(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸を細胞内に輸送する方法の提供。【解決手段】高分子マトリックス、核酸発現ベクター、及び脂質から作製される微粒子の調製物。高分子マトリックスには、水に対する溶解度が約1mg/l未満である一つ又は複数の合成高分子が含まれる。少なくとも90％の微粒子が直径約100ミクロン未満である。核酸は、少なくとも50％が閉環の形状であるようなRNA、または少なくとも50％がスーパーコイルであるような環状DNAプラスミド分子のいずれかである。【選択図】図２
2011088909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子マトリックス；
脂質；及び
核酸分子
を含む、直径約20ミクロン未満の微粒子であって、リポソーム内にカプセル化され（encapsulate）ず、細胞を含まない微粒子。
【請求項２】
核酸分子が環状である、請求項1記載の微粒子。
【請求項３】
核酸がプラスミドである、請求項1記載の微粒子。
【請求項４】
核酸分子が、コード配列に機能的に連結された発現制御配列を含む、請求項1記載の微粒子。
【請求項５】
標的分子をさらに含む、請求項1記載の微粒子。
【請求項６】
安定化剤をさらに含む、請求項1記載の微粒子。
【請求項７】
請求項1記載の複数の微粒子を含む、微粒子の調製物。
【請求項８】
高分子マトリックス；
脂質；及び
コード配列に機能的に連結された発現制御配列を含む核酸分子
を含む、直径約20ミクロン未満の微粒子であって、
コード配列が、
(a)(i)天然の哺乳動物のタンパク質；または(ii)哺乳動物に感染する感染因子由来の天然のタンパク質の断片；または(iii)直列に連結された(i)の複数の断片；または(iv)直列に連結された(ii)の複数の断片
の配列と本質的に同一な配列を持つ、少なくとも7アミノ酸長であるポリペプチド；
(b)それがクラスIまたはクラスIIMHC分子に結合するのを可能にする長さ及び配列を持つペプチド；
(c)直列に連結されたか、または重複する配列を共有するかいずれかの、少なくとも二つの(b)のペプチドからなるポリペプチド；及び
(d)輸送配列に連結された(a)、(b)、または(c)のいずれか
からなる群より選択される発現産物をコードし、
発現産物が任意でアミノ末端のメチオニン残基を含むことを規定し、またさらに発現産物が天然の完全長タンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を持たない発現産物であることを規定する、微粒子。
【請求項９】
脂質が、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、及び両性イオン性脂質からなる群より選択される請求項8記載の微粒子。
【請求項１０】
脂質がセチルトリメチルアンモニウムである、請求項8記載の微粒子。
【請求項１１】
脂質がリン脂質である、請求項8記載の微粒子。
【請求項１２】
脂質がホスファチジルコリンである、請求項8記載の微粒子。
【請求項１３】
第2の脂質をさらに含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項１４】
発現産物が、直列に連結された(b)の少なくとも二個のペプチドからなるポリペプチドであって、少なくとも二つの(b)のペプチドが同一でない、請求項8記載の微粒子。
【請求項１５】
発現産物が少なくとも二つの重複する(b)のペプチドからなるポリペプチドである、請求項8記載の微粒子。
【請求項１６】
発現産物が、それがクラスIMHC分子に結合するのを可能にする長さ及び配列を持つペプチドを含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項１７】
発現産物が、それがクラスIIMHC分子に結合するのを可能にする長さ及び配列を持つペプチドを含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項１８】
発現産物が免疫原性である、請求項8記載の微粒子。
【請求項１９】
発現産物が免疫原性である、請求項14記載の微粒子。
【請求項２０】
発現産物が免疫原性である、請求項15記載の微粒子。
【請求項２１】
発現産物が免疫原性である、請求項16記載の微粒子。
【請求項２２】
発現産物が免疫原性である、請求項17記載の微粒子。
【請求項２３】
発現産物が、(1)T細胞によって認識される天然のペプチドの配列と25％未満異なるアミノ酸配列を持つ；及び(2)T細胞によって認識される、請求項8記載の微粒子。
【請求項２４】
発現産物が、ミエリン塩基性タンパク質（MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、非変異（invariant）鎖、GAD65、島細胞抗原、デスモグレイン、α-クリスタリン、及びβ-クリスタリンからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも10アミノ酸長の断片の配列と少なくとも50％の同一性をもつアミノ酸配列からなり、断片がクラスIIMHC分子に結合する、請求項8記載の微粒子。
【請求項２５】
発現産物が、配列番号1〜配列番号46からなる群より選択される配列と本質的に同一なアミノ酸配列を含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項２６】
発現産物が、小胞体に輸送する配列、リソソームに輸送する配列、エンドソームに輸送する配列、細胞内小胞に輸送する配列、及び核に輸送する配列からなる群より選択される輸送配列を含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項２７】
発現産物が、腫瘍抗原の抗原性部分の配列と本質的に同一なアミノ酸配列を含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項２８】
腫瘍抗原が、表3に列挙されたタンパク質からなる群より選択される、請求項8記載の微粒子。
【請求項２９】
発現産物が、ウイルス、細菌、及び寄生性真核生物からなる群より選択される感染因子によって天然に発現するタンパク質の抗原性断片の配列と本質的に同一なアミノ酸配列を含む、請求項8記載の微粒子。
【請求項３０】
感染因子が、単純ヘルペス（herpes simplex）ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、プラスモジウム（Plasmodium）種、クラミジア（Chlamidia）、及びマイコバクテリアからなる群より選択される請求項29記載の微粒子。
【請求項３１】
感染因子がヒトパピローマウイルスである、請求項29記載の微粒子。
【請求項３２】
感染因子がヒト免疫不全ウイルスである、請求項29記載の微粒子。
【請求項３３】
請求項8記載の微粒子を含む、微粒子の調製物。
【請求項３４】
請求項1記載の微粒子を供給する段階；及び
動物に微粒子を導入する段階
を含む、動物に核酸を投与する方法。
【請求項３５】
微粒子が動物の粘膜組織に導入される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
粘膜組織が膣組織である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
(1)有機溶媒に溶解した高分子を含む第1溶液を供給する段階；
(2)極性溶媒もしくは親水性溶媒に溶解または懸濁された核酸を含む第2溶液を供給する段階；
(3)第1乳液を形成するために、第1溶液及び第2溶液を混合する段階；及び
(4)第2乳液を形成するために、第1乳液を第3溶液と混合する段階
を含む、微粒子を調製するための方法であって、少なくとも一つの第1溶液、第2溶液、及び第3溶液が脂質を含み、かつ
両方の混合段階が、平均直径が100ミクロン未満の微粒子を作製する一方で核酸の剪断を最少にするやり方で行われる、方法。
【請求項３８】
脂質が第1溶液に含まれる、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
脂質が第1溶液中に0.001％〜10％（重量/容積）の濃度で存在する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
脂質が第2溶液に含まれる請求項37記載の方法。
【請求項４１】
脂質が第2溶液中に0.001％〜10％（重量/容積）の濃度で存在する、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
第2溶液が、安定化化合物（stabilizer compound）または表面活性剤をさらに含む、請求項37記載の方法。
【請求項４３】
第1溶液、第2溶液及び第3溶液の少なくとも一つが、第2の脂質をさらに含む、請求項37記載の方法。
【請求項４４】
脂質が陽イオン性脂質である、請求項37記載の方法。
【請求項４５】
脂質がセチルトリメチルアンモニウムである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項４７】
脂質がホスファチジルコリンである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
凍結微粒子を作製するため、0℃以下の温度に微粒子を供する段階；及び
凍結乾燥微粒子を作製するため、凍結微粒子を凍結乾燥させる段階
からなる追加段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４９】
請求項38記載の方法によって作製される微粒子。
【請求項５０】
請求項40記載の方法によって作製される微粒子。
【請求項５１】
請求項7記載の調製物を供給する段階；及び
動物に調製物を導入する段階
を含む、動物に核酸を投与する方法。
【請求項５２】
請求項8記載の微粒子を供給する段階；及び
動物に微粒子を導入する段階
を含む、動物に核酸を投与する方法。
【請求項５３】
そのそれぞれが高分子マトリックス、核酸分子、及び脂質を含む複数の微粒子を含む調製物であって、微粒子がリポソームにカプセル化されず、また微粒子が細胞を含まない、調製物。
【請求項５４】
脂質が、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、及び両性イオン性脂質からなる群より選択される、請求項53記載の調製物。
【請求項５５】
脂質が陽イオン性脂質である、請求項54記載の調製物。
【請求項５６】
脂質がセチルトリメチルアンモニウムである、請求項55記載の調製物。
【請求項５７】
脂質がリン脂質である、請求項53記載の調製物。
【請求項５８】
脂質がホスファチジルコリンである、請求項57記載の調製物。
【請求項５９】
第2の脂質をさらに含む、請求項53記載の調製物。
【請求項６０】
微粒子が安定化化合物をさらに含む、請求項53記載の調製物。
【請求項６１】
微粒子が炭水化物をさらに含む、請求項53記載の調製物。
【請求項６２】
微粒子が炭水化物をさらに含む、請求項60記載の調製物。
【請求項６３】
核酸分子がプラスミドである、請求項53記載の調製物。
【請求項６４】
微粒子中の核酸分子の少なくとも50％がスーパーコイルである、請求項53記載の調製物。
【請求項６５】
微粒子の少なくとも90％が直径約11ミクロン未満である、請求項62記載の調製物。
【請求項６６】
高分子マトリックスが生物分解性である、請求項53記載の調製物。
【請求項６７】
高分子マトリックスが合成の生物分解性コポリマーを含む請求項53記載の調製物。
【請求項６８】
コポリマーが乳酸-グリコール酸共重合体（poly-lactic-co-glycolic acid）（PLGA)である、請求項67記載の調製物。
【請求項６９】
コポリマーにおけるグリコール酸に対する乳酸の比率が、重量比で約1：2〜約4：1の範囲内である、請求項68記載の調製物。
【請求項７０】
コポリマーにおけるグリコール酸に対する乳酸の比率が、重量比で約65：35である、請求項68記載の調製物。
【請求項７１】
微粒子が薬学的に許容される担体に懸濁される、請求項53記載の調製物。
【請求項７２】
核酸分子がコード配列に機能的に連結された発現制御配列を含む、請求項53記載の調製物。
【請求項７３】
それぞれが、高分子マトリックス；
脂質；
タンパク質性抗原決定基；及び
抗原性ポリペプチドをコードする単離された核酸分子
を含む、複数の微粒子を含む調製物。
【請求項７４】
単離された核酸分子がプラスミドである、請求項73記載の調製物。
【請求項７５】
請求項53記載の調製物を供給する段階；及び
動物に該調製物を導入する段階
を含む、動物に核酸を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、核酸を細胞内に輸送する方法に関する。
【０００２】
遺伝子治療は、例えば、嚢胞性線維症などの遺伝性疾患を治療するのに、非常に有望な技術である。また、遺伝子治療は、例えば、ガン細胞の中での発現を狙った細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子のように、自然には宿主細胞に存在しない遺伝子からの遺伝子産物を発現させたいときにも用いることができる。遺伝子治療は、いくつかの種類に分類することができる。嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、または重症複合免疫不全症（SCID）などの遺伝性疾患におけるように、哺乳動物の全生存期間中にわたり、欠陥遺伝子を置換することが望ましい場合もある。他の場合には、例えば、感染期間中など、一定の期間だけ、治療用ポリペプチドを発現する遺伝子による治療が望ましい場合もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの形、またはリボザイムの形になった核酸も、治療上用いられる。さらに、この核酸によってコードされるポリペプチドを、哺乳動物における免疫応答の効果的な刺激因子とすることができる。
【０００３】
遺伝子を細胞の中に導入するために、ウイルスベクターによる感染、バイオリスティク法による導入、「裸」のDNAの注射（米国特許第5,580,859号）（特許文献１）、およびリポソームまたは高分子粒子による輸送など、さまざまな技術が用いられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第5,580,859号
【特許文献２】国際公開第９８／３１３９８号
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、貪食作用に適したサイズをもつ、核酸を含む微粒子（微小球とも呼ばれる）を、核酸の完全性を損なうことなく製造できるという所見に基づいている。これらの微粒子は、ポリヌクレオチドを貪食細胞の中に輸送するために非常に有効なベクターである。
【０００６】
一般的に、本発明は、高分子マトリックスと核酸とを含む直径20ミクロン未満の微粒子を特徴とする。この高分子マトリックスは、水への溶解度がおよそ1 mg/l未満の一つ以上の合成高分子を含むが、ここで、合成とは、天然のものではないことと定義される。この核酸は、その少なくとも50％（好ましくは少なくとも70％、または、さらに80％）が閉環状になっているRNAか、その少なくとも25％（好ましくは少なくとも35％、40％、50％、60％、70％、または、さらに80％）がスーパーコイル化した環状プラスミドDNA分子のいずれかである。プラスミドは線状であっても環状であってもよい。環状で二本鎖の場合はニックが形成され、即ち開環状になるか、スーパーコイル状になると考えられる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであり、これも線状であってもよい。
【０００７】
高分子マトリックスは、水への溶解度がおよそ1 mg/l未満の一つ又は複数の合成高分子からできている。少なくとも50％（および、好ましくは少なくとも70％、または、さらに80％）の核酸分子がスーパーコイルDNAの形になっている。
【０００８】
高分子マトリックスは、生物分解性のものでもよい。ここでは、生物分解性とは、高分子が、正常な代謝経路によって、宿主細胞から一掃されることが分かっている化合物に、時間をかけて分解されることを意味するよう用いられる。一般的に、生物分解性高分子は、患者に注射した後、実質的に約1カ月で、また、２年以内には確実に代謝される。特定の場合には、この高分子マトリックスは、例えば、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）など、１種類の合成生物分解性のコポリマーから作製することができる。コポリマー内のグリコール酸に対する乳酸の比率は、重量で約1：2から約4：1の範囲にすることができ、好ましくは重量で約1：1から約2：1の範囲にすることができ、最も好ましくは重量で約65：35することができる。場合によっては、高分子マトリックスは、所定の細胞型または組織型に対する微粒子の特異性を高めるためのリガンド、レセプター、または抗体などの標的分子も含む。
【０００９】
特定の適用において、微粒子は、約11ミクロン未満の直径をもつ。この微粒子は、水溶液に懸濁することができ（例えば、注射によって輸送するため）、または、乾燥させた固体の状態におくことができる（例えば、貯蔵のため、または吸入を介した送達、移植もしくは経口送達のため）。核酸は、コード配列に機能的に連結された調節配列でもよい。発現制御配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーなど、転写または翻訳を調節することが分かっている核酸配列が含まれる。好ましい例において、DNAの少なくとも60％または70％がスーパーコイル化している。より好ましくは、少なくとも80％がスーパーコイル化している。
【００１０】
別の態様において、本発明は、高分子マトリックスと、コード配列に機能的に連結された発現制御配列をもつ（好ましくは、閉鎖した環状の）核酸分子とを含む、直径約20ミクロン未満の微粒子を特徴とする。このコード配列によってコードされる発現産物は、哺乳動物の天然のタンパク質の断片、もしくは哺乳動物に感染するか、さもなければ哺乳動物にとって有害なタンパク質の断片の配列と本質的に同一の配列をもつ、少なくとも長さ7アミノ酸のポリペプチドでもよく、または、クラスIもしくはクラスIIMHC分子に結合することのできる長さおよび配列をもつペプチドでもよい。実施例が、国際公開公報第94/04171号に示されており、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１１】
ここで、DNA配列またはポリペプチド配列に関して本質的に同一とは、参照配列にできるだけ近似するようにアラインメントを作成したときに、天然の配列と25％を超えては相違しないこと、および、その違いが、このDNAまたはポリペプチドの、本発明の方法における望ましい機能に有害な影響を与えないことを意味するよう定義される。タンパク質の断片という用語は、タンパク質全部未満の場合を意味するよう用いられている。
【００１２】
二個のアミノ酸配列または二個の核酸の同一性の割合を決定するために、それらの配列は適当な比較の目的で並べられる（例えばギャップを、第2のアミノ酸または核酸配列と最適に整列させた第1のアミノ酸または核酸配列の配列に導入するとよい）。そこで対応するアミノ酸の部位またはヌクレオチドの部位で、アミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第1配列の部位が第2配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその部位で同一である。二つの配列間の同一性の割合は、配列が共有している同一の部位の関数である（即ち、同一率％＝同一の部位の数/部位の総数（例えば、重複する部位）×100）。好ましくはこの二つの配列の長さは同じである。
【００１３】
二つの配列間の相同性の割合の決定は、Karlin及びAltschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268に記載され、Karlin及びAltschul(1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 5873-5877で改変された計算式を用いて達成できる。このような計算式は、Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のXBLAST及びXBLASTプログラムに組み入れられる。BLAST核酸検索法はNBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いて行うことができ、それによって本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列が得られる。BLASTタンパク質検索法は、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて行うことができ、それによって本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列が得られる。比較の目的でギャップが形成された整列法を得るためには、ギャップを形成したBLASTをAltschulら(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されたように用いればよい。また、分子間の異なる関係を検出する検索を繰り返し行うためにPSI-Blastを用いてもよい。同様に、BLAST、ギャップBLAST、及びPSI-Blastプログラムを用いる場合には、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメーターが用いられるはずである。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。
【００１４】
同一性の割合を算出する場合、正確に適合するもののみをカウントする。
【００１５】
ペプチドまたはポリペプチドは、輸送配列に連結させることができる。「輸送配列（trafficking sequence）」という用語は、それを融合したポリペプチドが、例えば、核、小胞体、ゴルジ装置、細胞内小胞、リソソーム、またはエンドソームなど、細胞の特定の区分に移送されるようにするアミノ酸配列を意味する。
【００１６】
発現産物が、クラスIまたはクラスIIMHC分子を結合することのできる長さと配列をもつペプチドを含む態様においては、発現産物は、典型的には免疫原性である。この発現産物は、なお同じT細胞によって認識されて、T細胞のサイトカインプロフィールを変更することができるならば（「変化したペプチドリガンド」）、T細胞によって認識される天然のタンパク質の配列とアミノ酸残基の一致率が25％を超えないで異なるアミノ酸配列をもつことができる。例えば、病原性ウイルス系統、またはHLAアロタイプ結合との交差反応性を増強させるために発現産物と天然のタンパク質との違いを操作することができる。
【００１７】
発現産物の例には、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、インバリアント鎖、GAD65、島細胞抗原、デスモグレイン、α-クリスタリン、またはβ-クリスタリンの断片で、クラスIIMHC分子に結合する断片の配列に、少なくとも50％一致するアミノ酸などがある。表1に、自己免疫疾患に関係すると考えられている、このような発現産物がたくさん列挙されている。これらのタンパク質の断片は、MBPの残基80〜102（配列番号：1）、PLPの残基170〜191（配列番号：2）、またはインバリアント鎖の残基80〜124（配列番号：3）など、配列番号：1〜46のいずれかに本質的に同一でもよい。別の断片が、表2に列挙されている。
【００１８】
または、この発現産物は、ヒトパピローマウイルスE1遺伝子、E2遺伝子、E6遺伝子、およびE7遺伝子、Her2/neu遺伝子、前立腺特異的抗原遺伝子、T細胞（MART）遺伝子によって認識されるメラノーマ抗原の遺伝子、またはメラノーマ抗原遺伝子（MAGE）によってコードされる抗原など、表3に列挙されている腫瘍抗原のいずれかの抗原部位の配列と本質的に同一のアミノ酸配列を含むことができる。ここでも、発現産物を、交差反応性が増強されるように操作することができる。
【００１９】
さらに別の場合には、発現産物は、例えば、ヒトパピローマウイルス（HPV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純疱疹ウイルス（HSV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）などの慢性的に細胞に感染するウイルス；マイコバクテリアなどの細菌；カンジダ属、アスペルギルス属、クリプトコックス属もしくはヒストプラスマ属の生物種、またはプラスモディウム属（Plasmodium）の生物種などの他の真核生物によって天然に発現されるタンパク質の抗原性断片の配列に本質的に同一のアミノ酸配列を含む。このようなクラスI結合断片、および腫瘍抗原の断片の代表的なリストが、表4に含まれている。
【００２０】
ここに記載された微粒子の核酸は、微粒子のいたるところに分布されているか、あるいはその微粒子内の少数の決まった領域に存在しているか、そのいずれであってもよい。また、核酸は中空のコアを持つ微粒子のコア部分に存在していてもよい。この微粒子は、細胞（例えば細菌の細胞）を、または天然の細胞のゲノム、例えば天然の細胞の無傷のゲノムを含んでいないことが好ましい。
【００２１】
微粒子はまた、安定化化合物（例えば、炭水化物、陽イオン性化合物、多イオン性化合物、例えばPluronic-F68 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO）、またはDNA縮合剤）を含むことができる。安定化化合物は、微粒子を製造する際のある時点で核酸を保護するため（例えば、その核酸をスーパーコイル状に保ったり、それが崩壊することから保護したりするため）に作用する化合物である。安定化化合物の例としては、デキストロース、スクロース、デキストラン、トレハロースポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン硫酸塩、陽イオン性ペプチド、多イオン性剤、例えばPluronic-F-68 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO）、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドのような脂質が挙げられる。この安定化化合物は、後で高分子マトリックスから放出された後でもDNAと関連し続けると考えられる。
【００２２】
本発明はまた、本明細書に記載した微粒子のような微粒子を含む、微粒子の調製物を特徴とする。ある態様では、調製物に含まれる少なくとも90％の微粒子が直径約100ミクロン未満である。ある場合には、少なくとも90％の微粒子が直径約20ミクロン未満、好ましくは約11ミクロン未満であることが望ましい。
【００２３】
別の態様において、本発明は、高分子マトリックスと、コード配列に機能的に連結された発現制御配列をもつ核酸分子とを含む、直径約20ミクロン未満の微粒子を特徴とする。
【００２４】
（表１）  自己抗原
2011088909.tif 000003
2011088909.tif 000004
参照：
a)HLA&Disease, Academic Press, New York, 1994, (R. Lechler, ed)におけるHLA及び自己免疫疾患、R. Heard, pg. 123-151
b)Cell 80, 7-10 (1995)
c)Cell 67, 869-877 (1991)
d)JEM 181, 1835-1845 (1995)
【００２５】
（表２）  クラスII関連ペプチド
2011088909.tif 000005
2011088909.tif 000006
2011088909.tif 000007
【００２６】
（表３）  腫瘍抗原
2011088909.tif 000008
2011088909.tif 000009
【００２７】
（表４）  クラスI関連腫瘍および病原性ペプチド
2011088909.tif 000010
2011088909.tif 000011
2011088909.tif 000012
2011088909.tif 000013
【００２８】
本明細書における核酸分子には、コード配列に機能的に連結された発現制御配列が含まれる。コード配列によってコードされた発現産物は、インビボでマクロファージにおいて発現させた場合、特異的または一般的のいずれかで免疫応答を下流調節するタンパク質である。このようなタンパク質の例には、耐性タンパク質、MHC遮断ペプチド、変性したペプチドリガンド、受容体、転写因子、及びサイトカイン類が含まれる。
【００２９】
ここに記載された微粒子のある態様では、核酸はペプチドをコードする必要はないが、γ-インターフェロン、IL-2、もしくは他のサイトカインの放出を刺激することによって、またはB細胞、マクロファージ、樹状細胞、もしくはT細胞を多クローン性に活性化することによって免疫応答を調節できる。例えば、ポリI:C、またはCpG含有核酸配列を用いることができる（KlinmanらのProc. Nat. Acad. Sci. (USA) 93: 2879, 1996、SatoらのScience 273: 352, 1995）。
【００３０】
別の態様において、本発明は、微粒子を調製するための方法を特徴とする。有機溶媒に溶解した高分子を含む第一の溶液を、極性または親水性の溶媒（例えば、エチレンジアミン四酢酸、もしくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、またはこれらを組み合わせたものを含み、選択的に、陽イオン性ペプチド、脂質、またはデンドリマーなどのDNA縮合剤を含む緩衝溶液）の中に溶解または懸濁した核酸を含む第二の溶液と混合する（例えば、超音波破砕、均質化、ボルテックス破砕、ミクロフルイダイゼーション（microfluidization）。この混合液が、第一の乳液を形成する。そして、第一の乳液に、例えばPluronic F-68（Sigma-Aldrich Co.）のような界面活性剤を含みうる第三の溶液を混ぜて、高分子マトリックスと核酸とを含む第二の乳液を形成させる。この混合段階は、例えば、ホモジナイザー、ボルテックスミキサー、ミクロフルイダイザー（microfluidizer）、または超音波破砕器の中で行うことができる。どちらの混合段階も、平均して直径が100ミクロン未満の微粒子が製造される一方、核酸が剪断されるのを最小限にするような様式で行われる。
【００３１】
例えば、カラムクロマトグラフィー、または（例えば、エタノールまたはイソプロパノール沈殿によって）核酸をさらに精製してから、精製または沈殿した核酸を、水性、極性、または親水性の溶液中に溶解または懸濁化して、第二の溶液を調製することができる。
【００３２】
第一の溶液または第二の溶液は、カプセル化の間、または微粒子形成の全過程で核酸をスーパーコイル化した状態に保つことによって、核酸または乳液を安定化することができる界面活性剤、DNA縮合剤、または安定化化合物（例えば、1〜10％デキストロース、トレハロース、スクロース、デキストラン、またはその他の糖類、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、Pluronic F-68（Sigma-Aldrich Co.、St. Louis、MO）、その他の脂質、またはデキストラン硫酸）を、選択的に含むことができる。
【００３３】
第二の乳液は、選択的に、ポリビニルアルコールなどの有機溶媒を含む第四の溶液と混合させることができる。第二の乳液は（すなわち、単独または第四の乳液とともに）、例えば、溶媒の迅速な蒸発を促すために、選択的には、高温で（例えば、室温から約60℃に）攪拌することができる。溶媒を除去する他の方法には、アルコールの添加、真空の適用、または希釈が含まれる。
【００３４】
方法は、有機溶媒を除去し、それによって洗浄された微粒子を製造するために、水性溶液で微粒子を洗浄するという、さらに別の段階を含んでいてもよい。そして、洗浄された微粒子を0℃よりも低い温度に置いて凍結微粒子を製造し、次に、凍結乾燥させて、凍結乾燥微粒子を製造することができる。この微粒子は、凍結乾燥（をするとすれば）の前または後に、選択的に、例えば、トゥイーン-80（Tween-80）、マンニトール、ソルビトール、またはカルボキシメチル-セルロースなどの賦形剤に懸濁することができる。
【００３５】
望ましいならば、この方法は、微粒子をスクリーニングして、直径が100ミクロン（または、さらに20ミクロン）よりも大きい微粒子を取り除くという別の段階を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、高分子マトリックス、タンパク性抗原決定基、および、前記のタンパク性抗原決定基とは異なる、または同一の抗原性ポリペプチドをコードするDNA分子を含む微粒子の調製物を特徴とする。この抗原決定基は、抗体反応を誘発することができるエピトープを含んでいる。このDNAから発現される抗原性ポリペプチドは、T細胞応答（例えば、CTL応答）を誘導することができる。このDNAはプラスミドDNAでもよく、抗原決定基と同じ微粒子の中で結合させることができ、または、この2つを別々の微粒子に入れて、その後一緒に混合することができる。場合によっては、タンパク性抗原決定基ではなくオリゴヌクレオチドを、核酸のプラスミドと一緒にカプセル化することができる。または、オリゴヌクレオチドは、別個の粒子中にカプセル化することができる。このオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスまたはリボザイム活性をもつことができる。
【００３７】
別の態様において、本発明は、上記の段落で説明されている微粒子のいずれかを動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、またはフェレットなど）の体内に導入することによって、動物に核酸を投与する方法を特徴とする。微粒子を、水溶液に懸濁して、または別の適当な製剤として提供して、例えば、動物に、経口、膣内、直腸内もしくは注入により送達するか、注射するか、または植え込む（例えば、外科的に）ことができる。これらは、選択的に、サイトカイン、インターフェロン、抗原、またはアジュバントなどのタンパク質とともに輸送することができる。
【００３８】
別の態様において、本発明は、それぞれが、高分子マトリックス、安定化化合物、および核酸発現ベクターを含む微粒子の調製物を特徴とする。この高分子マトリックスは、水への溶解度がおよそ1 mg/l未満の一つ以上の合成高分子を含むが、これに関して、合成とは、天然のものではないものと定義される。少なくとも90％の微粒子が、100ミクロン未満の直径をもつ。核酸は、RNAまたはDNAのいずれかでありうる。RNAとして存在する場合、いくつかの態様において、少なくとも50％（好ましくは、少なくとも70％または80％）が閉環状のRNAである。この核酸は線状分子であっても環状分子であってもよく、したがって例えばプラスミドの可能性があり、またウイルスのゲノムや、ウイルスのゲノムの一部を含んでいてもよい。環状で二本鎖の場合には、それにニックが形成されたり、即ち開環状であったり、また超-コイル状であったりする。ある態様においては核酸はプラスミド分子であり、その少なくとも25％（また好ましくは、少なくとも35％、40％、50％、60％、70％、または80％と同程度）がスーパーコイル状である。
【００３９】
また核酸はオリゴヌクレオチドであってもよく、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。また調製物には、安定化化合物である例えばデキストロース、スクロース、デキストラン、トレハロースポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン硫酸塩、及び陽イオン性ペプチドも含むことができる。
【００４０】
別の態様では、本発明は微粒子の調製物を特徴とし、そのそれぞれには高分子マトリックス、核酸分子、及び脂質が含まれる。微粒子はリポソームにカプセル化されておらず、またその微粒子は細胞を含んでいない。「細胞を含まない」とは、微粒子が細胞（例えば細菌の細胞）を含まないことを意味している。上記に説明されているようにマクロファージのような細胞によって、微粒子それ自体が取り込まれる可能性があることが理解できる。
【００４１】
本態様における核酸は、上記に述べた核酸分子のどれかであってもよく、それにはまた、単離された核酸分子が含まれていてもよい。単離された核酸分子によると、何らかの合成の核酸分子（組換え体を含む）、または天然に存在するウイルスもしくは細胞から取り出される天然の核酸分子が意味される。
【００４２】
脂質は例えば陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、もしくは両性イオン性脂質であってもよいし、あるいは電荷を持っていなくてもよい。脂質の例には、セチルトリメチルアンモニウムや、例えばホスファチジルコリンのようなリン脂質が含まれる。微粒子は、あるタイプの脂質、例えばレシチン脂質調製物に存在する脂質を一個またはそれ以上含んでいてもよいし、また上記に記載したような一個またはそれ以上の安定化化合物も含んでいてもよい。
【００４３】
別の態様において本発明には、直径が約20ミクロン未満であって、高分子マトリックス、脂質、及び核酸分子を含む微粒子が含まれる。この微粒子はリポソームにカプセル化されておらず、またこの微粒子は細胞を含まない。
【００４４】
微粒子に含まれる核酸分子は環状の可能性があって、その核酸分子にはコード配列に機能的に連結された発現制御配列が含まれているであろう。この微粒子には任意で、上記に記載したような安定化化合物、または標的分子が含まれる。
【００４５】
別の態様において本発明には、直径が約20ミクロン未満であって、好ましくはリポソームにカプセル化されていない微粒子が含まれる。この微粒子には高分子マトリックス、脂質、及びコード配列に機能的に連結された発現制御配列を含む核酸分子が含まれる。このコード配列には、(1)(a)天然の哺乳動物のタンパク質、または(b)哺乳動物を感染する感染因子から得られる天然のタンパク質の断片の配列に本質的に同一の配列を持つ、長さが少なくとも7個のアミノ酸からなるポリペプチド、(2)それがクラスIまたはクラスIIMHC分子に結合するのを可能にする長さと配列を持つペプチド、及び輸送配列に結合するポリペプチドまたはペプチドが含まれる。発現産物は付加的にアミノ末端のメチオニン残基を含んでいてもよく、またそれは免疫原性であろう。
【００４６】
発現産物には、上記の(1)(a)または(1)(b)または(2)から誘導される重複抗原性ペプチド、例えば、直列に連結された2個、3個、4個またはそれ以上の抗原性のペプチドが含まれうり、そこでは第1の配列のカルボキシ末端の配列が第2の配列のアミノ末端の一部分を形成していて、また第2の配列のカルボキシ末端の一部分が第3の配列のアミノ末端の一部分を形成しており、他にも同様に形成されている。重複するペプチドを含むアミノ酸配列の一例はアミノ酸配列、LLMGTLGIVCPIC（配列番号：110）であり、それにはクラスIMHC結合性ペプチドである、LLMGTLGIV（配列番号：111）及びTLGIVCPIC（配列番号：115）が含まれる。
【００４７】
発現産物は別の場合、あるいは付加的な場合において、二個またはそれ以上の抗原性ペプチドを持つポリペプチドを含んでおり、その際の抗原領域は重複していない。ペプチドからなるこれらの縦列配列は、同じであってもよいし異なっていてもよいような2個、3個、4個またはそれ以上（例えば10個まで、あるいは20個かそれ以上まで）のペプチドを含む可能性がある。このような縦列に配列したペプチドはもちろん、重複するペプチドを介して広がっている。
【００４８】
ある態様での発現産物は、(1)T細胞によって認識される天然のペプチドのアミノ酸配列と25％より大きくは異ならないアミノ酸配列を持っていて、(2)T細胞によって認識され、そして好ましくは(3)T細胞のサイトカインプロフィールを変える（例えば、「変異したペプチドリガンド」）。
【００４９】
上記の発現産物には、タンパク質の長さが少なくとも10アミノ酸の断片配列に対して少なくとも50％が同一であるクラスIIMHC結合性アミノ酸配列が含まれるであろう。そのタンパク質は、例えばミエリン塩基性タンパク質（MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、非変異鎖、GAD65、島細胞抗原、デスモグレイン、α-クリスタリン、及びβ-クリスタリンであることができるし、また配列番号1-46の配列の一つまたはそれ以上に本質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。
【００５０】
上記の発現産物はまた、輸送配列、例えば小胞体に輸送する配列、リソソームに輸送する配列、エンドソームに輸送する配列、細胞内小胞に輸送する配列、及び核に輸送する配列などの輸送配列も含むことができる。このような輸送配列には、シグナルペプチド（翻訳の際にERにタンパク質を導くアミノ末端配列）、KDELのようなER保持ペプチド、KFERQ及びQREFKのようなリソソーム-標的ペプチド、さらにK、R、D、E、F、I、V、及びLから選択される4個の残基によって一方の側を固めたQを持つ他のペンタペプチドが含まれる。核に局在化する配列には、ChelskyらのMol. Cell Biol., 9: 2487, 1989、RobbinsのCell, 64: 615, 1991、及びDingwallらのTIBS, 16: 478, 1991に記載されたようなヌクレオプラスミン-、及びSV40-様の核標的シグナルが含まれる。ある種の核局在化配列には、AVKRPAATKKAGQAKKK（配列番号：112）、RPAATKKAGQAKKKKLD（配列番号：113）、及びAVKRPAATKKAGQAKKKLD（配列番号：114）が含まれる。
【００５１】
他の態様において発現産物にはまた、腫瘍抗原、例えば表3に列挙したタンパク質の一つから得られる腫瘍抗原の抗原性部位の配列に本質的に同一のアミノ酸配も含まれる。
【００５２】
また発現産物は、感染因子によって天然に発現したタンパク質の抗原性の断片の配列に本質的に同一のアミノ酸配列を含んでいてもよい。その感染因子は、例えばウイルス、細菌、または酵母のような寄生性の真核生物であってもよい。したがって感染因子は、例えばヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、プラスモジウム種（Plasmodium species）、マイコバクテリア、クラミジア（Chlamidia）、及びヘリコバクター種を含むことができる。
【００５３】
また、上記に記載された脂質含有微粒子を動物に導入することによって、動物（例えばヒト）に核酸を投与する方法も本発明に含まれる。脂質粒子にはさらに、安定化剤を含んでいてもよい。この微粒子は経口、経粘膜、吸入により導入することができるし、また、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内注入によるような非経口ルートで導入することもできる。
【００５４】
別の態様において本発明は、脂質含有微粒子を調製する方法を含む。その段階には、有機溶媒に溶解した高分子を含む第1溶液を供給する段階、極性溶媒もしくは親水性溶媒に溶解または懸濁された核酸を含む第2溶液を供給する段階が含まれる。その第1溶液と第2溶液は、第1乳液を作製するために混合される。続いてこの第1乳液を第3溶液と混合して第2の乳液を作製する。第1、第2、及び第3溶液の少なくとも一つはまた、一つの脂質または複数の脂質を含む。この両方の混合段階は、平均直径が100ミクロンよりも小さな微粒子が作製されるのに対して、核酸の剪断は最少にする方式で行われる。
【００５５】
一つまたは複数の脂質は、第1、第2、または第3の溶液か、これらの溶液の組み合わせのいずれかに含まれていればよい。ある態様では脂質は、一つもしくは二つの溶液中に、0.001％から10.0％の濃度で、または0.1％から1.0％（重量/容積）の濃度で存在している。
【００５６】
この方法には、任意に、凍結微粒子を作製するために0℃以下の温度に微粒子を置く段階、及び凍結乾燥微粒子を作製するために凍結微粒子を凍結乾燥する段階が含まれていてもよい。
【００５７】
本発明はまた微粒子の調製物も含み、そのそれぞれには高分子マトリックス、脂質、タンパク質性抗原決定基、抗原性ポリペプチドをコードする単離された核酸分子、そして任意であるが、安定化剤が含まれる。
【００５８】
また本発明には、脂質含有の微粒子の調製物を供給する段階、及び動物にその調製物を導入する段階により動物に核酸を投与する方法が含まれる。この脂質含有微粒子は、任意で少なくとも一つの安定化剤である例えば炭水化物を含んでいてもよい。
【００５９】
別途定義されていないかぎり、本明細書において用いられている技術用語と科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味をもつ。本明細書において説明されている方法および材料と同じか、または同等のものを、本発明を実施または試験するために用いることができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、全部、参照として本明細書に組み入れられる。矛盾があるときには、定義も含めて、本出願が調節をする。さらに、実施例は例示のためのものに過ぎず、限定的なものとすることを意図していない。
【００６０】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】pVA2.1/4プラスミドのプラスミド地図である。
【図１Ｂ】ルシフェラーゼプラスミドのプラスミド地図である。
【図１Ｃ】VSV-Npepプラスミドのプラスミド地図である。
【図２】COULTER（登録商標）カウンターで分析した、DNAを含む微粒子のサイズ分布のグラフである。
【図３】異なった破砕速度と破砕時間に関係する、DNAスーパーコイリングの程度を示す、2枚のアガロース電気泳動ゲル写真の組である。
【図４】微粒子存在下または非存在下での細胞集団を比較した一組のFACSを印刷したものである。
【図５】エフェクター：標的の比率に対する特異的溶解のグラフである。
【図６】エフェクター：標的の比率に対する特異的溶解のグラフである。
【図７】エフェクター：標的の比率に対する特異的溶解のグラフである。
【図８】エフェクター：標的の比率に対する特異的溶解のグラフである。
【図９】エフェクター：標的の比率に対する特異的溶解のグラフである。
【図１０】TEまたはCTABに再懸濁されたDNAより調製される微粒子から時間の経過にしたがって放出されるDNAを示すグラフである。
【図１１】脂質（「TE」）、レシチン、またはオボシン（OVOTHIN）（商標）160を含まない微粒子から時間の経過にしたがって放出されるDNAを示すグラフである。
【図１２】ルシフェラーゼをコードするDNAを含む脂質含有微粒子を注入したマウスから得られるT細胞性応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
本発明の微粒子は、2つの方法のいずれかで調剤される：すなわち、時間をかけて徐々に核酸が放出されるところの（1）患者の貪食細胞への輸送を最大化するか、または（2）患者の組織への蓄積が行われるようにするが、この核酸は、微粒子から解離されると、隣接する細胞（抗原提示細胞、すなわちAPCを含む）によって取り込まれる。どちらの場合にも、DNAが損なわれないよう維持することが、より重要である。プラスミドDNAについては、これは、スーパーコイル化しているプラスミド分子の割合を最大にし、それによって、スーパーコイル化していない（すなわち、ニックが入っているか、直鎖状の）プラスミドよりも安定しているか、またはより効率的なトランスフェクションもしくは転写が可能になることを意味する。スーパーコイル状のプラスミドの最大化された割合は、細胞中のDNAまたは微粒子の安定性を増加させる可能性もある。
【００６３】
核酸が損なわれないように保護するための手段は、微粒子を形成する過程で核酸に必ずかかる剪断力を最小限にすること、調製の間を通じて、超音波破砕、均質化、ミクロフルイダイゼーション、または他の混合にかける時間を制限すること、および核酸の単離とカプセル化の間を通じて、緩衝剤か、その他の安定化化合物を加えることなどである。例えば、切断を最低限にするが、所望のサイズの微粒子を形成する、超音波破砕の時間と強度とのバランスをとる必要がある。これらの技術については後述する。
【００６４】
本発明の微粒子は、例えば、癌、表1に記載した自己免疫疾患のいずれか、または特定の定義された核酸によって治療できるその他の症状を治療するための薬剤を製造するときに用いることができる。
【００６５】
マクロファージ、樹状細胞、およびその他のAPCによる微粒子の貪食は、これらの細胞の中に微粒子を導入するのに有効な方法である。微粒子の大きさを約20μｍよりも小さくすること、好ましくは、11μｍよりも小さくすることによって、これらの細胞による貪食を増進することができる。また、微粒子に用いられる高分子のタイプが、後述するように、貪食細胞による取り込みの効率に影響することがある。
【００６６】
網状内皮系（RES）の貪食細胞による取り込みが望ましいときには、微粒子を、直接血流の中に（すなわち、静脈内または動脈内への注射または輸液によって）輸送することができる。または、微粒子は、経口で、粘膜部位、鼻腔、膣内、直腸内、または病変内に送達されうる。微粒子はまた、皮下注射を介して、排出用リンパ節の食細胞による取り込みを促進することもできる。また、微粒子は、皮内から（すなわち、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞などの皮膚のAPCに）もしくは筋内から導入することができる。最後に、微粒子を肺胞のマクロファージに取り込ませる場合には、この微粒子を、（例えば、粉末状の微粒子、または微粒子を含む霧状またはエアロゾル化した溶液または懸濁液の吸入によって）肺の中に導入することができる。
【００６７】
貪食細胞が微粒子を貪食すると、核酸は、細胞の内部に放出される。放出されると、所期の機能を営むことができる。すなわち、例えば、正常な細胞内の転写/翻訳装置による発現（発現の場合）、または、細胞内のプロセスの変化（アンチセンスまたはリボザイム分子の場合）など。
【００６８】
これらの微粒子は、受動的にマクロファージならびに専門的なAPCおよび貪食細胞の他のタイプを標的とするため、免疫機能を調節するための手段になる。マクロファージと樹状細胞は、MHCクラスIおよびII分子をともに発現する、専門的なAPCとして機能する。加えて、DNAの分裂作用は、B細胞、T細胞、および他の細胞により媒介される非特異的免疫反応を刺激するために使用されうる。
【００６９】
MHCクラスIまたはクラスII分子に結合する外来抗原をコードする発現ベクターの微粒子による輸送は、抗原に対する宿主のT細胞応答を誘導し、それによって、宿主に免疫を付与する。
【００７０】
発現ベクターが、自己免疫に関与するクラスIIMHC分子に結合する遮断ペプチド（国際公開公報第94/04171号を参照）をコードする場合には、クラスII分子による、自己免疫疾患関連自己ペプチドの提示が阻止され、自己免疫疾患の症状が緩和される。
【００７１】
別の例において、自己免疫誘導ペプチドと同一、またはほぼ同一のMHC結合ペプチドが、T細胞をトレランス誘導またはアネルギー誘導することによって、T細胞の機能に影響を与えることができる。または、MHC/ペプチド複合体認識後のサイトカイン分泌プロファイルを変更することによって、T細胞の機能が調節されるように、ペプチドを設計してもよい。T細胞によって認識されるペプチドは、B細胞に特定のクラスの抗体を産生させたり、炎症反応を誘導したり、さらには、宿主T細胞の反応を促進させたりするサイトカインの分泌を誘導することができる。
【００７２】
免疫応答の誘導（例えば、ペプチドもしくはタンパク質に対して特異的な抗体反応）には、いくつかの因子が必要である。この多因子的な性質が、本発明の微粒子を用いて、多くの面で免疫関連細胞を操作しようという企てを惹き起こしたのである。例えば、各微粒子の中にDNAとポリペプチドをもつ微粒子を調製することができ、または、微粒子はDNAもしくはポリペプチドのいずれかを有するように調製され、その後混合されうる。これらの二重機能をもつ微粒子については、後に検討する。
【００７３】
CTL反応
クラスI分子は、抗原ペプチドに未分化のT細胞を提示する。T細胞を完全に活性化するためには、抗原ペプチド以外の因子が必要である。インターロイキン-2（IL-2）、IL-12、およびガンマインターフェロン（γ-IFN）などの非特異的タンパク質は、CTL応答を促進し、CTLエピトープを含むポリペプチドをコードするDNAとともに提供することができる。または、ヘルパーT（TH）決定基をもつタンパク質を、CTLエピトープコードするDNAとともに包含させることができる。THエピトープは、TH細胞からのサイトカインの分泌を促進して、発生したT細胞のCTLへの分化に関与する。
【００７４】
または、リンパ球とマクロファージの特定の領域への移動を促進するタンパク質、核酸、またはアジュバントを、適当なDNA分子とともに微粒子に包含させることができるかもしれない。微粒子が分解するにつれて、タンパク質の放出による貪食細胞とT細胞の流入が起こるため、結果的にDNAの取り込みが促進される。このマクロファージは、残っている微粒子を貪食して、抗原提示細胞として作用するため、このT細胞がエフェクター細胞になると考えられる。
【００７５】
抗体反応
ある感染病原体を宿主から除去するには、抗体とCTL応答の両方が必要とされるかもしれない。例えば、インフルエンザウイルスが宿主に侵入すると、抗体は、しばしば、それが宿主に感染するのを阻止することができる。しかし、細胞が感染してしまうと、感染した細胞を除去し、宿主の中でさらにウイルスが産生されるのを防ぐためにCTL応答が必要となる。
【００７６】
一般的に、抗体反応は、立体構造的な決定基を目的とするため、そのような決定基を含むタンパク質、またはタンパク質の断片があることが必要である。これに対して、T細胞エピトープは、典型的には、長さ7〜25残基ばかりの直鎖的な決定基である。したがって、CTLと抗体の両反応を誘導する必要があるときには、抗原タンパク質と、T細胞エピトープをコードするDNAとを微粒子の中に含ませることができる。
【００７７】
微粒子からタンパク質をゆっくりと放出させることによって、B細胞の認識と、その後の抗体分泌がもたらされる。さらに、微粒子の貪食によって、APCは、（1）目的のDNAを発現し、それによって、T細胞応答を発生させ、また、（2）微粒子から放出されたタンパク質を消化して、それによって、以後、クラスIもしくはクラスII分子によって提示されるペプチドを生成すると考えられる。クラスII/ペプチド複合体によって活性化されたTH細胞は、非特異的なサイトカインを分泌するため、クラスIもしくはクラスII分子による提示は、抗体応答とCTL応答の両方を促進する。
【００７８】
免疫抑制
一定の免疫応答は、アレルギーと自己免疫をもたらすため、宿主にとって有害なことがある。これらの例では、組織損傷的な免疫細胞が必要である。免疫抑制は、変化したペプチドリガンド、トレランス誘導ペプチド、またはTH細胞およびCTLを下降制御するエピトープ（例えば、「遮断」抗体）をコードするDNAをもつ微粒子によって達成される。これらの微粒子では、一定のタンパク質をDNAとともに担体微粒子に包含させることによって、免疫抑制DNAの効果を増強することができよう。このようなタンパク質のリストには、抗体、レセプター、転写因子、ホルモン、およびインターロイキンなどが含まれる。
【００７９】
例えば、サイトカインを刺激する抗体、細胞表面レセプター、または、インテグリン、もしくは細胞間接着分子（ICAM）などのホーミングタンパク質は、免疫抑制DNAエピトープの効能を高めることができる。これらのタンパク質は、既に活性化されたT細胞の応答を阻害するように働く一方で、このDNAは、発生するT細胞の活性化をさらに阻害する。T細胞制御反応の誘導は、T細胞レセプター（TCR）が関与しているときに存在するサイトカイン環境による影響を受けることがある。IL-4、IL-10、およびIL-6は、DNAにコードされているエピトープに応答して、TH2の分化を促進する。TH2応答は、TH1細胞の活性を阻害することができ、それに対応した、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および若年性糖尿病の病理をもたらす有害な反応を阻害することができる。
【００８０】
共刺激的分子（例えば、CD-40、gp-39、B7-1、およびB7-2）、またはアポトーシスに関与する分子（例えば、Fas、FasL、Bc12、カスパーゼ、bax、TNFα、またはTNFαレセプター）の可溶性型を含むタンパク質を封入することが、特定のT細胞および/またはB細胞の反応が活性化されるのを阻害するためのもう一つの方法である。例えば、B7-1は、TH1細胞の活性化に関与し、B7-2は、TH2細胞を活性化する。必要とされる反応に応じて、これらのタンパク質の一方、もしくは他方をDNAとともに微粒子に包含させるか、または、別の微粒子に入れ、DNAを含む微粒子と混合して供給することができる。
【００８１】
移植のための微粒子
本発明の第二の微粒子調剤は、細胞によって直接取り込まれることを意図しておらず、生物性分解によって微粒子から放出されたときにだけ細胞によって取り込まれる核酸をゆっくりと放出するための貯蔵装置として主に用いることを意図している。この核酸は、例えば、ゆっくりと放出する過程を通して核酸の完全性を維持するために、安定化剤と複合体を形成することができる。したがって、この態様の高分子粒子は、貪食を防止するのに十分な大きさでなければならない（すなわち、5μｍ、および、好ましくは20μｍよりも大きい）。このような粒子は、より小さな粒子を作成するために上記した方法によって作製されるが、前記第一と第二の乳液の混合強度を低くする。すなわち、より低いホモジナイズ速度、ボルテックスミキサーの速度、または超音波の設定を用いることによって、5μｍよりも100μｍに近い直径を有する粒子を得ることができる。混合する時間、第一の乳液の粘度、または、第一溶液中の高分子濃度を変更して、粒子の寸法に影響を与えることができる。
【００８２】
大きな微粒子は、筋内、皮下、皮内、静脈内、または腹腔内への注射によって；（鼻腔内または肺内からの）吸入によって；例えば、錠剤などの形態において、経口的に；または、移植によって輸送されるように、懸濁液、粉末、または移植可能な固体として調剤することができる。これらの粒子は、例えば、アンチセンス分子、遺伝子置換治療薬、サイトカインによる、抗原による、もしくはホルモンによる治療薬の輸送方法、または、免疫抑制剤など、比較的長い期間にわたるゆっくりとした放出が望まれる発現ベクター、またはその他の核酸を輸送するのに有用である。分解、およびそれに続く放出の速度は、高分子の処方によってさまざまである。このパラメータを用いて、免疫機能を調節することができる。例えば、IL-4またはIL-10の輸送については、比較的ゆっくりと放出させたいと望む場合や、IL-2またはγ-IFNの輸送については、比較的速く放出させたいと望む場合がありうる。
【００８３】
高分子粒子組成物
高分子材料は、市販している供給業者から入手するか、既知の方法によって調製することができる。例えば、乳酸とグリコール酸の高分子は、米国特許第4,293,539号で述べられているようにして生成するか、または、アルドリッチ社（Aldrich）から購入することができる。
【００８４】
または、あるいはさらに、高分子マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）、重合無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、タンパク質性高分子、ポリペプチド、ポリエステル、またはアルギニン酸塩、キトサン、およびゼラチンのような天然に存在する高分子などである。
【００８５】
本発明の処方剤において有用な、好ましい徐放性物質には、ポリ無水物、乳酸とグリコール酸のコポリマーで、グリコール酸に対する乳酸の重量比が4：1以下であるもの、および、例えば、1％の無水マレイン酸のような無水物などの分解を促進する触媒を含むポリオルトエステルなどがある。乳酸は、生体の中で分解するのに少なくとも1年かかるため、長期間にわたる分解が望ましいという状況にあるときだけ、この高分子を単独で利用すべきである。
【００８６】
核酸と高分子粒子との結合
二重乳化法を用いて、核酸を含む高分子粒子を作製することができる。まず、高分子を有機溶媒に溶解させる。好ましい高分子は、乳酸/グリコール酸の重量比が65：35、50：50、または75：25のポリ乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）である。次に、水性溶液に懸濁した核酸の試料を高分子溶液に加えて、この2つの溶液を混合して第一の乳液を形成する。これらの溶液は、ボルテックス破砕、ミクロフルイダイゼーション、振盪、超音波破砕、または均質化することにより混合することができる。最も好ましいのは、核酸が、ニック、剪断、または分解という形で受ける損傷ができるだけ少ない方法で、なお、適当な乳液を形成できる方法である。例えば、1/8"のマイクロチッププローブをもつビブラセル-モデル（Vibra-cell model）VC-250超音波破砕器を#3に設定するか、ミクロフルイダイザーの圧力を調節することによって、またはSL2T Silversonホモジナイザーを10Kで5/8"チップで使用することによって許容できる結果を得ることができる。
【００８７】
この処理の際、有機溶媒の中に水滴（核酸を含んでいる）が形成される。望ましいならば、例えばゲル電気泳動によって、核酸が損なわれていないことを評価するために、この時点で、少量の核酸を分離することができる。
【００８８】
水性溶液に懸濁する前に核酸をアルコール沈殿するか、またはさらに精製することによって、カプセル化の効率を向上させることができる。エタノールによる沈殿によって、取り込まれるDNAが147％まで増加し、また、イソプロパノールによる沈殿によっては、170％まで増加する結果となった。
【００８９】
水性溶液の性質が、スーパーコイル化したDNAの収率に影響を与える可能性がある。例えば、DNA試料の調製と精製の過程でエンドトキシンを取り除くためによく用いられるポリミキシンB（polymyxin）などの界面活性剤は、DNAのカプセル化効率を低下させることがある。特に、カプセル化の過程で、界面活性剤および/または安定化剤を用いるときには、カプセル化効率に対するマイナスの効果と、スーパーコイルに対するプラスの効果との均衡をとる必要がある。さらに、ゲル電気泳動によって解析したところによると、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、またはTRISとEDTAとを組み合わせたもの（TE）のいずれかを含む緩衝溶液を加えると、スーパーコイル化したプラスミドDNAの安定化がもたらされる。pHの効果も観察されている。デキストラン硫酸、デキストロース、デキストラン、CTAB、ポリビニルアルコール、およびスクロースなど、その他の安定化化合物も、単独でも、TE緩衝液と組み合わせても、DNAのスーパーコイルの安定性と程度とを高めることが分かっている。安定化剤を組み合わせて用いれば、スーパーコイルDNAの量を増加させることができる。荷電した液体（例えば、CTAB）、例えばPluroinc F-68（Sigma-Aldrich Co.、St. Luis、MO）などのプルロニック（pluronic）、陽イオン性ペプチド、またはデンドリマー（J. Controlled Release, 39: 357, 1996）などの安定化剤により、DNAを縮合させるか、沈殿させることができる。さらに、安定化剤は、カプセル化の過程で形成させる粒子の物理的な性質に影響することがある。例えば、カプセル化処理の過程で、糖類または界面活性剤が存在すると、有孔の内部または外部構造をもつ有孔粒子が生成され、粒子からの薬剤のより迅速な排出が可能になる。この安定化剤は、例えばカプセル化の間、もしくは凍結乾燥の間、またはその両方の間など、微小球の調製過程のいかなる時点でも作用させることができる。
【００９０】
そして、第一の乳液を有機溶液に加えて微粒子を形成させる。この溶液は、例えば、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトン、ポリビニルピロリドン（PVP）を含み、好ましくは、ポリビニルアルコール（PVA）を含む。最も好ましくは、溶液が、PVAの重量比率が溶液の容量に対して1：100から8：100を有する。第一の乳液は、一般的に、ホモジナイザー（例えば、7000 RPMで12秒間に設定したシルバーソンモデルL4RTホモジナイザー（5/8"プローブ）、またはミクロフルイダイザーの中で撹拌しながら、有機溶液に加える。
【００９１】
この処理によって、次に、（例えば、ホモジナイザーの中、ミクロフルイダイザーの中、または撹拌プレート上で）攪拌しながら他の有機溶液を添加して、第二の乳液が形成される。この段階によって、放出されるべき第一の有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）が生じ、微小球が固くなる。または、熱、真空、もしくは希釈を用いて、溶媒の蒸発を促進させることができる。有機溶媒の緩慢な放出（例えば、室温で）は、「海綿状」の粒子をもたらすが、迅速な放出（例えば、高温での）によって、中空の微粒子が生じる。後者の溶液は、例えば0.05％ w/v PVAでもよい。糖または別の化合物をDNAに加えるのであれば、容量オスモル濃度を等しくするために、同じ濃度の化合物を第三または第四の溶液を加えることができ、硬化処理の間に微粒子から核酸が失われるのを効果的に減らすことができる。この結果できた微粒子は、有機化合物を除去するために、水で何度か洗浄する。望ましいサイズよりも大きな粒子を選択的に除去するために、粒子をサイズスクリーニングにかけることができる。微粒子のサイズが重要でなければ、この整粒段階を省くことができる。洗浄後、粒子をすぐに用いるか、後の使用まで凍結させるか、または保存するために凍結乾燥することができる。
【００９２】
既に上で詳しく説明したように、第一の乳液を作るときには、より弱い乳化条件を用いることによって、移植に用いる粒子のように、大きな粒子を得ることができる。例えば、高分子の濃度を変えるか、乳液の粘性を変えるか、第一の乳液の粒子サイズを変える（例えば、ミクロフルイダイザーの中で第一の乳液を作製する間に用いる圧力を減らすことによって、より大きな粒子を作ることができる）か、または、例えば、5000 RPMで約12秒間と設定したシルバーソンホモジナイザーによってホモジナイズすることによって、より大きな粒子を得ることができよう。
【００９３】
洗浄された微粒子、または洗浄され、且つ凍結乾燥された微粒子は、微小球の中にあるスーパーコイル化したプラスミドDNAの量にマイナスとなるような効果を与えることなしに、賦形剤の中に懸濁することができる。炭水化物、高分子、または脂質のような賦形剤は、薬剤の調合においてはよく用いられ、ここでは、微小球を効率的に再懸濁させ、沈殿するのを防ぎ、および/または微小球を懸濁液のなかに保持する。ゲル電気泳動で解析したところ、賦形剤（Tween 80、マンニトール、ソルビトール、およびカルボキシメチルセルロースを含む）は、凍結乾燥の前または凍結乾燥後では、DNAの安定性またはまたはスーパーコイル化に対して何ら影響を及ぼさない。
【００９４】
賦形剤中の微小球または微小球懸濁液を回収した後、将来使用するために、試料を凍結し、凍結乾燥することができる。
【００９５】
微粒子の特徴付け
上記の方法によって調製された微粒子のサイズ分布を、COULTER（登録商標）カウンターを用いて計測することができる。この器具により、粒子のサイズ分布プロファイルと、粒子の統計的解析が提供される。または、サイジングスライド、または接眼レンズに適合した顕微鏡下で可視化することによって、粒子の平均サイズを計測することができる。
【００９６】
望ましいならば、以下の手順によって、解析のために、微粒子から核酸を抽出することができる。微粒子を、水性溶液存在下で、クロロフォルムまたは塩化メチレンなどの有機溶媒に溶かす。高分子は、有機層の中に留まり、DNAは水層に移行する。これらの層の界面を遠心分離によってより明確にする。水層を分離することによって、核酸が回収できる。核酸は常法に従って、塩およびエタノールで沈殿させることによって水相から回収される。分解していないかをテストするために、抽出した核酸をHPLCまたはゲル電気泳動によって解析することができる。
【００９７】
微粒子の細胞内輸送
DNAを含む微粒子を、食塩水、緩衝塩類溶液、組織培養培地、または別の生理学的に許容される担体に再懸濁する。インビトロ/エクスビボで用いるためには、哺乳動物の接着細胞の培養液または細胞懸濁液に、微粒子の懸濁液を加えることができる。1〜24時間インキュベーションした後、ウシ胎児血清をアスピレーションまたは遠心分離することによって、取り込まれなかった粒子を除去する。これらの細胞は、すぐに解析するか、将来解析するために再培養することができる。
【００９８】
核酸を含む微粒子の細胞内への取り込みは、PCRによって、または、核酸の発現をアッセイすることによって検出することができる。例えば、ノザンブロット、逆転写酵素PCR、またはRNAマッピングによって、核酸の転写を測定することができる。タンパク質の発現は、適当な抗体によるアッセイ、または核酸によってコードされるポリペプチドの機能に合わせた機能的アッセイ法によって測定することができる。例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸を発現する細胞を、以下のように測定することができる：適当な緩衝液（例えば、細胞溶解培養試薬、プロメガ社製、ウィスコンシン州マディソン（Promega Corp, Madison, WI））に溶解した後、溶解液を、ルシフェリンを含む基質（プロメガ社製）に加えてから、出てくる光をルミノメータ、またはシンチレーションカウンターで測定する。出てくる光は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現に直接比例している。
【００９９】
核酸が、クラスIまたはクラスII MHC分子と相互作用することが分かっているペプチドをコードしているならば、蛍光活性化セルソーター（FACS）を用い、そのMHC分子/ペプチド複合体に特異的な抗体を用いて、その細胞の細胞表面上の複合体を検出することができる。このような抗体を、常法を用いて作製することができる（Murphyら、Nature, Vol. 338, 1989, pp. 765-767）。このペプチドをコードする核酸を含む微粒子とともにインキュベーションした後、細胞を、組織培養培地の中で、特異的な抗体とともに10〜120分間インキュベートする。培地の中で細胞を洗浄して、過剰な抗体を除去する。一次抗体に結合する、蛍光標識した二次抗体を細胞とともにインキュベートする。これらの二次抗体は、よく市販されているが、既知の方法を用いて調製することもできる。FACS解析する前には、過剰な二次抗体を洗い流しておかなければならない。
【０１００】
Tエフェクター細胞またはBエフェクター細胞を注視することによって測定することもできる。例えば、T細胞増殖、細胞傷害活性、アポトーシス、またはサイトカイン分泌などを測定することができる。
【０１０１】
または、蛍光標識した核酸を用い、また、FACSまたは顕微鏡検査によって細胞を解析することによって、粒子の細胞内輸送を直接に明らかにすることができる。蛍光標識された核酸を中に取り込むことによって、細胞は、バックグランドのレベルを超えて蛍光を発するようになる。FACSは迅速かつ定量的であるため、核酸をインビトロまたはインビボで輸送するための条件を最適化するために特に有用である。このような最適化を行った後は、蛍光標識の使用を中止する。
【０１０２】
例えば、核酸がリボザイムもしくはアンチセンス分子であるか、またはどちらかに転写される場合など、核酸そのものが細胞内の機能に影響を与える場合には、適当な機能的アッセイ法を利用することができる。例えば、もし、リボザイムまたはアンチセンス核酸が、特定の細胞内タンパク質の発現を低下させるように設計されていれば、そのタンパク質の発現をモニターすることができる。
【０１０３】
微粒子のインビボ輸送
核酸を含む微粒子を、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、腹膜内、鼻腔内、または皮下から、哺乳動物に注射することができる。または、例えば、微粒子を含む溶液もしくは粉末を吸入することによって、または微粒子を含む錠剤もしくは溶液を嚥下することによって、胃腸管もしくは気道の中に導入することができる。または、微粒子は、膣内、鼻腔、もしくは直腸内のような粘膜部位中に導入することができる。核酸の発現を適当な方法でモニターする。例えば、目的とする免疫原性タンパク質をコードする核酸の発現は、このタンパク質に対する抗体またはT細胞応答を注視することによってアッセイすることができる。
【０１０４】
ELISAアッセイ法で、血清を調べることによって、抗体反応を測定することができる。このアッセイ法においては、目的のタンパク質で96穴プレートの上を被覆し、検査されている被験者の血清を連続希釈したものを、各ウエルの中にピペットで入れてゆく。次に、抗ヒト、ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗体のような、二次的な酵素結合抗体をウエルに加える。目的とするタンパク質に対する抗体が、検査されている被験者の血清の中に存在していたら、それらは、プレートに固定されているタンパク質に結合し、次に、二次抗体による結合が起きるはずである。この酵素に対する基質を混合液の中に加え、ELISAプレート読み取り器で比色変化を定量する。陽性の血清反応は、微粒子のDNAによってコードされている免疫原性タンパク質が、検査されている被験者において発現されており、かつ、抗体反応を刺激したことを示している。または、ELISAスポットアッセイ法を用いることができる。
【０１０５】
タンパク質をコードする核酸を含む微粒子を細胞内に輸送した後に、このタンパク質に反応して起こるT細胞増殖を、実験動物の脾臓、リンパ節、または末梢血リンパ球の中に存在するT細胞を解析することによって測定する。このような生物源から得られたT細胞を、目的のタンパク質またはペプチドが存在するところで、同一遺伝子系のAPCとともにインキュベートする。常法にしたがい、3H-チミジンの取り込みによって、T細胞の増殖をモニターする。細胞の中に取り込まれた放射能量は、微粒子が輸送する核酸の発現によって、検査用被験動物の中で誘導される増殖反応の強さと直接相関する。陽性の応答は、このタンパク質またはペプチドをコードするDNAを含む微粒子が、インビボで、APCによって取り込まれて発現されたことを示している。
【０１０６】
標準的な51Cr放出アッセイ法によって、細胞傷害性T細胞の発生を明らかにすることができる。これらのアッセイ法において、検査用被験動物から得られた脾臓細胞または末梢血リンパ球を、同一遺伝子系のAPC、および、目的のタンパク質か、もしくはこのタンパク質に由来するエピトープのいずれかが存在する中で培養する。4〜6日間後、細胞傷害性Tエフェクター細胞を、目的とするタンパク質から得られたエピトープを発現する、51Cr標識した標的細胞と混合する。もし、検査用被験動物が、微粒子の中に含まれている核酸によってコードされているタンパク質またはペプチドに対する細胞傷害性T細胞反応を起こしていれば、この細胞傷害性T細胞が標的を溶解させるはずである。溶解された標的は、放射性51Crを培地の中に放出する。シンチレーションカウンターで、培地の等量液の放射能を測定する。ELISAまたはFACSなどのアッセイ法を用いて、T細胞に応答するサイトカインプロファイルを測定することもできる。
【０１０７】
脂質含有微粒子
ここに記載された微粒子は一種類またはそれ以上の種類の脂質も含む。微粒子内の脂質の含有物は微粒子に含まれる核酸の安定性を増加させることができ、それは例えば、共有結合して閉じた二本鎖のDNA分子をスーパーコイル状態に維持することによる。さらにこの粒子内に脂質が存在すると、薬物または核酸がその微粒子から放出される速度を調節、即ち速度を速めたり、遅くしたりできると考えられている。
【０１０８】
この微粒子に脂質を添加することで、ある場合には核酸のカプセル化効率を高めたり、また微粒子内の核酸の負荷を増加させたりできる。例えばカプセル化効率は、脂質が存在すると内部の水性相と有機相との間の界面張力を減少させるために改善されるのであろう。この界面張力の減少は核酸にとってより好ましい環境を作り出し、それによってミクロスフェア内の保持力が高まると考えられる。界面張力が減少するとまた、第1乳濁剤を手動操作をほとんど行うことなく作製できるようになり、それによって核酸の剪断が小さくなるとともに、カプセル化効率が高くなる。微粒子に脂質の存在によって、ミクロスフェア/核酸の配合剤の安定性を高め、また微粒子の疎水的な特徴を強めることができ、それによって食作用のある細胞による取り込みが大きくなる可能性もある。
【０１０９】
この脂質は、陽イオン性、陰イオン性、もしくは両性イオン性であってもよいし、また、非極性グリセライドのような電荷のない基を持っていてもよい。好ましくはその脂質は、微粒子をカプセル化する（即ち、取り囲む）リポソームとしては存在しない。この脂質は任意でミセルを形成することができる。
【０１１０】
この微粒子で用いることのできる脂質の例としては、（カルボキシ酸のような）酸、（アミンのような）塩基、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジル酸が挙げられ、それには次の置換基の一つまたはそれ以上が含まれる。即ち、プロピノイル（トリアノイック）、ブチロイル（テトラノイック）、バレロイル（ペンタノイック）、カプロイル（ヘキサノイック）、ヘプタノイル（ヘプタノイック）、カプロイル（デカノイック）、ウンデカノイル（ウンデカノイック）、ラウロイル（ドデカノイック）、トリデカノイル（トリデカノイック）、メリストイル（テトラデカノイック）、ペンタデカノイル（ペンタデカノイック）、パルミトイル（ヘキサデカノイック）、フィタノイル（3，7，11，15-テトラメチルヘキサデカノイック）、ヘプタデカノイル（ヘプタデカノイック）、ステアロイル（オクタデカノイック）、ブロモステアロイル（ジブロモステアロイック）、ノナデカノイル（ノナデカノイック）、アラキドイル（エイコサノイック）、ヘネイコサノイル（ヘネイコサノイク）、ベヘノイル（ドコサノイック）、トリコサノイル（トリコサノイック）、リグノセロイル（テトラコサノイック）、ミリストレオイル（9-シス-テトラデカノイック）、ミリステライドイル（9-トランス-テトラデカノイック）、パルミトレオイル（9-シス-ヘキサデカノイック）、パルミテライドイル（9-トランス-ヘキサデセノイック）、ペトロセリノイル（6-シス-オクタデセノイック）、オレオイル（9-シス-オクタデセノイック）、エライドイル（9-トランス-オクタデセノイック）、リノレオイル（9-シス-12-シス-オクタデカジエノイック）、リノレノイル（9-シス-12-シス-15-シスオクタデカドエノイック）、エイコセノイル（11-シス-エイコセノイック）、アラキドノイル（5，8，11，14（すべてシス）エイコサテトラエノイック）、エルコイル（13-シス-ドクセノイック）、及びナーボノイル（15-シス-テトラオセノイック）である。
【０１１１】
この他の適当な脂質には、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（「CTAB」）として入手可能な、セチルトリメチルアンモニウムが含まれる。
【０１１２】
一個以上の脂質を用いて、脂質含有微粒子を作製してもよい。適当な市販の脂質調製物にはレシチン、オボシン(OVOTHIN)160（商標）、及びエピクロン(EPIKURON)135（商標）脂質懸濁液があり、そのすべてがLucas Meyer, Inc,, Decatur, ILより入手できる。
【０１１３】
脂質はまた、微生物である例えばマイコバクテリウムから単離することもできる。その脂質は好ましくは、例えばPamer, Trend Microbiol. 7: 13, 1999、Braud, Curr Opin. Immunol. 11:100, 1999、Jackman, Crit. Rev. Immunol. 19: 49, 1999、及びPrigozy, Trends Microbiol. 6: 454, 1998に記載されたようなCD1-制限脂質である。
【０１１４】
微粒子に入れた脂質に加えて、その微粒子を脂質（または脂質懸濁液）に懸濁すると、例えば注入による供給性を改善できる。
【０１１５】
観察された放出量が比較的増加しているか、あるいは減少しているかは、微粒子で用いた一脂質または複数の脂質のタイプに部分的に依存している。微粒子から放出される核酸を増加させる脂質の例としては、CTABとレシチンとオボシン（OVOTHIN）（商標）脂質の調製物が挙げられる。
【０１１６】
脂質の化学的性質は、粒子に含まれる核酸との空間的な関係に影響を与える。脂質が陽イオン性であると、核酸と直接相互作用しそうである。脂質が電荷をもたないと、微粒子内で散在して広がるであろう。
【０１１７】
この脂質含有微粒子はまた、上記に記載した安定化剤を含んでいてもよい。スクロースのような安定化剤とともに微粒子に含まれる脂質の含有物は、その微粒子内の核酸を放出する際に共同的に作用して放出を増加させる。
【０１１８】
脂質含有微粒子は上述したように、高分子を含む有機溶媒か、DNA溶液を含む水性溶媒か、または第2の乳液を形成するために用いられる第3の溶液かそのいずれかに脂質を添加することによって調製できる。有機溶媒または水性溶媒に特定の脂質が溶解する特徴から用いられる溶媒を決定できるであろう。
【０１１９】
いくつかの脂質または一つの脂質の懸濁液は、有機溶媒か水性溶液のいずれかに添加すればよい。しかしながら得られた微粒子の放出特性は異なるであろう。例えば、レシチン脂質懸濁液を水性の核酸含有溶液に添加して調製した微粒子は、脂質を用いないで調製した微粒子によって放出される量と同じか、あるいはその量よりも少ない量を放出する。対照的に、有機溶媒にレシチン脂質懸濁液を添加すると、より多くの核酸を放出する微粒子が作製する。
【０１２０】
微粒子はさらに、脂質含有溶液に再懸濁することによって、微粒子の再懸濁、及び分散を容易に行える。
【０１２１】
本明細書に記載した脂質含有微粒子に加えて、キチン、ゼラチン、またはアルギネート(alginate)のようなタンパク質の大分子を用いて、即ちこれらの大分子と脂質をさまざまなに組み合わせて微粒子を作製することもできる。これらの他の大分子を用いて作製したこれらの微粒子は、上記に記載した安定化剤を更に含んでいてもよい。
【０１２２】
以下は、本発明の実施例である。これらを、決して、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【実施例】
【０１２３】
実施例1：DNAの取り込み；粒子サイズとDNAの完全性の解析
取り込みのためのDNA調製
MEGA-PREP（登録商標）キット（キアゲン（Qiagen）社製）を用いる常法により、製造業者の指示にしたがってプラスミドDNAを調製した。すべてのDNA操作には、エンドトキシンを含まない緩衝液キット（キアゲン（Qiagen）社製）を用いた。蒸留し、脱イオンし、滅菌した水の中にDNAを再懸濁し、最終濃度を3μg/μlとした。図1は、a）ルシフェラーゼ、b）VSV-Npepと名づけられた、水胞性口内炎ウイルス（VSV）のペプチドエピトープ、およびc）A2.1/4と名づけられた、ヒトパピローマウイルス（HPV）のペプチドエピトープDNA発現ベクターのプラスミド地図を示している。
【０１２４】
DNAとPLGAとの結合
200 mgの乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）（アルドリッチ（Aldrich）社製、乳酸とグリコール酸の比率は65：35）を、5〜7 mlの塩化メチレンに溶解した。上で調製した、900μgのDNAを含むDNA溶液300μlをPLGA溶液に加えた。この混合液を、設定を#3にして5〜60秒間、モデル550 SONIC DISMEMBRTOR（登録商標）（フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific）社製）の中で超音波破砕し、できた乳液を解析した。十分に無傷な（下記のようにして判定された）DNAをもつ、望ましいサイズの粒子を含むことが分かっている乳液を、50 mlの水様の1％ w/v ポリビニルアルコール（PVA）（分子量範囲：30〜70 kdal）を入れたビーカーに加えた。この混合液をPOWERGEN（登録商標）ホモジナイザー（フィッシャーサイエンティフィック社製）の中で、3000〜9000 RPMで5〜60秒にセットしてホモジナイズした。再び、DNAが損なわれていないかを解析した。DNAが十分に無傷であることが分かった場合に、この結果できた第二の乳液を、絶えず撹拌しながら、100 mlの水様の0.05％ PVAを入れた第二のビーカーの中に移した。撹拌を2〜3時間続けた。
【０１２５】
微粒子の溶液を、250 mlの遠心管の中に注入して、2000 rpmで10分間回転させた。遠心管の内容液をデカントし、沈降した粒子を100 mlの脱イオン水に再懸濁した。遠心分離とデカントの段階を繰り返した後、粒子を液体窒素で凍らせ、最後に、乾燥するまで凍結乾燥させた。
【０１２６】
微粒子のサイズプロファイルの分析
5 mgの凍結乾燥させた微粒子を200μlの水に再懸濁した。この結果できた懸濁液を、COULTER（登録商標）カウンターによって解析するために、約1：10,000に希釈した。図2は、およそ85％の微粒子が、直径1.1μｍ〜10μｍの間にあることを示している、COULTER（登録商標）カウンターからの出力結果を印刷したものである。
【０１２７】
DNAの完全性の判定
2〜5μgの微粒子を、EPPENDORF（登録商標）チューブの中で、10μlの水で湿潤させた。高分子マトリックスを溶かすために、500μlのクロロフォルムを加えて徹底的に混合した。500μlの水を加えて、再び混合した。この結果できた乳液を14,000 rpmで5分間遠心分離した。水層をきれいなEPPENDORF（登録商標）チューブの中に移して、2倍等量のエタノール、および0.1倍等量の3 M酢酸ナトリウム水溶液を加えた。この混合液を、14,000 rpmで10分間遠心分離した。上清を吸引した後、沈殿したDNAを50μlの水に再懸濁した。DNAを、0.8％アガロースゲル上で、インプットDNAを含む標準の隣りに電気泳動した。ゲル上のDNAは、UV光箱上で可視化した。標準と比較することによって、微粒子のDNAの完全性が明らかになる。インプットDNAに較べて、取り込まれたDNAでスーパーコイル化したDNAの割合が高いままならば、微粒子形成処理は成功したものと考えた。
【０１２８】
図3Aと3Bに示されているように、破砕速度と破砕時間は、DNAの完全性と反比例する。図3Aは、7000 rpmで1分間破砕して調製した微粒子から単離したDNA（レーン1）、およびスーパーコイル化したインプットDNA（レーン2）を示している。図3Bは、7000 rpmで5秒間破砕して調製した微粒子から単離したDNA（レーン1）、5000 rpmで1分間破砕して調製した微粒子から単離したDNA（レーン2）、およびスーパーコイル化したインプットDNA（レーン3）を示している。
【０１２９】
実施例2：DNAと微小球の調製
DNA調製
500 mlのバクテリア培養液を1リットルの遠心用ボトルの中に入れた。この培養液を、20℃、4000 rpmで20分間遠心分離した。沈殿したバクテリアから培地を注ぎ出して捨てた。バクテリアの沈殿を塊が残らないように50 mlのP1緩衝液（50 mM トリス塩酸、pH 8.0; 10 mM EDTA; 100μg/ml RNAse）に完全に再懸濁した。50 mlのP2緩衝液（200 mM 水酸化ナトリウム、1％ SDS）を加えてゆっくりと撹拌して、この懸濁液を室温で5分間インキュベートした。すぐに、ゆっくり混合しながら、50 mlのP3緩衝液（3.0 M 酢酸カリウム、pH 5.5、4℃に冷やして置く）を加えた。この懸濁液を氷上で30分間インキュベートしてから、4℃、4000 rpmで30分間遠心分離した。
【０１３０】
折り畳んだ丸い濾紙を水で湿らせた。遠心分離が完了したところで、上清をすぐに濾紙を通過するように注いだ。濾過した上清は、きれいな250 mLの遠心用ボトルの中に集めた。
【０１３１】
15 mLのキアゲンER（Quiagen ER）緩衝液を濾過した溶菌液に加え、ボトルを10回転倒させて混合した。この溶菌液を氷上で30分間インキュベートした。
【０１３２】
35 mLのQBT緩衝液（750 mM 塩化ナトリウム；50 mM MOPS, pH 7.0; 15％ イソプロパノール；および0.15％トリトンX-100）を加えて、キアゲンチップ2500カラムを平衡化した。このカラムは、自然流下させて空にした。インキュベートした溶菌液をカラムに入れて、自然流下させた。このカラムを4×50 mlのキアゲンエンドフリー（Qiagen Endofree）QC緩衝液（1.0 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15％ イソプロパノール）で洗浄した。35 mlのQN緩衝液（1.6 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15％ イソプロパノール）によって、50 mlのポリプロピレン製のスクリューキャップ付遠心チューブの中にDNAを溶出した。このDNA懸濁液を、もう一本の50 mlスクリューキャップチューブの中に、およそ17.5 mlの懸濁液を注ぎ入れて2本のチューブに分注した。
【０１３３】
滅菌した10 mlピペットを用いて、12.25 mlのイソプロパノールを各チューブに加えた。このチューブをしっかり密封して徹底的に混合した。各チューブの内容物を、30 mlのコーレックス（Corex）（VWR社製）遠心管の中に入れた。各コーレックスチューブを商標登録パラフィルム（PARAFILM）で覆った。このチューブを、4℃、11,000 rpmで30分間遠心分離した。
【０１３４】
各チューブから上清を吸引して、ペレットを2 mlの70％エタノールで洗浄した。エタノールは、吸引して取り除いた。ペレットを10分間風乾し、次に、0.5〜1.0 mlの水に再懸濁して、滅菌した1.5 mlの遠心チューブの中に移した。
【０１３５】
微小球の調製
200 mgのPLGAを、14 mlの培養チューブの中の7 mlの塩化メチレンに溶解した。7 mmの混合用ヘッドを具備した、フィッシャーサイエンティフィック社製のパワージェン（PowerGen）700ホモジナイザーを、目盛り6と速度4.5に設定した。フィッシャーサイエンティフィック社製のソニックディスメンブレイター（Sonic Dismembrator）550超音波破砕器を、目盛り3に設定した。
【０１３６】
300μlのH2O中に1.2 mgのDNAをPLGA溶液に加えて、その結果できた混合液を15秒間超音波破砕した。50 mlの1.0％ PVAを、100 mlビーカーの中に注入し、ホモジナイザーの下に置いた。ホモジナイザーのプローブがビーカーの底から約4 mmのところに来るまで沈め、ホモジナイザーに電力を供給した。直ちに、DNA/PLGA混合液をビーカーの中に注ぎ入れて、この結果できた乳液を10秒間ホモジナイズした。このホモジネートを、0.05％ PVA入りのビーカーの中に注入した。
【０１３７】
得られた乳液を2時間撹拌して、250 mlのコニカル遠心管に注入して、2000 rpmで10分間回転させた。沈殿した微小球を50 mlの水で洗浄し、50 mlのポリプロピレン製の遠心チューブの中に移して、2000 rpmで10分間回転させた。このペレットを液体窒素で凍らせてから、一晩凍結乾燥させた。
【０１３８】
ゲル解析のための微小球からのDNA抽出
液体に懸濁した1 mlの微小球を、1.5 mlの遠心チューブの中に移して、14,000 rpmで5分間遠心分離した。上清をほとんど除去した。50 μlのTE緩衝液（10 mMトリス塩酸、pH 8.0; 1 mM EDTA）を加え、チューブの側面を軽く叩いて微小球を再懸濁した。
【０１３９】
凍結乾燥した微小球、または真空乾燥した微小球を分離するために、2〜4 mgの微小球を計り分けて、1.5 mlの遠心チューブの中に入れた。70 μlのTE緩衝液を加え、微小球を再懸濁した。
【０１４０】
それぞれのチューブに200μlのクロロフォルムを加えてから、チューブを2分間強く、しかし、激しすぎないように振って、水層と有機層とを混和させた。このチューブを14,000 rpmで5分間遠心分離した。30μlの水層を注意深く新しいチューブの中に移した。
【０１４１】
微小球のピコグリーンとゲル解析
3.5〜4.5 mgの微小球を計り分けて、1.5 mlの遠心チューブの中に入れた。各チューブに100μlのDMSOを加え、室温で10分間、このチューブを回転させた。この試料を回転台から取り出し、試料が完全に溶けていることを眼で調べて確認した。必要な場合には、ピペットの先端を用いて、残っている塊を壊した。どの試料も、DMSOの中に30分以上入れたままにしてはおかなかった。
【０１４２】
調べようとする各試料毎に、990μlのTEをピペットで、3本の別々の遠心チューブに入れた。混和しながら、990μlのTEのそれぞれに、10μlのDMSO/微小球溶液をピペットで注入した。この混合液を14,000 rpmで5分間遠心分離した。
【０１４３】
各試料毎に、1.2 mlのTEの等量液を、5 mlの丸底のスナップ付遠心チューブの中に入れた。1 mlのTE/DMSO/微小球の混合液から50μlを1.2 mlのTEに加えた。1.25 mlのピコグリーン（Molecular Probes、Eugene、OR）試薬を各チューブに加えて、蛍光測定器で蛍光を測定した。
【０１４４】
実施例3：アルコール沈殿
エタノール沈殿
実施例2にしたがって、DNAを調製した。それぞれが、1.2 mgのDNAを含む3つの試料に、0.1倍容の3 M酢酸ナトリウムと2倍容のエタノールを加えて沈殿させた。最終濃度が4 mg/mlになるように、DNAを水に再懸濁させた。2つの試料のDNAは、使用する直前に再懸濁し、3つめの試料のDNAは、再懸濁してから4時間室温で回転させておいた。4 mg/mlの対照DNAは、エタノール沈殿を行わなかった。
【０１４５】
実施例2で説明されている方法によって、4つの試料の各々を、微小球の中にカプセル化した。実施例2で説明されているところにしたがって、ピコグリ
ーン解析を行って、微小球1 mg当りのDNA量を決定した。次の結果が得られた。
2011088909.tif 000014
【０１４６】
この結果は、微小球の中にカプセル化する前に、DNAをエタノール沈殿すると、取り込み率が31％から56％を超える範囲で増加することを示しており、これは、カプセル化されたDNAの量が44〜62％増加することを示している。
【０１４７】
上記で観察されたエタノール沈殿効果が、DNA調製処理とは無関係であることを、次の実験で確認する。
【０１４８】
DNAを3つの異なる設備で調製した。試料番号1は、実施例2にしたがって調製した。試料番号2は、ER-除去緩衝液を加えずに、実施例2にしたがって調製した。試料番号3は、スケールアップした発酵製造を行って調製した。これら3つのDNA試料は、大きさ4.5 kbと10 kbの2つの異なるプラスミド（DNA-1とDNA-3は同じもの）で代表させた。エタノール沈殿によって、カプセル化の効率が向上するかを、3つのDNA試料で調べた。0.1倍容の3 M酢酸ナトリウムと2倍容のエタノールを加えて、それぞれ1.2 mgのDNAを含む3つのDNA試料を沈殿させた。このDNAを、濃度が4 mg/mlになるように水に再懸濁させた。4 mg/mlの3つの対照用DNA試料については、エタノール沈殿を行わなかった。
【０１４９】
実施例2で説明されている方法によって、各試料をカプセル化した。
【０１５０】
実施例2で説明されているピコグリーン解析を行って、微小球1 mg当りのDNA量
を測定した。次の結果が得られた。
2011088909.tif 000015
【０１５１】
データは、エタノール沈殿によって、微小球の中にカプセル化されるDNAの量が、29〜59％増加したことを示している。この効果は、大きさや調製技術とは関係なく維持されることが明らかになった。
【０１５２】
イソプロパノール沈殿対エタノール沈殿
エタノールまたはイソプロパノールでプラスミドDNAを沈殿させて、水の中に4時間、または16時間再懸濁した。対照DNAは、沈殿させなかった。微小球は、実施例2のプロトコールにしたがって作製した。次の結果が得られた。
2011088909.tif 000016
【０１５３】
これらのデータは、DNA沈殿に用いられるアルコールの種類、およびDNA沈殿後の経過時間と関係なく、アルコールによる沈殿が、DNAのカプセル化効率を高めることを示している。
【０１５４】
電解伝導度
エタノール沈殿したDNA試料および沈殿させなかったDNA試料の電解伝導度を、伝導度系を用いて測定した。DNAを沈殿させる、塩類の存在量が減少する結果となることが分かった。エタノール沈殿を行わなかった場合の伝導度は384μΩであったが、エタノール沈殿後の伝導度は182μΩになった。このように、アルコールによる沈殿、またはこの他の塩/混入物除去手段も、カプセル化の効率を高める可能性が高い。したがって、混入物を含まないDNAをもたらす処理は、DNAのカプセル化効率を高める可能性が高いと考えられる。
【０１５５】
そして、DNAをエタノール沈殿するか、0.4 M NaClと5％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）存在下で沈殿させた。そして、このDNAを上述したようにカプセル化した。このDNAを抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。その結果、CTABによるDNAの沈殿は、微小球内のスーパーコイルDNAの量を顕著に増加させることが示された。しかし、これは、カプセル化効率の減少（6％、26％未満）を伴っていた。
【０１５６】
実施例4：安定化化合物の添加
TE緩衝液
エタノール沈殿の後、DNAの安定性を高める目的で、プラスミドDNAをTE緩衝液に再懸濁した。そして、実施例2で説明されているように、微小球を調製した。微小球からDNAを抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。一つのレーンにはインプットプラスミド（pIiPLPLR）を流し、別のレーンには、エタノール沈殿し、水に再懸濁し、さらに微小球の中にカプセル化した後のプラスミドDNAを流し、そして、さらに別のレーンには、エタノール沈殿し、TE緩衝液に再懸濁し、さらに、微小球の中にカプセル化した後のプラスミドDNAを流した。その結果、微小球の中のスーパーコイル化したDNAの量は、TE緩衝液に再懸濁することによって増加することが示された。
【０１５７】
pbkcmv-n-p、およびE3PLPLRと名づけられた、2つの別のプラスミドで、上記と同じ条件の実験を行った。この実験によって、この2つの別のプラスミドもTE緩衝液によって安定化されることが確認された。
【０１５８】
TE効果のタイミングを判定するために次の実験を行った。2 gのPLGAを18 mlの塩化メチレンに溶解した。500μgのDNAをエタノール沈殿して、3.6 mlのTEまたは水に溶かした。この2種類の溶液を、数回転倒混和して混合し、次に、目盛りを3にして10秒間、1/8"のマイクロチップによって、フィッシャー社製の装置（実施例2を参照のこと）の中で超音波破砕した。超音波破砕後のさまざまな時間（すなわち、5、15、30、45、および60秒後）に、1 mlの試料を各チューブから取り出して、100μlの水を加え、エッペンドルフ遠心チューブの中で遠心分離し、遠心分離した試料の上層を別のチューブに移した。そして、ゲル電気泳動によってこの試料を解析した。
【０１５９】
この結果、TE緩衝液は、カプセル化処理における初期、すなわち水中油乳液を形成している間、DNAを安定化する作用をもつことが示された。
【０１６０】
TE緩衝液におけるトリス、および/またはEDTAの効果を判定するために、実施例2の方法によって微小球の中でカプセル化させる前に、DNAを、水、TE緩衝液、10 mM トリス、または1 mM EDTAに再懸濁した。このDNAを微小球から抽出して、アガロースゲル上で解析した。トリスとEDTAは、それぞれ、カプセル化処理過程と凍結乾燥の間中、DNAを保護することができるという点で、完全なTE緩衝液と同じであることが分かった。
【０１６１】
pHがカプセル化に及ぼす影響を測定するために、実験を行った（以前の実験では、EDTA、トリス、およびTE容液のpHは、すべて同じであった）。エタノール沈殿して、異なるpHのトリス、またはリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）に懸濁したDNAをカプセル化することによって微小球を作製した。粒子を凍結乾燥してからDNAを抽出して、アガロースゲル上で解析した。その結果、カプセル化されたDNAの安定性に対し、有意なpH効果があることが示された。水（pH 6.5）、PBS（pH 7.3）、およびトリス（pH 6.8）の中にDNAを再懸濁すると、すべてで、微小球内の全DNAに関してスーパーコイル化したDNAの比率が減少した。pHを7.5か、それ以上に上昇させると、スーパーコイルの量に対して陽性の効果があったが、このことは、DNAの安定性を維持するには、塩基性のpHレベルが重要であることを示唆して
いる。また、pHを上昇させると、カプセル化の効率にも効果があった：
2011088909.tif 000017
【０１６２】
別の緩衝液化合物
ホウ酸とリン酸緩衝液についても、カプセル化したDNAの品質に対するそれらの効果を調べた。DNAをエタノール沈殿し、さまざまな緩衝溶液に懸濁して、実施例2の方法にしたがってカプセル化した。このDNAを微小球から抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。TE、BE、およびPEはすべて、カプセル化したDNAで、50％よりも高いスーパーコイルを産生した。また、トリス、ホウ酸、またはリン酸存在下でのEDTAからもたらされる、DNAにとってさらに別の利益となる点も発見された。
【０１６３】
別の安定化化合物
緩衝液以外にも、別の化合物を調べて、カプセル化の過程でDNAを保護することができるかを見た。プラスミドDNAをエタノール沈殿して、水、またはデキストラン硫酸溶液に再懸濁した。そして、実施例2の方法にしたがって微小球を調製した。凍結乾燥の前後に微小球からDNAを抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。
【０１６４】
この結果、安定化剤を添加することによって、水だけでDNAを再懸濁するよりも、より多くのスーパーコイル化したDNAがカプセル化されるということが示唆された。DNA構造が最も改善されるのが、10％デキストラン硫酸溶液で観察された。保護は、2つの段階で起きたようである。デキストラン硫酸の効果は、カプセル化した後の、DNAを凍結乾燥する前に見られ、デキストラン硫酸の量を増加させるにつれて、DNAのより大きな割合が、スーパーコイル化した状態のままになった。安定化剤によってもたらされる保護は、凍結乾燥処理の過程でも生じた。というのは、この処理過程の間、安定化剤が存在すると、スーパーコイル化した状態で残っているDNAの割合が高くなったからである。
【０１６５】
TE、および別の安定化剤の効果が相加的であるか否かを判定するために、エタノール沈殿したDNAを、別の安定化剤（例えば、スクロース、デキストロース、またはデキストラン）を含んでいるか、またはそれを含まないTEまたは水に懸濁した。実施例2の方法にしたがって、微小球を調製した。DNAを微小球から抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。
【０１６６】
その結果、同じ条件の下で、カプセル化後、より高い割合のDNAをスーパーコイル化した状態に留めておくという限りでは、DNAは、安定化剤/TE溶液に再懸濁する方が、TEだけを用いるよりは優れているか、または同等であるということが示された。
【０１６７】
また、安定化剤の効果が相加的であるか否かを判定するために、安定化剤を組み合わせて添加した。DNAをエタノール沈殿して、さまざまな安定化剤溶液に再懸濁した。実施例2で説明されているようにして、このDNAをカプセル化し、抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。その結果、安定化剤を組み合わせて用いれば、カプセル化されたスーパーコイルDNAの量が増加することが示された。
【０１６８】
実施例5：賦形剤の添加
カプセル化したプラスミドDNAに対して、賦形剤化合物が有害な効果を与えるかどうかを判定するために、凍結乾燥の前に、賦形剤を含む溶液の中に微小球を再懸濁した以外は、実施例2のプロトコールにしたがい、エタノール沈殿したDNAから微小球を調製した。そして、実施例2と同じように、各試料を凍結し、凍結乾燥した。50 mg/mlで再懸濁したときに、微小球における賦形剤の最終濃度は、0.1％ トゥイーン（Tween） 80、5％ D-ソルビトール、5％ D-マンニトール、または0.5％カルボキシメチルセルロース（CMC）であった。DNAを微小球から抽出して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。
【０１６９】
凍結乾燥の前に賦形剤を添加しても、DNAの安定性、またはスーパーコイルの程度に有意な影響を与えることはないことが明らかになった。
【０１７０】
実施例6：インビトロの細胞研究
DNAを含む微粒子のインビトロでの貪食作用
6ウエルの組織培養皿の2ウエルずつの中に、約106個のマクロファージを入れて、10％ウシ胎児血清を含む3 mlのRPMI培地の中で培養した。ルシフェラーゼをコードするDNAを含む微粒子5 mgを200μlの塩類溶液の中に再懸濁して、その結果できた懸濁液を50μl取って、マクロファージを含むウエルの一つに加えた。培養皿を1〜6時間、37℃でインキュベートした。ベクトン・ディキンソン社製（Becton Dickenson）のFACS装置を用いて、FACSによって細胞の側方対前方の散乱（すなわち、細胞内の複合性対サイズ）を解析した。
【０１７１】
図4は、この結果を示したものである。貪食しなかった細胞集団が、領域R1に見られる。貪食している細胞は、同じ大きさのままである（FSCプロファイル）が、側方の散乱プロファイルの増大を示す。これらの細胞は、領域R2に見られる。
【０１７２】
貪食後のDNA発現の測定
24ウエルの組織培養皿の2つのウエルの中で、約2.5×105個のマクロファージを、10％ウシ胎児血清を含む1 mlのRPMI培地に入れて培養した。この培養皿を37℃で6時間インキュベートした。ルシフェラーゼをコードするDNAを含む、1 mgの凍結乾燥した微粒子を、400μlの塩類溶液の中に再懸濁した。この結果できた懸濁液の6μlを、マクロファージを含むウエルの一つに加え、懸濁液25μlをもう一つのウエルに加えた。この培養皿を37℃で4時間インキュベートした。微粒子を含む培地を取り除いて、新鮮な培地を細胞に加えた。再び、この培養皿を37℃で1〜5日間インキュベートした。チューブの中に細胞を回収して、15,000 RPMで5分間回転させた。沈殿した細胞を、エッペンドルフ（EPPENDORF）（登録商標）チューブの中で1×細胞溶解緩衝液（Cell Lysis Buffer）（プロメガ社製）100μlに再懸濁した。すべての細胞残渣を取り除くために、この混合液を14,000 RPMで5分間遠心分離した。100μlのルシフェラーゼ基質（プロメガ社製）に5μlの上清を加えて、トップカウント（TOPCOUNT）（登録商標）ルミノメータ/シンチレーション結合カウンター（パッカードインスツルメンツ社製（Packard Instruments））上に出力された光を測定して、細胞溶解液の測定を行った。
【０１７３】
この実験のデータは、表5に提供されている。例えば、ルシフェラーゼDNAを含む微粒子を貪食した細胞は、実際に、このDNAを発現することが示されている。このようにして、DNAの完全性と機能性とが確認される。また、これらのデータから、貪食による微粒子の取り込みによって、DNAの核への到達が阻害されないことが示される。
【０１７４】
（表５）  カプセル化したDNAの貪食によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物の発現がもたらされる
2011088909.tif 000018
データは、0.01分あたりのカウント数になっている。
【０１７５】
実施例7：インビボでの細胞研究
取り込まれたDNAのインビボでの発現
微粒子中の45 mgのルシフェラーゼcDNAを、250μlの塩類溶液に再懸濁した。こうしてできた懸濁液40μlを、マウスの前脛骨筋のそれぞれに注射した。7日後、各前脛骨筋を切り出して、ドライアイス上のエッペンドルフ（登録商標）チューブの中に入れた。ドライアイスで冷やした乳鉢と乳棒を用いて、各前脛骨筋を粉状になるまで磨砕して、エッペンドルフ（登録商標）チューブの中に戻した。500μlの1×細胞溶解緩衝液（Cell Lysis Buffer）（プロメガ社製）を加えた。このチューブをボルテックスミキサー上で逆さまにして、4℃で15分間振とうした。このチューブと内容物を液体窒素で凍らせてから、37℃で融解した。この凍結/融解サイクルをさらに2回繰り返した。チューブを14,000 RPMで10分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移して、再び5分間遠心分離した。発現を測定するために、20μlの上清を100μlのルシフェラーゼ基質（プロメガ社製）に加えて、トップカウント（TOPCOUNT）（登録商標）ルミノメータ/シンチレーション結合カウンター（パッカードインスツルメンツ社製（Packard Instruments））上に出力される光を測定した。
【０１７６】
この実験のデータは、表6に提供されている。これらは、筋肉細胞が、微粒子から放出されるDNAを発現できることを示している。これらの細胞が貪食することは知られていないので、これは貯蔵効果の実例である。
【０１７７】
（表６）  マウスの筋肉における、カプセル化されたルシフェラーゼDNAの発現
2011088909.tif 000019
データは、0.01分あたりのカウント数になっている。
【０１７８】
DNAを含む微粒子を注射した後の細胞傷害性T細胞の産生
VSV-NpepをコードするDNAを含む90 mgの微粒子を、900μlの塩類溶液に再懸濁した。対照用ベクターDNAを含む60 mgの微粒子を、600μlの塩類溶液に再懸濁した。300μgのVSV-NpepプラスミドDNAを、300μlの塩類溶液に再懸濁した。300μgの対照用ベクターDNAを、300μlの塩類溶液に再懸濁した。150μgのVSV-Nペプチドを、フロイントの不完全アジュバント（IFA）に再懸濁した。
【０１７９】
5種類の懸濁液を、次のプログラムにしたがって、腹膜内、筋肉内、または皮下から注射した。
【０１８０】
1．腹膜内：
3匹のマウスからなる第1グループに、VSV-Npep DNAを含む100μlの微粒子を腹膜内に注射した（グループ1）。3匹のマウスからなる第2グループに、対照用ベクターDNAを含む100μlの微粒子を注射した（グループ2）。
【０１８１】
2．筋肉内：
（各前脛骨筋の中に）：3匹のマウスからなる第3グループに、VSV-Npep DNAを含む100μlの微粒子を筋肉内に注射した（グループ3）。3匹のマウスからなる第4グループに、対照用ベクターDNAを含む100μlの微粒子を注射した（グループ4）。3匹のマウスからなる第5グループに、50μg/肢のVSV-Npep プラスミドDNAを注射した（すなわち、微粒子なしで）（グループ5）。3匹のマウスからなる第6グループに、50μg/肢の対照用ベクターのプラスミドDNAを注射した（グループ6）。
【０１８２】
3．皮下：
3匹のマウスからなる第7グループに、VSV-Npep DNAを含む100μlの微粒子を皮下注射した（グループ7）。3匹のマウスからなる第8グループに、50μgのVSV-Nペプチド/IFAを注射した（グループ8）。
【０１８３】
2週間後、微粒子なしで、合成ペプチドまたはDNAを注射されたグループ5、6および8に再注射した。最初に微粒子を注射されたグループ1〜4、および7には再注射は行わなかった。
【０１８４】
最後に注射をしてから7日後、マウスの脾臓を回収した。常法によって単一細胞懸濁液を作製したが、赤血球細胞を溶解し、残った細胞を、10％ウシ胎児血清を含むRPMIに再懸濁して、最終濃度を4×106エフェクター細胞/mlとした。次に、各グループからの細胞の半分を、予めマイトマイシンCで処理しておいた、ペプチドを与えた（peptide-pulsed）同数の同種同系の刺激細胞とともに37℃で6日間インキュベートした。残った細胞は、50μMのペプチドだけとインキュベートした。
【０１８５】
インキュベーション2日目以降に、ConA中でインキュベートした細胞から得られた0.1倍等量のIL-2を含む上清を加えた。インキュベーション6日目以降に、エフェクター細胞を回収して、51Cr標識した、ペプチドを与えた標的細胞を入れた、96穴の丸底培養皿の中で、37℃で5時間インキュベートした。ウエルについて、エフェクター細胞対標的細胞の比率は、200：1から1：1までの範囲であった。
【０１８６】
最大の溶解レベルを測定するために、20μlの10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液を、標的細胞のみが入った特定のウエルに加えた。自然に溶解するレベルを測定するため、特定のウエルを、培地のみ（すなわち、標的細胞はあるが、エフェクター細胞はない）とインキュベートした。特異的な溶解は、以下のとおり計算する：［（実験的な溶解）−（自然溶解）/（最大溶解）−（自然溶解）］×100＝特異的溶解
【０１８７】
これらの結果を図5〜9に示す。
【０１８８】
図5に関連した実験において、VSV-Nタンパク質から得られたペプチドをコードするDNAを含む微粒子によって、腹膜内から免疫したマウス（グループ1）のエフェクター細胞の、さまざまな標的細胞に対する細胞傷害活性を調べた。VSVペプチドは、マウスのH-2KbクラスIレセプターに結合する。同種同系の標的は、H-2Kbレセプターを発現させるが、本実験で用いられた同種異系の標的はH-2Kｄレセプターを発現させる。
【０１８９】
ペプチドなしの同種同系の標的（EL4）、VSVペプチドで標識した同種同系の標的（EL4/VSV）、SVペプチド（すなわち、非特異的ペプチド）で標識した同種同系の標的（EL4/SV）、およびVSVペプチドで標識した同種異系の標的（P815/VSV）について、CTL活性を調べた。
【０１９０】
同種異系の標的（P815/VSV）はH-2Kbレセプターを発現しないため、エフェクター細胞によって認識されて溶解されることはない。VSVペプチドと混合されたP815標的は、溶解されない。VSVペプチドをもたない同種同系の標的（EL4）も溶解されない。VSV以外のペプチドを発現する同種同系の標的（EL4/SV）も溶解されない。適切なMHCレセプターと適切なペプチドの両方をもつ標的（EL4/VSV）だけが溶解される。
【０１９１】
まとめると、これらのデータは、VSVペプチドをコードするDNAを含む微粒子で免疫することによって、CTL活性が誘発されうること、溶解はMHCに制約されペプチド特異的であることを示している。換言すると、適切なMHCレセプターをもつ適切なペプチドのみが、本発明によって免疫して作出されたCTLのT細胞レセプターによって認識される。これによって、微粒子が、望ましい機能を果たしていることが示された。
【０１９２】
次に、合成ペプチドで皮下的にマウス（グループ8）を免疫することによって発生するCTL応答を、VSVペプチドをコードするDNAを含む微粒子によって腹膜内からマウスを免疫する（グループ1および2）ことによって発生するCTL応答とを比較した。図6には、VSV-NペプチドをコードするDNAを含む微粒子（MS-VSV；グループ1）、VSVペプチドをコードしていない対照用ベクターDNAを含む微粒子（MS-ベクター；グループ2）、または合成VSV-Nペプチド（ペプチド；グループ8）のいずれかでマウスを免疫することによって発生するCTLについて、100：1のE：T比で得られた細胞溶解が示されている。この標的は、VSVペプチドで標識した同種同系（EL4）細胞であった。
【０１９３】
微粒子（MS-VSV）中のVSV-Npep DNAによって免疫されたマウス（33％の特異的溶解）は、空のベクターDNAを含む対照用微粒子（MS-ベクター）によって免疫されたマウス（10％の特異的溶解）よりも強いCTL応答を生じた。VSV-Nペプチド（ペプチド）で免疫されたマウスは、VSV-Npep DNAを含む微粒子（MS-VSV）によって免疫されたマウスよりも弱いCTL応答を生じさせる。したがって、微粒子は、望ましい機能を果たしていた。
【０１９４】
微粒子（MS-VSV）に含まれているVSV-Npep DNAによって腹膜内から免疫したマウスにおけるCTL応答を、「裸の」VSV DNA（VSV）によって筋肉内から免疫したマウスのCTL応答と比較した。DNAを含む微粒子で免疫したマウス（MS-VSV；グループ1）におけるCTL応答は、E：T比3：1で裸のDNA（VSV；グループ5）によって免疫したマウスにおけるCTL応答よりも強かった（図7）。この標的は、VSVペプチドで標識された同種同系（EL4）細胞であった。微粒子で免疫したマウスは1回しか処理しなかったが、裸のDNAを取り込んだマウスは2回免疫した。したがって、図7のデータは、微粒子中のDNAの一度の注射が、より大量の裸のDNAを2度注射するよりも効果的であったことを示している。
【０１９５】
図8は、注射が腹膜内ではなく皮下から行われた（グループ8マウス）以外は、図5で述べられた実験と同等の実験の結果を示している。この実験は、VSV-Npep DNAを含む微粒子の皮下注射も、CTL応答を産生するために効果的であることを明らかにした。
【０１９６】
図9で示された実験も、得られた結果が、VSV-Npep DNAに独特なものではないこと示すために、異なるペプチドをコードするDNAが用いられた以外は、図5で述べられた実験と同様である。HLA-A2トランスジェニックマウスを、ヒトパピローマウイルス（HPV）のE7ペプチドからのペプチドをコードするDNAを含む微粒子によって免疫した。A2.1/4と名づけられた、このHPV E7ペプチドは、ヒトのMHCレセプターHLA-A2に結合する。この実験では、CTLエフェクターが、適正なHPVペプチド（A2.1/4）で標識されているか、そうでなければ標識されていない（ペプチドなし）同種同系の標的（すなわち、適正なHLAレセプターをもつ標的）を溶解する能力を評価した。E：T比は、X軸に沿って表示されている。
【０１９７】
実施例8：DNAを含む微粒子による治療
実施例1の方法にしたがって、PLPの170〜191番目の残基（配列番号：2）に約50％一致したアミノ酸配列をもつペプチドをコードするDNAを含む微粒子を調製する。自己抗原に応答して、T細胞が過剰なTH1サイトカイン（すなわち、IL-2とγ-IFN）を分泌する、多発性硬化症の患者に、100μlから10 mlの微粒子を静脈注射する。APCによるPLP様ペプチドの発現は、自己抗原に応答して、代わりに、TH2サイトカイン（すなわち、IL-4とIL-10）を産生するようになるなど、T細胞のサイトカインプロファイルの切り換えをもたらす。
【０１９８】
実施例9：DNAを含む微粒子によるトレランス誘導
実施例1の方法にしたがって、MBPの33〜52番目の残基（配列番号：34）と一致するアミノ酸配列をもつペプチドをコードするDNAを含む微粒子を調製する。哺乳動物に、1〜500μlの微粒子を皮下注射する。APCによるMBPペプチドの発現は、自己抗原を認識するT細胞のトレランス誘導をもたらす。
【０１９９】
実施例10：微粒子の移植
輸送配列、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）の80〜102番目の残基（配列番号：1）と本質的に同一のペプチドの両方をコードする配列に機能的に連結された発現制御配列を含むDNA分子を、実施例1の方法にしたがって、高分子と結合させて微粒子を形成する。100μｍ未満の粒子を除去する。微粒子の高分子成分は、乳酸-グリコール酸共重合体で、グリコール酸に対する乳酸の比率は、重量で約65：35である。こうしてできた微粒子を患者の皮下に外科的に移植する。
【０２００】
実施例11：DNAとタンパク質の両方を含む微粒子の調製
MEGA-PREP（登録商標）キット（キアゲン（Qiagen）社製）を用いた標準的な方法によって、製造業者の指示にしたがってプラスミドDNAを調製する。すべてのDNA操作には、エンドトキシンを含まない緩衝液キット（キアゲン（Qiagen）社製）を用いる。蒸留し、脱イオンし、滅菌した水の中にDNAを再懸濁して、最終濃度を3μg/μlとする。さらに、0〜40 mgの精製タンパク質を約1 mlのDNA溶液に加える。タンパク質の全量の約20％に等しい量のゼラチンを加える。
【０２０１】
400 mgまでのPLGA（すなわち、タンパク質全量の少なくとも10倍）を、約7 mlの塩化メチレンに溶解する。DNA/タンパク質溶液を、PLGA溶液の中に注ぎ入れ、ホモジナイズするか、超音波破砕して第一の乳液を形成させる。第一の乳液を、約50〜100 mlの界面活性剤の水性溶液の中に加える（例えば、重量で0.05％から2％のPVA）。この混合液を、約3000〜8000 RPMでホモジナイズして、第二の乳液を形成させる。そして、実施例1の方法にしたがって、微粒子を分離する。
【０２０２】
実施例12：DNAとタンパク質の両方を含む微粒子による治療
B型肝炎ウイルス（HBV）に対するB細胞の応答を誘導するのに必要な構造決定因子をもつ抗原タンパク質、およびHBVに対するCTLエピトープをコードするDNAを両方とも含む微粒子を、実施例10の方法にしたがって調製する。HBVに感染した患者、またはHBVによる感染の危険がある患者を微粒子で免疫する。
【０２０３】
貪食されない微粒子からのタンパク質の徐放によって、B細胞による構造決定因子の認識、それに続く抗体分泌が起きる。DNAの徐放、または別の微粒子の貪食によって、APCが、（1）目的のDNAを発現するようになり、それによって、T細胞応答を生じる、また、（2）微粒子から放出されたタンパク質を消化するようになり、それによって、その後、クラスIまたはII分子によって提示されるペプチドが生じる。クラスII/ペプチド複合体によって活性化されるTH細胞は、非特異的サイトカインを分泌するので、クラスI分子による提示はCTL応答を促進し、クラスII分子による提示は抗体応答とT細胞応答の両方を促進する。
【０２０４】
この結果、患者からHBVが除去され、患者の細胞の中でのウイルスの産生を持続的に阻害するようになる。
【０２０５】
実施例13：プラスミドDNAを含む微粒子の、マウスの樹状細胞による貪食
カプセル化処理過程で、蛍光性オリゴヌクレオチドを付加した以外は、実施例2の方法にしたがって、微小球を調製した。マウスから脾臓樹状細胞を分離して、何も入れないか、蛍光ビーズを入れるか、または調製した微粒子を入れてインキュベートした。細胞のFACS解析によって、蛍光ビーズも、調製された微粒子もどちらも貪食されることが示された。その上、樹状細胞によって取り込まれないかぎり、調製された微粒子は蛍光を発せず、このことから、貪食の後、微小球が水和されて分解されるようになり、カプセル化されたDNAが細胞の細胞質中に放出されることが示唆される。
【０２０６】
実施例14：脂質含有微粒子の調製
脂質含有微粒子を調製するために、14mlのチューブ中で200mgのPLGAを7mlのメチレンクロライド（「DCM」）（J. T. Baker, Catalog #9324-11）に溶解した。得られたPLGA/DCM溶液を、35mlのマークで50mlのポリプロピレン製のシリンダー状チューブを切断して準備した35mlのポリプロピレン製シリンダー状チューブに注入した。オボシン(OVOTHIN)（商標）脂質溶液をそのPLGA/DCM溶液に添加して、最終濃度を0.05％（容量/容量）にした。
【０２０７】
5/8インチのスロット式ミキシングヘッドを取り付けたシルバーソンSL2Tホモジナイザー（East Longmeadow, MA）を設定値10に予め設定した。ホモジナイゼーションを始める前に50mlの1.0％ PVA溶液（平均分子量：23,000、88％が均質化されている）を100mlのビーカーに注入し、また、100mlの0.05％ PVA/300Mmのスクロース溶液を1.5インチの攪拌棒を入れた250mlのビーカーに注入した。そのビーカーを攪拌プレート上に設置した。
【０２０８】
300μlのTE/10％ SDSに入れた1.2mgのpBVKCMluc DNAを、そのPLGA/DCM溶液に添加した。その混合液を2分間、室温でホモジナイズすることによって、DNA/PLGA乳液を作製した。それからそのホモジナイザーを止めて、DNA/PLGA乳液を取り出した。1.0％のPVA溶液（50Ml）をそのホモジナイザープローブのあるところに配置し、ホモジナイゼーションを再開した。DNA/PLGA乳液を直ちに1.0％のPVA溶液を入れたビーカーに注入し、その混合液を1分間ホモジナイズした。続いてその混合液を、0.05％のPVAを入れて攪拌プレート上に置いたビーカーに注入し、2時間攪拌した。
【０２０９】
2時間経過後、その混合液を250Mlの円錐型遠心分離チューブに注入し、ベックマンGS6R臨床遠心分離器で2500rpmにて10分間、回転した。ペレットになった微粒子を水で二回洗浄した。
【０２１０】
二回洗浄した後でペレットを水に再懸濁し、液体窒素で凍結してから少なくとも11時間、凍結乾燥させた。
【０２１１】
TE/スクロースを用いて調製した微粒子から得られるDNAは、2.33μg/ml（DNA/PLGA）の濃度で、そして55％がスーパーコイルを形成して存在していたが、オボシン（商標）脂質を用いて調製した微粒子から得られるDNAは、1.66μg/mlの濃度で、60％のスーパーコイルを形成して存在していた。
【０２１２】
実施例15：CMVluc DNAを含むホスファチジルコリン含有微粒子の調製
pBKCMVlucプラスミドDNAをエタノール中で沈降させ、TE Ph8.0/10％スクロースからなる溶液に再懸濁した。ホスファチジルコリン（「PC」）に多く含まれるレシチン脂質調製物（Lucas Meyer, Catalog No. LECI-PC35F)を、表7及び8に示されているような種々の濃度（容量/容量）のDNA溶液に添加した。
【０２１３】
脂質調製物は、DNA溶液に添加された後、最初は大きな凝集を形成していた。その凝集は20秒間渦巻きを作った後で小さな凝集に分散した。室温で30分間やさしく攪拌すると、PCはコロイド状の懸濁液を形成した。
【０２１４】
レシチン含有微粒子は、その懸濁液をPLGA/DCM溶液に添加し、上記の実施例14に記載したように処理することで形成した。その微粒子について観察された直径は1-10μmの範囲であった。
【０２１５】
表7及び8には、TE中、または10％のスクロースやさまざまな濃度のレシチンを添加したTE中に再懸濁したDNAを用いて作製された微粒子に含まれるプラスミドDNAの濃度（高分子材料1mgあたりのDNAのマイクログラムで表示されている）、スーパーコイル(sc)の比率、及び微粒子にカプセル化された最初のプラスミドDNAの比率が示されている。最終的な濃度が示されている。
【０２１６】
【表７】
2011088909.tif 000020
【０２１７】
【表８】
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【０２１８】
表7は、レシチンを最初の濃度である0-1.0％に添加しても、その粒子に含まれる最終的なDNA濃度、スーパーコイルの比率、またはカプセル化されたDNAの比率によって示されているように、カプセル化されたDNAの性質に有意の影響を与えなかったことを証明している。
【０２１９】
表8は、5％または10％の初期濃度でレシチンが存在するとレシチンを用いていないかあるいは1％のレシチンを用いて調製した微粒子に比較して、スーパーコイルが増加するとともにDNA濃度が低くなる結果が得られたことを示している。
【０２２０】
実施例16：インビトロでの脂質微粒子の放出特性
微粒子から放出されるDNAの量は、DNAを含む微粒子を調製し、続いてその微粒子を水性媒体に再懸濁し、さらに指示色素ピコグリーン（the indicator dye PicoGreen）を用いてDNAの存在について上澄みを評価することによって測定した。
【０２２１】
TEのみで、またはCTABを入れたTEで調製した約150mgの微粒子を15mLのTEに溶解してからスライド-A-ライザー（Slide-A-Lyser)（商標）膜（分子量、カットオフ、10,000）に注入し、それを続いて1リットルのTEに37℃で入れて攪拌した。試料を時点でシリンジを用いて除去し、75μlのアリコートを14krpmで5分間遠心分離した。その上澄みを除去し、この画分をピコグリーン(PicoGreen)を用いてアッセイした。
【０２２２】
図10は、TEまたはCTAB中で再懸濁したDNAを用いて調製した微粒子より時間をかけて放出されたDNAの比率を示している。TE微粒子から放出されたDNAの比率は、7日後の20％以下から、42日後の約40％までわずかに増加した。対照的に、CTAB微粒子から放出されたDNAの比率は、7日後の約60％から42日後の80％以上へと増加した。これらのデータは、CTABが微粒子から放出されるDNAの量を増加させることを証明している。
【０２２３】
また脂質含有微粒子からのDNAの放出は、TE、TE/10％のスクロース、0.04％のレシチン、及び0.04％のオボシン160脂質を用いて調製した微粒子においても調べた。プラスミドDNAを含む微粒子をTEに再懸濁し、放出をピコグリーン分析によって評価した。
【０２２４】
図11は、さまざまな脂質を用いて調製した微粒子から経時的に放出されたDNAの比率を示す。0.04％のレシチンまたは0.04％のオボシン(OVOTHIN)160（商標）を用いて調製した微粒子から放出されたDNAの比率は、50日後では約80％であった。
【０２２５】
対照的に、TEを用いて調製した微粒子から50日後に放出されたのはDNAの約20％であって、また10％のスクロース/TEを用いて調製した微粒子から放出されたのはDNAの約60％であった。これらの結果は、微粒子に脂質が存在するとその微粒子から放出されるDNAの量を増加できることを証明している。
【０２２６】
実施例17：脂質含有微粒子の投与後のT細胞増殖評価
Balb/cマウスに、PBKCMVlucプラスミドとオボシン（商標）脂質調製物を含む200μlの微粒子を静脈内注入した。脾臓を注入を行ってから11週目に取り出し、T細胞増殖性についてのアッセイをおこなって分析した。
【０２２７】
RBCを溶解して脾臓細胞を洗浄し、計数してから96ウェルの平面底のプレートに、5×105個または2.5×105個の細胞/ウェルで、10％のFCSを含むRPMI培地に植え付けた。
【０２２８】
ルシフェラーゼ抗原(Promega Corp, Madison WI)を1から50μg/mlの範囲の濃度で添加した。研究は、1ウェルあたり250,000個または500,000個の細胞のいずれかを用いて進行させた。その細胞を37℃で5日間インキュベートし、その後H3チミジンをそれぞれのウェルに添加した。H3チミジンの添加をしてから24時間後、その細胞をトムテック(TOMTEC)（商標）細胞収集装置上に収集し、その放射活性を測定した。
【０２２９】
この研究から得られる結果が図12に示されている。抗原増殖性反応を、250,000個の細胞と500,000個の細胞の両方を用いて検出した。これらの結果は、その注入された微粒子がコードされたルシフェラーゼに特異的なT細胞性応答を刺激したことを証明している。
【０２３０】
その他の態様
本発明は、その詳細な説明とともに説明してきたが、前記の説明は、例示を目的として成されたものであり、添付の特許請求の範囲を制約するものではない。別の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【図１Ａ】
2011088909.tif 000022
【図１Ｂ】
2011088909.tif 000023
【図１Ｃ】
2011088909.tif 000024
【図２】
2011088909.tif 000025
【図３】
2011088909.tif 000026
【図４】
2011088909.tif 000027
【図５】
2011088909.tif 000028
【図６】
2011088909.tif 000029
【図７】
2011088909.tif 000030
【図８】
2011088909.tif 000031
【図９】
2011088909.tif 000032
【図１０】
2011088909.tif 000033
【図１１】
2011088909.tif 000034
【図１２】
2011088909.tif 000035
【配列表】
2011088909000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月28日(2010.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)有機溶媒に溶解した高分子を含む第1溶液を供給する段階；
(2)極性溶媒もしくは親水性溶媒に溶解または懸濁された核酸を含む第2溶液を供給する段階；
(3)第1乳液を形成するために、第1溶液及び第2溶液を混合する段階；及び
(4)第2乳液を形成するために、第1乳液を第3溶液と混合する段階
を含む、微粒子を調製するための方法であって、少なくとも一つの第1溶液、第2溶液、及び第3溶液が脂質を含み、かつ
両方の混合段階が、平均直径が100ミクロン未満の微粒子を作製する一方で核酸の剪断を最少にするやり方で行われる、方法。