(57)【要約】【課題】  特別な装置および設備を必要とすることなく、簡便に遺伝子を検出するための前処理方法を提供する。【解決手段】生体試料中の遺伝子を検出するための試料の前処理方法であって、下記の工程を含む試料の前処理方法Ａ）試料中の細胞を破壊する細胞破壊工程Ｂ）試料中のタンパク質を除去するタンパク質除去工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の遺伝子を検出するための試料の前処理方法であって、下記の工程を含む試料の前処理方法
Ａ）試料中の細胞を破壊する細胞破壊工程
Ｂ）試料中のタンパク質を除去するタンパク質除去工程
【請求項２】
Ａ）工程が、界面活性剤を用いた処理である請求項１記載の試料の前処理方法
【請求項３】
界面活性剤が、イオン性界面活性剤である請求項２記載の試料の前処理方法。
【請求項４】
イオン性界面活性剤が、ＳＤＳである請求項３記載の試料の前処理方法。
【請求項５】
Ｂ）工程が、Ａ）工程後の試料をカラムで処理する請求項１から４のいずれか一項に記載の試料の前処理方法。
【請求項６】
カラムの処理が、試料を充填したカラムを遠心する処理である請求項５記載の試料の前処理方法。
【請求項７】
遺伝子が、ウイルス遺伝子である請求項１から６のいずれか一項に記載の試料の前処理方法。
【請求項８】
ウイルスが、インフルエンザウイルスである請求項７記載の試料の前処理方法。
【請求項９】
インフルエンザウイルスが、新型インフルエンザウイルスである請求項８載の試料の前処理方法。
【請求項１０】
遺伝子増幅法を用いた生体試料中の遺伝子の検出方法であって、試料を、請求項１から９のいずれか一つの方法によって、前処理し、その後、遺伝子増幅法で遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
遺伝子増幅法が、等温増幅法である請求項１０記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１２】
等温増幅法が、下記ＴＰを用いた増幅法である請求項１１記載の遺伝子の検出方法。
ＴＰ：標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ′）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ′）を前記配列（Ａｃ′）の５’側に含んでなるプライマー。
【請求項１３】
等温増幅法が、一対のＴＰを用いた等温増幅法またはＴＰとＦＰを用いた等温増幅法である請求項１２記載の遺伝子の検出方法。
ＦＰ：標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ′）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ′）を前記配列（Ｃｃ′）の５’側に含んでなるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生体試料中の遺伝子を検出するための試料の前処理方法及び遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  生体試料、バクテリア、ウイルス等に含まれる核酸を検出及び増幅する場合には、各種の方法が知られている。例えば、プローブと検出対象の核酸とのハイブリダイゼーションの有無により、核酸を検出するハイブリダイゼーション法や、プライマーを伸長させて検出対象の核酸を増幅する方法が知られている。【０００３】  核酸を増幅して目的の遺伝子を検出する方法は、例えば、ＰＣＲ法が、一般的である。しかしながら、ＰＣＲ法は、温度サイクルを必要とするため、専用のサーマルサイクラーが必要となる。また、遺伝子の変異（例えば、ＳＮＰｓ）の検出に関しては、ＰＣＲ法は検出感度に問題がある。等温増幅が可能で検出精度が高い遺伝子の増幅方法としては、本出願人が開発した、Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ２（ＳｍａｒｔＡｍｐ２）と通称される方法がある（特許文献１）。この方法は、ターンバックプライマー（ＴＰ）およびフォールディングプライマー（ＦＰ）を主要プライマーとした非対称のプライマーセットを用いた等温での核酸増幅法である。この方法では、原理的にバックグラウンドの上昇を抑えて遺伝子変異の検出感度を向上させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献１】  特許第３８６７９２６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  一般に、核酸増幅による遺伝子の検出においては、検出前の試料の前処理として、生体試料中の夾雑物の除去が実施される。一方、季節性のインフルエンザに加え、最近では、新しいタイプのインフルエンザ（新型インフルエンザ）も発生し、大流行の兆しがある。インフルエンザのウイルスのタイプを特定することは、治療方法の方針の決定に極めて重要である。しかも、臨床現場で高精度でウイルス遺伝子を検出する必要がある。このため、特別な装置および設備を用いない簡便なウイルス遺伝子の検出手法の確立が求められている。このような要望は、ウイルス遺伝子に限らず、大腸菌等の細菌遺伝子の検出等、生体試料中のあらゆる遺伝子の検出に求められている。【０００５】  そこで、本発明は、特別な装置および設備を必要しない簡便な生体試料の前処理方法及び遺伝子の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明の前処理方法は、生体試料中の遺伝子を検出するための試料の前処理方法であって、下記の工程を含む試料の前処理方法である。
Ａ）試料中の細胞を破壊する細胞破壊工程
Ｂ）試料中のタンパク質を除去するタンパク質除去工程【０００７】  本発明の遺伝子検出方法は、遺伝子増幅法を用いた生体試料中の遺伝子の検出方法であって、試料を、本発明の前処理方法によって、前処理し、その後、遺伝子増幅法で遺伝子を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】  このように、本発明の前処理方法は、細胞破壊工程およびタンパク質除去工程を有するため、特別な装置および設備を必要とすることなく簡便に実施できる。その結果、本発明の前処理方法を用いた遺伝子の検出方法も、特別の装置および設備を必要とすることなく簡便に、しかも高い精度で遺伝子の検出（遺伝子の変異を含む）を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の実施例１の結果を示す図である。
【図２】  図２は、本発明の実施例２の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】  本発明の前処理方法において、Ａ）工程が、界面活性剤を用いた処理であることが好ましい。前記界面活性剤が、イオン性界面活性剤であることが好ましい。前記イオン性界面活性剤が、ＳＤＳであることが好ましい。
【００１０】  本発明の前処理方法において、Ｂ）工程が、Ａ）工程後の試料をカラムで処理することが好ましい。前記カラムの処理が、試料を充填したカラムを遠心する処理であることが好ましい。
【００１１】  本発明の前処理方法において、前記遺伝子が、ウイルス遺伝子であることが好ましい。前記ウイルスが、インフルエンザウイルスであることが好ましい。前記インフルエンザウイルスが、新型インフルエンザウイルスであることが好ましい。
【００１２】  本発明の遺伝子の検出方法において、遺伝子増幅法が、等温増幅法であることが好ましい。
【００１３】  前記等温増幅法が、下記ＴＰを用いた増幅法であることが好ましい。
ＴＰ：標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ′）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ′）を前記配列（Ａｃ′）の５’側に含んでなるプライマー。
【００１４】  前記等温増幅法が、プライマーセットとして、一対のＴＰを用いた等温増幅法またはＴＰとＦＰを用いた等温増幅法であることが好ましい。
ＦＰ：標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ′）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ′）を前記配列（Ｃｃ′）の５’側に含んでなるプライマー。
【００１５】  本発明者は、夾雑物による核酸の検出及び増幅阻害作用を減少又は抑制する物質を鋭意検討し、生体試料中の目的核酸を含む細胞を破壊させ、さらに、生体試料中の目的核酸の検出及び／又は増幅を阻害するタンパク質を除去する方法を開発し、簡易かつ迅速に核酸を検出及び／又は増幅できる方法を見出した。
【００１６】  本発明者らは、生体試料に陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン系界面活性剤のいずれを用いることができ、高分子系のもの及び低分子系のもののいずれからなる群から選択される少なくとも１種類の強力な変性効果のある物質を試料に添加することによって、生体試料中の目的核酸を含む細胞を破壊させ、目的核酸の検出及び／又は増幅効率が高まることがわかった。
【００１７】  さらに、本発明は、強力な変性効果のある物質を試料に添加することによって、目的核酸を含む細胞を破壊させたサンプルをカラム処理することで、生体試料中の目的核酸の検出及び／又は増幅を阻害するタンパク質を除去する方法を開発し、簡易かつ迅速に核酸を検出及び／又は増幅できる方法を見出した。
【００１８】  通常は、核酸の検出及び／又は増幅効率を上げるために、フェノールやクロロホルム等の有機溶媒を用いて、煩雑な手段で生体試料から予め核酸抽出及び精製処理を行うが、本発明の方法では、そのような有機溶媒を用いずに、簡易かつ迅速に核酸を検出及び／又は増幅できる。
【００１９】  オリゴヌクレオチドを相補的結合させるステップは、プローブをハイブリダイゼーションさせるステップとすることができ、プローブをハイブリダイゼーションさせた後、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インベーダー法、パルサー法、コロニーハイブリダイゼーション法、ＬＣＲ法及びｂＤＮＡ法からなる群から選択される方法により検出対象の核酸を検出することができる。
【００２０】  オリゴヌクレオチドを相補的結合させるステップは、プライマーをアニーリングさせるステップとすることができ、この場合、プライマーの３’末端から核酸鎖を伸長させることにより核酸を増幅するステップをさらに含んでもよい。核酸を増幅するステップは、等温増幅法により行っても良い。また、核酸を増幅するステップは、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＨＤＡ法及びＳｍａｒｔＡｍｐ２法からなる群から選択される方法により行うことができる。特に、ＬＡＭＰ法又はＳｍａｒｔＡｍｐ２法により、核酸を好適に増幅することができる。
【００２１】前記の生体試料、さらに生体試料の処理工程における溶液は、緩衝剤および塩類を含み、前記緩衝剤が、ＭＥＳ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝剤、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、リン酸ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳおよびＣＡＰＳからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記塩類が、ＮａＣｌおよびＫＣｌの少なくとも一方を含む試料の前処理方法である。
【００２２】  「界面活性剤」は、疎水性溶媒および細胞膜の疎水的部分と相互作用しうる疎水性領域もしくは部分、および溶液中で正または負の電荷を有しうるかまたは電荷のない極性領域を有しうる親水性領域もしくは部分を有する分子または分子のクラスを意味する。
「非イオン性界面活性剤」は、その親水性領域もしくは部分に少なくとも１個の極性で電荷のない基もしくはイオンを含んでいる界面活性剤を意味する。
「イオン性界面活性剤」は、親水性領域または部分に少なくとも１個の正または負に帯電した基もしくはイオンを含んでいる界面活性剤を意味する。
【００２３】    界面活性剤としては、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン系界面活性剤のいずれを用いることができ、高分子系のもの及び低分子系のものいずれも使用可能である。
【００２４】  カラムの素材としては、各種有機材料、無機材料をあげることができる。
【００２５】  前記カラムの大きさは、測定阻害物質を除去する容量を有することが必須であり、測定対象となる試料の量に応じて適宜選択できる。
【００２６】カラムに充填する担体としては、ＧＥヘルスケア社のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００ＳＦ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ、さらに、ＴＯＳＯＨ社のＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５５、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−７５、さらに、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（タカラバイオ社）のＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１０、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−３０、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１００、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−２００、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−４００、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１０００などがあるが、これらのみに限定されるものではなく、分離可能な担体カラムであればいずれか、さらには、それらの組み合わせ等も使用可能である。
【００２７】  生体試料をカラムに通す方法としては、重力による送液、遠心力による送液、加圧による送液、吸引による送液など、特に限定されない。
【００２８】  また、本発明は、試料中の細胞を破壊する細胞破壊工程、試料中のタンパク質を除去するタンパク質除去工程を行い、その後、遺伝子増幅法で遺伝子を検出する方法に関する。
【００２９】  本発明は、有機溶媒を用いた核酸抽出及び精製処理を行っていない試料を用いた場合でも、直接に迅速及び簡便に標的核酸の検出及び増幅を行うことができる。また、本発明の方法は、簡便であるため、コンタミネーションの機会を増やすことなく、標的核酸の検出及び／又は増幅を正確に行うことができる。
【００３０】  本発明では、生体試料中の細胞を界面活性剤を用いて破壊する処理工程、破壊された試料中のタンパク質を除去するために簡易カラムを通しタンパク質除去の処理工程を行うことによって、夾雑物による阻害作用を受けることなく効果的に標的核酸の検出及び／又は増幅を行うことができる。また、これらの処理に代えて、又は、これらの処理に加えて、試料を加熱変性することによっても、夾雑物による阻害作用を受けることなく効果的に標的核酸の検出及び／又は増幅を行うことができる。
【００３１】本発明で検出の対象とする遺伝子としては、ウイルス遺伝子、バクテリア遺伝子、ヒトゲノム遺伝子等があげられるが、特に、インフルエンザウイルス、新型インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ノロウイルス、サイトメガロウイルス等のウイルス遺伝子が好適に適用できる。また、試料中には、緩衝剤および塩類を含んでもよく、緩衝剤としてはＭＥＳ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝剤、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、リン酸ｂｕｆｆｅｒ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳおよびＣＡＰＳからなる群から選択される少なくとも一つであり、塩類としてはＮａＣｌおよびＫＣｌの少なくとも一方を含む試料が例示できるが、より望ましくは、緩衝剤が、ＭＥＳおよび酢酸−酢酸ナトリウム緩衝剤の少なくとも一方であり、前記塩類が、ＮａＣｌおよびＫＣｌの少なくとも一方を含むことが好ましい。
【００３２】  上記の処理工程を行うことにより、標的核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドによる核酸への相補的結合が、夾雑物による阻害作用を受けなくなる又は受けにくくなると考えられる。したがって、プローブによる標的核酸へのハイブリダイゼーション又はプライマーによる標的核酸へのアニーリングが円滑に行われる。プライマーによる標的核酸へのアニーリング効率が高まると、プライマーの３’末端からのヌクレオチド鎖の伸長効率も高まり、核酸の増幅の効率が向上する。
【００３３】  上記の処理工程に加えて、加熱処理を行なっても良い。加熱処理は、上記の処理工程の前、途中、処理後のいずれにおいても行うことができる。加熱温度は、３７℃以上、好ましくは４５℃以上、より好ましくは５５℃以上、さらに好ましくは８０℃以上とすることができる。加熱時間は、特に限定されず、極めて短時間の処理でも可能である。例えば、０．０１秒以上、又は３秒以上、好ましくは１分以上、より好ましくは３分以上行うことができる。例えば、加熱条件の一つとして、９８℃で３分間の加熱を例示できるが、当業者はこの条件以外に任意の時間及び温度を設定できる。また、この加熱処理をＰＣＲ法のような加熱を伴う反応の１ステップとして行うこともできる。
【００３４】  また、上記の処理工程に加えて、アルカリ処理を行なっても良い。アルカリ処理は、上記の処理工程の前、途中、工程後のいずれでもアルカリ溶液を試料に混合することにより行うことができる。アルカリ溶液としては、アルカリ金属水酸化物の溶液、例えば水酸化ナトリウム溶液及び水酸化カリウム溶液を例示できるが、これらに限定されない。アルカリ濃度（ＯＨ−１の濃度）は、０．１ｍＭ以上、又は１ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上とすることができる。あるいは、ｐＨ７以上、好ましくはｐＨ８以上、より好ましくはｐＨ９以上とすることができる。アルカリ濃度及びｐＨは、その後の検出または増幅ステップを阻害しない限り、任意の濃度及びｐＨで行うことができる（例えば１０Ｍ以下）。
【００３５】  さらに、加熱処理とアルカリ処理の両方を行うことも可能である。例えば、試料に上記物質を加えて、さらにアルカリ溶液と混合した後、９８℃で３分間の熱処理を行うことができる。
【００３６】  オリゴヌクレオチドは、検出対象の核酸配列の一部にハイブリダイズするプローブ又は検出対象の核酸配列の一部にアニーリングするプライマーとすることができる。プローブは、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列を有するものである。検出すべき核酸配列又はその相補鎖にハイブリダイズできる限り、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に、プローブの全塩基が相補的でなくともよい。また、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的ではない配列を、プローブの一部に有しても良い。さらに、プローブは、検出のために標識されていてもよく、例えば、プローブは、放射性同位体、蛍光物質、酵素、その他の化学物質等により標識されていてもよい。プローブは、固相表面に固定あるいは吸着した形態をとることができ、又は、遊離した状態のものを使用することができる。固定又は吸着したプローブは、例えば、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態とすることができる。
【００３７】  プライマーは、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列を有するものであり、２以上のプライマーからなるプライマーセットとして用いられてもよい。検出すべき核酸配列又はその相補鎖にアニーリングできる限り、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列に、プライマーの全塩基が相補的でなくてもよい。また、検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列に相補的ではない配列を、プライマーの一部に有しても良い。プライマーの一部に含まれる検出すべき核酸配列又はその相補鎖に相補的な配列に相補的ではない配列としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターなどが挙げられる。さらに、プライマーは、検出のために標識されていてもよく、例えば、プライマーは、放射性同位体、蛍光物質、酵素、その他の化学物質等により標識されていてもよい。
【００３８】  検出対象の核酸配列は、例えば二本鎖核酸からなる遺伝子であればセンス側の塩基配列でもアンチセンス側の塩基配列を検出してもよい。例えば、アンチセンス側の核酸配列を検出することによってその相補的であるセンス側の核酸配列（すなわち遺伝子の塩基配列）を検出することができる。検出対象の核酸は、例えば、バクテリア、ウイルス、細菌、原虫、多細胞生物、プラスミドまたはある種の疾患に対する前傾向又は傾向に関連する遺伝子の変異等の遺伝的条件等の核酸を含む生物に特有な核酸であり、特にＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００３９】  本発明では、界面活性剤としては、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン系界面活性剤のいずれを用いることができ、高分子系のもの及び低分子系のものいずれも使用可能である。
【００４０】  強力な変性効果のある物質として、界面活性剤の具体的な例は、純石けん分、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩を含み、より具体的にはＮ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］、Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−９］、Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−１０］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（８）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ［ＮＰ−４０］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ［Ｔｗｅｅｎ２０］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ［Ｔｗｅｅｎ４０］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ［Ｔｗｅｅｎ６０］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ［Ｔｗｅｅｎ８０］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２３）Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ［Ｂｒｉｊ３５］、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ＣｅｔｈｙｌＥｔｈｅｒ［Ｂｒｉｊ５８］、ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｈｅｐｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｎｏｎｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、Ｓａｐｏｎｉｎ，ｆｒｏｍ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ、３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ＣＨＡＰＳＯ］、３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ＣＨＡＰＳ］、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ［ＳＤＳ］、Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ［ＳＤＢＳ］、Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ［ＬＤＳ］、Ｌｉｔｈｉｕｍ３，５−Ｄｉｉｏｄｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ［Ｔｒｉｓ  ＤＳ］、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｏｌａｔｅ、Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｓａｌｃｏｓｉｎａｔｅ、Ｃｅｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ［ＣＴＡＢ］、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅなどのいずれか又はそれらの混合物とすることができる。
【００４１】  カラムの素材としては、各種有機材料、無機材料をあげることができ、例えば、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、シリコン等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体；石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類、セラミックスおよびその複合体などが好ましく用いられる。製造方法としては、射出成形でも切削加工でもかまわないが、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）の射出成形品が特に好ましく用いられる。
【００４２】  前記カラムの大きさは、測定阻害物質を除去する容量を有することが必須であり、測定対象となる試料の量に応じて適宜選択できる。カラムの形状は、横断面が円、多角形など特に限定されないが、短径（円の場合は直径、多角形の場合は中心を通る最も短い径を意味する）より流路長のほうが長い方が好ましい。例えば、生体サンプルに対してカラム内の担体容量は２０倍程度必要であり、生体サンプル０．０５ｍＬに対してカラム内の担体容量は１．０ｍＬ以上必要となるが、カラム長と断面積にも依存するのでこの限りではない。例えば、通常断面の短径が０．１ｍｍ〜１００ｍｍ、流路長が１ｍｍ〜１００ｃｍの範囲とすることができる。
【００４３】カラムに充填する担体としては、ＧＥヘルスケア社のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００ＳＦ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ、さらに、ＴＯＳＯＨ社のＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−５５、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−６５、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−７５、さらに、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（タカラバイオ社）のＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１０、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−３０、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１００、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−２００、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−４００、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  ＴＥ−１０００などがあるが、これらのみに限定されるものではなく、分離可能な担体カラムであればいずれか、さらには、それらの組み合わせ等も使用可能である。
【００４４】  生体試料をカラムに通す方法としては、重力による送液、遠心力による送液、加圧による送液、吸引による送液など、特に限定されないが、生体試料の回収率が高い遠心送液が好ましく用いられる。遠心力によりカラム中を送液することで、新たにポンプなどを必要とせず、簡便な系を確立することができる。
【００４５】  生体試料としては、動物由来及び植物由来、ウイルス、バクテリア由来の試料が挙げられるがこれらに限定されない。動物由来の試料としては、血液（全血、分離血液細胞を含む）、血清、血漿、細胞（培養細胞系を含む）、組織、体液（耳漏、鼻汁、膿、腹水、胸水、胆汁、髄液、喀痰など）、粘膜細胞（口腔粘膜細胞、胃粘膜細胞、気道粘膜細胞など）、鼻腔粘膜や口腔粘膜から綿棒などで採取したぬぐい液、汗、羊水、排出物（尿及び糞便等）、内視鏡などによる各臓器からのブラッシング、採取液、バイオプシー試料、肺胞洗浄液などが例示できるが、これらに限定されない。植物由来の試料としては、植物体全体、培養細胞、組織、根、茎、葉、花、種子などの器官が例示できるが、これらに限定されない。微生物由来の試料としては、微生物培養物などが例示できる。また、生体試料に限らず、海水、土壌など、任意の試料に対して適用することができる。
【００４６】  生体試料として、感染症の有無を検査する方法に本法は有用である。呼吸器感染症に関わるウイルスやバクテリアの遺伝子検出、特にインフルエンザウイルス、さらに、２００９年にアウトブレイクした新型インフルエンザウイルス（新型豚由来Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ｓ−ＯＩＶ））の検出に本法は有用であるが、この検出に限定されるものではない。
【００４７】  本発明によれば、目的核酸を含む細胞を界面活性剤を用いて破壊させ、そのサンプルをカラム処理することで、生体試料中の目的核酸の検出及び／又は増幅を阻害するタンパク質を除去し、簡易かつ迅速に核酸を検出及び／又は増幅できる。
【００４８】  プローブにより核酸を検出する方法としては、ＤＮＡを検出するサザンハイブリダイゼーション、ＲＮＡを検出するノーザンハイブリダイゼーション、インベーダー法、パルサー法、ｂＤＮＡ法が例示できるが、これらに限定されない。
【００４９】  サザンハイブリダイゼーションは、目的の配列を有するＤＮＡを検出する方法であり、一般的には、次のような手順により行われる。ＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロース電気泳動により分離する。アガロースゲル内のＤＮＡをアルカリ処理により一本鎖に変性させる。次に、ＤＮＡ断片を電気泳動後のゲルからニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンなどのメンブレンに移し、酵素や放射性同位元素により標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、プローブに相補的な配列をもったＤＮＡを検出する。
【００５０】  ノーザンハイブリダイゼーションは、目的の配列を有するＲＮＡを検出する方法であり、一般的には、次のような手順により行われる。ＲＮＡを変性条件下でアガロース電気泳動により分離する。続いて、ＲＮＡを電気泳動後のゲルからニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンなどのメンブレンに移し、酵素や放射性同位元素により標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、プローブに相補的な配列をもったＲＮＡを検出する。
【００５１】  インベーダー法は、標的ＤＮＡの一塩基ミスマッチの構造変化を特異的に認識する酵素を用いた蛍光シグナルの検出よって一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法であり、一般的には次のような手順により行われる。アレルプローブ、インベーダープローブ及びＦＲＥＴプローブと呼ばれる３種類のプローブを用意する。アレルプローブは、鋳型に特異的な配列を３’側に有し、側は鋳型の配列を無関係な配列（フラップ）を５’側に有する。アレルプローブの鋳型に特異的な３’側の配列のうちの５’末端は、ＳＮＰ部位であり、検出対象のアレルの塩基と相補的であるよう設計されている。インベーダープローブは、ＳＮＰ部位から鋳型の３’側に相補的に結合するよう設計されているが、ＳＮＰ部位に対応する塩基は任意の塩基でよい。ＦＲＥＴプローブは、３’側にフラップと相補的な配列と、５’側にヘアピン構造を形成するパリンドローム配列を持つ。ＦＲＥＴプローブの５’末端には、蛍光色素が結合し、さらにその近傍にはクエンチャーが結合している。
【００５２】  これらの３種のプローブを標的ＤＮＡとハイブリッドさせて、酵素ｃｌｅａｖａｇｅを作用させる。このとき、ＳＮＰ部位に対応するアレルプローブの塩基がＳＮＰ部位の塩基に相補的に結合すると、インベーダープローブの３’末端が侵入する。この構造を酵素ｃｌｅａｖａｇｅが認識してフラップの部位でアレルプローブが切断されてフラップ部分が遊離する。遊離したフラップは、ＦＲＥＴプローブに結合する。フラップがＦＲＥＴプローブに結合すると、さらにこの構造を酵素ｃｌｅａｖａｇｅが認識して、ＦＲＥＰプローブの５’末端が切断され、クエンチャーにより消光されていた蛍光色素が遊離し、蛍光が検出されるようになる。
【００５３】  パルサー法は、あらかじめ用意した相補的な３つの領域からなる２種類のＤＮＡプローブに標識を付し，それらにハイブリダイゼーションを繰り返させることで，蜂の巣のような形に結合・増幅し大きなＤＮＡの塊を作らせ，これをシグナルとなる。検出したい遺伝子にこのシグナルを結合させることで，その存在が確認できる。この方法は、ハイブリダイゼーションの過程に核酸合成酵素を必要とせず、等温で行えることから簡便であり、反応が短時間で行うことができ、ＤＮＡ及びＲＮＡのどちらも高感度に検出できる。
【００５４】  ｂＤＮＡ法は、分枝鎖プローブ法又はｂＤＮＡプローブ法とも呼ばれる核酸の検出法である。プローブと核酸をハイブリダイズさせ、さらに分枝ＤＮＡとよばれる増幅分子とハイブリダイズさせ、それを検出することにより、標的核酸を検出する。
【００５５】  プライマーを用いて核酸を増幅する技術には、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＳＤＡ法、ＨＤＡ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ２法などが例示できるが、これらに限定されない。これらの増幅技術は、増幅された核酸を検出することにより目的とする核酸を検出する工程をさらに含んでも良い。ＰＣＲのような温度をサイクル的に変化させることによる増幅及び等温で反応をおこさせる等温増幅法のいずれをも使用できる。例えば、等温増幅法としては、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＲＣＡ法、ＳＤＡ法、ＴＲＣ法、ＨＤＡ法及びＳｍａｒｔＡｍｐ２法が例示できるが、特にＴＰを用いるＬＡＭＰ法又はＳｍａｒｔＡｍｐ２法が好ましい。
【００５６】  ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡに相補的な１セットのプライマーを設計し、プライマーに挟まれた領域をＤＮＡポリメラーゼにより反応容器内で増幅する技術である。ＰＣＲ法には、様々な変法があり、逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成した後にＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲ法、ＳＮＰをタイピングするための蛍光プローブであるＴａｑＭａｎプローブとＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより特定のアレルのみを増幅するＴａｑＭａｎＰＣＲ法など、様々な改良が当業者には公知の技術である。
【００５７】  ＴＭＡ法は、標的ＲＮＡと同一配列のフォワードプライマー及び３’側に標的ＲＮＡと相補的な配列と５’側にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの認識するプロモーター配列とを有するリバースプライマーを用いて、ＲＮａｓｅ活性を有するＲＮＡポリメラーゼにより鋳型ＲＮＡから転写産物を得て、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成することを組み合わせて、標的ＲＮＡを特異的に増幅する方法である。
【００５８】  ＮＡＳＢＡ法は、標的ＲＮＡと同一配列のフォワードプライマー及び３’側に標的ＲＮＡと相補的な配列と５’側にＴ７ポリメラーゼの認識するプロモーター配列とを有するリバースプライマーを用いて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより鋳型ＲＮＡから転写産物を得て、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成することを組み合わせて、標的ＲＮＡを特異的に増幅する方法である。
【００５９】  ＬＡＭＰ法は、２本のＴＰ（ターンバックプライマー）と２本のＯＰ（アウタープライマー）の合計４本以上からなる増幅方法で、増幅されたＤＮＡの両方の末端がループ構造を形成し、そのループ内にプライマーをアニーリングさせ、等温で標的ＤＮＡの特異的増幅を行う方法である。
【００６０】  ＩＣＡＭ法は、ＲＮＡ−ＤＮＡからなるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨを用いて、鎖置換反応、鋳型交換反応、ニック導入反応により等温で標的とするＤＮＡの特異的増幅を行う方法である。
【００６１】  ＳＤＡ法は、制限酵素による一本鎖ニックにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いた鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより合成された鎖により置換されたＤＮＡ鎖が次の複製の鋳型となり、標的ＤＮＡの増幅を行う方法である。
【００６２】  ＳｍａｒｔＡｍｐ２法は、二種のプライマーを含んでなるプライマーセットを用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、等温条件下で連続して標的核酸を合成する方法であり、本発明者が開発した方法である。プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなる。第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなる。
【００６３】  これらの核酸検出及び核酸増幅技術は、当業者に公知であり、プローブのハイブリダイズを伴う検出及び／又はプライマーのアニーリングを伴う増幅反応によるものであれば、任意の反応に本発明の技術を適用できる。
【００６４】  以下の実施例では、生体試料として鼻腔粘膜細胞を用い、その中に含まれる新型インフルエンザウイルス遺伝子中の標的核酸配列の増幅反応を行い、当該ウイルスの検出を試みた。ただし、本発明は、以下の実施例により、なんら制限および限定されない。
【実施例１】
【００６５】生体試料の処理方法
本発明を用いた核酸調整は以下のように行った。インフルエンザ患者１名の鼻空粘膜から採取した綿棒の先端を切り取り、１．５ｍＬチューブに回収し、そこに５％ＳＤＳ溶液を３００μＬ加え、ボルテックスミキサーを用いてよく撹拌し、粗抽出液を調整した。本実施例では、ＴＥバッファーで膨潤したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）−４００を充填したカラムを用いた。あらかじめ遠心によって、膨潤したバッファーを抜いたカラムに粗抽出液を１５μＬアプライし、卓上遠心機を用いて１分間遠心を行い、前処理済みサンプルを調整した。なお、健常人１名からもサンプルを採取し、同様に調製した。【００６６】核酸増幅反応
溶出した核酸を鋳型として、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による反応を行った。すなわち、溶液中で逆転写酵素によりｃＤＮＡを生成させ、同時に新型インフルエンザウイルスに特異的な遺伝子配列のみを増幅させた。ＬＡＭＰ法による検出は以下のように行った。反応系の組成（２５μＬ）は以下の通りである。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、３０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＫ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１２Ｕ  Ａａｃポリメラーゼ、０．２５Ｕ  ＡＭＶ、５μＬ前処理済みサンプル、１．８μＭ  ＴＰ１、１．８μＭ  ＴＰ２、０．６７５μＭ  ＢＰ１、０．９μＭ  ＢＰ２、０．２２５μＭ  ＯＰ１、０．２２５μＭ  ＯＰ２、０．２２５μＭ  ＢＰ３、で反応を行った。上記の反応組成で６０℃、４０分間反応を行った。反応はＭＸ−３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、経時的に蛍光強度を測定しながら行った。なお、新型インフルエンザウイルス遺伝子中の標的核酸配列とそれに基づいて設計、使用したＬＡＭＰ法用のプライマーセットの配列を以下に示す。【００６７】
2011115122.tif 000002
2011115122.tif 000003
【００６８】ウイルス検出の確認
結果は図１のとおりである。インフルエンザ患者の１検体は４０分以内に増幅が確認され、インフルエンザウィルスを検出することができ、その結果は免疫クロマトグラフィー法を用いた簡易テストの結果と一致した。また、健常人の１検体は４０分以内に増幅は確認されず、当該ウイルスを検出できなかった。生体試料の簡便な処理方法を用いることで、簡便迅速な検出が可能になった。
【実施例２】
【００６９】  実施例１と同じ前処理済みサンプルを用いてＲＴ−ＰＣＲ法による反応を行った。すなわち、溶液中で逆転写酵素によりｃＤＮＡを生成させ、同時に新型インフルエンザウイルスに特異的な遺伝子配列のみを増幅させた。ＰＣＲ法における検出は以下のように行った。市販されている新型インフルエンザ検出キット（Ｒｏｃｈｅ社製：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｔ）を用いて、上記核酸調整方法によって調整した核酸試料（前処理済みサンプル）からの検出を行った。反応系の組成（２０μＬ）は以下のとおりである。１×Ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、０．５μＭ  フォワードプライマー、０．５μＭ  リバースプライマー、０．２５μＭ  プローブ、これらに５ｕＬの核酸試料を添加して２０μＬの反応溶液になるようにして増幅反応を行った。上記反応組成で、キットのマニュアルに従い、下記の温度制御でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。反応はＭＸ−３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、経時的に蛍光強度を測定しながら行った。【００７０】＜ＰＣＲサイクル＞
５５℃  ８分
９５℃  ３０秒
９５℃  １秒、６０℃  ２０秒、７２℃  １秒  （４５サイクル）【００７１】ウイルス検出の確認
結果は図２のとおりである。インフルエンザ患者の１検体はＰＣＲの４５サイクル迄に増幅が確認され、インフルエンザウイルスを検出することが出来、その結果は免疫クロマトグラフィー法を用いた簡易テストの結果と一致した。また、健常人の１検体は、増幅が確認されず、当該ウイルスを検出できなかった。生体試料の簡便な処理方法を用いることで、簡便迅速な検出が可能になった。
【図１】
2011115122.tif 000004
【図２】
2011115122.tif 000005