(57)【要約】【課題】生体由来試料とこれを分解する酵素との組み合わせの自由度が高く、簡便な操作で多数の生体由来試料を、酵素反応で迅速に並行処理できる生体由来試料の前処理方法、並びに該前処理方法への適用に好適な生体由来試料の前処理キット及び前処理システムの提供。【解決手段】解析対象分子を含む生体由来試料と、前記分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記分子を分解する工程を有する生体由来試料の前処理方法；解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのキットであって、前記分子を分解する酵素が固定化され、生体由来試料と接触させることで前記分子を分解する微粒子を備えた生体由来試料の前処理キット：解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのシステムであって、生体由来試料と、前記分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記分子を分解する手段を有する生体由来試料の前処理システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象分子を含む生体由来試料と、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記解析対象分子を分解する工程を有することを特徴とする生体由来試料の前処理方法。
【請求項２】
一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を、同時に前記生体由来試料と接触させることを特徴とする請求項１に記載の生体由来試料の前処理方法。
【請求項３】
前記複数種の微粒子を混合し、得られた微粒子の混合物を前記生体由来試料と接触させることを特徴とする請求項２に記載の生体由来試料の前処理方法。
【請求項４】
解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのキットであって、
前記解析対象分子を分解する酵素が固定化され、前記生体由来試料と接触させることで、前記解析対象分子を分解する微粒子を備えたことを特徴とする生体由来試料の前処理キット。
【請求項５】
一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を備えたことを特徴とする請求項４に記載の生体由来試料の前処理キット。
【請求項６】
解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのシステムであって、
前記生体由来試料と、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記解析対象分子を分解する手段を有することを特徴とする生体由来試料の前処理システム。
【請求項７】
一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を、同時に前記生体由来試料と接触させることを特徴とする請求項６に記載の生体由来試料の前処理システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析対象分子を含む生体由来試料の、解析前における前処理方法、並びに該前処理方法への適用に好適な生体由来試料の前処理キット及び前処理システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
医学及び薬学分野全般においては、病気の診断や治療薬の開発の過程で、生体から血液等の各種生体由来試料を採取し、その中に含まれるタンパク質をはじめとする各種生体由来物質を解析したり、生体由来物質と化学物質との相互作用を解析したりする手法が種々適用されるようになっている。これら手法は、比較的簡便かつ安価に行うことができるため、近年は幅広く普及してきているが、一方で、解析対象の試料数も膨大となっているのが現状であり、これら手法の迅速化が重要な課題となっている。
【０００３】
このような中、生体由来試料中の解析対象分子の解析方法としては、質量分析法（マススペクトロメトリー）や液体クロマトグラフィーを適用する方法が主流となってきている。この時、特に解析対象分子がタンパク質等の高分子化合物である場合には、解析対象分子をそのままの形としてこれらの方法を適用することは通常困難であり、酵素で分解するなどして中〜低分子量の分解物に断片化し、これら分解物を上記方法に適用する。この時使用する酵素は、通常複数種である。
【０００４】
ここで、酵素反応における温度、ｐＨ等の至適条件は、酵素ごとに異なることが多く、そのため、複数種の酵素を使用して解析対象分子を分解する場合には、酵素ごとに液層中で反応を行うことになる。
しかし、この場合には、各酵素反応を至適条件下で十分に行うことができる反面、工程数の増加に伴い作業が煩雑になってしまう。また、使用した酵素は反応液からの回収が困難であり、分解物の回収及び分離も煩雑となってしまう。そして、解析対象分子と類似の高分子化合物である酵素が除去できていない場合には、解析対象分子の解析精度を低下させてしまう。
【０００５】
これに対して、複数種の酵素を酵素ごとに領域を分離して基体上に固定化した酵素固定化基体を使用して、解析対象分子に対して複数種の酵素反応を並行して行う、生体由来試料の前処理方法が開示されている（特許文献１参照）。
特許文献１には、酵素固定化基体として、基体が平板状のものが開示されており、その作製方法については以下のように説明されている。すなわち、基体表面にシールを貼付してマスキングし、酵素を固定化する複数の領域のみ前記シールを剥離させることで、基体表面に酵素を固定化するための領域のパターニングを行う。次いで、一つの前記領域には一種の酵素溶液のみを滴下するようにして、複数の前記領域すべてに異なる酵素溶液を滴下し、所定時間保温することで、複数種の酵素を酵素ごとに領域を分離して基体上に固定化する。次いで、各領域を分離している領域間のシールを剥離させ、すべての領域を連結させ、基体の周辺部に枠状にシールが残された平板状の酵素固定化基体を得る。
得られた酵素固定化基体の表面に解析対象分子を含む試料を滴下すると、シールの枠内に試料が保持され、この状態を所定の温度及び時間維持することで、それぞれの酵素固定化領域で異なる酵素反応が並行して進行する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２６２８２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１に記載の前処理方法では、酵素固定化基体として具体的に開示されているのは、基体が平板状のものだけである。そして、このような平板状の酵素固定化基体の作製は、上記のように煩雑な工程を伴うと共に、酵素固定化領域を微細にパターニングするのには限界があり、大量の試料を迅速に解析する能力が限られる。また、解析に供する試料と酵素との組み合わせの自由度にも限界がある。そして、特許文献１には、平板状以外の酵素固定化基体とそれを使用した場合の前処理方法については、具体的な開示が無い。
これに対して、生体由来試料と酵素との組み合わせの自由度が高く、より簡便な操作でより大量の試料を並行して迅速に前処理できる方法の開発が強く望まれている。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、生体由来試料とこれを分解する酵素との組み合わせの自由度が高く、簡便な操作で多数の生体由来試料を、酵素反応で迅速に並行処理できる生体由来試料の前処理方法、並びに該前処理方法への適用に好適な生体由来試料の前処理キット及び前処理システムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、
本発明は、解析対象分子を含む生体由来試料と、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記解析対象分子を分解する工程を有することを特徴とする生体由来試料の前処理方法を提供する。
本発明の生体由来試料の前処理方法においては、一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を、同時に前記生体由来試料と接触させることが好ましい。
本発明の生体由来試料の前処理方法においては、前記複数種の微粒子を混合し、得られた微粒子の混合物を前記生体由来試料と接触させることが好ましい。
また、本発明は、解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのキットであって、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化され、前記生体由来試料と接触させることで、前記解析対象分子を分解する微粒子を備えたことを特徴とする生体由来試料の前処理キットを提供する。
本発明の生体由来試料の前処理キットにおいては、一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を備えたことが好ましい。
また、本発明は、解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのシステムであって、前記生体由来試料と、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記解析対象分子を分解する手段を有することを特徴とする生体由来試料の前処理システムを提供する。
本発明の生体由来試料の前処理システムにおいては、一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を、同時に前記生体由来試料と接触させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体由来試料とこれを分解する酵素との組み合わせの自由度が高く、簡便な操作で多数の生体由来試料を、酵素反応で迅速に並行処理できる生体由来試料の前処理方法、並びに該前処理方法への適用に好適な生体由来試料の前処理キット及び前処理システムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるチトクロムｃ分解物の解析結果を示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】実施例２における酵素反応の時間とチトクロムｃの分解率との関係を示すグラフである。
【図３】（ａ）比較例２及び（ｂ）実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜生体由来試料の前処理方法＞
本発明の生体由来試料の前処理方法は、解析対象分子を含む生体由来試料と、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化された微粒子（以下、酵素固定化微粒子と略記することがある）とを接触させて、前記解析対象分子を分解する工程を有することを特徴とする。
解析対象分子は、そのままの状態では分子サイズが大きい等の理由で、機器を使用する解析に供するのが困難である。そこで、本発明においては、解析対象分子を酵素で前処理し、分子サイズが小さく、解析に適した分解物とする。このようにすることで、例えば、それぞれの分解物の解析データをとりまとめて、分解前の解析対象分子の種類や構造等に関する情報を容易に取得できる。
【００１３】
本発明において、生体とは動物や植物等の区別なく、すべてのものが対象となるが、動物であることが好ましい。
また、生体由来試料としては、解析対象分子を含み、主に液状であって、生体から採取した試料そのもの；生体から採取した試料を適宜濃度調整、成分調整又は成分分離等の処理に供したもの；生体組織等の固形物を液状に加工したもの等が例示できるが、これらに限定されない。なかでも好ましいものとして、血液、血清、血漿等が例示できる。
【００１４】
解析対象分子は、目的に応じて適宜選択すれば良く、特に限定されない。なかでも好ましいものとしては、タンパク質、ペプチド、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等が例示できる。
【００１５】
酵素固定化微粒子における酵素は、解析対象分子の分解能を有するものであり、解析対象分子の種類に応じて適宜選択すれば良い。
好ましい酵素としては、例えば、タンパク質分解酵素であれば、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ等が例示できる。糖鎖遊離酵素であれば、グリコペプチダーゼ等が例示できる。酵素は、後述するように、二種以上を併用することもでき、例えば、糖タンパク質を分解し、ペプチド及び糖鎖を生じさせる場合には、トリプシン及びグリコペプチダーゼの二種類の酵素を併用すれば良く、アミノ酸及び糖鎖を生じさせる場合には、トリプシン、プロナーゼ及びグリコペプチダーゼの三種類の酵素を併用すれば良い。
【００１６】
酵素固定化微粒子としては、ガラス製、樹脂製等の微粒子表面に露出されている官能基と、酵素中の官能基との間で結合が形成されることで、微粒子に酵素が固定化されたものが例示できる。前記結合としては共有結合が好ましく、前記結合を形成する官能基の組み合わせとしては、カルボキシ基又はエポキシ基とアミノ基との組み合わせが例示できるが、これに限定されない。官能基の組み合わせは、ｐＨ等、酵素固定化微粒子の使用条件を考慮して、前記結合が切断されないように、公知のものから選択すれば良い。
【００１７】
前記結合は、官能基の組み合わせに応じて公知の方法で形成でき、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）等の脱水縮合剤を併用しても良い。
【００１８】
前記樹脂は天然樹脂及び合成樹脂のいずれでも良く、前記結合を形成し得る官能基を有していれば特に限定されない。合成樹脂であれば、好ましいものとしてスチレンとメタクリル酸との共重合体が例示できる。
【００１９】
また、酵素固定化微粒子としては、金属を含む材質の微粒子表面をコーティングした皮膜中の官能基と、酵素中の官能基との間で結合が形成されることで、コーティングされた微粒子に酵素が固定化されたものが例示できる。
前記金属を含む材質としては、四酸化三鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）、三酸化二鉄（γ−Ｆｅ2 Ｏ3 ）、酸化クロム（ＣｒＯ２）、各種フェライト等の磁性体；鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属；コバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金が例示できる。
前記皮膜の材質としては、高分子化合物が好ましく、前記樹脂と同様のものが例示できる。
【００２０】
酵素固定化微粒子の平均粒子径は、目的に応じて選択すれば良いが、取り扱い易く、且つ反応を円滑に進行させることができる観点から、１〜２００μｍであることが好ましく、２〜５０μｍであることがより好ましい。
【００２１】
一つの微粒子に固定化されている酵素は、一種でも良いし二種以上でも良い。二種以上である場合、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
【００２２】
本発明においては、生体由来試料及び酵素固定化微粒子を接触させることで、生体由来試料に含まれる解析対象分子を酵素反応で分解する。
生体由来試料との接触に供する酵素固定化微粒子は、一種でも良いし二種以上でも良い。なお、本発明においては、酵素固定化微粒子における酵素及び微粒子の少なくとも一方の種類が互いに異なる場合、酵素固定化微粒子の種類が互いに異なることを意味するものとする。
【００２３】
酵素固定化微粒子との一回の接触に供する解析対象分子は、一種でも良いし二種以上でも良い。また、生体由来試料との一回の接触に供する酵素固定化微粒子中の酵素も、一種でも良いし二種以上でも良い。
したがって、具体的な反応方法としては、以下のものが例示できる。
（１）一種の解析対象分子と一種の酵素とを反応させる方法
（２）一種の解析対象分子と二種以上の酵素とを反応させる方法
（３）二種以上の解析対象分子と一種の酵素とを反応させる方法
（４）二種以上の解析対象分子と二種以上の酵素とを反応させる方法
【００２４】
二種以上の酵素を使用する場合には、一種の酵素が固定化された酵素固定化微粒子で、酵素の種類が互いに異なる二種以上の酵素固定化微粒子を併用しても良いし、二種以上の酵素が固定化された酵素固定化微粒子を一種単独で使用しても良く、二種以上の酵素が固定化された酵素固定化微粒子を二種以上併用しても良い。
【００２５】
一種又は二種以上の酵素が固定化された酵素固定化微粒子を二種以上併用する場合には、これら酵素固定化微粒子のすべてを生体由来試料と同時に接触させても良いし、一部又はすべての酵素固定化微粒子を順次生体由来試料と接触させても良い。
そして、二種以上の酵素固定化微粒子を生体由来試料と同時に接触させる場合には、これら酵素固定化微粒子を混合してから生体由来試料と接触させても良いし、混合することなく生体由来試料と接触させても良い。
【００２６】
二種以上の酵素を使用する場合には、一種の酵素が固定化された酵素固定化微粒子で、酵素の種類が互いに異なる二種以上の酵素固定化微粒子を併用することが好ましい。例えば、特開２００６−２６２８２９号公報に開示されている方法に従って、平板状の基体の同じ領域内に複数種の酵素を固定化する場合には、基体上において複数種の酵素が互いに接触した状態に置かれるが、この場合、複数種の酵素同士が互いに作用し合うことにより、酵素の自己分解が生じ易く、作製した平板状の酵素固定化基体は、酵素反応を十分に行うことができないことがある。そして、複数種の酵素を酵素ごとに領域を分離して基体上に固定化する場合には、先に説明したように、酵素固定化基体の作製に煩雑な工程を伴うと共に、酵素固定化領域を微細にパターニングするのには限界があり、大量の試料を迅速に解析する能力が限られる。また、解析に供する試料と酵素との組み合わせの自由度にも限界がある。これに対して、上記のように、二種以上の酵素固定化微粒子を併用する場合には、特に、酵素の自己分解を抑制する一層高い効果が得られ、酵素反応を迅速且つ十分に進行させる高い効果が得られる。さらに、一つの微粒子に固定化する酵素が一種であるため、酵素固定化微粒子の作製も一層容易である。
【００２７】
一回の接触に供する解析対象分子及び酵素は、それぞれ最大で三種類であることが好ましい。このようにすることで、解析を一層円滑に行うことができる。また、酵素の種類を三種類以下とすることで、酵素固定化微粒子の作製工程数も削減できる。
【００２８】
生体由来試料及び酵素固定化微粒子は、溶媒中で接触させることが好ましい。この時の溶媒としては、水溶液が好ましく、緩衝液がより好ましい。
また、溶媒のｐＨを使用する酵素の至適ｐＨ又はその近傍に調整することで、酵素反応を一層良好に進行させることができる。
【００２９】
反応温度は、酵素が失活せず、解析対象分子が熱分解しない範囲に設定すれば良いが、使用する酵素の至適温度又はその近傍に調整することで、酵素反応を一層良好に進行させることができる。
また、反応時間は、酵素及び解析対象分子の種類や、反応温度に応じて適宜調節すれば良い。
酵素の使用量は、解析対象分子の種類や濃度に応じて調節すれば良く、微粒子への酵素の固定量や酵素固定化微粒子の使用量により調節できる。
【００３０】
酵素反応は、通常のフラスコ等の反応容器内で行っても良いが、例えば、反応液の保持部が多数設けられたプレート状の反応手段を使用して、多数の反応を並行して行うことが好ましい。このようなプレート状の反応手段としては、９６ウェルプレートのように反応液の保持部として凹部が多数設けられたものや、反応液の保持部として撥水面で区切られた親水面が表面に多数設けられたものが例示できる。
【００３１】
反応液は撹拌することが好ましく、撹拌方法としては、撹拌子又は撹拌翼を回転させる方法、超音波を印加する方法、反応液を保持した反応手段を揺動させる方法等、公知の方法から選択すれば良い。
【００３２】
反応後は、酵素固定化微粒子及び必要に応じてその他の不溶物をろ過等により除去して、ろ液を回収することで、酵素反応の生成物（解析対象分子の分解物）が得られる。
【００３３】
本発明によれば、一回の接触に供する解析対象分子及び酵素の種類を、一種から複数種まで幅広く任意に設定できるので、行なう酵素反応の種類を一種から複数種まで幅広く高い自由度で設定できる。すなわち、生体由来試料とこれを分解する酵素との組み合わせの自由度が高い。そして、操作も簡便なので、多数の生体由来試料を、酵素反応で迅速に並行処理できる。特に、酵素の種類が異なる二種以上の酵素固定化微粒子を併用する場合には、二種以上の酵素を併用する従来の方法よりも、酵素の自己分解を抑制する効果が高いので、酵素反応を迅速且つ十分に進行させる効果が極めて高い。
【００３４】
＜生体由来試料の前処理キット＞
本発明の生体由来試料の前処理キットは、解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのキットであって、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化され、前記生体由来試料と接触させることで、前記解析対象分子を分解する微粒子を備えたことを特徴とする。かかる微粒子は、上記本発明の前処理方法における酵素固定化微粒子と同じである。
【００３５】
本発明の前処理キットは、上記本発明の生体由来試料の前処理への適用に好適なものであり、前記酵素固定化微粒子以外に、その他の構成要素を含んでいても良い。ここで、その他の構成要素としては、解析対象分子の分解（酵素反応）を行うための各種緩衝液が例示できる。
本発明の前処理キットは、一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を備えたものが好ましい。
【００３６】
＜生体由来試料の前処理システム＞
また、本発明の生体由来試料の前処理システムは、解析対象分子を含む生体由来試料を前処理するためのシステムであって、前記生体由来試料と、前記解析対象分子を分解する酵素が固定化された微粒子とを接触させて、前記解析対象分子を分解する手段（以下、分解手段と略記する）を有することを特徴とする。かかる微粒子は、上記本発明の前処理方法における酵素固定化微粒子と同じである。
【００３７】
本発明の前処理システムは、上記本発明の生体由来試料の前処理への適用に好適なものであり、前記分解手段以外に、その他の構成要素を含んでいても良い。ここで、その他の構成要素としては、酵素反応の生成物を検出するための手段が例示でき、より具体的には、分光学的手段で化学物質を検出する各種検出器が例示できる。
本発明の前処理システムは、前記分解手段において、一つの微粒子に一種類の酵素が固定化され、前記酵素の種類が互いに異なる複数種の微粒子を、同時に前記生体由来試料と接触させるようになっていることが好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下において「Ｍ」とは、「ｍｏｌ／ｌ」を指す。
【００３９】
［実施例１］
（１）トリプシン固定化微粒子の作製
トリプシン（ＳＩＧＭＡ社製）とｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、濃度が１ｍｇ／ｍｌのトリプシン水溶液を調製し、エポキシ修飾磁性微粒子（商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ｅｐｏｘｙ、平均粒子径２．８μｍ、ベリタス社製）５ｍｇに対して、前記水溶液を１００μｌ添加した。そして、前記磁性微粒子を含む前記水溶液を４℃で一晩インキュベートすることで反応を行い、前記磁性微粒子にトリプシンを固定化した。この反応では、トリプシン中のアミノ基と前記磁性微粒子中のエポキシ基とが反応に関与することで、前記磁性微粒子にトリプシンが固定化されたと考えられる。
次いで、反応後の前記水溶液からトリプシン固定化磁性微粒子を分離し、この微粒子に対してｐＨ７．４のＰＢＳを５００μｌ添加して撹拌した後、ＰＢＳを除くことで洗浄を行い、この洗浄操作を合計で三回行った。
【００４０】
（２）チトクロムｃのトリプシン固定化磁性微粒子による分解
チトクロムｃ（和光純薬社製）とｐＨ７．４のＰＢＳを使用して、濃度が０．２ｍｇ／ｍｌのチトクロムｃ水溶液を調製し、これを上記で得たトリプシン固定化磁性微粒子に対して、１００μｌ添加した。そして、前記トリプシン固定化磁性微粒子を含む前記水溶液を３７℃で２０分間インキュベートすることで酵素反応を行い、チトクロムｃを分解した。
【００４１】
（３）チトクロムｃ分解物の検出
磁性体を使用することで、前記酵素反応液から前記トリプシン固定化磁性微粒子を回収し、酵素反応液を採取して、下記条件でＨＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー）により、チトクロムｃ分解物を検出した。この時得られたＨＰＬＣチャートを図１に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ（東ソー社製）
移動相Ａ液：０．１体積％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５体積％アセトニトリル水溶液
移動相Ｂ液：０．１体積％ＴＦＡを含む９５体積％アセトニトリル水溶液
グラジエント：測定開始後０〜３０分間でＡ液の比率を１００体積%から６０体積％（Ｂ液の比率を０体積%から４０体積％）へ変化させるリニアグラジエント
流速：１ｍｌ／分
検出：紫外吸光（２１４ｎｍ）
【００４２】
図１に示すように、チトクロムｃ分解物である各種ペプチドを精度良く分離でき、チトクロムｃの解析に有用な情報が得られた。このように、本発明によって、解析対象分子であるチトクロムｃの前処理を簡便な操作で迅速に行うことができた。なお、ここでは、一種の生体由来試料（チトクロムｃ水溶液）と一種の酵素とを反応させたが、上記のように酵素反応は迅速に進行し、操作上の問題点も全く無く、生体由来試料と酵素とをそれぞれ一種以上任意に組み合わせて、高い自由度で酵素反応を行えることが確認できた。
【００４３】
［実施例２］
酵素反応時間を２０分間に代わり４０分間としたこと以外は、実施例１と同様に、トリプシン固定化磁性微粒子でチトクロムｃを分解し、この時のチトクロムｃの分解挙動を確認した。より具体的には、酵素反応開始から１０分間ごとに少量の反応液を採取し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して、未分解のタンパク質（チトクロムｃ）のバンド濃度から、チトクロムｃの分解率を判定した。バンド濃度の判定には、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用した。酵素反応の時間と分解率との関係を示すグラフを図２に示す。
【００４４】
図２からも明らかなように、チトクロムｃの分解率は、反応開始から２０分間の段階ですでに９５％以上に達しており、チトクロムｃを十分に分解するためには、酵素反応時間を２０分間以上とすることが好ましいことが確認できた。
【００４５】
［比較例１］
特開２００６−２６２８２９号公報に記載の方法に従って、平板状の基体にトリプシンを固定化した。そして、トリプシン固定化磁性微粒子に代わり、得られた平板状のトリプシン固定化基体を使用したこと以外は、実施例２と同様にチトクロムｃを分解し、この時のチトクロムｃの分解挙動を確認した。
その結果、実施例２の場合とほぼ同様の分解挙動を示した。すなわち、実施例２での酵素反応の速さは、比較例１の場合と同様であり、十分な速さであった。
【００４６】
［実施例３］
トリプシンに代わりＬｙｓＣ（リソソーム加水分解酵素）を使用したこと以外は、実施例１と同様の方法で、ＬｙｓＣ固定化磁性微粒子を作製した。
そして、ｐＨ７．４のＰＢＳを使用して、濃度が１ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧと略記する）水溶液を調製し、これを上記で得たＬｙｓＣ固定化磁性微粒子と、実施例１で作製したトリプシン固定化微粒子との混合物（混合比（質量比）１：１）に対して、１００μｌ添加した。そして、前記磁性微粒子の混合物を含む前記水溶液を３７℃で１２時間インキュベートすることで酵素反応を行い、ＩｇＧを分解した。
次いで、実施例２と同様に、反応液を採取し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、ＩｇＧの分解率を判定した。この時の泳動像を図３（ｂ）に示す。なお、図３（ｂ）中、レーン４は分子量マーカーの、レーン５は分解前のＩｇＧの、レーン６はＩｇＧ分解後の泳動像をそれぞれ示す。
【００４７】
［比較例２］
トリプシンに代わりトリプシン及びＬｙｓＣの混合物を使用したこと以外は、比較例１と同様の方法で、平板状のトリプシン及びＬｙｓＣ固定化基体を作製した。
次いで、ＬｙｓＣ固定化磁性微粒子とトリプシン固定化微粒子との混合物に代わり、作製した前記基体を使用したこと以外は、実施例３と同様にＩｇＧを分解し、ＩｇＧの分解率を判定した。この時の泳動像を図３（ａ）に示す。なお、図３（ａ）中、レーン１は分子量マーカーの、レーン２は分解前のＩｇＧの、レーン３はＩｇＧ分解後の泳動像をそれぞれ示す。また、レーン１の左側に記載の数値は、分子サイズ（ｋＤａ）である。
【００４８】
図３（ｂ）から明らかなように、実施例３では、レーン６において、未分解のＩｇＧに由来するバンドは完全に消失しており、ＩｇＧの分解反応が完全に進行したことを確認できた。
一方、図３（ａ）から明らかなように、比較例２では、レーン３において、未分解のＩｇＧに由来するバンドが残存しており、ＩｇＧの分解反応が不十分であることが確認できた。その原因は、トリプシン及びＬｙｓＣを混合した際に、これら酵素同士が作用し合い、酵素の自己分解が進行したためであると考えられる。
このように、一つの平板状の基体に複数種の酵素を固定化する場合には、これら酵素の自己分解が避けられないのに対し、一つの微粒子に一種類の酵素を固定化した酵素固定化微粒子を複数種混合した場合には、このような酵素の自己分解が抑制されるので、所望の酵素反応を迅速且つ十分に進行させることができることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、医学及び薬学分野全般において、病気の診断や治療薬の開発等に利用可能である。
【図１】
2011254729.tif 000002
【図２】
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【図３】
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