(57)【要約】【課題】インボルクリン発現抑制剤、及びインボルクリン発現抑制効果を有する皮膚老化予防剤を提供する。【解決手段】枳実（キジツ）、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、イチハツ（Iris tectorum）、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）及び陳皮（チンピ）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有するインボルクリン発現抑制剤及び皮膚老化予防剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枳実（キジツ）、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、イチハツ（Iris tectorum）、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）及び陳皮（チンピ）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有するインボルクリン発現抑制剤。
【請求項２】
枳実（キジツ）、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、イチハツ（Iris tectorum）、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）及び陳皮（チンピ）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚老化予防剤。
【請求項３】
ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、及びアメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インボルクリン発現抑制剤、皮膚老化予防剤及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インボルクリンは、表皮角化細胞の分化にしたがって有棘細胞で産生されるタンパク質で、角質細胞の細胞膜を裏打ちする強靭な不溶性膜であるコーニファイドエンベロープ（角質肥厚膜、cornified  envelope：以下ＣＥとも略記する）の主構成要素の１つである。ＣＥは、インボルクリンをはじめとする複数のＣＥ前駆体タンパク質が、酵素トランスグルタミナーゼにより架橋され不溶化して形成される。さらに、ＣＥを構成するインボルクリンは、その一部にセラミド等の脂質が共有結合し、疎水的な構造をとることで細胞間脂質ラメラ構造の形成にも寄与している。こうしたＣＥの形成・成熟化によって、細胞間脂質のラメラ構造が安定化して角質層のバリア機能が正常に働き、皮膚の水分保持機能や外部からの刺激に対する抵抗性を高めることができる。
【０００３】
このように、ＣＥは皮膚のバリア機能や皮膚の水分保持機能に重要な役割を果たしており、従来から、ＣＥの形成・成熟異常と種々の皮膚疾患との関連性が指摘されている。最近では、皮膚の老化に伴ってＣＥを構成する前駆体タンパク質の発現が増加すること、それに起因して、しわ形成、きめの減少、肌あれが起こることが指摘されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２８８１１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた発現抑制効果を奏するインボルクリン発現抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、インボルクリンの発現を抑制し、皮膚老化の予防・改善効果を奏しうる皮膚老化予防剤及び皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記課題に鑑み、健全なＣＥの形成を促進する要因として、ＣＥを構成する前駆体タンパク質に着目した。そのなかでも、ＣＥの主構成要素であり含有比率が最も高く、かつ細胞間脂質のラメラ構造の形成に関与するインボルクリンの発現が、特に皮膚の老化に大きな影響を与えると考え、インボルクリンの発現量をコントロールすることができれば、皮膚老化の予防・改善に資すると考えた。この知見に基づいて、インボルクリンの発現を抑制する作用を持つ物質を鋭意検討した結果、ある特定の植物抽出物にインボルクリンの発現を抑制する作用があることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
本発明は、枳実（キジツ）、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、イチハツ（Iris tectorum）、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）及び陳皮（チンピ）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有するインボルクリン発現抑制剤に関する。
【０００８】
また、本発明は、枳実（キジツ）、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、イチハツ（Iris tectorum）、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）及び陳皮（チンピ）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚老化予防剤に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、及びアメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のインボルクリン発現抑制剤は、優れたインボルクリン発現抑制効果を奏する。また、本発明の皮膚老化予防剤及び皮膚外用剤は、インボルクリンの発現を抑制し、皮膚老化の予防・改善効果を奏しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】枳実（キジツ）、セイヨウメギ、ムラサキマサキ、イチハツ、ホソバムラサキバレンギク、ヨロイグサ、ムラサキセンダイハギ、コウホン、アメリカサンショウ及び陳皮（チンピ）抽出物をそれぞれ添加したときのＰＲＬＰ０  ＲＮＡ相対発現量及びＩＶＬ／ＲＰＬＰ０  ＲＮＡ相対発現量を示す図である。なお、抽出物の濃度は、枳実（キジツ）、イチハツ、ヨロイグサ及びコウホンについては１．０％、セイヨウメギ、ムラサキマサキ、ホソバムラサキバレンギク、ムラサキセンダイハギ、アメリカサンショウ及び陳皮（チンピ）については０．５％である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のインボルクリン発現抑制剤及び皮膚老化予防剤は、枳実（キジツ）、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）、イチハツ（Iris tectorum）、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）、コウホン（Ligusticum sinense）、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）及び陳皮（チンピ）からなる群より選ばれる１種以上の植物の抽出物を有効成分として含有する。
【００１３】
本発明に用いられる植物について説明する。
本発明において、枳実（キジツ）は、ミカン科ミカン属の植物であるダイダイ（Citrus aurantium  L.  var.  daidai  Makino）の未熟果実、ミカン科ミカン属の植物であるナツミカン（Citrus natsudaidai  Hayata）の未熟果実、及びその他近縁植物の未熟果実である。枳実（キジツ）は、従来から生薬として用いられ、胃腸の機能改善等が知られている。
本発明において、セイヨウメギ（Berberis vulgaris）はバーベリーともいい、メギ科メギ属の植物である。
本発明において、ムラサキマサキ（Euonymus atropurpureus）はワーフー（Wahoo）ともいい、ニシキギ科ニシキギ属の植物である。
本発明において、イチハツ（一初）（Iris tectorum）は、アヤメ科アヤメ属の植物である。その根茎は鳶尾（エンビ）とも呼ばれ、生薬等として用いられている。
本発明において、ホソバムラサキバレンギク（Echinacea angustifolia）はエチナシ又はエキナセアともいい、キク科ムラサキバレンギク属の植物である。
本発明において、ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）は、セリ科シシウド属の植物である。その根は白シ（ビャクシ）とも呼ばれ、生薬等として用いられている。
本発明において、ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）はワイルドインディゴともいい、マメ科ムラサキセンダイハギ属の植物である。
本発明において、コウホン（藁本）（Ligusticum sinense）は、セリ科マルバトウキ（コウホン）属の植物である。その根茎は藁本（コウホン）と呼ばれる生薬等として用いられている。
本発明において、アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）はプリックリーアッシュともいい、ミカン科サンショウ属の植物である。
本発明において、陳皮（チンピ）は、ミカン科ミカン属の植物であるウンシュウミカン（Citrus unshiu  Markovich）の成熟果皮及びその他近縁植物の成熟果皮である。陳皮（チンピ）は、従来から生薬等として用いられている。
これらの植物は、自生しているものや市販のものから入手することができ、そのいずれを用いてもよい。
【００１４】
本発明における上記植物は、その植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、全草、根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子、果皮、莢、芽、花穂、心材等の任意の部分、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ又は複数を使用することができる。
【００１５】
本発明においては、上記植物の各部位の中でも、特に下記の部位を用いることが好ましい。
枳実（キジツ）については、ダイダイ又はナツミカンの未熟果実を用いることが好ましい。
【００１６】
セイヨウメギについては、セイヨウメギの根及び／又は樹皮を用いることが好ましい。
ムラサキマサキについては、ムラサキマサキの根及び／又は樹皮を用いることが好ましい。
イチハツについては、イチハツの根を用いることが好ましい。また、イチハツの根を用いる場合、生薬や漢方等として使用される鳶尾（エンビ）を用いてもよい。
ホソバムラサキバレンギクについては、ホソバムラサキバレンギクの葉を用いることが好ましい。
ヨロイグサについては、ヨロイグサの根を用いることが好ましい。また、ヨロイグサの根を用いる場合、生薬や漢方等として使用される白シ（ビャクシ）を用いてもよい。
ムラサキセンダイハギについては、ムラサキセンダイハギの葉を用いることが好ましい。
コウホンについては、コウホンの根茎を用いることが好ましい。また、コウホンの根茎を用いる場合、生薬や漢方等として使用される藁本（コウホン）を用いてもよい。
アメリカサンショウについては、アメリカサンショウの樹皮を用いることが好ましい。
陳皮（チンピ）については、ウンシュウミカンの成熟果皮を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明において、上記植物は、生のまま、絞り汁、乾燥粉末または溶剤抽出物等として使用される。
本発明において用いる、枳実、セイヨウメギ、ムラサキマサキ、イチハツ、ホソバムラサキバレンギク、ヨロイグサ、ムラサキセンダイハギ、コウホン、アメリカサンショウ及び陳皮の抽出物の製造方法については特に限定はなく、上記植物を通常の方法で抽出することにより抽出物を得ることができる。具体的には、上記植物を乾燥させた乾燥物、その粉砕物等を圧搾抽出することにより得られる搾汁、各種抽出溶剤による粗抽出物、粗抽出物を分配又はカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで精製して得られた抽出物画分などを本発明における抽出物として用いることができる。
上記の植物は生のままで抽出に供することも可能であるが、より抽出効率を高めるために、乾燥、細断、粉砕などの工程を加えることも好ましい。本発明の植物抽出物としては、上記植物を乾燥させた乾燥物又はその粉砕物から、抽出溶剤を用いて得られた抽出物を用いることがより好ましい。
【００１８】
本発明に用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイル等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の２種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。このうち、水、アルコール類、水−アルコール混合液を用いるのが好ましく、エタノール水溶液を用いるのがより好ましく、２０〜８０％エタノール水溶液（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いるのが特に好ましい。
【００１９】
本発明で用いられる抽出物を得るための抽出条件については、使用する溶剤によって異なり特に制限はないが、例えば水、アルコール類又は水−アルコール混合液により抽出する場合、好ましくは植物１質量部に対して１〜５０容量部の溶剤を用い、好ましくは４〜１００℃、より好ましくは２０〜６０℃の温度で、好ましくは１時間〜３０日間、より好ましくは１日〜２０日間静置抽出するのが好ましい。また、抽出効率を上げる為、併せて攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。
【００２０】
上記溶媒で抽出して得られた抽出物はそのまま使用してもよいが、濃縮したものを水や各種溶媒に再度溶解したり、液-液分配や吸着樹脂カラム、活性炭処理などによる夾雑物の除去処理を行うことも可能である。本発明において、植物の抽出物とは、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末を包含するものである。
また、本発明のインボルクリン発現抑制剤、皮膚老化予防剤又は皮膚外用剤においては、上記各植物又はその抽出物を単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００２１】
枳実、セイヨウメギ、ムラサキマサキ、イチハツ、ホソバムラサキバレンギク、ヨロイグサ、ムラサキセンダイハギ、コウホン、アメリカサンショウ及び陳皮から得られた植物抽出物は、後述の実施例に示すように優れたインボルクリン発現抑制作用を有し、これら抽出物を含有させることでインボルクリン発現抑制剤を得ることができる。また、前述したように、表皮におけるインボルクリンの発現量の増加と皮膚老化との間には関連があることが指摘されており、上記植物又はその抽出物を含有させることで皮膚老化の予防・改善を目的とした医薬、化粧料として使用可能である。さらに、視力障害の原因となるはん痕性角結膜症の患者の結膜では、インボルクリン等の角化に関与するタンパク及びそれらを架橋する酵素トランスグルタミナーゼの発現量が健常者に比べて増加しているとの報告がある（Investigative  Ophthalmology  and  Visual  Science  2001、42(3)、549-556）。このことから、上記植物又はその抽出物を含有させることで、はん痕性角結膜症の予防・治療を目的とした医薬等としても使用可能である。上記植物又はその抽出物がインボルクリン発現抑制作用を有することは従来全く知られておらず、本発明者等により得られた新しい知見である。
【００２２】
上記の植物又はその抽出物はそのままインボルクリン発現抑制剤として用いてもよい。又は、その効果に影響を与えない範囲で、上記植物抽出物に各種添加剤等を加えてもよい。例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体又は固体の賦形剤又は増量剤を加えてインボルクリン発現抑制剤として用いてもよい。
組成物とする場合、インボルクリン発現抑制剤中の上記植物抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分濃度として０．０００１〜１０質量％含まれるのが好ましく、０．０１〜５質量％含まれるのがより好ましく、０．１〜５質量％含まれるのがさらに好ましい。
【００２３】
上記の植物又はその抽出物はそのまま皮膚老化予防剤として用いてもよい。又は、上記植物抽出物を有効成分として含有させ、その効果に影響を与えない範囲で、他の成分を配合して皮膚老化予防剤とすることもできる。例えば、従来から皮膚老化の予防・改善作用が知られているジメトキシベンゾキノン、ゲラニルゲラニルアセトン等を併せて添加してもよい。さらに、皮膚老化防止剤以外の薬効成分として、保湿剤、美白剤、皮膚セラミド増加剤、皮膚表皮細胞促進剤等を併せて添加してもよい。
組成物とする場合、皮膚老化予防剤中の上記植物抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分濃度として０．０１〜１５質量％含まれるのが好ましく、０．１〜１０質量％含まれるのがより好ましく、１〜５質量％含まれるのがさらに好ましい。
【００２４】
本発明のインボルクリン発現抑制剤及び皮膚老化予防剤は、皮膚外用剤の形態で使用することができる。本発明の皮膚外用剤は、インボルクリン発現抑制作用を奏する上記植物抽出物、すなわち、枳実、セイヨウメギ、ムラサキマサキ、イチハツ、ホソバムラサキバレンギク、ヨロイグサ、ムラサキセンダイハギ、コウホン、アメリカサンショウ及び／又は陳皮の植物抽出物を有効成分として含有し、皮膚老化の予防・改善のために好適に用いられるものである。
また、本発明のインボルクリン発現抑制剤及び皮膚老化予防剤は皮膚外用剤以外の形態、例えば経口剤等として使用することも可能である。
【００２５】
本発明において、「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品、等として皮膚に適用されるものを意味する。その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。
本発明の皮膚外用剤には、上記植物抽出物に加えて、上述した各種添加剤やその他の薬効成分を適宜加えることができる。さらには取りうる剤型に応じて、皮膚外用剤に通常用いられる各種成分を配合することができる。皮膚外用剤の剤型として、具体的には、クリーム、乳液、ローション、ゲル、軟膏、ペースト、パック、シート状製品等、外用適用可能な種々の剤型とすることができ、これらの剤型とするにあたって、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等を配合することができる。
本発明の皮膚外用剤に含まれる上記植物抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分濃度として０．０１〜１５質量％含まれるのが好ましく、０．１〜１０質量％含まれるのがより好ましく、１〜５質量％含まれるのがさらに好ましい。
【００２６】
本発明の皮膚外用剤の使用量は、使用者の年齢、体重、症状の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態等により適宜選択、決定される。例えば、一般に１日当たり０．００１ｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重が好ましく、１日数回に分けて投与してもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
各抽出物の製造例
（製造例１）枳実抽出物の調製
ダイダイ（Ciyrus aurantium  L.  var.  daidai  Makino）の未熟果実の乾燥物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で２１日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、ダイダイ抽出物２９０．４ｍＬ（蒸発残分４．０８％（ｗ／ｖ））を得た。
【００２９】
（製造例２）セイヨウメギ抽出液の調製
セイヨウメギ(Berberis vulgaris)の根の細断物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で２３日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、セイヨウメギ抽出物３２３．７ｍＬ（蒸発残分０．５８％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３０】
（製造例３）ムラサキマサキ抽出物の調製
ムラサキマサキ(Euonymus atropurpureus)の根の細断物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で２０日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、ムラサキマサキ抽出物３１２．６ｍＬ（蒸発残分１．３０％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３１】
（製造例４）イチハツ抽出物の調製
イチハツ（Iris tectorum）の根の細断物２００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液３０００ｍＬを加え、８５℃加熱下、３時間抽出を行った。冷却後、抽出物をろ過、減圧濃縮して固形物３１ｇを得た。固形物を５０ｖｏｌ％エタノールに溶解し、イチハツ抽出物３１００ｍＬ（蒸発残分１．０％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３２】
（製造例５）ホソバムラサキバレンギク抽出物の調製
ホソバムラサキバレンギク（Echinecea angustifolia）の葉の乾燥物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で１３日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、ホソバムラサキバレンギク抽出物２３５．９ｍＬ（蒸発残分１．５７％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３３】
（製造例６）ヨロイグサ抽出物の調製
ヨロイグサ（Angelica dahurica  Benth.  et  Hook）の根の細断物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で２５日間抽出を行った。抽出物をろ過し、ヨロイグサ抽出物３４２．４ｍＬ（蒸発残分１．５３％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３４】
（製造例７）ムラサキセンダイハギ抽出物の調製
ムラサキセンダイハギ（Baptisia tinctoria）の葉の乾燥物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で１９日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、ムラサキセンダイハギ抽出物３２６．０ｍＬ（蒸発残分１．２０％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３５】
（製造例８）コウホン抽出物の調製
コウホン（Ligusticum sinense）の根茎４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で２５日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、コウホン抽出物３１９．７ｍＬ（蒸発残分２．０７％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３６】
（製造例９）アメリカサンショウ抽出物の調製
アメリカサンショウ（Zanthoxylum americanum）の樹皮の細断物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で２１日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、アメリカサンショウ抽出物３１９．７ｍＬ（蒸発残分１．１９％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３７】
（製造例１０）陳皮抽出物の調製
ウンシュウミカン（Citrus unshu  Markovich）の成熟果皮の細断物４０ｇに５０ｖｏｌ％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温、静置条件下で１８日間抽出を行った。その後、抽出物をろ過し、ウンシュウミカン抽出物３０４．６ｍＬ（蒸発残分３．３５％（ｗ／ｖ））を得た。
【００３８】
試験例  インボルクリン発現抑制試験
（１）正常ヒト表皮角化細胞
以下の２種類の正常ヒト表皮角化細胞を用いた。
ｉ）正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞：ＫＫ−４００９、ロット番号５Ｃ０７５９、クラボウ（倉敷紡績株式会社）製
ｉｉ）正常ヒト成人男性包皮由来表皮角化細胞：ＫＪＢ−１００、ロット番号ＦＯＲ２１Ｍ１１０５、コージンバイオ株式会社製
【００３９】
（２）培地やその他の試薬
培地として、正常ヒト表皮角化細胞増殖用無血清液体培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２  Ｍ−ＥＰＩ−２１５０Ｓ、クラボウ製）を用いた。添加剤としては、終濃度１０μｇ／ｍＬインスリン（ＩＮＳ）、０．１ｎｇ／ｍＬヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、０．５μｇ／ｍＬハイドロコーチゾン（ＨＣ）、抗菌剤（５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ）、０．４％Ｖ／Ｖウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）を用いた。
上記の添加剤を全て添加した培地：ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２（＋）を増殖用培地として以下の試験に用いた。また、上記の添加剤のうちＩＮＳ、ＨＣ、抗菌剤を添加した培地：ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２（−）を植物抽出物添加時の培地として用いた。継代培養には、０．０２５％Ｗ／Ｖのトリプシンと０．０１％Ｗ／ＶのＥＤＴＡとを含むトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＨＫ−３１２０、クラボウ製）とＦＢＳを１０％含むトリプシン中和液（ＨＫ−３２２０、クラボウ製）を用いた。
【００４０】
（３）インボルクリン発現抑制試験
６穴プレート又は１２穴プレートに正常ヒト表皮角化細胞を１．０〜１．５×１０４ｃｍ２にて播種し、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２（＋）培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で培養した。１〜３日間培養を行い、５０％〜６０％コンフルエントの状態になるのを確認した。その後、ＰＢＳで２回細胞を洗浄し、培地をＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２（−）に交換し、さらに２４時間培養した。上記で調製した植物抽出物を終濃度が０．５％Ｖ／Ｖ又は１．０％Ｖ／Ｖとなるようにそれぞれ添加したＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２（−）培地に交換し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとしては、それぞれの植物エキスの抽出溶媒を用いた。
ＰＢＳで２回細胞を洗浄し、アイソジェン（３１１−０２５０１、ニッポンジーン社製）を添加し、細胞を回収した。ニッポンジーン社が提示する標準的な方法に従い、細胞からＲＮＡを抽出、精製した。精製したＲＮＡの濃度の測定には、吸光分光度計及びＱｕａｎｔ−ｉＴＴＭ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｋｉｔ（Ｒ１１４９０、インビトロジェン社製）をそれぞれ用いた。インビトロジェン社が提示する標準的な方法に従い、ＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡ濃度を測定後、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（２０５３１１、キアゲン社製）を用いて、キアゲン社が提示する標準的な方法に従い、精製したＲＮＡからｃＤＮＡを得た。
アプライドバイオシステムズ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、インボルクリン（以下、ＩＶＬとも略記する）遺伝子及び内部標準遺伝子としてＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｒｇｅ  ＰＯ（以下、ＰＲＬＰ０とも略記する）遺伝子のＲＮＡの発現量をそれぞれ定量した。アプライドバイオシステムズ社が提示する標準的な方法に従い、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（４３０４４３７、  アプライドバイオシステムズ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（ＩＶＬ：Ｈｓ００８４６３０７＿ｓ１、ＲＰＬＰ０：Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍＬ、アプライドバイオシステムズ製）を用いた。各遺伝子について検量線法による相対定量を行なった。評価にあたり、ＩＶＬ遺伝子のＲＮＡ発現量を内部標準遺伝子であるＲＰＬＰ０遺伝子のＲＮＡ発現量で補正し、ＩＶＬ／ＲＰＬＰ０  ＲＮＡ量とした。更に、コントロールとして抽出溶媒のみを添加した細胞系のＩＶＬ／ＲＰＬＰ０  ＲＮＡ量を１とし、それに対する各抽出物のＩＶＬ／ＲＰＬＰ０  ＲＮＡ量を相対値で表しＩＶＬ／ＲＰＬＰ０  ＲＮＡ  相対発現量とした。結果を図１に示す。図１において、ＰＲＬＰ０  ＲＮＡ  相対発現量を四角、ＩＶＬ／ＲＰＬＰ０  ＲＮＡ  相対発現量を棒グラフでそれぞれ示す。
【００４１】
図１から明らかなように、枳実、セイヨウメギ、ムラサキマサキ、イチハツ、ホソバムラサキバレンギク、ヨロイグサ、ムラサキセンダイハギ、コウホン、アメリカサンショウ及び陳皮抽出物が、それぞれインボルクリン発現を抑制する作用を有することが認められた。したがって、上記植物またはその抽出物を含有する本発明のインボルクリン発現抑制剤は、インボルクリンの発現を抑制することができる。
前述のように、インボルクリンの発現を抑制すると皮膚の老化が改善・抑制されることが知られている。したがって、図１の結果から、本発明の上記植物及びその抽出物はインボルクリンの発現を抑制することで、皮膚老化を予防・改善できることがわかる。
【００４２】
（処方例）
前記製造例で得られた抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、美容液、化粧水を常法により各々調製した。
【００４３】
１．ローションの調製
（組成）                                              （配合：質量％）
エタノール                                          ８０．０    
モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン            ０．５    
香料                                                  ０．１    
精製水                                              １８．４    
抽出物                                                １．０    
【００４４】
２．美容液の調製
（組成）                                              （配合：質量％）
パルミチン酸カルシウム                                １．８    
スクワレン                                          ２０．０    
パルミチン酸                                          ２．０      
ステアリン酸                                          ３．０    
グリセリン                                          ２０．０    
１，３−ブチレングリコール                          １０．０    
精製水                                              ４２．２    
抽出物                                                １．０    
【００４５】
３．化粧水の調製
（組成）                                              （配合：質量％）
Ｎ−アミジノ―トランス―４―ヒドロキシ―Ｌ−プロリン      ２．０  
エデト酸２ナトリウム                                      ０．０５    
モノラウリン酸ポリエチレン（２０）ソルビタン              １．０      
１，３−ブチレングリコール                                ３．０      
ソルビトール（７０）                                      ２．０    
ピロリドンカルボン酸ナトリウム                            ３．０    
エタノール                                              １０．０
抽出物                                                    １．０
精製水                                                  ７７．９５
【図１】
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