(57)【要約】【課題】ドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤、及び当該化合物を有効成分として含有する美白剤。2011105666.tif 000009（式中、Ｒは炭素数１〜５のアシル基を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【化１】
2011105666.tif 000007
（式中、Ｒは炭素数１〜５のアシル基を表す。）
【請求項２】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する美白剤。
【化２】
2011105666.tif 000008
（式中、Ｒは炭素数１〜５のアシル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから酵素チロシナーゼの作用によって生合成される。このメラニン生合成に関わる酵素であるチロシナーゼに変異が生じると、皮膚、毛髪のメラニン色素の形成が異常となることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
メラニン生合成において重要な役割を果たすチロシナーゼは、美白素材の標的物質としても有用であると考えられており、従来からチロシナーゼに注目した美白素材の探求がなされている。チロシナーゼは、具体的には、チロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びDHI活性を有し、チロシン及びドーパを前駆体としたメラニン合成反応を触媒している。そのため、チロシナーゼ酵素活性を検討する際に、例えばドーパオキシダーゼ活性等を指標として用いることができ、実際に、ドーパオキシダーゼ活性は、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている（例えば、非特許文献２参照）。この手法によれば、メラノサイト内のドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制する物質を評価することができる。
【０００４】
このように従来から、チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制しうる物質、産生したメラニンを減少しうる物質等の探求がなされ、美白成分としてそれらの物質の使用が検討されてきた。例えば、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】King  RA．Oetting  WS．Hearing  VJ．In  Metabolic  bases  of  inherited  disease（Scriver  CR．Beaudet  AL．Sly  WS．Valle  D.，eds.)，McGraw-Hill，New  York，4353-4392，1995
【非特許文献２】Wrathall  JR．et  al.，JCB  1973  57：406-423
【非特許文献３】美白戦略（南江堂）ＩＶ．，美白剤の薬理と臨床，ｐ95-115
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができるドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン生成を抑制する美白剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題に鑑み、美白作用を有する新規素材を探求すべく鋭意検討を行った。その結果、下記一般式（１）で表される化合物がドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することを見い出し、該化合物が新規の美白成分として有用であるとの知見を得た。本発明はこれに基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供する。
【０００９】
【化１】
2011105666.tif 000002
（式中、Ｒは炭素数１〜５のアシル基を表す。）
【００１０】
また、本発明は、前記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する美白剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤は、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する前記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する。そのため、本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することができ、チロシナーゼによって生成されるメラニンを抑制し、シミ・ソバカスや日焼け後の色素沈着等を予防又は防止効果を奏しうるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤は、下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する。
【００１３】
【化２】
2011105666.tif 000003
【００１４】
一般式（１）中、Ｒは炭素数１〜５のアシル基を表す。
Ｒとしては、炭素数１〜３のアシル基が好ましく、炭素数２のアシル基がより好ましい。Ｒとして具体的には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基等が挙げられ、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基が好ましく、アセチル基がより好ましい。なお、Ｒがアセチル基である一般式（１）で表される化合物は、テルペン類の１種のトウセンダニン（Toosendanin）である。
一般式（１）で表される化合物は、下記の互変異性をとりうるが、本発明の一般式（１）で表される化合物においては、その両方の互変異性体が包含される。
【００１５】
【化３】
2011105666.tif 000004
【００１６】
本発明に用いる前記一般式（１）で表される化合物の製造方法としては、特に限定されず、化学合成したものを用いてもよく、天然物由来の材料から抽出や精製等したものであってもよい。また、試薬として市販されているものを用いることもできる。
試薬としては、ＡｖａＣｈｅｍ社（ＵＳＡ）から市販されているもの等を利用できる。
【００１７】
天然物由来の材料から前記一般式（１）で表される化合物を得る方法としては、例えば、トウセンダン（学名：Melia toosendan  Sieb.  et  Zucc.）、センダン（学名：Melia azedarach）、チャンチン（学名：Toona sinensis）等の植物から単離することができる。
これらの植物は、その全ての任意の部分（上記植物の全木、全草、根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子等）が使用可能である。特に、トウセンダンから単離する場合は、その樹皮、種子又は果実を用いることが好ましい。また、トウセンダンの果実を基原植物として得られた生薬、川楝子（センレンシ）を用いることもできる。センダンから単離する場合は、その樹皮を用いることが好ましい。また、センダンの樹皮を基原植物として得られた生薬、苦楝皮（クレンピ）を用いることもできる。チャンチンから単離する場合は、その樹皮を用いることが好ましい。
また、これらの各植物又は各部位を適宜組み合わせて用い、前記一般式（１）で表される化合物を単離することもできる。
【００１８】
これらの植物から、前記一般式（１）で表される化合物を単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、上述した植物を適当な溶媒を用いて抽出し、得られた植物抽出物からクロマトグラフィー等の手法により一般式（１）で表される化合物を単離する方法が挙げられる。
植物抽出物の調製には、上記植物をそのまま用いてもよく、乾燥粉砕して用いることもできる。抽出に用いる溶媒としては、通常植物成分の抽出に用いられるもの、例えば水、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール及びこれらの混合溶液等を用いることができる。また抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば上記植物を５〜８０℃で２時間〜６０日間浸漬又は加熱還流すればよい。
具体的な抽出、単離法としては、後述の実施例で示す方法を用いることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
後述の実施例で実証しているように、前記一般式（１）で表される化合物は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制する。そのため、該化合物を含有する本発明の美白剤は、チロシナーゼ活性を抑制でき、皮膚におけるメラニン産生を抑制し美白効果を奏するものである。また、前記一般式（１）で表される化合物はドーパオキシダーゼ活性抑制剤又はチロシナーゼ活性抑制剤として用いることもできる。
特表２００６−５１４６５７号公報には、トウセンダニンを含有する組成物がシワの予防・改善に用いられることが開示されている。また、生薬の川楝子（センレンシ）や苦楝皮（クレンピ）には駆虫作用があることが知られていた。しかしながら、前記一般式（１）で表される化合物がドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制する作用を有し、美白成分として有用であることは、本発明者らによって新たに得られた知見である。
なお、本発明において「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００２０】
本発明において、前記一般式（１）で表される化合物はそのままドーパオキシダーゼ活性抑制剤又は美白剤として用いてもよい。または、上記抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えて用いてもよい。この場合、前記一般式（１）で表される化合物の量は特に制限されないが、前記一般式（１）で表される化合物が０．００００１〜３質量％含まれるのが好ましく、０．０１〜１質量％含まれるのがより好ましい。
【００２１】
特に、前記一般式（１）で表される化合物を美白剤として用いる場合、該化合物に加えて、他の美白成分を加えて用いてもよい。本発明の美白剤を、他の美白成分等とともに組成物として用いる場合、前記一般式（１）で表される化合物の量は特に制限されないが、前記一般式（１）で表される化合物が０．００００１〜３質量％含まれるのが好ましく、０．０１〜１質量％含まれるのがより好ましい。
【００２２】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤は、皮膚外用剤の形態で使用することができる。「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚に適用されるものを意味し、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
皮膚外用剤の形態で使用する場合には、前記一般式（１）で表される化合物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、高分子化合物、防腐剤、前述した美白成分以外の薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。また、前記一般式（１）で表される化合物を含有する皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり０．１〜５μｇ、液状製剤の場合、同じく０．１〜１０μｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
合成例
トウセンダンの果実（センレンシ、新和物産社製）８００ｇを、８Ｌの５０％エタノールで２０〜３５℃、７日間抽出し、溶媒を濃縮したところ、抽出固形分１２３．５ｇが得られた。得られた抽出固形分を、ドーパオキシダーゼ活性を指標に分画を行なった。水と酢酸エチルを用いて液々分配を行なったところ、酢酸エチル層２０．７８ｇ（収率１６．８％）に活性が集約した。酢酸エチル層をさらにシリカゲルカラムにより分画を行なったところ、画分（１）７．４９ｇ（収率６．１％）得た。さらにこの画分を、シリカゲルカラムを用いて分画を行い、画分（２）２．７８ｇ（収率２．３％）が得られた。次に、この画分をＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア社製：ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  ＬＨ２０）によって分画し、画分（３）１．２８ｇ（収率１．０％）を得た。この内３４０ｍｇをＨＰＬＣで分画したところ、画分（４）１６４．８ｍｇ（収率０．４８％）を得た。さらにこの内２０ｍｇを用いてＨＰＬＣで分画を行なったところ、画分（５）１．４ｍｇ（収率０．０３％）が得られた。この画分（５）を、ＮＭＲを用いて構造解析を行った。なお、ＮＭＲによる構造解析には、試薬として市販されているトウセンダニン（ＡｖａＣｈｅｍ社製）を比較用として用いた。ＮＭＲによる構造解析の結果を表１に示す。
その結果、トウセンダンから単離された活性成分は下記表１に示す構造を有する化合物であり、この化合物はトウセンダニン（toosendanin）であると同定した。なお、表１中、Ａｃはアセチル基を表す。
【００２５】
【表１】
2011105666.tif 000005
【００２６】
試験例  ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human  Melanocyte  Growth  Supplement）（いずれもCascade  Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
【００２７】
試料として上記合成例で単離した化合物トウセンダニンを終濃度１００ｎＭとなるように添加した。また、参考用試料として、コウジ酸をそれぞれ終濃度１０μＭ，１ｍＭとなるように添加したものを作製した。コウジ酸は、チロシナーゼに対して高い阻害活性を有する美白成分として公知のものである。
最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００２８】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）  ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）          ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）                ０．５体積％
ハイドロコーチゾン                    ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン                            ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン                      ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン                              ５μｇ／ｍｌ
【００２９】
培養終了後、メラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder  A．J.，Harris  H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００３０】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン  ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を表２に示す。なお、ドーパオキシダーゼ活性の値は、各試料を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００３１】
【表２】
2011105666.tif 000006
【００３２】
表２の結果から明らかなように、トウセンダンから単離されたトウセンダニンを添加した系では、ドーパオキシダーゼ活性が大幅に低下しており、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができることがわかった。特に、公知の美白成分であるコウジ酸と比較して、極めて低い濃度でありながらドーパオキシダーゼ活性を抑制することができた。また、前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成に関するチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられている。したがってトウセンダニンは、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制でき、美白成分として有用であることがわかる。
【００３３】
（処方例）
前記製造例で得られた抽出物を有効成分として、下記に示す組成のローション、乳液、美容液、クリーム及びパックを常法により各々調製した。
【００３４】
１．ローションの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
トウセンダニン                                                        ０・１
１，３−ブチレングリコール                                            ８．０
グリセリン                                                            ５．０
エタノール                                                            ３．０
カミツレエキス                                                        ３．０
キキョウエキス                                                        １．０
チョウジエキス                                                        １．０
キサンタンガム                                                        ０．１
ヒアルロン酸                                                          ０．１
リン酸二ナトリウム                                                    ０．１
リン酸二水素ナトリウム                                                ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド                                          ２．０
精製水                                                                残部
香料                                                                  適量
防腐剤                                                                適量
【００３５】
２．乳液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
トウセンダニン                                                        ０．５
カミツレエキス                                                        １．０
キキョウエキス                                                        １．０
アルテアエキス                                                        ２．０
スクワラン                                                            ３．０
オリブ油                                                              ３．０
グリセリン                                                            ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40）  １．０
カルボキシビニルポリマー                                              ０．２
水酸化カリウム                                                        ０．１
キサンタンガム                                                        ０．２
エデト酸二ナトリウム                                                  ０．０２
精製水                                                                残部
防腐剤                                                                適量
【００３６】
３．美容液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
トウセンダニン                                                        ０．５
カミツレエキス                                                        １．０
キキョウエキス                                                        １．０
チョウジエキス                                                        １．０
カルボキシビニルポリマー                                              ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                              ０．２
水酸化カリウム                                                        ０．２
キサンタンガム                                                        ０．１
ヒアルロン酸                                                          ０．２
クエン酸ナトリウム                                                    ０．１５
クエン酸                                                              ０．０３
グリセリン                                                          １０．０
１，３−ブチレングリコール                                            ５．０
エデト酸二ナトリム                                                    ０．０５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量
【００３７】
４．クリームの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
トウセンダニン                                                        １・０
カミツレエキス                                                        ２．０
キキョウエキス                                                        ２．０
チョウジエキス                                                        ２．０
メチルポリシロキサン                                                  ３．０
スクワラン                                                            ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール                                    ３．０
ステアリルアルコール                                                  １．５
セタノール                                                            １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60）  ０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                              ０．３
水酸化カリウム                                                        ０．１５
キサンタンガム                                                        ０．１
エデト酸二ナトリウム                                                  ０．０５
精製水                                                                残部
防腐剤                                                                適量
香料                                                                  適量
【００３８】
５．パックの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
トウセンダニン                                                      １・０
カミツレエキス                                                      ２．０
キキョウエキス                                                      １．０
ジプロピレングリコール                                              ３．０
ポリエチレングリコール（平均分子量１５００）                        ２．０
１，３−ブチレングリコール                                          ５．０
グリセリン                                                          ５．０
クエン酸ナトリウム                                                  ０．５
ポリビニルアルコール                                                １０
乳酸                                                                ０．３
ポリオキシエチレンデシルテトレデシルエーテル                        ０．５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量