(57)【要約】【課題】真核細胞における目的の組換え分子の大量産生に適切な、厳密に調節された誘導性遺伝子発現システムを提供すること。【解決手段】真核細胞における、誘導性の遺伝子発現のための組成物および方法。目的のヌクレオチド配列の発現は、転写ブロッキングドメインおよびリガンド結合ドメインからなる調節融合タンパク質によって制御される。リガンド結合ドメインに対する認識リガンドが存在する場合、ヌクレオチド配列の転写はブロックされる。認識リガンドの除去により、目的のヌクレオチド配列は、転写される。本方法は、真核細胞における所望の産物の大量調製に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許出願の記載）
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）の下で、米国仮出願第６０／３８４，００４号（２００２年５月２９日出願）の優先権を主張し、その出願は、本明細書中で、本出願中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、真核細胞における誘導性の遺伝子発現のための方法に関する。本発明は、誘導性の遺伝子発現が可能な細胞、このような細胞を含むトランスジェニック動物、ならびに調節融合タンパク質を含むヌクレオチド配列およびタンパク質を、さらに含む。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞における目的の組換えヌクレオチド配列の制御された発現のための種々の方法が、当該分野で公知である。例えば、Ｎｏら（Ｎｏら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３３４６−３３５１）は、ＶＰ１６転写活性化ドメインに融合するエクジソン核レセプターからなるキメラ転写活性化因子を利用する、誘導性の遺伝子発現システムを記載する。誘導物質の存在下で、このキメラ転写活性化因子は、プロモーターから上流の認識配列に結合し、目的のヌクレオチド配列の転写を刺激する。誘導物質の非存在下で、目的のヌクレオチド配列の発現は、減少し、目的のプロモーターのヌクレオチド配列からの転写の基礎レベルに依存する。Ｇｏｓｓｅｎら（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１）は、キメラタンパク質ｔＴＡ（ＶＰ１６転写活性化ドメインに融合するＴｅｔＲリプレッサータンパク質からなる）に基づく目的のヌクレオチド配列の発現を制御するシステムを記載する。エクジソンシステムと同様に、ＴｅｔＲ  ＤＮＡ結合部位を特定するＤＮＡ配列は、遺伝子プロモーターの上流に挿入され、それにより、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質の結合が、プロモーターからの転写および目的のヌクレオチド配列の発現を刺激する。ＶＰ１６転写活性化ドメインを利用する、標的化された転写調節のための最小プロモーターに近位の特定のＤＮＡ結合部位に標的化された他のシステムもまた、開発されており、これらとしては、以下が挙げられる：ＧＡＬ４−ＶＰ１６（Ｓａｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：５６３−５６４）、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６（Ｂｒｅｎｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０：７２９−７３６）、およびＬａｃＩ−ＶＰ１６（Ｌａｂｏｗら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４２−３３５６）。他のＴｅｔＲベースのシステムは、以下において記載される：Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９０７−１９１４およびＹａｏら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１９３９−１９５０。
最小のプロモーターの使用に関連する、漏出性の発現から生じる問題により、グルココルチコイド核レセプターまたはエストロゲン核レセプターのステロイド結合ドメインの融合を使用するシステムが導かれた。（例えば、Ｍａｔｔｉｏｎｉら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：３３５−３５２；Ｌｏｕｖｉｏｎら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３１：１２９−１３４；Ｉｉｄａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６０５４−６０５９を、参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｏら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３３４６−３３５１
【非特許文献２】Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１
【非特許文献３】Ｓａｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：５６３−５６４
【非特許文献４】Ｂｒｅｎｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０：７２９−７３６
【非特許文献５】Ｌａｂｏｗら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４２−３３５６
【非特許文献６】Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９０７−１９１４
【非特許文献７】Ｙａｏら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１９３９−１９５０
【非特許文献８】Ｍａｔｔｉｏｎｉら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：３３５−３５２
【非特許文献９】Ｌｏｕｖｉｏｎら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３１：１２９−１３４
【非特許文献１０】Ｉｉｄａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６０５４−６０５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、真核細胞における目的の組換え分子の大量産生に適切な、厳密に調節された誘導性遺伝子発現システムに関する。本発明のシステムの構成要素としては、以下が挙げられる：転写ブロッキングドメインおよびリガンド結合ドメインを有する融合タンパク質；この融合タンパク質の転写ブロッキングドメインに結合し、ヌクレオチド配列の転写を阻害するオペレーター；およびオペレーターの制御下にあるプロモーター。目的のヌクレオチド配列の発現が阻害されることが所望される場合、このシステムは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合可能なリガンドを含み、これにより、融合タンパク質が安定化される。目的のヌクレオチド配列が発現されることが所望される場合、リガンドは除去され、融合タンパク質の不安定化および分解を生じる。従って、認識リガンドの非存在において、融合たんぱく質は、オペレーターから除去され、そして目的のヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターのオペレーター阻害が除去され、それにより、目的のヌクレオチド配列の発現が可能になる。
【０００６】
第１の局面において、本発明は、真核細胞において、目的のヌクレオチド配列の発現を誘導する方法であって、この方法は、以下：（ａ）真核細胞を提供する工程であって、この真核細胞は、以下：（ｉ）調節融合タンパク質（ＲＰＲ）をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、この融合タンパク質は、以下：（１）この目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび（２）リガンド結合ドメインからなる融合タンパク質である、ヌクレオチド配列；（ｉｉ）この目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）この転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、真核細胞である、工程；（ｂ）この融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程（ａ）の細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、この目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程；ならびに（ｃ）この細胞の存在下からこのリガンドを除去する工程であって、ここで、この目的のヌクレオチド配列の発現が誘導される工程を、包含する。
【０００７】
転写ブロッキングドメインは、ＤＮＡに結合可能であり、かつ隣接するプロモーターからの転写をブロック可能なタンパク質である。より特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質、バクテリオファージリプレッサータンパク質、真核生物リプレッサータンパク質、または酵母リプレッサータンパク質に由来し得る。より特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質またはバクテリオファージリプレッサータンパク質に由来する。さらにより特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｒｐＲ、Ａｒｃ、およびλＣｌからなる群から選択されるリプレッサータンパク質に由来する。別の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、真核生物リプレッサータンパク質に由来する。さらにより特定の実施形態において、このリプレッサータンパク質は、ＧＡＬ４に由来する。
【０００８】
本発明の方法の別の特定の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、ＤＮＡに結合し得るが切断し得ない変異制限酵素であり、オペレーターが、この制限酵素の認識部位である。より特定の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、変異Ｎｏｔ１である。
【０００９】
特定の実施形態において、リガンド結合ドメインは、ステロイドレセプター、甲状腺レセプターまたはレチノイドレセプターに由来する。より特定の実施形態において、このリガンド結合ドメインは、エストロゲンレセプターに由来し、そしてその同族リガンドは、エストロゲンである。さらにより特定の実施形態において、このエストロゲンレセプターは、１つ以上の変異（例えば、Ｔ２変異）を含み、その同族リガンドは、タモキシフェンである。
【００１０】
種々の真核細胞が、本発明の方法において使用され得る。これらの真核細胞としては、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、ＢＨＫもしくはＮＳ０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
本発明は、目的のヌクレオチド配列の転写において広範に使用され得、この目的の産物は、ｍＲＮＡもしくは触媒活性ＲＮＡ、または転写された目的のヌクレオチド配列から生じる下流産物（例えば、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント）のような、転写産物であり得る。このタンパク質またはタンパク質フラグメントとしては、ホルモン、レセプターもしくはレセプターフラグメント、抗体もしくは抗体フラグメント、生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、酵素、リプレッサータンパク質、またはＤＮＡ結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
第２の局面において、本発明は、調節融合タンパク質（ＲＰＲ）をコードする、単離されたヌクレオチド配列に特徴を有する。ここで、この融合タンパク質は、（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメイン（このリガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で、この融合タンパク質が安定化される）からなる。
【００１３】
別の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質、バクテリオファージリプレッサータンパク質、真核生物リプレッサータンパク質、または酵母リプレッサータンパク質に由来し得る。より特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質またはバクテリオファージリプレッサータンパク質（例えば、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｒｐＲ、Ａｒｃ、およびλＣｌ）に由来する。別の実施形態において、真核生物リプレッサータンパク質（例えば、ＧＡＬ４）に由来する。別の特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、ＤＮＡに結合し得るが切断し得ない変異制限酵素であり、オペレーターが、この制限酵素の認識部位である。この特定の実施形態において、例えば、転写ブロッキングドメインは、変異Ｎｏｔ１である。
【００１４】
特定の実施形態において、リガンド結合ドメインは、ステロイドレセプター、甲状腺レセプターまたはレチノイドレセプターに由来する。より特定の実施形態において、このリガンド結合ドメインは、エストロゲンレセプターに由来し、そしてその同族リガンドは、エストロゲンである。さらにより特定の実施形態において、このエストロゲンレセプターは、１つ以上の変異（例えば、Ｔ２変異）を含み、その認識リガンドは、タモキシフェンである。
【００１５】
第３の関連する局面において、本発明は、調節融合タンパク質（ＲＰＲ）の特徴を有する。ここでこの調節融合タンパク質（ＲＰＲ）は、（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメイン（このリガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で、この融合タンパク質が安定化される）からなる。特定の実施形態において、この調節融合タンパク質（ＲＰＲ）は、本質的に、（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメイン（このリガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で、この融合タンパク質が安定化される）からなる。
【００１６】
第４の局面において、本発明は、目的のヌクレオチド配列の誘導性の発現が可能な真核細胞に特徴を有する。ここで、この目的のヌクレオチド配列は、以下を含む：調節融合タンパク質（ＲＰＲ）をコードするヌクレオチド配列（ここでこの融合タンパク質（ＲＰＲ）は、（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメインからなる）；（ｉｉ）この目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）この転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター。特定の実施形態において、この真核細胞融合タンパク質は、本質的に以下からなる：（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメインからなる）；（ｉｉ）この目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）この転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター。
【００１７】
第５の局面において、本発明は、目的のヌクレオチド配列の誘導性の発現が可能な真核細胞を含むトランスジェニック動物に特徴を有する。ここで、この目的のヌクレオチド配列は、以下を含む：調節融合タンパク質（ＲＰＲ）をコードするヌクレオチド（ここでこの融合タンパク質は、（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメインからなる）；（ｉｉ）この目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）この転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター。
【００１８】
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
真核細胞において、目的のヌクレオチド配列の発現を誘導する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）真核細胞を提供する工程であって、該真核細胞は、以下：（ｉ）調節融合タンパク質（ＲＰＲ）をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下：（１）該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび（２）リガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列；（ｉｉ）該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、工程；
（ｂ）該融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程（ａ）の細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程；ならびに
（ｃ）該細胞の存在下から該リガンドを除去する工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が誘導される、工程、
を、包含する、方法。
（項目２）
前記転写ブロッキングドメインが、細菌性転写ブロッキングタンパク質、バクテリオファージ転写ブロッキングタンパク質、真核生物転写ブロッキングタンパク質、または酵母転写ブロッキングタンパク質に由来する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記転写ブロッキングドメインが、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｒｐＲ、ＡｒｃおよびλＣｌからなる群から選択される、細菌性転写ブロッキングタンパク質に由来する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記転写ブロッキングドメインが、真核生物転写ブロッキングタンパク質に由来し、該真核転写ブロッキングタンパク質はＧＡＬ４である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記転写ブロッキングドメインが、ＤＮＡに結合し得るが切断し得ない変異制限酵素であり、前記オペレーターが、該制限酵素の認識部位である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記転写ブロッキングドメインが、変異Ｎｏｔ１酵素である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記リガンド結合ドメインが、ステロイドレセプター、甲状腺レセプターまたはレチノイドレセプターに由来する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記リガンド結合ドメインが、エストロゲンレセプターに由来し、そして、その同族リガンドがエストロゲンである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記リガンド結合ドメインが、エストロゲンに由来し、そして、その同族リガンドがタモキシフェンである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結する前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ラウス肉腫ウイルス、メタロチオネイン、ノパリンシンテターゼ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡ、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ、Ｇａｌ４、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ、アルカリホスファターゼ、エラスターゼＩ；インスリン；免疫グロブリン；マウス乳癌ウイルス；アルブミン；α−胎児タンパク質；α１−アンチトリプシン；β−グロビン；およびミオシン軽鎖−２に由来する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記プロモーターが、ＣＭＶ−ＭＩＥである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記真核細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞、またはＮＳＯ細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記オペレーターが、ＴｅｔＯまたはＡｒｃＯである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記オペレーターが、前記プロモーターのすぐ下流に位置する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記オペレーターが、前記プロモーターの１０塩基対以内に位置する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記リガンドの非存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも２０倍高い、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記リガンドの非存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも５０倍高い、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
調節融合タンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下：（１）目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および（２）リガンド結合ドメインからなり、ここで、該リガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で該融合タンパク質が安定化される、ヌクレオチド配列。
（項目１９）
項目１８に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、調節融合タンパク質。
（項目２０）
目的のヌクレオチド配列の発言を誘導し得る真核生物であって、調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該融合タンパク質は、以下：（１）該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび（２）リガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列；（ｉｉ）該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、真核細胞。
（項目２１）
項目２０に記載の細胞を含む、トランスジェニック動物。
（項目２２）
真核細胞において、目的のヌクレオチド配列由来の産物の生成を制御する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）真核細胞を提供する工程であって、該真核細胞は、以下：（ｉ）調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下：（１）該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび（２）リガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列；（ｉｉ）該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター；および（ｉｉｉ）該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、工程；
（ｂ）該融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程（ａ）の細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程；  
（ｃ）該細胞の存在下から該リガンドを除去する工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が誘導され、そして該目的のヌクレオチド配列の産物が生成される、工程
を、包含する、方法。
（項目２３）
前記目的のヌクレオチド配列の産物が、ＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質フラグメントである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記リガンドの存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド非存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より１００倍低い、項目２２に記載の方法。
他の目的および有利性は、以下の詳細な説明を概説することから明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＣＭＶプロモーターからのＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２の発現に望ましい、ｐＴＥ３１３の構造を表す。
【図２】図２は、ＣＭＶプロモーターからのヒトＦＣγＲＩの発現（テトラサイクリンリプレッサーによって調節される）に望ましい、ｐＴＥ１５８の構造を表す。
【図３】図３は、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節されるｈＦｃγＲＩ遺伝子を発現するＣＨＯ  Ｋ１クローンを単離するために使用される、２つの戦略の概要を示す。
【図４】図４は、ＯＨＴ存在下もしくは非存在下、またはＯＨＴおよびＤｏｘの存在下において増殖したＣＨＯ  Ｋｌ−ＦｃＲ／ｐＴＥ３１３クローンＤ１２４（ＦＩＴＣ−Ｆｃで染色した）のフローサイトメトリヒストグラムを示す。
【図５】図５は、融合タンパク質Ａｒｃ２−ＥＲＬＢＤＴ２の概略図である。
【図６】図６は、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサー（ＴＡＴＡボックス）のすぐ下流に、直列するアークオペレーター（ａｒｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒ）を有する、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡＯのハイブリッドプロモーター（配列番号７）の概略図である。
【図７】図７は、ＯＨＴ存在下または非存在下で増殖した、ＣＨＯ  Ｋ１−ＦｃＲ／ｐＴＥ５３４クローンＣ１７（ＥＩＴＣ−Ｆｃ）のフローサイトメトリのヒストグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法および特定の実験条件に限定されず、このような方法および条件は変わり得ることが、理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するのみの目的であり、限定することを意図しない。何故なら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲にのみ限定されるからである。
本明細書中および特許請求の範囲の中で使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに指示しない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「方法」の言及は、本明細書中で記載される型ならびに／または本開示を読むことで当業者に明らかになる、１つ以上の方法および／もしくは工程などを含む。
【００２１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書中に記載のものと類似または等価の任意の方法および材料が、本発明を実施または試験するために使用され得るが、ここでは、好ましい方法および材料が、記載される。本明細書中で言及された全ての刊行物は、この刊行物が引用されたことに関する方法および／または材料を説明するために、本明細書中で参考として援用される。
【００２２】
（一般的説明）
本発明は、真核細胞における遺伝子発現が、オペレーター（このオペレーターは、調節融合タンパク質（ＲＦＰ）によって調節される）によって制御される強いプロモーターを使用して厳密に調節され得るという概念に、一部基づく。このＲＦＰは、本質的に転写ブロッキングドメイン、およびその活性を調節するリガンド結合ドメインからなる。リガンド結合ドメインの同族リガンドの存在下において、ＲＦＰはオペレーターに結合し、それにより、ＧＯＩの転写を妨げる。同族リガンドが取り除かれた場合、ＲＦＰは、不安定化され、そして目的のヌクレオチド配列の転写が進行する。
【００２３】
本明細書中に記載される調節システムは、目的のヌクレオチド配列の発現の厳密に調節された制御と、大量産生に適した、目的のヌクレオチド配列の高レベルの発現が可能な細胞株の単離を組み合わせるという、特有の利点を提供する。「厳密に調節された」は、本発明の融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、目的のヌクレオチド配列の転写が実質的に低下する（例えば、リガンド存在下で、リガンド非存在下で見られる転写のレベルと比較して、転写における少なくとも２０分の１への低下が達成される）を意味する。より特定の実施形態において、本発明の方法は、リガンド存在下の転写において、少なくとも５０分の１へ以下の低下を達成する。さらにより特定の実施形態において、本発明の方法は、リガンド存在下の転写において、１００分の１以下への低下を達成する。本発明の方法によって達成される転写制御の程度の例は、図４および図７において示される。本発明の方法によって達成される転写の調節の程度はまた、リガンド非存在下における目的のヌクレオチド配列の発現における相違によっても述べられ、これは、リガンド存在下における目的のヌクレオチド配列の発現よりも、少なくとも２０倍より大きく、好ましくは少なくとも５０倍より大きく、より好ましくは少なくとも１００倍より大きく。
【００２４】
目的のヌクレオチド配列を高レベルで発現可能な細胞株の単離は、厳密な調節を必要とするが、目的のヌクレオチド配列の発現誘導は、好ましくは、誘導体の添加よりむしろ誘導体の除去によって達成され、これは、大量産生の間にリガンドの添加を必要とするシステムに対して製造コストを削減する手段として、実質的に商業的に重要である。本発明は、これらの要求を満足させる調節システムを説明する。
【００２５】
（目的のヌクレオチド配列）
本発明の方法は、任意の目的のヌクレオチド配列の転写を制御するために広範に使用され得る。本発明の方法は、所望のタンパク質またはタンパク質フラグメント（例えば、融合またはキメラのタンパク質またはペプチド）を産生するために使用され得る。さらに、目的の産物は、転写産物（例えば、ｍＲＮＡもしくは触媒活性ＲＮＡ、または最初の転写産物の作用から生じる下流産物）であり得る。
【００２６】
目的のタンパク質としては、ホルモン、レセプターもしくはレセプターフラグメント、抗体もしくは抗体フラグメント、生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、酵素、リプレッサータンパク質、またはＤＮＡ結合タンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２７】
（プロモーター）
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、作動可能に連結した（すなわち、適切なシグナルが存在する場合、目的のヌクレオチド配列の転写を可能にする方法で連結した）ＤＮＡ配列の直接転写に十分なＤＮＡ配列を示す。目的のヌクレオチド配列の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントの制御下に置かれ得る。
【００２８】
本発明において使用され得る有用なプロモーターとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの長い３’末端反復配列に含まれるプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、マウスサイトメガロウイルスＩＥプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎら，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１）；ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンテターゼプロモーター領域、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、および光合成酵素リブロース２リン酸カルボキシラーゼのプロモーターを含む植物発現ベクター；酵母または他の真菌類由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター）、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写調節領域：エラスターゼＩ；インスリン；免疫グロブリン；マウス乳腺癌ウイルス；アルブミン；α−フェトプロテイン；α１−抗トリプシン；β−グロビン；およびミオシン軽鎖−２。
【００２９】
（オペレーター）
本明細書中で使用される場合、「オペレーター」は、遺伝子がＲＦＰのオペレーターへの結合によって調節され得、結果としてＧＯＩの転写を妨げるかまたは可能にするような方法によって、遺伝子内またはその近傍に導入される、ＤＮＡ配列を示す。原核細胞およびバクテリオファージにおける多くのオペレーターは、よく特徴付けられている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｄ．  Ｖｏｌ２  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９９６）。これらとしては、Ｅ．ｃｏｌｉのＬｅｘＡ遺伝子のオペレーター領域（ＬｅｘＡペプチドに結合する）ならびに乳糖オペレーターおよびトリプトファンオペレーター（Ｅ．ｃｏｌｉのＬａｃＩおよびｔｒｐＲ遺伝子にコードされるリプレッサータンパク質に結合する）が挙げられるが、これらに限定されない。これらとしてはまた、λＰＲ遺伝子およびファージＰ２２ａｎｔ／ｍｎｔ遺伝子に由来するバクテリオファージオペレーター（λｃＩおよびＰ２２ａｒｃによってコードされるリプレッサータンパク質に結合する）が挙げられる。代替の実施形態において、ＲＦＰの転写ブロッキングドメインが制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者は、このオペレーターが、プロモーターに隣接するか、または３’側でなければならず、これにより、プロモーターによって転写を制御し得ることを理解する。例えば、米国特許第５，９７２６５０号（本明細書中で参考として援用される）は、ｔｅｔＯ配列が、ＴＡＴＡボックスから特定の距離の範囲内に存在することを明確に述べている。特定の実施形態において、オペレーターは、好ましくは、プロモーターのすぐ下流に置かれる。他の実施形態において、このオペレーターは、プロモーターから１０塩基対以内に置かれる。
【００３０】
（転写ブロッキングドメイン）
本明細書中で使用される場合、転写ブロッキングドメインは、オペレーターとのその相互作用の結果として転写をブロッキング可能な任意のドメインであり得る。このようなドメインは、細菌、バクテリオファージ、または酵母に由来し得、そしてその機能がリガンド結合に依存するリプレッサーまたはその誘導体（例えば、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩおよびＡｒｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、転写ブロッキングドメインは、哺乳動物細胞（例えば、Ｙｉｎら１９９５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６２０９−６２１８に記載されるように）または植物細胞（例えば、Ｗｉｌｄｅら１９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３８に記載されるように）に由来し得る。転写ブロッキングドメインはまた、合成的に作製され得る。例えば、転写ブロッキングドメインは、ＤＮＡを切断し得ないように変異された制限酵素であり得る。このような場合、この酵素の認識配列は、オペレーターとして使用される。
【００３１】
（リガンド結合ドメイン）
融合タンパク質のオペレーターと相互作用する能力が転写ブロッキングドメインで制御される一方、融合タンパク質の活性は、リガンド結合ドメインによって調節される。リガンド結合ドメインは、その同族リガンドに結合した場合、機能的なポリペプチドを与える（例えば、ポリペプチドを安定化する）、任意のポリペプチドに由来し得る。リガンド結合ドメインは、天然に存在するリガンド結合ドメインおよびその機能的誘導体を含むことを意味する。本明細書中で使用する場合、「同族リガンド」は、リガンド結合ドメイン、およびその機能的誘導体に結合する天然に存在するリガンドを含む。このようなリガンド結合ドメインの例としては、ステロイドレセプター、グルココルチコイドレセプター、レチノイドレセプターおよび甲状腺レセプターのリガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない（Ｅｉｌｅｒｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：６６−６８；Ｐｉｃａｒｄら（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５４：１０７３−１０８０）。実施例１〜３は、融合タンパク質の転写ブロッキングドメインがＴｅｔＲであり、リガンド結合ドメインがＴ２変異を有するエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤＴ２；Ｆｅｉｌら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７）である本発明の１つの実施形態を説明する。ＴｅｔＯ配列が強力なＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターの下流および近位に置かれる場合、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯプロモーターからの目的のヌクレオチド配列（この場合ｈＦｃγＲＩ）の転写は、タモキシフェンの存在下でブロックされ、タモキシフェンの除去によりブロック解除される。
【００３２】
（細胞選択方法論）  
本発明の方法は、目的のヌクレオチド配列について高産生率を有する細胞を産生する。以下の実験の章において記載される方法に加えて、当該分野で公知の種々の選択プロセスが使用され得る。１つの好ましい実施形態において、選択プロセスは、２００２年１１月１４日に公開されたＵＳＳＮ  ２００２０１６８７０２（本明細書中で詳細に参考として援用される）に記載される、「ＦＡＳＴＲ」方法論である。ＦＡＳＴＲ方法論は、融合タンパク質の直接スクリーニングによる、本発明のサイトカイン特異的融合タンパク質を分泌する細胞の迅速な単離のための高スループットスクリーニング方法である。
【００３３】
（トランスジェニック動物）
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製を企図する。例えば、哺乳動物において、目的のヌクレオチド配列の発現を調節することが望ましい場合がある。本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、哺乳動物のゲノムに統合され得、それにより、そのプロモーターが融合タンパク質に反応し得るように操作される、目的のヌクレオチド配列の発現を調節する。さらに、トランスジェニック動物は、目的のヌクレオチド配列の供給源として有用であり得る。
【００３４】
トランスジェニック動物は、受精卵細胞の雄性前核への核酸構築物の導入（例えば、微量注入法、レトロウイルス感染）し、卵細胞を偽妊娠した養母動物（ｆｅｍａｌｅ  ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）において発生させることによって産生され得る。発現ベクターにおいて有用な、何らかの調節配列または他の配列は、トランスジェニック配列の一部を形成し得る。組織特異的調節配列は、導入遺伝子の発現を特定の細胞に向けるために、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
【００３５】
（キット）
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの融合タンパク質を満たした１つ以上の容器を含むキットを提供する。必要に応じて、このような容器は、医薬品または生物学的製品の製造、使用、販売を規制する行政機関により定められた形態で認められ得、この形態は、（ａ）ヒト投与のための製造、使用、販売の機関による承認、（ｂ）使用の説明、またはこの両方を反映する。
【００３６】
（特定の実施形態）
実施例１は、ｐＴＥ３１３プラスミド、ｐＴＥ０８４プラスミド、およびｐＴＥ１５８プラスミドの構築を記載する。ｐＴＥ３１３を、調節融合タンパク質ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２の高レベル発現のために設計した。これは、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２融合遺伝子がＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動される第１の独立した発現カセット、およびＳＶ４０プロモーターによって駆動されるブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）抵抗性遺伝子である第２の独立したカセットを含む（図１）。ｐＴＥ０８４を、ｈＦｃγＲＩ（ヒトＩｇＧのＦｃドメインに対する高親和性細胞表面レセプター）の高レベル発現のために設計した。２つの縦列のＴｅｔＲオペレーターを、ｐＴＥ０８４内のＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置することによって、ｐＴＥ１５８を産生した（図２）。ｐＴＥ３１３によるトランスフェクション後にＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２  ＲＦＰによって調節されたｈＦｃγＲＩ遺伝子を発現するＣＨＯ  Ｋ１細胞を、実施例２において記載されるように産生し、そして同定した。
【００３７】
ｐＴＥ３１３によるトランスフェクション後にＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２  ＲＦＰによって調節されるｈＦｃγＲＩ遺伝子を発現するクローンを単離するために、２つの戦略が、使用される（図３）。両戦略を、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２  ＲＦＰのＣＨＯ  Ｋ１−ＦｃＲ細胞の導入および単離後に得られた細胞の同じプールから開始した（実施例３）。これらの結果は、組換え遺伝子の発現は、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２によって厳密に調節され得、そして発現の誘導は、タモキシフェン存在下におけるドキシサイクリンの添加またはタモキシフェンの除去のどちらかによって達成され得ることを、明らかに示す（図４）。培地からの低分子の除去による目的のヌクレオチド配列の発現の誘導を、希釈または培地交換によって容易に達成した。このことは、大規模に発現を誘導するための、対費用効果の高い手段を提供する。さらに、これらのデータは、発現の厳密な調節は、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２調節融合タンパク質によって達成され得ることを示す。
【００３８】
ｈＦｃγＲＩ（ＣＭＶ−ＭＥ／ＡｒｃＯ２プロモーターによって駆動される）を発現するＣＨＯ  Ｋ１細胞を、実施例４および実施例５において記載のように産生した。Ａｒｃ−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節される誘導性細胞株を、図３において示した戦略と同様の戦略によって選択し、そしてＯＨＴの増殖培地中の存在に対する応答における厳密な調節を示した（実施例６および図７）。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は、本発明の方法および化合物をいかに作製しそして使用するかについて、当業者に完全な開示および記載を提供するために示され、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定することを意図しない。使用した数（例えば、量、温度など）に関し、正確を期するよう努力したが、幾つかの実験的誤差およびずれは勘定に入れられるべきである。示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧またはその近くである。
【００４０】
（実施例１．ｐＴＥ３１３、ｐＴＥ０８４およびｐＴＥ１５８の構築）
ｐＴＥ３１３を、ｐＴＡ−ＥＲ−ＬＢＤ−Ｔ２（Ｔ２変異を有するヒトエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤＴ２）（Ｆｅｉｌら，１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７：７５２−７５７）をコードする）由来の９７５ｂｐのＥｃｏＲ  Ｉフラグメント（平滑化）をｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ−１０２５−２０）のＥｃｏＲ  Ｉ部位（平滑化、ＴｅｔＲ  Ｃ末端のすぐ後のリンカー領域中）内に連結することにより、構築した。Ｔ２変異であるＧ４００Ｖ、Ｍ５４３Ａ、およびＬ５４４Ａにより、エストラジオールアナログであるドキシサイクリンとの結合に対する特異性を与えられる。ライゲーションによって生じた所望のプラスミドにおいてＥＲＬＢＤＴ２をコードするフラグメントの、連結から生じる適切な方向を、ＤＮＡ配列決定によって確かめた。この構築により、エストロゲンレセプターのアミノ酸Ｎ３０４〜Ｖ５９５（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ０３３７２）と融合したＴｅｔＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＦ７５６０８）のアミノ酸Ｍ１〜Ｓ２０７からなる融合タンパク質をコードする遺伝子が生じた。この遺伝子によってコードされるキメラタンパク質もまた、エストロゲンレセプターにおいて、Ｔ２変異であるＧ４００Ｖ、Ｍ５４３Ａ、およびＬ５４４Ａを有する。プラスミドｐＴＥ３１３は、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動されるＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２融合遺伝子であるカセットを含み、そしてＳＶ４０プロモーターによって駆動されるブラスチシジン抵抗性遺伝子である第２のカセットを含む（図１）。
【００４１】
ｐＴＥ０８４を、ヒトＦｃγＲＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２１０９１）をコードするｐＣＡＥ１００由来の１，４３６ｂｐのＸｂａ  Ｉフラグメントを、ｐＲＧ８２１（Ｇ４１８に抵抗性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ）遺伝子をコードするベクター）のＸｂａＩ部位内に連結することによって、構築した。このライゲーションから生じる、所望のプラスミドにおけるｈＦｃｇＲＩの方向性は、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＩ、およびＳｔｕ  Ｉでの制限マッピングによって試験され得る。２つの縦列のＴｅｔＲオペレーターをコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＴＥ０８４中のＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置し、ｐＴＥ１５８を作製した（図２）。このプラスミドにおいて、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターからのｈＦｃγＲＩの転写は、ＴｅｔＲまたはＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節された。
【００４２】
（実施例２．ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯによって駆動されるｈＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ  Ｋ１誘導体の構築）
ＣＨＯ  Ｋ１細胞（３×１０６細胞）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の指示に従って用いて、ｐＴＥ１５８でトランスフェクトした。細胞を、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む培地（１０％ウシ胎仔血清、９０％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；全ての試薬は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）内に、１２日間置いた。Ｇ４１８抵抗性の細胞を、トリプシン処理し、プールし、そしてＦＩＴＣ結合ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（ＦＩＴＣ−ｈＦｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。簡潔には、１０ｃｍ培養プレート上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム非含有のダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１回洗浄した。２ｍｌの０．２５％トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、各プレートに添加し、そして３７℃で４〜５分インキュベートした。このプレートを、細胞がプレートから解離するまで旋回した。４ｍｌの培地を、細胞の離れた各プレートに直ちに加えた。細胞を、次いで、１，０００×ｇ、４分間の遠心分離によって回収し、培地で希釈した、４ｍｌの２μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−ｈＦｃに再懸濁した。細胞を、次いで、プラットフォーム振盪機（ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｓｈａｋｅｒ）上に置き、そして１時間室温で染色した。未結合のＦＩＴＣ−ｈＦｃを除去するため、細胞を、８ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。ＦＩＴＣ−ｈＦｃと結合することが可能な洗浄した細胞を、ＭｏｆｌｏＴＭセルソーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）においてフローサイトメトリで測定した。ＦＩＴＣ−ｈＦｃは、非トランスフェクト親ＣＨＯ  Ｋ１細胞を染色しなかったが、Ｇ４１８抵抗性ｐＴＥ１５８トランスフェクトプールにおいて蛍光の分布を生じた。Ｇ４１８抵抗性集団由来の蛍光細胞の全プールを、フローサイトメトリによって収集し、展開し、次いでｈＦｃγＲＩの発現についてのフローサイトメトリによって分析した。この集団における、最高１５％蛍光を有する細胞を単離し、プールし、そして展開し、ｈＦｃγＲＩを高レベルで発現するＧ４１８抵抗性細胞の集団を生じた。この細胞の集団を、ＣＨＯ  Ｋ１−ＦｃＲと名付け、そしてｐＴＥ３１３のトランスフェクション後、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２  ＲＦＰによって調節されるｈＦｃγＲＩ遺伝子を発現するクローンを単離するために、使用した。
【００４３】
（実施例３．ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節されるｈＦｃγＲＩ発現を有する、ＣＨＯ  Ｋ１細胞株の構築）
ＣＨＯ  Ｋ１−ＦｃＲ細胞（２×１０６細胞）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭを用いてｐＴＥ３１３でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および１０μｇ／ｍｌのブラスチシジンで１４日間、ｐＴＥ１５８およびｐＴＥ３１３の両プラスミドについて選択した。フローサイトメトリによる分析の２日前、細胞を、２００ｎＭタモキシフェン（ＯＨＴ）含有培地中でインキュベートし、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２の活性を安定化し、ｈＦｃｇＲＩの発現を抑制した。細胞を、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色し、そして最低２％の蛍光を有し、ｈＦｃγＲＩ発現の抑制を示すこれらの細胞を、回収し、プールＡ１を得た。次いで、このプールを、図３において概略される２つの戦略のための細胞の供給源として使用した。
【００４４】
ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節されるｈＦｃγＲＩを発現したクローンを、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在または非存在によってＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２活性を操作することによって単離した。１つの戦略は、ＯＨＴおよびＤｏｘの存在下で高レベルのｈＦｃγＲＩを発現する細胞を単離し、続いて、ＯＨＴ存在下Ｄｏｘの非存在下で非発現細胞を単離することを包含した。あるいは、ＯＨＴ存在下Ｄｏｘの非存在下で低レベルのｈＦｃγＲＩを発現する細胞を最初に単離し、次いで、高発現細胞をＯＨＴ存在下でＤｏｘでの誘導によってこのプールから単離した。両戦略は、誘導条件または抑制条件を変えた下での一連の細胞単離、ならびにＯＨＴおよびＤｏｘの両方の非存在下での高レベルのｈＦｃγＲＩを発現した単一細胞の最終的な単離を、使用した（図３）。
【００４５】
プールＡ１を２００ｎＭ  ＯＨＴ存在下で７日間展開し、次いで、２つのシャーレに分けた；１つのシャーレは、１μｇ／ｍｌのＤｏｘ培地を含み、他方は含まなかった。細胞を、３日間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色し、ｈＦｃγＲＩの存在を検出した。１μｇ／ｍｌのＤｏｘで誘導した、培養物からの上位６０％のｈＦｃγＲＩ陽性細胞を、単離し、プールＢ１１を得た。そして最低３０％の蛍光を有する細胞を、Ｄｏｘ非含有培地中で増殖した細胞から単離し、プールＢ１２を得た。プールＢ１１を、Ｄｏｘ非含有２００ｎＭタモキシフェン中で増殖し、そして最低１％の蛍光を有する細胞を回収し、プールＣ１１を得た。プールＢ１２を２００ｎＭ  ＯＨＴおよび１μｇ／ｍｌのＤｏｘ中で増殖し、ｈＦｃγＲＩ陽性細胞の上位１％をプールとして回収し、プールＣ１２を得た。次いで、Ｃ１１およびＣ１２の両プールを、ＯＨＴおよびＤｏｘの両方を非含有の下で展開した。次いで、ＯＨＴおよびＤｏｘの非存在下で最高レベルのｈＦｃγＲＩを発現した細胞（上位１％）を、９６ウェルプレート上に、１ウェルにつき１細胞でソートした。これらの細胞は、誘導または抑制されたｈＦｃγＲＩ発現の単離を変えた結果として、ｈＦｃγＲＩの低い非誘導性発現を有し、そしてＯＨＴの除去によって誘導された場合、高レベルのｈＦｃγＲＩを有するべきである。
【００４６】
展開後、１０個の独立したクローンを、ＯＨＴ除去または１μｇ／ｍｌのＤｏｘの添加によるそのｈＦｃγＲＩ誘導について、ＦＩＴＣ−ｈＦｃでの免疫染色およびフローサイトメトリによる分析によって特徴付けた。１つのクローン（プールＣ１２からのＤ１２４）の分析は、Ｄｏｘなしでは、ｈＦｃγＲＩの検出可能レベルが存在しないことを示したが、一方、高レベルのｈＦｃγＲＩ発現が、ＯＨＴおよびＤｏｘの非存在下において、観察された。さらに、ＯＨＴ存在下で増殖した細胞への１μｇ／ｍｌでのＤｏｘの添加もまた、高レベルのｈＦｃγＲＩ発現をもたらした。このクローンにおけるｈＦｃγＲＩ発現のレベル（ＯＨＴの除去またはＯＨＴ存在下での１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンによる誘導から生じる）は、識別不能であった（図４）。
【００４７】
（実施例４．ｐＴＥ５２８、ｐＴＥ５２９、およびｐＴＥ５３４の構築）
ファージＰ２２  Ａｒｃリプレッサー遺伝子は、５３アミノ酸（ファージＰ２２ゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ００２３７１）のヌクレオチド３８，３３６〜３８，４９４にコードされる、Ｍ１〜Ａ５３）の転写リプレッサーをコードする。Ａｒｃによって媒介される転写抑制は、ダイマーのオペレーターの半分部分への配列付加に関する。以前、１５アミノ酸リンカーによって繋げられた２つのＡｒｃタンパク質からなる単一鎖ダイマーは、野生型リプレッサーよりもａｒｃオペレーターＤＮＡに対する高親和性を有することが示された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１０９−１１６）。単一鎖ダイマーのオペレーターＤＮＡについてのより高い親和性の利点を得るために、６個のヒスチジン残基からなるＨｉｓタグ配列を融合したこの単一鎖Ａｒｃダイマーをコードした合成ＤＮＡを、設計した。４４４ｂｐのこの合成ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメントを、ｐＵＣ１１９内にクローン化し、そしてｐＣＵ１１９−Ａｒｃ２−Ｈｉｓ６（Ｂｌｕｅｈｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を得た。次いで、このＡｒｃ２ダイマー遺伝子を、このプラスミドから切り出し、Ａｒｃ２遺伝子の発現がＵｂｃプロモーター／β−グロブリンイントロンに依存するように、ｐＲＧ９８５のＸｈｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＴＥ５２８を得た。
【００４８】
Ａｒｃ２−ＥＲＬＢＤＴ２融合タンパク質（図５）を、ヒトＥＲＬＢＤＴ２コードＤＮＡを上述のように含むｐＴＥ５０２からの３３６１ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＴＥ５２８のＢａｍＨＩ部位内に連結することによって構築し、ｐＴＥ５２９を得た。生じたＡｒｃ２−ＥＲＬＢＤＴ２融合タンパク質は、Ａｒｃ２遺伝子とＥＲＬＢＤＴ２遺伝子との間に（ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２におけるＴｅｔＲとＥＲＬＢＤＴ２との間（配列番号３）と同様に）、同じ１１アミノ酸リンカー（ＡＹＳＧＳＲＥＬＩＲＬ）（配列番号１）を有した。
【００４９】
ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴＯプロモーターにおける、ＴｅｔオペレーターのＡｒｃオペレーター（ファージＰ２２ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ００２３７１）中の３８，２７３塩基対〜３８，２９３塩基対によってコードされる）への交換のために、ｐＴＥ１５８を、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲによってＤＮＡフラグメントを増幅するためのテンプレートとして使用した：（５’−ＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴ−３’  （配列番号４）および５’ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＴＡＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＧＴＡＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＣＣＣＡ−３’）（配列番号５）。縦列のＡｒｃオペレーターをコードするこのＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてｐＴＥ１５８内の同じ部位にクローン化した。ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡＯハイブリッドプロモーターは、２つの縦列のａｒｃオペレーターを、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に有する（図６）（配列番号６）。結果として、Ａｒｃ２−ＥＲＬＢＤＴ２転写リプレッサーは、ｐＴＥ５３４におけるＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡＯプロモーターからのｈＦｃγＲＩの転写を調節し得る。
【００５０】
（実施例５．ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡｒｃＯ２プロモーターによって駆動されるｈＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ  Ｋ１誘導体の構築）
ＣＨＯ  Ｋ１細胞（２×１０６）を、上述のように、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭを使用して、ｐＴＥ５３４でトランスフェクトした。この細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）含有の培養培地（１０％ウシ胎仔血清、９０％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；全ての試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）内に、１２日間置いた。Ｇ４１８耐性の細胞を、上述のように、トリプシン処理し、プールし、そして２μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（ＦＩＴＣ−ｈＦｃ）で染色した。ＦＩＴＣ−ｈＦｃは、非トランスフェクト親ＣＨＯ  Ｋ１細胞を染色しなかった。ｈＦｃγＲＩを発現する細胞は、ＦＩＴＣ−ｈＦｃと結合し、そしてその蛍光に基づいて、ＭｏｆｌｏＴＭセルソーターにおいて、フローサイトメトリによって単離した。この集団において、最高３％の蛍光を有する細胞を、単離し、プールし、そして展開した。このｈＦｃγＲＩ陽性プールを、ＦＩＴＣ−ｈＦｃでの細胞表面染色を繰り返し、集団中の上位３０％の最も蛍光を発する細胞をソーティングすることによって富化し、プールＢを得た。ｈＦｃγＲＩを発現する上位２０％以内の細胞プールＢを単離し、プールＣを得た。プールＣ２（ＣＨＯＫ１／ｐＴＥ５３４）を使用し、Ａｒｃ−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節される誘導性細胞株を産生した。
【００５１】
（実施例６．Ａｒｃ−ＥＲＬＢＤＴ２依存性ｈＦｃγＲＩ発現を有するＣＨＯ  Ｋ１細胞株の構築）
ＣＨＯ  Ｋ１／ｐＴＥ５３４細胞（２×１０６／シャーレ）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭを使用して、ｐＲＧ９８５（空ベクター）またはｐＴＥ５２９のどちらかでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ＯＨＴ非存在下で、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８および１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンで１４日間選択した。細胞を、上述のように、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色し、そしてフローサイトメトリで分析した。ｐＲＧ９８５でトランスフェクトした細胞は、親細胞に類似し、分析の前にＯＨＴの存在下で増殖させてもさせなくても、同様のｈＦｃγＲＩ染色プロフィールを有した。対照的に、ｐＴＥ５２９でトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１／ｐＴＥ５３４細胞におけるｈＦｃγＲＩ発現は、増殖培地中のＯＨＴの存在に対し、顕著な応答を示した。増殖培地中のＯＨＴの非存在下において、Ｇ４１８およびピューロマイシンに耐性な細胞の大部分が、ｈＦｃγＲＩ発現に対し陽性であり、そしてｈＦｃγＲＩ陽性細胞の上位３０％を、プールとしてソートした。このプールをＯＨＴ存在下で１０日間展開し、ｈＦｃγＲＩ発現について染色し、そしてフローサイトメトリで分析した。このプール中の７０％以上の細胞が、ＯＨＴ存在下でｈＦｃγＲＩを発現せず、そして最低３０％を発現するこれらの細胞を、プールとしてソートした。次いで、これらの細胞を、培地中のＯＨＴの非存在下で展開した。ＯＨＴ非存在下で最高レベルのｈＦｃγＲＩを発現した細胞（上位１％）を、９６ウェルプレート中に１ウェルにつき１細胞でソートした。
【００５２】
ＯＨＴの培地中の存在に対する応答において厳密な調節を示すクローンを、フローサイトメトリによってさらに特徴付けた。これらのクローンにおけるｈＦｃγＲＩ発現のＯＨＴ依存性調節を、フローサイトメトリ後／および引き続いてのＦＩＴＣ−ｈＦｃでの免疫染色によって確認した。ＯＨＴが培地中に存在した場合、１つのクローン（Ｃ１７）において、検出可能なレベルのｈＦｃγＲＩは、何も観察されなかったが、一方、ＯＨＴの非存在下での増殖は、これらのクローンにおいて、ｈＦｃγＲＩの発現を誘導した（図７）。
【００５３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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