(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドの製造方法の提供。【解決手段】Ｄ−アミノ酸またはその誘導体をアシル供与体とし、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体をアシル受容体として、ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼを用いて反応を行う、ジペプチド製造方法。Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドを立体選択的に生成しうる、ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドの製造方法であって、Ｄ−アミノ酸またはその誘導体をアシル供与体とし、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体をアシル受容体として、ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼを用いて反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼがストレプトマイセス属に属する微生物由来のものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼが独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として受託された微生物に由来するものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼが独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として受託された微生物に由来するものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
アシル供与体が、カルボキシル基をエステル基で保護されたＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸アミドであり、アシル受容体が、Ｌ−アミノ酸、カルボキシル基をエステル基で保護されたＬ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸アミドである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
アシル受容体がＬ−アミノ酸である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として受託された微生物が産生するペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼ。
【請求項８】
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として受託された微生物が産生するペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼ。
【請求項９】
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として受託された微生物。
【請求項１０】
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として受託された微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素によるペプチドの合成方法に関する。詳細には、本発明は、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドの製造方法であって、Ｄ−アミノ酸またはその誘導体をアシル供与体とし、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体をアシル受容体として、ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼを用いて反応を行うことを特徴とする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、生理活性が通常のＬ−アミノ酸からなるペプチドとは異なる場合が多く、医薬品、研究用試薬等の分野で利用が期待されている。生体はペプチド等の物質の立体構造に対して厳密であり、所望の特性を有する物質を立体選択的に合成することが望まれる。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドの合成例は多くある（例えば、特許文献１、２および非特許文献１参照）。しかしながら、様々な基質を用いて、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体およびその環化ジペプチドを立体選択的に高い収率で酵素合成し得た例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】再表２００５−５２１５３明細書
【特許文献２】特表平４−５０１０５６明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biotechnol Lett. 27, 1199-1203 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチドおよびその環化ジペプチドを立体選択的に酵素合成することが本発明の課題であった。しかも、様々な基質から、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有する広範なジペプチドおよびその環化ジペプチドを高い収率で得ることも本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、微生物からペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼを精製し、これ用いることにより上記課題を解決できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドの製造方法であって、Ｄ−アミノ酸またはその誘導体をアシル供与体とし、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体をアシル受容体として、ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼを用いて反応を行うことを特徴とする方法；
（２）ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼがストレプトマイセス属に属する微生物由来のものである、（１）記載の方法；
（３）ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼが独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として受託された微生物に由来するものである、（２）記載の方法；
（４）ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼが独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として受託された微生物に由来するものである、（２）記載の方法；
（５）アシル供与体が、カルボキシル基をエステル基で保護されたＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸アミドであり、アシル受容体が、Ｌ−アミノ酸、カルボキシル基をエステル基で保護されたＬ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸アミドである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）アシル受容体がＬ−アミノ酸である、（５）記載の方法；
（７）独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として受託された微生物が産生するペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼ；
（８）独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として受託された微生物が産生するペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼ；
（９）独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として受託された微生物；
（１０）独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として受託された微生物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、Ｄ−アミノ酸をＮ末端にＬ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドを立体選択的に製造する方法が提供される。さらに本発明によれば、Ｄ−アミノ酸をＮ末端にＬ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体およびその環化物を立体選択的に合成できる酵素が提供される。しかも、反応に使用できる基質（アミノ酸およびアミノ酸誘導体）特異性が広い。したがって、本発明の製造方法により、生理活性物質、医薬、研究用試薬あるいは新素材の合成材料としての利用が期待される、Ｄ−アミノ酸をＮ末端にＬ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体およびその環化物を、容易に合成することができる。しかも、本発明によれば、非常に幅広く様々なジペプチド、その誘導体またはその環化物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼ（中央のレーン）および８３Ｄ１２株のＳ１２アミノペプチダーゼ（右のレーン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。左のレーンはマーカーであり、下から３０ＫＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、８０ｋＤａである。
【図２】図２は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの推定アミノ酸配列を、ストレプトマイセス属あるいはバチルス属のβ−ラクタマーゼ、アルカリＤ−ペプチダーゼ、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼと比較した図である。上から、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼ、Bacillus cereusのＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ、Bacillus cereusのＤ−ペプチダーゼ、Streptomyces clavuligerusの推定β−ラクタマーゼ、Streptomyces clavuligerusの推定Ｄ−体特異的エンドペプチダーゼ、Streptomyces clavuligerusの推定アルカリＤ−ペプチダーゼ、Streptomyces clavuligerusの推定Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ、Streptomyces sp. R61のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼの推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌの濃度を２０ｍＭ、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅの濃度を０〜４０ｍＭとして（上図）、あるいはＬ−Ｔｒｐの濃度を０〜４０ｍＭとして（中図）、ジペプチドの生成について検討した結果、ならびにＬ−Ｔｒｐ−ＯＭｅの濃度を２０ｍＭ、Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌの濃度を０〜４０ｍＭとして（下図）反応させた場合の生成物について検討した結果を示す図である。
【図４】図４は、Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌの濃度を２０ｍＭ、Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅの濃度を２０ｍＭとして、ジペプチドおよびその環化物の生成反応を行った場合の生成物の質量分析結果の一例を示す図である。
【図５】図５は、Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌの濃度を２０ｍＭ、Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅの濃度を２０ｍＭとして、ジペプチドおよびその環化物の生成の経時変化について検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明する。特に断らないかぎり、本明細書の用語は当業者に認識されている一般的な意味に解される。また、本明細書において、アミノ酸の表記はカナ標記のほか、３文字表記、１文字表記を用いるが、これらも当業者に公知である。本明細書に用いる環化ペプチドの標記も当業者に公知のもので、例えば、Ｄ−プロリンがＮ末端側、Ｌ−アルギニンがＣ末端にあるジペプチド（Ｄ−プロリル−Ｌ−アルギニン）をＤ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＡｒｇあるいはＤＰ−ＬＲと標記することがある。また例えば、Ｄ−プロリンがＮ末端側、Ｌ−アルギニンがＣ末端にあるジペプチド（Ｄ−プロリル−Ｌ−アルギニン）の環化ジペプチドをｃ（Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ）あるいはｃ（ＤＰ−ＬＲ）と標記することがある。表２において、同一アミノ酸からなるオリゴペプチドを表す際に、例えばＤ−フェニルアラニンからなるジペプチドを（ＤＦ）２と表すことがある。
【００１１】
本発明は、１の態様において、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドの製造方法を提供する。該方法において、Ｄ−アミノ酸またはその誘導体をアシル供与体とし、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体をアシル受容体として、ペプチダーゼファミリーＳ１２に属するアミノペプチダーゼ（本明細書において、「Ｓ１２アミノペプチダーゼ」と略称することがある）を用いて反応を行う。Ｓ１２アミノペプチダーゼは、特異的にＤ−アミノ酸誘導体の加水分解反応を触媒する酵素であり、活性中心にセリン残基を持つものをいう。
【００１２】
本発明に用いるＳ１２アミノペプチダーゼはいかなる生物に由来するものであってもよいが、好ましくは、ストレプトマイセス属、バチラス属、シュードモナス属、アエロモナス属、ミコバクテリウム属、オクロバクトラム属、ピロコッカス属、ロドコッカス属、キサントモナス属からなる群より選択される微生物に由来するものである。より好ましくは、本発明に用いるＳ１２アミノペプチダーゼはストレプトマイセス属の微生物に由来するものであり、例えば、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、２０１０年１月８日付けで受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１を付与された微生物、および２０１０年１月２５日付けで受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２を付与された微生物に由来するものである。
【００１３】
本発明に用いるＳ１２アミノペプチダーゼは市販品を用いてもよく、上記微生物を培養することにより取得してもよい。微生物の培養方法、酵素の取得、精製方法は当業者によく知られている。例えば、Ｓ１２アミノペプチダーゼ生産菌を培養し、培養濾液または菌体破砕物を得て、硫安濃縮、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーとのクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の手段を用いてＳ１２アミノペプチダーゼを得ることができる。あるいは、Ｓ１２アミノペプチダーゼをコードする遺伝子をベクターに組み込み、大腸菌などの宿主に導入して培養することにより、Ｓ１２アミノペプチダーゼを得てもよい。遺伝子導入による蛋白の生産方法は当業者に公知である。本発明に使用する酵素は単品または高純度のものであってもよく、部分精製品や粗精製品であってもよい。使用酵素の純度は、目的生成物の収率、目的生成物の純度（副反応の多さまたは少なさ）、反応速度などの条件を考慮して当業者が適宜選択することができる。
【００１４】
本発明の製造方法において、アシル供与体としてＤ−アミノ酸（誘導体となっていない）またはその誘導体を用いる。アシル供与体としてのＤ−アミノ酸およびその誘導体の種類は特に限定されず、いずれのＤ−アミノ酸およびその誘導体であってもよい。また、アシル供与体としてのＤ−アミノ酸およびその誘導体を構成するＤ−アミノ酸は天然アミノ酸のＤ−体であってもよく、非天然アミノ酸のＤ−体であってもよい。目的生成物の収率の高さ、副反応の起こりにくさ、目的生成物の純度の点から、アシル供与体としてはＤ−アミノ酸の誘導体が好ましい。アシル供与体Ｄ−アミノ酸の誘導体としては、Ｄ−アミノ酸のカルボキシル基をアルキルエステル基やベンジルエステル基で保護したもの等が例示されるが、これらに限定されない。アルキルエステル基はジペプチド反応に影響しない程度のサイズであることが望ましく、例えば、炭素数１〜４個程度のアルキル基を含むエステル基が好ましい。好ましいエステル保護基の例としてはメチルエステル基、ベンジルエステル基などが挙げられる。Ｄ−アミノ酸のｐ−ニトロアニリン誘導体などもアシル供与体として用いることができる。
【００１５】
本発明の製造方法において、アシル受容体として、広範な種類のＬ−アミノ酸（誘導体となっていない）またはその誘導体を用いることができる。本発明の製造方法に使用するアシル受容体としては、天然Ｌ−アミノ酸およびその誘導体、非天然Ｌ−アミノ酸およびその誘導体を用いることができる。したがって、本発明の製造方法によって広範な種類のジペプチドを得ることができる（例えば、表１参照）。アシル受容体としてのＬ−アミノ酸は誘導体化されていなくてもよい。アシル受容体アミノ酸の誘導体としては、これらのＬ−アミノ酸のカルボキシル基をアルキルエステル基やベンジルエステル基で保護したもの、あるいはこれらのアミノ酸のカルボキシル基をアミド化したもの等が例示されるが、これらに限定されない。アルキルエステル基はジペプチド反応に影響しない程度のサイズであることが望ましく、例えば、炭素数１〜４個程度のアルキル基を含むエステル基が好ましい。好ましいエステル保護基の例としてはメチルエステル基、エチルエステル基、ベンジルエステル基などが挙げられる。アミノ酸のアミド体などもアシル受容体として用いることができる。
【００１６】
上記のようなアミノ酸の誘導体の製造方法は公知であり、当業者はこれらの方法を適宜選択して容易に目的の誘導体を得ることができる。アミノ酸のアルキルエステルは、例えばアミノ酸を塩酸含有アルコール溶液で処理するか、あるいはＣｌＳ（＝Ｏ）ＯＲ（Ｒはアルキル基）で処理することにより得ることができる。アミノ酸のベンジルエステルは、例えばベンジルアルコール中の酸触媒または縮合剤で処理することにより得ることができる。アミノ酸のｔ−ブチルエステルは、例えばイソブテンおよび硫酸触媒で処理することにより得ることができる。アミノ酸のアミドは、例えばアミノ酸を塩化チオニルで処理し、次いで、アミンと反応させることにより得ることができる。これらの手法はあくまでも例示である。
【００１７】
本発明の製造方法におけるペプチド合成条件は、使用するＳ１２アミノペプチダーゼの種類や量、基質の種類や量、目的生成物の種類や量などの諸因子に応じて、当業者が決定することができる。例えば、反応温度、反応ｐＨ、反応時間、使用酵素の種類および量、使用基質およびそれらの量などを、当業者は通常の知識および手法を用いて容易に選択、決定することができ、適当な反応装置や緩衝液などを用いて目的のジペプチドを得ることができる。
【００１８】
本発明の製造方法において、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチドのみならず、その環化ジペプチドを得ることもできる。当業者は、酵素の種類や量、基質の種類や量、反応のｐＨや温度ならびに反応時間等の条件を調節して、目的のジペプチドの生成あるいはその環化ジペプチドの生成について最適な条件を見出すことができる。
【００１９】
本発明の製造方法におけるペプチド合成は水溶液中にて行うことができるが、水溶性有機溶媒中（水との混合系でもよい）、あるいは水不溶性有機溶媒系と水系との二相系にて行うこともできる。本発明の製造方法に使用する酵素は遊離状態であってもよく、連続反応を行う目的、あるいは有機溶媒による変性を抑制する目的などから、本発明の製造方法に使用する酵素は担体に固定化されていてもよい。酵素の担体への固定化方法、ならびに担体の選択は当業者に公知であり、適宜行うことができる。バイオリアクター中で固定化酵素を用いて連続的に目的のペプチドを製造することもできる。例えば、多孔性シリカゲル、ガラスビース、セラミックス、アルギン酸ゲルなどの粒状担体またはＰＦＴＥ膜などの膜担体に酵素を固定化することができ、固定化方法もグルタルアルデヒドなどによる架橋法、ゲル状担体への包括法、担体表面への共有結合法や吸着法などがある。これらの手法はあくまでも例示である。
【００２０】
反応生成物の分析あるいは反応の経時変化の追跡には公知の手段、方法を用いることができ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、質量スペクトル分析（ＭＳ）、あるいは超高品質液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどを用いることができるが、これらの手段、方法に限定されない。反応後、目的とする反応生成物を反応系から精製あるいは単離することができる。生成物の精製、単離には公知の手段、方法を用いることができ、例えば、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの各種クロマトグラフィーを用いることができるが、これらの手段、方法に限定されない。
【００２１】
反応に使用した基質が誘導体化されていた場合には、通常、生成物も誘導体であるが、当業者は、生成物を誘導体化されていないもの、あるいは他の誘導体に適宜変換することができる。かかる変換も当業者の技量の範囲内であり、容易に行うことができる。生成物ペプチドのカルボキシル基がアルキルエステル基で保護されている場合には、例えばアルカリで処理を行って脱保護することができる。生成物ペプチドのカルボキシル基がベンジルエステル基で保護されている場合には、例えば水素化反応を用いて脱保護することができる。生成物ペプチドのカルボキシル基がｔ−ブチルエステル基で保護されている場合には、例えばトリフルオロ酢酸で処理して脱保護することができる。生成物ペプチドのカルボキシル基がアミド化されている場合には、例えば酸での処理を行うことができる。これらの手法はあくまでも例示である。
【００２２】
以下に実施例を用いて本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
実施例１．  土壌分離菌からのＳ１２アミノペプチダーゼの精製およびその性質
（１）土壌からのＳ１２アミノペプチダーゼ生産菌の分離と同定
土壌から分離した２０００株から、Ｄ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを基質とした酵素活性測定によるスクリーニングを行って、２株のＳ１２アミノペプチダーゼ生産菌を得た。酵素活性測定は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｍａｌａｔｅ（ｐＨ６．５）中で、Ｄ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（１ｍＭ）を基質として２５℃で反応させ、遊離したｐ−ニトロアニリンを４０５ｎｍの吸光度にて測定することにより行った。以下の精製工程においても、上記酵素活性測定法を用いた。
【００２４】
得られた２株のＳ１２アミノペプチダーゼ生産菌の１６ＳリボソームＲＮＡ分析を行って、これらがストレプトマイセス属の菌株であると同定した。これらの菌株をStreptomyces sp. 82F2（以下、「８２Ｆ２株」と称することがある）およびStreptomyces sp. 83D12（以下、「８３Ｄ１２株」と称することがある）と命名した。８２Ｆ２株を、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、２０１０年１月８日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１を付与された。８３Ｄ１２株を、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、２０１０年１月２５日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２を付与された。
【００２５】
（２）８２Ｆ２株からのＳ１２アミノペプチダーゼの精製
８２Ｆ２株を４００ｍｌの液体培地中で２５℃、６日間好気的に振盪培養した。培地は０．８％  Ｋ２ＨＰＯ４、２．０％  グルコース、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％  ポリペプトン、および０．５％  酵母エキスを含むものであった。培養上清を硫安にて４５％飽和とし、４５％飽和硫安を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて平衡化したＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに供した。カラムを２０％飽和硫安で洗浄し、その後１００ｍＭ  Ｔｒｉａ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて酵素を溶出させた。高活性フラクションを集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。透析物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したスピンカラム（Ｖｉｖａｐｕｒｅ−Ｑ；  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ）に供した。カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で酵素を溶出させた。高活性フラクションを集め、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対して透析した。透析物を、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で平衡化したスピンカラム（Ｖｉｖａｐｕｒｅ−ＱＳ；  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ）に供した。０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でカラムを洗浄し、０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で酵素を溶出させた。得られた酵素をアミノ酸配列決定に供した。８２Ｆ２株からのＳ１２アミノペプチダーゼの精製について、表１にまとめた。
【表１】
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【００２６】
８３Ｄ１２株からのＳ１２アミノペプチダーゼについても同様に精製を行った。８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼおよび８３Ｄ１２株のＳ１２アミノペプチダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの分子量は約３７ｋＤａ、８３Ｄ１２株のＳ１２アミノペプチダーゼの分子量は約３９ｋＤａであった。また、ゲル濾過によれば、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの分子量は約３５４００であった。
【００２７】
（３）８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
上記のごとく精製した８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼを１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（変性条件下；Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.）に供し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色にて蛋白を検出し、蛋白バンドを膜から切り出した。得られた蛋白試料をＡＰＲＯ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．に送付し、分析を依頼した。エドマン分解によりＮ末端アミノ酸配列はＡｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａであることが判明した。２つの内部配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号：１）およびＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：２）も判明した。これらの情報に基づいて遺伝子のクローニングを行った。
【００２８】
８２Ｆ２株の染色体ＤＮＡを調製し（Saito, H., and K. Miura. 1963. Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment. Biochim. Biophys. Acta 72:619-629.）、下記のプライマーセット：
5'-ACSGTSCGSCAGCTSCTSCAGCA-3'  （配列番号：３）
5'-GTGSACSGGSGCGTTSACGTC-3'  （配列番号：４）
を用いるＰＣＲにより、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡフラグメントを得た。部分配列を決定した後、キット（PCR DIG Probe; Roche Molecular Biochemicals）を用いてジゴキシゲニン標識ＰＣＲプローブを合成した。ＳｍａＩで消化された染色体ＤＮＡフラグメントとＳａｃＩで消化された染色体ＤＮＡフラグメントをジゴキシゲニン標識ＰＣＲプローブとハイブリダイズさせた。陽性フラグメントを回収し、自己ライゲーションさせた。ライゲーション産物を、下記のプライマーセット：
5'-CGGATCATCAAGCCGCTCAAG-3'  （配列番号：５）
5'-TCCTCGGTGTAGCTGTAGATG-3'  （配列番号：６）
を用いてＰＣＲ増幅し、生成物を配列決定に供した。配列決定されたＤＮＡ（配列番号：７）は、ＤＤＢＪデータベースの受領番号ＡＢ５３１３８９を付与された。配列決定されたヌクレオチド配列から８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼのアミノ酸配列を推定した（配列番号：８）。シグナル配列を除く推定分子量は３７３９４であった。８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼは、公知のストレプトマイセス属あるいはバチルス属のβ−ラクタマーゼ、アルカリＤ−ペプチダーゼ、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼとは３０〜６０％のアミノ酸配列同一性を示した。また、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼはこれらの酵素に共通する活性部位のＳｘＴＫモチーフを有していた。
【００２９】
（４）８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼのペプチド合成能
Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを基質として反応させ、ＴＬＣ（６０  Ｆ２５４；  Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．  Ｉｎｃ．；ｎ−ブタノール−酢酸−水（３：１：１，ｖｏｌ／ｖｏｌ）にて約１時間展開；ニンヒドリンで検出）および質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）にて生成物を調べた。Ｄ−Ｐｈｅのほかに質量分析にて［Ｍ＋Ｈ］＋が３１３の生成物も確認され、この生成物はＤ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅであると同定された。Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの生成は確認されなかった。これらの結果から、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼはペプチド合成反応を触媒することがわかった。８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼのペプチド合成反応の最適ｐＨは８〜９あるいはそれ以上であった。
【００３０】
Ｄ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを基質とした酵素活性測定により、熱安定性およびｐＨ安定性を調べた。８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼは４５℃まで安定で、５０℃で約５０％の活性を保持すること、そしてｐＨ５．０〜１０．５において安定であることもわかった。
【実施例２】
【００３１】
実施例２．  ８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの大量生産
下記のプライマーセット：
5'-TGGCCATGGCGCCCGCGAAGCCGGACCACG-3'  （配列番号：９）
5'-AAGCTTCTACTTCTTCGGGGCGGTGCCGCA-3'  （配列番号：１０）
（下線はMscI及びHindIIIの切断部位を示す。）
を用いて、８２Ｆ２株の染色体ＤＮＡからＳ１２アミノペプチダーゼをコードする遺伝子（シグナル配列を除く）を増幅した。ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ中にクローニングし、配列決定により正しくクローニングされていることを確認した。８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードする遺伝子を、ｐＥＴ−２２ｂのＭｓｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップ中にサブクローニングして発現ベクターｐＥＴ−８２ＦＳ１２を得た。
【００３２】
ｐＥＴ−８２ＦＳ１２を導入されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１００ｍｌのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴＭ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）中で、２５℃、２４時間が培養し、遠心分離により菌体を除去し、上清を得た。ゲル濾過で調べたところ、Ｓ１２アミノペプチダーゼは上清中の蛋白の約５０％を占めていた。実施例１に記載のごとく上清からＳ１２アミノペプチダーゼを精製した。その分子量は質量分析で３６８６８Ｄａ、ゲル濾過で３５４００であった。
【実施例３】
【００３３】
実施例３．  ８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼによる各種ペプチド合成反応
２μｌのアシル供与体基質および２μｌのアシル受容体基質（いずれもＤＭＳＯ中約０．５Ｍ）を、４４μｌの０．２５Ｍの緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））に添加し、酵素液（０．７５ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ添加することにより反応を開始させた。反応は２５℃で１時間行った。０．０５ｍｌの３％ギ酸を添加することにより反応を停止した。得られた反応混合物を質量分析にて分析した。
【００３４】
各種の基質を用いて反応を行った結果を表２に示す。
【表２】
2011152075.tif 000003
2011152075.tif 000004
表中、基質の欄はアミノ酸の種類と誘導体化されている場合には誘導体の種類を示す。生成物の欄は、基質とＤ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌ、および基質とＬ−Ｌｅｕ−ＯＥｔとの組合せから生じた生成物の種類を示す。生成物の同定および測定は質量スペクトルにより行った。カテゴリーの欄は、ペプチド合成反応において基質がアシル供与体として作用したか（ｄｏｎｏｒ）、アシル受容体として作用したか（ａｃｃｅｐｔｏｒ）、それらの両方として作用したか（ｂｏｔｈ）を示す。ｎ．ｄ．は検出不可能であったことを示す。----は検討しなかったことを示す。
【００３５】
表２の結果から、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチドまたはその誘導体を主生成物とすることがわかった。Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の配置は厳密で、Ｌ−アミノ酸をＮ末端に、Ｄ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチドの生成は確認されなかった。また、基質の幅が広いことも８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの特徴といえる。
【実施例４】
【００３６】
実施例４．  Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌをアシル供与体、Ｌ−ＴｒｐまたはＬ−Ｔｒｐ−ＯＭｅをアシル受容体とした場合の、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼによるジペプチドの生成
Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌの濃度を２０ｍＭ、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅまたはＬ−Ｔｒｐの濃度を０〜４０ｍＭとして、実施例３に記載したのと同様に反応を行って、ジペプチドの生成について検討した。生成物を質量分析にて分析した。Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅのいずれをアシル受容体としてもジペプチドが生成し、それぞれＤ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅが主生成物であった（それぞれ図３の上図、中図）。Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅをアシル受容体とした場合のほうが、アシル受容体が低濃度であっても所望のジペプチドの収率が高かった。さらに、Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＭｅの濃度を２０ｍＭ、Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌの濃度を０〜４０ｍＭとして反応させた場合の生成物についても検討した（図３の下図）。この場合、Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＢｚｌの濃度を２０ｍＭ、Ｌ−Ｔｒｐの濃度を０〜４０ｍＭとして反応させた場合と同様の結果となった。
【実施例５】
【００３７】
実施例５．  Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌをアシル供与体、Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅをアシル受容体とした場合の、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼによるジペプチドおよびその環化ペプチドの生成
Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌの濃度を２０ｍＭ、Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅの濃度を２０ｍＭとして、実施例３に記載したのと同様に反応を行って、ジペプチドおよびその環化物の生成について検討した。反応は５００分まで行い、経時的にサンプリングした。生成物を質量分析にて分析した。この反応の生成物の質量分析の結果の例を図４に、この反応の生成物の経時変化を図５に示す。反応初期（約６０分まで）はＤ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅの生成が優勢であったが、１００分を越えたあたりから、環化物であるｃ（Ｄ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）の生成が優勢となり、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅは徐々に減少した。４８０分の反応でｃ（Ｄ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）の生成量は１０．２ｍＭであり、変換率は５０％以上であった。
【００３８】
８３Ｄ１２株のＳ１２アミノペプチダーゼを用いて反応を行った場合にも、同様の反応パターンが観測された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、様々な基質から、Ｄ−アミノ酸をＮ末端に、Ｌ−アミノ酸をＣ末端に有するジペプチド、その誘導体、またはその環化ジペプチドを立体選択的に高い収率で製造する方法、ならびに該方法に使用される酵素が提供されるので、新たな生理活性を有する様々なペプチドの合成が可能になる。したがって、本発明は、生理活性物質、医薬、研究用試薬、および新素材の合成材料の製造などの分野において利用可能である。
【受託番号】
【００４０】
８２Ｆ２株は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８５１として独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
８３Ｄ１２株は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６２として独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託された。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号：１は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの内部アミノ酸配列である。
配列番号：２は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの内部アミノ酸配列である。
配列番号：３は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにて増幅するためのプライマーである。
配列番号：４は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにて増幅するためのプライマーである。
配列番号：５は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲにて増幅するためのプライマーである。
配列番号：６は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲにて増幅するためのプライマーである。
配列番号：７は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列である。１１１８番目〜２２６６番目の塩基がオープンリーディングフレームである。
配列番号：８は、８２Ｆ２株のＳ１２アミノペプチダーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号：９は、８２Ｆ２株の染色体ＤＮＡからＳ１２アミノペプチダーゼをコードする遺伝子（シグナル配列を除く）をＰＣＲにて増幅するためのプライマーである。
配列番号：１０は、８２Ｆ２株の染色体ＤＮＡからＳ１２アミノペプチダーゼをコードする遺伝子（シグナル配列を除く）をＰＣＲにて増幅するためのプライマーである。
【図１】
2011152075.tif 000005
【図２】
2011152075.tif 000006
【図３】
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【図４】
2011152075.tif 000008
【図５】
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【配列表】
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