(57)【要約】【課題】安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができ、かつ中性領域でも活性を示すホスホリパーゼＣおよびこれを用いてリン脂質を分解する方法を提供する。【解決手段】モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリを粉砕して濾過した濾液、あるいは遠心分離した際の上澄み液を、アセトンなどの有機溶媒と混合したのち、沈殿物を必要に応じて、凍結乾燥等することにより、粗酵素として抽出する。リン脂質を分解する際に酵素として用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されることを特徴とするホスホリパーゼＣ。
【請求項２】
リン脂質に、請求項１記載のホスホリパーゼＣを加えて、リン酸ジエステル結合を加水分解することを特徴とするリン脂質の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なホスホリパーゼＣおよびそれを用いたりん脂質の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＣは、リン脂質のリン酸ジエステル結合を加水分解する酵素である。これまで、各種ホスホリパーゼＣが知られており、例えば、細菌由来のホスホリパーゼＣでは、シュードモーナス・シュルキリエンシス（Ｐｓｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｓｃｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉｓ）、ブルコールデリア・シュードマレイ（Ｂｕｌｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、バチラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クロストリディウム・ぺルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）が報告されている（例えば、非特許文献１〜４、特許文献１参照）。また、放線菌由来のホスホリパーゼＣでは、ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈａｃｈｉｊｙｏｅｎｓｉｓ）が報告されている（例えば、特許文献２参照）。更に、酵母由来のホスホリパーゼＣでは、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が報告されている（例えば、非特許文献５，６参照）。加えて、カビ由来のホスホリパーゼＣでは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）が報告されている（例えば、非特許文献７、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５０−１０７１８３号公報
【特許文献２】特開昭４９−５５８９３号公報
【特許文献３】特開２０００−１６６５４３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】コルブスリサテら（ＫｏｒｂｓｒｉｓａｔｅＳ． ｅｔ. ａｌ．）「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー」（Ｊｏｕｎａｌｏｆ ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１９９９年、３７巻、ｐ．３７４２−３７４５
【非特許文献２】タンら（ＴａｎＣ． ｅｔ. ａｌ．）「プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピューリフィケイション」（ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１９９７年、１０巻、ｐ．３６５−３７２
【非特許文献３】ダウガーティーら（ＤａｕｇｈｅｒｔｙＳ． ｅｔ. ａｌ．）「インフェクション・アンド・イミュニティー」（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１９９３年、６１巻、ｐ．５０７８−５０８９
【非特許文献４】ティットバールら（ＴｉｔｂａｌｌＲ． ｅｔ. ａｌ．）「インフェクション・アンド・イミュニティー」（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１９８９年、５７巻、ｐ．３６７−３７６
【非特許文献５】アンダルツら（ＡｎｄａｌｕｚＥ． ｅｔ. ａｌ．）「イースト」（Ｙｅａｓｔ）２００１年、１８巻、ｐ．７１１−７２１
【非特許文献６】パイネら（ＰａｙｎｅＷ． ｅｔ. ａｌ．）「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）１９９３年、１３巻、ｐ．４３５１−４３６４
【非特許文献７】マツオカら（ＭａｔｓｕｏｋａＳ． ｅｔ. ａｌ．）「バイオテクノロジー・アンド・アプライドバイオケミストリー」（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８７年、９巻、ｐ．４０１−４０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらのホスホリパーゼＣを生産するに際して、各種の問題が内在しており、特に微生物由来のホスホリパーゼＣは、一部のものについて病原性が指摘されており、すべてのものについて安全であるということはできず、特に、食品分野に利用するには問題があった。
【０００６】
また、これらのホスホリパーゼＣは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールのみに有効であり、また、酸性領域でのみ活性を示すという問題があった。更に、動物由来のホスホリパーゼＣは、宗教的に受け入れられない国や地域があり、汎用性の観点からも問題があった。
【０００７】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができ、中性領域でも活性を示すホスホリパーゼＣおよびこれを用いてリン脂質を分解する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のホスホリパーゼＣは、モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されるものである。
【０００９】
本発明のリン脂質の分解方法は、リン脂質に、モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されるホスホリパーゼＣを加えて、リン酸ジエステル結合を加水分解するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のホスホリパーゼＣによれば、モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されたものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができる。また、中性領域においても活性を有するので、本発明のリン脂質の分解方法によれば、種々のリン脂質を効率よく分解することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の一実施の形態に係るホスホリパーゼＣは、モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されるものである。モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されるものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用できるようになっている。
【００１３】
なお、モモは、桃（学名  Ａｍｙｇｄａｌｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ）であり、バラ科モモ属の落葉小高木である。春には五弁または多重弁の花を咲かせ、夏には水分が多く甘い球形の果実を実らせる中国原産の植物である。モモは食用あるいは観賞用として世界各地で栽培されている。本実施の形態に係るホスホリパーゼＣは、モモの果実を原料とする。モモの品種としては、例えば、日本の市場に出回っているものでは、白桃系の桃、白鳳系の桃、果肉の黄色い黄桃、あかつき、ゆうぞら、川中島、白桃、まどか、名月などがあり、これらのうち１種または２種以上を原料とすることができる。
【００１４】
レタスは、キク科アキノノゲシ属の一年草または二年草であり、野菜として利用され、和名をチシャと呼ぶ植物である。レタスの品種としては、例えば、ヘッドレタス（Ｌ.  ｓ.  ｖａｒ.  ｃａｐｉａｔａ)−タマチシャ、リーフレタス（Ｌ.  ｓ.  ｖａｒ.  ｃｒｉｓｐａ)−葉チシャ、チリメンヂシャ、立ちレタス（Ｌ.  ｓ.  ｖａｒ.  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ)−立ちヂシャ、カッティングレタス（Ｌ.  ｓ.  ｖａｒ.  ｃｒｉｓｐａ)−カキヂシャ、ステムレタス（Ｌ.  ｓ.  ｖａｒ.  ａｎｇｕｓｔａｎａ)−茎チシャがあり、これらのうち１種または２種以上を原料とすることができる。
【００１５】
トマトは、ナス科ナス属の多年生であり、原産地はアンデス地方とされる緑黄色野菜の一種である。トマトの品種としては、例えば、桃色系トマト、ファースト系トマト、ミニトマト、高糖度系トマト、ミディトマト、調理用トマトがあり、これらのうち１種または２種以上を原料とすることができる。
【００１６】
キャベツは、アブラナ科アブラナ属の多年草であり、野菜として広く利用されている。キャベツの品種としては、例えば、日本国内で一般に消費されている玉に加え、ムラサキキャベツ、サボイキャベツ、ハボタンがあり、これらのうち１種または２種以上を原料とすることができる。
【００１７】
ナスは、ナス科ナス属の植物の果実である。ナスの品種としては山科なす、賀茂なす、田屋なす、十市なす、水なす、下田なす、民田なす、ていざなす、やきなすなどがあり、これらのうち１種または２種以上を原料とすることができる。
【００１８】
キュウリは、ウリ科キュウリ属のつる性一年草の果実である。キュウリの品種としては、例えば、白イボ系、黒イボ系、四葉（スーヨー）胡瓜、四川胡瓜、馬込半白胡瓜、高井戸節成胡瓜、加賀太胡瓜、聖護院胡瓜、毛馬胡瓜、大和三尺、ピクルス用キュウリがあり、これらのうち１種または２種以上を原料とすることができる。
【００１９】
このホスホリパーゼＣは、例えば、モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスあるいはキュウリを粉砕して濾過した濾液、あるいは遠心分離した際の上澄み液を、アセトンなどの有機溶媒と混合したのち、沈殿物を必要に応じて、凍結乾燥等することにより、粗酵素液あるいは粗酵素粉末として抽出することができる。更に、例えば、この粗酵素を塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を、ホスホリパーゼＣの理化学的性質を考慮した条件下で行うことにより、濃縮して採取することができる。なお、ホスホリパーゼＣの抽出は、このような方法に限定されるものではなく、適宜専門業者が行う他の方法により行うようにしてもよい。
【００２０】
モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されるホスホリパーゼＣは、中性領域においても加水分解活性を有しており、リン脂質を効率的に加水分解することができる。例えば、ホスファチジルコリンを原料として、１，２−ジグリセリドとホスホコリンとを効率的に製造することができる。なお、このホスホリパーゼＣを用いてリン脂質の加水分解反応を行う際に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加するようにすれば、反応性を高めることができるので好ましい。また、例えば、ホスファチジルコリンを原料として、１，２−ジグリセリドとホスホコリンとを製造したのち、水洗あるいはカラム精製などにより、ホスファチジルコリンを除去することにより、リン脂質を除去することができる。
【００２１】
このように本実施の形態のホスホリパーゼＣによれば、モモ、レタス、トマト、キャベツ、ナスまたはキュウリから抽出されたものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができる。また、中性領域においても活性を有するので、種々のリン脂質を効率よく分解することができる。よって、例えば、ホスファチジルコリンを原料として、１，２−ジグリセリドとホスホコリンとを効率的に製造することができる。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
レタス（茨城県産）４００ｇに純水６００ｍｌを加え、氷冷下にてワーリングブレンダー（ハイパワーホモジナイザー，広沢鉄工所社製）でホモジナイズ（１００００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、５回）した。これをガーゼ濾過したのち、濾液を遠心分離機（ＣＸ−２５０、Ｔｏｍｙ社製）で遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎ）して、上澄み液を回収した。続いて、回収した上澄み液に対して２倍量の冷アセトンを撹拌しながら加え、氷冷下で１時間静置したのち、生じた沈殿を遠心分離（１００００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）して回収し、真空凍結乾燥機（ＶＤ−８００Ｆ、Ｔａｉｔｅｃ社製）で凍結乾燥した。凍結乾燥物を氷冷させた乳鉢で微粉末にし、得られた粉末をレタスホスホリパーゼＣとして、−２０℃で保存した。得られたレタスホスホリパーゼＣについて加水分解活性を測定したところ、８１．７Ｕ／ｇであった。
【００２３】
また、レタスに代えてトマト（桃太郎：熊本県産）、モモ（福島県産）、キャベツ（愛知県産）、ナス（会津丸：福島県産）、又はキュウリを用いたことを除き、他はレタスと同様にしてトマトホスホリパーゼＣ、モモホスホリパーゼＣ、キャベツホスホリパーゼＣ、ナスホスホリパーゼＣ、又はキュウリホスホリパーゼＣをそれぞれ得た。得られた各ホスホリパーゼＣについて加水分解活性を測定したところ、トマトホスホリパーゼＣが４９．４Ｕ／ｇ、モモホスホリパーゼＣが２１３Ｕ／ｇ、キャベツホスホリパーゼＣが２８．１Ｕ／ｇ、ナスホスホリパーゼＣが３２．６Ｕ／ｇ、キュウリホスホリパーゼＣが２０３Ｕ／ｇであった。
【００２４】
なお、加水分解活性は、リン脂質（代表的には、ホスファチジルコリン）を基質として、酵素反応により遊離するリン酸を定量することによって測定した。具体的には、まず、リン脂質として１％（ｗ／ｖ）のホスファチジルコリン５μＬと、０．２ＭのＥＤＴＡ３μＬと、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）２８２μＬとを混合し、３７℃で５分間加熱した後、酵素液を１０μＬ加えて撹拌し、３７℃で１０分間反応させた。その後、反応液を１００℃で１０分間加熱して、反応を停止させた。反応終了後、この反応液１０μＬをアルカリホスファターゼ溶液（０．２ｕｎｉｔｓのアルカリホスファターゼと、１ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２と、５０ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）との混合溶液）１９０μＬに添加し、３７℃にて２０分間脱リン酸化反応を行った。その後、遊離したリン酸を定量することにより、ホスホリパーゼＣの加水分解活性を求めた。これにより求めたホスホリパーゼＣの１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのホスホリル塩基を遊離する酵素量である。
【００２５】
（比較例１）
レタスに代えてホウレンソウ（北海道産）又はネギ（埼玉県産）を用い、実施例１と同様にして、ホウレンソウホスホリパーゼＣ又はネギホスホリパーゼＣを調製した。得られたホウレンソウホスホリパーゼＣおよびネギホスホリパーゼＣについても、実施例１と同様にして加水分解活性を測定したところ、どちらも加水分解活性は微弱であった。
【００２６】
（実施例１と比較例１との比較）
実施例１によれば高い加水分解活性が得られたのに対して、比較例１では微弱であった。すなわち、レタス、トマト、モモ、キャベツ、ナス、又はキュウリから抽出されたホスホリパーゼＣによれば、高い加水分解活性を得ることができ、リン脂質を高い効率で分解することができることがわかった。
【００２７】
（実施例２）
実施例１において調製したレタスホスホリパーゼＣ、キャベツホスホリパーゼＣおよびキュウリホスホリパーゼＣについて、リン脂質として１０％（ｗ／ｖ）のホスファチジン酸、又は１０％（ｗ／ｖ）のホスファチジルエタノールアミンを用い、実施例１と同様にして加水分解反応を行い、加水分解活性を測定した。なお、リン脂質としてホスファチジン酸を用いた場合には、酵素反応させた後、アルカリホスファターゼ溶液で処理せずに、純水１９０μＬに加えて遊離したリン酸を定量した。また、実施例１において調製したキュウリホスホリパーゼＣについて、リン脂質としてスフィンゴミエリンを用い、実施例１と同様にして加水分解反応を行い、加水分解活性を測定した。
【００２８】
その結果、リン脂質としてホスファチジン酸を用いた場合の加水分解活性は、レタスホスホリパーゼＣが９５．９Ｕ／ｇ、キャベツホスホリパーゼＣが５６．５Ｕ／ｇ、キュウリホスホリパーゼＣが１４４Ｕ／ｇであった。また、リン脂質としてホスファチジルエタノールアミンを用いた場合の加水分解活性は、レタスホスホリパーゼＣが１１０Ｕ／ｇ、キャベツホスホリパーゼＣが７０．６Ｕ／ｇ、キュウリホスホリパーゼＣが１３１Ｕ／ｇであった。更に、リン脂質としてスフィンゴミエリンを用いた場合におけるキュウリホスホリパーゼＣの加水分解活性は、２７５Ｕ／ｇであった。すなわち、様々なリン脂質について、高い加水分解活性をえら得ることが分かった。
【００２９】
以上、実施の形態および実施例を挙げて本発明を説明したが、本発明は、上記実施の形態および実施例に限定されるものではなく、種々変形可能である。例えば、上記実施の形態および上記実施例では、ホスホリパーゼＣの抽出方法、精製方法およびホスホリパーゼＣを用いたリン脂質の加水分解方法について具体的に説明したが、他の方法により行うようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
リン脂質の加水分解に用いることができる。