(57)【要約】      （修正有）【課題】樟芝を用いた肝臓保護試験、免疫試験、安全性試験の提供。【解決手段】樟芝カプセルをラットおよびマウスに投与する。まず、肝臓保護試験では毎週２回、合計８週間、四塩化炭素によって誘発させた慢性肝炎の罹患ラットを用いて、ＧＰＴおよびＧＯＴの測定、肝臓および脾臓の重量と肝臓含水量の測定、肝臓タンパク質およびヒドロキシプロリン含量の測定。特異的免疫試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに試験物質を投与し、卵白アルブミンを注射後、免疫細胞増殖作用および血清特異的抗体生成の免疫調節機能を測定。非特異的免疫試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに連続６週間、試験物質の投与試験を行い、腹腔マクロファージ活性の促進、抗腫瘍細胞のホルモン分泌の調節、および血清抗体生成を促進する免疫調節機能を測定。いずれの試験でも樟芝抽出物は、有効性を示した。【選択図】図１
2011088877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樟芝抽出物カプセルを投与し、毎週２回、合計８週間、四塩化炭素によって誘発させた慢性肝炎の罹患ラットを用いて、ＧＰＴおよびＧＯＴの測定、肝臓および脾臓の重量と肝臓含水量の測定、肝臓タンパク質およびヒドロキシプロリン含量の測定の結果、四塩化炭素により誘発されたラットの慢性肝炎を軽減させることを証明した肝臓保護試験方法。
【請求項２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに樟芝抽出物カプセルを投与し、卵白アルブミンを注射後、免疫細胞増殖作用および血清特異的抗体生成の免疫調節機能を促進することを示した特異的免疫試験方法。
【請求項３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに連続６週間、樟芝抽出物カプセルの投与試験を行うことにより、腹腔マクロファージ活性の促進、抗腫瘍細胞のホルモン分泌の調節、および血清抗体生成を促進する免疫調節機能を有することを示した非特異的免疫試験方法。
【請求項４】
樟芝抽出物カプセルを投与し、１プレートあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、１．２５ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．３１２５ｍｇの濃度で試験を行い、本条件では、代謝活性の過程の経過に関わらず、復帰突然変異を誘発しないとの結果を示した、サルモネラ菌を用いた平板法による復帰突然変異試験と、
投与量を本試験の最高処理投与量である５ｍｇ／ｍｌに定め、その他の投与量を順次２．５、１．２５、０．６２５および０．３１２５ｍｇ／ｍｌとし、合計２００の分裂中期の細胞を観察した結果が、ポジティブコントロール群の染色体異常細胞数がネガティブコントロール群より顕著に高く（Ｐ＜０．０１）、さらに、ネガティブコントロール群の染色体異常数は３％以下であり、この試験の有効性を示した、哺乳類細胞を用いた体外染色体異常試験と、
げっ歯類の動物体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の末梢血に対して、小核を発生する率を測定する試験であって、直接または間接的に赤血球染色体または有糸分裂細胞に誘発される遺伝子変異、および損傷を誘発する程度を評価するもので、小核の発生率は、１０００個あたりの網状赤血球のうち、各投与量群およびネガティブコントロール群において、４８または７２時間に関わらず顕著な有意差を示さなかったが、ポジティブコントロール群の網状赤血球の発生率の平均値は低下し、また網状赤血球の小核発生率の平均値は増加したため、試験結果の有効性を認めることができる、げっ歯類の末梢血を用いた小核試験と、
（１）臨床症状の観察、
（２）死亡率、
（３）体重変化、
（４）飼料摂取量、
（５）病変の肉眼観察、
（６）臨床病理分析、
（７）臓器重量の比較、
（８）組織の病理判断、
の８項目について評価し、これらの項目を満たすことを示した、亜慢性毒性に関する、ラットを用いた９０日間反復経口投与試験と、
（１）臨床観察、
（２）体重変化、
（３）飼料摂取、
（４）平均黄体数、着床数、胎児数、着床前および着床後の胎児死亡率、
（５）胎児の性別比、重量および身長、
（６）胎児の外観異常検査、
（７）胎児の内臓および骨格異常検査、
（８）胎児骨格の骨化程度、
の８項目について評価し、これらの項目を満たすことを示した、ラットを用いた催奇形性試験、
の以上５項目に関して、試験物質について行った安定性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、四塩化炭素により誘発される慢性肝炎の罹患ラットを用いた肝臓保護試験、マウスを用いた経口投与および注射による免疫試験、それと同時に行った五項目の安全性試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術による樟芝＜ベニクスノキタケ＞の人工抽出物は、含まれる多糖類およびトリテルペンの成分が一様ではない。肝臓保護および身体の免疫機能に対する働きは、大きな効果を発揮することができるが、それを証明するための信頼できる実験がなく、これは、樟芝抽出物が改善を必要とする点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明では、特殊製法を利用し、固体培養により得られた樟芝カプセルをラットおよびマウスに投与し、それぞれ肝臓保護および免疫調節機能の測定を行い、本発明を証明する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（一）肝臓保護試験
本試験は、ラット体重１００ｇあたり０．２ｍｌの四塩化炭素溶液を標準投与量とし、毎週２回、計８週間投与した。試験群に、試験開始１日前から実験終了まで、該樟芝を毎日１回経口投与した。雄性ウィスターラットは楽斯科生物科技股ふん有限公司から提供され、飼育温度は２２±２℃、照明時間は１２時間（０７：００点灯、１９：００消灯）とした。飼料は福寿牌のマウス飼料、飲み水はＲＯ純水器で処理した飲料水で自由摂取とした。試験動物については、２週間の飼育、検疫を経て、健康で体重が正常に増加した動物を選別し、試験に用いた。
【０００５】
肝臓が損傷を受けると、肝細胞のＧＯＴおよびＧＰＴが流れ出し、血清中のＧＯＴおよびＧＰＴ活性が上昇する。ＧＰＴは肝臓の特異的指標で、定常状態の指標である。肝臓の損傷、炎症が起こると、肝臓の再生が始まり、肝臓の重量は増加し、含水率が増加する。肝線維症では脾臓の血流量に影響して脾臓が腫大する。これらはすべて肝臓が損傷を受けたか、または線維症であるかどうかの測定に使用できる。
【０００６】
肝臓の合成能は、血漿中のアルブミンまたは肝臓のタンパク質含量を測定することによりわかる。
【０００７】
本試験は、四塩化炭素により誘発される慢性肝炎によって、樟芝の投与実験、およびシリマリン薬の投与効果との比較を行った。８週間の実験の結果、表１に示すように、ＧＰＴが１３９６Ｕ／Ｌから７８４Ｕ／Ｌに顕著に低下した。表３に示すように、肝臓タンパク質は、組織１ｇあたり１４９ｍｇから１８３ｍｇに上昇し、本発明の肝臓保護機能を顕著に示した。
【０００８】
（二）特異的免疫試験
正常な免疫機能であるか、またはある疾病が免疫機能に著しく関与するとき、試験物質の免疫機能調節を正確に評価する必要があり、動物モデルの作製または人体の臨床試験による評価が必要となる。特異的免疫機能評価試験は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに試験物質を投与し、卵白アルブミン（オボアルブミン、ＯＶＡ）を注射後、免疫細胞増殖作用および血清抗体濃度などをそれぞれ測定する。したがって、免疫細胞の機能を評価するとき、質および量の両面から分析するべきである。量は主に各種免疫細胞の数を測定する。現在フローサイトメーターを用いて免疫細胞の容易で正確な算出を行うことができる。質は、特異的免疫反応の関連指標により、試験物質の完全で具体的な免疫調節機能を評価する。
【０００９】
本発明は、１０週間連続して試験物質をＢＡＬＢ／ｃマウスに経口投与し、免疫細胞増殖作用および血清抗体生成をそれぞれ測定した。試験結果を以下に示す。
【００１０】
免疫細胞増殖作用（表４）：ポジティブコントロール群の脾臓細胞をＬＰＳ刺激すると、免疫細胞増殖作用はコントロール群より顕著に高かった。試験物質の低、中、高投与量群、およびポジティブコントロール群の脾臓細胞をＯＶＡ刺激すると、免疫細胞増殖作用は、コントロール群より顕著に高かった。
【００１１】
血清抗体生成（表５）：試験前、１次感作前、および２次感作前における、各投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＧに関して、コントロール群との間に有意差はなかった。各投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＭに関して、コントロール群との間に有意差はなかった。各投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＥに関して、コントロール群との間に有意差はなかった。屠殺時における、高投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＧに関して、コントロール群より顕著に高かった。ポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＭは、コントロール群よりも顕著に高かった。各投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＥは、コントロール群との間に有意差はなかった。
【００１２】
前述の結果により、本発明は特異的免疫機能試験において、免疫細胞増殖作用および血清特異的抗体生成の免疫調節機能を促進することが示された。
【００１３】
（三）非特異的免疫試験
この試験の目的は、非特異的免疫反応の指標により、試験物質の非特異的免疫調節機能を評価する。正常な免疫機能であるか、またはある疾病が免疫機能に著しく関与するとき、試験物質の免疫調節機能を正確に評価するなら、動物モデルの作製または人体の臨床試験による評価が必要となる。非特異的免疫機能評価試験は、試験物質を投与後、免疫細胞増殖作用、ナチュラルキラー細胞活性、腹腔マクロファージ活性、細胞表面マーカー、細胞のホルモン分泌機能、および血清抗体濃度などをそれぞれ測定する。したがって、免疫細胞の機能を評価するとき、質および量の両面から分析するべきである。量は主に各種免疫細胞の数を測定する。現在フローサイトメーターを用いて免疫細胞の容易で正確な算出をおこなうことができる。質は、非特異的免疫反応の関連指標により、試験物質の完全で具体的な免疫調節機能を評価する。
【００１４】
この試験は、本発明が非特異的免疫調節機能において、有効であるかを測定するものである。６週間連続で試験物質をＢＡＬＢ／ｃマウスに経口投与し、腹腔マクロファージ活性、細胞のホルモン分泌機能、および血清抗体生成などをそれぞれ測定した。試験結果を以下に示す。
【００１５】
腹腔マクロファージ活性（表６）：ＭＯＩが５の場合、試験物質の中、高投与量群、およびポジティブコントロール群の腹腔マクロファージ活性はコントロール群より顕著に高かった。
【００１６】
細胞のホルモン分泌機能（表７）：試験物質の低、中、高投与量群、およびポジティブコントロール群の脾臓をＬＰＳ刺激すると、ＴＮＦ−αの分泌は、コントロール群より顕著に高かった。試験物質の中投与量群、およびポジティブコントロール群の脾臓細胞をＣｏｎＡ刺激すると、ＩＦＮ−γの分泌量は、コントロール群より顕著に高かった。
【００１７】
血清抗体生成（表８）：屠殺時、低、中、高投与量群、およびポジティブコントロール群の免疫グロブリンＧは、コントロール群より顕著に高かった。
【００１８】
前述の結果により、本発明は非特異的免疫機能試験において、腹腔マクロファージ活性の促進、抗腫瘍細胞のホルモン分泌の調節、ならびに血清抗体生成を促進する免疫調節機能を有することが示された。
【００１９】
（四）安全性試験
１．サルモネラ菌の復帰突然変異試験
２．哺乳類細胞を用いた体外染色体異常試験
３．げっ歯類の末梢血を用いた小核試験
４．亜慢性毒性に関する、ラットを用いた９０日間反復経口投与試験
５．ラットを用いた催奇形性試験
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は本発明の肝臓保護試験のブロックフローチャート図である。
【図２】図２は本発明の特異的および非特異的免疫試験のブロックフローチャート図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２１】
（一）肝臓保護試験
試験群および投与量
１．投与量の計算：本発明では、服用量を１錠５００ｍｇ、毎日４錠と推奨する。用量は成人で５００ｍｇ×４＝２０００ｍｇ／日である。ラットへの投与量は、実験動物およびヒトの表面積比などにより、有効な投与量の換算比率を計算した。ラット２００ｇおよびヒト７０ｋｇの表面積比は０．０１８であるため、ラットへの投与量は毎日２０００ｍｇ×０．０１８＝０．０３６ｇ／２００ｇ体重、すなわち１８０ｍｇ／ｋｇである。本試験で使用する投与量は、毎日１８０、５４０、１０８０ｍｇ／ｋｇとし、それぞれヒトの服用量の１、３、６倍である。コントロール群ラットには同体積の０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を投与した。コントロール薬剤シリマリン（ｓｉｇｍａ）の投与量は２００ｍｇ／ｋｇとした。
【００２２】
２．試験物質の調製：使用する前にカプセルを開けて粉末を取り出し、０．５％ＣＭＣで濃度がそれぞれ１８、５４、および１０８ｍｇ／ｍｌのけん濁液を調製した。経口投与し、投与量はラットの体重１００ｇ当たり１ｍｌとした。コントロール薬剤シリマリンは０．５％ＣＭＣにけん濁させ、２０ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００２３】
３．実験計画：四塩化炭素溶液の１回目の投与前日から試験物質の投与を始め、その後、ラットを屠殺する前日まで毎日投与した。投与時間は毎日午後１：００〜１：４０とした。毎週２回四塩化炭素溶液を経口投与し、１回目および３回目の投与時は、ラットを一晩絶食させ、その他の投与時は絶食させなかった。四塩化炭素の投与時間は午前８：００〜８：４０とした。四塩化炭素を投与後、満１、３、６週経過時に、ラットをエーテル麻酔して尾動脈から採血し、血漿の生化学値を測定した。８週目の採血時は、同時にラットを屠殺し、すばやく肝臓および脾臓を摘出し、氷冷した生理食塩水で洗浄後、水分を除き、重量を測定した。肝臓の最大葉を２つに分け、相当する部分をそれぞれ（１）１０％中性ホルマリン溶液に浸して病理切片に使用し、（２）重量測定後、１００℃で完全に乾燥させ、コラーゲン含量を測定した。残りの肝臓は４つに分けて−８０℃に保存した。毎週１回体重を測定し、その週の試験物質投与の体重データとした。四塩化炭素はオリーブ油に溶解して２０％溶液を調製し、毎回の投与量は０．２ｍｌ／１００ｇ体重とした。
【００２４】
４．実験結果
（１）血清ＧＯＴ、ＧＰＴおよびアルブミン値に対する影響（表１）
ラットに四塩化炭素を投与後、１、３、６および８週目の血漿ＧＯＴおよびＧＰＴ値はともにコントロール群よりも顕著に高かった。１週目から８週目の、樟芝（５４０、１０８０ｍｇ／ｋｇ）処理したラットの血漿ＧＰＴおよびＧＯＴ値は、四塩化炭素群よりも低かった。シリマリン処理したラットの１週目から８週目の血漿ＧＯＴおよびＧＰＴ値はともに変化がなかった。ラットに四塩化炭素を投与後、６および８週目の血漿アルブミン値はコントロール群より低かった。樟芝処理のラットの６週目の血漿アルブミン値は影響がなく、樟芝（１０８０ｍｇ／ｋｇ）処理のラットは、８週目の血漿アルブミン値が増加した。シリマリン処理のラットの６および８週目の血漿アルブミン値は改善効果がみられなかった。
【００２５】
【表１】
2011088877.tif 000003
【００２６】
（２）肝臓および脾臓重量と肝臓含水量に対する影響（表２）
ラットに四塩化炭素を投与後、最終的な肝臓および脾臓の重量はコントロール群より高かった。樟芝およびシリマリン処理群の肝臓重量を四塩化炭素群と比較すると有意差はなかった。樟芝（１０８０ｍｇ／ｋｇ）処理群の脾臓重量は四塩化炭素群より明らかに低かった。四塩化炭素群の肝臓含水率はコントロール群より明らかに高く、樟芝（１０８０ｍｇ／ｋｇ）処理群の肝臓含水率は四塩化炭素群より低かった。シリマリン処理のラットの肝臓および脾臓重量と肝臓の含水量はすべて影響がなかった。
【００２７】
【表２】
2011088877.tif 000004
【００２８】
（３）タンパク質およびヒドロキシプロリン含量に対する影響（表３）
四塩化炭素により誘発される慢性肝炎の罹患ラットでは、肝臓の可溶性タンパク質含量が低下する。樟芝（１０８０ｍｇ／ｋｇ）処理群を四塩化炭素群と比較すると、肝臓の可溶性タンパク質含量は明らかに増加し、シリマリンは四塩化炭素が引き起こす肝臓の可溶性タンパク質含量の減少に対して影響を及ぼさなかった。四塩化炭素により誘発される慢性肝炎の罹患ラットでは肝臓のヒドロキシプロリン含量が明らかに増加した。樟芝（１０８０ｍｇ／ｋｇ）処理群の肝臓ヒドロキシプロリン含量は四塩化炭素群より明らかに低かった。シリマリンは、四塩化炭素が引き起こすヒドロキシプロリン含量の増加に対して変化を示さなかった。
【００２９】
【表３】
2011088877.tif 000005
【００３０】
５．結論
以上の結果を総合して、本発明では動物実験結果により以下の機能を有することが明確に示された：
１．血漿ＧＰＴおよびＧＯＴ値が低下する
２．血漿アルブミンが増加する
３．脾臓の腫大が軽減する
４．肝臓の含水量が低下する
５．肝臓のタンパク質含量が増加する。
【００３１】
（二）特異的免疫試験
財団法人国家実験研究院国家実験動物センターより４〜５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。マウスは免疫機能評価に適した実験動物である。該種マウスはすでに豊富な基礎的参考資料およびデータを有しており、本試験結果の分析および評価に利用できる。実験計画は以下の通りである。
【００３２】
１．飼育管理
ａ．飼育室  第Ｃ室
【００３３】
ｂ．飼育環境
【表４】
2011088877.tif 000006
【００３４】
ｃ．環境測定
【表５】
2011088877.tif 000007
【００３５】
ｄ．飼育ケージおよび匹数
【表６】
2011088877.tif 000008
【００３６】
ｅ．飼料
【表７】
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【００３７】
ｆ．飲料水
【表８】
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【００３８】
ｇ．動物室入室および器材搬入
【表９】
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【００３９】
２．投与量の設定
ａ．コントロール群：１０ｍｌ／ｋｇ（注射用蒸留水）
ｂ．低投与量群：０．２６ｇ／ｋｇ（ヒトの推奨服用量の１倍量）
ｃ．中投与量群：０．７８ｇ／ｋｇ（ヒトの推奨服用量の３倍量）
ｄ．高投与量群：１．３０ｇ／ｋｇ（ヒトの推奨服用量の６倍量）
ｅ．ポジティブコントロール群：０．３０ｇ／ｋｇ（市販の雙鶴極品霊芝）
【００４０】
３．試験群分け
【表１０】
2011088877.tif 000012
【００４１】
試験動物８０匹の雌性マウスを搬入後、まず臨時で番号付けを行い、体重を測定した。約１週間の飼育、検疫の間は、臨床症状の観察を毎日行った。最後に獣医師の判断により健康で体重が正常に増加した動物を選別し、試験に用いた。各群の動物総数は５０匹であった。
【００４２】
４．試験物質、コントロール物質の投与
ａ．試験物質の調製方法、投与方法、投与回数：試験物質を異なる濃度に調製し、試験開始日に１回経口投与し、合計１０週間投与した。６週目は同時にＯＶＡおよび完全フロイントアジュバンド（ＣＦＡ）を、８週目には同時にＯＶＡおよび不完全フロイントアジュバンド（ＩＦＡ）を腹腔注射した。
【００４３】
ｂ．投与量の計算：投与量の計算はその週の体重データを基準とし、マウスそれぞれの体重１ｋｇあたり体積１０ｍｌを投与した。
【００４４】
５．動物の群分けならびに個体および群分けの識別
ａ．群分け
購入後、動物室でまず機器への適応期を与え、体重測定後、Ｓ方式により体重が近いもので群を編成し、統計分析により各群間に顕著な有意差がないことを確認した。
【００４５】
ｂ．個体識別
耳標（耳パンチ法）。
【００４６】
ｃ．試験群の識別
各試験群の飼育ケージに、ケージ番号、種、性別、週齢および動物番号を表記したカードをつけた。
【００４７】
６．動物の観察および検査項目
ａ．臨床症状の観察
試験期間は毎日臨床的観察を行い、動物が臨床症状、その他異常な中毒症状を示したか、または死亡したかどうかを記録した。休暇日も通常通り臨床症状の観察を行った。発見日とあらゆる異常症状および程度を個別の動物データ表に記録した。瀕死の動物は、安楽死させて解剖を行った。死亡動物も解剖を行い、死亡原因を調査した。
【００４８】
ｂ．体重測定
試験動物は、投与日の投与開始前、投与期間の毎週１回、屠殺日に体重を測定した。
【００４９】
ｃ．飼料摂取量
投与期間は動物の飼料摂取量を毎週１回測定した。測定方法は体重測定当日に一定量の飼料を加え、１週間後飼料の消費量および余剰量（ｇ／マウス／ケージ）を算出した。
【００５０】
７．卵白アルブミン（オボアルブミン、ＯＶＡ）を腹腔注射によりマウスに投与した。マウスへの試験物質の投与前にまず採血し、実験基準値とした。投与６週間時に１回目のＯＶＡ注射を行い、マウスを感作した。各マウスに６．２５μｇのＯＶＡおよびＣＦＡを腹腔内に注射し、ＯＶＡ特異的抗体を産生させ、２週間後に２回目の腹腔注射で１２．５μｇのＯＶＡおよびＩＦＡを注入して追加感作とした。試験前、ＯＶＡ感作前、２次感作前および屠殺時に、それぞれ採血を行い血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ濃度の追跡を行った。その濃度計算はＴＭＢ呈色後の吸光値（Ａｂｓｏｒｂｅｎｃｉｅｓ、Ａ）により計算した。単位はＥＬＩＳＡユニット（ＥＵ）であり、計算式は以下の通りである。ＥＬＩＳＡユニット、ＥＵ＝（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ａｂｌａｎｋ）
【００５１】
８．測定方法
免疫細胞増殖作用の測定は、試験物質を連続１０週間投与後、投与期間に２回ＯＶＡを投与し、試験動物の脾臓細胞を摘出した。刺激物（コンカナバリンＡ、ＣｏｎＡ、リポ多糖、ＬＰＳ、またはオボアルブミン、ＯＶＡ）による刺激後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔで測定し、各投与量群および対照群で有意差があるかどうかを調べた。
【００５２】
ＯＶＡが誘発する特異的抗体の生成は、試験前、ＯＶＡ感作前、２次感作前、および屠殺時に採血し、ＥＬＩＳＡにより血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ濃度を測定した。各投与量群および対照群で有意差があるかどうかを調べた。
【００５３】
９．実施結果
（１）免疫細胞増殖作用（表４）：マウス屠殺後、脾臓細胞を摘出し、マイトジェン（コンカナバリンＡ、ＣｏｎＡ、リポ多糖、ＬＰＳ、またはオボアルブミン、ＯＶＡ）を添加して培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔで免疫細胞増殖作用を測定した。ポジティブコントロール群の脾臓細胞の免疫細胞増殖作用は、ＬＰＳ刺激により、コントロール群より顕著に高かった。（Ｐ＜０．０５）。試験物質の各投与量群およびポジティブコントロール群の脾臓細胞の免疫細胞増殖作用は、ＯＶＡ刺激により、コントロール群より顕著に高く（Ｐ＜０．０５、表に示す）、試験物質が免疫細胞増殖作用を促進することを示した。
【００５４】
【表１１】
2011088877.tif 000013
【００５５】
（２）ＯＶＡにより誘発される特異的抗体生成（表５）：試験物質の投与期間のうち、試験前、１次ＯＶＡ感作前、２次感作前、および屠殺時に採血し、ＥＬＩＳＡにより血清中のＯＶＡ特異的免疫グロブリン濃度を測定した。試験前、１次ＯＶＡ感作前、および２次感作前の血清中免疫グロブリン濃度について、各投与量群およびポジティブコントロール群は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差を示さなかった。屠殺時の血清中の免疫グロブリン濃度について、試験物質高投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＧ（Ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＧ）は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差がみられた（Ｐ＜０．０５、表に示す）。このほか、ポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＭ（Ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＭ）も、統計上コントロール群との間に顕著な有意差が見られ（Ｐ＜０．０５、表に示す）、試験物質各投与量群およびポジティブコントロール群のＯＶＡ特異的免疫グロブリンＥ（Ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＥ）は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差を示さなかった（Ｐ＜０．０５、表に示す）。本試験物質がＯＶＡ特異的抗体ＩｇＧの生成を促進する機能を有することを示した。
【００５６】
【表１２】
2011088877.tif 000014
【００５７】
１０．結論
前述の結果から、本発明の特異的免疫機能試験において、免疫細胞増殖作用および血清特異的抗体生成の免疫調節機能を促進することを示した。
【００５８】
（三）非特異的免疫試験
財団法人国家実験研究院国家実験動物センターより４〜５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。マウスは免疫機能評価に適した実験動物である。該種マウスはすでに豊富な基礎的参考資料およびデータを有しており、本試験結果の分析および評価に利用できる。
【００５９】
１．実験計画は、本発明「特異的免疫試験」１から６と同じである。
【００６０】
２．測定方法：
（１）腹腔マクロファージ活性
試験物質を連続６週間投与後、試験動物の腹腔マクロファージ細胞を摘出し、蛍光標識したＥ．ｃｏｌｉ（ＦＩＴＣ−Ｅ．ｃｏｌｉ）を取り込ませ、フローサイトメーターによりその活性を分析した。各投与量群をコントロール群と比較して有意差があるかどうかを調べた。
【００６１】
（２）細胞のホルモン分泌機能
試験物質を６週間連続で投与後、試験動物の脾臓細胞を摘出し、刺激物（ＣｏｎＡまたはＬＰＳ）を添加し、４８〜７２時間培養した。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ）により細胞のホルモン分泌量を測定し、各投与量群をコントロール群と比較して有意差があるかどうかを調べた。
【００６２】
（３）血清抗体生成
試験物質の投与期間中に、試験物質の投与前、投与後３週間、および屠殺時に血液を採取し、ＥＬＩＳＡにより血清中の各免疫グロブリン濃度を測定した。各投与量群をコントロール群と比較して有意差があるかどうかを調べた。
【００６３】
３．実験結果
（１）腹腔マクロファージ活性（表６）
マウス屠殺後、腹腔マクロファージを回収し、ＦＩＴＣ−Ｅ．ｃｏｌｉを添加してこれを取り込ませ、フローサイトメーターでマクロファージ活性を分析した。感染の多重度（ＭＯＩ）が５の時、試験物質の中、高投与量群およびポジティブコントロール群の腹腔マクロファージ活性はコントロール群より顕著に高かった（Ｐ＜０．０５）。本試験物質が腹腔マクロファージ活性を促進することを示した。
【００６４】
【表１３】
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【００６５】
（２）細胞のホルモン分泌機能（表７）
マウスを屠殺し、脾臓細胞を摘出した後、マイトジェン無添加およびマイトジェン添加（ＣｏｎＡまたはＬＰＳ）によって刺激し、それぞれ４８〜７２時間培養後、ＥＬＩＳＡにより免疫細胞が細胞のホルモンを分泌する状態を測定した。ＣｏｎＡまたはＬＰＳの刺激による脾臓細胞のインターロイキンＩＬ−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）の分泌に関して、試験物質各投与量群およびポジティブコントロール群は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差は見られなかった。ＬＰＳの刺激により、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、ＴＮＦ−α）の分泌に関して、試験物質各投与量群およびポジティブコントロール群は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差が見られた（Ｐ＜０．０５）。ＣｏｎＡの刺激により、インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ、ＩＦＮ−γ）の分泌について、試験物質中投与量群およびポジティブコントロール群は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差が見られた（Ｐ＜０．０５）。本試験物質が抗腫瘍細胞のホルモン分泌を調節する機能を有することを示した。
【００６６】
【表１４】
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【００６７】
（３）血清抗体生成（表８）
試験物質の投与期間、試験物質投与前、投与後３週目、および屠殺時に採血し、ＥＬＩＳＡにより血清中の免疫グロブリン濃度を測定した。投与前の血清中免疫グロブリン濃度は、各投与量群においてコントロール群との間に顕著な有意差は見られなかった。投与中の血清中免疫グロブリン濃度は、各投与量群においてコントロール群との間に顕著な有意差は見られなかった。屠殺時の血清中免疫グロブリン濃度は、試験物質の低、中、高投与量群およびポジティブコントロール群の免疫グロブリンＧ（イムノグロブリンＧ、ＩｇＧ）は、統計上コントロール群との間に顕著な有意差を示した（Ｐ＜０．０５）。ＩｇＭについては、各投与量群は統計上コントロール群との間に顕著な有意差を示さなかった。本試験物質が血清抗体ＩｇＧの生成を促進することを示した。
【００６８】
【表１５】
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【００６９】
４．結論
前述の結果から、本発明の非特異的免疫機能試験において、腹腔マクロファージ活性、細胞のホルモン分泌、および血清抗体生成の免疫調節機能を促進することを示した。
【００７０】
（四）安全性試験
１．サルモネラ菌の復帰突然変異試験
サルモネラ菌の復帰突然変異試験（エームス試験）の目的は、ラット肝臓の代謝システムの活性化前または活性化後に、試験物質により遺伝子の突然変異が起こるかどうかを試験するものであり、この試験によって、試験物質の遺伝子毒性を評価できる。本試験はＯＥＣＤガイドライン４７１の基準を順守して行った。この結果により、試験物質が本実験計画の条件において、代謝の活性化過程の経過に関わらず、サルモネラ菌の復帰突然変異を誘発しないことを示した。
【００７１】
２．哺乳類細胞を用いた体外染色体異常試験
本試験の目的は、ラット肝臓の活性化酵素の代謝前および代謝後に、試験物質がチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）に対して、直接または間接的に染色体構造の変異を引き起こす種類、数、および細胞毒性を評価するものであり、試験物質の体外における哺乳類細胞の遺伝子毒性を評価する。本試験はＯＥＣＤガイドライン４７３の基準を順守して行った。この結果により、本試験濃度では、哺乳類を用いた体外染色体異常試験において陰性であることが示された。
【００７２】
３．げっ歯類の末梢血を用いた小核試験
本試験の目的は、本発明において、試験物質がげっ歯類体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の末梢血において小核が発生する率を測定し、直接または間接的に赤血球の染色体もしくは有糸分裂細胞の遺伝子変異および損傷を誘発する程度を測定するものであり、本発明の動物体内における遺伝子毒性を評価する。本試験はＯＥＣＤガイドライン４７４の基準を順守して行った。１０００ｍｇ／ｋｇＢＷ、２０００ｍｇ／ｋｇＢＷおよび４０００ｍｇ／ｋｇＢＷの各投与量の結果によると、試験物質について、動物体内の末梢血を用いた小核試験は陰性であることを示した。
【００７３】
４．亜慢性毒性に関する、ラットを用いた９０日間反復経口投与試験
本試験はＯＥＣＤガイドライン４０８の基準を順守して行った。その目的は、試験物質を９０日間反復投与した後、ラットに対して毒性を生じるかを測定し、毒性変化の発生について調べ、同時に無毒性量を調べるものである。雌雄ＳＤラットに９０日間の試験物質の反復投与を行った結果、臨床病理および病理組織学上、試験物質と関係のある病変が発見されなかったことを示した。このため、３０００ｍｇ／ｋｇが「無毒性量」（Ｎｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｌｅｖｅｌ、ＮＯＡＥＬ）とみなすことができる。
【００７４】
５．ラットを用いた催奇形性試験
本試験の目的は、妊娠ラットに対する毒性反応、および動物胎児の器官形成期に起こる胎児死亡、発育遅延、または奇形について、試験物質が及ぼす可能性を調べるものである。本試験では、試験物質の最高投与量３０００ｍｇ／ｋｇを妊娠ラットに反復投与したが、一般的な毒性反応は見られず、胎児の器官形成または発育にも影響を及ぼさなかった。したがって、３０００ｍｇ／ｋｇは「無毒性量」（Ｎｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｌｅｖｅｌ、ＮＯＡＥＬ）である。
【図１】
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【図２】
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