(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸分子、特にＧＣリッチ核酸分子の合成を増強させるための組成物および方法を提供する。【解決手段】特定の構造式からなる群より選択される１つ以上の窒素含有有機化合物（それらの塩もしくは誘導体）、好ましくは４−メチルモルホリンＮ−オキシドまたはベタイン（カルボキシメチルトリメチルアンモニウム）を含む組成物、ならびにプロリンおよびＮ−アルキルイミダゾール化合物、より好ましくはプロリン、１−メチルイミダゾールもしくは４−メチルイミダゾールからなる群より選択される１つ以上の化合物をさらに含む組成物。増幅、逆転写、配列決定、高忠実度の核酸分子の合成方法。前記方法によって合成される核酸分子、もしくはその誘導体、ならびにこのような核酸分子、誘導体を含むベクターおよび宿主細胞。前記１つ以上の組成物を含む核酸分子の合成、増幅、逆転写または配列決定のためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を合成する際に使用するための組成物であって、該組成物が、以下の式Ｉもしくは式ＩＩからなる群より選択される化学式を有する１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含む組成物であって、
【化１】
2011041573.tif 000009
ここで、Ａは
【化２】
2011041573.tif 000010
であり；
ここで、Ｘは
【化３】
2011041573.tif 000011
であり；
ここで、ｑ＝１〜１００，０００であって、ここでｑ＝２〜１００，０００である場合、式Ｉの各モノマーは式Ｉの他のモノマーと同じであっても異なっていてもよく；
ここで、ＺはＹと同じであっても異なっていてもよく；
ここで、各ＹおよびＺは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＰＯ3Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈおよび水素からなる群より独立して選択され；
ここで、ｆは０〜２の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、そしてｅは０〜２の整数であり；
ここで、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は同じであっても異なっていてもよく、そして水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、メルカプタン、チオール、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、カルボニル、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より独立して選択され、そしてｄは０〜２の整数であり；
ここで、ａ、ｂ、およびｃは独立して、０〜１の整数であり、ただし、ａ、ｄ、およびｃのうち２つより多くは０でなく；
ここで、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであっても異なっていてもよく、そして以下：
ａ）＝Ｏ；
ｂ)
【化４】
2011041573.tif 000012
からなる群より独立して選択され；
ここで、各Ｒ7およびＷは、同じであっても異なっていてもよく、そして水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、カルボニル、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より独立して選択され；ｇは０〜２の整数であり、そしてｎは０〜２０の整数であり；
【化５】
2011041573.tif 000013
ここで、式ＩＩは飽和または不飽和であり；
ここで、ｑ＝１〜１００，０００であり、ここでｑ＝２〜１００，０００の場合、式ＩＩの各モノマーは式ＩＩの他の各モノマーと同じであっても異なっていてもよく；
ここで、ＸはＮ、Ｃ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群より選択され；
ここで、ＹはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、−Ｏ−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＨ2−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2−ＮＨ−、−Ｏ−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−、−ＮＨ−Ｓ−、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｓ−および他のメルカプタン、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より選択され；
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、同じてあっても異なっていてもよく、そして水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より独立して選択され；そして
ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｍ、ｎ、およびｏは、同じであっても異なっていてもよい整数であり、そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅについては０〜２より、そしてｍ、ｎ、およびｏについては０〜５より独立して選択される、
組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、ただし、ｑ＝１および（Ｒ1）a、（Ｒ2）b、および（Ｒ3）cのうち１つが酸素であり、そして他の２つが同じかまたは異なり、そして水素、メチル、エチルおよびプロピルからなる群より独立して選択されるならば、Ａはメチル、エチルまたはプロピルではない、組成物。
【請求項３】
ａ、ｂ、またはｃが０である場合、対応するＲ基が電子対である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｙおよび／またはＸがＮであり、そしてｍ、ｎおよびｏが１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｙおよび／またはＸがＮおよび／またはＯであり、そしてｍおよびｎが１であり、そしてｏが２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、式ＩまたはＩＩを有する少なくとも２つの化合物、あるいはそれらの塩または誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、式ＩまたはＩＩを有する２〜５の化合物、あるいはそれらの塩または誘導体を含む。請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、プロリンまたはそれらの誘導体を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物がＮ−アルキルイミダゾール化合物を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｎ−アルキルイミダゾール化合物が１−メチルイミダゾールまたは４−メチルイミダゾールである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物が、４−メチルモルホリンＮ−オキシド、ベタイン、カルニチン、エクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）、平均分子量約５０，０００〜約５００，０００ダルトンのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、および平均分子量約１００，０００〜約２００，０００ダルトンのポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、４−メチルモルホリンＮ−オキシド、ベタイン、カルニチン、エクトイン、平均分子量約５０，０００〜約５００，０００ダルトンのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、および平均分子量約１００，０００〜約２００，０００ダルトンのポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
核酸ポリメラーゼ活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
核酸ポリメラーゼ活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴTM、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM、およびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
１つ以上のアミノ酸、１つ以上のサッカリド、１つ以上のポリアルコール、またはそれらの誘導体、あるいはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分を含む核酸分子を合成する際に使用するための、組成物。
【請求項２１】
請求項１または２０のいずれか１項に記載の２つ以上の化合物または成分を組み合わせることによって得られる、組成物。
【請求項２２】
核酸分子を合成するための方法であって、該方法は：
（ａ）核酸の鋳型を、請求項１または２０に記載の１つ以上の組成物と混合し、混合物を形成する工程；および
（ｂ）該鋳型の全体または一部に相補的な第１の核酸分子を作製するのに充分な条件下で該混合物をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記第１の核酸分子の全体または部分に相補的な第２の核酸分子を作製するのに充分な条件下で、該第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法に従って作製される、核酸分子。
【請求項２５】
核酸分子を増幅するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）核酸の鋳型を、請求項１または２０に記載の１つ以上の組成物と混合し、混合物を形成する工程；および
（ｂ）該鋳型の全体または一部に相補的な核酸分子を増幅するのに充分な条件下で該混合物をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
核酸分子を配列決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）配列決定されるべき核酸分子を、１つ以上のプライマー、請求項１または２０に記載の１つ以上の組成物、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の終結因子と混合し、混合物を形成する工程；
（ｂ）配列決定されるべき該分子の全体または一部に相補的な分子の集団を合成するのに充分な条件下で該混合物をインキュベートする工程；および
（ｃ）該集団を分離して、配列決定されるべき該分子の全体または一部のヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
核酸分子を合成する際に使用するためのキットであって、該キットが、請求項１または２０に記載の１つ以上の化合物または成分を含む、キット。
【請求項２８】
前記キットが、少なくとも２つの前記化合物または成分を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記キットが、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の転写酵素、１つ以上の適切な緩衝液、１つ以上のプライマー、および１つ以上の終結因子からなる群より選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景)
（発明の分野)
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野にある。本発明は、一般に核酸分子、特にＧＣリッチ核酸鋳型の合成を増強するのに有用な化合物、組成物、および方法に関する。特に、本発明は、式Ｉおよび式ＩＩからなる群より選択される式を有する１つ以上の化合物を含む組成物を提供する。好ましくは、４−メチルモルホリンＮ−オキシド、ベタイン（カルボキシメチルトリメチルアンモニウム）、任意のアミノ酸（またはその誘導体）、および／またはＮ−アルキルイミダゾール（例えば、１−メチルイミダゾールまたは４−メチルイミダゾール）が本発明に従って使用される。好ましい局面において、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上などの本発明の化合物が組み合わされ、核酸合成を容易にする。
【０００２】
本発明はまた、本発明の１つ以上の化合物、ならびに（ｉ）１つ以上の核酸分子（核酸の鋳型を含む）、（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチド、（ｉｉｉ）１つ以上のポリメラーゼまたは逆転写酵素、および（ｉｖ）１つ以上の緩衝塩からなる群より選択される１つ以上のさらなる成分を含む組成物に関する。
【０００３】
本発明のこれらの化合物および組成物は、増幅（特に、ＰＣＲ）、逆転写、および配列決定による方法を含む、核酸分子の増強された、高忠実度の合成のための方法において使用され得る。本発明はまた、これらの方法によって生成される核酸分子、フラグメントもしくはそれらの誘導体、ならびにこのような核酸分子、フラグメント、もしくは誘導体を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はまた、所望のポリペプチドを産生するこのような核酸分子の使用に関する。本発明はまた、本発明の組成物または化合物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連分野)
（ゲノムＤＮＡ)
生物体、組織または細胞の構造および生理を試験する際、それらの遺伝的内容を決定することがしばしば所望される。生物体の遺伝的骨格（すなわち、ゲノム）は、生物体の体細胞および生殖細胞中に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基の二本鎖配列においてコードされる。ＤＮＡの特定のセグメント、すなわち遺伝子の遺伝的内容は、この遺伝子が最終的にコードするタンパク質の生成によってのみ発現される。タンパク質を生成するために、ＤＮＡ二重らせんの１本の鎖の相補的なコピー（「センス」鎖）が、ポリメラーゼ酵素によって生成され、その結果、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の特異的な配列が生じる。次いでこのｍＲＮＡは、細胞のタンパク質合成機構によって翻訳され、その結果、この遺伝子によってコードされる特定のタンパク質の生成が生じる。構造的、調節的または未知の機能の役割を果たし得るタンパク質をコードしないゲノム（すなわち、「非コード」領域）においてさらなる配列が存在する。従って、生物体または細胞のゲノムは、介在性非コードＤＮＡ配列とともにタンパク質コード遺伝子の完全な収集である。重要なことに、多細胞生物の各体細胞は、病巣感染または癌の場合を除いて、生物体のゲノムＤＮＡの完全な相補体を含み、ここで、異種の１つ以上のＤＮＡ配列が特定の細胞のゲノムＤＮＡに挿入され得、そしてその生物体の他の非感染細胞には挿入されないかもしれない。しかし以下に述べるように、ゲノムＤＮＡを構成する遺伝子の発現は、個々の細胞の間で変化し得る。
【０００５】
（ｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリー)
所定の細胞、組織、または生物内には、無数のｍＲＮＡ種が存在し、各々が別々のかつ特定のタンパク質をコードする。この事実は、組織または細胞における遺伝子発現を研究することに興味を抱く研究者に対して強力なツールを提供する。ｍＲＮＡ分子は、種々の分子生物学的技法により単離され、そしてさらに操作され得、それにより、細胞、組織、または生物の完全に機能的な遺伝子含有量の評価を可能にする。
【０００６】
遺伝子発現の研究に対する１つの一般的なアプローチは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの産生である。この技術において、ある生物由来のｍＲＮＡ分子は、その生物の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離は、しばしば、デオキシチミジン（ｄＴ）のオリゴマーがそこに複合体化される固相クロマトグラフィーマトリックス（例えば、セルロースまたはヒドロキシアパタイト）を利用する。全ての真核生物ｍＲＮＡ分子上の３’末端は、一繋ぎのデオキシアデノシン（ｄＡ）塩基を含み、そしてｄＡはｄＴに結合するので、ｍＲＮＡ分子は、組織または細胞抽出物における他の分子および物質から迅速に精製され得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡコピーが、酵素リバーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）を使用して作製され得る。これにより、一本鎖ｃＤＮＡ分子が産生される。次いで、一本鎖ｃＤＮＡは、オリジナルのｍＲＮＡ（従って、このｍＲＮＡをコードするオリジナルの二本鎖ＤＮＡ配列であって、その生物のゲノムに含まれるもの）の完全な二本鎖ＤＮＡコピーに、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって変換され得る。次いで、タンパク質特異的二本鎖ｃＤＮＡは、プラスミドに挿入され得、これは次いで宿主細菌細胞へと導入される。次いで、細菌細胞は、培養培地において増殖され、目的の遺伝子を含有する（または、多くの場合、発現する）細菌細胞の集団を生じる。
【０００７】
この全プロセス（ｍＲＮＡの単離からｃＤＮＡのプラスミドへの挿入から、単離された遺伝子を含有する細菌集団の増殖まで）は、「ｃＤＮＡクローニング」と呼ばれる。ｃＤＮＡが多くの異なるｍＲＮＡから調製される場合、ｃＤＮＡの得られるセットは、「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれ、供給源の細胞、組織、または生物に存在する異なる機能的（すなわち、発現された）遺伝子を表す。これらのｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型分析は、それらが由来する生物の構造および機能に関する多くの情報を生み出し得る。
【０００８】
（ＤＮＡ増幅)
サンプル中のＤＮＡの特定の配列のコピー数を増大させる、すなわち「増幅」させるために、研究者らは、多くの増幅技術に依存してきた。一般的に使用される増幅技術は、Ｍｕｌｌｉｓおよびその共同研究者らの記載するポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）法（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，８００，１５９号）である。この方法は、増幅されるべきＤＮＡ配列上の対立する領域に相補的である「プライマー」配列を使用する。これらのプライマーは、ＤＮＡ標的サンプルに、モル濃度過剰のヌクレオチド塩基およびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに添加され、そしてそのプライマーは、それらの標的に塩基特異的結合相互作用（すなわち、アデニンはチミンに、シトシンはグアニンに結合する）を介して結合する。温度を増大させ、そして低下させるサイクルにその反応混合物を繰り返し通す（標的配列上の２つのＤＮＡ鎖の解離、ポリメラーゼによる各鎖の相補コピーの合成、および新たな相補鎖の再アニーリングを可能にするため）ことによって、ＤＮＡの特定の配列のコピー数が迅速に増大され得る。
【０００９】
標的核酸配列の増幅についての他の技術がまた、開発されている。例えば、Ｗａｌｋｅｒら（米国特許第５，４５５，１６６号；ＥＰ０６８４３１５）は、Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）と呼ばれる方法を記載し、これは、単一の温度で操作され、そして標的ＤＮＡ配列の一本鎖フラグメント（これは、次いで、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を産生するための鋳型として役立つ）を生成する酵素のポリメラーゼ／エンドヌクレアーゼの組み合わせを使用する点で、ＰＣＲとは異なる。核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ））と呼ばれる代替の増幅手順は、Ｄａｖｅｙら（米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ０３２９８２２）に開示される。ＳＤＡと同様に、ＮＡＳＢＡは、等温反応を使用するが、ＰＣＲまたはＳＤＡにおけるようなＤＮＡプライマーではなく、増幅のためにＲＮＡプライマーの使用に基づいている。別の公知の増幅手順には、Ｂｅｒｎｉｎｇｅｒら（米国特許第５，１９４，３７０号）に記載されるプロモーター連結活性化転写酵素（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＬＡＴ））が含まれる。
【００１０】
（ＰＣＲに基づくＤＮＡフィンガープリンティング)
種々の増幅技術が利用可能であるにもかかわらず、ほとんどのＤＮＡフィンガープリンティング法は、増幅についてはＰＣＲに依存し、この技術について利用可能である十分に特徴づけられたプロトコルおよび自動化を利用する。これらのＰＣＲに基づくフィンガープリンティング技術の例には、ランダム増幅化多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ（ＲＡＰＤ））分析（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．Ｋ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２２）：６５３１−６５３５（１９９０））、任意のプライマーＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）（ＡＰ−ＰＣＲ；Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．，およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２４）：７２１３−７２１８（１９９０））、ＤＮＡ増幅フィンガープリント法（ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（ＤＡＦ；Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５５３−５５７（１９９１））、およびミニサテライト領域ＤＮＡのマイクロサテライトＰＣＲまたは直接的増幅（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｉｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｒｅｇｉｏｎ  ＤＮＡ）（ＤＡＭＤ；Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（２４）：５７８２−５７８５（１９９３））が含まれる。これらの方法の全ては、任意に選択されたプライマーを使用するＰＣＲによるランダムＤＮＡフラグメントの増幅に基づく。
【００１１】
（ＤＮＡ配列決定)
一般に、２つの技術は、核酸を配列決定するために伝統的に使用されてきた。その共同開発者（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０−５６４、１９７７）にちなんで「マキサムおよびギルバート配列決定法」と呼ばれる第一の方法においては、ＤＮＡが放射標識され、４つのサンプルに分割され、そしてＤＮＡ中の特定のヌクレオチド塩基を選択的に破壊し、そして損傷部位で分子を切断する化学物質で処理される。得られるフラグメントをゲル電気泳動により明確なバンドへと分離し、そしてそのゲルをＸ線フィルムに曝露することによって、オリジナルのＤＮＡ分子の配列がそのフィルムから読みとられ得る。この技術は、特定の複雑なＤＮＡ分子（霊長類ウイルスＳＶ４０（Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０，１９７８；Ｒｅｄｄｙ，Ｖ．Ｂ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００：４９４−５０２，１９７８）、および細菌プラスミドｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｇ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．４３：４４４−４４８，１９７５）を含む）の配列を決定するために使用されてきた。
【００１２】
その開発者（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４４，４４８，１９７５）にちなんで「サンガー配列決定法」と命名された配列決定のための代替の技術は、より一般的に利用される。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性を使用し、これは、反応終結ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７，１９７７）および短いプライマー（そのいずれかが検出可能に標識され得る）の混合物と合わせた場合、４つのジデオキシ塩基の１つで特異的に終結された一連の新たに合成されたＤＮＡフラグメントを生じる。次いで、これらのフラグメントは、ゲル電気泳動によって分離され、そしてその配列が、上記のマキサムおよびギルバート配列決定法について記載したように決定される。４つの別々の反応（各ｄｄＮＴＰについて一回）を行うことにより、かなり複雑なＤＮＡ分子の配列でさえ、迅速に決定され得る（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２６５：６７８−６９５，１９７７；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５３８−５５６，１９８７）。サンガーの配列決定法は、通常、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを利用する（米国特許第４，７９５，６９９号）が、Ｔ７ポリメラーゼ変異体を使用するこの技術の最近の改変は、配列決定が、４つ全ての鎖終結ｄｄＮＴＰを異なる濃度で含有する単回の配列決定反応（米国特許第４，９６２，０２０号および同第５，１７３，４１１号）を使用することによって達成されることを可能にする。反応混合物において反応を害するピロリン酸の蓄積を低減または排除するためのこの技術に対するさらなる改変はまた、記載されている（米国特許第５，４９８，５２３号）。核酸分子を配列決定するための他の改変がまた記載されている（Ｍｕｒｒａｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：８８８９，１９８９；およびＣｒａｘｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３：２０−２５，１９９１、を参照のこと）。
【００１３】
（限定)
上記のように、鋳型核酸分子の信頼性のある、かつ高忠実度の複製は、増幅、逆転写、および配列決定プロトコルにおける核酸分子の合成における本質的な工程である。しかし、この合成を達成するための標準的な組成およびプロトコルの使用は、しばしば、次の点で非効率的である：それらが核酸鋳型における特定の二次構造（Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ら、ＦＯＣＵＳ  １１（４）：６０（１９８９）；Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｗ．，およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１（１９９１））障壁、および配列（Ｍｅｓｓｅｒ，Ｌ．Ｉ．，ら、Ｖｉｒｏｌ．１４６：１４６（１９８５））；Ａｂｂｏｔｔｓ，Ｊ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０３１２−１０３２３（１９９３））障壁で核酸合成を未完のまま終結させる傾向がある。これは、高グアニジン／シトシン含量を有する鋳型配列（すなわち、「ＧＣリッチ」鋳型）およびかなり大きなサイズの鋳型配列（すなわち、約３〜５ｋｂ長よりも長い鋳型）について特に本当である。鋳型核酸分子におけるこれらの二次構造および配列の障壁は、ホモポリマーストレッチで頻繁に発生し（Ｍｅｓｓｅｒ．Ｌ．Ｉ．ら、Ｖｉｒｏｌ．１４６：１４６（１９８５））；Ｈｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４６６９−４６７８（１９８９）；Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｗ．，およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１（１９９１））、そして二次構造障壁よりむしろ、配列障壁がより頻繁である（Ａｂｂｏｔｔｓ，Ｊ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０３１２−１０３２３（１９９３））。これらの障壁が克服できる場合には、合成反応における合計のかつ全長の核酸産物の収量が増大し得る。
【００１４】
反応混合物のイオン強度または浸透圧、特にＮａ+およびＫ+イオンの濃度、の調整が、インビボでと同様に（ＬｅＲｕｄｕｌｉｅｒ，Ｄ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１０６４（１９８４）；Ｂｕｃｈｅ，Ａ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．８（３）：６０１（１９９０）；Ｍａｒｑｕｅｔ，Ｒ．，およびＨｏｕｓｓｉｅｒ，Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９（１）：１５９（１９９１）；Ｂｕｃｈｅ，Ａ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．１１（１）：９５（１９９３）；Ｗｏｏｄｆｏｒｄ，Ｋ．，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（３）：５３９（１９９５）；Ｆｌｏｃｋ、Ｓ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７０：１４５６（１９９６）；Ｆｌｏｃｋ，Ｓ．、ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７１：１５１９（１９９６）；ＥＰ０８２１０５９Ａ２）、インビトロで核酸の二次構造および縮合に影響を及ぼし得ることを、いくつかの報告が示していた。これらの研究のいくつかにおいて、インビトロ核酸コンホメーションおよび安定性が、トレハロースのようなポリサッカライド（Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｐ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５２０−５２４（１９９８））、グリセロールおよびジメチルスルホキシドのような特定の共溶媒（Ｖａｒａｄａｒａｊ，Ｋ．，およびＳｋｉｎｎｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ  １４０：１（１９９４））；グリシンおよびその誘導体（Ｂｕｃｈｅ，Ａ．，ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４７（２）：３６７（１９８９）；Ｆｌｏｃｋ，Ｓ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．１３（１）：８７（１９９５）；Ｈｏｕｓｓｉｅｒ，Ｃ．，ら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７Ａ（３）：３１３（１９９７））；βアラニン、アスパラギン、およびシスタミンのような低分子量アミン（Ｋｏｎｄａｋｏｖａ，Ｎ．Ｖ．，ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ）９（５）：７４２（１９７５）；Ａｓｌａｎｉａｎ，Ｖ．Ｍ．，ら、Ｂｉｏｆｉｚｉｋａ  ２９（４）：５６４（１９８４））；ならびに他の窒素含有化合物およびプロリン、ベタイン、およびエクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）のようなアミノ酸（Ｒｅｅｓ，Ｗ．Ａ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１３７−１４４（１９９３）；ＷＯ９５／２０６８２；ＤＥ４４１１５８８Ｃ１；ＤＥ４４１１５９４Ｃ１；Ｍｙｔｅｌｋａ，Ｄ．Ｓ．，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１４）：２７７４（１９９６）；Ｂａｓｋａｒａｎ，Ｎ．，ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：６３３（１９９６）；Ｗｅｉｓｓｅｎｓｔｅｉｎｅｒ，Ｔ．，およびＬａｎｃｈｂｕｒｙ，Ｊ．Ｓ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１（６）：１１０２（１９９６）；Ｒａｊｅｎｄｒａｋｕｍａｒ，Ｃ．Ｓ．Ｖ．，ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．４１０：２０１−２０５（１９９７）；Ｈｅｎｋｅ，Ｗ．，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１９）：３９５７（１９９７）；Ｈｅｎｇｅｎ，Ｐ．Ｎ．ＴＩＢＳ  ２２：２２５（１９９７））を含む多くの天然および合成の浸透保護剤化合物の任意のものを含有する緩衝溶液において改善されるべきであることが見出された。ベタインおよびエクトインは、種々の細菌および動物の細胞における天然の浸透圧保護剤である（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１０）：４８４５（１９８７）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｋ．，ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２９１（３）：１８９（１９９６）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｋ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４（２）：２８３（１９９６）；Ｍａｌｉｎ，Ｇ．，およびＬａｐｉｄｏｔ，Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（２）：３８５（１９９６）；Ｇｏｕｅｓｂｅｔ，Ｇ．，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（２）：４４７（１９９６）；Ｃａｎｏｖａｓ，Ｄ．，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（２４）：７２２１（１９９６）；Ｃａｎｏｖａｓ，Ｄ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４１）：２５７９４−２５８０１（１９９７）。
【００１５】
しかし、当該分野には、核酸分子、特にＧＣリッチおよび／または比較的大きな核酸分子の合成を増強するのに有用である化合物、組成物、および方法についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１６】
（発明の簡単な要旨)
本発明は、一般に、核酸分子、特にＧＣリッチ核酸鋳型に由来する核酸分子の合成を増強するのに有用な化合物、組成物、および方法に関する。１つの局面において、本発明は、核酸分子の合成における使用のための、特に増幅、逆転写、および配列決定反応のような鋳型媒介合成のための化合物および組成物に関する。本発明の化合物および組成物は、式Ｉおよび式ＩＩからなる群から選択される化学式を有する１つ以上の化合物、およびその塩または誘導体を含む。１つの好ましい局面において、本発明において使用される化合物には、任意のアミノ酸、任意のサッカライド（モノサッカライドまたはポリサッカライド）、任意のポリアルコール、またはこれらの塩もしくは誘導体が含まれる。本発明の化合物または組成物には、式Ｉまたは式ＩＩに示される化学式を有する化合物、またはその塩もしくは誘導体が含まれ、ここで、そのアリール基は、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントラシル基、インデニル基、アズレニル基、ビフェニル基、ビフェニレニル基、およびフルオレニル基からなる群から選択され；ここで、そのハロ基は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択され；ここで、そのアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、およびデシルからなる群から選択され、そして分枝鎖アルキル基であり得；ここで、そのアルケニル基は、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基、およびデシニル基からなる群から選択され、そして分枝鎖アルケニル基であり得；ここで、そのアルケニル基は、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、へプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、およびデシニル基からなる群から選択され、そして分枝鎖アルキニル基であり得；そしてここで低級アルコキシ（エーテル）基は、上記のアルキル基の１つによって酸素置換されている。本発明はまた、このような化合物の塩および誘導体に関する。本発明の特に好ましい局面において、化合物は、４−メチルモルホリンＮ−オキシド、ベタイン、カルニチン、エクトイン、プロリン、グリシン、ピペコリン酸、トリメチルアミンＮオキシド、Ｎ−アルキルイミダゾール化合物（例えば、１−メチルイミダゾールもしくは４−メチルイミダゾール）、平均分子量約５０，０００〜約５００，０００ダルトンのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、平均分子量約１００，０００〜約２００，０００ダルトンのポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、またはその塩もしくは誘導体からなる群から選択される。本発明はまた、本発明の化合物、ならびに（ｉ）熱安定酵素であり得る核酸ポリメラーゼ活性有する１つ以上の酵素、（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチド、（ｉｉｉ）１つ以上の緩衝化塩、および（ｉｖ）１つ以上の核酸分子からなる群から選択される１つ以上のさらなる成分を含む組成物に関する。本発明のこの局面に従う好ましいこのような酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴTM、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM、およびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体）、および逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体）が含まれ得る。好ましくは、このような逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨスペース活性が減少するか、または実質的に減少する。
【００１７】
本発明はまた、核酸分子を合成するための方法に関し、この方法は、（ａ）核酸鋳型（ｃＤＮＡ分子のようなＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子であり得る）と１つ以上の（好ましくは２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上等）の本発明の化合物もしくは組成物とを混合して、混合物を形成する工程；および（ｂ）その混合物を、その鋳型の全部もしくは一部と相補的な第一の核酸分子を作製するために十分な条件下でインキュベートする工程、を包含する。本発明のこのような方法には、必要に応じて、１つ以上のさらなる工程（例えば、上記の第一の核酸分子を、この第一の核酸分子の全部または一部に対して相補的な第二の核酸分子を作製するために十分な条件下でインキュベートする工程）が包含され得る。本発明はまた、これらの方法によって作製される核酸分子、これらの核酸分子を含むベクター（発現ベクターであり得る）、ならびにこれらの核酸分子もしくはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、ポリペプチドを産生する方法に関し、この方法は、上記の宿主細胞を、この宿主による上記ポリペプチドの産生に都合のよい条件下で培養する工程、およびそのポリペプチドを単離する工程を包含する。本発明はまた、このような方法によって産生されるポリペプチドに関する。
【００１８】
本発明はまた、核酸分子を増幅するための方法に関し、この方法は、（ａ）核酸鋳型を１つ以上の本発明の化合物もしくは組成物と混合して、混合物を形成する工程、および（ｂ）その混合物を、その鋳型の全部もしくは一部に相補的な核酸分子を増幅するために十分な条件下でインキュベートする工程、を包含する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡ分子を増幅する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）第一および第二のプライマーを提供する工程であって、この第一のプライマーは、上記ＤＮＡ分子の上記第一鎖の３’末端またはその付近の配列に対して相補的であり、そして上記第二のプライマーは、上記ＤＮＡ分子の上記第二鎖の３’末端またはその付近の配列に対して相補的である、工程；
（ｂ）上記第一のプライマーを上記第一鎖に、そして上記第二のプライマーを上記第二鎖に対して、本発明の１つ以上の化合物もしくは組成物の存在下で、この第一鎖に対して相補的な第３のＤＮＡ分子およびこの第二鎖に対して相補的な第４のＤＮＡが合成されるような条件下でハイブリダイズする工程；
（ｃ）上記第一鎖および第三鎖、そして上記第二鎖および第四鎖を変性させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を一回以上繰り返す工程、
を包含する。
【００１９】
このような条件は、一つ以上のポリメラーゼ、一つ以上のヌクレオチドおよび／または一つ以上の緩衝用塩の存在下でのインキュベーションを包含し得る。本発明はまた、これらの方法によって増幅された核酸分子に関する。
【００２０】
本発明はまた、以下の工程：（ａ）配列決定されるべき核酸分子を、１つ以上のプライマー、本発明の１つ以上の化合物または組成物、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の終結因子と混合させ、混合物を形成する工程；（ｂ）配列決定されるべき分子の全部もしくは一部に対して相補的な分子の集団を合成するために十分な条件下でその混合物をインキュベートする工程；ならびに（ｃ）配列決定されるべき分子の全部および一部のヌクレオチド配列を決定するためにその集団を分離する工程、を包含する核酸分子を配列決定するための方法に関する。本発明は、より詳細には、ＤＮＡ分子を配列決定する方法に関し、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第一のＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズする工程；（ｂ）上記工程（ａ）の分子を、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、本発明の１つ以上の化合物または組成物、および１つ以上のターミネーターヌクレオチドと接触させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、上記第一のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子のランダム集団と合成するために十分な条件下でインキュベートする工程であって、ここで、この合成されたＤＮＡ分子が、この第一のＤＮＡ分子よりも長さが短く、そしてこの合成されたＤＮＡ分子が、その３’末端のターミネーターヌクレオチドを含む、工程；ならびに（ｄ）上記合成されたＤＮＡ分子を、サイズにより分離することにより、上記第一のＤＮＡ分子の少なくとも上記ヌクレオチド配列の一部が決定され得る工程。
【００２１】
このようなターミネーターヌクレオチドには、ｄｄＮＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、もしくはｄｄＣＴＰが含まれる。このような条件には、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼおよび／または緩衝用塩の存在下でのインキュベーションが含まれ得る。
【００２２】
本発明はまた、核酸分子の合成における使用のためのキットに関し、そのキットは、１つ以上の本発明の化合物または組成物を含む１つ以上の容器を含む。本発明のこれらのキットは、必要に応じて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ、および／または逆転写酵素、適切な緩衝液、１つ以上のプライマー、および１つ以上の終結因子（例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド）からなる群から選択される１つ以上のさらなる構成要素を含み得る。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施態様は、以下の図面および本発明の説明、ならびに請求の範囲に照らして、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、指示した濃度のプロリン、１−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、ベタインの存在下、またはこれらの共溶媒のいずれも存在しない下で増幅したＰＣＲ反応混合物のサンプルの、エチジウムブロミド染色したアガロースゲルの写真である。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカーである。
【図２】図２は、指示した濃度のベタインまたはＭＭＮＯの存在下で増幅したＰＣＲ反応混合物のサンプルの、エチジウムブロミド染色したアガロースゲルの写真である。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。
【図３】図３は、種々の化合物の組合せの存在下または非存在下で、３つの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアンプリコン（ＡｐｒＤ、ＡｐｒＥおよびＡｐｒＦ）の増幅のサンプルのエチジウムブロミド染色したアガロースゲルの写真である。レーン１：１Ｍベタイン；レーン２  １Ｍ  ＴＭＡＮＯ；レーン３−７：２Ｍ（レーン３）、１Ｍ（レーン４）、０．５Ｍ（レーン６）、０．４Ｍ（レーン６）、または０．２Ｍ（レーン７）のＭＭＮＯ；レーン８：化合物なしのコントロール、Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。
【図４】図４は、指示した濃度のベタイン、ＭＭＮＯまたはプロリンの存在または非存在下で、異なる反応緩衝液条件の下でのｐ５３エキソン１０のＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図５】図５は、指示した濃度のベタイン、ＭＭＮＯまたはプロリンの存在または非存在下で、異なる反応緩衝液条件の下でのＤｒａ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図６】図６は、異なるの比でのＭＭＮＯおよびプロリンの混合物の存在または非存在下で、あるいはベタイン、ＭＭＮＯまたはプロリン単独の存在下で、異なる反応緩衝液条件（Ｍｇ++濃度）の下でのｐ５３エキソン１０のＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図７】図７は、異なるの比でのＭＭＮＯおよびプロリンの混合物の存在または非存在下で、あるいはベタイン、ＭＭＮＯまたはプロリン単独の存在下で、異なる反応緩衝液条件（Ｍｇ++濃度）の下でのＤｒａ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。
【図８】図８は、ＧＣリッチなＰ３２Ｄ９テンプレートのＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真であり、これは、ＭＭＮＯおよびプロリンの混合物、またはベタインの、最適アニーリング温度に対する効果を示す。
【図９】図９は、ベタインまたはＭＭＮＯとプロリンとの１：１の混合物のいずれかの種々の濃度の存在下での、Ｋ５６２細胞株のゲノムＤＮＡ由来の脆弱Ｘ遺伝子座のＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。レーン１：共溶媒なし；レーン２：０．２５Ｍ；レーン３：０．５Ｍ；レーン４：０．７５Ｍ、レーン５：１Ｍ、レーン６：１．２５Ｍ、レーン７：１．５Ｍ、レーン８：１．７５Ｍ、レーン９：２Ｍ。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。
【図１０】図１０は、異なる濃度のＭＭＮＯとプロリンとの１；１混合物の存在下または非存在下での、２つの異なる長ＧＣリッチアデノウイルスＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。レーン１：共溶媒なし；レーン２：０．２５Ｍ；レーン３：０．５Ｍ；レーン４：１．０Ｍ。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。
【図１１】図１１は、ＭＭＮＯとプロリンとの１；１混合物（レーンＡ）、ベタイン（レーンＢ）、Ｌ−カルニチン（レーンＣ）、またはＤＬ−ピペコリン酸（レーンＤ）の種々の濃度の存在下または非存在下でのＫ５６２ゲノムＤＮＡのＧＣリッチフラグメントのＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。レーン１：共溶媒なし；レーン２：０．２５Ｍ；レーン３：０．５Ｍ；レーン４：１Ｍ；レーン５：１．５Ｍ；レーン６：２Ｍ。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。
【図１２】図１２は、ベタイン（レーンＡ）またはエクトイン（ｅｃｔｏｉｎ）（レーンＢ）の種々の濃度の存在下または非存在下でのＫ５６２ゲノムＤＮＡのＧＣリッチフラグメントのＰＣＲ増幅のサンプルの臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。レーン１：共溶媒なし；レーン２：０．２５Ｍ；レーン３：０．５Ｍ；レーン４：１Ｍ；レーン５：１．５Ｍ；レーン６：２Ｍ。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。
【図１３】図１３は、本発明に従って使用され得る多数の例示的な化合物の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明)
（定義)
以下の説明において、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語が広汎に利用される。そのような用語によって与えられる範囲を含め、発明の詳細な説明および請求の範囲のより明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００２６】
ライブラリー。本明細書において使用される場合、用語「ライブラリー」または「核酸ライブラリー」とは、１つの生物のＤＮＡ内容物の全部または有意な部分を代表する１セットの核酸分子（環状または直鎖状）（「ゲノムライブラリー」）または細胞、組織、器官もしくは生物において発現された遺伝子の全部または有意な部分を代表する１セットの核酸分子（「ｃＤＮＡライブラリー」）を意味する。そのようなライブラリーは、１以上のベクター中に含まれていても、含まれていなくてもよい。
【００２７】
ベクター。本明細書において使用される場合、「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、ファージミドまたはファージＤＮＡもしくは他のＤＮＡ分子であって、宿主中で自立複製し得、そして１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられるものである。この認識部位では、このようなＤＮＡ配列では、そのベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく決定可能な様式で切断され得、そしてそこに、ＤＮＡが挿入されてその複製およびクローニングをなされ得る。そのベクターは、そのベクターを用いて形質転換された細胞の同定において使用するために適切なマーカーをさらに含み得る。例えば、マーカーとしては、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２８】
プライマー。本明細書において使用される場合、「プライマー」とは、一本鎖のオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡ分子の複製または重合化の間のヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長されるものをいう。
【００２９】
テンプレート。用語「テンプレート」とは、本明細書において使用される場合、二本鎖または一本鎖の核酸分子であって、増幅され、合成され、または配列決定されるべきものをいう。二本鎖分子の場合において、その鎖を変性させて第一鎖および第二鎖を形成することは、好ましくは、これらの分子が増幅され得、合成され得、または配列決定され得る前に行われるか、あるいは、二本鎖分子は、直接テンプレートとして使用され得る。一本鎖テンプレートについて、そのテンプレートの一部と相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズし、次いで１つ以上のポリメラーゼがそのテンプレートの全部または一部に相補的な核酸分子を合成し得る。あるいは、二本鎖テンプレートについて、１つ以上のプロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＴ３プロモーター）を、１つ以上のポリメラーゼと組み合せて使用して、そのテンプレートの全部または一部と相補的な核酸分子を作製し得る。本発明に従って、新たに合成された分子は、もとのテンプレートと等しい長さかまたはそれより短くあり得る。
【００３０】
取り込み。用語「取り込み（む）」とは、本明細書において使用される場合、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子あるいはプライマーの一部となることを意味する。
【００３１】
増幅。本明細書において使用される場合、「増幅」とは、ポリメラーゼの使用によってヌクレオチド配列のコピー数を増加させるための任意のインビトロ方法をいう。核酸増幅によって、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子あるいはプライマーへのヌクレオチドの組込みがおこり、それによって、テンプレートと相補的な新しい分子が形成される。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書において使用される場合、１つの増幅反応は、多数回の複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１つのＰＣＲ反応は、５〜１００の「サイクル」のＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。
【００３２】
オリゴヌクレオチド。「オリゴヌクレオチド」とは、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの３’位と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの５’位との間のホスホジエステル結合によって結合されるヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成または天然の分子をいう。ヌクレオチド。本明細書において使用される場合、「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組合せをいう。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位（ＤＮＡおよびＲＮＡ）である。用語ヌクレオチドには、リボヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰまたはそれらの誘導体）が含まれる。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰおよびそれらを含む核酸分子に対してヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体が含まれる。用語ヌクレオチドはまた、本明細書において使用される場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体という。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰが含まれるがそれらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、標識されていていなくても、または周知技術によって検出可能に標識されていてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。
【００３３】
ハイブリダイゼーション。用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ（する）」とは、２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の塩基対が二本鎖分子を与えることをいう。本明細書において使用される場合、２つの核酸分子は、塩基対が完全に相補的でなくても、ハイブリダイズし得る。従って、ミスマッチの塩基は、当該分野で周知な適切な条件が使用される場合２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨害しない。
【００３４】
単位。用語「単位」は、本明細書において使用される場合、酵素の活性をいう。例えば、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼに言及する場合、１単位の活性は、３０分間に、標準的なプライムされたＤＮＡ合成条件下で、１０ナノモルのｄＮＴＰを酸不溶性材料（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）へ取り込む酵素の量をいう。
【００３５】
本明細書において使用されるような組換えＤＮＡ技術ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で使用される他の用語は、適用される技術分野の当業者によって一般的に理解される。
【００３６】
（概説)
本発明は、一般に、核酸分子、特に、ＧＣリッチな核酸テンプレートの合成を増強するにおいて有用な化合物、組成物および方法に関する。特に、本発明は、以下の式Ｉおよび式ＩＩからなる群より選択される式を有する化合物および１つ以上の化合物を含む組成物、またはその塩もしくは誘導体を提供する。好ましくは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つなどのこのような化合物または組成物が、本発明に従って使用される。最も好ましくは、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３のこのような化合物または組成物が使用される。本発明の化合物または組成物は、塩の形態で存在し得る。
式Ｉ
【００３７】
【化６】
2011041573.tif 000002
ここで、Ａは、
【００３８】
【化７】
2011041573.tif 000003
であり、ここで、Ｘは、
【００３９】
【化８】
2011041573.tif 000004
であり、ここでＺは、Ｙと同じであっても、異なっていてもよく、
ここで、ＹおよびＺは各々独立して、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、ＰＯ3Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈおよび水素からなる群より選択され、ｆは、０〜２の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、そしてｅは、０〜２の整数であり；
ここで、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、同一であっても、異なっていてもよく、そして独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、カルボニル、スルホニル、スルホン基およびアミド基からなる群より選択され、そしてｄは、０〜２の整数であり；
ここで、ａ、ｂおよびｃは、独立して０〜１の整数であり、ただし、ａ、ｂおよびｃの２つ以下が０であり；
ここで、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであっても、異なっていてもよく、そして独立して、以下からなる群より選択され：
ａ）＝Ｏ
ｂ）（Ｗ）g
｜
−（ＣＲ7）n；
ここで、Ｒ7およびＷは各々、同じであっても、異なっていてもよく、そして独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、カルボニル、スルホニル、スルホン基およびアミド基からなる群より選択され；ｇは、０〜２の整数であり；そしてｎは０〜２０の整数であり；そして
ここで、ｑは、１〜１００，０００であり得る。
【００４０】
式Ｉの化合物において、ｑ＝１である場合、式Ｉの化合物は、モノマーと考えられ得、そしてｑ＝２〜１００，０００である場合、式Ｉの化合物は、２〜１００，０００のモノマーから構成されるマルチマーまたはポリマーであると考えられ得る。このモノマーは、各々が同じ構造を有していても、異なる構造を有していてもよく、そして１つ以上の基を通じて１つ以上の結合によって結合されて式Ｉの化合物のマルチマー（例えば、ポリマー）を形成し得る。
【００４１】
好ましい局面において、ａ、ｂまたはｃが０である場合、対応するＲ基は、電子対である。
【００４２】
別の好ましい実施態様において、ｑ＝１であり、そして（Ｒ1）a、（Ｒ2）bおよび（Ｒ3）cが＝Ｏであり、そして他の２つのＲ基が同じであるかまたは異なっており、そして独立して水素、メチル、エチルおよびプロピルからなる群より選択される場合、Ａは、メチルでも、エチルでも、プロピルでもない。
式ＩＩ
【００４３】
【化９】
2011041573.tif 000005
ここで、式ＩＩは、飽和であるか、または不飽和であり；
ここで、ｑは、１〜１００，０００であり得；
ここで、Ｘは、Ｎ、Ｃ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群より選択され；
Ｙは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、−Ｏ−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｓ−、−ＮＨ−ＣＨ2−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｓ−、および他のメルカプタン、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、スルホニル、スルホン基、およびアミド基からなる群より選択され；そして
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、同一であっても、異なっていてもよく、そして独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、スルホニル、スルホン基およびアミド基からなる群より選択され；
ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｍ、ｎ、およびｏは、整数であって、同じであっても、異なっていてもよく、そして独立して、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅについては、０〜２から選択され、そしてｍ、ｎおよびｏについては、０〜５から選択される。
【００４４】
式ＩＩの化合物において、ｑ＝１である場合、式ＩＩの化合物は、モノマーと考えられ得、そしてｑ＝２〜１００，０００である場合、式ＩＩの化合物は、２〜１００，０００のモノマーから構成されるマルチマーまたはポリマーであると考えられ得る。このモノマーは、各々が同じ構造を有していても、異なる構造を有していてもよく、そして１つ以上の基を通じて１つ以上の結合によって結合されて式ＩＩの化合物のマルチマー（例えば、ポリマー）を形成し得る。
【００４５】
本発明の１つの好ましい局面において、Ｙおよび／またはＺはＮであり、そしてｍ、ｎおよびｏは１である。別の好ましい局面において、Ｙおよび／またはＸは、Ｎおよび／またはＯであり、そしてｍおよびｎは、１であり、そしてｏは２である。好ましくは、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよび／またはｅは０である場合、対応するＲ基は、電子対であるか、または、不飽和構造の形成に関与する。
【００４６】
式Ｉおよび式ＩＩの化合物について：
代表的なＣ6-14アリール基は、以下を含むがそれらに限定されない：フェニル基、ベンジル基、メチルインドリル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントラシル基、インデニル基、アズレニル基、ビフェニル基、ビフェニレニル基、およびフルオレニル基；
代表的なハロ基は、以下を含むがそれらに限定されない：フッ素、塩素、臭素およびヨウ素；
代表的なＣ1-15アルキル基は、以下を含むがそれらに限定されない：メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ならびに分枝鎖アルキル基；
代表的なＣ2-15アルケニル基は、以下を含むがそれらに限定されない：エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、へプテニル基、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基など、ならびに分枝鎖アルケニル基；
代表的なＣ2-15アルキニル基は、以下を含む：エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、へプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基など、ならびに分枝鎖アルキニル基；
代表的な低級アルコキシ（エーテル）基は、上記において言及したＣ1-4アルキル基の１つによる酸素置換物を含み；そして
代表的なＣ2-6アルカノイルオキシ基は、アセトキシ、プロピオニルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシおよびそれらの分枝鎖異性体を含む。
【００４７】
本発明に従って使用され得る化合物は、糖類、アミノ酸および多価アルコールならびにそれらの誘導体を含む。糖類の例は、オリゴ糖、および単糖類（例えば、トレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース（ｌｅｖａｎｂｉｏｓｅ）、キトビオース（ｑｕｉｔｏｂｉｏｓｅ）、２−β−グルクロノシルグルクロン酸（２−β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、レブロース、キシリトールおよびアラビトール）を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
このようなアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジン、ならびにそれらの誘導体を含み得るが、それらに限定されない。アミノ酸のＤ型およびＬ型、ならびに非タンパク質アミノ酸の両方が、本発明にしたがって使用され得る。例としては、Ｎ−（３’−オン−５’−メチル）−ヘキシルアラニン、ロイシンベタイン、Ｎ−メチルイソロイシン、およびγ−グルタミルロイシンが挙げられる。
【００４９】
多価アルコールの例としては、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールなどを含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の好ましい化合物は、４−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド（ＭＭＮＯ）、およびＮ−アルキルイミダゾール化合物（例えば、１−メチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、および４−メチルイミダゾール、ベタイン（カルボキシメチル−トリメチルアンモニウム）、タウリン、エクトイン、ピペコリン酸（ｐｉｐｅｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ピペコリン酸、２−モルフォリノエタンスルホン酸、ピリジン  Ｎ−オキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアミン  Ｎ−オキシド、３−メチルイソキサゾール−５（４Ｈ）−オンモルホリン塩、グリシン、ソルコシン（ｓｏｒｃｏｓｉｎｅ）、Ｎ−Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−メチル−プロリン、４−ヒドロキシ−プロリン、１−メチル−２−ピロールカルボン酸、１−メチルインドール−２−カルボン酸、２−ピラジンカルボン酸、５−メチル−２−ピラジンカルボン酸、４−メチル−５−イミダゾール−カルボキシアルデヒド（ｃａｒｂｏｘｏａｌｄｅｈｙｄｅ）、１−メチルピロール−２−カルボン酸、硝酸１−エチル−３−メチルイミダゾリウム（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ）、エチルアゼチジン−１−プロピオネート、Ｎ，Ｎ−ジメチル−フェニルアラニン、Ｓ−カルボキシメチル−システイン、２−イミダゾールカルボキシアルデヒド（ｉｍｉｄａｚｏｌｅｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）、４−イミダゾール酢酸、４−イミダゾールカルボン酸、４，５−イミダゾールジカルボン酸（ｉｍｉｄａｚｄｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カルニチンＮe−アセチル−ｂ−リジン、γ−アミノ酪酸、トランス−４−ヒドロキシスタキドリン、Ｎα−カルバモイル−Ｌ−グルタミン  ｌ−アミド、コリン、ジメチルテチン、（スルホベタインおよびジメチルアセトテチン、ならびにそれらの誘導体）、Ｎ−アセチルグルタミニルグルタミンアミド、ジメチルスルホニオプロピオネート（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エクトイン（１，４，５，６−テトラヒドロ−２メチル−４−ピリミジン（ｐｉｒｙｍｉｄｉｎｅ）カルボン酸）、ヒドロキシエクトイン、グルタミン酸、β−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｍｉｎｅ）、オクトピン、サルコシン、ならびにトリメチルアミン  Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）、平均分子量が約５０，０００〜約５００，０００ダルトンのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、平均分子量が約１００，０００〜約２００，０００ダルトンのポリ（ジアリルジメチル塩化アンモニウム）ならびに他のアミノ酸およびその誘導体を含み得るが、それに限定されない。
【００５１】
さらに好ましい化合物には、式ＩおよびＩＩの化合物の誘導体および塩を含む。例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物が、カルボキシル（Ｃ＝Ｏ）基を含む場合、本発明の化合物は、化学合成の慣用的な方法（例えば、カルボキシル含有化合物とアルコールまたはアミノ化合物を凝集させることによって）を使用して調製され得るカルボキシル基のエステルおよびアミドを含む。本発明のこの側面に従った有用なアルコールの例は、Ｃ1-6アルコールおよびＣ7-12アラルカノール（ａｒａｌｋａｎｏｌ）化合物を含み、これらはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、およびそれらの分枝鎖アイソマーを含むが、これに限定されない。本発明のこの局面に従った有用なアミノ化合物の例は、Ｃ1-6アミノ化合物およびＣ7-12アラルクアミノ（ａｒａｌｋａｍｉｎｏ）化合物を含み、これらはメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミンおよびそれらの分枝鎖アイソマーを含むが、これに限定されない。式Ｉまたは式ＩＩの化合物が、ヒドロキシ（−ＯＨ）基を含む場合、本発明の化合物は、ヒドロキシ含有化合物と、例えば、Ｃ1-6アルカン酸、Ｃ6-12アラルカン酸（ａｒａｌｋａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）またはＣ2-12ジアルカン酸またはその無水物（例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸およびそれらの分枝鎖アイソマー、ならびにコハク酸、無水コハク酸、フマル酸、マレイン酸など）との凝集により調製され得るそのような化合物のエステルを含む。本発明に従って調製され、そして使用され得る式Ｉおよび式ＩＩの化合物の他の誘導体は、本明細書に含まれる教示および当該分野の知識を考慮すると当業者に明らかである。
【００５２】
式ＩおよびＩＩの化合物の塩もまた本発明の範囲内に含まれる。式ＩおよびＩＩの化合物の酸を付加した塩は、慣用的な化学合成の方法（例えば、塩酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、カルボン酸、リン酸、シュウ酸などを含む酸の溶液との特定の化合物溶液の混合による）により形成され得る。式ＩおよびＩＩの化合物の塩基性塩は、化学合成の慣用的な方法（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化コリン、炭酸ソーダ、Ｔｒｉｓなどのような塩基性の溶液との特定の化合物溶液の混合による）を使用して形成され得る。本発明に従って調製されそして使用され得る式ＩおよびＩＩの化合物の他の塩は、本明細書中に含まれる教示および当該分野の知識を考慮すると当業者に明らかである。
【００５３】
上記の化合物および組成物は、単独でまたはそれらの任意の組み合わせで使用され得る。好ましくは、少なくとも２つの組み合わせ、少なくとも３つの組み合わせ、少なくとも４つの組み合わせ、少なくとも５つの組み合わせなどが、本発明に従って使用される。好ましい局面において、２〜１０個、２〜９個、２〜８個、２〜７個、２〜６個、２〜５個、２〜４個、および２〜３個のこのような化合物が、使用される。好ましい局面において、本発明は、上記の化合物の任意の組み合わせを混合することにより得られる組成物に関する。このような化合物と共に混合する場合、特定の相互作用が生じ得、これは、混合されている化合物の１つ以上の構造を変化し得、そして新規なまたは異なる化合物を生じ得る。
【００５４】
これらの組成物は、核酸分子の増強された、高性能な合成のための方法に使用され得、これらは、増幅方法（特にＰＣＲ）、逆転写方法、および配列決定方法を含む。本発明はまた、これらの方法により生成される核酸分子、それらのフラグメントまたはそれらの誘導体、およびこのような核酸分子、フラグメントまたは誘導体を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はまた、所望のポリペプチドを生成するためのこのような核酸分子の使用に関する。本発明はまた、本発明の化合物または組成物を含むキットに関する。
【００５５】
（合成方法)
式ＩおよびＩＩの化合物は、以下のように当業者に公知な有機化学合成の標準的な技術を使用して合成され得る。
【００５６】
式Ｉの化合物の合成は、以下のように実行され得る：
【００５７】
【化１０】
2011041573.tif 000006
例えば、ここでＲ4およびＺはＨであり、Ｙは−ＣＯ2Ｈであり、ｄ，ｅ、ｆ、およびｍは、１であり、次いで、出発化学物質は、市販のＢｒＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈである。
【００５８】
式ＩＩの化合物の合成は、以下のように実行され得る：
【００５９】
【化１１】
2011041573.tif 000007
例えば、ここで、Ｒ2およびＲ3は、Ｈであり；ｂおよびｍは、１であり、；ｃ−１およびｎ−１は、０であり、次いで、出発化学物質は、市販のＮＨ2−ＣＨ2−ＣＯＨである。
【００６０】
ＢｒＣＨ2ＣＯ2Ｈ、ＣＨ3ＣＨ（Ｂｒ）ＣＯ2Ｈ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（Ｂｒ）ＣＯ2Ｈ、ＢｒＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、Ｃｌ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃｌ（ＣＨ3）2ＣＨＣＨ（Ｂｒ）ＣＯ2、ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ（Ｂｒ）ＣＯ2Ｈ、ＢｒＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、ＢｒＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、ＨＯ2ＣＣＨ2ＣＨ（Ｂｒ）ＣＯ2Ｈもまた、市販されている。このような化合物は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し得る。
【００６１】
アミノ酸、およびそれらの誘導体、糖類、およびそれらの誘導体、ならびにＮ−アルキルイミダゾール化合物（１−メチルイミダゾールおよび４−メチルイミダゾールを含む）のような、本発明において使用するための、多数の化合物は、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、商業的に入手され得る。
【００６２】
本発明の組成物を処方するために、上記の１つ以上の化合物が，任意の様式で一緒に混合され得る。このような混合物は、それらの粉末の形態でこれらの化合物を混合させる工程、水溶性溶媒または有機溶媒中で各化合物の溶液を調製する工程、ならびに本発明の組成物を形成するために、溶液を混合する工程、あるいは少なくとも１つの化合物の溶液を調製する工程、および１つ以上のさらなる化合物の粉末形態を混合する工程により、達成され得る。
【００６３】
本発明のさらなる好ましい局面において、本発明の組成物は、核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをさらに含み得る。核酸ポリメラーゼ活性を有するこのような好ましい酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、および逆転写酵素活性を有するポリペプチドを含み得るが、これらに限定されない。
【００６４】
さらに好ましくは、本発明の組成物は、作業濃度で、または濃縮物（２×、５×、１０×、５０×など）として提供される。このような組成物は、種々の温度での保存の際に、好ましくは安定である。用語「安定」および「安定性」は、本明細書において使用される場合、一般的に、組成物が、約４℃の温度での約１週間、約−２０℃の温度で約６ヶ月間保存された後、元の酵素および／または化合物の活性の、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、および最も好ましくは約９０％の成分（例えば、組成物の化合物または酵素）を保持することを意味する。本明細書で使用する場合、用語「作業濃度」は、特定の機能（例えば核酸の合成）を行なうために、溶液中で使用される最適濃度または最適に近い濃度である化学化合物または酵素の濃度を意味する。
【００６５】
本発明の組成物の形成において使用され得る水は、好ましくは、蒸留され、脱イオン化され、および滅菌濾過され（０．１〜０．２μｍフィルターを通して）、ならびにＤＮａｓｅ酵素およびＲＮａｓｅ酵素によって汚染されていない水である。このような水は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から市販されているか、または必要な場合は、当業者に周知の方法に従って作製され得る。
【００６６】
化学（および必要に応じてポリペプチド）成分に加えて、本発明の組成物は、好ましくは、１つ以上の緩衝液および核酸分子の合成に必要なコファクターを含む。本発明の組成物の形成に使用するための特に好ましい緩衝液は、酢酸塩、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、またはトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の遊離酸形態であるが、等価な結果を有するＴＲＩＳ（登録商標）と、ほぼ同じイオン強度およびｐＫａの代替緩衝液が、使用され得る。緩衝液の塩に加えて、カリウム塩（好ましくは、塩化カリウムまたは酢酸カリウム）およびマグネシウム塩（好ましくは、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム）のようなコファクター塩が、組成物中に含まれる。
【００６７】
しばしば、最初に緩衝液およびコファクター塩を作業濃度で水に溶解すること、ならびに化学化合物（および必要に応じてポリペプチド）を添加する前に溶液のｐＨを調整することは、好ましい。この方法において、任意のｐＨ感受性化学化合物およびポリペプチドは、本発明の組成物の処方の間、酸媒介のまたはアルカリ媒介の不活化または分解をあまり受けない。
【００６８】
緩衝化塩溶液を処方するために、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の塩であり、そして最も好ましくは、その塩酸塩の塩である緩衝剤の塩は、十分な量の水と合わされ、５〜１５０ミリモーラーの濃度のＴＲＩＳ（登録商標）を、好ましくは、１０〜６０ミリモーラーのＴＲＩＳ（登録商標）を、最も好ましくは、約２０〜６０ミリモーラーのＴＲＩＳ（登録商標）を有する溶液を生じる。この溶液にマグネシウム塩（好ましくは、その塩化物または酢酸塩のいずれか）が添加され、１〜１０ミリモーラー、好ましくは１．５〜８．０ミリモーラー、および最も好ましくは、約３〜７．５ミリモーラーのその作業濃度を提供し得る。カリウム塩（最も好ましくは、塩化カリウム）もまた、１０〜１００ミリモーラーの作業濃度で、および最も好ましくは、約７５ミリモーラーの作業濃度で溶液に添加され得る。ジチオスレイトールのような還元剤は、好ましくは約１〜１００ｍＭの終濃度で、より好ましくは、約５〜５０ｍＭまたは約７．５〜２０ｍＭの濃度で、そして最も好ましくは、約１０ｍＭの濃度で、溶液に添加され得る。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウムのような少量のＥＤＴＡの塩もまた添加され得るが（好ましくは、約０．１ｍＭ）、ＥＤＴＡの含有は、本発明の組成物の機能または安定性に必須ではないようである。全ての緩衝液および塩を添加した後、この緩衝化塩溶液は、すべての塩が溶解するまでよく混合され、そしてｐＨは、当該分野で公知の方法を使用して、７．４〜９．２のｐＨ値、好ましくは８．０〜９．０のｐＨ値、ならびに最も好ましくは、約８．４のｐＨ値に調整される。
【００６９】
これらの緩衝化塩溶液に、本発明の化合物および必要に応じて、核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを添加し、本発明の組成物を生成する。
【００７０】
好ましい組成物において、本発明の化合物は、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、約１：１、約１：１．２５、約１：１．５、約１：１．７５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０のモル比あるいは化学量論比で混合される。より好ましくは、化合物は、約１：１のモル比または化学量論比で混合される。他のモル比または化学量論比が、慣用的な最適化により決定され得る。２つより多い化合物を使用して、本発明の組成物を形成する場合、各化合物の量が、核酸合成に対する効果を試験することにより容易に最適化され得る。次いで、これらの化合物は、以下に記載の核酸合成方法で使用するために、約０．０１〜５Ｍ、約０．０５〜５Ｍ、約０．１〜４Ｍ、約０．２５〜３Ｍ、約０．３〜２．５Ｍ、約０．４〜２Ｍ、約０．４〜１．５Ｍ、約０．４〜１Ｍ、または約０．４〜０．８Ｍの作業濃度で好ましくは組成物中に処方される。使用される化合物によって、他のモル量が、所望の結果に依存して使用され得る。次いで、本発明の組成物は、核酸分子の合成に使用するまで、６５℃で２〜４週間、室温〜３７℃で１〜２ヶ月、４℃で１〜６ヶ月、そして−２０℃で３ヶ月から１年以上保存され得る。
【００７１】
ポリメラーゼ活性を有する種々のポリペプチドは、本発明に従って有用である。核酸ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを含む）のような酵素が、これらのポリペプチドの中に含まれる。このようなポリメラーゼは、以下を含むがそれに限定されない：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴTMＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＫＤＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体。Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体のようなＲＮＡポリメラーゼもまた、本発明に従って使用され得る。
【００７２】
本発明おいて使用される核酸ポリメラーゼは、中温性または好熱性であり得、そして好ましくは、好熱性である。好ましい中温性のＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどを含む。本発明の方法および組成物において使用され得る、好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＶＥＮＴTMおよびＤＥＥＰＶＥＮＴTM  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体を含む（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，０７９，３５２号；米国特許第５，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＷＯ９２／０６１８８；ＷＯ９２／０６２００；ＷＯ９６／１０６４０；Ｂａｒｎｅｓ、Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ、Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ、Ｊ．−Ｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。長い核酸分子（例えば、約３〜５Ｋｂ長より長い核酸分子）の増幅のために、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼ（一方は、３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いており、そして片方は、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）が、代表的に使用される。米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；Ｂａｒｎｅｓ、Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；および同時係属中の米国特許出願第０８／８０１，７２０号（１９９７年２月１４日出願）（これらの開示の全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。実質的に３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（ｅｘｏ-）、Ｔｍａ（ｅｘｏ-）、Ｐｆｕ（ｅｘｏ-）、Ｐｗｏ（ｅｘｏ-）およびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体改変体および誘導体を含むが、それらに限定されない。
【００７３】
本発明において使用するための逆転写活性を有するポリペプチドは、逆転写活性を有する任意のポリペプチドを含む。このような酵素は、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌性逆転写酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ、Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体（例えば、Ａ．Ｊｏｈｎ  ＨｕｇｈｅｓおよびＤｅｂ  Ｋ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅの同時係属中の米国特許出願第０８／７０６，７０２号および同第０８／７０６，７０６号（ともに、１９９６年９月９日出願））（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を含む、がそれらに限定されない。本発明の使用のために好ましい酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性において減少または実質的に減少する酵素を含む。「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性において実質的に減少する」酵素とは、酵素が、対応する野生型またはＲＮａｓｅ  Ｈ+酵素（例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素）のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、または５％未満、そして最も好ましくは約２％未満の活性を有することを意味する。任意の酵素のＲＮａｓｅ酵素活性は、様々なアッセイ（例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ、Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）に記載されるアッセイ）によって決定され得、この開示の全ては、本明細書中に参考として全てが援用される。本発明の使用のために特に好ましいこのようなポリペプチドは、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽球症関連ウイルス）Ｈ-逆転写酵素およびＨＩＶ  Ｈ-逆転写酵素を含むが、これらに限定されない。しかし、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が実質的に減少しているリボ核酸分子（すなわち、逆転写酵素活性を有する）から、ＤＮＡ分子を生成し得る任意の酵素は、本発明の組成物、方法およびキットにおいて同価に使用され得ることが当業者に理解される。
【００７４】
本発明において使用するための、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から商業的に入手され得る。本発明における使用のための逆転写活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から商業的に入手され得る。あるいは、逆転写活性を有するポリペプチドは、それらの天然のウイルスまたは細菌供給源から、当業者に周知の天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従って、単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写活性を有するポリペプチドは、当業者に知られる組換えＤＮＡ技術により調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ、Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ、Ｄ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ  Ａ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。
【００７５】
ポリメラーゼ活性または逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、好ましくは、約０．１〜２００単位／ｍｌ、約０．１〜５０単位／ｍｌ、約０．１〜４０単位／ｍｌ、約０．１〜３６単位／ｍｌ、約０．１〜３４単位／ｍｌ、約０．１〜３２単位／ｍｌ、約０．１〜３０単位／ｍｌ、または約０．１〜２０単位／ｍｌの溶液中の最終濃度で、そして最も好ましくは約２０〜４０単位／ｍｌの濃度で、本発明の組成物および方法において使用される。もちろん、本発明における使用に適切なこのようなポリメラーゼまたは逆転写酵素の他の適切な濃度は、当業者に明らかである。
【００７６】
（核酸合成の方法)
本発明の化合物および組成物は、核酸の合成のための方法において使用され得る。特に、本発明の化合物および組成物は、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応を介して、高含量のグアニンおよびシトシンを有する核酸分子（すなわち、「ＧＣリッチ」核酸分子）の合成を容易にすることが発見されている。従って、本発明の化合物および組成物は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ（特に、ｃＤＮＡ）分子およびＲＮＡ（特に、ｍＲＮＡ）分子）の合成を必要とする任意の方法において使用され得る。本発明の化合物または組成物が有利に使用され得る方法としては、核酸合成方法、核酸増幅方法、核酸逆転写酵素、および核酸配列決定方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
（合成)
本発明のこの局面に従う核酸合成方法は、１以上の工程を包含し得る。例えば、本発明は、（ａ）核酸テンプレートと本発明の１以上の上記の化合物および組成物を混合して、混合物を形成する工程；および（ｂ）そのテンプレートの全てまたは一部に相補的な第一の核酸分子を生成するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む、核酸分子を合成するための方法を提供する。本発明のこの局面に従って、核酸テンプレートは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子またはライブラリー）、あるいはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）であり得る。
【００７８】
本発明に従って、投入する（ｉｎｐｕｔ）核酸分子またはライブラリーは、天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官または生物体）から得られた核酸分子の集団から調製され得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物（以下の属の種の細胞を含む、細菌細胞；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）または真核生物（以下を含む；真菌（特に、酵母）、植物、原生生物、および他の寄生動物、ならびに昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ種細胞）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ細胞）、および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む動物）であり得る。
【００７９】
核酸分子の供給源または核酸分子のライブラリーとして使用され得る哺乳動物体細胞としては以下が挙げられる；血球（網状赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋由来の筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞および骨芽細胞を含む）、および他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュヴァン細胞）。哺乳動物生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）もまた、本発明での使用のための核酸の供給源またはライブラリーとして使用され得る。上記の体細胞および生殖細胞を生じる前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）および幹細胞も、同様に使用され得る。以下のような哺乳動物の組織または器官もまた、核酸の供給源としての使用に適切である；脳組織、腎臓組織、肝臓組織、膵臓組織、血液組織、骨髄組織、筋肉組織、神経組織、皮膚組織、尿生殖組織、循環組織、リンパ組織、胃腸組織および結合組織の供給源、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）胚または胎児由来の組織または器官。
【００８０】
上記の任意の原核生物または真核生物の、細胞、組織、および器官は、正常、病的状態、形質転換体、樹立体、前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、胎性、または胚性であり得る。病的細胞は、例えば、感染性疾患（細菌、真菌または酵母、ウイルス（ＨＩＶを含む）あるいは寄生動物により引き起こされる）、遺伝的または生化学的病理（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィーまたは多発性硬化症）、あるいは癌性プロセスに関与する細胞を含み得る。形質転換動物細胞株または樹立動物細胞株としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、Ｆ９細胞などが挙げられ得る。本発明の方法での使用のための核酸供給源として適切な、他の細胞、細胞株、組織、器官および生物体は、当業者に明らかである。これらの細胞、組織、器官および生物体は、これらの天然の供給源から得られ得るか、またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような供給源および他の当業者に公知の供給源から商業的に得られ得る。
【００８１】
一旦、出発細胞、出発組織、出発器官、または他の出発サンプルが得られたら、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ）分子）が単離され得るか、あるいは、それらからｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーが、当該分野で周知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ  １５：６８７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３））によって調製され得る。
【００８２】
本発明のこの局面の実施において、第一の核酸分子を、上記のように得られた核酸テンプレート（好ましくはＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）、またはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子またはポリＡ＋ＲＮＡ分子））を、本発明の上記の１以上の化合物または組成物と混合して混合物を生成することにより合成され得る。投入された核酸分子の、逆転写（ＲＮＡテンプレートの場合）および／または重合化に都合のよい条件下で、その核酸テンプレートの全てまたは一部に相補的な第一の核酸分子の合成が、達成される。このような合成は、通常、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、またはそれらの誘導体）の存在下で達成される。
【００８３】
あるいは、本発明の化合物、組成物および方法は、二本鎖核酸分子の単一の管における合成に使用され得る。このアプローチにおいて、上記で合成された第一の核酸分子は、第一の核酸分子の全てまたは一部に相補的である第二の核酸分子を生成するのに十分な条件下でインキュベートされる。この第二鎖の合成は、例えば、改変Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ反応（Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｆｏｃｕｓ  ９：１（１９８７））により達成され得る。
【００８４】
もちろん、本発明の組成物および方法が有利に利用され得る核酸合成の他の技術は、当業者に容易に明らかである。
【００８５】
（増幅および配列決定の方法)
本発明の他の局面において、本発明の組成物は、核酸分子の増幅または配列決定のための方法において使用され得る。本発明のこの局面に従う核酸増幅方法は、一工程（例えば、一工程ＲＴ−ＰＣＲ）または二工程（例えば、二工程ＲＴ−ＰＣＲ）逆転写酵素増幅反応として当該分野で一般に公知の方法において、逆転写酵素活性を有する１以上のポリペプチドの使用をさらに含み得る。長い核酸分子（すなわち、長さ約３〜５Ｋｂより大きい）の増幅のために、本発明の組成物は、１９９７年２月１４日に出願の同一人の、同時係属中の米国出願第０８／８０１，７２０号（この開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に詳細に記載されるような、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの組み合わせを含み得る。
【００８６】
本発明のこの局面に従う増幅方法は、１以上の工程を含み得る。例えば、本発明は、（ａ）核酸テンプレートと本発明の１以上の上記の化合物または組成物を混合して、混合物を形成する工程；および（ｂ）そのテンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む、核酸分子を増幅するための方法を提供する。本発明はまた、このような方法によって増幅された核酸分子を提供する。
【００８７】
核酸分子またはフラグメントの増幅あるいは分析のための一般的な方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，８００，１５９号；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）を参照のこと）。例えば、本発明に従って使用され得る増幅方法は、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号；ＥＰ０６８４３１５）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ；米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ０３２９８２２）。
【００８８】
代表的に、これらの増幅方法は、以下の工程を包含する；核酸サンプルを１以上のプライマー配列の存在下で、核酸ポリメラーゼ活性を有する１以上のポリペプチドを含む化合物または組成物（例えば、本発明の化合物または組成物）に接触させる工程、その核酸サンプルを、好ましくはＰＣＲまたは等価の自動増幅技術によって増幅して、増幅された核酸フラグメントの収集物を生成する工程、ならびに必要に応じて、その増幅された核酸フラグメントを、好ましくはゲル電気泳動によって大きさで分離する工程、および核酸フラグメントの存在について、例えば、エチジウムブロマイドのような核酸染色色素でゲルを染色することにより、そのゲルを分析する工程。
【００８９】
本発明の方法による増幅後、その増幅された核酸フラグメントを、さらなる使用または特徴付けのために単離し得る。この工程は、通常、任意の物理的または生化学的方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（サイズクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびイムノクロマトグラフィーを含む）、密度勾配遠心および免疫吸着を含む）によって、その増幅された核酸フラグメントを大きさで分離することにより達成される。ゲル電気泳動による核酸フラグメントの分離が、とくに好ましい。なぜなら、それは、多くの核酸フラグメントの迅速で、かつ高い再現性のある厳密な分離方法を提供し、そして核酸のいくつかのサンプル中のフラグメントの直接的な、同時比較を可能にするからである。別の好ましい実施態様において、このアプローチを拡大して、これらのフラグメントまたは本発明の方法によって増幅された任意の核酸フラグメントを単離し得、そして特徴付け得る。従って、本発明はまた、本発明の増幅または合成方法によって生成された、単離された核酸分子に関する。
【００９０】
この実施態様において、１以上の増幅された核酸分子フラグメントは、標準的な技術（例えば、電気溶出または物理的な切り出し）に従って、同定（上記を参照のこと）に使用されたそのゲルから取り出される。次いで、その単離された独特の核酸フラグメントを、種々の原核生物（細菌）細胞または真核生物（酵母、植物、またはヒトおよび他の哺乳動物を含む動物）細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適切な、標準的なヌクレオチドベクター（発現ベクターを含む）に挿入され得る。あるいは、本発明の化合物、組成物および方法を使用して、増幅されそして単離された核酸分子は、例えば、配列決定法（すなわち、核酸フラグメントのヌクレオチド配列を決定すること）によって、以下に記載の方法、および当該分野で標準的な他の方法（例えば、米国特許第４，９６２，０２２および同第５，４９８，５２３号（これらは、ＤＮＡ配列決定法に関する）を参照のこと）によって、さらに特徴付けられ得る。
【００９１】
本発明に従う核酸配列決定方法は、１以上の工程を含み得る。例えば、本発明は、以下を含む核酸分子の配列決定のための方法を提供する；（ａ）配列決定されるべき核酸分子を、１以上のプライマー、本発明の１以上の上記の化合物および組成物、１以上のヌクレオチド、および１以上の終結物質（例えば、ジデオキシヌクレオチド）を混合して、混合物を形成する工程；（ｂ）配列決定されるべきその分子の全てまたは一部に相補的な分子の集団を合成するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程；および（ｃ）配列決定されるべきその分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定するために、その集団を分離する工程。
【００９２】
本発明の組成物を使用し得る核酸配列決定技術として、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号に開示されるような、ジデオキシ配列決定法が挙げられる。
【００９３】
（ベクターおよび宿主細胞)
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、およびこれらのベクターおよび宿主細胞を使用する、組換えポリペプチドの生成方法に関する。
【００９４】
本発明で使用されるベクターは、例えば、ファージまたはプラスミドであり得、そして好ましくは、プラスミドである。目的のポリペプチドをコードする核酸に対する、シス作用性の制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主により供給され得るか、補完ベクターにより供給され得るか、または宿主内への導入の際にそのベクター自体により供給され得る。
【００９５】
これに関する特定の好ましい実施態様において、ベクターは、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドの特異的発現を提供し；このような発現ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る。このようなベクターの中で、操作しやすい環境因子（例えば、温度および栄養添加物）により誘導されるベクターが、特に好ましい。
【００９６】
本発明において有用である発現ベクターとしては、染色体由来ベクター、エピソーム由来ベクターおよびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））が挙げられる。
【００９７】
ＤＮＡ挿入物は、ファージλＰLプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーターのような、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。遺伝子融合構築物は、転写開始、終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。その構築物により発現された成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリヌクレオチドの、その始まりで翻訳開始コドン、およびその末端で適切に配置される終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００９８】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーとしては、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００９９】
本発明での使用にとりわけ好ましいベクターとしては、以下が挙げられる；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）；ならびにｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＲＤ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１００】
適切な宿主細胞の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｅｒｗｉｎｉａ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉが宿主細胞として好ましく、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ＢおよびＳｔｂｌ２が、とくに好ましい。これらは、市販されている（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。
【０１０１】
（ペプチド生成)
上記のように、本発明の方法は、上記の核酸分子またはベクターの宿主細胞への挿入、およびその宿主細胞による目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を経て、任意の長さの任意のポリペプチドの生成に適している。形質転換宿主細胞を作製するための、宿主細胞内への核酸分子またはベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によりもたらされ得る。そのような方法は、例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような、多くの標準的な実験マニュアルに記載される。一旦、形質転換宿主細胞が得られたら、その細胞は、ｐＨおよび温度の任意の生理学的適合条件下で、宿主細胞の増殖を補助する、炭素、窒素、および必須ミネラルの同化可能な供給源を含む、任意の適切な栄養培地中で培養され得る。組換えポリペプチド産生培養条件は、その宿主細胞を形質転換するために使用されたベクターの型に従って変化する。例えば、特定の発現ベクターは、その組換えポリペプチドの産生を生じる遺伝子発現を開始するために、特定の温度での細胞増殖、またはその細胞増殖培地への特定の化学物質または誘導物質の添加を必要とする調節領域を含む。従って、本明細書中で使用される、用語「組換えポリペプチド産生条件」は、培養条件の任意の１つのセットに限定されるよう意味されない。上記の宿主細胞およびベクターについての適切な培養培地および条件は、当該分野で周知である。宿主細胞でのその産生の後、目的のポリペプチドは、いくつかの技術によって単離され得る。その宿主細胞から目的のポリペプチドを遊離するために、その細胞を溶解するか、または破壊する。この溶解は、その細胞に低張液を接触することによってか、リゾチームのような細胞壁破壊酵素で処理することによってか、超音波処理によってか、高圧での処理によってか、または上記の方法の組み合わせによって達成され得る。当業者に公知の、他の細菌細胞の破壊および溶解の方法もまた、使用され得る。
【０１０２】
破壊後に、そのポリペプチドは、複合混合物中の粒子の分離に適切な任意の技術により、細胞細片から分離され得る。次いで、そのポリペプチドは、周知の単離技術により精製され得る。精製のための適切な技術としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、電気泳動、免疫吸着、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）ＬＣ（ＨＰＬＣ）、高速（ｆａｓｔ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）ＬＣ（ＦＰＬＣ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
（キット)
本発明はまた、核酸分子の合成、増幅、または配列決定のためのキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、１以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）を含み得、これらは、本発明の１以上の組成物を含み得る。
【０１０４】
本発明のキットは、以下の１以上の成分を含み得る：（ｉ）本発明の１以上の化合物または組成物、（ｉｉ）１以上のポリメラーゼまたは逆転写酵素、（ｉｉｉ）１以上の適切な緩衝液、（ｉｖ）１以上のヌクレオチド、および（ｖ）１以上のプライマー。
【０１０５】
本明細書中に記載される方法および適用に対する、他の適切な改変ならびに順応は自明であり、そして本発明またはそれらのいずれの実施態様の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に容易に明らかである。ここで、本発明が詳細に記載されたが、本発明は、以下の実施例を参照することによって、より明らかに理解され、この以下の実施例は、例示の目的のみで本明細書中に含まれ、そして本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１０６】
（導入)
４−メチルモルホリンＮ−オキシド（本明細書中以降、「ＭＭＮＯ」という）を、高ＧＣ含量（例えば、ＣＡＧ反復、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓゲノムＤＮＡなど）を含む、多くの異なるＰＣＲアンプリコンで試験した。試験したアンプリコンは、通用している標準的ＰＣＲ反応混合液を用いて増幅することが困難であった。高ＧＣ含量アンプリコンからのＰＣＲ実行における新規の共溶媒の有効性を試験するために、ＭＭＮＯおよび他の共溶媒を異なる濃度でＰＣＲ反応混合液に添加した。
【０１０７】
（方法)
以下の章は、実施例において使用された化学物質の調製を記載する。
【０１０８】
（２．２×ＰＣＲ混合液の調製（実施例１−３）)
実施例１−３において、テンプレートＤＮＡおよびプライマーを除いて以下に列挙された全ての成分を含有する２．２×ＰＣＲ混合液を調製した。以下の表は、２．２×ＰＣＲ混合液の調製方法を例示する。
【０１０９】
【表１】
2011041573.tif 000008
（実施例１−９についての物質）：ベタイン一水和物（［カルボキシメチル］トリメチル−アンモニウム）、Ｌ−プロリン、４−メチルモルホリン−４−オキシド（ＭＭＮＯ）、エクトイン（ＴＨＰ［Ｂ］；［Ｓ］−２−メチル−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸）、ＤＬ−ピペコリン酸（ＤＬ−２−ピペリジンカルボン酸）、およびＬ−カルニチン（［−］−ｂ−ヒドロキシ−ｇ−［トリメチルアンモニオ］酪酸塩）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、そして滅菌蒸留水中に４Ｍストック溶液として調製し、そして濾過滅菌した。ＰＣＲ試薬：プラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度、１０×Ｔａｑ緩衝液（１×＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ）、５０ｍＭ塩化マグネシウム、１０×Ｔａｑ高忠実度緩衝液（１×＝６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ4（ｐＨ８．９）、１８ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、５０ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、Ｋ５６２ヒトゲノムＤＮＡ，および滅菌蒸留水を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から脱塩調製物として購入し、そしてさらなる精製なしで使用した。
【０１１０】
（実施例１：ＧＣリッチテンプレートからのＰＣＲ増幅を改善するための、プロリン，１−メチルイミダゾールおよび４−メチルイミダゾールの滴定)
いくつかの化学物質を試験して、それらがＧＣリッチテンプレートを使用するＰＣＲ実行を改善するか否かを調べた。第１の実施例において、ＧＣリッチテンプレートＰ５５Ｇ１２を、以下の３つの異なる化学物質のうちの１つの種々の濃度で試験した：アミノ酸プロリン、１−メチルイミダゾールおよび４−メチルイミダゾール。以下の成分を０．２ｍｌチューブ内で組合わせた：２．２×ＰＣＲ混合液１３ｍｌ、テンプレートＤＮＡ  ０．５ｍｌ（１０ｐｇ）、プライマー混合物（各１０ｍＭ）０．５ｍｌ、および４Ｍの化学物質溶液（プロリン、１−メチルイミダゾール、または４−メチルイミダゾールのいずれか）１３ｍｌ。そしてこの溶液を、ピペッティングによって混合した。ＰＣＲのプログラムは、以下の通りであった：９５℃で３分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル。ＰＣＲを実行した後、５ｍｌのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）色素を各チューブに添加し、そして１２ｍｌの混合液を電気泳動用アガロースゲルにローディングし、次いでＤＮＡフラグメントの存在について、このゲルをエチジウムブロマイド染色した。
【０１１１】
図１に示されるように、これら３つの化学物質の各々の特定の濃度は、他の濃度よりも良好に機能した。プロリンの場合、３００〜６００ｍＭがＰ５５Ｇ１２の最適な増幅を提供したが、６００ｍＭより高い濃度は全く産物を提供しなかった。１−メチルイミダゾールの場合、１００ｍＭおよび２００ｍＭが最良に働いたが、より高いかもしくはより低い濃度は、全く働かないかまたは非常により少ない産物を生成するかのいずれかであった。４−メチルイミダゾールの場合、わずかにより低い範囲の濃度が、増幅を改善した：６０〜１００ｍＭ。ＰＣＲ反応へのこれらの化合物の添加がない場合には増幅産物は全く存在せず、そして１Ｍのベタインが、反応を生産性にするのに有効であったことに留意のこと。
【０１１２】
（実施例２：ＧＣリッチテンプレートのＰＣＲについての４−メチルモルホリンＮ−オキシド（ＭＭＮＯ）の滴定；ＭＭＮＯおよびベタインの比較)
実施例１において、ＭＭＮＯを、ＧＣリッチテンプレートでのＰＣＲ実行を改善するための新規の試薬として同定した。取り組まれるべき次の問題は、ＰＣＲ混合液中のその濃度に対する、ＭＭＮＯの実行の依存性であった。ＧＣリッチアンプリコンＰ５５Ｇ１２は、１Ｍベタインまたは種々の濃度のＭＭＮＯの存在下で、実施例１において上記されたように増幅された。
【０１１３】
図２に示されるように、ＰＣＲ反応混合液中の４００〜１０００ｍＭのＭＭＮＯの含有が、１ＭベタインでのＰＣＲ産物の生成に強度において匹敵するＰＣＲ産物の生成を生じた。４００ｍＭより低いＭＭＮＯ濃度は、ＰＣＲ産物の生成を生じなかった。
【０１１４】
（実施例３：高ＧＣ含量アンプリコンのＰＣＲ増幅：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアンプリコン)
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのゲノムは、高ＧＣ含量（７０％のＧＣ）を含み、従ってＰＣＲによる増幅にとって興味深いものである。従って、サイズが１．３ｋｂ〜１．８ｋｂの範囲にある３つの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアンプリコンを、ＰＣＲ反応混合液中のベタイン、ＭＭＮＯまたはトリメチルアミン  Ｎ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）を使用する本発明のＰＣＲ方法において試験した。これら反応物中のテンプレートＤＮＡが、３０ｎｇのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａゲノムＤＮＡからなることを除いて、実施例１において記載されたものと同じ反応調製物を使用した。以下のＰＣＲプログラムを、ＤＮＡ増幅について使用した：９５℃で５分間；９４℃で２分間、５８℃で３０秒間、および７２℃で２分間の３５サイクル。
【０１１５】
図３に示されるように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの配列Ｄは、ベタインまたはＭＭＮＯの存在下で増幅され、一方で、配列ＥおよびＦは、ベタイン、ＭＭＮＯまたはＴＭＡＮＯの存在下で増幅された。これらの結果は、長い天然のＧＣリッチ配列（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのゲノム由来の配列）が、本発明の組成物および方法を使用して効率的に増幅され得ることを示す。
【０１１６】
（実施例４：ＧＣリッチテンプレートのＰＣＲ増幅の増強についての、ベタイン、プロリン、およびＭＭＮＯの比較)
変動する濃度のベタイン、プロリン、およびＭＭＮＯを、ヒトｐ５３エキソン１０の１５６ｂｐフラグメント（６２．２％のＧＣ）またはＤｅｉｎｏｃｏｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子についての２７８２ｂｐのコード領域（６６．７％のＧＣ）のＰＣＲ増幅を増強するそれらの効力について試験した。反応パラメータを変動させて、緩衝液組成およびマグネシウム濃度の効果を評価した。
【０１１７】
ＰＣＲ増幅を、薄壁の０．２ｍｌチューブを用いて、以下を含む５０ｍｌ反応物中で実行した：２．５ＵのプラチナＴａｑ、１×Ｔａｑ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ）または１×Ｔａｑ高忠実度緩衝液（６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ4（ｐＨ８．９）、１８ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4）のいずれか、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、および２００ｎＭの各プライマー。マグネシウム濃度として、塩化マグネシウム（Ｔａｑ緩衝液反応）または硫酸マグネシウム（Ｔａｑ高忠実度緩衝液反応）のいずれかを、１．０ｍＭと２．５ｍＭとの間を変動させた。各共溶媒（ベタイン、ＭＭＮＯ、またはプロリン）の量を、各図に示されるように変動させた。反応を、Ｐｒｅｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒモデル９６００または２４００サーマルサイクラーのいずれかを使用して温度サイクルした。ヒトｐ５３エキソン１０配列の増幅について、反応物は１００ｎｇのＫ５６２ヒトゲノムＤＮＡを含有し、そして９５℃で１分間、次いで９５℃で３０秒間の変性；６０℃で３０秒間のアニーリングおよび６８℃で１分間の伸長の３５サイクルでインキュベートした。ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ遺伝子の増幅について、反応物は２０ｎｇのＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓゲノムＤＮＡを含有し、そして９５℃で１分間、次いで９５℃で３０秒間の変性；５５℃で３０秒間のアニーリング、および６８℃で３分間の伸長の３５サイクルでインキュベートした。１０ｍｌの各ＰＣＲを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって、予期されるＤＮＡフラグメントの存在について分析した。
【０１１８】
図４に示されるように、１５６ｂｐのヒトｐ５３配列の首尾良い増幅は、マグネシウム濃度および特定の緩衝液条件に依存した。添加される共溶媒の非存在下で、標準的ＰＣＲ緩衝液を含有する反応物中で特定の産物は検出されず、そして１．０ｍＭのＭｇＳＯ4でのみ硫酸アンモニウム緩衝液（Ｔａｑ高忠実度緩衝液）を有するＰＣＲにおいて検出可能であった。ベタイン、ＭＭＮＯまたはプロリン共溶媒の添加は、両方の緩衝液系において、より広範なマグネシウム濃度にわたり、増幅産物の特異性および収率を改善した。最適マグネシウム濃度範囲でのＭＭＮＯの効果は、ベタインまたはプロリンのいずれかの効果よりもあまり明白でなかった。広範なマグネシウム最適条件を生成するベタインまたはプロリンの濃度は、Ｔａｑ高忠実度緩衝液よりもＴａｑ緩衝液において高かった。
【０１１９】
ｐ５３エキソン１０の増幅で得られた結果とは対照的に、ＭＭＮＯは、１．０〜２．５ｍＭの広範なマグネシウム濃度範囲にわたり、Ｄｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉについてより長い２．８ｋｂアンプリコンのＰＣＲを増強するのに高度に有効であった（図５）。この効果は、０．４Ｍと０．８Ｍとの間のＭＭＮＯ濃度に対して得られ、そして１Ｍのベタインについて観察された効果と類似した。プロリンの添加もまた、ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉフラグメントの増幅を増強するのに有効であった：しかし、プロリンについての有効濃度の範囲は非常により狭く、そしてマグネシウム濃度範囲に対するその効果は、ベタインまたはＭＭＮＯについて観察された効果よりも明白でなかった。一般に、Ｔａｑ高忠実度緩衝液を含有する反応物中よりも標準的Ｔａｑ緩衝液反応物中において、より高い濃度の各共溶媒がＰＣＲを増強するために必要とされた。これは、ｐ５３エキソン１０の増幅について得られた結果と一致する。Ｄｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  ＩのＰＣＲ産物は、共溶媒を含有しない反応物中において観察されなかった。
【０１２０】
（実施例５：ＭＭＮＯおよびプロリンの混合液はＧＣリッチテンプレートのＰＣＲ増幅を増強する)
前述の実施例の結果は、プロリンが短いＧＣリッチテンプレートの増幅について反応の最適条件を増強するのに高度に有効であり、そしてＭＭＮＯが長いＧＣリッチテンプレートの増幅を増強するのに有効であることを実証したので、この２つの化合物の混合物を試験して、これらがフラグメントのサイズとは無関係にＧＣリッチテンプレート増幅の増強を提供するか否かを調べた。この可能性を試験するために、ＧＣリッチテンプレートを、プロリン、ＭＭＮＯ、またはその両方を含む組成の存在下で増幅した。
【０１２１】
混合物組成において、ＭＭＮＯおよびプロリンの４Ｍ溶液を、それぞれ３：１、２：１、１：１、１：２および１：３の比率で組合わせて、４Ｍのハイブリッド共溶媒混合物を組成した。次いで、これらの混合物を、ｐ５３エキソン１０およびＤｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  ＩのＰＣＲ増幅に対する効果についてアッセイした。ＰＣＲ反応を、上記のように１×Ｔａｑ高忠実度緩衝液中にプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを有する５０ｍｌ容量において実施した。硫酸マグネシウム濃度を、試験される共溶媒の各濃度に対して１．０〜２．５ｍＭの間で変動させた。ＭＭＮＯ、ＭＭＮＯおよびプロリンの混合物、プロリン、ならびにベタインの濃度は、各図に示される通りである。
【０１２２】
図６において示されるように、ＭＭＮＯおよびプロリンの混合物は、いずれかの共溶媒単独で得られるより広範なマグネシウム濃度範囲および共溶媒濃度範囲にわたって、１５６ｂｐのｐ５３エキソン１０フラグメントの特異的増幅を増強するのに有効であった。ＭＭＮＯ：プロリン混合物の使用はまた、２．８ｋｂのＤｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉフラグメントの増幅を促進するのに高度に有効であり、そしてプロリン単独で得られる範囲よりも有効マグネシウム濃度範囲および共溶媒濃度範囲を有意に拡大した（図７）。以前に観察されたように、ＭＭＮＯは、試験されたマグネシウム濃度および共溶媒濃度の全範囲にわたってＰＣＲ増幅を増強した。ひとまとめにして、これらの結果は、Ｎ−アルキルカルボン酸およびＮ−アルキルアミン酸化物の混合物を含む組成物の使用が、ＧＣリッチテンプレートのＰＣＲ増幅を増強するために活用され得る新規の特性を生じることを実証する。詳細には、２：１〜１：２の比率で組合わせられたＭＭＮＯおよびプロリンの混合物を使用して、広範なサイズの範囲にわたりＧＣリッチテンプレートのＰＣＲ増幅を増強し得、そしてより広範なマグネシウム濃度にわたってＰＣＲ増幅の信頼度を増加し得る。
【０１２３】
（実施例６：ＭＭＮＯ：プロリン混合物は、広範なアニーリング温度最適にわたりＧＣリッチテンプレートのＰＣＲを増強する)
ＰＣＲ反応の間の最適アニーリング温度に対するＰＣＲ共溶媒の効果を評価するために、ＧＣリッチテンプレートＰ３２Ｄ９を、上記のＭＭＮＯ：プロリン混合組成物を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応を、薄壁の０．２ｍｌチューブ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、以下を含む５０ｍｌ反応物中で５０ｍｌ容量において実行した：２．５ＵのプラチナＴａｑ、１×Ｔａｑ高忠実度緩衝液（６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ4（ｐＨ８．９）、１８ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4）、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、１００ｎｇのＫ５６２ヒトゲノムＤＮＡ、および０．５Ｍのベタインもしくは０．５Ｍの１：１のＭＭＮＯ：プロリンのいずれかの添加共溶媒または添加共溶媒なし。濃縮したＭＭＮＯ：プロリン混合物を、等容量の４ＭのＭＭＮＯおよび４Ｍプロリンを混合することによって調製した。アニーリング温度の最適条件を、オイルなしの操作のために加温した蓋を有する勾配ブロックＲｏｂｏ−ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して研究した。９５℃での１分間の変性に続き、反応を９５℃で４５秒間；５５〜６６℃で４５秒間、６８℃で１分間で３５回サイクルした。各ＰＣＲの１０ｍｌを、０．５×ＴＢＥ中のアガロースゲル電気泳動（１％アガロース１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、およびエチジウムブロマイド染色によって分析した。
【０１２４】
図８において示されるように、ＰＣＲ共溶媒の非存在下において、特異的なＰＣＲ産物（１４９ｂｐ、７８．５％ＧＣのフラグメント）は、６６℃でのみ得られた。アニーリング温度を減少させるにつれて、産物の収率は迅速に減少し、非特異的産物の増幅を生じた。対照的に、ベタインおよびＭＭＮＯ：プロリン混合物の両方は、有効なアニーリング温度の範囲を拡大した。ＭＭＮＯ：プロリン混合物の使用は、ベタインで得られる産物収率よりも高い産物収率を生じ、そして６６℃から５５℃の全てのアニーリング温度勾配にわたり特異的産物の検出を可能にした。
【０１２５】
（実施例７：脆弱Ｘ  ＣＧＧ反復配列の増幅に対するＭＭＮＯ：プロリン混合物の使用)
ＭＭＮＯ：プロリン混合物を、非常に高いＧＣ含量のＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を促進するその能力についてベタインと比較した。プライマーを、脆弱Ｘ遺伝子座にあるヒトＦＭＲ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６１３７８）のＣＧＧ反復配列を含むように設計した。ＰＣＲ増幅を、２．５ＵプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度、１００ｎｇのＫ５６２ゲノムＤＮＡ、および２ｍＭ硫酸マグネシウム（最終濃度）を補充された１×Ｔａｑ高忠実度緩衝液を使用して、上記のように実施した。上記のように調製された４ＭのＭＭＮＯ：プロリン混合物、または４Ｍのベタインのアリコートを、いずれかの共溶媒の０．２５Ｍ〜２Ｍの最終濃度を生成するように量を変動してＰＣＲに添加した。ＰＣＲを、９５℃で１分間、次いで９５℃で３０秒間；５８℃で３０秒間；６８℃で３０秒間の３５サイクルでインキュベートした。これらの研究結果のアガロースゲル分析を図９に示す。
【０１２６】
これらの研究結果は、ベタインと比較した場合に、極めて高い（８０％を超える）ＧＣ含量の標的配列のＰＣＲ増幅を促進するＭＭＮＯ：プロリン混合物の優れた能力を実証する。ＰＣＲ共溶媒の非存在下において、特異的なＰＣＲ産物は全く検出されなかった。しかし、１．７５Ｍのベタインを含有する反応物中において、予期されるサイズのわずかなバンドが認識できた。対照的に、ＣＧＧ反復配列の頑健（ｒｏｂｕｓｔ）な増幅は、１．５〜２ＭのＭＭＮＯ：プロリンを含有する反応物中において実証された。
【０１２７】
（実施例８：長いＰＣＲ（ｌｏｎｇ  ＰＣＲ）におけるＭＭＮＯ：プロリン混合物の使用)
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびプルーフリーディング活性を保有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡポリメラーゼ混合液が、４０ｋｂまでのＤＮＡフラグメントの増幅のために使用されている（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０（１９９４））。長いＧＣリッチの配列の増幅を促進するＭＭＮＯ：プロリン混合物の能力を、２型アデノウイルスＤＮＡの７．７７ｋｂフラグメントまたは９．７５ｋｂフラグメント（約６０％のＧＣ）を増幅するように設計されたプライマーを使用して試験した。ＰＣＲを、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの代わりに２．５ＵプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼの酵素混合物である）を用いることを除いて本質的に上記のように、１ｐｇの２型アデノウイルスＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、１．５ｍＭの硫酸マグネシウムで補充された１×Ｔａｑ高忠実度緩衝液、および変動量（０〜１Ｍ）のＭＭＮＯ：プロリン混合物を使用して実施した。反応物を、９５℃で１分間、次いで９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で１０分間の３５サイクルでインキュベートした。
【０１２８】
図１０に示されるように、予期された７．７７ｋｂおよび９．７５ｋｂのＤＮＡフラグメントの首尾良い増幅は、ＭＭＮＯ：プロリン共溶媒の含有に依存した。特異的な産物は、ＭＭＮＯ：プロリンを有さない反応物中において検出されなかった；しかし、０．２５ＭのＭＭＮＯ：プロリン混合物を含有することによって、頑健な増幅および高産物収率が得られた。長いＰＣＲにおける産物収率は、ＭＭＮＯ：プロリンの濃度が増加するにつれて７．３ｋｂおよび９．７ｋｂの両方の標的についての産物収率が減少するように、使用されたＭＭＮＯ：プロリンの量に感受性であった。
【０１２９】
（実施例９：ＧＣリッチテンプレートのＰＣＲ増幅を増強するための補償溶質の比較)
広範な種々のアミノ化合物が、浸透圧ストレスから生物体を保護する際に重要な機能を果たすことが示されている。ベタインおよびプロリンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける主要な浸透圧保護物質（ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）である。これらの両方の化合物はＤＮＡヘリックスの安定性を破壊し、それによってＧＣリッチテンプレートの増幅を促進するので、他の公知の浸透圧調節化合物および市販の浸透圧調節化合物のＰＣＲにおける効果を研究した。
【０１３０】
ＰＣＲ混合液を、以下を含む５０ｍｌ容量中に調製した：２．５ＵのプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ4（ｐＨ８．９）、１８ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4、２００ｍＭのｄＮＴＰ（各々）、２００ｎＭのプライマー（各々）、１００ｎｇのＫ５６２ヒトゲノムＤＮＡ。そして変動量のＰＣＲ共溶媒を調製した。反応を、９５℃で１分間、次いで９５℃で３０秒間；５８℃で３０秒間；６８℃で１分間の３５サイクルでインキュベートした。
【０１３１】
ＭＭＮＯ：プロリン混合物、ベタイン、Ｌ−カルニチン、およびＤＬ−ピペコリン酸の効力の比較を図１１に示す。一方、ベタインに対してエクトインを比較した別個の実験の結果を、図１２に示す。実験条件は、最終反応物の容量が２５ｍｌであることを除き、本質的に上記と同じ条件であった。
【０１３２】
これらの実験において試験された全てのオスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）は、Ｐ３２Ｄ９配列の増幅を可能にするのに効果的であり、そして広範な種々のＮ−アルキルカルボン酸誘導体が、困難なテンプレート（例えば、ＧＣ含量が高いテンプレート）のＰＣＲ増幅を促進するために使用され得ることを実証する。
【０１３３】
ここで、理解の明確化の目的で、例示および実施例によって幾分詳細に本発明を十分に記載してきたが、同じことが本発明またはその任意の特定の実施態様の範囲に影響することなく、条件、処方、および他のパラメータの広範かつ等価な範囲内で本発明を改変または変更することによって実施され得、そしてそのような改変または変更が添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されることは、当業者に明らかである。
【０１３４】
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明の属する技術分野の当業者の技術レベルの指標であり、そして各個々の刊行物、特許、または特許出願が明確および個々に参考として援用されることが示される場合と同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【図１】
2011041573.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年11月12日(2010.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を合成する際に使用するための組成物であって、該組成物が、以下の式Ｉもしくは式ＩＩからなる群より選択される化学式を有する１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含む組成物であって、
【化１】
2011041573.tif 000027
ここで、Ａは
【化２】
2011041573.tif 000028
であり；
ここで、Ｘは
【化３】
2011041573.tif 000029
であり；
ここで、ｑ＝１〜１００，０００であって、ここでｑ＝２〜１００，０００である場合、式Ｉの各モノマーは式Ｉの他のモノマーと同じであっても異なっていてもよく；
ここで、ＺはＹと同じであっても異なっていてもよく；
ここで、各ＹおよびＺは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＰＯ3Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈおよび水素からなる群より独立して選択され；
ここで、ｆは０〜２の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、そしてｅは０〜２の整数であり；
ここで、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は同じであっても異なっていてもよく、そして水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、メルカプタン、チオール、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、カルボニル、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より独立して選択され、そしてｄは０〜２の整数であり；
ここで、ａ、ｂ、およびｃは独立して、０〜１の整数であり、ただし、ａ、ｄ、およびｃのうち２つより多くは０でなく；
ここで、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、同じであっても異なっていてもよく、そして以下：
ａ）＝Ｏ；
ｂ)
【化４】
2011041573.tif 000030
からなる群より独立して選択され；
ここで、各Ｒ7およびＷは、同じであっても異なっていてもよく、そして水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、カルボニル、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より独立して選択され；ｇは０〜２の整数であり、そしてｎは０〜２０の整数であり；
【化５】
2011041573.tif 000031
ここで、式ＩＩは飽和または不飽和であり；
ここで、ｑ＝１〜１００，０００であり、ここでｑ＝２〜１００，０００の場合、式ＩＩの各モノマーは式ＩＩの他の各モノマーと同じであっても異なっていてもよく；
ここで、ＸはＮ、Ｃ、Ｏ、ＰおよびＳからなる群より選択され；
ここで、ＹはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、−Ｏ−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＨ2−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ3）−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ3）2−ＮＨ−、−Ｏ−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−、−ＮＨ−Ｓ−、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｓ−および他のメルカプタン、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より選択され；
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、同じてあっても異なっていてもよく、そして水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、チオール、メルカプタン、ハロ、ニトロ、ニトリロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアリール、ホスファト、アルコキシ、オキシド、エーテル、エステル（アルカノイルオキシ）、カルボキシ、スルホニル、スルホンおよびアミド基からなる群より独立して選択され；そして
ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｍ、ｎ、およびｏは、同じであっても異なっていてもよい整数であり、そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅについては０〜２より、そしてｍ、ｎ、およびｏについては０〜５より独立して選択される、
組成物。