(57)【要約】【課題】本発明は、代謝工学を使用して発酵中のアミノ酸収率の改善の問題を解決する。【解決手段】本発明は、概して、非改変細菌細胞と比較してＮＡＤＰＨが増量している改変細菌細胞を培養する工程を包含し、それによって、該改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率が非改変細菌細胞からの収率よりも高い、Ｌ−アミノ酸を生成する方法に関する。本発明はまた、リン酸グルコイソメラーゼをコードする遺伝子にも関する。特定の実施形態では、本発明の改変細菌細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼおよび６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを包含する群から選択される増量された１つ以上の酵素を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概してＬ−アミノ酸の生成方法およびホスホグルコイソメラーゼをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景情報）
細菌細胞は発酵プロセスによるアミノ酸生成のために産業上使用される（Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：１５７−１６５（１９９１）、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，  Ｓ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｋ．およびＮａｇａｓａｋｉ，  Ｓ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４：１２８−１２９（１９５８））。多数の研究レポートおよびレビューが発酵プロセスおよびアミノ酸蓄積のメカニズムについて明らかにされているとはいえ、微生物からのアミノ酸収率を増加させるためには、さらなる進歩が必要である（Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：１５７−１６５（１９９１）、  Ａｉｄａ，  Ｋ．ら、編、“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”講談社（東京）／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８６）およびＭａｒｋ，  Ａ．ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：３５−４８（１９９９））。
【０００３】
グルコース誘導体化炭素のフラックスを芳香族アミノ酸形成の方へ指向させる代謝工学を使用する成功例がいくつかある（Ｆｌｏｒｅｓ，  Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：６２０−６２３（１９９６））。しかし、プロデューサー株での成功した応用はまだ実証されていない（Ｂｅｒｒｙ，  Ａ．，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １４：２５０−２５６（１９９６））。
代謝工学は、発酵中の様々な代謝経路を通した開始物質（例えば炭水化物および有機酸）の炭素フローの操作に関する。例えば、13Ｃ  ＮＭＲ研究を使用したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの中心的代謝における研究がなされた（非特許文献１，非特許文献２）。さらにまた、13Ｃ  ＮＭＲを使用して、Ｗａｌｋｅｒら（非特許文献３）はＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍによるグルタミン酸発酵を解析し、そしてＩｎｂａｒら（非特許文献４）はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍによるリジン発酵を研究した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓ．ら、  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：１５７−１６５（１９９１）
【非特許文献２】Ｍａｒｋ，  Ａ．ら、  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４９：１１１−１２９（１９９６）
【非特許文献３】Ｗａｌｋｅｒ，  Ｔ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１１８９−１１９５（１９８２）
【非特許文献４】Ｉｎｂａｒ，  Ｌ．ら、  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４９：６０１−６０７（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、代謝工学を使用して発酵中のアミノ酸収率の改善の問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、非改変細菌細胞と比較してＮＡＤＰＨ量を増加させた改変細菌細胞を培養することによってＬ−アミノ酸を生成する方法を提供し、それによってこの改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率を非改変細菌細胞からの収率よりも増加させる。また、本発明は、以下を提供する：
（項目１）  Ｌ−アミノ酸を生成する方法であって、非改変細菌細胞と比較してＮＡＤＰＨが増量している改変細菌細胞を培養する工程を包含する方法であって、該改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率が非改変細菌細胞からの収率よりも高い、方法；
（項目２）  前記改変細菌細胞が、ペントースリン酸経路の酸化分岐を通した炭素フラックスの増加を有する、項目１に記載の方法；
（項目３）  項目２に記載の方法であって、ここで、前記改変細菌細胞がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼおよび６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを包含する群から選択される増量された１つ以上の酵素を有する、方法；
（項目４）  前記改変細菌細胞が解糖系を通した炭素フラックスの減少を有する、項目１に記載の方法；
（項目５）  前記改変細菌細胞が減量された６−ホスホグルコースイソメラーゼ酵素活性を有する、項目４に記載の方法；
（項目６）  前記改変細菌細胞からの前記Ｌ−アミノ酸収率が前記非改変細菌細胞からの収率よりも約１％〜約１００％高い、項目１に記載の方法；
（項目７）  前記改変細菌細胞が変異体ｐｇｉ遺伝子を有する、項目１に記載の方法；
（項目８）  項目１に記載の方法であって、前記改変細菌細胞が以下：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域をサブクローニングする工程、および
（ｂ）工程（ａ）から生じるベクターを相同組換えを介して細菌ゲノムへ挿入する工程、
によって生成される、方法。
（項目９）  前記改変細菌細胞が増量されたリンゴ酸酵素を有する、項目１に記載の方法；
（項目１０）  前記改変細菌細胞が増量されたイソクエン酸デヒドロゲナーゼを有する、項目１に記載の方法；
（項目１１）  前記改変細菌細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞である、項目１に記載の方法；
（項目１２）  前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞が、変異したｐｇｉ遺伝子からなる群より選択された遺伝子を有する、項目１１に記載の方法；
（項目１３）  前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンを含む、項目１に記載の方法；
（項目１４）  ｐＤＰＴｐｇｉ２を含有するベクター；
（項目１５）  変異したｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞の生成方法であって、以下：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域を自殺ベクターにサブクローニングする工程、および
（ｂ）工程（ａ）から生じるベクターを細菌ゲノムへ挿入し、それによって改変されたｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞を生成する工程、
を包含する、方法；
（項目１６）  前記自殺ベクターが、選択可能なマーカーを有するｐＢＧＳ１３１ベースのレプリコンおよび選択可能なマーカーを有するＣｏｌＥ１ベースのレプリコンを包含する群から選択される、項目１５に記載の方法；
（項目１７）  項目１５に記載の方法によって生成された、改変細菌細胞；
（項目１８）  Ｌ−アミノ酸を生成する方法であって、以下：
非改変細菌細胞と比較して減量された６−ホスホグルコースイソメラーゼ酵素活性を有する改変細菌細胞を培養する工程であって、該改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率が非改変細菌細胞からの収率よりも高い工程、を包含する、方法；
（項目１９）  前記改変細菌細胞からの前記Ｌ−アミノ酸収率が、前記非改変細菌細胞からの収率よりも約１％〜約１００％高い、項目１８に記載の方法；
（項目２０）  前記改変細菌細胞が変異体ｐｇｉ遺伝子を有する、項目１８に記載の方法；
（項目２１）  項目１８に記載の方法であって、前記改変細菌細胞が以下：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域をサブクローニングする工程、および
（ｂ）工程（ａ）から生じるベクターを相同組換えを介して細菌ゲノムへ挿入する工程、
によって生成される、方法；
（項目２２）  前記改変細菌細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞である、項目１８に記載の方法；
（項目２３）  前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンを含む、項目１８に記載の方法；
【０００７】
本発明はまた、変異ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｇｉ）遺伝子を有する細菌細胞の生成方法も提供し、この方法は、
（ａ）このｐｇｉ遺伝子の内部領域を自殺ベクターにサブクローニングする工程、および
（ｂ）相同組換えを介してこの自殺ベクターを細菌ゲノムへ挿入する工程
を包含し、それによって改変ｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞が生成される。さらに本発明は、この方法によって生成される改変細菌細胞を提供する。
【０００８】
本発明はまた、この方法に有用なベクターを提供する。
【０００９】
さらに本発明は、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホスホグルコースイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリペプチドは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２）に見られるアミノ酸配列、または１９９９年８月１７日にＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４として細菌宿主中に寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の１つを有する。
【００１０】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターおよびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびに、そのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、ならびに組換え技術によってＰｇｉポリペプチドまたはペプチドの生成にそのようなベクターおよび宿主細胞を使用する方法に関する。
【００１１】
本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列を有する単離されたＰｇｉペプチドを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のさらなる利点は以下の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐｇｉのヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）配列および推定アミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）配列を示す。Ｐｇｉペプチドは約５９ｋＤａの推定分子量を有する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐｇｉのヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）配列および推定アミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）配列を示す。Ｐｇｉペプチドは約５９ｋＤａの推定分子量を有する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｐｇｉのヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）配列および推定アミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）配列を示す。Ｐｇｉペプチドは約５９ｋＤａの推定分子量を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
細菌細胞中の増加させたＮＡＤＰＨ量は、特にＮＡＤＰＨが律速因子である同化プロセスにおいて生成収率を増加することが本明細書中で確認された。異化反応からエネルギーを要求する生合成反応（例えば、アミノ酸の形成）に化学エネルギーを運ぶ方法は、水素原子または電子の形である。還元媒体として効果的であるためには、水素原子は、かなりの自由エネルギーを有していなければならない。そのような高エネルギー水素原子は、デヒドロゲナーゼによって細胞燃料から得られ、この酵素は、水素原子の燃料分子からの除去および特異的補酵素、特にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化型（ＮＡＤＰ+）への移動を触媒する。ＮＡＤＰＨと命名されたこの補酵素の還元型あるいは水素運搬型は、異化反応から電子要求生合成反応へのエネルギー豊富な電子のキャリアーである。
【００１５】
本発明は、非改変細菌細胞と比較してＮＡＤＰＨ量を増加させた改変細菌細胞を培養することによるＬ−アミノ酸生成方法を提供し、それによってこの改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率を非改変細菌細胞からの収率よりも増加させる。好ましいアミノ酸はＬ−リジン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンである。本明細書で使用される、改変細菌細胞は、非改変細菌細胞と比較してＮＡＤＰＨ量を増加した細菌細胞として定義される。
【００１６】
１つの好ましい実施形態では、「変化」細菌細胞は「変異した」細菌細胞である。「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は娘細胞へ伝えられ得る遺伝物質における任意の検出可能な変化である。変異は任意の検出可能な化学的あるいは物理的な構造に影響を及ぼす不自然な変化、変異性、複製、表現型機能あるいは１つ以上のデオキシリボヌクレオチドの組換え（ヌクレオチドが逆位を伴なって、または逆位を伴なわずに、付加され、欠失され、置換され、反転されあるいは新しい位置へ転位され得る）（あるいはそれらの組み合わせ）であり得る。変異は自然に起こり得、変異誘発物質の適用または組換えＤＮＡ技術の適用によって実験的に引き起こされ得る。核酸分子の変異変化は、変異から生じる。変異ポリペプチドは変異核酸分子から生じ得る。
【００１７】
さらに、改変あるいは変異した細菌細胞は、遺伝的に「変異されていない（ｕｎｍｕｔａｔｅｄ）」細胞と比較してＮＡＤＰＨの増加した量を得るために、遺伝的に「変異」され得る。
【００１８】
改変細菌細胞中の増加したＮＡＤＰＨの量は、結果としてアミノ酸の生成増加を生じる。好ましくは、改変細菌細胞中でアミノ酸収率が非改変細胞からの収率を超えて増加し、この範囲は約１％より高く、そして好ましくは約１％から約１００％まで、好ましくは約２％から約８０％まで、そしてより好ましくは約５％から約６０％まで、そしてなおさらに好ましくは約１０％から約８０％である。本明細書で使用される「収率」は生成されたアミノ酸のグラムを、消費されたグルコースのグラムで除算し、１００を乗算したものと規定される。
【００１９】
本発明に従って、本発明の改変細菌細胞は炭素源および窒素源を含む培養培地で培養される。例えば、炭素源はアラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルビン酸塩あるいはコハク酸塩であり得る。この炭素源は好ましくは０．１〜１０重量％、好ましくは、０．５〜６．０重量％の初期濃度である。炭素源のすべては培養開始前に培地に加えられ得るか、あるいは培養中段階的にあるいは連続的に加えられ得る。
【００２０】
本明細書で使用する培地は、固形あるいは液体、合成（すなわち人工的）あるいは天然であり得、そして本発明の改変細菌細胞の培養に十分な栄養素を含む。好ましくは、使用された培地が液体培地であり、さらに好ましくは合成液体培地である。
【００２１】
本発明の実施形態に記載した上記および以下に使用された、天然あるいは合成培養培地はまた、窒素源、適切な無機塩、および（適切な場合）改変細菌細胞の培養に適切な様々な微量栄養素、成長因子などを含み、そしてまた少なくとも１つの補充炭素源を含み得る。使用されるこれらの添加成分のそれぞれの量は、好ましくはアミノ酸生成を最大にするよう選択される。当該分野で公知の様々な方法および技術によって、そのような量は当業者によって経験的に決定され得る。
【００２２】
適切な補充炭素源の実例となる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：他の炭水化物（例えばグルコース、フルクトース、スクロース、デンプンあるいはデンプン加水分解物、セルロース加水分解物および糖液）；有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、蟻酸、リンゴ酸、クエン酸およびフマル酸）；およびアルコール（例えばグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトール）。
【００２３】
適切な窒素源の実例となる例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンモニアガスおよびアンモニア水を含むアンモニア；無機塩または有機酸のアンモニア塩（例えば塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム）；尿素；亜硝酸塩あるいは硝酸塩、および純粋あるいは粗製調製物のいずれかとしてのアミノ酸を含む他の窒素含有原料であって、肉抽出物、ペプトン、魚ミール、魚加水分解物、コーン染出液（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、カゼイン加水分解物、大豆油粕加水分解物、酵母抽出物、乾燥酵母、エタノール酵母留出物、大豆粉、綿実粕、などである。
【００２４】
適切な無機塩の実例となる例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素の塩、ならびにリン酸。
【００２５】
適切な微量栄養素、成長因子などの実例となる例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：補酵素Ａ、パントテン酸、ピリドキシン−塩化水素、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ−６，８−チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ12、他のビタミン、アデニン、ウラシル、グアニン、チミンおよびシトシンなどの塩基、Ｌアミノ酸、チオ硫酸ナトリウム、ｐ−またはｒ−アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロ酢酸などであって、これらは精製もしくは部分的に精製された化合物として、または天然原料中に存在するかどちらかである。本発明の微生物株の培養は、当業者にとって公知である任意のサブマージ（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ）発酵技術（例えばエアリフト、伝統的分散撹拌型あるいは振とう培養）を使用して成し遂げられ得る。
【００２６】
温度、ｐＨ、通気速度、撹拌速度、培養時間などを含む、使用された前記培養の条件は、アミノ酸生成を最大にするように当業者によって経験的に決定され得る。特異的培養条件の選択は、例えば培地組成、および型、培養技術ならびに同様の検討材料などの因子に依存する。
【００２７】
十分な期間培養後、細胞中および／あるいは培養ブロス中に蓄積された１つ以上の種類のアミノ酸が、アミノ酸はイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、溶媒抽出、アフィニティークロマトグラフィーあるいはそれらの任意の組み合わせを含む任意の公知の方法によって単離され得る。培養に使用した条件に適した任意の方法が使用され得る。
【００２８】
好ましい細菌細胞はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｌ種およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。細菌細胞中で好まれるのはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞である。本明細書で使用する、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍと同義である。
【００２９】
本発明において、概して微生物中のＮＡＤＰＨの増加は、この生物体の解糖系とペントースリン酸系との間の炭素フラックス配分を変化させて達成される。本明細書で使用する「炭素フラックス」は競合経路に関して特定の代謝経路を下方に進めるグルコース分子の数をいう。
【００３０】
好ましくは、ペントースリン酸経路の酸化分岐（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｒａｎｃｈ）を通じて炭素フラックスが増加することによって、ＮＡＤＰＨの利用能が増加する。理論的にはグルコースが独占的にペントースリン酸経路で代謝されると、１つのグルコースあたり１２個のＮＡＤＰＨが発生する、しかしＴＣＡ回路（トリカルボン酸回路、クエン酸回路とも呼ばれる）でグルコースが代謝されると、１つのグルコースあり２個のＮＡＤＰＨしか生成されない。Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：１５７−１６５（１９９１）。本発明は、改変細菌細胞の培養によってＬ−アミノ酸を生成する方法を提供し、この細胞はペントースリン酸経路を通した炭素フラックスの増加を有する。
【００３１】
生体中で異化されるグルコースのほとんどは解糖系へ進み、結果としてピルビン酸塩を生成する。ペントースリン酸経路は、ヘキソースモノリン酸シャントとも呼ばれ、グルコース異化の代替経路である。ペントースリン酸経路はＮＡＤＰＨを生成し、そしてリジン発酵条件下でより活性である。Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７：１５７−１６５（１９９１）。
【００３２】
本発明において、改変細菌細胞は、その細胞中でペントースリン酸経路の酸化分岐を通じて炭素フラックスが増加する細胞であり得る。特に本発明では、改変細菌細胞はペントースリン酸経路に含まれる１つ以上の酵素の量が増加した細胞であり得る。そのようなペントースリン酸酵素は、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース５−リン酸−３−エピメラーゼ、リブロース５−リン酸イソメラーゼおよび６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼならびに６−ホスホグルコノラクトナーゼを含む群から選択される。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明はさらに非改変細胞と比較して、リンゴ酸酵素の量が増加した改変細菌細胞を培養することによってＬ−アミノ酸を生成する方法を提供する。リンゴ酸酵素はＮＡＤＰＨ+を使用したリンゴ酸の反応を触媒し、ピルビン酸塩、二酸化炭素、ＮＡＤＰＨおよびＨ+を生成する。
【００３４】
好ましい実施形態として、本発明はさらに非改変細胞と比較してイソクエン酸デヒドロゲナーゼの量が増加した改変細菌細胞を培養することによってＬ−アミノ酸を生成する方法を提供する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ+とのイソクエン酸の反応を触媒し、α−ケトグルタレート、二酸化炭素、ＮＡＤＰＨおよびＨ+を生成する。
【００３５】
解糖系およびペントースリン酸経路の両方はグルコースについて競合する。本発明において、改変細菌細胞は、この細胞中で解糖系を通じた炭素フラックスの減少あるいは遮断が結果としてペントースリン酸経路の酸化分岐を通した炭素フラックスを増加させる細胞であり得る。本発明で用いられる場合、改変細菌細胞は、細胞中で解糖系を通じた炭素フラックスの減少が解糖系に含まれる１つ以上の酵素の量の減少を通して達成される細胞であり得る。好ましい酵素は、６−ホスホグルコースイソメラーゼ、フルクトースジホスフェートアルドラーゼ、Ｄ−グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エンドラーゼあるいはピルベートキナーゼである。好ましい酵素は６−ホスホグルコースイソメラーゼである。
【００３６】
改変細菌細胞中の解糖系酵素の量を減少させる好ましい方法は、この酵素をコードする遺伝子を変異させることによる。本明細書中で使用される場合、好ましいのは、６−ホスホグルコースイソメラーゼ（「ｐｇｉ」）をコードする遺伝子の発現をブロックする（無効）か、または弱める（減少）ことである。
【００３７】
解糖系に含まれる酵素をコードする遺伝子の発現をブロックする（無効）か、または弱める（減少）好ましい方法は、自殺ベクター（組み込みベクターとも呼ばれる）を使用することである。本明細書で使用される場合、自殺ベクターは、特定の生物体内では自律複製を行わず、次いで細胞中に導入され、そして生物体の染色体の相同領域を組換えて相同遺伝子の挿入性の不活化を引き起こすベクターとして定義される。遺伝子の挿入性不活化はこの遺伝子のリーディングフレームを崩壊させることによって達成される。この遺伝子の挿入性不活化は、遺伝子の内部位置が相同性領域として使用された場合にのみ生じる。
【００３８】
組換え構築物は、本発明の細菌細胞の中へ、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、結合体化、エレクトロポレーション、電気的形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクションおよび形質転換あるいはその他の方法などの周知の技術を用いて、導入され得る。そのような方法はＤａｖｉｓら、“Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”（１９８６）などの多くの標準的実験室マニュアルに記載されている。
【００３９】
好ましい実施形態として、改変細菌細胞は以下によって作製される：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域を自殺ベクターにサブクローニングする工程、
および
（ｂ）相同組換えを介してこの自殺ベクターを細菌ゲノムへ挿入する工程。内部領域は該当のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始コドンと終止コドンを含まないそれらの間の連続したＤＮＡ配列として定義され得る。好ましくは内部領域はゲノム組み込みを促進し、そして結果としてこの当該ＯＲＦから機能を有さないポリペプチドを発現するよう選択される。
【００４０】
特定の好ましい実施形態において、自殺ベクターは、変異特異的および／あるいは条件特異的に誘導され得る。そのようなベクターの間で特に好ましいのは、温度および栄養添加物などの操作しやすい環境因子によって誘導可能なベクターである。他の適切な環境因子は当業者にとって容易に明白である。
【００４１】
本発明の改変細菌細胞は少なくとも１つのマーカー遺伝子を必要に応じて含む自殺ベクターを用いて形質転換され得る。そのようなマーカーとしては、アミカシン、アウグメンチン（ａｕｇｍｅｎｔｉｎ）（アモキシリンおよびクラブロニック酸（ｃｌａｖｕｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、アンピシリン、セファゾリン、セフォキシチン、セフタジジム、セフチオフール（ｃｅｆｔｉｏｆｕｒ）、セファロチン、クロラムフェニコール、エンロフロキサシン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、エリスロマイシン、フロールフェニコール（ｆｌｏｒｆｅｎｉｃｏｌ）、ゲンタマイシン、イミペネム、カナマイシン、サラフロキシシン（ｓａｒａｆｌｏｘｉｃｉｎ）、テトラサイクリン、チカルシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、トリメトプリムあるいはチルマイコシン（ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ）の耐性遺伝子が挙げられる。好ましいマーカーとしては、クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。他の適切なマーカーは当業者にとって容易に明白である。
【００４２】
自殺ベクターの使用の例示的な例は、以下の通りである：遺伝子の内部領域は、ポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅され、そしてこの増幅によって得られるフラグメントは、抗生物質耐性マーカー遺伝子を含む自殺ベクターにサブクローニングされ、そしてこの自殺ベクターは、本来の生物に形質転換される。抗生物質耐性クローンの回収は、相同遺伝子の挿入性不活性化を意味する。この自殺ベクターは、標的生物において自律複製できないプラスミドを含み得る。標的生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉではない場合、Ｃｏｌ  Ｅ１ベースのレプリコンが好ましい。Ｃｏｌ  Ｅ１ベースのレプリコンの中でも、ｐＢＧＳ１３１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、受託番号３７４４３）が好ましい。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明はさらに、変異ｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞を作製する方法を提供する。特に好ましい実施形態において、本発明は、変異ｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞を作製する方法を提供し、この方法は、（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域を自殺ベクターにサブクローニングする工程；および（ｂ）この自殺ベクターを相同組換えを介して細菌ゲノムに挿入する工程を包含し、これによって、改変されたｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞が作製される。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の方法に従って作製された細菌細胞を提供する。
【００４５】
改変細菌細胞の作製の例示的な例は、以下である。６−ホスホグルコースイソメラーゼ（解糖系酵素）をコードする、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐｇｉ遺伝子の領域が、適切なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。好ましくは、このＰＣＲプライマーは、配列番号３および配列番号４（これらは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩのための認識配列を含む）において列挙されるプライマーである。ＨｉｎｄＩＩＩでの制限後、次いでこのＰＣＲ産物は、自殺ベクターｐＢＧＳ１３１にサブクローニングされる。得られるサブクローンは、ｐＤＰＴｐｇｉ２と命名される。次いで、サブクローンｐＤＰＴｐｇｉ２は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに形質転換され、そしてカナマイシン耐性コロニーが適切な培地において選択される。カナマイシン耐性コロニーの単離は、組み込み事象が生じたことを意味する。主に、組み込みは、相同組換えを介して起こり、ｐｇｉ遺伝子の破壊を生じる。
【００４６】
改変細菌細胞を作製する別の好ましい方法は、遺伝子の前にあるプロモーターの変更によって適切な遺伝子の発現をブロックすること、または弱めることによる。任意の供給源由来の異なるプロモーターを使用することまたはネイティブプロモーターのヌクレオチド配列を変化させることによるのが好ましい。ネイティブプロモーターのヌクレオチド配列を変化させる方法の中でもＰＣＲ変異誘発が好ましい。本発明におけるこの使用に適切な公知の細菌プロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰRプロモーターおよびλＰLプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーターまたは本発明の細菌細胞に対して内因性であるプロモーターが挙げられる。ペントースリン酸経路に関与する酵素をコードする遺伝子のアップレギュレーションがまた好ましい。これは、この遺伝子を制御するプロモーターの改変によってなされ得、その結果、ネイティブプロモーターよりも強力なプロモーターが使用される。ペントースリン酸経路の遺伝子をアップレギュレートする別の好ましい方法は、ゲノム組み込みプラスミドまたは自律複製プラスミドの使用を介して問題の遺伝子のコピー数を増加させることである。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明はまた、改変細菌細胞を培養する工程を包含するＬアミノ酸を生成する方法を提供し、ここでこの細菌細胞は、変異ｐｇｉ遺伝子からなる群より選択される遺伝子を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞である。
【００４８】
改変細菌細胞を生成する別の好ましい方法は、解糖系に関与する酵素をコードする遺伝子を変異させ、解糖系酵素をコードする遺伝子のブロックされた発現または弱められた発現を生じさせる工程を包含する。変異遺伝子を調製するための適切な方法の例示的な例としては、ＰＣＲ変異誘発、インビトロ化学変異誘発、オリゴヌクレオチド変異誘発、紫外線光またはＸ線での照射による変異誘発または化学的変異誘発物質（例えば、ニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホネート、ナイトロジェンマスタードなど）を用いる処理による変異誘発、遺伝子組み込み技術（挿入エレメントまたはトランスポゾンによって、あるいは、線状もしくは環状ＤＮＡ分子を形質転換する相同組換えによって媒介される組み込み技術）、およびバクテリオファージ（例えば、Ｐ１）によって媒介される形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｒ．ＧｌｉｃｋおよびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；ならびにＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅ  Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）に記載される。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明はさらに、変異ｐｇｉ遺伝子を含む単離された細菌細胞または精製された細菌細胞を提供する。
【００５０】
本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されたアミノ酸配列を有するＰｇｉポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１（配列番号１）に示されたヌクレオチド配列は、ＤＮＡクローンを配列決定することによって得られ得る。このＤＮＡ分子は、ブダペスト条約規約の下で１９９９年８月１７日にＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）（１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｏｎｉｓ  ６１６０４，ＵＳＡ）に寄託され、そして受託番号Ｂ−３０１７４を得た。この寄託されたクローンは、ｐ４１−１３（Ｃ０１）プラスミド中にある。
【００５１】
本発明は、以下からなる群より選択された単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２におけるアミノ酸約１〜約５４０を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列のうち１つを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補鎖；
（ｄ）（ａ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリヌクレオチド改変体であって、ここで
（１）この変更が、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ａ）に存在するヌクレオチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド改変体；
（ｅ）（ｂ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリヌクレオチド改変体であって、ここで、
（１）この変更が、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ｂ）に存在するヌクレオチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド改変体；
（ｆ）（ｃ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリヌクレオチド改変体であって、ここで、
（１）この変更が、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ｃ）に存在するヌクレオチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド改変体。
【００５２】
本発明はさらに、上記の核酸分子を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、配列番号１における完全なヌクレオチド配列を有する。
【００５３】
本発明はさらに、上記の核酸分子を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、配列番号２における完全なアミノ酸配列を有するＰｇｉポリペプチドをコードする配列番号１におけるヌクレオチド配列を有する。
【００５４】
本発明はさらに、上記の核酸分子を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４において含まれるＤＮＡクローンによってコードされるＰｇｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５５】
本発明はさらに、上記核酸分子の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）におけるヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、ここで、ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみ、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。
【００５６】
本発明はさらに、組換えベクターを作製する方法を提供し、該方法は、上記の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する。
【００５７】
本発明はさらに、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、組換え宿主細胞を作製する方法を提供し、該方法は、上記のベクターを、宿主細胞に導入する工程を包含する。本発明はさらに、上記のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はさらに、Ｐｇｉポリペプチドを生成する方法を提供し、該方法は、上記の組換え細胞を、このポリペプチドが発現され、そしてこのポリペプチドを回収するような条件下で培養する工程を包含する。
【００５８】
本発明はさらに、以下からなる群より選択される単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２におけるアミノ酸約１〜約５４０を含むポリペプチド；
（ｂ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列を変更することによって作製されたポリペプチド改変体であって、ここで
（１）この変更が、挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ａ）に存在するアミノ酸の総数の５％以下である、ポリペプチド改変体；
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリペプチド改変体であって、ここで、
（１）この変更が、挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ｂ）に存在するアミノ酸の総数の５％以下である、ポリペプチド改変体。
【００５９】
（核酸分子）
他に示さない限り、ＤＮＡ分子の配列決定をすることによって本明細書中で決定された全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知であるように、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの誤りを含み得る。自動操作によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的に、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％同一〜少なくとも約９９．９％同一である。当該分野でも公知であるように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトの原因となり、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、このような挿入または欠失の位置から始まる、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００６０】
本明細書中で提供される情報（例えば、図１におけるヌクレオチド配列）を使用することで、Ｐｇｉポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニング手順およびスクリーニング手順を使用して得られ得る。
【００６１】
従って、本発明は、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４として同定され、かつ図１（配列番号１および配列番号２）において示される、宿主において含まれるクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するＰｇｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００６２】
当業者が理解するように、配列決定の誤りの可能性のために、寄託されたクローンによってコードされる推定Ｐｇｉポリペプチドは、約５４０アミノ酸を含むが、５００〜５８０個のアミノ酸範囲のいずれでかであり得る。
【００６３】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られたか、または合成的に生成されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても公知であるコード鎖であり得るか、またはこれは、アンチセンス鎖とも言われる非コード鎖であり得る。
【００６４】
「単離された」核酸分子によって、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞において維持された組換えＤＮＡ分子あるいは溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に従って単離された核酸分子としては、さらに、このような合成的に生成された分子が挙げられる。
【００６５】
本発明の単離された核酸分子としては、図１（配列番号１）に示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図１（配列番号２）に示されるＰｇｉタンパク質についてのコード配列を含むＤＮＡ分子；および上記の配列とは実質的に異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、なおＰｇｉタンパク質をコードするＤＮＡ分子が挙げられる。当然のことながら、遺伝コードは当該分野において周知である。従って、このような縮重改変体を作製することは、当業者には慣用的である。
【００６６】
さらに、本発明は、配列番号１の大部分に関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。
【００６７】
別の局面において、本発明は、１９９９年８月１７日にＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４として寄託された核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するＰｇｉポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はさらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列または上記の寄託されたクローンにおいて含まれるｐｇｉゲノム配列のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記の配列のうち１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝マッピングのためのプローブとして有用である。
【００６８】
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたクローンのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）において示されたヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、本明細書中で議論される診断プローブおよびプライマーとして有用である、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）長、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ長、およびさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントが意図される。当然、より長い５０ｎｔ長、７５ｎｔ長、１００ｎｔ長、１２５ｎｔ長、１５０ｎｔ長、１７５ｎｔ長、２００ｎｔ長、２２５ｎｔ長、２５０ｎｔ長、３００ｎｔ長、３２５ｎｔ長、３５０ｎｔ長、３７５ｎｔ長、４００ｎｔ長、４２５ｎｔ長、４５０ｎｔ長、４７５ｎｔ長、５００ｎｔ長、５２５ｎｔ長、５５０ｎｔ長のフラグメントはまた、寄託されたクローンのヌクレオチド配列、または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の全てではないが、ほとんどに対応するフラグメントとして本発明に従って有用である。少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントによって、例えば、寄託されたクローンのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上連続する塩基を含むフラグメントが意図される。
【００６９】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４において含まれる寄託されたクローン）におけるポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液における４２℃での一晩のインキュベーション、続いて約６５℃での０．１×ＳＳＣにおけるフィルターの洗浄が意図される。
【００７０】
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上記および以下でより詳細に議論された診断プローブおよびプライマーとして有用である。
【００７１】
例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部によって、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたクローンあるいは図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列由来の２０以上連続するヌクレオチドが意図される。当然、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるｐｇｉ  ｃＤＮＡの３’末端のポリ（Ａ）領域）に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補性ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドにおいて含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補鎖を含む任意の核酸分子（例えば、実際には、任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【００７２】
示されたように、Ｐｇｉポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、１つの核酸分子だけでポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；ポリペプチドおよびさらなる配列についてのコード配列（例えば、アミノ酸リーダー配列または分泌配列（例えば、プレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列、またはプレプロタンパク質配列））；さらなる非コード配列（例えば、非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡのプロセシング（例えば、リボソーム結合）およびｍＲＮＡの安定性に役割を果たす転写非翻訳配列）を含むが、これらに限定されない）と一緒に上記のさらなるコード配列を有するか、またはこれを有さないポリペプチドのコード配列；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供するアミノ酸）についてコードするさらなるコード配列を含むが、これらに限定されない。従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、特に、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に提供されるタグ）であり、その多くは、市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製のために提供される。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集タンパク質由来のエピトープに対応する精製に有用である別のペプチドである。このインフルエンザ赤血球凝集タンパク質は、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）によって記載されている。以下に議論するように、他のこのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端においてＦｃに融合されるＰｇｉを含む。
【００７３】
上記のプローブ、プライマー、および／または核酸フラグメントを使用して、発酵中のｐｇｉ遺伝子の発現をモニターし得る。
【００７４】
本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関する。この改変体は、Ｐｇｉタンパク質の一部、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は天然に存在し得る（例えば、天然の対立遺伝子改変体）。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つが意図される。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して作製され得る。
【００７５】
このような改変体としては、１つ以上のヌクレオチドが関与し得るヌクレオチドの置換、欠失または付加によって作製される改変体が挙げられる。この改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において改変され得る。コード領域における改変は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これらは、Ｐｇｉタンパク質またはその一部の特性および活性を変更しない。これに関して保存的置換が特に好ましい。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態としては、（ａ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４において含まれるクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有する全長Ｐｇｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）または（ｂ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が挙げられる。
【００７７】
Ｐｇｉポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、このポリヌクレオチド配列が、Ｐｇｉポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いてこのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。すなわち、参照配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが、欠失または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列における全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が、参照配列に挿入され得る。この参照配列のこれらの変異は、参照配列におけるヌクレオチド、または参照配列内の１つ以上連続する基におけるヌクレオチドのいずれかの間で個々に散在して、この参照ヌクレオチド配列の５’末端位置もしくは３’末端位置、あるいはこれらの末端位置間のいずれの場所においてでも起こり得る。
【００７８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレオチド配列に、または寄託されたクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かを、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて慣用的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））の局所相同性アルゴリズムを使用し、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例えば９５％同一であるか否かを決定する場合、当然、パラメーターは、同一性のパーセンテージが、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、かつ参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの、相同性におけるギャップを可能にするように設定される。
【００７９】
本願は、核酸分子がＰｇｉ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図１（配列番号１）に示される核酸配列あるいは寄託されたクローンの核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子が、Ｐｇｉ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者はなお、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして核酸分子の使用方法を知っているからである。Ｐｇｉ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用は、とりわけ、ｐｇｉ  ｍＲＮＡ発現を検出するためにゲノムライブラリーおよびノーザンブロット分析においてｐｇｉ遺伝子またはその対立遺伝子改変体を単離する工程を含む。
【００８０】
しかし、図１に示される核酸配列（配列番号１）に、または寄託されたクローンの核酸配列（実際には、Ｐｇｉタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする）に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列を有する核酸分子が好ましい。「Ｐｇｉ活性を有するポリペプチド」とは、類似の活性を示すポリペプチドを意図するが、特定の生物学的アッセイで測定した場合、本発明のＰｇｉタンパク質の活性と同一である必要はない。
【００８１】
当然ながら、遺伝子コードの縮重性に起因して、当業者は、寄託されたクローンの核酸配列に、または図１に示される核酸配列（配列番号１）に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「Ｐｇｉタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペプチドをコードするので、これは、上記に記載の比較アッセイを実施しなくても当業者に明白である。縮重してない改変体であるこのような核酸分子について、適切な数が、Ｐｇｉタンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることも、さらに当該分野で認識される。これの理由によって、当業者は、タンパク質機能にほとんど影響しそうにないか、または有意に影響しなさそうな、アミノ酸置換（例えば、第１の脂肪族アミノ酸の第２の脂肪族アミノ酸での置換）に完全に気づく。
【００８２】
例えば、表現型がサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｉ：１３０６〜１３１０（１９９０）（ここで、著者らは、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど耐性であることを示す）に提供される。
【００８３】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作されている宿主細胞、および組換え技術によるＰｇｉポリペプチドまたはそのフラグメントの生成に関する。
【００８４】
このポリヌクレオチドは、宿主において増殖するための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、そして宿主細胞に形質導入され得る。
【００８５】
このＤＮＡインサートは、いくつか名前を挙げれば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーターのような適切なプロモーターに作動可能に連結されなければならない。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写領域において、転写開始部位、転写終止部位、および翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、開始部位で翻訳開始コドンを、そして翻訳されるポリペプチドのほぼ末端に位置する終止コドン（ＵＡＡ，ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００８６】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養のための、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、またはアンピシリンに耐性の遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【００８７】
本発明のタンパク質の生成において用いるために適切な公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩプロモーターおよびｌａｃ  Ｚプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターが挙げられる。
【００８８】
従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の生成に有用な発現ベクターに関する。
【００８９】
細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明白である。
【００９０】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法により達成され得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような、多くの標準的実験マニュアルに記載されている。
【００９１】
このポリペプチドは、融合機能的タンパク質のような改変形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域を含み得る。例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電したアミノ酸）の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加され、精製の間、または引き続く操作および貯蔵の間、宿主細胞における安定性および永続性を改善し得る。ペプチド部分はまた、ポリペプチドに付加され、精製を容易にし得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を発生させるための、安定性を改善するための、そして精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該分野では、精通され、かつ慣用的な技術である。
【００９２】
Ｐｇｉタンパク質は、周知の方法により、組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。この方法は、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。本発明のポリペプチドとしては、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）から、組換え技術によって生成された産物が挙げられる。組換え生成手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果としてある場合には、最初に改変されたメチオニン残基を含み得る。
【００９３】
（Ｐｇｉポリペプチドおよびフラグメント）
本発明はさらに、寄託されたクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する単離されたＰｇｉポリペプチド、または図１のアミノ酸配列（配列番号２）、または上記のポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。
【００９４】
Ｐｇｉポリペプチドの同じアミノ酸配列が、このタンパク質の構造または機能への有意な影響なしに、変化され得ることが当該分野で認識される。配列においてこのような差異が意図される場合、タンパク質上に活性を決定する重要な領域が存在することを忘れてはならない。
【００９５】
従って、本発明はさらに、実質的なＰｇｉポリペプチド活性を示すか、またはＰｇｉタンパク質の領域（例えば、以下に考察されるタンパク質部分）を含む、Ｐｇｉポリペプチドの改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。上記のように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントでありそうかに関するガイダンス（手引き）は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に見出され得る。
【００９６】
従って、図１のポリペプチド（配列番号２）、または寄託されたクローンによりコードされるＰｇｉポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、以下であり得る：（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されているもの、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされたものであってもよいし、そうでなくてもよい、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が置換基を含んでいるもの、または（ｉｉｉ）このポリペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチド（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、またはリーダー配列もしくは分泌配列）、またはポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列と融合されているもの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００９７】
示されるように、変化は、マイナーな性質の変化（例えば、タンパク質の折り畳み、または活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換）であることが好ましい（表１を参照のこと）。
【００９８】
【表１】
2011041582.tif 000002
当然ながら、当業者によって作製されるアミノ酸置換基の数は、上記の因子を含む多くの因子に依存する。一般に、任意の所定のＰｇｉポリペプチドについてのアミノ酸置換の数は、５０、４０、３０、２０、１０、５、または３より多くない。
【００９９】
機能に必須である本発明のＰｇｉタンパク質中のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、またはアラニンスキャンニング変異誘発）により同定され得る（ＣｕｎｎｉｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中のあらゆる残基に、単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子を、ホスホグルコースイソメラーゼ活性について試験する。
【０１００】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供され、そして好ましくは、実質的に精製される。「単離されたポリペプチド」とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを意図する。従って、生成されたポリペプチドおよび／または組換え宿主細胞内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的にのために単離が考慮される。また、「単離されたポリペプチド」は、組換え宿主細胞から、部分的に、または実質的に、精製されたポリペプチドを意図する。例えば、組換え的に生成されたバージョンのＰｇｉポリペプチドは、ＳｉｍｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０（１９８８）に記載の１工程方法によって実質的に精製され得る。
【０１０１】
本発明のポリペプチドは、寄託されたＤＮＡによってコードされるＰｇｉポリペプチド、および寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに、図１のポリペプチド（配列番号２）に、少なくとも９５％同一、なおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部を含む。
【０１０２】
Ｐｇｉポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「同一」である、アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチド配列がＰｇｉポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸について５つまでのアミノ酸変化を有し得る以外は、このポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列に同一であることを意図する。言換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列におけるアミノ酸残基の５％までが、欠失されるか、もしくは別のアミノ酸で置換されてもよく、または参照配列中の総アミノ酸残基の５％までのアミノ酸のアミノ酸数が、参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で、またはそれらの末端位置間のどこでも、参照配列内の残基の間で個々にか、または参照配列内の１つ以上の連続する基でのいずれかに分散して、生じ得る。
【０１０３】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）に、または寄託されたクローンによりコードされるアミノ酸配列番号に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に９５％同一であるか否かを決定する場合、当然ながら、パラメーターは同一性パーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって算出されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の総数の５％まで相同性におけるギャップが許されるように設定する。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の、または分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして用いられ得る。
【０１０５】
（Ｎ末端欠失およびＣ末端欠失の変異体）
１つの実施形態において、本発明は、図１に示されるＰｇｉポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基を欠失しているポリペプチド、または寄託されたクローンのＤＮＡによりコードされるポリペプチドを提供する。詳細には、１つの実施形態において、ＰｇｉポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ〜５４０により記載され得、ここでｍは、２〜５３９の任意の１つの整数であり、配列番号２において同定されたアミノ酸残基の位置に対応し、そして、好ましくは、本明細書に特定されるＮ末端欠失において同定されたＮ末端アミノ酸残基の１つに対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のＰｇｉポリペプチドのＣ末端欠失に関し、これは、一般式１〜ｎにより記載され、ここでｎは、２〜５３９の任意の１つの整数であり、配列番号２において同定されたアミノ酸残基の位置に対応し、そして好ましくは、本明細書に特定されるＣ末端欠失の１つにおいて同定された残基に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０１０７】
本発明のさらなる実施形態は、一般式ｍ〜ｎで記載されるアミノ酸残基を含むポリペプチドフラグメント、またはこのアミノ酸残基から構成されるポリペプチドフラグメントに関し、ｍおよびｎは、それぞれ、これらのシンボルについて上記で特定されたアミノ酸残基のいずれか１つに対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０１０８】
以下の実施例は、例示のみであり、そして添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を限定することは意図しない。種々の改変およびバリエーションが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の方法においてなされ得ることは当業者には明白である。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等の範囲内ならば、本発明の改変およびバリエーションをカバーすることが意図される。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１−ＤＮＡ単離および精製）
ＤＮＡを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４細胞の培養物から単離した。ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４細胞を、ＣＭ培地（表Ｂ）から収集し、そして１０ｍｌのＴＥ  ｐＨ８（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ*Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。４０μｇのＲＮａｓｅ  Ａおよび１０ｍｇのリゾチームを懸濁物１ｍｌあたりに添加し、そしてこの懸濁物を３７℃で３０分間インキュベートした。この懸濁物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で１．０％にし、そして０．１ｍｇ／ｌのプロテイナーゼＫを添加した。そして細胞を３７℃で１０分間インキュベートすることにより溶解した。核酸をＴＥ飽和フェノール（ｐＨ７）で３回抽出し、続いてエタノール沈殿で精製した。核酸沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄し、そしてＴＥ  ｐＨ８に再溶解した。ＤＮＡの濃度を分光光度計で２６０ｎｍで定量した。ＤＮＡ調製物の純度を、分光光度計で（Ａ２６０／Ａ２８０比およびＡ２６０／Ａ２３０比）、そしてアガロースゲル電気泳動（１×ＴＡＥ中、０．８％アガロース）により決定した。
【０１１０】
ゲノムＤＮＡの配列決定を、当業者に公知のように、それぞれ、ｐＧＥＭ３およびＬｏｒｉｓｔ６を用いて、プラスミドおよびコスミドのライブラリーを作製することにより、実施した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｇｉ遺伝子を、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  登録番号Ｐ７７８９５、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｇ６ＰＩ＿ＭＹＣＴＵ）のグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼに対する相同性により同定した。
【０１１１】
（実施例２−ｐｇｉを破壊させることによるＮＡＤＰＨ利用性の増大）
ペントースリン酸経路の酸化分岐を通した炭素フラックスの増大が、６−グルコースリン酸イソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子を破壊することにより達成された。２つのＰＣＲプライマーを、上記のゲノムＤＮＡ配列から設計し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｇｉ遺伝子の６８０ｂｐの内部領域の増幅を促進した。これらのプライマーは以下であった：
ｐｇｉｆ*（配列番号３）５’ｇｃｔｇａｔｇｔｃｃａｃｇａａｇｃｔｔｔｇｇｇａｃ３’
ｐｇｉｆ*（配列番号４）３’ｇｃｔｇａｇａａｃｃｔｔｇｇａａｔａａｇｇｔａｇｇ３’。
【０１１２】
プライマーｐｇｉｆ*およびｐｇｉｆ*は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を含む。ｐｇｉｆ*の場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍヌクレオチド配列から３つの変化を作製し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列を組み込むことが必要であった。これらのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位は、サブクローニングを容易にした。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅条件を以下のとおり使用した。各ＰＣＲ反応の最終容量は、１００μｌであった。各プライマーの１００ｎｇを、５０ｎｇの高分子量Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ２１７９９ゲノムＤＮＡおよび２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとともに用いた。反応緩衝液は、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により推奨される濃度で含み、そしてｄＮＴＰをまた、最終濃度２００μＭで含んだ。サイクルのパラメーターは以下の通りであった：９４℃１分、続いて、９４℃３０秒、６０℃３０秒、そして７２℃１分（３０サイクル）、７２℃７分、続いて凍結。
【０１１４】
Ｈｉｎｄ  ＩＩＩでの制限消化の際、ＰＣＲ産物を約６６０ｂｐのサイズに低下させた。次いでこのフラグメントを自殺ベクターｐＢＧＳ１３１中にサブクローニングした。得られたサブクローンをｐＤＰＴｐｇｉ２と名付けた。
【０１１５】
コンピテントＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＮＲＲＬＢ１１４７４）細胞への電気的形質転換後に、最終濃度１０μｇ／ｍｌでカナマイシンを含有するＣＭ（表Ｂ）寒天プレート上で組み込みを選択した。変異株においてグルコースリン酸イソメラーゼ活性が存在しないことを酵素アッセイで確認した。このことは、これらの株においてｐｇｉ遺伝子が破壊されていることを示す。
【０１１６】
振盪フラスコ実験により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ１１４７４）ｐｇｉ変異体が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ１１４７４）に比べて、リジン力価および収率を改善していることが示される（表Ａ）。
【０１１７】
【表２】
2011041582.tif 000003
【０１１８】
【表３】
2011041582.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2011041582.tif 000005
（実施例３：６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）をコードする遺伝子の破壊）
６−ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）をコードする遺伝子を、実施例２のｐｇｉ遺伝子について記載した方法と同様の方法で破壊した。ｐｆｋＡ遺伝子の破壊を変異体の抽出物の酵素アッセイにより確認し、そして６−ホスホフルクトキナーゼ活性が欠失していることを示した。予想に反して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４）ｐｆｋＡ変異体は、グルコースを利用することができなかった。
【０１２０】
本明細書において引用した全ての特許および刊行物は、その全体が参考として本明細書中に明白に援用されている。
【０１２１】
前述の発明は、明確さおよび理解の目的でいくらか詳細に記載してきたが、形態および詳細の種々の変更が、本発明の真の範囲および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく成され得ることは、本開示の内容から当業者に明白である。
【０１２２】
【表５】
2011041582.tif 000006
【図１Ａ】
2011041582.tif 000007
【図１Ｂ】
2011041582.tif 000008
【図１Ｃ】
2011041582.tif 000009
【配列表】
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