(57)【要約】【課題】微粒子を沈降速度法により精密に分級することができる微粒子分級装置および方法を提供すること。【解決手段】微粒子分級装置１は、分離流路３の上流部にキャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成する連続密度勾配形成器４を備えており、その連続密度勾配形成器４は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部１１と、流路部１１内を流れるキャリア液相を少なくとも動径方向に攪拌させる攪拌手段１２を有しており、攪拌手段１２により、流路部１１内を流れるキャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、キャリア液相の密度勾配材の拡散を能動的に促進させる動的拡散促進方式により連続密度勾配を形成する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心ローター内にてキャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収が時間連続的に行われる分離流路で、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級装置であって、
前記分離流路の上流部に連結されてキャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成する連続密度勾配形成器を備え、
該連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部と、該流路部内を前記キャリア液相が流れる際に、該キャリア液相の流れを利用して前記キャリア液相の能動的攪拌を行う攪拌手段を有し、該攪拌手段により、前記流路部内を流れる前記キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、密度勾配材の動径方向への拡散を能動的に促進させる動的拡散促進方式により前記連続密度勾配を形成することを特徴とする微粒子分級装置。
【請求項２】
遠心ローター内にてキャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収が時間連続的に行われる分離流路で、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級装置であって、
前記分離流路の上流部に連結されてキャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成する連続密度勾配形成器を備え、
該連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部と、該流路部内を前記キャリア液相が流れる際に、該キャリア液相の流れを利用して前記キャリア液相の能動的攪拌を行う攪拌手段を有し、該攪拌手段により、前記流路部内を流れるキャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、キャリア液相の動径方向への熱拡散を能動的に促進させる動的拡散促進方式により前記連続密度勾配を形成することを特徴とする微粒子分級装置。
【請求項３】
前記攪拌手段は、前記流路部内を上流側と下流側に仕切る仕切部と、仕切部に動径方向に所定間隔をおいて設けられてキャリア液相が通過可能な通過部とを有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微粒子分級装置。
【請求項４】
前記仕切部は、前記流路部内で動径方向に沿って延在して前記流路部内を上流側と下流側に仕切り、キャリア液相が通過可能な穴部が穿設された仕切板を有することを特徴とする請求項３に記載の微粒子分級装置。
【請求項５】
前記穴部は、動径方向に所定間隔をあけて複数設けられていることを特徴とする請求項４に記載の微粒子分級装置。
【請求項６】
前記穴部は、動径方向に直交する方向に延在する形状を有するスリットであることを特徴とする請求項４または５に記載の微粒子分級装置。
【請求項７】
前記仕切板は、前記流路部内の上流側から下流側に向かって所定間隔を開けて複数枚が設けられていることを特徴とする請求項４から請求項６のいずれか一項に記載の微粒子分級装置。
【請求項８】
前記仕切板は、前記流路部内に着脱可能に取り付けられていることを特徴とする請求項４から請求項７のいずれか一項に記載の微粒子分級装置。
【請求項９】
前記攪拌手段は、前記流路部内にて前記動径方向に所定間隔をおいて並べられた複数本の棒状部材を有し、前記仕切部が前記複数の棒状部材によって形成され、前記通過部が前記各棒状部材の間に形成された間隙によって形成されていることを特徴とする請求項２に記載の微粒子分級装置。
【請求項１０】
前記攪拌手段は、前記動径方向に並べられた複数本の棒状部材を一組とし、該複数の組がキャリア液相の流れ方向に所定間隔をおいて連続するように設けられていることを特徴とする請求項９に記載の微粒子分級装置。
【請求項１１】
前記攪拌手段は、前記複数の組のうち、上流側と下流側に対向する各組の棒状部材同士の位置が、キャリア液相の流れ方向に重ならないように、動径方向に互い違いに配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の微粒子分級装置。
【請求項１２】
各棒状部材は、動径方向に移行するにしたがって、前記棒状部材の径が太くなるように形成されていることを特徴とする請求項９から請求項１１のいずれか一項に記載の微粒子分級装置。
【請求項１３】
前記攪拌手段が、前記流路部内の動径方向において前記キャリア液相の密度勾配が急峻となる位置に集中的に配置される例のように、各動径方向位置における攪拌作用の必要性に応じて前記攪拌手段が動径方向に配置されていることを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の微粒子分級装置。
【請求項１４】
前記連続密度勾配形成器の上流側に密度の異なる少なくとも２以上のキャリア液相を連続的に供給するキャリア液相供給手段を有することを特徴とする請求項１に記載の微粒子分級装置。
【請求項１５】
前記連続密度勾配形成器の上流側に温度の異なる少なくとも２以上のキャリア液相を連続的に供給するキャリア液相供給手段を有することを特徴とする請求項２に記載の微粒子分級装置。
【請求項１６】
前記キャリア液相供給手段は、前記遠心ローターの径方向内側に高温のキャリア液相を供給し、前記遠心ローターの径方向外側に低温のキャリア液相を供給することを特徴とする請求項１５に記載の微粒子分級装置。
【請求項１７】
前記攪拌手段は、前記各キャリア液相がマージする位置に設けられていることを特徴とする請求項１４から請求項１６のいずれか一項に記載の微粒子分級装置。
【請求項１８】
遠心ローター内の分離流路にて、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級方法であって、
分離流路の上流部に設けた連続密度勾配形成器により、キャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成し、
前記分離流路内で、前記キャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収を時間連続的に行い、
前記連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かって前記キャリア液相が流れる流路部と、該流路部内を流れるキャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う攪拌手段を有し、該攪拌手段により、前記流路部内を流れる前記キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、密度勾配材の動径方向への拡散を能動的に促進させる動的拡散促進方式により前記連続密度勾配を形成することを特徴とする微粒分級方法。
【請求項１９】
遠心ローター内の分離流路にて、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級方法であって、
前記分離流路の上流部に設けた連続密度勾配形成器により、キャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成し、
前記分離流路内で、前記キャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収を時間連続的に行い、
前記連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かって前記キャリア液相が流れる流路部と、該流路部内を流れる前記キャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う攪拌手段を有し、該攪拌手段により、前記流路部内を流れる前記キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、キャリア液相の動径方向への熱拡散を能動的に促進させる動的拡散促進方式により前記連続密度勾配を形成することを特徴とする微粒子分級方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒径がミクロンからナノ領域の微粒子を分級する微粒子分級装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微粒子の分級方法としては、気相（または真空）中で分級する方法と、液相中で分級する方法がある。このうち、気相中で分級する方法は、処理容量が小さく、また微粒子が会合しやすいため、真の粒径による分級にはなかなかならないという問題があった。
【０００３】
一方、液相中で分級する場合は、気相中の場合と異なり、微粒子は会合しにくく、また微粒子が分散媒中を移動する際に大きな抵抗が発生し、その抵抗は粒径に鋭敏に依存することから、真の粒径により微粒子を容易に分級することが可能となる。そこで、これらの観点から液相中で分級する方法が着目されている。
【０００４】
液相中の微粒子を分級する方法としては、遠心分離を利用する方法が代表的で、遠心分離法には沈降平衡法や沈降速度法などがある。沈降平衡法は、微粒子をその浮游密度の差で分級する方法であり、沈降速度法は、微粒子をその沈降速度の差で分級する方法である。
【０００５】
沈降速度法では各試料粒子は、その粒子固有の沈降速度係数に応じた沈降速度により液相内を沈降し、沈降開始後ある時間だけ経過すると、その沈降速度係数に応じて異なる沈降位置に存在する。試料粒子の沈降速度係数は、試料粒子の密度と実効粒径により決まるが、もし試料密度が同じであれば、試料粒子を実効粒径により分級することが出来ることになる。製造工程や実験室での調製操作においては、同一密度の試料を粒径により分けたいことが多い。
【０００６】
そして、微粒子を回収する方式としては、回分（バッチ）方式と、半連続方式と、完全連続方式の３つの方式がある。回分方式は、チューブやその他の形状の処理容器を用いて、一回の運転毎の対象微粒子を分級処理する方式である。回分方式では、少量ずつの処理しか行えず、かつ（回転開始から加速、一定回転、回転減速そして停止という）一回の運転ごとに条件が微妙に異なってしまうことから、バッチ間で粒径が微妙に異なってしまうという問題がある。
【０００７】
これに対して、半連続方式および完全連続方式では、連続的な運転をすることにより、回分方式よりも試料処理量を増大させることができ、また運転条件を安定させることにより、終始一定の粒径を回収することが可能である。
【０００８】
本願発明者は、遠心ローター内の分離流路にてキャリア液相中の微粒子試料を沈降速度法により、連続的にかつ高分解能で分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級方法および装置を開発して提案している（特許文献１を参照）。
【０００９】
特許文献１の微粒子分級方法および装置では、分離流路の入口に、密度勾配材を用いた連続密度勾配形成器を設けて、分離流路内にキャリア液相の溶液密度が遠心ローターの動径方向外側に向かって連続的に増大する連続密度勾配を形成し、原材料の供給および分級した微粒子の回収を完全連続方式により行っている。
【００１０】
特許文献１の方法および装置は、密度勾配材の分子等が分子運動によって拡散するという「自然の摂理」を利用しているもので確実性が高く、密度勾配材の拡散により形成される密度勾配プロファイルを数値シミュレーション等で求めることも難しくない。
【００１１】
この方法および装置に用いられる連続密度勾配形成器は、キャリア液相をローター動径方向に大幅圧縮し、下流側でその動径方向の圧縮を元に戻す構成（密度勾配材の静的拡散促進方式）により、速やかな連続密度勾配（階段状のように、ギクシャクしていない密度勾配）形成を実現するものである。キャリア液相上にこの連続密度勾配が存在することにより、分離流路内における乱流生成が抑えられる（空間的整序性が確保される）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４２４７３９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願発明者は、さらなる鋭意研究の結果、特許文献１の微粒子分級装置とは異なる構成により、特許文献１の微粒子分級装置と同等もしくはそれ以上の作用効果と実用性を有する微粒子分級装置および方法を見出した。
【００１４】
本発明の目的は、微粒子を沈降速度法により、連続的にかつ高分解能で分級することができる微粒子分級装置および方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決する本発明の微粒子分級装置は、遠心ローター内にてキャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収が時間連続的に行われる分離流路で、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級装置であって、分離流路の上流部に連結されてキャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配（ギクシャクした階段状密度勾配の不都合な核心は、密度勾配として平坦な部分が存在することである）を形成する連続密度勾配形成器を備え、連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる際、キャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う（キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換する）攪拌手段を有することで、もって密度勾配材の動径方向への拡散を能動的に促進させるという動的拡散促進方式により連続密度勾配を形成することを特徴としている。
【００１６】
本発明の微粒子分級装置において、攪拌手段は、流路部内を上流側と下流側に仕切る仕切部と、仕切部に動径方向に所定間隔をおいて設けられてキャリア液相が通過可能な通過部とを有していることが好ましい。
【００１７】
また、攪拌手段は、流路部内で動径方向に沿って延在して流路部内を上流側と下流側に仕切り、キャリア液相が通過可能な穴部が穿設された仕切板を有することが好ましい。穴部は、動径方向に所定間隔をあけて複数本が設けられていることが好ましい。そして、穴部は、動径方向に直交する方向に延在する形状を有するスリットであることが好ましい。仕切板は、流路部内に着脱可能に取り付けられていることが好ましい。
【００１８】
攪拌手段は、流路部内にて動径方向に所定間隔をおいて並べられた複数本の棒状部材を有し、仕切部が複数の棒状部材によって形成され、通過部が各棒状部材の間に形成された間隙によって形成されていることが好ましい。
【００１９】
攪拌手段は、動径方向に並べられた複数本の棒状部材を一組とし、複数の組がキャリア液相の流れ方向に所定間隔をおいて連続するように設けられていることが好ましい。また、攪拌手段は、複数の組のうち、上流側と下流側に対向する各組の棒状部材同士の位置が、キャリア液相の流れ方向に重ならないように、動径方向に互い違いに配置されていることが好ましい。そして、各棒状部材は、動径方向外側に向かって移行するにしたがって、棒状部材の径が太くなるように形成されていることが好ましい。
【００２０】
本発明の微粒子分級方法は、遠心ローター内の分離流路にて、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級方法であって、分離流路の上流部に設けた連続密度勾配形成器により、キャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成し、分離流路内で、キャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収を時間連続的に行い、連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部と、流路部を流れるキャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う（キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換する）攪拌手段を有することで、もって密度勾配材の動径方向への拡散を能動的に促進させるという動的拡散促進方式により連続密度勾配を形成することを特徴としている。
【００２１】
本発明の微粒子分級装置は、遠心ローター内にてキャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収が時間連続的に行われる分離流路で、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級装置であって、分離流路の上流部に連結されてキャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成する連続密度勾配形成器を備え、連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部と、流路部を流れるキャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う（キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換する）攪拌手段を有することで、もってキャリア液相の動径方向への熱拡散を能動的に促進させるという動的拡散促進方式により連続密度勾配を形成することを特徴としている。
【００２２】
本発明の微粒子分級装置において、連続密度勾配形成器の上流側に互いに温度の異なる複数のキャリア液相を供給するキャリア液相供給手段を有することが好ましい。キャリア液相供給手段は、動径方向内側に高温のキャリア液相を供給し、動径方向外側に低温のキャリア液相を供給することが好ましい。
【００２３】
本発明の微粒子分級方法は、遠心ローター内の分離流路にて、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いた微粒子分級方法であって、分離流路の上流部に設けた連続密度勾配形成器により、キャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態である連続密度勾配を形成し、分離流路内で、キャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収を時間連続的に行い、連続密度勾配形成器は、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部と、流路部を流れるキャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う（キャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換する）攪拌手段を有することで、もってキャリア液相の動径方向への熱拡散を能動的に促進させるという動的拡散促進方式により連続密度勾配を形成することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
上記構成を有する微粒子分級装置および方法によれば、試料微粒子を分散担持しているキャリア液相の流れのエネルギーを、密度勾配材等の能動的拡散過程に転換・利用することで、より効率的に連続密度勾配を形成することができる。したがって、外形寸法をコンパクトに保つことができ、装置全体のデザインの融通性を大幅に向上させることができる。
【００２５】
上記構成を有する微粒子分級装置および方法は、特許文献１に記載された静的拡散促進方式と比較して、より人為性の高いものであり、形成される密度勾配プロファイルの数値シミュレーション等は容易ではないが、連続密度勾配形成器として高い効率の実現が可能であり、連続密度勾配形成器の外形も小さくて済む、などの長所を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】微粒子分級装置の分離流路と連続密度勾配形成器の斜視図。
【図２】分離流路と連続密度勾配形成器を遠心ローターに配置した様子を示した図。
【図３】図２のＡ−Ａ線断面図。
【図４】微粒子の大きさによる流路外壁への移動の相異を説明する図。
【図５】連続密度勾配形成器の実施例１を説明する図。
【図６】連続密度勾配形成器の実施例２を説明する図。
【図７】図６の一部拡大図。
【図８】連続密度勾配形成器の実施例３を説明する図。
【図９】図８の一部拡大図。
【図１０】連続密度勾配形成器の実施例４を説明する図。
【図１１】図１０の一部拡大図。
【図１２】実施例４の連続密度勾配形成器をローター回転軸方向の上方から見た図。
【図１３】スリットによるキャリア液相の攪拌作用を説明する図。
【図１４】スリットの構成を説明する正面図。
【図１５】動径方向位置と密度勾配との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
＜第１実施の形態＞
次に、本実施の形態について以下に図面を参照しながら説明する。
【００２８】
図１は、本実施の形態における微粒子分級装置の分離流路と連続密度勾配形成器を示す斜視図、図２は、分離流路と連続密度勾配形成器を遠心ローターに配置した様子を示した図、図３は、図２のＡ−Ａ線断面図である。
【００２９】
本発明の微粒子分級装置及び方法は、遠心ローター２内にてキャリア液相の供給と回収、及び微粒子試料の供給と回収が時間連続的に行われる分離流路で、分離対象とする微粒子試料をキャリア液相中において沈降速度法により分離する遠心分離方式を用いたものである。
【００３０】
本実施の形態における微粒子分級装置１は、上下を回転自在に支持された遠心ローター２と、遠心ローター２を高速で回転駆動させる駆動モータ（図示せず）を有している。
遠心ローター２は、回転軸に沿って回転軸両端から回転シールなどにより複数の流路が接続されており、これら複数の流路を介して、キャリア液相や微粒子試料の供給と、分級後のキャリア液相や微粒子の回収が行われる。
【００３１】
遠心ローター２内には、図１及び図２に示すように、遠心ローター２の周方向に沿って円弧状に延在する分離流路３が設けられており、その分離流路３の上流部に連続密度勾配形成器４が連結された構造を有している。
【００３２】
分離流路３は、図２に示すように、上流側から下流側に向かってキャリア液相を流すことができるようになっている。例えば、図３に示すように、閉断面形状を有しており、所定の高さ幅を有して回転中心を中心として湾曲する流路内壁３ａと、該流路内壁３ａの径方向外側に対向する流路外壁３ｂと、流路内壁３ａの上端部と流路外壁３ｂの上端部との間に亘って平面状に延在する上面壁３ｃと、流路内壁３ａの下端部と流路外壁３ｂの下端部との間に亘って平面状に延在する下面壁３ｄを有する。
【００３３】
連続密度勾配形成器４は、分離流路３の上流部に連結されており、キャリア液相に溶解している溶質（密度勾配材と呼ばれる）の濃度を変えることにより、液相密度の制御を行う。連続密度勾配形成器４の上流部（入口）には、例えば図２に示すように２本またはそれ以上の液相供給チューブが接続され、これらの液相供給チューブを通して、異なるバルク密度を持つ少なくとも２以上の密度勾配材溶液が連続的に供給される（キャリア液相供給手段）。例えば、動径方向内側にバルク密度の低いキャリア液相が供給され、動径方向外側にバルク密度の高いキャリア液相が供給される。バルク密度は２種類に限定されるものではなく、３種類以上であってもよい。
【００３４】
連続密度勾配形成器４の下流部からは、遠心ローター２の動径方向ｒの変化方向、すなわち、動径方向外側に向かって連続的に増大する密度勾配（連続密度勾配）を持つキャリア液相が出てくることになる。連続密度勾配形成器４は、キャリア液相の連続密度勾配を形成する（不連続な密度変化を必要なだけ滑らかにする）のに必要な長さをローター円周方向（流れの方向）に有する。
【００３５】
連続密度勾配形成器４は、連続密度勾配形成器４の上流部から、密度の異なる二種類のキャリア液相が連続的に供給されると、連続密度勾配形成器４を通過する間に、これら二種類のキャリア液相を互いにマージして、動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態に転換して連続密度勾配を形成し、その連続密度勾配を有するキャリア液相を分離流路３の上流部に時間連続で供給する。本発明の特徴部分である連続密度勾配形成器４の内部構成については、後述する。
【００３６】
分離流路３の上流部には、分離流路３内に微粒子試料を注入する試料注入ポート５が設けられている。試料注入ポート５は、分離流路３の上流部で且つ流路内壁３ａの近傍に配置されている。
【００３７】
試料注入ポート５は、本実施の形態のように微粒子Ｐがキャリア液相より重い沈降モードでは分離流路３の流路内壁３ａに近い位置に配置されるが、微粒子Ｐがキャリア液相より軽い浮上モードでは分離流路３の流路外壁３ｂに近い位置に配置される。試料注入ポート５は、試料供給チューブを介して試料ポンプ（図示せず）に接続されており、微粒子Ｐを含む試料液からなる微粒子試料を分離流路３の上流部に連続的に供給するようになっている。
【００３８】
分離流路３の上流部から時間連続で供給されたキャリア液相と微粒子試料は、高速回転している遠心ローター２の分離流路３内を上流側から下流側に向かって数分から数十分かけて移動する。
【００３９】
図４は、図２と同じ方向から遠心ローター２内の分離流路３を眺めた原理説明図であり、簡単のために直交座標系により表示したものである。図の上方にローター回転軸が位置し、縦軸方向上方から下方に向かう方向である動径方向外側に向かって遠心力が作用している。
【００４０】
キャリア液相は、連続密度勾配形成器４によって動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態に転換されて連続密度勾配とされた状態で分離流路３内を上流から下流に時間連続で流れており、試料注入ポート５から微粒子試料が時間連続で供給される。
【００４１】
試料注入ポート５から分離流路３内に注入された微粒子試料の微粒子Ｐは、分離流路３内を流れるキャリア液相と共に上流から下流に移動し、かつ、遠心力によって分離流路３内を動径方向に移動する。そして、分離流路３を移動する間に、粒径の大きい微粒子Ｐほど外方へ速やかに沈降して分離流路３の流路外壁３ｂに到達する。
【００４２】
微粒子Ｐの回収は、時間連続的に行われ、例えば、分離流路３に設けられた目的試料回収ポート６から目的の大きさを有する微粒子を回収する完全連続方式としてもよく、また、分離流路３の下流部に設けられた液相（及び微粒子のその他の画分）回収ポートからキャリア液相を回収しながら流路外壁３ｂに沈積させた微粒子Ｐを遠心ローター２の回転停止後に回収する半連続方式としてもよい。
【００４３】
目的試料回収ポート６は、例えば図４に示すように、１カ所で済ませる方式も可能であり、また、複数箇所に設けることもできる。試料注入ポート５と目的試料回収ポート６は、沈降（又は浮上）距離に関する微粒子Ｐ毎の差異を小さくするために、動径方向に狭い幅（小さいΔｒ）を有している。
【００４４】
次に、本発明の特徴部分である連続密度勾配形成器４の構成について図５から図１５を用いて説明する。
【００４５】
連続密度勾配形成器４は、図５等に示すように、上流側から下流側に向かってキャリア液相が流れる流路部１１と、流路部１１内を流れるキャリアを攪拌させる攪拌手段１２を有する。攪拌手段１２は、流路部１１内を流れるキャリア液相の流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、密度勾配材の拡散を能動的に促進させることで、キャリア液相の動径方向の密度勾配を階段状のもの（キャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在する様態）から連続状のもの（キャリア液相の動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない様態）に速やかに転換する構成を有している。
【００４６】
攪拌手段１２は、流路部１１をキャリア液相が流れる方向に対して垂直な平面で切った流路断面内において、キャリア液相の流れをブロックする部分と、キャリア液相が通過可能な部分とを有し、通過しようとするキャリア液相に不均一な作用を及ぼす不均一構造を有する。この不均一構造によって、キャリア液相は、流路断面内に構造物が何も存在しない場合と比較して、流路断面内のどの位置を通過しようとするかに依存して、ブロックされたり、あるいは通過を許されたりという具合に、攪拌手段１２によって顕著に異なる作用を受ける。
【００４７】
例えば、攪拌手段１２は、流路部１１内を上流側と下流側に仕切る仕切部と、仕切部に動径方向に所定間隔をおいて設けられたキャリア液相が通過可能な通過部とを有しており、通過部を通過する際にキャリア液相の流れが乱れるのを利用してキャリア液相を攪拌させるように構成されている。
【００４８】
このような不均一構造について、仕切部でキャリア液相の流れを完全にブロックし、通過部でキャリア液相を自由に通過させるという構造は同じでも、例えば、仕切部に対する通過部の流路断面に占める面積比（開口率に相当）を小さくすることで、不均一性をさらに大きくすることができる。それは、仕切部では流速が０となるのに対して、通過部での流速は、開口率が小さくなるほど大きくなる、すなわち、それだけ、仕切部と通過部との間のコントラストが大きくなる結果として理解できる。
【００４９】
図５は、連続密度勾配形成器の実施例１を示す図である。連続密度勾配形成器４の流路部１１は、分離流路３とほぼ同一の断面形状を有しており、説明の便宜上、図５では、上面壁を省略して示している。
【００５０】
例えば、図５に示す実施例１の連続密度勾配形成器４は、流路部１１内において、複数の棒状部材である丸棒（円柱）１３を動径方向に所定間隔をおいて並べて、その動径方向に並べられた複数本の丸棒１３を一組とし、複数の組がキャリア液相の流れ方向に所定間隔をおいて連続するように設けられている。そして、上流側と下流側に対向する各組の丸棒１３同士の位置が、キャリア液相の流れ方向に重ならないように、動径方向に互い違いに配置されている。
【００５１】
したがって、これらの動径方向に並べられた複数本の丸棒１３によって流路部１１内が上流側と下流側に仕切られて仕切部が形成され、各丸棒１３の間に形成された間隙によって通過部が形成される。この連続密度勾配形成器４によれば、各丸棒１３の間にキャリア液相を通過させることによって、丸棒１３の軸方向に直交する方向に選択的に攪拌を引き起こさせることができる。
【００５２】
したがって、流路部１１の流路方向の長さが短くても、流路部１１内を流れるキャリア液相を動径方向に十分に攪拌することができ、動径方向の密度勾配を階段状のものから連続状のものに速やかに転換して連続密度勾配を形成することができる。
【００５３】
図６は、連続密度勾配形成器の実施例２を示す図であり、流路部内をローター回転軸方向の上方から見たものである。そして、図７は、図６の一部を拡大して示す図である。
【００５４】
図６に示す実施例２の連続密度勾配形成器４は、複数の丸棒１３を図５に示すものよりも密に並べた構成を有している。複数の丸棒１３を密に並べた構造の方が、図７に示すように、各丸棒１３の間を通過する際のキャリア液相の攪拌が、動径方向においてより多く行われ、動径方向の混合を積極的に促進させることができる。なお、各丸棒１３は、流路部１１のカーブに対応するために、動径方向外側に向かって移行するにしたがって、丸棒１３の径が太くなるように形成されている。なお、実施例１、２では、棒状部材の例として丸棒の場合を例に説明したが、丸棒に限定されるものではなく、断面が正四角形、正六角形、正八角形等の角棒など、他の棒形状でもよい。
【００５５】
図８は、連続密度勾配形成器の実施例３を示す図、図９は、図８の一部拡大図である。図８に示す実施例３の連続密度勾配形成器４は、流路部１１内を上流側と下流側に仕切る仕切板２１を有しており、その仕切板２１には、動径方向に所定間隔をおいて円形孔（穴部）２２が設けられている。
【００５６】
円形孔２２は、流路部１１の流路幅Ｗ及び流路高さＨの方向に所定間隔をあけて複数個が設けられている。仕切板２１は、動径方向に沿って延在するように配置されており、流路部１１の流れ方向に所定間隔をあけて複数枚が設けられている。
【００５７】
上記構成を有する実施例３の連続密度勾配形成器４によれば、円形孔２２にキャリア液相を通過させることによって、図９に示すように、円形孔２２から孔径方向外側に向かって全方向に均等に攪拌を引き起こさせることができる。したがって、流路部１１の流路方向の長さが短くても、流路部１１内を流れるキャリア液相を動径方向に十分に攪拌することができ、動径方向の密度勾配を階段状のものから連続状のものに速やかに転換して連続密度勾配を形成することができる。
【００５８】
したがって、連続密度勾配形成器４の長手方向の長さを短くすることができ、その分だけ分離流路３の長さを長く取ることができるなど、ローター寸法上の制約を緩和することができる。また、図５〜図７に示す丸棒１３を用いた攪拌方法（実施例１、２）と比較して、流路部１１の空隙部分の実体積が減少する割合が少なく、流路部１１内における流れの線速度の上昇を抑制することができる。そして、丸棒１３よりも、シンプル且つ頑丈な構造（耐遠心力性）とすることができる。
【００５９】
図１０は、連続密度勾配形成器の実施例４を示す図、図１１は、図１０の一部拡大図、図１２は、実施例４の連続密度勾配形成器をローター回転軸方向の上方からみた図である。そして、図１３は、スリットによるキャリア液相の攪拌作用を説明する図、図１４は、スリットの構成を説明する図である。
【００６０】
図１０に示す実施例４の連続密度勾配形成器４は、図８および図９に示す円形孔２２の代わりに、仕切板２１にスリット（穴部）２３を設けたものである。スリット２３は、図１０および図１４に示すように、動径方向に直交する方向（ローター回転軸方向と平行）に延在する形状を有し、複数本が動径方向に所定間隔をあけて配置されている。スリット２３は、キャリア液相を通過させることによって、図１１および図１３に示すように、スリット２３からスリット２３の長手方向と垂直な方向に攪拌を引き起こさせることができる。
【００６１】
したがって、攪拌が求められている動径方向（遠心力方向）に選択的に攪拌を引き起こさせることができ、実施例３の円形孔２２と比較して、より少ない流通抵抗で攪拌させることができる。したがって、仕切板２１により発生する流通抵抗を抑えつつ、動径方向に十分な攪拌力を発生させることができる。
【００６２】
キャリア液相は、図１３に示すように、動径方向に隣り合う２つのスリット２３、２３を通過すると、動径方向に沿って互いに接近する方向に流れて、スリット２３の長手方向と垂直な方向に攪拌を引き起こさせる。したがって、キャリア液相の動径方向の攪拌を更に促進させることができる（キャリア液相の運動に対するコリオリ力による）。  
【００６３】
仕切板２１の外形寸法は、主として、分離流路３の断面寸法で決まる。流れの線速度（システム全体としての運動方針で決まる）と、図１４に示す各パラメータａ〜ｄ（特定寸法）等により、仕切板１枚当たりの攪拌（液相マージ）効率、流通抵抗、構造強度などが決まる。
【００６４】
例えば、全長９０ｃｍの分離流路３を３０分という時間をかけてキャリア液相がゆっくりと流れる場合、分離流路３での流速は０．５ｍｍ／秒である。したがって、仮に、連続密度勾配形成器４が、幅０．２ｍｍのスリット２３を動径方向に４ｍｍ間隔で並べた仕切板２１を有する場合、開孔率は（孔面積の合計／仕切板面積）は５％以下になり、キャリア液相がスリット２３を通過する際の流速は、１０ｍｍ／秒以上になる。もしこれで、連続密度勾配形成器４による擾乱の起き方が足りないという場合には、動径方向のスリット間隔ｄを更に大きくするか、スリット幅ｂを狭くすることにより、更に擾乱させることができる。
【００６５】
なお、実施例４では、図１４に示すように、スリット２３がローター回転軸方向に３段に分けられた場合を例に説明したが、この実施例に限定されるものではなく、例えば、遠心力が作用する下でのスリットの歪みが所定範囲内に収まる構造強度が得られるのであれば、２段に分ける構成や、上下に分けることなく上端と下端との間に亘って延在する構成としてもよい。
【００６６】
このように、実施例４の連続密度勾配形成器４によれば、流路部１１の流路方向の長さが短くても、流路部１１内を流れるキャリア液相を動径方向に十分に攪拌することができ、動径方向の密度勾配を階段状のものから連続状のものに速やかに転換して連続密度勾配を形成することができる。
【００６７】
したがって、実施例３と比較して、キャリア液相のマージをより効果的に実現でき、連続密度勾配形成器４の長手方向の長さを更に短くすることができる。また、図４及び図５に示す丸棒１３を用いた攪拌方法と比較して、流路部１１の空隙部分の実体積が減少する割合が少なく、流路部１１内における流れの線速度の上昇を抑制することができる。そして、丸棒１３よりも、シンプル且つ頑丈な構造（耐遠心力性）とすることができる。
【００６８】
なお、実施例３、４の仕切板２１は、流路部１１内に着脱自在に設けられており、例えば仕切板２１の抜き差しにより、仕切板２１の枚数、円形孔２２やスリット２３の大きさ、幅、数、分布などのパラメータを自由に調整できる。このパラメータ調整機能により、密度勾配の深さなど、分離条件の最適化を容易に行うことができる。
【００６９】
また、上述の各実施例において、丸棒１３の太さ、形状、本数、動径方向における配置間隔、あるいは、仕切板２１の円形孔２２やスリット２３の大きさ、幅、数、分布の少なくとも一つを、流路部１１内の流れ方向における配置位置に応じて変更することができる。
【００７０】
例えば、連続密度勾配形成器４に供給されるキャリア液相が２種類の場合を例に説明すると、連続密度勾配形成器４の上流部分（２つのキャリア液相のマージ過程が始まって間もなくの部分）においては、流路部内の動径方向中間位置に急峻な液相密度の勾配が存在する。このような液相密度の勾配が急峻な部位で拡散促進を図るには、一般に強い攪拌力が要求される。
【００７１】
一方、動径方向外側の流路外壁３ｂ付近及び動径方向内側の流路内壁３ａ付近では、液相密度は、ほとんどフラットであり、このような部位でキャリア液相を攪拌しても拡散を促進することにならないので意味がない。
【００７２】
そこで、連続密度勾配形成器４の上流部分においては、仕切板２１の穴部（円形孔２２やスリット２３）などの攪拌力発生部位を、キャリア液相の密度勾配が急峻となる位置である流路部の動径方向中間位置などにしかるべく集中して設けることによって、効率よく連続密度勾配を形成することができる。
【００７３】
本発明は、流れのエネルギーの一部を攪拌のエネルギーに変換して利用するという原理に基づくものであり、攪拌エネルギーには限りがある。したがって、上記したように攪拌エネルギーが必要なところに攪拌力発生部位を集中して配置することによって、連続密度勾配を形成する効率を上げることができる。
【００７４】
次に、粒径分布の広い微粒子試料からシャープな粒径画分を高い回収率で回収する方法について説明する。
【００７５】
連続密度勾配形成器４の下流部には、図６、図１２に示すように、流路部１１内を動径方向内側と外側に仕切る隔壁部３１が設けられている。隔壁部３１は、試料注入ポート５から上流側に向かって、連続密度勾配形成器４の流路部１１の途中位置まで空間的に連続しており、流路部１１のローター回転軸方向に亘って隙間なく仕切っており、この区間における動径方向の物質移動を遮断している。
【００７６】
したがって、隔壁部３１を間に介して径方向内側と径方向外側との間に亘る流路部１１内のキャリア液相の攪拌が隔壁部３１の上流端から下流端（試料注入ポートの位置）まで遮断され、試料注入位置において密度勾配の段差を生じさせることができる。
【００７７】
図１５は、動径方向位置と密度勾配との関係を示すグラフであり、図１５に実線で示す密度勾配プロファイルは、隔壁部３１が設けられている場合に生じる密度勾配を示し、図１５に点線で示した密度勾配プロファイルは、隔壁部３１が設けられていない場合に生じる密度勾配を示している。
【００７８】
この隔壁部３１を設けることによって、図１５に実線で示すように、試料注入位置におけるキャリア液相のバルク密度の許容範囲を広げることができる。したがって、微粒子試料のバルク密度と試料注入位置におけるキャリア液相のバルク密度を容易に一致させることができ、微粒子試料のバンド幅の幅広化を防ぐことができる。したがって、試料注入ポートの動径方向幅を沈降距離に比して十分に狭くすることができ、粒径分布の広い原試料から、非常にシャープな粒径画分を高い回収率で回収することができる。
【００７９】
上記構成を有する連続密度勾配形成器４によれば、試料微粒子を分散担持しているキャリア液相の流れのエネルギーを密度勾配材の能動的拡散過程に転換・利用することができ、より短い距離で連続密度勾配を形成することができる。したがって、外形寸法をコンパクトに保つことができ、装置全体のデザインの融通性を大幅に向上させることができる。
【００８０】
＜第２実施の形態＞
次に、第２実施の形態について説明する。
【００８１】
上記した第１実施の形態は、キャリア液相に溶解している密度勾配材の濃度を変えることにより、キャリア液相中に密度勾配を形成するものであるが、本実施の形態では、キャリア液相中に温度勾配を形成することによって、キャリア液相中に密度勾配を形成することを特徴としている。具体的には、連続密度勾配形成器の上流側、あるいは、入口部（上流部）において、第１実施の形態における異なる濃度の密度勾配材の代わりに、温度の異なる少なくとも２以上のキャリア液相を供給して、動径方向への熱拡散を促進させる構成とする。第１実施の形態では、密度勾配材の輸送が液相分子の移動と並行して起こるのに対して、本実施の形態では、熱輸送が液相分子の移動と並行して起こる。
【００８２】
例えば、連続密度勾配形成器４の上流部（入口）に接続された２本またはそれ以上の液相供給チューブを通して、互いに温度の異なる少なくとも２以上のキャリア液相を連続的に供給する（キャリア液相供給手段）。本実施の形態では、遠心ローター２の回転中心側、すなわち、動径方向内側には高温のキャリア液相を供給し、遠心ローター２の回転外側、すなわち、動径方向外側には、低温のキャリア液相を供給する。
【００８３】
連続密度勾配形成器４は、攪拌手段１２により、流路部１１内を流れるキャリア液相の流れを利用してキャリア液相の能動的攪拌を行う。攪拌手段１２は、キャリア液相との流れエネルギーの一部を攪拌エネルギーに変換して、キャリア液相の動径方向への熱拡散を能動的に促進させる動的拡散促進方式により連続密度勾配を形成する。
【００８４】
したがって、連続密度勾配形成器４の下流部からは、遠心ローター２の動径方向外側に向かって連続的に増大する密度勾配（連続密度勾配）を持つキャリア液相が出てくることになる。
【００８５】
このように、連続密度勾配形成器４は、連続密度勾配形成器４の上流部から、動径方向に温度の異なる二種類のキャリア液相が連続的に供給されると、連続密度勾配形成器４を通過する間に、これら高温と低温の二種類のキャリア液相を互いにマージして、キャリア液相の動径方向に温度勾配を形成し、動径方向の密度勾配について平坦な部分が存在しない連続密度勾配を形成し、その連続密度勾配を有するキャリア液相を分離流路３の上流部に時間連続で供給することができる。
【００８６】
本実施の形態によれば、密度勾配材を用いる必要がないので、試料の分級後に密度勾配材を除去する作業を省略でき、試料処理工程の簡素化を図ることができる。そして、経済性、および、環境への優しさを向上させることができる。
【００８７】
なお、本発明は、上述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。例えば、上述の第１実施の形態では、バルク密度の異なる２種類のキャリア液相を連続密度勾配形成器４の上流部分に供給する場合を例に説明し、第２実施の形態では、高温と低温の２種類のキャリア液相を連続密度勾配形成器４の上流部分に供給する場合を例に説明したが、キャリア液相の種類は、２種類に限定されず、３以上であってもよい。
【００８８】
また、上述の第１の実施の形態では、動径方向内側にバルク密度の低いキャリア液相を供給し、動径方向外側にバルク密度の高いキャリア液相を供給する場合を例に説明し、上述の第２の実施の形態では、動径方向内側に高温のキャリア液相を供給し、動径方向外側に低温のキャリア液相を供給する場合を例に説明したが、各キャリア液相を供給する場所は、連続密度勾配形成器４の上流部分であればよく、特に限定されるものではない。
【００８９】
機械的にどのような位置に供給しても、強大な遠心力によって密度の高いものは動径方向外側に自動的に移動して連続密度勾配が形成される。また、動径方向内側にバルク密度の低いキャリア液相あるいは低温のキャリア液相を供給し、動径方向外側にバルク密度の高いキャリア液相あるいは高温のキャリア液相を供給して、動径方向の位置を交換するように移動させて連続密度勾配を形成することもできる。
【符号の説明】
【００９０】
１  微粒子分級装置
２  遠心ローター
３  分離流路
４  連続密度勾配形成器
１１  流路部
１２  攪拌手段
１３  丸棒
２１  仕切板
２２  円形孔（穴部）
２３  スリット（穴部）
【図１】
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【図２】
2011218348.tif 000004
【図３】
2011218348.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2011218348.tif 000008
【図７】
2011218348.tif 000009
【図８】
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【図９】
2011218348.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2011218348.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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