(57)【要約】【課題】本発明は、生体適合性、生体吸収性、注射可能、かつｉｎ  ｓｉｔｕで硬化する組織工学用途に有用なポリ（カプロラクトン−フマレート）重合体に関する。【解決手段】本発明は、前記課題を解決するために、カプロラクトン構造単位とフマル酸構造単位からなる二元共重合体を含む架橋性生分解性生体適合性材料を提供する。【選択図】図１
2011137166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプロラクトン単位とフマレート単位からなる二元共重合体を含む架橋性生分解性生体適合性材料。
【請求項２】
前記共重合体は、３，０００〜４，０００の範囲の数平均分子量を有する、請求項１に記載の共重合体。
【請求項３】
前記共重合体は、２〜４の範囲の多分散性指数を有する、請求項１に記載の共重合体。
【請求項４】
前記共重合体は、５０℃〜７０℃の範囲の融点を有する、請求項１に記載の共重合体。
【請求項５】
前記共重合体は、前記融点より高い温度で注射可能である、請求項４に記載の共重合体。
【請求項６】
前記共重合体は、３０℃〜４０℃の範囲の硬化点を有する、請求項１に記載の共重合体。
【請求項７】
（ｉ）カプロラクトンと、（ii）フマル酸またはその塩とを反応させることにより調製される、請求項１に記載の共重合体。
【請求項８】
前記共重合体は、ポリ（ε−カプロラクトン）とフマル酸クロライドとを反応させることにより調製される、請求項７に記載の共重合体。
【請求項９】
前記ポリ（カプロラクトン）は、５００ダルトン〜１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項８に記載の共重合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年７月１日付けで出願された米国仮特許出願第６０／４８４，６０号より優先権を主張する。
【０００２】
本研究は、助成金番号Ｒ０１−ＡＲ４５８７１−０２で国立衛生研究所により支援を受けた。
【０００３】
本発明は、生体適合性、生体吸収性、注射可能、かつｉｎ  ｓｉｔｕで硬化するスカフォード(scaffold)として組織工学用途に有用なポリ（カプロラクトン−フマレート）重合体の合成に関する。
【背景技術】
【０００４】
骨再生に対する臨床的要求は多様であり、融合を達成するために骨移植片手術を必要とする骨格異常の患者は、米国では毎年おおよそ１，０００，０００人いる。これらには、原発腫瘍および転移性腫瘍の切除、骨格外傷による骨損失、骨欠損を有する関節の一次および修正総合関節形成術、脊髄関節固定術、ならびに骨粗鬆による強度不足からくる骨折を導く骨梁空隙(trabecular  voids)から生じる適用が挙げられる。骨移植片材料の選択、調製、および適用においてなされる最新の臨床判断には、しばしば多くの要因が関係している。構造的側面から、手術管理計画を決定する前に、複数の決定がなされる必要がある。
【０００５】
第一に、失われた骨の型を決定しなければならない。欠損は、海綿骨、皮質骨、または骨の両方の構造的型の組み合わせであってもよい。第二に、欠損の性質が、包まれており骨性または軟部組織殻を有するのか、または包まれずに骨連続性の断片的損失として現れているのかを定義しなければならない。第三に、欠損の大きさ（骨梁空隙の大きさまたは断片的欠損の長さ）を決定しなければならない。移植選択決定に加わる機械的課題点として、再構築されるべき欠損の骨格上の位置およびその場所で予想される負荷が挙げら得る。また、ホストの併発疾病(co-morbidities)（例えば、糖尿病）などの生物学的課題点も全て骨移植片組み込み過程に影響を及ぼす可能性がある。最後に、移植材料の選択の一因となる手術課題点として、欠損の大きさに対する手術接触入り口(surgical  access  portal)の大きさに関する考慮が挙げられる。
【０００６】
骨格異常を治療する最新の臨床方法として、骨の移植、または連続性を再生させるための他の材料の使用が挙げられる。自家骨移植片は、骨置換の最高基準(gold  standard)であった。なぜなら、それは、治癒のための、骨原性細胞、骨誘導(osteoinductive)因子、および骨伝導(osteoconductive)マトリクッスといった必須の要素を提供するからである。しかしながら、自家移植骨の供給の制約、およびドナー部位の病的状態の両方のため、自家骨移植片が単独で用いられ得る場合の範囲が制限されている。同種移植骨は、大量供給で利用可能であるものの、自家移植骨と比較して移植片組み込みの割合が低いこと、およびドナーからホストへの病原移送の可能性があることを含む欠点を有する。
【０００７】
金属は欠損部位ですぐに機械的支持となるが、ホストの組織との理想的な全体統合には遠く及ばず、金属疲労で破損する前に骨が治癒しないと、結局、疲労負荷のために失敗する恐れがある。β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）およびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスは、両方とも骨伝導性であり、かつ金属補綴が骨へ結合するのを促進させるためのそれら金属補綴の表面コーティングとしての臨床使用が見いだされている。粒子の形で、それらは主として圧縮状態で重合体複合材料の機械強度を増加させるが、ねじれや曲げの力への耐性を向上させるのにはそれほど効果的ではない。ポリ（メタクリル酸メチル）骨セメントは、注入または成形することができ、ときには空洞欠損および区域欠損（それぞれ、巨大細胞腫瘍の掻爬から、または脊柱転移性疾患での椎骨体の摘除からもたらされるものなど）の両方を充填するのに用いられる。しかしながら、発熱重合化反応の間、温度は１００℃まで上昇する恐れがあり、放出された熱による局所的組織損傷の危険性がある。さらに、ポリ（メタクリル酸メチル）は、非生分解性であり、したがって時とともに疲労によるダメージが蓄積して、結局機械的に破損してしまう。
【０００８】
合成生分解性重合体は、治療の選択肢を提供するかもしれないが、現在は利用できない。これらの材料は、事実上無制限な供給で製造することができ、それらの設計における柔軟性は、様々な機械特性、生物学的特性、分解特性、およびレオロジー特性をもつ広範囲の重合体の合成を可能にする。例えば、それらの機械特性および分解特性を、合成の際に重合体分子量を変化させることにより操作することができ、したがって特定の用途に適するように調整することができる。骨格再生生体材料の注射可能な性質は、接触の限られた、または変則的な形の欠損を充填するのには理想的であるだろう。例えば、現在臨床で使用されている低侵襲性の内視鏡技法は、後外側横突間突起脊椎固定(posterolateral  intertransverse  process  spinal  fusion)用の注射可能な形態の生体材料を挿入することを可能にするだろう。これは、移植片材料を配置するために現在は避けられない過剰な露出および筋肉剥離による手術外傷を減少させるだろう。注射可能な材料は、周囲の皮質骨に大きな接触穴を開けることなく、関節周囲の骨折、骨粗鬆症の脊髄骨折、または骨嚢胞(bone  cysts)から海綿状空隙に入れることができる。これらの臨床状況は、骨組織工学用の注射可能な生分解性重合体複合材料の開発の動機となっている。
【０００９】
このように、注射されてｉｎ  ｓｉｔｕで架橋することにより欠損を充填することができる生分解性スカフォードは、既存の方法に魅力的な補強を提案する（Yaszemski  et  al.，「骨組織工学技術の臨床的要求(Clinical  needs  for  bone  tissue  engineering  technology)」，in  Bone  Engineering，J．E．Davis，Ed．Toronto，Em  Squared，2000，pp.541-547を参照）。合成代用骨または合成骨セメントとして用いられる、以前の材料として、上記に記載されるポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ラクチド−グリコリド）、およびポリ（プロピレンフマレート）が挙げられる。ポリ（メタクリル酸メチル）は、通常は生体吸収性ではない。ポリ（ラクチド−グリコリド）は、１５０℃を超える高い軟化温度を有し、しかも架橋性ではない。ポリ（プロピレンフマレート）は、ヒトの生物学的温度である３７℃まで冷却した際に固化せず、したがってその分解を制御することが難しい。
【００１０】
低侵襲性用途に向けて、研究者らは、化学的酸化還元開始によりｉｎ  ｓｉｔｕで架橋させることができ、組織成長を促進することができ、かつ治療される特定の臨床的筋書きに適した機械特性を有する、注射可能な系を追求している。注射でき、かつｉｎ  ｓｉｔｕで架橋させることができる生体適合性重合体が、骨組織工学用に開発されているものの、マクロマーの２０重量％よりも多い量の架橋剤（Ｎ−ビニルピロリドン（ＮＶＰ）または無水メタクリル酸など）が、架橋させるのに必要である（例えば、Peter  et  al.，注射可能なポリ（プロピレンフマレート）／β−リン酸三カルシウムペーストの架橋特徴および生分解性骨セメントとして使用される架橋した複合体の機械特性(Crosslinking  characteristics  of  an  injectable  poly(propylene  fumarate)/beta-tricalcium  phosphate  paste  and  mechanical  properties  of  the  crosslinked  composite  for  use  as  a  biodegradable  bone  cement)」，J．Biomed．Mater．Res.，Vol.44，pp.314-321を参照）。架橋剤は、潜在的に毒性化合物である。
【００１１】
したがって、注射されてｉｎ  ｓｉｔｕで架橋することにより骨欠損を充填することができる、改善された生分解性スカフォードが引き続き要求されている。詳細には、骨組織工学用の、改善された生体適合性、生体吸収性、かつ注射可能な重合体が要求されており、ここで重合体は架橋剤なしで自己架橋することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明に従って、得られる共重合体が架橋剤なしで自己架橋し得るように、ｉｎ  ｓｉｔｕでの架橋に用いられ得る不飽和炭素−炭素二重結合を含有するフマリルハライド（例えば、フマル酸クロライド）またはフマル酸が、柔軟な骨格を有する生分解性マクロマーと共重合化される。ポリ（ε−カプロラクトン）は、米国食品医薬品局によって承認された、吸収性縫合に使用するための分解性重合体であり、優れた生体適合性を有する。ポリ（ε−カプロラクトン）に基づく構築物は、誘導骨再生に使用されてきており（Elfick，「一時的な関節スペーサーに有力な材料としてのポリ（ε−カプロラクトン）(Poly(ε-caprolactone)  as  a  potential  material  for  a  temporary  joint  spacer)」，Biomaterials，Vol.23，pp.4463-4467，2002を参照）、したがってこれは柔軟性マクロマーとしてフマル酸クロライドとの共重合化に適している。本発明は、組織工学用の、生体適合性、生体吸収性、注射可能、かつ自己架橋性重合体としてのポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）の合成を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの実施の態様において、生体材料は、縮重合法を用いてフマル酸クロライドまたはフマル酸を５００〜１０，０００ダルトンの範囲の低分子量のポリ（ε−カプロラクトン）と反応させてポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）を生成させることにより、合成される。低分子量ポリ（ε−カプロラクトン）は、溶融または溶媒鋳造によりスカフォードに組み立てられ得るが、これは硬組織の再生用スカフォードとして適した機械特性を有さない。
【００１４】
本発明の対象であるポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）は、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）の分子量に依存して５０〜７０℃の間の融点を有する、吸収性かつ半結晶性の重合体である。その融点より上では、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）は、不定形または封入された形で、細孔形成剤(porogen)、開始剤、架橋剤、促進剤、希釈剤、発泡剤(forming，agent)、緩衝剤、阻害剤触媒、成長因子、粒子状および繊維状補強材料、ならびに安定剤などの他の配合成分と物理的に混合可能な自由な流動体であり、そしてポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）はシリンジを介して注射されて、生体組織の再生に用いられるスカフォードを組み立てることができる。融点より下は、例えば、ヒトの生物学的温度である３７℃（９８．６°Ｆ）では、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）は、化学的架橋だけでなく物理的に固化して硬くなる。
【００１５】
物理的架橋は、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）鎖のポリ（ε−カプロラクトン）セグメントの部分的結晶化により起こる。化学的架橋は適した開始剤、促進剤、または架橋剤の存在下、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）鎖のフマレート基の二重結合の架橋により生じる。しかしながら、架橋剤は、通常は必要ない。物理的架橋および化学的架橋の程度は、ポリ（ε−カプロラクトン）の分子量、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）マクロマーの分子量、およびポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）マクロマー中のフマレート対ポリ（ε−カプロラクトン）の比により、独立して制御され得る。ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）マクロマーの分解挙動もまた、ポリ（ε−カプロラクトン）の分子量、ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）マクロマーの分子量、およびポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）マクロマー中のフマレート対ポリ（ε−カプロラクトン）の比により、制御され得る。
【００１６】
本発明による生体適合性かつ生体吸収性ポリ（カプロラクトン−フマレート）生体材料は、５０〜７０℃の間の融点、および３０〜４０℃の間の硬化点を有する。この独特の特性は、この生体材料を、骨格再構築に適用するための注射可能かつｉｎ−ｓｉｔｕで硬化するスカフォードの組み立てに対して有用にしている。本発明の適用は、分解挙動が制御された、注射可能な生体吸収性合成代用骨として、または注射可能な生体吸収性骨セメントとしてであり得る。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、注射されてｉｎ  ｓｉｔｕで硬化してスカフォードを形成することができる、組織および／または骨格再構築用の、架橋性生分解性の重合体材料が提供される。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および添付の請求項を考慮することでより良く理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ポリ（ε−カプロラクトン）の数平均分子量が７６０ダルトンであるポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）のＦＴＩＲスペクトルである。
【図２】ポリ（ε−カプロラクトン）の数平均分子量が７６０ダルトンであるポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）のＭｎが３，６８０ダルトンおよび多分散性指数が２．３であるポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）スカフォードの断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】ポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）のＭｎが３，６８０ダルトンおよび多分散性指数が２．３であるポリ（ε−カプロラクトン−フマレート）スカフォードの縦断面のマイクロコンピュータ断層診断写真である。
【図５】ポリ（カプロラクトン−フマレート）（ＰＣＬＦ）ディスクに４８時間曝露した後の生存細胞の画分を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下：
【化１】
2011137166.tif 000003
のカプロラクトン単位、ならびに以下：
【化２】
2011137166.tif 000004
および／または
【化３】
2011137166.tif 000005
のフマレート単位からなる、生体適合性、生体吸収性、注射可能、かつ自己架橋性共重合体であるポリ（カプロラクトン−フマレート）を提供する。
【００２１】
１つの態様において、共重合体は、３，０００〜４，０００の範囲の数平均分子量、および２〜４の範囲の多分散性指数を有する。共重合体は、５０℃〜７０℃の範囲の融点を有し、そして融点より高い温度で注射可能である。
【００２２】
共重合体を調製する１つの方法において、得られる共重合体が架橋剤なしで自己架橋し得るように、ｉｎ  ｓｉｔｕでの架橋に用いられ得る不飽和炭素−炭素二重結合を含有する、フマリルハライド（例えば、フマル酸クロライド）などのフマル酸塩またはフマル酸が、柔軟な骨格を有するポリ（カプロラクトン）マクロマー（例えば、５００〜１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するポリ（ε−カプロラクトン））と共重合化される。
【００２３】
別の態様において、本発明は、カプロラクトン単位およびフマレート単位を有する本発明による共重合体、およびフリーラジカル開始剤（例えば、過酸化ベンゾイル）を含む自己架橋性生分解性材料を提供する。自己架橋性生分解性材料は、注射可能な代用骨または注射可能な骨セメントとして用いられ得る。１つの態様において、自己架橋性生分解性材料は、塩化ナトリウム結晶などの細孔形成剤を含む。自己架橋性生分解性材料はまた、ジメチルトルイジンなどの促進剤も含んでも良い。生分解性材料は自己架橋性であるため、架橋剤を含む必要がない。別の態様において、自己架橋性生分解性材料は、粒子状または繊維状補強材料を含む。好ましくは、粒子状または繊維状補強材料は、ヒドロキシアパタイトなどの生体活性セラミックスを含む。
【００２４】
自己架橋性生分解性材料は、組織再生用のスカフォードを調製するのに用いられ得る。スカフォードは、カプロラクトン単位およびフマレート単位を含む本発明による共重合体から形成された生分解性マトリクッスを含む。マトリクッスは、ヒドロキシアパタイトなどの粒子状または繊維状補強材料を含んでもよい。スカフォードは、細孔形成剤が重合性スカフォードに封入され、かつ材料の固体化の際、溶解して多孔質のスカフォードを形成する塩化ナトリウム塩の結晶などの細孔形成剤とともに形成されてもよい。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「生体適合性」材料は、重篤または増大する応答と対照的に、穏やかで、しばしば一時的な、移植応答のみを刺激するものである。本明細書中で使用される場合、「生分解性」材料は、通常のｉｎ  ｖｉｖｏ生理学的条件下で、代謝または排泄可能な成分に分解されるものである。本明細書中で使用される場合、「生体吸収性」材料は、身体の化学的／生物学的作用のため、限られた範囲の時間で崩壊するものである。「注射可能」により、共重合体が医療用シリンジによりある部位に送達され得ることを意味する。「自己架橋性」により、本発明による重合体の官能基と、同一の重合体または本発明による別の重合体の官能基との間の架橋を形成する架橋剤なしに、本発明による重合体の官能基が同一の重合体または本発明による別の重合体の官能基と架橋し得ることを意味する。
【００２６】
本明細書中の「分子量」という用語は、「重量平均分子量」（Ｍw＝ΣiＮiＭi2／ΣiＮiＭi）を示す。用いられた方法に応じて結果が異なる場合があるが、重量平均分子量（Ｍw）は様々な方法で決定可能であるものの、ゲル浸透クロマトグラフィーをもちいることが簡便である。本明細書中で使用される場合、「数平均分子量」（Ｍn）という用語は、重合体試料中の全分子の合計重量を、そこに含まれるモル数の合計で割ったものを示す（Ｍｎ＝ΣiＮiＭi／ΣiＮi）。用いられた方法に応じて結果が異なる場合があるが、数平均分子量は様々な方法で決定可能であるものの、ゲル浸透クロマトグラフィーをもちいることが簡便である。本明細書中で使用される場合、「多分散性」という用語は、材料の「重量平均分子量」をその「数平均分子量」で割ったもの（Ｍw／Ｍn）を示す。
【実施例１】
【００２７】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために示され、いかなる方法でも本発明を制限することを意図しない。
【００２８】
Ａ．ポリ（カプロラクトン−フマレート）マクロマーの合成
塩化メチレン中、触媒としてトリエチルアミンを用いて、ポリ（ε−カプロラクトン）とフマル酸クロライドとの縮重合によりポリ（カプロラクトン−フマレート）マクロマーを合成した。全ての化学薬品は、Aldrich(Milwaukee，WI，USA)から購入した。塩化メチレンおよびトリエチルアミンは、反応前に水素化カルシウムで乾燥および蒸留した。フマル酸クロライドは、１６１℃で蒸留して精製した。３４０ダルトン、７６０ダルトン、１２００ダルトンの数平均分子量（Ｍn）を有する３種のポリ（ε−カプロラクトン）の試料を用いた。３種のポリ（ε−カプロラクトン）の試料の多分散性指数は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で求めたところ、それぞれ、１．７、１．８、および１．８であった。ポリ（ε−カプロラクトン）の試料は、反応前に、５ｍｍＨｇ未満の減圧下、６０℃で、少なくとも１２時間乾燥させた。フマル酸クロライド対ポリ（ε−カプロラクトン）のモル比は０．９であった。７６０のＭnを有するポリ（ε−カプロラクトン）の代表的な反応は以下のとおりであった。
【００２９】
三つ口反応フラスコ中、窒素雰囲気下、４０ｍｍｏｌのポリ（ε−カプロラクトン）を３００ｍｌの塩化メチレンに溶解した。３６ｍｍｏｌのフマル酸クロライドおよび７２ｍｍｏｌのトリエチルアミンを２５ｍｌの塩化メチレンに溶解させて、反応系に撹拌しながら滴下した。反応容器を氷浴に入れて、発熱反応による温度上昇を抑えた。フマル酸クロライドおよびトリエチルアミンを加えた後、周辺条件下で反応を２４時間続けさせた。
【００３０】
反応の完了後、溶媒を周辺温度および減圧下でロータリエバポレーション(rotovaporation)により除去し、残渣を５００ｍｌの無水酢酸エチルに溶解して、副生成物のトリエチルアミン塩酸塩をろ過して除去し、３０℃で減圧蒸留して酢酸エチルを除去した。重合体を塩化メチレンに再溶解して、氷冷したエチルエーテルで２回沈殿させた。重合体を、減圧下（５ｍｍＨｇ未満）、周辺温度で少なくとも１２時間乾燥させ、用いるまで−２０℃で貯蔵した。
【００３１】
Ｂ．ゲル浸透クロマトグラフィー
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、ポリ（カプロラクトン−フマレート）マクロマーの分子量および多分散性を求めた。５１５型ＨＰＬＣポンプおよび２４１０型屈折率検出器と接続したＷａｔｅｒｓ  ７１７プラスオートサンプラーＧＰＣシステム(Waters，Milford，MA，USA)でＧＰＣを行った。カラムは、スタイラジェルＨＲ４Ｅカラム（７．８×３００ＭＭ、Waters）と直列に並んだスタイラジェルＨＴガードカラム（７．８×３００ｍｍ、Waters）からなった。重合体試料（２０μｌ）を、テトラヒドロフラン中２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。０．４７４ｋＤ、６．６９ｋＤ、１８．６ｋＤ、および３８ｋＤのＭｎおよび１．１未満の多分散性を有する単分散ポリスチレン標準（Polysciences，Warrington，PA）を用いて較正曲線を構築した。
【００３２】
Ｃ．1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲ
核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて、マクロマー中のフマレート基の存在を確認した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ５００ＭＨｚシステム(Bruker  Analytic  GmbH，Rheinstetten，Germany)を用いて周辺温度で1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記録した。1Ｈ−ＮＭＲについては、パルス角、パルス持続期間、遅延時間、収集時間、分解能、および走査回数は、それぞれ、９０°、６μ秒、７秒、３秒、０．１７Ｈｚ、および３２であった。13Ｃ−ＮＭＲについては、それぞれ９０°、４μ秒、５秒、２００ｍ秒、２．４Ｈｚ、および２０４８であった。ＮＭＲ用の重合体溶液は、内部標準として１％ｖ／ｖトリメチルシラン（ＴＭＳ）を含有する重水素化クロロホルム（９９．８原子％重水素化，Aldrich）で、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。
【００３３】
Ｄ．フーリエ変換赤外分光法
ＦＴＳ−４０フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴＩＲ）(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)を用いて、１，０００〜４，０００ｃｍ-1のＩＲ領域で、ポリ（カプロラクトン−フマレート）の吸収を測定した。重合体の薄膜を大きさ３ｍｍ×３２ｍｍのＣａＦ2ディスク(Wilmad  Glass，Buena，NJ，USA)に載せ、そして乾燥窒素雰囲気下、１６回の平均走査および４ｃｍ-1の分解能でスペクトルを収集した。ポリ（カプロラクトン−フマレート）のアセトン溶液（１ｍｌのアセトン中５０ｍｇのポリ（カプロラクトン−フマレート））の滴をＣａＦ2ディスクに落として周辺条件で３０秒間乾燥させた。次いで、これを減圧下周辺温度で３０秒間乾燥させ、そして最後に６０℃に加熱してフィルムに残存する全ての溶媒を除去した。
【００３４】
Ｅ．スカフォード組み立て
細孔形成剤として塩化ナトリウム塩粒子を用いて、フリーラジカル重合を介してフマレート炭素−炭素二重結合の自己架橋によりスカフォードを調製した。過酸化ベンゾイルおよびジメチルトルイジンを、それぞれフリーラジカル開始剤および促進剤として用いた。架橋反応に用いた全ての化学薬品は、Aldrichから入手して、そのまま用いた。ふるい分けにより得られた塩粒子の大きさの分布は、平均４００μｍで、１００〜７００μｍの範囲であった。スカフォードの組み立ての代表的な手順は以下のとおりであった。
【００３５】
シンチレーションバイアル中、１グラムのポリ（カプロラクトン−フマレート）を７５体積％の空隙率に相当する５．０ｇの細孔形成剤と混合した。５０μｌの開始剤溶液（２５０μｌのＮ−ビニルピロリドン中５０ｍｇの過酸化ベンゾイル）および４０μｌの促進剤溶液（９４０μｌの塩化メチレン中６０μｌのジメチルトルイジン）を加えて、十分に混合した。Ｎ−ビニルピロリドンを、ポリ（カプロラクトン−フマレート）の２重量％に満たない量で用いて、開始剤を溶解させたが、架橋剤としては使用されなかった。重合性スカフォードを５ｍｍ×１８ｍｍのＴｅｆｌｏｎ製の型に移し、そして手で押して最大限に詰めた。型を対流式オーブンに１時間入れて、架橋を促進した。架橋後、型を周辺温度に冷却し、スカフォードを型から取り出し、そして直径および長さが５ｍｍ×８ｍｍの円筒型標本を、Ｉｓｏｍｅｔ低速のこぎり(Buehler，Lake  Bluff，IL，USA)で切り取った。スカフォードを蒸留水（ＤＷ）中に３日間置くことで塩を浸出させ、この間、水は１２時間ごとに交換した。スカフォードを、制御雰囲気下、周辺温度で１日、そして５ｍｍＨｇ未満の減圧下で少なくとも１２時間乾燥させた。
【００３６】
Ｆ．走査型電子顕微鏡
冷陰極電界放射型走査型電子顕微鏡（Ｓ−４７００，Hitachi  Instruments  inc.，Tokyo，Japan）を用いてスカフォードの細孔形態を検査した。各スカフォードを液体窒素温度で割り、スカフォードの平坦な内部断面を露出させた。試料を、Ｈａｎｉｄ−Ｔａｋパテ(Super  Glue  Corp.，Rancho  Cucamonga，CA，USA)を用いてＳＥＭスタブ(Ted  Pella，Redding，CA，USA)にマウントし、そしてこれにコロイド銀を塗って装置に電気的に接地した。これを、減圧デシケーター中で一晩乾燥させた。装置を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ／Ｐｏｌａｒｏｎ  Ｅ５４００高分解能スパッタコーター(Bio-Rad/Polaron，Cambridge，MA)を用いて９０ｍＡで３０秒間、金−パラジウムでスパッタコーティングした。試料を、５ｋＶの加速電圧でＳＥＭで視察した。
【００３７】
Ｇ．マイクロコンピュータ断層診断
マイクロＣＴスキャナを、Mayo  Clinic(Rochester，MN，USA)の生理学画像研究(Physiological  Imaging  Research)の研究室で、市販されている部品から自作した。スキャナは、上限１０億個の立方体のボクセルからなる三次元画像を作り出す。標本を結晶の近くに配置して、各Ｘ線照射源とそれに付随する電荷連動記録デバイス(device  recording)との間で、等角度で数百回、３６０°方向で回転させた。総合三次元画像表示分析プログラム(Analyze（登録商標），Mayo  Foundation，Mayo  Clinic，Rochester，MN，USA)を用いて、重合体スカフォードの微小構造を定量的に評価した。異なる密度の領域を表すボクセルを分割するために、オペレータの選択した強度閾値で画像を分断した。画像はそれから診断されて、各材料の体積画分が求められ、内部結合性(interconnectivity)が測定され、そして孤立した細孔の大きさ分布が求められた。
【００３８】
Ｈ．細胞毒性評価
雑種犬の足から線維芽細胞を単離した。簡単には、無菌条件下、腱を摘出して、０．２％コラーゲン分解酵素III型(Worthington  Biochemical  Corp.，Lakewood，NJ，USA)溶液を用いて、オービタルシェーカー上、ダルベッコ変法イーグル培地(Gibco，Life  Technologies，Gaithersburg，MD，USA)中３７℃で２４時間消化した。細胞懸濁液を、ポリスチレンフラスコの、９００ｍｌの蒸留脱イオン水中１３．４ｇのＤＭＥＭおよび３．７ｇの重炭酸ナトリウム、１０％ｖ／ｖのウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ｖ／ｖのペニシリン−ストレプトマイシン溶液（１ｍｌあたり１０，０００単位のペニシリンおよび１０ｍｇのストレプトマイシン）を含有する一次培地に蒔いた。蒔いた後、懸濁液を、５％のＣＯ2、９５％の相対湿度のインキュベーター中３７℃で１２時間、インキュベートした。細胞をＰＢＸで２回洗浄し、そして２ｍｌの０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡに５分間曝露することにより、酵素的にリフトした(lifted)。懸濁液を遠心分離し、そして細胞毒性評価のため一次培地に再懸濁させた。
【００３９】
細胞を、滅菌した５ｍｍ×０．５ｍｍのポリ（カプロラクトン−フマレート）ディスクの存在下、１２ウェルプレートに、３００μｌ／ｃｍ2の一次培地中２×１０4個／ｃｍ2の密度で蒔いて、細胞毒性評価を行った。細胞の付着および増殖のため、プレートを４８時間インキュベートした。細胞を、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５  Ｚｅｉｓｓ  光学顕微鏡(Carl  Zeiss，Germany)で視察した。ポリ（カプロラクトン−フマレート）フィルムを、スカフォード組み立ての段落で記載されるとおりに、過酸化ベンゾイルおよびジメチルトルイジンをそれぞれ開始剤および促進剤として用いて、細孔形成剤としての塩を用いずにポリ（カプロラクトン−フマレート）の自己架橋により調製した。フィルムを作るため、混合物を、４０℃で２７５Ｉｂ／ｉｎ2の圧力で圧縮した。穿孔器を用いて直径５ｍｍのディスクをフィルムから切り取った。ディスクを過剰な７０％エタノールに移して一晩震盪させて滅菌し、次いでＰＢＳで少なくとも３回洗浄してから１２ウェルプレートに加えた。
【００４０】
Ｉ．細胞適合性評価
ＡＳＴＭＦ８１３−０１をポリ（カプロラクトン−フマレート）（ＰＣＬＦ）スカフォードの細胞直接接触の評価に用いた。ヒト骨芽細胞を用いた。細胞の単離および特性決定は、S.A.Harris，et  al.，「条件的に不死化したヒト胎児骨芽細胞株の発達および特性決定(Development  and  characterization  of  a  conditionally  immortalized  human  fetal  osteoblast  cell  line)」，J．Bone．Miner．Res.，10-2（1995）p.178-186に記載される。冷凍保存した細胞を解凍して、ポリスチレンフラスコの、ＤＭＥＭ／Ｆ１２および重炭酸ナトリウム、１０％ｖ／ｖのウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ならびに１５０ｍｇのジェネテシンを含有する培地に蒔いた。蒔いた後、懸濁液を、５％のＣＯ2、９５％の相対湿度のインキュベーター中３４℃で１２時間インキュベートした。細胞を、３００μｌの培地中６．５×１０4個／ｃｍ2の密度で、２４ウェルプレートに播種し、４８時間インキュベートした。次いで、ディスクを取り出し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培地を各ウェルに添加し、そしてさらに２４時間インキュベートした。細胞を、トリパンブルー染色を用いて、血球計数器で計数した。ＰＣＬＦディスクに４８時間曝露した後の生存細胞の画分を図５に示す。対照、ＰＣＬのＭnが７６０（Ｌ１０）、および１２００（Ｌ２０）である直鎖ＰＣＬＦ、ならびにＰＣＬのＭnが３４０（Ｘ５）、７６０（Ｘ１０）、および１２００ｇ／ｍｏｌ（Ｘ２０）である架橋ＰＣＬＦについて、生存細胞の画分は、それぞれ、０．８５±０．０４、０．８６±０．０４、０．８３±０．０３、０．８４±０．０７、０．８４±０．０６、および０．８６±０．０２であった。ＰＣＬＦスカフォードの存在下、ヒト骨芽細胞にたいする副作用は観測されなかった。
【００４１】
結果および考察
Ｍnが３，６８０ダルトンでありポリ（カプロラクトン）数平均分子量が７６０ダルトンであるポリ（カプロラクトン−フマレート）のＦＴＩＲスペクトルを再検討した。図１を参照。２，９４４ｃｍ-1および２，８６５ｃｍ-1のピーク位置の吸収帯が観測されたが、これらはポリ（カプロラクトン）のメチレン基の非対称伸縮（ｖasＣＨ2）および対称伸縮（ｖsＣＨ2）によるものである。１，７２４ｃｍ-1のピーク位置の吸収帯が観測されたが、これはポリ（カプロラクトン）およびフマレート基のカルボニル（Ｃ＝Ｏ）振動によるものである。１，４１９ｃｍ-1のピーク位置の弱い吸収帯が観測されたが、これはｃｉｓ−二置換フマレート基のＣ−Ｈゆれ振動によるものであり、ポリ（カプロラクトン）のスペクトルには存在しない。
【００４２】
Ｍnが３，６８０ダルトンでありポリ（カプロラクトン）数平均分子量が７６０ダルトンであるポリ（カプロラクトン−フマレート）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを再検討した。図２を参照。１．３８ｐｐｍおよび１．６５ｐｐｍのピーク位置の化学シフトが観測されたが、これらはそれぞれ、ポリ（カプロラクトン）の、１つのメチレン基および１つの（−ＣＨ2Ｏ）基の２つのメチレン（−ＣＨ2）基に付着したメチレン水素、によるものである。２．３ｐｐｍのピーク位置の化学シフトが観測されたが、これはポリ（カプロラクトン）の、メチレン（−ＣＨ2）基とカルボキシル（−ＣＯＯＲ）基に付着したメチレン水素によるものである。中心が３．６ｐｐｍの化学シフトが観測されたが、これはポリ（カプロラクトン）の、−ＣＨ2とヒドロキシル基（−ＯＨ）に付着した末端のメチレン水素によるものである。中心が４．１ｐｐｍの化学シフトが観測されたが、これは−ＣＨ2と−ＯＣＯＲに付着した、末端ではないメチレン水素によるものである。中心が４．１ｐｐｍのピーク対３．６ｐｐｍのものの比は、Ｍnが３，６８０ダルトンのポリ（カプロラクトン−フマレート）では３．９に等しく、これはポリ（カプロラクトン）のフマル酸クロライドとの共重合の度合いに関連している。この比はゲル浸透クロマトグラフィーで得られたポリ（カプロラクトン−フマレート）の分子量と一致する。
【００４３】
中心が３．１ｐｐｍおよび４．３５ｐｐｍの比較的小さいピークが観測されたが、これらはポリ（カプロラクトン）の、残余のエトキシ基のメチレン水素によるものである。６．８ｐｐｍのピーク位置の化学シフトが観測されたが、これはポリ（カプロラクトン−フマレート）のフマレート基の水素によるものであり、ポリ（カプロラクトン）のスペクトルには存在しない。フマレート水素の化学シフトが７．０ｐｐｍ未満であることから、共重合体中のフマレート基はｃｉｓ配座にある。６．８ｐｐｍの化学シフトの存在は、フマレート基がポリ（カプロラクトン）に組み込まれていることをはっきりと示した。
【００４４】
ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）分子量の関数としてのポリ（カプロラクトン−フマレート）（ＰＣＬＦ）の分子量を表１に示す。フマル酸クロライド−ポリ（カプロラクトン）（ＦＣ／ＰＣＬ）比は全ての配合で０．９であった。数平均分子量が３４０ダルトン、７６０ダルトン、および１，２００ダルトンであるポリ（カプロラクトン）は、それぞれ、分子量が３，１５０、３，６８０、および３，８７０ダルトンであるポリ（カプロラクトン−フマレート）共重合体を生成した。全ての分子量について、ポリ（カプロラクトン−フマレート）の多分散性指数はポリ（カプロラクトン）のものよりも明らかに高かった。
【００４５】
【表１】
2011137166.tif 000006
【００４６】
スカフォードを、ポリ（カプロラクトン−フマレート）共重合体から、細孔形成剤としての塩、化学開始剤としての過酸化ベンゾイル、促進剤としてのジメチルトルイジンを使用して、組み立てた。Ｍnが３，６８０ダルトン、多分散性指数が２．３、そして７５体積％の塩含量のポリ（カプロラクトン−フマレート）スカフォードの断面のＳＥＭ写真を作成した。図３を参照。ＳＥＭ画像は、非常に多孔質で結合し合った固体スカフォードを示した。
【００４７】
同一のスカフォードの縦断面もまた、マイクロ−ＣＴで得て作成した。図４を参照。マイクロコンピュータ断層診断画像は、架橋剤なしで、三次元の多孔質で結合し合ったポリ（カプロラクトン−フマレート）スカフォードが形成されたことを確認した。
【００４８】
化学的に開始させて自己架橋したポリ（カプロラクトン−フマレート）のディスクを、培養した線維芽細胞に上限４８時間曝露させた。細胞は、ポリ（カプロラクトン−フマレート）ディスクの存在下、増殖した。ポリ（カプロラクトン−フマレート）スカフォードの存在下、細胞への副作用は観測されなかった。
【００４９】
したがって、自己架橋性かつ生分解性のマクロマーが、誘導骨再生用に開発された。１つの実施態様において、マクロマーは、ｉｎ−ｓｉｔｕでの架橋用の二重結合を含むフマル酸クロライドと、自己架橋性を促進するための柔軟な鎖を有するポリ（ε−カプロラクトン）との共重合体である。ポリ（カプロラクトン−フマレート）は、フーリエ変換赤外線分光法、核磁気共鳴分光法、およびゲル浸透クロマトグラフィーで特性決定された。多孔質スカフォードは、細孔形成剤としての塩化ナトリウム粒子および化学開始系を使用して組み立てられた。ポリ（カプロラクトン−フマレート）スカフォードは、走査型電子顕微鏡およびマイクロコンピュータ断層診断で特性決定された。ポリ（カプロラクトン−フマレート）共重合体は、架橋剤を用いることなく、首尾よく自己架橋した。この共重合体は、骨格異常を治療するための注射可能な自己架橋性材料として有用である。
【００５０】
本発明は、特定の実施態様を参照してかなり詳細に記載されたものの、当業者は、本発明が、制限としてではなく例示の目的で記載された実施態様と異なって実施され得ることを理解するだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書中に含まれる実施態様の記載に限定されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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