(57)【要約】【課題】神経細胞の分化促進活性を有する、安全性に優れた経細胞分化促進剤を提供すること。【解決手段】Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるペプチドまたはその塩を有効成分とする神経細胞分化促進剤。該神経細胞分化促進剤は、神経細胞分化促進活性が高く、有効成分であるペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）はコラーゲンなどの生体由来のものであるため、安全性も高い。該神経細胞分化促進剤は、ヒトや非ヒト動物の脳内における神経疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、認知症、うつ病）の治療剤として用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるペプチドまたはその塩を有効成分とする神経細胞分化促進剤。
【請求項２】
経口投与される請求項１記載の神経細胞分化促進剤。
【請求項３】
非経口投与される請求項１記載の神経細胞分化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性が高く、且つ継続摂取が容易な神経細胞分化促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病やパーキンソン病など脳の神経変性疾患に対する根本的な治療剤は未だに存在していない。病気の進行を遅らせることができても、疾病そのものを治癒することはできず、また医薬品の副作用も問題になっているのが現状である。その結果、日本においては急速な高齢化に伴い認知症患者数が増加し、社会問題となっている。一方、健常人であっても、加齢に伴い物忘れが多発したり学習能が低下したりするが、やはりこれらの現象も脳における神経変性が一因であるといわれている。これらの機能低下に対し、予防可能な健康食品や医薬品が望まれているが、やはり決定的なものは知られていない。
【０００３】
これらの脳機能異常に起因する疾病や生理現象に対して、神経細胞の分化促進が有効な防御手段であると考えられている。
【０００４】
神経細胞は、その周囲に存在するグリア細胞などから分泌される神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの生理活性物質により、神経細胞の分化、維持、修復が制御されている。神経栄養因子の代表的なものとして神経成長因子（ＮＧＦ：ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）が知られているが、ＮＧＦは神経細胞の分化、維持および修復作用を有し、脳神経系の機能回復を促進する重要なタンパク質である。しかしながら、ＮＧＦは高分子であるために血液脳関門を通過できず、経口摂取する医薬品や食品としての開発は容易でない。また、効果的な遺伝子治療も実用化には程遠い。したがって、ＮＧＦ様あるいはＮＧＦの作用を増強する性質を有し、血液脳関門を通過する低分子化合物が望まれている。
【０００５】
ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞は、ＮＧＦを添加することによりその細胞の増殖が停止し、神経突起を持つ神経様細胞に分化することが知られており、神経細胞分化促進作用を有する化合物の探索に多用されるモデル細胞である。
【０００６】
現在までにも、ＰＣ１２細胞を対象とする神経細胞の分化を促進する剤が多く特定され開示されている。（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）。しかしながら、これらの有効成分は、吸収性や安定性に乏しい高分子なペプチドであったり、化学合成法による非天然物であったり、あるいは天然物であっても微生物による産物であり、人の食経験がないものであり、安全性の観点で問題を有している。食経験のある冬虫夏草由来の新規セスキテルペン（特許文献７）については、冬虫夏草から抽出精製するには希少成分ゆえに大量生産は困難であるし、前駆体からの合成でもコスト面の問題があり、また食品としては使用しにくい。また、神経網の形成促進作用を有する脂肪酸も提示されているが、低濃度での活性は低く、また脂肪酸の多量摂取がカロリー過多になり、さらに脂肪酸が有する他の生理活性により代謝が乱される危険性がある（特許文献８）。
【０００７】
神経細胞分化促進作用を有するペプチドとしては、他にも報告があるが（非特許文献１）、プロテアーゼ耐性を有する構造をとったものは示されていない。
【０００８】
一方、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列からなるペプチドに関しては、創傷治療用組成物としての使用（特許文献９）、コラーゲン産生剤（特許文献１０）、調味料（特許文献１１）が知れているが、いずれも脳内の神経細胞に関係した技術ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１８９６１５号公報
【特許文献２】特開２００６−４２６８４号公報
【特許文献３】特開２０００−１２５８９４号公報
【特許文献４】特開平１１−４９７１８号公報
【特許文献５】特開平９−３２３９２８号公報
【特許文献６】特許第３９９０４７７号公報
【特許文献７】特開２００３−２５２８７６号公報
【特許文献８】特開２００７−２１７３１１号公報
【特許文献９】特開平１０−３１０５３４号公報
【特許文献１０】特開２００３−１３７８０７号公報
【特許文献１１】国際公開第２００４／１０７８８０号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（１２）、２５４１−２５４７，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、神経細胞の分化促進活性を有する、安全性に優れた神経細胞分化促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、神経細胞の分化促進活性を有する成分について鋭意検討を重ねた結果、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａが優れた神経細胞分化促進活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるペプチド、またはその塩を有効成分とする神経細胞分化促進剤、
〔２〕経口投与される前記〔１〕記載の神経細胞分化促進剤、
〔３〕非経口投与される前記〔１〕記載の神経細胞分化促進剤
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の神経細胞分化促進剤は、神経細胞分化促進活性が高く、有効成分であるペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）はコラーゲンなどの生体由来のものであるため、安全性も高い。
【００１５】
また、ヒトや非ヒト動物の生体内に存在するほとんどのプロテアーゼは、Ｘ−Ｐｒｏ結合を切断することは困難であり、またＰｒｏ−Ｙ結合を切断することも比較的困難であることが知られている。したがって、本発明の神経細胞分化促進剤の有効成分であるペプチドは３残基であり、生体内のプロテアーゼに対する耐性は高いため、生体内でも安定して存在できる。
【００１６】
また、従来から、医薬品としての生理活性ペプチドは、高い生理活性が失われないように静脈内注射などの非経口投与などにより投薬されており、さらに、経粘膜吸収されやすい低分子のペプチドに限っては、実際に経粘膜吸収型のインスリン製剤などに見られるように医療現場で広く実地に応用されている。したがって、本発明の神経細胞分化促進剤の有効成分であるペプチドは３残基の低分子であることから、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与などの非経口投与だけでなく、経口投与した場合でも、口腔粘膜、胃壁、腸壁などを経て生体内へ吸収されやすい。
【００１７】
以上のように、本発明の神経細胞分化促進剤は、生体内に吸収されやすい低分子を主成分としており、吸収後に血液中や組織・器官でできる限り安定に存在することが予想され、投与経路に関わらず、血流を通じて脳内に有効量が到達することができるため、少ない量でも生理活性（神経細胞分化促進活性）を発揮することが可能な神経細胞分化促進剤である。
【００１８】
また、本発明の神経細胞分化促進剤は、有効成分であるペプチドは３残基の低分子であることから低アレルゲン性である。
【００１９】
また、本発明の神経細胞分化促進剤は、水に可溶なペプチドであり、さらに加熱処理などによっても酸化や分解が起こりにくい安定性の高いペプチドであることから、保存性や加工適性に優れる。
【００２０】
なお、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａを部分配列とする生理活性ペプチドが種々報告されているが、ペプチドは一残基欠失あるいは改変するだけで、生理活性は消失もしくは増強されることは公知のことであるから、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの神経細胞分化促進活性を類似ペプチドから推定することは極めて困難である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、実施例における、ＰＣ１２細胞の分化促進作用の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例において、ＮＧＦのみを添加したＰＣ１２細胞の顕微鏡で観察したときの状態を示す図である。
【図３】図３は、実施例において、ＮＧＦとペプチドＧＰＡを添加したＰＣ１２細胞の顕微鏡で観察したときの状態を示す図である。
【図４】図４は、実施例において、ＮＧＦとペプチドＧＰＭを添加したＰＣ１２細胞の顕微鏡で観察したときの状態を示す図である。
【図５】図５は、実施例において、ＮＧＦとペプチドＧＰＳを添加したＰＣ１２細胞の顕微鏡で観察したときの状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａのアミノ酸配列からなるペプチドが、神経細胞の分化促進活性を有することを初めて見出し、完成させたものである。
【００２３】
即ち、本発明の神経新生促進剤は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、本発明で用いるペプチドと略する）またはその塩を含有する。本明細書においては、特に断わらない限り、アミノ酸残基は、Ｌ型アミノ酸残基を意味する。
【００２４】
本発明で用いるペプチドの塩としては、食品としての使用が可能なナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、リジン、オルニチンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
本発明の有効成分であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるペプチドまたはその塩は、水和物、各種溶媒和物として、または結晶多形の物質として単離される場合もあり、本発明にはこれらの単離されたものおよび混合物の全てが包含される。
【００２５】
本発明で用いるペプチドまたはその塩は、タンパク質の酵素分解物から公知の方法によって製造することもできるし、該ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、公知のペプチド合成法に準じて製造することもできる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
【００２６】
前記タンパク質としては、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、人参タンパク質などが挙げられる。
前記タンパク質の酵素分解については、タンパク質の種類や酵素の種類、反応条件など、特に限定されるものではなく、基質となるタンパク質中にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ配列が１箇所以上存在しており、１段階以上の酵素消化あるいは複数種類の酵素消化により、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａが生じる条件であればよい。例えば、コラーゲンあるいはゼラチンのコラゲナーゼ消化が該当する。酵素消化後は、通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられるペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２７】
なお、化学的な合成反応後も上記と同様な公知の精製法が適用できる。
【００２８】
また、本発明で用いられるペプチドを遺伝工学的な手法で製造する方法として、例えば、前記ペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを作製して行うことができる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した原料由来のｃＤＮＡ、前記した原料由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００２９】
前記のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡリガーゼ、制限酵素などの公知の方法を用いてベクターに組み込み、次いでそのベクターを宿主細胞中で増幅させることも可能である。ベクター、宿主細胞などについては公知のものであれば特に限定はない。培養した宿主細胞から本発明のペプチドを分離精製することで、本発明に用いられるペプチドを大量に得ることができる。分離精製方法としては、公知の方法であれば特に限定はない。
【００３０】
これらの中でも、タンパク質の酵素分解物を用いることは、安定して大量生産をし易い観点から好ましい。
【００３１】
本発明の神経細胞分化促進剤は、前記ペプチドまたはその塩を有効成分とするものであり、前記ペプチドまたはその塩は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、人参タンパク質などの食経験のある生体由来の成分であるため、安全性が高く、低毒性のものである。
【００３２】
本発明の神経細胞分化促進剤は、例えば、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
【００３３】
本発明の神経細胞分化促進剤は、前記のヒトや非ヒト動物の脳における神経細胞の分化を促進することから、前記の動物において脳内における神経疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、認知症、うつ病）の治療剤として用いることができる。
【００３４】
神経疾患治療剤としては従来から種々の合成系の試薬が市販されているが、これらの市販された試薬は、種々の副作用を伴うことが報告されている。また、神経疾患治療剤は副作用を起こさないよう、投薬という行為にも熟練を要するという問題もある。
これに対して、本発明の神経細胞分化促進剤は、有効成分である前記ペプチドまたはその塩がわずか３残基の低分子ペプチドであることから内因性ホルモン様の強力な生理活性を示すものではないと考えられる。したがって、マイルドに作用すると考えられる点で安全性に優れている。また古来より食品中の一成分として食経験がある点からも、安全性に優れるという利点がある。
【００３５】
本発明の神経細胞分化促進剤を治療剤として用いる場合、前記ペプチドまたはその塩を、単独または賦形剤あるいは担体と混合して、経口投与剤、注射剤、点滴剤あるいは坐剤などとすることができる。
前記賦形剤や担体としては薬剤学的に許容されれば問題なく、投与経路や投与方法によりその種類および組成は異なる。
【００３６】
経口投与剤としては、目的に応じていろいろな基材を選択でき、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミ、飲料などが挙げられる。中でも、前記ペプチドまたはその塩を少量で継続的に摂取する場合は、おいしさや手軽さを付与することが出来、継続して摂取するにはより効果的であるため、味覚を感じる基材である飴、グミあるいは飲料といった基材が望ましい。しかし、有効成分をある程度の量を含有させると、そのおいしさを損なうことや、場合によってはその基材そのものの物性を変化させてしまうこともある。したがって、数ｇといったある一定量の有効成分を継続的に摂取する場合は、いわゆるサプリメントといわれるような形が望ましく、水やお湯で服用するような固体組成物であることが好ましい。
【００３７】
前記固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤などが挙げられる。このような固体組成物においては、前記ペプチドまたはその塩が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、ショ糖、乳糖、ぶどう糖などの各種糖類、マンニトール、ソルビトールなどの各種糖アルコール、さらにはヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、各種でんぷんなどと混合される。固体組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、ラクトースのような安定化剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解剤乃至溶解補助剤を含有してもよい。場合によっては、香料、甘味料などといった添加物も使用できる。また、錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖などの糖類、マルチトールなどの糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどでコーティングを施したりすることもできる。また、固体組成物を胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。
【００３８】
注射剤または点滴剤としては、生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトール等の糖類溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール類に前記ペプチドまたはその塩を配合することが望ましい。
【００３９】
また、坐剤としては、前記ペプチドまたはその塩を、油脂性基剤、水溶性基剤などの基剤、必要であれば乳化剤、懸濁化剤などと混和して均等にした後、適当な形状にし、溶解法、冷圧法、手工法によって調製したものが挙げられる。
【００４０】
前記治療剤としての製剤中における前記ペプチドまたはその塩の含有量は、製剤の種類により異なるが、通常０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８重量％である。例えば、注射剤として用いる場合には、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％の有効成分を含むことが望ましい。
【００４１】
治療剤の場合、前記ペプチドまたはその塩の投与量は、ヒトであれば通常成人一日当たり、経口投与で１０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇが好適であり、これを１日１回あるいは２〜数回に分けて投与される。また、注射液などの非経口投与であれば、ヒトであれば通常成人一日当たり、前記ペプチドまたはその塩の投与量は、２ｍｇ〜６ｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２ｇが好適であり、これを１日１回あるいは２〜数回に分けて投与される。
なお、投与量は、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。被検体がヒト以外の非ヒト動物であれば上記のヒトに準じて投与量を調整すればよい。
【００４２】
また、本発明の神経細胞分化促進剤は、安全性に優れるために、他の脳機能改善効果を有するといわれている化合物や素材と組み合わせて使用することも可能である。このような化合物や素材の例として、脳の栄養源であるブドウ糖、神経系に作用するカフェイン等のプリン誘導体、脳の構成成分であるフォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸等の脂質、血流改善作用を有するイチョウ葉エキスなどの組成物、補酵素であるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、酸化型コエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０などが挙げられる。組み合わせ方は何ら制限されるものではなく、期待する効果の程度、味などの呈味面、コスト、加工適性や安定性などから適したもの１種以上を組み合わせて用いることができる。この場合、本発明の神経細胞分化促進効果と、併用する化合物や素材が奏する効果との相加効果に留まらず、想定される以上の治癒速度や治療効果までもが得られることが考えられる。これは、作用メカニズムが異なる複数の素材の組み合わせ効果によるものである。
【００４３】
また、本発明の神経新生促進剤は、ヒトおよび非ヒト動物における神経疾患の予防を目的に使用することができる。
【００４４】
本発明の神経細胞分化促進剤は、神経疾患の予防を期待して使用する場合は、前記のような経口投与剤、注射剤、点滴剤、坐剤などの形態で、その有効量をヒトまたは非ヒト動物に対して投与することができる。
【００４５】
また、本発明の神経細胞分化促進剤は、極めて優れた安全性、吸収性、低アレルゲン性、物性面の安定性や優れた加工適性を兼ね備えていることから、調製粉乳、離乳食など乳幼児用食品に用いることもでき、さらに、高齢者向けの咀嚼や嚥下困難者向けのゼリー状の栄養食品の原料の一部として用いることもできる。
【００４６】
神経疾患の予防のための前記ペプチドまたはその塩の投与量としては、被検体の年齢、体重、症状、治療効果、投与ルート等により異なり、これらを考慮して適宜設定されるが、例えば、ヒトであれば通常成人一日当たり、０．１ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｇが好適であり、これを１日１回あるいは２〜数回に分けて投与される。投与量は予防目的やその他の種々の条件によって変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。被検体が非ヒト動物であれば上記のヒトに準じて投与量を調整すればよい。
【００４７】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これにより本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
（実験設計）
ＰＣ１２細胞を用い、ペプチドの神経細胞分化促進作用を検討した。この目的は、神経幹細胞が神経細胞へと分化する過程（以降、神経分化という）において、被験物質の分化促進作用について検討するものである。実験系としては、ＰＣ１２細胞を利用する。ＰＣ１２細胞は副腎髄質由来の褐色細胞腫であり、神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で神経突起の形成と伸長がおこり、カテコールアミン性の神経様細胞に分化することが知られている（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｔｓｃｈｌｅｒ，  １９７６）。この系は、比較的容易に幹細胞様の細胞株から神経様細胞へと分化する過程が観察できることから、神経分化の分子メカニズムを究明する上で世界的に利用されている。
【００４９】
（被験試料の合成・精製）
被験試料として用いた３種類のペプチド、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（以下ＧＰＡと記す）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（以下ＧＰＭと記す）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（以下ＧＰＳと記す）は和光純薬株式会社から購入した。全て、Ｆ−ｍｏｃ法にてそれぞれ化学合成され、全てＨＰＬＣにより純度が９９％以上になるように精製されたものである。
【００５０】
（神経細胞分化促進活性の測定）
ＰＣ１２細胞を培養するにあたり、培養液は８５％ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、品番７２４００−０４７）、１０％馬血清（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、品番１６０５０−１２２）、５％仔牛血清（Ｓｉｇｍａ社、品番Ｆ９４２３）、および５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン・５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、品番１５１４０−１２２）を含む培地を、培養皿はタイプＩＶコラーゲン（ＴｙｐｅＩＶ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ）でコーテ
ィングされた６０ｍｍ径の細胞培養用プラスチックディッシュ（Ｉｗａｋｉ社、品番１２−０１８−００４）を用いた。ＰＣ１２細胞はＤＳファーマバイオメディカル社より入手し（品番８８０２２４０１）、細胞を５ｍｌの培養液を含んだ培養皿に入れて、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ2の条件で増殖状態を維持し、週に１−２度の培地交換および週に１度の継代培養を行った。
【００５１】
分化誘導に際しては、顕微鏡観察の便宜上、コラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ社、品番１  １７９  １７９）でコーティングしたカバースリップ（径１５ｍｍの円形ガラス薄片、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ社、品番１５、Ｎｏ．１）上で細胞を培養した。分化誘導の前日、コーティングされたカバースリップが入った１２ウェルプレート（ＴＰＰ社、品番９２４１２）に、細胞密度が２．５〜１０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2になるようにＰＣ１２細胞懸濁液を注ぎ（０．６ｍｌ細胞懸濁液／ウェル）、培養液中で１日間前培養を行った。分化誘導の当日、１２ウェルプレートの培養液を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄したのち（培養液中の血清やカバースリップに付着しなかった細胞を除去する目的）、各種の分化誘導培地を添加した。分化誘導培地は、９９％ＲＰＭＩ１６４０培地、１％馬血清、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを基本組成とし、分化誘導剤としてＮＧＦを終濃度が５０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。ネガティブコントロールにはＮＧＦを含まない培地を用い、通常この条件下ではＰＣ１２細胞の神経分化は誘導されない。また、ＮＧＦと共に各種の合成ペプチド（ＧＰＡ、ＧＰＭ、ＧＰＳ）を終濃度１０μＭ含有する分化誘導培地を調製し、各ペプチドの分化促進に対する作用を比較した。これら各種の分化誘導培地でＰＣ１２細胞をさらに１週間インキュベータで培養し、神経様細胞への分化を誘導した。１回の実験につき、各サンプルあたり少なくとも２つのウェルを使用し、複数回実験を行った。
【００５２】
ＰＣ１２細胞の神経分化は、神経突起の形成の有無をもって判定した。神経突起は通常、分化細胞あたり１本から数本観察され、直径が１μｍ程度、長さが数μｍから数百μｍと細長い構造を有し、分岐もみられる。本実験では、神経突起を明瞭に観察するために、神経突起を構成する主要な構造タンパク質であるチュブリンに注目し、抗チュブリン抗体をもちいて蛍光抗体染色を行った。即ち、１週間の分化誘導後、１２ウェルプレートの分化誘導培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）を注いで、室温で１５分間細胞を固定した。次に、１００％メタノールに置換して−２０℃で２０分間放置することで、細胞膜を溶解し抗体の浸透を高める処理を行い、その後ＰＢＳで洗浄した。さらに、抗体の非特異的吸着を防ぐために３％の血清を含むＰＢＳ（ブロッキング溶液）で１０分間処理を行った。抗体溶液は、ブロッキング溶液に蛍光物質Ｃｙ３で化学標識された抗チュブリン−マウスモノクローナル抗体（６００倍希釈、Ｓｉｇｍａ社、品番Ｃ４５８５）と核染色剤であるＳＹＴＯ１３ｇｒｅｅｎ（１，０００倍希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社、品番Ｓ７５７５）を加えて調製し、これを前処理した細胞に加えて室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳによる洗浄で反応していない抗体を除去し、最後に封入剤（５０％グリセリン）を用いてプレパラートを作製した。
【００５３】
観察は、ＬＳＭ５１０レーザー操作共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を用い、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）およびヘリウムネオンレーザー（５４３ｎｍ）による励起光で、ＳＹＴＯ１３ｇｒｅｅｎの緑色蛍光（５０９ｎｍ）およびＣｙ３の赤色蛍光（５６８ｎｍ）を観察した。２０倍（２０×）の対物レンズを用いて２００倍で蛍光観察を行い、カバースリップの異なる領域にある細胞を無作為に撮影した（およそ１０細胞／画像）。それぞれのサンプルにつき、細胞数が少なくとも１５０個以上になるように観察を行った。画像解析では、ＳＹＴ１３ｇｒｅｅｎ核染色により正常な細胞核を有する細胞を計測して細胞数とし、Ｃｙ３標識−抗チュブリン抗体で染色された長さ５μｍ以上の神経突起を有する細胞を計測して分化細胞数とした。各画像について分化細胞の割合（分化細胞数／全細胞数のパーセント表示）を算出して統計解析（ＳＰＳＳ）を行い、各ペプチドの神経細胞の分化における促進活性を検討した。
【００５４】
（結果）
分化誘導１週間後、ＮＧＦを添加していないネガティブコントロールではＣｙ３標識−抗チュブリン抗体で陽性の５μｍ以上の神経突起を有する分化細胞はみられなかった（データ省略）。一方、図１に示すように、ＮＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した検体では神経突起を有する細胞が観察され、全細胞数に対する分化細胞の割合は２１．３％であった（分化細胞数：３７２、未分化細胞数：１３７６、合計１７４８；図１中にＮＧＦとして示す）。次に、ＮＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）と共に３つの異なる合成トリペプチド（ＧＰＡ、ＧＰＭ、およびＧＰＳ）を終濃度が１０μＭになるように加えたサンプルについて解析を行った（図１中にＮＧＦ＋ＧＰＡ、ＮＧＦ＋ＧＰＭ、ＮＧＦ＋ＧＰＳとして示す）。分化細胞の割合は、それぞれのペプチドについて２８．８％（分化細胞：４６、未分化細胞：１１４、合計：１６０）、２１．１％（分化３７、未分化１３８、合計１７５）、２３．２％（分化５７、未分化１８９、合計２４６）であった。また、ＮＧＦのみに対してχ2検定を行ったところ、ＮＧＦとＮＧＦ＋ＧＰＡとの比較では、両側有意確率がｐ＜０．０５となり、ＧＰＡが１０μＭの濃度でＰＣ１２細胞の神経分化を促進させることが判明した。しかし、１０μＭのＧＰＭとＧＰＳの両ペプチドについてもχ2検定をしたところ、有意差がなかったことから（それぞれｐ値が１．００と０．５０８）、神経分化の促進作用がみられないことが分かった。すなわち、ＧＰＡは特異的にＰＣ１２細胞の分化を促進していることが考えられ、このことから、一般的な神経幹細胞（例えば、ヒトの成人の脳組織にみられる神経幹細胞）に対しても、ＧＰＡは神経分化を促進する可能性が高いと推測される。
【００５５】
なお、図２〜５に前記染色後のＰＣ１２細胞の写真を示した。図３に示すようにＧＰＡを添加したＰＣ１２細胞では、神経突起を長く伸ばしている状態が観察され、分化が促進されている状態が良く分かる。
また、ＧＰＡを添加したＰＣ１２細胞は、培養状態がよく、細胞毒性などの兆候は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の神経細胞分化促進剤は、抗アルツハイマー病、抗パーキンソン病、抗筋萎縮性側索硬化症、抗抗認知症、抗うつ病などの、神経疾患用治療剤、予防剤として好適に使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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