(57)【要約】      （修正有）【課題】チチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体の抑制剤及び発癌抑制剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】チオール化合物を有効成分として用いる、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化抑制剤。該チオール化合物は、システイン、Ｎ-アセチル-システイン（ＮＡＣ）及びチオール基を有するシステイン誘導体から選択される１種又は２種以上である。及び重金属の存在下に、１種又は２種以上の被験物をチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質を含む評価系に供給する工程と、前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して発癌抑制能を評価する工程と、を備える、発癌抑制剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール化合物を有効成分とする、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化抑制剤。
【請求項２】
前記チオール化合物は、システイン、Ｎ-アセチル-システイン（ＮＡＣ）及びチオール基を有するシステイン誘導体から選択される１種又は２種以上である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
前記チオール化合物はシステイン及びＮＡＣである、請求項２に記載の抑制剤。
【請求項４】
重金属による前記タンパク質の二量体化を抑制する、請求項１〜３のいずれかに記載の抑制剤。
【請求項５】
前記重金属はヒ素である、請求項４に記載の抑制剤。
【請求項６】
チオール化合物を含有する、発癌抑制剤。
【請求項７】
チオール化合物を含有する、食品添加剤。
【請求項８】
チオール化合物を有効成分とする癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項９】
発癌抑制剤のスクリーニング方法であって、
重金属の存在下に、１種又は２種以上の被験物をチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質を含む評価系に供給する工程と、
前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して発癌抑制能を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項１０】
前記供給工程は、ヒ素の存在下で実施する工程である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質は、ｃ−ＲＥＴ遺伝子及び／又はＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、前記評価系は、ｃ−ＲＥＴ遺伝子及び／又はＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ遺伝子が発現される細胞である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
重金属含有可能性のある検体の安全性評価方法であって、
前記検体の有する前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して前記検体の有する二量体化促進活性を評価する工程と、
を備える方法。
【請求項１３】
重金属汚染物の発癌毒性の抑制方法であって、
前記重金属汚染物とチオール化合物とを接触させて、前記チオール化合物により重金属の発癌毒性を減少させる工程、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼの二量体化を介した発癌毒性の評価方法及び発癌予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、高濃度の重金属を含んだ飲料井戸水（＞５ｍｇ／リットル）の飲用による慢性重金属中毒患者の数は、世界で７０００万人以上であることが報告され、エイズウイルス感染者の数を上回るとさえ言われている。近年、こうした慢性重金属中毒患者では、皮膚癌、肺癌、肝臓癌、膀胱癌等の発癌リスクが増加することが報告されている(非特許文献１、２，３、４)。これまで、ヒ素は、癌原遺伝子産物とマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）といった発癌関連分子を活性化することで、ヒトの良性細胞の悪性転化に関与するする可能性が示されている（非特許文献５、６）。逆に、ヒ素は血液系腫瘍に対してだけでなく固形腫瘍に対してもアポトーシスを介した抗癌作用を持つことも報告されている（非特許文献７、８、９、１０）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Mandal BK et al., Chem Res Toxicol. 14:371-378.
【非特許文献２】Schwartz RA, 1997, Int J Dermatol. 36:241-250.
【非特許文献３】Shi et al., Mol Cell Biochem. 255:67-78.
【非特許文献４】Smith AH et al., 1992. Cancer risks from arsenic in drinking water. Environ. Health Perspect. 97:259-267
【非特許文献５】Benbrahim-Tallaa L et al., Toxicol Appl Pharmacol. 2005 Aug 15;206(3):288-98.
【非特許文献６】Achanzar WE et al., J Natl Cancer Inst. 2002 Dec 18;94(24):1888-91.
【非特許文献７】Dilda PJ et al., Arsenical-based cancer drugs. Cancer Treat Rev. 2007
【非特許文献８】Ivanov VN et al., J Biol Chem. 2004 May 21;279(21):22747-58.
【非特許文献９】Niu, C et al., Blood 94:3315-3324; 1999.
【非特許文献１０】Soignet, S. L. et al., N. Engl. J. Med. 339:1341-1348; 1998.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ヒ素の癌に対する正（抗癌作用）と負（腫瘍促進作用）の二方向の作用のメカニズムについてはほとんど分かっていない。このため、ヒ素等の重金属に誘起される癌に対する有効な予防方法も知られていない。さらに、こうした重金属により汚染された可能性のある水の発癌毒性を簡易に評価する手法も知られていない。
【０００５】
本明細書の開示は、環境中にあるヒ素などの重金属による発癌毒性を評価する技術、あるいは当該毒性を低下させることができる技術を提供することを目的とする。すなわち、重金属の毒性を低下させることのできる薬剤、重金属を含む可能性のある摂取物の毒性評価方法、当該摂取物中の重金属毒性を抑制する浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ヒ素の発癌の作用メカニズムを解明する過程において、ヒ素など重金属を介した発癌メカニズムに関する知見を得た。さらに、チロシンキナーゼ活性を有する遺伝子産物の二量体化を抑制して発癌を抑制するのに有効な化合物やそのような化合物のスクリーニング方法に関する知見も得た。本明細書の開示によれば以下の手段が提供される。
【０００７】
本明細書の開示によれば、チオール化合物を有効成分とする、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化抑制剤が提供される。また、チオール化合物を含有する、発癌抑制剤が提供される。さらに、チオール化合物を含有する、添加剤、栄養補助組成物及び飲料が提供される。さらにまた、チオール化合物を有効成分とする癌の予防又は治療用医薬組成物が提供される。これらの開示に関し、前記チオール化合物は、システイン、Ｎ-アセチル-システイン（ＮＡＣ）及びチオール基を有するシステイン誘導体から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。また、これらの各種薬剤及び医薬組成物は、重金属によるチロシンキナーゼ活性抑制剤であることが好ましい。より好ましくは、ヒ素によるチロシンキナーゼ活性を抑制するものである。さらに、前記チオール化合物はシステイン及びＮＡＣであることが好ましい。
【０００８】
本明細書の開示によれば、発癌抑制剤のスクリーニング方法であって、重金属の存在下に、１種又は２種以上の被験物をチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質を含む評価系に供給する工程と、前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して発癌抑制能を評価する工程と、を備える、方法が提供される。
【０００９】
前記スクリーニング方法においては、前記供給工程は、ヒ素の存在下で実施されることが好ましい。さらに、前記タンパク質は、ｃ−ＲＥＴ遺伝子及び／又はＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、前記評価系は、ｃ−ＲＥＴ遺伝子及び／又はＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ遺伝子が発現される細胞であることが好ましい。
【００１０】
本明細書の開示によれば、重金属含有可能性のある検体の安全性評価方法であって、前記検体の有する前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して前記検体の有する二量体化促進活性を評価する工程と、を備える方法が提供される。前記検体は、食用又は飲用であることが好ましい。
【００１１】
本明細書の開示によれば、重金属汚染物の浄化方法であって、前記重金属汚染物とチオール化合物とを接触させる工程を、備える、方法も提供される。前記重金属汚染物は食用又は飲用であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】変異型RET cDNAコンストラクトの模式図（１Ａ）とRET-PTC1及びその変異型のｃＤＮＡコンストラクトの模式図（１Ｂ）とを示す図である。
【図２】ヒ素がｃ−ＲＥＴキナーゼ活性をｃ−ＲＥＴタンパク質の二量体化により促進することを示す図である。
【図３】ヒ素が遺伝的変異により既に活性化されたＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａを、その二量体化によりスーパー活性化することを示す図である。
【図４】ヒ素が細胞外ドメインなしのＲＥＴの二量体化を介した活性化を促進することを示す図である。
【図５】ヒ素が、３７６位のシステインをアラニンで置換した細胞外ドメイン除去ＲＥＴの二量体化を促進しないことを示す図である。
【図６】ヒ素が免疫沈降させたＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質の二量体〜多量体化を介した活性化を促進することを示す図である。
【図７】NIH3T3細胞、c-RET及びRET-MEN2Aが導入されたNIH3T3細胞におけるチロシンキナーゼの（無刺激状態の）本質的な活性レベルとヒ素の効果を示す図である。
【図８】ヒ素によるc-RETの活性化、RET-MEN2Aのスーパー活性化に対するL-システインの効果を示す図である。
【図９】ヒ素による活性化型MMP-2分泌におけるL-システインの効果を示す図である。
【図１０】ヒ素によるPARP分解におけるL-システインの効果を示す図である。を示す図である。
【図１１】ヒ素による細胞死におけるL-システインの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書の開示は、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化抑制剤、発癌抑制剤、癌の予防・治療用医薬組成物、発癌抑制剤のスクリーニング方法、重金属含有可能性のある検体の安全性評価方法、重金属汚染可物の浄化方法等に関する。本発明者は、非悪性細胞株（癌原遺伝子であるc-RETをNIH3T3細胞に導入した細胞株）と悪性細胞株（癌遺伝子であるRET-MEN2AをNIH3T3細胞に導入した細胞株）を作製しヒ素の２つの相反する作用を明らかにしようとした。ヒ素は、原癌遺伝子c-RETのチロシンキナーゼ活性を促進しただけでなく、癌遺伝子RET-MEN2Aタンパク質の三次元構造の修飾（二量体〜多量体形成）を促進することで活性化した。また、ヒ素は、活性化型のマトリックスメタロプロテイナーゼ-２（MMP-2）の分泌をRET-MEN2Aを導入した細胞株、c-RETを導入した細胞株の両方で上昇させた。これらの結果より、ヒ素は悪性細胞株、非悪性細胞株の両方に対して、腫瘍促進効果を持つことがわかった。一方、ヒ素の抗癌作用は、悪性細胞株、非悪性細胞株の両方に対してポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）の分解と細胞死の促進によって示された。一方、L-システインはこうした癌原遺伝子や癌遺伝子の産物のチロシンキナーゼ活性及びダイマー化を促進した。以上のことから、Ｌ−システインなどのチオール化合物は、癌の発症の起因となるチロシンキナーゼ活性を有する遺伝子産物の二量体化がわかった。以下、本明細書の開示による各種実施形態について適宜図面を参照しながら説明する。
【００１４】
（チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化抑制剤）
本明細書に開示されるチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化抑制剤（以下、単に本抑制剤という。）は、チオール化合物を有効成分とすることができる。
【００１５】
本二量体抑制剤は、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化を抑制することができる。チロシンキナーゼは、タンパク質のチロシン残基を特異的にリン酸化する酵素である。チロシンキナーゼには、増殖因子が結合して活性化する受容体型と、増殖因子が結合しない非受容体型の二つがある。したがって、本明細書においてチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質としては、受容体型チロシンキナーゼ及びチロシンキナーゼ活性を有する発癌遺伝子産物が挙げられる。このような受容体型チロシンキナーゼは、文献（Kawamoto Y, Takeda K, Okuno Y, Yamakawa Y, Ito Y, Taguchi R, Kato M, Suzuki H, Takahashi M, Nakashima I. 2004. Identification of RET autophosphorylation sites by mass spectrometry. J Biol Chem. 279:14213-14224.）に示されるように数多く知られているが、例えば、上皮成長因子受容体(EGRR)、血小板由来増殖因子（PDGF）受容体(PDGFR)、ニューロトロフィン（神経栄養因子）受容体、インスリン受容体およびインスリン様増殖因子（insulin-like growth factor、IGF1）受容体、血管内皮細胞増殖因子 (VEGF) 受容体 (VEGFR)、幹細胞因子（Stem cell factor、scf）受容体（c-KIT）等を示すことができる。これらのEGFR、PDGFR、VEGFR、c-KIT遺伝子等の癌原遺伝子産物は、癌促進分子としても知られている。また、癌遺伝子産物としては、RET-MEN2A、RET-MEN2B、RET-PTC、RFP-RET遺伝子産物等が挙げられる。
【００１６】
（チオール化合物）
チオール化合物は、水素化されたイオウを末端に有する化合物であり、一般式Ｒ−ＳＨ（Ｒは有機基を表す。）で表すことができる。チオール化合物としては、特に限定されないでＳＨ基を備える有機化合物が挙げられるが、ヒトを含む哺乳類などへの投与を考慮すると、システインのほか、Ｎ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）などのシステイン誘導体及びメチオニンが挙げられる。また、グルタチオン等が挙げられる。なお、システイン、メチオニン、ＮＡＣ等に関し、光学異性体の存在する化合物に関しては、Ｌ−体であってもＤ−体であってもよく、ラセミ体であってもよい。好ましくは、Ｌ−体及びラセミ体であり、より好ましくはＬ−体である。チオール化合物のなかでも、システイン及びＮＡＣが好ましい。チオール化合物は、１種を用いるほか２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１７】
本明細書の開示を拘束するものではないが、チオール化合物の前記タンパク質の二量体化抑制効果は、チオール化合物が重金属と反応し、前記タンパク質中のＳＨ基が重金属による酸化を免れるからであると推測される。チオール化合物の前記タンパク質の二量体化抑制作用は、例えば、非還元状態で泳動されたウエスタンブロット法 (Kato et al, Mol Biol Cell , Vol.11, 93-101, January 2000)や質量分析機(LC-MS) 等により二量体を検出することにより測定できる。より具体的には、非還元状態でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ後、メンブランへの転写、抗体との反応させることにより検出することができる。また、二量体化抑制作用により、チロシンキナーゼの活性化が抑制されるため、チロシンキナーゼ活性を測定することによってもよい。チロシンキナーゼ活性はキナーゼアッセイ法(Kato et al, Mol Biol Cell , 2000; 中島泉（編）．免疫実験法ハンドブック. 名古屋大学出版会, 2006)によっても測定することができる。あるいは、市販のキナーゼアッセイキットを用いて測定してもよい。このような量的評価を行うことで本抑制剤を適用する系におけるチオール化合物の有効量を取得することができる。
【００１８】
本二量体抑制剤は、ヒ素などの重金属の存在下又は非存在下でも前記タンパク質の二量体化を抑制することができる。ヒ素などの重金属は前記タンパク質の二量体化を促進するが、チオール化合物は、こうした促進物質の存在下であっても、有効に前記タンパク質の二量体化を抑制できる。また、本二量体化抑制剤は、ヒ素などの重金属以外の要因による前記タンパク質の二量体化も抑制できる。
【００１９】
なお、本明細書において、「重金属」とは、ヒ素のほか、クロム、カドミウム、水銀、亜鉛、マンガン、コバルト、ニッケル、モリブデン、タングステン、スズ、ビスマス、ウラン、プルトニウム、鉛、金、銀、銅、アンチモン、バリウム、ストロンチウム等が挙げられる。なかでも、本明細書においては、ヒ素、鉄、コバルト、ニッケル、金、銀、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、スズ、鉛、アンチモン、ビスマス、バリウム、ストロンチウム等を対象とすることができる。
【００２０】
（発癌抑制剤）
本二量体化抑制剤は、前記タンパク質の二量体化を抑制できることから、チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化を抑制して、ヒ素による健康への悪影響を抑制し、癌を予防しあるいは悪化を抑制する発癌抑制剤として用いることができる。
【００２１】
（添加剤としての利用）
本二量体抑制剤は、例えば、ヒ素などの重金属が混入ないし含有される可能性のある食品（飲料を含む）に対する添加剤としても利用することができる。本二量体化抑制剤が、食品とともに摂取されることで、含有される可能性のあるヒ素などの重金属によるチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化を抑制して、ヒ素による健康への悪影響を抑制し、癌を予防しあるいは悪化を抑制することができる。本明細書に開示される添加剤を添加する対象としては、生鮮食品、加工食品、飲料等、特に限定されない。本二量体化抑制剤は、例えば、ヒ素などの重金属による汚染可能性のある井戸水、湧水、河川水及び水道水並びにこれらを原料水とする飲料（水及びそのほかの飲料を含む。）に好ましく用いられる。具体的には、バングラデシュ、ベトナム、タイ、カンボジア、中国、モンゴル、台湾、アメリカ、マレーシア等における飲用水、特に、井戸水等の重金属汚染地域において、重金属の発癌毒性を抑制するために、貯蔵された飲用井戸水等に対する添加剤として用いることができる。
【００２２】
（食用組成物）
本明細書に開示される食用組成物は、チオール化合物を含有することができる。チオール化合物は、ヒ素をはじめとする重金属によるチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質二量体化を抑制することができる。食用組成物中にチオール化合物を含有することで、当該食用組成物や食餌中の重金属による悪影響を抑制し、発癌を予防しあるいは悪化を抑制することができる。食用組成物としては、特に限定しないで固体、流動体、ゲル状体、液体等、特に食品の状態や組成を限定しない。飲料であってもよい。例えば、食品組成物は、重金属含有可能性のある、井戸水、湧水、河川水及び水道水並びにこれらを原料水とする飲料（水及びそのほかの飲料を含む。）であることが好ましい。
【００２３】
（栄養補助用組成物）
本明細書に開示される栄養補助用組成物は、チオール化合物を含有することができる。本明細書に開示される栄養補助用組成物は、食餌に含まれる可能性のある前記タンパク質の二量体化を抑制して、重金属による健康への悪影響を抑制し、癌を予防しあるいは悪化を抑制することができる。特に、ヒ素などの重金属による汚染可能性のあるチロシンキナーゼ活性のあるタンパク質の二量体化を抑制して、例えば、重金属中毒患者のような重金属による健康への悪影響を抑制し、癌を予防しあるいは悪化を抑制することができる。栄養補助用組成物としては、経口摂取の他、経管摂取の形態を採ることができる。栄養補助用組成物は、固体、流動体、ゲル状体、液体等各種の形態を採ることができる。また、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤等、医薬品に準じ各種の経口用製剤形態を採ることもできる。
【００２４】
（癌の予防又は治療用医薬組成物）
本明細書に開示される癌の予防又は治療用医薬組成物（以下、単に本医薬組成物という。）は、チオール化合物を有効成分として含有することができる。本発明者らは、上述のように、ヒ素が特定のチオール基を標的として作用してチロシンキナーゼ活性を有する遺伝子産物の活性化、すなわち、二量体の形成を促進するという知見を得た。また、Ｌ−システインなどのチオール化合物がこのようなヒ素による二量体形成を抑制するという知見も得た。チロシンキナーゼ活性を有する遺伝子産物の二量体化は、各種の癌を誘発することが知られている。したがって、チオール化合物は、ヒ素によって誘発される癌のほか、前記タンパク質、すなわち、チロシンキナーゼ活性を有する遺伝子産物の二量体化が関連した癌の誘発を抑制しあるいは悪化を抑制すると考えられる。このような癌としては、多発性内分泌腺種2A型（MEN2A）等(Asai N et al., Mol Cell Biol. 1995 Mar;15(3):1613-9)が挙げられる。また、EGFR、PDGFR、VEGFR、c-KITをはじめとする受容体型チロシンキナーゼの二量体形成による活性化が直接的又は間接的に発症に関わっていることが報告されている癌についても、チオール化合物が有効であると考えられる。具体的には、乳癌、子宮癌、皮膚癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、胆嚢・胆管癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、口腔低癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、甲状腺癌、精巣癌、前立腺癌、悪性黒色腫、白血病、骨肉腫、リンパ腫が挙げられる。
【００２５】
本医薬組成物は、例えば、重金属汚染可能性のある井戸水、湧水、河川水及び水道水並びにこれらを原料水とする飲料（水及びそのほかの飲料を含む。）飲用する個体（ヒト及び動物）に投与されることが好ましい。これらの飲用個体において、前記タンパク質の二量体化が抑制され又は発癌可能性が低減された飲用水あるいは飲料であることが好ましい。
【００２６】
本医薬組成物が含有するチオール化合物は、チオール化合物は、Ｌ−システイン及びチオール基を有するＬ−システイン誘導体から選択される１種又は２種以上であることが好ましく、より好ましくはＬ−システインである。
【００２７】
本医薬組成物は、各種製剤形態を採ることができる。本医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤若しくはシロップ剤等の経口投与用組成物である。これらの組成物には、更に、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリン、カルボキシメチルデンプンのような澱粉誘導体；結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤：及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；脂肪酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、前記賦形剤と同様の化合物、及び、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いる事ができる。
【００２８】
本医薬組成物におけるチオール化合物の使用量は、混入可能性のあるヒ素の量、年齢、投与方法等により異なるが、おおよそ下記の許容量の範囲内において、１日当り１〜数回適宜投与されることが好ましい。例えば、チオール化合物(典型的には、L−システイン)は、体重６０ｋｇの成人に投与する場合に、一日あたりの下限はおおよそ30 mg/人とすることができ、好ましくは180 mg/人である。また、同上限おおよそは、2400 mg/人とすることができ、好ましくは240 mg/人である。
【００２９】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体抑制剤のスクリーニング方法(以下、単に本スクリーニング方法という。)は、重金属の存在下に、１種又は２種以上の被験化合物をチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質を含む評価系に供給する工程と、前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して前記１種又は２種以上の被験化合物の二量体化抑制活性を評価する工程と、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、「重金属によるチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質の二量体化の抑制化合物」及び／又は「重金属による発癌を抑制する化合物」をスクリーニングすることができる。
【００３０】
本スクリーニング方法を適用する被験化合物は特に限定されない。チオール化合物であってもよいし、そのほかの化合物であってもよい。また、本スクリーニング方法におけるチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質を含む評価系としては、非受容体型及び受容体型を問わず、癌原遺伝子産物または癌遺伝子産物を発現しているほとんど全ての細胞株を使用できるが、ヒトなどのc-ＲＥＴ遺伝子やＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ遺伝子を導入したヒトなどに由来する細胞であることが好ましい。このほか、評価系に適用可能な細胞としては、c-RETやRET-MEN2A遺伝子を導入した細胞が挙げられる。また、評価にあたり、前記タンパク質の二量体量やチロシンキナーゼ活性の測定方法は特に限定しないが、それぞれ既に説明した「還元状態と非還元状態の両方でのウエスタンブロット法」や「還元状態と非還元状態の両方でのin vitro キナーゼアッセイ法」等が挙げられる。
【００３１】
前記スクリーニング方法において、前記被験化合物の供給工程は、ヒ素の存在下で実施することが好ましい。また、前記遺伝子産物は、c-ＲＥＴ遺伝子及び／又はＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、前記スクリーニング方法は、ヒ素による発癌抑制剤のスクリーニング方法であることが好ましい。
【００３２】
（重金属含有可能性のある検体の安全性評価方法）
本明細書に開示される重金属含有可能性のある検体の安全性評価方法は、前記検体の有する前記タンパク質の二量体量及び／又はチロシンキナーゼ活性を測定して前記検体の有する二量体化促進活性を評価する工程と、を備えることができる。本評価方法によれば、検体が有する可能性のある二量体化促進活性を評価して、重金属による発癌毒性などの安全性を評価することができる。本評価方法を用いることで、検体の重金属含有程度や発癌毒性など安全性を容易に評価できる。尚、刺激の種類や強さによっては、癌遺伝子産物は二量体よりも多量体を形成することがある（図６Ｃのレーン３、４）。二量体も多量体も同様に、タンパク質の三次元修飾の結果であるので、二量体だけではなく、多量体も重金属含有可能性のある検体の安全性評価方法として用いることができる。
【００３３】
検体としては、重金属を含有する可能性があればよく、特に限定されない。典型的には、物質としては、井戸水、湧水、河川水及び水道水並びにこれらを原料水とする飲料水（水及び飲料を含む。）や、水産物及び水産加工品、野菜や果物等の食品、重金属を含有した薬剤等が挙げられる。さらに、ヒトや動物を対象として、体内に蓄積した重金属を浄化し、発癌を抑制するための薬剤としても使用できる。検体が飲料水などの液体の場合、重金属含有画分を含むように適宜分画・抽出してもよい。また、必要な重金属濃度を得るために希釈又は濃縮してもよい。また、検体が、固形物等の場合にも、重金属含有画分を含むように、適宜、抽出等の操作を行うことが好ましい。二量体化濃度及び／又はチロシンキナーゼ活性は既に述べたスクリーニング方法等と同様に実施すればよい。
【００３４】
（重金属汚染物の発癌毒性の抑制方法）
本明細書に開示される重金属汚染物の発癌毒性の抑制方法は、前記重金属汚染物とチオール化合物とを接触させて、前記チオール化合物により重金属の発癌毒性を減少させる工程、を備えることができる。本抑制方法によれば、重金属汚染物が有するチロシンキナーゼ活性を有する遺伝子産物の二量体化促進活性をチオール化合物により抑制して、重金属による発癌毒性を低減することができる。
【００３５】
重金属汚染物とチオール化合物とを接触させて重金属の発癌毒性を減少させる形態としては、特に限定されない。例えば、予め、ヒトなどの動物の体外において、重金属汚染物とチオール化合物とを接触（共存）させておき、この状態でこれらをそのまま体内に導入して体内において重金属による発癌毒性を減少させてもよい。この形態は、重金属汚染物の体内での発癌毒性を減少させる、浄化方法でもある。また、たとえば、重金属汚染物とチオール化合物とを別個にそれぞれヒトなどの動物の体内に導入してその体内においてこれらを接触させて、発癌毒性を減少させてもよい。より具体的には、前者としては、重金属汚染可能性のある汚染された水にチオール化合物を添加して飲用組成物等として飲用する形態が挙げられ、後者としては、本明細書に開示される予防・治療用医薬組成物が投与されること形態が挙げられる。さらに、他の形態として、Ｌ−システインなどのチオール化合物を担持させた固相担体（各種材料からなるビーズやこれらを充填したカラム等）と重金属汚染物とを接触させてもよい。チオール化合物を保持した固相担体を用いることで、チオール化合物とキレート結合した重金属を重金属汚染物から除去することで、重金属汚染物自体からヒ素をチオール化合物との接触により除去して発癌毒性を低減することもできる。この形態は、ヒ素をチオール化合物で除去することによる浄化方法でもある。
【００３６】
重金属汚染物は、本明細書の開示の抑制方法が重金属による発癌毒性を未然に防止するものであるため、重金属を含有する可能性があればよく、特に限定されない。典型的には、井戸水、湧水、河川水及び水道水並びにこれらを原料水とする飲料水（水及び飲料を含む。）や、水産物及び水産加工品等が挙げられる。重金属汚染物が飲料水などの液体の場合、重金属含有画分を含むように適宜分画・抽出してもよい。また、必要な重金属濃度を得るために希釈又は濃縮してもよい。また、検体が、固形物等の場合にも、重金属含有画分を含むように、適宜、抽出等の操作を行うことが好ましい。二量体化濃度及び／又はチロシンキナーゼ活性は既に述べたスクリーニング方法等と同様に実施すればよい。
【００３７】
なお、本抑制方法は、上記接触工程を備える、浄化物の製造方法としても実施できる。これらの方法によって得られる浄化物は、ヒトを含む動物が摂取等したときにおいても、重金属による発癌毒性が低減されており、より安全性の高いものとなっている。
【実施例】
【００３８】
以下、本明細書の開示を、実施例を挙げて具体的に説明する。なお、以下の実施例は、本明細書の開示を説明するものであって、限定するものではない。最初に、以下の実施例で用いた形質転換細胞の作製及びキナーゼアッセイについて説明する。
【００３９】
（形質転換細胞の作製）
以下の実施例で用いるc-RET導入細胞及びRET-MEN2A導入細胞を作製するために、ロングアイソフォーム（1114アミノ酸）をコードするヒトRET cDNAを準備した。このcDNAをAPtag-1ベクター（Maloney murine leukemia virus long terminal repeat を有する）（Kato M et al., Cancer Res. 62:2414-2412(2002)）にクローニングした。文献（Kato et al, Mol Biol Cell , Vol.11, 93-101, January 2000））に記載の方法によりヒトRET-の634番目のシステインをアルギニンに置換することでヒトRERT-MEN2A（Cys634Arg; RERT-MEN2A）のcDNAを同じベクターにクローニングした。１０μｇのＮＩＨ ３Ｔ３ ＤＮＡとともにこれらの各組換えプラスミド（０．１μｇ）でNIH 3T3細胞（５×１０5 cells／60mm 直径のディッシュ）を形質転換した。細胞を８％牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル最小必須培地（DMEM）、で培養した。これらのｃＤＮＡの構造を図１Ａに示す。図１Ａにおいて、SSはシグナル配列、CADはカドヘリンライクドメイン、CYSはシステインリッチ領域、TMは膜貫通ドメイン、TK１、TK2はチロシンキナーゼドメインを、それぞれ示す。
【００４０】
（キナーゼ活性の測定）
NIH3T3細胞、c-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞における、キナーゼの活性化レベルをRETキナーゼのY905のリン酸化レベルと、in vitro キナーゼアッセイ法とで確認した。RETキナーゼのY905のリン酸化レベルは、キナーゼ活性、形質転換活性（癌化能）、転移能に非常に重要であることを示している（Iwashita T et al., Oncogene. 1996 Feb 1;12(3):481-7, Kato M et al., Antioxid Redox Signal. 2000 Winter;2(4):841-9, Kato et al. 2002）。このため、c-RETとRET-MEN2AのY905のリン酸化レベルを調べることでキナーゼ活性の測定を行うことも可能である。
【００４１】
（キナーゼのＹ905のリン酸化レベルの測定）
0.1〜1000μＭの範囲内の各種濃度のヒ素（ＮａＡｓＯ2）をc-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞に加えて培養後、2ME非含有の非還元状態および2ME含有の還元状態のサンプルバッファを用いてサンプルを作製し、抗リン酸化Y905（pY905）抗体、抗RET抗体を用いてウエスタンブロットを行うことにより、細胞内におけるRETタンパク質の単量体、二量体、多量体の発現量およびRETキナーゼの単量体、二量体、多量体のチロシンキナーゼ活性レベルを調べた。
【００４２】
（in vitro キナーゼアッセイ）
in vitro キナーゼアッセイは、文献（既出免疫実験法ハンドブック）に記載の方法で行った。0.1〜1000μＭの範囲内の各種濃度のヒ素をc-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞に添加し、培養後、細胞をmＲＩＰＡバッファで溶解し、遠心して上清を細胞溶出液とした。この細胞溶出液にビーズに固定化した抗ＲＥＴ抗体を添加し、４℃でインキュベートしてＲＥＴタンパク質の免疫沈降をおこなった。免疫沈降後、mＲＩＰＡバッファ及びキナーゼバッファで洗浄し、２μｇのmyelin basic protein（MBP）（基質）とともにキナーゼバッファ中に懸濁し、γ-32P ATPを加えて、３０℃で20分間インキュベートした。その後、２−ＭＥ含有及び非含有のサンプルバッファを加えてサンプルを作製し、SDS-PAGEにて、in vitroに抽出されたRETキナーゼの単量体、二量体、多量体におけるキナーゼ活性レベルを調べた。
【００４３】
なお、ウエスタンブロットは、文献（既出免疫実験法ハンドブック）に記載の方法で行った。すなわち、細胞溶解物（５０μｇ／レーン）を還元状態（+2ME：2-メルカプトエタノール添加）と非還元状態（-2ME：2-メルカプトエタノール非添加）にてSDS-PAGEに供し、その後、２フッ化ポリビリニデン膜に転写した。抗体との反応後に蛍光試薬で検出した。すべての実験は3回行われ、再現性が確認されている。
【実施例１】
【００４４】
（二量体化を伴うヒ素媒介性ｃ−ＲＥＴキナーゼ活性化）
本実施例では、ｃ−ＲＥＴ導入細胞を用いて、ウエスタンブロット及びキナーゼアッセイを用いて、濃度依存的にｃ−ＲＥＴチロシンキナーゼが活性化されるかどうかを確認した。すなわち、ｃ−ＲＥＴ導入細胞の溶解液につき、ヒ素の存在下及び非存在下で抗リン酸化チロシン（図２Ａのレーン１〜４）又は抗ＲＥＴ抗体（図２Ａのレーン５〜８）によるウエスタンブロット又は抗ＲＥＴ抗体による免疫沈降後のキナーゼアッセイ（図２Ｃ、２Ｆ）を行った。また、前記細胞溶解液を、抗チロシン９０５リン酸化（Ｙ９０５−Ｐ）抗体（図２Ｂレーン１、２，２Ｅのレーン１〜４）、抗チロシン１０６２リン酸化（Ｙ１０６２−Ｐ）抗体（図２Ｂのレーン３，４）又は抗ＲＥＴ抗体（図２Ｂのレーン５、６，２Ｄのレーン１〜８）でウエスタンブロットを行った。図２Ａ〜２Ｃ、図２Ｄのレーン１〜４、図２Ｅと２Ｆのレーン１，２についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元状態で行った。また、図２Ｄのレーン５〜８、図２Ｅと２Ｆのレーン３、４は、非還元状態で行った。また、図２Ａ、２Ｂは１０％、図２Ｃは１３％、図２Ｄ〜２Ｆは、６％のゲル濃度であった。
【００４５】
結果を図２Ａ〜２Ｆに示す。なお、図２以降の図において、ＩＰは免疫沈降、ＩＢはイムノブロット(ウエスタンブロット)、ｐＲＥＴは、自己リン酸化ｃ−ＲＥＴ、ｐＭＢＰはリン酸化ミエリンリン酸化タンパク質、Ｍは単量体ＲＥＴ、Ｄは二量体ＲＥＴを示す。
【００４６】
図２Ａに示すように、１０〜１０００μＭのヒ素が濃度依存的にｃ-ＲＥＴチロシンキナーゼの活性を向上させた。加えて、１００μＭ（図２Ｂ参照）のヒ素がｃ-ＲＥＴ分子における９０５位及び１０６２位のチロシン（Ｙ９０５及びＹ１０６２）の双方のリン酸化を促進した。これらリン酸化は、チロシンキナーゼの活性化と転移活性に重要であることがわかっている(Kato M et al., Cancer Res. 62:2414-2412(2002))。１００μＭのヒ素による自己リン酸化とＭＢＰ（ミオリン塩基タンパク質）のリン酸化の促進は、in vitroキナーゼアッセイによっても確認できた（図２Ｃ）。
【００４７】
次に、ヒ素媒介性のｃ−ＲＥＴキナーゼの活性化がｃ−ＲＥＴタンパク質の二量体化に依存しているかどうかを確認した。結果は、図２Ｄに示すように、非還元状態において、二量体化ｃ−ＲＥＴタンパク質は、１０〜１０００μＭのヒ素により濃度依存的に増加した。これに対して、単量体のｃ−ＲＥＴタンパク質は、ヒ素濃度依存的に減少した。増大した二量体化ｃ−ＲＥＴタンパク質レベルは、還元剤（２ＭＥ）による処理によって減少した。このことは、二量体化は、チオール依存的に生じていることを示唆している。また、図２Ｅ及び図２Ｆに示すように、二量体化を形成したタンパク質におけるＹ９０５のリン酸化レベル（図２Ｅのレーン３、４）及び自己リン酸化レベル(図２Ｆのレーン３，４)は、ヒ素（１００μＭ）により顕著に増大した。これに対応して、増大した二量体部分におけるＹ９０５のリン酸化と自己リン酸化は、還元状態（図２Ｅ及び２Ｆのレーン１及び２）において減少した。
【実施例２】
【００４８】
（ヒ素媒介性のＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａキナーゼのスーパー活性化）
本実施例では、既に説明したウエスタンブロットとキナーゼアッセイを用いて、ヒ素によって媒介されるＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａキナーゼのスーパー活性化について確認した。すなわち、ＲＥＴ−ＭＥＴ２Ａ導入細胞の溶解液につき、ヒ素の存在下（１００μＭ）及び非存在下で、抗ＲＥＴ抗体による免疫沈降後に抗リン酸化チロシン（図３Ｂのレーン１，２）及び抗ＲＥＴ抗体（図３Ｂのレーン３，４）によるウエスタンブロット、抗ＲＥＴ抗体による免疫沈降後にin vitroキナーゼアッセイ（図３Ａ、３Ｄ及び３Ｇ）を行った。また、細胞溶解液を、抗Ｙ９０５−Ｐ抗体（図３Ｃのレーン１，２、３Ｆのレーン１〜４）、抗Ｙ１０６２−Ｐ抗体（図３Ｃのレーン３，４）又は抗ＲＥＴ抗体（図３Ｃのレーン５、６、３Ｅのレーン１〜４）でウエスタンブロットを行った。図３Ａ〜３Ｄ、図３Ｅ〜３Ｇのレーン１、２についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元状態（+2ME）で行った。また、図３Ｅ〜３Ｇのレーン３、４は、非還元状態（-2ME）で行った。また、図３Ｅ〜３Ｇは６％、図３Ｂ、３Ｃは１０％、図３Ａ、３Ｄは、１３％のゲル濃度であった。結果を図３Ａ〜図３Ｇに示す。
【００４９】
図３Ａに示すように、ＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａの構成的なキナーゼ活性は、遺伝的改変によりｃ−ＲＥＴキナーゼに比べて５〜１０倍増強された。これは、二量体化ＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａタンパク質の割合（約３０％、図３Ｅのレーン３）がｃ−ＲＥＴタンパク質の比率（１％未満、図２Ｄのレーン５）よりも相当程度高いからである。自己リン酸化のレベル（図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ）及びＭＢＰリン酸化（図３Ｄ）は、１００μＭのヒ素によりさらに３〜１０倍増大した。これらの結果によれば、ヒ素は、遺伝子改変により既に活性化されたＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａキナーゼをさらに活性化（スーパー活性化）することがわかった。非還元状態では、１００μＭのヒ素によって刺激されたＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ蛋白質の５０％以上が二量体の状態にあった（図３Ｅのレーン４）。そして、非還元状態において、二量体を形成したＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａの活性は、１００μＭのヒ素によって強く賦活された（図３Ｆ及び図３Ｇ）。ｃ−ＲＥＴにおいて示すように（図２、二量体状態におけるＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａのタンパク質及び活性化レベルは、還元状態において減少した（図３Ｅ〜３Ｇのレーン１、２）。これらの結果によれば、ヒ素は、ジスルフィド結合による二量体化の促進を介して、ＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａキナーゼをスーパー活性化することがわかった。
【実施例３】
【００５０】
（ヒ素媒介性ＲＥＴキナーゼ活性化の分子内標的）
本実施例では、ｃ−ＲＥＴタンパク質のヒ素反応性ドメインを確認した。すなわち、既述のウエスタンブロットとキナーゼアッセイを利用するとともに、ヒトＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質をコードするＤＮＡ（図１Ｂ参照、Takeda K, et al., FEBS Lett. 580:839-843, 2006.）を含むプラスミドベクターで、既に記載の方法に準じてＮＩＨ ３Ｔ３細胞（５×１０5 cells／６０ｍｍ直径のディッシュ）を形質転換し、ＲＥＴ−ＰＴＣ１導入細胞を得た。この導入細胞を用いて実験を行った。すなわち、ヒ素１０〜１００μＭ存在下に、抗ＲＥＴ抗体による免疫沈降後に、各図に示す抗体を用いてウエスタンブロット（図４Ａのレーン１、２及び図４Ａのレーン３，４）、または抗ＲＥＴ抗体による免疫沈降後、in vitroキナーゼアッセイ（図４Ｃ、４Ｆ）を先の実施例に準じて行った。また、前記細胞溶解液につき、抗Ｙ９０５−Ｐ抗体（図４Ｂのレーン１〜３、４Ｅのレーン１〜６）及び抗ＲＥＴ抗体（図４Ｂのレーン４〜６、４Ｄのレーン1〜６）を用いてウエスタンブロットを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元状態（図４Ａ〜４Ｃ、図４Ｄと４Ｅのレーン１〜３、図４Ｆのレーン１，２）及び非還元状態（図４Ｄと４Ｅのレーン４〜６、図４Ｆのレーン３，４）で行った。また、図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｅ及び４Ｆについては１０％、図４Ｃは１３％のゲル濃度で行った。結果を図４Ａ〜４Ｆに示す。
【００５１】
図４Ａ〜４Ｃに示すように、ヒ素（１０μＭ及び／又は１００μＭ）は、細胞外ドメインを除去したＰＥＴ−ＰＴＣ１のキナーゼの産生を向上させた。ヒ素（１０μＭ及び／又は１００μＭ）は、非還元状態において、二量体を形成したＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質（図４Ｄ）とキナーゼ活性（図４Ｅ、４Ｆ）のレベルを増大させた。また、還元状態では、二量体化したＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質は、ほとんど見られなかった。これらの結果から、ヒ素は、ＲＥＴタンパク質の細胞内ドメインにおけるシステインと少なくとも反応し、ジスルフィド結合を促進し、キナーゼの活性化を誘導することがわかった。
【実施例４】
【００５２】
（ヒ素媒介性ＲＥＴ−ＰＴＣ１キナーゼ活性化における標的アミノ酸）
本実施例では、ＲＥＴ−ＰＴＣ１において、ヒ素の標的となるシステインについて調べた。すなわち、ＲＥＴ−ＰＴＣ１中のシステインをアラニンに置換した変異体を発現するプラスミドベクターを既述の方法に準じて作製して導入細胞を取得し、これらの細胞につき同様に既述のウエスタンブロット及びキナーゼアッセイに準じて試験を行った。システイン３７６（Ｃ３７６）及びシステイン３６５（Ｃ３６５）は、他のチロシンキナーゼと比べてよく保存されている。したがって、システインをアラニンで置換した２種の変異体（ＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３６５Ａ及びＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３７６Ａ）を発現するそれぞれの導入細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を作製した（図１Ｂ）。
【００５３】
具体的には、ヒ素１００〜１０００μＭ存在下に、２種類の導入細胞の溶解液につき、抗ＲＥＴ抗体による免疫沈降後、in vitroキナーゼアッセイ（図５Ａのレーン３，４、５Ｂのレーン１〜５、５Ｄのレーン１〜８）を先の実施例に準じて行った。また、細胞溶解液につき、抗ＲＥＴ抗体（図５Ａのレーン１、２、５Ｃのレーン１〜１０）を用いてウエスタンブロットを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元状態（図５Ａ、５Ｂ、図５Ｃのレーン１、２、５、６及び７、図５Ｄのレーン１、２、５及び６）及び非還元状態（図５Ｃのレーン３、４、８、９及び１０、図５Ｄのレーン３、４、７及び８）で行った。結果を図５Ａ〜５Ｄに示す。
【００５４】
図５Ａのレーン１及び２に示すように、これら２種の変異体タンパク質ＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３６５Ａ及びＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３７６Ａの各細胞内発現量に差はなかったが（図５Ａのレーン１、２）、前者（ＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３６５Ａ）の活性は、他の一方よりもずっと高かった（図５Ａのレーン３、４）。ヒ素は、非還元状態において、二量体化形成を促進してＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３６５Ａの活性を増大させた（図５Ｂのレーン１、２；図５Ｃのレーン３，４；図５Ｄのレーン３，４）。しかしながら、１００μＭ及び１０００μＭのヒ素は、ＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３７６Ａキナーゼの活性を増大させなかった（図５Ｂのレーン３〜５、図５ＤＤのレーン５〜８）。また、非還元状態下のＲＥＴ−ＰＴＣ１−Ｃ３７６Ａの二量体状態にあるタンパク質（図５Ｃのレーン８〜１０）及びキナーゼ活性(図５Ｄのレーン７，８)のレベルはヒ素による刺激によっても変化しなかった。これらの結果から、細胞内ドメインにあるＣ３７６は、ヒ素媒介性の二量体化及びキナーゼ活性化の主要な標的アミノ酸であることがわかった。
【実施例５】
【００５５】
（免疫沈降させたＲＥＴタンパク質のヒ素媒介性のキナーゼ活性化）
本実施例では、ヒ素がチオール依存性の二量体形成を伴って免疫沈降させたＲＥＴタンパク質の活性を調節しているかどうかを調べた。すなわち、既述のキナーゼアッセイに準じて、ＲＥＴ−ＰＴＣ１のキナーゼ活性を試験した。抗ＲＥＴ抗体で免疫沈降させたＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質をビトロキナーゼアッセイ（図６Ａ、６Ｂ）及び１００ｎＭのヒ素の存在下及び非存在下で抗ＲＥＴ抗体（図６Ｃ）を用いてウエスタンブロットを行った。結果を図６Ａ〜６Ｃに示す。
【００５６】
図６Ａに示すように、免疫沈降させたＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質に直接添加された場合でも、ヒ素は、ＲＥＴ−ＰＴＣ１キナーゼの活性を増大させた。二量体状態にある免疫沈降させたＲＥＴ−ＰＴＣ１のキナーゼ活性は、非還元状態において１００ｎＭのヒ素により上昇した（図６Ｂ、レーン３，４）。また、二量体状態にあるＲＥＴ−ＰＴＣ１のキナーゼ活性は、還元状態において減少した（図６Ｂ、レーン１、２）。免疫沈降させたＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質のほとんどは、非還元状態において二量体状態あるいは多量体状態にあった（図６Ｃのレーン３）。二量体及び多量体を形成している免疫沈降されたＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質は、さらに、非還元状態においてヒ素（１００ｎＭ）によって、二量体〜多量体は、さらに増大された（図６Ｃのレーン４）。二量体状態又は多量体状態にあるＲＥＴ−ＰＴＣ１タンパク質のほとんどは、還元状態で減少した（図６Ｃのレーン１、２）。これらの結果から、ヒ素媒介性のキナーゼ活性化は、チオール依存的な反応であることがわかった。
【実施例６】
【００５７】
（c-RET、RET-MEN2Aキナーゼに対するヒ素の効果）
本実施例では、NIH3T3細胞、c-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞において、無刺激状態での本質的なチロシンキナーゼ活性を比較した。次いで、ヒ素の存在下での、チロシンキナーゼ活性を比較した。
【００５８】
c-RET導入細胞及びRET-MEN2A導入細胞を作製するために、ロングアイソフォーム（1114アミノ酸）をコードするヒトRET cDNAを準備した。このcDNAをAPtag-1ベクター（Maloney murine leukemia virus long terminal repeat を有する）（Kato M et al., Cancer Res. 62:2414-2412(2002)）にクローニングした。文献（Kato et al, Mol Biol Cell , Vol.11, 93-101, January 2000））に記載の方法によりヒトRET-の634番目のシステインをアルギニンに置換することでヒトRET-MEN2A（Cys634Arg; RERT-MEN2A）のcDNAを同じベクターにクローニングした。１０μｇのＮＩＨ ３Ｔ３ ＤＮＡとともにこれらの各組換えプラスミド（０．１μｇ）でNIH 3T3細胞（５×１０5 cells／60mm 直径のディッシュ）を形質転換した。細胞を８％牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル最小必須培地（DMEM）で培養した。これらのcDNAの構造を図１Ａに示す。図１Ａにおいて、SSはシグナル配列、CADはカドヘリンライクドメイン、CYSはシステインリッチ領域、TMは膜貫通ドメイン、TK１、TK2はチロシンキナーゼドメインを、それぞれ示す。
【００５９】
まず、NIH3T3細胞、c-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞における、キナーゼの活性化レベルをin vitro キナーゼアッセイ法にて比較した。一方、RETキナーゼのY905のリン酸化レベルは、キナーゼ活性、形質転換活性（癌化能）、転移能に非常に重要であることを示しているので（Iwashita T et al., Oncogene. 1996 Feb 1;12(3):481-7, Kato M et al., Antioxid Redox Signal. 2000 Winter;2(4):841-9, Kato et al. 2002）、c-RETとRET-MEN2AのY905のリン酸化レベルを調べることでキナーゼ活性の測定を行うことも可能である。
【００６０】
0.1〜1000μＭの範囲内の各種濃度のヒ素（ＮａＡｓＯ2）をc-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞に加えて培養後、2ME非含有の非還元状態および2ME含有の還元状態のサンプルバッファを用いてサンプルを作製し、抗リン酸化Y905（pY905）抗体、抗RET抗体を用いてウエスタンブロットを行うことにより、細胞内におけるRETタンパク質の単量体、二量体、多量体の発現量およびRETキナーゼの単量体、二量体、多量体のチロシンキナーゼ活性レベルを調べた。さらに、in vitro キナーゼアッセイ法を用いた。すなわち、0.1〜1000μＭの範囲内の各種濃度のヒ素をc-RET導入細胞、RET-MEN2A導入細胞に添加し、培養後、細胞をmＲＩＰＡバッファで溶解し、遠心して上清を細胞溶出液とした。この細胞溶出液にビーズに固定化した抗ＲＥＴ抗体を添加し、４℃でインキュベートしてＲＥＴタンパク質の免疫沈降をおこなった。免疫沈降後、mＲＩＰＡバッファ及びキナーゼバッファで洗浄し、２μｇのmyelin basic protein（MBP）（基質）とともにキナーゼバッファ中に懸濁し、γ-32P ATPを加えて、３０℃で20分間インキュベートした。その後、２−ＭＥ含有及び非含有のサンプルバッファを加えてサンプルを作製し、SDS-PAGEにて、in vitroに抽出されたRETキナーゼの単量体、二量体、多量体におけるキナーゼ活性レベルを調べた。
【００６１】
なお、ウエスタンブロットは、文献（既出免疫実験法ハンドブック）に記載の方法で行った。すなわち、細胞溶解物（５０μｇ／レーン）を還元状態（+2ME）と非還元状態（-2ME）にてSDS-PAGEに供し、その後、２フッ化ポリビリニデン膜に転写した。抗体との反応後に蛍光試薬で検出した。すべての実験は3回行われ、再現性が確認されている。
【００６２】
これらの結果を図７Ａ、７Ｂに示す。なお、図７Ａ、７Ｂにおいて、pRET、17KDaと155 kDaは、自己リン酸化されたRETを示し、pMBPはリン酸化されたミエリン塩基性タンパク質（MBP）を示す。
【００６３】
図７Ａに示すように、RET-MEN2A の自己リン酸化はc-RETよりも３〜１０倍高かった（図７Ａのレーン２，３）。RETキナーゼの基質である、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のリン酸化レベルもまたc-RET キナーゼのリン酸化レベルと比べて３〜１０倍上昇していた（図７Ａのレーン２，３）。さらに、905番のチロシンがフェニルアラニンに置換されたRET-MEN2A-Y905F細胞導入株のチロシンキナーゼ活性は、明らかに減少していた（図７Ａのレーン２〜４）。
【００６４】
また、図７Ｂに示すように、10〜１00 μMの濃度のヒ素を添加することで、c-RETの活性が2-10倍上昇した（図７Bのレーン1-4、9-12）。同じ濃度のヒ素は、遺伝子の点変異によって既に活性化されているRET-MEN2Aのキナーゼ活性をさらに激しく活性化（スーパー活性化）した（図７Bのレーン5-8、13-16）。
【実施例７】
【００６５】
（ヒ素によるc-RETの活性化、RET-MEN2Aのスーパー活性化に対するL-システインの効果の確認）
本実施例では、ヒ素によるc-RETキナーゼ活性のメカニズムを調べた。リガンドとの結合やRET-MEN2Aの点変異によって促進RETの二量体形成が促進されるとRETのキナーゼ活性が促進される(Asai N et al., Mol Cell Biol. 1995 Mar;15(3):1613-9、Santoro M te al., Science. 1995 Jan 20;267(5196):381-3, Chiariello M et al., Oncogene. 1998 May 14;16(19):2435-45)。そこで、ヒ素によるc-RETキナーゼの活性化は、c-RET二量体形成の促進によるものかどうかを調べた。具体的には、それぞれの濃度のヒ素、L-システインをc-RETあるいはRET-MEN2A導入NIH3T3細胞に同時に加え、37℃で90分培養し、細胞溶出液を抗RET抗体、抗pY905抗体を用いて還元条件下（＋２ＭＥ：２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）添加）及び非還元条件下（−２ＭＥ：２−ＭＥ添加なし）でウエスタンブロッティングを行った。すべての実験は3回行われ、再現性が確認されている。結果を図８Ａ、８Ｂに示す。
【００６６】
図８Ａに示すように、c-RETタンパク質二量体とY905がリン酸化されたc-RETタンパク質二量体は、非還元条件下において、ヒ素が存在しないときは非常に少ないが（図８Ａのレーン５と１３）、100 μMのヒ素添加により10倍以上増加することがわかった（図８Ａのレーン７と１５）。還元剤(2ME)を加えた還元条件下では、c-RETタンパク質二量体もY905がリン酸化されたc-RETタンパク質二量体も減少し（図８Ａのレーン1、3、9、11）、二量体形成は、チオール依存的に生じていること示唆した。ヒ素が存在しない時のc-RETタンパク質二量体形成とY905がリン酸化されたc-RETタンパク質二量体形成におけるL-システインの効果は少なかったが（図８Ａのレーン2、6、10、14）、ヒ素によるc-RET二量体形成とY905のリン酸化を多いに抑制した（図８Ａのレーン4、8、12、16）。これらの結果より、ヒ素によるc-RETキナーゼの活性化は、L-システインによって抑制されることがわかった。
【００６７】
また、図８Ｂに示すように、RET-MEN2A の二量体形成率（図８Ｂのレーン５）はヒ素のない条件であっても、c-RETよりも（図3Aのレーン5）非常に高かった（RET-MEN2Aでは20-30%、c-RETでは1%未満）。非還元条件下において、二量体を形成したRET-MEN2Aのタンパク質量とY905のリン酸化レベルは、100 μMのヒ素の添加により3から10倍上昇した（図８Bのレーン7と15）。ヒ素はY905のリン酸化されたRET-MEN2Aの二量体量を増加させた（図８Bのレーン13と15）が、還元条件下では減少した（図８Bのレーン1、3、9、11）。この結果から、この二量体形成はチオール依存的に生じていることがわかった。
【００６８】
L-システインは、RET-MEN2Aの二量体形成を抑制することで、RET-MEN2AキナーゼのY905のリン酸化を抑制しした（（図８Bのレーン6と14）。L-システインは、ヒ素による二量体形成の促進を抑制し、さらにRET-MEN2AのY905のリン酸化も抑制した（図８Bのレーン8と16）。このことから、ヒ素存在下、非存在下のおけるRET-MEN2Aキナーゼの活性化は、L-システインによって抑制されることがわかった。
【００６９】
in vitroにおけるRETの過度の活性化は、癌の発生に関わることが報告されている(Kato et al, 2002; Iwashita et al, Oncogene, 1996)。これまでに、RETキナーゼが、遺伝的に活性化されたRETトランスジェニックマウスでは、メラノーマ、リンパ腫、甲状腺癌が発症することが分かっている(Iwamoto T et al., Eur J Immunol. 1991 Aug;21(8):1809-14, Iwamoto T et al., Oncogene. 1990 Apr;5(4):535-42, Kato M et al., Oncogene. 17:1885-1888(1998.), Kawai K et al., Cancer Res. 60:5254-5260(2000))。さらに、N-アセチル-システイン（NAC）は紫外線によって誘導される皮膚がんを非常に抑制することが報告されている（D'Agostini F et al., Carcinogenesis. 2005 Mar;26(3):657-64）。こうしたことから、L-システインはキナーゼとリンクした癌の抑制剤として利用できると考えられる。
【実施例８】
【００７０】
（ヒ素による活性化型MMP-2分泌におけるL-システインの効果の確認）
本実施例では、活性化型MMP-2の分泌へのヒ素の影響を調べた。具体的には、所定の濃度のヒ素、L-システインをc-RETあるいはRET-MEN2A導入NIH3T3細胞に同時に加えて37℃で20時間培養し培養上清をザイモグラフィーに用いた。すべての実験は3回行われ、再現性が確認されている。結果を図９Ａ、９Ｂに示す。ザイモグラフィーは、２−ＭＥを含まない６倍量の緩衝液を用いて文献（Kato M et al., J Toxicol Environ Health A. 2008;71(16):1053-5）記載の方法に準じて行った。
【００７１】
図９Ａに示すように、c-RET導入細胞における活性化型MMP-2は、200 μMのL-システインの存在、非存在に関わらずほとんど検出できなかった（図９Ａのレーン１と２）。100 μMのヒ素は、活性化型MMP-2の分泌を誘導した（図９Ａのレーン３）。200 μMのL-システインは、ヒ素によって誘導される活性化型MMP-2の分泌を抑制した（図９Ａのレーン４）。一方、RET-MEN2A導入細胞においては、活性化型MMP-2がL-システインの有無に関わらず検出された（図９Ｂのレーン1、2）。ヒ素は、活性化型MMP-2の分泌を強く誘導し（図９Ｂのレーン３）、L-システインはヒ素によって誘導される活性化型MMP-2の分泌を抑制した（図９Ｂのレーン４）。これらの結果より、L-システインはヒ素による活性化型MMP-2の分泌を抑制することがわかった。
【実施例９】
【００７２】
（ヒ素によるPARP分解を介したアポトーシスに対するL-システインの効果）
本実施例では、L-システインがヒ素によるPARP（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）の活性化に与える影響を調べた。具体的には、ヒ素、L-システインをc-RETあるいはRET-MEN2A導入NIH3T3細胞に同時に加えて37℃で12時間培養し、細胞溶出液を抗PARP抗体、抗β-アクチン抗体を用いてイムノブロットを行った。すべての実験は3回行われ、再現性が確認されている。結果を図１０Ａ、１０Ｂに示す。
【００７３】
図１０Ａに示すように、c-RET導入細胞とRET-MEN2A導入細胞にヒ素を加えて12時間培養すると、PARP（116 kDa）のほとんどは85 kDaのフラグメントに分解され、活性化された（図１０Ａ、１０Ｂのレーン1、5）。予想外に、ヒ素の３倍量のL-システインをこれらに加えてもPARPの分解を抑制しなかった（図１０A、１０Bのレーン5-8）。一方、ヒ素によるRETキナーゼ活性を抑制するためにはヒ素の２倍量のL-システインで十分であった。これらの結果より、L-システインのヒ素誘導型PARP依存的アポトーシスに対する抑制効果は、制限されていることがわかった。
【実施例１０】
【００７４】
（ヒ素による細胞死におけるL-システインの効果の確認）
本実施例では、ヒ素誘導型細胞死に対するL-システインの効果を調べた。すなわち、所定濃度のヒ素、L-システインをc-RET、RET-MEN2A導入NIH3T3細胞に加えて37℃で12時間培養し細胞生存を調べた。すべての実験は3回行われ、再現性が確認されている。結果を図１１に示す。
【００７５】
図１１に示すように、ヒ素（100 μM）は、c-RET導入細胞とRET-MEN2A導入細胞の両方において、約50%の割合で細胞死を引き起こしたが、これに200 μMのL-システインを加えても細胞死には影響が見られなかった。これらの結果より、L-システインのヒ素誘導型細胞死への抑制効果は制限されていることがわかった。
【００７６】
以上説明したように、L-システインは、ヒ素によるRETキナーゼの活性化（図７）と活性化型MMP-2分泌量の増加（図８）を抑制したが、PARPの分解（図１０）と細胞死（図１１）には影響を与えなかった。これらの結果より、L-システインによるヒ素の発癌作用の抑制効果は、単に、ヒ素とL-システインが直接結合することだけではないことが証明された。さらに、ヒ素の主要な抗癌効果は、悪性細胞におけるアポトーシスの促進によるものであると報告されている（Kang YH et al., Cancer Res. 2004 Dec 15;64(24):8960-7, Park MT et al., Mol Cancer Ther. 2007 Jan;6(1):82-92, Li H et al., J Exp Clin Cancer Res. 2009, Aug 8;28:110）。これによると、以上の実施例の結果（図１０、１１）から、ヒ素の二倍濃度のL-システインは、癌細胞に対して、ヒ素の抗癌作用にほとんど影響を与えないことがわかった。以上の実施例から、L-システインなどのチオール化合物は、ヒ素の抗癌作用に影響を与える事なく、ヒ素の発癌作用を抑制するのに適した化合物であることがわかった。
【００７７】
ヒ素は白血病等の悪性腫瘍の治療薬として臨床応用されている。ヒ素と等モル以上の量のL-システインやNACは、 ヒ素のアポトーシスを介した抗腫瘍作用を阻害することなく、ヒ素の腫瘍促進作用を抑制することができる。ゆえに、ヒ素を含有する悪性腫瘍の治療薬とL-システイン又はNACを併用することにより、ヒ素を含有する悪性腫瘍の治療薬の患者に対する安全性を高めることができる。
【図１】
2011088829.tif 000002
【図２】
2011088829.tif 000003
【図３】
2011088829.tif 000004
【図４】
2011088829.tif 000005
【図５】
2011088829.tif 000006
【図６】
2011088829.tif 000007
【図７】
2011088829.tif 000008
【図８】
2011088829.tif 000009
【図９】
2011088829.tif 000010
【図１０】
2011088829.tif 000011
【図１１】
2011088829.tif 000012