(57)【要約】【課題】  眼血管新生を処置または予防するための方法を提供すること。【解決手段】  有効量のスタウロスポリン誘導体を投与し、網膜または脈絡膜血管新生を処置または予防することを見いだした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2011088938.tif 000005
[式中、Ｒが、ヒドロカルビル基ＲＯまたはアシル基Ａｃを示す]
の化合物またはその塩の、眼血管新生疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における使用。
【請求項２】
ヒドロカルビル基が、非環式、炭素環式、炭素環式−非環式、ヘテロ環式またはヘテロ環式−非環式ヒドロカルビル基である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
非環式ヒドロカルビル基が、Ｃ１−Ｃ２０−アルキル基、Ｃ２−Ｃ２０ヒドロキシアルキル基(ヒドロキシル基が１位の他の任意の位置にある)、シアノ−[Ｃ１−Ｃ２０]−アルキル基、カルボキシ−[Ｃ１−Ｃ２０]−アルキル基(カルボキシル基が)、またはＣ３−Ｃ２０−アルケニル基(遊離原子価が、二重結合と同じ炭素原子上ではない)の基である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
炭素環式ヒドロカルビル基が、単、二、複環式シクロアルキル;シクロアルケニル;シクロアルカンジエニル;およびアリールの基である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
炭素環式−非環式基が、１またはより多い炭素環式基を担持している非環式基であり、そして、ヘテロ環式基およびヘテロ環式−非環式基が、単環式、二環式、複環式、アザ−、チア−、オキサ−、タザ−、オキサザ−、ジアザ−、トリアザ−、およびテトラザ−環式芳香族性質の基である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
アシル基が、要すれば官能基によって修飾された、カルボン酸、有機スルホン酸、または要すればエステル化されたリン酸である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
アシル基が、式Ｚ−Ｃ(＝Ｗ)−を有する請求項６に記載の使用であって、Ｗが、酸素、硫黄、またはイミノ、そしてＺが、水素、Ｃ１−Ｃ７アルキル、アミノ、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾフラニルまたはベンズイミダゾリルである、使用。
【請求項８】
アシル基が、式ＲｂＯ−ＣＯ−を有する請求項６に記載の使用であって、ＲｂＯが、水素、ベンゾイル、またはＣ１−Ｃ１９アルキル基である、使用。
【請求項９】
アシル基が、式ＲＯ−Ｏ−ＣＯ−を有する請求項６に記載の使用であって、ＲＯが、非環式、炭素環式、炭素環式−非環式、ヘテロ環式またはヘテロ環式−非環式ヒドロカルビル基である、使用。
【請求項１０】
アシル基が、式
【化２】
2011088938.tif 000006
[式中、Ｒ１およびＲ２が、水素および非置換非環式Ｃ１−Ｃ７ヒドロカルビルから独立的に選択される]
を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
アシル基が、式ＲＯ−ＳＯ２−を有する請求項６に記載の使用であって、ＲＯが、ヒドロカルビル基である、使用。
【請求項１２】
アシル基が、式
【化３】
2011088938.tif 000007
[式中、Ｒ１およびＲ２が、水素、非置換非環式Ｃ１−Ｃ７ヒドロカルビルから独立的に選択される]
を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項１３】
活性成分が、Ｎ−(３−カルボキシ−プロピオニル)−スタウロスポリン、Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリン、Ｎ−トリフルオロアセチル−スタウロスポリン、Ｎ−メチルアミノチオカルボニル−スタウロスポリン、Ｎ−フェニルカルバモイル−スタウロスポリン、Ｎ−(３−ニトロ−ベンゾイル)−スタウロスポリン、Ｎ−(３−フルオロベンゾイル)−スタウロスポリン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−スタウロスポリン、Ｎ−(４−カルボキシベンゾイル)−スタウロスポリン、Ｎ−(３，５−ジニトロベンゾイル)−スタウロスポリン、Ｎ−アラニル−スタウロスポリン、Ｎ−エチル−スタウロスポリン、Ｎ−カルボキシメチル−スタウロスポリン、Ｎ−[(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)−アセチル]−スタウロスポリン、Ｎ−(２−アミノアセチル)−スタウロスポリン、およびそれらの塩から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
活性成分が、Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリンまたはその塩である、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
処置および／または予防が、ヒト眼血管新生疾患の処置および／または予防である、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
処置および／または予防が、ヒト網膜血管新生疾患の処置および／または予防である、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
処置および／または予防が、ヒト脈絡膜血管新生疾患の処置および／または予防である、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
処置および／または予防が、哺乳類眼血管新生疾患の処置および／または予防である、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
眼血管新生疾患の処置または予防のための医薬組成物であって、該組成物が、請求項１に記載の式(Ｉ)の化合物またはその塩の治療有効量を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
化合物が、Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリンである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、眼血管新生疾患、例えば、網膜血管新生および脈絡膜血管新生の処置のための医薬の製造における、スタウロスポリン誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼の網膜は、血液供給を２の血管床、すなわち網膜の内側３分の２を供給する網膜血管、および外側３分の１を供給する脈絡膜血管から受ける。網膜毛細血管の閉鎖という結果となる網膜血管の損傷は、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、分枝網膜静脈閉塞、および中心網膜静脈閉塞を含む、いくつかの疾患段階に存在する;それらは、虚血性網膜症として集合的に呼ばれる。網膜の虚血は、血管新生を刺激する１またはより多い血管形成因子の放出という結果となる。新しい血管は、内部制限膜(internal limiting membrane,ＩＬＭ)を突破し、網膜の内部表面の内側を覆い、そして硝子体の外部表面に沿って成長する。それらは、多くの他の細胞を増し、そして血管、細胞、および細胞外マトリックスのシートを生産し、網膜上にひきつりが生じ、しばしば網膜剥離および視覚の重度な喪失につながる。
【０００３】
脈絡膜血管新生は、多くの疾患段階に存在し、最も一般的なものは年齢関連性黄斑変性症である。この症状において、明敏および詳細な視覚のために特に適応した黄斑は、光受容体およびＲＰＥ細胞の漸進的な死によって損傷を受ける。これは、中心視覚の漸進的な喪失という結果となるその疾患の変性部分を構成する。細胞死の理由は既知ではなく、現在処置はない。変性が起こると、新しい血管が、脈絡膜から成長しＲＰＥ下および網膜下空間に侵入する傾向がある。
【０００４】
この段階は、脈絡膜血管新生(ＣＮＶ)と呼ばれており、それは、しばしば出血および瘢痕から、視覚の迅速かつ重度な喪失につながる。患者のかなり少数にしか当てはまらないのだが、もし、ＣＮＶは、よく輪郭を描けられ、中心窩の中央より下方でないならば、レーザー処置が時に助けとなることができる。レーザーが最初成功しても、再発ＣＮＶおよび視覚の喪失は高率である。血管成長の刺激に対する処置が、必要であり、網膜または脈絡膜血管新生のいずれかを有する患者に有益である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明によれば、網膜血管新生および脈絡膜血管新生を含む眼血管新生疾患を処置または予防するための方法が提供される。その方法は、スタウロスポリン誘導体またはその塩の有効量を投与することの段階を有する。
【０００６】
本発明のスタウロスポリン処置は、眼血管新生を阻害し予防することにおいて高度に有効であり、効率が限られた先行技術のレーザー処置と異なる。さらに、スタウロスポリン処置は投与することが簡単であり、例えば、レーザー処置のような侵襲性であり複雑な装置を要する先行技術の処置方法と異なる。
【０００７】
本発明は、眼血管新生疾患を処置するための方法を提供する。その方法は、スタウロスポリン誘導体を含む医薬を使用する。驚くべきことに、式(Ｉ)の化合物が、網膜血管新生および脈絡膜血管新生を含む眼血管新生を処置することにとって高度に有用であることが見出された。
【０００８】
これに応じて、本発明は、式(Ｉ)
【化１】
2011088938.tif 000002
[式中、Ｒは、ヒドロカルビル基Ｒ０またはアシル基Ａｃを示す]、
の化合物の、眼血管新生疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における使用に関する。
【０００９】
適当なヒドロカルビル基は、好ましくは３０、特に１８の炭素原子の最大の総数を有する、非環式、炭素環式および炭素環式−非環式ヒドロカルビル基を含む。さらに適当なヒドロカルビル基は、ヘテロ環式基およびへテロ環式−非環式基である。ヒドロカルビル基(ＲＯ)は、飽和であっても不飽和であっても、置換であっても非置換であってもよい。適当なアシル基は、要すれば官能基によって修飾されたカルボン酸および有機スルホン酸、および要すればエステル化されたリン酸、例えばピロ−またはオルト−リン酸を含む。
【００１０】
好ましい非環式ヒドロカルビル基は、Ｃ１−Ｃ２０−アルキル基;、Ｃ２−Ｃ２０ヒドロキシアルキル基(ヒドロキシル基が、１位以外の任意の位置にある);シアノ−[Ｃ１−Ｃ２０]−アルキル基;カルボキシ−[Ｃ１−Ｃ２０]−アルキル基(カルボキシル基が);およびＣ３−Ｃ２０−アルケニル基(遊離原子価が二重結合と同じ炭素原子上ではない)を含む。典型的な非環式ヒドロカルビル基は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびヘプチルのような低級アルキル；例えば、プロペニル、２−または３−メタリルおよび２−または３−ブテニルのような低級アルケニル;例えば、１−ペンタ−２，４−ジニルのような低級アルカジエニル;および例えば、プロパルギルまたは２−ブチニルのような低級アルキニル、の基である。好ましい炭素環式ヒドロカルビル基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロ[２，２，２]オクチル、２−ビシクロ[２，２，１]ヘプチルおよびアダマンチルのような、単、二または複環式シクロアルキル;シクロアルケニル;シクロアルカンジエニル;および対応するアリール、の基である。アリール基は、フェニル、ナフチル(例えば、１−または２−ナフチル)、ビフェニリル(例えば、４−ビフェニリル)、アントリル、フルオレニル、アズレニル、および１またはより多い飽和環を有するその芳香族類似物、の基を含む。好ましい炭素環式−非環式基は、１またはより多い炭素環式基を担持している非環式基である。ヘテロ環式基およびヘテロ環式−非環式基は、単環式、二環式、複環式、アザ−、チア−、オキサ−、タザ−、オキサザ−、ジアザ−、トリアザ−、およびテトラザ−環式芳香族性質の基を含む。
【００１１】
要すれば官能基によって修飾されたカルボン酸(Ａｃ１)に由来する典型的なアシル基は、Ｗが、酸素、硫黄、またはイミノであり、そしてＺが、水素、ヒドロカルビルＲＯ、ヒドロカルビルオキシＲＯＯ、またはアミノである、式Ｚ−Ｃ(＝Ｗ)−を有する。好ましくは、Ｗが、酸素または硫黄であり、そしてＺが、Ｃ１−Ｃ７アルキル、特にＣ１−Ｃ４アルキルであり、そしてそれらは要すればハロゲン、カルボキシルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニルにより置換されている。さらに好ましいＺは、フェニル、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾフラニルまたはベンズイミダゾリルであり、それぞれは、非置換であるかまたはＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、メチレンジオキシ、シアノおよび／またはその塩で置換されている。好ましいＡｃ１アシル基は、式ＲｂＯ−ＣＯ−を有し、そのＲｂＯは、水素、ベンゾイル、またはヒドロカルビル基、例えば、カルボキシル基、シアノ基、エステル基、アミノ基またはハロゲンで要すれば置換されているＣ１−Ｃ１９アルキル基である。
【００１２】
好ましいＡｃ１アシル基のさらなる群は、式ＲＯ−Ｃ−ＣＯ−を有する。好ましいＡｃ１アシル基のなおさらなる群は、式
【化２】
2011088938.tif 000003
[式中、Ｒ１およびＲ２は、水素および非置換非環式Ｃ１−Ｃ７ヒドロカルビル、好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルおよびＣ３−Ｃ７アルケニルから独立的に選択される。独立的に、Ｒ１およびＲ２は、単環式アリール、アルアルキル、またはアルアルケニル(最大１０炭素原子を有する)であることができ、それぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲンおよび／またはニトロで要すれば置換されている。特に、この群の望ましい基は、Ｒ１として水素、そしてＲ２として要すれば置換されている、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ３−Ｃ７アルケニル、フェニル、ピリジル、ピリミジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾフラニルまたはベンズイミダゾリルを有する]
を有する。
【００１３】
有機スルホン酸(Ａｃ２)から誘導される典型的なアシル基は、式ＲＯ−ＳＯ２−を有し、その中でＲＯは、ヒドロカルビル基である。好ましくは、スルホン酸アシル基のＲＯは、Ｃ１−Ｃ７アルキル、フェニル、ピリジル、ピリミジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾフラニルまたはベンズイミダゾリルであり、それぞれは、それは非置換であるか、またはＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル、メチレンジオキシ、シアノおよび／またはその塩によって置換されている。
【００１４】
要すればエステル化されたリン酸(Ａｃ３)から誘導された典型的なアシル基は、式
【化３】
2011088938.tif 000004
[式中、Ｒ１およびＲ２は、水素、非置換非環式Ｃ１−Ｃ７ヒドロカルビル、好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルおよびＣ３−Ｃ７アルケニルから独立的に選択される。Ｒ１およびＲ２は、独立的に、単環式アリール、アルアルキルまたはアルアルケニル(最大１０の炭素原子を有する)であることができ、それぞれは、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲンおよび／またはニトロによって要すれば置換されている]
を有する。
【００１５】
さらに適当なスタウロスポリン誘導体は、Ｒが、グリシン、フェニルグリシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、ロイシン、セリン、バリン、チロシン、アルギニン、ヒスチジンおよびアスパラギンから選択されるαアミノ酸またはそれらの塩から誘導される式Ｉのスタウロスポリンを含む。本発明の適当なスタウロスポリン誘導体は、Caravatti et al.の米国特許番号５０９３３３０においてさらに詳細に記載されている。その特許におけるスタウロスポリン誘導体の記載を、引用をもって本明細書の一部とする。
【００１６】
本発明に関し、式Ｉの特に好ましいスタウロスポリン誘導体は：
Ｎ−(３−カルボキシプロピオニル)−スタウロスポリン、Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリン、Ｎ−トリフルオロアセチル−スタウロスポリン、Ｎ−メチルアミノチオカルボニル−スタウロスポリン、Ｎ−フェニルカルバモイル−スタウロスポリン、Ｎ−(３−ニトロベンゾイル)−スタウロスポリン、Ｎ−(３−フルオロベンゾイル)スタウロスポリン、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−スタウロスポリン、Ｎ−(４−カルボキシベンゾイル)−スタウロスポリン、Ｎ−(３，５−ジニトロベンゾイル)−スタウロスポリン  Ｎ−アラニル−スタウロスポリン、Ｎ−エチル−スタウロスポリン、Ｎ−カルボキシメチル−スタウロスポリン、Ｎ−[(ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニルアミノ)−アセチル]−スタウロスポリン、Ｎ−(２−アミノアセチル)−スタウロスポリン、および薬学的に許容できるそれらの塩
を含む。
【００１７】
活性成分として式Ｉの化合物を含む本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、硝子体内、結膜下または皮膚下投与のように、経腸に、経鼻に、口腔内に、直腸に、局所に、経口に、および非経口に、投与されることができ、哺乳類対象、特にヒトにおける眼血管新生を処置する。その組成物は、活性成分を単体で、または好ましくは薬学的に許容できる担体と一緒に活性成分を含み得る。活性成分の有効な用量は、標的疾患の型、並びに種、年齢、体重および対象の内科的症状、薬物動態学的データー、および投与の様式に依存する。
【００１８】
式Ｉの化合物は、動物、例えばヒトの病理学的症状に対する有効量において投与される。約７０ｋｇの体重を有する個体については、投与される１日の総用量は、約０．１ｇないし約２０ｇ、好ましくは約０．５ｇないし約５ｇ、の活性成分であり、そして適当な医薬組成物は、約１％ないし約９５％の活性成分を有し得る。適当な単位服用形態は、被覆および非被覆錠剤、アンプル、バイアル、座薬、またはカプセルを含む。他の適当な服用形態は、注射剤、眼内剤、眼球内剤、軟膏剤、クリーム剤、ペースト剤、泡剤、チンキ剤、リップスティック剤、点眼剤、経口ドロップ剤、噴霧剤、分散剤等を含む。本発明の医薬組成物は、当業界で既知の方法で製剤され、例えば通常の混合、顆粒化、被覆、溶解または凍結乾燥工程の方法による。
【００１９】
活性成分の溶液、および懸濁剤または分散剤、特に等張水性溶液、分散剤または懸濁剤の使用が好ましい。活性成分を含む適当な医薬組成物は、例えば、マンニトールおよびデンプンのような担体、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節のための塩類、緩衝剤等を有し得る。その組成物は、当業界で既知の方法で製剤され、例えば通常の溶解および凍結乾燥工程の方法による。その組成物の溶液または懸濁剤の形態は、粘性増大剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、およびゼラチン;および可溶化剤、例えばTween80[ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノオレエート;ＩＣＩ Americas, Inc, USAの商標]を含み得る。
【００２０】
適当な担体は、充填剤、例えば、糖、例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール;セルロース製剤;リン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム;結合剤、例えば、デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびポリビニルピロリドン;および、要すれば、崩壊剤、例えば、デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸またはその塩を含む。付加的な適当な賦形剤は、流動調整剤および滑沢剤、例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムまたはカルシウムのようなその塩、ポリエチレングリコール、およびその誘導体である。
【００２１】
本発明の活性成分、すなわちスタウロスポリン誘導体は、完全にまたは実質的に完全に眼血管新生、特に網膜血管新生および脈絡膜血管新生を阻害する。さらに、本発明の化合物は、個体に投与されるときに、予防的効果が観察される。各場合、病理学的な血管における影響は、完全またはほとんど完全な阻害を伴って劇的かつ深遠であるが、成熟網膜血管における同定可能な毒性効果はない。
本発明を以下の実施例でさらに詳細に記載する。しかし本発明はそれに限定して解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２２】
実施例１
虚血性網膜症を、Ｃ５７／ＢＬ６ＪマウスにSmith et al., Oxygen-induced Retinopathy in the Mouse, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 101-111(1994)によって記載された方法で生成する。７日齢のマウスおよびその母を、気密インキュベーターに置き、７５±３％酸素の大気に５日間さらす。インキュベーターの温度を、２３±２℃に保持し、酸素を酸素アナライザーによって８時間ごとに測定する。５日後、マウスをインキュベーターから移動し、室空気中に置き、薬物処置に付する。Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリン(ＮＢＳ)を、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、水で最終濃度に希釈し;ＤＭＳＯの最大濃度は１％である。媒体(１％ＤＭＳＯ)または様々な濃度の薬物を含む媒体(容量＝１０μｌ／ｇ体重)を、胃の中に強制喫食させる。異なるマウスに、６０、３００または６００ｍｇのＮＢＳ／ｋｇ体重を与える。コントロールとしてのマウスの群にＮＢＳを欠く媒体を与える。
【００２３】
処置の５日後、マウスを屠殺し、速やかに眼を取り出し最適切断温度の包埋化合物(ＯＣＴ; Miles Diagnostics, Elkhart, IN)中で凍結し、または１０％のリン酸緩衝ホルマリン中で固定しパラフィン中に包埋する。成熟Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスも薬物または媒体で強制喫食によって処置し、５日後、屠殺しその眼を凍結またはパラフィン切片のために加工する。
【００２４】
薬物処置およびコントロールのマウスからの眼の凍結切片（１０μｍ）を、選択的に内皮細胞に結合するビオチン化されたグリフォニアシンプリシフォリアレクチンＢ４(Vector Laboratories, Burlingame, CA)によって組織化学的に染色する。スライドをメタノール／Ｈ２Ｏ２中で１０分間４℃でインキュベートし、ｐＨ７．６の０．０５Ｍのトリス緩衝生食水（ＴＢＳ）で洗浄し、１０％の通常のブタ血清中で３０分間インキュベートする。スライドを２時間室温でビオチン化されたレクチンとともにインキュベートし、０．０５ＭのＴＢＳでのリンスの後、ペルオキシダーセに結合されたアビジン(Vector Laboratories)とともに４５分間室温でインキュベートする。０．０５ＭのＴＢＳでの１０分間の洗浄の後、スライドをジアミノベンジジンとインキュベートし、茶色の反応産物を得る。いくつかのスライドをヘマトキシリンで後染色しすべてをCyosealで包埋する。
【００２５】
定量的な評価を実施するために、１０μｍ毎の連続的切片を各眼球の半分まで切断し、大体５０−６０μｍ離れた切片をレクチンで染色し、分析のための眼について１３切片を作成する。レクチン染色切片をAxioskop顕微鏡(Zeiss, Thornwood, NY)で調査し、画像を３ＣＣＤカラービデオカメラ(IK-TU40A,Toshiba, Tokyo, Japan)およびフレームグラバーを使用してデジタル化する。Image-Pro Plusソフトウェアー(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)を網膜の表面のレクチン染色細胞を輪郭化するために使用し、その面積を測定する。各眼からの１３の測定の平均を単一実験値として使用する。
【００２６】
ＮＢＳを欠く媒体で処置された虚血性網膜症を有するマウスは、少数の結合血管を有する表面および深部毛細血管床において通常の血管を示す非虚血性のマウスと比較して、網膜表面における細胞の大きいかたまりを有する網膜に渡り内皮細胞染色域の顕著な増大を示す。６００ｍｇ／ｋｇのＮＢＳを１日に１回５日間与えた虚血性マウスは、媒体処置したマウスと比較して、網膜の表面上および内部に内皮細胞染色の劇的な減少を有する。実際、ＮＢＳ処置虚血性マウスの網膜内の内皮細胞染色は、非虚血性マウスのそれよりも少ない。高倍率により、網膜の表面上に分析可能な内皮細胞が存在しないことを示され、血管新生の完全な阻害があることがわかる。深部毛細血管床が通常位置する、内部核層および外部網状層における内皮細胞染色の顕著な不存在も見出される。
【００２７】
強制喫食により１日に２回３００ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇのＮＢＳを与えられた虚血性網膜症を有するマウスは、網膜の表面上に血管新生のいくつかのかたまりを示し、それは媒体処置コントロールのマウスの網膜における凝集より少ない。ＮＢＳ処置マウスの網膜も、網膜内の内皮染色の幾分の減少を示す。画像分析の結果は、１日に１回６００または６０ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスの網膜上および内の内皮細胞染色が、媒体処置マウスにおけるそれより有意により少ないことを立証し、そして１日に２回処置されたマウスと比較して用量依存効果を示した。その結果は、スタウロスポリン誘導体が網膜血管新生を阻害することを明白に立証している。
【００２８】
実施例２
成熟Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに、１日１回強制喫食により媒体または６００ｍｇ／ｋｇのＮＢＳを与え、５日後、屠殺しその眼を実施例１のように加工する。
画像分析は、媒体処置マウスと比較してＮＢＳ処置マウスにおける、網膜の内皮染色の総面積または網膜血管の外観に相違がないことを示す。その分析は、ＮＢＳおよび媒体処置マウス間の網膜の内皮細胞染色の量に相違がないことも示す。このことは、スタウロスポリン誘導体が成熟血管の内皮細胞に対し毒性のないことを立証している。
【００２９】
実施例３
新生仔のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウス(neonatal mice)の一腹仔を、処置およびコントロール群に分割し、それぞれ１日に１００mg／kgの薬物または媒体の皮下注射を受ける。７または１０日齢に、マウスをエーテルで麻酔し、５０ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン標識されたデキストラン(2×106平均ｍｗ、Sigma, St. Louis, MO)を含む１ｍｌのリン酸緩衝生食水で潅流する。Tobe et al., Evolution of Neovascularization in Mice with Overexpression of VEGF in Photoreceptors, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188(1998)に記載の通りである。眼を取り外し、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１時間固定する。
【００３０】
角膜および水晶体を取り出し網膜全体を注意深くアイカップから切除する。放射状の切断を網膜の縁から赤道ヘ４個の四分円のすべてに実施し、網膜を光受容体が上方をむくようにAquamount中にフラットマウントする。フラットマウントを蛍光顕微鏡により調査し、画像を３ＣＣＤカラービデオカメラおよびフレームグラバーを使用してデジタル化する。Image-Pro(商標)Plusを、各四分円における視神経の中心から発達中の網膜血管の先端(leading front)までの距離を測定するために使用し、平均値を単一実験値として使用する。
【００３１】
７日齢に、媒体処置マウスにおける網膜血管はほとんど網膜の辺縁の縁に達しているが、ＮＢＳ処置マウスにおいて網膜血管は辺縁までの中間よりわずかに先まで伸長しているに過ぎない。１０日齢に、表面毛細血管床は完成し、網膜の辺縁の縁へ全体的に伸長しており、深部毛細血管床は部分的に発達している。しかしＮＢＳ処置マウスにおいて、表面毛細血管床は、未だ網膜の縁に到達していない。視神経から血管先端までの距離を画像分析によって算出し、７日および１０日齢における処置およびコントロールのマウス間の相違は統計的に有意である。このことは、スタウロスポリン誘導体が、網膜血管発達を阻害することを示唆している。
【００３２】
実施例４
動物の処置について、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをAssociation for Research in Vision and Ophthalmology resolutionにしたがって処置する。脈絡膜血管新生を前記の技術Tobe et al. Targeted disruption of the FGF2 gene dose not prevent choroidal neovascularization in murine model, Amer. J Path(印刷中)の修飾によって生成する。簡単には、４ないし５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを塩酸ケタミン(１００ｍｇ／ｋｇ体重)で麻酔し、瞳孔を１％トロピカミドで拡張させる 。クリプトンレーザー光凝固(１００μｍスポットサイズ、０．１秒間、１５０ｍＷ)の３ヵ所の熱傷を、Coherent Model 920 Photocoagulatorのスリットランプデリバリーシステムおよびコンタクトレンズとしての手持ちカバースライドを使用して各網膜に誘導する。
【００３３】
熱傷を網膜の後極の９、１２、および３時の位置に実施する。ブルッフ膜の破裂を示すレーザー時のバブルの形成は、ＣＮＶの取得における重要なファクターであるので、全３ヵ所の熱傷についてバブルの形成されたマウスのみが含まれる。１０匹のマウスを無作為に媒体のみの処置に割り当て、１０匹のマウスを強制喫食により経口的に与えられる４００ｍｇ／ｋｇ／日のＮＢＳを含む媒体を受けるように割り当てる。１４日後、マウスをペントバルビトールナトリウムの過服用によって殺し、その眼を速やかに取り外し最適切断温度の包埋化合物(ＯＣＴ)中に凍結する。凍結一連切片(１０μｍ)を各熱傷の全長にわたって切断し、内皮細胞に選択的に結合するビオチン化されたグリフォニアシンプリシフォリアレクチンＢ４(Vector Laboratories, Burlingame, CA)で組織化学的に染色する。
【００３４】
スライドをメタノール／Ｈ２Ｏ２中で３０分間４℃でインキュベートし、０．０５ＭのｐＨ７．４のトリス緩衝生食水(ＴＢＳ)で洗浄し、１０％の通常ブタ血清中で３０分間インキュベートする。スライドを０．０５ＭのＴＢＳでリンスし、ビオチン化されたレクチンと２時間３７℃でインキュベートする。０．０５ＭのＴＢＳでのリンスの後、スライドをストレプトアビジンフォスファターゼ(Kirkegaard and Perry Laboratories, Cabin John, MD)と３０分間室温でインキュベートする。０．０５ＭのｐＨ７．６のトリス緩衝液中での１０分間のインキュベーションの後、スライドをHistomark Red(Kirkegaard and Perry)中で展開し赤色反応産物を得、Cytoseal(Stephens Scientific, Riverdale,NJ)で包埋する。いくつかのスライドを、Contrast Blue(Kirkegaard and Perry)で後染色する。
【００３５】
定量的な評価を実施するために、レクチン染色切片をAxioskop顕微鏡(Zeiss, Thornwood, NY)で調査し、画像を３CCDカラービデオカメラ(IK-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan)およびフレームグラバーを使用してデジタル化する。Image-Pro Plusソフトウェアー(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)を網膜下空間のレクチン染色血管の面積の輪郭化および測定に使用する。各病変について面積測定を、いくつかの病変がみられるすべての切片について実施し、合算し、合計面積測定値を得る。値を平均し、マウスあたりの単一実験値を得る。不等分散に関する２試料ｔ検定を実施し、処置およびコントロールのマウス間の対数平均合計面積を比較する。
【００３６】
レーザーの２週間後、マウスの両群におけるすべての病変は、これを覆っている網膜に対する大体等価な損傷を有するブルッフ膜に裂け目を示す。媒体のみで処置されたすべてのマウスは、各レーザー誘導ブルッフ膜の破裂の位置において脈絡膜血管新生の大面積を示す。新しい血管の辺縁に沿って網膜色素上皮細胞の増殖が見られる。レクチンで染色された網膜血管は、網膜全体にわたって見られる。これに対し、４００mg／kg／日のＮＢＳを与えられたすべてのマウスは、各レーザー誘導ブルッフ膜の破裂の位置における脈絡膜血管新生が、もしあってもほとんどない。ほとんどの例において、全部の熱傷にわたって分析可能なレクチン染色血管新生組織はみられないが、いくつかの熱傷はレクチン染色組織の薄いディスクのある領域を含んでいる。ＲＰＥ細胞の穏やかな増殖がある。処置マウスの眼における脈絡膜血管新生の顕著な減少にもかかわらず、全体に渡る網膜血管は通常であるように見える。これは後染色をしない切片において最もよく見られる。
【００３７】
病変あたりのレクチン染色の合計面積の定量は、媒体のみで処置されたマウスにおける病変(0.0695621±0.0073960mm2)と比較して、ＮＢＳで処置されたマウスにおける劇的な減少(0.0090182±0.0017540mm2)を示す。この相違は高度に統計的に有意である(Ｐ＝０.００４)。これらの結果は、スタウロスポリン誘導体が劇的に脈絡膜血管新生を阻害することを明白に立証している。
【００３８】
前記の実施例は、活性成分の効力を例示する。本発明のスタウロスポリン誘導体は、完全にまたは実質的に完全に網膜および脈絡膜血管新生を阻害することにおいて高度に有効であり、活性成分は、通常のおよび／または実際的な薬物処置様式によって患者に投与されることができる。