(57)【要約】【課題】DNAを増幅するためのより実用的な方法を提供する。【解決手段】DNAを増幅するのにあたり、５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素で前記DNAを処理して、第１の二本鎖DNA断片を準備し、この第１の二本鎖DNA断片に前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通性のある塩基配列を含む増幅用配列とを有するアダプターDNAを連結して第２の二本鎖DNA断片を取得し、この第２の二本鎖DNA断片をDNAポリメラーゼを用いて増幅するようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAを増幅する方法であって、
５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位を含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素で前記DNAを処理して、第１の二本鎖DNA断片を準備する工程と、
前記第１の二本鎖DNA断片に前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通性のある塩基配列を含む増幅用配列とを有するアダプターDNAを連結して第２の二本鎖DNA断片を取得する工程と、
前記第２の二本鎖DNA断片をDNAポリメラーゼを用いて増幅する工程と、
を備える、方法。
【請求項２】
前記第１の二本鎖DNA断片の取得工程は、９塩基の塩基長を有する前記オーバーハングを形成する前記制限酵素で処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限酵素は、TspRIである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の二本鎖DNA断片の取得工程は、前記二本鎖DNA断片の３’末端側及び５’末端側に共通する塩基配列を含む前記増幅用配列を有する新生オーバーハングを形成可能な前記アダプターDNAを用いる工程である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記増幅工程は、前記増幅用配列に相補的なプライマーを用いてPCRにより前記第２のDNA断片を増幅する工程である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の二本鎖DNA断片の取得工程は、前記二本鎖DNA断片の３’末端側及び５’末端側に、それぞれ末端ヘアピン構造を形成可能な塩基配列を含む前記増幅用配列を有する前記アダプターDNAを用いる工程である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記増幅工程は、恒温増幅によって前記第２の二本鎖DNAを増幅する工程である、請求項６に記載の増幅方法。
【請求項８】
前記第１の二本鎖DNA断片の準備工程は、１種の前記制限酵素で前記DNAを処理して前記第１の二本鎖DNA断片を準備する工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項９】
前記第１の二本鎖DNA断片の準備工程は、２種以上の前記制限酵素をそれぞれ用いて前記DNAを処理して、それぞれ前記第２の二本鎖DNA断片を準備する工程であり、
前記第２の二本鎖DNA断片の取得工程は、２種以上の前記制限酵素についてそれぞれ得られた前記第１の二本鎖DNA断片につき、前記第２の二本鎖DNA断片を取得する工程であり、
前記増幅工程は、２種以上の前記制限酵素についてそれぞれ得られた前記第２の二本鎖DNA断片につき、増幅工程を実施する工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
DNAを増幅するキットであって、
５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位を含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素と、
前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通性のある塩基配列を含む増幅用配列とを有するアダプターDNAと、
を含む、キット。
【請求項１１】
さらに、前記アダプターDNA中の共通性のある増幅用配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記アダプターDNAは、末端ヘアピン構造を形成可能な塩基配列を含む前記増幅用配列を有する、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの増幅方法に関し、特に、ゲノムDNAなど任意のDNAを増幅する方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの増幅方法の一つとして、全ゲノム増幅法（WGA：Whole Genome Amplification）法がある。ＷＧＡ法は、DNAを１０4〜１０5程度に増幅して、希少なDNA試料から大量のDNAを取得する有用な手段であると考えられている。マイクロサテライト分析や一塩基多型（SNP）の検出、Comparative Genomic Hybridazation（CGH）マイクロアレイなど、様々な生物医学的アプリケーションの有用なツールとなっている。WGA法としては、LMP（Ligation-Mediated PCR）法とMDA（Multiple Displacement Amplification）法とが知られている。
【０００３】
MDA法は、バクテリオファージ由来のphi29 DNA ポリメラーゼを利用してゲノムDNAを増幅する方法である（非特許文献１）。ランダムヘキサマープライマーを鋳型ゲノムDNAにアニールさせ、phi29 DNA ポリメラーゼによる相補鎖の合成を開始し、合成された相補鎖にさらにプライマーがアニールしphi29 DNA ポリメラーゼによる合成が開始して、連続的にDNA増幅が行われる。LMP法は、ゲノムDNAを５００bp程度の断片とした後、その断片の両端にプライマーとするアダプターを付加することでライブラリを作成し、このライブラリをＰＣＲ増幅することで偏りのないゲノムDNAの増幅が可能とされている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dean F.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (8), 5261-5266 (2002)
【非特許文献２】Klein C.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (8), 4494-4499 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、MDA法は、すべてDNAを均一に増幅しにくいため、正確にDNAを分析できない可能性があった。また、LMP法は、主としてDNAをDnaseIで切断し、その平滑末端を利用してライゲーションを行うため、連結の効率が高くない場合には副反応が起こりやすいという問題があった。さらに、酵素の量や処理時間を厳密にコントロールして切断断片の長さをコントロールして一定の温度サイクルでのPCRを実現する必要があるが、実際にはそのようなコントロールは極めて困難であった。
【０００６】
以上のことから、現状において、より実用的なDNAの増幅方法が求められている。そこで、本発明は、より実用的なDNAの増幅方法を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、DNAの増幅に際し、増幅対象DNAを一定以上の塩基長であって任意塩基を含むオーバーハングが生じるように制限酵素にて切断し、このDNA断片を用いて増幅工程を実施することで、均一にかつ高効率に増幅対象DNAを増幅できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本明細書の開示によれば、DNAを増幅する方法であって、５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位を含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素で前記DNAを処理して、第１の二本鎖DNA断片を準備する工程と、前記第１の二本鎖DNA断片に前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通性のある塩基配列を含む増幅用配列とを有するアダプターDNAを連結して第２の二本鎖DNA断片を取得する工程と、前記第２の二本鎖DNA断片をDNAポリメラーゼを用いて増幅する工程と、を備える方法が提供される。
【０００９】
本増幅方法においては、前記第１の二本鎖DNA断片の取得工程は、９塩基の塩基長を有する前記オーバーハングを形成する前記制限酵素で処理することを含むことができる。この態様において、前記制限酵素は、TspRIとすることができる。
【００１０】
本増幅方法においては、前記第２の二本鎖DNA断片の取得工程は、前記二本鎖DNA断片の３’末端側及び５’末端側に共通する塩基配列を含む前記増幅用配列を有する前記アダプターDNAを用いる工程とすることができる。この態様において、前記増幅工程は、前記増幅用配列に相補的なプライマーを用いてPCRにより前記第２のDNA断片を増幅する工程とすることもできる。
【００１１】
本増幅方法においては、前記第２の二本鎖DNA断片の取得工程は、前記二本鎖DNA断片の３’末端側及び５’末端側に、それぞれ末端ヘアピン構造を形成可能な塩基配列を含む前記増幅用配列を有する前記アダプターDNAを用いる工程とすることができる。この態様において、前記増幅工程は、恒温増幅によって前記第２の二本鎖DNAを増幅する工程とすることもできる。
【００１２】
本増幅方法においては、前記第１の二本鎖DNA断片の準備工程は、１種の前記制限酵素で前記DNAを処理して前記第１の二本鎖DNA断片を準備する工程とすることができる。また、前記第１の二本鎖DNA断片の準備工程は、２種以上の前記制限酵素をそれぞれ用いて前記DNAを処理して、それぞれ前記第２の二本鎖DNA断片を準備する工程であり、前記第２の二本鎖DNA断片の取得工程は、２種以上の前記制限酵素についてそれぞれ得られた前記第１の二本鎖DNA断片につき、前記第２の二本鎖DNA断片を取得する工程であり、前記増幅工程は、２種以上の前記制限酵素についてそれぞれ得られた前記第２の二本鎖DNA断片につき、増幅工程を実施する工程であるとしてもよい。
【００１３】
本明細書の開示によれば、DNAを増幅するキットであって、５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位を含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素と、前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通性のある塩基配列を含む増幅用配列とを有するアダプターDNAと、を含む、キットが提供される。
【００１４】
本キットは、さらに、前記アダプターDNA中の共通性のある増幅用配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むこともできる。また、本キットにおいて、前記アダプターDNAは、末端ヘアピン構造を形成可能な塩基配列を含む前記増幅用配列を有することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の概要の一例を示す図である。
【図２】増幅工程の他の態様（恒温増幅工程）を示す図である。
【図３】実施例１において、増幅したDNAの電気泳動分析結果を示す図である。図３（ａ）は、プラスミド pQBI T7-GFP DNAのTspRIによる切断断片の組成を示し、図３（ｂ）は、増幅したDNAの泳動図を示す。
【図４】実施例２において増幅したE.coli K-12の全ゲノムDNAの電気泳動分析結果を示す図である。レーン１はE.coli K-12数十個からのDNA増幅結果を示し、レーン２は、コントロールを示す。
【図５】実施例３において増幅したヒト細胞の全ゲノムDNAの電気泳動分析結果を示す図である。レーン1は約１００個のヒト293FT細胞からのDNA増幅結果を示し、レーン２は、約１０個のヒト293T細胞からのDNA増幅結果を示し、レーン３は、約１個のヒト293T細胞からのDNA増幅結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書の開示されるDNAを増幅する方法は、５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位を含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素で前記DNAを処理して、第１の二本鎖DNA断片を準備する工程と、前記第１の二本鎖DNA断片に前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通性のある塩基配列を含む増幅用配列とを有するアダプターDNAを連結して第２の二本鎖DNA断片を取得する工程と、前記第２の二本鎖DNA断片をDNAポリメラーゼを用いて増幅する工程と、を備えることができる。
【００１７】
この増幅方法によれば、特定の制限酵素で処理することにより、アニールしやすさと特異性とを兼ね備えたオーバーハングを有する第１の二本鎖DNA断片を準備することができる。この第１の二本鎖DNA断片は、適切なオーバーハングを有するため、アダプターDNAとの効率的かつ特異的にアニールし、連結されて共通性のある増幅用配列を有する第２の二本鎖DNA断片を効率よくかつ精度よく得ることができる。さらに、この第２の二本鎖DNA断片を共通性のある増幅用配列を利用して増幅することで簡易にかつ効率的に増幅工程を実施することができる。
【００１８】
すなわち、本増幅方法によれば、所定の態様のオーバーハングを形成可能な制限酵素を用いて第１の二本鎖DNA断片を準備することで、第２の二本鎖DNA断片の取得工程における特異性及び効率性を確保するとともに、増幅工程の効率性及び均質性を確保することができるようになる。このように、オーバーハングの多様性を利用して、最終的に高効率で良好な増幅を容易に達成できることは、本出願の出願時以前においては見出されていなかったことである。
【００１９】
以下、こうした増幅方法及びその利用についての各種実施形態について説明する。図１は、本明細書の開示の増幅方法の一例の概要を示す図である。
【００２０】
（DNAの増幅方法）
本明細書の開示のDNAの増幅方法は、試料中のDNAを増幅する方法であって、試料中の特定のDNA又はDNA中の特定領域を特異的に増幅することを意図するものではない。好ましくは、本増幅方法は、試料中のDNAをできるだけ非特異的にできるだけ均一に増幅することを意図している。また、本増幅方法は、試料中のDNAの複製物の生産方法であるといえる。ここで複製物とは、試料中のDNAを複数の二本鎖DNA断片に断片化して複製したものを意味している。
【００２１】
また、本増幅方法は、増幅に適したライブラリの調製方法とすることもできる。本明細書の開示の増幅方法によれば、DNAから効率的にライブラリを構築することができる。
【００２２】
（増幅対象であるDNA）
本明細書の開示の増幅方法が増幅対象とするDNAは、特に限定しない。ヒトを含む各種生物又はウイルスのゲノムDNA又はその一部であってもよく、プリオン等の非生物のDNA又はその一部であってもよいし、RNAを利用して酵素的に合成したDNAであってもよいし、化学合成DNAであってもよい。増幅対象であるDNAは、複数種のDNAを含んでいてもよい。また、形態は、鎖状であってもよいし、環状であってもよいし、これらの混合物であってもよい。直接の増幅対象は、二本鎖DNAであることが好ましい。一本鎖DNAやRNAを増幅対象とするとき、適宜、公知の方法で二本鎖DNAを調製することが好ましい。増幅対象となるDNAを含む試料は、特に限定されない。人等の生物体から採取した体液、排泄物、組織及び細胞又はその抽出物を含むものであってもよいし、食品又はその抽出物等であってもよい。微生物やウイルス等の増殖物であってもよい。
【００２３】
（第１の二本鎖DNA断片を準備する工程）
本工程は、５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素でDNAを処理して、第１の二本鎖DNA断片を準備する工程とすることができる。この工程を実施することで、５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位を含むオーバーハングを有する二本鎖DNA断片を準備することができる。第１の二本鎖DNA断片がかかるオーバーハングを有することで、後段の第２の二本鎖DNA断片の調製工程を、的確にかつ効率的に実施できる。
【００２４】
本工程では、オーバーハングを形成する制限酵素を用いて増幅対象DNAを切断処理して、オーバーハングを有する第１の二本鎖DNA断片を準備する。制限酵素は、５塩基以上の塩基長を有するオーバーハングを形成する制限酵素を用いることができる。オーバーハングが５塩基以上であると、後段の工程でアダプターDNAとの連結特異性を確保することができるため、確実に第２の二本鎖DNAを取得することができる。制限酵素が形成するオーバーハングは、より好ましくは、６塩基以上であり、さらに好ましくは７塩基以上であり、一層好ましくは８塩基以上であり、最も好ましくは９塩基以上である。
【００２５】
制限酵素が生成するオーバーハングは、１塩基又は２塩基以上の任意塩基部位を含むことが好ましい。本明細書において任意塩基部位とは、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣののうち２塩基以上のいずれかが任意に適用される部位をいうものとする。したがって、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれであってもよい部位のほか、Ｃ又はＧであってもよい部位も任意塩基部位に含まれる。既に説明したように、任意塩基部位を含むことで、オーバーハング間の回文配列に基づいてオーバーハング同士がアニールすることによる二量体形成を抑制することができ、後述するアダプターDNAとの相補性を確保して効率的にかつ的確に連結させることができる。２塩基以上の任意塩基部位は連続していてもよくオーバーハング中に含まれる１塩基又は２塩基以上の認識部位を構成する塩基を介して配列していてもよい。任意の塩基は好ましくは３塩基以上であり、より好ましくは４塩基以上である。例えば、Hga Iの場合は、５塩基のオーバーハングはNNNNNであり、1024種類（45）のアダプターDNAを使用すれば、全ての配列の増幅ができる。したがって、Hga Iで処理した場合には、第１の二本鎖DNA断片に形成されるオーバーハングは当該二本鎖DNA断片に特異的な５つの連続した塩基からなる配列を有することになる。こうした特異的なオーバーハングに相補的なアダプターDNAを用いることでターゲットDNAの増幅の均質性が向上する。
【００２６】
制限酵素の認識部位を構成する塩基数は特に限定しないが、準備する第１の二本鎖DNA断片の長さが増幅に適しているかどうか等を考慮して決定することができる。認識部位を構成する塩基数が多い場合には、認識部位の存在頻度が低くなり平均してより長い第１の二本鎖DNA断片が形成され、当該塩基数が少ない場合には、認識部位の存在頻度が高くなり平均してより短い第１の二本鎖DNA断片が形成されるようになる。例えば、認識部位の構成塩基数が４塩基以上６塩基以下程度（典型的には５塩基）であると、増幅効率等の関係から好ましい長さの二本鎖DNA断片を得ることができる。例えば、TspRIの場合、CASTG（CACTG又はCAGTG）の配列があれば、切断ができる。TspRIの切断サイトは、平均的には、400−500塩基程度に一箇所であると考えられる。認識部位は、オーバーハング中にあってもよいし、オーバーハング以外であってもよい。
【００２７】
こうした制限酵素としては、例えば、Hga I （５塩基のオーバーハング、５塩基の認識配列）、Bae I （５塩基のオーバーハング、６．５塩基の認識配列）、Hin4 I （５塩基のオーバーハング、５塩基の認識配列）、Alo I （５塩基のオーバーハング、７塩基の認識配列）、Bsp24 I （５塩基のオーバーハング、６塩基の認識配列）、Hae IV （５塩基と６塩基のオーバーハング、５塩基の認識配列）、Cje I （６塩基のオーバーハング、５塩基の認識配列）、CjeP I （６塩基のオーバーハング、５塩基の認識配列）及びTspRI （９塩基のオーバーハング、４．５塩基の認識配列）が挙げられる。なかでも、６塩基以上のオーバーハングを生成する制限酵素が好ましく、より好ましくは９塩基のオーバーハングを生成する制限酵素である。
【００２８】
制限酵素は、こうした制限酵素１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。すなわち、増幅対象であるDNAに対して、１種類の制限酵素のみを作用させて第１の二本鎖DNA断片を準備してもよいし、DNAに対して２種類以上の制限酵素を同時に作用させてもよい。１種の制限酵素を作用させることで、アダプターは、当該１種の制限酵素によって形成されるオーバーハングに応じて調製すればよいため、第1の二本鎖DNA断片の準備工程を簡略化することができる。また、２種類以上の制限酵素を同時に作用させることで、例えば、長い塩基数の認識配列の制限酵素を用いた場合でも、適切な長さの第１の二本鎖DNA断片を得ることができる。なお、２種類以上の制限酵素を用いる場合、アダプターDNAも２種類以上の制限酵素によって形成されるそれぞれのオーバーハングに応じた種類を容易する必要がある。
【００２９】
また、DNAに対して、２種類以上の制限酵素をそれぞれ作用させてもよい。すなわち、異なる制限酵素でそれぞれDNAを切断処理することで、制限酵素毎に第１の二本鎖DNA断片を準備する工程を実施してもよい。こうすることで、1種の制限酵素のみではアダプターDNAを連結できないような断片の生成を回避することが困難であり、増幅できないDNA領域が発生する可能性があるが、２種以上の制限酵素で異なる切断部位で異なる第１の二本鎖DNA断片のセットを形成することで、増幅を免れるDNA領域を可能な限り少なくすることができる。
【００３０】
以上のようにして、増幅対象であるDNAを制限酵素を用いて切断処理することで、用いた制限酵素によって生じうるオーバーハングを備える第１の二本鎖DNA断片を準備することができる。１種類の制限酵素を用いた場合でも、オーバーハングに１塩基以上の任意塩基部位を有するため、オーバーハングの態様は必ずしも１種類の塩基配列に限定されないで、複数種類の態様が存在する。また、本工程では、通常、複数の第１の二本鎖DNA断片が生じることのが、を準備する工程と
【００３１】
（第２の二本鎖DNA断片の取得工程）
本工程は、第１の二本鎖DNA断片にオーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通の塩基配列を含む増幅用配列とを有する１種又は２種以上のアダプターDNAを連結して第２の二本鎖DNA断片を取得する工程とすることができる。本工程によれば、第１の二本鎖DNA断片を、増幅に適した形態に調製することができる。共通の増幅用配列を含むことで、効率的な増幅が可能となっている。
【００３２】
（アダプターDNA）
本工程はで用いるアダプターDNAは、少なくとも第１の二本鎖DNA断片のオーバーハングに相補的な塩基配列を含む連結用配列と、増幅のための共通の塩基配列を含む増幅用配列と有していれば足りる。連結用配列は、第１の二本鎖DNA断片の準備に用いた制限酵素によって形成されるであろうオーバーハングの塩基配列に基づいて決定することができる。すなわち、オーバーハングに生じうる可能性のある塩基配列に連結できるように、可能性ある塩基配列の全てに相補的な塩基配列を含む連結用配列を決定し準備するようにする。こうすることで、制限酵素処理で生じうる全ての第１の二本鎖DNA断片を確実に第２の二本鎖DNA断片に調製することができる。このためには、オーバーハングに含まれる一つの任意塩基部位毎に、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣの４種類の塩基をそれぞれ配置する塩基配列を設計するようにする。例えば、オーバーハング中に一つの任意塩基部位が１つある場合には、当該一つの任意塩基部位に対して４つの塩基をそれぞれ導入した４種類の連結用配列を有するアダプターDNAを設計し準備する必要がある。
【００３３】
また、アダプターDNAは、第１の二本鎖DNA断片のオーバーハング中に制限酵素の認識配列を含む場合には、当該認識配列に対して相補的な塩基配列を連結用配列中に含むことができる。
【００３４】
アダプターDNAは、さらに、増幅用配列を含むことができる。増幅用配列は、後段での増幅工程において第２の二本鎖DNA断片を増幅工程の態様に応じて決定することができる。例えば、いわゆる温度サイクルを実施するＰＣＲの場合には、プライマーがアニールするための配列とすることができる。この場合の増幅用配列の長さは特に限定しないが、例えば、１８塩基長以上２５塩基長以下程度とすることができる。ＰＣＲ増幅を意図するアダプターDNAは図１に示すように一本鎖DNAであってもよいが、同時に図１に示すように、少なくとも一部に二本鎖部分を有していてもよい。こうすることで、オーバーハングが短い場合であっても効率的に第１の二本鎖DNA断片と連結させることができる。アダプターDNAを二本鎖DNA部分を有するようにするとき、二本鎖部分は、アダプターDNAにおいて、連結用配列をオーバーハング化できるように連結用配列に隣接するDNA鎖の部分に相補的な一本鎖DNAを組み合わせることができる。
【００３５】
この態様のアダプターDNAにおいて、増幅用配列の塩基配列のバリエーションは、１種類であってもよいし２種類以上であってもよい。増幅用配列は、連結用配列の多様さよりも、より多様性が乏しいことが好ましい。すなわち、連結用配列に比較してより共通性のある塩基配列であることが好ましい。増幅用配列の種類をより少なくすることで、増幅効率を均一化するとともに増幅効率を向上させることができる。増幅用配列を単一種類とすることで、増幅効率を最も均一化しかつ最大化することができる。すなわち、第１の二本鎖DNA断片の３’末端側及び５’末端側に共通する塩基配列を増幅用配列として有する新生オーバーハングを形成可能なアダプターDNAとすることが好ましい。こうすることで、増幅工程で用いるプライマーを１種類のみとすることができるとともに、第１の二本鎖DNA断片長に依存して第２の二本鎖DNA断片長が広範囲にわたって多様化したときであっても、均一にかつ効率よく第２の二本鎖DNA断片を増幅できる。
【００３６】
また、アダプターDNAは、後段での増幅工程で鎖置換型DNAポリメラーゼを用いた恒温増幅工程を実施する場合には、例えば、図２に示すように、第２の二本鎖DNA断片において各鎖の末端に末端ヘアピン構造を形成可能な形成することができる。すなわち、第１の二本鎖DNA断片の３’末端側及び５’末端側に、それぞれ末端ヘアピン構造を形成可能な塩基配列を付与可能なアダプターを用いることができる。こうした末端ヘアピン構造を形成することで図２に示すようにして末端以外の領域を反復して含んだ増幅産物を得ることができるようになる。このようなアダプターDNAは、連結用配列に加えて、末端ヘアピン構造を形成可能な回文配列の塩基配列を増幅用配列の一部として有する一本鎖DNA鎖と、この増幅用配列に相補的でかつ同様に回文配列の塩基配列を増幅用配列の他の一部として有するように対合するDNA鎖とを備えて、二本鎖部分を形成していてもよい。なお、この態様のアダプターDNAにおいても、連結用配列はオーバーハングに形成されている。
【００３７】
さらにアダプターDNAには、転写、形質転換、塩基配列解析に適した塩基配列を含むことができる。例えば、増幅工程後に実施する可能性のあるシークエンシング、転写反応、形質転換、細胞内又は試験管内増幅などに利用可能な塩基配列のDNA領域が挙げられる。例えば、シークエンシング用プライマー配列を使用すれば、後段の増幅工程で増幅した産物を直接シークエンスできる。このような塩基配列は、アダプターDNA中の増幅用配列や連結用配列に適宜含めることができるほか、別途追加することもできる。
【００３８】
以上のことから、アダプターDNAは、連結用配列及び増幅用配列のバリエーションに応じて１種又は２種以上を準備することができる。
【００３９】
本工程は、このようなアダプターDNAと第１の二本鎖DNA断片とを連結して、第２の日本鎖DNA断片を取得する。これらの連結は、例えばT4DNAリガーゼなどのDNAリガーゼを用いて酵素の種類に応じた温度（例えば、１０℃以上３７℃以下程度）で実施することができる。DNAリガーゼとしては、比較低温で作動するT4DNAリガーゼやE. Coli DNAリガーゼなどが好ましく用いることができる。
【００４０】
（増幅工程）
増幅工程では、第２の二本鎖DNA断片を、DNAポリメラーゼを用いて増幅することができる。第２の二本鎖DNA断片の備える増幅用配列を利用してDNAポリメラーゼによって第２の二本鎖DNA断片を増幅し、これにより、増幅対象であるDNAを増幅することができる。DNAポリメラーゼを用いた増幅工程の態様は、第２の二本鎖DNA断片を取得するのに用いたアダプターDNAの増幅用配列に態様に応じて適宜決定することができる。例えば、第２の二本鎖DNA断片が、PCRプライマーがアニール可能に構成されるアダプターDNA由来の増幅用配列を有しているときには、増幅用配列に相補的なプライマーを用いて公知のPCRを用いて増幅工程を実施できる。プライマーは、増幅用配列の種類に応じて準備するが、第２の二本鎖DNA断片が有する両末端の増幅用配列が単一の塩基配列を有している場合には、かかる単一の増幅用配列に相補的な単一の種類のプライマーを用いること効率的にかつ均一に第２の二本鎖DNA断片を増幅することができる。特に、第２の二本鎖DNA断片長がバラエティに富む場合であっても、各断片について均一な増幅が可能となる。こうしたPCR工程の条件は、当業者であれば適宜設定することができる。この場合の増幅用配列の長さは特に限定しないが、例えば、１８塩基長以上２５塩基長以下程度とすることができる。
【００４１】
また、アダプターDNAとして、第２の二本鎖ＤＮＡ断片の両末端の各鎖にヘアピン構造を形成可能な増幅用配列を有するDNAを用いた場合には、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いて恒温増幅工程（Liang X.G. et al. Biochemistry 43, 13459-13466, 2004）を実施することができる。恒温増幅工程を実施することで、温度制御を簡略ないし省略して増幅できるため、第２の二本鎖DNA断片の均一な増幅が可能となる。なお、ヘアピン構造を形成可能な増幅用配列を有するアダプターDNAを用いれば、第２の二本鎖DNA断片の末端はヘアピン構造を採ることができる。鎖置換型DNAポリメラーゼとしては、Phi29 DNA polymerase等の公知の鎖置換型DNAポリメラーゼを用いることができる。
【００４２】
本工程によれば、第２の二本鎖DNA断片の増幅産物を得ることができる。結果として増幅対象たるDNAを増幅することができる。
【００４３】
本増幅方法によれば、特定の態様のオーバーハングを形成可能な制限酵素を用いて増幅対象DNAを切断処理して得られる第１の二本鎖DNA断片を準備し、こうして得られたオーバーハングの塩基配列の多様性を利用する。すなわち、第１の二本鎖DNA断片と、オーバーハングの塩基配列の多様性に応じた連結用配列とより共通性のある増幅用配列とを有するアダプターDNAとを用いることで、効率的にかつ均一的にこれらをアニールさせかつ連結させることができる。この結果、より共通性を有して増幅に適した増幅用配列を有する第２の二本鎖DNA断片を容易に得ることができる。第２の二本鎖DNA断片を、その増幅用配列を利用して増幅することで、増幅対象であるDNAを容易に高効率で増幅することができる。したがって、本増幅方法によれば、例えば、１個から数個レベルの細胞由来のDNA等、少ないDNAから十分量のDNAを容易に得ることができる。
【００４４】
特に、増幅用配列の共通性を高めること、すなわち、増幅用配列の多様性を小さくすることで（最も好ましくは単一種類とする）で、準備するアダプターDNAの種類及びプライマーの種類を少なくして、より低コストで高効率な第２の二本鎖DNA断片の取得工程及び増幅工程を可能とする。
【００４５】
また、本増幅方法によれば、増幅対象DNAがゲノムなど長い場合に特に有効である。例えば、大腸菌は全長460万塩基対のゲノムDNAを持つが、TspRIの切断断片は約１万個となり、同じオーバーハングを持つ断片の数は２０個以上となる。これに対し、プラスミドの場合では同じオーバーハングを持つ断片の数は１個しかないことになる。すなわち、増幅対象DNAが長くなり、制限酵素による切断断片の数が増え、連結反応とPCRなどによる増幅の効率が高くなる。すなわち、切断断片の数が多くなると、ライゲーションの効率とPCRの効率が増える。つまり、得られる二本鎖DNA断片は、中央よりの配列と関係なく増幅するので、切断断片数が増えて二本鎖DNA断片、すなわち、末端の濃度が高くなると、増幅効率が向上することになる。
【００４６】
（DNAの増幅キット）
本明細書の開示のDNAの増幅キットは、DNAを５塩基以上の塩基長を有しかつ１以上の任意塩基部位含むオーバーハングを形成する１種又は２種以上の制限酵素と、前記オーバーハングの塩基配列に相補的な塩基配列を含む連結用配列と増幅のための共通の塩基配列を含む増幅用配列とを有する１種又は２種以上のアダプターDNAと、を含むことができる。こうしたキットによれば、本明細書の開示のDNAの増幅方法を容易に実施することができる。
【００４７】
本増幅キットにおける、制限酵素、第１の二本鎖DNA断片、アダプターDNA、第２の二本鎖DNA断片には、本明細書の開示のDNAの増幅方法に関し既に説明した態様の全てが適用される。したがって、制限酵素の種類によって、アダプターDNAの態様は種々変化することになる。
【００４８】
本増幅キットがPCR増幅を意図する場合、アダプターDNAは図１に示すように一本鎖DNAであってもよいが、同時に図１に示すように、少なくとも一部に二本鎖部分を有していてもよい。こうすることで、オーバーハングが短い場合であっても効率的に第１の二本鎖DNA断片と連結させることができる。アダプターDNAを、二本鎖DNA部分を有するようにするとき、二本鎖部分は、アダプターDNAにおいて、連結用配列をオーバーハング化できるように連結用配列に隣接するDNA鎖の部分に相補的な一本鎖DNAを組み合わせて構成することができる。
【００４９】
本増幅キットがPCR増幅を意図する場合、アダプターDNA中の共通性のある増幅用配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むことができる。こうすることでプライマーによるPCR工程に適した増幅キットを得ることができる。プライマーの種類は、アダプターDNA中に含まれる増幅用配列の多様性に依存する。アダプターDNAが増幅用配列に関して２種類準備される場合には、これら２種類の増幅用配列に対応した２種類のプライマーが準備される。アダプターDNAが単一種類の増幅用配列を有する場合には、単一種類のプライマーが準備される。さらに、この態様の増幅キットは、PCRに適したDNAポリメラーゼを含むこともできる。
【００５０】
本増幅キットが、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いた恒温増幅を意図する場合、アダプターDNAは、増幅用配列として、末端ヘアピン構造を形成可能な塩基配列を有するようにすることができる。こうしたアダプターDNAを用いて取得した第２の二本鎖DNA断片において、末端ヘアピン構造を形成させるとき、その３’末端から鎖置換型DNAポリメラーゼによる新生DNA鎖の合成が開始されることになる。さらに、この態様の増幅キットは、鎖置換型DNAポリメラーゼを含んでいてもよい。
【００５１】
本増幅キットにおいては、第１の二本鎖DNA断片とアダプターDNAとを連結するためのT4DNAリガーゼなどのDNAリガーゼを含んでいてもよい。
【００５２】
（DNAの検出方法）
本明細書の開示のDNAの検出方法は、既に説明した第１の二本鎖DNA断片の準備工程と、第２の二本鎖DNA断片の取得工程と、増幅工程と、に加えて、増幅工程での増幅産物の検出工程と、を備えることができる。本検出方法によれば、高効率によって増幅対象であるDNAを増幅でき、この増幅産物を用いて検出工程を実施できるため、結果として、高い感度で検出工程を実施できる。検出工程では、特に検出対象を限定するものではないが、増幅対象DNAに含まれる１種又は２種以上のターゲットDNAを検出することもできる。
【００５３】
本検出方法の検出工程における、増幅産物の検出方法は特に限定されない。一般的なDNAの検出方法である、電気泳動、増幅産物のプローブ（通常のプローブ他、モレキュラービーコン型プローブを含む）による検出等が挙げられる。プローブは例えば、アレイ等のように固相に結合されていてもよい。また、プローブは、蛍光等のシグナル物質によるシグナル化を伴うものであってもよい。また、こうした検出工程は、増幅工程後の増幅産物のみに対して行うことに限定するものではなく、増幅工程中の増幅産物に対してリアルタイムに実施することもできる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
本実施例では、プラスミド pQBI T7-GFP (5115 bp) を増幅対象DNAとして、制限酵素TspRIを用いて増幅した例である。このプラスミドの開示される塩基配列に基づけば、制限酵素TspRIにより切断すると、図３（ａ）に示すように、15本の切断断片を生成することがわかっている。断片の長さはそれぞれ1525、63、861、360、248、113、285、242、506、13、271、149、105、347、27塩基対であり、平均341bpとなる。
【００５６】
本実施例で用いるアダプターとプライマーの配列は以下の通りであった。アダプターの塩基配列中の各Nにつき、４種類の塩基全ての組み合わせでアダプターを合成した。
アダプター: 5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC- NNCAC(G)TGNN-3’  長さ31 nt（配列番号１）プライマー: 5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’  長さ22 nt（配列番号２）
【００５７】
各工程における主な反応条件は以下の通りとした。
（１）第１の二本鎖DNA断片準備工程
制限酵素TspRIによる切断：65℃、3 h （50 mM 酢酸ナトリウム, 20 mM Tris-酢酸、 10 mM Mg(OAc)2, ｐH7.9（25oC）、プラスミドDNAの濃度0.01pM -1 pM
（２）第２の二本鎖DNA断片取得工程
DNA T4 LigaseによるLigation：25℃, 16h (1 mM アダプターDNA, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, 1 mM ATP, 10 mM Dithiothreitol, pH 7.5（25℃)）
（３）増幅工程
Phusion DNA polymerase によるPCR：35 サイクル（98℃で10秒、60℃で30秒、72℃で45秒）（1 mM プライマー）
【００５８】
以上の条件で、各工程を実施し得られた増幅産物（DNA）を電気泳動により分析した。その結果を、図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）に示すように、0.1 pMという非常に低い濃度においても、DNAの増幅を確認することができた。さらに、10 fM（0.01 pM）までの増幅が確認された。
【実施例２】
【００５９】
本実施例では、E.coli K-12 (464万 bp)の全ゲノムを増幅対象DNAとして、制限酵素TspRIを用いて増幅した。開示される塩基配列に基づけば、制限酵素TspRIにより切断すると、10344箇所の切断箇所があり、平均して１箇所の切断箇所あたり、450 bpとなることがわかっている。この大腸菌をそのまま試料として用いる以外は、実施例１と同様にして各工程を実施した。なお、大腸菌はPCRの高温条件下で破砕されるため、破砕工程を省略した。結果を図４に示す。図４に示すように、数十個の大腸菌から得たDNAを増幅できることを確認できた（レーン１参照）。
【実施例３】
【００６０】
本実施例では、ヒトゲノムDNA (30億塩基対)を増幅対象DNAとして、制限酵素TspRIを用いて増幅した。ヒトの293FT細胞（ヒト癌化腎臓細胞）を破砕液の上清をそのまま試料として用いる以外は、実施例１と同様にして各工程を実施した。結果を図５に示す。図５に示すように、約１００個のヒト細胞（レーン１)、約１０個のヒト細胞（レーン２）及び約１個のヒト細胞（レーン３）からDNAを増幅できることを確認できた。この方法によれば、増幅対象DNAが長くなる場合は増幅効率が高くなることがわかった。すなわち、細胞１個からでも、十分な効率でDNAを増幅できることがわかった。
（配列表フリーテキスト）
配列番号１，２：合成ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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