(57)【要約】【課題】単一の天然物由来の抽出物で、皮膚や髪の変形と皮膚の色素異常に対して、十分な改善効果を示す抽出物を見出し、それを用いた化粧料を提供すること。【解決手段】ツクシからの抽出物を有効成分として含有し、美白効果、皮膚状態改善効果又は髪状態改善効果を有するものであることを特徴とする化粧料、また、ツクシの胞子からの抽出物を実質的に含有せず、ツクシの胞子形成下部からの抽出物を有効成分として含有する化粧料、また、胞子を内包するツクシの胞子形成部を実質的に除き、ツクシの胞子形成下部のみから抽出したものであることを特徴とする抽出物。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツクシからの抽出物を有効成分として含有し、美白効果、皮膚状態改善効果又は髪状態改善効果を有するものであることを特徴とする化粧料。
【請求項２】
ツクシの胞子からの抽出物を実質的に含有せず、ツクシの胞子形成下部からの抽出物を有効成分として含有する請求項１に記載の化粧料。
【請求項３】
胞子を内包するツクシの胞子形成部からの抽出物を実質的に含有しない請求項１又は請求項２に記載の化粧料。
【請求項４】
上記美白効果が、細胞内チロシナーゼ活性を抑制するものである請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の化粧料。
【請求項５】
上記皮膚状態改善効果が、肌のうるおい感、肌のつや又は肌のハリを改善させるものである請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の化粧料。
【請求項６】
上記髪状態改善効果が、櫛通り又は髪のつやを改善させるものである請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の化粧料。
【請求項７】
上記抽出物が、ツクシの胞子形成下部から、水と１，３−ブチレングリコールとの混合溶媒で抽出したものである請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の化粧料。
【請求項８】
胞子を内包するツクシの胞子形成部を実質的に除き、ツクシの胞子形成下部のみから抽出したものであることを特徴とする抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツクシの特定部分からの抽出物を有効成分として含有し、美白効果、皮膚状態改善効果又は髪状態改善効果を有する化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や髪は、人体内部の多様な器官を、熱、光、衝撃等から保護し、湿度や温度を一定に維持する機能を有する重要な器官である。また、人体外部に露出した最大の器官でもあるため、人の美容と健康状態のバロメーターとなっている。更に、加齢と共に皮膚に生じるしみやくすみ、皮膚や髪のつややハリの欠如等の変化は、その人自身の老化の指標ともなるため、皮膚や髪の状態を健全な状態に維持することは、美容・健康と共に若々しさを維持するという意味でも重要なポイントとなっている。
【０００３】
皮膚は、外側から角質層、表皮、真皮という三層構造を持ち、髪の構造もほぼ同様で毛表皮、毛皮質、毛髄質の三層の細胞で構成されている。角質層は通常の皮膚細胞が角化の途中で細胞核を失ったもので、ブロック状に何層も重なった構造になっている。この角質層は皮脂腺から分泌される皮脂に覆われることによって皮膚にうるおいと滑らかさが与えられ、外部からの刺激を防ぐ機能が増強される。ただし、皮脂の分泌は多ければよい訳ではなく、水分保持量とのバランスが重要である。この角質層、表皮、真皮にかけての皮膚の変形が皮膚のシワやたるみとなって現れる。また角質層の下の表皮の一番下に位置する基底層にはメラノサイト（色素細胞）があって、紫外線によって活性化し、メラニン色素を作り出す。このメラニン色素の産生、代謝、排泄（垢）のバランスが崩れると皮膚の黒化、シミ等の色素異常となって現れる。
【０００４】
以上の様に、皮膚の変形と皮膚の色素異常は全く異なったメカニズムによって起こるものである。一方、皮膚の変形と色素異常の原因は共に、加齢の進行と紫外線の被爆によることが知られている。中でも紫外線による皮膚の変形は光老化と呼ばれ、単なる加齢による老化の進行による場合より皮膚や髪に対する影響が大きいとされている。光老化の詳細なメカニズムには不明な点も多いが、紫外線の被爆によって発生した活性酸素による真皮成分の変性が、しわやたるみ等の皮膚の変形の大きな原因となっている。
【０００５】
髪も同様に、紫外線によりキューティクルのめくれ上がり等の変形を受ける。そのため、活性酸素消去作用のある成分を皮膚の変形を改善するために用いる提案が成されている。それらの多くは安全性を考慮し、元々皮膚に優しい植物等の抽出物を活性酸素消去成分として用いるものである（例えば、特許文献１）。
【０００６】
皮膚の変形と皮膚の色素異常の両者に対処する方法として、それぞれのメカニズムに合った数種類の抽出物や薬剤を組み合わせて用いる方法が考えられる。特許文献２には、その例として、椰子科植物ビンロウの種子であるビンロウジの抽出物を、しわ改善効果を持つ抽出物として用い、甘草抽出物を、美白効果を持つ抽出物として用いることで、皮膚のしわ改善と美白の二重機能を有する化粧料組成物が記載されている。
【０００７】
シダ植物であるスギナ（Equisetum arvense）は胞子で繁殖する。この胞子をつけ、胞子を散布するために特化した茎が「ツクシ」であり、「ツクシ」は、スギナの胞子茎（又は胞子穂、胞子体）と呼ばれることもある。通常スギナと呼ばれているものは、ツクシがその役割を終えた後に生えてくる葉緑素を持つ緑色の栄養茎と葉のことである。従って、スギナの葉には通常のシダ植物の葉裏にある胞子嚢がない。
【０００８】
栄養茎と葉であるスギナの抽出物は、「スギナエキス」として、化粧料や皮膚外用剤の成分としてよく用いられている。例えば、特許文献３には、美白用皮膚外用剤として用いた例が記載されており、特許文献４には、皮膚外用剤中の抗酸化剤として用いた例が記載されている。
【０００９】
一方、「ツクシ」は、山菜として食されていることから、主に食品としての利用が検討されている。例えば、特許文献５には、ツクシ抽出物を含有する食品を、抗アレルギー作用を有する健康食品として用いた例が記載されている。食品以外の用途としては、特許文献６に抗腫瘍性物質として用いた例がある。
【００１０】
上記したように、皮膚や髪を健全な状態に維持するためには、例えば皮膚の場合は、異なったメカニズムによって発生する皮膚の変形と皮膚の色素異常の両方を防ぐことが重要である。そのためには、特許文献２のように皮膚の変形に効果のある抽出物や薬剤と、皮膚の色素異常に効果のある抽出物や薬剤の複数の抽出物や薬剤を組み合わせる方法が最も合目的的である。しかしながら、近年、スキンケア、ヘアケアの分野においては、できるだけシンプルな成分構成を持ち、安全性もできるだけ高い化粧料が求められるようになってきており、先のような複数由来の抽出物や薬剤により複合的な効果を実現することは、好ましくない場合もあった。
【００１１】
近年、天然物からの抽出物を含有した化粧料への関心が大きくなってきており、美白、皮膚・髪状態の改善への要求は、ますます高くなってきているが、かかる公知技術では不十分であり、更なる進展が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−００１６３４号公報
【特許文献２】特表２００６−５１４９７９号公報
【特許文献３】特開平８−３１０９３９号公報
【特許文献４】特開２００３−１７１３１０号公報
【特許文献５】特開２００３−０６１６１７号公報
【特許文献６】特開平１１−２４６４２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、その課題は、単一の天然物由来の抽出物で、皮膚や髪の変形と、皮膚の色素異常に対して、十分な改善効果を示す抽出物を見出し、それを用いた化粧料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、スギナの胞子茎であるツクシからの抽出物が、メラニン生成の第一段階で機能するチロシナーゼの活性を効果的に抑制できることを見出した。
【００１５】
更に、本発明者は、スギナの胞子からの抽出物が、ウサギ角膜由来細胞に対して刺激性を有し、また、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞活性を低下させることを見出した。そして、かかる胞子を抽出対象から除くことによって、細胞刺激性がなく、細胞活性を低下させずに、上記効果を有する抽出物が得られることを見出した。
【００１６】
また、かかる抽出物を含有する化粧料は、肌のうるおい感、肌のつや、肌のハリ等を良くする効果；皮膚の変形・変質を改善する皮膚状態改善効果；髪のつや、櫛通り等を良くするといった髪状態改善効果等があることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、ツクシからの抽出物を有効成分として含有し、美白効果、皮膚状態改善効果又は髪状態改善効果を有するものであることを特徴とする化粧料を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、ツクシの胞子からの抽出物を実質的に含有せず、ツクシの胞子形成下部からの抽出物を有効成分として含有する上記の化粧料を提供するものである。
【００１９】
また、本発明は、ツクシの胞子からの抽出物を実質的に含有しないのみならず、「該胞子を内包しているツクシの胞子形成部」全体からの抽出物を実質的に含有せず、ツクシの胞子形成下部からの抽出物を有効成分として含有する上記の化粧料を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、上記美白効果が、細胞内チロシナーゼ活性を抑制するものである上記の化粧料を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、上記抽出物が、ツクシの胞子形成下部から、水と１，３−ブチレングリコールとの混合溶媒で抽出したものである上記の化粧料を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、胞子を内包するツクシの胞子形成部を実質的に除き、ツクシの胞子形成下部のみから抽出したものであることを特徴とする抽出物を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、皮膚や髪に対して極めて安全という基礎化粧料として好ましい特性を有し、単一の天然物由来の抽出物というきわめてシンプルな構成にもかかわらず、皮膚や髪の変形・変質と、皮膚の色素異常の両方に対して複合的な効果を発揮する化粧料を提供することができる。すなわち、細胞内チロシナーゼ活性を抑制し、美白効果を有すると共に、肌のうるおい感、肌のつや、肌のハリ等を改善させる皮膚状態改善効果を有し、また、櫛通り、髪のつや等を改善させる髪状態改善効果を有する化粧料を提供することができる。
【００２４】
また、本発明は、更に、スギナの胞子（すなわち、ツクシの胞子）からの抽出物を実質的に含まないことによって、細胞に対する刺激がなく（ウサギ角膜由来細胞で確認）、細胞活性の低下もなく（正常ヒト皮膚由来線維芽細胞で確認）、安全性の高い化粧料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ツクシの全草からの抽出物のメラニン生成抑制効果を示す図で、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞におけるチロシナーゼ活性を示す図である。
【図２】ツクシの全草からの抽出物のＢ１６マウスメラノーマ細胞の細胞活性に与える影響を示す図である。
【図３】ツクシの胞子形成部のみからの抽出物及びツクシの胞子形成下部のみからの抽出物の、ウサギ角膜由来細胞に対する細胞膜刺激を示す図である。
【図４】ツクシの胞子形成部のみからの抽出物及びツクシの胞子形成下部のみからの抽出物の、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞に対する細胞活性を示す図である。
【図５】ツクシの胞子形成部のみからの抽出物及びツクシの胞子形成下部のみからの抽出物の、メラニン生成抑制効果を示す図で、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞におけるチロシナーゼ活性を示す図である。
【図６】ツクシの胞子形成部のみからの抽出物及びツクシの胞子形成下部のみからの抽出物の、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の細胞活性に与える影響を示す図である。
【図７】ツクシにおける、ツクシの「全草」、ツクシの「胞子形成部」及びツクシの「胞子形成下部」の場所を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の具体的形態に限定されるものではなく、その技術的範囲内で任意に変形することができる。
【００２７】
本発明の化粧料は、ツクシからの抽出物を有効成分として含有する。「ツクシ（土筆）」とは、トクサ科のシダ植物であるスギナ（Ｅｑｕｉｓｅｔｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ）の胞子を生じるための胞子茎をいう。通常は早春に、スギナの栄養茎（これを一般には「スギナ」という）よりも早期に地上に現れる。葉緑体を含まず淡褐色である。図７に示したように、ツクシ（以下、「ツクシ全草」ということもある）は、ツクシの先端部に存在する「胞子形成部」とその下から地面までに存在する「胞子形成下部」からなっている。ツクシの胞子形成部は、胞子嚢穂（のうすい）ともいい、胞子を内包している部分である。胞子形成下部は、ツクシ全草から胞子形成部を除いた部分であり、そこには、いわゆる「ツクシの袴（はかま）」といわれる茶色で輪状の葉も含まれる。
【００２８】
本発明における抽出物は、ツクシ全草から抽出溶媒で抽出することによって得られる。好ましくは、ツクシの胞子形成下部を、抽出溶媒で抽出することによって得られる。ツクシ全草から抽出溶媒で抽出してもよいが、ツクシの胞子からの抽出物を実質的に含有しないことが、抽出物を細胞刺激性のないものにし、細胞活性を低下させないものにする点で好ましい。胞子のみを抽出対象から除いてもよいが、「胞子を内包するツクシの胞子形成部」全体を抽出対象から除くことが、胞子のみを除こうとすると胞子嚢穂が十分に開いてから胞子のみを除く必要があり面倒である点、胞子のみを完全に除くことが困難な場合がある点、胞子を内包する胞子形成部全体を胞子ごと除いてしまった方が簡便である点等から好ましい。
【００２９】
すなわち、本発明の化粧料は、胞子を内包するツクシの胞子形成部からの抽出物を実質的に含有しないことが上記点から特に好ましい。また、胞子からの抽出物を実質的に含有せず、ツクシの胞子形成下部のみからの抽出物を有効成分として含有することが特に好ましい。
【００３０】
抽出する方法については特に限定はなく、公知の方法が用いられるが、浸漬抽出が簡便であるため特に好ましい。また、抽出対象は、そのままでもよいし、切り刻んだもの、すりつぶしたもの等でもよく、乾燥、凍結乾燥等の処理を施した後のものであってもよい。
【００３１】
抽出物を得るための抽出溶媒としては特に限定はないが、水又は水溶性溶媒であることが、有効成分が抽出できる点、その後の化粧料としての用途に使用し易い点等から好ましい。中でも特に好ましいものとして、水、炭素数１〜４の１価アルコール、多価アルコール等が挙げられる。具体的には、例えば、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、ペンタンジオール、グリセリン等が好ましいものとして挙げられる。これらは１種又は２種以上の混合で用いられる。
【００３２】
より好ましくは、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、ペンタンジオール、グリセリン等、また、これらと水との混合物である。中でも、１，３−ブチレングリコールは、低刺激性で安全性が高いこと、抽出時間が長い場合に防腐効果もあること等からより好適に用いることができる。更に、水と１，３−ブチレングリコールとの混合溶媒は、上記効果に加えて、有効成分が効率よく抽出できる点、そのまま配合して化粧料を調製し易い点で更に好ましい。
【００３３】
水と１，３−ブチレングリコールとの混合溶媒の場合、１，３−ブチレングリコールの含有割合は特に限定はないが、混合溶媒全体に対して、１０質量％〜８０質量％の範囲が、防腐効果もあり、皮膚刺激性が緩和される等の点で好ましく、２０質量％〜４０質量％範囲が、同様の点から特に好ましい。
【００３４】
抽出温度は特に限定はないが、抽出効率等の点で、４〜８５℃が好ましく、２０〜３０℃が特に好ましい。
【００３５】
抽出時間は、ツクシが生の状態か乾燥品か、細断が細かいか荒いか、抽出時の温度が高いか低いか、攪拌操作を行うか否か等によって異なってくるが、抽出温度２０℃で浸漬抽出の場合は、１日間〜６０日間が好ましく、２日間〜３０日間がより好ましく、５日間〜１５日間が特に好ましい。
【００３６】
以上の抽出操作後に、要すれば余分な植物体を濾過等によって取り除いた液を「抽出液」として本発明に使用することができる。抽出液の安定化のためには熟成期間を取ることが好ましい。熟成期間は特に限定はないが、１４日〜３０日が好ましい。こうして得られた抽出液は、淡黄色〜褐色をしており、強い香りを有さないので、そのままあらゆる剤形の化粧料に加えて用いることができる。
【００３７】
本発明の化粧料は、ツクシからの抽出物を有効成分として含有する。有効成分として含有するとは、美白効果、皮膚状態改善効果又は髪状態改善効果を有する成分として含有することを意味し、また、メラニン生成抑制効果、細胞内チロシナーゼ活性抑制効果を示すものとして含有することを意味する。
【００３８】
上記抽出液は、そのまま化粧料の成分として配合することが可能であるが、該抽出液を、溶媒置換、溶媒留去等によって処理をして得られたものを配合して化粧料としてもよい。更に、凍結乾燥法、スプレードライ法等の操作で粉末化してから、化粧料の成分として配合してもよい。
【００３９】
上記抽出液にはツクシからの抽出物が含有されているが、該抽出物の化粧料中の配合量は、抽出物中の有効成分の含有量、化粧料の種類等にもよるが、化粧料全体に対して、該抽出物は、通常０．００００１質量％〜１質量％、好ましくは０．０００１質量％〜０．１質量％、特に好ましくは０．００１質量％〜０．０１質量％となるように配合される。配合量が少なすぎる場合は、前記効果が得られない場合があり、また多すぎる場合には、配合量に見合った効果の上昇が得られず、コスト的にも不利となる場合がある。
【００４０】
本発明の化粧料としては、洗顔料、化粧水（ローション）、美容液、パック、乳液、クリーム、ヒゲ剃り用剤、ファンデーション、石鹸、ボディーソープ、リップクリーム、口紅、アイシャドウ、ほほ紅、シャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアパック、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、育毛料等が挙げられる。
【００４１】
本発明の化粧料の剤型としては、液状、乳液状、懸濁液、ゲル状、パック状、ペースト状、パウダー状、顆粒状、スプレー状、ハップ剤状等が挙げられる。
【００４２】
本発明の化粧料には、ツクシ抽出物以外に、その剤型にあわせて「他の成分」を含有できる。「他の成分」としては、具体的には例えば、水、アルコール類、界面活性剤、保湿剤（グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、アミノ酸、尿素、ピロリドンカルボン酸塩、核酸類等）、増粘剤（ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、キトサン、メチルセルロース等）、ワックス、ワセリン、炭化水素類、脂肪酸、シリコーン油、トリグリセライド類、ステアリン酸イソプロピル等のエステル油類、天然油脂類、多糖類（アルギン酸、カラギーナン等）、防腐剤、殺菌剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、抗酸化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、ビタミン類、粉体類等を、本発明の目的を達成する範囲で配合することができる。なお、本発明における化粧料を構成する成分は決して上述のものに限られるものではなく、化粧料に用いる成分であれば配合が可能である。
【００４３】
また、本発明の化粧料の剤形がパウダー状である場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダー及びそれらの混合物が配合できる。本発明の化粧料の剤形がスプレー状の場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、ジメチルエーテル等の推進剤を更に含むことができる。
【実施例】
【００４４】
以下、ツクシ抽出物の製造例、試験例（有効性評価）、試験例（安全性評価）、化粧料製造例及び化粧料の評価例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら具体的な例に限定されるものではない。なお、以下、特に記載がない限り、「％」は「質量％」を示す。
【００４５】
製造例１
ツクシの全草１ｋｇを細かく刻み、１，３−ブチレングリコール６ｋｇと水１４ｋｇの混合溶媒（１，３−ブチレングリコールの３０％水溶液２０ｋｇ）に浸漬し、室温（約２５℃）で１週間抽出した後、濾過精製を行い、「ツクシ全草抽出液」を得た。
【００４６】
試験例１（有効性評価）
［「ツクシ全草抽出液」の、マウスメラノーマＢ１６培養細胞によるメラニン生成抑制効果の確認試験］
＜試験方法＞
１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬを用いて、９６穴マイクロプレートに、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を１．５×１０４個／穴になるように播種後、３７℃、５体積％二酸化炭素（ＣＯ２）気相下で１日間予備培養を行った。この細胞に製造例１で得られた「ツクシ全草抽出液」を、イーグルＭＥＭ培地全体に対して、１％、２％、４％の濃度となるように、１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬに添加し、３７℃、５体積％二酸化炭素（ＣＯ２）気相下で２日間培養した。
【００４７】
その後、培養液を除去し、界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）を添加した細胞処理液に、細胞内チロシナーゼ活性測定用に、０．１％のＬ−ドーパ、又は、細胞活性測定用に０．５％のＭＴＴを添加して、３７℃で反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅl ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、波長４９０ｎｍの吸光度で細胞内チロシナーゼ活性を測定し、波長５７０〜６５５ｎｍの吸光度で細胞活性を測定した。
【００４８】
なお、コントロールとして、製造例１のツクシ全草抽出液に代えて、１．５ｍＭのコウジ酸を添加したもの、及び、試料を加えないもの（ブランク）についても、細胞内チロシナーゼ活性の測定と細胞活性の測定を行った。
【００４９】
＜結果＞
得られた細胞内チロシナーゼ活性の測定結果を図１に、細胞活性の測定結果を図２に示す。製造例１で得られたツクシ抽出物は、細胞活性に影響を与えることなく（図２）、濃度依存的に細胞内チロシナーゼ活性を有意に抑制することが確認された（図１）。図１と図２は何れも８回の平均を棒グラフにしたものであり、棒の上に示した範囲は標準偏差の範囲である。図１中、「**」を付した値は、ｔ検定においてｐ＜０．０１であり、有意差があることを示す。
【００５０】
製造例２
ツクシの胞子形成部１ｋｇを細かく刻み、１，３−ブチレングリコール６ｋｇと水１４ｋｇの混合溶媒（１，３−ブチレングリコールの３０％水溶液２０ｋｇ）に浸漬し、室温（約２５℃）で１週間抽出した後、濾過精製を行い、「ツクシ胞子形成部抽出液」を得た。
【００５１】
製造例３
ツクシの胞子形成下部１ｋｇを細かく刻み、１，３−ブチレングリコール６ｋｇと水１４ｋｇの混合溶媒（１，３−ブチレングリコールの３０％水溶液２０ｋｇ）に浸漬し、室温（約２５℃）で１週間抽出した後、濾過精製を行い、「ツクシ胞子形成下部抽出液」を得た。
【００５２】
試験例２（安全性評価）
［「ツクシ胞子形成部抽出液」と「ツクシ胞子形成下部抽出液」の、ウサギ角膜由来細胞に対する細胞膜刺激性の評価］
＜試験方法＞
ウサギ角膜由来細胞を１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬを用いて、９６穴マイクロプレートに１．５×１０４個／穴になるように播種後、３７℃、５体積％二酸化炭素（ＣＯ２）気相の条件下で１日間予備培養を行った。この細胞に、製造例２で得られた「ツクシ胞子形成部抽出液」、及び製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」を、１％、２％、５％の濃度となるように、１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬに溶解して添加し、２日間培養した。
【００５３】
次に、培養液を除去し、８０μｇ／ｍＬのニュートラルレッド（ＮＲ）を添加して３７℃で反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅl ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、波長４９０ｎｍで細胞膜刺激を測定した。４９０ｎｍの吸光度（Absorbance（ＡＢＳ））は、ニュートラルレッド（ＮＲ）の取込量に比例し、ニュートラルレッド（ＮＲ）の取込量が小さいほど細胞膜刺激が大きいことを示す。
【００５４】
なお、比較のため、製造例２および製造例３のツクシ抽出液の代わりに、コントロールとして、５０μｇ／ｍＬドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した場合、及び、試料を加えないもの（ブランク）についても、同様の試験を行った。
【００５５】
＜結果＞
製造例２で得られた「ツクシ胞子形成部抽出液」、及び製造例３得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」のウサギ角膜由来細胞に対する細胞膜刺激を図３に示した。図３は８回の平均を棒グラフにしており、棒の上に示した範囲は標準偏差の範囲である。図３中、「**」を付した値は、ｔ検定においてｐ＜０．０１であり、有意差があることを示す。
【００５６】
製造例２の「ツクシ胞子形成部抽出液」は、５％濃度でウサギ角膜由来細胞に対する刺激が確認されたが、製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」では、何れの濃度でもウサギ角膜由来細胞に対する刺激が確認されなかった。なお、試料無添加（ブランク）では刺激が確認されず、コントロールのＳＤＳでは有意差で刺激が確認された。
【００５７】
試験例３（安全性評価）
［「ツクシ胞子形成部抽出液」と「ツクシ胞子形成下部抽出液」の、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞に対する細胞活性の評価］
＜試験方法＞
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬを用いて、９６穴マイクロプレートに、２．０×１０４個／穴になるように播種後、３７℃、５体積％二酸化炭素（ＣＯ２）気相の条件下で１日間予備培養を行った。この細胞に、製造例２で得られた「ツクシ胞子形成部抽出液」、及び製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」を、１％、２％、５％の濃度となるように１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬに溶解して添加し、２日間培養した。
【００５８】
次に、０．５％のＭＴＴを添加して３７℃で反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅl ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、波長５７０〜６５５ｎｍで細胞活性をそれぞれ測定した。５７０〜６５５ｎｍの吸光度（Absorbance（ＡＢＳ））が小さいほど細胞活性が低いことを示す。
【００５９】
なお、比較のため、製造例２および製造例３のツクシ抽出液の代わりに、コントロールとして５０μＬ／ｍＬドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した場合、及び、試料を加えないもの（ブランク）についても、同様の試験を行った。
【００６０】
＜結果＞
製造例２で得られた「ツクシ胞子形成部抽出液」、及び製造例３得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞に対する細胞活性を図４に示した。図４は４回の平均を棒グラフにしており、棒の上に示した範囲は標準偏差の範囲である。図４中、「**」を付した値は、ｔ検定においてｐ＜０．０１であり、有意差があることを示す。
【００６１】
製造例２の「ツクシ胞子形成部抽出液」は、５％濃度で正常ヒト皮膚由来線維芽細胞活性の低下が確認されたが、製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」では、何れの濃度でも正常ヒト皮膚由来線維芽細胞活性の低下が確認されなかった。試料無添加（ブランク）では低下が確認されず、コントロールのＳＤＳでは有意差で低下が確認された。
【００６２】
試験例４（有効性評価）
［「ツクシ胞子形成部抽出液」と「ツクシ胞子形成下部抽出液」の、マウスメラノーマＢ１６培養細胞によるメラニン生成抑制効果の確認試験］
＜試験方法＞
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬを用いて、９６穴マイクロプレートに、１．５×１０４個／穴になるように播種後、３７℃、５体積％二酸化炭素（ＣＯ２）気相の条件下で１日間予備培養を行った。この細胞に、製造例２で得られた「ツクシ胞子形成部抽出液」、及び製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」を、１％、２％、４％の濃度となるように、１０Ｖ／Ｖ％牛胎仔血清を含むイーグルＭＥＭ培地１００μＬに溶解して添加し、２日間培養した。
【００６３】
次に、培養液を除去し、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加した細胞処理液に、０．１％のＬ−ドーパ又は０．５％のＭＴＴを添加して、３７℃で反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅl ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、波長４９０ｎｍで細胞内チロシナーゼ活性を測定し、また、５７０〜６３０ｎｍで細胞活性を測定した。
【００６４】
なお、比較のため、製造例２および製造例３のツクシ抽出液の代わりに、ポジティブコントロールとして１．５ｍＭのコウジ酸を添加した場合、及び、試料を加えないもの（ブランク）についても、同様の試験を行った。
【００６５】
＜結果＞
製造例２で得られた「ツクシ胞子形成部抽出液」、及び製造例３得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞内チロシナーゼ活性を図５に示し、細胞活性を図６に示した。図５、図６は何れも８回の平均を棒グラフにしており、棒の上に示した範囲は標準偏差の範囲である。図５中、「**」を付した値は、ｔ検定においてｐ＜０．０１であり、有意差があることを示す。
【００６６】
製造例２の「ツクシ胞子形成部抽出液」も製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」も共に、細胞活性を低下せしめることなく（図６）、細胞内チロシナーゼ活性を濃度依存的にかつ有意に抑制することが判った（図５）。
【００６７】
製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」を用いて、以下の配合組成で各種化粧料を製造した。
【００６８】
化粧料製造例１
（化粧水）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                                [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」    １．００
濃グリセリン                              ２．００
１，３−ブチレングリコール              １０．００
キサンタンガム                            ０．０５
ヒアルロン酸ナトリウム                    ０．０１
防腐剤                                      適量
精製水                          全量が１００．００となる量
【００６９】
化粧料製造例２
（乳液）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                                [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」    ３．００
トリオクタン酸グリセリル                  ３．００
ホホバ油                                  １．００
オリブ油                                  １．００
メチルポリシロキサン                      ０．１０
天然ビタミンＥ                            ０．１０
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレエート    １．５０
ソルビタンモノオレエート                  １．５０
Ｌ−アルギニン                            ２．００
Ｌ−セリン                                ０．５０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム            ０．１０
ポリビニルピロリドン                      ０．０５
防腐剤                                      適量
精製水                          全量が１００．００となる量
【００７０】
化粧料製造例３
（クリーム）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                                [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」    ０．５０
ベヘニルアルコール                        ２．００
トリオクタン酸グリセリル                  ３．００
ホホバ油                                  １．００
オリブ油                                  １．００
メチルポリシロキサン                      ０．１０
天然ビタミンＥ                            ０．１０
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノステアレート  ２．５０
ＰＯＥ（８０）硬化ヒマシ油                ０．５０
Ｌ−アルギニン                            ２．００
Ｌ−セリン                                ０．５０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム            ０．１０
カルボキシビニルポリマー                  ０．０５
水酸化カリウム                            ０．０１
防腐剤                                      適量
精製水                          全量が１００．００となる量
【００７１】
化粧料製造例４
（美容液）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                                [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」    ５．００
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液）  １０．００
カルボキシビニルセルロース                ３．００
グリセリン                              １０．００
植物抽出物                                ０．５０
トリエタノールアミン                      ０．１５
メチルパラベン                            ０．１０
クインシード液（１％水溶液）            １０．００
ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液）      ４．００
Ｌ−アルギニン                            ２．００
精製水                          全量が１００．００となる量
【００７２】
化粧料製造例５
（パック）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                                      [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」          １．５０
ヒドロキシエトキシセルロース                    ３．００
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液）        １０．００
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（１５ＥＯ）  １．００
Ｌ−アルギニン                                  ２．００
エタノール                                      ５．００
防腐剤                                            適量
精製水                                全量が１００．００となる量
【００７３】
比較化粧料製造例１
（比較化粧水）
化粧料製造例１において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例１と同様にして比較化粧水を調製した。
【００７４】
比較化粧料製造例２
（比較乳液）
化粧料製造例２において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例２と同様にして比較乳液を調製した。
【００７５】
比較化粧料製造例３
（比較クリーム）
化粧料製造例３において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例３と同様にして比較クリームを調製した。
【００７６】
比較化粧料製造例４
（比較美容液）
化粧料製造例４において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例４と同様にして比較美容液を調製した。
【００７７】
比較化粧料製造例５
（比較パック）
化粧料製造例５において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例５と同様にして比較パックを調製した。
【００７８】
評価例１
＜皮膚状態改善効果＞
肌に衰えを訴えた４０〜５０歳台の２０名の女性被験者に対して、顔全体に化粧料製造例１〜５で製造した化粧料、及び比較化粧料製造例１〜５で製造した比較化粧料について、朝晩２回塗布してもらい、以下の判定基準に基づいて、（ａ）肌のうるおい感、（ｂ）肌のつや、（ｃ）肌のハリについて使用前後の肌状態について、使用開始１ヵ月後に官能評価を行った。なお、本試験期間を通して皮膚に異常を訴えた者はいなかった。
【００７９】
［皮膚状態改善効果の判定基準］
Ａ  極めて顕著に改善した
Ｂ  顕著に改善した
Ｃ  わずかに改善した
Ｄ  変化を認めなかった
Ｅ  増悪を感じた
【００８０】
「（ａ）肌のうるおい感」に関し、判定Ａ〜Ｅとしたそれぞれの人数を以下の表１に示す。
【表１】
2011088856.tif 000003
【００８１】
「（ｂ）肌のつや」に関し、判定Ａ〜Ｅとしたそれぞれの人数を表２に示す。
【表２】
2011088856.tif 000004
【００８２】
「（ｃ）肌のハリ」に関し、判定Ａ〜Ｅとしたそれぞれの人数を表３に示す。
【表３】
2011088856.tif 000005
【００８３】
評価例１（表１〜３）の結果から、皮膚状態改善効果について、（ａ）肌のうるおい感、（ｂ）肌のつや、（ｃ）肌のハリ、の全ての項目において、ツクシ抽出物を有効成分として配合した化粧料製造例１〜５の化粧料の方が、ツクシ抽出物を配合していない比較化粧料製造例１〜５の比較化粧料に比べて明確に優れた評価結果を与えた。
【００８４】
化粧料製造例６
（ヘアクリーム）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                                        [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」    ５．００
流動パラフィン                          １５．００
ワセリン                                １５．００
ミツロウ                                  ２．００
カルボキシビニルポリマー                  ０．１０
キサンタンガム                            ０．１０
グリセリン                                ５．００
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油            ３．００
水酸化ナトリウム                          ０．０５
防腐剤                                      適量
精製水                          全量が１００．００となる量
【００８５】
化粧料製造例７
（リンス）
下記の配合成分を常法に従って配合して調製した。
[配合成分]                            [質量％]
製造例３の「ツクシ胞子形成下部抽出液」    ５．００
シリコーン油                              ３．００
流動パラフィン                            １．００
セチルアルコール                          １．５０
ステアリルアルコール                      １．００
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム      ０．７０
グリセリン                                ３．００
防腐剤                                      適量
精製水                          全量が１００．００となる量
【００８６】
比較化粧料製造例６
（比較ヘアクリーム）
化粧料製造例６において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例６と同様にして比較ヘアクリームを調製した。
【００８７】
比較化粧料製造例７
（比較リンス）
化粧料製造例７において、製造例３で得られた「ツクシ胞子形成下部抽出液」の代わりに精製水を使用した以外は化粧料製造例７と同様にして比較リンスを調製した。
【００８８】
評価例２
＜髪状態改善効果＞
無作為に選んだ年齢２０〜４０歳台の２０名の女性被験者に対して、化粧料製造例６、７の化粧料及び比較化粧料製造例６、７の比較化粧料について、連日頭髪に使用してもらい、以下の判定基準に基づいて、（ａ）櫛通り、（ｂ）髪のつやについて、使用前後の髪状態について、使用開始１ヵ月後に官能評価を行った。なお、本試験期間を通して異常を訴えた者はいなかった。
【００８９】
［髪状態改善効果の判定基準］
Ａ  極めて顕著に改善した
Ｂ  顕著に改善した
Ｃ  わずかに改善した
Ｄ  変化を認めなかった
Ｅ  増悪を感じた
【００９０】
「（ａ）櫛通り」に関し、判定Ａ〜Ｅとしたそれぞれの人数を表４に示す。
【表４】
2011088856.tif 000006
【００９１】
「（ｂ）髪のつや」に関し、判定Ａ〜Ｅとしたそれぞれの人数を表５に示す。
【表５】
2011088856.tif 000007
【００９２】
評価例２（表４、５）の結果から、髪状態改善効果について、（ａ）櫛通り、（ｂ）髪のつや、の両方の項目において、ツクシ抽出物を有効成分として配合した化粧料製造例７、８の化粧料の方が、ツクシ抽出物を配合していない比較化粧料製造例７、８の比較化粧料に比べて明確に優れた評価結果を与えた。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のツクシ抽出物を有効成分として配合した化粧料は、シンプルで安全な成分構成であるにもかかわらず、美白効果、皮膚状態改善効果、髪状態改善効果という複合的な効果を有しているので、従来の化粧料に比べて優れた化粧料として広く利用されるものである。
【図１】
2011088856.tif 000008
【図２】
2011088856.tif 000009
【図３】
2011088856.tif 000010
【図４】
2011088856.tif 000011
【図５】
2011088856.tif 000012
【図６】
2011088856.tif 000013
【図７】
2011088856.tif 000014