(57)【要約】【課題】貯蔵の間で凍結製品に存在する氷の結晶は、再結晶化のような動的な工程の結果としてサイズを増大する傾向を有する。【解決手段】ハイドロフォビンを含む冷凍組成物が提供される。更に冷凍食料品における氷の結晶の成長の阻害及び／または氷の結晶の性質の改変におけるハイドロフォビンの使用が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも０．０１重量％の単離された形態のハイドロフォビンを含む、アイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、シャーベット、またはフローズンカスタードである冷凍菓子製品であって、前記ハイドロフォビンが固体重量に基づいて少なくとも１０％の純度である冷凍菓子製品。
【請求項２】
ハイドロフォビンがクラスＩＩハイドロフォビンである、請求項１に記載の冷凍菓子製品。
【請求項３】
曝気されていない、請求項１または２に記載の冷凍菓子製品。
【請求項４】
アイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、シャーベット、またはフローズンカスタードである冷凍菓子製品における氷の結晶の成長の阻害におけるハイドロフォビンの使用。
【請求項５】
アイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、シャーベット、またはフローズンカスタードである冷凍菓子製品における氷の結晶の特性の改変におけるハイドロフォビンの使用。
【請求項６】
アイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、シャーベット、またはフローズンカスタードである冷凍菓子製品の温度耐性の改善におけるハイドロフォビンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロフォビンを含む冷凍製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
貯蔵の間で凍結製品に存在する氷の結晶は、再結晶化のような動的な工程の結果としてサイズを増大する傾向を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 01/74864
【特許文献２】WO 96/41882
【特許文献３】WO 01/57076
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ice Cream, 第４版, Arbuckle (1986), Van Nostrand Reinhold Company, New York, NY
【非特許文献２】Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
【非特許文献３】Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 第４版, John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献４】Current Protocols in Molecular Biology
【非特許文献５】Wessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38: 1-45
【非特許文献６】Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646
【非特許文献７】De Vocht等, 1998, Biophys. J. 74: 2059-68
【非特許文献８】Wosten等, 1994, Embo. J. 13: 5848-54
【非特許文献９】MacCabe及びVan Alfen, 1999, App. Environ. Microbiol 65: 5431-5435
【非特許文献１０】Collen等, 2002, Biochem Biophys Acta. 1569: 139-50
【非特許文献１１】Calonje等, 2002, Can. J. Microbiol. 48: 1030-4
【非特許文献１２】Askolin等, 2001, Appl Microbiol Biotechnol. 57: 124-30
【非特許文献１３】De Vries等, 1999, Eur J Biochem. 262: 377-85
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これは、好ましくない外観及び許容しがたい口解け感のような好ましくない製品の特徴を導き、及び／または損傷の発生を導く。氷の再結晶化の工程を阻害するために、「抗凍結タンパク質」（または「氷構造化タンパク質」としても知られている）と称されるタンパク質を使用することが以前に示唆されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、ハイドロフォビンと称される真菌で見出されるあるクラスのタンパク質が、冷凍製品における氷の化粧の成長を阻害できることを見出した。
【０００７】
従って、本発明は、ハイドロフォビン、好ましくは単離された形態のハイドロフォビンを含む冷凍食料品のような冷凍組成物を提供する。関連する特徴点では、本発明は、空気−液体表面でアセンブリーが可能な形態のハイドロフォビンを含む冷凍食料品のような冷凍組成物、及び前記形態のハイドロフォビンが添加されている冷凍食料品のような冷凍組成物を提供する。
【０００８】
好ましくは、ハイドロフォビンはクラスＩＩハイドロフォビンである。
【０００９】
好ましい実施態様では、ハイドロフォビンは少なくとも０．００１重量％、より好ましくは少なくとも０．０１重量％の量で存在する。
【００１０】
一つの実施態様では、冷凍組成物は曝気されている、別の実施態様では、冷凍組成物は曝気されていない。
【００１１】
関連する特徴点では、本発明は、ハイドロフィビン、好ましくは単離された形態のハイドロフォビンと、食料品の少なくとも一つの残余の成分とを含み、非冷凍形態で存在する、本発明の冷凍食料品を生産するための組成物を提供する。好ましくは前記組成物は、食料品の全ての残余の成分を含む。
【００１２】
関連する実施態様では、本発明は、ハイドロフォビン、好ましくは単離された形態のハイドロフォビンと、食料品の少なくとも一つの残余の非液体成分とを含む、本発明の冷凍食料品の生産のためのドライ組成物を提供する。好ましくは前記組成物は、食料品の全ての残余の非液体成分を含む。
【００１３】
本発明はまた、冷凍組成物における氷の結晶の成長を阻害する方法におけるハイドロフォビンの使用を提供する。好ましくはハイドロフォビンは氷の再結晶化を阻害するために使用される。
【００１４】
関連する特徴点では、本発明はまた、冷凍組成物における氷の結晶の特性を改変する方法におけるハイドロフォビンの使用を提供する。
【００１５】
本発明は更に、組成物の冷凍の前及び／または最中にハイドロフォビンを組成物に添加することを含む、冷凍組成物における氷の結晶の成長、例えば氷の再結晶化を阻害する方法を提供する。
【００１６】
関連する特徴点では、本発明は、製品の冷凍の前及び／または最中ハイドロフォビンを組成物に添加することを含む、冷凍組成物における氷の結晶の特性を改変する方法を提供する。
【００１７】
上述の使用及び方法の好ましい実施態様では、組成物は冷凍食料品である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、曝気冷凍製品についての剪断態様を示す図表である。
【図２】図２は、新鮮な及び放置後の製品微小構造についての走査型電子顕微鏡写真である（倍率×１００）。
【図３】図３は、新鮮な及び放置後の製品微小構造についての走査型電子顕微鏡写真である（倍率×３００）。
【図４】図４は、曝気されていない製品微小構造の走査型電子顕微鏡写真を示す（ＨＦＢＩＩなし）（倍率×５０）。
【図５】図５は、曝気されていない製品微小構造の走査型電子顕微鏡写真を示す（ＨＦＢＩＩあり）（倍率×５０）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
他に規定がなければ、ここで使用される全ての技術用語及び学術用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する（例えば冷蔵菓子／冷凍菓子製造、化学、バイオテクノロジーにおける用語）。冷蔵菓子／冷凍菓子製造で使用される各種の用語及び技術の定義及び記載は、Ice Cream, 第４版, Arbuckle (1986), Van Nostrand Reinhold Company, New York, NYに見出される。分子的用法及び生化学的方法について使用される標準技術は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、及びAusubel等, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 第４版, John Wiley & Sons, Inc.、及びCurrent Protocols in Molecular Biologyの表題の完全版に見出すことができる。
【００２０】
ハイドロフォビン
ハイドロフォビンは、疎水性／親水性界面で自己アセンブリーでき、以下の保存配列：
Ｘｎ−Ｃ−Ｘ５−９−Ｃ−Ｃ−Ｘ１１−３９−Ｃ−Ｘ８−２３−Ｃ−Ｘ５−９−Ｃ−Ｃ−Ｘ６−１８−Ｃ−Ｘｍ（配列番号１)
［式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を表し、ｎ及びｍは独立に整数を表す］
を有する周知のクラスのタンパク質である(Wessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38: 1-45; Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646)。典型的にハイドロフォビンは、１２５アミノ酸までの長さを有する。保存配列中のシステイン残基（Ｃ）は、ジスルフィド架橋の一部を形成する。本発明の内容では、用語「ハイドロフォビン」は、以下の配列：
Ｘｎ−Ｃ−Ｘ１−５０−Ｃ−Ｘ０−５−Ｃ−Ｘ１−１００−Ｃ−Ｘ１−１００−Ｃ−Ｘ１−５０−Ｃ−Ｘ０−５−Ｃ−Ｘ１−５０−Ｃ−Ｘｍ（配列番号２)
を含むタンパク質のようなタンパク質フィルムを生ずる疎水性／親水性界面で自己アセンブリーの特徴を未だ示す機能的に同等なタンパク質、またはタンパク質フィルムを生ずる疎水性／親水性界面で自己アセンブリーの特徴を未だ示すその一部を含むように、より広い意味を有する。本発明の定義によれば、自己アセンブリーは、テフロン（登録商標）にタンパク質を吸着させ、二次構造（一般的にα−ヘリックス）の存在を確立するための円２色性を使用することによって検出できる(De Vocht等, 1998, Biophys. J. 74: 2059-68)。
【００２１】
フィルムの形成は、タンパク質溶液中でテフロン（登録商標）シートをインキュベートし、引き続き水またはバッファーで少なくとも３回洗浄することによって確立できる(Wosten等, 1994, Embo. J. 13: 5848-54)。タンパク質フィルムは、蛍光マーカーでのラベリングのようないずれの適切な方法によって、または当該技術分野で十分に確立されている蛍光抗体の使用によって視覚化できる。ｍ及びｎは典型的に、０から２０００の範囲の値を有するが、とりわけｍ及びｎは全部で１００または２００未満である。本発明の内容におけるハイドロフォビンの定義は、ハイドロフォビンと別のポリペプチドとの融合タンパク質、並びにハイドロフォビンとポリサッカリドのような他の分子との接合物を含む。
【００２２】
今日までに同定されたハイドロフォビンは一般的に、クラスＩまたはクラスＩＩのいずれかとして分類されている。両者のタイプは、両親媒性フィルム内に疎水性界面で自己アセンブリーする分泌タンパク質として真菌で同定されている。クラスＩハイドロフォビンの会合物は比較的疎水性である一方、クラスＩＩハイドロフォビンの会合物は各種の溶媒中に容易に溶解する。
【００２３】
ハイドロフォビン様タンパク質は、Actinomycete種及びSteptomyces種のような繊維状細菌で同定されている（WO 01/74864）。これらの細菌タンパク質は、真菌ハイドロフォビンと比較して、二つのみのシステイン残基を有しているため一つのみのジスルフィド架橋を形成する。そのようなタンパク質は、配列番号１及び２に示されたコンセンサス配列を有するハイドロフォビンの機能的な同等物の例であり、本発明の範囲内に存在する。
【００２４】
ハイドロフォビンは、いずれかの適切な方法により、繊維状真菌のような天然の供給源からの抽出によって得ることができる。例えばハイドロフォビンは、増殖培地内にハイドロフォビンを分泌する繊維状真菌の培養によって、または６０％エタノールでの真菌菌糸体からの抽出によって得ることができる。ハイドロフォビンを天然に分泌する宿主生物からハイドロフォビンを単離することが特に好ましい。好ましい宿主は、線菌綱（例えばTrichoderma）、担子菌綱、及び子嚢菌綱である。特に好ましい宿主は、クリパリンと称されるハイドロフォビンを分泌するCryphonectria parasticaのような食品グレードの生物である(MacCabe及びVan Alfen, 1999, App. Environ. Microbiol 65: 5431-5435)。
【００２５】
別法として、ハイドロフォビンは組換え法の使用によって得ることができる。例えば典型的に微生物である宿主細胞を、ハイドロフォビンを発現するように修飾してもよく、次いでハイドロフォビンを単離し、本発明に従って使用できる。宿主細胞内にハイドロフォビンをコードする核酸構築物を導入するための方法は、当該技術分野で周知である。ハイドロフォビンをコードする３４を超える遺伝子が、16の真菌種についてクローン化されている（例えばAgaricus bisporusで同定されたハイドロフォビンの配列を与えるWO 96/41882；及びWosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55: 625-646を参照）。組換え法はまた、ハイドロフォビン配列を修飾するために、または所望の特性／改良された特性を有する新規なハイドロフォビンを合成するためにも使用できる。
【００２６】
典型的に、適切な宿主細胞または生物は、所望のハイドロフォビンをコードする核酸構築物によってトランスフォームされる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳のための必要なエレメントをコードする適切な発現ベクターに、適切な条件下（例えば正しい配向及び正しいフレームワークで、適切な標的化配列及び発現配列と共に）で発現するような態様で挿入できる。これらの発現ベクターを構築するのに必要な方法は当業者に周知である。
【００２７】
数多くの発現系が、ポリペプチドコード配列を発現するために使用されて良い。これらは細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫細胞系、植物培養細胞系、適切な発現ベクターでトランスフォームされた植物体全体を含むが、これらに制限されない。好ましい宿主は、食品グレードと考慮される−「一般的に安全と考慮される（ＧＲＡＳ）」−ものである。
【００２８】
適切な真菌種は、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Hansenula属、Candida属、Schizosaccharomyces属等のような（これらに制限されない）酵母、Aspergillus属、Trichoderma属、Mucor属、Neurospora属、Fusarium属等のような（これらに制限されない）糸状菌種を含む。
【００２９】
ハイドロフォビンをコードする配列は、天然で同定されるハイドロフォビンに対してアミノ酸レベルで好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９５％または１００％同一である。しかしながら当業者は、ハイドロフォビンの生物学的活性を減少しない保存的置換または他のアミノ酸変化を導入しても良い。本発明の目的のため、天然に存在するハイドロフォビンに対して高レベルの同一性を有するこれらのハイドロフォビンは、用語「ハイドロフォビン」の範囲内に存在する。
【００３０】
ハイドロフォビンは、例えばWO 01/57076に記載された方法によって、培養培地または細胞抽出物から精製でき、当該文献は、ハイドロフォビン含有溶液に存在するハイドロフォビンを表面に吸着させ、Tween 20のような界面活性剤と表面を接触させ、表面からハイドロフォビンを溶出することを含む。Collen等, 2002, Biochem Biophys Acta. 1569: 139-50; Calonje等, 2002, Can. J. Microbiol. 48: 1030-4; Askolin等, 2001, Appl Microbiol Biotechnol. 57: 124-30;及びDe Vries等, 1999, Eur J Biochem. 262: 377-85参照。
【００３１】
冷凍組成物
冷凍組成物／冷凍製品は、冷凍食料品及び冷凍生物学的材料を含む。冷凍食料品は、冷凍の植物由来の材料、例えば果実及び野菜、冷凍の動物由来の材料、例えば冷凍肉及び魚、並びに冷凍加工食料品、例えばレディーメイド食料、ソース、及び冷凍菓子、例えばアイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、シャーベット、スラッシュ、フローズンカスタード、ウォーターアイス、ソルベ、アイス、及びフローズンプーリを含む。
【００３２】
本発明の冷凍組成物は、曝気されていてもされていなくても良い。用語「曝気」は、例えば機械的手段によって、製品中に気体が意図的に取り込まれていることを意味する。気体は、空気、窒素、または二酸化炭素のようないずれかの食品グレードのものであることができる。特に曝気食料品に関して、曝気の度合いは典型的に、「オーバーラン」に関して定義される。本発明の内容では、オーバーラン％は、以下のような体積に関して定義される：
（（最終曝気製品の体積−ミックスの体積）／ミックスの体積）×１００
【００３３】
製品中に存在するオーバーランの量は、所望の製品の特徴に依存して変化するであろう。例えば、アイスクリームにおけるオーバーランのレベルは典型的に約７０から１００％であり、ウォーターアイスにおけるオーバーランは２５から３０％である。
【００３４】
冷凍食料品のような曝気されていない組成物は、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満のオーバーランを有する。曝気されていない冷凍食料品は、気体含有量を増大するためにホイップのような意図的な工程に供されない。言うまでもなく、曝気されていない冷凍食料品の調製の間で、空気のような低レベルの気体が製品中に取り込まれて良いことは予測されるであろう。
【００３５】
冷凍菓子製品
冷凍菓子は、典型的に牛乳または牛乳固形分を含む菓子、例えばアイスクリーム、ミルクアイス、フローズンヨーグルト、シャーベット、及びフローズンカスタード、並びに牛乳または牛乳固形分を含まない冷凍菓子、例えばウォーターアイス、ソルベ、アイス、及びフローズンプーリを含む。
【００３６】
冷凍菓子は、製品の少なくとも一部または領域、例えばコアまたは層がハイドロフォビンを含まない複合製品の形態で存在しても良い。この例として、ハイドロフォビンを含むアイスクリーム、ミルクアイス、またはウォーターで被覆された、アイスハイドロフォビンを含まないアイスクリームのコアを含む製品が挙げられるであろう。複合製品の場合、添加されるハイドロフォビンの重量％の量は、ハイドロフォビンを含む菓子の成分に関してのみ計算され、複合製品に関して計算されるものではないことが予測されよう。
【００３７】
曝気冷凍菓子は、好ましくは２５から３００％、例えば２５から１５０％、より好ましくは５０から１５０％のオーバーランを有する。
【００３８】
本発明の冷凍組成物中に存在するハイドロフォビンの量は、一般的に製品の処方、及び曝気製品の場合、空気相の体積に依存して変化するであろう。典型的に製品は、少なくとも０．００１重量％、より好ましくは少なくとも０．００５または０．０１重量％のハイドロフォビンを含むであろう。典型的に製品は、１重量％未満のハイドロフォビンを含むであろう。ハイドロフォビンは単一の供給源または複数の供給源から由来してよく、例えばハイドロフォビンは、二つ以上の異なるハイドロフォビンポリペプチドの混合物であることができる。
【００３９】
好ましくはハイドロフォビンは、クラスＩＩハイドロフォビンである。
【００４０】
本発明はまた、ハイドロフォビンを含む、本発明の冷凍食料品の生産のための組成物を包含する。一般的にハイドロフォビンは、単離された形態、典型的に少なくとも部分的に精製された形態、例えば固体重量に基づいて少なくとも１０％または２０％の純度で存在するであろう。かくしてハイドロフィンは、天然でハイドロフォビンを発現するマッシュルームのような天然に存在する生物の一部としては添加されない。代わりにハイドロフォビンは典型的に、天然に存在する供給源から抽出されているか、宿主生物における組換え発現によって得られたものである。
【００４１】
そのような組成物は、液体プレミックス、例えば冷凍菓子製品の生産で使用されるプレミックス、及びドライミックス、例えばパウダーを含み、冷凍の前または最中に、後者に対してミルクまたは水のような水性液体を添加する。
【００４２】
本発明の冷凍食料品の生産するための組成物は、ハイドロフォビンに加えて、食料品に通常含まれる他の成分、例えば糖、脂肪、乳化剤、香味剤等を含むであろう。前記組成物は、容易に加工して、本発明の冷凍食料品を形成するように、食料品作製に必要とされる残余の成分の全てを含んで良い。
【００４３】
本発明の冷凍食料品の生産のためのドライ組成物もまた、ハイドロフォビンに加えて、食料品に通常含まれる他の成分、例えば糖、脂肪、乳化剤、香味剤等を含むであろう。前記組成物は、ユーザーが必要とする全てが水またはミルクのような水性液体を添加して、組成物を容易に加工し、本発明の冷凍食料品を形成するように、食料品作製に必要とされる残余の非液体成分の全てを含んで良い。例としてパウダーまたは顆粒を含むこれらのドライ組成物は、産業上の使用及び小売用の使用の両者のためにデザインでき、減少した嵩とより長い貯蔵期間の利益を有する。
【００４４】
ハイドロフォビンは、氷の結晶の成長、例えば氷の再結晶化を阻害する、及び／または氷の結晶の特性を改変するのに利用可能な形態及び量で添加される。用語「添加」により、ハイドロフォビンは、その氷の結晶の成長を阻害する、及び／または氷の結晶の特性を改変する特性を利用する目的のために、食料品に故意に導入される。従って、ハイドロフォビンポリペプチドを含んで良い真菌混在物を含む食品成分が存在または添加される場合、これは本発明の内容の範囲内で、ハイドロフォビンを添加することを構成しない。
【００４５】
典型的にハイドロフォビンは、空気−液体表面で自己アセンブリーが可能な形態で、食料品に添加される。
【００４６】
典型的にハイドロフォビンは、単離された形態、典型的に少なくとも部分的に精製された形態、例えば固体重量に基づいて少なくとも１０％の純度で、本発明の食料品または組成物に添加される。「単離された形態での添加」により、ハイドロフォビンが、天然でハイドロフォビンを発現するマッシュルームのような天然に存在する生物の一部として添加されないことを意味する。代わりにハイドロフォビンは典型的に、天然に存在する供給源から抽出されているか、宿主生物における組換え発現によって得られたものである。
【００４７】
添加されるハイドロフォビンは、氷の結晶の成長を減少または阻害する、例えば氷の再結晶化の工程を阻害する、及び／または氷の結晶の特性（即ち氷の結晶の形状）を改変するのために使用できる。阻害及び／または改変は、冷凍の間及び冷凍の後、例えば貯蔵の間で生じることができる。冷凍の間での氷の結晶の成長の阻害、及び／または氷の結晶の特性の改変は、製品のきめを変更するために使用できる。氷の再結晶化の阻害は、熱環境での貯蔵に応答する製品安定性を改善する。
【００４８】
ハイドロフォビンは、細胞生物学的材料における氷の再結晶化のような氷の結晶の成長を阻害するため、及び／または氷の結晶の特性を変更するためにも使用できる。これは、生物学的材料を保存するために使用される冷凍工程の結果として、細胞に対する損傷を減少する役目を果たすであろう。そのような生物学的材料は、単細胞生物及び細胞系列の培養物；生殖体、例えば製品及び卵子；並びに植物及び動物の両者の多細胞生物から由来する組織及び器官を含む。
【００４９】
従って本発明は、単離された形態のハイドロフォビンを含む、好ましくは少なくとも０．００１重量％のハイドロフォビンを含む冷凍細胞生物学的材料を提供し、但しヒトは特に排除される。
【００５０】
本発明は更に、冷凍細胞生物学的材料における氷の再結晶化のような氷の結晶の成長を阻害するための、及び／または氷の結晶の特性を改変するための、ハイドロフォビンの使用を提供する。阻害／改変は、生物学的材料の冷凍の最中及び／または後に実施できる。
【００５１】
本発明は、以下の実施例を参考にして更に記載されるが、実施例は説明的且つ非制限的なものである。
【実施例】
【００５２】
実施例１−曝気冷凍製品
３タイプのタンパク質を使用して、曝気冷凍製品を調製した：
Ａ：カゼイン酸ナトリウム（ＮａＣａｓ）
Ｂ：スキムミルクパウダー（ＳＭＰ）
Ｃ：Trichoderma Reesei由来のハイドロフォビン（ＨＦＢＩＩ）
【００５３】
製品の微小構造及び物理的特性を、温度での放置の摂生の前後の両者で比較した。
【００５４】
材料
使用された材料の詳細は表１に要約されており、曝気冷凍製品のそれぞれを調製した処方が表２に示されている。
【００５５】
表１：使用された材料
【表１】
2011041584.tif 000002
【００５６】
表２：使用された処方
【表２】
2011041584.tif 000003
【００５７】
曝気冷凍製品の調製
ミックス（エマルション）調製
全てのミックスを１００ｇのバッチで作製した。ミックスＡ及びＢ（それぞれをカゼイン酸ナトリウム及びスキムミルクを含む）については、タンパク質をスクロースと組み合わせ、磁性スターラーを使用して冷水中に分散した。次いでこの溶液を攪拌しながら６０℃に加熱し、５分間維持した後に４０℃に冷却した。次いでMoltenココナッツ脂肪を添加し、溶液中に十分に浸液した先端で７０％の振動で３分間、水性ミックスを迅速にソニケートした（６．４ｍｍの先細り先端を有するBranson Sonifer）。次いで、溶液の温度が５℃になるまで、エマルションを−１０℃の水冷バスで迅速に冷却し、脂肪小滴を結晶化した。更なる使用までミックスを５℃で貯蔵した。
【００５８】
ミックスＣ（ＨＦＢＩＩを含む）については、最初にスクロースを攪拌しながら冷水中に分散した。次いで、ＨＦＢＩＩの必要な濃度の半分を、等量物としてこれに添加した。次いで溶液を３０秒間超音波バスで穏やかにソニケートし、ＨＦＢＩＩを十分に分散した。次いでこの溶液を磁性スターラーで攪拌し、４０℃に加熱した。次いで溶融脂肪を添加し、ミックスを乳化し、ミックスＡ及びＢについて記載されたように冷却した。次いでＨＦＢＩＩの更なる等量物をこの冷却溶液に添加し、ＨＦＢＩＩ濃度を０．２％までもたらした。最初の０．１％のＨＦＢＩＩは脂肪の乳化及び安定化のためのものであった。ＨＦＢＩＩの第二の添加は、十分に過剰なＨＦＢＩＩを提供し、良好な曝気と気泡安定性を提供するであろう。
【００５９】
冷蔵エマルションに対する粒径分析を、Malvern Mastersizer 2000を使用して実施した。
【００６０】
エマルションの分析
この方法体系に引き続き、脂肪小滴を有するエマルションの作製が可能であった。測定された油性小滴のサイズの要約が表３に示されている。
【００６１】
表３：Malvern Mastersizer 2000を使用して測定されたエマルション粒径
【表３】
2011041584.tif 000004
【００６２】
剪断冷凍方法
８０ｍｌのミックスを、１０５ｍｍの高さと７２ｍｍの直径の内部形状を有する円筒状の垂直に立直した被覆ステンレススチール容器で同時に剪断して冷凍した。容器の蓋は、４６％（１８０ｍｌ）のサンプルを維持するように５４％の内部体積を充填した。サンプルの剪断のために使用されるローターは、回転するにつれて容器の表面縁を擦るように、正確な割合の四角形の羽根車からなる（寸法７２ｍｍ×４１．５ｍｍ）。四角形の付属物に対して４５°の角度で配置された二つの半円形（直径６０ｍｍ）の高剪断ブレードも、ローターに結合されている。容器をクーラーが流動する覆いによって囲む。
【００６３】
要約すると、曝気して冷凍したプロトタイプを以下のように生産する：封入した容器の内部のミックスを、空気を取り込ませるために高剪断速度の羽根車で混合する。同時にクーラーを容器の覆いの周囲に流動させ、ミックスを冷却して冷凍する。羽根車は壁の内部をも薬、そこに形成する氷を除去して、ミックスの残りにこれを取り込ませる。高剪断を使用して最初にミックスを曝気し、次いで剪断速度を遅くしてより好適な冷却と冷凍を可能にする。各ミックスについて使用された剪断の態様は図１に模式的に提供されている。
【００６４】
ミックスＡ及びＢ（それぞれカゼイン酸ナトリウム及びスキムミルクを含む）での冷凍と曝気の工程のため、クーラー（−１８℃にセット）を時間＝０分から循環するようにセットする。ミックスＡ及びＢについて開始時の比較的遅い攪拌は、ミックスの冷却とある程度の粘性（氷の形成と取り込みを介して）の生産を可能にし、その後より高剪断を使用して曝気を実施する。高速での短時間で空気を取り込ませ、次いで速度を段階的に下げてサンプルを少なくとも−５℃に到達させる。
【００６５】
ミックスＣ（ＨＦＢＩＩを含む）については、ポットを約５℃に冷蔵し、サンプルを添加し、曝気のための高剪定断面を開始した。クーラー（−１８℃にセット）は、１００％のオーバーランを生産するのに必要な増加時間のため、９分まで循環のスイッチを入れなかった。クーラーが循環するようにスイッチを入れたら（９分で）、上述（Ａ及びＢについて）のものと同じ剪断−冷却パターンを採用した。
【００６６】
この工程の最後で、オーバーランを測定し、サンプル（約１５ｇ）を小さなポットに配置した。各製品を−８０℃にセットした冷蔵庫で１０分間更に冷却し、その後−２０℃で貯蔵した。
【００６７】
曝気冷凍製品の分析
全ての曝気冷凍製品を、二つの温度の態様下で貯蔵した：
（ａ）−２０℃。生産の一週間以内でその後の分析を実施し、これを「フレッシュ」製品と称する。
（ｂ）温度で貯蔵したサンプルは１または２週間−１０℃で貯蔵し、その後分析前に−２０℃で貯蔵した。
【００６８】
表８：工程の詳細、及びミックスＡ、Ｂ、及びＣから調製された製品の製品オーバーラン
【表４】
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【００６９】
最終製品を以下のように分析した：
フレッシュに生産された製品のオーバーラン；
フレッシュな製品と温度で貯蔵した製品に関するＳＥＭ分析；
フレッシュな製品と温度で貯蔵した製品に関する溶融の挙動。
【００７０】
オーバーラン
製品のそれぞれについてのオーバーランは表４に要約されている。全てのミックスが曝気可能であり、有意な量の空気を取り込んだ。
【００７１】
微小構造安定性：方法体系
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
各製品の微小構造を、低温走査型電子顕微鏡（ＬＴＳＥＭ）を使用して視覚化した。サンプルをドライアイスで−８０℃に冷却し、サンプルの切片を切断した。約５ｍｍ×５ｍｍ×１０ｍｍのサイズのこの切片を、Tissue Tek: OCT（登録商標）化合物（ＰＶＡ１１％、カルボワックス５％、及び８５％の非反応性成分）を使用してサンプルホルダーに搭載した。ホルダーを含むサンプルを液体窒素スラッシュ内に沈め、低温調製チェンバー：Oxford Instrument CT1500HFに移した。チェンバーを約１０−４バールの真空下に配置し、サンプルを−９０℃に温める。氷をゆっくりとエッチングし、氷自体では生じない表面の詳細を明らかにし、６０から９０秒間の一定の真空下でこの温度で水を除去する。エッチングしたら、サンプルを−１１０℃に冷却して昇華を実施し、アルゴンプラズマを使用して金を被覆する。この工程も、１０−１ミリバールの適用圧力で４５秒間６ミリアンペアの電流で真空下で実施する。次いでサンプルを、−１６０℃の温度でOxford Instrumentsコールドステージを備えた従来の走査型電子顕微鏡(JSM 5600)に移す。サンプルを調べて、興味ある領域をデジタルイメージ獲得ソフトウェアーにより捕捉する。
【００７２】
冷凍破壊透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
約５ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの小さなブロックを、冷蔵外科用メスを使用してドライアイスのベッドに配置されたアルミニウムプレート上のサンプルから切り出した。サンプルブロックを、Tissue-Tek O.C.T化合物(Sakura Finetek, Europe BV)を使用して大きな「トップハット」冷凍破壊ホルダーに垂直に搭載した。液体窒素下でCressingtion CFE-50の移動装置にホルダーを迅速に配置し、冷凍破壊チェンバー（−１８０℃）に移した。スイング式ミクロトームナイフからの単一のブローでサンプルを破壊し、−９５℃で１０分間エッチングした。エッチングした表面を２ｎｍの厚みに白金／カーボンでロータリーシャドウし（４５℃）、次いで１０ｎｍの厚みにカーボンで被覆した。被覆サンプルをチェンバーから取り出し、装置に移し、金属レプリカを水でサンプルから浮かび上がらせた。レプリカ断片をクロム酸で洗浄し、水で数回洗浄し、その後４００メッシュの銅ＥＭグリッドに集積した。グリッドはＴＥＭにより調査の前に乾燥させた。
【００７３】
１００ＫＶで操作するJEOL 1200 EX II顕微鏡を使用して、ＴＥＭ長鎖を実施した。Bioscanカメラ及びDigital Micrographソフトウェアー(Gatan Inc)を使用してイメージを得た。
【００７４】
微小構造分析：結果
フレッシュな製品と温度で貯蔵した冷凍製品の微小構造を調べるために、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用した。代表的なイメージが、異なる倍率で図２及び３に示されている。
【００７５】
ＨＦＢＩＩ含有製品（ミックスＣから調製した）は、従来のタンパク質を含むもの（即ちミックスＡまたはＢ）と有意に驚くほど異なることが、フレッシュサンプルから得た結果により示された。観察された異なる特性は、より小さい空気セル、より小さい氷の結晶、より角ばった氷の結晶、及びわずかにより固着した氷の結晶であった。製品Ａ及びＢについては、フレッシュサンプルにおける氷の結晶のサイズが５０−１００μｍの直径であると概算される。製品Ｃについては、氷のサイズは４０−６０μｍの直径であると概算される。
【００７６】
温度で貯蔵した後、ＳＥＭのイメージは、ＨＦＢＩＩ含有製品（ミックスＣ由来）は初期の微小構造を維持した、即ち見かけの空気の気泡の粗化はほとんど存在しないことが明確に示される。これは、−１０℃での１及び２週間の貯蔵の後でも当てはまる。しかしながら、ＮａＣａｓ及びＳＭＰを含むプロトタイプ（それぞれミックスＡ及びＢ由来）は、ほんの１週間の後に−１０℃での温度貯蔵下で、期待の構造の非常にひどい合着を示す。
【００７７】
全体として、ＨＦＢＩＩを含んで作製された冷凍製品は、カゼイン酸ナトリウムまたはスキムミルクパウダーを使用して作製された冷凍製品よりも、温度の貯蔵に対してずっと優れた安定性を示すことは明らかである。ＨＦＢＩＩは、空気気泡安定性及び氷の結晶のサイズの安定性に対して効果を有する。
【００７８】
溶融の挙動：方法体系
冷凍製品のサンプルを室温（２０℃）で金属グリッドに配置した。製品が溶融する態様の差異、特に形状の維持及び起泡安定性を、時間の関数として観察した。
【００７９】
溶融の挙動：結果
これらの微小構造の差異（安定な気泡および安定な氷）は、冷凍製品の溶融の挙動にあるインパクトを有する。ミックスＣ（ＨＦＢＩＩを含む）から製造された曝気冷凍サンプルは、カゼイン酸ナトリウムまたはスキムミルクパウダーで製造された製品（即ちそれぞれミックスＡ及びＢ）と比較して、溶融の際により良好に形状を維持した。
【００８０】
氷が溶けて水を形成するにつれて、それは溶融グリッドに流動した。しかしながら、ＨＦＢＩＩを有する製品については、多くの起泡がグリッドに維持され、いくらか安定な起泡の小滴が下に観察された−これらの特徴のいずれもが、従来のタンパク質（カゼイン酸ナトリウム及びスキムミルクパウダー）では観察されなかった。これは使用されたタンパク質のそれぞれの間の起泡安定性の差異を説明する。
【００８１】
製品Ａ、Ｂ、及びＣの間のきめの差異
３種の製品の間のきめの明確な差異も、−１０℃での１週間の貯蔵後（即ち温度で貯蔵したサンプル）で観察できた。カゼイン酸ナトリウム（Ａ）及びスキムミルクパウダー（Ｂ）を使用して製造された製品を扱う際には、これらは非常に柔らかく非常にもろいきめを有することに注意すべきであったが、これはサンプルポットに貼り付けるために使用されたシリコンペーパーからきれいに除去するのが困難であった。他方で、ＨＦＢＩＩ（Ｃ）を使用して作製された製品は非常に堅く、サンプルポットに張り付いたシリコンペーパーから非常にきれいに放出された。言い換えると、ＨＦＢＩＩを使用して調製された製品は、カゼイン酸ナトリウムまたはスキムミルクパウダーを使用して調製された製品より、微視的且つ巨視的なスケールの両者で温度の貯蔵に対してずっと優れた安定性を示す。
【００８２】
実施例２：曝気されていない冷凍製品
一方はTrichoderma reesei由来のハイドロフォビンＨＦＢＩＩを含み、他方は含まない、二つの溶液を調製した。溶液の組成物は表５に示された通りであった。
【００８３】
表５：曝気されていない製品についての処方
【表５】
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【００８４】
ＨＦＢＩＩは上述の通りVTT Biotechnologyから供給され、スクロースはTate & Lyleによって供給された。キサンタンは、CP Kelco(Atlanta, USA)によって供給される冷水分散グレード(Keltrol RD)であった。
【００８５】
曝気されていない冷凍製品の調製と分析
両者の溶液を１００ｇのバッチで調製した。スクロース／キサンタン溶液を、スクロース及びキサンタンの乾燥混合物に室温で必要量の脱イオン性を添加することによって調製した。次いで溶解物が完全に溶解するまで磁性スターラーを使用してこれを混合した。サンプル２の場合、次いでＨＦＢＩＩを５．３ｍｇ／ｍｌの等量物の溶液として添加し、その後溶液を更に１０分間磁性スターラーで再び混合した。
【００８６】
曝気されていない溶液の冷凍を、静かに（即ち同時に剪断を適用することなく）実施した。各溶液を使用して、８ｍｌの体積の小さなペトリ皿に充填した。次いでこれらを２４時間−１８℃で家庭用冷蔵庫に配置し、その間でサンプルの冷凍が生じた。
【００８７】
冷凍に引き続き、各サンプルを微小構造を、実施例１に記載されたのと同じ調製方法を使用してＳＥＭにより分析した。
【００８８】
微小構造分析−結果
５０倍の倍率での各サンプルのＳＥＭイメージの代表図が図４及び５に示されている。ＨＦＢＩＩを含む溶液（サンプル２）の微小構造がより細かく、より小さな特徴的な寸法を有する氷の結晶を含むことが観察できる。例えば、サンプル１（図４）における長い樹上状の構造は、サンプル２（図５）で観察されたものよりより広くてより長い。これは、氷の結晶の成長工程を阻害する、即ちより小さいサイズの結晶を生ずることに関するハイドロフォビンの効果を説明する。
【００８９】
上述の個々のセクションにおいて参照される本発明の各種の特徴及び実施態様は、適切なように必要に応じて変更を加えて、他のセクションに適用される。従って、一つのセクションで特定される特徴は、適切なように他のセクションで特定される特徴と結び付けてよい。
【００９０】
この明細書で言及される全ての文献は、参考として個々に取り込まれる、上述の方法及び本発明の製品の各種の変形例及び変更例は、本発明の範囲から離れることなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して記載されているが、特許請求の範囲に記載された本発明は、そのような特定の実施態様に制限されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかである本発明を実施するために記載された態様の各種の変形例は、以下の特許請求の範囲内にあることが企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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