(57)【要約】      （修正有）【課題】インターロイキン−４およびその誘導体が不溶性蛋白質凝集体、いわゆる封入体として発現される大腸菌培地からインターロイキン−４もしくは関連バリアントを精製する方法の提供。【解決手段】（ａ）封入体中に発現させること、（ｂ）細胞を分解し、封入体を分離すること、（ｃ）そのように得られた封入体を洗浄すること、（ｄ）変性により封入体を可溶化させること、（ｅ）発現生成物を復元すること、および（ｆ）発現生成物を精製すること、を含んで成り、（ｃ）で封入体が封入体の表面に結合された脂質もしくは細胞壁断片中に含まれる脂質を効果的に可溶化させる洗浄剤を含むバッファーで洗浄され、復元（ｅ）が人工的シャペロンの存在下で実施される、インターロイキン−４の突然変異蛋白質の調製法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）封入体中に発現させること、
（ｂ）細胞を分解し、封入体を分離すること、
（ｃ）そのように得られた封入体を洗浄すること、
（ｄ）変性により封入体を可溶化させること、
（ｅ）発現生成物を復元すること、および
（ｆ）発現生成物を精製すること、
を含んで成り、（ｃ）で封入体が封入体の表面に結合された脂質もしくは細胞壁断片中に含まれる脂質を効果的に可溶化させる洗浄剤を含むバッファーで洗浄され、復元（ｅ）が人工的シャペロンの存在下で実施されることを特徴とする、組換え体発現によるインターロイキン−４もしくはインターロイキン−４の突然変異蛋白質の調製法であって、蛋白質濃度が０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲内にある、上記調整法。
【請求項２】
封入体を洗浄するための洗浄剤が非イオン洗浄剤、イオン界面活性剤もしくは双性イオン洗浄剤である請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗浄剤がＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、デスオキシコレートおよびｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔシリーズ（Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の群から選択される双性イオン洗浄剤である請求項１記載の方法。
【請求項４】
封入体のための洗浄バッファーが７と１０の間のｐＨを維持するバッファーである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
洗浄バッファーが更にキレート物質を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
キレート形成物質がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）もしくはトランス−１，２−ジアミノ−シクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）の群から選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
組換え蛋白質がインターロイキン４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄである請求項１〜６記載の方法。
【請求項８】
精製（ｆ）がクロマトグラフィーにより実施される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概括的に、インターロイキン−４およびその誘導体が不溶性の蛋白質凝集体、いわゆる封入体として発現される、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）培地からのインターロイキン−４もしくは関連バリアントの精製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）は約１０．５の塩基性ｐＩをもつ１５．０００ダルトンのポリペプチドであり、ハツカネズミのＩＬ−４（ｍＩＬ−４）は６．５の中性ｐＩをもつ１３．６００ダルトンのポリペプチドである。インターロイキン−４はリンパ細胞および骨髄細胞の増殖、成熟、生存および分化を誘発し、調整するサイトカインの１族に属する（非特許文献１参照）。ｈＩＬ−４およびｍＩＬ−４の完全なアンタゴニスト、部分的および選択的アゴニストはＳｅｂａｌｄおよびＧｒｕｎｅｗａｌｄ他により記載されている（特許文献１、非特許文献２および特許文献２参照）。改善された折り畳み収率をもたらすヒトＩＬ−４の突然変異蛋白質が近年記載された（非特許文献３参照）。
【０００３】
ｈＩＬ−４のｃＤＮＡは不溶性封入体として大腸菌中に発現された（特許文献３、非特許文献４および非特許文献５参照）。高レベルの生物学的活性を有する組換えヒトＩＬ−４はこの源から単離することができることが示された。しかし、発現率、精製総収率および復元収率がこれらの系（ｓｙｓｔｅｍ）の商業的使用に十分ではない。
【０００４】
活性ヒトＩＬ−４もしくは関連バリアントの臨床使用には細胞成分もしくはそれぞれの発現系の汚染物により汚染されていない高純度の物質が必要である。従って、高収率および高純度の最適化大腸菌発現系からの活性ＩＬ−４もしくは関連突然変異蛋白質の精製が必要である（特許文献４参照）。
【０００５】
組換えバクテリアもしくはその他の宿主細胞においては，異種蛋白質を十分量発現させることができるので、組換えＤＮＡ法により、ヒト由来の生物学的活性ポリペプチドの大量生産が選択されるべき方法になった。
【０００６】
本発明は大量のＩＬ−４もしくはそのバリアントを含む不溶性封入体を精製することおよび更に、可溶化分子を正確に折り畳まれた、生物学的に活性な高純度のポリペプチドに精製することに関する。
【０００７】
遺伝子組換えされた生物薬剤は具体的には、例えば核酸、宿主細胞の蛋白質、エンドトキシン、脂質、多糖類他のような様々な宿主細胞の汚染物を含む、細胞を含まない培養液の上澄み液から精製される。他の分子から、特にジスルフィド−アイソフォーム、アミノ酸ミス対合物を含む誘導体、酸化形態およびホルミル化分子のような、非常に密接に関連し、分離が困難なものから、インターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質を選択的に精製するための効果的方法が当該技術分野に必要である。
【０００８】
凝集した不溶性形態、いわゆる「封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ）」中に標的蛋白質を発現する大腸菌細胞からのインターロイキン−４の精製は最初にＫａｓｔｅｌｅｉｎおよびｖａｎ  Ｋｉｍｍｅｎａｄｅにより記載された（特許文献５参照）。低細胞密度の発酵体から誘導される細胞が音波処理により分解され、遠心分離後、残留ペレットを酸化還元グルタチオンを含む５Ｍのグアニジウム−ＨＣｌ中に溶解された。２５０ｍｇ／Ｌの最終蛋白質濃度までの１０倍希釈により構造復元を達成した。次に形成された沈殿物を遠心分離除去し、上澄みを再度リン酸塩バッファー生理食塩水に対して透析した。
新規の沈殿物を除去するために再度遠心分離が必要であった。次に蛋白質を８ｇ／Ｌまで濃縮するために限外濾過を使用し、それにより再度沈殿物を形成した。最後に、復元され、濃縮されたインターロイキン−４をサイズ排除樹脂上のみのクロマトグラフィーにかけた。ヒトインターロイキン−４の生物学的活性の測定のためのアッセイもまた、引用された記事に記載された。明らかに復元段階およびその後の段階は激しい沈殿をこおむり、関与するクロマトグラフィー段階は密接に関連したアイソフォームを分離することはできない。更に、精製されたインターロイキン−４は酸化物質およびその他の関連生成物により汚染された。Ｖａｎ  Ｋｉｍｍｅｎａｄｅおよび共同研究者は最終生成物のエンドトキシンおよび宿主細胞蛋白質含量に関する数字を与えなかった。しかし、限外濾過およびゲル濾過は核酸、エンドトキシンおよび宿主細胞蛋白質に関して高い清浄化因子（ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）をもたらさないことは一般に知られている。従って、生成物は医薬として許容できる品質（ｑｕａｌｉｔｙ）をもたらすことは期待できない。
【０００９】
ハツカネズミのＩＬ−４はＬｅｖｉｎｅおよび共同研究者により大腸菌からの封入体から単離された（非特許文献６参照）。その方法は復元段階および２回のその後のクロマトグラフィー段階（カチオン交換、ゲル濾過）を伴う。しかし、ハツカネズミＩＬ−４は異なるアイソフォームのみならずまたＮ−末端延長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を含んだ。エンドトキシンもしくは核酸のような宿主細胞不純物の除去はＬｅｖｉｎｅおよび共同研究者により記載されなかった。従ってその方法はこれらの汚染物間を十分に区別することができず、大腸菌の封入体からの医薬品級のヒトＩＬ−４もしくはその突然変異蛋白質の精製に応用することはできない。
【００１０】
従って、変性インターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質を単離し、インターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質を効果的に復元してジスルフィド架橋を形成し、そしてクロマトグラフィーおよび濾過によりインターロイキン−４をその密接に関連したアイソフォーム、誘導体および宿主細胞汚染物から分離するための改善法を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
その均一性の著しい改善をもたらすインターロイキン−４を精製する方法を提供することが更なる目的である。
【００１２】
これらの目的は当業者には明白であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】Ｓｅｂａｌｄ  Ｗ（１９９８）：米国特許第５，７２３，１１８号明細書（国際公開第９３／１０２３５号パンフレット）、１９９８年３月３日公開
【特許文献２】Ｓｈａｎａｆｅｌｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、国際公開第９７／４７７４４号パンフレット、１９９６年６月１４日公開
【特許文献３】Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ，ｖａｎ  Ｋｉｍｍｅｎａｄｅ  Ａ（１９８７）：欧州特許出願第０３０１８３５号明細書、１９８７年７月２９日公開
【特許文献４】Ａｐｅｌｅｒ  Ｈ，Ｗｅｈｌｍａｎｎ  Ｈ（１９９９）Ｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｎｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｍｕｔｅｉｎｓ．欧州特許出願第００１００１２９．６号明細書．１９９９年１月７日公開
【特許文献５】Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ，ｖａｎ  Ｋｉｍｍｅｎａｄｅ  Ａ（１９８７）：欧州特許出願第０３０１８３５号明細書，１９８７年７月２９日公開
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｃａｌｌａｒｄ  Ｒ，Ｇｅａｒｉｎｇ  Ａ（１９９４）：Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆａｃｔｓ  ｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
【非特許文献２】Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ  ＳＭ，Ｋｕｎｚｍａｎｎ  Ｓ，Ｓｃｈｎａｒｒ  Ｂ，Ｅｚｅｒｎｉｅｋｓ  Ｊ，Ｓｅｂａｌｄ  Ｗ，Ｄｕｓｃｈｌ  Ａ（１９９７）：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２（３）：１４８０−１４８３
【非特許文献３】Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ  Ｈ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｊ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＫＨ，Ａｐｅｌｅｒ  Ｈ，Ｓｅｂａｌｄ  Ｗ，Ｏｓｈｋｉｎａｔ  Ｈ，Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｌ（２０００）：Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８４：２１７−２３０
【非特許文献４】ｖａｎ  Ｋｉｍｍｅｎａｄｅ  Ａ，Ｂｏｎｄ  ＭＷ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＪＨ，Ｌａｑｕｏｉ  Ｃ，Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：１０９−１１４
【非特許文献５】Ｊａｙａｒａｍ  Ｂ，Ｂｅｖｏｓ  Ｒ，Ｇｕｉｓｅｚ  Ｙ，Ｆｉｅｒｓ  Ｗ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７９：３４５−３５４
【非特許文献６】Ｌｅｖｉｎｅ  ＡＤ，Ｒａｎｇｗａｌａ  ＳＨ，Ｈｏｒｎ  ＮＡ，Ｐｅｅｌ  ＭＡ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＢＫ，Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ  ＲＭ，Ｍａｎｎｉｎｇ  ＬＡ，Ｂｉｓｈｏｐ  ＢＦ，Ｏｌｉｎｓ  ＰＯ（１９９５）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１３）：７４４５−７４５２
【発明の概要】
【００１５】
１アスペクトにおいて本発明は、大腸菌細胞を効果的に分解し、次に遠心分離とクロスフロー微量濾過の組み合わせにより、放出された凝集インターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質を精製して、インターロイキン−４をその生構造に効果的に復元するための出発物質として使用することができる高純度の封入体調製物をもたらすための方法を提供する。
【００１６】
もう１つのアスペクトにおいて、本発明は比較的高蛋白質濃度のインターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質を復元して高い復元率を与える方法を提供する。蛋白質の回収率は概括的に９０％を超える。
【００１７】
組換えインターロイキン−４の単離は様々な異なる宿主細胞汚染物からの蛋白質の分離を伴う。工程の各段階は十分な分離を起こさせる特別なバッファーを伴う。通常のクロマトグラフィー媒質を使用して通常のように同時精製する、いくつかのインターロイキン−４バリアントの存在は特別な最終的クロマトグラフィー段階および条件を必要とする。これらの物質は主として、インターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質のジスルフィド−コンホーマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ）、メチオニン−スルホキシドバリアント、Ｎ−末端部に部分的に切断されたホルミル−メチオニン残基をもつバリアント、誤って取り込まれたアミノ酸をもつバリアントおよび、可能なこれらのバリアントのすべての種類の組合わせから成る。
【００１８】
本発明において、様々な密接に関連したバリアントからインターロイキン−４もしくはその突然変異蛋白質を好ましく分離するための条件が特定される。この方法を使用して、組換えインターロイキン−４およびその突然変異蛋白質を高純度で、商業的に魅力的な収率で単離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
Ａ．定義
本明細書で使用される「ＩＬ−４」は、天然の配列のもしくはバリアント形態のイヌ、
ヒツジ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス、ラットおよび好ましくはヒトを含むあらゆる種からのそして、天然の、合成のもしくは組換えで生産されようと、あらゆる源からのインターロイキン−４を表わす。ＩＬ−４は好ましくは組換えにより生産される。好ましい方法において、ＩＬ−４はクローン生産され、そのＤＮＡは例えば、Ａｐｅｌｅｒ  ＆  Ｗｅｈｌｍａｎｎにより１９９９年に記載の方法により発現される（Ａｐｅｌｅｒ  Ｈ，Ｗｈｅｌｍａｎｎ  Ｈ（１９９９）  Ｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｍｕｔｅｉｎｓ（プラスミド、それらの構造並びにインターロイキン−４およびインターロイキン−４突然変異蛋白質の製造におけるそれらの使用）．欧州特許出願第００１００１２９．６号明細書、１９９９年１月７日公開、を参照されたい）。
【００２０】
好ましいＩＬ−４バリアントは１９９８年３月３に公開の米国特許第５，７２３，１１８号（国際公開第９３／１０２３５号パンフレット）に記載のものである。
【００２１】
本明細書で使用される「バッファー」はその酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を表わす。本発明の復元アスペクトのためのバッファーは約６〜９、好ましくは、６．５〜８のｐＨ範囲を有する。この範囲内にｐＨを調整するであろうバッファーの例はクエン酸塩−ＮａＯＨ、ＴＲＩＳ−Ｈｌもしくはトリエタノールアミン−ＨＣｌのようなＧＯＯＤ−バッファーおよび、好ましくはリン酸塩バッファーである。
【００２２】
本発明のセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーアスペクトのためのバッファーは約５〜９、好ましくは６〜８のｐＨ範囲を有する。この範囲内にｐＨを調整するであろうバッファーの例は好ましくはリン酸塩バッファーである。溶離がリン酸塩濃度の直線的増加により実施されない場合は、塩、好ましくはＮａＣｌもしくはＫＣｌを５ｍＭから塩の溶解度限度までの範囲内の濃度でバッファーに添加する。
【００２３】
本発明の金属キレート親和性クロマトグラフィーアスペクトのためのバッファーは６〜９、好ましくは７〜８のｐＨ範囲を有する。この範囲内にｐＨを調整するであろうバッファーの例はリン酸塩およびその他の非キレート形成成分、いわゆる非−ＧＯＯＤバッファー（例えばグリシン−ＮａＯＨ、Ｎ−エチルモルホリノ−ＨＣｌもしくは２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−ＨＣｌ）である。
【００２４】
本明細書で使用される「修飾試薬（ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）」は例えばトリフルオロ酢酸、アンモニウム塩、リン酸塩、酢酸およびＮａＣｌのような、逆相クロマトグラフィーに使用されるイオン対試薬を表わす。
【００２５】
本明細書で使用される用語「リン酸塩」は好ましくは、アルカリ土類もしくはアルカリ金属元素もしくはアンモニウムカチオンからのカチオンを有し、かつリン酸アニオンを有する塩を表わす。このような塩の例にはリン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウムおよびリン酸カリウムが含まれる。本明細書でもっとも好ましい塩はリン酸ナトリウムおよびカリウムである。
【００２６】
本明細書で使用される「アルコール」および「アルコール溶媒」はアルコールに対して一般に使用される用語の意味で、好ましくは１〜１０個の炭素原子をもつアルコール、より好ましくはメタノール、エタノール、イソ−プロパノール、ｎ−もしくはｔ−プロパノール並びにグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、そしてもっとも好ましくはエタノールもしくはイソプロパノールを意味する。これらの溶媒は水溶液に添加される時に溶液の極性を減少することにより溶液の疎水性を増加する溶媒である。
【００２７】
「極性の非プロトン性溶媒」はアルコールの代わりにもしくはそれに加えて使用することができるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、アセトニトリル（ＡＣＮ）、他のような分子である。本明細書でもっとも好ましい極性非プロトン性溶媒はアセトニトリルである。
【００２８】
Ｂ．発明の実施法
本発明の方法は最初に不溶性凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）、いわゆる「封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ）」として、あらゆる適切な方法により適当な単離バッファー中の原核生物の宿主細胞から変性（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）インターロイキン−４を精製することを伴う。このような適当な方法は例えば、大部分の宿主蛋白質を可溶化するために適したイオン強度をもつが凝集インターロイキン−４が実質的に不溶性であるバッファーに細胞を暴露し、そして封入体を放出し、例えば遠心分離もしくは微量濾過による回収を可能にさせるように細胞を分解すること、である。この方法は周知であり、例えば米国特許第４，５１１，５０３号明細書に記載されている。
【００２９】
端的には、細胞をバッファー（具体的にはｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、約０．０１〜２Ｍの、好ましくは０．１〜０．２Ｍのイオン強度を使用して）中に懸濁させる。十分なイオン強度値を維持するためには塩化ナトリウムを含むあらゆる適当な塩が有用である。次にこのバッファー中に懸濁される間に細胞を例えば、機械的方法、例えば、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎプレス法、フレンチプレス法、Ｂｒａｎ  ＆  Ｌｕｅｂｂｅホモジナイザーもしくはマイクロフリューダイザー、もしくは音波オシレーターのような一般に使用される方法を使用する分解により、または化学的もしくはリゾチームを使用する酵素的方法によりまたはこれらの方法のあらゆる組み合わせにより分解する。
【００３０】
細胞を分解後、懸濁液を具体的には遠心分離して封入体をペレットにする。１態様において、この段階は約５００〜１５．０００×ｇ、好ましくは約１２．０００×ｇで、容量および遠心分離機のデザインに応じる十分な時間、通常約１０〜３０分間、標準の遠心分離機中で実施される。生成されるペレットは実質的にすべての封入体を含むが、分解が完全でない場合には細胞壁フラグメントおよび未分解細胞が沈殿する。細胞分解の完全性は少容量の分解バッファー中にペレットを再懸濁させ、この懸濁液を位相差顕微鏡、レーザー回折（例えばＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００）によりアッセイすることにより、もしくは周知の方法に従う染料法により総可溶性蛋白質を測定することにより（例えばＢｒａｄｆｏｒｄ他（１９７６）：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）アッセイすることができる。破壊細胞もしくは完全細胞の存在または放出された可溶性蛋白質の不完全性は更なる分解が必要であることを示す。懸濁液を再度遠心分離し、ペレットを回収し、再懸濁し、そして分析する。
【００３１】
適した封入体洗浄バッファーのｐＨ範囲は具体的にはｐＨ７〜１０、好ましくはｐＨ８〜９である。この後者の範囲内のｐＨを呈するであろうバッファーの例にはグリシン、ＣＡＰＳＯ（３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパン−スルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］−エタンスルホン酸）およびＴＲＩＳ−ＨＣＬ（トリス−［ヒドロキシメチル」アミノメタン塩酸）が含まれる。本明細書で好ましいバッファーは好ましくは５０〜５００ｍＭの濃度、より好ましくは１００〜２００ｍＭの濃度で、約７〜１０、好ましくは約８〜９のｐＨのＴＲＩＳ−ＨＣＬである。洗浄バッファー中に含まれる更なる物質は、大腸菌細胞の外壁でリポ多糖類（ＬＰＳ）を架橋することが知られている、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス−（２−アミノエチル
）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）もしくはトランス−１，２−ジアミノ−シクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）錯体形成Ｃａ２＋−イオンのようなキレート物質である（Ｗｉｔｈｏｌｔ他（１９７６）：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３（３）：５３４−５４４）。更に、非イオン性洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−シリーズ、ドデシルマルトシド他）、イオン界面活性剤（例えばＳＤＳ、ＣＴＡＣ、ＣＴＡＢ、コール酸およびその誘導体）もしくはもっとも好ましくは双性イオン洗浄剤（例えばＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ−シリーズ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、デスオキシコレート）のような、封入体表面に結合された脂質もしくは細胞壁フラグメント中に含まれる脂質を効果的に可溶化させる適した洗浄剤が洗浄バッファーに含まれなければならない。これらの界面活性剤の濃度は洗浄剤−ミセルおよび混合された洗浄剤−脂質−ミセルの形成を確保するために十分に高くなければならず、それぞれの界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に左右される。洗浄バッファー中の界面活性剤の濃度は好ましくはＣＭＣ−値より十分に上、もっとも好ましくは２倍上でなければならない。封入体もしくは細胞壁フラグメントと結合した脂質を効果的に可溶化するためには、もっとも好ましくは、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４を０．０１％〜５％の間、好ましくは０．１％〜１％の間の濃度で使用することができる。更に、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４のような塩を洗浄バッファー中に含むことは、使用される洗浄剤に応じてインターロイキン−４の回収率の喪失をもたらすかも知れないが（１０〜４０％の喪失）、外膜の蛋白質の除去の効率を高めるために洗浄バッファー中に例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４のような塩を含むことができる。更に、封入体中に存在するあらゆる共有結合のシスチン橋を減少するために、例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノールもしくはシステインのようなメルカプタンを０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭの濃度で洗浄バッファー中に含むことができる。核酸は封入体中の蛋白質含量の０．５％までを表わすことができ（Ｖａｌａｘ  ＆  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ（１９９３）：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．９（５）：５３９−５４７）、従ってＲＮＡｓｅもしくは好ましくはＤＮＡｓｅを洗浄バッファー中に含むことができる。例えば、０．５〜８Ｍ、好ましくは２〜４Ｍの濃度の尿素もしくは０．５〜４Ｍ、好ましくは２〜４Ｍの濃度のグアニジニウム塩酸のようなその他のカオトロピック物質も洗浄バッファーに添加することができる。
【００３２】
更に、封入体の範囲内の密度をもつ細胞デブリ並びに、エンドトキシン、核酸、蛋白質もしくは低分子量汚染物のような可溶性宿主細胞不純物を除去するためにはクロスフロー微量濾過（ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による封入体の更なる精製が必要かも知れない。この目的のために、０．１μｍ〜０．６５μｍ、好ましくは０．２２〜０．４５μｍ、もっとも好ましくは０．４５μｍの排除限界をもつ膜を使用することができる。適した膜の材料には、表面修飾を伴うもしくは伴わないポリスルホンおよびポリエーテルスルホン膜、テフロン（登録商標）（ＰＶＤＦ）膜、ナイロン膜、ＰＴＦＥ膜および好ましくはセルロースもしくはセルロースアセテート膜およびそれらの誘導体が含まれる。適した装置には、直線もしくはコイル状繊維を含む中空繊維系、膜の層の発生を最小にするために膜が回転する動力学的膜濾過ユニット、膜の層の形成が振動の影響により最小にされる振動膜濾過ユニット、スクリーンを伴わない（開放チャンネル）カセットシステム、およびもっとも好ましくは異なるタイプのデザインのスクリーンを備えたカセットシステムが含まれる。例えば０．４５μｍのカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）をもつＨｙｄｒｏｓａｒｔスーパーワイドチャンネルカセットを使用することができる（特許出願第０１／０４６３４号、ドイツ特許出願第１００  ２２  ２５８号明細書を参照されたい）。クロスフロー微量濾過に使用される洗浄バッファーは前記のものと同様である。
【００３３】
洗浄した封入体ペレットを遠心分離器からもしくはクロスフロー微量濾過装置から回収後、物質を液化ガス、例えば液体窒素もしくは二酸化炭素中に凍結することにより長期間保存することができる。この目的のために、いくつかの方法が商業的に使用可能である（
例えばＭｅｓｓｅｒ  Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｎｉｃｅ，ＵＳＡ）。この封入体懸濁液を液体窒素もしくは液体二酸化炭素のいずれかを含む撹拌容器中に一定の流量でポンプで送る。液体ガスと封入体懸濁液の接触時に液滴が即座に凍結する。最終的に凍結封入体のペレットをふるいにより容器から取り出し、共融点より下の温度で保存することができる。
【００３４】
極低温ペレット系から得た後に、インターロイキン−４を下記のように活性形態に適切に復元させる。
【００３５】
変性インターロイキン−４を含む封入体極低温ペレットは急速解凍され、次に適当なアニオンもしくはカチオン洗浄剤またはカオトロピック塩（例えば、尿素、ＫＳＣＮ、ＮａＪ、ＭｇＣｌ２もしくはもっとも好ましくはグアニジウム塩のような）の添加によりアルカリ性バッファー中に可溶化される。洗浄剤の例は例えばナトリウムドデシルスルフェート、ナトリウムテトラデシルスルフェート、ラウリルサルコシン、コール酸およびその誘導体、タウロコール酸およびその誘導体並びにｔｅｒｔ−オクチルフェニルプロパンスルホン酸（ＴＯＰＰＳ）（アニオン界面活性剤）またはセチルトリメチルアンモニウムクロリドもしくはブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（カチオン界面活性剤）であり、それらは０．１％〜１０％、好ましくは０．５％の低濃度で封入体を効果的に可溶化させる。アルカリ性バッファー中でインターロイキン−４の可溶化を起させるような封入体濃度、インキュベート時間およびインキュベート温度の条件下でインキュベートを実施する。
【００３６】
バッファー中のインターロイキン−４の可溶化の度合いの測定は、混濁度測定により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で高速度遠心分離（１２．０００×ｇ、３０分間）後の上澄みとペレット間のインターロイキン−４分別物を分析することにより、蛋白質アッセイ（ＢＣＡ−アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ））によりもしくはＲＰ−ＨＰＬＣにより適切に実施される。
【００３７】
可溶化のためのアルカリ性バッファーのｐＨ範囲は具体的には少なくとも約８であり、好ましい範囲は約７〜１０である。この後者の範囲内のｐＨを与えるであろうバッファーの例にはグリシン、ＣＡＰＳＯ（３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパン−スルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］−エタンスルホン酸）およびＴＲＩＳ−ＨＣＬ（トリス−［ヒドロキシメチル」アミノメタン塩酸）が含まれる。本明細書で好ましいバッファーは好ましくは２００ｍＭの濃度で、約７〜１０の、好ましくは約８〜９のｐＨのＴＲＩＳ−ＨＣＬである。
【００３８】
可溶化のためのバッファー溶液中のインターロイキン−４の濃度はインターロイキン−４が実質的に可溶化され、完全に変性されるであろうようなものでなければならない。カオトロピック剤もしくは洗浄剤の残留濃度をできるだけ低く保つために、復元前により濃縮した可溶化蛋白質溶液を生成することが望ましい。従って、インターロイキン−４の好ましい濃度は少なくとも１０ｇ／Ｌ、より好ましい範囲は２０〜３０ｇ／Ｌである。可溶化後、システイン−ＳＨ基をスルヒドリル−還元剤（メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）もしくはＬ−システインのような）の添加により還元するかまたはスルファイトおよび酸化剤（例えば、ヨードソベンゾエートもしくは好ましくはテトラチオネートのような）の添加により化学的に誘導することができる（Ｋｅｌｌａ  ＆  Ｋｉｎｓｅｌｌ（１９８５）：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：２５１−２６３；Ｋｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）：Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．７：５３５−５４８）。
【００３９】
折りたたみのためには、インターロイキン−４を例えば１０ｇ／Ｌの濃度まで８Ｍのグアニジニウム塩酸中に可溶化し、５０倍および１００倍モル過剰のスルファイトおよびテトラチオネートの添加によりスルフィト分解し、４Ｍグアニジニウム塩酸を含む可溶化バッファーに対して透析もしくはダイアフィルトレーションして、過剰な誘導試薬を除去し、例えば５０ｍｇ／Ｌまで希釈することができる。透析に対しては、３５００ダルトンのカットオフを伴うバッグ（例えばＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ）を使用することができる。ダイアフィルトレーションに対しては３〜１０ｋＤ、好ましくは５〜１０ｋＤの範囲内のカットオフを伴う限外濾過膜を使用することができる。適した膜材料には表面修飾を伴うもしくは伴わないポリスルホンおよびポリエーテルスルホン膜、並びに好ましくはセルロースもしくはセルロースアセテート膜およびそれらの誘導体が含まれる。適した装置には直線もしくはコイル状繊維を含む中空繊維装置、スクリーンを伴わないカセット装置（開放チャンネル）、およびもっとも好ましくは異なるタイプのデザインのスクリーンを備えたカセット装置が含まれる。例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤスクリーンチャンネル膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ）を使用することができる。
【００４０】
インターロイキン−４を前記のように可溶化し、化学的に誘導後に、復元前に、固定化金属キレート親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、固定化合成リガンド上親和性クロマトグラフィーによりもしくは中速度逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により分子を更に精製することができる。これらのクロマトグラフィー段階は前記のクロスフロー限外濾過段階の代わりに使用することができる。
【００４１】
ＩＭＡＣの場合には、可溶化インターロイキン−４封入体（前記参照）をバッファーで希釈して３Ｍ以上の最終グアニジニウム塩酸濃度を達成する。３Ｍ未満では、変性インターロイキン−４分子は沈殿する傾向がある。可溶化およびＩＭＡＣによる更なる精製のために好ましいバッファーは例えばリン酸塩であるが、例えばグリシン−ＮａＯＨ、Ｎ−エチルモルホリノ−ＨＣｌもしくは２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−ＨＣｌのような、６〜９、もっとも好ましくはｐＨ７〜８の好ましいｐＨ範囲内に緩衝する他の非キレート成分（いわゆる非ＧＯＯＤバッファー）もその代わりに使用することができる。
【００４２】
ＩＭＡＣは充填床もしくは拡大床（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ−ＩＭＡＣ）、双方の操作法で実施することができる。非変性インターロイキン−４はα−ヘリカル（Ｈｉｓ（５９）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ）、β−ストランド（Ｈｉｓ（１）−Ｘ−Ｃｙｓ，Ｈｉｓ（７５）−Ｘ−Ｈｉｓ）およびβ−ターン（Ｈｉｓ（２）−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ）モーティブ（ｍｏｔｉｖｅｓ）中に幾つかのヒスチジン−残基を含み、文献から、非変性のインターロイキン−４がＩＭＡＣに結合されていることが知られたが（Ｎａｖｅｈ他（１９９１）：米国特許第５，０３４，１３３号、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ提供）、グアニジン−変性インターロイキン−４もまたＩＭＡＣ−樹脂に結合することは驚くべきことである。結合力の減少する順に並べた変性インターロイキン−４（４Ｍのグアニジニウム塩酸、リン酸塩バッファー、もっとも好ましくはｐＨ７）の結合に適する金属イオンはＣｕ＞Ｎｉ＞Ｃｏ＞Ｚｎである。変性インターロイキン−４に選択的に結合するためには好ましくはＮｉ−イオンが使用される。ＩＭＡＣ−樹脂の動力学的結合能は約１０〜１２ｇ蛋白質／樹脂１Ｌである。拡大床（ｘｐａｎｄｅｄ−ｂｅｄ）の操作法は蛋白質精製と残留細胞壁フラグメントおよび他の非蛋白質汚染物の除去の組み合わせを可能にする。適当な金属イオンを充填したＩＭＡＣ−樹脂に結合した変性インターロイキン−４の溶離は、直線状もしくは段階的勾配の、適当な置換物（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）（例えばヒスチジン、ヒスタミン、ＩＭＡＣのその他の文献で周知の置換物のような）により、またはもっとも好ましくは１０ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度のイミダゾール、もっとも好ましくは１０〜５０ｍＭのイミダゾールにより達成することができる。画分を含む生成物を合わせる。ＩＭＡＣ後の変性インターロイキン−４の純度はＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ｓｔａｉｎ）により判定すると概括的に約９０％であり、インターロイキン−４の平均回収率は８０％より良い。
【００４３】
次に、インターロイキン−４を復元して、その生物学的に活性な形態を形成する。インターロイキン−４を復元し、正しいジスルフィド橋を形成するためには幾つかの経路がある：
【００４４】
１．マトリックス補助復元
クロマトグラフィー樹脂に結合した蛋白質の復元は確立された方法である（Ｌａｓ他（１９８４）：米国特許第５７３９２８１号、１４／０４／１９９８公開；国際公開第９４１８２２７号、１８／０８／１９９４公開、Ｄｅｎｚｙｍｅ，デンマーク）。一般に使用されるイオン交換マトリックス補助復元の主要な欠点は、樹脂に対する蛋白質の複数地点の結合であり、それが蛋白質の低い柔軟性をもたらし、それが正しい三次元構造の形成を妨げる可能性がある。更に、Ｌａｓおよび共同研究者により開示された特許に従うと（前記参照）カオトロープの濃度が変わると、インターロイキン−４は樹脂上に定量的に沈殿し、それがカラムの閉塞をもたらす。
【００４５】
グアニジン変性インターロイキン−４は、もっとも恐らくは樹脂に対するインターロイキン−４の単一点もしくは複数点結合により、金属キレート樹脂に結合することが示されたので、ＩＭＡＣ−補助復元は可能である。インターロイキン−４がマトリックス（例えばキレート−セファロースＦＦもしくは、好ましくはＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ−ＩＭＡＣ（双方ともＰｈａｒｍａｃｉａから）のような）に結合された後に、適当な減少する勾配のグアニジニウム塩酸および適当な酸化還元シャフリング系が適用されて、インターロイキン−４をその生物学的活性形態に復元させる。勾配の形態は直線状に減少する勾配もしくは好ましくはギザギザのプロファイルをもつ減少勾配であるかも知れない。後者のタイプの勾配においては、直線状の減少の次にカオトロープの険しい、段階的なより僅かな上昇が続き、次に再度直線状減少が続く。酸化還元シャフリング系は適当には例えば、グルタチオン−に基づく系、システイン系もしくは２−メルカプトイミダゾール系である。他のメルカプタンは樹脂上に結合される金属を妨げる傾向がある。好ましいグルタチオンの酸化形態および還元形態の比率は１：５０〜５０：１、好ましくは４０：１の範囲内で変動することができる。
【００４６】
ＩＭＡＣに基づくマトリックス補助復元系を使用して、インターロイキン−４はＳｈｅｎ他（１９９６）：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４０（１）：２５２−２６１，Ｗａｎｇ他（１９９７）：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９４（５）：１６５７−１６６２により記載されたように、インターロイキン−４受容体のα−鎖（ＩＬ−４Ｒα）に対するインターロイキン−４の親和性の測定により決定されるようなその生物学的活性形態に復元させることができる。結合親和性を反映する結合定数（Ｋｏｎ：４．６７Ｅ＋０７［Ｍ−１ｓ−１］）および解離定数（ｋｏｆｆ：３．８１Ｅ−１１［Ｍ−１］）は対照基準物質（ｋｏｎ：４．１４Ｅ＋０７［Ｍ−１ｓ−１］；ｋｏｆｆ：４．６８Ｅ−１１［Ｍ−１］）に匹敵した。
【００４７】
２．透析もしくはダイアフィルトレーションによる復元
復元バッファーに対する透析もしくはダイアフィルトレーションの前に、可溶化され、そして好ましくはスルフィト分解された封入体を、０．０１ｇ／Ｌ〜０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ〜０．３ｇ／Ｌ、もっとも好ましくは０．２ｇ／Ｌ〜０．３ｇ／Ｌに蛋白質濃度を調整するために、希釈バッファー（例えば４Ｍのグアニジニウム塩酸、０．６Ｍのアルギニン塩酸、例えば５０ｍＭのリン酸塩バッファー、ｐＨ７）で希釈するこ
とができる。次にスルファイト保護基を例えばβ−メルカプトエタノール、還元グルタチオン、２−メルカプトイミダゾールもしくは好ましくはシステインのようなメルカプタンの添加により除去する。透析は３．５ｋＤと１０ｋＤの間にカットオフを伴う透析バッグを使用して実施する。２倍のバッファーは０．１〜１．５Ｍ、好ましくは０．４〜１Ｍで添加されたアルギニンを含む２０倍容量の復元バッファーに対して交換する。ダイアフィルトレーションは大規模復元の場合に透析の代わりに使用することができる。この目的のためには、１〜３０ｋＤ、もっとも好ましくは５〜１０ｋＤの好ましいカットオフを伴う適した膜を使用する。この方法に適する限外濾過膜は例えば、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロースおよび、もっとも好ましくはセルロース−アセテート誘導体である。ダイアフィルトレーションは４容量の復元バッファー（前記参照）に対して実施される。
【００４８】
可溶性蛋白質に関する復元収率は概括的に８０％を超える。
【００４９】
３．希釈による復元
この場合には、異なる操作法を相互の代わりに使用することができる：
ａ）カオトロープ剤の存在下での変性インターロイキン−４の還元、
ｂ）希釈後のインターロイキン−４の還元、
ｃ）希釈中のインターロイキン−４の還元。
【００５０】
操作法は正しく折り畳まれたインターロイキン−４の最終収率および総蛋白質の最終回収率を規定することが見いだされた。他方で、システイン塩酸およびシステイン塩基はほぼ同様な復元収率を与える。システインの濃度は好ましくは０．１ｍＭと１０ｍＭの間、より好ましくは０．４ｍＭと２ｍＭの間である。最初の蛋白質濃度は、回収された、誤って折り畳まれたコンホーマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）に対する、正しく折り畳まれたものの比率がＲＰ−ＨＰＬＣもしくはＢａｉＣｏｒｅ−アッセイにより測定されて、最大になるようなものである。正しく折り畳まれたコンホーマーの最大収率をもたらすインターロイキン−４の好ましい濃度は約１０ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌ、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは２５０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌの間の範囲内にある。方法３ｃは最大量の正しく折り畳まれたインターロイキン−４（概括的に約３０〜３５％）および総蛋白質の最大回収率（概括的に約１００％）をもたらす。
【００５１】
４．人工的シャペロン系
一連の酵素の構造復元に対し人工的シャペロン系が記載された（Ｇｅｌｌｍａｎ他（１９９４）：米国特許第５  ５６３  ０５７号、１９９４年１０月出願、Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ；Ｓｉｖａｋａｍａ他（１９９９）：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．４４３（２）：２１５−２１９）。変性インターロイキン−４を含む適当な洗浄剤複合体、第２段階において蛋白質−洗浄剤−複合体から洗浄剤を取り除く適当な「ストリッピング」剤および酸化還元系（前記参照）をインターロイキン−４の構造復元を達成するための最適な濃度で選択しなければならない。適切な洗浄剤はイオン性、非イオン性から双性イオン洗浄剤までにわたる。前記のように、インターロイキン−４封入体は更に人工的シャペロン系による構造復元期間中にも使用することができる一連の洗浄剤中で効果的に可溶化させることができる。グアニジニウム塩が封入体を可溶化するために使用される場合には、例えばナトリウムドデシルスルフェートのようなアニオン洗浄剤はグアニジニウム−アルキル塩の沈殿のために使用することができない。
【００５２】
好ましい洗浄剤はカチオン性および双性イオン洗浄剤であり、より好ましいものは双性イオン洗浄剤であり、更により好ましいものはＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−８〜Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１６であり、もっとも好ましいものはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４である。変性インターロイキン−４を効果的に可溶
化する好ましい濃度はそれぞれの洗浄剤のＣＭＣ以上に位置する。例えばＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（ＣＭＣ０．２〜０．４ｍＭ）は０．１〜１０ｍＭで、より好ましくは０．５〜５ｍＭ、もっとも好ましくは１〜４ｍＭで変性インターロイキン−４を可溶化する。
【００５３】
適した「ストリッピング」剤は洗浄剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に影響を与え（ｅｆｆｅｃｔ）、それにより洗浄剤−蛋白質相互作用に影響を与えるあらゆる化合物である。これらの化合物は好ましくは、両親媒性を示し、それにより１分子中で親水性および疎水性部分を露出する。このような人工的シャペロン系において環式デキストリン（例えばχ−もしくは好ましくはα−、β−シクロデキストリンのような）、または線状デキストリン（例えばデキストリン−１５、デキストリン−２０もしくは好ましくはデキストリン−１０のような）を好ましく使用することができる。
【００５４】
更に、構造復元中にインターロイキン−４の凝集動態に影響を与えるその他の化合物を人工的シャペロン系に添加することができる。適した化合物は好ましくは、１０ｍＭとそれぞれの塩の溶解限度の間の濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＫＩ、ＫＳＣＮ、グアニジニウム−塩、尿素もしくはその誘導体のような）である。その他の適した化合物には、アミノ酸（例えばアルギニンもしくはロイシンのような）、ベタインもしくはスルホベタイン、ポリ（エチレン）−グリコールまたは低分子量アルコールが含まれる。アミノ酸、ベタインおよびスルホベタインの場合には、濃度の好ましい範囲は０．０５と１Ｍの間である。ポリ（エチレン）−グリコールは０．１ｍＭ〜１０ｍＭの間、好ましくは０．５〜１ｍＭの間の濃度で添加することができる。
【００５５】
蛋白質濃度は０．０１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．５ｇ／Ｌの範囲内にある。
【００５６】
５．その他の方法
構造復元は具体的には約＋０℃〜４５℃で、好ましくは約２０〜４０℃で、より好ましくは約２３〜３７℃で、更により好ましくは約２５〜３０℃で、少なくとも約１時間実施される。
【００５７】
構造復元のための出発物質として、還元された可溶化インターロイキン−４を使用する場合には、酸化を実施するために空気もしくは酸素ガスのような酸素源を混入するかまたは構造復元バッファー中に導入する。酸素は、インターロイキン−４もしくは他のあらゆる試薬が構造復元バッファーに添加される前を含むすべての時点で構造復元バッファー中に存在することができる。
【００５８】
導入される酸素源の量は、もしあるとすれば、例えば使用される容器の種類、インターロイキン−４の濃度、酸素源の種類、存在する重金属の種類および量、存在する還元剤の種類および量並びに存在する残留カオトロープ剤の種類および量並びに構造復元バッファーのｐＨによるであろう。概括的に酸素は撹拌装置を使用して能動的に（例えば、ヘッドスペース中の空気として）導入されるであろう。あるいはまた、空気はスパージャーにより導入することができる。構造復元バッファー中に存在する酸素の量は好ましくは、約１〜４８時間、より好ましくは約１〜２４時間、もっとも好ましくは約１〜１８時間にインターロイキン−４のシステイン残基の酸化を可能にするのに十分でなければならない。大規模の構造復元にはより高い酸素散布率が必要である。
【００５９】
構造復元のための出発物質としてスルフィト分解された、可溶化インターロイキン−４を使用する場合には、望ましくない酸化反応を抑制するために、適当な金属キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス−（
２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）もしくはトランス−１，２−ジアミノ−シクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）のような）を構造復元バッファーに添加することができる。この場合、ジスルフィド橋を形成するためのシステインの酸化に酸素供給は必要ではない。
【００６０】
インターロイキン−４の凝集を最小にするために、構造復元中にインターロイキン−４の凝集動態に影響を与えるその他の化合物を構造復元バッファーに添加することができる。適した化合物および／もしくは化合物の組み合わせ物は別の発明に記載されている（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｊ（２００１）：欧州特許第０１１２７３７３．７号、２００１年１１月２２日認可）。
【００６１】
インターロイキン−４を構造復元後、個別のもしくはあらゆる組み合わせの以下の方法がより高い純度を得るために適した精製法の例である：親和性、金属キレート、イオン交換もしくはヒドロキシアパタイトカラム上の分別、沈殿、限外濾過、逆相低速度、中速度もしくは高速度クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５  Ｓ、Ｍｏｎｏ  Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＥＭＤ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）、Ｈｙｐｅｒ−Ｄ  ＣＭ、Ｈｙｐｅｒ−Ｄ  Ｓ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０−Ｓ（ＴｏｓｏＨａａｓ）のようなイオン交換樹脂上クロマトグラフィー、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  Ｈｙｄｒｏｘｉａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）、セラミックヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）、ヒドロキシアパタイト（Ｍｅｒｃｋ）のようなヒドロキシアパタイト樹脂上クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｂｉｏｓｅｃ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）を使用するゲル濾過、Ｃ４−、Ｃ８−もしくはＣ１８−リガンド、例えばＶｙｄａｃ  Ｃ８、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、ＹＭＣ  Ｃ４、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  Ｃ１８、Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ１８を含むシリカ基剤の逆相樹脂上クロマトグラフィー、Ｓｏｕｒｃｅ  １５  ＲＰＣ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  ＲＰＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−１０００、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００  ＨＲ、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００  ＳＤ（ＴｏｓｏＨａａｓ）、小孔もしくは中孔もしくは大孔ＲＰＣ−樹脂（Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｌａｂｓ）、ＰＲＰ−３（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）のようなポリマー基剤の逆相樹脂（ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマー）上クロマトグラフィー。
【００６２】
好ましい態様において、構造復元プールは約２．５〜８、好ましくは３〜５、より好ましくは３にｐＨ調整され、デプスフィルターにより精製され、そして低速度逆相カラム上に直接充填される。充填バッファーは好ましくは、約０．１％〜１％の、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、酢酸もしくは、より好ましくはリン酸のような酸を含む。溶離バッファーは好ましくは約５０〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは７０〜８０％のアルコール性もしくは極性非プロトン性溶媒および約０．１％〜１％の、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、酢酸もしくはより好ましくはリン酸のような酸を含んで成る。溶媒は好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、１−もしくは２−プロパノール、ｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたはアセトニトリルである。更により好ましくは溶媒はエタノールである。
【００６３】
次にカラムを好ましくは約３のｐＨのバッファーで洗浄して、未結合の不純物を除き、インターロイキン−４を直線状勾配もしくは増加する百分率の溶離バッファーで溶離する。より好ましくは勾配は１段階（２０％溶離バッファー）および直線状増加部分（２０〜９０％溶離バッファー）から成る。
【００６４】
親和性もしくはＩＭＡＣもしくは好ましくは中速逆相カラムのいずれかからのプールはｐＨ５．５〜９、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５に調整し、デプスフィルターし、好ましくはＵｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト、通常のヒドロキシアパタイトもしくはより好ましくはセラミックヒドロキシアパタイトのようなヒドロキシアパタイトカラム上に適用される。好ましくはリン酸塩バッファーである出発バッファーで洗浄後、カラムを増加するリン酸塩勾配で溶離する。溶離バッファーは３００〜１０００ｍＭのリン酸塩、好ましくは５００〜８００ｍＭ、より好ましくは５００ｍＭを含む。勾配の第１の部分は階段溶離（１８％溶離バッファー）を伴い、そして第２の部分は６０％までの直線状増加の溶離バッファーを伴う。最後にカラムを１００％の溶離バッファーで洗浄する。
【００６５】
本発明の好ましい態様において、中速逆相クロマトグラフィー後のプールをスルホン酸リガンドもしくはスルホプロピルリガンドを含むポリマーのカチオン交換樹脂（例えばＳｏｕｒｃｅ  Ｓ、ＴｏｓｏＨａａｓのＴＳＫ  ＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＬａｂｓのＰＬ−ＳＣＸ、ＢｉｏＲａｄのＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＰｏｒｏｓ  ＨＳ、ＢｉｏｐｅｐｒａのＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｓもしくは同様の樹脂）上に直接適用する。カラムを希リン酸バッファー（ｐＨ３）で洗浄し、生成物を同一バッファー中で塩化ナトリウムの勾配（１Ｍまで）を適用して溶離する。
【００６６】
前記のもののような部分的に精製された工程プール（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｐｏｏｌ）で出発して、インターロイキン−４およびそのバリアントの混合物を逆相液体クロマトグラフィーカラム上に充填する。充填溶媒は好ましくは塩酸、硫酸、リン酸、酢酸もしくはより好ましくはトリフルオロ酢酸のような希酸である。カラムは好ましくは約５〜４０μｍ、より好ましくは約１０〜２０μｍの粒径および約１００〜５０００Åの孔径を有する媒質を充填する。シリカの逆相媒質の場合には、Ｃ４−、Ｃ８−もしくはＣ１８−アルキルの側鎖を使用することができる。より好ましくは、ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマー基剤の合成逆相媒質が使用される。
【００６７】
カラム上に充填されるインターロイキン−４の量は概括的に約０．０１〜４０ｇの蛋白質／１Ｌの樹脂、より好ましくは約０．０２〜２０ｇの蛋白質／１Ｌの樹脂、そしてもっとも好ましくは１〜１２ｇの蛋白質／１Ｌの樹脂である。本発明の工程の第２段階において、インターロイキン−４は約２〜７、好ましくは約２〜４のｐＨでカラムから溶離される。溶離バッファーは好ましくは約５０〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは７０〜８０％のアルコール性もしくは非極性、非プロトン性の溶媒および約０．１％〜１％の、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸もしくはより好ましくはトリフルオロ酢酸のような酸を含んで成る。溶媒は好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、１−もしくは２−プロパノール、ｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたはアセトニトリルである。溶媒はより好ましくはエタノールである。
【００６８】
次にカラムを好ましい３のｐＨのバッファーで洗浄して未結合不純物を除き、インターロイキン−４を直線状勾配もしくは増加百分率の溶離バッファーで溶離する。勾配は１段（２０％溶離バッファー）および直線状増加部分（２０〜９０％溶離バッファー）から成る。
【００６９】
溶離温度は、より高いもしくはより低い温度を使用することはできるが、概括的に約２０℃〜６０℃である。温度は好ましくは約２０℃〜３０℃に維持される。
【００７０】
インターロイキン−４をカラムから溶離後、以下のように医薬組成物に適切に調製され
る。溶出液はｐＨ３〜８、より好ましくは約３〜５にｐＨ−調整され、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロースおよびより好ましくはセルロース−アセテートおよびその誘導体のような適した限外濾過膜をとおして濾過する。蛋白質の濃度は残留物容量の最終濃縮中に約１〜６０ｇ／Ｌ、好ましくは約５〜２０ｇ／Ｌまでに調整する。調製物バッファーは医薬として許容できる担体、すなわち使用される用量および濃度で受益者に無毒であり、調製物の他の成分と相容性であるものから成る。調製物は例えばポリペプチドに有害であることが周知の酸化剤およびその他の化合物を含まない。最終調製物は液体もしくは凍結乾燥した固体であることができる。
【００７１】
治療的投与に使用することができるインターロイキン−４は滅菌でなければならない。滅菌は滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンカットオフ膜）をとおす濾過により容易に達成される。治療的インターロイキン−４組成物は概括的に滅菌アクセス口を有する容器、例えば皮下注射針により貫通できるストッパーを備えた静脈内溶液ギャブもしくはバイアル中にいれる。
【００７２】
インターロイキン−４は通常、１回量もしくは複数回用量の容器、例えば水溶液として、もしくは再製造のための凍結乾燥調製物として密封されたアンプルもしくはバイアル中に保存されるであろう。凍結乾燥調製物の１例として、５ｍＬのバイアルに滅菌濾過したインターロイキン−４水溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）１ｍＬを充填し、生成される混合物を適当な凍結乾燥プログラムを使用して凍結乾燥する。次に注射用静菌水を使用して凍結乾燥インターロイキン−４を再製造することにより注射液を調製する。
【００７３】
本発明は、本発明を具体的に示すことを意図し、その範囲を限定することを意図しない以下の実施例についてより完全に理解されるであろう。すべての文献および特許の引用は引用により明白に取り入れられている。
【００７４】
Ｃ．実施例
【実施例１】
【００７５】
酵素によるおよび機械的処理（高圧ホモジナイゼーション）を使用する方法による細胞分解
ＩＬ−４の封入体を含む５０ｇの湿った大腸菌細胞を２５０ｍＬの分解バッファー（０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ）中で洗浄し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）する。細胞ペレットを２５０ｍＬの分解バッファー中に再懸濁させ、リゾチーム１２ｍｇ（〜１ｍｇリゾチーム／１ｇ細胞乾燥重量）を添加し、室温で３０分間インキュベートする。次に前以て処理された懸濁液を６０〜７０ｍＬ／分の流量で、５００〜１０００バールのホモジナイズ圧で実験室規模のホモジナイザー（例えばＳｔａｎｓｔｅｄ，Ｂｒａｎ  ＆  Ｌｕｅｂｂｅ，Ｍａｎｔｏｎ  Ｇａｕｌｉｎ）中でホモジナイズする（３〜５サイクル）。分解効率を説明の節で言及されたいずれかの手段により監視する。具体的には８５％を超える細胞が分解される。
【実施例２】
【００７６】
遠心分離および／もしくはクロスフロー微量濾過による封入体の精製
放出されたＩＬ−４封入体を含む分解細胞の懸濁液（実施例１）を遠心分離（８０００ｇ、１５分）し、封入体のペレットを２５０ｍＬのＩＢ洗浄バッファー（０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４）中に再懸濁させる。この洗浄手順を更に３〜５回繰り返す。洗浄したＩＢを遠心分離により回収する（前記参照）。
【００７７】
更に、ＩＬ−４を含む封入体をクロスフロー微量濾過により洗浄することができる。こ
の目的のためには、適当な微量濾過スクリーンチャンネル膜（例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ、０．４５μ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、広巾チャンネル膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ；Ｐａｌｌ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）もしくはコイル状中空繊維モジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧｍｂＨ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）を備えた適当なクロスフロー装置を使用することができる。精製された封入体はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定されると＞８０％の純度である。
【実施例３】
【００７８】
ＩＬ−４の可溶化および化学的修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
洗浄ＩＢ（実施例２）を１２５ｍＬの可溶化バッファー（７ＭのグアニジンＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７）中に再懸濁させる。ジスルフィド橋のスルフィト分解を４ｇのナトリウムスルファイト（室温で撹拌しながら２４０分間インキュベート）および１．３ｇのカリウムテトラチオネート（室温で撹拌しながら３０分間インキュベート）を添加することにより実施する。スルフィト分解後、不溶性物質を遠心分離（８０００ｇ、１５分間）により除き、過剰のスルファイトおよびテトラチオネートを適当な限外濾過膜（例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）を使用して、ＧｕＨＣｌ−透析バッファー（４Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７）に対するダイアフィルトレーションにより除去する。
【実施例４】
【００７９】
可溶化され化学的に修飾されたＩＬ−４の金属−キレート親和性精製
Ｓ−スルホン化ＩＬ−４（実施例３）の金属−キレート親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）をＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン）および適当なゲル（例えばＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ−ＩＭＡＣ−ゲル；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン）上で実施することができる。充填操作法でゲル容量を３Ｌに調節する。最大圧を１バールに設定する。流量を充填操作法において１５０ｃｍ／時間、そして拡大操作法においては３００ｃｍ／時間に調節する。ＩＭＡＣ−バッファーＡ（４ＭのグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭの二ナトリウム水素リン酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中でクロマトグラフィーを実施する。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ−ＩＭＡＣゲルの動力学的結合能は約１０ｇ蛋白質／ゲル１Ｌである。ＩＬ−４の溶離のためには、ＩＭＡＣ−バッファーＢ（４ＭグアニジニウムＨＣｌ、５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．０）を使用する。ニッケルイオンのストリッピングをＩＭＡＣ−バッファー（４ＭのグアニジンＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を使用して実施する。ＩＬ−４の結合の前にＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ−ＩＭＡＣにニッケルイオンを充填する（蒸留水中８．５ｇ／１ｌのニッケル−アセテート四水和物）。イミダゾール−プールの画分を含む生成物を合わせると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色）により判定されると約９０％の生成物純度をもたらす。ＩＬ−４の平均回収率は概括的に８０％を超える。
【実施例５】
【００８０】
化学的に修飾されたＩＬ−４の復元
スルフィト分解したＩＬ−４の構造復元を異なる方法を使用して実施することができる：
１．透析による構造復元
実験室規模
構造復元バッファーに対する透析による構造復元の前に、可溶化され、スルフィト分解された封入体（実施例３）をＧｕＨＣｌ−希釈バッファー（４Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．６Ｍアルギニン−ＨＣｌ、５０ｍＭのリン酸塩バッファー、ｐＨ７）で７．５倍に希
釈すると、１．８Ｌの最終容量および０．２〜０．３ｇ／Ｌの蛋白質濃度をもたらす。次に１．２１ｇ／ＬのＬ−システインを添加する（２．２ｇ、３０分間、撹拌）ことによりスルファイト保護基を除去する。３６Ｌの構造復元バッファー（５０ｍＭのリン酸塩バッファー、ｐＨ６．５、０．６Ｍのアルギニン−ＨＣｌ）に対して１０℃で２倍の透析（１６時間および６時間）により復元を実施する。濾過された（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  ３００、０．２２μ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）透析物の容量は１．８７Ｌである。可溶性蛋白質に関する復元収率は概括的に８０％を超える。３０〜４０ｍｇ／Ｌの正確に折り畳んだＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの復元収率を得る。
【００８１】
大規模
大規模透析は特別に設計されたステンレス−鋼のタンクを使用して実施することができる。２基のタンク（各約３００Ｌ容量）をポンプにより連結した。第２のポンプはバッファー貯蔵タンク中にバッファーを配送した。タンクの入り口は底部にあり、他方、出口は上部に配置された。透析バッグをタンク中に浮かべてバッファー溶液中につるすためにタンク内に２本のステンレス鋼の棒を使用した。バルク容量のバッファーを１２００−Ｌの撹拌タンク中に保存し、２基のタンク中に連続的にポンプで送った。バッファーを１０℃に維持した。復元の９６時間中、温度およびポンプの動態をオンラインでモニターした。
【００８２】
変性された、スルフィト分解されたＩＬ−４（実施例３）を２００ｍｇ／Ｌの最終蛋白質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）に希釈する。次に、Ｌ−システインを１５ｍＭの最終濃度（１．８ｇ／ｌ、システイン残留物に比較すると約１８０倍過剰）まで添加する。蛋白質懸濁液を透析バッグ中に充填し（約１ｍ）、それをプラスチックのクリップを使用して閉める。透析バッグをバッファーのための入り口および出口並びに透析バッグを固定するための金属棒を備えたステンレス鋼のタンク中に吊るす。透析バッファー（１２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、７ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．１）を使用して、２０倍容量（１２５０Ｌ）の、希釈され、変性された化学修飾されたＩＬ−４に対する透析により復元を実施する。透析２日後、バッファーを交換し、透析を更に４８時間継続する。可溶性蛋白質に関する復元収率は概括的に８０％を超える。３０〜４０ｍｇ／Ｌの正確に折り畳んだＩＬ−４のＲ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの復元収率を得る。
【００８３】
２．ダイアフィルトレーションによる構造復元
ダイアフィルトレーションによる構造復元を５〜１０ｋＤのカットオフ膜（例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ドイツもしくはＯｍｅｇａスクリーン−チャンネル５ｋＤ、Ｆｉｌｔｒｏｎ，ドイツ）を使用して実施する。５０ｍＭのリン酸塩もしくは４Ｍのグアニジニウム塩酸（ＧｕＨＣｌ）を含むトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７）中に溶解されたスルフィト分解ＩＬ−４（実施例３）をダイアフィルトレーション装置に適用する。ＧｕＨＣｌの除去は５０ｍＭのリン酸塩もしくはＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７）および０．６ＭのＬ−アルギニンを含む復元バッファー６容量に対するダイアフィルトレーションにより実施する。可溶性蛋白質に関する復元収率は概括的に８０％を超える。野生型ＩＬ−４および異なる突然変異蛋白質に関する詳細についてはＤｏｍｉｎｇｕｅｓ他（２０００）：Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８４：２１７−２３０を参照されたい。
【００８４】
３．希釈による構造復元
この場合は、異なる操作法を代わりに使用することができる：
ａ）カオトロープ剤、例えばグアニジニウム塩酸の存在下での変性ＩＬ−４およびその突然変異蛋白質の還元、
ｂ）希釈後のＩＬ−４およびその突然変異蛋白質の還元、
ｃ）希釈中のＩＬ−４およびその突然変異蛋白質の還元。
【００８５】
操作法は正しく折り畳まれたＩＬ−４の最終収率および総蛋白質の最終回収率を規定することが見いだされた。他方で、Ｌ−システイン塩酸およびＬ−システイン塩基はほぼ同等な復元率を与える。方法３ｃは最大量の正しく折り畳まれたＩＬ−４（それぞれの突然変異蛋白質に基づいて概括的に１０〜３５％）および最大の総蛋白質回収率（約１００％）をもたらす。
【００８６】
復元法３ｃは５０〜２５０ｍｇ／Ｌの最終蛋白質濃度まで０．６ＭのＬ−アルギニン−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．４〜２．４ｍＭのＬ−システイン（蛋白質濃度に応じて）および１ｍＭのＥＴＤＡから成る復元バッファー中にＳ−スルホン化ＩＬ−４（実施例３参照）を希釈することにより実施する。復元混合物を室温で穏やかに撹拌し、復元反応速度を時間間隔をおいて採取された試料のＲＰ４−ＨＰＬＣ分析によりモニターする。２４時間後、復元反応は完了し、更に処理する。
【００８７】
４．人工的シャペロンを使用する復元
実施例１、実施例２および実施例３に記載のように調製されたＳ−スルホン化ＩＬ−４は以下の復元バッファー：５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、１．２ｍＭのＬ−システイン、０．２ＭのＬ−アルギニンもしくは０．４ＭのＬ−シジンまたは０．４Ｍのナトリウムもしくはアンモニウムサルフェート、中に希釈することによる人工的シャペロンを使用して最良に復元することができる。最終蛋白質濃度は１０と１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜５００ｍｇ／Ｌの間で変動することができる。蛋白質−洗浄剤−複合体の形成は３時間実施される。次に、β−シクロデキストリンを復元混合物に添加すると、６（１２ｍＭ）のβ−シクロデキストリン／洗浄剤のモル比を与える。復元反応はβ−ＣＤ−添加の４時間後に終結する（総復元時間：７〜８時間）。復元は実施例９に記載のようにＲＰ４−ＨＰＬＣによりモニターされる。可溶性蛋白質の総回収率は８５％より良い。総復元率は約１８％である。４５ｍｇ／Ｌの正しく折り畳んだＩＬ−４のＲ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの復元収量が得られる。
【実施例６】
【００８８】
復元ＩＬ−４の濃縮
ＩＬ−４の復元中に生成された比較的高い容量を更なる工程段階をとおして濃縮しなければならない。原則的に、これは限外濾過によりもしくはクロマトグラフィーにより実施することができる。双方の方法に対して以下の節に例を与える。
ａ）限外濾過／ダイアフィルトレーション
復元ＩＬ−４の濃縮は例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）もしくはＯｍｅｇａ  ５ｋＤ（Ｆｉｌｔｒｏｎ，ドイツ）のような限外濾過膜（カットオフ：５〜１０ｋＤ）を備えた適切な濾過装置を使用して実施する。約３００ｍｇ／Ｌの最終蛋白質濃度に容量を減少後、生成物溶液を４容量の復元バッファーに対してダイアフィルトレーションする（実施例５．１参照）。蛋白質の回収率は概括的に９０％以上である。
ｂ）中速度逆相クロマトグラフィー
カラム（例えば１００ｍＬの床容量）にポリマー基材の逆相樹脂（例えばＳｏｕｒｃｅ
３０  ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン）、ＣＧ−１０００（ＴｏｓｏＨａａｓ、ドイツ）のような）もしくはもう１種の同等な大きい空隙のポリマーＲＰＣ樹脂（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｌａｂｓ  ｌａｒｇｅ  ｐｏｒｅ、１０〜２５μもしくは５０〜７５μの粒径、４０００Åまでの孔径）を充填する。カラムをバッファーＡ（トリフルオロ酢酸もしくはＨ３ＰＯ３のような０．１％の酸）で平衡にする。デプスフィルターした（例えばＳｅｉｔｚ  Ｂｉｏ４０／２０カスケード、ＩＬ−４の定量的回収）復元用混合物をカラムに充填しそして洗浄後、直線状勾配のエタノール（
１カラム容量の溶離剤Ｂ２０〜５０％、７カラム容量の溶離剤Ｂ５０〜８０％）もしくは適当なその他の有機溶媒を使用して生成物を溶離する。生成物を含む画分を分析的逆相ＨＰＬＣにより分析し、正しく折り畳んだアイソフォームに関して５０％を超える純度に従ってプールする。主要プール中のＩＬ−４の回収率は具体的には８８％まで良好である。主要プール中のＩＬ−４の純度は分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより判定されると概括的に＞５０％である。
【実施例７】
【００８９】
［実施例７ａ］セラミックヒドロキシアパタイトによる部分的に精製されたＩＬ−４の中速度クロマトグラフィーによる精製
実施例６ｂに従って調製された主要プールの希釈後（蒸溜水で１：５）、塩基性リン酸塩（例えばＫ２ＨＰＯ４）によりｐＨを６．５（±０．５）に調整する。生成される溶液をデプスフィルター（例えばＳｅｉｔｚ  Ｂｉｏ４０／２０）をとおして濾過し、ＩＬ−４の定量的な回収を得る。出発物質が実施例６ａに従って調製された場合は、５ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ６．５（±０．５））で溶液の伝導度を＜５ｍＳ／ｃｍに調整する。前記リン酸塩バッファーで前以て平衡化されたセラミックヒドロキシアパタイトを充填されたカラム（１４ｃｍφ×１０．５ｃｍ高さ；タイプ−ＩＣＨＡ、ＢｉｏＲａｄ、ドイツ）をとおして２００ｃｍ／時間の流量で溶液をポンプで送る。ＯＤ２８０信号が基底線に到達するまで、約３カラム容量の５ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ６．５（±０．５））でカラム中の未結合蛋白質を洗浄する。直線状勾配のリン酸塩（２０カラム容量）を使用することにより２００ｃｍ／時間の流量で生成物を溶離する。１Ｌの画分を収集し、ＩＬ−４を含むものを分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより同定し、合わせる。主要プール中のＩＬ−４の回収率は具体的には８５％までも良好である。ＣＨＡプール中のＩＬ−４の純度は分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより判定されると＞７０％である。
【００９０】
［実施例７ｂ］カチオン交換クロマトグラフィーによる一部精製されたＩＬ−４の中速度クロマトグラフィー精製
実施例６に従って調製されたＩＬ−４のプールされた活性溶液の伝導度を脱イオン水で＜５ｍＳ／ｃｍに調整する。２０ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ３）で前以て平衡化されたＳｏｕｒｃｅ  １５  Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５μ粒径；カラムディメンション：１４ｃｍφ×１０ｃｍ高さ）を充填されたカラムをとおして溶液を２００ｃｍ／時間の流量でポンプで流す。ＯＤ２８０信号が基底線に到達するまで、約３カラム容量の２０ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ３）でカラム中の未結合蛋白質を洗浄する。直線状ＮａＣｌ勾配（２０カラム容量）を使用することにより２００ｃｍ／時間の流量で生成物を溶離する。１Ｌの画分を収集し、ＩＬ−４を含むものを分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより同定し、合わせる。主要プール中のＩＬ−４の回収率は具体的には７５％までも良好である。カチオン交換プール中のＩＬ−４の純度は分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより判定されると＞７０％である。
【実施例８】
【００９１】
ＩＬ−４の最終クロマトグラフィー精製
実施例７ａもしくは実施例７ｂからのＩＬ−４の活性プールを濾過し（例えばＳａｒｔｏｂｒａｎ  ３００、０．２２μ）、ＨＰＬＣバッファーＡ（０．１％ＴＦＡ／水）で前以て平衡化されたＳｏｕｒｃｅ  １５  ＲＰＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５μ粒径；カラムディメンション：３．２ｃｍ×１２ｃｍ）上に適用する。次に未結合物質を溶離（３カラム容量）し、勾配（１６％エタノール、０．１ＣＶ、１６〜４０％エタノール、３ＣＶ、４０〜６４％エタノール、７ＣＶ）を使用して２２５ｃｍ／時間の流量でＩＬ−４を溶離する。画分（１０ｍＬ）をＨＰＬＣバッファーＡで適当に希釈し、分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣを使用して正しく折り畳んだ蛋白質を分析する。主要プール中のＩＬ−４の回収率は具体的には８７％までも良好である。ＲＰＣプール中のＩ
Ｌ−４の純度は分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより判定されると概括的に＞８０％である。
【実施例９】
【００９２】
分析法
正しく折り畳んだＩＬ−４およびその突然変異蛋白質を含む画分を決定するために使用されるアッセイはすべて通常のものである。精製ＩＬ−４の測定における２８０ｎｍのＵＶ吸収に対してＡ２８０光学密度単位（ＯＤ）はアミノ酸組成分析により１．６ｍｇに等しく、Ｌｏｗｒｙの方法により２．０ｍｇに等しい。アミノ酸置換物（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に応じて、異なる突然変異蛋白質に異なる因子を適用しなければならない。Ｌｏｗｒｙの方法はＬｏｗｒｙ他（１９５１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５に記載されている。分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣを１．０ｍｌ／分の流量でＹＭＣイソ−ブチルＣ４カラム（５μ、２００Å、４．６×２５０ｍｍ）上で実施する。検出波長は２１０ｎｍである。バッファーＡは０．１％ＴＦＡであり、バッファーＢは７０％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡである。勾配は以下：０〜２分、４０％Ｂ；２〜１９．５分、４０〜８５％Ｂ；１９．５〜２０分、８５％〜１００％Ｂ；２０〜２１分、１００％Ｂ、２１〜２２分、１００〜４０％Ｂ、２２〜２５分、４０％Ｂ（再平衡）、のように実施する。その他のＩＬ−４突然変異蛋白質は僅かに異なる溶離動態を示す。アミノ酸置換物に応じて、ＩＬ−４突然変異蛋白質は野生型ＩＬ−４に比較してより早くもしくはより遅く溶離するかも知れない。
【実施例１０】
【００９３】
方法＃１を使用して生成された最終ＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの生化学的特徴付け
実施例１、２、３、４、５．１、６ａ、７ａおよび８に記載の方法を使用して、ＩＬ−４のＲ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの最終生成物を調製し、生化学的に特徴を調べた。Ｃ−およびＮ−末端配列分析並びにアミノ酸分析により分子の同定が示された。第１サイクルの％−ＰＴＨ−メチオニンとして表わされる平均均一度は９４％であった。マトリックス支援レーザー脱離分光分析（ＭＡＬＤＩ）を使用して分子量を測定した。ＩＬ−４Ｒ１２１Ｄ
Ｙ１２４Ｄ突然変異蛋白質の平均分子量は１４．９９５ダルトン（ＳＴＤ：±３、ｎ＝７）に決定し、予測分子量（１４．９９８ダルトン）およびＭＡＬＤＩ法の精度に良好に一致した。逆相（Ｃ１８−樹脂）高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ１８−ＨＰＬＣ）を高度分解法として使用して、最終生成物の純度を測定し、９０％であった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン）および中性ｐＨの希釈リン酸塩バッファー中０．６ＭのＮａＣｌを使用してゲル透過クロマトグラフィーを実施した。ダイマー／オリゴマーの量は１％より十分少なく、比較的小さい分解生成物の量は検出限界（０．０４％）より下であった。エンドトキシン含量は薬局方ＬＡＬアッセイに従って測定した。平均エンドトキシン含量は０．２４ＥＵ／ｍｇ（ＳＴＤ：±０．３４，ｎ＝１０）であった。最終生成物の染色体のＤＮＡ−含量は閾値ＤＮＡアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）の検出限界（８ｐｇＤＮＡ／蛋白質１ｍｇ）より下であった。方法＃１から誘導されたＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの完全な拮抗作用はインビボで（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ  ＡＢ，Ｆｏｒｔｅ  ＣＰ，Ｋａｓｐｅｒ  ＪＪ，ＳａｎｃｈｅｚＰｅｓｃａｄｏｒ  Ｌ，Ｗｅｔｚｅｌ  Ｍ，Ｇｕｎｄｅｌ
Ｒ，Ｇｒｅｖｅ  ＪＭ（１９９８）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５（１６），９４５４−９４５８；Ｍｏｒｔｏｎ  Ｍ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｐ，Ｘｕ  Ｊ，Ｇｏｒｉｎａ  Ｓ，Ｒｏｃｚｎｉａｋ  Ｓ，Ｆｉｔｃｈ  Ｎ，Ｇｕｎｄｅｌ  Ｒ（１９９９）：Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９（３．Ｓｕｐｐｌ．）：Ａ６６０およびＨａｒｒｉｓ  Ｐ，Ｌｉｎｄｅｌｌ  Ｄ，Ｆｉｔｃｈ  Ｎ，Ｇｕｎｄｅｌ  Ｒ（１９９９）：Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９（３．Ｓｕｐｐｌ．）：Ａ２３０）そしてインビトロで受容体結合アッセイ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）：Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０：２５２−２
６１，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ９４：１６５７−１６６２）およびルシフェラーゼリポーター細胞培養アッセイ双方を使用して示された。ｋｏｎは４．３Ｅ＋０７［Ｍ−１ｓ−１］でありｋｏｆｆは４．９Ｅ−１１［Ｍ−１］であった。ＩＬ−４のＲ１２１Ｄ  Ｙ１２４ＤのＩＣ５０値は６ｎＭであった。
【００９４】
方法＃２を使用して生成された最終ＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの生化学的特徴付け
実施例１、２、３、５．３ｃ、６ｂ、７ａおよび８に記載の方法を使用してもまた、ＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄの最終生成物を調製し、生化学的に特徴を調べた。Ｃ−およびＮ−末端配列分析並びにアミノ酸分析により分子の同定が示された。第１サイクルの％−ＰＴＨ−メチオニンとして表わされる平均均一度は９４．６％であった。マトリックス支援レーザー脱離分光分析（ＭＡＬＤＩ）を使用して分子量を測定した。ＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄ突然変異蛋白質の平均分子量は１４．９９９ダルトン（ＳＴＤ：±６、ｎ＝１１）に決定され、それは予測分子量（１４．９９８ダルトン）およびＭＡＬＤＩ法の精度に良好に一致した。逆相（Ｃ１８−樹脂）高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ１８−ＨＰＬＣ）を高度分解法として使用して、最終生成物の純度を測定し、９２％であった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデン）および中性ｐＨの希釈リン酸塩バッファー中０．６ＭのＮａＣｌを使用してゲル透過クロマトグラフィーを実施した。ダイマー／オリゴマーの量は＜０．２％より十分下であり、比較的小さい分解生成物の量は検出限界（０．０４％）より下であった。エンドトキシン含量は薬局方ＬＡＬアッセイに従って測定した。平均エンドトキシン含量は０．０３ＥＵ／ｍｇ（ＳＴＤ：±０．０１３，ｎ＝１１）であった。最終生成物の染色体のＤＮＡ−含量は閾値ＤＮＡアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）の検出限界（８ｐｇＤＮＡ／蛋白質１ｍｇ）より下であった。方法＃２から誘導されたＩＬ−４のＲ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄ調製物の拮抗作用は受容体結合アッセイ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）：Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０：２５２−２６１，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ  ９４：１６５７−１６６２）およびルシフェラーゼレポーター細胞培養アッセイ双方により決定された。ｋｏｎは４．１Ｅ＋０７［Ｍ−１ｓ−１］でありｋｏｆｆは４．７Ｅ−１１［Ｍ−１］であった。ＩＬ−４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４ＤのＩＣ５０値は４ｎＭであった。
【実施例１１】
【００９５】
ルシフェラーゼレポーター細胞培養アッセイ
レポーター遺伝子細胞株、Ｄ２−４９細胞をＢＬ−２細胞、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株中へのＩμ／Ｌｕｃ．遺伝子の安定な導入（ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）により確立した。Ｄ２−４９細胞を１０％コウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）、１００μｇ／１ｍｌのストレプトマシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）、１００ＩＵ／１ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）および８００μｇ／１ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を補給されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。Ｄ２−４９細胞を３〜４日毎に継代培養した。ルシフェラーゼの導入のために、３×１０６細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁液１００μｌを９６ウェルプレートのウェルに入れ、別記されない限り組換えヒトＩＬ−４を伴ってもしくは伴わずに２４時間培養した。
【００９６】
ＡＴＰとのルシフェリンの混合物はルシフェラーゼに反応してグロータイプの蛍光信号を発生する原理に基づきルシフェラーゼレベルを測定した。すなわち、特定の実験条件下で、Ｄ２−４９細胞の培養後、ＬｕｃＬｉｔｅＴＭ溶液（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）を細胞懸濁液に添加した。発生された蛍光の強度をマイクロプレー
トシンチレーションおよび蛍光計測器、ＴｏｐＣｏｕｎｔＴＭ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）により即座に測定した。
【００９７】
ＬｕｃＬｉｔｅキット（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，米国）、ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，米国）、ＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，米国）、ＩＬ−５（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，英国）、ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ＩＬ−１３（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国）、ＩＦＮ−（Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）は購入した。
【実施例１２】
【００９８】
ハツカネズミのインターロイキン−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの精製
ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの封入体を含む３６０ｇの湿った大腸菌−細胞を１８００ｍＬの分解バッファー（０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ）中で洗浄し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）する。細胞ペレットを１８００ｍＬの分解バッファー中に再懸濁し、８６ｍｇのリゾチーム（〜１ｍｇリゾチーム／細胞乾燥重量１ｇ）を添加し、室温で３０分間インキュベートする。７．２ｇのＭｇＣｌ２（×６Ｈ２Ｏ）を添加し、撹拌溶解する。次に１８μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ；０．２５Ｕ／ｍＬ）を添加し、懸濁液を室温で更に３０分間撹拌する。懸濁液を８０００×ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを１８００ｍＬの蒸留水中に再懸濁させる（浸透圧衝撃）。説明の項に挙げたいずれかの方法により分解効率をモニターする。具体的には８５％を超える細胞が分解される。
【００９９】
放出された封入体を更に、８０００×ｇで１５分間の遠心分離および洗浄バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）中への再懸濁を伴う繰り返しの遠心分離および洗浄段階（３回）により精製する。
【０１００】
洗浄したＩＢの１８０ｇ（湿潤重量）を１８０ｍＬの可溶化バッファー（７ＭのグアニジニンＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７）中に再懸濁させる。総蛋白質含量をＢＣＡ−アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して２．２ｇに決定する。
【０１０１】
ジスルフィド橋のスルフィト分解を、ナトリウムスルファイト４ｇ（室温で２４０分間インキュベート）およびカリウムテトラチオネート１．３ｇ（室温で３０分間インキュベート）を添加することにより実施する。スルフィト分解後、不溶性物質を遠心分離（８０００ｇ、１５分間）により除き、適当な限外濾過膜（例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋＤ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）を使用して、過剰スルファイトおよびテトラチオネートをＧｕＨＣｌ−透析バッファー（４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７）に対するダイアフィルトレーションにより除く。総蛋白質含量はＢＣＡ−アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１．６ｇ（７３％段階収率）に決定する。Ｓ−スルホン化ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの純度は分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより２５％（ピーク面積パーセント）に決定された。
【０１０２】
構造復元は、０．６ＭのＬ−アルギニン−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８ｍＭのＬ−システイン（蛋白質濃度に応じて）および１ｍＭのＥＴＤＡから成る復元バッファー６．３５Ｌ中にＳ−スルホン化ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄ（８８ｍＬ）を２５０ｍｇ／Ｌの最終蛋白質濃度まで希釈することにより実施する。復元混合物を室温で穏やかに撹拌し、間隔をおいて採取された試料のＲＰ４−ＨＰＬＣ分析により復元反応速度をモニターする。２４時間後、復元反応は終結し、更に処理する。正しく折り畳んだ、未誘導ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの３００ｍｇが形成され（１９％総復元収率）、総蛋白質
回収量は１．６ｇ（１００％段階収率）である。
【０１０３】
復元混合物を２５％ＨＣｌの添加によりｐＨ３に調整し、デプスフィルター（例えばＳｅｉｔｚ  Ｂｉｏ４０／２０）をとおして濾過し、定量的回収を得る。次に濾液を０．１％リン酸で平衡にさせたＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−１０００（ＴｏｓｏＨａａｓ）を前以て充填された逆相カラム上に適用する。１５０ｃｍ／時間の流量で１４ｇ蛋白質／樹脂１Ｌの容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）まで樹脂を充填する。カラムを３カラム容量（ＣＶ）の０．１％リン酸で洗浄する。次に５ＣＶの２０％溶離剤Ｂ（０．１％リン酸、８０％エタノール）でカラムをとおして洗浄する。次に７ＣＶの２０％〜９０％の直線勾配の溶離剤Ｂを適用する。カラム容量の２５％画分を採取し、ＲＰ４−ＨＰＬＣによりｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄにつき分析する。２０％を超える純度をもつ生成物を含む画分をプールすると主要プールを与える。主要プール内に、合計で、正しく折り畳んだ、未誘導ｍＩＬ−４のＱ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの２８８ｍｇを見いだす（９６％段階収率）。
【０１０４】
主要プールをＫ２ＨＰＯ４（１Ｍ）の添加によりｐＨ６．０に調整し、定量的回収のためにデプスフィルター（例えばＳｅｉｔｚ  Ｂｉｏ４０／２０）する。
【０１０５】
５ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ６）で前以て平衡にしたセラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩ、８０μ粒径、ＢｉｏＲａｄ）を充填したカラム上で２００ｃｍ／時間の流量で中間精製を実施する。１０ｇ蛋白質／樹脂１Ｌの容量までカラムを充填する。ＯＤ２８０信号が基底線に到達するまで、約３カラム容量の５ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ６）でカラム中の未結合蛋白質を洗浄する。生成物を直線状勾配の０．５Ｍリン酸塩（２０カラム容量）を使用することにより２００ｃｍ／時間の流量で溶離する。画分サイズはカラム容量の２５％である。＞５０％（ピーク面積パーセント）の純度のｍＩＬ−４
Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄを含む画分を分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより同定し、合わせる。ＣＨＡプール中のｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの純度は分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより判定されると＞７０％である。ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの２４７ｍｇの段階収量を主要画分中に得る（８６％）。
【０１０６】
ＣＨＡ主要プールを濾過し（例えばＳａｒｔｏｂｒａｎ  ３００、０．２２μ）、ＨＰＬＣバッファーＡ（０．１％ＴＦＡ／水）で前以て平衡にさせたＳｏｕｒｃｅ  １５  ＲＰＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５μｍ粒径）上に適用する。次に未結合物質を溶離し（３カラム容量）、勾配（１６％エタノール、０．１ＣＶ、１６〜４０％エタノール、３ＣＶ、４０〜６４％エタノール、７ＣＶ）を使用して２２５ｃｍ／時間の流量でＩＬ−４を溶出する。画分（１０ｍＬ）をＨＰＬＣバッファーＡで適当に希釈し、分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣを使用して正しく折り畳んだ蛋白質につき分析する。ＲＰＣプール中のｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの純度を分析的ＲＰ４−ＨＰＬＣにより判定すると＞８４％である。主要画分中のｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの２２５ｍｇの段階収量を得る（９１％）。従って最初の総蛋白質使用量（２．２ｇ）に対応する精製ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄの最終総収率は１０％である。
【０１０７】
最終ＲＰＣ主要プールを水で希釈し、０．２２μフィルターで滅菌濾過し、分注し、凍結乾燥する。生成物を２４カ月間を超えて＜−１８℃で安定に保存する。
【０１０８】
最終ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄ調製物の蛋白質化学的分析を文献記載の標準法を使用して実施した。最初の１５アミノ酸残基のＮ−末端配列により同一性を確認した。純度は第１サイクル中でＰＴＨ−メチオニン９５％であった。アミノ酸分析により０．５％未満の誤って取り込まれたノルロイシンを認めた。ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄ（ＢｉｏＲａｄ）の結合定数のインビトロアッセイは正確な三次元構造（ｋｏｆｆ：１．６９×１０−３［ｓ−１］，Ｋｏｎ：４．３４×１０６［Ｍ−１ｓ−１］、ｎ＝９；
ｍＩＬ−４対照：ｋｏｆｆ：０．８９×１０−３［ｓ−１］），ｋｏｎ：７．５１×１０６［Ｍ−１ｓ−１］，ｎ＝６）を示した。ｍＩＬ−４  Ｑ１１６Ｄ  Ｙ１１９Ｄ突然変異蛋白質の生物学的機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）はまたインビボでも示された（Ｎｅｌｄｅ  Ａ，Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ  Ｓ，Ｂｒｏｅｃｋｅｒ  ＥＢ，Ｓｅｂａｌｄ  Ｗ，Ｄｕｓｃｈｌ  Ａ（２００２）：Ａｌｌｅｒｇｙ，出版）。
【０１０９】
薬局方ＬＡＬアッセイにより決定されたエンドトキシン含量は＜０．０３ＥＵ／蛋白質１ｍｇであった。
【０１１０】
以下に、本発明の主な特徴と態様を列挙する。
１．（ａ）封入体中に発現させること、
（ｂ）細胞を分解し、封入体を分離すること、
（ｃ）そのように得られた封入体を洗浄すること、
（ｄ）変性により封入体を可溶化させること、
（ｅ）発現生成物を復元すること、および
（ｆ）発現生成物を精製すること、
を含んで成り、（ｃ）で封入体が封入体の表面に結合された脂質もしくは細胞壁断片中に含まれる脂質を効果的に可溶化させる洗浄剤を含むバッファーで洗浄されることを特徴とする、組換え体発現によるインターロイキン−４もしくはインターロイキン−４の突然変異蛋白質の調製法。
２．封入体を洗浄するための洗浄剤が非イオン洗浄剤、イオン界面活性剤もしくは双性イオン洗浄剤である１項記載の方法。
３．洗浄剤がＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、デスオキシコレートおよびｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔシリーズ（Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の群から選択される双性イオン洗浄剤である１項記載の方法。
４．封入体のための洗浄バッファーが７と１０の間のｐＨを維持するバッファーである１〜３項のいずれかに記載の方法。
５．洗浄バッファーが更にキレート物質を含む１〜４項のいずれかに記載の方法。
６．キレート形成物質がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）もしくはトランス−１，２−ジアミノ−シクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）の群から選択される５項記載の方法。
７．組換え蛋白質がインターロイキン４  Ｒ１２１Ｄ  Ｙ１２４Ｄである１〜６項記載の方法。
８．復元（ｅ）が場合により人工的シャペロンの存在下で透析、ダイアフィルトレーションもしくは希釈により実施される１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
９．復元（ｅ）が人工的シャペロンの存在下で実施される８項記載の方法。
１０．精製（ｆ）がクロマトグラフィーにより実施される１〜９項のいずれか１項に記載の方法。