(57)【要約】      （修正有）【課題】組換えＭＶＡウィルスの生産に使用できるＭＶＡ変異体、変異ＭＶＡウィルスで感染させた宿主細胞を提供する。【解決手段】ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列、そのプロモーター配列またはその機能性部分が、変異、欠失またはその両方によってＭＶＡゲノムにおいて不活性化されている新規ＭＶＡ変異体、前記変異ＭＶＡウィルスで感染させた宿主細胞。さらにＤＮＡ−ベクター構築物、変異ＭＶＡウィルスおよびＤＮＡ-ベクター構築物の使用による組換えＭＶＡの生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＶＡ変異体であって、ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列およびそのプロモータ
ー配列、または、前記これらの配列の機能性部分が、不活性であり、好ましくは欠失また
は変異により不活性である、ＭＶＡ変異体。
【請求項２】
宿主細胞であって、請求項１記載のＭＶＡで感染された宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が、真核細胞である、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項４】
請求項３記載の真核細胞であって、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞
、ＢＨＫ-２１細胞、ＢＳ-Ｃ-１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＶ-１細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ
-５細胞、Ｂ-細胞またはヒト一次細胞(例えば、一次線維芽細胞、樹状細胞)である細胞。
【請求項５】
ＤＮＡベクター構築物であって、ワクシニアウィルス(ＶＶ)Ｋ１Ｌ遺伝子をコードする
配列、または、機能的に同等な遺伝子をコードする配列を含むＤＮＡベクター構築物。
【請求項６】
さらに外来タンパク質またはその機能性部分をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項５
記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項７】
外来タンパク質が、治療ポリペプチドおよび病原性物質ならびにそれらの機能性部分か
らなる群由来の異種タンパク質である、請求項６記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項８】
治療ペプチドが、例えば、抗体のポリペプチド、ケモカイン、サイトカインまたはイン
ターフェロンのような分泌タンパク質からなる群由来のペプチドである、請求項７記載の
ＤＮＡベクター構築物。
【請求項９】
病原性物質が、腫瘍細胞、腫瘍細胞関連抗原ならびにこれらの機能性部分、および、ウ
ィルス、細菌、原虫および寄生虫からなる群由来である請求項８記載のＤＮＡベクター構
築物。
【請求項１０】
ウィルスが、インフルエンザウィルス、はしか（measles）ならびに呼吸シンシチウム
（respiratory syncytial）ウィルス、デング熱ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ヒト
肝炎ウィルス、ヘルペスウィルスおよびパピローマウィルスからなる群から選択される、
請求項８記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１１】
原虫がPlasmodium falciparumである、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１２】
細菌が、結核の原因であるMycobacteriaである、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物
。
【請求項１３】
腫瘍関連抗原、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク１ならびに２のよう
なメラノーマ関連分化抗原、ＭＡＧＥ−１、−２、−３ならびにＢＡＧＥのような腫瘍精
巣抗原、および、Ｈｅｒ-２／ｎｅｕ、ＭＵＣ-１ならびにｐ５３のような、ガンにおいて
過剰発現する非変異共用（non-mutated shared）抗原からなる群から選択される、請求項
９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１４】
ＶＶ Ｋ１Ｌおよび外来タンパク質コード領域が、それぞれ、ＭＶＡゲノム内の非必須
部位をフランキングするＤＮＡ配列によってフランキングされている、請求項６〜１３の
いずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１５】
非必須部位が、ＭＶＡゲノムにおける欠失III部位、ＭＶＡゲノム内でＫ１Ｌを遺伝子
工学で欠失させた部位、または、請求項１記載の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位である
、請求項１４記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１６】
ベクターが、
・  ＶＶのＫ１Ｌコード配列を含むＫ１Ｌマーカー遺伝子および転写ユニット、好ましく
は、その真正プロモーターの転写制御配列を含む、
・  相同組換えによって組換えＭＶＡから前記マーカーを後に除去するための、Ｋ１Ｌマ
ーカー遺伝子をフランキングする２つのＤＮＡ配列、好ましくは、２つの同一挿入ＤＮＡ
断片（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ由来）、
・  クローニングサイト、好ましくは、任意に異種遺伝子が挿入されるマルチプルクロー
ニングサイト、
・  ワクシニアウィルスに特異的な転写のためのプロモーター、好ましくはワクシニアウ
ィルス誘導プロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポ
ックスウィルスプロモーター、または、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能とする
合成プロモーター、
という機能性関連組成（functionally linked components）を含み、
前記組成が、請求項１記載の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位、ＭＶＡゲノム内の欠失
III部位、または、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位への、外来遺
伝子の標的挿入に必須である２つのＭＶＡ-ＤＮＡ配列によりフランキングされている、
請求項５〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１７】
構築物がプラスミドである、請求項５〜１６のいずれか一項に記載のDNAベクター構築
物。
【請求項１８】
組換えＭＶＡの生産方法であって、
請求項１記載のＭＶＡ変異体または野生型ＭＶＡにより、ＭＶＡ宿主細胞を感染させる
工程、
請求項５〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物で、前記宿主細胞をトラ
ンスフェクトする工程、および、
ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、または、ＭＶＡもしくは請求項１記載の変異ＭＶＡの増殖
生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復し
たＭＶＡを選択する工程を含む組換えＭＶＡの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＭＶＡウィルスの生産に使用できるＭＶＡ変異体に関し、同様に、こ
れらの変異ＭＶＡウィルスで感染させた宿主細胞に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡベ
クター構築物、前記変異ＭＶＡウィルスおよびＤＮＡ-ベクター構築物の使用によって組
換えＭＶＡを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクシニアウィルス（ＶＶ）は、ポックスウィルスファミリーのオルソポックスウィル
ス属に属している。ワクチニアウィルスのある株は、長い間、天然痘に対する免疫のため
の生菌ワクチンとして使用されており、例えば、Lister Institute （英国）のElstree株
があげられる。ワクチン接種に由来する合併症のため(Schar, Zeitschr. fur Praventivm
edizin 18, 4144 [1973])、天然痘は根絶されたというＷＨＯによる１９８０年の宣言以
来、今日ではハイリスクの人々にのみ天然痘に対する予防接種がなされている。
【０００３】
ワクシニアウィルスは、外来抗原の生産やデリバリーのためのベクターとして使用され
ている (Smith et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383407 [1
984])。これは、ワクシニアウィルスのゲノムに、ＤＮＡ組換え技術によって導入された
外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）を内含する。ウィルスのライフサイクルに必
須ではないウィルスＤＮＡ内の部位で前記遺伝子が結合されている場合、新たに生産され
た組換えワクシニアウィルスは、感染、すなわち外来細胞に感染でき、このため結合した
ＤＮＡ配列を発現することも可能となる(EP Patent Applications No. 83,286 およびNo.
110,385)。このようにして調製された組換えワクシニアウィルスは、一方では感染予防
のための生菌ワクチンとして使用でき、他方、真核細胞における異種タンパク質の調製の
ための生菌ワクチンとして使用できる。
【０００４】
ワクシニアウィルスは、中でも最も広範囲にわたって評価されている生菌ベクターであ
り、組換えワクチンとしての使用をサポートする特有の特徴を有している。すなわち、極
めて安定、安価に製造でき、処理が容易であり、多数の外来ＤＮＡに適用できるという点
である。また、抗体応答と細胞毒応答の両方を誘発するという利点を有し、より自然な方
法において免疫システムへの抗原の提示を可能とし、また、広い様々な種類の動物モデル
における感染疾患を防御するベクターワクチンとしての使用も成功している。加えて、ワ
クシニアベクターは、組換えタンパク質の構造−機能の相関性を分析し、体液性および細
胞媒介免疫応答のターゲットを決定し、また、特定の疾患の防御に必要な免疫防御のタイ
プを調べるための、極めて価値のあるリサーチツールである。
【０００５】
しかしながら、ワクシニアウィルスは、ヒトへの感染性を示し、試験室において発現ベ
クターとして使用することは、安全性の問題や規制に影響する。さらに、例えば、ヒトに
対する新規治療や予防への取組みのために、組換えタンパク質または組換えウィルス粒子
を生産するというような、組換えワクシニアウィルスの将来的な適用可能性は、組換えワ
クシニアベクターの増殖複製により妨げられる。文献に記載された組換えワクシニアウィ
ルスの多くは、ワクシニアウィルスの Western Reserve（ＷＲ）株に基づいている。他方
、この株は、高神経毒性であり、ヒトや動物での使用にあまり適していないことが知られ
ている (Morita et al., Vaccine 5, 6570 [1987])。
【０００６】
ＶＶ標準株の安全性の問題は、in vitroでの制限された複製能力やin vivoでの無毒性
を特徴とする非常に弱毒化されたウィルス株からのワクシニアベクターの開発により対処
されている。望ましくない副作用を避けるために特別に培養されたウィルス株が長年知ら
れている。そして、トリ線維芽細胞におけるワクシニアウィルス（ＣＶＡ）Ａｎｋａｒａ
株の長期連続的な継代により、改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の
培養が可能となっている（Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H. (1975) In
fection 3, 6-14; Swiss Patent No. 568 392）。ＭＶＡウィルスは、ブタペスト条約の
要求を遵守して、ＣＮＣＭ（Institut Pasteur, Collectione Nationale de Cultures de
Microorganisms, 25, rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に、１９８７年１
２月５日、寄託番号Ｉ−７２１で寄託された。
【０００７】
ＭＶＡウィルスは、ゲノムにおける変化を決定するために、野生株ＣＶＡ株と比較して
分析されている。６個の主な欠失（欠失Ｉ、II、III、IV、ＶおよびVI）が同定されてい
る(Meyer, H., Sutter, G. and Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 10311038)。この改
変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａは、ワクチン接種に使用した際、結果として副
作用を起こさないという極めて低い毒性を示す。このため、免疫無防備状態の患者の初回
接種に特に適している。ＭＶＡ株の優れた特性は、多くの臨床試験において証明されてい
る(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375390 [1987], Stickl et al.
, Dtsch. med. Wschr. 99, 23862392 [1974])。
【０００８】
改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、組換え遺伝子の発現のため
に安全なウィルスベクターとして有用なツールであり、タンパク質機能のin vitro研究ま
たは抗原特異性細胞応答もしくは体液性免疫応答のin vivo誘導のような異なる目的にも
使用できる。ＭＶＡの主な利点は、ヒトや多くの哺乳類細胞における複製欠陥にかかわら
ず、高レベルの遺伝子発現が可能であることである。優れた安全性の実績を有するワクチ
ンであるＭＶＡは、生物学的安全性レベル１での取扱いが可能であり、動物に異種抗原を
導入した際の、免疫原性および安全性が立証されており（１−８）、さらに、第１のヒト
候補ワクチンについての臨床試験が進められている(９−１１)。
【０００９】
新たな構築物の評価についての要求が増加しているが、ウィルスの増殖欠損や発生する
細胞障害効果の減少のため、複製コンピテント組換えワクシニアウィルスと比較した場合
、ＭＶＡベクターの生産は異なっている。組換えＭＶＡの迅速且つ簡便な製造方法が、多
数候補構築物の相対評価を可能とするために必要である。
【００１０】
親株と比較して、ＭＶＡは、Ｋ１Ｌ遺伝子のほとんどを含む親株のゲノムの約１５％（
３０，０００塩基対）の構成を欠失している。長さ２６３ｂｐの断片のみが、ＭＶＡゲノ
ムにまだ存在する。ＭＶＡのＫ１Ｌ遺伝子配列は、文献（Antoine, G., F. Scheiflinger
, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998）に開示されるように、２０６８５−２０９８１
の部位で、ＭＶＡゲノムにおけるＯＲＦ ０２２Ｌのはじめの２６３ｂｐを示す。改変さ
れたワクチニアＡｎｋａｒａ株の完全なゲノム配列および他のオルソポックスウィルス属
との比較は、文献（Virology 244:365-396）に開示されている。
【００１１】
以前より、ワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１Ｌのトランジェント発現の選択に基づ
く、組換えＭＶＡの容易且つ高効率な製造方法が開発されている。この方法は、ウサギ腎
臓ＲＫ-１３細胞におけるＭＶＡ生育を助けるためのストリンジェントマーカーとなるワ
クシニアウィルスＫ１Ｌ遺伝子機能を用いて、トランジェンント宿主域遺伝子発現による
組換えＭＶＡの選択に基づいている（１２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
新たなＭＶＡベクタープラスミドの構築物とその使用は、トランジェント選択可能マー
カーとしてワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１Ｌの発現カセットを備えることが開示さ
れている。これらのプラスミドは、ＭＶＡゲノムに、付加的な組換え遺伝子を安定に挿入
すること、ＭＶＡゲノム配列の正確なターゲット変異のいずれも可能とする。Ｋ１Ｌ遺伝
子をフランキングする反復ＤＮＡ配列は、非選択生育条件下、相同組換えによりウィルス
ゲノムからマーカー遺伝子を除去するようにデザインされた。
【００１３】
クラゲAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子を含む異種遺伝
子配列を有する多重組換えＭＶＡの構築のために、この簡単な選択プロトコールを使用す
る際、発明者らは、単離した組換えＭＶＡの一部は、ＲＫ１３細胞で生育できるが、目的
のターゲット遺伝子を発現しないことを観察した。多重単離ＭＶＡの分子分析において、
二つの異なる失敗が明らかとなった。すなわち、(ｉ)組換え遺伝子の挿入ではなく、Ｋ１
Ｌマーカー遺伝子のみが存在する組換え遺伝子の挿入部位で、（ii）ＭＶＡゲノム内の天
然欠失II領域が、影響／トランケートされているということである（図１Ａ）。第１の考
察は、ＭＶＡゲノムにおけるｆｌａｎｋ Ｉ遺伝子配列と、従来のトランスファープラス
ミドのｆｌａｎｋ Ｉ反復配列との間における、第１の単交雑（single cross）の事象が
原因であり、残りのｆｌａｎｋ Ｉ配列間での相同組換えという第２の事象が続き、結果
として、ＭＶＡゲノムへのＫ１Ｌマーカー配列のみの安定した挿入となる。第２の考察は
、相同組換え事象がＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列とトランスファープラスミドとの間
で起きる場合に生じる。後者の組換え事象の可能性は、Tscharke & Smith(１３)により示
唆されている。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、前述の問題を回避した、組換えＭＶＡの改良された生産方法
の提供である。さらに、本発明の目的は、このような組換え方法に使用できる、ＭＶＡ変
異体およびＤＮＡベクター構築物の提供である。これは、従属クレームの主題により実行
される。本発明の好ましい形態は、従属クレームに示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列（以下に示す断片のみからなる）、好まし
くはそのプロモーター配列またはその機能性部分が、変異、欠失またはその両方によって
ＭＶＡゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とする、新規ＭＶＡ変異体が提供さ
れる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＭＶＡゲノム（ＨｉｎｄIII制限地図）およびベクタープラスミドｐIIIｄＨＲのマップ図
【図１Ｂ】ＭＶＡゲノムからのＫ１Ｌ配列の除去を示すであって、上図は、ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄIII制限地図、下図は、Ｋ１Ｌ遺伝子の断片を含む、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位でのＯＲＦｓを示す。
【図１Ｃ】新規ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲを示す図。
【図２】ＨＣＶ nonstructuralタンパク質３の遺伝子配列を含む組換えＭＶＡの構築およびゲノム構造を示す図。
【図３】ＭＶＡ-Ｐ７．５-ＮＳ３のin vitro特性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上述のように、Ｋ１Ｌ遺伝子の長さ２６４ｂｐの断片のみがＭＶＡゲノム（コード配列
）に存在する。さらに、個々の制御配列は、約１００ｂｐの付加塩基を含む。ＭＶＡ Ｋ
１遺伝子配列は、文献（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner
. 1998）に記載されているように、ＭＶＡゲノムのｎｔ２０６８５−２０９８１位のＯＲ
Ｆ ０２２Ｌの部分である。このように、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列および制御配列の機能
性部分の不活性化は、本発明の目的を実行するために十分であることがわかる。「不活性
化」とは、ＭＶＡゲノム内の天然欠失II領域（region of natural deletion II）におけ
る影響（affection）／トランケーション（truncation）（および、目的の遺伝子の発現
を欠くという結果）の原因となる、ＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子とトランスファープラス
ミド（ＤＮＡベクター構築物）との間での相同組換えを避けるための配列における改変を
意味する。
【００１８】
好ましい形態において、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子は、好ましくは、そのプロモーター配列
もしくはその機能性部分と共に、ウィルスゲノムからの欠失により不活性化されている。
また、Ｋ１Ｌ配列機能における組換えＭＶＡの欠陥は、例えば、Ｋ１Ｌ遺伝子に特異的な
組換えの阻害を通じてＫ１Ｌ配列の不活性化を導く挿入突然変異等の配列突然変異により
発生してもよい。この組換えＭＶＡは、外来遺伝子の導入方法、および、例えば、組換え
ＭＶＡを生産する方法等、その後の形質転換株の選択方法に有益に使用できる。
【００１９】
上述のように、ＭＶＡゲノムの不活性は、不活性程度を意味し、この結果、一般的に、
ＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列とトランスファープラスミド（ベクター構築物）との間
の相同組換えを妨げることとなる。変異の場合、本発明の不活性化Ｋ１Ｌ配列とＶＶ Ｋ
１Ｌ遺伝子との間の相同性は、５０％以下であり、好ましくは１０〜５０％の範囲、より
好ましくは１５〜４０％、特に好ましくは２０〜３０％の範囲である。相同性０％であっ
てもよい。
【００２０】
欠失による不活性の場合、欠失断片は、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子の少なくとも１００ｂｐ
を含み、より好ましくは１５０または２００ｂｐを含む。上述のように、全２６４ｂｐを
欠失することも可能である。さらに、制御配列は、相同組換えの事象を避けるために、広
い範囲で欠失することが望ましい。コード配列および制御配列の両方からなる全Ｋ１Ｌ配
列を欠失してもよい（例えば、約３６０ｂｐの欠失）。
【００２１】
近年確立されたプラスミドＤＮＡのトランスフェクション方法を使用して一次トリ線維
芽細胞（ＣＥＦ）をＭＶＡに感染させ、引き続き、ミコフェノール酸存在下で、β-ガラ
クトシダーゼを生産するウィルスの選択を行い(Sutter, G. and B. Moss. 1992, PNAS US
A 89:10847-10851.)、ウィルスゲノムから欠失したＫ１Ｌコード配列を有する変異ＭＶＡ
を生産した。
【００２２】
本発明の基本原理は、ＭＶＡが、誘導された適当なＤＮＡ配列（Ｋ１Ｌコード配列、お
よび、さらに任意で、異種タンパク質をコードするようなＤＮＡ配列）なしにＲＫ-１３
細胞に存在する間は、複製は起こらないという点である。このため、本発明の方法／ＭＶ
Ａ変異体／ＤＮＡ構築物は、組換えＭＶＡの選択に適しており、組換えＭＶＡの効率良い
生産のツールとして使用できる。
【００２３】
ここで、「組換えＭＶＡ」とは、例えば、ＤＮＡ組換え技術により遺伝的に変化したＭ
ＶＡを意味し、これは、例えば、ワクチンとして、または、発現ベクターとしての使用に
適用できる。
【００２４】
本発明によれば、組換えＭＶＡワクシニアウィルスは、以下のように調製できる。しか
しながら、当業者は、本発明の範囲内で技術常識に基づいて変更できると理解できる。さ
らに、ここで述べる文献は引用により取り入れる。
【００２５】
ワクシニアウィルス（ＶＶ）Ｋ１Ｌタンパク質またはＫ１Ｌ由来ポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列、および、例えば、ＭＶＡゲノム内の欠失III等の天然に発生する欠失の
ような非本質的な部位をフランキングするＤＮＡ配列によって両側がフランキングされた
外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、細胞に導入され、好ま
しくは、真核細胞に導入される。好ましくは、鳥類、哺乳類およびヒト細胞が使用できる
。好ましい真核細胞は、相同組換えが起きるように、本発明の変異ＭＶＡで感染させたＢ
ＨＫ-２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１０）、ＢＳＣ-１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-２６）、ＣＶ-１(Ｅ
ＣＡＣＣ ８７０３２６０５)またはＭＡ１４(ＥＣＡＣＣ ８５１０２９１８)細胞である
。さらに好ましい宿主細胞は、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞、ベロ
細胞、ＭＲＣ-５細胞、Ｂ-細胞またはヒト一次細胞（例えば、一次線維芽細胞、樹状細胞
である。
【００２６】
上述のように、ＤＮＡ構築物は、ＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子または機能的に等しい遺伝子をコ
ードする配列を含む。本発明において機能的に等しいとは、機能を変化することなく、Ｖ
Ｖ Ｋ１Ｌ遺伝子の核酸と比較した場合に、１以上の置換、挿入および／または欠失を含
むような核酸を意味する。これらは好ましくは１であり、２、３、４またはそれ以上のヌ
クレオチド、５’末端、３’末端または核酸配列内において欠失し、これらのヌクレオチ
ドは、他により置換されてもよい。本発明によれば、ＶＶ Ｋ１Ｌと同等のタンパク質を
コードする核酸は、例えば、オリジナルのＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子（上記）の核酸との相同性
が、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％または９５％である。
【００２７】
このような関係において、特に、例えば、“サイレント”チェンジと呼ばれる配列内で
の欠失、挿入および／または置換がなされた、ＶＶ Ｋ１Ｌタンパク質と同等なタンパク
質をコードするＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子の変異体は、本発明の部分とみなされる。
【００２８】
例えば、核酸配列におけるこのような変化は、同等のアミノ酸で置換することが考えら
れる。例えば、保存アミノ酸置換のように、類似する構造および／または化学特性である
類似アミノ酸で１つのアミノ酸を置換するアミノ酸置換が好ましい。
【００２９】
アミノ酸置換は、関連する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または
両親媒性（親媒性）の特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、疎水性アミノ
酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ
プトファンおよびメチオニンである。極性、中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正電荷（塩基性）
は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負電荷アミノ酸は、アスパラギン酸お
よびグルタミン酸を含む。
【００３０】
「挿入」または「欠失」は、通常、１〜５アミノ酸の範囲である。許される変異の程度
は、組換えＤＮＡ法を用いたポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換
の順序的な適用を通じて経験的に決定できる。結果として得られる変異体は、生物活性で
試験できる。
【００３１】
タンパクのＮ末端およびＣ末端に影響するヌクレオチド変化は、通常、タンパク質活性
を変化しない。これらの部分は、通常、生物活性に関与しないからである。示唆された修
飾は、それぞれ、技術分野の範囲であり、コードされる産物の生物活性の維持に基づく範
囲である。
【００３２】
ＤＮＡ構築物が、真核細胞に導入され、Ｋ１ＬコードＤＮＡおよび外来ＤＮＡが、ウィ
ルスＤＮＡと結合すると、例えば、ＲＫ-１３細胞のようなウィルス成育をサポートする
Ｋ１Ｌ機能を必要とする細胞内での継代を通じて、所望の組換えワクシニアウィルスＭＶ
Ａを単離できる。組換えウィルスのクローニングは、プラーク精製のような公知技術で可
能である（Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 15931596 [1982], Franke 
et al., Mol. Cell. Biol. 19181924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 3
4033409 [1985], Fathi et al., Virology 97105 [1986]）。
【００３３】
挿入されるＤＮＡ構築物は、鎖状でも環状でもよい。環状ＤＮＡが好ましく使用される
。特に好ましくはプラスミドの使用である。
【００３４】
ＤＮＡ構築物は、例えば、ＭＶＡゲノム(Sutter, G. and Moss, B. (1992) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 89, 1084710851)内の欠失III部位、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子
工学で欠失させた部位、または、本発明の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位であるような
、非必須部位の左右をフランキングする配列を含んでもよい。
【００３５】
外来ＤＮＡ配列は、例えば、自然に欠損が生じるような、非必須部位をフランキングす
る配列の間に挿入されてもよい。
【００３６】
外来ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子でもよい。前記治療用ポリ
ペプチドは、ワクチン接種の目的または治療もしくは科学的に価値のあるポリペプチドの
生産に好ましく使用できる、例えば、抗体ポリペプチド、ケモカイン、サイトカインもし
くはインターフェロン等の分泌タンパク質、または、病原性物質由来のポリペプチドであ
る。病原性物質は、生物における多種多様な非限定的な腫瘍細胞や、疾患の原因となり、
これにより病理学的発達を導く、ウィルス、細菌および寄生虫があげられる。このような
病原性物質の例は、Davis, B.D. ら(Microbiology, 3rd ed., Harper International Edi
tion)により報告されている。病原性物質の好ましい遺伝子は、インフルエンザウィルス
、はしか呼吸性シンシチウムウィルス（measles and respiratory syncytial viruses）
、デング熱ウィルス、例えば、ＨＩＶ ＩおよびＨＩＶ IIのようなヒト免疫不全ウィルス
、例えば、ＨＣＶやＨＢＶ等のヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、パピローマウィル
ス、プラスモジウムマラリア原虫、および、結核を引き起こすマイコバクテリアの遺伝子
等である。
【００３７】
腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関
連タンパク質１および２等のメラノーマ関連分化抗原、例えば、ＭＡＧＥ-１、-２、-３
およびＢＡＧＥのような腫瘍精巣（cancer testes）抗原、および、Ｈｅｒ-２／ｎｅｕ、
ＭＵＣ-１ならびにｐ５３のような、ガンにおいて過剰発現する非変異共用（non-mutated
shared）抗原の遺伝子である。
【００３８】
外来ＤＮＡ配列または遺伝子を発現するために、ＤＮＡに存在する遺伝子の翻訳に必要
とされる制御配列が必要である。このような制御配列（プロモーターと呼ばれる）は、当
該技術分野において公知である。例えば、ＥＰ-Ａ-１９８，３２８に開示されるワクシニ
ア１１ｋＤａ遺伝子、ＥＰ-Ａ-１１０，３８５に開示されるプロモーターのような、ワク
シニアウィルスに特異的なプロモーター、もしくは、ワクシニアウィルスに特異的な転写
を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な
転写を可能にする合成プロモーター等があげられる。
【００３９】
好ましい対応において、本発明のＤＮＡ−ベクター構築物は、以下の
・  ＶＶのＫ１Ｌコード配列を含むＫ１Ｌマーカー遺伝子および転写ユニット、好ましく
は、その真正プロモーターの転写制御配列を含む、
・  相同組換えによって組換えＭＶＡから前記マーカーを後に除去するための、Ｋ１Ｌマ
ーカー遺伝子をフランキングする２つのＤＮＡ配列、好ましくは、２つの同一挿入ＤＮＡ
断片（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ由来）、
・  クローニングサイト、好ましくは、任意に異種遺伝子が挿入されるマルチプルクロー
ニングサイト、
・  ワクシニアウィルスに特異的な転写のためのプロモーター、好ましくはワクシニアウ
ィルス誘導プロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポ
ックスウィルスプロモーター、または、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能とする
合成プロモーター、
という機能性関連組成（functionally linked components）を含み、
前記組成が、上述の本発明の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位、ＭＶＡゲノム内の欠失
III部位、または、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位への、外来遺
伝子の標的挿入に必須である２つのＭＶＡ-ＤＮＡ配列によりフランキングされている。
【００４０】
ＤＮＡ構築物は、例えば、カルシウムリン酸沈殿法 (Graham et al., Virol. 52, 4564
67 [1973]; Wigler et al., Cell 777785 [1979])、エレクトロポレーション法 (Neumann
et al., EMBO J. 1, 841845 [1982])、マイクロインジェクション法（Graessmann et al
., Meth. Enzymology 101, 482492 (1983)）、リポソーム法 (Straubinger et al., Meth
ods in Enzymology 101, 512527 (1983))、スフェロプラスト法 (Schaffner, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 77, 21632167 (1980))、または、当該技術分野の公知の方法であるト
ランスフェクションによって細胞に導入できる。カルシウムリン酸沈殿法によるトランス
フェクションが好ましく使用できる。
【００４１】
ワクチンの調製のため、本発明により生産されるＭＶＡワクシニアウィルスは、生理学
的に許容できる形状に変化してもよい。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用する
ワクチン調製における長年の経験に基づいて行うことができる（Kaplan, Br. Med. Bull.
25, 131135 [1969]）。一般的に、組換えＭＶＡ約１０6〜１０8粒子が、アンプル（好ま
しくはガラスアンプル）において、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンを含むリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中で凍結乾燥される。凍結乾燥は、非経口投与に適
した希釈剤（マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、またはポリビニ
ルピロリドン）または他の助剤（抗酸化剤、安定化剤等）を含んでもよい。そして、ガラ
スアンプルは密封し保存できる。好ましくは−２０℃で数ヶ月である。
【００４２】
ワクチン接種のため、凍結乾燥物は、０．１〜０．２ｍｌの水溶液（好ましくは生理食
塩水）に溶解でき、例えば、皮内接種により非経口的に投与できる。本発明のワクチンは
、好ましくは皮内注射される。わずかな腫れ物および赤味、時々痛みが、注射部位に見ら
れる（Stickl et al., supra)。投与方法、投与量や投与数は、当業者により最適化でき
る。外来抗原に対する高いレベルの免疫応答を得るためには、長期間に渡り数回ワクチン
を投与することが適切な手法である。
【００４３】
要約として、組換えＭＶＡの生産に関する本発明の方法は、変異ＭＶＡで上述のように
宿主細胞を感染させる工程、本発明のＤＮＡベクター構築物で前記宿主細胞をトランスフ
ェクトする工程、および、ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、または、ＭＶＡもしくは請求項１
記載の変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細
胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程を含む。
【００４４】
図面の簡単な説明
図１：Ｋ１Ｌに基づく宿主範囲の選択の可能なpit-fallおよびそれらの除去に関する図
。
（Ａ）ＭＶＡゲノム（ＨｉｎｄIII制限地図）およびベクタープラスミドｐIIIｄＨＲのマ
ップ図。欠失II部位：Ｋ１Ｌ遺伝子の断片（斜線のボックス）を含むＯＲＦｓの表示。欠
失III部位：ｆｌａｎｋ-Ｉおよびｆｌａｎｋ-IIは、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位への外
来遺伝子のターゲット挿入に必須であるＭＶＡ-ＤＮＡ配列である。ｆｌａｎｋ-１-ｒｅ
ｐは、相同組換えによりＫ１Ｌ発現カセットの欠失を可能とするｆｌａｎｋ-Ｉの右末端
に相同の２８３ｂｐ反復ＭＶＡ-ＤＮＡ断片の部分を示す。Ｋ１Ｌマーカー：真正のプロ
モーターを含むＫ１Ｌ遺伝子配列、Ｐvv：ワクシニアウィルス特異的プロモーター、ＭＣ
Ｓ：マルチプルクローニングサイト。１および２：通常のＫ１Ｌ選択を用いた潜在的に不
必要な相同組換え事象（点線で示す）。（Ｂ）ＭＶＡゲノムからのＫ１Ｌ配列の除去。上
は、ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄIII制限地図、下は、Ｋ１Ｌ遺伝子の断片（斜線のボックス
）を含む、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位でのＯＲＦｓを表す。ｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅ
ｌ：Ｋ１Ｌ欠失プラスミド、２６１ｂｐＫ１Ｌ断片をフランキングするＭＶＡ配列（Ｎ２
ＬおよびＫ２Ｌ遺伝子配列）を有する、Ｎ２Ｌ-ｒｅｐ：Ｎ２Ｌ ＯＲＦの５’領域の３１
５ｂｐ反復、Ｐ１１：ワクシニアウィルス後期プロモーター、Ｐ７．５：ワクシニアウィ
ルス早期／後期プロモーター、ＬａｃＺ：β-ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌ
ｉ ＬａｃＺ遺伝子、ｇｐｔ：キサンチン-グアニン-ホスホリボシル-トランスフェラーゼ
をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ 遺伝子。下は、ＭＶＡ−IInewの欠損II領域を示す。
（Ｃ）新規ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲ。ｆｌａｎｋ-Ｉおよびｆｌａｎ
ｋ-IIは、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位への外来遺伝子のターゲット挿入に必須のＭＶＡ-
ＤＮＡ配列である。Ｋ１Ｌ-マーカー：真正のプロモーターを含むＫ１Ｌ遺伝子配列、Ｐv
v:ワクシニアウィルス特異性のプロモーター、ＭＣＳ：マルチプルクローニングサイト。
同一のｌａｃＺ-誘導ＤＮＡ断片（ｄｅｌ）の２つのコピーは、相同組換えにより組換え
ＭＶＡから選択性マーカーを後に除去するために、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子のそれぞれの末
端に位置している。
【００４５】
図２：ＨＣＶ nonstructuralタンパク質３の遺伝子配列を含む組換えＭＶＡの構築およ
びゲノム構造
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIに対するＭＶＡゲノムの概略地図を上に示す。ＨＣ
Ｖコード配列は、ワクシニアウィルス早期／後期プロモーターＰ７．５の転写制御下に置
かれており、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位で相同組換えにより挿入されている。ｆｌａ
ｎｋ１およびｆｌａｎｋ２は、欠失III部位に隣接するＭＶＡ-ＤＮＡ配列であり、ＭＶＡ
ゲノムへの組換えをターゲットとするために働く。Ｒｅｃ２は、ｆｌａｎｋ１の末端に対
応し、相同組換えにより最終的な組換えウィルスのゲノムからＫ１Ｌ選択性マーカーを除
去するための、２８３ｂｐ反復ＭＶＡ-ＤＮＡ配列の部分を示す。組換えＭＶＡ-ＨＣＶ-
ＮＳ３のゲノム構造の説明は以下に示す。
【００４６】
図３：ＭＶＡ-Ｐ７．５-ＮＳ３のin vitro特性
左図：欠失III部位に挿入された遺伝子配列およびＮＳ-３特異的配列をモニターする、
ウィルスＤＮＡのＰＣＲ分析。野生型ＭＶＡのゲノムＤＮＡ、ＭＶＡ-ＨＣＶ-ＮＳ３およ
びトランスファープラスミドｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５-ＮＳ３を、アガロースゲル電気泳動
により分離した特有のＤＮＡ断片の増幅のため、鋳型ＤＮＡとして使用した。１-ｋＢ-Ｌ
ａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）をマーカーとして使用した（レーン１）。右図：ＣＥＦ細胞に
１０ ＩＵ／細胞のＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｐ７．５-ＮＳ３を感染させ、２４時間宿主感染
を行った。溶解細胞からのタンパク質は、ＳＤＳ-１０％ＰＡＧＥで分離し、ポリクロー
ナルＨＣＶ特異的抗血清を用いたウェスタンブロットにより分析した。部位およびタンパ
ク質標準の分子量（ｋＤａ）は、レーンＭＷに示す。
【００４７】
以下に示す実施例は、本発明のさらなる理解に貢献するものであるが、本発明を実施例
の主題に限定するためのものではない。
【実施例１】
【００４８】
実施例
トランジェントＫ１Ｌ選択技術を改良するため、発明者らは、Ｋ１Ｌを有さないＭＶＡ
の構築（例：ＭＶＡ（IInew）、図１Ｂ）および新規ＤＮＡベクター構築物（トランスフ
ァープラスミド）（例：pIIIΔHR、図１Ｃ）のデザインという２つの手段を採用した。
【００４９】
１．ウィルスの生育および精製
１．１  ＭＶＡおよびＭＶＡ変異ウィルスの生育
ＭＶＡウィルスは、トリ胚線維芽（ＣＥＦ）培養において原株であるＣＶＡ株の連続継
代により生産される、非常に弱毒化されたワクチンウィルスである。ワクシニアのＭＶＡ
株の生産、特性および使用に関する沿革の一般的なレビューとして、Mayrら（Mayr et al
. in Infection 3, 614 [1975].）により開示された要約を参照することができる。ＣＥ
Ｆへの適合のため、他の細胞システムにおけるＭＶＡウィルスの生育は、非常に制限され
る。容易にセルラインを維持できるという特徴を示す乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−
２１）は、高効率ＣＥＦのように、ＭＶＡ生育、組換え遺伝子の優れた発現をサポートし
、発現ベクターおよび生菌組換えワクチンの発展において、標準化されたＭＶＡの生育の
ために推奨される（Drexler et al. 1998, J. Gen. Virol., 79, 347-352）。
【００５０】
ＭＶＡウィルスは、一般にＣＥＦ細胞で生育され、その宿主細胞に適応する。ＣＥＦ細
胞の調製のため、インキュベートした鶏卵から１１日胚を単離し、四肢を除去し、胚を小
さな断片にカットして、室温で２時間、２５％トリプシン含有溶液内でゆっくり解離させ
た。得られた細胞懸濁を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ
／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）および２ｍＭグルタミンを含む等量
の培地Ｉ(ＭＥＭイーグル：例えば、Gibco（Basle, Switzerland；Order No. 0721500）
より入手可能)に希釈し、セルスクリーン（例えば、Technomara AG（Zurich, Switzerlan
d；Order No. Bellco 1985；150 mesh）より入手可能）を通してろ過した。そして、ベン
チ遠心機(Hermle KG, D7209 Gosheim, FRG)において、室温で５分、２０００ｒｐｍの遠
心により、細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を１／４量の培地Ｉにより回収し、この方法に
より得られたＣＥＦ細胞を細胞培養皿に撒いた。これらを、所望の細胞密度に応じて、１
〜２日、３７℃で、ＣＯ2インキュベーターにより培地中で生育させ、直接、または、さ
らに１〜２細胞継代の後、感染に使用した。初代培養の調製の明確な記載は、R.I. Fresh
neyによる「“Culture of animal cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983] Chapt
er 11, page 99 et seq.」に見出すことができる。
【００５１】
本発明のＭＶＡ変異は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した最小必須培地（ＭＥ
Ｍ）で生育させたＣＥＦ細胞または乳児ハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞(American Type
Culture Collection ATCC CCL-10)で定法により増殖させる。ＢＨＫ−２１細胞は、３７
℃、５％ＣＯ2の湿雰囲気下に維持させた。
【００５２】
ウィルスは、以下に示すようにして感染に使用した。細胞を１７５ｃｍ2細胞培養ボト
ルで培養した。８０〜９０％気密で、培地を除去し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ／Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ；例えば、Animed AG（Muttenz, Switzerland, Order No. 23.100.10）のＭＶ
Ａ懸濁液（細胞あたり０．０１感染粒子、０．０１ｍｌ／ｃｍ2）とともに、細胞を１時
間インキュベートした。それから、培地を添加し（０．２ｍｌ／ｃｍ2）、細胞の約８０
％が丸くなるまで、約２〜３日間、３７℃で前記ボトルをインキュベートした。更なるプ
ロセス（精製等）の前、溶解したウィルスは、細胞および培地とともに、処理することな
く前記細胞培養ボトル中で−３０℃に保存した。
【００５３】
１．２  ウィルスの精製
出来るだけ精製され、宿主細胞に特異的な成分を含まないウィルス調製物を得るために
行われる精製工程は、ＭＶＡおよびＷＲウィルスで同一とした(Joklik, Virology 18, 91
8 [1962], Zwartouw et al., J. gen. Microbiol. 29, 523529 [1962])。感染させて−３
０℃で保存した細胞培養を解凍し、残存細胞を振り落とすか、プラスチック基板でかき取
り、細胞およびウィルスを遠心分離によって培地から除去した(Sorvall centrigue、ＧＳ
Ａローター、１時間、５００ｒｐｍ、１０℃)。ウィルスおよび細胞粒子からなる沈殿物
を、１回ＰＢＳ（沈殿量の１０〜２０倍）に懸濁し、懸濁液を上述のように遠心分離した
。新たな沈殿物を１０倍量のＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に懸濁し、残存している無傷細胞を分裂させ、細
胞膜からウィルス粒子を遊離させるために、懸濁液を超音波（４mm直径チップを備えたLa
bsonic 1510、Bender and Hobein（Zurich, Switzerland）；２×１０秒、６０ワット、
室温）で簡単に処理した。細胞核および大きな細胞デブリスを、後の簡単な懸濁液の遠心
分離において除去した（Sorvall GSAローター、DuPont Co., D6353  Bad Nauheim, FRG；
３分、３０００ｒｐｍ、１０℃）。沈殿物は、上述のように、再度ＲＳＢ緩衝液に懸濁し
、超音波処理、遠心分離処理を行った。遊離ウィルス粒子を含む回収した上清をあわせて
、３５％スクロース含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌからなるパ
ッドに層状に広げ、そして、Kontron TST 28.38/17 ローターで遠心分離した(Kontron In
strumente, Zurich, Switzerland; Beckman SW 27 rotorに相当；９０分、１４，０００
ｒｐｍ、１０℃)。上清をデカンタし、ウィルス粒子を含む沈殿を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌで回収し、超音波(２×１０秒、室温、上述の機器)による簡
単な処理でホモジネートし、さらなる精製のためにステップグラジェントに供した。この
グラジェントステップは、それぞれ、スクロースの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．０）溶液５ｍｌ（スクロース濃度ステップ：２０％、２５％、３０％、３５％および４
０％）の組成とした。グラジェントは、Kontron TST 28.38/17ローターを用いて、１４，
０００ｒｐｍ、１０℃、３５分で遠心した。この遠心後、ウィルス粒子を含むいくつかの
分離ゾーンが、３０％〜４０％スクロースの間におけるグラジェント領域でみられた。こ
の領域をグラジェント（１０ｍｌ）から吸い上げ、スクロース溶液をＰＢＳ（２０ｍｌ）
で希釈し、ウィルス粒子を遠心分離によってそこから沈殿させた(Kontron TST 28.38/17 
ローター、９０分、１４，０００ｒｐｍ、１０℃)。純粋なウィルス粒子でほぼ構成され
ている沈殿を、ウィルス濃度が平均１〜５×１０9ｐｆｕ／ｍｌに相当するようにＰＢＳ
で回収した。精製されたウィルス原液は、後続の実験のため、直接またはＰＢＳで希釈し
て使用した。
【００５４】
２．変異ＭＶＡウィルスの構築および特性
２．１  Ｋ１Ｌ欠失プラスミド
ＭＶＡゲノムから、ＭＶＡ ＯＲＦ ０２２Ｌ（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dor
ner, and F. G. Falkner. 1998. Virology 244:365-396に開示されているように、全欠失
配列は、ＭＶＡゲノムのｎｔ２０７１９〜２１１６９から構成される）のプロモーター配
列とともに、残りの２６３ｂｐのＫ１Ｌ配列を除去するために、発明者らは、欠失プラス
ミドｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ（ｐＵＣII−ＬＺのｆｌａｎｋ １）(14)を構築した。こ
のプラスミドは、ＭＶＡゲノム内の欠失II部位（the site of deletion II）への相同組
換えに予め使用されるものであり、Ｋ１Ｌ遺伝子を含まず、以下のＰＣＲによって単離さ
れた新たなｆｌａｎｋ（Ｋ２Ｌ）により置換されている。前記ＰＣＲは、ＭＶＡゲノム遺
伝子から、プライマーIIf1newAおよびIIf1newBを用いて行われる。
IIf1newA：5' CAG CTG CAG CGG CCG CCT TAC ACC GTA CCC 3' (SEQ ID NO: 1)
IIf1newB：5' CAG GCA TGC GTA GAA CGT AGA TCC GG 3' (SEQ ID NO: 2)
さらに、Ｎ２Ｌオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’領域３１５ｂｐ反復（以
下のプライマーdelIIAおよびdelIIBを用いたＰＣＲにより単離）は、ＬａｃＺ-ｇｐｔ-カ
セットの下流に挿入され、これによってｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌが作製され、Ｎ２Ｌ
遺伝子配列の相同組換えによりマーカーカセットを欠失できる。
delIIA：5' CAG CTG CAG CCA TAA TGG TCA ATC GCC 3'
(SEQ ID NO: 3)
delIIB：5' CAG GCG GCC GCG GTA TTC GAT GAT TAT TTT TAA CAA AAT AAC 3'
(SEQ ID NO: 4)
【００５５】
２．２  ＭＶＡ変異の生成
ＭＶＡ（IInew）は、ＭＶＡ(クローン分離株Ｆ６（clonal isolate F6）)を感染させた
初代トリ線維芽（ＣＥＦ）へのｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ ＤＮＡのトランスフェクショ
ンによって生産され、続いて、上述のような（７）ミコフェノール酸存在下でβ−ガラク
トシダーゼを生産するウィルスの選択が行われた。組換えＭＶＡの選択後、選択プレッシ
ャーを除去し（selective pressure was removed）、マーカーフリーのウィルスを単離し
た（図１Ｂ）。
【００５６】
３．  組換えＭＶＡウィルスの生産
３．１  ベクタープラスミドの構築
さらに、ＭＶＡトランスファープラスミドにおけるＭＶＡゲノム配列とＭＶＡ反復配列
との間での相同組換えの可能性を排除するために、我々は、ｌａｃＺ遺伝子由来の２つの
短い２１６ｂｐ反復配列により挟まれた、Ｋ１Ｌマーカーカセットを含む新たなプラスミ
ドｐIIIΔＨＲをデザインした。
【００５７】
Ｋ１Ｌマーカーカセット、その真正プロモーターの転写制御下における完全なＫ１Ｌコ
ード配列は、ワクシニアウィルスWestern Reserve株(Dr. B. Moss（LVD-NIH, Bethesda M
D, USA）より提供)のゲノムＤＮＡ由来１１００ｂｐＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオ
チドK1L-5'-3 CAG CAG CCC GGG TGC GAT AGC CAT GTA TCT ACT AAT CAG (SEQ ID NO: 5)
およびK1L-3'-1 CAG CAG CCC GGG GGA AAT CTA TCT TAT ATA CAC (SEQ ID NO: 6)を用い
たＰＣＲにより増幅した（制限酵素ＳｍａＩの部位を下線で示す）。
【００５８】
この両末端に同方向繰り返しを有するＫ１Ｌマーカーカセットは、先に開示（１２）さ
れたｐΔＫ１Ｌより切り離し、ｐIIIΔＨＲ（図１Ｃ）を生産するために、ｐIIIｄＨＲに
Ｋ１Ｌマーカーおよびｆｌａｎｋ Ｉ反復に代えて挿入した。最終のＭＶＡ組換えウィル
スのゲノムは、ターゲット遺伝子配列および１つのＬａｃＺ遺伝子断片を含む。付加する
外来ＤＮＡの挿入は、結果として「無害（clean）」ではないベクターウィルス生じ、さ
らに、この挿入配列は、組換えＭＶＡの簡便な同定のために、一般的な遺伝子マーカーと
して働くこともできる。
【００５９】
３．２  組換えＭＶＡの構成および単離
感染／トランスフェクション実験における組換え効率についてのこれらの変化の効果を
測定した。ＣＥＦ細胞を、ＭＶＡ（Ｆ６）またはＭＶＡ（IInew）で感染し、ｐIIIｄＨＲ
-ｇｆｐまたはｐIIIΔＨＲ-ｇｆｐでトランスフェクトした。サンプルは、４８時間で回
収され、一部分がＲＫ１３モノレイヤーの感染に使用された。３日後、感染させたモノレ
イヤーを完全に回収し、ＲＫ１３細胞への第２継代を行った。３日のポスト感染で、多数
の可視／ｇｆｐ蛍光細胞凝集体が、光／ＵＶ光顕微鏡観察により測定された。それから、
発明者らは、例えば、Ｋ１Ｌマーカーカセットやｇｆｐ遺伝子のＭＶＡへの挿入のような
、正しい組換え事象のパーセンテージを算出するためにこのデータを使用した（表１）。
発明者により作成された通常の選択システム（ＭＶＡ（Ｆ６）およびｐIIIｄＨＲ-ｇｆｐ
）を使用したところ、第２ＲＫ１３継代後におけるＫ１Ｌおよびｇｆｐに対するて全ての
フォーカス組換えの３０．５％であることがわかった。ＭＶＡゲノムからの残りのＫ１Ｌ
配列の除去は、適切な組換え事象をわずかに促進した（４５％、ＭＶＡ（IInew）およびp
IIIｄＨＲ-ｇｆｐ）。これに対して、ＭＶＡトランスファープラスミドからのｆｌａｎｋ
１反復配列の除去は、残りのＫ１Ｌ配列を持つＭＶＡを使用した場合でさえ、所望の組換
え事象（７１％）という明らかな増加結果となった。発明者らは、新規ＭＶＡおよびｇｆ
ｐトランスファープラスミド（ＭＶＡ（IInew）およびpIIIΔＨＲ-ｇｆｐ）を使用した場
合に、事実上１００％効率を得た。ＲＫ１３細胞におけるはじめのブラインド継代は、希
釈液のプレーティングおよびフォーカス量の測定前に行われた。これは、第１ＲＫ１３継
代におけるＧＦＰポジティブ細胞凝集体の測定をする際、結果が適切な組換え事象の高い
数値を示唆し、さらに、次の継代に入る時、約半分のウィルス単離体が、ＧＦＰポジティ
ブウィルスフォーカスを誘導できないことが観察されたためである。この観察は、おそら
く不安定な単一組換え事象および／またはキャリーオーバープラスミドＤＮＡ由来のとラ
ンジェントｇｆｐ発現に基づく。
【００６０】
発明者らは、さらに、（ｉ）ＭＶＡゲノム内の残存Ｋ１Ｌ配列の除去、（ii）トランジ
ェントマーカー遺伝子を欠失するための相同性非ＭＶＡ配列を有する新規ＭＶＡトランス
ファープラスミドのデザインによって、Ｋ１Ｌに基づく選択技術を改良した。各方法は、
異なる程度であっても、すでに所望の組換えウィルスの生産を改善した。修飾されたＭＶ
Ａベクタープラスミドと、Ｋ１Ｌ配列を有さないＭＶＡバックボーンウィルスとの組み合
わせは、効率的な選択およびターゲットゲノム部位への遺伝子の正確な移動を可能とし、
事実上、ＭＶＡ組換えウィルスのみを単離することを可能とする。
【００６１】
４．ｒＭＶＡの生産／選択の方法
ＨＣＶ-Ｊ株（遺伝子型１ｂ）のnonstructural ３（ＮＳ３）オープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）を発現する組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）の構築は、内因性Ｋ１Ｌ配列を欠
くＭＶＡ親ウィルス（ＭＶＡ-IInew）を基礎としてｒＭＶＡを生産し、異種、非ＭＶＡ反
復要素（ＬａｃＺ）を有するプラスミドを使用する、我々の新規技術の有益な使用の実施
例として供給できる。はじめから、我々は、Staib C.,ら（Staib C., et al. 2000, Biot
echniques 28:1137-1148）に開示されているような我々の通常の宿主範囲選択プロトコー
ルを使用する、ＨＣＶ-Ｊ株（遺伝型１ｂ）のＨＣＶ ＮＳ３遺伝子（ＭＶＡ-ＨＣＶ／Ｎ
Ｓ３）の発現のためのｒＭＶＡの生産を試みていた。
【００６２】
ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドは、慢性肝炎の日本人患者由来であり、京都大学（D
r. Kunitada Shimotohno）より入手した。これを、ＰＣＲ増幅を用いたＮＳ３遺伝子 (Ｈ
ＣＶ ポリプロテインアミノ酸１０２８−１６５８)の調製に使用し、また、対応するＰＣ
Ｒ産物をＭＶＡトランスファーベクターｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５（図２）へのクローニン
グのために使用した。ＭＶＡ（clonal isolate F6）でのＣＥＦモノレイヤーの感染なら
びにｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５-ＮＳ３でのトランスフェクションの後、選択マーカーとして
Ｋ１Ｌを使用して、ＲＫ１３細胞におけるいくつかのプラーク精製工程を行った。我々は
、真の（bona fide）組換えウィルスを得ることができなかった。我々は、ｒＭＶＡゲノ
ムの欠失３（ｄｅｌ３）部位内に安定に結合したＫ１Ｌ配列のみを有するＭＶＡを単離し
たが、安定に生育するウィルス継代は得られなかった。改善策として、我々は、改良した
新規Ｋ１Ｌ選択技術の使用を決定し、ＮＳ３遺伝子配列を新規ＭＶＡプラスミドｐIII-Δ
ＨＲ-Ｐ７．５にクローニングし、相同組換えによる発現カセットの結合のために、レセ
プターウィルスとしてＫ１Ｌフリーの改善された単離ＭＶＡ-IInewを使用した。戦略の変
更により、数回のプラーク精製ステップのみで所望の組換えウィルスＭＶＡ-ＨＣＶ／Ｎ
Ｓ３を生産し単離することができた。図３は、ちょうどＭＶＡゲノムｄｅｌ３部位でのＮ
Ｓ３ ＯＲＦの適切な挿入および完全なＫ１Ｌ選択マーカーカセットの除去をモニターす
るＰＣＲ分析（左図）によるｒＭＶＡのin vitro特性を示す。さらに、新たに生産された
組換えＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３は、ウェスタンブロット分析（図３、右図）に示すように
、ＣＥＦ細胞の感染において、適切なＮＳ３ポリペプチドを生産できる。ＭＶＡ-ＨＣＶ
／ＮＳ３は、現在、ヒトのＨＣＶ感染に対する予防および／または治療の改善のための、
有望な候補ベクターウィルスとして評価できる。重要な新規のｒＭＶＡ構築物は、標準方
法によって作製することは不可能でないとしても非常に困難であると推測されるが、本特
許出願に開示された我々の改善した方法論により、実際に重要な新規のｒＭＶＡ構築物を
得ることが今や可能となった。
【００６３】
参考文献
１．  Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., SP, O. N., Stapra
ns, S. I., Montefiori, D. C., XU, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S., Candido, M. 
A., Kozyr, N. L., Earl, P. L., Smith, J. M., Ma, H. L., Grimm, B. D., Hulsey, M.
L., Miller, J., McClure, H. M., McNicholl, J. M., Moss, B., and Robinson, H. L.
(2001). Control of a Mucosal Challenge and Prevention of AIDS by a Multiprotein
DNA/MVA Vaccine. Science 292(5514), 69-74.
２．  Belyakov, I.M., L.S. Wyatt, J.D. Ahlers, P. Earl, C.D. Pendleton, B.L. Kel
sall, W. Strober, B. Moss and J.A. Berzofsky. 1998. Induction of a mucosal cytot
oxic T-lymphocyte response by intrarectal immunization with a replication-defici
ent recombinant vaccinia virus expressing human immunodeficiency virus 89.6 enve
lope protein. J. Virol. 72:8264-8272.
３．  Drexler, I., E. Antunes, M. Schmitz, T. Wolfel, C. Huber, V. Erfle, P. Rie
ber, M. Theobald and G. Sutter. 1999. Modified vaccinia virus Ankara for deliver
y of human tyrosinase as melanoma-associated antigen: induction of tyrosinase- a
nd melanoma-specific human leukocyte antigen A*0201-restricted cytotoxic T cells
in vitro and in vivo. Cancer Res. 59:4955-4963.
４．  Hirsch, V.M., Fuerst, T.R., Sutter, G., Carroll, M.W., Yang, L.C., Goldste
in, S., Piatak, M., Elkins, W.R., Alvord, W.G., Montefiori, D.C., Moss, B. and L
ifson, J.D. (1996) Patterns of viral replication correlate with outcome in simia
n immunodeficiency virus (SIV)- infected macaques: Effect of prior immunization 
with a trivalent SIV vaccine in modified vaccinia virus Ankara. J. Virol. 70, 37
41-3752.
５．  Moss, B. 1996. Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expr
ession, vaccination, and safety. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11341-11348.
６．Schneider, J., S.C. Gilbert, T.J. Blanchard, T. Hanke, K.J. Robson, C.M. Han
nan, M. Becker, R. Sinden, G.L. Smith and A.V. Hill. 1998. Enhanced immunogenici
ty for CD8+ T cell induction and complete protective efficacy of malaria DNA vac
cination by boosting with modified vaccinia virus Ankara. Nat Med. 4:397-402.
７．  Sutter, G. and B. Moss. 1992. Nonreplicating vaccinia vector efficiently e
xpresses recombinant genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847-10851.８．  Sutt
er, G., L. S. Wyatt, P. L. Foley, J. R. Bennink and B. Moss. 1994. A recombinant
vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain 
of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vac
cine 12:1032-1040.
９．  Corona Gutierrez CM, Tinoco A, Lopez Contreras M, Navarro T, Calzado P, Va
rgas L, Reyes L, Posternak R, Rosales R. (2002). Clinical protocol. A phase II s
tudy: efficacy of the gene therapy of the MVA E2 recombinant virus in the treatm
ent of precancerous lesions (NIC I and NIC II) associated with infection of onco
genic human papillomavirus. Hum Gene Ther 13(9):1127-40
１０．  Hanke T, McMichael AJ, Mwau M, Wee EG, Ceberej I, Patel S, Sutton J, Tom
linson M, Samuel RV. (2002). Development of a DNA-MVA/HIVA vaccine for Kenya. Va
ccine 20(15):1995-8
１１．  Hill AV, Reece W, Gothard P, Moorthy V, Roberts M, Flanagan K, Plebanski
M, Hannan C, Hu JT, Anderson R, Degano P, Schneider J, Prieur E, Sheu E, Gilber
t SC. (2000).DNA-based vaccines for malaria: a heterologous prime-boost immunisa
tion strategy. Dev Biol (Basel) 104:171-9
１２．Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter,
G. (2000) Transient host range selection for genetic engineering of modified va
ccinia virus Ankara. BioTechniques 6,1137-42, 1144-6, 1148.
１３．Tscharke, D. C., and Smith, G. L. (2002). Notes on Transient Host Range Se
lection for Engeneering Vaccinia Virus Strain MVA. BioTechniques 33: 186-188.
１４．  Sutter, G., Ohlmann, M., and Erfle, V. 1995. Non-replicating vaccinia ve
ctor efficiently expresses bacteriophage T7 RNA polymerase. FEBS Lett. 371(1):9-
12.
【００６４】
【表１】
2011055840.tif 000002
【００６５】
表１：通常、新規ＭＶＡおよびトランスファープラスミドを使用した組換え効率
パーセンテージは、ｇｆｐ発現フォーカスと光顕微鏡下で可視のフォーカスとの非として
算出した。かっこ内の数値は、各サンプルの２つの異なる１０倍希釈についてのカウント
したフォーカスの絶対値を示し、３回の試験の表示である。
【図１Ａ】
2011055840.tif 000003
【図１Ｂ】
2011055840.tif 000004
【図１Ｃ】
2011055840.tif 000005
【図２】
2011055840.tif 000006
【図３】
2011055840.tif 000007
【配列表】
2011055840000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月16日(2010.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＭＶＡの生産方法における、ＭＶＡ変異体の使用であって、
前記ＭＶＡ変異体は、ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列及びそのプロモーター配列又はこれらの配列の機能性部分が、機能を有するＫ１Ｌ遺伝子との間の相同組換えを妨げるのに十分な程度に欠失又は変異しているＭＶＡ変異体であり、
前記組換えＭＶＡの生産方法は、下記工程を含む、ＭＶＡ変異体の使用；
前記ＭＶＡ変異体によりＭＶＡ宿主細胞を感染させる工程；
ワクシニアウィルス(ＶＶ)Ｋ１Ｌ遺伝子をコードする配列又は機能的に同等な遺伝子をコードする配列、及び、外来タンパク質又はその機能性部分をコードするＤＮＡ配列を含み、ＶＶＫ１Ｌ及び外来タンパク質コード領域が前記ＭＶＡ変異体の非必須部位をフランキングするＤＮＡ配列によってフランキングされているＤＮＡベクター構築物であって、前記非必須部位が、ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列及びそのプロモーター配列又はこれらの配列の機能性部分が機能を有するＫ１Ｌ遺伝子との間の相同組換えを妨げるのに十分な程度に欠失又は変異している前記部位であるＤＮＡベクター構築物で、前記宿主細胞をトランスフェクトする工程；及び、
ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、又は、ＭＶＡもしくは前記変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程。
【請求項２】
組換えＭＶＡの生産方法における、宿主細胞の使用であって、前記組換えＭＶＡの生産方法が、下記工程を含む、宿主細胞の使用；
ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列及びそのプロモーター配列又はこれらの配列の機能性部分が機能を有するＫ１Ｌ遺伝子との間の相同組換えを妨げるのに十分な程度に欠失又は変異しているＭＶＡ変異体により、前記宿主細胞を感染させる工程；
ワクシニアウィルス(ＶＶ)Ｋ１Ｌ遺伝子をコードする配列又は機能的に同等な遺伝子をコードする配列、及び、外来タンパク質又はその機能性部分をコードするＤＮＡ配列を含み、ＶＶＫ１Ｌ及び外来タンパク質コード領域が前記ＭＶＡ変異体の非必須部位をフランキングするＤＮＡ配列によってフランキングされているＤＮＡベクター構築物であって、前記非必須部位が、ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列及びそのプロモーター配列又はこれらの配列の機能性部分が機能を有するＫ１Ｌ遺伝子との間の相同組換えを妨げるのに十分な程度に欠失又は変異している前記部位であるＤＮＡベクター構築物で、前記宿主細胞をトランスフェクトする工程；及び、
ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、又は、ＭＶＡもしくは前記変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程。
【請求項３】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記真核細胞が、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞、ＢＨＫ-２１細胞、ＢＳ-Ｃ-１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＶ-１細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ-５細胞、Ｂ-細胞又はヒト一次細胞である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記ヒト一次細胞が、一次線維芽細胞又は樹状細胞である、請求項４記載の使用。