(57)【要約】      （修正有）【課題】ニジマス等の養殖場において発生するミスカビ病に有用な抗カビ剤である新規化合物及びその製造法の提供。【解決手段】式（Ｉ’）2011093836.tif 000008で表される化合物又はその塩、及び微生物を用いる該化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2011093836.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ６−１４アリール基を示し、
Ｒ２は、水素原子又は置換されていてもよいヒドロキシル基を示し、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、又はアシル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がすべて水素原子であって、式（Ｉ’）：
【化２】
2011093836.tif 000007
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物を生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積させ、該化合物を採取することを特徴とする請求項１に記載の化合物の製造法。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含む抗カビ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗カビ物質として有用な新規化合物、および微生物を用いたその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くから、淡水魚、例えばニジマス等の養殖場において、ミズカビ病といわれる魚病が問題となっている。ミズカビ病は、卵菌網（Oomycetes）、ミズカビ目（Saprolegniales）、ミズカビ科（Saprolegniaceae）のミズカビ属（Saprolegnia）、ワタカビ属（Achlya）、アファノマイセス属（Aphanomyces）の種によって引き起こされる。卵菌網は、近年の分子解析および生化学的な研究により、原生生物界の不等毛類に分類され、菌類様の外見を持ち（非特許文献１）、植物病原菌のPhytophthora属もこのグループに属している。
【０００３】
従来、色素剤のマラカイトグリーンがミズカビ病の起因生物に低濃度で活性を示し（非特許文献２）、また、安価であることから予防・治療剤として使用されてきた。しかし、近年、その発がん性が懸念され、養殖食用魚への使用が禁止された。これの代替品となる養殖魚又は魚卵のミズカビ病防止薬剤として、例えば、オゾン（特許文献１）、電解水（特許文献２）、有機酸（特許文献３）及びバチルス・ズブチリス菌（特許文献４）が提案されている。また、合成抗菌保存剤のブロノポール（C3H6BrNO4）を有効成分とする薬剤（商品名「パイセス」、ノバルティスアニマルヘルス株式会社製）などが販売されている。しかし、「パイセス」はマラカイトグリーンと比べて高価であり、また、有効成分であるブロノポールには食用カキ（EC50  0.77mg/L）、魚類の餌として有用なミジンコ（EC50  1.4mg/L）、緑藻（EC50  0.0537mg/L）などの水棲生物に強い毒性が認められているため（非特許文献３）、廃棄する際に大量の水での希釈を必要とする等の問題がある。よって、より安全で効果の高い抗カビ剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平０５−２３６８４３号公報
【特許文献２】特開平１１−２６６７３３号公報
【特許文献３】特開２００７−２５４４６３号公報
【特許文献４】国際公開第２００６／１０１０６０号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】千原光雄、藻類の多様性と系統、裳華房  (１９９９)
【非特許文献２】江草周三、魚介類の感染症・寄生虫病、恒星社厚生閣  （２００４）
【非特許文献３】マテリアル・セイフティー・データ・シート  プロダクト・コード：#0585  （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、新規な抗カビ物質を天然界から検索し、その新規物質およびその製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、ストレプトマイセス属に属する微生物の培養液から得られた化合物が、選択的な抗ミズカビ物質であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
・  式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
2011093836.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ６−１４アリール基を示し、
Ｒ２は、水素原子又は置換されていてもよいヒドロキシル基を示し、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、又はアシル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【００１０】
（２）式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がすべて水素原子であって、式（Ｉ’）：
【００１１】
【化２】
2011093836.tif 000003
【００１２】
で表される（１）に記載の化合物又はその塩。
（３）（１）に記載の化合物を生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積させ、該化合物を採取することを特徴とする（１）に記載の化合物の製造法。
（４）（１）に記載の化合物を有効成分として含む抗カビ剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、新規な抗カビ物質及び該物質の微生物を用いた製造法を提供する。本発明の化合物は、高い抗カビ活性を有するため、抗カビ剤、具体的には、魚病の予防又は治療剤、または卵菌類を起因生物とする植物疫病の防除剤成分として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明の化合物は、放線菌（ストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株等）から単離・精製された化合物であり、抗カビ活性を有するものである。本発明の化合物の性質及びその製造方法について以下に詳述する。
１．本発明の化合物の性質
本発明の化合物は、式（Ｉ）：
【００１６】
【化３】
2011093836.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ６−１４アリール基を示し、
Ｒ２は、水素原子又は置換されていてもよいヒドロキシル基を示し、
Ｒ３及びＲ４は同一又は異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、又はアシル基を示す。）
で表される化合物（以下、「式（Ｉ）の化合物」という場合もある）である。
【００１８】
Ｒ１におけるＣ１−６アルキル基として、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
【００１９】
Ｃ６−１４アリール基として、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ２における置換されていてもよいヒドロキシル基の置換基として、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基等を挙げることができる。
【００２１】
ここで、Ｃ１−６アルキル基として、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
【００２２】
Ｃ２−６アルケニル基として、例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル等が挙げられる。
【００２３】
Ｃ２−６アルキニル基として、例えば、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル等が挙げられる。
【００２４】
Ｃ３−６シクロアルキル基として、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。
【００２５】
Ｃ６−１４アリール基として、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。
【００２６】
Ｃ７−１６アラルキル基として、例えば、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル等が挙げられる。
【００２７】
アシル基として、例えば、アセチル基、プロパノイル基、ベンゾイル基等が挙げられる。
【００２８】
Ｒ３及びＲ４におけるＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、及びアシル基の例として、上記Ｒ２におけるヒドロキシル基の置換基（Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基）と同じものを挙げることができる。
【００２９】
なお、式（Ｉ）の化合物は、従来の方法に従って塩（特に酸付加塩）を形成することができる。形成された化合物の塩も、本願発明に含まれる。
【００３０】
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、酢酸塩等が挙げられる。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物の塩基付加塩としては無機塩基又は有機塩基との塩が挙げられる。無機塩基との塩として、例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等が挙げられる、有機塩基との塩として、例えば、第１級、第２級及び第３級脂肪族及び芳香族アミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、４種のブチルアミン異性体、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、キヌクリジン、ピリジン、キノリン及びイソキノリン、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、ヒドラバミン）との塩、ならびに例えばアルギニン、リシンなどのようなアミノ酸との塩が挙げられる。
【００３２】
本発明の式（Ｉ）の化合物又はその塩は溶媒和物としても提供され得る。溶媒和物として、例えば、水和物、アルコール（例えば、メタノール、エタノール等）和物等が挙げられる。
【００３３】
上記式（Ｉ）で表される化合物の中で、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子又はヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４が水素原子である化合物が好ましい。
【００３４】
より好ましい化合物は、上記式（Ｉ）で表される化合物の中で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がすべて水素原子である化合物である。すなわち、下記式（Ｉ’）：
【００３５】
【化４】
2011093836.tif 000005
【００３６】
で表される化合物（以下、「式（Ｉ’）の化合物」という場合もある）がより好ましい。
【００３７】
上記式（Ｉ’）で表される化合物の構造式及び理化学的性質は以下のとおりである：
（１）物質の色 ：無色
（２）分子量 ：363
（３）分子式 ：C23H25NO3
（４）質量分析 ：高分解能FABMS（高速中性粒子衝突イオン化質量分析）、実測値 362.1743（M−H）−、計算値362.1756（C23H24NO3）
（５）紫外線吸収スペクトル（メタノール中） λmax（logε） 216nm (4.34), 237(4.47), 261(4.11), 300(4.13)
（６）比旋光度[α]D92.0°（c = 0.1、メタノール）
（７）１Ｈ  ＮＭＲ（重メタノール中で測定、600MHz）
δppm 1.26(3H, s, H-17), 1.47(3H, s, H-18), 1.51(1H, dd, J=11.8, 1.8Hz, H-5), 1.58(1H, dt, J=13.1, 3.6Hz, H-1a), 1.91(1H, dq, J=13.6, 3.6Hz, H-2a), 2.18(1H, m, H-6a), 2.24(1H, m, H-6b), 2.28(1H, dq, J=13.1, 3.2Hz, H-2b), 2.58(1H, dt, J=13.1, 3.1Hz, H-1b), 3.03(1H, dt, J=12.7, 5.9Hz, H-7a), 3.10(1H, dt, J=16.3, 3.6 Hz, H-7b), 3.23(1H, dd, J=12.3, 4.6Hz, H-3), 7.03(1H, s, H-8), 7.05(1H, t, J=6.8 Hz, H-12), 7.25(1H, , t, J=7.3 Hz, H-11), 7.32(1H, d, J=7.7 Hz, H-10), 7.93(1H, d, J=7.3Hz, H-13), 7.94(1H, s, H-14), 10.86(1H, s, NH)
（８）１３Ｃ  ＮＭＲ(重メタノール中で測定、125MHz)
δppm 21.57(t, C-6), 23.56(q, C-18), 23.89(q, C-17), 29.20(t, C-2), 32.87(t, C-7), 38.93(s, C-15), 39.00(t, C-1), 48.48(s, C-4), 53.12(d, C-5), 78.02(d, C-3), 109.58(d, C-8), 116.55(d, C-14), 118.21(d, C-12), 119.54(d, C-13), 122.40(s, C-13b), 123.94(s, C-13a), 125.18(d, C-11), 138.82(s, C-7a), 139.13(s, C-8a), 139.56(s, C-14a), 140.57(s, C-9a), 180.18(s, C-16)
（９）溶解性 :メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、クロロホルムに可溶。水に難溶。
（１０）式（Ｉ’）には４個の不斉炭素が含まれており、ＲＯＳＥＹスペクトルの解析を行い、これらの相対配置を決定した。次に３位のヒドロキシル基にα−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸（ＭＴＰＡ）を導入し、改良Ｍｏｓｈｅｒ法によって、３位の絶対配置をＳと決定した。これらの結果から、式（Ｉ’）の化合物の絶対配置を３Ｓ、４Ｓ、５Ｒ、１５Ｓと決定した。
【００３８】
２．本発明の化合物の製造
２．１．式（Ｉ）の化合物の製造
本発明の式（Ｉ）の化合物は、微生物を培地に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積させ、該培養物から該化合物を採取することにより製造することができる。
【００３９】
（１）微生物
本発明の製造方法において用いることのできる微生物としては、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属し、かつ上記式（Ｉ）で表される化合物を生産することが可能な微生物であれば特に限定されない。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株、及び該菌株に由来する変異株、あるいは該菌株の類似菌株を挙げることができる。なお、ストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に、平成２１年１０月２８日に、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８５６として寄託されている。この菌株は、上記（Ｉ’）の化合物を製造することができる。
【００４０】
ここでいう「変異株」は任意の適当な変異原を用いた変異誘発処理により得られたものであり、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００４１】
ここでいう「類似菌株」としては、ストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１に示す）と９５％以上相同な塩基配列で表される１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子を持つ菌株を挙げることができる。１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の相同性は９５％以上であればよいが、９７％以上であることが好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、１００％相同であることが最も好ましい。
【００４２】
ストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列決定のため、プライマーとして真正細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡのほぼ全長を増幅することの出来る２７Ｆおよび１４９２Ｒのプライマーセットを用い、ＰＣＲを行った。決定した１４５０塩基の配列を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を行った結果、相同性の高い上位３０位まではストレプトマイセス・スピーシーズまたは属未定の放線菌であり、いずれも９８％以上の相同性であったことから、本菌株をストレプトマイセス・スピーシーズに分類した。
【００４３】
ストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株の細菌学的性質については以下の通りである。
1） 細胞の形：菌糸を形成する。
2） 胞子の有無 ：有り。
3） ハーフストレングス培地 ：良好に生育，コロニーは円形，台状，菌糸状，中心部分は褐色で周囲は白色。
4） スターチカゼイン液体培養 ：良好に生育。
5） デンプンの加水分解 ：分解する。
6） 色素の生成 ：寒天培地、液体培地で暗褐色の色素を生産。
7） 生育の範囲（ｐＨ）：ｐＨ６〜９
【００４４】
（２）微生物の培養
本発明における微生物の培養は、通常の微生物の培養方法が用いられる。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育・生産促進物質を適宜含有する培地であれば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独又は組み合わせて用いられる。さらに、必要に応じて炭化水素、アルコール類、有機酸、アミノ酸（トリプトファンなど）なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実かす、カザミノ酸などが単独又は組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの無機塩類を加える。さらに使用する微生物の生育や本発明の化合物の生産を促進する微量成分を適当に添加することができ、そのような成分は当業者であれば適当なものを選択することができる。
【００４５】
培養法としては、液体培養が適しているが、これに限定されるものではない。培養温度は、２５〜３７℃が適当であり、培養中の培地のｐＨは７〜９に維持することが望ましく、震盪速度が３０〜１２０ｒｐｍで回転又は往復震盪培養することが望ましい。液体培養で通常５〜１４日間培養を行うと、目的化合物が培養液中ならびに菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達した時に培養を停止する。
【００４６】
（３）化合物の単離・精製
培養物から本発明の化合物を単離・精製するには、微生物代謝生産物をその培養物から単離・精製するために常用される方法に従って行われる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養瀘液と菌体に分け、濾液を酢酸エチルなど有機溶媒で抽出する。また培養濾液は酢酸エチル、クロロホルムなどで抽出する。ついで、抽出液を濃縮し、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどにより精製を行い、本発明の化合物を得る。得られた化合物は、ＮＭＲ解析などの通常の化学的手法により、上記「１．本発明の化合物の性質」に記載した性質を示すか否かを調べることにより、本発明の化合物であることを確認することができる。
【００４７】
なお、培養、精製操作中の本発明の化合物の動向は、フォトダイオードアレイ検出器付き高速液体クロマトグラフィーにより、紫外線吸収を指標として追跡することができる。
【００４８】
３．本発明の化合物の用途
本発明の化合物は、下記の実施例に示すように、カビ類、特に卵菌類への発育阻害活性が強いので、抗カビ剤として利用することができる。本発明の化合物を有効成分として含む抗カビ剤は、例えば、魚類のカビ病、例えば、ウナギの綿かぶり病、ギンザケ、ニジマス等のミズカビ病、サケ科魚類稚魚の内臓真菌症、ヘペレイのミズカビ病、アユの真菌性肉芽腫症等の予防薬又は治療薬、好ましくは魚用の抗ミズカビ剤（ミズカビ予防薬又は治療薬）等として利用することができる。また、卵菌類を起因生物とする植物疫病の防除剤成分として有用である。
【００４９】
本発明の化合物を魚類のカビ病の予防薬又は治療薬として使用するには、例えば、本発明の化合物を魚類の試料に混合するか、魚類の養殖水槽に混合するか、又は魚類の養殖水槽の使用砂に混合すればよい。あるいは、本発明の化合物を０．００１〜０．１重量％程度含む水又は海水中に魚類又はその卵を浸漬させる、本発明の化合物を０．００１〜０．１重量％程度含む懸濁液を魚類の体又は卵全体に噴霧する、又は本発明の化合物を０．００１〜０．１重量％程度含む懸濁液を魚類の静脈又は腹腔内に注射器を用いて接種することも可能である。
【実施例】
【００５０】
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明は実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５１】
式（Ｉ’）の化合物の製造
式（Ｉ’）の化合物の生産菌としてストレプトマイセス・スピーシーズＫＳ−８４株を用いた。該菌株を、２００ｍＬのスターチカゼイン培地（スターチ 1.0%、カゼイン 0.03%、NaCl 0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.005%、CaCO3 0.002%、FeSO4・7H2O 0.001% (W/V)、pH 7.2）を入れた５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコ中で、３０℃にて５日間回転振盪（１００ｒｐｍ）培養し、次に行う大量培養の種菌とした。この種菌培養物を１Ｌのスターチカゼイン培地の入った２Ｌの坂口フラスコ８０本（計１２Ｌ）に１０ｍＬずつ植菌し、３０℃、５日間、往復震盪（１００ｒｐｍ）培養した。培養中、培地のｐＨは特に制御しなかった。
【００５２】
このようにして得られた培養液１２Ｌをろ過し、菌体と上清に分離した。上清は等量の酢酸エチルで二回抽出した。得られた抽出物をＯＤＳシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。ワコーゲル５０Ｃ１８（和光純薬）を担体として用い、移動層として、まず、２０％、５０％、７０％アセトニトリル水で、最後に１００％アセトニトリルにて溶出した。５０％アセトニトリル水にて溶出した画分に抗卵菌活性が認められた。
【００５３】
次に、それら画分を高速液体クロマトグラフィー（カラム：コスモシル5C18ARII（直径１０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）、移動相：４５％アセトニトリル水、流速４ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍ）にて精製した。このような大量培養とその培養物から、培養物計１２Ｌから本発明の式（Ｉ’）の化合物を１５ｍｇ得た。
【００５４】
抗菌活性の測定
上記化合物の真核微生物に対する活性は、９６穴マイクロプレートを用いて以下のようにして測定した。試料を滅菌した１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）水に懸濁し、１０分間超音波処理して各種濃度の試料懸濁液を調製した。９６穴マイクロプレートの各ウェルに試料懸濁液５０μｌ、滅菌した４倍濃縮液体培地５０μｌ、予め準備した被検生物の胞子懸濁液または菌懸濁液１００μｌを分注した。実験は２連で行い、被検生物に応じた温度で一定時間培養後に、微生物の生育を倒立顕微鏡で観察し、活性の有無を判断した。被検生物および培養条件は以下の通りである。Saprolegnia parasitica：ＧＹ培地（グルコース１％、酵母エキス０．２５％、ｐＨ６．５）、１８℃、２４時間、Phoma sp.：ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％、ｐＨ６．５）、３０℃、３０時間、Saccharomyces cerevisiae：サブロー培地（マルトース４％、ペプトン１％、ｐＨ  ６．０）、３０℃、３０時間。
【００５５】
また、原核生物に対する活性は、ペーパーディスク法により被検生物を練り込んだ寒天平板培地上で測定した。Escherichia coli およびBacillus subtilis を試験管中の滅菌したＬＢ培地（グルコース０．５％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．２）３ｍＬに植菌して、１晩３７℃で培養した。この前培養液を、滅菌したＬＢ寒天培地（寒天１．５％）に１％接種して、検定用寒天平板を作成した。試料をメタノールに溶解して、各種濃度の試料溶液を作成し、ペーパーディスク（ADVANTEC、直径８ｍｍ、ｔｈｉｃｋ）に染み込ませた後、風乾して検定用寒天平板上に置き、３７℃で１晩培養した。ペーパーディスク周辺の阻止円の形成を観察し、活性の有無を判断した。
【００５６】
真核微生物への最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は以下の通りであった。Saprolegnia parasitica：３．０μｇ／ｍＬ、Saccharomyces cerevisiae：＞２，０００μｇ／ｍＬ、Phoma sp.：２４２μｇ／ｍＬ。また、原核微生物のEscherichia coli およびBacillus subtilisに対しては、１，０００μｇ／ｍＬでも生育阻止円が認められなかった。
【００５７】
この結果から、式（Ｉ’）の化合物は、ミズカビ（Saprolegnia parasitica）には低濃度で効くが、真核微生物の酵母（Saccharomyces cerevisiae）及び原核微生物には効かず、Phoma sp.に対しても弱い活性しか示さないことがわかる。よって、式（Ｉ’）の化合物は、選択的な抗ミズカビ活性を有していると考えられる。
【配列表】
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