(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸分子の合成を増強するための核酸インヒビター、組成物および方法を提供する。【解決手段】核酸の合成、配列決定または増幅の阻害もしくは制御であり、詳細には、そのような合成、増幅、または配列決定反応の際に使用するための、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドに対する親和性を有する核酸。核酸インヒビターは、特定の条件下（例えば、周囲温度）において非特異的核酸合成を阻害し得る。従って、核酸分子の「ホットスタート」合成に関し、非特異的核酸合成を防止するか、減少させるか、または実質的に減少させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸合成を阻害するための組成物であって、該組成物は、ポリメラーゼ活性を有する酵素と結合し得る核酸インヒビター、または該酵素に対する親和性を有する核酸インヒビターを含む、組成物。
【請求項２】
前記核酸インヒビターがヘアピンを形成するか、または二本鎖核酸分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記酵素に対する前記核酸インヒビターの結合または親和性が、核酸の合成、増幅または配列決定のための条件下で阻害されるか、減少されるか、実質的に減少されるか、または排除される、組成物。
【請求項４】
前記核酸インヒビターが、前記酵素と複合体を形成し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記酵素が好熱性である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、ここで前記核酸インヒビターが、核酸の合成、増幅または配列決定のための条件下で変性されているか、または阻害する能力を減少されている、組成物
【請求項８】
請求項５に記載の組成物であって、ここで、核酸ポリメラーゼ活性を有する前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素からなる群から選択される、組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴTM  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴTM  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素およびＨＩＶ逆転写酵素、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体からなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記逆転写酵素が、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を実質的に減少されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
核酸分子を合成するための方法であって、以下：
１つ以上の請求項１に記載の核酸インヒビターおよび１つ以上のテンプレートを、ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素と混合する工程；ならびに
該テンプレートの全てまたは一部に相補的な１つ以上の第１の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
核酸合成を妨げる条件下、および／またはポリメラーゼ活性を有する前記酵素への前記核酸インヒビターの結合を可能にする条件下で、前記混合する工程が達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸インヒビターの阻害作用を減少させるのに十分な条件下、および／あるいはポリメラーゼ活性を有する前記酵素への該核酸インヒビターの結合を阻害するか、減少するか、実質的に減少するか、または排除するのに十分な条件下で、前記第１の核酸分子の合成が達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
１以上のヌクレオチドおよび１以上のプライマーからなる群より選択される、少なくとも１つの成分の存在下で、前記合成が達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記テンプレートが、二本鎖核酸分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の前記第１の核酸分子を、該第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法に従って作製された、核酸分子。
【請求項１９】
核酸分子を増幅するための方法であって、以下：
請求項１に記載の少なくとも１つの核酸インヒビターを、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素および１つ以上のテンプレートと混合する工程；ならびに
該テンプレートの全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
核酸増幅を妨げるのに十分な条件下、および／またはポリメラーゼ活性を有する前記酵素への前記核酸インヒビターの結合を可能にするのに十分な条件下で、前記混合する工程が達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸インヒビターを変性するのに十分な条件下、または増幅を阻害する前記インヒビターの能力を減少するのに十分な条件下で、前記増幅工程が達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅工程が、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分の存在下において達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記テンプレートが、二本鎖核酸分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法に従って作製された核酸分子。
【請求項２５】
核酸分子を配列決定するための方法であって、以下：
配列決定される少なくとも１つの核酸分子を、１以上の請求項１に記載の核酸インヒビター、ポリメラーゼ活性を有する１以上の酵素および１以上の終結因子と混合する工程；
配列決定される該分子の全てまたは一部に相補的な分子の集団を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程；ならびに
該集団を分離して、該配列決定される分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
合成を妨げるのに十分な条件下、および／またはポリメラーゼ活性を有する前記酵素への前記核酸インヒビターの結合を可能にするのに十分な条件下で、前記混合する工程が達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記合成が、前記核酸インヒビターを変性するのに十分な条件下、および／または該核酸インヒビターの阻害作用を減少するのに十分条件下において達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記合成が、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上のプライマーからなる群から選択される少なくとも１つの成分の存在下において達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記配列決定される分子が二本鎖核酸分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
核酸分子の合成、増幅または配列決定において使用するためのキットであって、該キットは、１つ以上の請求項１に記載の核酸インヒビターを備える、キット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットであって、該キットは、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上の適切な緩衝液、１つ以上のプライマーおよび１つ以上の終結因子からなる群から選択される１つ以上の成分をさらに備える、キット。
【請求項３２】
二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するための方法であって、以下：
第１のプライマーおよび第２のプライマーならびに請求項１に記載の１つ以上の核酸インヒビターを、該インヒビターが核酸合成を妨げるかもしくは阻害するような条件下で提供する工程であって、ここで、該第１のプライマーは、該ＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端以内または３’末端または３’末端近辺の配列に相補的であり、かつ該第２のプライマーは、該ＤＮＡ分子の第２の鎖の３’末端以内または３’末端または３’末端近辺の配列に相補的である、工程；
該第１のプライマーを該第１の鎖にハイブリダイズさせ、そして該第２のプライマーを該第２の鎖にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした分子を形成する工程；
該第１の鎖の全てまたは一部に相補的な第３のＤＮＡ分子および該第２の鎖の全てまたは一部に相補的な第４のＤＮＡ分子の合成を可能にするのに十分な条件下で、該ハイブリダイズした分子をインキュベートする工程；
該第１の鎖および該第３の鎖、ならびに該第２の鎖および該第４の鎖を変性させる工程；ならびに
工程（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）を、１回以上繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法であって、以下：
１つ以上のｍＲＮＡテンプレート、１つ以上の逆転写酵素を、１つ以上の請求項１に記載の核酸インヒビターと混合する工程；および
該テンプレートの全てまたは一部に相補的な１つ以上のｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
核酸の合成を妨げるのに十分な条件下、および／または前記逆転写酵素への前記核酸インヒビターの結合を可能にするのに十分な条件下で、前記混合する工程が達成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸の合成、増幅もしくは配列決定を阻害または妨げるための方法であって、該方法は以下：
１つ以上の請求項１に記載の核酸インヒビターを、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素と混合する工程；ならびに
核酸の合成、増幅および／または配列決定を阻害または妨げるのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
５’部分および３’部分を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで、該３’部分が一連の連続デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、かつ該５’部分が一連の連続リボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、該３’部分の全てまたは一部が、該５’部分の全てまたは一部と塩基対形成し得る、オリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記５’部分が、５’オーバーハングを形成するリボヌクレオチドを含む、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記３’部分の末端ヌクレオチドが、伸長不可であるような１つ以上の改変を含む、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記改変が、前記ヌクレオチドの３’ヒドロキシルのリン酸化である、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
１つ以上のヌクレアーゼに対して耐性であるように１つ以上の改変を含む、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記改変がホスホロチオエートである、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記改変がヒドロキシル基のメチル化である、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
細胞内のポリメラーゼ酵素を阻害する方法であって、該方法は以下：
細胞内にオリゴヌクレオチドを導入する工程であって、該オリゴヌクレオチドは、５’部分および３’部分を含み、ここで該３’部分が一連の連続デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、かつ該５’部分が一連の連続リボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、該３’部分の全てまたは一部が、該５’部分の全てまたは一部と塩基対形成し得る、工程；および
該オリゴヌクレオチドを用いて該ポリメラーゼの阻害を引き起こす工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドの前記５’部分が、５’オーバーハングを形成するリボヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリメラーゼがＨＩＶ逆転写酵素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、以下：
ウイルスを提供する工程であって、該ウイルスは逆転写酵素を含み、そして該ウイルスは複製のために該逆転写酵素の活性を必要とする、工程；
該逆転写酵素を、該逆転写酵素の活性を阻害し、それにより該ウイルスの複製を阻害するオリゴヌクレオチドと接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、５’部分および３’部分を含み、該３’部分が一連の連続デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、かつ該５’部分が一連の連続リボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、該３’部分の全てまたは一部が、該５’部分の全てまたは一部と塩基対形成し得る、方法。
【請求項４９】
前記５’部分が、５’オーバーハングを形成するリボヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記接触工程が、前記オリゴヌクレオチドを細胞内に導入する工程を包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
被験体におけるウイルス感染を処置する方法であって、該方法は、以下：
該被験体に、５’部分および３’部分を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物を投与する工程であって、ここで、該３’部分が一連の連続デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、かつ該５’部分が一連の連続リボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、該３’部分の全てまたは一部が、該５’部分の全てまたは一部と塩基対形成し得る、工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
１つ以上の逆転写酵素と結合するか、または該酵素に対して親和性を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
１つ以上のリボヌクレオチドまたはその誘導体、および１つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含む、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドが、分解または消化に対して耐性である、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
１つ以上の逆転写酵素を阻害する方法であって、該方法は、以下：
サンプルまたは細胞を、１つ以上の逆転写酵素と結合する１つ以上のオリゴヌクレオチド、または該酵素に対して親和性を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させて、該オリゴヌクレオチドに、該逆転写酵素のポリメラーゼ活性の阻害を引き起こさせる、工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドの分解または消化を阻害または防止するための１つ以上の改変を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
被験体におけるウイルス感染を処置する方法であって、該方法は、以下：
請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、該被験体に投与する工程；および
該オリゴヌクレオチドに、該被験体における該ウイルス感染を阻害または予防を引き起こさせる工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、周囲温度で生じる非特異的な核酸合成を減少することによって、核酸合成の感度および特異性を増加するための方法に関する。本発明はまた、ポリメラーゼに対して高い親和性を有する新規の核酸に関する。本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、核酸合成およびｃＤＮＡ合成において使用され得る。
【０００２】
本発明はまた、例えば、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドに結合することによって、核酸合成、配列決定、増幅およびｃＤＮＡ合成を阻害または阻止し得る核酸および組成物に関する。さらに、本発明の材料および方法は、それらの生活循環の完成のための逆転写酵素活性に依存する生物（レトロウイルスなど）の複製を阻害するために、治療法として使用され得る。本発明はまた、核酸分子などを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はまた、本発明の組成物または核酸を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分子の形成を合成する。プライマーの一本鎖ＤＮＡテンプレートへのハイブリダイゼーション時において、ポリメラーゼは、伸長する鎖の３’ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的に付加して、５’→３’の方向にＤＮＡを合成する。従って、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびプライマーの存在下で、新しいＤＮＡ分子（一本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的）が合成され得る。
【０００４】
中温性ＤＮＡポリメラーゼと高温性ＤＮＡポリメラーゼの両方が、核酸を合成するために使用される。中温性ポリメラーゼよりも耐熱性ポリメラーゼを使用することは、好ましい。なぜなら、耐熱性ポリメラーゼとともに使用された、より高いアニーリング温度は、誤ってアニーリングしたプライマー由来の非特異的ではないＤＮＡ産物を生じるためである。これらの非特異的な産物は、ポリメラーゼに基づいたアッセイの感度を減少し得、そしてそれぞれのプライマーセットに対する過度の最適化を必要とし得る。さらに、周囲温度において高い活性レベルを有するポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ由来のＤＮＡポリメラーゼ）が使用される場合、この問題は増強される。
【０００５】
生物、組織、または細胞の構造および生理を試験する際に、その遺伝的内容を決定することがしばしば望ましい。生物の遺伝的枠組みは、生物の体細胞および生殖細胞に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド塩基の二本鎖配列にコードされる。ＤＮＡの特定のセグメントの遺伝的内容、すなわち遺伝子は、その遺伝子がコードするタンパク質の産生時のみ明かにされる。タンパク質を産生するために、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖（「コード」鎖）の相補的なコピーを、ポリメラーゼ酵素によって産生し、リボ核酸（ＲＮＡ）の特定の配列を生じる。この特定の型のＲＮＡは、タンパク質の産生のためにＤＮＡ由来の遺伝的メッセージを含むので、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
【０００６】
所与の細胞、組織または生物において、それぞれ別々のおよび特定のタンパク質をコードする多くのｍＲＮＡ種が存在する。この事実は、組織または細胞における遺伝的発現を研究することに興味を持つ研究者にとって強力なツールを提供する。ｍＲＮＡ分子が単離され得、さらに種々の分子生物学的技術によって操作され、それによって、細胞、組織または生物の全機能の遺伝的内容の解明が可能になる。
【０００７】
遺伝子発現の研究に対する通常のアプローチは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの産生である。この技術において、生物由来のｍＲＮＡ分子は、生物の細胞または組織の抽出物から単離される。この単離は、しばしば、チミジン（Ｔ）のオリゴマーが複合体化されたクロマトグラフィーマトリックス（例えば、セルロースまたはアガロース）を使用する。大部分の真核生物ｍＲＮＡ分子の３’末端が、アデノシン（Ａ）塩基のストリングを含み、ＡがＴに結合するので、ｍＲＮＡ分子は、組織または細胞抽出物において他の分子および基質から迅速に精製され得る。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡコピーが、逆転写酵素（ＲＴ）またはＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して作製され得、これは、一本鎖ｃＤＮＡ分子の産生を生じる。次いで、一本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、元のｍＲＮＡ（従って、生物のゲノムに含まれる、このｍＲＮＡをコードする元の二本鎖ＤＮＡ配列）の完全な二本鎖ＤＮＡコピー（すなわち、二本鎖ｃＤＮＡ）に変換され得る。次いでタンパク質特異的二本鎖ｃＤＮＡがベクターに挿入され得、次いでこれは、宿主細菌、酵母、動物細胞または植物細胞に導入され、このプロセスは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる。次いで、宿主細胞は、培養培地において増殖され、目的の遺伝子または目的の遺伝子の部分を含む（あるいは多くの場合、これらを発現する）宿主細胞の集団を生じる。
【０００８】
この全体のプロセス（ｍＲＮＡの単離からｃＤＮＡのベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドなど）への挿入、単離された遺伝子または遺伝子の部分を含む宿主細胞集団の増殖）は、「ｃＤＮＡクローニング」と呼ばれる。ｃＤＮＡが多くの異なるｍＲＮＡから調製される場合、生じるｃＤＮＡのセットは、「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれ、ｃＤＮＡのセットが、供給源の細胞、組織、または生物に存在する機能的な遺伝的情報を含む遺伝子または遺伝子の部分の「集団」を表すので、適切な用語である。
【０００９】
ｃＤＮＡ分子の合成は、ｍＲＮＡ分子の３’末端においてまたはその近くで開始し、成長する鎖にヌクレオチドを連続的に付加して５’→３’方向に進行する。オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してポリＡテールの３’末端でｃＤＮＡ合成をプライミングすることによって、このｍＲＮＡの３’メッセージが、産生されるｃＤＮＡ分子において表されることが確実になる。ｃＤＮＡ合成の間の感度および特異性を増加する能力は、さらに代表的なｃＤＮＡライブラリーを提供し、全長ｃＤＮＡ分子（例えば、全長遺伝子）を有するｃＤＮＡライブラリーの可能性を増加し得る。このような進歩は、目的の全長遺伝子を見つけ出す確率を非常に改善する。
【００１０】
研究目的のためのそれらの重要性に加えて、逆転写酵素は、多数の重要な病原性ウイルス（特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））の生活環において重要な役割を果たす。その生活環を完成させるために、ＨＩＶおよび他の類似したウイルスは、宿主の遺伝物質への組み込みのために、ウイルスＲＮＡゲノムをＤＮＡに変換する逆転写酵素を使用しなければならない。この工程は、ウイルス生活環にとって重要であり、そして宿主細胞は、類似した逆転写酵素活性に対する必要性を全く有していないことから、逆転写酵素は、化学療法の標的として集中的に研究されている。概して、逆転写酵素を標的とする大部分の治療試薬は、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＡＺＴ）である。オリゴヌクレオチドベースの試薬（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム）を使用する他の治療様式は、ウイルスの複製を阻害するために使用されるが、これらの試薬は、ウイルスゲノムの核酸に対して標的化する代わりに、逆転写酵素に対して特異的に標的化されない。例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５５０７−５５１１（１９８８）：非特許文献１，Ｍａｔｓｕｋａｒａら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ａｎａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｖ（ａｒｔ／ｔｒｓ）ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２４４−４２４８（１９８９）：非特許文献２，Ｒｏｓｓｉら、「Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ−１  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ８：１８３：１８９（１９９２）：非特許文献３，Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）ａｎｄ  ｂｙ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：４６０７−４６１２（１９９２）：非特許文献４ ａｎｄ  Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎら、「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｇａｇ，ｐｏｌ  ａｎｄ  ｒｅｖ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１」Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：５３−６２（１９９２）：非特許文献５を参照のこと。それらは、本明細書中に参考として明確に援用される。逆転写酵素によってオリゴヌクレオチドの伸長が妨げられ、３’末端でブロックされるオリゴヌクレオチドもまた、インヒビター（例えば、���ｕｓｔｅｒｍａｎｎら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｒｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｂｙ  ３’−ｂｌｏｃｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４３（１２）：２５８１−２５８９（１９９２）：非特許文献６を参照のこと）として考えられる。上述のそれぞれの参考文献は、その全体が、本明細書中に明確に援用される。
【００１１】
オリゴヌクレオチドは、抗ＨＩＶ活性のために調査されてきた。例えば、Ｉｄｒｉｓｓら、（１９９４），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ８（２）９７−１１２：非特許文献７は、ＨＩＶ  ＲＴ活性のインヒビターとしてのヘアピン構造のＤＮＡオリゴヌクレオチドを開示し、これに対し、Ｋｕｗａｓａｋｉら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２２８：６２３−６３１：非特許文献８は、抗ＨＩＶ活性を有するデオキシ−ヌクレオチドおよび２’−メトキシ−ヌクレオチドの混合物を含むアンチセンスヘアピンオリゴヌクレオチドを開示する。
【００１２】
ポリメラーゼ活性を調節するためのこれらの努力および他の努力に逆らうことなく、当該分野に、ポリメラーゼの望ましくない活性を妨げるための物質および方法の必要性が残るが、そのような合成が望ましい場合、ポリメラーゼによる核酸の合成が可能である。これら必要性および他の必要性は、本発明によって満たされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５５０７−５５１１（１９８８）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｋａｒａら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ａｎａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｖ（ａｒｔ／ｔｒｓ）ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２４４−４２４８（１９８９）
【非特許文献３】Ｒｏｓｓｉら、「Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ−１  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ８：１８３：１８９（１９９２）
【非特許文献４】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）ａｎｄ  ｂｙ  ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：４６０７−４６１２（１９９２）
【非特許文献５】Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎら、「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｇａｇ，ｐｏｌ  ａｎｄ  ｒｅｖ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１」Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：５３−６２（１９９２）
【非特許文献６】Ａｕｓｔｅｒｍａｎｎら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｒｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｂｙ  ３’−ｂｌｏｃｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４３（１２）：２５８１−２５８９（１９９２）
【非特許文献７】Ｉｄｒｉｓｓら、（１９９４），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ８（２）９７−１１２
【非特許文献８】Ｋｕｗａｓａｋｉら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２２８：６２３−６３１
【発明の概要】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、特定の条件下で（好ましくは、周囲温度でおよび／または細胞中で）核酸合成を阻害するか、減少するか、実質的に減少するかまたは排除するための材料および方法を提供し、そのような合成が望ましい場合、合成が可能である。
【００１５】
好ましい局面において、本発明は、反応の準備（ｓｅｔ  ｕｐ）中（例えば、インビトロ）の、そして好ましくは、核酸合成の最適反応条件が達成される前の、核酸合成の防止および阻害するのための方法に関する。準最適条件または反応準備期間でのそのような合成の阻害は、非特異的核酸合成を防止または減少させる。一旦、反応準備が完成し、そして最適条件に達すれば、核酸合成は開始され得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、細胞に、本発明のオリゴヌクレオチドまたはインヒビター（好ましくは、５’部分および３’部分を含むそのオリゴヌクレオチド）を導入することによって、細胞内（例えば、インビボ）のポリメラーゼ酵素を阻害する方法に関し、ここで、その３’部分は、１つ以上のデオキシヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして５’部分は１つ以上のリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、ここで、その３’部分のすべてまたは一部は、その５’部分の全部または一部に塩基対形成し得、ポリメラーゼの阻害を生じる条件下で、前記細胞をインキュベートし得る。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの５’部分は、５’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を形成する。別の局面では、そのオリゴヌクレオチドは、ヘアピンの形態で存在し、そして好ましくは、そのヘアピンの基部は、一連の連続するリボヌクレオチド塩基対を含むか、または一連の連続するデオキシリボヌクレオチドとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、逆転写酵素であって、そして好ましくは、ＨＩＶ逆転写酵素であり得る。
【００１７】
別の局面では、本発明は、ウイルス（このウイルスは、逆転写酵素を含み、そして複製のための逆転写酵素の活性を必要とする）を提供することによって、そして前記逆転写酵素を、逆転写酵素活性を阻害する本発明のオリゴヌクレオチドまたはインヒビターと接触させることによって、ウイルスの複製を阻害する方法を提供し、従って、そのウイルスの複製を阻害する。いくつかの実施形態では、そのオリゴヌクレオチドは、５’部分および３’部分を含み、ここで、その３’部分は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、前記５’部分は、１つ以上のリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、ここで、その３’部分の全部または一部は、その５’部分の全部または一部に塩基対形成し得る。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの５’部分は、５’オーバーハングを形成する。別の局面では、そのオリゴヌクレオチドは、ヘアピンの形態で存在し、そして好ましくは、一連の連続するリボヌクレオチド塩基対を含むヘアピンの基部であるか、または一連の連続したデオキシリボヌクレオチドとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、そのウイルスは、ＨＩＶである。いくつかの実施形態では、接触させることは、細胞にそのオリゴヌクレオチドを導入することを含む。
【００１８】
さらに具体的には、本発明は、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）に結合または相互作用する、抑制的な核酸またはオリゴヌクレオチドを導入することによって、核酸合成を制御することに関する。従って、そのような抑制的核酸またはオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼに結合し得、そしてポリメラーゼまたは逆転写酵素と、プライマー／テンプレートとの結合または相互作用を妨げることによって、核酸合成に干渉し得る。その分子が目的の重合化酵素と結合または相互作用し得る限り、任意の形態の核酸分子が使用され得るが、好ましくは、そのような抑制的な核酸分子は、二本鎖分子である。そのような分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖分子であり得る。誘導性核酸分子はまた、例えば、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、連結核酸（ＬＮＡ、Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｂｏｕｌｄｅｒ  Ｃｏ．より入手可能）および改変ヌクレオチドを含む核酸分子として使用され得る。さらに、その核酸分子は、任意の形態または位相（例えば、直線構造、環状構造、高次コイル構造、１つ以上の一本鎖部分を有する二本鎖構造、ヘアピン構造）、または他の分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質など）との複合型で存在し得る。そのような抑制的核酸は、好ましくは、二本鎖核酸分子（それは、１つ以上の内部部分、５’および３’の一本鎖部分を含み得る）、または二本鎖形態に折り畳まれ得る（すなわち、１つ以上のヘアピンループを形成する）一本鎖核酸分子を含み、結果として、核酸分子の二本鎖部分の少なくとも１つは、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドに結合し得る。１つの局面では、本発明で使用されるその核酸分子は、高い親和性で、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素など）と結合する。一旦、そのポリメラーゼまたは逆転写酵素が、抑制的な核酸と複合体化すると、プライマー／テンプレート基質にアニーリングするためには利用できず、実質的に減少したポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を生じるか、または全く活性を生じない。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’および３’部分を含み得、ここで、その３’部分は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、その５’部分は、１つ以上のリボヌクレオチドまたはその誘導体を含み、そして、ここで、その３’部分の全てまたは一部は、その５’部分の全てまたは一部に塩基対形成し得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’部分を含み得、ここで、リボヌクレオチドを含む５’部分は、５’オーバーハング部分を形成し得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、伸長可能とならないように、１つ以上の改変を含み得る。いくつかの実施形態では、この改変は、大部分の３’のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、この改変は、３’ヒドロキシルの大部分の３’ヌクレオチドのリン酸化である。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、１つ以上のヌクレアーゼによる消化または分解に耐性となるために、１つ以上の改変を含み得る。いくつ���の実施形態では、この改変は、１つ以上のホスホロチオエートの部分の取り込みであり得る。いくつかの実施形態では、この改変は、１つ以上のヒドロキシル基のアルキル化を含み得る。
【００１９】
従って、阻害核酸は、反応混合物（ここで、阻害核酸は、ポリメラーゼに競合的に結合または相互作用する）中に好ましくは導入され、それにより、特定の反応条件下で、ポリメラーゼによる合成を阻害する。従って、インヒビターおよびポリメラーゼの相互作用または結合は、好ましくは、インヒビター／ポリメラーゼ複合体の形成を生じる。
【００２０】
本発明の核酸によるポリメラーゼ活性または核酸合成の阻害は、好ましくは低減されるか、実質的に低減されるか、阻害されるか、または排除され、その結果、核酸合成は、反応条件が変化する場合、例えば、温度が上昇される場合、進行し得る。好ましい局面において、変化した条件は、ポリメラーゼと相互作用してポリメラーゼの放出および／または阻害核酸の変性または不活性化を引き起こす、阻害核酸の能力に影響し、このポリメラーゼを利用可能にして、核酸合成を進行させることを可能にする。１つの局面において、阻害核酸およびプライマー／テンプレート基質は、ポリメラーゼと競合的に相互作用して、合成を阻害する。変化した条件下で、競合的な相互作用は低減され、その結果、核酸合成が生じる。別の局面において、変化した条件は、２本鎖阻害核酸分子（ヘアピンを含む）を生じ、変性または融解して、その結果ポリメラーゼと実質的に結合または相互作用しない１本鎖分子を形成する。別の局面において、条件（すなわち、温度が、例えば周囲温度に対して低下する）における第２の変化は、本発明の阻害核酸分子が、核酸合成を再活性化または再び阻害することを可能にする。つまり、インヒビターは、変化した条件下でポリメラーゼまたは逆転写酵素と再び相互作用または結合し得る。例えば、変化した条件は、インヒビターがポリメラーゼまたは逆転写酵素と、結合または相互作用する能力を効率的に増強する２本鎖分子を形成することを可能にし得る。従って、本発明通りに、インヒビターは、さらなるインヒビターを添加する必要なく、複数の調節または反応条件における変化（すなわち、温度変化）を必要とし得る合成反応（単一または複数）の間に、再利用または再利用可能であり得る。
【００２１】
従って、本発明は、１つ以上の核酸分子を合成するための方法に関し、これは（ａ）１つ以上の核酸テンプレート（これは、ｃＤＮＡ分子のようなＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子であり得る）を、１つ以上のプライマー、および１つ以上の阻害核酸またはポリメラーゼ活性を有する酵素と結合または相互作用することが可能な本発明の組成物と混合すること、ならびに（ｂ）全てまたは一部のテンプレートに相補的な１つ以上の第１の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在中で、その混合物をインキュベートすること、を包含する。あるいは、この方法は、一つ以上の阻害核酸を、１つ以上のポリメラーゼと混合すること、および１つ以上の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、このような混合物をインキュベートすることを包含し得る。このような条件は、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の核酸合成緩衝液の使用を含み得る。本発明のこのような方法は、必要に応じて、１つ以上のさらなる工程（例えば、第１の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、合成された第１の核酸分子をインキュベートする工程）を包含し得る。これらのさらなる工程はまた、本発明の阻害核酸分子の使用を含み得る。本発明はまた、これらの方法により合成される核酸分子に関する。
【００２２】
関連する局面において、核酸合成方法は、（ａ）１つ以上のポリメラーゼを、１つ以上の本発明の阻害核酸分子と混合すること、および（ｂ）このようなポリメラーゼのポリメラーゼ活性を、不活性化または実質的に阻害もしくは低減するのに十分な条件下で、このような混合物をインキュベートすること、を包含し得る。別の局面において、このようなインキュベーションは、このような核酸合成を阻害するかまたは妨げるのに十分な条件下にある。
【００２３】
本発明はまた、１つ以上の核酸分子を増幅するための方法に関し、この方法は、（ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、１つ以上のプライマー、およびポリメラーゼ活性を有する酵素と結合または相互作用可能な本発明の、１つ以上の阻害核酸分子または組成物と混合すること、ならびに（ｂ）テンプレートの全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在中で、その混合物をインキュベートすること、を包含する。さらに詳細には、本発明は、ＤＮＡ分子を増幅する方法に関し、この方法は、以下：（ａ）第１および第２のプライマー（ここで上記第１のプライマーは、上記ＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端内か、またはその３’末端においてか、またはその３’末端付近の配列に相補的であり、そして上記第２のプライマーは、上記ＤＮＡ分子の第２鎖の３’末端内か、またはその３’末端においてか、またはその３’末端付近の配列に相補的である）、ならびに本発明の１つ以上の阻害核酸または組成物（例えば、ポリメラーゼ活性を有する酵素に対して親和性を有する核酸）を提供すること；（ｂ）上記第１のプライマーを上記第１鎖に対して、および上記第２のプライマーを上記第２鎖に対してハイブリダイズすること；（ｃ）上記第１鎖の全てまたはその一部分に相補的な第３のＤＮＡ分子および上記第２鎖の全てまたはその一部分に相補的な第４のＤＮＡ分子が合成されるような条件下で、混合物をインキュベートすること；（ｄ）上記第１鎖および第３鎖、ならびに上記第２鎖および第４鎖を変性すること；ならびに（ｅ）工程（ａ）〜（ｃ）または（ｄ）を、１回以上繰り返すことを包含する。このような条件は、１つ以上のポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチドおよび／または１つ以上の緩衝塩の存在下でのインキュベーションを含み得る。本発明はまた、これらの方法により増幅される核酸分子に関する。
【００２４】
関連する局面において、核酸増幅方法は、（ａ）１つ以上のポリメラーゼを、本発明の一つ以上の阻害核酸分子と混合すること、および（ｂ）このようなポリメラーゼのポリメラーゼ活性を不活性化または実質的に阻害もしくは低減するのに十分な条件下で、このような混合物をインキュベートすること、を包含し得る。別の局面において、このようなインキュベーションは、このような核酸の増幅を阻害または妨げるのに十分な条件下である。
【００２５】
本発明はまた、以下を含む、核酸分子を配列決定する方法に関する：（ａ）配列決定される核酸分子を、１つ以上のプライマー、本発明の１つ以上の阻害核酸または組成物、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の終結薬剤を混合し、混合物を形成すること；（ｂ）配列決定される分子の全てまたは一部分に相補的な分子の集団を合成するのに十分な条件下で、この混合物をインキュベートすること；ならびに（ｃ）配列決定される分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定するためにその集団を分離すること。本発明は、より詳細には、以下を含む、核酸分子を配列決定する方法に関する：（ａ）本発明の阻害核酸または組成物（これに対して、ポリメラーゼ活性を有する酵素は親和性）、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の終結薬剤を提供すること；（ｂ）プライマーを、第１の核酸分子に対してハイブリダイズすること；（ｃ）上記第１の核酸分子に相補的な核酸分子のランダムな集団を合成するのに十分な条件下で、工程（ｂ）の混合物をインキュベートし、ここで上記合成された分子は、上記第１の分子より長さが短く、そして上記合成された分子は、それらの３’末端において終結ヌクレオチドを含む、こと；および（ｄ）大きさによって上記合成された分子を分離し、その結果上記第１の核酸分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部分が決定され得る、こと。このような終結ヌクレオチドとしては、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄｄＮＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰまたはｄｄＣＴＰ）が挙げられる。このような条件としては、１つ以上のポリメラーゼおよび／または緩衝塩の存在下でのインキュべーションが挙げられ得る。
【００２６】
関連する局面において、核酸配列決定方法は、（ａ）本発明の１つ以上の阻害核酸分子と、１つ以上のポリメラーゼを混合すること、および（ｂ）このようなポリメラーゼのポリメラーゼ活性を不活性化または実質的に阻害するのに十分な条件下で、このような混合物をインキュベートすること、を包含し得る。別の局面において、このようなインキュベーションは、このような核酸配列決定を阻害または妨げるのに十分な条件下である。
【００２７】
本発明はまた、本発明の阻害核酸および本発明の阻害核酸を含む組成物、これらの核酸分子を含むベクター（これは発現ベクターであり得る）、およびこれらの核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の組成物はまた、本発明の方法を行うために作製されるか、またはこのような方法を行う間に産生される組成物を含み得る。本発明はまた、薬学的組成物に関する。このような組成物は、本発明の１つ以上の阻害核酸分子またはオリゴヌクレオチドならびに１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ（例えば、高温性もしくは中温性のＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）、１つ以上の適切な緩衝液または緩衝塩、１つ以上のプライマー、１つ以上の終結薬剤、１つ以上のウイルス、１つ以上の細胞、および本発明の方法により産生される１つ以上の増幅または合成された核酸分子からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分を含み得る。本発明はまた、宿主細胞による核酸の産生を支持する条件下で、上記の宿主細胞を培養すること、およびその核酸を単離することを含む、阻害核酸を産生する方法に関する。本発明はまた、合成方法により産生される核酸に関する。本発明のこのような阻害核酸分子はまた、標準的な化学合成技術により作製され得る。
【００２８】
関連する局面において、本発明は、ポリメラーゼ活性のインビボでの阻害についての材料および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、生物への本発明の阻害オリゴヌクレオチドの導入、それによって生物内に存在するポリメラーゼを阻害することを提供する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、逆転写酵素、好ましくはウイルス性逆転写酵素であり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、逆転写酵素を阻害するオリゴヌクレオチドを引き起こす条件下で、ウイルス性逆転写酵素を発現する細胞またはウイルスをこの阻害オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、ウイルス逆転写酵素の阻害についての方法を提供する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、周知技術により、細胞によってオリゴヌクレオチドを取り込ませるのに十分な条件下で、細胞と接触される。いくつかの実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを細胞により取り込ませ、かつ逆転写酵素を阻害させる条件下で、ウイルスのライフサイクルを完了するために逆転写酵素活性を必要とするそのウイルスで感染された細胞を、阻害オリゴヌクレオチドと接触させ、それによってウイルスの増殖を阻害することを包含する、ウイルスの増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを細胞により取り込ませ、かつ逆転写酵素を阻害させる条件下で、生物または被験体の感染された細胞を、阻害オリゴヌクレオチドを含む組成物と接触させること、それによって生物体を処置することを包含する、ウイルスのライフサイクルを完了するために逆転写酵素活性を必要とするそのウイルスで感染された生物または被験体を処置する方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、核酸分子の合成、配列決定および増幅における使用のためキットに関し、これは、本発明の１つ以上の阻害核酸または組成物を含む一つ以上の容器を備える。本発明のこれらのキットは、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ（例えば、高温性もしくは中温性のＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）、１つ以上の適切な緩衝液、１つ以上のプライマーおよび１つ以上のターミネーター薬剤（例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド）からなる群より選択される１つ以上のさらなる成分を必要に応じて含み得る。本発明はまた、本発明の阻害核酸を含むウイルス複製を阻害するキットまたはウイルス感染を処置するためのキットに関する。このようなキットはまた、本発明の方法を行うための指示書またはプロトコルを備え得る。
【００３０】
本発明の他の好ましい実施形態は、本発明の以下の図面および説明、ならびに請求の範囲を考慮して、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼの活性は、定性的に決定された。パネルＡ：インヒビターＡの非存在下における決定、パネルＢ：インヒビターの存在下における決定。左から右へ、各パネルの５つのレーンは、反応がクエンチされる前に経過する、１５秒、３０秒、１分、２分および５分の時点である。ＰおよびＣは、それぞれ、プライマーの位置、およびコントロールレーンを示す。インヒビターＡは、その末端に、ジデオキシヌクレオチドを含まなかった。
【図２】２．７Ｋｂ標的ＤＮＡ配列（ｐＵＣ１９）の増幅は、テンプレートの５つの異なる希釈において実施された。標的は、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼにより増幅された。Ｔｎｅポリメラーゼ（８５ｎＭ（例えば、１ユニット）および４２．５ｎＭ（例えば、０．５ユニット））の２つの異なる濃度ならびにそれぞれインヒビターＢ複合体（ポリメラーゼ濃度に対して１５０倍の過剰なヘアピンＢを使用する）が、各増幅条件について使用された。レーン１、２、３、４および５における標的ＤＮＡの濃度は、それぞれ、１００ｐｇ、２０ｐｇ、２ｐｇ、０．２ｐｇおよび０．０２ｐｇである。インヒビターＢは、その末端に、ジデオキシヌクレオチドを含まなかった。
【図３】１Ｋｂ、３Ｋｂおよび５Ｋｂ標的ＤＮＡ配列（ヒトゲノム供給源）は、それぞれ、パネルＡ、ＢおよびＣにおいて表されるように、Ｔｎｅ（８５ｎＭ（例えば、１ユニット）およびＴａｑ（例えば、１ユニット））ＤＮＡポリメラーゼにより増幅された。ａ、ｂ、ｃおよびｄとして表される各パネルの４つのレーンは、それぞれ、Ｔｎｅ（＋１２５倍過剰なインヒビターＡ）、Ｔｎｅ（＋５０倍過剰なインヒビターＡ）、Ｔｎｅ（インヒビターなし）およびＴａｑ（インヒビターなし）である。インヒビターＡは、３’末端ジデオキシヌクレオチド（すなわち、ｄｄＴ）を含んだ。
【図４】５Ｋｂおよび１５Ｋｂ標的ＤＮＡ配列の増幅（ヒトゲノム供給源）が、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（８．５ｎＭ（例えば、０．１ユニット））を用いて実施された。５つのパネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、反応条件（それぞれ、Ｔｎｅ（インヒビターなし）、Ｔｎｅ（＋５０倍過剰なインヒビター）、Ｔｎｅ（＋１５０倍過剰なインヒビター）、Ｔｎｅ（＋３００倍過剰なインヒビター）、Ｔｎｅ（＋７５０倍過剰なインヒビター））を表す。各パネルについての２つのレーン（ａおよびｂ）は、５Ｋｂおよび１５Ｋｂの標的サイズの増幅を表す。このアッセイについて、末端ジデオキシヌクレオチドを含まないインヒビターＢが、使用された。
【図５】３Ｋｂ標的ＤＮＡ配列の増幅（ヒトゲノム供給源）が、１ユニットＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施された。３つのパネルＡ、ＢおよびＣは、反応条件（ＡおよびＢについては、同じプライマー配列が使用された）を表す。Ｉ）ＰＣＲミックスは、９４℃にて１分間インキュベートされ、そして氷上に設定され、ミスプライミングを強制した。全てのＰＣＲ反応が、３０分間２５℃にて設定され、その結果非特異的ＤＮＡ合成を増大した。各条件は、４つのレーン（レーンａ（Ｔａｑコントロール）、レーンｂ（Ｔａｑ＋１６ｎＭインヒビター）、レーンｃ（Ｔａｑ＋３２ｎＭインヒビター）およびレーンｄ（Ｔａｑ＋６４ｎＭインヒビター））を有する。末端ジデオキシヌクレオチドを含まないインヒビターＢが使用された。
【図６Ａ】図６Ａは、周囲温度（左のバー）、３７℃（中央のバー）および５５℃（右のバー）において、核酸インヒビターの非存在および存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉのポリメラーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。ＴＳは、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、ＴＳ−Ｄは、核酸インヒビターＤの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、ＴＳ−Ｅは、核酸インヒビターＥの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTMにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、そしてＴＳ−Ｈは、核酸インヒビターＨの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、周囲温度（左のバー）、３７℃（中央のバー）および５５℃（右のバー）において、核酸インヒビターの非存在および存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉのポリメラーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。ＴＳは、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、ＴＳ−Ｃは、核酸インヒビターＣの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、ＴＳ−Ｈは、核酸インヒビターＨの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、ＴＳ−Ｅは、核酸インヒビターＥの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、ＴＳ−Ｆは、核酸インヒビターＦの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示し、そしてＴＳ−Ｇは、核酸インヒビターＧの存在下で、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔTM  Ｉにより開始されるポリメラーゼ反応を示す。
【図７】図７は、ＮＦ２遺伝子の１．６ｋｂ（Ａ）、２ｋｂ（Ｂ）および２．６ｋｂ（Ｃ）フラグメントを用いた増幅反応の結果を示すアガロースゲルの写真である。各パネルにおいて、レーンａは、Ｔａｑポリメラーゼ単独を使用した増幅であり、レーンｂは、インヒビターＨＰＨＨ４Ｓｓｐａ３の存在下で、１．２：１のモル比のインヒビター：ポリメラーゼにおける増幅反応であり、そしてレーンｃは、白金Ｔａｑを使用した増幅である。
【図８】図８は、示された温度におけるｄＮＴＰ取り込みアッセイの結果を示す棒グラフである。各温度において、濃い黒の長方形は、Ｔａｑポリメラーゼ単独を用いて得られる結果を表し、ストライプの長方形は、インヒビターＨＰＨＨ４Ｓｓｐａ３を用いて、モル比２：１のインヒビター：ポリメラーゼで得られた結果を表し、白の長方形は、同じインヒビーを用いて、モル比７．５：１のインヒビター：ポリメラーゼにおいて得られる結果を表す。
【図９】図９は、示されたモル比で存在するインヒビターＨＰＨＨ４Ｓｓｐａ３によるＴａｑポリメラーゼの用量依存阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の説明において、組換えＤＮＡ技術に使用される多くの用語が、広範に使用される。明細書および特許請求の範囲（このような用語を与えられる範囲を含む）に関して、より明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００３３】
（プライマー）本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、ＤＮＡ分子の増幅または重合の間にヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される、一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。
【００３４】
（テンプレート）用語「テンプレート」は、本明細書中で使用される場合、増幅、合成または配列決定される、二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう。二本鎖分子の場合、第１の鎖および第２の鎖を形成するための鎖の変性は、好ましくは、これらの分子が増幅、合成、または配列決定され得る前に実施されるか、あるいは、二本鎖分子は、テンプレートとして直接使用され得る。一本鎖テンプレートに関して、テンプレートの一部に相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いで１つ以上のポリメラーゼが、このテンプレートの全体または一部に相補的な核酸分子を合成し得る。あるいは、二本鎖テンプレートに関して、１つ以上のプロモーター（例えば、ＳＰ６、Ｔ７またはＴ３プロモーター）は、１つ以上のポリメラーゼと組合せて使用され、テンプレートの全体または一部に相補的な核酸分子を作製し得る。本発明に従って新規に合成された分子は、本来のテンプレートに等しい長さかまたはそれよりも短い長さであり得る。
【００３５】
（組込み）用語「組込み」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ分子またはプライマーの部分になることを意味する。
【００３６】
（増幅）本明細書中で使用される場合、「増幅」は、ポリメラーゼの使用によって、ヌクレオチド配列のコピー数を増加するための任意のインビトロの方法をいう。核酸増幅は、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの組込みを生じ、それによってテンプレートに相補的な新規分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書中で使用される場合、１つの増幅反応は、多く回の複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１回のＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の変性および合成の５〜１００「サイクル」からなり得る。
【００３７】
（ヌクレオチド）本明細書中で使用される場合「ヌクレオチド」は、塩基−糖−リン酸塩の組み合わせをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマーユニットである。ヌクレオチドはまた、このようなヌクレオチドの一リン酸塩、二リン酸塩、および三リン酸塩の形態を含み得る。用語ヌクレオチドとしては、リボヌクレオシド三リン酸ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体）が挙げられる。このような誘導体としては、例えば［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ（ｄｅａｚａ）−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、ならびにヌクレオチド誘導体（これは、これを含む核酸分子にヌクレアーゼ耐性を与える）が挙げられる。用語ヌクレオチドはまた、本明細書中で使用される場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体をいう。ジデオキシヌクレオシド三リン酸塩の例示された例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、非標識であり得るか、または周知技術によって検出可能に標識され得る。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。
【００３８】
（ブロッキング剤）「ブロッキング剤」は、ヌクレオチド（またはその誘導体）、改変されたオリゴヌクレオチドおよび／またはヌクレアーゼ活性によるこのような核酸分子の分解または消化を防止または阻害するために本発明の核酸インヒビターに取り込まれる１つ以上の他の改変物をいう。１つまたは複数のブロッキング剤は、核酸インヒビターの３’末端またはその付近、および／あるいは５’末端またはその付近で、本発明の核酸インヒビター内部に取り込まれ得る。好ましくは、このようなブロッキング剤は、直線インヒビター核酸分子については、このような分子の３’末端またはその付近、および／あるいは５’末端またはその付近、および／あるいは５’から３’へのエキソヌクレアーゼの好ましい切断位置に位置される（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．，Ｂｒｏｗ，Ｍ．Ａ．Ｄ．，およびＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，７７８−７８３）。好ましくは、このようなブロッキング剤は、使用されるポリメラーゼまたは逆転写酵素に関連するか、あるいはこの合成反応中に存在し得るエキソヌクレアーゼ活性によって、インヒビター核酸分子の分解または消化を防止もしくは阻害する。例えば、本発明のブロッキング剤は、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）に関連する３’エキソヌクレアーゼ活性および／または５’エキソヌクレアーゼ活性によって、インヒビター核酸分子の分解（ｄｅｇｒｅｄａｔｉｏｎ）または消化を防止する。本発明に従う好ましいブロッキング剤としては、ジデオキシヌクレオチドおよびその誘導体（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰ）が挙げられる。本発明に従う使用のための他のブロッキング剤としては、ＡＺＴ、ホスファミド骨格（例えば、ＰＮＡ）、３’−ｄＮＴＰ（例えば、コンジセピン（Ｃｏｎｄｙｃｅｐｉｎ））またはブロッキング基を（好ましくは３’位に）含む任意のヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。このようなブロッキング剤は、好ましくは、本発明の抑制性核酸の変化または消化から、エキソヌクレアーゼ活性（例えば、３’−エキソヌクレアーゼ活性）を阻害または防止するように作用する。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの５’末端は、これを５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性にするために改変され得る。このような改変の１つは、さらなるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの５’末端に５’−５’連結で付加することであり得る（Ｋｏｚａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：３７５７を参照のこと）。これは、オリゴヌクレオチドの５’末端で生じ、これは３’を有する５’末端を生じる。別の局面において、このようなブロッキング剤は、好ましくは、本発明の抑制性核酸への改変または変化（例えば，ヌクレオチドの取り込み）により、ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害または防止する。
【００３９】
（オリゴヌクレオチド）本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、１つのヌクレオチドのペントースの３’位と隣接ヌクレオチドのペントースの５’位との間のリン酸ジエステル結合によって結合され得る、共有結合したヌクレオチド配列を含む、合成的にまたは生物学的に生成した分子をいう。本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、天然の核酸分子（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびに非天然分子または誘導体分子（例えば、ペプチド核酸、ホスホチオエートを含む核酸、ホスホネートを含む核酸など）を含むことが理解される。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変されたかまたは天然に存在しない糖残基（すなわち、アラビノース（ａｒａｂａｉｎｏｓｅ））、および／あるいは改変された塩基性残基を含み得る。オリゴヌクレオチドは、誘導体分子（例えば、種々の天然ヌクレオチド、誘導体ヌクレオチド、改変されたヌクレオチドまたはこれらの組合わせを含む核酸分）を含むことが理解される。従って、本発明の方法において有用な任意のオリゴヌクレオチドまたは他の分子は、この定義によって意図される。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、この分子の、特定のタンパク質、酵素または基質との相互作用を防ぐブロッキング基を含み得る。
【００４０】
（ヘアピン）本明細書中で使用される場合、用語「ヘアピン」は、オリゴヌクレオチドの１つ以上の部分が、オリゴヌクレオチドの１つ以上の他の部分と塩基対を形成するオリゴヌクレオチドの構造を示すために使用される。２つの部分が塩基対形成してオリゴヌクレオチドの二本鎖部分を形成する場合、この二本鎖部分はステムといわれ得る。従って、使用した相補的な部分の数に依存して、多数のステム（好ましくは、１〜１０）が形成され得る。さらに、１つ以上のステムの形成は、好ましくは、ヘアピン分子中に１つ以上のループ構造の形成を可能とする。別の局面において、１つ以上のループ構造のいずれかが、ループの内の１つ以上の部位で切断またはニック形成され得るが、好ましくは、少なくとも１つのループはこのように切断またはニック形成されない。オリゴヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド（これが塩基対形成して、約３ヌクレオチド〜約１００以上のヌクレオチド、約３ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約３ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、および約３〜約１０ヌクレオチドのステムを形成する）の数を変化するように選択され得る。さらに、このオリゴヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド（これは、０ヌクレオチド〜約１００以上のヌクレオチド、０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、または０〜約１０ヌクレオチドの塩基対を形成しない）の数を変化するように変化され得る。塩基対形成するオリゴヌクレオチドの２つの部分は、オリゴヌクレオチドの配列中のどこにでも位置し得るか、またはかなり多数の位置であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つの塩基対形成部分は、オリゴヌクレオチドの３’末端を含み得る。いくつかの実施形態において、１つの塩基対形成部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端を含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つの塩基対形成部分は、３’末端を含み得るが、他方、他の塩基対形成部分は５’末端を含み得、そして、塩基対が形成される場合、このオリゴヌクレオチドのステムは平滑末端である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドの塩基対形成部分の位置は、３’オーバーハング、５’オーバーハングを形成するように選択され得、および／または３’の大部分のヌクレオチドも５’の大部分のヌクレオチドも塩基対形成に関係しないように選択され得る。
【００４１】
（ハイブリダイゼーション）用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」は、二本鎖分子を得るための２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはＰＮＡ）の塩基対形成をいう。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子はハイブリダイズされ得るが、塩基対形成は、完全に相補的ではない。従って、ミスマッチの塩基は、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。ただし、当該分野で周知の適切な条件が使用される。好ましい局面において、二本鎖抑制性分子は、ハイブリダイズする相補的な一本鎖分子が分離することを可能にするような特定の条件下で変性される。形成した一本鎖分子は、ポリメラーゼと相互作用するか、またはこれと結合しないか、あるいは対応する二本鎖分子と比較して減少した効率でポリメラーゼと相互作用するか、またはこれと結合する。
【００４２】
（ユニット）用語「ユニット」は、本明細書中で使用される場合、酵素の活性をいう。例えば、ＤＮＡポリメラーゼをいう場合、１ユニットの活性は、標準的にプライムされたＤＮＡ合成条件下で３０分間、酸不溶性物質（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に、１０ナノモルのｄＮＴＰを取り込む酵素の量である。
【００４３】
（ウイルス）本明細書中で使用される場合、そのライフサイクルを完了するために逆転写酵素活性を必要とするウイルスとしては、以下を含むレトロウイルス科ファミリーの任意のメンバーが挙げられるが、これらに限定されないことが理解される：ヒト免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病（ｌｅｕｕｋｅｍｉａ）ウイルス、ヒトＴリンパ増殖性ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ肉腫および白血病ウイルス、ヒツジのマエディ／ビスナウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、サル免疫不全ウイルスおよび当業者に公知の他のレトロウイルス。
【００４４】
（ベクター）用語「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、プラスミド、ファージミド、コスミドまたはファージの核酸あるいは宿主細胞中で自律的に複製可能であり得る他の核酸分子である。好ましくは、ベクターは、１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられ、この認識部位で、このような核酸配列が、ベクターの本質的な生物学的機能の損失なしに決定可能な様式で切断され得る。そしてその複製およびクローニングをもたらすために、このベクター内に核酸分子がスプライシングされ得る。クローニングベクターは、このクローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用に適切な１つ以上のマーカーをさらに含み得る。例えば、マーカーは、抗生物質耐性変化遺伝子であり、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
（発現ベクター）用語「発現ベクター」は、本明細書中で使用する場合、クローニングベクターに類似のベクターであるが、宿主への形質転換後、ベクターにクローン化された遺伝子の発現を増強し得るベクターをいう。このクローン化された遺伝子は、特定の制御配列（例えば、プロモーター配列）の制御下に、通常、配置される（すなわち作動可能に連結される）。
【００４６】
（組換え宿主）用語「組換え宿主」は、本明細書中で使用する場合、発現ベクター、クローニングベクターまたは任意の他の核酸分子に所望のクローン化された遺伝子を含む、任意の原核微生物または真核生物微生物をいう。用語「組換え宿主」はまた、宿主の染色体または宿主のゲノムに所望の遺伝子を含むように遺伝的に操作された、これらの宿主細胞を含むことを意味する。
【００４７】
（宿主）用語「宿主」は、本明細書中で使用される場合、複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは本発明の抑制性核酸分子を含む任意の核酸分子のレシピエントである、任意の原核微生物または真核生物微生物をいう。この核酸分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点を含み得るが、これらに限定されない。
【００４８】
（プロモーター）用語「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子の５’領域として一般的に記載され、開始コドンの近傍に位置するＤＮＡ配列をいう。プロモーター領域で、隣接遺伝子の転写が開始される。
【００４９】
（遺伝子）用語「遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配列をいう。このＤＮＡ配列は、プロモーターおよび構造遺伝子、ならびにタンパク質の発現に関連する他の配列を含む。
【００５０】
（構造遺伝子）用語「構造遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列をいい、次いでこのメッセンジャーＲＮＡは、特定のポリペプチドの特徴的なアミノ酸配列に翻訳される。
【００５１】
（作動可能に連結される）用語「作動可能に連結される」は、本明細書中で使用される場合、プロモーターが、構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現の開始を制御するために配置されることを意味する。
【００５２】
（発現）用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子がポリペプチドを産生するプロセスをいう。発現は、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。
【００５３】
（実質的に純粋）本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋」は、所望の精製分子（例えば、タンパク質または核酸分子（本発明の抑制性核酸分子を含む））が、代表的に所望の分子に結合する混入物を本質的に含まないことを意味する。混入成分としては、本発明の抑制性または合成反応に干渉し得、および／または本発明の抑制性核酸分子（例えば、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ）を分解または消化するか、あるいは本発明の方法によって産生した合成核酸分子または増幅核酸分子を分解または消化する化合物または分子が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００５４】
（耐熱性）本明細書中で使用される場合、「耐熱性」は、熱による不活化に対してより耐性であるＤＮＡポリメラーゼをいう。ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’方向でプライマーを伸長することによって一本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分子の形成を、合成する。中温性ＤＮＡポリメラーゼについてのこの活性は、熱処理によって不活化され得る。例えば、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ活性は、９０℃の温度に３０秒間、酵素を曝露することによって完全に不活化される。本明細書中で使用される場合、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、中温性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱不活化に対してより耐性である。しかし、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、熱不活化に完全に耐性である酵素をいうことは意味せず、従って、熱処理は、ある程度までＤＮＡポリメラーゼ活性を減少し得る。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはまた、代表的に、中温性ポリメラーゼより高い最適温度を有する。
【００５５】
（３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性）「３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性」は、当該分野で周知の酵素学的活性である。この活性は、しばしばＤＮＡポリメラーゼと関連し、そして、ＤＮＡ複製の「編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）」または補正メカニズムと関連すると考えられる。
【００５６】
「ＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少した」は、本明細書中で以下のいずれかとして定義される：（１）対応する非変異、野生型酵素の約１０％または１０％未満の、好ましくは約１％または１％未満の３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する変異ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは（２）約１ユニット／ｍｇのタンパク質未満、または好ましくは約０．１ユニット／ｍｇタンパク質または０．１ユニット／ｍｇタンパク質未満の３’から５’へのエキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポリメラーゼ。３’から５’へのエキソヌクレアーゼの活性のユニットは、６０分間３７℃で１０ナノモルの基質末端を可溶化する活性の量として定義される（「ＢＲＬ  １９８９  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＆Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅ」第５頁に記載されるように、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によって、［3Ｈ］ｄＴＴＰで標識されたλＤＮＡ  ３’末端のＨｈａＩフラグメントを用いてアッセイされた）。タンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９７６）の方法によって測定される。比較手段として、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２によってコードされる天然の野生型Ｔ５−ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）またはＴ５−ＤＮＡＰは、約１０ユニット／ｍｇタンパク質の比活性を有するが、ｐＴＴＰＱ１９−Ｔ５−２（Ｅｘｏ−）（米国特許第５，２７０，１７９号）によってコードされるＤＮＡポリメラーゼは、約０．０００１ユニット／ｍｇタンパク質の比活性を有するか、または非改変酵素の比活性の０．００１％を有する（１０5倍の減少）。本発明に従って使用されるポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し得るか、または実質的に減少され得る。
【００５７】
（５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性）
「５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性」はまた、当該分野で周知の酵素活性である。この活性は、しばしば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｏｌＩおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）に関連する。
【００５８】
「５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性において実質的に減少されたポリメラーゼ」は、（１）対応する変異されてない野生型酵素のうちの約１０％以下、または好ましくは約１％以下の５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異または改変されたポリメラーゼ、あるいは（２）約１ユニット／ｍｇタンパク質未満、または好ましくは約０．１ユニット／ｍｇタンパク質以下の５’〜３’エキソヌクレアーゼ特異的活性を有するポリメラーゼのいずれかとして本明細書中で定義される。
【００５９】
３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性および５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性の両方は、配列決定ゲル上で観察され得る。活性な５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性は、モノヌクレオチドを取り除くことによって配列決定ゲルにおいて異なるサイズの産物を産生し、かつ増殖プライマー（ｇｒｏｗｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’末端からより長い産物を産生する。３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性は、配列決定ゲルにおいて放射標識されたプライマーの分解の後に測定され得る。したがって、これらの活性の相対量（例えば、野生型ポリメラーゼと変異体または改変されたポリメラーゼとを比較することによる）は、慣用的にすぎない実験を用いて測定され得る。
【００６０】
（阻害性核酸）
本発明の核酸は、一本鎖核酸および二本鎖核酸（三本鎖分子（例えば、３重らせん）のような他の複数鎖の分子が使用され得るが）を含み、これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、または他の誘導核酸分子あるいはそれらの組み合わせから構成される核酸が挙げられる。阻害性核酸は、第１セットの条件（好ましくは、周囲温度）にて１つの部位を形成し得る配列を含み、その部位は、ポリメラーゼ活性を有する酵素を結合するための、合成または増幅において使用されるテンプレート／プライマー基質と競合し、かつ核酸合成または増幅のための第２セットの条件（好ましくは、上昇された温度）下であまり効率的でなく競合する。好ましくは、阻害性核酸の配列は、合成、増幅または配列決定反応において使用される、阻害されるプライマーに相補的ではない。認識されるように、他の核酸（天然の核酸、非天然の核酸、修飾された核酸など）は、本発明に従って選択されかつ使用され得る。このような選択は、結合研究および／または核酸合成阻害アッセイによって達成され得る。ヘアピン形成のための核酸配列の設計は、当業者により達成され得る（例えば、Ａｎｔａｏ，Ｖ．Ｐ．およびＴｉｎｏｃｏ，Ｉ．Ｊｒ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：８１９−８２４を参照のこと）。好ましくは、核酸インヒビターは、ヌクレアーゼ耐性（３’〜５’エキソヌクレアーゼおよび５’〜３’エキソヌクレアーゼ）および／または重合化に対して不活性にされ得る。核酸をエキソヌクレアーゼおよび重合化に対して不活性にするための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、誘導ヌクレオチドを含み得る誘導核酸分子を用いること（例えば、ホスフェートよりむしろホスファミドおよび／またはホスホロチオエートバックボーンを用いること）、ならびに／または１以上のブロック因子の、本発明の阻害性核酸分子への添加をを含む。阻害性核酸は、好ましくは、二本鎖ステム（ｓｔｅｍ）と１以上のヘアピンループ構造を形成する。二本鎖ステムは、設計された、平滑末端および／または一本鎖突出を（例えば、５’末端および／または３’末端において）有し、その結果、ポリメラーゼの代表的なプライマー／テンプレート基質を模倣し得る。
【００６１】
本発明の阻害性核酸は、好ましくは、ポリメラーゼまたは転写酵素の存在下でこのような合成、配列決定または増幅を防止または阻害するのに十分な合成、配列決定または増幅反応における最終濃度で本発明の組成物および方法において使用される。本発明の阻害性核酸の、ポリメラーゼまたは逆転写酵素に対する比は、使用されるポリメラーゼまたは逆転写酵素に依存して変化し得る。合成、配列決定または増幅反応のための阻害性核酸の、ポリメラーゼ／逆転写酵素に対するモル比は、約０．００１〜１００：１；０．０１〜１０００：１；０．１〜１０，０００：１；１〜１００，０００：１；１〜５００，０００：１；または１〜１，０００，０００：１の範囲であり得る。当然のことながら、このような阻害性核酸の本発明において使用するために適切なポリメラーゼ／逆転写酵素に対する他の適切な比は、当業者に明らかであるかまたは慣用的にすぎない実験を用いて測定される。
【００６２】
本発明の阻害性核酸分子は、標準化学的オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、当該分野で公知のホルホルアミダイトおよび他のもの、米国特許第５，５２９，７５６号を参照のこと）によって合成され得る。あるいは、組み換えＤＮＡ技術を使用して、目的の阻害性核酸分子を、ベクターにクローニングすること、このベクターを宿主細胞に導入すること、宿主細胞を増殖すること、そしてこの宿主細胞から目的の阻害性核酸分子を単離することによって産生し得る。本発明の阻害性核酸分子はまた、カスタムオリゴヌクレオチドの市販の供給元（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手され得るか、または例えば、核酸合成または増幅反応においてポリメラーゼを使用することによって酵素学的に作成され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、治療目的のために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、複製するために逆転写酵素活性を必要とするウイルスに感染した被験体（例えば、ヒトまたは動物）を処置し得る。治療的処置のために、オリゴヌクレチドは、薬学的に受容可能な組成物として投与され得、ここで、本発明の１以上のオリゴヌクレオチドは、１以上のキャリア、シックナー、賦形薬、緩衝液、防腐剤、表面活性剤、賦形剤などと混合され得る。薬学的組成物はまた、オリゴヌクレオチドに加えて、１以上のさらなる活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬など）を含み得る。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物を投与するために一般的に使用される任意の経路によって投与され得る。例えば、投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内が挙げあられる）、経口的に、吸入によってか、または、非経口的に、例えば、静脈内滴注または皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射によって行われる。
【００６５】
局所投与のために処方される薬学的組成物は、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および散剤が挙げられ得る。任意の従来の薬学的賦形剤（例えば、キャリア、水性ベース、粉末ベースまたは油性ベース、シックナーなど）が、使用され得る。
【００６６】
経口投与のために処方される薬学的組成物は、１以上の散剤、顆粒、水もしくは非水性培質における懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェット（ｓａｃｈｅｔ）あるいは錠剤の形態であり得る。経口投与のために処方される薬学的組成物は、シックナー、香味料、賦形薬、乳化剤、分散剤、結合剤などをさらに含み得る。
【００６７】
非経口投与のために処方される薬学的組成物としては、緩衝液、賦形薬および他の適切な添加物をも含み得る滅菌水溶液が挙げられ得る。
【００６８】
本発明の薬学的組成物は、治療的有効用量で投与され得る。治療的有効用量は、宿主内のウイルスの複製を阻害する用量である。ウイルスの複製は、処置が治療的に有効であるために、完全に排除される必要はない。ウイルスの複製の速度の減少は、治療的に有効であり得る。本発明の薬学的組成物の１以上の用量は、数日から数ヶ月の期間に、１日あたり単回投与であり得るかまたは複数回投与であり得る処置の期間、あるいは治療の効果があるかまたは疾患状態の縮小が達成されるまで、１日に１回以上投与され得る。当業者は、最適投薬量、投薬経路、および用量が投与されるべき頻度を容易に決定し得る。
【００６９】
（ポリメラーゼ）
本発明の阻害性核酸が結合または相互作用し得る、ポリメラーゼ活性を有する酵素としては、核酸合成、増幅または配列決定反応において使用される任意の酵素が挙げられる。このようなポリメラーゼとしては、ポリメラーゼ（ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ）、および逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴTMＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＫＯＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥTM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  ＩＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および一般に、ｐｏｌ  Ｉ型のＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体）はまた、本発明に従って使用され得る。
【００７０】
本発明において使用された核酸ポリメラーゼは、中温性または高温性であり得、そして好ましくは、中温性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＰｏｌＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼ（およびこれらのそれぞれのクレノウフラグメント）、このファミリーのいずれかは、生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｒ．Ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌ５、ｐｈｉ−Ｃ３１、Ｔ７、Ｔ３、Ｔ５、ＳＰ０１、ＳＰ０２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＩＰ−１由来のミトコンドリア、ならびに真核生物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ａｓｔａｔｋｅ，Ｍ．ら、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８、１４７−１６５）、ならびに任意の供給源から単離されたｐｏｌ  ＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、およびその変異体、誘導体または改変体などが挙げられる。本発明の方法および組成物において使用され得る好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶＥＮＴTMＤＮＡポリメラーゼおよびＤＥＥＰＶＥＮＴTMＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその変異体、改変体および誘導体が挙げられる（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，０７９，３５２号号；米国特許第５，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＷＯ  ９２／０６１８８；ＷＯ  ９２／０６２００；  ＷＯ  ９６／１０６４０；ＷＯ  ９７／０９４５１；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））が挙げられる。
【００７１】
本発明において使用する逆転写酵素は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素を含む。このような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９６／１０６４０およびＷＯ  ９７／０９４５１）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）ならびにそれらの変異体、改変体または誘導体（例えば、ＷＯ  ９７／０９４５１およびＷＯ  ９８／４７９１２を参照のこと）が挙げられるが、それらに限定されない。本発明において使用される好ましい酵素としては、減少したＲＮａｓｅ  Ｈ活性、または実質的に減少したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有するか、あるいはＲＮａｓｅ  Ｈ活性が排除された酵素が挙げられる。「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の実質的に減少した」酵素によって、対応する野生型またはＲＮａｓｅ  Ｈ+酵素（例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素）のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、１０％未満または５％未満、そして最も好ましくは、約２％未満の活性を有する酵素を意味する。任意の酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、種々のアッセイ（例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）において記載されるアッセイ（この参考文献の全ての開示は、本明細書中で参考として完全に援用される））によって決定され得る。本発明における使用のための特に好ましいポリペプチドとしては、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽球症関連ウイルス）Ｈ-逆転写酵素およびＨＩＶ  Ｈ-逆転写酵素（米国特許第５，２４４，７９７号およびＷＯ  ９８／４７９１２を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を産生し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素が、本発明の組成物、方法およびキットにおいて同等に使用され得ることは当業者に理解される。
【００７２】
本発明における使用のためのポリメラーゼ活性を有する酵素は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から、市販により入手可能であり得る。本発明における使用のための、逆転写酵素活性を有する酵素は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から市販により入手可能であり得る。あるいは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素は、当業者に周知の、天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従って、その天然のウイルスまたは細菌の供給源から、単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、このようなポリメラーゼ／逆転写酵素は、当業者が熟知している組換えＤＮＡ技術によって、調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；米国特許第５，２２４，７９７号；ＷＯ  ９８／４７９１２；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．、およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有する酵素の例としては、本願に記載される任意のものが挙げられ得る。
【００７３】
（核酸合成、増幅および配列決定の方法）
本発明の阻害性核酸および組成物は、核酸の合成のための方法において使用され得る。特に、本発明の阻害性核酸および組成物が、非特異的な核酸合成（特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応において）を減少することが発見された。従って、本発明の阻害性核酸および組成物は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）分子およびＲＮＡ分子）の合成を必要とする任意の方法において使用され得る。本発明の阻害性核酸または組成物が、有利に使用され得る、方法としては、「ホットスタート」合成または増幅（ここで、この反応は、この阻害性核酸がＤＮＡ合成または増幅を競合的に阻害し得る温度でセットアップされ、増幅反応の合成を、温度を上昇することによって開始し、このポリメラーゼのインヒビターによる競合的阻害を減少し、従って、核酸合成または増幅が起こることを可能にする）を含む、核酸合成方法、核酸増幅方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明のこの局面に従う核酸合成方法は、１つ以上の工程を包含し得る。例えば、本発明は、（ａ）核酸テンプレートを、１つ以上のプライマーおよび本発明の１以上の阻害性核酸（同じであっても異なってもよい）ならびにポリメラーゼ活性または逆転写活性を有する１つ以上の酵素と混合し、混合物を形成する工程；（ｂ）核酸合成を阻害または予防するのに十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程；および（ｃ）このテンプレートの全てまたは一部に相補的である第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、この混合物をインキュベートする工程を包含する、核酸分子を合成するための方法を提供する。本発明のこの局面に従って、この核酸テンプレートは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリー）、またはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）あるいは分子の集団であり得る。ｐＨ、温度、イオン強度、およびインキュベーション時間のような合成を可能にするのに十分な条件は、当業者に公知の慣用的方法に従って最適化され得る。
【００７５】
本発明によれば、投入またはテンプレートの核酸分子またはライブラリーは、天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官または生物）から得られる核酸分子の集団から調製され得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原核生物の細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの属の種のものを含む、細菌細胞）であっても真核生物の細胞（真菌（特に、酵母）、植物、原生動物および他の寄生生物、ならびに昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．細胞）、線虫（特に、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ細胞）、および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む動物を含む）であってもよい。
【００７６】
一旦、出発の細胞、組織、器官または他のサンプルが得られると、当該分野において周知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ  １５：６８７−７０１（１９７８）；Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．、およびＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．、およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）を参照のこと）により、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはポリＡ＋  ＲＮＡ）の分子）が単離され得るか、またはｃＤＮＡ分子もしくはライブラリーがそれから調製される。
【００７７】
本発明の好ましい局面の実施において、上記のように得られる核酸テンプレート（これは好ましくは、ＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子もしくはポリＡ＋  ＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子である）を、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の上記の酵素と混合して、そこに本発明の阻害性の核酸または組成物を添加して混合物を形成することによって、第１の核酸分子が合成され得る。核酸テンプレートの全てまたは一部と相補的である、第一の核酸分子の合成は、好ましくは、反応の温度を上昇させ、そして本発明の阻害性核酸の競合阻害を減少し、これによって投入核酸分子またはテンプレート核酸分子の逆転写（ＲＮＡテンプレートの場合）および／またはポリマー化を助けることによって達成される。このような合成は好ましくは、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、またはこれらの誘導体）の存在下で達成される。
【００７８】
もちろん、本発明の阻害性の核酸、組成物および方法が有利に使用され得る、核酸合成の他の技術が、当業者に容易に明らかである。
【００７９】
本発明の他の局面において、本発明の阻害性の核酸および組成物が、核酸分子を増幅または配列決定するための方法において、使用され得る。本発明のこの局面による、核酸増幅方法は、１工程逆転写酵素増幅反応（例えば、１工程ＲＴ−ＰＣＲ）または２工程逆転写酵素増幅反応（例えば、２工程ＲＴ−ＰＣＲ）として当該分野において一般的に公知の方法において、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドの使用をさらに包含し得る。長い核酸分子（例えば、約３〜５Ｋｂ長より長い）の増幅のためには、ＷＯ９８／０６７３６およびＷＯ９５／１６０２８に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼの組合せが使用され得る。
【００８０】
本発明のこの局面による増幅方法は、１以上の工程を包含し得る。例えば、本発明は、以下の工程を包含する、核酸分子を増幅するための方法を提供する：（ａ）ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素を本発明の阻害性の核酸または組成物および１つ以上の核酸テンプレートと混合する工程；（ｂ）この混合物を、核酸増幅を阻害または妨害するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする工程；および（ｃ）ポリメラーゼ活性を有する酵素が、このテンプレートの全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅することを可能にするのに十分な条件下でこの混合物をインキュベートする工程。本発明はまた、このような方法により増幅された核酸分子を提供する。
【００８１】
核酸分子またはフラグメントを増幅および分析するための一般的方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，８００，１５９号；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）を参照のこと）。例えば、本発明に従って使用され得る増幅方法としては、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号；ＥＰ  ０  ６８４  ３１５）、ならびに核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ  ０  ３２９  ８２２）が挙げられる。
【００８２】
代表的に、これらの増幅方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素を本発明の１つ以上の阻害性核酸と混合し、複合体（タンパク質−核酸）を形成する工程；（ｂ）核酸サンプルを１つ以上のプライマー配列の存在下で（ａ）の複合体と混合する工程；および（ｃ）好ましくはＰＣＲまたは等価な自動化増幅技術によって、この核酸サンプルを増幅して、増幅された核酸フラグメントのコレクションを生成する工程。
【００８３】
本発明の方法による増幅または合成に続いて、増幅または合成された核酸フラグメントを、さらなる使用または特徴付けのために、単離し得る。この工程は、通常、任意の物理的または生化学的手段（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（サイジングクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および免疫クロマトグラフィーを含む）、密度勾配遠心分離および免疫吸着が挙げられる）によって、増幅または合成された核酸フラグメントを大きさで分離することにより、達成される。ゲル電気泳動による核酸フラグメントの分離が、特に好ましい。なぜなら、これは、多数の核酸フラグメントの高感度な分離の、迅速かつ再現性の高い手段を提供し、そして核酸のいくつかのサンプルにおけるフラグメントの、直接的な同時の比較を可能にするからである。別の好ましい実施形態において、このアプローチを拡張して、これらのフラグメントまたは本発明の方法により増幅もしくは合成された任意の核酸フラグメントを、単離および特徴付けし得る。従って、本発明はまた、本発明の増幅または合成の方法により産生される、単離された核酸分子に関する。
【００８４】
この実施形態において、１つ以上の増幅または合成された核酸フラグメントが、標準的な技術（例えば、電気溶出または物理的切除）に従って、同定のために使用されたゲル（上記を参照のこと）から除去される。次いで、この単離された独自の核酸フラグメントを、種々の原核生物（細菌）細胞または真核生物（酵母、植物またはヒトおよび他の哺乳動物を含む動物）細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適した標準的なベクター（発現ベクターを含む）に、挿入し得る。あるいは、本発明の方法により産生された核酸分子を、例えば、配列決定（例えば、核酸フラグメントのヌクレオチド配列の決定）、以下に記載の方法および当該分野において標準的な他の方法（例えば、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号を参照のこと、これらは、ＤＮＡ配列決定の方法に関する）によって、さらに特徴付け得る。
【００８５】
本発明による、核酸配列決定の方法は、１以上の工程を包含し得る。例えば、本発明は、以下の工程を包含する核酸分子の配列決定のための方法を提供する：（ａ）ポリメラーゼ活性を有する酵素を、本発明の１つ以上の阻害性核酸、配列決定される核酸分子、１つ以上のプライマー、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の終止因子（例えば、ジデオキシヌクレオチド）と混合して、混合物を形成する工程；（ｂ）この混合物を、核酸の配列決定または合成を阻害もしくは妨害するのに十分な条件下でインキュベートする工程；（ｃ）この混合物を、配列決定される分子の全てまたは一部に相補的である分子の集団を合成するために十分な条件下で、インキュベートする工程；ならびに（ｄ）この集団を分離して、配列決定される分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する工程。
【００８６】
本発明の阻害性の分子または組成物を使用し得る、核酸配列決定技術としては、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号に開示されるもののような、ジデオキシ配列決定方法が挙げられる。
【００８７】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の阻害性核酸分子を含む、ベクターに関する。さらに、本発明は、本発明の阻害性核酸を含む宿主細胞、および好ましくは、このような核酸を含む組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこれらのベクターおよび宿主細胞を使用する、本発明の核酸の産生のための方法に関する。本発明の方法によって産生される核酸合成産物および核酸増幅産物はまた、本発明に従ってベクターおよび宿主細胞にクローン化され、このような核酸分子またはこのような核酸分子によってコードされるタンパク質の産生を容易にし得る。
【００８８】
このベクターは好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養のためのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
適切な宿主細胞の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞として好ましいものは、Ｅ．ｃｏｌｉであり、そして特に好ましいものは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ株およびＳｔｂｌ２株であり、これらは市販されている（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）。
【００９０】
（核酸産生）
上記のように、本発明の方法は、上記の核酸分子もしくはベクターの宿主細胞への挿入および宿主細胞からの核酸分子の単離またはこの核酸分子を発現している宿主細胞からのタンパク質の単離を介する任意の核酸またはこのような核酸分子によってコードされる任意のタンパク質の産生に適する。形質転換された宿主細胞を産生するための、核酸分子またはベクターの、宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法により達成され得る。このような方法は、多くの標準的な実験室手引書（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載されている。好ましくは、化学的にコンピテントな細胞または電気コンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な細胞が、このような形質転換反応のために用いられる。一旦、形質転換された宿主細胞が得られると、この細胞は、任意の生理学的に適合性の条件のｐＨおよび温度のもとで、宿主細胞の増殖を支持する炭素、窒素、および必須無機物の同化可能な供給源を含む任意の適切な栄養培地中で、培養され得る。例えば、特定の発現ベクターは、特定の温度での細胞増殖、または細胞増殖のための特定の化学物質もしくは誘導薬剤の添加を必要とする調節領域を含む。上記宿主細胞およびベクターのための適切な培養培地および条件は、当該分野において周知である。宿主細胞中での産生に続いて、目的の核酸またはタンパク質は、いくつかの技術により単離され得る。目的の核酸またはタンパク質を宿主細胞から遊離させるために、好ましくは、細胞が溶解または破壊される。この溶解は、細胞を低張性溶液に接触させること、リボザイムのような細胞壁破壊酵素で処理すること、超音波処理、高圧での処理、または上記方法の組合せにより、達成され得る。当業者に公知の、細菌細胞の破壊および溶解の他の方法もまた、使用され得る。
【００９１】
破壊に続いて、核酸またはタンパク質は、複雑な混合物中の粒子を分離するために適した任意の技術により、細胞の破片から分離され得る。次いで、この核酸またはタンパク質は、周知の単離技術によって、精製され得る。精製のための適切な技術としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、電気泳動、免疫吸着、ＣｓＣｌ遠心分離、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高性能ＬＣ（ＨＰＬＣ）、高速ＬＣ（ＦＰＬＣ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
（キット）
本発明はまた、核酸分子を合成、増幅、または配列決定する際に使用するための、キットを提供する。本発明のこの局面によるキットは、１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）を含み得、これは、１つ以上の本発明の阻害性の核酸および／または組成物を収容し得る。
【００９３】
本発明のキットは、以下の成分のうちの１つ以上を含み得る：（ｉ）１つ以上の本発明の核酸または組成物、（ｉｉ）１つ以上のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素、（ｉｉｉ）１つ以上の適切な緩衝液または緩衝塩、（ｉｖ）１つ以上のヌクレオチド；および（ｖ）１つ以上のプライマー。
【００９４】
本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適合が明らかであり、そして本発明の範囲またはそのあらゆる実施形態から逸脱することなくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。ここで、本発明を詳細に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに明白に理解される。この実施例は、例示のみの目的で本明細書中に組み込まれ、そして本発明を限定することは、意図されない。
【実施例】
【００９５】
（実施例１  核酸インヒビター）
核酸インヒビターを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成し、そしてＨＰＬＣまたはＰＡＧＥ精製した。
核酸インヒビター  Ａ（３４マー）
【００９６】
【化１】
2011041572.tif 000002
核酸インヒビター  Ｂ（５５マー）
【００９７】
【化２】
2011041572.tif 000003
周囲温度において、上記の配列は、ヘアピン様構造（ＡｎｔａｏおよびＴｉｎｏｃｏ，１９９２（前出））を形成する（以下の構造を参照のこと）。
【００９８】
いくつかの実施形態において、インヒビターＡの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント変異体（Ｆ７６２Ｙ）を使用してジデオキシチミン三リン酸で３’末端においてキャップ形成し得る（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９２，６３３９−６３４３）。このオリゴヌクレオチドの３’−ＯＨ末端を、３７℃で３０分間５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５緩衝液中２ｍＭ  Ｍｇ2+の存在下で２０μＭ  ｄｄＴＴＰにおいてポリメラーゼによってｄｄＴＴＰを用いて伸長した。伸長の後、このサンプルを、３分間１００℃の水浴中に置き、タンパク質を変性した。加熱後、オリゴヌクレオチドサンプルを、周囲温度まで緩やかに冷却し（２〜３時間）、ヘアピン構造の形成を可能にした。
ヘアピン構造としての核酸インヒビターＡ：
【００９９】
【化３】
2011041572.tif 000004
ヘアピン構造としての核酸インヒビターＢ
【０１００】
【化４】
2011041572.tif 000005
いくつかの実施形態において、核酸インヒビターＢを、上記のようにｄｄＧＴＰによって３’末端においてキャップ形成し得る。
【０１０１】
本発明を、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて試験した−デオキシヌクレオチドの成長している鎖への組み込みにおいて低温度で有意に効果的である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（３７℃でのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりも約５０倍を超える効果）。使用したＴｎｅは、Ｄ１３７Ａ変異体の効力によって実質的に減少した５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を与えることを除いて野生型であった（ＷＯ  ９８／０９４５１を参照のこと）。
【０１０２】
（実施例２）
（インヒビターでのポリメラーゼの阻害）
Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ活性の時間経過を、３つの異なる温度で、３４／６０マーのプライマー／テンプレート基質を用いて定性的に決定した。図１は、これらの実験からの結果を示す。各温度について、ポリメラーゼ活性を、インヒビターＡの不在（パネルＡ）および存在（パネルＢ）下で測定した。反応混合物のアリコートを種々の時点で採取し、そしてアガロースゲル上で分離した。各パネルの５つのレーンは、左から右に、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、および５分間（反応がクエンチする前に経過した時間）。ＰおよびＣは、それぞれ、プライマー位置およびコントロールレーンを示す。
【０１０３】
図１において見られ得るように、Ｔｎｅによって触媒されるポリメラーゼ反応の阻害効力は、温度が上昇するにつれて、有意に減少する。
【０１０４】
（実施例３）
（プラスミドＤＮＡ供給源からの標的ＤＮＡ配列の増幅）
ｐＵＣ１９プラスミド由来の２．７Ｋｂの標的ＤＮＡ配列を、テンプレートの５つの異なる希釈物を用いて増幅した。標的を、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼによって増幅した。２つの異なる濃度のＴｎｅポリメラーゼ（８５ｎＭ（例えば、１ユニット）および４２．５ｎＭ（すなわち、０．５ユニット））およびインヒビター核酸に複合体化されたＴｎｅ（ポリメラーゼに対して１５０倍過剰のインヒビターＢを使用）を、各増幅条件で使用した。この結果を図２に示す。レーン１、２、３、４および５の標的ＤＮＡの濃度は、それぞれ、１００ｐｇ、２０ｐｇ、２ｐｇ、０．２ｐｇ、および０．０２ｐｇを示す。
【０１０５】
結果は、Ｔｎｅの感度がインヒビターの添加によって大いに改善され、そして標的分子の相対的純度が非常に増強されたことを示す。
【０１０６】
（実施例４）
（ゲノムＤＮＡ供給源からの標的ＤＮＡ配列の増幅）
１Ｋｂ、３Ｋｂ、および５Ｋｂの標的ＤＮＡ配列を、それぞれ、図３のパネルＡ、Ｂ、およびＣにおいて示されるように、Ｔｎｅ（８５ｎＭ（例えば、１ユニット））およびＴａｑ（１ユニット）ＤＮＡポリメラーゼによって増幅した。ａ、ｂ、ｃおよびｄとして示される、各パネルの４つのレーンは、それぞれ、Ｔｎｅ（＋１２５倍過剰のインヒビターＡ（ｄｄＴキャップ形成化））、Ｔｎｅ（＋５０倍過剰のインヒビターＡ（ｄｄＴキャップ形成化））、Ｔｎｅ（インヒビターなし）、およびＴａｑ（インヒビターなし）である。
【０１０７】
結果は、Ｔｎｅの感度がインヒビターの添加によって大いに改善され、そして各標的条件について、標的分子の相対的純度が非常に改善されたことを示す。
【０１０８】
（実施例５）
（Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼによる、５および１５Ｋｂの標的ＤＮＡ配列の増幅）
図４の５つのパネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、以下の反応条件を示す：それぞれ、コントロールＴｎｅ（インヒビターなし）、Ｔｎｅ（＋５０倍過剰のインヒビターＢ）、Ｔｎｅ（＋１５０倍過剰のインヒビターＢ）、Ｔｎｅ（＋３００倍過剰のインヒビターＢ）、Ｔｎｅ（＋７５０倍過剰のインヒビターＢ）。ＡおよびＢとして示された、各パネルの２つのレーンは、５および１５Ｋｂの標的サイズの増幅に関する。各反応におけるＴｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は、８．５ｎＭ（例えば、０．１ユニット）であった。
【０１０９】
図４において見られ得るように、Ｔｎｅの感度は、このインヒビターの添加によって大いに改善され、そしてインヒビターの濃度が最適化されるにつれて、標的分子の相対的純度は非常に改善された。パネルＤおよびＥにおいて示されるように、１５Ｋｂの産物は、インヒビター核酸の存在下におけるＴａｑ  ＰＣＲ条件（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）下のＴｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼによってのみ増幅され得る。
【０１１０】
（実施例６）
（１ユニットのＴａｑによる、３Ｋｂの標的ＤＮＡ配列（ヒトゲノム供給源）の増幅）
（ＤＮＡポリメラーゼ）
図５の３つのパネルＡ、Ｂ、およびＣは、反応条件を示す。ＡおよびＢについては、同じプライマー配列を使用した。Ａでは、ＰＣＲ混合物を、９４℃で１分間インキュベートし、そしてミスプライミング（ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）させるために、氷上に置いた。すべてのＰＣＲ反応を、非特異的ＤＮＡ合成を増加させるために、２５℃で３０分間に設定した。各条件：レーンＡ（Ｔａｑコントロール）、Ｂ（Ｔａｑ＋１２６ｎＭインヒビター）、Ｃ（Ｔａｑ＋３２ｎＭインヒビター）、およびＤ（Ｔａｑ＋６４ｎＭインヒビター）。
【０１１１】
結果は、非特異的ＤＮＡ合成の有意な減少および標的配列産物量の増強を生じる各々の場合において、Ｔａｑの特異性が、インヒビターの添加によって大いに改善されたことを示す。
【０１１２】
（実施例７）
（本発明のオリゴヌクレオチドを用いた、ＲＴの阻害）
ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ  ＲＮａｓｅ欠損変異体逆転写酵素（ＲＴ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）のＤＮＡポリメラーゼ活性を、周囲温度、３７℃および５５℃にて、オリゴヌクレオチドインヒビター分子の存在下および不在下で決定した。オリゴヌクレオチドインヒビターの配列および二次元構造を以下に示す。ＲＴのポリメラーゼ活性を、プライマー／テンプレート基質としてオリゴ（ｄＧ）15／ポリｒＣ（ｏｌｉｇ（ｄＧ）15／ｐｏｌｙｒＣ）を使用して、定常状態の動力学的条件下で決定した。このアッセイは、Ｐｏｌｅｓｋｙら（１９９０）によって記載されており、そしてわずかな改変を伴って使用した。
【０１１３】
（オリゴヌクレオチドインヒビター）
本発明者らのアッセイにおいて使用されたすべての核酸インヒビターは、ＨＰＬＣ精製され、そして３’末端に、ホスフェート（ＰＯ4-）で合成的にキャップ形成された。核酸インヒビターの長さに影響を与えずに、二本鎖の融解温度を低下させるために、分子の二本鎖部分にミスマッチを導入した。核酸インヒビターＨは、本発明者らの実験条件下で二本鎖構造を形成しないコントロールオリゴ核酸であり、そしてＲＮＡ配列による阻害レベルを決定するために使用される。
【０１１４】
（核酸インヒビターＣ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって合成））
１７／２７マーのＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖核酸インヒビター。
【０１１５】
【化５】
2011041572.tif 000006
（核酸インヒビターＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成））
５０マーのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸。ＲＮＡ塩基に下線を付す。
【０１１６】
【化６】
2011041572.tif 000007
（核酸インヒビターＤのヘアピン構造）
【０１１７】
【化７】
2011041572.tif 000008
（核酸インヒビターＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成））
５０マーのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸。ＲＮＡ塩基は一重下線であり、そして２つのミスマッチ位置は、対応するヘアピン構造のＤＮＡ部分に二重下線を付す。
【０１１８】
【化８】
2011041572.tif 000009
（核酸インヒビターＥのヘアピン構造）
【０１１９】
【化９】
2011041572.tif 000010
（核酸インヒビターＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成））
５０マーのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸。ＲＮＡ塩基に一重下線を付し、そして３つのミスマッチ位置は、対応するヘアピン構造のＤＮＡ部分に二重下線を付す。
【０１２０】
【化１０】
2011041572.tif 000011
（核酸インヒビターＦのヘアピン構造）
【０１２１】
【化１１】
2011041572.tif 000012
（核酸インヒビターＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成））
５０マーのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸。ＲＮＡ塩基に一重下線を付し、そして４つのミスマッチ位置は、対応するヘアピン構造のＤＮＡ部分に二重下線を付す。
【０１２２】
【化１２】
2011041572.tif 000013
（核酸インヒビターＧのヘアピン構造）
【０１２３】
【化１３】
2011041572.tif 000014
（核酸インヒビターＨ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成））
５０マーのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド核酸。ＲＮＡ塩基に一重下線を付す。
【０１２４】
【化１４】
2011041572.tif 000015
周囲温度（約２２℃）、３７℃、および５５℃での、核酸インヒビターの存在下および不在下におけるＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩの相対的ポリメラーゼ活性を決定した。ｄＧＴＰ（ｄＧＴ32Ｐでスパイク化（ｓｐｉｋｅ））およびＭｇＣｌ2の存在下におけるプライマー／テンプレートの溶液に、ＲＴまたはＲＴ／インヒビター（５μＬ）を添加することによって、重合化反応を開始した（最終反応容量５０μＬ）。この混合物を、反応温度でインキュベートし、そしてサンプル（５μＬ）を、１分（２２℃）および１５秒（３７℃および５５℃）の間隔で取り出し、そして５０μＬの２５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に添加した。クエンチした溶液の一部分を、ＤＥ−８１フィルターに適用した。取り込まれていないｄＧＴＰを取り除くための洗浄の後、ＥｃｏｎｏＦｌｕｏｒ−２（Ｐａｃｋａｒｄ）を含むシンチレーションバイアル中で、このフィルターをカウントした。反応の見かけ上の速度を、速度プロット（時間間隔に対してプロットされたｃｏｍ）から導き出した。オリゴ（ｄＧ）15／ポリｒＣの反応濃度は、プライマーで８００ｎＭであり、ｄＧＴＰは１００μＭであり、そしてＭｇＣｌ2およびＫＣｌは、それぞれ、１０ｍＭおよび５０ｍＭであった。各反応条件について、逆転写酵素の濃度を１２ｎＭに維持した。一方、各オリゴヌクレオチドインヒビターの濃度は、５４０ｎＭであった。
【０１２５】
インヒビターの存在下および不在下において、周囲温度、３７℃、および５５℃で、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMにより触媒される重合化反応の相対的活性を、図６Ａおよび６Ｂに示す。オリゴヌクレオチドインヒビター（遊離ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ）の不在下の活性を、各温度での測定値に対して、１に正規化した。インヒビターの存在下でのＲＴ活性は、各温度で、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMの活性と相関した。そして相対的な正規化活性を棒グラフとして表し、これを図６Ａおよび６Ｂに示す。各反応条件セットについて、３つの棒は、左から右に、それぞれ、周囲温度、３７℃、および５５℃で実施された反応を示す。図６ＡのＴＳ、ＴＳ−Ｄ、ＴＳ−ＥおよびＴＳ−Ｈは、それぞれ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＤ複合体、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＥ複合体、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＨ複合体によって開始されたポリメラーゼ反応を示す。ＲＴ活性の阻害効力は温度に依存し、このことは、核酸インヒビターによるＲＴの阻害レベルが、核酸の融解温度に依存することを示す。
【０１２６】
（核酸インヒビターＤ）
上記の実験条件下において、重合化反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化させることによって、各反応温度で、ＲＴ活性が約８５〜９０％阻害された。阻害レベルの相対的な類似性は、ＲＴ活性についてアッセイされた温度範囲における、この核酸インヒビターのヘアピン構造の安定性を示す。
【０１２７】
（核酸インヒビターＥ）
上記の実験条件下において、重合化反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化させることによって、周囲温度および３７℃では、ＲＴ活性が約９０％阻害されたが、５５℃では阻害レベルは４５％であった。５５℃での阻害レベルの有意な減少は、このヘアピン構造が、２つのミスマッチの導入によって不安定化されたことを示唆する。この結果は、逆転写酵素によって触媒されるポリメラーゼ反応の「ホット−スタート」が、周囲温度では二本鎖を形成するが所望される重合化温度では変性する核酸インヒビターを使用することによって、増強され得ることを示唆する。
【０１２８】
（核酸インヒビターＨ）
上記の実験条件下において、重合化反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化させることによって、周囲温度で、ＲＴ活性が約５０％阻害された。３７℃および５５℃での阻害レベルは無いに等しく、本発明者らの実験誤差の範囲内であった。この結果は、周囲温度での阻害のバックグラウンドレベル（これは、プライマー／テンプレート基質の競合に由来しない）が存在することを示唆する。一方、本発明者らの実験条件下において、インヒビターＨの添加による阻害レベルは、３７℃および５５℃では、ごくわずかであった。
【０１２９】
残存する上記の核酸インヒビターの存在下および不在下におけるＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩの相対的ポリメラーゼ活性を図６Ｂに示す。各反応条件セットについて、３つの棒は左から右に、それぞれ、周囲温度、３７℃、および５５℃で実施された反応を示す。ＴＳ、ＴＳ−Ｃ、ＴＳ−Ｈ、ＴＳ−Ｅ、ＴＳ−ＦおよびＴＳ−Ｇは、それぞれ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＣ複合体、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＨ複合体、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＥ複合体、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＦ複合体、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩ−核酸インヒビターＧ複合体によって開始されたポリメラーゼ反応を示す。
【０１３０】
（核酸インヒビターＣ）
実験条件下において、ポリメラーゼを開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸（ＤＮＡ／ＤＮＡ）と複合体化することは、ＲＴ活性を各反応温度において約７０％阻害した。阻害レベルの相対的な類似性は、ＲＴ活性がアッセイされる温度範囲における、この核酸配列の二本鎖構造の安定性を示す。
【０１３１】
（核酸インヒビターＨ）
実験条件下において、重合反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化することは、ＲＴ活性を周囲温度において約４０％阻害した。３７℃および５５℃における阻害レベルは、本発明者らの実験誤差内では、無視できるほどであった。
【０１３２】
（核酸インヒビターＥ）
実験条件下において、重合反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化することは、ＲＴ活性を周囲温度および３７℃において９０％よりも大きく阻害したが、５５℃においては、阻害レベルは６０％であった。
【０１３３】
（核酸インヒビターＦ）
実験条件下において、重合反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化することは、ＲＴ活性を、周囲温度において約８０％、３７℃において６５％、そして５５℃において４０％阻害した。
反応温度の上昇と相関した阻害レベルの減少は、３つのミスマッチに起因する、ヘアピン構造の不安定化を示す。
【０１３４】
（核酸インヒビターＧ）
実験条件下において、重合反応を開始する前に、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔTMＩを約５０倍過剰のこの核酸と複合体化することは、ＲＴ活性を、周囲温度において約８０％、３７℃において５５％、そして５５℃において３０％阻害した。
反応温度の上昇と相関した阻害レベルの減少は、３つのミスマッチに起因する、ヘアピン構造の不安定化を示す。
【０１３５】
（実施例８）
（細胞内での逆転写酵素活性の阻害）
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、細胞内での逆転写酵素の活性を阻害し得る。細胞内での使用のためのオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、改変されて、細胞内に存在し得る１つ以上のヌクレアーゼ酵素に対して耐性にされ得る。例えば、核酸インヒビターの誘導体は、１つ以上の以下の改変によって合成され得る：１）オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分上のリボース基のうちの１つ以上を、アルキル化（例えば、好ましくは２’−ＯＨにおいてメチル化し、２’−Ｏメチルを生成する）し得る；２）オリゴヌクレオチド（例えば、核酸のＤＮＡ部分）のヌクレオチド間結合のうちの１つ以上に、ホスホロチオエート結合のような改変された結合を含ませ得る；３）オリゴヌクレオチドの３’末端を、伸長しないように、キャップ化し得る（例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはジデオキシヌクレオチドを用いてか、または伸長しないように３’ヒドロキシルの他の改変を用いる）。細胞性ＲＮａｓｅ活性に対する耐性レベルを増加する他の改変、および／または、他の細胞因子によるＤＮＡ分解の効率を減少する他の改変は、当業者に公知であり、そして、本発明のオリゴヌクレオチドの設計に組み込まれ得る。オリゴヌクレオチドを１つ以上の細胞分解因子に対して耐性にすることに加えて、ホスホロチオエートは、所定のインヒビターが宿主染色体上の領域に相同性の領域を含む場合、宿主染色体への相同組変えの可能性を減少する。
【０１３６】
オリゴヌクレオチド（ｏｌｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を、アッセイして、細胞において逆転写酵素活性に対する阻害効果を有するか否かを決定し得る。
本発明のオリゴヌクレオチドで処理される細胞、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、当業者に公知の任意の方法を用いて核酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）でトランスフェクトし得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドを、脂質媒介トランスフェクトを用いて細胞に導入し得る（例えば、米国特許第５，３３４，７６１号；同第５，６７４，９０８号；同第５，６２７，１５９号；同第５，７３６，３９２号；同第５，２７９，８３３号および公開された国際出願ＷＯ９４／２７３４５（これらの全ては、参考として本明細書中に特に援用される）を参照のこと）。
【０１３７】
細胞のトランスフェクト後、逆転写酵素を発現するウイルス（例えば、モロニーウイルスマウス白血病Ｖ、Ｍ−ＭＬＶ）は、そのウイルスを用いて細胞を効果的に感染し、逆転写酵素活性の供給源をもたらすために添加され得る。（Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒａｓｓａｒｔ，Ｅ．，１９８０）。細胞のアリコートを、逆転写酵素活性についてアッセイするために、ある間隔で遠心分離し、そして溶解する。核酸インヒビターでトランスフェクトされた細胞から誘導されるＲＴ活性のレベルと、トランスフェクトされていない細胞から誘導されるＲＴ活性のレベルを比較することによって、細胞におけるウイルス増殖の阻害効果を決定し得る。
【０１３８】
（実施例９）
（ホスホロチオエート置換のオリゴヌクレオチドを用いたＴａｑポリメラーゼ阻害）
いくつかの好ましい実施形態において、１つ以上のホスホロチオエート残基を、本発明のオリゴヌクレオチドに組み込み得る。当業者は、そのようなヌクレオチド間結合を組み込むオリゴヌクレオチドが、反応混合物中または細胞内に存在し得るヌクレアーゼ活性に対してより耐性であり得ることを理解する。従って、そのような改変は、インビボ使用またはインビトロ使用が意図されたオリゴヌクレオチド中でなされ得る。いくつかの好ましい実施形態において、全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合であり得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端が、改変されて、そのオリゴヌクレオチドは、反応混合物中または細胞内に存在する任意の３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性に対してより耐性になり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルを、例えば、スペーサー改変因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）をヒドロキシル基にカップリングすることによって改変し得る。そのようなスペーサー改変因子は、市販され（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、そして、ヘテロ原子を含む１つ以上の基で置換され得る炭素原子の鎖を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルを、ヘテロ原子を含む基（例えば、アミン基またはヒドロキシル基など）で終結する３炭素スペーサーで改変し得る。
そのようなスペーサー改変因子のオリゴヌクレオチドへの組み込みは、当業者に周知の化学を使用して、例えば、適切に保護されたホスホルアミダイトバージョンのスペーサーの組み込みによって、達成され得る。
【０１４０】
ホスホロチオエート改変されたオリゴヌクレオチドがＴａｑポリメラーゼを阻害する効果を試験するために、全てのホスフェートヌクレオチド間結合がホスホロチオエートヌクレオチド間結合に変化されたオリゴヌクレオチドを、構築した。４つのそのようなオリゴヌクレオチドを構築した。これらの配列を以下に提供する。
ＨＰＨＨ１は、３ヌクレオチドループを有し、二量体領域の融解温度が５９℃であり、そして二本鎖形成のΔＧ＝−１５．７０ｋｃａｌ／ｍｏｌである、ホスホロチオエートヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０１４１】
【化１５】
2011041572.tif 000016
（配列番号９）
ＨＰＨＨ２は、３ヌクレオチドループを有し、二量体領域の融解温度が６７℃であり、そして二本鎖形成のΔＧ＝−１８．１０ｋｃａｌ／ｍｏｌである、ホスホロチオエートヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０１４２】
【化１６】
2011041572.tif 000017
（配列番号１０）
ＨＰＨＨ３は、５ヌクレオチドループを有し、二量体領域の融解温度が７０℃であり、そして二本鎖形成のΔＧ＝−１８．９０ｋｃａｌ／ｍｏｌである、ホスホロチオエートヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０１４３】
【化１７】
2011041572.tif 000018
（配列番号１１）
ＨＰＨＨ４は、４ヌクレオチドループを有し、二量体の融解温度が６５℃であり、そして二本鎖形成のΔＧ＝−１３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０１４４】
【化１８】
2011041572.tif 000019
（配列番号１２）
幹構造の形成に関与する塩基を、縦線で示す。オリゴヌクレオチドが、ヒドロキシルで終結する３炭素スペーサー基によって３’末端において改変される場合、名称Ｓｓｐａ３を、このオリゴヌクレオチドの名前に加えた。
【０１４５】
図７を参照して、増幅は反応してＮＦ２遺伝子の１．６ｋｂ（Ａ）フラグメント、２ｋｂ（Ｂ）フラグメントおよび２．６ｋｂ（Ｃ）フラグメントを生成する。各パネルにおいて、レーンａは、Ｔａｑポリメラーゼ単独による増幅であり、レーンｂは、インヒビターＨＰＨＨ４Ｓｓｐａ３の存在下（インヒビター：ポリメラーゼが１．２：１のモル比）における増幅反応であり、レーンｃは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑによる増幅である。テンプレートは、２００ｎｇのゲノムＤＮＡであった。各パネルにおいて、レーンａおよびレーンｃに対するレーンｂの比較は、インヒビターの存在が、これらの反応条件下において全長生成物の量を改善し、そしてより短い生成物の量を減少することを示す。
【０１４６】
図８に示されるように、ヌクレオチド取り込みアッセイにおけるＴａｑポリメラーゼの活性を、３つの温度（２５℃、５５℃および７２℃）において、２つの異なる濃度のインヒビターＨＰＨＨ４Ｓｓｐａ３（インヒビター：ポリメラーゼのモル比が、２：１および７．５：１）の存在下で決定した。各温度において、黒い棒線は、Ｔａｑポリメラーゼ単独であり、ストライプの棒線は、Ｔａｑポリメラーゼおよびインヒビター（インヒビター：ポリメラーゼの比が、２：１）、そして白い棒線は、Ｔａｑおよびインヒビター（インヒビター：ポリメラーゼの比が、７．５：１）である。組み込みを、α−［32Ｐ］−ｄＣＴＰの存在下、示された温度でインキュベートされたＰＣＲ反応混合物中でアッセイした。３０分後、ＥＤＴＡの添加によってこの反応を停止させ、そして各反応のアリコートを、ＧＦ／Ｃフィルター上にスポットした。このフィルターをＴＣＡを用いて洗浄し、そしてカウントした。活性を、同じ温度におけるＴａｑポリメラーゼの活性量に対して規準化した。
【０１４７】
２５℃、２：１の比において、Ｔａｑ活性は、阻害されていないポリメラーゼの約６０％に減少されたが、７．５：１の比は、約９０％活性を減少させた。５５℃（典型的なアニーリング温度）において、阻害はなお観察され、２：１および７．５：１において、それぞれ、約２０％および約６０％の活性の減少であった。７２℃（典型的な伸長温度）において、阻害は、２．５：１の比ではほとんど無視でき、そして７．５：１の比では約５０％であった。これらのデータは、阻害は温度依存的であり、より低い温度（すなわち、オリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造である場合）においてより大きな阻害が、より高い温度においてより低い阻害が観察されることを示す。
【０１４８】
インヒビターＨＰＨＨＳｓｐａ３によるＴａｑポリメラーゼ阻害の濃度依存性を、３７℃において研究し、結果を図９に示す。上記の組み込みアッセイを使用した。これらの結果は、阻害は用量依存的であり、インヒビター：ポリメラーゼが０．５：１のモル比におけるわずかな阻害（２０％）から、７．５：１におけるほぼ完全な阻害（９６％）までが見出された。比較として、抗体（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ）により阻害されるＴａｑポリメラーゼを、同じ条件下で試験した。７．５：１のモル比において、本発明のインヒビターは、この抗体に匹敵する量のＴａｑ活性阻害を提供する。
【０１４９】
これまで理解の明確化を目的として、本発明を、いくらか詳細に例示および実施例によって十分に記載してきた。本発明が、本発明の範囲および本発明の任意の特定の実施形態に影響を与えることなく、条件、処方および他のパラメーターの広範および等価な範囲内で、本発明を改変または変更することによって実施され得ることは、当業者に明らかである。そして、このような改変または変更は添付の特許請求の範囲内に含まれることが、意図される。
【０１５０】
本明細書中に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明に関連する当業者のレベルを示し、そして、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が詳細かつ個々に参考として組み込まれることが示されるのと同じ程度まで、本明細書中に参考として組み込まれ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2011041572000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月12日(2010.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸合成を阻害するための組成物であって、該組成物は、ポリメラーゼ活性を有する酵素と結合し得る核酸インヒビター、または該酵素に対する親和性を有する核酸インヒビターを含む、組成物。