(57)【要約】【課題】  多発性硬化症を含む中枢神経系を冒す自己免疫疾患における中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させる方法を提供することを目的とする。【解決手段】  グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストを含む組成物を、ＧＬＰ−１Ｒを活性化する有効量で当該処置を必要とする哺乳動物に投与し、それによって中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させることを含む、中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストを含む組成物を、ＧＬＰ−１Ｒを活性化する有効量で当該処置を必要とする哺乳動物に投与し、それによって中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させることを含む、中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させる方法。
【請求項２】
哺乳動物が自己免疫障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自己免疫障害が多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、自己免疫障害が、免疫拒絶、移植片対宿主病、ブドウ膜炎、視神経症、視神経炎、横断性脊髄炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、又はグレーブス病と関連している、上記方法。
【請求項５】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＯＡＰ−１８９である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＤＰＰ−４阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが抗ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストがエキセンジン−４のフラグメント又は誘導体を含み、ここでエキセンジン−４のフラグメント又は誘導体がＧＬＰ−１Ｒに結合しそれを活性化する、上記方法。
【請求項１０】
ＧＬＰアゴニストが、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド及び抗体を含むＧＬＰ−１Ｒアゴニスト−抗体コンジュゲート（ＧＡＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ＧＡＣが以下の構造：
【化１】
2011057670.tif 000031
〔式中、
ペプチドは以下の式：
Ｒ1−［Ｈ1 Ｘ2 Ｅ3  Ｇ4  Ｔ5  Ｆ6  Ｔ7  Ｓ8  Ｄ9  Ｘ10  Ｓ11  Ｘ12  Ｘ13  Ｘ14  Ｅ15  Ｘ16  Ｘ17  Ａ18  Ｘ19  Ｘ20  Ｘ21  Ｆ22  Ｘ23  Ｘ24  Ｘ25  Ｘ26  Ｘ27  Ｘ28  Ｘ29  Ｘ30  Ｘ31  Ｘ32  Ｘ33  Ｘ34  Ｘ35  Ｘ36  Ｘ37  Ｘ38  Ｘ39  Ｘ40  （配列番号３）］−Ｒ2
［式中、
Ｒ1は、不存在、ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、又はＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3であり；
Ｒ2は、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣ6
Ｈ5、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ2ＣＨ3、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基又は糖質であり；そして
Ｘ2は、Ａｉｂ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａなどの遮断基であり；
Ｘ10はＶ、Ｌ、Ｉ、又はＡであり；
Ｘ12は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ13は、Ｑ又はＹであり；
Ｘ14は、Ｇ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、又はＬであり；
Ｘ16は、Ｋ、Ｄ、Ｅ、又はＧであり；
Ｘ17は、Ｅ又はＱであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、又はＡであり；
Ｘ20は、オルニチン、又はＫ（ＳＨ）Ｒなどの誘導体化リジン基、又はＫであり；
Ｘ21は、Ｌ又はＥであり；
Ｘ23は、Ｉ又はＬであり；
Ｘ24は、Ａ又はＥであり；
Ｘ25は、Ｗ又はＦであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＩであり；
Ｘ27は、Ｉ、Ｋ、又はＶであり；
Ｘ28は、Ｒ、オルニチン、Ｎ、又はＫであり；
Ｘ29は、Ａｉｂ又はＧであり；
Ｘ30は、任意のアミノ酸、好ましくはＧ又はＲであり；
Ｘ31は、Ｐ又は不存在であり；
Ｘ32は、Ｓ又は不存在であり；
Ｘ33は、Ｓ又は不存在であり；
Ｘ34は、Ｇ又は不存在であり；
Ｘ35は、Ａ又は不存在であり；
Ｘ36は、Ｐ又は不存在であり；
Ｘ37は、Ｐ又は不存在であり；
Ｘ38は、Ｐ又は不存在であり；
Ｘ39は、Ｓ又は不存在であり；そして
Ｘ40は、連結残基又は不存在であり；
そして、ここで、
Ｘ10、Ｓ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ24、Ｘ26、Ｘ27、Ｘ28、Ｘ32、Ｘ33、Ｘ34、Ｘ35、Ｘ36、Ｘ37、Ｘ38、Ｘ39、又はＸ40の１つは、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合した求核性側鎖を含む連結残基で置換され、ここで連結残基は、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、リジンのホモログ（Ｋ（ＳＨ）を含む）、ホモシステイン、及びホモセリンから成る群から選択される］のものである〕
のものである、上記方法。
【請求項１２】
ＧＡＣが以下の構造：
【化３】
2011057670.tif 000032
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＡＣが以下の構造：
【化４】
2011057670.tif 000033
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶH、二重特異性抗体及びミニ抗体から成る群から選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から成る群から選択される定常ドメインを含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年８月２７日に出願された米国仮出願第６１／２３７６５４号の利益を主張するものであり、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表に関する参照）
本願は電子出願されており、そしてテキスト形式で電子的に提出された配列表を含む。テキストファイルは、２０１０年８月９日に作成された「PC33892ASeqList.txt」と題する、そして３０ＫＢのサイズを有する配列表を含む。本テキストファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、そしてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、多発性硬化症を含む中枢神経系を冒す自己免疫疾患の処置に関する。本発明は、中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させるためのグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストを提供する。
【背景技術】
【０００４】
多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症、脱髄、及び軸索傷害によって特徴付けられる中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性自己免疫疾患である。本疾患は世界で百万人以上の人々を冒し、男性よりも女性で２倍罹患しやすい。ＭＳの症状は、通常２０歳〜４０歳の間に発現する。
【０００５】
ＭＳの特徴は研究されているが、本疾患の病因は不明である。当該特徴としては、ＣＮＳ組織の損傷、ミクログリアの活性化、炎症性サイトカイン産生、Ｔ細胞移動及びクローン型拡大の停止、及びマクロファージエフェクター機能変化、ＭＨＣの産生、アップレギュレーション、及びＴ細胞浸潤によるＣＮＳへの直接攻撃を含む。
【０００６】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳの標準モデルと考えられる。マウス疾患モデルは、ＭＳの病因を研究し、その処置のための薬剤を評価するために使用されている(非特許文献１)。ＥＡＥの臨床的特徴は、多数の浸潤リンパ球及びマクロファージによるＣＮＳの炎症及び脱髄を含む。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含む、ミエリンの幾つかの異なるタンパク質成分によるマウスの能動免疫は、自己免疫抗体の産生及び上行性麻痺の臨床症状を誘発する。疾患は、マウス株及び免疫に使用されるミエリンタンパク質によって急性又は慢性となり得る。ＥＡＥは、ＭＳの病因を研究し、その処置のための薬剤を評価するのに使用されている(非特許文献１)。
【０００７】
ＭＳは大部分、神経組織に豊富に存在する脂質及び幾つかのタンパク質を含む、ミエリンに対するＴ細胞反応に起因する。脱髄及び臨床的麻痺は、ミエリン抗原に対して特異性を有するＴｈ１及びＴｈ１７表現型のＴ細胞によるＣＮＳ組織浸潤に起因する。Ｔｈ１細胞は、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを含む炎症性サイトカインを産生する。ＩＬ−１７発現は、ＭＳ患者、並びに関節リウマチ及び過敏性腸疾患患者で増加している(非特許文献２、３)。このことは、自己免疫疾患におけるＴｈ１７細胞の病原性役割を示唆する。ＣＮＳの損傷は、自己免疫抗体の産生及び補体活性化を含む他の免疫反応によっても引き起こされると考えられる。Ｂ細胞は、疾患の全期間にわたって認められるイソタイプのＭＢＰ特異的及びＭＯＧ特異的抗体を有するＭＳ及びＥＡＥの早期及び晩期の期間に関わる。脳及び脊髄組織から調製した切片は、白血球浸潤（特にリンパ球及びマクロファージ）及び神経系の基になる組織の破壊を呈する。
【０００８】
グルカゴン様ペプチド（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１）は、ラット及びヒトの両方におけるグルコインクレチンである(非特許文献４、５)。インスリン分泌の増加及びグルカゴン分泌の減少に加えて、３０アミノ酸のＧＬＰ−１ペプチドはプロインスリン遺伝子転写を促進し、胃内容排出時間を減速し、そして食物摂取を減少させる。ＧＬＰ−１は、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に結合することによってその生理作用を示す。ＧＬＰ−１Ｒは、多くの重要な生理的及び病態生理的過程を調節する、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＬＣＲ）スーパーファミリーのクラスＢ受容体サブクラスに属する。ＧＬＰ−１Ｒは、Ｇタンパク質活性化、ｃＡＭＰ産生増加及びＰＫＡの活性化に連結する７回膜貫通受容体である。また、ＧＬＰ−１Ｒを通して開始されるＰＫＡ非依存性反応である。ＧＬＰ−１の作用に対する他の反応は、例えば、膵β細胞増殖及びβ細胞アポトーシスの減少と同時に増殖を含む。加えて、ＧＬＰ−１活性は、膵臓細胞におけるグルコース輸送体−２（ＧＬＵＴ２）及びグルコキナーゼ遺伝子の発現増加をもたらすことができる。
【０００９】
ＧＬＰ−１は、また、孤束核（ＮＴＳ）の尾部領域のニューロンによっても合成されるニューロペプチドである(非特許文献６)。ＧＬＰ−１免疫反応性線維及びＧＬＰ−１Ｒは、脳全体に広く発現しているように見える(非特許文献６、７、８)。ＧＬＰ−１Ｒ欠損マウスは、海馬体細胞におけるＧｌｐ１ｒ遺伝子導入後の表現型修正を伴う、カイニン酸投与後の発作強度及びニューロン損傷を増強している (非特許文献９)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Aharoni, R. et al., 2005, J. Neurosci. 25:8217-28
【非特許文献２】Komiyama, Y. et al., 2006, J. Immunol. 177, 566-573
【非特許文献３】Matusevicius, D. et al., 1999, Mult. Scler. 5, 101-104
【非特許文献４】Dupre and Ebert and Creutzfeld, 1987, Diabetes Metab. Rev. 3
【非特許文献５】Mojsov et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:11880
【非特許文献６】Jin, S. L. et al., 1988, J Comp Neurol. 271:519-532
【非特許文献７】Larsen, P. J. et al., 1997, Neuroscience 77:257-270
【非特許文献８】Merchenthaler, I. et al., 1999, J Comp Neurol 403:261-280
【非特許文献９】During, M. J. et al., 2003, Nat Med. 9(9):1173-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
１つの態様では、本発明は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む組成物を、ＧＬＰ−１Ｒを活性化する有効量で当該処置が必要な哺乳動物に投与し、それによって中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させることを含む、中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させる方法を提供する。本発明は、哺乳動物の中枢神経系組織の白血球浸潤を減少させるために使用される薬剤の製造における、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの使用を更に提供する。本発明は、哺乳動物のＴｈ１及びＴｈ１７細胞数を減少させるために使用される薬剤の製造における、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの使用を更に提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
幾つかの実施態様では、哺乳動物は自己免疫障害を有する。１つの実施態様では、自己免疫障害は実験的自己免疫性脳脊髄炎である。別の実施態様では、自己免疫障害は多発性硬化症である。他の実施態様では、自己免疫障害は、免疫拒絶、移植片対宿主病、ブドウ膜炎、視神経症、視神経炎、横断性脊髄炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、又はグレーブス病と関連している。好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００１３】
幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む組成物の投与は、哺乳動物のリ
ンパ節においてＴｈ１及び／又はＴｈ１７細胞数を減少させる。幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む組成物の投与は、哺乳動物のリンパ節においてＴｅｒ１１９＋赤血球系細胞を減少させる。
【００１４】
好ましい実施態様では、浸潤白血球はＴ細胞及びマクロファージを含む。特定の実施態様では、浸潤白血球はＣＤ３発現及びＣＤ６８発現白血球を含む。好ましい実施態様では、中枢神経系組織は脳組織又は脊髄組織である。
【００１５】
幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１ＲアゴニストはＯＡＰ−１８９である。他の実施態様では、ＧＬＰ−１ＲアゴニストはＤＰＰ−４阻害剤である。他の実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは抗ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体である。
【００１６】
幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。幾つかの実施態様では、天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニストはエキセンジン−４である。関連実施態様では、天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニストはエキセンジン−４のフラグメント又は誘導体を含む。幾つかの実施態様では、エキセンジン−４のフラグメント又は誘導体は、ＧＬＰ−１Ｒに結合してそれを活性化する。
【００１７】
幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド及び抗体を含むＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体コンジュゲート（「ＧＡＣ」）を含む。関連する実施態様では、ＧＡＣは以下の構造：
【化１】
2011057670.tif 000002
式中、
ペプチドは以下の式：
Ｒ1−［Ｈ1  Ｘ2  Ｅ3  Ｇ4  Ｔ5  Ｆ6  Ｔ7  Ｓ8  Ｄ9  Ｘ10  Ｓ11  Ｘ12  Ｘ13  Ｘ14
Ｅ15  Ｘ16  Ｘ17  Ａ18  Ｘ19  Ｘ20  Ｘ21  Ｆ22  Ｘ23  Ｘ24  Ｘ25  Ｘ26  Ｘ27  Ｘ28  Ｘ29  Ｘ30  Ｘ31  Ｘ32  Ｘ33  Ｘ34  Ｘ35  Ｘ36  Ｘ37  Ｘ38  Ｘ39  Ｘ40  （配列番号３）］−Ｒ2
式中、
Ｒ1は不存在、ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、又はＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3であり；Ｒ2はＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣ6Ｈ5、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ2ＣＨ3、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基又は糖質であり、そしてＸ2はＡｉｂ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａなどの遮断基であり；Ｘ10はＶ、Ｌ、Ｉ、又はＡであり；Ｘ12はＳ又はＫであり；Ｘ13はＱ又はＹであり；Ｘ14はＧ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、又はＬであり；Ｘ16はＫ、Ｄ、Ｅ、又はＧであり；Ｘ17はＥ又はＱ；Ｘ19はＬ、Ｉ、Ｖ、又はＡであり；Ｘ20はオルニチン、又はＫ（ＳＨ）Ｒなどの誘導体化リジン基、又はＫであり；Ｘ21はＬ又はＥであり；Ｘ23はＩ又はＬであり；Ｘ24はＡ又はＥであり；Ｘ25はＷ又はＦであり；Ｘ26はＬ又はＩであり；Ｘ27はＩ、Ｋ、又はＶであり；Ｘ28はＲ、オルニチン、Ｎ、又はＫであり；Ｘ29はＡｉｂ又はＧであり；Ｘ30は任意のアミノ酸、好ましくはＧ又はＲであり；Ｘ31はＰ又は不存在であり；Ｘ32はＳ又は不存在であり；Ｘ33はＳ又は不存在であり；Ｘ34はＧ又は不存在であり；Ｘ35はＡ又は不存在であり；Ｘ36はＰ又は不存在であり；Ｘ37はＰ又は不存在であり；Ｘ38はＰ又は不存在であり；Ｘ39はＳ又は不存在であり；そしてＸ40は連結残基又は不存在であり；そしてここで、Ｘ10、Ｓ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ24、Ｘ26、Ｘ27、Ｘ28、Ｘ32、Ｘ33、Ｘ34、Ｘ35、Ｘ36、Ｘ37、Ｘ38、Ｘ39、又はＸ40の１つは、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合した求核性側鎖を含む連結残基で置換され、ここで連結残基はＫ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、リジンのホモログ（Ｋ（ＳＨ）を含む）、ホモシステイン、及びホモセリンから成る群から選択される；
を有するものであってよい。
【００１８】
幾つかの実施態様では、ＧＡＣは以下の構造：
【化２】
2011057670.tif 000003
を含むことができる。
【００１９】
幾つかの実施態様では、ＧＡＣは以下の構造：
【化３】
2011057670.tif 000004
を含むことができる。
【００２０】
幾つかの実施態様では、抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶH、二重特異性抗体及びミニ抗体から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から成る群から選択される定常ドメインを含む。幾つかの実施態様では、抗体は触媒抗体である。幾つかの実施態様では、抗体はアルドラーゼ抗体である。幾つかの実施態様では、アルドラーゼ抗体は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列を含む。
【００２１】
他の実施態様では、本発明は、ＧＬＰ−１Ｒを活性化するのに有効量のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト及び使用説明書を含む、中枢神経系組織の白血球浸潤を低減するための部品キットを提供する。関する実施態様では、本発明は、ＧＬＰ−１Ｒを活性化するのに有効量のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト及び使用説明書を含む、中枢神経系を冒す自己免疫障害を処置するするための部品キットを提供する。
【００２２】
本発明のこれらの及び他の態様は、以下の記述及び実施例から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＭＯＧ免疫後のＥＡＥ動物中の浸潤細胞体、Ｔ細胞、単球及びミクログリアを示す組織化学を図示する。ＥＡＥ動物（上側パネル）及び健常動物（下側パネル）からの脊髄切片を、浸潤細胞体(左)、浸潤Ｔ細胞を検出する抗ＣＤ３抗体(中間)、又は単球及びミクログリアを検出する抗ＣＤ６８抗体(右)を染色するために、クレシルバイオレットで染色した。
【図２】ＭＯＧ免疫後に１ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した動物における、ＥＡＥの臨床的悪性度を示すグラフを図示する。動物に、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＸＥ４）、２ｍｇ／ｋｇニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、又はＰＢＳ（対照）のいずれかを、ＭＯＧ免疫後に日０から日９まで毎日与えた。マウスを以下のスコアリング・システムによりＥＡＥの臨床徴候を毎日評価した：０＝正常；１＝尾跛行；２＝やや後肢弱；３＝準じて重度後肢弱（動物は困難を伴なうがまだ歩行可能）；４＝重度後肢弱（動物はまだ後肢を動かせるが歩行不能）；５＝完全後肢麻痺；及び６＝死亡。
【図３】ＭＯＧ免疫後に１ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置したＥＡＥ動物における、病的状態を示すグラフを図示する。動物を、ＭＯＧ免疫後日０から日６まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＸＥ４）又はＰＢＳで毎日、又はＧＬＰ−１アゴニストＧＡＣ−１（１ｍｇ／ｋｇ）で週１回処置した。臨床スコアを毎日モニターし、上記のように評価した。
【図４】ＭＯＧ免疫後に種々の用量のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（エキセンジン−４又はＧＡＣ−１）で処置した、ＥＡＥ動物における病的状態を示すグラフを図示する。エキセンジン−４（ＥＸＥ４）処置した動物を、ＭＯＧ免疫後日０から日２まで毎日３ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４で処置し、そして日３から日８まで毎日１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４で処置した。ＧＡＣ−１処置動物を、日０に３ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１で処置し、続いて免疫後日７に始めて１ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１を週１回処置した。対照動物は、対照ＰＢＳで毎日処置した。臨床スコアを毎日モニターした。ＥＡＥの臨床徴候を上記のように評価した。
【図５】Ａ〜Ｃは、（Ａ）ＰＢＳ対照処置及び（Ｂ）エキセンジン−４処置及び（Ｃ）ＧＡＣ−１処置をした、ＥＡＥ動物からの脊髄切片の組織化学染色の結果を図示する。切片のミエリンをルクソールファーストブルーで染色した。黒矢印は、ルクソールファーストブルー染色低下を示す白質の脱髄を示す。
【図６】Ａ〜Ｆは、ＰＢＳ対照（Ａ、Ｄ）及びエキセンジン−４処置（Ｂ、Ｅ）及びＧＡＣ−１処置（Ｃ、Ｆ）とした、ＥＡＥ動物からの脊髄切片の免疫組織化学染色の結果を図示する。切片は、ＣＤ３（Ａ〜Ｃ）又はＣＤ６８（Ｄ〜Ｆ）に特異的な抗体で染色された。呈示切片は脊髄断面切片の前角である。
【図７】ＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体で染色された脳、及び脊髄からのＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５hi細胞（活性化ミクログリア及び浸潤マクロファージ）及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５lo細胞（静止ミクログリア）集団の、フローサイトメトリー分析からのデータを示すグラフを図示する。各グラフにおいて、エキセンジン−４（ＥＸＥ４）処置をしたＥＡＥ動物からの細胞のＭＨＣクラスＩＩ発現は黒実線（□）で表わされ、そして対照処置をしたＥＡＥ動物からの細胞のＭＨＣクラスＩＩ発現は点線
【化４】
2011057670.tif 000005
で表わされる。上側パネル：疾患発症時の動物から採取した細胞。下側パネル：疾患発症時の動物から採取した細胞。
【図８】ＥＡＥの養子免疫伝達モデルで脾細胞の病原性を示すグラフを図示する。左のグラフ：動物にＰＬＰｐ（１３９−１５１）免疫後、日０から日４まで１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＸＥ４）又はＰＢＳ（対照）を毎日与えた。動物を免疫後日５に犠牲にした。右のグラフ：エキセンジン−４処置ドナー(▽)及びＰＢＳ処置ドナー（■）からの脾細胞をナイーブＳＪＬ／Ｊ動物に伝達した。レシピエントマウスの臨床スコア及び体重変化を毎日モニターした。ＥＡＥの臨床徴候を上記のように評価した。
【図９】Ａ〜Ｃは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置後のリンパ節重量及び脾臓重量及びサイズを図示する。動物は、ＭＯＧ免疫後日０から日５まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＡＥ−ＥＸＥ４）、ＰＢＳ（ＥＡＥ−ビヒクル）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン対照（ＥＡＥ−Ｄｅｘ）で毎日処置した。ナイーブ動物はＭＯＧで免疫されなかった。（Ａ）鼠径リンパ節重量。（Ｂ）脾臓重量。（Ｃ）ナイーブ動物、ビヒクルで処置したＥＡＥ動物及びエキセンジン−４で処置したＥＡＥ動物からの脾臓。
【図１０】Ａ〜Ｆは、ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物における免疫学的変化を示すグラフを図示する。動物を、ＭＯＧ免疫後日０から日６まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＸＥ４）又はＰＢＳで毎日処置した。動物を、免疫後日６に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。リンパ球（Ａ−Ｃ）及び単球（Ｄ−Ｆ）を、脾臓（Ａ、Ｄ）、リンパ節（Ｂ、Ｅ）及び末梢血（Ｃ、Ｆ）から測定した。ｙ−軸は、リンパ球（Ａ−Ｃ）又は単球（Ｄ−Ｆ）である細胞の割合を示す。
【図１１】Ａ〜Ｆは、ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物における免疫学的変化を示すグラフを図示する。動物を、ＭＯＧ免疫後日０から日６まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＸＥ４）又はＰＢＳで毎日処置した。動物を、免疫後日６に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。ＣＤ４＋細胞（Ａ〜Ｃ）及び細胞ＣＤ８＋（Ｄ〜Ｆ）を、脾臓（Ａ、Ｄ）、リンパ節（Ｂ、Ｅ）及び末梢血（Ｃ、Ｆ）から測定した。ｙ−軸には、表示されたマーカーに対する陽性染色細胞の割合が示される。
【図１２】Ａ〜Ｆは、ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物における免疫学的変化を示すグラフを図示する。動物を、ＭＯＧ免疫後日０から日６まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＸＥ４）又はＰＢＳで毎日処置した。動物を、免疫後日６に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。ＣＤ１９＋細胞（Ａ〜Ｃ）及びＴｅｒ１１９＋細胞（Ｄ〜Ｆ）をリンパ球（Ａ〜Ｃ）及び単球（Ｄ〜Ｆ）を、脾臓（Ａ、Ｄ）、リンパ節（Ｂ、Ｅ）及び末梢血（Ｃ、Ｆ）から測定した。ｙ−軸には、表示されたマーカーに対する陽性染色細胞の割合が示される。
【図１３】ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物におけるＴｅｒ１１９＋細胞集団変化を示すグラフを図示する。動物を、日０から日５まで、ＰＢＳ（ＥＡＥ−ＰＢＳ）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＡＥ−ＥＸＥ４）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ＥＡＥ−ｄｅｘ）で毎日処置した。動物を、免疫後日５に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。脾臓細胞は、赤血球系統マーカーＴｅｒ１１９で表面染色された。Ｔｅｒ１１９に陽性の染色細胞の割合をｙ−軸に示す。
【図１４】ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物における活性化Ｔ細胞集団変化を示すグラフを図示する。動物を、日０から日５まで、ＰＢＳ（ＥＡＥ−ＰＢＳ）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＡＥ−ＥＸＥ４）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ＥＡＥ−ｄｅｘ）で毎日処置した。動物を、免疫後日５に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。リンパ節からの活性化Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４４（ＣＤ４４hi）を有するＣＤ４＋細胞と同定された。ｙ−軸は、処置群及びナイーブ群のそれぞれにおける、高レベルのＣＤ４４を有するＣＤ４＋細胞の割合を表わす。
【図１５】ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物における増殖細胞集団変化を示すグラフを図示する。動物を、日０から日５まで、ＰＢＳ（ＥＡＥ−ＰＢＳ）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＡＥ−ＥＸＥ４）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ＥＡＥ−ｄｅｘ）で毎日処置した。動物を、免疫後日５に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。リンパ節細胞をＭＯＧ刺激により培養し、そして細胞増殖を測定するためにＢｒｄＵで処置した。ｙ−軸は、処置群及びナイーブ群のそれぞれにおける、ＢｒｄＵ陽性のＣＤ４＋の割合を表わす。
【図１６】ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物におけるＩＬ−１７＋細胞集団変化を示すグラフを図示する。動物を、ＰＢＳ（ＥＡＥ−ＰＢＳ）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＡＥ−ＥＸＥ４）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ＥＡＥ−ｄｅｘ）で毎日処置した。動物を、免疫後日５（左図）及び日７(右図)に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。鼠径リンパ節細胞は、ＣＤ４、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γで染色された。ＩＬ−１７に対して陽性染色のＣＤ４＋細胞の割合をｙ−軸に示す。
【図１７】ＭＯＧ免疫に続いてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した後の、ＥＡＥ動物におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）細胞集団変化を示すグラフを図示する。動物を、日０から日５まで、ＰＢＳ（ＥＡＥ−ＰＢＳ）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ＥＡＥ−ＥＸＥ４）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ＥＡＥ−ｄｅｘ）で毎日処置した。動物を、免疫後日５に、免疫されなかった（ナイーブ）マウスと共に犠牲にした。鼠径リンパ節細胞は、ＣＤ４、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γで染色された。ＩＦＮ−γに対して陽性染色のＣＤ４＋細胞の割合をｙ−軸に示す。
【図１８】ＭＯＧ免疫後にＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（エキセンジン−４）又はＤＰＰ−４阻害剤（シタグリプチン）で処置した、ＥＡＥ動物における病的状態を示すグラフを図示する。ＭＯＧ免疫動物に、１ｍｇ／ｋｇシタグリプチン、１０ｍｇ／ｋｇシタグリプチン、エキセンジン−４、又はメチルセルロースを投与した。臨床スコアを毎日モニターした。ＥＡＥの臨床徴候を上記のように評価した。
【図１９】ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（エキセンジン−４）又はビヒクルで処置した、ＥＡＥ動物の病的状態を示すグラフを図示する。免疫後日２９に始めて、ＰＬＰ免疫ＳＪＬ／Ｊマウスに、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４又はビヒクルを毎日投与した。臨床スコアを毎日モニターした。ＥＡＥの臨床徴候を以下のように評価した：０、麻痺なし；１、尾色調欠失；２、後肢弱；３、後肢麻痺；４、後肢及び前脚麻痺；５、瀕死又は死亡。
【図２０】エキセンジン−４又はＰＢＳで処置した迷走神経切離又は迷走神経非切離ＥＡＥ動物における、病的状態を示すグラフを図示する。マウスを、以下のスコアリング・システムに従い、ＥＡＥの臨床徴候について毎日評価した：０＝正常；１＝尾跛行；２＝中等度後肢弱；３＝準じて重度後肢弱（動物は困難を伴なうがまだ歩行可能）；４＝重度後肢弱（動物はまだ後肢を動かせるが歩行不能）；５＝完全後肢麻痺；及び６＝死亡。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、多発性硬化症及び他の自己免疫障害の処置のためのＧＬＰ−１Ｒアゴニストを使用する方法に関する。
【００２５】
一般的方法
本発明は、分子生物学、細胞生物学及び免疫学の分野で使用される従来技術を採用する。当該技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版」（Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, second edition） (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press;「オリゴヌクレオチド合成 」（Oligonucleotide Synthesis） (M.J. Gait, ed., 1984);「分子生物学の方法」（Methods in Molecular Biology）, Humana Press;「細胞生物学：実験室ノート」（Cell Biology: A Laboratory Notebook）(J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;「動物細胞培養」（Animal Cell Culture）(R.I. Freshney, ed., 1987);「細胞及び組織培養入門」（Introduction to Cell and Tissue Culture） (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; 「細胞及び組織培養：実験室操作」（Cell and Tissue Culture:  Laboratory Procedures） (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;「酵素学における方法」（Methods in Enzymology） (Academic Press, Inc.);「実験免疫学便覧」（Handbook of Experimental Immunology） (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.);「哺乳動物細胞での遺伝子移入ベクター」（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells） (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987);「分子生物学の最近のプロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology） (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987);「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR:  The Polymerase Chain Reaction）, (Mullis, et al., eds., 1994);「免疫学における最近のプロトコール」（Current Protocols in Immunology） (J.E. Coligan et al., eds., 1991);「分子生物学における短プロトコール」（Short Protocols in Molecular Biology） (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997);「抗体」（Antibodies） (P. Finch, 1997);「抗体：実践的アプローチ」（Antibodies:  a practical approach） (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);「モノクローナル抗体：実践的アプローチ」（Monoclonal antibodies :  a practical approach） (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);「抗体の使用法：実験室マニュアル」（Using antibodies:  a laboratory manual） (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);「抗体」（The Antibodies） (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)などの参考文献中に記載されている。
【００２６】
定義
以下の略語、用語及び語句は、下記に定義されているように本明細書で使用される。特に明記しない限り、本明細書に記載の本発明に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。更に、文脈のよって規定されない限り、単数用語は複数を含み、そして複数用語は単数を含むものとする。
【００２７】
【表１】
2011057670.tif 000006
【００２８】
例えば、Ｄ−Ａｌａ又はＮ−Ｍｅ−Ｄ−Ｉｌｅのような「Ｄ」接頭辞により特に指示がない限り、本明細書に記載のペプチド中のアミノ酸及びアミノアシル残基のα炭素の立体化学は、「Ｌ」立体配置である。 Cahn-Ingold-Prelog の「Ｒ」及び「Ｓ」記号は、ペプチドのＮ−末端で特定のアシル置換基におけるキラル中心の立体化学を明示するために使用される。記号「Ｒ、Ｓ」は２つのエナンチオマー型のラセミ混合物を示すことを意味する。この命名法は、R. S. Cahn, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 5:385-415 (1966)に記載のものに従う。
【００２９】
Ｄ−ＨはＤヒスチジンを指す。
本明細書で使用される２−アミノイソ酪酸は、以下の構造：
【化５】
2011057670.tif 000007
を有する。
【００３０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を表すために互換性を持って使用される。本明細書で使用されるこれらの用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的アナログである、アミノ酸重合体に適用してもよい。これらの用語は、天然アミノ酸重合体に適用してもよい。ペプチドの結合機能が維持される限り、アミノ酸はＬ又はＤ型であってよい。ペプチドは環状であってよく、ペプチド内の２つの非隣接アミノ酸間で分子内結合、例えば、骨格から骨格、側鎖から骨格及び側鎖から側鎖への環化を有してもよい。環状ペプチドは、当技術分野で周知の方法によって製造することができる。例えば、米国特許第６０１３６２５号；S. Cheng et al., J Med. Chem. 37:1-8 (1994)を参照されたい。
【００３１】
すべてのペプチド配列は一般に認められている慣例に従って書かれるが、それによれば、α−Ｎ末端アミノ酸残基は左側であり、そしてα−Ｃ末端アミノ酸残基は右側である。本明細書で使用される用語「Ｎ末端」は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−アミノ基を指し、そして用語「Ｃ末端」はペプチド中のアミノ酸の遊離カルボン酸末端を指す。１つの基を有するＮ末端であるペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基のα−アミノ窒素上に１つの基を保持するペプチドを指す。１つの基を有するＮ末端であるるアミノ酸は、α−アミノ窒素上に１つの基を保持するアミノ酸を指す。
【００３２】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される用語は、インタクトポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、そのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）及びドメイン抗体（例えば、サメ及びラクダ科抗体を含む）、及び抗体部分を含む融合タンパク質、更に抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のその他の修飾立体配置のいずれをも包含する。抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（又はそのサブクラス）などいずれのクラスの抗体をも含み、そして抗体はいずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに帰属することができる。免疫グロブリンには５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、そしてこれらの幾つかはサブクラス(イソタイプ)、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元立体配置は周知である。
【００３３】
本明細書で使用される「浸潤白血球」は、自己免疫疾患、優先してＣＮＳを冒す自己免疫疾患の結果として、脳及び脊髄組織を含む中枢神経系（ＣＮＳ）組織へ侵入、浸潤、又は移動する白血球である。浸潤白血球は、主としてＴ細胞及び単球であるが、他の白血球が存在してもよい。
【００３４】
本明細書で使用される「白血球浸潤減少」は、脳及び脊髄組織を含むＣＮＳ組織へ白血球の移動（即ち、侵入又は浸潤）を減少させることを指す。白血球浸潤減少は、特にＣＮＳ組織を構成する神経細胞及び／又は他の支持細胞について、白血球浸潤によって媒介される細胞毒性を減少させることを指す。白血球浸潤は、Ｔ細胞及び単球によって媒介される侵入を含む。白血球浸潤減少は、自己免疫攻撃からＣＮＳ組織を守ることを含む。白血球浸潤によって破壊されるＣＮＳの細胞は、ミエリン発現細胞及び隣接非ミエリン発現細胞を含む。細胞破壊は、アポトーシス、壊死、又はその組み合わせであってよい。白血球浸潤減少は、疾患進行減速、病的状態の発症または重症度の遅延、生存期間の延長、クオリティオブライフの改善、認知、運動又は行動症状の減少又は安定化などの臨床的適応によって特徴付けられる。白血球浸潤減少は、中枢神経系（ＣＮＳ）組織への白血球の移動リスクを抑制し又は減少させることも含む。白血球浸潤減少は、部分的又は完全であってもよく、例えば、その減少は、本明細書に記載のように相対的又は実質的減少で、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は更に約９５％であってよい。
【００３５】
本明細書で使用される「ＧＬＰ−１Ｒ」は、ＧＬＰ−１Ｒの活性の少なくとも一部を保持する、いずれかの型のＧＬＰ−１Ｒ及びその変異体を指す。ヒトＧＬＰ−１Ｒに対する特定の言及によるような、特に別の指示がない限り、ＧＬＰ−１Ｒは、天然配列ＧＬＰ−１Ｒの全哺乳動物種、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。
【００３６】
本明細書で使用される「ＧＬＰ−１受容体アゴニスト」又は「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト」は、ＧＬＰ−１Ｒの活性化量を増加させる分子であり、天然アゴニストＧＬＰ−１及びエキセンジン−４によって産生するものと類似の効果をもたらす。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、例えば、ＧＬＰ−１Ｒに結合して活性化させることにより、ＧＬＰ−１Ｒに立体配座変化を引き起こすことにより、ＧＬＰ−１Ｒに結合したＧタンパク質の活性化を引き起こすことにより、ＧＬＰ−１Ｒを長期間（無期限を含む）活性化（例えば、活性立体配座において）状態にさせることにより、天然アゴニストの結合を調節することにより、ＧＬＰ−１のインヒビターをブロック、又はその反対にＧＬＰ−１Ｒ活性化を調節し若しくはＧＬＰ−１Ｒ活性化に特徴的な細胞内イベントのカスケードを開始させることにより、ＧＬＰ−１Ｒの活性化を増加させる。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの好ましい特性は、本明細書に記載されている。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、又はそれ以上ＧＬＰ−１Ｒの活性化を増加することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト」は、自然に存在しＧＬＰ−１Ｒの活性剤として機能する分子である。既知のＧＬＰ−１Ｒの天然アゴニストは、ペプチドホルモンＧＬＰ−１及びエキセンジン−４である。天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、突然変異したＧＬＰ−１Ｒ対立遺伝子を有する動物に発現したポリペプチドなどの天然変異体分子を含む。
【００３８】
「生物活性」は、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストと併せて使用する場合、一般に、ＧＬＰ−１Ｒを結合及び活性化する能力及び／又はＧＬＰ−１Ｒシグナル伝達機能によって媒介される下流経路を有することを指す。本明細書で使用される「生物活性」は、ＧＬＰ−１Ｒ発現細胞上で、ＧＬＰ−１Ｒの天然リガンドとして、ＧＬＰ−１の作用によって誘導されるものに共通した１つ又はそれ以上のエフェクター機能を包含する。生物活性は、以下：ＧＬＰ−１Ｒを結合し活性化する能力；ＧＬＰ−１Ｒに結合し活性化すること、ＧＬＰ−１Ｒの立体配座変化を引き起こす能力、ＧＬＰ−１Ｒに結合したＧタンパク質の活性化を引き起こす能力、ＧＬＰ−１Ｒを長期間（無期限を含む）活性化（例えば、活性立体配座において）状態にさせる能力、細胞内ｃＡＭＰを増加させる能力、インスリン放出を促進する能力、及びＧＬＰ−１Ｒ活性化に特徴的な細胞内イベントのカスケードを開始させる能力、のいずれか１つ又はそれ以上を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用される「完全アゴニスト」は、有効濃度でＧＬＰ−１Ｒの測定可能な効果を、本質的に完全に誘導するアゴニストである。例えば、ＧＬＰ−１Ｒの測定可能な効果は、ｃＡＭＰレベル増加であってよい。部分アゴニストとは、測定可能な効果を部分的に誘導することができるが、しかし最大濃度でも完全アゴニストではないアゴニストを意味する。実質的に完全とは、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の測定可能な効果が誘導されることを意味する。関連する「測定可能な効果」は、本明細書に記載されている。
【００４０】
本明細書で使用される「フラグメント」ポリペプチドは、少なくとも幾つかの生物特性を保持する大型ポリペプチド、即ち、ＧＬＰ−１Ｒを活性化する能力などを有する大型ポリペプチドの一部分である。好ましいフラグメントは、大型ポリペプチドの生物特性をもたらすアミノ酸残基及び／又は構造又は大型ポリペプチドを含む。ポリペプチドフラグメントはペプチドとも呼ばれるが、本明細書ではポリペプチドとペプチド間で区別はされない。典型的フラグメントは本明細書に記載されている。フラグメントは、本明細書に記載のように誘導体化されてもよい。
【００４１】
本明細書で使用される「誘導体」ポリペプチドは、官能基又は官能部分の付加又は除去などの、１つ又はそれ以上の共有若しくは非共有修飾を有する。誘導体の例は、本明細書に提供される。
【００４２】
本明細書で使用される特定のポリペプチド配列の「変異体」は、デフォルト・パラメータで設定されたClustal V又はBLAST、例えば、「BLAST 2 Sequence」ツール、バージョン２．０．９（１９９９年５月７日）などのアルゴリズムを用いて、特定長さの１つのポリペプチド配列を超える特定のポリペプチド配列と、少なくとも４０％配列同一性を有するポリペプチド配列と定義される。当該の１対のポリペプチドは、１つのポリペプチドのある規定の長さにわたって、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％以上の配列同一性を示してもよい。
【００４３】
ポリペプチド配列に適用され本明細書で使用される「配列同一性」は、Clustal V、MEGALIGN、又はBLASTなどの標準化アルゴリズムを用いて整列された、少なくとも２つのポリペプチド配列間の残基整合の割合を指す。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。幾つかのアラインメント法は、保存アミノ酸配列を考慮に入れる。本明細書に記載の当該保存配列は、一般的に、置換部位での電荷と疎水性を保存し、その結果ポリペプチドの構造(及び機能)を保存する。
【００４４】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、いずれの長さの、好ましくは相対的に短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）アミノ酸鎖をも指すように、本明細書では互換性を持って使用される。アミノ酸鎖は直鎖状又は分枝鎖状であってよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、及び／又は非アミノ酸によって遮断されてもよい。この用語は、天然修飾又は遮断；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との結合などその他の操作又は修飾によるアミノ酸鎖を包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ又はそれ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、並びに当技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも、本定義の範囲内である。当然のことながら、ポリペプチドは、一本鎖又は会合鎖として存在し得る。
【００４５】
当技術分野で公知の本明細書において互換性を持って使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、いずれかの長さのヌクレオチド鎖を指し、そしてＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらのアナログ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより鎖中に取り込むことができるいずれの基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在するならば、ヌクレオチド構造への修飾は鎖の会合前又は後になされてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により遮断される。ポリヌクレオチドは、標識成分と併せることによるなど、重合後に更に修飾してもよい。他のタイプの修飾は、例えば、「ｃａｐｓ」、アナログによる１つ又はそれ以上の天然ヌクレオチドの置換、例えば、非荷電結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバメートなど）による及び荷電結合（ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）によるもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）などのペンダント部分を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）によるもの、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、硼素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）によるものなどのヌクレオチド間修飾、並びに１つ又は複数のポリヌクレオチド非修飾型を含む。更に、糖類に通常存在するいずれかのヒドロキシル基も、例えば、ホスホネート基、ホスフェイト基により置換され、標準保護基により保護され、若しくは更なるヌクレオチドへの更なる結合の調製のために活性化されてもよく、又は固体支持体に結合されてもよい。５’及び３’末端ＯＨは、リン酸化され又はアミン若しくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシル基も、標準的な保護基へ誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環糖類アナログ、α又はβアノマー糖類、アラビノース、キシロース又はリキソースなどのエピマー糖類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース、非環式糖アナログ及びメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオチドアナログを含む、一般的に当技術分野で公知のリボース又はデオキシリボース糖類の類似形も含むことができる。１つ又はそれ以上のホスホジエステル結合は、代わりの結合基によって置換してもよい。これらの代わりの結合基は、ホスフェイトがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（Ｏ）ＮＲ2（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ2（「ホルムアセタール」）によって置換され、ここで、各Ｒ又はＲ’は、独立に、Ｈ、又は場合によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルキルを含む、置換若しくは非置換アルキル（１〜２０℃）である実施態様を含むが、これらに限定されない���ポリヌクレオチド中の全結合が同一である必要はない。前記の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、本明細書で言及する全ポリヌクレオチドに適用される。
【００４６】
本明細書で使用される「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（即ち、不純物無し）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、尚より好ましくは少なくとも９８％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【００４７】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入部分の取り込みのために１つ又は複数のベクターのレシピエントになり得るか又はなっている個々の細胞又は細胞培養液を含む。宿主細胞は単一宿主細胞の子孫を含み、そして子孫は、自然の、偶発的、又は意図的な突然変異の故に元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態において又はゲノムＤＮＡ相補性において）である必要はない。宿主細胞は、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドにより、インビボでトランスフェクトされる細胞を含む。
【００４８】
本明細書で使用される「処置」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的として、有益な又は所望の臨床結果は、以下：運動改善、脚弱減少、ＣＮＳのリンパ球浸潤減少、及びＭＳを含む自己免疫疾患に起因する脱髄減少の１つ又はそれ以上を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
「発症減少」は、この病態に一般的に使用される他の薬剤（例えば、それへの露出）の量及び／又は治療の必要性の減少を含んでもよい、いずれかの重症度の減少を意味する。当業者には当然のことながら、個体は処置へのそれらの反応性の点で変動してもよく、そのようなものとして、例えば、「発症を減少させる方法」は、当該投与がその特定の個体にそのような発症減少をもたらす可能性があるという合理的な予測に基づいて、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを投与することを反映する。
【００５０】
「改善」は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを投与しないことに比べて、１つ又はそれ以上の症状の低減又は改善を意味する。「改善」は、症状の期間の短縮又は減少をも含む。
【００５１】
本明細書で使用される「ＧＬＰ−１Ｒを活性化するのに有効な量」、又はＧＬＰ−１Ｒアゴニストについての同様の表現は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの投与前のベースラインレベルと比べて、ＧＬＰ−１Ｒ活性化（本明細書に記載され当技術分野で公知）の増加に十分な量を指す。活性の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１０％、少なくとも２００％、又はそれ以上であってよい。この量は、投与経路、体内でのＧＬＰ−１Ｒアゴニストの半減期、溶解性、バイオアベイラビリティ、クリアランス率、並びにＧＬＰ−１Ｒアゴニストの他の薬物動力学的特性、動物又は患者などの体重及び代謝のような考慮すべき事項を勘案するものである。
【００５２】
本明細書で使用される、薬剤、化合物、又は医薬組成物の「有効投薬量」又は「有効量」は、いずれか１つ又はそれ以上の有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用では、有益な又は所望の結果は、疾患の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、その合併症及び疾患の進展時に現われる中間の病的表現型を含む、疾患のリスクの除去又は減少、重症度の軽減、又は発症遅延を含む。治療的使用では、有益な又は所望の結果は、例えば、ＣＭＴ疾患の１つ又はそれ以上の症状の減少、疾患を処置するのに必要とされる他の薬剤の用量減少、別の薬剤の効果の強化、及び／又は患者の疾患進行遅延などの臨床結果を含む。有効投薬量は、１つ又はそれ以上の投与方法で投与することができる。本発明の目的のために、薬剤、化合物、又は医薬組成物の有効投薬量は、予防的又は治療的処置を直接的にせよ間接的にせよ達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されているように、薬剤、化合物、又は医薬組成物の有効投薬量は、別の薬剤、化合物、又は医薬組成物と併せて達成しても又は達成しなくてもよい。従って、「有効投薬量」は、１つ又はそれ以上の治療薬を投与する状況で考慮してもよく、そして１つ又はそれ以上の他の薬剤と併せて所望の結果が得られる可能性があるか又は得られる場合、単剤は有効量で与えられるものと考えてよい。
【００５３】
本明細書で使用される「処置が必要な動物」又は類似の表現は、ＣＮＳに関わる自己免疫疾患を発症するリスクを有するか又はその危険性がある動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を意味する。ＣＮＳを冒す自己免疫疾患（又は障害、無差別に）の例は、マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）、及び他の動物に見られる類似の自己免疫疾患である。ＣＮＳの自己免疫攻撃は、例えば、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患、及びパーキンソン病にも見られる。
【００５４】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラットを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される「ベクター」は、宿主細胞中の関係する１つ又はそれ以上の１つ又は複数の遺伝子若しくは１つ又は複数の配列をデリバリーし、そして好ましくは発現することができる構成物を意味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び生成細胞などの特定の真核細胞を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される「発現調節配列」は、核酸の転写を方向付ける核酸配列を意味する。発現調節配列は、構成的若しくは誘導型プロモーター、又はエンハンサーなどのプロモーターであってよい。発現調節配列は転写する核酸配列に機能的に結合される。
【００５７】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される医薬品添加剤」は、有効成分と組み合わせた場合、成分が生物活性を保持することを可能とし、そして対象の免疫系と非反応性であるいずれの物質をも含む。例としては、リン酸緩衝食塩溶液などのいずれかの標準的薬剤担体、水、油／水乳濁液などの乳剤、及び種々のタイプの湿潤剤が挙げられるが、それらに限定されない。エアロゾル又は非経口的投与のための好ましい賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は生理食塩水（０.９％）である。当該担体を含む組成物は、周知の従来法（例えば、「Remingtonの薬学、第１８版」（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition）, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 及び「Remington、薬剤学の科学及び実践」（Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.） Mack Publishing, 2000を参照）によって製剤化される。
【００５８】
本明細書で使用される「末梢投与」又は「末梢血管から投与される」は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は血液脳関門（ＢＢＢ）の外側で対象に薬剤を導入することを指す。末梢投与は、脊椎又は脳への直接投与以外のいずれの投与経路をも包含する。末梢投与は局所的又は全身的であってよい。
【００５９】
中枢神経系（ＣＮＳ）を冒す自己免疫障害の処置のための、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト
本発明は、多発性硬化症及び中枢神経系（ＣＮＳ）を冒す他の自己免疫障害の処置のための、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの使用方法を提供する。本発明の１つの特徴として、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＣＮＳの組織への白血球浸潤を減少し及びＣＮＳの構成的神経組織の破壊を減少し、その結果として脚麻痺などこの疾患の臨床症状を改善するのに有効である。特に、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ミエリン抗原を提示し、そしてそれらを産生する細胞に対する細胞毒性作用に寄与するのに活性を有する、単球及びＴ細胞の移動を減少させる。
【００６０】
本発明に至る観察は、十分認められているＭＳの動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスを用いて行なわれた。ＥＡＥは、ヒトのＭＳと多くの臨床的及び病態的特徴を共有する実験的病状である。多くのＦＤＡ承認のＭＳ治療法が先ず発見され、そしてマウス及びラットにおけるＥＡＥモデルを基準に開発された（Steinman and Zamvil,
2006により検討された）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含む、ミエリンの幾つかの異なるタンパク質成分によるＥＡＥマウスの能動的免疫は、自己抗体の産生及び上行性麻痺の臨床症状を誘発する。例えば、ＭＯＧペプチドアミノ酸３５−５５（Aharoni, R., et al.）又はＰＬＰペプチドアミノ酸１３９−１５１（ＰＬＰｐ（１３９−１５１））で免疫後に、ＥＡＥをＣ５７ＢＬ／６マウスに誘発することができる。ＭＯＧ又はＰＬＰによる免疫は、ＭＳに類似した脱髄及び病的状態を引き起こすミエリン特異的自己免疫反応を誘導する。ＥＡＥの臨床的特徴は、多数の浸潤リンパ球、単球及びマクロファージによるＣＮＳの炎症及び脱髄を含む（図１）。
【００６１】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを用いる動物実験
本発明の裏付けとして行なわれた実験では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの直接投与は、ＣＮＳ特異的自己免疫疾患動物における病的状態及びＣＮＳ組織障害を減少させることが示された（図２〜４）。エキセンジン−４（ＥＸＥ４）は、ＭＯＧ免疫した後に続いてＥＡＥ動物に投与された。エキセンジン−４で処置した動物は、対照動物と比べて病的状態の有意な減少を示した。この結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの投与が、慢性ＥＡＥの進行を緩徐化させるのに有効なことを証明した。実験は、症状の発症に関してエキセンジン−４によって得られた保護が、ｔｒｋＢアゴニストＮＴ４（ＰＣＴ国際公開第２００８／０７８１７９号を参照）によって得られた保護と少なくとも同じ（もし、より良くない場合は）であること、そしてエキセンジン−４による処置は、処置が有効になるために症状発症時点まで継続する必要はないことを示した（図２）。
【００６２】
動物実験では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト化合物ＧＡＣ−１の週１回の投与が、対照と比べてＥＡＥ罹病率に対して有意な保護をもたらすことを示した。ＧＡＣ−１は週１回ベースで投与した場合に有効であった。実験は、ＧＡＣ−１による週１回の処置が、症状発症の時点まで少なくとも１日１回のエキセンジン−４処置と同様に保護することを示した。
【００６３】
組織学的分析は、対照ＥＡＥ動物からの切片と比べて、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストによって処置した動物から調製した切片においては、脱髄及び白血球浸潤減少を示した（図５Ａ〜Ｃ及び６Ａ〜Ｆ）。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物は、ＣＮＳＣＤ３＋細胞浸潤の証拠を事実上示さなかった。浸潤細胞の特定はＣＤ３発現Ｔ細胞及びＣＤ６８発現マクロファージの染色によって行なわれた。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物からの脊髄組織は、対照動物と比べた場合、実質的にＴ細胞及び単球浸潤減少を示した（図６Ａ〜Ｆ）。ＣＮＳ組織切片の組織化学染色の結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置がＣＮＳのリンパ球及び単球浸潤を減少させることを証明した。
【００６４】
ＥＡＥマウスでの活性化マーカーＭＨＣクラスＩＩ発現の解析は、エキセンジン−４による処置が、脳及び脊髄の両方において、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５hi（活性化ミクログリア及び浸潤マクロファージ）及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５lo（静止ミクログリア）細胞集団の両方で、ＭＨＣクラスＩＩの発現レベルを減少させることを示した（図７）。エキセンジン−４を与えたＥＡＥマウスからの静止ミクログリア、活性化ミクログリア及び浸潤マクロファージは、症状発症及び疾患ピークの両方で、ビヒクル処置対照動物からの細胞と比べてＭＨＣクラスＩＩ発現の低下を示した。
【００６５】
動物実験では、エキセンジン−４処置マウスの脾細胞は、ＥＡＥの養子免疫伝達モデルにおいて低病原性であることを示した（図８）。エキセンジン−４処置ＰＬＰ誘導マウスから分離した脾細胞を受けたマウスは、対照（ＰＢＳ処置）ＰＬＰ誘導マウスから分離した脾細胞を受けたマウスよりも実質的に低重度の疾患を発症した。
【００６６】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置ＥＡＥマウスの鼠径リンパ節重量は、ビヒクル処置対照ＥＡＥ動物のリンパ節よりも小さかった（図９Ａ）。対照処置ＥＡＥ動物のリンパ節は実質的に重かった。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置ＥＡＥマウスの脾臓はナイーブ動物の脾臓の重量及びサイズと同程度であり、ビヒクル処置対照ＥＡＥ動物の脾臓と対照的に、実質的に重くそして大きかった（図９Ｂ〜Ｃ）。
【００６７】
ＥＡＥ動物のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置に由来する免疫学的変化を解析するために動物実験が行なわれた（図１０Ａ〜Ｆ、１１Ａ〜Ｆ及び１２Ａ〜Ｆ）。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は、ナイーブ動物のＴｅｒ１１９＋細胞数の近くまで、ＭＯＧ誘発動物でＴｅｒ１１９＋細胞数の大幅減少をもたらした（図１２Ｄ〜Ｆ及び１３）。対照的に、ＰＢＳ処置対照ＥＡＥ動物は、Ｔｅｒ１１９＋細胞数を増加した。加えて、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は、ナイーブ動物と比べてＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ＋細胞数を増加したＰＢＳ処置対照ＥＡＥ動物と比べて、ＥＡＥ動物でＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ＋細胞数を減少させた（図１６及び１７）。免疫学的解析の結果、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は、ＥＡＥ動物でのヘルパーＴ細胞レベルを減少させることを示唆する。
【００６８】
上記の結果は、ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＣＮＳの脱髄及び白血球浸潤を減少させ、そして広く認められているＭＳの動物モデルであるＥＡＥの進行を緩徐化させるのに有効であることを証明した。天然のＧＬＰ−１Ｒアゴニストエキセンジン−４及びＧＬＰ−１ＲアゴニストＧＡＣ−１は、いずれも疾患進行減速に有効であった。組織化学実験では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが、Ｔ細胞及び単球によるＣＮＳ組織の浸潤を減少させることを示した。
【００６９】
ＣＮＳ自己免疫障害に対するＧＬＰ−１Ｒアゴニスト
理論に限定されることなく、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、主として白血球の移動を調節し、及び／又はＴｈ１及びＴｈ１７細胞レベルを減少させることにより機能すると考えられる。本方法は、更なる治療効果をもたらすために最近の免疫抑制療法と併用してもよい。
【００７０】
本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、多数の自己免疫又は関連疾患において、ＣＮＳ組織の白血球浸潤を減少させるために使用することができる。本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、多数の自己免疫又は関連疾患において、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞レベルを減少させるためにも使用することができる。ＭＳのモデルであることに加えて、ＥＡＥマウスは、視神経炎を研究するために使用することもできる。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、とりわけ白血球浸潤及び／又はＴｈ１及びＴｈ１７細胞によって媒介されるすべてのこれらの疾患及び他の自己免疫障害におけるＣＮＳ免疫浸潤を軽減することが期待される。用語の疾患及び障害は、区別せずに使用することを銘記されたい。
【００７１】
本発明の特徴は、自己免疫疾患を患っている動物に対するＧＬＰ−１Ｒアゴニストの直接投与である。本発明の好ましい実施態様はポリペプチドについて記載されているが、本発明は体内においてコード化されたＧＬＰ−１Ｒアゴニストの発現を方向付ける、当該ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチドをコード化するポリペプチドの投与を包含する。直接ＤＮＡ注入及び遺伝子療法デリバリーの方法は当技術分野で公知である。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド、又はそれらをコード化するポリヌクレオチドは、薬剤の投与により誘導するのと対照的に、動物に直接投与される。本発明は、天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト及び／又はアゴニスト抗体に合致する方法でＧＬＰ−１Ｒを結合し活性化する、ペプチド模倣薬分子をも包含する。
【００７２】
本明細書に記載の方法に従って使用するための特定のＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、以下に更に詳細に記載される。更なるＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、本発明の範囲から逸脱することなく当業者には明らかなものである。
【００７３】
天然のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト及びそれらの誘導体
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、プロエキセンジン（例えば、米国特許第６７２３５３０号を参照）、エキセンジン−３（例えば、米国特許第５４２４２８６号を参照）、ＯＡＰ−１８９（例えば、米国特許出願公開第２００９０１８１８８５号を参照、その全文は、参照することにより本明細書に組み入れられている）、及びオキシントモジュリンを含む、天然アゴニストポリペプチド、そのフラグメント、変異体、及び誘導体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用されるＧＬＰ−１及び／又はエキセンジン−４ポリペプチド配列は、結果として生じるポリペプチドがＧＬＰ−１Ｒに結合してアゴニストとして機能するという条件で、対応するＧＬＰ−１Ｒと同じ種から又は異なる種から生じたものであってよい。
【００７４】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、天然及び変異ＧＬＰ−１を含む。ＧＬＰ−１ポリペプチドは、多数の哺乳動物で同定されている。ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号１）は、２位置のアラニンにおいて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−４）によるＧＬＰ−１の切断によって生成された３０アミノ酸ＧＬＰ−１（７〜３６）ペプチドである。D.J.Drucker(2001)「内分泌学」（Endocrinology）142:521-527。ＧＬＰ−１（７〜３６）はＧＬＰ−１Ｒアゴニストとして機能し、グルコース依存性インスリン分泌増加をもたらす。しかしながら、ＧＬＰ−１（７〜３６）の半減期はわずか数分である。ピロテアーゼ切断部位は、ＧＬＰ−１ポリペプチドの半減期を延長するために除去されても、又はそれらの活性の調節を可能にするために加えられてもよい。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＰＥＧなどの半減期拡張部分、ＩｇＧＦｃ領域、アルブミン、又はＭｙｃ、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｈｉｓ−６、又はＦＬＡＧなどのペプチド若しくはエピトープに、結合又は融合してもよい。他の典型的ＧＬＰ−１ポリペプチドは、ＧＬＰ−１（７〜３７）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号４２）及びＧＬＰ−１（１〜４５）を含む（例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３２７５４号を参照）。
【００７５】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、更に天然及び変異エキセンジン−４を含む。エキセンジン−４はアメリカドクトカゲの唾液中に同定されている。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１と約５３％相同性の３９アミノ酸ペプチドである。アメリカドクトカゲエキセンジン−４の配列は、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２）である。ＧＬＰ−１（７〜３６）のように、エキセンジン−４はＧＬＰ−１Ｒアゴニストとして機能し、グルコース依存性インスリン分泌を促進する。しかしながら、ＧＬＰ−１（７〜３６）と異なり、エキセンジン−４はＤＰＰ−４による切断に対する抵抗性の増加を示す。ＧＬＰ−１（７〜３６）のＮ末端領域及びエキセンジン−４はほとんど同一であるが、有意な差異は第２アミノ酸残基である。この残基はＧＬＰ−１（７〜３６）ではアラニンであり、しかしエキセンジン−４ではグリシンである。Ｎ末端領域におけるこの単一アミノ酸は、ＤＰＰ−４消化に対するエキセンジン−４の抵抗性の増加に関与している。エキセンジン−４とＧＬＰ−１（７〜３６）との間の別な有意な差異は、Ｔｒｐケージを形成するエキセンジン−４のＣ末端における９つの更なるアミノ酸残基の存在である。
【００７６】
本発明の天然及び変異ＧＬＰ−１及びエキセンジン−４ポリペプチドは、キメラ、変異体、フラグメント（ペプチドを含む）、及び／又はその誘導体を含む。好ましいフラグメントは、天然ポリペプチドのＧＬＰ−１Ｒ結合部分、又はキメラの、コンセンサス、又は突然変異した等価結合部分を含む。フラグメントは合成ペプチドを含む。変異体は、保存又は非保存アミノ酸置換を有する天然アミノ酸配列変異体を含む。典型的変異体としては、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（米国特許出願公開第２００６０２０５０３７号）、ＯＡＰ−１８９、エキセンジン−４−Ｔｆ（国際公開公報第２００８０１２６２９号）、ＧＬＰ−１、及び米国特許出願公開第２００４０２４２８５３号に開示のエキセンジン−４ペプチドアナログが含まれるが、これらに限定されない。ＯＡＰ−１８９の配列は、ＨＡＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＥＱＥＬＶＫＹＦＩＱＷＬＫＮＡＧＰＳＫＮＮＩＡ（配列番号４３）である。
【００７７】
保存置換は、類似のサイズ、電荷、又は疎水性のアミノ酸残基を含む。例えば、ＡｌａはＶａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅによって置換してもよい。ＡｒｇはＬｙｓ、Ｇｌｎ、又はＡｓｎによって置換してもよい。ＡｓｎはＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇによって置換してもよい。ＡｓｐはＧｌｕによって置換してもよい。ＣｙｓはＳｅｒによって置換してもよい。ＧｌｎはＡｓｎによって置換してもよい。ＧｌｕはＡｓｐによって置換してもよい。ＧｌｙはＰｒｏによって置換してもよい。ＨｉｓはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇによって置換してもよい。ＩｌｅはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、又はノルロイシンによって置換してもよい。Ｌｅｕはノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＰｈｅによって置換してもよい。ＬｙｓはＡｒｇ、Ｇｌｎ、又はＡｓｎによって置換してもよい。ＭｅｔはＬｅｕ、Ｐｈｅ、又はＩｌｅによって置換してもよい。ＰｈｅはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、又はＡｌａによって置換してもよい。ＰｒｏはＧｌｙによって置換してもよい。ＳｅｒはＴｈｒによって置換してもよい。ＴｈｒはＳｅｒによって置換してもよい。ＴｒｐはＴｙｒによって置換してもよい。ＴｙｒはＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、又はＳｅｒによって置換してもよい。ＶａｌはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、又はノルロイシンによって置換してもよい。
【００７８】
機能の実質的な修飾は、（ａ）例えば、シート又はヘリカル立体配座として置換の部位におけるポリペプチドの骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の大きさの維持に対するそれらの効果において著しく異なる置換を選択することによって達成されると考えられる。天然残基は共通の側鎖特性（これらのあるものは、幾つかの官能基に分類することができる）に基づいてグループ分けされる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；及び
（６）たわみを誘導する残基：Ｇｌｙ及びＰｒｏ。
【００７９】
非保存置換は、１つのクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換し、又は前項で保存性と特定されなかった置換に関わる。
【００８０】
アゴニストの適正な立体配座を維持するのに関係しないいずれのシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し又は異常架橋を防止するために一般的にセリンと置換してよい。反対に、１つ又は複数のシステイン結合がその安定性を改善するためにアゴニストに付加されてもよい。
【００８１】
アミノ酸修飾は、可変領域など１領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸を変化させ又は修飾することから、完全な再設計までの範囲で変動することができる。可変領域の変化は、結合親和性及び／又は特異性を変えることができる。
【００８２】
変異体は、結果として得られるポリペプチド又は誘導体がＧＬＰ−１Ｒに結合してアゴニストとして機能するという条件で、天然アミノ酸配列変異体及び改変変異体を含む。ＧＬＰ−１Ｒ活性化を測定するための分析については、本明細書及び引用文献に記載されている。
【００８３】
誘導体は、共有結合又は非共有結合修飾ペプチド及びポリペプチド（例えば、アシル化、ペグ化、ファルネシル化、グリコシル化、又はリン酸化ポリペプチド）である。ポリペプチドは、結合及び／又は活性を調節し、生体内画像化を可能にし、半減期を調節し、血液脳関門を通る輸送を調節し、又は特定の細胞型又は組織へのポリペプチドのターゲッティングを補助するために、更なる官能基を含んでもよい。ポリペプチドは、置換がＧＬＰ−１Ｒへのポリペプチドの結合し、又はアゴニスト活性に実質的に影響を与えないことを条件として、修飾（例えば、ペグ化、グリコシル化、又は他の部位の追加）を促進させるためのアミノ酸置換を含んでもよい。
【００８４】
一般的な修飾は、生物活性の最小ロスで全身クリアランスを減少させるペグ化である。ポリエチレングリコール重合体（ＰＥＧ）は、当技術分野で公知の方法（例えば、Roberts et al. (2002)，「最新ドラッグデリバリー概説」（Advanced Drug Delivery Reviews）54:459-476; Sakane et al. (1997) Pharm. Res. 14:1085-91を参照）を用いて、ＧＬＰ−１及びエキセンジン−４ポリペプチド（並びにＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体）の種々の官能基へ結合してもよい。ＰＥＧは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、修飾又は天然Ｎ末端、アミン基、及びチオール基に結合してもよい。幾つかの実施態様では、１つ又はそれ以上の表面アミノ酸残基はＰＥＧ分子で修飾される。ＰＥＧ分子には様々なサイズ（例えば、約２〜４０ｋＤａの範囲）がある。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、又は他のポリペプチドに結合するＰＥＧ分子は、約２,０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００Ｄａのいずれかの分子量を有することができる。ＰＥＧ分子は、単一又は分枝鎖状であってよい。ＧＬＰ−１ＲアゴニストポリペプチドへＰＥＧを結合させるために、１つ又は両方の末端に官能基を有するＰＥＧの誘導体を使用してもよい。官能基は、ポリペプチド上の利用可能な反応性基のタイプに基づいて選択される。誘導体をポリペプチドに結合する方法は当技術分野で公知である。ＰＥＧのＮ末端特異的結合の１つの例は、ペグ化を促進するために１の位置の残基をセリン又はトレオニンに突然変異させることである。
【００８５】
ポリペプチド又はそれらの誘導体は、直接又は合成リンカーを経て他の分子に結合してもよい。好ましいＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド、そのフラグメント、又は誘導体は、その価値が報告されている天然のＧＬＰ−１Ｒアゴニストと比べて、類似の又はより優れた親和性、選択性、及び活性化を示す。アゴニストポリペプチドの小部分は「ペプチド」と呼ばれるが、この専門用語は、これに限定されると解釈すべきではない。
【００８６】
好ましいＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＥＡＥ動物モデルを含む本明細書に記載の数々の実験及び分析において、エキセンジン−４及びＧＡＣ−１と比べて類似の生物学的特性を示す。
【００８７】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト−抗体コンジュゲート
誘導体は、半減期を延長し及び／又は薬効を強化するための、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドの抗体への共有結合を更に含む。例えば、抗体の結合部位に直接か又は介在リンカーを介して、結合したＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド剤を含むＧＬＰ−１Ｒアゴニスト化合物は、米国特許出願公開第２００９００９８１３０号及びＰＣＴ国際公開第２００８／０８１４１８号に記載されており、いずれも、それらの全文が参照することにより本明細書に組み入れられている。当該ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト化合物は、本明細書では「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト−抗体コンジュゲート」又は「ＧＡＣ」と呼ばれる。ＧＡＣは、直接か又はリンカーを経て抗体に結合した、例えば、ＧＬＰ−１又はエキセンジン−４フラグメント又は誘導体などのＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドを含む。リンカーが使用される幾つかの実施態様では、リンカーは、ＧＬＰ−１ＲアゴニストペプチドとＧＬＰ−１Ｒ間の抗体制限結合を避けるために、抗体からＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドを遠ざけるように作用すると考えられる。
【００８８】
本明細書に記載のＧＡＣは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド、即ち、ＧＬＰ−１Ｒの活性化量を増加させるペプチドを含み、これは天然アゴニストＧＬＰ−１及びエキセンジン−４によって生じるものと類似の効果をもたらす。幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒペプチドは、１つ又はそれ以上のＲ基によって隣接してもよい。例えば、幾つかの実施態様では、ＧＡＣのＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、以下の構造を有してよい：Ｒ1−ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号１）−Ｒ2、ここで、Ｒ1は不存在、ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、又はＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3であり；そしてＲ2はＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣ6Ｈ5、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ2ＣＨ3、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基又は糖質である。他の実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、以下の構造を有してよい：Ｒ1−ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２）−Ｒ2（配列番号４）；ここで、Ｒ1は不存在、ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、又はＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3であり；そしてＲ2はＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣ6Ｈ5、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ2ＣＨ3、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基又は糖質である。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、配列番号１及び２のアナログを更に含む。当該アナログは、例えば、バイオアベイラビリティ増加、安定性増加、ＥＡＥ処置プロファイル改善、Ｔｈ１７細胞数減少プロファイル改善、食欲抑制改善、体重管理改善、及び／又は宿主免疫認識減少などの更なる有利な特性を有してもよい。本明細書で使用される配列番号１又は配列番号２のペプチドアナログは、本質的に配列番号１又は配列番号２の配列を有するペプチドであるが、しかし１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失、又はそれらの組み合わせを有する。
【００８９】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含む。好適な典型的配列番号１及び配列番号２アナログは、例えば、２００８年１月４日に出願された米国特許出願第１１／９６９８５０号（米国特許出願公開第２００９００９８１３０号として公開）の表ＩＩに記載され、その全文は、参照することにより本明細書に組み入れられている。
【００９０】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、当技術分野で周知の技術を用いて調製することができる。例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体コンジュゲート化合物を製造する方法は、米国特許出願公開第２００９００９８１３０号に記載されている。一般的には、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドの合成が第１工程であり、そして米国特許出願公開第２００９００９８１３０号に記載のように行なわれる。次いで、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、結合成分（リンカー）への連結のために誘導体化され、次いで抗体へ結合される。当業者には当然のことながら、使用される特異的合成工程は、３成分の正確な性質によって決まる。このように、本明細書に記載のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド−リンカーコンジュゲート及びＧＡＣは、容易に合成することができる。
【００９１】
本明細書で使用される「抗体」は、Ｂ細胞及びその変異体の産物である免疫グロブリン、並びにＴ細胞及びその変異体の産物であるＴ細胞受容体（ＴｃＲ）を含む。結合部位は抗原結合に関与する抗体分子の一部を指す。
【００９２】
本明細書に記載のＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、直接か又はリンカーを経て抗体中の結合部位に共有結合してもよい。適切なリンカーは、標的薬剤と抗体間で十分な距離を与えるように選択することができる。他のリンカーの検討としては、得られるＧＡＣ及びＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド−リンカーの物理的又は薬物動力学的特性に対する影響、溶解性、親油性、親水性、疎水性、安定性（概ね安定並びに計画的分解）、剛性、柔軟性、免疫原性、抗体結合の調節、ミセル又はリポソームへの取り込まれ能力などが含まれる。ペプチド組成、リンカー組成、結合残基位置の更に微小な変化は、得られる分子の種々の特性（例えば、安定性、溶解性、半減期、バイオアベイラビリティ、標的結合能力、アゴニスト又はアンタゴニスト活性、薬物動力学など）に対して予測できない及び驚くべき効果を有することができる。
【００９３】
幾つかの実施態様では、本発明を用いて使用するためのペプチドは、式Ｉ：
Ｒ1−［Ｈ1  Ｘ2  Ｅ3  Ｇ4  Ｔ5  Ｆ6  Ｔ7  Ｓ8  Ｄ9  Ｘ10  Ｓ11  Ｘ12  Ｘ13  Ｘ14
Ｅ15  Ｘ16  Ｘ17  Ａ18  Ｘ19  Ｘ20  Ｘ21  Ｆ22  Ｘ23  Ｘ24  Ｘ25  Ｘ26  Ｘ27  Ｘ28  Ｘ29  Ｘ30  Ｘ31  Ｘ32  Ｘ33  Ｘ34  Ｘ35  Ｘ36  Ｘ37  Ｘ38  Ｘ39  Ｘ40（配列番号３）］−Ｒ2
式中、
Ｘ2は、Ａｉｂ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａなどの保護基であり；Ｘ10は、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＡであり；Ｘ12は、Ｓ又はＫであり；Ｘ13は、Ｑ又はＹであり；Ｘ14は、Ｇ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ又はＬであり；Ｘ16は、Ｋ、Ｄ、Ｅ又はＧであり；Ｘ17は、Ｅ又はＱであり；Ｘ19は、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＡであり；Ｘ20は、オルニチン又はＫ（ＳＨ）Ｒ若しくはＫなどの誘導体化リジン基であり；Ｘ21は、Ｌ又はＥであり；Ｘ23は、Ｉ又はＬであり；Ｘ24は、Ａ又はＥであり；Ｘ25は、Ｗ又はＦであり；Ｘ26は、Ｌ又はＩであり；Ｘ27は、Ｉ、Ｋ又はＶであり；Ｘ28は、Ｒ、オルニチン、Ｎ又はＫであり；Ｘ29は、Ａｉｂ
又はＧであり；Ｘ30は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＧ又はＲであり；Ｘ31は、Ｐ又は不存在であり；Ｘ32は、Ｓ又は不存在であり；Ｘ33は、Ｓ又は不存在であり；Ｘ34は、Ｇ又は不存在であり；Ｘ35は、Ａ又は不存在であり；Ｘ36は、Ｐ又は不存在であり；Ｘ37は、Ｐ又は不存在であり；Ｘ38は、Ｐ又は不存在であり；Ｘ39は、Ｓ又は不存在であり；そしてＸ40は、連結残基又は不存在であり；かつ、Ｘ10、Ｓ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ24、Ｘ26、Ｘ27、Ｘ28、Ｘ32、Ｘ33、Ｘ34、Ｘ35、Ｘ36、Ｘ37、Ｘ38、Ｘ39又はＸ40の１つは、直接又は中間リンカーを経由して抗体の結合部位に共有結合できる求核性側鎖を含む連結残基（−［ＬＲ］−）で置換され、そして連結残基はＫ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、リジンのホモログ（Ｋ（ＳＨ）を含む）、ホモシステイン及びホモセリンから成る群から選択されてよい；
のものであってよい。
【００９４】
幾つかの実施態様では、本発明を用いて使用するためのペプチドは、式ＩＩ：
Ｒ1−［Ｈ1−（Ａｉｂ）2−Ｅ3−Ｇ4−Ｔ5−Ｆ6−Ｔ7−Ｓ8−Ｄ9−Ｖ10−Ｓ11−Ｓ12−Ｙ13−Ｌ14−Ｅ15−Ｇ16−Ｑ17−Ａ18−Ａ19−Ｋ20−Ｅ21−Ｆ22−Ｉ23−Ａ24−Ｗ25−Ｌ26−Ｖ27−Ｋ28−Ｇ29−Ｒ30（配列番号４）］−Ｒ2
の配列を含む。幾つかの実施態様では、残基の１つは結合残基と置換されてもよい。幾つかの実施態様では、Ｇ16又はＡ24の１つは、直接又は中間リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合できる求核性側鎖を含む結合残基で置換され、そして結合残基は、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、リジンのホモログ（Ｋ（ＳＨ）を含む）、ホモシステイン及びホモセリンから成る群から選択されてもよい。他の実施態様では、リンカーは、Ｒ30基のＣ末端、又は３１位置での更なる残基のＣ末端に共有結合してもよい。
【００９５】
幾つかの実施態様では、本発明を用いて使用するためのペプチドは、式ＩＩＩ：
Ｒ1−［Ｈ1−（Ａｉｂ）2−Ｅ3−Ｇ4−Ｔ5−Ｆ6−Ｔ7−Ｓ8−Ｄ9−Ｌ10−Ｓ11−Ｋ12−Ｑ13−Ｍ14−Ｅ15−Ｅ16−Ｅ17−Ａ18−Ｖ19−Ｒ20−Ｌ21−Ｆ22−Ｉ23−Ｅ24−Ｗ25−Ｌ26−Ｋ27−Ｎ28−Ｇ29−Ｇ30−Ｐ31−Ｓ32−Ｓ33−Ｇ34−Ａ35−Ｐ36−Ｐ37−Ｐ38−Ｓ39−Ｘ40（配列番号５）］−Ｒ2
式中、
Ｘ40は、結合残基又は不存在であり、Ｌ10、Ｓ11、Ｋ12、Ｑ13、Ｍ14、Ｅ16、Ｅ17、Ａ19、Ｒ20、Ｌ21、Ｅ24、Ｌ26、Ｋ27、Ｎ28、Ｇ32、Ｓ33、Ｇ34、Ａ35、Ｐ36、Ｐ37、Ｐ38、Ｓ39又はＸ40の１つは、直接又は中間リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合できる求核性側鎖を含む結合残基（−［ＬＲ］−）で置換され、かつ、結合残基は、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、リジンのホモログ（Ｋ（ＳＨ）を含む）、ホモシステイン及びホモセリンから成る群から選択されてもよい；
の配列を含んでもよい。
【００９６】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩでは、Ｘ2はＡｉｂなどの保護残基であってよく、又はアラニン、（例えば、ＧＬＰ１に見られるような）、又はグリシン（例えば、エキセンジン−４に見られるような）、又は別の残基であってもよい。
【００９７】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩでは、Ｒ1は、不存在、ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3又はＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3であってよく；そしてＲ2は、不存在、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）、ＮＨＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ3、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、ＮＨＣ6Ｈ5、ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＨＯＣＨ2ＣＨ3、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基又は糖質であってよい。
【００９８】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩでは；Ｒ1は不存在であってよい。式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩでは；Ｒ2はＮＨ2であってよい。
【００９９】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩでは、結合残基はリジン（Ｋ）であってよい。結合残基はＣであってよい。式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩでは、結合残基はＫ（ＳＨ）：
【化６】
2011057670.tif 000008
であってよい。
【０１００】
結合残基がＫ、Ｋ（ＳＨ）又はＣの場合、結合残基は下式：
【化７】
2011057670.tif 000009
のリンカーに更に共有結合してもよい。
【０１０１】
このリンカーは、下式：
【化８】
2011057670.tif 000010
のようにβラクタム基を通して抗体に共有結合してもよい。
【０１０２】
幾つかの実施態様では、リンカーのβラクタム基は、下式：
【化９】
2011057670.tif 000011
のように、抗体の２つの結合部位の少なくとも１つに共有結合してもよい。
【０１０３】
幾つかの実施態様では、結合残基及びリンカーは下式：
【化１０】
2011057670.tif 000012
の構造のものであってよい。
【０１０４】
幾つかの実施態様では、リンカー及び結合残基は、下式：
【化１１】
2011057670.tif 000013
のように、式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩによって例示されたもののようなＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドに共有結合してもよい。
【０１０５】
幾つかの実施態様では、ペプチド−リンカー複合体は下式：
【化１２】
2011057670.tif 000014
のように、抗体に共有結合してもよい。
【０１０６】
幾つかの実施態様では、ペプチド−リンカー複合体は下式：
【化１３】
2011057670.tif 000015
のように、抗体の結合部位の少なくとも１つに結合する。
【０１０７】
特定の実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチドは、配列：
Ｈ1−（Ａｉｂ）2−Ｅ3−Ｇ4−Ｔ5−Ｆ6−Ｔ7−Ｓ8−Ｄ9−Ｌ10−Ｓ11−Ｋ12−Ｑ13−Ｍ14−Ｅ15−Ｅ16−Ｅ17−Ａ18−Ｖ19−Ｒ20−Ｌ21−Ｆ22−Ｉ23−Ｅ24−Ｗ25−Ｌ26−Ｋ27−Ｎ28−Ｇ29−Ｇ30−Ｐ31−Ｓ32−Ｓ33−Ｇ34−Ａ35−Ｐ36−Ｐ37−Ｐ38−Ｓ39−Ｘ40（配列番号６）］
式中、
Ｍ14又はＸ40の１つは結合残基で置換される；
を含んでもよく、幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド−リンカーは、下式：
【化１４】
2011057670.tif 000016
のようにＫ40（結合残基）を経由してリンカーＡに結合したペプチド：
ＮＨ2−［Ｈ−（Ａｉｂ）−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ（配列番号７）］−ＮＨ2
を含む。
【０１０８】
化合物ＧＡＣ−１では、ペプチド：
ＮＨ2−［Ｈ−（Ａｉｂ）−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ（配列番号７）］−ＮＨ2
は、下式：
【化１５】
2011057670.tif 000017
のようにＫ40（結合残基）を経由してリンカーＡに結合し、抗体の結合部位に結合している。
【０１０９】
従って、ＧＡＣ−１は下式：
【化１６】
2011057670.tif 000018
の構造を有する。
【０１１０】
別の実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド−リンカーは、ペプチド：
ＮＨ2−［Ｈ−（Ａｉｂ）−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ（配列番号８）］−ＮＨ2
を含み、このペプチドは、下式：
【化１７】
2011057670.tif 000019
のようにＫ14（結合残基）を経由してリンカーＡに結合している。
【０１１１】
化合物ＧＡＣ−２では、ペプチド：
ＮＨ2−［Ｈ−（Ａｉｂ）−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ  （配列番号８）］−ＮＨ2
は、下式：
【化１８】
2011057670.tif 000020
のようにＫ14（結合残基）を経由してリンカーＡに結合し、抗体の結合部位に結合している。
【０１１２】
従って、ＧＡＣ−２は以下の構造：
【化１９】
2011057670.tif 000021
を有する。
【０１１３】
典型的なＧＡＣは、下記の表１に与えられるいずれかのペプチド配列を有するＧＡＣを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様では、ＧＡＣＧＬＰ−１Ｒアゴニスト化合物は、表１からのいずれかのＧＡＣである。表１に示されるデータは、米国特許出願公報第２００９００９８１３０号に記載の方法を用いて得られた。表１に与えられるＥＣ50値は、例えば、米国特許出願公報第２００９００９８１３０号の実施例３０に記載の、グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）分析を用いて測定された。表１において、ＥＣ50欄の（Ｐ）は、ペプチドを抗体に連結する場合のＥＣ50を示す。
【０１１４】
【表２】
2011057670.tif 000022
【０１１５】
【表３】
2011057670.tif 000023
【０１１６】
【表４】
2011057670.tif 000024
【０１１７】
上記のように、本発明で使用するための化合物は、抗体に共有結合してもよい。米国特許出願公開第２００９００９８１３０号（全文が参照することにより本明細書に組み入れられている）は、とりわけ、抗体、有用なフラグメント及び変異体及びその修飾、結合部位及びＣＤＲ、抗体調製、発現、ヒト化、アミノ酸修飾、糖鎖付加、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体の血清半減期増加、発現ベクター、哺乳動物宿主系及び折畳み、そして抗体技術の他の要素を記載している。
【０１１８】
幾つかの実施態様では、本発明の化合物と併せて使用することができる幾つかの抗体は、抗体結合部位に反応性側鎖を有してもよい。反応性側鎖は天然に存在してもよく、又は突然変異により抗体中に入れられてもよい。抗体結合部位の反応性残基は、残基が抗体を作製するために最初に同定されたリンパ系細胞に存在する核酸によりコード化される場合など、抗体と関連してもよい。代わりに、アミノ酸残基は、特定の残基をコード化するために、ＤＮＡを意図的に突然変異させることにより生じてもよい（例えば、Meares et al.による国際公開公報第０１／２２９２２号を参照）。反応性残基は、例えば、本明細書に記載の固有のコドン、ｔＲＮＡ、及びアミノアシル−ｔＲＮＡを用いた生合成取り込みによる非天然残基であってよい。別のアプローチでは、アミノ酸残基又はその反応性官能基（例えば、求核性アミノ基又はスルフヒドリル基）が、抗体結合部位中のアミノ酸残基に結合してもよい。従って、本明細書で使用される「抗体の結合部位中のアミノ酸残基を通して」生じる抗体との共有結合は、結合が抗体結合部位のアミノ酸残基へ直接であっても、又は抗体結合部位におけるアミノ酸残基の側鎖へ結合する化学部分を通してであってもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸はシステインであり、そして側鎖の反応基はスルフヒドリル基である。他の実施態様では、アミノ酸残基はリジンであり、そして側鎖の反応基はε−アミノ基である。
【０１１９】
触媒抗体は、１つ又はそれ以上の反応性アミノ酸側鎖を含む、好適な結合部位を有する抗体の１つの供給源である。当該抗体は、アルドラーゼ抗体、βラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、アミダーゼ抗体などを含む。
【０１２０】
１つの実施態様は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ３３Ｆ１２及びｍＡｂ３８Ｃ２、並びに当該抗体の好適なキメラ及びヒト化バージョン（例えば、ｈ３８Ｃ２、配列番号１１及び１２）などのアルドラーゼ抗体を含む。
【０１２１】
ｈ３８Ｃ２軽鎖配列（２１９アミノ酸）：
【化２０】
2011057670.tif 000025
【０１２２】
ｈ３８Ｃ２ｈ鎖配列（４４８アミノ酸）：
【化２１】
2011057670.tif 000026
【０１２３】
マウスｍＡｂ３８Ｃ２（及びｈ３８Ｃ２）は、ＨＣＤＲ３に近接してしかし外側に反応性リジンを有し、そして反応性免疫及び機構的模倣天然アルドラーゼ酵素によって生成した、新しいクラスの触媒抗体のプロトタイプである。C.F. Barbas 3rd et al., Science 278:2085-2092, 1997を参照。使用してもよい他のアルドラーゼ触媒抗体は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１５を有するハイブリドーマ８５Ａ２；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１４を有するハイブリドーマ８５Ｃ７；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１７を有するハイブリドーマ９２Ｆ９；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２３を有するハイブリドーマ９３Ｆ３；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２４を有するハイブリドーマ８４Ｇ３；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１８を有するハイブリドーマ８４Ｇ１１；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０１９を有するハイブリドーマ８４Ｈ９；ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−８２５を有するハイブリドーマ８５Ｈ６；ＡＴＣＣ  受入番号ＰＴＡ−１０１６を有するハイブリドーマ９０Ｇ８を含む。反応性リジンを通して、これらの抗体は、天然アルドラーゼのエナミンメカニズムを用いて、アルドール及びレトロアルドール反応を触媒する。例えば、J. Wagner et al., Science 270:1797-1800, 1995; C.F. Barbas 3rd et al., Science 278:2085-2092, 1997; G. Zhong et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38:3738-3741, 1999; A. Karlstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97:3878-3883, 2000を参照されたい。アルドラーゼ抗体、及びアルドラーゼ抗体を生成する方法は、米国特許出願公開第６２１０９３８号、第６３６８８３９号、第６３２６１７６号、第６５８９７６６号、第５９８５６２６号、及び第５７３３７５号に記載され、これらは、参照することにより本明細書に組み入れられている。
【０１２４】
本発明の化合物は、チオエステラーゼ及びエステラーゼ触媒抗体の結合部位に見られるもののように、反応性システインに、本発明の化合物を結合させることによって形成してもよい。好適なチオエステラーゼ触媒抗体は、K.D. Janda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2532-2536 (1994）によって記載されている。 好適なエステラーゼ触媒抗体は、P. Wirsching et al., Science 270:1775-1782 (1995）によって記載されている。反応性アミノ酸含有抗体は、反応性アミノ酸をコードするために抗体結合部位を突然変異させること、又は反応基を含むリンカーで抗体結合部位のアミノ酸側鎖を誘導化することを含み、当技術分野で周知の手段により調製してもよい。
【０１２５】
幾つかの実施態様では、抗体はヒト化抗体であってよい。好ましくは、ヒト化抗体は、βラクタム基又は結合部位に共有結合を形成することができる他の化学基に対して、高結合親和性を保持する。種々の形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体が意図される。幾つかの実施態様では、抗体は、ヒト定常ドメインＣκ及びＣγ1１を有するｈ３８ｃ２ＩｇＧ１及びｈ３８ｃ２Ｆａｂなどの、ヒト化アルドラーゼ触媒抗体である。C. Rader et al.,
2003, J. Mol. Bio. 332:889-899は、ｈ３８ｃ２Ｆａｂ及びｈ３８ｃ２ＩｇＧ１を産生するために使用することができる遺伝子配列及びベクターを開示している。ヒト生殖細胞系Ｖk遺伝子ＤＰＫ−９及びヒトＪk遺伝子ＪＫ４を、ｍ３８ｃ２のκ軽鎖可変ドメインのヒト化に対するフレームワークとして使用し、そしてヒト生殖細胞系遺伝子ＤＰ−４７及びＪH遺伝子ＪＨ４をｍ３８ｃ２の重鎖可変ドメインのヒト化に対するフレームワークとして使用した。Ｇ１ｍ（ｆ）アロタイプを有する抗体ｈ３８ｃ２ＩｇＧ１を含む本発明の化合物の特定の実施態様では、リンカーのβラクタム基は、重鎖の９９の位置でリジン残基の側鎖に結合してもよい。他の実施態様は、ｈ３８ｃ２の可変ドメイン（ＶL及びＶH）及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からの定常ドメインを含むキメラ抗体を使用してもよい。抗体は、ｈ３８ｃ２からのＶH及びＶLドメインを含む完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶH、ＶL、二重特異性抗体、又はミニ抗体であってよい。抗体は、ｈ３８ｃ２からのＶH及びＶLドメイン及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から成る群から選択される定常ドメインを含む抗体であってもよい。幾つかの実施態様では、抗体はｈ３８Ｃ２ＩｇＧ１であってもよい。幾つかの実施態様では、抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体からの定常領域を含むマウスアルドラーゼ抗体のヒト化バージョンであってもよい。他の実施態様では、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体からの可変領域、及びヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体からの定常領域を含むキメラ抗体であってよい。更なる実施態様では、抗体は、天然又はナイーブヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体からのポリペプチド配列を含む、マウスアルドラーゼ抗体の完全ヒト化バージョンであってよい。
【０１２６】
ヒト化アルドラーゼ抗体フラグメントの種々の形態も意図される。１つの実施態様では、ｈ３８ｃ２Ｆ（ａｂ’）2を使用する。ｈ３８ｃ２Ｆ（ａｂ’）2はｈ３８ｃ２ＩｇＧ１のタンパク分解によって産生してもよい。別の実施態様は、介在リンカー（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3により選択的に結合されるｈ３８ｃ２からのＶL及びＶHドメインを含む、ｈ３８ｃ２ｓｃＦｖを使用する。ヒト化に代わる方法として、ヒト抗体を生成することができる。
【０１２７】
他のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、例えば、抗ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体の、エキセナチド（BYETTA(登録商標)）、アルビグルチド、Ｒ１５８３、リラグルチド、ＡＶＥ−００１０、Ｓ４Ｐ及びＢｏｃ５（Chen et al. (2007), Proc. Natl. Acad. Sci. USA.104:943-948を参照）を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、ドゥトグリプチン（dutogliptin）、ゲミグリプチン(gemigliptin)、アログリプチン及びベルベリンなどのＤＰＰ−４阻害剤をも含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
幾つかの実施態様では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、モノクローナル抗ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体である。モノクローナル抗ＧＬＰ−１Ｒ抗体は当業者により容易に生産することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的手法は、現在当技術分野で周知である。例えば、M. Schreier et al., 「ハイブリドーマ技術」（Hybridoma Techniques） (Cold Spring Harbor Laboratory 1980); Hammerling et al.,「モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ」（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas） (Elsevier Biomedical Press 1981); Kennett et al.,「モノクローナル抗体」（Monoclonal Antibodies） (Plenum Press 1980)を参照されたい。不死化抗体分泌細胞系は、発癌ＤＮＡ又はＥＢＶによるＢリンパ球の直接形質転換など、融合以外の技術によっても産生することができる。必要に応じて、後に不死化細胞系に転換する正常Ｂリンパ球集団にチャレンジするために、幾つかの抗原供給源を使用することができる。
【０１３０】
ポリヌクレオチド
幾つかの実施態様では、本発明は、本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作製し発現することができる。
【０１３１】
幾つかの実施態様では、本発明は、本発明のいずれかのポリヌクレオチドを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。幾つかの実施態様では、組成物は、本明細書に記載のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施態様では、組成物は、本明細書に記載のいずれかのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。発現ベクター及びポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書に更に記載されている。
【０１３２】
幾つかの実施態様では、本発明は、本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。
【０１３３】
いずれの当該配列に補完的なポリヌクレオチドも、本発明に包括される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディング又はアンチセンス）又は二本鎖であってよく、そしてＤＮＡ（ゲノム、又は合成）又はＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含み１対１様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、及びイントロンを含まないｍＲＮＡ分子を含む。更なるコード又は非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド中に存在してもよいが、しなくてもよく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子及び／又は支持物質に結合してもよいが、しなくてもよい。
【０１３４】
ポリヌクレオチドは、天然配列（即ち、抗体又はその部分をコード化する内在性配列）を含み、又は当該配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コード化ポリペプチドの免疫反応性が天然の免疫反応性分子に比べて低下しないように、１つ又はそれ以上の置換、付加、欠失及び又は挿入を含む。コード化ポリペプチドの免疫反応性に及ぼす影響は、一般的に本明細書に記載のように評価することができる。変異体は、好ましくは、天然抗体又はその部分をコード化するポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％同一性、より好ましくは少なくとも約８０％同一性、尚より好ましくは少なくとも約９０％同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９５％同一性を示す。
【０１３５】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、下記に示す最大対応に整列した場合に、２つの配列中のヌクレオチド又はアミノ酸の配列が同じならば「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、一般的に配列類似性の局所領域を同定し比較する比較窓を通して配列を比較することによって行なわれる。本明細書で使用される「比較窓」は、少なくとも約２０の隣接位置、通常は３０から約７５まで、又は４０から約５０までのセグメントを指し、その場合、配列は、２つの配列を最適に整列した後で、同数の隣接位置の参照配列と比較してもよい。
【０１３６】
比較のための配列の最適アラインメントは、初期設定パラメータを用いたバイオインファマティクス・ソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）のLasergene一式中のMegalignプログラムを用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載された幾つかのアラインメント・スキームを具体化する: Dayhoff, M.O., 1978,「タンパク質進化の変化モデル−距離関係を検出するマトリックス」（A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships）. In Dayhoff, M.O. (ed.) 「タンパク質の配列と構造の地図」（Atlas of Protein Sequence and Structure）, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990,「アラインメント及び系統発生論の統一手法」（Unified Approach to Alignment and Phylogenes） pp. 626-645「酵素学の方法」（Methods in Enzymology） vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973,「数量分類学、数量分類学の原理と実際」（Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy）, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
【０１３７】
好ましくは、「配列同一性の割合」は、少なくとも２０位置の比較窓を通して２つの最適整列配列を比較することによって決定されるが、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントに対する参照配列（付加又は欠失を含まない）と比べて、２０％以下、通常は５から１５％、又は１０から１２％の付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含んでもよい。この割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が整合位置の数を与えるために両配列に生じる位置数を決定すること、参照配列（即ち窓サイズ）における位置の総数によって整合位置数を割ること、そして配列同一性の割合を与えるために結果に１００を掛けることによって算出される。
【０１３８】
又はその代わりに、変異体は、実質的に天然遺伝子又はその部分若しくは相補体に実質的に相同性であってもよい。当該ポリヌクレオチド変異体は、天然ポリペプチド（又は相補配列）をコード化するＤＮＡ配列へ中程度のストリンジェントな条件下において、ハイブリダイズすることができる。
【０１３９】
好適な「中程度ストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予洗すること；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで、一夜ハイブリダイズすること；続いて０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣのそれぞれで６５℃にて２０分間２回洗浄することを含む。
【０１４０】
本明細書で使用される「高度ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いる；（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアミドなどの変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸緩衝液を、７５０ｍＭ食塩、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共にｐＨ６．５で４２℃にて用いる；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波分解サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を４２℃にて、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃にて、そして５０％ホルムアミドを５５℃にて洗浄液で、続いてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣから成る高ストリンジェンシー洗浄液を５５℃にて用いるような条件である。熟練技術者、温度、イオン強度などを調整し、必要に応じてプローブ長さなどの因子を適合させる方法を認識するであろう。
【０１４１】
当業者には当然のことながら、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコード化する多くのヌクレオチド配列がある。これらのポリヌクレオチドの一部は、いずれもの天然遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を保有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差に因って変動するポリヌクレオチドが、本発明によって特に意図される。更に、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加及び／又は置換などの１つ又はそれ以上の突然変異の結果として変化する、内在性遺伝子である。得られるｍＲＮＡ及びタンパク質は構造又は機能の変化を有していてもよいが、しかし有していなくてもよい。対立遺伝子は標準技術（ハイブリダイゼーション、増幅及び／又はデータベース配列比較）を用いて同定することができる。
【０１４２】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組み換え法  又はＰＣＲを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成法は、当技術分野において周知されており、本明細書において詳細に説明する必要はない。当業者は、本明細書で提供される配列及び所望のＤＮＡ配列を生産するために、市販のＤＮＡ合成装置を使用することができる。
【０１４３】
組み換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入し、そして更に本明細書に記載のようにベクターを複製及び増幅するために、好適な宿主細胞中へ順々に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のいずれの手段によっても宿主細胞中に挿入し得る。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−交配又はエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。いったん導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、細胞内で非組込み型ベクター(プラスミドなど)として保持され、又は宿主細胞ゲノムに組込むことができる。このように増幅したポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法により宿主細胞から単離することができる。例えば、上記Sambrook et al., 1989を参照されたい。
【０１４４】
代わりに、ＰＣＲはＤＮＡの再生産を可能にする。ＰＣＲ技術は当技術分野で周知であり、米国特許第４６８３１９５号、第４８００１５９号、第４７５４０６５号及び第４６８３２０２号、並びに「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR:The Polymerase Chain Reaction）, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994）に記載されている。
【０１４５】
ＲＮＡは、適切なベクターに分離ＤＮＡを用いること、それを好適な宿主細胞へ挿入することにより得ることができる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡへ転写される場合、ＲＮＡは、例えば、上記のSambrook et al., 1989に記載のように、当業者に周知の方法を用いて分離することができる。
【０１４６】
好適なクローニングベクターは、標準技術に従って構成してもよく、又は当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択したクローニングベクターは、使用する目的の宿主細胞によって変化する可能性があると同時に、有用なクローニングベクターは、一般的に自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対して単一標的を有する可能性があり、及び／又はベクターを含むクローンを選択するのに使用することが可能なマーカー遺伝子を保有することができる。好適な例は、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Bluescript（例えば、ｐＢＳＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、並びにｐＳＡ３及びｐＡＴ２８などのシャトルベクターを含む。これら及び他の多くのクローニングベクターは、BioRad, Strategene、及び Invitrogenなどの販売業者から入手可能である。
【０１４７】
発現ベクターは、一般的に本発明のポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構成物である。発現ベクターは、宿主細胞内で染色体ＤＮＡのエピソームとしてか又は内在性部分として複製可能でなければならないことが示唆される。好適な発現ベクターとしては、例えば、ＰＣＴ国際公開第８７／０４４６２号に開示のように、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクター、コスミド、及び１つ又は複数の発現ベクターを含むが、それらに限定されない。ベクター成分は、一般的に１つ又はそれ以上の以下のもの：シグナル配列；複製の起源；１つ又はそれ以上のマーカー遺伝子；好適な転写調節因子（プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターなど）を含むが、それらに限定されない。発現（即ち、翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、及び終止コドンなどの１つ又はそれ以上の翻訳調節因子が有用である。
【０１４８】
関係するポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、又は他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント法（パーティクルガン法）；リポフェクション；及び感染（例えば、ベクターはワクシニアウイルスなどの感染体である）を含む多くの適切な手段のいずれかにより、細胞宿主に導入することができる。ベクター又はポリヌクレオチドを導入する選択は、しばしば宿主細胞の特性によって決まる。
【０１４９】
本発明は、本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドを含む宿主細胞をも提供する。ヘテロ接合性ＤＮＡを過剰発現することができるいずれの宿主細胞も、関係するポリペプチド又はタンパク質をコード化する遺伝子を分離する目的で使用することができる。哺乳動物宿主細胞の例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、及びＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＰＣＴ国際公開第８７／０４４６２号をも参照されたい。好適な非哺乳動物宿主細胞としては、原核細胞（大腸菌又は枯草菌など）及び酵母（Ｓ．セレビシアエ、Ｓ．ポンベ；又はＫ．ラクチスなど）が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中に存在する場合、関係する対応の内在性抗体又はタンパク質よりも約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、尚より好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＧＬＰ−１Ｒ又はＧＬＰ−１Ｒドメインに特異的に結合する宿主細胞のスクリーニングは、免疫測定又はＦＡＣＳによって達成される。関係するタンパク質を過剰発現する細胞は同定することができる。
【０１５０】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト組成物
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、多発性硬化症など中枢神経系を冒す自己免疫疾患の処置のための薬剤製造に使用することができる。このように、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む組成物は、本明細書に記載のように哺乳動物（ヒト患者を含む）における疾患を処置するのに使用することができる。
【０１５１】
本発明の方法で使用される組成物は、有効量のＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む。当然のことながら、組成物は１つより多いＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含むことができる。
【０１５２】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト組成物は、更に好適な薬学的に許容される医薬品添加剤を含んでもよい。好適な担体、賦形剤及び医薬品添加剤は当技術分野で周知されており、糖質、ろう、水溶性及び／又は膨潤性重合体、親水性又は疎水性物質、ゼラチン、脂肪油、溶媒、水などの物質を含む。使用される特定の担体、賦形剤及び医薬品添加剤は、本発明の化合物が適用される手段及び目的によって決まるものである。一般的に、安全な溶媒は、水などの非毒性水性溶媒及び水に溶解又は混合可能な他の非毒性溶媒である。好適な水性溶媒としては、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）など、及びその混合物である。製剤も、薬剤（即ち、本発明の化合物又はその医薬組成物）の洗練された提示、又は医薬品（即ち、薬剤）の製造における補助をもたらすために、１つ又はそれ以上の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、抗酸化剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味剤、芳香剤、着香剤及び他の既知添加剤を含む。幾つかの製剤は、リポソームなどの単体を含む。リポソーム製剤はサイトフェクチン、多重層ベシクル及び単層ベシクルを含むが、それらに限定されない。非経口及び経口ドラッグデリバリーのための医薬品添加剤及び製剤は、Remington, 「薬剤学の科学と実践」（The Science and Practice of Pharmacy） (2000)に記載されている。
【０１５３】
一般的に、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト組成物は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化されるが、他の投与形態を使用することができる。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、植物性又は他の類似の油脂、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル又はプロピレングリコールなどの水性又は非水溶媒にそれらを溶解、懸濁化及び乳化することにより；そして必要に応じて、溶解剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤及び保存剤などの既存の添加剤を用いて、注射製剤に製剤化することができる。
【０１５４】
投与及び投薬
本明細書に例示した投与計画及び治療投薬量は、動物体重、血中のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの半減期、及びＧＬＰ−１Ｒアゴニストの親和性などの当該因子によって決められた。好ましい投与計画及び投薬量は、投与間で体内のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの治療量を維持する。エキセンジン−４及びＧＡＣ−１の有効投薬量範囲は、本明細書に、Davies et al., 1993に、及び他の参考文献中に例示されている。
【０１５５】
本発明の裏付けとして行なわれた実験で示されるように、疾患経過中の初期でのエキセンジン−４による「パルス処置」は、動物の病的状態を減少させるのに十分であると考えられる。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの継続投与は、処置の有効性に必要ではないと考えられる。ＧＡＣによる処置などの他の実施態様では、週１回未満の頻度の処置は、処置の有効性に十分と考えられる。
【０１５６】
特定の薬剤投与計画、即ち、用量、投与時期及び反復は、処置されるヒト及び動物の年齢、病態、及び体重によって決まるといえる。初期薬剤投与計画は、動物実験から外挿してもよい。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト投与の時期／頻度は、特定のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの循環半減期（又は神経組織中の半減期）、血液脳関門を通過するアゴニストの量、細胞中のアゴニストの半減期、毒性、及びいわゆる副作用を基準にすべきである。
【０１５７】
本研究では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの投与は、腹腔内 (i.p.) 注射によって行なわれる；しかしながら他の投与経路も有効と予想される（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）。頭蓋内又は脊髄内／髄腔内投与（又はＣＮＳの他の組織への投与）は有効と考えられる。他の投与経路は、特定のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、そのコーティング、コンジュゲーション、又は特定の生物学的特性（例えば、経口、舌下、滑液嚢内、粘膜、経皮、関節内、腟内、肛門、尿道内、経鼻、耳内、経吸入、吸入法、経カテーテル、ボーラス投与、ステント又は他の埋め込み型装置、塞栓性組成物、点滴、貼付又は可溶性フィルムなど）に応じて好適であり得る。
【０１５８】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、好適な末梢経路を経由して好ましく投与される。それにもかかわらず、当然のことながら、わずかな割合のアゴニストが血液脳関門を通過し、中枢神経系の細胞にデリバリーされると考えられる。幾つかの例では、ＣＮＳへの経路をたどる末梢投与ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの量は小さい（せいぜい１％未満）。
【０１５９】
本発明の特徴は、自己免疫疾患を患う哺乳動物対象に対するＧＬＰ−１Ｒアゴニストの直接投与である。「直接」は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストポリペプチド、又は当該ポリペプチドの発現を方向付けすることができるポリヌクレオチドが、イノキュレーションの標準経路により動物にデリバリーされることを意味する。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、グルココルチコイド、細胞静止薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、メトトレキサート、アザチオプリン及びメルカプトプリン）などの免疫抑制薬、細胞傷害抗体（例えば、Ｔ細胞受容体及びＩＬ−２受容体特異的抗体）、Ｂ細胞欠失療法（例えば、抗ＣＤ２０抗体／RITUXAN（登録商標）、抗ＢＬｙＳ抗体）、Ｔ細胞移動障害薬（例えば、抗インテグリンα４／β１抗体／TYSABRI（登録商標）、イムノフィリンに作用する薬剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）、グラチラマー／COPAXONE（登録商標）、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノラート、及び外来抗体又は治療用抗原に対する動物の免疫反応を抑制するために使用される他の生物剤を含み、他の薬剤との組み合わせで動物にデリバリーしてもよい。
【０１６０】
自己免疫疾患を患うヒトを含む哺乳動物対象の処置において、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又は薬学的に許容される誘導体の治療的有効量が投与される。例えば、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、約０.１ｍｇ／ｋｇ体重から約１５ｍｇ／ｋｇ体重までの毎日の静脈内点滴で投与することができる。従って、１つの実施態様は、約０.５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。別の実施態様は、約０.７５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。別の実施態様は、約１.０ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。別の実施態様は、約２.５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。別の実施態様は、約５ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。別の実施態様は、約１０.０ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。別の実施態様は、約１５.０ｍｇ／ｋｇ体重の用量を与える。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はその薬学的に許容される誘導体の用量を、１日当り約１回から週当たり２回、又は代わりに毎週約１回から月当たり１回の間隔で投与する必要がある。１つの実施態様では、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト又はその薬学的に許容される誘導体のピーク血漿中濃度を達成するために、１用量は約０．００２ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌまで投与される。これは、適切な製剤（化学の当業者に公知のいずれの好適な製剤も使用することができる）において投与成分溶液の無菌注射剤によって達成し得る。望ましい血中レベルは、妥当な分析方法により測定した血漿中レベルを確認しながら、本発明のＧＬＰ−１Ｒアゴニストの持続点滴によって維持してもよい。
【０１６１】
個体に対してＧＡＣを投与する１つの方法は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド−リンカーコンジュゲートを個体に投与し、それがインビボで適切な抗体の結合部位と共有化合物を形成することを可能にすることを含む。インビボで形成するＧＡＣの抗体部分は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストペプチド−リンカーコンジュゲートの投与の前、同時、又は後に個体に投与してもよい。ＧＬＰ−１Ｒペプチドは、リンカー／反応性部分を含んでもよく、又は抗体結合部位は標的剤に共有結合するように好適に修飾してもよい。代わりに又は加えて、抗体は、適切な免疫原により免疫後に個体の循環中に存在し得る。例えば、触媒抗体は、担体タンパク質に結合された基質の反応性中間体で免疫することにより作成してもよい。R.A. Lerner and C.F. Barbas 3rd, 1996, Acta Chem. Scand. 50:672-678を参照されたい。特に、アルドラーゼ触媒抗体は、P. Wirsching et al., 1995, Science 270:1775-1782 (commenting on J. Wagner et al., 1995, Science 270:1797-1800)によって記載されているように、ジケトン部分に結合したキーホールリンペットヘモシアニンと投与することにより作成してもよい。
【０１６２】
天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニストより優れたＧＡＣの利点は、ＧＡＣが循環タンパク質リガンドと比べて、相対的に長い循環半減期を有する傾向を示すことである。例えば、天然アゴニストが連日投与を必要とする場合、ＧＡＣは週１回投与するだけでよい。
【０１６３】
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストによる処置は、多発性硬化症及び関連疾患に対し、既存の処置法と組み合わせることができる。多発性硬化症の処置及び管理のための既存薬は、以下：ＡＢＣ（即ち、Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone) 処置 (例えば、インターフェロン１ａ(AVONEX（登録商標）, REBIF（登録商標）)、インターフェロン１ｂ(BETASERON（登録商標）, BETAFERON（登録商標）)、酢酸グラチラマー(COPAXONE(登録商標));化学療法薬(例えば、ミトキサントロン (NOVANTRONE（登録商標）)、アザチオプリン(IMURAN（登録商標）)、シクロホスファミド(CYTOXAN（登録商標）, NEOSAR（登録商標）)、サイクロセリン(SANDIMMUNE（登録商標）)、メトトレキサート、及びクラドリビン(LEUSTATIN（登録商標）); コルチコステロイド及び副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（例えば、メチルプレドニゾロン(DEPO-MEDROL（登録商標）, SOLU-MEDROL（登録商標）)、プレドニゾン(DELTASONE（登録商標）)、プレドニゾロン(DELTA-CORTEF（登録商標）)、デキサメタゾン(MEDROL（登録商標）, DECADRON（登録商標）)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH（登録商標）)、及びコルチコトロフィン(ACTHAR（登録商標）); 疼痛介在(感覚異常) (例えば、カルバマゼピン(TEGRETOL（登録商標）, EPITOL（登録商標）, ATRETOL（登録商標）, CARBATROL（登録商標）)、ガバペンチン(NEURONTIN（登録商標）)、トピラマート(TOPAMAX（登録商標）)、ゾニサミド(ZONEGRAN（登録商標）)、フェニトイン(DILANTIN（登録商標）)、デシプラミン(NORPRAMIN（登録商標）)、アミトリプチリン(ELAVIL（登録商標）)、イミプラミン(TOFRANIL（登録商標）, IMAVATE（商標）, JANIMINE（登録商標）)、ドキセピン(SINEQUAN（登録商標）, ADAPIN（登録商標）, TRIADAPIN（登録商標）, ZONALON（登録商標）)、プロトリプチリン(VIVACTIL（登録商標）)、大麻及び合成カンナビノイド(MARINOL（登録商標）)、ペントキシフィリン(TRENTAL（登録商標）)、イブプロフェン(NEUROFEN（登録商標）)、アスピリン、アセトアミノフェン、及びヒドロキシジン(ATARAX（登録商標）); 及び他の処置法（例えば、ナタリズマブ(ANTEGREN（登録商標）)、アレムツズマブ(CAMPATH-1H（登録商標）)、４−アミノピリジン(FAMPRIDINE（登録商標）)、３，４−ジアミノピリジン、エリプロジル、ＩＶ免疫グロブリン（GAMMAGARD（登録商標）, GAMMAR-IV（登録商標）, GAMIMUNE N（登録商標）, IVEEGAM（登録商標）, PANGLOBULIN（登録商標）, SANDOGLOBULIN（登録商標）, VENOGLOBULIN（登録商標））を含むが、それらに限定されない。
【０１６４】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するための部品のキット（キット）も提供する。本発明のキットは、本明細書に記載のＧＬＰ−１Ｒアゴニストを含む１つ又はそれ以上の容器、及び本明細書に記載の本発明のいずれかの方法に沿った使用説明書を含む。一般的に、これらの使用説明書は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの投与方法についての解説を含む。キットは、処置が必要な動物を特定し、そして処置の有効性をモニター又は測定するための使用説明書を更に含む。使用説明書は、一般的に、投薬量、投与計画（投与の頻度）、及び投与経路に関する情報を含む。キットで提供される使用説明書は、データファイル又は表計算ソフトの形式で書かれ、又は機械／コンピュータ可読であってよい。容器は単位用量、大量包装（例えば、マルチドーズ包装）又はサブユニット用量であってよい。本発明のキットで提供される使用説明書は、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれるペーパーシート）に関する通常書面での使用説明書であるが、機械可読使用説明書（例えば、磁気又は光学保存ディスク媒体の使用説明書）も認められる。
【０１６５】
キットは、シリンジ、針、カテーテル、吸入器、ポンプ、アルコール交換、ゲージ、ＣＮＳ生検器具、組織学的抗体及び染色液などを含む、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストを投与するための器具をも含む。キットの構成部品は必要に応じて滅菌される。キットは、酢酸グラチラマー（ＧＡ）及びデキサメタゾンなどの免疫抑制薬を含む更なる薬剤を提供してもよいが、それらに限定されない。キットは、日付印、不正開封防止包装、及び高周波識別（ＲＦＩＤ）タグ又は他の在庫管理機能を含んでもよい。
【０１６６】
本発明のキットは、好適に包装されている。好適な包装は、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封Mylar又はプラスチックバッグ）などを含むが、これらに限定されない。吸入器などの特殊器具、経鼻投与器具（例えば、噴霧器）又はミニポンプなどの輸液用器具と組み合わせて使用するための包装も意図される。キットは、滅菌点検口（例えば、容器は皮下注射針によって穿通できる栓を有する静脈注射液バッグ又はバイアルであってよい）を有してよい。容器は、滅菌点検口（例えば、容器は皮下注射針によって穿通できる栓を有する静脈注射液バッグ又はバイアルであってよい）を有してもよい。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。容器は、第２の薬学低活性剤を含んでもよい。
【０１６７】
場合により、キットは緩衝剤などの更なる成分及び解説的情報を提供してもよい。通常、キットは、容器及び容器について又はそれに関連するラベル又は１つ又は複数の添付文書を含む。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例は説明の目的のためだけに提示され、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際、本明細書に示されそして記載されるものに加えられる本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者には明らかとなり、そして添付した特許請求の範囲内に属するものである。
【０１６９】
〔実施例１〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの同定
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、１つ又はそれ以上の以下の方法を含み、当該技術分野において認められている方法を用いて同定することができる。例えば、細胞内ｃＡＭＰの濃度増加を検出するアッセイを使用してもよい。このアッセイは、例えばｃＡＭＰ応答配列の調節下にあるレポーター遺伝子の発現を測定することによる、ｃＡＭＰの定性的又は定量的測定、並びに選択したＧＰＣＲの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストの同定及びキャラクタリゼーションに好適である。レポーターを発現するレポーター遺伝子を誘導することができる化合物は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストと同定される。１つのこのような分析は、候補化合物へのその反応を検出するために、ＧＬＰ−１Ｒ遺伝子の発現ベクター及びｃＡＭＰ応答配列の調節下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現ベクターにより、安定的にトランスフェクトされる、ヒト胎児腎細胞を用いる (Thorens, 1992,「細胞生物学」（Cell Biology) 89: 8641-8645; Drucker et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.84: 3434-3438）。
【０１７０】
アッセイの第１段階は、ＧＰＣＲ、本ケースではＧＬＰ−１Ｒ、の立体配座変化を含み、ここでこの受容体はｃＡＭＰ応答配列の調節下にあるレポーター遺伝子を含む真核細胞の細胞膜に存在する。受容体は、内在性受容体又は受容体をコード化する核酸であってよく、又は受容体構築物は、細胞に形質転換されてもよい。典型的には、第１の固相（例えば、第１のアッセイプレートのウェル）は、このような細胞（通常は哺乳動物細胞系）が固相に付着するように細胞の実質的に均質集団でコーティングされる。しばしば、細胞は付着性で、それにより自然に第１固相に付着する。次いで、候補アゴニストなどの被検体は、受容体（例えば、ＧＬＰ−１Ｒ）が被検体に暴露（又はそれと接触）するように、付着細胞を有するウェルに加えられる。このアッセイは、関心あるＧＰＣＲ（例えば、ＧＬＰ−１Ｒ）のアゴニストリガンドの同定を可能にする。被検体への暴露に続いて、付着細胞はレポーター遺伝子の発現を可能にする所定時間（例えば、約６時間）の間、適した条件下にインキュベートされる。
【０１７１】
次いで、細胞はアッセイの検出相にかけられる状態になる。レポーター遺伝子の発現は、例えばルシフェラーゼ活性の検出により測定される。ルシフェラーゼ活性の検出は、当技術分野で公知の任意の様々な適した方法によって行なうことができる。
【０１７２】
最初の同定に続いて、候補（例えば、抗ＧＬＰ−１Ｒモノクローナル抗体）のアゴニスト活性は、細胞内ｃＡＭＰの濃度を測定することにより更に確認し、リファインすることができる。典型的には、第１の固相（例えば、第１のアッセイプレートのウェル）は、このような細胞（通常は、例えばＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞系）が固相に付着するように細胞の実質的に均質集団でコーティングされる。候補は細胞を含むアッセイプレートに接種され、そして例えば約１時間適した条件下にインキュベートされる。細胞内のｃＡＭＰ濃度は、当業者に公知であって任意の種々の適した方法で検出することができる。例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度は、ｃＡＭＰ−Screen Direct(登録商標) システムキット（Applied Biosystems）の仕様書に従って検出することができる。HitHunter（登録商標）cAMP XS + Assay（DiscoveRX(登録商標））、インビトロベースの競合免疫測定法などの他のｃＡＭＰアッセイキットが商業的に入手可能である。簡潔に言えば、細胞溶解物からの遊離ｃＡＭＰは、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の小分子ペプチドフラグメント、標識ＥＤ−ｃＡＭＰコンジュゲートに対して抗体結合を競合する。遊離ｃＡＭＰの不存在下では、ＥＤ−ｃＡＭＰコンジュゲートは抗体によって捕捉されて、相補性に利用できないことから、低シグナルの結果となる。遊離ｃＡＭＰの存在下では、抗体部位は占有され、ＥＤ−ｃＡＭＰコンジュゲートをフリーのままにしてＥＡを補完できるようにし、基質加水分解に活性なβ−ｇａｌＥＦＣ酵素を形成させて化学発光シグナルを産生する。陽性シグナルは、抗体によって結合された遊離ｃＡＭＰの量に正比例して発生する。
【０１７３】
候補（例えば、ＧＬＰ−１Ｒモノクローナル抗体）のアゴニスト活性は、標的生物活性を試験するために知られているバイオアッセイにより、更に確認し、リファインすることができる。例えば、候補がＧＬＰ−１Ｒをアゴナイズする能力は、インスリン分泌を測定するアッセイで試験することができる。候補がインスリン分泌を促進させる能力は、ＲＩＮ−３８ラットインスリノーマ細胞系などの培養動物細胞に候補を与え、そして培地への免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）の放出をモニターすることにより測定することができる。代わりに、候補を動物に注射し、そして免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）の血漿レベルをモニターすることができる。
【０１７４】
ＩＲＩの存在は、例えばインスリンを特異的に検出することができる、ラジオイムノアッセイの使用を通して検出することができる。ＩＲＩの存在を検出することが可能な任意のラジオイムノアッセイを使用することができる；１つのこのようなアッセイはAlbano, J. D. M., et al., 1972, Acta Endocrinol., 70:487-509の方法の変法である。この変法では、ｐＨ７．４のリン酸／アルブミン緩衝液が用いられる。インキュベーションは、５００μｌのリン酸緩衝液、５０μｌの灌流液サンプル又は灌流液中のラットインスリン標準、１００μｌの抗インスリン抗血清（Wellcome Laboratories; １：４０，０００希釈)、及び１００μｌの125Ｉインスリンの連続添加で調製し、１０×７５ｍｍ使い捨てガラス管中で７５０μｌの総量とした。４℃で２〜３日間インキュベーション後、遊離インスリンは活性炭分離により抗体結合インスリンから分離される。アッセイ感度は１〜２ｕＵ／ｍＬである。組織培養で増殖した細胞の細胞培養培地へのＩＲＩ放出を測定するために、好ましくは放射標識をプロインスリンに組み込む。ポリペプチドを標識することが可能な任意の放射標識を使用することができるが、標識プロインスリンを得るためには、3Ｈロイシンを使用することが好ましい。  
【０１７５】
候補ＧＬＰ−１Ｒアゴニストがインスリン分泌促進特性を有するかどうかを測定するために、膵注入によって測定することもできる。In situ単離ラット膵灌流アッセイは、Penhos, J. C., et al., 1969, 「糖尿病」（Diabetes), 18:733-738の方法の変法である。３５０〜６００ｇ質量の絶食雄Charles River系アルビノラットをアミタールナトリウム (Eli Lilly and Co.：１６０ｎｇ／ｋｇ)の腹腔内注射で麻酔した。腎臓、副腎、胃、及び下部結腸血管を結紮した。全腸を、約４ｃｍの十二指腸及び下行結腸及び直腸を除いて切除した。従って腸の一小部分だけを灌流して、グルカゴン様免疫反応性を有する腸内物質による干渉の可能性を最小化した。灌流液は、４％デキストランＴ７０及び０．２％ウシ血清アルブミン画分Ｖを備えた改変クレブスリンガー（Krebs-Ringer）重炭酸緩衝液であり、そして９５％Ｏ2及び５％ＣＯ2でバブルさせた。非拍動流、４チャンネルローラーベアリングポンプ（Buchler polystatic, Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Corp.）を使用し、そして１つの灌流液源から他へのスイッチは、３方コックで切替えることにより達成した。灌流を行なって、モニターし、そして解析する方法は、Weir, G. C., et al., 1974, J. Olin. Inestigat. 54:1403-1412の方法に従うが、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
〔実施例２〕
多数のリンパ球及びマクロファージは自己免疫疾患マウスのＣＮＳに浸潤する
本実施例は、炎症細胞でＣＮＳの浸潤を説明する。
ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に再度、４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。ＭＯＧ免疫後日１８に動物（ＥＡＥ及びナイーブ）を犠牲にした。脊髄を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして２０μＭで凍結切片化した。ＣＤ３(Chemicon）及びＣＤ６８（Serotec）に対する一次抗体で免疫組織化学を行なった。Alexa 488（Invitrogen）に結合したヤギ抗ラット二次抗体を検出に使用した。クレシルバイオレット及びルクソールファーストブルー染色を使用して、浸潤細胞体及びミエリンを染色した。
図１の染色結果は、ＥＡＥマウス（上側）のＣＮＳが、健常マウス(下側)と比べて多数の浸潤Ｔ細胞、単球及びミクログリアを有することを示す。
【０１７７】
〔実施例３〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの直接投与は自己免疫疾患における罹病率（morbidity）を減少させる
本発明の裏付けとして行なった実験では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの直接投与は、ＣＮＳ特異的自己免疫疾患の動物における罹病率及びＣＮＳ組織損傷を減少させることが示された（図２）。ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちにそして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。
マウスをＭＯＧ免疫後日０から日９まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝１０）、２ｍｇ／ｋｇＮＴ４（陽性対照、ｎ＝１０）又はビヒクル（ＰＢＳ、陰性対照、ｎ＝１０）で毎日処置した。動物の罹病率を以下のようにスコア化した：０＝正常；１＝尾跛行；２＝中等度後肢弱；３＝準じて重度後肢弱（動物は困難を伴なうがまだ歩行可能）；４＝重度後肢弱（動物はまだ後肢を動かせるが歩行不能）；５＝完全後肢麻痺；及び６＝死亡。エキセンジン−４で処置した動物は、対照動物と比べて有意な罹病率低下を示した（図２）。この結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが慢性ＥＡＥの進行を緩徐化させるのに有効なことを示した。
【０１７８】
〔実施例４〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト化合物は自己免疫疾患の罹病率を減少させるのに有効である
動物実験は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト抗体コンジュゲート化合物ＧＡＣ−１が、対照免疫グロブリンと比べてＥＡＥ罹病率に対して有意な保護をもたらすことを示した（図３及び４）。
ＥＡＥを、ＣＦＡ(Difco)に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco)を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。マウスをＭＯＧ免疫後日０から日６まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝１０）か又はビヒクル（ｎ＝１０）で毎日処置した。別の群のマウスを、１ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１（ｎ＝１０）により週１回ベースで処置した。マウスを以下の尺度に従ってＥＡＥの臨床徴候で毎日評価した：０＝正常；１＝尾跛行；２＝中等度後肢弱；３＝準じて重度後肢弱（動物は困難を伴なうがまだ歩行可能）；４＝重度後肢弱（動物はまだ後肢を動かせるが歩行不能）；５＝完全後肢麻痺；及び６＝死亡。ＧＡＣ−１は、ＭＯＧ免疫後週１回投与した場合、罹病率を減少させるのに有効であった（図３）。
別の実験では、ＥＡＥを前記のように誘発した。第１群の動物をＭＯＧ免疫後、日０から日２まで３ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝１０）で、そして日３から日８まで１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４で処置した。第２群の動物をＭＯＧ免疫後日０に３ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１（ｎ＝１０）で処置し、その後免疫後日７に開始して１ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１で週１回処置した。第３群の動物はＰＢＳ（対照、ｎ＝１０）で毎日処置した。臨床スコアを前記の基準に従って毎日モニターした。ＧＡＣ−１は、３ｍｇ／ｋｇの初回用量で投与し、その後１ｍｇ／ｋｇの週１回用量で投与した場合にも、尚罹病率を減少させるのにより有効と考えられた（図４）。結果は、３ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１の初回用量が、１ｍｇ／ｋｇだけの用量よりも罹病率に対して一層の保護（即ち、より低い罹病率）をもたらすことを示した。
【０１７９】
〔実施例５〕
ＧＬＰ−１ＲアゴニストはＣＮＳの炎症細胞浸潤をブロックし、自己免疫疾患の脱髄を減少させる
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが動物での保護を媒介するメカニズムを更に解明するために、組織学的分析を行なった。脊髄切片を対照、エキセンジン−４処置、及びＧＡＣ−１処置ＥＡＥ誘発動物から調製し、次いでミエリン又は浸潤細胞を同定する白血球マーカーに特異的な抗体を染色するために、ルクソールファーストブルーで染色した。対照動物では、染色はミエリン発現神経細胞のバックグラウンドに対して、白血球浸潤及び細胞破壊の領域を示した（図５Ａ、６Ａ及び６Ｄ）。白血球浸潤減少がＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物から調製した切片で認められた（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｅ及び６Ｆ）。かなりのＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物は、ＣＮＳ白血球浸潤の証拠を実質的に示さなかった。
【０１８０】
脊髄切片を、脱髄を測定するルクソールファーストブルーで染色した（図５Ａ−Ｃ）。ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。動物を１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４又はＰＢＳ対照で毎日、又は１ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１で週１回処置した。動物をＭＯＧ免疫後日１８に犠牲にした。脊髄を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして２０μＭで凍結切片化した。ミエリン染色は、ルクソールファーストブルーを用いて行なった。
【０１８１】
図５Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ処置対照ＥＡＥ動物（図５Ａ）、エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物（図５Ｂ）及びＧＡＣ−１処置ＥＡＥ動物（図５Ｃ）からの脊髄の代表的な画像を示している。対照マウスの脳は、重度脱髄の領域（即ち、図５Ａの黒矢によって示されるように、ルクソールファーストブルー染色の不存在）を示した。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物の切片には、重度脱髄及び／又はニューロン死の領域は認められなかった（図５Ｂ及びＣ）。ＣＮＳ組織切片の組織化学染色の結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置がＣＮＳの脱髄を減少させることを実証した。
【０１８２】
浸潤細胞の同定は、２つの白血球マーカー、Ｔ細胞に存在するＣＤ３及びマクロファージに存在するＣＤ６８に特異的な抗体を用いて行なわれた。ＥＡＥを前記のように雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発した。動物を１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４又はＰＢＳ対照で毎日、又は１ｍｇ／ｋｇＧＡＣ−１で週１回処置した。動物をＭＯＧ免疫後日１２に犠牲にした。脊髄を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして２０μＭで凍結切片化した。免疫組織化学はＣＤ３（Chemicon）及びＣＤ６８（Serotec）に対する一次抗体を用いて行なわれた。Alexa488（Invitrogen）に接合したヤギ抗ラット二次抗体が検出に使用された。
【０１８３】
図６Ａ〜Ｃは、ＣＤ３抗体で染色した結果を示す。多数の明染色断続領域が脱髄領域に対応して対照動物の脊髄に現われた（図６Ａ）。対照的に、エキセンジン−４又はＧＡＣ−１で処置したマウスから得た脊髄切片は、ＣＤ３に対していずれも事実上染色を示さなかったことから（それぞれ、図６Ｂ及び６Ｃ）、Ｔ細胞浸潤はＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物で実質的に減少することが示された。当該観察は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物からの脊髄組織が、対照動物と比べた場合、Ｔ細胞浸潤減少を実質的に示すことを指示した。
【０１８４】
図６Ｄ〜Ｆは、ＣＤ６８抗体による染色の結果を示す。対照マウス（図６Ｄ）から調製した切片は、エキセンジン−４又はＧＡＣ−１処置マウスからの切片（それぞれ、図６Ｅ及び６Ｆ）よりも強く染色した。当該観察は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物からの脊髄組織が、対照動物と比べた場合実質的に単球浸潤減少を示すことを指示した。総合すれば、ＣＮＳ組織切片の免疫組織化学染色の結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置がＣＮＳのリンパ球及び単球浸潤を減少させることを実証した。
【０１８５】
〔実施例６〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは脳及び脊髄のミクログリア及び浸潤マクロファージ中の活性化マーカーを減少させる
本実施例は、疾患発症時（ＭＯＧ誘発後日１５）及び疾患ピーク時（ＭＯＧ誘発後日２８）の両方における、脳及び脊髄のミクログリア及び浸潤マクロファージ中の活性化マーカー、ＭＨＣ−ＩＩ発現のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト媒介による減少を例証する。
ＣＮＳ中の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対するエキセンジン−４の作用を評価するために、日０にマウスにＭＯＧを投与した。ＭＯＧ誘発動物に、日０から日９まで（各処置群ｎ＝９）エキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを投与した。３匹のエキセンジン−４処置ＥＡＥマウス及び３匹のビヒクル処置ＥＡＥ対照マウスを、日１５（疾患発症）及び日２８(疾患ピーク)に犠牲にした。ミクログリアを犠牲動物から分離した。簡潔に言えば、マウスをイソフルランで麻酔し、排出液がクリアになるまで左室を通して冷滅菌ＰＢＳで灌流した。脊髄及び脳は冷ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に集めた。脊髄及び脳を、ＨＢＳＳを用いてナイロン細胞ストレーナー（１００μｍ）を通して押し出した。集めて漉した物質を、遠心分離によりペレット化した。ペレットは、脊髄又は脳当り１ｍｌのＨＢＳＳに、コード（cord）当り３００Ｕ／ｍｌのＩＶ型クロストリジウムコラゲナーゼを用いて再懸濁した。３７℃インキュベータ中で６０分間のインキュベーションを行った後、脊髄又は脳ホモジネートを３０％パーコール（Percoll）に入れ、７０％パーコールを下に入れた。そのグラジエントを遠心分離し、そして単球細胞を３０％／７０％パーコール界面から集めた。残存パーコールを除去するために、３５０ｇで５分間、ｃＤＭＥＭ中にて２回界面から細胞を洗浄した。
【０１８６】
精製α−ＦｃｇＲ（２．４Ｇ２）でブロック後、単細胞懸濁液を多色フローサイトメトリーで染色した。ＭＨＣクラスＩＩ（１０−３．６）、Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ）、ＣＤ４５及びＣＤ１１ｂに特異的なモノクローナル抗体はBD  Biosciencesから購入した。死細胞を排除するために、サンプルをフローサイトメトリー解析前に、Hoescht 33342（ＨＯ、Calbiochem）と共に氷上で５分間インキュベートした。成熟及び／又は固定アーチファクトを回避するために、細胞懸濁液を染色後直ちに解析した。死細胞（ＨＯhi）及びＢ２２０hi細胞は解析中に排除された。ミクログリア及びＣＮＳ−マクロファージ解析では、サンプルをＬＳＲＩＩで解析し、そしてflowjoソフトウェア（FlowJo, Ashland, Oregon）で解析した。
【０１８７】
ミクログリアサブセットを、ＣＤ４５及びＣＤ１１ｂの発現に基づいて異なるサブセットに分けた。２つの異なる細胞集団サブセット、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５hi（活性化ミクログリア及び浸潤マクロファージ）及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５lo（静止ミクログリア）について、ミクログリア／単球活性化マーカーＭＨＣクラスＩＩの発現プロファイルを更に解析した。
【０１８８】
フローサイトメトリー解析の結果は、エキセンジン−４による処置が、症状発症（即ち、誘発後日１５）及び疾患ピーク（即ち、誘発後日２８）の両時点で、脳及び脊髄の両方において、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５hi及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５lo細胞集団の両方でＭＨＣクラスＩＩの発現レベルを減少させることを示す（図７）。図７に図示した各グラフは、示された蛍光強度で染色された全細胞の割合を示す。蛍光強度は、細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩ発現量を表わす（ＭＨＣクラスＩＩ発現は蛍光強度と正に相関した）。
【０１８９】
解析の結果は、ビヒクル処置対照ＥＡＥ動物の細胞との比較により、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置が、疾患発症及び疾患ピーク両時点において脳及び脊髄ミクログリア及び浸潤マクロファージでのＡＰＣ活性化マーカーＭＨＣクラスＩＩの発現を抑制することを実証した。
【０１９０】
〔実施例７〕
エキセンジン−４処置マウスからの脾細胞はＥＡＥの養子免疫伝達モデルにおいて低病原性である
本実施例は、養子免疫伝達モデルにおけるエキセンジン−４処置ＥＡＥマウスの脾細胞の病原性減少を例証する。
ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した５００μｇのＰＬＰｐ（１３９−１５１）の注射により８から１２週齢のＳＪＬ／Ｊ雌マウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) に誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加した。免疫動物を１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝７）か又はＰＢＳ（ｎ＝７）で毎日処置した。処置動物を免疫後日５に犠牲にし、脾臓及び排出リンパ節を集めた。細胞を２０μｇ／ｍｌＰＬＰｐ（１３９−１５１）と共にインビトロで培養した。４８時間後、培養細胞を集め、ナイーブＳＪＬ／Ｊ動物に尾静脈注射を通して注入した。２千万の細胞を各動物に注射した。動物に、エキセンジン−４処置ドナー（ｎ＝７）か又は対照ＰＢＳ処置ドナー（ｎ＝７）からの細胞を投与した。
レシピエントマウスは、臨床スコア及び体重変化を毎日モニターした。ＥＡＥの臨床徴候を以下の尺度により評価した：０＝正常；１＝尾跛行；２＝中等度後肢弱；３＝準じて重度後肢弱（動物は困難を伴なうがまだ歩行可能）；４＝重度後肢弱（動物はまだ後肢を動かせるが歩行不能）；５＝完全後肢麻痺；及び６＝死亡。図８に示すように、エキセンジン−４処置動物からのドナー細胞を投与したマウスは、ＰＢＳ処置対照動物からのドナー細胞を投与したマウスよりも有意に低い疾患重症度を有した。この結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置が、ＥＡＥの養子免疫伝達モデルにおける脾細胞の病原性を減少させることを実証した。
【０１９１】
〔実施例８〕
エキセンジン−４はＥＡＥ誘発マウスにおいて二次リンパ器官のサイズを縮小させた
本実施例は、ＥＡＥマウスにおける二次リンパ器官のサイズに対するエキセンジン−４の効果を例証する。
ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。ＭＯＧ誘発動物を１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝７）、ＰＢＳ（ｎ＝７）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ｎ＝３）対照で毎日処置した。１群のナイーブ動物（ｎ＝３）も含まれた。疾患誘発後日５に動物を安楽死させた。脾臓及び鼠径リンパ節を解剖して秤量した。リンパ節質量及び脾臓質量及びサイズは、ＰＢＳで処置したＥＡＥ動物で顕著に増加した（図９Ａ〜９Ｃ）。しかしながら、エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物のリンパ節（図９Ａ）及び脾臓（図９Ｂ）は、対照動物よりも有意に少ない質量であった。同様に、免疫抑制薬デキサメタゾンもＥＡＥ動物のリンパ節及び脾臓質量を減少させた。エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物の脾臓はナイーブ動物の脾臓と同程度のサイズであった（図９Ｃ）。対照的に、対照ＥＡＥ動物の脾臓は有意に肥大した（図９Ｃ）。これらの結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置がＥＡＥの二次リンパ器官のサイズを減少させるのに有効なことを実証した。
【０１９２】
〔実施例９〕
自己免疫疾患におけるエキセンジン−４治療後の免疫学的変化
本実施例は、エキセンジン−４処置後の免疫学的変化を例証する。
最新のＭＳ治療薬（コルチコステロイド及びＣＤ２０抗体RITUXANTMを含む）は、免疫抑制、Ｔ細胞枯渇、Ｂ細胞枯渇及び／又は免疫反応に関する他の作用を示す免疫調節薬である。ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＥＡＥにおいてＴ細胞及びＢ細胞集団に影響を与えるかどうかを判定するために、ＥＡＥ動物の免疫学的変化を、エキセンジン−４処置後に評価した。比較のために、動物を陰性対照としてのＰＢＳで処置した。
【０１９３】
ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。動物を免疫後日０から日６まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝３）か又はＰＢＳ（ｎ＝３）で毎日処置した。処置動物を、免疫しなかったナイーブマウス（ｎ＝３）と共に免疫後日６に犠牲にした。脾臓、リンパ節及び末梢血を集めた。赤血球細胞の細胞分離及び溶解後に、細胞を発蛍光団結合ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）及びＴｅｒ１１９抗体（BD Biosciences）で染色した。細胞を、FACSAriaTMセルソーター（BD Biosciences）による蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて解析した。
【０１９４】
脾臓、リンパ節及び血液中のリンパ球レベルは、ＰＢＳ処置ＥＡＥ動物と比べてエキセンジン−４処置ＥＡＥ動物では不変と思われた（図１０Ａ〜Ｃ）。脾臓中の単球レベルは、脾臓エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物でやや減少したが（図１０Ｄ）、リンパ節及び血液中では有意に変化しなかった（図１０Ｅ及び１０Ｆ）。エキセンジン−４処置はＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞集団を有意に変化させなかった（図１１Ａ〜Ｆ）。エキセンジン−４マーカーに由来するＣＤ１９＋集団の変化は、正に統計的有意水準に達した（図１２Ａ〜Ｃ）。これらの所見は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞を直接殺細胞するコルチコステロイド及びRITUXANTMなどの免疫抑制薬と、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの作用メカニズムは異なることを示唆する。
【０１９５】
ＥＡＥ動物のエキセンジン−４処置により、脾臓においてＴｅｒ１１９＋細胞集団がナイーブレベルに戻る大幅な減少が認められた（図１２Ｄ）。Ｔｅｒ１１９＋細胞はリンパ節には存在せず（図１２Ｅ）、そして血液中で有意に変化しなかった（図１２Ｆ）。この結果は、エキセンジン−処置が、ＥＡＥマウス脾臓中のＴｅｒ１１９＋細胞集団を減少させるのに非常に有効なことを実証した。
【０１９６】
別の実験では、ＥＡＥを前記のように雌マウスに誘発させた。動物を１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝７）、ＰＢＳ（ｎ＝７）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ｎ＝３）対照で毎日処置した。１群のナイーブ動物（ｎ＝３）も実験に含まれた。疾患誘発後日５に動物を安楽死させた。脾臓及び鼠径リンパ節を解剖し、そして細胞を分離し、赤血球分化マーカーＴｅｒ１１９及びＣＤ４の表面染色を行ない、ＦＡＣＳで解析した。Ｔｅｒ１１９＋細胞の割合を測定した（図１３）。罹患動物はナイーブ動物に比べて高率のＴｅｒ１１９＋細胞を有する一方で、エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物は、ＰＢＳ処置ＥＡＥ動物と比べて低率のＴｅｒ１１９＋細胞を有した。免疫抑制薬デキサメタゾンによる処置も、ＥＡＥ動物においてＴｅｒ１１９＋細胞の２０〜２５％減少をもたらしたが、エキセンジン−４処置（５０〜５５％）ほどではなかった。この結果は、エキセンジン−４処置がＭＯＧ免疫動物の脾臓中のＴｅｒ１１９＋細胞の割合を減少させるのに有効なことを実証した。
【０１９７】
〔実施例１０〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は自己免疫疾患におけるＴ細胞活性化を減少させた
本実施例は、ＥＡＥマウスのエキセンジン−４処置後のＴ細胞活性化レベルの変化を例証する。
ＥＡＥを、前記のようにＭＯＧ（３５−５５）により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発した。免疫動物は、ＰＢＳビヒクル（ｎ＝７）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝７）、又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ｎ＝３）で毎日処置した。動物は、免疫しなかったナイーブ群の３匹のマウスと共に、免疫後日５に犠牲にした。リンパ節を集めた。細胞分離及び赤血球細胞の溶解後に、細胞を発蛍光団結合ＣＤ４及びＣＤ４４抗体（BDbiosciences）で染色した。細胞はFACSariaTMセルソーター (BD Biosciences）を用いて解析した。解析では、ＦＡＣＳ像はＣＤ４＋細胞でゲートされた。高レベルのＣＤ４４（ＣＤ４４hi）を有する細胞及びＣＤ４に対する陽性染色は、活性化ＣＤ４細胞と同定した。ＣＤ４＋ＣＤ４４hi細胞の割合を各処置群で解析した。
図１４に示すように、約３５％のＣＤ４細胞がナイーブ動物で活性化（ＣＤ４＋ＣＤ４４hi）された。ＥＡＥ動物からの約６０％のＣＤ４細胞が活性化された(図１４)。エキセンジン−４及びデキサメタゾンによる両処置は、活性化Ｔ細胞の割合を減少させ、ナイーブレベルに戻した（図１４）。データを一元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、続いてペアワイズ比較のためのダネット（Dunnett）事後検定を行なった。２アスタリスク（**）は、Ｐ値が、ＰＢＳ処置ＥＡＥとエキセンジン−４処置ＥＡＥ群間で、ペアワイズ比較で０.０１より小さいことを示す。      
この結果は、エキセンジン−４処置が、 ＥＡＥ誘発後のＴ細胞活性化を抑制するのに有効なことを実証した。
【０１９８】
〔実施例１１〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は自己免疫疾患においてＣＤ４Ｔ細胞増殖を阻害した
本実施例は、ＥＡＥマウスのエキセンジン−４処置後のＴ細胞増殖の変化を例証する。
ＥＡＥを、前記のようにＭＯＧ（３５−５５）により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発した。免疫動物は、ＰＢＳビヒクル（ｎ＝７）、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝７）、又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ｎ＝３）で毎日処置した。動物は、免疫しなかったナイーブ群の３匹のマウスと共に、免疫後日５に犠牲にした。リンパ節を集め、４８時間ＭＯＧ刺激で培養し、次いで増殖細胞を同定するためにＢｒｄＵで処置した。ＢｒｄＵの添加の１８時間後細胞を採取した。細胞増殖を測定するために、ＢｒｄＵ染色キット（BD Biosciences）をパシフィックブルー結合ＣＤ４抗体と一緒に使用した。細胞は、FACSariaTMセルソーター（BD Biosciences）を用いて解析した。ＣＤ４＋／ＢｒｄＵ＋細胞は増殖ＣＤ４Ｔ細胞と同定した。
図１５に示すように、ナイーブ動物からのＣＤ４細胞はＭＯＧ刺激に応答してほとんど増殖せず；ナイーブ動物からのわずか約３％のＣＤ４Ｔ細胞がＢｒｄＵに対して陽性であった。対照的に、ＥＡＥ動物からの細胞は、ＭＯＧ刺激に応答してナイーブ動物からの細胞よりもはるかに大幅な程度増殖していた（図１５）。エキセンジン−４及びデキサメタゾンによる処置は、ＣＤ４細胞増殖を有意に阻害した（図１５）。データを一元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、続いてペアワイズ比較のためのダネット事後検定を行なった。３アスタリスク（***）は、Ｐ値が、ＰＢＳ処置ＥＡＥとエキセンジン−４処置ＥＡＥ群間で、ペアワイズ比較で０.０１より小さいことを示す。
この結果は、エキセンジン−４処置がＥＡＥ誘発後にＣＤ４＋細胞の増殖を減少させるに有効なことを実証した。
【０１９９】
〔実施例１２〕
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は自己免疫疾患における脾細胞サイトカインレベルを変化させた
本実施例は、ＥＡＥマウスのエキセンジン−４処置後の脾細胞サイトカインレベル変化を例証する。
ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＥＡＥのサイトカインレベルに影響を与えるかどうかを判定するために、ＥＡＥ動物における脾細胞サイトカインレベルの変化を、エキセンジン−４処置後に評価した。ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。誘発動物を、対照ビヒクル（ＰＢＳ）又はエキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置した。脾細胞（表２の第１列の「ＳＰＬ」）及びリンパ節（表２の第１列の「ＬＮ」）細胞をＥＡＥ誘発後日７に処置動物から単離し、そしてナイーブ動物（ｎ＝７）からも単離した。細胞を２０μｇ／ｍｌのＭＯＧを含む刺激培地中で４８時間培養した。培養培地中のサイトカインレベルをProcartaR Cytokine アッセイキット（Panomics（登録商標））を用いて測定した。使用したキットには、３２の別な種類のサイトカイン及びケモカイン測定用ビーズ結合抗体が含まれた。
【０２００】
ＰＢＳ処置群（対照、表２の第３列）及びエキセンジン−４処置群（対照、表２の第４列）間で有意なレベル変化を示したサイトカインが、表２にリストアップされている。データを一元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、続いてペアワイズ比較のためのダネット事後検定を行なった。１アスタリスク（*）は、ＰＢＳ処置ＥＡＥとエキセンジン−４処置ＥＡＥ群間で、ペアワイズ比較で、Ｐ値が０.０５より小さいことを示し、そして２アスタリスク（**）は、Ｐ値が０.０１より小さいことを示す。
【０２０１】
【表５】
2011057670.tif 000027
【０２０２】
結果は、エキセンジン−４処置が、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインのレベルを低下させ、疾患進行の減弱をもたらすことを示唆する。表２のデータは、エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物からの細胞におけるサイトカイン発現のＦＡＣＳ解析と一致する（例えば、実施例１３を参照）。
【０２０３】
〔実施例１３〕
エキセンジン−４処置はＥＡＥ誘発後にリンパ節中のＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ細胞を減少させた
本実施例は、ＥＡＥマウスのエキセンジン−４処置後のＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ細胞集団の変化を例証する。
ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＥＡＥ中のＴｈ１７及びＴｈ１細胞集団に影響を与えるかどうかを判定するために、ＥＡＥ動物中のＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−γ細胞集団の変化を、エキセンジン−４処置後に評価した。ＩＬ−１７はＴｈ１７細胞に存在し、ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞に存在する。比較のために、動物を、陰性対照としてＰＢＳで、陽性対照としてデキサメタゾンで処置した。ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco)を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。動物を、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４（ｎ＝７）、ＰＢＳ（ｎ＝７）又は４ｍｇ／ｋｇデキサメタゾン（ｎ＝３）対照で毎日処置した。１群のナイーブ動物（ｎ＝３）も含まれた。疾患誘発後日５又は日７に動物を安楽死させた。鼠径リンパ節を解剖してＦＡＣＳにより解析した。細胞をＣＤ４について表面染色し、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γについて細胞内染色した。ＣＤ４及びＩＬ−１７、又はＣＤ４及びＩＦＮ−γについて二重陽性細胞を、ＦＡＣＳにより解析した。
【０２０４】
罹患動物がナイーブ動物と比べて高率のＩＬ−１７＋細胞を有していた一方で、  エキセンジン−４−処置ＥＡＥ動物は、ＭＯＧ免疫後日５及び日７の両日において、ＰＢＳ処置ＥＡＥ動物と比べて低率のＩＬ−１７＋細胞を有していた（図１６）。免疫抑制薬デキサメタゾンによる処置も、ＥＡＥ動物におけるＩＬ−１７＋細胞の５０％減少をもたらしたが、エキセンジン−４処置（８０〜９０％）ほどではなかった。この結果は、エキセンジン−４処置が、リンパ節におけるＴｅｒ１１９＋細胞の割合を減少させるのに有効なことを実証した。
【０２０５】
リンパ節中のＩＦＮ−γ＋細胞集団の大幅な減少が、ＥＡＥ動物のエキセンジン−４処置で認められた（図１７）。予想通り、免疫抑制薬デキサメタゾンも、ＥＡＥ動物においてＩＦＮ−γ＋細胞の減少をもたらした。この結果は、エキセンジン−４処置が、ＥＡＥマウスのリンパ節中のＩＦＮ−γ＋細胞集団を減少させるのに有効なことを実証した。これらの結果は、ＭＯＧ免疫動物におけるＴｈ１７及びＴｈ１の両細胞を減少させるＧＬＰ−１Ｒアゴニストの役割を裏付けるものである。
【０２０６】
両方の天然ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト、及びＧＬＰ−１ＲアゴニストＣｏｖＸ体は、ＥＡＥの進行を緩徐化させるのに有効である。天然アゴニストエキセンジン−４及びＧＡＣ−１は、いずれも疾患進行を緩徐化させるのに有効であった。エキセンジン−４は、ＥＡＥ症状の発症前に投与した場合に有効であった。ＧＡＣ−１は、ＥＡＥ症状の発症前及び発症後週１回ベースで投与した場合に有効であった。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの初回量の増加は罹病率減少と関連し、用量依存性を示唆した。組織化学実験は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが、Ｔ細胞及び単球によるＣＮＳ組織の浸潤を減少させることを示した。ミエリン染色は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置動物の神経細胞に対する損傷の減少を示した。ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置は、ＥＡＥの発症及びピーク時で、脳及び脊髄ミクログリア、及び浸潤するマクロファージのＡＰＣ活性化マーカーＭＨＣクラスＩＩの発現を抑制した。
【０２０７】
エキセンジン−４を用いて、ＧＬＰ−１ＲアゴニストがＥＡＥ進行に影響を与えるメカニズムを更に検討した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞を直接殺細胞する、コルチコステロイド及びRITUXANTMなどの免疫抑制薬とＧＬＰ−１Ｒアゴニストの作用メカニズムは異なっているようである。これは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが、ＥＡＥ誘発動物におけるＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞集団を有意に変化させなかったという観察における証拠である。しかしながら、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストは、ＭＯＧ免疫動物のリンパ節におけるＩＬ−１７＋及びＩＦＮ−ｇ＋細胞集団の両方を減少させた。これらの結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト処置が、リンパ節におけるＴｈ１７及びＴｈ１集団を減少させることを実証した。
【０２０８】
〔実施例１４〕
ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤は自己免疫疾患の罹病率を減少させるのに有効である
本実施例は、ＤＰＰ−４阻害剤の処置によるＧＬＰ−１レベル上昇が、ＥＡＥ進行を減弱させることができることを例証する。動物実験は、ＤＰＰ−４阻害剤シタグリプチンが、メチルセルローズ陰性対照と比べて、ＥＡＥ罹病率に対して有意な保護をもたらすことを示した（図１８）。
ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）により生体内で分解される。ＤＰＰ−４阻害剤は、例えばシタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、ドュトグリプチン（dutogliptin）、ゲミグリプチン(gemigliptin)、アログリプチン及びベルベリンを含むが、これらに限定されない。ＤＰＰ−４阻害剤シタグリプチンが、グルコースレベル増加及びＧＬＰ−１レベル上昇を抑制することができるかどうかを試験するために、４群の１２月齢雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４〜５）を一夜絶食させ、次の朝に経口ブドウ糖負荷試験にかけた。経口グルコース負荷の１時間前に、試験動物に１ｍｇ／ｋｇか又は１０ｍｇ／ｋｇシタグリプチンを経口投与した。陰性対照群の動物にはメチルセルロースを投与し、陽性対照群にはエキセンジン−４(１ｍｇ／ｋｇＩＰ)を投与した。経口グルコース負荷後、グルコースレベルを２０、４０、６０及び１２０分で試験した。グルコース及びＧＬＰ−１レベルをチェックするため、血液サンプルもグルコース負荷の２０分後に採取した。エキセンジン−４処置は、ほとんど完全にグルコース上昇をブロックした。いずれのシタグリプチン濃度による処置も、メチルセルロース対照と比べて低いグルコースレベルの傾向を示したが、二元配置ＡＮＯＶＡによる統計的有意水準に至らなかった。いずれの用量でのシタグリプチンも、メチルセルロース対照と比べて経口グルコース負荷の２０分後に血中ＧＬＰ−１レベルを有意に増加させた。
【０２０９】
自己免疫疾患におけるＤＰＰ−４阻害剤の効果を試験するために、ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco）を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。マウスに免疫後日０から日２８まで、１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４、１０ｍｇ／ｋｇシタグリプチン、１ｍｇ／ｋｇシタグリプチン又はメチルセルロース（陰性対照）を毎日１回投与した。免疫後日５に血液サンプルをＧＬＰ１レベルの測定のために採取した。１０ｍｇ／ｋｇシタグリプチン処置動物は、メチルセルロース処置動物と比べて有意に高いＧＬＰ１レベルを有した。疾患進行をモニターするために、動物の罹病率を毎日以下のようにスコア化した：０＝正常；１＝尾跛行；２＝中等度後肢弱；３＝準じて重度後肢弱（動物は困難を伴なうがまだ歩行可能）；４＝重度後肢弱（動物はまだ後肢を動かせるが歩行不能）；５＝完全後肢麻痺；及び６＝死亡。エキセンジン−４又はシタグリプチンで処置した動物は、対照動物と比べて有意な罹病率減少を示した（図１８）。図１８のグラフに示されるように、エキセンジン−４による処置は日２５を通してＥＡＥ進行を大きく減弱させ、１ｍｇ／ｋｇか又は１０ｍｇ／ｋｇシタグリプチンによる処置は、病徴を減弱させる傾向を示した。１０ｍｇ／ｋｇシタグリプチン処置群での疾患スコアは、メチルセルロース処置群と比べて日１８から日２０まで有意に低かった（図１８）。本結果は、エキセンジン−４及びシタグリプチンがいずれも慢性ＥＡＥの進行を緩徐化させるのに有効なことを実証した。
【０２１０】
〔実施例１５〕
末梢免疫細胞はエキセンジン−４の標的ではない
本実施例は、末梢免疫細胞がエキセンジン−４の標的ではないことを例証する。
ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト−抗体コンジュゲートＧＡＣ−２（前記）が、エキセンジン−４／ＧＬＰ−１受容体の発現をチェックするための染色試薬として使用された。ＧＡＣ−２は、発蛍光団アレクサ４８８で標識した。本実施例では、ＧＬＰ−１Ｒ発現ＣＨＯ細胞を陽性対照として使用した。ＧＬＰ−１Ｒ発現ＣＨＯ細胞又はナイーブＣＨＯ細胞を１％ＦＢＳでブロックし、次いでＧＡＣ−２−アレクサ４８８で染色して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって解析した。ナイーブＣＨＯ細胞中の全細胞がＧＡＣ−２染色に対して陰性なのに、３４％のＧＬＰ−１Ｒ発現ＣＨＯ細胞はＧＡＣ−２について陽性であったことから、ＧＡＣ−２−アレクサ４８８は生細胞でのＧＬＰ−１Ｒ発現を認識することができることが示された。
ナイーブ動物及び及びＥＡＥ動物由来の脾臓リンパ節及び血液からの白血球について、ＧＬＰ−１Ｒ又は他の可能なエキセンジン−４受容体の発現を調べた。リンパ球及び単球マクロファージコンパートメントの両方について、エキセンジン−４／ＧＬＰ−１受容体発現をＧＡＣ−２を用いて解析した。いずれのコンパートメントにも陽性シグナルが認められなかったことから、エキセンジン−４／ＧＬＰ−１受容体は末梢リンパ器官に発現しないか、又はそれらの発現レベルが非常に低く検出閾値以下であることが示された。
エキセンジン−４が末梢免疫細胞に直接作用するかどうかを試験するために、リンパ球細胞をエキセンジン−４（１０μｇ／ｍｌ）又はビヒクル（陰性対照）の存在下ＭＯＧでインビトロ処理した。ＭＯＧの代わりに、ＰＢＳを活性化の陰性対照として使用した。ＭＯＧ処理リンパ球細胞の活性化は、ＣＤ４４発現（Ｔ−細胞活性化）及びＭＨＣＩＩ発現（ＡＰＣ活性化）を解析することにより測定した。ＭＯＧ処理細胞にエキセンジン−４を与えた場合、活性化阻害は認められなかった。これらの結果は、末梢免疫細胞はエキセンジン−４の標的ではないことを示す。
【０２１１】
〔実施例１６〕
進行中のＥＡＥマウスの罹病率を減少させるエキセンジン−４処置
本実施例は、進行中のＥＡＥマウスの処置におけるエキセンジン−４の有効性を例証する。
本発明の裏付けのために行なわれた実験では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの直接投与は、進行中のＥＡＥマウスの罹病率を減少させることを示した（図１９）。ＥＡＥを、４ｍｇ／ｍｌの結核加熱死菌Ｈ３７Ｒａ（Difco Laboratories）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に溶解した２００μｇのＰＬＰ（ｐ１３９−１５１）による免疫で、ＳＪＬ／Ｊマウス（８から１２週齢、the Jackson Laboratory）に誘発した（Youssef et al., Nature (2002) 420:78-84を参照）。免疫マウスの体重測定及びＥＡＥの臨床徴候を毎日調べてスコア化した。急性ＥＡＥをＳＪＬ／Ｊに樹立後、マウス（ｎ＝２８）を臨床スコア及び体重に基づいて２群に無作為割付けした。
エキセンジン−４処置は、再発の初めに開始した（免疫後日２９）。エキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ）か又はビヒクル（ＰＢＳ；対照用）を毎日１回投与した（ｉ．ｐ．）。マウスを無作為割付けした後、日２９から日６３まで毎日処置した。動物の罹病率を以下のようにスコア化した：０、麻痺なし；１、尾色調消失；２、後肢弱；３、後肢麻痺；４、後肢及び前脚麻痺；５、瀕死又は死亡。エキセンジン−４で処置した動物は、対照動物と比べて有意な罹病率減少を示した。この結果は、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストが進行中のＥＡＥマウスの罹病率を減少させるのに有効なことを実証した。
【０２１２】
〔実施例１７〕
インビボで細胞のエキセンジン−４処置は抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖をブロックする
本実施例は、エキセンジン−４でインビボ処置後の細胞の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の阻害を例証する。
本発明の裏付けのために行なわれた実験では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストでの細胞のインビボ処置は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害することが示された（図１９）。ＳＪＬ／ＪＥＡＥ動物及びＣ５７ＢＬ／６ＥＡＥ動物の両方からの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖はブロックされた。ＳＪＬ／Ｊ雌マウス（８から１２週齢、the Jackson Laboratory）において、ＥＡＥを、４ｍｇ／ｍｌの結核加熱死菌Ｈ３７Ｒａ（Difco Laboratories）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に溶解した２００μｇのＰＬＰ（ｐ１３９−１５１）による免疫で誘発した（Youssef et al., Nature (2002) 420:78-84を参照)。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＥＡＥを、ＣＦＡ（Difco）に乳化した２００μｇの脳炎誘発性ペプチドＭＯＧ（３５−５５）のｓ．ｃ．注射により誘発し、そして４ｍｇ／ｍｌの結核菌 (Difco)を実験日０に追加し、その後直ちに、そして４８時間後に、再度４００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｖ．注射した。マウスをエキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ）か又はビヒクルのみ（ＰＢＳ；対照として）で毎日処置した。
【０２１３】
免疫後日５に、排出リンパ節及び脾臓を処置動物から単離した。リンパ節及び脾臓からの細胞を洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌの最終濃度で予熱したＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁した。細胞増殖をモニターするために、細胞をＣＦＳＥで標識し、次いでＰＬＰ又はＭＯＧペプチドの存在下で増殖させた。ＣＦＳＥ溶液（Invitrogen, catalog #C34554）を１μＭの最終濃度まで加えた。細胞を３７℃で１０分間色素と共にインキュベートし、次いで５容の氷冷培養培地の添加及び５分の氷上インキュベーションによってクエンチした。細胞を遠心分離によりペレット化し、新鮮培地にて全部を３洗液で洗浄した。細胞を計数し、そしてＰＬＰｐ１３９−１５１（ＳＪＬ／Ｊマウスからの細胞）か又はＭＯＧｐ３５−５５（Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの細胞）ペプチドのいずれかと共に、０、１０、及び５０μｇ／ｍｌで７２時間インキュベートした。細胞はフローサイトメトリーで分析した。ＣＦＳＡ染色を欠く細胞を増殖Ｔ細胞と同定した。そのデータを表３に要約する。
【０２１４】
【表６】
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【０２１５】
表３中のデータは、ＳＪＬ／Ｊ−ＥＡＥ及びＣ５７ＢＬ／６ＥＡＥマウスのエキセンジン−４処置が、対照動物と比べて増殖抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少をもたらすことを示す。この結果は、細胞をインビボにてＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した場合に、ＥＡＥ動物からの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖がブロックされることを実証した。
【０２１６】
前記のインビボエキセンジン−４処置の結果と対照的に、エキセンジン−４は、インビトロで脾細胞に投与した場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に影響を与えなかった。簡潔に言えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊ脾細胞から単離した。細胞増殖をモニターするために、細胞を前記のようにＣＦＳＥで標識し、次いでプレート結合抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍｌ）で活性化した。エキセンジン−４（０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌで）又はビヒクル（ＰＢＳ）を細胞培養物に加え、そして細胞を７２時間処置した。処置細胞をフローサイトメトリーで分析した。ＣＦＳＡ染色を欠く細胞を増殖性Ｔ細胞と同定した。インビトロにおいてエキセンジン−４で処置したＣＤ４＋Ｔ細胞は、対照細胞と同等に増殖した。この結果は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が、細胞をインビボでＧＬＰ−１Ｒアゴニストで処置した場合には影響されないことを実証した。
【０２１７】
〔実施例１８〕
表面ＧＬＰ−１Ｒは末梢免疫細胞で検出されない
本実施例は、末梢免疫細胞におけるエキセンジン−４染色の不存在を例証する。
ＧＬＰ−１Ｒ発現ＣＨＯ細胞及び親ＣＨＯ細胞を、固定又は透過処理（permeabilization）なしでＦＩＴＣ標識ＧＡＣ−２細胞と共にインキュベートした。細胞を一次抗体（トータル５０μｌ中で１０μｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーを用いて分析した。ＦＩＴＣシグナルはＧＬＰ−１Ｒ発現ＣＨＯ細胞で検出されたが、親ＣＨＯ細胞では検出されなかった。このように、ＧＡＣ−２は、細胞表面でＧＬＰ−１Ｒを検出することができる。
脾臓、リンパ節及び血液からの末梢免疫細胞は、ＭＯＧｐ３５−５５による免疫の５日後にナイーブ動物及びＥＡＥ動物から単離された。単離細胞をＦＩＴＣ標識ＧＡＣ−２で染色し、フローサイトメトリーで分析しリンパ球及び単球にゲーティングした。ＧＬＰ−１Ｒ染色は、これらの細胞集団のいずれでも検出されなかった。この結果は、これらの末梢リンパ器官細胞がそれらの表面でＧＬＰ−１Ｒを発現しないこと、又は表面ＧＬＰ−１Ｒ発現が検出レベル以下であることを示唆する。
【０２１８】
〔実施例１９〕
エキセンジン−４は２Ｄ２マウスモデルにおいてインビトロで免疫細胞のＭＯＧ活性化に影響を与えない
本実施例は、エキセンジン−４が免疫細胞のインビトロでＭＯＧ活性化をブロックしないことを例証する。
脾臓及びリンパ節細胞を７週齢の２Ｄ２マウスから単離し、そしてＭＯＧ刺激の有り又は無しで４８時間培養した。エキセンジン−４（１０μｇ／ｍｌ）又はビヒクル（ＰＢＳ）をＭＯＧ刺激２Ｄ２細胞培養溶液に加えた。培養において４８時間のＭＯＧ刺激後、細胞を集め、抗ＣＤ４４抗体及び抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。抗ＣＤ４４抗体をＴ細胞活性化のマーカーとして使用した。抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体をＡＰＣ活性化のマーカーとして使用した。
ＭＯＧで刺激した脾臓及びリンパ節細胞は、活性化Ｔ細胞の存在について陽性として染色した。エキセンジン−４処置はＴ細胞活性化をブロックしなかった。ＭＯＧ刺激の不存在下に培養された細胞は、活性化Ｔ細胞について有意な染色を欠いていた。この結果は、２Ｄ２脾細胞及びリンパ節Ｔ細胞がＭＯＧ刺激によってエキソビボで活性化し得ること、及びエキセンジン−４処置がエキソビボで活性化を直接ブロックしないことを示す。
ＭＯＧで刺激した脾細胞及びリンパ節細胞は、活性化ＡＰＣ細胞の存在について陽性として染色した。エキセンジン−４処置はＡＰＣ細胞活性化をブロックしなかった。ＭＯＧ刺激の不存在下に培養された細胞は、活性化ＡＰＣ細胞についての有意な染色を欠いていた。この結果は、２Ｄ２脾細胞及びリンパ節抗原提示細胞が、ＭＯＧ刺激によってエキソビボで活性化し得ることを示唆するが、エキセンジン−４はエキソビボで活性化を直接ブロックしないようである。
【０２１９】
〔実施例２０〕
エキセンジン−４処置の効果は炎症性サイトカイン産生を阻害する
本実施例は、炎症性サイトカイン産生に対するＧＬＰ−１Ｒの効果を例証する。
ＳＪＬ／ＪＥＡＥマウスモデルを用いて、炎症性サイトカイン産生に対するインビボでのエキセンジン−４処置の効果を検討した。再発寛解ＥＡＥを、ＰＬＰ（ｐ１３９−１５１）免疫により８週齢ＳＪＬ／Ｊ動物に誘発した。１群の動物を１ｍｇ／ｋｇエキセンジン−４で毎日処置し、そして第２群の動物をＰＢＳ（対照）で処置した。免疫後日５に、脾細胞を両群の動物から単離し、ＭＯＧ刺激によりインビトロで培養した。ＭＯＧ刺激による培養の４８時間後に培養培地を集め、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７のLUMINEX（登録商標）サイトカインアッセイを用いてサイトカイン産生レベルを解析した。
【０２２０】
エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物からの脾細胞は、対照ＥＡＥ動物からの脾細胞と比べて、有意に少ない量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７を産生した。このことは、エキセンジン−４がＰＬＰ（ｐ１３９〜１５１）免疫後にＴｈ１及びＴｈ１７細胞を正常化するのに有効なことを示す。
【０２２１】
２Ｄ２脾細胞培養を用いて、エキソビボ系において炎症性サイトカイン産生に対するエキセンジン−４の効果を解析した。７週齢２Ｄ２動物からの脾細胞を単離し、ＭＯＧ刺激の有り又は無しで培養した。ＭＯＧ刺激による脾細胞培養において、エキセンジン−４がエキソビボでＴｈ１又はＴｈ１７細胞を減少させるかどうかを試験するために、種々の濃度のエキセンジン−４（１０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）を加えた。ＰＢＳを陰性対照として用いた。エキセンジン−４又はＰＢＳ添加の４８時間後に、培養培地を集め、サイトカインレベルを測定した。ＭＯＧで刺激した細胞からの培地は、高レベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７を有した。対照的に、ＭＯＧで刺激しなかった細胞からの培地は、最小レベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７を含んでいた。培養液中のエキセンジン−４の存在は、ＩＦＮ−γの産生に対して効果がなかった。更に、１０ｎｇ／ｍｌエキセンジン−４で処置した細胞により産生したＩＬ−１７のレベルは、エキセンジン−４で処置しなかった細胞により産生したレベルと差がなかった。しかしながら、１０ｎｇ／ｍｌか又は３００ｎｇ／ｍｌで処置した細胞からの培地はやや低いＩＬ−１７のレベルを有するようであるが、その差は統計的に有意ではなかった。
【０２２２】
これらの結果は、エキセンジン−４がインビボのＥＡＥマウスモデルにおいて、炎症性サイトカイン産生を減少させることを実証した。しかしながら、対照的に、エキセンジン−４は２Ｄ２エキソビボモデルにおける炎症性サイトカイン産生を減少させなかった。これらの結果は、エキセンジン−４が、脾臓又はリンパ節を直接標的化しないようであることを実証した。
【０２２３】
〔実施例２１〕
エキセンジン−４処置はＥＡＥ動物の胸腺中のＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞を激減させる
本実施例は、ＥＡＥ動物の胸腺中のＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞の減少を例証する。
ＥＡＥを誘発するために、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを皮下によりＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、免疫後直ちに、そして４８時間後に百日咳毒素をｉ．ｐ．注射した。１群の動物をエキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝３）で毎日処置し、そして別の群を対照ＰＢＳ（ｎ＝４）で処置した。免疫後日４に、エキセンジン−４処置及び対照動物の胸腺を採取した。４ナイーブ動物の胸腺を同時に採取した。胸腺を測定し、そして胸腺細胞を単離し、計数し、染色し、次いでフローサイトメトリーで分析した。そのデータを下の表４に要約する。
【０２２４】
【表７】
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【０２２５】
表４に示されるように、対照ＥＡＥ動物の胸腺はナイーブ動物の胸腺と比べて有意に小さかった（ｐ＝０．００７）。エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物の胸腺は、対照ＥＡＥ動物の胸腺よりも更に小さかった（ｐ＝０．００２）。対照ＥＡＥ動物、エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物、及びナイーブ動物の胸腺からの胸腺細胞を単離した。前記の胸腺計測と一致して、対照ＥＡＥ動物からの総胸腺細胞数は、ナイーブ動物よりも有意に少なかった。エキセンジン−４処置ＥＡＥ動物からの総胸腺細胞数は、対照動物よりも有意に少なかった。
【０２２６】
胸腺細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。ナイーブ動物からの総胸腺細胞集団の８４．６±０．３％はＣＤ４、ＣＤ８二重陽性であった。対照ＥＡＥ動物の総胸腺細胞集団の３０．３±１１．９％はＣＤ４、ＣＤ８二重陽性であった。このデータは、ＭＯＧ刺激に応答して胸腺中の二重陽性Ｔ細胞の分化及び成熟を反映している。エキセンジン−４で処置したＥＡＥ動物では、ＣＤ４、ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞集団は、ほとんど完全に消失した−エキセンジン−４で処置したＥＡＥ動物からの総胸腺細胞集団のわずか２．３±０．３％が、ＣＤ４、ＣＤ８二重陽性であった。更なる研究は、エキセンジン−４で処置した動物において脾臓及びリンパ節細胞数の増加はないことを実証した。これらの結果は、エキセンジン−４が細胞死によるＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞の減少を引き起こす可能性を示唆する。
【０２２７】
別の研究では、Ｔ細胞成熟ナイーブ動物、及びＥＡＥ動物に対するエキセンジン−４の効果を検討した。ＥＡＥを、ＭＯＧ／ＣＦＡの皮下注射し、続いて百日咳毒素をｉ．ｐ．注射することにより８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘発した。ナイーブ及びＥＡＥ動物を３群（ｎ＝３）に分けて、それぞれＰＢＳ(対照)、エキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ）又はデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）で処置した。デキサメタゾンは、Ｔ細胞死を引き起こすことが知られている。免疫後日６に胸腺を採取した。胸腺細胞を単離し、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。データを下の表５に要約する。
【０２２８】
【表８】
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【０２２９】
ＥＡＥ対照動物の胸腺細胞では、ＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞集団（２１．７±６．３％）は、ナイーブコントロール動物（８６．３±１．１％）と比べて減少した。エキセンジン−４処置及びデキサメタゾン処置の両方は、ＥＡＥ動物のＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞集団（それぞれ、５．６±２．６％及び１．５±０．５％）を急激に減少させた。
【０２３０】
ナイーブ動物からの総胸腺細胞集団の８６．３±１．１％はＣＤ４、ＣＤ８二重陽性であった。デキサメタゾン処置は、ＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞集団の有意な減少を引き起こした−デキサメタゾンで処置したナイーブ動物からの総胸腺細胞集団のわずか１２．４±３．３％がＣＤ４、ＣＤ８二重陽性であった。しかしながら、エキセンジン−４処置は、ナイーブ動物の胸腺のＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞集団に影響を与えなかった。エキセンジン−４で処置したナイーブ動物からの総胸腺細胞集団の８１．５±２．０％は、ＣＤ４、ＣＤ８二重陽性であった。
【０２３１】
これらの結果は、エキセンジン−４処置はＥＡＥ動物の胸腺においてＣＤ４、ＣＤ８二重陽性細胞の減少をもたらすが、ナイーブ動物では減少をもたらさないことを実証した。
【０２３２】
〔実施例２２〕
迷走神経切離術は体重減少に対するエキセンジン−４の効果を消失させるが、ＥＡＥ進行に対するエキセンジン−４の効果に影響を与えない
本実施例は、エキセンジン−４処置に対する迷走神経切離術の効果を例証する。
ＥＡＥ進行に対するエキセンジン−４の効果が迷走神経を通して媒介されるかどうかを検討するために、ＥＡＥを、迷走神経切離した８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６動物（The Jackson Laboratory）に誘発した。ＥＡＥを、ＭＯＧ／ＣＦＡの皮下免疫により、続いてその直後、及び４８時間後に、百日咳毒素をｉ．ｐ．注射することにより、迷走神経切離及び迷走神経非切離マウスに誘発した。免疫動物を２群（ｎ＝７〜８）に分けた。１群はエキセンジン−４（１ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置し、そして他の群はＰＢＳ（対照）で処置した。体重及びＥＡＥ臨床スコアを毎日モニターした。日２０の実験終了時に、動物を安楽死させた。胃計測の結果は、迷走神経切離動物の迷走神経が適正に切断されたことを確認した。
【０２３３】
ＭＯＧ免疫の最初の４日以内に、エキセンジン−４処置迷走神経非切離ＥＡＥマウスは、対照の迷走神経非切離ＥＡＥマウスと比べてそれらの体重の１０％が減量した。迷走神経切離マウスでは、、エキセンジン−４処置ＥＡＥマウスと対照ＥＡＥマウス間で体重の差は認められなかった。このように、迷走神経切離術は、体重減少に対するエキセンジン−４の効果を消失させた。この結果は、体重変化に対するエキセンジン−４の効果が、インタクト迷走神経に依存していることを示唆する。
【０２３４】
ＥＡＥ疾患進行は、迷走神経切離術によって影響を受けなかった。迷走神経切離及び迷走神経非切離マウスの両方では、エキセンジン−４処置はＰＢＳ処置動物と比べてＥＡＥ進行を顕著に遅延させた（図２０）。このように、迷走神経切離術は、ＥＡＥ疾患進行のエキセンジン−４媒介遅延に影響を与えた。この結果は、ＥＡＥに対するエキセンジン−４の効果が、迷走神経によって媒介されないことを示唆する。
【０２３５】
開示された教示は、種々の応用、方法、キット及び組成物に関連して記載されているが、当然のことながら、種々の変更及び改変は、本明細書に記載の教示及び以下の特許請求の範囲から逸脱しない範囲で行なうことができる。前述の実施例は、開示された教示をより的確に例証するために提供されるものであって、本明細書に記載の教示の範囲を限定することを意図するものではない。本教示はこれらの典型的な実施態様について記載されているが、熟練技術者には当然のことながら、これらの典型的な実施態様の変形及び改変は、過度の実験なしに可能である。そのようなすべての変形及び改変は、本教示の範囲内である。
【０２３６】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、系統立てる目的のためだけであり、決して記載された主題を限定するものと解釈すべきではない。当然のことながら、本教示に論じられる温度、濃度、時間などの前に「約」が存在し、その結果、僅かなそして実体のない偏差は、本明細書中の本教示の範囲内であることを暗示する。本願では、特に明記しない限り、単数の使用は複数を含んでいる。また、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる」（comprising）、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」、「含有している（containing）」、「包む（include）」、「含む（includes）」及び「含んでいる（including）」の使用は限定することを意図するものではない。当然のことながら、前述の概要及びその後の詳細な説明は、単に例示しそして説明するためであって、本発明を制限するものではない。
【０２３７】
特許、特許出願、学術論文、教科書など、及びそれらがすでに存在しない程度までそれらに引用されている参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。１つ又はそれ以上の組み込まれた文献及び類似の資料が、定義された用語、用語の用法、記載技術など（これらに限定されない）を含め本出願と異なり又は相反する事象では、本願が規制する。
【０２３８】
前述の記載及び実施例は、本発明の一定の格別な実施態様を詳述し、発明者によって意図されたベストモードを記載している。しかし、当然のことながら、いかに前述の記載がテキスト中に詳述されていても、本発明は様々な方法で実施することができ、そして本発明は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物のいずれかに従って解釈すべきものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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