(57)【要約】【課題】アミノ酸などの低分子に対する高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを提供し、そして高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを効率よくスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】本発明は、原子間力顕微鏡を用いて核酸アプタマーをスクリーニングする方法を提供し、該方法は、（ａ）原子間力顕微鏡の探針に標的物質を固定する工程、（ｂ）平板の表面に核酸を非共有結合を介して固定する工程、（ｃ）工程（ａ）で得られた探針で、工程（ｂ）で得られた平板の表面を走査する工程、（ｄ）工程（ｃ）において、該平板の表面から遊離して該探針に捕捉された核酸を回収する工程、（ｅ）工程（ｄ）で得られた核酸について該標的物質に対する結合力を測定する工程、および（ｆ）工程（ｅ）で測定した結合力が一定値を示す核酸アプタマーが出現するまで、工程（ｂ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原子間力顕微鏡を用いて核酸アプタマーをスクリーニングする方法であって、
（ａ）原子間力顕微鏡の探針に標的物質を固定する工程、
（ｂ）平板の表面に核酸を非共有結合を介して固定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られた探針で、工程（ｂ）で得られた平板の表面を走査する工程、
（ｄ）工程（ｃ）において、該平板の表面から遊離して該探針に捕捉された核酸を回収する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた核酸について該標的物質に対する結合力を測定する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）で測定した結合力が一定値を示す核酸アプタマーが出現するまで、工程（ｂ）〜（ｅ）を繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸アプタマーが、ＤＮＡアプタマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的物質が、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的物質が、ロイシンである、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記平板が、金板である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）が、
（ｂ１）平板の表面にアビジンを固定する工程、
（ｂ２）ビオチンを末端に有する核酸を調製する工程、
（ｂ３）工程（ｂ１）で得られた平板の表面に工程（ｂ２）で得られた核酸を固定する工程
を含む、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）が、メチオニンを含有する溶液中で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記結合力が、表面プラズモン共鳴法により測定した前記標的物質に対する解離定数である、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記一定値が、１．５５×１０−６Ｍ以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の方法により得られるＤＮＡアプタマーであって、表面プラズモン共鳴法により測定されるＬ−ロイシンに対する解離定数が１．５５×１０−６Ｍ以下を示すＤＮＡアプタマー。
【請求項１１】
配列番号３に記載の塩基配列の１位から６４位までの塩基配列またはその相補配列、および配列番号４に記載の塩基配列の１位から２６位までの塩基配列またはその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アプタマーおよび核酸アプタマーのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、標的物質と特異的に結合する核酸分子やペプチドをいう。これまでに、有機化合物、タンパク質、核酸、細胞、細胞組織、微生物などの標的物質に対する種々のアプタマーが知られている。核酸アプタマーは、抗体のような特異的な分子認識が可能な生体物質として、薬剤などへの応用が期待されている。核酸アプタマーは、試験管内で化学的に、しかも短時間で合成可能であり、免疫原性もほとんどないか全くない点が抗体にはない利点である。
【０００３】
目的とする標的物質と特異的に結合する核酸アプタマーを得る方法はＳＥＬＥＸ法として知られている。通常、ランダム配列の巨大ライブラリから親和性クロマトグラフィーの原理を用いてスクリーニングを行う。しかし、１回のスクリーニングで得られる核酸の標的物質に対する結合力や特異性は十分でないため、スクリーニングで得られた核酸のライブラリからさらにスクリーニングを繰り返す必要がある。通常、スクリーニングを繰り返す回数は、標的物質にも依存するが、数回から十数回である。このため、十分な結合力と特異性を有する核酸アプタマーを得るためには、多くの労力と時間を要する。
【０００４】
ところで、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）を用いると、探針と試料との間に作用する力を検出することができる。探針はカンチレバーとも呼ばれ、このカンチレバーを試料に近づけていくと、カンチレバーと試料との間に生じる微弱な力の作用によりカンチレバーがたわみ、このたわみ量を光てこ方式により検出する。光てこ方式とは、半導体レーザーをカンチレバー背面に照射し、反射したレーザー光を上下左右に４分割された光センサーで検出する方法である。このカンチレバーのたわみ量と探針・試料間の距離との関係をプロットしたフォースカーブを解析することにより探針・試料間に作用する力や、試料の硬さに関する情報を得ることができる。また、検出したたわみ量は試料台にフィードバックされ、たわみ量が一定になるように試料台の高さを制御しながら、試料表面に沿って水平方向にカンチレバーを走査することにより、試料表面の形状を知ることができる。ＡＦＭは、大気中や液体中、高温や低温などの様々な環境下で、導体、絶縁体などの試料の区別なく使用できる。生体試料などを自然に近い状態で用いることも可能である。これらの特徴から、ＡＦＭは新規バイオセンシングのツールとして期待されている（非特許文献１および２）。
【０００５】
本発明者らは、核酸アプタマーを得るためのＳＥＬＥＸ法において、親和性クロマトグラフィーに代えて、ＡＦＭを用いるスクリーニング方法を試みた（非特許文献３）。すなわち、５’末端をビオチン化した１本鎖ＤＮＡをアビジンを介してＡＦＭの探針（カンチレバー）に固定し、このカンチレバーを用いて、標的物質としてトロンビンを固定した金板表面を走査した。カンチレバーに固定した１本鎖ＤＮＡの中にアプタマーが存在すれば、アプタマーは、大量のトロンビン上の走査の過程で漏れなく確実に、アビジン・ビオチン間の結合力よりも上回るアプタマー・トロンビン間の結合力により、カンチレバーから遊離して金板上に捕捉されると考えられる。そこで、カンチレバーに捕捉された１本鎖ＤＮＡを回収し、増幅して、さらにカンチレバーに固定して、同様の操作を繰り返した。この結果、得られる１本鎖ＤＮＡのトロンビンとの結合力は、スクリーニング操作を繰り返すごとに上昇すること、すなわちアプタマーがスクリーニングされていることを見出した。
【０００６】
しかし、非特許文献３に記載の方法では、ＡＦＭカンチレバーに固定できる１本鎖ＤＮＡの数が少ないことから、高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを得るためには、従来のＳＥＬＥＸ法と同様、数回以上のスクリーニングが必要であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Katoら、「In vitro selection of DNA aptamers which bind to cholic acid」、Biochimica et Biophysica Acta、2000年、第1493巻、p. 12-18
【非特許文献２】V. Dupresら、「Probing molecular recognition sites on biosurfaces using AFM」、Biomaterials、2007年、第28巻、p. 2393-2402
【非特許文献３】宮地ら、「原子間力顕微鏡を用いたＤＮＡ  ａｍｔａｍｅｒの選抜」、日本化学会第８８春季年会講演予稿集、社団法人日本化学会、平成２０年３月１２日、４Ａ４−３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アミノ酸などの低分子に対する高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを提供し、そして高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを効率よくスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、原子間力顕微鏡を用いて核酸アプタマーをスクリーニングする方法において、原子間力顕微鏡の探針に標的物質を固定し、かつ探針で走査する平板の表面に核酸を固定することによって、高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを効率よくスクリーニングする方法を提供できることを見出し、本発明を完成した。この方法により、アミノ酸などの低分子に対する高い特異的結合力を有する核酸アプタマーが得られる。
【００１０】
本発明は、原子間力顕微鏡を用いて核酸アプタマーをスクリーニングする方法を提供し、該方法は、（ａ）原子間力顕微鏡の探針に標的物質を固定する工程、（ｂ）平板の表面に核酸を非共有結合を介して固定する工程、（ｃ）工程（ａ）で得られた探針で、工程（ｂ）で得られた平板の表面を走査する工程、（ｄ）工程（ｃ）において、該平板の表面から遊離して該探針に捕捉された核酸を回収する工程、（ｅ）工程（ｄ）で得られた核酸について該標的物質に対する結合力を測定する工程、および（ｆ）工程（ｅ）で測定した結合力が一定値を示す核酸アプタマーが出現するまで、工程（ｂ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含む。
【００１１】
１つの実施態様では、上記核酸アプタマーは、ＤＮＡアプタマーである。
【００１２】
１つの実施態様では、上記標的物質は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記標的物質は、ロイシンである。
【００１４】
１つの実施態様では、上記平板は、金板である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記工程（ｂ）は、（ｂ１）平板の表面にアビジンを固定する工程、（ｂ２）ビオチンを末端に有する核酸を調製する工程、（ｂ３）工程（ｂ１）で得られた平板の表面に工程（ｂ２）で得られた核酸を固定する工程を含む。
【００１６】
１つの実施態様では、上記工程（ｃ）は、メチオニンを含有する溶液中で行われる。
【００１７】
１つの実施態様では、上記結合力は、表面プラズモン共鳴法により測定した前記標的物質に対する解離定数である。
【００１８】
ある実施態様では、上記一定値は、１．５５×１０−６Ｍ以下である。
【００１９】
本発明は、上記方法により得られるＤＮＡアプタマーを提供し、該ＤＮＡアプタマーは、表面プラズモン共鳴法により測定されるＬ−ロイシンに対する解離定数が１．５５×１０−６Ｍ以下を示す。
【００２０】
本発明は、配列番号３に記載の塩基配列の１位から６４位までの塩基配列またはその相補配列、および配列番号４に記載の塩基配列の１位から２６位までの塩基配列またはその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡアプタマーを提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、アミノ酸などの低分子に対する高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを提供し、そして高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを効率よくスクリーニングする方法を提供することができる。本発明によれば、核酸アプタマーをバイオセンサーのセンサー素子やドラッグデリバリーシステムのターゲッティング分子として応用できる可能性が広がる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の方法の概略を示す模式図である。
【図２】Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力を示すヒストグラム（ａ）および（ｂ）、ならびにその平均値を示すグラフ（ｃ）である。
【図３】Ｌ−ロイシンまたはＬ−メチオニンと１本鎖ＤＮＡとの結合力の平均値を示すグラフである。
【図４】ＳＰＲセンサーチップへのＬ−ロイシンの固定手順を示す模式図である。
【図５】Ｌ−ロイシンを固定したＳＰＲセンサーチップにＬＡ−１をインジェクトした場合のＳＰＲシグナルの経時変化を示すセンサーグラム（ａ）およびＬＡ−１の濃度とＳＰＲシグナルの平衡値との関係を示すグラフ（ｂ）である。
【図６】Ｌ−ロイシンを固定したＳＰＲセンサーチップにＬＢ−１をインジェクトした場合のＳＰＲシグナルの経時変化を示すセンサーグラム（ａ）およびＬＢ−１の濃度とＳＰＲシグナルの平衡値との関係を示すグラフ（ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明で用いる原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）とは、走査型プローブ顕微鏡の一種で、探針と試料との原子間に作用する力を検出して画像を得る顕微鏡をいう。例えば、セイコーインスツル株式会社製、オリンパス株式会社製、株式会社島津製作所製の原子間力顕微鏡が挙げられる。
【００２４】
本発明でいう核酸アプタマーとは、標的物質と特異的に結合する核酸分子をいう。核酸アプタマーの標的物質との結合力は、後述するように一定値を示す必要がある。核酸アプタマーとしては、例えば、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーが挙げられるが、安定性の観点からＤＮＡアプタマーが好ましい。核酸の塩基配列の長さは特に制限されないが、好ましくは２０〜１００塩基である。図１に示すように、２次構造として、ヘアピン型、バルジ型、Ｇ−カルテット型などをとるものが知られているが、２次構造は特に制限されない。
【００２５】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の探針（以下、カンチレバーということがある）の材質は特に制限されない。金または金コーティングされた材料が好ましい。金の単分子結晶は、チオール基やジスルフィド基を持つ分子と特異的に結合して、単分子膜を形成する（自己組織化膜形成）。
【００２６】
原子間力顕微鏡の探針に標的物質を固定する方法は、平板の表面に核酸を固定する方法（以下で詳述）で作用する力よりも強い力で固定できる方法であればよい。例えば、共有結合を介して固定する方法が挙げられる。共有結合を介して固定する方法としては、例えば、架橋剤を用いる方法が挙げられる。架橋剤としては、例えば、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド）が挙げられる。
【００２７】
本発明で用いる標的物質は特に制限されない。無機物と有機物とを問わない。有機物としては、例えば、有機化合物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、糖が挙げられる。細胞、細胞組織、微生物などであってもよい。
【００２８】
本発明で用いる平板は、核酸を固定できればよく、材質も特に制限されない。好ましくは平板であり、金または金コーティングされた材料が好ましい。
【００２９】
平板の表面に核酸を固定する方法は、上記の原子間力顕微鏡の探針に標的物質を固定する方法で作用する力よりも弱い力で固定できる方法であればよく、好ましくは非共有結合を介して固定する方法である。非共有結合を介して固定する方法としては、例えば、イオン結合を介して固定する方法、分子間力を介して固定する方法が挙げられる。好ましくは、分子間力を介して固定する方法である。分子間力を介して固定する方法としては、例えば、抗体・抗原間の結合力を介して固定する方法、リガンド・受容体間の結合力を介して固定する方法、アビジン・ビオチン間の結合力を介して固定する方法が挙げられる。
【００３０】
アビジン・ビオチン間の結合力を介して固定する方法は、好ましくは、平板の表面にアビジンを固定する工程、ビオチンを末端に有する核酸を調製する工程、アビジンを固定した平板の表面にビオチンを末端に有する核酸を固定する工程を含む。
【００３１】
アビジンとしては、例えば、卵白由来のアビジン、ストレプトマイセス属細菌由来のストレプトアビジンが挙げられる。
【００３２】
平板の表面にアビジンを固定する方法としては、例えば、架橋剤を用いる方法が挙げられる。架橋剤としては、例えば、ＤＴＳＳＰ、ＳＰＤＰ、ＥＭＣＳが挙げられる。
【００３３】
ビオチンを末端に有する核酸を調製する方法は特に制限されない。例えば、核酸を化学合成し、５’末端または３’末端にビオチンを共有結合させる方法が挙げられる。あるいは予めビオチンを５’末端に有するプライマーを調製し、このプライマーを用いてＰＣＲ法などにより核酸を合成する方法が挙げられる。
【００３４】
アビジンを固定した平板の表面にビオチンを末端に有する核酸を固定する方法は特に制限されない。例えば、ビオチンを末端に有する核酸の溶液にアビジンを固定した平板を浸漬する方法が挙げられる。ビオチンを末端に有する核酸の溶液中の核酸の濃度としては、１μＭが好ましい。
【００３５】
標的物質を固定した探針で、核酸を固定した平板の表面を走査する方法は特に制限されない。例えば、大気中で走査する方法、液体中で走査する方法が挙げられる。生理学的条件を考慮すると、液体中で走査する方法が好ましい。スクリーニングの効率を上げる観点から、標的物質と類似する構造を有する物質を含有する溶液中で走査する方法がより好ましい。例えば、標的物質がロイシンの場合には、ロイシンと類似する構造を有するメチオニンを溶液中に含有させることがより好ましい。また、例えば、標的物質がバリンの場合には、バリンと類似する構造を有するアラニンとイソロイシンとを溶液中に含有させることがより好ましい。
【００３６】
核酸を固定した平板の表面から遊離して標的物質を固定した探針に捕捉された核酸を回収する方法は特に制限されない。例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。
【００３７】
得られた核酸について、標的物質に対する結合力を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＡＦＭ法により測定する方法、解離定数を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により測定する方法が挙げられる。結合力の解析に加えて速度論的解析もできる点でＳＰＲ法が好ましい。
【００３８】
本発明では、結合力が一定値を示す核酸アプタマーが出現するまで、上記工程を繰り返す。一定値としては、結合力がＳＰＲ法により解離定数として測定される場合、好ましくは２×１０−６Ｍ以下、より好ましくは１．５５×１０−６Ｍ以下である。
【００３９】
上記方法によりＤＮＡアプタマーを得ることができる。このようにして得られた本発明のＤＮＡアプタマーは、例えば、配列番号３または４に記載の塩基配列またはその相補配列を有する。本発明のＤＮＡアプタマーは、ＳＰＲ法により測定されるＬ−ロイシンに対する解離定数が１．５５×１０−６Ｍ以下を示す。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下の実施例において、％は％(w/v)を表す。
【００４１】
実施例１：ＡＦＭカンチレバーへのＬ−ロイシンの固定
ＡＦＭ（セイコーインスツル株式会社製）のカンチレバー（Ｂｉｏ−ｌｅｖｅｒ；金コーティング；ばね定数：０．０３Ｎ／ｍ；共振周波数：３７ｋＨｚ；レバーの長さ：６０μｍ；レバーの高さ：７μｍ）をオゾン発生装置（和研薬株式会社製）内に１時間静置して、カンチレバー表面上の有機物を除去した。このカンチレバーを、４ｍｇ／ｍＬのＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］；ＰＩＥＲＣＥ社製）溶液１００μＬに浸漬し、室温にて３０分間遮光静置した後、超純水１０ｍＬで洗浄した。この過程で、ＤＴＳＳＰ分子中のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が切れて形成されたチオール基（−ＳＨ）がカンチレバー表面の金単分子結晶と結合する。次いで、リン酸緩衝液（ＰＢＳ；１００ｍＭリン酸，１５０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．５）にて調製した２０ｍｇ／ｍＬのＬ−ロイシン（ナカライテスク株式会社製）溶液１００μＬに浸漬し、室温にて１時間遮光静置した後、フォールディング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１０ｍＬで洗浄した。この過程で、ＤＴＳＳＰ分子末端のスクシンイミド基がＬ−ロイシン分子中のアミノ基と結合する。このようにして、Ｌ−ロイシンを固定したＡＦＭカンチレバーを調製した。
【００４２】
実施例２：金板表面への１本鎖ＤＮＡの固定（ラウンド１スクリーニング）
（２本鎖ＤＮＡライブラリの作製）
６０塩基のランダム配列を有する１本鎖ＤＮＡの混合液（Ｎ６０溶液）を鋳型ＤＮＡ溶液として用いて、以下の反応液組成および反応条件でＰＣＲ反応を行った。
【００４３】
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ溶液                １μＬ
Ｐ１プライマー（配列番号１）  ２μＬ
Ｐ２プライマー（配列番号２）  ２μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）        ５μＬ
１０×緩衝液                  ５μＬ
蒸留水                    ３．５μＬ
ポリメラーゼ              ０．５μＬ
計                          ５０μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）、１０×緩衝液およびポリメラーゼは、Expand Long Template PCR System（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）のものを用いた。
【００４４】
＜反応条件＞
９５℃：１分→９５℃：２分→（９５℃：１５秒→７２℃：３０秒）×２０→７２℃：１０分→４℃
【００４５】
次いで、反応液５０μＬに６×サンプル緩衝液（３０％グリセロール，０．２５％ブロモフェノールブルー，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１０μＬを混合し、混合液を９％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。電気泳動用緩衝液には、ＴＢＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭホウ酸，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いた。電気泳動したゲルを０．１％のエチジウムブロミド溶液に浸漬し、エチジウムブロミド溶液から取り出したゲルに３６５ｎｍのＵＶを照射して、約８０〜１２０塩基対の長さの２本鎖ＤＮＡを含有するゲルを切り出した。切り出したゲルから常法に従い２本鎖ＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ＝８．０）１００μＬに溶解して、２本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。
【００４６】
（ビオチンを末端に有する１本鎖ＤＮＡライブラリの作製）
上記２本鎖ＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いて、以下の反応液組成および反応条件でＰＣＲ反応を行った。ビオチンを５’末端に有するビオチン化Ｐ１プライマーは、ライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して作製した。
【００４７】
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ溶液                          １μＬ
ビオチン化Ｐ１プライマー（配列番号１）  ２μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）                  ５μＬ
１０×緩衝液                            ５μＬ
蒸留水                            ３６．５μＬ
ポリメラーゼ                        ０．５μＬ
計                                    ５０μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）、１０×緩衝液およびポリメラーゼは、Expand Long Template PCR System（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）のものを用いた。
【００４８】
＜反応条件＞
９５℃：１分→９５℃：２分→（９５℃：１５秒→７２℃：３０秒）×４５→７２℃：１０分→４℃
【００４９】
次いで、反応液にエタノールを混合して沈殿を生じさせ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液４５μＬに溶解して、１本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。
【００５０】
（金板表面への１本鎖ＤＮＡの固定）
スライドガラス（松浪硝子工業株式会社製）に、３７７ｐａｒｔＡ（エポキシ樹脂；Ｅｐｏｘｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１５０μＬと３７７ｐａｒｔＢ（硬化剤；Ｅｐｏｘｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１５０μＬとの混合液５μＬを滴下し、次いで金蒸着ウエハ（株式会社ＳＵＭＣＯ製）を接着させた。これをマッフル炉（株式会社デンケン製）に入れ、１５０℃にて１時間加熱してエポキシ樹脂を固めた後、自然冷却した。スライドガラスからウエハを剥がして、金表面を有するスライドガラスを金板として得た。
【００５１】
この金板に、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて調製した４ｍｇ／ｍＬのＤＴＳＳＰ溶液１００μＬを丁寧に滴下し、次いで金板を室温にて３０分間遮光静置した後、超純水１０ｍＬで洗浄した。この過程で、ＤＴＳＳＰ分子中のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が切れて形成されたチオール基（−ＳＨ）が金板表面の金単分子結晶と結合する。この金板に、ＰＢＳにて調製した１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１００μＬを丁寧に滴下し、次いで金板を室温にて１時間遮光静置した後、ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄した。この過程で、ＤＴＳＳＰ分子末端のスクシンイミド基がストレプトアビジン分子中のアミノ基と結合する。この金板に、フォールディング緩衝液にてＯＤ（２６０ｎｍ）＝０．４となるように調製した１本鎖ＤＮＡ溶液１００μＬを丁寧に滴下し、次いで金板を室温にて１時間遮光静置した後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０１％含むフォールディング緩衝液１０ｍＬ、次いでフォールディング緩衝液１０ｍＬで洗浄した。このようにして、１本鎖ＤＮＡを固定した金板を作製した。
【００５２】
実施例３：ＡＦＭのカンチレバーによる金板表面の走査（ラウンド１スクリーニング）
以下の走査条件で常法に従い、実施例１で調製したＡＦＭカンチレバーを用いて、実施例２で作製した金板の表面を走査し、ＡＦＭカンチレバーと金板表面との間に作用する力（Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力）を測定した。結果を図２（ａ）に示す。
【００５３】
＜走査条件＞
ＡＦＭ：コンタクトモード、ＦＣＭ（Ｆｏｒｃｅ  Ｃｕｒｖｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ）測定モード
分解能：２０μｍ×２０μｍ→５１２×５１２画素
走査周波数：１Ｈｚ
走査溶液：フォールディング緩衝液にて調製した１００ｍＭメチオニン（ナカライテスク株式会社製）溶液
【００５４】
実施例４：ＡＦＭカンチレバーに捕捉された１本鎖ＤＮＡの回収（ラウンド１スクリーニング）
実施例３の走査を終了したカンチレバーを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むフォールディング緩衝液１０ｍＬで洗浄し、次いで１％ＤＭＳＯを含むＴＥ緩衝液２００μＬに浸漬し、９８℃にて５分間加熱した後、氷上にて５分間冷却した。溶液を回収し、溶液にエタノールを混合して沈殿を生じさせ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液２０μＬに溶解して、１本鎖ＤＮＡ溶出液を得た。
【００５５】
実施例５：ラウンド２スクリーニング
実施例２において、鋳型ＤＮＡ溶液としてＮ６０溶液の代わりに実施例４で得られた１本鎖ＤＮＡ溶出液を用いたこと以外は、実施例２〜４と同様にして、１本鎖ＤＮＡ溶出液を得た。
【００５６】
実施例６：ラウンド３スクリーニング
実施例２において、鋳型ＤＮＡ溶液としてＮ６０溶液の代わりに実施例５で得られた１本鎖ＤＮＡ溶出液を用いたこと以外は、実施例２〜４と同様にして、１本鎖ＤＮＡ溶出液を得た。Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力を測定した結果を図２（ｂ）に示す。
【００５７】
実施例７：ラウンド４スクリーニング
実施例２において、鋳型ＤＮＡ溶液としてＮ６０溶液の代わりに実施例６で得られた１本鎖ＤＮＡ溶出液を用いたこと以外は、実施例２〜４と同様にして、１本鎖ＤＮＡ溶出液を得た。
【００５８】
実施例５、６および７において測定した、Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力の平均値を図２（ｃ）に示す。図２（ｃ）に示すように、Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力の平均値は、実施例２〜４（ラウンド１）、実施例５（ラウンド２）および実施例６（ラウンド３）とスクリーニングのラウンドが進むにしたがって、それぞれ６６．２ｐＮ、８９．５ｐＮおよび１３４．８ｐＮと増加したが、実施例７（ラウンド４）ではラウンドが進んだにもかかわらず１２９．０ｐＮと減少した。最終的に、Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力の平均値として最も高い値は、実施例６（ラウンド３）において、実施例５（ラウンド２）で得られた１本鎖ＤＮＡ溶出液を用いた場合の１３４ｐＮであった。このように、Ｌ−ロイシンに対する高い結合力を有する１本鎖ＤＮＡがわずか２ラウンドのスクリーニングで得られることがわかった。したがって、本発明の方法は、従来のＳＥＬＥＸ法に比べてスクリーニングのラウンド数を大幅に減少させることができる。
【００５９】
実施例８：実施例５（ラウンド２スクリーニング）で得られた１本鎖ＤＮＡの評価
実施例２において、鋳型ＤＮＡ溶液としてＮ６０溶液の代わりに実施例５で得られた１本鎖ＤＮＡ溶出液を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、１本鎖ＤＮＡを固定した金板を作製した。
【００６０】
（Ｌ−ロイシンに対する結合力の評価）
走査溶液としてフォールディング緩衝液にて調製した１００ｍＭメチオニン溶液の代わりにフォールディング緩衝液を用いたこと以外は実施例３と同様の走査条件で常法に従い、実施例１で調製したＬ−ロイシンを固定したＡＦＭカンチレバーを用いて、上記作製した金板の表面を走査し、ＡＦＭカンチレバーと金板表面との間に作用する力（Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力）を測定した。結果を図３に示す。Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力は、６７．２ｐＮであった。
【００６１】
（Ｌ−メチオニンに対する結合力の評価）
Ｌ−ロイシンの代わりにＬ−メチオニンを用いたこと以外は実施例１と同様にして、Ｌ−メチオニンを固定したＡＦＭカンチレバーを調製した。
【００６２】
走査溶液としてフォールディング緩衝液にて調製した１００ｍＭメチオニン溶液の代わりにフォールディング緩衝液を用いたこと以外は実施例３と同様の走査条件で常法に従い、上記調製したＬ−メチオニンを固定したＡＦＭカンチレバーを用いて、上記作製した金板の表面を走査し、ＡＦＭカンチレバーと金板表面との間に作用する力（Ｌ−メチオニンと１本鎖ＤＮＡとの結合力）を測定した。結果を図３に示す。Ｌ−メチオニンと１本鎖ＤＮＡとの結合力は、１６．６ｐＮであった。
【００６３】
図３に示すように、実施例５で得られた１本鎖ＤＮＡを固定した金板を用いた場合、Ｌ−ロイシンと１本鎖ＤＮＡとの結合力の方が、Ｌ−メチオニンと１本鎖ＤＮＡとの結合力よりも大きかった。このことから、実施例５では、Ｌ−ロイシンに対する高い特異的結合力を有する１本鎖ＤＮＡが得られたものと考えられる。
【００６４】
実施例９：実施例５（ラウンド２スクリーニング）で得られた１本鎖ＤＮＡの単離および塩基配列解読
（１本鎖ＤＮＡの単離）
鋳型ＤＮＡ溶液として実施例５で得られた１本鎖ＤＮＡ溶出液を用いたこと以外は実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
【００６５】
次いで、反応液にエタノールを混合して沈殿を生じさせ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液２０μＬに溶解して、１本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。
【００６６】
次いで、以下の反応液組成でライゲーション反応を１６℃にて６時間以上行った。
【００６７】
＜反応液組成＞
pTA2 vector（東洋紡績株式会社製）                         １μＬ
１本鎖ＤＮＡ溶液                                          ４μＬ
Ｉ液（DNA Ligation Kit Ver.2.1；タカラバイオ株式会社製）  ５μＬ
計                                                      １０μＬ
【００６８】
次いで、反応液１０μＬを大腸菌コンピテントセル（Ｎｏｖａ  ｂｌｕｅ；タカラバイオ株式会社製）１００μＬと混合し、混合液で常法に従い大腸菌を形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上でスクリーニングした。
【００６９】
次いで、得られた大腸菌の形質転換体から、常法のアルカリＳＤＳ法に従い、プラスミドを抽出した。プラスミド抽出液に等量の１３％ポリエチレングリコール溶液を混合して沈殿を生じさせ、沈殿をＴＥ緩衝液５０μＬに溶解して、プラスミド溶液を調製した。
【００７０】
次いで、得られたプラスミドがインサートを有しているか否かを確認するために、得られたプラスミド溶液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いて、以下の反応液組成および反応条件でＰＣＲ反応を行った。
【００７１】
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ溶液                ０．４μＬ
Ｐ１プライマー（配列番号１）  ０．４μＬ
Ｐ２プライマー（配列番号２）  ０．４μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）        １．０μＬ
１０×緩衝液                  １．０μＬ
蒸留水                      ６．７８μＬ
ポリメラーゼ                ０．０２μＬ
計                              １０μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）、１０×緩衝液およびポリメラーゼは、Expand Long Template PCR System（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）のものを用いた。
【００７２】
＜反応条件＞
９５℃：２分→（９５℃：１５秒→７２℃：３０秒）×２０→７２℃：１０分→４℃
【００７３】
次いで、実施例２と同様にして、反応液１０μＬに６×サンプル緩衝液２μＬを混合し、混合液を９％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。電気泳動したゲルを０．１％のエチジウムブロミド溶液に浸漬し、エチジウムブロミド溶液から取り出したゲルに３６５ｎｍのＵＶを照射して、約８０〜１２０塩基対の長さの２本鎖ＤＮＡの有無を確認した。このようにして、インサートを有しているプラスミドクローンをスクリーニングした。
【００７４】
（１本鎖ＤＮＡの塩基配列解読）
インサートを有しているプラスミドクローンについて、プラスミド溶液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いて、以下の反応液組成および反応条件でＰＣＲ反応を行った。
【００７５】
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ溶液                                    １μＬ
M13 Rvプライマー（タカラバイオ株式会社製）        １μＬ
DTCS Quick Start Master Mix（ＢＥＣＫＭＡＮ社製） ４μＬ
蒸留水                                            ４μＬ
計                                              １０μＬ
【００７６】
次いで、得られた反応液についてBECKMAN CEQ8000（ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を用いて塩基配列解読を行った。解読したクローンＬＡ−１（６４ｍｅｒ）およびＬＢ−１（２６ｍｅｒ）の塩基配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。
【００７７】
ＬＡ−１は、内部に「ＧＧＧＧＴＧＧＧＧ」の配列を含んでおり、Ｇカルテット構造（図１参照）の存在が示唆される。
【００７８】
実施例１０：実施例９で単離した１本鎖ＤＮＡのＳＰＲ法による評価
（ＳＰＲセンサーチップへのＬ−ロイシンおよびＬ−メチオニンの固定）
２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて調製した１０ｍｇ／ｍＬのＬ−ロイシン溶液５０μＬとＤＭＳＯにて調製した１５ｍｇ／ｍＬのＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド；株式会社同仁化学研究所製）溶液５０μＬとを混合し、室温にて遮光下、１．５時間反応させた。この反応液１００μＬに５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）９００μＬを混合して、１ｍｇ／ｍＬのＬ−ロイシン−ＥＭＣＳ溶液を調製した。
【００７９】
同様にして、１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン−ＥＭＣＳ溶液を調製した。
【００８０】
次いで、以下の固定手順に従い、ＳＰＲ測定装置Biacore 3000（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）のセンサーチップにＬ−ロイシンまたはコントロールとしてＬ−メチオニンを固定した。この固定においては、図４に示すように、１本鎖ＤＮＡがＬ−ロイシンと十分相互作用できるように、ＳＰＲセンサーチップとＬ−ロイシンとの間にシスタミンおよびＥＭＣＳを介在させた。
【００８１】
＜固定手順＞
１．ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）との等量混合液１００μＬを流速１０μＬ／分でインジェクトした（ＳＰＲセンサーチップへのＮＨＳの固定）。
２．５００ｍＭシスタミン溶液７０μＬを流速５μＬ／分で３回インジェクトした（ＮＨＳへのシスタミンの結合）。
３．超純水にて調製した１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液３００μＬを流速１０μＬ／分でインジェクトした（シスタミンの還元）。
４．１ｍｇ／ｍＬのＬ−ロイシン−ＥＭＣＳ溶液またはＬ−メチオニン−ＥＭＣＳ溶液３０μＬを流速５μＬ／分で１０回インジェクトした（シスタミンへのＬ−ロイシン−ＥＭＣＳまたはＬ−メチオニン−ＥＭＣＳの結合）。
【００８２】
ＳＰＲセンサーチップへの固定量は、Ｌ−ロイシンでは２５２ＲＵ、およびＬ−メチオニンでは１６７ＲＵであった。
【００８３】
（実施例９で単離した１本鎖ＤＮＡの表面プラズモン共鳴法による評価）
実施例９で単離したＬＡ−１およびＬＢ−１の溶液の濃度をＴＥ緩衝液にて１μＭに調整し、この溶液２０μＬを、Ｌ−ロイシンを固定したＳＰＲセンサーチップに流速５μＬ／分でインジェクトした。同様にして、０．５および０．４μＭに調整した溶液をインジェクトした。結果をそれぞれ図５および６に示す。
【００８４】
図５（ｂ）に示すように、ＬＡ−１については、解離定数ＫＤ＝１．３３×１０−７という値が得られた。図６（ｂ）に示すように、ＬＢ−１については、ＫＤ＝１．５５×１０−６という値が得られた。これらの値は、アミノ酸のような小分子に対するアプタマーとして機能するには、十分であると考えられる。なお、Ｌ−メチオニンを固定したＳＰＲセンサーチップを用いた場合には、ＬＡ−１またはＬＢ−１とＬ−メチオニンとの結合を示すＳＰＲシグナルは得られなかった（データを示さず）。このように、２回のスクリーニングによってＤＮＡアプタマーを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、アミノ酸などの低分子に対する高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを提供し、そして高い特異的結合力を有する核酸アプタマーを効率よくスクリーニングする方法を提供することができる。本発明によれば、核酸アプタマーをバイオセンサーのセンサー素子やドラッグデリバリーシステムのターゲッティング分子として応用できる可能性が広がる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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