(57)【要約】      （修正有）【課題】目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別する方法の提供。【解決手段】プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有する薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット。また、かかるカセットを使用した、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群の選別方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有することを特徴とする薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット。
【請求項２】
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３’非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項５】
ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項６】
モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の発現カセット。
【請求項８】
ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項４〜７のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
目的タンパク質遺伝子発現カセットをさらに有することを特徴とする請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
目的タンパク質遺伝子発現カセット中の目的タンパク質遺伝子が、抗体の重鎖又は／及び軽鎖遺伝子のコード配列であることを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
マルチクローニングサイトを備えた発現カセットをさらに有することを特徴とする請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項９に記載の発現ベクターと、目的タンパク質遺伝子発現カセット又はマルチクローニングサイトを備えた発現カセットを有する発現ベクターとからなる一対の発現ベクター。
【請求項１５】
マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されている請求項１４に記載の一対の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
【請求項１７】
宿主細胞が動物細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
動物細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
【請求項２１】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
【請求項２２】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法。
【請求項２３】
タンパク質が、抗体であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質が、ワクチンであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、アミノ酸を生産する方法。
【請求項２６】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、ヌクレオチドを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術によって、目的とするタンパク質の遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞の中から目的とするタンパク質の遺伝子を高レベルで発現する細胞を効率的に選別するために使用できる薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットに関する。本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、所望のタンパク質の機能解析などの基礎研究は勿論、遺伝子工学的手法により、動物細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核細胞に基づくもの、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属など）及び哺乳類細胞などの動物細胞を含む真核細胞に基づくものの両者が用いられている。これらの中でも動物細胞、特に哺乳類細胞に基づく発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳類動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与するため、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞に基づく発現システムを利用した方が、治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。
【０００３】
組換えタンパク質を産生する細胞を樹立する方法としては、一般に、目的タンパク質の遺伝子を発現する遺伝子構築物を宿主細胞へ遺伝子導入し、得られた形質転換細胞の中からこの遺伝子構築物が宿主細胞のゲノム上に安定導入された細胞を選別する。この際、前記遺伝子構築物に、薬剤選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を目的タンパク質の遺伝子と同一プロモーター下あるいは別個のプロモーター下で発現するように挿入しておき、薬剤選択によって生き残った細胞を目的タンパク質の遺伝子が安定導入された細胞として選別する。目的タンパク質の発現レベルは、目的タンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの領域に導入されるかによって大きく変動するが、導入領域の制御は、通常不可能である。従って、遺伝子導入しても大半の細胞は目的タンパク質遺伝子を発現しないか又は発現量が低い。このため、従来、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞の取得には、１０００〜数千の細胞サンプルから１〜２個の細胞株を選別する作業を数ヶ月〜１年かけて繰り返し行っており、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞の選別に膨大な労力と時間を要していた。
【０００４】
そこで、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別するため、薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化することに基づく方法が開発されてきた。薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化すると、薬剤選択マーカー遺伝子が宿主細胞ゲノム内の低発現領域に導入された形質転換細胞は、薬剤選択マーカー（薬剤耐性遺伝子）を十分に発現することができないので、死滅してしまい、高発現領域に導入された形質転換細胞のみが薬剤選択によって生き残る。この生き残った形質転換細胞では、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して目的タンパク質遺伝子を有する可能性が高いため、目的タンパク質遺伝子も宿主細胞ゲノム内の高発現部位に導入されており、目的タンパク質遺伝子が高レベルで発現されている可能性が高い。このことを利用して、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率良く選別することができると考えられる。
【０００５】
薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する１つの方法としては、薬剤選択マーカーの発現に用いるプロモーターとして、転写活性の弱いプロモーターであるＨｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターを利用する方法（非特許文献１）や、野生型の転写活性レベルよりも減弱化された変異型プロモーターを用いて薬剤選択マーカーの発現を抑える方法（特許文献１、２）が挙げられる。しかしながら、本発明者らがこれらの方法を追試したところ、いずれの方法も薬剤選択マーカーの発現を減弱化するという面で効果がほとんど見られなかった。このことから、これらの方法を用いて目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別するということは難しいと考えられた。
【０００６】
薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する別の方法としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列に変異を導入して薬剤選択マーカー自体の機能を減弱化する方法（特許文献３、４）が挙げられる。本発明者らがこの方法を追試したところ、この方法を用いることにより薬剤選択マーカーの機能を多少減弱化することができ、薬剤選択の結果として少量の発現量の向上した細胞株を取得することができた。しかしながら、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を選別する点での効率は良くなく、この方法による顕著な効果は見られなかった。
【０００７】
このように、従来公知の薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する方法は、いずれも効率が悪く、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別する好適な方法は未だ確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ５，６２７，０３３
【特許文献２】ＷＯ２００５／０２４０１５
【特許文献３】ＷＯ２００１／０３２９０１
【特許文献４】ＷＯ２００４／０５０８８４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｗａ  Ｈ、Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ．（１９９１）  Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００
【非特許文献２】Ｂａｋｈｅｅｔ  Ｔ，Ｆｒｅｖｅｌ  Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｂ．Ｒ．Ｇ、  Ｇｒｅｅｒ  Ｗ，Ｋｈａｂａｒ  Ｋ．Ｓ．Ａ．（２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：２４６−２５４
【非特許文献３】Ｌａｇｎａｄｏ  Ｃ．Ａ，Ｂｒｏｗｎ  Ｃ．Ｌ，Ｇｏｏｄａｌｌ  Ｇ．Ｊ．（１９９４）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：７９８４−７９９５
【非特許文献４】Ｚｕｂｉａｇａ  Ａ．Ｍ，Ｂｅｌａｓｃｏ  Ｊ．Ｇ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｅ．（１９９５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：２２１９−２２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別することを可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するため、薬剤選択マーカーの発現や機能を効率的に減弱化する別の方法について鋭意検討した結果、ｍＲＮＡ不安定化配列を利用して薬剤選択マーカー遺伝子の発現を減弱化することを想起した。そして、種々の薬剤選択マーカーの発現カセットにｍＲＮＡ不安定化配列を挿入し、細胞の形質転換及び薬剤選択を行ったところ、コロニー数が有意に減少した。さらに導入された目的タンパク質遺伝子の発現を詳しく解析した結果、高発現細胞の割合が有意に上昇することを見出し、本発明を完成させるに到った。
【００１２】
すなわち、本発明によれば、以下が提供される：
（１）プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有することを特徴とする薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット。
（２）薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする（１）に記載の発現カセット。
（３）薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする（２）に記載の発現カセット。
（４）ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３’非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一項に記載の発現カセット。
（５）ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一項に記載の発現カセット。
（６）モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする（５）に記載の発現カセット。
（７）モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする（６）に記載の発現カセット。
（８）ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする（４）〜（７）のいずれか一項に記載の発現カセット。
（９）（１）〜（８）のいずれか一項に記載の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
（１０）目的タンパク質遺伝子発現カセットをさらに有することを特徴とする（９）に記載の発現ベクター。
（１１）目的タンパク質遺伝子発現カセット中の目的タンパク質遺伝子が、抗体の重鎖又は／及び軽鎖遺伝子のコード配列であることを特徴とする（１０）に記載の発現ベクター。
（１２）マルチクローニングサイトを備えた発現カセットをさらに有することを特徴とする（９）に記載の発現ベクター。
（１３）マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されていることを特徴とする（１２）に記載の発現ベクター。
（１４）（９）に記載の発現ベクターと、目的タンパク質遺伝子発現カセット又はマルチクローニングサイトを備えた発現カセットを有する発現ベクターとからなる一対の発現ベクター。
（１５）マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されている（１４）に記載の一対の発現ベクター。
（１６）（９）〜（１５）のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
（１７）宿主細胞が動物細胞であることを特徴とする（１６）に記載の形質転換細胞。
（１８）動物細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする（１７）に記載の形質転換細胞。
（１９）哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする（１８）に記載の形質転換細胞。
（２０）（１６）〜（１９）のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
（２１）（１６）〜（１９）のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
（２２）（１６）〜（１９）のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法。
（２３）タンパク質が、抗体であることを特徴とする（２２）に記載の方法。
（２４）タンパク質が、ワクチンであることを特徴とする（２２）に記載の方法。
（２５）（１６）〜（１９）のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、アミノ酸を生産する方法。
（２６）（１６）〜（１９）のいずれかに記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、ヌクレオチドを生産する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、ｍＲＮＡ不安定化配列が挿入されているため、ｍＲＮＡ不安定化配列を有さない従来の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットに比べてｍＲＮＡが不安定化されて薬剤選択マーカーの発現が減弱化されており、宿主細胞ゲノム内の高発現領域に組み込まれないと、薬剤存在下で形質転換細胞の生存が困難となる。このため、薬剤選択マーカー遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノム内の高発現領域に組み込まれた形質転換細胞のみが薬剤選択によって生き残ることができる。その結果、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する高発現細胞を効率的に選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２の構築を示す図である。
【図２】ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築を示す図である。以下、図中、Ｐｕｒとは、ピューロマイシン耐性遺伝子のことである。また、図中、ｉＰＣＲとは、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲのことである。
【図３】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図４】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図５】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図６】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団を薬剤選択した際の明視野像である。
【図７】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒのコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。
【図８】ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４のコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。
【図９】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｎｅｏとは、ネオマイシン耐性遺伝子のことである。
【図１０】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築を示す図である。
【図１１】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１２】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図１３】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｈｙｇとは、ハイグロマイシン耐性遺伝子のことである。
【図１４】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１５】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１６】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図１７】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１８】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図１９】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【図２０】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の構築を示す図である。
【図２１】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図２２】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】
タンパク質の機能解析や有用タンパク質の生産のために、遺伝子組み換え技術を用いて、細胞、特に動物細胞に、目的とするタンパク質の遺伝子を導入し、組換えタンパク質として発現させる方法が広く用いられている。具体的には、プラスミドベクターに代表されるベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入し、細胞にベクターを取り込ませた後、組換えにより目的タンパク質遺伝子を細胞ゲノムに組み込み、細胞を形質転換させる方法がよく用いられている。
【００１７】
細胞のゲノムは染色体上に存在するが、染色体はヒストンのアセチル化や高度な凝集（ヘテロクロマチン）等により遺伝子の発現が制御されており、挿入される染色体の場所によって遺伝子の発現量は大きく異なる。ベクターを用いて細胞を形質転換する方法においては、細胞ゲノムのどの場所に目的タンパク質遺伝子が導入されるかを制御することはできず、そのため形質転換細胞における目的タンパク質遺伝子の発現量、ひいては目的タンパク質の生産量は、細胞株によって大きく異なることになる。
【００１８】
また、遺伝子組み換えがうまくいかず、目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれていない場合も多い。
【００１９】
そこで、従前、予め発現ベクターに薬剤耐性（薬剤選択マーカー）遺伝子を挿入しておき、細胞にこのベクターを遺伝子導入した後、培地中に薬剤を投与して（薬剤選択）、形質転換が成功した細胞を選択し、その後、生じた細胞群から高い発現を示す細胞株を繰り返し選別する作業が行われてきた。しかしながら、この方法では多数の細胞株を用意する必要があり、また長期間の培養を必要とする細胞の選別作業を繰り返し行うため、多大の労力と時間を要してきた。加えて、薬剤耐性遺伝子は多くの場合、少量の発現でも薬剤に対する耐性を示すため、生存した細胞の中には、薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノム内の低発現領域に組込まれており目的タンパク質遺伝子の発現量が少ない細胞株も混在しており、更に労力と時間に拍車をかけてきた。
【００２０】
本発明はこれらの問題を解決するためになされたものであり、従来公知の薬剤耐性（薬剤選択マーカー）遺伝子を使用した選別において、ｍＲＮＡ不安定化配列を利用することによって薬剤耐性遺伝子の発現量を大きく抑え、宿主細胞ゲノム内の高発現領域に薬剤耐性遺伝子が組込まれた形質転換細胞のみが薬剤選択後に生き残るようにしたものである。薬剤耐性遺伝子の近隣には目的タンパク質の遺伝子が組込まれているため、生き残った細胞では、目的タンパク質遺伝子も高発現領域に組込まれている可能性が高い。従って、本発明によれば、（ｉ）遺伝子組み換えがうまくいかず、目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれていない細胞、（ｉｉ）遺伝子組み換えに成功したが、薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノムの低発現領域に組込まれている細胞、及び（ｉｉｉ）遺伝子組み換えに成功し、しかも薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノムの高発現領域に組込まれている細胞の中から、（ｉｉｉ）の遺伝子組み換えに成功し、しかも薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノムの高発現領域に組込まれている細胞のみを薬剤選択によって効率的に選別することができる。従来公知の選別方法では、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の細胞から（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の細胞を薬剤選択によって選別することができるが、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の細胞から（ｉｉｉ）の細胞のみを薬剤選択によって選別することはできず、薬剤選択後に生き残った形質転換細胞について目的タンパク質遺伝子の発現レベルを別途確認して、（ｉｉｉ）の高発現細胞を選別していた。本発明の方法は、薬剤選択のみによって（ｉ）〜（ｉｉｉ）の細胞から（ｉｉｉ）の高発現細胞を一気に選別することができるため、効率的であり、結果として高発現細胞を迅速に選別することができる。
【００２１】
本発明の第一の側面によれば、プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有することを特徴とする薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが提供される。
【００２２】
本発明において、発現カセットとは、プロモーターから遺伝子コード配列、ターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）までの遺伝子発現の単位をいう。加えて、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を含むこともある。したがって、例えば「薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列であるものをいう。
【００２３】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、ｍＲＮＡ不安定化配列を有することを除いては、従来公知の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと同様の構成を有する。そこで、まず、ｍＲＮＡ不安定化配列について説明する。
本発明は、ｍＲＮＡ不安定化配列が極めて効果的に薬剤耐性遺伝子の発現を減弱化することができることを見出したことに基づくものである。本発明のｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを搭載した発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入した場合、ｍＲＮＡ不安定化配列を含まない場合と比較して、薬剤選択後の生存細胞数、あるいはそのコロニーは１／１０〜１／１００に減少する。これはｍＲＮＡ不安定配列の存在により薬剤選択マーカーのｍＲＮＡが不安定化し、薬剤選択マーカーの発現量が下がるため、宿主細胞のゲノム中で転写活性の高い高発現領域に当該発現カセットが組み込まれた細胞でなければ薬剤選択下での生存が困難になるためと考えられる。
【００２４】
「ｍＲＮＡ不安定化配列」とは、この配列を有するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの細胞内半減期を低減させる機能を有するヌクレオチド配列のことであり、自然界では初期応答遺伝子などに存在することが見出されている。
【００２５】
ｍＲＮＡ不安定化配列は、いくつかの遺伝子ではコード配列中、あるいは５’ＵＴＲ（非翻訳領域）に存在するものもあるが、多くは３’ＵＴＲに存在する。３’ＵＴＲに存在するｍＲＮＡ不安定化配列としては、ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）、ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍＲＮＡ  ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ、ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＲＥ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ｌｏｎｇ  ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐなどが知られている。これらの中でもＡＲＥは、恒常的にｍＲＮＡを不安定化できることから、本発明に用いるｍＲＮＡ不安定化配列として好ましい。
【００２６】
ＡＲＥとは、ｍＲＮＡにおける「ＡＵが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を高い割合で含む配列もしくは領域を意味する。またＡＲＥとは、前記エレメントをコードするＤＮＡにおける「ＡＴが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を高い割合で含む配列もしくは領域を指すためにも用いられる。
【００２７】
ＡＲＥは、造血細胞増殖因子遺伝子、成長因子遺伝子、インターロイキン遺伝子、インターフェロン等のサイトカイン遺伝子、及びいくつかの癌原遺伝子（プロトオンコジーン）などに見られる（非特許文献２）。本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットでは、これらの遺伝子中のＡＲＥに相当する核酸配列をそのまま利用してもよいが、ＡＲＥ中のモチーフ配列として知られるＴＡＴＴＴＡＴ（非特許文献３）やＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）（非特許文献４）などを利用する方が、不要な制限酵素認識配列を発現ベクターに挿入してしまうことを避けることができ、利便性が高い。
【００２８】
ＡＲＥを持つ遺伝子の例としては、造血細胞増殖因子についてはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｉｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキンについてはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β、２，３、４、６、８、１０、１１、インターフェロンについてはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、癌原遺伝子についてはｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，Ｐｉｍ−１などが例示される。このほかにもＴｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ２など多くの遺伝子がＡＲＥを持つことが知られており、例示された遺伝子に限定されない。
【００２９】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおいて使用することができるｍＲＮＡ不安定化配列としては、下記のものが例示される。
【００３０】
ＡＴＴＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
【００３１】
ＡＴＴＴＡのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
【００３２】
ＴＡＴＴＴＡＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
【００３３】
ＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）のモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。（Ｔ／Ａ）はＴまたはＡのいずれかである。
【００３４】
これらの配列は、１ないし数塩基の置換／挿入／欠失を含んでもよく、ＤＮＡの複製の誤りや突然変異などの自然変異によるもの、人為的な変異導入によるもの等が想定される。また、モチーフ配列の繰り返し間には１〜１００塩基程度のスペーサー配列またはリンカー配列を含んでもよい。加えて、モチーフ配列の逆位を含むものであってもよい。
【００３５】
これらのモチーフ配列の繰り返し数は、１回でもよいが、２回以上、より好ましくは４回以上とすることにより、ｍＲＮＡの不安定化効果を一層高めることができ、選別効率を顕著に増大させることができる。
【００３６】
繰り返しの回数の上限は特に限定されないが、細胞へのベクターの取り込みの観点から、発現ベクターが最大１０ｋｂｐ〜２０ｋｂｐ長となるようなものが望ましい。ただし、繰り返し配列数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの不安定化の効果は飽和に向かい、一定の繰り返し数を超えるとそれ以上の顕著な効果を望めなくなる。上限値を定めるものではないが、１０回以上の繰り返し配列は実用上意味がない。
【００３７】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるプロモーターとしては、動物細胞、特に哺乳類細胞で発現可能なプロモーターであれば特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒトヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーター、などのウイルスに由来するものや、マウスｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ−ｋｉｎａｓｅ１遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーターのハイブリッドが挙げられる。ここで、プロモーターは、プロモーターのコア領域に限るものではなく、エンハンサー領域を含む場合もある。薬剤選択マーカーの発現を減弱化するため、転写活性が低いものがより好ましい。転写活性の低いプロモーターとして変異型のプロモーターなどを利用してもよいし、コザック配列を置換してもよい。さらに、ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返しの回数を少なくし、転写活性の弱いプロモーターを併用するのも１つの想定される実施態様である。
【００３８】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおける薬剤選択マーカー遺伝子としては、薬剤選択に一般的に使用される薬剤に対して耐性を示す遺伝子が好適に用いられる。タンパク質合成阻害系抗生物質を薬剤として用いる場合には、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子を用いることが好ましい。特に限定されるものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子（ジェネティシン耐性遺伝子としての機能も有する）として、Ｔｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ、実施例、比較例および図面ではＨｙｇと記載）、ピューロマイシン耐性遺伝子として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ、実施例、比較例および図面ではＰｕｒと記載）、ブラストサイジン耐性遺伝子として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ）などが例示される。これらの中でも、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが好ましく、より好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼであり、さらに好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。
【００３９】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるポリアデニレーションシグナル（ターミネーター配列）としては、ＳＶ４０ウイルス由来ｌａｔｅ  ｐｏｌｙＡシグナル、ｅａｒｌｙ  ｐｏｌｙＡシグナル、ＨＳＶ−ｔｋ由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長因子遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナルなどが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００４０】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット中でのプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルの配置順序は、薬剤選択マーカー遺伝子の発現が可能である限り特に限定されないが、一般的にプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルをこの順序で上流から下流に向かって配置する。これらの四つの要素は、相互に直接連結されている必要はなく、所望により、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を間に有していてもよい。
【００４１】
本発明の第二の側面によれば、本発明の第一の側面による薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクターが提供される。
【００４２】
本発明において、発現ベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクターであることができる。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。
【００４３】
本発明の発現ベクターは、目的タンパク質の遺伝子を、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと独立した別個の発現カセットの形でさらに含むことが好ましい。真核細胞の場合、目的タンパク質遺伝子と薬剤選択マーカー遺伝子を内在性リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ、ＩＲＥＳ）でつなぐポリシストロン性の発現を行う方法もあるが、目的タンパク質遺伝子と薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列が１つのｍＲＮＡとして合成されるため、ｍＲＮＡ不安定化配列を挿入すると、目的タンパク質遺伝子のｍＲＮＡが減少してしまい、高発現細胞を得られない。そのため、本発明の発現ベクターでは、目的タンパク質遺伝子は、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと独立した発現カセットとして配置されることが好ましい。この場合、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが別個のベクター上に配置された一対の発現ベクターの形で利用されてもよいが、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが同一のベクター上に配置されることがより好ましい。
【００４４】
前記薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的遺伝子タンパク質の発現カセットが同一のベクター上に配置される場合、両者は隣接してもよいし、間にスペーサー配列が挿入されていてもよい。目的タンパク質遺伝子の発現カセットは薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流、下流のいずれに配置されても良いが、隣接して挿入される際には、目的タンパク質遺伝子の発現カセットが上流になるように配置される方が好ましい。さらに、スペーサー配列として、隣接する発現カセットの転写干渉を抑制するためのインスレーター配列が挿入されていても良い。
【００４５】
薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、１つのベクターに２つ以上含まれていても良い。この場合、同一の薬剤選択マーカーが選ばれる場合もあるし、それぞれ異なる薬剤選択マーカーが選ばれる場合もある。また、各薬剤選択マーカーは隣接して配置されても良いし、離れて配置されていても良い。
【００４６】
目的のタンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、目的タンパク質の発現カセットを複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形にしてもよい。
【００４７】
また、複数のポリペプチド発現カセットをそれぞれ異なるベクターに挿入し、それぞれのベクターを１つの宿主細胞へ導入して形質転換細胞を作製し、目的タンパク質を生産することができる。この場合、各ベクターに薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを配置することができ、それぞれ同一の薬剤選択マーカーを用いることもできるが、異なる薬剤選択マーカーを用いる方が、各ポリペプチドが全て高発現を示す細胞を効率よく取得する点で有利であり、好ましい。
【００４８】
目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、プロモーター、遺伝子コード配列、及びターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）からなる。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的タンパク質遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはＣＨＯ由来のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １（ＥＦ１α）遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター／エンハンサーのハイブリッド、例えばＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。
【００４９】
代替実施態様として、目的タンパク質遺伝子の発現カセットに、このタンパク質遺伝子のコード配列の代わりに、複数の制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトが配置されており、このマルチクローニングサイトに種々の目的タンパク質遺伝子（外来遺伝子）のｃＤＮＡやコード配列を導入できるように構築された発現ベクターを挙げることができる。
【００５０】
本発明の第三の側面によれば、本発明の第二の側面による発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞が提供される。
【００５１】
本発明の形質転換細胞における宿主細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、これらに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞などを広く導入対象とすることができる。また、大腸菌などの細菌細胞や酵母、昆虫細胞などを用いたタンパク質生産システムにも応用しうる。
【００５２】
宿主細胞の形質転換方法は、当業者であれば適宜選択しうるが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション等が挙げられる。
【００５３】
本発明の第四の側面によれば、本発明の第三の側面による形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法が提供される。また、本発明の第五の側面によれば、本発明の第三の側面による形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群が提供される。
【００５４】
薬剤選択に使用する薬剤は、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット中の薬剤選択マーカー遺伝子の種類に応じて決定される。また、使用する薬剤の濃度としては、一般に使用される濃度の範囲で高発現細胞の濃縮が可能であるが、少し高めの濃度が好ましい。最適な濃度は、宿主細胞や用いる培地の種類によって変化する。これらの濃度の設定方法は当業者にとっては公知であり、適宜設定しうる。例えば、産業用の生産細胞として用いられるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ‘ｓ  Ｆ１２培地で培養し、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のピューロマイシンの濃度としては、５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは７．５μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上である。同様の培養条件でハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のハイグロマイシンＢの濃度としては、２００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは６００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上である。同様の培養条件でネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＧ４１８の濃度としては、好ましくは４００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１，０００μｇ／ｍｌ以上である。
【００５５】
本発明の選別方法では、薬剤選択により、ｍＲＮＡの不安定化を伴わない従来の薬剤選択を行った細胞群に比べて、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が有意に高くなる。従って、従来は、薬剤選択後の膨大なサンプルから目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞株を選別する作業を繰り返し行わなければならなかったが、本発明によれば、薬剤選択マーカーのｍＲＮＡ不安定化を含む薬剤選択のみによって、選別の候補となるサンプル数を大幅に絞ることができる。本発明の選別方法を用いれば、薬剤選択後も生存する細胞群（ポリクローン）の大部分を占める、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群から細胞を単離し、培養することにより、容易に高発現を示す細胞株（モノクローン）を取得することができる。本発明の実施態様の一例として、４．０×１０５個の細胞に本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが挿入されたベクターを遺伝子導入した後、薬剤選択を行って生じた細胞群から１００の細胞株をランダムに選択して、個々の細胞株の発現量を調べることにより目的タンパク質の高発現株を容易に取得することができる。
【００５６】
細胞の発現レベルはレポーター遺伝子の発現量により調べることができるが、一例として、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子（Ｃｏｖａｌｙｓ社）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子を含む発現カセットを本発明の発現ベクターに導入し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）等のフローサイトメーターを用いて蛍光強度を解析することにより調べることができる。別の例として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを本発明による発現ベクターに導入後、細胞溶解液にＤ−ルシフェリンを添加してルミノメーターで発光量を測定することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子に限らず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を利用することで抗体等の目的タンパク質の発現を調べることもできる。
【００５７】
本発明により、細胞選別の工程及び時間を大幅に短縮することができると共に、高発現を示す細胞の割合が上昇することにより、短時間で効率的に目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞を取得することができ、従来技術と比べて極めて顕著な効果を示す。
【００５８】
例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）により、蛍光強度ＦＬ１にてＳＮＡＰ２６ｍの発現量を測定した場合、ＦＬ１が２００以上若しくは１０００以上を示す細胞の割合は、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有さない細胞に比べて、本発明による細胞では１．１倍以上、また多くの場合１．５倍から２倍以上大きくなる効果が認められた。また、ＦＬ１が２００以上を示す細胞の割合の増加率よりもＦＬ１が１０００以上を示す細胞の割合の増加率の方が高い傾向が見られており、本発明により選別される細胞群が、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有さない細胞に比べて高い発現を示すという効果を裏付けている。
【００５９】
本発明の第六の側面によれば、本発明の第三の側面による形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法が提供される。
【００６０】
一つの実施態様では、生産されるタンパク質は、抗体である。哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、二次元電気泳動等により測定することができる。
【００６１】
本発明の方法により生産された抗体は、医薬として使用することができる。かかる医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にて公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。
【００６２】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、好ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【００６３】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００６４】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【００６５】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【００６６】
別の実施態様では、生産されるタンパク質は、ワクチンである。
【００６７】
ワクチンとしては、病原体のエピトープのアミノ酸配列からなるタンパク質をワクチンとして使用することができる。また、ウイルス体の構成タンパク質すべてを生産するのみならず、エンベロープタンパク等を生産し、ワクチンとして使用することができる。
【００６８】
ワクチンは任意の経路の投与のための製剤とすることができる。粘膜型投与、例えば、経口経路、経鼻経路、経気道経路、経膣経路、経直腸経路の他、非粘膜経路による投与、例えば皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のためのワクチン製剤が挙げられる。
【００６９】
本発明の第七の側面によれば、本発明の第三の側面による形質転換細胞を用いることを特徴とする、アミノ酸を生産する方法が提供される。また、本発明の第八の側面によれば、本発明の第三の側面による形質転換細胞を用いることを特徴とする、ヌクレオチドを生産する方法が提供される。
【００７０】
アミノ酸の生産は、まず形質転換細胞にポリペプチドを生産させ、そのポリペプチドを加水分解することによって行うことができる。また、アミノ酸の生体外合成に必要な酵素などを形質転換細胞に生産させることによって行うこともできる。ヌクレオチドの生産も、ヌクレオチドの生体外合成に必要な酵素などを形質転換細胞に生産させることによって行うことができる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００７２】
（実施例１及び比較例１）
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）プラスミドベクターｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）の構築
図１に示すスキームに従って、プラスミドベクターｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。即ち、まずＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃベクター（ｐＥＬｕｃ−ｔｅｓｔ）（東洋紡績社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイトにＣＭＶプロモーター（配列番号１）が導入されたｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃ（ＥＬｕｃ）遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍ（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）からＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶを構築した。続いて、ｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを配列番号４，５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。
【００７３】
続いて、図２に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ（クロンテック社製）のピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列の３’末端に、配列番号６、７のプライマーとＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、ｍＲＮＡ不安定化配列としてＡＲＥモチーフ配列ＴＴＡＴＴＴＡＴＴの４回の繰り返し（Ｎ４）を挿入してｐＰＵＲ・Ｎ４を構築した。
【００７４】
つづいて、図３に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ，ｐＰＵＲ・Ｎ４を鋳型として、配列番号８、９のプライマーとＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲによって、ＳＶ４０  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ−ｐＡ、ＳＶ４０  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ・Ｎ４−ｐＡの薬剤発現カセット断片を増幅した。ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２と前記増幅断片をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩで部分消化して連結し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例），ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）を構築した。
【００７５】
（２）プラスミドベクターｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）の細胞導入
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研バイオリソースセンター、Ｎｏ．ＲＣＢ０２８５）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（日水製薬社製）を使用した。
【００７６】
トランスフェクションは、３μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、１μｇのプラスミドとしてｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−ＰｕｒあるいはｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４にこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。３週間の選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に２μＭ  ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【００７７】
図４は、薬剤選択後のｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。横軸が蛍光強度（ＦＬ１）、縦軸がカウント数である。また、図５に蛍光強度ＦＬ１がそれぞれ２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化配列であるＮ４（実施例）が挿入されたｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団には、Ｎ４が挿入されていないｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）で形質転換された細胞集団と比較して、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【００７８】
（実施例２及び比較例２）
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
実施例１（１）で構築した二種類のプラスミドベクターを使用して実施例１（２）と同様に遺伝子導入を行った。次に、ピューロマイシンの濃度を９μｇ／ｍｌに変更し、選択培養の期間を２週間に変更した以外は、実施例１（２）と同様にして選択培養を行った。選択培養終了後、形成されたコロニーを顕微鏡下でピペットの先でｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒについては４８クローン、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については２０クローンをかきとり、１２ウェルプレートに播種した。増殖が認められた、それぞれ３６クローン、１０クローンについて、実施例１（２）と同様にＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５で標識処理をし、ＦＡＣＳ解析を実施した。
【００７９】
図６に、薬剤選択後の細胞の明視野像を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）に比べ、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）については生存細胞数、コロニー数が顕著に減少し、選択効果が高いことが示唆される。
【００８０】
図７にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。図８にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ（比較例）では、高発現クローンは３６クローン中１クローン（２．８％）しか認められなかった。一方、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）では、取得されたクローンは少ないものの、ＳＮＡＰｍ高発現クローンのヒット率が４０％（１０クローン中４クローン）と非常に選択効果が高いことが確認された。また、これらの結果から、実施例１（２）で認められたように、薬剤選択後の細胞集団をＦＡＣＳ解析することによって示される高発現細胞の割合の上昇と、高発現クローンの取得の効率化との間に相関が確認されたことから、以後の解析は細胞集団のＦＡＣＳ解析によって効果の確認を実施した。
【００８１】
（実施例３及び比較例３）
ＥＦ１αプロモーター使用下での薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）プラスミドベクターｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２（比較例）の構築
次に、目的タンパク質遺伝子発現カセットのプロモーターをＣＭＶプロモーターからＥＦ１αプロモーターに置換した場合も、実施例１，２と同様の効果が認められるかどうかを検討するため、プラスミドベクターを構築した。本実験では、図９に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置換したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣを鋳型に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを用いて発現カセットの上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥを構築した。更にこのプラスミドを鋳型に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを用いて発現カセットの下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を構築した。
【００８２】
このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を用いて、図１０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２（比較例）を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩを用いて抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を構築した。このプラスミドから制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩを用いてネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＰＵＲ・Ｎ４から下流にＮ４配列を付加したピューロマイシン耐性遺伝子を配列番号１４，１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）を構築した。続いて、このプラスミドを鋳型に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１６、１７のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流のＮ４配列を削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２（比較例）を構築した。
【００８３】
（２）プラスミドベクターｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）の細胞導入
実施例１（２）に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例３（１）で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）でリニアライズ（直鎖状化）した。トランスフェクションは、３μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、前記のリニアライズしたプラスミド１μｇを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、５、７．５、あるいは１０μｇ／ｍｌピューロマイシンをそれぞれ含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例１（２）に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【００８４】
図１１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のピューロマイシン濃度に関わらず、ｍＲＮＡ不安定化配列であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団には、Ｎ４が挿入されていないｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ―ＲＥ２（比較例）で形質転換された細胞集団と比較して、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【００８５】
（実施例４及び比較例４）
薬剤選択マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）プラスミドベクターｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ‐ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４（実施例）の構築
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにハイグロマイシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化配列の効果が認められるかどうかを検討するため、プラスミドを構築した。本実験では、図１３に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミドの制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセットの上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。更にこのプラスミドを鋳型に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを用いて発現カセットの下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２を構築した。
【００８６】
このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２をＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社製）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号１８、１９のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２の制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、図１４に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩを用いて抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号３，２０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（比較例）を構築した。続いて、このプラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２２のプライマーを用いてハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にＮ４（実施例）配列を付加して、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４（実施例）を構築した。
【００８７】
（２）プラスミドベクターｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４（実施例）の細胞導入
実施例１（２）に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４（１）で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例３（２）に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌハイグロマイシン  ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例１（２）に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【００８８】
図１５は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１６に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化配列であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団には、Ｎ４が挿入されていないｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（比較例）で形質転換された細胞集団と比較して、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【００８９】
（実施例５及び比較例５）
薬剤選択マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）プラスミドベクターｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４（実施例）の構築
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化配列の効果が認められるかどうかを検討するため、図１７に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４（実施例）を構築した。即ち、実施例４と同様にしてｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２（比較例）構築した。次に、このプラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２３のプライマーを用いてネオマイシン耐性遺伝子の下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４（実施例）を構築した。
【００９０】
（２）プラスミドベクターｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４（実施例）の細胞導入
実施例１（２）に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例３（２）に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン  Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例１（２）に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【００９１】
図１８は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２（比較例）及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１９に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化配列であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４（実施例）で形質転換された細胞集団には、Ｎ４が挿入されていないｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２（比較例）で形質転換された細胞集団と比較して、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。
【００９２】
（実施例６）
ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返し回数の検討
ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返し回数が高発現細胞の選択効率に与える影響を検討するため、実施例３のプラスミドにおいて繰り返し回数を４回から２回、６回、又は８回に変更したものを図２０に示すスキームに従って構築した。即ち、実施例３（１）に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号１６、２４のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流にＮ２配列（ＡＲＥモチーフ配列ＴＴＡＴＴＴＡＴＴの２回の繰り返し）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２を構築した。また、同様の方法で、配列番号７、２４のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流にＮ６配列（ＡＲＥモチーフ配列ＴＴＡＴＴＴＡＴＴの６回の繰り返し）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６を構築し、配列番号７、２５のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流にＮ８配列（ＡＲＥモチーフ配列ＴＴＡＴＴＴＡＴＴの８回の繰り返し）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。
【００９３】
実施例１（２）に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例３（２）に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、７．５μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例１（２）に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
【００９４】
図２１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、繰り返し回数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６あるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換したとき、繰り返し回数の少ない、Ｎ２あるいはＮ４が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２あるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換したときと比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返し回数が多いほど高発現細胞の選択効率が高いことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、一緒に導入された目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞を薬剤選択によって効率的に濃縮でき、高発現細胞株の樹立作業を低減短縮することができる。従って、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを使用した細胞発現システムは、種々の哺乳類細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号２〜９は、実施例１に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号１０〜１７は、実施例４に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号１８〜２２は、実施例６に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号２３は、実施例８に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号２４及び２５は、実施例１０に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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