(57)【要約】      （修正有）【課題】グリホサート耐性形質転換植物の作出に有用な、変異型５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）グリホサート耐性遺伝子を提供する。【解決手段】変異型５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ遺伝子であって、少なくとも１つのトレオニン１０２→イソロイシン置換を含むことを特徴とするＤＮＡ遺伝子。前記遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする植物細胞。前記細胞を再生させることにより得られることを特徴とする植物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ遺伝子であって、少なくとも１つのトレオニン１０２→イソロイシン置換を含むことを特徴とするＤＮＡ遺伝子。
【請求項２】
ＥＰＳＰＳ中に、第１の変異とは異なる少なくとも１つの第２の変異をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項３】
プロリン１０６→セリン置換からなる変異をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項４】
グリシン１０１→アラニン置換からなる変異をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項５】
細菌由来であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項６】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ属の細菌由来であることを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項７】
植物由来であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項８】
トウモロコシ由来であることを特徴とする、請求項７に記載のＤＮＡ遺伝子。
【請求項９】
少なくとも１つのトレオニン１０２→イソロイシン置換を含むことを特徴とする変異型ＥＰＳＰＳタンパク質。
【請求項１０】
異種であり且つ植物中で機能し得る、５′及び３′位にコード配列並びに調節成分を含むキメラ遺伝子であって、コード配列として、請求項１から８のいずれか一項に記載の配列を少なくとも１つ含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項１１】
植物ウイルスプロモーターを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１２】
植物プロモーター（例えば、α−チューブリン、ヒストン、イントロン、アクチンなど）を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、植物を形質転換するためのベクター。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする植物細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞を再生させることにより得られることを特徴とする植物。
【請求項１６】
ＥＰＳＰシンターゼを標的とする除草剤に対する耐性が改善された植物を作出する方法であって、植物細胞又はプロトプラストを、請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子で形質転換し、次いで形質転換された細胞を再生させることを特徴とする方法。
【請求項１７】
ＥＰＳＰＳを標的とする除草剤で植物を処理する方法であって、除草剤を請求項１５に記載の植物に施用することを特徴とする方法。
【請求項１８】
グリホサート又はグリホサート前駆体を施用することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しい５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（又はＥＰＳＰＳ）に関する。このＥＰＳＰＳは、ＥＰＳＰＳ活性のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に関して競合的阻害剤である除草剤に関して増加した耐性を発揮する。このより耐性のあるＥＰＳＰシンターゼは少なくとも一つの「イソロイシンによるスレオニン」置換を有する。本発明は、このような蛋白質をコードする遺伝子、この遺伝子を有するキメラ遺伝子構築物により形質転換された植物細胞、これらの細胞から再生された植物及びこれらの形質転換植物を用いる交配から生成する植物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
グリホセート（glyphosate）、スルホセート（sulfosate）及びフォサメチン（fosametine）はホスホノメチルグリシンファミリーである。それらは本質的にＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）に関して５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．１９）又はＥＰＳＰＳの競合的阻害剤として作用する。それらの植物への適用後、それらは植物を移動して、急速に成長する部分、特に茎及び根の尖端に集積され、敏感な植物の駆除部分に損傷を生じさせる。
【０００３】
これらの産物の主要標的であるプラスチドＥＰＳＰＳは芳香族アミノ酸の生合成の経路の酵素であり、それは一又はそれ以上の核遺伝子によりコードされ、細胞質前駆体の形で合成され、ついでプラスチドに移行され、成熟体としてそこに蓄積される。
【０００４】
グリホセート及びそのファミリー産物ヘの植物の耐性は、植物又は細菌の起源の、この遺伝子の生成物のグリホセートによる阻害の特性に関して変異され又はそうではないＥＰＳＰＳ遺伝子を、それらのゲノムへ安定して導入することにより、得られる。グリホセートの作用の様式及び使用される遺伝子の生成物のグリホセートへの耐性の程度の観点から、プラスチドに実質的な量で蓄積されるように、この遺伝子の翻訳産物が発現されるようにするのが有利である。
【０００５】
プラスチド区画内にこのＥＰＳＰＳ酵素を局在化させると、その競合的阻害剤（グリホセート）に対してこの酵素をより抵抗性にする少なくとも一つの変異を有するＥＰＳＰＳをコードする遺伝子を植物のゲノムに導入することにより、上記の種類の除草剤、特にＮ−ホスホノメチルグリシン又はグリホセートへの耐性を植物に与えることは、例えば、米国特許第４，５３５，０６０号により既知である。しかし、これらの方法は、農業条件下でこれらの植物の使用においてより大きい信頼性を得るように改良される必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４５３５０６０号明細書
【発明の概要】
【０００７】
本記述では、「植物」は光合成の可能な分化した多細胞生物体を意味すると理解され、「植物細胞」は植物を起源とし、カルスのような未分化組織又は胚又は植物部分又は種子のような分化組織を構成可能な細胞を意味すると理解される。
【０００８】
本発明の主題は、ホスホノメチルグリシンファミリー除草剤への耐性遺伝子を含む新しいキメラ遺伝子により形質転換された細胞の再生による、これらの除草剤への増加した耐性を有する形質転換植物の生成である。
【０００９】
本発明の主題は、その標的としてＥＰＳＰＳを有する植物に除草剤に関して増加した耐性を与えるキメラ遺伝子でもある。このキメラ遺伝子は、転写方向順に、プロモーター領域、必要によりトランジットペプチド領域、グリホセート耐性酵素をコードする遺伝子配列及び３‘末端の非翻訳ポリアデニル化シグナル領域からなり、このグリホセート耐性遺伝子は、それから誘導される遺伝子と比較して、「ａｒｏＡ」（ＥＰＳＰＳ）領域において「イソロイシンによるスレオニン１０２」置換を含むことで特徴づけられるものである。好ましくは、さらに、同じ領域に「セリンによるプロリン１０６」置換を有する。これらの置換は何らかの起源、特に植物、細菌、藻類又は菌類起源のＥＰＳＰＳ配列に導入され又は存在する。
【００１０】
トランジットペプチド領域において使用できるトランジットペプチドは、それ自体既知であり、例えばトウモロコシ、ヒマワリ、マメ、タバコ、又は同類を起源とする、植物由来である。第一及び第二のトランジットペプチドは、同一であるか、類似しているか又は異なっている。それらは、さらに、それぞれ、欧州特許第０５０８９０９号にあるように、一又はそれ以上のトランジットペプチドユニットからなる。この特性領域の役割は、成熟及び天然蛋白質を、及び特に上記変異ＥＰＳＰＳを、プラスミド区画で最大の効率で放出させることである。
【００１１】
本発明によるキメラ遺伝子のプロモーター領域は、有利には、植物で自然に発現される（チューブリン、イントロン、アクチン、ヒストン）少なくとも一つのプロモーター遺伝子又はプロモーターフラグメントからなりうる。
【００１２】
キメラ遺伝子の３’末端における非翻訳転写終止シグナル領域はいずれの起源でもよく、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子のような細菌起源のもの、又は欧州特許出願（欧州出願６３３３１７）にあるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａヒストンＨ４Ａ７４８遺伝子のような植物起源ものであってもよい。
【００１３】
本発明によるキメラ遺伝子は、上記必須部分に加えて、少なくとも一つの非翻訳中間（リンカー）領域を含み、上記異なる転写領域の間に配置される。この中間領域は何らかの起源、例えば、細菌、ウイルス、又は植物起源である。
【００１４】
トウモロコシＥＰＳＰＳをコードするｃＤＮＡの単離：
以下に、二つの変異の導入のための基質としてのトウモロコシＥＰＳＰＳｃＤＮＡの取得の、異なる段階を述べる。下記の操作全ては実施例の方法で与えられ、同じ結果に到達するために利用可能な異なる方法の中から行われる選択に対応する。この選択は結果の質に影響がなく、従って、いずれの適当な方法も同じ結果に到達するために当業者によって使用されうる。ＤＮＡフラグメントの操作の方法の大部分は、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版された、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第１巻及び２巻（１９８９）に記載されている（以後、この研究で記述されたプロトコルへの参照は「参照ＣＰＭＢ」と示されるであろう）。この研究で記述されたプロトコルによって行われたＤＮＡに関する操作は特に次の通りである：ＤＮＡフラグメントの連結、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる処理、少量調製又は大量調製のいずれかとしての、プラスミド及びバクテリオファージλＤＮＡの調製、及びそれぞれサザン法及びノーザン法によるＤＮＡ並びにＲＮＡ分析。この研究で記述された他の方法にも従い、これらのプロトコルへの重要な修正又は追加のみが以下に記述される。
【実施例】
【００１５】
実施例  １
１．Ａｒａｂｉｏｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳフラグメントの取得
ａ）それぞれの配列の二種の２０量体オリゴヌクレオチド：
５‘−ＧＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣ−３‘
５‘−ＧＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡ−３’
がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｋｌｅｅ  Ｈ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１０、４３７−４４２）の配列から合成された。これら二種のオリゴヌクレオチドはそれぞれ公にされた配列の１５２３から１５４３まで及び１７３７から１７１７までの位置で、逆の配向である。
【００１６】
ｂ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（変種コロンビア）全ＤＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ参照：６９７０−１）から得られた。
【００１７】
ｃ）５０ナノグラム（ｎｇ）のＤＮＡがオリゴヌクレオチドの各々の３００ｎｇと混合され、供給者により推奨されている増幅用の標準媒体の条件下にて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００装置にて３５増幅周期に付される。生じた２０４−ｂｐフラグメントはＡｒａｂｉｄｏｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳフラグメントを構成している。
【００１８】
２．ＢＭＳトウモロコシ細胞系からのｃＤＮＡライブラリーの構築
ａ）ろ過された細胞の５ｇが液体窒素中で磨砕され、全核酸が次の修正でＳｈｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．により記述された方法によって抽出される：
−溶解緩衝液のｐＨはｐＨ９．０に調製され；
−イソプロパノールによる沈澱後、ペレットを水中に入れ、溶解後、２．５ＭＬｉＣｌにされる。１２時間℃でインキュベーション後、４℃で３０，０００ｇで１５分間遠沈のペレットを再溶解する。ついでＬｉＣｌ沈澱段階を繰り返す。再溶解したペレットは全核酸のＲＮＡ画分を構成している。
【００１９】
ｂ）ＲＮＡ画分のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ画分が「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載のようにオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム上のクロマトグラフィーにより得られる。
【００２０】
ｃ）合成ＥｃｏＲＩ末端を有する二本鎖ｃＤＮＡの合成：これは、この合成に必要とされる異なる試薬のキットの形での供給者からのプロトコルにより行われる：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社からの「コピーキット」。
【００２１】
次のそれぞれの配列の、二つの一本鎖及び部分的に相補的なオリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３’
５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’（後者はリン酸化されている）が平滑端二本鎖ｃＤＮＡと結合される。
【００２２】
このアダプターの連結は二本鎖ｃＤＮＡに付いたＳｍａＩ部位及び二本鎖ｃＤＮＡの各末端の付着形のＥｃｏＲＩ部位の生成をもたらす。
【００２３】
ｄ）ライブラリーの創成：
末端に人工的な付着ＥｃｏＲＩ部位を有するｃＤＮＡを、供給者Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのプロトコルによりＥｃｏＲＩで切断し脱リン酸したバクテリオファージλｇｔ１０ｃＤＮＡと結合する。
【００２４】
連結反応の一部を、供給者の指示により、キャプシド封入抽出物、すなわちＧｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄにてインビトロでキャプシド封入された。このライブラリーは細菌Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ６００ｈｆｌを用いて力価測定された。それによって得られたライブラリーは増幅され、同じ供給者の指示によって貯蔵され、ＢＭＳトウモロコシ細胞けん濁液ｃＤＮＡライブラリーを構成する。
【００２５】
３．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰプローブを用いるＢＭＳトウモロコシ細胞けん濁液ｃＤＮＡの選別
続くプロトコルは、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）により公にされたＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１巻及び２巻（ＣＰＭＢ）のものである。簡潔に言えば、約１０６個の組換えファージが１００ファージ／ｃｍ２の平均密度でＬＢ皿上に塗布される。溶菌斑はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上で重複してレプリカされる。
【００２６】
ＤＮＡは１６００ｋＪ  ＵＶ処理（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）によりフィルタ上に固定された。フィルタは６ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／０．２５スキムミルク中で６５℃で２時間予備ハイブリダイズされた。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳプローブは供給者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏキット）によるランダムプライミングにより［３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識された。得られた比活性はフラグメントμｇ当たり１０８ｃｐｍである。１００℃で５分間の変性後、プローブは予備ハイブリダイゼーション媒体に加えられ、ハイブリダイゼーションを５５℃で１４時間続けられる。フィルタはＫｏｄａｋ  ＸＡＲ５フィルム及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｓｃｒｅｅｎ  ＲＰＮ強化スクリーンで−８０℃４８時間蛍光撮影される。陽性スポットが生じた皿とフィルタ上の陽性スポットを配列させると、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブと陽性ハイブリダイゼーション反応を示すファージに対応する区域を皿から拾うことを可能にする。この塗布し、移し、ハイブリダイズさせ及び回収するステップは、皿中のすべてのスポットが引き続き精製されたファージの１００％がハイブリダイゼーションで陽性となるまで繰り返される。次いで個別のファージ溶菌斑は希釈剤λ媒体（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；０．１％ゼラチン）中に取り出され；溶液中のこれらのファージはＢＭＳトウモロコシ細胞けん濁液のＥＰＳＰ−陽性クローンを構成する。
【００２７】
４．ＢＮＳトウモロコシ細胞けん濁液のＥＰＳＰクローンのＤＮＡの調製及び分析
約５×１０８のファージが２／ｍｌのＯＤ６００ｎｍ値のＣ６００ｈｆｌ細菌の２０ｍｌに加えられ、３７℃で１５分間インキュベートされる。このけん濁液はついで１−ｌＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ中の２００ｍｌの細菌成長培地中に希釈され、２５０ｒｐｍで回転撹拌機で撹拌される。培地が透明になると、濁った細菌の溶菌に対応する溶菌とし、これは約４時間の撹拌後に起こる。この上澄みはついで「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載のように処理される。得られたＤＮＡはＢＭＳトウモロコシ細胞けん濁液のＥＰＳＰクローンに対応する。
【００２８】
このＤＮＡの１から２μｇがＥｃｏＲＩで切断され、０．８％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上で分離される。最終的証明は、生成したＤＮＡがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイゼーションシグナルを実際に示すことを調べることにある。電気泳動後、ＤＮＡフラグメントは「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されたサザンのプロトコルによりＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上に移される。フィルタは上記３節に記載された条件によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイズさせられる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイゼーションシグナルを示し、最長のＥｃｏＲＩフラグメントを含むクローンは約１．７ｋｂｐのゲル上で推定された寸法を有する。
【００２９】
５．クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１の取得
１．７−ｋｂｐ挿入断片を含むファージクローンの１０μｇがＥｃｏＲＩで消化され、０．８％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上で分離される。１．７−ｋｂｐ挿入断片を含むゲルフラグメントは供給者、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのプロトコルによりβ−アガロースで処理される。１．７−ｋｂｐフラグメントの精製ＤＮＡは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｐｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載された連結反応プロトコルによりＥｃｏＲＩで切断されたプラスミドｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡと１２℃で１４時間連結される。上記連結反応混合物の２μｌがエレクトロポレーションコンピーテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂの一部の形質転換のために使用され、形質転換は次の条件を用いるエレクトロポレーションで達成される：コンピーテント細菌の混合物及び連結反応媒体は、予め０℃まで冷却された厚さ０．２ｃｍ（Ｂｉｏｒａｄ）のエレクトロポレーションセルに導入される。Ｂｉｏｒａｄで作られたエレクトロポレータを用いるエレクトロポレーションの物理的条件は２５００Ｖ、２５μＦ及び２００Ωである。これらの条件下で、コンデンサの平均放電時間は４．２ミリ秒のオーダーである。細菌はついでＳＯＣ培地（ＣＰＭＢ参照）の１ｍｌ中に採られ、１５−ｍｌＣｏｒｎｉｎｇ管中回転撹拌機上で２００ｒｐｍで１時間撹拌される。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンが補足されたＬＢ／寒天培地上に塗布後、３７℃一夜成長した細菌クローンの少量調製は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されたプロトコルにより生成される。ＥｃｏＲＩによるＤＮＡの消化及び０．８％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上の電気泳動での分離の後、１．７−ｋｂｐ挿入断片を有するクローンが保持される。最終的証明は、精製ＤＮＡが実際にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示すことを調べることにより行う。電気泳動後、ＤＮＡフラグメントは「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されたサザンのプロトコルによりＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ膜上に移される。フィルタは上記３節に記載された条件によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイズされる。１．７−ｋｂｐ挿入断片を有し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳプローブとハイブリダイズするプラスミドクローンは大規模に調製され、細菌の溶菌から生じるＤＮＡは「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されたようにＣｓＣｌ勾配上で精製された。精製ＤＮＡは、供給者の指示によるＰｈａｒｍａｃｉａキットを用いて、同じ供給者により指示されたＭ１３直接及び逆共通プライマーをプライマーとして使用して、部分的に配列決定された。精製した部分配列は約０．５ｋｂｐに及ぶ。成熟蛋白質（約５０アミノ酸残基）の領域の誘導されたアミノ酸配列は、米国特許ＵＳＰ４，９７１，９０８に記載された成熟トウモロコシＥＰＳＰＳの対応する���ミノ酸配列と１００％同一性を示す。ＢＭＳトウモロコシ細胞けん濁液のＥＰＳＰＤＮＡの１．７−ｋｂｐＥｃｏＲＩフラグメントに対応するこのクローンは、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１と命名された。このクローンの完全な配列はＰｈａｒｍａｃｉａキットのプロトコルを用い、相補的オリゴヌクレオチド及び反対配向のものを各２５０ｂｐ近似的に合成して両方のストランドについて決定された。この１７１３−ｂｐクローンの得られた完全な配列は配列番号１に示される。
【００３０】
６．クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５の取得
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１の配列の分析、及び特に誘導されたアミノ酸配列とトウモロコシのそれとの比較は、トウモロコシＥＰＳＰＳの成熟部分のＮＨ２末端アラニンをコードするＧＣＧコドンの９２ｂｐ上流の配列延長を示す（米国特許第４，９７１，９０８号）。同様に、トウモロコシＥＰＳＰＳの成熟部分のＣＯＯＨ末端アスパラギンをコードするＡＡＴコドンの２８８ｂｐ下流の延長が観察される（米国特許第４，９７１，９０８号）。これら二つの部分は、ＮＨ２末端延長の場合には、プラスチド局在化に対するシグナルペプチドの配列の部分に、ＣＯＯＨ末端延長の場合には、ｃＤＮＡの非翻訳３’領域に対応するであろう。
【００３１】
米国特許第４，９７１，９０８号に記載されたように、トウモロコシＥＰＳＰＳｃＤＮＡの成熟部分をコードするｃＤＮＡを得るために、次の操作が行われた：
ａ）非翻訳３’領域の除去：ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２の構築：
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１は制限酵素ＡｓｅＩで切断され、この開裂から生じる末端はＣＰＭＢに記載されたプロトコルによりＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによる処理で平滑端とされた。制限酵素ＳａｃＩＩによる開裂がついで行われた。これらの操作から生じるＤＮＡは１％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上で電気泳動で分離された。
【００３２】
０．４−ｋｂｐ「ＡｓｅＩ−平滑末端／ＳａｃＩＩ挿入断片」を含むゲルフラグメントはゲルから切り取られ、上記５節に記載されたプロトコルにより精製された。クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１のＤＮＡはクローン化ベクターｐＵＣ１９のポリリンカーに位置したＨｉｎｄＩＩＩ部位で制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、この開裂から生じる末端はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによる処理で平滑端とされた。制限酵素ＳａｃＩＩによる開裂がついで行われた。これらの操作から生じるＤＮＡは０．７％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上で電気泳動で分離された。
【００３３】
約３．７−ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ平滑断端／ＳａｃＩＩ挿入断片を含むゲルフラグメントはゲルから切り取られ、上記５節に記載されたプロトコルにより精製された。
【００３４】
二つの挿入断片は連結され、連結反応混合物の２μｌが５節で記載のようにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用された。
【００３５】
異なるクローンのプラスミドＤＮＡの内容はｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１について記載された方法により分析された。選ばれたプラスミドクローンの一つは約１．４５−ｋｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片を含む。このクローンの末端の配列から、挿入断片の５’末端がｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１の対応する末端に正確に対応すること、及び３’末端が次の配列を有することが明らかになる：
「５’−・・・ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴ−３’」。
【００３６】
下線を付けた配列はＣＯＯＨ末端アミノ酸アスパラギンのコドンに対応し、次のコドンは翻訳停止コドンに対応する。下流のヌクレオチドはｐＵＣ１９ポリリンカーの配列要素に対応する。成熟トウモロコシＥＰＳＰＳの翻訳末端部位までのｐＲＰＡ−ＭＬ−７１１配列からなり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位までのｐＵＣポリリンカーの配列が続くこのクローンは、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２と命名された。
【００３７】
ｂ）ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２の５’末端の修飾：ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５の構築：
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２は制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断された。これらの操作から生じるＤＮＡは０．８％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上で電気泳動により精製された。１．３−ｋｂｐＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片を含むゲルフラグメントはゲルから切り取られ、上記５節に記載されたプロトコルにより精製された。この挿入断片は、次の配列の二つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの各々の等分子量の存在で：
オリゴ１：５’−ＧＡＧＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡ−３’
オリゴ２：５’−ＧＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＣＴＣ−３’
及び制限酵素ＢａｍＨＩ並びにＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＵＣ１９の存在で、連結された。
【００３８】
２μｌの連結反応混合物は５節で記載のようにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを変換するために使用された。５節の記載の方法により異なるクローンのプラスミドＤＮＡ内容の分析後、約１．３−ｋｂｐ挿入断片を有するクローンの一つは引き続く分析のために保持された。選ばれたクローンの５’末端の配列は、この領域のＤＮＡ配列が次であることを明らかにする：
ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩ部位までのｐＵＣ１９ポリリンカーの配列、クローン化で使用されたオリゴヌクレオチドの配列が続き、ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２に存在する配列の残りが続く。このクローンはｐＲＰＡ−ＭＬ−７１３と命名された。このクローンは成熟ＥＰＳＰシンターゼのＮ末端アラニンコドンの上流のＮｃｏＩ部位に含まれるメチオニンＡＴＧコドンを有する。さらに、Ｎ末端のアラニン及びグリシンコドンは保存されたが、第三番目可変塩基において修飾された：最初のＧＣＧＧＧＴは修飾されたＧＣＣＧＧＣを与える。
【００３９】
クローンｐＲＰＡ−ＭＬ−７１３は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、この開裂の末端はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによる処理で平滑端とされた。制限酵素ＳａｃＩによる開裂がついで行われた。この処理から生じるＤＮＡは０．８％ＬＧＴＡ／ＴＢＥアガロースゲル（ＣＰＭＢ参照）上で電気泳動で分離された。１．３−ｋｂｐ「ＨｉｎｄＩＩＩ平滑端／ＳａｃＩ」挿入断片を含むゲルフラグメントはゲルから切り取られ、上記５節に記載されたプロトコルにより精製された。この挿入断片は制限酵素ＸｂａＩで消化されたプラスミドｐＵＣ１９の存在下に連結され、この開裂の末端はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによる処理で平滑断端とされた。制限酵素ＳａｃＩによる開裂がついで行われた。２μｌの連結反応混合物が５節で記載のようにＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用された。５節で記載の方法により異なるクローンのプラスミドＤＮＡ内容の分析後、約１．３−ｋｂｐ挿入断片を有するクローンの一つが引き続く分析のために保持された。選ばれたクローンの末端の配列はＤＮＡ配列が次であることを明らかにする：ＥｃｏＲＩからＳａｃＩ部位までのｐＵＣ１９ポリリンカーの配列、それから上記のオリゴヌクレオチド１の４ｂｐＧＡＴＣＣが削除されたクローニングに使用されたオリゴヌクレオチドの配列が続き、ＨｉｎｄＩＩＩ部位までのｐＲＰＡ−ＭＬ−７１２に存在する配列の残り及びＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのｐＵＣ１９ポリリンカーの配列が続く。このクローンはｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５と命名された。
【００４０】
７．変異トウモロコシＥＰＳＰＳをコードするｃＤＮＡの取得
全ての変異誘発段階は供給者の指示によるＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｕ．Ｓ．Ｅ．変異誘発キットで行われた。この変異誘発システムの原理は次の通りである：プラスミドＤＮＡは熱で変成され、一方で変異誘発オリゴヌクレオチド、他方で除去されるべきポリリンカーに存在する独特の制限酵素部位の存在を可能にするオリゴヌクレオチドの過剰モル量の存在で再連結される。再連結段階後、相補的ストランドの合成が、供給される適当な緩衝液中のＴ４ＤＮＡリガーゼ及び遺伝子３２蛋白質の存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの作用で行われる。合成生成物は、それに対する部位が変異誘発で消失したと推定される制限酵素の存在下にインキュベートされる。特にｍｕｔＳ変異を有するＥ．ｃｏｌｉ株はこのＤＮＡの形質転換のためのホストとして使用される。液体培地中にて増殖させた後、全プラスミドＤＮＡは調製され、前に使用した制限酵素の存在下でインキュベートされる。これらの処理の後、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂは形質転換のためのホストとして使用される。単離されたクローンのプラスミドＤＮＡは調製され、導入された変異の存在が配列決定により証明される。
【００４１】
Ａ）−ＥＰＳＰシンターゼ活性の競合的阻害剤である産物に対してトウモロコシのＥＰＳＰＳ抵抗性に原則的に影響することのない部位又は配列の修飾：ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５から内部ＮｃｏＩ部位の除去。
【００４２】
ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５配列をＮ末端のアラニンコドンＧＣＣの最初の塩基を位置１と置くことにより任意に番号を付ける。この配列は位置１２１７にＮｃｏＩ部位を有する。部位修飾オリゴヌクレオチドは次の配列を有する：
５’−ＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’。
【００４３】
上述の参考文献による配列決定すると、変異誘発後に読まれた配列は使用したオリゴヌクレオチドのものに対応している。ＮｃｏＩ部位は実際に除去され、この領域でアミノ酸への翻訳はｐＲＰＡ−ＭＬ−７１５に存在する最初の配列を保存している。
【００４４】
このクローンはｐＲＰＡ−ＭＬ−７１６と命名する。
【００４５】
このクローンの１３４０−ｂｐ配列は配列番号２及び配列番号３で示される。
【００４６】
Ｂ）−増加すべきＥＰＳＰシンターゼ活性の競合的阻害剤である産物に対するトウモロコシのＥＰＳＰＳ抵抗性を可能にする配列修飾。
【００４７】
次のオリゴヌクレオチドが使用された：
ａ）変異Ｔｈｒ１０２→Ｉｌｅ。
５’−ＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ−３’
ｂ）変異Ｐｒｏ１０６→Ｓｅｒ。
５’−ＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＣＴＴＧＡＣＡＧＣ−３’
ｃ）変異Ｇｌｙ１０１→Ａｌａ及びＴｈｒ１０２→Ｉｌｅ。
５’−ＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧ−３’
ｄ）変異Ｔｈｒ１０２→Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６→Ｓｅｒ。
５’−ＧＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＣＴＴＧＡＣＡＧＣ−３’
【００４８】
配列決定後、三個の変異したフラグメントにおける変異誘発後に読まれた配列は、使用した変異誘発オリゴヌクレオチドのものに対応する変異領域を除いて、親ｐＲＰＡ−ＭＬ−７１６ＤＮＡ配列に同じである。これらのクローンは次のように命名される：変異Ｔｈｒ１０２→ＩｌｅについてｐＲＰＡ−ＭＬ−７１７、変異Ｐｒｏ１０６→ＳｅｒについてｐＲＰＡ−ＭＬ−７１８、変異Ｇｌｙ１０１→Ａｌａ及びＴｈｒ１０２→ＩｌｅについてｐＲＰＡ−ＭＬ−７１９並びに変異Ｔｈｒ１０２→Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６→ＳｅｒについてｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０。
【００４９】
ｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０の１３４０−ｂｐ配列は配列番号４及び配列番号５で示される。
【００５０】
１３９５−ｂｐＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片は、ＥＰＳＰＳの競合的阻害剤である除草剤への抵抗性、特にグリホセート抵抗性の導入のために使用された全ての構築物の基礎である。この挿入断片は、明細書の残りでは「トウモロコシＥＰＳＰＳ二重変異株」と呼ばれるだろう。
【００５１】
実施例  ２：
異なる変異株のグリホセートインビトロ耐性
２．ａ：ＥＰＳＰシンターゼの抽出
異なるＥＰＳＰシンターゼ遺伝子はＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩカセットの形でＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断されたプラスミドベクターｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、参照：２７−５００７−０１）に導入される。異なるＥＰＳＰシンターゼを過剰発現する組換えＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細菌はペレット化した細胞の１０ｇ当たり４０ｍｌの緩衝液中で超音波処理され、この同じ緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５０ｍＭメルカプトエタノール、５ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭＰＭＳＦ）で洗浄され、それに１ｇのポリビニルピロリドンが加えられる。けん濁液は４℃で１５分間撹拌され、ついで２７，０００ｇ及び４℃で２０分間遠沈される。
【００５２】
硫酸アンモニウムが溶液を硫酸アンモニウムに関して４０％飽和になるように上澄液に加えられる。混合物は２７，０００ｇ及び４℃で２０分間遠沈される。硫酸アンモニウムが溶液を硫酸アンモニウムに関して７０％飽和になるように新しい上澄液に加えられる。混合物は２７，０００ｇ及び４℃で３０分間遠沈される。この蛋白質ペレットに存在するＥＰＳＰシンターゼは１ｍｌの緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８及び５０ｍＭメルカプトエタノール）中に取り出される。この溶液は４℃でこの同じ緩衝液の２リットルに対して一夜透析される。
【００５３】
２．ｂ：酵素活性
各酵素の活性及びそのグリホセート抵抗性は次の反応混合物中３７℃で１０分にわたってインビトロで測定される：１００ｍＭマレイン酸、ｐＨ５．６、１ｍＭホスホエノールピルビン酸、３ｍＭシキミ酸３−リン酸（Ｋｎｏｗｅｌ  Ｐ．Ｆ．及びＳｐｒｉｎｓｏｎ  Ｄ．Ｂ．１９７０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７Ａ、３５１−３５２によりＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ２５５９７株から調製された）及び１０ｍＭフッ化カリウム。酵素抽出物はグリホセートの添加後最後の瞬間に加えられ、その最終濃度は０から２０ｍＭまで変化する。
【００５４】
活性は、Ｔａｕｓｋｙ  Ｈ．Ａ．及びＳｈｏｒｒ  Ｅ．１９５３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０２、６７５−６８５の方法により遊離されたリン酸を分析することにより測定される。
【００５５】
これらの条件下で、野性型（ＷＴ）酵素は０．１２ｍＭのグリホセート濃度ですでに８５％阻害される。この濃度で、Ｓｅｒ１０６として知られている変異酵素は５０％だけ阻害されるが、他の三種の変異体、Ｉｌｅ１０２、Ｉｌｅ１０２／Ｓｅｒ１０６及びＡｌａ１０１／Ｉｌｅ１０２はほとんど又は全く阻害を示さなかった。
【００５６】
グリホセート濃度を、変異酵素Ｉｌｅ１０２の５０％阻害を生じるために１０倍、すなわち１．２ｍＭにせねばならず、変異Ｉｌｅ１０２／Ｓｅｒ１０６、Ａｌａ／Ｉｌｅ及びＡｌａはまだ阻害されない。
【００５７】
変異Ａｌａ／Ｉｌｅ及びＡｌａの活性は１０ｍＭのグリホセート濃度まで阻害されないこと、及び変異Ｉｌｅ／Ｓｅｒ１０６のそれはグリホセート濃度が２倍、すなわち２０ｍＭでさえも、減少しないことは注目されるべきである。
【００５８】
実施例  ３
形質転換タバコ植物の抵抗性
１−１−形質転換
ベクターｐＲＰＡ−ＲＤ−１７３が、コスミドｐＴＶＫ２９１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）を運ぶＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に導入される。形質転換技術はＨｏｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）の方法に基づく。
【００５９】
１−２−再生
葉外植片からのＰＢＤ６タバコ（起源ＳＥＩＴＡフランス）の再生は、３０ｇ／ｌの蔗糖及び２００μｇ／ｍｌのカナマイシンからなるＭｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｃｏｏｇ（ＭＳ）基本培地で行われる。葉外植片は温室又はインビトロで栽培された植物から移され、三逐次段階により葉ディスク技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，Ｖｏｌ．２２７，ｐｐ．１２２９−１２３１）により形質転換される：第一は０．０５ｍｇ／ｌのナフチル酢酸（ＮＡＡ）及び２ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含む３０ｇ／ｌの蔗糖を補足した培地上での芽の誘導からなる。この段階中に形成された芽はついで３０ｇ／ｌの蔗糖が補足されているが、いかなるホルモンも含まないＭＳ培地での栽培により１０日間発育させられる。発育した芽はついで塩類、ビタミン及び糖の含量の半分を有するがいかなるホルモンも含まない発根ＭＳ培地に移され、栽培される。約１５日後、根が付いた芽は土壌に移される。
【００６０】
１−３−グリホセート抵抗性
２０本の形質転換植物が再生され、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７３の構築物について温室に移された。これらの植物は５葉段階においてヘクタール当たり０．８ｋｇのグリホセート活性物質に対応する「ラウンドアップ」の水性けん濁液で処理された。
【００６１】
結果は、処理後３週間記録された植物毒性の観察に対応する。これらの条件下で、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７３構築物で形質転換された植物が非常に良い耐性を示すが、非形質転換対照植物は完全に破壊された。
【００６２】
これらの結果は、同じグリホセート耐性をコードする遺伝子について本発明によるキメラ遺伝子の使用でもたらされた改良を明白に示す。
【００６３】
実施例  ４
トウモロコシ細胞の形質転換及び選択
指数的成長段階のＢＭＳ（Ｂｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ  Ｓｗｅｅｔ）トウモロコシ細胞に、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７（Ｋｌｅｉｎ  Ｔ．Ｍ．，Ｗｏｌｆ  Ｅ．Ｄ．，Ｗｕ  Ｒ．及びＳａｎｄｆｏｒｄ  Ｊ．Ｃ．（１９８７）：Ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＮＡＴＵＲＥ  Ｖｏｌ．３２７ｐｐ．７０−７３）により記載された原理及びプロトコルによって構築物ｐＲＰＡ−ＲＤ−１３０により衝撃（bombard）を与えられる。
【００６４】
衝撃後二日、２ｍＭ  Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを含む同じ培地に移される。
【００６５】
この培地で選別の８週間後、発育したカルスが選ばれ、ついで増幅され、ＰＣＲで分析され、キメラＯＴＰ−ＥＰＳＰＳ遺伝子の存在を明らかにされる。
【００６６】
衝撃が与えられず２ｍＭ  Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを含む同じ培地で育てられた細胞は除草剤で阻止され、発育しない。
【００６７】
本発明による形質転換植物は、導入されたキメラ遺伝子の発現に対応する表現型性格を有する系統及び雑種を得るための親として使用されるだろう。
【００６８】
プラスミド構築の説明
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４：ｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０への「ｎｏｓ」ポリアデニル化シグナルの付加による、トウモロコシ二重変異ＥＰＳＰＳ遺伝子（Ｔｈｒ  １０２→Ｉｌｅ及びＰｒｏ  １０６→Ｓｅｒ）を含むクローニングカセットの形成。ｐＲＰＡ−ＭＬ−７２０をＨｉｎｄIIIで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理して平滑末端を得る。ＮｃｏＩで２回目の切断を行い、ＥＰＳＰＳフラグメントを精製する。次いで、ＥＰＳＰＳ遺伝子を、精製したｐＲＰＡ−ＲＤ−１２（ノパリンシンターゼのポリアデニル化シグナルを含むクローニングカセット）と連結して、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４を得る。有用な精製ベクターｐＲＰＡ−ＲＤ−１２を得るためには、該ベクターを前もってＳａｌＩで切断し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＮｃｏＩで２回目の切断を行う必要があった。
【００６９】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４への最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）の付加による、プラスミドを標的とするＥＰＳＰＳ遺伝子を含むクローニングカセットの形成。ｐＲＰＡ−ＲＤ−７（ヨーロッパ特許出願ＥＰ６５２２８６号）をＳｐｈＩで切断、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＳｐｅＩで切断し、ＯＴＰフラグメントを精製する。このＯＴＰフラグメントを、前もってＮｃｏＩで切断しておいたｐＲＰＡ−ＲＤ−１２４中にクローン化し、クレノウＤＮＡフラグメントで処理して突出する３′部分を除去し、次いで、ＳｐｅＩで切断する。次いで、このクローンの配列を決定して、ＯＴＰとＥＰＳＰＳ遺伝子との正しい翻訳融合を確実にすることにより、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５を得る。
【００７０】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１３０：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５へのＨ３Ｃ４トウモロコシヒストンプロモーター及びｐＲＰＡ−ＲＤ−１２３（ヨーロッパ特許出願ＥＰ５０７６９８号）のａｄｈｌ  イントロン  １配列の付加による、モノコチレドンの組織中で二重突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を発現させるために植物中で発現させるカセットの形成。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２３（ａｄｈｌ  イントロン  １と融合したＨ３Ｃ４トウモロコシヒストンプロモーターを含むカセット）をＮｃｏＩ及びＳａｃＩで切断する。次いで、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２３由来のプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを精製し、前もってＮｃｏＩ及びＳａｃＩで切断しておいたｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５と連結する。
【００７１】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１５９：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５へのＨ４Ａ７４８  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ヒストン二プロモーター（ヨーロッパ特許出願ＥＰ５０７６９８号）の付加による、双子葉植物の組織中で「ＯＴＰ−二重変異ＥＰＳＰＳ遺伝子」を発現させるために植物中で発現させるカセットの形成。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１３２〔Ｈ４Ａ７４８二プロモーター（ヨーロッパ特許出願ＥＰ５０７６９８）を含むカセット〕をＮｃｏＩ及びＳａｃＩで切断する。次いで、精製したプロモーターフラグメントを、前もってＥｃｏＩ及びＳａｃＩで切断しておいたｐＲＰＡ−ＲＤ−１２５中にクローン化する。
【００７２】
ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７３：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＬ−１５０Ａ（ヨーロッパ特許出願第５０８９０９号）へのｐＲＰＡ−ＲＤ−１５９の「Ｈ４Ａ７４８プロモーター−ＯＴＰ−二重変異ＥＰＳＰＳ遺伝子」遺伝子の付加による、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換ベクターの形成。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１５９をＮｏｔＩで切断し、クレノウポリメラーゼで処理する。次いで、このフラグメントをＳｍａＩを含むｐＲＰＡ−ＢＬ−１５０Ａ中にクローン化する。
【配列表】
2011041567000001.app
【外国語明細書】
2011041567000001.pdf