(57)【要約】【課題】真菌である酵母  Cyniclomycesguttulatusは、その培養に特殊培地と通常ではない培養条件が必要なため、一般の真菌検査では分離培養が出来ない事情があった。本酵母はイヌの出血性下痢の原因菌とされ、その同定が急がれていた。しかしながら、１）培養のための準備が煩雑で小動物臨床現場（動物病院）で簡便に出来る検査ではなく、２）外注検査に真菌分離と指定して検体を提出しても炭酸ガス培養が必要なため、培養結果は陰性と判断される可能性があり、しかも３）本菌種の分離同定を取り扱っている検査業者がないため簡便な検査培地を入手することが出来ない、などの問題があった。【解決手段】これらの問題を解決すべく、本発明のキットを開発した。このキットを用いる真菌の検査方法では、簡便で、炭酸ガス培養装置を必要とせず、かつ培地がキットに含まれている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡ寒天培地の組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕中に、検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって採取し、更に穿刺および塗布し、３５℃から３７℃の条件下で培養を行い、該高層寒天培地中の独立なコロニーを採取することを特徴とする、真菌Cyniclomyces guttulatusの分離方法。
【請求項２】
検体から真菌Cyniclomyces
guttulatusを分離する方法であって、以下の手段を含む分離方法。
１）滅菌密封したガラス容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡ寒天培地の組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）操作により作製する手段。
２）検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって採取する手段。
３）検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって、滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地に穿刺および塗布する手段。
４）３５℃の条件下で培養を行う手段。
５）高層ＹＰＧＡ寒天培地中の独立なコロニーを採取する手段。
６）採取した独立なコロニーが単一コロニーであることを確認する手段。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の検体が、イヌの糞便又はウサギの糞便であることを特徴とする、真菌Cyniclomyces guttulatusの分離方法。
【請求項４】
真菌Cyniclomyces
guttulatusの同定方法であって、イヌの糞便に該真菌が存在するか否かの決定方法であって、下記工程を含む同定方法。
１）滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡ寒天培地の組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）により作製する工程。
２）検体であるイヌの糞便を、滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって採取する工程。
３）該検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって、滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地に穿刺および塗布する工程。
４）３５℃の条件下で培養を行う工程。
５）高層ＹＰＧＡ寒天培地中の独立なコロニーを採取する工程。
６）採取した独立なコロニーが単一コロニーであることを確認し、光学顕微鏡でそのコロニーを形成する菌形状を観察する工程。
７）観察した菌形状が真菌Cyniclomyces guttulatusか否かを判定する工程。
【請求項５】
請求項４に記載の真菌Cyniclomyces guttulatusの同定方法に用いるキット。
【請求項６】
以下の手段を具備する、検体の真菌Cyniclomyces guttulatusの同定方法に用いるキット。
１）滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡ寒天培地の組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕
２）滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具
【請求項７】
請求項６に記載の検体が、イヌの糞便であることを特徴とする、真菌Cyniclomyces
guttulatusの同定方法に用いるキット。
【請求項８】
炭酸ガス培養装置を用いず、３５℃から３７℃の条件下で培養することを特徴とする請求項６又は７に記載の真菌Cyniclomyces guttulatusの同定方法に用いるキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌である酵母Cyniclomyces guttulatusの分離・同定方法に関し、更にはそれに用いるキットに関わる。
【背景技術】
【０００２】
真菌である酵母  Cyniclomyces guttulatus（以下、C. guttulatus）はウサギの消化管の常在菌で、糞便中にみられる菌種である。（非特許文献１）。更に、本酵母は、その培養に特殊培地と通常ではない培養条件が必要なため、一般の真菌検査では分離培養が出来ない事情がある。つまり、従来の培養方法は，ｐHを調節した培地を用い、更に、嫌気的条件下の培養を行うため、炭酸ガス培養装置が必要であった。（非特許文献１）。
【０００３】
本酵母は獣医科領域、特に小動物臨床領域では、近年、イヌの出血性下痢の原因菌であることが示唆されている。（非特許文献２）。しかし、例えばイヌの糞便中に酵母様菌体を顕微鏡的に検出できる場合にも、外部検査会社等に真菌検査を依頼しても、上記のような事情で、往々にして陰性とされてきた。
【０００４】
本発明は、培地、その形状、培養容器，付属する検体採集道具の工夫、更には、新たな培養方法により，小動物臨床領域での出血性下痢症原因真菌である酵母Ｃ．guttulatusの分離・培養を簡便に行えるように作製した分離用特殊培地キットに関わり、更には、該酵母の同定法に関わる。本発明の特徴を挙げると、１）従来のような液体培地を必要としない、２）従来のようなｐH調節も特に必要としない、更に、３）従来のような炭酸ガス培養設備を必要としない、点が挙げられる。
より、具体的には、ガラス製小型密閉容器に入れられた固形培地に付属の先端鋭利な串状物を患者の検体、例えばイヌの糞便の一部にその先端を挿入し，少量の糞便を付着させたものを固形培地中心部に穿刺し，35℃の孵卵器にて培養する方式である。この方法は、検査業者から動物病院に配布し、回収、検査することが可能であり、孵卵器の設備が有れば臨床現場で簡単に診断することも可能であり、更に、一般の検査業者でもすぐに導入できる方法である、と考えられ、有用性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Charles H.Zierdt ら、「Cyniclomyces guttulatus  （Saccharomycopsis guttulata ） - culture,ultrastructure and physiology 」、Antonie van Leeuwenhoekvol.54, p357-366, (1988)。
【非特許文献２】斉藤  邦史ら、「犬の糞便中に認められた酵母様真菌Cyniclomyces guttulatus」。 Kunifumi Saitoら、「Cyniclomyces guttulatus : it can now be clearly observed in caninefeces. 」。（以上の文献は、斉藤動物病院のウェブアドレス: http://www33.ocn.ne.jp/~saitoahohp/Cyniclomyces.hmlより入手可能である。）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の従来技術の欠点や問題点を挙げると以下のようである。
１）培養のための準備が煩雑で小動物臨床現場（動物病院）で簡便に出来る検査ではなく、２）外注検査に真菌分離と指定して検体を提出しても炭酸ガス培養が必要なため、培養結果は陰性と判断される可能性があり、しかも３）本菌種の分離同定を取り扱っている検査業者がないため簡便な検査培地を入手することが出来ない、などが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの問題を解決すべく、本発明のキット等を開発した。このキットを用いる真菌の検査方法では、簡便で、炭酸ガス培養装置を必要とせず、かつ培地がキットに含まれている。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する：
１）滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔〔ＹＰＧＡの組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕中に、検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって採取し、更に穿刺および塗布し、３５℃から３７℃の条件下で培養を行い、該高層寒天培地中の独立なコロニーを採取することを特徴とする、真菌Cyniclomyces guttulatusの分離方法、に関する。
２）検体から真菌Cyniclomyces
guttulatusを分離する方法であって、以下の手段を含む分離方法に関する。
（１）滅菌密封したガラス容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡの組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）操作により作製する手段。
（２）検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって採取する手段。
（３）検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって、滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地に穿刺および塗布する手段。
（４）３５℃の条件下で培養を行う手段。
（５）高層ＹＰＧＡ寒天培中の独立なコロニーを採取する手段。
（６）採取した独立なコロニーが単一コロニーであることを確認する手段。
３）更に、上記１）又は２）にある検体が、イヌの糞便又はウサギの糞便であることを特徴とする、真菌Cyniclomyces guttulatusの分離方法に関する。
４）また、真菌Cyniclomyces
guttulatusの同定方法であって、イヌの糞便に該真菌が存在するか否かの決定方法であって、下記工程を含む同定方法に関する。
（１）滅菌密封したガラス容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡの組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）により作製する工程。
（２）検体であるイヌの糞便を、滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって採取する工程。
（３）該検体を滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具をもって、滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地に穿刺および塗布する工程。
（４）３５℃の条件下で培養を行う工程。
（５）高層ＹＰＧＡ寒天培地中の独立なコロニーを採取する工程。
（６）採取した独立なコロニーが単一コロニーであることを確認し、光学顕微鏡でそのコロニーを形成する菌形状を観察する工程。
（７）観察した菌形状が真菌Cyniclomyces
guttulatusか否かを判定する工程。
５）更に、上記真菌Cyniclomyces
guttulatusの同定方法に用いるキットに関する。
６）また、以下の手段を具備する、真菌Cyniclomyces guttulatusの同定方法に用いるキットに関する。
（１）滅菌密封したガラス容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地〔ＹＰＧＡの組成は、１％(w/v)酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％(w/v)ブドウ糖、１％(w/v)ペプトン、および１．５％(w/v)寒天〕
（２）滅菌した先鋭な形状の検体採取並びに該高層寒天培地中に穿刺および塗布可能な器具
７）上記６）に記載の検体が、イヌの糞便であることを特徴とする、真菌Cyniclomyces guttulatusの同定方法に用いるキットに関する。
８）更に、炭酸ガス培養装置を用いず、３５℃から３７℃の条件下で培養することを特徴とする上記６）又は７）に記載の真菌Cyniclomyces guttulatusの同定方法に用いるキットの使用に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、炭酸ガス培養装置を使用し、かつｐＨを下げたりして、酵母C.
guttulatus以外の菌類の発育を阻止して、コロニー純化を繰り返し、単一の酵母C. guttulatusコロニーを得ていた従来技術に対し、簡便にかつ炭酸ガス培養装置を用いずに該酵母の分離ができるようになった。
【００１０】
さらに本発明によれば、キットとして、その培地と摂取器具等が提供されることのより、今まで以上の簡便さをもって、獣医科領域の各種検体中の酵母C. guttulatusの存在を判定することができ、治療方針を立てる上での情報を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＹＰＧＡ培地に塗布後、好気的条件下（Ｏ２培養）および嫌気的条件下（ＣＯ２培養）で酵母C.guttulatusの集落を示した図である。好気的条件下では、丸で囲んだ集落が相当する。（試験例１）
【図２】酵母C.guttulatusの分離・培養の集落を示す図である。（実施例１）
【図３】図2に示したものの高倍率の酵母C.guttulatusの分離・培養の集落を示す図である。丸で囲んだ集落が相当する。（実施例１）
【図４】酵母C.guttulatusの同定に係わる顕微鏡像である。Ｙ字状や竹とんぼ状の形態を示すのが、酵母C. ｇuttulatusである。（ラクトフェノールコルトンブルー固定染色像）
【図５】酵母C.guttulatusの同定に係わる顕微鏡像である。Ｙ字状や竹とんぼ状の形態を示すのが、酵母C. ｇuttulatusである。（ラクトフェノール固定）
【図６】本発明のキットの一例を示した図である。本例は滅菌した高層ＹＰＧＡ寒天培地、滅菌した竹串よりなる分離・培養用キットである。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、獣医科領域で病原性を有する酵母C.guttulatusの分離および同定法に関わる。Cyniclomyces guttulatusは、サッカロミセス亜科、シニクロミセス属に属する子嚢菌類である。従来、Saccharomyces  guttulatus、 Saccharomycopsis guttulatusなどと呼ばれていたが、現在C.guttulatusとして分類されている。この酵母はウサギやモルモットの胃、腸内に存在する酵母様真菌として考えられていたが、上述したように最近、慢性下痢を呈するイヌの糞便中にも存在することが知られている。イヌの疾病に関し、この菌種に関する相談が増加しており、飼育家族、臨床関係者の間で知られるようになった菌種である。
本酵母の培養は１０％程度の炭酸ガス条件下での培養が必要であり、かつ培地も特殊なイーストエキストラクトを加えたサブロー寒天培地も必要で，疾病の原因菌として、本酵母については、分離培養による確定診断が臨床現場や一般の検査室では出来ずにいた、という現状があった。
更に、本酵母は5-FC以外、ほとんど抗真菌薬に耐性を示し、よって治療は難渋し、小動物患者のQOLに大きく関わることとなっている。現在、ヒト感染例は知られていないが、感染動物の飼育者への不安は大きく、疾病の原因菌としての同定を行い、更に他の細菌性、ウイルス性、原虫性下痢症との鑑別が必須となっている。
【００１３】
表１に、我が国における 獣医科領域のCyniclomyces guttulatus 感染症の一例を示す。表中、「斉藤動物病院web」は、非特許文献2として挙げたwebのホームページからアクセス可能である。また、「佐野個人情報」は、本特許出願の発明者である佐野文子が個人的に得た情報に基づいている。
【表１】
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【００１４】
本発明の分離法等に関わる、滅菌密封容器は滅菌状態が保たれればその種類を問わないが、ガラス製、ポリエチレン製、ポリプロピレン製等をあげることができ、好ましくはガラスの滅菌密封容器が挙げられる。更に、ガラス製でその蓋が高圧蒸気滅菌可能なスクリュー栓であるものが、検体の摂取等に好適に適用で好ましい。なお、ガラス製の容器部分は、アルミホイルにて開口部を塞ぐことで、乾熱滅菌操作で滅菌することもできる。
【００１５】
本発明の滅菌密封した容器の高層ＹＰＧＡ寒天培地の製作には、通常の方法で作製すればよく、各組成を蒸留水に加温して一様に溶かし、容器に分注し、高圧蒸気滅菌操作（例えば、１２１℃、１気圧で１５分）をし、寒天が固まるまで、静置すればよい。
高層寒天培地は、高層であればよく、斜面の形状でもかまわない。なお、ＹＰＧＡ寒天培地のｐＨを低く調製する必要はない。更に、クロラムフェにコール等の抗生物質等を一般的には添加し、目的の菌以外の発育を抑えることが考えられるが、本発明では抗生物質等の添加を行わずに実施が可能である。
【００１６】
検体の摂取と高層寒天培地中への穿刺および塗布可能な器具は、例えば、白金線、滅菌された竹串、滅菌されたゼムクリップを一部又は全部を延ばしたものなどが挙げられる。白金線など、火炎滅菌可能なものは何度でも滅菌後使用可能であるが、現実的には、現場での一回の使用が主となるので、高圧蒸気滅菌等で滅菌されたアルミホイルに包まれた竹串や伸ばされたゼムクリップ等が好適である。
検体の採取と高層寒天培地中への穿刺および塗布可能という機能が具備されていれば、ある一定の長さを持ち、先が先鋭であれば（例えば、針金状であれば）、本発明の要件として十分である。
【００１７】
検体が高層寒天培地中へ穿刺および塗布された、容器の培養は、炭酸ガス培養装置（例えば１０％炭酸ガス条件下）を用いず、普通の恒温インキュベーター（一般の孵卵器等）であればよく、その温度は３０℃から３７℃が好ましく、他の菌種との生育の差などを考慮すると、３５℃から３７℃、更には３５℃が好ましい。培養は、１日から７日もあればよく、高層寒天培地中の独立のコロニーが観察できる３から７日が好ましく、更にはコロニーがある程度の大きさで確実に確認できる大きさとなる３日から５日が好適である。
【００１８】
検体は種類を限らないが、イヌやウサギが挙げられ、それらの糞便は、排泄直後のものでも、直腸内に滞留中のものを採取しても良い。先に述べた、イヌの慢性下痢の病因菌との観点から、イヌの糞便が検体として挙げられる。
【００１９】
高層寒天培地中のコロニーは、摂取後、何回かの純化操作があれば、酵母C.guttulatusの分離方法としては好ましい。同定するだけであるなら、１回の独立コロニー摂取でもよい。
コロニーを形成する菌体の形状は、光学的顕微鏡で観察すればよく、形成されたクリーム白色コロニーを直針型白金耳でとり、ラクトフェノール固定もしくはラクトフェノールコルトンブルー固定染色などを行い観察すればよい。酵母C.guttulatusは、長楕円型の酵母細胞が竹とんぼ状もしくはＹ字状の集団となって現れる。なお、真菌用蛍光染色液ファンギローラＹ（日本商事）などを使用することもできる。
【００２０】
キットとしては、図６にその一例を示したが、上記機能を具備する、組合せであればよく、大量生産可能なものが商業的には好ましい。この場合、エチレンオキサイド滅菌器具として、上記機能を具備する使い捨てのプラスチック製品と高層寒天培地の組合せが考えられ、観察用のガラスプレートやコロニー採取用の採取器具がキットの中に含まれていてもよい。
【００２１】
本特許出願に至る発明者の実験並びに考え方は、１）先ず、試験例1で示されるように、従来行われていた条件とは異なり、培地の低ｐＨ調整や抗生物質の添加なしで、嫌気的条件下で酵母C.guttulatusのコロニーが形成されることを見出し、２）更に、嫌気的条件である１０％炭酸ガス雰囲気下という条件を考え、高層ＹＰＧＡ寒天培地に穿刺および塗布することにより、実施例1で示されるように、滅菌密封した容器の３５℃から３７℃の孵卵器中で、酵母C.guttulatusのコロニーが形成できることを確認し、更に最適な条件を研究し、ここに炭酸ガス培養装置を用いないでも酵母C.guttulatusが分離できることを見出し発明を完成した、ということとなる。
本発明は、酵母C.guttulatusの分離方法に留まらず、例えばイヌの疾病原因菌の酵母C.guttulatusの同定や確定という方法に使用可能で、かつ商業的に用いられキットの構成および使用まで含まれる。
【００２２】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
（試験例１）
平板ＹＰＧＡ寒天培地に検体（イヌの糞便）を播種し、好気的条件下と嫌気的条件下（１０％炭酸ガス）にて７日間培養した結果である。図１にその結果を示す。好気的条件下で培養したコロニー（集落）のうち酵母C.guttulatusのコロニーを丸印で示す。また、嫌気的条件下で培養したバクテリア上のコロニー（集落）が酵母C.guttulatusであった。
つまり、本試験により、ｐＨを酸性条件とせず、クロラムフェニコール等の抗生物質を添加しないＹＰＧＡ培地において、嫌気的条件とすることで酵母C.guttulatusのコロニーを形成することが明らかとなった。
【００２４】
（実施例１）
（材料および方法）
（培地）ＹＰＧＡ培地（１％酵母エキス（イーストエキストラクト）、２％ブドウ糖（デキストロース）、１％ペプトン及び１．５％寒天を含む）を調製した。
調製後、培地成分を加温により溶解し、直接培地容器に入れたのち、高圧蒸気滅菌した。なお、培地形状は、約５センチ程度の高層斜面培地とした。
（培養方法）３５℃で一般の孵卵器を使用した。
（検体採材用用具）先の尖った針金状の滅菌直針型白金耳や滅菌竹串を用いた。
（検体採取並びに培養）イヌの糞便（排泄直後のもの）の内部に火炎滅菌，冷却した直針型白金耳をさし、そのまま高層（斜面）寒天培地に穿刺培養した。（図２および３）
（コロニーの判定）培地中に観察されるクリーム白色の集落を直針型白金耳でとり、ラクトフェノール固定もしくはラクトフェノールコトンブルーで固定染色し、光学顕微鏡下で観察した。（図５および４）  
【００２５】
（結果）
図２および図３に培養結果を示した。図３が高拡大の図で、穿刺した近傍の培地中にコロニーが形成された。
本コロニーの光学顕微鏡像が図４と図５である。図４はラクトフェノールコトンブルーで固定染色したもの、図５がラクトフェノール固定したものである。長楕円型の細胞が竹とんぼ状もしくはＹ字状の集団として観察され、酵母C.guttulatusの形態の特徴と一致し、本酵母と同定できた。
【００２６】
（実施例２）
図６に示される、高層ＹＰＧＡ寒天培地（本寒天培地は斜面としていない）を保持した滅菌密封したスクリューキャップ付きガラス容器と滅菌した竹串からなるキットを作製した。
このキットをもって、真菌検査を希望した獣医師の方に送付し、イヌの糞便を検体として採取し実施例１に準じて、酵母C.guttulatusの同定を行った。表１にある症例１６から２２については、本実施例に基づき酵母C.guttulatusが同定された例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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