(57)【要約】【課題】  試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を用いて測定対象物と複合体を形成し、前記担体と複合体を形成しなかった未反応物を選択的に除去後、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質で測定する方法で用いる試薬において、前記測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含む固相試薬と、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含む標識試薬とが一つの容器に収容された凍結乾燥試薬と比較し、固相試薬への非特異吸着に起因するバックグランドが低く、優れた測定性能が得られる試薬を提供すること。【解決手段】  固相試薬と標識試薬とを、それぞれ異なる収容部に収容して凍結乾燥した試薬により、前記課題を解決した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を用いて測定対象物と複合体を形成し、前記担体と複合体を形成しなかった未反応物を除去後、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質で測定する方法で用いる試薬であって、
前記測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含む固相試薬と、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含む標識試薬とを、それぞれ異なる収容部に収容して凍結乾燥した試薬。
【請求項２】
固相試薬と標識試薬とを、収容部を２つ備えた容器のそれぞれの収容部に収容した、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
担体が磁性粒子である、請求項１または２に記載の試薬。
【請求項４】
測定対象物と特異的に反応する物質が抗体または抗原である、請求項１から３のいずれかに記載の試薬。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の試薬を用いた、測定対象物の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を用いて測定対象物と複合体を形成し、未反応物を除去後、試料中の測定対象物を測定するのに用いる凍結乾燥試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光法や化学発光法を利用した不均一系の高感度免疫測定装置に使用されている免疫反応試薬は、おもに、試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含んだ固相試薬と、測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含んだ標識試薬とからなる。固相試薬における、試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化するための担体として広く用いられる磁性粒子は、固−液反応速度を上げるために、通常は粒径１から５μｍのものが用いられる。固相試薬および標識試薬はそれぞれ液状バルク品として供給されているが、保存安定性を確保する目的で粒径１から２ｍｍ程度の磁性粒子を担体とした固相試薬と標識試薬とを一つの測定容器に入れて凍結乾燥した、いわゆるオールインワンタイプの凍結乾燥試薬で供給されているものもある。前記凍結乾燥試薬の利点としては、保存安定性向上のほか、検体の分注操作のみで反応を開始することができるため、試薬分注ユニットが不要となり、装置構成が簡便になることもあげられる。
【０００３】
磁性粒子を担体とした固相試薬の凍結乾燥についての従来技術として、特許文献１に記載のフィブリノゲン定量用試薬がある。特許文献１ではトロンビン活性をもつ蛋白質、磁性粒子および添加物を凍結乾燥し、希釈検体と直接反応後、振動磁場と静止永久磁場の組み合わせをかけて共存磁性粒子の運動シグナルを光学的にモニターすることによりフィブリノゲンを迅速に定量している。しかしながら、特許文献１の方法は不均一測定系ではないため標識試薬を使用していない。
【０００４】
オールインワンタイプの凍結乾燥試薬の例としては、特許文献２および３がある。いずれも、容器の内壁に固定化した抗体または抗原、容器内壁に結合していない標識抗体または標識抗原、および添加物を一つの凍結乾燥試薬にした不均一系の１ステップ反応試薬を開示している。前記試薬は、検体を分注して抗原抗体反応を開始し、固相に捕捉された成分（Ｂｏｕｎｄ）と捕捉されなかった成分（Ｆｒｅｅ）を分けるＢ／Ｆ分離を行なったのち、免疫複合体中の標識に由来するシグナルに基づいて測定対象物を定量する測定方法に用いられる。特許文献３は、さらに凍結乾燥試薬の改良製法も開示しており、具体的には、標識抗原または標識抗体を反応容器槽内壁に結合した抗体または抗原との間に遮断層を設けて、同一容器内で凍結乾燥試薬を製造する方法を開示している。
【０００５】
オールインワンタイプの凍結乾燥試薬であり、固相試薬の担体として磁性粒子を用いた不均一系競合法の凍結乾燥試薬の例として、特許文献４がある。特許文献４で開示の凍結乾燥試薬は、あらかじめ磁性粒子を担体とした固相試薬と標識抗原とを一つの凍結乾燥試薬にしているため、検体分注と同時に競合反応が開始される。よって、用手法にて標識抗原を分注する測定方法に比べて測定精度が向上する利点がある。
【０００６】
しかしながら、１回の測定に必要な分量の、担体に固定化した測定対象物と特異的に反応する物質、および測定対象物と特異的に反応する標識された物質が、個別の容器にそれぞれ凍結乾燥された、不均一系測定用の免疫反応試薬は従来技術の中には見当たらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２７７６４８８号公報
【特許文献２】特開昭５１−０７０８１２号公報
【特許文献３】特許第３５３７８２９号公報
【特許文献４】特開昭６２−１５１７５８号公報
【特許文献５】特開２００５−０７７１４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
固相試薬と標識試薬とを一つの容器に収容した、オールインワンタイプの凍結乾燥試薬には以下に示す問題がある。
【０００９】
まず、真空凍結乾燥における最初の凍結工程において、溶液の局所濃縮を完全に避けることができないという問題がある。オールインワンタイプの凍結乾燥試薬では、１ステップ反応に必要な成分である固相試薬および標識試薬をすべて共存させている。そのため、局所濃縮により成分同士が接触・作用しやすくなり、試薬性能に悪影響を及ぼす。例えば、抗原または抗体を固定化した担体に対して標識抗体や標識抗原などが非特異的に吸着すると、測定のバックグランドが上昇し、測定感度が低下する。また、担体に結合した抗体または標識を結合した抗体が他の共存物の影響で劣化すると、レスポンスが低下する課題がある。
【００１０】
また、真空凍結乾燥における乾燥工程において、乾燥開始直後で起きる突沸や減圧解除時の急激な空気流入による固体飛散により、測定容器の内壁上部に標識試薬が付着する問題がある。標識試薬成分の付着はＢ／Ｆ分離時における洗浄不良の原因となる。洗浄不良はデータの偽高値につながるため、特に標識試薬成分の真空凍結乾燥は細心の注意を払う必要があった。
【００１１】
そこで本発明の目的は、固相試薬と標識試薬とを一つの容器に収容した凍結乾燥試薬と比較し、固相試薬への非特異吸着に起因するバックグランドが低く、優れた測定性能が得られる試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１３】
第一の発明は、
試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を用いて測定対象物と複合体を形成し、前記担体と複合体を形成しなかった未反応物を除去後、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質で測定する方法で用いる試薬であって、
前記測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含む固相試薬と、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含む標識試薬とを、それぞれ異なる収容部に収容して凍結乾燥した試薬である。
【００１４】
第二の発明は、固相試薬と標識試薬とを、収容部を２つ備えた容器のそれぞれの収容部に収容した、第一の発明に記載の試薬である。
【００１５】
第三の発明は、担体が磁性粒子である、第一または第二の発明に記載の試薬である。
【００１６】
第四の発明は、測定対象物と特異的に反応する物質が抗体または抗原である、第一から第三のいずれかの発明に記載の試薬である。
【００１７】
第五の発明は、第一から第四のいずれかの発明に記載の試薬を用いた、測定対象物の測定方法である。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の試薬で用いる、試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化させるための担体の形状は、粒子状、チューブ状、プレート状などが例示できるが、粒子状、特に球状粒子の担体が好ましい。担体の材質は、ガラス、シリカなどの無機物質、各種合成高分子化合物からなるプラスチック、セルロ−ス誘導体など、免疫測定に用いられる担体であれば特に制限はない。一例として、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ナイロン、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、ポリスチレン、スチレン−アクリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、またはこれらを主成分とする共重合体もしくは混合物といった、熱可塑性樹脂製の担体があげられる。担体の平均粒径についても特に制限はなく、例えば０．０１から１００００μｍ程度の粒径の担体を使用することができる。本発明の試薬で用いる担体は、磁気感応成分を含有しない担体でもよいが、磁気感応成分を含有した担体（磁性粒子）のほうがその後の未反応成分の除去が容易となる点で好ましい。前記磁気感応性成分としては、例えばマンガン−亜鉛フェライトなどのソフトフェライト、四三酸化鉄を主成分とするマグネタイトなどがあげられる。前記磁気感応性成分は、前述した熱可塑性樹脂からなる担体の作製時に混合することで内部に一様に含有させてもよいし、多層構造からなる担体の１つの層に含有させてもよいし、吸着や熱融着などにより表面に担持させることで含有させてもよい。磁気感応性成分の担体への含有量（担持量）は、担体を流動させるために作用させる磁界の強度、担体の流動性の程度により適宜決定することができるが、通常は磁性粒子重量の１から８０％であり、５から５０％程度が好ましい。なお、前記磁気感応性成分そのものを、本発明の試薬で用いる担体そのもの、または担体の核として用いてもよい。
【００２０】
本発明の試薬で用いる測定対象物と特異的に反応する物質とは、抗体、抗原、核酸、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、レセプター、リガンド、酵素、基質などが例示される。また、測定対象物と特異的に反応する物質を担体に固定化する方法としては、測定対象物と特異的に反応する物質と担体とを混合することによって生じる物理的な吸着を用いる物理吸着法や、カルボジイミドなどのカップリング剤により担体表面のカルボキシル基やアミノ基と反応特異的成分とを化学的に結合させる化学結合法などが例示できる。また測定対象物と特異的に反応する物質を、スペーサー分子を介して担体に結合させてもよい。さらにアルブミンなどのタンパク質に化学結合法を用いてスペーサー分子を介して結合させた後、前記タンパク質を担体に結合させてもよい。測定対象物と特異的に反応する物質は、１種類を担体に担持するのみならず、前記物質の組み合わせも使用できる。前記物質の組み合わせの例としては、抗体のＦｃフラグメントと特異的に反応する抗Ｆｃ抗体をあらかじめ担体に固定化し、その後測定対象物と特異的に反応する抗体を、前記Ｆｃ部分を用いて抗Ｆｃ抗体を介して担体に固定化したものがあげられる。前記物質の組み合わせの別の例としては、抗イムノグロブリンＧ抗体をあらかじめ担体に固定化し、その後測定対象物と特異的に反応するイムノグロブリンＧ型抗体を、抗イムノグロブリンＧ抗体を介して担体に固定化したものがあげられる。前記物質の組み合わせのさらに別の例としては、ストレプトアビジンを固定化した担体に、測定対象物と特異的に反応するビオチン標識抗体を、ビオチン−ストレプトアビジンを介して担体に固定化したものがあげられる。測定対象物と特異的に反応する物質を担体に固定化した後、担体表面の未結合領域をウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）やカゼインなどのタンパク質で塞ぐこと（以下、ブロッキングという）により担体への非特異的吸着を十分に抑えた固相担体を調製することもできる。さらに、ブロッキングを終えた固相担体を含む溶液に、固定化した測定対象物と特異的に反応する物質を安定化させる、あるいは担体同士の吸着、凝集を防止するなどの目的で、デキストラン硫酸あるいはヘパリン硫酸などの糖類、または前記ブロッキング用タンパク質などを保護剤として添加してもよい。
【００２１】
本発明の試薬に用いる測定対象物と特異的に反応する物質に標識する物質とは、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウム誘導体などの発光物質、フルオレセインやローダミンなどの蛍光物質などが例示でき、通常の酵素免疫測定法や発光または蛍光免疫測定法に用いられるものであれば特に制限はない。
【００２２】
本発明の試薬を収容する収容部を備えた容器には、天面に開口部を設け下方に有底筒状部を設けた収容部を備えた通常のチューブ状容器、前記チューブ状容器が一列または複数列に一体的に接続された多連容器（一例として、図１に示す２つのチューブを一体的に接続した容器がある）、マイクロプレート、基板に流路を形成し前記流路の途中または流路に接続するように複数の収容部を設けたマイクロチップなどが例示できるが、複数の収容部を一体的に接続する方法や容器形状には特に制限はない。
【００２３】
本発明の試薬を製造する際に用いる凍結乾燥法は、公知の手法を用いて行なえばよい。凍結乾燥法の一態様を以下に示す。試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含む固相試薬と、測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含む標識試薬をそれぞれ調製後、それぞれ異なる収容部（通常のチューブ状容器を用いるときはそれぞれ異なる容器、多連容器やマイクロプレートなどを用いるときは前記容器やプレートに備えたそれぞれ異なる収容部）にいれ、−４０℃で２時間凍結する。その後、１０−１から１０−２Ｔｏｒｒの減圧下、１．５時間で−２０℃まで上昇させた後、−２０℃で２時間乾燥する。さらに１．５時間で２５℃まで上昇させた後、２５℃で５時間乾燥することによって本発明の試薬を得ることができる。
【００２４】
本発明の試薬を用いた測定方法の一例を以下に示す。まず、本発明の試薬の一態様である、２つの収容部を備えた容器の一方の収容部に抗原と特異的に反応する抗体を固定化した固相を含む固相試薬を凍結乾燥したものが、他方の収容部に固相に固定化した抗体とは別の抗原エピトープを認識する標識抗体を含む標識試薬を凍結乾燥したものが、それぞれアルミシールにて密閉封入された凍結乾燥試薬を用意する。
【００２５】
前記試薬を用いて２ステップサンドイッチ法にて検体中の抗原を測定する場合の一例としては、
（１）標識試薬の凍結乾燥体が収容された収容部に溶解液を分注して標識試薬を溶解し、
（２）固相試薬の凍結乾燥体が収容された収容部に検体および分注液を分注し、固相試薬の溶解撹拌および第１抗原抗体反応を行ない、
（３）第１Ｂ／Ｆ分離を行ない、
（４）（１）で溶解した標識試薬を（２）の収容部に分注し撹拌後、第２抗原抗体反応を行ない、
（５）第２Ｂ／Ｆ分離を行ない、
（６）標識物質を定量し、濃度換算する方法がある。
【００２６】
また、前記試薬を用いて１ステップサンドイッチ法にて検体中の抗原を測定する場合の一例としては、
（１）標識試薬の凍結乾燥体が収容された収容部に溶解液を分注して標識試薬を溶解し、
（２）固相試薬の凍結乾燥体が収容された収容部に検体および分注液を分注し、
（３）（１）で溶解した標識試薬の一部を（２）の収容部に分注後撹拌し、
（４）抗原抗体反応を行ない、
（５）Ｂ／Ｆ分離を行ない、
（６）標識物質を定量し、濃度換算する方法がある。
【００２７】
さらに、前記試薬を用いて１ステップサンドイッチ法にて検体中の抗原を測定する場合の別の例としては、
（１）標識試薬の凍結乾燥体が収容された収容部に検体および分注液を分注後、溶解撹拌し、
（２）（１）の混合液の一部を固相試薬の凍結乾燥体が収容された収容部に分注後、溶解撹拌し、
（３）抗原抗体反応を行ない、
（４）Ｂ／Ｆ分離を行ない、
（５）標識物質を定量し、濃度換算する方法がある。
【００２８】
以上のように、試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含む固相試薬を、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含む標識試薬とは異なる収容部に収容し凍結乾燥後、測定時に各収容部内で溶解し、前記標識試薬を前記固相試薬が収容された収容部に分注することで、容器内壁に付着した凍結乾燥物の影響を考慮しなくても問題なく測定できる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の試薬は、試料中の測定対象物と特異的に反応する物質を固定化した担体を含む固相試薬と、前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質を含む標識試薬とが異なる収容部に収容された状態で凍結乾燥されている。そのため、
（１）前記測定対象物と特異的に反応する標識された物質の、担体や容器などへの非特異吸着により生じるバックグランドシグナルが低減されるため、測定性能が向上し、
（２）試薬組成を、固相試薬側と標識試薬側とで、個別に最適化することができるため、保存安定性の向上が容易に達成できる、
という効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例で使用した２つの収容部を備えた円筒型測定容器を示す図。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子の調製
（１）カルボキシル化磁性微粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ−Ｍ２７０  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ、２．８μｍ、ベリタス社製）３３３μＬ（３０ｍｇ／ｍＬ）をプロピレン製チューブに入れ、１ｍＬの０．０１Ｍ水酸化ナトリウムで３回洗浄後、１ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて２回洗浄し、１ｍｇのＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を含む１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を１ｍＬ添加し、室温で１時間振盪撹拌した。
（２）磁性微粒子を集磁後、上清を除去し、２ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて３回洗浄し、０．９ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、１００μＬの１ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨ抗体溶液を添加し、２時間室温にて振盪撹拌した。
（３）０．１％アジ化ナトリウムを含む２ｍＬの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０にて１回洗浄後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％アジ化ナトリウムを含んだ２ｍＬの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて３回洗浄し、同緩衝液中で室温下、２時間ブロッキングした。
【００３３】
実施例２  凍結乾燥試薬の調製
（１）１ステップ法用凍結乾燥試薬（比較例）
（１−１）実施例１で得られた抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子の懸濁液１００μＬより集磁操作により上清を除去後、１ｍＬの希釈液Ａ（５％ＢＳＡ、５％スクロース、０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））を添加して１回洗浄し、５００μＬの希釈液Ａに懸濁した。
（１−２）図１に示す円筒型測定容器１０（ポリプロピレン製、各槽１１Ａ・１１Ｂの容量５００μＬ）の一方の槽１１Ａに（１−１）の懸濁液４０μＬ添加し、さらに同じ槽１１Ａに１４μｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＴＳＨ抗体を１０μＬ添加して凍結乾燥後、容器開口部をアルミシールにて密閉した。
【００３４】
（２）２ステップ法用凍結乾燥試薬（本発明）
図１に示す円筒型測定容器１０の一方の槽１１Ａに（１−１）の懸濁液５０μＬ添加し、他方の槽１１Ｂに希釈液Ａにて希釈した２．８μｇ／ｍＬのＡＬＰ標識抗ＴＳＨ抗体溶液７０μＬ添加して凍結乾燥後、容器開口部をアルミシールにて密閉した。
【００３５】
実施例３  凍結乾燥試薬を用いた免疫測定
（１）１ステップ法用凍結乾燥試薬を用いた免疫測定（比較例）
（１−１）実施例２の（１）で得られた１ステップ法用凍結乾燥試薬中の凍結乾燥体に標準試料５０μＬを添加して溶解撹拌後、３７℃で５分間静置し、１ステップサンドイッチ法の抗原抗体反応を行なった。
（１−２）１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてＢ／Ｆ洗浄を８回行なった。
（１−３）０．４ｍＭのＡＬＰ用化学発光基質溶液（東ソー、特許文献５）１００μＬを添加して３７℃で５分間反応させてエンドポイント測光し、測定値を求めた。
【００３６】
（２）２ステップ法用凍結乾燥試薬を用いた免疫測定（本発明）
（２−１）実施例２の（２）で得られた２ステップ法用凍結乾燥試薬のうち、抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子懸濁液の凍結乾燥物に標準試料５０μＬを、ＡＬＰ標識抗ＴＳＨ抗体溶液の凍結乾燥物に精製水７０μＬを、それぞれ添加して溶解撹拌後、３７℃にて５分間静置し、２ステップサンドイッチ法の第１反応を行なった。
（２−２）１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて第１Ｂ／Ｆ洗浄を３回行なった。
（２−３）溶解撹拌済みのＡＬＰ標識抗ＴＳＨ抗体試薬５０μＬを磁性粒子側の槽１１Ａに分注し、３７℃で３分間反応を行なった（第２反応）。
（２−４）（２−２）の洗浄液を用いて第２Ｂ／Ｆ洗浄を８回行なった。
（２−５）０．４ｍＭのＡＬＰ用化学発光基質溶液（東ソー、特許文献５）１００μＬを添加して３７℃・５分間反応させてエンドポイント測光し、測定値を求めた。
【００３７】
（３）  液状試薬を用いた１ステップ免疫測定法
（３−１）図１に示す２槽式円筒型測定容器１０の一方の槽１１Ａに４ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子懸濁液を１０μＬ、３．５μｇ／ｍＬのＡＬＰ標識抗ＴＳＨ抗体を４０μＬ、標準試料を５０μＬ添加して撹拌し、３７℃にて５分間静置することで、１ステップサンドイッチ法の抗原抗体反応を行なった。
（３−２）１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてＢ／Ｆ洗浄を８回行なった。
（３−３）０．４ｍＭのＡＬＰ用化学発光基質溶液（東ソー、特許文献５）１００μＬを添加して３７℃で５分間反応させてエンドポイント測光し、測定値を求めた。
【００３８】
（４）  液状試薬を用いた２ステップ免疫測定法
（４−１）図１に示す２槽式円筒型測定容器１０の一方の槽１１Ａに４ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨ抗体固定化磁性粒子懸濁液を１０μＬ、希釈液を４０μＬ、標準試料を５０μＬ添加して撹拌し、３７℃にて５分間静置して、２ステップサンドイッチ法の第１反応を行なった。
（４−２）１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて第１Ｂ／Ｆ洗浄を３回行なった。
（４−３）２．８μｇ／ｍＬのＡＬＰ標識抗ＴＳＨ抗体を５０μＬ添加し、３７℃で３分間反応を行なった（第２反応）。
（４−４）（４−２）の洗浄液を用いて第２Ｂ／Ｆ洗浄を８回行なった。
（４−５）０．４ｍＭのＡＬＰ用化学発光基質溶液（東ソー、特許文献５）１００μＬを添加して３７℃で５分間反応させてエンドポイント測光し、測定値を求めた。
【００３９】
結果を表１に示す。１ステップ法用および２ステップ法用の凍結乾燥試薬を用いてＴＳＨ標準液（０および１０μＩＵ／ｍＬ）をそれぞれ３回測定し、得られた平均カウント値（ｃｐｓ）および液状試薬での平均カウント値を１００％としたときの各凍結乾燥試薬の平均カウント値を相対％として計算した値（表１中かっこで示した値）を比較した。
【００４０】
【表１】
2011137694.tif 000002
【００４１】
１ステップ法用凍結乾燥試薬を用いた場合、ゼロ濃度標準試料のカウント値が液状試薬のカウント値に比べ、２．３倍（２３０％）と顕著に高値であった。これは、１ステップ法用凍結乾燥試薬が、抗体固定化磁性粒子と標識抗体とが混合した状態で凍結乾燥しているため、凍結乾燥工程中に局所濃縮した標識抗体が固相である磁性粒子と接触し、非特異吸着が生じやすくなったためと考えられる。一方、抗体固定化磁性粒子および標識抗体を個別に凍結乾燥した２ステップ用凍結乾燥試薬（本発明の試薬）においては、ゼロ濃度標準試料の平均カウント値が液状試薬の平均カウント値に比べて上昇していないことから、本発明の試薬が、低濃度域がより精度よく測定可能な、安定な試薬形態であることがわかる。
【符号の説明】
【００４２】
１０：測定容器
１１：槽
【図１】
2011137694.tif 000003