(57)【要約】      （修正有）【課題】大規模培養における細菌毒素の増強された生成のための方法および組成物を提供する。【解決手段】細菌毒素発現インヒビターを減少させるための方法および組成物。具体的には、毒素発現インヒビター結合化合物の添加、毒素インヒビター代謝前駆体の濃度を減少させた培養培地、および毒素インヒビター代謝前駆体を代謝するために必要な酵素を欠いている、遺伝子改変した毒素生成細菌。【選択図】図１
2011152141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／１９４，４７８号（２０００年４月４日出
願）および同第６０／１９４，４８２号（２００年４月４日出願）に対する優先
権を主張し、これらの出願は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（配列表、表またはコンピュータープログラムリストに対する参照）
コンピューター読み取り可能な形式における配列表が、本明細書とともに含ま
れる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、細胞内および細胞外毒素の発現インヒビターの蓄積を減少または排
除する方法および組成物を用いて、細菌毒素の生成を増大することに関する。具
体的には、本発明は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種の毒素発現インヒビターの蓄積を
減少または排除するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明
は、百日咳毒素、パータクチン、アデニレートシクラーゼ毒素である溶血素、繊
維性血球凝集素および他の毒素の高収率生成に関する。
【０００４】
百日咳毒素（ＰＴ）は、毒性Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳を引き起こす微
生物）により生成される種々の成分のうちの１つである。百日咳は、呼吸器系の
重篤な感染であり、かつては、米国で毎年５，０００〜１０，０００名もの人々
が死亡する原因であった。百日咳ワクチンの出現以来、百日咳に関連した死亡者
数は一年に２０名未満に減少した。現在では、全ての百日咳感染のうち約５０％
が１歳未満の子供で生じ、そして１５歳を超える子供では、わずか１５％に生じ
るにすぎない。Ｋｉｄｓ  Ｈｅａｌｔｈ．ｏｒｇ（２０００年３月２３日閲覧）
〈ｈｔｔｐ：／／ｋｉｄｓｈｅａｌｔｈ．ｏｒｇ／ｐａｒｅｎｔ／ｃｏｍｍｏｎ
／ｗｈｏｏｐｉｎｇ＿ｃｏｕｇｈ．ｈｔｍｌ〉。
【０００５】
ＰＴは、百日咳に対するワクチンにおいて主要な防御抗原である。Ｂ．ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓにより生成される目的の他の成分は、繊維性血球凝集素、熱不安定
性毒素、アデニレートシクラーゼなどであり、これらはまた、防御抗原として重
要な役割を果たし得る。診断試薬または化学的試薬として、およびワクチンの調
製において有用なこれらの成分の大規模生成は、微生物の大規模培養を要する。
しかし、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、大規模醗酵槽で増殖させることが困難であ
ることが証明されている培養しにくい微生物である。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの
培養のための古来からの方法は、静置培養における培養または醗酵槽における培
養を用いる。静置培養における増殖は、労働集約的である一方、醗酵規模での培
養は、ボルテックスによる攪拌および表面通気を要する。結果として、醗酵槽の
有効容積は、減少され、そしてＢ．ｐｅｒｔｕｓｉｓの増殖のための醗酵槽の改
変がしばしば必要である。さらに、これらの条件下での醗酵の間に生成されるＰ
Ｔの量は、変動性であり、しばしば低い。
【０００６】
米国特許第５，３３８，６７０号は、鉄イオン（すなわち、硫酸鉄）の存在下
でＢ．ｐｅｒｔｕｓｉｓを生成するための方法を開示する。高い鉄含有量により
、より高い細菌増殖が支持される一方で、ＰＴの生成は抑制される。改変Ｓｔａ
ｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地の鉄含有量を推奨される濃度の１０％に調節する
ことにより、ＰＴの生成は最適化された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、以下によりＢ．ｐｅｒｔｕｓｉｓから得られるＰＴの収率を改善す
ることを試みる：（１）硫酸（ＳＯ４２−）を排除する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）
増殖培地に可溶性塩を導入すること、および／または（２）Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉ
ｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を用いること。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、培養培地中に細菌毒素発現インヒビターが蓄積し、そのために有意
に毒素生成を減少させるという発見に基づく。さらに、本発明は、毒素発現イン
ヒビターの抑制または排除が、毒素発現を有意に上方調節し得るという知見に基
づく。本発明の非限定的例は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．、具体的には、Ｂ
．ｐｅｒｔｕｓｉｓおよび／またはＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（これら
は、それぞれ百日咳毒素（ＰＴ）およびパータクチンを生成する）を用いること
を開示する。しかし、より高い細菌毒素レベルが、本発明の教示（アデニレート
シクラーゼ毒素である溶血素、および繊維性血球凝集素を含むが、これらに限定
されない）を利用して、他の細菌培養系において達成され得ることが理解される
。
【０００９】
一般に、本発明は、細胞内および細胞外ＰＴインヒビター蓄積を排除または減
少する（これにより、有意なＰＴ生成の増加を生じる）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓ
を培養するために用いられる方法および組成物を開示することにより、例示され
る。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｉｓ増殖を支持し、硫酸
アニオンによりＰＴ発現阻害を防止または減少する新規な培養培地を調製するた
めの方法および組成物が開示される。これらの培地組成物および関連する方法と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
培養培地と、硫酸アニオンと実質的に不溶性の錯体を形成する、有効量の１以上
の可溶性金属塩とを混合する工程。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖を支持する培
養培地が提供され、この培地は、ＰＴインヒビターと実質的に不溶性の錯体を形
成するある量の１以上の可溶性塩を含み、ここで、この量は、ＰＴ発現の阻害を
防止または減少する。具体的には、硫酸アニオンと実質的に不溶性の錯体を形成
する可溶性塩が開示される。
【００１２】
本発明の他の実施形態としては、ＰＴインヒビターの蓄積に寄与する培地構成
成分を制限または排除することによりＰＴインヒビターを減少する、Ｂ．ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ培養培地、およびこの培地を作製し、用いるための方法が挙げられ
る。具体的には、本発明の１つの実施形態において、システイン濃度が低減され
る。
【００１３】
本発明はまた、有意なＰＴ生成の増加を生じる培養培地中でＰＴインヒビター
の蓄積を排除または減少させる条件下でＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養する工程
、およびこの培養培地からＰＴを単離する工程を包含する、ＰＴを生成するため
の方法および組成物に関する。
【００１４】
本発明のなお別の実施形態において、ＰＴ生成は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシ
ステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を用いて増強される。本発明の１
つの実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地中でＢ．ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を増殖する工程、および
この培養培地からＰＴを単離する工程を包含する、ＰＴを生成する方法が提供さ
れる。
【００１５】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
【００１６】
（項目１）  細菌毒素の増強された生成のための方法であって、該方法は
、毒素生成細菌を培養する工程を包含し、該毒素生成細菌により形成される毒素
発現インヒビターが排除または減少される、方法。
【００１７】
（項目２）  項目１に記載の方法であって、前記毒素生成細菌が、Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ＶｉｂｒｉｏおよびＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａからなる属より選択される、方法。
【００１８】
（項目３）  項目２に記載の方法であって、前記毒素生成細菌が、Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎ
ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａである、方法。
【００１９】
（項目４）  項目１または３に記載の方法であって、前記毒素が、百日
咳毒素（ＰＴ）またはパータクチンである、方法。
【００２０】
（項目５）  項目１に記載の方法であって、前記毒素発現インヒビター
が硫酸イオンである、方法。
【００２１】
（項目６）  項目５に記載の方法であって、前記硫酸イオンが、以下：
ａ）細菌培養培地に、該硫酸イオンと実質的に不溶性の錯体を形成する組成物
を添加すること；
ｂ）硫酸イオン代謝前駆体を欠く細菌培養培地または該硫酸イオン代謝前駆体
の濃度が減少した細菌培養培地を提供すること；および
ｃ）システインデスルフィナーゼノックアウト変異細菌を提供すること、
からなる群より選択される方法を用いて、細菌培養培地から排除または減少され
る、方法。
【００２２】
（項目７）  項目６に記載の方法であって、前記組成物が可溶性金属塩
である、方法。
【００２３】
（項目８）  項目７に記載の方法であって、前記可溶性金属塩がＢａＣ
ｌ２またはＢａＢｒ２である、方法。
【００２４】
（項目９）  項目８に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、Ｐｂ
（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
【００２５】
（項目１０）  項目６に記載の方法であって、前記硫酸イオン代謝前駆
体が、システインである、方法。
【００２６】
（項目１１）  項目６に記載の方法であって、前記硫酸イオン代謝前駆
体を欠く細菌培養培地または前記硫酸イオン前駆体の濃度が減少した細菌培養培
地が、前記硫酸イオンと実質的に不溶性の錯体を形成する可溶性金属塩をさらに
含む、方法。
【００２７】
（項目１２）  項目６に記載の方法であって、前記システインデスルフ
ィナーゼノックアウト変異細菌が、組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓまたは組換えＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａであ
る、方法。
【００２８】
（項目１３）  Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養する方法であって、硫酸と
実質的に不溶性の錯体を形成する、有効量の１以上の可溶性金属塩の存在下で、
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養する工程を包含する、方法。
【００２９】
（項目１４）  項目１３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、方法。
【００３０】
（項目１５）  項目１３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
ＢａＣｌ２またはＢａＢｒ２である、方法。
【００３１】
（項目１６）  項目１３に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
【００３２】
（項目１７）  Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖を支持し、そして硫酸によ
りＰＴ発現の阻害を防止または減少させる培養培地を作製する方法であって、該
方法は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養培地と、硫酸と実質的に不溶性の錯体を形
成する、有効量の１以上の可溶性金属塩とを混合する工程を包含する、方法。
【００３３】
（項目１８）  項目１７に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、方法。
【００３４】
（項目１９）  項目１７に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
ＢａＣｌ２またはＢａＢｒ２である、方法。
【００３５】
（項目２０）  項目１７に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
【００３６】
（項目２１）  Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖を支持する培養培地であっ
て、該培地は、硫酸と実質的に不溶性の錯体を形成するある量の１以上の可溶性
金属塩を含み、該量は、硫酸によるＰＴ発現の阻害を防止または減少させる、培
養培地。
【００３７】
（項目２２）  項目２１に記載の培養培地であって、前記可溶性金属塩
が、Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、培養培地。
【００３８】
（項目２３）  項目２１に記載の培養培地であって、前記可溶性金属塩
が、ＢａＣｌ２またはＢａＢｒ２である、培養培地。
【００３９】
（項目２４）  項目２１に記載の培養培地であって、前記可溶性金属塩
が、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、培養培
地。
【００４０】
（項目２５）  ＰＴを生成する方法であって、該方法は、硫酸と実質的に
不溶性の錯体を形成する有効量の可溶性金属塩を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培
養培地においてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを増殖する工程、および該ＰＴを該培養
培地から単離する工程を包含する、方法。
【００４１】
（項目２６）  項目２５に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
Ｂａ（ＩＩ）ハライドである、方法。
【００４２】
（項目２７）  項目２５に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
ＢａＣｌ２またはＢａＢｒ２である、方法。
【００４３】
（項目２８）  項目２５に記載の方法であって、前記可溶性金属塩が、
Ｐｂ（ＩＩ）、Ｓｒ（ＩＩ）またはＡｇ（ＩＩ）の可溶性塩である、方法。
【００４４】
（項目２９）  Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノッ
クアウト変異体。
【００４５】
（項目３０）  ＰＴを生成する方法であって、該方法は、Ｂ．ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ培養培地においてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼ
ノックアウト変異体を増殖する工程、および該ＰＴを該培養培地から単離する工
程を包含する、方法。
【００４６】
（項目３１）  ＰＴの増強された生成のための方法であって、該方法は、
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓシステインデスルフィナーゼノックアウト変異体を培養
する工程を包含し、それにより、非システインデスルフィナーゼノックアウト変
異体を用いた場合と比較して、生成したＰＴの増強した量が生成される、方法。
【００４７】
（項目３２）  アミノ酸配列ＧＧＧＤＧＳＦＳＧＦＧＤＧＳＦＳＧＦＧ−
ＯＨ（配列番号５）を含む、ペプチド。
【００４８】
（項目３３）  混合物から細菌毒素を単離する方法であって、該方法は、
ペプチドアフィニティーカラムを調製する工程であって、該ペプチドが、ＧＧ
ＧＤＧＳＦＳＧＦＧＤＧＳＦＳＧＦＧ−ＯＨ（配列番号５）を含むアミノ酸配列
を有する、工程；
該細菌毒素を含む該混合物を該ペプチドアフィニティーカラムに添加する工程
であって、該細菌毒素が該ペプチドに結合する、工程；
該結合した細菌毒素を、該ペプチドから遊離させる工程；および
該単離した細菌毒素を収集する工程、
を包含する、方法。
【００４９】
（項目３４）  項目３３に記載の方法であって、前記細菌毒素がＢｏｒ
ｄｅｔｅｌｌａ属から得られる、方法。
【００５０】
（項目３５）  項目３４に記載の方法であって、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉ
ｃａからなる群より選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種をさらに含む、方法。
【００５１】
（項目３６）  項目３３に記載の方法であって、前記細菌毒素が百日咳
毒素またはパータクチンである、方法。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、醗酵時間の関数として生成したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖（ＯＤ  ６５０）およびＰＴの量における変化（［Ｐｔｘ］／ＯＤ）を示すグラフ。
【図２】図２は、血液寒天プレートの写真。
【図３】図３は、コントロール培養物上清（Ｃｔｒ．）、使用済み培養培地由来の３，０００ＫＤａより小さい（３Ｋより小さい）分子を含む培養培地、および使用済み培養培地由来の３，０００ＫＤａより大きい（３Ｋより大きい）分子を含む培養培地中のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖（ＯＤ  ６５０）およびＰＴの量（Ｐｔｘ濃度）における変化を示す棒グラフ。
【図４Ａ】図４Ａは、醗酵中のアミノ酸プロフィールを示す、醗酵時間  対  アスパラギン酸、トレオニン、システインおよびリジン濃度（ｍｇ／Ｌ）ならびにアルギニン、メチオニンおよびプロリン濃度（ｍｇ／Ｌ）のグラフ。
【図４Ｂ】図４Ｂは、醗酵時間の関数として有機酸濃度の変化を示す、時間（時間）  対  面積（ｍＡＵ  秒）のグラフ。
【図５】図５は、種々の培養時間でのスルフェート濃度（μｇ／ｍＬ）を示す棒グラフ。
【図６】図６は、２つのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株（株１＝ＣＳ−８７、株２＝ＡＴＣＣ９７９７）についての産生されたＰＴの量（μｇ／ｍｌ／ＯＤ６５０）に対するＢａＣｌ２の濃度（ｍＭ）の増加の効果を示すグラフ。
【図７−１】図７は、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ  ＤＮＡデータベースに見出されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ配列（コンティグ３１４）との、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６から単離されたシステインデスルフィナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す。
【図７−２】図７は、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ  ＤＮＡデータベースに見出されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ配列（コンティグ３１４）との、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６から単離されたシステインデスルフィナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す。
【図７−３】図７は、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ  ＤＮＡデータベースに見出されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ配列（コンティグ３１４）との、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６から単離されたシステインデスルフィナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、６００ｎｍの吸光度での、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中の総Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素産生測定をグラフ表示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、毒素／光学濃度単位（ｍｇ／ｍＬ）で測定した、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中の総Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素産生をグラフ表示する。
【図９】図９は、制限システイン条件下での２０リットル醗酵槽中の総Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにおける内部および外部スルフェート濃度をグラフ表示する。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明）
細菌感染の最も重篤な結果は、しばしば、宿主中の毒素発現から生じる。非限
定的な例として、破傷風毒素を産生するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ
、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生される神経毒、偽膜性腸炎を引き起こす
毒素を産生するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、胃腸炎および腸チフスを引き起こす腸
毒素を産生するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、敗血症性ショックを引き起
こす毒素を発現し得るＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、および百
日咳の要因となる毒素を産生するＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓが挙げられる。他の毒
素産生性の細菌属としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢
菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）が挙げられるが、
これらに限定されない。幸運にも、細菌毒素の最も重篤な効果を予防および／ま
たは軽減するワクチンが利用可能である。これらのワクチンは、主に、改変され
た細菌毒素、致死用量未満の精製毒素および／または全細胞ホモジネートから構
成される。
【００５４】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）ワクチンは、ワクチ
ンレシピエントにおける百日咳の予防に特に効果的であることがわかっている。
百日咳毒素（ＰＴ）を単独またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの他の抗原と組み合わ
せて含む、非細胞百日咳（ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（ＡＰ）
ワクチンは、百日咳感染の予防に非常に効果的であることが見出されている。し
かし、ＰＴおよび他の百日咳抗原の多くは微量で発現されるので、収率を最大に
するために培養条件を最適化することが重要である。標準的なＳｔａｉｎｅｒ−
Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培地を使用して、バッチ醗酵途中での百日咳毒素／光学
濃度（ＰＴ／ＯＤ６５０）の比の減少が観察された。この現象が基質利用能また
は負のフィードバック阻害の欠如に起因するか否かを決定するために、研究を行
って、使用済み培地がＰＴ発現についての阻害性因子を含むか否かを決定し、そ
してこれらの因子を同定した。培養上清サンプルを、醗酵の種々の段階から採取
し、そして基本塩を欠くＳＳ培地成分を再供給した。これらのサンプルを使用し
て第２の培養を開始し、そしてＰＴ／ＯＤ６５０比を、新鮮なＳＳ培地と比較し
て測定した。未処理の使用済み培地および３，０００ｋＤａより小さい分子を含
有するこの培地の画分の両方が、ＰＴの産生を阻害した。Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎ
ｇｏｕ寒天（ＢＧＡ）上での交差画線実験は、新鮮に画線した細菌における溶血
活性のインヒビターの産生を確認した。クーマシー染色したゲルは、全細胞タン
パク質プロフィールが、新鮮な培地と比較して、その画分培地において有意に異
なることを示し、これは、阻害性因子が２成分の調節系に影響を及ぼしているこ
とを示唆する。これらの阻害性化合物をさらに同定するために、Ｂ．ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓの中間代謝物の完全なフラックス分析（使用済み培地のＨＰＬＣおよび
これらの経路中の重要な酵素によるアミノ酸および有機酸分析を含む）を行った
。硫黄含有アミノ酸（メチオニン）およびピルビン酸が、増殖の後期対数期中に
蓄積する（２００ｍｇ／Ｌまで）ことが見出された。ＬＣ−ＭＳによる全ての上
清画分の試験は、システイン消費のための経路がスルフェートの形成を導くこと
を示唆する。次いで、これは、ＰＴ発現の負のフィードバックインヒビターとし
て作用した。
【００５５】
スルフェートは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにおけるＰＴ発現のインヒビターと
して作用するので、醗酵が進行するにつれて細胞内および細胞外のスルフェート
蓄積を減少または排除するための方法を開発した。本発明の１つの実施形態にお
いて、これらの方法は、スルフェートと実質的に不溶性の錯体を形成する有効量
の可溶性塩の添加を包含する。このような可溶性塩としては、アルカリ土類金属
または他の塩（ＰｂおよびＡｇ）が挙げられる。本発明の好ましい塩は、アルカ
リ土類金属塩である、より好ましい塩は、ハロゲン化Ｂａ（ＩＩ）塩である。最
も好ましいハロゲン化Ｂａ（ＩＩ）塩は、ＢａＣ１２またはＢａＢｒ２である。
【００５６】
塩化バリウムは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによって産生されたＰＴの量の増加
の促進において効果的であることが示されている。ＡＴＣＣ９７９７またはＣＳ
８７  Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株をＢａＣｌ２の存在下で培養した場合に、ＰＴ
収率における１ＯＤ単位あたりの１０倍の増加が観察された。このケースにおい
て、ＢａＣｌ２の非存在下でのＰＴの量は、２０ｍＭ  ＢａＣｌ２を用いた場合
に０．５２５μｇ／ｍＬ／ＯＤ６５０であるのに対して、０．０５μｇ／ｍＬ／
ＯＤ６５０であった。「有効量」の塩は、醗酵を塩の非存在下で行った場合と比
較して、醗酵中のスルフェートによるＰＴ発現の阻害を防止または減少する量を
意味する。
【００５７】
スルフェート錯体の可溶性は、溶解度積（Ｋｓｐ）によって規定される。スル
フェート錯体は、Ｋｓｐが２５℃で１×１０−５以下である場合に、「実質的に
不溶性」であると規定される。好ましくは、Ｋｓｐは、２５℃で１×１０−７〜
１×１０−１０である。最も好ましくは、Ｋｓｐは、２５℃で１×１０−８〜１
×１０−１０である。選択されたスルフェート錯体についての上述の範囲内ある
溶解度積を、表１に示す。
【００５８】
表１：選択されたスルフェート錯体についてのＫｓｐ値
【００５９】
【表１】
2011152141.tif 000003
【００６０】
ａＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉ
ｃｓ−第６５版、Ｗｅａｓｔ（編）、Ｂ−２２０頁（１９８４）。
【００６１】
表１に示されるスルフェート錯体は例であることが意味され、それ自体が、本
発明の範囲を制限することを意味しない。さらに、スルフェート錯体が、必ずし
も増殖培地中に完全に不溶性ではないことに留意すべきである。スルフェート錯
体は、単に、スルフェートによるＰＴ発現の阻害を防止または減少するのに十分
に不溶性でなければならない。
【００６２】
本発明の塩は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養が開始される前または後で培地
に添加され得る。あるいは、塩は、培地の調製に使用する水の添加の前または後
であるが、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の導入の前に、培地の他の成分と共に混
合され得る。
【００６３】
醗酵中に産生されるＰＴの量の増加を促進するために本発明において使用され
得る塩の量は、約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは、約１０ｍＭ〜約
３０ｍＭ、もっともの好ましくは、約２０ｍＭであり得る。通常には、約１０ｍ
Ｍ〜約２０ｍＭの塩が、スルフェートによるＰＴ発現の阻害を防止または減少す
るために効果的である。当業者は、単なる慣用的な実験によって、任意の特定の
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株におけるＰＴ発現の阻害を効果的に防止または減少す
る最適な量の塩を決定し得る。
【００６４】
別の実施形態において、本発明者らは、毒素インヒビター前駆体の培地濃度を
調節することが、細胞内および細胞外の両方の毒素インヒビターの濃度を減少し
得ることを決定した。例えば、限定することを意図しないが、本発明者らは、Ｐ
Ｔインヒビター（スルファイトおよびスルフェートを含むが、これらに限定され
ない）が、システイン代謝の最終生成物として産生されることを決定した。要す
るに、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａは、酵素システインデスルフィナーゼを含む経路を
介して、硫黄含有アミノ酸であるシステインを代謝する。システイン代謝の間に
、スルフヒラル（ｓｕｌｆｈｙｒａｌ）基が、システイン分子から酵素的に切断
される。このスルフヒラル基は、スルファイトおよびスルフェートにさらに代謝
され、これらが、細菌細胞内および細胞外環境内に蓄積する。結果として、シス
テインの存在下でＢｏｒｄｅｔｅｌｌａを長く増殖させるほど、細胞内および細
胞外スルフェート濃度は高くなり、そしてＰＴ産生は減少する。
【００６５】
開始培養培地システイン濃度と最終スルフェート濃度との間の関係に基づいて
、本発明者らは、開始システイン濃度を減少することが、細胞内および細胞外の
スルフェート蓄積の減少を生じ、結果としてＰＴ阻害の減少を生じるという、非
限定的な理論を展開した。スルフェート濃度に対するシステイン濃度の変化の効
果を評価するために、本発明者らは、３つの異なる培養系を開発し、これらは、
以下の略語を用いて識別される：ＬＣＭＳＳＢ、ＬＣＭＳＳＦＢ、ＬＣＭＳＳＢ
ａ。ＬＣＭＳＳＢ（制限システイン改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅバッチ
）培養系は、以下の表２に示される培地を使用してバッチ様式で増殖されるＢ．
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからなった。手短に言うと、「バッチ様式」は、微生物が、
有意な量の使用済み（すなわち、使用した）培養培地の補充または交換を伴わず
に、単一の培養培地（通常、液体または半液体）中で培養されるプロセスである
。本発明において、バッチ様式培養物（ＬＣＭＳＳＢ）を、当業者に公知の手順
を使用して６００ｎｍで分光光度的に測定した場合に、細菌の光学濃度が１．０
より高い吸光度に到達するまで、約３５℃〜３７℃で好気的にインキュベートし
た。第２の培養系ＬＣＭＳＳＦＢ（制限システイン改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈ
ｏｌｔｅ供給バッチ）は、表３に開示される培養培地を使用して維持した。シス
テインは、この基底培地には添加されなかったことに留意する。代わりに、Ｌ−
システインを、インキュベーション期間全体にわたって２０ｍｇ／時間の速度で
添加した。最後の培養系は、ＬＣＭＳＳＢａ（制限システイン改変Ｓｔａｉｎｅ
ｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅバッチ＋ＢａＣｌ２）と称され、これは、表２に示される基
礎培地を使用した。
【００６６】
３つ全ての培養系を播種し、そして以下のように維持した：Ｂｏｒｄｅｔｅｌ
ｌａ培養物を、ＡＦＳ  Ｂｉｏｃｏｍｍａｎｄ  ｖ２．０（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓ
ｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪ）に連結した２０リット
ルバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＢｉｏＦｌｏ  ＩＶ（登録
商標）（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ  
ＮＪ））中、約３５℃〜３７℃でインキュベートした。このＡＦＳ  Ｂｉｏｃｏ
ｍｍａｎｄ  ｖ２．０は、ｐＨ、攪拌、溶存酸素、温度、およびエアーフロー速
度についてのデータを収集した。消泡剤およびｐＨ制御剤のためのさらなるポン
プを、必要な場合に追加し、これは、当業者に公知である。エアーフローを４．
０リットル／分に調整し、溶存酸素を４０％に維持し、そしてｐＨを約７．２に
維持した。
【００６７】
各２０リットルバイオリアクターは、１１リットルの試験培地を含み、そして
１リットルの活発に増殖している細菌開始培養物を播種した。この活発に増殖し
ている開始培養物は、１リットルのＳｔａｉｎｅｒ  Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培
地（この処方は、表５および６に示される）を含む振盪フラスコに凍結シードを
播種して調製し、そして１．０  より高いＯＤ６００の光学濃度に到達するまで
（約２０〜２４時間）インキュベートした。
【００６８】
播種した醗酵槽を、３〜６時間間隔でサンプリングし、そして遠心分離を使用
して培養上清と細胞ペレットに分けた。培養上清を、ＰＴ、スルフェート、有機
酸、アミノ酸および細菌密度についてアッセイした。細菌細胞ペレットを、内部
のスルフェートおよびＰＴ濃度について分析した。各培養系は、培養物の細菌集
団の密度が、約１．０を超える吸光度単位に到達したときに（播種後約１２時間
）、特定の補充を受けた。ＬＣＭＳＳＢおよびＬＣＭＳＳＢａの両方は、１０．
０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび５．０ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウ
ム（ＦｅＳＯ４／グルタミン酸補充）に加えて、以下の表４に記載の２００ｍＬ
のアミノ酸補充を受けた。ＬＣＭＳＳＢａ培養物はまた、２０ｎＭのＢａＣｌ２
の最終培養培地濃度を得るのに十分な１ｍＭのＢａＣｌ２を受け；ＬＣＭＳＳＦ
Ｂ培養物は、システインを除くさらなるアミノ酸と共にＦｅＳＯ４／グルタミン
酸補充を受け、ＢａＣｌ２は受けなかった。補充後、醗酵槽を、実験を終了する
直前まで培養した。
【００６９】
【表２】
2011152141.tif 000004
【００７０】
【表３】
2011152141.tif 000005
【００７１】
【表４】
2011152141.tif 000006
【００７２】
３つ全ての還元システイン培養系（ＬＣＭＳＳＢ、ＬＣＭＳＳＦＢ、およびＬ
ＣＭＳＳＢａ）を、当該分野で公知のシステイン濃度を有する従来のＳＳ培地と
並行して試験した。Ｂｏｒｔｄｅｔｅｌｌａ細菌およびＰＴ濃度を、図８Ａおよ
び８Ｂにグラフ表示する。最大のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ細胞濃度は約３２時間で
到達することが、図８Ａから理解され得る。最大の増殖は、通常のＰＴ産生培地
をバッチ様式での改変ＳＳと比較した場合に、ほぼ同じであった。図８Ｂは、培
養培地の最大のＰＴ産生（ｍｇ／ｍｌ）を示す。全体的なＰＴ産生における有意
な改善が、従来の培養系と比較した場合、本発明のシステイン制限培養系のいず
れかを使用して現実化されることが容易に明らかである。さらに、図９は、制限
システイン条件下での２０リットル醗酵槽中のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞にお
ける内部および外部のスルフェート濃度を示す。ＬＣＭＳＳＢａ培養系は、全体
的なＰＴ産生における最良の改善を示した。従って、本発明者らによって理論付
けられたように、ＰＴ産生は、培養培地中のインヒビター前駆体の量を制限する
ことによって有意に改善され得る。さらに、よりさらなる改変が、本発明の前駆
体制限培養系を本発明の毒素発現インヒビター除去系と組み合わせた場合に現実
化され得る。
【００７３】
本発明者らは、以下を実証した：１）毒素産生細菌の培地中に蓄積する特定の
毒素発現インヒビターが、全体的な毒素産生を有意に減少し得る；および２）培
養培地からの毒素発現インヒビターの除去、または培養培地中のインヒビター前
駆体を減少することによる毒素インヒビター形成の減少が、全体的な毒素産生を
有意に増加し得る。従って、本発明者らは、毒素発現インヒビターを産生する毒
素産生生物の能力を遺伝的に不能化することが、全体的な毒素産生における同様
の増加を生じ得ると理論付けた。結果として、本発明のなお別の実施形態におい
て、培養中にスルフェートを産生せず、従って、ＰＴ発現の阻害を示さない、シ
ステインデスルフィナーゼ活性を欠失する組換えＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（「ノ
ックアウト変異体」）を提供する。このようなノックアウト変異体は、多くの異
なる方法のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第５，５５７，０
３２号および同第５，６１４，３９６号を参照のこと。このような方法は、一般
に、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体ＤＮＡとのＤＮＡ構築物の相同組換えを含む
。相同組換えは、十分に研究されており、これは、各々の最初に存在する分子の
一方の領域が他方の分子の領域に連結されるような、同じかまたは実質的に類似
（すなわち、相同な）の配列を有する２つの核酸分子の切断およびその２つの分
子の連結を生じる、天然の細胞プロセスである（Ｓｅｄｉｖｙ，Ｊ．Ｍ．Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：１１９２−１１９６（１９８８）を参照のこと）。従って
、相同組換えは、細胞が、ＤＮＡの「領域」をあるＤＮＡ分子から別のＤＮＡ分
子に移入し得る、配列特異的プロセスである。相同組換えが２つのＤＮＡ分子間
で生じるために、これらの分子は、互いに「相同な領域」を保持しなければなら
ない。このような相同な領域は、少なくとも２塩基対長でなければならない。２
つのＤＮＡ分子は、一方が、相同組換えを生じ得るように第２の分子中の領域に
類似する配列の領域を含む場合に、相同な領域を保持する。特定の領域に２つの
相同な領域が隣接する場合、ついで、２つの組換え事象が生じ得、これが、その
２つの組換え分子間での領域の交換を生じる。相同組換えは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ中に天然に存在する酵素によって触媒される。
【００７４】
１つのこのような方法において、例えば、プラスミドに含まれるシステインデ
スルフィナーゼをコードする遺伝子（図７）を、その遺伝子内を切断するように
選択された制限酵素で切断し、その結果、マーカー遺伝子をコードする新しいＤ
ＮＡ配列が、システインデスルフィナーゼ遺伝子配列内に挿入され得る。このマ
ーカー遺伝子は、システインデスルフィナーゼ遺伝子の発現を妨げるように作用
する。マーカー遺伝子は、検出可能および／またはアッセイ可能である任意の核
酸配列であり得るが、好ましい実施形態において、これは、抗生物質耐性遺伝子
である。マーカー遺伝子は、それ自身のプロモーター、またはＢ．ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓにおいて活性であるかまたは容易に活性化され得る、任意の供給源由来の
別の強力なプロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態において、マー
カー遺伝子は、システインデスルフィナーゼ遺伝子のプロモーターを使用して転
写され得る。このマーカー遺伝子は、転写を終結するために、その遺伝子の３’
末端にポリＡ配列が結合され得る。好ましいマーカー遺伝子としては、任意の抗
生物質耐性遺伝子（例えば、ｅｒｍＣ’（エリスロマイシン耐性遺伝子）、ｎｅ
ｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）、ａｍｐ（アンピシリン耐性遺伝子）、ｋａｎ（
カナマイシン耐性遺伝子）、およびｇｅｎｔ（ゲンタマイシン耐性遺伝子））が
挙げられる。
【００７５】
ＤＮＡ配列を適切な制限酵素（例えば、ＳｐｌＩおよびＳｐｈＩまたはＰｓｔ
ＩおよびＰｖｏＩ）で消化した後、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍ
ａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））
に開示される方法を使用して、マーカー遺伝子配列を、システインデスルフィナ
ーゼＤＮＡ配列に連結する。連結されるＤＮＡフラグメントの末端は適合性でな
ければならず；これは、全てのフラグメントを適合性の末端を生じる酵素で切断
するか、または連結前に末端を平滑化するかのいずれかによって達成される。平
滑化は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、クレノウフラグメント（ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ）または付着末端を充填するための他のＤＮＡポリメラーゼの
使用によって行われる。この構築物は、システインデスルフィナーゼ遺伝子の規
定の領域に対応する（例えば、システインデスルフィナーゼ遺伝子の３’末端お
よび５’末端に対応する）ＤＮＡ配列を含み、これが、相同組換えによる構築物
の組み込みを可能にする。このＤＮＡ構築物は、第２の抗生物質耐性遺伝子を有
するプラスミドに連結され得る。
【００７６】
次いで、構築物を、周知の方法を使用して（例えば、エレクトロポレーション
またはトランスフェクトしたＥ．ｃｏｌｉ細胞との接合によって）Ｂ．ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓへトランスフェクトされ得る。細胞のスクリーニングは、存在する抗
生物質耐性遺伝子に対応する１以上の抗生物質の致死濃度の存在下で細胞を培養
することによって達成される。生存する細胞は、その中にノックアウト構築物が
組み込まれている。選択された細胞がその中にプラスミド構築物を有さないよう
に、非複製プラスミドを使用し得る。ノックアウト構築物の組み込みを確かめる
ために、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ＤＮＡのサザンブロットに、マーカー配列に
のみおよび／または除去されたシステインデスルフィナーゼの部分にのみハイブ
リダイズするように設計された配列をプローブし得る。あるいは、またはさらに
、ＤＮＡは、システインデスルフィナーゼ遺伝子の３’末端および５’末端に対
応するプローブを用いるＰＣＲによって増幅され得る。最後に、システインデス
ルフィナーゼ活性をアッセイし得る。
【００７７】
別の実施形態において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、システインデスルフィナ
ーゼ遺伝子のコード配列に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列の存在下
で培養され得る。この実施形態において、ヌクレオチド配列は、Ｂ．ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓによって取り込まれ、システインデスルフィナーゼコード遺伝子にハイ
ブリダイズし、そしてこの遺伝子の翻訳を阻害する。遺伝子の塩基と相互作用し
て、共有結合を形成しそれによって翻訳を阻害する、改変されたヌクレオチド配
列もまた使用され得る。米国特許第６，０１５，６７６号を参照のこと。
【００７８】
システインデスルフィナーゼ遺伝子に対してアンチセンスであるヌクレオチド
の例としては、少なくとも８塩基、好ましくは、１０〜１５塩基の任意のヌクレ
オチドが挙げられ、これらは、図７のコード領域に相補的である。例としては、
以下が挙げられる：
ＧＡＴＴＧＣＴＧＡＴ（配列番号１）
ＴＡＧＡＴＧＧＧＧＣ（配列番号２）
本発明において、種々の培地が、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを培養するために使
用され得る。非限定的で例示的な培地としては、Ｓｔａｉｎｅｒ  Ｓｃｈｏｌｔ
ｅおよびＧＭＡＲ改変培地が挙げられる。Ｓｔａｉｎｅｒ  Ｓｃｈｏｌｔｅおよ
びＧＭＡＲ改変培地の成分を、それぞれ、表２および３に示す。
【００７９】
【表５】
2011152141.tif 000007
【００８０】
【表６】
2011152141.tif 000008
【００８１】
本発明の方法によって産生されたＰＴ毒素は、Ｓｅｋｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５８：１４６４７−１４６５１（１９８３）によって記載の方法
に従って精製され得る。手短に言うと、Ｓｅｋｕｒａの方法は、２つの連続的な
クロマトグラフィー工程を使用してＰＴを精製する。第１の工程は、Ａｆｆｉ−
ゲルブルーカラムでのクロマトグラフィーを含む。第２の工程は、フェツイン−
アガロースカラムでのクロマトグラフィーを含む。ＳｅｋｕｒａらのＰＴ精製方
法は、比較的大量（１０ｍｇを超える）のＰＴの慣用的かつ迅速な精製を可能に
する。あるいは、ＰＴは、ペプチドアフィニティーカラムを使用して精製され得
る。このようなカラムを、以下の実施例１において記載する。この実施形態にお
いて、ＰＴを、カラムに吸着させ、緩衝液（例えば、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ＨＣ
ｌ、ｐＨ＝６．２）で洗浄し、次いで、ＰＴを、４ＭのＭｇＣｌ２で溶出する。
このＭｇＣｌ２は、透析によって除去され、実質的に純粋なＰＴを得る。
【００８２】
ここでは、本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照す
ることによって理解される。これらの実施例は、例示目的でのみ本明細書中に提
供され、他に特定化されない限り限定することが意図されない。
【００８３】
（実施例１）
（材料および方法）
生物：野生型Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＣＳ８７を、これらの研究のほとんど
で用いた。この株は中国を起源とし、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）の国立小児保健発育研究所
（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  
ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ＮＩＣＨＤ）に渡された。さ
らに、ＢＰのいくつかの株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａ
ｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られ、これらには、ＡＴＣＣＣ番号１０３８０が挙
げられるが、これに限定されない。これらの両方は、本明細書中に開示されたシ
ステインデスルフィナーゼノックアウトを調製するために適切である。生物は、
−７０℃で保存するか、または３７℃での維持される加湿インキュベーター中の
ＢＧＡ（ＢＢＬ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で維持する。
【００８４】
細胞を培養するために用いた培地は、ＳｔａｉｎｅｒおよびＳｃｈｏｌｔｅ．
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：２１１−２２０（１９７０）に記載さ
れる規定培地に類似した。この１リットルの培地は、以下を含んだ：１０．７ｇ
グルタミン酸ナトリウム、０．２４ｇ  プロリン、２．５ｇ  ＮａＣｌ、０．
５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇ  ＫＣｌ、０．１ｇ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２
０ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５２ｇ  Ｔｒｉｓ、２０ｍｇ  アスコルビ
ン酸、１００ｍｇ  グルタチオン、４０ｍｇ  システイン、および４ｍｇ  ナイ
アシン。これらの塩、グルタミン酸およびプロリンを、基底処方物として調製し
、そして滅菌のためにオートクレーブした。培地の残りの物（補充物）は、濃縮
形態（１００倍）で調製し、そしてフィルター滅菌した。培地の最終ｐＨは、７
．２〜７．５であった。いくつかの実験において、１０ｍｇ／ｍＬのＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏを添加した。生物を、３７℃に維持したＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ
Ｉｎｎｏｖａ  Ｍｏｄｅｌ  ４３００振盪インキュベーター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕ
ｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）中の３連のバッフ
ルしたＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ、または１２Ｌの作動容量を有するバッチ
様式で作動するＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ２０Ｌ  ＢｉｏＦｌｏ  ＩＶ（Ｎ
ｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかにおいて増殖さ
せた。リアクタを、ＡＦＳ  Ｂｉｏ  Ｃｏｍｍａｎｄ  ｖ２．０（Ｎｅｗ  Ｂｒ
ｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（これは、ｐＨ、攪拌、溶存酸素、温
度、およびエアーフロー速度についてのデータを収集した）および消泡剤および
ｐＨ制御剤のためのさらなるポンプに連結した。全ての実験において、醗酵槽の
エアーフロー速度を０．１２５ｖｖｍに設定し、温度を３６．５℃で制御した。
溶存酸素（ＤＯ）を、１５０〜１０００ＲＰＭの振盪カスケードを使用すること
によって４０％で維持した。ｐＨを、５０％  Ｈ３ＰＯ４の添加によって７．２
に制御した。
【００８５】
リアクタに、約１１Ｌの規定培地を量り分け、そして活発に増殖しているシー
ド（１Ｌ）を播種して、１２Ｌの総作動容量にした。サンプルを、３〜６時間毎
に再滅菌サンプルポートから採取した。細胞外代謝物の分析のために、上清を、
０．２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に通して濾過し、そして−２０℃で保存した。
【００８６】
培養物の増殖を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ  Ｓｐｅｃ  １２０（Ｓｈｉｍａｄ
ｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用して６５０ｎｍの光学濃度（ＯＤ６５０
）によって測定した。培養物の純度を、グラム染色ならびにＢＧＡ（ＢＢＬ，Ｉ
ｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびトリプシカーゼ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓ
ｅ）ダイズ寒天（ＴＳＡ；ＢＢＬ，Ｉｎｃ．）上でのプレーティングによって確
かめた。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの純粋培養物は、全ての生物が、グラム陰性染
色し、ＢＧＡ寒天で増殖し、そしてＴＳＡ寒天で増殖しないことを示す。
【００８７】
アミノ酸分析：アミノ酸の分析および定量を、ＡｍｉｎｏＱｕａｎｔカラム（
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｒｃｋａｒｄ  Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）に
ついて提供されるように、オンラインプレカラム誘導体化を使用して、逆相高圧
液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって行った。一次アミノ酸を、
ＯＰＡ試薬（０．４Ｍホウ酸緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フタルアルデヒド
、１０ｍｇ／ｍｌ  ３−メルカプトプロピオン酸）によって誘導体化し、一方、
二次アミノ酸を、ＦＭＯＣ試薬（アセトニトリル中の２．５ｍｇ／ｍｌ  ９−フ
ルオレニルメチルクロロホルメート）によって誘導体化した。一次アミノ酸につ
いて、移動相は、酢酸ナトリウム／エタノールアミン／テトラヒドロフラン（ｐ
Ｈ  ７．２±０．０５）からなり、３３８ｎｍで検出した。二次アミノ酸は、酢
酸ナトリウム／エタノール／アセトニトリル移動相（ｐＨ  ７．２±０．０５）
を使用して溶出し、２６２ｎｍで検出した。各アミノ酸の同定を、異なる濃度（
１００、２５０および１０００ｐｍｏｌ／μｌ）のアミノ酸標準（Ｈｅｗｌｅｔ
ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）のセットを用いて行った。ＨＰＬＣ  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−
１０５０（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を、ＨＰ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏ
ｎソフトウェア（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃａｒｄ，ｖ２．０）と連結して、これ
らの分析に使用した。
【００８８】
有機酸の検出および定量：有機酸を、ＨＰ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  ｖ２．
０ソフトウェアを連動し、４ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４の移動気相を有するＢｉｏＲａｄ
Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を備えた、Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−１０５０
（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して検出した。カラムを３５℃で平
衡化し、そして平衡（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）流速は６ｍｌ／分であった。検出を
、２１５ｎｍで行った。各有機酸の同定を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  
Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）（これは、シュウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、マレイ
ン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ギ酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムの
混合物からなる）を注入することによって達成した。ピルビン酸を、この有機酸
標準に２．５ｇ／ｍｌのピルビン酸を添加することによって評価した。
【００８９】
各有機酸を、以下の酵素キットを使用して、そして以下の製造業者推奨のプロ
トコルに従って定量した：クエン酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ
キット１３９−０７６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；コハク酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ
キット１７６−２８１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；ギ酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキッ
ト９７９−７３２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；酢酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット１
４８−２６１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ，ＩＮ）；シュウ酸、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット７
５５−６９９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ，ＩＮ）；およびピルビン酸、Ｓｉｇｍａキット７２６−ＵＶ（Ｓｉｇｍ
ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００９０】
定量的ＰＴ  ＥＬＩＳＡアッセイ：マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉ
ｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  ＩＩＦ，Ｖａｎｇａｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＮＪ）を、１ウェルあたり０．１ｍｌのフェチン（Ｓｉｇ
ｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（０．１Ｍ炭酸ナトリウム中０．２μｇ／ｍ
ｌ（ｐＨ９．６））を添加することにより感作し、そして室温で一晩インキュベ
ートした。このプレートを、０．９％  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｂｒｉｊ  ３５
、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および０．０２％アジドを含む溶液を
用いて５回洗浄した。ＰＴを含むサンプルを、０．５％  Ｂｒｉｊ３５を含むＰ
ＢＳ中で希釈し、そしてプレートに添加し、そして室温で２時間インキュベート
した。このプレートを、再度、上記のように洗浄し、そしてＰＴ（２０．６）に
対するモノクローナル抗体をＰＢＳを用いて希釈した。Ｉｂｓｅｎら、Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２４０８−２４１８（１９９３）。このプレートを再
度洗浄し、そして二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇ
ＧおよびＩｇＭ（Ｔａｇｏ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、ＰＢ
Ｓ−Ｂｒｉｊ中に希釈した）を、このプレートに添加し、次いで、室温で２時間
インキュベートした。このプレートを、上記のように洗浄し、そしてｐ−ニトロ
フェノールホスフェート（Ｓｉｇｍａホスファターゼ基質１０４）（１ｍｇ／ｍ
ｌ（０．１Ｍ  ジエタノールアミン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣ
ｌ２、および０．０２％アジド（ｐＨ９．８）の溶液中））を添加した。このプ
レートを３７℃にて１時間インキュベートし、そして４０５ｎｍでの吸収をＤｙ
ｎｅｘ  Ｍｏｄｅｌ  ＭＲＸマイクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用いて決
定した。各プレートについて、検量線を、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡおよび０．
１％グリセロール中に希釈した、精製したＰＴ（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃ．）を用いて作成した。培養サンプルからのＰＴの濃
度を、検量線から計算した。
【００９１】
スルフェート定量：培地内のスルフェート濃度を、Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆらの方
法を用いて定量した。このアッセイをマイクロプレートアッセイに適用した。Ｍ
ｅｌｎｉｃｏｆｆら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．１４：３７７−３８６（１９７６）。
【００９２】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｎｉｆＳ様遺伝子のクローニング：ｎｉｆＳ様遺伝
子を含むＤＮＡフラグメントを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  
Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０により増幅した。反応混合物（５０μｌ）は、以下を含ん
だ：２０ｎｇの精製Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体ＤＮＡ、０．２μＭの各プラ
イマー（正方向プライマー：５’ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  Ａ
ＴＣ  ＴＡＣ３’（配列番号３）；逆方向プライマー：５’ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ｔ
ＴＧ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＧ３’（配列番号４））、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１
０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４００μＭの各
ｄＮＴＰ、および２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）。条件は以下である：第１のサイ
クル、９４℃で２分；次いで、９４℃（２分）、４２℃（１分）、および７２℃
（２分）で３５サイクル；そして最後に８分間の７２℃のインキュベーション。
ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中でゲル精製し、そしてｐＣＲ（登録商標）
ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にｐＢＰｆ
ｉｌＳを製造する製造業者により勧められる条件を用いて連結した。プラスミド
ｐＢＰｆｉｌＳを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ形
質転換し、そして形質転換体を、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地において選択した。配列
決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  Ｍｏｄｅｌ  ３
１０自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，
Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示書および配列決定キ
ットを用いて行った。
【００９３】
ＢＰｆｉｌＳ様遺伝子中にヌル変異を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株の構築：
本発明の教示に従って作製したｐＢＰｆｉｌＳプラスミドを、ＳｐｌＩおよびＳ
ｐｈＩを用いて切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）のクレノウフラグメントを用いて末端を平滑末端化した。切断プラス
ミドを、ゲル精製し、そして平滑末端化エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＣ
’）またはルシフェラーゼを、プラスミド構築物中へ連結した。Ｋｌｕｇｍａｎ
ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２０６６−２０７１（１９８９）。ＤＨ
５の形質転換体は、１ｍｌあたり１００μｇのエリスロマイシンに対する耐性を
有することを確認した。構築したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇ
ｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて再単離し、そして変異した
挿入物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いてプラスミドを切断することにより
単離した。この挿入物をゲル精製し、そしてプラスミドｐＳＳ１１２９のＢａｍ
ＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位へと連結してｐＢＲΔｆｉｌＳを作製した。Ｓｔｉ
ｂｉｔｚ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：２４８４−２４９２（１９９８）
。これをＥ．ｃｏｌｉ株ＳＭ１０中へ形質転換し、そしてこの形質転換体を用い
てＳｔｉｂｉｔｚにより記載されるようにＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＢＰ５３６
と結合した。「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｕｎｔｅｒｓ
ｅｌｅｃｔａｂｌｅ  Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｌｉ
ｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ」，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃ
ｌａｒｋおよびＢａｖｏｉｌ（編）３０１−３０８頁（１９９７）。染色体内に
ヌルＢｐｆｉｌＳ遺伝子を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ単離物を、ＢＧＡ寒天上
で、ゲンタマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性、および／またはエリスロマ
イシン耐性、あるいはルシフェラーゼ活性について選択した。
【００９４】
その他：すべての物質を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入し
、そして／またはこれらは、入手可能な最高グレードであった。総タンパク質を
、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃ
ｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により定量した。ヒ
トＩｇＧをスタンダードとして使用した。形質転換実験に用いられるＢｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＢＰ５３６株（ＢＰ３３８株の自発的ストレ
プトマイシン耐性変異体）（Ｓｔｉｂｉｔｚ，ＳおよびＭ−Ｓ．Ｙａｎｇ．１９
９１．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：４２８８−４２９６）を、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔ
ｒａｔｉｏｎのＳｃｏｔｔ  Ｓｔｉｂｉｔｚ博士から得た。これらに由来する形
質転換されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓノックアウト変異体を、ＢＰ５３６ｐＷＹ
株と命名し、そしてブタペスト条約に基づいて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託し
た。用いられる全ての方法は、当業者に全て周知である。例えば、Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＸＸ巻、Ｂ．Ｄ．Ｓｈｅｐａｒ
ｄおよびＭ．Ｓ．Ｇｉｌｍｏｒｅ（編）（１９９５）；ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ，Ｌ．Ａｌｐｈｅｙ．Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ（１９９７）；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｔ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．Ｃ．Ｔｅｎｏｖｅ
ｒおよびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ（編）（１９９３）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｄ．Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ（編）（１９８７）ＪｏｎｅｓおよびＢａｒｔｌ
ｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  
ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｊ
．Ｗ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ａ．ＳｔｅｉｚおよびＡ．Ｍ．Ｗｅｉｎｅｒ（編）
（１９８７）Ｔｈｅ  Ｂｅｎｇｅｒｍａｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
【００９５】
（結果）
ＢＰのブロス培養におけるＰＴ産生のインヒビターの検出：サンプルをＢＰ培
養の増殖期の間の様々な時間で得た。このサンプルを、ＯＤ６５０を測定するこ
とによりＢＰ増殖についておよびＥＬＩＳＡによりＰＴの産生についてモニター
した。結果を１ｍｌ／ＯＤ６５０あたりのＰＴのμｇとして計算して、１細胞あ
たり産生されたＰＴの量を概算した。図１に示されるように、１細胞あたり産生
されたＰＴの量は、増殖サイクルを通じて中間で大幅に減少した。Ｂ．ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓは、対数増殖を続けたが、ＰＴの産生は、殆どＰＴ産生の全面的な排
除まで減少するようであった。このことは、ＰＴ産生のインヒビターは、培養の
初期の間に生成され、そして阻害濃度に達した後、ＰＴ産生を終えることを示唆
した。この仮説を試験するために、静止期まで増殖したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
培養物由来の培養上清を凍結乾燥し、そして塩基性塩を欠く増殖培地を用いて再
構築した。次いで、この混合物を用いて、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの２代目の培
養物を増殖し、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに用いられる本来の培地と比較した。サ
ンプルを得て、そして上記のようにアッセイした。２つの培地の各々におけるＢ
．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖は類似し、ほぼ同じレベルに達するＯＤ６５０を有
する。しかし、再構築した混合物において産生したＰＴの総量は、本来の培地の
量と比較して大幅に減少した。このような阻害、およびこのインヒビターはアデ
ニル化シクラーゼの産生（血液寒天プレートに対する溶血の原因）もまた生じる
ことのより視覚的実証を、図２に示す。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの初期画線を、
ＢＧＡプレート上に作製し、そして４８時間増殖させた。次いで、第２の交叉画
線を作製し、そして寒天プレートを、さらに４８時間インキュベートした。非溶
血の帯域は、初期増殖画線から放射状に延びることが考えられ得る。インヒビタ
ーの特徴付けは、使用済みの培養培地を３，０００ＭＷＣＯフィルターを通じて
濾過し、浸透液および濾液の両方を保持することにより始めた。この両方を、上
記のように、凍結乾燥および再構築した。図３は、ＧＭＡＲ培地と比較した場合
のこれらの混合物におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖の結果を示す。ＰＴの産
生は、浸透混合物により阻害された。このことは、このインヒビターが３，００
０より小さい分子量を有したことを示唆する。
【００９６】
アミノ酸分析および有機酸分析：アミノ酸分析および有機酸分析の両方を代表
的なＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養の過程の間の様々な時間で得たサンプルに対し
て行い、これらの化合物の増加および／または増加のタイミングが、ＰＴの産生
阻害のタイミングと相関するか否かを決定した。これらのデータを、図４ａおよ
び４ｂに示す。ＰＴ産生の低下は、増殖期（代表的には２０時間）のほぼ半分を
過ぎて生じることに注目すべきである。３つの化合物（メチオニン、システイン
、およびピルビン酸）が、出現し、そしてこの時間の周囲で濃度の上昇を続ける
。メチオニンの増加が初めに生じ、次いでシステインおよびピルビン酸が出現す
るようである。多くの経路が、メチオニンからシステインへの代謝に関連する。
しかし、わずかな経路が、システインからピルビン酸に生じる。３つのこのよう
な経路は、Ｌｅｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｏｒｔｈ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４４１頁（１９７０）に示される。これらの３つの経
路の各々において、システインのイオウ基が除去され、そしてピルビン酸が生成
され、それによりこれらの化合物の各々の増加がお互いに、および培地内のイオ
ウの増加と関連付けられる。
【００９７】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培地中のイオウ産生：イオウの濃度を、培養サンプル
のおのおのに対して決定し、そしてＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖（ＯＤ６５０）
と時間とを比較した。図５は、図４のデータを作成するために用いたのと同じサ
ンプルに対するこれらの実証の結果を示す。このデータは、似通った時間でメチ
オニン、システイン、そして最後にピルビン酸の濃度が増加する場合、イオウの
産生の大きな増加が存在することを実証する。
【００９８】
ＢａＣｌ２の存在下でのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの増殖およびＰＴの産生：イ
オウイオンは、ビルレント期から静止期までのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのモジュ
レーターである。この調節は、タンパク質ＢｖｇＳおよびＢｖｇＡにより調節さ
れる。ＢｖｇＳおよびＢｖｇＡは、二成分調節分子（ｔｗｏ  ｃｏｍｐｏｎｅｎ
ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の大きなファミリーのメンバ
ーである。これは、外来のイオウの添加が、ＰＴを含むいくつかのビルレンス因
子の産生をダウンレギュレートすることが長い間知られていた（Ｗｅｉｓｓおよ
びＨｅｗｌｅｔｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：６６１−６８
６（１９８６））が、この系と相互作用する化合物の同定は、未知のままであっ
た。システイン異化またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖の過程の間の別の供給源
由来のイオウの可能性のある生成が、ＰＴ産生に影響し得るか否かを決定するた
めに、ある方法は、培養物からのイオウの影響を不活化するかまたは取り除くか
のいずれかをしようとする。ＢａＣｌ２の形態のバリウムは、水の中で非常に可
溶性（１．８Ｍ（２５℃）および２．８Ｍ（１００℃））であるが、ＢａＳＯ４
は、非常に不溶性（１０．７μＭ（２５℃）および１７．７μＭ（１００℃））
である。溶解度の差異を、しばしば用いて、さらなる測定のために溶液からイオ
ウを沈殿させる。ＢａＣｌ２の様々な濃度を、増殖培地に添加し、そして培地に
おけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ増殖とＰＴの産生を比較した。これらのデータを
図５に示す。両方の濃度でのＢａＣｌ２の添加は、正常な培地と比較した場合に
、９７９７株においてより増加するにもかかわらず、両方のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ株において１細胞あたりのＰＴの産生を増加した。可視的な沈殿（おそらく
ＢａＳＯ４）が、培養の時間に渡り蓄積が見られることに注目すべきである。こ
れらのデータは、培養物内のＰＴの負のフィードバックインヒビターが、イオウ
であることを示唆する。
【００９９】
ＢＰからのシステインスルフィネートデスルフィナーゼ遺伝子のクローニング
：システインからのイオウの除去を引き起こす、可能な酵素の１つである、ｎｉ
ｆＳ様遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉからクローニングおよび特徴付けされた。Ｍｉｈ
ａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２４１７−２２４２４（１９９
７）。この配列を使用して、相同性を、部分的Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓゲノムデ
ータベース中で探した。ｎｉｆＳ遺伝子に対して高い相同性を示すオープンリー
ディングフレームを見出し、そして適切なＰＣＲプライマーを合成した。適切な
サイズのＰＣＲ産物を、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体ＤＮＡを用いて産生し、
ＴＡクローニングベクターｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯへとクローニング
し、そして当業者に公知の方法を用いて配列決定した（図７）。
【０１００】
ペプチド合成および精製：配列ＧＧＧＤＧＳＦＳＧＦＧＤＧＳＦＳＧＦＧ−Ｏ
Ｈ（配列番号５）を含むペプチドをＡＢＩ４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてＮＭＰ
−ｔ−ブトキシカルボニル化学を用いてＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合
成した。このペプチドを脱保護し、そしてアニソールの存在下でのＨＦを用いる
処理（０℃／１時間）により樹脂から取り出した。このペプチドの予備精製を、
Ｃ−１８カラム（２．１４ＩＤ×３０ｃｍ）（Ｄｙｎａｍａｘ−Ｒａｉｎｉｎ，
Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて行った。このペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｉｃ
ｏｔａｇシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるＰＴＣアミ
ノ酸分析により定量した。合成したペプチドを、総溶出プロフィールの９５％を
構成する主要ピークとしてＣ−１８カラムから溶出する。精製ペプチドのアミノ
酸組成は、ペプチドを合成するために用いられた配列と良好な一致を示した。
【０１０１】
ペプチドアフィニティーカラムの構築：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを
、Ｂｒａｎｄｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３８６：１９
６−２０２（１９７５）により記載される方法を用いて活性化した。簡単には、
０．１Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ８．０）中の５０％ゲルスラリーのプレウォッシ
ュＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを、エタノール中の２５０ｍＭ  ｐ−ベン
ゾキノンの溶液を用いて処理して、２０％エタノールおよび５０ｍＭ  ｐ−ベン
ゾキノンの最終濃度を得た。懸濁液を、室温で１時間穏やかに攪拌した。次いで
、活性化Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを、目の粗い焼結ガラス漏斗におい
て、２０％エタノール、脱イオン化Ｈ２Ｏ、１Ｍ  ＮａＣｌの各々を２容量用い
て、広範に洗浄し、そして、もう一度、脱イオン化Ｈ２Ｏを用いて洗浄した。活
性化Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂを吸引して、コンパクトな固まりにし、
そして０．１Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ８．０）中の２ｍｇ／ｍｌのペプチドを含
む溶液の１容量を添加し、そしてこの混合物を４℃で２４時間連続して回転させ
た。次いで、１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．０）を添加し、そして回転
を、室温で１時間続けた。次いで、このゲル混合物を、０．１Ｍ  ＮａＨＰＯ４
（ｐＨ７．０）中の脱イオン化Ｈ２Ｏ、１Ｍ  ＮａＣｌを用いて広範に洗浄した
。最初のペプチド溶液およびカップリング工程の直後の上清のアリコートを保持
し、そしてＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ  Ｓｐｅｃ  １２０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃ
ｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を用いてＡ２８０を測定して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録
商標）６Ｂへのペプチドの取り込みを決定した。
【０１０２】
上記の記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し得、そして
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変化および改変を過
度の実験なしに種々の用途および条件に適用させ得る。全ての特許、特許出願、
および本明細書中で引用する刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【図１】
2011152141.tif 000009
【図２】
2011152141.tif 000010
【図３】
2011152141.tif 000011
【図４Ａ】
2011152141.tif 000012
【図４Ｂ】
2011152141.tif 000013
【図５】
2011152141.tif 000014
【図６】
2011152141.tif 000015
【図７−１】
2011152141.tif 000016
【図７−２】
2011152141.tif 000017
【図７−３】
2011152141.tif 000018
【図８Ａ】
2011152141.tif 000019
【図８Ｂ】
2011152141.tif 000020
【図９】
2011152141.tif 000021
【外国語明細書】
2011152141000001.pdf