(57)【要約】      （修正有）【課題】サルアデノウイルス遺伝子を発現する細胞系、ベクターおよび細胞系の使用方法の提供。【解決手段】６種のサルアデノウイルスの単離された核酸配列およびアミノ酸配列、これらの配列を含むベクターおよびサルアデノウイルス遺伝子を発現する細胞系。また、ベクターおよびサルアデノウイルス配列およびヘテロロガスな遺伝子を含んでなる組換えベクターを、哺乳動物患者に投与することを含む、細胞の多数の使用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を有するＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質を含んでなるキャプシドを有する組換えアデノウイルスであって、該アデノウイルスは、更に、Ｅ１遺伝子の一部または全部を欠いているアデノウイルス配列、複製およびキャプシド形成に必要な５’および３’アデノウイルス・シスエレメント、および宿主細胞中での導入遺伝子の発現を支配する配列に操作可能に連結されたアデノウイルスにヘテロロガスな導入遺伝子を含んでなる、上記組換えアデノウイルス。
【請求項２】
キャプシドが更に配列番号２１のＡｄＰａｎ５繊維タンパク質フラグメントを含んでなる、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
キャプシドが配列番号４のＡｄＰａｎ５繊維タンパク質を含んでなる、請求項１または２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
キャプシドが更に、ＡｄＰａｎ５ペントンタンパク質を含んでなる、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
キャプシドがＡｄＰａｎ５キャプシドである、請求項１から４のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
複製およびキャプシド形成に必要な５’および３’アデノウイルス・シスエレメントを含んでなるシュードタイプ化されたアデノウイルスである、請求項５に記載の組換えアデノウイルスであって、シスエレメントが、ＡｄＰａｎ５にヘテロロガスなアデノウイルスからの、アデノウイルス５’逆方向末端反復およびアデノウイルス３’逆方向末端配列を含んでなる、上記組換えアデノウイルス。
【請求項７】
ＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質のフラグメントを含有するヘキソンを含んでなるキャプシド、Ｅ１遺伝子の一部または全部を欠いているアデノウイルス配列、およびＡｄＰａｎ５にヘテロロガスな核酸配列を有する、組換えアデノウイルスであって、ここで、ＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質のフラグメントは、配列番号３のＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質配列の全長の５０アミノ酸のＮ末端またはＣ末端の切頭型である、上記組換えアデノウイルス。
【請求項８】
アデノウイルスが、更に、Ｐａｎ５配列番号１の、
５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列；
Ｅ３領域、またはＥ３  ＯＲＦ１、Ｅ３  ＯＲＦ２、Ｅ３  ＯＲＦ３、Ｅ３  ＯＲＦ４、Ｅ３  ＯＲＦ５、Ｅ３  ＯＲＦ６、Ｅ３  ＯＲＦ７、Ｅ３  ＯＲＦ８およびＥ３  ＯＲＦ９からなる群から選択されるそのフラグメント；
Ｅ４領域、またはＥ４  ＯＲＦ７、Ｅ４  ＯＲＦ６、Ｅ４  ＯＲＦ４、Ｅ４  ＯＲＦ３、Ｅ４  ＯＲＦ２およびＥ４  ＯＲＦ１からなる群から選択されるそのフラグメント；および
３’ＩＴＲ、
からなる群の１またはそれ以上から選択されるアデノウイルス核酸配列、またはそれらに相補的な配列、を含んで成る請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
Ｐａｎ５配列番号２のペントンタンパク質；および
Ｐａｎ５配列番号４の繊維タンパク質
から選択される、少なくとも１つのサルキャプシドタンパク質を含んでなる、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１に記載の組換えアデノウイルスを含んでなる単離された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１に記載の組換えアデノウイルス及び製薬学的に許容し得る担体を含んでなる組成物。
【請求項１２】
哺乳動物宿主における感染源に対する免疫応答を誘導するため医薬の製造のための、請求項１から９のいずれか１に記載の組換えアデノウイルスの使用であって、導入遺伝子またはヘテロロガスな配列が感染源の抗原をコードする、上記使用。
【請求項１３】
ＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質のフラグメントとＡｄＰａｎ５にヘテロロガスな核酸配列とを含有するヘキソン、を含んでなるキャプシドを有する組換えアデノウイルスであって、ここで、ＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質のフラグメントは、配列番号３のＡｄＰａｎ５ヘキソンタンパク質配列の５０アミノ酸のＮ末端またはＣ末端の切頭型であるか、または、
配列番号３のアミノ酸残基１２５から４４３；
配列番号３のアミノ酸残基１３８から４４１；
配列番号３のアミノ酸残基１３８から１６３；
配列番号３のアミノ酸残基１７０から１７６；および
配列番号３のアミノ酸残基４０４から４３０残基
からなる群から選択される、
上記組換えアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アデノウイルスは約３６キロベース（ｋｂ）のゲノムサイズを持つ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、種々の標的組織で高度に効率的な遺伝子転移を達成するその能力、および大きな導入遺伝子容量により遺伝子転移の応用に広く使用されてきた。従来は、アデノウイルスのＥ１遺伝子が削除され、そして選択したプロモーター、問題の遺伝子のｃＤＮＡ配列およびポリＡシグナルからなる導入遺伝子カセットに置き換えられ、複製欠損性組換えウイルスが生成された。
【０００２】
アデノウイルスは多数の他のマイナータンパク質、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２と一緒に３つの主要なタンパク質、ヘキソン（ＩＩ）、ペントン塩基（ＩＩＩ）および小塊状繊維（ｋｎｏｂｂｅｄ  ｆｉｂｅｒ）（ＩＶ）からなるイコサヘドロンキャプシドを持つ特徴的形態を有する［非特許文献１］。このウイルスゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を有する５’末端に共有結合した末端タンパク質を含む直線状の二本鎖ＤＮＡである。ウイルスＤＮＡは高度に塩基性のタンパク質ＶＩＩおよびｍｕと名付けられている小さいペプチドに密接に会合している。別のタンパク質、ＶはこのＤＮＡ−タンパク質複合体と共にパッケージングされ、そしてタンパク質ＶＩを介してキャプシドへの構造的連結を提供する。またウイルスは、成熟した感染性ウイルスを生産するために幾つかの構造タンパク質のプロセッシングに必要なウイルスがコードするプロテアーゼも含む。
【０００３】
組換えアデノウイルスは宿主細胞へ分子を送達するためにも記載されてきた。例えば２種類のチンパンジーアデノウイルスのゲノムについて記載する特許文献１を参照にされたい。
【０００４】
当該技術分野で必要とされているのは、集団中における選択されたアデノウイルス血清型に対する既存の免疫の効果を回避し、かつ／または必要ならば反復投与および２回目のワクチン接種による力価ブースティング（ｔｉｔｅｒ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ）に有用な、より効果的なベクターである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，０８３，７１６号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：２５７３−２６０４（Ｎｏｖ２０００）
【発明の概要】
【０００７】
発明の要約
本発明は、６種のサルアデノウイルスの単離された核酸配列およびアミノ酸配列、これらの配列を含むベクターおよびサルアデノウイルス遺伝子を発現する細胞系を提供する。また本発明のベクターおよび細胞の多数の使用方法も提供する。
【０００８】
本発明の方法には１以上の選択されたヘテロロガスな遺伝子（１つまたは複数）を、本発明のベクターを投与することにより哺乳動物患者に送達することが関与する。様々なベクター構築物はヒトのアデノウイルスではなくサルに由来するので、非−サルのヒトまた
は獣医学上の患者の免疫系は、外来抗原としてのベクターに対して即座に応答するよう初回感作されていない。すなわち本発明の組成物の使用により、非−サル患者に投与した時、選択した導入遺伝子のより安定した発現が可能となる。ワクチン接種のために本発明の組成物を使用することにより、防御免疫応答を誘導するための選択した抗原の提示が可能となる。いかなる理論にも拘束されることなく、ヒト樹状細胞を形質導入するための本発明のアデノウイルスの能力は少なくとも部分的には免疫応答を誘導するための本発明の組換え構築物の能力に起因する。本発明の組換えサルアデノウイルスは、インビトロでヘテロロガスな遺伝子産物を生産するためにも使用することができる。そのような遺伝子産物自体が本明細書に記載するような様々な目的に様々に有用である。
【０００９】
本発明のこれらのおよび他の態様および利点を以下により詳細に記載する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、元々はチンパンジーのリンパ節から単離されたＡｄＰａｎ５［配列番号１−４、１５および２１］、ＡｄＰａｎ６［配列番号５−８、１６および１９］およびＡｄ血清型Ｐａｎ７［配列番号９−１２、１７および２０］に由来する新規核酸およびアミノ酸配列を提供する。本明細書を通して幾つかの場合では、これらのアデノウイルスは代わりにそれぞれ本明細書中Ｃ５、Ｃ６およびＣ７と命名する。また元々はカニクイザルの腎臓細胞から単離されたアデノウイルスＳＶ１［配列番号２４−２８］に由来する配列も提供する。また本発明は、元々はアカゲザルの腎臓細胞から単離されたアデノウイルスＳＶ−２５［配列番号２９−３３］およびＳＶ−３９［配列番号３４−３７］の配列も提供する。
【００１１】
本発明は、組換えタンパク質またはフラグメントまたは他の試薬をインビトロで生産するために使用するための新規アデノウイルスベクターおよびこれらベクターを生産するパッケージング細胞系を提供する。本発明はさらに治療用またはワクチン接種の目的でヘテロロガスな分子の送達に使用するための組成物も提供する。そのような治療用またはワクチン接種組成物は、挿入されたヘテロロガスな分子を運ぶアデノウイルスベクターを含む。さらに本発明の新規配列は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの生産に必要な必須のヘルパー機能を提供するにも有用である。このように本発明はこれら配列をそのような生産法で使用するヘルパー構築物、方法および細胞系を提供する。
【００１２】
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、核酸またはそのフラグメントを指す時、適切なヌクレオチド挿入または欠損が別の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約９５〜９９％にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。
【００１３】
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、アミノ酸またはそのフラグメントを指す時、適切なアミノ酸挿入または欠損が別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約９５〜９９％にアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのタンパク質、または少なくとも８個のアミノ酸、またはより望ましくは少なくとも１５個のアミノ酸長であるそのフラグメントにわたる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。
【００１４】
本内容において核酸配列の「同一性の割合」または「同一の」という用語は、最大の対応について並べた時、２つの配列中で同じ残基を指す。配列同一性の比較の長さは、完全長のゲノム（例えば約３６ｋｂｐ）、遺伝子の完全長のオープンリーディングフレイム、タンパク質、サブユニットまたは酵素［例えばアデノウイルスコード領域を提供する表を参照にされたい］にわたることができ、あるいは少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしより小さいフラグメント間、例えば少なくとも約
９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチド間の同一性も望ましくなり得る。同様に「配列同一性の割合」は完全長のタンパク質またはそのフラグメントにわたるアミノ酸配列について容易に決定することができる。適当にはフラグメントは少なくとも約８個のアミノ酸長であり、そして最高７００個のアミノ酸であることができる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。
【００１５】
同一性はデフォルト設定で本明細書に定義されるようなアルゴリズムおよびコンピュータープログラムを使用して容易に定められる。好ましくはそのような同一性は完全長のタンパク質、酵素またはサブユニットにわたるか、あるいは少なくとも約８個のアミノ酸長のフラグメントにわたる。しかし同一性はより短い領域に基づいてもよく、ここで同一の遺伝子産物を使用するために適する領域が入力される。
【００１６】
本明細書に記載するように、アライメントはインターネットのウェッブサーバーを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」のように様々に公開または市販されて利用可能なマルチプルシークエンスアライメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して行う。あるいはベクター  ＮＴＩユーティリティ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）も使用する。ヌクレオチド配列の同一性の測定するために使用することができる、当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムがあり、それらには上記のプログラムに含まれるものを含む。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＦａｓｔａ、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを使用して比較することができる。Ｆａｓｔａはクエリとサーチ配列との間で最高の重複の領域のアライメントおよび配列同一性の割合を提供する。例えば核酸配列間の配列同一性の割合は、引用により本明細書に編入するＧＣＧバージョン６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（６のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスについてはＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦａｓｔａを使用して決定することができる。同様なプログラムがアミノ酸アライメントを行うために利用可能である。一般にこれらのプログラムはデフォルト設定で使用するが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。あるいは当業者は参照にしたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。
【００１７】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用するように、用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および他の変形の中でも「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を含むその変形、他の成分、要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）、工程等を含むことができる。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、他の成分、要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）、工程等を含まない。
【００１８】
Ｉ．サルアデノウイルス配列
本発明は、自然に伴う他のウイルス性物質から単離されたＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５およびＳＶ３９の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
【００１９】
Ａ．核酸配列
本発明のＰａｎ５核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜３６４６２を含む。本発明のＰａｎ６核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１〜３６６０４を含む。本発明のＰａｎ７核酸配列は、配列番号９のヌクレオチド１〜３６５３５を含む。本発明のＳＶ１核酸配列は、配列番号２４のヌクレオチド１〜３４２６４を含む。本発明のＳＶ２５核酸配列は、配列番号２９のヌクレオチド１〜３１０４４を含む。本発明のＳＶ３９核酸配列は、配列番号３４のヌクレオチド１〜３４１１５を含む。本明細書に編入する配列表を参照
にされたい。
【００２０】
本発明の核酸配列はさらに配列番号５、９、２４、２９および３４の配列に相補的な鎖、ならびにこれらの配列図およびそれらの相補鎖の配列に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。さらに本発明は配列表に対して９５〜９８％よりも高い、そしてより好ましくは約９９〜９９．９％よりも高い相同性を有するか、または同一である核酸配列を含む。また本発明の核酸配列に含まれるのは、配列番号５、９、２４、２９および３４に提供される配列およびそれらの相補鎖の自然な変異体および工作された修飾を持つ核酸配列である。そのような修飾には例えば当該技術分野で既知の標識、メチル化および１以上の自然に存在するヌクレオチドの縮重ヌクレオチドとの置換を含む。
【００２１】
さらに本発明は、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５およびＳＶ３９の配列のフラグメント、それらの相補鎖、それらに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡの配列を包含する。適当なフラグメントは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、そして機能的フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。例えば機能的フラグメントは所望するアデノウイルス産物を発現することができるか、または組換えウイルスベクターの生産に有用となり得る。そのようなフラグメントには以下の表に掲げる遺伝子配列およびフラグメントを含む。
【００２２】
以下の表は本発明のサルアデノウイルス配列中の転写領域およびオープンリーディングフレイムを提供する。ある遺伝子については転写産物およびオープンリーディングフレイム（ＯＲＦｓ）は、配列番号５、９、２４、２９および３４に提示する配列に相補的な鎖上に位置する。例えばＥ２ｂ、Ｅ４およびＥ２ａを参照にされたい。コードされるタンパク質の理論上の分子量も示す。Ｅ１ａオープンリーディングフレイムＰａｎ５［配列番号１のｎｔ５７６〜１４３６］、Ｐａｎ６［配列番号５のｎｔ５７６〜１４３７］およびＰａｎ７［配列番号９のｎｔ５７６〜１４３７］は、内部スプライス部位を含む。これらのスプライス部位を以下の表に記す。
【００２３】
【表１】
2011055835.tif 000002
【００２４】
【表２】
2011055835.tif 000003
【００２５】
【表３】
2011055835.tif 000004
【００２６】
【表４】
2011055835.tif 000005
【００２７】
【表５】
2011055835.tif 000006
【００２８】
【表６】
2011055835.tif 000007
【００２９】
【表７】
2011055835.tif 000008
【００３０】
【表８】
2011055835.tif 000009
【００３１】
【表９】
2011055835.tif 000010
【００３２】
【表１０】
2011055835.tif 000011
【００３３】
【表１１】
2011055835.tif 000012
【００３４】
Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５およびＳＶ３９アデノウイルスの核酸配列は、治療薬および種々のベクター系および宿主細胞の構築に有用である。本明細書で使用するようにベクターには、裸のＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、コスミドまたはエピソームを含む任意の適当な核酸分子を含む。これらの配列および産物は単独で、あるいは他のアデノウイルス配列またはフラグメントと組み合わせて、あるいは他のアデノウイルスもしくは非−アデノウイルス配列の要素と組み合わせて使用することができる。本発明のアデノウイルス配列はアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターまたはワクチンベクターとしても有用である。このように本発明はさらに核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび本発明のＡｄ配列を含む宿主細胞を提供する。
【００３５】
例えば本発明は、本発明のサルＡｄ  ＩＴＲ配列を含む核酸分子を包含する。別の例では、本発明は所望するＡｄ遺伝子産物をコードする本発明のサルＡｄ配列を含む核酸分子を提供する。さらに本発明の配列を使用して構築した別の核酸分子も、本明細書に提供する情報を考慮して当業者には容易に明らかとなるだろう。
【００３６】
１つの態様では、本明細書で同定したサルＡｄ遺伝子領域は細胞にヘテロロガスな分子を送達するための様々なベクターに使用することができる。例えばベクターは宿主細胞にパッケージングされるウイルスベクターを作成する目的のために、アデノウイルスキャプシドタンパク質（またはそのフラグメント）を発現するために作成される。そのようなベクターはトランスでの発現のために設計することができる。あるいはそのようなベクターは、所望するアデノウイルスの機能、例えば１以上のＥ１ａ、Ｅ１ｂ、末端反復配列、Ｅ
２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｅ４ＯＲＦ６領域を発現する配列を安定に含む細胞を提供するために設計される。
【００３７】
加えてアデノウイルス遺伝子およびそのフラグメントは、ヘルパー依存性ウイルス（例えば本質的機能が削除されたアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ））の生産に必要なヘルパー機能を提供するために有用である。そのような生産方法に本発明のサルアデノウイルス配列を、ヒトＡｄについて記載した方法に類似する様式のような方法に利用する。しかし本発明の配列の使用は本発明のサルアデノウイルス配列とヒトＡｄの配列との間の配列中の差異により、ｒＡＡＶ生産中に感染性のアデノウイルスの混入を生じる可能性があるヒトＡｄＥ１機能を持つ宿主細胞、例えば２９３細胞中でのヘルパー機能との相同的組換えの可能性を本質的に排除する。
【００３８】
アデノウイルスヘルパー機能を使用してｒＡＡＶを生産する方法は、ヒトアデノウイルス血清型を用いた技術文献で詳細に記載された。例えば米国特許第６，２５８，５９５号明細書およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい。また米国特許第５，８７１，９８２号明細書；国際公開第９９／１４３５４号；同第９９／１５６８５号；同第９９／４７６９１号パンフレットも参照にされたい。これらの方法は非−ヒト霊長類ＡＡＶ血清型を含む非−ヒト血清型ＡＡＶでの生産にも使用することができる。必要なヘルパー機能を提供する本発明のサルアデノウイルス遺伝子配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６）は必要なアデノウイルス機能を提供するために特に有用であることができると同時に、典型的にはヒト起源のｒＡＡＶ−パッケージング細胞に存在する他のアデノウイルスとの組換えの可能性を最少にするか、または排除する。このように本発明のアデノウイルス配列の選択した遺伝子またはオープンリーディングフレイムを、これらのｒＡＡＶ生産法に利用することができる。
【００３９】
あるいは本発明の組換えアデノウイルスサルベクターをこれらの方法で利用することができる。そのような組換えアデノウイルスサルベクターには、例えばハイブリッドチンパンジーＡｄ／ＡＡＶを含むことができ、ここでチンパンジーＡｄ配列は、例えば発現を制御する調節配列の制御下にＡＡＶ３’および／または５’ＩＴＲｓおよび導入遺伝子からなるｒＡＡＶ発現カセットを挟む。当業者は本発明のさらに別のサルアデノウイルスベクターおよび／または遺伝子配列がｒＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパーに依存性の他のウイルスの生産に有用であると認識するだろう。
【００４０】
さらに別の態様では、所望する生理学的効果を達成するために、核酸分子は宿主細胞へ送達し、そして選択したアデノウイルス遺伝子産物を発現するために設計される。例えば本発明のアデノウイルスＥ１ａタンパク質をコードする配列を含む核酸分子は、癌治療薬として使用するために個体に送達され得る。場合によりそのような分子は脂質基材の担体に配合され、そして癌細胞を優先的に標的とする。そのような製剤は他の癌治療薬（例えばシスプラチン、タキソール等）と組み合わせることができる。本明細書に提供するアデノウイルス配列に関するさらに別の使用は、当業者には直ちに明らかであろう。
【００４１】
加えて当業者は本発明のＡｄ配列が、治療薬および免疫原性分子のインビトロ、エクスビボまたはインビボ送達のための様々なウイルスおよび非ウイルスベクター系に使用するために容易に適合させることができると直ちに理解するだろう。例えば本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５および／またはＳＶ３９サルＡｄゲノムは、様々なｒＡｄおよび非−ｒＡｄベクター系に使用することができる。そのようなベクター系には、例えばとりわけプラスミド、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルス系を含むことができる。これらベクター系の選択は本発明を限定するものではない。
【００４２】
本発明はさらに本発明のサルおよびサルに由来するタンパク質の生産に有用な分子を提供する。本発明のサルＡｄのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを持つそのような分子は、裸のＤＮＡ、プラスミド、ウイルスまたは他のどのような遺伝要素であることもできる。
【００４３】
Ｂ．本発明のサルアデノウイルスタンパク質
本発明はさらに、本発明のアデノウイルス核酸によりコードされるタンパク質、酵素およびそれらのフラグメントのような上記アデノウイルスの遺伝子産物を提供する。本発明はさらに、他の方法により生成されたこれら核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５およびＳＶ３９タンパク質、酵素およびそれらのフラグメントを包含する。そのようなタンパク質には上記の表、図１および２に確認されるオープンリーディングフレイムによりコードされるもの、およびそれらのフラグメントを含む。
【００４４】
このように１つの観点では、本発明は実質的に純粋な、すなわち他のウイルス性およびタンパク質様タンパク質を含まない独特なサルアデノウイルスタンパク質を提供する。好ましくはこれらのタンパク質は少なくとも１０％均一、より好ましくは６０％均一、そして最も好ましくは９５％均一である。
【００４５】
１つの態様では、本発明は独特なサル−由来キャプシドタンパク質を提供する。本明細書で使用するようにサル−由来キャプシドタンパク質には、限定するわけではないがキメラキャプシドタンパク質、融合タンパク質、人工キャプシドタンパク質、合成キャプシドタンパク質および組換え的なキャプシドタンパク質を含め、これらのタンパク質の生成手段を限定せずに、上記定義のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９キャプシドタンパク質またはそれらのフラグメントを含む任意のアデノウイルスキャプシドタンパク質を含む。
【００４６】
適当にはこれらのサル−由来キャプシドタンパク質は、１以上のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９領域またはそれらのフラグメント（例えばヘキソン、ペントン、繊維またはそれらのフラグメント）を、異なるアデノウイルス血清型のキャプシド領域もしくはそのフラグメント、または修飾されたサルキャプシドタンパク質もしくはフラグメントと本明細書に記載するように組み合わせて含む。本明細書で使用する「改変されたトロピズムに関連するキャプシドタンパク質の修飾」には、特異性が改変されるように改変されたキャプシドタンパク質、すなわちペントン、ヘキソンまたは繊維タンパク質領域、または繊維領域の小塊ドメイン、それをコードするポリヌクレオチドのようなそれらのフラグメントを含む。サル−由来キャプシドは、１以上の本発明のサルＡｄまたはヒトもしくは非−ヒト起源でよい他のＡｄ血清型で構築され得る。そのようなＡｄはＡＴＣＣ、商業用および研究用の供給元を含む様々な供給元から得ることができ、あるいはＡｄの配列はＧｅｎＢａｎｋまたは他の適切な供給元から得ることができる。
【００４７】
本発明のサルアデノウイルスのペントンタンパク質のアミノ酸配列を本明細書に提供する。ＡｄＰａｎ５ペントンタンパク質は、配列番号２に提供する。ＡｄＰａｎ７ペントンは、配列番号１０に提供する。ＡｄＰａｎ６ペントンは、配列番号６に提供する。ＳＶ１ペントンは、配列番号２５に提供する。ＳＶ２５ペントンタンパク質は、配列番号３０に提供する。ＳＶ３９ペントンは、配列番号３５に提供する。適切にはこれら任意のペントンタンパク質またはそれらの独特なフラグメントを様々な目的に利用することができる。適当なフラグメントの例には、上記および配列番号２、配列番号６、配列番号２５、配列番号３０または配列番号３５に提供されるアミノ酸の番号付けに基づき、約５０、１００、１５０または２００個のアミノ酸のＮ−末端および／またはＣ−末端短縮化を有するペントンを含む。他の適当なフラグメントには、より短い内部、Ｃ−末端またはＮ−末端フ
ラグメントを含む。さらにペントンタンパク質は、当業者に知られている様々な目的のために修飾されることができる。
【００４８】
本発明はさらに、Ｐａｎ５［配列番号３］、Ｐａｎ６［配列番号７］、Ｐａｎ７［配列番号１１］、ＳＶ１［配列番号２６］、ＳＶ２５［配列番号３１］および／またはＳＶ３９［配列番号３６］のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列を提供する。適切にはこのヘキソンタンパク質またはそれらの独特なフラグメントは、様々な目的に利用することができる。適切なフラグメントの例には、上記および配列番号３、７、１１、２６、３１および３６に提供されるアミノ酸の番号付けに基づき、約５０、１００、１５０、２００、３００、４００または５００個のアミノ酸のＮ−末端および／またはＣ−末端短縮化を有するヘキソンを含む。他の適当なフラグメントには、より短い内部、Ｃ−末端またはＮ−末端フラグメントを含む。例えば１つの適切なフラグメントはＤＥ１およびＦＧ１と命名されたヘキソンタンパク質のループ領域（ドメイン）、またはそれらの超可変領域。そのようなフラグメントは配列番号３、７、１１、２６、３１または３６に関して、サルヘキソンタンパク質のアミノ酸残基約１２５〜４４３；約１３８〜４４１、または約残基１３８〜残基１６３に広がるもののようなより小さいフラグメント；約１７０〜約１７６；約１９５〜約２０３；約２３３〜約２４６；約２５３〜約２６４；約２８７〜約２９７；および約４０４〜４３０に広がるアミノ酸領域を含む。他の適当なフラグメントは当業者により容易に同定され得る。さらにヘキソンタンパク質を当業者に知られている様々な目的に修飾することができる。ヘキソンタンパク質はアデノウイルスの血清型の決定基であるので、そのような人工のヘキソンタンパク質は人工の血清型を有するアデノウイルスを生じるだろう。他の人工キャプシドタンパク質も、本発明のチンパンジーＡｄペントン配列および／または繊維配列および／またはそれらのフラグメントを使用して構築することができる。
【００４９】
一例では、改変されたヘキソンタンパク質を有するアデノウイルスを本発明のヘキソンタンパク質の配列を利用して生成することが望ましい。ヘキソンタンパク質の１つの適切な改変法が、引用により本明細書に編入する米国特許第５，９２２，３１５号明細書に記載されている。この方法では、アデノウイルスヘキソンの少なくとも１つのループ領域が別のアデノウイルス血清型の少なくとも１つのループ領域と変えられている。すなわちそのように改変されたアデノウイルスヘキソンタンパク質の少なくとも１つのループ領域は、本発明のサルＡｄヘキソンループ領域である（例えばＰａｎ７）。１つの態様では、Ｐａｎ７ヘキソンタンパク質のループ領域は別のアデノウイルス血清型に由来するループ領域に置き換えられる。別の態様では、Ｐａｎ７ヘキソンのループ領域を別のアデノウイルス血清型に由来するループ領域に置き換えるために使用する。適当なアデノウイルス血清型は、本明細書に記載するようにヒトおよび非−ヒト血清型の中から容易に選択することができる。Ｐａｎ７は具体的説明の目的のみに選択し；本発明の他のサルＡｄヘキソンタンパク質も同様に改変することができ、あるいは別のＡｄヘキソンを改変するために使用することができる。適当な血清型の選択は、本発明を限定するものではない。本発明のヘキソンタンパク質配列のさらに別の使用は、当業者には直ちに明白となるだろう。
【００５０】
本発明はさらに本発明のサルアデノウイルスの繊維タンパク質を包含する。ＡｄＰａｎ５の繊維タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。繊維タンパク質ＡｄＰａｎ６は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。ＡｄＰａｎ７の繊維タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ＳＶ−１は２つの繊維タンパク質を有し；繊維２は配列番号２７のアミノ酸配列を有し、そして繊維１は配列番号２８のアミノ酸配列を有する。ＳＶ−２５も２つの繊維タンパク質を有し；繊維２は配列番号３２のアミノ酸配列を有し、そして繊維１は配列番号３３のアミノ酸配列を有する。ＳＶ−３９の繊維タンパク質は配列番号３７のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
適切にこの繊維タンパク質またはそれらの独特なフラグメントを、様々な目的に利用することができる。１つの適切なフラグメントは繊維小塊であり、これは配列番号４、８、１２、２８、３２、３３および３７のアミノ酸約２４７〜４２５に広がる。図２を参照にされたい。他の適当なフラグメントの例には、上記および配列番号４、８、１２、２８、３２、３３および３７に提供されるアミノ酸の番号付けに基づき、約５０、１００、１５０もしくは２００個のアミノ酸のＮ−末端および／またはＣ−末端短縮化を有する繊維を含む。さらに別の適当なフラグメントには内部フラグメントを含む。さらに繊維タンパク質は当業者に知られている種々の技術を使用して修飾することができる。
【００５２】
本発明はさらに、少なくとも８アミノ酸長である本発明のタンパク質の独特なフラグメントを包含する。しかし他の所望する長さのフラグメントを容易に使用することができる。さら本発明は、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９遺伝子産物の収量および／または発現を強化するために導入できるような修飾、例えばＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９遺伝子産物のすべてまたはフラグメントが（直接またはリンカーを介して）強化するための融合パートナーに融合している融合分子の構築物を包含する。他の適切な修飾には限定するわけではないが、通常は開裂され、そして成熟タンパク質または酵素を提供するプレ−またはプロ−タンパク質を排除するためにコード領域（例えばタンパク質または酵素）の短縮化、および／または分泌可能な遺伝子産物を提供するためにコード領域の突然変異を含む。さらに他の修飾が当業者には明白であろう。本発明はさらに本明細書に提供するＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９タンパク質に少なくとも約９５％〜９９％の同一性を有するタンパク質を包含する。
【００５３】
本明細書に記載するように、本発明のアデノウイルスキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のＡｄ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの効力を縮小する応用に使用するために特によく適している。本発明のｒＡｄベクターは、反復遺伝子治療または免疫応答（ワクチン力価）のブーストのための再投与に特に有利である。
【００５４】
特定の状況下では、１以上のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５および／またはＳＶ３９遺伝子産物（例えばキャプシドタンパク質またはそれらのフラグメント）を使用して抗体を生成することが望ましいかもしれない。本明細書で使用する用語「抗体」は、エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を称する。このように本発明の抗体は好ましくは特異的に、しかも交差反応性無しで、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９エピトープに結合する。本発明では抗体は、例えば高親和性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体、組換え抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在する。そのような抗体は免疫グロブリンのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥクラスから派生する。
【００５５】
そのような抗体は当該技術分野で既知な多数の方法を使用して生成することができる。適当な抗体は周知の従来技術、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎおよびその多くの既知の変法により生成することができる。同様に望ましい高力価抗体は、これらの抗原に対して開発されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に既知の組換え技術を応用することにより生成される［例えばＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号パンフレット；英国特許出願公開第２１８８６３８号明細書；Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３；ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／国際公開第９００７８６１号パンフレット；およびＲｉｅｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１
を参照にされたい］。あるいは抗体は本発明の抗原に対する動物またはヒト抗体の相補性決定領域を操作することにより生産することができる。例えばＥ．Ｍａｒｋ  ａｎｄ  Ｐａｄｌｉｎ、「モノクローナル抗体のヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、第４章、実験薬理学のハンドブック（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第１１３巻、モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、スプリンガーファーラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）（１９９４年６月）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、抗体を使用して：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６を参照にされたい。さらに本発明により提供されるのは、抗−イディオタイプ抗体（Ａｂ２）および抗−抗−イディオタイプ抗体（Ａｂ３）である。例えばＭ．Ｗｅｔｔｅｎｄｏｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，「抗−イディオタイプ抗体による抗−腫瘍免疫の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、イディオタイプのネットワークおよび疾患（Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）で、Ｊ．Ｃｅｒｎｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈｉｅｒｎａｕｘ編集、１９９０  Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ワシントンＤ．Ｃ．第２０３〜２２９頁を参照にされたい］。これらの抗−イディオタイプおよび抗−抗−イディオタイプ抗体は、当業者に周知の技術を使用して生産される。これらの抗体は、診断および臨床的方法およびキットを含め様々な目的に使用することができる。
【００５６】
特定の状況下では、検出可能な標識またはタグを本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９遺伝子産物、抗体または他の構築物に導入することが望ましい。本明細書で使用するように検出可能な標識は、単独または他の分子との相互作用で検出可能なシグナルを提供することができる分子である。最も望ましくは標識は免疫組織化学的分析または免疫蛍光顕微鏡で直ちに使用するために視覚的、例えば蛍光により検出することができる。例えば適当な標識にはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン−Ｏ（ＣＰＯ）またはタンデム色素、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）およびＰＥ−テキサスレッド（ＥＣＤ）を含む。これらすべての蛍光色素は市販されており、そしてそれらの使用は当該技術分野では知られている。他の有用な標識には金コロイド標識を含む。さらに別の有用な標識には放射性化合物または元素を含む。加えて標識にはアッセイで比色シグナルを示すように作動する様々な酵素系を含み、例えばグルコースオキシダーゼ（これは基質としてグルコースを使用する）は生成物としてペルオキシドを放出し、これはペルオキシダーゼおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のような水素供与体の存在下で酸化ＴＭＢを生成し、これが青色として見える。他の例には西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、およびＡＴＰ、グルコースおよびＮＡＤ＋と反応して生成物の中でも３４０ｎｍの波長の吸収増加として検出されるＮＡＤＨを生じるグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼと組み合わせたヘキソキナーゼを含む。
【００５７】
本発明の方法に利用される他の標識系は他の手段、例えば着色されたラテックス微小球［バングス  ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディアナ］により検出可能であり、ここで包埋された色素は酵素の代わりに使用されて標的配列と
結合物を形成し、適用可能なアッセイで生じた複合体の存在を示す視覚的シグナルを提供する。
【００５８】
標識を所望の分子にカップリングまたは会合させる方法は同様に通例であり、そして当業者に知られている。標識結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の既知の方法は記載されている［例えば蛍光プローブおよび研究用化学品のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社、ユージーン、オレゴン州、１９９６；ピアスカタログハンドブック（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、ライフサイエンスおよび分析研究用製品、ピアスケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社、ロックフォード、イリノイ州、１９９４／１９９５を参照にされたい］。このように標識およびカップリング法の選択は本発明を限定しない。
【００５９】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え生産、化学合成を含む任意の適当な手段、または他の合成手段により生産することができる。適当な生産技術は当業者に周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，モレキュラークローニング：ア
ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー出版（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）を参照にされたい。あるいはペプチドは周知の固相ペプチド合成法により合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（フリーマン、サンフランシスコ、１９６９）、第２７−６２頁）。これらのおよび他の適切な生産法は当業者の知識の範囲内であり、そして本発明を限定するものではない。
【００６０】
さらに当業者は本発明のＡｄ配列を、治療用および免疫原性分子のインビトロ、エクスビボまたはインビボ送達に、種々のウイルスおよび非−ウイルスベクター系で使用するために容易に適合させることができると容易に理解するだろう。例えば１つの態様では、本明細書に記載するサルＡｄキャプシドタンパク質および他のサルアデノウイルスタンパク質を、遺伝子、タンパク質および他の所望する診断用、治療用および免疫原性分子の非ウイルス性の、タンパク質に基づく送達に使用する。１つのそのような態様では、本発明のタンパク質を直接的または間接的にアデノウイルスのレセプターを持つ細胞を標的とする分子に連結する。好ましくは細胞表面レセプターに関するリガンドを有するヘキソン、ペントン、繊維またはそれらのフラグメントのようなキャプシドタンパク質を、そのような標的化のために選択する。送達のための適当な分子は、本明細書に記載する治療用分子およびそれらの遺伝子産物の中から選択される。脂質、ポリＬｙｓ等を含む様々なリンカーをリンカーとして利用することができる。例えばサルのペントンタンパク質は、Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ＬＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｍａｙ；８（１０）：７９５−８０３およびＭｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ＬＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｄｅｃ：８（２３）：１７５３−１７６１に記載されている様式に準じて、サルのペントン配列を使用して融合タンパク質の生産によりそのような目的に容易に利用することができる。あるいはサルＡｄタンパク質ＩＸのアミノ酸配列は、米国特許出願第２００１００４７０８１号明細書に記載されているようにベクターを細胞表面レセプターに標的化するために利用することができる。適当なリガンドにはＣＤ４０抗原、ＲＧＤ−含有またはポリリシン−含有配列等を含む。さらに例えばヘキソンタンパク質および／または繊維タンパク質を含む他のサルＡｄタンパク質を、これらおよび類似の目的に使用することができる。
【００６１】
さらに本発明の他のアデノウイルスタンパク質を単独で、または他のアデノウイルスタ
ンパク質と組み合わせて、当業者には容易に明白な様々な目的に使用することができる。加えて、本発明のアデノウイルスタンパク質に関するさらに他の使用は、当業者に直ちに明らかとなるであろう。
【００６２】
ＩＩ．組換えアデノウイルスベクター
本発明の組成物は、治療用またはワクチンのいずれかの目的でヘテロロガスな分子を細胞に送達するベクターを含む。本明細書で使用するようにベクターには、限定するわけではないが裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミドまたはウイルスを含む任意の遺伝子要素を含むことができる。そのようなベクターはＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５および／またはＳＶ３９のサルアデノウイルスＤＮＡおよびミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を含む。「ミニ遺伝子」とは選択したヘテロロガスな遺伝子と宿主細胞中で遺伝子産物の翻訳、転写および／または発現を駆動するために必要な他の調節要素との組み合わせを意味する。
【００６３】
典型的には本発明のアデノウイルスベクターは、選択したアデノウイルス遺伝子に自然な領域に他のアデノウイルス配列を含む核酸分子中にミニ遺伝子を配置するように設計される。ミニ遺伝子は所望により既存の遺伝子領域に挿入して、その領域の機能を破壊することができる。あるいはミニ遺伝子は部分的または完全に削除されたアデノウイルス遺伝子の部位に挿入してもよい。例えばミニ遺伝子を、選択することができる部位の中でも機能的Ｅ１削除または機能的Ｅ３削除の部位のような部位に配置することができる。用語「機能的に削除された」または「機能的削除」とは、突然変異または修飾により十分量の遺伝子領域が除去されるかまたはそうではなく傷害を受けて、その遺伝子領域がもはや遺伝子発現の機能的産物を生産できないことを意味する。所望により、全遺伝子領域を除去してもよい。遺伝子破壊または削除について他の適当な部位は、本出願のいたるところで検討する。
【００６４】
例えば組換えウイルスの生成に有用な生産ベクターについて、ベクターはミニ遺伝子およびアデノウイルスゲノムの５’末端もしくはアデノウイルスゲノムの３’末端のいずれか、またはアデノウイルスゲノムの５’および３’末端の両方を含むことができる。アデノウイルスゲノムの５’末端は、パッケージングおよび複製に必要な５’シス−エレメント；すなわち５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（これは複製の起点として機能する）および天然の５’パッケージングエンハンサードメイン（これは直線状のＡｄゲノムをパッケージングするために必要な配列およびＥ１プロモーター用のエンハンサーエレメントを含む）を含む。アデノウイルスゲノムの３’末端は、パッケージングおよびキャプシド形成に必要な３’シス−エレメント（ＩＴＲｓを含む）を含む。適当には組換えアデノウイルスは５’および３’の両方のアデノウイルスシス−エレメントを含み、そしてミニ遺伝子は５’と３’アデノウイルス配列の間に配置される。本発明の任意のアデノウイルスベクターはさらなるアデノウイルス配列も含むことができる。
【００６５】
適当には本発明のこれらのアデノウイルスベクターは、本発明のアデノウイルスゲノムに由来する１以上のアデノウイルス要素を含む。１つの態様では、ベクターはＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９に由来するアデノウイルスＩＴＲｓおよび同じアデノウイルス血清型に由来するさらなるアデノウイルス配列を含む。別の態様では、ベクターはＩＴＲｓを提供する血清型とは異なるアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルス配列を含む。本明細書に定義するように、シュードタイプ化されたアデノウイルスとは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質がＩＴＲｓを提供する血清型とは異なる血清型に由来するアデノウイルスを指す。ＩＴＲｓの血清型およびベクターに存在する他のアデノウイルス配列の血清型の選択は、本発明を限定しない。種々のアデノウイルス株がバージニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能であり、あるいは様々な商業用および研究用の供給元から要求に応じて入手可能
である。さらに多くのそのような株の配列が、例えばＰｕｂＭｅｄおよびＧｅｎＢａｎｋを含む種々のデータベースから利用可能である。他のサルから、またはヒトアデノウイルスから調製したホモロガスなアデノウイルスベクターは、公開された技術文献に記載されている［例えば米国特許第５，２４０，８４６号明細書を参照にされたい］。Ａｄ５型［ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ７３２６０］を含め、多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。アデノウイルスの配列は、血清型２、３、４、７、１２および４０、そしてさらに現在同定されている任意のヒトの型を含むような既知のアデノウイルス血清型から得ることができる。同様に非−ヒト動物（例えばサル）に感染することが知られている同様のアデノウイルスも、本発明のベクター構築物に採用することができる。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照にされたい。
【００６６】
本明細書に記載するベクターの構築に使用するウイルスの配列、必要ならばヘルパーウイルス、および組換えウイルス粒子、および他のベクター成分および配列は、上記のように得ることができる。本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５および／またはＳＶ３９サルアデノウイルス配列のＤＮＡ配列は、ベクターおよびそのようなベクターを調製するために有用な細胞系を構築するために使用される。
【００６７】
配列の削除、挿入および他の突然変異を含む、本発明のベクターを形成する核酸配列の修飾は、標準的な分子生物学的技術を使用して生成することができ、そして本発明の範囲内にある。
【００６８】
Ａ．「ミニ遺伝子」
導入遺伝子の選択、「ミニ遺伝子」のクローニングおよび構築、およびそのウイルスベクターへの挿入に使用する方法は、本明細書に提供される技術を考慮すれば当業者の技術内である。
【００６９】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、問題のポリペプチド、タンパク質または他の産物をコードする導入遺伝子を挟むベクター配列にヘテロロガスな核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で調節成分に操作可能に連結される。
【００７０】
導入遺伝子配列の組成は、生成するベクターに課される使用に依存するだろう。例えば導入遺伝子配列の１つの種類はレポーター配列を含み、これは発現により検出可能なシグナルを生産する。そのようなレポーター配列には限定するわけではないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集タンパク質、および当該技術分野で周知の他のもの（これらに対する高親和性抗体が存在するか、あるいは通例の手段により生成することができる）、ならびに中でもとりわけ赤血球凝集素またはＭｙｃに由来する抗原のタグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。これらのコード配列はそれらの発現を駆動する調節要素と会合した時、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティングアッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えばマーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを持つベクターの存在は、ベータガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。導入遺伝子がＧＦＰまたはルシフェラーゼである場合、シグナルを持つベクターはルミノメーター中での色または光の生産により視覚的に測定することができる。
【００７１】
しかし望ましくは、導入遺伝子はタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素または触媒ＲＮＡのような生物学および医学で有用な産物をコードする非−マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子にはｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の１例は、処置する動物中で標的核酸配列の発現を無効にする配列である。
【００７２】
導入遺伝子は、例えば遺伝子欠損の処置に、癌の治療またはワクチンとして、免疫応答を誘導するために、および／または予防用ワクチンの目的に使用することができる。本明細書で使用するように免疫応答の誘導とは、分子に対するＴ細胞および／または体液性免疫応答を誘導する分子（例えば遺伝子産物）の能力を称する。本発明はさらに、例えば多−サブユニットタンパク質により引き起こされる状態を正すか、または改善するために多数の導入遺伝子を使用することを含む。特定の状況ではタンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチドまたはタグをコードするために種々の導入遺伝子を使用することができる。これは例えば、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい時、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子またはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞が多−サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞を異なる各サブユニットを含む組換えウイルスに感染させる。あるいはタンパク質の種々のサブユニットが同じ導入遺伝子によりコードされてもよい。この場合、１つの導入遺伝子が各サブユニットをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットのＤＮＡはインターナルリボザイムエントリーサイト（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）により分けられている。これは各サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが小さい時、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの全サイズが５キロベース未満である時に望ましい。ＩＲＥＳに対する代わりとして、ＤＮＡは２Ａペプチド（これは翻訳後反応（ｅｖｅｎｔ）で自己−開裂する）をコードする配列により分けられてもよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８（Ｐｔ１）：１３−２１（Ｊａｎ１９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ  ２００１）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ  ２００１）を参照にされたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳよりも有意に小さく、スペースが限定因子となる時の使用によく適している。しかし選択した導入遺伝子は生物学的に活性な産物または他の産物、例えば研究に望ましいいかなる産物もコードすることができる。
【００７３】
適切な導入遺伝子は当業者により容易に選択され得る。導入遺伝子の選択が本発明を限定するとは考えられない。
【００７４】
２．調節要素
ミニ遺伝子に関して上記で確認した主要な要素に加えて、本発明により生産されたベクターはプラスミドベクターでトランスフェクトした、またはウイルスに感染した細胞での転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で導入遺伝子に操作可能に連結された、必要な通常の制御要素も含む。本明細書で使用するように「操作可能に連結した」配列には、問題の遺伝子に連続する発現制御配列、およびトランスに作用するか、または問題の遺伝子を制御するために一定距離の発現制御配列の両方を含む。
【００７５】
発現制御配列には適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニレーション（ポリＡ）シグナルのような効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわちＫｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および所望により、コードされた産物の分泌を強化する配列を含む。天然の、構成的な、誘導性のおよび／また
は組織特異的なプロモーターを含む莫大な数の発現制御配列が当該技術分野では知られており、そして利用することができる。
【００７６】
構成的プロモーターの例には限定するわけではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）［例えばＢｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照にされたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を含む。
【００７７】
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、そして外から供給される化合物、温度のような環境的因子、または特別な生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、あるいは複製している細胞のみで調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定するわけではないがインビトロゲン、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびアリアド（Ａｒｉａｄ）を含む様々な商業的供給源から入手することができる。多くの他の系が記載され、そして当業者により容易に選択され得る。例えば誘導性プロモーターには亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターおよびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを含む。他の誘導性の系にはＴ７ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］，テトラサイクリン−抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン−誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）を参照にされたい］を含む。他の系にはカストラジオール、ジフェノールムリスレロンを使用するＦＫ５０６二量体、ＶＰ１６またはｐ６５、ＲＵ４８６−誘導性系［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］およびラパマイシン−誘導性系［Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を含む。幾つかの誘導性プロモーターの効率は時間経過に伴い上昇する。そのような場合、そのような系の効率はタンデムに多くのリプレッサーを挿入すること、例えばＩＲＥＳによりＴｅｔＲに連結されたＴｅｔＲにより強化することができる。あるいは所望の機能をスクリーニングする前に少なくとも３日間待つことができる。所望するタンパク質の発現は、この系の効率を強化するための既知の手段により強化することができる。例えばウッドチャック（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を使用すること。
【００７８】
別の態様では、導入遺伝子に天然のプロモーターを使用する。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が自然な発現を模するべきであることが望まれる時に好適となり得る。天然のプロモーターは導入遺伝子の発現が一時的にもしくは発育的に、または組織特異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用することができる。さらなる態様では、エンハンサーエレメント、ポリアデニレーション部位またはＫｏｚａｋ共通配列のような他の天然発現制御要素を使用して、自然な発現を模することもできる。
【００７９】
導入遺伝子の別の態様には、組織−特異的プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現が望まれる場合、筋肉中で活性なプロモーターを使用するべきである。これらには骨格筋β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン
、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成の筋肉プロモーターを含む（Ｌｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９）を参照にされたい）。組織−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６））、骨のオステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６）），リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプター鎖）、ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターのような神経性（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽−鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン−特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））について知られている。
【００８０】
場合により治療的に有用な、または免疫原性の産物をコードする導入遺伝子を持つベクターは、中でもジェネティシン、ヒグロマイシンまたはピューロマイシン耐性をコードする配列を含むことができる選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含んでもよい。そのような選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子（好ましくはウイルス粒子にパッケージングされるウイルスゲノムの外側に位置する）を使用して、アンピシリン耐性のような細菌細胞中でのプラスミドの存在のシグナルを出すことができる。ベクターの他の成分には、複製起点を含むことができる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は通例であり、そして多くのそのような配列を利用することができる［たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい］。
【００８１】
これらのベクターは、本明細書に提供する技術および配列を当業者に既知の技術と一緒に使用して作成される。そのような技術にはテキスト［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州］に記載されているような通例のｃＤＮＡのクローニング技法、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応および所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適当な方法の使用を含む。
【００８２】
ＩＩＩ．組換えウイルス粒子の生産
１つの態様ではサルアデノウイルスプラスミド（または他のベクター）を使用して、組換えアデノウイルス粒子を生産する。１つの態様では、組換えアデノウイルスはＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子が機能的に削除され、そして場合により他の突然変異、例えば温度−感受性突然変異または他の遺伝子の削除を持つ。他の態様では、完全なＥ１ａおよび／またはＥ１ｂ領域が組換えアデノウイルスに保持されていることが望ましい。そのような完全なＥ１領域はアデノウイルスゲノム中で自然な位置に配置されるか、または天然のアデノウイルスゲノム中で削除された部位に配置されてもよい（例えばＥ３領域）。
【００８３】
遺伝子をヒト（または他の哺乳動物）細胞へ送達するために有用なサルアデノウイルスベクターの構築において、ある範囲のアデノウイルス核酸配列をベクターに使用すること
ができる。例えばアデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全部または一部を、組換えウイルスの部分を形成するサルアデノウイルス配列から排除することができる。サルＥ３の機能は組換えウイルス粒子の機能および生産には無関係であると考えられている。サルアデノウイルスベクターはＥ４遺伝子の少なくともＯＲＦ６領域の削除を有するように、そしてより望ましくはこの領域の機能の重複から、全Ｅ４領域の削除を有するように構築することもできる。本発明のさらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａに削除を含む。削除はサルアデノウイルスゲノムの任意の後期遺伝子Ｌ１からＬ５に作成することができる。同様に中期遺伝子ＩＸおよびＩＶａ２中の削除は幾つかの目的に有用となり得る。他の削除を別の構造的または非構造的アデノウイルス遺伝子に作成することができる。上記に検討した削除は個々に使用することができ、すなわち本発明で使用するアデノウイルス配列は単一領域にのみ削除を含むことができる。あるいはそれらの生物学的活性を破壊するために効果的な全遺伝子またはその部分の削除を、任意に組み合わせてもよい。例えば１つの例示ベクターでは、アデノウイルス配列はＥ１遺伝子およびＥ４遺伝子の削除、またはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ３遺伝子の削除、またはＥ１およびＥ３遺伝子の削除、またはＥ３の削除を含むか、または含まずにＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４遺伝子の削除等を有することができる。上記に検討したように、そのような削除は温度−感受性突然変異のような他の突然変異と組み合わせて使用して所望の結果を達成することができる。
【００８４】
任意の本質的なアデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４  ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）を欠いているアデノウイルスベクターを、アデノウイルス粒子のウイルス感染性および増殖に必要な欠けている（ｍｉｓｓｉｎｇ）アデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養する。これらのヘルパー機能は、アデノウイルスベクターを１以上のヘルパー構築物（例えばプラスミドまたはウイルス）またはパッケージング宿主細胞の存在下で培養することにより提供することができる。例えば「最少」ヒトＡｄベクターの調製について１９９６年５月９日に公開された国際公開第９６／１３５９７号パンフレットに記載された技術を参照にされたい、そしてこれは引用により本明細書に編入する。
【００８５】
１．ヘルパーウイルス
このようにミニ遺伝子を運ぶために使用されるウイルスベクターのサルアデノウイルス遺伝子内容物に依存して、ヘルパーアデノウイルスまたは非−複製ウイルスフラグメントが、ミニ遺伝子を含む感染性の組換えウイルス粒子を生産するために必要な十分なサルアデノウイルス遺伝子配列を提供するために必要となり得る。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物には存在せず、かつ／またはベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞系により発現されない選択したアデノウイルス遺伝子配列を含む。１つの態様では、ヘルパーウイルスは複製−欠損であり、そして上記の配列に加えて種々のアデノウイルス遺伝子を含む。そのようなヘルパーウイルスは、望ましくはＥ１−発現細胞系と組み合わせて使用される。
【００８６】
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９９：４９（１９９４年４月１日）に記載されているようにポリ−カチオン結合物中に形成することもできる。ヘルパーウイルスは場合により第２のレポーターミニ遺伝子を含んでもよい。多数のそのようなレポーター遺伝子が当該技術分野では知られている。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子とは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Ａｄベクターおよびヘルパーウイルスの両方を独立して監視できるようにする。この第２レポーターの使用により、精製時に生成した組換えウイルスとヘルパーウイルスとの間の分離が可能となる。
【００８７】
２．相補細胞系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ）
任意の上記遺伝子が任意に削除されている組換えサルアデノウイルス（Ａｄ）を生成するために、削除された遺伝子領域の機能は、ウイルスの複製および感染に必須であるならば、ヘルパーウイルスまたは細胞系、すなわち相補またはパッケージング細胞系により組換えウイルスに供給されなければならない。多くの状況において、ヒトＥ１を発現する細胞系を使用してチンパンジーＡｄベクターを相補作用する（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）ことができる。これは本発明のチンパンジーＡｄ配列と現在利用可能なパッケージング細胞中に見いだされるヒトＡｄＥ１配列との間の多様性により、現在のヒトＥ１−含有細胞の使用が複製可能なアデノウイルスの生成を複製および生産プロセス中に妨げるので、特に有利である。しかし特定の状況下ではＥ１−削除サルアデノウイルスの生産に利用することができるＥ１遺伝子産物を発現する細胞系を利用することが望ましいだろう。そのような細胞系が記載された。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照にされたい。
【００８８】
所望により、本明細書に提供する配列を利用してパッケージング細胞、または最低限、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９に由来するアデノウイルスＥ１遺伝子を、選択した親の細胞系中で発現するためのプロモーターの転写制御下で発現する細胞系を生成することができる。誘導性または構成的プロモーターをこの目的に使用することができる。そのようなプロモーターの例は、本明細書のいたるところに詳細に記載する。親の細胞は所望するＡｄＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９遺伝子を発現する新規細胞系を生成するために選択する。限定するわけではないが、そのような親細胞系はとりわけＨｅＬａ［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］、ＨＥＫ２９３、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞であることができる。これらの細胞系はすべて、２０１１０−２２０９、バージニア州マナッサス、１０８０１ブルヴァール大学のアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である。他の適当な親細胞系は他の供給元から得ることができる。
【００８９】
そのようなＥ１−発現細胞系は、組換えサルアデノウイルスＥ１削除ベクターの生成に有用である。さらにあるいは選択的に、本発明は組換えサルウイルスベクターの生成に使用する本質的に同じ手順を使用して構築することができる、１以上のサルアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／またはＥ４  ＯＲＦ６を発現する細胞系を提供する。そのような細胞系は、これらの産物をコードする本質的遺伝子が削除されたアデノウイルスベクターをトランス相補するために、あるいはヘルパー−依存性ウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供するために利用することができる。本発明による宿主細胞の生成には、選択したＤＮＡ配列の集成のような技術が関与する。この集成は通例の技術を利用して達成することができる。そのような技術は周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、同上に記載されているｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望するヌクレオチド配列を提供する任意の他の適当な方法と組み合わせたアデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を含む。
【００９０】
さらに別の選択では、本質的なアデノウイルス遺伝子産物はアデノウイルスベクターおよび／またはヘルパーウイルスによりトランスで提供される。そのような場合、適当な宿主細胞は原核（例えば細菌）細胞および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含む任意の生物から選択することができる。特に望ましい宿主細胞は限定するわけではないがＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ２９３細胞またはＰＥＲＣ６（その両方が機能的アデノウイルスＥ１を発現する）［Ｆａｌｌａｕｘ，ＦＪ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９：１９０９−１９１７］、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２および初代繊維芽細胞、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来する肝細胞および
筋芽細胞のような細胞を含む任意の哺乳動物種から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず；哺乳動物細胞の種類、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等も本発明を限定しない。
【００９１】
３．ウイルス粒子の集合および細胞系のトランスフェクション
一般にミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する時、ベクターは約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、そして好ましくは約１０〜約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０４細胞〜約１×１０１３細胞、そして好ましくは約１０５細胞に送達される。しかし宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対的量は、選択したベクター、送達法および選択した宿主細胞のような因子を考慮して調整するとができる。
【００９２】
ベクターは裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルス等を含め、当該技術分野で既知の、または上記に開示した任意のベクターでよい。ベクターの宿主細胞への導入はトランスフェクションおよび感染を含め、当該技術分野で知られているか、または上記に開示した任意の手段により行うことができる。１以上のアデノウイルス遺伝子が宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ、エピソームとして安定に発現されるか、または一時的に発現される。遺伝子産物はすべてエピソームで一時的に発現されるか、または安定に組み込まれるか、または遺伝子産物の幾つかが安定に発現されるが、その他は一時的に発現され得る。さらに各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択することができる。プロモーターは生物または細胞の特異的な生理学的状態（すなわち分化状態または複製中または静止細胞）により、あるいは例えば外から加えた因子により調節され得る。
【００９３】
分子（プラスミドまたはウイルスとして）を宿主細胞へ導入することは、当業者に知られている技術を使用して、および本明細書を通して検討したように達成することができる。好適な態様では、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用する。
【００９４】
アデノウイルスの選択したＤＮＡ配列ならびに導入遺伝子および他のベクター要素の種々の中間プラスミドへの集成、および組換えウイルス粒子を生成するためのプラスミドおよびベクターの使用はすべて通例の技術を使用して達成される。そのような技術にはテキスト［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、同上］に記載されているような通例のｃＤＮＡのクローニング技法、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適当な方法の使用を含む。標準的なトランスフェクションおよびコートランスフェクション技法、例えばＣａＰＯ４沈殿技法を使用する。使用する他の常法には、ウイルスゲノムの相同的組換え、寒天層中のウイルスプラークの形成、シグナル生成の測定法等を含む。
【００９５】
例えば所望するミニ遺伝子を含むウイルスベクターを構築し、そして集成した後、ベクターはヘルパーウイルスの存在下でインビトロでパッケージング細胞系にトランスフェクトされる。相同的組換えがヘルパーとベクター配列との間で起こり、これによりベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列の複製およびビリオンキャプシドへをパッケージングが可能となり、組換えウイルスベクター粒子が生成する。そのようなウイルス粒子を生産する現行法は、トランスフェクションに基づく。しかし本発明はそのような方法に限定されない。
【００９６】
生成した組換えサルアデノウイルスは選択した導入遺伝子を選択した細胞に転移させるために有用である。パッケージング細胞系で成長した組換えウイルスを用いたインビボの実験では、本発明のＥ１−削除組換えサルアデノウイルスベクターが、導入遺伝子を非−
サル、好ましくはヒトの細胞へ転移させるための用途を示す。
【００９７】
ＩＶ．組換えアデノウイルスベクターの使用
本発明の組換えサルアデノウイルスベクターは、ヒトまたは非−サルの獣医学上の患者に、インビトロ、エクスビボおよびインビボで遺伝子を転移するために有用である。
【００９８】
本明細書に記載する組換えアデノウイルスベクターは、インビトロでヘテロロガスな遺伝子によりコードされる産物を生産するための発現ベクターとして使用することができる。例えばＥ１削除の位置に挿入された遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、上記のようにＥ１−発現細胞系にトランスフェクトすることができる。あるいは複製−可能なアデノウイルスを別の選択した細胞系で使用してもよい。次いでトランスフェクトされた細胞は通例の様式で培養され、組換えアデノウイルスがプロモーターから遺伝子産物を発現することを可能にする。次いで遺伝子産物は、タンパク質の分離およびカルチャーからの回収の既知の常法により培養基から回収され得る。
【００９９】
本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９に由来する組換えサルアデノウイルスベクターは、たとえ生物が１以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体を有する場合でも、選択した導入遺伝子を選択した細胞にインビボまたはエクスビボで送達することができる効率的な遺伝子転移媒体を提供する。１つの態様では、ｒＡＡＶおよび細胞をエクスビボで混合し；感染した細胞を常法を使用して培養し；そして形質導入した細胞を患者に再注入する。このような組成物は治療目的および防御免疫を誘導することを含む免疫感作のための遺伝子送達に特によく適している。
【０１００】
より一般的には、本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９組換えアデノウイルスベクターは、以下に記載するように治療用または免疫原性分子を送達するために利用される。両方の応用について、本発明の組換えアデノウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターの反復送達が関与する処方での使用に特によく適していることは容易に理解されるだろう。そのような処方には典型的にはウイルスキャプシドが改変されている一連のウイルスベクターの送達を含む。ウイルスキャプシドはそれぞれの後の投与に、または特定の血清型のキャプシドを予め選択した回数（例えば１、２、３、４以上）投与した後に変えることができる。このように処方には第１のサルキャプシドを持つｒＡｄの送達、第２のサルキャプシドを持つｒＡｄの送達、そして第３のサルキャプシドでの送達を含むことができる。本発明のＡｄキャプシドを単独で、互いに組み合わせて、または他のＡｄ血清型と組み合わせて使用する様々な他の処方は、当業者には明白であろう。場合によりそのような処方には他の非−ヒト霊長類のアデノウイルス、ヒトアデノウイルスまたは本明細書に記載するような人工血清型のキャプシドを持つｒＡｄ投与を含んでもよい。処方の各フェイズでは、単一のＡｄ血清型キャプシドの一連の注射（または他の送達経路）、続いて別のＡｄ血清型キャプシドの一連の注射の投与を含んでもよい。あるいは本発明の組換えＡｄベクターは、他のウイルス系、非−ウイルス送達系、タンパク質、ペプチドおよび他の生物学的に活性な分子を含む他の非−アデノウイルス媒介型送達系が関与する処方に利用することができる。
【０１０１】
以下の章では本発明のアデノウイルスベクターを介して送達され得る例示分子に焦点をあてる。
【０１０２】
Ａ．治療用分子のＡｄ−媒介型送達
１つの態様では、上記組換えベクターは遺伝子治療に関して公開された方法に従いヒトに投与される。選択した導入遺伝子を持つサルのウイルスベクターは、好ましくは生物学的に適合性がある溶液または製薬学的に許容され得る送達賦形剤中に懸濁されて患者に投与することができる。適当な賦形剤には滅菌塩水を含む。製薬学的に許容され得る担体と
なることが知られており、そして当業者に周知な他の水性および非−水性の等張滅菌注射溶液、および水性および非−水性の滅菌懸濁液を、この目的に使用することができる。
【０１０３】
サルアデノウイルスベクターは標的細胞を形質導入し、そして医学分野の当業者により定められ得る副作用無しで、または医学的に許容される生理学的効果で治療的利益を提供するために、十分なレベルの遺伝子転移および発現を提供するために十分な量で投与される。通例の、そして製薬学的に許容され得る投与経路には、限定するわけではないが網膜への直接送達および他の眼内送達法、肝臓への直接的送達、吸入、鼻内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸、経口および他の非経口投与経路を含む。投与経路は所望により組み合わせるか、または導入遺伝子または状態に依存して調整することができる。投与経路は主に処置する状態の性質に依存する。
【０１０４】
ウイルスベクターの投薬用量は、処置する状態、患者の年齢、体重および健康のような因子に主に依存し、そして患者間で変動し得る。例えばウイルスベクターの治療に効果的な成人ヒトまたは獣医学上の投薬用量は、一般に約１×１０６〜約１×１０１５粒子、約１×１０１１〜１×１０１３粒子、または約１×１０９〜１×１０１２粒子のウイルス濃度を含む約１００μＬ〜約１００ｍＬの範囲内の担体である。投薬用量は動物のサイズおよび投与経路に依存した範囲になるだろう。例えば筋肉内注射に適するヒトまたは獣医学上の投薬用量（動物の体重約８０ｋｇあたり）は、１つの部位に１ｍＬあたり約１×１０９〜約５×１０１２粒子の範囲である。場合により多くの投与部位に送達してもよい。別の例では、適当なヒトまたは獣医学上の投薬用量は、経口製剤について約１×１０１１〜約１×１０１５粒子の範囲でよい。当業者はこれらの用量を投与経路、および組換えベクター用の治療またはワクチンの応用に依存して調整することができる。導入遺伝子の発現レベル、または免疫原について循環する抗体レベルは、投薬頻度を決定するために監視することができる。投与の時期および頻度を決定するためのさらに別の方法は当業者に直ちに明らかである。
【０１０５】
方法の任意の工程には、ウイルスベクターの投与と同時、前、または後のいずれかに適当量の短期作用免疫調節物質を患者に同時投与することを含む。選択した免疫調節物質は、本発明の組換えベクターに対して向けられた中和抗体の形成を阻害できるか、またはベクターの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）排除を阻害できる作用物質とここでは定義する。免疫調節物質はＴヘルパー物質（ＴＨ１またはＴＨ２）とＢ細胞との間の相互作用を妨害して抗体形成を阻害することができる。あるいは免疫調節物質はＴＨ１細胞とＣＴＬｓとの間の相互作用を阻害して、ベクターのＣＴＬ排除が発生することを減少させることができる。種々の有用な免疫調節物質およびそれを使用するための投薬用量が、例えばＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（９）（１９９６年９月）；１９９６年５月２日に公開された国際公開第９６／１２４０６号パンフレット；および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３０３５に開示され、これらはすべて引用により本明細書に編入する。
【０１０６】
１．治療用の導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療用産物には、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦ、アクチビン、インヒビンを含むトランスフォーミ
ング増殖因子スーパーファミリーの任意のもの、あるいは任意の骨誘導タンパク質（ＢＭＰ）のＢＭＰｓ１〜１５、増殖因子のヒレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ  分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの任意のもの、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、アグリン、セマフォリン／コラポスリンファミリーの任意のもの、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン類（ｅｐｈｒｉｎｓ）、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび増殖および分化因子を含む。
【０１０７】
他の有用な導入遺伝子産物には、限定するわけではないがトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を含む）、単球誘引タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子およびインターフェロン、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫系により生産される遺伝子産物も、本発明に有用である。これらには限定するわけではないが免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を含む。有用な遺伝子産物には補体調節タンパク質、膜コファクタータンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質を含む。
【０１０８】
さらに他の有用な遺伝子産物には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レセプター、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプターおよびスカベンジャーレセプターを含むコレステロール調節に関するレセプターを包含する。また本発明は、グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプター、ビタミンＤレセプターおよび他の核レセプターを含むステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーの員のような遺伝子産物も包含する。加えて有用な遺伝子産物には、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ−結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、および翼型ヘリックス（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ）タンパク質のフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）ファミリーのような転写因子を含む。
【０１０９】
他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ、デヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グリコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配
列を含む。
【０１１０】
他の有用な遺伝子産物には、挿入、削除またはアミノ酸置換を含む自然には存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドのような天然には存在しないポリペプチドを含む。例えば単鎖の工作された免疫グロブリンは特定の免疫抑制患者に有用となり得る。他の種類の天然には存在しない遺伝子配列には、標的の過剰発現を低下させるために使用することができるアンチセンス分子およびリボザイムのような触媒核酸を含む。
【０１１１】
遺伝子の発現の減少および／または調節は、癌および乾癬のような過増殖細胞の特徴である過増殖状態を処置するために特に望ましい。標的とするポリペプチドには、正常細胞に比べて過増殖細胞で排他的に、または高レベルで生産されるポリペプチドを含む。標的抗原には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎおよびトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦのような癌遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。標的抗原として癌遺伝子産物に加えて、抗−癌治療および防御的処方のための標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫により作られた抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの可変領域を含み、これらは態様によっては自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍−関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞中で高レベルで見いだされるポリペプチドのような標的ポリペプチドとして使用することができる。
【０１１２】
他の適切な治療用ポリペプチドおよびタンパク質には、自己免疫疾患、および細胞レセプターおよび自己に向かう抗体を生産する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対して広範な防御免疫応答を与えることによる疾患を患っている個体を処置するために有用なものを含む。Ｔ細胞性自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む。これらの各疾患は、内因性の抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関係する炎症カスケードを開始するＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）を特徴とする。
【０１１３】
本発明のサルアデノウイルスベクターは、導入遺伝子を多数のアデノウイルスが媒介して送達することが望まれる治療的処方、例えば同じ導入遺伝子の再送達が関与する処方または他の導入遺伝子の送達が関与する併用処方に特によく適している。そのような処方には、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９サルアデノウイルスベクターの投与、続いて同じ血清型のアデノウイルスに由来するベクターの再投与を含むことができる。特に望ましい処方には、本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９サルアデノウイルスベクターの投与を含み、ここで初回投与で送達されるウイルスベクターの血清型は、１以上の後の投与で使用するウイルスベクターの血清型とは異なる。例えば治療的処方には、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９ベクターの投与および同じかまたは異なる血清型の１以上のアデノウイルスベクターの反復投与を含む。別の例では、治療的処方にはアデノウイルスベクターの投与、続いて最初に送達したアデノウイルスベクターとは異なる血清型の本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９ベクターの反復投与、そして場合によりさらに同じか、または好ましくは前の投与工程でのベクターの血清型とは異なる別のベクターの投与を含む。これらの処方は本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９血清型を使用して構築したアデノウイルスベクターの送達には限定されない。むしろこれらの処方は限定するわけではないが他のサルアデノウイルス血清型（例えばＰａｎ９またはＣ６８、Ｃ１等）、他の非−ヒト霊長類のア
デノウイルス血清型、またはヒトのアデノウイルス血清型を含む他のアデノウイルス血清型のベクターを、本発明の１以上のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５またはＳＶ３９ベクターと組み合わせて容易に利用することができる。そのようなサルまたは他の非ヒト霊長類アデノウイルス血清型は、本明細書のいたるところで検討する。さらにこれらの治療的処方には、本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、ＳＶ１、ＳＶ２５および／またはＳＶ３９アデノウイルスベクターを、非−アデノウイルスベクター、非−ウイルスベクターおよび／または種々の他の治療的に有用な化合物または分子と組み合わせて、同時または順次のいずれかで送達することを含んでもよい。本発明はこれらの治療的処方には限定されず、その多様性は当業者には容易に明らかである。
【０１１４】
Ｂ．免疫原導入遺伝子のＡｄ−媒介型送達
組換えサルアデノウイルスは、免疫原組成物としても使用することができる。本明細書で使用する免疫原組成物は、哺乳動物、そして好ましくは霊長類への送達後に免疫原組成物により送達された導入遺伝子産物に対する体液性（例えば抗体）または細胞性（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）応答が高められる組成物である。本発明は所望の免疫原をコードする遺伝子をアデノウイルス配列の削除に含むことができる組換えサルＡｄを提供する。サルアデノウイルスはヒト起源のアデノウイルスに比べて、異なる動物種で生きている組換えウイルスワクチンとして使用するためにより適していると思われるが、そのような使用に限定されない。組換えアデノウイルスは、抗原（１つまたは複数）が免疫応答の誘導に重要な任意の病原体に対する予防用または治療用ワクチンとして使用することができ、そしてすでに同定され、そしてそのｃＤＮＡを利用することができる病原体の伝播を制限することができる。
【０１１５】
そのようなワクチン（または他の免疫原性）組成物は、上記のように適当な送達媒体中に配合される。一般に免疫原性組成物の用量は、治療用組成物について上記に定めた範囲である。選択した遺伝子の免疫のレベルは、もしあれば追加免疫についての必要性を決定するために監視することができる。血清中の抗体力価の評価後、任意に追加免疫感作することが望ましいかもしれない。
【０１１６】
場合により本発明のワクチン組成物は、例えばアジュバント、安定化剤、ｐＨ調整剤、保存剤等を含む他の成分を含むように配合することができる。そのような成分はワクチン分野の当業者には周知である。適当なアジュバントの例は、限定するわけではないがリポソーム、ミョウバン、モノホスホリル脂質Ａ、およびサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンドおよび任意のそれらの組み合わせのような生物学的に活性因子を含む。これらの生物学的に活性な因子のあるものは、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを介してインビボで発現され得る。例えばそのようなアジュバントは抗原をコードする初回感作ＤＮＡワクチンと共に投与して、抗原のみをコードするＤＮＡワクチンでの初回感作で生じる免疫応答に比べて、抗原−特異的免疫応答を強化することができる。
【０１１７】
組換えアデノウイルスは「免疫原的量」、すなわち所望の細胞をトランスフェクトし、そして免疫応答を誘導するために選択した遺伝子の十分な発現レベルを提供するための投与経路で効果的な組換えアデノウイルスの量で投与される。防御免疫が提供される場合、組換えアデノウイルスは感染および／または再発疾患の防止に有用なワクチン組成物になると考えられる。
【０１１８】
あるいは、またはさらに、本発明のベクターは選択した免疫原に対して免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子を含んでもよい。本発明の組換えアデノウイルスは、ベクターにより発現される挿入されたヘテロロガスな抗原性タンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞および抗体の誘導に高度に効率的であることが予想される。
【０１１９】
例えば免疫原は種々のウイルス科から選択することができる。免疫応答を望む所望のウイルス科の例は、一般的な風邪の原因の約５０％を占めるライノウイルス属を含むピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのようなヒト腸内ウイルスを含む腸内ウイルス属；および主に非−ヒト動物において足および口の疾患の原因であるアフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）属を含む。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを含む。別のウイルス科には、流行性胃腸炎の重要な病原体であるウイルスのノーウォーク群を包含するカルシウイルス科を含む。ヒトおよび非−ヒト動物に免疫応答を誘導するための標的抗原として使用するために望ましいさらに別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロス川ウイルスおよびベネゼエラ、東部および西部ウマ脳髄膜炎を含むアルファウイルス属、および風疹ウイルスを含むルビウイルスを含むトガウイルス科である。フラビウイルス科にはデング、黄熱、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスを含む。他の標的抗原は、感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数の非−ヒトウイルス、および普通の風邪および／または非−Ａ、ＢまたはＣ型肝炎の原因となり得るヒト呼吸コロナウイルスを含むＣ型肝炎またはコロナウイルス科から生成することができる。コロナウイルス科内で、標的抗原にはＥ１（Ｍまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたは赤血球凝集素−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）、糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオキャプシド）を含む。さらに別の抗原は、ベシキュロウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的な狂犬病ウイルス（例えば狂犬病）を含むラブドウイルス科を標的とすることができる。ラブドウイルス科内で適当な抗原は、Ｇタンパク質またはＮタンパク質に由来することができる。マールブルグおよびエボラウイルスのような出血性の発熱ウイルスを含むフィロウイルス科も抗原の適当な供給源となり得る。パラミクソウイルス科には、１型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ウシ３型パラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、２型パラインフルエンザウイルス、４型パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンバーを含むモルビリウイルス、および呼吸合胞体ウイルスを含むニューモウイルスを含む。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルスの科に分類され、そして抗原の適切な供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブンヤウイルス科には、ブンヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラ  クロス（Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ））、フレホウイルス属（リフト渓谷熱）、ハンタウイルス属（プレマーラ（ｐｕｒｅｍａｌ��）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）および種々の割り当てられていないブンガウイルス属（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）を含む。アレナウイルス科は、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属（これは小児の急性胃腸炎の原因である）、オルビウイルス属およびカルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）属（コロラドダニ熱、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）を含む。
【０１２０】
レトロウイルス科には、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（これはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプーマウイルスを含む）のようなヒトおよび獣医学上の疾患を包含するオンコリウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）の亜科を含む。レンチウイルスの中から多くの適当な抗原が記載され、そして容易に選択することができる。適当なＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例には限定するわけではないがｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎ
ｖ、Ｔａｔ、ＮｅｆおよびＲｅｖタンパク質、ならびにそれらの種々のフラグメントを含む。例えばＥｎｖタンパク質の適当なフラグメントにはｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１のようなそのサブユニット、またはそれらのより小さいフラグメント、例えば少なくとも約８個のアミノ酸長のフラグメントを含むことができる。同様にｔａｔタンパク質のフラグメントを選択することができる。［米国特許第５，８９１，９９４号および同第６，１９３，９８１号明細書を参照にされたい。］またＤ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２−２４６７（Ｍａｒｃｈ  ２００１）、およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（６  Ａｐｒｉｌ  ２００１）に記載されたＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質も参照にされたい。別の例では、ＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドを使用して、融合ペプチドまたは他の免疫原性分子を形成することができる。例えば２００１年、８月２日に公開された国際公開第０１／５４７１９号および１９９９年４月８日に抗体された同第９９／１６８８４号パンフレットに記載されたＨＩＶ−１  Ｔａｔおよび／またはＮｅｆ融合タンパク質および免疫感作処方を参照にされたい。本発明は本明細書に記載するＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原性タンパク質またはペプチドに限定されない。さらにこれらのタンパク質に対する様々な修飾が記載され、そして当業者は容易に作成することができる。例えば米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記載されている修飾ｇａｇタンパク質を参照にされたい。さらに任意の所望するＨＩＶおよび／またはＳＩＶ免疫原を単独で、または組み合わせて送達することができる。そのような組み合わせは単一ベクターから、または多数のベクターからの発現を含むことができる。場合により別の組み合わせには１以上の発現した免疫原の送達とタンパク質状の１以上の免疫原の送達が関与する。そのような組み合わせを以下により詳細に検討する。
【０１２１】
パポバウイルス科にはポリオーマウイルス（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）の亜科およびパピローマウイルス（癌または乳頭腫の悪性の進行に関連する）の亜科を含む。アデノウイルス科には呼吸疾患および／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科のネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス（ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａｖｉｒｕｓ）、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科には、シンプレックスウイルス（ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセーロウイルス属（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス属（ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））を含むベータヘルペスウイルス亜科、およびリンホクリプトウイルス属（ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、伝染性鼻気管支炎、マルク病ウイルスおよびラジノウイルス属（ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含むガンマヘルペスウイルス亜科を含む。ポックスウイルス科にはオルソポックスウイルス（バリオーラ（Ｖａｒｉｏｌａ）（痘瘡）およびワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含するポックスウイルス亜科、およびエントモポックスウイルスの亜科を含む。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスを含む。適当な抗原源となり得る１つの分類されていないウイルスは、デルタ肝炎ウイルスである。さらに別のウイル源には、鳥類感染性嚢疾患ウイルスおよびブタ呼吸および生殖症候群ウイルスを含む。アルファウルイス科にはウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。
【０１２２】
本発明はヒトまたは非−ヒト動物を、ヒトおよび非−ヒト動物に感染するか細菌、菌類、寄生微生物もしくは多細胞寄生生物を含む他の病原体に対して免疫感作するために有用な免疫原、あるいは癌細胞または腫瘍細胞に由来する免疫原も包含する。細菌病原体の例には、病原性グラム−陽性球菌を含み、それらには肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）；ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）；および連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉ）を含む。病原性グラム−陰性球菌には髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）；淋菌（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む。病原性腸内グラム−陰性桿菌には、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびイケネーラ属（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ属（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲーラ属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィラス属（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセーラ属（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；Ｈ．デュクレイ（ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ属（ｂｒｕｃｅｌｌａ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルシニア属（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ属）；ストレプトバシラス  モニリホルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリウム属（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）を含む；グラム陽性桿菌にはリステアリモノシトゲネシス（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径肉芽腫）；およびバルトネラ症を含む。病原性の嫌気性細菌により引き起こされる疾患には、破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム属（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；結核；ハンセン病；および他のマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含む。病原性スピロヘーター疾患には梅毒；トリポネーマ症；フランベジア、ピンタおよび性行為外の梅毒；およびレプトスピラ症を含む。より高等な病原性細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染には、放線菌症；ノルカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイドミコーシス症、ペトリリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコシース；および皮膚糸状菌症を含む。リケッチア感染にはチフス熱、ロッキー山熱病、Ｑ熱およびリケッチア痘を含む。マイコプラズマおよびクラミジア感染の例には：マイコプラズマ肺炎；リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染を含む。病原性真核生物には、病原性原生成物および蠕虫を含み、そしてそれらにより引き起こされる感染には；アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラズマ  ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住虫吸虫症；線虫症；吸虫綱に属する吸虫類または吸虫類；および多節条虫亜綱（条虫）感染を含む。
【０１２３】
多くのこれら生物および／またはそれらにより生産されたトキシンが疾病管理センター［（ＣＤＣ）、米国の保健福祉省］により、生物学的攻撃に使用するための可能性を有する病原体として同定された。例えばこれら生物剤の幾つかには、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（悪疫）、大痘瘡（痘瘡）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、およびウイルス性出血熱［フィロウイルス属（例えばエボラ、マールブルグ］、およびアレナウイルス属［例えばラッサ、マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ］）これらすべては現在、カテゴリーＡ剤に属する；Ｑ熱リケッチア菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシン  トキシン）、ガス壊疽（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（イプシロントキシン）、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびそのトキシン（エンテロトキシンＢ）、クラミジア  シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、オウム病、水の安全
性に関する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム  パルバム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、チフス熱（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｉｉ）およびウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネゼエラ  ウマ  脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；このすべてが現在、カテゴリーＢ剤に属する；および現在、カテゴリーＣ剤に分類されるニパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスおよびハンタウイルスを含む。さらにそのように分類されるか、または異なって分類される他の生物を、将来、そのような目的に同定し、かつ／または使用することができる。ウイルスベクターおよび本明細書に記載する他の構築物は、感染または他の副作用を防止し、かつ／または処置するこれらの生物、ウイルス、それらのトキシンまたは副産物に由来する抗原を、これらの生物剤で送達するために有用であると理解されるであろう。
【０１２４】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、ＣＴＬを含む免疫応答を誘導してこれらＴ細胞を排除する。ＲＡでは、疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲにはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。ＭＳでは、疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲにはＶ−７およびＶα−１０を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。硬皮症では、この疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲにはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする組換えサルアデノウイルスの送達は、硬皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。
【０１２５】
Ｃ．Ａｄ−媒介型送達法
治療レベルまたは免疫のレベルでは選択した遺伝子を監視して、もしあるならば追加免疫の必要性を決定する。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答あるいは場合により血清中の抗体力価の評価後に、任意の追加免疫感作が望ましいかもしれない。場合により本発明の組換えサルアデノウイルスベクターを単回投与または様々な処方を組み合わせて、例えば他の有効成分が関与する処置計画または過程と組み合わせて、または初回−追加処方（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ）で送達することができる。そのような様々な処方が当該技術分野で記載され、そして容易に選択することができる。
【０１２６】
例えば初回−追加処方は、タンパク質またはそのような抗原をコードする配列を持つ組換えウイルスのような従来の抗原で第２、追加、投与に対して、免疫系を初回免疫感作するためのＤＮＡ（例えばプラスミド）に基づくベクターの投与を含むことができる。例えば引用により本明細書に編入する２０００年３月２日に公開された国際公開第００／１１１４０号明細書を参照にされたい。あるいは免疫感作処方には、抗原を持つベクター（ウイルスまたはＤＮＡに基づくいずれか）またはタンパク質に対する免疫応答を増強（ｂｏｏｓｔ）するために、本発明の組換えサルアデノウイルスベクターの投与を含むことができる。さらに別の選択では、免疫感作処方にはタンパク質の投与に続いて抗原をコードするベクターでの追加免疫を含む。
【０１２７】
１つの態様では、本発明は上記抗原を持つプラスミドＤＮＡベクターを送達し、続いて本発明の組換えサルアデノウイルスベクターでの追加免疫により、選択した抗原に対する免疫応答を初回そして追加免疫感作する方法を提供する。１つの態様では、初回−追加処方には、初回および／または追加免疫媒体からの複数のタンパク質の発現を含む。例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶに対する免疫応答を生じるために有用なタンパク質サブユニットを
発現させるために多タンパク質処方を記載するＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（２００１年４月６日）を参照にされたい。例えばＤＮＡの初回免疫感作は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸおよびＶｐｒおよびＥｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖを１回の転写から送達することができる。あるいはＳＩＶ  Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＨＩＶ−１  Ｅｎｖは本発明の組換えアデノウイルス構築物で送達される。さらに別の処方が、国際公開第９９／１６８８４号および同第０１／５４７１９号パンフレットに記載されている。
【０１２８】
しかし初回−追加処方はＨＩＶの免疫感作またはこれら抗原の送達に限定されない。例えば、初回免疫感作には本発明の第１のチンパンジーベクターを送達し、続いて第２のチンパンジーベクターで、あるいは抗原自体をタンパク質形態で含む組成物で追加免疫感作することを含む。１つの態様では、初回−追加処方は抗原が誘導されるウイルス、細菌または他の生物に対する防御免疫応答を提供することができる。別の望ましい態様では、初回−追加処方は治療薬が投与される状態の存在を検出するための通例のアッセイを使用して測定することができる治療効果を提供する。
【０１２９】
初回免疫感作組成物は、身体の様々な部位に用量依存的様式で投与することができ、これは所望の免疫応答を標的とする抗原に依存する。本発明は注射（１回または複数回）の量および部位または製薬学的担体には限定されない。むしろ処方には初回および／または追加免疫感作工程を含むことができ、その各々が単回用量、または毎時間、毎日、毎週もしくは毎月もしくは毎年投与される投薬用量を含むことができる。例として哺乳動物は約１０μｇから約５０μｇの間のプラスミドを担体中に含む１または２回の用量を受けることができる。望ましいＤＮＡ組成物の量は、約１μｇから約１０，０００μｇの間のＤＮＡベクターの範囲である。投薬用量は患者の体重１ｋｇあたり約１μｇから約１０００μｇのＤＮＡで変動し得る。送達の量または部位は、望ましくは哺乳動物の同一性および状態に基づき選択される。
【０１３０】
哺乳動物への抗原の送達に適するベクターの投薬用量単位を本明細書に記載する。投与用のベクターは、そのような投与における当業者に明らかな等張性塩；等張性塩溶液または他の製剤のような製薬学的または生理学的に許容され得る担体に懸濁または溶解することにより調製される。適切な担体は当業者には明らかであり、そして大部分が投与経路に依存する。本発明の組成物は、生分解性の生物適合性ポリマーを使用した徐放性製剤で、あるいはミセル、ゲルおよびリポソームを使用した部位上（ｏｎ−ｓｉｔｅ）の送達により、上記の経路に従い哺乳動物に投与することができる。場合により本発明の初回免疫感作工程は、初回免疫感作組成物と適当量の本明細書に定めるようなアジュバントを投与することを含んでなる。
【０１３１】
好ましくは追加免疫感作組成物は、哺乳動物個体に初回免疫感作組成物を投与してから約２〜約２７週間後に投与する。追加免疫感作組成物の投与は、初回感作ＤＮＡワクチンにより投与されるものと同じ抗原を含むか、または送達できる有効量の追加免疫感作組成物を使用して行う。追加免疫感作組成物は、同じウイルス源（例えば本発明のアデノウイルス配列）または別の起源に由来する組換えウイルスベクターから成ることができる。あるいは「追加免疫感作組成物」は、初回感作するＤＮＡワクチンにコードされる抗原と同じ抗原を含む組成物であることができるが、タンパク質またはペプチドの状態であり、この組成物はその宿主に免疫応答を誘導する。別の態様では追加免疫感作組成物は、哺乳動物細胞中でのＤＮＡ配列の発現を支配する調節配列の制御下に、抗原をコードするＤＮＡ配列、例えば周知な細菌またはウイルスベクターのようなベクターを含む。追加免疫感作組成物の主な要件は、組成物の抗原が初回免疫感作組成物にコードされる抗原と同じ抗原であるか、または交差反応性の抗原であることである。
【０１３２】
別の態様では本発明のサルアデノウイルスベクターは、様々な他の免疫感作および治療的処方に使用するにも十分に適している。そのような処方には本発明のサルアデノウイルスベクターの送達と同時に、または順次に異なる血清型キャプシドのＡｄベクターの送達を含むことができ、この処方では本発明のアデノウイルスベクターが非−Ａｄベクターと同時に、または順次に送達され、この投薬法は本発明のアデノウイルスベクターがタンパク質、ペプチドおよび／または他の生物学的に有用な治療薬または免疫原性化合物と同時に、または順次に送達される。そのような使用は当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】チンパンジーアデノウイルスＣ１［配列番号１３］、チンパンジーアデノウイルスＣ６８（Ｐａｎ−９）［配列番号１４］および本発明の新規Ｐａｎ５［配列番号１５］、Ｐａｎ６［配列番号１６］およびＰａｎ７［配列番号１７］チンパンジーアデノウイルス配列のキャプシドタンパク質ヘキソンのＬ１およびＬ２ループ部分のアミノ酸配列のアライメントを提供する。介在する保存領域はアデノウイルス血清型間で保存されたペデスタルドメインの部分である。
【図２】チンパンジーＣ６８（Ｐａｎ−９）［配列番号１８］、Ｐａｎ−６［配列番号１９］、Ｐａｎ−７［配列番号２０］およびＰａｎ−５［配列番号２１］およびヒトアデノウイルス血清型２［配列番号２２］および５［配列番号２３］の繊維小塊ドメインのアミノ酸配列のアライメントを提供する。
【０１３４】
以下の実施例はサルアデノウイルスのクローニングおよび本発明の例示的な組換えアデノウイルスベクターの構築を具体的に説明する。これらの実施例は具体的説明だけであり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１３５】
ウイルス増殖
元はチンパンジーのリンパ節から単離したＰａｎ５［ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−５９１］、Ｐａｎ６［ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−５９２］およびＰａｎ７［ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−５９３］ウイルスを、２９３細胞［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３］中で増殖させた。典型的には、これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）［シグマ（Ｓｉｇｍａ）またはハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ローガン、ユタ州］および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（シグマ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；シグマ、セントルイス、ミズーリ州）で培養した。２９３細胞の感染は、２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で最初に２４時間行い、その後ＦＣＳを加えて１０％の最終濃度とした。感染した細胞は、１００％の細胞がウイルス−誘導の細胞変性効果（ＣＰＥ）を表す時に収穫し、そして次いで回収し、そして遠心により濃縮する。細胞ペレットを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、そして３サイクルの凍結および解凍により分解する。ウイルス調製物は、塩化セシウム密度勾配で２回の超遠心工程後に得、そしてウイルスのストックを１〜５×１０１２粒子／ｍｌに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５０％グリセロール中で希釈し、そして−７０℃で保存する。
【０１３６】
２９３細胞がこれらのアデノウイルスを増殖させる能力は、他の非−ヒトアデノウイルス血清型の知識に基づく予想を超えた。
【０１３７】
ウイルス 収量（８×１０８個の細胞で生産されたウイルス粒子）
Ｐａｎ５                  ８．８×１０１３
Ｐａｎ６                  １．６×１０１４
Ｐａｎ７                  ８．８×１０１３
【実施例２】
【０１３８】
ウイルスゲノムＤＮＡの特性決定
ゲノムＤＮＡは実施例１の精製したウイルス調製物から分離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩ制限酵素で製造元の推薦に従い消化した。結果（示さず）は、本発明のＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７ゲノムおよび公開されているＰａｎ９（Ｃ６８）ゲノムが異なる制限パターンを示し、すなわち互いに異なることを示した。
【０１３９】
Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７のヌクレオチド配列を決定した。Ｐａｎ５  ＤＮＡの上鎖のヌクレオチド配列を配列番号１に報告する。Ｐａｎ６  ＤＮＡの上鎖のヌクレオチド配列を配列番号５に報告する。Ｐａｎ７  ＤＮＡの上鎖のヌクレオチド配列を配列番号９に報告する。
【０１４０】
ウイルスＤＮＡ配列の調節およびコード領域は、通常の設定で上記の「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ」プログラムを使用した既知のアデノウイルス配列に対する相同性により同定した。アデノウイルス配列を提供する上記の表を参照にされたい。オープンリーディングフレイムが翻訳され、そして予想されるアミノ酸配列についてすでに記載されたアデノウイルスのタンパク質配列、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ７、Ａｄ１２およびＡｄ４０に対する相同性について調査した。
【０１４１】
配列の分析は、ヒトアデノウイルスに存在するものと類似するゲノム構成を明らかとし、ヒトＡｄ４と最大の類似性があった。しかしヘキソン超可変領域中の実質的な差異が、チンパンジーアデノウイルスとＡｄＨｕ４を含む他の既知のアデノウイルスとの間で記録された。これらの差異はすでに得られている血清学的な交差反応性データによく合う（以下を参照にされたい）。
【０１４２】
ヘキソン配列の部分のアライメントを図１に示す。示した部分は外側に配置されて伸びているループＤＥ１およびＦＧ１に相当するヘキソンの領域に由来し、ここに血清間の最大の可変性が観察される。ヘキソンの塩基に貢献し、血清間型で高度に保存されている介在部分も存在する（公開されたＡｄＣ６８配列の残基３０８〜３６８に対応する；米国特許第６，０８３，７１６号明細書）。以下の表はヘキソンタンパク質中のアミノ酸の対での比較をまとめる。
【０１４３】
【表１２】
2011055835.tif 000013
【０１４４】
チンパンジーアデノウイルスの繊維小塊ドメイン（レセプター結合の原因である）分析は、構造に全体的な類似性を示す（図２）。
【０１４５】
ｈｕＡｄ５とＣ６８との間のＥ１タンパク質の配列類似性の程度（以下の表を参照にされたい）は、ｈｕＡｄ５とＰａｎ−５、Ｐａｎ−６とＰａｎ−７間と同様である。
【０１４６】
【表１３】
2011055835.tif 000014
【０１４７】
【表１４】
2011055835.tif 000015
【０１４８】
ＡｄＣ５、ＡｄＣ６およびＡｄＣ７の複製−欠損変更体は、ミニ遺伝子カセットがＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子の位置に挿入されている以下の実施例に記載されている分子クローニング法により作成した。組換えウイルスの分子クローンをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅｄ）し、そして公開されているＣｓＣｌ沈降法［Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０（１９９６）］を使用する大規模精製用の２９３細胞で成長させた。ベクターの収量は、約１×１０９個の２９３細胞が対応するウイルスに感染している５０プレート（１５０ｍｍ）調製（ｐｒｅｐ）に基づいた。収量は分光光度計でウイルス
粒子濃度を測定することにより決定した。Ｅ１−欠損ウイルスを構築した後、ＨＥＫ２９３細胞（ヒトアデノウイルス血清型５Ｅ１機能を発現する）が新規ウイルスベクターのＥ１欠損をトランス−相補し、そして高力価ストックの生産を可能にすることを決定した。これら２、３の組換えウイルスのウイルス収量の例を以下の表に示す。
【０１４９】
これらのベクターについて導入遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルファ−１−アンチ−トリプシン（Ａ１ＡＴ）、エボラ糖タンパク質（ｅｂｏ）、膜貫通および細胞質ドメインを欠く可溶性エボラ糖タンパク質変異体（ｓＥｂｏ）、およびエボラ糖タンパク質の３種の欠損突然変異体（ＥｂｏΔ２、ＥｂｏΔ３およびＥｂｏΔ４）が、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）により発現された。以下の表では、ＮＤは実験を行わなかったことを示す。
【０１５０】
【表１５】
2011055835.tif 000016
【０１５１】
ヒトアデノウイルスＥ１が本発明のＥ１−欠損チンパンジーウイルスをトランス−相補する能力は、これが本発明のＥ１−欠損チンパンジーアデノウイルスベクターの生産を可能とすると同時に、ヒトＡｄと本明細書に記載するチンパンジーアデノウイルスとの間の配列の差異による相同的組換えの危険性を排除するので大変有利である。
【実施例３】
【０１５２】
Ｐａｎ５、６、７ウイルスの血清学的実験
ヘキソン超可変領域中の差異から、Ｃ５、Ｃ６およびＣ７ウイルスはＡｄＨｕ４を含むヒトアデノウイルスとは血清学的に異なることが予想された。
【０１５３】
１．野生型ウイルスの交差反応性
抗体の交差反応性を決定するための野生型ウイルスのスクリーニングに関して、複製可能なウイルスを使用し、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害を測定した。簡単に説明すると、５×１０１２粒子／ｍｌで保存したアデノウイルス（Ａｄｈｕ５、Ｐａｎ−５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＡｄＣ６８）の調製物を、アッセイのために１／６００に希釈した。このウイルス濃度は、中和なしで４８時間以内に１００％のＣＰＥが生じることから選択した。ウイルスを２９３細胞（９６ウェル皿中に４×１０４細胞／ウェル）を加える前に、１：２０希釈血清を加えた。アッセイはＣＰＥの存在または不存在として読む
；完全な中和は細胞変性効果が無いと読む。結果を以下の表にまとめる。９／３６のヒト血清がＡｄｈｕ５誘導ＣＰＥを中和したことは、ヒトの個体群における以前の中和抗体の予測と一致する。数は中和（分子）を示した全個体  対  調査した総数（分母）を示す。ＮＤ＝測定成せず。
【０１５４】
【表１６】
2011055835.tif 000017
【０１５５】
調査したすべてのヒト血清の中で、３５／３６がＡｄＣ６８に対する中和について陰性であったが、Ｐａｎ−５、Ｐａｎ−６およびＰａｎ−７に対する中和については３６／３６が陰性であった。調査した５２匹のアカゲザルのうち、いずれもチンパンジーアデノウイルスに対して中和を示さなかった；アカゲザルはＨＩＶワクチンを評価するための好適な臨床前モデルである。２０匹のチンパンジーうちの９から１２匹が幾つかの別のチンパンジーアデノウイルスに対して実質的な中和を有し、実際に特有のチンパンジー−特異的病原体であるという事実と一致した。興味深いことには、Ｐａｎ−５、Ｐａｎ−６またはＡｄＣ６８にのみ中和抗体をもつチンパンジーがおり、これらチンパンジーアデノウイルスベクターの幾つかは互いに交差中和せず、そして異なる血清型であるという仮説を支持する。
【０１５６】
同じアッセイを２０匹のチンパンジー血清サンプルについて行った。サンプルの５０％が異なる程度で（Ｐａｎ５に対して４０％：Ｐａｎ６に対して４０％；Ｐａｎ７に対して５５％：そしてＣ６８に対して６０％）血清学的に反応した。陽性血清サンプルの中で、それら中の１つがすべての４種のチンパンジーウイルスに対して強い中和活性を有した。
【０１５７】
２．組換えウイルスとの交差−中和
異なる血清型間の交差−中和の程度をより正確に測定するために、各サルアデノウイルスに対する高力価ポリクローナル抗体を得た。これはアジュバントとして前に記載されたＣ６８チンパンジーアデノウイルスに基づく、ＧＦＰを含有する組換えウイルスを使用してウサギの筋肉内免疫感作により行った。次いで血清は本発明の３種のチンパンジーアデノウイルス、ＡｄＣ５、ＡｄＣ６およびＡｄＣ７のそれぞれに対して中和活性をアッセイするために使用した。ウサギ１ｋｇあたりにＣ６８ＣＭＶＧＦＰベクターの５×１０１２のウイルス粒子を筋肉内注射し、そして同じ用量を使用して５週間後に追加免疫感作した。９週目に集めた血液は、Ｃ６８ならびにＰａｎ−５およびＰａｎ−７に対して極めて有力な中和活性を示したが、Ｐａｎ−６には示さず（以下の表を参照にされたい）、Ｃ６８（またはＰａｎ−５およびＰａｎ−７）に基づくワクチンの投与にＰａｎ−６に基づくベクターを使用した追加免疫が効果的に続く可能性を示す。しかしこの相関性のレベルは、抗ウイルス抗体力価がこのウサギで達成されるほどは高くない状況では、再投与を必ずしも妨げないことが分かった。以下の表では＋は３３％ＣＰＥ；＋＋は６６％ＣＰＥ；＋＋＋は１００％ＣＰＥを示す。
【０１５８】
【表１７】
2011055835.tif 000018
【０１５９】
３．中和抗体の検出に関する定量的アッセイ
この結果は、ＧＦＰベクターの形質導入に基づく中和抗体を検出するためのより定量的に基づくアッセイにより確認した。簡単に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群を５．０×１０１０粒子／ｍｌのＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７またはＣ６８で筋肉内または静脈内で免疫感作した。２８日目の採血からの血清を、１／２０および１／８０の希釈でＣ６８ＣＭＶＥＧＦＰに対して交差−中和活性について試験した。まとめると、ヒト免疫グロブリンの製薬学的調製物をＰａｎ５、６および７およびＣ６８に対する血清学的反応に関して試験し、Ｐａｎ７およびＣ６８に対して幾らか低レベルの中和活性が検出された。Ｐａｎ５またはＰａｎ６に対する中和活性は検出されなかった。３６名のヒト個体からの血清サンプルを、同じアッセイで検査した。血清サンプルは１／２０希釈で試験した。結果では、わずか１名の個体がＣ６８に対して明瞭な中和活性を有することが示された。Ｐａｎ５、Ｐａｎ６またはＰａｎ７に対する中和活性は検出されなかった。
【０１６０】
４．インビトロ交差−中和
各アデノウイルスＰａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７、およびＣ６８に対して生じた高力価ウサギポリクローナル抗体によるサルアデノウイルスの交差−中和を試験した。
【０１６１】
ウサギを１０１３粒子の各チンパンジーアデノウイルスの筋肉内注射で免疫感作し、そして不完全フロインドアジュバントを用いて同用量で４０日後に追加免疫感作した。血清を分析し、または中和抗体の存在は２倍の連続希釈物を、ＧＦＰを発現する適切な各チンパンジーアデノウイルスベクターの１０９ゲノムコピーとインキューベーションし、そして２９３細胞に適用した時にＧＦＰの発現の弱化について試験した。ＧＦＰ発現に５０％低下を生じた血清の希釈は、その特定のウイルスに対する中和抗体力価として採点した。
【０１６２】
結果を表に示す。データはＡｄ  Ｐａｎ６が他のチンパンジーアデノウイルスに比べて最も血清学的に異なるらしいことを示したヘキソンのアミノ酸配列の配列分析からの予想と合致する。
【０１６３】
【表１８】
2011055835.tif 000019
【０１６４】
サルアデノウイルスと交差−反応する抗体が、ヒトでは普及率が低くなるかどうかを決定するために、サルアデノウイルスＳＶ１、ＳＶ３９およびＳＶ２５を、市販されているプールヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）とインキューベーションした時、それらが中和に耐えられる能力について試験した。同じアッセイをＡｄｈｕ５およびチンパンジーアデノウイルスＰａｎ−５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＣ６８を用いても行った。さらなる実験では、マウスからの血清をチンパンジーアデノウイルスＣ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ６８の１つで免疫感作し、そしてそれらがサルアデノウイルスＳＶ−１５、ＳＶ−２３、ＳＡ−１７、およびヒヒアデノウイルスを交差−中和する能力について試験した。
【実施例４】
【０１６５】
組換えＥ１−欠損Ｐａｎ５ベクターの生成
修飾ｐＸプラスミドは、部位指向的突然変異誘発法によりｐＸ（クローンテック）のｂｌａ遺伝子領域のＦｓｐＩ部位を破壊することにより調製した。生成した修飾プラスミド（ｐＸ’と命名）は、ｆ１  ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ−ｃｄｓ）を含む３０００ｂｐの環状プラスミドである。
【０１６６】
Ａ．Ｐａｎ−５アデノウイルスプラスミドの生産
Ｐａｎ５ＤＮＡフラグメントのｐＸ’への順次クローニング用のポリリンカーを作成する。ポリリンカーはＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩでの消化後に存在するｐＸ’ポリリンカーに置き換える。Ｐａｎ５の平滑−ＦｓｅＩフラグメントを、ポリリンカーのＳｍａＩおよ
びＦｓｅＩ部位へ挿入する。フラグメントはアデノウイルスゲノム（ｂｐ１〜３６０６、配列番号１）の５’末端を含む。Ｐａｎ５のＳｎａＢＩ−ＦｓｐＩフラグメント（ｂｐ４５５〜３４８４、配列番号１）は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ（クローンテック）からＩ−ＣｅｕおよびＰＩ−Ｓｃｅ部位により挟まれた短い配列に置き換えて、アデノウイルスゲノムのＥ１領域を排除する。Ｐａｎ５のＥｃｏＲＩ−平滑フラグメント（ｂｐ２８６５８〜３６４６２、配列番号１）は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入し（アデノウイルスゲノムの３’末端を提供するために）；ＦｓｅＩ−ＭｌｕＩフラグメント（ｂｐ３６０６〜１５１３５、配列番号１）をポリリンカーに挿入し；そしてＭｌｕＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをポリリンカーに挿入する（ｂｐ〜１５１３５〜２８６５８、配列番号１）。場合により所望する導入遺伝子を新たに作成したｐＸ’Ｐａｎ５ΔＥ１ベクターのＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入する。
【０１６７】
Ｂ．ｐＸ’Ｐａｎ５ΔＥ１を作成する別の方法
最初のプラスミドｐＸは、上記のようにクローンテックから入手可能なｐＡｄＸアデノウイルスプラスミドに由来する。その後、ｐＸ’のＰａｃＩ−ＸｈｏＩ領域を削除し、そして平滑末端化したＰａｎ５ポリリンカーをＦｓｐＩ部位に挿入してｐＸ’ＰＬＮＫ（２９９４ｂｐ）を作成した。Ｐａｎ５の５’末端−ＦｓｅＩ領域（ｂｐ１〜３６０７、配列番号１）を、ｐＸ’ＬＮＫのＳｍａＩおよびＦｓｅＩ部位に挿入して、ｐＸ’Ｐａｎ５−５’プラスミド（６５９１ｂｐ）を生成した。ｐＸ’Ｐａｎ５−５’のＳｎａＢｉ−Ｎｄｅ１領域を切り出し、そしてｐＲＣＳからＰＣＲ増幅したＣｅｕ／Ｓｃｅカセットと置き換えて、ｐＸ’Ｐａｎ５−５’ΔＥ１（４３７４ｂｐ）を作成した。簡単に説明すると、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩレアカッター部位を含む配列をｐＲＣＳからＰＣＲ増幅した（３１１３ｂｐ）。３’ＰＣＲプライマーはＮｄｅＩ部位をＰＣＲ産物に導入した。
【０１６８】
ｐＸ’Ｐａｎ５−５’ΔＥ１（４３７４ｂｐ）中のＰａｎ５ＤＮＡを延長するために、Ｐａｎ５のＦｓｅＩ−ＭｌｕＩ領域（ｂｐ３６０７〜１５１３５、配列番号１）を加えて、ｐＸ’Ｐａｎ５−５’Ｍｌｕ（１５９００ｂｐ）を作成する。Ｐａｎ５配列の残るＭｌｕＩ−３’末端（ｂｐ１５１３５〜３６４６２、配列番号１）を、ベクターのポリリンカーのＭｌｕＩとＥｃｏＲＶ部位との間に加えて、Ｅ１領域に削除を含有する完全長のＰａｎ５−配列を含むｐＸ’Ｐａｎ５ΔＥ１を形成する。
【０１６９】
Ｃ．組換えウイルスの生成
ｐＸ’Ｐａｎ５ΔＥ１から組換えアデノウイルスを生成するために、プラスミドはＥ１を発現するヘルパー、あるいは２９３細胞系または本明細書に記載するように調製した細胞系のようなＥ１−発現パッケージング細胞系に由来する細胞とコトランスフェクションする。パッケージング細胞中でのＥ１の発現は、Ｐａｎ５ΔＥ１の複製およびビリオンキャプシドへのパッケージングを可能とする。別の態様では、ｐＸ’Ｐａｎ５ΔＥ１でトランスフェクトしたパッケージング細胞を、目的の導入遺伝子をもつ上記のアデノウイルスベクターでトランスフェクトする。ヘルパーとプラスミドとの間で相同的組換えが起こり、これによりベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製され、そしてビリオンキャプシドにパッケージングされるようになり、組換えアデノウイルスを生じる。
【０１７０】
トランスフェクションに続いて２週間の寒天重層、その後にウイルスはプラークを形成し、増殖し、そして導入遺伝子の発現について調査される。幾つかのさらなるプラーク精製に続いてさらに別の培養の拡大を行う。最終的に細胞を回収し、ウイルス抽出物を調製し、そして所望の導入遺伝子を含む組換えチンパンジーアデノウイルスを、ＣｓＣｌ勾配での浮遊密度超遠心により、または当業者に知られている別の手段により精製する。
【実施例５】
【０１７１】
組換えＥ１−欠損Ｐａｎ６ベクターの作成
Ａ．Ｐａｎ６−アデノウイルスプラスミドの構築法
１．末端フラグメントのクローニング
Ｐａｎ６ウイルスはプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）およびプロテアナーゼ（ｐｒｏｔｅａｎａｓｅ）Ｋ処理、そしてフェノール抽出により脱タンパク質する。合成の１２ｂｐ  ＰｍｅＩリンカーを、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：６００３（１９８３）に記載されているようにウイルスＤＮＡに連結する。次いでウイルスＤＮＡはＸｂａＩで消化して、５’末端フラグメント（６０４３ｂｐ）を単離する。次いでＡｄ６  ＸｂａＩ５’フラグメントをｐＸリンクにＳｍａＩおよびＸｂａＩ部位で連結して、ｐＸ−ＡｄＰａｎ６−０−１６．５を形成する。ＰｍｅＩリンカーを含むウイルスＤＮＡもＰａｃＩで消化して６４７５ｂｐの３’末端フラグメントを単離し、そしてｐＸリンクへＰａｃＩおよびＳｍａＩ部位でクローン化してｐＸＡｄＰａｎ６−８２−１００を作成する。
【０１７２】
２．５’クローンからＥ１の削除
Ｅ１（ｍ．ｕ．１．２−９）を削除するために、ｐＸ−ＡｄＰａｎ６−０−１６．５中のＢｓｉＷｉ−ＸｂａＩフラグメントを、ＢｓｉＷｉおよびＸｂａＩで処理したｍ．ｕ．９−１６．７フラグメントに広がるＰＣＲフラグメントに置き換え、ｐＸ−Ａｄ−Ｐａｎ６ｍ．ｕ．０−１，９−１６．５を導く。
【０１７３】
３．５’および３’クローンの融合および中央ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを受けるためのアンカー部位の作成
第１に、５’クローン、ｐＸ−Ａｄ−Ｐａｎ６ｍ．ｕ．０−１，９−１６．５は、Ｐａｎ６ゲノムからの第２のＸｂａＩフラグメント（４３５０ｂｐ、ｍ．ｕ．１６．５−２８）をｐＸ−Ａｄ−Ｐａｎ６ｍ．ｕ．０−１，９−１６．５のＸｂａＩ部位に挿入することによりさらに拡大する。この構築物をｐＸＡｄ−Ｐａｎ６−ｍｕ０−１，９−２８と命名する。
【０１７４】
第２に、３’クローンもＰａｎ６ゲノムからのｍ．ｕ．４１−８２を網羅する１５０２６ｂｐのＭｌｕＩ／ＰａｃＩフラグメントを、ｐＸ−Ａｄ−Ｐａｎ６−８２−１００のＭｌｕＩ／ＰａｃＩ部位に挿入することにより拡大し、ｐＸＡｄ−Ｐａｎ６−ｍ．ｕ．４１−１００を作成する。
【０１７５】
次いで８１６７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ  Ｐａｎ６フラグメントをｐＸＡｄ−Ｐａｎ６−ｍ．ｕ．０−１，９−２８から単離し、そしてｐＸＡｄＰａｎ６−ｍ．ｕ．４１−１００に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ平滑部位でサブクローン化する。この５’および３’融合クローンをｐＸＡｄＰａｎ６ｍｕ０−１，９−１９．５，６４−１００と呼ぶ。
【０１７６】
４．ゲノムの中央フラグメントの融合クローンへの挿入（ｄｒｏｐ）
Ｐａｎ６から１６３３５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ｍ．ｕ．１９．５−６４）を、ｐＸＡｄＰａｎ６ｍｕ０−１，９−１９．５，６４−１００のＨｉｎｄＩＩＩ部位へ挿入して、ｐＸＡｄＰａｎ６−０−１，９−１００を形成する。
【０１７７】
５．問題の遺伝子を直接的にクローニングし、そして組換え形質転換体を緑／白選択するための最終構築物へのＰＫＧＦＰ選択マーカーの導入
ＧＦＰをｌａｃプロモーター下で発現し、そして制限酵素、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩをコードするレアイントロンの認識部位に挟まれたミニ遺伝子カセットを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｐｋＧＦＰ（裸：ｂａｒｅ）からＳａｐＩおよびＤｒａＩＩＩ消化により単離し、続いてフィリング−イン反応を行った。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｐｋＧＦＰ（裸）プ
ラスミドは４１２６ｂｐ長であり、そしてＣｏｌＥ１−Ｏｒｉ、カナマイシン耐性遺伝子、ｐｌａｃ、ＬａｃＺプロモーター−ＧＦＰｍｕｔ３−１ｃｄｓ（クローンテック）およびＧＦＰｍｕｔ３−１ｃｄｓ（クローンテック）を含む。このカセットを、ＳｒｆＩ切断および平滑化ｐＸＡｄＰａｎ６−０−１，９−１００にサブクローン化する。この最終構築物をｐＸ−Ｐａｎ６−ｐｋＧＦＰｍｕ．０−１，９−１００と呼び、これは直接的連結および遺伝的ｐＳｈｕｔｔｌｅｐｋＧＦＰベクターと組み合わせた緑／白選択による問題の遺伝子を持つ組換えＥ１−削除Ｐａｎ６分子クローンの作成に有用である。
【０１７８】
Ｂ．Ｐａｎ−６プラスミドの別の作成法
１．５’末端フラグメントのクローニング
Ｐａｎ６ウイルスは、上記のようにプロナーゼおよびプロテアナーゼＫ処理、そしてフェノール抽出により脱タンパク質し、そして合成の１２ｂｐ  ＰｍｅＩリンカーを記載のようにウイルスＤＮＡに連結する。上のＡ部に記載したようにＡｄＰａｎ６  ５’ＸｂａＩフラグメントを単離し、そしてｐＸに連結して、ｐＸ−ＡｄＰａｎ６−０−１６．５（９０２２ｂｐ）を形成する。
【０１７９】
２．５’クローンからＥ１の削除
Ｅ１（ｍ．ｕ．１．２−９）を削除するために、ｐＸ−ＡｄＰａｎ６−０−１６．５をＳｎａＢＩおよびＮｄｅＩで消化して、Ｅ１ａおよびＥ１ｂタンパク質をコードする領域（３４４２〜６３１０ｂｐ）を除去する。続いてこのベクターは、選択マーカーを持つミニ遺伝子カセットと共に平滑化のためにＢｓｉＷを用いて消化される。
【０１８０】
３．選択マーカーの導入
ｌａｃプロモーター下にＧＦＰを発現し、そして制限酵素、ＰＩ−ＸｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩをコードするレアーイントロンの認識部位に挟まれたミニ遺伝子カセットを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｐｋＧＦＰから上記のように単離した。次いでＤｒａＩＩＩ−ＳａｐＩフラグメントを、消化したｐＸ−ＡｄＰａｎ６−０−１６．５に連結してｐＸ−ＡｄＰａｎ６ＭＵ０−１６．５ΔＥ１（７７４９ｂｐ）を形成した。
【０１８１】
４．Ｐａｎ−６アデノウイルス配列の延長
ｐＸ−ＡｄＰａｎ６ＭＵ０−１６．５ΔＥ１をＸｂａＩ消化に供して、ＸｂａＩ−ＲｓｒＩＩリンカーの挿入を可能とする。ＡｄＰａｎ６ゲノムからＸｂａＩ／ＲｓｒＩＩ消化フラグメントを単離し（ｍｕ２８−１００、２６２４０ｂｐ）、そしてＸｂａＩ／ＲｓｒＩＩ消化ｐＸ−ＡｄＰａｎ６ＭＵ０−１６．５ΔＥ１に連結して、ｐＸ−ＡｄＰａｎ６ＭＵ０−１，９−１６．５，２８−１００を提供した。次いでＰａｎ６ゲノムから第２のＸｂａＩフラグメント（ｍｕ１６．５−２８、４３５０ｂｐ）をこのプラスミドに連結して、ｐＸ−ＡｄＰａｎ６ＭＵ０−１，９−１００（３８５５１ｂｐ）を形成する。
【０１８２】
Ｃ．組換えアデノウイルスの作成
Ａ部またはｂで上記のように調製したＥ１−削除Ｐａｎ６プラスミドから組換えアデノウイルスを作成するために、プラスミドはＥ１を発現するヘルパー、あるいは２９３細胞系または本明細書に記載するように調製した細胞系のようなＥ１−発現パッケージング細胞系に由来する細胞とコトランスフェクションする。パッケージング細胞中でのＥ１の発現は、Ｐａｎ６−ｐｋＧＦＰｍｕ．０−１，９−１００の複製およびビリオンキャプシドへのパッケージングを可能とする。別の態様では、ｐＸ−Ｐａｎ６−ｐｋＧＦＰｍｕ．０−９，９−１００でトランスフェクトしたパッケージング細胞を、別の目的の導入遺伝子をもつ上記のアデノウイルスベクターでトランスフェクトする。
【実施例６】
【０１８３】
組換えＥ１−欠損Ｐａｎ７ベクターの作成
Ａ．Ｐａｎ７プラスミドの作成
制限部位Ｐａｃ−ＳｍａＩ−ＦｓｅＩ−ＭｌｕＩ−ＥｃｏＲＶ−ＰａｃＩを含む合成リンカーを、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで切断したｐＢＲ３２２にクローン化した。ＡｄＰａｎ７の左末端（ｂｐ１−３６１８）を、ＳｍａＩとＦｓｅＩ部位との間にクローン化した。次いでアデノウイルスＥ１をクローン化した左末端からＳｎａＢＩおよびＮｄｅＩを用いて切り出し、そしてｐＳｈｕｔｔｌｅ（クローンテック）からのＩ−Ｃｅｕ−ＧＦＰ−ＰＩ−ＳｃｅＩカセットを正しい位置に挿入した。生成したプラスミドをＦｓｅＩおよびＭｌｕＩで切断し、そしてＡｄ  Ｐａｎ７フラグメントＦｓｅＩ（ｂｐ３６１８）〜ＭｌｕＩ（ｂｐ１５５１１４）を挿入して左末端を延長した。構築物（ｐＰａｎ７ｐＧＦＰ）は、ＭｌｕＩ部位（ｂｐ１５１１４）からの２１４２１ｂｐのＡｄＰａｎ７右末端フラグメントを上記プラスミドのＭｌｕＩとＥｃｏＲＶとの間に挿入することにより完成し、組換えアデノウイルスの作成に適するＥ１欠損アデノウイルスＰａ７の完全な分子クローンを作成した。場合により、所望する導入遺伝子を新たに作成したｐＰａｎ７ベクタープラスミドのＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入する。
【０１８４】
Ｂ．Ｅ１−欠損Ｐａｎ７ウイルスベクターの構築
ｐＰａｎ７ΔＥ１から組換えアデノウイルスを作成するために、プラスミドをＥ１を発現するヘルパー、あるいは２９３細胞系または本明細書に記載するように調製した細胞系のようなＥ１−発現パッケージング細胞系に由来する細胞にコトランスフェクションする。パッケージング細胞中でのＥ１の発現は、Ｐａｎ７ΔＥ１の複製およびビリオンキャプシドへのパッケージングを可能とする。別の態様では、ｐＸ’Ｐａｎ７ΔＥ１でトランスフェクトしたパッケージング細胞を、目的の導入遺伝子をもつ上記のアデノウイルスベクターでトランスフェクトする。相同的組換えがヘルパーとプラスミドとの間で起こり、これによりベクター中のアデノウイルス−導入配列が複製され、そしてビリオンキャプシドへのパッケージングが可能となり、組換えアデノウイルスを生じる。トランスフェクションおよび精製は上記の通りである。
【実施例７】
【０１８５】
Ｅ１遺伝子を発現するプラスミドベクターの作成
Ｐａｎ５Ｅ１領域の遺伝子をコードするプラスミドベクターを構築し、そしてこれらのプラスミドはウイルスＥ１タンパク質を発現する安定な細胞系を作成するために使用する。
【０１８６】
Ｐａｎ５のＥ１領域は、この領域をｐＳｈｕｔｔｌｅ（クローンテック）からのフラグメントに置き換える前に、本質的に上記実施例４に記載のようにｐＸ’にクローン化する。発現プラスミドはＰａｎ５アデノウイルスゲノム配列中で少なくともｂｐ１〜３９５９に広がるＰａｎ５アデノウイルスゲノム配列を含む。このように発現プラスミドはヘテロロガスなプロモーターの制御下にチンパンジーＡｄ  Ｐａｎ５のＥ１ａおよびＥ１ｂをコードする配列を含む。同様の発現プラスミドは、上記の表で確認されるＡｄ  Ｐａｎ６およびＡｄ  Ｐａｎ７  Ｅ１領域を使用して作成することができる。
【実施例８】
【０１８７】
チンパンジーアデノウイルスＥ１タンパク質を発現する細胞系の作成
ウイルスＥ１タンパク質を発現する細胞系は、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２）に実施例６のプラスミドをトランスフェクションすることにより作成する。これらの細胞系はゲノムウイルスＤＮＡおよび上記のような発現プラスミドのコトランスフェクションにより、Ｅ１−欠損組換えチンパンジーアデノウイルスの生産に有用である。これらの細胞系のトランスフェクション、ならびにそれから組換えチンパンジーアデノウイルスの単離および精製は、他のアデノウイルス、すなわちヒトアデノウイルスに関する常法により行う［例えばＨｏｒｗｉｔｚ、同上および他の標準的テキストを参照にされたい］。
【０１８８】
Ａ．Ｐａｎ５Ｅ１タンパク質を発現する細胞系
１０ｃｍ皿中のＨｅＬａ細胞を、１０μｇのｐＸ−Ｐａｎ５１−Ｅ１ＤＮＡでＣｅｌｌｐｈｅｃｔ（商標）キット（ファルマシア（Ｐａｈｒｍａｃｉａ）、ウプサラ、スウェーデン）を使用し、そして製造元のプロトコールに従いトランスフェクトする。トランスフェクションから２２時間後、細胞を３分間のグリセロールショック（Ｈｅｐｅｓ緩衝化塩溶液、ｐＨ７．５中の１５％グリセロール）にかけ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを補充したＤＥＭＥ（ＨｅＬａ）またはＦ１２Ｋ（Ａ５４９；ライフテクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）培地で１回洗浄し、次いで上記培地中で６時間、３７℃でインキューベーションする。トランスフェクトした細胞を２連の１５ｃｍプレートに１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０および１：３２０の比率で分ける。３７℃で一晩インキューベーションした後、培地にＧ４１８（ライフテクノロジーズ社）を１μｇ／ｍｌの濃度で補充する。培地を５日毎に交換し、そしてクローンをトランスフェクションから２０日後に単離する。
【０１８９】
ＨｅＬａＥ１細胞クローンを単離し、そしてそれらがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）感染および組換えＬａｃＺタンパク質の発現を増強する能力について以下に記載のようにアッセイする。
【０１９０】
Ｂ．Ｅ１発現細胞系をスクリーニングするためのＡＡＶ増強アッセイ
ＡＡＶは、その生活環を完遂するためにアデノウイルスがコードするタンパク質が必要である。アデノウイルスＥ１タンパク質ならびにＥ４領域がコードするＯＲＦ６タンパク質は、ＡＡＶ感染の増強に必要である。Ｅ１発現に基づくＡＡＶ増強に関するアッセイを使用する。簡単に説明すると、アデノウイルスＥ１−発現細胞を同定する方法は、推定されるアデノウイルスＥ１−発現細胞およびアデノウイルス配列を含まない細胞を別個の培養で、アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）発現マーカー遺伝子およびヒトアデノウイルスのＥ４遺伝子のＯＲＦ６を発現するＡＡＶの両方で適当な時期に感染させる工程を含んでなる。生成した細胞中のマーカー遺伝子の活性を測定し、そして対照細胞よりも有意に大きな測定可能なマーカー活性を持つ細胞を、確認されたＥ１−発現細胞として選択する。以下の実験では、マーカー遺伝子はｌａｃＺ遺伝子であり、そしてマーカー活性は青色染色の外観である。
【０１９１】
例えば、上記の細胞系ならびに非トランスフェクト対照細胞（ＨｅＬａ）に、マーカー遺伝子、例えばＡＶ．ＬａｃＺ［Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０（１９９６）］を持つＡＡＶベクター、およびヒト５のＯＲＦ６領域を発現するＡＡＶベクター（ＡＶ．ｏｒｆ６）を、細胞あたり１００ゲノムで感染させる。プラスミドのＤＮＡ配列はＬａｃＺ導入遺伝子、および発現産物が１本鎖（ｓｓ）から２本鎖（ｄｓ）へのｒＡＡＶゲノムＤＮＡへの変換を促進するオープンリーディングフレイムであるＡｄ  Ｅ４  ＯＲＦ６を含む新規な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成する。これらのベクターを２％ＦＣＳおよび１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含有する培地中で３７℃にて４時間インキューベーションし、この時点で１０％ＦＣＳを含む等容量の培地を加える。当業者は任意のマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）、例えばアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびその他をこのアッセイの最初のＡＡＶベクターに使用できると理解するはずである。抗体−酵素アッセイを使用して抗原のレベルを定量することもでき、ここでマーカーは抗原を発現する。このアッセイはマーカー遺伝子の同一性に限定されない。感染から２０〜２４時間後、細胞は標準的方法を使用してＬａｃＺ活性について染色する。４時間後、細胞を顕微鏡で観察し、そしてＡ５４９またはＨｅＬａ細胞対照よりも有意により青色の細胞を陽性と採点する。
【実施例９】
【０１９２】
導入遺伝子の宿主細胞への送達
次いで上記実施例４、５または６に記載した生成した組換えチンパンジーアデノウイルスを使用して、導入遺伝子を哺乳動物、好ましくはヒトの細胞に送達する。例えば組換えウイルスの精製後、ヒトの胚性腎２９３細胞を細胞あたり５０粒子のＭＯＩで感染させる。ＧＦＰ発現は感染から２４時間後に記録した。
【０１９３】
Ａ．Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＰａｎ−９ベクターを介するマウスモデルの遺伝子転移
組換えチンパンジーアデノウイルスの遺伝子転移効率および毒物学的プロフィールは、マウスの肝臓に向けられた遺伝子転移、マウスの肺に向けられた遺伝子転移、およびマウスの筋肉に向けられた遺伝子転移と比較した。
【０１９４】
ＣＭＶプロモーターの制御下にＬａｃＺを含むＥ１−欠損アデノウイルスベクターは、ヒトＡｄ５、チンパンジーＰａｎ６、チンパンジーＰａｎ７およびチンパンジーＰａｎ９（Ｃ６８）についての本明細書の技術を使用して構築した。ベクターは免疫−欠損ＮＣＲヌードマウス（各実験について８０）に以下のように送達した。肝臓の実験については、１００μｌ（１×１０１１粒子）を尾の静脈に注射した。肺の実験については、５０μｌ（５×１０１０粒子）を気管内に送達した。筋肉の実験については、２５μｌ（５×１０１０粒子）を脛側前面に注射した。マウスをベクター注射から３、７、１４および２８日後に屠殺した（各時点で群毎に５匹の動物）。各検死で、肝臓／肺／筋肉組織を回収し、そしてクリオブロック（ｃｒｙｏｂｌｏｃｋ）およびパラフィン包埋するために調製した。クリオブロックをＸ−ｇａｌ染色用に切片とし、そして組織病理学用にパラフィン切片をＨ＆Ｅ染色する。各時点で、最終採血を行った。血清サンプルを肝機能検査に供した。
【０１９５】
この実験では、チンパンジーアデノウイルスＰａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＰａｎ−９は肝臓および肺への遺伝子転移においてｈｕＡｄ５よりも効率が低いことが観察された。しかしこれはｈｕＡｄ５で観察される肝臓毒性を減少させるために、特定の環境では望ましいかもしれない。筋肉での遺伝子転移効率は、血清間での変動が低かった。
【０１９６】
Ｂ．Ａｄｈｕ５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＰａｎ９ベクター間の血清型スイッチングによるアデノウイルスベクターの再投与の可能性に対するマウスの実験
マウス（Ｃ５７／Ｂ１６；４／群）に、Ａｄｈｕ５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＰａｎ９に基づくＬａｃＺベクター（Ｈ５．０４０ＣＭＶＬａｃＺ、Ｐａｎ６．０００ＣＭＶＬａｃＺ、Ｐａｎ７．０００ＣＭＶＬａｃＺ、Ｐａｎ９．０００ＣＭＶＬａｃＺ；１０１１粒子／注射）を尾の静脈から投与した。３０日後、マウスにα１−アンチトリプシンを発現するアデノウイルスベクターを再投与した（Ｈ５．０４０ＣＭＶｈＡ１ＡＴ、Ｐａｎ６．０００ＣＭＶｈＡ１ＡＴ、１×１０１１粒子、Ｐａｎ７．０００ＣＭＶｈＡ１ＡＴ、Ｐａｎ９．０００ＣＭＶｈＡ１ＡＴ、１０１１粒子／注射）。再投与されたベクターによる成功裏の形質導入は、血清α１−アンチトリプシンを再投与から３および７日後に測定することにより監視する。
【０１９７】
ｈｕＡｄ５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＰａｎ９に基づくアデノウイルスベクターがそれぞれ、マウスの肝臓を形質導入する能力を他の血清型に対する中和抗体の存在下で決定した。結果をこの表にまとめる。
【０１９８】
【表１９】
2011055835.tif 000020
【０１９９】
ベクターが他の血清型に対する中和抗体の存在下でマウスの肝臓を形質導入する能力。
【０２００】
このようにｈｕＡｄ５での免疫感作は、チンパンジーアデノウイルスベクターＰａｎ−６、Ｐａｎ−７またはＰａｎ−９（Ｃ６８）のいずれかの再投与を妨げない。この実験はＰａｎ−７が抗原の関連性のスペクトルにおいてＰａｎ−６とＰａｎ−７との間であり、そして両方と交差−反応することも示すようである；しかしＰａｎ−６およびＰａｎ−９は互いに中和しない。これは相同性の比較に基づき驚くべき結果であり、Ｐａｎ−６がＰａｎ−７およびＰａｎ−９とは極めてことなることを示している。Ｐａｎ−９に対して生じた抗血清の評価ではＰａｎ−６に対する交差−中和は示されなかったが、Ｐａｎ−７に対してはわずかな中和が示され、Ｐａｎ−６が他とは異なることが明らかである。
【実施例１０】
【０２０１】
組換えＥ１−欠損ＳＶ−２５ベクターの生成
工作されたＥ１欠損を除き、完全なＳＶ−２５ゲノムを含むプラスミドを構築した。Ｅ１削除の部位に、シャトルプラスミドから導入遺伝子の挿入を可能とする制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩに関する認識部位（ここで導入遺伝子カセットはこれら２つの酵素認識部位により挟まれている）を挿入した。
【０２０２】
制限部位ＳｗａＩ−ＳｎａＢＩ−ＳｐｅＩ−ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｗａＩを含む合成リンカーを、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで切断したｐＢＲ３２２にクローン化した。これは２つの合成オリゴマーＳＶ２５Ｔ（５’−ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＡＡ−３’、配列番号３８）およびＳＶ２５Ｂ（５’−ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＧＣＧ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３’、配列番号３９）を一緒にアリーリングし、そしてこれをＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで切断したｐＢＲ３２２に挿入することにより行った。ＡｄＳＶ２５の左末端（ｂｐ１〜１０５７、配列番号３９）を、ＳｎａＢＩとＳｐｅＩ部位との間の上記リンカーにクローン化した。ＡｄＳＶ２５の右末端（ｂｐ２８０５９〜３１０４２、配列番号２９）を、ＡｆｌＩＩとＥｃｏＲＶ部位との間のリンカーにクローン化した。次いでアデノウイルスＥ１はＥｃｏＲＩ部位（ｂｐ５４７）からＸｈｏＩ（ｂｐ２０３１）の間でクローン化した左末端から以下のように切り出した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ（クローンテック）からＰＣＲで生成したＩ−Ｃｅｕ−ＰＩ−ＳｃｅＩカセットを、ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩ部位との間に挿入した。次いでＡｄ  ＳＶ−２５の１０１５４ｂｐのＸｈｏＩフラグメント（ｂｐ２０３１〜ｂｐ１２１８５、配列番号２９）をＳｐｅＩ部位に挿入した。生成したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして構築物（ｐＳＶ２５）は、１８３４４ｂｐのＡｄＳＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ｂｐ１１９８４〜３０３２８、配列番号２９）を挿入することにより、組換えアデノウイルスの生成に適当なＥ１欠損アデノウイルスＳＶ２５の完全な分子クローンを生成した。場合により所望する導入遺伝子を新たに作成したｐＳＶ２５ベクタープラスミドのＩ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入する。
【０２０３】
マーカー遺伝子を持つＡｄＳＶ２５を生成するために、事前にプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（クローンテック）にクローン化したＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現カセットを、制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで切り出し、そして同じ酵素で消化したｐＳＶ２５（または本明細書に記載する別のＡｄチンパンジープラスミド）に連結する。生成したプラスミド（ｐＳＶ２５ＧＦＰ）をＳｗａＩで消化して細菌のプラスミド骨格を分離し、そしてＥ１相補細胞系ＨＥＫ２９３にトランスフェクトする。約１０日後、複製可能なウイルスの存在を示す細胞変性効果が観察された。このＧＦＰを発現するＡｄＳＶ２５に基づくアデノウイルスベクターの成功裏の生成は、トランスフェクトした培養からの上清を新しい細胞培養に適用することにより確認された。２次的に感染した細胞の存在は、細胞群中の緑色蛍光タンパク質の観察により決定した。
【実施例１１】
【０２０４】
Ｅ３欠損Ｐａｎ−５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＣ６８ベクターの構築
アデノウイルスベクターのクローニング能力を強化するために、Ｅ３領域は培養中にウイルスの増殖に必要ではない遺伝子をコードするのでこの領域を削除することができる。この目的に向けて、Ｐａｎ−５、Ｐａｎ−６、Ｐａｎ−７およびＣ６８のＥ３−欠損変更体を作成した（Ｅ３１−９を含む３．５ｋｂ  Ｎｒｕ−ＡｖｒＩＩフラグメントが削除される）。
【０２０５】
Ａ．Ｅ３欠損Ｐａｎ５に基づくベクター
Ｅ１欠損ｐＰａｎ５−ｐｋＧＦＰプラスミドをＡｖｒＩＩエンドヌクレアーゼで処理して、Ｅ３領域を含有する５．８ｋｂのフラグメントを単離し、そしてｐＰａｎ５−ｐｋＧＦＰとＡｖｒＩＩ欠損とを再環状化して、構築物ｐＰａｎ５−ｐｋＧＦＰ−Ｅ３−ＡｖｒＩＩを形成した。続いてＮｒｕＩ消化によるＥ３領域のさらなる削除のために、５．８ｋｂのＡｖｒＩＩフラグメントをｐＳＬ−Ｐａｎ５−Ｅ３−ＡｖｒＩＩにサブクローン化した。これによりプラスミドｐＳＬ−Ｐａｎ５−Ｅ３欠損を導いた。最終的な構築物ｐＰａｎ５−Ｅ３−ｐｋＧＦＰは、ｐＳＬ−Ｐａｎ５−Ｅ３−欠損プラスミドから４．３ｋｂのＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩフラグメントを除去し、そしてｐＰａｎ５−ｐｋＧＦＰ−Ｅ３−ＡｖｒＩＩにＡｖｒＩＩ部位で挿入することにより生成した。最終的な構築物では、Ｅ３領域に３．１ｋｂの欠損が達成された。
【０２０６】
Ｂ．Ｅ３欠損Ｐａｎ６に基づくベクター
Ｅ１欠損ｐＰａｎ６−ｐｋＧＦＰ分子クローンをＳｂｆＩおよびＮｏｔＩで消化して１９．３ｋｂのフラグメントを単離し、そしてＳｂｆＩ部位に戻して連結した。生成した構築物ｐＰａｎ６−ＳｂｆＩ−Ｅ３をＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＳｗａＩで処理してｐＰａｎ６−Ｅ３を生成した。最後にｐＰａｎ６−ｐｋＧＦＰのＳｂｆＩ消化からの２１ｋｂのＳｂｆＩフラグメントをｐＰａｎ６−Ｅ３にサブクローン化して、Ｅ３に４ｋｐの欠損を持つｐＰａｎ６−Ｅ３−ｐｋＧＦＰを作成した。
【０２０７】
Ｃ．Ｅ３欠損Ｐａｎ７およびＰａｎ９ベクター
同じ方法を使用して両方のベクターにＥ３の欠損を達成した。最初にＥ３領域に広がる５．８ｋｂのＡｖｒＩＩフラグメントをｐＳＬ−１１８０にサブクローン化し、続いてＮｒｕ消化によりＥ３の削除を行った。生成したプラスミドをＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩで処理して４．４ｋｂのフラグメントを得、そしてｐＰａｎ７−ｐｋＧＦＰおよびｐＰａｎ９−ｐｋＧＦＰにＡｖｒＩＩ部位でクローン化して、それぞれ元のＥ３含有ＡｖｒＩＩフラグメントと置き換えた。これにより最終的なｐＰａｎ７−Ｅ３−ｐｋＧＦＰおよびｐＰａｎ９−Ｅ３−ｐｋＧＦＰ構築物は３．５ｋｂのＥ３欠損を有する。
【実施例１２】
【０２０８】
Ｅ３−およびＥ４−欠損Ｐａｎ−７ベクターの構築
アデノウイルスのＥ１領域の欠損（第１世代アデノウイルス）は、それらを複製不能にするが、アデノウイルスベクター骨格遺伝子の発現が完全に破壊されたわけではない。Ｅ４領域の欠損はこの残存する遺伝子発現をかなり弱め、そして安全性の利益を付与することができる。２．５ｋｂを欠損を含むＥ４−欠損Ｐａｎ−７ベクター（Ｅ４ＯＲＦ１−ＯＲＦ７を含むＰｖｕＩＩ−ＡｇｅＩフラグメントを欠く）を構築した。このウイルスの高力価ストックは、Ｅ１に加えて必須なＥ４遺伝子（ｏｒｆ６）を発現するＨＥＫ２９３に基づく細胞系を使用して作成した。
【０２０９】
１．Ｐａｎ７の分子クローン中のＥ４削除
１９ｂｐのＸｂａＩフラグメントをｐＰａｎ７−ｐｋＧＦＰから削除してｐＰａｎ７−ＸｂａＩを作成し、これから２．５４ｋｂのＥ４フラグメントをＡｇｅＩおよびＰｖｕＩＩ部分消化により削除し、ｐＰａｎ７−ＸｂａＩ−Ｅ４を生成した。ｐＰａｎ７−Ｅ４−ｐｋＧＦＰプラスミドは、ｐＰａｎ７−ＸｂａＩ−Ｅ４から２つの順次クローニング工程により生成し、両方がｐＰａｎ７−ｐｋＧＦＰ構築物に由来する１９ｋｂのＸｂａＩおよび１５ｋｂのＩ−ＣｅｕＩ／ＭｌｕＩフラグメントを加えた。
【０２１０】
２．Ｐａｎ９ベクターへのＥ３およびＥ４欠損の導入
Ｅ４領域を含有する１１ｋｂのプラスミドであるｐＰａｎ９−ＥｃｏＲＩは、ＥｃｏＲＩ消化および自己連結後にｐＰａｎ９ｐｋＧＦＰから１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント
を回収することにより作成した。Ｅ４領域はＡｇｅＩ消化／フィルイン（ｆｉｌｌｅｄ  ｉｎ）、およびＰｖｕＩＩ部分消化および自己連結によりこの構築物から削除して、ｐＰａｎ９−ＥｃｏＲＩ−Ｅ４を作成した。２３ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＰａｎ９−ｐｋＧＦＰから単離し、そしてｐＰａｎ９−ＥｃｏＲＩ−Ｅ４にＥｃｏＲＩ部位で挿入し、続いて５．８ｋｂのＡｖｒＩＩフラグメントをｐＰａｎ９−ｐｋＧＦＰから加えて、最終産物ｐＰａｎ９−Ｅ３−Ｅ４−ｐｋＧＦを形成した。野生型Ｐａｎ９のゲノムサイズと比較して、このＥ１−Ｅ３−Ｅ４欠損ベクターは、８ｋｂまでの導入遺伝子容量を有する。
【０２１１】
３．レポーター遺伝子、Ｅｂｏの糖−および核タンパク質を含む目的遺伝子を持つミニ遺伝子カセットのＰａｎベクターへの導入
組換えウイルスの分子クローンを作成するために、高度に効率的な直接的クローニングおよび緑／白選択法を採用した。簡単に説明すると、目的遺伝子をｐＳｈｕｔｔｌｅｐｋＧＦＰに組換え体の白色コロニーを選択することによりクローン化した。続いてミニ遺伝子カセットは、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ部位でｐｋＧＦＰカセットと交換し、そして正しい組換え体について幾つかの白色コロニーをスクリーニングすることにより、チンパンジーのアデノウイルス骨格プラスミドである種々の欠損を有するｐＰａｎＸ−ｐｋＧＦＰ中に簡単に転移させた。
【０２１２】
４．初期領域に多くの欠損を持つＰａｎベクターの分子クローンのレスキューおよびウイルス増殖
チンパンジーのアデノウイルスベクターのＥ１−Ｅ３欠損分子クローンをレスキューするために、クローンを適切な制限酵素で直線状とし、そして通常の２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞にいったん完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、粗ライゼートを回収し、そして２９３細胞中で大規模感染に拡大させた。ウイルスはＣｓＣｌ沈降法により精製した。
【０２１３】
Ｅ１−Ｅ４およびＥ１−Ｅ３−Ｅ４欠損Ｐａｎベクターについて、１０−３細胞（２９３細胞に基づくＥ１−Ｅ４相補細胞系）をベクターのレスキューおよび増殖に使用した。１０−３細胞中でのＥ４  ＯＲＦ６遺伝子発現は、１５０μＭのＺｎＳＯ４を培養基に加えることにより誘導した。
【実施例１３】
【０２１４】
野生型および変異体ＥｂｏＺＧＰを発現するアデノウイルスベクターを用いたワクチン接種
エボラエンベロープキメラを発現するＡｄＨｕ５またはＡｄＣ７ベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象としたインビボの免疫感作実験用に生成した。異なるウイルス骨格を有する組換えウイルスは分子クローニング法により作成し、ここでミニ遺伝子カセットがＥ１−欠損の場所に挿入された。すべての組換えウイルスの分子クローンはレスキューされ、そしてＣｓＣｌ沈降法を使用した大規模精製のために２９３細胞中で成長させた。ＡｄＨｕ５またはＡｄＰａｎ７（Ｃ７）によりコードされる５個のＥｂｏＺ変異体を選択し、そして生産させて筋肉内Ａｄ注射後のそれらの相対的免疫原性について評価した。ｗｔＥｂｏ、可溶性Ｅｂｏ変異体、ＥｂｏΔ１、ＥｂｏΔ２、ＥｂｏΔ３、ＥｂｏΔ４、ＥｂｏΔ５Ｓ、ＥｂｏΔ６Ｓ、ＥｂｏΔ７ＳおよびＥｂｏΔ８Ｓはそれらの最初のワクチン実験で評価した。以下の表にまとめるデータについて、感染した２９３細胞で生産され、そして増幅したウイルス粒子の数（ｍｌあたり、または総数）は、分光光学的読み取りにより確立した。
【０２１５】
【表２０】
2011055835.tif 000021
【０２１６】
ベクターはＣ５７ＢＬ／６マウスの筋肉内に投与し（１０１１ゲノムコピー／細胞）、そしてエボラエンベロープ糖タンパク質に対して生じた免疫応答の最初の尺度として、２８日後にウイルス中和抗体（ＶＮＡ）の存在を評価した。ここでＶＮＡは、野生型エボラエンベロープでシュードタイプ化されたＨＩＶに基づくベクターにより媒介されるＨｅＬａ細胞の形質導入を阻害することができる血清抗体と定める。
【０２１７】
ＥｂｏＺシュードタイプに対するＶＮＡは、ＡｄＨｕ５よりも高い力価を生じるＡｄＰａｎ７（Ｃ７）で検出された。ＥｂｏＺΔ３は導入遺伝子標的という意味で最高のＶＮＡを誘導した。以下の表でまとめるデータでは、ＨＩＶ−ＥｂｏＺ−ＧＦＰシュードタイプ（逆数希釈）に対する中和抗体力価を提供する（Ｎ−５動物／群）。
【０２１８】
【表２１】
2011055835.tif 000022
【実施例１４】
【０２１９】
エボラタンパク質のＰａｎ７媒介型発現
エボラエンベロープタンパク質およびエボラ核抗原を発現するＰａｎ−７ベクターを評価するためのマウス実験を開始した。これらはそれぞれ４つのエボラｅｎｖ構築物を発現するＡｄｈｕ５またはＰａｎ−７を筋肉内（ＩＭ）に注射したＣ５７／Ｂ１／６マウスにおける中和抗体の評価を対象とする。
【０２２０】
Ａ．エボラｅｎｖ構築物を発現するＡｄｈｕ５またはＰａｎ−７をＩＭ注射したＣ５７Ｂ１／６マウスからのＣＴＬの評価
１．エボラウイルスでのマウスにおける対抗実験
エボラエンベロープに対する中和抗体（ＮＡＢ）応答は、エボラエンベロープ糖タンパ
ク質の数種の構築物（ｅＥｂｏ、ＮＴＤ２、ＮＴＤ３、ＮＴＤ４）でシュードタイプ化されたレンチウイルス（ＨＩＶ）ベクターの中和を媒介した免疫感作マウスの血清を調査することにより分析した。Ｃ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウスは、エボラエンベロープ変異体をコードするＣ７（ＡｄＰａｎ−７）のマウスあたり５×１０１０の粒子の単回の筋肉内注射を受けた。中和抗体はワクチン接種から３０日後に評価した。簡単に説明すると、β−ガラクトシダーゼをコードするエボラザイールシュードタイプ化ＨＩＶベクター（ＥｂｏＺ−ＨＩＶ−ＬａｃＺ）を３７℃で２時間、異なる希釈の不活性化マウス血清とインキューベーションした。血清とインキューベーションした後、次いでＥｂｏＺ−ＨＩＶ−ＬａｃＺは３７℃で１６時間、ＨｅＬａ細胞を感染させるために使用した。感染性はβ−ガラクトシダーゼ陽性の形質導入されたＨｅＬａ細胞のＸ−ｇａｌ染色により示した。中和力価は、β−ガラクトシダーゼ陽性の青色細胞の数に５０％の減少が観察される血清の逆数希釈を示す。血清は５×１０１０粒子／動物の単回筋肉内（Ｉ．Ｍ．）投与からなる免疫感作から３０日後に集めた。エボラシュードタイプ化ＨＩＶに対する中和抗体は、すべての群から検出することができ、抗体力価はＡｄ−ＥｂｏＺ（ＥｂｏＺを発現するＡｄｈｕ５）、Ａｄ−ＮＴＤ３（ＮＴＤ３を発現するＡｄｈｕ５）およびＣ７−ｓＥｂｏ（可溶性ＥｂｏＺを発現するＡｄＰａｎ−７）についての２０から、Ｃ７−ＮＴＤ（可溶性ＮＴＤ３を発現するＡｄＰａｎ−７）およびＣ−ＮＴＤ４（可溶性ＮＴＤ３を発現するＡｄＰａｎ−７）の１３０にわたる範囲であった。ＢＡＬＢ／ｃマウスを対象とした同じ免疫感作法では、Ａｄ−およびＣ７−ＮＴＤ２およびＮＴＤ４について、低い中和抗体力価がもたらされた。
【０２２１】
Ｂ．細胞性免疫応答
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象としたエボラエンベロープに対する細胞性免疫応答は、動物あたり５×１０１０粒子のＣ７−ＬａｃＺまたはＣ７−エボラエンベロープ変異体の単回Ｉ．Ｍ．投与から８日後に評価した。マウスにＬａｃＺまたはエボラエンベロープ変異体をコードする５×１０１０粒子のＣ７をＩ．Ｍ．ワクチン注射した。免疫感作したマウスの脾臓リンパ球はワクチン注射から８日後に集め、そして支持細胞（野生型のエボラエンベロープをコードするヒトアデノウイルス血清型５に感染した未処置マウスに由来する脾臓細胞、そして照射した）を用いてインビトロで刺激した。標準的な５時間のＣＴＬアッセイは、ＥｂｏＺのエクスプレッサーでトランスフェクトした５１Ｃｒ−標識相乗的Ｃ５７細胞を使用して行った。
【０２２２】
陽性のＭＨＣ−拘束細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答はエボラエンベロープ変異体をコードするすべてのＡｄＰａｎ−７から観察され、ＮＴＤ２、ＮＴＤ３またはＮＴＤ４免疫感作マウスからの応答がより高かった。実際に、エボラエンベロープ変異体をコードするＣ７を免疫感作したマウスに由来するエフェクター細胞は、ＥｂｏＺでトランスフェクトした標的細胞を認識し、そして３０％の特異的溶菌まで回復したＣＴＬ応答を与えた。ナイーブな、またはＬａｃＺ免疫感作対象マウスに由来するエフェクター細胞では５％未満の溶菌が見られ、溶菌がエボラエンベロープ抗原に特異的であることが確認された。
【０２２３】
Ｃ．防御実験
マウスを対象とした成功したワクチンとしてのＥｂｏＺバリアントをコードするＣ７（ＡｄＰａｎ−７）を評価する最も直接的な手段は、マウス適合エボラザイールウイルスを用いて、致死的チャレンジ後の体重損失および死に対する防御を評価することであった。ＢＡＬＢ／ｃマウスは以前に行ったように動物あたり５×１０１０粒子の単回用量で免疫感作し、そしてワクチン注射した動物はマウス適合エボラザイールの２００ＬＤ５０で２１日後にチャレンジした（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。すべての対照マウス（賦形剤およびＣ７−ＬａｃＺ）はチャレンジから５〜９日の間に死亡した。対照的に（Ｃ７−ｓＥｂｏ群からの）１匹を除き、すべてのワクチン接種したマウスはエボラザイールでのチャレンジで生存した。
【０２２４】
Ｃ７−ｓＥｂｏでワクチン接種したマウスからの体重損失は４〜７日に観察された。逆毛だち（ｐｉｌｏ−ｅｒｅｃｔｉｏｎ）のような病気の兆候、および軽度から重度の無気力もＣ７−ｓＥｂｏ、ＮＴＤ２およびＮＴＤ３でワクチン注射したマウスで４〜７日に観察された。Ｃ７−ＥｂｏＺおよびＣ７−ＮＴＤ４を免疫感作したマウスは、病気の兆候を示さなかった。全体として、Ｃ７−ＥｂｏＺおよびＣ７−ＮＴＤ４の単回投与は、恐らく有意なＴ細胞性免疫により病気および死から免疫感作したマウスを完全に防御した。
【０２２５】
上記に引用したすべての文書は、引用により本明細書に編入する。本発明の多数の修飾および変更が上記の明細書の範囲に含まれ、そして当業者には明白であると予想される。異なるミニ遺伝子の選択またはベクターまたは免疫モジュレーターの投薬用量の選択のような本発明の組成物および方法に対するそのような修飾および変更は、これに添付する特許請求の範囲の範囲内であると考える。
【０２２６】
以下に本発明の主な特徴及び態様を列挙する。
【０２２７】
１．
（ａ）配列番号１の核酸１〜３６４６２の配列を有するＰａｎ５：
（ｂ）配列番号５の核酸１〜３６６０４の配列を有するＰａｎ６：
（ｃ）配列番号９の核酸１〜３６５３５の配列を有するＰａｎ７：
（ｄ）配列番号２４の核酸１〜３４２６４の配列を有するＳＶ１：
（ｅ）配列番号２９の核酸１〜３１０４４の配列を有するＳＶ２５：
（ｆ）配列番号３４の核酸１〜３４１１５の配列を有するＳＶ３９：
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の配列に相補的な核酸配列：
からなる群から選択される単離されたサルアデノウイルス核酸配列。
【０２２８】
２．Ｐａｎ５配列番号１；Ｐａｎ６配列番号５；Ｐａｎ７配列番号９；ＳＶ１配列番号２４；ＳＶ２５配列番号２９；およびＳＶ３９配列番号３４の
（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）アデノウイルスＥ１ａ領域、または１３Ｓ、１２Ｓおよび９Ｓ領域の中から選択されるそのフラグメント；
（ｃ）アデノウイルスＥ１ｂ領域、またはスモールＴ、ラージＴ、ＩＸおよびＩＶａ２領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（ｄ）Ｅ２ｂ領域；
（ｅ）Ｌ１領域、または２８．１ｋＤタンパク質、ポリメラーゼ、アグノタンパク質、５２／５５ｋＤタンパク質およびＩＩＩａタンパク質からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（ｆ）Ｌ２領域、またはペントン、ＶＩＩ、ＶＩおよびＭｕタンパク質からなる群から選択されるそのフラグメント；
（ｇ）Ｌ３領域、またはＶＩ、ヘキソンまたはエンドプロテアーゼからなる群から選択されるそのフラグメント；
（ｈ）２ａタンパク質；
（ｉ）Ｌ４領域、または１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤ相同体およびＶＩＩＩからなる群から選択されるそのフラグメント；
（ｊ）Ｅ３領域、またはＥ３  ＯＲＦ１、Ｅ３  ＯＲＦ２、Ｅ３  ＯＲＦ３、Ｅ３  ＯＲＦ４、Ｅ３  ＯＲＦ５、Ｅ３  ＯＲＦ６、Ｅ３  ＯＲＦ７、Ｅ３  ＯＲＦ８およびＥ３  ＯＲＦ９からなる群から選択されるそのフラグメント；
（ｋ）Ｌ５領域、または繊維タンパク質から選択されるそのフラグメント；
（ｌ）Ｅ４領域、またはＥ４  ＯＲＦ７、Ｅ４  ＯＲＦ６、Ｅ４  ＯＲＦ４、Ｅ４  ＯＲＦ３、Ｅ４  ＯＲＦ２およびＥ４  ＯＲＦ１からなる群から選択されるそのフラグメント
；および
（ｍ）３’ＩＴＲ、
あるいは任意の（ａ）〜（ｍ）に相補的な配列からなる群の１以上から選択される単離されたサルアデノウイルス血清型核酸配列。
【０２２９】
３．上記２．に記載された核酸配列によりコードされるサルアデノウイルスタンパク質。
【０２３０】
４．上記２．に記載されたヘテロロガスなサルアデノウイルス配列を含んでなる核酸分子。
【０２３１】
５．上記サルアデノウイルス配列がアデノウイルス遺伝子産物をコードし、そして宿主細胞中でアデノウイルス遺伝子産物の発現を支配する調節配列に操作可能に連結されている、上記４．に記載の核酸分子。
【０２３２】
６．上記サルアデノウイルス配列がＰａｎ５配列番号１；Ｐａｎ６配列番号５；Ｐａｎ７配列番号９；ＳＶ１配列番号２４；ＳＶ２５配列番号２９；およびＳＶ３９配列番号３４のＥ１ａ領域を含んでなる、上記４．または５．に記載の核酸分子。
【０２３３】
７．上記６．に記載の核酸分子および生理学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【０２３４】
８．
（ａ）Ｐａｎ５配列番号３、Ｐａｎ６配列番号７、Ｐａｎ７配列番号１１、ＳＶ１配列番号２６、ＳＶ２５配列番号３１、またはＳＶ３９配列番号３６のヘキソンタンパク質、またはそのフラグメント；
（ｂ）Ｐａｎ５配列番号２、Ｐａｎ６配列番号６、Ｐａｎ７配列番号１０、ＳＶ１配列番号２５、ＳＶ２５配列番号３０またはＳＶ３９配列番号３５のペントンタンパク質；
（ｃ）Ｐａｎ５配列番号４、Ｐａｎ６配列番号８、Ｐａｎ７配列番号１２、ＳＶ１配列番号２７および配列番号２８、ＳＶ２５配列番号３２および配列番号３３またはＳＶ３９配列番号３７の繊維タンパク質、またはそのフラグメント、
からなる群から選択される単離されたサルアデノウイルスキャプシドタンパク質。
【０２３５】
９．上記８．に記載のキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを含んでなる人工アデノウイルス血清型。
【０２３６】
１０．上記キャプシドがＰａｎ５配列番号１５、Ｐａｎ６配列番号１６およびＰａｎ７配列番号１７からなる群から選択されるヘキソンタンパク質のフラグメントを含んでなる、上記９．に記載の人工アデノウイルス血清型。
【０２３７】
１１．上記キャプシドがＰａｎ６配列番号１９、Ｐａｎ７配列番号２０およびＰａｎ５配列番号２１からなる群から選択される繊維タンパク質のフラグメントを含んでなる、上記９．または１０．に記載の人工アデノウイルス血清型。
【０２３８】
１２．上記３．もしくは８．に記載のタンパク質または上記９．ないし１１．のいずれかに記載の人工アデノウイルス血清型をコードするヘテロロガスな配列を含んでなる核酸分子。
【０２３９】
１３．上記２．に記載のサルアデノウイルス配列または上記４．もしくは１２．に記載の核酸分子および宿主細胞中で該遺伝子の発現を支配する配列に操作可能に連結されたヘテロロガスな遺伝子を含んでなる組換えベクター。
【０２４０】
１４．さらに複製およびキャプシド形成に必要な５’および３’アデノウイルス・シスエレメントを含んでなる、上記１３．に記載の組換えベクター。
【０２４１】
１５．上記ベクターがウイルスである上記１３．または上記１４．に記載の組換えベクター。
【０２４２】
１６．上記ベクターがＥ１遺伝子のすべてまたは一部を欠いている上記１３．ないし１５．のいずれかに記載の組換えベクター。
【０２４３】
１７．上記３．に記載のサルキャプシドタンパク質または上記９．ないし１１．のいずれかに記載の人工アデノウイルス血清型を含んでなる組換えウイルス。
【０２４４】
１８．上記４．ないし６．または１２．のいずれかに記載の核酸分子、上記１３．ないし１６．のいずれかに記載の組換えベクター、または上記１７．に記載の組換えウイルスを含んでなる宿主細胞。
【０２４５】
１９．上記宿主細胞が核酸分子または組換えベクターにより安定に形質転換されている、上記１８．に記載の宿主細胞。
【０２４６】
２０．上記宿主細胞が上記核酸分子または組換えベクターから１以上のアデノウイルス遺伝子産物を発現し、該アデノウイルス遺伝子産物がＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよびＥ４  ＯＲＦ６からなる群から選択される、上記１８．または１９．に記載の宿主細胞。
【０２４７】
２１．上記宿主細胞が、サルアデノウイルス逆方向末端反復を含んでなる核酸分子で安定に形質転換されている、上記１８．ないし２０．のいずれかに記載の宿主細胞。
【０２４８】
２２．製薬学的に許容されうる担体中に組換えベクターを含んでなる組成物であって、該ベクターが上記１．または２．のいずれかに記載のサルアデノウイルス配列および宿主細胞中で該遺伝子の発現を支配する調節配列に操作可能に連結された選択されたヘテロロガスな遺伝子を含んでなる上記組成物。
【０２４９】
２３．ヘテロロガスな遺伝子を哺乳動物細胞に送達するための方法であって、該細胞に有効量の上記１３．ないし１６．のいずれかに記載のベクターまたは上記１７．に記載のウイルスを導入することを含んでなる上記方法。
【０２５０】
２４．ヘテロロガスな遺伝子を哺乳動物に反復投与する方法であって：
（ａ）該哺乳動物にヘテスロロガスな遺伝子を含んでなる第１ベクターを導入し、そして（ｂ）該哺乳動物にヘテスロロガスな遺伝子を含んでなる第２ベクターを導入する、
工程を含んでなり、ここで少なくとも第１ウイルスまたは第２ベクターが上記１７．に記載のウイルスであり、そして第１および第２の組換えベクターが異なるものである上記方法。
【０２５１】
２５．哺乳導入細胞を上記１３．ないし１６．のいずれかに記載のベクターまたは上記１７．に記載のウイルスで感染させ、該細胞を適切な条件下で培養し、そして該細胞培養から発現した遺伝子産物を回収することを含んでなる、選択した遺伝子産物の生産法。
【０２５２】
２６．感染源に対する哺乳動物宿主の免疫応答を誘導する方法であって、該宿主に有効量の上記１７．に記載の組換えアデノウイルスを投与することを含んでなり、ここで該ヘテロロガスな遺伝子が感染源の抗原をコードする上記方法。
【０２５３】
２７．組換えアデノウイルスを投与する前にヘテロロガスな遺伝子を含んでなるＤＮＡワクチンで宿主を初回感作する工程を含んでなる、上記２６．に記載の方法。
【０２５４】
２８．選択した宿主細胞に送達するための、ヘテロロガスな分子に連結された上記８．に記載のサルアデノウイルスキャプシドタンパク質を含んでなる組成物。
【０２５５】
２９．個体に上記２８．に記載の組成物を送達することを含んでなる、アデノウイルスレセプターを有する細胞を標的とする方法。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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