(57)【要約】【課題】カルニチンに含まれる副生成物等の不純物を高い感度でかつ簡便に検出する方法を提供すること【解決手段】  下記の工程を含む、カルニチン混合物に含まれる微量不純物を検出する方法。（I）不純物及びカルニチンを含む混合物と無機塩類とを含有するアルコール溶液を調製する工程（II）前記アルコール溶液中に析出する不溶解物を分離する工程（III）前記不溶解物の成分を分析することにより前記不純物を検出する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、一般式（１）:
【化５】
2011085511.tif 000007
（式中、Ｒ１はヒドロキシル基又はβ位の炭素との炭素-炭素二重結合を表し、Ｒ２は、シアノ基、ヒドロキシル基、アミド基、１〜３級のアミノ基又はカルボキシル基を表し、他方のカルボキシル基と互いに架橋して環状構造を形成してもよい。）
で示される化合物及び/又は一般式（２）：
【化６】
2011085511.tif 000008
（式中、Ｒ１はヒドロキシル基又はβ位の炭素との炭素-炭素二重結合を表し、Ｒ２はシアノ基、ヒドロキシル基、アミド基、１〜４級のアミノ基又はカルボキシル基を表す。）
で示される化合物を検出する方法。
（I）  一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物及びカルニチンを含むカルニチン混合物と無機塩類とを含有するアルコール溶液を調製する工程
（II）  前記アルコール溶液中に析出する不溶解物を分離する工程
（III）  前記不溶解物の成分を分析することにより前記化合物を検出する工程
【請求項２】
一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物は、前記カルニチンに対して少なくとも0.001％の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルコール溶液が、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール及び１-ブタノールからなる群から選ばれる少なくとも１種のアルコール溶液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
無機塩類が、硫酸ナトリウム、硫酸一水素ナトリウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸一水素二ナトリウム、炭酸二水素一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム及びリン酸二水素一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分析が、核磁気共鳴法（NMR法）、液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリー法（LC-MS法）又はこれらの組み合わせにより行われるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物を検出する工程が、前記不溶解物を重水に溶解して分析溶液を調製し、該分析溶液をNMR装置で分析することにより、前記化合物を検出する工程である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記一般式（１）で示される化合物が、4-ヒドロキシ-2-ブテン酸、3,4-ジヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシグルタル酸、3-ヒドロキシ-4-カルボキシブタナミド及び4-シアノ-3-ヒドロキシブタン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記一般式（２）で示される化合物が、2-ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム、4-シアノ-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-ブタナミニウム、2,3-ジヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-プロパナムニウム、4-アミノ-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-ブタナミニウム及び3-カルバモイル-2-プロペニルトリメチルアンモニウムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が、ベタイン類を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベタイン類が、γ‐ブチロベタイン又はクロトノベタインである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルニチン混合物に含まれる微量不純物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルニチンは食品として人が食するものであるため、含有する不純物の管理は食の安全性を確保する上で非常に重要である。不純物は大別すると無機不純物と有機不純物に分けられるが、このうち有機不純物を管理する方法としては、欧州薬局方に記載されている順相系充填剤を用いたHPLCクロマトグラフィによる有機不純物の検出方法（非特許文献１）が挙げられる。
【０００３】
しかしながら、上記検出方法は、UV検出器を用いて205nmにおけるUV吸収の強度で有機不純物を検出する方法であるため、カルボニル基と共役位の関係にある不飽和結合を有していない一般式（１）で示される化合物は検出感度が低く、上記検出方法にて微量検出を行うことは難しい。また一般式（２）で示される化合物は205nmにおけるUV吸収を殆ど有さないため、このような化合物を不純物として検出することはほぼ不可能である。
下記の一般式（２）で示される化合物はトリメチルアンモニウム基すなわち４級アンモニウムを有しており常時一価の陽イオンの状態であることから、イオンを検出する検出器を有したクロマトグラフィ、すなわち質量分析計を検出器とする液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリや電気伝導度検出器を検出器とするイオンクロマトグラフィなどにより高感度に検出、定量することが可能である。しかしながら液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリは非常に高価であることや、測定結果や性能維持が担当者の知識、経験、技量などに左右される等の理由から汎用性に欠け、品質管理の為の装置として向いていない一面がある。一方イオンクロマトグラフィは下記の一般式（１）で示される化合物と一般式（２）で示される化合物を同時に検出することができず、またトリメチルアンモニウムのようなトリアルキルアンモニウムを含む化合物は陽イオン交換カラムに対する保持が非常に強いためにカラムからの溶出が困難になることがあり、簡便に分析することが困難である。
【０００４】
核磁気共鳴装置は、高価ではあるが一般式（１）で示される化合物と一般式（２）で示される化合物を不純物として混合した状態で分離することなく検出することが可能であり、また特殊な測定法でなければ経験、技量に寄らずかつ簡便に同じ結果が得られるなど、利点も多い。しかしながら感度が高くないため一般式（１）で示される化合物と一般式（２）で示される化合物の検出下限は0.1％程度と推測され、現状では微量不純物を確認する装置として適していない。
【非特許文献１】European Pharmacopoeia 3rd Edition, 644, (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の主な目的はカルニチンに含まれる副生成物等の不純物を高い感度でかつ簡便に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の溶媒及び無機塩を用いることにより微量に含まれている特定の不純物を析出させることが可能であることを見い出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］  下記の工程を含む、一般式（１）:
【化１】
2011085511.tif 000002
（式中、Ｒ１はヒドロキシル基又はβ位の炭素との炭素-炭素二重結合を表し、Ｒ２は、シアノ基、ヒドロキシル基、アミド基、１〜３級のアミノ基又はカルボキシル基を表し、他方のカルボキシル基と互いに架橋して環状構造を形成してもよい。）
で示される化合物及び/又は一般式（２）：
【化２】
2011085511.tif 000003
（式中、Ｒ１はヒドロキシル基又はβ位の炭素との炭素-炭素二重結合を表し、Ｒ２はシアノ基、ヒドロキシル基、アミド基、１〜４級のアミノ基又はカルボキシル基を表す。）
で示される化合物を検出する方法。
（I）  一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物及びカルニチンを含むカルニチン混合物と無機塩類とを含有するアルコール溶液を調製する工程
（II）  前記アルコール溶液中に析出する不溶解物を分離する工程
（III）  前記不溶解物の成分を分析することにより前記化合物を検出する工程
［２］  一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物は、前記カルニチンに対して少なくとも0.001％の量で存在する、上記［１］に記載の方法。
［３］  前記アルコール溶液が、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール及び１-ブタノールからなる群から選ばれる少なくとも１種のアルコール溶液である、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  無機塩類が、硫酸ナトリウム、硫酸一水素ナトリウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸一水素二ナトリウム、炭酸二水素一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム及びリン酸二水素一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］  前記分析が、核磁気共鳴法（NMR法）、液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリー法（LC-MS法）又はこれらの組み合わせにより行われるものである、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］  前記化合物を検出する工程が、前記不溶解物を重水に溶解して分析溶液を調製し、該分析溶液をNMR装置で分析することにより、前記化合物を検出する工程である、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］  前記一般式（１）で示される化合物が、4-ヒドロキシ-2-ブテン酸、3,4-ジヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシグルタル酸、3-ヒドロキシ-4-カルボキシブタナミド及び4-シアノ-3-ヒドロキシブタン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］  前記一般式（２）で示される化合物が、2-ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム、4-シアノ-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-ブタナミニウム、2,3-ジヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-プロパナムニウム、4-アミノ-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-ブタナミニウム及び3-カルバモイル-2-プロペニルトリメチルアンモニウムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］  前記混合物が、ベタイン類を更に含む、上記［１］に記載の方法。
［１０］  前記ベタイン類が、γ‐ブチロベタイン又はクロトノベタインである、上記［９］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微量不純物検出方法によれば、カルニチンに含まれる副生成物等の不純物を高い感度でかつ簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】カルニチン混合物に含まれる不純物の核磁気共鳴（NMR）スペクトルを示す図である。
【図２】カルニチン混合物に含まれる不純物の核磁気共鳴（NMR）スペクトルを示す図である。
【図３】カルニチン混合物に含まれる不純物の核磁気共鳴（NMR）スペクトルを示す図である。
【図４】カルニチン混合物に含まれる不純物の核磁気共鳴（NMR）スペクトルを示す図である。
【図５】NMRスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、（I）検出対象の化合物及びカルニチンを含む混合物と無機塩類とを含有するアルコール溶液を調製する工程、（II）前記アルコール溶液中に析出する不溶解物を分離する工程、及び(III)  前記不溶解物の成分を分析することにより前記化合物を検出する工程を含む、検出対象の化合物の検出方法である。以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】
カルニチン
本発明において、カルニチンの種類は特に限定されない。カルニチンは光学活性を有しており、本発明において精製されるカルニチンとしては光学活性体の種類は限定されない。例えば、ラセミ体のカルニチンを使用することもでき、この場合、D体及びL体のいずれも使用できる。D体及びL体の混合物も使用することができ、この場合、D-カルニチンに対してL-カルニチンが過剰に含まれる混合物が好ましい。
【００１２】
本発明におけるカルニチンには、カルニチンの誘導体も含まれる。誘導体の種類は限定されないが、例えば、カルニチンアシルエステル等を挙げることができる。
【００１３】
また、カルニチンとしては、市販のものを使用してもよく、あるいは、公知又は新規な方法で製造したカルニチンを使用してもよい。このようなカルニチンとしては、例えば、（i）ジクロロプロパノールを酵素反応によりシアノ化及びアミド化した後、４級化し、加水分解等を行うことにより得られたL-カルニチン、（ii）エピクロロヒドリンを順次、４級化、シアノ化、アミド化、光学分割等に供して得られたL-カルニチン、（iii）ブチロラクトンを開環、４級化、微生物による反応等に供して得られたL-カルニチン、（iv）クロロアセト酢酸エチルを不斉還元、４級化、加水分解等に供して得られたL-カルニチン等を挙げることができるが、特に（i）の製法で得られたカルニチンを使用することが好ましい。（i）の製法の詳細は、特開2008-133198に記載されている。
【００１４】
使用するカルニチンの状態も限定されるものではなく、結晶状のものでも、あるいは、溶液に溶解しているカルニチンでも使用することができる。カルニチン溶液としては、合成直後のカルニチン水溶液だけでなく、イオン交換カラム、電気透析等の精製工程を経たカルニチン溶液も使用することができる。また、カルニチン水溶液をアルコール等で溶媒置換して得られるカルニチン溶液も使用できる。
【００１５】
不純物及びカルニチンを含む混合物
本発明において分析に供されるカルニチンの混合物（以下、「カルニチン混合物」と称する）は、上記のカルニチンの他に不純物を含むものである。不純物としては、一般式（I）:
【化３】
2011085511.tif 000004
（式中、Ｒ１はヒドロキシル基又はβ位の炭素との炭素-炭素二重結合を表し、Ｒ２は、シアノ基、ヒドロキシル基、アミド基、１〜３級のアミノ基又はカルボキシル基を表し、他方のカルボキシル基と互いに架橋して環状構造を形成してもよい。）
で示される化合物、及び一般式（２）：
【化４】
2011085511.tif 000005
（式中、Ｒ１はヒドロキシル基又はβ位の炭素との炭素-炭素二重結合を表し、Ｒ２はシアノ基、ヒドロキシル基、アミド基、１〜４級のアミノ基又はカルボキシル基を表す。）
で示される化合物が挙げられる。
【００１６】
一般式（１）に示される化合物の具体例としては、4-ヒドロキシ-2-ブテン酸、3,4-ジヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシグルタル酸、3-ヒドロキシ-4-カルボキシブタナミド及び4-シアノ-3-ヒドロキシブタン酸並びにこれらの塩又はエステル等が挙げられ、本発明においては、特に、3-ヒドロキシグルタル酸ジナトリウムが上げられる。
【００１７】
一般式（２）に示される化合物の具体例としては、2-ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム、4-シアノ-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-ブタナミニウム、2,3-ジヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-プロパナムニウム、4-アミノ-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-ブタナミニウム及び3-カルバモイル-2-プロペニルトリメチルアンモニウム並びにこれらの塩又はエステル等が挙げられ、特に、2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムジクロライドが挙げられる。これら不純物の含有量については、カルニチンに対して微量（0.001％（10ppm）以上の量）に存在していれば検出可能である。
【００１８】
ベタイン類
本発明において、カルニチン混合物は、上記のカルニチン、一般式（１）に示される化合物及び一般式（２）に示される化合物の他にベタイン類を含んでいてもよい。本発明において、「ベタイン類」及び「ベタイン」という用語は、両方とも、第4級アンモニウム塩基、オキソニウム塩基及びスルホニウム塩基等の分子内塩で両性イオンを形成する分子を意味する。本発明におけるベタインは、中性のものだけでなく、正電荷又は負電荷を帯びているものも含み、その種類は特に限定されないが、好ましくはγ‐ブチロベタイン又はクロトノベタインである。
【００１９】
（I）  一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物及びカルニチンを含む混合物と無機塩類とを含有するアルコール溶液を調製する工程
本発明において使用するアルコール溶液とは、（i）少なくとも１種類のアルコール系溶媒、又は（ii）少なくとも１種類のアルコール系溶媒と少なくとも１種類の有機溶媒とを含む溶液である。
アルコール系溶媒としては、カルニチンが溶解するものであれば特に限定されないが、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノールからなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましく、特に、メタノール及びエタノールが好ましい。
【００２０】
これらのアルコール系溶媒は、１種類を単独で使用することもでき、あるいは、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。２種類以上を組み合わせて用いる場合には、カルニチンが溶解し、無機塩が不溶若しくは難溶でかつ一般式（１）に示される化合物又は一般式（２）に示される化合物を析出させることができれば、混合する（組み合わせる）アルコールの種類及び混合比は限定されない。
【００２１】
このようなアルコール混合溶媒の例としては、1-ブタノールとメタノール又は1-ブタノールとエタノール等の組み合わせが好ましい。このような溶媒を用いることにより、無機塩を添加した際に不純物を効率良く析出させることが可能となるからである。混合溶媒の比率は、例えば、1-ブタノールとメタノール又はエタノールとの混合溶媒を用いる場合、メタノール又はエタノールは、１-ブタノール中0.1〜100％程度の任意の割合で使用することが可能である。
【００２２】
また、本発明では、当該アルコール系溶媒と有機溶媒を組み合わせて用いることも可能である。当該有機溶媒としては、アセトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン及びジメチルスルホキシドからなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００２３】
アルコール系溶媒と有機溶媒との組み合わせは、カルニチンが溶解し、無機塩が不溶若しくは難溶でかつ無機塩を添加した際に一般式（１）に示される化合物及び一般式（２）に示される化合物を析出させることができれば限定されない。このようなアルコール系溶媒と有機溶媒の組合せの例としては、アルコール系溶媒としてメタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール等を使用する場合、有機溶媒はアセトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル等を使用することが好ましい。
【００２４】
アルコール系溶媒と有機溶媒との混合比については、カルニチンが溶解し、無機塩が不溶若しくは難溶でかつ無機塩を添加した際に不純物を析出させるような混合比であればよく、このような混合比は、当業者であれば適宜選択することができる。
【００２５】
アルコール系溶媒は、カルニチンが溶解し、無機塩が不溶若しくは難溶でかつ無機塩を添加した際に一般式（１）に示される化合物及び一般式（２）に示される化合物が析出するものである限り、水を含んでいてもよい。カルニチン混合物を含むアルコール溶液の調製方法は特に限定されない。カルニチン混合物に(i)アルコール系溶媒又は(ii) アルコール系溶媒と有機溶媒の混合溶媒を添加することもでき、あるいは、該溶媒にカルニチン混合物を添加してもよい。また、これらの添加は、一度に全量を添加することもでき、あるいは、数回に分けて添加することもできる。添加する際に溶媒を攪拌しながらカルニチン混合物を添加すると、カルニチンの溶解が促進されるので好ましい。攪拌の速度及び攪拌時間については特に限定されるものではなく、当業者が適宜選択することができる。
【００２６】
カルニチン混合物の量に対する溶媒の量は特に限定されないが、カルニチン（質量）に対して溶媒の量（質量）が約1.5〜20倍量であることが好ましく、約2〜10倍量がより好ましい。さらに溶媒がメタノールの場合は、カルニチンに対する溶媒の量は、好ましくは、2〜4倍量、より好ましくは、2.5倍量であり、エタノールの場合は、好ましくは、7〜11倍量、より好ましくは、9倍量である。無機塩を添加した際に一般式（１）に示される化合物及び一般式（２）に示される化合物を効率良く析出させることが可能となるからである。カルニチン混合物を溶媒に添加する時の溶媒の温度は、カルニチンが安定に存在する範囲であれば特に限定はされない。例えば、約5〜80℃、好ましくは、10〜40℃で行えば、分解物の生成を防ぐことができるので好ましい。また、カルニチン混合物、又はカルニチン混合物を含むアルコール溶液のｐＨは特に限定されないが、5〜9程度、好ましくは、6〜8の中性領域に調整することが好ましい。
【００２７】
本発明において使用する無機塩としてはアルコール系溶媒に不溶若しくは難溶であれば特に限定されないが、硫酸ナトリウム、硫酸一水素ナトリウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸一水素二ナトリウム、炭酸二水素一ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素一ナトリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種類の化合物が好ましく、特に、硫酸ナトリウムが好ましい。
【００２８】
無機塩は、１種類を単独で使用することもでき、あるいは、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。２種類以上を組み合わせて用いる場合には、アルコール系溶媒に不溶若しくは難溶でかつ無機塩を添加した際に一般式（１）に示される化合物及び一般式（２）に示される化合物を析出させることができる限り、混合する（組み合わせる）無機塩の種類及び混合比は限定されない。また、無機塩は、アルコール系溶媒に不溶若しくは難溶でかつ無機塩を添加した際に一般式（１）に示される化合物及び一般式（２）に示される化合物が析出するものである限り、含水物であってもよい。
【００２９】
無機塩の添加量については、カルニチンを含有するアルコール溶液に対する無機塩の溶解度以上の添加量であれば特に限定されないが、カルニチンのメタノール溶液であればカルニチンに対して200ppm〜1200ppmが好ましく、300ppm〜500ppmがさらに好ましく、約400ppmが最も好ましい。また、カルニチンのエタノール溶液であれはカルニチンに対して10ppm〜200ppmが好ましく、15ppm〜100ppmがさらに好ましく、約20ppmが最も好ましい。この場合、「約」とは、この語に続く数値の±10％の範囲の値を含むことを意味する。
【００３０】
無機塩をアルコール溶液に添加する調製方法は特に限定されない。カルニチン混合物を含有するアルコール溶液に無機塩を添加することもでき、あるいは、カルニチンと無機塩を混合し、これをアルコール溶液に溶解してもよい。また、これらの添加は、一度に全量を添加することもでき、あるいは、数回に分けて添加することもできる。添加する際に、カルニチンの溶解を促進するため、溶媒を攪拌しながらカルニチン混合物を添加することが好ましい。攪拌の速度及び攪拌時間については特に限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択することができる。カルニチン混合物を含むアルコール溶液に無機塩を添加する時の溶液の温度は、カルニチンが安定に存在する範囲であれば特に限定はされない。例えば、5〜80℃程度、好ましくは、10〜40℃で行えば、分解物の生成を防ぐことができるので好ましい。
【００３１】
（II）  前記アルコール溶液中に析出する不溶解物を分離する工程
上記で説明したように、一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物及びカルニチンを含む混合物と無機塩類とを含有するアルコール溶液を調製すると、該アルコール溶液中に不溶解物が析出する。この際、カルニチン（及びベタイン類）は、アルコール溶液中に溶解した状態にあるが、一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物は、上記不溶解物に含まれる。溶解物を分離する手段としては、ろ過、蒸発乾固、遠心分離等の分離手段が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
遠心分離を行う場合、分離する際の重力加速度は不溶物が沈殿する大きさであれば特に限定されない。また遠心分離を行う時間については特に限定されないが30秒以上2分以下が望ましい。温度については不溶物が溶解しなければ特に限定されないが、10〜30℃の室温で行うことが望ましい。
【００３３】
不溶解物を分離する手段としてろ過を行う場合、分離に用いる濾紙、濾布又はカートリッジフィルターは特に限定されないが、好ましくは、保留粒子径が、約0.1μm〜3.0μm、さらに好ましくは、約0.2μm〜1.0μmの濾紙、濾布又はカートリッジフィルターが好ましい。目抜けを抑えながら効率的に濾過を行うことができるからである。また、ろ過は、アスピレーター等を用いた吸引ろ過が好ましい。
【００３４】
（III）  不溶解物の成分を分析することにより前記化合物を検出する工程
上述の通り、一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物は、上記不溶解物に含まれるので、この不溶解物の成分を分析することにより、一般式（１）で示される化合物及び一般式（２）で示される化合物を検出することができる。
不溶解物の成分を分析する方法の好ましい例として、質量分析計を検出器とする液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリー法（LC-MS法）や核磁気共鳴法（NMR法）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
例えば、LC-MS法を行う場合、不溶解物に水を加えて溶解した調製溶液の成分を分析することにより不純物を検出することが可能である。また成分分析する際の温度は不溶解物が溶解しなければ特に限定されるものではない。
【００３６】
また、例えば、核磁気共鳴装置を用いて不溶解物の成分を分析することも可能である。本分析方法は、不溶解物に含まれる無機塩の存在による影響を受けることなく、かつ高感度に不純物を検出できる点で、特に好ましい。成分分析する際の温度は不溶解物が析出しなければ特に限定しないが、10〜60℃で測定することが望ましい。使用する重溶媒は、アルコール溶液から分離した不溶解物を溶解できる重溶媒であれば特に種類は限定されないが、重水又は重アルコール溶媒が好ましく、特に、重メタノールが好ましい。核磁気共鳴装置の磁場の強さは特に不純物が検出できる強さを有していれば特に限定されないが、90 MHz以上の磁場の強さを有するマグネットを用いることが好ましい。
【００３７】
また、無機塩類の添加によりアルコール溶液中に析出した不溶解物は、上記の分離手段によって分離した後に、そのまま成分分析に付してもよいが、好ましくは、分離後かつ成分分析前に、リンスを行って、分離した該不溶解物と接触する残存アルコール溶液に含まれるカルニチン（及びベタイン類）を成分分析の検出限界未満にまで除去することが好ましい。分離した不溶物をリンスする溶媒としては、不溶物を溶解させず、かつカルニチン（及びベタイン類）を溶解する溶媒であれば特に限定されないが、先にカルニチン（及びベタイン類）を含有するアルコール溶液を調製した際に使用したアルコールと同一種類のアルコールを用いることが望ましい。リンスは、分離した不溶解物と接触する残存アルコール溶液のカルニチンの濃度が成分分析の検出下限未満になるまで繰り返すことが好ましく、その反復回数は特に限定されないが、好ましくは、５〜１０回である。
【００３８】
以上の方法にて、一般式（１）で示される化合物、及び一般式（２）で示される化合物から選ばれる少なくとも１種及びカルニチンを含むカルニチン混合物に含まれる微量不純物を検出することができる。
【００３９】
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。但し、以下の実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例及び比較例に於ける％表示は質量％である。
【実施例１】
【００４０】
特開2008-133198に記載の方法、即ち、ジクロロプロパノールを酵素反応によりシアノ化及びアミド化した後、４級化し、加水分解等を行う方法により得られたカルニチン199.04g（クロトノベタインを0.002％含有）に超純水600mlを加え、攪拌しながら均一に溶解して水溶液を調製した。この水溶液に、3-ヒドロキシグルタル酸ジナトリウムを39.1mg（3-ヒドロキシグルタル酸としてL-カルニチンに対して0.016％（160ppm））、2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムジクロライドを23.9mg（2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムとしてL-カルニチンに対して0.0086％（86ppm））加え、均一になるまで30分間攪拌を行い、不純物含有カルニチン水溶液を調製した。得られた水溶液を肉眼で確認したところ溶液中に白濁物は確認されなかった。このように調製した不純物含有カルニチン水溶液をロータリーエバポレーターを用いて60℃、減圧下にて濃縮し、乾固した。さらに減圧乾燥械にて50℃、5時間乾燥させ、不純物含有カルニチン混合物（約200g）を得た。
【００４１】
次に不純物含有カルニチン混合物を39.8g秤量し、マグネティックスターラーで撹拌しながらメタノールを加えて終量を100gとすることにより不純物含有カルニチン混合物を40％含むメタノール溶液を調製した。
【００４２】
一方、硫酸ナトリウム（無水）410mgを秤量し、超純水を加えて終量を10200mgとすることで、硫酸ナトリウム水溶液を調製した。この硫酸ナトリウム水溶液のうち400mgを、先に調製した、不純物含有カルニチン混合物のメタノール溶液に加えて、L-カルニチンに対しておよそ400ppmの硫酸ナトリウムが含まれる溶液を調製し、この溶液をマグネティックスターラーで１時間撹拌し、白濁物を析出させた。生じた白濁物を分離するため、この溶液をエッペンドルフチューブに分注し、遠心分離器「チビタンII（10000rpm）」にて１分間遠心分離を行い、白濁物をエッペンドルフチューブの底に集めた。上清液を捨てた後、同条件にて残った撹拌液について遠心分離を順次繰り返し、撹拌液を全て処理し最終的に白濁物を１本のエッペンドルフチューブに集めた。
【００４３】
得られた白濁物をリンスするため、上清液を除いた白濁物に200μlのメタノールを加えてボルテックスにて10秒間攪拌し、１分間遠心分離を行い白濁物を沈殿させた。上清液のメタノールを除去した後、再度200μlのメタノールを加えて同様のリンス操作を行った。リンス操作は合計６回行い、理論上残液を1/6400万以下に希釈し、残液に含まれるカルニチン量を約0.0000006％（6ppb）以下にした。リンスを行った白濁物を減圧乾燥機にて50℃で10時間乾燥させることによりメタノールを除去し、NMR測定用試料（約15mg）を得た。
【００４４】
得られたNMR測定用試料全量に重水0.9mlを加えて試料を溶解した後、270MHzの測定磁場を有する核磁気共鳴装置にて1H-NMRを測定した。その結果、図1に示すようにNMRスペクトルにおいてL-カルニチンの他、微量に存在する3-ヒドロキシグルタル酸（L-カルニチンに対して0.0160％（160.0ppm）：ピーク2.34ppm〜2.42ppm、4.26ppm〜4.38ppm）及び2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム（L-カルニチンに対して0.0086％（86ppm）：ピーク3.29ppm）を確認することができた。
【００４５】
核磁気共鳴装置による測定は、以下に示す条件で行った。
【００４６】
【表１】
2011085511.tif 000006
【実施例２】
【００４７】
実施例１で用いたカルニチンと同様の方法で得られたカルニチン100.01g（クロトノベタインを0.002％含有）に超純水120mlを加え、攪拌しながら均一に溶解して水溶液を調製した。この水溶液に、3-ヒドロキシグルタル酸ジナトリウムを147mg（3-ヒドロキシグルタル酸としてL-カルニチンに対して0.12％（1200ppm））、2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムジクロライドを10.29mg（2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムとしてL-カルニチンに対して0.0073％（73ppm））、硫酸ナトリウムを200.94mg（L-カルニチンに対して2000ppm）加え、均一になるまで攪拌を行い、不純物含有カルニチン水溶液を調製した。得られた水溶液を肉眼で確認したところ溶液中に白濁物は確認されなかった。
【００４８】
このように調製した不純物含有カルニチン水溶液をロータリーエバポレーターを用いて60℃にて減圧下にて濃縮し、乾固した。さらに減圧乾燥械にて50℃、5時間乾燥させ、不純物含有カルニチン混合物（約100g）を得た。
【００４９】
得られた不純物含有カルニチン混合物を2.0g秤量し、エタノールを加えて終量を20.32gすることにより不純物含有カルニチン混合物を10％含むエタノール溶液を調製し、この溶液をマグネティックスターラーで室温にて１時間撹拌した。室温にて１時間放置して白濁物を十分析出させた後、この溶液をエッペンドルフチューブに分注し、遠心分離器「チビタンII（10000rpm）」にて１分間遠心分離を行い、白濁物をエッペンドルフチューブの底に集めた。上清液を捨てた後、同条件にて残った撹拌液について遠心分離を順次繰り返し、最終的に白濁物を１本のエッペンドルフチューブに集めた。
【００５０】
得られた白濁物をリンスするため、上清液を除いた白濁物に200μlのエタノールを加え、ボルテックスにて10秒間攪拌し、１分間遠心分離を行って白濁物を沈殿させた。上清液のメタノールを除去した後、再度200μlのメタノールを加え、同様のリンス操作を行った。リンス操作は合計６回行い、理論上残液を1/6400万以下に希釈した。リンスした白濁物を減圧乾燥機にて50℃で10時間乾燥させることによりエタノールを除去し、NMR測定用試料（約100mg）を得た。
【００５１】
得られたNMR測定用試料全量に重水0.9mlを加えて試料を溶解した後、270MHzの測定磁場を有する核磁気共鳴装置にて1H-NMRを測定した。その結果、図2に示すようにNMRスペクトルにおいてL-カルニチンの他、微量に存在する3-ヒドロキシグルタル酸（L-カルニチンに対して0.12％（1200ppm）：ピーク2.34ppm〜2.42ppm、4.26ppm〜4.38ppm）及び2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム（L-カルニチンに対して0.0073％（73ppm）：ピーク3.29ppm）を確認することができた。
【実施例３】
【００５２】
実施例１で用いたカルニチンと同様の方法で得られたカルニチン405.73g（クロトノベタインを0.002％含有）に超純水を加え終量を821.24gとし（49.4％w/w）、約30分間マグネティックスターラーで攪拌して均一に溶解して水溶液を調製した。この水溶液159.13g を300mlビーカーに採った。この水溶液に3-ヒドロキシグルタル酸ジナトリウム2.067mg（3-ヒドロキシグルタル酸としてL-カルニチンに対して0.002％（20ppm））、2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムジクロライドを1.100mg（2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムとしてL-カルニチンに対して0.001％（10ppm））を加えてマグネティックスターラーにてさらに攪拌を行い、不純物含有カルニチン水溶液を調製した。得られた水溶液を肉眼で確認したところ溶液中に白濁物は確認されなかった。
【００５３】
一方、硫酸ナトリウム409.62mgを25mlメスフラスコに採り、超純水を加えて終量を10200mgとすることで、硫酸ナトリウム水溶液を調製した。
【００５４】
先に調製した不純物含有カルニチン水溶液42.27gを200mlビーカーに採り、硫酸ナトリウム水溶液を2534μl加え、マグネティックスターラーで30分間撹拌した。このようにしてL-カルニチンに対して0.2％（2000ppm）の硫酸ナトリウム、0.002％（20ppm） の3-ヒドロキシグルタル酸、0.001％（10ppm）の 2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムを含有する溶液を得た。この溶液をロータリーエバポレーターにて用いて60℃で減圧下で濃縮し、乾固した。さらに減圧乾燥械にて50℃で5時間乾燥させ、不純物含有カルニチン混合物（約20g）を得た。
【００５５】
得られた不純物含有カルニチン混合物を20mlのガラス製スクリュー瓶中に2.18g秤量し、エタノールを加えて終量を21.76gとし、マグネティックスターラーで10分間撹拌して不純物含有カルニチン混合物を10％含むエタノール溶液を調製した。この溶液を室温にて１時間放置して白濁物を十分析出させた後、エッペンドルフチューブに分注し、遠心分離器「チビタンII（10000rpm）」にて１分間遠心分離を行い、白濁物をエッペンドルフチューブの底に集めた。上清液を捨てた後、同条件にて遠心分離を順次繰り返し、エタノール溶液全てを処理し最終的に白濁物を１本のエッペンドルフチューブに集めた。
【００５６】
得られた白濁物をリンスするため、上清液を除いた白濁物に200μlのエタノールを加えてボルテックスにて10秒間攪拌し、１分間遠心分離を行い白濁物を沈殿させた。上清液のメタノールを除去した後、再度200μlのメタノールを加えて同様のリンス操作を行った。リンス操作は合計６回行い、理論上残液を1/6400万以下に希釈し、残液に含まれるカルニチン量を約0.0000002％（2ppb）以下にした。リンスを行った白濁物を減圧乾燥機にて50℃、10時間乾燥させることによりエタノールを除去し、NMR測定用試料（約40mg）を得た。
【００５７】
得られたNMR測定用試料全量に重水0.9mlを加えて試料を溶解した後、270MHzの測定磁場を有する核磁気共鳴装置にて1H-NMRを測定した。その結果、図3に示すようにNMRスペクトルにおいてL-カルニチンの他、微量に存在する3-ヒドロキシグルタル酸（L-カルニチンに対して0.002％（20ppm）：ピーク2.34ppm〜2.42ppm、4.26ppm〜4.38ppm）及び2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム（L-カルニチンに対して0.001％（10ppm）：ピーク3.29ppm）を確認することができた。
【実施例４】
【００５８】
実施例１で用いたカルニチンと同様の方法で得られたカルニチン405.73g（クロトノベタインを0.002％含有）に超純水を加えて終量を821.24gとし（49.4％w/w）、約30分間マグネティックスターラーにて攪拌し均一に溶解して水溶液を調製した。この水溶液160.32gを300mlビーカーに採った。この溶液に3-ヒドロキシグルタル酸ジナトリウム208.30mg（3-ヒドロキシグルタル酸としてL-カルニチンに対して0.2％（2000ppm））、2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムジクロライド110.88mg（2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムとしてL-カルニチンに対して0.1％（1000ppm））を加えてマグネティックスターラーにてさらに攪拌を行い、不純物含有カルニチン水溶液を調製した。得られた水溶液を肉眼で確認したところ溶液中に白濁物は確認されなかった。
【００５９】
一方、硫酸ナトリウム409.62mgを25mlメスフラスコに採り、超純水を加えて終量を10200mgとすることで、硫酸ナトリウム水溶液を調製した。
【００６０】
次に調製した不純物含有カルニチン水溶液44.93gを200mlビーカーに採り、硫酸ナトリウム水溶液を2696μl加え、マグネティックスターラーにて30分間撹拌した。このようにしてL-カルニチンに対して0.2％（2000ppm）の硫酸ナトリウム、0.2％（2000ppm） の3-ヒドロキシグルタル酸、0.1％（1000ppm）の 2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムを含有する溶液を得た。この溶液を、ロータリーエバポレーターを用いて60℃にて減圧下で濃縮し、乾固した。さらに減圧乾燥械にて50℃で5時間乾燥させ、不純物含有カルニチン混合物（約20g）を得た。
【００６１】
得られた不純物含有カルニチン混合物を20mlのガラス製スクリュー瓶に2.08g秤量し、エタノールを加えて終量を20.56gとし、マグネティックスターラーで10分間撹拌して不純物含有カルニチン混合物を10％含むエタノール溶液を調製した。この溶液を室温にて１時間放置して白濁物を十分析出させた後、エッペンドルフチューブに分注し、遠心分離器「チビタンII（10000rpm）」にて１分間遠心分離を行い、白濁物をエッペンドルフチューブ内にペレット化した。上清液を捨てた後、同条件にて遠心分離を順次繰り返し、エタノール溶液全てを処理し最終的に白濁物を１本のエッペンドルフチューブに集めた。
【００６２】
得られた白濁物をリンスするため、上清液を除いた白濁物に200μlのエタノールを加えてボルテックスにて10秒間攪拌し、１分間遠心分離を行って白濁物を沈殿させた。上清液のメタノールを除去した後、再度200μlのメタノールを加え、同様のリンス操作を行った。リンス操作は合計６回行い、理論上残液を1/6400万以下に希釈し、残液に含まれるカルニチン量を約0.0000002％（2ppb）以下にした。リンスを行った白濁物を減圧乾燥機にて50℃で10時間乾燥させることによりエタノールを除去し、NMR測定用試料（約40mg）を得た。
【００６３】
得られたNMR測定用試料全量に重水0.9mlを加えて試料を溶解した後、270MHzの測定磁場を有する核磁気共鳴装置にて1H-NMRを測定した。図4に示すように3-ヒドロキシグルタル酸（L-カルニチンに対して0.2％（2000ppm）：2.34ppm〜2.42ppm、4.26ppm〜4.38ppm）および2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム（L-カルニチンに対して0.1％（1000ppm）：3.29ppm）のシグナル強度（図４下段のNMRスペクトル）は、実施例3における3-ヒドロキシグルタル酸（L-カルニチンに対して0.002％（20ppm））および2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム（L-カルニチンに対して0.001％（10ppm））のシグナル強度（図４上段のNMRスペクトル）よりも大きいことが確認された。したがって、本実施例により、硫酸ナトリウムの含有量は同じであっても不純物含有量に比例してシグナル強度も大きくなることが確認された。
［比較例１］
【００６４】
実施例１にて得られた不純物含有カルニチン混合物を40.2g秤量し、マグネティックスターラーで撹拌しながらメタノールを加えて終量を100.2gとし、不純物含有カルニチン混合物を40％含むメタノール溶液を調製したところ、溶液中に白濁物は確認されなかった。したがって、本実施例により、実施例１にて得られた不純物含有カルニチン混合物に含まれている不純物はメタノールに溶解することが確認された。またこれらの不純物は硫酸ナトリウム存在下で硫酸ナトリウムと共に白濁沈殿することが確認された。
［比較例２］
【００６５】
実施例２にて得られた不純物含有カルニチン混合物を60mg秤量し、重メタノール0.9mlを加えて溶解した後、270MHzの測定磁場を有する核磁気共鳴装置にて1H-NMRを測定した。含有する不純物量はL-カルニチンに対して3-ヒドロキシグルタル酸として0.12％、2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウムとして0.0073％であり、実施例２で示したように、硫酸ナトリウムが存在すると含有不純物が硫酸ナトリウムと共に沈殿し、核磁気共鳴装置でこれらの存在を検出可能なことは確認済みである。しかしながら図５に示すように、硫酸ナトリウムを含有しない不純物含有カルニチン混合物そのものを測定しても、NMRスペクトルにおいて3-ヒドロキシグルタル酸（2.34ppm〜2.42ppm、4.26ppm〜4.38ppm）及び2−ヒドロキシ-N,N,N,N,N,N-ヘキサメチル-1,3-プロパンジアミニウム（3.29ppm）は検出することができなかった。
【００６６】
上記実施例及び比較例の結果から、カルニチン混合物及び無機塩類を含むアルコール溶液を調製することにより、不純物が不溶解物として析出し、この不溶解物の成分を分析することにより、従来技術では検出が極めて困難であった微量の不純物を検出可能なことが実証された。
【図１】
2011085511.tif 000009
【図２】
2011085511.tif 000010
【図３】
2011085511.tif 000011
【図４】
2011085511.tif 000012
【図５】
2011085511.tif 000013