(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒゼンダニ由来核酸の特異的かつ高感度な検出方法およびこの方法に使用されるオリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定の配列またはその相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを使用して検体中の核酸を２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅して検出するヒゼンダニ由来の核酸の検出方法、および前記オリゴヌクレオチドを含むヒゼンダニ由来核酸の検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号３〜８のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む一組のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、配列番号３、５および７のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、そして配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、配列番号４、６および８のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３記載の一組のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１１〜１６のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１１、１３および１５のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１２、１４および１６のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを含む一組のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１個の請求項１、２もしくは５記載のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１個の請求項３、４もしくは６記載の一組のオリゴヌクレオチドを使用して検体中の核酸を増幅する工程、および増幅された核酸を検出する工程を含む、ヒゼンダニ由来核酸の検出方法。
【請求項８】
核酸の増幅が２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
１回目のＰＣＲが配列番号３または５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４または６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われ、２回目のＰＣＲが配列番号７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１回目のＰＣＲが配列番号９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われ、２回目のＰＣＲが配列番号１１、１３または１５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１２、１４または１６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１個の請求項１、２もしくは５記載のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１個の請求項３、４もしくは６記載の一組のオリゴヌクレオチドを含む、ヒゼンダニ由来核酸の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疥癬の診断方法に関する。詳細には、本発明は、ヒゼンダニ由来核酸の特異的かつ高感度な検出方法およびこの方法に使用されるオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
疥癬は、ヒゼンダニ（Sarcoptes scabiei）が皮膚の角質層に寄生して起きる皮膚感染症であり、疥癬にかかると発疹とともに強いかゆみの症状が見られる。ヒトにおけるビゼンダニに起因する疥癬の侵襲は世界中に分布しており、そして最近の疥癬に関する問題は主に貧困および過密状態に関係している。その臨床症状は定型的であるが、免疫不全患者、精神障害者、高齢患者などにおいて臨床症状は変化しうる。したがって、そのような患者（しばしばナーシングホームなどに居住している）の診断は困難な場合がある。この疾患の早期の同定は、罹患者の選択的な治療を可能にし、伝染および集団治療の必要性を減じ、ダニの薬剤抵抗性を高める可能性を制限し、そして感染領域内の集団において疥癬蔓延をおさえる新たな手段を提供する。
【０００３】
現在、疥癬の診断は、皮膚の一部を採取して得られる皮膚擦過の顕微鏡下での検査によるダニの直接的な確認によって行われている。しかし、実際にダニを発見することは容易ではなく、皮膚症状からは疥癬が疑われる例であってもダニ虫体が発見できない例も多い。近年では、ダーマスコピーが、手技に未熟であっても、高い特異性で感度が高い技術であると報告されている。しかし、皮膚に存在するダニの数は少ないので、顕微鏡検査やダーマスコピーによる診断法の感度は十分ではない。さらに、多発性擦過傷またはプラークを生じる重篤な過敏性反応を呈する患者の場合、これらの診断を行うことは困難となる。
【０００４】
ヒトヒゼンダニに対する抗体の同定に関するいくつかの報告があるが、そのような抗体を用いた方法の感度は低く、疥癬の診断には使用できない。さらに、最近の免疫学的研究により、前記抗体がチリダニ類アレルゲンと交差反応性を示すことが実証された（非特許文献１、２）。
【０００５】
個々のヒゼンダニの遺伝子タイピングを可能にするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくストラテジー（ＤＮＡフィンガープリンティング）が開発されている。このような方法の大部分では、ヒゼンダニのマイクロサテライト遺伝子座に隣接する特有の配列から設計されたプライマーセットを用いた１回のＰＣＲが行われている。近年、皮膚擦過検体中のヒゼンダニＤＮＡを検出するための方法が開発された（非特許文献３）。この方法は、上記のようなヒゼンダニのＤＮＡフィンガープリンティングに使用されていたマイクロサテライト保存配列に基づいて設計されたジゴキシゲニン標識プライマーを使用してＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をビオチン化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート上でペルオキシダーゼを結合させた抗ジゴキシゲニン抗体を使用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出する方法（ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ）である。この文献では、この系の感度が、臭化エチジウム染色したアガロースゲルの分析より高いことが記載されている。しかし、この方法による検出の特異性および感度が、例えば、臨床的に疑わしい疥癬患者（疥癬疑心患者）からの皮膚擦過検体中のヒゼンダニＤＮＡの検出のような目的のために十分であるかどうかは不明である。
【０００６】
このように、疥癬をより特異的かつ高感度に診断できる簡便な方法の提供が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arlian, L.G. et al., Vet. Parasitol., 90:315-326 (2000)
【非特許文献２】Arlian, L.G. et al., J. Med. Entomol., 41:74-77 (2004)
【非特許文献３】Bezold, G. et al., Br. J. Dermatol., 144:614-618 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、疥癬の診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、
［１］配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド；
［２］配列番号３〜８のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、［１］のオリゴヌクレオチド；
［３］配列番号１のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む一組のオリゴヌクレオチド；
［４］配列番号１のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、配列番号３、５および７のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、そして配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、配列番号４、６および８のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである、［３］の一組のオリゴヌクレオチド；
［５］配列番号１１〜１６のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド；
［６］配列番号１１、１３および１５のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１２、１４および１６のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを含む一組のオリゴヌクレオチド；
［７］少なくとも１個の［１］、［２］もしくは［５］のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１個の［３］、［４］もしくは［６］の一組のオリゴヌクレオチドを使用して検体中の核酸を増幅する工程、および増幅された核酸を検出する工程を含む、ヒゼンダニ由来核酸の検出方法；
［８］核酸の増幅が２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる、［７］の方法；
［９］１回目のＰＣＲが配列番号３または５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４または６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われ、２回目のＰＣＲが配列番号７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われる、［８］の方法；
［１０］１回目のＰＣＲが配列番号９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われ、２回目のＰＣＲが配列番号１１、１３または１５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１２、１４または１６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを使用して行われる、［８］の方法；
［１１］少なくとも１個の［１］、［２］もしくは［５］のオリゴヌクレオチド、または少なくとも１個の［３］、［４］もしくは［６］の一組のオリゴヌクレオチドを含む、ヒゼンダニ由来核酸の検出用キット；
が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ヒゼンダニ由来核酸の特異的かつ高感度な検出方法およびこの方法に使用されるオリゴヌクレオチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ネステッドＰＣＲによるヒゼンダニＤＮＡの検出を示す図である。ＤＮＡを、健常な提供者（レーン１および２）、皮膚炎患者（レーン３）、接触性皮膚炎患者（レーン４）、湿疹患者（レーン５）、足白癬患者（レーン６）および疥癬患者（レーン７〜１０）の皮膚擦過検体から精製した。レーンＭは、１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカーを示す。ａ：ＳＭＨ遺伝子を増幅するためのＳＭＨ−ＯＵＴ３およびＳＭＨ−ＯＵＴ４のプライマーセットを用いて行った１回目のＰＣＲの結果を示す。ｂ：ａのＰＣＲ産物を１００倍に希釈したものに対して、ＳＭＨ遺伝子を増幅するためのＳＭＨ−ＩＮ１およびＳＭＨ−ＩＮ２のプライマーセットを用いて行った２回目のＰＣＲの結果を示す。ｃ：ＩＴＳ−２遺伝子を増幅するためのＲＩＢ−１８およびＲＩＢ−３のプライマーセットを用いて行った１回目のＰＣＲの結果を示す。ｄ：ｃのＰＣＲ産物を１００倍に希釈したものに対して、ＩＴＳ−２遺伝子を増幅するためのＲＩＢ−１５３ｆおよびＲＩＢ−３９６ｒのプライマーセットを用いて行った２回目のＰＣＲの結果を示す。ｅ：ヒトβ−グロビン用のプライマーセットを用いて行った１回のＰＣＲの結果を示す。
【図２】ネステッドＰＣＲの特異性を示す図である。チリダニ類ＤＮＡを含んだ健常な提供者の皮膚擦過検体からのＤＮＡ（レーン１、４、７および１０）、ヒゼンダニＤＮＡを含んだ健常な提供者の皮膚擦過サンプルからのＤＮＡ（レーン２、５、８および１１）、および健常な提供者の皮膚擦過サンプルからのＤＮＡ（レーン３、６、９および１２）に対して、チリダニ類ＥＦ−１α用のプライマーセット（レーン１〜３）、ヒゼンダニのＳＭＨ用のプライマーセット（レーン４〜６）およびヒゼンダニのＩＴＳ−２用のプライマーセット（レーン７−９）を用いてネステッドＰＣＲを行った。陽性対照として、ヒトβ−グロビン用のプライマーセットを用いて１回のＰＣＲを行った（レーン１０〜１２）。レーンＭは、１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカーを示す。
【図３】ネステッドＰＣＲの分析感度を示す図である。健常な提供者の皮膚擦過からのＤＮＡ溶液を溶媒として用いて作製したヒゼンダニＤＮＡの三倍希釈系列に対して、ＳＭＨ用またはＩＴＳ−２用のプライマーセットを用いたネステッドＰＣＲ、およびヒトβ−グロビン用のプライマーセットを用いた１回のＰＣＲを行った。図に示した数字は、ヒゼンダニＤＮＡ濃度である。レーンＭは、１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカーを示す。
【図４】疥癬患者から得たダニ陰性皮膚擦過検体におけるヒゼンダニＤＮＡの検出率を示す図である。疥癬患者から得たダニ陰性皮膚擦過検体に対して、ＳＭＨ用またはＩＴＳ−２用のプライマーセットを用いたネステッドＰＣＲを行った。陽性検体のパーセンテージを横軸に示す。棒グラフ中の数字は、陽性（陰影）および陰性（白）の検体数を示す。
【図５】臨床的に疑わしい疥癬患者（疥癬疑心患者）からのダニ陰性皮膚擦過検体のヒゼンダニＤＮＡ検出率を示す図である。疥癬疑心患者から得たダニ陰性皮膚擦過検体に対して、ＳＭＨ用またはＩＴＳ−２用のプライマーセットを用いたネステッドＰＣＲを行った。陽性の検体または患者のパーセンテージを横軸に示す。棒グラフ中の数字は、陽性（陰影）および陰性（白）の検体数または人数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
疥癬は、ヒゼンダニ科のダニであるヒゼンダニ（Sarcoptes scabiei）が皮膚の角質層に寄生して起きる皮膚感染症である。ヒゼンダニの体長は雌が０．４ｍｍ、雄が０．３ｍｍと非常に小さく、肉眼では観察できない。交尾したヒゼンダニの雌は、皮膚の角質層に疥癬トンネルと呼ばれる穴を掘りそこで産卵する。疥癬にかかると、腕、腹部、背部、股関節、脚領域などに発疹とともに強いかゆみの症状が見られる。一般的な疥癬は通常疥癬と呼ばれ、より重篤な疥癬はノルウェー疥癬、角化型疥癬などと呼ばれる。疥癬の治療にはイベルメクチンなどの薬剤が使用される。
【００１３】
本発明において使用する「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。好ましくは、核酸はＤＮＡである。ＲＮＡを増幅する場合、好ましくは逆転写反応によって相補的ＤＮＡを合成し、増幅反応に供する。
【００１４】
本発明において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのオリゴマーを指す。好ましくは、オリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドからなるが、標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを妨げない限り、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドなどデオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチドを含めてもよい。オリゴヌクレオチドを核酸増幅反応においてプライマーとして使用することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用することができる。
【００１５】
オリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチドの有する配列、使用目的（プライマー、プローブ）などに応じて変動しうる。長さは、例えば少なくとも１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドであり、そして例えば１００ヌクレオチド以下、好ましくは５０ヌクレオチド以下、より好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
【００１６】
オリゴヌクレオチドを検出のために標識してもよい。任意の標識、例えばビオチン標識、ジゴキシゲニン標識などを使用することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドを常法に従って、例えば市販の合成装置を使用して合成することができる。また、当業者は、オリゴヌクレオチドの適切な配列を常法に従って、例えばGenetyx（ゼネティックス社）などのソフトウェアを使用して選択することができる。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドを、ヒゼンダニ由来核酸を増幅するためのプライマーとして、またはヒゼンダニ由来核酸を特異的に検出するためのプローブとして使用することができる。
【００１８】
主にヒゼンダニの遺伝子タイピングを目的とした従来の方法の大部分では、ヒゼンダニのマイクロサテライト遺伝子座に隣接する特有配列から設計されたプライマーが使用されている。チリダニ類は、ヒト皮膚に付着している可能性がもっとも高いダニであり、有力なアレルゲンの供給源でもあるとの研究結果が報告されている。ヒゼンダニのｃＤＮＡライブラリー中にチリダニ類アレルゲンのホモログをコードするｃＤＮＡが含まれていることから、ヒゼンダニ遺伝子とチリダニ類遺伝子との配列類似性が示唆されているが（Fischer, K. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 68:61-64 (2003)）、上記のようなマイクロサテライトマーカーを用いたヒゼンダニ遺伝子の検出において、ヒゼンダニとチリダニ類との区別が可能かどうかの検討はなされていなかった。さらに、マイクロサテライトのマーカーを使用したＰＣＲ法においては、ヌル対立遺伝子の頻度が高いという報告もあるので（Walton, S.F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 61:542-547 (1999)）、この方法では解析不能な場合が多く存在する可能性がある。また、上記のマイクロサテライトマーカーの使用に関する報告の多くは、寄生しているダニの数が通常疥癬に比較して多い角化型疥癬の患者に関するものなので、通常疥癬患者や臨床的に疑わしい疥癬患者（疥癬疑心患者）などのようにダニの数が少ない場合に適用可能であるかどうかは不明である。
【００１９】
１つの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、リボソームＲＮＡ遺伝子に存在する第２内部転写スペーサー（second internal transcribed spacer；ＩＴＳ−２）という領域に特異的な配列を有する。この遺伝子領域はダニの系統発生の関係や種特異性を研究するために使用されており（Berrilli, F. et al., Parasitol. Res., 88:772-777 (2002)；Zahler, M. et al., Int. J. Parasitol., 29:759-766 (1999)；Alasaad, S. et al., Vet. Parasitol., 159:181-185 (2009)）、ヒゼンダニをチリダニ類と有効に区別できると考えられる。別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ミオシンＨ鎖（ＳＭＨ）遺伝子に特異的な配列を有する。ここで、ＳＭＨ遺伝子は本発明者らによってクローニングされ、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する。上記のようにヌル対立遺伝子が存在する可能性があるマイクロサテライト遺伝子に比べ、ヒゼンダニの体内を構成するＳＭＨの遺伝子は、ヒゼンダニの存在を確認する目的に使用する遺伝子として有用である。これらのいずれのオリゴヌクレオチドを使用したネステッドＰＣＲでも、チリダニ類ＤＮＡを増幅することなく、ヒゼンダニＤＮＡを特異的に増幅することができる。このように、これらのオリゴヌクレオチドを使用して、チリダニ類ＤＮＡとヒゼンダニＤＮＡを区別することができる。
【００２０】
１つの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３〜８のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。これらのオリゴヌクレオチドをＳＭＨ遺伝子の検出に使用することができる。ここで、配列番号３、５および７のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１のヌクレオチド配列の８５５〜８７５位、８６５〜８８６位および９６４〜９８３位に対応し、配列番号４、６および８のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１のヌクレオチド配列の１５２３〜１５４４位、１５１７〜１５３８位および１３２８〜１３４８位の相補配列に対応する。
【００２１】
本発明の１つの実施態様によれば、配列番号１のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む一組のオリゴヌクレオチドが提供される。好ましくは、上記一組のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、配列番号３、５または７のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、そして配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列から選択される少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、配列番号４、６および８のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
さらに好ましくは、配列番号５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの対を１回目のＰＣＲ用に、そして配列番号７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの対を２回目のＰＣＲ用に使用した２段階のＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ）を行うことによって、ＳＭＨ遺伝子を高感度かつ特異的に増幅することができる。
【００２３】
１つの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１１〜１６のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。これらのオリゴヌクレオチドをＩＴＳ−２遺伝子の検出に使用することができる。
【００２４】
本発明の１つの実施態様によれば、配列番号１１、１３および１５のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１２、１４および１６のヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを含む一組のオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２５】
さらに好ましくは、配列番号９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの対を１回目のＰＣＲ用に、そして配列番号１３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの対を２回目のＰＣＲ用に使用した２段階のＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ）を行うことによって、ＩＴＳ−２遺伝子を高感度かつ特異的に増幅することができる。
【００２６】
本発明の別の実施態様によれば、上記のオリゴヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドを使用して検体中の核酸を増幅する工程、および増幅された核酸を検出する工程を含む、ヒゼンダニ由来核酸の検出方法が提供される。
【００２７】
本発明の方法のために、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づく任意の核酸増幅方法を使用することができる。好ましくは、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。より好ましくは、増幅は２段階のＰＣＲまたは「ネステッドＰＣＲ」（nested PCR）によって行われる。通常のＰＣＲにおいては、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のヌクレオチド配列から選択される連続したヌクレオチドからなるプライマー（上流プライマー、フォワードプライマー）と他方の鎖（相補鎖）の配列から選択される連続したヌクレオチドからなるプライマー（下流プライマー、リバースプライマー）に挟まれた標的核酸の領域を増幅する（本明細書において１回のＰＣＲともいう）。一方、２段階のＰＣＲまたはネステッドＰＣＲにおいて、１回目のＰＣＲによって増幅された領域中の、プライマー設計のために選択された配列より内側のヌクレオチド配列に対応するプライマー対を使用して、１回目のＰＣＲ産物を鋳型として２回目のＰＣＲを行う。１回目のＰＣＲによって鋳型の量が増加するので、より高い感度での検出が可能になり、そして１回目のＰＣＲ用のプライマー対に特異的な配列を有し、かつ２回目のＰＣＲ用のプライマー対に特異的な配列も有するという要件を満たした配列のみが増幅されるので、より高い特異性での検出が可能になる。
【００２８】
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、チリダニ類ＤＮＡを増幅することなく、ヒゼンダニＤＮＡを特異的に増幅することができるので、本発明の検出方法は、高い特異性を有する。また、核酸を２段階のＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ）により増幅すれば、さらに高い感度でヒゼンダニ由来核酸を検出することができる。本発明の方法による検出限界は、増幅反応に供する検体中の核酸の濃度で表した場合、例えば１ｐｇ／μｌ以下、好ましくは３００ｆｇ／μｌ以下、より好ましくは１００ｆｇ／μｌ以下、例えば１ｆｇ／μｌ以上、好ましくは３ｆｇ／μｌ以上、より好ましくは１０ｆｇ／μｌである。
【００２９】
本発明の方法に供される検体は、疥癬患者または臨床的に疑わしい疥癬患者（疥癬疑心患者）から得られた検体など、ヒゼンダニを含む可能性のある任意の検体である。検体は、例えば、腕、腹部、背部、股関節または脚領域などの患部を安全かみそりの刃などで剃ることにより集められた皮膚擦過である。好ましくは、検体から核酸を抽出、精製した後に増幅のために使用する。核酸の抽出、精製は常法に従って行われ、市販のキットを使用してもよい。
【００３０】
本発明の方法の感度および特異性は高いので、顕微鏡下での検査において皮膚擦過中にヒゼンダニの存在が確認されない、疥癬疑心患者から得られたダニ陰性皮膚擦過検体についても、ヒゼンダニ由来核酸を検出することが可能である。従って、本発明の方法によって、従来法では可能ではなかった潜行性の感染症の発見を効率的に行うことができる。また、本発明の方法によって疥癬をより高感度かつ特異的に診断できるので、イベルメクチン投与の乱用を回避することができ、その結果、イベルメクチン耐性を示すヒゼンダニの発生を抑制できる。
【００３１】
本発明のさらなる実施態様によれば、上記のオリゴヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドを含む、ヒゼンダニ由来核酸の検出用キットが提供される。キットには、核酸の増幅、検出などに使用される任意の成分を含めることができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
材料および方法
皮膚検体
疥癬患者を、顕微鏡下での検査において皮膚擦過中にヒゼンダニが存在するかどうかによって診断した。ダニは検出されなかったが、臨床的に疑わしい疥癬患者（疥癬疑心患者）を、日本皮膚学会が提唱しているガイドラインにそって、臨床皮膚症状および発生の疫学的状態により診断した。疥癬疑心患者の皮膚症状は、疥癬トンネル型や丘疹型であった。疥癬以外の皮膚病患者には、白癬が１０例、湿疹が５例、皮膚炎が３例、他の皮膚疾患が５例含まれた。通常疥癬患者２２例、他の皮膚病患者２３例、健常な提供者３０例、および疥癬疑心患者３８例からの皮膚擦過を本研究で解析した。検体数、平均年齢、性別の情報を表１にまとめる。鹿児島大学の倫理審査委員会から承認された方法により、すべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。皮膚擦過を、腕、腹部、背部、股関節または脚領域を安全かみそりの刃で剃ることにより集めた。これらの検体を、ＤＮＡ精製まで７０％のエタノールに浸し、４℃で保存した。皮膚検体は、重量が１．１ｍｇから１１２．１ｍｇまで（平均４１．０ｍｇ±標準偏差２１．８ｍｇ）であった。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
ヒゼンダニとチリダニ類の採取
ヒゼンダニを、角化型疥癬患者の皮膚擦過から採取した。約１００匹のダニをＤＮＡ精製に使用し、ＤＮＡの濃度をNanoDrop 8000（Thermo Fisher Scientific社）によって測定した。チリダニ類を、７０％のエタノールに浸した家のホコリから採取した。ダニの検体をディッシュに広げ、顕微鏡下で検査した。ダニ虫体を、ピペットで吸い込むことによって拾った。いくつかのチリダニ類ダニを健常な提供者からの皮膚擦過に加え、これらの皮膚擦過検体をＤＮＡ精製に供した。
【００３６】
ＤＮＡ精製
ＤＮＡ精製を、以前の報告（Berrilli, F. et al.（上記））に若干の変更を加えて行った。手短に述べると、検体を液体窒素によって直ちに凍結し、そこに４００μｌの抽出溶液（１％のＳＤＳ、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた。検体を２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ロシュ社）４８μｌとともに５６℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡをフェノール、フェノール／クロロホルム、クロロホルム抽出によって精製し、１ｍｌのエタノールを加えて沈殿させた。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで一度洗浄した後、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０））中に懸濁した。
【００３７】
ヒゼンダニミオシンＨ鎖（ＳＭＨ）ｃＤＮＡのクローニング
ヒゼンダニのｃＤＮＡライブラリーは、D. J. Kemp教授のご好意により供与された（Fischer, K. et al., Biotechniques, 34:250-252, 254 (2003)；Fischer, K. et al.（上記））。ヒゼンダニｃＤＮＡライブラリーが作製されたZAP Express cDNA Synthesis Kit（ストラタジーン社）の説明書に従ってｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させ、ニトロセルロース膜に転写した後、疥癬患者血清に含まれる抗体と反応するクローンをスクリーニングすることによって、１つのクローンをライブラリより得た。陽性クローンのヌクレオチド配列を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencingキット（アプライドバイオシステム社）を使用して決定した。ホモロジー検索を、DNA Database of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトにおいて利用可能なＦＡＳＴＡプログラムを用いて行った。その結果、このクローンのヌクレオチド配列には他の種、例えば旋毛虫（登録番号AY033438）またはアゲハ蝶（登録番号AB264661）のミオシンＨ鎖と類似性があることが明らかとなった。
【００３８】
プライマー
ヒゼンダニミオシンＨ鎖（ＳＭＨ）遺伝子を増幅するためのプライマー配列を、上記で得たＤＮＡ配列情報に基づいて設計した。プライマーＳＭＨ−ＯＵＴ３（フォワード）（配列番号５）およびＳＭＨ−ＯＵＴ４（リバース）（配列番号６）を１回目のＰＣＲのために使用し、そしてＳＭＨ−ＩＮ１（フォワード）（配列番号７）およびＳＭＨ−ＩＮ２（リバース）（配列番号８）を２回目のＰＣＲのために使用した。
【００３９】
１回目のＰＣＲに使用したプライマーＲＩＢ−１８（フォワード）（配列番号９）およびＲＩＢ−３（リバース）（配列番号１０）は、２つのヒゼンダニ属リボソームＲＮＡ遺伝子の間に存在する第２内部転写スペーサー（second internal transcribed spacer；ＩＴＳ−２）遺伝子の増幅を行うために設計されたものである。プライマーＲＩＢ−１５３ｆ（フォワード）（配列番号１３）およびＲＩＢ−３９６ｒ（リバース）（配列番号１６）を２回目のＰＣＲに使用するためにＩＴＳ−２の配列データに基づいて設計した（Berrilli, F. et al.（上記）；Zahler, M. et al.（上記））。
【００４０】
チリダニ類（コナヒョウダニおよびヤケヒョウヒダニ）のＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを伸張因子（elongation factor）1α（ＥＦ−１α）遺伝子配列に基づいて設計した（Klimov, P.B. et al., Mol. Phylogenet. Evol., 47:1135-1156 (2008)）。プライマーＤＥＲ＿ＥＦ１Ａ１（フォワード）（配列番号１７）およびＤＥＲ＿ＥＦ１Ａ２（リバース）（配列番号１８）を１回目のＰＣＲのために使用した。プライマーＤＥＲ＿ＥＦ１Ａ３（フォワード）（配列番号１９）およびＤＥＲ＿ＥＦ１Ａ４（リバース）（配列番号２０）を２回目のＰＣＲのために使用した。プライマーＨ−Ｂ−ＧＬＯＢＩＮ１（フォワード）（配列番号２１）およびＨ−Ｂ−ＧＬＯＢＩＮ２（リバース）（配列番号２２）をヒトβ−グロビンの増幅のために使用した（非特許文献３）。
【００４１】
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）
ＰＣＲ反応の混合液を、１０μｌのGoTaq Green Master Mix（プロメガ社）、蒸留水７μｌ、１μｌの１０μＭフォワードプライマー、１μｌの１０μＭリバースプライマーおよび１μｌのＤＮＡサンプルを加えて調製した。ＰＣＲ反応を、以下のプログラムで実行した。ＰＣＲチューブを１０秒間９６℃で急速に加熱した後、３０秒間９４℃、３０秒間６０℃および９０秒間７２℃の反応を３６サイクル行った。これらのサイクルの後、ＰＣＲチューブを２分間７２℃で加熱し、４℃で保持した。２回目のＰＣＲ反応のために、１０μｌのGoTaq、７μｌの蒸留水、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ１０μＭ）を１μｌずつ、１回目のＰＣＲ反応液の１００倍希釈液を１μｌ加えた。２回目のＰＣＲプログラムは、１回目のプログラムと同様であった。バックグランドが低く、陽性バンドがはっきり現れるように２回目のＰＣＲのサイクル数を決定した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、０．２μｇ／ｍｌ臭化エチジウムでの染色により視覚化した。
【００４２】
ＰＣＲ産物のクローニングと配列決定
ＰＣＲ産物の２％アガロースゲルからの精製をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて行った。精製したＰＣＲ産物を、TA PCR Cloningキット（バイオダイナミック社）を用いてｐＴＡＣ−１ベクターに挿入した。プラスミドにクローン化されたＤＮＡの配列を上記のように決定した。
【００４３】
実施例１：ネステッドＰＣＲによるヒゼンダニ由来核酸の検出
健常な提供者（レーン１〜２）および疥癬以外の皮膚疾患患者（レーン３〜６）から得られた皮膚擦過検体は、ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的とする１回のＰＣＲにおいて陰性であった（図１ａ（ＳＭＨ）および図１ｃ（ＩＴＳ−２））。対照的に、予想される長さのＰＣＲ産物が、疥癬患者からの検体のいくつかで検出された（レーン７〜１０）。さらに、非特異的なＰＣＲ産物が、いくつかの非疥癬患者および疥癬患者の検体で検出された。
【００４４】
ヒゼンダニＰＣＲ検査法の感度および特異性を増すために、ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を対象としたネステッドＰＣＲをヒゼンダニＤＮＡ検出のために使用した（図１ｂ（ＳＭＨ）および図１ｄ（ＩＴＳ−２））。ネステッドＰＣＲにより、疥癬患者の検体で予想される長さのＰＣＲ産物が得られ、健常な提供者や他の皮膚疾患患者ではＰＣＲ産物は検出されなかった。
【００４５】
さらに、ＰＣＲ産物の配列分析により目的の産物であることを確認した。ここで、ヒゼンダニの生息地の差（オーストラリアおよび鹿児島県沖永良部島）による遺伝子多形に起因すると考えられる配列番号１の配列との配列の違いが若干みられた。一例を配列番号２に示す。配列番号２の配列は配列番号１の８８７位から１５１６位に対応する。配列番号１では、１０８１位がＧ、１２２４位がＡ、１４３７位がＣであるのに対して、配列番号２では、１９５位がＴ、３３８位がＧ、５５１位がＡと、３箇所の配列が異なる。
【００４６】
実施例２：ネステッドＰＣＲの特異性の検討
上記のネステッドＰＣＲによってチリダニ類のようなヒゼンダニ以外のダニ種についても非特異的に陽性の結果が得られる可能性を否定するために、健常な提供者からの皮膚擦過検体にチリダニ類またはヒゼンダニを加えて、あるいはダニを加えないで得たサンプルに対してネステッドＰＣＲを行った（図２）。ヒゼンダニの遺伝子（ＳＭＨ（レーン４〜６）およびＩＴＳ−２（レーン７〜９））を標的としたネステッドＰＣＲでは、チリダニ類を含んでいる検体（レーン４、７）は陰性の結果を示したが、チリダニ類の伸張因子１α（ＥＦ−１α）遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲ（レーン１〜３）では同じ検体で陽性の結果が得られた（レーン１）。このように、ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲはヒゼンダニに特異的であることが示された。
【００４７】
実施例３：ネステッドＰＣＲの感度の検討
上記のネステッドＰＣＲにおけるヒゼンダニＤＮＡ検出感度を調べるために、一匹のヒゼンダニから得られたＤＮＡを健常な提供者から得られたＤＮＡ溶液で図３に示した割合の通り希釈し、そのサンプルをネステッドＰＣＲで解析した。ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲでの検出限界はそれぞれ３００ｆｇ／μｌ以下と１００ｆｇ／μｌ以下であった（図３）。
【００４８】
すなわち、これらのプライマーセットを使用したネステッドＰＣＲによって、一匹のダニを皮膚擦過検体に加えたときに約１０００倍の希釈液についてさえヒゼンダニＤＮＡを検出することができたので、ヒゼンダニの小さな断片、卵や糞便からのゲノムＤＮＡが、これらのネステッドＰＣＲで検出されると考えられる。このように、それぞれの遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲが高感度であることが示された。
【００４９】
実施例４：ネステッドＰＣＲによる皮膚擦過検体中に存在するヒゼンダニＤＮＡの検出の感度および特異性
上記のネステッドＰＣＲの疥癬診断への適用可能性を検討するために、さらに多くの疥癬患者、健常な提供者、他の皮膚疾患患者から得られた検体を解析した。２２名の疥癬患者から得られた３１例のダニ陽性皮膚擦過検体をＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲにより解析した結果、すべての検体で陽性の結果が得られた（データは示さず）。一方、これらのネステッドＰＣＲでは、健常な提供者３０例および疥癬以外の皮膚疾患患者２３例から得られた検体でヒゼンダニＤＮＡが陰性であった（データは示さず）。このように、本発明のネステッドＰＣＲが高感度かつ特異的であることがさらに示された。
【００５０】
実施例５：疥癬患者および疥癬疑心患者から採取したダニ陰性皮膚擦過検体におけるヒゼンダニＤＮＡの検出
次に、疥癬患者から採取したダニ陰性皮膚擦過検体においてネステッドＰＣＲによりヒゼンダニＤＮＡの検出を試みた。ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲを行ったところ、５１検体中それぞれ２２検体（ＳＭＨ遺伝子）および３２検体（ＩＴＳ−２遺伝子）についてヒゼンダニＤＮＡ陽性の結果を得た（図４）。ＳＭＨ用のプライマーセットを用いて陽性の結果が得られた検体は全てＩＴＳ−２用のプライマーセットを用いて陽性の結果を与えた。
【００５１】
疥癬と思われる皮膚症状を呈している患者（疥癬疑心患者）から得られたダニ陰性皮膚擦過検体に対してネステッドＰＣＲを行った。ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲにより、９４検体中それぞれ３３検体（ＳＭＨ遺伝子）および５１検体（ＩＴＳ−２遺伝子）についてヒゼンダニＤＮＡ陽性の結果を得た（図５）。ＳＭＨ用のプライマーセットを用いて陽性の結果が得られた検体は全てＩＴＳ−２用のプライマーセットを用いて陽性の結果を与えた。ＤＮＡ配列の更なる分析により、ＩＴＳ−２用のプライマーセットを用いた場合でのみ陽性であった検体において増幅されたＰＣＲ産物はヒゼンダニのＩＴＳ−２遺伝子に由来することを確認した。疥癬疑心患者におけるヒゼンダニＤＮＡの検出率は、ＳＭＨ遺伝子およびＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲについてそれぞれ３７％および６１％であった。
【００５２】
疥癬患者および疥癬疑心患者のいずれの場合でも、ＩＴＳ−２遺伝子を標的としたネステッドＰＣＲは、ＳＭＨ遺伝子を標的とした場合に比べて検出感度が高かった。この結果は実施例３における検出限界の結果と一致する。いずれの場合でも臨床的に疥癬が疑われた患者の約半数について陽性の結果が得られ、本発明の方法の高い感度が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、ヒゼンダニ由来核酸の特異的かつ高感度な検出方法およびこの方法に使用されるオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の方法およびオリゴヌクレオチドは、疥癬の診断に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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