(57)【要約】      （修正有）【課題】フルオロキノロンに対する耐性克服剤の提供。【解決手段】耐性克服機構として、少なくとも部分的には、ＡｃｒＡＢ遺伝子座の不活化により耐性菌細胞であっても抗生物質および非抗生物質薬剤に対し過敏になる。驚くべきことに、この事は微生物を高度に薬物耐性とする染色体突然変異を有する高耐性微生物にも当てはまる。従って、一つの態様において、微生物が耐性である薬物と、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤とを対象に投与し、感染を治療することを特徴とする対象中の薬物耐性微生物で生じる感染の治療方法が確立された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に明細書本文に記載した通りのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本研究の少なくとも一部は合衆国公衆衛生サービス（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）ＧＭ５１６６１の助成金を受けた。従って合衆国政府は本発明においてある権利を所有する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の生育を阻害するために用いられる薬物が異なると、異なった標的を阻害することによって作用する。例えば、フルオロキノロン系抗生物質はＤＮＡ合成を阻害する作用を有する。治療に用いる場合、フルオロキノロンは経口で良く吸収され、血清中よりも呼吸系分泌物中高濃度で分泌され、マクロファージ中に濃縮される。さらに、フルオロキノロンには十分な寛容性があり、長期の治療で優れた安全成績がある。
【０００３】
抗生物質耐性、特にフルオロキノロンに対する耐性が問題となっている。グラム陰性菌におけるフルオロキノロン耐性は、基本的には薬物の標的蛋白質に影響する突然変異で生じる。フルオロキノロンの場合は、これらの標的はＤＮＡジャイラーゼおよびトポイソメラーゼＩＶである。さらに、ｍａｒＡ、ｓｏｘＳまたはｒｏｂ等の調節遺伝子に影響する突然変異がフルオロキノロン耐性を生じさせ得る（エーチンガー（Ｏｅｔｈｉｎｇｅｒ）ら、１９９８、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：１１１）。ｍａｒ  Ａは様々な抗生物質耐性に関与するｍａｒＲＡＢオペロンによってコードされる転写活性化因子である（アレクシャン（Ａｌｅｋｓｈｕｎ）ら、１９７７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。Ａｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１、２０６７−２０７５）。ｍａｒＲＡＢ遺伝子座はテトラサイクリン、クロラムフェニコール、フルオロキノロン、ナリジクス酸、リファンピン、ペニシリンその他の化合物に対する耐性を与える。しかしながら、ｍａｒＲＡＢは複数薬物流出系をコードしない。むしろ、その遺伝子は薬物耐性を直接媒介するにおいて重要な他の遺伝子座、例えば外膜ポリンに対する遺伝子であるｏｍｐＦ、およびＡｃｒＡＢ流出蛋白質に対するａｃｒＡＢ遺伝子の発現を制御する。
【０００４】
ＡｃｒＢは哺乳動物の小腸中の胆汁酸塩に対する細胞防御を幇助すると思われるが（タナシー（Ｔｈａｎａｓｓｉ）ら、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９、２５１２−１５１８）、その通常の生理学的役割が未知の複数薬物流出ポンプである（ニカイドウ（Ｎｉｋａｉｄｏ、Ｈ．、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８、５８５３−５８５９；オクス（Ｏｋｕｓｕ）ら、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８、３０６−３０８）。ＡｃｒＡＢオペロンはＭａｒＡで昂進される（マー（Ｍａ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６、４５−５５）。リプレッサー遺伝子ｍａｒＲの突然変異によりｍａｒＡが過剰発現する（アレクシャン（Ａｌｅｋｓｈｕｎ）ら、１９９７、ＡＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１、２０６７−２０７５；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５、１４８４−４９２；セアン（Ｓｅｏａｎ）ら、１９９５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７、３４１４−３４１９）。ｓｏｘＳ遺伝子はａｃｒＡＢも正に調節し得る（マーら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９、１０１−１０２）ＭａｒＡホモログをコードする（アレクシャンら、１９９７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１、２０６７−２０７５；リー（Ｌｉ）ら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０、９３７−９４５；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１、４４１―４４８）。
【０００５】
ＡｃｒＡＢポンプはエリスロマイシン、フシジン酸、色素および界面活性剤等の蛋白質チャネルを通過し難い、大きな親油性薬物に対する耐性を主として制御するが、チャネルを通って拡散し得る小さい抗生物質、例えばテトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびフルオロキノロン等に対する微生物の感受性はそのままである（ニカイドウ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７８：５８５３）。最近、ＡｃｒＡＢポンプが微生物生育を制御するために用いられる他の薬物、例えばトリクロサン等の非抗生物質薬剤に対する耐性を媒介するのに重要であることが見出された（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９８年９月１５日、１６６：３０５−９）。
【０００６】
微生物はしばしば抗生物質および／または非抗生物質薬剤に対し耐性になる。これは、それらの薬物を不活化する、薬物の標的を修飾する、または薬物の能動流出をもたらす酵素をコードする遺伝子を獲得することにより生じ得る。キノロン、スルホンアミドおよびトリメトプリン等の合成抗生物質を不活化する酵素は発見されていない。不活化または修飾酵素が出現していないこれらの抗生物質および天然物の場合、耐性は、通常、標的の修飾で生じる（スプラット（Ｓｐｒａｔｔ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：３８８）。微生物、特に薬物耐性の高い微生物における薬物耐性の改良された制御法は大いに有益であると思われる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的には、ＡｃｒＡＢ遺伝子座の不活化により耐性菌細胞であっても抗生物質および非抗生物質薬剤に対し過敏になるという知見に基づいている。驚くべきことに、この事は微生物を高度に薬物耐性とする染色体突然変異を有する高耐性微生物にも当てはまる。
【０００８】
従って、一つの態様において、本発明は、微生物が耐性である薬物と、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤とを対象に投与し、感染を治療することを特徴とする対象中の薬物耐性微生物で生じる感染の治療方法を提供する。
【０００９】
一つの実施態様において、薬物は抗生物質である。好ましい実施態様において、抗生物質はフルオロキノロンおよびリファンピンよりなる群から選択される。もう一つの実施態様において、薬物は非抗生物質薬剤である。またもう一つの実施態様において、薬物は非抗生物質薬剤であるトリクロサンである。
【００１０】
一つの実施態様において、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤が予防のために投与される。もう一つの実施態様において、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤が治療のために投与される。
【００１１】
もう一つの態様において、本発明はフルオロキノロンとＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤を対象に投与し、それにより、フルオロキノロン耐性感染を治療することよりなる、対象におけるフルオロキノロン耐性感染の治療方法に関する。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明はＡｃｒＡＢ様流出ポンプを有する微生物を試験化合物および指示薬化合物と接触させ、指示薬化合物の流出に対する試験化合物の効果を測定し、試験化合物がＡｃｒＡＢ流出ポンプの活性を阻害する能力を試験することによって薬物耐性を減少させる化合物を同定することを特徴とする薬物耐性を軽減する化合物のスクリーニング方法に関する。
【００１３】
一つの実施態様において、微生物は薬物耐性である。好ましい実施態様において、微生物細胞は薬物耐性が高い。より好ましい実施態様において、微生物はフルオロキノロンに対する耐性が高い。もう一つの実施態様において、微生物細胞は薬物標的遺伝子に少なくとも１個所の突然変異を有する。もう一つの実施態様において、微生物細胞は薬物標的遺伝子に少なくとも２個所の突然変異を有する。好ましい実施態様において、ジャイラーゼ（ｇｙｒＡ）、トポイソメラーゼ（ｐａｒＣ）、ＲＮＡポリメラーゼおよびｆａｂＩよりなる群から選択される遺伝子に突然変異が存在する。
【００１４】
一つの実施態様において、対象のアッセイには化合物が微生物におけるフルオロキノロン耐性を軽減する能力を検出することが含まれる。
【００１５】
もう一つの実施態様において、本発明はｉ）ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを有する微生物を試験化合物および指示薬化合物に接触させ、ｉｉ）その化合物がＡｃｒＡＢ様流出ポンプの活性を阻害する能力を試験し、ｉｉｉ）その化合物が非ＡｃｒＡＢ流出ポンプの活性を阻害する能力を試験し、ｉｖ）ＡｃｒＡＢ様流出ポンプと非ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの活性を阻害する化合物を同定し、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを特異的に妨害する化合物を同定することを特徴とするＡｃｒＡＢ様流出ポンプの活性を特異的に阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
またもう一つの態様において、本発明は、１種以上の薬物に対し耐性である微生物を、その微生物が耐性である薬物およびＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤と接触させ、薬物の抗微生物活性を増強することを特徴とする薬物の抗微生物活性の増強方法を提供する。
【００１７】
一つの実施態様では、接触工程は半ビボで生じる。一つの実施態様では、微生物を非抗生物質薬剤とＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤と接触させる。一つの実施態様では、非抗生物質薬剤はシクロヘキサジン、第四級アンモニウム化合物、パイン油および一般的に安全と考えられる化合物（ＧＲＡＳ）よりなる群から選択される。
【００１８】
もう一つの態様では、本発明はＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤および抗生物質を含む医薬組成物を提供する。一つの実施態様では、医薬組成物は医薬上許容される担体をさらに含む。好ましい実施態様では、抗生物質はフルオロキノロンおよびリファンピンよりなる群から選択される。
【００１９】
（発明の実施の形態）
本発明は、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの基質である薬物に対する耐性制御の進歩を示す。好ましい実施態様では、本発明の方法を抗生物質および非抗生物質薬剤に対する耐性を制御するために用いることができる。特に好ましい実施態様では、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの基質である薬物には抗生物質、例えばフルオロキノロンまたはリファンピンが含まれる。本発明はさらに、本発明の方法およびその使用法を用いて得られるＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤に関する。他の特に好ましい実施態様では、薬物には非抗生物質薬剤、例えばトリクロサンが含まれる。本発明の方法は、薬物標的分子を変化させる染色体突然変異を有する薬物耐性の高い微生物であっても、薬物耐性の制御に有効である。例えば、微生物突然変異体の解析から、フルオロキノロン標的遺伝子ｇｙｒＡ、調節遺伝子ｍａｒＲ、さらにシプロフロキサシンのＡｃｒＡＢ媒介流出に影響すると思われる未同定遺伝子における突然変異のすべてがフルオロキノロン耐性に寄与することが明らかになっている。驚くべきことに、ＡｃｒＡＢ遺伝子座の不活化により、耐性の高い細胞でもフルオロキノロンおよびある種の他の関係のない薬物に対し、トポイソメラーゼ突然変異体の間でも感受性が高くなった。これらの研究は、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの機能を妨害すると、高レベルの薬物耐性でも減少することを示している。
【００２０】
従って、本発明は、とりわけ、薬物耐性、特にフルオロキノロンおよびトリクロサン等の抗生物質および非抗生物質薬剤耐性を軽減する化合物のスクリーニング方法、およびＡｃｒＡＢ様流出ポンプを特異的に妨害する化合物のスクリーニング方法を提供する。さらに本発明は薬物の抗微生物活性の増強方法と、感染の治療法を提供する。
【００２１】
本発明をさらに説明する前に、明細書、実施例および添付の請求の範囲に用いられたいくつかの用語を、便宜上以下に集める。
【００２２】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる「感染」と言う用語には対象内または対象上に微生物が存在することが含まれ、その生育が阻害された場合、対象に有益であると考えられる。従って、「感染」という用語は病原体の存在に加えて、検出できない正常な微生物群の、例えば火傷対象の皮膚上または免疫欠損対象の胃腸管中の存在も含まれる。本明細書で用いられる「治療」とは、予防または治療目的で対象に化合物を投与することである。「投与」という用語には、例えば感染部位へ薬物を送達するに役立つ任意の方法による対象への送達が含まれる。薬物の投与は例えば経口、静脈内または局所である。
【００２３】
本明細書で用いる「薬物」という用語には、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの基質である化合物が含まれる。「薬物」という用語は、微生物の生育を低減する、宿主に感染を起こす微生物の能力を低減する、または微生物が環境中で増殖または感染性を維持する能力を低減する化合物を含む。このような薬物には抗生物質および非抗生物質薬物が含まれる。「薬物」という用語は、微生物にとって静止性または殺菌性である抗感染化合物、例えば微生物の生育または生命力を阻害する抗菌性化合物を含む。好ましい抗感染化合物は微生物の抗生物質に対する感受性を増加させるか、微生物の感染性または毒性を減少させる。ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの基質は公知の方法、および本明細書に詳細に述べる方法を用いて容易に同定することができる。例えば、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの基質である推定薬物を例えば放射線でラベルし、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを有する微生物細胞、およびＡｃｒＡＢ様流出ポンプを欠く微生物細胞における薬物の微生物細胞からの放出を試験する。このようなポンプを有する微生物中よりも、このようなポンプを持たない微生物中でより高い細胞内濃度で存在する薬物は、ポンプの基質である薬物である。
【００２４】
「薬物」という用語には、殺菌剤、防腐剤および表面散布化合物等のＭａｒ型フェノタイプが耐性を媒介することが知られている抗菌剤が含まれる。例えば、抗生物質、殺菌または酸化的ストレス誘発剤を含む他の型の抗菌剤、および有機溶剤がこの用語に含まれる。「薬物」という用語はまた、殺生物剤を含む。「殺生物」という用語は、通常の熟練を有する当業者が本発明に先立って細胞を「非特異的に」殺すと信じていた試薬、またはその作用機構が例えば本発明以前は不明である、通常の熟練を有する当業者がその試薬が標的特異性であると予期していなかった広いスペクトルの試薬を含む。殺生物剤の例にはパラベン、クロルブタノール、フェノール、エチレンオキサイドおよびホルムアルデヒド等のアルキル化試薬、水銀その他の重金属、界面活性剤、酸、アルカリおよびクロルヘキシジンが含まれる。他の殺生物剤にはトリクロサン、パイン油、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム化合物、クロロキシロール、クロルヘキシジン、シクロヘキシジン、トリクロロカーボンおよび消毒剤が含まれる。「殺菌性」という用語は細菌を殺す試薬を言い、「静菌性」という用語は細菌の生育を阻害する試薬を言う。
【００２５】
「抗生物質」という用語は自然界で生物により合成され、天然起源から単離された抗微生物剤、および化学的に合成された薬物であると認識され、それらを含む。この用語はメネンシンおよびニゲリシン等のポリエーテルイオノフォア、エリスロマイシンおよびタイロシン等のマクロライド抗生物質、ストレプトマイシンおよびカナマイシン等のアミノグリコシド抗生物質、ペニシリンおよびセファロスポリン等のβ−ラクタム抗生物質、およびスブチリシンおよびネオスポリン等のポリペプチド抗生物質を含むが、それに限定されない。抗生物質の半合成誘導体、および化学的方法で生産される抗生物質もこの用語に包含される。イソニアジド、トリメトプリン、キノロン、フルオロキノロンおよびサルファ剤等の化学的に誘導された抗菌剤は抗菌剤と考えられ、抗生物質と言う用語はこれらも含む。天然物由来の製品およい化学的に合成される化合物を含めることは本発明のスクリーニングの範囲である。
【００２６】
「殺生物性」と言う用語とは対照的に、抗生物質または「ヒトに対する使用が認可された抗微生物薬物」は、微生物細胞中で特定の分子標的を有すると考えられる。治療薬の微生物標的は、治療が必要な対象の生理学的標的と十分に異なっているので、抗生物質または薬物が対象に対し最小の副作用を有することが好ましい。
【００２７】
「非抗生物質薬剤」と言う用語には、抗生物質であると考えられていないａｃｒＡＢ様流出ポンプの基質が含まれる。非抗生物質薬剤の例には例えば殺生物剤、消毒剤または抗感染剤が含まれる。非抗生物質薬剤には、例えばある目的、またはクリーニング製品に使用される消費商品に組み込まれているａｃｒＡＢ様流出ポンプの基質も含まれる。
【００２８】
本明細書で用いる「フルオロキノロン」という用語には、少なくとも１個のフッ素原子で置換されたキノロンが含まれる。好ましいフルオロキノロンには４位にカルボニルを有する化合物が含まれる。フッ素置換の好ましい位置は５、６および７位である。ＮＲ'Ｒ''、ＣＮ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ３、ＣＣｌ３，ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＯＮＲ'Ｒ''、Ｓ（Ｏ）ＮＲ'Ｒ''、ＣＨＯ，ＯＣＦ３、ＯＣＣｌ３、ＳＣＦ３、ＳＣＣｌ３、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'およびＯＲ'等の別な置換基を有する化合物が誘導体に含まれるが、それに限定されない。ここでＲ'およびＲ''はそれぞれ独立に水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、Ｃ２−Ｃ４アルキニルまたは所望により置換されていてもよい環状または複素環基である。フルオロキノロンと言う用語は、ナフチリジノン等の７位に複素環置換基を有する化合物も包含する。好ましい置換基にはピペラジニル基および他の複素環基、カルボン酸基、および置換または無置換アルキル基が含まれる。好ましいフルオロキノロンの例が以下に示されるが、ここでＸはＣＨまたはＮまたはＣＲ６であり、Ｒ１はシクロアルキル基を含む、または所望によりハロゲンで置換されていてもよい低級アルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に置換または無置換低級アルキルまたは水素であり、Ｒ５はフッ素、水素またはアミノ基であり、Ｒ６は水素またはフッ素である。
【化１】
2011137028.tif 000002
【００２９】
本明細書で用いる「複数薬物耐性（ＭＤＲ）」と言う用語は、抗生物質と非抗生物質化合物の双方に対する耐性を含む。ＭＤＲは生物中の染色体またはプラスミドにコードされた遺伝子座、例えばｍａｒＲＡＢ座の転写増大に由来し、例えば流出ポンプまたは微生物学的異化または代謝プロセスを刺激することにより、生物が暴露された化合物ならびにその他の関連しない化合物に対する毒性効果を最小にする能力を有する様になる。本明細書で用いる「薬物に耐性である微生物、または薬物耐性微生物」と言う語句には、標的遺伝子の突然変異、または薬物耐性に影響する遺伝子座、例えば流出ポンプ遺伝子の転写の増大が特徴である微生物が含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「薬物に耐性である微生物または薬物耐性微生物」と言う用語には、薬物の標的である遺伝子の突然変異が特徴である微生物が含まれる。
【００３１】
本明細書で用いる「薬物耐性が高い微生物または高薬物耐性微生物」と言う用語には、薬物耐性に影響する複数（１を超える）の遺伝子の突然変異が特徴である微生物が含まれる。薬物耐性が高い微生物は以下の３つの形質の少なくとも２つが特徴であることが好ましい：（１）微生物を１種以上の薬物に耐性にする薬物標的をコードする少なくとも１個の遺伝子の突然変異（ジャイラーゼｆａｂＩまたはトポイソメラーゼ変異）を有する；（２）（（１）における遺伝子と同じまたは異なった遺伝子に）薬物耐性を増加させる第２の突然変異を有する；および（３）（例えば、ｍａｒ遺伝子座の増大した転写の結果として）少なくとも１個の流出ポンプの発現が増加している。「突然変異」と言う用語は、薬物耐性に影響し得る、微生物中の核酸分子配列（染色体またはエピソームいずれか）中の少なくとも１個のヌクレオチドの変化（例えば置換、欠失または挿入）を含む。この様な突然変異の結果、例えば微生物中の遺伝子制御の変化、または異なったペプチドの発現がもたらされる。この様な突然変異は、微生物が耐性である薬物の標的をコードする遺伝子中で生じることが好ましい。
【００３２】
一つの実施態様では、薬物は抗生物質である。好ましい実施態様では、薬物はフルオロキノロンである。
【００３３】
もう一つの実施態様では、薬物は例えばトリクロサン、パイン油、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム化合物、クロロキシロール、トリクロカーボンまたは本明細書により詳細に記載される消毒薬等の非抗生物質剤である。特に好ましい実施態様では、薬物は非抗生物質剤でないａｃｒＡＢ様流出ポンプの基質である。
【００３４】
薬物耐性の高い微生物は、先行する形質の一つのみが特徴である微生物より薬物耐性が高い。一般に、抗生物質の効果をこの様な耐性の高い微生物に試験した場合、ただ１個の上記形質が特徴である微生物、または複数の抗生物質耐性が特徴であるが薬物耐性が高くない微生物で観測される濃度より、抗生物質は約２倍から１００倍以上高い最小の阻止濃度（ＭＣＩ）を示すと思われる。
【００３５】
本明細書で用いる「薬物標的」と言う用語は、薬物が作用する分子、または非耐性微生物中で変化してその正常な機能を維持せず、微生物の生育が阻害される分子を含む。例えば、例示的な薬物標的にはフルオロキノロン抗生物質の標的であるＤＮＡジャイラーゼおよびトポイソメラーゼ分子、リファンピンの標的であるＲＮＡポリメラーゼが含まれる（ヒース（Ｈｅａｔｈ  Ｒ，Ｊ．）ら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４；レヴィー（Ｌｅｖｙ  Ｃ，Ｗ，）ら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：３８３−４；マックミューリー（ＭｃＭｕｒｒｙ  Ｌ．Ｍ．）ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：５３１）。一つの実施態様では、薬物標的はＦａｂＩでない。
【００３６】
本明細書で用いる「ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ」にはＡｃｒＡＢポンプと関連し、それを含む、Ｅ．ｃｏｌｉのＡｃｒＡＢ流出ポンプと相同性を有する流出ポンプが含まれる。ＡｃｒＡＢポンプは耐性、小結節形成および分裂（ＲＮＤ）タイプのポンプである。ＲＤＮポンプは１２個の膜貫通ラセンを有する。ａｃｒＡおよびａｃｒＢ遺伝子はクローン化され、配列が決定されている（マーら、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：６２２９）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡｃｒＡＢの配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ００７３４として寄託されている。ＡｃｒＡＢ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉの他、他の細菌種中に別な相同体を有する。例えば、ＡｃｒＡＢ流出ポンプの相同体がＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ中（サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６８５５）、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｏｈｉｍｕｒｉｕｍ中（ニカイドウら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４６８６）に同定されている。ＡｃｒＡＢの相同体の例にはＭｔｒＣＤ、ＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭ、ＭｅｘＣＤ−ＯｐｒＪ、ＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮおよびＹｈｉＵＶが含まれる。この様な相同体を、ＡｃｒＡＢポンプと共通の相同性と構造に基づき、および／またはそれらが放出する化合物の類似性に基づき、通常の熟練を有する当業者が容易に同定し得る。他の微生物からの新規ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの単離を、公知の技術、すなわち核酸ハイブリダイゼーションおよび機能性クローニングを用いて行うことができる。
【００３７】
本明細書で用いる「ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤」とは、ＡｃｒＡＢ様ポンプが、この様な阻害剤がない場合は通常放出し得る化合物を放出する能力に干渉する化合物を言う。この様な阻害剤は例えばポンプを妨害することによりＡｃｒＡＢ様ポンプの活性を直接的に阻害し得るか、またはａｃｒＡ様および／またはａｃｒＢ様遺伝子の転写を減少することにより間接的に阻害し得る。単独で使用されたＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤は耐性および／または高耐性微生物の生育を阻害し得るか、または微生物が耐性である薬物の活性を抑制し得る。
【００３８】
本明細書で用いられる「非ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ」には、Ｅ．ｃｏｌｉのＡｃｒＡＢ流出ポンプに関連しない流出ポンプが含まれる。この様なポンプは例えば主要促進ポンプ、膜融合タンパク質およびＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）ポンプを含む。
【００３９】
本明細書で用いる、微生物の生育に関係する「生育」には、微生物の再生または菌数増加、例えば大きさの増大よりはむしろ数の増加が含まれる。この用語はまた、微生物の進行過程の代謝プロセス、例えば細胞が分裂していない時に細胞が生き続けるプロセスが含まれる。
【００４０】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」には、どの遺伝子が作動可能にプロモーターに結合しているかを容易に検出できる生成物をコードする任意の遺伝子が含まれる。作動可能に結合したとは、適当な条件下でＲＮＡポリメラーゼが制御領域のプロモーターに結合し、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を転写し続けることを意味する。好ましい実施態様では、レポーター遺伝子構築体はレポーター遺伝子に結合したプロモーターよりなる。しかしながら、ある実施態様では他の配列、例えば転写制御配列をレポーター遺伝子構築体に含むことが望ましい。例えば、プロモーター領域へのＲＮＡポリメラーゼの結合を変化させるか、またはｍＲＮＡの転写または伸長の開始に干渉することで、プロモーター活性の調節が行われる。従って、本明細書で転写制御要素または配列と総括される配列も、レポーター遺伝子構築体に含まれる。さらに、この構築体は得られたｍＲＮＡの翻訳を変化させ、それにより、レポーター遺伝子生産物の量を変化させるヌクレオチド配列も含み得る。
【００４１】
本明細書で用いる「試験化合物」と言う用語は、その化合物がＡｃｒＡＢ様流出ポンプの活性を変化させるかどうかを決定するために、本発明の分析を用いて試験される試薬を含む。１種以上の試験化合物、例えば複数の試験化合物を、そのＡｃｒＡＢ様流出ポンプの活性を調節する能力について、スクリーニング分析で同時に試験し得る。
【００４２】
本発明の分析で試験し得る化合物には抗生物質および非抗生物質化合物が含まれる。活性が試験できる試験化合物の例にはペプチド、非ペプチド化合物、核酸、炭水化物、小さい有機分子（例えばポリケチド）および天然物抽出物ライブラリーが含まれるが、それに限定されない。「非ペプチド化合物」と言う用語には、少なくとも一部が天然ペプチド結合に結合した、天然起源Ｌ−アミノ酸残基とは異なる分子構造でなる化合物が含まれる。しかしながら、「非ペプチド化合物」には、Ｄ−アミノ酸、非天然起源Ｌ−アミノ酸、修飾ペプチド骨格等のその全体または一部がペプチド類似の構造でなる化合物と共に、その全部または一部が天然ペプチド結合に結合した天然起源Ｌ−アミノ酸に関係しない構造でなる分子構造が含まれる。「非ペプチド化合物」には天然物も含まれる。
【００４３】
本明細書で用いる「指示薬化合物」と言う用語は、通常ＡｃｒＡＢ様流出ポンプで流出される化合物が含まれる。指示薬化合物は、試験化合物のＡｃｒＡＢ様流出ポンプの活性に対する効果を測定するためのＡｃｒＡＢ様流出ポンプ活性のマーカーとして用いられる。指示薬化合物の例には例えば抗生物質および色素が含まれる。
【００４４】
ＩＩ．ＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤
流出ポンプの既知の阻害剤を本発明の方法と組成物に使用することができる。阻害剤の例は以前にＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３２８５に記載されている（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−β−ナフチルアミドを含む）。流出ポンプ阻害化合物の試験法もその中に記載されている。その他の有用な阻害剤にはエタノール（濃度約４％）、メタノール、ヘキサンおよびミノサイクリンが含まれる。また別な阻害剤には、流出ポンプをコードする遺伝子に向けられるアンチセンス核酸およびリボザイムが含まれる。その他の流出ポンプ阻害剤の特性は例えばＷＯ９６／３３２８５に記載されている。
【００４５】
その他のＡｃｒＡＢ様流出ポンプの例には、例えばＡｃｒＡＢ遺伝子に結合し、その転写または翻訳を阻止するアンチセンス核酸が含まれる。流出ポンプに結合する抗生物質または流出ポンプの発現を制御するタンパク質は、他のクラスの阻害剤である。さらに別の阻害剤には、流出ポンプの発現を抑制する遺伝子、または流出ポンプの発現を調節する調節遺伝子座が含まれる。この様な遺伝子またはその発現生成物の量を増加させることで、微生物中の流出ポンプの発現を減少させることができる。
【００４６】
上記の様に、本発明は流出ポンプ（例えばａｒｃＡ）をコードする核酸分子、または流出ポンプ（例えばｍａｒＡ、ｒｏｂまたはｓｏｘＳ）の発現を制御する分子に選択的に結合する、オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス核酸を包含する。本明細書に用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス分子」と言う用語は、生理学的条件下で特定の遺伝子を有するＤＮＡおよび／またはその遺伝子に対するＲＮＡ転写体にハイブリダイゼーションし、その遺伝子の転写またはそのＲＮＡの転写を阻害するオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチド、または修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンス分子は標的遺伝子または転写体とハイブリダイゼーションすることにより、標的遺伝子の転写または翻訳を妨害する様に設計されている。当業者は、オリゴヌクレオチドの正確な長さとその標的との相補度が、標的の配列とその配列を含む特定の塩基を含む選ばれた特定の標的に依存することを理解し得ると思われる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが生理条件下で標的と選択的に結合する、すなわち生理条件下で標的細胞中のどの配列と結合するよりも実質的により強く標的配列に結合する様に構築されることが好ましい。関連する遺伝子の核酸配列に基づき、当業者はいくつかのアンチセンス分子の任意のものを容易に選択し合成し、本発明に従って使用することができる。阻害がのために充分に選択的かつ強力であるためには、この様なアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個の標的に相補的な塩基を有する必要があるが、ある場合は長さがわずか７塩基である修飾オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して成功することもある（ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４、１９９６）。アンチセンスオリゴヌクレオチドが２０〜３０塩基の相補配列を有することが最も好ましい。遺伝子またはＲＮＡ転写体の任意の領域に対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを選び得るが、好ましい実施態様ではアンチセンスオリゴヌクレオチドは翻訳開始、転写開始またはプロモーター部位等のＮ−末端または５'上流部位に対応する。さらに、３'−非翻訳領域を標的とすることもできる。さらに、ＲＮＡ二次構造が予想されず、タンパク質が結合するとは思われない部位をアンチセンスが標的とすることが好ましい。
【００４７】
ある実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは“天然”、すなわち非修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはその任意の組み合わせで構成され得る。すなわち、ある天然ヌクレオチドの５'末端および他の天然ヌクレオチドの３'末端が、天然系におけると同様にホスホジエステルヌクレオシド間結合を経て共有結合している。これらのオリゴヌクレオチドを、手動または自動シンセサイザーで実施し得る標準法で調製し得る。それらはまた、ベクターによる組換えでも製造し得る。
【００４８】
好ましい実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが“修飾”オリゴヌクレオチドも含み得る。すなわち、オリゴヌクレオチドを、天然起源オリゴヌクレオチドに対応する、標的とのハイブリダイゼーションを阻止せず、むしろその安定性または標的指向を増進し、治療効果を促進する様々な方法で修飾し得る。
【００４９】
本明細書で用いる“修飾オリゴヌクレオチド”と言う用語は、（１）そのヌクレオチドの少なくとも２個が合成ヌクレオシド間結合（すなわち、あるヌクレオチドの５'末端と別なヌクレオチドの３'末端間のホスホジエステル結合以外の結合）を経て共有結合しているオリゴヌクレオチド、および／または（２）通常は核酸に結合していない置換基がオリゴヌクレオチドに共有結合しているオリゴヌクレオチドを意味する。好ましい合成ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホアミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００５０】
“修飾オリゴヌクレオチド”と言う用語はまた、共有結合で修飾された塩基および／または糖を含む。例えば、修飾オリゴヌクレオチドには、３'位のヒドロキシ基以外の低分子量有機基、および５'位のホスフェート基以外に共有結合した骨格糖を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。従って、修飾オリゴヌクレオチドは２'−Ｏ−アルキル化リボース基も含み得る。さらに、修飾オリゴヌクレオチドはリボースの代わりにアラビノースを含むこともできる。従って、本発明は、１以上の担体と共に、生理条件下でｍａｒ／ｓｏｘ／ｒｏｂまたは流出ポンプポリペプチドと相補性である修飾アンチセンス分子を含む調製物を提供する。
【００５１】
上記の様に、本発明はさらに流出ポンプに対する選択的結合能を有する抗体または抗体の断片と共に、流出ポンプの発現を制御するポリペプチドの使用を包含する。“抗体”と言う用語は、通常の方法で調製されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはそれらの断片を含む。
【００５２】
従って、他の実施態様では、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプに対する抗体を流出ポンプ阻害剤として使用することができる。ポリクローナル抗流出ポンプ抗体を、適当な動物をＡｃｒＡＢ様流出ポンプ由来の免疫原で免疫することにより、上記の様に調製することが可能である。免疫動物中の抗流出ポンプ抗体力値を、免疫した流出ポンプを用いる酵素結合免疫検定分析（ＥＬＩＳＡ）等で経時的にモニターすることが可能である。所望であれば、流出ポンプを指向する抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離し、プロテインＡクロマトグラフィー等の公知の技術でさらに精製し、ＩｇＧ分画を得ることができる。免疫後の適当な時点で、すなわち抗流出ポンプ抗体力値が最高の時点で、抗体生産細胞を動物から採取し、コーラー（Ｋｏｈｌｅ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）が最初に記述したハイブリドーマ技術（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、１９８１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；ブラウンら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；イエー（Ｙｅ）ら、１９７６、ＰＮＡＳ７６：２９２７−３１；およびイエーら、１９８２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２９：２６９−７５も参照）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コツボー（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（コール（Ｃｏｌｅ）ら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７−９６頁）またはトリオーマ技術等の標準技術でモノクローナル抗体の調製するために使用し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は公知である（ケネス（Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｕｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮｗｅＹｏｒｋ、１９８０；レーナー（Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ）、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；ゲフター（Ｇｅｆｔｅｒ）ら、１９７７、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−３６参照）。簡単に言えば、不滅細胞系（典型的にはミエローマ）を上記の様に流出ポンプで免疫した哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾臓細胞）と融合し得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄液をスクリーニングしてＡｃｒＡＢ様流出ポンプに特異的に結合するモノクローン抗体を産出するハイブリドーマを同定する。
【００５３】
リンパ球と不滅化細胞系との融合に用いられる公知の多くのプロトコールの任意のものを、抗流出ポンプモノクローナル抗体を生成するために用いることができる（例えばガルフレ（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ）ら、１９７７、Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５０５２；ゲフター（Ｇｅｆｔｅｒ）ら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．上記；レルナー（ｌｅｒｎｅｒ）、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｍｅｄ．上記；ケネス（Ｋｅｎｎｅｔｈ）、Ｍｏｎｏｃｌａｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上記参照）。さらに、通常の熟練を有する研究者は、この様な方法の多くの有用な変法があることを認識し得ると考えられる。典型的には、不滅細胞系（例えばミエローマ細胞株）がリンパ球と同じ哺乳動物種から誘導される。例えば、マウスハイブリドーマを本発明の免疫原調製物で免疫したマウス由来のリンパ球と不滅化マウス細胞系を融合することにより作成できる。好ましい不滅細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミンを含む培地（ＨＡＴ培地）に感受性のマウスミエローマ細胞株である。数多くのミエローマ細胞株の任意のもの、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞株を、標準技術により融合パートナーとして使用し得る。これらのミエローマ細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてマウス脾臓細胞と融合する。次に融合で得られるハイブリドーマ細胞を、未融合および非生産性融合ミエローマ細胞を殺す（未融合脾臓細胞は形質転換されていないので、数日後に死滅する）ＨＡＴ培地を用いて選択する。本発明のモノクローン抗体を生産するハイブリドーマを標準ＥＬＩＳＡ分析を用い、ハイブリドーマ培養上澄で流出ポンプに結合する抗体をスクリーニングすることにより検出する。
【００５４】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するための別法として、モノクローナル抗流出ポンプ抗体を組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージ提示ライブラリー）を流出ポンプでスクリーニングして同定し単離し、流出ポンプに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することができる。ファージ提示ライブラリーを作成しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびスタラタジーン（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ）ＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージ表示キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体提示ライブラリーを作成しスクリーニングするのに特に使いやすい方法と試薬の例を、例えばラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、ＵＳ特許５、２２３、４０９；カング（Ｋａｎｇ）ら、ＷＯ国際公開ＷＯ９２／１８６１９；ダウエル（Ｄｏｗｅｒ）ら、ＷＯ国際公開ＷＯ９１／１７２７１；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、国際公開ＷＯ９２／１５６７９；ブレイトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）ら、国際公開ＷＯ９３／０１２８８；マックカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、国際公開ＷＯ９２／０１０４７；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）ら、国際公開ＷＯ９２／０９６９０；ランドナー（Ｒａｎｄｎｅｒ）ら、国際公開ＷＯ９０／０２８０９；フックス（Ｆｕｃｈｓ）ら、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２；ヘイ（Ｈａｙ）ら、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ３：８１−８５；フセ（Ｈｕｓｅ）ら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）ら、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ１２：７２５−７３４：ホーキンス（Ｈｏｗｋｉｎｓ）ら、１９９２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２２６：８８９−８９６；クラークソン（Ｃｌａｒｋｓｏｎ）ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８；グラム（Ｇｒａｍ）ら、１９９２、ＰＮＡＳ８９：３５７６−３５８０；ガラード（Ｇａｒｒａｄ）ら、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７；ホーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、１９９１、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；バルバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、１９９１、ＰＮＡＳ８８：７９７８−７９８２；およびマックガフェルティ（ＭｃＧａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０、３４８：５５２−５５４に見出すことができる。
【００５５】
さらに、標準組換えＤＮＡ技術を用いて製造し得る、ヒトおよび非ヒト部分を有するキメラおよびヒト型モノクローナル抗体等の組換え抗流出ポンプ抗体も本発明の範囲内である。この様なキメラおよびヒト型モノクローナル抗体を公知の組換えＤＮＡ技術、例えばロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；アキラ（Ａｋｉｒａ）ら、欧州特許出願１８４、１８７；タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ．）、欧州特許出願１７１、４９６；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、欧州特許出願１７３、４９４；ノイバオガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、米国特許４、８１６、５６７；キャビリーら、欧州特許出願１２５、０２３；ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１１０４３；リュー（Ｌｉｕ）ら、１９８７、ＰＮＡＳ８４：３４３９−３４４３；リューら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；サン（Ｓｕｎ）ら、１９８７、ＰＮＡＳ８４：２１４−２１８；ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、１９８７、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；シャウ（Ｓｈａｗ）ら、１９８８、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８０：１５５３−１５５９；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．）、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；オイ（Ｏｉ）ら、１９８６、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）、ＵＳ特許５，２２５，５３９；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２―５２５；ベルホーヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を用いて生産することができる。
【００５６】
ＩＩＩ．新規阻害剤のスクリーニング方法
一つの態様で、本発明はＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤のスクリーニング方法を提供する。この方法では、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを発現する微生物を試験化合物および指示薬化合物と接触させる。試験化合物とは、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを阻害する能力を試験される化合物である。指示薬化合物とは、通常ＡｃｅＡＢ様流出ポンプで流出される化合物である。本方法を用いて、試験化合物がＡｃｒＡＢ流出様ポンプの活性を阻害する能力が、指示薬化合物（例えばフルオロキノロンまたは染料）の細胞内濃度が試験化合物の存在で上昇するかどうかを測定して示される。指示薬化合物の細胞内濃度が、試験化合物がない場合の細胞内濃度に比べて試験化合物の存在で増加する場合、その化合物はＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤であると同定される。従って、微生物中に存在するＡｃｒＡＢ様流出ポンプが指示薬化合物を流出する能力に試験化合物が影響するかどうかを示すことにより、試験化合物がＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤であるかどうかを決定することができる。
【００５７】
指示薬化合物の“細胞内濃度”には、微生物の最外膜内の指示薬化合物の濃度も含まれる。微生物の最外膜とは例えば原形質膜である。グラム陰性菌の場合は、それに関係する“細胞内濃度”とは指示薬化合物が局在する細胞空間内、例えば指示薬化合物の標的を含む細胞空間の濃度である。
【００５８】
本発明の方法を用いて同定される阻害剤は、例えば立体阻害剤によりＡｃｒＡＢ様ポンプに直接作用するか、または例えばより遠距離作用に影響する、例えばポンプの発現に関与する遺伝子の転写を調節することにより、間接的に作用する。
【００５９】
一つの実施態様では、この方法は微生物中で化合物がフルオロキノロン耐性を減少させる能力を検出することを含む。例えば、一つの実施態様では、指示薬化合物はフルオロキノロンを含み、フルオロキノロンの細胞内濃度に対する試験化合物の微生物中の効果が測定される。一つの実施態様では、フルオロキノロンの細胞内濃度、例えば微生物相棒の抽出物中の増加を直接測定し得る。例えば、放射線標識フルオロキノロン、例えば［１４Ｃ−］シプロフロキサシンの蓄積を標準技術を用いて測定し得る。例えば、微生物を指示薬組成としての放射線標識フルオロキノロンと、試験化合物の存在または不在で接触させることができる。細胞内部のフルオロキノロンの濃度を、二つの群（試験化合物の存在または不在で）から収穫し、細胞に付随する放射能を液体シンチレーションカウンターで計数することにより、平衡状態で測定し得る。他の実施態様では、フルオロキノロンの細胞内濃度の増加を、例えば一定濃度のフルオロキノロンが微生物と接触した場合、試験化合物の存在で微生物の生育を充分に阻害するが、試験化合物の不在では阻害しないことを示すことにより、直接測定できる。
【００６０】
本発明の分析の一つの実施態様では、指示薬化合物の細胞内濃度が上昇したかどうかを決める工程は、指示薬化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の減少を測定することにより行われる。この様な分析は、例えば抗生物質耐性ディスク分析等の標準法を用いて行われる。
【００６１】
他の実施態様では、指示薬化合物の細胞内濃度の測定が、分光光度法で容易に検出し得る指示薬化合物を用いて促進される。この様な化合物は例えば塩基性色素等の色素またはフルオロフォアであり得る。指示薬化合物の例にはアクリジン、エチジウムブロマイド、ゲンチアンバイオレット、マラカイトグリーン、メチレンブルー、ベンジンバイオレット、ブロモチモールブルー、トルイジンブルー、ローズベンガル、アルシアンブルー、ルテニウムレッド、ファーストグリーン、アニリンブルー、キシレンッシアノール、ブロモフェノールブルー、クマシーブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、トリパンブルーおよびフェノールレッドが含まれる。
【００６２】
この様な分析では、細胞が指示薬化合物を放出する能力に対する試験化合物の効果を分光光度法で測定できる。例えば、色素またはフルオロフォアの細胞内濃度を、指示体化合物の懸濁媒体中の濃度を測定して、または細胞中の指示薬化合物の濃度を測定して間接的に測定できる。これは、例えば指示薬化合物を細胞から抽出して、または細胞自体の目視検査により行われる。
【００６３】
他の実施態様では、微生物中の指示薬化合物の存在を、指示薬化合物の存在に敏感なレポーター遺伝子を用いて検出できる。レポーター遺伝子の例は公知である。例えば、レポーター遺伝子により、指示薬化合物の存在を比色または酵素的に読み出すことができる。また別な実施態様では、その発現が微生物中の薬物の存在で誘導し得るレポーター遺伝子が使用できる。例えば、微生物は推定されるＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤があってもなくても薬物の存在で生育可能である。流出ポンプが阻害されている細胞では、薬物の濃度が増加し、リセプター遺伝子が発現する。この方法で、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤が、その薬物の流出速度を阻害する、従ってリセプター遺伝子発現を誘導する能力で同定される。
【００６４】
他の実施態様では、１次スクリーニング分析が使用され、関連する薬物を含まない指示薬化合物、例えばフルオロキノロンまたはトリクロサンが使用される。一つの実施態様では、試験化合物の細胞内濃度を増加させる試験化合物を同定すると２次スクリーニング分析が行われ、関連する薬物に対する同じ試験化合物の効果、例えばフルオロキノロン耐性が測定される。
【００６５】
他の態様では、本発明はＡｃｒＡＢ様流出ポンプを特異的に妨害する化合物のスクリーニング法を提供する。一つの実施態様では、その方法にはＡｃｒＡＢ様流出ポンプを試験化合物と指示薬化合物に接触させることを含む。次いで試験化合物は、先に述べた様にそのＡｃｒＡＢ様流出ポンプを妨害する能力が試験される。ＡｃｒＡＢ阻害剤の候補として同定された化合物の特異性が、その非ＡｃｒＡＢ流出ポンプを妨害する能力ついて試験される。ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを妨害し、非ＡｃｒＡＢ流出ポンプを妨害しない化合物を、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを特異的に妨害する化合物として同定することができる。
【００６６】
一つの実施態様では、本発明の方法でＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤であるとして同定された化合物の使用は、薬物耐性微生物または薬物耐性微生物から高度に薬物耐性微生物への発展を阻止する。
【００６７】
ＩＶ．薬物の抗微生物活性の増強法
本発明の一つの態様には、１種または複数の薬物に耐性である微生物を、微生物が耐性である薬物とＡｃｒＡＢ様流出ポンプに接触させることによる、薬物の抗微生物活性増強法が含まれる。一つの実施態様では、微生物を半ビボで薬物とＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤と接触させる。この方法は例えば、感染の拡大を防止するために表面を殺菌する、または微生物生育で汚染した表面を清浄にするのに用いることができる。微生物と接触させるために用いられる薬物は、非抗生物質薬剤であることが好ましい。好ましい実施態様では、微生物をトリクロサンおよびＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤と接触させる。
【００６８】
一つの実施態様では、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤および薬物を殺菌剤中、例えば耐性微生物と接触する洗浄製品または家庭用品中で組み合わせることができる。例えば洗浄製品を対象物（例えば石鹸またはローション）上で局所的に使用するか、表面の清浄化に使用し得る。一つの実施態様では、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤自体が殺菌剤である。
【００６９】
Ｖ．微生物感染の治療法
本発明の一つの実施態様では、微生物が耐性である薬物とＡｃｒＡＢ様流出ポンプの阻害剤を対象に投与することからなる、対象の薬物耐性感染の治療法が提供される。本明細書で用いる“投与”と言う用語は、薬物を対象に生体内および／または生体外で接触させることを含む。従って、流出ポンプ阻害剤と薬物を生体内治療のために投与するか、または局所的例えば皮膚または目に用いることができる。
【００７０】
一つの実施態様では、薬物は抗生物質、例えばフルオロキノロンである。他の実施態様では、薬物は非抗生物質組成物、例えばトリクロサンである。別な実施態様では、治療される感染は通常非抗生物質組成物で治療されるものである。他の実施態様では、治療される感染は通常非抗生物質組成物で治療されるものではない。
【００７１】
治療法の一つの実施態様では、流出ポンプ阻害剤と薬物が対象に別々に投与される。他の実施態様では、流出ポンプ阻害剤と薬物が同時に投与される。一つの実施態様では、薬物とＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害剤の同時投与は、流出ポンプ阻害剤と微生物が耐性である薬物でなる医薬組成物の投与で促進される。
【００７２】
対象に投与される流出ポンプ阻害剤の量は治療上有効な量、例えば流出ポンプ阻害剤が流出ポンプ活性を減少させるに十分な量である。薬物治療で恩恵を受けると思われる対象、例えば微生物に感染し手いる対象に投与される流出ポンプ阻害剤の投与量は、通常の熟練を有する当業者が容易に決定することができる。理想的には、投与される流出ポンプ阻害剤の投与量は流出ポンプ活性を減少させるに充分であると考えられ、薬物の標準投与量は、例えば微生物生育を阻害して対象に恩恵を与える結果となる治療効果を有する。“治療効果”と言う語句は、対象の症状を軽減するか、生存期間を延長することを意味する。好ましい実施態様では、治療効果は微生物感染の排除である。
【００７３】
一つの実施態様では、対象は鳥類、例えばニワトリまたは七面鳥である。他の実施態様では、対照はウマ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌまたはネコ等の哺乳動物である。好ましい実施態様では対象はヒトである。
【００７４】
一つの実施態様では、対象への感染が予防的に治療される。“予防的”治療と言う用語はまだ感染していないが、感染し易い、または感染の危険がある対象を治療することを意味する。一つの実施態様では、流出ポンプ阻害剤を感染体に暴露される前に投与する。他の実施態様では、対象が薬物耐性微生物に暴露される前に流出ポンプ阻害剤を対象に投与する。“治療”処置と言う用語は、すでに感染している対象に化合物を投与することを言う。
【００７５】
一つの実施態様では、流出ポンプ阻害剤および／または薬物をプロドラッグの形で、例えば細胞内で修飾されて流出ポンプ阻害剤またはフルオロキノロンの活性型を生成する形で投与される。
【００７６】
この様な化合物の毒性および治療効率を、例えばＬＤ５０（試験群の５０％に対する致死投与量）およびＥＤ５０（試験群の５０％が有効に治療される投与量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準薬学手順で決定できる。毒性および治療効果の投与量比は治療指数と呼ばれ、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表現される。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養分析および動物試験で得られるデータを、ヒトの対象に使用するための投与量範囲の調剤に用いることができる。この様な化合物の投与量は、毒性がないかごくわずかであるＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、採用された投与形式と利用する投与経路によって、この範囲で変化する。例えば、一つの実施態様では、流出ポンプ阻害剤の治療時の血清濃度は０．１〜１００μｇ／ｍｌである。
【００７７】
ＶＩ．微生物
フルオロキノロン耐性に影響する、本発明の分析に使用する物質源、または生育阻害の標的としての化合物を試験するために使用するには、様々な異なった微生物が適している。“微生物”と言う用語は、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプを有する任意の微生物が含まれ、好ましくは細菌、カビまたはプロトゾアを含む単細胞微生物である。他の実施態様では、本発明で使用するに適した微生物は多細胞微生物、例えば寄生虫またはカビである。好ましい実施態様では、微生物はヒト、動物または植物に対して病原性である。従って、これらの開示された微生物の任意のものを無傷の細胞、または本明細書で述べる無細胞分析の溜めの材料源として使用し得る。
【００７８】
好ましい実施態様では、クレームされた方法で使用するための微生物はグラム陰性またはグラム陽性菌である。好ましい実施態様では、抗生物質に対し耐性になる、例えばＭＤＲを示す任意の細菌がクレームされた方法で使用するに適している。
【００７９】
好ましい実施態様では、試験に適した微生物はＥｂｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ属由来である。好ましい実施態様では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａおよびＥｒｗｉｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａよりなる群より選択された属がクレームされた分析に使用される。
【００８０】
さらに別な実施態様では、試験される微生物はグラム陽性菌であり、Ｌａｃｔｏｂａａｃｉｌｌｕｓ、Ａｚｏｒｈｕｚｏｂｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｂｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂｉｂｒｉｏ、Ｓｈｐｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｓｓｕａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓよりなる群より選択された属由来である。
【００８１】
また別な実施態様では、試験される微生物は例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来の抗酸菌である。
【００８２】
また別な実施態様では、試験される微生物は例えばＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓよりなる群より選択された属由来である。
【００８３】
他の実施態様では、試験される微生物はカビである。好ましい実施態様では、カビは例えばＭｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓまたはＣａａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ等のＭｕｃｏｒまたはＣａｎｄｉｄａ属由来である。
【００８４】
また別な実施態様では、試験される微生物は原生動物である。好ましい実施態様では、微生物はｍａｌａｒｉａまたはｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ寄生虫である。
【００８５】
一つの実施態様では、微生物は１種以上の薬物に耐性である。好ましい実施態様では、微生物は１種以上の薬物に耐性が高い。一つの実施態様では、薬物は抗生物質である。好ましい実施態様では、薬物はフルオロキノロンである。他の実施態様では、薬物は非抗生物質薬剤である。他の実施態様では、薬物はトリクロサンである。一つの実施態様では、微生物は微生物が耐性である薬物の標的である遺伝子、例えばトポイソメラーゼ、ジャイラーゼまたはｆａｂＩ遺伝子の突然変異を含む。他の実施態様では、微生物はトポイソメラーゼ、ジャイラーゼまたはｆａｂＩ遺伝子の少なくとも２個に突然変異を含む。
【００８６】
ＶＩＩ．試験化合物
本発明の方法における試験用の化合物を様々な異なった、既知または新規の起源から導くことができる。一つの実施態様では、ＡｃｒＡＢ様ポンプ妨害剤を同定するために、化合物のライブラリーが本発明の方法で試験される。好ましい実施態様では、環境保護庁（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）により一般に安全であると見なされる化合物（ＧＲＡＳ）のリスト間の化合物が本発明の方法で試験される。一つの実施態様では、ＡｃｒＡＢ様流出ポンプ阻害はそれ自体がポンプの基質である。
【００８７】
薬物化学の最近の動向には、ライブラリーと呼ばれる化合物の混合物の製造が含まれる。ペプチドのライブラリーは当業界で十分に確立されているが、新しい技術が開発され、他の化合物の混合物の製造が可能になっている。それらはベンゾジアゼピン（ブーニン（Ｂｕｎｉｎ）ら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；デウイット（ＤｅＷｉｔｔ）ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９）、ペプトイド（ツッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ）、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）、オリゴカルバメート（チョー（Ｃｈｏ）ら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３）およびヒダントイン（デウィットら、上記）である。レベック（Ｒｅｂｅｋ）らは１０４〜１０５の差の小さい有機分子の分子ライブラリー合成に対するアプローチを記載している（カレル（Ｃａｒｅｌｌ）ら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；カレルら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１）。
【００８８】
本発明の分析におけるスクリーニングのための化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、脱コンボルーションを必要とする合成ライブラリー法、１ビーズ１化合物ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法を含む公知のコンビナトーリアルライブラリー法の様々なアプローチの任意のものを用いて得られる。生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限られるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用可能である（ラム（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ＤｒｕｇＤｅｓ．、１９９７、１２：１４５）。
【００８９】
活性をスクリーニングし得る化合物の例にはペプチド、核酸、炭水化物。小有機分子（例えばポリケチド：ケーン（Ｃａｎｅ）ら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３）および天然物抽出ライブラリーが含まれるが、それに限定されない。一つの実施態様では、試験化合物はペプチドまたはペプチド類似化合物である。他の実施態様では、化合物は小さな有機非ペプチド化合物である。
【００９０】
分子ライブラリー合成のための他の方法の例は文献中、例えばエルブ（Ｅｒｂ）ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１１４２２；ホーエル（Ｈｏｗｅｌｌ）ら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｐａｈｍａｃｏｌｏｇｙ３３：６８；およびギャロップ（Ｇａｌｌｏｐ）ら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出される。化合物のライブラリーは溶液中（例えばフーテン（Ｈｏｕｔｅｎ）、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：４１２−４２１）またはビーズ（ラム、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４）、チップ（フォドール（Ｆｏｄｏｒ）１９９３、ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５−５５６）、バクテリア（ランダーＵＳＰ５、２２３、４０９）、胚芽（ランダーＵＳＰ‘４０９）、プラスミド（カル（Ｃｕｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９）上、またはファージ（スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０；デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６；クヴィルラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；フェリシ（Ｆｅｌｉｃｉ）、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０；ランダー、上述）上に提示される。他のタイプのペプチドライブラリーも発現する。例えばＵＳ特許５、２７０、１８１参照。また別な実施態様では、組み合わせペプチドをｃＤＮＡライブラリーから製造することができる。
【００９１】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本発明は治療上有効投与量の流出ポンプ阻害、および１種以上の医薬上許容される担体（添加剤）および／または希釈剤を含む、医薬上許容される組成物を提供する。組成物には第２の抗菌性物質、例えば抗菌性化合物、好ましくはフルオロキノロン等の抗生物質を含むことができる。
【００９２】
以下に詳細に述べる様に、医薬組成物を、以下に用いられるものを含む固体または液体の形で投与するために調剤することができる：（１）経口投与、例えば飲み薬（水溶液または非水溶液、または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末、顆粒、ペースト；（２）非経口投与、例えば皮下、筋肉内または静脈内注射、または例えば消毒液または懸濁液；（３）局所投与、例えば皮膚に施すクリーム、軟膏、またはスプレー；（４）例えばペッサリー、クリーム、フォームまたは座薬として膣内または直腸内投与；または（５）例えば化合物を含む水性エアゾル、リポソーム製剤または固体粒子としてのエアゾル。
【００９３】
本明細書で用いる“医薬上許容される担体”という語句は、固体または固体充填剤、希釈剤、溶剤またはカプセル化物質等の薬学的に許容し得る物質、組成物またはビヒクルを意味し、一つの器官または体の一部から他の器官または体の一部へ、その生物的効果に影響を与えずに本発明の抗菌性薬物または化合物を運送または移動することに関与している。各担体は化合物の他の内容物と適合し、対象に無害であるという意味で“許容される”必要がある。医薬上許容される担体として作用する物質の例には（１）ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖、（２）コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン、（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体、（４）トラガカント粉末、（５）モルツ、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバターおよび座薬ワックス等の賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油等のオイル、（１０）プロピレングリコール等のグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）無パロジェン水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、（２１）および医薬組成物に用いられる無毒性適合物質が含まれる。例えばレクチン等の被覆剤を用いて分散剤の場合は必要な粒径を保つことにより、または界面活性剤を用いることにより、適切な流動性が維持される。
【００９４】
組成物は保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤等のまた別な薬物も含み得る。微生物の働きの防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌剤および抗カビ剤を含むことによって保証される。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物中に含むことも望ましい。さらに、注射可能な医薬の形の長期吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収遅延剤を含ませることによって可能になる。
【００９５】
ある場合は、薬の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射の薬の吸収を遅らせることが望ましい。このことは、水溶性に乏しい結晶質または非晶質物質を使用する液状懸濁物を用いて行われる。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存するが、結晶の大きさおよび結晶形にも依存する。また、非経口投与薬物の遅延吸収が薬物をオイルビヒクル中に溶解または懸濁することで行われる。
【００９６】
本発明の医薬組成物を体の上皮表面へ経口、非経口、局所、経直腸、径鼻、膣内、槽内で投与し得る。薬物は当然、各投与経路に適した形で与えられる。例えば、錠剤またはカプセルの形、注射、吸入、目薬、軟膏により投与され、注射、輸液または吸入により投与され、ローションまたは軟膏により局所投与され、直腸または膣座薬として投与される。
【００９７】
本明細書に用いられる“非経口投与”および“非経口的に投与する”という語句は、消化管および局所投与以外の投与法を意味し、通常は注射を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、皮下、表皮下、耳介内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射または点滴を含むがそれに限定されない。
【００９８】
本明細書で用いる“全身投与”、“全身投与する”、“末梢投与”、“末梢投与する”という語句は、スクロースオクタサルフェートおよび／または抗菌または避妊薬、中枢神経系へ直接投与する以外の医薬または他の物質が対象の生体系に入り、それにより代謝または同様の過程を受ける投与、例えば皮下投与を意味する。
【００９９】
ある方法では、本発明の組成物を任意の上皮表面に局所的に投与することができる。本発明による“表皮表面”とは、体の外部表面または皮膚および粘膜表面を含むがそれに限定されない空洞構造を覆う、組織の領域であると定義される。この様な皮膚表面は口蓋、咽頭、食道、肺、眼、耳、鼻、頬、舌、膣、子宮、尿生殖器、消化管および肛門表面を含む。
【０１００】
組成物を局所投与に用いられる様々な従来の形に製剤することができる。これらには例えば液体溶液または懸濁液、潅腸剤、浣腸剤、ゲル、クリーム、エマルジョン、ローション、スラリー、粉末、スプレー、口紅、フォーム、ペースト、歯磨、軟膏、膏薬、バルサム剤、ドロップ、トローチ、チューインガム、糖錠、うがい液等の半固体および液体製剤が含まれる。
【０１０１】
局所投与用の従来から用いられる担体にはペクチン、ゼラチンおよび／またはその誘導体、ポリ乳酸またはポリグリコール酸またはそのコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは酸化セルロース等のセルロース誘導体、グアーガム、アカシアガム、カラヤガム、トラガカントガム、ベントナイト、寒天、カーボマー、ブラッダーラック、セラトニア、デキストリンおよびその誘導体、カッチガム、ヘクトライト、イスパグラ殻、ポリビニルピロリドン、シリカおよびその誘導体、キサンタンガム、カオリン、タルク、デンプンおよびその誘導体、パラフィン、水、植物および動物油、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、エタノール、プロパノール、プロピレングリコール（グリコール、アルコール）、不揮発油、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、マグネシウムまたはカルシウム塩（塩化物、炭酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、グルセプ酸塩または酒石酸塩）が含まれる。
【０１０２】
この様な組成物は例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ等の望ましくない細胞を治療または予防する、または庖疹を含む口腔感染、目、皮膚または下部腸管の感染の治療または予防に特に有用である。局所剤に対する標準組成物戦略を、薬物の持続および滞留時間を増進し、達成する予防効率を改善するために、抗菌性化合物、またはその医薬上許容されるその塩に適用することができる。
【０１０３】
下部腸管または膣に用いられる局所投与では、直腸座薬、適当な潅腸剤、ゲル、軟膏、溶液、懸濁液または挿入剤が用いられる。局所経皮パッチも用いることができる。経皮パッチは、本発明の組成物の身体への配送を制御できる利点がある。この様な製剤形式は、薬物を適当な媒体中へ溶解または分散して作成できる。
【０１０４】
本発明の組成物を直腸または膣投与のために座薬の形で投与することができる。これらは、薬物を室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って直腸または膣で融けて薬物を放出する、適当な非刺激性担体と混合して調製される。この様な材料にはココアバター、蜜蝋、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチル酸塩が含まれ、それらは室温では固体であるが身体温度では液体であり、従って直腸または膣空腔で融けて活性薬物を放出する。
【０１０５】
膣投与に適した組成物には、適当であることが公知である担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、フィルム、またはスプレー組成物も含まれる。スクロースオクタサルフェート／避妊薬製剤に用いられる担体は、膣投与および／または避妊具の被覆に適合しなければならない。ダイアフラム、ゼリー、ドウチ、フォーム、フィルム、軟膏、クリーム、バルサム、ゲル、ペースト、スラリー、膣座薬、性交潤滑剤、およびコンドーム、避妊スポンジ、頚部キャップおよび／またはダイアフラム等の固体、半固体および液体製剤中で組み合わせが可能である。
【０１０６】
眼経の投与では、医薬組成物は塩化ベンジルアルコニウム等の保存剤を含む、または含まない等張のｐＨ調製滅菌食塩水中のミクロ懸濁物、または等張のｐＨ調製滅菌食塩水溶液として製剤される。または、眼科用として、組成物は石油等の軟膏として製剤される。組成物の例には眼科用軟膏、粉末、溶液等が含まれる。
【０１０７】
スクロースオクタサルフェートおよび／または抗生物質または避妊薬に加えて、粉末およびスプレーはラクトース、タルク、サリシル酸、水酸化アルミニウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。スプレーはさらにクロロフルオロ炭化水素およびブタンおよびプロパン等の揮発性無置換炭化水素等の通常のプロペラントを含むことができる。
【０１０８】
通常、水性エアゾルが、通常の医薬上許容される担体および安定剤を含む水溶液または懸濁液を製剤して作成される。担体および安定剤は特定の化合物の要請によって変化するが、典型的には非イオン性界面活性剤（ツイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール）、血清アルブミン等の接種用タンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レクチン、グリシン等のアミノ酸、緩衝剤、塩、糖または糖アルコールを含む。エアゾルは通常、等張溶液から調製される。
【０１０９】
本発明の組成物を、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、糖錠（通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントガム等の呈味基剤）、粉末、顆粒を含むがそれに限定されない経口で許容し得る製剤形式で、または水溶液または非水溶液中の懸濁液として、または油／水または水／油液体エマルジョンとして、またはエリキシルまたはシロップとして、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアガム等の不活性基剤を用いて）および／またはうがい薬として投与し得るが、それぞれは所定量のスクロースオクタサルフェートおよび／または抗生物質または避妊薬を活性成分として含んでいる。化合物を巨丸剤、舐剤またはペーストとして投与できる。経口用の錠剤の場合は、通常用いられる担体にはラクトースおよびコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も典型的には添加される。カプセル型の経口投与では、有用な基借財にはラクトースおよび乾燥コーンスターチが含まれる。経口用に水性懸濁液が必要な場合、活性成分がエマルジョン化および懸濁剤と組み合わされる。必要あれば、ある種の甘味、芳香剤または着色剤も添加される。
【０１１０】
錠剤、および糖衣剤、カプセル、ピルおよび顆粒等の他の固体製剤を、医薬製剤技術で公知の消化器被覆または他の被覆等の被覆および核付きで打ち出しまたは調製できる。それらはまた、例えば所定の放出プロフィルを与える様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、その中の活性成分を徐々に放出または放出制御する様に製剤し得る。それらは例えばバクテリア保持フィルターを通す濾過、または滅菌水に可溶の滅菌固体組成物の形の殺菌剤、または使用直前に他の滅菌注入媒体を加えて滅菌することができる。これらの組成物はまた随意に不透明化剤を含み、活性成分のみを放出する、または好ましくは腸管のある部分で随意に遅延放出する組成物でもあり得る。使用可能な埋め込み組成物の例にはポリマー物質およびワックスが含まれる。活性成分はまた、１種または複数の上記賦形剤でミクロカプセル化された形でもよい。
【０１１１】
経口投与用の液体製剤には薬学的に許容し得るエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップまたはエリキシルが含まれる。活性成分に加え、液体製剤は例えば水またはエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、ピーナッツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、カスター油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびそれらの混合物等の他の溶剤および可溶化剤および乳化剤等の当業界で通常用いられる不活性希釈剤を含むことができる。
【０１１２】
不活性希釈剤の他、経口組成物は湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、芳香剤、着色剤、香料および保存剤等のアジュバントも含むことができる
【０１１３】
抗菌剤に加え、懸濁液は例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタハイドロキサイド、ベントナイト、寒天およびトラガカントガム、および／またはそれらの混合物等の懸濁剤を含み得る
【０１１４】
本発明の滅菌注射製剤は水性または油性懸濁液である。懸濁液を、適当な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の技術で製剤し得る。湿潤剤、乳化剤およびラウリル硫酸ナトリウムおよびステア燐酸マグネシウム等の潤滑剤に加え、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、芳香剤および香料、保存剤および抗酸化剤も組成物中に存在し得る。
【０１１５】
滅菌注射製剤は例えば１、３−ブタノール中の溶液等の無毒性の非経口で許容し得る希釈剤または溶媒中の滅菌用注射液または懸濁液であってもよい。使用し得る、許容し得るビヒクルおよび溶剤には水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌非揮発性油が溶剤または懸濁媒体として通常用いられる。この目的では、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の軟質非揮発油を使用し得る。オレイン酸およびそのグリセリド等の脂肪酸が、特にそのポリオキシ化誘導体が、オリーブ油またはカスター油等の天然の医薬上許容されるオイルと同様に注射液の調合に有用である。これらのオイル溶液または懸濁液は長鎖アルコール希釈剤または分散剤も含み得る。
【０１１６】
アンチセンス核酸分子であるＡｃｒＡＢ流出ポンプ阻害剤の場合は、オリゴマー投与の最適コースは所望の結果または治療する対象によって変化し得る。本発明文脈で言う“投与”とは細胞をオリゴマーと接触させることを言う。アンチセンス分子の投与量は、例えばＲＮＡの安定性の読み出しまたは治療応答で測定される、標的ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の発現を最適に減少させる様に、不必要な実験を行わずに調節し得る。例えば、核酸標的でコードされたタンパク質の発現を測定して、それに従って投与療法を調製する必要があるかどうかを決定する。さらに、細胞内、または細胞で製造されたＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの増加または減少を、当業界で認められた技術を任意の用いて測定できる。転写が減少したかどうかを決定することにより、標的ＲＮＡの分解も含めてアンチセンス分子の有効性を決定できる。
【０１１７】
本明細書で言う“医薬上許容される担体”には適当な溶剤、分散媒体、被覆、抗菌性および抗カビ剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。医薬的活性物質に対するこの様な媒体および薬物の使用は公知である。従来の媒体または薬物が活性成分と不適合である場合を除き、それを治療用組成物に用いることができる。補助活性成分も組成物に加えることができる。
【０１１８】
アンチセンス分子をリポソームまたはポリエチレングリコール変性リポソームまたはカチオン性脂質との混合物を非経口投与のために加えてもよい。リポソームへのさらに別な物質、例えば特定の標的微生物上に見出される膜タンパク質に対し反応性の抗体の配合は、アンチセンス分子が特定の細胞型を標的にするのを助ける。
【０１１９】
さらに、例えばラタイザク（Ｒａｔａｉｃｚａｋ）ら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８９：１１８２３−１１８２７）が記載している様に、本発明のオリゴマーを投与するために、本発明はこの様なアンチセンス分子を連続的に点滴する浸透圧ポンプを備えている。この様な浸透圧ポンプは、例えばアルゼット社（Ａｌｚｅｔ  Ｃｏ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。カチオン性脂質担体中の局所投与および非経口投与が好ましい。
【０１２０】
生体内投与に関して、本発明の製剤を選ばれた投与経路に適した様々な形、すなわち非経口、経口または腹腔内で対象に投与し得る。好ましい非経口投与には以下の経路による投与が含まれる：静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、眼球内、滑液包内、経皮膚を含む経上皮、吸入を経由する肺、眼、舌下および頬、眼を含む局所、皮膚、眼球、直腸、およびガス注入を含む鼻吸入。非経経路中で静脈内投与が好ましい。
【０１２１】
非経口投与用の医薬製剤には、水溶性または水分散性の形の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、適当な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与することもできる。適当な親油性溶剤またはビヒクルは脂肪酸、例えばゴマ油、または合成脂肪酸、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射用懸濁液には懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランが含まれ、随意には懸濁液は安定剤を含み得る。
【０１２２】
薬物送達ビヒクルを例えば生体外、全身、または局所投与用に選択することができる。これらのビヒクルは徐放容器として働く様に、またはその内容物を標的細胞に配送する様に設計することが可能である。ある種の直接送達薬物ビヒクルを使用する利点は、服薬毎に複数の分子が送達されることである。この様なビヒクルは、そうでなければ迅速に血流から消失する薬物の循環半減期を延長することが知られている。この分類に入る、この様な特殊な薬物送達ビヒクルの例には、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアがある。
【０１２３】
記載されたアンチセンス分子を全身的に対象に投与し得る。全身吸収とは、薬物が血流中に入り、次いで全身に分布することを言う。全身投与を行う投与経路には静脈内、皮下、腹腔内、および経鼻がある。この様な送達経路のそれぞれは、アンチセンス分子を接近し得る病変細胞へ送達する。皮下投与に続き、治療薬は局所リンパ球へ沁み出し、リンパネットワークを通って循環系に入る。循環系へ入る速度は分子量または分子サイズの関数であることが示されている。リポソームまたは他の薬物、担体の使用により、アンチセンス分子がリンパ節に局在化する。アンチセンス分子は細胞内へ拡散する様に修飾されるか、またはリポソームが未修飾または修飾オリゴマー細胞内への送達に関与する。
【０１２４】
予防目的の用途では、微生物との物理的接触前に本発明の治療用組成物を適用する。物理的接触前の適用のタイミングを、化合物の予防効果を最大にするために最適化することができる。適用のタイミングは投与法、投与される上皮表面、表面積、投与量、上皮表面のｐＨ下での組成物の安定性と有効性、投与の頻度、例えば一回投与か複数回投与かにより変化すると考えられる。適用のタイミングを組成物の一回投与で充分である様に決めることが好ましい。当業者は、化合物の予防効果を最大にする様に、最も適当な時間間隔を決定し得ると考えられる。
【０１２５】
通常の熟練を有する当業者は、必要な医薬組成物の有効量を決定し処方することができる。例えば、所望の治療効果を得るために必要以下のレベルの投与量で出発し、所望の効果を達成するまで徐々に投与量を増加させる。一般に、本発明の組成物の適当な毎日の投与量は、治療効果を得るに有効な最低投与量である組成物のその量である。この様な効果的な投与量は、一般に上記の因子に依存すると思われる。投与は静脈内、冠状動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましい。
【０１２６】
本発明の実施には、特に指定されない限り、当業界の技術範囲である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術が用いられる。この様な技術は文献に十分に説明されている。例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）ら編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ。Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．）ら編（Ｗｉｌｅｙ、ＮＹ、１９５５）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第Ｉ巻および第ＩＩ巻（グローバー（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ）ら、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４）；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、ＵＳ特許４、６８３、１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ハーメス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）およびヒギンス（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）およびウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（ワイヤー（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ）およびブラックウエル（Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、１９８６）；およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．）、Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９７２）。
【０１２７】
本出願を通じて引用した全ての参照文献、係属特許出願および公開特許は本命最初に参照文献として明白に取り込まれている。
【０１２８】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、それは本発明をさらに制約するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１はシプロフロキサシン（ＣＩＰ）の活性化細胞による蓄積を示す。生体外でＥ．ｃｏｌｉ−Ｋ１２株ＡＧ１００およびＡＧ１１２より誘導されたフルオロキノロン耐性変異株による［１４Ｃ−］シプロフロキサシンの取り込みを、１０μＭシプロフロキサシン添加後に平衡状態で３０℃で分析した。細胞は野生型ａｃｒＡＢ遺伝子を有する（実線バー）か、またはａｃｒＡＢ欠失（点線バー）であった。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
実施例
実施例１．ＡｃｒＡＢポンプによる流出を阻止することは、薬物標的遺伝子に染色体突然変異を有する微生物を薬物感受性にする。
ＡｃｒＡＢ複数薬物流出ポンプがない場合のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのジャイラーゼ突然変異の無効性
フルオロキノロン［ＦＱ］は野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの生育をきわめて低い濃度で阻害する。ＦＱ流出が野生型Ｅ．ｃｏｌｉに存在するが、臨床耐性の発達中に増進する場合以外はその重要性は最低である。ｍａｒおよびｓｏｘレギュロンの制御下にあるＡｃｒＡＢ流出ポンプの、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＱに対する感受性と臨床耐性のレベルについての役割を理解するため、ＦＱ耐性を有する二系列のＥ．ｃｏｌｉＫ−１２細胞（野生型ＡＧ１００および同質遺伝子型Ｍａｒ突然変異体ＡＧ１０２由来）をオフロキサシン［ｏｆｘ］含有プレート上での生体外増幅で生成し、耐性突然変異株の性格付けを行った。ＡｃｒＡＢをノックアウトするため、Ｐ１形質導入を用いた。放射線標識シオウロフラキシン［ｃｆｘ］細胞全体へのエネルギー依存性取り込みを、ＡｃｒＡＢの存在および不在で測定し、ｏｆｘＭＩＣをブロスミクロ希釈で測定した。ＡＧ１００では、ｏｆｘ耐性が４段階で０．０３ｍｇ／ｌから４ｍｇ／ｌに増進した（１２８倍）が、各段階には（発生の順序で）ｇｙｒＡ突然変異、ｍａｒ突然変異、未同定突然変異、および第２ｇｙｒＡ突然変異が含まれていた。Ｍａｒ突然変異体から出発し、ＡＧ１０２を０．１２５ｍｇ／ｌから８ｍｇ／ｌへ（６４倍）の３段階で増幅したが、それには１個のｇｙｒＡ突然変異と２個の未同定突然変異が含まれていた。ＡｘｒＡＢのノックアウトによりＭＩＣが４から１２８倍減少し、トポイソメラーゼ突然変異で媒介される耐性が劇的に減少した。ｏｆｘＭＩＣ  ±  ＡｃｒＡＢは以下の通りであった（ｍｇ／ｌ）：ＡＧ１００シリーズ：０．０３／＜０．０１５、０．２５／０．０６、１．０／０．０６、２．０／０．０６、４．０／０．１２６；ＡＧ１０２シリーズ：０．１２６／＜０．０１５、１．０／０．０６、４．０／０．０６、８．０／０．０６。ｃｆｘの能動流出がＡｃｒＡＢ流出ポンプの存在で見られた。しかしながら、活性化されたＡｃｒＡＢ欠失突然変異体における薬物蓄積は脱活性細胞中のものと同等、すなわち流出はＡｃｒＡＢの欠失で完全に消失した。従って、ＡｃｒＡＢ複数薬物流出ポンプは、単にそれだけでないとしても、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｆｘの細胞内濃度を制御する主要な流出ポンプである。それが存在しない場合、高細胞内薬物濃度により、トポイソメラーゼ突然変異は臨床ＦＱ耐性を達成する上で相対的に無効になる。
【０１３１】
ＡｃｒＡＢ流出ポンプの欠失は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのジャイラーゼ突然変異体におけるフルオロキノロン耐性を減少させる
フルオロキノロン耐性突然変異体を野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＫ１２株から選び、そのＭａｒ突然変異体を固体培地上でオフロキサシンのレベルを上げて段階的に暴露した。放射線標識シプロフロキサシンによるノーザン（ＲＮＡ）ブロット分析による突然変異段階の解析、配列決定および蓄積の研究から、標的遺伝子ｇｙｒＡにおける突然変異、調節遺伝子ｍａｒＲおよび別な、ＡｃｒＡＢ媒介シプロフロキサシン流出に影響すると思われる未同定の遺伝子のすべてがフルオロキノロン耐性に寄与していることが示された。ＡｃｒＡＢ遺伝子座の不活化により、全ての種がフルオロキノロンおよびいくつかの他の関係しない薬物に過剰感受性になった。これらの研究は、ＡｃｒＡＢ流出ポンプの野生型機能がトポイソメラーゼで媒介される臨床フルオロキノロン耐性の発現に必要であることを示した。
【０１３２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるフルオロキノロン［ＤＱ］耐性は薬物、すなわちＤＮＡジャイラーゼ（フーパー（Ｈｏｏｐｅｒ  Ｄ．Ｃ．）ら、１９８７、Ｔｈｅ  ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ８２：１２−２０；ピドック（Ｐｉｄｄｏｃｋ  Ｌ．Ｊ．Ｖ）、１９９５、Ｄｒｕｇｓ４９：１９−３５）、およびトポイソメラーゼＩＶ（ヘーシング（Ｈｅｉｓｉｎｇ、Ｐ．）、１９９６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：８７９−８８５）の標的タンパク質の突然変異で起こり得る。ｍａｒＡ（コーエン（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｐ．）ら、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：１４８４−１４９２；コーエン、１９８９、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｒ．３３：１３１８−１３２５）またはｓｏｘ（アマビル（Ａｍａｂｉｌｅ−Ｃｕｅｖａｓ、Ｃ．Ｆ）およびデンプル（Ｄｅｍｐｌｅ、Ｂ．）、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ１９：４４７９−４４８４）等の調節遺伝子に影響する突然変異も耐性をもたらす。後者の遺伝子は取り込みを減少させるか、および／または薬物の流出を増加させて細胞内薬物濃度を調節する（アレクシャン（Ａｌｅｋｓｈｕｎ、Ｍ．Ｎ．）およびレービー（Ｌｅｖｙ、Ｓ．Ｂ．）、１９９７、Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：２０６７−２０７５）。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＭａｒＡの過剰発現によりＯｍｐＦポリンの発現が減少し（コーエンら、１９８８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５４１６−５４２２）、ＡｃｒＡＢ発現を増加し（オークス（Ｏｋｕｓｕ、Ｈ．）ら、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０６−３０８）、そのために多数の抗菌剤に対する耐性を得る（アレクシャンおよびレービー、１９７７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｇｅｍｏｔｈｅｒ．４１：２０６７−２０７５）。高レベルの臨床的に重要なＦＱ耐性を導く一連の出来事はまだほとんど理解されていない。母体となる株を通常単離できないので、臨床的ＦＱ耐性株に関する研究の支援は限られている。生体外で選択された突然変異株での研究は、フェノタイプの差（ＭＩＣの外膜のプロフィル、フルオロキノロンの蓄積）の記述に限られるか、またはキノロン耐性（ＱＲＤＲ）を決めるｇｙｅＡおよび／またはｐａｒＣの領域の突然変異に絞られていた（ヘーシング（Ｈｅｉｓｉｎｇ、Ｐ．）、１９９６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：８７９−８８５；ピドック（Ｐｉｄｄｏｃｋ、Ｌ．Ｊ．Ｖ．）ら、１９９１、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２８：１８５−１９８；テネー（Ｔｅｎｎｅｙ、Ｊ．Ｈ．）ら、１９８３、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２３：１８８−１８９；ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｍ．）ら、１９９０、  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７３−１７５）。この生体外研究では、オフロキサシン上での段階的選別中に獲得したトポイソメラーゼ突然変異で媒介されるＦＱ耐性における、ＡｃｒＡＢ流出ポンプの役割が調べられた。ＡｃｒＡＢ流出ポンプがＦＱ耐性レベルに重要であることが見出された。
【０１３３】
この実施例では以下の材料と方法が用いられた。
抗生物質、薬品および培地：オフロキサシン（ＯＦＬ）はヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ、フランクフルト、ドイツ）から提供された。放射線ラベル［１４Ｃ］−シプロフロキキサシンはバイエル（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，ドイツ）から提供された。カルボニルシアナイドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）をシグマ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、有機溶剤をアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ，ミルウォーキー、ＷＩ）から購入した。特に注釈しない限り、株はＬＢブロス中（１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物および１０ｇのＮａＣｌ）で生育させた。
【０１３４】
細菌種およびプラスミド：全ての株はプラスミドのないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＡＧ１００（ジョージ（Ｇｅｏｒｇｅ  Ａ．Ｍ．）およびレビー（Ｓ．Ｂ．Ｌｅｖｙ）、１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５：５３１−５４０）およびテトラサイクリン上で２段階で選別したそのＭａｒ突然変異体ＡＧ１１２（本研究）由来である。野生型Ｅ．ｃｏｌｉＧＣ４４６８、それに由来するＳｏｘ突然変異体ＪＴＧ１０７８（ｓｏｚＲ１０５；グリーンベルグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｔ．）ら、１９９１、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：４４３３―４４３９）およびｓｏｘ遺伝子を４３２ｂｐ−フラグメント上に有するｐＳＸＳ（アマビル（Ａｍａｂｉｌｅ−Ｃｕｅｖａｓ、Ｃ．Ｆ．）およびデンプル（Ｂ．Ｄｅｍｐｌｅ）、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ１９：４４７９−４４８４）。ＪＺＭ１２０はマー（Ｍａ，Ｄ）、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：４５−５５に記載されている。
【０１３５】
フルオロキノロン耐性突然変異体の選別：１−ＡＧ１００、２°−ＡＧ１００、３＊−ＡＧ１００、４＊−ＡＧ１００および１'−ＡＧ１１２，２'−ＡＧ１１２、３'−ＡＧ１１２はそれぞれ、固体培地上のＡＧ１００およびＡＧ１１２由来の段階的突然変異であった。各段階で、終夜培養の約１０１１個の細胞を、濃度を増加させたＯＦＬで補充した数個のＬＢ寒天プレート上でプレートした。単一コロニーをＯＦＬ補充寒天プレート上でさらに精製した。突然変異株２°−ＡＧ１００が一つのシリーズで出現し、突然変異３＊−および４＊−ＡＧ１００は第２シリーズで出現した。
【０１３６】
感受性試験：選択した抗菌剤のＭＩＣを、カチオン調節ミューラー−ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）ブロス（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＭＤ）および５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの接種体を用い、ＮＣＣＬＳ法および説明ガイドラインに従って標準ブロスミクロ希釈法で決定した（ＮＣＣＬＳ．１９９７、希釈抗菌性感受性試験法。好気性生育細菌試験−第４版；承認標準法、ＮＣＣＬＳ文書Ｍ７−Ａ４（ＩＳＢＮ１−５６２３８−３０９−４）、ＮＣＣＬＳ，９４０Ｗｅｓｔ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｏａｄ、Ｓｕｉｔｅ１４００、Ｗａｙｎｅ、Ｐｅｎｎｓｉｌｖａｎｉａ１９０８７）。市販マイクロタイタープレート上の抗菌剤（Ｍｅｒｌｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｂｏｒｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）はＦＱシプロフロシサシン（ＣＩＰ）、エノキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン（ＯＦＬ）、ペフロキサシン、スパフロキサシン（ＳＰＸ）およびトロバフロキサシン（ＴＶＡ）を含んでいた。それらはまた、テトラサイクリン（ＴＥＴ）、クロラムフェニコール（ＣＭＬ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）、セフォキシチン（ＣＦＯＸ）、セファクロール、セフィキシンおよびロラカルベフを含んでいた。胆汁酸塩のＭＩＣをブロスミクロ希釈法で測定した。コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムをＬＢブロス中で順番に希釈し、試験管を５×１０５ＣＦＵ／ｍｌで接種した。ブロス抗生物質と胆汁酸のＭＩＣを独立の実験で２回測定し、再現性のある結果を得た。
【０１３７】
Ｐ１形質導入：ＡｃｒＡＢ欠失株をＪＺＭ１２０株（マー（Ｍａ、Ｄ）ら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：４５−５５）由来のａｃｒＡＢ：：Ｔｎ９０３ｋａｎｒのＡＧ１００、ＡＧ１１２、および全ての誘導ＦＱ耐性突然変異体中へのＰ１形質導入（プロベンス（Ｐｒｏｖｅｎｃｅ、Ｄ．Ｌ．）およびカーチス（Ｃｕｒｔｉｓ  ＩＩＩ）、１９９４、ゲルハルト（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、ミューレー（Ｍｕｒｒａｙ、Ｗ．Ａ．Ｗｏｏｄ）およびクリーク（Ｋｒｉｅｇ、Ｎ．Ｒ．）編、一般および分子バクテリオロジー、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、３１７−３４７頁）で構築した。ＡｃｒＡＢ欠失株をＡＧ１００ＡＫ，１〜４＊−ＡＧ１００ＡＫ，ＡＧ１１２ＡＫおよび１'〜３'−ＡＧ１１２ＡＫとした。各宿主毎に２個の独立した形質転換体を確保した。ＡｃｒＡＢの欠失は、ＰＣＲ分析で無傷の標的ＤＮＡがないこと、および先の報告（タナシー（Ｔｈａｎａｓｓｉ，Ｄ．Ｇ．）ら、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：１５１２−１５１８）の通り、胆汁酸塩に対する感受性が大きく増加したことで確認した。
【０１３８】
ＤＮＡ配列決定：フルオロキノロン耐性突然変異株におけるｇｙｒＡ（ヌクレオチド１２３〜３６６）またはｐａｒＣ（ヌクレオチド１４５〜４９２）のＱＲＤＲをＰＣＲで増幅し、先の記載通りＱｉａ−クイックカラム（Ｑｕｉａ−ｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した（コンラッド（Ｃｏｎｒａｄ、Ｓ．Ｍ．）ら、１９９６、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：４４２−４５５；コンラッドら、１９９６、第３６回抗菌剤および化学療法国際会議プログラムおよびアブストラクト）。ｍａｒＯＲをｂｐ１３１１から１８５８まで、先の記載通りプライマーペアーＯＲＡＢ２およびＲＫ３で増幅した（エーシンガー（Ｏｅｔｈｉｎｇｅｒ、Ｍ．）ら、１９９８、Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，４２：２０８９−２０９４）。直接サイクル配列決定を自動３７３ＡＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。
【０１３９】
ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット分析：ノーザンブロット解析を先に詳細に述べられている様に行った（エーシンガーら、１９９８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２０８９−２０９４）。簡単に言えば、ＲＮＡを３０℃で生育した対数中期相から塩化セシウム法で収穫した。ｍａｒＲＡＢオペロンおよびｓｏｘＲＳオペロンそれぞれの状態の評価のため、培養体を分け、培養体の半分を５ｍＭサリシル酸ナトリウム（ｍａｒＲＡＢオペロン）および１．３ｍＭのパラクアット（ｓｏｘＲＳオペロン）でそれぞれ誘導した。最近の文献（エーシンガーら、１９９８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２０８９−２０９４）とおり、双方のオペロンからの転写レベルを、放射線ラベルＤＮＡプローブ（ｍａｒＡまたはｓｏｘＳ）を膜結合ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）へのハイブリダイゼーション、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒスクリーン経の暴露、およびＩｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）による可視化で評価した。
【０１４０】
細胞全体の［１４Ｃ］−シプロフロキサシンの蓄積：培養体を３０℃、ＬＢブロス中で対数相に生育し５０ｍＭ燐酸カリウム／０．２％グルコース（ｐＨ７．４）中で洗浄、同じ緩衝液中にＯＤ６００＝５〜７で懸濁した。［１４Ｃ］−シプロフロキサシン（比放射能：５９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を１０μＭで加えた。５０μｌの細胞標識懸濁液を５ｍｌの１００ｍＭ  ＬｉＣｌ／５０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．４）中に希釈し、５および１５分後に平衡状態で蓄積を測定し、直ちにＧｅｌｍａｎメトリセル混合セルロースエステルメンブレンフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ、Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）上に集め、５ｍｌの同じ緩衝液で洗浄した。フィルターを乾燥し、Ｂｅｔａｆｌｏｕｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）を用いて放射能を液体シンチレーションカウンターで分析した。計数効率は９０％であった。細胞がない場合のフィルターへの放射線標識の結合を差し引いた。使用時、プロトン駆動力を破壊するカルボニルサイアナイドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）を最終濃度２００μＭで加え、シプロフロキサシンの蓄積をその後５および１５分に分析した。１つの実験で５種の株までを検討し、さらにＡＧ１１２を対照株として含む様に、分析を設計した。結果をＣＩＰの蓄積として、ＯＤ６００ユニットあたりピコモル単位で計算したが、ＯＤ６００が１に等しい場合、１ＯＤ６００ユニットは１ｍｌ中の細胞数を現す（約１０９Ｅ，ｃｏｌｉ細胞、約０．３ｍｇのタンパク質）。活性化細胞のＣＩＰ蓄積と脱活性化（ＣＣＰ−処理）細胞のＣＩＰ蓄積の比を上記流出の間接目安として用いた（レービー、１９９２、Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：６９５−７０３）。これらの計算で、（５および１５分）前およびＣＣＣＰ添加後（２５分および３５分）で得られた結果を平均し、比率を脱活性化（すなわち最高）蓄積の％で表した。
【０１４１】
異なった段階の突然変異体の突然変異頻度は８×１０−８〜１０−１０の範囲であり、これは先のデータ（ヘーシング、１９９６、Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：８７９−８８５；ピドック（Ｐｉｄｄｏｃｋ，Ｌ．Ｊ．Ｖ．）ら、１９９１、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｇｅｍｏｔｈｅｒ．２８：１８５−１９８；ワタナベら、１９９０、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｇｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７３−１７５）と良く一致している。生育が損なわれた突然変異体はなかった。第１突然変異段階ではＡＧ１００とそのＭａｒ突然変異体でＯＦＬ耐性が８倍増加した（表１）。その後の増加は全ての段階で２〜４倍であり（表１および２）、３'−ＡＧ１１２で８μｇ／ｍｌの最高ＭＩＣＯＦＬが得られた。ＭＩＣとＦＱは平行に増加し、ＭＩＣの順番はＯＦＬ＞ＣＩＰ＞ＴＶＡ＝ＳＰＸであった（表２）。
【０１４２】
構造および調節遺伝子中の染色体突然変異の同定、および関連しない抗生物質への感受性：ｇｙｒＡのＱＲＤＲの配列決定により、コドン８７における同じ点突然変異（グリシンのアスパルテートへの置換）が、ＡＧ１００およびＡＧ１１２由来の突然変異体の双方で最初の突然変異段階で生じることが示された（表１）。これらの突然変異は、それ以外の複数の耐性フェノタイプ（Ｍａｒ）を生じず、ＭＩＣのＦＱへの増加をもたらした。より高いＦＱ耐性への段階的生体外突然変異誘発中の一連の出来事における最初の“眼にみえる”突然変異である、ｇｙｒＡ突然変異に関する報告はいくつかある（ヘーシング、１９９６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：８７９−８８５；カーン（Ｋｅｒｎ、Ｗ．Ｖ．）ら、１９９７、第３７回抗菌剤および化学療法学際会議プログラムおよび抄録、トロント（抄録）；ピドックら、１９９１、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２８：１８５−１９８）。第１ｇｙｒＡ突然変異の位置のＡＧ１００とＡＧ１１２間の一致は、偶然の一致と思われる。
【０１４３】
ＡＧ１００バックグラウンドにおける第２段階突然変異は、２°−ＡＧ１００のノーザンブロット分析によるｍａｒＲＡＢの過剰発現で示される様に、Ｍａｒ突然変異であった。この様な過剰発現は、ＡＧ１００の３個の独立に選んだ第２段階突然変異体で見出された。ｍａｒＡの構造過剰発現はＴＥＴ、ＣＭＬおよびＣＦＯＸに対する耐性の増加と関連していた（表２）。ｍａｒＲの回想的配列決定により、第３段階の突然変異体３＊−ＡＧ１００が２°−ＡＧ１００由来であることが示された（表１）。多くの努力にもかかわらず、ｍａｒＲ中の１６３４Ｇ→Ｔ転移による推定される第２段階Ｍａｒ突然変異体は回収されず、さらに検討された。
【０１４４】
予想された（ジョージおよびレービー、１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５：５３１−５４０）様に、ｍａｒＲＡＢはＭａｒ突然変異体およびその後に誘導された突然変異体内で抑制された。親株ＡＧ１１２のｍａｒＯＲの配列決定により、アミノ酸１２のコドン後の５塩基対の欠失が同定され、１個のアミノ酸の欠失とその後の完全なタンパク質配列の変化となった（表１）。これらのデータは、ｇｙｒＡ遺伝子における１個の突然変異により、ｍａｒＡ自体の発現より若干高い耐性が与えられること（ＭＩＣＯＦＬ＝０．２５μｇ／ｍｌ対０．１２５μｇ／ｍｌ；１ＡＧ１００対ＡＧ１１２、表１）、および２個の突然変異が増殖し得ることを示す。より高いＦＱ耐性へのその後の段階中に、ただ１個の突然変異体、４＊−ＡＧ１００はコドン８３でロイシンをセリンに置換する第２の突然変異を獲得した（表１）。ｇｙｒＡ、ｏａｒＣまたはｍａｒＯＲにおけるそれ以上の突然変異はより耐性の突然変異体のいずれでも同定されず、どの段階でもｓｏｘＳを構造的に過剰発現しなかった。ｇｙｒＡ／Ｍａｒ二重突然変異体１'−ＡＧ１１２由来の突然変異体２'−ＡＧ１１２は、ｍａｒＯＲにそれ以上の突然変異を起こさず、複数の薬物に対する耐性が増加していることを示した（表２）。可能なその他の突然変異により、ａｃｒＡＢが調節される可能性がある。対照的に、次段階の突然変異体３'−ＡＧ１１２がＦＱおよびＣＯＦＸのみに耐性を増加した（表２）。この耐性に対する分子的基盤は未知である。
【０１４５】
活性化細胞全体中のＣＩＰの蓄積は、５分間でプラトーに達し、ＡＧ１００で平均１０３ｐｍｏｌＣＩＰ／ＯＤＵ６００であった。プロトン駆動力が２００μＭ  ＣＣＰを添加することにより消失した場合、［１４Ｃ−］シプロフロキサシンの蓄積は倍増した（２０１ｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００）。これらの発見により、ＦＱ感受性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＦＱの蓄積を減少する、すなわち能動流出を示すためにエネルギーを使用するというノルフロキサシンによる先の研究（コーエンら、１９８８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３２：１１８７−１１９１）が確認された。この減少はまた、オフロシサシンを用いてＰｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓでも観察された（イシイ（Ｉｓｈｉｉ、Ｈ．）ら、１９９１、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２８：８２７−８３６）。比較として、ＡＧ１１２における蓄積は野生型の５４％、平均５６ｐｍｏｌＣＩＰ／ＯＤＵ６００であり、ＣＣＣＰ後に２２６  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００に増加した。細胞を脱活性化した場合のＣＩＰまたはノルフロキサシンのＡＧ１００親株のレベルへの迅速な蓄積（コーエンら、１９８８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３２：１１８７−１１９１）は、Ｍａｒ突然変異体における薬物蓄積の減少の主な機構としての外膜ポリンのダウンレギュレーションを除外する。活性化第１段階突然変異体１−ＡＧ１００および１'−ＡＧ１１２で蓄積したＣＩＰの量、および脱活性化後の薬物取り込みの減少は、親株ＡＧ１００およびＡＧ１１２それぞれのものと実質的に同じである。第２段階Ｍａｒ突然変異体２°−ＡＧ１００では、蓄積は６５ｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００（野生型の６５％、図１）に減少した。独立に単離された突然変異体３＊−および４＊−ＡＧ１００では蓄積の減少は大きかった（それぞれ１６ｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００＝野生型の１６％；および２０ｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００＝野生型の１９％）。同様に、突然変異体２'−ＡＧ１１２および３'−ＡＧ１１２はＭａｒ突然変異体ＡＧ１１２および１'−ＡＧ１１２よりかなり少ないＣＩＰを蓄積した（双方の株で２６ｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００対５６ｐｍｏｌｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００および５７ｐｍｏｌ  ＣＩＰ／ＯＤＵ６００、それぞれ野生型の２５％対５４％および５５％、図１）。薬物のより効率的な流出のため、３＊−／４＊−ＡＧ１００および２'−／３'−ＡＧ１１２における抗外部薬物レベルでのＣＩＰの細胞内濃度は、低レベルでの親株のものと同じ程度とおもわれ、突然変異はより高い細胞内ＦＱ濃度で生存する。元になる機構がどのようであれ、それが細胞のＴＥＴ、ＣＭＬおよびＣＦＯＸに対する耐性も増加させる。
【０１４６】
ＡｒｃＡＢ欠失の効果：ＡｃｒＡＢ複数薬物流出ポンプが欠失すると、すべての株でＣＩＰの能動流出が完全に失われた。ΔａｃｒＡＢ欠失を有する活性化ＡＧ１００細胞は活性化ａｃｒＡＢ＋細胞の２倍以上のＣＩＰを蓄積した（図１）。ｍａｒＲＡＢまたはｇｙｒＡの突然変異にも拘わらず、ΔａｃｒＡＢを有するいずれの株間でもＣＩＰ取り込みの差は認められなかった（図１）。全てのΔａｃｒＡＢ株はすべてのＦＱに対しきわめて過剰感受性になったが、ｇｙｒＡに新しく獲得した突然変異を有する突然変異体（表１）は予期される倍数のＦＱ耐性を維持していた（表２）。しかしながら、この耐性は臨床的に優位であるよりははるかに下であった。例えばＧｙｒＡ２重突然変異体４＊−ＡＧ１００ΔａｃｒＡＢはわずか０．１２５μｇ／ｍｌのＭＩＣＯＦＬを示したのみであった。興味深いことに、異なったＦＱのＭＩＣの差がΔａｃｒＡＢ株ではもはや観測されなかった。例えば２°−ＡＧ１００ΔａｃｒＡＢ＋ではＭＩＣＯＦＬ＝ＭＩＣＣＩＰ＝ＭＩＣＴＶＡ＝０．０６μｇ／ｍｌ、一方、ａｃｒＢ＋株では２°−ＡＧ１００  ＭＩＣＯＦＬ＝１μｇ／ｍｌ、ＭＩＣＣＩＰ＝０．５μｇ／ｍｌ、ＭＩＣＴＶＡ＝０．２５μｇ／ｍｌ（表２）。ＳＰＸ似たいして、全てのΔａｃｒＡＢ突然変異体は検出限界以下であった（ＭＩＣＳＰＸΔ０．０１５μｇ／ｍｌ）。このことは、活性化細胞でＡｃｒＡＢポンプで流出される薬物の割合がはるかに高いことを反映していると思われる。ａｃｒＡＢ欠失はまた、ｍａｒＡの過剰発現で与えられる複数薬物耐性を除去し、従ってＡｃｒＡＢ複数薬物流出ポンプがＭａｒ突然変異体の抗生物質耐性フェノタイプで主要な役割を果たすという以前の結果（オクツ、マーおよびニカイドウ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０６−３０８）を強調している。また別な、いまだ未知の突然変異もａｃｒＡＢの欠失で完全に消失した（表２）。従って、薬物耐性に対する１つ以上の別な突然変異の効果はａｃｒＡＢを経由して作用すると思われる。
結論：ノルフロキサシン耐性Ｅ．ｃｏｌｉの選別に関する以前の報告は、ＦＱ体制突然変異体を生体外で増幅する間に７種の関係のない抗生物質のＭＩＣの変化を示さなかった（テネー（Ｔｅｎｎｅｙ、Ｊ．Ｈ．）ら、１１９８３、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２３：１８８−１８９）。別な研究では、ｇｙｒＡ突然変異体由来の１０個の第２段階突然変異体のうち２個のみが複数耐性フェノタイプを示すことを示した（ピドックら、１９９１、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２８：１８５−１９８）。
【０１４７】
本発明研究の結果は、先に報告された結果とは対照的である。３つの独立なシリーズにおけるＦＱ耐性の生体外増幅中の段階的突然変異の発生では、最初にｇｙｒＡ突然変異を生じ、その後ｍａｒ遺伝子座の過剰発現を生じる突然変異を起こした。ｍａｒＡ突然変異も、ＦＱ耐性Ｅ．ｃｏｌｉの生体以外で選別中の第２段階の突然変異中に他の研究者により観察された（バーゲル（Ｂａｇｅｌ、Ｓ．）ら、１９９９、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：８６８−８７５）。
【０１４８】
最近の実験で、同じ生体外実験条件が２個の臨床Ｅ，ｃｏｌｉ単離株の突然変異体を選別するために適用された（ケルン（Ｋｅｒｎ、Ｗ．Ｖ．）ら、１９９７、第３７回抗菌剤および化学療法学際会議プログラムおよび抄録、トロント）。第２段階突然変異体は一つの株ではＭａｒ突然変異体であり、他の株ではＳｏｘ突然変異であったので（ケルンら、１９９７、第３７回抗菌剤および化学療法学際会議プログラムおよび抄録、トロント）、調節遺伝子における突然変異がしばしば生じる。しかしながら、臨床起源のＦＱ耐性Ｅ．ｃｏｌｉは、構造ＭａｒまたはＳｏｘ突然変異体の割合はわずか１０％〜１５％であり（エーシンガーら、１９９８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２０８９−２０９４）、本発明の生体外実験より低い頻度であることが示されている。
【０１４９】
Ｅ．ｃｏｌｉ中のポンプの数が多い（ニカイドウ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８：５８５３−５８５９；ポールセン（Ｐａｕｌｓｅｎ、Ｉ．Ｔ．）ら、１９９６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６０：５７５−６０８）ことを考えると、ＡｃｒＡＢポンプがない場合は他のポンプのいずれもＣＩＰを能動は流出しないことは驚くべきことである。従って、ＡｃｒＡＢ複数薬物流出ポンプはＣＩＰを基質として使用する唯一の、または少なくとも最も重要なポンプである様に思われる。
【０１５０】
これらの知見は、ＡｃｒＡＢポンプの欠失に大きく影響されるＥ．ｃｏｌｉのトリクロサン感受性に関する最近のデータに対応する（マックミューリーら、１９９８、ＦＥＢＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６６：３０５−３０９）。ａｃｒＡＢ、ｍａｒＡまたはｓｏｘＳの過剰発現が細胞のトリクロサンに対する耐性を約２倍増加させるが、トリクロサンの標的であるエノイルリダクターゼ（ｆａｂＩでコードされる）の突然変異は細胞の耐性を約１００倍にした（マックミューレーら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：５３１−５３２）。しかしながら、ａｃｒＡＢの欠失は全ての株で耐性を１０倍減少させ、ｆａｂＩ突然変異の効果をより小さくしているが、これはＦＱの場合のトポイソメラーゼ突然変異の有効性の減少と類似している。
【０１５１】
本研究の知見の優れた点は、ＡｃｒＡＢ流出ポンプがＥ．ｃｏｌｉの内在性および獲得耐性レベルの双方で強力な役割を有することである。これらのデータは、流出機構がＦＱの作用をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（ニカイドウ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５８３３−５８５９）のみならず、Ｅ．ｃｏｌｉにおいても減少させることを示しているが、後者の微生物では薬物はより透過性のポリンチャネルを通って迅速に拡散する（ニカイドウ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５８５３―５８５９）。ｍａｒＯＲまたはｓｏｚＲＳの突然変異に加えて、染色体遺伝子座における未同定の突然変異が、ＡｃｒＡＢを経由する流出を増加させることにより、耐性レベルを明らかに変化させる。ＡｃｒＡＢ流出ポンプを妨害すると、ＦＱ等の薬物の効果をトポイソメラーゼ突然変異の場合でも増加させると考えられる。
【表１】
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【表２】
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【０１５２】
本出願で引用した全ての参考文献、係属出願および公開特許の内容は、参照資料として本明細書で明白に用いられている。
【０１５３】
同等物
当業者は、通常の実験以上でない方法で、本明細書に記載された本発明の実施態様に対する多くの等価な内容を理解または確認し得ると考えられる。この様な同等物は本発明のクレームに含まれる。
【図１】
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【外国語明細書】
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