(57)【要約】【課題】分離膜を用いた発酵により生産品を製造・回収する際、微生物混合液の高濃度発酵に対するろ過性の保持が可能な連続発酵の運転方法を提供する。【解決手段】変換前物質を含んだ原液を発酵槽に導入し、微生物含有液を用いて変換前物質を変換した後、分離膜を用いてろ過し、連続的に非透過液を発酵槽に保持しつつ変換後物質を含んだ透過液を取り出す連続発酵装置の運転方法において、分離膜の２次側から１次側に逆圧洗浄する逆圧洗浄液に含まれる水分量に応じて、変換前物質を含んだ原液に添加する水分量、ｐＨ調整液に添加する水分量、および発酵槽に直接添加する水分量からなる群の中から選ばれる少なくとも１つの水分量を調整し、発酵槽に流入する水分の総量を一定に制御することを特徴とする連続発酵装置の運転方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変換前物質を含んだ原液を発酵槽に導入し、微生物含有液を用いて変換前物質を変換した後、分離膜を用いてろ過し、連続的に非透過液を発酵槽に保持しつつ変換後物質を含んだ透過液を取り出す連続発酵装置の運転方法において、分離膜の２次側から１次側に逆圧洗浄する逆圧洗浄液に含まれる水分量に応じて、変換前物質を含んだ原液に添加する水分量、ｐＨ調整液に添加する水分量、および発酵槽に直接添加する水分量からなる群の中から選ばれる少なくとも１つの水分量を調整し、発酵槽に流入する水分の総量を一定に制御することを特徴とする連続発酵装置の運転方法。
【請求項２】
逆圧洗浄液がアルカリ、酸、または酸化剤の何れかを含むことを特徴とする請求項１に記載の連続発酵装置の運転方法。
【請求項３】
逆圧洗浄をする際に、一旦ろ過を停止し、逆圧洗浄液で分離膜を浸漬することを特徴とする請求項１または２に記載の連続発酵装置の運転方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離膜を用いて発酵により連続的に化成品を製造する連続発酵装置の運転方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間の経過とともに発酵液中の生産物である変換後物質濃度が高くなり、生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で変換後物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの生産について、このような連続発酵法が提案されている（非特許文献１）。しかしながら、これらの例では、発酵液へ変換前物質の連続的な供給を行うと共に、微生物や培養細胞を含んだ発酵液が抜き出されるために、発酵液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上が限定されたものであった。
【０００５】
このことから、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜でろ過し、ろ液から生産物を回収すると同時にろ過された微生物や培養細胞を発酵液に保持または環流させることにより、発酵液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミック膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が提案されている（特許文献１および特許文献２）が、これらの提案では、分離膜の目詰まりによるろ過流量やろ過効率の低下に問題がある。また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献３）。しかしながら、この提案では、膜分離において約２００ｋＰａのような高いろ過圧が採用されている。高いろ過圧は、コスト的に不利であるばかりでなく、ろ過処理において微生物や培養細胞が圧力によって物理的なダメージをうけることから、微生物や培養細胞を連続的に発酵液に戻す連続発酵法においては適切でない。
【０００７】
分離膜の目詰まり防止のために、間欠ろ過を行う方法が提案されている（特許文献４）が、連続ろ過に比べ改善はしているが、連続発酵３００〜４００時間で膜差圧が上昇する問題がある。
【０００８】
また、分離膜の二次側から一次側へ逆圧洗浄を行う方法も提案されている（特許文献５）が、分離膜の目詰まりは低減できるものの、発酵液を分離膜の逆圧洗浄液により希釈するために、ろ過液中の変換後物質物濃度が低くなり生産効率が低下し、さらに後工程で分離する水分量が増加するので非効率となる問題がある。
【０００９】
分離膜の２次側から１次側へアルカリなどのｐＨ調整液で逆圧洗浄を行う方法も提案されている（特許文献６）が、アルカリなどを使用することで分離膜の目詰まりを防止する効果は大きいが、所定量以上のｐＨ調整液を逆圧洗浄する必要があり、分離膜の逆圧洗浄液により発酵液を希釈するために、ろ過液中の変換後物質濃度が低くなり生産効率が低下し、さらに後工程で分離する水分量が増加するので非効率となる問題がある。
【００１０】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。
【００１１】
すなわち、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜でろ過し、ろ液から生産物を回収すると同時にろ過された微生物や培養細胞を発酵液に環流させ、発酵液中の微生物や培養細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特公平７−１２１２１６号公報
【特許文献２】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献３】特開２００５−３３３８８６号公報
【特許文献４】特開２００９−６５９６６号公報
【特許文献５】特公平７−１２３０３号公報
【特許文献６】特開２００８−１６１０７１号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ヒラノ・トシヒコら (Toshihiko Hirao et.al.)、「アプライドマイクロバイアルアンドマイクロバイオロジー」(Appl.Microbiol.Biotechnol.),32,269-273(1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高い生産性を維持することができる連続発酵による化学品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明は、下記（１）〜（３）の構成からなる。
【００１６】
（１）変換前物質を含んだ原液を発酵槽に導入し、微生物含有液を用いて変換前物質を変換した後、分離膜を用いてろ過し、連続的に非透過液を発酵槽に保持しつつ変換後物質を含んだ透過液を取り出す連続発酵装置の運転方法において、分離膜の２次側から１次側に逆圧洗浄する逆圧洗浄液に含まれる水分量に応じて、変換前物質を含んだ原液に添加する水分量、ｐＨ調整液に添加する水分量、および発酵槽に直接添加する水分量からなる群の中から選ばれる少なくとも１つの水分量を調整し、発酵槽に流入する水分の総量を一定に制御することを特徴とする連続発酵装置の運転方法。
（２）逆圧洗浄液がアルカリ、酸、または酸化剤の何れかを含むことを特徴とする（１）に記載の連続発酵装置の運転方法。
（３）逆圧洗浄をする際に、一旦ろ過を停止し、逆圧洗浄液で分離膜を浸漬することを特徴とする（１）または（２）に記載の連続発酵装置の運転方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、分離膜を用いて発酵液をろ過すると共に、連続的に非透過液を発酵槽に保持しつつ変換後物質を含んだ透過液を取り出す連続発酵運転において、発酵液中の水分を一定に維持しながら、膜ろ過により発生する膜の汚れを効果的に洗浄することにより、安定に低コストで発酵生産効率を著しく向上させることができ、かつ、洗浄廃液および引き抜き培養液が発生しないことで処理費用の低減ができる。
【００１８】
また、本発明によれば、簡便な方法で、長時間にわたり安定して高い生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明で用いられる膜分離型連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、変換前物質を含んだ原液を発酵槽に導入し、微生物含有液を用いて変換前物質を変換した後、分離膜を用いてろ過し、連続的に非透過液を発酵槽に保持しつつ変換後物質を含んだ透過液を取り出す連続発酵装置の運転方法において、分離膜の２次側から１次側に逆圧洗浄する逆圧洗浄液に含まれる水分量に応じて、変換前物質を含んだ原液に添加する水分量、ｐＨ調整液に添加する水分量、および発酵槽に直接添加する水分量からなる群の中から選ばれる少なくとも１つの水分量を調整し、発酵槽に流入する水分の総量を一定に制御することを特徴とする連続発酵装置の運転方法である。
【００２１】
本発明の膜モジュールに用いられる分離膜は、有機膜、無機膜を問わず、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セラミックス製の膜のように耐薬品性を持つ分離膜であれば良い。
【００２２】
本発明で用いられる分離膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが好ましい。また、分離膜の形状は、平膜、中空糸膜などいずれの形状のものも採用することができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、前記の分離膜を用い、膜間差圧を０.１〜２０ｋＰａの範囲にしてろ過処理を行うことができる。
【００２４】
本発明においての膜モジュールは、耐薬品性に優れる材質で作られ、洗浄液をモジュールの２次側から１次側へ注入できる形状であれば良い。
【００２５】
本発明で使用される微生物や培養細胞の発酵原料、すなわち変換前物質は、発酵培養する微生物や培養細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよい。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地等が好ましく用いられる。前記発酵培養する微生物や培養細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものを一部含む液体であれば、例えば廃水または下水も、そのまま、または発酵原料を添加して使用してもよい。
【００２６】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉、澱粉加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ケーンジュース、甜菜糖蜜またはケーンジュースからの抽出物もしくは濃縮液、甜菜糖蜜またはケーンジュースのろ過液、シラップ（ハイテストモラセス）、甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖、菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された精製糖、更には酢酸やフマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなどが使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００２７】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００２８】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜使用することができる。
【００２９】
本発明において、微生物の発酵は、通常、ｐＨが４〜８で温度が２０〜６５℃の範囲で行うことができる。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。
【００３０】
培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を好適には２１％以上に保つ、発酵液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００３１】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続発酵法は、管理上は、通常、単一の発酵槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続発酵法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。その場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続発酵を行っても、発酵生産物の高生産性は得られる。
【００３２】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、真核細胞または原核細胞が用いられ、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、乳酸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００３３】
本発明で用いられる真核細胞の最も際立った特徴は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持ち、細胞核（核）を有さない原核生物とは明確に区別される。本発明では、その真核細胞のうちで更に好ましくは酵母を好ましく用いることができる。本発明において好適な酵母としては、例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母とサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母が挙げられる。
【００３４】
本発明で用いられる原核細胞の最も際立った特徴は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造をもたないことであり、細胞核（核）を有する真核生物とは明確に区別される。本発明では、その真核細胞のうちで乳酸菌を好ましく用いることができる。
【００３５】
本発明の製造方法で得られる化学品、すなわち変換後物質は、上記の微生物や培養細胞が発酵液中に生産する物質である。化学品としては、例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオール、カダベリンおよびグリセロール等が挙げられる。また、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸等を挙げることができ、核酸であればイノシン、グアノシンおよびシチジン等を挙げることができる。
【００３６】
また、本発明の製造方法で得られる変換後物質は、化成品、乳製品、医薬品、食品または醸造品のうち、少なくとも１種を含む流体物、または排水であることが好ましい。ここで化成品としては、例えば、有機酸、アミノ酸および核酸のように、膜分離ろ過後の工程により化学製品を作ることに適用可能な物質、乳製品としては、例えば、低脂肪牛乳など、膜分離ろ過後の工程により乳製品として適用可能な物質、医薬品としては、例えば、酵素、抗生物質、組み換えタンパク質のように、膜分離ろ過後の工程により医薬品を作ることに適用可能な物質、食品としては、例えば、乳酸飲料など、膜分離ろ過後の工程により食品として適用可能な物質、醸造品としては、例えば、ビール、焼酎など、膜分離ろ過後の工程によりアルコールを含む飲料として適用可能な物質、排水としては、例えば、食品洗浄排水、乳製品洗浄排水などの生産品洗浄後の排水や、有機物を豊富に含む家庭排水などが挙げられる。
【００３７】
本発明で乳酸を製造する場合、真核細胞であれば酵母、原核細胞であれば乳酸菌を用いることが好ましい。このうち酵母は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を細胞に導入した酵母が好ましい。このうち乳酸菌は、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する乳酸菌を用いることが好ましく、更に好ましくは対等収率として８０％以上の乳酸菌であることが好適である。
【００３８】
本発明で乳酸を製造する場合に好ましく用いられる乳酸菌としては、例えば、野生型株では、乳酸を合成する能力を有するラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。
【００３９】
また、乳酸の対糖収率や光学純度が高い乳酸菌を選択して用いることができ、例えば、Ｄ−乳酸を選択して生産する能力を有する乳酸菌としてはスポロラクトバチルス属に属するＤ−乳酸生産菌が挙げられ、好ましい具体例として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）が使用できる。さらに好ましくは、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ ２３４９２、ＡＴＣＣ ２３４９３、ＡＴＣＣ ２３４９４、ＡＴＣＣ ２３４９５、ＡＴＣＣ ２３４９６、ＡＴＣＣ ２２３５４９、ＩＡＭ１２３２６、ＩＡＭ １２３２７、ＩＡＭ １２３２８、ＩＡＭ １２３２９、ＩＡＭ １２３３０、ＩＡＭ １２３３１、ＩＡＭ １２３７９、ＤＳＭ ２３１５、ＤＳＭ ６４７７、ＤＳＭ ６５１０、ＤＳＭ ６５１１、ＤＳＭ ６７６３、ＤＳＭ ６７６４、ＤＳＭ ６７７１などとスポロラクトバチルス・イヌリナスＪＣＭ ６０１４などが挙げられる。
【００４０】
Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００４１】
本発明において、微生物や培養細胞の発酵液を膜モジュール中の分離膜でろ過処理する際の膜間差圧は、微生物や培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にしてろ過処理することが重要である。膜間差圧は、好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａの範囲である。上記膜間差圧の範囲を外れた場合、原核微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
【００４２】
ろ過の駆動力としては、発酵液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホン、またはクロスフロー循環ポンプにより分離膜に膜間差圧を発生させることができる。また、ろ過の駆動力として分離膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよい。また、クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができる。更に、発酵液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００４３】
従来は、逆圧洗浄により発酵槽に水分が流入した場合、発酵槽での発酵液容量を一定に保つ必要があるため、逆圧洗浄により流入した水分量だけ、変換前物質を含んだ原液またはｐＨ調整液を減量する必要があった。通常、ｐＨ調整液の添加量は少ないため、変換前物質を含んだ原液の量を減らす必要があるが、この場合、発酵の原料である変換前物質を減量するため、変換後物質の生産量が減少する問題があった。
【００４４】
そこで、本願発明者らは、変換前物質を含んだ原液に含まれる水分量、あるいはｐＨ調整液に含まれる水分量を予め少なくする、すなわち、変換前物質を含んだ原液、あるいはｐＨ調整液の濃度を予め高めておいて、別途水分を添加することによって発酵槽に流入する水分の総量を一定に制御することを着想した。そこから、逆圧洗浄液に含まれる水分量に応じて、変換前物質を含んだ原液に添加する水分量、ｐＨ調整液に添加する水分量、および発酵槽に直接添加する水分量からなる群の中から選ばれる少なくとも１つの水分量を調整し、発酵槽に流入する水分の総量を一定に制御する、本願発明を見出すに至ったものである。
【００４５】
本発明によれば、逆圧洗浄によって発酵槽に流入する水分量が多い場合には、変換前物質を含んだ原液の添加量を一定に保ったまま添加する水分量を少なくし、また逆圧洗浄によって発酵槽に流入する水分量が少ない場合には、変換前物質を含んだ原液の添加量を一定に保ったまま添加する水分量を多くすることで、逆圧洗浄によって発酵槽に流入する水分量に関わらず、常に変換前物質を含んだ原液の添加量および発酵槽に流入する水分量を一定に保ったまま運転を継続することが可能となる。
【００４６】
この際、水を添加する箇所としては、変換前物質を含んだ原液の槽に添加しても構わないし、変換前物質を含んだ原液の槽から発酵槽に至るまでの配管から添加しても構わない。同じく、ｐＨ調整液の槽に添加しても構わないし、ｐＨ調整液の槽から発酵槽に至るまでの配管から添加しても構わない。また、発酵槽に直接添加しても構わないし、前記の複数の箇所から添加しても構わない。
【００４７】
発酵槽に直接水を添加する場合、ろ過を行っている際に添加する水分量から、逆圧洗浄時に逆圧洗浄で発酵槽に流入する水分量だけ減らす方法も好ましい。
【００４８】
なお変換前物質は水への溶解性が高く、濃度の高低の変化に対して問題無く対応し発酵することができるものが多い。
【００４９】
ここで、連続運転している発酵液に流入する水分の総量は、変換前物質を含んだ原液に含まれる水分、ｐＨ調整液に含まれる水分、分離膜の２次側から１次側に逆圧洗浄する逆圧洗浄液に含まれる水分、および、添加する水分の物質収支から計算することができる。またカールフィッシャーなどの水分測定装置により水分自体を測定することもできる。
【００５０】
発酵液の水分の総量が少ないと、発酵液中の変換後物質の濃度が高いこと、または発酵液に添加する変換前物質濃度が高いことにより発生する発酵阻害による生産性の低下や、発酵阻害により発酵液に残存する変換前物質がろ過液に含まれて流出し、変換前物質投入に対する収率が低下、コストアップに直結し、生産効率が低下する問題がある。また変換後物質が金属イオンなどとと結合して塩を形成し飽和溶解度以上となり析出し変換後物質の回収が困難になる懸念がある。
【００５１】
このため変換前物質や変換後物質は、発酵に用いる微生物により異なるが、例えば変換前物質が糖類であれば、発酵液中の糖類濃度は５ｇ／Ｌ以下になるように水分量を制御することが望ましい。また例えば、乳酸発酵で中和に水酸化カルシウムを用いる場合は、発酵液中の乳酸濃度は６０ｇ／Ｌ以下になるように水分量を制御することが望ましい。
【００５２】
発酵液の水分の総量が多いと、ろ過量は同じでもろ過液中の変換後物質濃度が低くなるために変換後物質の生産量が低くなる問題がある。生産量を確保しようとろ過量を増加させるには、必要ろ過面積が増加するため、設備費の増加などコストアップする問題がある。また変換後物質濃度も低いため、発酵速度が低く抑えられ、生産性が制限される問題がある。また、水分の総量が多いと、後工程で蒸発法などにより水分を分離するコストが増加する問題がある。
【００５３】
本発明においては、分離膜の逆圧洗浄液として、発酵に大きく阻害しない範囲で、アルカリ、酸または酸化剤を使用することができる。ここで、アルカリは、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などを挙げることができる。酸は、シュウ酸、クエン酸、塩酸、硝酸などを挙げることができる。また酸化剤は、次亜塩素酸塩水溶液、過酸化水素水などを挙げることができる。
【００５４】
また、この逆圧洗浄液は、同時に発酵液のｐＨ調整にも使用することができる。ｐＨ調整は、変換後物質への変換を行う過程で、発酵液のｐＨが上昇または下降することによって、変換後物質への変換速度が低下するのを回避するためにｐＨを所定の範囲に保つために、ｐＨが上昇した場合はｐＨが低下する作用を有する液を、ｐＨが下降した場合はｐＨが上昇する作用を有する液を必要量供給する操作のことである。具体的には、ｐＨセンサー、コントローラー、ポンプ、ｐＨ調整液等を用いる方法を例示できる。
【００５５】
特に有機酸発酵等の物質の変換において、発酵液のｐＨが下降する場合に、ｐＨ調整液としてアルカリ溶液を添加するケースでは、分離膜の洗浄により好適に使用することができる。これは、発酵生産において一般にみられる汚れ、詰まり物は、アルカリ溶液で除去できるものが多く、特にタンパク質などの有機性物質は高いｐＨによって徐々に加水分解され溶解性となるためである。
【００５６】
また、逆圧洗浄液の逆圧洗浄速度は、膜ろ過速度の０．５〜５倍範囲であり、より好ましくは１〜３倍である。逆圧洗浄速度がこの範囲より高いと、分離膜に損傷を与える可能性があり、またこの範囲より低いと洗浄効果が充分に得られないことがある。
【００５７】
ここで、逆圧洗浄とは、分離膜の２次側である多孔性膜処理水側から、１次側である発酵液側へ液体を送ることにより、膜面のファウリング物質を除去する方法である。
【００５８】
逆圧洗浄液の逆圧洗浄周期は、膜差圧および膜差圧の変化により決定することができる。逆圧洗浄周期は、０．５〜１２回／時間の範囲であり、より好ましくは１〜６回／時間である。逆圧洗浄周期がこの範囲より多いと、分離膜に損傷を与える可能性があり、またこの範囲より少ないと、洗浄効果が充分に得られないことがある。
【００５９】
逆圧洗浄液の逆圧洗浄時間は、逆圧洗浄周期、膜差圧および膜差圧の変化により決定することができる。逆圧洗浄時間は、５〜３００秒／回の範囲であり、より好ましくは３０〜１２０秒／回である。逆圧洗浄時間がこの範囲より長いと、分離膜に損傷を与える可能性があり、またこの範囲より短いと、洗浄効果が充分に得られないことがある。
【００６０】
また逆圧洗浄をする際に、一旦ろ過を停止し、逆圧洗浄液で分離膜を浸漬することができる。浸漬時間は、浸漬洗浄周期、膜差圧および膜差圧の変化により決定することができる。浸漬時間は、好ましくは１〜２４時間／回、より好ましくは３〜１２時間／回である。
【００６１】
分離膜を複数系列とし、分離膜を逆圧洗浄液で浸漬洗浄する際に、系列を切り替えて、ろ過が全停止しない様にすることも好ましく採用できる。
【００６２】
洗浄剤保管タンク、洗浄剤供給ポンプ、洗浄剤保管タンクからモジュールまでの配管およびバルブは、耐薬品性に優れるものを使用すれば良い。逆圧洗浄剤の注入は手動でも可能だが、ろ過・逆洗制御装置を設け、ろ過ポンプおよびろ過側バルブ、洗浄剤供給ポンプおよび洗浄剤供給バルブを、タイマーなどにより自動的に制御して注入することが望ましい。
【００６３】
連続発酵の運転においては、微生物発酵槽の微生物濃度をモニタリングすることが望ましい。微生物濃度の測定はサンプルを採取し、測定することでも可能だが、微生物発酵槽に、ＭＬＳＳ測定器など、微生物濃度センサーを設置し、微生物濃度の変化状況を連続的にモニタリングすることが望ましい。
【００６４】
次に、本発明で用いられる連続発酵装置について、図を用いて説明する。
【００６５】
図１は、本発明の逆圧洗浄液の供給方法で用いられる連続発酵装置を例示説明するための概略側面図である。図１は、分離膜モジュールが、発酵槽の外部に設置された代表的な連続発酵装置の例である。図１において、連続発酵装置は、発酵槽１と分離膜モジュール２と洗浄剤供給部で基本的に構成されている。ここで、分離膜モジュール２には、多数の中空糸膜が組み込まれている。また、洗浄剤供給部は、ろ過バルブ１３と洗浄液供給ポンプ１２と洗浄液供給バルブ１４で構成される。前記分離膜モジュールおよび洗浄液供給部については、後に詳述する。また、分離膜モジュール２は、循環ポンプ８を介して発酵槽１に接続されている。
【００６６】
図１において、培地供給ポンプ９によって培地を発酵槽１に投入し、必要に応じて、撹拌装置４で発酵槽１内の発酵液を撹拌し、また、必要に応じて、気体供給装置１５によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置１５で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサー・制御装置５および中和剤供給ポンプ１０によって発酵液のｐＨを調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００６７】
さらに、装置内の発酵液は、循環ポンプ８によって発酵槽１と分離膜モジュール２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵液は、分離膜モジュール２によって微生物と発酵生産物にろ過・分離され、装置系から取り出すことができる。また、ろ過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜モジュール２によるろ過・分離には、循環ポンプ８による圧力によって、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じてろ過ポンプ１１を設け、差圧センサー・制御装置７によって発酵液量を適当に調整することができる。必要に応じて、温度制御装置３によって、発酵槽１の温度を一定に維持することができ、微生物濃度を高く維持することができる。
【００６８】
本発明の洗浄液の供給方法で用いられる洗浄液供給部は、ろ過バルブ１３と洗浄液供給ポンプ１２と洗浄液供給バルブ１４で構成される。
【００６９】
また発酵槽には直接、水を添加することができ、水供給部は、水供給ポンプ１６で構成される。水は滅菌用フィルターを通すなどして無菌化したものを用いる。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、図1の概要図に示す装置を用いた連続発酵の具体的な実施態様について、実施例を挙げて説明する。
【００７１】
実施例１
まず、膜ろ過モジュールを製作した。膜モジュールの製作に使用した中空糸膜は、東レ（株）製加圧式PVDF中空糸膜モジュール“ＨＦＳ１０２０”を解体して、接着固定されていない部分のみを切り出し、得られたPVDF中空糸膜を使用した。分離膜モジュール部材としてはポリカーボネート樹脂の成型品を用いた。作製した膜ろ過モジュールの容量は0.06Lで、膜ろ過モジュールの有効ろ過面積は200平方cmであった。製作した多孔性中空糸膜および膜ろ過モジュールを用いて、実施例１を行った。実施例1における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。
発酵槽容量:2(L)
発酵槽有効容積:1.5(L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン中空糸膜60本（有効長8cm、総有効膜面積 0.020(m2）)
温度調整:37(℃)
発酵槽通気量:窒素ガス0.2(L/min)
発酵槽攪拌速度:600(rpm)
pH調整:3N Ｃａ(ＯＨ)2によりpH6に調整
乳酸発酵培地供給速度:15〜300mL/hrの範囲で可変
発酵液循環装置による循環液量:3.5(L/min)
膜ろ過流量:0.1(L/h)
膜ろ過流量制御:吸引ポンプによる流量制御
間欠的なろ過処理：ろ過処理(9分間)〜ろ過停止処理(1分間)の周期運転
アルカリ逆洗：非ろ過処理(1分間)時に実施。アルカリは0.01N Ｃａ(ＯＨ)2を使用。
【００７２】
培地は高圧蒸気滅菌(121℃、15分)して用いた。微生物として  Sporolactobacillus laevolacticus  JCM2513（SL株）を用い、変換前物質である培地として表1に示す組成の乳酸発酵培地を用い、変換後物質である乳酸の濃度の評価には、下記に示したHPLCを用いて以下の条件下で行った。
【００７３】
【表１】
2011193787.tif 000003
【００７４】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：5 mM  p-トルエンスルホン酸（0.8 mL/min）
反応相：5 mM  p-トルエンスルホン酸、20 mM  ビストリス、0.1 mM  EDTA・2Na（0.8 mL/min）
検出方法：電気伝導度
カラム温度：45℃
なお、乳酸の光学純度の分析は、以下の条件下で行った。
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：1 mM 硫酸銅水溶液
流速：1.0 mL/分
検出方法 ：UV 254 nm
温度 ：30℃
L-乳酸の光学純度は、次式（ｉ）で計算される。
光学純度（％）＝100×（L-D）／（D＋L）  ・・・（ｉ）
また、D-乳酸の光学純度は、次式（ｉｉ）で計算される。
光学純度（％）＝100×（D-L）／（D＋L）  ・・・（ｉｉ）
ここで、LはL-乳酸の濃度を表し、DはD-乳酸の濃度を表す。
【００７５】
培養は、まずSL株を試験管で5mLの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地100mLに植菌し、500mL容坂口フラスコで24時間、30℃で振とう培養した(前々培養)。前々培養液を、図1に示す連続発酵装置の1.5Lの発酵槽に培地を入れて植菌し、付属の攪拌装置4によって攪拌し、発酵槽1の通気量の調整、温度調整、pH調整を行い、循環ポンプ8を稼働させることなく、24時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、循環ポンプ8を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、乳酸発酵培地の連続供給を行い、膜分離型連続発酵装置の発酵液量を1.5Lとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるD−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、ろ過ポンプ11から出てくるろ過量を測定し、膜ろ過量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜ろ過発酵液中の生産されたD−乳酸濃度および光学純度を測定した。
【００７６】
膜ろ過運転は、ろ過ポンプ11を用いて行い、ろ過流量は0〜50時間まではろ過を行わず、50時間からろ過を開始した。9分ろ過、その後1分間ろ過停止を繰り返し行い、アルカリでの逆圧洗浄はろ過停止時に1分間行った。ろ過差圧は差圧計を用いて測定した。
【００７７】
発酵液中の変換後物質である乳酸濃度が60g/Ｌ以下になるように変換前物質を含む原液と逆圧洗浄液に含まれる水分を制御することとし、逆圧洗浄液に含まれる水分量に相当する17g/hrを減量するため、変換前物質を含む原液の添加量を75g/hrから58g/hrへ、変換前物質量は8g/hrで同量として、水分量を67g/hrから50g/hrに減らした。ここで計算の簡素化のため、逆圧洗浄液量はアルカリを含むが、組成のほとんどが水であることから全てを水として計算した。また乳酸発酵培地のグルコース等の水以外の成分に含まれる水分は無しとして計算した。
【００７８】
得られた実験結果を表2に示す。その結果、連続発酵を570時間、膜ろ過差圧を安定的に維持して運転することができ、効果的な分離膜洗浄を行うことが可能であった。また、乳酸生産速度も最大2.7g/L/hrと効率的な生産をすることが可能であった。
【００７９】
【表２】
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【００８０】
比較例１
実施例１の比較対象として、逆圧洗浄無しでろ過を連続的に行い、その他は同様の条件でＤ−乳酸の連続発酵を行った結果、連続発酵230時間で膜差圧が上昇し運転が困難となった。また、乳酸生産速度も最大0.8g/L/hrと低かった。表２に実験結果を示す。
【００８１】
比較例２
実施例１の比較対象として、9分ろ過、その後1分間停止を繰り返し行い、逆圧洗浄は無しで、その他は同様の条件でＤ−乳酸の連続発酵を行った結果、連続発酵430時間で膜差圧が上昇し運転が困難となった。また乳酸生産速度は最大0.9g/L/hrと低かった。表２に実験結果を示す。
【００８２】
比較例３
実施例１の比較対象として、9分ろ過、その後1分間停止を繰り返し行い、逆圧洗浄は0.01N Ｃａ(ＯＨ)2を使用して行った。変換前物質を含む原液の水分は表１のままで、水分の調整は無しで、変換前物質を含む原液の添加量を、75g/hrから58g/hr、水分の添加量としては67g/hrから53g/hr、変換前物質の添加量を8g/hrから6g/hrに減らした。その他は同様の条件でＤ−乳酸の連続発酵を行った結果、連続発酵570時間まで運転できたが、乳酸生産速度は最大1.9g/L/hrと低かった。表２に実験結果を示す。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、簡便な方法で、発酵液中の水分を一定に維持しながら、膜ろ過により発生する膜の汚れを効果的に洗浄することにより、安定に低コストで発酵生産効率を著しく向上させることができ、かつ、洗浄廃液および引き抜き培養液から発生する処理費用の低減ができる。広く発酵工業において、発酵生産物を効率的に安定に生産することが可能となる。
【符号の説明】
【００８４】
１  発酵槽
２  分離膜モジュール
３  温度制御装置
４  攪拌装置
５  pHセンサー・制御装置
６  レベルセンサー・制御装置
７  差圧センサー・制御装置
８  循環ポンプ
９  培地供給ポンプ
１０  中和剤供給ポンプ
１１  ろ過ポンプ
１２  洗浄剤供給ポンプ
１３  ろ過バルブ
１４  洗浄剤バルブ
１５  気体供給装置
１６  水供給ポンプ
【図１】
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