフトウェア）のマルチアラインメント性を使用して計
算することができる。
【０１３３】
一旦ソフトウェアによって最適なアラインメントが得られると、相同率、好ましくは配
列同一率を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部と
してこれを計算し、数値で結果が得られる。
【０１３４】
配列はまた、サイレントに変化させて機能的に同等の変異酵素が得られるアミノ酸残基
の欠失、挿入、または置換を有し得る。物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極
性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて意図的
なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負電荷のアミノ酸にはアスパラギン酸およ
びグルタミン酸が含まれ、正電荷のアミノ酸にはリジンおよびアルギンが含まれ、類似の
親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有する非荷電極性末端基を有
するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギ
ン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【０１３５】
特に、変異型は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株、サーモアネロバク
テリウム・サーモスルフリゲンスＥＭ１株（タビウム）、またはＮｏｖａｍｙｌ（登録商
標）配列由来の基準および／または親酵素と活性部位を含む少なくとも５０個または１０
０個のアミノ酸残基と少なくとも５０、６０、７０％、好ましくは少なくとも８０％（例
えば、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、または少なくとも９８％もしく
は９９％）相同なアミノ酸同一性を有する。
【０１３６】
ヌクレオチド配列の調製
本明細書中に定義の特定の性質を有する酵素または修飾に適切な酵素のいずれかをコー
ドするヌクレオチド配列を、酵素を産生する任意の細胞または生物から同定および／また
は単離および／または精製することができる。ヌクレオチド配列の同定および／または単
離および／または精製についての分野で種々の方法が周知である。例として、一旦適切な
配列が同定および／または単離および／または精製されると、ＰＣＲ増幅技術を使用して
より多数の配列を調製することができる。
【０１３７】
さらなる例として、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーを、酵素を産生
する生物由来の染色体ＤＮＡまたは伝令ＲＮＡを使用して構築することができる。酵素の
アミノ酸配列が公知である場合、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを使用
して生物から調製したゲノムライブラリー由来の酵素コードクローンを同定することがで
きる。あるいは、別の公知の酵素遺伝子に対する配列ホモログを含む標識オリゴヌクレオ
チドプローブを使用して、酵素コードクローンを同定することができる。後者の場合、低
ストリンジェンシーのハイブリッド形成および洗浄条件を使用する。
【０１３８】
あるいは、酵素コードクローンを、プラスミドなどの発現ベクターへのゲノムＤＮＡフ
ラグメントの挿入、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでの酵素陰性細菌の形質転換、お
よびその後の形質転換細菌の酵素の基質を含む寒天へのプレーティング、それによる酵素
発現クローンの同定によって同定することができる。
【０１３９】
なおさらに別の態様では、酵素をコードするヌクレオチド配列を、確立された標準的方
法（例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，ｐ１８５９−１８６９に記載のホスホラミダイト法または
Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，ｐ８０１−８０５に記載
の方法）によって合成することができる。ホスホロアミダイト法では、例えば、自動ＤＮ
Ａ合成機でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、
適切なベクター中でクローン化する。
【０１４０】
ヌクレオチド配列は、標準的技術により、合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ
起源（必要に応じて）のフラグメントのライゲーションによって調製した混合ゲノム起源
および合成起源、混合合成起源およびｃＤＮＡ起源、または混合ゲノム起源およびｃＤＮ
Ａ起源であり得る。各ライゲーションしたフラグメントは、全ヌクレオチド配列の種々の
部分に対応する。ＤＮＡ配列を、例えば、ＵＳ４，６８３，２０２またはＳａｉｋｉ  Ｒ
Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７−４９１）に記
載の特定のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製すること
もできる。
【０１４１】
変異誘発
タンパク質および酵素の１つの一般的な修飾アプローチは、ランダム変異誘発に基づい
ている。例えば、適切な物理的または化学的変異誘発剤の使用、適切なオリゴヌクレオチ
ドの使用、または変異性ＰＣＲなどのＰＣＲ作製変異誘発への前駆体ＤＮＡ配列の適用に
よってランダム変異誘発を行うことができる。さらに、これらの変異誘発剤の任意の組み
合わせの使用によってランダム変異誘発を行うことができる。変異誘発剤は、例えば、挿
入、欠失、トランジション、トランスバージョン、逆位、および／またはスクランブリン
グを誘導するものであり得る。本発明に適切な物理的または化学的薬剤の例には、特に、
紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、およびヌクレオチド類似体が含まれる。この
ような薬剤を使用する場合、典型的には、変異誘発が起こる適切な条件下での最適な変異
誘発剤の存在下での変異誘発すべき基準および／または親酵素をコードするＤＮＡ配列の
インキュベーションおよび所望の性質を有する変異ＤＮＡの選択によって変異誘発を行う
。
【０１４２】
オリゴヌクレオチドの補助によって変異誘発が行われる場合、オリゴヌクレオチド合成
時に１つまたは複数の非基準および／または非親ヌクレオチドを組み込むようにオリゴヌ
クレオチドをデザインすることができる。この目的は、特定のヌクレオチドの組み込みを
最大にして所望のアミノ酸発現を確実にするためである。これらのオリゴヌクレオチドを
、任意の確立された技術（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ）または適切と考えられる任意のＤＮ
Ａポリメラーゼおよびリガーゼによって本発明のα−アミラーゼファミリーメンバーをコ
ードするＤＮＡに組み込むことができる。
【０１４３】
さらなる実施形態では、本発明の変異ポリペプチドは、精製および単離された天然に存
在する変異α−アミラーゼファミリーメンバーであり得る。あるいは、変異α−アミラー
ゼファミリーメンバーを、本明細書中に記載の物理的および／または化学的変異誘発物質
を生物に供し、その後そのα−アミラーゼ遺伝子中に変異を含む生物をスクリーニングす
ることによって作製することができる。天然に存在する変異体およびランダム変異誘発に
よって作製された変異体を、α−アミラーゼファミリー遺伝子領域を増幅するための適切
な核酸プライマーを使用したＰＣＲスクリーニングなどの種々の技術の使用および得られ
たフラグメントの配列決定を使用して同定／スクリーニングすることができる。
【０１４４】
したがって、本発明の変異ポリペプチドには、天然に存在する変異α−アミラーゼファ
ミリーメンバー（既存の生物から精製および単離されたものまたは組換えによって得られ
たもの）、ランダム変異誘発によって得られた変異α−アミラーゼファミリーメンバー、
および部位特異的変異誘発によって得られた変異酵素が含まれる。
【０１４５】
本発明の変異ポリペプチドを、α−アミラーゼファミリーメンバーのエキソアミラーゼ
として作用する能力に必ずしも影響を与えないさらなる修飾に供することもできる。
【０１４６】
例えば、以下の表にしたがって、同類置換を行うことができる。第２列中の同一ブロッ
クおよび好ましくは第３列中の同一ライン中のアミノ酸を互いに置換することができる。
【０１４７】
【表２】
2011254828.tif 000003
【０１４８】
本発明のポリペプチドには、加水分解活性が増加し、任意選択的にエンドアミラーゼ活
性が減少したα−アミラーゼファミリーメンバーの全長配列のフラグメントも含まれる。
【０１４９】
本発明のポリペプチドは、典型的には、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に異種
アミノ酸配列をさらに含み得る。異種配列には、細胞内または細胞外タンパク質ターゲテ
ィングに影響を与える配列（リーダー配列など）が含まれ得る。
【０１５０】
本発明のポリペプチドは、典型的には、例えば、本明細書中に記載の組換え手段によっ
て作製される。しかし、これらを固相合成などの当業者に周知の技術を使用した合成手段
によって作製することもできる。本発明のポリペプチドを、例えば、抽出および精製を補
助するために融合タンパク質として産生することもできる。融合タンパク質配列を除去す
るために融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間にトロンビン切断部位
などのタンパク質分解的切断部位を含むことも都合がよい。好ましくは、融合タンパク質
は、目的のタンパク質配列の機能を損なわない。
【０１５１】
本発明の組換え発現産物に適切な生物活性を付与する必要があり得るので、適切な宿主
細胞の使用により、このような翻訳後修飾が得られると予想される。
【０１５２】
部位特異的変異誘発
一旦酵素コードヌクレオチド配列が単離されるか、推定酵素コードヌクレオチド配列が
同定されると、本発明の酵素を調製するために配列を変異させることが望ましい。
【０１５３】
合成オリゴヌクレオチドを使用して、変異を移入することができる。これらのオリゴヌ
クレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０１５４】
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１
９８４）２，ｐ６４６−６４９）に開示されている。酵素コードヌクレオチド配列への別
の変異の移入方法は、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）１８０，ｐ１４７−１５１）に記載されている。
【０１５５】
合成
本発明の１つの態様では、本発明で用いる配列は、合成配列（すなわち、インビトロで
の化学合成および酵素合成によって調製された配列）である。これには、メチロトローフ
酵母ピキアおよびハンセヌラなどの宿主生物についての至適なコドン使用頻度を使用して
作製した配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド配列をコードする核酸配列を
含む。
【０１５７】
多数の異なるポリヌクレオチドが遺伝コードの縮重の結果として同一のポリペプチドを
コードすることができることが当業者に理解される。さらに、当業者は日常的技術を使用
して本発明のポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン利用頻度を反映す
るように本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド配列に影響を与え
ないヌクレオチド置換を行うことができると理解すべきである。
【０１５８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。これらは一本鎖または
二本鎖であり得る。これらはまた、合成または修飾ヌクレオチド中に含まれるポリヌクレ
オチドであり得る。多数の異なるオリゴヌクレオチド修飾型が当分野で公知である。これ
らには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および
／または５’末端へのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的
のために、本明細書中に記載のポリヌクレオチドを当分野で利用可能な任意の方法で修飾
することができると理解すべきである。本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または
寿命を増大させるためにこのような修飾を行うことができる。
【０１５９】
酵素の発現
本発明で使用するヌクレオチド配列を、組換え複製ベクターに組み込むことができる。
このベクターを使用して、酵素形態で、および／または適合可能な宿主細胞中でヌクレオ
チド配列を複製および発現することができる。
【０１６０】
調節配列（例えば、調節配列）を使用して、発現を調節することができる。
【０１６１】
ヌクレオチド配列の発現による宿主組換え細胞によって産生された酵素は分泌されても
よく、使用した配列および／またはベクターに応じて細胞内に含んでいてもよい。特定の
原核細胞膜および真核細胞膜を介した物質コード配列の分泌を指示するシグナル配列を使
用して、コード配列をデザインしてもよい。
【０１６２】
調節配列
いくつかの適用では、本発明で使用するヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞など
によってヌクレオチド配列を発現することができる調節配列に作動可能に連結されている
。例として、本発明は、このような調節配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチ
ド配列を含むベクター（すなわち、そのベクターは、発現ベクターである）を対象とする
。
【０１６３】
用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図する様式で機能する関係にあ
る近位をいう。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列を、調節配列と適合する
条件下でコード配列が発現するような方法でライゲーションする。
【０１６４】
用語「調節配列」には、プロモーターおよびエンハンサーならびに他の発現調節シグナ
ルが含まれる。
【０１６５】
用語「プロモーター」は、当分野における通常の意味で使用される（例えば、ＲＮＡポ
リメラーゼ結合部位）。
【０１６６】
異種調節領域（例えば、プロモーター、分泌リーダー領域、および終結領域）の選択に
よって、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を増強することもできる。
【０１６７】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列を、少なくともプロモーターに作動可能に連結
させることができる。
【０１６８】
細菌、真菌、または酵母宿主中のヌクレオチド配列の転写を指示するための適切なプロ
モーターの例は、当分野で周知である。
【０１６９】
構築物
用語「構築物」は、「結合体」、「カセット」、および「ハイブリッド」などの用語と
同義であり、プロモーターに直接または間接的に結合した本発明で使用されるヌクレオチ
ド配列が含まれる。
【０１７０】
間接的結合の例は、Ｓｈ１イントロンまたはＡＤＨイントロンなどのイントロン配列な
どの適切なスペーサー基の供給であり、本発明のプロモーターおよびヌクレオチド配列を
媒介する。これは、本発明に関する用語「融合した」にあてはまり、直接または間接的結
合が含まれる。いくつかの例では、この用語は、通常の状態で野生型遺伝子プロモーター
と結合したタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせおよび共に天然
の環境下に存在する場合に対象としない。
【０１７１】
構築物は、遺伝子構築物が選択を可能にするマーカーを含むか発現することができる。
【０１７２】
いくつかの適用のために、好ましくは、本発明の構築物は、少なくともプロモーターに
作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
発現ベクター
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロ発現が可能な構築物を意味する。
【０１７４】
好ましくは、発現ベクターを、適切な宿主生物のゲノムに移入する。用語「組み込まれ
た」は、好ましくは、ゲノムへの安定な組込みを対象とする。
【０１７５】
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が適切な宿主生物によってヌクレオチ
ド配列を発現することができる調節配列に作動可能に連結されたベクター中に存在するこ
とができる。
【０１７６】
本発明で使用されるベクターを、本発明のポリペプチドを発現するために本明細書中に
記載のように適切な宿主細胞に形質転換することができる。
【０１７７】
ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージベクター）の選択は、導入
される宿主細胞に依存することが多い。
【０１７８】
本発明で使用されるベクターは、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイ
シン耐性、クロラムフェニコール耐性、またはテトラサイクリン耐性）を付与する遺伝子
などの１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。あるいは、コトランスフェ
クションによって選択することができる（ＷＯ９１／１７２４３に記載）。
【０１７９】
ベクターを、例えば、ＲＮＡ産生のためまたは宿主細胞のトランスフェクション、形質
転換、遺伝子導入、または感染のためにインビトロで使用することができる。
【０１８０】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、複製可能なベクターへの本発明のヌク
レオチド配列の移入、適合可能な宿主細胞へのベクターの移入、およびベクター複製条件
下での宿主細胞の成長による本発明のヌクレオチド配列の作製方法を提供する。
【０１８１】
ベクターはさらに、問題の宿主細胞でベクターを複製させることができるヌクレオチド
配列を含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐ
ＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、およびｐＩＪ７０２の複製起点である。
【０１８２】
宿主細胞
本発明に関する用語「宿主細胞」には、本明細書中に記載され、且つ本明細書中で定義
の特性を有する酵素の組換え産生で使用されるヌクレオチド配列または発現ベクターのい
ずれかを含む任意の細胞が含まれる。
【０１８３】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明の酵素を発現するヌクレオチド配列
で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。ベクターと適合可能な細
胞を選択し、これらの細胞は、例えば、原核細胞（例えば、細菌）、真菌細胞、酵母細胞
、または植物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞ではない。
【０１８４】
適切な細菌宿主生物の例は、グラム陽性またはグラム陰性細菌種である。
【０１８５】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質および／または発現するタンパク質
のさらなるプロセシングの望ましさに依存して、酵母または他の真菌などの真核生物宿主
が好ましい。一般に、操作がより簡単なので、真菌細胞よりも酵母細胞が好ましい。しか
し、いくつかのタンパク質は、酵母細胞からあまり分泌されないか、場合によっては、適
切にプロセシングされない（例えば、酵母における過剰グリコシル化）。これらの場合、
異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
【０１８６】
適切な宿主細胞（酵母、真菌、および植物宿主細胞など）の使用により、本発明の組換
え発現産物に適切な生物活性を付与するのに必要であり得る翻訳後修飾（例えば、ミリス
トイル化、グリコシル化、切断、脂質付加反応、およびチロシン、セリン、トレオニンの
リン酸化）を行うことができる。
【０１８７】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損またはプロテアーゼ欠乏（ｍｉｎｕｓ）株であり得る。
【０１８８】
生物
本発明に関する用語、「生物」には、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列およ
び／またはこれから得られた産物を含むことができ、そして／または生物中に存在する場
合、プロモーターにより本発明のヌクレオチド配列を発現することができる任意の生物が
含まれる。
【０１８９】
本発明のポリペプチドが他のα−アミラーゼファミリーメンバーを実質的に含まない形
態で産生される異種宿主を選択することもできる。通常このような酵素を天然に産生しな
い宿主の選択によってこれを行うことができる。
【０１９０】
適切な生物には、原核生物、真菌、酵母、または植物が含まれ得る。
【０１９１】
本発明に関する用語、「形質転換生物」には、本発明の酵素をコードするヌクレオチド
配列および／またはこれから得られた産物を含む任意の生物が含まれ、そして／またはプ
ロモーターにより生物内で本発明のヌクレオチド配列を発現することができる任意の生物
が含まれる。好ましくは、ヌクレオチド配列を生物のゲノムに組み込む。
【０１９２】
用語「形質転換生物」は、天然環境下でも存在する天然のプロモーターの調節下に存在
する場合、天然の環境下での天然のヌクレオチドコード配列は対象としない。
【０１９３】
したがって、本発明の形質転換生物には、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列
、本発明の構築物、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発明の組
織、またはその産物の任意の１つまたは組み合わせを含む生物が含まれる。
【０１９４】
例えば、形質転換生物はまた、異種プロモーターの調節下で本発明の酵素をコードする
ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１９５】
宿主細胞／生物の形質転換
先に示すように、宿主生物は、原核生物または真核生物であり得る。
【０１９６】
適切な原核生物宿主の例には、大腸菌およびバチルス・ズブチリスが含まれる。バチル
ス属由来の細菌は、培養倍地中へのタンパク質の分泌能力のために異種宿主として適切で
あり得る。宿主として適切な他の細菌は、ストレプトマイセス属およびシュードモナス属
由来の細菌である。適切な原核生物宿主の例には、バチルス・オートリチクス、バチルス
・セレウス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ株アルカロフィラス種、バチルス・コアグランス、バチルス・フィルムス、バチル
ス・ハロフィルス、バチルス・マセランス、バチルス・メガテリウム、バチルス・オーベ
ンシス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・ズブチリス、ストレプトマイセ
ス・ムリヌス、ストレプトマイセス・リビダンスなどのグラム陽性細菌または大腸菌など
のグラム陰性細菌が含まれる。原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当分野で十分に
報告されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８
９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）およ
びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９），４ｔｈ  Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
【０１９７】
原核生物宿主を使用する場合、ヌクレオチド配列は、形質転換前にイントロンの除去な
どによって適切に修飾される必要があり得る。いくつかの例では、生物は、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌、より好ましくは、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓまたはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓであることが好ましい。
【０１９８】
当分野で公知の種々の方法（プロトプラスト形成およびプロトプラスト形質転換および
その後の公知の様式での細胞壁の再生を含むプロセスなど）を使用して、糸状菌細胞を形
質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用をＥＰ０２３８０２
３に記載する。
【０１９９】
本発明の範囲内の真菌発現宿主の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種およびＴｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、およびＰｒｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ種などの細菌、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ種などの酵母である。特に好ましい発現宿主は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅ
ｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．ｖａｒ  ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．ｖａｒ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌ
ｅａｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏ
ｒｖｚａｅ、Ｔｈｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。
【０２００】
真菌および酵母の形質転換に関する一般的教示を以下の節で示す。
【０２０１】
別の宿主生物は、植物であり得る。植物形質転換で使用される一般的技術の概説が、Ｐ
ｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ（１９９１）４２：２０５−２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆ
ｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７
−２７）の論文に見られる。植物形質転換に関するさらなる技術が、ＥＰ−Ａ−０４４９
３７５号に見られる。
【０２０２】
形質転換真菌
宿主生物は、真菌（糸状菌など）であってもよい。適切なこのような宿主の例には、Ｔ
ｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、およびＴｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ属などに属する任意のメンバーが含まれる。
【０２０３】
糸状菌の形質転換についての技術は、糸状菌の標準的な形質転換技術および真菌の培養
が当分野で周知であることが記載されているＵＳ−Ａ−５７４１６６５号に概説されてい
る。Ｎ．クラッサに適用した技術の広範な概説は、例えば、Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  ｄｅ  
Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９−１４３に見
出される。
【０２０４】
糸状菌の形質転換についてのさらなる技術は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７号に概説され
ている。
【０２０５】
１つの態様では、宿主生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ属の宿主生物であり得る。
【０２０６】
本発明の形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを、例えば、以下の教示によって調製するこ
ともできる。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  
ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ
Ｊ．Ｒ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ．Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ  ｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  ２９．
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９９４．ｐｐ．６４１−６６６）。
糸状菌における遺伝子発現は、Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ｍａｙ；２０（５）：２００−６，Ａｒｃｈｅｒ＆Ｐｅ
ｂｅｒｄｙ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１７（４）：２７３
−３０６に概説されている。
【０２０７】
形質転換酵母
別の実施形態では、形質転換生物は酵母であり得る。
【０２０８】
酵母における異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉ
ｏｌ（１９９５），４９：３４１−５４およびＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ（１９９７）Ｏｃｔ；８（５）：５５４−６０に記載されている。
【０２０９】
これに関して、異種遺伝子発現用の送達体としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ  Ｒｅｖ（２０００  ２４（１）：４５−６６を参照のこと）などの酵母を使用するこ
とができる。
【０２１０】
サッカロマイセス・セレビシエにおける異種遺伝子発現の原理および遺伝子産物分泌の
概説は、Ｅ  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ  Ｋｅｎｎｙ（１９９３，「Ｙｅａｓｔ  ａｓ
ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ」，Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ５，Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｈ  Ｒｏｓｅ  
ａｎｄ  Ｊ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）によって記載されている。
【０２１１】
酵母の形質転換のために、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例えば
、本発明の形質転換サッカロマイセスを、以下のＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７
８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ  Ｄ（１
９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈ  ｅｔ  ａ
ｌ（１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３，１６３−１６８）の教示によっ
て調製することができる。
【０２１２】
栄養要求性マーカーである優性抗生物質耐性マーカーなどの種々の選択マーカーを使用
して、形質転換酵母細胞を選択することができる。
【０２１３】
培養および産生
本発明のヌクレオチド配列で形質導入した宿主細胞を、コードされた酵素の産生に有益
であり、細胞および／または培養培地からの酵素の回収が容易になる条件下で培養するこ
とができる。
【０２１４】
細胞培養で使用した培地は、問題の宿主細胞の成長および酵素発現に適切な任意の従来
の培地であり得る。
【０２１５】
なおさらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載の宿主細胞を変異型の産生ならび
に細胞および／または培養培地からの変異型の回収に適切な条件下で培養する工程を含む
、本発明の変異型の産生方法に関する。
【０２１６】
組換え細胞によって産生されたタンパク質を、細胞表面にディスプレイすることができ
る。
【０２１７】
周知の手順を使用して、酵素を宿主細胞から分泌させ、培養培地から都合よく回収する
ことができる。
【０２１８】
分泌
多くの場合、発現宿主から酵素をより容易に回収することができる培養培地中に酵素を
分泌させることが望ましい。本発明によれば、所望の発現宿主に基づいて、選択リーダー
配列を選択することができる。本発明の状況によってハイブリッドシグナル配列を使用す
ることもできる。
【０２１９】
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇ
ｌａＡ−例えば、アスペルギルス由来の１８種および２４種両方のアミノ酸異形）、ａ因
子遺伝子（酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、
およびＨａｎｓｅｎｕｌａ）、またはα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の
ものである。
【０２２０】
例として、大腸菌における異種タンパク質分泌は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（
１９９０）１８２：１３２−４３に概説されている。
【０２２１】
変異型の単離
宿主細胞から分泌されたα−アミラーゼファミリー変異型を、周知の手順（遠心分離ま
たは濾過による培地からの細胞の分離ならびに硫酸アンモニウムなどの塩によるタンパク
質画分の沈殿およびその後のイオン交換クロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグ
ラフィなどのクロマトグラフィ手順の使用が含まれる）によって培養培地から都合よく回
収することができる。
【０２２２】
検出
アミノ酸配列の発現の種々の検出および測定プロトコールが当分野で公知である。例に
は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍
光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０２２３】
広範な種々の標識および結合技術は当業者に公知であり、種々の核酸およびアミノ酸ア
ッセイで使用することができる。
【０２２４】
多数の企業（ファルマシア  バイオテック（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃ
ｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）など）が市販のキットおよびこれらの手順についてのプロトコ
ールを提供している。
【０２２５】
適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光剤、または
発色剤、ならびに基質、補因子、インヒビター、および磁性粒子などが含まれる。このよ
うな標識を開示する特許には、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７号、ＵＳ−Ａ−３，８５０
，７５２号、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０号、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５号、ＵＳ
−Ａ−４，２７７，４３７号、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９号、およびＵＳ−Ａ−４，
３６６，２４１号が含まれる。
【０２２６】
また、組換え免疫グロブリンを、ＵＳ−Ａ−４，１８６，５６７号に記載のように産生
することができる。
【０２２７】
α−アミラーゼファミリー変異型の試験
本明細書中に記載の任意の方法によって産生された変異型を、精製前または精製後に、
基準および／または親酵素と比較したエンドアミラーゼ活性の減少および加水分解活性の
増加について試験することができる。
【０２２８】
したがって、目的の変異型を発現することができる微生物を適切な倍地中および変異型
選択に適切な条件下にてインキュベートする。
【０２２９】
アッセイ
本発明の変異型を、（Ｐｅｎｎｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，３４：３３６８−３３７６）による還元力増加の測定によって決定する加水
分解活性についても試験した。
【０２３０】
エンド活性のみを切断することができる架橋デンプン基質であるＰＨＡＤＥＢＡＳ試験
（ファルマシア）を使用してエンド活性を決定した。基質（１錠に４ｍｌクエン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）および１０ｍＭ塩化カルシウムを含む）を、０．１〜１ｍｇ／
ｍｌ酵素とインキュベートし、定期的に１００μｌサンプルを取り出し、０．９ｍｌの０
．２Ｍ水酸化ナトリウムを添加して反応を停止させた。沈降後（５分間）、６２０ｎｍの
吸光度を測定した。エンド活性を、１分あたりの吸光度の変化として示す。野生型ＣＧＴ
アーゼの活性を１００％と定義する。
【０２３１】
融合タンパク質
本発明で使用されるアミノ酸配列を、例えば、抽出および精製を補助するために融合タ
ンパク質として産生することができる。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列
の活性を妨害しない。
【０２３２】
単離
１つの態様では、酵素または酵素のヌクレオチド配列またはこれらのいずれかの使用に
よって得られた産物は単離形態であることが好ましい。用語「単離」は、酵素または酵素
のヌクレオチド配列またはこれらのいずれかの使用によって得られた産物が酵素またはそ
のヌクレオチド配列が事実上天然に結合し、且つ天然で見出される少なくとも１つの他の
成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。タンパク質をタンパク質の意図する
目的を妨げることなくキャリアまたは希釈剤と混合することができ、且つ依然として実質
的に単離されていると見なされると理解される。
【０２３３】
精製
１つの態様では、酵素または酵素のヌクレオチド配列またはこれらのいずれかの使用に
よって得られた産物は精製形態であることが好ましい。用語「精製」は、酵素または酵素
のヌクレオチド配列またはこれらのいずれかの使用によって得られた産物が比較的純粋な
状態（例えば、少なくとも純度約９０％、少なくとも純度約９５％、または少なくとも純
度約９８％）にあることを意味する。
【０２３４】
ハイブリッド形成
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的な配列または本発明の配列もしくは相補配列
のいずれかとハイブリッド形成することができる配列を含む。
【０２３５】
本明細書中で使用される、用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸の鎖が塩基対
合によって相補鎖と連結するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクノ
ロジーで実施される増幅プロセスが含まれるべきである。
【０２３６】
本明細書中で言及される「ハイブリダイゼーション」は、類似ＤＮＡ配列が、本明細書
中に記載の少なくとも低ストリンジェンシー条件下で配列番号１、配列番号２、または配
列番号３に示す核酸配列の一部をコードするタンパク質に対応するヌクレオチド配列とハ
イブリッド形成することを示す。
【０２３７】
ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡまたはＲＮＡ配列との間の低ストリンジェンシーで
のハイブリッド形成を決定するための適切な実験条件は、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／
クエン酸ナトリウム、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で１０分間のハイブリッド形成のため
のＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含むフィルターの予備浸漬、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性超音波処理サケ精子ＤＮ
Ａを含む溶液中でのフィルターの予備ハイブリッド形成、およびその後のランダム32Ｐ−
ｄＣＴＰ標識（比活性は１×１０９ｃｍｐ／μｇ超）プローブを含む同一の溶液での４５
℃で１２時間のハイブリッド形成を含む。次いで、フィルターを、少なくとも５５℃（低
ストリンジェンシー）、少なくとも６０℃（中程度のストリンジェンシー）、より好まし
くは少なくとも６５℃（中程度／高ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも７
０℃（高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも７５℃（非常に高いス
トリンジェンシー）にて２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間２回洗浄する。
【０２３８】
上記条件下でオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成する分子を、例えば、Ｘ
線フィルムへの曝露によって検出することができる。
【０２３９】
用途
本発明のα−アミラーゼファミリー変異型は、種々の産業上の利用で有利に使用するこ
とができる有益な性質を有する。特に、酵素は、パン・菓子製造業に共通のデンプンベー
スの食物の退行およびそれによる腐敗の遅延または防止に潜在的用途がある。
【０２４０】
さらなる態様では、本発明の変異型を、ベーカリー製品または食料の調製に使用する。
特定の態様に対しては、食料はベーカリー製品（パンまたは当分野で公知の従来技術によ
って調製したペストリーなどの他のパン生地の製品など）であることが好ましい。
【０２４１】
α−アミラーゼ変異型を、酵素のみまたは１つまたは複数のさらなる酵素（キシラナー
ゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ、および他の酸化還元酵素またはデンプン分解酵
素など）と組み合わせて使用することができる。
【０２４２】
いくつかの変異型は、直鎖状オリゴサッカライドの製造プロセスまたはデンプンからの
甘味料およびエタノールの製造、および／またはテキスタイルデサイン（ｔｅｘｔｉｌｅ
ｄｅｓｉｚｉｎｇ）で特に有用である。従来のデンプン変換プロセス条件（デンプン液
化および／または糖化プロセスが含まれる）が公知である。
【０２４３】
したがって、別の態様では、本発明は、線状オリゴサッカライド、特に２〜１２グルコ
ース単位の線状オリゴサッカライド、好ましくは２〜９グルコース単位の線状オリゴサッ
カライドの製造プロセスで使用するためのＣＧＴアーゼ変異型を提供する。
【０２４４】
大規模適用
本発明の１つの好ましい実施形態では、大規模適用のためにアミノ酸配列を使用する。
【０２４５】
好ましくは、宿主生物の培養後の１リットルの総細胞培養液体積あたり１ｇから約２ｇ
までの量でアミノ酸配列を産生する。
【０２４６】
好ましくは、宿主生物の培養後の１リットルの総細胞培養液体積あたり１００ｍｇから
約９００ｍｇまでの量でアミノ酸配列を産生する。
【０２４７】
好ましくは、宿主生物の培養後の１リットルの総細胞培養液体積あたり２５０ｍｇから
約５００ｍｇまでの量でアミノ酸配列を産生する。
【０２４８】
食物
本発明の組成物を、食物もしくは食物の調製で使用することができる。本明細書中の用
語「食物」は、広義で使用され、ヒト用食物および動物用食物（すなわち、飼料）を対象
とする。好ましい態様では、食物はヒトが消費するためのものである。
【０２４９】
食物は、使用および／または適用様式および／または投与様式に依存して溶液または固
体の形態であってもよい。
【０２５０】
食品成分
本発明の組成物を、食品成分として使用することができる。
【０２５１】
本明細書中で使用される、用語「食品成分」には、機能食品または食料に添加するか添
加することができる処方物および例えば酸性化または乳化が必要な広範な種々の製品中に
低レベルで使用することができる処方物が含まれる。
【０２５２】
食品成分は、使用および／または適用様式および／または投与様式に依存して溶液また
は固体の形態であり得る。
【０２５３】
栄養補助食品
本発明の組成物は栄養補助食品であり得るか、これに添加することができる。
【０２５４】
機能食品
本発明の組成物は機能食品であり得るか、これに添加することができる。
【０２５５】
本明細書中で使用される、用語「機能食品」は、栄養学的効果および／または味の満足
度を得ることができるだけでなく、さらに有利な効果を消費者に伝えることができる食品
を意味する。
【０２５６】
機能食品の法的定義づけは存在しないにもかかわらず、この領域に興味を持つほとんど
の当事者は、これらを特定の健康上の効果を有するものとして食品市場に出すことに同意
している。
【０２５７】
食品
本発明の組成物を、１つまたは複数の菓子製品、乳製品、および／またはベーカリー製
品などの食品の調製で使用することができる。
【０２５８】
一定の態様のために、好ましくは、食料は、パン、ペストリー、ビスケット、またはク
ッキーなどのベーカリー製品である。
【０２５９】
本発明はまた、酵素または酵素によって産生された生成物を別の食品成分と混合する工
程を含む、食品または食品成分の調製方法を提供する。調製方法または食品成分はまた、
本発明の別の態様である。
【０２６０】
組換えＤＮＡ技術
一般に、本明細書中に記載の任意の分子技術は当分野で周知であるが、特に、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  
Ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．を参照することができる。
【０２６１】
［実施例］
本発明を、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を制限することを決して意図しない以
下の実験手順および実施例を参照してさらに例示する。
【０２６２】
表１。５０℃でのＢＣ２５１およびタビウムＣＧＴアーゼ変異型の加水分解活性および
エンド活性。
図面の詳細な説明
【０２６３】
図１。マルトノナオース基質とＢ．サーキュランスＣＧＴアーゼの基質結合間隙との間
の相互作用の略図。矢印は、サブサイト−１と＋１との間の切断されやすい結合を示し、
水素結合を破線で示す。Ａｒｇ４７およびＡｓｎ９４は、非切断基質と相互作用しないが
、それぞれ反応中間体と相互作用してγ−シクロデキストリンを生成する（１６：４１）
。Ｐｈｅ１８３およびＰｈｅ２５９は、糖環と疎水性スタッキング相互作用を示す。明確
にするために、−２、−１、および＋１サブサイトの全てを示しているわけではない。図
は、（５）から採用した。
【０２６４】
図２。ＣＧＴアーゼによって触媒された反応の略図。結合の切断後、共有結合性反応酵
素−グリコシル中間体が形成される。反応の第２工程では、反応中間体が受容体分子に移
行する。環化反応では、共有結合オリゴサッカライドの末端ＯＨ−４基が受容体として使
用されるのに対し、水または第２の糖はそれぞれ加水分解および不均化反応で受容体とし
て使用される。この図は、参考文献（２３）から採用した。
【０２６５】
図３。ＢＣ２５１ｃｇｔ遺伝子のＰＣＲ増幅時に使用したＭｎＣｌ2濃度の関数として
（ＬＢデンプンプレート上で）活性デンプン分解ＣＧＴアーゼを発現したクローンの比率
。
【０２６６】
図４。結合したマルトノナオース（グレイ）（５）を有するＢ．サーキュランスＤ２２
９Ｎ／Ｅ２５７Ｑ  ＣＧＴアーゼの構造に重ね合わせたＡ２３０Ｖ変異構造（黒）の拡大
図。明確にするために、基質結合サブサイト（−２〜＋２）のみを示す。変異Ａ２３０Ｖ
のバリン側鎖により、マルトノナオース構造の受容体サブサイト＋１中にグルコースのＯ
３原子と密接な接触（１．９Å）を形成する（アラニン側鎖は３．２Åである）。
【０２６７】
図５。これは、ＵＳ−Ａ−６４８２６２２号の図４に示す配列アラインメントを示す。
【０２６８】
実験手順
構造決定
ＢＣ２５１  ＣＧＴアーゼ変異Ａ２３０Ｖの結晶を、６０％ｖ／ｖの２−メチル−２，
４−ペンタンジオール、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、および５％ｗ／
ｖのマルトースから成長させた（１７）。ハウスＭＡＲＣＣＤシステム（ＭａｒＵＳＡ  
Ｉｎｃ．，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＵＳＡ）およびオスミウムミラーを備えたＢｒｕｋｅｒＮ
ｏｎｉｕｓ  ＦＲ５９１回転陽極ジェネレータからのＣｕＫａ照射を使用して直径１６５
ｍｍのデータを１００Ｋで収集する。ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを使用して処
理した（１８）。除去した全ての水および糖を含むマルトテトロース（ｍａｌｔｏｔｅｔ
ｒａｏｕｓ）（ＰＤＢコード１ＣＸＦ）と配位結合したＣＧＴアーゼの構造を出発モデル
として使用した。ＣＮＳを使用して精密化した（１９）。リガンドを、プログラムＯを使
用してσＡ加重２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ電子密度マップ中においた。変異Ａ２３０
Ｖの原子座標および構造を、プロテインデータバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に寄
託した。
【０２６９】
細菌株およびプラスミド
ＤＮＡ操作のために大腸菌ＭＣ１０６１（２１）を使用し、タンパク質産生のためにＢ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ１０４Ａ（２２）を使用した。プラスミドｐＤ
Ｐ６６ｋ（７）およびｐＣＳｃｇｔ−ｔｔ（２３）を、ＢＣ２５１のｃｇｔ遺伝子および
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ  
ＥＭ１株（タビウム）と共にそれぞれ変異誘発およびタンパク質産生のために使用した。
プラスミド保有株を、大腸菌またはＢ．ズブチリスについてそれぞれ５０または６μｇ／
ｍｌのカナマイシンの存在下でＬＢ培地（２４）にて３７℃で成長させた。適切な場合、
デンプン分解ＣＧＴアーゼを発現するコロニーを同定するためにジャガイモデンプン（１
．５％ｗ／ｖ）をＬＢ−寒天プレートに添加した。Ｂｒｏｎ（２５）にしたがって、Ｂ．
ズブチリスの形質転換を行った。
【０２７０】
部位特異的変異誘発
（７；１１）に記載のようにｐＤＰ６６ｋ−およびｐＣＳｃｇｔ−ｔｔに変異および制
限部位を導入し、ＤＮＡ配列決定によって評価した。ｐＤＰ６６ｋ−に導入したＸｈｏＩ
およびＫｐｎＩ制限部位により、ＢＣ２５１  ＣＧＴアーゼの環状化、不均化、および加
水分解活性に測定可能な効果を示さないＶ６ＳおよびＡ６７８Ｇ変異体（それぞれＮ末端
およびＣ末端付近）が得られた（データ示さず）。
【０２７１】
使用したプライマーは、以下であった。
【化１】
2011254828.tif 000004
【０２７２】
変異ヌクレオチドおよび制限部位に下線を引く。
【０２７３】
飽和変異誘発
ＢＣ２５１  ＣＧＴアーゼのＡｌａ２３０を、１９個の全ての他のアミノ酸残基に置換
した。プライマー：
【化２】
2011254828.tif 000005
（ＮはＡ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ＋であり、ＳはＧ＋Ｃであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を使用した本明細書中に記載の部位特異的変異誘発手順を使用して、変異を移入した。
【０２７４】
変異性ＰＣＲ変異誘発
プライマーＦ１およびＲ１を使用して、ｐＤＰ６６ｋ−からＢＣ２５１ｃｇｔ遺伝子を
増幅した。ＰＣＲ混合物（５０μｌ）は以下を含んでいた。１×ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ緩衝液、１ｍＭのＭｇＳＯ4、０〜１ｍＭのＭｎＣｌ2、０．６ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．
０７μＭの各プライマー、２０ｎｇのテンプレート、および２．５ユニットのＴａｑ  Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）。ＰＣＲ反応を２５サイクル行った。９４℃で３０秒間
、５４℃で４０秒間、および７２℃で２分間。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで
切断し、アガロースゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ゲル抽出キット；キアゲン）から得られた
断片（２０１６ｂｐ）を抽出し、ｐＤＰ６６ｋ−にクローン化し、野生型ｃｇｔ遺伝子を
置換した。ＣＧＴアーゼ（ＣＧＴアーゼは細胞外酵素である）の移行シグナルをコードす
る配列を超えたＸｈｏＩ部位は１２ヌクレオチドであり、遺伝子の終止コドン前のＫｐｎ
Ｉ部位は３０ヌクレオチドである。
【０２７５】
ＤＮＡ配列決定
Ｔｈｅｒｍｏ配列蛍光プライマーサイクル配列キット（アマシャム  ファルマシア  バ
イオテック  ＡＢ）を使用して二本鎖ＤＮＡに対してサイクル配列決定（２６）を行い、
ＢＭＴＣのＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＬＦ−Ｅｘｐｒｅｓｓ配列決定機（Ｇｒｏｎｉｎｇｅ
ｎ，オランダ）で反応させた。変異性ＰＣＲ変異体は二本鎖配列決定を行った（６配列反
応／変異体）。
【０２７６】
加水分解活性が増加したＣＧＴアーゼ変異型の選択
変異性ＰＣＲ産物とプラスミドｐＤＰ６６ｋ−とのライゲーション混合物を、ＬＢ−寒
天プレート上にプレートした大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換し、得られたコロニーをＱ−
ｐｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｎｅｗ  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｍｓｐｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用し
て９６ウェルマイクロタイタープレート中の２００μｌのＬＢ培地に移した。一晩のイン
キュベーション後（７５０ｒｐｍ）、２５μｌの各培養を、細胞溶解のためにウェルあた
り２５μｌの細菌タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏ
ｉｓ）を含む第２のマイクロタイタープレートに移した。その後、２００μｌの１％（ｗ
／ｖ）可溶性デンプン（Ｌａｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｌｅｕｇｅｒ，Ｗｉｊｎｅｇｅｎ，Ｂ
ｅｌｇｉｕｍ）を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、マイ
クロタイタープレートを、オーブン中にて５０℃で２時間インキュベートした。形成され
た還元糖の量を、Ｎｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉアッセイの適合させたバージョンを使用
して測定した（２７；２８）。４０μｌの反応物を、４０μｌの溶液Ｄを含むポリプロピ
レンマイクロタイタープレートに添加した。ポリプロピレン製の蓋でマイクロタイタープ
レートの密封後、これらをオーブンにて１００℃で３０分間インキュベートした。室温へ
の冷却後、１６０μｌの溶液Ｅを添加し、数分以内に発色した。マイクロタイタープレー
トを視覚的にスクリーニングするか、もしくは５２５ｎｍの吸光度を測定した。溶液Ｄは
、２５ｍｌの溶液Ａ（１Ｌの純水中に２５ｇ  Ｎａ2ＣＯ3、２５ｇ酒石酸ナトリウムカリ
ウム、および２００ｇ  Ｎａ2ＳＯ4を含む溶液）および１ｍｌの溶液Ｂ（２００ｍｌの純
水中に３０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏおよび０．２ｍｌ硫酸を含む溶液）からなる。溶液Ｅ
は、１５．６ｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏおよび９５０ｍｌ純水中に１３．１ｍｌ
硫酸を含む純水、さらに５０ｍｌ純水中に溶解した１．９ｇのＮａ2ＨＡｓＯ4・７Ｈ2Ｏ
からなる。
【０２７７】
酵素アッセイ
記載のようにＣＧＴアーゼタンパク質を産生および精製した（２９）。ＢＣ２５１では
５０℃、タビウムＣＧＴアーゼでは６０℃それぞれにて、全酵素アッセイを１０ｍＭクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で行った。０．１〜０．５μｇ酵素／ｍｌと２．
５％（ｗ／ｖ）部分加水分解ジャガイモデンプン（Ｐａｓｅｌｌｉ  ＳＡ２；Ａｖｅｂｅ
，Ｆｏｘｈｏｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とのインキュベーションによって環
状化活性を決定した。フェノールフタレインを使用してβ−シクロデキストリンの形成量
を測定した（３０）。０．１μｇ酵素／ｍｌ、１ｍＭの４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトヘプタノシド−４−６−Ｏ−エチリデン（ＥＰＳ；Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｃｏｕｎｔｙ
Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、ドナーとしての１０ｍＭマルトース、および受容
体基質をそれぞれ使用して記載のように不均化活性を決定した（１３；３１）。０．５〜
５μｇ酵素／ｍｌと１％（ｗ／ｖ）可溶性デンプン（Ｌａｍｅｒｓ＆Ｐｌｅｕｇｅｒ，Ｗ
ｉｊｎｅｇｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（２９）とのインキュベーション時の還元力の増加の
測定によって加水分解活性を決定した。
【０２７８】
構造比較
三次元構造を示し、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．７（ｂ２
）（３２）およびプログラムＯ（２０）を使用して比較した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標
）  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１ｇ用のＳｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  ＶｉｅｗｅｒおよびＰｏｖ−Ｒ
ａｙを使用して図を作製した。使用したＢＣ２５１  ＣＧＴアーゼ構造は、プロテインデ
ータバンク（３３）のエントリー１ＣＤＧ（１７）および１ＣＸＫ（５）であった。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】マルトノナオース基質とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＣＧＴアーゼの基質結合間隙との間の相互作用の略図である。
【図２】ＣＧＴアーゼによって触媒される反応の略図である。
【図３】活性デンプン分解ＣＧＴアーゼを発現したクローンの比率を示す図である。
【図４】Ａ２３０Ｖ変異構造の拡大図である。
【図５】配列アラインメントを示す図である。
【図６】配列アラインメントを示す図である。
【実施例１】
【０２８０】
変異性ＰＣＲ条件
１０種の異なるＭｎＣｌ2濃度でのＢＣ２５１ｃｇｔ遺伝子（配列番号４）の増幅によ
って至適な変異性ＰＣＲ変異誘発条件を決定した。プラスミドｐＤＰ６６ｋ−中でＰＣＲ
産物をクローン化し、大腸菌に形質転換し、デンプンを補足したＬＢプレートにプレーテ
ィングした。デンプン分解ＣＧＴアーゼ形態を発現するコロニーのみがコロニー周囲にハ
ローを形成する。ハロー形成コロニーの比率は、ＭｎＣｌ2濃度の増大と共に減少し（図
３）、変異体の不活性化数はＭｎＣｌ2濃度の増大と共に増大することを示す。至適変異
性ＰＣＲ条件として０．２〜０．３ＭのＭｎＣｌ2濃度を選択し、このＭｎＣｌ2濃度で得
られた（変異）ＣＧＴアーゼクローンの約９０％がデンプン分解活性を保持する（図３）
。
【実施例２】
【０２８１】
加水分解活性を増大するための変異型をデザインした
加水分解活性が増加したＣＧＴアーゼ変異体を選択するために、第１ラウンドの変異誘
発および選択で加水分解活性について約１２，０００個のクローンをアッセイした。ＰＣ
Ｒで使用したＭｎＣｌ2濃度は、０．２ｍＭ（６，０００クローン）および０．３ｍＭ（
６，０００クローン）であった。２２個のクローンが顕著に増加した加水分解活性を示し
ていた。各陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、その後これを使用してコードさ
れた変異タンパク質を産生および精製した。２２の変異ＣＧＴアーゼは全て野生型ＣＧＴ
アーゼよりも高い加水分解活性および低い環状化活性を示した。いくつかの変異体は、環
状化活性よりもさらにより高い加水分解活性を示した。
【０２８２】
ＰＣＲ増幅時に０．２５ｍＭのＭｎＣｌ2を使用した第２および第３ラウンドの変異誘
発でＣＧＴアーゼの加水分解活性はさらに増大した。変異体６および６−２を、第２およ
び第３ラウンドの変異誘発でのＰＣＲテンプレートとしてそれぞれ使用した。これらの変
異型はその変異誘発ラウンド後に最も高い加水分解活性を示した。約１０，０００クロー
ンをそれぞれ第２および第３ラウンドの変異誘発で加水分解活性についてアッセイし、そ
れぞれ４個および８個のクローンの加水分解活性が増加した。陽性クローンのプラスミド
ＤＮＡを単離し、コードされたタンパク質を産生および精製した。第２ラウンドで同定さ
れた変異ＣＧＴアーゼは、親変異体６よりも加水分解活性が非常に高かった。驚いたこと
に、環状化活性も増加したが、加水分解活性の増加について選択した。第３ラウンドの変
異誘発後に加水分解活性はさらに増加するのに対し、環状化活性は親変異体６−２と比較
して影響を受けないかあるいか低下した。したがって、環状化活性が約１／１０であり、
且つ加水分解活性が約９０倍の変異ＣＧＴアーゼは第３ラウンドの変異誘発および選択に
おいてのみ得られた。
【０２８３】
加水分解活性が増加した変異型のＤＮＡ配列決定
加水分解活性が増加した３４個の選択されたＣＧＴアーゼ変異型のうち、２２個（２０
１６ｂｐ）をヌクレオチド配列決定に供した。これにより、４１個のヌクレオチド置換お
よび３１個のアミノ酸変異が明らかとなり、そのうちの１５アミノ酸変異体が異なった。
さらなる終止コドンは見出されず、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥで選択された全変異タンパク
質の野生型サイズと一致した（データ示さず）。変異体は１ラウンドの変異誘発あたり１
〜３個のヌクレオチドが変異し（平均１．９個）、それにより１つまたは２つのアミノ酸
が変異した（平均１．４個）。各変異誘発ラウンドおよび異なる使用ＭｎＣｌ2濃度（０
．２、０．２５、および０．３ｍＭ）についての変異頻度の変動は小さかった（ＤＮＡお
よびアミノ酸レベルで１０％未満）。ＧからＡ、ＣからＴ、ＴからＣ、およびＡからＧへ
の置換が最も頻繁に認められたのに対して、ＣからＡ、ＡまたはＧからＴ、ＧからＣ、お
よびＴからＧへの変異は認められなかった。ＣからＴおよびＴからＣへの変異が頻繁に認
められるのは、これらの変化が加水分解活性を増加させるアミノ酸変異を得るのに必要で
あるので、適用した選択に起因する。
【実施例３】
【０２８４】
加水分解活性を増加させる変異
第１ラウンドの変異誘発後に最も高い加水分解活性を示す１２個の変異体は、第２の変
異の有無にかかわらずＦ２５９Ｓ（４倍）変異またはＡ２３０Ｖ（配列番号１）（８倍）
変異のいずれかを有していた。Ａ２３０Ｖ／Ｖ６６０Ａ変異に加えて、一旦Ａ２４５Ｔ／
Ａ３５７Ｔに組み合わされると、第２ラウンドの変異誘発によってＦ２１Ｌ変異（３倍）
が得られた。第３ラウンドの変異誘発後、変異Ｎ８Ｓ、Ｒ４７Ｗ、Ｎ９４Ｓ、およびＱ３
２０Ｌが同定されたが、Ｎ８ＳはＮ９４Ｓとの組み合わせのみで同定された。加水分解活
性が明確に増加した変異のうち、３つの変異がサブサイト−３（Ａｒｇ４７）、サブサイ
ト＋１（Ａｌａ２３０）、およびサブサイト＋２（Ｐｈｅ２５９）の基質結合溝中に存在
する残基に存在し（図１）、基質と直接相互作用しない残基中で１つの変異が起こった（
Ｐｈｅ２１）。
【０２８５】
驚いたことに、加水分解活性率が増加した変異型は、加水分解活性：エンドアミラーゼ
活性比が著しく減少し、このことは、これらの変異型のエキソ特異性が著しく改良させた
ことを証明する（表１）。
【０２８６】
部位特異的変異体
同定された１５種の異なるアミノ酸変異のうち、７つの変異（Ｎ８Ｓ、Ｉ２１５Ｖ、Ｎ
２９９Ｄ、Ｔ５１４Ａ、Ｋ６５５Ｅ、Ｖ６６０Ａ、およびＡ６７２Ｇ）のみが第２の変異
（Ａ２３０Ｖ、Ｆ２５９Ｓ、またはＮ９４Ｓ）と組み合わせて見出された。単一なＡ２３
０Ｖ、Ｆ２５９Ｓ、およびＮ９４Ｓ変異体と二重変異体との比較によって、これら７つの
変異は加水分解活性にさらに寄与しないことが示された。変異Ｖ６６０Ａについてはこれ
が確認され、野生型ＣＧＴアーゼと類似の活性を有していた。
【０２８７】
他の８つの変異Ｆ２１Ｌ、Ｒ４７Ｗ、Ｎ９４Ｓ、Ａ２３０Ｖ、Ａ２４５Ｔ、Ｆ２５９Ｓ
、Ｑ３２０Ｌ、およびＡ３５７Ｔの各効果を分析するために、これらを単一変異として野
生型ＣＧＴアーゼに移入した。野生型ＣＧＴアーゼと比較して、Ｎ９４Ｓ、Ａ２４５Ｔ、
Ｑ３２０Ｌ、およびＡ３５７Ｔによって加水分解活性はほとんど変化しないのに対して、
Ｆ２１Ｌ、Ｒ４７Ｗ、Ａ２３０Ｖ、およびＦ２５９Ｓによって加水分解活性が明確に増加
するようである。さらに、より高い不均化活性を有する変異体Ｒ４７Ｗを除いたこれら８
つの変異は環状化活性および不均化活性を低下させた。特に、変異体Ａ２３０Ｖは、環状
化活性および不均化活性を劇的に低下させた。したがって、ＣＧＴアーゼの低加水分解活
性に重要ないくつかの残基（Ｐｈｅ２１、Ａｒｇ４７、Ａｌａ２３０、およびＰｈｅ２５
９）を同定した。
【０２８８】
飽和突然変異
変異性ＰＣＲ変異誘発では単一の位置に全ての可能な変異を移入することができないの
で（３４）、飽和変異誘発を使用してＡｌａ２３０位も調査した。加水分解活性および環
状化活性について５００個のクローンをアッセイした。ほとんどのクローン（７０％）が
野生型環状化活性のせいぜい約５％を示すのに対し、環状化活性が増加したものはなく、
環状化反応についてこの残基は重要でないことを示す。４０個のクローン（８％）の加水
分解活性が非常に増加した。これらのうちの８個を配列決定用に無作為に選択し、その全
てがＡ２３０Ｖ変異を含んでいた（配列番号１）。したがって、２３０位のアラニンのバ
リン側鎖への変化のみで強力にＣＧＴアーゼの加水分解活性を増加させ、且つ環状化活性
を減少させるのに十分である。
【実施例４】
【０２８９】
タビウムＣＧＴアーゼ−（配列番号５）
変異Ａ２３０ＶをタビウムＣＧＴアーゼ（Ａ２３１Ｖ、タビウム、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  
ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリング、配列番号２）（このＣＧＴアーゼはほと
んどの他のＣＧＴアーゼと比較して比較的高い加水分解活性を示すため）にも移入した（
３５）。ＢＣ２５１のＣＧＴアーゼにおける効果と同様に、Ａ２３１Ｖ変異によるタビウ
ムＣＧＴアーゼの環状活性の減少および加水分解活性の増加は著しかった。このＣＧＴア
ーゼの加水分解活性をさらに増強するために、タビウム変異体Ｆ２６０Ｅが現在のところ
ＣＧＴアーゼについてこれまでに記載されている加水分解活性で最も高いので、二重変異
体Ａ２３１Ｖ／Ｆ２６０Ｅを構築した（１１）。しかし、二重変異体は野生型タビウムＣ
ＧＴアーゼより加水分解活性がさらにより低く、２つの単一の変異は互いに排他的であり
、付加的ではないことを示す。
【実施例５】
【０２９０】
変異Ａ２３０Ｖにより、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴア
ーゼ）の生成物および基質特異性を実質的に変化させることが見出された（すなわち、Ｃ
ＧＴアーゼがトランスフェラーゼから加水分解酵素に変換されて、エキソ特異性が一方の
ＣＧＴアーゼ（タビウム）では１４倍超に増加し、別（ＢＣ２５１）では１００倍超に増
加する）（表１を参照のこと）。
【０２９１】
Ｎｏｖａｍｙｌは構造がＣＧＴアーゼと非常に密接に関連し、同一の位置および高次構
造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）で対応する残基Ａ２２９を含むので、同等の変異Ａ２２
９ＶはＮｏｖａｍｙｌのエキソ特異性を有意に増加させる可能性が最も高く、それにより
その硬化防止機能性（ａｎｔｉｓｔａｌｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）が著しく
改良される（Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）とサーモアネロバクテリウム・サーモスルフリ
ゲンス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、およびサーモアネロバクター由来のＣ
ＧＴアーゼとの配列アラインメントを示す、ＵＳ−６，４８２，６２２を参照のこと）（
図５を参照のこと）。
【０２９２】
Ｎｏｖａｍｙｌは、その構造が脆弱になることによってその吸水性が低下するポリサッ
カリド分子の無作為な切断によってプロセシングされてデンプンが得られるエンドアミラ
ーゼ活性およびエキソアミラーゼ活性の両方を有する。
【０２９３】
したがって、本発明は、末端からデンプンをプロセシングすることができ、それにより
その構造および吸水能力が脆弱にならない変異酵素が得られるために市場価値の高い、エ
キソアミラーゼ活性が増加し、任意選択的にエンドアミラーゼ活性が減少したＮｏｖａｍ
ｙｌ（登録商標）変異型（またはＳＡＳのような代替物）の開発可能性を提供する。
【実施例６】
【０２９４】
マルトース生成α−アミラーゼＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）（配列番号６）
マルトース生成α−アミラーゼＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）（Ａ２２９Ｖ、Ｎｏｖａｍ
ｙｌ（登録商標）、配列番号３）にも変異Ａ２３０Ｖを移入した。この酵素は、ＥＰ１２
０６９３（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから販売）で教示されて
いる。
【０２９５】
Ａ２２９Ｖ変異は、加水分解活性：エンド活性比を非常に増加させ、それによりエキソ
特異性が有意に改良されることが見出された。
【０２９６】
さらに、飽和変異誘発によるＡ２２９からＧまたはＡ以外の全ての残基への変化から類
似の効果が認められた。
【０２９７】
Ａ２９９Ｖ変異とＹ２５８Ｘ変異との組み合わせ（Ｘは非芳香族残基）は、変異型のエ
キソ特異性の増加にさらにより有効であることが見出された。
【０２９８】
本明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として組み込まれる。本発明の
記載の方法およびシステムの種々の修正形態および変形形態は、本発明の範囲および精神
を逸脱することなく当業者に明らかであり得る。本発明を特定の好ましい実施形態と組み
合わせて記載しているが、特許請求の範囲に記載の本発明はこのような特定の実施形態に
よって過度に制限されないと理解すべきである。実際、生化学分野および生物工学分野ま
たは関連分野の当業者に自明の発明の実施の記載の様式の種々の修正形態は特許請求の範
囲の範囲内であることが意図される。
【０２９９】
【表３】
2011254828.tif 000006
【０３００】
［参考文献］
【表４Ａ】
2011254828.tif 000007
【表４Ｂ】
2011254828.tif 000008
【表４Ｃ】
2011254828.tif 000009
【０３０１】
【化３Ａ】
2011254828.tif 000010
【化３Ｂ】
2011254828.tif 000011
【化３Ｃ】
2011254828.tif 000012
【化３Ｄ】
2011254828.tif 000013
【化３Ｅ】
2011254828.tif 000014
【図１】
2011254828.tif 000015
【図２】
2011254828.tif 000016
【図３】
2011254828.tif 000017
【図４】
2011254828.tif 000018
【図５】
2011254828.tif 000019
【図６】
2011254828.tif 000020
【配列表】
2011254828000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月31日(2011.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：２３０位、８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリーの他の相同なメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む単離および／または精製酵素変異型において、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリーのメンバーである、単離および／または精製酵素変異型。
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月8日(2011.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準酵素に対してＡ２３０Ｖ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリー１３の他のメンバー中の同等の位置にアミノ酸修飾を含む単離および／または精製酵素変異型において、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリー１３のメンバーである、単離および／または精製酵素変異型。
【請求項２】
前記酵素変異型が、基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：８位、２１位、４７位、９４位、２１５位、２３２位、２４５位、２５９位、２６３位、２９９位、３２０位、３５７位、５１４位、６３３位、６５５位、６６０位、６７２位（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリー１３の他のメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項１に記載の酵素変異型。
【請求項３】
前記酵素変異型が基準酵素に対して１つまたは複数の以下の位置：
８位（前記変異は、８Ｃ；８Ｄ；８Ｆ；８Ｉ；８Ｎ；８Ｐ；８Ｓ；８Ｗ；または８Ｙのいずれかに対するものである）、
２１位（前記変異は、２１Ａ；２１Ｄ；２１Ｆ；２１Ｌ；２１Ｔ；２１Ｖ；２１Ｗ；または２１Ｙのいずれかに対するものである）、
４７位（前記変異は、４７Ａ；４７Ｃ；４７Ｄ；４７Ｅ；４７Ｆ；４７Ｇ；４７Ｉ；４７Ｋ；４７Ｑ；４７Ｌ；４７Ｎ；４７Ｐ；４７Ｒ；４７Ｓ；４７Ｔ；４７Ｖ；または４７Ｗのいずれかに対するものである）、
９４位（前記変異は、９４Ｎまたは９４Ｓのいずれかに対するものである）、
２１５位（前記変異は、２１５Ｉまたは２１５Ｖのいずれかに対するものである）、
２３２位（前記変異は、２３２Ｌのいずれかに対するものである）、
２４５位（前記変異は、２４５Ａまたは２４５Ｔのいずれかに対するものである）、
２５９位（前記変異は、２５９Ａ；２５９Ｅ；２５９Ｆ；２５９Ｉ；または２５９Ｓのいずれかに対するものである）、
２６３位（前記変異は、２６３Ａのいずれかに対するものである）、
２９９位（前記変異は、２９９Ｄのいずれかに対するものである）、
３２０位（前記変異は、３２０Ｑまたは３２０Ｌのいずれかに対するものである）、
３５７位（前記変異は、３５７Ａまたは３５７Ｔのいずれかに対するものである）、
５１４位（前記変異は、５１４Ａのいずれかに対するものである）、
６３３位（前記変異は、６３３Ａのいずれかに対するものである）、
６５５位（前記変異は、６５５Ｋまたは６５５Ｅのいずれかに対するものである）、
６６０位（前記変異は、６６０Ａまたは６６０Ｖのいずれかに対するものである）、および／または
６７２位（前記変異は、６７２Ａまたは６７２Ｇのいずれかに対するものである）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリー１３の他のメンバー中の同等の位置に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１または請求項２に記載の酵素変異型。
【請求項４】
前記酵素変異型が、デンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素よりもエンドアミラーゼ活性が低い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項５】
前記基準酵素が前駆体酵素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項６】
前記基準酵素が野生型酵素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項７】
前記基準酵素が、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）またはマルトース生成α−アミラーゼから誘導される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項８】
前記変異型酵素が、得られた転写産物が前記酵素変異型であるか、前記酵素変異型を含むように変異されたＤＮＡから調製される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項９】
前記基準酵素がマルトース生成α−アミラーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１０】
前記基準酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ株、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ株、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ株、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ株、またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株であるかこれらから誘導される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１１】
前記基準が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ２５１株、またはその同族体、変異体、もしくは変異型であるか、これらから誘導される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１２】
前記アミノ酸修飾が、配列番号１に記載のＡ２３０Ｖ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）での修飾である、請求項１１に記載の酵素変異型。
【請求項１３】
前記基準酵素がＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓであるか、これから誘導される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１４】
前記基準酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ属であるか、これから誘導される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１５】
前記基準酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のマルトース生成α−アミラーゼ、またはその同族体、変異体、もしくは変異型であるか、これらから誘導される、請求項１４に記載の酵素変異型。
【請求項１６】
前記酵素変異型が、前駆体酵素Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）、またはその同族体、変異体、もしくは変異型に由来する、請求項１５に記載の酵素変異型。
【請求項１７】
前記アミノ酸修飾が、少なくとも配列番号３に記載のＡ２３０Ｖ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）での修飾である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の酵素変異型。
【請求項１８】
酵素変異型の調製方法において、前記方法は、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記酵素変異型が、基準酵素に対してＡ２３０Ｖ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリー１３の他のメンバー中の同等の位置にアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリー１３のメンバーである、方法。
【請求項１９】
前記変異ヌクレオチド配列を基準ヌクレオチド配列の変異によって調製する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異ヌクレオチド配列を調製する工程を含む、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記基準酵素がＣＧＴアーゼである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記基準酵素が配列番号４または配列番号５である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記基準酵素がマルトース生成α−アミラーゼである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記基準酵素が配列番号６である、請求項１８〜２０または請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素変異型を単離および／または精製する、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
酵素変異型の調製方法において、前記方法は、前記酵素変異型をコードする変異ヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、前記変異ヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列の変異から得られ、前記基準ヌクレオチド配列が基準酵素をコードし、前記基準酵素がα−アミラーゼファミリー１３のメンバーであり、前記酵素変異型が、基準酵素に対してＡ２３０Ｖ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣＧＴアーゼナンバリングを使用）、またはα−アミラーゼファミリー１３の他のメンバー中の同等の位置にアミノ酸修飾を含み、
前記酵素変異型がデンプンとのインキュベーション時に同一条件下での基準酵素と比較して加水分解酵素活性が高く、
前記基準酵素がα−アミラーゼファミリー１３のメンバーである、方法。
【請求項２７】
前記変異酵素を単離および／または精製する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる酵素変異型。
【請求項２９】
請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法によって得られた酵素変異型。
【請求項３０】
前記酵素変異型が請求項２〜１７のいずれか一項で定義されたものである、請求項２８または２９に記載の酵素変異型。
【請求項３１】
食品調製における請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の酵素変異型の使用。
【請求項３２】
前記食品がベーカリー製品である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分（ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）または食料成分（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）と混合する工程を含む、食品の調製プロセス。
【請求項３４】
前記食品をパッケージングする工程を含む、請求項３３に記載の食品の調製プロセス。
【請求項３５】
前記パッケージングされた食品を食品としてラベリングする工程を含む、請求項３４に記載の食品の調製プロセス。
【請求項３６】
前記食品がベーカリー製品である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３７】
デンプンを変異酵素と接触させて酵素によりデンプンから１つまたは複数の線状生成物（ｌｉｎｅａｒ ｐｒｏｄｕｃｔ）を生成する工程と、前記酵素変異型が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の酵素変異型であることとを含む、デンプンの処理プロセス。
【請求項３８】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の酵素変異型をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３９】
請求項３８に記載のヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項４０】
請求項３８に記載のヌクレオチド配列または請求項３９に記載の構築物を含むベクター。
【請求項４１】
請求項３８に記載のヌクレオチド配列、請求項３９に記載の構築物、または請求項４０に記載のベクターが組み込まれた宿主細胞。
【請求項４２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の酵素変異型または請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の酵素変異型の調製方法において、請求項３８に記載のヌクレオチド配列、または請求項３９に記載の構築物、請求項４０に記載のベクター、もしくは請求項４１に記載の宿主細胞中のヌクレオチド配列を発現する工程と、任意選択的にこれらの発現産物を単離および／または精製する工程とを含む、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって得ることができる酵素変異型。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法によって得られた酵素変異型。
【請求項４５】
食品調製における請求項４３または請求項４４に記載の酵素変異型の使用。
【請求項４６】
前記食品がベーカリー製品である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
請求項４３または請求項４４に記載の酵素変異型を少なくとも１つのさらなる食品成分または食料成分と混合する工程を含む、食品の調製プロセス。
【請求項４８】
前記食品をパッケージングする工程を含む、請求項４７に記載の食品の調製プロセス。
【請求項４９】
前記パッケージングされた食品を食品としてラベリングする工程を含む、請求項４８に記載の食品の調製プロセス。
【請求項５０】
前記食物または食料がベーカリー製品である、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５１】
デンプンを変異酵素と接触させて酵素によりデンプンから１つまたは複数の環状生成物（ｃｙｃｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ）を生成する工程と、前記酵素変異型が、請求項４３または請求項４４に記載の酵素変異型であることとを含む、デンプンの処理プロセス。