(57)【要約】【課題】  望ましい鎖長を有する一重鎖ポリヌクレオチド、或いは二重鎖ポリヌクレオチドの酵素的合成法を提供することを課題とする。【解決手段】基質としてポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）を用い、基質に対して適当量のオリゴＡをプライマーとして添加することによる望ましい鎖長の一重鎖ポリヌクレオチドを製造する方法であり、望ましい鎖長が２００〜５００塩基対であり、オリゴＡの量が、基質の１／１０〜１／１００の濃度であることを特徴とするポリヌクレオチドを製造する方法であり、合成されるポリヌクレオチドが、Ｐｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）或いはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である合成法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質に対して適当量のオリゴＡを添加することによる望ましい鎖長の一本鎖ポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項２】
望ましい鎖長が２００〜５００塩基対である請求項１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項３】
オリゴＡの量が、基質の１／１０〜１／１００の濃度であることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項４】
基質がポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）である請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項５】
５’末端に一定の塩基を付加することによりランダムなアニーリングを防ぎ、望ましい鎖長の二本鎖ポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項６】
一本鎖ポリヌクレオチドが、Ｐｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）である請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項７】
二本鎖ポリヌクレオチドがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である請求項５に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
【請求項８】
オリゴＡが、ｐＡｐＡ（ｎ＝２）、ｐＡｐＡｐＡ（ｎ＝３）、ｐＡｐＡｐＡｐＡ（ｎ＝４）、ＡｐＡ（n＝２）又はＡｐＡｐA（n＝４）である請求項１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（但し、Ａはアデニンヌクレオチドを示し、ｐはリン酸基を示す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの合成法にかかり、詳細には、プライマーとしてオリゴＡを用いることによるＰｏｌｙ（Ｉ）、Ｐｏｌｙ（Ｃ）、或いはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）などについて、望ましい分子量、すなわち鎖長を有するポリヌクレオチドの合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、或いは、一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）、Ｐｏｌｙ（Ｃ）は種々の薬理作用を発揮し、近年その薬理作用に基づく応用性が注目されている。
特に、ＩｇＡ抗体を誘導する経鼻投与アジュバントとして一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、さらに二重鎖ポリヌクレオチドとしてのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）又はＰｏｌｙ（Ａ：Ｃ）について注目がもたれている（特許文献１）。
【０００３】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の合成方法にあっては、化学的合成法と酵素的合成法があり、それぞれ長所及び短所がある。例えば、化学的合成法では、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の構成成分であるＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）について予め定められた鎖長の分子を合成することができ、ほぼ同じ長さをもつＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）をアニーリング（annealing）させることで、均一の二重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を作成することができる利点を有している。
しかしながら、必要とされる鎖長としての２００−ｍｅｒ以上のＰｏｌｙ（Ｉ）やＰｏｌｙ（Ｃ）を合成するには、多量の出発物質を必要とし、またその製造コストは膨大なものとなる。
【０００４】
一方、酵素的合成法は比較的安価にＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）を合成することができるが、それぞれの鎖長のコントロールが困難であり、非常に広範囲の分子量分布を持つ一重鎖のＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）が合成されてくる。したがって、そのようなＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）をアニーリングさせると、相補的に二重鎖を形成する部分以外にどちらかの鎖が余分になりフリーとなる。その結果、その部分に相補的な一重鎖が結合し、低分子のものから、非常に巨大な分子までの分子量分布の広い二重鎖が形成されることになる。そのため、得られた巨大Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む溶液は粘度が高くなり、容易に限外濾過膜を通過しない問題が生じ、精製をすることが困難のものとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−０７７０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は上記の現状を鑑み、問題点を解決した望ましい鎖長を有する一重鎖ポリヌクレオチド、或いは二重鎖ポリヌクレオチド、特にＰｏｌｙ（Ｉ）、Ｐｏｌｙ（Ｃ）並びにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の合成法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる課題を解決するための本発明は、具体的には以下の構成からなる。
（１）基質に対して適当量のオリゴＡを添加することによる望ましい鎖長の一重鎖ポリヌクレオチドを製造する方法。
（２）望ましい鎖長が２００〜５００塩基対である上記１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（３）オリゴＡの量が、基質の１／１０〜１／１００の濃度であることを特徴とする上記１又は２に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（４）基質がポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）である上記１、２又は３に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（５）５’末端に一定の塩基を付加することによりランダムなアニーリングを防ぎ、望ましい鎖長の二重鎖ポリヌクレオチドを製造する方法。
（６）一重鎖ポリヌクレオチドが、Ｐｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）である上記１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（７）二重鎖ポリヌクレオチドがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である上記５に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（７）オリゴＡが、ｐＡｐＡ（ｎ＝２）、ｐＡｐＡｐＡ（ｎ＝３）、ｐＡｐＡｐＡｐＡ（ｎ＝４）、ＡｐＡ（n＝２）又はＡｐＡｐA（n＝４）である上記１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（但し、Ａはアデニンヌクレオチドを示し、ｐはリン酸基を示す）
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明が提供する、これまで高価な化学的な製造方法により合成されていた一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、或いは二重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、簡便な方法により安価に合成し得る利点を有している。
また、本発明法による合成されるポリヌクレオチドは望ましい鎖長を有するものであり、低分子のものから、非常に巨大な分子までの分子量分布の広い二重鎖が形成される酵素的合成法に比較して、ほぼ同じ長さをもつＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）をアニーリング（annealing）させることで、均一の二重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を作成することができる利点を有している。
【０００９】
したがって、インフルエンザウイルスに対するワクチン療法におけるＩｇＡ抗体を誘導する経鼻投与アジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、更には、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｃ）を安価に提供し得ものであり、その産業上の利点は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のＰｏｌｙ（Ｉ）並びにＰｏｌｙ（Ａ）の具体的製造法を示した物である。
【図２】実施例２により得られたＰｏｌｙ（Ａ）の分布を示した図である。
【図３】実施例２により得られたＰｏｌｙ（Ｇ）の分布を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者等は、経済的に効率的な酵素法を用いることにより、合成される一重鎖のＰｏｌｙ（Ｉ）およびＰｏｌｙ（Ｃ）の分子量を制限することにより、最終的に得られ二重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をある一定の分子量範囲に収めることを目的とし、一重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ）およびＰｏｌｙ（Ｃ）を効率よく合成する方法検討した。
【００１２】
その結果、ポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）はリボ核酸二ヌクレオチドを基質としてポリリボ核酸を合成するのに用いられている。このＰＮＰはオリゴＡなどのプライマーを用いることで、その反応速度が数倍から１０倍以上速くなることが知られており、この反応速度の違いを利用して、ポリリボ核酸を合成しようと試みた。
その結果、ＰＮＰを基質として用いることにより、酵素反応は選択的にプライマーを取り合うことなり、同時に起こるプライマーを利用しない反応はゆっくり進むので、大部分の基質を消費したところで、できるポリリボ核酸は短鎖のものと長鎖のものの混合物となることを確認した。
【００１３】
しかしながら、従来の酵素法と異なり、低分子から高分子まで一様に分布するものでなく、低分子のものとある一定の鎖長をもつ高分子のものとの混合物となる。これを分子篩等の方法で分離することにより分子量分布の狭いポリリボ核酸を得ることができることことを確認した。
したがって、かかる方法を用いて、特異的な薬理作用をもつ望ましい分子量分布の限られたＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を製造することが可能となった。
その具体的方法の実際を図示すれば、図１に示したようにまとめられる。
【実施例】
【００１４】
以下に本発明について、実施例を挙げて具体的に説明する。
【００１５】
実施例１：
反応組成として以下のものを使用した。
Tris-HCl（ｐＨ９．５）              ７４ｍＭ
EDTA                                ０．６７ｍＭ
塩化マグネシウム                    ５３ｍＭ
ＮＤＰ（ヌクレオチド二リン酸）      ６．６ｍＭ
ＡｐＡｐＡ（プライマー）            ０．０７ｍＭ
Ｅｎｚｙｍｅ                        ２００units
全    量                    ２００μＬ
反応条件としては、６５℃にて６０分間反応させた。
【００１６】
所望の反応時間後、過剰のＣＤＴＡ又は酢酸を添加して反応を終了させ、アガロース電気泳動にて分子量分布を調べた。
その電気泳動の結果から、分子量ピークの分布は、約２００塩基対（ヌクレオチド）であり、±１σでは３００〜７００塩基対（ヌクレオチド）であった。
なお、プライマーとしてオリゴＡを用いないで反応させた場合には、反応速度が遅く、生成されるポリヌクレオチドの分子量分布が広く、±１σに相当する分子量分布は、約５０〜１７００塩基対（ヌクレオチド）であった。
実施例２：
【００１７】
同様の方法により、ＡＤＰからＰｏｌｙ（Ａ）を合成し、その蔗糖密度勾配遠心法で分析したものを図２として示した。
また、同様の方法により、ＧＤＰからＰｏｌｙ（Ｇ）を合成し、その蔗糖密度勾配遠心法で分析したものを図３として示した。
図２から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ａ）のピークは約７ｓであり、２００程度の塩基対（ヌクレオチド）であった。
また、図３から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ｇ）のピークは約８ｓであり、３００程度の塩基対（ヌクレオチド）であった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
発明により、これまで高価な化学的な製造方法により合成されていた一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、或いは二重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、簡便な方法により安価に合成される。
本発明が提供するポリヌクレオチドは、望ましい分子量としての鎖長を有するものであり、品質も良好なものであることから、インフルエンザウイルスに対するワクチン療法におけるＩｇＡ抗体を誘導する経鼻投与アジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、更には、Ｐｏｌｙ（I：Ｃ）を安価に提供し得ものである。
したがって、その産業上の利点は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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