(57)【要約】【課題】  高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を簡便かつより正確に評価する装置および高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を簡便かつより正確に評価する方法を提供する。【解決手段】  高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する装置であって、高分子化合物またはその複合体を投入する第１領域部と、この第１領域部に隣接されており当該第１領域部から透過される高分子化合物またはその複合体を収容する第２領域部と、第１領域部と第２領域部との境界上に配置された透過性基材とを有しており、透過性基材は、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに、第１領域部側の片面に密着結合した単層細胞を形成可能であって高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている。【選択図】  図１
2011115097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する装置であって、
高分子化合物またはその複合体を投入する第１領域部と、
この第１領域部に隣接されており当該第１領域部から透過される高分子化合物またはその複合体を収容する第２領域部と、
前記第１領域部と前記第２領域部との境界上に配置された透過性基材とを有しており、
前記透過性基材は、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに、前記第１領域部側の片面に密着結合した単層細胞を形成可能であって高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている、前記装置。
【請求項２】
ゼラチンを用いて電界紡糸法により作製した繊維の直径Ｄが５００ｎｍ≦Ｄ≦１０００ｎｍであり、前記繊維間の距離Ｉが５μｍ≦Ｉ≦２０μｍである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
高分子化合物またはその複合体が脂質または脂質膜構造体である、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する方法であって、
ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる工程と、
前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させる工程と、
前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記単層細胞と前記透過性基材とを透過した高分子化合物またはその複合体から細胞透過性を評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項５】
高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する方法であって、
ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材の片面に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体を取得する工程と、
前記透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる工程と、
前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記単層細胞および前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体を取得する工程と、
取得した前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体と、取得した前記単層細胞および前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体とを比較して細胞透過性を評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項６】
ゼラチンを用いて電界紡糸法により作製した繊維の直径Ｄが５００ｎｍ≦Ｄ≦１０００ｎｍであり、前記繊維間の距離Ｉが５μｍ≦Ｉ≦２０μｍである、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
高分子化合物またはその複合体が脂質または脂質膜構造体である、請求項４から請求項６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価装置およびその細胞透過性評価方法、特に、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに第１領域部側の片面に密着結合した単層細胞を形成可能であって高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材を有する細胞透過性評価装置およびこの透過性基材を用いた細胞透過性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、薬物、あるいは遺伝子などの物質を、生物個体の標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性などの問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖などの機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。
【０００３】
一方、リポソームベクターや物質を内包したリポソームベクターなどの高分子化合物またはその複合体を血中に投与する場合、血中から標的部位への到達が大きな課題となる。血管内皮細胞は多くの組織において細胞間に密着結合を形成しており、血管内皮細胞間の間隙は約０．４ｎｍから約４ｎｍと極めて狭いため、血中に投与された高分子化合物またはその複合体が、この間隙を通過して標的部位へ到達することは困難である。そこで、細胞の有するトランスサイトーシスなどの機能を利用して、高分子化合物またはその複合体を細胞内透過させ、標的部位へ到達させる手法が研究開発されている。
【０００４】
このような研究開発においては、物質の細胞透過性、特に、高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する技術が重要である。従来の高分子化合物の細胞透過性を評価する方法として、従来用いられている細胞透過性評価装置であるＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（ミリポア社）、セルカルチャーインサートやマルチウェルインサート（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、あるいはトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）などを用いる方法が行われている。これら従来用いられている細胞透過性評価装置はいずれも同様の構造を有しており、図２に示すように、従来の細胞透過性評価装置５は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）などのポリエステルやポリカーボネートなどから形成されたメンブレン８を基底部に備えるインサート９、インサート９によって上下仕切られた上層領域６と下層領域７、および下層領域７を囲むウェルプレート１０からなり、メンブレン８は直径０．４μｍ、１．０μｍ、３．０μｍあるいは８．０μｍの微小な貫通孔を有している。従来の細胞透過性評価装置５を用いて高分子化合物などの細胞透過性を評価する場合は、上層領域６側においてメンブレン８を基材として細胞を単層培養した後、単層培養した細胞に試料を接触させる。試料が細胞透過性を有する場合、試料が細胞およびメンブレン８を透過して下層領域７へと移行するため、下層領域７において試料を検出することにより、試料の細胞透過性を評価することができる。
【０００５】
さらに、上記の構成に加え、下層領域７に移行した物質を検出するセンサーを備えた装置（特許文献１）や、上層領域６から下層領域７に移行した物質を吸着する吸着剤を備えた装置（特許文献２）が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００６−５０５２７８号公報
【特許文献２】特開２００９−５６０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の細胞透過性評価装置５が備えるメンブレン８において、メンブレン８の有する微小な貫通孔の直径（孔径）が１．０μｍ以下の場合、リポソームなどの高分子化合物またはその複合体はメンブレン８をほとんど透過することができない。また、メンブレン８の孔径が３．０μｍ以上の場合、培養した細胞がメンブレン８の上層領域６側に単層を形成することができず、さらに、メンブレン８の孔内やメンブレン８の下層領域７側にまで及んでしまうため、従来の細胞透過性評価装置５を用いて高分子化合物またはその複合体の細胞透過性の評価を正確に行うことは困難である。
【０００８】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を簡便かつより正確に評価する装置、および高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を簡便かつより正確に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成された透過性基材が高分子化合物またはその複合体を透過させること、その透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成することができることを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する装置であって、高分子化合物またはその複合体を投入する第１領域部と、この第１領域部に隣接されており当該第１領域部から透過される高分子化合物またはその複合体を収容する第２領域部と、前記第１領域部と前記第２領域部との境界上に配置された透過性基材とを有しており、前記透過性基材は、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに、前記第１領域部側の片面に密着結合した単層細胞を形成可能であって高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている、前記装置。
【００１１】
（２）ゼラチンを用いて電界紡糸法により作製した繊維の直径Ｄが５００ｎｍ≦Ｄ≦１０００ｎｍであり、前記繊維間の距離Ｉが５μｍ≦Ｉ≦２０μｍである、（１）に記載の装置。
【００１２】
（３）高分子化合物またはその複合体が脂質または脂質膜構造体である、（１）または（２）に記載の装置。
【００１３】
（４）高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する方法であって、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる工程と、前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させる工程と、前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記単層細胞と前記透過性基材とを透過した高分子化合物またはその複合体から細胞透過性を評価する工程とを有する、前記方法。
【００１４】
（５）高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する方法であって、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材の片面に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体を取得する工程と、前記透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる工程と、前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記単層細胞および前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体を取得する工程と、取得した前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体と、取得した前記単層細胞および前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体とを比較して細胞透過性を評価する工程とを有する、前記方法。
【００１５】
（６）ゼラチンを用いて電界紡糸法により作製した繊維の直径Ｄが５００ｎｍ≦Ｄ≦１０００ｎｍであり、前記繊維間の距離Ｉが５μｍ≦Ｉ≦２０μｍである、（４）または（５）に記載の方法。
【００１６】
（７）高分子化合物またはその複合体が脂質または脂質膜構造体である、（４）から（６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来の細胞透過性評価装置では評価することができなかった高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施形態における高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価装置１の基本構成を示す概念図である。
【図２】高分子化合物の細胞透過性を評価する際に従来用いられている、従来の細胞透過性評価装置５の態様を示す概念図である。
【図３】ゼラチンナノファイバーシートを電子顕微鏡で観察した図（写真）である。
【図４】本実施形態に係る細胞透過性評価装置１の透過性基材４および従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレン８における無細胞リポソーム透過率を示す図である。
【図５】本実施形態に係る細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞層の断面図（写真）である。
【図６】本実施形態に係る細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞のＺＯ−１タンパク質および核を検出した図（写真）である。
【図７】本実施形態に係る細胞透過性評価装置１においてＴＥＲ測定を行う方法の一態様を示す模式図である。
【図８】本実施形態に係る細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞、従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８において培養したＭＢＥＣ４細胞および従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８において培養したＭＦＬＮ４細胞のＴＥＲ測定結果を示す図である。
【図９】メンブレンの孔径がそれぞれ０．４μｍ、１．０μｍ、３．０μｍおよび８．０μｍの、従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８における無細胞リポソーム透過率を示す図である。図中、縦軸は無細胞リポソームの透過率（％）を示し、横軸は移行時間（時）を示す。
【図１０】従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８（孔径０．４μｍ）において培養したＭＢＥＣ４細胞のＺＯ−１タンパク質を、メンブレン８上部からメンブレン８下部に至るまで、観察深度を２．０μｍずつ変化させて観察した図（写真）である。
【図１１】従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８（孔径１．０μｍ）において培養したＭＢＥＣ４細胞のＺＯ−１タンパク質を、メンブレン８上部からメンブレン８下部に至るまで、観察深度を２．０μｍずつ変化させて観察した図（写真）である。
【図１２】従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８（孔径８．０μｍ）において培養したＭＢＥＣ４細胞のＺＯ−１タンパク質を、メンブレン８上部からメンブレン８下部に至るまで、観察深度を２．０μｍずつ変化させて観察した図（写真）である。
【図１３】従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製のメンブレン８（孔径８．０μｍ）において培養したＭＢＥＣ４細胞のＺＯ−１タンパク質および核を、メンブレン８上部からメンブレン８下部に至るまで観察深度を１．０μｍずつ変化させて観察した図（写真）である。
【図１４】ゼラチンコーティングしたＰＥＴ製のメンブレン８およびコラーゲンコーティングしたＰＥＴ製のメンブレン８（いずれもメンブレンの孔径は３．０μｍ）において培養したＭＢＥＣ４細胞のＺＯ−１タンパク質を、メンブレン８の上部、メンブレン８の内部、メンブレン８の下部において観察した図（写真）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明に係る高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価装置およびその細胞透過性評価方法について詳細に説明する。
【００２０】
まず、本発明に係る高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価装置の実施形態について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態における細胞透過性評価装置１の基本構成を説明する概念図である。図１に示すように、細胞透過性評価装置１は、主として、高分子化合物またはその複合体を投入する第１領域部２と、第１領域部２に隣接されており第１領域部２から透過される高分子化合物またはその複合体を収容する第２領域部３と、第１領域部２と第２領域部３との境界上に配置された透過性基材４とから構成されている。すなわち、第１領域部２と第２領域部３とは互いに隣接している。
【００２１】
第１領域部２は、高分子化合物またはその複合体を投入する領域であり、投入された高分子化合物またはその複合体を一定時間、保持する構成を有していればよい。そのような構成としては、例えば、液体を保持することができる容器などの態様を挙げることができる。容器を構成する素材としては特に限定されず、耐水性、耐食性、耐薬品性などに優れた素材が好ましいが、そのような素材としては、例えば、ガラス、プラスチック、ステンレスなどを挙げることができる。
【００２２】
本発明における高分子化合物としては、例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖類、プラスチック、シリコン、合成ゴムなどを挙げることができるが、脂質であることが好ましい。また、高分子化合物の複合体としては、例えば、脂質膜構造体、低分子化合物や高分子化合物を内包した脂質膜構造体、２分子のタンパク質が疎水性ドメインで結合した二量体タンパク質などを挙げることができる。脂質膜構造体としては、例えば、リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができ、リポソームとしては、例えば、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）などの一枚膜リポソーム、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、あるいはこれらに機能性分子を導入したもの、さらにはこれらに薬物、タンパク質、遺伝子などを内包させたものなどを挙げることができる。
【００２３】
第１領域部２に高分子化合物またはその複合体を投入する方法としては、当業者が適宜選択可能な方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、高分子化合物またはその複合体をＨＥＰＥＳ緩衝液などの緩衝液に溶解または懸濁させ、ピペットなどを用いてこの懸濁液を注入する方法などを挙げることができる。
【００２４】
第２領域部３は、第１領域部２に投入されて、後述する形成された単層細胞および透過性基材４、あるいは透過性基材４を透過した高分子化合物またはその複合体を収容する領域であり、透過した高分子化合物またはその複合体を保持する構成を有していればよい。そのような構成としては、上述の第１領域部２と同様の態様を挙げることができる。
【００２５】
透過性基材４は、ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されている。電界紡糸法は、極細の繊維（ナノファイバー）を作製する方法のひとつであり、原料である高分子溶液を充填する注射シリンジを有するシリンジ針と繊維を回収する電極とを対面に配置し、注射シリンジに高分子溶液を充填した後、シリンジ針と電極との間に高い電圧を印加しながらシリンジポンプを用いて充填された高分子溶液をシリンジ針から押し出すことにより、シリンジ針から電界に沿って螺旋状に飛び出した繊維電極に集積する方法である。
【００２６】
本発明において、ゼラチンを用いた電界紡糸法による繊維の作製は、当業者が適宜選択可能な器具や手法を組み合わせることにより行うことができ、注射シリンジ、シリンジポンプ、シリンジ針、高電圧発生器などを組み合わせて電界紡糸装置を作製し、これを用いて行ってもよく、市販の電界紡糸装置を用いて行ってもよい。また、原料のゼラチンの由来、ゼラチン溶液の調製に用いる溶媒の種類、ゼラチン溶液の濃度、シリンジ針の内径、ゼラチン溶液を押し出す速度、繊維を回収する電極の種類や形状、シリンジ針先端と繊維を回収する電極との距離、印加する電圧の大きさなどは、電界紡糸法による繊維の作製に用いる器具や手法、繊維の必要量、評価する高分子化合物またはその複合体の種類などに応じて適宜設定することができる。
【００２７】
ゼラチンを用いて電界紡糸法により作製した繊維の直径および繊維間の距離は、適宜常法に従い測定することができ、例えば、電子顕微鏡を用いて測定することができる。本発明において、ゼラチンを用いて電界紡糸法により作製した繊維の直径Ｄの値や繊維間の距離Ｉの値は特に限定されないが、５００ｎｍ≦Ｄ≦１０００ｎｍ、あるいは５μｍ≦Ｉ≦２０μｍであることが好ましい。また、透過性基材の厚さＴの値もまた、特に限定されないが、１５０μｍ≦Ｔ≦２５０μｍであることが好ましい。
【００２８】
透過性基材４は第１領域部２と第２領域部３との境界上に配置されるが、その態様は、第１領域部２と第２領域部３とを仕切るような態様でもよく、第１領域部２と第２領域部３との境界上の一部となるような態様でもよい。透過性基材４が第１領域部２と第２領域部３との境界上の一部にとなるような態様としては、例えば、ガラス、プラスチック、ステンレスなど、高分子化合物またはその複合体を透過させない素材で第１領域部２と第２領域部３とを仕切り、その一部を透過性基材４に置き換えるような態様を挙げることができる。
【００２９】
透過性基材４は、高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されているが、本発明において、「高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成」されているとは、高分子化合物またはその複合体の一部または全部が透過するように構成されていることをいう。
【００３０】
透過性基材４は、さらに、第１領域部２側の片面に密着結合した単層細胞を形成可能に構成されている。ここで、「単層細胞」とは、細胞同士が重なり合わずに並ぶことにより１つの層を形成している細胞群のことをいう。また、「密着結合」とは、隣り合って並んだ細胞間の隙間に、オクルディン、クローディンなどの密着結合形成タンパク質が高密度に並ぶことで細胞間の隙間を覆い、物質の通過を防ぐことができる、細胞間の結合様式である。
【００３１】
単層細胞を形成したか否かを確認する方法としては、例えば、培養した細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により染色した後、蛍光顕微鏡を用いて観察深度を変化させて画像を取得し、これらの画像をもとに構築した細胞層の断面図において、細胞層が一層を形成しているか否かを確認する方法の他、培養した細胞の細胞膜タンパク質であるＺＯ−１タンパク質を免疫蛍光染色した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察深度を変化させて観察し、透過性基材やメンブレンなどの培養基材の内部または下部（裏側）にあたる観察深度において蛍光が観察されるか否かを確認する方法を挙げることができる。
【００３２】
また、密着結合を形成したか否かを確認する方法としては、例えば、密着結合マーカータンパク質であるＺＯ−１タンパク質を免疫蛍光染色した後、蛍光顕微鏡を用いて確認する方法を挙げることができる他、培養した細胞について膜間電気抵抗（ＴＥＲ）測定を行うことにより確認する方法を挙げることができる。
【００３３】
ＴＥＲ測定とは、細胞層を挟んで配置した電極間の電気抵抗を測定することにより、当該細胞層における密着結合形成状態を確認する方法である。この測定方法は、細胞間に密着結合が形成されている場合、細胞膜の有する非導電性により電気抵抗が高くなることに基づいている。本発明においてＴＥＲ測定を行う場合、図７に示すように、上層側の領域（図１においては第１領域部２が、図２においては上層領域６がそれぞれ該当する）と下層側の領域（図１においては第２領域部３が、図２においては下層領域７がそれぞれ該当する）とにそれぞれ電極を配置し、電気抵抗を測定すればよい。
【００３４】
本発明において、透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる方法は、適宜、常法に従い行うことができる。そのような方法としては、例えば、透過性基材の片面に細胞懸濁液を接触させた状態で、適当な培養条件のもとでインキュベートする方法を挙げることができる。単層細胞を形成させるための細胞の培養条件は、用いる細胞の種類、培養液の種類、培養初期の細胞濃度、透過性基材の面積などに応じて適宜設定することができる。また、用いる細胞の種類は、密着結合が可能な細胞であれば特に限定されず、例えば、血管内皮細胞や皮膚上皮細胞などの上皮細胞を挙げることができる。
【００３５】
透過性基材４の第１領域部２側に密着結合した単層細胞が形成されている場合、第１領域部２に投入された高分子化合物またはその複合体は、透過性基材４の片面に形成された単層細胞を透過した後、透過性基材４を透過して第２領域部３に収容される。
【００３６】
なお、透過性基材４における高分子化合物またはその複合体の透過率を求める場合、例えば、第１領域部２に高分子化合物またはその複合体を投入し、一定時間置いた後、第２領域部３に存在する高分子化合物またはその複合体の量を測定し、投入した量に対する測定した量の割合を百分率で算出することにより求めることができる。
【００３７】
次に、本発明に係る高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価方法は、高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する方法であって、
（ｉ）ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる工程（単層細胞形成工程）
（ｉｉ）前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させる工程（試料接触工程）
（ｉｉｉ）前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記単層細胞と前記透過性基材とを透過した高分子化合物またはその複合体から細胞透過性を評価する工程（細胞透過性評価工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する。
【００３８】
（ｉｉ）試料接触工程において、透過性基材において培養した単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させる方法は、適宜、常法に従い行うことができる。そのような方法としては、例えば、細胞の培養液をＫｒｅｂｓ緩衝液に交換した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解または懸濁させた高分子化合物またはその複合体を、ピペットなどを用いて添加する方法などを挙げることができる。
【００３９】
（ｉｉｉ）細胞透過性評価工程において細胞透過性を評価する方法としては、例えば、（ｉｉ）試料接触工程において単層細胞に接触させた高分子化合物またはその複合体の量と、その後、それら単層細胞および透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体の量とを比較する方法を挙げることができる。
【００４０】
次に、本発明に係る高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価方法の異なる態様の一つは、高分子化合物またはその複合体の細胞透過性を評価する方法であって、
（ｉｖ）ゼラチンを用いた電界紡糸法により作製された繊維で構成されているとともに高分子化合物またはその複合体を透過可能に構成されている透過性基材の片面に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体を取得する工程（第１透過試料取得工程）
（ｖ）前記透過性基材の片面に密着結合した単層細胞を形成させる工程（単層細胞形成工程）
（ｖｉ）前記単層細胞に高分子化合物またはその複合体を接触させて前記単層細胞および前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体を取得する工程（第２透過試料取得工程）
（ｖｉｉ）取得した前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体と、取得した前記単層細胞および前記透過性基材を透過した高分子化合物またはその複合体とを比較して細胞透過性を評価する工程（細胞透過性評価工程）
以上（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）の工程を有する。
【００４１】
（ｖｉｉ）細胞透過性評価工程において細胞透過性を評価する方法としては、例えば、（ｉｖ）第１透過試料取得工程において取得した高分子化合物またはその複合体の量を測定し、続いて、（ｖｉ）第２透過試料取得工程において取得した高分子化合物またはその複合体の量を測定した後、これら測定した量を比較する方法を挙げることができる。この場合、（ｉｖ）第１透過試料取得工程において取得した高分子化合物またはその複合体の量に対する（ｖｉ）第２透過試料取得工程において取得した高分子化合物またはその複合体の量の比が大であるほど、試料である高分子化合物またはその複合体の細胞透過性は大であると評価することができる。
【００４２】
高分子化合物またはその複合体の量の測定は、適宜、当業者によって選択可能な方法に従って行うことができる。そのような方法としては、例えば、あらかじめ高分子化合物またはその複合体を放射性同位体（ＲＩ）、蛍光色素、あるいは検出可能な抗体により認識されるペプチドなどにより標識し、それぞれ、液体シンチレーションカウンター、実体顕微鏡、蛍光顕微鏡、免疫染色法などを用いて標識を検出して測定することができる。
【００４３】
以下、本発明に係る高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価装置、および高分子化合物またはその複合体の細胞透過性評価方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞実験材料の作製と調製
（１）透過性基材の作製
ゼラチン（新田ゼラチン社；牛骨由来；分子量１０００００；等電点５）をヘキサフルオロイソプロパノール（和光純薬工業社）に７％（ｗ／ｗ）となるよう溶解することによりゼラチン溶液を調製し、本発明者が作製した電界紡糸装置の５ｍＬの注射シリンジに充填した。注射シリンジには内径０．５１ｍｍのシリンジ針を接続し、繊維を回収する電極としてアルミホイルで覆った５ｃｍ×５ｃｍの正方形の金属板を設置した。電極であるシリンジ針先端と金属板とを２２ｃｍ離して配置し、これらの電極間に１４ｋＶの電圧を印加しながら注射シリンジに充填したゼラチン溶液を９ｍＬ／時間の速度で押し出し、金属板のアルミホイル上にゼラチン繊維の集積物を得た。得られたゼラチン繊維集積物を、１６０℃、２４時間、真空乾燥器（真空乾燥装置ＤＮ−３０Ｓ；佐藤真空株式会社）を用いて熱処理を行い、ゼラチンを熱脱水架橋させてゼラチンナノファイバーシートを得た。
【００４５】
熱処理後、電子顕微鏡を用いてゼラチンナノファイバーシートを観察した結果を図３に示す。図３に示すように、ゼラチンナノファイバーシートは、ゼラチン繊維がランダムに絡み合ってシートを形成していることが確認された。
【００４６】
また、ゼラチンナノファイバーシートの繊維の直径、繊維間の距離および厚さを、電子顕微鏡を用いて測定したところ、繊維の直径Ｄは５００ｎｍ≦Ｄ≦１０００ｎｍ、繊維間の距離Ｉは５μｍ≦Ｉ≦２０μｍ、ゼラチンナノファイバーシートの厚さＴは１５０μｍ≦Ｔ≦２５０μｍであったことから、ゼラチンナノファイバーシートは透過性を有することが確認された。
【００４７】
（２）細胞透過性評価装置の作製
従来の細胞透過性評価装置５｛Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）製、メンブレン孔径；３．０μｍ、２４ウェル｝のインサートに設置されたＰＥＴ製メンブレンを、カッターナイフを用いて切除した。続いて、本実施例（１）で作製したゼラチンナノファイバーシートを、ＰＥＴ製メンブレンを切除した部位にプラスチック用アロンアルファ（東亞合成社）を用いて接着することにより、ＰＥＴ製メンブレンに代えてゼラチンナノファイバーシートから構成された透過性基材４を有するインサートを作製した。このインサートを２４ウェルプレートに設置することにより、ＰＥＴ製メンブレンに代えてゼラチンナノファイバーシートから構成された透過性基材４を有する細胞透過性評価装置１を作製した（図１）。
【００４８】
（３）Ｋｒｅｂｓ緩衝液の調製
滅菌水を溶媒として、以下の組成のＫｒｅｂｓ緩衝液（ｐＨ７．３）を調製した。
【００４９】
Ｋｒｅｂｓ緩衝液の組成
ＫＣｌ（和光純薬工業社）                            ４．８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業社）                        １．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＳＯ４（和光純薬工業社）                         １．２ｍｍｏｌ／Ｌ
２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）（和光純薬工業社）
１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ２（和光純薬工業社）                         １．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ナカライテスク社）                    １２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３（和光純薬工業社）                     ２３．８ｍｍｏｌ／Ｌ
グルコース（和光純薬工業社）                        ５．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５０】
（４）ＲＩ標識リポソームの調製
卵黄フォスファチジルコリン｛Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，  Ｅｇｇ（Ｐｏｗｄｅｒ）；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社｝とコレステロール｛Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｐｏｗｄｅｒ）；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社｝とを卵黄フォスファチジルコリン：コレステロール＝７：３となるように混合して混合脂質粉末を調製した。続いて、調製した混合脂質粉末を、１ｎｍｏｌ／μＬとなるようにエタノールに溶解し、これをガラス製試験管に１３７．５μＬ入れ、放射性同位体（ＲＩ）である３Ｈ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＣＨＥ）２５０万ｄｐｍ〜５００万ｄｐｍと、クロロホルム１１２．５μＬとを添加して、短時間ボルテックス処理した後、常法に従い窒素ガス気流を用いてエタノール溶媒を除去した。続いて、２５０ｍＬのエタノールを添加して脂質を溶解し、常法に従い窒素ガス気流を用いてエタノール溶媒の除去を再度行うことにより、ＲＩで標識した脂質膜を調製した。ＨＥＰＥＳ（和光純薬工業社）を用いて常法に従い調製した１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をこの脂質膜に２５０μＬ添加し、室温で１５分間置いて水和させた後、ソニケーターを用いて３０秒間ソニケーションを行うことにより、ＲＩ標識リポソームを調製した。
【００５１】
（５）ＲＩ標識リポソームのサイズの確認
ＲＩを添加せずに、本実施例（４）に記載の方法によりＲＩ非標識リポソームを調製し、動的光散乱測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）によりサイズを測定したところ、リポソームの直径は約１００ｎｍであった。このことから、本実施例（４）で調製したＲＩ標識リポソームのサイズは、直径約１００ｎｍであることが明らかになった。
【００５２】
＜実施例２＞細胞透過性評価装置１の透過性基材４における無細胞リポソーム透過率の確認
実施例１（２）で作製した細胞透過性評価装置１およびメンブレン孔径が異なる３種類の従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、２４ウェル、メンブレン孔径；０．４μｍ、３．０μｍ、８．０μｍ）の上層側の領域に、実施例１（３）で調製したＫｒｅｂｓ緩衝液を１００μＬ／ウェル入れ、実施例１（４）で調製したＲＩ標識リポソームを１００μＬ（約１００万〜２００万ｄｐｍ）／ウェル添加した。２時間後に下層側の領域からＫｒｅｂｓ緩衝液を回収し、液体シンチレーションカウンターＴＲＩ−ＣＡＲＢ １６００ＴＲ（ＰＡＣＫＡＲＤ社）を用いて、回収したＫｒｅｂｓ緩衝液に含まれるＲＩ量を測定した。上層側の領域に添加したリポソームのＲＩ量に対する、測定したＲＩ量の割合を百分率で算出することにより、細胞透過性評価装置１の透過性基材４あるいは従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおける、細胞が培養されていない場合のリポソーム透過率（無細胞リポソーム透過率）とした。その結果を図４に示す。
【００５３】
図４に示すように、無細胞リポソーム透過率は、細胞透過性評価装置１では約１７．５％であったのに対し、メンブレン孔径が０．４μｍの従来の細胞透過性評価装置５では約０．１７％、メンブレン孔径３．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５では約１２％、メンブレン孔径８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５では約１９％であった。
【００５４】
以上の結果から、培養細胞が存在しない細胞透過性評価装置１の透過性基材４は、培養細胞が存在しない従来の細胞透過性評価装置５におけるメンブレン孔径８．０μｍのＰＥＴ製メンブレンと同程度に高い無細胞リポソーム透過率を有しており、約１７．５％のリポソームが透過性基材４を透過することが確認された。
【００５５】
＜実施例３＞細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養した細胞の状態確認
（１）細胞透過性評価装置１の透過性基材４および従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおける細胞の培養
国立大学法人東京大学分子細胞生物学研究所の鶴尾隆氏および内藤幹彦氏より供与されたマウス脳毛細血管内皮細胞由来のＭＢＥＣ４細胞、および、血管内皮細胞の前駆細胞であって密着結合を形成しないマウス胎児肺由来血管内皮細胞｛Ｍｏｕｓｅ Ｆｅｔａｌ Ｌｕｎｇ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ−４（ＭＦＬＮ４）細胞；Ｓｅｖｅｎ ｈｉｌｌｓ ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ社｝をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ (ＤＭＥＭ培地) に、それぞれ３０００００ｃｅｌｌ／ｍＬとなるよう懸濁した。ＭＢＥＣ４細胞の懸濁液を、細胞透過性評価装置１および従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、メンブレン孔径；０．４μｍ、２４ウェル）の上層側の領域に、それぞれ４００μＬ／ウェルとなるように入れた。また、ＭＦＬＮ４細胞の懸濁液は、従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、メンブレン孔径；０．４μｍ、２４ウェル）の上層側の領域に４００μＬ／ウェルとなるように入れた。これらを５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３日間〜５日間、ゼラチンナノファイバーシート上またはＰＥＴ製メンブレン上で静置培養した。
【００５６】
（２）ＭＢＥＣ４細胞の、細胞透過性評価装置１の透過性基材４における存在部位の確認
核を染色する蛍光色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＤＡＩＪＩＮＤＯ社）を１μｇ／ｍＬとなるよう、本実施例（１）でＭＢＥＣ４細胞を培養した細胞透過性評価装置１の上層側の領域に添加し、本実施例（１）に記載の培養条件にて、１５分間培養した。続いて、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社）および蛍光顕微鏡（ＴＥ２０００；Ｎｉｋｏｎ社）を用いて、観察深度を１５μｍずつ変化させてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光を検出し、画像を取得した。その後、取得した画像に基づいて、透過性基材４における細胞層の断面図を構築した。その結果を図５に示す。
【００５７】
図５に示すように、透過性基材４におけるＭＢＥＣ４細胞層では、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光で示される核がほぼ一層となっていることが明らかになった。この結果から、細胞透過性評価装置１の透過性基材４においてＭＢＥＣ４細胞を培養すると、単層細胞を形成できることが確認された。
【００５８】
（３）細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞の密着結合の確認
［３−１］ＺＯ−１タンパク質の免疫染色による確認
本実施例（１）で細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞を、透過性基材４ごと４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（和光純薬工業社）に１５分間浸漬して固定した後、一次抗体として密着結合マーカーであるＺＯ−１タンパク質の抗体（Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＺＯ−１；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および二次抗体としてＡｌｅｘａ５４６で標識した抗ウサギ抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、常法に従い免疫染色を行った。続いて１μｇ／ｍＬとなるようＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＤＡＩＪＩＮＤＯ社）を添加し、室温、遮光下にて１５分間静置した後、ＰＢＳにより洗浄した。その後、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社）および蛍光顕微鏡（ＴＥ２０００；Ｎｉｋｏｎ社）を用いてＡｌｅｘａ５４６およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光を検出した。その結果を図６に示す。
【００５９】
図６に示すように、透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞では、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光で示される核と核との間に、Ａｌｅｘａ５４６の蛍光で示されるＺＯ−１タンパク質が存在することが明らかになった。この結果から、細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞は密着結合を形成することが確認された。
【００６０】
［３−２］膜間電気抵抗（ＴＥＲ）の測定による確認
本実施例（１）でＭＢＥＣ４細胞を培養した細胞透過性評価装置１、ＭＢＥＣ４細胞を培養した従来の細胞透過性評価装置５およびＭＦＬＮ４細胞を培養した従来の細胞透過性評価装置５について、ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ−ＥＲＳ（ミリポア社）を用いて、上層側の領域および下層側の領域にそれぞれ電極を入れ、膜間電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。ＴＥＲ測定方法を図７に、測定結果を図８にそれぞれ示す。
【００６１】
細胞透過性評価装置１の透過性基材４あるいは従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいて、図７に示すような、培養された細胞間に密着結合が形成されている場合は、電気抵抗が発生するためＴＥＲの値は高くなる。測定の結果、図８に示すように、ＭＦＬＮ４細胞を培養した従来の細胞透過性評価装置５では、ＴＥＲの値は約１０Ω／ｃｍ２であったのに対し、ＭＢＥＣ４細胞を培養した従来の細胞透過性評価装置５では約２１０Ω／ｃｍ２、ＭＢＥＣ４細胞を培養した細胞透過性評価装置１では約２３０Ω／ｃｍ２の高い値がそれぞれ測定された。
【００６２】
これらの結果から、細胞透過性評価装置１の透過性基材４において培養したＭＢＥＣ４細胞では、従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいて培養したＭＢＥＣ４細胞と同程度に電気抵抗性を有する、高密度の密着結合が形成されることが確認された。
【００６３】
＜比較例１＞従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおける無細胞リポソーム透過率の確認
メンブレン孔径が異なる４種類の従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、２４ウェル、メンブレン孔径；０．４μｍ、１．０μｍ、３．０μｍ、８．０μｍ）について、実施例２に記載の方法により、無細胞リポソーム透過率を算出した。ただし、移行時間（上層側の領域にリポソームを添加後、下層側の領域からＫｒｅｂｓ緩衝液を回収するまでの時間）は、３時間、６時間および９時間とした。その結果を図９に示す。
【００６４】
図９に示すように、メンブレン孔径０．４μｍにおいて、いずれの移行時間の場合も、無細胞リポソーム透過率は約０．１７％から約０．２５％の間であり、メンブレン孔径１．０μｍにおいては、移行時間が３時間および６時間の場合では、無細胞リポソーム透過率は約０．２３％から約０．５％の間であり、移行時間が９時間の場合では、無細胞リポソーム透過率は約１．７５％であった。一方、メンブレン孔径３．０μｍにおいて、移行時間が３時間の場合では、無細胞リポソーム透過率は約１２％であり、移行時間が６時間および９時間の場合では、無細胞リポソーム透過率は約１７％から約１８％の間であった。また、メンブレン孔径８．０μｍにおいて、移行時間が３時間の場合では、無細胞リポソーム透過率は約１９％であり、移行時間が６時間および９時間の場合では、無細胞リポソーム透過率は約９％から約１０％の間であった。
【００６５】
これらの結果から、培養細胞が存在しない従来の細胞透過性評価装置５においては、メンブレン孔径が３．０μｍおよび８．０μｍの場合、１０％〜２０％のリポソームがＰＥＴ製メンブレンを透過することが確認された。一方、メンブレン孔径が０．４μｍおよび１．０μｍの場合は、ほとんどのリポソームがＰＥＴ製メンブレンを透過しないことが確認された。
【００６６】
＜比較例２＞ＰＥＴ製メンブレンにおけるＭＢＥＣ４細胞の存在部位の確認
（１）従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおけるＭＢＥＣ４細胞の培養
メンブレン孔径が異なる３種類の従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、２４ウェル、メンブレン孔径；０．４μｍ、１．０μｍ、８．０μｍ）において、実施例３（１）に記載の方法によりＭＢＥＣ４細胞を培養した。
【００６７】
（２）ＰＥＴ製メンブレンにおけるＭＢＥＣ４細胞の存在部位の確認
［２−１］サンプルの調製
本比較例（１）で培養したＭＢＥＣ４細胞について、実施例３（３）［３−１］に記載の方法によりＺＯ−１タンパク質の免疫染色を行った。メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５において培養したＭＢＥＣ４細胞については、ＺＯ−１タンパク質の免疫染色の後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた核の染色も行った。染色した細胞をメンブレンごと、グリセロールを９０％（ｖ／ｖ）含むリン酸緩衝生理食塩水を用いてスライドガラスに封入することにより、サンプルを調製した。
【００６８】
［２−２］ＺＯ−１タンパク質の検出による細胞の存在部位の確認
本比較例（２）［２−１］で調製したサンプルについて、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０−ＭＥＴＡ；Ｚｅｉｓｓ社）を用いてＡｌｅｘａ５４６の蛍光を検出した。検出はメンブレンの上部からメンブレンの下部（裏側）に至るまで、観察深度を変化させて行い、観察深度が最も小さい場合の画像をＡとし、観察深度が大きくなるに従って、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏとして、画像を取得した。メンブレン孔径が０．４μｍの従来の細胞透過性評価装置５における観察結果を図１０に、メンブレン孔径が１．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５における観察結果を図１１に、メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５における観察結果を図１２にそれぞれ示す。
【００６９】
図１０に示すように、メンブレン孔径が０．４μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養した場合、メンブレン上部を示すパネルＣ〜ＬにおいてＡｌｅｘａ５４６の蛍光が検出され、メンブレン内部を示すパネルＭ〜Ｏにおいては、Ａｌｅｘａ５４６の蛍光は検出されなかった。この結果から、メンブレン孔径が０．４μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養すると、単層細胞を形成できることが確認された。
【００７０】
また、図１１に示すように、メンブレン孔径が１．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養した場合、メンブレン上部を示すパネルＣ〜Ｉのみならず、メンブレン内部を示すパネルＪ〜Ｏにおいても、Ａｌｅｘａ５４６の蛍光が検出された。この結果から、メンブレン孔径が１．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養すると、単層細胞は形成できず、ＭＢＥＣ４細胞がメンブレン上部のみならずメンブレンの孔内にまで存在するようになることが確認された。
【００７１】
さらに、図１２に示すように、メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養した場合、メンブレン上部を示すパネルＣ〜Ｇのみならず、メンブレン内部を示すパネルＨ〜Ｊおよびメンブレン下部を示すパネルＫ〜Ｏに至るまでＡｌｅｘａ５４６の蛍光が検出された。この結果から、メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養すると、単層細胞は形成できず、ＭＢＥＣ４細胞がメンブレン上部のみならずメンブレンの孔内やメンブレン下部にまで存在するようになることが確認された。
【００７２】
［２−３］ＺＯ−１タンパク質および核の検出による細胞の存在部位の確認
続いて、本比較例（２）［２−１］で調製した、メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいて培養したＭＢＥＣ４細胞のサンプルについて、Ａｌｅｘａ５４６の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光を、本比較例（２）［２−２］に記載の方法により観察深度を変化させて検出し、ＡからＮまでの画像を取得した。その結果を図１３に示す。
【００７３】
図１３に示すように、メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養した場合、メンブレン上部を示すパネルＢ〜Ｈのみならず、メンブレン内部を示すパネルＩ〜ＮにおいてもＡｌｅｘａ５４６の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光が検出された。特に、パネルＩ〜Ｎにおいてはメンブレンの孔内にＡｌｅｘａ５４６の蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光が検出され、メンブレンの孔に核が詰まっている様子が見られた。この結果から、メンブレン孔径が８．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５のＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養すると、単層細胞は形成できず、ＭＢＥＣ４細胞がメンブレン上部のみならずメンブレンの孔内にまで存在するようになることが確認された。
【００７４】
＜比較例３＞ゼラチンあるいはコラーゲンでコーティングしたＰＥＴ製メンブレンにおけるＭＢＥＣ４細胞の存在部位の確認
（１）コーティングしたＰＥＴ製メンブレンを有する従来の細胞透過性評価装置５の作製
［１−１］ゼラチンコーティングしたＰＥＴ製メンブレンを有する従来の細胞透過性評価装置５の作製
リン酸緩衝生理食塩水にゼラチンパウダー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を２％（ｗ／ｗ）となるよう添加し、１２１℃にて１０分間オートクレーブに供して、ゼラチン溶液を調製した。メンブレン孔径が３．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、２４ウェル）の上層側の領域に、メンブレン全体が覆われる程度の量のゼラチン溶液を注ぎ、３７℃にて４時間インキュベートした後、ゼラチン溶液を除去した。
【００７５】
［１−２］コラーゲンコーティングしたＰＥＴ製メンブレンを有する従来の細胞透過性評価装置５の作製
ｐＨ３．０の希塩酸水溶液に０．３ｍｇ／ｍＬとなるようコラーゲン（新田ゼラチン社）を添加し、コラーゲン溶液を調製した。メンブレン孔径が３．０μｍの従来の細胞透過性評価装置５（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ；ミリポア社、メンブレン材質；ＰＥＴ製、２４ウェル）の上層側の領域に、メンブレン全体が覆われる程度の量のコラーゲン溶液を注ぎ、室温にて１時間インキュベートした後、コラーゲン溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水を用いてメンブレンを２度洗浄した。
【００７６】
（２）従来の細胞透過性評価装置５のコーティングしたＰＥＴ製メンブレンにおける細胞の培養
本比較例（１）［１−１］で作製したゼラチンコーティングしたＰＥＴ製メンブレンを有する従来の細胞透過性評価装置５および本比較例（１）［１−２］で作製したコラーゲンコーティングしたＰＥＴ製メンブレンを有する従来の細胞透過性評価装置５に代えて、細胞透過性評価装置１において、実施例３（１）に記載の方法によりＭＢＥＣ４細胞を培養した。  
【００７７】
（３）コーティングしたＰＥＴ製メンブレンにおけるＭＢＥＣ４細胞の存在部位の確認
本比較例（２）で培養した細胞について、比較例２（２）［２−１］に記載の方法によりＺＯ−１タンパク質の免疫染色を行った後、サンプルを調製した。その後、比較例２（２）［２−２］に記載の方法によりＡｌｅｘａ５４６の蛍光の検出を行った。観察深度はメンブレン上部、メンブレン内部、メンブレン下部の３段階に分けて、画像を取得した。その結果を図１４に示す。
【００７８】
図１４に示すように、いずれのコーティングをしたＰＥＴ製メンブレンにおいても、メンブレン上部の画像において全体的にＡｌｅｘａ５４６の蛍光が検出されるのみならず、メンブレン内部の画像において、メンブレンの孔内にＡｌｅｘａ５４６の蛍光が検出された。これらの結果から、ゼラチンコーティングしたＰＥＴ製メンブレンまたはコラーゲンコーティングしたＰＥＴ製メンブレンにおいてＭＢＥＣ４細胞を培養すると、単層細胞を形成できず、ＭＢＥＣ４細胞がメンブレン上部のみならずメンブレンの孔内にまで存在するようになることが確認された。
【符号の説明】
【００７９】
１  細胞透過性評価装置
２  第１領域部
３  第２領域部
４  透過性基材
５  従来の細胞透過性評価装置
６  上層領域
７  下層領域
８  メンブレン
９  インサート
１０  ウェルプレート
【図１】
2011115097.tif 000003
【図２】
2011115097.tif 000004
【図３】
2011115097.tif 000005
【図４】
2011115097.tif 000006
【図５】
2011115097.tif 000007
【図６】
2011115097.tif 000008
【図７】
2011115097.tif 000009
【図８】
2011115097.tif 000010
【図９】
2011115097.tif 000011
【図１０】
2011115097.tif 000012
【図１１】
2011115097.tif 000013
【図１２】
2011115097.tif 000014
【図１３】
2011115097.tif 000015
【図１４】
2011115097.tif 000016