(57)【要約】【課題】ハチ刺傷の応急処置として用いられるステロイド剤やエピネフリン注射以外に、肥満細胞活性化の機序あるいは細胞傷害の詳細な機序に基づいた、ハチ毒による細胞と臓器における傷害作用を予防する方法または治療方法の確立が要請されている。【解決手段】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂをハチ刺傷により発現する直接的およびアレルギー症状の予防薬と治療薬の有効成分として使用する。【選択図】図１
2011088853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１、ＧＴ１あるいはそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするハチ毒による傷害作用に対する予防薬あるいは治療薬。
【請求項２】
上記ハチの毒成分として、スズメバチ、ミツバチ、アシナガバチおよびマルハナバチが含む毒成分またはこれらの少なくとも１つを含有するものである、請求項１に記載するハチ刺傷による傷害作用に対する予防薬あるいは治療薬。
【請求項３】
ガングリオシド、特にＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、ハチ毒による傷害の予防または治療用組成物。
【請求項４】
上記ハチ毒が、メリチン、マストパランまたはこれらの少なくとも１つを含有するものである、請求項３に記載する予防または治療組成物。
【請求項５】
上記組成物が、経口用、注射用および経皮外用からなる群から選択されるいずれかの形態を有する医薬組成物である、請求項１または３のいずれかに記載する予防または治療組成物。
【請求項６】
上記組成物が、経口用、注射用および外用からなる群から選択されるいずれかの形態を有する医薬品との配合剤、飲食用、化粧品等である、請求項１または３のいずれかに記載する予防または治療組成物。
【請求項７】
メリチン、マストパランを含むリピドラフト擾乱作用を有する生物毒による傷害作用に対する予防薬あるいは治療薬
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はハチ毒による細胞と臓器における傷害作用を予防し、また治療するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
養蜂家等農林産業従事者をはじめ山登りなどのレジャーにおける、ハチＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａによる被害は世界的に起こっている。特にわが国では、毎年のように８月以降全国各地でハチによる集団被害が発生しており、厚生労働省の人口動態統計によると、増減はあるものの近年は全国で毎年２０〜３０人が亡くなっている。発生場所は大半が山の中だが、都市近郊でも同じような被害が発生する自治体では、スズメバチ類の駆除費の一部補助制度を設けている所がある。スズメバチ類は、オオスズメバチ、クロスズメバチ、キイロスズメバチ、攻撃性はすくないもののミツバチ類は、ニホンミツバチ、セイヨウミツバチが挙げられる。ハチ刺されによる死亡事故は、林業などハチとの接触機会の多い山で働く人はもとより、最近、特に旅行等、自然にふれあう機会の増加や住居の山間部への増設などから、一般市民にもハチ刺され被害が多くなってきた。これらは、テレビや新聞等で駆除の実態が報道されている。
【０００３】
ハチ刺傷による作用には、直接作用とアレルギー作用がある。前者は、ハチ毒のもつ細胞膜作動性ペプチドによるもので、全身症状がすべての人に現れ、本特許に関わるものである。後者は、ハチ毒アレルギーに起因するアナフィラキシーショックによるもの多くの抗アレルギー剤が試みられてきた。最近アドレナリンの自己注射器が開発され、平成７年から治験的扱いとして当時製造・販売されていた米国から輸入し、現場の林業従事者や養蜂家に所持させ、効果を上げている。このため広く自己注射器の使用について強い要望が出され、平成１５年に、厚生労働省から承認され、販売が開始された。このことにより、自己注射器の使用が、民有林の作業従事者も使用可能となり、ハチ刺され死亡事故の発生が抑えられているが、これはあくまで、ハチ刺され後の緊急の手当てに使用するものである。アドレナリン自体、血圧上昇や動悸をひきおこすので、予防には使用できない。また、アレルギー作用を緩和するためにハチ毒の減感作療法によるＩｇＥ抗体からＩｇＧ４抗体への誘導があるが、減感作の効果はばらつきがあり不十分とされる。また本療法は逆にアレルギーを悪化させる危険性もある（非特許文献１）一般的なアレルギー薬として使用される抗ヒスタミン薬は毒の直接作用による腫れ、痒み、痛みあるいは細胞傷害作用を打ち消すことはできない。実際、ハチ毒にはアミン類(セロトニン、ドーパミン)やポリペプチド(メリチン、アパミン、マストパラン)、酵素(ホスホリパーゼＡ２、Ａ１、ヒアルロニダーゼ、酸フォスファターゼ)、キニンが含まれており、これらが相加あるいは相乗的に働いて直接的な毒作用による傷害や死亡に至ると考えられる。特にスズメバチ毒に含まれるマストパランやミツバチ毒のメリチンは肥満細胞からヒスタミン遊離と細胞傷害を同時に示す。これら毒作用により肥満細胞から炎症性メディエーターが放出され、ショックを引き起こし、死に至ることもある。事実、大量に刺された場合はアレルギーではなく毒の直接作用により死亡することがある（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
ところで、細胞膜に局在する脂質ラフトという構造体が、細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たしていることが近年明らかにされつつある。脂質ラフトは各種レセプターの他、イオンチャネルやホスホリパーゼなどのシグナル分子を集積しており、シグナルを効率的に変換できるように構成されている一方、病原細菌やウイルスあるいは毒素が特異的に認識する分子も有しており、それらの侵入門戸ともなりうる。肥満細胞の場合、脂質ラフトにはＩｇＥレセプターやそれに付随する各種シグナル分子が存在することが知られる。
【０００５】
ハチ毒の直接作用は、細胞膜作動性ペプチドによるものである。実際、スズメバチ毒素マストパランが標的とするシグナル分子は多く、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、カルモジュリン、プロテインキナーゼＣなどが挙げられるが、脂質ラフト作動性として概念化できる。ガングリオシドには細菌毒素のレセプター、細胞接着やシグナル伝達のメディエーターなど様々な機能があることが知られる。ガングリオシドは、学習能の向上、口腔内細菌改善作用、大腸菌の感染予防作用（特許文献  １−３  ）が報告されている。Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍにより考案された、ガングリオシド命名法において、ガングリオシドのＧに続く文字はシアル基の数を示す(非特許文献４)。Ｍはモノシアロ（シアル基１つ）、Ｄはジシアロ（シアル基２つ）、Ｔはトリシアロ（シアル基３つ）を意味する。ＧＭ３は、腸管粘膜の成熟を促進し、ＧＤ３は免疫能の調整を行っていることも注目されている（特許文献４−５）。
【０００６】
本発明は、この脂質ラフトを構成する分子の一つは糖脂質の一種であるガングリオシドが、脂質ラフトの擾乱を修飾することでハチ刺傷に対する予防と治療の手段を提供するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−２４６４１８号公報
【特許文献２】特開２００５−３２０２７５号公報
【特許文献３】特開２００１−２７０４号公報
【特許文献４】特開平８−１０９１４４号公報
【特許文献５】特開２００８−２１４２４１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ewan PW. Venom allergy. BMJ. 1998 May 2;316(7141):1365-8.
【非特許文献２】Vetter RS, Visscher PK, Camazine S. Mass envenomations by honey beesand wasps. West J Med. 1999 Apr;170(4):223-7.
【非特許文献３】平田博国  福田健：アナフィラキシーの歴史とハチ刺されによる現状  アレルギー・免疫  Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１，ｐｐ１３４−１３６、２００５．
【非特許文献４】Biochemistry Lehninger, 第2版, 1975, Worth Publishers Inc., ｐｐ２９４−２９５、１９７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ハチ刺傷の応急処置として用いられるステロイド剤やエピネフリン注射、抗ヒスタミン薬とともに、細胞傷害の詳細な機序に基づいた予防方法または治療方法の確立が広く要請されている。エピネフリンの自己注射には心臓に不整脈を引き起こす事象があるため、医薬品ではなく、安全に一般市民でも使用できる素材が要請されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで我々は本課題の解決を達成すべく研究したところ、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂが、ハチ毒の作用を抑制することを見出した。ミツバチ毒、ミツバチ毒由来メリチン、合成メリチン、スズメバチ毒、合成マストパランによる肥満細胞からのヒスタミン放出についてβ−ヘキソサミニダーゼを指標として測定した。β−ヘキソサミニダーゼは肥満細胞からヒスタミンとともに遊離してくる酵素の一種であり、そのため本酵素の測定は肥満細胞の活性化指標として最もよく行われる方法である。活性化の度合いは、肥満細胞に含まれる全量の何割が遊離されたのかを測定することで評価し、値が高いほど放出量が多いことを示す。我々は、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂは、細胞に前処理することで、ミツバチ毒、ミツバチ毒由来メリチン、合成メリチン、スズメバチ毒、合成マストパランによる肥満細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼの放出を強く抑制することを確認した。このことは、ガングリオシドがこれらハチ毒成分およびハチ毒による肥満細胞の活性化を抑制したことを示し、毒作用を減弱したと解釈できる。また各種ハチ毒の細胞傷害については、ＭＴＴ測定により評価した。生細胞にＭＴＴが取り込まれると、ミトコンドリアの酵素でフォルマザンに変化するので、生成したフォルマザン量を対照区と比較すれば、生細胞の割合を求めることができる。細胞傷害が起きた場合はミトコンドリアによるフォルマザン生成は生じない。ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂは、上記すべての毒および毒素による細胞傷害を強く抑制した。さらに、細胞内シグナル伝達分子あるいはレセプターが集積する脂質ラフトに存在するＧαｉおよびＧαｑタンパク質のハチ毒による移行について検討したところ、これらのガングリオシドが、その移行を抑制した。このことは、ガングリオシドが脂質ラフト擾乱作用を安定化したことを示す。本発明は以上の知見に基づき、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂをハチ毒により発現する各種症状の予防薬と治療薬の有効成分として応用するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のハチ刺され予防薬または治療薬により、ハチ毒の直接的な肥満細胞の活性化、また結果的に生ずる肥満細胞に起因する作用が抑制され、皮膚炎（蕁麻疹、腫れ等）、鼻炎（くしゃみ、鼻水、鼻づまり等）、消化器症状（吐き気、応答、腹痛、下痢等）、呼吸器症状（呼吸困難、動悸）ならびにアナフィラキシー様反応を抑制することができる。また本発明のハチ刺され予防薬または治療薬は、ハチ毒による細胞傷害も抑制することができ、よって組織傷害を低減することが可能である。以下、実験例によりさらに具体的に説明するが、本発明は本実験例や細胞によって限定されるものではない。特に、本発明の実験例では、ハチ毒によるアナフィラキシーショックを起こす動物であるイヌ（Walker T, et al., Imaging diagnosis: acute lung injury following
massive bee envenomation in a dog. Vet Radiol Ultrasound. 2005;46(4):300-3.）に由来する肥満細胞腫株化細胞を用いたが、皮膚や肺に存在する結合組織型肥満細胞の特徴をもち臨床の現場の状況をより強く反映する。イヌは愛玩動物として飼育されることが多く、食および住環境において最も人間に近い動物種である。また肥満細胞モデルとして多用されるのは、マウス由来のＲＢＬ−２Ｈ３細胞やラット腹腔内肥満細胞であるが、本実験に用いるＣＭ−ＭＣの遺伝子はそれらよりヒトの遺伝子に近いという点でも優れている。
【００１２】
材料と方法  
【００１３】
試薬
合成マストパランはメルク/カルビオケム (ダムルシタット、ドイツ)から購入した。ミツバチ毒由来メリチン、ウシ脳由来モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ウシ脳由来ジシアロガングリオシド（ＧＤ１ａ）、トリシアロガングリオシド（ＧＴ１ｂ）はシグマアルドリッチ(セントルイス、ミズーリ)から購入した。合成メリチンはアレキシスバイオケミカルズ（サンディエゴ，カリフォルニア）より購入した。抗Ｇαｑウサギポリクローナル抗体はアップステイト(レイクプラシド、ニューヨーク)より購入した。抗フロティリン−１マウス抗体はＢＤバイオサイエンス(サンホセ、カリフォルニア)より購入した。抗Ｇαｉマウスモノクローナル抗体はケミコンインターナショナル（テメクラ、カリフォルニア）より購入した。ペルオキシダーゼラベル抗ウサギ抗体はザイメド(南サンフランシスコ、カリフォルニア)より購入した。ペルオキシダーゼラベル抗マウス抗体はキルケガード＆ペリーラボラトリーズ（ガイセスブルグ、メリーランド）から購入した。ＲＰＭＩ−１６４０は和光純薬株式会社（東京）から購入した。ミツバチおよびオオスズメバチ毒凍結乾燥粉末は山田養蜂場(株)（岡山）より提供された。
【００１４】
ハチ毒の調製
ミツバチ毒は、ミツバチを−２０℃で仮死状態にし、毒嚢に含まれる毒液を取り出し−８０℃で凍結後、フリーズドライにて粉末にしたものを使用した。粉末は−２０℃で保管し、使用直前に蒸留水に溶解して使用した。スズメバチ毒は、ミツバチ毒と同様の方法で、スズメバチを−２０℃で仮死状態にし、毒嚢に含まれる毒液を取り出し−８０℃で凍結後、凍結乾燥して粉末にしたものを使用した。粉末は−２０℃で保管し、使用直前に蒸留水に溶解して使用した。
【００１５】
細胞培養方法
イヌ肥満細胞腫株化肥満細胞Ｃａｎｉｎｅ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍａｓｔｏｃｙｔｏｍａｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ（以下ＣＭ−ＭＣ）は１０％非働化ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ−１６４０培地にて培養した。
【００１６】
β−ヘキソサミニダーゼの測定
ＣＭ−ＭＣを、木谷、佐藤らの方法（Int Arch Allergy Immunol.2002: 129(4):305-13）に従って調整した。具体的には、ＣＭ−ＭＣをＰＩＰＥＳ−Ａで２回洗浄し（４℃で４３０×ｇ、５分間遠心分離）、ＰＩＰＥＳ−ＡＣＭで２．５×１０６細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。調製した細胞懸濁液を、１００μｌ／本の割合でポリスチレン製チューブに入れた。次に最終濃度が０，１，３，１０，３０μＭとなるようにＧＭ１、ＧＤ１ａ、またはＧＴ１ｂを加え、それぞれ３７℃１０分間前処理した後、ミツバチ毒、ミツバチ毒由来メリチン、合成メリチン、スズメバチ毒、合成マストパランで、それぞれ３７℃１０分間の刺激を行った。同時に、細胞が含有するβ-ヘキソサミニダーゼ総量を測定するため、０．２％のトライトンＸ−１００により３７℃１０分間の細胞溶解を行ったチューブも用意した。次にチューブを４℃で４３０×ｇ、５分間の遠心分離にかけ、上清５０μｌを新しいチューブに回収し、０．１ＭのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ｐＨ４．５）を１００μｌ添加して、３７℃で６０分間酵素反応させた後、０．２Ｍのグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．６）を１００μｌ添加して酵素反応を停止・発色させ、各反応液の吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレート・リーダー（Ｅｍａｘ、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。脱顆粒の指標として肥満細胞からのβ-ヘキソサミニダーゼ放出率（％）を、下式を用いて算出した。
【００１７】
（数１）
β-ヘキソサミニダーゼ放出率（％）
＝（培養上清中のβ-ヘキソサミニダーゼ量／細胞溶解液中のβ-ヘキソサミニダーゼ量）×１００
【００１８】
ＭＴＴ測定
ＣＭ−ＭＣをβ−ヘキソサミニダーゼ測定と同様の方法で調整後、刺激した。対照群として無添加の細胞も用意した。次にＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含むＰＢＳに懸濁後、３７℃で３時間培養した。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、４０ｍＭ  ＨＣｌを含むイソプロピルアルコールでフォルマザンを溶解した。上清の吸光度（５７０ｎｍ）を分光光度計(Ｕ−１８００、日立製作所)で測定し、下式に従って細胞傷害率（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ％）を算出した。なお、細胞傷害とは、ハチ毒によって生じる細胞の損傷を意味し、特にアレルギー作動性メディエーターやサイトカインを大量にもつ肥満細胞、具体的にはハチに刺された患部や毒の循環による細胞や細胞組織の破壊（壊死）と随伴する炎症とアナフィラキシー様反応が起こることを意味する。細胞傷害よりも続発する生体傷害を強調したものである。
【００１９】
（数２）
細胞傷害率(％)＝１００−ハチ毒で刺激した細胞におけるフォルマザン量／無添加の細胞におけるフォルマザン量×１００
【００２０】
脂質ラフトの分離
ＣＭ−ＭＣをβ−ヘキソサミニダーゼ測定と同様の方法で処理・刺激した。対照群として無添加の細胞も用意した。つぎに細胞をＰＩＰＥＳ−Ａで洗浄し、１０８個／ｍｌとなるように溶解液(５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ，５０ｍＭ  塩化ナトリウム，５  ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム，５  μｇ／ｍｌロイペプチン，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン，０．１％  トライトンＸ−１００)を加え、氷冷下で１０秒間超音波処理し、緩い攪拌を１時間加えた。この細胞溶解液と６０％ショ糖を含んだ溶解液３ｍｌを遠心管にて混和し、さらに３５％ショ糖溶解液４ｍｌ、５％ショ糖溶解液を重層させた。この試料を１００，０００×ｇ，４℃，２４時間の超遠心分離(ＲＰＳ４０−ＳＴローター、日立製作所)にかけた後、上から１ｍｌずつ回収し、各画分とした。
【００２１】
ウェスタンブロッティング
各画分を等量の試料緩衝液(１００ｍＭ  トリス，１００ｍＭ  ＤＴＴ，２％  ＳＤＳ，１０％  ショ糖，０．００６％  ブロモフェノールブルー)と混和し、１２．５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥし、さらにＰＶＤＦ膜(ハイボンドＰ+、アマシャムバイオサイエンス)に転写した。ＰＶＤＦ膜に２％スキムミルクで４℃一晩のブロッキングを行ない、ＴＢＳ−Ｔで１０分間２回の洗浄をした。ＴＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した抗フロティリン−１抗体と抗Ｇαｑ抗体、抗Ｇαｉ抗体による一次抗体反応を室温にて２時間行なった後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２００００倍希釈したＨＲＰ結合抗マウスポリクローナル抗体または抗ウサギポリクローナル抗体による二次抗体反応を室温にて１時間行なった。抗体反応終了後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄をし、ＥＣＬ−ＰＬＵＳ (アマシャムバイオサイエンス)によりバンドを検出した。
【実施例１】
【００２２】
ミツバチ毒の直接作用に対するガングリオシドの抑制効果。ガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂのミツバチ毒によるＣＭ−ＭＣの活性化および細胞傷害への影響を図１に示す。具体的には、各濃度のガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂでそれぞれ１０分間処理し、６μｇ／ｍｌのミツバチ毒で１０分間刺激したＣＭ−ＭＣからのβ−ヘキソサミニダーゼの放出率と細胞傷害を検討した。それぞれのガングリオシドはミツバチ毒によるβ−ヘキソサミニダーゼを濃度依存的に抑制した（図１Ａ）。またガングリオシド処理をすることで、ミツバチ毒による細胞傷害が濃度依存的に強く抑制された（図１Ｂ）。
【実施例２】
【００２３】
ミツバチ毒由来メリチンの作用に対するガングリオシドの抑制効果。ミツバチ毒において含有量がもっとも多い成分はメリチンである（Habermann E. Bee and wasp venoms. Science. 1972  28;177(46):314-22.）。メリチンは肥満細胞から直接的にヒスタミンを放出させることが知られており、例えばラット腹腔内肥満細胞（Br J Pharmacol. 1986 Jun;88(2):457-62.）やＲＢＬ−２Ｈ３細胞（Arch Pharm Res. 2006   29:508-13.）があげられる。各濃度のガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂでそれぞれ１０分間処理し、細胞傷害を起こさない濃度、すなわち０．４５μｇ／ｍｌのミツバチ毒由来メリチンで１０分間刺激したときのβ−ヘキソサミニダーゼは、ガングリオシドの濃度依存的に抑制された（図２Ａ）。同様に３μｇ／ｍｌのミツバチ毒由来メリチンで刺激したときのβ−ヘキソサミニダーゼ放出及び細胞傷害も、ガングリオシドにより濃度依存的に抑制された（図２Ｂ、Ｃ）。
【実施例３】
【００２４】
合成メリチンの作用に対するガングリオシドの抑制効果。次にガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂの合成メリチンによるＣＭ−ＭＣの活性化および細胞傷害への影響を図３に示す。具体的には、０，１，１０，３０μＭのガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂでそれぞれ１０分間処理し、３μｇ／ｍｌの合成メリチンで１０分間刺激した。ガングリオシドは合成メリチンによるβ−ヘキソサミニダーゼの放出を濃度依存的に抑制した（図３Ａ)。また同様にガングリオシドは細胞傷害に対しても濃度依存的に抑制した（図３Ｂ)。
【実施例４】
【００２５】
ガングリオシドのメリチンによるリピドラフト擾乱作用に対する安定化。脂質ラフト領域におけるＧタンパク質ＧαｑとＧαｉの分布の変動について検討した。図４は合成メリチンによるＧタンパク質の脂質ラフト領域からの移行と、これに対するガングリオシドオの影響を示したものである。図４ＡではＧαｑが５及び６番目の画分、すなわち脂質ラフト領域が存在する画分に検出されることを示す。またＧαｑは合成メリチンにより減少するが、ガングリオシドＧＭ１とＧＤ１ａがこれを抑制した。図４ＢはＧαｉが５及び６番目の画分、すなわち脂質ラフト領域が存在する画分に検出されることを示す。またＧαｉは合成メリチンにより減少するが、ガングリオシドＧＭ１とＧＤ１ａがこれを抑制した。図４Ｃは脂質ラフトのマーカー分子であるフロティリン−１（図中ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ−１）が６番目の画分に存在することを示す。これは本画分が脂質ラフトであることを裏付ける。また合成メリチン処理によりフロティリン−１は減少するが、ガングリオシドＧＭ１とＧＤ１ａはこれを抑制し、無刺激のＣＭ−ＭＣにおけるそれと同程度にまで回復させた。  
【実施例５】
【００２６】
スズメバチ毒の直接作用に対するガングリオシドの抑制効果。ガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂのスズメバチ毒によるＣＭ−ＭＣの活性化および細胞傷害への影響を図５に示す。具体的には０，１，３，１０，３０μＭのガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａ，ＧＴ１ｂでそれぞれ１０分間処理し、８０μｇ／ｍｌのスズメバチ毒で１０分間刺激したＣＭ−ＭＣからのβ−ヘキソサミニダーゼの放出率を図５(Ａ)に、細胞傷害を図５(Ｂ)に示す。図５Ａから、ガングリオシドは、スズメバチ毒によるβ−ヘキソサミニダーゼの放出を濃度依存的に強く抑制することがわかる。また図５Ｂから、ガングリオシドはスズメバチ毒による細胞傷害を濃度依存的に強く抑制することがわかる。
【実施例６】
【００２７】
マストパランの作用に対するガングリオシドの抑制効果。ガングリオシドＧＭ１およびＧＤ１ａの合成マストパランによるＣＭ−ＭＣの活性化および細胞傷害への影響を図６に示す。具体的には、０，１，１０，３０μＭのガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａでそれぞれ１０分間処理し、合成マストパランで１０分間刺激した。ガングリオシドは１０μｇ／ｍｌのマストパランによるβ−ヘキソサミニダーゼの放出を濃度依存的に抑制した(図６Ａ）。同様にガングリオシドは、３０μｇ／ｍｌの合成マストパランによるβ−ヘキソサミニダーゼの放出率を濃度依存的に抑制した(図６Ｂ）。同様にガングリオシド処理したＣＭ−ＭＣを３０μｇ／ｍｌの合成マストパランで１０分間刺激したときの細胞傷害を図６Ｃに示す。ガングリオシド処理をすることで、合成マストパランによる細胞傷害が濃度依存的に強く抑制されることがわかる。特に３０μＭのガングリオシドＧＭ１，ＧＤ１ａで処理した際は、細胞傷害はそれぞれ１８％および１４％にまで減少した。
【実施例７】
【００２８】
ガングリオシドのマストパランによるリピドラフト擾乱作用に対する安定化。脂質ラフト領域におけるＧαｑとＧαｉの分布の変動について検討した。図７はマストパランによるＧタンパク質の脂質ラフト領域から移行と、これに対するガングリオシドオ影響を示したものである。フロティリン−１（図中ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ−１）は脂質ラフトに存在する分子であるが、５及び６番目の画分に４８ｋＤａのタンパク質として、その存在を確認することができる(図７．最上段のレーン)。Ｇαｑは５及び６番目の画分、すなわち脂質ラフト領域が存在する画分に４２ｋＤａのタンパク質として検出された。マストパランはＧαｑを減少させたが、ＧＭ１とＧＤ１ａはこれを回復させた(図７．中間部Ｇαｑのレーン)。同様にＧαｉも脂質ラフト領域に４２ｋＤａのタンパク質として検出され、マストパランによる減少は両ガングリオシドによって抑えられた(図７．下部Ｇαｉのレーン)。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂで１０分間処理することで、６μｇ／ｍｌミツバチ毒で１０分間刺激したＣＭ−ＭＣにおけるβ−ヘキソサミニダーゼの放出および細胞傷害が抑制されたことを示す。
【図２】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂで１０分間処理することで、０．４５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌで刺激したＣＭ−ＭＣにおけるβ−ヘキソサミニダーゼの放出および３μｇ／ｍｌで刺激したときのＣＭ−ＭＣに対する細胞傷害が抑制されたことを示す。
【図３】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂで１０分間処理することで、３μｇ／ｍｌ合成メリチンで１０分間刺激したＣＭ−ＭＣにおけるβ−ヘキソサミニダーゼの放出および細胞傷害が抑制されたことを示す。
【図４】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａの合成メリチンによる脂質ラフトにおけるＧαｑとＧαｉの分布の変動に対する安定化を示す。
【図５】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂで１０分間処理することで、８０μｇ／ｍｌスズメバチ毒で１０分間刺激したＣＭ−ＭＣにおけるβ−ヘキソサミニダーゼの放出および細胞傷害が抑制されたことを示す。
【図６】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂで１０分間処理することで、１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌ合成マストパランで刺激したＣＭ−ＭＣにおけるβ−ヘキソサミニダーゼの放出および３μｇ／ｍｌ合成マストパランのＣＭ−ＭＣに対する細胞傷害が抑制されたことを示す。
【図７】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａの合成マストパランによるＧαｑとＧαｉの分布の変動に対する安定化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の抗アレルギー剤およびハチ毒による傷害の予防または治療用組成物（以下、「本発明の製剤」と総称する）は、いずれもガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂからなる群から選択される少なくとも１種のガングリオシドを有効成分とする。
【００３１】
（Ｉ）有効成分
本発明の製剤の有効成分であるガングリオシドは、糖鎖上に１つ以上のＮ−アセチルノイラミン酸を結合したスフィンゴ糖脂質の一種である。
【００３２】
現在４０種類以上の異なる型のガングリオシドが同定されている。これらはヘキソースおよびシアル残基の数ならびに相対的位置において異なっており、この差異がそれらの分類の基本を形成している。公知のガングリオシドのほとんど全ては、セラミドとのグリコシド結合においてグルコース残基を有し、Ｄ−ガラクトース残基およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基も有している。
【００３３】
本発明において有効成分として使用するガングリオシドＧＭ１は、スフィンゴ糖脂質のうちシアル酸（Ｎアセチラミン酸；Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＮｅｕＡｃ））が糖鎖に結合した構造をもつガングリオシドファミリーの中で最も研究されたガングリオシドのうちの１つ、詳細にはモノシアロシルガングリオシドのＧＭ１である。化学式として下記のように表され、ガラクトシル−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシルグルコシルセラミドとも称される：Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４（ＮｅｕＡｃα３）Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（式中、ＧａｌはＤ−ガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン；ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、ＧｌｃはＤ−グルコース、Ｃｅｒはセラミドを意味する）。
【００３４】
当該ガングリオシドＧＭ１は、コレラ毒素に対する天然のレセプターであることが知られている。可溶性ガングリオシドＧＭ１は、高親和性に毒素に結合し、そしてそれを不活性化する（Svennerholm 1976 Adv Exp Med Biol., 71：191-204）。
【００３５】
かかるガングリオシドＧＭ１のＭは「モノシアロ」、すなわち１つのシアル酸が糖鎖に結合していることを意味する。同様に、ガングリオシドＧＤ１aのＤは「ジシアロ」、ガングリオシドＧＴ１ｂのＴは「トリアシロ」を表し、それぞれ２つあるいは３つのシアル酸が糖鎖に結合していることを意味している。ガングリオシドＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂは、いずれもガングリオシドＧＭ１と同様に毒素に親和性があり、それを不活性化する機能を有しているものの、かかる機能はシアル酸の数に応じて、すなわちガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂの順に増強すると報告されている（安藤進、「脳機能とガングリオシド」共立出版、1997年）。後述する試験例で示すように、肥満細胞の脱顆粒および細胞傷害に対するガングリオシドの抑制機能も、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１およびＧＴ１の順に増強する。
【００３６】
後述する試験例に示すように、これらのガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂはいずれも、ハチ毒による肥満細胞の脱顆粒を抑制する作用を有している。よって、これらのガングリオシドはいずれも、１種単独または２種以上を組み合わせて、有効に利用することができる。また、これらのガングリオシドはいずれも、ハチ毒による細胞傷害を低減する作用を有している。このため、これらのガングリオシドの少なくとも１種は、ハチ毒による傷害、具体的には前述するハチ毒のもつ細胞膜作動性ペプチドが誘発する直接作用による全身症状並びにハチ毒による細胞傷害を予防した改善治療するための医薬組成物の有効成分として有効に利用することができる。
【００３７】
（II）ハチ毒傷害に対する予防または治療用組成物
本発明が対象とするハチ毒傷害に対する予防または治療用組成物（以下、これらを総称して「本発明の製剤」ともいう）は、前述するガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂの少なくとも１つを有効成分とするものである。
【００３８】
なお、当該本発明の製剤は、上記ガングリオシドを塩の形態、または溶媒和物、例えば水和物の形態で含有するものであってもよい。また、本発明が対象とするガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂは、本発明の効果を損なわない限り、修飾されていていてもよい。かかる修飾物としては、上記ガングリオシドのヒドロキシル、シアリン酸並びにセラミド基でのパー硫酸化誘導体を除き、サッカライド、シアリン酸またはセラミド残基の少なくとも一つのヒドロキシル基が硫酸でエステル化されてなるガングリオシド、またはこれらの塩を例示することができる（特表平８−５０７３０７号公報）。
【００３９】
本発明の製剤は、これらのガングリオシド１００％からなるものであってもよいし、またそうでなくても既存の抗アレルギー作用、具体的には肥満細胞の脱顆粒を抑制する作用を発揮する医薬品をも含有するものであってもよい。この場合、好ましくは細胞傷害を低減する作用を発揮する有効量のガングリオシドを含有することが好ましい。
【００４０】
なお、本発明の製剤の肥満細胞脱顆粒抑制作用、言い換えると抗アレルギー作用は、前述した試験実施例で示したように、肥満細胞からのβ-ヘキソサミニダーゼ放出抑制作用を指標として判断することができる。当該β-ヘキソサミニダーゼは、肥満細胞が脱顆粒する際に、ヒスタミンなどの化学物質と共に放出される物質であり、従来からＩ型アレルギー抑制効果の指標として使用されているものである。ここでハチ毒のハチとしては、スズメバチ、ミツバチ、アシナガバチ、およびマルハナバチを挙げることができるが、好ましくはスズメバチおよびミツバチであり、より好ましくは攻撃性の強いスズメバチである。なお、スズメバチには、オオスズメバチ、クロスズメバチ、チャイロスズメバチ、キイロスズメバチ、ヒメスズメバチ、コガタスズメバチ、モンスズメバチ、キオピホオナガスズメバチなどの種類がある。またミツバチには、ニホンミツバチおよびセイヨウミツバチなどの種類がある。なお、本発明においてハチ毒とは、ハチ毒の毒成分である、例えばメリチンやマストパランを意味するものであるとともにハチ毒全体そのものを意味する。
【００４１】
本発明の製剤のうち、ハチ毒傷害の予防または治療用組成物が対象とするハチ毒傷害には、前述するハチ毒をアレルゲンとするI型アレルギー反応に関係して生じる症状や病態、ならびにハチ毒によって直接生じる細胞傷害が含まれる。
【００４２】
本発明の製剤は、通常、有効量のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ）に加えて、薬品製剤学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。製剤中のガングリオシドの配合量は、対象とする疾患の種類やその重篤度、また投与形態に応じて適宜選択されるが、通常、全身投与製剤の場合には、総量として、本発明製剤の全体重量（１００重量％）の１〜９９重量％、特に１０〜５０重量％とすることができる。
【００４３】
本発明の製剤の経口１回あたりの投与量としては、ガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ）の総量に換算して１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは２〜４ｍｇ／ｋｇである。静脈内投与をする場合、ガングリオシドの有効血中濃度が２０−７０μｇ／ｍＬ、より好ましくは４０〜５０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。また、本発明製剤の一日投与量としては、ガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ）の総量に換算して、通常４０ｍｇ〜２００ｍｇを挙げることができる。なお、これらの投与量は、体重、年齢、性別等により変動し得る。
【００４４】
本発明の製剤の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、の非経口投与を挙げることができる。好ましくは、経口投与、経皮投与である。
【００４５】
本発明の製剤は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調剤することができる。以下に、各剤型について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。
【００４６】
経粘膜投与や経皮投与を行う場合の剤型として、軟膏、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、外用剤（軟膏剤、クリーム剤、貼布剤、液剤）等が、適応部位に応じて適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易吸収化等の修飾を施すことができる（実施例８）。
【００４７】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる（実施例９）。
【００４８】
静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる（実施例１０）。
【００４９】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、生体利用能、副作用等を考慮した、有効成分の利用の最適化を施した製剤である。
【００５０】
本発明の製剤にはその剤型に応じて、製剤として有効な添加剤を配合することができる。製剤学的に許容される添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。また、既存の抗アレルギー薬やステロイドを含めて、ハチによるアナフィラキシーにも作用するも総合的なハチ刺され治療製剤も挙げられる（実施例１１）。
【００５１】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができる。溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、各種界面活性剤等を挙げることができる。
【００５２】
賦形剤としては、デンプン、ブドウ糖、白糖、セルロース等を挙げることができる。結合剤としては、デンプン、セルロース、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物等を挙げることができる。
【００５３】
コーティングとしては、白糖によるものとフィルムコーティング法を挙げることができる。
【００５４】
外用剤の基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。
【００５５】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、滑石（タルク）、ワックス類、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００５６】
崩壊剤としては、デンプン、寒天、ゼラチン末、セルロース等を挙げることができる。
【００５７】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤等を挙げることができる。
【００５８】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール等を挙げることができる。
【００５９】
本発明のガングリオシドは、飲食物、化粧品等の形態でも提供されうる。本発明の医薬組成物を飲食物及び化粧品に添加することにより、その飲食物及び化粧品にハチ毒による毒作用を抑制するガングリオシドを配合することができる。飲食物としては、肉製品、加工野菜、惣菜類、菓子、パン、清涼飲料、果実飲料、酒類等又はその他の食品素材と混合した健康食品等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他の食品素材とは、例えば、糖類、食用タンパク質、アルコール、ビタミン、増粘多糖類、アミノ酸、色素、香料、乳化剤、膨張剤、保存剤等である。本発明の製剤の経口１回あたりの投与量としては、ガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ）の総量に換算して１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは２〜４ｍｇ／ｋｇである。化粧品等としては、化粧クリーム、化粧水、乳液、ファンデーション、口紅、マニキュア、ハンドクリーム、整髪料、ヘアトニック、育毛料、シャンプー、リンス、化粧石けんなどが挙げられ、歯磨剤、洗口剤等の日用品に使用することもできる。化粧品等を調製する場合には、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、動植物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、保存剤など、通常の化粧品素材として使用されているものを適宜配合して製造することができる。
【実施例８】
【００６０】
クリーム（外用剤）
下記処方に従って、クリーム１０ｇあたりガングリオシドを１ｇ含むクリームを調製する。なお、ここでガングリオシドは、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａまたはＧＴ１ｂを、それぞれを意味する。
ガングリオシド              １．０ｇ
ポリエチレングリコール      ０．３ｇ
ラノリン                      適量
【実施例９】
【００６１】
経口製剤（錠剤）
下記の組成により、１錠あたりガングリオシドを１００ｍｇ含む錠剤（1錠５００ｍｇ）を調製する。なお、ここで示すガングリオシドはそれぞれ、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａまたはＧＴ１ｂを指す。
1錠（５００ｍｇ）中
ガングリオシド                １００ｍｇ
乳糖                            ７２ｍｇ
セルロース                    １２４ｍｇ
デンプン                      １２４ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース    ６５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム        １０ｍｇ
甘味料                            ５ｍｇ
【実施例１０】
【００６２】
注射剤
下記処方に従って、ガングリオシドを８０ｍｇ含む注射剤２ｍｌバイアルあるいはアンプルを調製する。なお、ここでガングリオシドは、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａまたはＧＴ１ｂのいずれかを意味する。
ガングリオシド            ８０ｍｇ
塩化ナトリウム            １６ｍｇ
リン酸水素ナトリウム        ６ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム  ０．５ｍｇ
【実施例１１】
【００６３】
抗アナフィラキシー治療用配合剤。
下記処方に従って、ガングリオシドを２００ｍｇ含む注射剤１０ｍｌバイアルあるいはアンプルを調製する。なお、ここでガングリオシドは、ＧＭ１、ＧＤ１ａまたはＧＴ１ｂのいずれかを意味する。
ガングリオシド                ２００ｍｇ
ヒドロコルチゾンナトリウム    １３３７ｍｇ（ヒドロコルチゾン１，０００ｍｇ相当）
リン酸水素ナトリウム            ２９６ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム            ２７ｍｇ
【産業上の利用可能性】
【００６４】
ガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ）を得る方法は、どのような方法であってもよい。例えば、これらのガングリオシドはいずれもサツマイモなどの植物、牛乳などの乳、魚類から哺乳類にいたる多くの脊椎動物の脳や脊髄、ならびに神経細胞に含まれているため(Rahmann et al., Differential involvement of gangliosides versus
phospholipids in the process of temperature adaptation in vertebrates. A
comparative phenomenological   and physicochemical study. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998. 845:72-91)、これらを原料として分離精製して使用することができる。また無脊椎動物ではヒトデ、ウミシダ、ウニなど棘皮動物およびそれらの生殖細胞に含まれている(稲垣昌宣;ヒトデ類、ウミシダ類由来スフィンゴ糖脂質の化学的研究、薬学雑誌 2008.128(8):1187-1194, 山田耕史;医薬素材としての棘皮動物ナマコ類のスフィンゴ糖脂質成分に関する創薬化学的研究薬学雑誌 2002. 122(12):1133-1143)。
【００６５】
なお、ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂはいずれも現在商業的に入手可能であり、例えばウシ脳由来のガングリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂはシグマアルドリッチ社、和光純薬社、フナコシ社、およびカルビオケムなどから入手することができる。
【００６６】
動物の脳組織から、生体に毒性の少ないエタノールを抽出溶媒として析出させる方法がある（特開平10-218892）。また牛乳から効率よく濃縮調整する方法（特開昭63−269992号公報）を利用して得られたものを用いてもよい。即ち、牛乳、バターミルク、ホエー、脱脂乳等の乳原料に、塩酸や乳酸等の酸、またはトリプシン、ペプシン等の蛋白質分解酵素を作用させて、蛋白質を分解し、得られた蛋白質分解溶液を、限外濾過法、ゲル濾過法または透析法により処理し、ガングリオシドを濃縮して調製する。また最近では、ガングリオシドの医薬品応用やガングリオシドの誘導体の合成が試みられている（Patent application publication. US2003/053517 A1. Toffano et al.,
Therapeutic use of ganglioside GM1 in the treatment ofspinal cord injury;
Mocchetti I. Exogenous gangliosides, neuronal plasticity and repair, and the
neurotrophins. Cell Mol Life Sci 2005. 62:2283−94)。さらに純度の高い化学合成の試みも行われているが、ガングリオシドの生物活性研究の展開とともに医薬品や保健商品としての有用性の認識が広まれば、開発動機が促進され工業規模で大量に生産することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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