(57)【要約】      （修正有）【課題】任意のタンパク質と融合タンパク質を形成することで当該タンパク質の安定性を向上させることができるポリペプチド、およびそれを用いてタンパク質の安定性を向上させる方法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを任意のタンパク質に融合させる。（ａ）特定な配列からなるアミノ酸配列（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列の一部であって、少なくとも第１位〜第１０１位を含むアミノ酸配列（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の一部であって、少なくとも（ａ）のアミノ酸配列の第１位〜第１０１位に相当する部分を含むアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の安定性を向上させるポリペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部であって、少なくとも第１位〜第１０１位を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の一部であって、少なくとも配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１位〜第１０１位に相当する部分を含むアミノ酸配列
【請求項２】
前記安定性が、構造安定性である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記安定性または前記構造安定性が、プロテアーゼに対する安定性、熱に対する安定性、または酸に対する安定性である請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項４に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質を製造する工程を含有することを特徴とするタンパク質の安定性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の安定性を向上させるポリペプチドおよびその利用に関するものであり、詳細には、タンパク質の安定性を向上させるポリペプチド、当該ポリペプチドを含む融合タンパク質、それらをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、当該発現ベクターが導入された形質転換体、およびタンパク質の安定性を向上させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素は高い基質特異性、反応特異性から医薬品、食品、化成品、廃棄物処理、バイオマス利用など、幅広い分野で応用されている。一般に、酵素が産業利用される場合、利用環境の物理的・化学的条件（例えば、温度やｐＨ）に対して安定に機能を発揮することが求められる。例えば、プロテアーゼは、洗剤、皮革加工、食品加工、機能性ペプチド生産等において幅広く利用されている代表的な産業用酵素であるが、産業用酵素としての実用面で一番重用視されるのは、酵素の安定性および利用条件下での活性の高さである。特に、物理的・化学的に高い熱安定性が要求される場合が多く、それゆえ、産業用プロテアーゼには耐熱性プロテアーゼが広く使用されている。
【０００３】
例えば、本発明者らは、超好熱菌の１つであるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のサチライシンファミリーに属するプロテアーゼであるＴｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎを見出し、Ｔｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎがｐＨ９．５、温度８０℃〜１００℃で最も高い活性を示すこと、公知のプロテアーゼのなかで最も高い熱安定性を有することを報告している（非特許文献１および２参照）。また、本発明者らは、同じＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株から、Ｔｋ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎと異なる新規なプロテアーゼのＴｋ−ＳＰを見出し、１００℃で９０分間処理したときの残存活性が約５０％であることを報告している（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kannan, Y., Koga, Y., Inoue, Y., Haruki, M., Takagi, M., Imanaka, T. et al. Active subtilisin-like protease from a hyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence. Appl. Environ. Microbiol. 67, 2445-2552. (2001).
【非特許文献２】Pulido, M., Saito, K., Tanaka, S., Koga, Y., Takano, K. & Kanaya, S. Ca2+-dependent maturation of Tksubtilisin from a hyperthermophilic archaeon: propeptide is a potent inhibitor of the mature domain but is not required for its folding. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4154-4162. (2006).
【非特許文献３】Tita Foophow, Shun-ichi Tanaka, Yuichi Koga, Kazufumi Takano, Shigenori Kanaya, Second subtilisin homologue from Thermococcus kodakaraensis with N and C-terminal propeptides. 第81回日本生化学会大会、第31回日本分子生物学会年会合同大会講演要旨集, 2P-0232, 2008年12月9日−12日.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、耐熱性酵素は好熱菌由来の酵素をスクリーニングすることにより取得できる場合があるが、適切な生物を選択してスクリーニングを行っても、利用条件において高い安定性を有し、高い活性を発現できる酵素が必ずしも見つかるわけではない。また、タンパク質のアミノ酸配列を改変して安定性を付与する研究が行われているが、タンパク質機能に影響を与えずに安定性を向上させるような一般技術は確立していない。
【０００６】
そこで、本発明は、任意のタンパク質と融合タンパク質を形成することで当該タンパク質の安定性を向上させることができるポリペプチド、および当該ポリペプチドを用いてタンパク質の安定性を向上させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］タンパク質の安定性を向上させるポリペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部であって、少なくとも第１位〜第１０１位を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の一部であって、少なくとも配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１位〜第１０１位に相当する部分を含むアミノ酸配列
［２］前記安定性が、構造安定性である前記［１］に記載のポリペプチド。
［３］前記安定性または前記構造安定性が、プロテアーゼに対する安定性、熱に対する安定性、または酸に対する安定性である前記［１］または［２］に記載のポリペプチド。
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
［５］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド、または［４］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［６］前記［５］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［７］前記［６］に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
［８］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質を製造する工程を含有することを特徴とするタンパク質の安定性を向上させる方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、任意のタンパク質と融合タンパク質を形成することで当該タンパク質の安定性を向上させることができるポリペプチド、および当該ポリペプチドを用いてタンパク質の安定性を向上させる方法を提供することができる。本発明のポリペプチドを利用することにより、今まで産業利用に適していなかった酵素等を、産業上有利な温度条件やｐＨ条件の下で利用することが可能になる。それゆえ、本発明は、これまで利用できなかった用途にも酵素等の利用を可能とする極めて有用な技術である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＰｒｏＴｋ−ＳＰの一次構造を示す図である。
【図２】ＰｒｏＴｋ−ＳＰの三次構造を示す図である。
【図３】（Ａ）はＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの発現を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、（Ｂ）はＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの活性を確認したゼラチン電気泳動の結果を示す図である。
【図４】ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰおよびＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌのキモトリプシン（プロテアーゼ）に対する安定性を電気泳動により確認した結果を示す図である。
【図５】ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰおよびＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの熱安定性をＣＤ測定により確認した結果を示す図である。
【図６】（Ａ）はＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌおよびＰｒｏＴｋ−ＳＰの二次構造をＣＤスペクトル測定により確認した図であり、（Ｂ）はＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの酸性条件下における安定性をＣＤスペクトル測定により確認した図であり、（Ｃ）はＰｒｏＮＴｋ−ＳＰの酸性条件下における安定性をＣＤスペクトル測定により確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔ポリペプチド〕
本発明者らは、Ｔｋ−ＳＰ（非特許文献３）の研究を進める過程において、本発明のポリペプチドを見出した。以下に本発明に至る経過の概要を説明する。
【００１１】
図１にＴｋ−ＳＰの一次構造を示す。本発明者らは、Ｔｋ−ＳＰの前駆体（図１中「ＰｒｏＴｋ−ＳＰ」）は、Ｎ末端に１１３アミノ酸からなるプロ配列（図１中「Ｎ−ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ」）と、Ｃ末端に１０１アミノ酸からなるプロ配列（図１中「Ｃ−ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ」）とを有し、プロセシング（成熟化）を経ることにより両末端のプロ配列が切断されて、４２６アミノ酸からなるＴｋ−ＳＰ（成熟体）が得られることを見出していた（非特許文献３）。本発明者らは、Ｔｋ−ＳＰについて研究を進め、Ｎ末端のプロ配列のみを有する前駆体（以下「ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ」と記す。）を組み換えタンパク質として作製し、その三次元構造解析を行った。図２に、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰの三次元構造を示す。図２において、左下の薄い灰色で示された部分がＮ末端のプロ配列であり、それ以外の部分がＴｋ−ＳＰ（成熟体）である。図２からわかるように、Ｔｋ−ＳＰは２つのドメインからなり、そのＣ末端側のドメイン（図２右下の濃い灰色で示された部分）はジェリーロール構造を有することが明らかとなった。
【００１２】
本発明者らは、さらに研究を進め、Ｔｋ−ＳＰのＣ末端側のドメイン（以下「Ｊｅｌ」と記す。）が欠失したＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ（以下「ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌ」と記す。）を作製して、Ｊｅｌを有するＰｒｏＮＴｋ−ＳＰと比較検討し以下の知見を得た（実施例参照）
（１）ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌがプロテアーゼ活性を有していること
（２）ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌはプロテアーゼ（キモトリプシン）で分解されるが、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰは分解されないこと
（３）ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌは９０℃以下の温度で変性するが、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰは９０℃を超える温度でも変性しないこと
（４）ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌはｐＨ４以下では二次構造を維持できないが、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰはｐＨ４でも二次構造を維持できること
これらの知見により、本発明者らは、Ｔｋ−ＳＰのＣ末端側のドメイン（Ｊｅｌ）がＴｋ−ＳＰの機能ドメイン（図２中央の黒色で示された部分）の安定性を向上させる機能を有することを見出した。
【００１３】
以下、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、タンパク質の安定性を向上させる機能を有するものであればよい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部であって、少なくとも第１位〜第１０１位を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列の一部であって、少なくとも配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１位〜第１０１位に相当する部分を含むアミノ酸配列
【００１４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｔｋ−ＳＰの前駆体（以下「ＰｒｏＴｋ−ＳＰ」と記す。）のアミノ酸配列（配列番号３）の第４２２位〜第５３９位に該当する。本発明のポリペプチドは、図２に示した三次元構造の解析結果から、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち少なくとも第１位〜第１０１位のアミノ酸配列が必要であると推定されるが、さらに数個のアミノ酸が欠失していても、タンパク質の安定性を向上させる機能を有する限り、本発明に含まれる。
【００１５】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的変異法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質から単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。より好ましくは、保存性置換、欠失、または付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。
【００１６】
本明細書において「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸が複数のペプチド結合によって結合したものを意味し、特定の立体構造をつくっている状態のものおよび特定の立体構造をつくっていない状態のものを含む。また、本明細書において「タンパク質」は、ポリペプチドが特定の立体構造をつくった状態を意味する。
【００１７】
「タンパク質の安定性を向上させる」とは、本発明のポリペプチドを有するタンパク質と本発明のポリペプチドを有しないタンパク質の安定性を比較したときに、本発明のポリペプチドを有するタンパク質の安定性が向上していることを意味し、安定性の指標および向上の程度は問わない。安定性の指標としては、例えば、熱に対する安定性、酸に対する安定性、アルカリに対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、変性剤に対する安定性、界面活性剤に対する安定性、有機溶媒に対する安定性、長期保存に対する安定性、乾燥に対する安定性、凍結融解に対する安定性、変性に対する可逆性（一旦変性した後、元の構造に戻ること）、可溶性（溶液状態で沈殿しない状態を保つこと）などが挙げられる。本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの指標について安定性を向上させるものであればよい。ここで、上記例示した安定性の指標は、いずれもタンパク質の構造安定性の向上に依存して向上すると考えられる。つまり、各種条件下においてタンパク質の構造が不可逆的に変性しないことに起因して、上記指標の安定性が向上すると考えられる。したがって、「タンパク質の安定性」は「タンパク質の構造安定性」と換言することができる。
【００１８】
タンパク質の安定性が向上しているか否かの確認方法は特に限定されない。熱に対する安定性は、例えば、二次構造や三次構造が変化する温度（Ｔｍ）の変化を円偏光二色性スペクトル測定器や蛍光光度計、熱量計を用いて決定する方法で確認することができる。酸またはアルカリに対する安定性は、例えば、各ｐＨにおける構造変化を円偏光二色性スペクトル測定器や蛍光光度計などを用いる方法で確認することができる。プロテアーゼに対する安定性は、例えば、キモトリプシンのようなプロテアーゼを限定分解条件下で反応させ、分解産物の割合をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法で比較する方法で確認することができる。有機溶媒、界面活性剤、変性剤、長期保存、乾燥または凍結融解に対する安定性は、例えば、各条件に晒す前後の酵素活性の変化を比較する（残存活性測定）方法、または、構造の変化を物理化学的に測定する方法で確認することができる。可溶性の向上は、例えば、超遠心分離などにより不溶化したタンパク質を沈殿させた後、上清みに残ったタンパク質量を定量することで確認することができる。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法により本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を単離または合成して組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させることにより製造することができる。または、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によって製造することができる。
【００２０】
〔融合タンパク質〕
本発明のポリペプチドは、通常、安定性を向上させようとする目的タンパク質（以下単に「目的タンパク質」という。）と融合タンパク質を形成して使用する。すなわち、本発明のポリペプチドが目的タンパク質に連結した融合タンパク質として使用する。本発明は、このような本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。また、本発明は、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を製造する工程を含有するタンパク質の安定性を向上させる方法を提供する。
目的タンパク質は特に限定されず、安定性を向上させようとするタンパク質を適宜選択して決定すればよい。当該タンパク質は、全長タンパク質でもよく、部分タンパク質でもよいが、少なくとも機能ドメインを含むことが好ましい。機能ドメインを含むタンパク質の安定性を向上させることにより、本来機能の発現が困難な条件下において、当該タンパク質の機能を発現させることが可能となる。
【００２１】
本発明の融合タンパク質は、例えば、公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子と、目的タンパク質をコードする遺伝子とを適宜連結して融合遺伝子を作製し、これを発現ベクターに挿入して組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して発現させ、精製すればよい。また、融合遺伝子を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によっても製造することができる。
【００２２】
本発明の融合タンパク質において、本発明のポリペプチドは目的タンパク質のＮ末端側に連結してもよく、Ｃ末端側に連結してもよい。Ｔｋ−ＳＰでは機能ドメインのＣ末端に本発明のポリペプチドが結合していることから、目的タンパク質のＣ末端側に本発明のポリペプチドが連結した融合タンパク質が好ましいと推定される。また、本発明の融合タンパク質は、本発明のポリペプチドおよび目的タンパク質以外に他のペプチド（タンパク質）を含むものでもよい。他のペプチド（タンパク質）としては、例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ配列等が挙げられる。
【００２３】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のポリペプチドをコードするもの、または上記本発明の融合タンパク質をコードするものであればよい。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１位〜第１０１位は、配列番号２に示される塩基配列の第１位〜第３０３位がコードする。発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’側または３’側で上記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに融合されていればよい。目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報は、公知のデータベース等から得ることができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、上記他のペプチド（タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。
【００２４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ＤＮＡは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）、または、非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、配列番号２に示される塩基配列の５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に基づいてそれぞれプライマーを設計し、これらプライマーを用いてＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株のゲノムＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドも同様に、目的タンパク質の塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、目的タンパク質が由来する生物種のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行うことで、取得することができる。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを公知の遺伝組み換え技術を用いて連結（ライゲーション）することにより作製できる。
【００２６】
〔発現ベクター〕
本発明は、本発明のポリペプチドや本発明の融合タンパク質を製造するために使用する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクターが好ましい。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００２７】
本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を回収、精製することができる。
【００２８】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、宿主が真核生物細胞の場合はジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、宿主がＥ．ｃｏｌｉまたは他の細菌の場合はテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００２９】
〔形質転換体〕
本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本明細書において「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、宿主細胞として公知の各種微生物、植物または動物を用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。
【００３０】
本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
本発明の形質転換体は、上記本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質が発現されていることを特徴とする。本発明の形質転換体は、上記本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質が安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの作製および活性確認〕
ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの発現系を構築し、大腸菌宿主での発現を確認した。すなわち、Ｔｋ−ＳＰのプロ体（ＰｒｏＴｋ−ＳＰ）のアミノ酸配列（配列番号３）の第１位〜第４２１位からなるＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌ（図２参照）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、ＰｒｏＴｋ−ＳＰ遺伝子（配列番号４）を鋳型とするＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴ２５ｂ（Novagen社製）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイトにライゲーションし、発現ベクターを構築した。この発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓｅＳを形質転換し、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌを大量発現する菌株を得た。
【００３３】
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＮＺＣＹＭ培地を用いて３７℃で培養した。ＯＤ600が約０．７に達した段階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を続けた。ＩＰＴＧ添加前、ＩＰＴＧ添加後１時間およびＩＰＴＧ添加後４時間の各時点で集菌し、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰの発現量を確認した。具体的には、各時点で培地５００μｌを採取し、遠心分離により集菌した。いずれのサンプルもＯＤ600値が同じになるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌懸濁液２０μｌに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）９８０μｌを加え、さらに１１２μｌのＴＣＡを加えて−２０℃で１２分間インキュベートした。遠心分離によりタンパク質を集め、７０％アセトンで洗浄し、２０μｌのＳＤＳサンプルバッファーに懸濁した。この懸濁液に２Ｍ ＮａＯＨを０．３μｌ加えて中和し、５分間煮沸した。
【００３４】
発現量の確認のために、煮沸後のサンプル１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ポリアクリルアミドゲル使用）に供した。結果を図３（Ａ）に示した。図３（Ａ）からわかるように、本発現系によりＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌが発現していることを確認した。また、培地にＩＰＴＧを添加してインキュベートすることにより、発現量が増加することが示された。
【００３５】
活性の確認のために、煮沸後のサンプル１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含む１５％ポリアクリルアミドゲルを使用）に供した。電気泳動後、ゲルを２．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で室温、１時間洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で８０℃、２時間インキュベートし、ＣＢＢ染色した。結果を図３（Ｂ）に示した。図３（Ｂ）からわかるように、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの位置には透明のバンドが現れており、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌはプロテアーゼ活性を有することが示された。
【００３６】
〔実施例２：Ｊｅｌ断片の有無による安定性の検討〕
（１）実験材料
Ｊｅｌ断片を有するＰｒｏＮＴｋ−ＳＰと、Ｊｅｌ断片がないＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌを用いた（図２参照）。また、比較のためにＣ末端側のプロペプチドも含むＰｒｏＴｋ−ＳＰを用いた（図２参照）。なお、いずれのタンパク質も、自己分解を防ぐために、プロテアーゼ活性中心の１つである配列番号３の第３５９位のセリンをアラニン変えた変異タンパク質を用いた。用いたタンパク質はいずれも実施例１のＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌと同様の方法で発現ベクターを構築し、大腸菌に導入して組換えタンパク質として発現させ、これを公知の方法で精製して、本実施例に供した。
【００３７】
（２）キモトリプシン（プロテアーゼ）に対する安定性の検討
８μｇのＰｒｏＮＴｋ−ＳＰまたはＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にキモトリプシンを０、０．０８、または０．８μｇ添加し、３０℃で１時間インキュベートした。ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰについては、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた場合も同様に行った。インキュベート後、各反応液に１１２μｌのＴＣＡを加えて−２０℃で１２分間インキュベートした。遠心分離によりタンパク質を集め、７０％アセトンで洗浄し、２０μｌのＳＤＳサンプルバッファーに懸濁した。この懸濁液に２Ｍ ＮａＯＨを０．３μｌ加えて中和し、５分間煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲルを使用）に供した。
【００３８】
結果を図４に示した。図４における各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ
レーン２：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ＋０．００８μｇキモトリプシン
レーン３：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ＋０．０８μｇキモトリプシン
レーン４：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ（＋ＣａＣｌ２）
レーン５：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ＋０．００８μｇキモトリプシン（＋ＣａＣｌ２）
レーン６：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ＋０．０８μｇキモトリプシン（＋ＣａＣｌ２）
レーン７：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌ
レーン８：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌ＋０．００８μｇキモトリプシン
レーン９：ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌ＋０．０８μｇキモトリプシン
図４から明らかなように、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰは、カルシウムイオンの有無に関わらず、キモトリプシンによりほとんど消化されることがなかったが（レーン２，３，５，６参照）、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌはキモトリプシンの添加量に依存してほぼ完全に消化された。この結果から、Ｊｅｌ断片によりプロテアーゼ耐性が向上することが明らかとなった。
【００３９】
（３）ＣＤ測定による熱安定性の検討
ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰまたはＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌを０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で含むように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、２０℃〜９５℃の各温度における波長２２２ｎｍのＣＤを測定することで熱安定性を検討した。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰは全温度範囲で二次構造を維持したが、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌは９０℃以下の温度で変性することが示された。この結果から、Ｊｅｌ断片により熱安定性が向上することが明らかとなった。
【００４０】
（４）ＣＤスペクトル測定による酸性ｐＨに対する安定性の検討
まず、確認のために、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰおよびＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌのＣＤスペクトルを、ＰｒｏＴｋ−ＳＰのＣＤスペクトルと比較した。すなわち、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰ、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌ、またはＰｒｏＴｋ−ＳＰが０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でそれぞれ溶解し、２５℃におけるＦａｒ−ＵＶ ＣＤスペクトルを測定し、タンパク質の二次構造をチェックした。
結果を図６（Ａ）に示した。図６（Ａ）から明らかなように、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰおよびＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌは、ＰｒｏＴｋ−ＳＰとほぼ同一のＣＤスペクトルを示したことから、いずれのタンパク質も同程度の二次構造を有しており、立体構造が正しく形成されていることが示された。
【００４１】
次に、ｐＨ２〜５の４種類のバッファーを用いた場合の安定性について検討した。ｐＨ５．０または４．０のバッファーとして５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを用い、ｐＨ３．０または２．０のバッファーとして５０ｍＭグリシン塩酸バッファーを用いた。ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰまたはＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌが０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように各バッファーで溶解して３０℃で３０分間インキュベートした後、Ｆａｒ−ＵＶ ＣＤスペクトルを測定し、タンパク質の二次構造をチェックした。
【００４２】
ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌの結果を図６（Ｂ）に、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰの結果を図６（Ｃ）にそれぞれ示した。図６（Ｂ）から、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰΔＪｅｌはｐＨ４．０においてＣＤスペクトルが浅くなることから、二次構造が部分的に崩れはじめており、ｐＨ３．０ではその程度はさらに顕著になる。ｐＨ２．０ではＣＤスペクトルの波形も異なり、明らかに二次構造が崩れていることがわかる。一方、図６（Ｃ）から、ＰｒｏＮＴｋ−ＳＰは、ｐＨ５．０および４．０では二次構造を維持しており、ｐＨ３．０で二次構造が崩れはじめていることがわかる。この結果から、Ｊｅｌ断片により酸耐性が向上することが明らかとなった。
【００４３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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