(57)【要約】【課題】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して免疫原性である複数抗原性ペプチドを提供すること。【解決手段】本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅチャレンジに対する防御を付与する複数抗原性ペプチド[（多重抗原性ペプチド）（マルチ抗原性ペプチド）（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）]（ＭＡＰ）を提供する。これらの複数抗原性ペプチドは、モノクローナル抗体に免疫特異的に結合するペプチドを含む。また、このような免疫原性ペプチドを含むワクチン、および本発明のＭＡＰを含む治療組成物を投与することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）に対して防御免疫を付与する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）に対して免疫を付与するワクチンとして投与され得る複数抗原性ペプチド（マルチ抗原性ペプチド）（ＭＡＰ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
肺炎球菌疾患は、合衆国および世界中における病気および死亡の主な原因であり続けている。現在用いられている多糖類ワクチンは、２歳未満の年齢の小児には有効性の限界があり、そしてワクチン接種した個体間で血清型特異的な有効性の変動を示す。これらの理由によって、複数の莢膜多糖類の使用を必要としない別のワクチン処方物が探求されてきた。可能性のあるストラテジーの１つは、ワクチン候補物として免疫原性の種共通タンパク質の使用を含む。これらのタンパク質は、他の免疫原性タンパク質と組み合わせて、またはタンパク質、多糖類、もしくはオリゴ糖の結合体ワクチンにおけるタンパク質キャリアとして、用いられ得る。共通のタンパク質を含む有効なワクチンは、多数の血清型に対するより広範な防御を提供することによって、（現行の２３価の多糖類ワクチンにおけるような）複数の莢膜多糖類に基づく処方物の必要性を排除し得る。さらに、タンパク質ベースのワクチンは、Ｔ細胞依存性であり、そして記憶応答を提供し、それによってさらに有効なワクチンとなる。
【０００３】
免疫原性の種共通タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから同定されている（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９０、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２１９１〜２１９５；および米国特許第５，４２２，４２７号）。３７ｋＤａのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質は、いくつかの研究の焦点であった。そして現在では、肺炎球菌表面接着タンパク質Ａ（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）（ＰｓａＡ）と名付けられている。（この３７ｋＤａのタンパク質は、米国特許第５，４２２，４２７号において、肺炎球菌海馬采タンパク質（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれていた；この用語は本明細書において交換可能に用いられる）。抗ＰｓａＡモノクローナル抗体を用いる免疫ブロット分析研究によって、ＰｓａＡが、２３の肺炎球菌ワクチン血清型の全てに共通であることが示された（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９０）。酵素結合免疫吸着アッセイ研究によって、肺炎球菌疾患を有する患者が、急性期血清抗体レベルに比べてＰｓａＡに対して回復期の血清の抗体増加を示すことが示されている（Ｔｈａｒｐｅら、１９９５、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎＡ（ＰｓａＡ）」Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２２７〜２２９；およびＴｈａｒｐｅら．，１９９４、「Ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」Ａｂｓｔｒ．Ｖ−２、ｐ６１７，１９９４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。さらに、限定的インビボ防御研究によって、３７ｋＤａタンパク質に対する抗体が、致死的チャレンジからマウスを防御することが示された。（Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら，１９９６「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆａｔａｌ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ（ＰｓａＡ）」Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２１：１７〜２２）。
【０００４】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ３６Ａ（非被包性の株）由来のＰｓａＡをコードする遺伝子を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにクローニングして、配列決定した；しかし、この株は、種々の血清型の間で高度に保存されている核酸をコードする３７ｋＤａタンパク質を含まない（Ｓａｍｐｓｏｎら、１９９４、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰｓａＡ，ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ３７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ａｄｈｅｓｉｎｓ」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：３１９〜３２４）。従って、この特定の核酸および対応するポリペプチドは、診断試薬として、感染防止において、感染処置において、またはワクチン開発において、の使用のための価値に限定される。１９９６年９月１７日に出願した米国特許出願第０８／７１５，１３１号（現在、米国特許第５，８５４，４１６号、これは、１９９４年４月４日出願の米国特許出願第０８／２２２，１７９号（これは現在破棄された）の一部係属出願であり、これは１９９１年９月１７日に出願された米国特許出願第０７／７９１，３７７号（現在、米国特許第５，４２２，４２７号）の一部係属出願である）（これらの全てが、その全体として本明細書において参考として援用される）において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７−ｋＤａタンパク質をコードする単離された核酸、サンプル中でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出する方法において用いられ得るこの核酸の少なくとも１０ヌクレオチドの特有のフラグメント、および免疫原性ワクチンが開示されている。さらに、免疫原性ワクチンにおいて用いられ得る、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７−ｋＤａタンパク質をコードする、この核酸によってコードされる精製されたポリペプチドが開示されている。さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７−ｋＤａタンパク質またはそのフラグメントに結合する精製された抗体（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出する方法、ならびに治療方法および予防方法において用いられ得る）が開示されている。配列保存性は、種共通ワクチンの候補に必要な要件である。肺炎球菌のタイプのなかでも、そして特に被包性の肺炎球菌のなかでも、多くの重篤な疾患症例を生じる、ＰｓａＡ遺伝子の配列保存は、なお検討中である。
【０００５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの複数の株に対するワクチンとして働き得るペプチドを提供するためには、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡに関連する特徴的なエピトープを同定する必要がある。本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡに関連する有効なエピトープペプチドを決定すること、そしてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する治療用組成物およびワクチンにおいてこれらのペプチドを使用することによって、この必要性に取り組む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ＰｓａＡエピトープに特異的なモノクローナル抗体に対する高い親和性の結合についてスクリーニングすることによってランダムライブラリーから得た新規な免疫原性ペプチドを提供する。さらに、本発明のペプチドは、被験体において免疫原として働き、これによってこの被験体による抗体の産生を有効に誘発し、そしてさらに、この被験体に対してＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染に対する防御免疫を付与する能力を有する。本発明はまた、このようなペプチドを得るために使用された選択方法に関する。
【０００７】
本発明のペプチドは、残基であって、その配列が以下：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、およびその免疫原性フラグメントからなる群より選択される残基を含むペプチドを含む。特定の実施形態において、このペプチドは、本質的に、以下：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、およびその免疫原性フラグメントから選択される配列からなる。特定の実施形態において、このペプチドは、以下：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、およびその免疫原性フラグメントから選択される配列からなる。
【０００８】
本発明は、さらに、上記のようなペプチドを提供する。ここで、このペプチドは、複数抗原性ペプチドである。１つの実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、およびその免疫原性フラグメントから選択される配列を含む少なくとも１つのアームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、およびその免疫原性フラグメントから選択される配列から本質的になる少なくとも１つのアームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、およびその免疫原性フラグメントから選択される配列からなる少なくとも１つのアームを有する。
【０００９】
この複数抗原性ペプチドはまた、配列番号５〜１０、またはその免疫原性フラグメントの任意の組み合わせを含む二相性ペプチド（バイペプチド）（ｂｉｐｅｐｔｉｄｅ）であり得る。１つの実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号６を含む少なくとも１つの第二アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号７を含む少なくとも１つの第二アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号８を含む少なくとも１つの第二アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号９を含む少なくとも１つの第二アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号６を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号７を含む少なくとも１つの第二アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号６を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号８、配列番号９、または配列番号１０を含む少なくとも１つの第二アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号１０を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号９を含む少なくとも１つの第二アームを有する。なお別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号１０を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号７を含む少なくとも１つの第二アームを有する。さらに別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号１０を含む少なくとも１つの第二アームを有する。
【００１０】
この複数抗原性ペプチドはまた、配列番号５〜１０、またはその免疫原性フラグメントの任意の組み合わせを含む三相性ペプチド（トリペプチド）（ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）であり得る。例えば、１つの実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、配列番号６を含む少なくとも１つの第二アーム、および配列番号７を含む少なくとも１つの第三アームを有する。別の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む少なくとも１つの第一アーム、配列番号９を含む少なくとも１つの第二アーム、および配列番号１０を含む少なくとも１つの第三アームを有する。なお他の実施形態において、この複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む第一アーム、配列番号１０を含む第二アーム、および配列番号７、８、もしくは９を含む第三アームを有する；またはこの複数抗原性ペプチドは、配列番号５を含む第一アーム、配列番号６を含む第二アーム、および配列番号８もしくは配列番号９を含む第三アームを有する；またはこの複数抗原性ペプチドは、配列番号６を含む第一アーム、配列番号７を含む第二アーム、および配列番号８、９、もしくは１０を含む第三アームを有する；またはこの複数抗原性ペプチドは、配列番号７を含む第一アーム、配列番号８を含む第二アーム、および配列番号９もしくは１０などを含む第三アームを有する。
【００１１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、いずれのアームも配列番号５、６、７、８、９、または１０の免疫原性フラグメントであり得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡによる動物の免疫に応答して得られたモノクローナル抗体に免疫特異的に結合するペプチドであり、ここでこのペプチドは脂溶化されている。１つの実施形態において、このペプチドは、モノパルミチン酸で脂溶化されている。
【００１３】
本発明はさらに、被験体においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染に対して防御免疫を付与する免疫応答を惹起するために、この被験体に投与されるべき免疫刺激キャリアと、この免疫原性ペプチドが組み合わされている、治療用組成物、および／またはワクチンを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、被験体においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染に対して防御免疫を付与する免疫応答を惹起するために、この被験体に投与されるべきアジュバントと、この免疫原性ペプチドが組み合わされている、治療用組成物、および／またはワクチンを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、この免疫原性ペプチドが、上記のような、本発明の複数抗原性ペプチドである、治療用組成物、および／またはワクチンを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、この免疫原性ペプチドが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡでの動物の免疫に応答して得られたモノクローナル抗体に免疫特異的に結合するペプチドである、治療用組成物、および／またはワクチンを提供する（ここで、このペプチドは脂溶化されている）。１つの実施形態において、このペプチドは、モノパルミチン酸で脂溶化されている。
【００１７】
本発明はなおさらに、被験体においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染に対して防御免疫を付与する方法を記載している。ここでは、本発明の治療用組成物、および／またはワクチンがこの被験体に投与される。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して被験体における免疫応答を惹起する、ＰｓａＡまたはそのフラグメントを組み込むペプチド（すなわち、免疫原性ペプチド）を同定するための方法を示す。この方法は、ランダムペプチドライブラリーを調製する工程、免疫原性ペプチドを同定するためにペプチドライブラリーをスクリーニングする工程、および免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を得る工程、包含する。
【００１９】
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡまたはＰｓａＡの免疫原性フラグメントを用いた動物の免疫に応答して得られたモノクローナル抗体に免疫特異的に結合する複数抗原性ペプチド。
（項目２）前記ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号５〜１０の免疫原性フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目３）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目４）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号６またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目５）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号７またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目６）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号８またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目７）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号９またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目８）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号１０またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目９）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号６またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第二アームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目１０）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第一アーム、および配列番号９またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第二アームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目１１）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第一アーム、配列番号６またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第二アーム、および配列番号７またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第三アームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目１２）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第一アーム、配列番号９またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第二アーム、および配列番号１０またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第三アームを有する、項目２に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目１３）前記複数抗原性ペプチドが、脂溶化されている、項目１に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目１４）前記複数抗原性ペプチドが、モノパルミチン酸で脂溶化されている、項目１３に記載の複数抗原性ペプチド。
（項目１５）被験体においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する防御免疫を付与する方法であって、該方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡまたはＰｓａＡの免疫原性フラグメントを用いた動物の免疫に応答して得られたモノクローナル抗体に免疫特異的に結合する複数抗原性ペプチドを含む治療組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで該複数抗原性ペプチドは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して免疫原性である、方法。
（項目１６）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号６またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号７またはその免疫原性フラグメントを含むアームを有する、項目１５に記載の方法。
（項目１９）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第一アーム、配列番号６またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第二アーム、および配列番号７またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第三アームを有する、項目１５に記載の方法。
（項目２０）前記複数抗原性ペプチドが、配列番号５またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第一アーム、配列番号９またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第二アーム、および配列番号１０またはその免疫原性フラグメントを含む少なくとも１つの第三アームを有する、項目１５に記載の方法。
（項目２１）前記複数抗原性ペプチドが、脂溶化されている、項目１５に記載の方法。
（項目２２）前記複数抗原性ペプチドが、モノパルミチン酸で脂溶化されている、項目２１に記載の方法。
本発明の利点は、添付の特許請求の範囲に特に挙げたエレメントおよび組み合わせの手段によって実現および達成される。前述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方とも例示的および説明的でしかなく、そして請求した本発明を限定しないことが理解される。本出願を通して、種々の刊行物が引用されている。これらの刊行物の開示は、その全体が参考として本出願に援用されており、本出願が属する当該分野の状況をさらに十分に記載している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、配列番号５または配列番号６のいずれかの配列を有する交互ペプチド（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のアームを有する二相性ペプチド異種ＭＡＰを示す図である。  図１Ｂは、配列番号５または配列番号９のいずれかの配列を有する交互ペプチドのアームを有する二相性ペプチド異種ＭＡＰを示す図である。  図１Ｃは、配列番号５の配列を有する第１アーム、配列番号１０の配列を有する第２アーム、および配列番号９の配列を有する第３のアーム有する三相性ペプチド異種ＭＡＰを示す図である。各ペプチド中のカルボキシ末端リジン（すなわち、Ｋ）残基は、ＭＡＰの２つのアーム間で共有される。ＮＬｅは、ノルロイシンである。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、非脂質化ＭＡＰの基本構造（図２Ａ）および脂質化ＭＡＰの基本構造（図２Ｂ）を示す図である。ここで、「Ｂ」は、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３のいずれかとして示す３つの１５アミノ酸ベースペプチドを表し；「Ｊ」は、パルミトイル（パルミチン酸）基を表し、これは、Ｕとして示す３アミノ酸鎖リンカー（−システイン−セリン−セリン−）を介してベースペプチド（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）のＮ末端に連結されている（Ｔａｍ  ＪＰ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｔａｍ，ＪＰ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，ＥＴ編，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９，３−１８頁）；Ｐ４３およびＰ４６、Ｂ＝Ｐ１（配列番号５）；Ｐ４４およびＰ４７、Ｂ＝Ｐ２（配列番号６）；ならびにＰ４５およびＰ４８、Ｂ＝Ｐ３（配列番号７）。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、非脂質化ＭＡＰの基本構造（図２Ａ）および脂質化ＭＡＰの基本構造（図２Ｂ）を示す図である。ここで、「Ｂ」は、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３のいずれかとして示す３つの１５アミノ酸ベースペプチドを表し；「Ｊ」は、パルミトイル（パルミチン酸）基を表し、これは、Ｕとして示す３アミノ酸鎖リンカー（−システイン−セリン−セリン−）を介してベースペプチド（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）のＮ末端に連結されている（Ｔａｍ  ＪＰ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｔａｍ，ＪＰ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，ＥＴ編，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９，３−１８頁）；Ｐ４３およびＰ４６、Ｂ＝Ｐ１（配列番号５）；Ｐ４４およびＰ４７、Ｂ＝Ｐ２（配列番号６）；ならびにＰ４５およびＰ４８、Ｂ＝Ｐ３（配列番号７）。
【図３】図３は、二相性ペプチドＰ７９およびＰ８０の基本構造を示す図である。ここで、ベースペプチドは、２アミノ酸リンカーのリジン−ノルロイシン（Ｋ−ＮＬｅ）によって一緒に連結されて、４分岐の二相性ペプチドを形成する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｎら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２３−３１，２０００；ならびにＴａｍ  ＪＰ（前出））。Ｐ７９は、ベースペプチドＰ１およびＰ２の各々の２単位からなる。二相性Ｐ８０において、Ｐ２単位は、Ｐ３単位で置換される。
【図４】図４は、三相性ペプチドＰ８１の基本構造を示す図である。ここで、ベースペプチドは、２アミノ酸リンカーのリジン−ノルロイシン（Ｋ−ＮＬｅ）によって一緒に連結されて、ベースペプチドＰ１、Ｐ２、およびＰ３からなる３分岐の三相性ペプチドを形成する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｎ（前出）およびＴａｍ，ＪＰ（前出））。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に使用される場合、「免疫原性ペプチド」は、被験体に投与された場合または他の方法で被験体によって摂取された場合に、免疫応答を誘発するペプチドをいう。免疫応答は、少なくとも、免疫原性物質に特異的に結合する抗体の産生（すなわち、体液性応答）を含む。免疫原性物質は、細胞性免疫学的応答をさらに誘発し得る。このような免疫原は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰｓａＡと免疫特異的に反応するモノクローナル抗体を用いてランダムペプチドのライブラリーをスクリーニングすることによって獲得される、免疫原性ペプチドのうちのいずれかである。
本明細書中に使用される場合、「免疫応答」および「免疫原性応答」は、少なくとも体液性応答、すなわち、免疫原性物質に特異的に結合する抗体の産生を含み得る。免疫原性応答は、代替的にかまたは付加的にかのいずれかで、細胞性免疫学的応答を言及し得る。
【００２２】
本明細書中に使用される場合、「防御免疫」は、被験体が、病原体関連免疫原への曝露に応答して抗体（このうちの少なくともいくつかは、中和抗体である）を産生した状態をいう。中和抗体は、病原体による増殖性感染が阻害されるかまたは排除されるように、病原体の免疫原性成分に結合し、その結果、被験体は、本質的に症候性の疾患がなくなる。防御免疫はまた、病原体因子の不活性化、損失、または破壊を導く代替の免疫原性応答から惹起され得る。
【００２３】
本明細書中に使用される場合、「免疫刺激キャリア」は、被験体に導入された場合にそれ自体が免疫応答を誘発する種々の免疫原性生物学的ポリマーのうちのいずれかをいう。免疫刺激キャリアは、目的の免疫原（例えば、本発明のペプチド）と組合わせて使用された場合、目的の免疫原に対する被験体の増強された免疫原性応答を提供する。さらに、本明細書中に使用される場合、「アジュバント」は、免疫原性物質と組合わせて投与された場合に、その物質の免疫原性活性を増強する組成物をいう。
【００２４】
本明細書中に使用される場合、「ライブラリー」は、生体高分子から誘導されたフラグメントのセットをいい、ここで、このセットの各メンバーは、所望の生物学的機能を発現する所望の生物学的活性をプロセスするための候補物である。ライブラリーは、ペプチドライブラリーまたはオリゴヌクレオチドフラグメントのライブラリー（この各々のメンバーは、ペプチドライブラリーの特定のメンバーをコードするヌクレオチド配列を含む）のいずれかである。本発明において、ペプチドライブラリーは、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーによってコードされるペプチドのセットである。所定のペプチドについての所望の活性は、ペプチドが、被験体においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して免疫原性であることである。
【００２５】
本明細書中に使用される場合、「被験体」は、病原体生物Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫応答を誘発することが所望される哺乳動物である。本発明の被験体の主なクラスは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが実際に病原性であるヒト（特に、乳児および高齢者）である。従って、ヒト被験体において、免疫応答は、防御免疫応答であることが意図される。非ヒト哺乳動物に関して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、本質的に病原性であっても、病原性でなくてもよい。免疫応答を提供する実験動物として使用されるこのような非ヒト被験体は、本発明の組成物および方法の特徴付けおよび最適化に有用であり得る。このような哺乳動物としては、非限定的な例として、マウス、ラット、および非ヒト霊長類が挙げられる。被験体のさらなるクラスとしては、獣医学的な実施に提供される動物（ペットおよび家畜動物を含む）が挙げられる。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅがこのような被験体において病原性である場合、防御免疫を誘発することが望ましい。
【００２６】
「精製されたタンパク質（精製タンパク質）」は、本明細書中に使用される場合、タンパク質と夾雑物または細胞成分とを区別することに関して、タンパク質またはフラグメントが、通常一緒にタンパク質が存在する夾雑物または細胞成分を十分に含まないことを意味する。「精製された（精製）」が、技術的に完全に純粋（均質）である調製物を有する必要があることは意図されないが、「精製された（精製）」は、本明細書中に使用される場合、通常一緒に存在する夾雑物または細胞成分から、アッセイ（例えば、免疫沈降またはＥＬＩＳＡ）において使用され得る状態でそのタンパク質を提供するほど十分に分離されていることを意味する。例えば、精製されたタンパク質は、電気泳動ゲルにおいて使用され得る。
【００２７】
本明細書中に使用される場合、「ストリンジェントな条件」は、核酸ハイブリダイゼーションプロトコールで使用される洗浄条件をいう。一般的に、洗浄条件は、変性温度が研究中の核酸ハイブリッドの計算Ｔｍ値よりも約５〜２０℃下であるように選択される、温度および塩濃度の組合わせであるべきである。温度および塩条件は、予備的な実験において経験的に容易に決定され、この予備的な実験において、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルは、プローブまたは目的の核酸をコードするタンパク質に対してハイブリダイズされ、次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される。このようなオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、各ＡまたはＴヌクレオチドについて約２℃、そして各ＧまたはＣについて約４℃を考慮することによって、概算され得る。従って、例えば、５０％  Ｇ−Ｃの１８ヌクレオチドプローブは、５４℃の概算Ｔｍ値を有する。
【００２８】
本明細書中に使用される場合、「治療組成物」は、防御免疫応答を誘発するために被験体に投与され得る組成物、および単独または免疫刺激キャリアもしくはアジュバントと組合わせた、本発明の免疫原性ペプチドのうちの１つ以上を含む組成物をいう。治療組成物は、混合物または化学結合体としてかのいずれかで、ペプチドおよびキャリアを含む。これらは一緒に、活性剤を構成する。１より多くのペプチドが使用され、そして組成物が結合体である場合、各ペプチドは、単独であるか、または免疫刺激キャリアに結合体化されるかのいずれかであり得る。さらに、治療組成物は、一般的に、活性剤が懸濁されるかまたは溶解された薬学的処方物の成分を含む。薬学的処方物の成分は、免疫学または薬学的科学の当業者に周知である。処方物は、免疫応答を誘発するために被験体に活性剤と投与し、そして免疫原性ペプチドに関連する病原体に対する防御免疫を与えるのに適切であるべきである。
【００２９】
本明細書中に使用される場合、用語「対立遺伝子バリエーション」または「対立遺伝子改変体」は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型から得られる免疫原性ＰｓａＡペプチドまたはタンパク質であって、参照血清型（例えば、血清型２）以外のものをいう。対立遺伝子改変体は、同じ３７ｋＤａ肺炎双球菌表面接着タンパク質、または配列番号２として配列表に示される３７ｋＤａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質から、その対応するアミノ酸同一性が１５％未満分岐した類似のタンパク質を記載する。好ましくは、この対立遺伝子改変体は、その対応するアミノ酸同一性において１０％未満の分岐であり、より好ましくは、その対応するアミノ酸同一性において、７％未満の分岐、より好ましくは５％未満の分岐、より好ましくは３％未満の分岐、より好ましくは２％未満の分岐、そして最も好ましくは１％未満の分岐である。これらのアミノ酸は、配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列内の置換であり得るか、または改変体は、配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列から欠失されるかもしくはこのアミノ酸配列に付加されるかのいずれかであり得る。
【００３０】
（核酸）
１つの局面において、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７ｋＤａタンパク質（そのアミノ酸配列は、配列番号２として配列表に示される）をコードする単離された核酸を提供する。用語「単離された（単離）」は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ中に天然に存在する他の遺伝子から本質的に分離された核酸をいう。１つの実施形態において、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７ｋＤａタンパク質をコードする単離された核酸を提供し、ここで、この核酸は、そのヌクレオチド配列が配列番号１として配列表に示される核酸である。配列番号１として配列表に示される核酸のうちの少なくとも１０ヌクレオチドの特有なフラグメントを含む単離された核酸もまた、提供される。
【００３１】
「特有なフラグメント」は、本明細書中に使用される場合、本発明がなされたときに既知である任意の他の核酸配列に同一でない少なくとも１０ヌクレオチドの核酸を意味する。配列番号１として配列表に示される核酸に特有である少なくとも１０ヌクレオチドの配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋに載せられた配列に対してまたは他の配列データベースに対して、ＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．）、またはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＷｏｒｄ  ＳｅａｒｃｈもしくはＦＡＳＴＡ（これらは、問題の核酸に対する類似性について載せられたヌクレオチド配列を検索する）のようなコンピュータープログラムを用いて問題の核酸配列を比較することによって、容易に確認され得る。配列が既知配列のいずれとも一致しない場合、その配列は、特有である。例えば、ヌクレオチド１〜１０の配列が、同一な一致についてデータベースを検索するために使用され得る。一致が見出されない場合、ヌクレオチド１〜１０は、特有なフラグメントを表す。次に、ヌクレオチド２〜１１の配列が、データベースを検索するために使用され得、次いでヌクレオチド３〜１２の配列、そしてそのようにして、配列番号１として配列表に示される配列のヌクレオチド１３２１〜１３３０まで検索するために使用され得る。同じ型の検索が、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチドの配列などについて実行され得る。可能なフラグメントは、１０ヌクレオチドの長さから配列番号１として配列表に示される配列セットより１ヌクレオチド少ない長さに及ぶ。これらの特有な核酸、ならびに縮重核酸は、例えば、３７ｋＤａタンパク質の対立遺伝子改変体を単離するためにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの他の株から核酸を増幅するためのプライマーとして使用され得るか、または３７ｋＤａタンパク質ＲＮＡの逆転写物についてのプライマーとして使用され得るか、または核酸ハイブリダイゼーションのような検出技術における使用のためのプローブとして使用され得る。当業者は、例え少なくとも１０ヌクレオチドの核酸が特定の遺伝子に特有であっても、核酸フラグメントはなお、多くの他の核酸にハイブリダイズし得、ゆえに、増幅および核酸検出のような技術に使用され得ることを認識する。
【００３２】
配列番号２として配列表に示されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７ｋＤａタンパク質の対立遺伝子改変体をコードする核酸もまた、提供される。３７ｋＤａタンパク質の対立遺伝子改変体をコードする核酸のタンパク質コード領域間の相同性は、好ましくは、３７ｋＤａタンパク質をコードする配列番号１として配列表に示される核酸のその領域から、２０％未満の分岐である。好ましくは、対応する核酸は、それらの配列同一性において１５％未満の分岐である。別の実施形態において、対応する核酸は、それらの配列同一性において１０％未満の分岐であり、より好ましくはそれらの対応するヌクレオチド同一性において、７％未満の分岐、より好ましくは５％未満の分岐、より好ましくは４％未満の分岐、より好ましくは３％未満の分岐、より好ましくは２％未満の分岐、そして最も好ましくは１％未満の分岐である。特に、核酸バリエーションは、配列番号２として配列表に示されるタンパク質から約１５％のアミノ酸配列バリエーションまで作製し得る。
【００３３】
当業者は、配列番号２として配列表に示される３７ｋＤａタンパク質のホモログまたは対立遺伝子改変体をコードする核酸が、関連グラム陽性細菌から単離され得ることを認識する。３７ｋＤａタンパク質をコードする核酸は、当業者に公知の任意の多数の技術によって獲得され得る。本発明の核酸（使用され得るプローブおよびプライマーを含む）を単離する方法は、米国特許出願番号０８／７１５，１３１（１９９６年９月１７日出願、現在、米国特許第５，８５４，４１６号であり、これは、米国特許出願番号第０８／２２２，１７９（１９９４年４月４日出願、現在は、放棄し、これは、米国特許出願番号０７／７９１，３７７（１９９１年９月１７日出願、現在は、米国特許第５，４２２，４２７号）の一部係属である）の一部係属である）に示される。これらの目的のために利用され得る一般的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７（四半期ごとに改訂される）に示される。核酸単離プロトコールに使用され得る増幅手順（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（すなわち、「ＰＣＲ」）を用いた増幅）は、当業者に周知である（例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂの３７ｋＤａタンパク質をコードする核酸の増幅の例は、本明細書中に含まれる実施例に議論されている。
【００３４】
（３７ｋＤａ  タンパク質（ＰｓａＡ））
本発明はまた、配列番号２として配列表に示される精製ポリペプチド、ならびに配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの特有なフラグメントを含む核酸によってコードされる精製ポリペプチドを提供する。このタンパク質は、ワクチン組成物ならびに感染の間にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して惹起された被験体の抗体を同定するための試薬として使用され得る。精製タンパク質はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出するための方法において使用され得る。
【００３５】
３７ｋＤａタンパク質の特有なフラグメントは、特有な核酸を同定するために使用される様式と同じ様式で同定され得る。例えば、配列番号２として配列表に示されるような３７ｋＤａタンパク質の配列由来の３アミノ酸以上の配列を使用して、タンパク質配列データベースを検索し得る。ゆえに、既知配列と一致しない配列が、特有である。これらのタンパク質およびタンパク質フラグメントを調製する方法は、米国特許出願番号０８／７１５，１３１（１９９６年９月１７日出願、現在、米国特許第５，８５４，４１６号であり、これは、米国特許出願番号第０８／２２２，１７９（１９９４年４月４日出願、現在は、放棄し、これは、米国特許出願番号０７／７９１，３７７（１９９１年９月１７日出願、現在は、米国特許第５，４２２，４２７号）の一部係属である）の一部係属である）に示される。
【００３６】
本発明は、３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質に関連するペプチドフラグメントを提供する。本発明のポリペプチドフラグメントは、３７ｋＤａタンパク質について上記で記載されるように、ポリペプチドフラグメントをコードする核酸をそのポリペプチドフラグメントを産生し得る発現系においてクローニングすることによって獲得される組み換えポリペプチドであり得る。例えば、有意な免疫応答を引き起こし得る３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質に関連する免疫反応性ペプチドを、この接着タンパク質に対して惹起された抗体を用い、このポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターにクローニングし、そしてさらなる用途（例えば、診断、治療、およびワクチン接種）のためにその特定のポリペプチドを単離することによって、同定し得る。免疫反応性および／または特異性に寄与しないアミノ酸は、それぞれの活性における損失を伴なうことなく、欠失され得る。例えば、アミノ末端アミノ酸またはカルボキシ末端アミノ酸は、上記に概説された手順を用いて同定された任意のペプチドから連続的に除去され得、そして免疫反応性が多くの利用可能なアッセイのうちのいずれかにおいて試験される。あるいは、内部アミノ酸が、連続的に除去され得、そして免疫反応性が、各欠失について試験される。
【００３７】
別の例において、３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質に関連するペプチドフラグメントは、少なくとも１つのアミノ酸が、特定の部分またはアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシ末端アミノ酸のうちのいずれかの部分、またはさらにポリペプチドの内部領域を本来占有しているアミノ酸残基の代わりに置換された改変ポリペプチドを含み得、ポリペプチドフラグメントもしくは他の部分（例えば、改変３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質の精製を容易にし得るビオチン）と置換され得る。
【００３８】
３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質に関連する免疫反応性ペプチドフラグメントとしては、ペプチドの免疫反応性が３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質と比較して有意に損なわれない限り、特定の領域または特定のアミノ酸残基の、挿入、欠失、置換または他の選択された改変を含み得る。これらの改変は、例えば、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去／付加するため、その生体寿命を増大するためなどのいくつかのさらなる特性を提供し得る。いずれにせよ、ペプチドは、３７ｋＤａ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着タンパク質に匹敵する、生物活性特性（例えば、免疫反応性）を保有しなければならない。
【００３９】
（抗体）
本発明は、配列表に配列番号１として示される核酸によってコードされるポリペプチドまたは配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの独特のフラグメントによってコードされるポリペプチドと選択的に結合する精製された抗体を用いる。この抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか）は、その天然に存在する形態またはその組換え形態の、３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質またはその独特のフラグメントに対して惹起され得る。この抗体は、種々の技術または手順（例えば、診断、処置または免疫）において用いられ得る。抗体は、多くの周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照のこと）によって調製され得る。手短には、精製された抗原は、免疫応答を惹起するに充分な量および間隔で動物に注射され得る。抗体は直接精製されて、ポリクローナル抗体が得られ得る。あるいは、脾臓細胞は、この動物から入手され得る。次いで、この細胞は不死細胞株と融合され、そして抗体分泌についてスクリーニングされて、モノクローナル抗体が得られ得る。この抗体を用いて、この抗原を分泌する細胞について核酸クローンライブラリーをスクリーニングし得る。次いで、これらのポジティブクローンは、配列決定され得る（例えば、Ｋｅｌｌｙら，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：１６３−１６７：Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，１９９２  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５を参照のこと）。
【００４０】
語句、ポリペプチドと「選択的に結合する」とは、タンパク質および他の生物物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）の不均質集団中のタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイ条件の下では、特定のタンパク質に結合した明記された抗体は、サンプル中に存在する他のタンパク質に対して顕著な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する選択的結合は、特定のタンパク質へのその特異性に関して選択される抗体を必要とし得る。種々の免疫アッセイ形式を用いて、特定のタンパク質に選択的に結合する抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを慣用的に用いて、タンパク質と選択的に免疫反応する抗体を選択する。選択的結合を選択するために用いられ得る免疫アッセイ形式および条件の説明に関して、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照のこと。いくつかの例では、モノクローナル抗体を種々の被験体から調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、Ｓｔｉｔｅｓら編，「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，（Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，第４版）およびその中に引用される参考文献、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８））に見出され得る。
【００４１】
本発明において用いられるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（本明細書中に参考として援用される、米国特許出願第０８／７１５，１３１号（１７，１９９６年９月１７日出願、現在、米国特許第５，８５４，４１６号）に開示される）は、ＭＡｂ  １Ｅ７Ａ３Ｄ７Ｃ２または抗体１Ｅ７Ａ３Ｄ７Ｃ２の特徴（例えば、その結合特異性およびその結合親和性）を保持するそのフラグメント；ＭＡｂ  １Ｂ６Ｅ１２Ｈ９または抗体１Ｂ６Ｅ１２Ｈ９の特徴を保持するそのフラグメント；ＭＡｂ  ３Ｃ４Ｄ５Ｃ７または抗体３Ｃ４Ｄ５Ｃ７の特徴を保持するそのフラグメント；ＭＡｂ  ４Ｅ９Ｇ９Ｄ３または抗体４Ｅ９Ｇ９Ｄ３の特徴を保持するそのフラグメント；ＭＡｂ  ４Ｈ５Ｃ１０Ｆ３または抗体４Ｈ５Ｃ１０Ｆ３の特徴を保持するそのフラグメント；ＭＡｂ  ６Ｆ６Ｆ９Ｃ８または抗体６Ｆ６Ｆ９Ｃ８の特徴を保持するそのフラグメント；およびＭＡｂ  ８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０または抗体８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０の特徴を保持するそのフラグメントである。
【００４２】
本発明において用いられるそれぞれのモノクローナル抗体を産生するために用いられるハイブリドーマ（本明細書中に参考として援用される、米国特許出願第０８／７１５，１３１号（１９９６年９月１７日出願、現在、米国特許第５，８５４，４１６号）に開示される）は、ハイブリドーマ１Ｅ７Ａ３Ｄ７Ｃ２、ハイブリドーマ１Ｂ６Ｅ１２Ｈ９、ハイブリドーマ３Ｃ４Ｄ５Ｃ７、ハイブリドーマ４Ｅ９Ｇ９Ｄ３、ハイブリドーマ４Ｈ５Ｃ１０Ｆ３、ハイブリドーマ６Ｆ６Ｆ９Ｃ８およびハイブリドーマ８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０である。
【００４３】
（治療組成物）
本発明によってまた提供されるのは、配列表において配列番号１として示される核酸または配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの独特のフラグメントによってコードされる免疫原性ポリペプチドを含む治療組成物である。本発明はまた、動物をＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡで免疫することに応じて得られるモノクローナル抗体に免疫特異的に結合する少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含む治療組成物を提供する。このような免疫原性ペプチドの例を、配列番号５〜配列番号１０に示す。この治療組成物は好ましくは、免疫刺激キャリアと合わされる。この治療組成物は、被験体に投与された場合、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する防御免疫を付与する。
【００４４】
本発明によって提供されるポリペプチドを用いて、３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質（またはその独特のフラグメント）を誘導した生物によって引き起こされる特定の疾患、感染または状態からの防御のために、被験体をワクチン接種し得る。血清型６Ｂの３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質のポリペプチドまたはその独特のフラグメントを用いて被験体生物を接種し、その結果、後にその被験体を、そのポリペプチドを誘導した生物による感染から防御し得る、そのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの存在に対する能動免疫応答をその被験体に生じさせ得る。当業者は、特定の株由来の３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質に対する免疫応答（特に、細胞媒介性免疫応答）が後に、再感染または近縁株による感染からの防御を提供し得ることを認識する。しかし、本発明によって提供される３７−ｋＤａタンパク質は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０の血清型間で比較的保存されており、それゆえ、多価ワクチンとして役立ち得る。本発明の３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質または免疫原性ペプチドでの免疫は、３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質を、単独で被験体に投与するかまたは薬学的に受容可能なキャリアと共に被験体に投与するかのいずれかによって達成され得る（Ｋｕｂｙ，Ｊ．１９９２「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。本発明の３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質または免疫原性ペプチドの免疫原性量は、標準的手順を用いて決定され得る。
【００４５】
手短には、種々の濃度の本発明のポリペプチドが調製され、被験体に投与され、そして各濃度に対する免疫原性応答（例えば、このポリペプチドに対する抗体または細胞媒介免疫の産生）が決定される。このポリペプチドの接種後に患者の細胞性および体液性の両方の免疫原性応答をモニタリングするための技術は、当該分野で周知である。例えば、サンプルは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてアッセイされて、特定の抗体（例えば、血清ＩｇＧ（Ｈｊｅｌｔら，Ｊ  ；Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２１：３９−４７，（１９８７）））の存在が検出され得る；リンパ球またはサイトカイン産生もまたモニタリングされ得る。任意の特定のポリペプチドの推定の免疫原性抗原の特異性は、接種された患者由来の血清、他の流体またはリンパ球を、他の密接に関連する３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質との交差反応性について試験することによって確認され得る。投与される本発明の３７−ｋＤａの肺炎球菌表面付着因子タンパク質のポリペプチドまたは免疫原性ペプチドの量は、被験体、被験体の状態、被験体の大きさなどに依存するが、免疫される特定の被験体について少なくとも免疫原性量である。このポリペプチドは、薬学的に受容可能なキャリアとともに、アジュバントを用いて、およびさらなる化合物（サイトカインを含む）を用いて処方され得る。
【００４６】
本発明の治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントは、標準的な判断基準（Ａｒｎｏｎ，Ｒ．（編）「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｉ：８３−９２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８７）によって選択され得る。「薬学的に受容可能な」によって、生物学的にも他の点でも望ましくないことがない物質が意味される（すなわち、この物質は、それを含む薬学的組成物の他の成分のいずれかとともに、何の望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、望ましくない様式で相互作用することもなく、選択された化合物とともに個体に投与され得る）。このキャリアまたはアジュバントは、投与方法および特定の患者に依存し得る。投与方法は、非経口的に、経口的に、舌下に、粘膜に、吸入によって、吸収によって、または注射によって行われ得る。適切な投薬形態の実際の調製方法は、当業者に周知であるか、または明らかである：例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｗ．（編）、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照のこと。用いられる場合、非経口投与は一般に、注射によって特徴付けられる。注射可能物質は、液体の溶液もしくは懸濁物、注射前の液体への溶解もしくは懸濁のために適切な固体形態、または乳濁物のいずれかとして、従来の形態で調製され得る。非経口投与のための別のアプローチは、一定レベルの投薬量が維持されるように、徐放（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）系または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系の使用を含む（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照のこと）。さらに、散剤またはエアゾールは、吸入による投与のために処方され得る。
【００４７】
（検出方法）
本発明は、免疫アッセイのいくつかのバリエーションに基づく、被験体におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出する方法を提供し、この方法は、配列表に配列番号１として示す核酸によってコードされる精製されたポリペプチド、配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの独特のフラグメントを含む核酸によってコードされる精製されたポリペプチド、配列表に配列番号１として示す核酸によってコードされる精製されたポリペプチドを選択的に結合する抗体、または配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの独特のフラグメントを含む核酸によってコードされる精製されたポリペプチドを選択的に結合する抗体のいずれかを使用し、そしてこの抗体とこのポリペプチドとの結合を検出し、この結合は、被験体におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を示す。以下の非包括的例が例示するように、抗原または抗体を検出するために用いられ得る多数の免疫診断方法が存在する。これらの方法ならびに他の方法は、抗原または抗体の存在を検出し得るだけでなく、抗原または抗体の定量をも行い得る。これらの方法は、米国特許出願第０８／７１５，１３１号（１９９６年９月１７日出願（現在、米国特許第５，８５４，４１６号）、米国特許出願第０８／７１５，１３１号は、米国特許出願第０８／２２２，１７９号（１９９４年４月４日出願（現在放棄された））の一部継続出願であり、米国特許出願第０８／２２２，１７９号は、米国特許出願第０７／７９１，３７７号（１９９１年９月１７日出願（現在、米国特許第５，４２２，４２７号）の一部継続出願である）に示される。一般に、本発明の実施において用いられ得る検出方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）に記載される。
【００４８】
（感染の処置方法および予防方法）
本発明はまた、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染の危険性がある被験体におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を予防する方法を提供し、この方法は、配列表に配列番号１として示すような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３７−ｋＤａタンパク質をコードする核酸によってコードされる免疫原性ポリペプチド、または配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの独特のフラグメントを含む核酸によってコードされる免疫原性ポリペプチド、または本発明の免疫原性ペプチド（例えば、配列番号５〜配列番号１０に示す免疫原性ペプチド）を単独で、または薬学的に受容可能なキャリアと共に含む、有効量の治療組成物をこの被験体に投与する工程を包含する。
【００４９】
本発明は、被験体におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を処置する方法をさらに提供し、この方法は、配列表に配列番号１として示すような核酸によってコードされるポリペプチドまたは配列番号１の少なくとも１０ヌクレオチドの独特のフラグメントを含む核酸によってコードされるポリペプチドに対する有効量の抗体を、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリアと共にのいずれかで、この被験体に投与する工程を包含する。特定の生物に既に感染した被験体を、この生物に対する抗体をこの被験体に投与することによって処置することは、当該分野で周知である。例えば、狂犬病ウイルスに以前に暴露された動物またはヒトから単離された免疫グロブリンは現在、狂犬病ウイルス感染についての治療である。感染した個体のより良好な処置は、これらの個体にモノクローナル抗体を投与することによって達成され得る。なぜなら、これらのモノクローナルは、ポリクローナルよりも特異的に反応または結合するからである（例えば、Ｋａｐｌａｎら，「Ｒａｂｉｅｓ」，Ｓｃｉ．Ａｍ．２４２：１２０−１３４（１９８０）を参照のこと）。
【００５０】
（エピトープ性免疫原性ペプチド）
本発明は、ＰｓａＡ抗原上のエピトープについて特異的なモノクローナル抗体によってペプチドの高親和性結合について選択することによって、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーによってコードされるペプチドとして得られる、新規のエピトープ性免疫原性ペプチドを開示する。
【００５１】
「バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」または「パニング」として公知の方法では、標的タンパク質または標的ペプチドは、微生物の外表面に異種挿入物として発現されるライブラリーから選択される。例えば、細菌またはウイルスは、融合物またはキメラが作製されるような方法でその染色体核酸中に組み込まれた、異種ペプチドまたは異種タンパク質の配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。この融合物は、異種ペプチドまたは異種タンパク質と直接連結された、微生物の天然のタンパク質を表す。一旦この微生物の表面に発現されると、これは、必要とされているペプチドまたはタンパク質に特異的なリガンド（例えば、特定のエピトープを認識する抗体）によってプロービングされ得る。捕捉によって一旦同定されると、核酸またはタンパク質のいずれかのこの異種配列は、入手および同定され得る。
【００５２】
この手順の通常の実行は、タンパク質化学、免疫学およびウイルス学の分野の当業者に周知である。糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄ）が用いられる。これらのバクテリオファージは、以下の２つの周知の構造タンパク質をその表面に有する：遺伝子ＩＩＩタンパク質および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質。このファージの核酸は、異種ペプチドの融合配列を、これらの構造タンパク質の一方または他方についての遺伝子とインフレームで取り込むことによって変更される。このようなペプチドの大きなセット（すなわち、ライブラリー）から標的ペプチドを求める場合、このペプチドライブラリーのメンバーをコードする異種ヌクレオチド配列の対応するライブラリーは、この構造タンパク質遺伝子中に組み込まれる。得られるバクテリオファージ集団（ファージディスプレイライブラリーと呼ばれる）は、ＰｓａＡ特異的リガンド（例えば、ＭＡｂ）が高親和性を有するこのペプチドライブラリーのメンバーを発現するウイルス粒子のみの選択を最適化する手順に供される。次いで、このようにして選択されたバクテリオファージ粒子は、さらなる培養によって増幅され得るか、またはそれらの核酸がポリメラーゼ連鎖反応のような方法によって増幅され得る。このようにして、捕捉された粒子の核酸が単離および配列決定されて、ＭＡｂまたは他のリガンドに結合した高親和性エピトープについてのコード配列を提供し得る。バイオパニングは、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．およびＫ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ（１９９３，「Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｐｈａｇｅ」，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７）に記載される。
【００５３】
本発明の免疫原性ペプチドを、病原性微生物に対する防御免疫を潜在的に惹起し得るペプチドの配列を同定する一般的利用可能性を有するバイオパニング手順を用いて入手した。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ランダムオリゴヌクレオチドから構成されるライブラリーを提供する工程であって、ここで、このオリゴヌクレオチドは、約３０〜４５ヌクレオチド長である、工程；
（ｂ）糸状バクテリオファージのコートタンパク質についての遺伝子が、このバクテリオファージについてのゲノムである完全な核酸内に含まれるように、このコートタンパク質のアミノ酸残基についてのコドンとインフレームで、このコートタンパク質についての遺伝子中にライブラリーのオリゴヌクレオチドを挿入し、そしてさらに、このコートタンパク質が発現され、そして完全なバクテリオファージ粒子中に取り込まれたときに、表面に露出することによって、抗体が結合し得るエピトープとしてこのペプチドが利用可能であるように、このオリゴヌクレオチドをこの遺伝子内に配置し、それにより、バクテリオファージライブラリーを作製する工程；
（ｃ）このバクテリオファージライブラリーを、このバクテリオファージによって感染され得る宿主中で培養することによって、このオリゴヌクレオチドライブラリーを保有するこのバクテリオファージライブラリーを増大させる工程；
（ｄ）病原性微生物由来の免疫原（例えば、免疫原性ペプチドまたは免疫原性ポリペプチド）で動物を免疫することに応じて得られたモノクローナル抗体と免疫特異的に反応する任意のバクテリオファージ粒子について、この増大させたバクテリオファージライブラリーをスクリーニングする工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において得られた任意のバクテリオファージ粒子のコートタンパク質について遺伝子を配列決定し、それによって、翻訳産物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する防御免疫を潜在的に惹起し得るペプチドの配列を有する、このオリゴヌクレオチドライブラリーのそのメンバーのヌクレオチド配列を生じる工程。
【００５４】
本発明の免疫原性ペプチドを得る際に用いられる特定の適用では、上記の方法はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関し、コートタンパク質は、糸状バクテリオファージのテイルタンパク質（例えば、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄ）である遺伝子ＩＩＩタンパク質であり、そしてモノクローナル抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎球菌表面接着Ａタンパク質（ＰｓａＡ）で動物を免疫することに応じて入手される。このペプチドは、この抗体について高い親和性を有するペプチドのみを細くすることを強調する手順を用いて入手される。このことにより、選択されたペプチドが防御体液免疫応答を効果的に誘導する可能性が高まる。
【００５５】
この抗体に結合するこのペプチドの配列は、バイオパニングプロセスにおいて得られるバクテリオファージ粒子の遺伝子ＩＩＩ融合物を配列決定することによって同定され得る。次いで、実際の免疫原性ペプチドは、従来のペプチド合成機を用いて合成され得る。次いで、これらのペプチドは、免疫原性ペプチドが、被験体へと投与される免疫刺激キャリアと合わされる治療組成物中に組み込まれる。有効量で投与されたら、この被験体は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体の産生を惹起する。これは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染に対する防御免疫の付与をこの被験体にもたらす。
【００５６】
ＰｓａＡは、効果的に免疫原性である、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）由来の３７−ｋＤａの種共通タンパク質である。これは、その多糖が、現在使用されている肺炎球菌ワクチンの成分である全ての血清型に共通である（Ｒｕｓｓｅｌｌら，１９９０，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２１９１−２１９５）。血清型Ｒ３６ＡからクローニングされたＰｓａＡ遺伝子の配列が記載されており（Ｒｕｓｓｅｌｌらに対する米国特許第５，４２２，４２７号）、そしてＰｓａＡタンパク質の配列が推定された。さらに、血清型２および血清型６Ｂ由来のクローニングされたＰｓａＡのヌクレオチド配列、ならびにそれらの対応するアミノ酸配列が決定されている（Ｂｅｒｒｙら，１９９６，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ＰｓａＡ，ａ  ３７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６４：５２５５−５２６２；Ｓａｍｐｓｏｎら，１９９７，「Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＰｓａＡ  ａｍｏｎｇ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５  １９６７−１９７１）。推定のリーダー配列を除いて、血清型６Ｂ由来のＰｓａＡと血清型２由来のＰｓａＡとの間では、全体で合計２９０残基のうち、６個のアミノ酸の相違が存在する；６Ｂと３６Ａとの間では、４５個のアミノ酸の相違が存在する（Ｓａｍｐｓｏｎら，同書）。この結果からＳａｍｐｓｏｎらは、血清型２および血清型６Ｂが肺炎球菌ＰｓａＡタンパク質のうちのプロトタイプの配列を表すことを示唆した。血清型３由来のＰｓａＡ（本明細書中に参考として援用される、米国特許出願第０８／７１５，１３１号（現在、米国特許第５，８５４，４１６号）に開示される）および血清型２２由来のＰｓａＡ（Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら，１９９６，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆａｔａｌｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ  （ＰｓａＡ）」，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２１：１７−２２）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのチャレンジ用量に対して、マウスにおける防御免疫を有効に提供する。
【００５７】
本発明のペプチドは、ＰｓａＡ特異的モノクローナル抗体に結合することによって選択される免疫原性エピトープを含む。好ましくは、このペプチドは、約１０〜２５アミノ酸残基長である。より好ましくは、このペプチドは、約１２〜２２アミノ酸残基長、そして最も好ましくは約アミノ酸１５残基長である。以下の実施例において示される実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８において提供される配列を有する。さらに、本発明は、これらの配列よりも短くてもよい免疫原性ペプチドを包含する。従って、例えば、配列番号５の免疫原性フラグメント、配列番号６の免疫原性フラグメント、配列番号７の免疫原性フラグメント、および配列番号８の免疫原性フラグメントはまた、本発明によって包含される。
【００５８】
現在、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの約９０の血清型が同定されている；これらは、すでに同定されたＰｓａＡ配列の対立遺伝子改変体であるＰｓａＡ抗原を有し得る。従って、本発明は、例えば、対立遺伝子改変体で免疫することによってモノクローナル抗体が惹起されるバイオパニング手順によって、または関連分野当業者に公知の他の方法で得られた対立遺伝子免疫原性ペプチドを包含する。このようなペプチドの配列は、以下の配列のいずれかに少なくとも８０％同一である；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号５の免疫原性フラグメント、配列番号６の免疫原性フラグメント、配列番号７の免疫原性フラグメント、および配列番号８の免疫原性フラグメント。
【００５９】
上に開示されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、本発明の手順においてさらに使用された。使用された特異的なＭＡｂは、１Ｅ７（１Ｅ７Ａ３Ｄ７Ｃ２）、６Ｆ６（６Ｆ６Ｆ９Ｃ８）、４Ｅ９（４Ｅ９Ｇ９Ｄ３）、８Ｇ１２（８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０）、および１Ｂ６（１Ｂ６Ｅ１２Ｈ９）と命名される。これらのＭＡｂは、ＰｓａＡでの動物の免疫の結果として得られた；従って、このような抗体は、抗原結合ドメインが本発明の免疫原性エピトープに結合する分子を代表する。
【００６０】
ＰｓａＡに関連する免疫原性エピトープの同定は、多数の方法のいずれかで達成され得る。免疫原性エピトープを同定するための方法は、ＰｓａＡでの一次免疫に応答して得られた任意のＭＡｂを使用し得る。ＰｓａＡの全体の分子構造をその部分またはフラグメントに狭める任意の手順が、その免疫原性エピトープを同定する際に使用され得る。１つの方法において、ＰｓａＡの特定の残基の化学的な改変は、抗ＰｓａＡ  ＭＡｂのようなリガンドとの反応性が損なわれ得る改変産物を生じる。結合が損なわれた産物においてどの残基（単数または複数）が改変されているかの知識を使用して、これらの残基を、潜在的にエピトープの一部分として同定し得る。さらに、上記のバイオパニングが使用され得る。
【００６１】
別の方法において、ＰｓａＡのフラグメントは、ペプチド合成によって化学的に合成され得る。一般に、そのＮ末端からそのＣ末端までのタンパク質の配列全体に沿った系統的な進行に相当するペプチドのセットが、合成される。既存の長さのウインドウは、本来の配列のほとんどまたは全てを包含するペプチドのセットを作製するタンパク質配列に沿って、「歩行」され得る。ペプチド合成の方法は、ペプチド化学、タンパク質化学、および免疫学の当業者に周知である。一旦ペプチド配列が特定されると、市販の機器は、これらの自動合成のために利用可能である。この方法で得られたペプチドのセットは、これらがＰｓａＡ特異的リガンド（例えば、抗ＰｓａＡ  ＭＡｂ）に結合するか否かを確証するためのアッセイに供され得る。免疫アッセイ方法は、このような決定のために好ましく、そして免疫学の当業者に周知である。これらは、例えば、競合的形式または直接的な異種型式を使用する、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような手順を含む。高い親和性でＰｓａＡ特異的リガンドに結合することが見出されたペプチドは、ＰｓａＡの免疫原性エピトープを含むかまたは包含することが推定される。
【００６２】
本発明の免疫原性ペプチドは、前述の段落において記載されるような選択手順またはスクリーニング手順で同定される。次に、陽性に選択されたペプチドの配列が、得られる必要がある。化学的改変の場合において、配列における阻害的な改変の位置は、この改変された残基を中心とするかまたはこれを含むペプチドを生じる。合成されたペプチドのスクリーニングの場合、配列は、陽性サンプルの同一性から直ちに利用可能である。バイオパニングの場合、陽性バクテリオファージが単離され、そして核酸が、培養物中のファージ粒子の拡大によってかまたは核酸自身の増幅によってのいずれかで増幅される。次いで、この核酸は単離され、そして異種ペプチドのコード配列を同定するために配列決定され、そしてペプチド配列を生じるためにコード配列は翻訳される。
【００６３】
一旦配列が既知となると、対応するペプチドが、被験体中で免疫原性ペプチドとして機能するように合成される。ペプチドを合成するための方法は、免疫化学、免疫学、および／またはタンパク質化学の当業者に周知である。例えば、ペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）の方法に従って、固相Ｆ−ｍｏｃ化学を使用して合成し得る。代表的には、このような合成は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から入手可能である自動合成機のような自動ペプチド合成機を使用して行なわれる。本発明に従って、ペプチドを合成するために使用され得る合成機の例は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ＡＣＴモデル３９６ＭＰＳである。一旦合成されると、配列は、代表的に、Ｐｏｒｔｏｎモデル２０９０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のような自動ペプチド配列決定装置を使用して確認される。
【００６４】
以下の実施例において実証され、そして上の「３７ｋＤａタンパク質」の節において議論されるように、ペプチドの免疫応答性が、３７ｋＤａ肺炎球菌表面接着タンパク質と比較して有意には損なわれていない条件で、本発明のペプチドは、特定の領域もしくは特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された改変を含み得る。本発明のペプチドに関して、成句「本質的になる」は、以下の実施例の節において示されるように、当業者によって同定され得そして慣例的に作製され得るような改変ペプチドをカバーすることが意図される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、免疫化学および免疫学の当業者に周知であり、そして「治療組成物」の節で本明細書中に議論されるように、被験体への投与の前に、免疫刺激キャリアおよび／またはアジュバントと組み合わされる。一般的な実施において、免疫刺激キャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ジフテリア類毒素などのようなタンパク質である。免疫原性ペプチドおよびキャリアは、非共有結合的または共有結合的に組み合わされ得る。非共有結合的に組み合わされる場合、これらは、被験体に投与される治療組成物中に成分を含むように、共に混合される。
【００６６】
本発明のペプチドに対する免疫応答を刺激するために使用され得る多数のアジュバントが、当該分野で公知である。例えば、ミョウバン、プロテオソーム、特定の脂質（例えば、パルミチン酸（以下を参照のこと））、ＱＳ２１、またはアルヒドロゲル（２％；＃Ａ１０９０ＢＳ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）は、本発明においてアジュバントとして使用され得る（ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｄ．Ｐ．，ら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ３８−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｌｉｐｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３１９０（１９９８）；Ｓｈｅｉｋｈ，Ｎ．Ａ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２９７４（１９９９）；およびＭｏｏｒｅ，Ａ．ら、「Ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ａｎｄ  ＱＳ２１  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｔｈ２  ｔｏ  Ｔｈ１」Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２５１７（１９９９））。
【００６７】
上記の結合体およびアジュバントに加えて、本発明のペプチドの免疫原性は、プロテオソームへのペプチドの付加によってか、またはシステイン残基の付加によって増強され得る。プロテオソームへの付加については、スペーサー（例えば、ＣＹＧＧスペーサー）およびラウロイル基は、ペプチドのアミノ末端に付加され得る（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）。ラウロイル基は、ペプチド基のプロテオソームへの疎水性複合体化を増強する（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら、「Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ，ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｎｃｈｏｒｓ，ｉｓｃｏｍｓ，ａｎｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」：Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｇ．Ｍ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１４１−１６０頁（１９９０）；Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ  ｖｉａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｆｅｅｔ  ｂｅｃｏｍｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８（１９８８）；およびＺｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｄ．ら、「Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｍａｎ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：８３６（１９７９））。他方、システイン基（例えば、上記のＣＹＧＧスペーサーにおけるシステイン）は、ペプチドの免疫原性を増強する（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら、（１９９０））。プロテオソームは、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら、（１９９０））によって記載されるように、Ｂ群髄膜炎菌９９Ｍ系統由来の外膜複合小胞から調製され得る。合成リポペプチドは、界面活性剤の存在下で成分を組み合わせることによって１：１（ｗ／ｗ）の比で、プロテオソームに複合体化され得る。界面活性剤は、徹底的な透析によって取り除かれ得る（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら、（１９８８））。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、ペプチドに対する免疫応答を刺激するために、例えば、モノパルミチン酸（これに限定されない）で脂溶化される（Ｖｅｒｈａｕｌら、「Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐａｃｅｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：２１９（１９９５））。モノパルミチン酸を含む、本発明のペプチドの脂溶化バージョンは、上記の標準アミノ酸結合と同じ反応条件を使用して、パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を樹脂結合ペプチドの脱保護したアミノ末端に結合することによって合成され得る（Ｖｅｒｈａｕｌら、前出）。いくつかの実施形態において、三相性ペプチドのシステイン−セリン−セリンは、モノパルミチン酸のような脂質の付加を容易にするために、本発明のペプチドのアミノ末端に付加される。
【００６９】
本発明のインビトロ合成ペプチドへの脂質の付加に加えて、本発明のペプチドの脂溶化バージョンは、当業者に公知の方法を使用する組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。例えば、本発明のペプチドをコードする核酸に結合した異種リーダー配列を含む構築物が、開発され得る。異種リーダー配列は、宿主生物によって脂溶化される。リーダー配列は、例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのｏｓｐＡ遺伝子に由来し得る（Ａｄｅｓら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ＰｓａＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ」ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０２００（１９９９））。
【００７０】
本発明の治療組成物は、上の「治療組成物」の節において記載される。本発明の治療組成物を調製する際に、免疫原性ペプチドは、被験体への投与のための薬学的に受容可能なビヒクルを用いて処方される。このようなビヒクルは、製薬科学の当業者に周知であり、そして経口、舌下、または非経口経路（静脈内、皮下、筋肉内、粘膜、および吸入を含むがこれらに限定されない）による投与のための、液体、ゲル、または固体形態の調製物を含む。これらの投薬形態は、即効性のバイオアベイラビリティーを有する溶液もしくは懸濁液のような従来の調製物であり得るか、またはこれらは、長時間にわたって、活性な免疫原性ペプチドをゆっくりと放出する特性を有する、制御放出処方物もしくは制御放出デバイスであり得る。好ましい実施形態において、本発明のペプチドを含む治療組成物は、これらが投与される被験体、好ましくはヒト被験体において、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する保護的な免疫を与える。
【００７１】
本明細書中に記載される方法によって開示されるペプチドに加えて、このようなペプチドの免疫原性フラグメントもまた、本発明内に包含される。免疫原性フラグメントは、配列が本発明のそれが由来するペプチド（親）の一部分の配列と同一でありそして免疫原性を保持する、親ペプチドよりも短い任意のペプチドである。このようなペプチドは、抗原性であるために少なくとも約６残基長でなければならないことが、免疫化学の分野で一般に理解される。従って、任意のフラグメントは、少なくとも６残基長であるべきであり、そして親ペプチドより１残基短い最大長さを有し得る。免疫原性フラグメントを同定することは、免疫原性を確認する任意の方法を使用して達成され得る。これらの方法としては、例えば、上記のバイオパニング手順、ならびに薬学的組成物の活性成分を形成するために免疫刺激キャリアと候補ペプチドを組み合わせる工程、薬学的組成物を被験体に投与する工程、および免疫原性応答が生じたか否かを評価する工程、による免疫原性の直接的な実証が挙げられる。
【００７２】
免疫原性であるとして明確に同定されたペプチドフラグメントはまた、被験体において保護的な免疫を惹起するその能力について評価され得る。これは、ＰｓａＡペプチドフラグメントに対して免疫原性応答を示す実験的被験体動物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによるチャレンジに抵抗するか否かを決定するための、本明細書中に記載される方法を使用して行なわれる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、免疫の効果を増強するためにお互いに組み合わせて投与される。「組み合わせた（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」投与は、同時投与および連続的投与ならびに組み合わせ形態でかまたは別々の投与を包含する。例えば、活性剤が本発明の単一の免疫原性ペプチドである治療組成物に加えて、組成物は、配列番号５またはその免疫原性フラグメント、配列番号６またはその免疫原性フラグメント、配列番号７またはその免疫原性フラグメント、配列番号８またはその免疫原性フラグメント、配列番号９またはその免疫原性フラグメント、配列番号１０またはその免疫原性フラグメント、あるいは長さが１０〜２５残基、好ましくは１２〜２２残基、またはより好ましくは約１５残基である、配列番号２のフラグメントによって与えられる配列を有する多重ペプチドを含み得る。１つの実施形態において、組成物は、配列番号５によって与えられる配列を有するペプチドおよび配列番号６によって与えられる配列を有するペプチドを含む。別の実施形態において、組成物は、配列番号５および配列番号９によって与えられる配列を有するペプチドを含む。
【００７４】
（多重抗原性ペプチド）
本発明のペプチドを投与するための別の実施形態において、ペプチドは、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として投与される（図１〜４）。多重抗原性ペプチドを合成および投与するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、「Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｒｉｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：１９３（１９９４）；Ｂａｓａｋら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＭＡＰ）ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ８−ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１：３８５（１９９５）を参照のこと）。好ましい方法において、多重抗原性ペプチドは、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｊ．Ｐ．Ｔａｍ  ａｎｄ  Ｅ．Ｔ．Ｋａｉｓｅｒ編、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３−１８（１９８９）の方法に従って、リジン残基から２つのペプチドを分枝することによって合成される。
【００７５】
１つの好ましい実施形態において、本発明のＭＡＰは、本発明のペプチドの１つの、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、そして最も好ましくは４つのコピーを含む。同質なＭＡＰは、そのアームの各々に同じペプチドを含むＭＡＰである。異種ＭＡＰは、そのアームに異なるペプチドを含むＭＡＰである。１つの実施形態において、同質な４アームＭＡＰは、配列番号５を含む。別の実施形態において、同質な４アームＭＡＰは、配列番号６を含む。別の実施形態において、同質な４アームＭＡＰは、配列番号７を含む。別の実施形態において、同質な４アームＭＡＰは、配列番号８を含む。別の実施形態において、同質な４アームＭＡＰは、配列番号９を含む。別の実施形態において、同質な４アームＭＡＰは、配列番号１０を含む。
【００７６】
別の実施形態において、本発明のＭＡＰは、配列番号５によって与えられる配列を有するペプチドまたはその免疫原性フラグメント、配列番号６またはその免疫原性フラグメント、配列番号７またはその免疫原性フラグメント、配列番号８またはその免疫原性フラグメント、配列番号９またはその免疫原性フラグメント、配列番号１０またはその免疫原性フラグメント、長さが１０〜２５残基、好ましくは１２〜２２残基、またはより好ましくは約１５残基である配列番号２のフラグメントを含む、本発明のペプチドのいずれかをアーム配列として有する３アームＭＡＰである。１つの実施形態において、３アームＭＡＰの第１のアームは、配列番号５によって与えられる配列を有するペプチドを含み、３アームＭＡＰの第２のアームは、配列番号９によって与えられる配列を有し、３アームＭＡＰの第３のアームは、配列番号１０によって与えられる配列を有する。３アームＭＡＰの別の実施形態において、アームは、それぞれ配列番号５、６および７を含む。
【００７７】
「治療組成物」の節において上記のように、本発明のペプチドの免疫原性の量は、標準的な手順を使用して決定され得る。例えば、初回免疫は、約１μｇと１０ｍｇとの間、好ましくは約１０μｇと１ｍｇとの間、そしてより好ましくは約５０μｇと５００μｇとの間の本発明の１つ以上のペプチドを含み得る。ブースター免疫は、代表的に、初回免疫を受ける動物に与えられる。ブースター投与の一般的な時間条件は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、ブースター投与は、初回投与の３週および６週後に与えられる。ブースター投与は、代表的に、初回免疫の約半分の量のペプチドを含む。
【００７８】
標準的な技術は、上の「治療組成物」の節において記載されるように、免疫に対する免疫原性応答をモニタリングするために使用され得る。例えば、免疫学的応答は、以下の実施例の節において示されるように、鼻咽頭（ＮＰ）チャレンジを使用して決定され得る。ＮＰチャレンジについては、被験体つまり動物、例えば、マウスは、０．８５％生理食塩水中に懸濁されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）で、鼻腔内（ＩＮ）にチャレンジされ得る。細菌増殖のための十分な時間後（例えば、鼻腔内チャレンジの５日後）、動物を屠殺し、そして鼻の洗浄を行ない、Ｗｕ，Ｈ．Ｙ．ら（「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ」Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２３：１２７（１９９７））の方法によって培養した。洗浄物は、１：４８６の最終希釈まで、３倍に希釈され得る。５０マイクロリットルの各希釈液を、血液寒天＋ゲンタマイシンプレート（５％脱線維素ヒツジ血液および０．５％ゲンタマイシンで補充したトリプチカーゼ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズ寒天）上で培養し得る。免疫マウスおよびプラセボ（ＰＢＳ）免疫コントロールにおけるＮＰコロニー形成および保因からのデータは、ｔ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定のような標準的な統計学的試験を使用して分析され得る。鼻咽頭保因は、１つの鼻当りのコロニー形成単位の数である。鼻咽頭コロニー形成は、少なくとも１ｃｆｕが２５μｌの鼻洗浄液で形成するか否かに依存して、マウスについて陽性または陰性のいずれかである。
【００７９】
以下の実施例は、本発明の完全な開示および説明を当業者に提供するために、開示される。これらは、本発明の単なる例示を意図し、発明者らが自分らの発明であると考えるものの範囲を制限することを意図しない。他に示されない限り、部（ｐａｒｔ）は重量部であり、温度は℃であり、そして圧力は、大気圧であるかまたはこれに近い。
【実施例】
【００８０】
（実施例）
（細菌株）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ３６Ａは、Ｄ．Ｅ．Ｂｒｉｌｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  ａｔ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）の厚意によって提供された。２４の血清型のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、Ｋ．Ｆａｃｋｌａｍ、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａによって提供された。これらの血清型は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１１Ｆ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆである。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｅ．ｃａｓｓｃｌｉｆｌａｖｕｓおよびＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍもまた、Ｒ．Ｆａｃｋｌａｍによって提供された。嫌気性細菌を、Ｖ．Ｒ．Ｄｏｗｅｌｌ、ＣＤＣから獲得した。これらとしては、Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ  ｌｅｎｔｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓが挙げられる。Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓおよびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、Ｒ．Ｗｅａｖｅｒ、ＣＤＣから獲得した。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、Ｒ．Ｃ．Ｇｏｏｄ、ＣＤＣによって提供された。Ｒ．Ｂａｒｎｅｓ、ＣＤＣは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを提供した。以下の残りの細菌は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＤＣのストックコレクションに由来する：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ，Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ｇｅｒｇｏｖｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ａ〜ｆ型）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｍｉｃｄａｄｅｉ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＧ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ。
【００８１】
（ＭＡｂの産生）
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、莢膜２型株Ｄ３９の粗誘導体である、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ３６Ａの全細胞懸濁物で免疫した（Ａｖｅｒｙら、（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．７９：１３７−１５７）。これらのマウスを３回の静脈内注射および１回の腹腔内注射によって免疫した。任意の回において注射された最大数の細胞は、約１０６であった。融合を、標準的な手順（Ｃｌａｆｉｎら（１９７８）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０７−１０９）を使用して、２５日目に行った。４匹のマウスの脾臓細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞に融合させた（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２７６：２６９−２７０）。増殖するハイブリドーマの培養液を、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ全細胞に対する抗体について、ＥＬＩＳＡで試験した。１Ｅ７Ａ３Ｄ７Ｃ２と命名されたクローンは、さらなる研究のために選択された１０のうちの１つであった。
【００８２】
（ＥＬＩＳＡ）
ハイブリドーマ培養物上清のスクリーニングを、ＥＬＩＳＡによって行った。Ｕ底のマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、０．１Ｍ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１：４，０００に希釈したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ全細胞懸濁物（１０９ｃｆｕ／ｍｌ）５０μｌで感作し、４℃で１６時間保持した。このプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．９％  ＮａＣｌ（ＮａＣｌ−Ｔ）で５回洗浄した。融合プレートからの培養物上清（５０μｌ）を、プレート中の、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％正常ウサギ血清、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０２％Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅを含む溶液（ｐＨ７．２）（ＥＬＩＳＡ希釈物、Ｗｅｌｌｓら（１９８７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：５１６−５２１）５０μｌに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。このプレートを、ＮａＣｌ−Ｔで５回洗浄した。ヤギ抗マウス免疫グロブリンセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体を含有するＥＬＩＳＡ希釈液の５０μｌを、各ウェルに添加した。このプレートを、３７℃で３０分間インキュベートした。このプレートを洗浄し、そして５０μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（０．００５％過酸化水素を含む０．１Ｍ  酢酸ナトリウム、０．１Ｍ  クエン酸（ｐＨ５．７）中に０．１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４１ｍｌの添加によって停止させ、そして光学密度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ）で４５０ｎｍで読み取った。０．２００より大きい光学密度を、陽性とみなした。
【００８３】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析）
硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Ｔｓａｎｇら（（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３７７−３９１）の方法によって、８％アクリルアミド分解ゲルを使用して実行した。等容積の、サンプル緩衝液（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の５％のＳＤＳ−１０％の２−メルカプトエタノール−２０％のグリセロール）および１μｌあたり２．４μｇのタンパク質を含む細胞懸濁物を混合し、１００℃で５分加熱し、そして５μｌのサンプルを１〜１５のウェルにアプライした。試験されるべきサンプルの一部の最終タンパク質含量が１．２μｇ／μｌ未満であった場合、１０μｌにボリュームアップしたサンプルをアプライして、１ウェル当たり６μｌの最終タンパク質濃度を達成した。タンパク質濃度を、Ｍａｒｋｗｅｌｌら（（１９７８）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：２０６−２１０）の方法によって、標準としてＢＳＡを使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ（（１９８１）Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：３０７−３１０）の方法によって銀染色したか、またはニトロセルロース上に電気ブロットした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｈ．）かのいずれかである。僅かに改変したＴｓａｎｇ（１９８３）らの方法に従って、このイムノブロット手順を行った。このブロットを、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５分間３回洗浄し、そして２５℃で一晩（１６時間）穏やかに攪拌した。ブロットを、カゼイン−チメロサール緩衝液（ＣＴＢ）で１時間ブロッキングした（Ｋｅｎｎａら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．、８５：４０９−４１９）。ＣＴＢで３回リンスした後、ブロットを、ヤギ抗マウス免疫グロブリンセイヨウワサビぺルオキシダーゼ結合体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆ）に、２５℃で２時間曝露した。結合体希釈物（１：２，０００）を、ＣＴＢで作製した。ブロットを、ＣＴＢで再び３回リンスし、そしてＰＢＳ中の３，３’−ジアミノベンジジン−４−ヒドロクロリド（ｐＨ７．２）（０．５ｍｇ／ｍｌ）に、０．００３％Ｈ２Ｏ２と共に２５℃で５分間曝露した。反応性を、ニトロセルロール紙上の可視的な色付バンドとして示した。低分子量のタンパク質標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、ＰＡＧＥおよびイムノブロットにおいて使用した。タンパク質標準に対するウサギ抗血清を使用して、標準を発色させた（Ｃａｒｌｏｎｅ（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５５：８９−９１）。Ｎｅｖｉｌｌｅら（（１９７４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２：９２−１０２）の方法によって、適切な分子量標準を使用して分子量を、算定した。
【００８４】
（免疫蛍光アッセイ）
視野当たり、約４００〜５００ｃｆｕを含む細菌懸濁物（１０μｌ）を、アセトン耐性の、１２ウェルの（直径５ｍｍ）ガラススライド（２５×７５ｍｍ）（Ｃｅｌ−Ｌｉｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｎｅｗｆｉｅｌｄ、ＮＪ）の各ウェル上で、室温で乾燥させた。次いで、スライドを、１０分間アセトンに浸漬し、そして室温で乾燥させた。ＭＡｂを、スライドに添加し、これを、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを、穏やかにＰＢＳでリンスし、そして５分間隔で２回浸し、フィルター紙にブロッティングし、そして室温で風乾させた。次いで、ヌルオレセイン標識したウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｗ．Ｆ．Ｂｉｂｂ、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡの厚意）を添加し、そしてスライドを、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらを、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてフィルター紙上に穏やかにブロティングした。スライドを、炭酸緩衝化かさ上げ液（ｐＨ９．０）およびカバースリップで覆い、次いで、ＨＢＯ−１００水銀入射光源、Ｉ立体フィルターシステム、４０×乾燥対物レンズおよび６．３×双眼鏡を備えたＬｅｉｔｚ  Ｄｉａｌｕｘ  ２０蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｅｉｇｈ、ＮＪ）を用いて読み取った。
【００８５】
（免疫電子顕微鏡）
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして１％パラホルムアルデヒド−０．１％グルタルアルデヒドの新たに作成した混合物中で、４℃で２０分間固定した。細胞を、段階的な一連のアルコールで脱水し、次いで、完全エタノールおよびＬｏｗｉｃｒｙｌ  Ｋ４Ｍ（Ｌａｄｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ）の１：１の混合物中で、４℃で１時間脱水した。細胞をペレット化し、そして完全エタノールおよびＬｏｗｉｃｒｙｌ  Ｋ４Ｍの１：２の混合物中で４℃で１時間懸濁した。これらを再びペレット化し、そしてＬｏｗｉｃｒｙｌ  Ｋ４Ｍ（未希釈）中で、４℃で１６時間懸濁した。細胞を、次の２４時間の間に新鮮かつ未希釈のＬｏｗｉｃｒｙｌ  Ｋ４Ｍに２回移した。Ｌｏｗｉｃｒｙｌ  Ｋ４Ｍ処理した細胞を、ゼラチンカプセルに包埋し、そしてアルミホイルで裏打ちした箱中に配置した。カプセルを、短波長ＵＶ光源を使用して、硬化した（３５ｃｍの距離で７２時間、−２０℃）。この箱を室温にし、そしてカプセルを１４日間までの間、硬化させ続けた。カプセルのサンプルを、１００μｍの厚さの切片に切断し、そしてニッケルの格子上に取り上げた。サンプルを含む格子を、アジ化ナトリウム（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）を含むＰＢＳ中のオボアルブミン溶液の滴上に５分間配置した。格子（湿性）を、ＢＳＡ試薬の溶液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、およびアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に希釈した一次ＭＡｂの溶液に移し、そして室温で１時間か、または加湿チャンバ中で４℃で１８〜４８時間インキュベートした。抗体結合コントロールとして、他の格子を、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに対するＭＡｂで湿らせた。この格子を、ＰＢＳで２回リンスし、そしてヤギ抗マウスＩｇＧ標識したコロイド状冷粒子（２０μｍ）（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）の滴上で室温で１時間インキュベートした。この格子を、２回リンスし、そして四酸化オスミウム、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて後染色した。この格子を、Ｐｈｉｌｉｐｓの４１０透過型電子顕微鏡を用いて試験した。
【００８６】
（ＣＢＡ／ＣａＨＮ／Ｊマウス）
Ｗｉｃｋｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：８６−１０１に記載されるようなＸ連鎖免疫不全（ｘｉｄ）ＣＢＡ／Ｎマウスを使用して、３７ｋＤａのタンパク質によって与えられる防御を研究した。
【００８７】
（実施例１．モノクローナル抗体）
ＭＡｂを、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｄｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）の方法によって産生し、Ｚｏｌａら（１９８２、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．Ｇ．Ｈｕｒｒｅｌｌ（編）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１〜５７頁）の方法によって改変した。マウスの免疫のために使用される３７ｋＤａの精製ＰｓａＡは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆに由来し、そしてＴｈａｒｐｅら（１９９６、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ（ＰｓａＡ）」、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３：２２７−２２９）の方法に従って精製した。全てのＭＡｂを、１Ｅ７（１Ｅ７Ａ３Ｄ７Ｃ２）以外は、血清型２２Ｆから精製したＰｓａＡで免疫することによって産生し、この１Ｅ７は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＲ３６Ａの非カプセル化株で免疫することによって産生した（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９０、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２１９１−２１９５）。ＰｓａＡを、以下の実施例３および５未示す手順を使用して単離した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いた１：１乳濁物中の１８０μｇ／ｍｌの最終濃度で、精製タンパク質で最初に腹腔内で免疫した。１ヵ月後、マウスを、アジュバントなしの１１０μｇ／ｍｌの精製ＰｓａＡでブーストした。ハイブリドーマ融合を、標準的な手順（Ｃｌａｆｉｎら、１９７８  「Ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｍａ−ｓｐｌｅｅｎ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０７−１０９）を使用して実行した。２匹のマウス由来の脾臓細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させた（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７８、「Ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９−２７０）。免疫したマウス由来の血清およびハイブリダイズした細胞由来の組織培養上清を、慣用的な手順において、ヤギ抗マウス免疫グロブリン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体を使用するＥＬＩＳＡによって、そして標準的なＰｓａＡに対するウェスタンブロッティングと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＰｓａＡに対する反応性について、スクリーニングした。スクリーニングにおいて陽性の結果を得るハイブリドーマを、増殖させ、そしてペプチドの同定において使用した；これらは、６Ｆ６（６Ｆ６Ｆ９Ｃ８）、４Ｅ９（４Ｅ９Ｇ９Ｄ３）、８Ｇ１２（８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０）および１Ｂ６（１Ｂ６Ｅ１２Ｈ９）であった。これらのＭＡｂを、１Ｅ７と共に、この研究において使用した。
【００８８】
ドットイムノブロットおよびウェスタンブロットアッセイによると、これらのＭＡｂは、最近のｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ多糖ワクチンに存在する２３の型特異的な血清型を示すＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床的単離体と反応した。ウェスタンブロットによって、検出された抗原が３７ｋＤａの分子量を有することを確認した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０の血清型の展開された研究において、前の段落で列挙された５つのＭＡｂ（１Ｅ７は含まない）は、９０の血清型のうち８９と反応した（１Ｂ６のみが血清型１６Ｆと反応できなかった）。これらの列挙されたＭＡｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ、呼吸器病原体、または２２の属および２９の種を示す非病原体と反応できなかった。ＭＡｂ  １Ｅ７は、試験された全てのｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ株（２４の血清型）と対応して反応し、１００％の感受性を得た。特異性について、５５の異なる細菌の非ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ株（１９の属と３６の種を示す）のうち、反応したものはなく、従って、１００％の特異性を得た。
【００８９】
実施例１１に記載される実験における使用のために必要とされる場合、ＭＡｂを、（最初にＤＭＳＯに溶解された）１００μｇのＮ−ヒドロキシスクシンンミジル−ビオチンエステルを有する０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）中の１ｍｇのタンパク質をインキュベートすることによってビオチン化した。
【００９０】
（実施例２．Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着因子Ａ遺伝子のクローニング）
制限酵素Ｓａｕ３Ａ１で消化したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化したｐＵＣ１３に連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＢ１に形質転換した。組換えクローンを、３７ｋＤａのモノクローナル抗体を使用して、コロニーイムノブロットによって同定した。プラスミドｐＳＴＲ３−１は、ｐＵＣ１３にクローニングされたｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着因子Ａ遺伝子の一例である。
【００９１】
（実施例３．精製ＰｓａＡの調製）
抗原または免疫原としての使用のためのＰｓａＡを、タンパク質精製のための任意の公知の方法を使用して精製し得る。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを、慣習的に培養し得、そして細胞を回収した。次いで、精製された３７ｋＤａタンパク質を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞塊から、非イオン性洗剤を用いて抽出することによって単離し得、そして、硫酸アンモニウム画分および等電点電気泳動法によってさらに精製し得る。（Ｔｈａｒｐｅら、１９９６、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ（ＰｓａＡ）」Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２２７−２２９）。
【００９２】
別の実施例において、３７ｋＤａのタンパク質をコードする発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ株、ＴＢ１の細胞を、従来の技術を使用して、培養および回収し得る。適切な発現ベクターの例は、バクテリオファージλＰＬプロモーター（例えば、ｐＫＫ１７７３−３）、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（例えば、ｐＥＴ−３ａ）、またはバクテリオファージＴ７プロモーターを含むベクターである。次いで、３７ｋＤａのタンパク質（ＰｓａＡ）を、タンパク質精製のための従来の方法を使用して、細胞から抽出し得る。
【００９３】
（３７ｋＤａのタンパク質を用いる防御実験）
（実施例４）
ｘｉｄ変異（Ｘ連鎖免疫不全）を保持する２０匹のＣＢ  Ａ／ＣａＨＮ／Ｊマウスを、この防御実験において使用した。これらを、毒性の莢膜３型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＷＵ２を用いるチャレンジに対しての防御について試験した。マウスを、ケタミン／ロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）で麻酔し、そして免疫前の血清を獲得するために、眼窩下で採血した。３７ｋＤａのタンパク質（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ表面接着因子（ａｄｈｅｓｉｎ）Ａ）を、タンパク質濃度１ｍｌあたり５４μｇに完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に乳濁させた。１０匹のマウスを、部位当たり０．１ｍｌで、２つの腋窩部位、および２つの鼡径部位に皮下的に注射し、約２２μｇのタンパク質／マウスを送達した。１０匹のコントロールマウスを、タンパク質の代わりに、ＣＦＡおよび緩衝液で独立に処置した。１４日後、１０匹の試験マウスを、３７ｋＤａのタンパク質１００μｇを用いて腹腔内（ＩＰ）に注射した；コントロールを、緩衝液でＩＰ注射した。ＩＰ免疫の８日後、全てのマウスを、眼窩下で採血して、免疫後の血清を獲得し、そしてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＷＵ２の対数期培養物の６０ｃｆｕを用いて静脈内（ＩＶ）でチャレンジした。マウスを、２１日間観察し、そして死亡を記録した。血清を、免疫前に収集して、基準の曝露を確立し、そしてまた、３７ｋＤａタンパク質に対する循環抗体を防御と相関させるために、完全免疫プロトコール（チャレンジ前ではない）後に収集した。得られた結果は、以下のようであった：
チャレンジ後の日数  １：死亡なし
２：３匹のコントロールマウスが死亡
３：２匹のコントロールマウスが死亡
４：２匹のコントロールマウスが死亡、１匹のコントロー
ルマウスが病気
５：１匹のコントロールマウスが死亡
６〜２１：死亡したマウスなし
３７ｋＤａのタンパク質による免疫：１０／１０生存
タンパク質を有さないコントロール、２／１０生存（８／１０死亡）
異なる統計的有意度：（ｐ＝０．０００８）順位和検定。
【００９４】
（実施例５）
ｘｉｄ変異を有する２０匹のＣＢＡ／ＣａＨＮ／Ｊマウスを、以下のプロトコールに従って注射した：
（１）全てのマウスを、免疫前に採血して、基準の免疫を確立した。１０匹の試験マウスを、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した３７ｋＤａのタンパク質抗原（ＰｓａＡ）の合計２１μｇを、４つの部位で皮下的に免役した。１０匹のコントロールマウスを、抗原の代わりにＣＦＡおよび緩衝液で同様に免疫した。
【００９５】
（２）１４日後、マウスを１００μｇの３７ｋＤａのタンパク質抗原で（試験マウス）、または緩衝液で（コントロール）、腹腔内に（ＩＰ）ブースとした。このブースター免疫では、アジュバントは使用しなかった。
【００９６】
（３）８日後、全てのマウスを眼窩洞を介して採血し、そしてこれらを、収集し、２つの群（免疫およびコントロール）にプールした。同時に、血液を、個々のマウスから収集して、抗体応答についてアッセイした。
【００９７】
（４）１日後、２匹のさらなるマウスを、受動的に免疫を移入させる試みのために、０．１ｍｌのプールされた免疫血清を用いて眼内に注射した。３匹のさらなるマウスを、０．１ｍｌのプールされたコントロールマウス血清を用いて腹腔内（ＩＰ）に注射した。（免疫したマウスから獲得した血清が少量であったために、５匹のマウスだけをこの工程で注射した）。
【００９８】
（５）ＩＰ注射の１時間後、これら５匹のマウスを、中期対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）の１４０コロニー形成単位（ｃｆｕ）のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ３型株ＷＵ２を用いて、静脈内（ｉｖ）にチャレンジした。
【００９９】
（６）同時に、１８匹（８匹は試験、１０匹はコントロール）のマウスを、ＷＵ２の同じ培養物でｉｖチャレンジした。
【０１００】
（７）死亡を毎日計数した。
結果：                                  死亡数／チャレンジした総数
３７ｋＤａのタンパク質での免疫：              ０／８
コントロールマウス：                          １０／１０
受動防御：
免疫血清を受けたマウス：                      ０／２
コントロール血清を受けたマウス：              ３／３
３７ｋＤａのタンパク質で免疫したマウスは、株ＷＵ２を用いた胎仔チャレンジから防御された；この免疫は、免疫されたマウス由来の血清を用いて受動的に移入され得た。（元々、１０匹の試験マウスを使用した。しかし、これらのマウスのうち２匹は、ＷＵ２を用いて免疫される前に、他の原因で死亡した）。
【０１０１】
（実施例６）
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、ヒト抗体の捕捉因子として、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの精製された３７ｋＤａのタンパク質抗原を使用して、発色させた。ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａを有することが既知の２４月齢未満の子供由来の対になった血清を、試験した。疾患の確認を、血液培養または尿中の抗原によって決定した。３５％（９／２６）が、同齢の群の病気でない子供由来の血清よりも、高い抗体力価を有することが見出された（ｐ＝０．０６）。これは、天然の感染後に３７ｋＤａのタンパク質抗原に対して、いく人かの子供が応答したことを例示する。
【０１０２】
（実施例７）
（３７ｋＤタンパク質またはポリペプチド結合体の調製）
結合体は、Ｔ細胞依存応答を誘起するために、リンカーを介して、３７ｋＤタンパク質あるいは３７ｋＤタンパク質由来の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドに結合するキャリアタンパク質の使用によって調製され得る。キャリアタンパク質は、任意の免疫原タンパク質、例えば、これらに限定されないが、キーホールリンペットヘモシニアン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素、ジフテリア毒素または細菌外膜タンパク質であり得る。結合体として有用な細菌外膜タンパク質の例としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの外膜タンパク質が挙げられる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＡ群、Ｂ群またはＣ群から選択され得る。さらに、３７ｋＤタンパク質またはそのポリペプチドは、結合体に使用され得、ここで３７ｋＤタンパク質またはそのポリペプチドは、Ｂ細胞刺激物質であるポリサッカライド抗原のためのＴ細胞依存免疫原性キャリアである。これは、ポリサッカライド抗原が、Ｂ細胞刺激物質であり、そして防御免疫が、通常、Ｂ細胞刺激物質およびＴ細胞刺激物質の組み合わせによって産生されるという理論に基づく。タンパク質抗原によって誘導される免疫応答は、Ｔ細胞依存特性（すなわち、追加免疫およびキャリアプライミング）を示す。２歳未満の多くの子供は、Ｔ細胞依存抗原に応答しないので、Ｔ細胞依存刺激物質は、重要である。抗原の接着または結合は、米国特許第４，８０８，７００号に記載されるような、従来のプロセスによって達成され得る。これは、キャリア免疫原と免疫原との間での共有化学結合を形成し得るさらなる化学物質を含む。
【０１０３】
本発明の３７ｋＤタンパク質抗原は、種々の方法において、哺乳動物、特にヒトに投与され得る。例示的な方法としては、ミョウバン沈殿物のような、非毒性アジュバントと共に与えられる非経口的な（皮下の）投与あるいは胃の活性の減少または消失後に与えられる経口的な投与あるいは胃液による不活化に対して抗原を保護する薬学的形態（例えば、保護的カプセルもしくはマイクロスフィア）を含む。用量レジメンおよび投薬レジメンは、主に、抗原が、治療目的または予防目的、患者および患者の履歴に関して投与されるかどうかに依存する。１用量あたりの投与される抗原の総薬学的有効量は、典型的には、１患者あたり約２μｇ〜５０μｇの範囲である。非経口投与に関して、抗原は、一般に、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと会合して単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン,）において処方される。このようなビヒクルは、本質的に非毒性かつ非治療的である。このようなビヒクルの例としては、水、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液および５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。非水性ビヒクル、例えば、不揮発性の動物油およびエチルオレアートもまた使用され得る。リポソームは、ビヒクルとして使用され得る。ビヒクルは、少量の添加剤、例えば、等張性および化学的安定性を増大する物質（例えば、緩衝液および保護剤）を含み得る。
【０１０４】
（実施例８）
（細菌株）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのすべての単離物を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）から得て、そして血清型を決定した。クローニングおよび配列決定のために使用した肺炎球菌血清型６Ｂ株は、ＣＤＣ参考株（ＳＰ−８６）であった。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、プラスミド（ｐＵＣ１９およびその誘導体）のためのレシピエント宿主として使用した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を、５％のヒツジ血球細胞と共にＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ大豆アガープレートで増殖するか、またはここで示された、０．５％酵母抽出物を含むＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで増殖した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、Ｌｕｒｉａブロスにおいて増殖した。ここで必要な場合、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を補充した。
【０１０５】
（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、血清型６Ｂ由来のＰｓａＡ遺伝子のクローニングおよび配列決定）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ由来の染色体ライブラリーを、上記されるように調製した。（Ｓａｍｐｓｏｎら，１９９４．「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰｓａＡ，ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ３７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ａｄｈｅｓｉｎｓ，」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：３１９−３２４）ただし、ｐＵＣ１８を、ｐＵＣ１３のかわりにクローニングベクターとして使用したことは除く。組換え体を、モノクローナル抗体１Ｅ７を使用してコロニー免疫ブロットによってスクリーニングした（Ｒｕｓｓｅｌｌら，１９９０，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２１９１−２１９５）。この手順および陽性クローンからのプラスミド精製（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚら，１９８１，「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｓｍｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ，」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２９８９−２９９８）ならびに制限エンドヌクレアーゼ分析は、全て以前に記載される（Ｓａｍｐｓｏｎら，１９９０，「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｔｐＢ，ｔｈｅ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ５８−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ（ｋＤａ）ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  ｔｈｅ  ６０−ｋＤａ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ，」Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．５８：３１５４−３１５７；およびＳａｍｐｓｏｎら，１９９４）。ドデシル硫酸アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット分析を、前のように行なった（Ｓａｍｐｓｏｎら，１９９０）。全ての他のＤＮＡ操作を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（上述）に記載される方法に従って行なった。ＤＮＡ配列決定を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ配列決定キットおよび手順（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）を使用して実施した。配列データを、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ配列分析ソフトウェアプログラム（Ｆｅｎｎｏら，１９８９，「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｙｐｅ  １  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ  ＦＷ２１３，」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３５２７−３５３３）で分析した。
【０１０６】
（ポリメラーゼ連鎖反応制限フラグメント長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）分析のためのゲノムＤＮＡの調製）高分子量肺炎球菌ＤＮＡを、改変したＧｒａｖｅｓら，１９９３，「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，」６１７−６２１頁，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｈｉｎｇら（編），Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）の手順によって調製した。型特異的Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６時間培養物を、３７℃で攪拌せずにネジキャップフラスコ中の０．５％の酵母抽出物を含む５０ｍｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで増殖した。培養物を、室温で８０００×ｇで１５分間ペレット化し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）で洗浄した。この細胞ペレットを、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および０．４％のＳＤＳからなる２．５ｍｌの緩衝液に可溶化した。１５μｌのプロテアーゼＫ（２０μｇ／ｍｌ）を、添加し、そしてリアーゼを、３７℃で１時間インキュベートした。この混合物を、反転して混合した後、５００μｌの５ＭのＮａＣｌの添加により０．４８ＭのＮａＣｌに調整し、４００μｌの１０％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含む０．７％のＮａＣｌを添加した。この懸濁液を、以前のように混合し、６５℃で３０分間インキュベートし、そして等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで抽出した。この上相の水を、１５００×ｇでの遠心分離によって分離し、そしてクロロホルム−イソアミルアルコールで抽出した。ＤＮＡを、−７０℃で２．５容量のエタノールで上の水相から３０分間かけて沈殿させた。これを、ペレット化し、そしてデシケーター中で乾燥し、水中で再懸濁し、そして２６０ｎｍで吸光度を測定することによって定量した。
【０１０７】
（ＰＣＲ−ＲＥＬＰ）制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｎＩＩおよびＮｈｅＩを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し；ＲｓａＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、Ｅｃｏ５７ＩおよびＸｍｎＩを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）から購入した。増幅反応のためのプライマー配列を、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ遺伝子（Ｐ１，ＡＧＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号３）；Ｐ２．ＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴ（配列番号４））および隣接領域の配列のＮ末端配列（ヌクレオチド１８１〜２０１）およびＣ末端配列（ヌクレオチド１１０６〜１１２６）から選択した。このプライマーを、標準的手順を使用して合成した。
【０１０８】
（（ｉ）ＤＮＡ増幅）この反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＣＲ増幅キットを用いて実施した。反応容量は、１００μｌであり、そしてＭｇを含まない標準１×反応緩衝液、１μＭの各プライマー、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、テンプレートＤＮＡおよび２．５ＵＴのＴａｑポリメラーゼを含んだ。テンプレートＤＮＡの供給源は、抽出された精製染色体ＤＮＡまた細菌コロニーのいずれかであった。増幅のための条件は、以下の通りであった：変性９４℃で１分間、アニーリング５２℃で０．５分間および伸長７２℃で１．５分間の３０サイクル。増幅産物を、１％のアガロースゲルで分離し、そしてエチレンブロマイドで可視化した。直接コロニー増幅手順を採用した。これは、染色体ＤＮＡの抽出の必要性を取り除くことによってテンプレート調製を短縮する。この手順は、プレートからＰＣＲ混合物に直接的に単一の細菌コロニーを添加することおよび９５℃で１０分間加熱することからなった。残りのＰＣＲ工程は、抽出した染色体ＤＮＡについて概説され、そして上記されるように実施した。
【０１０９】
（（ｉｉ）酵素消化）増幅産物の消化を、２０μｌの容量において指定された酵素について製造者によって指向されるように実施した。消化生成物を、アガロース（２％のメタファーアガロース、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｅ．）ゲル電気泳動によって分析し、そしてエチレンブロマイドで染色後可視化した。
【０１１０】
（型６Ｂ  ＰｓａＡの分析）ゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩによって部分的に消化し、ＢａｍＨＩ−消化ｐＵＣ１８に連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換するために使用した。組換えコロニーを、アンピシリン耐性およびイソプロピル−β−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在化における白色コロニーの形成について選択した。約２，５００コロニーのコロニー免疫ブロットスクリーニング（抗ＰｓａＡ  Ｍａｂを使用する）によって、２つの陽性コロニーを得た。これらを、選択し、精製し、そして同じＭＡｂを使用するウエスタンブロット分析によって再スクリーニングした。これら両方は、ＰｓａＡに対するＭａｂと反応性のタンパク質を発現し、そして約３７ｋＤの予想された分子量でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて移動した。１つを、継続した研究で選択され、そしてｐＳＴＲ６と命名した。組換えプラスミド由来のＤＮＡの限定された制限酵素分析は、陽性クローンが、酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに対する部位を伴う３．５ｋｂである挿入物を含むことを示した。ＰｓａＡコード領域を局在化するために、この挿入物を、ＳｓｔＩ（ベクター内のマルチクローニング部位）およびＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。この得られたフラグメントを、ｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。これは、約１．３ｋｂのサイズの挿入物を含む組換え体を産生した。得られたサブクローンｐＳＴＲ６ｙを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＰｓａＡ  Ｍａｂを使用するウエスタンブロットによって分析した場合、全長ＰｓａＡ免疫反応性タンパク質を発現することが示された。１．３ｋｂの挿入物の両方の鎖における完全なヌクレオチド配列を、この配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してプラスミドサブクローンの環状配列決定によって決定した。配列情報は、利用可能になっていた。完全な連鎖球菌性挿入物のヌクレオチド配列を、配列番号１のような配列表に示した。単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＰｓａＡ遺伝子配列をコードする、ヌクレオチド１８９で、開始し、そしてヌクレオチド１，１１７で終わる。このＯＲＦは、９３０ヌクレオチド長であり、そして増幅され、そしてｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣＴＭ発現系（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）のようなベクター系にサブクローニングされた場合、抗ＰｓａＡ  ＭＡｂ抗体に反応性の全長ＰｓａＡを発現する。このＯＲＦは、３４，５９８の推定分子量および５．２３の等電点を有する３０９アミノ酸のペプチドをコードする。Ｋｙｔｅら，１９８２，（「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，」Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２．）のアルゴリズムを使用するペプチドの分析によって、ペプチドが、推定リーダー配列をコードする２０個のアミノ酸の主要な疎水性領域を含むことが示される。このリーダーは、シグナルペプチダーゼ開裂のためのコンセンサス配列（ＬＸＸＣ）を含む。このリーダーの除去は、４．９７の推定等電点を有する分子量３２，４６５のペプチドを生じる。リボソーム結合部位のためのコンセンサス配列（Ｓｈｉｎｅら，１９７４，「Ｔｈｅ  ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｔｒｉｐｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．ＵＳＡ  ７１：１３２４−１３４６）は、ＡＴＧ開始コドンの５ヌクレオチド上流に位置する。
【０１１１】
（連鎖球菌性ホモログと血清型６Ｂ配列の比較）血清型６Ｂ  ＰｓａＡヌクレオチド配列（Ｂｉｌｏｆｓｋｙら，１９８８，Ａ  ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子配列データベース，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１８６１−１８６４）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５３５０９）およびその隣接領域と、以前公開された株Ｒ３６Ａ  ＰｓａＡ配列（Ｓａｍｐｓｏｎら，１９９４，「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰｓａＡ，  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ３７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ａｄｈｅｓｉｎｓ」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：３１９−３２４）との比較によって、ヌクレオチド配列間の差異が示される。２つの配列間の計算された相同性は、７４％である。不一致の主要な領域は、ＯＲＦの上流および下流の領域ならびに推定シグナルペプチドをコードする最初の６０個のヌクレオチドである。２つのＰｓａＡコード配列を、比較する場合、配列相同性は、７８％に増大する。血清型６Ｂ配列をまた、最近ＧｅｎＢａｎｋに提出された、別のワクチン血清型、血清型２（登録番号Ｕ４０７８６）に関するＰｓａＡ  ＤＮＡ配列と比較した。これらの２つの配列のコンピューター分析は、これらが、類似することを示す。この２つのＰｓａＡ  ＤＮＡ配列間の計算上のＤＮＡ相同性パーセントは、９９％である。２つの配列間に８個の単一の塩基の差異がある。血清型２  ＰｓａＡと血清型６ＢのＰｓａＡの比較は、ほとんど完全な同一性を示す：計算された類似値は、９９．３％である。ヌクレオチドレベルにおける８個の塩基の差異は、保存的置換を生じる２つの変更を伴う６個のアミノ酸のペプチドレベルにおける差異に翻訳される。さらなる分析およびビリダンスＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来の他の５個のＧｅｎＢａｎｋ  ＰｓａＡホモログと血清型６Ｂ配列の比較によって、有意な配列類似性が明らかになった（Ｆｅｎｎｏら，１９８９，「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ  ＦＷ２１３．」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３５２７−３５３３；Ｓａｍｐｓｏｎら，１９９４．「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＰｓａＡ，  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ３７−ｋｉｌｏｄｏｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ａｄｈｅｓｉｎｓ，」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：３１９−３２４：Ｇａｎｅｓｈｋｕｍａｒら，１９９１．「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｓａｌｉｖａ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＳｓａＢ）  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ  １２  ａｎｄ  ｐｏ���ｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｏａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ．」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１０９３−１０９９，Ｋｏｌｅｎｂｒａｎｄｅｒら，１９９４．「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ  ＰＫ４８８  ｃｏａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｇｅｎｅ  ｓｃａＡ  ａｎｄ  ＡＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：４４６９−４４８０；およびＬｏｗｅら，１９９５．「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ：  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｓｏｍｅ  ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｒａｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ．」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：７０３−７０６）。
【０１１２】
配列同一性は、ＰｓａＡ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ３６Ａ）、ＳｓａＢ（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）、ＦｉｍＡ（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｓ）、ＳｃａＡ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＥｆａＡ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）について、それぞれ、８１％、８１％、７７％、８２％および５７％であった。さらに、全ての６個の配列は、生物体において大きな類似性相同性を示した。それぞれは、最初の１７〜２０アミノ酸内にプロリポタンパク質コンセンサス配列ＬＸＸＣ（シグナルペプチダーゼＩＩ開裂のため）を含む疎水性リーダーペプチドを含む。このＮ末端リーダー配列は、最も大きな可変性の領域を示すことが明らかである。この後、アミノ酸３６から１５０までの高い類似性の領域が続く。アミノ酸１５０位から１９０位までの領域は、可変領域であり、そして別の保存領域が続く（アミノ酸１９８位〜３０９位）。
【０１１３】
（２３−バレント（ｖａｌｅｎｔ）ワクチンにおける２３種の血清型由来の染色体ＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析）ＰＣＲ−ＲＦＬＰを、使用して、２３バレントワクチンにおける２３種の血清型を示す、２３のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ血清型間のＰｓａＡ遺伝子の保存の程度を試験した。株Ｒ３６Ａに対応するプライマーを用いて肺炎球菌型株を増幅する以前の試みは、失敗であったので、ＰＣＲプライマーを、血清型６Ｂ由来のＰｓａＡ遺伝子のヌクレオチド配列、特にＰｓａＡポリペプチドのＮ末端およびＣ末端をコードする遺伝子の領域に基づいて選択した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ由来のＰｓａＡ遺伝子に相補的なプライマーを使用して、２３のバレントワクチンにおいて示される全ての２３種の血清型およびサブタイプ由来のＰｓａＡ遺伝子を、染色体ＤＮＡから増幅した。血清型６Ｂ  ＰｓａＡ遺伝子の全長にわたる制限エンドヌクレアーゼ消化部位を有する、全ての１０種の酵素を選択した。１０種のうち９種の酵素は、分析した全ての２３種のＰｓａＡ遺伝子と同一のパターンを生じる。
【０１１４】
１種の例外、制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉは、遺伝子内に６個の部位を有し、そして７ｂｐ、３０ｂｐ、６８ｂｐ、１４６ｂｐ、１５１ｂｐ、１６６ｂｐおよび３６２ｂｐのサイズに消化される７つのフラグメントを産生する。これらのフラグメントを、２％のメタファーアガロースゲルにおいて分離した場合、５つのバンドパターンが、見られ得る（７ｂｐフラグメントおよび３０ｂｐフラグメントは、サイズが小さいためこれらのゲルにおいて見られない）。２３種の血清型のうち２１種に関して、この５つのフラグメント酵素パターンが、見られた；しかし、血清型２および３３Ｆの株に関して、１４６ｂｐフラグメントは、存在せず、そして２つの新しいフラグメントが、６８ｂｐのフラグメントに隣接することが明らかになり、すべてで７個のバンドを生じる。従って、フラグメントの数の増加は、１４６ｂｐフラグメント内の付加的なＴｓｐ５Ｏ９Ｉ部位の存在から生じる。
【０１１５】
この外部の部位の発生率を確認するために、２３種の血清株のそれぞれの３〜４種のさらなる株のＴｓｐ５０９Ｉパターン（血清型２および血清型２５のさらなる株は、利用できなかった）を分析した。分析した全ての株は、血清型についてＣＤＣに提供された米国由来の無作為な臨床的単離物であった。８０種の株の大多数は、血液単離物である；例外は、脳脊髄液由来の２種の株、胸水由来の２種の株ならびにそれぞれ眼球および鼻由来の１種の株であった。分析した株の、１０％は、改変されたＲＦＬＰパターンを生じる、付加的なＴｓｐ５０９Ｉ部位を有する。この改変は、型４、８、１１Ｆおよび３３Ｆのみに見られた。この改変したパターンの発生率を決定する試みにおいて、これらの４つの型の８種のさらなる株由来のＰｓａＡ遺伝子を、Ｔｓｐ５０９Ｉバリエーションついて分析した（これらの４つの型について全てで〜１１−１２を有する）。
【０１１６】
表１は、血清型４、８、１１Ａおよび３３Ｆの分析を要約した。改変したパターンは、散発的に、血清型４および８に存在するが、１１Ａの株のうち１１、および３３Ｆの全ての株において本質的に常に存在する。バリエーションを示す株が、国内の多様な地域に由来するので、この発生のパターンは、米国の地理的な位置または地域に相関し得る。型４、８、１１Ａおよび３３Ｆの全ての株は、１種の３３Ｆ株を除いて血液単離物であった。３３Ｆは、鼻の単離物であって；従って、この改変の発生率における単離の部位の関連性は評価され得ない。
【０１１７】
（表１．さらなるＴｓｐ５０９Ｉ制限部位について選択された血清型のスクリーニング）
【０１１８】
【表１】
2011057691.tif 000002
ａ全ての２３のワクチン型の各々２〜３の株の調査を含む最初のＴｓｐ５０９Ｉ分析
ｂさらなるＴｓｐ５０９Ｉ部位を示す型のさらなる株のＴｓｐ５０９Ｉ分析
ｃ括弧に示されるものは、さらなる制限部位を有する血清型の数と試験した血清型の数の比である。
【０１１９】
この分析は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ由来のＰｓａＡをコードする遺伝子のクローニングおよび配列決定ならびに、２３種の肺炎球菌ポリサッカライドワクチン血清型における引き続く遺伝子の分析を開示する。配列分析によって、血清型６Ｂ配列および以前に公開された株Ｒ３６Ａが、予想よりも類似していないことが明らかになった。ヌクレオチド配列およびその隣接領域は、起源の株Ｒ３６Ａ  ＰｓａＡに対して７３％のみに相同であったが、実際のＰｓａＡコード配列は、７８％の計算された相同性を有した。２つの配列間のタンパク質配列類似性は、８１％しかなかった。新しく提供された血清型２肺炎球菌ＰｓａＡ（ワクチン血清型）と血清型６Ｂ配列の比較によって、ＤＮＡ相同性は９９％および９８％タンパク質配列類似性と計算された。さらに、これらの値は、ワクチン血清型内の遺伝子についての配列保存が、高度である証拠である。これらの２つの配列の推定アミノ酸配列を、属内のＰｓａＡ相同性について他の公開された配列と比較した場合、類似性の大きな領域は、全ての５種のタンパク質に明白であった。群内の類似性値は、５７〜８２％の範囲であった。
【０１２０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチン候補の必要性は、本発明者らが、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６ＢからＰｓａＡ遺伝子を、クローニングし、そして配列決定することを促進した。２つの肺炎球菌ＰｓａＡ遺伝子（６ＢおよびＲ３６Ａ）の間の不均質性によって、本発明者らは、ワクチン血清型を試験し、株間の多様性の程度を決定した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６ＢからのＰｓａＡ遺伝子のＮ末端コード領域およびＣ末端コード領域に対応するプライマーは、２３個全てのワクチン血清型を増幅した。血清型６Ｂ遺伝子のうちに２１個の部位を表す１０個の異なる制限酵素を使用するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析は、株間でたった１つの多様性領域を示しただけであり、これは、少数の株についてさらなるＴｓｐ５０９Ｉ部位を生じた。本研究は、血清型６Ｂ遺伝子の配列は、ワクチン血清型の間で見出される配列を代表することを実証する。このことについての証拠としては、血清型２と血清型６Ｂとの間の９９％のＤＮＡ配列同一性、および本研究において試験された２１個の部位を網羅する均一かつ同一な制限パターンが挙げられる。より初期の株Ｒ３６Ａ  ＰｓａＡ配列は、本明細書で分析された血清型において表面上は存在しない改変体配列を表すことが明らかである。なぜなら、発明者らは、株Ｒ３６Ａ  ＰｓａＡに対してプライマーを使用して、この配列を増幅することが不可能だったからである。しかし、本研究のより重要な局面は、分析したワクチン血清型間で、限定された多様性が存在することである。疾患を引き起こし、従ってそれに対する予防的手段が必要とされるものは、血清型である。これらの血清型の間でのＰｓａＡの遺伝的多様性の欠損は、遺伝子が高度に保存されており、そしてワクチン開発のための優れた候補であることを示唆する。
【０１２１】
（実施例９．モノクローナル抗体）
血清型２２Ｆ由来の３７ｋＤａのタンパク質を使用して、モノクローナル抗体（１Ｂ６Ｅ１２Ｈ９、３Ｃ４Ｄ５Ｃ７、４Ｅ９Ｇ９Ｄ３、４Ｈ５Ｃ１０Ｆ３、６Ｆ６Ｆ９Ｃ８、および８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０）を作製した（米国特許出願番号０８／７１５，１３１、現在は米国特許５，８５４，４１６号（これらは参考として本明細書中に援用される）において開示される）。これらのＭＡｂを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染からの防御を付与するその能力について、分析した。表２は、試験した５つのモノクローナル抗体の能力を示し、特に１つが、その後のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅチャレンジからの効率的な防御を与えた（８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０）。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの保護は用量応答性であった。これはこのモノクローナル抗体が、防御の原因であったことを示す（表３）。
【０１２２】
（表２．乳仔マウスにおける、抗３７ｋＤａモノクローナル抗体によって付与される、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂに対する受動防御）
【０１２３】
【表２】
2011057691.tif 000003
ａチャレンジ用量（１．７×１０３ｃｆｕ）または１０×菌血症用量１００％（ＢＤ１００）。１群あたり５匹のマウスに、５０μｇの総抗体を与えた。すべてのＭＡｂは、ＩｇＧである。
【０１２４】
（表３．抗３７ｋＤａモノクローナル抗体８Ｇ１２Ｇ１１Ｂ１０の受動防御能の可能性に対する、第２用量の効果）
【０１２５】
【表３】
2011057691.tif 000004
ａ全ての乳仔マウスを、１０×ＢＤ１００（２×１０３ｃｆｕ）でチャレンジした。ＭＡｂを、チャレンジの２４時間前（前）およびチャレンジの２４時間後（後）に与えた。１０匹のマウス／群。
【０１２６】
（実施例１０．ファージディスプレイライブラリー）
ｐＩＩＩコーティングタンパク質（ＰａｒｍｌｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８８）のＮ末端部分で位置する１５アミノ酸残基の挿入物を含むファージディスプレイライブラリーを、ベクターとしてファージＦＵＳＥ  ５において構築した。このライブラリーを、３３ｂｐの合成ＢｇＩＩフラグメントをＦＵＳＥ  ５に連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋｑｌｌ／ｋａｎ＋細胞を、エレクトロポレーションによってトランスフェクトすることにより作製した。このファージ子孫は、ディスプレイライブラリーを含む。
【０１２７】
（実施例１１．バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）によるスクリーニング）
４サイクルのバイオパニングを、実施例１０のファージディスプレイライブラリーをＰｓａＡエピトープペプチドについてスクリーニングする目的で、ファージ使用される各ＭＡｂについて行った（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ，１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７：２２８〜２５７）。ペトリ皿の基質を、実施例１において調製されるように、ストレプトアビジンおよび１０μｇのビオチン化抗ＰｓａＡ  ＭＡｂでコーティングした。残りのビオチン結合部位を、１．５ｍｌのＤ−ビオチン（１０ｍＭ）でブロックした。次いで、このファージライブラリー（１０１１〜１０１２個の形質転換単位）を、固定化したＭＡｂと共にインキュベートした。結合したファージを、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートから、０．１Ｎ  ＨＣｌ、ｐＨ２．２で溶出した。この溶出されたファージを、力価測定および増幅し、次いで上記のように行ったさらに２回の選択に供した。使用されたビオチン化ＭＡｂの量は、第２回目および第３回目においてそれぞれ１ｎＭおよび１ｐＭであり、その結果、高親和性のペプチドのみが、最後のサイクルの終了時に結合された。
【０１２８】
（実施例１２．免疫原性ペプチドのアミノ酸配列）
実施例１１の手順を使用して得られた、ライブラリー由来の高親和性ペプチドを、増殖および配列決定した。それぞれのＭＡｂについて、選択プロセスから生じた１０個のファージ検体を、配列決定した。約１μｇの一本鎖ＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出によって精製し、エタノール沈殿させ、そして７μｌの水に再懸濁した。全てのｆｄ−ｔｅｔ誘導ベクターに共通の、野生型ｐＩＩＩにおける領域から誘導されたＦＵＳＥ  ５ベクター配列に相補的な２７マーのプライマーおよび３５Ｓ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  バージョン２（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用して、配列決定反応を行った。得られた配列を、表４において示す。これらを、ＣｌｕｓｔａＩＶおよびｔＦａｓｔａプログラムを使用して、ＰｓａＡ株２および６Ｂの既知の配列と比較し、それぞれのペプチドが最も近く整列される、ＰｓａＡに関するエピトープを同定した。これらのエピトープ位置をまた、表４において示す。さらなる残基がこのタンパク質に存在し、ここでこのペプチド（配列番号７および配列番号８）の残基１３の後にギャップが出現する場合、ＭＡｂ（８Ｇ１２、６Ｆ６および１Ｅ７）を使用して得られるペプチドは、ＰｓａＡに最も整列する。
【０１２９】
（表４．ＭＡｂを用いたバイオパニングによって得られるペプチド配列）
【０１３０】
【表４】
2011057691.tif 000005
（実施例１３．ＰｓａＡの免疫原性ペプチドでのマウスの免疫）
配列番号５、６、７、および８において示される配列を有するペプチドを、従来の方法によって（例えば、自動化ペプチド合成器を使用して）合成し得る。このペプチドを、逆相ＨＰＬＣによって精製し得、そして主要なピークを収集し得る。ペプチド配列を、自動化配列決定装置（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡによって製造される自動化配列決定装置）を使用して、自動化ペプチド配列決定によって確認し得る。各ペプチドを、水溶性カルボジイミド試薬によって媒介されるカップリングを使用して、キーホールリンペットヘモシアニンのようなアジュバントに結合し得る。生じた結合体を、リン酸緩衝化生理食塩水  ｐＨ７．２に、最終濃度が約１８０μｇ／ｍｌとなるように溶解し得、そしてエマルジョン中に、約１：１の比でフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と合わせ得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、この懸濁液を用いて腹腔内に最初に免疫化し得、そして一月後、このマウスを、アジュバントを有さない約１１０μｇ／ｍｌの結合体を用い、ブーストし得る。
【０１３１】
（実施例１４．ファージディスプレイによって同定されたコンセンサスペプチドでのマウスの免疫）
ファージディスプレイによって同定されたいくつかのペプチドの配列由来のコンセンサス配列（配列番号８）を有するペプチドを、ＰｓａＡに対する免疫学的な応答を惹起するその能力について、試験した。上記の実施例１２に記載されるファージディスプレイ実験においてモノクローナル抗体８Ｇ１２、６Ｆ６および１Ｅ７に結合するペプチドに由来するこのコンセンサスペプチド（Ｌ  Ｖ  Ｒ  Ｒ  Ｆ  Ｖ  Ｈ  Ｒ  Ｒ  Ｐ  Ｈ  Ｖ  Ｅ  Ｓ  Ｑ；配列番号７）を、そのアミノ末端にＣＹＧＧスペーサーおよびラウロイル基を有するように合成した（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）。このラウロイル基は、プロテオソームに対するペプチド基の疎水性複合体形成を増強する（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら、「Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ，ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｎｃｈｏｒｓ，ｉｓｃｏｍｓ，ａｎｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｇ．Ｍ．、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１４１〜１６０頁（１９９０）；Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ  ｖｉａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｆｅｅｔ  ｂｅｃｏｍｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８（１９８８）；およびＺｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｄ．ら、「Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｍａｎ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：８３６（１９７９））。一方、このシステイン基は、ペプチドの免疫原性を増強する（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら（１９９０））。Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９０））によって記載されるように、プロテオソームを、群Ｂ．ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、株９９Ｍ由来の外膜複合体小胞から調製した。合成的リポペプチドを、界面活性剤の存在下で、成分を合わせることによって、１：１（ｗ／ｗ）の比で、プロテオソームに対して複合体形成させた。この界面活性剤を、大規模な透析によって除いた（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．ら（１９８８））。
【０１３２】
３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝４）を、１０、２５、または５０μｇのペプチド（配列番号５）／プロテオソーム複合体で、０週目にプライムした。次いで、それぞれの群におけるマウスを、１０、２５、または５０μｇのペプチド（配列番号５）／プロテオソーム複合体で、２週目および３週目にブーストした。０週目に２０μｇのＰｓａＡタンパク質でプライムしたマウスは、本研究のための陽性コントロールであった。陰性コントロールは、０週目に１０、２５、または５０μｇのプロテオソームでプライムし、そして２週目および３週目に１０、２５、または５０μｇのプロテオソームでブーストしたマウスから構成された。血清を、４週間にわたって毎週収集し、そして抗ＰｓａＡ特異的抗体を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって試験した。
【０１３３】
抗ＰｓａＡ特異的ＥＬＩＳＡを、以下のように実行した：Ｎｕｎｃ  ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｂプレートを、５μｇ／ｍｌの精製されたネイティブなＰｓａＡタンパク質で、４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、そして１％のＢＳＡを含むＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液でブロッキングした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡにおいて１：１０で始めたマウス血清の段階希釈物を、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ中に４０００：１で希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、プレートに添加した。抗ＰｓａＡ抗体を、ｏ−フェニレンジアミン基質を用いて３０分間、暗所で検出した。吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｅ１３１１（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で、４９０ｎｍで読み取った。
【０１３４】
ＭＡｂ  ８Ｇ１２、１Ｅ７および６Ｆ６によって選択されたペプチドの全ての配列は、ＰｓａＡ分子の同じ領域に整列した。ＭＡｂ  ８Ｇ１２によって選択された１つのペプチドは、上に示されるように、１Ｅ７および６Ｆ６によって選択されるペプチド（配列番号８）と同じ配列を有した。これらのペプチドとＰｓａＡとの間の相同性を決定し、これは６アミノ酸に存在した。この領域を使用して、コンセンサスペプチド配列（配列番号８）を規定した。このペプチドを、Ｎ末端ラウロイル基およびＣＹＧＧモチーフを用いて合成し、プロテオソームに複合体形成させ、そして免疫原性を改良した。マウスを、１０、２５、または５０μｇの、プロテオソームに複合体形成しているコンセンサスペプチドで免疫した。ペプチド免疫マウス由来の血清は、抗ＰｓａＡ応答を示した。本研究の結果を、表５および６において示す。このペプチド免疫マウスは、ＩｇＧ応答を発達させ、力価は４週目に１５９から２５２の範囲に及んだ。この力価を、プロテオソームバックグラウンド値に関してデータを標準化した後で計算した。３つの用量の群のうち、５０μｇのペプチド用量群に対する免疫応答が、最も高かった。しかし、このペプチドに対する抗ＰｓａＡ応答は、ＰｓａＡタンパク質に対する免疫応答よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。
【０１３５】
（表５．ＰｓａＡに対するＩｇＭの力価）
【０１３６】
【表５】
2011057691.tif 000006
このデータを、２０μｇのＰｓａＡで免疫したマウス由来のコントロール血清の２５％の力価として示す。
【０１３７】
（表６．ＰｓａＡに対するＩｇＧの力価）
【０１３８】
【表６】
2011057691.tif 000007
表５におけるように、このデータを、２０μｇのＰｓａＡで免疫したマウス由来のコントロール血清の２５％の力価として示す。
【０１３９】
（実施例１５．ファージディスプレイによって同定されたペプチドの脂溶化した形態および脂溶化していない形態での、マウスの免疫（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｎ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２３、２０００からのデータ）
配列番号５（Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｒ  Ｖ  Ｐ  Ｗ  Ｔ  Ａ  Ｗ  Ａ  Ｆ  Ｈ  Ｇ  Ｙ）のアミノ酸配列を有し、そしてＭＡｂ  ４Ｅ９を使用したファージディスプレイによって選択されたペプチドを、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅチャレンジからマウスを防御するその能力について試験した。このペプチドの２つの形態を合成した：一方は、そのＮ末端にパルミトイル残基を有し（「配列番号５−脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）」）、そしてもう一方は、このような誘導体化を有さない（「配列番号５−未脂溶化（ｕｎｌｉｐｉｄａｔｅｄ）」）。これらのペプチドを、Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に記載されるように固相Ｆ−ｍｏｃ化学を使用し、ＡＣＴモデル３９６ＨＰＳペプチド合成器（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を使用して合成した。モノパルミチン酸を含む上記に記載されるペプチドの脂溶化バージョンを、パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、上記に記載される標準的なアミノ酸結合（Ｖｅｒｈａｕｌら（１９９５））に関してと同じ反応条件を使用して樹脂結合ペプチドの脱保護されたアミノ末端に結合することによって、合成した。配列を、Ｐｏｒｔｏｎモデル＃２０９０自動化ペプチドシーケンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する、自動化されたペプチド配列決定によって検証した。ペプチドを、リン酸緩衝化生理食塩水  ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中に、最初の用量について１．０ｍｇ／ｍｌ、そして続く用量について０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように懸濁した。
【０１４０】
ペプチド配列番号５−脂溶化および配列番号５−未脂溶化の、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅチャレンジに対して防御する能力を分析するために、１０週齢のＮＤ−４マウス（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）を、３用量レジメンを使用して免疫した。試験マウス（各ペプチドについてｎ＝１５）は、０日目に１００μｇのペプチドの初回用量を受け、続いて３週目および５週目で、５０μｇのペプチドのブースター用量を受けた。このペプチド配列番号５−脂溶化を、１００μｌ  ＰＢＳ  ０．０１Ｍ、ｐＨ７．２に懸濁し、一方、未脂溶化ペプチド（配列番号５−未脂溶化）を、アジュバント  アルヒドロゲル（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（２％；＃Ａ１０９０ＢＳ、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）と共に、ＰＢＳ中に６．３ｍｇ／ｍｌの濃度で混合し、このペプチドの免疫原性を増強させた。コントロールマウス（ｎ＝１２）を、ペプチドを用いないこと以外は同様に免疫化した。各マウスを、肩の間に皮下で免疫した。最終のブーストの１週間後、全てのマウスを、４．９×１０６ｃｆｕのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの株ＰＬＮ−Ｄ３９（Ｊａｍｅｓ  Ｐａｔｏｎ、Ｗｏｍｅｎ’ｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎｏｒｔｈ  Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ｓ．Ａ．Ａｕｓｔｒａｌｉａによって寄贈された）（これはＤ３９のニューモライシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）陰性誘導体である）でチャレンジした。この５日後に安楽死させ、そして鼻洗浄物（ｎａｓａｌ  ｗａｓｈ）の培養をした。ＰＢＳ鼻洗浄を、Ｗｕ，Ｈ．Ｙ．ら（「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ」、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２３：１２７（１９９７））の方法によって行った。各洗浄物を、１：４８６の最終希釈物なるように３倍希釈した。５０μｌの各希釈物を、血液寒天＋ゲンタマイシンプレート（５％の脱線維したヒツジ血液および０．５％のゲンタマイシンを補充したトリプチカーゼ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズ寒天）上で培養した。免疫したマウスおよびプラセボ（ＰＢＳ免疫化コントロール）におけるＮＰコロニー形成および保因（ｃａｒｒｉａｇｅ）からのデータを、ｔ−検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定のいずれかを使用して分析した。鼻咽頭の保因は、鼻あたりのコロニー形成単位の数である。鼻咽頭のコロニー形成は、２５μｌの鼻洗浄物において少なくとも１ｃｆｕを形成するか否かに依存して、マウスについて陽性または陰性のいずれかである。
【０１４１】
ペプチド配列番号５−脂溶化および配列番号５−未脂溶化の、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅチャレンジに対して防御する能力を分析するために、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、配列番号５−脂溶化および配列番号５−未脂溶化、およびＰｓａＡで、上記のように免疫化した。ペプチド配列番号５−脂溶化で免疫されたマウスは、プラセボコントロールと比較した場合、細菌の鼻保因において統計学的に有意な減少（ｐ＜０．０５）を示した（表７）。さらに、ペプチド配列番号５−未脂溶化で免疫したマウスは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２によるコロニー形成に耐性である機会が４０％高かった（表７）。これは、プラセボコントロールと比較した場合、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５、Ｆｉｓｈｅｒの直接確立検定、両側検定）。肺炎球菌の鼻コロニー形成の減少は、非脂溶化ペプチド配列番号５−未脂溶化で免疫したマウスにおいて見出された；しかし、この減少は、プラセボコントロールと比較した場合、統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．４８）（表７）。
【０１４２】
（表７．Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける防御研究の要約＊）
【０１４３】
【表７】
2011057691.tif 000008
＊このデータは、３回の実験の保因（ｃｆｕ／鼻）の相乗平均として示される。
コロニー形成を、１ｃｆｕ／２５μｌ鼻洗浄物として規定する。この有意性を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ順位和検定を使用して計算する（ｐ＜０．０５）。
＊＊Ｎ末端の付加的なシステイン残基でのモノパルミチン酸を用いた脂溶化。この脂溶化されたペプチドは、システイン（Ｃ）残基がこのペプチドのアミノ末端にあるように、示された配列表からのアミノ酸配列のアミノ末端に結合したアミノ酸配列ＣＳＳを含んでいた。
【０１４４】
（実施例１６  複数抗原性ＰｓａＡペプチドでのマウスの免疫化）
配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示された配列を有するペプチドの、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの攻撃からマウスを防御する能力を、脂溶化形態もしくは複数抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形態で別個に投与するか、またはＭＡＰと結合して投与した場合に、調べた。配列番号５、配列番号６および配列番号７で与えらる配列を有するペプチドを、実施例１５に記載されるような、類似の試薬、装置、手順を使用して合成した。２つのアーム、３つアーム、または４つアームのうちいずれかを含む複数抗原性ペプチド（ＭＡＰ）（図１Ａ〜１Ｃ）を、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｊ．Ｐ．ＴａｍおよびＥ．Ｔ．Ｋａｉｓｅｒ編，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３−１８（１９８９）の方法に従って合成した。この実施例に記載される全てのＭＡＰは、合成を容易にするためのさらなるノルロイシン（ＮＬｅ）残基をカルボキシ末端に含む（図ｌＡ〜図１Ｃ）。ミョウバンを、非脂溶化ペプチドのためにこの懸濁物に添加した。
【０１４５】
別個の群のＮＤ−４マウス（ペプチド群およびコントロール群当たりｎ＝８）を、第０週、第３週、第５週の３回、それぞれ１００μｇ、５０μｇ、または５０μｇの非脂溶化ペプチドまたは脂溶化ペプチドのいずれかで、皮下にて免疫化した。第３の用量の１週間後、マウスを、１０μｌの０．８５％生理食塩水中に懸濁した、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型２、血清型４、または血清型６Ｂの１０６ｃｆｕで鼻腔内（ＩＮ）にて攻撃した。この５日後に、安楽死させ、そして鼻腔内洗浄液を培養した。鼻咽頭（ＮＰ）のコロニー形成およびキャリッジを、実施例１５に記載されるように、分析した。
【０１４６】
非脂溶化または脂溶化した、単相性ペプチドのＭＡＰ（すなわち、均質）および二相性ペプチドＭＡＰ（すなわち、２つの異なるペプチド配列を含む不均質ＭＡＰ）を用いた免疫化は、鼻腔内キャリッジに対するインビボ保護（すなわち、ｃｆｕの減少）によって確証が得られるような、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの攻撃に対する免疫学的応答を生じる。最も強い免疫学的応答を、二相性ペプチドＭＡＰの免疫化で観察した。ＮＰコロニー形成の減少を、脂溶化ペプチドおよび非脂溶化ペプチド、ならびに様々なＭＡＰ構築物で、観察し、そしてこの減少は、これらの間で変化した。非脂溶化単相性ペプチド（すなわち、均質な）ＭＡＰで免疫化することによって、ＮＰコロニー形成が４０％と９３％との間に減少した（表８）。脂溶化単相性ペプチドで免疫化することによって、ＮＰコロニー形成が、４８％と９４％との間に減少した。キャリッジで最も大きい減少は、二相性ペプチドＭＡＰで観察された。非脂溶化二相性ペプチドＭＡＰの免疫化によって、ＮＰコロニー形成が、６８％と９１％との間に減少した（表９）。二相性ペプチドＭＡＰの免疫化で観察された、このＮＰコロニー形成の減少は、試験した全ての血清型および二相性ペプチドについて統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０１４７】
ＰｓａＡに対するモノクローナルを使用するファージディスプレイ分析によって同定される、実験で使用したＰｓａＡペプチドは、免疫原性であり、そしてこれは、試験したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３つの血清型のキャリッジを減少した。さらに、二相性ペプチドＭＡＰは、単相性ペプチドＭＡＰよりも、キャリッジの減少においてより効率的であった。
【０１４８】
（表８．鼻咽頭（ＮＰ）コロニー形成の減少（％）：コントロールに比較した非脂溶化４アーム均質ＭＡＰ（Ｐ値））
【０１４９】
【表８】
2011057691.tif 000009
＊非脂溶化ペプチド（ＮＬ）。
＊＊コントロールからの統計的有意差（Ｐ≦０．０５）を、ｔ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定で算出した。
＊＊＊配列番号５の均質４アームＭＡＰ。
＊＊＊＊配列番号６の均質４アームＭＡＰ。
＊＊＊＊＊配列番号７の均質４アームＭＡＰ。
【０１５０】
（表９．コントロールに対して比較した本発明の脂溶化ペプチドＭＡＰおよび二相性ペプチドＭＡＰのＮＰコロニー形成の減少（％）＊）
【０１５１】
【表９】
2011057691.tif 000010
＊（Ｐ値）。
＊＊Ｎ末端のさらなるシステイン残基において、モノパルミチン酸で脂溶化。この脂溶化ペプチドは、このシステイン（Ｃ）残基がこのペプチドのアミノ末端になるように、示された配列表由来のアミノ酸配列のアミノ末端に結合するアミノ酸配列ＣＳＳを含む。
＊＊＊図１Ａに示されるような、配列番号５および配列番号６の不均質４アームＭＡＰ。
＊＊＊＊図１Ｂに示されるような、配列番号５および配列番号９の不均質４アームＭＡＰ。
【０１５２】
（実施例１７．三相性ペプチドＭＡＰでのマウスの免疫化）
均質（単相性ペプチド）３アームＭＡＰおよび不均質（二相性ペプチドまたは三相性ペプチド）３アームＭＡＰをまた、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの攻撃に対する防御を提供するために使用し得る。例えば、単相性ペプチドＭＡＰおよび二相性ペプチドＭＡＰについて上で記載したように、配列番号５〜配列番号１０のうちの任意の組み合わせを含む三相性ペプチド３アームＭＡＰまたはそれらの免疫原性フラグメント（例えば、各々が配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する、３アームを含む均質三相性ペプチドＭＡＰ、または配列番号５の配列を有する第１のアーム、配列番号９の配列を有する第２のアーム、および配列番号１０の配列を有する第３のアームを含む不均質三相性ペプチドＭＡＰ；例えば、図１Ｃ参照のこと）を、実施例１５および実施例１６に記載されるような、類似の試薬、装置、および手順を用いて、合成し得、そして試験し得る。三相性ペプチドの組み合わせの他のこのような例は、以下であるが、これらに限定されない：配列番号５を含む第１のアーム、配列番号６を含む第２のアーム、および配列番号７、配列番号８、または配列番号９を含む第３のアーム；配列番号５を含む第１のアーム、配列番号１０を含む第２のアーム、および配列番号７、配列番号８、または配列番号９を含む第３のアーム；配列番号６を含む第１のアーム、配列番号７を含む第２のアーム、および配列番号９または配列番号１０を含む第３のアームなど。
【０１５３】
（実施例１８．ＰｓａＡ由来のペプチドを用いた皮下免疫化による、マウスにおける肺炎球菌キャリッジの阻害）
本発明者らは、免疫化したマウスにおける、肺炎球菌（Ｐｎｃ）鼻咽頭（ＮＰ）キャリッジを阻害するＭＡＰの能力について、脂溶化形態または脂溶化形態の単独、または互いに組み合わせ（２つの二相性ペプチドおよび三相性ペプチド）のいずれかである、３つのＭＡＰを試験した。ＮＰキャリッジの阻害は、ＭＡＰの組み合わせおよび二相性ペプチドを使用して、均質ＭＡＰ単独に比べ、劇的に増大された。これらの観察は、この抗ＰｓａＡ  ＭＡｂファージディスプレイ発現ペプチドは、免疫原性であり、そしてマウスにおけるＮＰキャリッジを有意に減少することを示した。これらのＰｓａＡペプチドは、Ｐｎｃキャリッジ、中耳炎、および／また侵襲性Ｐｎｃ疾患の減少および／または除去について、ヒトおよび／または他の動物にとって、おそらくはワクチンとして有用である。
【０１５４】
（Ａ）材料および方法）
（細菌性単離体および増殖条件）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの３つの単離体（血清型２、血清型４および血清型６Ｂを表す）を、ＮＰキャリッジ実験のために使用した。血清型２である単離体ＰＬＮ−Ｄ３９は、Ｊａｍｅｓ  Ｐａｔｏｎ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎｏｒｔｈ  Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ｓ．Ａ．，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の厚意によって提供され；そして、血清型４である単離体ＤＳ２３４１−９４、および６Ｂである単離体ＤＳ  １７５６−９４は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆａｃｋｌａｍ（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）の厚意によって提供された。これらの選択された単離体は、代表的な株であり、発明者らの実験室および他の場所において動物モデル実験において頻繁に使用されていた。多数の実験が同じロットの細胞から開始され得たことを確実にするために、各肺炎球菌単離体の標準化ストック培養物を、上述したように調製した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＥら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：１３３−４０，１９９９）。実験を開始する際に、ストック細胞を、血液寒天培地（ＢＡ，５％脱フィブリンヒツジ血液を補充したＴｒｙｐｔｉｃａｓｅダイズ寒天；ＢＢＬ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）上で培養し、１０％  Ｌｅｖｉｎｔｈａｌ基礎培地（ＢＨＩ−１０Ｌ；ＢＢＬ）を補充した脳心臓注入ブロス（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ）（ＢＨＩ；ＢＢＬ）に移し、そして以前に記載したように動物接種のために操作した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＥら、前出）。
【０１５５】
（動物）
成体Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ＮＤ−４；雌性；８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから得た。到着時に、マウスを１ケージ８当たり匹の群に配置した。全ての動物を、標準的な条件（２５℃、相対湿度約４０％）下で、食料および水の任意の摂取を伴って収容した。全てのマウスが、実験前の１週間で、これらの新環境に対して順応することを可能にした。
【０１５６】
（ペプチド合成）
前述のペプチド（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３で示されるベースペプチド）のアミノ酸配列を、テンプレートとして使用する場合、脂溶化形態および非脂溶化形態の両方であって、３つの、４−アームで均質な複数抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を、非脂溶化二相性（４−アーム不均質）ペプチド構築物および三相性ペプチド（３−アーム均質）構築物と共に合成し、そして、マウスＮＰキャリッジモデルで研究した。これらのＭＡＰを、以前に記載された（Ｂａｒａｎｙ，ＧおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＲＢ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，第１巻，Ｇｒｏｓｓ，ＥおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ，編，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８０，ｌ−２８４頁；Ｖｅｒｈｅｕｌ，ＡＦら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８２：２１９−２２６，１９８５；ならびにＲｅｅｄ，ＲＣら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：４８２−４８８，１９９７）のような、標準Ｆｍｏｃプロトコルおよび改変Ｆｍｏｃプロトコルを使用する、ＡＣＴ  ３９６マルチプルペプチド合成機（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）で合成した。この二相性ペプチド構築物および三相性ペプチド構築物を、Ｔａｍの方法（Ｔａｍ  ＪＰ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｔａｍ，ＪＰおよびＫａｉｓｅｒ，ＥＴ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９，３−１８頁）を使用して、ピペリジンおよびヒドラジンでの、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の差次的脱保護（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）によって合成した。この粗ペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析、その後の、アミノ酸分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動および／またはペプチド配列決定のうちの１つ以上の手順によって、合成の忠実度について分析した。必要である場合、このペプチドを、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸緩衝系を使用して、半分取ＨＰＬＣによって精製した。
【０１５７】
構造的に、このＭＡＰは、互いに対して相同であり、そしてＰ１、Ｐ２またはＰ３のいずれかからなる、４つの分岐を含む。脂溶化形態（Ｐ４３、Ｐ４４、およびＰ４５として示される）および非脂溶化形態（Ｐ４６、Ｐ４７、およびＰ４８として示される）は、前者が、各ベースペプチド単位のＮ末端において、３アミノ酸リンカー（システイン−セリン−セリン）によって結合された、一置換パルミトイル残基を有することを除いて構造上は同一である（図２Ａおよび図２Ｂ）。このＭＡＰを、パルミチン酸で脂溶化し、ペプチド免疫原性におけるアジュバントの効果およびＮＰキャリッジに対するその後の影響を研究した。Ｐ７９およびＰ８０と称される二相性ペプチドは、ベースペプチドの組み合わせ（Ｐ１およびＰ２、またはＰ１およびＰ３）である（図３）。Ｐ７９は、Ｐ１およびＰ２の各々の２単位を含み、一方Ｐ８０中では、Ｐ２が、Ｐ３で置換されている。三相性ペプチド（Ｐ８１として同定され、そして３つの分岐からなる）は、ベースペプチドの各々の１つの単位から構成されている（図４）。全ての場合において、このペプチドの分岐を、３−アームのロイシン−ノルロイシンコアまたは４−アームのロイシン−ノルロイシンコアのいずれかに基づいて合成した（図１〜図３）。
【０１５８】
（マウス免疫化および攻撃）
マウスＮＰキャリッジモデル（前述）を使用して、ＮＰ  Ｐｎｃキャリッジの阻害における、免疫原性ＰｓａＡペプチドの影響を決定した（Ｌｉｐｓｉｔｃｈ，Ｍら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：２８９５−９０１，２０００）。マウスを、３用量レジメンに基づいて免疫化した。試験マウス（各ペプチドまたはペプチド構築物についてｎ＝８）は、第０日目での１００μｇの開始用量に続き、初回の用量から３週間後および５週間後に、適切なペプチドの５０μｇのブースター用量を受けた。この脂溶化ＭＡＰを、１００μＬの無菌０．０１Ｍ，ｐＨ  ７．２，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁したが、全ての他のペプチドを、１００μＬの、ＰＢＳ中で６．３ｍｇ／ｍＬのアジュバントミョウバン（アルヒドロゲル（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）−２％，＃Ａ１０９０Ｂ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）と混合し、このペプチドの免疫原性を増大させた。コントロールマウス（ｎ＝８）を、同様に免疫化したが、ペプチドは用いなかった。各マウスを、肩の間の皮下で免疫化した。最終ブースト後１週間目に、全てのマウスを、鼻腔内から、１０μＬの０．９％塩化ナトリウム緩衝液（ＳＣＢ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）に懸濁された適切なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ単離体の１〜３×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）で攻撃した。攻撃接種物を、１０倍に連続希釈し、ＢＡプレート上にプレートし、攻撃用量を決定した。
【０１５９】
（鼻腔洗浄および培養）
攻撃後５日目に、各マウスを安楽死させ、そしてＷｕら（Ｗｕ，ＨＹら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２３：１２７−３７，１９９７）によって記載されたように１００μＬのＳＣＢでこの鼻咽頭腔を洗浄した。この洗浄物を、３倍に連続希釈し、最終的に１：４８６の希釈とした。５０μｌの各希釈物を、ＢＡ＋ゲンタマイシンプレート（０．５％ゲンタマイシンを補充したＢＡプレート）上で培養した。培養物を、５％ＣＯ２雰囲気下かつ高湿度下にて、３７℃で一晩インキュベートした。可能な場合、クローンを、各希釈物のについて計数し、記録した。特定マウスのためのキャリッジを、各希釈物の計数を非希釈レベルに調整し、そして平均化した後に、５０μＬの回収した鼻腔洗浄物中のｃｆｕ数として規定した。キャリッジアッセイの検出感度は、４０ｃｆｕ／（ｍｌ鼻腔洗浄物）である。
【０１６０】
（統計方法）
Ｐｎｃキャリッジの阻害を、免疫化した試験マウスとこれらの対となる免疫原がないコントロールマウスとの間のＮＰキャリッジにおける有意差を算出することによって決定した。群の間の有意差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定によって計算された。危険率をＰ＜０．０５に設定した。統計計算を、ＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウエア，バーション２．０（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を使用して実行した。分析は、Ｐｎｃ血清型および免疫原処方物の各々についての単一の試験から生成されたデータに基づく。
【０１６１】
（Ｂ）結果）
（ＮＰキャリッジ阻害におけるＭＡＰ効果）
予備的な実験において、ＭＡＰ  Ｐ４３に対する免疫学的応答を、マウスを上記のようなスケジュール（データは示さない）に従って免疫化した場合に、マウスにおいて観察した（力価は一貫して１：５１２００以上であった）。これらの結果に基づいて、Ｐｎｃキャリッジ阻害実験を、成体マウスにおいて記載のペプチドで開始した。マウスを非脂溶化ＭＡＰであるＰ４６、Ｐ４７、またはＰ４８で免疫化し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型２、血清型４、または血清型６Ｂで攻撃した場合、有意な（Ｐ＜０．０５）なキャリッジ阻害を、コントロールと比較し、かつＮＰ腔でコロニー形成するｃｆｕのメジアン数で規定するときにキャリッジについて６０％を超える減少が存在した場合に、観察した（表１０）。Ｐ４６は、有意（Ｐ＜０．０５）に、血清型２および血清型４のＮＰコロニー形成を減少したが、血清型６Ｂのコロニー形成（Ｐ＝０．１１）は有意に減少しない。Ｐ４７およびＰ４８は、有意（Ｐ＜０．０５）に、各々１つの血清型、すなわち、それぞれ、血清型４および血清型６Ｂのコロニー形成を減少した。マウスを脂溶化ＭＡＰ  Ｐ４３、Ｐ４４、またＰ４５で免疫化した場合に、同様の結果が観察された（表１１）。Ｐｎｃコロニー形成が６８％減少した場合、鼻咽頭キャリッジ阻害は、有意（Ｐ＜０．０５）であった。血清型４のキャリッジを、これらのＭＡＰおよび血清型６Ｂ、血清型Ｐ４３、およびＰ４４の各々によって有意に（Ｐ＜０．０５）阻害した。しかし、これらのＭＡＰは、血清型２に対して有意な（Ｐ＜０．０５）なキャリッジ阻害を実証しなかったが、Ｐ４５で免疫化したマウスにおいて血清型２のＮＰコロニー形成に７０％減少が存在した（Ｐ＝０．２０）が、これらの有意（Ｐ＜０．０５）に阻害された血清型について、ＮＰ腔にコロニー形成するＰｎｃ細菌の数の平均は、非脂溶化および脂溶化ＭＡＰについて、それぞれ、５８％および７１％に減少された。
【０１６２】
（ＮＰキャリッジ阻害におけるＭＡＰの組み合わせまたはポリペプチドの効果）
このＭＡＰによるＮＰキャリッジ阻害についての有望な結果から、ＭＡＰの組み合わせおよびポリペプチド構築物を使用して、さらなる研究を進めた。マウスがＭＡＰの組み合わせ（Ｐ４３＋Ｐ４４またはＰ４３＋Ｐ４４＋Ｐ４５）または二相性ペプチド（Ｐ７９またはＰ８０）で免疫化される全ての場合にいおいて、ＮＰキャリッジの有意（Ｐ＜０．０５）な阻害を観察した（表１１）。ＮＰコロニー形成のレベルは、１つ（５５％）を除いて、全ての場合について有意（Ｐ＜０．０５）に少なくとも６７％減少した。しかし、マウスにおいてＮＰキャリッジを阻害する三相性ペプチドＰ８１の能力は、二相性ペプチドの能力ほど効果的ではなく、血清型２および血清型４において、それぞれ５３％および８９％の有意な（Ｐ＜０．０５）阻害を実証した（表１１）。血清型６Ｂに対する鼻咽頭キャリッジ阻害は、３９％（Ｐ＝０．１４）のみであった。二相性ペプチド阻害および三相性ペプチド阻害が有意（Ｐ＜０．０５）であった、これらの例について、平均値は、ＮＰ腔にコロニー形成するＰｎｃ細菌の数の平均は、それぞれ８０％および６０％減少した。
【０１６３】
（表１０．マウスモデルにおける、非脂溶化ＰｓａＡ  ＭＡＰによるＰｎｃ  ＮＰキャリッジの阻害）
【０１６４】
【表１０】
2011057691.tif 000011
ａデータは、鼻咽頭腔由来の１００μｌの洗浄物中で回収されたコロニー形成単位（ｃｆｕ）／マウス（ｎ＝８）のメジアン数を表す。マウスを、皮下にて１０６ｃｆｕで攻撃した。
ｂリン酸緩衝生理食塩水またはミョウバンのいずれかを注射されたコントロールマウスに対する有意差（Ｐ＜０．０５）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を、群の間の有意差の算出のために使用。
（表１１．マウスモデルにおける、脂溶化ＰｓａＡ  ＭＡＰによるＰｎｃ  ＮＰキャリッジの阻害）
【０１６５】
【表１１】
2011057691.tif 000012
ａデータは、鼻咽頭腔由来の１００μｌの洗浄物中で回収されたコロニー形成単位（ｃｆｕ）／マウス（ｎ＝８）のメジアン数を表す。マウスを、皮下にて１０６ｃｆｕで攻撃した。
ｂリン酸緩衝生理食塩水またはミョウバンのいずれかを注射されたコントロールマウスに対する有意差（Ｐ＜０．０５）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を、群の間の有意差の算出のために使用した。
（表１２．マウスモデルにおける、ＰｓａＡ  ＭＡＰの組み合わせ、二相性ペプチドまたは三相性ペプチドよる、Ｐｎｃ  ＮＰ  キャリッジの阻害）
【０１６６】
【表１２】
2011057691.tif 000013
ａデータは、鼻咽頭腔由来の１００μｌの洗浄物中で回収されたコロニー形成単位（ｃｆｕ）／マウス（ｎ＝８）のメジアン数を表す。マウスを、皮下にて１０６ｃｆｕで攻撃した。
ｂリン酸緩衝生理食塩水またはミョウバンのいずれかを注射されたコントロールマウスに対する有意差（Ｐ＜０．０５）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を、群の間の有意差の算出のために使用した。
［配列表］
【０１６７】
【表１３】
2011057691.tif 000014
2011057691.tif 000015
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【図１】
2011057691.tif 000019
【図２Ａ】
2011057691.tif 000020
【図２Ｂ】
2011057691.tif 000021
【図３】
2011057691.tif 000022
【図４】
2011057691.tif 000023