(57)【要約】【課題】動物細胞発現系のみを用いた完全ヒトモノクローナル抗体のディスプレイ法とそのスクリーニング法を構築し、抗体作製や親和性成熟のための手法として確立する。【解決手段】互いに異なるタンパク質をそれぞれコードする２つの構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現されたタンパク質を当該動物細胞の細胞膜表面に提示させる動物細胞ディスプレイ法およびそれを利用した完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法。【選択図】図１
2011182645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに異なるタンパク質をそれぞれコードする２つの構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現されたタンパク質を当該動物細胞の細胞膜表面に提示させることを特徴とする、動物細胞ディスプレイ法。
【請求項２】
前記内部リボソーム進入部位の上流側の前記構造遺伝子が抗体の重鎖をコードする構造遺伝子であり、前記内部リボソーム進入部位の下流側の前記構造遺伝子が前記抗体の軽鎖をコードする構造遺伝子であるか、または、前記内部リボソーム進入部位の上流側の前記構造遺伝子が抗体の軽鎖をコードする構造遺伝子であり、前記内部リボソーム進入部位下流側の前記構造遺伝子が前記抗体の重鎖をコードする構造遺伝子であって、バイシストロニックに発現された前記重鎖および軽鎖を有する抗体が動物細胞の細胞膜表面に提示される、請求項１に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項３】
重鎖をコードする構造遺伝子が上流側から可変領域、定常領域を順にコードするものであり、軽鎖をコードする構造遺伝子が上流側から可変領域、定常領域を順にコードするものである、請求項２に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項４】
前記ベクターが、重鎖をコードする構造遺伝子と軽鎖をコードする構造遺伝子との間に膜貫通ドメインをコードする遺伝子が介在されるように設計されたものである、請求項２または３に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項５】
前記ベクターが、膜貫通ドメインをコードする遺伝子の５’末端側のｌｏｘＰ配列がイントロンに隠されており、重鎖の定常領域にｌｏｘＰ配列由来のアミノ酸配列が余分に付加されないように設計されている、請求項４に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項６】
前記ベクターが、重鎖をコードする構造遺伝子と膜貫通ドメインをコードする遺伝子との間、ならびに、膜貫通ドメインをコードする遺伝子と軽鎖をコードする構造遺伝子との間にｌｏｘＰサイトが介在され、前記ベクターを前記動物細胞にトランスフェクションさせた後、当該動物細胞にＣｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションさせることによって、または、当該動物細胞にＣｒｅリコンビナーゼを脂質キャリアーによって導入することによって、当該動物細胞において２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子が除去されるように設計されたものである、請求項４または５に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項７】
前記動物細胞において２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子が除去されることによって、前記抗体が膜型から分泌型に変換される、請求項６に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項８】
前記抗体がヒトＩｇＧである、請求項１〜７のいずれかに記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項９】
前記抗体がヒト高親和性ＩｇＥレセプターα鎖抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項１０】
ヒト末梢血単核球にヒト幼若好塩基球ＫＵ８１２Ｆ細胞を用いてインビトロで抗原感作させて得られたものである、請求項９に記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項１１】
動物細胞がＦｌｐ−Ｉｎシステムを有するＣＨＯ細胞である、請求項１〜１０のいずれかに記載の動物細胞ディスプレイ法。
【請求項１２】
抗体の重鎖の可変領域をコードする遺伝子をランダム増幅する工程と、
得られた増幅産物を、上流側から重鎖の可変領域、重鎖の定常領域を順にコードする構造遺伝子と、上流側から軽鎖の可変領域、軽鎖の定常領域を順にコードする構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターに、ランダムに変異を起こさせた重鎖の可変領域をコードする構造遺伝子として、それぞれ組み込んだベクターを構築する工程と、
当該ベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現された抗体が細胞膜表面に提示された動物細胞のライブラリを構築する工程と、
蛍光活性化セルソーティングによって動物細胞のライブラリから親和性の高い抗体を細胞膜上に発現する動物細胞を選択する工程と、
選択された動物細胞に完全ヒトモノクローナル抗体を分泌させる工程とを含む、完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞ディスプレイ法およびそれを利用した完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体（免疫グロブリン（Ｉｇ）とも呼ばれる）は抗原を特異的に認識するタンパク質であり、その性質から「魔法の弾丸」と称されている。抗体は、Ｂ細胞によって生産・分泌され、分子への高度な特異性と幅広い多様性をもって複数の抗原に対して結合する。Ｉｇ遺伝子は、抗体産生応答の多様性を広げるために、組換え、突然変異や再編成によって異なる分子プロセスを受ける。Ｂ細胞発生の初期には、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは異なる組合せでＶ、ＤとＪ部分をまとめるために起こる。こうして抗体のレパートリを増加させる。Ｂ細胞発生の後期では、抗原刺激の後、ヌクレオチド変化は、抗体の親和性亢進とより多くの多様性を抗原に付与する体細胞超変異として知られるプロセスによって、可変部に導入されうる。
【０００３】
免疫グロブリンにはＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤの５つの種類が知られている。生物工学の観点から、ＩｇＧは抗体で最も重要な種類である。ＩｇＧは、構造的には、２つの同一の重鎖（Ｈ鎖）と２つの同一の軽鎖（Ｌ鎖）を有しており、重鎖は１つの可変領域（ＶH）と３つの定常領域（ＣH１、ＣH2、ＣH3）、軽鎖は１つの可変領域（ＶL）と１つの定常領域（ＣL）から構成される。また機能的には、抗体は、可動性のヒンジ部位を介して連結された、２つの抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）と定常領域（Ｆｃ）に分けられる。重鎖と軽鎖の可変領域のアミノ末端部分が、抗原を認識する。各可変領域は、主に抗原認識に関与し、相補性決定領域（ＣＤＲ：Complementarity Determining Region）と呼ばれる３つの高頻度可変性配列を持つ。可変部に残留するアミノ酸は、ループを支える足場として作用し、フレームワーク残基（ＦＲ：Framework Region）と呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、エフェクタ機能、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ：Antibody−Dependent Cell−mediated Cytoxicity）および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ：Complement-Dependent Cytotoxicity）を仲介する。
【０００４】
ＩｇＧの特徴は、モノクローナル抗体による治療法に適しており、ヒトＩｇＧに基づくモノクローナル抗体は、主に癌の抗体治療に使用されている。モノクローナル抗体産生における進展は、１９７５年に、ハイブリドーマ技術によってもたらされた。ハイブリドーマは、目標抗原を用いて免疫された動物の脾臓からとったＢリンパ球と不死化骨髄腫細胞との融合によって作られる雑種細胞である。限界希釈法クローン化の後、ハイブリドーマは希望する抗原に対する特異性をもつモノクローナル抗体の純粋かつ恒久的な供給源として使われる。一旦、培養で確立されると、抗原特異性が確証されたハイブリドーマは増殖させられ、モノクローナル抗体を永久に産生することができる。このような抗体は、癌をはじめとした種々の疾患の検査薬や治療薬など幅広い分野での応用が期待されている。中でもヒトモノクローナル抗体は分子標的医薬としてその利用が拡大しつつある。
【０００５】
ヒトへの投与のためには抗原性を示さず血中半減期の長いヒト抗体が望まれる。ヒトへの投与のためにＦＤＡから承認を得た最初のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）としては、移植臓器拒絶の治療に使われるマウス抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ｍｕｒｏｍｏｎａｂ（ＯＫＴ３）が知られている。しかしながらこのようなマウス抗体は、半減期が１５−３０時間と短く、頻繁な投与が必要とされる。また、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ：Human Anti−Mouse Antibody）による免疫反応を引き起こし、血中から迅速に排除されるだけでなく、反復投与の場合に過敏性反応から生命を脅かすアナフィラキシー反応にわたる副作用を引き起こす。このため、マウス抗体の有用性は、限定されるものであった。
【０００６】
このため、ヒトに投与した際のマウス抗体の免疫原性を減らすべく、齧歯目の可変領域とヒト定常領域とを有するキメラ抗体が開発された。このようなキメラ抗体は、ヒトにおける生物活性を改善し、血中での半減期をより長くし、免疫原性を低くでき得ることが予測された。しかし、実際にはマウス抗体よりも低い免疫原性であったにもかかわらず、ヒトの抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ：Human Anti−Chimeric Antibody）反応は依然として観察された。
【０００７】
そこで、抗体のマウス構成要素をさらに最小化するために、ヒト化抗体がタンパク質工学によって開発された。このようなヒト化抗体においては、抗原結合に関与するマウス抗体のＣＤＲループだけがヒトの可変領域のフレームワークに移植される。結果として作製されたヒト化抗体は９０％までヒト性であり、キメラ抗体よりも有意に抗原性を減らすことができ、反復投与に耐えることができた。しかしながらＣＤＲ移植は、容易な技術ではなく、また、もとのマウス抗体と比較してしばしば親和性の低下を起こす。
【０００８】
ヒト化抗体では、移植されたネズミのＣＤＲの構造を維持するために、可変領域の最適なフレームワーク部位が選択されなければならない。したがって、ヒトとマウスとの構造類似点を基礎としたヒトのテンプレートの選択や、コンピュータで導いた抗体可変領域モデリングといった幾つかの実験的なアプローチが、個々の抗体クローンをヒト化するために必要であった。このようにハイブリドーマ技術によるヒトモノクローナル抗体の産生は、マウスモノクローナル抗体の産生ほど容易ではなく、より安全な疾患の治療のための完全なヒト抗体を産生するための研究が数多くなされてきた。
【０００９】
また、マウス骨髄腫細胞とヒト免疫グロブリン産生細胞の融合によって調製されるキメラの融合細胞は、ヒト染色体が次第に失われることが原因で不安定な傾向にある。ヒト−ヒトハイブリドーマ技術には、ヒト由来親細胞１０5個につき、約０．１−１．０クローンという低い融合効率の問題がある。さらに、リンパ球のＥＢウイルス（ＥＢＶ：Epstein−Barr Virus）形質転換は生体外でヒトＢリンパ球を不死化することによりヒトモノクローナル抗体を得るために長く用いられてきたが、その方法はその効率の低さゆえにルーチンとしては受け入れられず、また結果として生じる形質転換細胞はしばしば不安定で、増殖しなかったり、ＩｇＧを分泌しなかったりする。細胞不死化に基づくこれらの方法が主にヒトモノクローナル抗体の産生に使われているにもかかわらず、細胞不死化の効率および抗原特異的抗体産生細胞の選別に関係する多くの問題がある。
【００１０】
これらの問題を解決し、完全なヒト抗体を得る目的で、ヒト起源の人工抗体フラグメントを発現するファージディスプレイ・ライブラリが開発された。哺乳類の免疫系では、高親和性を持つ抗体は、主として抗体遺伝子のＣＤＲ部分における生殖細胞系抗体遺伝子部分と体細胞超変異が組み合わさった組換えによって作られ、さらに親和性成熟によってより高親和性を持つ抗体を発現するＢリンパ球が選別され、増殖する。ファージ抗体技術は、ヒト抗体遺伝子の大規模なライブラリから標的抗原に特異的な抗体をコードした遺伝子をクローン化することによって、免疫系をうまくまねることができる。ファージ抗体技術では、ファージ外被タンパク質の一部として、抗体の可変部位のみを一本鎖抗体（Single Chain Fv, scFv）の形で発現させる。抗体遺伝子はファージ・外被タンパク質遺伝子に連結される。発現する際、コードされた融合タンパク質は、正常なファージ生成の過程で、ファージ粒子に組み込まれる。結果として生じるファージ粒子はその表面に抗体を発現し、抗体をコードする遺伝子を含む。タンパク質と遺伝子が連繋しているために、パニングと呼ばれる抗原に対する親和性選択法を通した特異的なファージ提示抗体の単離によって結果的に抗体をコードする遺伝子を選択することができる。一旦ライブラリが作られると、それを増幅することができ、繰り返し、多数の抗原に対して特異的な抗体を分離するのに用いることができる。
【００１１】
ヒトモノクローナル抗体を生成する他の方法では、細菌および酵母細胞表面ディスプレイ法が開発されている。ファージディスプレイを上回る細胞表面ディスプレイの重要な長所は、高親和性相互作用を同定し、抗体タンパク質発現を標準化して定量的に分析できるフローサイトメトリーソーティングを使用できることである。近年では、全長ＩｇＧ抗体は、本来の機能をモニタするために、大腸菌で発現することができる。リボソームディスプレイのような無細胞系は、かなりの大きさのライブラリを作製し抗体親和性成熟のために利用できるという点で役立つツールである。しかし、これらの技術はタンパク質の折り畳み、翻訳後修飾、コドン使用に関する問題のために、実際に親和性が改善された抗体の数は限定的である。
【００１２】
近年では、ヒトモノクローナル抗体の作製法は、哺乳類の発現系または単離されたＢ細胞を利用することが多い。ヒトモノクローナル抗体の親和性成熟のためのヒト細胞におけるｓｃＦｖディスプレイ法では、可変領域がより効率的に折り畳まれ、生体内での現場と最も類似しているヒト細胞環境で抗体遺伝子を発現させている（たとえば、Mitchell Ho et al., "Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells", Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 103, No. 25, (2006), pp.9637-9642（非特許文献１）を参照）。ただし、この方法では細胞膜表面にｓｃＦｖをモノクローンではなく、ポリクローンで発現させている。ヒトモノクローナル抗体を単離するための哺乳動物細胞上でのシンドビスウイルス仲介ｓｃＦｖディスプレイ法では、動物の細胞は、感染した細胞当たり一つの抗体遺伝子の発現を実現するために、低い感染多重度（ＭＯＩ：Multiplicity of Infection）で、ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含むシンドビスウイルスを細胞に感染させた（たとえば、Roger R. Beerli et al., "Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display", PNAS, Vol. 105, No. 38, (2008), pp.14336-14341（非特許文献３）を参照）。しかし、この方法では一細胞当たり一抗体遺伝子の発現を保証することは困難である。高親和性をもつモノクローナル抗体を単離するために、ワクチンに感作された抗原特異的メモリーＢ細胞が利用された。また、ヒトの体内で自然に産生された親和性成熟された抗原特異的抗体産生細胞を選択する方法では、抗原特異的抗体遺伝子が単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ（Real Time−Polymerase Chain Reaction）でヒトから単離されたＢ細胞から得られた。これらの方法では、生体内での免疫系が、高親和性と高特異性を持つヒトモノクローナル抗体を得るためには必要であった。しかし、任意の抗原に対する特異的抗体産生細胞を得るためにヒトに免疫感作を行うことは倫理上難しく、また多くの抗原がヒトの生体内での免疫感作には適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Mitchell Ho et al., "Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells", Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 103, No. 25, (2006), pp.9637-9642
【非特許文献２】Yoshiko Akamatsu et al., "Whole IgG surface display on mammalian cells: Application to isolation of neutralizing chicken monoclonal anti-IL-12 antibodies", Journal of Immunological Methods, Vol. 327, (2007), pp.40-52
【非特許文献３】Roger R. Beerli et al., "Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display", PNAS, Vol. 105, No. 38, (2008), pp.14336-14341
【非特許文献４】Paivi Pihkala et al., "An antigen-mediated selection system for mammalian cells that produce glycosylated single-chain Fv", Biochem. Biophys. Res. Commun, Vol. 324, (2004), pp.1165-1172
【非特許文献５】Ronald H. Hoess et al., "Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre with the recombining site loxP", Proc. Natl. Acad, Sci USA, Vol. 81, (1984), pp. 1026-1029
【非特許文献６】Stephen O' Gorman et al., "Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in Mammalian Cells", Science, Vol. 251, (1991), pp. 1351-1354
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
末梢血Ｂ細胞由来のヒト抗体遺伝子を用いたファージディスプレイ法は膨大なサイズのライブラリを作製するのに多大な時間と労力を必要とする。これらの問題点を解決する方法として、健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ：peripheral blood monocyte）を用いた「体外免疫法（in vitro immunization）」が本発明者によって独自に開発され、これまでに可溶性タンパク質やペプチドを抗原とした免疫応答の誘導に成功している。本発明者は、ＰＢＭＣに、ヒト高親和性ＩｇＥレセプターα鎖（ＦｃεＲＩα）を高発現するヒト幼若好塩基球ＫＵ８１２Ｆ細胞にインビトロで抗原感作させ、抗原特異的な免疫応答が誘導されたＰＢＭＣをファージディスプレイ法に供し、抗原タンパク質を用いたパニングにより抗原特異的ファージ抗体遺伝子の取得を行なった。得られた遺伝子のうち、反応性の高かったクローンをヒトＩｇＧ型に組換え、高生産性ＣＨＯ細胞で発現させることによりモノクローナル抗体を取得した。得られた抗体は、ＦｃεＲＩを特異的に認識するとともに、ＦｃεＲＩとＩｇＥの結合を阻害するものであった。
【００１５】
しかしながら、ファージディスプレイ法を用いたスクリーニングにより取得した抗原特異的一本鎖抗体遺伝子（ｓｃＦｖ（単鎖抗体）型）を完全ヒト抗体遺伝子（ヒトＩｇＧフォーマット）に組換えて動物細胞で発現させる際に多くの変異が生じ、特異性や親和性の消失が起こるために目的の抗体を取得するにあたって多大な労力を必要とする。これは微生物発現系においては動物細胞とコドン使用頻度が違うこと、正常なフォールディングや翻訳後修飾が行われないことなどが原因であると考えられた。このことは、たとえ抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を得るために効率的に体外免疫法とファージディスプレイ法を実行したとしても、ファージディスプレイ法を用いてスクリーニングした後の組換えのプロセスの間に、効率が非常に低下することを示す。さらに、取得された抗体には特異性はあるものの親和性が低いという問題もあった。
【００１６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、動物細胞発現系のみを用いた完全ヒトモノクローナル抗体のディスプレイ法とそのスクリーニング法を構築し、抗体作製や親和性成熟のための手法として確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の動物細胞ディスプレイ法は、互いに異なるタンパク質をそれぞれコードする２つの構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現されたタンパク質を当該動物細胞の細胞膜表面に提示させることを特徴とする。
【００１８】
本発明の動物細胞ディスプレイ法において、前記内部リボソーム進入部位の上流側の前記構造遺伝子が抗体の重鎖をコードする構造遺伝子であり、前記内部リボソーム進入部位の下流側の前記構造遺伝子が前記抗体の軽鎖をコードする構造遺伝子であるか、または、前記内部リボソーム進入部位の上流側の前記構造遺伝子が抗体の軽鎖をコードする構造遺伝子であり、前記内部リボソーム進入部位の下流側の前記構造遺伝子が前記抗体の重鎖をコードする構造遺伝子であって、バイシストロニックに発現された前記重鎖および軽鎖を有する抗体が動物細胞の細胞膜表面に提示されることが、好ましい。
【００１９】
本発明の動物細胞ディスプレイ法において、重鎖をコードする構造遺伝子が上流側から可変領域、定常領域を順にコードするものであり、軽鎖をコードする構造遺伝子が上流側から可変領域、定常領域を順にコードするものであることが、好ましい。
【００２０】
また本発明の動物細胞ディスプレイ法における前記ベクターは、重鎖をコードする構造遺伝子と軽鎖をコードする構造遺伝子との間に膜貫通ドメインをコードする遺伝子が介在されるように設計されたものであることが好ましい。この場合、前記ベクターが、膜貫通ドメインをコードする遺伝子の５’末端側のｌｏｘＰ配列がイントロンに隠されており、重鎖の定常領域にｌｏｘＰ配列由来のアミノ酸配列が余分に付加されないように設計されていることが好ましい。
【００２１】
また本発明においては、前記ベクターが、重鎖をコードする構造遺伝子と膜貫通ドメインをコードする遺伝子との間、ならびに、膜貫通ドメインをコードする遺伝子と軽鎖をコードする構造遺伝子との間にｌｏｘＰサイトが介在され、前記ベクターを前記動物細胞にトランスフェクションさせた後、当該動物細胞にＣｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションさせることによって、または、当該動物細胞にＣｒｅリコンビナーゼを脂質キャリアーによって導入することによって、当該動物細胞において２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子が除去されるように設計されたものであることが、好ましい。この場合、前記動物細胞において２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子が除去されることによって、前記抗体が膜型から分泌型に変換されることがより好ましい。
【００２２】
本発明における前記抗体は、ヒトＩｇＧであることが好ましい。
本発明における前記抗体は、ヒト高親和性ＩｇＥレセプターα鎖抗体であることが好ましく、ヒト末梢血単核球にヒト幼若好塩基球ＫＵ８１２Ｆ細胞を用いてインビトロで抗原感作させて得られたものであることが、好ましい。
【００２３】
本発明における動物細胞は、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを有するＣＨＯ細胞であることが、好ましい。
【００２４】
本発明はまた、抗体の重鎖の可変領域をコードする遺伝子をランダム増幅する工程と、得られた増幅産物を、上流側から重鎖の可変領域、重鎖の定常領域を順にコードする構造遺伝子と、上流側から軽鎖の可変領域、軽鎖の定常領域を順にコードする構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターに、ランダムに変異を起こさせた重鎖の可変領域をコードする構造遺伝子として、それぞれ組み込んだベクターを構築する工程と、当該ベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現された抗体が細胞膜表面に提示された動物細胞のライブラリを構築する工程と、蛍光活性化セルソーティングによって動物細胞のライブラリから親和性の高い抗体を細胞膜上に発現する動物細胞を選択する工程と、選択された動物細胞に完全ヒトモノクローナル抗体を分泌させる工程とを含む、完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法についても提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の動物細胞ディスプレイ法により、動物細胞発現系のみを用いた完全ヒトモノクローナル抗体のディスプレイ法とそのスクリーニング法が確立され、またこれを利用して、完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１（ａ）は、本発明の動物細胞ディスプレイ法において構築され得るベクターの具体的な一例を概念的に示す図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）に示すベクターを用いた動物細胞ディスプレイ方法を段階的に示す概念図である。
【図２】図２（ａ）は、後述する実験例１で本発明者が構築したベクターにおける重鎖の定常領域をコードする構造遺伝子の下流側と膜貫通ドメインをコードする遺伝子との間を模式的に示す図であり、図２（ｂ）は具体的な塩基配列、アミノ酸配列で示す図である。
【図３】実験例１におけるｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＬの構築の手順を段階的に示す模式図である。
【図４】実験例１におけるｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＨの構築の手順を段階的に示す模式図である。
【図５】実験例１における可変領域遺伝子の挿入の手順を段階的に示す模式図である。
【図６】実験例１におけるＣＨＯ細胞表面でのＩｇＧ分子発現を示すグラフであり、図６（ａ）はＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＨ抗体でＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を処理した場合、図６（ｂ）は抗ヒトＩｇκ抗体でｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を処理した場合の結果であり、網掛けの領域がＩｇＧプラスミドをトランスフェクトされた細胞、白抜きの領域がトランスフェクトされていない細胞をそれぞれ示している。
【図７】実験例１における表面でＩｇＧを発現するＣＨＯ細胞の抗高親和性ＩｇＥレセプターα鎖抗原結合活性を示すグラフであり、網掛けの領域がＩｇＧプラスミドをトランスフェクトされた細胞、白抜きの領域がトランスフェクトされていない細胞をそれぞれ示している。
【図８】図８（ａ）は、実験例１における膜貫通ドメインをコードする遺伝子の組換えの予想図であり、点線部はイントロン、矢印はｌｏｘＰ部位を示す。図８（ｂ）は、実際に膜貫通ドメインをコードする遺伝子の組換えを行なった結果を示す電気泳動写真である。
【図９】図９（ａ）は、実験例１におけるテンプレートＤＮＡの状態のスキームおよびＰＣＲによる増幅領域を模式的に示す図であり、図９（ｂ）は、膜貫通ドメインのないイントロンのスプライシング反応が起こったことを示す電気泳動写真である。
【図１０】ＣＥＰ４／Ｃｒｅを細胞へトランスフェクションさせた後の培養上清からＥＬＩＳＡでＩｇＧが検出された結果を示すグラフであり、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度である。
【図１１】実験例１におけるＣＨＯ細胞の細胞内ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで検出した結果を示すグラフであり、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度である。
【図１２】実験例２におけるＣＨＯ細胞のセルソーティングの結果を示すグラフであり、縦軸はＳＳＣ、横軸はＦＩＴＣの蛍光強度である。
【図１３】実験例２におけるソートされた細胞からの抗ＦｃεＲＩα抗体の反応性を比較して示すグラフであり、図１３（ａ）は図１１におけるＰ１領域、図１３（ｂ）は図１１におけるＰ２領域についての結果であり、いずれも縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
〔動物細胞ディスプレイ法〕
図１（ａ）は、本発明の動物細胞ディスプレイ法において構築され得るベクターの具体的な一例を概念的に示す図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）に示すベクターを用いた動物細胞ディスプレイ法を段階的に示す概念図である。本発明は、互いに異なるタンパク質をそれぞれコードする２つの構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現されたタンパク質を当該動物細胞の細胞膜表面に提示させることを特徴とする動物細胞ディスプレイ法を提供する。このような本発明の動物細胞ディスプレイ法により、動物細胞発現系のみを用いた完全ヒトモノクローナル抗体のディスプレイ法とそのスクリーニング法が確立され、またこれを利用して、完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟が可能となる。
【００２８】
本発明の動物細胞ディスプレイ法に用いられるベクターには、単一の上流プロモータの管理下で、単一の転写カセット内で少なくとも２つの遺伝子を発現する（すなわち、バイシストロニックに発現する）な構築物を設計するために使用され得ることが知られている内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：Internal Ribosome Entry Site）が用いられる。このようなＩＲＥＳを含むベクターを用いることで、ＩＲＥＳの上流側の構造遺伝子と下流側の構造遺伝子でそれぞれコードされるタンパク質を、２種類の独立した構成要素として、当該構成要素で構成された１つのタンパク質を発現させることが可能となる。
【００２９】
本発明の動物細胞ディスプレイ法に用いられるベクターにおける２つの構造遺伝子によりコードされるタンパク質としては特に制限されるものではないが、ヒトモノクローナル抗体の産生、特に後述する体外成熟（ヒトモノクローナル抗体の親和性の向上）に有用であることから、当該ベクターがトランスフェクションされたＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞の細胞膜表面に提示されるのは抗体であることが好ましい。
【００３０】
動物細胞の細胞膜表面に抗体を提示させる場合、以下の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかであることが好ましい。
【００３１】
（Ａ）前記ＩＲＥＳの上流側の前記構造遺伝子が抗体の重鎖をコードする構造遺伝子であり、前記ＩＲＥＳの下流側の前記構造遺伝子が前記抗体の軽鎖をコードする構造遺伝子である、
（Ｂ）前記ＩＲＥＳの上流側の前記構造遺伝子が抗体の軽鎖をコードする構造遺伝子であり、前記ＩＲＥＳの下流側の前記構造遺伝子が前記抗体の重鎖をコードする構造遺伝子である。
【００３２】
この（Ａ）または（Ｂ）の構成とすることにより、バイシストロニックに発現された前記重鎖および軽鎖を有する抗体を動物細胞の細胞膜表面に提示させることができるようになる。
【００３３】
また、本発明の動物細胞ディスプレイ法において、上述した（Ａ）、（Ｂ）のいずれの場合であっても、重鎖をコードする構造遺伝子が上流側から可変領域、定常領域を順にコードするものであり、軽鎖をコードする構造遺伝子が上流側から可変領域、定常領域を順にコードするものであることが、好ましい。
【００３４】
本発明に用いられるベクターとしては、特に制限はないが、プラスミドベクターを好適に用いることができる。
【００３５】
本発明の動物細胞ディスプレイ法には、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞が用いられる。ここで、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムは、動物細胞でのスクリーニングの制限を克服するため、安定して発現する細胞系を生成するために開発された系であり、動物細胞へのＦｌｐ−Ｉｎシステムの導入（Ｆｌｐ−Ｉｎ組換え）は、Saccharomyces cerevisiaeに由来するＦｌｐリコンビナーゼによって触媒されることが知られている。Ｆｌｐリコンビナーゼは、λインテグラーゼファミリーの一つであり、３４塩基対ＦＲＴ（Ｆｌｐ組換え標的作用点：Flp Recombination Target）認識目標配列を認識する。Ｆｌｐリコンビナーゼはまた、部位特異的なＤＮＡ組換えを通して、一つのＦＲＴ部位または細胞を組み込まれる細胞系のゲノムに、ＦＲＴ配列を含むプラスミドＤＮＡの挿入を仲介する（たとえば、Stephen O' Gorman et al., "Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in Mammalian Cells", Science, Vol. 251, (1991), pp. 1351-1354（非特許文献６）を参照。）。本発明では、このようなＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞に上述したようなベクターをトランスフェクションさせることで、動物細胞に複数のベクターが導入されることを回避し、バイシストロニックに発現されたタンパク質が当該動物細胞の細胞膜表面でクローンで提示される。
【００３６】
本発明に用いられる動物細胞は、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを導入し得る動物細胞であれば特に制限はなく、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ：Chinese Hamster Ovary）細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＶ−１細胞などが挙げられるが、これら以外にも、Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを導入可能な適宜の動物細胞を用いることができる。中でも、産業面で抗体産生のための宿主細胞として最も広範に利用されているという理由から、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。後述する実験例では、単一の統合ＦＲＴ部位を含み、ＦＲＴ部位の下流にコードされたｌａｃＺ−ゼオシン融合遺伝子を安定して発現するＦｌｐ−Ｉｎシステムを有するＣＨＯ細胞（Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞）が好適に用いられている。
【００３７】
また本発明の動物細胞ディスプレイ法における前記ベクターは、重鎖をコードする構造遺伝子と軽鎖をコードする構造遺伝子との間に膜貫通ドメインをコードする遺伝子が介在されるように設計されたものであることが好ましい。膜貫通ドメインをコードする遺伝子を含むことで、上述したベクターをトランスフェクションさせた動物細胞において、バイシストロニックに発現されたタンパク質を細胞膜表面に好適に提示させることができる。特にバイシストロニックに発現されたタンパク質が抗体である場合には、動物細胞の細胞膜表面に発現させた抗体を保持させるために、重鎖をコードする構造遺伝子（特に、重鎖の定常領域をコードする構造遺伝子）の下流側に、膜貫通ドメインをコードする遺伝子が配置されることが好ましい。膜貫通ドメインは、たとえばヒトγ１由来の膜貫通ドメインを好適に用いることができる。
【００３８】
ここで、図２（ａ）は、後述する実験例１で本発明者が構築したベクターにおける重鎖の定常領域をコードする構造遺伝子の下流側と膜貫通ドメインをコードする遺伝子との間を模式的に示す図であり、図２（ｂ）は具体的な塩基配列、アミノ酸配列を示している（塩基配列については配列番号１）。後述するように動物細胞にトランスフェクションさせた後、膜貫通ドメインをコードする遺伝子をＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えによって取り外し可能であるように、膜貫通ドメインをコードする遺伝子は、５’末端側のｌｏｘＰ配列を有していることが好ましい。このＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系は、酵母、植物、および動物を含む複数の生物で広く使われてきており、遺伝子不活性化または制御された異所性遺伝子発現によって特定の器官の基本的遺伝子の分析を可能にする。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系では、直列型ｌｏｘＰ  ＤＮＡ配列の間の組換えを触媒するためにＰ１バクテリオファージＣｒｅリコンビナーゼが利用される。Ｃｒｅタンパク質は、分子量３５０００の単一ポリペプチドであり、ｌｏｘＰ部位と結合して、２つのｌｏｘＰ部位の間の組換え反応を仲介する。またｌｏｘＰ配列は、８塩基対のスペーサ部位によって切り離されるＣｒｅ結合領域の２つの１３塩基対の逆方向反復からなる。このことは、この３４塩基対が効果的な組換えのために必要であることを示唆する。
【００３９】
本発明の動物細胞ディスプレイ法では、ＰＣＲの頻繁な使用を回避するとともに、このようなＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えを利用することで、バイシストロニックに発現されたタンパク質が抗体である場合には、膜型分子として発現された抗体を分泌型分子へと転換することができ、自然な環境である動物細胞発現プラットフォームを用いて抗原特異的な完全ヒトモノクローナル抗体のスクリーニングおよび産生細胞の取得が可能となる。また、本発明においては、前記ベクターが、膜貫通ドメインをコードする遺伝子の５’末端側のｌｏｘＰ配列がイントロンに隠されており、重鎖の定常領域にｌｏｘＰ配列由来のアミノ酸配列が付加されないように設計されていることが好ましい。これにより、３４塩基のｌｏｘＰ配列は、ベクターがトランスフェクションされた動物細胞においてバイシストロニックに発現された抗体の重鎖の定常領域のＣ末端に余分なアミノ酸が付加されてしまうことを回避することができる。
【００４０】
また本発明においては、前記ベクターが、重鎖をコードする構造遺伝子と膜貫通ドメインをコードする遺伝子との間、ならびに、膜貫通ドメインをコードする遺伝子と軽鎖をコードする構造遺伝子との間にｌｏｘＰサイトが介在されることが好ましい。具体的には、図２（ａ）に示したように、制限消化のためのＢａｍＨＩ部位が続く５‘スプライシング部位が、重鎖の定常領域をコードする構造遺伝子の３’末端側に加えられ、図２（ｂ）に示したように、ＢａｍＨＩ部位からの下流側で、２つのｌｏｘＰ配列は、分岐点配列（ＢＰＳ：Branch Point Sequence）の下流側と、膜貫通ドメインをコードする遺伝子の下流側にそれぞれ配置される。
【００４１】
本発明のベクターは、当該ベクターを前記動物細胞にトランスフェクションさせた後、当該動物細胞において２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子が除去されるように設計されたものであることが、好ましい。この２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子の除去は、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることが好ましい。
【００４２】
（ａ）前記ベクターを前記動物細胞にトランスフェクションさせた動物細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションさせる、
（ｂ）前記ベクターを前記動物細胞にトランスフェクションさせた動物細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼを脂質キャリアーによって導入する。
【００４３】
このようにしてＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えを利用して、該ベクターを前記動物細胞にトランスフェクションさせた後の動物細胞において２つのｌｏｘＰサイト間の膜貫通ドメインをコードする遺伝子が除去される。これにより、動物細胞においてバイシストロニックに発現された抗体は膜型から分泌型に好ましく変換されるようになる。
【００４４】
なお、本発明の動物細胞ディスプレイ法に利用されるベクターの構築、動物細胞へのトランスフェクションなどは、当分野の公知の遺伝子工学技術を適宜組み合わせることで、後述する実験例などの記載をもとに当業者であれば容易に実施可能である。
【００４５】
本発明における前記抗体は、ヒトＩｇＧであることが好ましい。このように本発明の動物細胞ディスプレイ法では、完全ヒトモノクローナル抗体を好適に産生することが可能となる。
【００４６】
本発明における前記抗体は、ヒト高親和性ＩｇＥレセプターα鎖抗体（ＦｃεＲＩα抗体）であることが好ましく、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）にヒト幼若好塩基球ＫＵ８１２Ｆ細胞でインビトロで抗原感作させて得られたものであることが、好ましい。ヒト高親和性ＩｇＥレセプターは、ＩｇＥのＦｃ領域を認識する受容体で、マスト細胞などに発現し、当該レセプターとＩｇＥコンプレックスが抗原によって架橋されることでアレルギーが誘発される。したがってこのヒト高親和性ＩｇＥレセプタとＩｇＥとの結合を阻害し得るＦｃεＲＩα抗体を得ることは、アレルギー治療への応用に有用である。
【００４７】
また、膜タンパク質に対する抗体は、多くの重要な反応（例えば免疫細胞と補体による拒絶、リガンドとしての反応、分子の相互作用の阻害）を制御することに貢献するが、高純度でかつ天然の配列をもつ膜タンパク質を大量に調製することは、それほど容易でない。このような問題に対し、述したように、本発明者は、「体外免疫法（in vitro immunization）」を独自に開発しており、これを利用して、抗原特異的な免疫応答が誘導されたＰＢＭＣが得られる。具体的には、末梢血から分離されたＰＢＭＣを、免疫抑制性細胞を除去するためにＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシン・メチル・エステルで処理した後、適当なサイトカイン条件とアジュバント（免疫増強剤）とともに培養し、抗原感作に供し、１週間培養後、抗原特異的抗体産生細胞が誘導される。これにより、抗原を精製することなしに、天然の配列をもつ膜タンパク質に対する免疫感作を行なうことが可能となる。
【００４８】
〔完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法（in vitro maturation）〕
本発明はまた、上述した本発明の動物細胞ディスプレイ法を利用した完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法も提供する。すなわち、本発明の完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法は、（１）抗体の重鎖の可変領域をコードする構造遺伝子をランダム増幅する工程と、（２）得られた増幅産物を、上流側から重鎖の可変領域、重鎖の定常領域を順にコードする構造遺伝子と、上流側から軽鎖の可変領域、軽鎖の定常領域を順にコードする構造遺伝子の間に、内部リボソーム進入部位をコードする遺伝子を介在させ、これらの遺伝子をバイシストロニックに発現させ得るように設計されたベクターにおける重鎖の可変領域をコードする構造遺伝子として、それぞれ組み込んだベクターを構築する工程と、（３）当該ベクターをＦｌｐ−Ｉｎシステムを有する動物細胞にトランスフェクションし、一細胞当たり一遺伝子の導入によりクローンで発現された抗体が細胞膜表面に提示された動物細胞のライブラリを構築する工程と、（４）蛍光活性化セルソーティングによって動物細胞のライブラリから親和性の高い抗体を細胞膜上に発現する動物細胞を選択する工程と、（５）選択された動物細胞に完全ヒトモノクローナル抗体を分泌させる工程とを含む、完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法についても提供する。
【００４９】
本発明の完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法ではまず、完全ヒトモノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードする構造遺伝子をランダム増幅する。このように抗体の重鎖の可変領域に人為的に突然変異を起こさせて多様化をもたせ、これを上述したベクターの抗体の重鎖の可変領域をコードする構造遺伝子として組み込み、得られたベクターを用いて上述した本発明の動物細胞ディスプレイ法を行なう。これによって、完全ヒトモノクローナル抗体がそれぞれクローンで細胞膜表面に提示された多様な抗体遺伝子を含む動物細胞ライブラリーを構築することができる。そして、このライブラリーの中から、最も親和性の高いクローンをセルソーターによって単離することにより、元の抗体よりも親和性の高い抗体を産生する動物細胞を得ることができる。このように、上述した本発明の動物細胞ディスプレイ法は、完全ヒトモノクローナル抗体の親和性の成熟を行なうために有用である。
【００５０】
以下、実験例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００５１】
＜実験例１＞
実験例１では、新しい動物細胞ディスプレイ・システムのためのプラスミドベクターを作製し、ヒトモノクローナル抗体を生成する系の効率と正確さを分析した。
【００５２】
〔材料と方法〕
〔１〕細胞株
細胞株としては、ＦＲＴ部位を含んでいるチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞）（インビトロジェン社から購入）を用いた。Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞系は、単一の組み込まれたＦＲＴ部位を含み、安定してｌａｃＺ−ゼオシン融合遺伝子を発現する。
【００５３】
〔２〕細胞培養
細胞と接触する全ての溶液と器材は、使用前に殺菌した。層流フードで適切な無菌技術を常に用いた。Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞は、３７℃、５％ＣＯ2の湿気のある環境で、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン（明治製菓）、１００ｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（明治製菓）、１００ｇ／ｍｌ  ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１０％  ウシ胎児血清を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（日水製薬）で培養した。
【００５４】
〔３〕β−ガラクトシダーゼ染色
ＦＲＴへの遺伝子挿入はβ−ガラクトシダーゼ染色により確認した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間固定した。固定後、細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−β−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むβ−ガラクトシダーゼ染色液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウム／リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．４）で、３７℃で２−４時間インキュベートした。ＤＮＡがＦＲＴ部位に挿入された細胞は染色されず、ＤＮＡがＦＲＴ部位に挿入されなかった細胞は、青変として特定された。
【００５５】
〔４〕細胞表面で完全なＩｇＧを発現するプラスミドベクターの構築
（１）ＰＣＲ
制限消化部位ＮｏｔＩ−Ｌｄを含むプライマー（配列番号２）と制限消化部位ＣＬ−ＡｐａＩを含むプライマー（配列番号３）との特異的プライマー対を用いて、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／ＣＬからＩｇκ鎖リーダー配列の後のκ鎖ＤＮＡの定常領域を増幅した。ＰＣＲ反応液は、０．５μｌのｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／ＣＬ、５μｌの１０×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、３μｌの上記特異的プライマー対、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μｌのＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを５０μｌになるように蒸留水を添加し、調製した。増幅は、３０回のＰＣＲサイクル（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間）で行なった。増幅産物を５μｌの臭化エチジウムで染色し、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。電気泳動後のＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。このようにして増幅産物ｌｅａｄｅｒ−Ｃκを得た。
【００５６】
制限消化部位ＮｈｅＩ−Ｌｄを含むプライマー（配列番号４）と制限消化部位ＩｇＧｃ−ＢａｍＨＩを含むプライマー（配列番号５）との特異的プライマー対を用いて、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／ＩｇＧｃからｇκ鎖リーダーシークエンス後の重鎖ＤＮＡの定常領域を増幅した。増幅は、０．５μｌのｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／ＩｇＧｃ、５μｌの１０×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、３μｌの上記特異的プライマー対、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μｌのＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを蒸留水を添加して５０μｌにし、調製した。増幅は、３０回のＰＣＲサイクル（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間）で行なった。増幅産物を５μｌの臭化エチジウムで染色し、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。電気泳動後のＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。このようにして増幅産物ｌｅａｄｅｒ−ＩｇＧｃを得た。
【００５７】
制限消化部位ＢｓｔＸＩ−ＩＲＥＳを含むプライマー（配列番号６）と制限消化部位ＩＲＥＳ−ＮｏｔＩを含むプライマー（配列番号７）との特異的プライマー対を用いて、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでｐＩＲＥＳｂｌｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＩＲＥＳ  ＤＮＡを増幅した。増幅は、０．５μｌのｐＩＲＥＳｂｌｅｏ、５μｌの１０×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、３μｌの上記特異的プライマー対、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μｌのＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを蒸留水を添加して５０μｌにし、調製した。増幅は、３０回のＰＣＲサイクル（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間）で行なった。増幅産物を５μｌの臭化エチジウムで染色し、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。電気泳動後のＤＮＡフラグメントをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。このようにして増幅産物ＩＲＥＳを得た。
【００５８】
（２）Ａ−テイリング
１５μｌの各ＰＣＲ産物ｌｅａｄｅｒ−Ｃκ、ｌｅａｄｅｒ−ＩｇＧｃおよびＩＲＥＳを、５μｌの１０×ＰＣＲバッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１μｌの１００ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼと混ぜ合わせ、５０μｌになるよう蒸留水を添加した。混合物を７０℃で２時間反応させた。反応生成物を染色液と混合させ、アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステムでＤＮＡフラグメントを精製した。このようにして、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をライゲーションするため、３つの増幅産物ｌｅａｄｅｒ−Ｃκ、ｌｅａｄｅｒ−ＩｇＧｃおよびＩＲＥＳの平滑断端終点にｄ（Ａ）を加えた。
【００５９】
（３）ライゲーションおよび形質転換
Ａテイリングされた各増幅産物をｐＧＥＭ  Ｔイージーベクターにライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有ＬＢプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、形成されたコロニーを採取し、ＰＣＲによるＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入を確認した。挿入されたベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有のＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）でプラスミドベクターｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＮｏｔＩ−Ｌｄ−Ｃκ−ＡｐａＩを調製した。
【００６０】
（４）塩基配列決定
これらの挿入された遺伝子の塩基配列を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて確認した。２００ｎｇ  プラスミドベクター、４μｌ  ５×シークエンシングバッファ、３．２ｐｍｏｌ  Ｔ７−２プライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号８）、１μｌ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｍｉｘに、最終的な量が２０μｌになるよう蒸留水を添加し、反応混合物を調製した。
【００６１】
９６℃で１０秒間の変性、５０℃で５秒間のアニーリング、６０℃で４分間の延長を１サイクルとして２５サイクルの条件でＰＣＲ反応を行なった。得られた増幅産物を、エタノール沈殿によって精製した。増幅産物を、２μｌの１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μｌの３Ｍ酢酸ソーダ、５０μｌの１００％エタノールに混合し、室温で１５分間保存させた。混合は、４℃で２０分間、２００００×ｇで遠心分離することにより行なった。上清除去および７０μｌの７０％エタノールでの洗浄後、沈殿物を４℃で１０分間２００００×ｇで遠心分離した。ペレットを真空条件の下で１０分間乾燥し、２０μｌのＨｉ−ｄｉｆｏｒｍａｍｉｄｅで懸濁した。生成物を９４℃で２分間インキュベート後、５分間氷の上で冷やし、３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
【００６２】
（５）ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＬの構築
図３に模式的に示す手順で、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＬを構築した。まず、１μｇのＤＮＡ（ｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＮｏｔＩ−Ｌｄ−Ｃκ−ＡｐａＩまたはｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、５μｌの１０×ＮＥＢバッファ４、０．５μｌの１００×ＢＳＡ（ＮＥＢ）、１μｌのＮｏｔＩ、１μｌのＡｐａＩと調合し、蒸留水を添加して５０μｌにした。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、ｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＮｏｔＩ−Ｌｄ−Ｃκ−ＡｐａＩ、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩとＡｐａＩで消化させた。制限消化後の生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。
【００６３】
次に、ｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＮｏｔＩ−Ｌｄ−Ｃκ−ＡｐａＩ、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴの制限消化の生成物を３：１の分子比率で混合した。この混合物に２×ライゲーションミックスを混合し、１６℃で３０分間混合して、インキュベートした。ライゲーション産物（ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＬ）を、氷の上で１０分間コンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）にトランスフェクションした。トランスフェクションさせた細胞を、３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、形成されたコロニーを採取し、ＰＣＲによるＮｏｔＩ−Ｌｄ−Ｃκ−ＡｐａＩ  ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入を確認した。
【００６４】
ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＬベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｍｌ  ＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、プラスミドベクターをＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で調製した。
【００６５】
（６）ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＨの構築
図４に模式的に示す手順で、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＨを構築した。１μｌのＤＮＡ（ｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＩＲＥＳまたはｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ）を、５μｌの１０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３、０．５μｌの１００×ＢＳＡ、１μｌのＢｓｔＸＩと混ぜ合わせ、蒸留水を添加して４９μｌにした。５５℃で２時間のインキュベーション後、１μｌのＮｏｔＩを混合液に加え、３７℃で２時間反応させ、プラスミドＤＮＡ  ｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＩＲＥＳとｐｃＤＮＡ５ＦＲＴを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩとＢｓｔＸＩで消化させた。制限消化後の生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。
【００６６】
次に、ｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＩＲＥＳ、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴの制限消化の生成物を３：１の分子比率で混合した。この混合物に２×ライゲーションミックスを混合し、１６℃で３０分間混合して、インキュベートした。ライゲーション産物（ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩＲＥＳ）を、上述と同様に、コンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）にライゲーション産物をトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）でプラスミドベクターを調製し、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩＲＥＳを得た。
【００６７】
次に、１μｌのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩＲＥＳまたはｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＮｈｅＩ−Ｌｄ−ＩｇＧｃ−ＢａｍＨＩ）を、５μｌの１０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２、０．５μｌの１００×ＢＳＡ、１μｌのＮｈｅＩ、０．５μｌのＢａｍＨＩと混合し、蒸留水を添加して５０μｌにした。混合液を３７℃で２時間インキュベートし、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩＲＥＳとｐＧｅｍＴｅａｓｙ／ＮｈｅＩ−Ｌｄ−ＩｇＧｃ−ＢａｍＨＩを、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化させた。制限消化後の生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。
【００６８】
次に、制限消化されたＬｄ−ＩｇＧｃフラグメントとｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩＲＥＳを分子比率３：１で混合した。この混合物に２×ライゲーションミックスと混ぜ合わせ、１６℃で３０分間インキュベートした。ライゲーション産物はコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）に、上述と同様にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、形成されたコロニーを採取し、ＰＣＲによってＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入を確認した。
【００６９】
挿入されたベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｍｌのＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、プラスミドベクターはＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で調製し、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｌｄ−ＩｇＧｃ−ＩＲＥＳを得た。
【００７０】
１μｇのｐＵＣ／ＴＭｉまたはｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｌｄ−ＩｇＧｃ−ＩＲＥＳを、５μｌの１０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２、０．５μｌの１００×ＢＳＡ、１μｌのＢｓｔＸ１と混ぜ合わせ、最大で４９μｌの蒸留水を添加した。５５℃で２時間のインキュベーション後、１μｌのＢａｍＨＩを、混合液に加え、３７℃で２時間反応させた。反応生成物を、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。
【００７１】
消化されたＴＭｉフラグメントとｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｌｄ−ＩｇＧｃ−ＩＲＥＳとを、分子比率３：１で混合した。この混合物に２×ライゲーションミックスを混合し、１６℃で３０分間インキュベートした。ライゲーション産物はコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）に、前述のようにトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレート上でインキュベートした。インキュベーション後、形成されたコロニーを採取し、ＰＣＲによってＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入を確認した。挿入されたベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）でプラスミドベクターを調製し、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＣＨを得た。ここで、プラスミドベクターｐＵＣは、イントロン（ＴＭｉ）に隠れているｌｏｘＰ配列間の膜貫通領域のＤＮＡフラグメントを含むように設計された。
【００７２】
（７）可変領域遺伝子の挿入
図５に模式的に示す手順で、可変領域遺伝子を挿入した。Ｃ９抗ＦｃεＲＩα抗体可変領域遺伝子（ＶＨとＶκ）を、モデル全ＩｇＧ発現ベクターの構築のために用いた。１μｌのＤＮＡ（プラスミドベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／Ｃ９ＨまたはｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＨ）を、５μｌの１０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２、０．５μｌの１００×ＢＳＡ１００、１μｌのＳｆｉＩと混合し、蒸留水を添加して５０μｌにした。０℃で２時間のインキュベーション後、１μｌのＸｈｏＩを混合液に加え、３７℃で２時間インキュベートし、プラスミドベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／Ｃ９ＨとｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＨとを、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩとＸｈｏＩとで消化した。制限消化後の生成物を５μｌの染色液と混ぜ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。ＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステムで精製した。
【００７３】
ＳｆｉＩとＸｈｏＩの消化された部位を含んでいるＣ９ＶＨ  ＤＮＡを制限酵素で消化されるｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＨベクターにライゲーションさせた。ライゲーション産物をコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）に、上述と同様にトランスフェクションした。３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレート上でインキュベーション後、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＨベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、プラスミドベクターをＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で調製した。
【００７４】
１μｌのＤＮＡ（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／Ｃ９ＬまたはｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃκ）を、５μｌの１０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２、０．５μｌの１００×ＢＳＡ、１μｌのＡｓｃＩ、１μｌのＫａｓＩと混合し、蒸留水を添加し５０μｌにした。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、プラスミドベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／Ｃ９ＬとｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃκとを、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩとＫａｓＩで消化した。制限消化後の生成物をアガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。ＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステムで精製した。
【００７５】
ＡｓｃＩとＫａｓＩで消化された制限部位を含むＣ９  ＶＬ  ＤＮＡを、酵素で消化されるｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃκベクターにライゲーションさせ、ライゲーション産物をコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）に上述と同様にトランスフェクションした。３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレート上でインキュベートした後、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９Ｌベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、プラスミドベクターをＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で調製した。
【００７６】
１μｌのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＨまたはｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９Ｌ）を、５μｌ  １０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２、０．５μｌの１００×ＢＳＡ１００、１μｌのＮｈｅＩ、１μｌのＮｏｔＩと混合させ、蒸留水を添加して５０μｌにした。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＮｏｔＩで消化した。制限消化後の生成物をアガロースゲル電気泳動にかけた後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステムでＤＮＡフラグメントを精製した。
【００７７】
得られた制限消化したＤＮＡフラグメントＮｈｅＩ−リーダー−ＶＨ−Ｇｃ−ＴＭ−ＩＲＥＳ−Ｎｏｔ  Ｉを制限消化したｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９Ｌプラスミドにライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）に上述と同様にトランスフェクションした。３７℃で終夜５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレートでインキュベーションした後、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＧベクターを保持する単一コロニーを採取し、３７℃で１８時間、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢでインキュベートした。インキュベーション後、プラスミドベクターをＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で調製した。
【００７８】
〔５〕全ＩｇＧ分子の発現
（１）ＦＬＰ−Ｉｎシステムによるトランスフェクション
人工脂質キャリアー（福岡県工業技術センターから提供）を使用して、トランスフェクションを行なった。トランスフェクションの日に７０−８０％の集密度になるように、トランスフェクションの前日にＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を６０ｍｍの培養ディッシュに播種した。Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞系は、単一の組み込まれたＦＲＴ部位を含み、ＦＲＴ部位の下流にコードされたｌａｃＺ−ゼオシン融合遺伝子を安定して発現する細胞である。ｐＯＧ４４でのＦｌｐ−ＩｎベクターＤＮＡトランスフェクション、それに続くハイグロマイシン処理の後、Ｆｌｐ−ＩｎがＦＲＴ部位に挿入された細胞は、ハイグロマイシン抵抗性を獲得し、ｌａｃＺ−ゼオシンを欠損する。
【００７９】
５００μｌハムＦ１２培地と１０μｇのＤＮＡ（１μｇ  ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧとＦｌｐ−Ｉｎ組換えのための９μｇのｐＯＧ４４）を穏やかに混合し、トランスフェクション試薬混合物を調製した。５０μｌの人工脂質キャリアーを、培地−ＤＮＡ混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。複合体が形成される間に、培養培地を１０％ＦＢＳを含む新しい５ｍｌハムＦ１２に置き換えた。トランスフェクション試薬混合物を培養ディッシュに加えた。
【００８０】
ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＧＦＰを用いて、Ｆｌｐ−Ｉｎ組換えを確認した。ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＧＦＰはｐＯＧ４４の有無にかかわらずＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされ、１０％ＦＢＳおよびハイグロマイシンを含むハムＦ１２培地で培養した。Ｆｌｐ−ＩｎベクターおよびｐＯＧ４４で共トランスフェクトされた細胞は、ハイグロマイシン抵抗性を獲得し、ＧＦＰ発現を示す蛍光を発した。Ｆｌｐ−Ｉｎシステムによって仲介される領域特異的組換えを確認するため、βガラクトシダーゼ染色を行なった。Ｆｌｐ−Ｉｎ組換えの後安定してＧＦＰを発現している細胞は、ｌａｃＺ活性が欠如していた。これらの結果は、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクターがＦｌｐ−Ｉｎシステムによって特異的にＦＲＴ部位に挿入されたことを示した。
【００８１】
（２）フローサイトメトリー分析
ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧプラスミドでトランスフェクションされたＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞のＩｇＧの発現を、フローサイトメトリーで測定した。細胞（２×１０5）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに採取し、ＰＢＥで洗浄した。細胞を、５０μｌのＰＢＥ中で、２μｌのＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ）抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）または２μｌのＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇκ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でインキュベートした。４℃で１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＥで洗浄し、５００μｌのＰＢＥで再懸濁した。その後、細胞が発する蛍光を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞のフローサイトメトリー分析の結果、ＰＥの蛍光強度が増加したことから、ＨおよびＬ鎖が細胞膜表面に発現していることが示された（図６）。次に、膜型ＩｇＧの抗原認識を測定するために、ＦＩＴＣ標識されたＦｃεＲＩαで細胞を処理した。ＩｇＧ発現細胞は、特異的にその抗原と結合した（図７）。
【００８２】
（３）Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え
上述と同様に、ＣｒｅリコンビナーゼをコードしているプラスミドＤＮＡ  ｐＣＥＰ４／Ｃｒｅを表面に膜型ＩｇＧを発現している細胞にトランスフェクションした。ｌｏｘＰ部位のＣｒｅによって仲介される組換えは、ＩｇＧ発現の形態を変えると予想された。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えによる細胞中での導入遺伝子の組換えの有無を、以下の手順で全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲに供することによって分析した。
【００８３】
（４）Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞からの全ＲＮＡの抽出
Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞からの全ＲＮＡを、Ｆａｓｔ  ＰｕｒｅＵ（商標）ＲＮＡキット（ＴＡＫＡＲＡ）で調製した。培養したＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を採取し、２‐メルカプトエタノールを含む３５０μｌの溶解バッファで懸濁させた。ピペットでの懸濁化後、５０μｌの溶解バッファを加え、１５秒間ボルテックスした。１７０μｌのエタノール（＞９９％）を加えた後、混合液を１分間ボルテックスし、カートリッジへ移した。１分間８０００×ｇで遠心分離後、７５０μｌの洗浄バッファを加え、遠心分離した。洗浄工程を３回繰り返した。カートリッジをコレクションチューブへ移し、５０μｌの溶離バッファを加えた。室温で４分間インキュベーション後、チューブを１分間８０００×ｇで遠心分離し、溶出したフラクションをＲＮＡ溶液として集めた。
【００８４】
（５）ｃＤＮＡ合成
Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴキット（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した１μｇの全ＲＮＡを６５℃で５分間変性させ、氷上に移した。５分間冷却後、ＲＮＡ溶液を２μｌの５×ＲＴバッファ、０．５μｌのプライマー混合物、０．５μｌのＲＴ酵素と混合させ、蒸留水を添加して１０μｌにした。混合液を、３７℃で１５分間、９８℃で５分間、４℃で保持、という条件で反応させた。
【００８５】
（６）ＰＣＲ
ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）でＰＣＲを行なった。Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞（１×１０5細胞）を、エッペンドルフチューブに採取し、ＰＢＳで洗浄した。ペレットを１００μｌのＰＢＳで懸濁させ、ゲノムＰＣＲのテンプレートとして用いた。テンプレートとしての０．５μｌのｃＤＮＡもしくは１μｌの細胞溶液、５μｌの２×ＫＯＤ−ＦＸ  バッファ、２μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、それぞれ０．３μｌのセンスプライマーＩｇＧｃ−ｍｄ（配列番号９）およびアンチセンスプライマーＩＲＥＳ−ｍｄ（配列番号１０）、０．２μｌのＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼを蒸留水を添加して１０μｌにし、ＰＣＲ反応液を調製した。上記プライマーは、欠失させた膜貫通ドメインをコードする遺伝子の前後のＤＮＡを検出するように設計した。９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲ反応を行なった。増幅産物を１μｌの染色液と混ぜ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。
【００８６】
膜貫通ドメインをコードする本来の導入遺伝子とうまく組換えられた導入遺伝子はそれぞれ６９６ｂｐと４６４ｂｐの長さの増幅フラグメントを与えると予想された（図８（ａ））。すなわち、本来の導入遺伝子に由来する６９６ｂｐ、成熟したｍＲＮＡに由来する５５６ｂｐ、ならびに、組換えられたＣｒｅ／ｌｏｘＰゲノム領域に由来する４６４ｂｐの３つのバンドが検出されると考えられた。実際、より短い４６４ｂｐの長さの組換えＤＮＡフラグメントが、ｐＣＥＰ４／Ｃｒｅトランスフェクションされた細胞で検出された（図８（ｂ））。さらに、これらの導入遺伝子のスプライシング反応もＰＣＲによって解析した。テンプレートＤＮＡの状態のスキームおよびＰＣＲによる増幅領域を図９（ａ）に模式的に示す。組換えの後、膜貫通ドメインのないイントロンのスプライシング反応が３００ｂｐ付近で確認された（図９（ｂ））。
【００８７】
（７）ＥＬＩＳＡ
次に、組換えられた導入遺伝子をもつ細胞が、予想通りに培養培地に全ＩｇＧを発現・分泌したかどうか確認するために、培養上清中のＩｇＧの量をＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ）で測定した。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、０．１Ｍ  炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．６）中で１００μｌの１０００倍希釈されたＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）でコートし、３７℃で２時間インキュベートした。その後、３７℃で２時間ＰＢＳ中の１％フィッシュゼラチン（ＦＧ）でブロックした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、５０μｌの連続希釈された培養上清を加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、捕捉されたＩｇＧに２０００倍希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、続いて３７℃で２時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、１００μｌ基質溶液、０．００３％Ｈ2Ｏ2含有０．１Ｍクエン酸バッファおよび０．３ｍｇ／ｍｌ  ２，２‘−アジド−ビス（３−エチルベンゾチアゾリジン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ：和光純薬）を加え、２０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８８】
その結果、ｐＣＥＰ４／Ｃｒｅを細胞へトランスフェクションさせた後の培養上清でＩｇＧが明らかに検出された（図１０）。一方、Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞可溶化物中のＩｇＧは、ＥＬＩＳＡでも測定された。ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧだけでトランスフェクションされたＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞では、ＩｇＧ分泌は検出されなかった（図１０）。しかし、細胞内ＩｇＧ分子は検出された（図１１）。これらの結果から、Ｃｒｅによって媒介される組換えが抗体提示細胞を抗体分泌細胞に変換することができることが確認された。
【００８９】
〔考察〕
抗体工学で現在使われる微生物には、タンパク質折り畳み、翻訳後修飾とコドン使用について問題がある。抗体の生物活性を発揮させるために、ｓｃＦｖフラグメントを全ＩｇＧ分子に変換し、哺乳動物細胞中で発現させる必要がある。微生物プラットフォームでタンパク質を発現させるファージディスプレイ法を用いて選択された抗体遺伝子が哺乳類の発現システムに発現されるとき、これらの深刻な問題がしばしば起こる。
【００９０】
本発明の新規動物細胞ディスプレイ法では、動物細胞の表面におけるヒト全ＩｇＧ提示が組織的になされ、適切な折り畳みと転写後修飾を受けた抗原特異性ヒトモノクローナルＩｇＧの産生とスクリーニングが可能であることが証明された。ＩｇＧ発現のためのプラスミドベクターは、Ｃ９抗ＦｃεＲＩα抗体の可変部領域遺伝子で構築され、Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされた。抗生物質での選択の後、細胞表面のＨ鎖とＬ鎖の発現は、フローサイトメトリーによって検出され、細胞表面で発現する抗体はＦｃεＲＩα抗原を捕捉した。これらの結果は、バイシストロニックなベクターが細胞表面で膜型全ＩｇＧを産生するために、同一のプロモータを用いて転写されたｍＲＮＡから、Ｈ鎖およびＬ鎖を発現することができることを示した。
【００９１】
細胞表面に提示され膜型全ＩｇＧを分泌型ＩｇＧの形に変換するために、ベクターのＨ鎖定常領域の下流は、スクリーニングの後にＣｒｅリコンビナーゼでの部位特異的組換えによってそれを除去するために、２つのｌｏｘＰ配列の間の膜貫通領域遺伝子に割って入るように設計されていた。イントロンに隠されたｌｏｘＰ配列をもつｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧベクターを構築し、トランスフェクションのために用いられた。これは、変換システムが、転写されたｌｏｘＰエレメント由来の不必要なアミノ酸を付加することで、分泌されたＩｇＧが天然の構造を形成できないかもしれないと予想されたためである。上述したように、全てのヒト抗体は、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧベクターのトランスフェクションによって細胞膜に提示された。提示されたＩｇＧはＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えによって分泌型にうまく変換された。ｌｏｘＰ配列を含む、人工的に構成されたイントロンのスプライシングがうまく作用しない場合、ＩｇＧはＨ鎖定常領域の下流の膜通過領域の間違ったポジショニングのため、動物細胞の細胞膜表面に提示されない。
【００９２】
また合成イントロンのスプライシング反応は、予想される適切な位置で起こったことが確認された。膜通過領域の中に存在している本来の３’ＳＳと類似した配列が３’ＳＳと認識されるかもしれないため、不規則なスプライシングが起こる可能性がある。しかしながら、ＥＬＩＳＡの結果によれば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えのない不規則なスプライシングによるＩｇＧ分泌は観察されなかった。スプライシングの比率は、３’ＳＳ付近で突然変異を誘発することによって、二者択一的に制御することができる。そのことは、ＩｇＧ分泌の効率が、さらなる研究によって、より改善される可能性があることを示している。癌遺伝子のような転写アクチベータを経てサイトメガロウイルス・プロモータを活性化することによって、培養細胞での組換えタンパク質生産性を強化するため、プロモーター活性化生産（ＰＡＰ）系は既に開発されている。ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞は、製薬産業で大多数の治療用抗体の生産に使われる主要な系である。
【００９３】
ＰＡＰ系はＣＨＯ細胞では非常に効果的であることが示され、高生産性Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を構築することが可能だろう。本研究のＩｇＧ発現および分泌レベルは、ＰＡＰ系と本発明の動物細胞ディスプレイ法との組合せによって増大されるかもしれない。
【００９４】
さらに、プラスミドベクターの構築は最適化され得る。第一に、発現ベクターｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧの構築において、Ｈ鎖定常領域とＩＲＥＳエレメント中にＫａｓＩ制限消化部位が存在したために２段階の組換えによってＶＬ組換えを行なうことが必要だった。すなわち、可変領域遺伝子の挿入は、Ｈ鎖とＬ鎖に対して別々のベクターで行われ、これらの２つのベクターは完全な発現プラスミドベクターを構築するために連結された。この問題はプラスミドベクターを最適化することにより解決できる。第二に、ＩｇＧ抗体遺伝子のバイシストロニックな発現は、重鎖、軽鎖の発現レベルのバランスに影響を及ぼす。抗体重鎖は、軽鎖と結合してＩｇ分子にならない限り、遊離抗体重鎖の状態では分泌されない。一方では、大部分の軽鎖は、遊離モノマーまたはダイマー分子として分泌され得る。ＩＲＥＳをもつバイシストロニック発現ベクターにおいて、ＩＲＥＳエレメントの後方に位置する第２シストロン遺伝子は、第１シストロン遺伝子より翻訳効率が１／１０程度に低下する。したがって、ＩＲＥＳエレメントの上流に軽鎖遺伝子を、下流に重鎖遺伝子を配置することにより、Ｉｇ分子の分泌効率を上げることができると考えられる。
【００９５】
ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧは、第１シストロンとしての重鎖、第２シストロンとしての軽鎖を用いてバイシストロニックな発現のために構築された。上述したように、ＩｇＧ発現ベクターの再構築によって組換えと全ＩｇＧ産生の効率を改善することが可能であろう。通常、ファージディスプレイ方法によるモノクローナル抗体の作製には、多くの作業が必要である。細胞膜表面の上でヒト全ＩｇＧを発現し、抗原に対して高度な結合活性を示している細胞は、セルソーターで容易にスクリーニングされる。スクリーニング後、抗体産生と抗体の特性の分析は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えを用いて膜型ＩｇＧを分泌型ＩｇＧ分子に転換することによって簡単に行なうことができる。これらの操作は高度な遺伝子組換え操作を必要としないため、ロボット化が可能であり、本発明の動物細胞ディスプレイ法は産業上極めて有用であると考えられる。
【００９６】
＜実験例２＞
体外免疫されたファージ・ライブラリから単離されたヒトモノクローナルＣ９抗ＦｃεＲＩα抗体は、明確にＦｃεＲＩαを認識し、ＫＵ８１２細胞の表面に発現する受容体を検出した。しかしながら、抗体の親和性は、高くなかった。実験例２では、Ｃ９抗体の体外親和性成熟における上述した実験例１で構築した動物細胞ディスプレイ法の有用性を示すことを目的とし、Ｃ９抗体遺伝子のＣＤＲＨ３をランダム増幅し、親和性最適化された抗体を動物細胞ディスプレイ法により単離した。
【００９７】
〔材料と方法〕
〔１〕Ｃ９  Ｈ鎖可変領域遺伝子のＣＤＲ３領域の突然変異生成
ＮＮＳ変性コドンを含む特異的プライマーを使用したＰＣＲによって、上述と実質的に同様にしてＣＤＲ３  ＶＨの突然変異生成を行なった。ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ／ｈＩｇＨ  Ｃ９）中に構築されたＣ９抗ＦｃεＲＩαＨ鎖をＰＣＲのテンプレートとして用いた。５０ｎｇのテンプレートを、３μｌの５ｍＭ  Ｃ９ＶＨＣＤＲ３プライマー（配列番号１１）、３μｌの５ｍＭ  Ｔ７−２プライマー（配列番号１２）、５μｌの１０×ＫＯＤ−プラスバッファ、５μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μｌのＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼと混合し、蒸留水を添加して５０μｌにした。増幅は、３０ＰＣＲサイクル（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間）行なった。ＰＣＲ産物を５μｌの染色液と混ぜ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。ＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステムで精製した。
【００９８】
〔２〕ライブラリ構築
増幅されたＣ９  ＶＨ  ＣＤＲ３ランダム化（Ｃ９ＶＨＣＤＲ３ｒ）ＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＧベクターを制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩとＸｈｏＩで制限消化した。１μｌのＤＮＡを、５μｌの１０×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２、０．５μｌの１００×ＢＳＡ、１μｌのＳｆｉＩと混ぜ、蒸留水を添加して５０μｌにした。５０℃で２時間のインキュベーション後、１μｌのＸｈｏＩを混合物に加え、３７℃で２時間インキュベートした。生成物を５μｌの染色液と混ぜ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを含むバンドを紫外線下で検出した。ＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌとＰＣＲクリーンアップシステムで精製した。制限消化ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩを含むＣ９ＶＨＣＤＲ３ｒ  ＤＮＡを、制限消化ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＧベクターにライゲーションした。
【００９９】
得られたライゲーション産物をコンピテント菌（大腸菌ＪＭ１０９）に上述と同様にしてトランスフェクションした。５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレート上で３７℃で終夜インキュベート後、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＧ−ＶＨＣＤＲ３ｒベクターを保持する単一コロニーを採取し、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ上で３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドベクターをＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調製した。リポフェクションによってＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞にプラスミドベクターをトランスフェクションした。
【０１００】
トランスフェクションの日に７０−８０％の集密度になるように、トランスフェクションの前日にＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を６０ｍｍディッシュに播種した。５００μｌハムＦ１２培地と１０μｇのＤＮＡ（１μｇ  ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／ＩｇＧとＦｌｐ−Ｉｎ組換えのための９μｇのｐＯＧ４４）を穏やかに混合し、トランスフェクション試薬混合物を調製した。５０μｌの人工脂質キャリアーを、培地−ＤＮＡ混合物に加え、１５分間室温でインキュベートした。この間、５ｍｌの１０％  ＦＢＳを含む新しいハムＦ１２と培地を交換し、トランスフェクション試薬混合物を培養ディッシュに加えた。抗生物質耐性細胞を選択するため、トランスフェクションの４８時間後に、ハイグロマイシンを培地に加えた。
【０１０１】
このようにしてＣＨＯ細胞表面ディスプレイライブラリ（内因的な抗体ホットスポットがそこでランダム化される）が構築された。抗体中に抗原結合を含んでいる６つのＣＤＲ（Ｈ鎖に３つ、Ｌさに３つ）がある。Ｃ９  ＶＨ遺伝子のＣＤＲ３は、ＣＤＲ３配列（ＣＡＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣ）をＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳに変異させるためにプライマーを用いてＰＣＲによってランダム化され、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｃ９ＩｇＧの親のＣ９  ＶＨ遺伝子に置き換えられた。ＣＤＲＨ３ランダム化ＩｇＧ（ＣＤＲＨ３ｒ）ライブラリは大腸菌細胞に形質導入され、ライブラリの複雑性は１．０×１０6の独立したクローンから構成された。その後ライブラリをｐＯＧ４４とともにＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、人工的にランダム化されたホットスポットを持つ変異体ＩｇＧは細胞表面で発現した。ＦｃεＲＩαに対する高い反応性をもつ変異体ＩｇＧのＣＨＯ細胞表面ディスプレイライブラリの隔離１２ウェルプレート中の１つのウェルでのトランスフェクションが、抗生物質選択の後トランスフェクションされたＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞の１．３×１０4のクローンを産生できた。
【０１０２】
〔３〕フローサイトメトリー
トランスフェクションされたＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞（２×１０5細胞）を、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに集め、ＰＢＥで洗浄した。細胞を２μｌのＰＥ複合化マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ）抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）または２μｌのＰＥ複合化マウス抗ヒトＩｇκ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）とともに、５０μｌのＰＢＥ中でインキュベートした。４℃で１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＥで洗浄し、５００μｌのＰＢＥで再懸濁した。細胞が発する蛍光を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。
【０１０３】
〔４〕蛍光度に関連したセルソーティング
細胞（１×１０6細胞）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブで採取し、１ｍｌ  ＰＢＥで洗浄した。細胞を、５μｍｏｌ  ＦＩＴＣコンジュゲートｒＦｃεＲＩαとともに２５０μｌのＰＢＥ中でインキュベートした。４℃で１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＥで洗浄し、２．５ｍｌ  ＰＢＥ中に再懸濁した。蛍光を発する細胞の中で、図１２に示すように、Ｐ１とＰ２の各集団をＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で９６穴プレートにソートし、培養した。ソートされた全９６０ウェル中３６０の細胞がクローンとして単一細胞から増殖した。
【０１０４】
〔５〕ＥＬＩＳＡ
細胞質内で発現するＩｇＧの量を、上述と同様にしてＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ）で測定した。
【０１０５】
〔６〕ダイレクトＥＬＩＳＡ
上述したように蛍光活性化された細胞をソートすることによってＩｇＧを産生している細胞（ＦｃεＲＩα提示ＣＨＯ細胞に高い反応性を有する）を選択した。各クローン細胞を約１．０×１０6個の細胞数になるまで培養した後、細胞を溶解用バッファで溶解し、免疫グロブリンの量をサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。９６ウェルのマイクロタイタープレートを０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．６）中で１００μｌの１０μｇ／ｍｌ  ｒＦｃεＲＩαでコートし、４℃で終夜インキュベートした。その後、ＰＢＳ中の１％ＦＧで３７℃で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００ｎｇの免疫グロブリンを含む全細胞溶菌液を加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＴＰＢＳで３回洗浄した。２０００倍希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを加えることで結合ＩｇＧを検出し、その後３７℃で２時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、１００μｌの基質溶液、０．００３％  Ｈ2Ｏ2含有０．１Ｍ  クエン酸塩バッファと０．３ｍｇ／ｍｌ  ２，２’アジドビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ；ＷＡＫＯ）が加えられ、２０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーを使用し、４０５ナノメートルの吸光度を測定した。
【０１０６】
結果、成長した３６０のクローンのうち３８のクローンでＩｇＧの産生が確認された。細胞溶解液に含まれる免疫グロブリンについて、ダイレクトＥＬＩＳＡによってＦｃεＲＩαに対する反応性を測定したところ、親の抗体Ｃ９より高い親和性をもつＩｇＧを産生している多くのクローンが、Ｐ１とＰ２両方のソートされた集団から得られた（図１３）。また、親の抗体Ｃ９のＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列（配列番号１３）と、Ｐ１から得られたＰ１０１、Ｐ２から得られたＰ２１６およびＰ２１７について、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列（配列番号１４、１５、１６）とを比較した。
【０１０７】
今回開示された実施の形態および実験例は全ての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内で全ての変更が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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