(57)【要約】【課題】ｍＲＮＡの切断の有無又はｍｉＲＮＡによる結合の有無を、直接検出できる方法の提供。【解決手段】蛍光標識プライマーを用いて、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡを導入した細胞又は内在ｍｉＲＮＡを含む細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程と、蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質から発生する蛍光を検出して解析し、逆転写反応産物中の蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程と、得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度に基づき、前記ｓｉＲＮＡ等による標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程とを有し、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記ｓｉＲＮＡ等による予測切断部位又は前記ｍｉＲＮＡによる予測結合部位よりも３’末端側の領域である遺伝子発現抑制効果評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の発現抑制効果を評価する方法であって、
ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡを導入した細胞又は内在ｍｉＲＮＡを含有している細胞を被検細胞とし、
（１ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、前記被検細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程と、
（１ｂ）前記工程（１ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程と、
（１ｃ）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度に基づき、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程と、
を有し、
前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記ｓｉＲＮＡ若しくは前記ｍｉＲＮＡによる予測切断部位又は前記ｍｉＲＮＡによる予測結合部位よりも３’末端側の領域であることを特徴とする遺伝子発現抑制効果評価方法。
【請求項２】
前記蛍光シグナルの解析を、蛍光相関分光法、蛍光偏光法、及び蛍光相互相関分光法からなる群より選択される方法により行うことを特徴とする請求項１記載の遺伝子発現抑制効果評価方法。
【請求項３】
前記工程（１ｃ）が下記工程（１ｃ’）であり、前記工程（１ｃ’）の前に、下記工程（１ａ’）及び（１ｂ’）を有することを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子発現抑制効果評価方法。
（１ａ’）前記蛍光標識プライマーを用いて、対照細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程。
（１ｂ’）前記工程（１ａ’）において得られた逆転写反応産物に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程。
（１ｃ’）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度と、前記工程（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度とを比較し、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程。
【請求項４】
前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記予測切断部位よりも３’末端側であり、かつ前記予測切断部位と隣接する領域であり、
前記工程（１ａ）及び（１ａ’）における逆転写反応が、さらに、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを用いて行われるものであって、前記蛍光標識ジデオキシヌクレオチドが、前記第１蛍光物質とは分光特性の異なる第２蛍光物質により標識されており、かつ、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の予測切断部位又は予測結合部位の５’末端側隣の塩基と相補的な塩基種であり、
前記蛍光シグナルの解析を蛍光相互相関分光法により行うものであり、
前記工程（１ｃ’）における評価を、下記（１−ｉ）〜（１−ｉｉｉ）により行うことを特徴とする請求項３記載の遺伝子発現抑制効果評価方法。
（１−ｉ）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）が、前記工程（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）よりも少ない場合に、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡにより前記予測切断部位が切断され、前記標的遺伝子の発現が抑制されたと評価する。
（１−ｉｉ）前記（１−ｉ）以外の場合であって、前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさが、前記工程（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさよりも小さい場合に、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡにより、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の前記予測切断部位以外の部位が切断され、前記標的遺伝子の発現が抑制されたと評価する。
（１−ｉｉｉ）前記（１−ｉ）及び（１−ｉｉ）のいずれにも該当しない場合に、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡにより、前記標的遺伝子の発現が抑制されていないと評価する。
【請求項５】
前記工程（１ｂ）及び（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）を、下記工程（ｐ）〜（ｓ）により作成した近似線に基づき補正し、当該補正後の値に基づいて工程（１ｃ’）を行うことを特徴とする請求項４記載の遺伝子発現抑制効果評価方法。
（ｐ）前記第１蛍光物質により標識された第１蛍光標識分子と、前記第２蛍光物質により標識された第２蛍光標識分子と、前記第１蛍光物質及び前記第２蛍光物質により標識された両蛍光標識分子とを準備する工程と、
（ｑ）前記第１蛍光標識分子と前記第２蛍光標識分子と前記両蛍光標識分子との総和に対する前記両蛍光標識分子の含有割合（モル比）が異なる検量線用試料系列を調製する工程と、
（ｒ）前記工程（ｑ）において調製した検量線用試料系列のそれぞれの検量線用試料に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光と前記第２蛍光物質を励起し得る波長の光とを別個に照射し、当該蛍光物質から発される蛍光を蛍光シグナルとしてそれぞれ検出し、検出された蛍光シグナルを蛍光相互相関分光法により解析して、当該検量線用試料中の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）を測定する工程と、
（ｓ）前記工程（ｒ）において測定された各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）と、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合との関係の近似線を作成する工程。
【請求項６】
ｍＲＮＡの切断を検出する方法であって、
（２ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、被検ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程と、
（２ｂ）前記工程（２ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程と、
（２ｃ）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度に基づき、前記被検ＲＮＡ中の標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を検出する工程と、
を有し、
前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が予測切断部位よりも３’末端側の領域であることを特徴とするｍＲＮＡの切断の検出方法。
【請求項７】
前記蛍光シグナルの解析を、蛍光相関分光法、蛍光偏光法、及び蛍光相互相関分光法からなる群より選択される方法により行うことを特徴とする請求項６記載のｍＲＮＡの切断の検出方法。
【請求項８】
前記工程（２ｃ）が下記工程（２ｃ’）であり、前記工程（２ｃ’）の前に、下記工程（２ａ’）及び（２ｂ’）を有することを特徴とする請求項６又は７記載のｍＲＮＡの切断の検出方法。
（２ａ’）前記蛍光標識プライマーを用いて、対照ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程。
（２ｂ’）前記工程（２ａ’）において得られた逆転写反応産物に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記第１蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程。
（２ｃ’）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度と、前記工程（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度とを比較し、前記被検ＲＮＡ中の標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を検出する工程。
【請求項９】
前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記予測切断部位よりも３’末端側であり、かつ前記予測切断部位と隣接する領域であり、
前記工程（２ａ）及び（２ａ’）における逆転写反応が、さらに、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを用いて行われるものであって、前記蛍光標識ジデオキシヌクレオチドが、前記第１蛍光物質とは分光特性の異なる第２蛍光物質により標識されており、かつ前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の予測切断部位の５’末端側隣の塩基と相補的な塩基種であり、
前記蛍光シグナルの解析を蛍光相互相関分光法により行うものであり、
前記工程（２ｃ’）において標的遺伝子のｍＲＮＡの切断が検出されたか否かの判断を、下記（２−ｉ）〜（２−ｉｉｉ）により行うことを特徴とする請求項８記載のｍＲＮＡの切断の検出方法。
（２−ｉ）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）が、前記工程（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）よりも少ない場合に、前記予測切断部位が切断されていると判断する。
（２−ｉｉ）前記（２−ｉ）以外の場合であって、前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさが、前記工程（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさよりも小さい場合に、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の前記予測切断部位以外の部位が切断されていると判断する。
（２−ｉｉｉ）前記（２−ｉ）及び（２−ｉｉ）のいずれにも該当しない場合に、前記標的遺伝子のｍＲＮＡは切断されていないと判断する。
【請求項１０】
前記工程（２ｂ）及び（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）を、下記工程（ｐ）〜（ｓ）により作成した近似線に基づき補正し、当該補正後の値に基づいて工程（２ｃ’）を行うことを特徴とする請求項９記載のｍＲＮＡの切断の検出方法。
（ｐ）前記第１蛍光物質により標識された第１蛍光標識分子と、前記第２蛍光物質により標識された第２蛍光標識分子と、前記第１蛍光物質及び前記第２蛍光物質により標識された両蛍光標識分子とを準備する工程と、
（ｑ）前記第１蛍光標識分子と前記第２蛍光標識分子と前記両蛍光標識分子との総和に対する前記両蛍光標識分子の含有割合（モル比）が異なる検量線用試料系列を調製する工程と、
（ｒ）前記工程（ｑ）において調製した検量線用試料系列のそれぞれの検量線用試料に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光と前記第２蛍光物質を励起し得る波長の光とを別個に照射し、当該蛍光物質から発される蛍光を蛍光シグナルとしてそれぞれ検出し、検出された蛍光シグナルを蛍光相互相関分光法により解析して、当該検量線用試料中の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）を測定する工程と、
（ｓ）前記工程（ｒ）において測定された各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）と、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合との関係の近似線を作成する工程。
【請求項１１】
前記被検ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入した被検細胞由来のＲＮＡであり、前記対照ＲＮＡが、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡを導入していない対照細胞由来のＲＮＡであることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のｍＲＮＡの切断の検出方法。
【請求項１２】
前記被検ＲＮＡが、内在ｍｉＲＮＡを含有している被検細胞由来のＲＮＡであり、前記対照ＲＮＡが、前記内在ｍｉＲＮＡを含有していない対照細胞由来のＲＮＡであることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のｍＲＮＡの切断の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによる遺伝子の発現抑制効果やｍＲＮＡの切断有無を、直接的かつ簡便に検出し評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内においては、タンパク質のｍＲＮＡを分解することにより、当該タンパク質の発現を抑制することができる。このようなｍＲＮＡを分解する反応としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）やｍｉＲＮＡによるｍＲＮＡの分解反応等が挙げられる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、線虫、ハエ、植物、動物等の様々な生物の細胞に、２本鎖ＲＮＡが取り込まれることにより、該２本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが分解される結果、任意の遺伝子発現が抑制される現象であり、この現象を利用して任意の遺伝子発現を阻害するＲＮＡ干渉法が近年注目されている。また、ｍｉＲＮＡは、タンパク質に翻訳されない２０数塩基のＲＮＡであり、翻訳抑制あるいはｍＲＮＡの分解に関与していることが示唆されている。
【０００３】
ＲＮＡ干渉において、切断された長い（一般的に２００塩基対以上）の２本鎖ＲＮＡは、細胞内で、リボヌクレアーゼの一種であるＤｉｃｅｒにより、２１〜２５塩基対の短い２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断される。この短い２本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、細胞質内でヘリカーゼによる巻き戻しを受けて１本鎖になり、この１本鎖ＲＮＡと、複数のタンパク質からなるＲＩＳＣ（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）とがＲＩＳＣ複合体を形成する。その後、該ＲＩＳＣ複合体中の１本鎖ＲＮＡと、相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡがさらに該ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、ＲＩＳＣのリボヌクレアーゼ活性により、該ｍＲＮＡが分解され、ジーンサイレンシング（遺伝子の発現抑制）が起こる。
【０００４】
但し、ヒト等の哺乳動物においては、長い２本鎖ＲＮＡにより、インターフェロン応答が引き起こされるため、長い２本鎖ＲＮＡをそのまま細胞に導入することはできない。このため、例えば、２本鎖ＲＮＡを組み込んだ発現ベクターとして細胞に導入する手法等がある。該手法では、プロモーター配列の下流にｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）の塩基配列を挿入した発現ベクターを用い、細胞内でｓｈＲＮＡからプロセッシングを経てｓｉＲＮＡを発現させてＲＮＡ干渉を起こさせるというものである。また、発現ベクターの構築には一定の時間がかかるため、より早く簡便に遺伝子発現抑制効果の確認を行いたい場合には、２１塩基対程度の化学合成されたｓｉＲＮＡを、直接細胞に導入する方法が用いられている。合成２本鎖ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により、相同組み換えによるノックアウトマウス作製のような設備と時間を必要とせず、培養細胞やモデル動物の実験系で、標的遺伝子のｍＲＮＡの分解によるノックダウンを簡単に行うことができるため、ＲＮＡ干渉は、遺伝子の機能解析や標的遺伝子のスクリーニング等に活用されている。
【０００５】
ＲＮＡ干渉においては、細胞内に導入された合成ｓｉＲＮＡは、目的のｍＲＮＡと相互作用し、これを切断することによって目的のタンパク質が翻訳されるのを抑制する。より詳細には、細胞内に導入されたｓｉＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒ等のＲＩＳＣローディングコンプレックスと相互作用し、ＲＩＳＣへと運ばれる。ＲＩＳＣは、２本鎖のｓｉＲＮＡを開裂し、生じた１本鎖ＲＮＡを取り込む。このとき、ＲＩＳＣへアンチセンス鎖が取り込まれることにより、ＲＩＳＣ−アンチセンス鎖複合体が形成される。該複合体がアンチセンス鎖と相補的な塩基配列を有する目的のｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＩＳＣによって該ｍＲＮＡは切断され、目的の遺伝子（標的遺伝子）の発現を抑制することができる。（例えば、非特許文献１参照。）
【０００６】
細胞内へ導入されたｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡ、又は内在ｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を確認するための手法としては、当該細胞における標的タンパク質の発現量を測定するタンパク質レベルの評価法と、標的遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するｍＲＮＡレベルの評価法とが用いられている。最終的な効果を確認するためにはタンパク質レベルの評価が重要だが、途中経過であるｍＲＮＡの切断効率をみるためには、ｍＲＮＡレベルの評価が必要である。標的遺伝子の発現抑制効果をｍＲＮＡレベルにおいて評価する方法としては、現在はＲＴ−ＰＣＲ法が主に用いられている（例えば、特許文献１参照。）該手法は、まず、ｓｉＲＮＡを導入した細胞を一定期間培養する。この培養した細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製する。得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲを行い、標的遺伝子由来のｍＲＮＡ量を定量的に測定し、標的遺伝子の発現が抑制されているか否かの評価を行う。標的遺伝子の発現が抑制されている場合には、標的遺伝子由来のｍＲＮＡ量が減少している。このため、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入前と比較し、該ｍＲＮＡ量の減少傾向が高いｓｉＲＮＡほど、標的遺伝子の発現抑制効果が高いと評価することができる。その他、リアルタイムＰＣＲに代えて通常のＰＣＲを行った場合であっても、蛍光相関分光法を用いることにより、得られたＰＣＲ産物中の標的遺伝子由来のｍＲＮＡのｃＤＮＡの量をより簡便かつ定量的に測定することもできる（例えば、特許文献２参照。）。
【０００７】
また、近年の一分子蛍光分析技術の進歩により、細胞内に導入したｓｉＲＮＡの挙動を直接観察することもできるようになってきている。例えば、蛍光標識したｓｉＲＮＡを細胞内に導入した後、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）や蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）を用いて、当該ｓｉＲＮＡの挙動を観察することができる。（例えば、非特許文献２参照。）その他、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を用いて、細胞内に導入したｓｉＲＮＡの状態や挙動を観察することもできる。（例えば、非特許文献３参照。）
【０００８】
一方で、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子発現抑制までの過程において、細胞に導入されたｓｉＲＮＡがヘリカーゼによって巻き戻され、開裂により生じた１本鎖ＲＮＡがＲＩＳＣに取り込まれる際に、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖が取り込まれ、ＲＩＳＣ−センス鎖複合体が形成されてしまう場合がある。この場合には、ＲＩＳＣ−センス鎖複合体によって、センス鎖と相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡが切断されてしまい、標的遺伝子とは別の遺伝子の発現が抑制される。このような、標的遺伝子以外の遺伝子が発現抑制される効果を、オフターゲット効果と呼ぶ。その他、ＲＩＳＣ−アンチセンス鎖複合体が形成された場合に、ミスマッチにより、アンチセンス鎖と非相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識して切断してしまい、標的遺伝子とは別の遺伝子の発現が抑制されることもある。このような効果もオフターゲット効果として知られている。
【０００９】
このようなオフターゲット効果を回避するために、導入するｓｉＲＮＡの設計に関していくつかの工夫がなされている。ＲＩＳＣ−アンチセンス鎖複合体を優先的に形成するためには、ＲＩＳＣを構成するＲＮＡヘリカーゼによるｓｉＲＮＡの開裂を、ｓｉＲＮＡのセンス鎖側から行うことが好ましい。そこで、例えば、ｓｉＲＮＡの設計において、アンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の５’末端の塩基配列を、グアニンやシトシンの多い配列（Ｇ／Ｃリッチ配列）とする一方で、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端の塩基配列を、アデニンやウラシルの多い配列（Ａ／Ｕリッチ配列）とすることにより、アンチセンス鎖とセンス鎖との結合力を、センス鎖の５’末端側のほうがセンス鎖の３’末端側よりも弱くなるようにし、ＲＩＳＣによる開裂を、優先的にセンス鎖側から行うようにする方法がある。その他、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基に修飾を行うことにより、ＲＩＳＣによる開裂を、優先的にセンス鎖側から行うようにする方法もある。
【００１０】
一般的に、オフターゲット効果の確認及び評価は、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入、細胞培養、ｍＲＮＡ抽出、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによる標的ｍＲＮＡの発現解析という工程を経て行っていた。ここで、使用したｓｉＲＮＡのオフターゲット効果の影響が大きい場合は、再度ｓｉＲＮＡの塩基配列等を再検討し、上記の一連の作業を再度行い、目的の機能を果たすオフターゲット効果の小さいｓｉＲＮＡを絞り込んでいく作業を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０５／０４９８２１号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−１２５９００号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】マルチネズ（Martinez）、外４名、セル（Cell）、２００２年、第１１０巻、５６３〜５７４ページ。
【非特許文献２】オート（Ohrt）、外７名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００８年、第３６巻第２０号、６４３９〜６４４９ページ。
【非特許文献３】ジャーヴ（Jarve）、外１１名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００７年、第３５巻第１８号、ｅ１２４。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、従来は、ｍＲＮＡレベルで標的遺伝子の発現抑制効果を評価する場合には、細胞から抽出したｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した後、このｃＤＮＡを鋳型としてさらにＰＣＲによる増幅を行うことによって、標的遺伝子のｍＲＮＡを間接的に検出している。つまり、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断自体を直接検出する方法ではないため、その信頼性に疑問が残る。このため、より直接的にｍＲＮＡの切断を検出し、標的遺伝子の発現抑制効果を評価する方法の開発が求められている。
【００１４】
すなわち、本発明は、ＰＣＲ等の増幅反応を用いずに、ｍＲＮＡが切断されているか否か、又はｍｉＲＮＡにより結合されているか否かを、直接検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡにより切断又は結合されると予測される部位の３’末端側の領域とハイブリダイズする蛍光標識プライマーを用いて逆転写反応を行い、当該蛍光標識プライマーの伸長産物を蛍光法により解析することにより、増幅反応を要することなくｍＲＮＡが切断されたか否かを検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、
（１）  遺伝子の発現抑制効果を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡを導入した細胞又は内在ｍｉＲＮＡを含有している細胞を被検細胞とし、（１ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、前記被検細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程と、（１ｂ）前記工程（１ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程と、（１ｃ）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度に基づき、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程と、を有し、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記ｓｉＲＮＡ若しくは前記ｍｉＲＮＡによる予測切断部位又は前記ｍｉＲＮＡによる予測結合部位よりも３’末端側の領域であることを特徴とする遺伝子発現抑制効果評価方法、
（２）  前記蛍光シグナルの解析を、蛍光相関分光法、蛍光偏光法、及び蛍光相互相関分光法からなる群より選択される方法により行うことを特徴とする前記（１）記載の遺伝子発現抑制効果評価方法、
（３）  前記工程（１ｃ）が下記工程（１ｃ’）であり、前記工程（１ｃ’）の前に、下記工程（１ａ’）及び（１ｂ’）を有することを特徴とする前記（１）又は（２）記載の遺伝子発現抑制効果評価方法；（１ａ’）前記蛍光標識プライマーを用いて、対照細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程、（１ｂ’）前記工程（１ａ’）において得られた逆転写反応産物に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程、（１ｃ’）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度と、前記工程（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度とを比較し、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程、
（４）  前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記予測切断部位よりも３’末端側であり、かつ前記予測切断部位と隣接する領域であり、前記工程（１ａ）及び（１ａ’）における逆転写反応が、さらに、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを用いて行われるものであって、前記蛍光標識ジデオキシヌクレオチドが、前記第１蛍光物質とは分光特性の異なる第２蛍光物質により標識されており、かつ、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の予測切断部位又は予測結合部位の５’末端側隣の塩基と相補的な塩基種であり、前記蛍光シグナルの解析を蛍光相互相関分光法により行うものであり、前記工程（１ｃ’）における評価を、下記（１−ｉ）〜（１−ｉｉｉ）により行うことを特徴とする前記（３）記載の遺伝子発現抑制効果評価方法；（１−ｉ）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）が、前記工程（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）よりも少ない場合に、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡにより前記予測切断部位が切断され、前記標的遺伝子の発現が抑制されたと評価する、（１−ｉｉ）前記（１−ｉ）以外の場合であって、前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさが、前記工程（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさよりも小さい場合に、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡにより、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の前記予測切断部位以外の部位が切断され、前記標的遺伝子の発現が抑制されたと評価する、（１−ｉｉｉ）前記（１−ｉ）及び（１−ｉｉ）のいずれにも該当しない場合に、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡにより、前記標的遺伝子の発現が抑制されていないと評価する、
（５）  前記工程（１ｂ）及び（１ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）を、下記工程（ｐ）〜（ｓ）により作成した近似線に基づき補正し、当該補正後の値に基づいて工程（１ｃ’）を行うことを特徴とする前記（４）記載の遺伝子発現抑制効果評価方法；（ｐ）前記第１蛍光物質により標識された第１蛍光標識分子と、前記第２蛍光物質により標識された第２蛍光標識分子と、前記第１蛍光物質及び前記第２蛍光物質により標識された両蛍光標識分子とを準備する工程と、（ｑ）前記第１蛍光標識分子と前記第２蛍光標識分子と前記両蛍光標識分子との総和に対する前記両蛍光標識分子の含有割合（モル比）が異なる検量線用試料系列を調製する工程と、（ｒ）前記工程（ｑ）において調製した検量線用試料系列のそれぞれの検量線用試料に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光と前記第２蛍光物質を励起し得る波長の光とを別個に照射し、当該蛍光物質から発される蛍光を蛍光シグナルとしてそれぞれ検出し、検出された蛍光シグナルを蛍光相互相関分光法により解析して、当該検量線用試料中の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）を測定する工程と、（ｓ）前記工程（ｒ）において測定された各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）と、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合との関係の近似線を作成する工程、
（６）  ｍＲＮＡの切断を検出する方法であって、（２ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、被検ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程と、（２ｂ）前記工程（２ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程と、（２ｃ）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度に基づき、前記被検ＲＮＡ中の標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を検出する工程と、を有し、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が予測切断部位よりも３’末端側の領域であることを特徴とするｍＲＮＡの切断の検出方法、
（７）  前記蛍光シグナルの解析を、蛍光相関分光法、蛍光偏光法、及び蛍光相互相関分光法からなる群より選択される方法により行うことを特徴とする前記（６）記載のｍＲＮＡの切断の検出方法、
（８）  前記工程（２ｃ）が下記工程（２ｃ’）であり、前記工程（２ｃ’）の前に、下記工程（２ａ’）及び（２ｂ’）を有することを特徴とする前記（６）又は（７）記載のｍＲＮＡの切断の検出方法；（２ａ’）前記蛍光標識プライマーを用いて、対照ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程、（２ｂ’）前記工程（２ａ’）において得られた逆転写反応産物に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記第１蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程、（２ｃ’）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度と、前記工程（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度とを比較し、前記被検ＲＮＡ中の標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を検出する工程、
（９）  前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、前記予測切断部位よりも３’末端側であり、かつ前記予測切断部位と隣接する領域であり、前記工程（２ａ）及び（２ａ’）における逆転写反応が、さらに、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを用いて行われるものであって、前記蛍光標識ジデオキシヌクレオチドが、前記第１蛍光物質とは分光特性の異なる第２蛍光物質により標識されており、かつ前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の予測切断部位の５’末端側隣の塩基と相補的な塩基種であり、前記蛍光シグナルの解析を蛍光相互相関分光法により行うものであり、前記工程（２ｃ’）において標的遺伝子のｍＲＮＡの切断が検出されたか否かの判断を、下記（２−ｉ）〜（２−ｉｉｉ）により行うことを特徴とする前記（８）記載のｍＲＮＡの切断の検出方法；（２−ｉ）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）が、前記工程（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）よりも少ない場合に、前記予測切断部位が切断されていると判断する、（２−ｉｉ）前記（２−ｉ）以外の場合であって、前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさが、前記工程（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物と前記標的遺伝子のｍＲＮＡとの会合体の一分子当たりの大きさよりも小さい場合に、前記標的遺伝子のｍＲＮＡ中の前記予測切断部位以外の部位が切断されていると判断する、（２−ｉｉｉ）前記（２−ｉ）及び（２−ｉｉ）のいずれにも該当しない場合に、前記標的遺伝子のｍＲＮＡは切断されていないと判断する、
（１０）  前記工程（２ｂ）及び（２ｂ’）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）を、下記工程（ｐ）〜（ｓ）により作成した近似線に基づき補正し、当該補正後の値に基づいて工程（２ｃ’）を行うことを特徴とする前記（９）記載のｍＲＮＡの切断の検出方法；（ｐ）前記第１蛍光物質により標識された第１蛍光標識分子と、前記第２蛍光物質により標識された第２蛍光標識分子と、前記第１蛍光物質及び前記第２蛍光物質により標識された両蛍光標識分子とを準備する工程と、（ｑ）前記第１蛍光標識分子と前記第２蛍光標識分子と前記両蛍光標識分子との総和に対する前記両蛍光標識分子の含有割合（モル比）が異なる検量線用試料系列を調製する工程と、（ｒ）前記工程（ｑ）において調製した検量線用試料系列のそれぞれの検量線用試料に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光と前記第２蛍光物質を励起し得る波長の光とを別個に照射し、当該蛍光物質から発される蛍光を蛍光シグナルとしてそれぞれ検出し、検出された蛍光シグナルを蛍光相互相関分光法により解析して、当該検量線用試料中の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）を測定する工程と、（ｓ）前記工程（ｒ）において測定された各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合（モル比）と、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合との関係の近似線を作成する工程、
（１１）  前記被検ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入した被検細胞由来のＲＮＡであり、前記対照ＲＮＡが、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡを導入していない対照細胞由来のＲＮＡであることを特徴とする前記（６）〜（１０）のいずれか記載のｍＲＮＡの切断の検出方法、
（１２）  前記被検ＲＮＡが、内在ｍｉＲＮＡを含有している被検細胞由来のＲＮＡであり、前記対照ＲＮＡが、前記内在ｍｉＲＮＡを含有していない対照細胞由来のＲＮＡであることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のｍＲＮＡの切断の検出方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法及びｍＲＮＡの切断の検出方法により、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を要することなく、直接ｍＲＮＡを解析することによって、ｍＲＮＡの切断の有無や、ｍｉＲＮＡに結合されているか否かを検出することができる。よって、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法により、ｍＲＮＡレベルにおけるＲＮＡ干渉活性やｍｉＲＮＡ活性について、信頼性の高い評価を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法及びｍＲＮＡの切断の検出方法における、蛍光標識プライマーを用いた逆転写反応の概念図である。
【図２】標的遺伝子のｍＲＮＡに対する切断活性を有することが期待されるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの評価を行う場合の、本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図３】本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法を用いて、被検細胞へ導入したｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡにより、標的遺伝子のｍＲＮＡが、予測切断部位において切断されているか否かを検出する方法を概念的に示した図である。
【図４】被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡの切断及び標的遺伝子の発現抑制効果を、検出及び評価する場合の、本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。
【図５】実施例１において、ＦＣＳ計測により測定された各試料の並進拡散時間（μ秒）を示した図である。
【図６】実施例２において、縦軸をＦＣＣＳ計測により得られた蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（ＤＣＣ）、横軸を実際の蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（Ｆｒａｃ．Ｇ／Ｒ−ＤＮＡ）として、検量線用試料系列の各検量線用試料のデータをプロットした図である。
【図７】実施例２において、逆転写反応産物に対して行ったＦＣＣＳ計測により求めた、逆転写反応産物中の逆転写反応により伸長したＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２の含有割合（％）を、図６に示す検量線に基づいて補正した結果を示した図である。
【図８】実施例３において、細胞に対してＦＣＣＳ計測を行った結果算出されたＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２（ローダミングリーン標識分子）及びＣｙ５−ｄｄＡＴＰ（Ｃｙ５標識分子）の蛍光自己相互相関関数曲線、並びに蛍光相互相関関数曲線を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明及び本願明細書において、特に記載が無い限り、「量」は「モル量」を、「量比」や「比」は「モル比」を、「比率」は「モル比率」を、「割合」は「モル量同士の割合」を、それぞれ意味する。
【００２０】
本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（以下、「標的ｍＲＮＡ」ということがある。）が、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡにより切断又は結合されることによって翻訳が阻害されることによる当該標的遺伝子の発現抑制において、蛍光標識プライマーを用いて標的遺伝子由来のｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、当該蛍光標識プライマーから発される蛍光シグナルに基づき解析することにより、当該ｍＲＮＡの切断の有無やｍｉＲＮＡによる結合の有無を検出することを特徴とする。本発明において用いられる蛍光標識プライマーは、標的ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡにより切断又は結合された場合には、逆転写反応によって得られる蛍光標識プライマーの伸長産物の伸長度が、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによる処理を受ける前の標的ｍＲＮＡを鋳型とした場合よりも非常に短くなり、場合によっては、全く伸長されなくなるように設計される。このため、逆転写産物中の当該蛍光標識プライマーの伸長産物の量や伸長度を測定することにより、標的ｍＲＮＡが、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによって切断又は結合されたか否かを検出することができる。
【００２１】
本発明において用いられる蛍光標識プライマーは、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプライマーであって、蛍光物質により標識されたプライマーである。なお、本発明において、蛍光標識プライマーの標識に用いられる蛍光物質を、第１蛍光物質という。
【００２２】
本発明において用いられる蛍光標識プライマーは、標的ｍＲＮＡ中の、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡによって切断されると予測される部位（予測切断部位）、又はｍｉＲＮＡが結合すると予測される部位（予測結合部位）よりも３’末端側の領域とハイブリダイズするように設計される。
【００２３】
なお、一般的に、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによるｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ等がハイブリダイズした領域において生じる。したがって、標的ｍＲＮＡ中の「ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡによる予測切断部位」は、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡがハイブリダイズすると予測される部分領域中に存在する。このため、蛍光標識プライマーが、ｓｉＲＮＡ等がハイブリダイズすると予測される領域の３’末端側の領域とハイブリダイズするように設計することにより、当該蛍光標識プライマーを、予測切断部位よりも３’末端側の領域とハイブリダイズさせることができる。
【００２４】
また、本発明において、「ｍｉＲＮＡによる予測結合部位」とは、標的ｍＲＮＡ中の部分領域であって、ｍｉＲＮＡがハイブリダイズすると予測される領域を意味する。すなわち、標的ｍＲＮＡ中の、ｍｉＲＮＡと相同性の高い塩基配列を有する領域である。
【００２５】
図１に、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法及びｍＲＮＡの切断の検出方法における、蛍光標識プライマーを用いた逆転写反応の概念図を示す。標的ｍＲＮＡ（１）の予測切断部位（２）が、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡによって切断されていない場合〔図１（Ａ）〕には、第１蛍光物質（３１）によって標識された蛍光標識プライマー（３）は、標的ｍＲＮＡ（１）の当該予測切断部位（２）よりも３’末端側の領域とハイブリダイズし、逆転写反応により、伸長する。なお、図中の蛍光標識プライマー（３）から伸びている点線部分は、逆転写反応により伸長した部分を示す。一方、予測切断部位（２）がｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡによって切断された場合〔図１（Ｂ）〕には、蛍光標識プライマー（３）は標的ｍＲＮＡの切断断片（１１）とハイブリダイズするものの、逆転写反応によって切断部位までしか伸長されない。また、蛍光標識プライマー（３）が、標的ｍＲＮＡ（１）中の実際の切断部位よりも３’末端側であり、かつ当該切断部位と隣接する領域とハイブリダイズする場合には、蛍光標識プライマー（３）は逆転写反応により伸長されない。なお、「切断部位の３’末端側であり、かつ当該切断部位と隣接する領域とハイブリダイズする」とは、切断部位の３’末端側隣の塩基と、蛍光標識プライマー（３）の３’末端の塩基とが塩基対を形成するようにハイブリダイズすることを意味する。
【００２６】
図１に示すように、ｍＲＮＡが切断されたか否かによって、逆転写反応により得られる蛍光標識プライマーの伸長産物が異なる。このため、蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡによって標的ｍＲＮＡが切断されたか否かを検出することができる。
【００２７】
また、ｍｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合している場合には、蛍光標識プライマーによる逆転写反応が阻害される。このため、ｍＲＮＡが切断される場合と同様に、蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定することにより、ｍｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合しているか否かを検出することができる。
【００２８】
標的ｍＲＮＡ中の蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域は、予測切断部位や予測結合部位よりも３’末端側の領域であればよいが、蛍光標識プライマーの３’末端の塩基と塩基対を形成するｍＲＮＡ中の塩基が、予測切断部位又は予測結合部位から３０塩基以内にあることが好ましく、２０塩基以内にあることがより好ましく、１０塩基以内にあることがさらに好ましく、隣接していることが特に好ましい。蛍光標識プライマーがハイブリダイズする領域と、予測切断部位又は予測結合部位との距離が短いほど、ｍＲＮＡが切断された場合（又はｍｉＲＮＡにより結合された場合）に得られる蛍光標識プライマーの伸長産物と、ｍＲＮＡが切断されなかった場合（又はｍｉＲＮＡにより結合されなかった場合）に得られる蛍光標識プライマーの伸長産物とを、より明確に識別することができる。
【００２９】
蛍光標識プライマーの塩基配列及び塩基長は、逆転写反応の際に、標的ｍＲＮＡを特異的に認識し、プライマーとして機能し得るものであれば特に限定されるものではなく、標的ｍＲＮＡの塩基配列、使用する逆転写酵素の種類等を考慮して、適宜設計することができる。例えば、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする領域が１５〜３０塩基、好ましくは２０塩基程度であれば、標的ｍＲＮＡに対する特異性を十分に高くし、逆転写反応における非特異的な反応を軽減し得ることが期待できる。
【００３０】
蛍光標識プライマーの標識に用いられる第１蛍光物質としては、特に限定されるものではなく、一般的に核酸やタンパク質等の蛍光標識に用いられる蛍光物質の中から適宜決定することができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７等のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅシリーズ（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６４７Ｎ等のＡＴＴＯ  ｄｙｅシリーズ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）、Ｃｙ５等のＣｙ  ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標）  Ｆｌｕｏｒ４８８（ＡｎａＳｐｅｃ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（インビトロジェン社製）、ＤＹ６４７（Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、ＴｅｘａｓＲｅｄ等がある。例えば、ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ、ＴＭＲ等のように、連続して光照射を行った場合でも比較的安定して蛍光を発するような退色し難い蛍光物質を標識として用いることにより、光照射の時間や回数の影響を抑えて、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した解析結果を得ることができる。
【００３１】
第１蛍光物質により標識される蛍光標識プライマー中の部位は、逆転写反応を阻害しない領域であれば、特に限定されるものではなく、蛍光標識の方法、蛍光標識プライマーの伸長産物の解析法の種類等を考慮して、適宜決定することができる。本発明においては、の５’末端に蛍光物質が標識されているプライマーであることが好ましい。
【００３２】
蛍光標識プライマーは、当該技術分野において公知のいずれの手法により設計し、合成してもよい。例えば、標的ｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、蛍光標識プライマーの塩基配列を常法により設計した後、該設計に基づき、公知の核酸合成反応により合成したプライマーに、公知の有機合成反応により第１蛍光物質を結合させることができる。また、第１蛍光物質により塩基が標識されたデオキシヌクレオチドを用いて合成することによっても、蛍光標識プライマーを製造することができる。
【００３３】
具体的には、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法は、下記工程（１ａ）〜（１ｃ）を有する。
（１ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、前記被検細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程。
（１ｂ）前記工程（１ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程。
（１ｃ）前記工程（１ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度に基づき、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程。
【００３４】
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（１ａ）として、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、被検細胞由来のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、逆転写反応産物を得る。
【００３５】
本発明において、標的遺伝子とは、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによって当該遺伝子のｍＲＮＡの正常な翻訳が阻害される遺伝子を意味する。本発明においては、標的遺伝子としては、タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、生物由来の天然の遺伝子であってもよく、人工的に変異又は合成された遺伝子であってもよい。また、標的遺伝子の由来する生物種は特に限定されるものではなく、線虫、ハエ等の昆虫、植物、動物、細菌やウィルス等のいずれであってもよい。本発明においては、ヒトをはじめとする哺乳動物由来の遺伝子であることが好ましい。
【００３６】
また、工程（１ａ）における逆転写反応において用いられる鋳型としては、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡにより、細胞が含有する標的ｍＲＮＡが切断又は結合されている被検細胞由来のＲＮＡを用いる。具体的には、予めｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡが導入された細胞、又は内在ｍｉＲＮＡを含有している細胞を被検細胞とし、これらの細胞由来のＲＮＡを用いる。
【００３７】
ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを細胞に導入することにより、当該細胞内のＲＮＡをｓｉＲＮＡ等によって処理することができる。ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡが標的遺伝子に対する発現抑制活性（ＲＮＡ干渉活性又はｍｉＲＮＡ活性）を有する場合には、細胞内に導入されたｓｉＲＮＡ等は、ＲＩＳＣ等の細胞内の分子を用いて反応を行い、当該細胞が含有する標的ｍＲＮＡを切断し、又は当該ｍＲＮＡと結合する。
【００３８】
同様に、ｍｉＲＮＡ活性を有する内在ｍｉＲＮＡを含有している細胞内では、当該内在ｍｉＲＮＡが標的遺伝子に対する発現抑制活性を有する場合には、当該細胞内の標的ｍＲＮＡは切断されていたり、当該内在ｍｉＲＮＡに結合されていたりする。
【００３９】
被検細胞に予め導入されるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの一部又は全部と相同的な塩基配列を有する１本鎖ＲＮＡであるセンス鎖と、該センス鎖と相補的な塩基配列を有する１本鎖ＲＮＡであるアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡであって、塩基配列が明らかであるものであれば、特に限定されるものではない。なお、該センス鎖には、標的遺伝子由来ｍＲＮＡと相同的な塩基配列以外にも、付加的な塩基配列を有していてもよく、また、リン酸化や２’−Ｏ−メチル化等による修飾がされていてもよい。アンチセンス鎖も、同様に、修飾がされていてもよい。
【００４０】
被検細胞に予め導入されるｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの一部又は全部とハイブリダイズ可能な塩基配列を有する１本鎖ＲＮＡであって、標的ｍＲＮＡ中のどの部位が、当該ｍｉＲＮＡによって切断される部位であるか、又は当該ｍｉＲＮＡが結合（ハイブリダイズ）する部位であるかが予測可能なものであれば、特に限定されるものではない。なお、被検細胞には、細胞内においてＤｉｃｅｒ等によるプロセッシングを受けてｍｉＲＮＡが形成される前駆体を導入してもよい。
【００４１】
本発明において被検細胞に予め導入されるｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡの塩基対長は、ＲＮＡ干渉活性やｍｉＲＮＡ活性において有効な長さであれば特に限定されるものではなく、標的遺伝子の種類や塩基配列、標的遺伝子が由来する生物種、細胞等への導入方法等を考慮して、適宜決定することができる。ヒト等の哺乳動物に対するＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡとしては、標的ｍＲＮＡと相補的な配列部分が１５〜２５塩基対長であることが好ましい。
【００４２】
本発明において被検細胞に予め導入されるｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡは、当該技術分野において公知のいずれの手法により設計し、合成してもよい。例えば、標的ｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡの塩基配列を常法により設計した後、該設計に基づき、公知の核酸合成反応により合成することができる。ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡの合成は、例えば、市販の合成機を用いて独自に合成してもよく、受託サービスを利用して合成することもできる。また、ｓｉＲＮＡを合成する場合には、例えば、センス鎖とアンチセンス鎖とを別個に合成した後、両者をアニーリングさせてもよく、アニーリング後には、残存する一本鎖ＲＮＡはエキソヌクレアーゼ処理等により除去しておくことが好ましい。
【００４３】
被検細胞へのｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡの導入は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよい。該手法としては、リポフェクチン等の脂質を用いた手法、エレクトロポレーション等の電気的な手法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。その他、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）等の市販の核酸導入試薬を用いることにより簡便に行うことができる。例えば、培養液と脂質とで調製したｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを、終濃度が１０ｎＭとなるように調製したものを、培養細胞へ導入する。導入処理後、全反射蛍光顕微鏡等を用いて蛍光観測することによって、導入の状態を確認することも可能である。
【００４４】
ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入した後、培養させた後の被検細胞由来のＲＮＡを、逆転写反応の鋳型とすることが好ましい。培養時間は、被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡを切断したり、標的ｍＲＮＡと結合するのに十分な時間であれば、特に限定されるものではなく、被検細胞の種類、ｓｉＲＮＡ等の細胞への導入方法、導入するｓｉＲＮＡ等の濃度等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ等を導入後、２４〜４８時間程度培養した後の被検細胞由来のＲＮＡを、鋳型として用いることができる。
【００４５】
工程（１ａ）における逆転写反応は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入した被検細胞から抽出したＲＮＡを添加した反応溶液中で（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系で）行ってもよく、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入した被検細胞内で（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏの反応系で）行っても良い。
【００４６】
逆転写反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系で行う場合、被検細胞からのＲＮＡの抽出は、細胞からＲＮＡを抽出する際に通常用いられているいずれの手法を用いて抽出してもよい。また、抽出されたＲＮＡは、逆転写反応を行う前に、ＤＮＡ分解酵素処理を行うことにより、混入されているＤＮＡを分解しておくことが好ましい。混入しているＤＮＡを予め分解しておくことにより、被検細胞由来のＤＮＡと、蛍光標識プライマーとが非特異的に反応することを防止することができる。
【００４７】
逆転写反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼ等の逆転写酵素、ヌクレオチド、バッファー等の試薬は、特に限定されるものではなく、逆転写反応を行う場合に通常用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。また、逆転写反応の際に、標的遺伝子由来のｍＲＮＡと蛍光標識プライマーとをアニーリングさせる温度は、蛍光標識プライマーのＴｍ値等を考慮して、適宜決定する。非特異的な逆転写反応を抑制することにより、本発明における評価の精度を向上させることができる。その他の逆転写反応の反応条件は、特に限定されるものではなく、使用する逆転写酵素の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００４８】
また、被検細胞に、蛍光標識プライマー及び逆転写酵素を導入した後、反応に十分な時間培養することによって、逆転写反応をｉｎ  ｖｉｖｏの反応系で行ことができる。蛍光標識プライマー等の被検細胞への導入は、前述のｓｉＲＮＡの導入と同様にして行うことができる。なお、蛍光標識プライマーと逆転写酵素は、同時に被検細胞へ導入してもよく、別個に導入してもよい。例えば、先に蛍光標識プライマーのみを被検細胞へ導入し、後述する蛍光標識プライマーの伸長産物を検出する際と同様にして、当該細胞中の第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出した後に、逆転写反応を導入して逆転写反応を開始させることが好ましい。逆転写反応開始前に予め蛍光標識プライマーの細胞内挙動を測定しておくことにより、逆転写反応に依存した蛍光シグナルの変化をより正確に測定することができるため、標的遺伝子の発現抑制効果の評価の信頼性をより高めることができる。
【００４９】
逆転写反応を被検細胞内で行う場合、逆転写酵素を導入した後の培養時間は、逆転写反応に十分な時間であれば特に限定されるものではなく、被検細胞の種類等を考慮して適宜決定することができる。例えば、１〜３時間、好ましくは２時間程度培養することによって、被検細胞内で逆転写反応を行うことができる。
【００５０】
次いで、工程（１ｂ）として、工程（１ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記第１蛍光物質を含む分子全体（未伸長の蛍光標識プライマーと蛍光標識プライマーの伸長産物の総和）に対する前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する。
【００５１】
蛍光シグナルの検出は、具体的には、蛍光光度計に、工程（１ａ）において得られた逆転写産物（逆転写反応を被検細胞中で行った場合には、当該被検細胞）を設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる。なお、検出した蛍光シグナルの解析を一分子蛍光解析法により行う場合には、一般的には、共焦点（コンフォーカル）光学系を利用して蛍光シグナルを検出するが、一分子蛍光解析を行うための一分子由来の蛍光シグナルを取得することができる光学系であれば、特に限定されるものではなく、共焦点光学系以外の他の光学系を用いることも可能である。その他、蛍光シグナルの解析を一分子ごとではなく、逆転写反応産物全体として解析する場合には、蛍光を検出可能な蛍光光度計やマイクロプレートリーダー等を用いて蛍光シグナルを検出することもできる。
【００５２】
蛍光シグナルの解析を一分子蛍光解析法により行う場合には、蛍光シグナルの計測条件は、使用する蛍光光度計や蛍光顕微鏡の仕様により、適宜決定することができるが、例えば、１サンプル当たり、１０〜１５秒間で５回程度行う。計測時間はこれ以上長くても良く、回数もこれ以上多くても良い。但し、検出に用いる装置の種類によっては、計測時間が１０秒間未満等の短時間である場合や、測定回数が１回程度のみである場合には、データの再現性、信頼性が低下するおそれがある。また、蛍光シグナルを計測するサンプルに対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得することができ、統計的な精度を高めることも可能である。
【００５３】
本発明において、蛍光シグナルの解析に用いられる蛍光解析法としては、例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光偏光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＰ）、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）、及び蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）等が挙げられる。ＦＰとしては、例えば、一分子蛍光解析法の１種である蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＤＡ−ＰＯ）であることが好ましい。本発明においては、伸長されなかった蛍光標識プライマーと、伸長された蛍光標識プライマーとの識別を、簡便にかつ精度よく行うことが可能であることから、特に、ＦＣＳ、ＦＰ、又はＦＣＣＳにより、蛍光シグナルを解析することが好ましい。また、これらの解析方法のうちの２種類以上を適宜組み合わせてもよい。
【００５４】
ＦＣＳは、反応溶液中の蛍光標識された分子（蛍光標識分子）の拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる手法である。具体的には、反応溶液中の蛍光標識された分子（蛍光標識分子）の拡散する時間（並進拡散時間）を、蛍光物質の種類ごとにそれぞれ求める。並進拡散時間は、分子の大きさによって異なる。例えば、大きな分子の並進拡散時間は、小さな分子の並進拡散時間よりも長い。このため、ＦＣＳは、分子の相互作用や、分解、凝集等による大きさの変化をモニターするために利用される手法である。
【００５５】
被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡがＲＮＡ干渉活性又はｍｉＲＮＡ活性を有する場合には、当該被検細胞中の標的ｍＲＮＡには、ｓｉＲＮＡ等の影響を受けていないものと、ｓｉＲＮＡ等により切断等がなされたものが存在している。よって、この場合、工程（１ａ）において得られた逆転写産物中には、未伸長の蛍光標識プライマーと、切断された標的遺伝子由来のｍＲＮＡを鋳型として得られた伸長度の短い蛍光標識プライマーの伸長産物と、ｓｉＲＮＡ等の影響を受けていない標的ｍＲＮＡを鋳型として得られた伸長度の長い蛍光標識プライマーの伸長産物との、並進拡散時間の異なる複数の分子が混在している。これに対して、ｓｉＲＮＡ等がＲＮＡ干渉活性等を有さない場合には、逆転写産物中には、未伸長の蛍光標識プライマーと、ｓｉＲＮＡ等の影響を受けていない標的ｍＲＮＡを鋳型として得られた伸長度の長い蛍光標識プライマーの伸長産物との、並進拡散時間の異なる２種類の分子のみが混在している。
【００５６】
このため、ＦＣＳを用いて解析することにより、得られた並進拡散時間から、逆転写反応産物中に存在する蛍光標識プライマーが、未伸長のプライマー又は伸長度の短いプライマーであるのか、伸長度の長いプライマーであるのかを、区別して識別することができる。これにより、逆転写反応産物中の第１蛍光物質を含む分子（蛍光標識プライマー）全体に対する、蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度を測定することができる。被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡがＲＮＡ干渉活性又はｍｉＲＮＡ活性を有する場合には、逆転写反応産物中の伸長度の短い蛍光標識プライマーの含有割合が、伸長度の長い蛍光標識プライマーの含有割合よりも有意に大きくなる。一方、ｓｉＲＮＡ等がＲＮＡ干渉活性等を有さない場合には、逆転写反応産物中には、伸長度の短い蛍光標識プライマーは存在せず、伸長度の長い蛍光標識プライマーの含有割合が大きくなる。
【００５７】
なお、標的ｍＲＮＡ中の蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、ｓｉＲＮＡ等による予測切断部位又は予測結合部位の３’末端側であって、当該部位と隣接する領域である場合には、切断された標的遺伝子由来のｍＲＮＡを鋳型とした場合には、当該蛍光標識プライマーは伸長しないため、逆転写産物中には、未伸長の蛍光標識プライマーと、ｓｉＲＮＡ等の影響を受けていない標的ｍＲＮＡを鋳型として得られた伸長度の長い蛍光標識プライマーの伸長産物との、並進拡散時間の異なる２種類の分子のみが混在している。よって、被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡがＲＮＡ干渉活性又はｍｉＲＮＡ活性を有する場合には、未伸長の蛍光標識プライマーの含有割合が、伸長度の長い蛍光標識プライマーの含有割合よりも有意に大きくなる。一方、ｓｉＲＮＡ等がＲＮＡ干渉活性等を有さない場合には、逆転写反応産物中には、伸長された蛍光標識プライマーの含有割合が、未伸長の蛍光標識プライマーの含有割合よりも有意に大きくなる。このため、各蛍光標識分子から測定された並進拡散時間に対して２成分解析を行うことにより、それぞれの並進拡散時間を有する分子の割合を算出することができる。
【００５８】
ＦＰは、蛍光分子に励起光として偏光を照射すると、生じる蛍光の偏光度が分子の状態によって異なること（蛍光異方性）を利用し、分子の状態を計測する方法である。大きな分子（分子量の大きい分子）は回転速度が遅いため、蛍光の偏光は解消せず、蛍光偏光度が大きくなる。一方、小さな分子（分子量の小さい分子）は回転速度が速いため、蛍光の偏光が解消され、蛍光偏光度は小さくなる。よって、逆転写反応産物の蛍光偏光度を測定することにより、逆転写反応産物中の蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合を求めることができる。
【００５９】
ＦＩＤＡ−ＰＯは、蛍光強度分布と蛍光偏光解析を複合させた手法であり、蛍光標識分子の蛍光偏光度とその分子数を求めることができる。前述したように、蛍光偏光度は、分子の大きさによって異なり、例えば、小さな分子は、大きな分子よりも分子の回転運動が速く、蛍光偏光度が小さくなる。
このため、ＦＩＤＡ−ＰＯを用いて解析することにより、得られた蛍光偏光度から、ＦＣＳを用いて解析した場合と同様に、逆転写反応産物中に存在する第１蛍光物質による蛍光標識分子が、未伸長の蛍光標識プライマーであるのか、切断等がなされた標的遺伝子由来のｍＲＮＡを鋳型として得られた伸長産物であるのか、天然の標的ｍＲＮＡを鋳型として得られた伸長産物であるのかを区別して識別し、逆転写反応産物中の蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度を測定することができる。
【００６０】
ＦＩＤＡは、反応溶液中の蛍光標識分子の一分子当たりの蛍光強度とその数を求めることができる手法である。また、観測領域中に、蛍光強度の異なる蛍光標識分子（すなわち、大きさの異なる分子）が存在する場合には、２成分解析を行うことにより、それぞれの大きさの分子の数や割合を算出することも可能である。例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、塩基配列や塩基の長さ等の蛍光色素の環境状態によって１分子あたりの蛍光強度が異なる場合がある。このため、第１蛍光物質の種類によっては、当該蛍光標識プライマーの伸長産物の蛍光強度は、未伸長の蛍光標識プライマーと比較して変化する可能性がある。よって、適当な種類の蛍光物質を第１蛍光物質として用いて、ＦＩＤＡを用いて解析し、各蛍光分子から得られた蛍光強度に対して２成分解析を行うことにより、逆転写反応産物中の蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度を測定することができる。
【００６１】
ＦＣＣＳは、分光特性の異なる蛍光標識分子の相互相関関数解析を行うことによって、それぞれの蛍光標識分子が同期した運動（相互相関を持った運動）か解離してランダムな運動（相互相関のない運動）かを見分けることができる手法である。測定試料に対し、各蛍光物質に対応した励起光を同時に照射し、それぞれの分子から検出された蛍光シグナルの相互相関を解析することにより、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。このため、例えば、工程（１ａ）の逆転写反応において、蛍光標識プライマーに付加して鎖を伸長するために用いられるジデオキシリボヌクレオチドやデオキシリボヌクレオチド等のヌクレオチド類を、第１蛍光物質とは分光特性の異なる蛍光物質（以下、「第２蛍光物質」）により標識されたものを用いることにより、未伸長の蛍光標識プライマーと当該蛍光標識プライマーの伸長産物とを区別して識別することができる。
【００６２】
具体的には、逆転写反応産物に対して、それぞれの蛍光物質ごとに励起し得る波長の光を照射し、蛍光シグナルを検出する。蛍光シグナルは、ＤＭ（ダイクロイックミラー）を用いて、それぞれの蛍光物質から発された蛍光シグナルに分離し、その蛍光強度の時系列変化を高感度の検出機で検出し、各蛍光シグナルの相互相関を求める。未伸長の蛍光標識プライマーは第１蛍光物質によってのみ標識されており、第２蛍光物質により標識したヌクレオチド類（以下、「蛍光標識ヌクレオチド」ということがある。）とはバラバラに動いており、第１蛍光物質と第２蛍光物質との蛍光シグナルの相互相関は弱くなる。一方で、伸長産物は、第１蛍光物質と第２蛍光物質の両方により標識されているため、両蛍光物質は同時に動いているため、各蛍光物質からの蛍光シグナルの相互相関は強くなる。したがって、各蛍光物質の蛍光シグナルの自己相関関数解析と相互相関関数解析の結果より、それぞれの蛍光標識分子の結合割合（同期して動いている分子の割合）が求められることから、逆転写反応産物中の蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合を測定することができる。
【００６３】
ＦＣＣＳは、それぞれの蛍光色素からの蛍光シグナルの同調具合をみているため、基本的にそれぞれの蛍光標識分子の大きさの影響を受けない。このため、相互作用前後での分子サイズの変化が小さい場合、例えば、天然の標的ｍＲＮＡを鋳型とした場合の蛍光標識プライマーの伸長産物の伸長度が短く（逆転写反応による伸長した鎖の長さが短く）、未伸長の蛍光標識プライマーとの分子サイズの相違が小さい場合であっても、好適に分子間相互作用を解析することができ、伸長産物と未伸長の蛍光標識プライマーとを十分な精度で識別することができる。
【００６４】
なお、第２蛍光物質は、第１蛍光物質とは分光特性の異なる蛍光物質でなければならない。ＦＣＣＳ解析においては、２種類の蛍光物質からそれぞれ発される蛍光を別個に測定することが必要であるため、第１蛍光物質と第２蛍光物質とは、励起後に発される蛍光の波長が被らない蛍光物質同士の組み合わせであることが好ましい。例えば、第１蛍光物質と第２蛍光物質のいずれか一方を緑色蛍光物質とし、他方を赤色蛍光物質とすることができる。緑色蛍光物質としては、例えば、励起光が４８８ｎｍ付近である蛍光物質、具体的には、ローダミングリーン、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８、ＦＡＭ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ等が挙げられる。一方、赤色蛍光物質としては、例えば、励起光が５９０ｎｍ以上の蛍光物質、具体的には、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＡＴＴＯ６３３、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６３３、Ｃｙ５等が挙げられる。また、第１蛍光物質及び第２蛍光物質は、両蛍光物質間でＦＲＥＴが生じない蛍光物質同士の組み合わせであることが好ましい。両蛍光物質間においてＦＲＥＴが生じると、ＦＣＣＳ解析の精度が低下してしまうためである。
【００６５】
天然の標的ｍＲＮＡを鋳型とした場合には、蛍光標識プライマーは逆転写反応により蛍光標識ヌクレオチドを用いて伸長され、得られた伸長産物中には、第１蛍光物質と第２蛍光物質との両方が同じ分子中に存在するため、緑色蛍光物質の自己相関カーブと、赤色蛍光物質の自己相関カーブとはほぼ一致し、両蛍光物質の相互相関カーブのＹ切片は大きい。一方、ｓｉＲＮＡ等により切断されたｍＲＮＡを鋳型とした場合には、蛍光標識プライマーは伸長することができず、蛍光標識プライマーと蛍光標識ヌクレオチドは別個の分子として存在し、緑色蛍光物質の自己相関カーブと、赤色蛍光物質の自己相関カーブとは解離し、両蛍光物質の相互相関カーブのＹ切片は、天然の標的ｍＲＮＡを鋳型とした場合よりも小さくなる。つまり、逆転写産物をＦＣＣＳ計測した際に、求められた相互相関カーブのＹ切片が小さいほど、被検細胞の導入したｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡにより、より多くの標的ｍＲＮＡが切断等されており、当該ｓｉＲＮＡ等の標的遺伝所の発現抑制効果が高いと評価することができる。
【００６６】
ＦＣＣＳ解析により、蛍光標識物質の伸長産物（第１蛍光物質と第２蛍光物質との両方を含む分子）の、逆転写反応産物中の含有割合は、下記のようにして算出することができる。なお、第１蛍光物質として緑色蛍光物質を、第２蛍光物質として赤色蛍光物質を、それぞれ用いたとする。
逆転写反応産物中の緑色蛍光物質と赤色蛍光物質とが結合している分子数（蛍光標識物質の伸長産物の分子数）をＮｇｒ、結合していない緑色蛍光物質の分子数（未伸長の蛍光標識プライマーの分子数）をＮｇ、結合していない赤色蛍光物質の分子数（遊離の蛍光標識ヌクレオチドの分子数）をＮｒとする。逆転写反応産物中に存在している分子の中で、蛍光標識物質の伸長産物の分子の含有割合（ＤＣＣ）は、緑色蛍光物質により標識された蛍光標識プライマーと赤色蛍光物質により標識された蛍光標識ヌクレオチドとが結合している割合であり、下記式（１）で表わされる。
式（１）    ＤＣＣ（％）＝１００×Ｎｇｒ／（Ｎｇｒ＋Ｎｇ＋Ｎｒ）
【００６７】
まず、緑色蛍光物質から発される蛍光シグナルから自己相関関数解析を行い、蛍光分子数ＮＧａｕｔｏを算出する。また、赤蛍光物質から発される蛍光シグナルから自己相関関数解析を行い、蛍光分子数ＮＲａｕｔｏを算出する。さらに、緑色蛍光物質からの蛍光と赤蛍光物質からの蛍光との相互相関関数解析を行い、Ｎｃｒｏｓｓを算出する。このようにして産出されたパラメータを用いると、下記式（２）で表わされる関係が成り立つ。
【００６８】
【数１】
2011041523.tif 000002
【００６９】
上記式中、ＮＧａｕｔｏは、ＮｇｒとＮｇとの和〔Ｎｇｒ＋Ｎｇ〕であり、ＮＲａｕｔｏは、ＮｇｒとＮｒとの和〔Ｎｇｒ＋Ｎｒ〕である。よって、解析結果に基づき、上記式より、Ｎｇｒ、Ｎｇ、及びＮｒが算出される（“Fluorescence correlation spectroscopy in nucleic acid analysis”, Fluorescence correlation spectroscopy-theory and applications, R.Rigler, E.S.Elson, Springer Series in Chemical physics 65, p33-35）。
【００７０】
ＦＣＳやＦＩＤＡ−ＰＯのように、分子の大きさの相違に基づいて、未伸長の蛍光標識プライマーと当該蛍光標識プライマーの伸長産物とを区別して識別する方法の場合には、蛍光シグナルを検出する前に、逆転写産物を、ＲＮＡ分解酵素処理しておくことが好ましい。逆転写産物中のＲＮＡを分解しておくことにより、蛍光標識プライマーの伸長の有無の識別精度をより改善することができる。
【００７１】
一方、逆転写反応を被検細胞中で行い、当該被検細胞中の蛍光シグナルを検出し解析する場合には、解析に分子の拡散運動のパラメータを含まないＦＩＤＡやＦＩＤＡ−ＰＯを用いることにより、データの解釈が容易となる。細胞内は均一な媒質ではなく、細胞骨格や小胞体やミトコンドリア等のオルガネラで満たされた状態であるため、細胞内の蛍光標識分子は均一な拡散運動をしているわけではない。ＦＣＳにおいては、分子の拡散を観測しているが、これは自由拡散を前提としているため、細胞内の蛍光分子から検出された蛍光シグナルをＦＣＳにより解析する場合には、データの解析が複雑になる場合がある。
【００７２】
また、ＦＣＣＳでは、２種類の蛍光標識分子を計測するため、２つの異なる波長の光を同じ対物レンズを用いてサンプルに照射しなくてはならず、対物レンズの色収差等によってサンプルの照射領域にずれが生じてしまうという問題がある。加えて、それぞれの分子を標識している蛍光物質の特性も異なる、という問題もある。このため、ＦＣＣＳにおいては、一般的に、２種類の異なる蛍光物質で標識された分子が１００％結合している場合にも、得られるデータの結合効率は１００％よりもはるかに小さい値にしか検出されないという原理的な問題がある。
【００７３】
このため、第２蛍光物質により標識したヌクレオチド類を用いて逆転写反応を行い、蛍光シグナルの検出をＦＣＣＳにより行う場合には、測定試料中の実際の第１蛍光物質と第２蛍光物質とが結合している分子の含有割合と、ＦＣＣＳ計測により測定・解析した結果に求められた当該分子の見かけの含有割合（測定値）との関係の近似線（以下、「検量線」ということがある。）を作成し、当該近似線に基づき、測定値を補正することが好ましい。本発明においては、このような近似線に基づいて測定値を補正することにより、逆転写産物中の蛍光標識物質の伸長産物の含有割合を、より定量的かつ正確に求めることができる。
【００７４】
検量線は、例えば、下記工程（ｐ）〜（ｓ）を行うことにより作成することができる。
（ｐ）前記第１蛍光物質により標識された第１蛍光標識分子と、前記第２蛍光物質により標識された第２蛍光標識分子と、前記第１蛍光物質及び前記第２蛍光物質により標識された両蛍光標識分子とを準備する工程と、
（ｑ）前記第１蛍光標識分子と前記第２蛍光標識分子と前記両蛍光標識分子との総和に対する前記両蛍光標識分子の含有割合（モル比）が異なる検量線用試料系列を調製する工程と、
（ｒ）前記工程（ｑ）において調製した検量線用試料系列のそれぞれの検量線用試料に、前記第１蛍光物質を励起し得る波長の光と前記第２蛍光物質を励起し得る波長の光とを別個に照射し、当該蛍光物質から発される蛍光を蛍光シグナルとしてそれぞれ検出し、検出された蛍光シグナルを蛍光相互相関分光法により解析して、当該検量線用試料中の両蛍光標識分子の見かけの含有割合（モル比）を測定する工程と、
（ｓ）前記工程（ｒ）において測定された各検量線用試料の両蛍光標識分子の見かけの含有割合（モル比）と、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合との関係の近似線を作成する工程。
【００７５】
工程（ｐ）において準備する第１蛍光標識分子、第２蛍光標識分子、及び両蛍光標識分子は、ＦＣＣＳ計測を行う条件において、結合等の相互作用を奏することがない分子であれば、特に限定されるものではない。例えば、第１蛍光標識分子として、５’末端に第１蛍光物質が標識されている１本鎖核酸、第２蛍光標識分子として、５’末端に第２蛍光物質が標識されている１本鎖核酸、両蛍光標識分子として、一方の末端が第１蛍光物質により標識されており、他方の末端が第２蛍光物質により標識されている２本鎖核酸を、それぞれ用いることができる。なお、この場合、各１本鎖核酸及び２本鎖核酸を構成する１本鎖核酸のそれぞれの塩基配列は、互いに非相補的であることが好ましい。
【００７６】
一方の末端が第１蛍光物質により標識されており、他方の末端が第２蛍光物質により標識されている２本鎖核酸としては、５’末端に第１蛍光物質が標識されている１本鎖核酸と５’末端に第２蛍光物質が標識されている１本鎖核酸とをアニーリングさせた会合体であることが好ましい。なお、アニーリング後は、酵素処理により、１本鎖核酸を分解し除去しておくことが好ましい。または、５’末端に蛍光物質が結合したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ産物として両末端が標識された２本鎖核酸を得ることができる。なお、ＰＣＲ産物を電気泳動法により分子量ごとに分離精製しておくことが好ましい。両蛍光標識分子として用いられる２本鎖核酸は、両末端平滑核酸であってもよく、５’突端末端核酸であってもよく、３’突端末端核酸であってもよい。
【００７７】
また、両蛍光標識分子中の第１蛍光物質と第２蛍光物質とは、互いにＦＲＥＴが生じない程度に離れた位置に存在していることが好ましい。例えば、両蛍光標識分子が、一方の末端が第１蛍光物質により標識されており、他方の末端が第２蛍光物質により標識されている２本鎖核酸である場合には、当該２本鎖核酸の長さは、１５塩基対長以上であることが好ましく、２０塩基対長程度であることがより好ましい。
【００７８】
工程（ｑ）において調製する検量線用試料系列を構成する検量線用試料の数は、特に限定されるものではなく、３〜２０種類程度であることが好ましい。また、各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合は、両蛍光標識分子の含有割合が０％の検量線用試料と１００％の検量線用試料を含んでいる限り、特に限定されるものではなく、標識に用いる蛍光物質の種類、一分子蛍光解析法の種類等を考慮して適宜決定することができる。例えば、両蛍光標識分子の含有割合が０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、及び１００％である１１種類の検量線用試料系列のように、各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合が等間隔に設定されているものであってもよく、０、１０、２０、４０、５０、８０、及び１００％である７種類の検量線用試料系列のように、各検量線用試料の両蛍光標識分子の含有割合が不等間隔に設定されているものであってもよい。なお、「両蛍光標識分子の含有割合が０％」とは、溶液中に両蛍光標識分子が存在せず、第１蛍光標識分子と第２蛍光標識分子とを等量ずつ含有する溶液であり、逆に、「両蛍光標識分子の含有割合が１００％」とは、溶液中に両蛍光標識分子のみが存在し、第１蛍光標識分子と第２蛍光標識分子の両方ともが存在しない溶液である。
【００７９】
また、各検量線用試料中の第１蛍光標識分子と第２蛍光標識分子の含有割合は、等量であることが好ましい。例えば、検量線用試料は、両蛍光標識分子の含有割合がＸ％である場合に、第１蛍光標識分子の含有割合が〔（１−Ｘ）／２〕％、第２蛍光標識分の含有割合が〔（１−Ｘ）／２〕％となるように調製することができる。
【００８０】
検量線用試料系列を構成する各検量線用試料の組成やｐＨは、工程（１ｂ）における蛍光シグナルの検出・解析の条件と同様に調整する。蛍光物質の種類によっては、検出される蛍光シグナルが、測定試料の組成やｐＨに影響を受ける場合があるためである。
【００８１】
次いで、工程（ｒ）として、工程（ｑ）において調製した検量線用試料系列のそれぞれの検量線用試料中の両蛍光標識分子の見かけの含有割合を測定する。具体的には、工程（１ｂ）と同様にして、各検量線用試料に、第１蛍光物質を励起し得る波長の光と、第２蛍光物質を励起し得る波長の光とをそれぞれ別個に照射し、それぞれの蛍光物質から発された蛍光シグナルに分離して検出し、検出された蛍光シグナルをＦＣＣＳ計測により解析する。蛍光シグナル検出に用いる装置、測定に用いる試料溶液の容量、測定温度、励起光の波長や強度、照射条件、蛍光シグナルの検出条件、並びに、ＦＣＣＳ計測の解析条件等は、工程（１ｂ）と同じ条件で行う。
【００８２】
その後工程（ｓ）として、工程（ｒ）において測定された各検量線用試料の両蛍光標識分子の見かけの含有割合と、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合とから、検量線を作成する。検量線の作成方法は、特に限定されるものではなく、通常、２種類の量的データの関係の近似線を作成する際に用いられる演算解析方法のいずれを用いて作成してもよい。例えば、横軸を各測定試料の実際の両蛍光標識分子の含有割合（％）、縦軸を測定された両蛍光標識分子の含有割合（％）としたグラフに、工程（ｃ）により求められたデータをプロットする。各プロットに対して最小二乗法等を行うことにより、検量線を作成することができる。
【００８３】
検量線は直線であることが好ましいが、必ずしも全測定範囲を１の直線に近似させる必要はない。例えば、後記実施例２に示すように、第１蛍光物質として、励起波長が４８８ｎｍである蛍光物質を用いた場合には、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合が低い領域と高い領域とで、それぞれ別個に、直線からなる近似線を作成することが好ましい。このように、測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合の低領域における近似線と、当該含有割合の高領域における近似線との２本の直線からなる近似線を検量線とすることにより、色収差等の影響を低減し、工程（１ｂ）において得られた測定値を、より精度よく補正することができる。
【００８４】
測定試料における実際の両蛍光標識分子の含有割合の低領域と高領域に分けて近似直線を作成する場合には、低領域と高領域との境界は、蛍光物質の種類により適宜決定することができる。例えば、励起波長が４８８ｎｍである蛍光物質を用いる場合には、この低領域と高領域との境界は、両蛍光標識分子の含有割合が６０〜８０％の範囲内になるように設定することが好ましく、６０〜７０％の範囲内になるように設定することがより好ましい。なお、「低領域と高領域との境界」とは、具体的には、両蛍光標識分子の含有割合の低領域にあるプロットから作成した近似直線と、高領域にあるプロットから作成した近似直線とが交差する点を示す。
【００８５】
なお、検量線の作成は、それぞれ工程（ｃ）（遺伝子の発現抑制効果の評価工程）の前に行っていればよく、上記工程（１ａ）及び（１ｂ）と検量線作成とを先に行ってもよい。例えば、工程（１ａ）及び（１ｂ）を行った後に検量線の作成を行ってもよく、検量線の作成を行った後に工程（１ａ）及び（１ｂ）を行ってもよい。さらに、工程（１ｂ）における反応溶液への励起光の照射から蛍光シグナルの検出までの操作を、検量線の作成における各検量線用試料への励起光の照射から蛍光シグナルの検出までの操作と同時に行っても良い。
【００８６】
また、検量線は、主に、標識する蛍光物質の種類や組み合わせ、当該蛍光物質により標識される核酸鎖等の分子中の位置等に依存する。また、一分子蛍光解析の計測条件等が等しい場合には、実験ごとの測定値の変動は小さい。このため、必ずしもｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡの種類ごとに検量線の作成を行う必要はなく、同種の蛍光物質によって標識されている別のｓｉＲＮＡ等のために既に作成した検量線を利用することもできる。
【００８７】
工程（１ｂ）において得られた蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度に基づき、被検細胞に導入したｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価する〔工程（１ｃ）〕。伸長度の長い伸長産物の含有割合が小さいほど、被検細胞中の標的ｍＲＮＡのより多くが、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡにより切断又はｍｉＲＮＡにより結合されており、これらのｓｉＲＮＡ等の遺伝子の発現抑制効果が高いと評価することができる。一方、伸長度の長い伸長産物の含有割合が大きいほど、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡによる切断又はｍｉＲＮＡによる結合がなされているｍＲＮＡ量が少なく、これらのｓｉＲＮＡ等の遺伝子の発現抑制効果が低いと評価することができる。
【００８８】
図２は、標的ｍＲＮＡに対する切断活性を有することが期待されるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの評価を行う場合の、本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図である。なお、本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法が、これらの態様に限定されるものではないことは言うまでもない。
【００８９】
まず、標的ｍＲＮＡを発現している細胞内へ、評価対象であるｓｉＲＮＡあるいはｍｉＲＮＡを導入する、又は、標的ｍＲＮＡを発現し、かつ内在ｍｉＲＮＡを含有する細胞を選択することにより、被検細胞を調製する（ステップ０１）。続く逆転写反応の鋳型とするＲＮＡを、当該被検細胞から抽出する必要があるか否かを判断し（ステップ０２）、必要がないと判断した場合には、当該被検細胞の細胞内において、逆転写反応を行い、蛍光法により当該被検内の蛍光分子を計測し解析を行う（ステップ０３）。解析の結果得られた蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度に基づき、標的ｍＲＮＡが切断されているか否かを判断し（ステップ０４）、ｓｉＲＮＡ等の遺伝子の発現抑制効果を評価する。一方、被検細胞からＲＮＡを抽出する必要があると判断した場合には、ＲＮＡの抽出を行い（ステップ０５）、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行った後、得られた逆転写産物中の蛍光分子を蛍光法により計測し（ステップ０６）、ステップ０４と同様にして、標的ｍＲＮＡが切断されているか否かを判断し（ステップ０７）、ｓｉＲＮＡ等の遺伝子の発現抑制効果を評価する。
【００９０】
本発明においては、さらに、対照細胞由来のＲＮＡを用いて、工程（１ａ）及び（１ｂ）と同様にして、蛍光標識プライマーを用いて逆転写反応を行い、得られた逆転写産物中の第１蛍光物質を含む分子全体に対する蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度を測定することが好ましい。ここで、対照細胞とは、標的ｍＲＮＡを含有する細胞であって、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制作用を受けていない細胞を意味する。例えば、被検細胞がｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入した細胞である場合には、当該ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを導入していない細胞を対照細胞とする。一方、測定対象である内在ｍｉＲＮＡを含有している細胞を被検細胞とした場合には、当該内在ｍｉＲＮＡを含有していない細胞、又は当該内在ｍｉＲＮＡをほとんど含まない細胞を対照細胞とする。測定対象である内在ｍｉＲＮＡを含有していない細胞は、当該内在ｍｉＲＮＡの発現をノックアウトすることにより作製することができる。また、当該内在ｍｉＲＮＡをほとんど含まない細胞としては、例えば、当該内在ｍｉＲＮＡの発現量が非常に少ないことが既知である細胞株を用いることができる。
【００９１】
対照細胞由来のＲＮＡを用いて得られた逆転写反応産物中には、理論上は、第１蛍光物質により標識された蛍光標識分子としては、未伸長の蛍光標識プライマーと、対照細胞由来のＲＮＡを用いた測定により、ｓｉＲＮＡ等の影響を受けていない天然の標的ｍＲＮＡを鋳型として得られた蛍光標識プライマーの伸長産物のみが存在している。このため、対照細胞由来のＲＮを用いた測定により、天然の標的ｍＲＮＡを鋳型として得られた蛍光標識プライマーの伸長産物の並進拡散時間、蛍光偏光度、及び蛍光強度を明らかにすることができる。具体的には、被検細胞由来のＲＮＡを用いて得られた解析結果と、対照細胞由来のＲＮＡを用いて得られた解析結果とを比較し、天然の標的遺伝子由来のｍＲＮＡを鋳型とした伸長産物の含有割合が小さくなっている場合には、被検細胞に導入したｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉活性又はｍｉＲＮＡを有しており、標的遺伝子の発現抑制効果を有していると判断することができる。また、当該含有割合の低下の程度が大きいほど、標的遺伝子の発現抑制効果が高いと評価することができる。
【００９２】
対照細胞としては、全くｓｉＲＮＡ等を導入していない細胞や、当該内在ｍｉＲＮＡを含有していない細胞等をそのまま用いてもよく、これらの細胞に、標的遺伝子に対する発現抑制作用を有さないことが明らかなｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）を、被検細胞と同様の方法で導入した細胞を用いてもよい。対照ｓｉＲＮＡとしては、ランダム配列を有するｓｉＲＮＡや、標的遺伝子以外の他の遺伝子のｍＲＮＡに対する特異的な発現抑制作用が確認されているｓｉＲＮＡ等が挙げられる。
【００９３】
なお、対照細胞由来のＲＮＡを用いた逆転写反応や、得られた逆転写反応産物の解析は、工程（１ａ）及び（１ｂ）の前に行ってもよく、後に行ってもよく、同時に行っても良い。
【００９４】
さらに、近年、ＲＮＡ干渉等による遺伝子の発現抑制効果を利用した医薬の開発が盛んであるが、医薬とする場合には、生体内におけるより詳細な作用機序が解明されていることが要求される。例えば、ＲＮＡ干渉法においては、導入されたｓｉＲＮＡによって、標的遺伝子由来のｍＲＮＡが切断されることのみならず、当該ｍＲＮＡのどの部位が切断されているのかについても明らかにされていることが好ましい。
【００９５】
本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法においては、工程（１ａ）において、第２蛍光物質により標識した特定の塩基種のジデオキシヌクレオチドを用いて逆転写反応を行い、工程（１ｂ）における蛍光シグナルの検出及び解析をＦＣＣＳによって行うことにより、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによるｍＲＮＡの切断部位をより正確に明らかにすることができる。具体的には、被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡの予測切断部位を切断したのか、標的ｍＲＮＡの予測切断部位以外の部位を切断したのか、標的ｍＲＮＡを切断していないのか、を区別して検出することができる。
【００９６】
具体的には、蛍光標識プライマーとして、標的ｍＲＮＡ中の、前記蛍光標識プライマーとハイブリダイズする領域が、予測切断部位の３’末端側であって、当該予測切断部位と隣接する領域となる、すなわち、当該予測切断領域において標的ｍＲＮＡが切断された場合には、逆転写反応による蛍光標識プライマーの伸長がなされないように設計したものを用いる。さらに、逆転写反応において、４種類の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、及びチミン）のうち、標的ｍＲＮＡ中の予測切断領域の５’末端側隣の塩基と相補的な塩基種のみ、第２蛍光物質により標識したジデオキシヌクレオチド（以下、「蛍光標識ｄｄＮＴＰ」ということがある。）を用いる。残りの３塩基種は、通常の逆転写反応において用いられる無標識のデオキシヌクレオチドを用いる。なお、蛍光標識ｄｄＮＴＰとしては、サンガー法等を行う際に一般的に用いられている蛍光標識ｄｄＮＴＰを用いることができる。
【００９７】
図３に、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法を用いて、被検細胞へ導入したｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡにより、標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断されているか否かを検出する方法を概念的に示した図である。図３（Ａ）は標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断された場合、図３（Ｂ）は標的ｍＲＮＡが、予測切断部位以外の部位において切断された場合、図３（Ｃ）は、標的ｍＲＮＡが切断されなかった場合を、それぞれ示す。なお、図３中、逆三角形は予測切断部位を、直線が標的ｍＲＮＡを、星形は第１蛍光物質を、星形が付加された直線は蛍光標識プライマーを、十字形は第２蛍光物質を、楕円形はジデオキシヌクレオチドを、十字形が付加された楕円は蛍光標識ｄｄＮＴＰを、それぞれ示す。
【００９８】
標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断された場合、蛍光標識プライマーは、切断された標的ｍＲＮＡの末端にハイブリダイズするため、逆転写反応を行ったとしても、蛍光標識プライマーは伸長せず、蛍光標識ｄｄＮＴＰは蛍光標識プライマーに付加されない。したがって、逆転写反応産物中では、蛍光標識ｄｄＮＴＰと蛍光標識プライマーとは別個の分子としてバラバラに存在しており、第1蛍光物質と第２蛍光物質との蛍光相互相関は観察されない〔図３（Ａ）〕。一方、予測切断部位において切断されなかった場合、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズした蛍光標識プライマーは、逆転写反応により伸長し、蛍光標識ｄｄＮＴＰが取り込まれる。ここで、ｄｄＮＴＰには新たにデオキシヌクレオチドを付加することができないため、伸長反応は停止する。すなわち、標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断されなかった場合には、蛍光標識プライマーに蛍光標識ｄｄＮＴＰが結合した伸長産物が得られる〔図３（Ｂ）、（Ｃ）〕。つまり、逆転写反応産物中に、第１蛍光物質と第２蛍光物質とが同一分子中に存在する分子の割合が高くなり、蛍光相互相関が観測される。
【００９９】
図３（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断された場合、第1蛍光物質の自己相関カーブと第２蛍光物質の自己相関カーブとは解離し、相互相関カーブのＹ切片は小さくなる。一方、標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断されなかった場合、第1蛍光物質と第２蛍光物質との相互相関カーブのＹ切片は大きくなる。このように、ＦＣＣＳを利用した本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法により、被検細胞へ導入したｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡが、標的遺伝子由来のｍＲＮＡを切断する部位を明らかにすることができる。
【０１００】
また、標的ｍＲＮＡが予測切断部位以外の部位において切断された場合には、逆転写反応産物中では、蛍光標識ｄｄＮＴＰが付加された蛍光標識プライマーの伸長産物と、鋳型としたｍＲＮＡの切断断片とが会合体を形成している〔図３（Ｂ）〕。一方、被検細胞へ導入したｓｉＲＮＡ等が標的ｍＲＮＡと相互作用することができず、標的ｍＲＮＡが切断されなかった場合には、逆転写反応産物中では、蛍光標識ｄｄＮＴＰが付加された蛍光標識プライマーの伸長産物と、鋳型とした未切断のｍＲＮＡとが会合体を形成している〔図３（Ｃ）〕。これらの会合体の大きさの違いを利用して、逆転写反応産物中の両会合体を識別して検出することにより、標的ｍＲＮＡが予測切断部位以外で切断されたのか、それとも、切断されていないのかを検出することができる。
【０１０１】
なお、両会合体の識別及び検出は、例えば、ＦＣＳやＦＩＤＡ−ＰＯ等を用いて逆転写反応産物を解析することによって行うことができる。ＦＣＳにより解析する場合には、例えば、計測により求められた並進拡散時間（ｔｓａｍｐｌｅ）と、対照細胞由来のＲＮＡを用いて同様にして調製した逆転写反応産物の並進拡散時間（ｔＮＣ）とを比較し、ｔＮＣ＞ｔｓａｍｐｌｅである場合には、標的ｍＲＮＡが予測切断部位以外で切断されていると判断することができる。一方、ｔＮＣ≒ｔｓａｍｐｌｅである場合には、標的ｍＲＮＡは切断されていないと判断することができる。ＦＩＤＡ−ＰＯにより解析する場合には、例えば、計測により求められた蛍光偏光度（ｍＰｓａｍｐｌｅ）と、対照細胞由来のＲＮＡを用いて同様にして調製した逆転写反応産物の蛍光偏光度（ｍＰＮＣ）とを比較し、ｍＰＮＣ＞ｍＰｓａｍｐｌｅである場合には、標的ｍＲＮＡが予測切断部位以外で切断されていると判断することができる。一方、ｍＰＮＣ≒ｍＰｓａｍｐｌｅである場合には、標的ｍＲＮＡは切断されていないと判断することができる。
【０１０２】
図４に、被検細胞に導入されたｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの切断を検出する場合の、本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法の一態様を示したフローチャート図を示す。なお、本発明の遺伝子の発現抑制効果評価方法が、これらの態様に限定されるものではないことは言うまでもない。
【０１０３】
まず、評価対象である目的のｓｉＲＮＡ（目的ｓｉＲＮＡ）を導入した被検細胞、ランダム配列からなる対照ｓｉＲＮＡを導入した対照細胞（第１対照細胞）、及びｓｉＲＮＡ導入処理をしていない対照細胞（第２対照細胞）の３種類の培養細胞を準備し（ステップ１０１）、それぞれを培養する（ステップ１０２）。培養後、逆転写反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系で行う場合には、各細胞を回収し、ＲＮＡを抽出する（ステップ１０３）。次いで、蛍光標識プライマー、逆転写酵素（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、蛍光標識ｄｄＮＴＰを添加し（ステップ１０４）、逆転写酵素による伸長反応（逆転写反応）を行う（ステップ１０５）。得られた逆転写反応産物に対して、ＦＣＣＳ計測を行い、蛍光標識プライマーと蛍光標識ｄｄＮＴＰの結合割合ＤＣＣを測定し、この測定値を検量線により補正し、逆転写反応産物中の伸長産物の含有割合を算出する（ステップ１０６）。被検細胞由来のＲＮＡを鋳型として得られた逆転写反応産物中の伸長産物の含有割合が１０％以下である場合には、蛍光標識プライマーが逆転写反応により伸長されておらず、よって、目的ｓｉＲＮＡにより、標的ｍＲＮＡの予測切断部位が切断されたと判断する（ステップ１０８）。一方、伸長産物の含有割合が１０％超である場合には、蛍光標識プライマーが逆転写反応により伸長されており、よって、目的ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの予測切断部位を切断していないと判断し、さらに同一の逆転写反応産物に対してＦＣＳ計測を行い、並進拡散時間ｔ１を測定する（ステップ１０９）。同様に、第２対照細胞由来のＲＮＡを鋳型として得られた逆転写反応産物に対してＦＣＳ計測を行い、並進拡散時間ｔ２を測定する（ステップ１１０）。並進拡散時間ｔ１が並進拡散時間ｔ２よりも小さい場合には、目的ｓｉＲＮＡにより、標的ｍＲＮＡの予測切断部位以外の部位が切断されたと判断する（ステップ１１２）。一方、並進拡散時間ｔ１が並進拡散時間ｔ２よりも小さくない場合には、目的ｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡを切断していない（オフターゲット）と判断する（ステップ１１３）。
【０１０４】
逆転写反応はｉｎ  ｖｉｖｏの反応系で行うこともできる。例えば、培養後の各細胞に対して、まず、蛍光標識プライマー及び蛍光標識ｄｄＮＴＰをマイクロインジェクションにより導入した後（ステップ１１４）、ＦＣＣＳ計測を行い、蛍光相互相関曲線１を求める（ステップ１１５）。ついで、さらに逆転写酵素（ＲＮＡ依存的ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）をマイクロインジェクションにより導入した後（ステップ１１６）、所定時間培養し、細胞内において導入した逆転写酵素による伸長反応を行う（ステップ１１７）。反応後、各細胞に対してＦＣＣＳ計測を行い、蛍光相互相関曲線２を求める（ステップ１１８）。被検細胞において、ステップ１１８において求めた蛍光相互相関曲線２のＹ切片（Ｙ２）とステップ１１５において求めた蛍光相互相関曲線１のＹ切片（Ｙ１）を比較し、Ｙ２がＹ１以下である場合には、蛍光標識プライマーに蛍光標識ｄｄＮＴＰが付加されておらず、目的ｓｉＲＮＡにより、標的ｍＲＮＡの予測切断部位が切断されたと判断する（ステップ１２０）。一方、Ｙ２が、Ｙ１よりも大きい場合には、逆転写反応により蛍光標識プライマーに蛍光標識ｄｄＮＴＰが付加されており、目的ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの予測切断部位を切断していないと判断する（ステップ１２１）。
【０１０５】
本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法と同様にして、標的ｍＲＮＡの切断の検出のみを行うこともできる。具体的には、本発明のｍＲＮＡの切断の検出方法（以下、本発明のｍＲＮＡ切断検出方法）は、下記工程（２ａ）〜（２ｃ）を有する。
（２ａ）標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得る蛍光標識プライマーを用いて、被検ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う工程と、
（２ｂ）前記工程（２ａ）において得られた逆転写反応産物に、前記蛍光標識プライマーの標識に用いた第１蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該第１蛍光物質から発生する蛍光を蛍光シグナルとして検出して解析することにより、当該逆転写反応産物中の前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度を測定する工程と、
（２ｃ）前記工程（２ｂ）において得られた前記蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合（モル比）又は伸長度に基づき、前記被検ＲＮＡ中の標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を検出する工程。
【０１０６】
工程（２ａ）は、逆転写反応の鋳型として、被検ＲＮＡを用いる以外は、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法の工程（１ａ）と同様にして行うことができる。また、工程（２ｂ）及び工程（２ｃ）は、それぞれ、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法の工程（１ｂ）及び工程（１ｃ）と同様にして行うことができる。
【０１０７】
被検ＲＮＡは、切断の有無を検出する目的である標的ｍＲＮＡを含有しているＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。例えば、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法において用いられた被検細胞由来のＲＮＡであってもよく、ｓｉＲＮＡ等を導入していない細胞から回収した標的ｍＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系でｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによって処理したものであってもよい。
【０１０８】
また、本発明のｍＲＮＡ切断検出方法は、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法と同様に、さらに、被検ＲＮＡに換えて対照ＲＮＡを用いて、工程（２ａ）及び（２ｂ）と同様にして、蛍光標識プライマーを用いて逆転写反応を行い、得られた逆転写産物中の第１蛍光物質を含む分子全体に対する蛍光標識プライマーの伸長産物の含有割合又は伸長度を測定することが好ましい。工程（２ｂ）により得られた結果を、対照ＲＮＡを鋳型とした場合の測定結果と比較することにより、標的ｍＲＮＡの切断の検出精度をより向上させることができる。
【０１０９】
対照ＲＮＡとしては、含有されている標的ｍＲＮＡが、切断されておらず、かつ、ｍｉＲＮＡ等のような逆転写反応を阻害するような分子に結合されていないことが明らかであるＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｓｉＲＮＡ等を導入していない細胞から回収したＲＮＡを用いることができる。その他、測定対象である内在ｍｉＲＮＡを含有していない細胞、又は当該内在ｍｉＲＮＡをほとんど含まない細胞から回収したＲＮＡを用いることもできる。
【０１１０】
本発明のｍＲＮＡ切断検出方法は、図４に示すように、標的ｍＲＮＡ中の予測切断領域の５’末端側隣の塩基と相補的な塩基種である蛍光標識ｄｄＮＴＰを用いて逆転写反応を行うことにより、標的ｍＲＮＡが予測切断部位において切断されている場合と、予測切断部位以外の部位において標的ｍＲＮＡが切断されている場合と、標的ｍＲＮＡが切断されていない場合とを、区別して検出することができる。
【０１１１】
このように、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法やｍＲＮＡ切断検出方法を用いることにより、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことなく、直接、ｍＲＮＡの切断の有無やｍｉＲＮＡによる結合の有無を調べることができ、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を、ｍＲＮＡレベルで検出し評価することができる。このため、本発明を用いることにより、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉活性を有するｓｉＲＮＡを製造する場合に、多数の候補ｓｉＲＮＡの中からよりＲＮＡ干渉活性の高いｓｉＲＮＡを簡便に絞りこむことができ、ｓｉＲＮＡの設計精度を向上させることができる。その他、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果を確認することもできる。
【０１１２】
また、本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法やｍＲＮＡ切断検出方法は、被検細胞へ蛍光標識プライマー等の必要な試薬を導入することにより、細胞内においてｍＲＮＡの切断の検出や標的遺伝子の発現抑制効果を評価することができる。すなわち、細胞からＲＮＡを抽出することなく、容易に、ＲＮＡ干渉活性やｍｉＲＮＡ活性を検出し評価することができる。
【実施例】
【０１１３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１４】
［実施例１］
標的遺伝子をＣＸＣＲ４遺伝子とし、ＣＸＣＲ４をノックダウンするためのｓｉＲＮＡ（ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡ）によって、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡが切断されるか否かを検出した。なお、ＣＸＣＲ４遺伝子は、骨髄間質細胞（ストローマ細胞）より分泌されるケモカインＳＤＦ−１のレセプター（ＧＰＣＲ）である。また、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡは、ＣＸＣＲ４遺伝子の発現抑制効果を有することが既知のｓｉＲＮＡである（例えば、RNA(2007), vol.13, p385-395参照。）。
まず、ＨｅＬａ細胞に、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）を用いてトランスフェクションした（被検細胞）。ＨｅＬａ細胞は、ＣＸＣＲ４を恒常的に発現している培養細胞（安定発現株）である。Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＦＬｕｃ）をノックダウン可能であることが分かっているｓｉＲＮＡ（ＦＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ）を対照ｓｉＲＮＡとし、このＦＬｕｃ−ｓｉＲＮＡも同様にトランスフェクションを行い、ＨｅＬａ細胞に導入した（対照細胞）。なお、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡ及びＦＬｕｃ−ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を表１に示す。表中、「ｄＴ」は、チミンデオキシリボヌクレオチドを意味する。
【０１１５】
【表１】
2011041523.tif 000003
【０１１６】
トランスフェクション後４８時間培養した後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）とＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）とを組み合わせて用いることによって、トータルＲＮＡを得た。続いて、得られたトータルＲＮＡに、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１を用いて逆転写反応を行った。コントロールとして、鋳型となるＲＮＡを添加せず、ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１のみを添加して、同様に逆転写反応を行った。なお、ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１は、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡと、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がハイブリダイズする領域よりも３’末端側の領域とハイブリダイズするように設計されており、かつ、５’末端がＴＡＭＲＡにより標識されたプライマーである。ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１の塩基配列を表１に示す。表１の「ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１」の塩基配列中の「ＴＡＭＲＡ」は蛍光物質ＴＡＭＲＡを意味する。
【０１１７】
逆転写反応産物を９５℃で５分間インキュベーションした後、氷上で急冷した。急冷した逆転写反応産物に対して、ＦＣＳ計測を行い、当該逆転写反応産物中のＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１のうち、逆転写反応により伸長したプライマーの含有割合を測定した。ＦＣＳ計測は、一分子蛍光解析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）を用いて行った。ＴＡＭＲＡは５４３ｎｍのレーザ（レーザパワー：１００μＷ）により励起し、計測メソッドとしてＦＣＳを用いて、１サンプルあたり１０秒間５回計測した。
【０１１８】
図５は、ＦＣＳ計測により測定された各試料の並進拡散時間（μ秒）を示した図である。図中、「プライマーのみ」は、ＲＮＡを添加せずに行った逆転写反応産物の測定結果を、「＋ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡ」は、被検細胞由来のＲＮＡを用いて行った逆転写反応産物の測定結果を、「＋ＦＬｕｃ−ｓｉＲＮＡ」は、対照細胞由来のＲＮＡを用いて行った逆転写反応産物の測定結果を、それぞれ示す。なお、「プライマーのみ」における測定結果が、逆転写反応により伸長されなかった場合のＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１の並進拡散時間となる。この結果、ＦＬｕｃ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞由来のＲＮＡを鋳型とした逆転写反応産物では、未伸長のＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１の並進拡散時間と比較して大きな値をとっており、逆転写反応によりＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１の伸長反応が進んだこと、すなわち、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡが切断されていないことが分かった。これに対して、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞由来のＲＮＡを鋳型とした逆転写反応産物では、未伸長のＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１の並進拡散時間と比較して値の差が小さいことから、ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−１の伸長反応がほとんど進行していないこと、すなわち、大半のＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡが切断されていることが明らかとなった。
これらの結果から、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡは、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡを切断するＲＮＡ干渉活性を有しており、ＣＸＣＲ４遺伝子の発現抑制効果を有することが分かった。
【０１１９】
［実施例２］
実施例１において用いたＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡが、実際にＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡを予測切断部位において切断しているか否かを調べた。
ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡによるＣＸＣＲ４遺伝子中の予測切断部位の塩基配列を表２に示す。表２中、「Ｔ＿Ｃ」が予測切断部位である。すなわち、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡは、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡを、表２の塩基配列中の９番目のチミン（Ｔ）と１０番目のシトシン（Ｃ）との間を切断すると予測された。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
まず、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞（被検細胞）と、ＣＸＣＲ４遺伝子に対する発現抑制効果を有さない対照ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞（第１対照細胞）と、ｓｉＲＮＡを導入せず、導入操作のみを行ったＨｅＬａ細胞（第２対照細胞）との３種類の細胞を調製した。細胞に対するｓｉＲＮＡの導入は、具体的には、導入試薬（ＮｅｏＦＸ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とｓｉＲＮＡとを混合した後、培養液Ｏｐｔｉ−ＭＥＭにて希釈したトランスフェクション溶液を、５〜１０ｎＭ程度の導入濃度となるようにＨｅＬａ細胞の培養液に添加した後、２４時間培養することにより行った。また、対照ｓｉＲＮＡとして、市販のランダム配列からなるｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ＃１）を用いた。
培養後、抽出キット（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、各細胞からトータルＲＮＡを得た。続いて、得られたトータルＲＮＡに、ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（５０μ／μｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と、ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２（最終濃度１０ｍＭ）、ｄＣＴＰ（最終濃度４ｍＭ）、ｄＴＴＰ（最終濃度４ｍＭ）、ｄＧＴＰ（最終濃度４ｍＭ）、及びＣｙ５−ｄｄＡＴＰ（最終濃度１０ｍＭ）（パーキンエルマー社製）を添加して逆転写反応を行った。逆転写反応の反応時間は、２５℃で１０分間、その後３７℃で１２０分間とした。なお、ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２は、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡと、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡによる予測切断部位の３’末端側であって、当該領域に隣接する領域とハイブリダイズするように設計されており、かつ、５’末端がローダミングリーンにより標識されたプライマーである。ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２の塩基配列を表２に示す。なお、「ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２」の塩基配列中の「ＲｈｏＧ」は蛍光物質ローダミングリーンを意味する。
【０１２２】
得られた逆転写反応産物に対して、ＦＣＣＳ計測を行い、当該逆転写反応産物中の逆転写反応により伸長したＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２（ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２とＣｙ５−ｄｄＡＴＰとが結合した分子）の含有割合を測定した。ＦＣＣＳ計測は、一分子蛍光解析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）を用いて行った。ローダミングリーンは４８８ｎｍのレーザ（レーザパワー：１００μＷ）により、Ｃｙ５は６３３ｎｍのレーザ（レーザパワー：１００μＷ）により、それぞれ励起した。計測メソッドは、ＦＣＣＳを用いて、１サンプルあたり１５秒間５回計測した。
【０１２３】
一方、測定値を補正するための検量線を作成した。具体的には、まず、ローダミングリーンとＡＴＴＯ６３３の両方により標識された蛍光標識２本鎖核酸と、５’末端がローダミングリーンにより標識されたＲｈｏＧ標識１本鎖核酸と、ＡＴＴＯ６３３により標識されたＡＴＴＯ６３３標識１本鎖核酸とを準備した。蛍光標識２本鎖核は、５’末端がローダミングリーンにより標識された１８塩基からなるフォワードプライマーと、５’末端がＡＴＴＯ６３３により標識された１９塩基からなるリバースプライマーを用いて、合成ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、５’末端がローダミングリーンにより標識された１本鎖核酸と５’末端がＡＴＴＯ６３３により標識された１本鎖核酸との会合体である蛍光標識２本鎖核酸（４０塩基対長）を調製した。ＰＣＲは、１サイクルが９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる熱サイクルを４０サイクル繰り返すことにより行った。得られたＰＣＲ産物は、１５％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、４０塩基対長のバンドを切り出し、市販の精製キット（Ｍｅｒｍａｉｄ、ＱＢｉｏｇｅｎｅ社製）を用いて精製した（ＰＡＧＥ精製）。
次いで、蛍光標識２本鎖核酸、検量線用ローダミングリーン標識１本鎖核酸、及び検量線用ＡＴＴＯ６３３標識１本鎖核酸を、それぞれ表３記載の含有割合となるように、７種類の検量線用試料を調製した。表３中、「２本鎖」は蛍光標識２本鎖核酸を、「ＲｈｏＧ１本鎖」は検量線用ローダミングリーン標識１本鎖核酸を、「ＡＴＴＯ１本鎖」は検量線用ＡＴＴＯ６３３標識１本鎖核酸を、それぞれ意味する。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
上記で調製した検量線用試料系列の各検量線用試料に対して、逆転写反応産物と同様にしてＦＣＣＳ計測を行い、検量線用試料中の蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（ＤＣＣ）を測定した。
図６は、縦軸をＦＣＣＳ計測により得られた蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（ＤＣＣ）、横軸を実際の蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（Ｆｒａｃ．Ｇ／Ｒ−ＤＮＡ）として、検量線用試料系列の各検量線用試料のデータをプロットした図である。このうち、実際の蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（Ｆｒａｃ．Ｇ／Ｒ−ＤＮＡ）が６０％以下の５プロット（低領域）に対して最小二乗法等を行い、近似直線（図６中、「低領域検量線」）を引いた。一方、実際の蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（Ｆｒａｃ．Ｇ／Ｒ−ＤＮＡ）が６０％超の２プロット（高領域）に対して最小二乗法等を行い、近似直線（図６中、「高領域検量線」）を引いた。すなわち、検量線は、実際の蛍光標識２本鎖核酸の含有割合（Ｆｒａｃ．Ｇ／Ｒ−ＤＮＡ）が低領域と高領域の境界以下の範囲では低領域検量線となり、当該境界以上の範囲では高領域検量線となる。なお、低領域検量線と高領域検量線の交点が、低領域と高領域の境界である。また、各検量線の傾きを下記に示す。
【０１２６】
【数２】
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【０１２７】
図７は、逆転写反応産物に対して行ったＦＣＣＳ計測により求めた、逆転写反応産物中の逆転写反応により伸長したＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２の含有割合（％）を、図６に示す検量線に基づいて補正した結果を示した図である。図中、「ネガコン１」は、第１対照細胞由来のＲＮＡを用いて行った逆転写反応産物の測定結果を、「ネガコン２」は、第２対照細胞由来のＲＮＡを用いて行った逆転写反応産物の測定結果を、「ＣＸＣＲ４」は、被検細胞由来のＲＮＡを用いて行った逆転写反応産物の測定結果を、それぞれ示す。この結果、第１対照細胞由来のＲＮＡ及び第２対照細胞由来のＲＮＡを鋳型とした場合には、逆転写反応産物中の３０％程度のＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２が伸長していた。これに対して、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞由来のＲＮＡを鋳型とした場合には、逆転写反応産物中の伸長したＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２の含有割合は１０％以下であった。この結果から、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡにより、表２に示す予測切断部位において、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡが切断されることが分かった。
【０１２８】
［実施例３］
実施例１及び２において用いたＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡが、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡを予測切断部位において切断しているか否かを、ｓｉＲＮＡを導入した細胞内において逆転写反応を行うことにより調べた。
まず、実施例２と同様にして、ＣＸＣＲ４−ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞（被検細胞）、対照ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ＃１）を導入したＨｅＬａ細胞（第１対照細胞）、及び導入操作のみを行ったＨｅＬａ細胞（第２対照細胞）を調製した。トランスフェクション後に２４時間培養した後、マイクロインジェクションにより、各細胞へ、Ｃｙ５−ｄｄＡＴＰ（パーキンエルマー社製）を導入した。Ｃｙ５−ｄｄＡＴＰを導入した細胞に対して、ＦＣＣＳ計測を行い、蛍光相互相関関数曲線１を算出した。
蛍光相互相関関数曲線１を算出した細胞に対して、マイクロインジェクションにより、さらにＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（５０μ／μｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を導入し、３７℃で１２０分間培養することにより、逆転写反応を行った。培養終了後の各細胞に対して、ＦＣＣＳ計測を行い、蛍光相互相関関数曲線２を算出した。
【０１２９】
図８は、細胞に対してＦＣＣＳ計測を行った結果算出されたＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２〔ローダミングリーン（ＲｈｏＧ）標識分子〕及びＣｙ５−ｄｄＡＴＰ（Ｃｙ５標識分子）の蛍光自己相互相関関数曲線、並びに蛍光相互相関関数曲線を示した図である。図８（Ａ）は、Ｃｙ５−ｄｄＡＴを導入した後、逆転写反応開始前の被検細胞の結果であり、図８（Ｂ）は、逆転写反応後の被検細胞の結果であり、図８（Ｃ）は、逆転写反応後の第１対照細胞の結果である。なお、第１対照細胞及び第２対照細胞の逆転写反応開始前の結果は、被検細胞の結果とほぼ等しかった。
この結果、被検細胞においては、逆転写反応前の蛍光相互相関関数曲線１のＹ切片と、逆転写反応後の蛍光相互相関関数曲線２のＹ切片とがほとんど等しく、逆転写反応によって、ＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２の伸長反応がほとんど進行していないこと、すなわち、大半のＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡが、予測切断部位において切断されていることが明らかとなった。一方で、第１対照細胞においては、逆転写反応後の蛍光相互相関関数曲線２のＹ切片は、逆転写反応前の蛍光相互相関関数曲線１のＹ切片よりも有意に大きく、逆転写反応によりＣＸＣＲ４−ｐｒｉｍｅｒ−２の伸長反応が進んだこと、すなわち、ＣＸＣＲ４遺伝子のｍＲＮＡが切断されていないことが分かった。
これらの結果から、逆転写反応並びに蛍光シグナルの検出及び解析を、ｓｉＲＮＡを導入した細胞内において行った場合であっても、標的遺伝子のｍＲＮＡが予測切断部位において切断されているか否かを検出し得ることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明の遺伝子発現抑制効果評価方法及びｍＲＮＡ切断検出方法は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を要することなく、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を評価することができるため、学術研究分野のみならず、ＲＮＡ干渉活性等を応用した核酸医薬の開発の分野においても利用が可能である。
【符号の説明】
【０１３１】
１…標的ｍＲＮＡ、２…予測切断部位、３…蛍光標識プライマー、１１…標的ｍＲＮＡの切断断片、１２…標的ｍＲＮＡの切断断片、３１…第１蛍光物質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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