(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類癌細胞のアポトーシスを誘導或いは刺激するために有用な、二価金属イオンを利用したＡｐｏ−２リガンド及びＡｐｏ−２リガンド製剤の製造方法、及びＡｐｏ−２Ｌ三量体製剤及び安定性を有するＡｐｏ−２リガンド及びＡｐｏ−２リガンド製剤の利用法の提供。【解決手段】Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）を、５℃で２４時間に渡って２０ｍＭＴｒｉｓ、８％トレハロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５製剤に含まれる５ｍＭの酢酸亜鉛或いは硫酸亜鉛等の特定の金属塩とともにインキュベートする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
製剤に存在する一つ又は複数の二価金属イオンの濃度がＡｐｏ−２リガンドに対して＜２Ｘモル比である、前記Ａｐｏ−２リガンド及び前記一つ又は複数の二価金属イオンを含んでなる製剤。
【請求項２】
前記一つ又は複数の二価金属イオンが亜鉛又はコバルトを含む、請求項１の製剤。
【請求項３】
前記一つ又は複数の二価金属イオンが亜鉛を含む、請求項２の製剤。
【請求項４】
前記亜鉛が塩化亜鉛、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、炭酸亜鉛及びクエン酸亜鉛から成る群から選択された、請求項３の製剤。
【請求項５】
前記製剤が製薬的に許容可能な製剤である、請求項１の製剤。
【請求項６】
前記Ａｐｏ−２リガンドが図１（配列番号：１）のアミノ酸１１４から２８１を含む、請求項１の製剤。
【請求項７】
前記Ａｐｏ−２リガンドが図１（配列番号：１）のアミノ酸１から２８１又はその変異体或いはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１の製剤。
【請求項８】
前記製剤がｐＨ約６から９である、請求項１の製剤。
【請求項９】
前記製剤がｐＨ約７から７．５である、請求項８の製剤。
【請求項１０】
前記製剤が水溶性製剤である、請求項１の製剤。
【請求項１１】
前記製剤が凍結乾燥製剤である、請求項１の製剤。
【請求項１２】
製剤に存在する一つ又は複数の二価金属イオンの濃度がＡｐｏ−２リガンドに対して≧２Ｘモル比である、前記Ａｐｏ−２リガンド及び前記一つ又は複数の二価金属イオンを含んでなる製剤。
【請求項１３】
Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドを一つ又は複数の二価金属イオンの有効量に曝露することを含んでなる、Ａｐｏ−２リガンド三量体の形成を促進する方法。
【請求項１４】
Ａｐｏ−２リガンドを混合すること、一つ又は複数の二価金属イオンの有効量、及び製薬的に許容可能な担体を含んでなる、Ａｐｏ−２リガンドの製薬的に許容可能な製剤を製造する方法。
【請求項１５】
Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドを一つ又は複数の二価金属イオンの有効量に曝露することを含んでなる、ジスルフィド結合Ａｐｏ−２リガンド二量体の形成を減じる方法。
【請求項１６】
（ａ）Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する複製可能なベクターを含んでなる宿主細胞を提供すること；（ｂ）一つ又は複数の二価金属イオンの有効量を含有する培養培地を提供すること；（ｃ）Ａｐｏ−２リガンドを発現するために十分な条件下で培養培地の宿主細胞を培養すること；（ｄ）培養培地又は宿主細胞からＡｐｏ−２リガンドを回収することの段階を含んでなる、Ａｐｏ−２リガンドを製造する方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記一つ又は複数の二価金属イオンが亜鉛を含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記亜鉛が硫酸亜鉛を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記一つ又は複数の二価金属イオンがコバルトを含む、請求項１６の方法。
【請求項２１】
前記コバルトが塩化コバルトを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記亜鉛が約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルの濃度で培養培地に存在する、請求項１８の方法。
【請求項２３】
前記複製可能なベクターが一つ又は複数のｔＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６の方法。
【請求項２４】
前記複製可能なベクターがｐＡＰＡｐｏ２−Ｐ２ＲＵベクターである請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記Ａｐｏ−２リガンドが図１（配列番号：１）のアミノ酸１１４から２８１を含む、請求項１６の方法。
【請求項２６】
前記Ａｐｏ−２リガンドが図１のアミノ酸１から２８１又はその生物学的に活性な断片或いは変異体を含む、請求項１６の方法。
【請求項２７】
（ａ）Ａｐｏ−２リガンドをコードするヌクレオチド配列を含有する複製可能なベクターを含んでなる宿主細胞を提供すること；（ｂ）培養培地を提供すること；（ｃ）Ａｐｏ−２リガンドを発現するために十分な条件下の培養培地で宿主細胞を培養すること；（ｄ）培養培地又は宿主細胞からＡｐｏ−２リガンドを回収すること；（ｅ）一つ又は複数の二価金属イオンの有効量の存在下でＡｐｏ−２リガンドを精製することの段階を含んでなる、Ａｐｏ−２リガンドを製造する方法。
【請求項２８】
段階（ｅ）の前記Ａｐｏ−２リガンドが一つ又は複数の二価金属イオン及び還元剤の存在下で精製される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記Ａｐｏ−２リガンドが図１（配列番号：１）のアミノ酸１１４から２８１を含む、請求項２７の方法。
【請求項３０】
前記Ａｐｏ−２リガンドが図１（配列番号：１）のアミノ酸１から２８１又はその生物学的活性断片或いは変異体を含む、請求項２７の方法。
【請求項３１】
（ａ）培養された原核生物宿主細胞で発現されるＡｐｏ−２リガンドを単離すること；（ｂ）一つ又は複数の二価金属イオン及び還元剤を含有するバッファー溶液へ前記単離Ａｐｏ−２リガンドを曝露すること；及び（ｃ）前記単離Ａｐｏ−２リガンドを回収することの段階を含んでなる原核生物細胞培養からＡｐｏ−２リガンドを回収する方法。
【請求項３２】
段階（ｂ）の前記一つ又は複数の二価金属イオンが亜鉛及びコバルトから成る群から選択され、前記還元剤がＤＴＴ及びＢＭＥから成る群から選択された、請求項３１の方法。
【請求項３３】
段階（ｃ）の前記Ａｐｏ−２リガンドを順次にカチオンクロマトグラフィー支持体、ヒドロキシアパタイト支持体、及び疎水性クロマトグラフィー支持体へ接触させて回収することを含んでなる、請求項３１の方法。
【請求項３４】
カチオンクロマトグラフィー支持体をＳＰ−セファロース、ＣＭ−セファロース、及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｃｅｒａｍｉｃ ＨＳ樹脂から成る群から選択する、請求項３４の方法。
【請求項３５】
疎水性クロマトグラフィー支持体をフェニルアガロース、ブチルアガロース、ＴＳＫ樹脂、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂から成る群から選択する、請求項３３の方法。
【請求項３６】
天然配列Ａｐｏ−２リガンドとは異なり、一つ又は複数の以下に示す図１（配列番号：１）の残基でのアミノ酸置換を含んでなる単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド：Ｒ１３０Ａ；Ｎ１３４Ａ；Ｌ１３６Ａ；Ｓ１３８Ａ；Ｎ１４０Ａ；Ｎ１４３Ａ；Ｓ１５３Ａ；Ｅ１５５Ａ；Ｒ１５８Ａ；Ｒ１７０Ａ；Ｋ１７９Ａ；Ｒ１９１Ａ；Ｑ１９３Ａ；Ｅ１９５Ａ；Ｋ１９７Ｄ；Ｋ２０１Ａ；Ｎ２０２Ａ；Ｄ２０３Ａ；Ｙ２１３Ａ；Ｄ２１８Ａ；Ｙ２４０Ａ；Ｋ２５１Ａ；Ｓ２５９Ａ；Ｄ２６７Ａ；Ｄ２６９Ａ。
【請求項３７】
天然配列Ａｐｏ−２リガンドとは異なり、一つ又は複数の以下に示す図１（配列番号：１）の残基でのアミノ酸置換を含んでなる単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド：Ｓ１４１Ａ、Ｋ１４２Ａ、Ｓ１５９Ａ、Ｈ２６４Ａ。
【請求項３８】
天然配列Ａｐｏ−２リガンドとは異なり、一つ又は複数の以下に示す図１（配列番号：１）の残基でのアミノ酸置換を含んでなる単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド：Ｒ１４９Ａ；Ｃ２３０Ｓ；Ｃ２３０Ａ；Ｑ２０５Ａ；Ｖ２０７Ａ；Ｙ２１６Ａ；Ｅ２３６Ａ；Ｙ２３７Ａ。
【請求項３９】
請求項３６のＡｐｏ−２リガンド変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
【請求項４０】
請求項３９の核酸を含んでなるベクター。
【請求項４１】
請求項４０のベクターを含んでなる宿主。
【請求項４２】
ｐＡＰＡｐｏ２−Ｐ２ＲＵベクター。
【請求項４３】
請求項４２のベクターを含んでなる宿主。
【請求項４４】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項３１の宿主細胞。
【請求項４５】
図１（配列番号：１）のアミノ酸１１４から２８１を含んでなり、請求項１６の方法で製造された、単離されたＡｐｏ−２リガンド。
【請求項４６】
図１（配列番号：１）のアミノ酸１から２８１、又はその生物学的に活性な断片或いは変異体を含んでなり、請求項１６に記載の方法で製造された、単離されたＡｐｏ−２リガンド。
【請求項４７】
図１（配列番号：１）のアミノ酸１１４から２８１を含んでなり、請求項２７の方法で製造された、単離されたＡｐｏ−２リガンド。
【請求項４８】
図１（配列番号：１）のアミノ酸１から２８１、又はその生物学的に活性な断片或いは変異体を含んでなり、請求項２７に記載の方法で製造された、単離されたＡｐｏ−２リガンド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、概して亜鉛又はコバルトなどの二価の金属イオンを利用したＡｐｏ−２リガンド及びＡｐｏ−２リガンド製剤の製造方法に関する。改良されたＡｐｏ−２Ｌ三量体製剤及び安定性を有するそのようなＡｐｏ−２リガンド及びＡｐｏ−２リガンド製剤の利用法が、同じく提供されている。本発明は、さらにＡｐｏ−２リガンド変異体、特にアラニン置換変異体に関する。
【０００２】
(発明の背景)
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barrら, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Stellerら, Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itohら, Cell, 66：233-243(1991)］。
【０００３】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」又は「リンホトキシン−α」）、リンホトキシン−β（「ＬＴ−β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される）、Ａｐｏ−２リガンド（トレイル（ＴＲＡＩＬ）とも称される）及びＡｐｏ−３リガンド（同じくＴＷＥＡＫと称される）が、サイトカインの腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85:3378-3404(1995)；Pittiら,  J. Biol. Chem., 271:12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3:673-682(1995)；Browningら，Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら,  Nature, 357:80-82(1992)、1997年1月16日に公開されたWO97/01633；1997年7月17日に公開されたWO97/25428；1997年12月11日に公開されたWO97/46686；9月18日に公開されたWO97/33899；Mastersら、Curr. Biol., 8：525-528(1998)；Chicheporticheら., Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びＡｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫ）は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。このようなＴＮＦファミリーサイトカインによる種々の細胞応答の誘導は、それらの特定の細胞レセプターへの結合によって開始されると考えられている。およそ５５−ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）及び７５−ｋＤａ（ＴＮＦＲ２）の二つの異なるＴＮＦレセプターが同定され［Hohmanら, J. Biol. Chem., 264:14927-14934(1989)；Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたEP 417,563］、両レセプター形態と一致するｃＤＮＡが同定され、特徴づけられている［Loesterら, Cell, 61:351(1990)；Schallら, Cell, 61: 361(1990)；Smithら, Science, 248: 1019-1023(1990)；Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834(1991)；Goodwinら, Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026(1991)］。広範な多形態性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に関連している［例えば、Takaoら, Immunogenetics, 37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典形態的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Yら, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。更に最近になって、組換え体可溶性ＴＮＦレセプターのクローニングがヘイル(Hale)らにより報告されている［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］。
【０００４】
１形態又は２形態のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schallら, 上掲；Loetscherら, 上掲；Smithら, 上掲；Nopharら, 上掲；Kohnoら, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Bannerら, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)らにより記載されている。
【０００５】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnsonら, Cell, 47：545(1986)；Radekeら, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovicら, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Malletら, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yoneharaら,J. Exp. Med., 169:1747-1756(1989)及びItohら, Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶形態ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Uptonら, Virology, 160：20-29(1987)；Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Uptonら, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：159-163(1991)］又はこのドメインにおける５-アミノ酸の挿入［Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合にはほとんど又は全く影響を持たないことが示されている［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲはＮＧＦ結合に関与せず、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む［Peetre, Cら, Eur. J. Hematol.,41：414-419(1988)；Seckinger, Pら, J. Biol. Chem., 264：11966-11973(1989)；Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１にはない。
【０００６】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドはII形態の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプター類はＩ形態の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典形態的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。このような新たに同定されたＴＮＦＲのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテゲリン(osteoprotegerin)（ＯＰＧ）［Brojatschら, Cell, 87:845-855 (1996); Montgomeryら, Cell, 87:427-436 (1996); Marstersら, J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997); Simonetら, Cell, 89:309-319 (1997)］を含む。シモネット(Simonet)らは、他の周知のＴＮＦＲ様分子とは異なり、ＯＰＧは疎水性の膜貫通−スパンニング配列を含まないと報告している。下記にて検討されているように、ＯＰＧはおとりレセプターのように作用すると考えられている。
【０００７】
さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーの新規なメンバーがマウスにおいて同定され、レセプターは、「糖質コルチコイド誘発腫瘍壊死因子レセプターファミリー関連遺伝子」に対して「ＧＩＴＲ」と命名された［Nocentiniら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216-6221 (1997)］。マウスＧＩＴＲレセプターは２２８アミノ酸のＩ形態膜貫通タンパク質であり、胸腺、脾臓及びリンパ節からの正常マウスＴリンパ球において発現される。マウスＧＩＴＲレセプターの発現は、抗-ＣＤ３抗体、ＣｏｎＡ又はホルボール１２-ミリステート１３-アセテートでの活性化の際にＴリンパ球で誘発される。筆者は、ＧＩＴＲレセプターがＴ細胞レセプター媒介細胞死の調節に関与していると考えている。
マースターズ(Marsters)ら，Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復においてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ている、Ａｐｏ-３と称されるヒトのポリペプチド全長天然配列を開示している［Marstersら, Curr. Biol., 6：1669(1996)も参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ-３は、ＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyanら, Science, 274：990(1996)；Kitsonら, Nature, 384：372(1996)；Bodmerら, Immunity, 6：79(1997)；Screatonら, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4615-4619(1997)］。
【０００８】
パン(pan)らは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させることにできる細胞内死亡ドメインを含むと報告された。パンらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られるリガンドのレセプターであると考えられることを開示している。
シェリダン(Sheridan)ら, Science, 277: 818-821 (1997)及びパンら, Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対するレセプターと思われる他の分子が記載されている。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ-２、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲＡＩＬ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれる［Screatonら, Curr.Biol. 7:693-696(1997)；Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387(1997)；Wuら, Nature Genetics, 17:141-143(1997)］）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞内死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。
【０００９】
さらに、もう一つの死ドメイン含有レセプター，ＤＲ６が最近、同定された［Panら, FEBS Letters, 431:351-356(1998)］。４つの推定上の細胞外ドメイン及び細胞質死ドメインを含んでいるだけでなく、ＤＲ６は細胞質領域のプロリンリッチモチーフと重なる推定上のロイシンジッパー配列を含むものと考えられている。プロリンリッチモチーフは、ｓｒｃ−ホモロジー３ドメインに結合する配列に類似し、これらは多くの細胞内シグナル伝達分子に見出される。
最近、同定されたＴＮＦＲファミリーメンバーのさらなるグループは、「おとりレセプター」と称され、それらはシグナルのトランスデューサーというよりも、阻害物質として機能すると考えられている。このグループは、分泌、可溶性タンパク質であるＯＰＧ［Simonetら, 上掲］及びＤＣＲ３［Pittiら, Nature, 396:699-703(1998)］のみならず、ＤＣＲ１（また、ＴＲＩＤ、ＬＩＴ或いはＴＲＡＩＬ−３と称された）［Panら, Science, 276：111-113(1997)；Sheridanら, Science, 277:818-821(1997)；McFarlaneら, J.Biol. Chem., 272:25417-25420(1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416:329-334(1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med. 186: 1156-1170(1997)；及びMongkolsapayaら, J. Immunol. 160:3-6(1998)］及びＤＣＲ２(また、ＴＲＵＮＤＤ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ４と呼ばれた）［Marstersら，Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Panら, FEBS Letters, 431:351-356(1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7:813-820(1997)］、双方の細胞表面分子を含む。
【００１０】
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの総説としては、Ashkenaziら, Science, 281:1305-1308(1998)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；及びGruss及びDower, 上掲を参照のこと。
多様な境界面に関与するあるタンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用において、亜鉛結合部位は構造的役割を担うことが示されているが［Feeseら, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:3544-3548(1994)；Somersら, Nature, 372: 478-481(1994)；Ramanら, Cell, 95: 939-950(1998)］、ＴＮＦファミリー（ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−アルファ、又はＴＮＦ−ベータ）で以前に構造的に特徴付けられたメンバーには、金属へ結合するものはない。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ような種々のホルモンの製剤における亜鉛のような金属イオンの利用は、文献に記載されている［例えば、1992年10月15日公開のWO92/17200を参照のこと］。レセプターへのｈＧＨの結合における亜鉛の関与は、1992年3月5日公開のWO92/03478に記載されていることに類似している。インターフェロン−アルファ二量体及びインターフェロン−ベータ二量体における亜鉛結合の役割は、それぞれWalterら, Structure, 4:1453-1463(1996)及びKarpusasら, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:11813-11818(1997)に報告されている。
亜鉛のような種々の金属イオンの構造的及び生物学的役割は、当該分野で概説されていおり、例えば、Christiansonら, Advances in Protein Chemistry, 42: 281-355(1991)を参照のこと。
【００１１】
（本発明の概要）    
本発明は、Ａｐｏ−２リガンドの製造の方法又はプロセス、或いはＡｐｏ−２リガンドを含む製剤における一つ又は複数の二価の金属イオンの包含は、Ａｐｏ−２リガンド三量体の産出高と安定性の増大を結果として生じることの発見に基づいている。現在、そのような一つ又は複数の二価の金属イオンの包含は、さらに、組み換え体細胞培養における発現でのＡｐｏ−２リガンド又はＡｐｏ−２三量体形成のフォールディング（折り畳み）を向上させうると考えられている。酸化的な環境下では、Ａｐｏ−２Ｌ単量体の遊離システインは、分子間ジスルフィド架橋を形成することが可能であり、Ａｐｏ−２Ｌの三量体形態にあるジスルフィド架橋Ａｐｏ−２Ｌ二量体種のみならず独立のＡｐｏ−２Ｌ二量体を生じる。そのようなＡｐｏ−２Ｌ二量体の形成は、Ａｐｏ−２Ｌの凝集、沈殿、及び／又は不活性化につながる。ここにおいて記載の方法及び製剤の二価の金属イオンの存在は、そのようなジスルフィド結合形成に対して防御する。Ａｐｏ−２Ｌ三量体の合成及び形成のプロセスにおける二価の金属イオンの包含が、ホモ三量体Ａｐｏ−２Ｌの蓄積及び回収をさらに向上させうることは明かである。出願人は、Ａｐｏ−２リガンド三量体は、ジスルフィド架橋Ａｐｏ−２Ｌ二量体と比較して約１０倍も活性がある（哺乳類癌細胞における細胞毒性活性）。
【００１２】
ここにおける発明の説明はＡｐｏ−２リガンドに関しているが、二価の金属イオンの利用による種々の他のタンパク質の生成及び安定化が考慮されている。そのような他のタンパク質は、特に生物活性のために三量体形成を必要とするタンパク質を含み、例えばＴＮＦファミリーの種々のメンバーがある。
一実施態様では、一つ又は複数の二価イオンを利用するＡｐｏ−２リガンドの生成方法を提供する。この方法は、Ａｐｏ−２リガンドをコードする核酸を含む複製可能なベクターを含んでなる宿主細胞を提供すること、一つ以上二価イオンを含有する培養培地を提供すること、Ａｐｏ−２リガンドの発現に十分な条件下での培養培地における宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は培養培地からのＡｐｏ−２リガンドを回収することの処置を含む。随意的に、一つ又は複数の二価イオンが回収又は精製プロセスにおいて利用される。
【００１３】
その他の実施態様では、本発明は、Ａｐｏ−２リガンドを含んでなるＡｐｏ−２リガンドの製剤を提供する。その組成物は、例えば、哺乳類癌細胞のアポトーシスを誘導或いは刺激するために有用な製薬的に許容可能な製剤であってもよい。
本発明のさらなる実施態様は、一つ又は複数の二価イオンを含有するそのようなＡｐｏ−２リガンド製剤を包含する製造品及びキットであってもよい。製造品及びキットは、容器、容器上の標識、及び容器内に含有される製剤を含む。容器上の標識は、製剤がある治療又は非治療的応用へ利用することが可能であることを示している。製剤は、Ａｐｏ−２リガンド及び一つ又は複数の二価の金属イオンを含有する。
【００１４】
その他の実施態様では、本発明は、ここにおいて記載の方法に従って生成されるＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを提供する。そのようなＡｐｏ−２リガンドポリペプチドは、生物学的に活性な断片又はその変異体と同様に、図１のアミノ酸１１４−２８１（配列番号：１）、図１のアミノ酸１−２８１（配列番号：１）を含んでもよい。
よりさらなる実施態様では、本発明はＡｐｏ−２リガンド変異体を提供する。特に、本発明は、Ａｐｏ−２リガンドの天然配列（図１；配列番号：１）における一つ又は複数のアミノ酸置換を含んでなるＡｐｏ−２リガンド変異体を提供する。アラニン置換を含んでなるＡｐｏ−２リガンド変異体は、下記の表１に提供されている。本発明は、また、そのようなＡｐｏ−２Ｌ変異体、及びＡｐｏ−２Ｌ変異体をコードする核酸分子を含有するベクター及び宿主細胞を提供する。
【００１５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
（定義）
「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」、及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、ここにおいて、図１（配列番号：１）に示されているアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４から２８１まで（１１４と２８１を含めて）、９５から２８１まで（９５と２８１を含めて）、残基９１から２８１まで（９１と２８１を含めて）、残基４１から２８１まで（４１と２８１を含めて）、残基１５から２８１まで（１５と２８１を含めて）、又は残基１から２８１まで（１と２８１を含めて）を含むポリペプチド配列の生物学的に活性な断片、欠損、挿入、又は置換変異体と同様に、上記のアミノ酸残基を包含するポリペプチド配列を称するために使用される。一実施態様では、ポリペプチド配列は図１（配列番号：１）の残基１１４から３８１を含む。随意的には、ポリペプチド配列は図１（配列番号：１）の残基９２から２８１又は残基９１から２８１を含む。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは、図１（配列番号：２）に示されている天然ヌクレオチド配列によってコードされうる。随意的には、残基Ｐｒｏ１１９（図１；配列番号：２）をコードするコドンは、「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」でありうる。その他の好ましい実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、上記の配列のすべてと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。本定義は、少なくともＡｐｏ−２リガンドの一つの天然アミノ酸がアラニン残基によって置換されているＡｐｏ−２リガンドの置換変異体を包含する。好ましい置換変異体は、下記の表１において同定されている一つ又は複数の残基の置換を含む。本定義は、また、Ａｐｏ−２リガンドソースから単離、又は組み換え体或いは合成方法によって調製される天然配列Ａｐｏ−２リガンドを包含する。本発明のＡｐｏ−２リガンドは、1997年1月16日に公開のWO97/01633及び1997年7月17日に公開のWO97/25428において開示されたＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されているポリペプチドを包含する。「Ａｐｏ−２リガンド」又は「Ａｐｏ−２Ｌ」という用語は、ポリペプチドの単量体、二量体又は三量体形態を含むＡｐｏ−２リガンドの形態を通常は称するのに使用される。特別に言及されていないのであれば、Ａｐｏ−２Ｌ配列において当てはまるアミノ酸残基すべての番号化は、図１（配列番号：１）に記載の番号を使用する。例えば、「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、図１（配列番号：１）において提供される配列の位置２０３のアスパラギン酸に相当する。
【００１６】
「Ａｐｏ−２リガンド細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ−２リガンドＥＣＤ」は、原則的に膜貫通及び細胞質ドメインの無いＡｐｏ−２リガンド形態に相当する。通常は、ＥＣＤは１％未満のそのような膜貫通及び細胞質ドメインを有し、及び好ましくは０．５％未満のそのようなドメインを有する。
「Ａｐｏ−２リガンド単量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ単量体」という用語は、Ａｐｏ−２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有結合性鎖に相当する。
「Ａｐｏ−２リガンド二量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ二量体」という用語は、ジスルフィド結合による共有結合性架橋で結合している二つのＡｐｏ−２Ｌ単量体に相当する。ここにおいて使用されているような用語は、Ａｐｏ−２Ｌの三量体形態の中にある独立したＡｐｏ−２Ｌ二量体及びＡｐｏ−２Ｌ二量体を包含する（すなわち、その他のＡｐｏ−２Ｌ単量体と会合している）。
「Ａｐｏ−２リガンド三量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ三量体」という用語は、非共有結合的に会合している三つのＡｐｏ−２Ｌ単量体に相当する。
【００１７】
「ＴＮＦファミリーメンバー」は、構造又は機能に関して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とある類似性を共有する種々のポリペプチドに関する広範な意味で使用されている。ＴＮＦファミリーのポリペプチドと関連しているある構造的及び機能的特徴は、当該分野で知られており、例えば上記の発明の背景に記載されている。これらに限定されるものではないが、そのようなポリペプチドは、当該分野においてＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される）、Ａｐｏ−２リガンド（トレイル（ＴＲＡＩＬ）とも称される）、Ａｐｏ−３リガンド（同じくＴＷＥＡＫと称される）、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ、又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される）と当該分野で称されるポリペプチドを包含する［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85:3378-3404(1995)；Pittiら,  J. Biol. Chem., 271:12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3:673-682(1995)；Browningら，Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら,  Nature, 357:80-82(1992)、1997年1月16日に公開されたWO97/01633；1997年7月17日に公開されたWO97/25428；Mastersら、Curr. Biol., 8：525-528(1998)；Chicheporticheら., Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日に公開のWO98/28426；1998年10月22日に公開のWO98/46751；1998年5月7日に公開のWO/98/18921；Mooreら, Science, 285: 260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem.., 274:15978-15981(1999)］。
【００１８】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、Ａｐｏ−２リガンド、又はその一部が「タグポリペプチド」に融合したものを含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、Ａｐｏ−２リガンドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００１９】
「二価の金属イオン」という用語は、二つの正電荷を有する金属イオンを称する。本発明における二価の金属イオンの利用の実施例としては、限定されるものではないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム、及びマンガンを包含する。用いられうるこのような金属の特有の形態は、上記に記載の二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、及び硫酸塩のような塩（例えば、製薬的に許容可能な塩）を包含する。本発明の利用において好ましい二価の金属イオンは、亜鉛、及びより好ましくはその塩で硫酸亜鉛である。ここにおいて記載の二価の金属イオンは、例えば、（１）所望する期間に渡ってＡｐｏ−２Ｌ三量体の貯蔵安定性を高める、（２）組み換え体細胞培養又は精製方法においてＡｐｏ−２Ｌ三量体の生産又は生産高を高める、（３）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の溶解性を高める（又は凝集性を低下させる）、又は（４）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の形成を高めるために十分な濃度又は量（例えば有効量）によって好んで用いられる。
【００２０】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典形態的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。Ａｐｏ−２の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２１】
「単離された」Ａｐｏ−２リガンド核酸分子は、同定され、Ａｐｏ−２リガンド核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ−２リガンド核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ−２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ−２リガンド核酸分子を含む。
【００２２】
ここで同定されているＡｐｏ−２リガンド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｐｏ−２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを割り当てることを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる当業者の技量の範囲内にある種々の方法によって達成することができる。ここにおける目的のためには、パーセントアミノ酸同一性値は、配列比較コンピュータープログラムALING-2を使用して得ることができ、このプログラムはジェネンテク社（Genentech Inc.）によって作成され、そのソースコードは米国著作権局、ワシントン，D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALING-2は、米国著作権登録番号TXU-510087の下で登録された。ALING-2プログラムはジェネンテク社、サウス  サン  フランシスコ，カリフォルニア（South San Francisco, California）から公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２３】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に配置されているときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現されるなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合しており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２４】
ここで意図している「生物学的に活性な」及び「生物学的活性」とは、（ａ）インビボ又はエキソビボで少なくとも１つの形態の哺乳動物細胞又はウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘導又は刺激する能力を有すること；（ｂ）抗体を産生することが可能であること、すなわち免疫原性であること；（ｃ）Ａｐｏ−２のレセプターへ結合すること及び／又は刺激することが可能あること；又は（ｃ）天然又は天然発生Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドの活性を保持することを意味する。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典形態的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば全てこの分野で知られている細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法により決定及び測定することができる。
【００２５】
「癌」、「癌性」又は「悪性の」という用語は、典形態的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、胃腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮体癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、多形態膠芽腫、子宮頚癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、大腸癌、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。  
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
【００２６】
II．  本発明の組成物と方法
ＴＮＦリガンドファミリーに関連した新規のサイトカインで、ここにおいて「Ａｐｏ−２リガンド」と同定されたサイトカインが記載されている。ヒトＡｐｏ−２リガンドのよ予測成熟アミノ酸配列は、２８１個のアミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算上の分子量を有する。シグナル配列の欠損及び内在性疎水性領域の存在は、Ａｐｏ−２リガンドがII形態膜貫通タンパク質であることを示唆する。また、可溶性細胞外ドメインＡｐｏ−２リガンドポリペプチドが記載されている。1997年7月17日に公開のWO97/25428を参照のこと。Ａｐｏ−２Ｌ置換変異体が，さらに記載されている。アラニンスキャンニング技術が、生物学的活性を有する種々の置換変異体分子を同定するために利用されてきた。Ａｐｏ−２リガンドの特定の置換変異体は、少なくとも一つのアミノ酸がアラニン残基によって置換されているものを含む。これらの置換変異体は、例えば、「Ｄ２０３Ａ」、「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」と同定されている。この命名法は、位置２０３、２１８、及び／又は２６９（図１（配列番号：１）に示されている番号を使用）のアスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換されているＡｐｏ−２リガンド変異体を同定するために利用されてている。随意的には、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、下記の表１に列挙されている一つ又はそれ以上のアラニン置換を含んでもよい。
【００２７】
Ａｐｏ−２リガンドの細胞外ドメインのＸ線結晶構造は、本発明において提供され、アラニンスキャンニング突然変異誘発は、そのレセプター接触領域のマッピングを提供するためにおこなわれていている。Ａｐｏ−２リガンドのために得られた構造は、Ａｐｏ−２リガンド三量体分子の三つのサブユニットの相互作用を調製する新規の二価金属イオン（亜鉛）結合部位を含有するホモ三量体タンパク質を明らかにする。
【００２８】
Ａｐｏ−２ＬのＸ線構造は、ＴＮＦ−アルファのモデルを利用する分子置換Eckら, J. Bio. Chem., 264: 17595-17605 (1989)］によって決定され、３．９オングストローム（１１４−２８１残基について）及び１．３オングストローム（Ｄ２１８Ａ変異体；９１−２８１形態）に精緻化される。ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、Ａｐｏ−２Ｌは、約５１００オングストローム２（単量体当たり１７００オングストローム２）を埋めて球状三量体を形成する、三つのゼリーロール単量体によって集約的な三量体を含むと思われる（図２Ａを参照のこと）。コアであるベータストランドの位置は、ＴＮＦ−アルファ又はＴＮＦ−ベータ のコアストランドと比較した場合は、０．８オングストロームのr.m.s.d.で、ＴＮＦ−アルファ［Eckら, 上掲；Jonesら, Nature, 338:225-228(1989)］、ＴＮＦ−ベータ［Eckら, J. Biol. Chem., 267:2119-2122(1992)］、及びＣＤ４０［Karpusasら, Structure, 3:1031-1039(1995)］の他の構造的に特徴付けられているＴＮＦ−ファミリーのメンバーと比べて良く保持されている。Ａｐｏ−２Ｌ三量体の境界面のどの残基も、すべての現在知られているヒトＴＮＦファミリーメンバーの配列の全体において完全に保持されているものはない；しかしながら、これら残基の疎水化学的性質は保持される（図３を参照のこと）。Ａｐｏ−２Ｌ三量体境界面の保持残基は、塩基の近傍（三量体で最も広い部分）及び三回転軸に沿ってクラスターを形成する。Ｃｙｓ２３０の近傍のＡｐｏ−２Ｌ三量体境界面の頂点の近くでは、構造は分岐しているように思われ、１９０及び２３０のループのコンホメーションは各構造において変わりやすい。
【００２９】
ベータ骨格コアとは対照的に、レセプター結合表面及びループの構造は、ＴＮＦファミリーメンバーの中でかなり変化する。Ａｐｏ−２リガンドの構造及びＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、そしてＣＤ４０Ｌの構造の間の一つの違いは、ストランドＡ及びＡ’の間のつながりである。ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、そしてＣＤ４０Ｌでは、ストランドＡの後には、ぎっしりと詰まったループが続ている。Ａｐｏ−２リガンドでは、１５残基の挿入がｋｏｎｏループを長くし、そのコンホメーションを変える。ループの最初の部分は（残基１３１から１４１）、ループの二番目の部分（残基１４２から１５４）が
ＣＤ４０Ｌに類似するコンホメーションをそのＣ末端部分に有して、分子の表面を一つの単量体−単量体境界面から次へ（図２Ａを参照のこと）と越える際に乱れる。
【００３０】
驚くべきことに、出願人は、三量体化境界面の頂点の近くに、新規の金属イオン（亜鉛）結合部位が埋もれていることを発見した。ＴＮＦファミリーメンバーは、配列分析によって、Ｃｙｓ２３０に関して三つのグループにわけられる：（１）ＴＮＦ−アルファ及びＦａｓリガンドのようなタンパク質のＣｙｓ２３０に一致するシステイン残基は、金属イオンとの相互作用を妨げるジスルフィド結合を形成することが可能な近傍のループ（Ａｐｏ−２Ｌの１９４−２０３）の中のその他のシステインに伴われている。（２）Ｃｙｓ２３０（例えばＴＮＦ−ベータ及びＯＰＧＬ）に一致するシステインを有しないタンパク質、及び（３）Ｃｙｓ２３０に一致するシステイン残基を一つのみ有するタンパク質である。他の種のＡｐｏ−２Ｌ及びその相同分子種は、後者の基準に当てはまり（すなわち、Ｃｙｓ２３０のみを有するタンパク質）、三量体表面において二価金属イオンと結合することが期待される。Ａｐｏ−２ＬのＣｙｓ２３０の即前の主要鎖のコンホメーションは、ＴＮＦ−アルファ及びＣＤ４０ＬのようなＴＨＦファミリーメンバーを含むジスルフィドとは異なる。Ａｐｏ−２Ｌでは、Ｃｙｓ２３０の側鎖は、境界面から遠ざかるのではなく、それに向かっている。
【００３１】
各Ａｐｏ−２Ｌ単量体のＣｙｓ２３０残基は内部を三量体軸へ向かせ、内部の溶媒分子と共に二価金属イオンを調製する。この二価金属イオン結合部位は、亜鉛結合部位にとって適切な結合及び角度を僅かに歪めた四面体幾何学を示し、溶媒へは完全に接触不可能である（図２Ｂ）を参照のこと）。結合金属の同一性は、誘導結合プラズマ原子発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を利用して確かめられる（実施例５を参照のこと）。ＩＣＰ−ＡＥＳを利用したＣｄ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＣｕの定量的分析では、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の分子当たり０．７９モルのＺｎ及び０．０６モルのＣｏが検出され、構造における結合イオンは、約１モル比に対して１の亜鉛であることが示された。この部位の重要性は、Ｃｙｓ２３０のアラニン置換が８倍未満のアポトーシス活性の減少となったことの観察によって示されていた（実施例７を参照のこと）。さらには、キレート試薬に対する透析によるＡｐｏ−２Ｌからの結合金属の除去は、ＤＲ５親和性の７倍の低下及びアポトーシス活性の９０倍未満の低下を生じた（実施例６を参照のこと）。Ｚｎの除去によって、システインは酸化されやすくなり、アポトーシス活性が低下したジスルフィド結合Ａｐｏ−２Ｌ二量体が形成された。金属結合部位がＡｐｏ−２Ｌ三量体構造に埋もれたように思われ、そしてレセプターに接触することが期待されないことから、データは、二価金属イオン結合が、三量体構造及びＡｐｏ−２Ｌの安定性の維持に重要であるろうことを示唆している。
【００３２】
Ａｐｏ−２リガンドのレセプター結合部位を地図で描くために、レセプター結合及び生物学的活性にとって重要なアミノ酸残基がアラニンスキャンニング突然変異誘発法によって同定された［Cunninghamら, Science, 244:1081-1085(1989)］。残基Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、又はＴｙｒ２３７での一つのアラニン置換は、バイオアッセイのアポトーシス活性において５倍以上の減少となり、レセプターに対する親和性の減少を示した（実施例３及び４を参照のこと）。ＤＲ４、ＤＲ５及びＤｃｒ２へのＡｐｏ−２Ｌの結合は、残基Ｇｌｎ２０５、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、又はＴｙｒ２３７でのアラニン置換によって最も影響を受け、これによって三つのレセプターすべてに対する親和性が少なくとも５倍の減少となった。また、減少したアポトーシス活性を有するこれら変異体のすべては、ＤＲ４又はＤＲ５のどちらか（又は両方）に対して正常に機能しない結合を示したが、これはレセプター結合がアポトーシス活性に必要であることを示している。
【００３３】
Ａｓｐ２１８及びＡｓｐ２６９でのアラニン置換は、増大したアポトーシス活性を有するＡｐｏ−２Ｌ変異体を生じた（実施例４を参照のこと）。残基Ａｓｐ２１８は、Ｔｙｒ２１６に近くに位置し、アポトーシス活性にとっては必要な残基の一つである。低分解Ａｐｏ−２Ｌ構造（１１４−２８１形態）との比較は、２１６−２２０ループのコンホメーションがＤ２１８Ａ変異の存在によって有意に改変されたように思えないことを示唆した。
【００３４】
突然変異誘発分析の結果がＡｐｏ−２Ｌ三量体構造に地図で描かれた際、レセプター結合及び生物活性のためのＡｐｏ−２Ｌ上の機能的エピトープは、ＴＮＦ−ベータに類似し、二つの単量体の接合点によって形成された表面に位置することが発見された（図５を参照のこと）。単量体−単量体境界面の浅い溝は、結合部位へ寄与する両単量体を有するレセプター結合部位を形成する。また、ＴＮＦ−アルファの残基Ａｒｇ３２、Ｔｙｒ８７、及びＡｓｐ１４３（Ａｐｏ−２Ｌの残基Ａｒｇ１５８、Ｔｙｒ２１６、及びＡｓｐ２６７に対応する）ＴＮＦレセプター結合へ寄与する［Gohら, Protein Engineering, 4:785-791(1991)］。対照的に、ＴＮＦ−アルファの残基（Ａｐｏ−２Ｌの残基Ｇｌｎ２０５、Ｇｌｕ２３６、及びＴｙｒ２３７に対応する）は、ＴＮＦＲ結合において比較的重要ではない役割を担う。従って、ＴＮＦ−アルファにとって、レセプター結合へは三量体構造の底部が最も重要な貢献をする一方で、Ａｐｏ−２Ｌでは、重要なレセプター結合残基は、同じく三量体構造の頂点に存在している。Ａｐｏ−２Ｌは、その標的レセプターとの相互作用のためのより大きくそしてより拡張した接触表面を有していることから、構造が知られているＴＮＦファミリーメンバーの中では独特であると思われる。好ましいＡｐｏ−２Ｌ変異体は、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基（すなわち、変異されない）を含むと考えられている。
【００３５】
下記の説明は、核酸をコードするＡｐｏ−２リガンドを含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の培養、及び細胞培養からポリペプチドを回収することによってＡｐｏ−２リガンドを生産する方法に言及している。
Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ−２リガンドｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリから得ることできる。従って、ヒトＡｐｏ−２リガンドＤＮＡは、WO97/25428に記載されているヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリのような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることが可能である。また、Ａｐｏ−２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【００３６】
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ-２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ-２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００３７】
Ａｐｏ-２リガンドのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ-２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような断片又は変異体は、全長Ａｐｏ-２リガンドについて図１（配列番号：１）に示したアミノ酸配列の細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠失を示す。挿入、置換及び／又は欠失の任意の組み合わせで最終構造物に到達することができるが、この最終構造物は、例えばここに定義する所望の生物活性又はアポトーシス活性を有する。好ましい実施態様では、断片又は変異体は、Ａｐｏ-２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ-２リガンドの全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、又は膜係留特性（膜アンカー特性）の改変のように、Ａｐｏ-２リガンドの翻訳後プロセスを改変し得る。
【００３８】
ここで記載されているＡｐｏ-２リガンド配列における変異は、米国特許第5,364,934号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して起こすことができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発などを含む。
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunninghamら, Science, 244: 1081 (1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることによっても好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：１(1976)］。
【００３９】
本発明の特定のＡｐｏ−２Ｌ変異体は、下記の表１に提供されている一つ又は複数の列挙されたアラニン置換を包含これらＡｐｏ−２Ｌポリペプチドを含む。このようなＡｐｏ−２Ｌ変異体は、典形態的には、少なくとも一つ又は複数のアミノ酸が天然Ａｐｏ−２Ｌアミノ酸配列（例えば、図１；配列番号：１に提供されている、全長又はＡｐｏ−２Ｌの成熟形態或いはその細胞外ドメイン配列）と異なる非天然発生アミノ酸配列を含む。随意的には、天然Ａｐｏ−２Ｌと比較してＡｐｏ−２Ｌ変異体において異なる一つ又は複数のアミノ酸は、表１に示されたようなアミノ酸置換を含む。本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図１（配列番号：１）の残基９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、そして表１に列挙されている一つ又は複数のアミノ酸置換を有する可溶性Ａｐｏ−２Ｌ変異体を含む。好ましいＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図１（配列番号：１）の残基９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、そしてレセプター結合のような生物活性を高める表１に列挙されている一つ又は複数のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００４０】
また、本発明の範囲内に含まれるＡｐｏ-２リガンド配列の変異体は、アミノ末端誘導体又は修飾形にも関連する。このようなＡｐｏ-２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン（例えばホルミルメチオニル又は他のブロックしたメチオニル種など）を有するここに記載した任意のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを含む。
天然又は変異体Ａｐｏ-２リガンドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。用いられるであろう任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終結配列は当該分野で知られており、WO97/25428にさらに詳しく記載されている。
【００４１】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ-２リガンド核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合したＡｐｏ-２リガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典形態的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例えば、養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ-２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ-２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
【００４２】
原核生物及び真核生物宿主に適したプロモーターは当該分野で知られており、WO97/25428にさらに詳しく記載されている。
大腸菌における可溶性Ａｐｏ−２Ｌの生産の好ましい方法には、生産物発現の制御のための誘発的プロモーターが用いられる。制御可能な誘発的なプロモーターの利用は、生産物発現の誘発、及び宿主によってうまく耐えることのできないかなりの量の生産物の蓄積の前に、所望する細胞密度への培養成長を可能にする。
【００４３】
Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の発現のために、三つの誘発的なプロモーター系（Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ））が出願人によって評価された。これら三つのプロモーターのそれぞれの利用は、収集細胞ペーストから回収されたかなりの量の可溶性で生物学的に活性なＡｐｏ−２Ｌ三量体を結果として生じた。しっかりとしたプロモーターコントロール、及び収集細胞ペーストにおいて達したより高い細胞密度及び力価のために、ＡＰプロモーターは試験されたこれら三つの誘発的なプロモーター系の中で好まれている。
一つ又は複数の上記に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。
【００４４】
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC 31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messingら, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxamら, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)を参照のこと］。
Ａｐｏ-２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookら, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＡｐｏ-２リガンドであるＡｐｏ-２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的のために特に有用である。
【００４５】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ-２リガンドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); EP117,060; 及びEP117,058に記載されている。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開されたDD266,710に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００４６】
大腸菌は、本発明において好ましい宿主細胞である。大腸菌は、グリコシル化の必要がなく、大きさが２０ｋｄ未満であるポリペプチドである、Ａｐｏ−２リガンド（１１４−２８１形態）の発現に特によく適している。生産宿主として、大腸菌は比較的に高い細胞密度で培養が可能であり、比較的に高いレベルの異種タンパク質の生産が可能である。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ-２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化Ａｐｏ-２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含むすべてのこのような宿主細胞の例は、さらにWO97/25428に記載されている。
【００４７】
宿主細胞をトランスフェクト（形質移入）し、好ましくは上述のＡｐｏ-２リガンド産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
トランスフェクション（形質移入）は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００４８】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願第WO89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に公開された国際特許出願第WO91/00358に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。
【００４９】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換は、典形態的には、Van solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドを生産するために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookらにより記載されているような適切な培地で培養される。大腸菌の培養に用いられうる培養培地の特定の形態は、下記の実施例にさらに記載されている。Ａｐｏ−２リガンドを生産するための宿主細胞は、種々の培養培地において培養することができる。
【００５０】
市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【００５１】
本発明に基づき、宿主細胞の培養又は発酵のために、典形態的には一つ又は複数の二価金属イオンが培養培地へ添加されるか或いは含まれる。二価金属イオンは、好ましくは、貯蔵安定性を増すため、溶解性を増すため、又は一つ又は複数の亜鉛イオンによって調製される安定なＡｐｏ−２Ｌ三量体の形成を補助するために十分な濃度レベルで培養培地に存在するか或いは添加される。添加される二価金属イオンの量は、一部は培養中の宿主細胞密度又はこのような二価金属イオンへの潜在的な宿主細胞感受性に依存する。培養におけるより高い細胞密度では、二価金属イオンの濃度を増すことは有益である。宿主細胞による生産物の発現中又は発現後に二価金属イオンが添加されたならば、宿主細胞による生産物の増加にともなって二価金属イオンの濃度を調節又は増加させることが望ましい。典形態的で普通に入手可能な細胞培養培地において存在しうる微量のレベルの二価金属イオンは、安定な三量体形成には十分ではないと一般的に考えられている。従って、ここに記載のように、さらなる量の二価金属イオンの添加は好まれている。
【００５２】
培養中の宿主細胞の成長期の間に二価金属イオンが添加されるならば、二価金属イオンは、逆に又は負の方向に宿主細胞へ影響しない濃度で培養培地へ好まれて添加される。振盪フラスコ培養では、１ｍＭより高い濃度でのＺｎＳＯ４の添加は、低い宿主細胞密度の結果を生じる可能性がある。当該分野に熟練した者は、細菌細胞は、細胞マトリックスと金属イオン複合体を形成することで、効果的に金属イオンを隔離することが可能であると理解する。従って、細胞培養では、成長期の後（所望する宿主細胞密度に達した後）又は宿主細胞による生産物発現の直前に、選択された二価金属イオンを添加することが好ましい。十分な量の二価金属イオンが存在していることを確かめるために、さらなる二価金属イオンが、生産物発現期の間に細胞培養培地へ添加又は供給される可能性がある。
【００５３】
培養培地の二価金属イオンは、宿主細胞に対して有害又は毒性でありうる濃度を越えてはならない。宿主細胞、大腸菌を用いる本発明の方法は、培養培地の二価金属イオンの濃度が約１ｍＭ（好ましくは≦１ｍＭ）を越えないことが好ましい。さらにより好ましくは、培養培地の二価金属イオン濃度は、約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルである。最も好ましくは、このような方法で使用される二価金属イオンは硫酸亜鉛である。金属イオン及びＡｐｏ−２リガンド三量体が１対１モル比で存在することが可能である量の二価金属イオンを細胞培養へ添加することが望ましい。
二価金属イオンは、細胞培養へ如何なる許容可能な形態でも添加が可能である。例えは、金属イオンの溶液は水を使って作ることが可能であり、次に、二価金属イオン溶液は培養培地へ添加又は供給することが可能である。
【００５４】
本発明の一実施態様では、選択Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１）は大腸菌で発現され、細胞培養の培養又は発酵の間、約４０−５０ｇｍ／Ｌ乾燥細胞重量につき約１．０−３．０ｍｍｏｌｅｓ／Ｌ−ｍｉｎの酸素取り込み速度で細胞活動が行われるようにプロセスパラメーターは設定されている。新規合成の初期Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドが、適切な蛋白質の折り畳み（フォールディング）及び三量体化に十分な時間を有することが好ましい。発酵プロセスの成長期は、３０℃で行われる。生産物発現の開始の直前において、プロセスの温度コントロール設定値は３０℃のまま又は残りの発酵のために２５℃へ下方移動されてもよい。随意的には、細胞培養中の細胞密度を増加させることが望ましく、これに応じて、上記にて言及したパラメーターを調整（又は増加）させることが可能である。例えば、容積生産高を増やすために細胞培養中の細胞密度を増やすことは有利な可能性がある。当該分野に熟練している者は、所望するならば、当該分野における常套的技術を利用し、細胞密度をますます増加させ、上記にて言及したパラメーターをますます増加させることができる。
【００５５】
Ａｐｏ−２Ｌの発現は、例えば、ここに記載された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、良く知られたサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインシトゥハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドを用いる方法も又使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性核種、蛍光剤、酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として働く。又、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、検定を実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００５６】
遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定によって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典形態的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネサンス標識等である。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、ここに記載されるようにして調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ-２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
Ａｐｏ-２リガンドは、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶解液から回収してもよい。Ａｐｏ-２リガンドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を放出させる。
【００５７】
Ａｐｏ-２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、Ａｐｏ-２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、Ａｐｏ-２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ-２リガンドを精製することが望ましい。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ-２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
好ましい実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドはアフィニティクロマトグラフィによって精製される。残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ-２リガンド変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な特性変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ-２リガンドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とＡｐｏ-２リガンドとの融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。
【００５８】
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ-２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ-２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば理解するであろう。
このような精製段階では、回収されたＡｐｏ−２Ｌを二価金属イオン含有溶液或いは一つ又は複数の二価金属イオンを含有する精製物質（例えばクロマトグラフィー媒体又は支持体）へ曝露することは望ましいことであろう。好ましい実施態様では、二価金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用される。随意的には、ＤＴＴ又はＢＭＥのような二価金属イオン及び還元剤の両方は、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用されてもよい。精製又は回収の間に二価金属イオンを使用することは、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の安定性を提供するか、或いは細胞培養段階の間に形成されるＡｐｏ−２Ｌ三量体を維持すると考えられる。
【００５９】
原核生物宿主細胞（最も好ましくは細菌宿主細胞から）から発現Ａｐｏ−２Ｌを精製及び回収する好ましい方法は、以下の（ａ）大腸菌細胞からＡｐｏ−２Ｌ（細胞内）を抽出すること；（ｂ）二価金属イオン及び／又は還元剤を含んでなるバッファー液において適切に折り畳まれたＡｐｏ−２Ｌを安定化すること；（ｃ）順次、カチオン（陽イオン）交換体、ハイドロキシアパタイト及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するクロマトグラフィーによってＡｐｏ−２Ｌを精製すること、及び（ｄ）各クロマトグラフィー支持体から、二価金属イオン及び／又は還元剤を含んでなるバッファー液へ選択的にＡｐｏ−２Ｌを溶出することを含む。このような方法に使用される二価金属イオン及び還元剤は、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸コバルト、ＤＴＴ及びＢＭＥ、そしてより好ましくは硫酸亜鉛又はＤＴＴを含む。この回収及び精製プロセスのさらなる詳細な説明は、下記の実施例８に提供されている。
上記において検討したように、本発明のこのような方法は、Ａｐｏ−２Ｌの他に、種々の他のタンパク質に対して有用かつ応用可能であり、これらタンパク質は、三量体化形態では活性が向上しているか、又は活性のためにタンパク質の三量体化が必要である。
【００６０】
また、Ａｐｏ−２リガンド及び一つ又は複数の二価金属イオンを含んでなる製剤が、本発明で提供されている。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適している（及びＡｐｏ−２Ｌ三量体の維持）。好ましい製剤は、Ａｐｏ−２Ｌ及び亜鉛又はコバルトを含む。より好ましくは、この製剤は金属がタンパク質に対して＜２Ｘモル比であるＡｐｏ−２Ｌ及び亜鉛又はコバルト溶液を含む。水溶性懸濁液が所望されるならば、製剤の二価金属イオンはタンパク質に対して＞２Ｘモル比であってもよい。硫酸亜鉛を使用し、製剤中の約１００ｍＭ濃度の硫酸亜鉛でＡｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）は沈殿し、水溶性懸濁物を形成することを出願人は見出した。＞２Ｘモル比では、製剤により高いの範囲の濃度の二価金属イオンがある可能性がり、その濃度は、金属イオンが製剤にとって有害になりうる又は治療的製剤としては望ましくないことを当該分野において熟練した者は理解する。
製剤は、既知の技術で調製することが可能である。例えば、Ａｐｏ−２Ｌ製剤はゲル濾過カラム上でのバッファー交換によって調製することが可能である。
【００６１】
典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液のようなバッファーが含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約６〜約９、さらに好ましくは約７〜約７．５である。好ましくは、亜鉛がＡｐｏ−２Ｌへ結合したままであることを確かなものにするためにｐＨは選択される。ｐＨが高すぎる又は低すぎるならば、亜鉛はＡｐｏ−２Ｌへ結合したままではなく、結果としてＡｐｏ−２Ｌの二量体が形成される傾向となる。例えばＡｐｏ−２リガンドの濃度及び投与経路よっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
【００６２】
Ａｐｏ−２Ｌの治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, A., Ed., (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメチオニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼチオニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール)；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；シュークロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００６３】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質である。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状、及び除放性製剤を含む。
【００６４】
Ａｐｏ-２リガンドの製剤としての有効な用量は経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲に含まれる。今日では、Ａｐｏ-２リガンドの有効用量又は量は、１日体重１ｋｇ当たり約１マイクログラム〜約１００ｍｇ又はそれ以上の範囲であると考えられている。用量の種内スケーリングは、この分野で周知の方法、例えばMordentiら, Pharmaceut. Res., 8 1351 (1991)に記載されているように実施することができる。当業者はＡｐｏ-２リガンドの投与しなければならない用量が、例えばＡｐｏ-２リガンドを受容する哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に施される他の薬又は治療に応じて変化することを理解するであろう。
【００６５】
インビボ投与に使用されるＡｐｏ−２Ｌは滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。Ａｐｏ−２Ｌは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、Ａｐｏ−２Ｌは典形態的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。Ａｐｏ−２Ｌの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。
治療的抗体組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えばEP 257,956参照）。
【００６６】
また、Ａｐｏ−２Ｌは、徐放性調製物の形態で投与することが可能である。徐放性調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langerら, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidmanら, Biopolymers 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン-酢酸ビニル（Langerら, 上掲）、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商品名）(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が含まれる。
ここにおいて記載されたＡｐｏ−２Ｌ及びその製剤は、種々の治療的及び非治療的応用へ用いられる。これら応用は、種々の癌（上記に提供されている）及びウイルスの状態の治療の方法である。このような治療的及び非治療的応用は、例えば、WO97/25428及びWO97/01633に記載されている。
【００６７】
ここに記載した疾患の診断又は治療に有用なＡｐｏ−２Ｌを含むキットのような製造品は、少なくとも１つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効なＡｐｏ−２Ｌ製剤を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい）。容器上又は添付されるラベルには、製剤が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【００６８】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【００６９】
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【００７０】
実施例１
Ａｐｏ−２Ｌ変異体の発現及び精製
Ａｐｏ−２Ｌのアラニン置換変異体は、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター制御によるＡｐｏ-２Ｌの９１−２８１アミノ酸形態の細胞内大腸菌発現のために設計されたプラスミド（ｐＡＰＯＫ５）（図１３を参照）のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Kunkelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)；Kunkelら, Methods in Enzymology, 154: 367-382 (1987)）によって構築された。ｐＡＰＯＫ５は、ｔｒｐプロモーターを持つプラスミドｐＳ１１６２へＡｐｏ-２ＬｃＤＮＡ（残基９１−２８１をコードする）をクローニングするためのＰＣＲの利用によって構築された。変異プラスミドによって形質転換された大腸菌株２９４は、３７℃で１００μＭ ＺｎＳＯ４が加えられたＭ９培地で対数期の中間点まで生育され、発現は２５μｇ／ｍＬのベータインドールアクリル酸の添加によって誘導され、そして培養は３０℃で一晩生育された。細胞は遠心分離及び凍結によって収集された。
細胞ペレットは６容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡでホモジナイズし、Ａｐｏ−２Ｌは、ニッケルで荷電されたキレート化 ｈｉＴＲＡＰカラム（ファルマシア）上のＩＭＡＣによって可溶性分画から単離された。Ａｐｏ−２Ｌは、固定化金属に対して弱い親和性を有し、低濃度のイミダゾールによって溶出が可能であった。最終精製物は、ＳＰ ｈｉＴＲＡＰカラム（ファルマシア）上のカチオン交換クロマトグラフィーによって得られた。精製Ａｐｏ−２Ｌ変異体の濃度は、１．４ｍｇ−１ｍｌｃｍ−１のｅ２８０を使用する吸光度測定によって測定された。
オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって同定されたＡｐｏ−２Ｌ変異体は、表１に記載されている。
【００７１】
2011088897.tif 000002
【００７２】
実施例２
Ａｐｏ−２Ｌの結晶学分析
Ａｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）の結晶は、２０℃で、５０％のｐｅｇ ２Ｋ ＭＭＥのウェル溶液を覆う４０ｕＬタンパク質（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中の２．６ｍｇ／ｍＬ）、２０ｕＬ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、及び１０ｕＬ ８％ ｐｅｇ ２Ｋ ＭＭＥを含有する７０ｕＬシッテングドロップ（sitting drop)の中で成長させ、非対称単位中の二つの単量体、及び単位格子定数ａ＝７２．５、ｃ＝１４０オングストロームで室温では３．９オングストロームへ回折する空間群Ｐ６３のメンバーであった。Ｄ２１８Ａ変異体（実施例１を参照）の結晶は、４℃で、３２％ ＭＰＤのウェル溶液を覆う４ｕＬの４％ＭＰＤ及び１０ｕＬタンパク質（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５の１．７ｍｇ／ｍｌ）を含有する１４ｕＬシッテングドロップ（sitting drop）中で成長し、非対称単位当たり１単量体で、単位格子定数ａ＝６６．４、ｃ＝１９７．７オングストロームで室温では１．３オングストロームへ回折する空間群Ｒ３２のメンバーであった。データは、Ａｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）の結晶に対して回折を３．９オングストロームに設定し、Ｄ２１８Ａ変異体の１．９オングストロームは、ＭＡＲ検出器が装備されているRigaku回転陽極X線発生装置で測定され、ＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで処理された［Otwinowskiら, Proceeding of the CCP4 Study Weekend：Data Collection and Processing(eds. Sawyerら）pp56-62 Daresbury Laboratory, Daresbury, England, 1993］Ｄ２１８Ａ変異体のための１．３オングストロームの設定データは、アルゴンヌ国立研究所のアドバンスフォトンソースにおいて測定、及びＨＫＬ２０００／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで加工されて、１００％の完成性と１２倍の冗長性、及びＩ／＜Ｉ＞＝１２．４をともなう６．４％のＲｓｙｍ（１．３５−１．３０シェルの中に３４％）を有した。
【００７３】
天然Ａｐｏ−２Ｌ構造は、プログラムＡｍｏｒｅ［Acta Cryst., D50:760-763(1994)］によるＴＮＦ−アルファ（ｐｄｂコード１ＴＮＦ）を基礎とするモデルを利用した分子置換によって解明され［Brunger, X-PLOR:version 3.1, Yale Press, New Haven 1987］、３５％のＲｆｒｅｅまで 厳密な２倍の非結晶学的リストレイン（non-crystallographic restraints)
によって精密化された。この構造は、２５％のＲｆｒｅｅ まで１．９オングストロームデータセットに対して、最後には、Ｒｅｆｍａｃ及びＳＨＥＬＸＬ ［Sheldrickら, Methods in Enzymology, pp.319-343, Academic Press, San Diego 1997］によってＲｆｒｅｅ＝２２％及び良好な幾何学（rmsd 結合０．０１１オングストローム、rsmd角度１．７°）を有する２０％Ｒｆａｃｔｏｒへ精密化された。すべての残基は、許容されるラマチャンドランプロットの領域の内側にある。精密化の間、電子密度の２８シグマピークは、三量体軸上のＣｙｓ２３０に関連する対称の間に観察された。この密度は、亜鉛イオンとしてモデル化され、Ｂ−因子の１０へ精密化された。三量体軸上の塩素分子は、亜鉛に対して四番目のリガンドとして存在する。最終モデルは、１７０の溶媒分子及び１亜鉛イオンそして１塩素イオンをともなう残基１２０−１３０、１４２−１９４、２０３−２８１から構成される。残基９１−１１９、１３１−１４１、及び１９５−２０２は秩序が乱れている。出発物質の質量分析が結晶が全長であることを示す一方で、幾つかの結晶のＮ末端配列の決定は、Ｎ末端が原形態を保っていることを確かなものにした。
結晶学的データの要約は、図２Ｃに提供されている。
【００７４】
実施例３
Ａｐｏ−２Ｌ変異体のレセプター結合親和性の決定
Ａｐｏ−２Ｌ変異体の固定化レセプターイムノアドヘシンへの結合の解離定数（Ｋｄ）（表１を参照）は、ファルマシアＢＩＡｃｏｒｅ １０００での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）から決定した。
ＤＲ５−ＩｇＧ（Ａｐｏ−２−ＩｇＧとも呼ばれている）及びＤｃＲ２−ＩｇＧレセプターイムノアドヘシンは、1998年11月19日に公開のWO98/51793及び1999年3月9日に公開のWO99/10484のそれぞれに記載されているように調製された。ＤＲ４−ＩｇＧは次のように調製された。成熟ＤＲ４ ＥＣＤ配列（アミノ酸１−２１８；Panら, 上掲）は、ｐＣＭＶ−１Ｆｌａｇベクター（Kodak）Ｆｌａｇシグナル配列の下流にクローニングし、ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のＣＨ１、ヒンジ及びＦｃ領域に融合した［Aruffoら, Cell, 61:1303-1313(1990)］。イムノアドヘシンは、ヒト２９３細胞への一過性のトランスフェクション（形質移入）によって発現させ、前掲のAshkenaziら, Proc.Natl.Acad.Sci., 88:10535-10539(1991）により記載されたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。
レセプターイムノアドヘシンは、アミンカップリングケミストリー（ファルマシアバイオセンサー）を利用して１０００−２０００共鳴単位のレベルでセンサーチップの表面へカップリングされた。１５．６ｎＭから５００ｎＭの範囲の濃度で２倍増加のＡｐｏ−２Ｌ結合のためにセンサーグラムは記録された。動力学的定数は、非線形態回帰分析によって決定され、結合定数を計算するために使用された。
結果は表１に示されている。
【００７５】
実施例４
インビトロＡｐｏ−２Ｌ変異体のアポトーシス活性
蛍光色素の代謝変換から細胞生存度を測定するバイオアッセイは、Ａｐｏ−２Ｌ変異体のアポトーシス活性を測定するために利用された。Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）又はＡｐｏ−２Ｌ変異体の連続２倍希釈物は（表１を参照）、０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で作製され、５０μｌの各希釈物は９６ウェルファルコン培養マイクロプレートの各ウェルへ移植された。５０μｌのＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ５８）（ＰＭＰＩ−１６４０、０．１％ＢＳＡの中）は、２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で添加された。これらの混合物は、３７℃で２４時間に渡ってインキュベートされた。２０時間目に、２５μＬのアラマーブルー（AccuMed, Inc., Westlake, Ohio）が添加された。細胞数は、５３０ｎｍで励起し、５９０ｎｍで相対蛍光を測定することで測定された。これらのデータは、細胞生存度の５０％減少を示すＡｐｏ−２Ｌの濃度、ＥＤ５０を計算するための４パラメーターフィットを利用することによって分析される。
【００７６】
残基Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６又はＴｙｒ２３７での一つのアラニン置換は、バイオアッセイにおいて５倍を越えるアポトーシス活性の減少を生じ、ＤＲ４、ＤＲ５及びＤｃＲ２に対する親和性の減少を示した（表１）。これらレセプターへのＡｐｏ−２Ｌ結合は、Ｇｌｎ２０５、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及びＴｙｒ２３７のアラニン置換によって最も影響を受け、これら全てにおいて、三つのレセプターすべてに対する親和性の少なくとも５倍の減少が生じた。また、低下したアポトーシス活性を有する全てのＡｐｏ−２Ｌ変異体は、ＤＲ４又はＤＲ５のどちらか（又は双方）に対する正常に機能しない結合を示し、レセプター結合は生物学的効果に必要であることを示唆した。Ａｓｐ２１８又はＡｓｐ２６９のアラニン置換は、アポトーシス活性の２倍を越える増加を生じた。殆どのアラニン置換がＤＲ４及びＤＲ５結合の双方に対して類似の効果を有し、唯一の例外はＧｌｎ１９３、Ｇｌｕ１９５、Ｓｅｒ２５９、Ｈｉｓ２６４、及びＡｓｐ２６７での変異であり、これらすべてがＤＲ４に対して５倍を越える効果（親和性の低下）があったが、ＤＲ５結合に対してはほんの僅か又は無視できるほどの効果であった。ＤｃＲ２結合の変化は、ＤＲ４結合に関して観察された効果へ匹敵する傾向があった。アポトーシス活性の消滅は、ＤＲ−５結合の低下とかなり関連していると思われ、ＤＲ５がＡｐｏ−２Ｌの投与へ応答するＳＫ−ＭＥＳの死のシグナル伝達に必要であることを示唆している。
【００７７】
実施例５
Ａｐｏ−２Ｌの金属内容物を決定するための基本的及び定量的分析
Ａｐｏ−２Ｌの基本的分析は、誘導結合発光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を使用することによって行われた。この定量では、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で製剤化されたＡｐｏ−２Ｌ（WO97/25428に開示した方法によって大腸菌で生産した１１４−２８１形態；ここにおいて記載された方法に従い、発酵又は精製の間には、さらなる量の二価金属イオンを添加しなかった）の２ｍｇ／ｍＬ溶液が使用された。この試料中及び製剤バッファーの一部分のＣｄ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ、及びＣｕのレベルが決定された。
【００７８】
2011088897.tif 000003
【００７９】
Ａｐｏ−２Ｌへ結合した金属は、Ｚｎ及びＣｏであった（表２）。計算されたモル比は、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の１モル当たり０．７９モルのＺｎ、及びＡｐｏ−２Ｌ三量体の１モル当たり０．０６モルのＣｏであった。これらのデータは、Ａｐｏ−２Ｌは三量体当たり一つのＺｎ結合部位を有することを示す。ここに記載の調製によるＡｐｏ−２Ｌでは、この部位は金属によって８５％で占有される。
【００８０】
実施例６
キレート剤を使用したＡｐｏ−２Ｌからの結合亜鉛除去の効果
Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の試料は、結合亜鉛を除去するためにキレート剤で処理された。試料は、最初に５０ｍＭ ＥＤＴＡの１０００容量の２回交換による透析、次に２ｍＭ １，１０−フェナントロリンの１０００容量の２回交換による透析、最後に金属を含まない２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５の１０００容量による透析を施された。キレート剤による前後において、試料はレセプター結合、金属内容物及びアポトーシス活性についてアッセイされた。レセプター結合は実施例３に記載のように測定され、金属内容物はＩＣＰ−ＡＥＳで決定され、そしてアポトーシス活性は実施例４に記載のようにアッセイされた。ＩＣＰ−ＡＥＳは、透析の処置が結合亜鉛を除去したことを示した。この処理の後、レセプター親和性は有意に減少し（表１）、アポトーシス活性は９０倍減少した（図４）。
【００８１】
円二色性スペクトルは、ＡＶＩＶ機器（Lakjewood, NJ）モデル２０２スペクトル旋光計に記録された。スペクトルは、５秒の平均時間で、０．５ｎｍの短縮距離（step size)、及び１ｃｍの路程を有する石英の長方形キュベットを使用して２５０ｎｍから２００ｎｍまでをスキャンされた。タンパク質濃度は２μＭで、ＰＢＳを含有する溶液であった。図６に示されているように、Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）は、高いベータシート内容物を有するタンパク質の典形態的なスペクトルを示した。結合亜鉛の除去は、ベータシート内容物が消滅したことを示唆する二色性ピークの強度の減少を生じる。
【００８２】
円二色性は、Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の熱安定性に対する亜鉛除去の影響をモニターするために利用された。また、これらの実験は、１ｃｍの石英の長方形キュベット及び２μＭ濃度のタンパク質を用いる。２２５ｎｍでの円二色性は、試料が３０から１００℃まで熱せられている間モニターされた。測定は、試料を１分、その温度で平衡化するようにした後に、２℃増分区切りで行われた。楕円率（ＣＤ）及びダイノード電圧の双方は記録され、ダイノード電圧の温度依存性が図７にプロットさている。ダイノード電圧は、試料の吸光度に比例する。試料の加熱によるダイノード電圧の増加は、タンパク質凝集を反映する。ダイノード電圧の増加は、２２５ｎｍにおける楕円率（ＣＤ）の減少によって示されているように、二次構造の損失を伴う。これらのデータは、Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）が、７５℃で起こるこの転移（Ｔｍ）の中間点での熱変性によって凝集することを示唆している。結合亜鉛の除去は、約５４℃での熱変性のＴｍの大きな減少を生じる。これらのデータは、結合亜鉛がホモ三量体Ａｐｏ−２Ｌの構造及び安定性の維持にとって必要であることを示す。
【００８３】
実施例７
変異によるＡｐｏ−２Ｌからの亜鉛結合部位の除去の影響
実施例１に記載のように、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を利用してＡｐｏ−２Ｌ（９１−２８１形態）のＣｙｓ２３０はＡｌａ又はＳｅｒで置換された。次に、変異タンパク質は、実施例１に記載のように発現及び精製された。表１に示されているように、Ａｐｏ−２Ｌ（９１−２８１形態）のＣ２３０及びＣ２３０Ｓ変異の両方がレセプター結合親和性を減じ、アポトーシス活性をかなり失っていた。Ａｐｏ−２ＬのＸ線構造は、Ｃｙｓ２３０が埋もれた残基であることを示し、それによってレセプターを複合体へ直接に接触させているようには思われないことから、これらのデータは、Ｃｙｓ２３０の変異が、ホモ三量体Ａｐｏ−２Ｌの構造又は安定性の変化によって間接的に活性へ影響することを示唆している。
【００８４】
実施例８
Ｚｎの添加が、可溶性Ａｐｏ−２Ｌリガンド産物の蓄積及び回収を改良する
Ａ．アルカリホスファターゼプロモーターによって制御されるＡｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）発現
ｐＡＰＡｐｏ２−Ｐ２ＲＵ（図１２参照）は、ｐｒｏ２及びａｒｇＵによってコードされているｔＲＮＡ'ｓ及びＡｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１形態）の同時発現をコードする。ｐＢＲ３２２を基礎とするプラスミド[Sutcliffe,  Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90(1978)]ｐＡＰＡｐｏ２−Ｐ２ＲＵは、大腸菌でＡｐｏ−２Ｌを生産するために使用された。Ａｐｏ−２Ｌの発現に必要な転写及び翻訳配列は、プラスミドｐｈＧＨ１［Changら, Gene,55:189-196(1987)］のために記載のように、アルカリホスファターゼプロモーター及びｔｒｐシャイン・ダルガーノによって提供されている。Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）のコード化配列は、シャイン・ダルガーノ配列及びプロモーターの下流に位置し、開始メチオニンがそれに先行して位置する。コード化配列は、潜在的な二次構造を除くために残基Ｐｒｏ１１９をコードするコドンが「ＣＣＴ」に代わり「ＣＣＧ」となったことを除くと、Ａｐｏ−２Ｌの残基１１４−２８１（図１）をコードするヌクレオチドを含む。ラムダから転写ターミネーターまでをコードする配列［Scholtissekら, Grosse Nucleic Acdis Research 15:3185 (1987)］は、Ａｐｏ−２Ｌコード化配列の後に続く。さらには、このプラスミドは、ａｒｇＵ／ｄｎａＹ［Garciaら, Cell, 45:453-459(1986)］及びｔＲＮＡ'ｓ ｐｒｏ２［Komineら, J. Mol. Biol., 212:579-598(1990)］の発現のための配列をも含む。これらの遺伝子は、ＰＣＲによって大腸菌ｗ３１１０からクローンされ、ラムダから転写ターミネーター配列の下流に置かれた。このプラスミドは、テトラサイクリン及びアンピシリン耐性の両方を生産宿主へ付与する。
【００８５】
４３Ｅ７株（大腸菌Ｗ３１１０ fhu(tonA) phoAΔ(argF-lac) ptr3 degP kanS ompT ilvG＋）は、ｔＲＮＡ'ｓ及びＡｐｏ−２の同時発現のための生産宿主として利用された。４３Ｅ７株のコンピテント細胞は調製され、標準的は方法を利用してｐＡＰＡｐｏ２−Ｐ２ＲＵへ形質転換された。形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（LB+Tet20）を含有するＬＢプレートから精選して筋状に塗りつけるように精製し、ＤＭＳＯで−８０℃で貯蔵する前に３０℃の振盪／インキュベーター中の２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培溶液で生育した。
振盪フラスコの種菌を、新鮮な解凍した貯蔵培養バイアルを用いて無菌培地に播種することにより振盪フラスコ種菌を調製した。適当な抗生物質を培地に含有せしめて選択圧を提供し、プラスミドの保持を確実にした。振盪フラスコ媒体組成を表３に示されている。振盪フラスコを約３０℃（２８℃−３２℃）で振盪しながら１４−１８時間印キュベートした。次いでこの培地を製造発酵容器の播種に使用した。播種容量は培地の初期容量の０．１％から１０％とした。
【００８６】
2011088897.tif 000004
【００８７】
Ａｐｏ−２Ｌの生産を表４に示した生産培地で実施した。発酵プロセスは、約３０℃（２８−３２℃）及びｐＨ７．０（６．５−７．５）で実施した。通気速度及び攪拌速度は、培地への十分な酸素輸送を与えるように設定した。リン酸塩の枯渇によって誘発される生産物発現の開始持に、プロセス温度を３０℃から２５℃へシフトした。発酵プロセスを通して、細胞培養へは、好気的条件を確かなものする一方で、コンピューターアルゴリズムに基づいて、培養の要求炭素を満たすようにグルコースが供給された。
【００８８】
発酵プロセスの間に、ＺｎＳＯ４の二回分の添加が行われた。一回分の添加は、生産物発現の誘発の直前に行われた。二回分の添加は、生産期のほぼ中間点で行われた。この実施例では、添加は、培養光学密度が約８０−１２０ＯＤ５５０の時、及び播種から約２８時間後に行った。各回分の金属イオンの添加によってほぼ５０−１００マイクロモル（最終濃度）に達するように、十分な量の１００ｍＭ ＺｎＳＯ４を添加した。
発酵は約３４−３５時間に渡って続くようにし、その後に続く生産物回収評価のために培養液から細胞ペレットが収集された。
【００８９】
2011088897.tif 000005
【００９０】
培養液は、発酵プロセスの経時変化を通して採取された。２０ＯＤ５５０の細胞密度に希釈された１ｍｌの培養液試料の細胞は、遠心分離によって収集され、生じた細胞ペレットは透析までは−２０℃で貯蔵された。細胞ペレットを、解凍し、０．５ｍｌの抽出バッファー(５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２ｍｇ／ｍｌ 鶏卵白リゾチーム)に再懸濁し、細胞質から生産物を遊離するために機械的に破壊した。三量体の定量のために除濁可溶化液をDionex ProPac IEX HPLC カラムへ負荷する前に、固体物は遠心分離によって細胞可溶化物から取り除かれた。０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で２５分間に渡る２５ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）バッファー中の５％−２２％１Ｍ ＮａＣｌグラジエントを用いることで、ＨＰＬＣアッセイ法によって生産物から汚染大腸菌タンパク質を分離した。
【００９１】
凍結細胞ペーストを、解凍し、抽出バッファー（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ バッファー、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞質分画からＡｐｏ−２Ｌ生産物を遊離するための機械的ホモジナイザーへ細胞懸濁物を複数回通した後、０．２％ＰＥＩ（最終濃度）を添加され、固体物を遠心分離によって取り除いた。除濁可溶化液を、３−４カラム容量の５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ／１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．２で前もって平衡化したＭＰＨＳカラム（Bio Rad）へ負荷する前に、Ｈ２Ｏによって１：１（Ｖ／Ｖ）に希釈し、ｐＨ７．２へ調製した。２−３カラム容量の平衡化バッファーでの洗浄段階と、これに続く平衡化バッファー中の０．１Ｍ ＮａＣｌグラジエントによる二回目の洗浄段階の後、Ａｐｏ−２Ｌタンパク質を、平衡化バッファー中の０．１Ｍから０．８Ｍ ＮａＣｌグラジエントの６カラム容量によってＭＰＨＳカラムから溶出した。カラム溶出分画を収集し、分析し、適切な分画をプールして＠４−８℃で貯蔵した。
【００９２】
発酵中のＡＰＯ−２Ｌ蓄積の分析は、ＺｎＳＯ４の添加は細胞成長へ有意に影響しなかったことを示した。Ａｐｏ−２Ｌリガンドの生産は、培地中のリン酸塩が枯渇した時に始まり、典形態的には播種の約１５−２５時間後に始まった。図８は、ＩＥＸ ＨＰＬＣ法によって検出された可溶性Ａｐｏ−２Ｌ三量体の蓄積の経時変化を示している。ＺｎＳＯ４の添加を伴う培養は、マイナスＺｎＳＯ４コントロールよりも細胞可溶化物試料中に高い生産物濃度を有した。
初期捕捉段階（ＩＥＸ クロマトグラフィーが関与）での生産物回収の分析（図９）は、ＺｎＳＯ４添加した及び添加せずに行った発酵からの細胞可溶化物のＭＰＨＳクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す。初期貫流（flow-through）及び洗浄段階の後、二つの主要ピークであるピークＡ及びピークＢが分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、両ピークは主にＡｐｏ−２Ｌで構成されていた。
【００９３】
両ピークからの精製物を調製し、生物学的な活性及び安定性を分析した。これらの研究から得られた結果は、ピークＢが時間の経過とともに凝集する傾向がより高いのに対して、ピークＡはＡｐｏ−２Ｌ産物のより安定なプールであることを示唆した。不安定性を最小化するために、ピークＢをさらなる回収から排除した。ピークＡのピークＢに対する比率は、各ピーク下の統合区域を表す切り出し跡を比較検討することによって見積もられた。表５に表として示された結果は、回収可能なプールのＡｐｏ−２Ｌ産物の量の有意な増加である、Ａｐｏ−２Ｌの割合のシフトとしてマイナスＺｎＳＯ４の場合の平均である約４５％からプラスＺｎＳＯ４の場合の約８０％へのシフトを示している。
【００９４】
2011088897.tif 000006
【００９５】
Ｂ．ｔｒｐプロモーターによって制御されているＡｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）の発現
ＰＳ１３４６．Ａｐｏ２Ｌ．０ プラスミド構築物：Ａｐｏ−２Ｌの１１４−２８１残基をコードするＤＮＡ（開始メチオニンコドンが先にある）を、ｐＳ１３４６プラスミドベクターへ挿入した。ｐＳ１３４６プラスミドは、ｐＨＧＨ２０７−１［DeBoerら, Promoters:Structure and Function, Praeger, New York, pp.462-481(1982)］の誘導体であり、Ａｐｏ−２Ｌコード化配列のラムダから転写ターミネーターまでをコードする配列［Scholtissekら,  Nucleic Acdis Res., 15:3185 (1987)］の下流を含む。
５４Ｃ２株（大腸菌Ｗ３１１０ fhuA(tonA) lon galE rpHts(htpRts) clp laclq）を、リガンドの発現がｔｒｐプロモーターで制御されている、Ａｐｏ−２リガンド（アミノ酸残基１１４−２８１）の発現の生産宿主に用いた。５４Ｃ２細胞のコンピテント細胞を調製し、標準的手法を利用してｐＳ１３４６．Ａｐｏ２Ｌ．０へ形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（LB+Tet20）を含有するＬＢプレートから精選して筋状に塗りつけるようにして精製し、ＤＭＳＯで−８０℃で貯蔵する前に３０℃の振盪／インキュベーターに中の２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培溶液で生育した。
【００９６】
生産生物体、５４Ｃ２／ｐＳ１３４６．Ａｐｏ２Ｌ．０で行われた実験は、培地組成物（表６）の僅かな調製、インデューサーであるインドール３−アクリル酸（ＩＡＡ）の添加、及びプロセスの長さを除いて、ＡＰプロモーター発現のために上記に示したような類似の発酵パラメーターにの下で行われた。初期成長期の間にプロモーター活性を抑制するために、トリプトファンを初期培地へ添加した。培養液の細胞密度が約３０ＯＤ５５０に達した時に、３０℃から２５℃への温度シフトを行った。培養液の細胞密度が約５５ＯＤ５５０に達した時に、インデューサーを添加した。ＺｎＳＯ４添加が行われた実験では、約５０−１００μＭの最終濃度に達するように、１００ｍＭ ＺｎＳＯ４溶液の十分量を細胞密度が約２５ＯＤ５５０の時及び播種から２４時間後に添加した。細胞ペーストを、インデューサー添加から６時間後に収集し、−２０℃から−８０℃で貯蔵した。
【００９７】
2011088897.tif 000007
【００９８】
ｔｒｐプロモーター系の細胞成長は、４０−６０ＯＤ５５０に達した後に低速した。ＩＡＡ添加による誘導の前にＡｐｏ−２リガンドの有意な漏出性発現があり、これは恐らく生育の問題が原因であった。細胞プロフィールは、ＺｎＳＯ４添加がない場合とある場合において同等であった。図１０は、ＩＥＸ ＨＰＬＣ法で検出された可溶性Ａｐｏ−２Ｌ三量体の蓄積の経時変化を示している。可溶性Ａｐｏ−２Ｌの蓄積は、ＺｎＳＯ４溶液とともに増加し続け、細胞可溶性試料においてより高い生産物濃度に達した。
【００９９】
Ｃ．二価金属イオン／ＤＴＴを利用した大腸菌からのＡｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２１８）の回収及び精製
以下のプロトコールは、大腸菌からのＡｐｏ−２Ｌの回収及び精製に利用してもよい。最初に、細胞はホモジジナイズされ、抽出は以下のようにして行われた。凍結収集された大腸菌を、６容量の抽出バッファー（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５ｍＭ ＤＴＴ（又は ＤＴＴに代わって５ｍＭ硫酸亜鉛）ｐＨ８．０）に懸濁する、又は全ての細胞培養液を５ｍＭ ＤＴＴ（又は ＤＴＴに代わって５ｍＭ硫酸亜鉛）＠ｐＨ８．０で調製する。懸濁物を、２−８℃で１時間に渡って徹底的に混合し、次にホモジナイザー（Gaulin Corporation, Everett, MA）によってホモジナイズする。破壊された細胞懸濁物を０．２％ ＰＥＩで１−２時間に渡って凝結させ、ＢＴＰＸ２０５（Alfa Laval Separation AB, スウェーデン）連続供給遠心分離（continuous feed centrifuge）によって遠心分離し、深濾過（depth filtration）によって除濁した。
【０１００】
抽出後、Ａｐｏ−２Ｌを以下のようにして精製した。除濁細胞懸濁液（抽出物）を等量のＨ２Ｏ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００で調製してｐＨ７．２とし、Macro-Prep ceramic High S(MP-HS)クロマトグラフィーを行った。この調製された抽出物を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−１００／１ｍＭ ＤＴＴ（又は１００ｕＭ 硫酸亜鉛）、ｐＨ７．２で平衡化したＭＰ−ＨＳカチオン交換体（Bio-Rad, Hercules,CA）に負荷する。（先の２段階は、ＳＰ−Sepharose Fast Flow（Amersham Pharmacia, スウェーデン）を代わりに用いてもよい）。非結合タンパク質は、貫流され、ベースライン＠Ａ２８０まで平衡化バッファーで洗浄することで除かれる。カラムを３容量の０．１Ｍ ＮａＣｌ／平衡化バッファーで洗浄する。Ａｐｏ−２Ｌを、８容量の平衡化バッファーに含まれる塩化ナトリウムの０．１から０．８Ｍの直線的なグラジエントで溶出する。分画を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＳＥＣ−ＨＰＬＣで適切に折り畳まれたＡｐｏ−２Ｌを含んでいると認められた分画をプールする。
ＭＰ−ＨＳカラムからのＡｐｏ−２Ｌのプールを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＤＴＴ（又は１００ｕＭ 硫酸亜鉛）、ｐＨ７．２で平衡化したMacro-Prepヒドロキシアパタイト（Bio-Rad, Hercules,CA）に負荷する。（Macro-Prepヒドロキシアパタイトに代わって、ＳＰ−Sepharose Fast Flowを用いてもよい。）試料を負荷した後、カラムをベースライン＠Ａ２８０まで平衡化バッファーで洗浄する。Ａｐｏ−２Ｌを、平衡化バッファー中の０．１５Ｍリン酸ナトリウムのイソクラティク処置を利用してカラムから溶出する。
【０１０１】
ＭＰ−ＨＡのプールを、等容量の１．０Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＤＴＴ（又は１００ｕＭ 硫酸亜鉛），ｐＨ７．５によって調製し、次に０．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＤＴＴ（又は１００ｕＭ 硫酸亜鉛），ｐＨ７．５で平衡化したフェニル-セファロースＦＦ（Amersham Pharmacia, スウェーデン)に負荷する。（０．５Ｍ 硫酸アンモニウムに代わって、０．６Ｍ 硫酸ナトリウムを用いてもよい）。カラムを平衡化バッファーで洗浄し、Ａｐｏ−２Ｌをカラム溶出物に収集する。
次にＡｐｏ−２Ｌを、限外濾過及びＧ−２５ゲル濾過（Amersham Pharmacia, スウェーデン）クロマトグラフィーによって製剤化する。フェニル-セファロースのプールを、ＴＦＦ限外濾過（Millipore, Bedford, MA）で濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／８％ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ，ｐＨ７．５でＧ−２５ゲル濾過によって製剤化する。（あるいは、ダイアフィルトレーションによって製剤化してもよい）。Ａｐｏ−２Ｌの最終純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びアミノ酸配列分析によって決定することが可能である。
【０１０２】
実施例９
塩化コバルトの添加が、可溶性Ａｐｏ−２Ｌリガンド生産物の蓄積及び回収を向上させる
アルカリホスファターゼプロモーターによって制御されるＡｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）の発現
実施例８Ａに記載の同じ生産生物体、培地、組成物、発酵条件及び試料分析は、Ｚｎ以外の金属イオンの添加、すなわち塩化コバルトのＡｐｏ−２Ｌ（アミノ酸残基１１４−２８１）産物の蓄積に対する影響の研究に利用された。Ｈ２Ｏに含まれる１００ｍＭ ＣｏＣｌ２溶液を１００ｍＭ ＺｎＳＯ４に代わって使用し、各２回の添加において５０−１００μＭの最終濃度に到達するように十分量を添加した。
図１１は、発酵プロセスの間の可溶性Ａｐｏ−２Ｌの蓄積に対するＣｏＣｌ２添加の利点を示している。ＺｎＳＯ４添加実験のように、有意ではないが、可溶性Ａｐｏ−２Ｌの高い蓄積速度がＩＥＸ ＨＰＬＣアッセイ法によって検出された。このデータは、ある金属イオンの添加が、Ａｐｏ−２Ｌの会合三量体を安定させる添加の効力と同様に、一般的には可溶性Ａｐｏ−２Ｌの蓄積を向上させることを示す。
【０１０３】
実施例１０
Ａｐｏ−２Ｌ製剤化に対する種々の金属イオンの影響
５０μｌ Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）を、５℃で２４時間に渡って２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８％トレハロース、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５製剤に含まれる５ｍＭの金属塩（下記の表７にそれぞれが列挙されている；金属のタンパク質に対する比率は１００：１）とインキュベートすることでインビトロアッセイを行った。次に、実施例４に記載のＳＫ−ＭＥＳアッセイを利用して、試料をアポトーシス活性に関して評価した。
ＥＣ５０（又は細胞の５０％を殺すことになるＡｐｏ−２Ｌ濃度）が表７（ｎｇ／ｍｌの単位）に示されている。表７に示されているように、培養への酢酸亜鉛及び硫酸亜鉛の添加は、Ａｐｏ−２Ｌ活性を増大させた。
【０１０４】
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【０１０５】
実施例１１
Ａｐｏ−２Ｌリガンド製剤安定性に対する亜鉛金属イオンの影響
実施例８Ｂに示されているように、ＭＰＨＳカチオン交換体を使用する最初の段階は二つのピークＡ及びＢを示す。この二つのピークの貯蔵安定性を検討するために、Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）を大腸菌発現産物（ｐＳ１３４６．ＡｐｏＬ．０プラスミドをｔｒｐプロモーターとともに使用）から抽出し、ＭＰＨＳカチオン交換体によって精製した。ＭＰＨＳピークＡを、さらにＭＰ−ヒドロキシアパタイト及びフェニル-セファロースＦＦによって精製し、次にＧ−２５ゲル濾過を使用して製剤化した。ＭＰＨＳピークＢを、ＭＰ−ヒドロキシアパタイト、フェニル-セファロースＦＦ、及びＮｉ-ＮＴＡスーパーフローによって精製し、Ｇ−２５ゲルによって２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８％トレハロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５へ製剤化した。試料を、無菌で３ｃｃのガラスバイアルに注入し、テフロンで覆われた灰色ブチルストッパーで密封した。精製され、製剤化されたピークＡ及びＢの貯蔵安定性を、表８に列挙されている時間（週（「ｗｋ」又は月（「ｍｏ」）及び温度（℃）で評価した。
【０１０６】
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【０１０７】
表８は、他のものの中での、パーセント単量体（％Ｍ）及びパーセント二量体（％Ｄ）を示している；「ＮＤ」は確定していない値に相当する。ピークＡは、ゼロ日におけるピークＢよりも僅かに少ない二量体及び他の不純物を含む。表８に示されているように、ピークＢは、３０℃でのかなりの沈殿で評価されたように（２ヶ月の時点で、ほぼさらに４０％）より熱に弱いことが見出された。５℃でも、ピークＢは、ピークＡより２倍もさらに二量体形成しやすい。ピークＡ及びピークＢの生化学的分析は、各ピークの物質は、それぞれの安定性に関する特性を除いて生化学的に同等であると示した。ピークＢのより低い安定性は、不適切な（三量体）会合又は低い亜鉛含量（ピークＡのタンパク質に対しては０．８３モル比の亜鉛、そしてピークＢのタンパク質に対しては０．７モル比の亜鉛）に関連していると考えられている。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ヒトＡｐｏ−２リガンドｃＤＮＡ（配列番号：２）のヌクレオチド配列、及びその誘導アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。ヌクレオチド位置４４７（配列番号：２の中の）の「Ｎ」は、「Ｔ」又は「Ｇ」をであろうヌクレオチド塩基を示すために使用されている。
【図２】Ａｐｏ−２Ｌの結晶構造を提供する。図２Ａは、３回転軸（３回対称軸）に沿った三量体の概略を示す。各単量体は同一である。秩序だったタンパク質構造は残基１２０から始まり、残基１３１−１４１は秩序だっておらず、残基１９５−２０１も同じである（破線で印されている）。溶媒リガンド及び三つの対称性が関連したシステインを含む亜鉛結合部位は、空間充填図として示されている。図２Ｂは、亜鉛結合部位の斜視立体密集図を提供する；Ｓγ−亜鉛−Ｓγ間の角度は１１２℃で、Ｓγ−亜鉛−溶媒角度は１０７℃で２．３オングストロームの亜鉛−硫黄及び２．３オングストロームの亜鉛−溶媒結合距離を有する。図２（及び５）は、プログラムMolscript［Kraulisら, J. Appl. Cryst., 24:946-950(1991)］及びRaster3D［Merritら, Acta Cryst., D50:869-873(1994)］によって作製された。図２Ｃは、実施例２に記載した実験の結晶データの要約である。
【図３】選択されたＴＮＦファミリーメンバーの配列アライメントを示す：ＴＮＦ−ベータ（配列番号：３）；ＴＮＦ−アルファ（配列番号：４）；ＣＤ４０Ｌ（配列番号：５）；ＦａｓＬ（配列番号：６）；ＲＡＮＫＬ（配列番号：７）。配列の上の矢は、Ａｐｏ２Ｌのベータ−ストランドを示す。整列化された配列の上に付けられている番号は、図１（配列番号：１）に提供されているＡｐｏ２Ｌ配列に付けられた番号と一致する（配列番号：１）。
【図４】亜鉛結合部位の機能的重要性を示すバイオアッセイデータを提供する。ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞生存度を、亜鉛を除くためにキレート剤で処理したＡｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）又は種々の濃度のＡｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）との一晩に渡るインキュベート後の代謝活性の蛍光アッセイによって決定した。
【図５】変異体解析を地図化したＡｐｏ−２Ｌの空間充填モデルを示す。三量体は図２のように方向付けられている。アラニンへ変異した際に５倍を越える生物活性の減少があった残基は標識され、そして暗く陰がつけられている。変異された他の残基は、中間の暗さで陰がつけられており、これら残基のうちの少数が標識されている。
【図６】結合亜鉛を除去するための処理の前後のＡｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の円二色性スペクトルを示す。
【図７】２２５ｎｍでの円二色性によってモニターされた亜鉛除去の前後のＡｐｏ−２Ｌの熱変性を示す。Ａｐｏ−２Ｌの２マイクロモル溶液のためのダイノード電圧が報告されている。
【図８】ＺｎＳＯ４添加のＡＰプロモーターを使用した大腸菌発現系における可溶性Ａｐｏ−２Ｌ産物蓄積に対する影響を示す（経時変化）。
【図９】ＺｎＳＯ４が存在する又は存在しない中で実施された大腸菌発現系（実施例８を参照のこと）の細胞可溶化物のＭＰＨＳクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す。
【図１０】ＺｎＳＯ４添加のｔｒｐプロモーターを使用した大腸菌発現系における可溶性Ａｐｏ−２Ｌ産物蓄積（ｇｍ／Ｌ）に対する影響を示す（経時変化）。
【図１１】ＣｏＣｌ２添加のＡＰプロモーターを使用した大腸菌発現系における可溶性Ａｐｏ−２Ｌ産物蓄積（ｇｍ／Ｌ）に対する影響を示す（経時変化）。
【図１２】ｐＡＰＡｐｏ２−Ｐ２ＲＵプラスミド構築物を示す。
【図１３】ｐＡＰＯＫ５プラスミド構築物を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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