(57)【要約】【課題】迅速に多種類の有害又は有毒渦鞭毛藻類を検出することができ、また海洋状況のモニタリングを行うことができるオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイ等を提供する。【解決手段】本発明は、有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列を含む、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用オリゴヌクレオチドプローブ、及び当該オリゴヌクレオチドプローブが基盤に配置された、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用マイクロアレイである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列を含む、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
前記少なくとも一部の塩基配列が、前記藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA遺伝子の塩基配列である、請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
前記少なくとも一部の塩基配列が、前記藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA遺伝子のD1領域又はD2領域の塩基配列である、請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
有害又は有毒渦鞭毛藻類が、Alexandrium属、Dinophysis属、Gambierdiscus属、Gymnodinium属、Karenia属、Ostreopsis属、Pfiesteria属、Prorocentrum属、Protoceratium属、Protoperidinium属及びPyrodinium属からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
下記(a)又は(b)のDNAの塩基配列を含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(a) 配列番号4、7、8、10〜16、20、22、27、29、31〜35、39〜47及び50〜58に示される塩基配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するDNA
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブが基盤に配置された、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用マイクロアレイ。
【請求項７】
複数の貫通孔を有し、それら貫通孔にゲルが保持されているマイクロアレイであって、前記ゲルに請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブが保持されている、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用マイクロアレイ。
【請求項８】
有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法であって、
所定の海域から海水を採取して被検体とし、当該被検体中の生物に由来する核酸を抽出する工程、及び
前記抽出した核酸を請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ又は請求項６若しくは７記載のマイクロアレイに接触させる工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記被検体が、所定の複数の海域から海水を採取して得られた複数の被験体である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の方法により得られた検出結果を解析し、当該解析結果を指標として海洋状況を推測することを特徴とする、海洋モニタリング方法。
【請求項１１】
請求項９記載の方法により得られた前記複数の被験体ごとの検出結果を比較解析し、当該解析結果を指標として海洋状況に対する地球温暖化の影響を推測することを特徴とする、海洋モニタリング方法。
【請求項１２】
前記複数の被験体ごとに、所定の有害又は有毒渦鞭毛藻類が検出されたか否かを比較することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
所定の有害又は有毒渦鞭毛藻類が、Pyrodinium属及び／又はGambierdiscus属である、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害又は有毒渦鞭毛藻類を検出するために用いられるオリゴヌクレオチドプローブ及びそれらが配置されたマイクロアレイ、並びに当該プローブ又はアレイを用いた有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法及び海洋モニタリング方法に関する。詳しくは、迅速に所定の有害又は有毒渦鞭毛藻類の存否を確認することができるオリゴヌクレオチドプローブ、マイクロアレイ及び検出方法、並びに海洋環境の状況を迅速に把握できる海洋モニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化による水温上昇によって生じる沖合及び沿岸の物理的又は化学的な海洋環境の変化に伴う生物生態系に及ぼす悪影響が懸念されている。これまで日本沿岸では、麻痺性貝毒原因種であるAlexandrium属数種やGymnodinium catenatum、二枚貝を特異的に殺滅するHeterocapsa circularisquama、有害赤潮生物であるCochlodinium polykrikoidesなどの出現が報告されてきたが、瀬戸内海及び九州沿岸域において、シガテラ毒原因種のGambierdiscus toxicusなどの熱帯性の有毒プランクトンの出現も報告されている。
今後さらに、熱帯又は亜熱帯に分布する有害又は有毒プランクトンの顕在化、分布域の拡大、あるいはバラスト水による他海域からの移入などが予測され、その結果、食用魚介類の高毒化や、人体への健康被害の拡大が懸念される。
このような理由、特に水産食品の安全性確保の面から、海洋食料を生産する対象海域での有害又は有毒渦鞭毛藻類の出現状況を知る迅速な方法の確立を早急に進める必要性がある。
【０００３】
ところで、従来、上記の有害又は有毒渦鞭毛藻類の分類は、顕微鏡下での目視観察により、検出及び同定がされ、数等の調査がされてきた。
しかしながら、有害又は有毒渦鞭毛藻類は、種間でその形態が酷似しており、鎧板配列等の形態的特徴の差や、遊泳法等で見分ける場合において、重きを置く形態形質が同定者によって異なり、主観的な判断を下されることがあった。また、形態形質が環境条件等によって変化しやすい、形態的特徴に基づく分類基準が十分統一されていないなど、客観的な分類が明確ではない等の問題もあった。さらに、実際の海水サンプル中には、複数種が同時に出現し、目視に頼る従来法では、正確な種同定、細胞密度の算出が難しく、現場モニタリング実施の大きな障害であった。
【０００４】
近年、このような問題点を改善するため、分子生物学的手法による客観性のある手法の開発、例えば、PCR-RFLP（Restricted Enzyme Length Polymorphism）法（非特許文献１及び２参照）、RNAをターゲットとしたFISH（Fluorescence In Situ Hybridization）法（非特許文献３〜５参照）、SHA（RNA-DNA Sandwich Hybridization）法（非特許文献６及び７参照）、１細胞を用いた標的遺伝子のダイレクトシークエンスによる配列決定（非特許文献８参照）、リアルタイムPCR法（非特許文献９〜１１参照）等の技術を利用した手法の開発が盛んに行われてきた。
しかしながら、これらの分子生物学的手法は、従来の顕微鏡下での目視調査と比較して客観性は向上したものの、簡便性、迅速性及び再現性の面で、さらに改善の必要性があった。
【０００５】
他方、多数の核酸を一度に判定する分子生物学的手法の一つとしてDNAチップ（マイクロアレイ）が開発され、迅速に結果が取得できるようになってきた。
DNAチップ法を利用した有害又は有毒プランクトンにおける研究については、これまでに若干の報告があるのみであるが（非特許文献１２〜１４参照）、いずれもAlexandrium属の検出に特化したDNAチップであり、多種類の有毒渦鞭毛藻類を区別することができない。また、これらのDNAチップは熱帯性又は亜熱帯性の有害又は有毒プランクトンの検出プローブと、温帯性の有毒又は有害プランクトンの検出プローブとの両方を搭載したチップではないため、これらを同時に検出できず、海洋状況における温暖化の指標となる熱帯性プランクトンのモニタリングを行うことができないものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Adachi M. et al. J. Phycol. 30: 857-863 (1994).
【非特許文献２】Scholin CA and Anderson DM. J. Phycol. 30: 744-754 (1994).
【非特許文献３】Scholin CA. et al. J. Phycol. 35: 1356-1367 (1999).
【非特許文献４】Hosoi-Tanabe S and Sako Y. Harmful Algae 4: 319-328 (2005).
【非特許文献５】Anderson DM. et al. Deep Sea Research II 52: 2467-2490 (2005).
【非特許文献６】Tyrrell JV. et al. Harmful Algae 1: 205-214 (2002).
【非特許文献７】Greenfield DL. et al. Limnol Oceanogr Methods: 426-435 (2006).
【非特許文献８】Bolch CJS. Phycologia 40: 162-167 (2001).
【非特許文献９】Hosoi-Tanabe S、 Nagai S. and Sako Y. Mar Biotechnol 6: 30-34.
【非特許文献１０】Kamikawa R、Hosoi-Tanabe S、Nagai S.et al. Fish Sci 71: 985-989 (2005).
【非特許文献１１】Kamikawa R、 Nagai S. et al. Harmful Algae 6: 413-420 (2007).
【非特許文献１２】Ki JS and Han MS. Biosens Bioelectron 21: 1812-1821 (2006).
【非特許文献１３】Ahn SA. et al. Appl Environ Microbiol 72: 5742-5749 (2006).
【非特許文献１４】Gescher C. et al. Harmful Algae 7: 485-494 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況下において、迅速に多種類の有害又は有毒渦鞭毛藻類を検出することができ、また海洋状況のモニタリングを行うことができる、オリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイ等の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用オリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイ、有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法、並びに海洋モニタリング方法等を提供するものである。
【０００９】
（１）有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列を含む、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
本発明のプローブにおいて、前記少なくとも一部の塩基配列としては、例えば、前記藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA遺伝子の塩基配列や、前記藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA遺伝子のD1領域又はD2領域の塩基配列が挙げられる。
本発明のプローブにおいて、有害又は有毒渦鞭毛藻類としては、例えば、Alexandrium属、Dinophysis属、Gambierdiscus属、Gymnodinium属、Karenia属、Ostreopsis属、Pfiesteria属、Prorocentrum属、Protoceratium属、Protoperidinium属及びPyrodinium属からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００１０】
本発明のプローブとしては、例えば、下記(a)又は(b)のDNAの塩基配列を含むものが挙げられる。
(a) 配列番号4、7、8、10〜16、20、22、27、29、31〜35、39〜47及び50〜58に示される塩基配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するDNA
【００１１】
（２）上記(1)に記載のオリゴヌクレオチドプローブが基盤に配置された、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用マイクロアレイ。
（３）複数の貫通孔を有し、それら貫通孔にゲルが保持されているマイクロアレイであって、前記ゲルに上記(1)に記載のオリゴヌクレオチドプローブが保持されている、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用マイクロアレイ。
【００１２】
（４）有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法であって、
所定の海域から海水を採取して被検体とし、当該被検体中の生物に由来する核酸を抽出する工程、及び
前記抽出した核酸を上記(1)に記載のオリゴヌクレオチドプローブ又は上記(2)若しくは(3)記載のマイクロアレイに接触させる工程
を含む、前記方法。
本発明の検出方法において、前記被検体としては、例えば、所定の複数の海域から海水を採取して得られた複数の被験体が挙げられる。
【００１３】
（５）上記(4)に記載の検出方法により得られた検出結果を解析し、当該解析結果を指標として海洋状況を推測することを特徴とする、海洋モニタリング方法。
（６）上記(4)に記載の検出方法により得られた前記複数の被験体ごとの検出結果を比較解析し、当該解析結果を指標として海洋状況に対する地球温暖化の影響を推測することを特徴とする、海洋モニタリング方法。
上記(6)のモニタリング方法としては、例えば、前記複数の被験体ごとに、所定の有害又は有毒渦鞭毛藻類が検出されたか否かを比較することを含む方法が挙げられる。ここで、当該所定の有害又は有毒渦鞭毛藻類としては、例えば、Pyrodinium属及び／又はGambierdiscus属が挙げられる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、現場海水域において複数の有害又は有毒渦鞭毛藻類を簡便、迅速かつ網羅的に検出することができ、さらにそれらの出現消長の追跡も可能となる、有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用のオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイ、並びに有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法を提供することができる。本発明は、熱帯又は亜熱帯性の新規有害又は有毒種の出現状況を把握し、赤潮及び貝毒の対策強化並びにそれらの迅速な予知システムの確立を可能とする点で、極めて有用なものである。
また、本発明のマイクロアレイ等を用いれば、熱帯又は亜熱帯に分布する有害又は有毒種の検出プローブを含むことにより、海洋状況における温暖化の指標である熱帯性プランクトンのモニタリングを迅速かつ正確に行うことができ、海洋環境に対する温暖化の影響把握が容易に可能となるため、本発明は極めて実用性に優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施例において製造したDNAチップ（DNAマイクロアレイ）の配列図を示す図である。図中の数字（外枠部分の数字を除く）はプローブ番号を表し、Bはプローブが配置されていないことを表す。また、外枠部分の数字及びアルファベットは、プローブの配置位置を特定するためのものである。
【図２】本実施例において製造したDNAチップ（DNAマイクロアレイ）の配列図を示す図である。図中の数字（外枠部分の数字を除く）はプローブ番号を表し、Bはプローブが配置されていないことを表す。また、外枠部分の数字及びアルファベットは、プローブの配置位置を特定するためのものである。
【図３】中空繊維束（中空繊維配列体）の製造用の配列固定治具を示す概略図である。
【符号の説明】
【００１６】
１１    孔
２１    多孔板
３１    中空繊維
４１    板状物
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１８】
１．本発明の概要
本発明者は、前述した課題、すなわち迅速に多種類の有害又は有毒渦鞭毛藻類を検出することができ、また海洋状況のモニタリングを行うことが可能なオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイ等の開発を行うにあたり、鋭意研究を行った結果、有害又は有毒渦鞭毛藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA遺伝子（LSU rRNA，28S rRNA）に着目し、特に当該遺伝子中のD1及びD2領域について前記渦鞭毛藻類の各々の種間で比較検討を行ったところ、各々の種に特異的な塩基配列が存在することを見出した。そこで、この特異的な配列を含む核酸断片（オリゴヌクレオチドプローブ）及びそれらが配置されたDNAマイクロアレイを用いることにより、迅速に多種類の有害又は有毒渦鞭毛藻類を特異的に検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
以上のように、本発明は、各種有害又は有毒渦鞭毛藻類の染色体DNA、具体的にはLSU rRNAのD1及びD2領域の塩基配列に着目することにより完成されたものであり、当該塩基配列又はその一部にハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが配置されたマイクロアレイに関するものである。すなわち、本発明は、各種有害又は有毒渦鞭毛藻類を迅速かつ特異的に検出することが可能なオリゴヌクレオチドプローブが配置されたマイクロアレイである。
【００１９】
２．有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用オリゴヌクレオチドプローブ
本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、DNA（染色体DNAやプラスミドDNA等）及びRNA（mRNA等）のいずれでもよく限定はされないが、染色体DNAであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記渦鞭毛藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA遺伝子（LSU rRNA，28S rRNA）の塩基配列とハイブリダイズすることができるものであることが好ましく、より好ましくは、当該LSU rRNAのD1領域又はD2領域の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。すなわち、本発明のプローブは、ノーザンブロッティングやマイクロアレイ等の発現解析において、上記特定の領域中の少なくとも一部の塩基配列に対して相補的となるように設計され、ハイブリダイゼーションを行ったときにハイブリダイズすることができるものを意味する。
本発明のプローブ（特にマイクロアレイ用のプローブ）は、検出目的となる各種の前記渦鞭毛藻類に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、Tmがそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要があり、遺伝子等を検出目的とする場合はそのmRNAの3'末端からの距離が比較的近いものである必要がある。
【００２０】
有害又は有毒渦鞭毛藻類の各々の種に対応する特異的な塩基配列は、例えば、マルチプルアラインメントをとり、種間で異なる領域にプローブを設計するなどの手段により見出すことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには、特に限定はないが、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ClustalX1.8等のプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整することができる。
本発明において、検出対象となる有害又は有毒渦鞭毛藻類としては、限定はされないが、Alexandrium属、Dinophysis属、Gambierdiscus属、Gymnodinium属、Karenia属、Ostreopsis属、Pfiesteria属、Prorocentrum属、Protoceratium属、Protoperidinium属及びPyrodinium属等の渦鞭毛藻類が挙げられ、これらうちの少なくとも１種、好ましくは２種以上を検出対象とすることが好ましい。また、例えば、海洋状況に対する地球温暖化の影響を推測する際には、Pyrodinium属及びGambierdiscus属を検出対象とすることが好ましい。
【００２１】
本発明のプローブを設計する際は、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを考慮する必要がある。ストリンジェンシーをある程度緊密にすることによって、各種の前記渦鞭毛藻類において各々の核酸中の特定の領域間で類似する塩基配列領域が存在しても、他の異なる領域を区別してハイブリダイズすることができる。また、当該特定の領域間の塩基配列がほとんど異なる場合は、ストリンジェンシーを緩やかに設定することができる。
【００２２】
このようなストリンジェンシーの条件としては、例えば緊密条件の場合は50〜60℃の条件下でのハイブリダイゼーションであり、ゆるやかな条件の場合は30〜40℃の条件下でのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションの条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20、40℃」、「0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20、37℃」、「0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20、30℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20、50℃」、「0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20、55℃」、「0.06M Tris・HCl／0.06M NaCl／0.05% Tween-20、60℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、プローブを添加して1時間以上50℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20中、50℃で20分の洗浄を4回、最後に、0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl、50℃で10分の洗浄を１回行う方法もある。ハイブリダイゼーション、あるいは洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件を設定することができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997)) 等を参照することができる。
【００２３】
本発明のプローブの長さは、限定はされないが、例えば、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは16〜50塩基であり、さらに好ましくは18〜35塩基である。プローブの長さが適切であれば（上記範囲内であれば）、非特異的なハイブリダイゼーション（ミスマッチ）を抑制し、特異的な検出に使用することができる。
本発明のプローブの設計の際には、プローブの融解温度（Tm）を確認しておくことが好ましい。Tmとは、任意の核酸鎖の50％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度を意味し、鋳型DNA又はRNAとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こりやすくなるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとする核酸断片のTmはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Tmの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばProbe Quest（登録商標；ダイナコム社）などが挙げられる。またTmの確認は、ソフトウエアを使わずに自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Nearest Neighbor Method）、Wallance法、GC％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明のプローブにおいては、限定はされないが、平均Tmが約35〜70℃あるいは45〜60℃であることが好ましい。なお、プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもGC含量等があり、その条件は当業者に周知である。
【００２４】
また、本発明のプローブを構成するヌクレオチド（核酸）は、DNA及びRNA、あるいはPNAのいずれであってもよく、DNA、RNA及びPNAの2種以上のハイブリッドであってもよい。
本発明のプローブとしては、具体的には、以下の(a)又は(b)のDNAの塩基配列を含むものが好ましく挙げられる。
(a) 配列番号4、7、8、10〜16、20、22、27、29、31〜35、39〜47及び50〜58に示される塩基配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有害又は有毒渦鞭毛藻類に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するDNA
【００２５】
上記(a)の各種DNAについて、それらの具体的な塩基配列、プローブ番号、プローブ名、検出対象となる渦鞭毛藻類については、後述する実施例及び表５等の記載が参照できる。
また、上記(b)のDNAは、上記(a)の各種DNA若しくはそれと相補的な塩基配列からなるDNA、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、前記と同様のものを参照することができる。上記(b)のDNAに関し、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が24〜390mM、温度が40〜65℃、好ましくは塩濃度が48.8〜195mM、温度が45〜60℃の条件を意味する。具体的には、例えば97.5mMで50℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間などの諸条件も考慮し、上記(b)のDNAを得るための条件を適宜設定することができる。ハイブリダイズするDNAとしては、上記(a)のDNAの塩基配列に対して少なくとも60％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上である。
【００２６】
本発明のプローブは、例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成する（精製はHPLC等により行う）ことにより作製することができる。そのようなプローブは、例えば、Probe Quest（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。また、本発明のプローブには、例えば、タグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。
本発明において、検出目的となる前記各種渦鞭毛藻類が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的の核酸の塩基配列（例えば前記D1及びD2領域の塩基配列）は、当該塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの塩基配列に由来する機能や活性を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。ここで「ストリンジェントな条件」は、前記と同様の条件を適用することができる。
【００２７】
３．有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用マイクロアレイ
上述した本発明のプローブは、支持体となる基盤に複数配置される。プローブが配置された基盤は一般的にDNAチップ又はDNAマイクロアレイと称される。支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Science 270, 467-470 (1995)等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Science 251, 767-773 (1991)等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるマイクロアレイ（以下「繊維型マイクロアレイ」と言う）が好ましく例示できる。このマクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型マイクロアレイ」とも言われる（特許第3510882号公報等参照）。
【００２８】
支持体へのプローブの固定方法は、限定はされず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。
以下、「貫通孔型マイクロアレイ」の一形態である繊維型マイクロアレイに関して詳細に説明する。このマイクロアレイは、例えば、下記(i)〜(iv)の工程を経て作製することができる。
(i) 複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
(ii) 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
(iii) オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
(iv) 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
【００２９】
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開2004-163211号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程(i)）。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平11-108928号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開2001-133453号公報参照）などが挙げられる。後者の方法に用いる配列固定治具については、図３に示す該略図が参照される。
製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程(ii)）。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
【００３０】
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程(iii)）。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。
中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程(iv)）。このようにして得られた薄片は、DNAマイクロアレイとして使用できる。当該アレイの厚みは、0.01mm〜1mm程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。
上述した繊維型マイクロアレイとしては、例えば、三菱レイヨン社製DNAチップ（Genopal TM）等が好ましく挙げられる。
【００３１】
繊維型マイクロアレイでは、上述のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面マイクロアレイに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。
また、マイクロアレイに配置されるプローブの種類の数は、１つのマイクロアレイ上（中）に1000種類以下、好ましくは500種類以下、さらに好ましくは250種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の渦鞭毛藻類をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。
なお、本明細書においては、DNAマイクロアレイ及びDNAチップ等の名称については、それぞれ区別はせず、同義語であるとする。
【００３２】
４．有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法
本発明の有害又は有毒渦鞭毛藻類の検出方法は、下記の工程を含む方法である。
(i) 所定の海域から海水を採取して被検体とし、当該被検体中の生物に由来する核酸を抽出する工程（抽出工程）
(ii) 上記抽出した核酸を、前述した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ（前記２.項）又は本発明のマイクロアレイ（前記３.項）に接触させる工程（検出工程）
【００３３】
以下に、本発明の検出方法の詳細を工程ごとに説明する。
(1) 工程(i)について
本工程（抽出工程）では、所定の海域から海水を採取して被検体とし、当該被検体中の生物に由来する核酸を抽出するが、被検体を採取する海域は特に限定はされない。採取する海水としては、限定はされないが、具体的には、海洋開発現場海域の海水、養殖場の海水、養殖場の海水、又は病気を発症している魚が生息する海水などが挙げられ、例えば、海洋の環境状況を知ろうとする目的で、その海域の海水を採取してもよい。また、当該被検体は、１つの海域から採取して得られた被験体であってもよいし、複数の海域から採取して得られた複数の被験体であってもよいが、複数の海域からサンプルを採取する場合は、例えば、複数の海域についての比較検討を行う、又は海域の状況ごとに海域のグループ分けを行うなど、多様化した様式の海洋モニタリングが可能である。
【００３４】
次いで、当該被検体中の生物に由来する核酸の抽出を行うが、これについては、例えば、プランクトンネットを通した海水サンプルを、さらに孔径0.22μm程度のフィルターにかけ、フィルター上に残ったものを収集しサンプルとし、当該サンプルから核酸（ポリヌクレオチド）の抽出を行うことができる。核酸は、二本鎖ポリヌクレオチドとして回収することが好ましい。核酸の抽出方法は、常法に従って行うことができ、例えば、濾過、培養、遠心、溶解等を行い、回収することができる。
【００３５】
上記サンプルから得られた核酸は、そのままマイクロアレイ等に接触させてもよいし、PCR等により所望の部位（塩基配列領域）を増幅し、その増幅断片をマイクロアレイ等に接触させてもよく、限定はされない。得られた核酸をテンプレートとして増幅する部位は、本発明のプローブ又は本発明のマイクロアレイに配置（搭載、固定）したオリゴヌクレオチドの塩基配列を含む核酸領域をコードする部位である。増幅する所望の部位は、限定はされず、前記渦鞭毛藻類の種を問わず保存性の高い領域の塩基配列を利用し、多種類の混合物を一度に増幅して得ることができる。このような増幅のための配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、In Silicoで決定してもよい。核酸又はアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、EMBL（European Molecular Biology Laboratry, EMBL nucleic acid sequence data library）、GenBank（Genetic sequence data bank）、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のTaxonomyデータベース等を利用できる。
【００３６】
具体的に、増幅する所望の部位としては、前記渦鞭毛藻類の染色体DNA中の大サブユニットリボソームRNA（LSU rRNA）遺伝子のD1又はD2領域であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るPCRプライマーとしては、例えば、下記のものが好ましく挙げられる。なお、PCR法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
【００３７】
フォワードプライマー  D1R：
5'-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3'  （配列番号１）
リバースプライマー    D2C：
5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3'  （配列番号２）
【００３８】
本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Cy5、Cy3、VIC、FAM、HEX、TET、フルオレセイン、FITC、TAMRA、Texas red、Yakima Yellow等）を用いることができる。
【００３９】
(2) 工程(ii)について
本工程（検出工程）では、工程(i)で得た核酸又はその増幅断片を、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のマイクロアレイに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、マイクロアレイに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、SDSやSSC等の緩衝液を用いて、常法に従い、適宜調製することができる。
ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、マイクロアレイに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、pH、温度等）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、あるいは類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの洗浄条件を意味する。
【００４０】
例えば、ハイブリダイゼーション反応時の条件としては、反応温度は、35〜70℃が好ましく、より好ましくは40〜65℃であり、ハイブリダイズさせる際の時間は、約1分〜16時間が好ましい。
また、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの洗浄条件としては、洗浄液組成は、0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20であることが好ましく、洗浄時の温度は、35〜80℃あるいは40〜65℃が好ましく、より好ましくは45〜60℃である。より具体的には、塩（ナトリウム）濃度が48〜780mMであり、温度が37〜80℃である条件が好ましく、より好ましくは塩濃度が97.5〜390mMであり、温度が45〜60℃である条件である。
【００４１】
洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、上記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、CRBIO（日立ソフトウェアエンジニアリング（株））、arrayWoRx（GE Healthcare社）、Affymetrix 428 Array Scanner（Affymetrix,社）、GenePix（Axon Instruments社）、ScanArray（PerkinElmer社）、三菱レイヨン社製の冷却CCD式蛍光検出装置などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、CCDカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウエアにより行う。定量ソフトウエアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、DNAフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンド（BG）として用いるなど、調整を行うことが好ましい。
このように、検出強度の測定により検出目的の有害又は有毒渦鞭毛藻類由来の核酸の検出を行い、その後は定法に従い、当該検出結果を指標として、各種当該渦鞭毛藻類の存在量などを測定することができる。
【００４２】
５．海洋モニタリング方法
本発明の海洋モニタリング方法は、上記本発明の検出方法を用いて得られた検出結果を解析し、この解析結果を指標として海洋の状況を推測することを特徴とする方法である。
モニタリングの対象となる、所定の海域の海水から採取した被検体は、１つの海域から採取したものであってもよいし、複数の海域から採取したものであってもよく限定はされないが、複数の海域から採取したものを対象とする場合は、これら複数の被験体ごとの検出結果を比較解析し、その解析結果を指標とすることにより、例えば、海洋状況に対する地球温暖化の影響を推測することもできる。この場合は、複数の被験体ごとに、所定の前記渦鞭毛藻類が検出されたか否かを比較することが好ましく、具体的には、Pyrodinium属及びGambierdiscus属のいずれか又は両方について検出の有無や存在量の程度を比較することが好ましい。
【００４３】
上記解析においては、具体的には、検出に使用したマイクロアレイ上での標識物質の検出パターンが、その海域の特徴を示すものと考えられる。例えば、１つの海域から被検体を採取した場合には、その海域に存在する有害又は有毒渦鞭毛藻類の有無及び海洋の環境状況を推定することができる。また、他の解析の態様としては、複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、それぞれの検出に使用したマイクロアレイ上での標識物質の検出パターンについて統計学的解析を行う態様が挙げられる。
統計的解析の方法としては、例えば、相関解析、階層的クラスタリング及び非階層的クラスタリングなどがある。より具体的には、相関解析時に用いる距離関数として、Pearson correlation、Cosine coefficient 等の手法が挙げられる。また、階層的クラスタリングとしては、UPGMA（unweighted-pair group methodusing arithmetic averages ）などの手法が挙げられる。このような解析手法を用い、クラスター解析を行うことにより、各海域のグループ化が可能であり、さらには各海域の類比などを判別することができる。その結果、例えば前述したように、海洋状況に対する地球温暖化の影響を推測することもできる。
【００４４】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
混合サンプルでのプローブの特異性の確認
以下のプランクトンのゲノムDNAを、独立行政法人水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所  赤潮環境部有毒プランクトン研究室および赤潮生物研究室で培養株を確立して継代培養したサンプルから抽出した。ゲノムＤＮＡ抽出は核酸抽出キット  DNeasy Plant Mini Kit（QIGEN社）を用いて行った。
1      Cochlodinium Polykrikoides
2      Heterocapsa pygmaea
3      Heterocapsa triquetra
4      Heterocapsa ildefina
5      Heterocapsa arctica
6      Heterocapsa circularisquama
7      Chattonella ovata
8      Karenia mikimotoi
9      Gymnodinium catenatum
10     Alexandrium affine
11     Alexandrium catenella
12     Alexandrium fraterculus
13     Alexandrium tamiyavanichii
14     Alexandrium tamarense
15     Heterosigma akashiwo
16     Alexandrium minutum
17     Karenia degitata
18     Alexandrium taylori
19     Alexandrium ostenfeldii
【００４６】
得られたゲノムDNA濃度を1ng/μlに調整し、PCRのテンプレートとして使用するまで-80℃で保存した。
引き続き、以下の表１にしたがって、ゲノムDNAを混合し、20種類のサンプルを調整した。表１において「○」印をつけた部分はそのゲノムDNAを1μl混合したことを示し、「×」印をつけた部分は、代わりに滅菌水1μlを混合したことを示す。すなわち、19μlのゲノムDNA混合溶液、20種類を作製した。
【００４７】
【表１】
2011182650.tif 000002
【００４８】
＜PCR反応＞
次に、これら有害又は有毒渦鞭毛藻類の大サブユニットリボソームＲＮＡ（LSU rRNA）遺伝子D1、D2領域の配列を増幅した。
前述の有害又は有毒渦鞭毛藻類混合ゲノムDNAをテンプレートとし、以下の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した。テンプレートDNAは、混合した19μlから1μlを用いた。PCR用キットは、QIGEN HotStarTaq Master Mix Kit（QIAGEN社）を用い、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ社、50μl、9600エミュレーションモード）により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、リバースプライマーは5'末端がCy5で蛍光標識化されているものを用いた。
【００４９】
フォワードプライマー  D1R：
5'-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3'  （配列番号１）
リバースプライマー    D2C：
5'-Cy5-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3'  （配列番号２）
【００５０】
＜反応液組成＞
2×HotStarTaq Master Mix           25μl
プライマーmix（10μM each）        5μl
テンプレートDNA（ゲノム混合物）    1μl
滅菌水                             19μl   
合計                               50μl
【００５１】
＜反応条件＞
94℃で5分間加熱後、「解離：94℃（30sec）→アニーリング：50℃（60sec）→合成：72℃（30sec）」を1サイクルとして計50サイクル行い、次いで72℃で5分間加熱した後、4℃で冷却した。
上記PCR後の反応液を、QIAGEN PCR MinElute精製キット（QIGEN社）でカラム精製し、22μl、1回で溶出した。約20μlのPCR産物を回収した。
【００５２】
＜DNAチップ：有害又は有毒渦鞭毛藻類検出基板の製造＞
貫通孔型のDNAチップを、特開2007-74950号公報（メチル化DNA及び/又は非メチル化DNAの検出方法）の実施例１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。
ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブ（キャプチャープローブ）は、下記配列番号３〜２３に示す配列情報をもつプローブを用いた。また、図１に、製造したDNAチップの配列図を示した。図中の番号は、配列番号3〜23に示されるプローブの番号を示している。ここで、配列番号3、5、7、17、18、23に示されるプローブは公知配列である。
【００５３】
プローブ番号１  Bax-28F620_A.tamarense
GGTGTATGTGTGTGTTCCTGTGCTT  （配列番号３）
プローブ番号２  No1_1_A.tamarense
TGGGCTGTGGGTGTAATGATTCTTTC  （配列番号４）
プローブ番号３  Bac-28F630_A.catenella
GTTTGTGTCCTTGTCCTTGAGGTTG  （配列番号５）
プローブ番号４  No4_9_A.catenella
CTTGTCCTTGAGGTTGCTTTCTCCCTT  （配列番号６）
プローブ番号５  Atamiy-602_A.tamiyavanichii
TGTGTGCACATATTGTTCTTCAGGA  （配列番号７）
【００５４】
プローブ番号６  No7_2_A.tamiyavanichii
GCATGCGTGTATAAGCATTTGTGTGC  （配列番号８）
プローブ番号７  No7_3_A.tamiyavanichii
CATGAATGGTATTATTCCTGTGGGGG  （配列番号９）
プローブ番号８  No8_6_Afraterculus
GTGTGTGCTAGTTATTTGTGCATGTGCTGAC  （配列番号１０）
プローブ番号９  No8_9_Afraterculus
GCAATGTTTGTTGCTGTGTGTGCTAG  （配列番号１１）
プローブ番号１０  No13_3_A.affine
TTCTTGAAGCTGGGCCTACCCTACTAGAG  （配列番号１２）
【００５５】
プローブ番号１１  GC01_G.catenatum
ACAAGCTAATGGTGACGAAATGGT  （配列番号１３）
プローブ番号１２  GC02_G.catenatum
ACACGCGTGGCACCTTCCTTACAAGC  （配列番号１４）
プローブ番号１３  No17_1_Gcatenatum
CAACAAACAGTTCAACCTTTGTGGGG  （配列番号１５）
プローブ番号１４  No.17_629_Gcatenatum
GTTGCTTCGTGTTGCGTGCTCTGGCG  （配列番号１６）
プローブ番号１５  Ki_and_Han_2006_Chattonella marina
TTACTCTCCTGTTGCTGTTTCTGTC  （配列番号１７）
【００５６】
プローブ番号１６  BCp-28F689_C.polykrikoides
CTTGGGTTGATCGTGGGTCCTGACA  （配列番号１８）
プローブ番号１７  Kg01_K.degitata
AGAACTCATTTCTTAACTGATCTCTGC  （配列番号１９）
プローブ番号１８  Kg02_K.degitata
TGCTTCGGGTCTGGAGCTTCGGCTCT  （配列番号２０）
プローブ番号１９  No26_30_Karenia-degitata
CTTAACTGATCTCTGCATGTCTGGTCGC  （配列番号２１）
プローブ番号２０  No33_1_Karenia mikimotoi
GATCTTCTGCTCTGCATGAAGGTTGTTG  （配列番号２２）
プローブ番号２１  Bha-28F618_H.akashiwo
GTATGCTGGTGTCTACTGCTTGCAG  （配列番号２３）
【００５７】
＜DNAチップへのハイブリダイゼーション＞
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
表１に示した各サンプル番号のサンプル      19μl
滅菌水                                    80μl
1M Tris/HCl（pH7.5）                      18μl
1M NaCl                                   18μl
0.5% Tween-20                             15μl   
合計                                      150μl
150μlのハイブリダイゼーション溶液を、前記DNAチップに接触させ（アプライし）、50℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００５８】
＜洗浄＞
ハイブリダイゼーション反応後、以下の手順(a)〜(d)でDNAチップを洗浄した
(a) 滅菌済みの遠心管に0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20を10ml入れ、これを2本用意した。同様に、滅菌済みの遠心管に0.12M Tris・HCl／0.12M NaClを10ml入れ、これを1本用意した。
(b) 0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20溶液が入った2本は50℃に保温し、残りの1本は室温に置いた。
(c) 保温した洗浄液が50℃に温まったところで、チャンバーからDNAチップを取り出して20分間浸漬した。その後、もう1本の洗浄液にDNAチップを取り出して移し入れ、再度20分間浸漬した。
(d) その後、50℃の洗浄液から室温の洗浄液にDNAチップを移した。
【００５９】
＜検出＞
上記洗浄後、三菱レイヨン社製の冷却CCD式蛍光検出装置（型番：0060304）を用い、下記検出条件で、各スポットの蛍光強度を測定した。
＜検出条件＞
中心励起波長  ：630nm
蛍光フィルター：Cy5フィルター
露光時間      ：1000msec
【００６０】
＜バックグラウンドの減算＞
チップごとに、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの上下２０％を除いた中央値）を各スポットの蛍光強度から減算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度（以後、シグナル強度と呼ぶ）を算出した。
【００６１】
＜結果＞
サンプル番号1〜20のシグナル強度の検出結果（算出結果）を下記の表２に示した。
例えば、サンプル番号１５番についての結果を考える。サンプル番号１５番は、表１よりA.tamarenseのゲノムDNAを含んでいないので、DNAチップで検出されないはずである。表２の結果を見ると、サンプル１５番を用いた時、プローブ番号1番、2番のシグナル強度は他のサンプルと比較して極端に低い値となっており、プローブ番号1番、2番ともに特異的に検出できていると考えられた。
【００６２】
同様に、サンプル番号１２番についての結果を考える。サンプル番号１２番は、表１よりA.catenellaのゲノムDNAを含んでいないので、DNAチップで検出されないはずである。表２の結果を見ると、サンプル１２番を用いた時、プローブ番号３番、４番のシグナル強度は他のサンプルと比較して極端に低い値となっており、プローブ番号３番、４番ともに特異的に検出できていると考えられた。
以下同様にして、他のプローブについても特異性を確認することができた。
【００６３】
【表２】
2011182650.tif 000003
【実施例２】
【００６４】
熱帯、亜熱帯性プランクトン用プローブ、追加試験プローブの追加
実施例１で使用した貫通孔型のDNAチップのプローブに、以下のプローブを追加して新規に貫通孔型のDNAチップを作製した。
【００６５】
プローブ番号２２  90622tamarense1
TTGGTGGGAGTGTTGCACT  （配列番号２４）
プローブ番号２３  90622tamarense2
ACTTGCTTGACAAGAGCTTTGGGC  （配列番号２５）
プローブ番号２４  90622tamarense3
CTGGTGTATGTGTGTGTTCC  （配列番号２６）
プローブ番号２５  90622tamarense4
GCTTGGGGATGCTTCCTTCCTTGGA  （配列番号２７）
プローブ番号２６  90622catenella1
TAACAATGGGTTTTGGCTGCA  （配列番号２８）
【００６６】
プローブ番号２７  90622catenella2
TGTGCCAGTTTTTATGTGGA  （配列番号２９）
プローブ番号２８  90622catenella3
GCATATGCATGTAATGATTTGCATGT  （配列番号３０）
プローブ番号２９  90622catenella4
TCCTTGTCCTTGAGGTTGCTTTCTC  （配列番号３１）
プローブ番号３０  90622fraterculus1
TGCATGTCGATGTGAATTGC  （配列番号３２）
プローブ番号３１  90622fraterculus2
GTGTGTGCTAGTTATTTGTGCATG  （配列番号３３）
【００６７】
プローブ番号３２  90622fraterculus3
CATGCATGCATGTGTGCTCAGG  （配列番号３４）
プローブ番号３３  90622fraterculus4
TGGGTGTTGTTCGCTGTATGG  （配列番号３５）
プローブ番号３４  90622ostenfeldii1
GAGATTGTTGCGTCCACTTGT  （配列番号３６）
プローブ番号３５  90622ostenfeldii2
GTGTGCCCTCTTGCCAAATG  （配列番号３７）
プローブ番号３６  90622ostenfeldii3
GGGCTCTCCTCCCTGGGCAC  （配列番号３８）
【００６８】
プローブ番号３７  90622bahamense1
GATTGTTGTGTGTTAGTGAC  （配列番号３９）
プローブ番号３８  90622bahamense2
AGTGACATAGGTCACCATGCAC  （配列番号４０）
プローブ番号３９  90622bahamense3
ACCTTGACATGTGTGCTGCAAG  （配列番号４１）
プローブ番号４０  90622bahamense4
TGTGCACCTTCTGGAACAACCC  （配列番号４２）
プローブ番号４１  90622mexicanum1
CTTGCTCCTCGCGCCCAGC  （配列番号４３）
【００６９】
プローブ番号４２  90622mexicanum2
GCTCCTCGCACCCAGCGCTCGGG  （配列番号４４）
プローブ番号４３  90622mexicanum3
CTTGGACGTGCTTGGGCGTGGGAGCTT  （配列番号４５）
プローブ番号４４  90622lima1
CATTCCCTTGCCAATTAATGCAA  （配列番号４６）
プローブ番号４５  90622lima2
CATTCCCTTGCCAACTAATGCAA  （配列番号４７）
プローブ番号４６  90622lima3
TGCAGCTCCCTGCCTACGAGGCA  （配列番号４８）
【００７０】
プローブ番号４７  90622lima4
AGCGCTCCATGCCTATCAGGCA  （配列番号４９）
プローブ番号４８  90622montis1
CTGTTGCAATGATTTTTTGTATCGTGATGC  （配列番号５０）
プローブ番号４９  90622montis2
GCAAGGCTATTGCAATGATTTTTTGTATAGTGATGC  （配列番号５１）
プローブ番号５０  90622montis3
AGAGCTTGCAATTGCTGAACTGATAAGC  （配列番号５２）
プローブ番号５１  90622Karenia brevis1
GGGACATGGTAATTTGCTTCCGGGC  （配列番号５３）
【００７１】
プローブ番号５２  90622Karenia brevis2
GTGTCTGGTCGCACTGCTCCG  （配列番号５４）
プローブ番号５３  90622Karenia brevis3
AATCTTCTGCTTGGCATGAAGGTTGCTA  （配列番号５５）
プローブ番号５４  90622taylory1
GCATGGGTTTAATGTGTAAATTGTATGAGC  （配列番号５６）
プローブ番号５５  90622taylory2
TTAGCTCGCATGTAGAGTGTCTGTGC  （配列番号５７）
プローブ番号５６  90622taylory3
CTGTGCAATGTAACATTGCAAC  （配列番号５８）
【００７２】
プローブ番号５７  90622 convolutum 1
GATGACAAAATGGTTCCATACG  （配列番号５９）
プローブ番号５８  90622 convolutum 2
GACAAAATGGTTCCATACGAC  （配列番号６０）
プローブ番号５９  90622 convolutum 3
GATGACAAAATGGTTCCATACGAC  （配列番号６１）
プローブ番号６０  90622toxicus1
GRAAGTGGAGTGYAAAGTGGGTGGTA  （配列番号６２）
プローブ番号６１  90622toxicus2
TGAGGGAARYGTGAAAAGGACTTTGGA  （配列番号６３）
プローブ番号６２  90622toxicus3
ACTTGCTGAWGDGCAAGCATACAG  （配列番号６４）
【００７３】
製造したDNAチップの配列図を図２に示した。
図中の番号１〜２１は、実施例１でのプローブ番号（配列番号３〜２３に示したプローブの番号）であり、番号２２〜６２は、本実施例２で列挙したプローブ番号（配列番号２４〜６４に示したプローブの番号）を示している。
【００７４】
実施例１と同様に以下のプランクトンのゲノムDNAを抽出・入手し、1ng/μlに調整して使用するまで-80℃に保存しておいた。
20     Pyrodinium bahamense
21     Prorocentrum mexicanum
22     Prorocentrum lima
23     Karenia brevis
24     Alexandrium taylori
25     Cochlodinium convolutum
26     Gambierdiscus toxicus
27     Coolia montis
28     Ostreopsis siamensis
【００７５】
＜PCR反応＞
次に、これら9種類の有毒渦鞭毛藻類の大サブユニットリボソームRNA（LSU rRNA）遺伝子D1、D2領域の配列を増幅した。
1ng/μl ゲノムDNA 1μlをテンプレートとし、以下の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した。PCR用キットは、QIGEN HotStarTaq Master Mix Kit（QIAGEN社）を用い、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ社、50μl、9600エミュレーションモード）により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、リバースプライマーは5'末端がCy5で蛍光標識化されているものを用いた。
【００７６】
フォワードプライマー  D1R：
5'-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3'  （配列番号１）
リバースプライマー    D2C：
5'-Cy5-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3'  （配列番号２）
【００７７】
＜反応液組成＞
2×HotStarTaq Master Mix           25μl
プライマーmix（10μM each）        5μl
テンプレートDNA（ゲノムDNA）       1μl
滅菌水                             19μl   
合計                               50μl
【００７８】
＜反応条件＞
94℃で5分間加熱後、「解離：94℃（30sec）→アニーリング：68℃（60sec）→合成：72℃（30sec）」を1サイクルとして計50サイクル行い、次いで72℃で5分間加熱した後、4℃で冷却した。
上記PCR後の反応液を、QIAGEN PCR MinElute精製キット（QIGEN社）でカラム精製し、22μl、1回で溶出した。約20μlのPCR産物を回収した。回収したPCR産物を電気泳動したところ、約700〜800bp付近に単一のバンドを認めた。
これら9種類の精製後のPCRをDNAチップにハイブリダイゼーションし、プローブの特異性を確認した。
【００７９】
＜DNAチップへのハイブリダイゼーション＞
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
精製後のPCR産物サンプル            15μl
滅菌水                             84μl
1M Tris/HCl（pH7.5）               18μl
1M NaCl                            18μl
0.5% Tween-20                      15μl   
合計                               150μl
150μlのハイブリダイゼーション溶液を、前記DNAチップに接触させ（アプライし）、50℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８０】
＜洗浄＞，＜検出＞，＜バックグラウンドの減算＞
これらについては、実施例１と同様の方法で実施した。
【００８１】
＜結果＞
シグナル強度の検出結果（算出結果）を下記の表３に示した。ここでプローブ番号１９、２０はKarenia brevisをハイブリダイゼーションしたときに、シグナル強度が上昇しているため、使用すべきプローブではないことが分かった。
また表３の結果から以下のことも分かった。
プローブ番号３７、３８、３９、４０の比較では、４０番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Pyrodinium bahamenseの検出には、プローブ番号４０番の配列のものが適していることが分かった。
プローブ番号６０、６１、６２の比較では、６０、６１番のプローブは、Gambierdiscus toxicus以外のものでもシグナル強度が上昇しており、６２番のみ使用できることが分かった。すなわち、Gambierdiscus toxicusの検出には、プローブ番号６２番の配列のものが適していることが分かった。
【００８２】
プローブ番号４１、４２、４３の比較では、４３番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Prorocentrum mexicanumの検出には、プローブ番号４３番の配列のものが適していることが分かった。
プローブ番号５７、５８、５９の比較では、５９番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Cochlodinium convolutumの検出には、プローブ番号５９番の配列のものが適していることが分かった。
プローブ番号５１、５２、５３の比較では、５１もしくは５２番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Karenia brevisの検出には、プローブ番号５１、もしくは５２番の配列のものが適していることが分かった。
【００８３】
プローブ番号４８、４９、５０の比較では、４８番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Coolia montisの検出には、プローブ番号４８番の配列のものが適していることが分かった。
プローブ番号４４、４５、４６、４７の比較では、４４番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Prorocentrum limaの検出には、プローブ番号４４番の配列のものが適していることが分かった。
プローブ番号５４、５５、５６、の比較では、５５番のプローブがもっともシグナル強度が高く、また特異的に検出できていることが明らかとなった。すなわち、Alexandrium tayloriの検出には、プローブ番号５５番の配列のものが適していることが分かった。
【００８４】
【表３】
2011182650.tif 000004
【実施例３】
【００８５】
海水に特定のプランクトンを添加したサンプルでの評価
より実際的な評価に耐えうるDNAチップとするために、実施例２で製造したDNAチップを用いて、引き続きプローブの評価を実施した。
【００８６】
＜サンプルの調製＞
2009年07月28日の広島湾桟橋海水を1リットル程度とり、これをオートクレーブして滅菌海水を得た。この滅菌海水50mlに、下記の(1)〜(12)及び(N)の組み合わせで、培養細胞を1種につき50細胞ずつ加えて、13種類のサンプルを作製した。その後、これらの溶液50mlを5マイクロのヌクレポアフィルター（直径24mm）上にろ過した。25mM NaOH に、Chelex100 Resin（Bio-Rad社製）が10％（w/vol）になるように懸濁した溶液を作製した。この溶液500μlに、上記のろ過したろ紙を入れ、100℃で10分間加熱した。氷上で冷却後、ボルテックスで混合し、さらに100mM Tris-HCl（pH7.5）を100μl加えてボルテックスで混合した。その後、卓上遠心機で遠心し、沈殿を底に沈ませ、上清をDNA抽出溶液として用いた。このようにして、12種類の混合DNA溶液とネガティブコントロール溶液を準備した。
【００８７】
＜サンプル番号，組み合わせの種類＞
(1)  A.tamarense、A.catenella、A.fraterculus
(2)  A.tamarense、A.catenella
(3)  A.fraterculus、A.ostenfeldii、H.akashiwo
(4)  H.akashiwo、G.catenatum、K.mikimotoi
(5)  G.catenatum、K.mikimotoi、K.brevis
(6)  K.brevis, C.polykrikoides，H.circularisquama
(7)  C.polykrikoides，H.circularisquama，A.affine
(8)  A.affine、A.tamiyavanichii、A.taylori
(9)  A.tamiyavanichii、A.taylori、C.montis
(10)  C.montis、Chattonella ovata、P.bahamense
(11)  Chattonella ovata、P.bahamense、P.lima
(12)  P.lima、P.mexicanum、A.tamarense
(N)  上記の培養細胞を全く加えていない海水のみ（Negative-Control）
これらすべて26種類のDNA溶液をPCR反応のテンプレートとして1μl使用した。
【００８８】
＜PCR反応＞，＜PCR反応後の精製＞，＜ハイブリダイゼーション＞，＜洗浄＞，
＜検出＞，＜バックグラウンドの減算＞
これらについては、実施例１と同様の方法で実施した。ただし、DNAチップは実施例２で製造したものを用いた。DNAチップでのシグナル強度の検出結果（算出結果）を下記表４に示した。表４中、太い四角で囲んである部分は海水に添加したプランクトンの種類である。また、灰色で示されている部位は、予期せぬクロスハイブリダイゼーションが起こった部位である。添加していないにもかかわらず、シグナル強度が500以上となった場合、クロスハイブリダイゼーションが起こったと判断した。
下記表４の結果と、実施例１、２の結果とを合わせた総合的な判断より、すべてのサンプルでクロスハイブリダイゼーションがなく、特異的に検出ができると考えられた新規なプローブを見出した。これら新規プローブを表５に示した。
【００８９】
【表４】
2011182650.tif 000005
【００９０】
【表５】
2011182650.tif 000006
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１〜６４：合成DNA
【図１】
2011182650.tif 000007
【図２】
2011182650.tif 000008
【図３】
2011182650.tif 000009
【配列表】
2011182650000001.app