(57)【要約】【課題】ヒト並びにマウス、ラット、家兎、その他の哺乳動物のMT1,2と特異的に反応するポリクロナール抗体を作製し、これを利用して生体成分中(血液、尿、組織)の微量MTを、正確に測定することのできる測定系を提供すること。特に今まで測定不可であった血中の低濃度ＭＴの測定を可能にする。それにより新しい診断法が確立する。【解決手段】MT と特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体およびこの抗体を利用したMTの高感度測定法、測定キットを開発した。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト並びにマウス、ラット、家兎その他哺乳動物のメタロチオネイン(以下MTと略)1，2と特異的に反応することを特徴とするポリクローナル抗体。
【請求項２】
MT蛋白1，2のN末端7アミノ酸ペプチド（末端アセチル化）とのみ交差する抗体である請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項３】
ラットMT2に、スカシ貝ヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSH）を結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から得られる抗血清を、さらにグロブリン分画に精製をすることにより得られたものである請求項１記載のポリクローナル抗体。
【請求項４】
検体に、請求項１ないし３の何れかに記載のポリクローナル抗体を作用させ、生体試料中（血液、尿、組織）のMTを測定することを特徴とする、高感度MTの酵素免疫定量法。
【請求項５】
請求項１ないし3の何れかに記載のポリクローナル抗体を含有することを特徴とする各種哺乳動物の生体試料中MTの測定キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素免疫定量法を用いた、簡便性、再現性、安定性に優れた高感度メタロチオネイン測定用キット
【背景技術】
【０００２】
従来の技術によりメタロチオネイン(以下ＭＴと略)の血中濃度の測定を目的としたRIA (非特許文献１,2), ELISA(非特許文献3，4)が報告されているが、いずれも不十分で現在一般に使用されていない。
【０００３】
従来法はMT1, MT2をそれぞれ別に測定しており、血中MT濃度で正常値領域以下の低濃度域の測定を可能にしたMT- ELISAは報告されていない。
【０００４】
これらの従来法では.動物並びにヒト血中MT濃度測定を、同一キットにより測定することは不可能であった。特にヒトMT低下症の検出を可能にする高感度メタロチオネインELISAは、現在までに開発されていない
【０００５】
従ってこのことを可能にする特異的な抗ＭＴ抗体を作成し、低濃度から高濃度のヒト並びに動物血中並びに尿中MT濃度の測定できるELISＡの開発が求められていた。
【０００６】
メタロチオネイン“MT”とは、生体成分として生体防御に働く低分子蛋白で、タンパク質のシステイン及びシスチン部のスルヒドリル基（-ＳＨ）ジスルフィド基（-Ｓ-Ｓ）が、金属イオンと結合して出来た化合物という意味でつくられた用語である（非特許文献5）。
【０００７】
金属元素を無機塩の型で経口的に摂取した場合、肝臓及び腎臓に多く集まるが、その際、金属元素と親和性の強いタンパク質が誘発的に生成されて、金属イオンとタンパク質からなる有機金属化合物のメタロチオネインが生体内で合成され、それが生体の毒物などに対する制御作用物質として働く。
【０００８】
例えば、少量のカドミウムイオンを経口的に与えておくと、動物のカドミウムイオンによる通常の致死量を超えても死なない。これは、生体内でカドミウムチオネインが生成されたことによる、免疫効果の結果と考えられている。実際、カドミウムイオンを含む塩類を経口的に動物に与えると、肝臓・腎臓・腸・脾臓などにメタロチオネイン（この場合はカドミウムチオネイン）が著明に増加し、その増加量はカドミウムの投与量にほぼ比例する（木村優著「微量元素の世界」より）
【０００９】
メタロチオネインの主な生理機能は以下の通りである。
1.必須微量元素の恒常性維持、あるいは過剰な重金属の解毒 
分子中に金属を取り込む性質に由来し、生物にとって必須ではあるが、その反応性の高さ故に毒性も有する重金属種の管理を行っている。さらに、代謝や転写を司る酵素に亜鉛含有酵素が多く存在することから、それらの酵素への亜鉛提供による代謝および転写調節の働きも示唆されている。
【００１０】
2.活性酸素種などのラジカルやアルキル化剤の消去 
システイン残基のチオール基がラジカル種と容易に反応する性質に由来する。すなわち、金属と結合していないチオールが毒性を有するラジカル種を消去している。また、メタロチオネインは20残基のシステインを有することから、この消去能は高く、酸化に対する防御因子として高い能力を持っている。さらに、サイトカインなどの生理活性物質や四肢緊縛、紫外線などの外的ストレスでも誘導されることから、抗炎症作用などの生体防御物質としての働きも注目されている(非特許文献6) 
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bremner I et al, Metallothionein II1987:507-17
【非特許文献２】Hamer DH, Ann Rev Biochem 1986; 55: 913-51
【非特許文献３】Grider a, eta l. L Lab Clin Med 1989; 113:221-２8
【非特許文献４】Akintola DF et al, J Lab Clin Med 1995; 125: 119-27
【非特許文献５】Margoshes M J Am Chem Soc 1957; 79:4813-4
【非特許文献６】Thornally PJ et al, Biochim Biophys Acta 1985; 827:36-44)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生体成分中に微量に存在するMT蛋白濃度を、簡便迅速、再現性よく測定することを目的とする。特にヒトにおけるMTの臨床的意義並びにその診断的有用性の確立のために、血中微量MT濃度の再現性の高い、簡便な高感度MT測定法が求められていた。
【００１３】
しかしながらこの目的を満たすための、特異性,親和性の高いMT抗体の作成が困難であり, 1 ng/mL以下の濃度の測定を可能にする高感度ELISA法の確立が難しかった。
【００１４】
従って本発明はそのような点を解決すべく、特異性、親和性の高いＭＴ抗体を作成し、試料の特殊な前処理を行うことにより,1 ng/mL以下の血中MT濃度をはじめ,体液、組織のMT濃度を、簡便かつ再現性の良いELISA法の確立を課題とした。
【００１５】
またMT1単独でなく、MT2も同時に測定でき、かつヒトＭＴ以外の哺乳動物のＭＴ測定も同時に測定が可能なＭＴ- ELISAの確立を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
1）抗ＭＴポリクローナル抗体の作成 と、それを用いたELISA法（ Competitive Enzyme-linked Immunoassay）の確立。
本発明はラットＭＴ２をKeyhole Limpet Hemocyanin (KLH)に結合したものを抗原として、家兎に免疫して作成したポリクロナール抗体を用いた。作成したＭＴ抗体とアミコンにて前処理をした試料サンプルを用いて、プレートに個相化したＭＴ抗原との競合反応を利用したELISA 法を確立した。
【発明の効果】
【００１７】
従来のＭＴ測定法の検出限界値は5 ng／ml以上であり、ヒト血中濃度の正常域より低濃度のMTを測定することができなかったため、ヒト血中MT濃度の測定法として十分ではなかった。本発明のMT-ELISA測定法は、500pg／ｍｌレベルの測定感度を有することから、低ＭＴ血症の検出も可能になり、疾病との関連を検討することが可能となった。また、試料の前処理法を工夫することにより、血中並びに尿中ＭＴの濃度測定を妨害する物質を除去し、MTの検出が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】家兎への5回のMT抗原の免疫スケジュール
【図２】抗体の認識部位の検討：ＭＴフラグメントの抗体との反応性。本抗体はN末端ペプチドでアセチル化メされたもののみと反応。
【図３】MT-ELISAの操作法の実際
【図４】MT測定の標準曲線（0.1ng/mＬから10、000ng/mLまでの測定域）
【図５】カドミウム投与によるマウス血中ＭＴ濃度の変化。投与後24時間で著明な血中MT濃度の上昇が認められた
【図６】カドミウム投与によるマウス組織のＭＴ濃度変化。投与後24時間で著明な各組織のMT濃度の上昇が認められた
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
図１に示したスケジュールにて、ＭＴポリクロナール抗体作成を行った。つまりラットMT2のメタロチオネイン各2mgを１mLのPBSに溶解後、等量のフロイントのアジュバントと混合し、ウサギに初回MT100μｇ/匹の量を皮下に投与した。その後２週間間隔でMT100μｇ/匹の免疫を行い、5回免疫後力価の測定を行った
【００２１】
図2に示したように、本抗体はアセチル基を持つMTのＮ末端ペプチド(7アミノ酸)とのみ、交差反応が認められた。従ってリコンビナントMTとは反応しない。またヒトとおなじMTのＮ末端構造をもつマウス、ラット,家兎等において,同じ反応性が認められた。
【００２２】
作成したMT抗体を用いて、以下のような競合反応を用いたMT-ELISA測定系を確立した。
【００２３】
図2に0.1ng/mLから10μｇ/mLまでのＭＴ標準曲を示した。
従ってヒト、実験動物の血中MT 0.5ng/mL濃度から1,000ng/mLまでの濃度域の測定が可能である
【００２４】
生体試料のMT濃度の測定
表１にヒト血中MT濃度の測定結果を示した
【表１】
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ヒト血清中のMT濃度測定に当たり、血清をそのまま反応系に加えても反応しないところから、分子量10万カットのアミコン限外濾過チューブにて分画し、遠心分離（12,０００ r.p.m ３０分）後、ろ液中のMT濃度を測定する。
【００２５】
それ以外の前処理法として、血清をPBSにて４倍希釈後、１０分間オーブンにて煮沸し、遠心分離後、上澄を測定する方法や、９９%アルコール、３%ズルフォサリチル酸等による除蛋白法も可能である。
【００２６】
なお血中にて添加したMTの回収試験の結果、100-138%の回収率が得られた。
同様の処理により、図５にカドミウム投与によるマウス血中ＭＴ濃度の変化を示した。カドミウム投与によりMT濃度が増加することが知られているが、血中にもその結果を反映している。
【００２７】
表２に実験動物の組織中MT濃度の測定結果を示した。カドミウム投与により臓器中のMT濃度が増加することが知られているが、その結果を反映している。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のポリクローナル抗体は、MT 1,2 と特異的に反応するため、ヒトをはじめとしてマウス、ラット、ウサギ等実験動物の、血中、尿中、組織等のMT濃度測定に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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