(57)【要約】【課題】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＲＡ５）をコードする新規遺伝子が開示される。【解決手段】宿主ゲノムへの異種配列の安定な遺伝子組み込みが可能な酵母株を作製および選択するための方法もまた提供される。別の局面において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列の縮重改変体である核酸配列、ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される核酸配列の破壊、欠失、または変異を含む宿主細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号２の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号２に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号３に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号２に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）少なくとも６０の連続するヌクレオチド長である、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記核酸配列がオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記核酸配列が直接反復配列によって隣接される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
さらに目的の配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記目的の配列がポリペプチドをコードする、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記核酸配列および前記目的の配列が１つ以上の発現制御配列を含む、請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号４の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号４に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号５に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号４に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）少なくとも６０の連続するヌクレオチド長である、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号６；
（ｂ）配列番号６の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号６に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号７に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号６に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）少なくとも６０の連続するヌクレオチド長である、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１、７、または８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
前記核酸配列がオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
ｐＪＮ２６６、ｐＪＮ３９５、ｐＪＮ３９６、ｐＪＮ３９８、およびｐＪＮ４０７からなる群より選択されるベクター。
【請求項１２】
単離されたポリペプチドであって：
（ａ）配列番号３；
（ｂ）配列番号３に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチド配列；
（ｃ）少なくとも２０の連続するアミノ酸長である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはその配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドがオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５；
（ｂ）配列番号５に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチド配列；
（ｃ）少なくとも２０の連続するアミノ酸長である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはその配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって：
（ａ）配列番号７；
（ｂ）配列番号７に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチド配列；
（ｃ）少なくとも２０の連続するアミノ酸長である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはその配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１６】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１２、１４、または１５に記載の単離されたポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１７】
前記異種アミノ酸配列が検出可能な部分である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１、７、または８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞であって：
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号２の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号２に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号３に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号２に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）少なくとも６０の連続するヌクレオチド長である、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列の破壊、欠失、または変異を含み、該宿主細胞は、該破壊、欠失または変異を有さない宿主細胞と比較して、該核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性が減少していることにより特徴付けられる、宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
１つ以上の目的の配列をさらに含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記目的の配列が１種以上のグリコシル化酵素をコードする、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記グリコシル化酵素が、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびタンパク質マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記目的の配列が１種以上の治療タンパク質をコードする、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記治療タンパク質が、ヒトプラスミノーゲンのｋｒｉｎｇｌｅドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、チマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、およびα−フェトプロテインからなる群より選択される、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１２、１４、または１５に記載の単離されたポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体。
【請求項２８】
宿主細胞中への異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法であって：
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号２の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号２に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号３に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号２に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）少なくとも６０の連続するヌクレオチド長である、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される配列に由来する、破壊、欠失、または変異された核酸配列の導入によって、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする宿主遺伝子を破壊する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞中への異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法であって：
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号２の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号２に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である核酸配列；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号３に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）配列番号２に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）少なくとも６０の連続するヌクレオチド長である、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする配列と連結して目的の配列を宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
異種核酸配列が安定に組み込まれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする配列が直接反復配列によって隣接される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
目的の配列がポリペプチドをコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドがグリコシル化酵素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記グリコシル化酵素が、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびタンパク質マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが治療タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療タンパク質が、ヒトプラスミノーゲンのｋｒｉｎｇｌｅドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、チマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、およびα−フェトプロテインからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の損失について対抗選択する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記対抗選択が５−フルオロオロチン酸に対する増殖についてである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記異種核酸配列が宿主細胞のＯＣＨ１遺伝子座に導入される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は酵母中で単離される新規な遺伝子に関する。本発明はまた、酵母ゲノムへの安定な遺伝子組み込みのために特に有用であるプラスミドに関する。本発明はまた、異種タンパク質の発現における新規な酵母株、および新規な株を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母株は異種タンパク質の産生のために一般的に使用される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、ペルオキシソーム生合成（Ｇｏｕｌｄら、Ｙｅａｓｔ  ８：６１３−６２８（１９９２））、自食作用（ＴｕｔｔｌｅおよびＤｕｎｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０８：２５−３５（１９９５）；Ｓａｋａｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４１：６２５−６３６（１９９８））、および分泌経路のオルガネラの組織化および生合成（Ｒｏｓｓａｎｅｓｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４５：６９−８１（１９９９））の研究のための評判のよいモデル系になっている。単純なＤＮＡ形質転換系の開発（Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５（１９８５））および選択マーカー遺伝子の利用可能性は、上記の実験を実行する際に非常に重要である。現在、生合成マーカー遺伝子ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４、およびＵＲＡ３は、形質転換された細胞について、選択するための対応する独立栄養性宿主株と合わせて使用される。Ｌｕｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）。形質転換体を同定するためのドミナントな選択マーカーの使用もまた可能であるが、マーカーは、薬物Ｚｅｏｃｉｎに対する耐性を付与するＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓからのＳｈｂｌｅ遺伝子（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４１−５３（１９９８））、薬物ブラスチシジンに対する耐性を付与するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓからのブラスチシジンＳデアミナーゼ遺伝子（Ｋｉｍｕｒａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：１２１−１２９（１９９４））に限定される。
【０００３】
相同組換えを通しての酵母ゲノムへのクローニングされたＤＮＡセグメントの安定な組み込みは当該分野で周知である。例えば、Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３６４−６３５８（１９８１）を参照のこと。より最近では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＵＲＡ３マーカー遺伝子を含む分子構築物を使用する相同組換えによって、複数の連鎖していない部位において組み込まれたＤＮＡを含む酵母株を生成するための方法が開発された。例えば、Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６：５４１−５４５（１９８７）を参照のこと。このアプローチにおいて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｈｉｓＧ  ＤＮＡの直接反復に隣接する構築物が生成される。この構築物は、目的のクローニングされた標的遺伝子に挿入され、そしてｈｉｓＧからの直接反復によって隣接され、さらに標的遺伝子からの５’および３’セグメントによって隣接される完全なＵＲＡ３遺伝子を含む直鎖状カセットが、形質転換によってＵｒａ３−変異体酵母株に導入される。ＵＲＡ３マーカー遺伝子に連結された標的遺伝子のゲノム遺伝子座における相同組換えから生じる安定な組み込みは、次いで、ウラシルの非存在下での増殖についての選択によって単離される。隣接するｈｉｓＧ直接反復セグメント間の組換え事象を通してのＵＲＡ３遺伝子の切除は、ウラシル栄養要求性（Ｕｒａ−）を回復するが、標的遺伝子の破壊されたゲノムコピーを後ろに残す。Ｓ，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵｒａ＋株は、ピリミジンアナログ５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を補充した培地上で増殖することが不可能であるのに対して、Ｕｒａ−細胞はこのような処理で生存する。従って、ＵＲＡ３遺伝子を欠く細胞は、５−ＦＯＡに対するポジティブ対比染色を使用して容易に同定される。Ｂｏｅｋｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６（１９８４）。リサイクル可能なＵＲＡ３マーカー構築物の反復使用を通して、目的の複数の異なる遺伝子は単一の株内で破壊され得る。同様のアプローチは他の真菌において使用されてきた。Ｗｉｌｓｏｎら、Ｙｅａｓｔ  １６：６５−７０（２０００）。
【０００４】
いくつかの遺伝子が並行して発現されなければならず、かついくつかの他の遺伝子が除去されなければならない広範な遺伝子操作プロジェクトは、宿主ゲノムへの異種タンパク質の安定な遺伝子組み込みのための対抗選択マーカーおよびプラスミドの使用を必要とする。最近、雄性不稔トウモロコシのミトコンドリアゲノムからのＴ−ｕｒｆ１３遺伝子に基づく新規な対抗選択マーカーがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓについて記載されている。Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：３０６−３１２（２００１）。しかし、Ｔ−ｕｒｆ１３遺伝子はさもなくば致死的ではない特定の遺伝子破壊を伴って条件的に致死的であるので、遺伝子の毒性は宿主特異的な問題であるようである。さらに、この遺伝子は、対比染色薬剤メトミルの非存在下でもまた毒性であり、それゆえに、対比染色工程はすぐに実行されなくてはならない。さらに、別々の遺伝子が最初のポジティブ選択工程のために必要であり、対抗選択工程のために使用される薬剤であるメトミルは光感受性であり、水性溶液中で急速に分解する。従って、この系は、同じ遺伝子がＵｒａ＋原栄養体の最初の選択、およびＵｒａ−独立栄養生物の引き続く対比染色の両方の原因である、上記のＵＲＡ３系よりも複雑である。独立栄養生物の選択および５−ＦＯＡまたは同様に作用する薬剤を使用する対比染色が、異なる遺伝子座における複数ラウンドの遺伝子形質転換において単一のマーカー遺伝子を選択および対抗選択するために使用され得る、酵母ピリミジン生合成経路における新規なマーカー遺伝子を見い出すために有用である。
【０００５】
６段階の酵素的段階を提供する５種の構造遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける内因性ピリミジン生合成の原因である。Ｍｏｎｔｉｇｎｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：４５５−４６２（１９８９）。この経路における最後の２段階である、オロチン酸からオロチジン５’−リン酸への転換、およびオロチジン５’−リン酸からウリジン５’−リン酸への転換は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴａｓｅ）およびオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰｄｅｃａｓｅ）によって触媒される。これらの酵素はＵＲＡ５遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子によってそれぞれコードされている。両方の遺伝子はクローニングされ、特徴付けされ、かつＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける遺伝子組み込みのために使用されてきたが、ＵＲＡ３遺伝子のみがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてクローニングされてきた。
【０００６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ５遺伝子は、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性がブロックされた、元の状態に戻っていないＥ．ｃｏｌｉ  ｐｙｒＥ変異体の相補によってクローニングされた。Ｍｏｎｔｉｇｎｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：４５５−４６２（１９８９）。この遺伝子を欠く酵母細胞は漏出表現型を示すが、しかし、このことは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、別のタンパク質がオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有することを示す。ＪｕｎｄおよびＬａｃｒｏｕｔｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０９：１９６−２０２（１９７２）を参照のこと。ＵＲＡ５遺伝子はまた、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓにおいて同定されてきた。Ｂａｉら、Ｙｅａｓｔ  １５：１３９３−１３９８（１９９９）。ＵＲＡ５遺伝子周辺の遺伝子の整列がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて試験されてきた。ＳａｎｃｈｅｚおよびＤｏｍｉｎｇｕｅｚ、Ｙｅａｓｔ  １８：８０７−８１３（２００１）。４種すべての生物において、ＵＲＡ５遺伝子および分泌経路において機能する遺伝子（ＳＥＣ６５遺伝子）は、互いに隣接して、かつ相対的に反対の方向で配列されている。
【０００７】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＵＲＡ３遺伝子を破壊することに基づく選択系は、最近開示された。米国特許第６，０５１，４１９号。そこに記載される方法はまた、「二方向性選択プロセス」と呼ばれるものにおける、「ポップ−イン」（遺伝子付加によるＤＮＡの形質転換の部位特異的組み込み）および「ポップ−アウト」（これらの遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子の１つの喪失を生じる、機能的遺伝子と非機能的遺伝子との間の組換え）を提供する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３を使用する「ポップ−イン／ポップ−アウト」遺伝子置換は、上記のように、選択マーカーがリサイクルされ得るので、便利な方法である。Ｂｏｅｋｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：１６４−１７５（１９８７）を参照のこと。しかし、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｕｒａ３栄養要求株はゆっくりと増殖する。米国特許第６，０５１，４１９号。さらに、「ポップアウト」工程における相同組換えの原因である配列は、単一の交叉組換えプロセスにおける「ポップイン」工程の原因である配列を同じであるので、「ポップ−イン」によって挿入される遺伝物質は「ポップ−アウト」によって失われるらしい。従って、この方法は、ゲノムに目的の発現可能な異種遺伝子を安定に組み込むためよりも、点変異または遺伝子破壊を生成するためにより適切である。
【０００８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの現在利用可能な栄養要求性株は、それぞれの栄養要求性マーカー遺伝子が復帰する潜在能力を有するというさらなる欠点に苦しんでいる。高い復帰率は、復帰突然変異体コロニーが偽陽性形質転換体として誤って同定されるので、栄養要求性株の有用性を減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＵＲＡ３選択および対抗選択系の有用性、ならびに他の酵母および真菌におけるこれらおよび現在の方法を使用することに対する制限があるので、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＵＲＡ５遺伝子の同定およびＵＲＡ５を使用する安定な遺伝子組み込み事象を選択するための系の開発は有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子のフラグメント、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７遺伝子のフラグメントのコード配列；これらの配列の縮重改変体である核酸配列；ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される核酸配列を含むか、またはこれらの配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、これらの単離されたポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子のフラグメント、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７遺伝子のフラグメントによってコードされる配列、ならびに関連するポリペプチド配列、フラグメント、および融合物からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはこれらの配列からなる単離されたポリペプチドを提供する。本発明の単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体もまた、提供される。
【００１２】
本発明はまた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列の縮重改変体である核酸配列、ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される核酸配列の破壊、欠失、または変異を含む宿主細胞を提供し、ここでこの宿主細胞は、破壊、欠失、または変異を伴わない宿主細胞と比較して、核酸配列によってコードされるポリペプチドの減少している活性を有する。
【００１３】
本発明はさらに、宿主細胞中における異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法を提供する。これらの方法は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列の縮重改変体である核酸配列、ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される配列に由来する、破壊、欠失、または変異した核酸配列の導入によって、宿主遺伝子によってコードされるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを破壊する工程を包含する。
【００１４】
さらに、本発明は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞中での異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法を提供する。これらの方法は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコード配列の縮重改変体である核酸配列、ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする配列と連結して、目的の配列を宿主細胞に導入する工程を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＵＲＡ５コード配列（配列番号２）およびそのコードポリペプチド（配列番号３）、ＳＥＣ６５コード配列の３’フラグメントに対して相補的な配列（配列番号４）およびそのコードされるポリペプチド（配列番号５）、ならびにＳＣＳ７コード配列の３’フラグメント（配列番号６）およびそのコードされるポリペプチド（配列番号７）を含む、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの１９４７ｂｐ  ＵＲＡ５含有ゲノムフラグメント（Ｓａｕ３Ａ−Ｓｓｐ１）（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、縮重プライマーを設計するために使用される配列のアラインメントを示す。ＵＲＡ４５関連配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵＲＡ５（配列番号８）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵＲＡ１０（配列番号９）、ならびにｋ．ｌａｃｔｉｓ（配列番号１０）由来のＵＲＡ５、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＵＲＡ５（配列番号１１）、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＵＲＡ５（配列番号１２）、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のＵＲＡ５（配列番号１３）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＵＲＡ５（配列番号１４）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＵＲＡ５（配列番号１５）、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＵＲＡ５（配列番号１６）である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＵＲ４５配列（配列番号３の残基２７〜８０）が比較のために示される。ＳＥＣ６５関連配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号１７）、ｋ．ｌａｃｔｉｓ（配列番号１８）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（配列番号１９）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（配列番号２０）、Ｎ．Ｃｒａｓｓａ（配列番号２１）、およびｓ．ｐｏｍｂｅ（配列番号２２）由来である。
【図３】図３は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ４遺伝子のクローニングにおいて使用された縮重オリゴヌクレオチドのいくつかを示す。これらのオリゴヌクレオチドは、ＵＲＡ５−１（配列番号２３）、ＵＲＡ５−２（配列番号２４）、ＵＲＡ５−３（配列番号２５）、ＵＲＡ５−４（配列番号２６）、ＵＲＡ５−５（配列番号２７）、およびＵＲＡ５−６（配列番号２８）である。
【図４】図４は、プラスミドｐＪＮ２６６（ＫＥＸ１遺伝子座を破壊するために使用され得るリサイクル可能なＵＲＡ３カセットを含む）；プラスミドｐＪＮ３１５（ｌａｃＺ直接反復に隣接されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ３遺伝子を含む）；およびプラスミドｐＪＮ３２９（ＯＣＨ１遺伝子座を破壊するために使用され得るリサイクル可能なＵＲＡ３カセットを含む）の制限マップを示す。
【図５】図５は、プラスミドｐＪＮ３９５（カナマイシン耐性遺伝子でマークされたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５破壊カセットを含む）；プラスミドｐＬＮ３９６（ｌａｃＺ直接反復によって隣接されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子を含む）；プラスミドｐＪＮ３９８（ＯＣＨ１遺伝子座をノックアウトするために使用され得るリサイクル可能なＵＲＡ５カセットを含む）；およびプラスミドｐＪＮ４０７（ＯＣＨ１遺伝子座への安定な組み込みのために使用され得るＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５−Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターカセットを含む）の制限マップを示す。
【図６】図６は、ＯＣＨ１遺伝子座へのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの安定な組み込みにおける、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５−Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本明細書において他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技術的用語は、当業者によって共通して理解される意味を有するべきである。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形は複数形を含むべきであり、複数形の用語は単数形を含むべきである。一般的に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技術と関連して使用される命名法は、周知でありかつ当該分野において一般的に使用される。本発明の方法および技術は、他に示されない限り、一般的に当該分野において周知であり、かつ本明細書を通して引用されかつ議論される種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献従来的な方法に従って実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２への補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第Ｉ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第ＩＩ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
【００１７】
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許、および他の参考文献は、本明細書によってその全体が参照として援用される。
【００１８】
以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【００１９】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、少なくとも１０塩基長のポリマー型のヌクレオチドをいう。この用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ（非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオシド結合、または両方）を含む。核酸は、任意のトポロジー的配置にあり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的二本鎖、分枝、ヘアピン、環状、または南京錠コンホメーションであり得る。
【００２０】
他に示されない限り、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、少なくともその一部が（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。２つの間の選択は、状況によって決定づけられる。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、プローブが所望の標的に対して相補的であるという要件によって決定づけられる。
【００２１】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマー）は、その天然の宿主細胞においてネイティブなポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞成分、例えば、それが天然には付随するリボソーム、ポリメラーゼ、およびゲノム配列から実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然に存在する環境から取り出されている、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見い出されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部に付随していない、（３）天然には連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、または（４）天然には存在しない、核酸またはポリヌクレオチドを含む。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組換えもしくはクローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログに関連して使用され得る。
【００２２】
しかし、「単離された」は、そのように記載された核酸またはポリヌクレオチドが、それ自体そのネイティブな環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。例えば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は、異種配列が内因性核酸配列に隣接して配置され、その結果、この内因性核酸配列の発現が変化される場合に、本明細書において「単離された」と見なされる。この状況において、異種配列は、その異種配列がそれ自体内因性（同じ宿主細胞またはその子孫から生じる）であるかまたは外因性（異なる宿主細胞またはその子孫から生じる）であるかに関わらず、内因性の核酸配列に天然に隣接しない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノム中の１つの遺伝子のネイティブなプロモーターに置換され得（例えば、相同組換えによって）、その結果、この遺伝子は、変化した発現パターンを有する。この遺伝子は、ここで「単離された」ことになる。なぜなら、この遺伝子は、それに天然に隣接する配列の少なくともいくつかから分離されているからである。
【００２３】
核酸配列はまた、それがゲノム中の対応する核酸に天然には起こらない任意の修飾を含む場合に「単離された」と見なされる。例えば、内因性コード配列は、それが人工的に（例えば、ヒトの介入によって）挿入、欠失、または点変異を含む場合に、「単離された」と見なされる。「単離された核酸」はまた、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含まないことが可能であるか、または組換え技術によって産生された培養培地を実質的に含まないことが可能であるか、または化学合成されたときに化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。
【００２４】
本明細書において使用される場合には、語句「縮重改変体」とは、参照核酸配列の「縮重改変体」が標準的な遺伝コードに従って翻訳され得る核酸配列を含み、その参照アミノ酸から翻訳されるものと同一のアミノ酸配列を提供する。用語「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」とは、配列中で必ずしも同一でないが、１つ以上の特定のセグメント中で互いに相同である標的アミノ酸配列をハイブリダイズすることが可能であるオリゴヌクレオチドを意味するために使用される。
【００２５】
用語「配列同一性パーセント」または「同一である」とは、核酸配列の状況において、最大の一致のためにアラインされたときに同じである２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチドのストレッチにわたり得、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチド以上である。ヌクレオチドの配列同一性を測定するために使用され得る、当該分野において公知の異なる多数のアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔ（これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムである）を使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（本明細書によってその全体が参照として援用される）。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、そのデフォルトパラメーター（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いてＦＡＳＴＡを使用して、またはＧＣＧバージョン６．１（参照として本明細書に援用される）に提供されるようなそのデフォルトパラメーターを用いてＧａｐを使用して決定され得る。代替的には、配列は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、とりわけ、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して比較され得る。
【００２６】
用語「実質的に相同」または「実質的に類似」とは、核酸またはそのフラグメントに関して参照される場合、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切ねヌクレオチドの挿入または欠失を用いて最適にアラインされた場合に、上記に議論したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定されるように、ヌクレオチドベースで少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常少なくとも約７０％、より通常には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００２７】
代替的には、実質的な相同性または類似性は、１つの核酸またはそのフラグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、別の核酸に対して、別の核酸の１本の鎖に対して、またはその相補鎖に対してハイブリダイズするときに存在する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」とは、核酸ハイブリダイゼーション実験の状況において、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補性領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチといった条件によって影響される。当業者は、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するためにいかにしてこれらのパラメーターを変化させるかを知っている。
【００２８】
一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の条件のセットの下で、特異的ＤＮＡハイブリッドについての熱融解点（Ｔｍ）より約２５℃下で実行される。「ストリンジェントな洗浄」は、特定の条件のセットの下で、特異的ＤＮＡハイブリッドについてのＴｍよりも約５℃下の温度で実行される。Ｔｍは、標的配列の５０％完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、９．５１頁（参照により本明細書によって援用される）参照のこと。本明細書における目的のために、「ストリンジェントな条件」とは、溶液相ハイブリダイゼーションのために、６×ＳＣＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％  ＳＤＳ中での、６５℃、８〜１２時間の水性（すなわち、ホルムアミドを含まない）ハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６５℃、２０分間の２回の洗浄として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性パーセントを含む多数の因子に依存して異なる速度で起こることが当業者によって理解される。
【００２９】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドともいわれる）は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに上記のポリマーの合成型および混合型を含み得る。これらは、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に修飾され得るか、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得る。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、荷電していない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、カルバメートなど）、荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、張り出し部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾連結（例えば、αアノマー性核酸など）が含まれる。水素結合および他の化学的相互作用を介して、指定された配列に結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。このような分子は当該分野において公知であり、かつ、例えば、分子のバックボーン中のリン酸結合の代わりにペプチド結合が置き換わるものが含まれる。他の修飾には、例えば、リボース環が架橋部分または他の構造、例えば、「ロックされた」核酸中に見い出される修飾などを含むアナログが含まれ得る。
【００３０】
用語「変異された」は、核酸配列に適用される場合には、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入、欠失、または変化され得ることを意味する。単一の変化は１つの遺伝子座において作製され得るか、または複数のヌクレオチドが単一の遺伝子座において挿入、欠失、または変化され得る。さらに、１つ以上の変化は、核酸配列中の任意の数の遺伝子座において作製され得る。核酸配列は、当該分野において公知である任意の方法によって変異され得、この方法には、「誤りがちなＰＣＲ」（ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを実行し、その結果、高い頻度の点変異が全長のＰＣＲ産物に沿って得られるプロセス；例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１：１１−１５（１９８９）ならびにＣａｌｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２）を参照のこと）；および「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発」（目的の任意のクローニングされたＤＮＡセグメントにおける部位特異的面の生成を可能にするプロセス；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７（１９８８）を参照のこと）などの変異誘発技術が含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
用語「ベクター」とは、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸の輸送を可能にする核酸分子をいう。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがそこに連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。別の型のベクターはウイルスベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る（以下により詳細に議論される）。特定のベクターは、それらが挿入される宿主中での自律的複製が可能である（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、かつそれによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向することが可能である。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語「目的の配列」または「目的の遺伝子」とは、宿主細胞中では通常産生されない、代表的にはタンパク質をコードする、核酸配列をいう。本明細書中に開示される方法は、１つ以上の目的の配列または目的の遺伝子が宿主ゲノムに安定に組み込まれることを可能にする。目的の配列の非限定的な例には、酵素活性（例えば、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびシアリルトランスフェラーゼなどの、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を与える酵素）を有する１つ以上のポリペプチドをコードする配列が含まれる。他の非限定的な例には、酵素活性（例えば、タンパク質−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）遺伝子なとの、宿主中でＯ−グリカン合成に影響を与える酵素）を有する１つ以上のポリペプチドをコードする配列が含まれる。なお他の配列が、ヒトプラスミノーゲンのｋｒｉｎｇｌｅドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、および顆粒球−ＣＳＦ）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、およびヒトプロテインＣ）、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、チマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、およびα−フェトプロテインなどの目的のタンパク質をコードする。
【００３３】
用語「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」とは、宿主細胞中で配列の存在または非存在についてポジティブまたはネガティブのいずれかでの選択を可能にする活性を発現することが可能である核酸配列をいう。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子は、その存在が、その遺伝子を含む細胞がウラシルの非存在下で増殖する能力によって選択され得るので、マーカー遺伝子である。その存在はまた、その遺伝子を有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖する能力を有さないことに対して選択され得る。マーカー配列または遺伝子は、必ずしも、ポジティブおよびネガティブの両方の選択可能性を示す必要はない。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４、およびＵＲＡ３が含まれる。
【００３４】
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、発現制御配列が目的の遺伝子を制御するために目的の遺伝子と連続している連結、ならびに目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは一定の距離離れて作用する発現制御配列をいう。
【００３５】
用語「発現制御配列」とは、本明細書で使用される場合、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現に影響を与えるために必要であるポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適切な転写の開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望される場合、タンパク質分泌を増強する配列。このような制御配列は、宿主生物に依存して異なる；原核生物においては、このような制御配列は、一般的にはプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現のために必須であるすべての構成成分を含むことが意図され、およびまた、その存在が遊離であるさらなる構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含み得る。
【００３６】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、本明細書において使用される場合、組換えベクターが導入される細胞をいうことが意図される。このような用語は、特定の対象の細胞のみならず、このような細胞の子孫もいうことが意図されることが理解されるべきである。変異および環境的な影響のいずれかに起因して、特定の改変が後に続く世代において起こり得るので、このような子孫は、実際、親と同一ではない可能性があるが、なお、本明細書において使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、培養中で増殖した単離された細胞もしくは細胞株であり得、または生きている組織もしくは生物中に存在する細胞であり得る。
【００３７】
用語「ペプチド」とは、本明細書で使用される場合、短いポリペプチド、例えば、代表的には約５０アミノ酸長未満、およびより代表的には約３０アミノ酸長未満であるものをいう。この用語は、本明細書で使用される場合、アナログ、ならびに構造的、および従って生物学的機能を模倣する模倣物を含む。
【００３８】
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質と天然には存在しないタンパク質の両方、ならびにそのフラグメント、変異体、誘導体、およびアナログを含む。ポリペプチドは、モノマー性またはポリマー性であり得る。さらに、ポリペプチドは、その各々が１つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含み得る。
【００３９】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導体の供給源に基づいて、（１）そのネイティブな状態においてそれに付随する天然に結合している成分が結合していない、（２）天然には見い出されない純度で存在している（ここで、純度は他の細胞物質の存在に関連して考えられるべきである（例えば、同じ種からの他のタンパク質が存在していない））、（３）異なる種からの細胞によって発現される、または（４）天然には存在しない（例えば、これは天然に見い出されるポリペプチドのフラグメントであるか、あるいはこれは天然には見い出されないアミノ酸のアナログもしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）。従って、化学合成されるか、またはそれが天然に生じる細胞とは異なる細胞系中で合成されるポリペプチドは、その天然に付随する成分から「単離される」。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に付随する成分を実質的に含まなくされ得る。このように定義されるように、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはオリゴペプチドが、そのネイティブな環境から物理的に分離されていることを必ずしも必要としない。
【００４０】
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、本明細書で使用される場合、全長ポリペプチドと比較して、欠失、例えば、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、このポリペプチドフラグメントは、フラグメントのアミノ酸配列が、天然に存在する配列中の対応する位置と同一である、連続する配列である。フラグメントは、代表的には、少なくとも５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１２、１４、１６、または１８アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２５、３０、３５、４０、または４５アミノ酸であり、さらにより好ましくは、少なくとも５０または６０アミノ酸長であり、およびなおより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００４１】
「修飾誘導体」とは、一次構造配列において実質的に相同であるが、これらが、例えば、インビボもしくはインビトロの化学修飾もしくは生化学的修飾を含み、またはネイティブなポリペプチドにおいては見い出されないアミノ酸を取り込む、ポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。このような修飾には、当業者によって容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性核種を用いる）、および種々の酵素的修飾が含まれる。ポリペプチドを標識するための種々の方法、およびこのような目的のために有用な置換基または標識は当該分野で周知であり、これには、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなどの放射活性アイソトープ、標識された抗リガンド（例えば、抗体）、蛍光団、化学発光剤、酵素、ならびに標識されたリガンドのための特異的結合対メンバーとして働き得る抗リガンドが含まれる。標識の選択は、必要とされる感度、プライマーの結合の容易さ、安定性の必要性、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２への補遺）を参照のこと（本明細書によって参照として援用される）。
【００４２】
用語「融合タンパク質」とは、異種アミノ酸配列に結合されたポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、それらが、２つ以上の異なるタンパク質からの２つ以上の所望の機能的エレメントを含むように構築され得るので、有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチドから少なくとも１０個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個または３０個のアミノ酸、なおより好ましくは少なくとも４０、５０、または６０個のアミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５、１００、または１２５個のアミノ酸を含む。本発明のタンパク質の完全さを含む融合タンパク質は、特に有用性を有する。本発明の融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長、しばしば少なくとも８アミノ酸長、および通常少なくとも１５、２０、および２５アミノ酸長である。より大きなポリペプチド（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域）、および全体のタンパク質でさえ（例えば、グリーン蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）クロモホア含有タンパク質）を含む融合タンパク質は、特に有用性を有する。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を構築すること、および次いで融合タンパク質を発現することによって、組換え的に産生され得る。代替的には、誘導タンパク質は、別のタンパク質に、ポリペプチドまたはそのフラグメントを架橋することによって化学的に産生され得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくともその一部が少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子、またはそのフラグメントによってコードされ、かつ所望の標的分子に特異的に結合し得るポリペプチドをいう。この用語は、天然に存在する形態、ならびにフラグメントおよび誘導体を含む。
【００４４】
用語「抗体」の範囲内にあるフラグメントには、そのフラグメントが標的分子への特異的結合可能なままである限り、種々のプロテアーゼによって産生されるもの、化学的切断および／もしくは化学的解離によって産生されるもの、ならびに組換え的に産生されるものが含まれる。このようなフラグメントの中には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）のフラグメントがある。
【００４５】
この用語の範囲内にある誘導体には、配列が改変されているが、標的分子への特異的結合が可能なままである抗体（またはそのフラグメント）が含まれる。これには以下が含まれる：種間キメラおよびヒト化抗体；抗体融合物；ヘテロマー抗体複合体および抗体融合物、例えばジアボディー（二特異性抗体）、単鎖ジアボディー、およびイントラボディー（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｒａｓｃｏ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９８）を参照のこと、これらの開示はその全体が参照として本明細書に援用される）。
【００４６】
本明細書で使用される場合、抗体は、ネイティブＢリンパ球の細胞培養からの収集、ハイブリドーマからの収集、組換え発現系およびファージディスプレイを含む、任意の公知の技術によって産生され得る。
【００４７】
用語「非ペプチドアナログ」とは、参照ポリペプチドの特性と類似である特性を有する化合物をいう。非ペプチド化合物はまた、「ペプチド模倣物」または「ペプチド類似物」と呼ばれる。例えば、以下を参照のこと：Ｊｏｎｅｓ、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｊｕｎｇ、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９９７）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９３）；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ，（Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９９２）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：３９２−３９６（１９８５）；および上記の各々において引用される参考文献（これらは参照として本明細書に援用される）。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの補助を用いて開発される。本発明の有用なペプチドと構造的に類似のペプチド模倣物は、等価な効果を生じるために使用され得、それゆえに本発明の一部として想定される。
【００４８】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」とは、その配列が、ネイティブなまたは野生型のタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再配列、または置換を含むポリペプチドをいう。ムテインは、１つ以上のアミノ酸の点変異（ここで、１つの位置における単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変化している）、１つ以上の挿入および／もしくは欠失（ここで、１つ以上のアミノ酸が、天然に存在するタンパク質の配列中で、それぞれ、挿入もしくは欠失されている）ならびに／または、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかもしくは両方においてアミノ酸配列の短縮を含み得る。ムテインは、天然に存在するタンパク質と比較して、同じ生物学的活性を有し得るが、好ましくは異なる生物学的活性を有する。
【００４９】
ムテインは、その野生型対応物に対して、少なくとも６５％の全体の配列相同性を有する。なおより好ましいのは、野生型タンパク質に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の全体の配列相同性を有するムテインである。さらにより好ましい実施形態において、ムテインは、少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは９８％、なおより好ましくは９９％、およびなおより好ましくは９９．９％の全体の配列同一性を示す。配列相同性は、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔなどの任意の一般的な配列分析アルゴリズムによって測定され得る。
【００５０】
アミノ酸置換は以下のものを含み得る：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるもの、（２）酸化に対する感受性を減少させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させるもの、（４）結合親和性または酵素活性を変化させるもの、および（５）このようなアナログの他の物理化学的特性または機能的特性を付与または修飾するもの。
【００５１】
本明細書で使用される場合、２０種の従来的なアミノ酸およびそれらの略号は従来的な使用に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧｏｌｕｂおよびＧｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ，第２版、１９９１）（これは参照によって本明細書に援用される）を参照のこと。２０種の従来型のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸（例えば、α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸）、および他の従来型でないアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドのための構成成分として適切であり得る。従来型でないアミノ酸には以下が含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、および他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチドの表記法において、標準的な使用および慣習に従って、左側の末端はアミノ末端に対応し、右側の末端はカルボキシ末端に対応する。
【００５２】
タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列に対して類似の配列を有する場合、第２のタンパク質に対して「相同性」を有するか、または「相同である」。代替的には、タンパク質は、２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質に対して相同性を有する（従って、用語「相同タンパク質」は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するために定義される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して少なくとも６５％の配列相同性を示すものであり、より好ましくは少なくとも７０％の配列相同性である。さらにより好ましいものは、野生型タンパク質に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、または９０％の配列相同性を示す相同タンパク質である。なおより好ましい実施形態において、相同タンパク質は、少なくとも９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を示す。本明細書で使用される場合、アミノ酸配列の２つの領域間の相同性（とりわけ、推定の構造類似性に関して）は、機能の類似性を意味するものと解釈される。
【００５３】
「相同な」がタンパク質またはペプチドに関連して使用される場合、同一でない残基の位置が保存性アミノ酸置換によって異なることが認識される。「保存性アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般的に、保存性アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存性置換によって互いに異なる場合において、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的性質について補正するために、情報に調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１および２５：３６５−８９（参照として本明細書に援用される）を参照のこと。
【００５４】
以下の６つの群は、互いに保存性置換であるアミノ酸を各々含む：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５５】
配列同一性パーセントともまた呼ばれる、ポリペプチドについての配列相同性は、代表的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の修飾（保存性アミノ酸置換を含む）に割り当てられた相同性の尺度を使用して、類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、密接に関連したポリペプチド（例えば、異なる種の生物からの相同ポリペプチド）間、または野生型とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターを用いて使用され得る「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。
【００５６】
好ましいアルゴリズムは、特定のポリペプチド配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースに対して比較する場合、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、とりわけ、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。
【００５７】
ＢＬＡＳＴｐのための好ましいパラメーターは以下の通りである：
予測値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；コスト対オープンギャップ：１１（デフォルト）；コスト対エクステンドギャップ：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；記述の数：１００（デフォルト）；ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。
【００５８】
相同性のために比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、代表的には少なくとも約２８残基、および好ましくは約３５残基よりも多くである。大量の異なる生物からの配列を含むデータベースを検索する際に、アミノ酸配列を比較することが好ましくあり得る。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当該分野において公知であるｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列との間のアラインメント、およびこの最良の重複の領域の配列同一性パーセントを提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（参照として本明細書に援用される）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧバージョン６．１（参照として本明細書に援用される）において提供されるように、そのデフォルトパラメーター（２のワードサイズおよびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用いるＦＡＳＴＡを使用して決定され得る。
【００５９】
「特異的結合」とは、環境中の他の分子に結合することに優先して、互いに結合する２つの分子の能力をいう。代表的には、「特異的結合」は、反応中の偶発的な結合を、少なくとも２倍、より代表的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍区別する。代表的には、特異的結合反応の親和性または結合性は、解離定数によって定量されるように、約１０−７Ｍ以上である（例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたはさらにより強い）。
【００６０】
用語「領域」は、本明細書で使用される場合、生体分子の一次構造の物理的に連続している部分をいう。タンパク質の場合において、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続する部分によって規定される。
【００６１】
用語「ドメイン」とは、本明細書で使用される場合、生体分子の公知のまたは疑われる機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、領域またはその部分と同じ長さに及び得る；ドメインはまた、生体分子の別個の、非連続的な領域を含み得る。タンパク質ドメインの例には、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが含まれるがこれらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「分子」は、低分子、ペプチド、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含むがこれらに限定されない任意の化合物を意味し、このような化合物は天然または合成であり得る。
【００６３】
他に定義されない限り、本明細書で使用される科学的用語および技術的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および物質が以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または等価な方法および物質もまた、本発明の実施において使用されることが可能であり、それらは当業者には明らかである。本明細書において言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。物質、方法、および実施例は例示目的のみであり、限定を意味するものではない。
【００６４】
本明細書および特許請求の範囲を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはそのバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、言及された数字または数字の群を含むことを意味するが、任意の他の数字または数字の群を排除することを意味しないことが理解される。
【００６５】
（核酸配列）
本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＵＲＡ５遺伝子およびその改変体を含む単離された核酸分子を提供する。酵素オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴａｓｅ、ＥＣ２．４．２．１０）をコードする、この遺伝子についての全長核酸配列は、図１において記載されるように同定および配列決定された。クローニングされたゲノム配列（配列番号１）の中には、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼについてのコード配列（配列番号２）が含まれている。このコードされたアミノ酸配列は、図１（配列番号３）においてもまた示されている。ＵＲＡ５遺伝子は、再利用可能な、選択可能な、かつ対抗選択可能なマーカーとして特に有用である。
【００６６】
本明細書に提供されるものは、宿主ゲノムへの異種遺伝子（すなわち、目的の遺伝子）の安定な遺伝子組み込みを促進することが可能である核酸分子である。安定な遺伝子組み込みを促進することが可能であるＵＲＡ５マーカーおよび核酸の組み合わせが、広範な株の修飾を可能にする。本明細書に開示される方法の反復使用が種々の遺伝子座において複数の遺伝子が破壊されることを可能にし、さらに任意の遺伝子または目的の遺伝子のこれらの部位における挿入を可能にすることは当業者には容易に明らかである。開示されたアプローチによって挿入される遺伝子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡにおいて選択された領域において安定に組み込まれる。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５コード配列（配列番号２）、およびそのホモログ、改変体、および誘導体を含むか、またはそれからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の縮重改変体である配列を含むか、またはそれからなる核酸配列を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、野生型遺伝子に対して少なくとも６５％の同一性を有する野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の改変体である配列を含むか、またはそれからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子に対して、少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性を有し得る。さらにより好ましくは、この核酸配列は、野生型遺伝子に対して、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに高い同一性を有し得る。
【００６８】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号３に少なくとも６５％同一であるポリペプチド配列をコードする核酸分子もまた提供される。代表的には、本発明の核酸分子は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性のポリペプチド配列をコードする。好ましくは、このコードされたポリペプチドは、配列番号３に対して８５％、９０％、または９５％同一であり、およびその同一性は、さらにより好ましくは、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに高くであり得る。
【００６９】
別の局面において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＳＥＣ６５遺伝子のフラグメントを提供する。ＵＲＡ５遺伝子から下流に位置し、かつ反対の配向にあるこのフラグメントは、図１（配列番号４）において示されるように同定された。ＳＥＣ６５フラグメントによってコードされるアミノ酸配列もまた、図１（配列番号５）に示される。従って、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＳＥＣ６５遺伝子フラグメント、およびそのホモログ、改変体、および誘導体を含む単離された核酸分子を提供する。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子（配列番号４）およびそのホモログ、改変体、および誘導体を含むか、またはそれからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。本発明の代替的な実施形態において、核酸配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子フラグメントの縮重改変体である。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態において、核酸配列は、野生型遺伝子フラグメントに対して、少なくとも６５％の同一性を有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子フラグメントの改変体である。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子フラグメントに対して、少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性を有し得る。さらにより好ましくは、この核酸配列は、野生型遺伝子フラグメントに対して、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに高い同一性を有し得る。
【００７２】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号５に少なくとも６５％同一であるポリペプチド配列をコードする核酸分子もまた提供される。代表的には、本発明の核酸分子は、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性のポリペプチド配列をコードする。好ましくは、このコードされたポリペプチドは、配列番号５に対して８５％、９０％、または９５％同一であり、およびその同一性は、さらにより好ましくは、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに高くであり得る。
【００７３】
さらに別の局面において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＳＣＳ７遺伝子のフラグメントを提供する。このフラグメントは、ＵＲＡ５遺伝子から上流に配置され、かつそれと同じ配向にあり、図１（配列番号６）に示されるように同定されている。ＳＣＳ７フラグメントによってコードされるアミノ酸配列がまた、図１（配列番号７）に示される。従って、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＳＣＳ７遺伝子フラグメントおよびその改変体を含む単離された核酸分子を提供する。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７遺伝子（配列番号６）のフラグメント、およびそのホモログ、改変体、および誘導体を含むか、またはそれからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。本発明の代替的な実施形態において、核酸配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７遺伝子フラグメントの縮重改変体である。
【００７５】
本発明の別のさらなる実施形態において、核酸配列は、野生型遺伝子フラグメントに対して少なくとも６５％の同一性を有する野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７遺伝子フラグメントの改変体である。この核酸配列は、好ましくは、野生型遺伝子フラグメントに対して、少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性を有し得る。さらにより好ましくは、この核酸配列は、野生型遺伝子フラグメントに対して、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに高い同一性を有し得る。
【００７６】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号７に少なくとも６５％同一であるポリペプチド配列をコードする核酸分子もまた提供される。代表的には、本発明の核酸分子は、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性のポリペプチド配列をコードする。好ましくは、このコードされたポリペプチドは、配列番号７に対して８５％、９０％、または９５％同一であり、およびその同一性は、さらにより好ましくは、９８％、９９％、９９．９％、またはさらに高くであり得る。
【００７７】
本発明はまた、上記の核酸配列分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する核酸分子を提供する。上記に定義したように、および当該分野で周知であるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、特定の条件のセットの下での特異的ＤＮＡハイブリッドのための熱融解点（Ｔｍ）よりも約２５℃下で実行され、ここで、Ｔｍとは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな洗浄は、特定の条件のセットの下で、特異的ＤＮＡハイブリッドのためのＴｍよりも約５℃低い温度で実行される。
【００７８】
上記の核酸配列のいずれか１つのフラグメントを含む核酸分子もまた、提供される。これらのフラグメントは、好ましくは、少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む。より好ましくは、この核酸配列のフラグメントは、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはさらにより多くの連続するヌクレオチドを含む。
【００７９】
本発明の核酸配列フラグメントは、種々の系および方法において有用性を示す。例えば、このフラグメントは、種々のハイブリダイゼーション技術におけるプローブとして使用され得る。方法に依存して、標的核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。標的核酸配列はハイブリダイゼーションの前に分画され得（例えば、ゲル電気泳動によって）、またはハイブリダイゼーションはインサイチュで試料上で行われ得る。当業者は、公知の配列の核酸プローブが、染色体構造を決定する際に（例えば、サザンブロッティングによって）、および遺伝子発現の測定において（例えば、ノーザンブロッティングによって）有用性を見いだすことを理解する。このような実験において、配列フラグメントは、好ましくは検出可能に標識され、その結果、標的配列へのそれらの特異的ハイブリダイゼーションが検出され得、必要に応じて定量され得る。当業者は、本発明の核酸フラグメントが、本明細書に具体的に記載されていない広範な種々のブロッティング技術において使用され得ることを理解する。
【００８０】
本明細書に開示される核酸配列フラグメントはまた、マイクロアレイ上に固定化された場合に、プローブとしての有用性を見いだすこともまた、理解されるべきである。支持基材上への核酸の沈着および固定によってマイクロアレイを作製するための方法は当該分野において周知である。以下において概説されている：ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２１（１）（補遺）：１−６０（１９９９）；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）（これらの開示はそれらの全体が参照として本明細書に援用される）。例えば、核酸配列フラグメント（例えば、本明細書に開示される核酸配列フラグメント）を含むマイクロアレイを使用する遺伝子発現の分析は、細胞生物学および分子生物学の分野における配列フラグメントについての十分に確立された有用性である。マイクロアレイ上に固定化された配列フラグメントについての他の用途は以下に記載されている：Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：１６８−１７３（１９９９）およびＺｗｅｉｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：４２９−４３６（１９９９）；ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（補遺）：１−６０（１９９９）；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）（これらの各々の開示はその全体が参照として本明細書に援用される）。
【００８１】
別の実施形態において、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。当該分野で周知であるように、酵素活性は、種々の方法において測定され得る。例えば、ＯＭＰの加ピロリン酸分解は分光学的に追跡され得る。Ｇｒｕｂｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０２９９−２０３０４（１９９３）。オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の分光学的アッセイのために有用な基質のさらなる例はまた、当該分野において公知である。Ｓｈｏｓｔａｋら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：３６５−３６９（１９９０）。代替的には、酵素の活性は、クロマトグラフィー技術によって、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって追跡され得る。ＣｈｕｎｇおよびＳｌｏａｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３７１：７１−８１（１９８６）。他の方法および技術もまた、当業者によって公知であるように、酵素活性の測定のために適切であり得る。
【００８２】
本発明はまた、直接反復配列に隣接された、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子、またはそのホモログ、改変体、または誘導体を含むカセットを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。直接的反復は、効率的な相同組換えを媒介するために十分な長さであり、それによって、ポジティブ選択マーカーとしてＵＲＡ５遺伝子を使用する形質転換の別のラウンドのための調製物において、宿主細胞からのＵＲＡ５マーカーを欠失させるための手段を提供する。相同組換えの効率を増加させるために、直接反復配列は、好ましくは、少なくとも２００ヌクレオチド長である（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｙｅａｓｔ；１６：６５−７０（２０００）を参照のこと）。代表的には、直接反復配列は、約２００ヌクレオチドから約１，１００ヌクレオチドまでであるが、これらはより長くてもよい。特定の好ましい実施形態において、直接反復配列は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｈｉｓＧセグメントに由来する。代替的には、直接反復は、ｌａｃＺリーディングフレームのセグメントから得られる。当業者は、実質的にあらゆる反復配列がまた、本発明のこの局面に従って、組換えのための隣接配列を提供するために使用され得ることを容易に理解する。
【００８３】
本発明のＵＲＡ５−含有カセットは、宿主からのＵＲＡ５配列の引き続く切除を媒介する直接反復配列に隣接するＵＲＡ５配列を含む。このようなＵＲＡ５カセットは、ＵＲＡ５遺伝子活性についての選択および対抗選択の両方を可能にする。ポジティブ選択工程は、ウラシルに対する栄養要求性を解放することに基づき、対抗選択は、ウラシル原栄養株において５−ＦＯＡに対する耐性の獲得に基づく。Ｂｏｅｋｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６（１９８４）。
【００８４】
従って、本発明は、発現に際してＵＲＡ５宿主における選択および対抗選択を可能にする、直接反復により隣接されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ５遺伝子（例えば、ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ、「ＵＲＡ５カセット」）を含む組換え核酸分子を提供する。好ましい実施形態において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５カセットで形質転換した酵母は、宿主と組換え核酸配列との間の相同組換えによって選択された位置において、ＵＲＡ５遺伝子を宿主ゲノムに組み込んだ。好ましくは、宿主は、内因性ＵＲＡ５遺伝子座への相同組換えを阻止するために内因性のＵＲＡ５配列が欠失されている。ＵＲＡ５カセット−含有組換え核酸分子は、好ましくは、ＵＲＡ５および他の所望される配列の、酵母宿主の選択の位置への組み込みを標的とする配列を含む。記載されるように、このような形質転換体は、Ｕｒａ−からＵｒａ＋への転換に基づいて選択される。次いで、ＵＲＡ５マーカー遺伝子に隣接する直接反復は、内部ＵＲＡ５マーカーを欠失する相同組換え事象を容易にする。このような事象を受けた細胞はＵｒａ−に戻り、５−ＦＯＡの存在下で増殖するそれらの能力によって選択される。この方法は、宿主細胞への、異種配列の効率的で安定な組み込みを提供する。
【００８５】
本発明のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５マーカー選択を使用することに対するいくつかの利点が存在する。第１に、このマーカー遺伝子は比較的小さく、約１ｋｂしかない。小さなサイズのマーカーは、より小さなプラスミドの構築を可能にする。さらに、小さなサイズは、ＵＲＡ５配列について欠失されていないＵｒａ−宿主株中での形質転換の間、栄養要求株マーカー遺伝子の遺伝子転換の速度を減少するはずである。この望ましくない結果は、ＨＩＳ４マーカーの場合において、形質転換されたコロニーの１０〜５０％を占め得る。ＨｉｇｇｉｎｓおよびＣｒｅｇｇ、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０３：１−１５（１９９８）。より遅い速度の遺伝子転換は、所望の標的部位において、ノック−インを有する形質転換体の画分を増加させるはずである。本発明のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５マーカー遺伝子は、さらに、自発的な逆転の頻度、および従って偽陽性のバックグラウンドコロニーをさらに減少するために、使用されて内因性のＵＲＡ５宿主配列を、欠失、またはさもなくば破壊し得る。
【００８６】
本発明の単離された核酸分子は、目的の配列または遺伝子をさらに含み得る。上記に記載されるように、目的の配列または遺伝子は、代表的には、宿主細胞中で通常は産生されないタンパク質をコードする。好ましい実施形態において、目的の配列または遺伝子で形質転換された酵母は、宿主と組換え核酸配列との間での相同組換えによって選択される位置に置いて、例えば、宿主ゲノム中に、安定に取り込まれた目的の配列または遺伝子を有する。目的の配列または遺伝子は、好ましくは、１つ以上の発現制御配列に連結され得、その結果、その配列によってコードされたタンパク質が、適切な条件下で、単離された核酸分子を含む宿主細胞中で発現され得る。
【００８７】
本発明はさらに、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５タンパク質のフラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。このタンパク質のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホモログは哺乳動物ＳＲＰ１９、シグナル認識粒子のサブユニットと関連し、かつ同様の機能を有すると考えられている。Ｈａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：５３２−５３３（１９９２）；ＳｔｉｒｌｉｎｇおよびＨｅｗｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：５３４−５３７（１９９２）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＥＣ６５遺伝子における変異は、温度感受性の細胞増殖を引き起こし得、かついくつかの分泌タンパク質および膜結合タンパク質の移行を欠損する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＥＣ６５タンパク質は、シグナル認識粒子との別のサブユニット、ＳＲＰ５４ｐの安定な結合のために必要とされる。同文献。ＳＲＰ５４ｐの過剰発現は、ＳＥＣ６５遺伝子の温度感受性の欠損を有する細胞において、増殖およびタンパク質移行の欠損を抑制する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子のフラグメントをコードする核酸分子は、全長遺伝子を同定するために使用され得、かつさらにコードされたタンパク質の発現および機能的活性をプローブするためにさらに使用され得る。このような活性には、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓシグナル認識粒子における構造的および機能的役割、ならびに小胞体を横切るタンパク質移行に対する関連する効果が含まれ得る。真菌ＳＥＣ６５−コードタンパク質間で共有された拡張されたドメイン構造、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＥＣ６５の短縮変異体の、この遺伝子における条件致死突然変異体を相補する能力（Ｒｅｇｎａｃｑら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９：７５３−７６２（１９９８））は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＥＣ６５遺伝子のフラグメントによってコードされるポリペプチドが同様の有用性を提供し得ることを示す。
【００８８】
本発明はさらに、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７タンパク質のフラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。ＳＣＳ７のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホモログを欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体は、野生型細胞における優先型であるイノシトールホスホリルセラミド種、ＩＰＣ−Ｃを蓄積し損なう。Ｄｕｎｎら、Ｙｅａｓｔ  １４：３１１−３２１（１９９８）。その代わりに、これらの変異体は、アミド結合Ｃ２６−脂肪酸上でヒドロキシル化されないと考えられているＩＰＣ−Ｂ種を蓄積する。さらに、ＳＣＳ７遺伝子の除去は、ＩＰＣ−Ｃのマンノシル化のために必要とされる遺伝子であるＣＳＧ１およびＣＳＧ２における変異のＣａ２＋感受性表現型を抑制する。同文献。これらの変異を有する細胞におけるＩＰＣ−Ｃの蓄積は、細胞をＣａ２＋感受性にする。全長Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＣＳ７遺伝子は、シトクロムｂ５様ドメインと、脂肪酸およびステロールの不飽和化またはヒドロキシル化を触媒するために鉄および酸素を使用するシトクロムｂ５依存性酵素のファミリーに類似するドメインの両方のドメインを含むタンパク質をコードする。同文献。それゆえに、コードされるタンパク質は、ＩＰＣ−ＣのＣ２６脂肪酸をヒドロキシル化する酵素であるらしい。細胞の膜組成に対するＳＣＳ７遺伝子における変異の効果は、Ｈａａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７０４−２９７１０（１９９７）（その全体が参照として本明細書に援用される）において記載されるように測定され得る。
【００８９】
本発明のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＳＣＳ７タンパク質のフラグメントをコードする単離された核酸分子は、全長型のＳＣＳ７遺伝子を同定および特徴付けするために使用され得る。本発明の単離された核酸分子はまた、ＳＣＳ７遺伝子の発現を測定するため、ならびにこの遺伝子およびそのコードされるタンパク質の特徴および機能、ならびに細胞の代謝におけるこの遺伝子の変化の効果を特徴付けするために使用され得る。
【００９０】
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５のクローニングのために有用な縮重オリゴヌクレオチド）
別の実施形態において、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の単離において有用な縮重オリゴヌクレオチドが提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の異なる部分を増幅することが可能である。これらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ１０遺伝子の一部に結合し得、かつこれを増幅し得る。これらのオリゴヌクレオチドがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＵＲＡ５遺伝子を増幅するのみであることは、この生物がＵＲＡ１０遺伝子を有していないことを示唆する。このオリゴヌクレオチドは、図３に示されるように、ＵＲＡ５遺伝子の位置にアニールする。このようなオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーションおよび増幅実験において有用である。
【００９１】
（ベクター）
本明細書にさらに記載されるような、上記の本明細書の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）もまた提供される。第１の実施形態において、このベクターは、上記の単離された核酸分子を含む。代替的な実施形態において、本発明のベクターは、１つ以上の発現制御配列に作動可能に連結された上記の核酸分子を含む。従って、本発明のベクターは、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するために使用され得る。
【００９２】
本発明のベクターはまた、それらが各細胞中で単一コピーで安定に維持されることを保証するエレメント（例えば、「ＣＥＮ」などのセントロメア様配列）を含み得る。代替的には、自律複製ベクターは、ベクターが宿主細胞あたり１コピーよりも多く複製されることを可能にするエレメント（例えば、自律複製配列、すなわち「ＡＲＳ」）を必要に応じて含み得る。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３５０巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ｂ，ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、遺伝子破壊または置換カセットとして機能するように設計された、自律複製しない統合型ベクターである。この型の統合型ベクターの例は、好ましくは、直接反復配列によって隣接される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＯＰＴ」）コード配列に連結された異種標的遺伝子の一部を少なくとも含む。従って、このベクターは、統合型ベクターを有する細胞中でＯＰＴ活性によって選択される配列の標的化された組み込みを可能にする。ＯＰＴコード配列の引き続く切除は、隣接する直接反復配列によって容易にされる。
【００９４】
他の実施形態において、本発明の統合型ベクターは、所望の特性を有するタンパク質をコードするさらなる異種配列、例えば、グリコシル化酵素をコードする配列を含み得、その結果、所望の配列が、組み込みの結果として宿主細胞ゲノムに導入され得る。これらの配列は、ＯＰＴコード配列が、隣接する直接反復配列間の組換えによって欠失された後でさえ、宿主ゲノムに残っている。
【００９５】
（単離されたポリペプチド）
本発明の別の局面に従って、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む）が提供される。１つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号３、５、または７に対応するポリペプチド配列を含む。本発明の代替的な実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号３、５、または７に対して少なくとも６５％同一であるポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号３、５、または７に対して少なくとも７０％、７５％、または８０％の同一性を有する。より好ましくは、この同一性は８５％、９０％、または９５％であるが、配列番号３、５、または７に対する同一性は、９８％、９９％、９９．９％、またはなおより高くであり得る。
【００９６】
本発明の他の実施形態に従って、上記のポリペプチド配列のフラグメントを含む単離されたポリペプチドが提供される。これらのフラグメントは、好ましくは、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、またはさらにより多くのアミノ酸を含む。
【００９７】
本発明のポリペプチドはまた、上記のポリペプチド配列と異種ポリペプチドとの間の融合物を含む。異種配列は、例えば、組換え的に発現されたタンパク質の精製および／または可視化を容易にするように設計された異種配列を含み得る。タンパク質融合物の他の非限定的な例には、ファージまたは細胞の表面上でのコードされたタンパク質のディスプレイを可能にするもの、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの固有の蛍光タンパク質に対する融合物、およびＩｇＧ  Ｆｃ領域に対する融合物が含まれる。
【００９８】
（宿主細胞）
本発明の別の局面において、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換した宿主細胞、およびその子孫が提供される。本発明のある実施形態において、これらの細胞は、ベクター上に本発明の核酸配列を有する。これらのベクターは自由に複製するベクターであってもよいが、そうである必要はない（以下を参照のこと）。本発明の他の実施形態において、核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、本発明の単離された核酸の破壊、欠失、または変異を用いる組換えによって変異されており、その結果、宿主細胞中のオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が、変異を欠く宿主細胞と比較して減少している。本発明の宿主細胞は、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａであるが、他の宿主細胞、とりわけ酵母細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００９９】
本発明の他の実施形態においてオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼが欠損している宿主細胞が、本発明の核酸分子および／または方法を使用して、宿主細胞ゲノムに１つ以上の配列および／または目的の遺伝子を組み込むために使用される。ある実施形態において、目的の配列または遺伝子は、宿主細胞の内因性遺伝子を破壊するように組み込まれる。組み込みを含む細胞は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の同時の組み込みに起因して、ウラシル原栄養性の回復によって同定される。さらなる本発明の実施形態において、修飾宿主細胞のウラシル栄養要求性は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が相同組換えによって切除されている細胞の選択によって提供される。
【０１００】
（抗体）
別の局面において、本発明は、本発明の単離されたポリペプチドおよびその誘導体、または本発明の単離された核酸によってコードされる１つ以上のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）を提供する。本発明の抗体は、そのネイティブなコンホメーションあるポリペプチド上に存在するものとして、またはある場合において、変性したときのポリペプチド上に存在するもの（例えば、ＳＤＳ中での可溶化によって）としてのいずれかで、このようなポリペプチドまたはポリフラグメントの直鎖状エピトープ、不連続エピトープ、またはコンホメーション的エピトープについて特異的であり得る。本発明によって提供される有用な抗体フラグメントの中には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および単鎖抗体Ｆｖフラグメントがある。
【０１０１】
「特異的に結合する」および「特異的結合」によって、抗体および第１の分子種が一緒に混合される他の分子種に対する結合に優先して、抗体が第１の分子種に結合する能力が意図される。抗体は、それが第１の分子種に特異的に結合し得るときに、第１の分子種を特異的に「認識する」といわれる。
【０１０２】
当該分野で周知であるように、抗体が混合物中で分子種間を区別し得る程度は、部分的には、混合物中の種のコンホメーションの関連性に依存する；代表的には、本発明の抗体は、関連性のないポリペプチドとの偶発的な結合に対して、少なくとも２倍、より代表的には少なくとも５倍、代表的には１０倍、２５倍、５０倍、７５倍より多く、およびしばしば１００倍より多く、および時折、５００倍または１０００倍より多く区別する。
【０１０３】
代表的には、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントについての本発明の抗体（または抗体マルチマー、ＩｇＭペンタマーの場合におけるように）の親和性または結合性は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、代表的には少なくとも約５×１０−７Ｍ、通常少なくとも約１×１０−７Ｍであり、１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、およびさらにより強い親和性または結合性が特に有用であることが分かった。
【０１０４】
本発明の単離された抗体は、任意の哺乳動物種からの天然に存在する型、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＡであり得る。例えば、抗体は、齧歯類（代表的にはマウスであるが、ラット、モルモット、およびハムスター）、ウサギ目（代表的にはウサギ）、およびまたより大きな哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマ）を含む種から通常得られる。動物は、代表的には、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを用いて、標準的な免疫プロトコールに従って同意の下で免疫される。
【０１０５】
本発明のポリペプチドの８個以上の連続するアミノ酸の実質的にすべてのフラグメントが、二官能性リンカーを使用して便利にキャリア（代表的には、ウシサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン、またはウシ血清アルブミン）に結合体化されたときに、免疫原として有効に使用され得る。免疫原性はまた、他の部分への本発明のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの融合物によって付与され得る。例えば、本発明のペプチドは、分枝ポリリジンコアマトリックス上の固相合成によって産生され得；これらの複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰ）は高純度、結合性の増加、正確な化学的定義、およびワクチン開発における安全性の改善を提供する。例えば、Ｔａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５４０９−５４１３（１９８８）；Ｐｏｓｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１７１９−１７２５（１９８８）を参照のこと。
【０１０６】
免疫のためのプロトコールは当該分野で十分に確立されている。このようなプロトコールは、しばしば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを伴うかまたは伴わないかのいずれかである、複数の免疫を含む。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、ポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質の免疫組織化学的検出において特定の利点を有し、そしてモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の特定のエピトープを同定および区別する際に利点を有する。免疫後、本発明の抗体は、当該分野において受容されている任意の技術を使用して産生され得る。組換え抗体産生のための宿主細胞（全抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体のいずれか）は、原核細胞または真核細胞であり得る。当該分野において周知であるように、原核生物宿主は、ファージディスプレイ抗体を産生するために特に有用である。哺乳動物、昆虫、植物、および真菌の細胞を含む真核生物細胞もまた、本発明の抗体、抗体フラグメント、および抗体誘導体の発現のために有用である。本発明の抗体はまた、無細胞翻訳によって調製され得る。
【０１０７】
本発明の単離された抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）は有用に標識され得る。それゆえに、本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの１つ以上に特異的に結合する標識された抗体を提供することである。標識の選択は、部分的には、所望される用途に依存する。ある場合において、本発明の抗体は、酵素で有用に標識され得る。代替的には、この抗体は、金コロイドまたは蛍光団で標識され得る。標識されたアビジン、ストレプトアビジン、キャプタビジン、またはニュートラビジンを使用する二次的検出のために、本発明の抗体は、ビオチンで有用に標識され得る。本発明の抗体が、例えば、ウェスタンブロッティング適用のために使用される場合、これらは、３３Ｐ、３２Ｐ、３Ｈ、および１２５Ｉなどの放射性同位元素で有用に標識され得る。理解されるように、上記の標識の使用は、任意の特定の適用に限定されない。
【０１０８】
（核酸配列の遺伝子組み込みのための方法−オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする宿主遺伝子の破壊）
本発明の別の実施形態に従って、宿主細胞のゲノムへの異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法が提供される。この実施形態の１つの局面において、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする宿主遺伝子は、本明細書に開示されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子由来の、破壊され、欠失され、またはさもなくば変異された核酸配列の導入によって破壊される。従って、点変異、再配列、挿入、または好ましくは欠失（「マークされた欠失」を含む、ここで、異種選択可能配列は置換された欠失されたＵＲＡ５配列を有する）を有する破壊された宿主細胞が提供される。ＵＲＡ５遺伝子が破壊され、かつ結果的にオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞は、異種配列が標的化された組み込みによって宿主細胞ゲノムに導入され得る、本発明のさらなる実施形態のための適切な宿主細胞として働く。
【０１０９】
（核酸配列の遺伝子組み込みのための方法−マーカー配列と結合されている目的の配列の導入）
本発明の別の局面において、異種核酸配列が、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＴ）活性を欠く（すなわち、Ｕｒａ５−）酵母宿主細胞に導入される。この方法を使用して導入される異種核酸配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＰＴ活性をコードする核酸配列に連結される（好ましくは、ベクター上で）。コンピテントＵｒａ５−宿主細胞へのベクターの形質転換の債に、本発明のＯＰＴ−コード配列に連結された異種配列を含む細胞が、ウラシル付加の非存在下で増殖する能力に基づいて選択され得る。
【０１１０】
１つの実施形態において、本発明の方法は、細胞複製の間に、母細胞から娘細胞に継代される自律複製ベクターをコンピテントＵｒａ５−宿主細胞に導入する工程を包含する。自律複製ベクターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＰＴ−コード配列に連結された目的の異種核酸配列を含み、かつ必要に応じて、それが各細胞中で単一のコピーで安定に維持されることを保証するエレメント（例えば、「ＣＥＮ」などのセントロメア様配列）を含む。別の実施形態において、自律複製ベクターは、ベクターが宿主細胞あたり１コピーよりも多く複製されることを可能にするエレメント（例えば、自律複製配列、すなわち「ＡＲＳ」）を必要に応じて含み得る。
【０１１１】
好ましい実施形態において、ベクターは、遺伝子破壊または置換カセットとして機能するように設計された、自律複製しない統合型ベクターである。本発明の統合型ベクターは、好ましくは、直接反復配列によって隣接される、本発明のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＰＴ−コード配列に連結された「標的遺伝子配列」（宿主細胞中の所望のゲノム部位における配列との相同組換えを受け得る配列）を含む１つ以上の領域を含む（以下を参照のこと）。ＯＰＴコード配列は、標的遺伝子配列に隣接し得るか（例えば、遺伝子置換カセット）、または標的遺伝子配列を破壊するように操作され得る（例えば、遺伝子破壊カセット）。置換カセットまたは破壊カセットにおける標的遺伝子配列の存在は、相同組換えによって、宿主中の特異的ゲノム領域へのカセットの組み込みを標的化する。
【０１１２】
本発明の好ましい方法において、望ましくない活性（例えば、酵素活性）をコードする宿主遺伝子は、相同組換えによって本発明のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＰＴコード置換カセットまたは破壊カセットを宿主遺伝子に標的化することによってに変異され（例えば、中断され）得る。好ましい実施形態において、望ましくないグリコシル化酵素活性（例えば、ＯＣＨ１などの開始マンノシルトランスフェラーゼ活性）は、宿主細胞中で破壊され、細胞中で産生されるポリペプチドのグリコシル化を変化させる。
【０１１３】
好ましくは、本発明の標的遺伝子の置換カセットまたは破壊カセットは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を隣接する直接反復配列をさらに含む。このような直接反復配列の特性はすでに記載されている。宿主細胞ゲノムへのカセットの標的化された組み込み、およびウラシルの非存在下での増殖のための組み込み体の選択の後、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子に隣接する直接反復配列は、宿主ゲノムからのＯＰＴ−コード配列の切除を促進する。オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く細胞は、５−ＦＯＡを含む培地中で増殖するそれらの能力について便利に対抗選択される。しかし、当業者は、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く細胞について対抗選択するために他の手段が使用され得ることを理解している。対抗選択段階から得られた細胞はオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠くので、同じＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＰＴ−コード核酸配列が、本発明のこの局面に従って、反復される遺伝子破壊事象において使用され得る。
【０１１４】
本発明のなおさらなる実施形態において、異種タンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子置換カセットまたは遺伝子破壊カセット中で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５に連結して操作される。好ましい実施形態において、このカセットは、望ましくない活性（例えば、酵素活性）をコードする宿主ゲノムの遺伝子座に組み込まれる。例えば、１つの好ましい実施形態において、このカセットは、開始マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする宿主遺伝子（例えば、ＯＣＨ１遺伝子）に組み込まれる。より好ましい実施形態において、このカセットはさらに、所望のグリコシル化酵素（マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）、およびタンパク質マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）を含むがこれらに限定されない）を含む１種以上の遺伝子をさらに含む。別の好ましい実施形態において、このカセットは、有用な治療タンパク質、例えば、ヒトプラスミノーゲンのｋｒｉｎｇｌｅドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、および顆粒球−ＣＳＦであるがこれらに限定されない）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、およびヒトプロテインＣ）、可溶性ＩｇＥレセプターα鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、チマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１抗トリプシン、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、およびα−フェトプロテインをコードする１種以上の遺伝子を含む。操作されたカセットは、このようなグリコシル化酵素をコードする「ノッキング−イン」遺伝子および他の目的の配列が、酵母細胞株において、ヒト様グリコシル化を有する糖タンパク質および他の有用な目的のタンパク質を産生するために有用である。ヒト様糖タンパク質を産生するための代表的な方法は、ＷＯ０２／００８７９において記載されており、これは参照として本明細書に援用される。
【０１１５】
以下の実施例は例示目的のみのためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１）
（一般的な材料および方法）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、組換えＤＮＡ研究のために使用した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０（野生型）およびＪＣ３０８（ａｄｅ１  ａｒｇ４  ｈｉｓ４  ｕｒａ３）（Ｌｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１））を、酵母株の構築のために使用した。ＰＣＲ反応を、ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔａｑ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、またはＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，ＴＸ）のいずれかを使用して、供給業者の推奨に従って実行した。制限酵素および修飾酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）またはＰｒｏｍｅｇａから入手した。
【０１１７】
修飾酵母株のＰＣＲ分析は以下の通りであった。単一コロニーを、１００μｌの破壊緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。１００ｍｇの酸洗浄したガラスビーズおよび１００μｌのフェノール−クロロホルムの付加後、溶液を１分間ボルテックスした。次いで、混合物を微量遠心分離機中で５分間、最大速度で遠心分離し、上清を回収し、そしてゲノムＤＮＡを１ｍｌの氷冷エタノールの付加により沈殿させた。７０％エタノールを用いる洗浄後、ペレットを１０μｌ破壊緩衝液中で再懸濁し、０．５から１μｌをＰＣＲ分析のために使用した。
【０１１８】
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のクローニング）
いくつかのストラテジーが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子をクローニングおよび同定するために使用され得る。好ましい方法は、種々の酵母種における遺伝子の整列の保存と組み合わせて、既存のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ５遺伝子の配列相同性を使用する工程を包含する。２種の遺伝子、ＵＲＡ５およびＳＥＣ６５は、少なくとも４種の酵母種：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて互いに反対の配向で隣接して配置されている。ＳａｎｃｈｅｚおよびＤｏｍｉｎｇｕｅｚ、Ｙｅａｓｔ  １８：８０７−８１３（２００１）。これらの遺伝子の各々によってコードされるタンパク質配列は、これらおよび他の微生物中で知られており（図２）、これらの配列は、例えば、ＣＯＤＥＨＯＰストラテジーを使用して、縮重プライマーを設計した。Ｒｏｓｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：１６２８−１６３５（１９９８）。ＵＲＡ５−１（図３）（配列番号２３）およびＳｅｃ６５−１
【０１１９】
【化１】
2011115182.tif 000002
（配列番号２９）と名付けられたこのような２つのプライマーを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡから１．１ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＵＲＡ５−１は、アミノ酸２７から開始するトップ鎖上にある。次いで、このＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、そして配列決定した。
【０１２０】
ＰＣＲによって生成した１１００ｂｐフラグメントは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ５に対して一方の末端で、ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびＳ．ｐｏｍｂｅからのＳＥＣ６５遺伝子に対して他方の末端で、高い相同性を示した。誘導されたヌクレオチド配列を使用して、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）によって提供されるように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの部分ゲノム配列を検索した。この検索の結果は、プライマー部位に隣接したさらなる０．９ｋｂのＤＮＡ配列を含む重複するＤＮＡフラグメントを同定した。タンパク質翻訳のための推定開始コドンがこの配列中にある。この推定開始コドンには、上流の約１５０ヌクレオチドの調節配列（プロモーター配列を含む）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＣＳ７に対して高い相同性を有する遺伝子の約０．７ｋｂの３’領域が先行する（図１）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の翻訳によって誘導されたタンパク質配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＵＲＡ５遺伝子に対して約６４％の同一性および約７８％の類似性を示し、他の種からのＵＲＡ５遺伝子に対してもまた高い相同性を示した。完全な１９４７ｂｐフラグメントを図１に示す。
【０１２１】
（代替的な縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５のクローニング）
縮重プライマーを、ＣＯＤＥＨＯＰストラテジーを使用して設計した。Ｒｏｓｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：１６２８−１６３５（１９９８）。ＵＲＡ５−１（配列番号２３）はコード鎖の縮重型であり、アミノ酸２７をコードするコドンから開始する。ＵＲＡ５−２（配列番号２４）はアミノ酸６６をコードするコドンから開始するコード鎖の縮重型である。ＵＲＡ５−３（配列番号２５）は、ＵＲＡ５−２の部分相補物である。ＵＲＡ５−４（配列番号２６）はアミノ酸１０５をコードするコドンから開始するコード鎖の縮重型である。ＵＲＡ５−５（配列番号２７）はＵＲＡ５−４の部分的相補物である。ＵＲＡ５−６（配列番号２８）はコード鎖の縮重型であり、アミノ酸１３０をコードするコドンで開始するコード鎖のセグメントにハイブリダイズするように設計されている。オリゴヌクレオチドによって結合されるＵＲＡ５中の配列および位置を図３に図示する。
【０１２２】
（実施例２）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の破壊）
クローニングされたＵＲＡ５遺伝子を、遺伝子特異的プライマーとともに使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムからのＵＲＡ５遺伝子を破壊するための構築物を生成し得る。破壊されたＵＲＡ５遺伝子を有する宿主細胞を、以下のようにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５破壊カセットを使用して作製した。
【０１２３】
トランスポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂのＳａｃＩ、ＸｂａＩフラグメントを、プラスミドｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｅｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４（１９９６））から切除し、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ、ＸｂａＩ部位にクローニングし、ｐＪＮ３７４を得た。オリゴヌクレオチドＵｒａ５−５５
【０１２４】
【化２】
2011115182.tif 000003
（配列番号３０）およびＵｒａ５−５３ｐ
【０１２５】
【化３】
2011115182.tif 000004
（配列番号３１）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして、およびＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＵＲＡ５  ＡＴＧの上流の領域を増幅するために使用した。得られたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＶで切断し、ｐＪＮ３７４のＥｃｏＩＣＲＩ部位にクローニングした。次いで、得られたプラスミドをＳａｌＩおよびＳｐｈＩで消化した。コード配列の一部およびＵＲＡ５遺伝子の３’領域に対応するＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＵｒａ５−３５ｐ
【０１２６】
【化４】
2011115182.tif 000005
（配列番号３２）およびＵｒａ５−３３
【０１２７】
【化５】
2011115182.tif 000006
（配列番号３３）を使用して増幅した。このフラグメントを、切断したプラスミドに挿入して、ｐＪＮ３９５（図５）を作製した。このプラスミドにおいて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子のコドン２７〜３９は、カナマイシン耐性遺伝子によって置き換えられていた。
【０１２８】
ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いるｐＪＮ３９５の消化後、線状化された破壊カセットを、エレクトロポレーションによってＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型株ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０（ＡＴＣＣ  ７６２７３）に形質転換し、そして細胞を、３００ｍｇ／ｌジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むＹＰＤプレート（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３５０巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ｂ，ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００２））上にプレートした。３０℃における４日間のインキュベーションの後、約１０，０００クローンを、５−ＦＯＡを含むプレート（１．４％酵母窒素ベース、２％デキストロース、０．２ｇ／ｌウラシル、１ｇｌ  ５−ＦＯＡ、４ｍｇ／ｌ  ビオチン、１．５％寒天）上で複製し、３０℃で７日間インキュベートした。５−ＦＯＡに耐性であるコロニー（２４０コロニー）を５−ＦＯＡプレート上で再ストリークし、次いで、ＹＰＤおよびＵｒａドロップアウトプレートに適用した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３５０巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ｂ，ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００２））。Ｕｒａドロップアウトプレート上で増殖し損ねたが、ＹＰＤ上で増殖することが可能であった細胞（もともとの２４０個の耐性コロニーのうちの２０５個）を、次いで液体ＹＰＤ中で増幅した。各約１０８細胞を、単一のＵｒａドロップアウトプレート上にプレートし、復帰突然変異株についてチェックした。１３個のクローンがＵｒａドロップアウトプレート上でコロニーを生じ、これはさらに試験しなかった。他のクローンは自発的に復帰することはできなかった。ＹＰＤおよび５−ＦＯＡ上での最も強固な増殖に基づいて、３１個のクローンを拾い上げ、コロニーＰＣＲによって試験し、そのうちの３０個がカナマイシンでマークされたＵＲＡ５ノックアウトであることが見い出された。これらの株中でのゲノムＵＲＡ５遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で破壊されたことを確証するために、コロニーＰＣＲ反応物の１つをＢｇｌＩＩまたはＸｂａＩで消化した。予想された制限パターンを示す株（２．３５ｋｂおよび１．０５ｋｂ）をＹＪＮ１６５と名付けた。
【０１２９】
（実施例３）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの安定な遺伝子修飾のためのベクターのセットの構築）
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける安定な遺伝子置き換えのために有用なベクターのセットを以下に記載するように構築した。高コピー数ベクター  ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１１９（１９８５））に基づいて、一連のモジュラープラスミドをアセンブルした。これは、数回の単純なサブクローニング工程の後で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子を、強力なＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で、目的の異種遺伝子と置き換えるために使用され得る。プラスミドｐＪＮ２６６（図４）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＥＸＩ遺伝子の５’領域および３’領域に相同である２つのフラグメントからなる。これらのセグメントは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＹＣＩ転写終結発現カセット（「ＣＹＣ１  ＴＴ」）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３栄養要求性マーカーカセットに隣接する。このプラスミドのすべての領域にマルチプル制限サイトが隣接し、そして個々に置換され得る。この発現カセットは、異種遺伝子の挿入のための複数のクローニング部位を含む。
【０１３０】
２つの再使用可能な栄養要求性マーカーカセットを、Ｌｕら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：１４１−１４６（１９９８）およびＡｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６：５４１−５４５（１９８７）によって記載されるアプローチに基づいて、組換え部位としてｌａｃＺリーディングフレームのセグメントからの直接反復を使用して構築した。対抗選択可能である栄養要求性マーカーとして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３遺伝子を含む２ｋｂＤＮＡセグメント、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子を有する１ｋｂフラグメントを使用した。次いで、両方のマーカーカセットを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１ノックアウトプラスミドに挿入した。次いで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５含有プラスミドを、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターについての異種遺伝子を含むプラスミドを生成するためにさらに修飾した。
【０１３１】
（方法）
プラスミド構築の第１の段階は、ノックアウトされる遺伝子の５’領域および３’領域についてのスペースホルダーとして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＫＥＸ１遺伝子のＤＮＡ領域を含むユニバーサルプラスミドのセット（Ｂｏｅｈｍら、Ｙｅａｓｔ  １５：５６３−５７２（１９９９））を作製する工程を含んだ。このプラスミドはまた、栄養要求性マーカーおよび外因性遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトを有する発現カセットのためのスペースホルダーとして、細菌の直接反復配列（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６：５４１−５４５（１９８７））に隣接された、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子を含んだ。
【０１３２】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＥＸ１−５’領域の０．９ｋｂフラグメントを、プライマーＫｅｘ５５
【０１３３】
【化６】
2011115182.tif 000007
（配列番号３４）およびＫｅｘ５３
【０１３４】
【化７】
2011115182.tif 000008
（配列番号３５）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＰＣＲによって増幅した。増幅されたフラグメントを、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＳａｃＩ部位、ＳａｌＩ部位にクローニングした。得られるプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断した。プライマーＫｅｘ３５
【０１３５】
【化８】
2011115182.tif 000009
（配列番号３６）およびＫｅｘ３３
【０１３６】
【化９】
2011115182.tif 000010
（配列番号３７）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅したＫＥＸＩ−３’領域の０．８ｋｂフラグメントを、切断されたプラスミドにクローニングして、ｐＪＮ２６２を作製した。このプラスミドをさらに、ＢａｍＨＩで切断した。次いで、ｐＮＫＹ５１（Ａｌａｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６：５４１−５４５（１９８７））からの３．８ｋｂ  ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを、両方の可能な方向でこの部位に挿入して、ｐＪＮ２６３およびｐＪＮ２６４を生成した。
【０１３７】
発現カセットを、クローニング部位としてＮｏｔＩおよびＰａｃＩを使用して作製した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＡＰＤＨプロモーターを、プライマーＧａｐ５
【０１３８】
【化１０】
2011115182.tif 000011
（配列番号３８）およびＧａｐ３
【０１３９】
【化１１】
2011115182.tif 000012
（配列番号３９）を使用して、プラスミドｐＧＡＰＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をテンプレートとして用いて増幅した。増幅したセグメントを、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＢａｍＨＩ部位、ＳｐｈＩ部位にクローニングした。得られるプラスミドを、ＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断した。ＣＹＣ１点Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｙターミネーター領域を、プライマーＣｙｃ５
【０１４０】
【化１２】
2011115182.tif 000013
（配列番号４０）およびＣｙｃ  ３
【０１４１】
【化１３】
2011115182.tif 000014
（配列番号４１）を使用して、プラスミドｐＰＩＣＺ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をテンプレートとして用いて増幅した。増幅したセグメントを切断して、ｐＪＮ２６１を作製した。発現カセットを、このプラスミドをＢａｍＨＩでの消化によって生成した。このフラグメントを、プラスミドｐＪＮ２６５を生成するためにｐＪＮ２６３（上記）に、またはプラスミドｐＪＮ２６６およびｐＪＮ２６７を生成するためにｐＪＮ２６４（上記）のいずれかに、インサートの方向に依存してクローニングした。ｐＪＮ２６６のマップを図４に示す。
【０１４２】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子についてのノックアウトプラスミドを、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩを用いてｐＪＮ２６３を消化することによって作製した。プライマーＯｃｈ５５
【０１４３】
【化１４】
2011115182.tif 000015
（配列番号４２）およびＯｃｈ５３
【０１４４】
【化１５】
2011115182.tif 000016
（配列番号４３）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅されたＯＣＨ１−５’領域の２．９ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを、オープン部位にクローニングした。得られるプラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＰｍｅＩで切断した。プライマーＯｃｈ３５
【０１４５】
【化１６】
2011115182.tif 000017
（配列番号４４）およびＯｃｈ３３
【０１４６】
【化１７】
2011115182.tif 000018
（配列番号４５）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅されたＯＣＨ１−３’領域の１．０ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを、切断したプラスミドに挿入して、ｐＪＮ２９８を生成した。同時にＯＣＨ１遺伝子をノックアウトしかつ新規な遺伝子を導入する可能性を許容するために、ｐＪＮ２６１（上記）のＢａｍＨＩ発現カセットを、ｐＪＮ２９８の独特なＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＪＮ２９９を作製する。
【０１４７】
ＵＲＡ３およびＵＲＡ５についてのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子破壊カセットを、Ｌｕら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：１４１−１４６（１９９８）に記載されるものと同様のストラテジーを使用して構築した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ３遺伝子の２．０ｋｂ  ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩフラグメントを、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＰｓｔＩ、ＸｂａＩ部位に挿入し、ｐＪＮ３０６を作製した。Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃＺオープンリーディングフレームの０．７ｋｂ  ＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ  ＤＮＡ（例えば、Ｋａｌｎｉｎｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：５９３−５９７（１９８３）を参照のこと）を、ＳａｃＩ部位、ＳｍａＩ部位にクローニングして、ｐＪＮ３０８を生じた。ＰｓｔＩを用いるｐＪＮ３０８の消化およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理の後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化された、ｌａｃＺからのＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを、プラスミドに挿入してｐＪＮ３１５を生成した（図４）。ｌａｃＺ／ＵＲＡ３破壊カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩを用いるｐＪＮ３１５の消化によって遊離させ、そしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した、次いで、このカセットフラグメントを、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、かつＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化したｐＪＮ２９９（上記）のバックボーンにクローニングした。得られるプラスミドをｐＪＮ３２９と名付けた（図４）。Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２−５０２７（２００３）もまた参照のこと。
【０１４８】
ｌａｃＺ／ＵＲＡ５破壊カセットを生成するために、ｌａｃＺのＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩフラグメントを、ｐＵＣ１９のＳａｃＩ部位、ＳｍａＩ部位にクローニングした。得られるプラスミドをＰｓｔＩで消化しかつ平滑末端化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化したｌａｃＺフラグメントをプラスミドに挿入して、ｐＪＮ３１６を生成した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子の１．０ｋｂフラグメントを、プライマーＵｒａ５Ｃｏｍｐ５
【０１４９】
【化１８】
2011115182.tif 000019
（配列番号４６）およびＵｒａ５Ｃｏｍｐ３
【０１５０】
【化１９】
2011115182.tif 000020
（配列番号４７）を使用してゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＪＮ３１６のＢａｍＨＩ部位、ＸｂａＩ部位にクローニングして、ｐＪＮ３９６（図５）を生成した。ｌａｃＺ／ＵＲＡ５カセットを、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いるこのプラスミドの消化によって遊離させた。
【０１５１】
異なる栄養要求性マーカーを含むＯＣＨ１ノックアウトプラスミドを作製するために、ｐＪＮ２９９（上記）を、ＰｍｅＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、そしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ＳａｃＩおよびＳｐｈＩを用いるｐＪＮ３１５（図４）の消化、およびＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いるｐＪＮ３９６（図５）の消化後、各栄養要求性マーカーカセットをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ｐＪＮ２９９バックボーンに連結した。これは、プラスミドｐＪＮ３２９（ＵＲＡ３）およびｐＪＮ３９８ａ（ＵＲＡ５）を生じた。
【０１５２】
プラスミドｐＪＮ３９８をさらに、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩを用いる消化によって修飾し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化した。Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１０６０８０に由来し（Ａｂｅｉｊｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５９６３−５９６８（１９９６））Ｋ．ｌａｃｔｉｓびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターを含むｐＤＬ０２の平滑末端化されたＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、オープン部位にクローニングし、ｐＪＮ４０７を作製した（図５）。
【０１５３】
（実施例４）
（対抗染色可能なマーカーのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子および再生の破壊）
プラスミドｐＪＮ３２９（ＵＲＡ３）を使用する株ＪＣ３０８（ａｄｅ１、ａｒｇ４、ｈｉｓ４、ｕｒａ３）（Ｌｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９（２００１）におけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１の破壊は、Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２−５０２７（２００３）に記載されている（これは、その全体が参照として本明細書に援用される）。
【０１５４】
ＵＲＡ５対抗選択マーカーを使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターについての遺伝子で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子を置き換えるために、１００μｇのｐＪＮ４０７をＳｆｉＩで消化し、エレクトロポレーションによってＹＪＮ１６５に形質転換した。ウラシルを各最小培地上での１０日間、室温でのインキュベーション後、４６０個のコロニーを拾い上げ、再ストリークした。３日後、４６０個すべてを２セットのＹＰＤプレートにストリークした。３７℃では増殖が不可能であったが、室温では増殖した５個のＵＲＡ＋クローンを、コロニーＰＣＲに供し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＯＣＨ１遺伝子の検出のために試験した。５個すべての株が、予測されたサイズのＰＣＲシグナルを生じた。第２のコロニーＰＣＲは、５個すべてのクローンが、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミントランスポーターについての遺伝子を含んだことを確証した。これらのクローンを、ＹＪＮ１９８−１〜５と名付けた。
【０１５５】
ｕｒａ５の栄養要求性を再生するために、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ５対立遺伝子を含む５個すべてのクローンを２日間ＹＰＤプレート上で増殖させ、次いで、５−ＦＯＡプレート上に拡げた。室温での６日間のインキュベーション後、５個すべてのクローンは、５−ＦＯＡに対して耐性であり、かつまたウラシルに対して栄養要求性であるクローンを生じた。ＹＪＮ１９８−２およびＹＪＮ１９８−３の対抗選択によって誘導された５−ＦＯＡに対して耐性のコロニーは、ＹＰＤ上で他よりも有意に遅く増殖し、そしてさらに試験を行わなかった。ＹＪＮ１９８−１、ＹＪＮ１９８−４、およびＹＪＮ１９８−５の対抗選択によって誘導された６個の増殖しているコロニーをＰＣＲ分析に供した。これらのコロニーは、すべて、ＵＲＡ５カセットを喪失したことが確認された、これらは、ＹＪＮ１９９−１〜６と名付けた。
【０１５６】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５−ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターカセットを使用する、ＯＣＨ１遺伝子座へのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの安定な組み込みを生じる、破壊およびマーカーリサイクリング工程の模式図を図６に示す。
【０１５７】
本発明の好ましい例示的な実施形態を記載してきたが、当業者は、本発明が、例示目的のみであって限定を意図しない記載された実施形態以外によって実施され得ることを理解する。本発明は、上記の特許請求の範囲によってのみ、限定される。
【図１】
2011115182.tif 000021
【図２】
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【図３】
2011115182.tif 000023
【図４】
2011115182.tif 000024
【図５】
2011115182.tif 000025
【図６】
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【配列表】
2011115182000001.app