(57)【要約】【課題】飼育環境下または野生状態の哺乳動物、特に、ネズミ、イノシシ、サルなどの有害動物の産子数を抑制する薬剤を提供する。【解決手段】ベルベリンまたはその塩あるいはベルベリン含有抽出物は、受精卵の発生能を阻害する作用を有するため、受胎調節薬、例えば、避妊薬として用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベルベリンまたはその塩を有効成分として含有する避妊薬。
【請求項２】
ベルベリン含有生薬抽出物を含有する避妊薬。
【請求項３】
さらにＰ糖タンパク阻害剤を含有する請求項１または２記載の避妊薬。
【請求項４】
ベルベリンまたはその塩が塩化ベルベリンまたは硫酸ベルベリンである、請求項１または３記載の避妊薬。
【請求項５】
ベルベリン含有生薬抽出物がオウレンまたはオウバク抽出物である、請求項２または３記載の避妊薬。
【請求項６】
哺乳動物（ヒトを除く）の受胎調節方法であって、有効量のベルベリンまたはその塩を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項７】
哺乳動物（ヒトを除く）の受胎調節方法であって、有効量のベルベリン含有生薬抽出物を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オウレンおよびオウバク抽出物あるいはベルベリンまたはその塩を含有する避妊薬ならびにそれらを用いた受胎調節法に関する。詳細には、オウレンおよびオウバク抽出物あるいはベルベリンまたはその塩が、受精卵の発生能阻害作用によって、体外での受精卵および生体内での受精卵の発生能を阻害し、動物、特に、有害動物の産子数を減少させ、繁殖を制御することに関する。
【背景技術】
【０００２】
オウレン（黄連）とは、キンポウゲ科のオウレン（学名：Coptis japonica Makino）またはその他同族植物の根をほとんど除いた根茎である。オウバク（黄柏または黄檗）とは、キハダ（学名：Phellodendoron amurense Ruprecht）またはその他同族植物の周皮を除いた樹皮である。オウレンおよびオウバクは、古くから、胃出血、胃潰瘍、下痢などの様々な疾患に対する治療薬として東洋医学で広く用いられてきた（非特許文献１参照）。オウレンには乾燥重で４．２％以上、オウバクには１．２％以上のベルベリン（ベンジルイソキノリンアルカロイドの一種）が主要成分として含まれていることが知られている。そのベルベリンは、健胃薬、整腸薬、止瀉薬としてのみではなく、ＨＩＶやコレラなどの疾患に対する治療薬としても用いられている（非特許文献１参照）。さらに、最近になって、ベルベリンには抗がん作用があることが明らかになり、副作用の少ない食道がんなどのがん治療薬としても注目されている（非特許文献２参照）。しかしながら、ベルベリンの作用として、受精卵の発生能阻害作用が存在するとの報告はない。
【０００３】
また、従来より、動物の避妊法として、卵巣を除去するなどの外科的手術は知られていたが、直接的に投与する避妊薬の存在は知られていなかった。しかしながら、ヒトに対しては、経口避妊薬としてピルが存在している。そこで、動物、特に、ネズミなどの有害動物の増殖を調節しやすくするために、外科的手術にかわる非侵蝕的受胎調節法として、例えば、ピルのような使用しやすい避妊薬が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Imanshahidi and Hosseinzadeh, Phytotherapy Research, 22, 999-1012, 2008
【非特許文献２】Iizuka et al., Cancer Letters, 19-25, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、飼育環境下または野生状態の哺乳動物、特に、ネズミ、イノシシ、サルなどの有害動物の産子数を抑制する薬剤を提供すること、詳細には、受精卵の発生能を阻害して有害動物の産子数を抑制するベルベリンまたはその塩あるいはベルベリン含有生薬抽出物を含有する避妊薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、オウレン、オウバクなどのベルベリン含有生薬抽出物が受精卵の発生能阻害作用を有することを見出した。さらに、その作用は、生薬抽出物の主要成分ベルベリンによるものであることが明らかにされた。ベルベリンを哺乳動物に投与すると、交尾後の産子数が減少することが認められたので、オウレン、オウバク抽出物ならびにベルベリンを非侵蝕的受胎調節法として使用できる可能性を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は：
（１）ベルベリンまたはその塩を有効成分として含有する避妊薬；
（２）ベルベリン含有生薬抽出物を含有する避妊薬；
（３）さらにＰ糖タンパク阻害剤を含有する（１）または（２）記載の避妊薬；
（４）ベルベリンまたはその塩が塩化ベルベリンまたは硫酸ベルベリンである、（１）または（３）記載の避妊薬；
（５）ベルベリン含有生薬抽出物がオウレンまたはオウバク抽出物である、（２）または（３）記載の避妊薬；
（６）哺乳動物（ヒトを除く）の受胎調節方法であって、有効量のベルベリンまたはその塩を該哺乳動物に投与することを含む方法；
（７）哺乳動物（ヒトを除く）の受胎調節方法であって、有効量のベルベリン含有生薬抽出物を該哺乳動物に投与することを含む方法；
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、飼育環境下または野生状態の哺乳動物の増殖数を、外科的手術を施すことなく、有意に抑制することができる。また、ネズミなどの有害動物に投与することによって、産子数の増殖を制御することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
マウス受精卵を体外で培養する実験系を用いて、これまで２７２種の植物性・動物性生薬抽出物について、発生能阻害作用の有無を調べてきた。その結果、オウレン抽出物は０．０００１ｍｇ／ｍｌで、オウバク抽出物は０．０１ｍｇ／ｍｌでマウス１細胞期受精卵の胚盤胞期への発生をほぼ完全に阻害することが判明した。オウレンおよびオウバクの主要成分がベルベリンであることから、塩化ベルベリンと硫酸ベルベリンの効果についても検討した。その結果、いずれも０．００００１ｍｇ／ｍｌ濃度でマウス前核期受精卵の胚盤胞への発生能をほぼ完全に阻害することが判明した。また、塩化ベルベリン０．１ｍｇを、雌マウスに２、３、または６回筋肉内投与すると、交尾後の胚盤胞への発生率が有意に低下することが明らかになった。さらに、塩化ベルベリン０．１ｍｇを６回投与した後、交配すると、産子への発生数が有意に減少することも明らかになった。
【００１０】
したがって、オウレン抽出物およびオウバク抽出物ならびにその主要成分ベルベリンは、マウス受精卵の発生能を阻害する作用を持つこと、投与方法を工夫することによって哺乳動物における受胎調節薬として使用できることが判明した。
【００１１】
本発明は、１の実施態様において、有効成分としてベルベリンまたはその塩あるいはベルベリン含有生薬抽出物を含有する避妊薬を提供する。具体的には、哺乳動物にオウレンまたはオウバク抽出物あるいは塩化ベルベリンまたは硫酸ベルベリンを投与することによって、受精卵の発生能を阻害し、生体外または生体内受精卵の胚発生を阻害し、交尾後の産子数を減少させる。剤形は、対象の身体状況、健康状態などに応じて適宜選択することができ、目的に応じた担体や賦形剤を使用して調製することができる。例えば、注射剤、輸液剤などの液剤、経皮パッチ、軟膏、クリーム、粉末、錠剤、顆粒などの半固形〜固形剤などにすることができる。また、本発明の避妊薬の投与方法として、限定するものではないが、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内または静脈内）、直腸、局所および鼻腔内投与が挙げられる。本発明においては、経口投与または筋肉投与などの非経口投与が好ましい。１の実施態様において、筋肉内投与が提供される。本発明の避妊薬によるベルベリンの投与量は、１回あたり通常０．０４ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．４ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回〜数回投与することができる。投与は毎日、数日ごと、１週間〜数週間ごと、１ヶ月〜数ヶ月ごとにすることができる。好ましくは、動物の繁殖期またはその直前に投与する。本発明の避妊薬中のベルベリンは１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。すなわち、ベルベリン、ベルベリンの塩、その誘導体などを用いることができる。本発明の避妊薬は、好ましくは、ベルベリンあるいは塩化ベルベリンまたは硫酸ベルベリンを含有する。また、本発明の避妊薬はベルベリン以外の他の有効成分、例えば公知の避妊薬、受胎調節薬（例えば、メンフェゴールなど）を含んでいてもよい。
【００１２】
本明細書において、「ベルベリンまたはその塩」とは、医薬的、薬理学的または生理学的に許容されるものであり、特に限定されるものではない。このような塩としては、例えば、塩酸塩、塩化物、硫酸塩、タンニン酸塩などが挙げられる。本発明において、好ましいベルベリンの塩は、塩化ベルベリンまたは硫酸ベルベリンである。
【００１３】
ベルベリンまたはその塩は、公知化合物であり、公知の方法により合成してもよく市販品として入手することもできる。
【００１４】
本明細書において、「ベルベリン含有生薬抽出物」とは、ベルベリンを主要成分として含有する生薬を、水などの溶媒で抽出して、常法により調製したものである。かかる生薬の例としては、オウレン、オウバク、宿根草、オレゴングレープなどが挙げられる。本発明において、好ましくは、オウレンおよびオウバク抽出物である。オウレンおよびオウバクの抽出には、限定するものではないが、水、メタノールなどの溶媒が用いられる。本発明において、好ましくは、水が用いられる。これらの抽出物を、公知の方法により、濃縮して用いることもできる。
【００１５】
本明細書において、「哺乳動物」とは、ヒトおよびヒト以外の動物、特に限定するものではないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サルなどが挙げられる。以下、マウスを対象哺乳動物として具体的に説明するが、当業者に明らかなごとく、公知技術に基づいて適宜修飾することにより、他の哺乳動物についても同様に適用できる。
【００１６】
本発明は、さらなる実施態様において、ベルベリンまたはその塩あるいはベルベリン含有生薬抽出物およびＰ糖タンパク阻害剤からなる避妊薬を提供する。ベルベリンまたはその塩を有効成分とする薬剤は、交尾後の産子数を有意に減少させるものの完全には阻害しない。これは、Ｐ糖タンパクが存在することによって、ベルベリンの子宮への到達率が低くなることによるものと考えられる。そのため、ベルベリンとＰ糖タンパク阻害剤を併用することにより、ベルベリンの吸収が促進され、交尾後の産子数を完全に阻害する可能性が高くなる。
【００１７】
本明細書において、「Ｐ糖タンパク阻害剤」とは、Ｐ糖タンパクの機能を抑制または阻止する薬剤をいい、本発明の場合には、ベルベリン、ベルベリンの塩、ベルベリン誘導体の生殖器官内への取り込みを増強する薬剤であり、例えば、シクロスポリンＡやベラパミルが挙げられる（Pan et al., Planta Med., 69, 632-636, 2002）。また、Ｐ糖タンパク阻害剤以外にも、例えば、ベルベリンの筋肉内への投与回数を減らすために用いられる、アジュバントなどの薬剤を使用することもできる。「Ｐ糖タンパク」とは、ＡＢＣトランスポーターの１種であり、細胞表面に存在し、抗がん剤をはじめ多数の薬物を細胞内から細胞外にくみ出すポンプとしての機能を有する。抗がん剤に対するがん細胞の耐性化機構の一つとして発見された。脳や肝臓、腎臓などの正常な細胞にも発現していて、本来は有害な代謝物や生体異物を体外に排出する作用を有する。
【００１８】
本発明は、別の実施態様において、有効量のベルベリンまたはその塩あるいはベルベリン含有生薬抽出物を哺乳動物（ヒトを除いてもよい）に投与することを含む、受胎調節法を提供する。本発明の受胎調節法は体外においても、体内においても効果的に作用することができる。特に、体外においては完全に受精卵の発生能を阻害することができる。
【００１９】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
実施例１：生薬抽出物の調製
２７２種の生薬（一般用漢方２１０処方記載ならびに（株）ウチダ和漢薬から入手）を、必要に応じて粉砕し、１０ｇの生薬を５０ｍｌの蒸留水で２０分間煮沸した。次いで、上清を採取し、５分間遠心分離し（２，０００ｒｐｍ、５℃）、上清を−２０℃のフリーザーに約１週間保管した。次いで、各生薬抽出物を凍結乾燥させ、密封容器に入れて、供試するまで４℃の冷蔵庫内に保管した。
【実施例２】
【００２１】
実施例２：マウス受精卵の採取
マウス受精卵は、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）と胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）注射によって過剰排卵処置した。次いで、ｈＣＧ投与の２０時間後に、雄と交配したＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ）雌マウスの卵管を採取し、ヒアルロニダーゼ添加Ｍ２培地中で切り開き、卵丘細胞を除去し、卵を得た。Ｍ２液で３回洗浄した後、２個の前核を有する卵を受精卵と判定して、流動パラフィンで覆ったＫＳＯＭａａ培地に移し、培養開始まで炭酸ガス培養器内に静置した。
【実施例３】
【００２２】
実施例３：生薬抽出物がマウス受精卵の体外発生能に及ぼす影響
各生薬抽出物を１、０．１、０．０１または０．００１ｍｇ／ｍｌ添加したＫＳＯＭａａ培地に受精卵を５〜２０個／１０μｌ移して、５日間３７℃の炭酸培養器内で培養し、受精卵の発生能を阻害する生薬を探索した。発育状態を毎日観察するとともに、ｈＣＧ投与の１１６時間後、得られた胚盤胞の細胞数を、内細胞塊と栄養外胚葉に分けて計測した。なお、対照区には、ＫＳＯＭａａ単独で受精卵を同様に培養して、得られた結果を用いた。有意差の有無については、発生率をχ２検定で、細胞数をｔ検定で解析し、判定した。ｐ＜０．０５である場合に、「有意差有り」として判定した。
【実施例４】
【００２３】
実施例４：オウレンおよびオウバク抽出物がマウス受精卵の体外発生能に及ぼす影響
実施例３のスクリーニングの結果、２７２種の生薬抽出物のうち、オウレンとオウバク抽出物がマウス受精卵の発生能阻害作用を有することが見出された。そこで、発生能阻害作用をもたらす両生薬の最低濃度を探索し、濃度依存性について試験した。０．００００１〜１ｍｇ／ｍｌのオウレンおよびオウバク抽出物を添加したＫＳＯＭａａ培地で、マウス受精卵を５日間体外培養して発生能を調べた。
【００２４】
結果
対照、０．００００１〜１ｍｇのオウレン抽出物、および０．００００１〜１ｍｇのオウバク抽出物のマウス前核期受精卵の体外発生能を、以下の表１に示す。以下の表において、２細胞とは卵割した胚をいい、胚盤胞とは桑実胚を経て将来胎子を形成する細胞群と胎盤を形成する細胞群に分化した胚をいう。そのため、胚盤胞を観察することにより、受精卵の発生能を確認することができる。
【表１】
2011088874.tif 000002
【００２５】
０．０００１ｍｇ／ｍｌの濃度のオウレン抽出物を添加した培養液でマウス前核期受精卵を５日間培養すると、胚盤胞への発生はほぼ完全に阻害された。また、オウバク抽出物も胚盤胞への発生が阻害されたが、その阻害作用はオウレンに比べると１００分の１程度であった。
【実施例５】
【００２６】
実施例５：ベルベリンがマウス受精卵の体外発生能に及ぼす影響
塩化ベルベリンおよび硫酸ベルベリンがマウス受精卵の体外発生能に及ぼす効果を試験した。０．００００００１〜０．０１ｍｇ／ｍｌの塩化ベルベリンおよび硫酸ベルベリンを添加したＫＳＯＭａａ培地で、マウス受精卵を５日間体外培養して発生能を調べた。
【００２７】
結果
対照および０．００００００１〜０．０１ｍｇ／ｍｌの塩化ベルベリン、ならびに対照および０．００００００１〜０．０１ｍｇ／ｍｌの硫酸ベルベリンのマウス前核期受精卵の体外発生能を、以下の表２に示す。
【表２】
2011088874.tif 000003
【００２８】
０．０００１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の塩化ベルベリンを添加した培養液でマウス前核期受精卵を５日間培養すると、胚盤胞への発生はほぼ完全に阻害された。阻害効果は濃度依存的であり、０．０００１ｍｇ／ｍｌ添加区では卵割は阻害されないが、胚盤胞への発生は完全に阻害された。硫酸ベルベリンでは、０．００００１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で胚盤胞への発生が完全に阻害された。
【実施例６】
【００２９】
実施例６：塩化ベルベリン投与が受精卵の体内発生能および産子数に及ぼす影響
塩化ベルベリン０．１ｍｇを１日１回雌マウスに筋肉内注射し（１、２、３または６回）、低量の性腺刺激ホルモン（２．５単位ＰＭＳＧとｈＣＧ）を用いて過剰排卵処置した。次いで、交配して４日目に採卵し、回収卵数と発生状態を調べた。また、同様に６回投与した雌を過剰排卵処置した後、交配して、妊娠１８．５日目に胎子数を検査した。なお、対照区には蒸留水を同様に投与した雌を用いた。
【表３】
2011088874.tif 000004
【００３０】
結果
対照（３回投与）と塩化ベルベリン（１、２または３回投与）、および対照（６回投与）と塩化ベルベリン（６回投与）の受精卵の体内発生能ならびに対照（６回投与）および塩化ベルベリン（６回投与）の産子への発生能を、それぞれ、以下の表４および表５に示す。
【表４】
2011088874.tif 000005
【００３１】
【表５】
2011088874.tif 000006
【００３２】
塩化ベルベリン０．１ｍｇを２、３、および６回投与した場合には、胚盤胞に発育していた卵の割合は、それぞれ、３３％、３８％、および１０％と蒸留水を投与した対照区（３回投与：４３％、６回投与：３５％）に比べて有意に低下していた。さらに、０．１ｍｇ塩化ベルベリンを投与した場合の産子数（１匹当たり１２．１匹）は、対照区（１匹当たり１７．３匹）に比べて有意に減少していた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、オウレン、オウバクなどのベルベリン含有生薬抽出物およびベルベリンまたはその塩は、体外での受精卵の胚発生を完全に阻害し、さらに、雌への投与後の生体内の胚発生と産子への発生を有意に阻害するので、動物の避妊薬として利用可能であるのみならず、ヒトに対する避妊薬にも応用可能である。