(57)【要約】【課題】検査試料中に含まれる可能性のあるカスパーゼを即時・簡便に定量分析できる方法を提供する。【解決手段】テープストリッピング法およびケミカルピーリング法から選ばれる少なくともいずれかの方法によってヒトの皮膚から検査試料を採取するステップと、カスパーゼと特異的かつ免疫学的に反応し得る反応体を含む試薬を、採取された前記検査試料と接触させ、カスパーゼと反応体との反応の結果を分析するステップとを含む、カスパーゼの分析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テープストリッピング法およびケミカルピーリング法から選ばれる少なくともいずれかの方法によってヒトの皮膚から検査試料を採取するステップと、
カスパーゼと特異的かつ免疫学的に反応し得る反応体を含む試薬を、採取された前記検査試料と接触させ、カスパーゼと反応体との反応の結果を分析するステップとを含む、カスパーゼの分析方法。
【請求項２】
検査試料を採取するステップが、溶剤を適用したテープストリッピング法によって、ヒトの皮膚の採取深度を規定して採取することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応体がカスパーゼ抗体であり、前記カスパーゼと前記カスパーゼ抗体との反応の結果を酵素免疫測定法によって分析する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カスパーゼ抗体として、一次抗体と二次抗体を用い、二次抗体が酵素標識したものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素標識に用いる酵素がペルオキシダーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ペルオキシダーゼによる触媒作用を、酸化還元試薬によって可視光波長領域の発色反応として分析する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酸化還元試薬が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検査試料中のカスパーゼを即時・簡便に分析できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚表皮の角質層（角化層）は、有害な環境から生体を保護するバリアの役割を担っている。この角質の形成が正常に行われない（皮膚の「不角全化」という）と、アトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患を引き起こす原因となる。
【０００３】
皮膚のケラチノサイトが終末分化することで角質が形成されることは判っていたが、そのメカニズムは十分解明されていなかった。１９９８年頃から、カスパーゼという酵素がこの角質の形成に深く関与していることが解明され始めた。たとえば、G. Pistritto et al., "Expression and transcriptional regulation of caspase-14 in simple and complex epithelia", Cell Death and Differentiation, Vol. 9, (2002), p.995-1006（非特許文献１）では、単純構造の上皮組織だけでなく複合構造の上皮組織からもカスパーゼ-14が発現することを報告している。Lorenzo Alibardi et al., "Ultrastructual Localization of Caspase-14 in Human Epidermis", Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Vol.52(12), (2004), p.1561-1574（非特許文献２）では、電子顕微鏡観察でカスパーゼ-14がヒト表皮に局在していることを報告している。A. A. Raymond et al., "Nine procaspases are expressed in normal human epidermis, but only caspase-14 is fully processed", Journal conpilation 2006, British Association of Dermatologists, British Journal of Dermatology, Vol. 156, (2007), p.420-427（非特許文献３）では、ヒト表皮をサンプルとしてカスパーゼ-1, -2, -3, -4, -6, -7, -8, -9, -10, -14 をエンコードするmRNAをRT-PCRで同定している。
【０００４】
カスパーゼがアポトーシス（細胞死）を引き起こすことによって、角質が形成されること示された。逆に、カスパーゼが充分産生されないと、不角全化を引き起こす原因となる。たとえば、Gong Wu et al., "Structual basis IAP recognition by Smac/DIABLO", Nature, Vol. 408, (2000), p.1008−1012（非特許文献４）では、アポトーシス性たんぱく質インヒビター (IAP) はカスパーゼ-14を阻害したりプロアポトーシス促進因子と拮抗することでアポトーシスをブロックすることが報告されている。Verhagen AM et al., "Inhibitor of apoptosis proteins and their relatives: IAPs and other BIRPs", Genome Biol. 2(7), (2001),:REVIEWS3009（非特許文献５）でも、IAPはカスパーゼと結合することでアポトーシスを防いでいることが報告されている。また、Stephen Hsu et al., "Green tea polyphenol induces caspase 14 in epidermal keratinocytes via MAPK pathways and reduces psoriasiform lesions in the flaky skin mouse model", Journal compilation 2007, Blackwell Munksgaard, Experimental Dermatology, Vol. 16, (2007), p.678-684（非特許文献６）では、緑茶に含まれるポリフェノールという成分が表皮のカスパーゼ-14の発現を促進し乾癬症を改善することを示唆している。
【０００５】
つまり、皮膚中のカスパーゼ（以下、「皮膚カスパーゼ」）を定量できれば、皮膚の角質層形成の指標になるだけでなく、皮膚疾患の指標になると考えられる。
【０００６】
しかし、カスパーゼは皮膚などの生体サンプルにごく微量しか存在しないため、その定量分析は非常に困難であり、上述したように現在は遺伝子発現解析などによって、その有無（高濃度か、低濃度かの定性分析）が評価されているだけであり、半定量分析や定量分析はほとんど行われていなかった。
【０００７】
たとえば特表２００９−５１１５７２号公報（特許文献１）には、被検体の皮膚などにおけるカスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を測定し、被検体における皮膚疾患などの素因を診断する方法が規定されている。しかしながら、カスパーゼ−８の発現レベルまたは活性を測定する方法としてＲＴ−ＰＣＲ法、イムノアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション分析、酵素活性の測定などと一般的な手法が列挙されているのみであり、何ら具体的には開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−５１１５７２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】G. Pistritto et al., "Expression and transcriptional regulation of caspase-14 in simple and complex epithelia", Cell Death and Differentiation, Vol. 9, (2002), p.995-1006
【非特許文献２】Lorenzo Alibardi et al., "Ultrastructual Localization of Caspase-14 in Human Epidermis", Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Vol.52(12), (2004), p.1561-1574
【非特許文献３】A. A. Raymond et al., "Nine procaspases are expressed in normal human epidermis, but only caspase-14 is fully processed", Journal compilation 2006, British Association of Dermatologists, British Journal of Dermatology, Vol. 156, (2007), p.420-427
【非特許文献４】Gong Wu et al., "Structual basis IAP recognition by Smac/DIABLO", Nature, Vol. 408, (2000), p.1008−1012
【非特許文献５】Verhagen AM et al., "Inhibitor of apoptosis proteins and their relatives: IAPs and other BIRPs", Genome Biol. 2(7), (2001),:REVIEWS3009.
【非特許文献６】Stephen Hsu et al., "Green tea polyphenol induces caspase 14 in epidermal keratinocytes via MAPK pathways and reduces psoriasiform lesions in the flaky skin mouse model", Journal compilation 2007, Blackwell Munksgaard, Experimental Dermatology, Vol. 16, (2007), p.678-684
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、検査試料中に含まれる可能性のある皮膚カスパーゼを即時・簡便に分析できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のカスパーゼの分析方法は、テープストリッピング法およびケミカルピーリング法から選ばれる少なくともいずれかの方法によってヒトの皮膚から検査試料を採取するステップと、カスパーゼと特異的かつ免疫学的に反応し得る反応体を含む試薬を、採取された前記検査試料と接触させ、カスパーゼと反応体との反応の結果を分析するステップとを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の分析方法において、検査試料を採取するステップは、溶剤を適用したテープストリッピング法によって、ヒトの皮膚の採取深度を規定して採取することが好ましい。
【００１３】
本発明において、前記反応体はカスパーゼ抗体であることが好ましく、この場合、前記カスパーゼと前記カスパーゼ抗体との反応の結果を酵素免疫測定法によって分析することがより好ましく、前記カスパーゼ抗体として、一次抗体と二次抗体を用い、二次抗体が酵素標識したものであることがより好ましい。
【００１４】
さらに本発明においては、前記酵素標識に用いる酵素がペルオキシダーゼであることが好ましく、ペルオキシダーゼによる触媒作用を、酸化還元試薬によって可視光波長領域の発色反応として分析することがより好ましい。また、この酸化還元試薬は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンであることが特に好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、検査試料中に含まれる可能性のあるカスパーゼを即時・簡便に分析できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のカスパーゼの分析方法の好適な一例を示すフローチャートである。
【図２】本発明のカスパーゼの分析方法の好適な一例を段階的に示す模式図である。
【図３】イムノアッセイにおける抗体の組み合わせを模式的に示す図である。
【図４】抗体の選定実験の結果を示すグラフであり、図４（ａ）は固相化抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合、図４（ｂ）は固相化抗体としてポリクローナル抗体を用いた場合を示している。
【図５】実験例３で得られた検量線を示すグラフである。
【図６】被検者４人（被検者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）から採取した検査試料それぞれについて、検量線を用いて皮膚カスパーゼを分析した結果を示すグラフである。
【図７】実験例５の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のカスパーゼの分析方法は、テープストリッピング法およびケミカルピーリング法から選ばれる少なくともいずれかの方法によってヒトの皮膚から検査試料を採取するステップと、カスパーゼ（皮膚カスパーゼ）と特異的かつ免疫学的に反応し得る反応体を含む試薬を、採取された前記検査試料と接触させ、カスパーゼと反応体との反応の結果を分析するステップとを含むことを特徴とする。このような本発明のカスパーゼの分析方法によれば、検査試料中に含まれる可能性のあるカスパーゼを即時・簡便に分析することが可能となる。
【００１８】
本発明において分析対象となるカスパーゼは、細胞にアポトーシスを起こさせるシグナル伝達経路を構成する、一群のシステインプロテアーゼであり、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４などの種類が知られている。本発明の分析方法では、これらのうちのどの種類のカスパーゼを分析の対象とするものであってもよいが、アポトーシス性タンパク質インヒビター（ＩＡＰ）は、カスパーゼと結合することで細胞死を防ぐことが分かっている（たとえば、Verhagen AM et al., "Inhibitor of apoptosis proteins and their relatives: IAPs and other BIRPs", Genome Biol. 2(7), (2001),:REVIEWS3009（非特許文献５を参照）ので、不全角化の指標としては、カスパーゼ−１４を分析の対象とすることが好ましい。
【００１９】
（検査試料を採取するステップ）
本発明の分析方法において分析に供する皮膚カスパーゼを含む可能性のある検査試料は、ヒトの皮膚、特にはヒトの皮膚の角質から採取された試料を用いる。試料を採取するヒトの身体の部位は、たとえば腕、顔、手、首などの皮膚が露出している部位であれば特に制限はされないが、同一の日照条件では、身体表面の凹凸形状の関係から顔では頬の上が光の照射を受けやすく、全身の比較では首の裏側が光の照射を受けやすい。このような理由から、これらの部位では皮膚バイオマーカーの変化が他の部位と比較して大きいので、サンプリング部位として好ましい。本発明における検査試料を採取するステップは、テープストリッピング法およびケミカルピーリング法から選ばれる少なくともいずれかの方法によってヒトの皮膚から検査試料を採取する。
【００２０】
テープストリッピング法とは、粘着剤を表面に塗布したシートをヒトの皮膚に貼着し、たとえば一定圧力で押すことができる治具で押さえた後、これを剥離し、粘着剤への付着物を回収することで、ヒトの皮膚から検査試料を採取する方法である。このようなシートの好適な具体例としては、D−Squame D100（Cuderm社製）（直径２２ｍｍ×厚み０．１ｍｍ程度）を挙げることができる。テープストリッピング法では、ほぼ１層ずつ角質を採取できるよう接着強度を調整することで、テープストリッピング法による検査試料の採取を繰り返し行えば、皮膚の所望の採取深度（皮膚表皮から奥行き方向に向かった深さ）の層の角質のみを検査試料として採取できるという利点がある。
【００２１】
一方、ケミカルピーリング法とは、化学薬品を皮膚に塗布することによって、角質細胞の接着を弱めたり、角質を軟化・溶解することで、ヒトの皮膚を剥離する方法である。このような溶剤（ケミカルピーリング剤）として、角質細胞の接着を弱めるためにはグリコール酸、乳酸などのＡＨＡ（α−hydroxy acids）、角質を軟化・溶解するためにはサリチル酸、トリクロロ酢酸などが知られており、具体的には「ノブ  セルニュー」シリーズ（常盤薬品工業（株）製）、「ジョルビ」シリーズ（（株）ケイセイより販売）などが挙げられる。皮膚科学的には、治療に用いる場合のガイドラインが、レベルＩ：最浅層ピーリング（角質層）、レベルＩＩ：浅層ピーリング（表皮顆粒層からの基底層の間）、レベルＩＩＩ：中間層ピーリング（表皮と真皮乳頭層の一部から全部）、レベルＩＶ：深層ピーリング（表皮と真皮乳頭層および網状層に及ぶ深さ）の４段階に分類されている。このようなケミカルピーリング法は、数層の角質をまとめて採取する場合に効率的であり、そのような場合に特に適している。
【００２２】
ここで、ヒトの角質層は２０層前後あり、奥行き方向によってカスパーゼ活性が変化し、角層の採取深度が皮膚内部に近づくほど低くなる。本発明における検査試料を採取するステップでは、ヒトの皮膚の採取深度を規定して採取することが好ましい。この場合、採取深度が規定できる採取方法として生体安全性に優れた、たとえば上述したような溶剤を適用したテープストリッピング法が特に適しており、正確な指標として用いるために有効である。
【００２３】
本発明における検査試料は、通常、採取された試料を抽出液に溶解させた液体試料として調製される。この抽出液としては、たとえば、酢酸緩衝液中にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１％含有させた、下記の表１に示す組成（１００ｍＬあたり）を有するものが好適に用いられる。表１に示す例の酢酸緩衝液では、濃度を低濃度（たとえば４ｍＭ）にすることで、その後の濃縮処理による影響を受けにくくしている。また、表１に示す例の酢酸緩衝液は、ｐＨを皮膚カスパーゼの最適ｐＨである５にしている。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
本発明において用いられる試薬に含まれる反応体としては、カスパーゼと特異的かつ免疫学的に反応し得るものであれば特に制限されるものではなく、たとえばカスパーゼ抗体が挙げられる。カスパーゼ抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいがモノクローナル抗体を用いることが好ましい。カスパーゼ抗体は、分析対象とするカスパーゼの種類に応じて従来公知の適宜のものを用いることができ、たとえばカスパーゼ−１４抗体としては、モノクローナル抗体（anti−Caspase−14（Human）、医学生物学研究所）、ポリクローナル抗体（Caspase−14 antibody（Rabbit polyclonal）、アブカム）などを用いることができる。
【００２６】
本発明においては、上述したカスパーゼとカスパーゼ抗体との反応の結果を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）によって分析することが好ましい。この場合、カスパーゼ抗体として、一次抗体と酵素標識された二次抗体を用い、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡ法を行うことが好ましい。
【００２７】
ここで、二次抗体の酵素標識に用いる酵素としては、当分野において従来より用いられている酵素を特に制限なく用いることができ、中でも、ペルオキシダーゼを標識酵素として用いることが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；horseradish peroxidase）が特に好ましい。
【００２８】
また標識酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼによる触媒作用を、酸化還元試薬によって可視光波長領域の発色反応として分析するようにすることが、好ましい。ここで、「可視光波長領域の発色反応」とは、ヒトが目視で認識できる発色反応を意味し、このような可視光波長領域の発色反応を利用することで、定性、半定量分析によるマス・スクリーニングの応用も可能となる。
【００２９】
酸化還元試薬としては、試薬中の過酸化水素により酸化されて可視光波長領域での発色反応をするものであればよく、たとえば特開２０００−２３６８９７号公報に記載されたものなどを特に制限されずに用いることができるが、下記化学式で示される構造を有する３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を酸化還元試薬として特に好適に用いることができる。酸化還元試薬としてＴＭＢＺを用いる場合、過酸化水素による酸化により、無色から青緑色の可視光波長領域での発色反応が起こる。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
酸化還元試薬の前記発色反応から、たとえば光学系測定装置を用いて吸光度を測定することで、検査試料に含まれる皮膚カスパーゼを分析することができる。なお、光学系測定装置は、特に制限なく従来公知の適宜のものを用いることができる。吸光度を測定する波長は、用いる酸化還元試薬によって決まり、たとえば酸化還元試薬としてＴＭＢＺを用いた場合、具体的には３００ｎｍを好適な例として挙げることができる。
【００３２】
ここで、図１は、本発明のカスパーゼの分析方法の好適な一例を示すフローチャートであり、図２は、本発明のカスパーゼの分析方法の好適な一例を段階的に示す模式図である。以下、図１および図２を参照しながら、本発明のカスパーゼの分析方法の好適な一例について説明する。本発明においてはまず、ＥＬＩＳＡプレート１にカスパーゼの一次抗体２を添加し、抗体の固相化を行う（図２（ａ））。次に、たとえば１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ溶液を添加して、ウシ血清アルブミン３でブロッキング処理を行う（図２（ｂ））。次に、検査試料を添加する。検査試料に皮膚カスパーゼが含まれる場合には、当該皮膚カスパーゼ４が一次抗体２と抗原抗体反応を起こす（図２（ｃ））。
【００３３】
洗浄によって不純物を除去した後、酵素６で標識された（たとえばＨＲＰ標識）カスパーゼの二次抗体５を添加し、二次抗体５と皮膚カスパーゼ４とを抗原抗体反応させる。その後、酸化還元試薬（たとえばＴＭＢＺ）を添加して可視光波長領域での発色反応を起こさせ、吸光度を測定する。このような手順で、検査試料中に皮膚カスパーゼが含まれる場合には、当該皮膚カスパーゼを定量的に分析することができる。
【００３４】
本発明のカスパーゼの分析方法は、検査試料に含まれる総タンパク量についても皮膚カスパーゼと同時に分析することが好ましい。実験例１にて後述するように、皮膚から採取される皮膚カスパーゼ量は、検体にバラツキがあり、皮膚カスパーゼおよび総タンパク量を同時に分析することで、皮膚カスパーゼのみを分析する場合と比較して、定量性を高めることができるためである。総タンパク量の分析は、たとえば、総タンパク質定量キット（ＤＣプロテインアッセイ、Bio−Rad Laboratories Inc.製）を用いたＬｏｗｒｙ法によって行うことができる。
【００３５】
以下、実験例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００３６】
＜実験例１：検査試料の調製＞
被検者は、男性被検者４名（年齢２２．８±２．９歳、平均±標準偏差）とし、直径２２ｍｍで円形状の角質採取テープ（Standard  D−Squame  D100、Cuderm社製）１枚のみを用い、角質採取テープを被検体の採取部位に３０秒間貼付してから剥離し、１．５ｍｌのチューブに回収した。このチューブに、抽出液（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００含有酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、４ｍＭ））を７５０μｌ加え、超音波洗浄器（２２１０ＤＴＨ、ヤマト科学（株）製）を用いて３７℃で３０分間超音波処理を行った。
【００３７】
ＥＬＩＳＡ測定において、抗体やサンプルの溶媒の組成が、プレートへの吸着や抗原抗体反応に影響する可能性があり、界面活性剤を使用できない。このため、ＥＬＩＳＡによるカスパーゼ−１４の分析に先立ち、検査試料の全量を限外ろ過フィルター（Ultrafree（登録商標）−0.5遠心式フィルターユニット、Millipore社製）を用い、重炭酸バッファー（１％エタノール含有１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９．３）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ダルベッコ緩衝液、ｐＨ７、０．１Ｍ）にバッファー交換した。具体的には、まず、１００μｌの検査試料を限外カラムに添加し、１００μｌイオン交換水を混合した後に、遠心分離器（日立製作所製、型番：ＣＦ１５Ｒ、ローター型番：Ｔ１５Ａ２２）で１２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。次に、カラムに残った上清に溶媒を添加し、ピペッティングで混合した。
【００３８】
＜実験例２：ＨＲＰ標識抗体の作成＞
酵素標識キット（Peroxidase labeling kit−SH、同仁化学研究所製）を用い、以下の手順でＨＲＰ標識抗体を作成した。まず、１００μｌのSolution Aとバッファー置換したカスパーゼ−１４抗体１００μｌを混合し、Filtration tubeへ滴下した後に１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行った。次に、１５０μｌのSolution AをReducing Agentに混合して溶解した。１５０μｌのReducing Agent溶液をFiltration tubeへ滴下してピペッティングで混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。１００μｌのSolution Bを滴下し、１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。次に、ろ液を除去し、２００μｌのSolution Bを滴下し、１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。５０μｌのReaction BufferをSH−Reactive Peroxidaseに滴下して溶解し、Filtration tubeに混合した。３７℃で１時間インキュベーションした後に、１００μｌのSolution Aを滴下した。１００００ｒｐｍ、１０分間インキュベーションした後、２００μｌのStrage Bufferをチューブに滴下し、１０回ピペッティングし、４℃で保存した。
【００３９】
＜実験例３：抗体の選定＞
ＥＬＩＳＡに使用する抗体は、固相化抗体と酵素標識抗体の２種類が必要であり、それぞれの使用する濃度を検討する必要がある。今回は、固相化抗体として１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（anti−Caspase−14（Human）、医学生物学研究所）とポリクローナル抗体（Caspase−14 antibody（Rabbit polyclonal）、アブカム）の２種類と、標識抗体としてポリクローナル抗体（実験例２で作成したＨＲＰ標識抗体）を用い、２．５、０．５、０．１μｇ／ｍｌの３濃度を検討した。また、測定対象としてカスパーゼ−１４標準液（Caspase−14（activated、human、recombinant）、5000U、SE−417；Biomol）を用いた。
【００４０】
抗体を固相化するために、１０μｇ／ｍｌの固相化抗体としてのモノクローナル抗体（anti−Caspase−14）またはポリクローナル抗体（Caspase−14 antibody）１００μｌをウェルに滴下し、４℃で一晩インキュベーションした後、３００μｌのWash Buffer（０．０５％  Tween−20含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄した。次に、ブロッキング処理を行うために、３００μｌのブロッキング溶液（１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水）を滴下し、４℃で４時間インキュベーションした後、３００μｌのWash Bufferで３回洗浄した。
【００４１】
１００μｌのカスパーゼ−１４標準液をウェルに滴下し、２５℃で２時間インキュベーションした後、３００μｌのWash Bufferで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗体を１００μｌ滴下し、２５℃で２時間インキュベーションした後、３００μｌのWash Bufferで６回洗浄した。２００μｌのＴＭＢＺ溶液を滴下し、５分間２００ｒｐｍ撹拌した後に、２５分間インキュベーション（遮光）し、発色反応させた。５０μｌのStop Solution（３Ｍ硫酸水溶液）を滴下して反応を停止させ、３分間２００ｒｐｍ撹拌した後に、蛍光プレートリーダー（1420 ARVO MX、PerkinElmer社製）で４５０ｎｍにおける吸光度（ΔＯＤ450）を測定した。
【００４２】
（結果と考察）
イムノアッセイでは、図３に模式的に示すように、固相化抗体にポリクローナル抗体Ａ１、標識抗体にポリクローナル抗体Ｂ１を用いる場合（図３（ａ））、固相化抗体にモノクローナル抗体Ａ２、標識抗体にポリクローナル抗体Ｂ１を用いる場合（図３（ｂ））、固相化抗体にモノクローナル抗体Ａ２、標識抗体にモノクローナル抗体Ｂ２を用いる場合（図３（ｃ））が考えられる。
【００４３】
図４は、抗体の選定実験の結果を示すグラフであり、図４（ａ）は固相化抗体にモノクローナル抗体Ａ２、標識抗体にポリクローナル抗体Ｂ１を用いた場合（図３（ｂ））、図４（ｂ）は固相化抗体にポリクローナル抗体Ａ１、標識抗体にポリクローナル抗体Ｂ１を用いた場合（図３（ａ））を示している。図４（ａ）、図４（ｂ）のいずれも、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度（ΔＯＤ450）であり、横軸はカスパーゼ−１４の濃度（ｎｇ／ｍｌ）であり、○は標識抗体の濃度が２．５μｇ／ｍｌである場合、△は標識抗体の濃度が０．５μｇ／ｍｌである場合、□は標識抗体の濃度が０．１μｇ／ｍｌである場合をそれぞれ示している。図４（ａ）、図４（ｂ）から分かるように、固相化抗体としてポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のいずれを用いた場合でも、カスパーゼ−１４濃度の上昇と共に吸光度は上昇し、また同様に、標識抗体の濃度の上昇と共に吸光度は上昇し、イムノアッセイ系として機能していることが示された。
【００４４】
固相化抗体にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれを用いた場合でも、標識抗体の濃度が２．５μｇ／ｍｌであるときに最も感度（勾配）が高く、良好な直線性が得られた。これらの実験から、固相化抗体として、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体、標識抗体として２．５μｇ／ｍｌのポリクローナル抗体を用いるときが最適条件であることが分かった。
【００４５】
固相化抗体として１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体、標識抗体として２．５μｇ／ｍｌのポリクローナル抗体を用い、上記カスパーゼ−１４標準液０．６〜１０ｎｇ／ｍｌにおいて検量線を作成したところ、ΔＯＤ450＝０．０４０８×［Ｃａｓｐａｓｅ−１４］−０．０４１５となりＲ2＝０．９４という良好な結果が得られた。図５は、得られた検量線を示すグラフであり、縦軸は吸光度（ΔＯＤ450）、横軸はカスパーゼ−１４の濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。
【００４６】
＜実験例４：ＥＬＩＳＡによる皮膚カスパーゼの分析＞
抗体を固相化するために、１０μｇ／ｍｌの固相化抗体としてのモノクローナル抗体（anti−Caspase−14）１００μｌをウェルに滴下し、４℃で一晩インキュベーションした後、３００μｌのWash Buffer（０．０５％  Tween−20含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄した。次に、ブロッキング処理をおこなうために、３００μｌのブロッキング溶液（１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水）を滴下し、４℃で４時間インキュベーションした後、３００μｌのWash Bufferで３回洗浄した。
【００４７】
１００μｌの検査試料をウェルに滴下し、２５℃で２時間インキュベーションした後、３００μｌのWash Bufferで３回洗浄した。２．５μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗体を１００μｌ滴下し、２５℃で２時間インキュベーションした後、３００μｌのWash Bufferで６回洗浄した。２００μｌのＴＭＢＺ溶液を滴下し、５分間２００ｒｐｍ撹拌した後に、２５分間インキュベーション（遮光）し、発色反応させた。５０μｌのStop Solution（３Ｍ硫酸水溶液）を滴下して反応を停止させ、３分間２００ｒｐｍ撹拌した後に、蛍光プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度（ΔＯＤ450）を測定した。
【００４８】
（結果と考察）
図６は、被検者４人（被検者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）から採取した検査試料それぞれについて、検量線を用いて皮膚カスパーゼを分析した結果を示すグラフであり、縦軸は検査試料に含まれていた皮膚カスパーゼの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。結果、被検者Ａは１５．５ｎｇ／ｍｌ、被検者Ｂは９．７６ｎｇ／ｍｌ、被検者Ｃは７．５１ｎｇ／ｍｌ、被検者Ｄは１４．３１ｎｇ／ｍｌであった。したがって、検量線の上限を１０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌへ拡張することで検査試料に含まれる皮膚カスパーゼ−１４の濃度を測定可能であることが示された。なお、カスパーゼ−１４の濃度測定に際しては、濃縮作業が必要ないことが分かった。
【００４９】
＜実験例５：角質深さによるカスパーゼ−１４濃度の比較＞
被検者を成人女性被検者３１名、角質採取部位を口元とし、角質深さによるカスパーゼ−１４濃度の比較を行った。被検者の同一の部位に、８枚の角質採取テープを繰り返し貼付してから剥離することで、角質サンプルを回収した。１〜４枚目を表層側の角質サンプル、５〜８枚目を深層側の角質サンプルとした。
【００５０】
図７は、実験例５の結果を示すグラフであり、縦軸は単位採取面積当りのカスパーゼ−１４質量（ｎｇ／ｃｍ2）である。カスパーゼ−１４の深さによる相違は、表層側（１〜４枚目）が１．１８±０．９７ｎｇ／ｃｍ2（平均±標準偏差）、深層側（５〜８枚目）が０．８９±０．６２ｎｇ／ｃｍ2（平均±標準偏差）となり、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定では統計的な有意差は確認されなかった（ｐ＞０．０５）が、表層よりも深層の方が低い値となる傾向が示された。カスパーゼ−１４は、角質水分量と相関があることも示唆されているので、被検者の日常の肌の手入れが影響しているのではないかと考えられた。
【００５１】
今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内で全ての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
ヒトの角質に含まれる皮膚カスパーゼの簡便・迅速な分析が実現されれば、皮膚の角質層形成の定量評価に有用である。また、本技術は、皮膚カスパーゼだけでなく他の皮膚酵素の迅速分析にも寄与すると考えられ、たとえば本発明のキットを使い捨て式のテストチップとして実現すれば、これをチェッカーとして角層細胞とキメを写し取り、肌情報をユーザーへフィードバックすることに寄与するなど化粧品分野での応用も可能であり、また、本発明のキットを使い捨て式の電気化学式バイオセンサとして実現すれば、非侵襲的な皮膚疾患のセンシング技術として、医療分野でも応用できるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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