(57)【要約】      （修正有）【課題】レーザ光の偏光方向を変化させて使用した場合でも光束の軸ズレ検出部への入射光量の変動が小さい光走査顕微鏡を提供する。【解決手段】レーザを光源とした走査手段を含む照明光学系と、前記レーザ光源と前記走査手段との間に配置され、光源の波長変更に伴って発生する、前記光の基準光路に対するズレを検出するズレ検出手段と、前記光の一部を前記ズレ検出手段に向けて導き、残りを前記走査手段に向けて導く第１の光分割手段とを備え、前記ズレ検出手段は、前記第１の光分割手段による分岐光のうちの一部を第１位置検出手段に向けて導く第２の光分割手段と、分岐光のうちの残りの少なくとも一部を第２位置検出手段に向けて導く光学素子とを含み、前記第１の分割手段、前記第２の分割手段は、各分割手段の入射面の垂線と前記照明光学系の光軸とのなす角をθ（°）とすると、以下の条件（１）を満たす。０°＜θ＜２７．３°（１）【選択図】図２
2011002607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源からの光を試料で走査する走査手段を含む照明光学系と、
前記レーザ光源と前記走査手段との間に配置され、前記レーザ光源からの光の波長変更に伴って発生する、前記光の基準光路に対するズレを検出するズレ検出手段と、
前記光の一部を前記ズレ検出手段に向けて導き、残りを前記走査手段に向けて導く第１の光分割手段とを備え、
前記ズレ検出手段は、前記第１の光分割手段により導かれた前記一部の光のうちの一部を第１位置検出手段に向けて導く第２の光分割手段と、
前記第一部の光のうちの残りの少なくとも一部を第２位置検出手段に向けて導く光学素子とを含み、
前記第１の分割手段、前記第２の分割手段は、各分割手段の入射面の垂線と前記照明光学系の光軸とのなす角をθ（°）とすると、以下の条件（１）を満たすように配置されてなることを特徴する光走査顕微鏡。
０°＜θ＜２７．３°            （１）
【請求項２】
前記第１位置検出手段及び前記第２位置検出手段は、これらの検出面が同一方向を向くように配置されてなる
請求項１記載の光走査顕微鏡。
【請求項３】
前記第第１の分割手段、前記第２の分割手段、及び前記光学素子の入射面の垂線と前記照明光学系の光軸とのなす角が全て同じであることを特徴とする請求項１又は２記載の光走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光走査顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
光走査顕微鏡では、レーザ光源の特性変化、波長切換時の内部光学素子の位置変化などにより、レーザ光の出射位置および出射角度が変動する。
【０００３】
そのため、光路中に光束のズレを検知する装置を設け、検知したズレ量に基づいて補正機構により光束を補正している（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、光走査顕微鏡において、赤外光を出射する短パルスレーザを使用した例として第２高調波（Second Harmonic Generation）顕微鏡が挙げられる。
【０００５】
第２高調波による観察では、試料へ入射させるレーザ光の偏光方向を試料に応じて変化させる必要がある。試料へ入射させるレーザ光の偏光方向を変化させるとそれに伴って第２高調波の強度が変化するので、最適な偏光方向を探しだす必要があるからである（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３２４６７８号公報
【非特許文献１】Sergey V. Plotnikov et.al  Biophysical Journal Vol.90, 第693-703頁 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
光を分割する方法として、一般的にハーフミラーに対し４５°の入射角で光を入射させて、反射光と透過光に分割することが行われている。
【０００８】
短パルスレーザから出射されるレーザ光は、偏光方向が一定であり、波長は調整によりある範囲内（例えば、690nm〜1040nm）で変えることが可能である。
【０００９】
前述したように、第２高調波（SHG）顕微鏡は、試料へ入射させるレーザ光の偏光方向を試料に応じて変化させる必要がある。これに伴って、光路分割手段へ入射するレーザ光の偏光方向が変化するので、光路分割手段による反射率が変化し、光束の軸ズレ検出部へ入射する光量が変動する。
【００１０】
レーザ光のズレを検出する検出素子として撮像素子やPSD（Position Sensing Detector）や４分割フォトダイオードなどの位置検出用光電素子が使われるが、S/Nを一定に保ち、分解能を確保するために、測定時の入射光量はなるべく一定であることが望ましい。
【００１１】
そこで、本発明はレーザ光の偏光方向を変化させて使用した場合であっても
光束の軸ズレ検出部への入射光量の変動が小さく精度よく軸ズレの検出ができる光走査顕微鏡を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明にかかる光走査顕微鏡は、レーザ光源からの光を試料で走査する走査手段を含む照明光学系と、前記レーザ光源と前記走査手段との間に配置され、前記レーザ光源からの光の波長変更に伴って発生する、前記光の基準光路に対するズレを検出するズレ検出手段と、前記光の一部を前記ズレ検出手段に向けて導き、残りを前記走査手段に向けて導く第１の光分割手段とを備え、
前記ズレ検出手段は、前記第１の光分割手段により導かれた前記一部の光のうちの一部を第１位置検出手段に向けて導く第２の光分割手段と、前記第一部の光のうちの残りの少なくとも一部を第２位置検出手段に向けて導く光学素子とを含み、  前記第１の分割手段、前記第２の分割手段は、各分割手段の入射面の垂線と前記照明光学系の光軸とのなす角をθ（°）とすると、以下の条件（１）を満たすように配置されてなる。
【００１３】
０°＜θ＜２７．３°              （１）
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、レーザ光の偏光方向を変化させて使用した場合であっても
光束の軸ズレ検出部への入射光量の変動が小さく精度よく軸ズレの検出ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１６】
［第１の実施の形態］
図１は、本発明を適用した第２高調波顕微鏡付き共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。
【００１７】
この第２高調波顕微鏡付き共焦点顕微鏡（以下、単に共焦点顕微鏡という）は、光を走査させるスキャンヘッド１１を顕微鏡１２に取り付けて通常の１光子励起による共焦点観察と、第２高調波による観察を実現する観察するシステムである。
【００１８】
共焦点顕微鏡では、観察対象の試料１３に照射する照明光の光源１４として、例えば、第２高調波による観察を行う場合は、赤外光を出射する短パルスレーザ光源が用いられる。
【００１９】
光源１４から出射した照明光（赤外光）は、ビームエキスパンダ１５によりビーム径が拡大するように整形されて平行光線とされ、回転可能に設けられた不図示のλ/２板により所望の偏光方向に変更され、さらにミラーホルダ１６に把持された全反射ミラー１７で反射される。全反射ミラー１７で反射された照明光は、入射位置シフタ１８を介してスキャンヘッド１１に入射する。
【００２０】
このようにして、空間伝播によりスキャンヘッド１１に導かれた照明光は、スキャンヘッド１１に設けられた光束の軸ズレ検出部４１、ダイクロイックミラー２０、走査ユニット２１、およびリレーレンズ２２を介して顕微鏡１２に入射する。そして、顕微鏡１２に入射した照明光は、顕微鏡１２内の対物レンズ２４を介してステージ２５上に載置された試料１３に照射される。
【００２１】
このとき、走査ユニット２１は、ダイクロイックミラー２０から入射した照明光を、図中、左右方向および奥行き方向に偏向させることにより、試料１３上で照明光を走査させる。試料１３に照明光が照射されると、試料１３からは観察光となる第２高調波（赤外光の半分の波長）が発生し、この第２高調波は試料１３の裏面側に配置された集光レンズ２６により集光され、光電検出素子２７で受光され、さらに光電検出素子２７により光電変換される。そして光電変換により得られた電気信号は、光電検出素子２７から制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。コンピュータ２９は、制御部２８からの電気信号に基づいて、試料１３の画像である観察画像の画像信号を生成して表示部３０に供給し、表示部３０に観察画像を表示させる。
【００２２】
赤外光を非対称の分子構造を有する物質（例えば、コラーゲン、筋繊維など）に照射すると第２高調波が発生するので、第２高調波の検出によって標本の状態を検知することができる。第２高調波は、照明光の集光点の近傍からしか発生せず、それ自体で高い空間分解能を有するため、ピンホールは不要である。
【００２３】
その結果、検出器を試料の近い位置に置くことができるため、第２高調波をより高い効率で検出することができる。
【００２４】
また、蛍光による共焦点観察では、光源１４から出射された照明光は、前述
と同様の光路を経て、対物レンズ２４を介して試料１３に照射される。
【００２５】
そして、試料１３からの蛍光は、照明光の光路を逆方向に通ってダイクロイックミラー２０に入射する。すなわち、試料１３から対物レンズ２４に入射した蛍光は、リレーレンズ２２および走査ユニット２１を介してダイクロイックミラー２０に入射する。
【００２６】
ダイクロイックミラー２０は、走査ユニット２１からの蛍光を反射して集光レンズ３１に入射させる。このダイクロイックミラー２０は、照明光の波長の光を透過させて、蛍光の波長の光を反射する。
【００２７】
ダイクロイックミラー２０から集光レンズ３１に入射した蛍光は、集光レンズ３１により集光され、共焦点絞り３２に設けられたピンホールを通って、光電検出素子３３に受光される。そして、光電検出素子３３が受光した蛍光を光電変換することにより得られた電気信号は、光電検出素子３３から制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。コンピュータ２９は、制御部２８からの電気信号に基づいて観察画像の画像信号を生成し、表示部３０に供給する。これにより、表示部３０に観察画像が表示される。
【００２８】
さらに、入射位置シフタ１８と、ダイクロイックミラー２０との間には、光束の軸ズレ検出部４１が配置されている。光束の軸ズレ検出部４１は、図２に示すように、入射位置シフタ１８からの照明光の一部を第１のビームサンプラー１９で反射して第２のビームサンプラー３４に入射させるとともに、残りの照明光を透過させてダイクロイックミラー２０に入射させる。
【００２９】
図２は、第１の実施形態における光束の軸ズレ検出部４１の構成を示す図である。
【００３０】
第１のビームサンプラー１９は、照明光が第１のビームサンプラー１９の入射面の垂線に対して２２．５°で入射するように配置される。また、第２のビームサンプラー３４は、第１のビームサンプラー１９の入射面からの反射光が、第２のビームサンプラー３４の入射面の垂線に対して２２．５°で入射するように配置される。  第３のビームサンプラー４０は、第２のビームサンプラー３４を透過した光が、第３のビームサンプラー４０の入射面の垂線に対して２２．５°で入射するように配置される。
【００３１】
第２のビームサンプラー３４の入射面で一部反射した反射光は、位置検出用光電素子３５で受光される。また、第３のビームサンプラー４０の入射面で一部反射した反射光は、位置検出用光電素子３６で受光される。
【００３２】
ここで第３のビームサンプラー４０は、光路を分割する必要は無く、第２のビームサンプラー３４を透過した光を位置検出用光電素子３６に適度な光量で入射させることができればよいので、ミラーと減光フィルタで構成されても良い。
【００３３】
各ビームサンプラー１９、３４、４０の入射面には、反射防止膜は形成されていない。
【００３４】
そのため、照明光が、各ビームサンプラー１９、３４、４０へ入射角θで入射した場合のＰ偏光の反射率及びＳ偏光の反射率は、以下のとおりである。
Ｒp＝〔tan[θ-arcsin(ｎ1/ｎ2×sinθ)]/tan[θ+arcsin(ｎ1/ｎ2×sinθ)]〕2
Ｒs＝〔sin[θ-arcsin(ｎ1/ｎ2×sinθ)]/sin[θ+arcsin(ｎ1/ｎ2×sinθ)]〕2
θ:入射角、ｎ1:空気の屈折率、ｎ2:硝子の屈折率
Ｒp／Ｒs＝１となるのが理想であるが、Ｒp／Ｒs＞０．５の範囲であれば許容できる。なお、Ｒｐ／Ｒｓ≦１である。
具体的には、入射角θが２２．５°、照明光の波長が８５２ｎｍ、各ビームサンプラー１９、３４、４０の材料が石英ガラスであるとすると、
ｎ1＝１、ｎ2＝１．４５３であるので、
Ｒp＝０．０２７＝２．７%、
Ｒs＝０．０４２＝４．２%      となる。
このとき、Ｒp／Ｒs＞０．５となる入射角θは、０°＜θ＜２７．３°の範囲である。なお、入射角θが８１°以上でもＲｐ／Ｒｓ＞０．５となるが、反射率が高すぎるので適さない。
【００３５】
各位置検出用光電素子３５、３６に入射する光量Ｐｏｗ1とＰｏｗ2は、第１のビームサンプラー１９に入射する光量をＰ0とすると、以下の式で表される。
【００３６】
Ｐｏｗ1＝Ｐ0×（ＲP又ハS）2
Ｐｏｗ2＝Ｐ0×（ＲP又ハS）2×（１−ＲP又ハS）
具体的には、第１のビームサンプラー１９の入射光量を１００ｍＷとすると、位置検出用光電素子３５に入射する光量は、
Ｐ偏光の場合  Ｐｏｗ1＝１００ｍＷ×０．０２７2＝７３μＷ
Ｓ偏光の場合  Ｐｏｗ1＝１００ｍＷ×０．０４２2＝１７６μＷ
であり、Ｐ偏光の場合とＳ偏光の場合との光量比を７３／１７６＝０．４１に抑えることが出来る。同様に位置検出用光電素子３６に入射する光量は、
Ｐ偏光の場合  Ｐｏｗ2＝１００ｍＷ×０．０２７2×（１−０．０２７）＝７１μＷ
Ｓ偏光の場合  Ｐｏｗ2＝１００ｍＷ×０．０４２2×（１−０．０４２）＝１６９μＷ
であり、Ｐ偏光の場合とＳ偏光の場合との光量比を７１／１６９＝０．４２に抑えることが出来る。
【００３７】
このように、入射角θを２７．３°より小さくすることで、Ｒｐ／Ｒｓ＞０．５となり、Ｐ偏光の場合とＳ偏光の場合との位置検出用光電素子３５、３６に入射する光量比を約０．２５から１の範囲に抑えることが出来るので、検出器の検出感度の幅を無理に広げる必要が無く、低コストで精度のよい軸ズレの検出が可能となる。
【００３８】
また、各ビームサンプラー１９、３４、４０の出射面には反射防止膜が形成されているが、そこでの僅かな反射光が位置検出用光電素子３５、３６に入射すると、それがノイズとなって照明光の入射位置を正しく検出することができなくなる。
【００３９】
そこで、各ビームサンプラー１９、３４、４０の出射面での反射光が位置検出用光電素子３５、３６に入射するのを防ぐために、反射光が通過する入射面上の位置に遮光板２８を設け、出射面での反射光を遮光する。
【００４０】
そのためには入射面で反射した光路と出射面で反射した光路の距離を離してそれらを十分に分離する必要がある。その方法として、各ビームサンプラー１９、３４、４０のガラス厚を大きくして、入射と出射面の間隔を広げる、又は、各ビームサンプラー１９、３４、４０のガラス材料として屈折率の小さいもの使用することが効果的である。
【００４１】
位置検出用光電素子３５、３６は、その検出面が略同一方向を向くように、略同一面上に配置されている。
【００４２】
初期調整の段階で、入射する照明光が位置検出用光電素子３５、３６のほぼ中央にくるように、位置検出用光電素子３５、３６の位置を調整する必要があるが、その検出面が略同一方向を向き、略同一面上に配置することにより、目視で照明光の入射位置を確認調整する場合には見やすく、位置検出用光電素子３５、３６の位置を微調整する際に操作性が良い、という有利がある。
【００４３】
ここで、位置検出用光電素子３５は、第２ビームサンプラー３４の入射面から位置検出用光電素子３５の受光面までの照明光の光路長がＬ１となる位置に配置され、位置検出用光電素子３６は、第２ビームサンプラー３４の入射面から第３のビームサンプラー４０の入射面を介して位置検出用光電素子３６の受光面までの照明光の光路長が、Ｌ１より長いＬ２となる位置に配置される。また、位置検出用光電素子３５および位置検出用光電素子３６は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Devices）等の撮像素子、ＰＳＤ（Position Sensing Detector）、４分割フォトダイオードなどの受光位置を検出可能な素子とされる。
【００４４】
位置検出用光電素子３５は、第２ビームサンプラー３４からの照明光を受光して光電変換し、光電変換により得られた検出信号Ｄ１をＡ／Ｄ（Analog/Digital）変換器３７に供給する。この検出信号Ｄ１は、受光面上の各位置に入射した光の強度を示す信号であり、Ａ／Ｄ変換器３７によりアナログ信号からデジタル信号に変換された後、制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。
【００４５】
位置検出用光電素子３６は、第３ビームサンプラー４０からの照明光を受光して光電変換し、光電変換により得られた検出信号Ｄ２をＡ／Ｄ変換器３７に供給する。この検出信号Ｄ２は、受光面上の各位置に入射した光の強度を示す信号であり、Ａ／Ｄ変換器３７によりアナログ信号からデジタル信号に変換された後、制御部２８を介してコンピュータ２９に供給される。
【００４６】
コンピュータ２９は、制御部２８からの検出信号Ｄ１および検出信号Ｄ２のデジタル信号に基づいて、位置検出用光電素子３５の受光面上における照明光の受光位置Ｐ１と、位置検出用光電素子３６の受光面上における照明光の受光位置Ｐ２とを検出する。
【００４７】
また、コンピュータ２９は、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光のチルト量、つまりチルトの角度（および方向）を演算処理により求め、駆動部３８に供給する。さらに、コンピュータ２９は、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２に基づいて、照明光のシフト量、すなわちシフトの大きさおよび方向を演算処理により求め、駆動部３９に供給する。
【００４８】
なお、コンピュータ２９が、検出された受光位置Ｐ１および受光位置Ｐ２を示す画像を表示部３０に表示させたり、演算処理により求められたチルト量およびシフト量を表示部３０に表示させたりするようにしてもよい。
【００４９】
駆動部３８は、コンピュータ２９から供給されたチルト量に基づいて、照明光のチルトが打ち消されるように、全反射ミラー１７を駆動する。すなわち、ミラーホルダ１６には、全反射ミラー１７を支持する互いに直交する２つの回転軸が設けられており、ミラーホルダ１６は、駆動部３８の制御に基づいて、それらの回転軸を中心として全反射ミラー１７を回動させる。これにより、照明光が傾けられ（あおられ）被検光路が傾斜し、照明光の角度のずれがなくなるように被検光路が補正される。
【００５０】
駆動部３９は、コンピュータ２９から供給されたシフト量に基づいて、照明光のシフトが打ち消されるように、入射位置シフタ１８を駆動する。すなわち、入射位置シフタ１８には、例えば、互いに直交する方向に回転する２枚の電動平行平面ガラス板が設けられており、入射位置シフタ１８は、駆動部３９の制御に基づいて、それらの電動平行平面ガラス板を回動させる。これにより、照明光が平行移動されて、被検光路と垂直な方向への光路のずれがなくなるように、被検光路が補正される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明にかかる共焦点顕微鏡の実施形態の構成を示す図である。
【図２】本発明にかかる共焦点顕微鏡の光束の軸ズレ検出部の構成を示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１１  スキャンヘッド，  １２  顕微鏡，  １６  ミラーホルダ，  １７  全反射ミラー，  １８  入射位置シフタ，  １９  ビームサンプラー，  ２９  コンピュータ，  ３０  表示部，  ３４  ビームサンプラー  ，  ３５  位置検出用光電素子，  ３６  位置検出用光電素子，  ３８  駆動部，  ３９  駆動部，４０  ビームサンプラー,  ４１  光束の軸ズレ検出部
【図１】
2011002607.tif 000003
【図２】
2011002607.tif 000004