(57)【要約】      （修正有）【課題】一本鎖・二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を、哺乳類の標的細胞に、効果的に送達する系を提供する。【解決手段】核酸に、ポリエチレングリコール鎖の共有結合したコンジュゲートと、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン（ＰＯ４３−）を含んでなる、有機−無機ハイブリッド型のナノ粒子。核酸は、一本鎖〜二本鎖の、オリゴ〜ポリヌクレオチドで良く、ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡ、もしくはＲＮＡアプタマーからなる群より選ぶ事ができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の３’または５’末端にポリエチレングリコールの共有結合したコンジュゲートと、カルシウムイオン
（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン（ＰＯ４３−）を含んでなる有機−無機ハイブリッド型のナノ粒子。
【請求項２】
コンジュゲートが、一般式Ｉ
Ａ−ＰＥＧ−Ｌ−核酸              （Ｉ）
式中、
ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を表し、
ＡはＰＥＧの末端基または末端部分を表し、
ＬはＰＥＧのＡ結合末端の別の末端と核酸の３’または５’末端を共有結合するリンカーを表し、そして
核酸は、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡからなる群より選ばれ、かつ、
カルシウムイオンがリン酸イオンより過剰当量存在する、
請求項１記載のナノ粒子。
【請求項３】
コンジュゲートにおけるＰＥＧが分子量７０００Ｄａ〜２５０００Ｄａの範囲内にあり、
核酸が約１６〜約４００のヌクレオチド鎖長の二本鎖または約４０〜約４００のヌクレオチド鎖を含んでなるＲＮＡまたはＤＮＡであり、リンカー中に生体内で開裂しうる結合が含まれており、かつ
カルシウムイオン対リン酸イオンのモル比率が、５０〜２００にあり、そして
核酸におけるリン酸イオンの少なくとも一部と過剰のカルシウムイオンが、イオン結合した状態にある、請求項２記載のナノ粒子。
【請求項４】
生体内で開裂しうる結合がジスルフィド結合（−ＳＳ−）またはエステル結合（−ＯＣＯ−）もしくは（−ＣＯＯ−）である請求項３記載のナノ粒子。
【請求項５】
核酸がｓｉＲＮＡおよびＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーからなる群より選ばれる請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項６】
核酸がｓｉＲＮＡである請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項７】
核酸がｓｉＲＮＡである請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項８】
核酸がｓｉＲＮＡである請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項９】
Ｍｇ２＋がさらに含まれている請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
核酸の３’または５’末端にポリエチレングリコールが共有結合したコンジュゲートおよびＣａ２＋を含んでなる水溶液と、ＰＯ４３−を含んでなる水溶液を、リン酸カルシウムと前記コンジュゲートがナノ粒子を形成しうる条件下で混合することを含んでなる、有機−無機ハイブリッド型のナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
コンジュゲートが一般式Ｉ
Ａ−ＰＥＧ−Ｌ−核酸              （Ｉ）
式中、
ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を表し、
ＡはＰＥＧ末端基または末端部分を表し、
ＬはＰＥＧのＡ結合末端の別の末端と核酸の３’または５’末端を共有結合するリンカーを表し、そして
核酸は、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡからなる群より選ばれ、かつ、Ｃａ２＋を含んでなる水溶液がＣａＣｌ２を用いて調製され、ＰＯ４３−を含んでなる水溶液がＮａ２ＨＰＯ４を用いて調製される請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子を有効成分として含んでなる、該ナノ粒子に含有されている核酸を導入することが望まれる哺乳類の細胞内に該核酸を送達するための組成物。
【請求項１３】
核酸がｓｉＲＮＡである請求項１２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を標的に送達するための有機−無機ハイブリッド型のナノ粒子、ならびにその製造方法および送達用の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、転写後レベルでのジーン・サイレンシングに関する細胞過程を制御するための魅惑的な研究手段である。ｓｉＲＮＡの哺乳類細胞内への導入はｍＲＮＡレベルで高度の配列特異的な遺伝子の発現阻害をもたらすので、この手法はアンチセンスの使用よりも有意に優れた効能を示すことが知られている（非特許文献１参照）。数年前の哺乳類細胞内でのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が媒介するジーン・サイレンシングの発見から、ｓｉＲＮＡを標的遺伝子のノックダウンに利用する膨大な数の研究活動が存在する（非特許文献２、３および４参照）。ウイルス疾患や癌などの各種遺伝子疾患の治療におけるｓｉＲＮＡの使用についての潜在力は極めて高いとはいえ、ヌクレアーゼに対して本質的に不安定であり、生体利用能も低いためｓｉＲＮＡの実用的な用途は限定されている（非特許文献５参照）。臨床に適する療法に組み入れる上での主要な障壁の一つは効率のよい遺伝子送達ベクターの開発にあることは衆目の一致するところである。
【０００３】
ウイルスベクターは、有用な遺伝子送達ベクターであることが明らかにされている一方で、それらの免疫原性、発癌性および高い製造コスト、等により臨床上の使用が制限されている（例えば、非特許文献６および７参照）。非ウイルス性ベクターは見込みのあるウイルスベクターの代替物としての考えが高まっている。非ウイルスベクターの中でも、カチオン性リピッドおよびポリマーをベースとする送達系に強い興味が集まっている。しかし、遺伝子療法でそれらの有用性を拡大するためには、血清耐容性、毒性の低減、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用効率の向上およびコストの低下が解決すべき課題として残存する。
【０００４】
リン酸カルシウムの結晶形態物（以下、ＣａＰと略記する）であるハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）がＤＮＡに対して結合親和性を示すことは既に報告されている（非特許文献８参照）。ナノサイズのＣａＰ粒子はＤＮＡについての効率のよいキャリアーであることが証明されてきた（例えば、非特許文献９および１０参照）。また、ＣａＰナノ粒子のサイズが効率のよいトランスフェクションを達成する上で重要な役割を担うことも見出されていたが、一方で、ＣａＰ結晶の迅速な成長が大きな沈殿を生成し、トランスフェクション効率を劇的に低下させることも知られていた（非特許文献１１参照）。
【０００５】
遺伝子送達用の新規なキャリアーの開発に向けた本発明者等のここ数年に亙る連続する研究を通じて、本発明者等はＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの送達用にＣａＰをベースとするハイブリッドナノベクターを至適化すべ鋭意研究してきた（例えば、それぞれ、非特許文献１２および非特許文献１３参照）。先に、本発明者等の一部は、ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（メタクリル酸）（ＰＥＧ−ＰＭＡ）を用いてＰＥＧ−ＰＭＡ／ＣａＰ／ｓｉＲＮＡハイブリッド型ナノ粒子を作製した（非特許文献１４および特許文献１参照）。培養細胞株では、かなり高濃度のＰＥＧ−ＰＭＡ（すなわち、４５０−５５０μｇ／ｍｌ）で有意なジーン・サイレンシングが達成された。しかし、単分散ナノ粒子の形成にとって高いＰＥＧ−ＰＭＡ濃度が必要であり、これが効率的なジーン・サイレンシングおよびハイブリッドナノ粒子中へのｓｉＲＮＡの取り込み効率に悪影響を及ぼすことから、可能ならば、さらに効果的な遺伝子または核酸の送達系を提供することが必要である。
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０１８６９０
【非特許文献１】Ｃ．Ｄ．Ｎｏｖｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００４，４３０，１６１．
【非特許文献２】Ｙ．Ｄｏｒｓｅｒｔｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００４，３，３１８．
【非特許文献３】Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，２１，１．
【非特許文献４】Ｒ．Ｃ．Ｃ．Ｒｙｔｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００５，１２，５．
【非特許文献５】Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４，３２．
【非特許文献６】Ｒ．Ｇ．Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２７０，４０４
【非特許文献７】Ｓ．Ｋ．Ｔｒｉｐａｔｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９６，２，５４５
【非特許文献８】Ｍ．Ｏｋａｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ，．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００１，２２，２４５９
【非特許文献９】Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９７３，５２，４５６
【非特許文献１０】Ａ．Ｍａｉｔｒａ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２００５，５，８９３
【非特許文献１１】Ｍ．Ｊｏｒｄａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９６，２４，５９６
【非特許文献１２】Ｙ．Ｋａｋｉｚａｗａ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００２，１８，４５３９
【非特許文献１３】Ｙ．Ｋａｋｉｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００４，９７，３４５
【非特許文献１４】Ｙ．Ｋａｋｉｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００６，１１１，３６８
【発明の開示】
【０００７】
上記ＰＥＧ−ＰＭＡ／ＣａＰハイブリッド型ナノ粒子内へｓｉＲＮＡが内包される現象について、本発明者等は、次の推測を行った。アニオン種、つまりＰＭＡおよびｓｉＲＮＡの存在が、アニオン性ＰＭＡ／ｓｉＲＮＡとＣａＰ表面上の陽電荷の間の結合の際にかならず競合を起こす。言い換えれば、このような競合の結果として、ＣａＰへのｓｉＲＮＡの取り込み効率は低下する。本発明者等は、こうような競合を避ける手段として、ＰＥＧ−ＰＭＡを使用することなく、ｓｉＲＮＡにポリエチレングリコール鎖の共有結合したコンジュゲートを上記系と組み合わせると前記問題点が本質的に解決できる可能性があると推測した。こうして、ｓｉＲＮＡにポリエチレングリコール鎖の共有結合したコンジュゲートを生成し、得られたコンジュゲートをＣａＰの形成系で使用してみたところ、現に、効率よくｓｉＲＮＡをＣａＰに取り込むことができることのみならず、容易に安定な単分散ナノ粒子を取得できることを見出した。そして、このようなナノ粒子は、標的細胞に効率よく取り込まれ、細胞内で該コンジュゲートを放出し、核酸の機能が効率よく発揮されることが確認された。また、短鎖のオリゴヌクレオチドもしくは小型の分子であるｓｉＲＮＡが効率よくＣａＰに取り込むことができることから理解できるように、他の一定の核酸も同様にこの新規な系に取り込み得ることも見出した。
【０００８】
こうして、本発明によれば、核酸の３’または５’末端にポリエチレングリコールの共有結合したコンジュゲートと、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン（ＰＯ４３−）を含んでなる有機−無機ハイブリッド型ナノ粒子が提供される。
【０００９】
好適な態様のナノ粒子では、前記コンジュゲートが、一般式Ｉ
Ａ−ＰＥＧ−Ｌ−核酸              （Ｉ）
式中、
ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を表し、
ＡはＰＥＧの末端基または末端部分を表し、
ＬはＰＥＧのＡ結合末端の別の末端と核酸の３’または５’末端を共有結合するリンカーを表し、そして
核酸は、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡからなる群より選ばれ、かつ、カルシウムイオンがリン酸イオンより過剰当量存在する。
【００１０】
別の態様の本発明としては、核酸の３’または５’末端にポリエチレングリコール鎖が共有結合したコンジュゲートおよびＣａ２＋を含んでなる水溶液と、ＰＯ４３−を含んでなる水溶液を、リン酸カルシウムと前記コンジュゲートがナノ粒子を形成しうる条件下で混合する工程を含んでなる、有機−無機ハイブリッド型ナノ粒子の製造方法、が提供される。
【００１１】
また、こうして提供されるナノ粒子は、哺乳類細胞に効率よく取り込まれるので、核酸を哺乳類細胞に送達するための研究用または医療用のツールとしての用途も提供される。
【００１２】
＜発明の詳細な記述＞
本発明にいう、核酸は、１より多くのヌクレオチドが５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子であって、動物または植物、特に、哺乳動物の生命現象に関与し得る分子を意味する。このような核酸鎖には、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡが包含され、二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡであることができる。ヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）から選ばれるが、前記核酸には、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で天然に存在する修飾ヌクレオチドまたは動物または植物、特に、哺乳動物細胞で複製でき、転写・翻訳の可能な非天然型塩基を有するヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００１３】
生命現象に関与し得る核酸分子は、欠損することにより何らかの疾患をもたらす遺伝子であることができる。また、特定の細胞内で、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）や標的ＤＮＡとの結合等を介して究極的には遺伝子発現を調節し得る分子をいう。本発明に従えば、比較的短い（オリゴ概念に包含される）ヌクレオチド鎖の、例えば、約４００までのヌクレオチドを含んでなる短鎖もしくは小型のオリゴヌクレオチドを有機−無機ハイブリッド型ナノ粒子内へ効率よく安定に内包せしめ得るので、それ自体公知のＲＮＡもしくはＤＮＡアプタマーの概念に包含される核酸分子、およびＲＮＡｉに利用できる、例えば、ｓｍａｌｌ（またはｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の概念に包含される核酸分子に本発明を都合よく適用することができる。
【００１４】
限定されるものではないが、本発明で好適、かつ、効果的に使用できる核酸分子のサイズは、二本鎖核酸である場合には、約１６〜約４００のヌクレオチド鎖長であり、一本鎖核酸である場合には約４０〜約４００のヌクレオチド鎖であることができる。特に、本発明で好適に使用できる核酸分子は、３’末端に２、３個のヌクレオチドのオーバーハングを有していてもよい、一本鎖に約１９〜３０、好ましくは、約１９〜２３のヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡ、および約５０〜１４０のヌクレオチドを有するＲＮＡもしくはＤＮＡアプタマーを挙げることができる。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計でき、このような遺伝子の例としては、非小細胞肺癌などに関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫などに関係のあるＢＣＬ−２、ク
ローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リウマチもしくは乾癬に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡＩ受容体、卵巣がんなどに関係のあるｃ−ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌などに関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ  Ｒｉα、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ
ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌などに関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎおよびＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。
【００１５】
核酸３’または５’末端にポリエチレングリコール鎖の共有結合したコンジュゲートは、上記の核酸分子とポリエチレングリコールを公知の連結方法で共有結合して生成できるコンジュゲートであって（例えば、ＷＯ  ２００６／０２５４１９、ＷＯ  ２００７／０２１１４２参照）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン（ＰＯ４３−）の存在する水性溶液中で有機−無機ハイブリッド型ナノ粒子を形成できるいかなるコンジュゲートをも包含する。このようなコンジュゲートの典型的なものとしては、下記一般式Ｉで表されるものを挙げることができる：
Ａ−ＰＥＧ−Ｌ−核酸              （Ｉ）
式中、
ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を表し、
ＡはＰＥＧの末端基または末端部分を表し、
ＬはＰＥＧのＡ結合末端の別の末端と核酸の３’または５’末端を共有結合するリンカーを表し、そして
核酸は、上述したオリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡからなる群より選ばれる。
【００１６】
ＰＥＧの分子量は、本発明の有機−無機ハイブリッド型ナノ粒子を形成できるものであれば限定されないが、約６０００Ｄａ〜約５００００Ｄａ、好ましくは約７０００Ｄａ〜約２５０００Ｄａ、より好ましくは約１００００Ｄａ〜約２５０００Ｄａの範囲内にあるものであることができる。
【００１７】
ＰＥＧの末端基または末端部分であるＡは、水素原子、Ｃ１−１０の直鎖もしくは分岐したアルキルもしくはアルケニル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシルまたはアリル等）、アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、ヒドロキシ基、Ｃ１−１０の直鎖もしくは分岐したアルコキシ基、アルデヒド基（またはホルミル：−ＣＨＯ）、アセタール化ホルミル基〔−ＣＨ（ＯＲ１）（ＯＲ２）、ここで、Ｒ１およびＲ２は相互に独立して、Ｃ１−４アルキルであるか、または一緒になってＣ１−４アルキレン鎖であることもできる〕、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、保護されたアミノ基および保護されたカルボキシル基（ここで、保護されたと称する場合の保護基は、ペプチド合成で慣用されているアミノ基またはカルボキシル基についての保護基を意味する。）からなる群より選ばれる基もしくは官能基であることができ、また、細胞表面受容体に結合しうる前記官能基を介して結合したリガンド（例、糖、ペプチド、等）または抗体等の機能性もしくは結合性部分であることができる。
【００１８】
リンカーＬは、二本鎖核酸に結合する場合には、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方の３’または５’末端に、また一本鎖核酸の場合も、その３’または５’末端のいずれかにリン酸エステル結合等の当該技術分野で公知のいずれかの結合様式で共有結合し、ＰＥＧ鎖のＡに対してもう一方の末端に炭素―炭素結合、エーテル結合、チオエーテ
ル結合、エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、ウレイド結合、尿素結合等を介して、共有結合する連結基である。Ｌは、上記のような両端の結合以外に、酸素原子もしくは硫黄原子１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を含むことができる。このようなアルキレン鎖としては、限定されるものでないが、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−およびＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−（ＣＨ２）６−等を挙げることができる。本発明では、このようなアルキレン鎖中に生理的条件下で開裂しうる結合、例えば、エンドソームにおける低ｐＨ（５．０〜６．０）において開裂しうるエステル結合または還元条件下もしくは還元剤として作用しうる物質の存在下で開裂し得るジスルフィド結合を含めることが好ましい。このような結合を含むアルキレン鎖の例としては、限定されるものでないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２−を挙げることができる。
【００１９】
本発明では、理論に拘束されるものではないが、上記のＡ−ＰＥＧ−Ｌ−核酸コンジュゲートが、アニオン荷電性の核酸部分を介して、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン（ＰＯ４３−）を特定の比率で含んでなるリン酸カルシウム（ＣａＰ）粒子のカチオン性表面および／または微小粒子内部に固定されまたは取り込まれた無機ハイブリッド型のナノ粒子が提供される。そのため、該ナノ粒子における、ＣａＰでは、カルシウムイオンがリン酸イオンより過剰当量存在し、好ましくは、ＣａＰのカルシウムイオン対リン酸イオンのモル比率が、２０〜５００、好ましくは３０〜３００、より好ましくは５０〜２００にある。こうして、該ナノ粒子では、ＣａＰにおける過剰のカルシウムイオンと前記コンジュゲートの核酸に由来するアニオン荷電性のリン酸部分がイオン−イオン相互作用をすることにより、ＣａＰ中に該コンジュゲート中の核酸部分を部分的にかまたは全体的に内包した形態にあるものと推測される。後述する当該ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を参照されたい。該ナノ粒子では、ＣａＰとコンジュゲートが、上述した過剰のカルシウムイオンにコンジュゲートの各分子内のリン酸部が少なくとも部分的に相互作用できるような比率で含まれておればよい。しかし、限定されるものでないが、核酸におけるリン酸部と過剰のカルシウムイオンが、モル比で、０．００１〜０．０５対１、好ましくは０．００２〜０．０１対１になるように選ばれる。また、カルシウムイオンは、別の多価カチオン、例えば、Ｍｇ２＋で部分的に置き換えられていてもよい。
【００２０】
本願発明にいう、ナノ粒子は、キュムラント平均粒子径がナノオーダー、限定されるのもでないが、３０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは、５０ｎｍ〜３００ｎｍであるが、数ミクロンの平均粒径を有する粒子も包含し得る概念として使用してきる。
【００２１】
このような有機−無機ハイブリッド型ナノ粒子は、前記コンジュゲートおよびＣａ２＋を含んでなる水溶液と、ＰＯ４３−を含んでなる水溶液をリン酸カルシウムと前記コンジュゲートがナノ粒子を形成しうる条件下で混合することにより製造できる。この水溶液の混合条件は、核酸に悪影響を及ぼさない条件下、例えば、１０℃〜５０℃で、１時間〜４０時間混合液を静置すればよい。混合後の水溶液中のコンジュゲートの濃度は、コンジュゲートが溶解できる濃度であればよいが、通常、ヌクレオチドを基準に０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは、０．２ｍＭ〜５ｍＭであり、カルシウムイオン濃度は、３０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜３００ｍＭであり、ＣａＰを形成するためのリン酸イオンの濃度は、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜１０ｍＭに設定できる。また、カルシウムイオン以外の多価カチオン、例えば、Ｍｇ２＋は、Ｃａ２＋に対して０．０１〜１当量含めることができる。
【００２２】
こうして、本発明により提供できる有機−無機ハイブリッド型のナノ粒子は、生理的条件下で動物または植物細胞、特に哺乳類細胞と接触させることにより、これらの細胞に効
率よく取り込まれ、こうして取り込まれた粒子は、通常、カルシウムイオン濃度の低い細胞内で徐々に崩壊してＡ−ＰＥＧ−Ｌ−核酸コンジュゲートを放出することができる。また、コンジュゲートのリガンド中に生理的条件下で開裂し得る結合を有する場合には、細胞内でコンジュゲートから核酸を開放し得る。カルシウムイオンおよびリン酸イオンは、本質的に細胞の生理および核酸の機能に悪影響を及ぼさないので、例えば、細胞内でカチオン性ポリマーが放出されることが予測される、ＷＯ  ２００６／０２５４１９またはＷＯ  ２００７／０２１１４２に記載されているｓｉＲＮＡ−ＰＥＧコンジュゲートとカチオン性ポリマーのイオンコンプレックスに比べて安全に使用できる。
【００２３】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されることは意図されていない。
【００２４】
＜製造例１＞  ＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌの合成
【化１】
2011010549.tif 000002
【００２５】
α−メトキシ−ω−メルカプト−ポリエチレングリコール（日本油脂、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＳＨ、重量平均分子量Ｍｗ＝１２０００）１００ｍｇをＴＨＦ１５ｍｌに溶解させ、さらに２，２’−ジピリジルジスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）１８４ｍｇ及びｎ−プロピルアミン１．７５ｍｌを加えた。反応液を室温で３時間撹拌した後、ジエチルエーテル５００ｍｌ中に滴下することにより白色沈殿を得た。この沈殿物を減圧ろ過により回収した後、ベンゼン３０ｍｌに溶解させ、凍結乾燥を行うことにより表題の化合物を得た。
【００２６】
＜製造例２＞  ＰＥＧ（１５ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌの合成
【化２】
2011010549.tif 000003
【００２７】
α−メトキシ−ω−メルカプト−ポリエチレングリコール（日本油脂、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＳＨ、重量平均分子量Ｍｗ＝１５０００）１２５ｍｇをＴＨＦ１５ｍｌに溶解させ、さらに２，２’−ジピリジルジスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）１８４ｍｇ及びｎ−プロピルアミン１．７５ｍｌを加えた。反応液を室温で３時間撹拌した後、ジエチルエーテル５００ｍｌ中に滴下することにより白色沈殿を得た。この沈殿物を減圧ろ過により回収した後、ベンゼン３０ｍｌに溶解させ、凍結乾燥を行うことにより表題の化合物を得た。
【００２８】
＜製造例３＞  ＰＥＧ（５ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌの合成
【化３】
2011010549.tif 000004
【００２９】
α−メトキシ−ω−メルカプト−ポリエチレングリコール（日本油脂、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＳＨ、重量平均分子量Ｍｗ＝５０００）４１．７ｍｇをＴＨＦ１５ｍｌに溶解させ、さらに２，２’−ジピリジルジスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）１８４ｍｇ及びｎ−プロピルアミン１．７５ｍｌを加えた。反応液を室温で３時間撹拌した後、ジエチルエーテル５００ｍｌ中に滴下することにより白色沈殿を得た。この沈殿物を減圧ろ過により回収した後、ベンゼン３０ｍｌに溶解させ、凍結乾燥を行うことにより表題の化合物を得た。
【００３０】
＜製造例４＞  ＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの調製
本実施例で用いるＳＨ−ｓｉＲＮＡは、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖として：５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’を用い、２本鎖を形成させたものであり、かつセンス鎖の５’末端にＳＨ修飾（Ｃ６  Ｓ−Ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）がなされたものである。
【００３１】
ＳＨ−ｓｉＲＮＡ（０．１μｍｏｌ）を、０．０５Ｍジチオスレイトールを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）の１．０ｍｌに溶解させ、室温で６時間置いた後にＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてジチオスレイトールを除去した。このＳＨ−ｓｉＲＮＡに対しＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌ（１２ｍｇ）を加え、室温で２４時間反応させた。反応物は逆相ＨＰＬＣで分取することにより精製を行った。逆相ＨＰＬＣにはカラムとしてＴＳＫｇｅｌ  Ｏｌｉｇｏ‐ＤＮＡ  ＲＰ（東ソー）を用い、溶離液として５％アセトニトリル含有０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（溶離液Ａ）および７０％アセトニトリル含有０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（溶離液Ｂ）を用い、溶離液Ａから溶離液Ｂへのリニアグラジエント（４０分、流速毎分１ｍｌ）により溶出を行った。検出にはＵＶ（検出波長２６０ｎｍ）を用いた。ＰＥＧ（１２ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡを含有するフラクションは、遠心エバポレーターにより濃縮した後にＮＡＰ−５カラムによって処理し、３３μＭのＰＥＧ（１２ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡを含有する１ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ溶液（ｐＨ７．４）を得た。
【００３２】
また、上記のＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌに代え、それぞれ、ＰＥＧ（５ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌおよびＰＥＧ（１５ｋＤａ）−ＳＳ−ｐｙｌを用いて相当するＰＥＧ（５ｋＤａ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡおよびＰＥＧ（１５ｋＤａ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡを得た。
【００３３】
＜実施例１＞  リン酸カルシウム粒子の調製
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ
ＰＥＧ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ  ３０μＭ
ＣａＣｌ２  ２５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２
Ｔｒｉｓ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  １ｍＭ
溶液ＡのｐＨ、ＰＥＧの分子量及びＭｇＣｌ２の濃度については表１に示した。
【００３４】
溶液Ｂ（ｐＨ  ７．５）
Ｎａ２ＨＰＯ４  １．５ｍＭ
ＮａＣｌ  １４０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ５０ｍＭ
表１に示した各組成の溶液Ａ２００μｌに対し、溶液Ｂを２００μｌ混合した後、２５℃で２４時間静置することで、粒子（１）〜（８）及び（Ｃ−１）の溶液を得た。
【００３５】
＜実施例２＞  リン酸カルシウム粒子（Ｃ−２）の調製
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：
ｓｉＲＮＡ（センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’を用い、２本鎖を形成させたもの）  ７０μｇ／ｍｌ塩化カルシウム  ２５０ｍＭ
以上の組成の溶液を、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．６）を用いて調製した。
【００３６】
溶液Ｂ：
リン酸一水素二ナトリウム  １．５ｍＭ
ＮａＣｌ  １４０ｍＭ
ＰＥＧ−ポリ（アスパラギン酸）  （ＰＥＧ分子量１２０００、ポリアスパラギン酸の重合度２４）  ３００μｇ／ｍｌ
以上の組成の溶液を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．６）を用いて調製した。
【００３７】
溶液Ａ２００μｌと溶液Ｂ２００μｌを混合し、２５℃で２４時間静置することで、粒子（Ｃ−２）の溶液を得た。
【００３８】
【表１】
2011010549.tif 000005
【００３９】
＜実施例３＞  ＰＥＧ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの調製の確認
ＰＥＧ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの生成を確認するため、２０％アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分析を行った。泳動後のゲルはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ  ＲＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。結果を図１に示す。ｓｉＲＮＡ（レーン３）にくらべ、ＰＥＧ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ（レーン１及び２）では泳動度が小さくなり、ＰＥＧの付加により高分子量化が起きたことを確認できた。また、ＳＳ結合の還元環境応答性を確認するためＰＥＧ−ＳＳ−ｓｉＲＮＡに１０ｍＭジチオスレイトールを加え、３７℃で２時間置いた後のサンプルについても分析を行ったところ、元のｓｉＲＮＡと同じ位置にバンドが現れ（レーン４及び５）、ＰＥＧの切断が確認できた。
【００４０】
＜実施例４＞  リン酸カルシウム粒子に含有されたｓｉＲＮＡ濃度の評価
各リン酸カルシウム粒子溶液４００μｌをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２５００×ｇで１０分間遠心ろ過し、ろ液の２６０ｎｍにおける吸光度をＮＤ−１０００（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。リン酸カルシウム粒子に含有されたｓｉＲＮＡの濃度は、粒子の調製時に添加したｓｉＲＮＡの濃度と、ろ液中のｓｉＲＮＡの濃度の差から算出した。
【００４１】
その結果、粒子（１）において粒子に含有されたｓｉＲＮＡの量は６７μｇであり、良好な結果であった。これに対し、粒子（Ｃ−２）において粒子に含有されたｓｉＲＮＡの量は８．１μｇと低い値であった。
【００４２】
＜実施例５＞  粒子径と粒子径分布の測定
粒子（１）〜（８）、（Ｃ−１）及び（Ｃ−２）について、キュムラント平均粒径及び分散度（ＰＤＩ）の測定をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。結果を表１に示す。粒子（１）から（８）及び粒子（Ｃ−２）のリン酸カルシウム粒子については分散度の狭い単分散な粒子が生成された。これに対し、粒子（Ｃ−１）のでは粒子径１μｍ以上の沈殿が生成された。この粒子においては、ＰＥＧの分子量が５０００と小さいためＰＥＧによる凝集防止効果が弱く、沈殿が生成したと考えられる。実施例１のサンプル（１）の粒子溶液について、粒子径分布のヒストグラムを図２（Ａ）に、そして透過型電子顕微鏡で撮影した顕微鏡写真（バーの寸法：１００ｎｍ）図２（Ｂ）に示した。
【００４３】
＜実施例６＞  ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の評価
本発明のｓｉＲＮＡ内包粒子について、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する発現抑制活性を評価した。
【００４４】
２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に、ヒト肝癌由来細胞株（Ｈｕｈ７  ｃｅｌｌ）を１ｘ１０４  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ  播種し２４時間培養した後、ホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（０．３６μｇ／ｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）とウミシイタケルシフェラーゼベクターｐＲＬ−ＣＭＶ（０．０４μｇ／ｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の各レポーター遺伝子を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００（１μｌ／ｗｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製品の添付書に従って細胞に導入した。４時間インキュベートした後に培地を交換し、各粒子の溶液を加えた後４８時間細胞と接触させた。培地中でのｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭとなるように各粒子を添加した。４８時間培養後に細胞を回収し、両レポーター遺伝子の発現量をＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。ウミシイタケルシフェラーゼ発現量に対するホタルルシフェラーゼ発現量の相対値（ｐＧＬ３／ｐＲＬ）により抑制活性を評価した（Ｎ＝３）。結果を図３に示す。
【００４５】
図３のグラフから、本発明のｓｉＲＮＡ内包粒子は、効率よく癌細胞に取り込まれ、該細胞における標的遺伝子の発現を有意に抑制することが分る。
【００４６】
＜実施例７＞  血清中での安定性評価
粒子（１）の溶液１００μｌに対し、１０％牛胎児血清（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μｌを加え、混合した。この溶液を３７℃の恒温槽中に静置し、一定時間毎に、前記溶液中の粒子の３７℃におけるキュムラント平均粒径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定した。その結果を図４に示す。１１時間後まで平均粒径に大きな変化は見られず、この粒子は血清存在下でも安定であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＰＥＧ（１２ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ、ＰＥＧ（１５ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡの生成を確認するため、２０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分析を行った結果を表す写真である。レーン１：ＰＥＧ（１２ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ、レーン２：ＰＥＧ−（１５ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ、レーン３：ｓｉＲＮＡ、レーン４：１０ｍＭ  ＤＴＴで処理したＰＥＧ（１２ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ、レーン５：１０ｍＭ  ＤＴＴで処理したＰＥＧ−（１５ｋ）−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ
【図２】動的光散乱測定によるリン酸カルシウム粒子（１）の粒径測定の結果を示すグラフ（Ａ）および透過型電子顕微鏡写真（Ｂ）である（写真中のバーのサイズは１００ｎｍを表す）である。
【図３】本発明のリン酸カルシウム粒子について、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図４】本発明のリン酸カルシウム粒子について、血清存在下における安定性を評価した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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