(57)【要約】【課題】血液を前処理することなくそのまま分析できる上に、血球の分離から染色、洗浄までを一貫して行うことができる循環腫瘍細胞(ＣＴＣ)の検出技術を提供すること。【解決手段】試料供給口と試料排出口、その間を連通するマイクロ流路が形成され、マイクロ流路の一部に相当する位置に開口窓が設けられた上部部材と；開口窓の下方に相当する位置に、ＣＴＣ捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイと、それを保持する密封性シールからなるマイクロキャビティアレイ保持部と；サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に設けられた吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路が形成された下部部材と；を備え、前記ＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔をニッケル基板や石英基板に形成したマイクロ流体デバイスを用いて、ＣＴＣを検出する。【選択図】図３
2011163830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズ選択マイクロキャビティアレイにより血液試料中に含まれる循環腫瘍細胞(ＣＴＣ)を捕捉することができるマイクロ流体デバイスであって、
試料供給口と試料排出口、及び試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路が形成され、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられた上部部材と；
前記上部部材の開口窓の下方に相当する位置に、ＣＴＣ捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイと、該サイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなるマイクロキャビティアレイ保持部と；
前記サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に設けられた吸引用開口窓と、前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路が形成された下部部材と；
を備えていることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
マイクロキャビティアレイ保持部が、２〜３枚のサイズ選択マイクロキャビティアレイと、各サイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなる多層に形成され、上層から下層に向かって、サイズ選択マイクロキャビティアレイに設けられた貫通孔の孔径が小さくなっていることを特徴とする請求項１記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
サイズ選択マイクロキャビティアレイが、孔径５μｍ〜２０μｍから選ばれる微細貫通孔を有するマイクロキャビティアレイであることを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
サイズ選択マイクロキャビティアレイが、孔径８μｍ又は１０μｍから選ばれる微細貫通孔を有し、孔の中心間距離６０μｍ、１００×１００の１０，０００孔をアレイ状に配したマイクロキャビティアレイであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
サイズ選択マイクロキャビティアレイのＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔が、電鋳技術を用いてニッケル基板に形成されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
サイズ選択マイクロキャビティアレイのＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔が、レーザー技術を用いて石英基板に形成されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
上部部材が、試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板とから構成されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
下部部材が、サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板とから構成されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
吸引口がペリスタルティックポンプに接続されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか記載のマイクロ流体デバイスを用いることを特徴とする循環腫瘍細胞(ＣＴＣ) の検出方法。
【請求項１１】
血液を前処理することなくそのまま試料として使用することを特徴とする請求項１０記載のＣＴＣの検出方法。
【請求項１２】
血液導入速度を２００〜１０００μＬ／ｍｉｎとすることを特徴とする請求項１０又は１１記載のＣＴＣの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイズ選択マイクロキャビティアレイ（size-selective microcavity array）を備えた、循環腫瘍細胞（Circulating tumor cell: ＣＴＣ）を捕捉することができるマイクロ流体デバイスや、該マイクロ流体デバイスを用いたＣＴＣの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＴＣはがん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞と定義され、原発腫瘍又は転移腫瘍から血管中へ浸潤した腫瘍細胞である。このＣＴＣの検出は、転移性悪性腫瘍の早期発見の方法の一つとして近年注目されている（例えば、非特許文献１又は２参照）。その理由は、Ｘ線写真や血清中の腫瘍マーカー検出よりも低侵襲かつ正確に転移性悪性腫瘍の診断を行え、患者の予後予測や治療効果の指標として利用できる点にある。
【０００３】
ＣＴＣは非常に稀少な細胞であり、転移性がん患者の血液に含まれる１０８〜１０９個の血液細胞の内、わずか１細胞程度しか存在しないことが知られている（例えば、非特許文献３又は４参照）。このため、末梢血から稀少なＣＴＣを正確に検出するための技術開発に多大な努力が注がれている。これまでに開発されてきた主要な検出方法には、免疫組織化学法（例えば、非特許文献３参照）、ＰＣＲ法（例えば、非特許文献５参照）、フローサイトメトリー法（例えば、非特許文献６参照）などがある。しかしながら、前述したようにＣＴＣは非常に稀少な細胞であるため、血液をそのままこれらの検出方法に供することは出来ない。通常は前処理として、ＣＴＣの濃縮操作が必須であり、検出法に則したレベルまでＣＴＣ存在比を濃縮させる必要がある。
【０００４】
ＣＴＣの濃縮方法として開発されてきた様々な手法の中で、最も広く利用されているのは、細胞表面の特異的抗原を標的とした腫瘍細胞の濃縮である。その多くは、上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule: ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気微粒子を血液と混合した後、磁石を用いて腫瘍細胞を濃縮する方法をとっている（例えば、非特許文献７参照）。しかしながら、ＥｐＣＡＭの発現量は腫瘍のタイプに依存し、大きく変動することが知られている（例えば、非特許文献８又は９参照）。その他の方法では、細胞のサイズなどの形態を基準として濃縮する手法がある。白血球に比べてサイズが大きな上皮性腫瘍細胞をフィルトレーションによって選別する方法は、ＩＳＥＴ法（Isolation by Size of Epithelial Tumor cells）と呼ばれている。ＩＳＥＴは、孔径８μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて血液をフィルトレーションするという簡便な手法であり、安価かつユーザーフレンドリーな手法である。ここで用いられているポリカーボネートメンブレンフィルターは、重イオンを照射した後、エッチングを行うトラックエッチングという手法によって、孔が形成されている。しかし、孔が比較的低密度であり、二つ又はそれ以上の孔が重なりあったりする問題があるため、ＣＴＣの捕捉に利用した場合、その捕捉効率は５０〜６０％とされている（例えば、非特許文献１０参照）。よって、濃縮法が簡便かつ効率も良い手法は未だ開発されていない。
【０００５】
ＣＴＣの検出を効率的かつ正確なものにするためには、濃縮と検出といった技術を首尾一貫して行うことが必要である。多段階のハンドリング操作、例えば細胞の染色、洗浄、分離、分注などの操作はＣＴＣのロスを引き起こすため、可能な限りこれらの操作を避け、一体の検出装置中で分析が一貫して行える形が望ましい。Ｃｅｌｌｓｅａｒｃｈ（VeridexTM, Warren, PA）はＣＴＣ検出装置として唯一ＦＤＡの認可を受けた装置である。この装置では、全血に対し抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気微粒子によるＣＴＣの濃縮を行い、腫瘍細胞に対して免疫染色を行った後、自動化蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる（例えば、非特許文献１１参照）。一方で、ＣＴＣ検出のためにマイクロ流体デバイスの開発も行われている。Tonerらが開発したＣＴＣ検出用マイクロ流体デバイスはＣＴＣ−ｃｈｉｐと呼ばれ（例えば、非特許文献１２参照）、フォトリソグラフィーによって形成されたシリコン製の流路内に、円筒状構造物（マイクロポスト）が７８０００個構成されている。このマイクロポストには、抗ＥｐＣＡＭ抗体がコーティングされており、本流路に血液を送液すると、血液中のＣＴＣがマイクロポスト上に捕捉される。捕捉されたＣＴＣに対して、上皮細胞マーカー（cytokeratin）をターゲットとした蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる。本装置は、手のひらに乗る小型デバイスでありながら、５ｍＬ以上の血液をそのまま分析に供することができるという大きな利点を持っている。実際に転移性がん患者血液からＣＴＣ検出を行っており、回収したＣＴＣからチロシンキナーゼ阻害薬に対する耐性を生む変異を検出することが出来ている（例えば、非特許文献１３参照）。ＣｅｌｌｓｅａｒｃｈやＣＴＣ−ｃｈｉｐを用いたＣＴＣ検出は転移性がん患者血液などの実サンプルを用いた実験が精力的に行われ実績を挙げているが、これらの手法は抗ＥｐＣＡＭ抗体でＣＴＣを濃縮するという原理になっている。そのため、ＣＴＣ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞は検出できないという問題点が挙げられる。
【０００６】
その他のグループでは、腫瘍細胞のサイズと形態を指標として、ＣＴＣを検出するマイクロ流体デバイスが開発されている。これらのデバイスでは、その流路構造内にメンブレンマイクロフィルター（例えば、非特許文献１４参照）や、三日月型の細胞捕捉ウェル（例えば、非特許文献１５参照）、４段階の細さの流路（例えば、非特許文献１６参照）を配して、血液中の血球細胞と腫瘍細胞をサイズによって選別し、腫瘍細胞を選択的に濃縮するものとしている。また、その流路を利用して、濃縮後の細胞に対して溶解などの操作を連続的に行うことが出来る。これらのデバイスを用いたモデル腫瘍細胞を用いた回収効率の評価実験においては、８０％以上のＣＴＣ回収効率を得ている。しかしながら、この評価はあくまでモデル細胞を用いた実験で行われており、実際にＣＴＣ検出時に必要となる細胞の染色操作や洗浄操作といった要素技術項目については検討されていない。さらに、がん患者血液などの実サンプルを用いた実験は行われておらず、実際にＣＴＣ検出に利用できるかどうかは明らかにされていない。
【０００７】
他方、本発明者らは、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉することができる単一細胞捕捉用のマイクロ流路デバイスや、かかるマイクロ流路デバイスを用いた試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで分離・捕捉する方法や、前記マイクロ流路デバイスを利用した単一細胞の遺伝子発現の定量的解析方法について提案している（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００９−００１６８４２
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Pantel K, Brakenhoff RH, Brandt B. 2008. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nat Rev Cancer 8(5):329-40.
【非特許文献２】Paterlini-Brechot P, Benali NL. 2007. Circulating tumor cells (ＣＴＣ) detection: clinical impact and future directions. Cancer Lett 253(2):180-204.
【非特許文献３】Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW and others. 2004. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 351(8):781-91.
【非特許文献４】Ross AA, Cooper BW, Lazarus HM, Mackay W, Moss TJ, Ciobanu N, Tallman MS, Kennedy MJ, Davidson NE, Sweet D and others. 1993. Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques. Blood 82(9):2605-10.
【非特許文献５】Schroder CP, Ruiters MH, de Jong S, Tiebosch AT, Wesseling J, Veenstra R, de Vries J, Hoekstra HJ, de Leij LF, de Vries EG. 2003. Detection of micrometastatic breast cancer by means of real time quantitative RT-PCR and immunostaining in perioperative blood samples and sentinel nodes. Int J Cancer 106(4):611-8.
【非特許文献６】Moreno JG, O'Hara SM, Gross S, Doyle G, Fritsche H, Gomella LG, Terstappen LW. 2001. Changes in circulating carcinoma cells in patients with metastatic prostate cancer correlate with disease status. Urology 58(3):386-92.
【非特許文献７】Allard WJ, Matera J, Miller MC, Repollet M, Connelly MC, Rao C, Tibbe AG, Uhr JW, Terstappen LW. 2004. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res 10(20):6897-904.
【非特許文献８】Gastl G, Spizzo G, Obrist P, Dunser M, Mikuz G. 2000. Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival. Lancet 356(9246):1981-2.
【非特許文献９】Went PT, Lugli A, Meier S, Bundi M, Mirlacher M, Sauter G, Dirnhofer S. 2004. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Hum Pathol 35(1):122-8.
【非特許文献１０】Rostagno P, Moll JL, Bisconte JC, Caldani C. 1997. Detection of rare circulating breast cancer cells by filtration cytometry and identification by DNA content: sensitivity in an experimental model. Anticancer Res 17(4A):2481-5.
【非特許文献１１】Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, Rau T, Schindlbeck C, Rack B, Janni W, Coith C, Beck K, Janicke F and others. 2007. Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the CellSearch system. Clin Cancer Res 13(3):920-8.
【非特許文献１２】Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, Bell DW, Irimia D, Ulkus L, Smith MR, Kwak EL, Digumarthy S, Muzikansky A and others. 2007. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450(7173):1235-9.
【非特許文献１３】Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, Ulkus L, Brannigan B, Collura CV, Inserra E, Diederichs S, Iafrate AJ, Bell DW and others. 2008. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. N EnglJ Med 359(4):366-77.
【非特許文献１４】Zheng S, Lin H, Liu JQ, Balic M, Datar R, Cote RJ, Tai YC. 2007. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. J Chromatogr A 1162(2):154-61.
【非特許文献１５】Tan SJ, Yobas L, Lee GY, Ong CN, Lim CT. 2009. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomed Microdevices 11(4):883-92.
【非特許文献１６】Mohamed H, Murray M, Turner JN, Caggana M. 2009. Isolation of tumor cells using size and deformation. J Chromatogr A 1216(47):8289-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、血液を前処理することなくそのまま分析できる；血球の分離から染色、洗浄までを一貫して行える；装置自体が小型で安価である；ＣＴＣの回収原理がＥｐＣＡＭなどの表面抗原に依らないこと；等の特徴を有するＣＴＣの検出技術として非常に強力なツールを提供することにある。  
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討し、従来の磁気分離法によるＣＴＣ回収に問題点が多いことから（後述の比較例参照）、腫瘍細胞の選択的な捕捉を可能とするサイズ選択マイクロキャビティアレイを開発し、血液からのＣＴＣ検出への応用を目指した。血液のフィルトレーションによってＣＴＣを検出する原理はＩＳＥＴ法と共通しているが、市販のメンブレンフィルターとは異なり、マイクロキャビティアレイの孔径、孔数、配置を正確に制御することができる、電鋳技術を用いてニッケル基板に形成されたＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイや、レーザー技術を用いて石英基板に形成されたＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイを構築した。また、マイクロ流体デバイス内にマイクロキャビティアレイを配することで、血液からのＣＴＣの濃縮に始まり、染色や洗浄のプロセスを一つのデバイス内で一貫して行うことが可能となることを見いだし、また、ＣＴＣが高密度に形成されたマイクロキャビティアレイ上に捕捉されるため、自動化蛍光顕微鏡などを用いて迅速に計数することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）サイズ選択マイクロキャビティアレイにより血液試料中に含まれる循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を捕捉することができるマイクロ流体デバイスであって、試料供給口と試料排出口、及び試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路が形成され、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられた上部部材と；前記上部部材の開口窓の下方に相当する位置に、ＣＴＣ捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイと、該サイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなるマイクロキャビティアレイ保持部と；前記サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に設けられた吸引用開口窓と、前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路が形成された下部部材と；を備えていることを特徴とするマイクロ流体デバイスに関する。
【００１３】
また本発明は、（２）マイクロキャビティアレイ保持部が、２〜３枚のサイズ選択マイクロキャビティアレイと，各サイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなる多層に形成され、上層から下層に向かって、サイズ選択マイクロキャビティアレイに設けられた貫通孔の孔径が小さくなっていることを特徴とする上記（１）記載のマイクロ流体デバイスや、（３）サイズ選択マイクロキャビティアレイが、孔径５μｍ〜２０μｍから選ばれる微細貫通孔を有するマイクロキャビティアレイであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のマイクロ流体デバイスや、（４）サイズ選択マイクロキャビティアレイが、孔径８μｍ又は１０μｍから選ばれる微細貫通孔を有し、孔の中心間距離６０μｍ、１００×１００の１０，０００孔をアレイ状に配したマイクロキャビティアレイであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスや、（５）サイズ選択マイクロキャビティアレイのＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔が、電鋳技術を用いてニッケル基板に形成されたものであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスや、（６）サイズ選択マイクロキャビティアレイのＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔が、レーザー技術を用いて石英基板に形成されたものであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスや、（７）上部部材が、試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板とから構成されていることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスや、（８）下部部材が、サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板とから構成されていることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスや、（９）吸引口がペリスタルティックポンプに接続されていることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスや、（１０）上記（１）〜（９）のいずれか記載のマイクロ流体デバイスを用いることを特徴とする循環腫瘍細胞（ＣＴＣ） の検出方法や、（１１）血液を前処理することなくそのまま試料として使用することを特徴とする上記（１０）記載のＣＴＣの検出方法や、（１２）血液導入速度を２００〜１０００μＬ／ｍｉｎとすることを特徴とする上記（１０）又は（１１）記載のＣＴＣの検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、血液を前処理することなくそのまま分析できる；血球の分離から染色、洗浄までを一貫して行える；装置自体が小型で安価である；ＣＴＣの回収原理がＥｐＣＡＭなどの表面抗原に依らないこと；等の特徴を有する、ＣＴＣを捕捉することができるサイズ選択マイクロキャビティアレイを備えたマイクロ流体デバイスや、該マイクロ流体デバイスを用いたＣＴＣの検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】サイズ選択マイクロキャビティアレイによるＣＴＣ検出原理を示す図である。
【図２】サイズ選択マイクロキャビティアレイを配したＣＴＣを回収する本発明のマイクロ流体デバイスの概要を示す図である。
【図３】本発明のサイズ選択マイクロキャビティアレイが積層されたマイクロ流体デバイスの概要を示す図である。
【図４】本発明のサイズ選択マイクロキャビティアレイが積層されたマイクロ流体デバイスの使用状態を示す図である。
【図５】サイズ選択マイクロキャビティアレイ（ニッケル基板）の模式図である。
【図６】孔径サイズが１０μｍのサイズ選択マイクロキャビティアレイ（ニッケル基板）の顕微鏡写真を示す図である。
【図７】血液導入速度とＣＴＣ回収率の関係性を示す図である。
【図８】サイズ選択マイクロキャビティアレイ（ニッケル基板）上に捉えられたＮＣＩ−Ｈ３５８細胞及び白血球細胞の蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図９】本発明のマイクロ流体デバイス（ニッケル基板）における、モデルＣＴＣの検出効率評価に関する結果を示す図である。
【図１０】本発明のマイクロ流体デバイス（ニッケル基板）における、ＭＣＦ−７，ＮＣＩ−Ｈ３５８，ＡＧＳ，ＳＷ６２０の各細胞株を用いて行ったＣＴＣ検出実験の結果を示す図である。
【図１１】ＭＣＦ−７，ＮＣＩ−Ｈ３５８，ＡＧＳ，ＳＷ６２０の各細胞のサイズ分布を示す図である。
【図１２】本発明のマイクロ流体デバイスを用いて、サイズ選択マイクロキャビティアレイ（石英基板）上に補足したＮＣＩ−Ｈ３５８細胞（肺がん細胞）の光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のマイクロ流体デバイスとしては、試料供給口と試料排出口、及び試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路が形成され、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられた上部部材と；前記上部部材の開口窓の下方に相当する位置に、ＣＴＣ捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイと、該サイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなるマイクロキャビティアレイ保持部と；前記サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に設けられた吸引用開口窓と、前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路が形成された下部部材と；を備え、サイズ選択マイクロキャビティアレイにより血液試料中に含まれるＣＴＣを捕捉することができる装置であれば特に制限されないが、前記上部部材とマイクロキャビティアレイ保持部と下部部材とが装脱着可能に構成され、かつ、前記サイズ選択マイクロキャビティアレイが交換可能に構成されているマイクロ流体デバイスを好適に例示することができる。ここでサイズ選択マイクロキャビティアレイを備えたＣＴＣ検出の原理を図１に示す。
【００１７】
上記マイクロキャビティアレイ保持部を単層で構成し（図２参照）、孔径の異なるサイズ選択マイクロキャビティアレイを順次交換してＣＴＣを検出することもできるが、マイクロキャビティアレイ保持部を、上層から下層に向かって、サイズ選択マイクロキャビティアレイに設けられた貫通孔の孔径が、例えば１５μｍ，１０μｍ，５μｍへと、あるいは１０μｍから８μｍへと順次小さくなっている２〜３枚のサイズ選択マイクロキャビティアレイと，各サイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなる多層に形成した積層マイクロ流体デバイスを好適に例示することができる（図３参照）。かかる多層に形成したマイクロ流体デバイスを用いたＣＴＣ検出の概念図を図４として示す。
【００１８】
上記サイズ選択マイクロキャビティアレイとしては、電鋳技術を用いてニッケル基板に形成されたＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔を有するものや、レーザー技術を用いてガラス基板、好ましくは石英基板に形成されたＣＴＣ捕捉用の微細貫通孔を有するものを好適に例示することができる。かかるサイズ選択マイクロキャビティアレイ（ニッケル基板）の模式図を図５に、また、孔径サイズが１０μｍのサイズ選択マイクロキャビティアレイ（ニッケル基板）の顕微鏡写真を図６に示す。電鋳技術を用いてニッケル基板に微細貫通孔を形成させることにより、ＣＴＣ捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を形成することができる。ＣＴＣ捕捉用の孔径としては、５μｍ，８μｍ，１０μｍ，１５μｍ，２０μｍなど通常孔径５μｍ〜２０μｍから選ぶことができ、孔数としては１０００個以上、好ましくは３０００個以上、より好ましくは５０００個以上、中でも１００×１００の１０，０００孔から１００，０００孔程度が特に好ましい。また、配置としては等間隔に設けることが好ましく、孔の中心間距離は２０μｍ以上とすることができ、例えば、孔径が８μｍや１０μｍの場合、孔の中心間距離を６０μｍ程度とすることができる。
【００１９】
上記密封性シールとしては、サイズ選択マイクロキャビティアレイと上部部材や下部部材との間、あるいはサイズ選択マイクロキャビティアレイ同士を密封しうるものであれば特に制限されず、ゴム製やプラスチック製の市販のシール部材を用いることができる。
【００２０】
上記上部部材としては、試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板とから構成されている部材を、製作や組立ての容易さから好適に挙げることができる。
【００２１】
前記上部基板としては、表面（上面又は側面）に試料供給口及び試料送出口が形成され、下面に試料供給口と試料送出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製の平板を例示することができ、上面は多少曲面となっていてもよく、また、下面は前記上部平板の上面と液密に積層しうる限り多少曲面となっていてもよいが、上下面とも水平面からなる平板が加工の簡便さの点で好ましい。マイクロ流路形成用の溝は、細胞の付着防止の点から、曲面状の内面となる溝、例えば半円筒状（断面半円弧状）の内面溝や断面が矩形の角形溝を好適に例示することができる。上記試料供給口に試料を供給するため、試料供給ポンプ等の試料供給手段が試料供給ラインを介して接続されている。さらに試料供給ラインのうち試料供給ポンプの上流には、試料供給バルブ及び試料貯留槽が上流側から下流側に向って順次接続しておくこともできる。また、上記試料送出口には、試料送出ポンプ等の試料送出手段が試料送出ラインを介して接続しておいてもよく、単に試料送出バルブを取付けておくこともできる。上記試料供給ポンプや試料送出ポンプとしては、チューブポンプもしくはプランジャポンプ等の微小流量を制御可能なマイクロポンプを具体的に例示することができる。
【００２２】
前記上部平板としては、上記の上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板を例示することができ、上部基板と協働してマイクロ流路を形成するため、上部基板に設けられたマイクロ流路形成用の溝に相当する上面位置に、マイクロ流路形成用の溝、例えば半円筒状（断面半円弧状）の内面溝を設けることもできるが、上面を平面としてマイクロ流路を形成することもできる。また、サイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓は、サイズ選択マイクロキャビティアレイの全面が露出する大きさのものが好ましく、窓の形状は円形、正方形等の矩形、三角形、楕円、角丸四角形などを具体的に例示することができる。
【００２３】
上記下部部材としては、サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板とから構成されている部材を、製作や組立ての容易さから好適に挙げることができる。
【００２４】
前記プラスチック製下部平板としては、サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられ、前記下部基板と協働して吸引流路を形成しうる平板であれば特に制限されず、吸引用開口窓の形状も特に制限されないが、通常円形として構成される。この下部平板は、減圧吸引条件下に、前記サイズ選択マイクロキャビティアレイと下部基板との隙間を気密に維持しうる平板形状に構成されている。
【００２５】
前記下部基板としては、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなるものであれば特に制限されず、吸引口は減圧吸引手段に連結され、サイズ選択マイクロキャビティアレイ上の試料液は、微細貫通孔、吸引用開口窓、吸引流路、吸引口を順次経由して排出される。吸引口にはペリスタルティックポンプに接続しておくことが好ましい。この吸引時には、前記上部基板の試料送出口の下流の試料送出バルブを閉塞しておくこともできる。また、下部基板の片側に、下から順次下部平板、サイズ選択マイクロキャビティアレイ、上部平板、上部基板を積層したときと同じ高さとなるような段差部を設けておくことが好ましい。このような段差部を設けることにより、減圧吸引時に下部基板上に下部平板、サイズ選択マイクロキャビティアレイ、上部平板、上部基板を安定に積層載置することができ、吸引圧によりこれら平板を互いにボルト等により固着することなく、しっかりと固定することができ、逆に、減圧解放時には簡便にこれら平板を互いにとり外すことができる。
【００２６】
前記上部基板、上部平板、下部平板、下部基板の材質としては、硬質のプラスチックが好ましく、これらは同じ材質でも異なる材質でも特に制限されず、ＰＤＭＳ（poly-dimethylsiloxisane）、ＰＭＭＡ（Poly(methyl methacrylate)）、ＰＣ、硬質ポリエチレン製等のプラスチック平板を例示することができるが、密封性シールとの密着性の点でＰＤＭＳが好ましい。
【００２７】
前記マイクロ流路の内面、好ましくはマイクロ流路の内面に加えてサイズ選択マイクロキャビティアレイの上面を非イオン性界面活性剤であらかじめ処理しておくことが、マイクロ流路内面への細胞の付着を防除する上で好ましい。この非イオン性界面活性剤処理に先だって、表面プラズマ処理をすることがより好ましい。陰イオン界面活性剤を用いて表面を被覆することにより、表面電位が負に帯電している微生物の吸着を防除することはできるが、細胞は十分に防除することができず、非イオン性界面活性剤で処理する必要がある。かかる非イオン性界面活性剤としては、ブロックポリマー型エーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル（シュガーエステル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルを例示することができるが、ブロックポリマー型エーテル、特にポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤が好ましい。上記ブロックポリマー型エーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＰ１２３）、ポリオキシエチレンオキシプロピレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ ４Ｐ．Ｏ）を挙げることができる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、例えば、水素添加ヒマシ油ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油等を挙げることができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリソルベート４０（ツイーン４０）、ポリソルベート６０（ツイーン６０）、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）を挙げることができる。例えば、プルロニックＦ１２７などのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤を用いる場合、その濃度は０．５〜１０％、好ましくは１〜５％程度である。
【００２８】
また、本発明のＣＴＣの検出方法としては、上記本発明のマイクロ流体デバイスを用いてＣＴＣの検出を行う方法であれば特に制限されず、血液を前処理することなくそのまま試料として使用することが好ましい。また、血液導入速度を２００〜１０００μＬ／ｍｉｎとすることがＣＴＣ回収率を高める点で好ましい。サイズ選択マイクロキャビティアレイ上に捕捉されたＣＴＣに対する検出は、ＦＩＴＣやＰＥで標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体等のＣＴＣ特異的な抗体を用いて蛍光染色して蛍光顕微鏡等により観察することにより行うことができる。また、光学顕微鏡を用いて明視野観察を行う場合には、パパニコロウ染色やギムザ染色を行うことで細胞内の核、細胞質等の形態的特徴を指標としてＣＴＣ検出を行うことが出来る。特に、捕捉したＣＴＣを長期的に観察する際には、光学顕微鏡を用いて明視野観察することが望ましい。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（ニッケル基板）
［試薬及び器具］
培地としてＲＰＭＩ−１６４０，ＤＭＥＭ，ＭＥＭをＳＩＧＭＡより購入した。これに、５６℃で３０分間加熱処理することで非動化した１０％ウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを抗生物質として添加し培養に用いた。ＭＥＭには１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬウシのインシュリン、１．５ｍｇ／ｍＬ重炭酸｛じゅうたんさん｝ナトリウムを添加し培養に用いた。細胞の染色に用いたＦＩＴＣ標識−抗ＣＤ４５抗体及びＰＥ標識−抗ＥｐＣＡＭ抗体はＢＤ bioscienceより購入した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２はMolecular probeより購入したものを利用した。実験には蒸留水又は超純水を用い、その他の試薬類は、すべて市販特級品又はそれに準じたものを使用した。細胞の懸濁，洗浄にはＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＢＳＡ）を用いた。
【００３１】
［サイズ選択マイクロキャビティアレイの作製］
マイクロキャビティアレイを加工するための基板としてニッケル基板（１８×１８ｍｍ，厚さ３５μｍ）を使用した。マイクロキャビティアレイを介して血液を直接送液し、血中のＣＴＣのみを選択的にマイクロキャビティ上に捕捉するため、血球成分のサイズとフィルトレーションに関する文献等の値から、マイクロキャビティアレイの孔径サイズは８〜１１μｍとした。ニッケル基板の加工に関しては、オプトニクス精密株式会社に依頼し、電鋳技術を用いてニッケル基板に貫通孔を加工した。孔の中心間距離を６０μｍとし、合計で１００×１００の１０，０００孔をアレイ状に配したものを設計した。図５にはサイズ選択マイクロキャビティアレイの模式図を、図６には孔径サイズが１０μｍのサイズ選択マイクロキャビティアレイの顕微鏡写真（×１０００）をそれぞれ示す。さらに、ＰＤＭＳマイクロ流路によりマイクロキャビティアレイ基板を挟み込む形式でのＣＴＣ回収装置を設計した。シリコンチューブ（０．５×１ｍｍ）からなるインレット（試料供給口），アウトレット（試料排出口）を配した上部流路と、吸引ラインを配した下部流路を作製した。これらのＰＤＭＳマイクロ流路をマイクロキャビティアレイに対して、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ  ｓｌｉｄｅ  ｓｅａｌ（TAKARABIO）を介して貼り付けた。これらのＰＤＭＳからなる構造体は、その型をＣＡＤ−ＣＡＭＭを用いてＰＭＭＡを切削することにより鋳型を作製し、この型にＰＤＭＳを注入し、加熱硬化させたものを使用した。ＣＴＣ回収装置は、シリンジを加工したリザーバーにインレットを接続し、下部流路をぺリスタルティックポンプに接続し、コンピューター制御式電動ステージを配した正立顕微鏡下に設置して使用した。図２には、サイズ選択マイクロキャビティアレイを配したＣＴＣを回収するマイクロ流体デバイスの概要が示され、図２ａはＣＴＣ回収マイクロ流体デバイスの模式図が、図２ｂには血液導入の様子が、それぞれ示されている。
【００３２】
本発明のマイクロ流体デバイスを用いたＣＴＣ回収の手順は以下の通りである。１）血液を（適宜希釈し）マイクロキャビティアレイを配したＣＴＣ回収装置に導入する。２）血球細胞はマイクロキャビティアレイを通り抜けさせ、サイズが大きな腫瘍細胞のみをマイクロキャビティアレイ上に捕捉する。３）染色液を同じようにマイクロキャビティアレイを介して送液し、マイクロキャビティアレイ上の腫瘍細胞又は白血球を蛍光免疫染色する。４）マイクロキャビティアレイ上の細胞の蛍光観察像を取得して、免疫表現型から腫瘍細胞を同定し、その数をカウントする。これらの操作を連続的に行うためにマイクロキャビティアレイに接続するマイクロ流路を作製した。上部流路のインレットは、シリンジを加工したリザーバーに接続し、このリザーバーに順次、サンプルや試薬を投入していくことで、細胞の捕捉や染色・洗浄を連続的に容易に行えるようにした。
【００３３】
［動物細胞の培養及び蛍光染色］
ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞、ＡＧＳ細胞、ＳＷ６２０細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃，５％ＣＯ２濃度下で静置培養した。培養３〜４日後、培地をピペッティングにより除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄を行った後、０．２％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３〜５分間インキュベートした。検鏡し細胞がディッシュから剥離していることを確認した後に、血清入り培地を加えトリプシン作用を止めてピペッティングし、細胞を回収した。回収した細胞は遠心後（１２００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）、上清を除去して新鮮培地に再懸濁し、培地をピペッティングにより全て回収した。トリパンブルーを用いた色素排除法により生細胞数を計数し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製後、新しいディッシュに播種した。ＭＣＦ−７細胞はＭＥＭ培地を用いて３７℃，５％ＣＯ２濃度下で静置培養した。培養後の操作は他の細胞と同様である。
【００３４】
また、細胞捕捉実験に用いる細胞として、１．５ｍＬチューブに１ｍＬの培地を回収した。回収した細胞はリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で遠心洗浄（２００ｇ，５ｍｉｎ）を３回繰り返した後にＰＢＳに再懸濁した。その後、５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＴＰＸ（Molecular Probes）を添加し、３０分間インキュベーションすることにより細胞を蛍光染色した。染色後、上記と同様の方法で遠心洗浄を行い、過剰な蛍光色素を取り除き、細胞捕捉実験に用いる蛍光染色細胞を調製した。また、モデル腫瘍細胞の回収効率評価実験には、ヘパリン含有真空採血管に採血した健常者血液に１０〜１００個の腫瘍細胞を混合させたサンプルを用いた。
【００３５】
［サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた細胞捕捉・循環腫瘍細胞検出操作］
リザーバーにＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＢＳＡ）１ｍＬを導入し、マイクロキャビティアレイ上をＰＢＳで満たしてから、ぺリスタルティックポンプを介して２００μＬ／ｍｉｎで送液を開始した。約５分後、リザーバーに１ｍＬの血液サンプルを導入した。約５分後、血球成分を流しきるために、リザーバーに２ｍＬのＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＢＳＡ）を導入した。約１０分後、ポンプ流速を２０μＬ／ｍｉｎに変更し、リザーバーに６００μＬの細胞染色液（ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（０．５μｇ／ｍＬ））を導入した。マイクロキャビティアレイ上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、リザーバーに１ｍＬのＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＢＳＡ）を導入して細胞の洗浄を行った。１５分間以上の洗浄を行った後に、蛍光顕微鏡観察を行った。
【００３６】
マイクロキャビティアレイ上に捕捉・回収された全ての細胞を観察するためにアレイ全体の撮像を行った。これにはコンピューター制御式電動ステージ、冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０；Olympus）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１; Olympus）を用い、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＰＥ由来の蛍光を観察するためにＷＵ、ＮＩＢＡ及びＣｙ３フィルターを用いてそれぞれ画像を取得した。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ（Mitani Corporation）を用いた。
【００３７】
［サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞回収の検討結果］
はじめに、作製したサイズ選択マイクロキャビティアレイを用いて、１ｍＬの血液を目詰まりなく送液することが出来るかを検討した。流速は、２００μＬ／ｍｉｎとした。これまで用いてきた孔径２μｍのマイクロキャビティアレイを用いて、血液を送液した場合、すぐさま目詰まりが起こった。一方、サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた場合では、スムーズな送液を行うことができ、血液１ｍＬを送液した後、バッファーを送液することで、マイクロキャビティアレイ上を綺麗に洗い流すことができた。
【００３８】
次に、孔径を大きくしたサイズ選択マイクロキャビティアレイを用いて、腫瘍細胞を通り抜けさせずにマイクロキャビティアレイ上に捉えられるかを検討した。ここでは、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞をモデル細胞として用い、細胞１００個をＰＢＳ１ｍＬに懸濁したものをサンプルとした。ポンプ流速を変化させた場合に、どれだけ細胞をマイクロキャビティアレイ上に回収できるかを検討した。血液導入速度とＣＴＣ回収率の関係性を図７に示す。流速は２００〜２０００μＬ／ｍｉｎまで変化させたが、１０００μＬ／ｍｉｎ以下の流速であれば、９０％近い回収効率を得られることが分かった。ポンプ流速をこれ以上に上げると、マイクロキャビティアレイ上に気泡が発生するなどの問題が起こることがあり、回収率は減少した。また、試行間誤差が大きくなるという問題もあることが分かった。よって、以後の実験では、１０００μＬ／ｍｉｎ以下の流速で血液導入と腫瘍細胞回収を行うこととした。
【００３９】
これまでに報告されているマイクロ流体デバイス型のＣＴＣ検出装置では、血液の送液速度は１０〜３００μＬ／ｍｉｎとされている（Nagrath et al. 2007; Tan et al. 2009）。よって、サイズ選択マイクロキャビティアレイが可能とするサンプル導入速度はこれらに比較して圧倒的に早いということが言える。血液サンプルの状態は採血時から時間が経つほど悪化していくことが考えられ、ＣＴＣの回収及び検出に与える影響も懸念される。よって、迅速な処理は検出精度を上げる目的でも重要な役割を果たすと考えられ、これは本装置の大きな利点と考えられる。
【００４０】
［モデル腫瘍細胞の回収効率の評価］
サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いたＣＴＣの回収効率を評価するために、健常者血液１ｍＬに１０，２５，５０，１００個の各ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を添加したサンプルを調製し、各サンプルにおける回収細胞数を評価した。図８はサイズ選択マイクロキャビティアレイ上に捉えられたＮＣＩ−Ｈ３５８細胞及び白血球細胞の蛍光顕微鏡写真である。図８に示されるように、回収された全ての細胞が核を有している。腫瘍細胞はＥｐＣＡＭを発現しているが、ＣＤ４５を発現していない。正常な血球細胞はＣＤ４５を発現しているが、ＥｐＣＡＭを発現していない。このように、染色液を導入することにより、細胞の染色が可能であり、その表現型の違いと細胞のサイズの違いから腫瘍細胞と正常白血球は容易に判別できた。処理後にサイズ選択マイクロキャビティアレイ上に残存する正常白血球数はおよそ１０００個ほどであったが、ＣＴＣのカウントに際しては妨げにならない量であった。また、ＣＴＣに関しては微細孔に捕捉されているため、アレイ領域だけのスキャニングで全回収細胞数をカウントできた。このモデルＣＴＣの検出効率評価に関する結果を図９に示す。この結果から１０〜１００個のＣＴＣ存在数において、９６％以上の回収率で安定的に細胞を回収し検出できることが示された。
【００４１】
［細胞サイズと循環腫瘍細胞回収の関係性の評価］
ヒトの血液１ｍＬ中には約５×１０９個の赤血球、約７×１０６個の白血球、約３×１０８個の血小板が存在している。それぞれのおおよその大きさは、赤血球が７〜８μｍ、血小板が２〜３μｍ、白血球は細胞によってサイズに幅があり、リンパ球などでは６〜１５μｍ、大きな単球では２０μｍになる。一方、上皮系の腫瘍細胞は多くが１０μｍ以上の直径を有している。また、血液細胞は毛細血管を巡り、体内を循環するという性質から上皮系の細胞などと比較して変形能が高いと考えられている。よって、数種の細胞株を用いた検出実験を行い、回収率を評価した後、これらのモデル腫瘍細胞のサイズを測定し、細胞サイズが回収効率に与える影響について考察した。
【００４２】
ＭＣＦ−７，ＮＣＩ−Ｈ３５８，ＡＧＳ，ＳＷ６２０の各細胞株を用いて行ったＣＴＣ検出実験の結果を図１０に、ＭＣＦ−７，ＮＣＩ−Ｈ３５８，ＡＧＳ，ＳＷ６２０の各細胞のサイズ分布を図１１に示す。１０μｍ径のサイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた場合、それぞれの細胞株の平均回収率は、ＭＣＦ−７：９８％，ＮＣＩ−Ｈ３５８：９６％，ＡＧＳ：７４％，ＳＷ６２０：３８％であった。また、用いた細胞のサイズを計測したところ、ヒト細気管支肺胞上皮癌ＮＣＩ−Ｈ３５８の場合、細胞のサイズは９〜３０μｍにまたがり、平均直径は約１８μｍであった。ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７は平均直径が２２μｍと最も大きく、サイズに１５〜４０μｍまでのバリエーションがあった。ＳＷ６２０細胞は、７〜２０μｍの範囲で１１μｍ径前後の細胞が最も多かった。ヒト胃癌ＡＧＳ細胞は、８〜２４μｍの範囲で１５μｍ径前後の細胞が最も多かった。これらの結果を見てみると、細胞サイズが１０μｍ以下までまたがる細胞については、回収率が低下していることが分かった。腫瘍細胞のサイズ分布は約８μｍ以上であることが示されている。このため、サイズ選択マイクロキャビティアレイの孔径を８μｍに変更して、ＳＷ６２０細胞の回収率を行った。その結果、回収率は９１％まで向上した。微細貫通孔の孔径や形状を最適化することによって、様々なタイプの腫瘍細胞を効率的に捕捉できるのではないかと考えられた。
【００４３】
［磁気分離を用いた循環腫瘍細胞回収との比較］
本発明のマイクロ流体デバイスを用いたＣＴＣ回収の有効性を評価するために、比較として一般的に用いられている磁気分離法を利用したＣＴＣ回収を行った。ここではMiltenyi Biotec社のＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）マイクロビーズと磁気分離カラムを用いた。健常者血液１ｍＬにモデル腫瘍細胞ＮＣＩ−Ｈ３５８を１００個添加したサンプルを調製し、腫瘍細胞の検出を試みた。磁気分離法は広く用いられている方法であるが、その処理には多段階の操作が必要である。この実験においても、はじめに、赤血球を取り除くために溶血操作を行った。溶血操作の後、磁気ビーズへの非特異吸着を抑制するためのブロッキング剤を添加し、続いてＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）マイクロビーズと反応させた。続いて各蛍光標識抗体を添加して細胞を染色した後、サンプルを磁気分離カラムに移して、洗浄することにより目的外の白血球などを洗い流し、最後にカラムを磁石からはずして、目的細胞を溶出させた。以上のように、磁気分離法はサンプルの移し変えや洗浄操作が非常に多いため、目的のＣＴＣをロスする危険性が非常に多い。結果として、１００個の細胞導入時の磁気分離による回収細胞数は５０個であった。サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた場合の回収細胞数は９６％であるので、磁気分離法と比較して、その回収効率は大幅に上回っていることが示された。磁気分離法における回収率は操作条件によって大きく影響を受けるが、ＥｐＣＡＭを標的とした場合の回収効率は９〜９０％と報告されており、各方法によって大きく異なっている（Lara et al. 2004）。また、標的としてもＥｐＣＡＭ以外にサイトケラチンを標的としてＣＴＣを特異的に分離する手法もある（Deng et al. 2008）。また、ＣＤ４５を標的として血液細胞をサンプルから除いてＣＴＣを濃縮する手法も報告されている（Allard et al. 2004）。しかし、どの抗原を標的としても、もともと大過剰に存在している血球細胞の混入は避けられないため、最終的なＣＴＣカウントに際して、疑陽性の細胞が検出される可能性を否定できない。また、多段階にわたる検出までのプロセスは煩雑であり、実験間誤差を生む要因となると考えられる。よって、操作の簡易性と再現性の高さといった観点からもサイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた本発明方法は有用な方法であるといえる。  
【実施例２】
【００４４】
（石英基板）
石英基板上にフェムト秒レーザを用いて、孔径８μｍのサイズ選択マイクロキャビティアレイ（孔数１０，０００個）を作製し、腫瘍細胞の捕捉について検討した。ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞をモデル細胞として用い、細胞１００個をＰＢＳ１ｍＬに懸濁したものをサンプルとした。ポンプ流速は２００μＬ／ｍｉｎとした。石英基板のサイズ選択マイクロキャビティアレイを用いてアレイ上に補足したＮＣＩ−Ｈ３５８細胞（肺がん細胞）の光学顕微鏡写真を図１２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明においては、マイクロキャビティアレイによる細胞集積化技術をＣＴＣの濃縮及び検出という目的に特化させて改良し、サイズ選択マイクロキャビティアレイを作り上げた。サイズ選択マイクロキャビティアレイは、細胞サイズの違いによって、上皮系腫瘍細胞と血球細胞を分離し、血中のＣＴＣを回収する有効な手段である。実施例に示されているとおり、腫瘍細胞モデルとしてＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を用いた場合、血液１ｍＬ中にＣＴＣが１０〜１００細胞個の条件で９６％以上の回収効率を得ることができた。また、複数の細胞株を用いた検討実験においては、細胞サイズが回収率に与える影響を考察したが、１０μｍ径のサイズ選択マイクロキャビティアレイではサイズの小さな腫瘍細胞を透過してしまう可能性が示唆された。これについては、より小さな孔径のサイズ選択マイクロキャビティアレイを利用又は併用することで、回収率を高められると考えられる。既存の方法との比較として、ＥｐＣＡＭマイクロビーズによる磁気回収法と比べたところ、本発明方法が回収率に優ることが明らかにされた。
【００４６】
本発明は以下に述べる特徴を有しており、ＣＴＣの検出技術の一つとして非常に強力なツールとなる。（１）血液を前処理することなくそのまま分析できることが挙げられる。従来法では、分析の妨げとなる赤血球を溶血させたり、白血球を除いたりといった操作が必須であったが、これらの処理を一切必要とせず、分析装置に直接導入することができる。（２）血球の分離から染色、洗浄までを一貫して行えることにある。本発明のマイクロ流体デバイスのような装置設計でなければ、試験管内の細胞に対して繰り返し染色と洗浄操作を行うことになるため、目的細胞のロスの低減を実現する目的で有効に働く。（３）腫瘍細胞が規則的に加工されたマイクロキャビティアレイ上に捕捉されることが挙げられる。従来のメンブレンフィルターを用いた血球フィルトレーション法などでは、孔径が均一ではなく、分散して存在しているため、捕捉の安定性やスキャニング時間に問題があった。本発明のマイクロ流体デバイスでは、均一な孔径で安定した細胞捕捉を実現し、アレイ領域のみのスキャニングによって、回収したＣＴＣをカウントすることができる。（４）本発明のマイクロ流体デバイスは、装置自体が小型で安価であるということが挙げられる。従来は、煩雑な作業を自動化するために、磁気分離やスキャニングといった要素技術を詰め込んだ大型装置（Ｃｅｌｌｓｅａｒｃｈなど）を用いなければ多検体の処理は困難であった。しかし、ポンプと蛍光顕微鏡さえあれば使用でき、同時並行に検体を処理できるうえに、熟練した技術も必要としない。（５）ＣＴＣの回収原理がＥｐＣＡＭなどの表面抗原に依らないことである。前述したように、ＥｐＣＡＭの発現量は検体毎に異なっており、これらを指標とした磁気分離法では、ＥｐＣＡＭ陰性の腫瘍細胞などは回収できない。これに対し、本発明では、細胞サイズという異なる概念で腫瘍細胞を回収でき、その後の解析等に供することもできる。上記実施例では、ＥｐＣＡＭ陽性細胞をＣＴＣとしてカウントしたが、異なるマーカーを標的とした染色操作も同じように実行でき、前述したｏｎ−ｃｈｉｐ  ＦＩＳＨを利用することでＣＴＣ特異的ｍＲＮＡの検出も可能であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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