(57)【要約】【課題】植物体中のヨウ素含有量を高める方法、及び当該方法により作製されたヨウ素高含有植物の提供。【解決手段】植物体中の、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能を破壊することを特徴とするヨウ素高含有植物の作製方法、及び、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能が破壊されていることを特徴とするヨウ素高含有植物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体中の、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能を破壊することを特徴とするヨウ素高含有植物の作製方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、ＨＯＬ（ＨＡＲＭＬＥＳＳ  ＴＯ  ＯＺＯＮＥ  ＬＡＹＥＲ）遺伝子、ＭＣＴ（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＴＭＴ（ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＨＴＭＴ（ｈａｌｉｄｅ／ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ) 遺伝子、及びそれらのホモログ遺伝子からなる群より選択される遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のヨウ素高含有植物の作製方法。
【請求項３】
前記遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のヨウ素高含有植物の作製方法。
（ａ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列と４５％以上の相同性を有し、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
前記植物体が、被子植物であることを特徴とする請求項１記載のヨウ素高含有植物の作製方法。
【請求項５】
前記遺伝子の機能破壊を、トランスポゾン・タギング法又はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）法により行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のヨウ素高含有植物の作製方法。
【請求項６】
ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能が破壊されていることを特徴とするヨウ素高含有植物。
【請求項７】
前記遺伝子が、ＨＯＬ（ＨＡＲＭＬＥＳＳ  ＴＯ  ＯＺＯＮＥ  ＬＡＹＥＲ）遺伝子、ＭＣＴ（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＴＭＴ（ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＨＴＭＴ（ｈａｌｉｄｅ／ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ) 遺伝子、及びそれらのホモログ遺伝子からなる群より選択される遺伝子であることを特徴とする請求項６記載のヨウ素高含有植物。
【請求項８】
前記遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項６記載のヨウ素高含有植物。
（ａ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列と４５％以上の相同性を有し、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
被子植物であることを特徴とする請求項６記載のヨウ素高含有植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヨウ素含有量の高い植物、及びヨウ素含有量の高い植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨウ素は必須栄養素の１つであり、甲状腺ホルモンの重要な構成要素である。ヨウ素が欠乏すると、甲状腺の機能が低下し、貧血、低体温等の身体機能の低下が引き起こされる。また、浮腫、皮膚の乾燥、体重増加、精神異常等の症状も観察される。特に子供の場合には、ヨウ素欠乏により、発育阻害と精神遅滞が生じてしまう。
【０００３】
また、地球表面上のヨウ素は、主に水溶性のヨウ素塩類として海水中に含まれており、地下資源としては非常に偏在している希少資源である。このため、土壌中にほとんどヨウ素が含まれていない内陸部においては、慢性的にヨウ素が欠乏し易く、ヨウ素欠乏症は、世界で問題となっている微量栄養素欠乏症の１つである。実際に、世界中で約２０億人が十分量のヨウ素を摂取できていないという報告もある（例えば、非特許文献１等参照。）。このため、ヨウ素欠乏症を撲滅するための試みが世界中で行われており、世界保健機関（ＷＨＯ）もヨウ素欠乏症の改善するための指針をまとめている（例えば、非特許文献２等参照。）。
【０００４】
ヨウ素欠乏症を解決するためには、安定なヨウ素供給方法の確立が必要であり、このため非常に有効な手法として、ヨウ素強化食品を継続摂取する方法がある。このようなヨウ素強化食品としては、ヨウ素添加食塩が一般的に普及している（例えば、非特許文献３参照。）。また、食用作物自体のヨウ素含有量を高めるために、ヨウ素を含む肥料を施肥する方法もある（例えば、非特許文献４〜６等参照。）。その他、ヨウ素自体や海藻抽出物を含有する栄養補助食品を摂取することによっても、ヨウ素欠乏を回避することができる。
【０００５】
一方で、近年、植物中のハロゲン化物の代謝酵素として、ＨＯＬ（ＨＡＲＭＬＥＳＳ  ＴＯ  ＯＺＯＮＥ  ＬＡＹＥＲ）遺伝子が報告されている。例えば、モデル植物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＨＯＬ（ＡｔＨＯＬ）は、ヨウ化物イオンをメチル化してヨウ化メチルを生成する反応を触媒する酵素である（例えば、非特許文献７参照。）。また、アブラナ科の植物である赤キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）から、チオールメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素であるＴＭＴ（ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が同定されているが、このＴＭＴは、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性も有している（例えば、非特許文献８及び９参照。）。さらに、塩生植物であるＢａｔｉｓ  ｍａｒｉｔｉｍａは、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ (ＳＡＭ)依存的なメチルトランスフェラーゼであるＭＣＴ（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を発現しており、当該ＭＣＴがヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有していることも報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。その他、多くの植物において、ヨウ化メチル産生能を有することが報告されている（例えば、非特許文献１１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】デ・ベノイスト（de Benoist）、外３名、フード・アンド・ニュートリション・ブリティン（Food and Nutrition Bulletin）、２００８年、第２９巻第３号、第１９５〜２０２ページ。
【非特許文献２】世界保健機関編、「Assessment of iodine deficiency disorders and monitoring their elimination - A guide for programme managers- Third edition」、２００７年。
【非特許文献３】ジマーマン（Zimmermann）、外２名、ランセット（The Lancet）、２００８年、第３７２巻、第１２５１〜１２６２ページ。
【非特許文献４】ブラスコ（Blasco）、外５名、アナルズ・オブ・アプライド・バイオロジー（Annals of Applied Biology）、２００８年、第１５２巻、第２８９〜２９９ページ。
【非特許文献５】ジュ（Zhu）、外３名、エンバイロメント・インターナショナル（Environment International）、２００３年、第２９巻、第３３〜３７ページ。
【非特許文献６】マッコウィァク（Mackowiak）、外１名、１９９９年、プラント・アンド・ソイル（Plant and Soil）、第２１２巻、第１３５〜１４３ページ。
【非特許文献７】ナガトシ（Nagatoshi）、外１名、プラント・バイオテクノロジー（Plant Biotechnology）、２００７年、第２４巻、第５０３〜５０６ページ。
【非特許文献８】アティー（Attieh）、外２名、アチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics）、２０００年、第３８０巻第２号、第２５７〜２６６ページ。
【非特許文献９】アティー（Attieh）、外２名、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、１９９５年、第２７０巻第１６号、第９２５０〜９２５７ページ。
【非特許文献１０】ニ（Ni）、外１名、米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９９９年、第９６巻、第３６１１〜３６１５ページ。
【非特許文献１１】サイニ（Saini）、外２名、プラント・セル・アンド・エンバイロメント（Plant, Cell and Environment）、１９９５年、第１８巻、第１０２７〜１０３３ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、例えばヨウ素添加食塩は、社会的、技術的インフラストラクチャーの未整備等の理由により、その恩恵を受けられない場合が多くある（例えば、非特許文献５参照。）。また、ヨウ素を含む肥料を施肥して作物を栽培することにより、ヨウ素含有量の高い植物を栽培することができるが、ヨウ素を含む肥料はコストがかかり、普及には困難が予想される。その他、栄養補助食品として摂取する場合には、過剰摂取による健康被害を引き起こし易いという問題もある。
このように、未だ完全なヨウ素欠乏症の解決には至っておらず、従来手法を補完することができるヨウ素の普及技術の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、植物体において、ＨＯＬ（ＨＡＲＭＬＥＳＳ  ＴＯ  ＯＺＯＮＥ  ＬＡＹＥＲ）遺伝子等のヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能を破壊することにより、当該植物のヨウ素含有量を高められることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）植物体中の、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能を破壊することを特徴とするヨウ素高含有植物の作製方法、
（２）  前記遺伝子が、ＨＯＬ（ＨＡＲＭＬＥＳＳ  ＴＯ  ＯＺＯＮＥ  ＬＡＹＥＲ）遺伝子、ＭＣＴ（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＴＭＴ（ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＨＴＭＴ（ｈａｌｉｄｅ／ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ) 遺伝子、及びそれらのホモログ遺伝子からなる群より選択される遺伝子であることを特徴とする前記（１）記載のヨウ素高含有植物の作製方法。
（３）前記遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする前記（１）記載のヨウ素高含有植物の作製方法；
（ａ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列と４５％以上の相同性を有し、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、
（４）  前記植物体が、被子植物であることを特徴とする前記（１）記載のヨウ素高含有植物の作製方法、
（５）  前記遺伝子の機能破壊を、トランスポゾン・タギング法又はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）法により行うことを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のヨウ素高含有植物の作製方法、
（６）  ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能が破壊されていることを特徴とするヨウ素高含有植物、
（７）  ＨＯＬ（ＨＡＲＭＬＥＳＳ  ＴＯ  ＯＺＯＮＥ  ＬＡＹＥＲ）遺伝子、ＭＣＴ（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＴＭＴ（ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ＨＴＭＴ（ｈａｌｉｄｅ／ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ) 遺伝子、及びそれらのホモログ遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が破壊されていることを特徴とする前記（６）記載のヨウ素高含有植物、
（８）  前記遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする前記（６）記載のヨウ素高含有植物；
（ａ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列と４５％以上の相同性を有し、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、
（９）  被子植物であることを特徴とする前記（６）記載のヨウ素高含有植物、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法により、植物のヨウ素含有量を高めた植物を作製することができる。このため、本発明のヨウ素高含有植物の作製方法を食用作物に対して実施することにより、肥料中にヨウ素を特別に施肥せずとも、ヨウ素含有量を高めた食用作物を栽培することができる。さらに、得られたヨウ素含有量の高い食用食物を食することにより、ヨウ素添加食塩や栄養補助食品よりも自然にヨウ素を摂取することができるため、過剰摂取等の問題が生じ難く、より安全にヨウ素欠乏症を予防することが期待できる。
また、当該作製方法により作製された本発明のヨウ素高含有植物は、元品種の植物と同様に栽培して収穫することができる。このため、特に、地域固有の栽培種に対して本発明のヨウ素高含有植物の作製方法を実施することにより、地域農業への浸透、普及が非常に容易なヨウ素高含有植物を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＯＬ遺伝子がコードするＨＯＬタンパク質のメチルトランスフェラーゼ酵素活性の概略図である。
【図２】シロイヌナズナのＨＯＬ遺伝子のホモログ遺伝子のアミノ酸配列に基づく系統樹を示した図である。
【図３】ＡｔＨＯＬ１、ＡｔＨＯＬ２、ＡｔＨＯＬ３、ＯｓＨＯＬ１、ＯｓＨＯＬ２、ＴＭＴ１、及びＢｍＭＣＴの各遺伝子情報から推定されるアミノ酸配列をアラインメントした図である。
【図４】実施例２において、作成された検量線を示した図である。
【図５】実施例２において、各シロイヌナズナ細胞抽出液中のヨウ化物イオン量の定量結果を示した図である。
【図６】実施例３において、作成された検量線を示した図である。
【図７】実施例３において、精製したＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＯｓＨＯＬ１タンパク質のヨウ化物イオンに対するＳＡＭ依存的なメチル基転移酵素活性の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、「ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性」とは、ヨウ化物イオンをメチル化してヨウ化メチルを生成する反応を触媒する酵素活性を意味する。
また、本発明において、「ヨウ素高含有植物」とは、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する植物において、当該遺伝子を破壊する前の植物体よりも、植物体中のヨウ素含有量が高い植物を意味する。
【００１３】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法は、植物体中の、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド（以下、単に「メチルトランスフェラーゼ酵素」ということがある。）をコードする遺伝子の機能を破壊することを特徴とする。メチルトランスフェラーゼ酵素により生成されるヨウ化メチルは揮発性であり、このため、生成されたヨウ化メチルの大部分は気体交換により大気中に放出される。本発明においては、このメチルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子（以下、単に「メチルトランスフェラーゼ遺伝子」ということがある。）の機能を破壊し、ヨウ化物イオンのメチル化を阻害することにより、植物体から放出されるヨウ化メチル量を低減させる結果、土壌中からヨウ化物イオンとして吸収されたヨウ素を効率よく植物体中に蓄積し、植物体中のヨウ素含有量を高めることができる。
【００１４】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法において、機能を破壊する遺伝子としては、メチルトランスフェラーゼ遺伝子であれば特に限定されるものではない。また、メチルトランスフェラーゼ酵素としては、ヨウ化物イオンを基質とする酵素であればよく、ヨウ化物イオン以外の他のハロゲン化物又はハロゲン化物類似化合物をメチル化可能な酵素であってもよい。このような遺伝子として、例えば、ヨウ化物イオンとチオールの両方を基質とするＨＴＭＴ（ｈａｌｉｄｅ／ｔｈｉｏｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子等が挙げられる（非特許文献９及び１０参照。）。
【００１５】
本発明においては、メチルトランスフェラーゼ遺伝子として、ＨＯＬ遺伝子、ＭＣＴ遺伝子、ＴＭＴ遺伝子、又はＨＴＭＴ遺伝子の機能を破壊することが好ましい。なお、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する限りにおいて、これらの遺伝子のホモログ遺伝子を、本発明のヨウ素高含有植物の作製方法において機能を破壊する遺伝子としてもよい。
【００１６】
ＨＯＬ遺伝子は、植物体中で塩化メチル等の生合成に関与しており、当該遺伝子を破壊した植物では、塩化メチル等の放出量が低下することが報告されている（リュー（Rhew）、外３名、カレント・バイオロジー（Current Biology）、２００３年、第１３巻、第１８０９〜１８１３ページ。）。図１は、ＨＯＬ遺伝子がコードするＨＯＬタンパク質のメチルトランスフェラーゼ酵素活性の概略図である。ＨＯＬタンパク質は、ヨウ化物イオンをはじめとする様々なハロゲン化物又はハロゲン化物類似化合物を、ＳＡＭ等のメチル基供与体の活性メチル基を用いて、ヨウ化メチル等のメチル化体を生成する。なお、このメチル化反応の植物にとっての役割は明らかではないが、ＨＯＬタンパク質の生体中の主な基質はヨウ化物イオンではなく、ＨＯＬタンパク質によってヨウ化物イオンからヨウ化メチルが生成される反応は、植物にとって重要な他のメチル化反応の副反応である可能性がある。
【００１７】
植物の種類によっては、一の植物中に、メチルトランスフェラーゼ酵素に複数種類のアイソザイムがある場合がある。本発明においては、メチルトランスフェラーゼ酵素の複数種類のアイソザイムのうち、いずれのアイソザイムをコードする遺伝子の機能を破壊してもよい。また、１種類のアイソザイムをコードする遺伝子の機能を破壊してもよく、２種類以上のアイソザイムをコードする遺伝子の機能を破壊してもよい。ここで、アイソザイムには、別個の遺伝子由来のメチルトランスフェラーゼ酵素のみならず、一の遺伝子から選択的スプライシングにより得られるアイソフォームも含まれる。
【００１８】
メチルトランスフェラーゼ酵素に複数種類のアイソザイムがある場合には、いずれのアイソザイムをコードする遺伝子を破壊するかは、各アイソザイムの発現部位や発現時期、発現量等を考慮して適宜決定することができる。例えば、食用植物の場合には、可食部位における発現量の多いアイソザイムを選択し、当該アイソザイムをコードする遺伝子の機能を破壊することにより、食用部位のヨウ素含有量が高い食物を作製することができる。
【００１９】
例えば、シロイヌナズナのＨＯＬ遺伝子には、ＡｔＨＯＬ１（アクセッション番号：ＮＭ＿１２９９５３）、ＡｔＨＯＬ２（アクセッション番号：ＮＭ＿１２９９５４）、ＡｔＨＯＬ３（アクセッション番号：ＮＭ＿１８００７２）の３つのアイソフォームがある。このうちＡｔＨＯＬ１タンパク質はユビキタスに発現しているが、ＡｔＨＯＬ２タンパク質及びＡｔＨＯＬ３タンパク質は、ＡｔＨＯＬ１タンパク質に比べて非常に発現量が少ないことが分かっている（非特許文献７参照。）。このため、ＡｔＨＯＬ２遺伝子又はＡｔＨＯＬ３遺伝子よりも、最も発現量が多いＡｔＨＯＬ１遺伝子の機能を破壊することにより、よりヨウ素含有量の高い植物を作製することができる。
【００２０】
なお、本発明及び本願明細書において、「アクセッション番号」とは、ＮＩＨ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のゲノム配列データベースであるＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を意味する。
【００２１】
メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する限りにおいて、シロイヌナズナのＨＯＬ（ＡｔＨＯＬ１、ＡｔＨＯＬ２、又はＡｔＨＯＬ３）と、アミノ酸配列の類似性が高いポリペプチドをコードする遺伝子を、本発明のヨウ素高含有植物の作製方法において機能を破壊する遺伝子としてもよい。このような遺伝子としては、配列番号２、４、又は６で表されるアミノ酸配列と３８％以上、好ましくは４５％以上の相同性を有し、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号２、４、及び６のアミノ酸配列は、それぞれ、ＡｔＨＯＬ１タンパク質、ＡｔＨＯＬ２タンパク質、及びＡｔＨＯＬ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。なお、「ポリペプチドをコードする遺伝子」には、当該ポリペプチドのみをコードする遺伝子のみならず、当該ポリペプチドを全体の一部として含む遺伝子も含まれる。
【００２２】
図２は、シロイヌナズナのＨＯＬ遺伝子のホモログ遺伝子のアミノ酸配列に基づく系統樹を示した図である。図中の各遺伝子が由来する生物種、データベース等への登録番号（registry numbers）、及び当該遺伝子がコードする推定タンパク質とＡｔＨＯＬ１タンパク質とのアミノ酸配列の相同性（表中「相同性」）を表１に示す。データベース等への登録番号には、アクセッション番号に加えて、ＤＯＥ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ/）、Ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ．ｃｎｓ．ｆｒ/ｓｐｉｐ/）、のＩＤ番号が記載されている。なお、Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａの遺伝子の配列は、２個のＥＳＴ配列を繋ぎ合わせたものであり、この２個のＥＳＴ配列の登録番号を記載した。各遺伝子の推定タンパク質とＡｔＨＯＬ１タンパク質との相同性は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いて求めた。また、図２の系統樹は、Ｎｊｐｌｏｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（ｕｎｒｏｏｔｅｄ）を用いて作成した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
後記実施例３において示すように、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）におけるシロイヌナズナのＡｔＨＯＬ１遺伝子のホモログ遺伝子であり、アミノ酸配列上４５．８％の相同性を有するＯｓＨＯＬ１が、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有していることが確認された。また、赤キャベツにおけるホモログ遺伝子であり、アミノ酸配列上８３．６〜８６．７％の相同性を有するＴＭＴ遺伝子も、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有していることが報告されている（非特許文献８及び９等参照。）。ここで、シロイヌナズナと赤キャベツは双子葉植物であるが、イネは単子葉植物である。つまり、これらの結果等から、少なくとも被子植物においては、シロイヌナズナのＨＯＬ遺伝子のホモログ遺伝子の機能や、ＨＯＬ遺伝子とアミノ酸配列の類似性が高いポリペプチドをコードする遺伝子の機能を破壊することにより、ヨウ素高含有植物を作製し得ることが明らかである。また、遺伝子の相同性検索の結果から、裸子植物やコケ類においても、シロイヌナズナのＨＯＬ遺伝子のホモログ遺伝子が存在していることが確認されている。よって、被子植物のみならず、裸子植物やコケ類においても、シロイヌナズナのＨＯＬ遺伝子のホモログ遺伝子の機能を破壊することにより、ヨウ素高含有植物を作製し得るといえる。
【００２５】
また、植物の種類によっては、メチルトランスフェラーゼ遺伝子が多型を有する場合がある。このような多型遺伝子であっても、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する限り、当該遺伝子の機能を破壊することにより、ヨウ素高含有植物を作製することができる。したがって、例えば、本発明においては、表１記載の遺伝子（各登録番号の塩基配列）の推定されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヨウ化物イオンを基質とするメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の機能を破壊してもよい。
【００２６】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法に供される植物としては、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する植物であれば特に限定されるものではなく、食用植物であってもよく、非食用植物であってもよい。具体的には、非特許文献１１中に記載の作物が例示できる。食用植物を用いた場合には、作製されたヨウ素含有量の高い食用植物を食することにより、ヨウ素を簡便かつ比較的安全に摂取することができる。ヒトの食糧となる植物のみならず、ヒト同様にヨウ素栄養を必要とする家畜、家禽の飼料用植物を用いることも好ましい。一方、非食用植物に対して用いた場合には、作製されたヨウ素高含有植物は、工業用等の食用以外の用途に用いられるヨウ素を回収するための良好な原料とすることができる。
【００２７】
ヨウ素含有量を高めたい所望の植物種において、メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が同定されていなかった場合であっても、当該植物種のＨＯＬ遺伝子は、ＡｔＨＯＬ１遺伝子等の公知のＨＯＬ遺伝子の塩基配列情報や推定されるアミノ酸配列情報等を用いて、公知の遺伝子解析方法により同定することができる。具体的には、例えば、対象とする植物からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、公知のＨＯＬ遺伝子の塩基配列情報に基づいて作成したディジェネレートプライマー等を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、目的のホモログ遺伝子の断片を取得し、塩基配列を決定する。決定された配列を基にＲＡＣＥ−ＰＣＲ法等を行うことにより、ホモログ遺伝子の全長を取得することができる。その他、対象とする植物の組織から、当該技術分野において行われている抽出・精製方法により、メチルトランスフェラーゼ酵素を回収し、アミノ酸配列を同定した後、得られたアミノ酸配列情報に基づいて作成したディジェネレートプライマー等を用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、目的のホモログ遺伝子の断片を取得する。取得された遺伝子断片から、同様にしてホモログ遺伝子の全長を取得することができる。
【００２８】
図３は、表１記載の遺伝子のうち、ＡｔＨＯＬ１、ＡｔＨＯＬ２、ＡｔＨＯＬ３、ＯｓＨＯＬ１、ＯｓＨＯＬ２、ＴＭＴ１、及びＢｍＭＣＴの各遺伝子情報から推定されるアミノ酸配列をアラインメントした図である。ＡｔＨＯＬ１遺伝子のホモログ遺伝子の同定を試みる場合には、これらの遺伝子間で保存性の高い領域に対するディジェネレートプライマーを設計し、これを用いることにより、より効率よくホモログ遺伝子断片を取得することができる。
【００２９】
本発明において、遺伝子の機能を破壊するとは、当該遺伝子がコードするメチルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を消失又は低下させることを意味する。遺伝子の機能の破壊は、例えば、当該遺伝子の全長又は少なくとも一部分を欠失させたり、当該遺伝子に１又は２以上の塩基からなる断片を挿入したり、当該遺伝子の全長又は少なくとも一部分を他のＤＮＡ断片に置換する等により行うことができる。
【００３０】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法において用いられる遺伝子の機能を破壊する方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。遺伝子の機能を破壊する方法としては、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた方法であってもよく、ガンマ線や中性子線等の放射線を照射したり、エチルメタンサルフォネート（ＥＭＳ）等の各種変異誘発剤で処理する等により、遺伝子変異を誘発する方法であってもよく、トランスポゾン・タギング法であってもよい。なお、遺伝子組み換え技術を用いた方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を用いて、Ｔ−ＤＮＡ等の生理的に不活性なＤＮＡ断片を、対象である植物体の標的の遺伝子のＤＮＡ中に組み込むことにより、当該遺伝子の機能を破壊する方法がある。
【００３１】
特に、本発明のヨウ素高含有植物の作製方法を、食用植物に対して行う場合には、遺伝子の機能の破壊を、遺伝子組み換え技術を用いずに行うことが好ましく、トランスポゾン・タギング法又はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）法により行うことがより好ましい。このような方法により遺伝子の機能の破壊を行うことにより、作製されたヨウ素高含有植物を食用とする場合にも、遺伝子組み換え技術に付随する社会的受容の障壁を回避することができる。
【００３２】
トランスポゾン・タギング法は、トランスポゾン（ＤＮＡ上のある部位から他の部位へ転位する特定の長さをもつ遺伝因子）を、標的の遺伝子のＤＮＡ中に挿入させることにより、当該遺伝子の機能を破壊する方法である。つまり、トランスポゾン・タギング法は、遺伝子組み換え技術とは異なり、植物体が元々有している変異能を利用する方法であり、従来から育種に多用されている方法である。
【００３３】
また、ＴＩＬＬＩＮＧ法は、ＥＭＳ等の変異原を用いた処理によって、植物のゲノムに人為的に突然変異を誘発し、得られた変異体の中から、目的遺伝子が変異した個体や所望の形質を有する個体を選抜する方法である。つまり、トランスポゾン・タギング法と同様にＴＩＬＬＩＮＧ法も、外来遺伝子を導入する必要がない。
【００３４】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法により作製されたヨウ素高含有植物は、メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子の機能が破壊される前の植物体と同様にして栽培し、収穫することができる。このため、本発明のヨウ素高含有植物により、特別な肥料・栽培操作等を要することなく、ヨウ素含有量の高いより高品質な植物（食用植物の場合には食糧）の生産が可能になる。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
［参考例１  シロイヌナズナの栽培条件］
以降で用いるシロイヌナズナ野生株及び遺伝子破壊株は、次の条件で栽培した。
（１）栽培用基本培地の調製
ｐＨ６．０付近に調整した１／２ＭＳ寒天培地（１／２ＭＳ塩、０．８％アガロース）を、１２１℃で２０分間オートクレーブした後、無菌条件下において寒天培地を作製した。
（２）シロイヌナズナ種子の播種及び生育
野生株及び遺伝子破壊株の種子を、滅菌処理後、上記（１）により調製した１／２ＭＳ寒天培地に播種した。５日間４℃において低温処理した後、人工気象器（製品番号：ＭＬＲ−３５０、ＳＡＮＹＯ社製）を用いて２０℃、中日光条件下（１２時間明期／１２時間暗期）において生育させた。
【００３７】
［実施例１  シロイヌナズナＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株の単離］
シロイヌナズナ野生株のＡｔＨＯＬ１上にＴ−ＤＮＡ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ＤＮＡ）が挿入された形質転換シロイヌナズナの種子を含む種子プール（Ｓｔｏｃｋ  ｎａｍｅ：ＳＡＬＫ００５２０４Ｃ）を、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＮＡＳＣ）より入手した。これらの種子プールから、Ｔ−ＤＮＡが染色体上の２個のＡｔＨＯＬ１遺伝子の両方に挿入されることにより、ＡｔＨＯＬ１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積が抑制される株を以下の手順により単離した。
【００３８】
（１）ＰＣＲ法によるＴ−ＤＮＡ挿入の確認
まず、種子プールの各種子を栽培し、得られた各植物体から染色体ＤＮＡを抽出した。
この抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｔ−ＤＮＡ配列に特異的なオリゴＤＮＡプライマー（ＬＢｂ１）及びＡｔＨＯＬ１遺伝子配列に特異的なオリゴＤＮＡプライマー（ＡｔＨＯＬ１−２）を用いてＰＣＲを行うことにより、Ｔ−ＤＮＡの挿入の有無を判別した。すなわち、ＰＣＲ産物が得られた種子にはＴ−ＤＮＡがＡｔＨＯＬ１遺伝子上に挿入されており、ＰＣＲ産物が得られなかった種子にはＴ−ＤＮＡはＡｔＨＯＬ１遺伝子上に挿入されていないと判別することができる。
また、同じく抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｔ−ＤＮＡの挿入領域（ＡｔＨＯＬ１遺伝子のほぼ全長）を挟むように設計された２種類のオリゴＤＮＡプライマー（ＡｔＨＯＬ１−２及びＡｔＨＯＬ１−３）を用いてＰＣＲを行うことにより、Ｔ−ＤＮＡのホモ挿入の有無を判別した。すなわち、ＰＣＲ産物が得られた種子には染色体上の２個のＡｔＨＯＬ１遺伝子の一方にのみＴ−ＤＮＡが挿入されており、ＰＣＲ産物が得られなかった種子にはＴ−ＤＮＡが染色体上の２個のＡｔＨＯＬ１遺伝子の両方に挿入されていると判別することができる。
なお、各ＰＣＲは、ＰＣＲ反応酵素としてＥｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとし、これを３０サイクル繰り返す反応条件で行った。また、ＰＣＲ産物の有無の確認は、アガロースゲル電気泳動により解析した。
【００３９】
（２）  Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の確認
上記（１）により単離したＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株の染色体ＤＮＡを鋳型として、オリゴＤＮＡプライマー（ＬＢｂ１）及びオリゴＤＮＡプライマー（ＡｔＨＯＬ１−２）を用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、Ｔ−ＤＮＡの境界領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を、オートシークエンサー（製品名：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定し、ＡｔＨＯＬ１遺伝子上のＴ−ＤＮＡ挿入部位を確認した。
【００４０】
（３）  ＲＴ−ＰＣＲによるＡｔＨＯＬ１遺伝子のｍＲＮＡ量の解析
上記（１）により単離したＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株を、播種後約４週間、中日条件下で生育させた幼苗から、ＯｕｇｈａｍらによるＨｏｔ  Ｐｈｅｎｏｌ法（Physiologia Plantarum, 1990, vol.79, p331-338）を改変した方法により、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。オリゴＤＮＡプライマー（ａｔｔＢ２Ｔ１９ＶＮ）とＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて逆転写反応を行い、この抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡを鋳型として、２種類のオリゴＤＮＡプライマー（ＡｔＨＯＬ１−２及びＡｔＨＯＬ１／２−１）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＡｔＨＯＬ１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積の有無を判別した。内部標準としてＡｔＰＰ２ＡＡ３遺伝子のｍＲＮＡを、２種類のオリゴＤＮＡプライマー（ＡｔＰＰ２ＡＡ３−１及びＡｔＰＰ２ＡＡ３−２）を用いて検出した。なお、ＰＣＲは、ＰＣＲ反応酵素としてＥｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で５０秒間を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返す反応条件で行った。また、ＰＣＲ産物の有無の確認は、アガロースゲル電気泳動により解析した。
この結果、ＰＣＲ産物は検出されず、上記（１）により単離したＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株には、ＡｔＨＯＬ１遺伝子のｍＲＮＡが蓄積されていないことが確認された。
【００４１】
また、表２に、上記（１）〜（３）で用いたオリゴＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
【００４２】
【表２】
2011182681.tif 000003
【００４３】
［実施例２  植物細胞内のヨウ化物イオンの定量］
実施例１において単離したＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株及びシロイヌナズナ野生株の植物細胞内のヨウ化物イオン濃度を調べた。
具体的には、以下のようにして行った。
【００４４】
（１）検量線の作成
各種濃度（３、４、８、１６、３２、又は６４μＭ）のヨウ化カリウム（ＫＩ）溶液１０μｌを、イオンクロマトグラフ用カラムを接続した液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器（６００  ｐｕｍｐ、６００Ｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、４８６  ｔｕｎａｂｌｅ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ社）に導入し、２３０ｎｍの吸光度をもとにヨウ化物イオン量を測定した。
測定結果から、検量線を作成した。得られた検量線を図４に示す。図中、横軸は液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器に導入したヨウ化カリウム量（ｐｍｏｌ）、縦軸は液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器により検出したヨウ化物イオンのピーク面積を示す。
【００４５】
（２）シロイヌナズナ細胞抽出液中のヨウ化物イオンの定量
参考例１で調製した１／２ＭＳ寒天培地に播種して１ヶ月生育させた後のＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株及びシロイヌナズナ野生株の幼苗約５０ｍｇに、８０％アセトンを２００μｌ添加し、細胞破砕装置（ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＬＴ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて破砕後、遠心分離し、上清を回収した。この操作を数回行って回収した全上清を、減圧乾固した後、超純水に溶解した。この溶液をさらに遠心分離し、回収された上清をシロイヌナズナ細胞抽出液とした。
シロイヌナズナ新鮮重量４．５ｍｇ分の抽出液を、液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器に導入し、ヨウ化物イオン量を測定した。
図４に示した検量線を用いて、測定結果から各シロイヌナズナ細胞抽出液中のヨウ化物イオン量を定量した。定量結果を図５に示す。縦軸は液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器により検出したヨウ化物イオン量を示す。この結果、ＡｔＨＯＬ１遺伝子破壊株（図中、「ｈｏｌ１」）は、シロイヌナズナ野生株（図中、「ＷＴ」）の約１２倍もヨウ化物イオン量が高いことが確認された。これらの結果から、ＨＯＬ遺伝子の機能を破壊することにより、植物体のヨウ素含有量を高められることが明らかである。
【００４６】
［実施例３  ＯｓＨＯＬ１のメチルトランスフェラーゼ酵素活性の測定］
（１）検量線の作成 
各種濃度（２０、４０、６０、８０、１００μＭ）のＳ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＳＡＨ）各７５μＬと、等量の１Ｍ  ＨＣｌＯ４とをそれぞれ混合し、遠心分離後、上清を回収した。回収された上清５０μＬを、ＯＤＳカラムを接続した液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器（６００  ｐｕｍｐ、６００Ｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ、４８６  ｔｕｎａｂｌｅ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ社）に導入し、イオン対クロマトグラフにより分離し、２５４ｎｍの吸光度をもとにＳＡＨ量を測定した。
測定結果から、検量線を作成した。得られた検量線を図６に示す。図中、横軸は液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器に導入したＳＡＨ量（ｎｍｏｌ）、縦軸は液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器により検出したＳＡＨのピーク面積を示す。
【００４７】
（２）シロイヌナズナＡｔＨＯＬ１及びイネＯｓＨＯＬ１融合タンパク質のメチル基転移酵素活性の測定
大腸菌用タンパク質発現ベクターｐＤＥＳＴ１５−Ｔベクターに、ＡｔＨＯＬ１全長を含むｃＤＮＡを導入したものをｐＤＥＳＴ１５−Ｔ−ＡｔＨＯＬ１とし、ＯｓＨＯＬ１全長を含むｃＤＮＡを導入したものをｐＤＥＳＴ１５−Ｔ−ＯｓＨＯＬ１とした。なお、ｐＤＥＳＴ１５−Ｔベクターは、ｐＤＥＳＴ１５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ処理によりＧＳＴタグが切断できるように改変したものである。
これらの各プラスミドを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で３７℃の条件において培養した。ＯＤ６００が０．３〜０．５に到達後、ＩＰＴＧ（終濃度０．８ｍＭ）及びエタノール（終濃度３％）を添加し、２５℃で約６時間培養した。このタンパク質発現誘導大腸菌を５０ｍＬチューブに回収し、遠心分離によりペレットを得て、−２０℃に保存した。このペレットを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した１×ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、氷で冷却しながら超音波発生機（ＵＤ−２００、トミー精工）を用いて超音波破砕処理を行った。得られた大腸菌の破砕液を遠心分離後、上清を回収し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムを用いて精製を行った。回収されたＧＳＴ融合ＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＧＳＴ融合ＯｓＨＯＬ１タンパク質を含む溶液は、限外濾過カラムを用いてｂｕｆｆｅｒ交換を行った。回収されたＧＳＴ融合ＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＧＳＴ融合ＯｓＨＯＬ１タンパク質のタンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
各タンパク質１ｍｇにつき１ｕｎｉｔのＴｈｒｏｍｂｉｎ溶液をそれぞれ添加して、室温で約６時間インキュベートした。Ｔｈｒｏｍｂｉｎ処理されたサンプルを４ｍＬ程度に希釈した後に、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを充填したカラムを通過させることにより、ＧＳＴタンパク質をカラムに吸着させて除くことにより、ＧＳＴタグを切断除去したＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＯｓＨＯＬ１タンパク質の溶液を得た。回収されたタンパク質溶液に、グリセロール（終濃度３０％）及びＤＴＴ（終濃度１ｍＭ）を添加し、−２０℃で保存した。また、カラム精製によって得られたタンパク質を１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動(３０ｍＡ／ゲル１枚)し、ＣＢＢ染色を行うことにより、ＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＯｓＨＯＬ１タンパク質が精製されていることを確認した。
【００４８】
得られたＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＯｓＨＯＬ１タンパク質のヨウ化物イオンに対するメチル基転移酵素活性を測定するために、終濃度０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ  ７．５）、各タンパク質、各基質溶液（終濃度０．１ｍＭ  ＫＩ、及び終濃度０．５ｍＭ  ＳＡＭ）を含む全量７５μＬの反応液を、２５℃で１時間反応させた。インキュベート後の反応液に、反応液と等量の１Ｍ  ＨＣｌＯ４を添加してよく混合することにより、反応を停止させた。この反応液を遠心分離した後、回収された上清５０μＬを液体クロマトグラフ／ＵＶ−ＶＩＳ検出器に導入し、酵素反応により生成するＳＡＨを定量した。
図６に示した検量線を用いて、測定結果から、精製したＡｔＨＯＬ１タンパク質及びＯｓＨＯＬ１タンパク質のヨウ化物イオンに対するＳＡＭ依存的なメチル基転移酵素活性を測定した。測定結果を図７に示す。縦軸には、ＡｔＨＯＬ１タンパク質の酵素活性を１００％として、ＯｓＨＯＬ１タンパク質の相対酵素活性を示した。この結果、シロイヌナズナのＡｔＨＯＬ１タンパク質だけでなく、イネのＯｓＨＯＬ１タンパク質も、ヨウ化物イオンに対するメチル基転移酵素活性を持つことが示された。この結果から、イネ植物体内においても、ＯｓＨＯＬ１タンパク質によって、ヨウ化物イオンがメチル化されヨウ化メチルへと変換されること、及びイネ中のＯｓＨＯＬ１遺伝子の機能を破壊することにより、イネ植物体内のヨウ化物イオンの大気への拡散が防止される結果、当該植物体内のヨウ素含量を上昇させられることが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のヨウ素高含有植物の作製方法は、植物中のヨウ素含有量を高めることができるため、主にヨウ素栄養強化食物の作製等の分野において利用が可能である。
【図１】
2011182681.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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