(57)【要約】【課題】化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な、皮膚バリア機能向上作用を有する物質の簡便、且つ、確実なスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】皮膚バリア機能向上作用を有する物質の作用機序に着目し、細胞におけるＴＲＰＶ活性化作用、並びに、ＴＪ及びＡＪの形成促進作用の度合いの大小を指標とした、簡便、効率的、且つ、精度よく皮膚バリア機能向上作用を有する成分のスクリーニング方法を提供することにより、本課題を解決する。【選択図】図１
2011115152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の、ＴＲＰＶ受容体の活性化作用の程度を計測し、タイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用の程度を計測し、これらの作用の程度の大小を指標として、それらの作用の程度が共に、それぞれの対照に比べ、大であるものを選別することを特徴とする、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＴＲＰＶ受容体の活性化作用並びにタイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用の程度の計測が、ヒト由来の細胞を用いて計測するものであることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記タイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用が、表皮のタイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ＴＲＰＶ受容体が、表皮細胞に存するＴＲＰＶ受容体であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ＴＲＰＶ受容体が、ＴＲＰＶ４であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ＴＲＰＶ４の活性化作用の程度の計測が、細胞内カルシウムイオン濃度上昇の程度を計測するものであることを特徴とする、請求項５に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記細胞内カルシウムイオン濃度上昇の程度の計測が、ＴＲＰＶ４過剰発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇の程度を計測するものであることを特徴とする、請求項６に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法により皮膚バリア機能改善作用を有する物質としてスクリーニングされた、皮膚バリア機能向上成分を含有してなる皮膚バリア機能向上用の組成物。
【請求項９】
化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料原料として好適な、皮膚バリア機能を向上させる成分のスクリーニング方法、該皮膚バリア機能向上作用を有する化粧料原料を含有してなる、化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚には、熱や痛みなどの外部刺激を生体内に伝える働きに加え、水分の蒸散を防いだり、外部刺激や物理的刺激から体内を保護するバリア機能が存し、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。この様な皮膚機能は、温度、湿度、過度の摩擦、生活リズムの変調、ストレスなどにより低下することが知られており、前記原因により、皮膚の乾燥が進み、刺激に対し過敏になり、刺激を受け易くなる等の皮膚症状が生じる。さらに、この状態が進めば、体外からの細菌や有害物質の侵入による直接的な障害、アレルギー反応などが生じ、アトピー性皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹等の皮膚障害の発症に繋がる。また、皮膚は、人目に触れ、見た目の美しさに直接影響するため、多くの女性にとって大きな関心事である。肌状態を健康に保つことを目的とし、皮膚バリア機能改善剤（例えば、特許文献１を参照）、肌荒れ改善剤（例えば、特許文献２を参照）、セラミド合成促進剤（例えば、特許文献３を参照）等を含有する皮膚外用剤などの様々な試みがなされている。これらは何れもそれなりに効果を奏するものの、十分に満足のいく効果とは言い難く、複数の因子を処置することで初めて大きな肌荒れ改善効果を発揮する。このため、より確実に肌荒れ改善するために、ひとつの素材で複数の因子に作用する素材の開発が求められてきたとも言える。
【０００３】
１９８９年にショウジョウバエの光受容器異常変異株の原因遺伝子として同定された非選択性陽イオンチャネルのＴＲＰ（Transient receptor potential）チャネルは、アミノ酸配列の相同性により少なくとも９種類のサブファミリーに分類される。ＴＲＰチャネルに属する温度感受性受容体は、初めてＴＲＰＶ１（Transient receptor potential vaniloid 1）の分子実体が解明された後、現在に至るまでに、哺乳類においては、低温から高温までそれぞれの温度刺激により開口する９種類の温度感受性受容体（ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１）が報告されている。ＴＲＰＶ４は、当初、低浸透圧で活性化される浸透圧感受性受容体として発見され、感覚神経、視床下部、皮膚、腎臓、肺、内耳などの様々な組織に発現することが確認され、浸透圧刺激、機械刺激による痛みや炎症性の痛みの伝達に重要な役割を果たしていることが知られている。また、細胞膜貫通型のカルシウム流入チャネルとして機能するＴＲＰＶ４は、前記の物理的な刺激に加え、内在性カンナビノイド、アラキドン酸代謝物、４α−ＰＤＤ(4alpha-phorbol 12,13-didecanoate）などの化合物によっても活性化される。別の視点に立てば、ＴＲＰＶ４は、カルシウムイオン濃度を制御することで、種々の生理作用をコントロールしているとも言える。前述の通り、多様な組織に発現し、物理的又は化学的な刺激応答に関与するＴＲＰＶ４には、多くの生物活性と関係することが考えられ、実際に、刺激及び痛みの認識、自閉症をはじめとする神経疾患症状に深く関与することが知られている。さらに、ＴＲＰＶ４欠損マウスにおける体重増加、総脂肪量及び内臓脂肪量の有意な抑制作用（例えば、特許文献１を参照）等のエネルギー代謝関連の活性が報告されている。また、表皮細胞に存在するＴＲＰＶに関する研究により、ＴＲＰＶは、水分蒸散センサーとしての機能を有し、４α−ＰＤＤによる活性化により、水分蒸散を抑制すること、皮膚バリア機能を亢進することが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
【０００４】
タイトジャンクション（ＴＪ：Tight-junction）及びアドヘレンスジャンクション（Ａ
Ｊ：Adherens-junction）は、細胞の周囲にベルト状に存在し、隣り合った細胞同士を密着させることにより隙間を塞ぐと共に、連続的に細胞を繋ぎ止める細胞間接着構造体である。皮膚組織において、ＴＪは顆粒層の表皮細胞に存在しており、水や物質が細胞間隙を透過するのを防ぎ、皮膚バリア機能を維持するために重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献３を参照）。また、ＴＪには、前記の物理的機能に加え、ＴＪを介した、物質の移送調節に関わる生物活性、例えば、カルシウムイオン透過性を調節しイオン分布の均衡を保つことにより、表皮細胞の分化、成熟、更には、肌状態に影響を及ぼすことなどが知られている（例えば、非特許文献４参照）。言い換えれば、カルシウムイオンの細胞内分配が皮膚バリア機能の向上に重要な役割を果たしていると言える（例えば、特許文献４を参照）。また、ＡＪの正常な形成がＴＪの形成に重要な役割を果たすことも知られている。しかしながら、共に表皮細胞膜上に存在していながら、ＴＪ及びＡＪなどの細胞間接着構造体とＴＲＰＶの相互作用に関しては、これまで全く知られていなかった。このため、共に表皮に存在し相互作用を介し皮膚バリア機能向上作用を発現するＴＲＰＶ４活性化作用を有する成分、並びに、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用による皮膚バリア機能向上作用を有する成分、取り分け、ＴＲＰＶ４活性化作用を介するＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を有する成分のスクリーニング方法は、新たな作用機序を有する皮膚バリア機能改善剤として期待される物質を簡便にスクリーニングするために非常に有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−００１９１４号公報
【特許文献２】特開２００８−０４４８５７号公報
【特許文献３】特開２００６−２３２７６９号公報
【特許文献４】特開２００６−２５０７８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Denda M. et al., J. Invest. Dermatol, 127(3),654-659(2007)
【非特許文献２】Denda M., International Journal of Cosmetic Science, 31, 79-86(2009)
【非特許文献３】Kurasawa M. et al., Biochemical and Biophysical Reseach Communications, 381, 171-175(2009)
【非特許文献４】Maeda T. et al., 36th International Congress of Physiological Sciences, P1PM-16-8(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、この様な状況下において為されたものであり、化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な皮膚バリア機能向上作用を有する成分を見出し、化粧品や医薬部外品に応用すべく、皮膚バリア機能向上作用を有する物質の簡便、且つ、確実なスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この様な状況に鑑みて、本発明者等は、皮膚バリア機能向上作用を有する物質の作用機序に着目し、かかる作用を有する物質を簡便、効率的、且つ、精度よくスクリーニングする方法を求めて、鋭意、努力を重ねた結果、化粧品素材にＴＲＰＶ４活性化作用とＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用とを有する素材が存することを見出した。これをもとに、細胞におけるＴＲＰＶの活性化作用、並びに、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用の度合いの大小を指標とした簡便、効率的、且つ精度よく皮膚バリア機能向上作用を有する成分をスクリーニングする方法を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下に示す通りである。
＜１＞  被験物質の、ＴＲＰＶ受容体の活性化作用の程度を計測し、タイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用の程度を計測し、これらの作用の程度の大小を指標として、それらの作用の程度が共に、それぞれの対照に比べ、大であるものを選別することを特徴とする、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜２＞  前記ＴＲＰＶ受容体の活性化作用並びにタイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用の程度の計測が、ヒト由来の細胞を用いて計測するものであることを特徴とする、＜１＞に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜３＞  前記タイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用が、表皮のタイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進作用であることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜４＞  前記ＴＲＰＶ受容体が、表皮細胞に存するＴＲＰＶ受容体であることを特徴とする、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜５＞  前記ＴＲＰＶ受容体が、ＴＲＰＶ４であることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜６＞  前記ＴＲＰＶ４の活性化作用の程度の計測が、細胞内カルシウムイオン濃度上昇の程度を計測するものであることを特徴とする、＜５＞に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜７＞  前記細胞内カルシウムイオン濃度上昇の程度の計測が、ＴＲＰＶ４過剰発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇の程度を計測するものであることを特徴とする、＜６＞に記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法。
＜８＞  ＜１＞〜＜７＞の何れかに記載の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法により皮膚バリア機能改善作用を有する物質としてスクリーニングされた、皮膚バリア機能向上成分を含有してなる皮膚バリア機能向上用の組成物。
＜９＞  化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞  皮膚外用剤であることを特徴とする、＜８＞又は＜９＞に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、簡便、効率的、且つ、精度よく皮膚バリア機能向上作用を有する成分をスクリーニングする方法を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＴＥＲ値測定によるＴＲＰＶ４活性化物質（４α−ＰＤＤ）によるＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を示す図である。
【図２】ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量測定によるＴＲＰＶ４活性化物質（４α−ＰＤＤ）によるＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を示す図である。
【図３】ｓｉ−ＲＮＡトランスフェクションによるＴＲＰＶ４ノックダウン効率を示す図である。
【図４】ＴＲＰＶ４ノックダウンによる正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫｎ）の細胞間接着関連遺伝子の発現量を示す図である。
【図５】ＴＲＰＶ４ノックダウン細胞におけるＴＥＲ値の経時変化を示す図である。
【図６】ＴＲＰＶ４ノックダウン細胞におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量測定の結果を示す図である。
【図７】ＴＲＰＶ４とＡＪ関連タンパク質との免疫沈降及び免疫ブロットの結果を示す図（写真）である。
【図８】ＮＨＥＫにおける温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化による活性型Ｒｈｏ量の変化を示す図（写真）である。
【図９】ＮＨＥＫにおける温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化によるＡＪ関連タンパク質の局在への影響を示す図（写真）である。
【図１０】ＮＨＥＫにおける温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化によるＴＪ関連タンパク質の局在への影響を示す図（写真）である。
【図１１】ＮＨＥＫにおける温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化によるＴＥＲ値の経時変化への影響を示す図である。
【図１２】（Ａ）ヒト肌組織における温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化によるバリア機能回復率の経時変化への影響を示す図である。  （Ｂ）バリア破壊後のヒト肌組織における温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化によるビオチン透過性の変化を示す図（写真）である。
【図１３】本発明の植物抽出物のＴＥＲ値測定（ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用）の結果を示す図である。
【図１４】本発明の植物抽出物のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量測定（ＴＪ及び／又はＡＪの機能向上作用）の結果を示す図である。
【図１５】ＴＲＰＶ４発現細胞における４α−ＰＤＤの細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図１６】ＴＲＰＶ４発現細胞における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図１７】ＴＲＰＶ４発現細胞における本発明のオオバナサルスベリ抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図１８】Ｍｏｃｋ細胞における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図１９】Ｍｏｃｋ細胞における本発明のオオバナサルスベリ抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図２０】ＴＲＰＶ４発現細胞における細胞外カルシウムイオンフリー環境における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図２１】ＴＲＰＶ４発現細胞の細胞外カルシウムイオンフリー環境における本発明のオオバナサルスベリ抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【図２２】Ｍｏｃｋ細胞の細胞外カルシウムイオンフリー環境における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウム濃度の増加作用を示す図である。
【図２３】マウスＴＲＰＶ４発現細胞に対する細胞外カルシウムイオンフリー環境及びカルシウム存在環境におけるアセンヤクエキスの細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分のスクリーニング方法＞
本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分のスクリーニング方法は、被験物質の細胞におけるＴＲＰＶの活性化作用の程度を計測し、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用の程度を計測し、これらの作用の程度の大小を指標として、それらの作用の程度が共に、それぞれの対照に比べて、大であるものを選別することを特徴とする、肌荒れ改善のための皮膚外用剤に含有させるべき、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法である。かかるスクリーニング方法を実行し、皮膚バリア機能を向上せしめる成分をスクリーニングするためには、細胞におけるＴＲＰＶの活性化作用を計測し、ＴＲＰＶの活性化作用を有するものをスクリーニングし、次いで、ＴＲＰＶ活性化作用を有する成分について、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用の程度を計測し、両方の作用を有するもののみを選択し、本発明の化粧料素材とするか、その逆に、素材について、細胞におけるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を計測し、かかる効果を奏する素材をスクリーニングし、しかる後に、このスクリーニングで選択された素材について、ＴＲＰＶの活性化作用を計測し、この作用の存するものを選択するか、ひとつの素材に付いて、ＴＲＰＶの活性化作用と、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を同時に測定し、両方の作用を有する素材を選択することの何れかを実施することが好ましく例示出来る。以下に、詳細に説明を加える。
まず、ＴＪ及び／又はＡＪに関して述べる。皮膚のバリア機能は、角層に由来するものと、表皮顆粒層に由来するものの２種類に大別される。角層のバリア機能は、保湿と、外界からの様々な外的刺激から体内を保護するための機能である。一方、表皮顆粒層のバリア機能は、細胞間接着部位に存在し、細胞の接着を制御する蛋白質複合体である密着結合（ＴＪ：Tight-junction）、接着結合（ＡＪ：Adherens-junction）などの特別な細胞間接着構造体が、水、カルシウムイオン、薬物などの物質透過性を調節するための機能である。特に、ＴＪ及びＡＪは、カルシウムイオンの細胞内分配を介し、皮膚バリア機能向上に重要な役割を果たしている。このため、ＴＪ及び／又はＡＪ形成を促進させることが出来る物質には、皮膚バリア機能向上効果が期待される。一方、ＴＲＰチャネルには、低温から高温までそれぞれの温度刺激により開口する９種類の温度感受性受容体（ＴＲＰＶ1、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１）が知られている。特に、ＴＲＰＶ３及びＴＲＰＶ４は、皮膚や免疫系細胞に発現する温度刺激受容体（ＴＲＰＶ３は、３２℃以上、ＴＲＰＶ４は、２７℃以上）であり、皮膚においては、主に表皮細胞に存在している。また、ＴＲＰＶは、温度感受性カルシウムイオンチャネルの分子実体であり、細胞内カルシウム濃度を調整することにより、皮膚バリア機能に深く関与すると考えられる。さらに、本願発明者により、ＴＲＰＶ４の活性化作用を介し、ＴＪ及びＡＪの形成が促進されることが明らかにされた。このため、ＴＪ又はＡＪなどの細胞間接着構造体とＴＲＰＶ（特に、ＴＲＰＶ４）には、相互作用により相加又は相乗的な皮膚バリア機能の向上が期待される。
【００１２】
本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分のスクリーニング方法におけるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用をスクリーニングする方法としては、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を評価することが出来る評価方法であれば、特段の限定なく適応することが出来るが、特に、表皮におけるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を有する成分のスクリーニング方法であることが好ましい。
本発明におけるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を有する成分とは、直接的又は間接的にＴＪ及び／又はＡＪなどの細胞間接着構造体に働きかけ、ＴＪ及び／又はＡＪ形成を促進させる成分であれば、特段の限定なく適応することが出来る。ＴＪ及びＡＪ形成促進作用を評価する方法としては、例えば、非特許文献３に記載された３次元表皮モデル又は生体皮膚を用いたビオチン標識拡散トレーサーによる細胞間物質移動確認法、培養細胞シートを用いたＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ細胞間物質透過試験法、フリーズフラクチャー法によるＴＪストランド観察によるストランドの出来具合で機能を類推する方法、更には、特開２００７−１７４９３１号公報に記載の経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ：transepitherial electrical resistance）を測定する方法等が例示出来るが、操作の簡便性や測定精度等の面から、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過性試験法、経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ値）を測定する方法が好適に例示出来る。
【００１３】
かかるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用の評価方法によれば、支持体上で構築した表皮角化細胞層における細胞間物質移動の程度を、細胞間物質透過性又は経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ値）の測定などにより確認し、細胞間物質移動の程度が、被験物質非存在下（対照）に比して、被験物質存在下で抑制された場合、又はＴＥＲが被験物質非存在下（対照）に比して、被験物質存在下で増加した場合、表皮角化細胞層のＴＪ及び／又はＡＪが緻密に構築されていると判断され、これによってin vivoの皮膚に適用した場合には、角層又は表皮顆粒層の物質透過抑制作用が向上し、以って、皮膚バリア機能が向上されると判定される。
【００１４】
本発明における表皮角化細胞層とは、カルシウムイオンを０．０４〜０．２ｍＭ程度含有する液体培地で表皮角化細胞を支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ程度含有する液体培地で培養（カルシウムイオンスイッチ）し得られることを特徴とする。
【００１５】
前記表皮角化細胞層形成に用いる表皮角化細胞としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、マウス、ブタ、ラットなどの異種の動物の細胞でも使用可能であるが、ヒトの皮膚へ適用を目的としていることから、ヒトの細胞を用いるのが好ましい。動物の表皮角化細胞を用いる場合には、動物より表皮角化細胞を採取し、常法に従って処理して用いることもできるし、既に市販されているものを購入して利用することもできる。ヒトの細胞としては、多くのメーカーより正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ：Normal Human Epidermal Keratinocytes）が、市販されており、これらを購入して使用することができ、好ましい。
【００１６】
かかる表皮角化細胞を培養すべきカルシウムイオンを０．０４ｍＭ〜０．２ｍＭ程度含有する液体培地としては、表皮角化細胞培養用の市販の培地を用いることができ、例えば、０．１５ｍＭのカルシウムイオンを含有する液体培地である、「Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２」（倉敷紡績株式会社製）が好適に例示できる。かかる培地を用いて、支持体の存在下表皮角化細胞を２.５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2程度播種し、３５〜４０℃で５％二酸化炭素気流下で２４〜９６時間程度培養することにより、支持体にコンフルエントな状態で細胞層が形成される。ここで、コンフルエントな状態としては、支持体の表面全体に少なくとも一層の細胞が存在し、部分的には、多くとも３層程度の積層でとどまっている状態を意味する。又、前記支持体としては、この様な細胞層の構築に使用される支持体であれば特段の限定はなく、０．１〜１２μｍ程度の微細孔が存在する膜が好ましく例示できる。この様な細胞層の構築のための支持体は既に市販されているものが存し、かかる市販品を購入して使用することができる。例えば、コーニング社やミリポア社より、ポリエチレンテレスタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトラフルオロエチレン製の膜が市販されているので、これらを購入して使用することができ、好ましい。これらの中では、コーニング社製「トランズウェル」（０．４μｍポアを有するポリエチレンテレフタレート膜）が好ましく例示できる。又、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ程度含有する液体培地としては、前記「Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２」に適宜塩化カルシウムなどのカルシウム塩を添加して調製し、用いることができる。かかる液体培地中で前記支持体上にコンフルエントとなって構築された表皮角化細胞層を３５〜４０℃で５％二酸化炭素気流下で２４〜９６時間程度培養することにより細胞分化が促進され、ＴＪ構造を有する細胞層とすることができる。これに被験物質を加えて更に同条件で十分な差が生じるまで２４〜９６時間程度培養し、被験物質を加えないで培養を続けたものとの細胞層の透過性あるいはＴＥＲ値の差を見ることにより、被験物質の表皮角化細胞層への影響を知ることができる。透過性の差は以下のスクリーニング法で述べるようにスクリーニングできる。
【００１７】
本発明の皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法におけるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用は、例えば、前記の支持体上に構築された表皮角化細胞層で隔された二室中の一室に、被験物質で処理後或いは被験物質と同時に標識物質を培地などとともに充填し、標識物質の他室への移動がどの程度被験物質の存在下で抑制されるかを指標に評価される。ここで、標識物質としては、その移動が明確に検知できるものであればその種類を問わず、電位差、電導度、電気抵抗の変化などでその移動が把握できるイオン性物質、吸光度や蛍光強度でその移動が把握できる蛍光標識物質や色剤などが例示できる。特に好ましいものとしてはイオン性物質が例示できる。かかるイオン性物質は培地に含有されているものでも良く、この場合は被験物質と標識物質の同時投与となり、かかるイオン性物質の移動の程度は細胞層の電気抵抗値を測定することによりスクリーニングできる。蛍光標識物質としては、蛍光標識デキストランなどが例示でき、添加後更にインキュベーションをして蛍光強度の変化を見ることが好ましい。
【００１８】
かかるスクリーニングにおいて、標識物質の細胞間移動が、被験物質の存在下での表皮角化細胞層形成において抑制された場合、表皮角化細胞層のＴＪ及び／又はＡＪ構築が緻
密にされていると判断され、これによってin vivoの皮膚に適用した場合には、角層若しくは表皮顆粒層の物質透過抑制効果が向上し、以って、皮膚バリア機能が向上されると判定される。従って、この様な被験物質は、皮膚に塗布すれば皮膚バリア機能を向上させる素材であると判別される。この有効性は、前記標識物質の細胞間移動において、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下では、好ましくは１０％以上の移動抑制が観測された場合に有効と判別される。又、その抑制の程度が著しいほど、皮膚バリア機能の向上作用は著しいと判別される。
【００１９】
本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分のスクリーニング方法におけるＴＲＰＶの活性化作用の評価方法としては、ＴＲＰＶの活性化作用が評価可能な方法であれば、特段の限定なく適応することが出来るが、特に、細胞内カルシウムイオン濃度を指標としたＴＲＰＶの活性化作用の評価方法が好ましい。また、前記ＴＲＰＶの活性化作用の評価方法の内、ＴＲＰＶ４の活性化作用を評価する方法が好ましい。これは、ＴＲＰＶ４が、表皮細胞に存することが確認されており、皮膚バリア機能への関与が期待されるためである。前記ＴＲＰＶの活性化作用を評価する方法の内、さらに好ましいものとしては、ＴＲＰＶ４の発現が確認された細胞、より好ましくは、ＴＲＰＶ４を過剰発現した細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を指標としてＴＲＰＶ４の活性化作用を判別する方法が好ましい。ＴＲＰＶ４の活性化作用を判別するための指標となる細胞内カルシウムイオン濃度を測定する方法としては、細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する方法であれば特段の限定なく適応することが出来るが、操作の簡便性、測定感度及び精度などの面から、例えば、Sokabe T, Tsujiuchi S, Kadowaki T, Tominaga M.: Drosophila painless is a Ca2+-requiring channel activated by noxious heat.: J Neurosci.， 2008 Oct 1;28（40）:9929-38などに記載のカルシウムイメージング法又はパッチクランプ法が好ましい。
かかるＴＲＰＶの活性化作用の評価方法によれば、ＴＲＰＶ４の発現が確認された細胞、又はＴＲＰＶ４を過剰発現した細胞における細胞内カルシウムイオン濃度をカルシウムイメージング法又はパッチクランプ法などにより確認し、細胞内カルシウムイオン濃度の程度が、被験物質非存在下（対照）に比して、被験物質存在下で増加した場合、ＴＲＰＶの機能が活性化されていると判断され、これによってin vivoの皮膚に適用した場合には、角層又は表皮顆粒層のＴＲＰＶのカルシウムイオン透過作用が促進され、以って、皮膚バリア機能が向上されると判定される。この有効性は、前記細胞内カルシウムイオン濃度において、被験物質の非存在下では全く増加が認められないのに比して、被験物質の存在下では、好ましくはイオノマイシン等の陽性対照に比べ、２０％以上の濃度の増加、さらに好ましくは３０％以上の濃度の増加が観測された場合に有効と判別される。又、その抑制の程度が著しいほど、皮膚バリア機能の向上作用は著しいと判別される。
なお、イオノマイシン等の陽性対照に対する、被験物質による細胞内カルシウムイオン濃度の増加率は、被験物質の添加により細胞内カルシウムイオン濃度が増加した細胞を無作為に３ないしは５個選択し、各々被験物質添加後のカルシウムイオン濃度から初期値、即ち添加前のカルシウムイオン濃度を減じて被験物質によるカルシウムイオン濃度増加量を算出し、引き続きイオノマイシン等の陽性対照添加後のカルシウムイオン濃度から初期値、即ち添加前のカルシウムイオンの濃度を減じて陽性対照によるカルシウムイオン濃度増加量を算出し、被験物質によるカルシウムイオン濃度増加量を陽性対照によるカルシウムイオン濃度増加量で除し、さらに１００を乗じた数字の平均値として算出される。
【００２０】
本発明のＴＲＰＶ活性化作用を有する成分を評価するために用いる細胞としては、ＴＲＰＶ発現が確認されている細胞であれば、特段の限定なく適用することが出来るが、測定感度及び精度の面から、ＴＲＰＶ過剰発現細胞を使用することがより好ましい。特に、ＴＲＰＶ１過剰発現細胞の作製に関しては、例えば、特開２００９−０８２０５３号公報に記載の方法に従い、また、ＴＲＰＶ４過剰発現細胞の作製に関しては、前記方法を基に、後記の方法によりＴＲＰＶ４過剰発現細胞を作製することが出来る。
【００２１】
本発明におけるＴＲＰＶ４活性化作用の評価に使用するＴＲＰＶ４の発現が確認されている細胞に関しては、ＴＲＰＶ４を発現している細胞であれば特段の限定なく適用出来、より好ましいものとしては、ＴＲＰＶ４発現ベクターを宿主細胞に導入することによりＴＲＰＶ４を過剰発現させた細胞が好ましい。また、ＴＲＰＶ４を過剰発現させる宿主細胞としては、細菌の細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等が好適に例示出来る。前記宿主細胞としては、ＴＲＰＶ４発現ベクターを取り込み、効率的にＴＲＰＶ４が発現され、且つ、培養が容易であることが好ましい。また、ＴＲＰＶ４発現ベクターの作製においては、ＴＲＰＶ４をコードするｃＤＮＡであれば特段の限定なく使用することが出来、より好ましいものとしては、哺乳動物細胞用ベクターであるｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）にＴＲＰＶ４をコードした核酸をライゲートしたものが好適に例示出来る。前記ＴＲＰＶ４をコードした核酸としては、全ての塩基配列をコードしたものを、例えば、ｍＲＮＡを抽出し、これに逆転写酵素を作用させｃＤＮＡとしたものを使用することも出来るし、ＴＲＰＶ４主要機能をコードした部分のみを適切なプライマーを選択し、ＰＣＲにより増幅させて、これを用いてライゲートすることも出来る。特に好ましいものとしては、配列番号１（配列表１）に示すオリゴヌクレオチドが例示出来、かかる配列のオリゴヌクレオチドは、配列番号２（配列表２）と配列番号３（配列表３）のプライマーを用いて抽出されたＤＮＡ或いは、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応に付すことにより、得ることができる。
【００２２】
本発明のＴＲＰＶ活性化作用の評価に使用することが出来る前記ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞は、当該細胞におけるＴＲＰＶ４の機能発現、蛋白質レベルでの発現、蛍光物質の共導入などを指標とし、選択することが出来る。前記ＴＲＰＶ４をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞の選択には、適切な選択培地を用いることが出来る。例えば、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ培地にＦＢＳ等の増殖因子を加えたものなどが好適に例示出来る。
【００２３】
前記ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳなど）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを成分とする培地であればよい。前記培地は、市販されている培地であってもよい。前記ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞の培養に用いられる培地としては、かかる細胞に適した培地であればよく、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。例えば、用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、高グルコース及び１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００２４】
本発明におけるＴＲＰＶ４活性化作用、並びに、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を有する物質は、それぞれの標的分子であるＴＲＰＶ４、並びに、ＴＪ及び／又はＡＪに共に作用することにより、相加又は相乗的な皮膚バリア機能向上作用を発現する。さらに、ＴＲＰＶ４と細胞間接着構造体のＴＪ及び／ＡＪは、相互作用することにより、言い換えれば、ＴＲＰＶ４に作用することによりＴＪ及び／又はＡＪの形成が促され、皮膚バリア機能向上作用が発揮されることにより、更なる皮膚バリア機能の向上が期待される。本発明におけるＴＲＰＶ（特に、ＴＲＰＶ４）と細胞間接着構造体のＴＪ及び／又はＡＪとの皮膚バリア機能向上に関する相互作用は、以下の試験結果（試験例１〜６）により確認される。即ち、ＴＲＰＶ４リガンドである４α−ＰＤＤによるＴＲＰＶ４活性化により、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進が確認された。即ち、ＴＲＰＶ４活性化作用を有する成分は、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進により皮膚バリア機能向上作用を奏しているということが出来る。
【００２５】
＜本発明のＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用、並びに、ＴＲＰＶ活性化作用を有する皮膚バリア機能向上作用を有する成分＞
本発明の主題となる皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法は、皮膚バリア機能向上作用を有する成分を選択する際に、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用、並びに、ＴＲＰＶ活性化作用の度合いの大小を指標とし、これらの作用の程度が共に、それぞれの対照に比べ、大であるものを選択することを特徴とする。前記のスクリーニング方法により選択される皮膚バリア機能向上成分としては、単純な化学物質、植物及び動植物からの抽出物とその分画精製物などの混合組成物の総称を意味する。また、本発明の皮膚バリア機能向上成分は、表皮に存在するＴＲＰＶ４と細胞間接着構造体のＴＪ及びＡＪに作用することにより、細胞内カルシウムイオン濃度を調整することにより皮膚バリア機能向上作用を発揮する。さらに、ＴＲＰＶ４の活性化作用を介し、ＴＪ及びＡＪの形成が促進することにより、相加又は相乗的な皮膚バリア機能の向上が期待される。同成分は、ＴＲＰＶ４の活性化作用を介したＴＪ及びＡＪの形成促進作用に加え、さらに、他のメカニズムによりＴＪ及びＡＪの形成促進作用を有するものであってもよい。
【００２６】
ここで、本発明におけるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用の程度を測定し、この作用の度合いが大きいものとして選別される成分としては、前記のＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用評価系（ＴＥＲ値測定、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験）においてＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を示す成分であれば、特段の限定なく適用出来る。前記ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を有する物質とは、具体的には、「ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験」においては、被験物質の存在下、被験物質の非存在下に比して、好ましくは１０％以上の細胞間物質透過作用を有する物質を意味し、或いは、「経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ値）測定試験」においては、被験物質存在下では、被験物質の非存在下に比して、ＴＥＲ値が、好ましくは１０％以上増加する作用を有する物質を意味する。これらの評価方法の何れかにおいて前記作用が認められれば、ＴＪ及びＡＪの形成促進作用を有する成分であると言うことが出来る。また、前記評価方法は、単独で使用することも出来るし、併用することも出来る。
【００２７】
また、本発明におけるＴＲＰＶ活性化作用の程度を測定し、この作用の度合いが大きいものとして選別される成分としては、ＴＲＰＶ活性化作用評価において活性を示す成分であれば、特段の限定なく適応することが出来る。ＴＲＰＶ活性化作用評価系としては、例えば、ＴＲＰＶ４過剰発現細胞を用いたカルシウムイメージング法、パッチクランプ法などのＴＲＰＶ活性化作用評価系などが好適に例示出来る。これらの内、好ましいものとしては、後述するＴＲＰＶ４活性化作用評価系の細胞内カルシウムイオン濃度を指標としたカルシウムイメージング法が好適に例示出来る。本発明のＴＲＰＶ活性化作用を有する成分としては、特に、後記の「ＴＲＰＶ活性化作用評価１：本発明における植物抽出物のカルシウムイメージング法によるＴＲＰＶ４活性化作用評価」においてＴＲＰＶ活性化作用を有する成分が好ましい。当該評価系においてＴＲＰＶ活性化作用を有する物質とは、ＴＲＰＶ４を発現する細胞において特異的に細胞外から細胞内へのカルシウムイオン流入を促進させる物質のことであり、好ましくは、その作用が４α−ＰＤＤと同等若しくはそれ以上の作用を有する物質を意味する。前記ＴＲＰＶ活性化作用に関する評価方法は、単独で使用することも出来るし、併用することも出来る。
【００２８】
かかるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用、並びに、ＴＲＰＶ活性化作用の程度を測定し、これらの作用が共に大であるものとして選別された皮膚バリア機能向上成分は、皮膚バリア機能の低下による様々な症状及び疾患の治療又は予防に好適に用いられる。また、その投与経路は問わないが、病巣に近接して投与する方法が好適に例示出来、特に、経皮投与が好ましい。前記疾患としては、肌荒れ、炎症、アトピー性皮膚炎等が好適に例示出来る。
【００２９】
この様なＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用、並びに、ＴＲＰＶ活性化作用の程度を測定し、これらの作用が共に大であると選別された皮膚バリア機能向上作用を有する成分としては、ミソハギ科サルスベリ属、アカネ科カギカズラ属に属する植物より得られる抽出物が好適に例示出来、さらに好ましくは、ミツハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビールより得られる抽出物が好適に例示出来る。前記植物の抽出物作製に用いる部位としては、植物体、花、葉、枝、根、果実、樹皮、地上部、木幹等が好適に例示出来る。ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリは、熱帯アジア原産の常緑小高木であり、日本においては、沖縄及び九州などで多く栽培されている。また、オオバナサルスベリの葉は糖尿病薬に用いるほか、葉は乾燥させることによりバナバ茶を製造し、漢方、サプリメント等として使用されている。アカネ科カギカズラ属ガンビールは、マラッカ海峡沿岸地方を原産とする植物である。ガンビールの葉より得られる乾燥水製エキスをアセンヤク（阿仙薬）と呼び、抗線溶活性作用、抗血栓作用、抗腫瘍作用などが知られている。本発明における前記の植物より得られる抽出物は、日本に於いて自生又は生育された植物、漢方生薬原料などとして販売される日本産のものを用い抽出物を作製することも出来るし、丸善株式会社などの植物抽出物を扱う会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することも出来る。抽出に際し、植物体、地上部又は木幹部は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物は、植物体、地上部乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することが出来る。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィーなどで分画精製し、所望の抽出物を得ることが出来る。尚、本発明においては、抽出物とは、抽出物自体、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。かかる成分の組成物における好ましい含有量は、０．０００００１〜２０質量％、より好ましくは、０．００００１質量％〜１０質量％であり、さらに好ましくは、０．０００１質量％〜５質量％である。これは、あまり濃すぎると効果が頭打ちになる場合があり、少なすぎると有効濃度とならない場合があるからである。
【００３０】
前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示出来る。
【００３１】
＜本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分を含有する組成物＞
本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分を含有する組成物は、細胞におけるＴＲＰＶ活性化作用の程度を計測し、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用の程度を計測し、これらの作用の度合いの大小を指標として、それらの作用の程度が共に、それぞれの対照に比べ、大であるものとしてスクリーニングされた、皮膚バリア機能向上成分を含有することを特徴とする。
【００３２】
前記皮膚バリア機能向上作用を有する成分の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤
、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤類、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。
【００３３】
本発明の皮膚バリア機能の向上作用を有する成分を含有する組成物としては、医薬品、化粧品、食品、飲料などが好適に例示出来、日常的に摂取出来ることから、食品、化粧品などに適用することが好ましい。その投与経路も、経口投与、経皮投与の何れもが可能であり、皮膚バリア機能の向上の目的では、関連臓器への到達効率のよい経皮投与を採用し、化粧品や皮膚外用医薬などの経皮組成物の形態を採用することが好ましい。勿論、経口投与などにより、有効成分を標的臓器である皮膚に到達させることも可能であり、食品などの経口投与剤系も疎外されるものではない。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例を挙げ、本発明に関し更に詳細に説明を加えるが、本発明は、かかる実施例にのみ限定を受けないことは、言うまでもない。
【００３５】
＜試験例１：ＴＥＲ値測定試験＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭカルシウムイオン含有培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２：倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて培養した。Millicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にトランズウェル（コーニング社製、３４６０−Ｃｌｅａｒ）をセットし、上層０．５ｍＬ、下層１．５ｍＬの前記培養液を入れ、前記トランズウェル上層に前記ＮＨＥＫを２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて２４時間培養した。前記ＮＨＥＫがコンフルエントまで増殖したことを確認し、１．５ｍＭ塩化カルシウムを含有したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、３３℃、５％二酸化炭素気流下にて２４〜７２時間培養して、表皮角化細胞層を構築した。その後、１０μＭ  ４α−ＰＤＤ（シグマ社製）、３mＭ  Ｃａｍｐｈｏｒ（カンファー、シグマ社製）又はメタノール（ベヒクル、和光純薬株式会社製）を添加した１．５ｍＭ塩化カルシウム含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、ＴＲＰＶ４／ＴＲＰＶ３活性化温度閾値以下である２４℃〜２８℃、５％二酸化炭素気流下にて培養した。各物質を含有する培地に交換後、０、３、６、９時間後にＴＥＲ値を測定した。ＴＥＲ値は、サンプルをクリーンベンチ内で３０分間馴化した後、Millicell ERS（ミリポア社製）を用いて測定を行った。結果を図１に示す。
【００３６】
皮膚バリア機能に深く関与する表皮においては、ＴＲＰＶ３及びＴＲＰＶ４の特異的な発現が確認されている。図１の結果より、ＴＲＰＶ４不活性温度領域において、ＴＲＰＶ４リガンドである４α−ＰＤＤ存在下で培養したＮＨＥＫは、非存在下で培養したＮＨＥＫに比して、統計的に有意なＴＥＲ値の上昇が確認された。一方、ＴＲＰＶ３リガンドの
カンファー存在下で培養したＮＨＥＫにおいては、非存在下に比して、ＴＥＲ値の上昇は認められなかった。ＴＥＲ値の上昇、即ち、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進による皮膚バリア機能向上作用は、ＴＲＰＶ４の特異的な活性化により発揮されることが示された。
【００３７】
＜試験例２：ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験＞
前記のＴＥＲ値測定試験において、測定に使用した培地交換後６時間後のサンプルの培地を除去した。前記トランズウェル上層に０．５ｍＬのＡｐｉｃａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（１．４５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、１ｍｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを含有するＰＢＳ）、下層に１．５ｍＬのＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ  Ｂｕｆｅｒ（１．４５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコースを含有するＰＢＳ）を添加し、３時間培養した。Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  Ｂｕｆｆｅｒを回収した後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＡｐｉｃａｌ  Ｂｕｆｆｅｒにより標準曲線群（１００ｍｇ／ｍＬ〜０ｍｇ／ｍＬ）を作製する。回収したＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ  Ｂｕｆｆｅｒを９６ｗｅｌｌに２００ｍＬずつ添加した後、分光光度計（励起４８５／５３５ｎｍ）にて測定した。結果を図２に示す。
【００３８】
図２の結果より、ＴＲＰＶ４活性化温度閾値以下において、ＴＲＰＶ４リガンドである４α−ＰＤＤ存在下で培養したＮＨＥＫは、非存在下で培養したＮＨＥＫに比して、統計的に有意なＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量の抑制が確認された。一方、ＴＲＰＶ３リガンドのカンファー存在下においては、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量の抑制は認められなかった。ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量の抑制、即ち、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進による皮膚バリア機能向上作用は、ＴＲＰＶ４の特異的な活性化により発揮されることが示された。
【００３９】
＜試験例３：ｓｉ−ＲＮＡ  トランスフェクション試験＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、サブコンフルエントになるまで培養した後、トリプシンＥＤＴＡにより剥離、回収し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに７．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて２時間培養した。また、以下の手順に従い、ｓｉ−ＲＮＡトランスフェクション（ｖｏｌｕｍｅは１ｗｅｌｌ分で記載）を行った。５００μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭに、５μＬの１０μＭ  ｓｉＲＮＡを加え、次に１５μＬのＨｉｐｅｒＦｅｃｔを加えてボルテックスにより混合した後、室温で１０分間静置した。ウェルに滴下し緩やかに拡散させた後、３７℃  ５％二酸化炭素気流下で２４時間培養した後、１．５ｍＭ塩化カルシウム含有（＋）−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地培地に交換し、経時的にＴＥＲ値及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過性を測定した。また、ｓｉ−ＲＮＡによるＴＲＰＶ４ノックダウン効率は、Hs TRPV4 1 SG QuantiTect Primer Assay（Qiagen社製: QT00077217、配列非公開）をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＴＲＰＶ４  ｍＲＮＡ発現量を求め、これにより確認した。結果を図３〜図６に示す。尚、ｓｉ−ＲＮＡは市販のデザイン済みsi−RNA ON−TARGET plus SMART pool Human TRPV4（Thermo scientific社製）を使用した。
【００４０】
図３及び図４の結果より、ＮＨＥＫにおけるｓｉ−ＲＮＡトランスフェクションにより、極めて高いノックダウン効率でＴＲＰＶ４  ｍＲＮＡの発現を抑制し、その抑制作用は、ＴＲＰＶ４に特異的であった。また、図５及び図６の結果により、コントロールｓｉ−ＲＮＡをトランスフェクションしたＮＨＥＫ（Ｍｏｃｋ）に比して、ＴＲＰＶ４をノックダウンしたＮＨＥＫ（ＴＲＰＶ４／ＫＤ）は、統計学的に有意なＴＥＲ値の抑制が確認された。さらに、ＴＲＰＶ４／ＫＤは、統計学的に有意なＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過性の増加が確認された。
【００４１】
＜試験例４：ヒト正常表皮角化細胞におけるＴＲＰＶ４の発現＞
ヒト正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）における、ＴＲＰＶ４タンパク質及びＴＲＰＶ４結合分子の存在を確認するために、免疫沈降を行った。抗体は、ポリＡｂ抗β−カテニン（ケミコン社製）、ｍＡｂ抗Ｅ−カドヘリン（タカラバイオ社製）及びポリＡｂ抗ＴＲＰＶ４（ＴＲＰＶ４のＮ末端ペプチドに対して、調製した）を用いた。
結果を図７に示す。左レーンは、ＮＨＥＫの膜画分を、抗β−カテニン抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）し、得られたコンプレックスのサンプルを分離し、抗Ｎ末端ＴＲＰＶ４抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）したものである。黒三角は、β−カテニンと共沈降したＴＲＰＶ４の位置を示す。右レーンは、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いて再ブロットしたものである。黒三角は、Ｅ−カドヘリンを示す。すなわちＴＲＰＶ４は、細胞膜に存在するβ−カテニンおよびＥ−カドヘリンと共免疫沈降された。β−カテニン及びＥ−カドヘリンはＡＪの主要構成タンパク質であることから、ＴＲＰＶ４が、ヒト角化細胞中にＡＪコンプレックスの一部として存在することが示唆された。
【００４２】
＜試験例５：温度変化及びＴＲＰＶ４活性化のヒト正常表皮角化細胞における分化過程への影響＞
ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーは、表皮角化細胞の分化において、重要な役割を果たすことが報告されている。Ｒｈｏファミリーは、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加により活性化され、アクチン形成、細胞間接着形成及び表層アクチン形成を含む角化細胞の分化を仲介する。ＴＲＰイオンチャネルは活性化すると、細胞外から細胞内へカルシウムイオンを流入させ、細胞内カルシウムイオン濃度の増加を促す。そこで、ＴＲＰＶ３及びＴＲＰＶ４が活性化される３３℃、並びに活性化温度閾値以下の２８℃で培養したＮＨＥＫ中における、活性型Ｒｈｏの発現量を評価した。
カルシウムイオンスイッチによる分化誘導後、ＮＨＥＫを３３℃又は２８℃で２４時間培養した。その後、２８℃で培養したＮＨＥＫを、１０μＭの４α−ＰＤＤ又は３ｍＭのカンファーで処理し、８時間培養した。これらの各々のＮＨＥＫについて活性型Ｒｈｏの発現量を免疫沈降法およびウェスタンブロッティング法を用いて評価した。
結果を図８に示す。活性型Ｒｈｏの発現量を上部パネルに示す。１５μgの全タンパク質を投入量としてロードした（下部パネル）。
２８℃で培養したＮＨＥＫの活性型Ｒｈｏの発現は、３３℃で培養したＮＨＥＫの活性型Ｒｈｏの発現よりも低かった。２８℃における活性型Ｒｈｏの発現量は、ＴＲＰＶ４活性化物質である４α−ＰＤＤの添加により、顕著に増加したが、ＴＲＰＶ３活性化物質であるカンファーによっては、増加しなかった。
これは、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４の活性化温度閾値以下ではＲｈｏ活性の増強には不十分であるが、ＴＲＰＶ４の化学的活性化によって特異的に補われることを示しており、ＴＲＰＶ４が仲介する細胞内カルシウムイオン流入がＲｈｏの活性化に関与することが示唆された。
【００４３】
次に、３３℃又は２８℃で培養、もしくは２８℃でＴＲＰＶ４およびＴＲＰＶ３を化学的に活性化したＮＨＥＫにおけるＡＪ及びＴＪ関連タンパク質（Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、アクチン及びオクルディン）の局在を比較するために、免疫蛍光染色を行った。
結果を図９に示す。カルシウムイオンスイッチによる分化誘導後、ＮＨＥＫを３３℃又は２８℃で２４時間培養した。その後、２８℃で培養したＮＨＥＫを、１０μＭの４α−ＰＤＤ又は３ｍＭのカンファーで処理した。これらのＮＨＥＫの細胞間接着形成過程をタイムコース（０−４８時間）で確認した。細胞膜周辺を取り囲むアクチン（原図では緑）、細胞間接着部に存在するβ−カテニン（原図では紫）及びＥ−カドヘリン（原図では赤）を、拡大イメージで示す。白矢印は、β−カテニン及びＥ−カドヘリンからなるＡＪの“ジッパー構造”を示す。）
カルシウムイオンスイッチによる分化誘導から４時間後、３３℃および２８℃で培養したＮＨＥＫは共に、ＡＪ関連タンパク質であるβ−カテニンとＥ−カドヘリンが細胞膜辺
縁部に沿って局在し、特徴的な“ジッパー構造"を示し、初期の細胞間接着は、培養温度に関係なく形成されることが示唆された。３３℃における２４及び４８時間後、細胞は互いに層をなし、周囲の表層アクチンは、明らかにハニカム様ネットワークを示した。対して、２８℃における細胞間接着は、２４及び４８時間後であっても、初期の形成段階のままであった。この未成熟な分化は、４α−ＰＤＤの添加により回復したが、カンファーでは回復されなかった。
【００４４】
さらに、カルシウムイオンスイッチによる分化誘導から４８時間後、ＴＪ関連タンパク質であるオクルディンの免疫蛍光染色を行い、その局在を確認した。抗体は、ｍＡｂ抗オクルディン（インビトロジェン社製）を用いた。
結果を図１０に示す。ＴＪ関連タンパク質の一つであるオクルディンは、分化誘導から４８時間後において、３３℃で培養したＮＨＥＫでは連続して細胞間接着部に沿って局在（原図では赤）したのに対し、２８℃においてはオクルディンの細胞間接着部における局在は断続的であった。また、ＡＪ関連タンパク質の場合と同様に、２８℃においてオクルディンは、４α−ＰＤＤにより連続的に局在したが、カンファーでは局在しなかった。
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＡＪおよびＴＪ関連ｍＲＮＡの発現レベルを確認したところ、４α−ＰＤＤの添加によるこれらのｍＲＮＡの発現量変化は確認されなかった。
これらの結果から、ＴＲＰＶ４活性化はＡＪおよびＴＪ関連分子の発現量に関与するのではなく、ヒト正常表皮角化細胞の分化過程におけるＡＪの構造形成を促し、結果としてＴＪ形成を促進することが示唆された。
【００４５】
＜試験例６：温度変化及びＴＲＰＶ４活性化によるヒト角化細胞及びヒト皮膚組織におけるバリア機能への影響＞
皮膚におけるバリア機能は、大きく角層バリア機能と表皮細胞間（ＴＪ）バリア機能に大別される。本検討では、ＮＨＥＫのＴＪバリア機能が、温度及びＴＲＰＶ４活性化により影響を受けるかを評価するために、ＴＪバリア機能を評価する際に指標とする経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）値を、Millicell-ERS（ミリポア社製）を用いて測定した。
カルシウムイオンスイッチによる分化誘導を行ったＮＨＥＫを３３℃（◇）もしくは２８℃（□）で培養し、培養開始から２４時間後に、２８℃で培養したＮＨＥＫに４α−ＰＤＤ（△）又はカンファー（○）を添加してＴＲＰＶ４およびＴＲＰＶ３活性化の化学的増強を行った。
結果を図１１に示す。矢印は、化学的増強のタイミングを示す。データは、５回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示す。（＊＊：Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．：有意ではない。）３３℃と２８℃間は、ｔ−検定により、２８℃におけるＴＲＰＶ活性化物質の有無間は、ＴＲＰＶ活性化物質無の値をコントロールとして設定したＤｕｎｎｅｔｔ法により、有意差検定を行った。Ｐ＜０．０５の値を有意と判断した。
２８℃で培養したＮＨＥＫのＴＥＲ値は、３３℃で培養したものに比べ有意に低く、２８℃におけるオクルディンの断片化した免疫蛍光シグナルの結果（図１０）を支持した。上記試験例１にも示したとおり、２８℃で化学的増強を行ったＮＨＥＫのＴＥＲ値は、ＴＲＰＶ活性化物質無であるコントロールと比べて、４α−ＰＤＤにより有意に増強されたが、カンファーでは増強されなかった。
これらのことは、ヒト角化細胞のＴＪバリア機能は、ＴＲＰＶ４活性化温度閾値以下で低減するが、化学的増強によってＴＲＰＶ４を特異的に活性化することで克服されることを示唆した。
さらに、上記のようなＴＪバリア機能の変化が、ＴＲＰＶ４の関与によって特異的に引き起こされる現象であることを確認するために、ｓｉ−ＲＮＡを用いたＮＨＥＫのＴＲＰＶ４ノックダウンを行った。ＴＲＰＶ４をノックダウンしたＮＨＥＫのＴＥＲ値は、コントロールｓｉ−ＲＮＡをトランスフェクションしたＮＨＥＫ（Ｍｏｃｋ）に比べ、有意に低減した。（図５）
これらのことは、ヒト角化細胞のＴＪバリア機能は、ＴＲＰＶ４の発現が抑制されるこ
とで、低減することを示唆した。
【００４６】
さらに、新鮮ヒト皮膚組織を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ評価により、角層バリア破壊後の皮膚バリア機能の回復における温度の影響を評価した。このとき用いたヒト皮膚組織は、インフォームドコンセントによって患者の同意を得た後に、外科的手術によって切除された皮膚組織（バイオプレディック社製及び順天堂浦安病院）である。これらのヒト皮膚組織を、Skin Long Term Culture Medium（バイオプレディック社製）を用いて前培養した後、Ｃ４０ＳＨ０２粘着テープ（生化学工業株式会社製）でストリッピング処理を行い角層を完全除去することで、バリア破壊を行った。角層除去によるバリア破壊の直後に、１０μＭの４α−ＰＤＤ、３ｍＭのカンファーをそれぞれ含む水溶液、又は水のみ５０μｌを、ヒト皮膚組織の角層除去部位に直接投与し、３３℃又は２８℃で培養した。皮膚バリア機能の回復は、VAPO SCAN AS-VT100RS（株式会社アサヒテクノラボ）により経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定し、これを下記式に適用して皮膚バリア機能回復率（％）を算出し、評価した：
（角層バリア破壊直後のＴＥＷＬ−各測定点におけるＴＥＷＬ）／（角層バリア破壊直後のＴＥＷＬ−角層バリア破壊前のＴＥＷＬ）×１００
また、２％ EZ-link sulfo-NHS-LC-ビオチン（ピアス社製）を、細胞間物質透過マーカーとして皮内に注入し、マーカーの細胞間透過性を、免疫蛍光染色により評価した。
結果を図１２（Ａ）に示す。（Ａ）は、バリア破壊後１．５、４及び２４時間における皮膚組織のバリア回復率を示す。各ラベルは以下を示す。◇：３３℃水投与、□：２８℃水投与、△：２８℃４α−ＰＤＤ投与、○：２８℃カンファー投与。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示す。（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊:Ｐ＜０．０１。）３３℃と２８℃間は、ｔ−検定により、２８℃におけるＴＲＰＶ活性化物質の有無間は、ＴＲＰＶ活性化物質無の値をコントロールとして設定したＤｕｎｎｅｔｔ法により、有意差検定を行った。Ｐ＜０．０５の値を有意と判断した。
バリア破壊後２４時間における、３３℃及び２８℃で培養した場合の皮膚組織のバリア機能回復率は、２８℃で培養した皮膚組織において、３３℃で培養した皮膚組織に比べ、有意に低減していた。４α−ＰＤＤ又はカンファーで処理した皮膚組織のバリア回復率について、２８℃で培養した皮膚組織をコントロールとして比較した結果、４α−ＰＤＤで処理した皮膚組織は、コントロールと比べ、有意に高い回復率を示したが、カンファーで処理した皮膚組織は、コントロールと比べ、有意に低い回復率を示した。
これらの結果は、以下に示す、細胞間物質透過の評価によっても支持される。
【００４７】
結果を図１２（Ｂ）に示す。（Ｂ）は、角層バリア破壊後２４時間における皮膚組織断面の免疫蛍光画像を示す。矢印は、表皮顆粒層に局在する主要なＴＪ関連タンパク質のひとつであるオクルディン（原図では緑）を示す。白三角は、オクルディンの位置を通過した物質透過マーカー（原図では赤）を示す。
３３℃で培養した皮膚組織において、物質透過マーカーはオクルディンが局在する表皮顆粒層の最表層部において、透過が遮断された。対して、２８℃で培養した皮膚組織では、物質透過マーカーは、オクルディンが局在する表皮顆粒層の最表層よりも上部へ漏出した。２８℃における物質透過マーカーの漏出は、４α−ＰＤＤにより抑制されたが、カンファーでは抑制されず、細胞間接着とりわけＴＪの強固さは、ＴＲＰＶ４の活性化に依存することを示した。
発明者等の先の報告では、表皮ＴＪが、角化細胞に極性を与え、ラメラボディ分泌を促進することにより、角層バリア形成において重要な役割を持つことを示した。したがって、ＴＲＰＶ４の活性化は、ＴＪバリア機能だけではなく、角層バリア機能をも調節していることが示唆される。
以上の結果から、すなわち、ＴＲＰＶ４の活性化温度閾値以下の低温では、皮膚バリア回復が遅れるが、ＴＲＰＶ４の活性化により特異的に補われることが示された。
【００４８】
［実施例１］
＜植物抽出物の製造方法＞
植物抽出物（ミツハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビールより得られる抽出物を含む）は、医薬部外品原料規格２００６に従い製造することも出来るし、丸善株式会社等により市販されている植物抽出物を購入し、使用することも出来る。本実施例においては、丸善株式会社より購入した植物抽出物を使用した。
【００４９】
［実施例２］
＜ＴＪ及びＡＪの形成促進作用評価１：本発明における植物抽出物のＴＥＲ値測定＞
前記の試験例１に記載の試験方法に従い、植物抽出物のＴＥＲ値を測定した。結果を図１３に示す。図１３において、縦軸は、ＴＥＲ値（Ωcｍ2）、横軸は、測定時間を表す。図１３の結果より、植物抽出物のうち、ミツハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビールより得られる抽出物は、顕著なＴＥＲ値の増加を示し、ＴＪ及び／又はＡＪの機能促進作用が認められた。
【００５０】
［実施例３］
＜ＴＪ及びＡＪの形成促進作用評価２：本発明における植物抽出物のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験＞
前記の試験例２に記載の試験方法に従い、植物抽出物のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過性を評価した。結果を図１４に示す。図１４の結果より、植物抽出物のうち、ミツハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビールより得られる抽出物には、顕著なＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過性の抑制が認められ、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用が認められた。
【００５１】
図１３及び図１４に示した結果より、ミツハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビールより得られる本発明の抽出物は、前記のＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用評価（ＴＥＲ値測定及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験）において、共にＴＪ及びＡＪ形成促進作用を示した。
【００５２】
［実施例４］
＜ヒトＴＲＰＶ４を発現する細胞の作製＞
下記の実験手順に従い、ヒトＴＲＰＶ４発現細胞を作製した。ヒトＴＲＰＶ４をコードするｃＤＮＡ〔配列番号１：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ  ０２１６２５の９０ｂｐ〜２７０５ｂｐのポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクターである商品名：ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）のＭＣＳのＢａｍＨＩサイト及びＸｈｏＩサイト間に挿入し、ヒトＴＲＰＶ４発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＶ４発現ベクター（０．５μｇ相当量）とＤｓＲｅｄ（０．１μｇ相当量）、プラスリージェント（商品名、カタログ番号：１１５１４−０１５、インビトロジェン社製）６μＬ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１、インビトロジェン社製）１００μＬとを混合し、混合物１を得た。また、リポフェクタミン（登録商標、カタログ番号：１８３２４−０１２、インビトロジェン社製）４μＬとＯＰＴＩ−ＭＥＭ １００μＬとを混合し、混合物２を得た。一方、ＨＥＫ２９３細胞（５×１０5ｃｅｌｌｓ／直径３５ｍｍシャーレ）を１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて７０％のコンフルエントまで培養した。その後、得られた細胞に、前記混合物１と混合物２との混合物を添加した。これにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＶ４発現ベクターを導入し、ＴＲＰＶ４発現細胞を得た。また、同様の方法で、ヒトＴＲＰＶ４を挿入していないベクターを作製し、これをＨＥＫ２９３細胞に導入してＭｏｃｋ細胞を作製した。
【００５３】
［実施例５］
＜ＴＲＰＶ活性化作用評価１：本発明における植物抽出物のカルシウムイメージング法によるＴＲＰＶ４活性化作用評価＞
本発明の植物抽出物を、溶液Ａ〔組成：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）〕に添加し、試験液を作製した。各試験液中における植物抽出物の濃度は、０．１質量％とした。前記の実施例４に従い作製されたＴＲＰＶ４発現細胞もしくはＭｏｃｋ細胞を、１〜２０μｇ／ｍＬのＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６０〜９０分間インキュベーション（３７℃、５％二酸化炭素気流下）して、ＴＲＰＶ４発現細胞もしくはＭｏｃｋ細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入した。ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入後のＴＲＰＶ４発現細胞もしくはＭｏｃｋ細胞を、カルシウムイメージング装置倒立顕微鏡のチャンバー（ＲＣ−２６Ｇ、Warner Instruments社製）にセットし、溶液Ａにて洗浄した。続いて、前記試験液をチャンバーに入れて循環させながら、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度とを測定した。その後、前記試験液を用いた場合の励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比（３４０ｎｍでの蛍光強度／３８０ｎｍでの蛍光強度）を算出した。細胞内カルシウムイオン濃度の変化（カルシウムイオン濃度の増加）に対する被験物質による亢進作用は、ＩｐＬａｂソフトウェア（Scanalytics社製）により解析した。また、陽性対照としてＴＲＰＶ４リガンドである4alpha-phorbol 12,13-didecanoate（４α−ＰＤＤ）（シグマ  アルドリッチ社製）を用いて同様の評価を実施した。結果を図１５〜図１７に示す。
【００５４】
図１５〜図１７の結果より、陽性対照の４α−ＰＤＤは、顕著な細胞内カルシウムイオン濃度の増加が認められ、この評価系の客観性が確認された。また、本発明の植物抽出物は、ＴＲＰＶ４発現細胞において顕著な細胞内カルシウムイオン濃度の増加が確認された。一方、Ｍｏｃｋ細胞においては確認されなかった（図１８及び１９）。さらに、カルシウムイオンフリーの溶液Ｂ〔組成：１４０mＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）〕に、本発明の植物抽出物としてアセンヤク抽出物を添加したところ、ＴＲＰＶ４発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化は確認されず（図２０及び２１）、Ｍｏｃｋ細胞においても確認されなかった（図２２及び図２３）。このことから、アセンヤクエキスによる細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用は、ＴＲＰＶ４を介した細胞外からのカルシウムイオン流入であることがわかる。
【００５５】
［実施例６］
＜本発明の組成物＞
＜本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分を含有する組成物（皮膚外用剤）の製造＞
表１及び２に示す処方に従って、本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分を含有する組成物（皮膚外用剤）であるローション化粧料を作製した。即ち、処方成分を８０℃で攪拌し、可溶化し、しかる後に、攪拌下冷却して、ローション化粧料［化粧料１及び２（皮膚外用剤１及び２）］を得た。また、同様の操作を行い本発明の組成物（皮膚外用剤）の「皮膚バリア機能向上作用を有する成分」を「水」に置換した比較例１も作製した。
【００５６】
【表１】
2011115152.tif 000003
【００５７】
【表２】
2011115152.tif 000004
【００５８】
［実施例７］
＜本発明の皮膚外用剤の肌荒れ改善試験＞
パネラーを使用し、本発明の皮膚外用剤である化粧料１、２及び比較例１について、テープストリッピングによって作製した肌荒れモデルでの、肌荒れ改善作用を評価した。即ち、片方の前腕に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を３つ規定し、テープストリッピングを各部位１５回行い、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）をインテグラル社製の「テヴァメ−タ−」で計測した。その後、一日一度検体（１部位に化粧料１、２及び比較例１のいずれか、どの部位にどの検体を塗布するかは被験者ごとに無作為に選択を５０μＬ塗布し、この作業を６日間続け、７日目に再度ＴＥＷＬを計測した。最初の日のＴＥＷＬ値から７日目のＴＥＷＬ値を減じ、最初の日のＴＥＷＬ値で除し、１００を乗じてＴＥＷＬ改善率（％）を算出した。ｎ数は１５とした。結果を表３に示す。これより、本発明の皮膚外用剤は肌荒れ改善作用に優れることがわかる。
【００５９】
【表３】
2011115152.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な皮膚バリア機能向上作用を有する成分をスクリーニングすることができ、化粧料などの皮膚外用剤に応用出来る。
【図１】
2011115152.tif 000006
【図２】
2011115152.tif 000007
【図３】
2011115152.tif 000008
【図４】
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【図５】
2011115152.tif 000010
【図６】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2011115152.tif 000014
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2011115152.tif 000020
【図２２】
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【図２３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2011115152.tif 000026
【図１１】
2011115152.tif 000027
【図１２】
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【配列表】
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