(57)【要約】      （修正有）【課題】非相同的組換え（ＮＨＲ）選好を有する糸状菌細胞ゲノムへの、ポリヌクレオチドの所定の部位に対する標的取込みの効率を増大させるための方法の提供。【解決手段】ポリヌクレオチドは、所定の部位との相同の領域を有し、取込み経路を相同的組換え（ＨＲ）へ導くステップを含んで成る方法。親細胞に由来する糸状菌変異体は高い効率のＨＲ経路および／または低い効率のＮＨＲ経路および／または同じ条件下の前記親細胞の前記ＨＲおよび／またはＮＨＲ効率および／またはＮＨＲ／ＨＲ比と比べ減少した効率のＮＨＲ／ＨＲ比を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨＲ選好の糸状菌細胞のゲノムへの所定の部位に対するポリヌクレオチドの標的取込みの効率を増大させるための方法であって、前記ポリヌクレオチドが、前記所定の部位との相同の領域を有し、ＨＲの方へ取込み経路を導くステップを含んで成る、方法。
【請求項２】
前記導くステップが、親糸状菌細胞の変異体を提供するステップを含んで成り、ＮＨＲ／ＨＲ比が、同じ条件下で測定された前記親生物における前記比と比べ変異体において減少している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記導くステップが、ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子に欠ける、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の減少したレベルを有する変異体を提供するステップを含んで成る請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異体が、好ましくは誘導性に、以下の遺伝子、すなわちｈｄｆＡまたはその相同体、ｈｄｆＢまたはその相同体、あるいはその両方の少なくとも１つに欠け、かつ／または、好ましくは誘導性に、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの減少した量を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＮＨＲに関与する遺伝子が非機能的変異形によって置換されている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記導くステップが、取込まれる前記ポリヌクレオチドに過剰な小さな二本鎖ポリヌクレオチドを添加するステップを含んで成る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記導くステップが、前記タンパク質の阻害剤を添加することによってＮＨＲにおいて活性の少なくとも１つのタンパク質の活性を減少させるステップを含んで成る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変異体がＨＲに関与する成分の増加したレベルを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＮＨＲ／ＨＲ比が５０未満、好ましくは１０未満、さらにより好ましくは１未満、かつ最も好ましくは０．００１未満である糸状菌が使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
親糸状菌細胞の変異体であって、前記親生物がＮＨＲ選好を有し、ＮＨＲ／ＨＲ比が、同じ条件下で測定された前記親生物における前記比と比べ変異体が減少している変異体。
【請求項１１】
前記変異体が、ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子を欠き、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の減少したレベルを有する、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体が、好ましくは誘導性に、以下の遺伝子、すなわちｈｄｆＡまたはその相同体、ｈｄｆＢまたはその相同体、あるいはその両方の少なくとも１つに欠け、かつ／または、好ましくは誘導性に、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの減少した量を有する、請求項１０または１１に記載の変異体。
【請求項１３】
前記生物のゲノムにおいて、ＮＨＲに関与する遺伝子が非機能的変異形によって置換されている請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体がＨＲに関与する成分の増加したレベルを有する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１５】
前記変異体が組換え変異体である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
ＮＨＲ／ＨＲ比が５０未満、好ましくは１０未満、さらにより好ましくは１未満、かつ最も好ましくは０．００１未満である糸状菌。
【請求項１７】
目的とするポリペプチドをコードする目的とする遺伝子を含んで成るＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物で形質転換された請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項１８】
前記糸状菌が、アスペルギルス種、ペニシリウム種、またはトリコデルマ種である、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項１９】
前記アスペルギルスが、アスペルギルス・ニゲル種またはアスペルギルス・オリゼ種である、請求項１８に記載の糸状菌。
【請求項２０】
前記ペニシリウムが、ペニシリウム・クリソゲヌム種またはペニシリウム・シトリナム種である、請求項１８に記載の糸状菌。
【請求項２１】
請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の糸状菌が使用される、目的とするポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２２】
請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の糸状菌が使用される、代謝産物を産生するための方法。
【請求項２３】
前記代謝産物がカルチノイド化合物またはベータ・ラクタム化合物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号２または５または１９または２２を有する単離ＤＮＡ配列またはその相同体。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＤＮＡ配列によってコードされた単離ポリペプチドまたはその相同体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は分子生物学の分野に関する。詳しくは、糸状菌のゲノムへの核酸の方向づけられた取込みの効率を改善する方法、およびその使用に関する。
【０００２】
［背景技術］
真核細胞は、ポリペプチドおよび二次代謝産物の（組換え）生産のための好ましい生物である。例えば、タンパク質生産菌株を構成する際には、生産されるタンパク質をコードする目的とする遺伝子の取込みの部位は、目的とする取込み遺伝子の転写および／または発現の調節に重要である。大部分の真核生物におけるＤＮＡのゲノムへの取込みは無作為に高頻度で起こるため、組換えＤＮＡ技術によるタンパク質生産菌株の構成はしばしば、生産されるタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る発現カセットの望ましくない無作為取込みをもたらす。発現カセットのこのコントロール不良の「無作為多重取込み」は潜在的に危険な過程であり、宿主のゲノムの望ましくな修飾をもたらしうる。したがって、高い効率で発現カセットの正確な標的を確実にすることによってタンパク質生産菌株を構成することが可能であることがきわめて望ましい。さらに、生物の増大する量の完全ゲノムの配列が入手可能になっている現在、これは過剰発現および削除ライブラリーの橋渡しをするゲノムを構成する機会を開く。かかるライブラリーの効率的な構成の重要な要件は、問題の生物が効率的に形質転換されうること、および核酸のゲノムへの直接の標的取込みに必要とされる必要な相同が比較的短いことである。
【０００３】
真核細胞は少なくとも２つの別個の経路を有し（１つは相同的組換えを介し、また１つは非相同的組換えを介し）、それらを通じて核酸（特にＤＮＡのコース）が宿主ゲノムへ取込まれうる。酵母サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、相同的組換え（ＨＲ）選好の生物である。この生物の非相同的組換えと相同的組換え（ＮＨＲ／ＨＲ）の比は、約０．０７〜０．００７のばらつきがありうる。
【０００４】
国際公開第０２／０５２０２６号パンフレットは、ＤＮＡ配列のそのゲノムへの改善された標的効率を有するサッカロミセス・セルビシエの変異体を開示している。かかる変異体菌株は、ＮＨＲに関与する遺伝子（ＫＵ７０）を欠いている。
【０００５】
サッカロミセス・セルビシエとは逆に、哺乳類細胞に至るまでの糸状菌細胞など大部分の真核生物はＮＨＲ選好を有する。糸状菌の中では、ＮＨＲ／ＨＲ比は１〜１００超の範囲である。かかる生物では、標的取込み頻度はやや低い。この頻度を改善するには、かかる生物のゲノムへ取込まれるポリヌクレオチド配列をフランキングする相同的領域の長さは、例えば単一遺伝子を分裂させるためには少なくとも２０００ｂｐ、および推定的形質転換体をスクリーニングするためには少なくとも５００ｂｐと比較的長いことが必要である。かかるフランキング領域の必要性は、前記ポリヌクレオチドを含んで成るＤＮＡ構成物をクローン化する際、かつそれで生物を形質転換する際の大きな負担を表し、さらに、そのフランキング領域内にある隣接遺伝子は形質転換後の組換え過程中に容易に阻害され、それによって望ましくない予想外の副作用を引起こしうる。
【０００６】
ＫＵ７０を欠く哺乳類細胞はすでに単離されている（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、（２００１年）、１５：３２３７−３２４２頁）。これらの変異体は６倍高い相同指向修復頻度を示すが、相同指向標的取込みの効率の増加は示さない。これは、ＨＲ選好の生物（サッカロミセス・セルビシエ）において得られる結果が、ＮＨＲ選好の生物には外挿されえないことを示す。
【０００７】
意外にも、本発明者らは、糸状菌におけるＨＲへ核酸の取込み経路を導くステップが結果として糸状菌のゲノムへの核酸の標的取込みの改善された効率をもたらすことを見出した。
【０００８】
［発明の詳細な説明］
本明細書で参照される、すべての特許および刊行物は、かかる特許および刊行物内で開示されたすべての配列および方法を含めて、参照により明示的に援用される。これらの特許および刊行物としては、欧州特許第３５７１２７Ｂ号明細書、同第６３５５７４Ｂ号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット、同第９８／４６７７２号パンフレットが挙げられる。
【０００９】
ポリヌクレオチドの糸状菌細胞のゲノムへの標的取込みの効率を増大させるための方法
本発明は、ＮＨＲ選好を有する糸状菌細胞のゲノムへのポリヌクレオチドの所定の部位に対する標的取込みの効率を増大させるための方法に関し、前記ポリヌクレオチドは、前記所定の部位との相同の領域を有し、取込み経路をＨＲへ導くステップを含んで成る。本発明は、ＨＲ経路の効率を上昇させることによって、かつ／またはＮＨＲ経路の効率を低下させる（削減を意味する）ことによって、かつ／またはＮＨＲ／ＨＲ比を減少させることによって、かかる導くステップに達する。
【００１０】
本発明に照らして、ＨＲ経路は、ポリヌクレオチドの宿主のゲノムへの標的取込みのコントロールに関与されるすべての遺伝子および構成要素と定義され、前記ポリヌクレオチドは、取込みが標的される宿主のゲノムの特定の所定部位と特定の相同を有する。ＮＨＲ経路は、宿主のゲノム配列との前記ポリヌクレオチドの相同の程度と関係なく、ポリヌクレオチドの宿主のゲノムへの取込みのコントロールに関与されるすべての遺伝子および構成要素と定義される。
【００１１】
好ましい実施形態によれば、導くステップは親糸状菌細胞の変異体を提供するステップを含んで成り、ここでＮＨＲ／ＨＲ比は、以下のアッセイによって測定された前記親生物における前記比と比べ少なくとも５％の変異体において減少する。より好ましくは、ＮＨＲ／ＨＲ比は、前記親生物における前記比と比べ少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、かつ最も好ましくは少なくとも１００％の変異体において減少する。
【００１２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の糸状菌細胞は、以下のアッセイによって測定されうるように、少なくとも２００、少なくとも５０、少なくとも１０であるＮＨＲ／ＨＲ比を有する。好ましくは、糸状菌細胞の比は少なくとも１、より好ましくは少なくとも０．５、さらにより好ましくは少なくとも０．１、さらにより好ましくは少なくとも０．０５、さらにより好ましくは少なくとも０．０１、さらにより好ましくは少なくとも０．００５、さらにより好ましくは少なくとも０．００１、さらにより好ましくは少なくとも０．０００５、さらにより好ましくは少なくとも０．０００１、かつ最も好ましくは少なくとも０．００００１である。
【００１３】
より好ましい実施形態によれば、本発明の糸状菌細胞は、以下のアッセイによって測定されるように２００未満、さらにより好ましくは５０未満、１０未満であるＮＨＲ／ＨＲ比を有する。さらにより好ましくは、糸状菌細胞の比は１未満、さらにより好ましくは０．５未満、さらにより好ましくは０．１未満、さらにより好ましくは０．０５未満、さらにより好ましくは０．０１未満、さらにより好ましくは０．００５未満、さらにより好ましくは０．００１未満、さらにより好ましくは０．０００５未満、さらにより好ましくは０．０００１未満、かつ最も好ましくは０．００００１未満である。
【００１４】
ＮＨＲ／ＨＲ比は、国際公開第０２／０５２０２６号パンフレット（表２、２３頁）に記載されたアッセイによって測定されることが好ましい。好ましい実施形態によれば、親生物は宿主細胞の部で定義された糸状菌細胞の１つである。別の好ましい実施形態によれば、本発明の糸状菌細胞は宿主細胞の部で定義された種由来である。
【００１５】
あるいは、またより好ましくない実施形態によれば、糸状菌におけるＮＨＲ／ＨＲ比は、かかる経路に関与する以下の成分、すなわちＫＵ７０、ＫＵ８０、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＸＲＳ２、ＳＩＲ４、ＬＩＧ４の少なくとも１つの転写プロファイリングおよび／またはノーザンブロット法および／またはウェスタンブロット法など当業者に周知の方法を使用してモニタリングされる。
【００１６】
本発明に照らして、「相同の領域」は「少なくとも１つ」の相同の領域を意味する。所定の部位が、本明細書では、宿主細胞によって含まれる遺伝物質内の部位と定義されるが、この同じ部位に対する相同を有するポリヌクレオチドが本発明による方法で取込まれる。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明は、ＮＨＲ選好を有する糸状菌細胞のゲノムへの所定部位に対するポリヌクレオチドの標的取込みの効率を増大させるための方法を提供するが、前記ポリヌクレオチドは、糸状菌を提供することによってＨＲへの取込み経路を導くステップを含んで成る前記所定の部位と相同の領域を有し、同じ条件下に由来する糸状菌のＮＨＲ経路の効率および／またはＮＨＲ／ＨＲ比と比べ、ＮＨＲ経路の効率は低下し、かつ／またはＮＨＲ／ＨＲ比は減少している。好ましい実施形態によれば、親生物は宿主細胞の部で定義されている糸状菌の１つである。
【００１８】
ＮＨＲ経路の効率は、国際公開第０２／０５２０２６号パンフレット（表２、２３頁）に記載されたアッセイで測定されることが好ましい。
【００１９】
あるいは、より好ましくない実施形態によれば、糸状菌におけるＮＨＲ経路の効率は、かかる経路に関与する成分の転写プロファイリングおよび／またはノーザンブロット法および／またはウェスタンブロット法など当業者に周知の方法を使用してモニタリングされる。より好ましくは、以下の成分、すなわちＫＵ７０、ＫＵ８０、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＸＲＳ２、ＳＩＲ４、ＬＩＧ４の少なくとも１つの発現レベルがモニタリングされる。さらにより好ましくは、ＫＵ複合体の相同的成分の発現レベルがモニタリングされる。最も好ましくは、相同的ＫＵ７０および／またはＫＵ８０の発現レベルがモニタリングされる。
【００２０】
ＮＨＲ効率の低下は、少なくとも得られた細胞が由来する親細胞におけるよりも低いことを意味する。好ましくは、低下は２倍低く、より好ましくは１０倍低く、さらにより好ましくは１００倍低く、最も好ましくは１０００倍超低く、かつさらに最も好ましくは、ノーザンまたはウェスタンブロット法、アレイ技術または表現型スクリーンを使用して検出可能ではないことを意味する。
【００２１】
使用されうる典型的な表現型スクリーンは、以下のステップ、すなわち、所定のゲノム部位の相同的配列によってフランキングされる選択マーカー遺伝子を含んで成る発現カセットで推定的ＮＨＲ変異体を形質転換するステップを含んで成る。この表現型スクリーンにおいて使用される選択マーカー遺伝子は、糸状菌の形質転換に有用である多くのマーカー遺伝子から選択されうる。一例として、これらのマーカーは、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子など優性および双方向選択マーカー遺伝子（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書または国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、またはｐｙｒＧなど栄養要求性マーカー遺伝子、および例えば、フレオマイシン（ｂｌｅ遺伝子によってコードされる産物はフレオマイシンに対する抵抗を与える）、ハイグロマイシンＢ、またはＧ４１８に対する抵抗を提供する抗生物質抵抗性遺伝子を含むがこれらに限定されない。好ましい選択マーカー遺伝子が、フレオマイシンに対する抵抗を与えるタンパク質をコードするｂｌｅ遺伝子である。推定的ＮＨＲ変異体はすでにこの所定のゲノム部位で、ａｍｄＳ遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）、硫酸パーミアーゼ（Ｓｕｔ  Ｂ）遺伝子、またはＰｙｒＧ遺伝子など双方向選択マーカー遺伝子を含有する。ｎｉａＤ遺伝子はすでに他所で記載されている（ゴウカ（Ｇｏｕｋａ）ＲＪ、ファン・ハルチングスフェルト（ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ）Ｗ、ボーベンベルグ（Ｂｏｖｅｎｂｅｒｇ）ＲＡ、ファン・デン・ホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ、ファン・ゴルコム（ｖａｎ  Ｇｏｒｃｏｍ）ＲＦ、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ−ｎｉｔｒｉｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９１年９月、２０（２）：１８９−９９頁）。ｎｉａＤ遺伝子は、細胞が塩素酸塩に耐性を示すようになると、塩素酸塩を含有するプレート上で形質転換体の直接選択を可能にする。ｓｕｔＢ遺伝子はすでに他所で記載されている（ファン・デ・カンプ（ｖａｎ  ｄｅ  Ｋａｍｐ）Ｍ、ピッツィニーニ（Ｐｉｚｚｉｎｉｎｉ）Ｅ、フォス（Ｖｏｓ）Ａ、ファン・デア・レンデ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｎｄｅ）ＴＲ、シュールス（Ｓｃｈｕｕｒｓ）ＴＡ、ニューベルト（Ｎｅｗｂｅｒｔ）ＲＷ、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）Ｇ、コーニングス（Ｋｏｎｉｎｇｓ）ＷＮ、ドリーゼン（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ）ＡＪ、Ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｔＡ  ａｎｄ  ｓｕｔＢ  ｇｅｎｅｓ．、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９９年１２月、１８１（２３）：７２２８−３４頁）。好ましい選択マーカー遺伝子が、Ａ．ニドゥランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモータに融合されるＡ．ニドゥランスａｍｄＳコード配列である（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書）。他の糸状菌からのａｍｄＳ遺伝子も使用されうる（国際���開第９７／０６２６１号パンフレット）。表現型スクリーンの好ましい形態において、ａｍｄＳ遺伝子は所定のゲノム部位に存在し、ｂｌｅ遺伝子は所定の部位に標的される遺伝子として使用される。非ＨＲ改善変異体において、ｂｌｅカセットは無作為にゲノムに取込み、多くの形質転換体がアセトアミドとフレオマイシンの両方を有する二重選択培地で成長し、かつ比較的少ない形質転換体がフルオロアセトアミド−フレオマイシンプレートで成長することを可能にする。改善されたＨＲを有する変異体においては、ａｍｄＳカセットがｂｌｅカセットで効率的に交換されると、アセトアミド−プレオマイシン二重選択プレートでの形質転換体の数は限られる。このカセットではより多くの変異体がフルオロアセトアミド−フレオマシン二重選択プレートで現れる。
【００２２】
別の好ましい実施形態によれば、低下したＮＨＲ効率および／または減少したＮＨＲ／ＨＲ比を有する糸状菌は、ＮＨＲに関与する１つの成分が阻害されている糸状菌である。これに関連して、「１つの（ａ）」は「少なくとも１つ」を意味する。すなわち、ＮＨＲに関与する少なくとも１つの成分が一定の糸状菌で阻害されている。阻害は、ＮＨＲに関与する遺伝子の発現レベルをダウンレギュレートし、またはＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子を不活性化することによって、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の発現レベルをダウンレギュレートし、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の（タンパク質）活性を（一時的に）減少させ、およびこれらの可能性の組合せによって達成されうる。
【００２３】
好ましくは、得られた糸状菌は、同じ条件下に由来する親糸状菌細胞における前記遺伝子の発現との比較によってダウンレギュレートされたＮＨＲに関与する遺伝子の発現を有する。好ましい実施形態によれば、親糸状菌は宿主細胞の部で定義される糸状菌の１つである。
【００２４】
遺伝子の発現レベル、またはＤＮＡ配列は、得られた糸状菌におけるこの特定の遺伝子またはＤＮＡ配列の発現レベルが、それが由来する親糸状菌における同じ遺伝子またはＤＮＡ配列の発現レベルよりも低い、好ましくは３倍低く、より好ましくは４倍低く、最も好ましくは４倍超低く、さらに最も好ましくは、ノーザンまたはウェスタンブロット法、またはトランスクリプトミクスおよびプロテオミクスのような「オミクス」法を使用して検出可能ではない場合にダウンレギュレートされる。
【００２５】
ＤＮＡ配列の発現レベルのダウン／アップレギュレーションは、例えば、ノーザンブロット法によって細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量を定量化することによって（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク・コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）、かつ／または、例えば、ウェスタンブロット法によって細胞に存在する対応するタンパク質の量を定量化することによってモニタリングされうる。ｍＲＮＡの量の差は、ＤＮＡ配列分析（アイゼン（Ｅｉｓｅｎ），Ｍ．Ｂ．およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ），Ｐ．Ｏ．、ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３年：３０３：１７９−２０５頁）によっても定量化されうる。
【００２６】
少なくとも１つの遺伝子またはＤＮＡ配列の発現レベルのダウンレギュレーションは、以下の方法の１つまたはその組合せによる遺伝子操作によって得られうる。すなわち、
ａ．組換え遺伝子操作法を使用するステップ、
ｂ．糸状菌を変異誘発に提示するステップ。
【００２７】
あるいは、または上記の方法と組合せて、かつ別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝子またはＤＮＡ配列の少なくとも１つの発現レベルのダウンレギュレーションは、糸状菌を阻害化合物／組成物に提示することによって得られうる。
【００２８】
得られた糸状菌はその後にＤＮＡ配列の前記遺伝子の発現レベルをモニタリングすることによって選択されうる。場合により、糸状菌はその後にそのＮＨＲ経路および／またはＨＲ経路の効率および／またはそのＮＨＲ／ＨＲ比を測定することによって選択されうる。本発明に照らして、糸状菌のＨＲ経路の効率は、一定の相同領域を使用することにより糸状菌のゲノムにおける一定のポリヌクレオチド配列の所定の部位への標的取込みの効率によって測定されうる。本発明に照らして、糸状菌のＮＨＲ経路の効率は、相同領域と関係なく糸状菌のゲノムにおける一定のポリヌクレオチド配列の非標的取込みの効率によって測定されうる。
【００２９】
より好ましくは、少なくとも１つのＤＮＡ配列の発現のダウンレギュレーションは、例えばステップａ．で定義された組換え遺伝子操作法で行われ、組換え糸状菌を得る。最も好ましくは、ステップａ．は、ＤＮＡ配列を削除するステップを含んで成り、さらに最も好ましくは、削除型ＤＮＡ配列はその非機能的変異形によって置換され、かつさらに最も好ましくは、削除および置換は、好ましくは欧州特許第３５７１２７Ｂ号明細書に記載された遺伝子置換によって行われる。
【００３０】
選ばれた糸状菌の少なくとも１つのＤＮＡ配列の削除または置換の場合、適切なＤＮＡ配列が標的遺伝子座で導入されなければならない。標的遺伝子座はこの場合、削除または置換されるＮＨＲ経路に関与するＤＮＡ配列である。適切なＤＮＡ配列は好ましくはクローニングベクター上に存在する。適切なクローニングベクターは、使用される糸状菌宿主細胞の染色体における所定の標的遺伝子座で取込むことが可能であるものである。
【００３１】
好ましい統合的クローニングベクターは、この所定の遺伝子座に対するクローニングベクターの取込みを標的するために削除または置換されるＤＮＡ配列に対して相同的であるＤＮＡ断片を含んで成る。標的取込みを促進するために、クローニングベクターは好ましくは宿主細胞の形質転換前に線状化される。好ましくは、線状化は、クローニングベクターの少なくとも１つ、ただし好ましくはいずれかの末端が削除または置換されるＤＮＡ配列に対して相同的な配列によってフランキングされるように実行される。
【００３２】
削除または置換されるＤＮＡ配列をフランキングする相同的配列の長さは好ましくは２ｋｂ未満、さらに好ましくは１ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．５ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．２ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．１ｋｂ未満、さらにより好ましくは５０ｂｐ未満、かつ最も好ましくは３０ｂｐ未満である。
【００３３】
クローニングベクターにおける選択マーカー遺伝子は、糸状菌の形質転換に有用である多くのマーカー遺伝子から選択されうる。一例として、これらのマーカーは、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子など優性および双方向選択マーカー遺伝子（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書または国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、またはｐｙｒＧなど栄養要求性マーカー遺伝子、および、例えば、フレオマイシン、ハイグロマイシンＢ、またはＧ４１８に対する抵抗を示す抗生物質抵抗性遺伝子を含むがこれらに限定されない。好ましい選択マーカー遺伝子が、Ａ．ニドゥランスｇｐｄＡプロモータに融合したＡ．ニドゥランスａｍｄＳコード配列である（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書）。他の糸状菌からのａｍｄＳ遺伝子も使用されうる（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子は、明確なＤＮＡ配列を置換および／または削除する同じ菌株における数倍で使用されうる利点を有する。
【００３４】
欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に記載されたフルオロアセトアミド培地の対抗選択を行うことで、結果として生じる菌株はマーカーを含まず、さらなる遺伝子修飾のために使用されうる。
【００３５】
一定のＤＮＡ配列の発現をダウンレギュレートするための好ましい方法が、野生型ＤＮＡ配列の削除および／または修飾ＤＮＡ配列による置換を含んで成るが、その発現産物は機能的ではない。削除および置換は、好ましくは、欧州特許第０３５７１２７Ｂ１号明細書に記載された遺伝子置換法によって実行される。遺伝子の特定の削除は、好ましくは、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に記載されているように選択マーカー遺伝子としてａｍｄＳ遺伝子を使用して実行される。
【００３６】
あるいは、または他の言及された方法と組合せて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコスミドのインビボ組換えに基づく方法が以下に記載されているように使用されうる。すなわち、Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（２０００年）、シャーベロシュ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ），ＭＫ、ジコ（Ｇｈｉｃｏ），Ｊ．Ｍ．、およびダンフェルト（ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ）Ｃ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８巻、２２号。この方法は、例えばＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）のような他の糸状菌に適用可能である。
【００３７】
ＤＮＡ配列の発現のダウンレギュレーションは、アンチセンス核酸を使用することによって、もしくはＵＶまたは化学的変異誘発を使用することによっても達成されうる（マテム（Ｍａｔｔｅｍ），Ｉ．Ｅ．、ファン・ヌルト（ｖａｎ  Ｎｏｏｒｔ）Ｊ．Ｍ．、ファン・デン・ベルグ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ），Ｐ．、アーチャー（Ａｒｃｈｅｒ），Ｄ．Ｂ．、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），Ｉ．Ｎ．、およびファン・デン・ホンデル，Ｃ．Ａ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２年８月、２３４（２）：３３２−６頁）。
【００３８】
好ましくは、ＮＨＲ経路にもたらされる欠損は誘導性のものである。これは、新しい調節領域によって、好ましくは抑制可能または調節可能なプロモータを使用することによって、より好ましくは、スイッチオン／オフされうるプロモータを使用することによって、すなわちグルコース抑制、もくしはアンモニア抑制、またはｐＨ抑制によって、ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子の内在性調節領域を置換することによって達成されうる。グルコース抑制されたプロモータの例は、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ｐｃｂＡＢプロモータ（マルチン（Ｍａｒｔｉｎ）ＪＦ、カスケイロ（Ｃａｓｑｕｅｉｒｏ）Ｊ、コサルコバ（Ｋｏｓａｌｋｏｖａ）Ｋ、マルコス（Ｍａｒｃｏｓ）ＡＴ、グチレツ（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ）Ｓ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．アントニー・ファン・リューエンヘック（Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ）、１９９９年１−２月、７５（１−２）：２１−３１頁、総説）、またはアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータである。オン／オフスイッチ可能なプロモータの例は以下の刊行物に記載されている。すなわち、
−Ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ／ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｄｕａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｌｌｏｗｓ  ｔｉｇｈｔ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ：ベリ（Ｂｅｌｌｉ）ら、（１９９８年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２６巻、４号：９４２−９４７頁、
−Ａ  ｌｉｇｈｔ−ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ：シミズ−サトウ（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓａｔｏ）ら、（２００２年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０巻、１０号、：１０４１−１０４４頁。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、糸状菌は、ＮＨＲ経路に関与する以下の酵母遺伝子、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２、およびＳＩＲ４と相同的である、その内在性遺伝子の少なくとも１つを欠いている（ファン・デン・ボシュ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ）ら（２００２年）：ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．３８３巻：８７３−８９２頁、およびアレン（Ａｌｌｅｎ）ら、（２００３年）：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１巻：９１３−９２０頁）。
【００４０】
ＮＨＲに関与する少なくとも１つの成分を有する全種類の変異体は、ＮＨＲの過程においてその機能を実行することがもはや可能ではなく、または少なくとも相当に可能性が低く、本発明によって意図された変異体である。好ましくは、ＮＨＲに関与する成分は、得られた変異体におけるＮＨＲ経路の効率が前記定義のアッセイで測定されたように同じ条件下に由来する親細胞における活性の９０％未満、さらに好ましくは８５％未満、より好ましくは８０％未満、さらにより好ましくは７０％未満、最も好ましくは５０％未満であるように阻害されている。
【００４１】
好ましい実施形態によれば、親糸状菌は宿主細胞の部で定義される糸状菌の１つである。
【００４２】
好ましくは、糸状菌細胞は以下の遺伝子の少なくとも１つを欠いている。すなわち、
−配列番号２または１９で識別されるｈｄｆＡもしくはその相同体、または
−配列番号５または２２で識別されるｈｄｆＢもしくはその相同体、またはその両方。
【００４３】
別の好ましい実施形態によれば、糸状菌は、誘導と同時に減少するこれら遺伝子ｈｄｆＡおよびｈｄｆＢによってコードされたタンパク質の少なくとも１つの量を有する。
【００４４】
別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝子またはＤＮＡ配列の発現レベルのダウンレギュレーションは、糸状菌を変異誘発にかけることによる遺伝子修飾によって得られうる。糸状菌細胞は、無作為変異誘発、およびその後に選択アッセイにかけられ、改善されたＨＲを有する変異体を変異体のすべての集団から単離することができる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によれば、宿主細胞の部で定義された糸状菌細胞の１つが変異誘発を実行する出発菌株として使用される。
【００４６】
例えば、出発菌株はＵＶ照射にかけられ、生存率が０．００１％〜６０％の範囲であるようにＵＶ照射にかけられる。好ましくは、生存率は０．０１％〜５０％の範囲である。分生子が、物理的または化学的手段によって糸状菌を突然変異させる好ましい材料であることは当業者に公知である。しかし、変異体は菌糸細胞から得ることもできる。また、ＵＶ以外の他の変異誘発処置が化学的薬剤（例えば、ＮＴＧ）として適用されうる。本明細書に記載された選択方法は、分生子または菌糸細胞のいずれかから得られる変異体を選択するためにも適用されうる。
【００４７】
好ましくは、変異誘発は分生子に適用される。ＵＶ照射は、好ましくは、７．５、１５、および３０分など異なる時間にわたって適用され、細胞における軽度、中等度、および強度の突然変異率レベルを得る。突然変異試料は、直接、再胞子形成され、または胞子形成が誘発された前に（例えば、実施例９に記載）、ＹＮＢまたはＹＥＰＤ（実施例９の定義）など富栄養培地において長い回復期間インキュベートされうる。
【００４８】
次いで、胞子形成バッチは遺伝子標的におけるその効率について試験されうる。これは以下の方法によって試験されうる。プロトプラストは、機能的選択マーカーの発現カセットを有する少なくとも１つ、好ましくは２つもしくはそれ以上のＤＮＡ断片で形質転換されうる。発現カセットにおける選択マーカー遺伝子は、糸状菌の形質転換に有用である多くのマーカー遺伝子から選択されうる。一例として、これらのマーカーは、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子など優性および双方向選択マーカー遺伝子（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書または国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、またはｐｙｒＧなど栄養要求性マーカー遺伝子、および例えば、フレオマイシン、ハイグロマイシンＢ、またはＧ４１８に対する抵抗を提供する抗生物質抵抗性遺伝子含むがこれらに限定されない。好ましくは、使用される選択マーカーはｂｌｅおよびａｍｄＳ遺伝子である。使用されるａｍｄＳカセットは、Ａ．ニドゥランスｇｐｄＡプロモータに融合したＡ．ニドゥランスコード配列である（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書）。他の糸状菌からのａｍｄＳ遺伝子も使用されうる（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。遺伝子ｂｌｅは、フレオマイシンに対する抵抗を与えることが可能なタンパク質をコードする。遺伝子ａｍｄＳは、細胞が唯一の窒素源としてアセトアミドで成長することを可能にするタンパク質をコードする（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に記載）。糸状菌のプロトプラストへのＤＮＡの移動に適用される方法は当技術分野で周知であり、フィンケルシュタイン（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ）とボール（Ｂａｌｌ）（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，バターワース・ハイネマン（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）（１９９２年）、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）とラシュア（Ｌａｓｕｒｅ）（編）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、ターナー、ピューラー（Ｐｕｅｈｌｅｒ）（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２完全改訂版、ＶＨＣ（１９９２年）を含む多くの文献に記載されている。Ｃａ−ＰＥＧ介在プロトプラスト形質転換は、欧州特許第６３５５７４Ｂ明細書に記載されているように使用される。
【００４９】
これら２つの発現カセットの糸状菌ゲノムにおける２つの明確な特定の遺伝子座への標的取込みを選択するには、ＤＮＡの短い相同的ストレッチが、例えば、ＤＮＡ断片の両側のＰＣＲを介して添加されうる。いくつかの種類の構成物を作り、改善された標的効率を有する変異体を選択する機会を改善しうる。すなわち、ＤＮＡの相同的ストレッチは通常、３０ｂｐ〜１０００ｂｐ、好ましくは３０ｂ〜７００ｂｐ、より好ましくは３０ｂｐ〜５００ｂｐ、さらにより好ましくは３０ｂｐ〜３００ｂｐ、より好ましく好ましくは３０ｂｐ〜２００ｂｐ、さらにより好ましくは３０ｂｐ〜１００ｂｐ、かつ最も好ましくは３０ｂｐでありうる。理論上、糸状菌ゲノムにおけるすべての遺伝子座が発現カセットの標的取込みのために選択されうる。好ましくは、標的が行われる遺伝子座は、この遺伝子座に存在する野生型遺伝子が発現カセットに含まれる遺伝子によって置換されている場合、得られた変異体が一定のアッセイによって検出可能である変化を示すようになっている。好ましくは、遺伝子座はｎｉａＤ遺伝子座であり、それによって硝酸還元酵素遺伝子を破壊し（ゴウカ  ＲＪ、ファン・ハルチングスフェルト  Ｗ、ボーフェンベルク（Ｂｏｖｅｎｂｅｒｇ）ＲＡ、ファン・デン・ホンデル  ＣＡ、ファン・ゴルコム  ＲＦ、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ−ｎｉｔｒｉｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１年９月、２０（２）：１８９−９９頁）、細胞が塩素酸塩に対して抵抗性になると、塩素酸塩を含有するプレート上で形質転換体の直接選択を可能にする。別の好ましい遺伝子座はｓｕｔＢ遺伝子座であり、それによって硫酸パーミアーゼ遺伝子を破壊し（ファン・デ・カンプ  Ｍ、ピッツィニーニ  Ｅ、フォス  Ａ、ファン・デア・レンデ  ＴＲ、シュールス  ＴＡ、ニューベルト  ＲＷ、ターナー  Ｇ、コーニングス  ＷＮ、ドリーゼン  ＡＪ、Ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｔＡ  ａｎｄ  ｓｕｔＢ  ｇｅｎｅｓ．、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９９年１２月、１８１（２３）：７２２８−３４頁）、セレン酸塩を含有するプレート上で形質転換体の直接選択を可能にする。存在する両方の選択マーカーを有し、かつ取込み遺伝子座に存在する遺伝子の不活性化に起因する２つの変化を有する変異体は、改善された標的取込みを有する菌株である。
【００５０】
別の好ましい実施形態によれば、ＮＨＲ経路における低下した効率、または減少したＮＨＲ／ＨＲ比および／またはＨＲ経路の高い効率は、ＮＨＲに関与する成分を減少させることによって、より好ましくは部分的もしくは最も好ましくは完全に阻害することによって得られる。
【００５１】
ＮＨＲに関与する成分の部分的または完全な阻害は異なる方法によって、例えば、かかる成分もしくは化学的阻害剤またはタンパク質阻害剤もしくは物理的阻害剤（ツール（Ｔｏｕｒ）Ｏ．ら（２００３年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．２１巻、１２号、１５０５−１５０８頁）またはペプチド阻害剤もしくはアンチセンス分子またはＲＮＡｉ分子（Ｒ．Ｓ．カマス（Ｋａｍａｔｈ）ら、（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｏｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡｉ．４２１巻、２３１−２３７頁）に対する抗体によって得られうる。阻害の種類（部分的またはより好ましくは完全）に関係なく、ＮＨＲに関与する成分が上記定義されたＮＨＲの過程におけるその機能を実行することがもはや不可能であり、少なくとも相当に可能性が低いことが重要である。
【００５２】
ＮＨＲに関与する成分は、酵母ＫＵ７０、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＩＩ、ＸＲＳ２、ＬＩＧ４、ＳＩＲ４、ＫＵ８０、ＬＩＦＬ、もしくはＮＥＩＬ、または会合成分の糸状菌相同体を含んで成る。遺伝子の命名は生物間で異なるため、機能的等価物および／またはその機能的断片はすべて、酵母遺伝子ＫＵ７０、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＩＩ、ＸＲＳ２、ＬＩＧ４、ＳＩＲ４、ＫＵ８０、ＬＩＦＬ、またはＮＥＩＬの少なくとも１つの機能（機能であって、量ではなく）を実行するのが可能であると本明細書で定義されているが、これらは本発明にも含まれる。ＮＨＲに関与する成分を一時的に（部分的より好ましくは完全に）阻害することによって、核酸が所望の位置で取込まれるが、ＮＨＲに関与する成分を永続的に修飾することはなく、かつＮＨＲに関与するかかる修飾成分の永続的存在によって引起こされる望ましくない副作用を予防する。
【００５３】
上記の方法に加えて、または代替として、ＮＨＲに関与するタンパク質の活性を阻害することによって低下したＮＨＲ効率を得ること、または代わりのシグナル配列（ラモン・ド・ルーカス（Ｒａｍｏｎ  ｄｅ  Ｌｕｃａｓ），Ｊ．、マルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）Ｏ、ペレス（Ｐｅｒｅｚ）Ｐ．、イザベル・ロペス（Ｉｓａｂｅｌ  Ｌｏｐｅｚ），Ｍ．、バレンシアーノ（Ｖａｌｅｎｃｉａｎｏ），Ｓ．、およびラボルダ（Ｌａｂｏｒｄａ），Ｆ．、Ｔｈｅ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｃｕＨ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００１年７月２４日、２０１（２）：１９３−８頁）、または保持シグナル（デルクス（Ｄｅｒｋｘ），Ｐ．Ｍ．とマドリッド（Ｍａｄｒｉｄ），Ｓ．  Ｍ．、Ｔｈｅ  ｆｏｌｄａｓｅ  ＣＹＰＢ  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ＨＥＥＬ．  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００１年１２月、２６６（４）：５３７−４５頁）によってＮＨＲ関与タンパク質を再局在することも可能である。
【００５４】
あるいは、または上記の方法と組合せて、タンパク質活性の阻害はＵＶまたは化学的変異誘発によって（マテム，Ｉ．Ｅ．、ファン・ヌルト  Ｊ．Ｍ．、ファン・デン・ベルグ，Ｐ．、アーチャー，Ｄ．Ｂ．、ロバーツ，Ｉ．Ｎ．、およびファン・デン・ホンデル，Ｃ．Ａ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２年８月、２３４（２）：３３２−６頁）、または親和性のプロテアソーム阻害剤のような阻害剤の使用によって（クラスト−ラクタクリスチン−β−ラクトン、アフィニティー・リサーチ・プロダクツ社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．）、ＣＷ８４０５−Ｚ０２１８５）も得られうる。
【００５５】
別の好ましい実施形態によれば、ＨＲへ導くステップは、取込まれるポリヌクレオチドは別にして、結合し、ＮＨＲ成分の発現を制限することが可能な過剰な小さな二本鎖ポリヌクレオチドを添加するステップを含んで成る（アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）Ｎ．ら：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６７巻、４号、６５７−６８５頁）。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明は、所定の部位へのポリヌクレオチドの標的取込みの効率を増大させる方法を提供し、それによって前記ポリヌクレオチドは、糸状菌細胞を提供することによってＨＲへ取込み経路を導くステップを含んで成るＮＨＲ選好を有する糸状菌において、前記所定の部位で、またはその周りで相同性を有し、ここでＨＲ経路の効率は同じ条件下に由来する親糸状菌の１つに比べ高められている。ＨＲ経路の効率は、好ましくは、ＮＨＲ／ＨＲ比を測定するために使用されたものと同じアッセイによって測定される。好ましい実施形態によれば、親生物は宿主細胞の部で定義されている糸状菌の１つである。
【００５７】
高められたというのは、得られる細胞が由来する親細胞におけるよりも少なくとも高いことを意味する。好ましくは、高められたというのは、２倍高い、より好ましくは３倍高い、さらにより好ましくは４倍高い、最も好ましくは、ノーザン、またはウェスタンブロット法、もしくはアレイ技術、または表現型スクリーンを使用して４倍超高いことを意味する。
【００５８】
別の好ましい実施形態によれば、糸状菌は、それが由来する糸状菌細胞における同じ遺伝子の発現レベルと比較することによってアップレギュレートされている、ＨＲに関与する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを有する。これは、ＨＲに関与する成分をコードする遺伝子の発現レベルを増大させることによって、かつ／またはＨＲに関与する成分の発現レベルを増大させることによって、かつ／またはＨＲに関与する成分の活性を（一時的に）増大させることによって達成されうる。
【００５９】
好ましくは、得られた糸状菌は、それが由来する糸状菌細胞における同じ遺伝子の発現レベルと比較することによってアップレギュレートされている、ＨＲに関与する遺伝子の発現を有する。
【００６０】
ＤＮＡ配列の発現レベルは、得られた糸状菌におけるこの特定のＤＮＡ配列の発現レベルが、それが由来する親糸状菌における同じＤＮＡ配列の発現レベルよりも高い、好ましくは３倍高い、より好ましくは４倍高い、最も好ましくは、ノーザン、またはウェスタンブロット法、もしくはアレイ技術を使用して４倍超高い場合にアップレギュレートされる。好ましい実施形態によれば、親生物は宿主細胞で定義されている糸状菌の１つである。
【００６１】
少なくとも１つのＤＮＡ配列の発現レベルのアップレギュレーションは、以下の方法の１つによって、またはその組合せによる遺伝子操作によって得られうる。すなわち、
ｃ．組換え遺伝子操作法を使用するステップ、
ｄ．糸状菌を変異誘発させるステップ、
あるいは、または上記の方法と組合せ、かつ別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝子またはＤＮＡ配列の発現レベルのアップレギュレーションは、糸状菌を活性化化合物／組成物に提示することによって得られうる。
【００６２】
糸状菌はその後に前記ＤＮＡ配列の発現レベル、および場合により糸状菌のＨＲ経路の効率をモニタリングすることによって選択されうる。糸状菌のＨＲ効率は、一定の相同領域を使用することにより糸状菌のゲノムにおける所定の部位への一定のポリヌクレオチド配列の標的取込みの効率によって測定されうる。
【００６３】
好ましくは、少なくとも１つのＤＮＡ配列の発現のアップレギュレーションは、組換え糸状菌を得るステップａ．で定義されているような組換え遺伝子操作法で行われる。好ましくは、ステップａ．は、ＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物で糸状菌を形質転換するステップを含んで成り、好ましくは前記ＤＮＡ配列は高発現遺伝子のプロモータに操作連結されている。選択プロモータは、過剰発現されるＤＮＡ配列の内在性プロモータよりも強い場合がある。ＤＮＡ配列の発現のプロモータは、高発現真菌遺伝子由来であることが好ましい。
【００６４】
多くの好ましい高発現真菌遺伝子が一例として挙げられている。すなわち、アスペルギルスまたはトリコルデルマからのアミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、またはセロビオヒドロラーゼ遺伝子である。これらの目的のために最も好ましい高発現遺伝子は、アスペルギルス・ニゲル・グルコアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、またはトリコデルマ・エセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ遺伝子である。グルコアミラーゼプロモータが、使用される最も好ましいプロモータである。これらの高発現遺伝子は、クローニングベクターの取込みのための標的遺伝子座として、および高発現真菌遺伝子の供給源として適切である。
【００６５】
別の好ましい実施形態によれば、ステップａ．は、好ましくは、ＤＮＡ配列のそのゲノムコピー取込みによって、より好ましくは、高発現遺伝子座で、好ましくはグルコアミラーゼ遺伝子座でＤＮＡ配列の取込みを標的することによって、糸状菌細胞へのＤＮＡ配列のコピー数を増大させるステップを含んで成る。
【００６６】
ＤＮＡ配列の発現のアップレギュレーションは、ＤＮＡ配列の少なくとも１つにコピーを糸状菌へ導入することによって、または強いプロモータのために変更し、または良好な動態および／または寿命を有するタンパク質をコードする遺伝子のために変更することによってＤＮＡ配列のコピー数を増大させることによって達成されうる。ＤＮＡ配列はプラスミドに存在し、またはゲノムへ取込みうる。当業者は２つの代替の可能性のうちで選択しうる。すなわち、
−ＨＲ経路に関与する糸状菌の少なくとも１つの内在性ＤＮＡ配列を過剰発現する。この場合、糸状菌はその内在性ＤＮＡ配列のいくつかのコピーを含んで成る。
−ＨＲに関与する少なくとも１つの非相同ＤＮＡを過剰発現する。この場合、糸状菌はＨＲに関与するその内在性ＤＮＡ配列、およびさらにＨＲに関与する非相同ＤＮＡ配列の少なくとも１つのコピーを有することになる。この非相同ＤＮＡ配列はその対応する内在性ＤＮＡ配列の相同体である。
【００６７】
糸状菌は、ＤＮＡ配列の１つもしくはそれ以上のコピーで形質転換されうる（とりわけ、チルブム（Ｔｉｌｂｕｍ）ら、１９８３年、Ｇｅｎｅ、２６：２０５−２２１頁による）。ＤＮＡ配列は、糸状菌のゲノムへ安定して取込まれ、または自発的複製が可能なＤＮＡ分子の一部として細胞へ導入されうる。ＤＮＡ配列は、クローニングベクターに存在することが好ましい。糸状菌宿主細胞を形質転換することが可能なクローニングベクターが本発明における使用に適切である。したがって、本発明において使用するためのクローニングベクターは、糸状菌宿主細胞の染色体において無作為または所定の標的遺伝子座で取込む統合的クローニングベクター、およびＡＭＡ１配列を含んで成るベクターなど自発的に維持されるクローニングベクターを含んで成る。本発明の好ましい実施形態において、統合的クローニングベクターは、糸状菌宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座における、この所定の遺伝子座にクローニングベクターの取込みを標的するためのＤＮＡ断片を含んで成る。標的取込みを促進するために、クローニングベクターは宿主細胞の形質転換前に線状化されることが好ましい。線状化は、クローニングベクターの少なくとも１つであるが、好ましくはいずれかの末端が標的遺伝子座と相同的な配列によってフランキングされるように実行されることが好ましい。標的遺伝子座をフランキングする相同的配列の長さは好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。
【００６８】
好ましくは、標的遺伝子座と相同的であるクローニングベクターにおけるＤＮＡ配列は、高発現遺伝子座由来であり、これは、糸状菌宿主細胞において高い発現レベルが可能である遺伝子由来であることを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高発現遺伝子が、本明細書では、そのｍＲＮＡが、例えば、誘導条件下に全細胞のｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成しうる遺伝子、あるいは、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成し、または、分泌遺伝子産物の場合、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルに分泌されうる遺伝子と定義されている（欧州特許第３５７１２７Ｂ１号明細書に記載）。
【００６９】
過剰発現されるＤＮＡ配列のコピーの数を増加させるには、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載された遺伝子変換の方法が使用されうる。
【００７０】
当業者は、標的のための相同的ＤＮＡ配列およびプロモータ配列が１つのＤＮＡ断片で一致しうることを理解するであろう。上記の高発現遺伝子のリストも標的遺伝子座として適合されている。
【００７１】
自発的に維持されるクローニングベクターの例が、ＡＭＡ１配列を含んで成るクローニングベクターである。ＡＭＡ１は、アスペルギルス・ニドゥランスから単離された６．０ｋｂゲノムＤＮＡ断片であるが、これはアスペルギルスにおける自発的維持が可能である（例えば、アレスケンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）とクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７頁を参照）。
【００７２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、ステップａ．は、選択マーカー遺伝子を含んで成るＤＮＡ構成物で糸状菌を形質転換するステップを含んで成る。クローニングベクターにおける選択マーカー遺伝子は、糸状菌の形質転換に有用である多くのマーカー遺伝子から選択されうる。一例として、これらのマーカーは、ａｍｄＳ遺伝子など優性および双方向選択マーカー遺伝子（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書または国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、またはｐｙｒＧなど栄養要求性マーカー遺伝子、および例えば、フレオマイシン、ハイグロマイシンＢ、またはＧ４１８に対する抵抗を提供する抗生物質抵抗性遺伝子を含むがこれらに限定されない。優性および双方向選択マーカー遺伝子の使用が好ましい。好ましくは、ａｍｄＳ遺伝子が好ましく、より好ましくは、アスペルギルス・ニドゥランスまたはアスペルギルス・ニゲルからのａｍｄＳ遺伝子である。最も好ましい選択マーカー遺伝子が、Ａ．ニドゥランスｇｐｄＡプロモータに融合したＡ．ニドゥランスａｍｄＳコード配列である（ＥＰ６３５５７４号明細書を参照）。他の糸状菌からのａｍｄＳ遺伝子も使用される（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。ａｍｄＳ選択マーカー遺伝子は、それが同じ菌株において数倍で使用され、明確なＤＮＡ配列を導入し、過剰発現し、かつ／または削除しうる利点を有する。欧州特許第６３５５７４号明細書に記載されたフルオロアセトアミド培地での対抗選択を用いて、結果として生じる菌株はマーカーを含まず、さらなる遺伝子修飾のために使用されうる。
【００７３】
あるいは、または上記の方法とともに、ＤＮＡ配列の発現のアップレギュレーションがＵＶまたは化学的変異誘発を使用して達成されうる（マテム，Ｉ．Ｅ．、ファン・ヌルトＪ．Ｍ．、ファン・デン・ベルグ，Ｐ．、アーチャー，Ｄ．Ｂ．、ロバーツ，Ｉ．Ｎ．、およびファン・デン・ホンデル，Ｃ．Ａ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２年８月、２３４（２）：３３２−６頁）。
【００７４】
さらに、かつ／またはＨＲに関与するＤＮＡ配列の発現のアップレギュレーションと組合せて、ＵＶまたは化学的変異誘発によってＨＲに関与するタンパク質の活性を増大させることによってＨＲ効率の増大を得ることも可能である（マテム，Ｉ．Ｅ．、ファン・ヌルト  Ｊ．Ｍ．、ファン・デン・ベルグ，Ｐ．、アーチャー，Ｄ．Ｂ．、ロバーツ，Ｉ．Ｎ．、およびファン・デン・ホンデル，Ｃ．Ａ．、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２年８月、２３４（２）：３３２−６頁）。
【００７５】
当業者は、ＤＮＡ配列の発現のアップレギュレーションを達成するには、記載された方法の各々を別々に、または組合せて使用しうることを理解するであろう。
【００７６】
当業者は、増大したＨＲ／ＮＨＲ比、および／または低下したＮＨＲ効率、および／または高いＨＲ効率を有する糸状菌を得るには、糸状菌における一定の遺伝子の発現をそれぞれダウンおよびアップレギュレートするために記載された各々の方法の少なくとも１つを使用することができる。好ましくは、低下したＮＨＲ効率および高いＨＲ効率を有する組換え糸状菌を得るために糸状菌で実行される方法のすべては、優性および双方向選択マーカー、好ましくはａｍｄＳ遺伝子、より好ましくは、アスペルギルス・ニドゥランスまたはアスペルギルス・ニゲルからのａｍｄＳ遺伝子を使用して実行されている。
【００７７】
得られた糸状菌はその後、前述されているように、例えばノーザンおよび／またはウェスタンブロット法および／またはアレイおよび／または表現型スクリーニングを使用することによって前記ＤＮＡ配列の発現レベルをモニタリングすることによって選択されうる。場合により、細胞のＮＨＲおよび／またはＨＲ経路の効率がモニタリングされる。糸状菌のこれらの経路の効率は以前に規定されているようにモニタリングされうる。
【００７８】
好ましくは、ＨＲ経路にもたらされる修飾は誘導性のものである。これは誘導性調節領域によってＨＲに関与する成分をコードする遺伝子の内在性調節領域を置換することによって、好ましくは誘導性プロモータを使用することによって達成されうる。誘導性プロモータの例は、アスペルギルス・ニゲルのグルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼプロモータ、ｐａｆプロモータ（マルクス（Ｍａｒｘ），Ｆ．、ハース（Ｈａａｓ），Ｈ．、ラインドル（Ｒｅｉｎｄｌ），Ｍ．、ストッフラー（Ｓｔｏｆｆｌｅｒ），Ｇ．、ロットスパイヒ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ），Ｆ．、およびレドル（Ｒｅｄｌ），Ｂ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ｐａｆ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ａｂｕｎｄａｎｔｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｇｅｎｅ  １６７（１−２頁）、１６７−  １７１頁  （１９９５年）、またはペニシリウム・クリソゲヌムのｐｃｂＣプロモータ（マルチン  ＪＦ、カスケイロ  Ｊ、コサルコワ  Ｋ、マルコス  ＡＴ、グチレス  Ｓ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．  １９９９年１−２月、７５（１−２頁）：２１−３１、総説）、またはＮＨＲに関与する遺伝子の発現のダウンレギュレーションについて以前に引用されたスイッチオン／オフシステムである。
【００７９】
好ましい実施形態によれば、修飾されるＨＲ経路に関与する遺伝子は、以下の遺伝子またはその相同体、すなわち、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２である。
【００８０】
ＨＲの過程においてその機能を実行することがより可能または少なくとも相当により可能である、ＨＲに関与する少なくとも１つの成分を有する変異体のすべての種類が、本発明によって意図される変異体である。好ましくは、ＨＲに関与する成分の活性は修飾されており、ＨＲ経路の効率は、以前に規定されたアッセイにおいて測定されるように、同じ条件下にそれが由来する親細胞における効率の１１０％超、より好ましくは２００％超、最も好ましくは５００％超である。好ましい実施形態によれば、親生物は宿主細胞の部で定義される糸状菌の１つである。本発明による方法は、広範囲であるが限定的に上述されているように、さまざまな用途において使用されうる。一部の特定の用途が以下に記載されている。
【００８１】
宿主細胞
したがって、本発明はさらに糸状菌それ自体に関するが、これは好ましくは、前記糸状菌細胞のゲノムへの所定の部位に対するポリヌクレオチドの標的取込みの効率を増大させるための本発明の方法において使用され、前記糸状菌はＮＨＲ選好を有し、かつ前記ポリヌクレオチドは前記所定の部位と相同の領域を有するとともに、前記方法は取込み経路をＨＲへ導くステップを含んで成る。この方法において使用されうる糸状菌の特徴は以前に規定されている。
【００８２】
本発明の方法において好ましく使用される糸状菌は親細胞に由来する変異体であり、ＮＨＲ／ＨＲの比が減少しており、かつ／またはＮＨＲ経路の効率が低下されており、かつ／またはＨＲ経路の効率が同じ条件下に前記親生物における前記比および前記効率と比べ前記変異体細胞において高められている。ＮＨＲ／ＨＲの比および／またはＮＨＲ経路の効率および／またはＨＲ経路の効率を測定するために使用されるアッセイは以前に記載されている。
【００８３】
本発明の宿主細胞が糸状菌であるが、これはクローニングベクターで形質転換されることが可能である。したがって、試験される大部分の糸状菌では、それらはアスペルギルスのために開発された形質転換プロトコールを使用して形質転換されうることがわかった（とりわけ、チルブムら、１９８３年、Ｇｅｎｅ、２６：２０５−２２１頁による）。当業者は、糸状菌宿主種の有効な形質転換が、本明細書で具体的に例示されたベクター、選択マーカー系、プロモータ、および形質転換プロトコールの使用に限定されていない。
【００８４】
糸状菌は本明細書では、糸状形態における分類Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａの真核微生物と定義されており、すなわち、その栄養成長は菌糸伸長によって起こる。好ましい糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ペニシリウム属、およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属からなる群から選択される。
【００８５】
本発明のより好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ニドゥランス、Ａ．オリゼ、Ａ．ソーヤ（ｓｏｊａｅ）、Ａ．ニゲル群のアスペルギルス、トリコデルマ・エセイ、およびペニシリウム種からなる群から選択される。好ましくは、ペニシリウムはペニシリウム・クリソゲヌムまたはペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）種である。
【００８６】
Ａ．ニゲル群は本明細書ではレイパー（Ｒａｐｅｒ）とフェネル（Ｆｅｎｎｅｌｌ）（１９６５年、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，２９３−３４４頁）に従って定義され、かつこれらの著者らによって含まれるすべての（黒色）アスペルギルスを含んで成る。最も好ましい糸状菌宿主細胞は、Ａ．ニゲル群、Ａ．オリゼのアスペルギルス、トリコデルマ・エセイ、およびペニシリウム・クリソゲヌムから成る群から選択される。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、親生物は寄託された糸状菌細胞アスペルギルス・ニゲルＣＢＳ５１３．８８、アスペルギルス・オリゼＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、ペニシリウム・クリソゲヌムＣＢＳ４５５．９５、またはペニシリウム・シトリヌムＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲヌムＰ２、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・エセイＡＴＣＣ２６９２１またはＡＴＣＣ５６７６５またはＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ルキノウェンゼ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６、クラビセプス・パスパリ（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐａｓｐａｌｉ）ＣＢＳ１１０．２２、クラビセプス・プルプラ（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＣＢＳ１６４．５９、ペニシリウム・ブリビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）ＡＴＣＣ  ９０５６、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０５４２、アスペルギルス・ニドゥランスＡＴＣＣ２８９０１およびまたはそれらの誘導体である。
【００８８】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の糸状菌細胞は、以下のアッセイによって測定されるように、少なくとも２００、少なくとも５０、少なくとも１０であるＮＨＲ／ＨＲ比を有する。好ましくは、糸状菌細胞の比は少なくとも１、より好ましくは少なくとも０．５、さらにより好ましくは少なくとも０．１、さらにより好ましくは少なくとも０．０５、さらにより好ましくは少なくとも０．０１さらにより好ましくは少なくとも０．００５さらにより好ましくは少なくとも０．００１さらにより好ましくは少なくとも０．０００５さらにより好ましくは少なくとも０．０００１、かつ最も好ましくは少なくとも０．００００１である。
【００８９】
より好ましい実施形態によれば、本発明の糸状菌細胞は、以下のアッセイによって測定されるように２００未満、さらにより好ましくは５０未満、１０未満であるＮＨＲ／ＨＲ比を有する。さらにより好ましくは、糸状菌細胞の比は１未満、さらにより好ましくは０．５未満、さらにより好ましくは０．１未満、さらにより好ましくは０．０５未満、さらにより好ましくは０．０１未満、さらにより好ましくは０．００５未満、さらにより好ましくは０．００１未満、さらにより好ましくは０．０００５未満、さらにより好ましくは０．０００１未満、かつ最も好ましくは０．００００１未満である。
【００９０】
ＮＨＲ／ＨＲの比は好ましくは国際公開第０２／０５２０２６号パンフレット（表２、２３頁）に記載されたアッセイによって測定される。
【００９１】
好ましくは、糸状菌細胞は、ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子を欠き、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の減少したレベルを有する。
【００９２】
さらにより好ましくは、糸状菌細胞は以下の遺伝子の少なくとも１つを欠いている。すなわち、ｈｄｆＡまたは配列番号２または１９で識別されるその相同体、ｈｄｆＢまたは配列番号５、もしくは２２または両方で識別されるその相同体、かつ／または、好ましくは、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの減少した量を有する。
【００９３】
最も好ましくは、糸状菌細胞は誘導性に以下の遺伝子の少なくとも１つを欠いている。すなわち、ｈｄｆＡまたは配列番号２または１９で識別されるその相同体、ｈｄｆＢまたは配列番号５、もしくは２２または両方で識別されるその相同体、かつ／または、好ましくは誘導性に、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの減少した量を有する。
【００９４】
別の好ましい実施形態によれば、糸状菌細胞は、そのゲノムにおいて、ＮＨＲに関与する遺伝子が非機能的遺伝子によって、もしくは選択マーカーによって、または別の遺伝子によって置換されているようになっている。
【００９５】
別の好ましい実施形態によれば、変異体はＨＲに関与する成分の増大したレベルを有する。
【００９６】
本発明による糸状菌は、分子生物学法によって得られている。かかる遺伝子組換え法によって得られる糸状菌は組換え糸状菌と定義される。しかし本発明に即した組換え糸状菌は、早期に変異誘発法にかけられ、別の望ましい効果を達成しうる。最も好ましい実施形態によれば、得られる糸状菌は組換え糸状菌である。
【００９７】
本発明の宿主細胞の使用
好ましい実施形態によれば、少なくとも、例えば、形質転換またはエレクトロポレーションの方法、および前記ポリヌクレオチドの前記細胞の遺伝物質への取込みによって、目的とするポリヌクレオチドを本発明の糸状菌へ導入するステップを含んで成る方法が提供される。取込みは複合方法であり、核酸配列が宿主細胞の遺伝物質の一部となる。核酸取込みの方法における１つのステップは組換えであり、組換えによって、核酸配列が交換または挿入され、導入された核酸は宿主細胞の遺伝物質の一部となる。原則として、２種類の組換え法が可能である。すなわち、相同的および非正統的すなわちＮＨＲである。大部分の（高等）真核生物はＨＲを実行することはなく、または少なくとも顕著に実行することはないが、かかる方法を達成する必須タンパク質は利用可能である。この現象の１つの理由は、（高等）真核生物における相同的組換えの頻繁な使用が、繰返し核酸配列の存在により望ましくない染色体再配置をもたらしうることである。本発明による方法によってＨＲを達成するには、所定の部位との相同性を有するポリヌクレオチドを提供することが重要である。相同の割合および相同的領域の長さが相同的組換えにおいて重要な役割を果たすことは当業者に明らかである。相同の割合はほぼ１００％であることが好ましい。当業者であれば、低い割合の相同も相同的組換えの分野で使用されるが、例えば、相同の領域、およびその全体的な分布に依存し、ＨＲの低い効率をもたらしうるが、依然として有用であり、したがって本発明に含まれることを認識している。さらに、（ほぼ）相同的領域の長さは約３ｋｂであり、これは相同的組換えを導くのに十分である。少なくとも１つの相同的領域が組換えには必要であるが、より好ましくは、目的とする核酸をフランキングする２つの相同的領域が標的取込みのために使用される。当業者は、相同の適切な割合、相同の長さ、および相同的領域の量を選択するやり方を知っている。かかる相同を提供することによって、核酸が宿主細胞の遺伝物質内のすべての所望の位置で取込まれる。本明細書で開示された本発明が、相同の長さおよび相同の割合がＨＲを提供／可能にするのに十分に高い限り、すべての核酸（好ましくはＤＮＡ）を所定の部位に導くために使用されることは当業者には明らかである。
【００９８】
本発明がなされる前は、ポリヌクレオチドがつねに容易にすべての所望の位置で一定の糸状菌のゲノムへ取込まれたわけではない。本発明による方法は、例えば、さまざまな方法で遺伝子機能に影響を及ぼすために、完全な不活性化のためだけではなく、発現レベルまたは発現の調節における変化、タンパク質活性またはコードされたタンパク質の細胞内標的の変化を介在するためにも適用される。完全な不活性化は、通常、アンチセンス技術またはＲＮＡｉ技術（ズレナー（Ｚｒｅｎｎｅｒ）Ｒ、ウィルミッツァー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ）Ｌ、ソネワルド（Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ）Ｕ、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  Ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ．Ｐｌａｎｔａ．（１９９３年）、１９０（２）：２４７−５２頁）など既存の方法によって達成されえないが、例えば、代謝経路の望ましくない側枝をコントロールし、例えば、（ベータ・ラクタム）抗生物質またはカルチノイドなど特定の二次代謝産物の産生を増大させる遺伝子の不活性化に有用である。完全な不活性化は、毒性または望ましくない化合物の産生を削減させるためにも有用である（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｉｎ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ；Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ＫＤら、Ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６３年）３３：３７５−８３頁）。完全な不活性化は、発酵過程および下流処理が改善されるような方法で生物の形態を変化させるのにも有用である。
【００９９】
本発明は、代わりの調節配列によって既存の調節配列を置換し、内在性遺伝子の発現（例えば、特定の誘導剤に反応した発現）を変化させることを可能にする。
【０１００】
本発明の一態様は、本発明の方法による活性遺伝子の不活性遺伝子による置換に関する。完全な不活性化は、通常、アンチセンス技術またはＲＮＡｉ技術など既存の方法によって達成されえないが、例えば、代謝経路の望ましくない側枝をコントロールし、例えば、でんぷんなどバルク製品の品質を増大し、または特定の二次代謝産物の産生を増大させ、または望ましくない代謝産物の形成を阻害するために有用である。
【０１０１】
本発明の別の態様は、糸状菌細胞の広範囲の代謝再プログラミングまたはエンジニアリングに関する。完全に新しい経路の導入および／または望ましくない経路の修飾は、タンパク質または代謝産物など特定の化合物の生産に具体的に適合される細胞の取得をもたらす。
【０１０２】
本発明の別の態様は、不活性または変化した遺伝子の活性遺伝子による置換に関する。例えば、伝統的な変異誘発の有効な期間後、選択された糸状菌株が無作為変異誘発法の間に変化し、さらに不活性化した一部の内在性遺伝子を有する場合が多い。
【０１０３】
本発明のさらに別の態様では、抗生物質の糸状菌細胞に対する抵抗を与える物資を導入する方法が提供される。さらに本発明の別の態様では、所望の特性を糸状菌細胞に与える方法が提供される。好ましい実施形態では、遺伝子送達賦形剤が使用され、所望のポリヌクレオチドを所定の部位に送達する。遺伝子送達賦形剤は当技術分野で周知であり、説明で以前に記載されている。
【０１０４】
本発明の別の態様による別の好ましい方法も、例えば、所望の新規生成物のためのもので所望の発現プロフィールを与える遺伝子の既存のコード配列を置換することによって、新規生成物をコードする導入遺伝子の予測可能な発現を達成する。より好ましい実施形態によれば、本発明によって提供される糸状菌はさらに、産生される所望のタンパク質の所望の遺伝子コードを含んで成るＤＮＡ構成物を含んで成る。
【０１０５】
好ましくは、産生される所望のタンパク質をコードする所望の遺伝子は発現ベクターへ挿入され、これはその後に得られた宿主細胞を形質転換するために使用される。発現ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、プロモータなどの適切な発現シグナル、場合によりシグナル配列および末端に操作連結されうるが、これらは宿主生物におけるタンパク質の発現および合成を導くことが可能である。
【０１０６】
より好ましくは、所望の遺伝子はプロモータおよび分泌シグナルに操作連結される。所望の遺伝子を発現させるために使用されうる方法は、ＤＮＡ配列の発現のアップレギュレーションの部で記載されたものと同じであり、その発現産物はＨＲ、すなわち、コピー数の増大、標的取込み、高発現遺伝子のプロモータの使用、選択マーカー遺伝子およびそれらの組合せの選択に関与する。
【０１０７】
所望のタンパク質は好ましくは酵素である。タンパク質が自然に分泌されない場合は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが当技術分野で周知の方法に従ってシグナル配列を有するように修飾されうる。分泌されるタンパク質は、自然に発現される内在性タンパク質でありうるが、非相同でもありうる。非相同は、タンパク質によってコードされる遺伝子が野生型糸状菌における自然条件下に産生されないことを意味する。本発明の糸状菌によって産生されうる酵素の例は、カルボヒドラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドラーゼまたはβ−グルコシダーゼなどのセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはキシラナーゼ、キシロシダーゼ、マナナース、ガラクタナース、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼなどのペクチン分解酵素、またはアミノ分解酵素、フィターゼなどのホスファターゼ、リパーゼなどのエステラーゼ、タンパク質分解酵素、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼなどの酸化還元酵素である。より好ましくは、所望の遺伝子はフィターゼをコードする。
【０１０８】
別の例として、既存のコード配列が修飾され、コードされたタンパク質は、例えば、改善された熱的特性および／または改善された動態特性（Ｋｍ、Ｋｃａｔ）、および／または改善された酵素安定性、および／または基質範囲の延長、および／または寿命の増大等を有するタンパク質を作る最適特徴を有するようになる。
【０１０９】
本発明はさらに目的とするポリペプチドを製造するための本発明の糸状菌の使用に関する。あるいは、得られた糸状菌は二次代謝産物を製造するために使用されうる。好ましい二次代謝産物は、カルチノイド化合物、ベータ−ラクタム化合物、薬剤、抗腫瘍化合物等である。
【０１１０】
好ましくは、本発明で得られた糸状菌は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を促す条件下に形質転換された宿主細胞を培養し、かつ例えば以下の文献に記載された所望のタンパク質を回収することによって所望のタンパク質を製造するために使用される。すなわち、
−リー（Ｌｉ），Ｚ．Ｊ．、シュクラ（Ｓｈｕｋｌａ），Ｖ．、フォルダイス（Ｆｏｒｄｙｃｅ），Ａ．Ｐ．、ペデルセン（ペデルセン），Ａ．Ｇ．、ウェグナー（Ｗｅｇｎｅｒ），Ｋ．Ｓ．、マルテン（Ｍａｒｔｅｎ），Ｍ．Ｒ．、Ｆｕｎｇａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ａ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｃａｌｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０００年１１月５日、７０（３）：３００−１２頁
−ウィザース（Ｗｉｔｈｅｒｓ），Ｊ．Ｍ．、スウィフト（Ｓｗｉｆｔ），Ｒ．Ｊ．、ウィーベ（Ｗｉｅｂｅ），Ｍ．Ｇ．、ロブソン（Ｒｏｂｓｏｎ），Ｇ．Ｄ．、プント（Ｐｕｎｔ），Ｐ．Ｊ．、ファン・デン・ホンデル，Ｃ．Ａ．、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｓｔａｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８年８月２０日、５９（４）：４０７−１８頁。
−アマルラー（Ａｍａｎｕｌｌａｈ），Ａ．、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ），Ｌ．Ｈ．、ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ），Ｋ．、ニーナウ（Ｎｉｅｎｏｗ），Ａ．Ｗ．、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｒ．Ｃ．、Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００２年３月３０日、７７（７）：８１５−２６頁。
【０１１１】
ＤＮＡ配列およびこれらのＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチド
本発明の別の態様によれば、以下の単離ｃＤＮＡ配列が提供される。すなわち、
配列番号２  Ａ．ニゲルからのｈｄｆＡ
配列番号１９  ペニシリウム・クリソゲヌムからのｈｄｆＡ
配列番号５  Ａ．ニゲルからのｈｄｆＢ
配列番号２２  ペニシリウム・クリソゲヌムからのｈｄｆＢ
およびそれらの相同体。
【０１１２】
配列番号１、１８、４、および２１の各々は、それぞれ、上記の各々のｃＤＮＡ配列と関係があるゲノムＤＮＡ配列に対応する。
【０１１３】
配列番号３、２０、６、および２３の各々は、それぞれ、上記のそれぞれのｃＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質配列に対応する。
【０１１４】
本明細書で提供される配列情報は、誤って識別された塩基の包含を必要とするために狭義に考えるべきではない。本明細書で開示された特定の配列は、特にＡ．ニゲルまたはペニシリウム・クリソゲノムにおける糸状菌から完全な遺伝子を単離するために容易に使用されうるが、次いでさらに配列分析に容易にかけられ、それによって配列決定の誤りを識別することができる。
【０１１５】
別段の指示がない限り、本明細書でのＤＮＡ分子の配列決定によって決定される全ヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサを使用して決定され、かつ本明細書で決定されるＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドの全アミノ酸配列は上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。したがって、この自動化法によって決定されるＤＮＡ配列について当技術分野で周知であるように、本明細書で決定されたヌクレオチド配列はいつくかの誤りを含有する。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は一般的に、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、より一般的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当技術分野で周知の手動のＤＮＡ配列決定法を含む他の方法によってより正確に決定されうる。やはり当技術分野で周知であるように、実際の配列と比べ決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または削除が、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトをもたらし、決定されたヌクレオチド配列によってコードされた予測アミノ酸配列が、かかる挿入または削除の点で開始する、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされたアミノ酸配列と完全に異なるようになる。
【０１１６】
当業者は、かかる誤って識別された塩基を識別することが可能であり、かかる誤りを正すやり方を知っている。
【０１１７】
「相同」は以下に定義されている。相同的はアスペルギルス・ニゲルまたはペニシリウム・クリソゲノム以外の他の糸状菌由来を意味すると理解されうる。
【０１１８】
他の生物からの全長ＤＮＡは、他の生物、例えば、糸状菌、具体的には、それらをスクリーニングすることによってアスペルギルス種またはペニシリウム種から構成されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーを使用して得られうる。
【０１１９】
本発明は、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢのパラログをも包含する。本発明に照らして、パラログは、配列番号１または配列番号４または配列番号１８または配列番号２１と相同的、かつそれぞれ、Ａ．ニゲルまたはペニシリウム・クリソゲノム由来のＤＮＡ配列を意味する。
【０１２０】
例えば、アスペルギルスまたはペニシリウム菌株は、ノーザンブロット分析によって相同的ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢポリヌクレオチドについてスクリーニングされうる。本発明によるポリヌクレオチドと相同的な転写産物の検出と同時に、ｃＤＮＡライブラリーが、当業者に公知の標準の方法を利用することにより、適切な菌株から単離されるＲＮＡで構成されうる。あるいは、全ゲノムＤＮＡライブラリーが、本発明によるｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢにハイブリダイズ可能なプローブを使用することによりスクリーニングされうる。
【０１２１】
相同的遺伝子配列は、例えば、本明細書で教示されたヌクレオチド配列に基づき設計された２つの退化オリゴヌクレオチドプライマープールを使用するＰＣＲを実行することによって単離されうる。
【０１２２】
反応のためのテンプレートは、本発明によるポリヌクレオチドを発現することが知られ、またはそう思われる菌株から調製されるｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡでありうる。ＰＣＲ産物はサブクローン化されて配列決定され、増幅配列が新しいｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ核酸配列、またはそれらの機能的等価物の配列を示すことを確実にしうる。
【０１２３】
次いで、ＰＣＲ断片を使用し、さまざまな既知の方法によって行われる完全長ｃＤＮＡを単離することができる。例えば、増幅断片は標識され、バクテリオファージまたはコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。あるいは、標識断片を使用してゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１２４】
ＰＣＲ技術をも使用し、他の生物から完全長ｃＤＮＡ配列を単離することができる。例えば、ＲＮＡは、標準の方法に従い、適切な細胞または組織源から単離されうる。逆転写反応は、最初のストランド合成のプライミングのために増幅断片の大部分の５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡで実行されうる。
【０１２５】
次いで、結果として生じるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準の末端トランスフェラーゼ反応を使用して（例えば、グアニンで）「末端付加」されうるが、このハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化されうるとともに、次いで第２のストランド合成が（例えば、ポリＣプライマーで）プライミングされうる。したがって、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列は容易に単離されうる。有用なクローニング法の検討では、例えば、サンブルックら、上記参照、およびオーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、下記参照を参照。
【０１２６】
「相同」は機能的等価物を意味するとも理解されうる。
【０１２７】
「機能的等価物」および「機能的変異形」という語は本明細書で同義で使用される。ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ  ＤＮＡの機能的等価物は、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢの特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ断片である。本発明によるｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢポリペプチドの機能的等価物は、ＮＨＲ複合体の一部として少なくとも１つの機能を示すポリペプチドである。したがって、機能的等価物も生体活性断片をも包含する。
【０１２８】
機能的タンパク質またはポリペプチド等価物は、配列番号３または６または２０または２３または非必須アミノ酸の置換、挿入、または削除を有する配列の１つもしくはそれ以上のアミノ酸の保存的置換のみを含有しうる。したがって、非必須アミノ酸は、生体機能を実質的に変化せずにこれらの配列の１つにおいて変化されうる残基である。例えば、本発明のｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質の中で保存されるアミノ酸残基は、特に変化の影響を受けにくいことが予測される。さらに、本発明のｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質の中で保存されるアミノ酸は、変化の影響を受ける可能性が低い。
【０１２９】
「保存的置換」という語は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換を意味することが意図されている。これらのファミリーは当技術分野で周知であり、塩基側鎖（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含むアミノ酸を含む。
【０１３０】
機能的核酸等価物は一般的に、サイレント突然変異、すなわちコードされたポリペプチドの生体機能を変化させることがない突然変異を含有しうる。したがって、本発明は、特定の生物活性に重要ではないアミノ酸残基における変化を含有するｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質をコードする核酸分子を提供する。かかるｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質はアミノ酸配列において配列番号３または６、または２０または２３と異なり、さらにその生物活性の少なくとも１つを保持する。一実施形態において、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るが、そのタンパク質は、配列番号３または６または２０または２３で示されたアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上相同の実質的に相同のアミノ酸配列を含んで成る。例えば、表現型的にサイレントアミノ酸置換するやり方に関する手引きは、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ），Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０頁（１９９０年）に示されており、ここで著者らは、変化に対するアミノ酸配列の耐性を研究する２つの主要な方法があることを示している。最初の方法は進化の方法に依拠し、ここで突然変異は自然な選択によって受入れられ、または拒絶される。第２の方法では、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸の変化を導入する遺伝子操作、および選択、すなわちスクリーニングが使用され、機能性を維持する配列を特定する。著者らが述べているように、これらの研究では、タンパク質が意外にもアミノ酸置換に耐えることが示された。著者らはさらにどの変化がタンパク質の特定の位置で許容的である可能性が高いかを示している。例えば、大部分の埋もれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖のほとんどの特徴は、ほとんどの場合、保存されていない。かかる表現型的にサイレントの他の置換がボウイ（Ｂｏｗｉｅ）らおよびそれに引用された文献に記載されている。
【０１３１】
配列番号３または６または２０または２３によるタンパク質と相同的なｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質をコードする単離核酸分子が、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換、削除、または挿入がコードされたタンパク質へ導入されるように、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または削除を配列番号２または配列番号５、または配列番号１９または配列番号２２によるコードヌクレオチド配列へ導入しすることによって生成されうる。かかる突然変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発など標準の方法によって導入されうる。
【０１３２】
「機能的等価物」という用語は、Ａ．ニゲルのｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質のオルソログをも包含する。Ａ．ニゲルのｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質のオルソログは、他の菌株または種から単離されうるとともに、同様または同一の生物活性を有するタンパク質である。かかるオルソログは、配列番号３または６または２０または２３と実質的に相同的であるアミノ酸配列を含んで成るとして容易に識別されうる。
【０１３３】
「相同」は「実質的に相同」の意味としても理解されうる。
【０１３４】
「実質的に相同」という用語は、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列と十分または最小の数の同一または等価の（例えば、同様の側鎖を有する）アミノ酸またはヌクレオチドを含有する第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指し、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列は共通のドメインを有するようになっている。例えば、約４５％、好ましくは約５０％、好ましくは約６０％、好ましくは約６５％、より好ましくは約７０％、さらにより好ましくは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％もしくはそれ以上の同一性を有する共通のドメイン含有するアミノ酸またはヌクレオチド配列が、十分に同一と本明細書で規定されている。
【０１３５】
また、配列番号２または５または１９または２２と異なるヌクレオチド配列を有する他のｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢファミリーメンバーをコードする核酸も本発明の範囲内である。さらに、異なる種からのｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質をコードする核酸は、したがって配列番号２または５または１９または２２と異なるヌクレオチド配列を有する。
【０１３６】
本発明のｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢＤＮＡの変異形（例えば、天然対立遺伝子多型）および相同体に対応する核酸分子が、好ましくはきわめて厳格なハイブリダイゼーション条件下に標準のハイブリダイゼーション法によるハイブリダイゼーションプローブとして本明細書で開示されたｃＤＮＡまたはその適切な断片を使用する本明細書で開示されたｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ核酸とのその相同に基づき単離されうる。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション反応の「厳格性」は、当業者によって容易に決定可能であり、ほとんどの場合、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算である。一般に、長いプローブは適切なアニーリングのために高い温度を必要とするが、短いプローブは低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションはほとんどの場合、相補鎖がその融解温度未満の環境で存在する場合に再アニーリングする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同の程度が高いほど、使用されうる相対温度は高くなる。結果として、高い相対温度は、反応条件をより厳格にする傾向があるが、低い温度は厳格でなくなることになる。
【０１３８】
ハイブリダイゼーション反応の厳格性の追加の詳細および説明については、オーズベルら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ワイリー・インターサイエンス・パブリッシャーズ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（１９９５年）を参照されたい。
【０１３９】
本明細書で規定される「厳格な条件」または「高厳格性条件」は、以下によって識別されうる。すなわち、（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃下に使用し、（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｄｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウムとともにｐＨ６．５で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃下に使用し、または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０Ｒｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃下に使用するとともに、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃下および５５℃下での５０％ホルムアミド中での洗浄後、５５℃下にＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣから成る高厳格性洗浄を行う。
【０１４０】
「中程度に厳格な条件」は、サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１９８９年によって記載されているように識別されうるとともに、洗浄液および上記の厳格性の低いハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度に厳格な条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液中３７℃での一夜インキュベーション後、ろ過液の１×ＳＳＣ中約３７〜５０℃下での洗浄である。当業者は、温度、イオン強度等を調節するやり方を、必要に応じて、プローブの長さなどの要因を適合させ、または配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムを使用することによって認識するであろう。
【０１４１】
相同的（同様または同一）配列は、「配列比較アルゴリズム」を使用することによっても決定されうる。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）とウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１年）の局所相同アルゴリズムによって、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）とブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０年）の相同アラインメントアルゴリズムによって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）とリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国（ＵＳＡ）８５：２４４４頁（１９８８年）の類似性法の調査によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））によって、または目視検査によって実行されうる。配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの例がＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）に記載されている。
【０１４２】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって公開されている。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは最初に、データベース配列における同じ長さの単語と整列すると一部の正に評価された閾値スコアＴに一致またはこれを満たすクエリー配列における長さＷの短い単語を識別することによる高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）の識別を含む。これら最初の近傍単語のヒットは、それらを含有する長いＨＳＰを見出す出発点として作用する。単語のヒットは、累積的アラインメントスコアが増大しうる限り比較される２つの配列の各々に沿った両方の方向で拡大する。単語のヒットの拡張は、累積的アラインメントスコアが最大達成値から数量Ｘだけ減少すると停止し、累積的スコアはゼロもしくはそれ未満になり、またはどちらか一方の配列の末端に達する。
【０１４３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムでは初期設定として１１の語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）とヘニコフ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国（ＵＳＡ）８９：１０９１５頁（１９８９年）を参照）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較が使用される。
【０１４４】
次いで、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する（例えば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）とアルトシュール、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国（ＵＳＡ）９０：５８７３−５７８７頁（１９９３年）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これはそれによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の適合が偶然に起こりうる確率の指標を提供する。例えば、アミノ酸配列がプロテアーゼなどのタンパク質と同様とみなされるのは、プロテアーゼアミノ酸配列などのタンパク質との試験アミノ酸配列の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、かつ最も好ましくは約０．００１未満である場合である。好ましくは、類似性は、配列番号２、５、１９、および２２を有するＤＮＡ配列の１つと少なくとも４０％相同である。より好ましくは、類似性は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％である。
【０１４５】
ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ配列の自然発生的対立遺伝子多型に加えて、当業者は、突然変異によって配列番号２またｈ５または１９または２２のヌクレオチド配列へ変化が導入され、それによってｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質の機能を実質的に変化させることなく、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらしうることを認識するであろう。
【０１４６】
本発明の別の態様において、劣化ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質が提供される。劣化ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質は、少なくとも１つの生物活性が減少しているタンパク質である。かかるタンパク質は、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢコード配列の全部または一部に沿って、飽和変異誘発によるなど、突然変異を無作為に導入することによって得られうるが、結果として生じる変異体は組換え発現され、生物活性についてスクリーニングされる。例えば、当業界は、その酵素活性を測定するための標準のアッセイを提供しており、したがって劣化タンパク質が容易に選択されうる。好ましくは、アッセイは以前に記載されているものである（例えば、国際公開第０２／０５２０２６号パンフレット、２３頁、または表現型スクリーニングアッセイを参照）。
【０１４７】
好ましい実施形態では、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質は、配列番号３または６または２０または２３によるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢポリペプチドは、配列番号３または６または２０または２３によるアミノ酸配列と実質的に相同的であり、かつ配列番号３または６または２０または２３によるポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持するが、自然の変動もしくは上述の変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。
【０１４８】
別の好ましい実施形態によれば、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質は、好ましくはきわめて厳格なハイブリダイゼーション条件下、配列番号２または５または１９または２２による核酸にハイブリダイズが可能な単離核酸断片によってコードされたアミノ酸配列を有する。
【０１４９】
したがって、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質は、配列番号３または６または２０または２３で示されたアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上相同のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質であり、配列番号３または６または２０または２３によるポリペプチドの少なくとも１つの機能的活性を保持する。
【０１５０】
本発明によるタンパク質の機能的等価物は、例えば、一定の活性の本発明のタンパク質の変異体、例えば、切断変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによっても識別されうる。一実施形態では、変異形の変化に富んだライブラリーが核酸レベルでコンビナトリアル変異誘発によって生成される。変異形の変化に富んだライブラリーが、例えば、退化セットの潜在的タンパク質配列が個別のポリペプチドとして、あるいは、一連の大きな融合タンパク質として（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列へ酵素的にライゲートすることによって生成されうる。退化オリゴヌクレオチド配列からの本発明のポリペプチドの潜在的な変異形のライブラリーを生成するために使用されうるさまざまな方法がある。退化オリゴヌクレオチドを合成するための方法が当技術分野で周知である（例えば、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３頁、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３頁、イタクラら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６頁、イケ（Ｉｋｅ）ら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７頁）を参照）。
【０１５１】
また、本発明のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを使用し、変異形のその後の選択をスクリーニングするためのポリペプチドの変化に富んだ集団を生成することができる。例えば、コード配列断片のライブラリーが、目的とするコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を切断が分子当たり約１回のみ生じる条件下にヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生させて異なる切断生成物からのセンス／アンチセンスペアを含みうる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理によって再形成二本鎖から一本鎖部分を除去し、結果として生じる断片ライブラリーを発現ベクターへライゲートすることによって生成されうる。この方法によって、目的とするタンパク質のさまざまなサイズのＮ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーが得られうる。
【０１５２】
切断の点突然変異によって製造されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、かつ選択された特性を有する遺伝子産物のＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの方法が当技術分野で周知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループット分析に適している最も広く使用される方法は一般的に遺伝子ライブラリーを確実な発現ベクターへクローニングし、適切な細胞を結果として生じるベクターのライブラリーで形質転換し、かつ所望の活性の検出がその生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下にコンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを含む。ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を増強する技術である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）は、本発明のタンパク質の変異形を識別するスクリーニングアッセイと組合せて使用されうる（アーキン（Ａｒｋｉｎ）と（ユアバン（Ｙｏｕｒｖａｎ）（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  米国（ＵＳＡ）８９：７８１１−７８１５頁、デルグレーブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１頁）。
【０１５３】
配列番号２および５および１９および２２で示されたｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ遺伝子配列に加えて、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質のアミノ酸の変化をもたらしうるＤＮＡ配列多型が、一定の集団内に存在しうることを当業者には明らかであろう。かかる遺伝子多型は、自然な対立遺伝子の変動により異なる集団からの、または集団内の細胞に存在しうる。対立遺伝子変異形も機能的等価物を含みうる。
【０１５４】
本発明によるポリヌクレオチドの断片は、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドをも含んで成る。かかるポリヌクレオチドはＰＣＲ反応のプローブまたはプライマーとして機能しうる。
【０１５５】
それらが機能的または非機能的ポリペプチドをコードするかどうかに関係なく本発明による核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用されうる。ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ活性を有するポリペプチドをコードすることがない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、（１）ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢタンパク質をコードする遺伝子、またその対立遺伝子変異形をｃＤＮＡライブラリーから、例えば、Ａ．ニゲルまたはペニシリウム・クリソゲヌム以外の他の生物から単離、（２）フェルマ（Ｖｅｒｍａ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ペルガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８８年）に記載されているｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ遺伝子の正確な染色体位置を提供する中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、（３）特定の組織および／または細胞におけるｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ  ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析、および４）一定の生体（例えば、組織）試料におけるｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢプローブにハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析する診断ツールとして使用されうるプローブおよびプライマーがある。
【０１５６】
ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ遺伝子またはｃＤＮＡの機能的等価物を得る方法も本発明によって包含される。かかる方法は、配列番号２または５または１９または２２による配列またはその変異形の全部または一部をコードする単離核酸を含む標識プローブを得るステップ、ライブラリーにおける核酸断片に対するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下に標識プローブで核酸断片ライブラリーをスクリーニングするステップ、それによって核酸二本鎖を形成するステップ、および任意の標識二本鎖における核酸断片から完全長遺伝子配列を調製し、ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ遺伝子に関係がある遺伝子を得るステップを必要とする。
【０１５７】
１つの実施形態において、本発明のｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ核酸は、配列番号１、または２、または４、または５、または１８、または１９、または２１、または２２に示されている核酸配列と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上相同である。
【０１５８】
別の好ましい実施形態において本発明のｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢポリペプチドは、配列番号３または６または２０または２３に示されたアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上相同である。
【０１５９】
本発明は、配列番号１、または２、または４、または５、または１８、または１９、または２１、または２２それ自体を有するＤＮＡ配列、および上記のその相同体に関する。これらのＤＮＡ配列に関し、かつ遺伝子コードの退化によって得られるＤＮＡ配列も本発明の一部である。ＤＮＡ配列番号２、５、１９、および２２に関し、かつハイブリダイゼーション（前段落参照）によって得られるＤＮＡ配列も発明の一部である。これらＤＮＡ配列によってコードされた単離ポリペプチドまたは上記のその相同体も本発明の一部である。ポリペプチドｈｄｆＡおよびｈｄｆＢは、ＮＨＲに関与する機能を有する。これらポリペプチドのすべてが本発明の方法において使用され、改善された標的効率を有しうる糸状菌を得ることができる。
【０１６０】
本発明は、以下の実施例でより詳細に例示される。かかる実施例は本発明の範囲を限定することが意図されていない。
【実施例】
【０１６１】
実施例１：ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ遺伝子の識別および削除ベクターの構成。
アスペルギルス・ニゲル菌株ＣＢＳ５１３．８８のゲノムＤＮＡを配列決定し、分析した。ＫＵ７０およびＫＵ８０との相同体と注釈付きの翻訳タンパク質を有する２つの遺伝子を識別し、それぞれｈｄｆＡおよびｈｄｆＢと命名した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（イントロンを有する）および遺伝子の約１０００ｂｐ５’および３’を含んで成るｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢ遺伝子座の配列が、配列表１および４に示されている。ｈｄｆＡおよび／またはｈｄｆＢの遺伝子置換ベクターが、既知の原理に従って設計され、ルーチンのクローニング法に従って構成された（図１および２を参照）。本質的に、これらのベクターは、予定されたゲノム遺伝子座での相同的組換えのｈｄｆ  ＯＲＦの約１０００ｂｐフランキング領域を含んで成る。また、それらは、Ａ．ニドゥランス双方向ａｍｄＳ選択マーカー、中間直接繰返しを含有する。これら削除ベクターの一般設計は、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットにおいて既述されている。
【０１６２】
実施例２：アスペルギルス・ニゲルにおけるｈｄｆＡ遺伝子の不活性化。
削除ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＡの直鎖ＤＮＡ（図１）を単離して使用し、以前に記載された方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．（１９９２年）リード・パブリッシング（Ｒｅｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）（米国（ＵＳＡ））、第６章：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  １１３〜１５６頁）を使用することによりアスペルギルス・ニゲルＣＢＳ５１３．８８を形質転換した。この直鎖ＤＮＡはｈｄｆＡ遺伝子座でゲノムへ取込むことができ、したがって、図３に示されているようにａｍｄＳ遺伝子によってｈｄｆＡ遺伝子を置換する。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に記載された標準の方法に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロ・アセトアミド培地上にプレーティングし、ａｍｄＳマーカーを失った菌株を選択した。発育コロニーをｈｄｆＡ遺伝子座での取込みについてＰＣＲで診断し、候補の菌株をｈｄｆＡ遺伝子の削除についてサザン分析で試験した。ｈｄｆＡ遺伝子の削除は、遺伝子座全体をカバーするＤＮＡ断片の約２．２ｋｂサイズの削減によって検出可能であり、適切なプローブにハイブリダイズされた。約８個の菌株が、約４００の初期形質転換体のプールからゲノムｈｄｆＡ遺伝子の除去を示した。
【０１６３】
菌株ｄＨＤＦＡを不活性化したｈｄｆＡ遺伝子を有する代表的な菌株として選択した。
【０１６４】
実施例３：アスペルギルス・ニゲルにおけるｈｄｆＢ遺伝子の不活性化。
削除ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＢの直鎖ＤＮＡ（図２）を単離して使用し、アスペルギルス・ニゲル菌株ＣＢＳ５１３．８８を形質転換した。この直鎖ＤＮＡはｈｄｆＢ遺伝子座でゲノムへ取込むことができ、したがって、ａｍｄＳ遺伝子によってｈｄｆＢ遺伝子を置換する（図４）。実施例２に記載されたものと同じ遺伝子置換法を使用した。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、標準の方法に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロ・アセトアミド培地上にプレーティングし、ａｍｄＳマーカーを失った菌株を選択した（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書）。発育コロニーをｈｄｆＢ遺伝子座での取込みについてＰＣＲで診断し、候補の菌株をｈｄｆＢ遺伝子の削除についてサザン分析で試験した。ｈｄｆＢ遺伝子の削除は、遺伝子座全体をカバーするＤＮＡ断片の約２．６ｋｂサイズの削減によって検出可能であり、適切なプローブにハイブリダイズされた。約７個の菌株が、約３７０の初期形質転換体のプールからゲノムｈｄｆＢ遺伝子の除去を示した。
【０１６５】
菌株ｄＨＤＦＢを不活性化したｈｄｆＢ遺伝子を有する代表的な菌株として選択した。
【０１６６】
実施例４：アスペルギルス・ニゲルにおけるｈｄｆＡおよびｈｄｆＢ遺伝子の不活性化。
削除ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＢの直鎖ＤＮＡ（図２）を単離して使用し、実施例２で得られた菌株ｄＨＤＦＡを形質転換した。この直鎖ＤＮＡはｈｄｆＢ遺伝子座でゲノムへ取込むことができ、したがって、ａｍｄＳ遺伝子によってｈｄｆＢ遺伝子を置換する（図４）。実施例２に記載されたものと同じ遺伝子置換法を使用した。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、標準の方法に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロ・アセトアミド培地上にプレーティングし、ａｍｄＳマーカーを失った菌株を選択した。発育コロニーをｈｄｆＢ遺伝子座での取込みについてＰＣＲで診断し、候補の菌株をｈｄｆＢ遺伝子の削除についてサザン分析で試験した。ｈｄｆＢ遺伝子の削除は、遺伝子座全体をカバーするＤＮＡ断片の約２．６ｋｂサイズの削減によって検出可能であり、適切なプローブにハイブリダイズされた。約１５個の菌株が、約３８０の初期形質転換体のプールからゲノムｈｄｆＢ遺伝子の除去を示した。
【０１６７】
菌株ｄＨＤＦＡＢを不活性化したｈｄｆＡおよびｈｄｆＢ遺伝子を有する代表的な菌株として選択した。
【０１６８】
実施例５：単一相同的組換えイベントの改善された標的
ＤＮＡが予定された遺伝子座でアスペルギルス・ニゲルのゲノムへ取込みうる１つの機序は、単一相同的組換えによるものである。相同的ＤＮＡは、組換えによってゲノム位置で整列して取込む（図５を参照）。２つのベクターを使用し、実施例２、３、および４で得られたアスペルギルス・ニゲル菌株の単一相同的組換えによる標的効率を試験した。２つのベクターは、組換えおよび結果として生じる取込みを導くグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子座と相同の領域を含んで成る（図５）。
【０１６９】
かかる相同的取込みのために設計された第１のベクターはすでに以前に国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載されている（ｐＧＢＦＩＮ１１−ＥＰＯ）。このベクターは、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子を含有する。
【０１７０】
第２のベクター（ｐＧＢＦＩＮ１１−ＰＬＡ）は、Ａ．オリゼからのホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）をコードする遺伝子を含有する。この酵素をコードする遺伝子はすでに公表されている（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）Ｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９年）、６３巻、５号、８２０−８２６頁）。この遺伝子は、ｐＧＢＦＩＮ１１−ＥＰＯにおけるプロリン特異的エンドプロテアーゼ遺伝子のクローニングのために国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載されたのと同じ方法を使用してｐＧＢＦＩＮ１１へクローン化された。
【０１７１】
菌株ＣＢＳ５１３．８８、ｄＨＤＦＡ、ｄＨＤＦＢ、およびｄＨＤＦＡＢを実施例２で既述された形質転換法に従ってｐＧＢＦＩＮ１１−ＥＰＯまたはＧＢＦＩＮ１１−ＰＬＡプラスミドのいずれかで形質転換した。得られた結果は、使用された両方のプラスミドで同じであった。発明者らはそれぞれ、標的遺伝子座で取込まれたプラスミドによる形質転換体の５％、１０％、１０％、および１０％を見出した。したがって、発明者らは、アスペルギルス・ニゲルにおける少なくとも１つのｈｄｆ遺伝子の不活性化が単一の相同的組換えイベントによってこれらの菌株の標的効率の大幅な増大をもたらすと結論づけた。
【０１７２】
実施例６：数種類の遺伝子座での二重相同的組換えイベントの改善された標的。
さらに、ゲノムからの遺伝子をコードする多くのアミラーゼの不活性化のために設計された削除ベクターでのｄＨＤＦＡ菌株の形質転換によって標的効率を測定した。遺伝子フランキング領域を実質的に実施例１に記載されているようにクローン化し、結果として生じるベクターを線状化し、これを使用してＣＢＳ５１３−８８およびｄＨＤＦＡ菌株のプロトプラストを形質転換した。標的頻度をＰＣＲ分析、および対応する遺伝子の不活性化を示す活性に基づくプレートアッセイによって測定した。後者は、０．４％寒天を補充したＰＤＡプレート上で形質転換体を増殖させ、その後にヨード／カリウムヨード溶液（ルゴール（Ｌｕｇｏｌ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｌ６１４６）による染色によって行われた。以下の表１でわかるように、ＰＣＲ分析および／または対応する遺伝子の不活性化を示す活性に基づくプレートアッセイによって判定された標的頻度は、ＣＢＳ５１３．８８菌株で観察されたものに比べ大幅に改善された。
【０１７３】
【表１】
2011152148.tif 000002
【０１７４】
これらの所見により、アスペルギルス・ニゲルにおける少なくとも１つのｈｄｆ遺伝子の不活性化が結果として二重相同的組換えによる取込みに対するベクターの標的効率の大幅な増大をもたらすという本発明者らの結論がさらに裏付けられる。
【０１７５】
実施例７：標的頻度に対するａｍｙＢＩＩ遺伝子の相同的フランキング領域のサイズ削減の効果。
別個の一連の実験において、二重相同的組換えによる形質転換効率および標的頻度に対するフランキング領域長さの効果をさらに調査した。菌株ＣＢＳ５１３．８８およびｄＨＤＦＡのプロトプラストを、可変長のａｍｙＢＩＩフランキング領域によってフランキングされたＡ．ニドゥランスａｍｄＳマーカーを含むＰＣＲ断片で形質転換した。表２に示されたデータは、増強された全体的な形質転換効率に加えて、統合的カセットの標的がｄＨＤＦＡ菌株においてはるかに改善されたことを明らかに示す。
【０１７６】
【表２】
2011152148.tif 000003
【０１７７】
実施例８：ポリペプチドの表現型分析および製造。
ｄＨＤＦＡ、ｄＨＤＦＢ、またはｄＨＤＦＡＢ菌株の固体培地または振盪フラスコでの発育中の表現型の差異は確認されなかった。プラスミドｐＧＢＦＩＮ１１−ＥＰＯまたはｐＢＧＦＩＮ−ＰＬＡで形質転換されたｄＨＤＦＡ、ｄＨＤＦＢ、およびｄＨＤＦＡＢ菌株はすべて、以下の方法に従って判定されるように培地へ活性酵素を分泌した。
【０１７８】
固体培地はポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地（ジフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ポテトデキストロース寒天（ＰＯＴＡＴＯ  ＤＥＸＴＲＯＳＥ  ＡＧＡＲ）、培養培地、カタログ番号２１３４００、１９９６−１９９７年）であった。
【０１７９】
振盪フラスコ実験を欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に記載されているように培地１００ｍｌ中、３４℃下、および５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコを使用してインキュベーター振盪機中１７０ｒｐｍで行った。発酵の４日後、試料を取り、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性またはホスホリパーゼ活性のいずれかに判定した。
【０１８０】
プロリン特異的エンドプロテアーゼのタンパク質分解活性を分光光度法で時間内にｐＨ５および約３７℃で基質としてＺ−グリ（Ｇｌｙ）（シン）−プロ（Ｐｒｏ）（リン）−ｐＮＡを使用して測定した。１Ｕプロリン特異的エンドプロテアーゼは、毎分Ｚ−グリ（Ｇｌｙ）（シン）−プロ（Ｐｒｏ）（リン）−ｐＮＡ１ミクロモルをｐＨ５および３７℃下に変換する酵素の量と定義されている。
【０１８１】
アスペルギルス・ニゲル（ＰＬＡ１）からのホスホリパーゼＰＬＡ１活性を分光光度法で測定するために、人工的基質、すなわち、１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリン（ｄｉＣ８、基質）が使用される。ＰＬＡ１はＡ１位で硫化物結合を加水分解し、チオオクタン酸を解離する。チオオクタン酸は、４，４ジチオピリジン（呈色試薬、４−ＤＴＤＰ）と反応し、４−チオピリドンを形成する。４−チオピリドンは、３３４ｎｍの波長を有する放射線を吸収する４−メルカプトピリジンと互変異性平衡にある。同波長での吸光変化は測定される。１単位は、１ｎｍｏｌチオオクタン酸を１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンから毎分３７℃およびｐＨ４．０で遊離する酵素の量である。
【０１８２】
基質溶液は、エタノール６６ｍｌ当たりｄｉＣ８  １ｇを溶解し、酢酸バッファー２６４ｍｌを添加することによって調製される。酢酸バッファーは、０．２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００を含有する０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ３．８５を含んで成る。呈色試薬は、１１ｍＭ  ４，４−ジチオジピリジン溶液である。これは、２ｍｌエッペンドルフ試料カップ中に４，４−ジチオジピリジン５．０ｍｇを秤量し、エタノール１．００ｍｌ中に溶解することによって調製した。ミリＱ水１．００ｍｌを添加した。
【０１８３】
興味深いことに、色差またはコロニー外観など形態的変化は、ＣＢＳ５１３．８８から得られた形質転換体よりもｄＨＤＦＡ、ｄＨＤＦＢ、およびｄＨＤＦＡＢ菌株から得られた形質転換体で低頻度に生じた。これは無作為取込み（ＮＨＲ）の削減によるものであり、したがって予想外の表現型の変化を阻止すると考えられる。
【０１８４】
実施例９：変異誘発による相同的組換えの改善された効率を有するペニシリウム変異体の単離
遺伝子標的の改善された効率を有する変異体を単離するために、典型的な変異誘発と分子生物学の組合せを適用した。ペニシリウム・クリソゲヌム（ＣＢＳ  ４５５．９５）胞子をＹＥＰＤ（ジフコ製の２％酵母抽出物、ジフコ製の１％ペプトン、２％グルコース）中で胞子形成するコロニーから得た。これらの胞子を滅菌水道水中で洗浄し、ｍｌ当たり１０８分生子を含有する懸濁液１０ｍｌを２５４ｎｍでＵＶ照射にかけた（シルバニア（Ｓｙｌｖａｎｉａ）、１５ワット・ブラックライトブルー管、モデルＦＴ１５Ｔ８／ＢＬＢ）。ＵＶ照射を７．５、１５、または３０分間当てると同時に、懸濁液をゆっくり振盪した。これらの異なる照射時間は、細胞における軽度、中等度、および強度の突然変異率レベルを得るために選択された。暗所での回収の１時間後、これら３時点からの細胞を２つの同等のアリコートに分けた。第１の試料を既述のように直接再胞子形成し（ヘルスバッハ（Ｈｅｒｓｂａｃｈ），ＧＪＭ、ファン・デン・ビーク（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｅｅｋ），ＣＰ、およびファン・ジユック（Ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋ），ＰＷＭ．Ｔｈｅ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｖａｎｄａｍｍｅ  ＥＪ（編）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（４５−１４０頁）、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク）、もう一方の試料をＹＮＢ培地（アミノ酸（ジフコ）、２．０％ｗ／ｖグルコースとともに０．６７％ｗ／ｖ酵母窒素塩基）中で長い回収期間、胞子形成を導入する前に４時間、２５℃下にインキュベートした。
【０１８５】
第３の変異誘発試料をＹＮＢ中で一夜、野生型胞子を発生させた後、滅菌水道水での２つの洗浄ステップによって得て、滅菌水道水中に再懸濁した。さらにＵＶ照射を７．５、１５、および３０分間当てると同時に、懸濁液をゆっくり振盪した。これらの試料を（上述したように）暗所での回収の１時間後に直接、再胞子形成した。
【０１８６】
これらの望ましい変異体をこれら変異誘発集団から選択するために、変異誘発集団をＹＥＰＤ培地に接種した。発芽後、細胞の発達を標準の光学顕微鏡を使用して追跡した。培養の平均菌糸が申し分なく発達している場合、細胞を収穫し、溶解酵素でインキュベートし、プロトプラストを得た。プロトプラストを機能的選択マーカーの発現カセットを有する２つのＤＮＡ断片、ｂｌｅおよびａｍｄＳで形質転換された。遺伝子ｂｌｅはフレオマイシンへの耐性を与えることが可能なタンパク質をコードする（コラー（Ｋｏｌａｒ）Ｍ、プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ファン・デン・ホンデル  ＣＡ、シュワブ（Ｓｃｈｗａｂ）Ｈ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ．１９８８年、６２（１）：１２７−３４頁）。遺伝子ａｍｄＳは、細胞が唯一の窒素源としてアセトアミドで発育することを可能にするタンパク質をコードする（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書に記載）。Ｐ．クリソゲヌムのプロトプラストへのＤＮＡの移動に適用される方法は当技術分野で周知であり、フィンケルシュタインとボール（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（１９９２年）、ベネットとラシュア（編）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、ターナー、ピューラー（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２完全改訂版、ＶＨＣ（１９９２年）を含む多くの文献に記載されている。Ｃａ−ＰＥＧ介在プロトプラスト形質転換はＥＰ６３５５７４号明細書に記載されているように使用される。
【０１８７】
ペニシリウムゲノムにおける特異的遺伝子座に対するこれらの発現カセットの標的取込みを選択するために、ＤＮＡの短い相同的伸長をＤＮＡ断片の両側でＰＣＲによって添加した。３タイプの構成物を作った。すなわち、第１のタイプは３０ｂｐのＤＮＡの相同的伸長を、第２のタイプは５０ｂｐ、および第３は１００ｂｐを含有する。選択は、２７の明確なバッチを規定する３０、５０、または１００ｂｐの相同的伸長を有する２つのＤＮＡ構成物（ｂｌｅおよびａｍｄＳ）で９つの胞子形成バッチから得られた変異体を形質転換することによって行った。ｂｌｅ遺伝子はｎｉａＤ遺伝子座に標的され、それによって硝酸還元酵素遺伝子を破壊し（ゴウカ  ＲＪ、ファン・ハルチングスフェルト  Ｗ、ボーベンベルグ  ＲＡ、ファン・デン・ホンデル  ＣＡ、ファン・ゴルコム  ＲＦ、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒａｔｅ−ｎｉｔｒｉｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９１年９月、２０（２）：１８９−９９頁）、細胞が塩素酸塩に耐性となると、塩素酸塩を含有するプレートへの形質転換体の選択を導くことを可能にした。ａｍｄＳ遺伝子はｓｕｔＢ遺伝子座に標的され、それによって硫酸パーミアーゼ遺伝子を破壊し（ファン・デ・カンプ  Ｍ、ピッツィニーニ  Ｅ、フォス  Ａ、ファン・デア・レンデ  ＴＲ、シュールス  ＴＡ、ニューベルト  ＲＷ、ターナー  Ｇ、コーニングス  ＷＮ、ドリーゼン  ＡＪ、Ｓｕｌｆａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｔＡ  ａｎｄ  ｓｕｔＢ  ｇｅｎｅｓ．、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９９年１２月、１８１（２３）：７２２８−３４頁）、セレン酸塩を含有するプレートへの形質転換体の選択を導くことを可能にした。形質転換体が最初に塩素酸塩で選択され、次いでセレン酸塩について試験された。さらに、選択マーカーの存在は、唯一の窒素源としてアセトアミドを含有するプレート（欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書）、次いでフレオマイシンを含有するプレートで証明された。対照野生型Ｐ．クリソゲヌムとしてＣＢＳ４５５．９５も同じＤＮＡ断片で形質転換された。存在する両方の選択マーカーを有し、塩素酸塩およびセレン酸塩に対して耐性の変異体は改善された標的取込みを有する菌株である。
【０１８８】
【表３】
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【０１８９】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】アスペルギルス・ニゲルにおけるｈｄｆＡ遺伝子を不活性化するために使用される置換ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＡを示す図である。置換ベクターは、ｈｄｆＡフランキング領域、ａｍｄＳマーカー、および大腸菌ＤＮＡを含んで成る。大腸菌ＤＮＡは、Ａ．ニゲル菌株の形質転換前に制限酵素ＡｓｃｌおよびＮｏｔｌによる消化によって除去された。
【図２】Ａ．ニゲルにおけるｈｄｆＢ遺伝子を不活性化するために使用される置換ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＢを示す図である。置換ベクターは、ｈｄｆＢフランキング領域、ａｍｄＳマーカー、および大腸菌ＤＮＡを含んで成る。大腸菌ＤＮＡは、Ａ．ニゲル菌株の形質転換前に制限酵素ＡｓｃｌおよびＮｏｔｌによる消化によって除去された。
【図３】Ａ．ニゲルのｈｄｆＡ遺伝子を削除するために使用される方法を示す図である。使用されるＤＮＡ構成物は、ｈｄｆＡ遺伝子の相同領域（５’および３’）によってフランキングされたａｍｄＳ選択マーカーを含んで成る（１）。この構成物は、ゲノムｈｄｆＡ遺伝子座で二重相同的組換え（Ｘ）を通じて取込み（２）、かつゲノムｈｄｆＡ遺伝子を置換する（３）。その後、直接繰返し（Ｕ）にわたる組換えがａｍｄＳマーカーを除去し、結果としてｈｄｆＡ遺伝子の正確な切除が生じる（４）。
【図４】Ａ．ニゲルのｈｄｆＢ遺伝子を削除するために使用される方法を示す図である。ＤＮＡ構成物は、ｈｄｆＢ遺伝子の相同領域（５’および３’）によってフランキングされたａｍｄＳ選択マーカーを含んで成る（１）。この構成物は、ゲノムｈｄｆＢ遺伝子座で二重相同的組換え（Ｘ）を通じて取込み（２）、かつゲノムｈｄｆＢ遺伝子コピーを置換する（３）。その後、直接繰返し（Ｕ）にわたる組換えがａｍｄＳマーカーを除去し、結果としてｈｄｆＢ遺伝子の正確な切除が生じる（４）。
【図５】単一相同的組換えを通じてＤＮＡ構成物をＡ．ニゲルのゲノムへ取込むために使用される概略的な方法を示す図である。発現ベクターは、選択可能なａｍｄＳマーカーおよびｇｌａＡ遺伝子座の相同的領域によってフランキングされた目的とする遺伝子（それぞれ、３’ｇｌａＡおよび３’’ｇｌａＡ）を含んで成り、ゲノムｇｌａＡ遺伝子座での取込みを導く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年5月9日(2011.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨＲ選好の糸状菌細胞のゲノムへの所定の部位に対するポリヌクレオチドの標的取込みの効率を増大させるための方法であって、
前記ポリヌクレオチドが、前記所定の部位との相同の領域を有し、
親糸状菌細胞の変異体を提供するステップを含んで成り、当該変異体は、ＮＨＲ／ＨＲ比が、同じ条件下で測定された前記親糸状菌細胞における前記比と比べて少なくとも５０％減少しており、
前記変異体は、ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子が欠損し、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の減少したレベルを有し、
前記ＮＨＲに関与する成分は、酵母ＫＵ７０、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＩＩ、ＸＲＳ２、ＬＩＧ４、ＳＩＲ４、ＫＵ８０、ＬＩＦＬ及びＮＥＩＬの糸状菌相同体からなる群より選択され、
前記親糸状菌は、アスペルギルス属又はペニシリウム属より選択され、但し、アスペルギルス・ニジュランスではない、方法。
【請求項２】
前記変異体が、以下の遺伝子、すなわちｈｄｆＡまたはその相同体、ｈｄｆＢまたはその相同体、あるいはその両方の少なくとも１つに欠け、かつ／または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの減少した量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＨＲに関与する遺伝子が非機能的変異形によって置換されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異体がＨＲに関与する成分の増加したレベルを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＮＨＲ／ＨＲ比が５０未満である糸状菌が使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子の欠損は誘導性のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
親糸状菌細胞の変異体であって、
前記親糸状菌細胞がＮＨＲ選好を有し、前記変異体は、ＮＨＲ／ＨＲ比が、同じ条件下で測定された前記親糸状菌細胞における前記比と比べて少なくとも５０％減少しており、
前記変異体は、ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子が欠損し、かつ／またはＮＨＲに関与する成分の減少したレベルを有し、
前記ＮＨＲに関与する成分は、酵母ＫＵ７０、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＩＩ、ＸＲＳ２、ＬＩＧ４、ＳＩＲ４、ＫＵ８０、ＬＩＦＬ及びＮＥＩＬの糸状菌相同体からなる群より選択され、
前記親糸状菌は、アスペルギルス属又はペニシリウム属より選択され、但し、アスペルギルス・ニジュランスではない、変異体。
【請求項８】
前記変異体が、以下の遺伝子、すなわちｈｄｆＡまたはその相同体、ｈｄｆＢまたはその相同体、あるいはその両方の少なくとも１つに欠け、かつ／または、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも１つの減少した量を有する、請求項７に記載の変異体。
【請求項９】
前記親糸状菌のゲノムにおいて、ＮＨＲに関与する遺伝子が非機能的変異形によって置換されている請求項７または８に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体がＨＲに関与する成分の増加したレベルを有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体が組換え変異体である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１２】
ＮＨＲ／ＨＲ比が５０未満である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
目的とするポリペプチドをコードする目的とする遺伝子を含んで成るＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物で形質転換された請求項７〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
前記アスペルギルスが、アスペルギルス・ニゲル種またはアスペルギルス・オリゼ種である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１５】
前記ペニシリウムが、ペニシリウム・クリソゲヌム種またはペニシリウム・シトリナム種である、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
ＮＨＲに関与する成分をコードする遺伝子の欠損は誘導性のものである、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１７】
請求項７〜１６のいずれか一項に記載の変異体が使用される、目的とするポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１８】
請求項７〜１６のいずれか一項に記載の変異体が使用される、代謝産物を産生するための方法。
【請求項１９】
前記代謝産物がカルチノイド化合物またはベータ・ラクタム化合物である、請求項１８に記載の方法。