(57)【要約】【課題】被験体が心臓血管疾患を発症する、有する、または、心臓血管疾患の合併症を経験する危険性を有するかどうかを調べる方法を提供する。【解決手段】被験体、特にヒト被験体が心臓血管疾患の合併症を発症する、有する、または経験する危険性を有するかどうかを調べるための方法および現方法により心臓血管疾患の危険性があることが同定された被験体を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は被験体の身体由来サンプル中の酸化されたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。また、本方法において使用するためのキットおよび試薬を提供する。また、被験体における心臓血管疾患の状態、および、心臓血管疾患を有する被験体に対する治療薬の作用をモニタリングするための方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本出願において記載された研究は、助成金番号ＨＬ６２５２６、ＨＬ０７６４９１、ＨＬ７０６２１、ＨＬ０７７６９２およびＨＬ６６０８２によって、少なくとも部分的に支持される。
【０００２】
（優先権の主張）
本出願は、米国特許仮出願第６０／５２７，１７８号（２００３年１２月５日出願）、米国特許仮出願第６０／６００，５２７号（２００４年８月１１日出願）、米国特許仮出願第６０／６００，５５１号（２００４年８月１１日出願）、および米国特許仮出願第６０／６１９，０４４号（２００４年１０月１５日出願）に対する優先権を主張し、これらの全ては、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は心臓血管疾患の分野に関する。より詳細には、被験体、特にヒト被験体が心臓血管疾患を発症するか、心臓血管疾患を有するか、または、心臓血管疾患の合併症を経験する危険性を有するかどうかを調べるためのマーカーおよび方法に関する。本出願はまた被験体における心臓血管疾患の状態、または、心臓血管疾患を有する被験体に対する治療薬の作用をモニタリングするためのこのようなマーカーおよび方法の使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
心臓血管疾患（ＣＶＤ）はアテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、脳血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患および末梢血管疾患を包含する心臓および血管の疾患に関する一般的な用語である。ＣＶＤを有する被験体は多くの合併症、例えば心筋梗塞、卒中、狭心症、一過性虚血発作、うっ血性心障害、大動脈瘤および死亡を発症する場合がある。ＣＶＤは米国の死亡例では２例中の１例に相当し、死亡原因の第１位である。即ち、心臓血管疾患の防止は主要な公衆衛生上の重要な領域である。
【０００５】
低脂肪食および運動はＣＶＤを防止するために推奨されている。更に、多くの治療薬がＣＶＤ発症または保有の危険性を有することが解っている個体に対して医療専門家により処方されている。これらにはコレステロールおよびトリグリセリドの血中濃度を低下させる脂質低下剤、血圧を正常化させる薬剤、血小板の活性化を防止し、血管の炎症を低減するアスピリンまたは血小板ＡＤＰレセプター拮抗剤（例えばクロピドグレルおよびチクロピジン）のような薬剤、および、炎症を低減し、インスリン感受性を誘発し、血管機能を改善し、脂質の異常性を是正する広範な代謝作用を有する多面作用性の薬剤、例えばパーオキシソーム増殖物質活性化レセプター（ＰＰＡＲ）作用薬が包含される。より攻撃的な治療、例えば複数の薬剤の投与または外科的介入がハイリスクの個体において使用される。ＣＶＤ療法は有害な副作用を有する場合があるため、ＣＶＤを発症するか保有している危険性を有する個体、特にハイリスクの個体を同定するための方法が望まれている。
【０００６】
現在、数種の危険因子がＣＶＤを発症または保有する個体の危険性を評価し、そしてハイリスクの個体を同定するために医療専門家により使用されている。心臓血管疾患の主要な危険因子は年齢、高血圧、早期ＣＶＤの家族歴、喫煙、高値の総コレステロール、低値のＨＤＬコレステロール、肥満および糖尿病を包含する。ＣＶＤの主要な危険因子は相加的なものであり、典型的にはＣＶＤに関する治療により最も利益を被ると考えられる個体を標的にした危険予測アルゴリズムにおいて医師等により共に使用されている。これらのアルゴリズムは１０年以内のＣＶＤの危険性を予測するための高い感度および特異性を達成する。しかしながら、既存のアルゴリズムがＣＶＤ発症のより高い確率を予測する能力は限定されている。現在危険因子の何れも有していない個体のうち、ＣＶＤ発症の１０年間の危険性はなお約２％である。更にまた、多数のＣＶＤの合併症は現在知られた危険因子を使用して判定した場合、見かけ上は軽度または中等度の危険プロファイルを有する個体において起こっている。即ち既存の心臓血管危険性のアルゴリズムを拡張してＣＶＤの危険性を有するか罹患している個体のより広いスペクトルを同定する必要がある。
アテローム性動脈硬化症の機序は十分理解されていない。過去１０年に渡り、多数の臨床、病理、生化学および遺伝子的なデータがアテローム性動脈硬化症は慢性炎症性障害であるという見解を支持している。感受性であるが非特異的な炎症マーカーである急性期の反応体（例えばＣ反応性タンパク質、補体タンパク質）は脂肪層および後期のアテローム性動脈硬化症患部においてリッチ化される。最近の予測的臨床治験において、Ｃ反応性タンパク質のベースライン血漿中のレベルは初回心筋梗塞および見かけ上健康な個体における卒中の危険性を独立して予測している。特許文献１は心臓血管障害を発症する個体の危険性を特徴付けるためにＣ反応性タンパク質、サイトカインおよび細胞接着分子を使用する方法を記載している。有用では有るが、これらのマーカーはＣＶＤ以外の原因のために炎症を有する個体の血液中に存在する場合があり、従って、マーカーは十分特異的であるとはいえない。更にまた、そのレベルのモジュレーションはＣＶＤの罹患率または死亡率の低減を予測するとは解っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，０４０，１４７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
心臓血管疾患を有する被験体の危険性を特徴付けるための方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の１つ以上の酸化アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）関連生体分子のレベルを決定する工程であって、ここで該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントから選択される、工程
を包含し、そして
対照値または内標準と比較した場合の該生物学的サンプル中の該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連酸化生体分子のレベルの上昇は、該被験体が心臓血管疾患を有する危険性を有することを示す、方法。
（項目２）
前記１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の少なくとも１つが、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記方法が、以下のアミノ酸残基：クロロチロシン、ニトロチロシン、ジチロシン、トリヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、メチオニンスルホキシドおよびチロシンパーオキシドの１つ以上を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを検出するための手順または試薬を使用する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記方法が、配列番号１における位置１８、位置２９、位置１６６、位置１９２、位置２３６の任意の１つ、または該位置の任意の組合せにおいて酸化アミノ酸残基を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドを検出するための手順を使用する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルが、ヒト被験体の対照集団由来の比較可能な生物学的サンプル中の、該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルに基づいた対照値または対照値の範囲と比較される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記生物学的サンプルが、血液、血清または血漿である、項目１に記載の方法。
（項目７）
心臓血管疾患についての被験体の危険性プロファイルを特徴付けるための方法であって、該方法は、
該被験体由来の身体サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを対照値と比較することによって、第１の危険値を決定する工程；ならびに、
該被験体における１つ以上のさらなる心臓血管危険値を測定する工程であって、ここで該１つ以上のさらなる危険値は、
ａ）該被験体の血圧を決定する工程；
ｂ）該被験体由来の生物学的サンプル中の低密度リポタンパク質もしくはコレステロール、または両方のレベルを決定する工程；
ｃ）ストレス試験に対する該被験体の応答を評価する工程；
ｄ）該被験体由来の生物学的サンプル中のミエロペルオキシダーゼ、Ｃ反応性タンパク質または両方のレベルを決定する工程；および、
ｅ）該被験体のアテローム性動脈硬化性プラーク負荷を決定する工程
によって得られる、工程、ならびに、
該第１の危険値を該１つ以上のさらなる危険値と合わせて、最終危険値を提供する工程を包含する、方法。
（項目８）
心臓血管疾患を発症する被験体の危険性を特徴付けるための方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを決定する工程であって、ここで該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントから選択される、工程
を包含し、そして
対照値または内標準と比較した場合の該生物学的サンプル中の該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連酸化生体分子のレベルの上昇は、該被験体が心臓血管疾患を発症する危険性を有することを示す、方法。
（項目９）
前記１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の少なくとも１つが、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記方法が、以下のアミノ酸残基：クロロチロシン、ニトロチロシン、ジチロシン、トリヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、メチオニンスルホキシドおよびチロシンパーオキシドの１つ以上を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを検出するための手順または試薬を使用する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記方法が、配列番号１における位置１８、位置２９、位置１６６、位置１９２、位置２３６の任意の１つ、または該位置の任意の組合せにおいて酸化アミノ酸残基を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドを検出するための手順を使用する、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルが、ヒト被験体の対照集団由来の比較可能な生物学的サンプル中の、該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルに基づいた対照値または対照値の範囲と比較される、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記生物学的サンプルが、血液、血清または血漿である、項目８に記載の方法。
（項目１４）
前記被験体が、見かけ上健康なヒト被験体である、項目８に記載の方法。
（項目１５）
前記被験体が、非喫煙者である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記被験体が、心臓血管疾患の高い危険性を有することが別段知られない、項目８記載の方法。
（項目１７）
胸部痛を呈している被験体において重大な有害心臓事象を経験する短期的な危険性を特徴付けるための方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを決定する工程であって、ここで該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントから選択される、工程
を包含し、そして
対照値または内標準と比較した場合の該生物学的サンプル中の該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連酸化生体分子のレベルの上昇は、該被験体が重大な心臓事象を経験する危険性を有することを示す、方法。
（項目１８）
前記１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の少なくとも１つが、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記方法が、以下のアミノ酸残基：クロロチロシン、ニトロチロシン、ジチロシン、トリヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、メチオニンスルホキシドおよびチロシンパーオキシドの１つ以上を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを検出するための手順または試薬を使用する、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記方法が、配列番号１における位置１８、位置２９、位置１６６、位置１９２、位置２３６の任意の１つ、または該位置の任意の組合せにおいて酸化アミノ酸残基を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドを検出するための手順を使用する、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルが、ヒト被験体の対照集団由来の比較可能な生物学的サンプル中の、該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルに基づいた対照値または対照値の範囲と比較される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記生物学的サンプルが、血液、血清または血漿である、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
心臓血管疾患を有することが疑われるか、または心臓血管疾患を有すると診断された被験体において治療を評価するための方法であって、該方法は、
治療の前に該被験体から採取された生物学的サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを決定する工程、および、
治療の間または治療の後に該被験体から採取された対応する生物学的サンプル中の該酸化ａｐｏ−Ａ１関連生体分子の１つ以上のレベルを決定する工程
を包含し、
ここで治療の前に採取されたサンプル中の該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルと比較した場合の、治療の後または治療の間に採取されたサンプル中の該１つ以上の酸化ａｐｏ−Ａ１関連生体分子のレベルの低下は、処置される被験体における心臓血管疾患に対する治療の正の効果を示す、方法。
（項目２４）
前記生物学的サンプルが、血液、血清または血漿である、項目１３に記載の方法。
（項目２５）
心臓血管疾患の合併症を経験する被験体の危険性を評価する方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の生体分子の１つ以上の酸化形態のレベルを、被験体の対照集団由来の生物学的サンプル中の該生体分子の該１つ以上の酸化形態のレベルと比較する工程であって、
ここで該生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメント、またはそれらの組合せである、工程、ならびに、
被験体の対照集団に由来する対照値と比較した、該被験体の身体サンプル中の該１つ以上の酸化生体分子のレベルに基づいて、心臓血管疾患の合併症を経験する該被験体の危険性を特徴付ける工程
を包含する、方法。
（項目２６）
被験体の対照集団の由来の生物学的サンプル中の生体分子の前記１つ以上の酸化形態のレベルとを比較した場合の、該被験体由来の生物学的サンプル中の該生体分子の該１つ以上の酸化形態のレベルとの間の差が、心臓血管疾患の合併症を経験する該被験体の危険性の程度を示す、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記方法が、以下のアミノ酸残基：クロロチロシン、ニトロチロシン、ジチロシン、トリヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、メチオニンスルホキシド残基およびチロシンパーオキシドの１つ以上を含む、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを検出するための手順または試薬を使用する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記サンプルが、血液またはその画分である、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
胸部痛を呈している被験体において医療介入を必要とする短期的な危険性を決定する方法であって、該方法は、
該被験体由来の身体サンプル中の危険性予測因子のレベルを評価する工程であって、ここで該危険性予測因子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメント、またはこれらの任意の組合せである、工程
を包含し、
ここで該被験体の身体サンプル中の該危険性予測因子のレベルと、対照集団由来の比較可能な身体サンプル中の該危険性予測因子のレベルとの間の差は、該被験体において短期的な医療介入を必要とする危険性の程度を確立する、方法。
（項目３０）
１以上の急性有害心臓血管事象を経験している被験体において、次の急性心臓血管事象を経験する危険性を特徴付ける方法であって、該方法は、
最初の時点において該被験体から採取された生物学的サンプルと、次の時点において該被験体から採取された対応する生物学的サンプルとにおける酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の１つ以上のレベルを決定する工程
を包含し、
ここで該最初の時点と比較した、該次の時点において採取された生物学的サンプル中の該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルの上昇は、次の有害な心臓血管事象を経験する該被験体の危険性が増加していることを示す、方法。
（項目３１）
心臓血管疾患（ＣＶＤ）を有する被験体において、ＣＶＤの状態を経時的にモニタリングするための方法であって、該方法は、
最初の時点において該被験体から採取された生物学的サンプルと、次の時点において該被験体から採取された対応する生物学的サンプルとにおいて、酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の１つ以上のレベルを決定する工程
を包含し、ここで該最初の時点と比較した、該次の時点において採取された生物学的サンプル中の該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルの上昇は、該被験体のＣＶＤが悪化したことを示す、方法。
（項目３２）
酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントに対して免疫特異的な抗体であって、該ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは、少なくとも３アミノ酸長であり、そして、以下のアミノ酸残基：クロロチロシン、ニトロチロシン、ジチロシン、トリヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、メチオニンスルホキシド残基およびチロシンパーオキシドの１つ以上を含む、抗体。
（項目３３）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのクロロチロシンを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３４）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのニトロチロシンを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３５）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのジヒドロフェニルアラニンを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３６）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのトリヒドロキシフェニルアラニンを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３７）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのジチロシンを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３８）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのメチオニンスルホキシドを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目３９）
前記酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントが、少なくとも１つのチロシンパーオキシドを含む、項目３２に記載の抗体。
（項目４０）
キットであって、該キットは、
酸化ａｐｏＡ−ＩまたはａｐｏＡ−Ｉの酸化フラグメントを検出するための１つ以上の試薬、ならびに
１つ以上の以下の印刷された物質：心臓血管疾患の試験被験体の危険性を評価する方法において該試薬を使用するための説明書、試験被験体の心臓血管疾患の危険性を評価するための情報、および心臓血管疾患の危険性を有すると決定された被験体を処置するための推奨事項、
を含む、キット。
（項目４１）
前記１つ以上の試薬の少なくとも１つが、酸化ａｐｏ  ＡＩもしくはａｐｏ  ＡＩの酸化ペプチドフラグメント、または両方に対して免疫特異的である抗体である、項目４０に記載のキット。
（項目４２）
前記１つ以上の試薬の少なくとも１つが、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントである、項目４０に記載のキット。
（項目４３）
心臓血管疾患を有することが疑われるか、または心臓血管疾患を有すると診断されたヒトを処置する方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを決定する工程であって、ここで該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントから選択される、工程
を包含し、
ここで該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルは、対照サンプルと比較して高く、短期的な有害心臓事象の該ヒトの危険性を低減するための介入処置を提供する、方法。
（項目４４）
前記介入処置が、被験体に対して心臓血管疾患の薬物療法を推奨すること、該被験体に対して冠動脈造影を推奨すること、該被験体に対して冠動脈バイパス手術を推奨することから選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
心臓血管疾患を有することが疑われるか、または心臓血管疾患を有すると診断されたヒトを処置する方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを決定する工程であって、ここで該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントから選択される、工程
を包含し、そして、
ここで該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルは、対照サンプルと比較し
て高く、該ヒトの長期的な心臓血管の健康状態を改善するために該ヒトにアドバイスを提供する、方法。
（項目４６）
心臓血管障害の危険性を低下されるために被験体を処置するための方法であって、該方法は、
該被験体由来の生物学的サンプル中の１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを決定する工程であって、ここで該１つ以上のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は、酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントから選択される、工程
を包含し、そして、
ここで該１つ以上の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルは、対照サンプルと比較して高く、抗炎症剤、抗血栓剤、抗血小板剤、フィブリン溶解剤、脂質低下剤、直接的トロンビンインヒビター、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター、細胞接着分子に結合してこのような分子に結合する白血球の能力を阻害する薬剤、カルシウムチャンネルブロッカー、βアドレナリン作用性レセプターブロッカー、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターまたはアンギオテンシン系インヒビターから選択される薬剤が、該被験体に投与される、方法。
（項目４７）
該被験体が、薬剤による処置を要する症状を別段有さない、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記被験体が、見かけ上健康であり、そして有害な心臓血管事象の高い危険性を別段有さない、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記被験体が、非高脂血症である、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記薬剤が、非アスピリン抗炎症剤である、項目４６に記載の方法。
本発明は被験体、特にヒト被験体が心臓血管疾患を有する危険性を特徴付けるための方法を提供する。本発明はまた心臓血管疾患を発症する被験体の危険性を特徴付ける方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は心臓血管疾患の合併症を経験する被験体の危険性を特徴付けるための方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は胸痛を有する被験体が短期的に心臓発作または他の主要な有害心臓事象を経験する危険性を有するかどうかを調べるための方法を提供する。本発明は特に高度に積極的なＣＶＤ療法を要する被験体並びにＣＶＤまたはＣＶＤの合併症を抑制または防止することを標的にした療法を必要としない被験体を同定するために有用である。
【０００９】
１つの実施形態において本発明の方法は被験体から得られた生体由来サンプル中の１つ以上の酸化された生体分子（以降総称して酸化「アポリポタンパク質Ａ１−関連生体分子」と称する）のレベルを測定することを含む。１つの実施形態において酸化アポリポタンパク質Ａ１（「ａｐｏＡ−Ｉ」）関連生体分子は酸化高密度リポタンパク質「ＨＤＬ」である。別の実施形態においては、酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は酸化ａｐｏＡ−Ｉである。別の実施形態においては酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子は酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントである。被験体由来の生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを対照被験体集団から得た匹敵する生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上の測定から誘導された対照値と比較してよい。或いは、被験体から得られた生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルは、被験体から得られた生物学的サンプル中の酸化された内標準のレベルと比較してよい。このような内標準の例は酸化されたアルブミンまたは酸化された総タンパク質を包含するが、これらには限定されない。
【００１０】
１つの実施形態において、比較はＣＶＤを診断するための標準的プロトコルを用いて調べた場合のＣＶＤを有する被験体の現在の危険性を特徴付けるものである。更にまた、被験体の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子レベルと対照値との間の差の程度も、危険性の程度を特徴付けし、これにより、どの被験体が特定の療法から最大利益を被るかを決定するために有用である。別の実施形態においては、比較は将来においてＣＶＤを発症する被験体の危険性を特徴付ける。別の実施形態において、比較は、ＣＶＤの合併症を経験する被験体の危険性を特徴付けるために使用できる。本発明の方法はまた、胸痛を呈している被験体が短期的、例えば被験体が胸痛を呈した翌日、３ヵ月後または６ヶ月後に主要な有害心臓事象、例えば心筋梗塞、再梗塞、血管再生の必要性または死亡を経験する危険性を有するかどうかを調べるためにも使用できる。
【００１１】
更にまた被験体におけるＣＶＤの状態を経時的にモニタリングするための方法も提供される。１つの実施形態において、方法は、初回において被験体から採取した生物学的サンプル中、および、その後の時点において被験体から採取した相当する生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。初回と比較した場合、後の時点において採取した生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルの上昇は、ＣＶＤを有する被験体の危険性が上昇していることを示す。酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連分子１つ以上のレベルが低下していることは、ＣＶＤを有する被験体の危険性が低下していることを示す。心筋梗塞または虚血発作のような急性の有害心臓血管事象を既に経験している被験体については、このような方法は後の急性の有害心臓血管事象を経験する被験体の危険性を評価するためにも有用である。このような被験体においては、酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルの上昇は、被験体が後の有害な心臓血管事象を経験する危険性が上昇していることを示す。経時的に被験体において酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルが低下していることは、被験体が後の有害な心臓血管事象を経験する危険性が低下していることを示す。
【００１２】
別の実施形態において、本発明はＣＶＤを安定化または退行させることを指向した療法に対する被験体の応答を特徴付けるための方法を提供する。この方法は治療の前に対照から採取した生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定すること、および、治療の最中または後に被験体から採取した相当する生物学的サンプル中の酸化ａｐｏ−Ａ１関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。治療の前に採取したサンプル中の酸化ａｐｏ−Ａ１関連生体分子１つ以上のレベルと比較した場合の治療の後または最中に採取したサンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルの低下は、治療した被験体における心臓血管疾患に対する治療の正の作用を示している。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は本発明の方法において使用する酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上に対して免疫特異的な抗体を提供する。このような抗体は被験体から得た生物学的サンプル中のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子のレベルを測定または計測するために有用である。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は試験被験体から得た生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、および／または、酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルを評価するための試薬を含むキットに関する。本キットはまた本方法を実施するための取扱説明書またはＣＶＤの試験被験体の危険性を評価するために有用な情報のような印刷物を含む。そのような情報は例えばカットオフ値、特定のカットオフ値における感度、並びに試験の結果に基づいて危険性を特徴付けるための他の印刷物を包含するがこれらに限定されない。一部の実施形態においては、そのようなキットは対照試薬、例えば酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、および／または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントも含んでよい。
別の実施形態においては、本発明は心臓血管疾患の危険性を低下させるための被験体の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はニトロチロシン含有ペプチドの衝突誘導解離（ＣＩＤ）スペクトルを示す。スペクトルは方法において記載する通り、ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−タンパク質ニトロ化系（Ａ−Ｄ）またはパーオキシニトライト（Ｅ）の何れかで処理したＨＤＬに由来するａｐｏＡ−Ｉのバンドのゲル内トリプシン消化物の分析の間に得られた。二重または三重に荷電されたイオン（記載通り）を検出し、イオントラップ質量スペクトル分析システムを用いたＬＣタンデムＭＳ実験においてフラグメント化した。スペクトルＡおよびＤにおいて配列決定したペプチドはＭＰＯ媒介反応においてのみ検出された。スペクトルＢおよびＣにおいて配列決定したペプチドはＭＰＯ媒介およびパーオキシニトライト媒介反応の両方において検出された。スペクトルＥにおいて配列決定されたペプチドはパーオキシニトライト媒介反応においてのみ検出された。
【図２】図２はクロロチロシン含有ペプチドの衝突誘導解離（ＣＩＤ）スペクトルを示す。スペクトルは方法において記載する通り、ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−タンパク質塩素化系の何れかで処理したＨＤＬに由来するａｐｏＡ−Ｉのバンドのゲル内トリプシン消化物の分析の間に得られた。二重または三重に荷電されたイオン（記載通り）を検出し、イオントラップ質量スペクトル分析システムを用いたＬＣタンデムＭＳ実験においてフラグメント化した。同じシリーズのペプチドをＭＰＯおよびＨＯＣｌ媒介反応の両方において配列決定した。
【図３】図３はａｐｏＡ−Ｉ改変部位の総括である。それぞれの反応により改変された特定のチロシン残基を示す。アミノ酸配列（配列番号１）は成熟ａｐｏＡ−Ｉタンパク質に対するＮＣＢＩアクセッション番号２２９５１３に基づく。この論文において引用された全てのアミノ酸残基のナンバリングは成熟タンパク質のこのアミノ酸配列を指す。
【図４】図４は用量依存性のａｐｏＡ−Ｉニトロ化および逆コレステロール輸送活性の障害を示す。ＨＤＬは１．５時間、記載の通り、漸増量のＨ２Ｏ２を有するＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−反応またはパーオキシニトライトの何れかのシリーズにおいてニトロ化した。Ａ）ＨＤＬのＡＢＣＡ１依存性逆コレステロール流出に対するニトロ化反応の作用。各反応の改変ＨＤＬはその後、３Ｈコレステロール標識アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）を負荷したマウスＲＡＷ２６４マクロファージと共にインキュベートした。これらの細胞にｃＡＭＰ存在下で改変ＨＤＬを投与することにより逆コレステロール輸送のＡＢＣＡ１依存性成分を測定した。４時間後、培地および細胞内の３Ｈを計数し、総３Ｈコレステロール（培地＋細胞内）で割った培地中の３Ｈコレステロールの量としてパーセント流出を計算した。全数値は未改変ＨＤＬで得られたＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出に対して規格化した。Ｂ）ＬＣ−ＭＳを用いて測定したａｐｏＡ−Ｉニトロ化の部位特異的定量。改変ＨＤＬ反応中のタンパク質を冷アセトンで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルー染色により検出した。ａｐｏＡ−Ｉをゲルから切り出し、そして、トリプシン消化した。ニトロ化反応の進行はネイティブの比較参照ペプチド法を用いて定量的に追跡した。ネイティブの比較参照ペプチドに対する各目的のチロシンを含有する各トリプシンペプチドのピーク面積比を測定した。各ペプチドのパーセント改変は未投与対照と相対比較した各ペプチドの量の低減に基づいて求めた。
【図５】図５は用量依存性のａｐｏＡ−Ｉ塩素化および逆コレステロール輸送活性の障害を示す。ＨＤＬは１．５時間、記載の通り、漸増量のＨ２Ｏ２を有するＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−反応またはＨＯＣｌの何れかのシリーズにおいて塩素化した。Ａ）ＨＤＬのＡＢＣＡ１依存性逆コレステロール流出に対する各塩素化反応の作用。流出はニトロ化産物に関して図４に記載したものと同様の方法を用いて求めた。Ｂ）ＬＣ−ＭＳを用いて測定したａｐｏＡ−Ｉ塩素化の部位特異的定量。これらの部位を検出して特徴付けるために用いた方法は図４に示す通りである。
【図６】ａｐｏＡ−Ｉの改変はＡＢＣＡ１依存性コレステロールアクセプター活性と同調して脂質の結合を抑制する。Ａ）ａｐｏＡ−Ｉ脂質結合活性は３７℃、１時間の過程に渡ってホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）誘導ＬＤＬ凝集を抑制するその能力により試験した。３μｇ／ｍｌのａｐｏＡ−ＩまたはＨ２Ｏ２改変ａｐｏＡ−Ｉは概ね同程度までＬＤＬ凝集を低減した。未改変ａｐｏＡ−Ｉと比較して、完全ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−改変系および程度は低下するがＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−系もＰＬＣ投与ＬＤＬに結合してその凝集を抑制する能力が低下したａｐｏＡ−Ｉをもたらした。数値は３連のウェルの平均を示す。ａｐｏＡ−ＩがＬＤＬ凝集を抑制する能力は用量依存的であった（データ示さず）。Ｂ）脂質結合は図６Ａに示す実験の初期の傾きから計算し、そして未改変ａｐｏＡ−Ｉの数値に対して規格化した（ｘ軸）。同一のａｐｏＡ−Ｉ調製物を用いて３連で８Ｂｒ−ｃＡＭＰ投与ＲＡＷ２６４．７からのＡＢＣＡ１依存性脂質流出を試験し（図５に示す）、未改変のａｐｏＡ−Ｉに関する数値に対して規格化した（ｙ軸）。ＭＰＯ改変は脂質の結合およびＡＢＣＡ１依存性のコレステロールアクセプター活性の両方の同調した低減をもたらした（直線回帰ｒ２＝０．９６、ｐ＜０．０００１）。
【図７】図７はＬＣタンデム質量スペクトル分析によるヒトアテローム組織から単離されたａｐｏＡ−Ｉ中のニトロ化ペプチドの検出を示す。ヒトアテローム組織から免疫アフィニティー精製されたａｐｏＡ−Ｉのゲル内トリプシン消化の後の未改変、ニトロ化および塩素化されたペプチドのインビボの検出のための選択反応モニタリングクロマトグラム（ＳＲＭ）。Ａ）インビトロ実験で測定された望ましいＹ１９２部位を含有するペプチドの未改変およびニトロ化形態の検出。Ｂ）ペプチドの同一性とニトロ化の位置を確認するためのこの保持時間において記録されたＣＩＤスペクトル。Ｃ）二次的なＹ１６６部位を含有するペプチドの未改変、ニトロ化および塩素化形態（それぞれ上から下へ）の検出。同様に、この保持時間（Ｄ）で記録されたＣＩＤスペクトルはペプチドの同一性およびニトロ化および塩素化の位置を確認している。ニトロ化ペプチドのＣＩＤスペクトルは明白ではなく、推定塩素化ペプチドの分子イオンのＣＩＤスペクトルもまた、同時に溶出し同様の分子量を有するこのペプチドのトリヒドロキシフェニルアラニン含有形態と顕著に重複している。
【図８Ａ】図８はＬＣタンデム質量スペクトル分析によるヒトアテローム組織から単離されたａｐｏＡ−Ｉ中のニトロ化ペプチドの検出を示す。ヒトアテローム組織から免疫アフィニティー精製されたａｐｏＡ−Ｉのゲル内トリプシン消化の後の未改変、酸化ペプチドのインビボの検出のための選択反応モニタリングクロマトグラム（ＳＲＭ）。Ａ）ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチド（Ｔ１６１−Ｒ１７１）のＣＩＤスペクトル。トリヒドロキシフェニルアラニン（ＴＯＰＡ）またはチロシンヒドロキシパーオキシドと同一の質量を有する残基はＣＩＤスペクトルを用いて１６６位に検出される。Ｂ）ａｐｏＡ−Ｉの未改変ペプチド（Ｄ２８−Ｋ４０）のＣＩＤスペクトル。Ｃ）ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチド（Ｄ２８−Ｋ４０）のＣＩＤスペクトル。ＴＯＰＡまたはチロシンヒドロキシパーオキシドと同一の質量を有する残基が２９位に検出され、そして、ジヒドロキシフェニルアラニンが３３位に検出される。
【図８Ｂ】図８はＬＣタンデム質量スペクトル分析によるヒトアテローム組織から単離されたａｐｏＡ−Ｉ中のニトロ化ペプチドの検出を示す。ヒトアテローム組織から免疫アフィニティー精製されたａｐｏＡ−Ｉのゲル内トリプシン消化の後の未改変、酸化ペプチドのインビボの検出のための選択反応モニタリングクロマトグラム（ＳＲＭ）。Ａ）ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチド（Ｔ１６１−Ｒ１７１）のＣＩＤスペクトル。トリヒドロキシフェニルアラニン（ＴＯＰＡ）またはチロシンヒドロキシパーオキシドと同一の質量を有する残基はＣＩＤスペクトルを用いて１６６位に検出される。Ｂ）ａｐｏＡ−Ｉの未改変ペプチド（Ｄ２８−Ｋ４０）のＣＩＤスペクトル。Ｃ）ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチド（Ｄ２８−Ｋ４０）のＣＩＤスペクトル。ＴＯＰＡまたはチロシンヒドロキシパーオキシドと同一の質量を有する残基が２９位に検出され、そして、ジヒドロキシフェニルアラニンが３３位に検出される。
【図８Ｃ】図８はＬＣタンデム質量スペクトル分析によるヒトアテローム組織から単離されたａｐｏＡ−Ｉ中のニトロ化ペプチドの検出を示す。ヒトアテローム組織から免疫アフィニティー精製されたａｐｏＡ−Ｉのゲル内トリプシン消化の後の未改変、酸化ペプチドのインビボの検出のための選択反応モニタリングクロマトグラム（ＳＲＭ）。Ａ）ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチド（Ｔ１６１−Ｒ１７１）のＣＩＤスペクトル。トリヒドロキシフェニルアラニン（ＴＯＰＡ）またはチロシンヒドロキシパーオキシドと同一の質量を有する残基はＣＩＤスペクトルを用いて１６６位に検出される。Ｂ）ａｐｏＡ−Ｉの未改変ペプチド（Ｄ２８−Ｋ４０）のＣＩＤスペクトル。Ｃ）ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチド（Ｄ２８−Ｋ４０）のＣＩＤスペクトル。ＴＯＰＡまたはチロシンヒドロキシパーオキシドと同一の質量を有する残基が２９位に検出され、そして、ジヒドロキシフェニルアラニンが３３位に検出される。
【図９】図９はミエロペルオキシダーゼに関する速度論的モデルである。
【図１０】図１０は特定のミエロペルオキシダーゼにより生成された反応性の中間体および一部のＭＰＯにより生産された酸化生成物の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明をより詳細な実施形態を参照しながら、場合により添付図面も参照しながら、これより更に説明する。しかしながら、本発明は異なる形態において具現化してよく、そして本明細書に記載した実施形態に限定して解釈されるべきではない。むしろこのような実施形態は本明細書の開示が十分で完全となり、そして当業者に対し本発明の範囲が伝達されるように提示するものである。
【００１７】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的および科学的な用語は本発明が属する技術の当業者が一般的に理解するものと同様の意味を有する。本明細書で本発明の説明において使用する用語は特定の実施形態を説明するのみであり、本発明を限定する意図はない。本発明の説明および添付請求項において使用する場合、特段の記載が無い限り、単数と複数は区別しない。
【００１８】
特段の記載が無い限り、明細書および請求項において使用する場合の成分の量、分子量、反応条件等の特性を表現する全ての数は「約」という用語により全ての場合において加減されるものである。従って、特段の記載が無い限り、以下の明細書および請求項に記載する数値的特性は本発明の実施形態において得ようとする所望の特性に応じて変動してよい概数である。本発明の広範な範囲を示す数値範囲およびパラメーターは概数であるが、特定の実施例において示した数値は可能な限り厳密に報告する。しかしながら何れの数値もその該当する測定において認められる誤差から必然的に生じるある程度の誤差を含んでいる。
【００１９】
本明細書に記載する全ての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
（心臓血管疾患の危険性を予測するための方法およびマーカー）
本明細書に記載するものはＣＶＤを発症する、ＣＶＤを保有する、またはＣＶＤ合併症を経験する被験体の危険性を特徴付けるための方法およびマーカーである。この内容において、このような方法およびマーカーは無防備なプラークを有するか、または、心筋梗塞を経験する被験体の危険性を特徴付けるために有用である。
【００２１】
１つの実施形態において方法は被験体から得た生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。１つの実施形態において、酸化ａｐｏ−Ａ１関連生体分子の少なくとも１つはＨＤＬの酸化形態である。「高密度リポタンパク質」または「ＨＤＬ」という用語は本明細書においては、当業者の一般的な使用法に従って定義される。
【００２２】
別の実施形態において、酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の少なくとも１つはアポリポタンパク質Ａ１の酸化形態である。別の実施形態において、酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の少なくとも１つは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントである。このようなフラグメントは３アミノ酸長以上であり、そこに含有される酸化されたアミノ酸残基を除いて、配列番号１の部分と同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態においては、このようなａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは、ペプチドの誘導元であるａｐｏＡ−Ｉタンパク質がミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）関連の系により酸化されたことを示す酸化されたアミノ酸１つ以上を含む。特定の実施形態においては、酸化されたアミノ酸は配列番号１の１８、２９、１６６、１９２、２３６位またはその何れかの組合せにおいて存在する。ａｐｏＡ−Ｉの酸化はＭＰＯにより生成された反応性の塩素化物質種（例えばＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−系またはＨＯＣｌにより形成されたもの）またはＭＰＯ関連反応性窒素物質種（例えばＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−系またはＯＮＯＯ−により形成されたもの）または代替のＭＰＯ関連酸化経路（例えばＭＰＯにより生成されたチロシル基生成系）への曝露により起こってよい。即ち、適当なペプチドの例はクロロチロシン、ニトロチロシン、ジチロシン、メチオニンスルホキシド、オキソヒスチジン、トリヒドロキシフェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、チロシンパーオキシドまたはＭＰＯにより生成された酸化物へのａｐｏＡ−Ｉの曝露により形成された他の酸化されたアミノ酸を含むａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを包含するがこれらに限定されない。適当なａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントの例は以下の表１に示すペプチドを包含するが、これらに限定されない。
【００２３】
【表１】
2011002460.tif 000002
次に試験被験体の身体由来サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを対照被験体の匹敵する身体由来サンプル中のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルから誘導された対照値と比較してよい。別の実施形態においては、次に試験被験体の身体由来サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを被験体の身体由来サンプル中の他の酸化された生体分子のレベルに基づいた内標準と比較してよい。適当な内標準分子の例は、被験体の身体由来サンプル中の酸化された総タンパク質のレベルおよび被験体の身体由来サンプル中の酸化されたアルブミンのレベルを包含するがこれらに限定されない。自身のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルが対照値より高値であるか、または対照値の高値範囲内にあるような試験被験体は、自身のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルが対照値以下であるか対照値の低値範囲内にあるような試験被験体よりも、心臓血管疾患を有するか発症する危険性がより高い。更にまた、被験体の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子レベルと対照値の差の程度は、危険性の程度を特徴付けし、これにより、どの被験体が特定の療法から最大の利益を被るかを判定するためにも有用である。
【００２４】
特定の実施形態においては、被験体のＣＶＤ危険性プロファイルは、被験体の身体由来サンプル中のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを対照集団における該ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルと比較することにより得られる第１の危険値を、最終危険値を与えるために別の危険値１つ以上と組み合わせることにより求める。このような別の危険値は、被験体の血圧を測定すること、ストレス試験への被験体の応答を評価すること、被験体の身体由来サンプル中のミエロペルオキシダーゼ、Ｃ反応性タンパク質、低密度リポタンパク質またはコレステロールのレベルを測定すること、または、被験体のアテローム性動脈硬化性プラーク負荷（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ  ｂｕｒｄｅｎ）を評価することを包含するがこれらに限定されない手順により得てよい。
【００２５】
１つの実施形態において、心臓血管疾患を有する試験被験体の危険性を評価するために方法を使用する。ヒト被験体が冠動脈疾患を有するか、冠動脈疾患の合併症を経験する危険性を有するかどうかを調べる医療上の手順は、冠動脈血管造影、冠動脈血管内超音波（ＩＶＵＳ）、ストレス試験（造影を伴うか伴わない）、頚動脈内膜中央肥厚の評価、仮想病理学の技術の実施を伴うか伴わない頚動脈超音波試験、冠動脈電子線コンピューター断層撮影（ＥＢＴＣ）、心臓コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、ＣＴ血管撮影、心臓磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）および磁気共鳴血管撮影（ＭＲＡ）を包含するがこれらに限定されない。心臓血管疾患は典型的には被験体の血管系の一領域に限局されないため、冠動脈疾患を有するか、有する危険性を有すると診断された被験体はＣＶＤの他の形態、例えば脳血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患および末梢動脈疾患を発症または有する危険もあると考えられる。心臓血管疾患を有する危険性のある被験体は異常なストレス試験結果または異常な心臓カテーテル挿入を有する危険性がある。ＣＶＤを有する危険性のある被験体はまた、非侵襲的な撮影技術を用いて評価することができる特徴である増大した頚動脈内膜中央肥厚および冠動脈石灰化を示す危険性がある。ＣＶＤを有する危険性のある被験体はまた血管内超音波を用いて調べることができる特徴である増大したアテローム性動脈硬化性のプラーク負荷を有する危険性がある。
【００２６】
別の実施形態においては、本発明の方法は将来において心臓血管疾患を発症する試験被験体の危険性を評価するために使用する。１つの実施形態において試験被験体は見かけ上は健康な個体である。別の実施形態において被験体は、心臓血管疾患を有する危険性が別段高くない。別の実施形態においては、本発明の方法は、胸痛を呈している被験体が、被験体が胸痛を呈した後の短期間に心臓発作または他の主要な有害心臓事象、例えば心臓発作、心筋梗塞、再梗塞、血管再生の必要性または死亡を経験する危険性を有するかどうかを調べるために使用する。本明細書においては、「短期」という用語は１年以内を意味する。即ち、短期の危険性を有する被験体は胸痛を呈した翌日、３ヵ月後または６ヶ月後までに主要な有害心臓事象を経験する危険性を有する。
【００２７】
本発明はまたＣＶＤを有すると診断されている被験体におけるＣＶＤの状態を経時的にモニタリングするための方法を提供する。この内容において、方法はＣＶＤを有する被験体のアテローム性動脈硬化症の進行または退行の危険性をモニタリングするためにも有用である。１つの実施形態において、方法は初回において被験体から採取した生物学的サンプル中、および、その後の時点において被験体から採取した相当する生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。初回と比較した場合、後の時点において採取した生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルの上昇は、被験体のＣＤＶが進行または悪化していることを示す。酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連分子１つ以上のレベルが低下していることはＣＶＤが改善または退行したことを示している。急性の有害心臓血管事象、例えば心筋梗塞または虚血発作を既に経験している被験体の場合、このような方法はまた、後の急性有害心臓血管事象を有する被験体の危険性を評価するために使用できる。被験体において酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルが経時的に上昇していることは、後の有害心臓血管事象を経験する被験体の危険性が上昇していることを示す。被験体において酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルが経時的に低下していることは、後の有害心臓血管事象を経験する被験体の危険性が低下していることを示す。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は心臓血管疾患を有することが疑われるか、または有すると診断された被験体における治療法を評価するための方法を提供する。この方法は治療の前に対照から採取した生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、ａｐｏＡ−Ｉの酸化ペプチドフラグメントおよびこれらの組合せを包含する酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定すること、および、治療の最中または後に被験体から採取した相当する生物学的サンプル中の酸化ａｐｏ−Ａ１関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。治療の前に採取したサンプル中の酸化ａｐｏＡ１関連生体分子１つ以上のレベルと比較した場合の治療の後または最中に採取したサンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルの低下は治療した被験体における心臓血管疾患に対する治療の正の作用を示す。
【００２９】
本発明の心臓血管疾患予測方法は少なくとも部分的には、心臓血管疾患を有する被験体から得た身体由来サンプル中のアポリポタンパク質Ａ１は、総タンパク質と比較して、優先的に酸化、例えばニトロ化または塩素化されることを本発明者らが発見したことに基づいている。これらの酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の存在はＭＰＯにより生成された酸化剤を介して生産されると考えられる。ＭＰＯ（ドナー：過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．１１．１．７）は約１５０ｋＤａの４量体の重度にグリコシル化した塩基性（ＰＩ．１０）のヘムタンパク質である。これは２つの同一のジスルフィド結合したプロトマーを有し、その各々はプロトポルフィリン含有の５９〜６４ｋＤａの重サブユニットおよび１４ｋＤａの軽サブユニットを有している（Ｎａｕｓｅｅｆ，Ｗ．Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ６７：１５０４−１５０７；１９８６）。
【００３０】
ＭＰＯは好中球および単球に豊富であり、それぞれ、これらの細胞の乾燥重量の５％および１〜２％に相当する（Ｎａｕｓｅｅｆ，Ｗ．Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ６７：１５０４−１５０７；１９８６．，Ｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｋ．Ｉｎ：Ｅｖｅｒｓｅ  Ｊ．；Ｅｖｅｒｓｅ  Ｋ．；Ｇｒｉｓｈａｍ  Ｍ．Ｂ．，ｅｄｓ．Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １ｓｔ  ｅｄ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１９９１：３７−６２）。ヘムタンパク質は白血球の一次アズール好性顆粒中に貯留され、種々のアゴニストの食細胞活性化の後に細胞外環境および食胞融解小体のコンパートメントの両方の中に分泌される（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．；１９７８）。
【００３１】
最近提案されたＭＰＯに関する実用的な速度論的モデルを図１２に示す。ＭＰＯは複数の中間的状態を有する複合的ヘムタンパク質であり、その各々はＯ２−およびＨ２Ｏ２のような還元型酸素物質種および一酸化窒素（ＮＯ、一酸化窒素）の利用性により影響される（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５−５４３０；２０００）。基底状態において、ＭＰＯは第二鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ））形態で存在する。Ｈ２Ｏ２の添加により、ＭＰＯのヘム基が２ｅ−等量により酸化され、化合物Ｉと称される反応性のフェリルπカチオンラジカル中間体を形成する。Ｃｌ−、Ｂｒ−およびＩ−のようなハライドおよび擬似ハライドのチオシアネート（ＳＣＮ−）の存在下においては、化合物Ｉは単一の２ｅ−工程において容易に還元されて、ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）および相当する次亜ハロゲン酸（ＨＯＸ）を再生する。ハライドおよびチオシアネートの血漿中レベルにおいては（１００ｍＭ  Ｃｌ−  １００ｍＭ  Ｂｒ−、５０ｍＭ  ＳＣＮ−  １００ｎＭ  Ｉ−）、塩化物が最もよい基質であり、強力な塩素化酸化剤である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）が形成される（Ｆｏｏｔｅ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ；．Ｎａｔｕｒｅ  ３０１：７１５−７２６；１９８３．，Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：５９８−６０７；１９８２）。
【００３２】
化合物Ｉはまた多くの有機物質を酸化することができるが、ヘムは２つの逐次的な１ｅ−還元工程を起こし、化合物ＩＩおよびＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）をそれぞれ生成する（図１２）。低分子量化合物は主に、ＭＰＯの基質として作用し、拡散性の酸化剤およびフリーラジカル物質種を生成し、次にこれがヘムの酸化電位を遠位の標的に運搬することができる。ハライドおよびＳＣＮ−のほかに、ＭＰＯの自然発生的な基質の一部は亜硝酸（ＮＯ２−）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７６１７−７６２５；１９９７）、チロシン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７６１７−７６２５；１９９７）、アスコルビン酸（Ｍａｒｑｕｅｚ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：５６６６−５６７０；１９９０）、尿酸（Ｍａｅｈｌｙ，Ｈ．Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：７９８−８０１；１９５５）、カテコールアミン（Ｍｅｔｏｄｉｅｗａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９３：４４５−４４８；１９９０）、エストロゲン（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：９８３−９９８；１９７７）およびセロトニン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．７０：３０５−３２１；１９８９）を包含する。ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）はまた還元されて不活性の第一鉄の形態ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）となることができる（Ｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｋ．Ｉｎ：Ｅｖｅｒｓｅ  Ｊ．；Ｅｖｅｒｓｅ  Ｋ．；Ｇｒｉｓｈａｍ  Ｍ．Ｂ．，ｅｄｓ．Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １ｓｔ  ｅｄ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１９９１：３７−６２．，（Ｋｅｔｔｌｅ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｄｏｘ．Ｒｅｐ．３：３−１５；１９９７）。ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）およびＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）はそれぞれＯ２−およびＯ２に結合して第一鉄ジオキシ中間体である化合物ＩＩＩ（ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）−Ｏ２）を形成する（図１２）。スペクトル試験によれば、化合物ＩＩＩへのＨ２Ｏ２の添加により、最終的には化合物ＩＩが形成されることが実証されている。即ち、化合物ＩＩＩは間接的に１ｅ−過酸化反応を促進する。
【００３３】
最近の研究によれば、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）により生成される比較的寿命の長いフリーラジカルであるＮＯのＭＰＯパーオキシダーゼ活性モジュレーションにおける役割が同定されている（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５−５４３０；２０００）。ＭＰＯおよびＮＯＳの誘導型アイソフォームは白血球の一次顆粒中に共局在している。食細胞活性化の間、例えば細菌の摂食の間、ＭＰＯおよびＮＯＳは食胞融解小体および細胞外コンパートメントの中に分泌され、そして細菌タンパク質のニトロ化が観察される（Ｅｖａｎｓ，Ｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９５５３−９５５８；１９９６）。急速速度論的試験によればＮＯの低レベルにおいては、基質のＭＰＯ触媒過酸化の初期速度は上昇することが実証されている。機序はＭＰＯ触媒反応における律速段階である化合物ＩＩからＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）への還元の加速を介したものである（図１）（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５−５４３０；２０００．，Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｉｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３７５２４−３７５３２，２０００）。より高いレベルのＮＯにおいては、スペクトル識別可能なニトロシル複合体であるＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＮＯの形成を介してＭＰＯの可逆的阻害が起こる（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５−５４３０；２０００）。ＮＯはまたＭＰＯ化合物Ｉに対する基質としても作用し、その化合物ＩＩへの還元をもたらす（前述）。更にまたＮＯの存在下では、パーオキシダーゼサイクルを経由するＭＰＯの全体的ターンオーバー速度はほぼ１０００倍増強される（前述）。最終的に、ＮＯはＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）に可逆的に結合して相当するＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＯ中間体を形成し、これはＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）およびＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＮＯと平衡状態にある（図１）（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５−５４３０；２０００．，Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｉｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３７５２４−３７５３２，２０００）。
【００３４】
上記した通り、ＭＰＯはＨ２Ｏ２と共同の基質として種々のものを利用することにより中間体として反応性の酸化剤を形成することができる。これらの物質種により生成された多くの安定な最終生成物が特徴付けられており、そして、ヒトアテローム性動脈硬化症患部から回収されたタンパク質、脂質およびＬＤＬ中でリッチ化されることがわかっている（Ｃｈｉｓｏｌｍ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４５２−１１４５６；１９９４，Ｈａｚｅｌｌ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５３５−１５４４；１９９６，Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２０７５−２０８１；１９９７，Ｌｅｅｕｗｅｎｂｕｒｇｈ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４３３−１４３６；１９９７，Ｌｅｅｕｗｅｎｂｕｒｇｈ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３５２０−３５２６；１９９７）。図１３はそれぞれが血管の患部においてリッチ化されることが解っているＭＰＯにより形成される反応性の中間体および生成物の一部をまとめたものである。
【００３５】
（生物学的サンプル）
被験体における心臓血管疾患を予測またはモニタリングするため、または、心臓血管疾患を有する被験体に対する治療薬の作用を評価するために有用である適当な生物学的サンプルは、例えば全血サンプル、血液画分のサンプル、例えば血清および血漿を包含するがこれらに限定されない。サンプルは新鮮血液または保存血液（例えば血液バンク）または血液画分であってよい。サンプルは本発明の試験のために明示的に入手した血液サンプルまたは本発明の試験のためにサブサンプリングすることのできる別の目的のために得られた血液サンプルであってよい。
【００３６】
１つの実施形態において、生物学的サンプルは全血である。全血は標準的な臨床的手順を用いて被験体から得てよい。別の実施形態においては、生物学的サンプルは血漿である。血漿は抗凝固処理した血液の遠心分離により全血サンプルから得てよい。このような操作により白血球成分のバフィーコートおよび血漿の上澄みが得られる。別の実施形態においては、生物学的サンプルは血清である。血清は抗凝固剤非含有の試験管内に収集されている全血サンプルの遠心分離により得られる。血液は遠心分離前に凝固させてよい。遠心分離により得られる黄色みを帯びた赤色の液体が血清である。
【００３７】
サンプルは必要に応じて適切な緩衝液で希釈することにより前処理し、ヘパリン添加し、必要に応じて濃縮するか、または、何れかの方法、例えば超遠心分離、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による分画、またはデキストランスルフェートによるアポリポタンパク質Ｂ含有タンパク質の沈殿または他の方法により分画してよい。生理学的ｐＨにおける種々の緩衝物質、例えばリン酸塩、トリス等の１つを使用した多くの標準的な水性の緩衝溶液のいずれかを使用できる。
【００３８】
（被験体）
被験体は自身のＣＶＤの危険性を特徴付けるために試験される何れかのヒトまたは他の動物である。特定の実施形態においては、被験体は有害な心臓血管事象の高い危険性を別段有さない。有害な心臓血管事象の高い危険性を有する被験体とは、心臓血管疾患の家族歴、高値の脂質を有する者、喫煙者、以前の急性の心臓血管事象等を有する者等である（例えばＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（以後「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ」と称する）を参照）。
【００３９】
特定の実施形態においては、被験体は見かけ上健康な非喫煙者である。「見かけ上健康な」とは、本明細書においては、アテローム性動脈硬化症の存在を示す何れかの兆候または症状、例えば狭心症、急性の有害心臓血管事象の病歴、例えば心筋梗塞または卒中、例えば冠動脈血管造影のような（しかしこれには限定されない）診断撮影法によるアテローム性動脈硬化症の症候を有する者として以前に診断されたことがない個体を意味する。見かけ上健康な個体はまた、疾患の症状を別段呈さない。換言すれば、このような個体は医療専門家により検査された場合、健康または疾患の症状を有さないものとして特徴付けられる。「非喫煙者」とは評価時点において喫煙者ではない個体を意味する。これには全く喫煙したことが無い者、並びに過去に喫煙したことがあるが現在はもはや喫煙していない者が包含される。
【００４０】
（酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルを測定するためのイムノアッセイ）
生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルはこのような酸化された生体分子に対して免疫反応性であるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて測定することができる。例えば、ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを含有するニトロチロシンに免疫特異的な抗体を作成し、標準的な手順で標識し、次にイムノアッセイで使用することによりサンプル中のこのようなニトロチロシン含有ａｐｏＡ−Ｉペプチドの存在を検出してよい。適当なイムノアッセイは、例えば固相および液相の両方のラジオイムノアッセイ、蛍光連結試験、競合的イムノアッセイまたは酵素連結免疫吸着試験を包含する。特定の実施形態においては、イムノアッセイはまたサンプル中に存在する酸化された生体分子の量を定量するために使用される。
【００４１】
選択された酸化されたポリペプチド物質種に対して作成されたモノクローナル抗体は確立された手順に従って生成される。一般的に酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは宿主動物を免疫化するために使用される。
【００４２】
適当な宿主動物には、例えばウサギ、マウス、ラット、ヤギおよびモルモットが包含されるがこれらに限定されない。種々のアジュバントを使用して宿主動物における免疫学的応答を増大させてよい。使用するアジュバントは、少なくとも部分的に宿主動物種に依存する。このような動物は抗体分子の異種起源の集団を生産し、これらはポリクローナル抗体と称され、免疫化された動物の血清から誘導してよい。
【００４３】
特定の抗原に結合する抗体の同種起源の集団であるモノクローナル抗体は連続した細胞系統から得られる。モノクローナル抗体を産生する従来の方法はＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４９５−４９７（１９７５））のハイブリドーマ法およびＫｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法である。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉｇａ、ＩｇＤの何れかの免疫グロブリンクラスおよびその何れかのクラスであってよい。改変されたアミノ酸、例えば３−ニトロチロシンに対する抗体を調製するための手順はＹｅ，Ｙ．Ｚ．，Ｍ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｚ．Ｑ．Ｈｕａｎｇ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｂｅｃｋｍａｎ，１９９６．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６９：２０１−２０９に記載されている。
【００４４】
（抗体の調製）
酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは酸化されたタンパク質またはペプチドフラグメントに免疫特異的な抗体を産生するための免疫原として使用できる。「免疫特異的」という用語は、抗体が非酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを含む他のタンパク質またはポリペプチドに対するよりも酸化ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントに対する実質的により高値の親和性を有することを意味する。このような抗体は例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖およびＦａｂフラグメントを包含してよい。
【００４５】
酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは少なくとも３アミノ酸長であり、そして改変されたａｐｏＡ−Ｉタンパク質配列を含む、即ちペプチドは、酸化されたアミノ酸、特に酸化されたチロシン残基の存在を除いて、配列番号１の配列番号と同一の配列を含む。ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは３アミノ酸長であることができる。別の実施形態においては、ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長である。別の実施形態においては、ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜２１０、２１１〜２２０、２２１〜２３０または２３１〜２４２アミノ酸長である。
【００４６】
６アミノ酸長未満のペプチドは、従来は別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンまたは抗体キメラ分子のものと融合されている。より大きいフラグメント、例えば６〜２４２アミノ酸長のａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントもまた免疫原として使用してよい。ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のより大きい免疫原性フラグメントの構造はソフトウエアプログラム、例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを用いて決定することができ、これにより親水性および疎水性を判断し、そして分子の表面に存在する可能性のあるタンパク質の領域を確認することができる。
【００４７】
ポリクローナル抗体は宿主動物にａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはａｐｏＡ−ＩペプチドフラグメントまたはａｐｏＡ−Ｉを投与することにより従来の手法を用いて生成する。宿主動物種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させてよい。ヒトにおいて使用されるアジュバントのうち、Ｂａｃｉｌｌｉ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルブムが特に好ましい。従来のプロトコルもまた免疫化された動物から血液を採取するため、および血液から血清およびＩｇＧ画分を単離するために使用される。
【００４８】
モノクローナル抗体の調製のためには、従来のハイブリドーマ法を使用する。このような抗体は培養物中の連続細胞系統により生産させる。モノクローナル抗体を調製する適当な手法は例えばハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法およびＥＢＶハイブリドーマ法を包含するがこれらに限定されない。
【００４９】
所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングのために種々のイムノアッセイを用いてよい。これらには競合的結合を使用するプロトコルまたは免疫放射線測定試験を包含し、そして、典型的には該当する酸化ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドと抗体との間の複合体の形成の測定を包含する。
【００５０】
本発明の抗体は被験体由来の生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントの存在を検出または量を測定するために使用してよい。この方法は本発明の抗体１つ以上に個体から採取したサンプルを接触させること；および抗体とサンプル中のタンパク質またはペプチドとの間の複合体の形成を評価することを含む。検出を容易にするために、抗体をカラム、プラスチックディッシュ、マトリックスまたはメンブレン、好ましくはニトロセルロースのような基盤に結合することができる。サンプルは組織または生物学的液体、例えば尿、全血または滲出物、好ましくは血清であってよい。サンプルは未処理であるか、沈殿、分画、分離または精製に付した後に抗体と混合してよい。サンプル中の抗体と単離されたＨＤＬ、タンパク質またはペプチドとの間の相互作用は、放射線測定、比色または蛍光測定の手段、サイズ分離、または沈殿により検出される。好ましくは抗体−タンパク質またはペプチド複合体の検出は検出可能なタグ、例えば酵素、蛍光団または発色団にカップリングされた二次抗体の添加により行う。複合体の形成は個体の生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−ＩまたはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントの存在を示す。
【００５１】
特定の実施形態においては、この方法は酵素連結免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンイムノブロット手順を使用する。
【００５２】
（酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントを測定するための別の方法）
質量スペクトル分析系の方法（例えばＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）もまた以下の例に示す通り生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉおよび酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルを評価するために使用してよい。このような方法は当該分野で標準的であり、そして例えばオンラインエレクトロスプレーイオン化タンデム質量スペクトル分析を伴ったＨＰＬＣを包含する。親（未改変）および改変（ニトロ化、塩素化）された形態のための合成による標準的なトリプシン消化ペプチドは市販のｆｍｏｃ改変アミノ酸を用いた自動ペプチド合成装置により容易に作成できる。親分子、即ち未改変ＨＤＬ、ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントは、付加された部分、付加されたＮＯ２またはＣｌ−部分のために、酸化された分子とは異なる質量を有する。即ち個々の親→娘のイオンの転移が各ペプチドについて可能である。ニトロ基をＴｙｒに付加するとＴｙｒ上のフェノキシ水素のｐＫａが１０から７に変化する。即ち、改変および未改変ペプチドの間の電荷の差および極性の変化はＨＰＬＣにおいても異なる保持時間を示す可能性が高い。
【００５３】
（対照値）
試験被験体から得られた生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−Ｉおよび／またはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルは対照値と比較してよい。対照値は対照集団、即ち一般的集団またはヒト被験体の選択された集団から得られた匹敵するサンプル中のそれぞれ酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−Ｉおよび／またはａｐｏＡ−Ｉのレベルに基づく。例えば選択集団は見かけ上健康な被験体よりなるものであってよい。「見かけ上健康な」とは、本明細書においては、アテローム性動脈硬化症の存在を示す何れかの兆候または症状、例えば狭心症、急性の有害心臓血管事象の病歴、例えば心筋梗塞または卒中、例えば冠動脈血管造影のような（しかしこれには限定されない）診断撮影によるアテローム性動脈硬化症の症候を以前に有していたことがない個体を意味する。見かけ上健康な個体はまた、疾患の症状を別段呈さない。換言すれば、このような個体は医療専門家により検査された場合、健康または疾患の症状を有さないものとして特徴付けられる。別の例においては、対照値は見かけ上健康な非喫煙者集団から誘導できる。「非喫煙者」とは評価時点において喫煙者ではない個体を意味する。これには全く喫煙したことが無い者、並びに過去に喫煙したことがあるが現在はもはや喫煙していない者が包含される。見かけ上健康な非喫煙者集団は喫煙者集団または以前に心臓血管障害を有していた者の集団とは異なる正常範囲の酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−Ｉおよび／またはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルを有する。従って、選択された対照値は試験被験体が属する範疇を考慮してよい。適切な範疇は当業者による日常的実験内で選択できる。
【００５４】
対照値は試験被験体より得られた酸化されたポリペプチドのレベルを特徴付けるために使用される数値と関連する。即ち、酸化されたポリペプチドのレベルが血液ｍｌ当たりの酸化ａｐｏＡ−Ｉの単位のような絶対値である場合は、対照値もまた一般的集団またはヒト被験体の選択された集団における個体の血液ｍｌ当たりの酸化ａｐｏＡ−Ｉの単位に基づく。同様に、酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−ＩまたはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルがサイトグラムより得られた任意の単位のような代表的数値である場合は、対照値も代表的数値に基づく。
【００５５】
対照値は種々の形態をとりえる。対照値は中央値または平均値のような単一のカットオフ値であることができる。対照値は１つの定義された群の危険性が別の定義された群の危険性の二倍であるような比較グループに基づいて確立することができる。対照値は均等に（または非均等に）グループ、例えば低危険性群、中危険性群および高危険性群に、或いは最低四半が最低危険性の個体であり最高四半が最高危険性の個体である４分割群に分割でき、そしてＣＶＤを有する試験被験体の危険性はその自身の試験値が属する群に基づくことができる。
【００５６】
得られた生物学的サンプル中の酸化ＨＤＬ、ａｐｏＡ−Ｉおよび／またはａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントの対照値、例えば平均レベル、中央レベルまたは「カットオフ」レベルは、参照により本明細書に特に組み込まれるＫｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｒｕａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡに記載の通り、一般的集団または選択された集団の個体の大標本を試験すること、および、最適特異性（最高真陰性率）および感度（最高真陽性率）を定義する正の基準または受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）を選択するための予測値法などの統計モデルを用いることにより確立することができる。「カットオフ」値は試験された各危険予測因子に対して求めることができる。以下に記載する実施例１において使用した標準化された方法はＫｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｗａｌｔｅｒｓｄｏｒｐｈ，Ａ．Ｎ．ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，Ｈ．１９８４．“Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１０５：３９９−４０３に記載されているグアイアコール酸化試験を使用している。
【００５７】
（試験被験体由来の酸化された生体分子と対照値の比較）
個体の生物学的サンプル中の各選択された酸化された生体分子、即ち酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、酸化ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドフラグメントのレベルは単一の対照値または対照値の範囲と比較してよい。試験被験体の生物学的サンプル中の現在の危険予測因子のレベルが対照値より高値、または対照値を超過するかその高い範囲内にある場合は、試験被験体は対照値に匹敵するかそれ未満または対照値の低い範囲内にあるレベルを有する個体よりもＣＶＤを発症または有する危険性が高値である。逆に、試験被験体の生物学的サンプル中の現在の危険予測因子のレベルが対照値未満、または対照値の低い範囲内にある場合は、試験被験体は対照値に匹敵するかそれより高値または対照値を超過するかその高い範囲内にあるレベルを有する個体よりもＣＶＤを発症または有する危険性が低値である。試験被験体の危険性予測因子のレベルと対照値の間の差の範囲はまた、危険性の範囲を特徴付けることによりどの個体が特定の積極的治療から最も大きい利益を被るかを決定するためにも有用である。対照値の範囲を複数の群、例えば高危険性、平均的危険性および低危険性の個体に対する対照値範囲に分割されるこのような場合には、比較は該当する危険性予測因子の試験被験体のレベルがどの群に属するかを決定することを包含する。
【００５８】
或いは、酸化された生体分子、すなわち酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントのレベルはサンプル中の酸化された内標準のレベルと比較してよい。適当な内標準の例はサンプル中の酸化された総タンパク質のレベルまたはサンプル中の酸化されたアルブミンのレベルを包含するがこれらに限定されない。
【００５９】
本発明の予測試験はＣＶＤを防止することを目標とする、或いは、ＣＶＤの進行を遅延させるための治療薬を個体に対して処方するべきか否か、またはそれを何時行うかを決定するために有用である。例えば、あるカットオフ値より高値または「正常範囲」より上３分の１または４分の１内にある酸化ａｐｏＡ−Ｉの値を有する個体は脂質低化剤による更に積極的な介入、生活様式の変更等の必要のある者として識別できる。
【００６０】
（ＣＶＤ治療薬の評価）
更にまた、ＣＶＤを有するか発症する危険性を有すると診断されている個体に対するＣＶＤ治療薬の作用を評価するための方法が提供される。このような治療薬は、抗炎症剤、インスリン感作剤、抗高血圧剤、抗血栓剤、抗血小板剤、フィブリン溶解剤、脂質低化剤、直接のトロンビンインヒビター、ＡＣＡＴインヒビター、ＣＤＴＰインヒビターチオグリチゾン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター、ＨＤＬ代謝を上昇または改変することを指向した薬剤、例えばａｐｏＡ−ＩミラノまたはＣＥＴＰインヒビター（例えばトルセトラピブ）または人工ＨＤＬとして作用するように設計された薬剤を包含するがこれらに限定されない。このような評価は治療薬の投与の前に被験体から採取された生物学的サンプルおよび治療薬の投与の後に被験体から採取された相当する生物学的液体の酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定することを含む。治療薬投与前に採取されたサンプル中の選択された危険性マーカーのレベルと比較した場合に治療薬投与後に採取されたサンプル中の選択された危険性マーカーのレベルが低下していることは、治療された被験体における心臓血管疾患に対する治療薬の正の作用を示している。
【００６１】
（キット）
本発明の方法を実施するためのキットも提供される。このようなキットは生物学的サンプル中の酸化ａｐｏＡ−Ｉ、酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメント、酸化ＨＤＬまたはこれらの組合せを評価するための試薬を含有する。１つの実施形態において、試薬は酸化ａｐｏＡ−Ｉまたは酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントまたは両方に免疫特異的な抗体である。１つの実施形態において、キットはまた本発明の方法において試薬を使用するための取扱説明書を含む。別の実施形態においては、キットは心臓血管疾患または合併症の被験体の危険性を測定するために有用な情報を含む。そのような情報は例えばカットオフ値、特定のカットオフ値における感度、並びに試験の結果に基づいて危険性を特徴付けるための他の印刷物を包含するがこれらに限定されない。一部の実施形態においては、そのようなキットは対照試薬、例えば酸化ＨＤＬ、酸化ａｐｏＡ−Ｉ、および／または酸化ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメントも含んでよい。
【００６２】
（治療方法）
本発明はまた心臓血管障害またはそのような障害の合併症の危険性を低下させるための被験体の治療方法に関する。１つの実施形態において、この方法は被験体由来の身体由来サンプル中のａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルを測定すること、および、ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上のレベルが被験体の対照集団由来の匹敵する身体由来サンプルのレベルと比較した場合に高値である場合には、抗炎症剤、抗血栓剤、抗血小板剤、フィブリン溶解剤、脂質低下剤、直接的トロンビンインヒビター、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター、細胞接着分子に結合してこのような分子に結合する白血球の能力を阻害する薬剤、カルシウムチャンネルブロッカー、βアドレナリン作用性レセプターブロッカー、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、アンギオテンシン系インヒビターおよび／またはその組合せから選択される薬剤を被験体に投与することを含む。薬剤は将来心臓血管障害を発症する被験体の危険性を低下させるために有効な量で投与する。
【００６３】
「抗炎症」剤とは、例えばアルクロフェナク；アルクロメタゾンジプロピオネート；アルゲストンアセトニド；αアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アムフェナクナトリウム；塩酸アミプリローズ；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド２ナトリウム；ベンダザク；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；クロベタゾールプロピオネート；クロベタゾンブチレート；クロピラク；クロチカゾンプロピオネート；コルメタゾンアセテート；コルトドキソン；デフラザコルト；デソニド；デソキシメタゾン；デキサメタゾンジプロピオネート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；ジフロラゾンジアセテート；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサール；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク；フェンドサール；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナミン酸；フルミゾール；フルニゾリドアセテート；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロンアセテート；フルカゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；フルチカゾンプロピオネート；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；ハロベタゾールプロピオネート；ハロプレドンアセテート；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドンアセテート；イソキセパク；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロルノキシカム；ロテプレドノールエタボネート；メクロフェナメートナトリウム；メクロフェナミン酸；メクロリゾンジブチレート；メフェナミン酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニソロンスレプタネート；モルニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナメート；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドール酸；プロカゾン；プロキサゾール；プロキサゾールシトレート；リメキソロン；ロマザリット；サルコレックス；サルナセジン；サルサレート；サリシレート；塩化サンギナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダック；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；チキソコルトールピバレート；トルメチン；トルメチンナトリウム；ト���クロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；グルココルチコイド；ゾメピラクナトリウムを包含するがこれらに限定されない。
【００６４】
「抗血栓」および／または「フィブリン溶解」剤とはプラスミノーゲン（プレカリクレイン、キニノゲン、第ＸＩＩ、ＸＩＩＩａ因子、プラスミノーゲンプロアクティベーターおよび組織プラスミノーゲン活性化物質［ＴＰＡ］の相互作用を介してプラスミンとなる）ストレプトキナーゼ；ウロキナーゼ；アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ活性化物質複合体；プロウロキナーゼ；（Ｐｒｏ−ＵＫ）；ｒＴＰＡ（アルテプラーゼまたはアクチバーゼ；ｒは組み換えを示す）；ｒＰｒｏ−ＵＫ；アボキナーゼ；エミナーゼ；塩酸スレプターゼアナグレリド；ビバリルジン；ダルテパリンナトリウム；ダナパロイドナトリウム；塩酸ダゾキシベン；エフェガトランスルフェート；エノキサパリンナトリウム；イフェトロバン；イフェトロバンナトリウム；チンザパリンナトリウム；レタプラーゼ；トリフェナグレル；ワーファリン；デキストランを包含するがこれらに限定されない。
【００６５】
「抗血小板」剤とはクロプリドグレル；スルフィンピラゾン；アスピリン；ジピリダモール；クロフィブレート；ピリジノールカーバメート；ＰＧＥ；グルカゴン；アンチセロトニン剤；カフェイン；テオフィリンペントキシフィリン；チクロピジン；アナグレリドを包含するがこれらに限定されない。
【００６６】
「脂質低下」剤とはジェムフィブロジル、コリスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸、プロブコールロバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチンおよび他のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素インヒビターを包含するがこれらに限定されない。
【００６７】
「直接的トロンビンインヒビター」とはヒルジン、ヒルゲン、ヒルログ、アガトロバン、ＰＰＡＣＫ、トロンビンアプタマーを包含するがこれらに限定されない。
【００６８】
「糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター」とは抗体および非抗体の両方であり、例えばＲｅｏＰｒｏ（アビシキサマブ）、ラミフィバン、チロフィバンを包含するがこれらに限定されない。
【００６９】
「カルシウムチャンネルブロッカー」とは高血圧、狭心症および心不整脈のような幾つかの心臓血管障害を含む種々の疾患の管理において重要な治療上の価値を有する化合物の化学的に多様なクラスである（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．ｖ．５２，（ｓｕｐｐｌ．１），ｐ．１３−１６（１９８３）；Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；ＭｃＣａｌｌ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒａｃｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ，ｖ．１０．ｐ．１−１１（１９８５））。カルシウムチャンネルブロッカーは細胞のカルシウムチャンネルを調節することにより細胞へのカルシウムの進入を防止または遅延させる薬剤の異種の群である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐａ．，ｐ．９６３（１９９５））。本発明において有用である現在入手可能なカルシウムチャンネルブロッカーの大部分は薬剤の３種の主要な化学的グループ、即ちニフェジピンのようなジヒドロピリジン類、ベラパミルのようなフェニルアルキルアミン類、および、ジルチアゼムのようなベンゾチアゼピン類の１つに属する。本発明で有用な他のカルシウムチャンネルブロッカーは例えばアムリノン、アムロジピン、ベンサイクラン、フェロジピン、フェンジリン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、パーヘキシレン、ガロパミル、チアパミルおよびチアパミル類似体（例えば１９９３ＲＯ−１１−２９３３）、フェニトイン、バルビツレートおよびペプチドジノルフィン、オメガ−コノトキシンおよびオメガ−アガトキシン等および／または薬学的に受容可能なその塩を包含するがこれらに限定されない。
【００７０】
「β−アドレナリン作用性レセプターブロッキング剤」とは狭心症、高血圧および心不整脈におけるカテコールアミンの心臓血管作用に拮抗する薬剤のクラスである。β−アドレナリン作用性レセプターブロッカーは例えばアテノロール、アセブトロール、アルプレノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ブニトロロール、カルテオロール、セリプロロール、ヘドロキサロール、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノール、メチンドール、メトプロロール、メトリゾラノロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、プラクトロール、プラクトロール、ソタロルナドロール、チプレノロール、トマロロール、チモロール、ブプラノロール、ペンブトロール、トリメプラノール、２−（３−（１，１−ジメチルエチル）−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）−３−ピリデンカルボニトリルＨＣｌ、１−ブチルアミノ−３−（２，５−ジクロロフェノキシ）−２−プロパノール、１−イソプロピルアミノ−３−（４−（２−シクロプロピルメトキシエチル）フェノキシ）−２−プロパノール、３−イソプロピルアミノ−１−（７−メチルインダン−４−イルオキシ）−２−ブタノール、２−（３−ｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルチオ）−４−（５−カルバモイル−２−チエニル）チアゾール、７−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルアミンプロポキシ）フタリドを包含するがこれらに限定されない。上記した化合物は異性体混合物として、または、そのそれぞれの左旋性または右旋性の形態において使用できる。
【００７１】
適当なＣＯＸ−２インヒビターは例えば、米国特許５，４７４，９９５に記載されているＣＯＸ−２インヒビターである「ｃｏｘ−２インヒビターとしてのフェニル複素環」；米国特許５，５２１，２１３の「シクロオキシゲナーゼ−２のインヒビターとしてのジアリル２環式複素環」；米国特許５，５３６，７５２の「ＣＯＸ−２インヒビターとしてのフェニル複素環」；米国特許５，５５０，１４２の「ＣＯＸ−２インヒビターとしてのフェニル複素環」；米国特許５，５５２，４２２の「抗炎症剤としてのアリール置換５，５縮合芳香族窒素化合物」；米国特許５，６０４，２５３の「シクロオキシゲナーゼインヒビターとしてのＮ−ベンジルインドール−３−イルプロパン酸誘導体」；米国特許５，６０４，２６０の「シクロオキシゲナーゼ−２のインヒビターとしての５−メタンスルホンアミド−１−インダノン」；米国特許５，６３９，７８０の「シクロオキシゲナーゼインヒビターとしてのＮ−ベンジルインドール−３−イルブタン酸誘導体」；米国特許５，６７７，３１８の「抗炎症剤としてのジフェニル−１，２，３−チアジアゾール」；米国特許５，６９１，３７４の「ＣＯＸ−２インヒビターとしてのジアリール−５−酸素化−２−（５Ｈ）−フラノン」；米国特許５，６９８，５８４の「ＣＯＸ−２インヒビターのプロドラッグとしての３，４−ジアリール−２−ヒドロキシ−２，５−ジヒドロフラン」；米国特許５，７１０，１４０の「ＣＯＸ−２インヒビターとしてのフェニル複素環」；米国特許５，７３３，９０９の「ＣＯＸ−２インヒビターのプロドラッグとしてのジフェニルスチルベン」；米国特許５，７８９，４１３の「ＣＯＸ−２インヒビターとしてのアルキル化スチレン」；米国特許５，８１７，７００の「シクロオキシゲナーゼインヒビターとしてのビスアリールシクロブテン誘導体」；米国特許５，８４９，９４３の「シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターとして有用なスチルベン誘導体」；米国特許５，８６１，４１９の「選択的シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターとしての置換ピリジン」；米国特許５，９２２，７４２の「選択的シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターとしてのピリジニル−２−シクロペンテン−１−オン」；米国特許５，９２５，６３１の「ＣＯＸ−２インヒビターのプロドラッグとしてのアルキル化スチレン」を包含するがこれらに限定されず、これらは全て共通してＭｅｒｃｋ  Ｆｒｏｓｓｔ  Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ．（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）に譲渡されている。別のＣＯＸ−２インヒビターはまた「シクロオキシゲナーゼ−２および５−リポキシゲナーゼインヒビターとしての置換スルホニルフェニルヘテロ環」と題されたＧ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ＆Ｃｏ．（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌ．）に譲渡されている米国特許５，６４３，９３３に記載されている。
【００７２】
「アンギオテンシン系インヒビター」とはアンギオテンシンＩＩの機能、合成または異化に干渉する薬剤である。これらの薬剤には例えばアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アンギオテンシンＩＩ拮抗剤、アンギオテンシンＩＩレセプター拮抗剤、アンギオテンシンＩＩの異化を活性化する薬剤、および、アンギオテンシンＩＩが最終的に誘導される元になるアンギオテンシンＩの合成を防止する薬剤が包含されるがこれらに限定されない。レニンアンギオテンシン系は血行力学および水分と電解質のバランスの調節に関与している。血液容量、腎潅流圧力または血漿中のＮａ．ｓｕｐ．＋の濃度を低下させる因子は系を活性化させる傾向にあるが、これらのパラメーターを上昇させる因子はその機能を抑制する傾向を有する。
【００７３】
アンギオテンシン（レニン−アンギオテンシン）系インヒビターはアンジオテンシノーゲンまたはアンギオテンシンＩからのアンギオテンシンＩＩの生産に干渉するか、または、アンギオテンシンＩＩの活性に干渉する作用を有する化合物である。このようなインヒビターは当業者にはよく知られており、そしてレニンおよびＡＣＥを包含するアンギオテンシンＩＩの最終的生産に関与する酵素を阻害する作用を有する化合物を包含する。それらはまた生産された後のアンギオテンシンＩＩの活性に干渉する化合物も包含する。このような化合物のクラスの例は、抗体（例えばレニンに対する）、アミノ酸およびその類似体（例えばより大型の分子にコンジュゲートしたものも含む）、ペプチド（アンギオテンシンおよびアンギオテンシンＩのペプチド類似体も含む）、プロレニン関連類似体等を包含する。最も強力で有用なレニン−アンギオテンシン系のインヒビターに含まれるものはレニンインヒビター、ＡＣＥインヒビターおよびアンギオテンシンＩＩ拮抗剤である。
【００７４】
アンギオテンシンＩＩ拮抗剤の例はペプチド化合物（例えばサララシン、［（Ｓａｎ１）（Ｖａｌ５）（Ａｌａ８）］アンギオテンシン−（１−８）オクタペプチドおよび関連の類似体）；Ｎ−置換イミダゾール−２−オン（米国特許５，０８７，６３４）；イミダゾールアセテート誘導体、例えば２−Ｎ−ブチル−４−クロロ−１−（２−クロロベンジル）イミダゾール−５−酢酸（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２４７（１），１−７（１９８８）参照）；４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−カルボン酸および類似体誘導体（米国特許４，８１６，４６３）；Ｎ２−テトラゾール−β−グルクロニド類似体（米国特許５，０８５，９９２）；置換ピロール類、ピラゾール類およびトリアゾール類（米国特許５，０８１，１２７）；フェノールおよび複素環誘導体、例えば１，３−イミダゾール（米国特許５，０７３，５６６）；イミダゾ縮合７員環複素環（米国特許５，０６４，８２５）；ペプチド（例えば米国特許４，７７２，６８４）；アンギオテンシンＩＩに対する抗体（例えば米国特許４，３０２，３８６）；およびアラルキルイミダゾール化合物、例えばビフェニルメチル置換イミダゾール（例えばＥＰ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２５３，３１０，Ｊａｎ．２０，１９８８）；ＥＳ８８９１（Ｎ−モルホリノアセチル−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニル−（４，チアゾリル）−Ｌ−アラニル（３５，４５）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−シクロ−ヘキサペンタノイル−Ｎ−ヘキシルアミド、Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）；ＳＫＦ１０８５６６（Ｅ−α−２−［２−ブチル−１−（カルボキシフェニル）メチル］１Ｈ−イミダゾール−５−イル［メチラン］−２−チオフェンプロパン酸、Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａ．）；Ｌｏｓａｒｔａｎ（ＤＵＰ７５３ＩＭＫ９５４，ＤｕＰｏｎｔ  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；Ｒｅｍｉｋｉｒｉｎ（ＲＯ４２−５８９２、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  ＡＧ）；Ａ．ｓｕｂ．２アゴニスト（Ｍａｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｉｌｌ  Ｄｏｗ）および特定の非ペプチド複素環（Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を包含する。ＡＣＥインヒビターとして有用であることが解っている化合物のクラスはアシルメルカプトおよびメルカプトアルカノイルプロリン類、例えばカプトプリル（米国特許４，１０５，７７６）およびゾフェノプリル（米国特許４，３１６，９０６）、カルボキシアルキルジペプチド類、例えばエナラプリル（米国特許４，３７４，８２９）、リシノプリル（米国特許４，３７４，８２９）、キナプリル（米国特許４，３４４，９４９）、ラミプリル（米国特許４，５８７，２５８）およびペリンドプリル（米国特許４，５０８，７２９）、カルボキシアルキルジペプチド模倣物、例えばシラザプリル（米国特許４，５１２，９２４）およびベナザプリル（米国特許４，４１０，５２０）、ホスフィニルアルカノイルプロリン類、例えばフォシノプリル（米国特許４，３３７，２０１）およびトランドロプリルを包含する。
【００７５】
米国特許の要件であるレニンインヒビターの例は以下の通り、即ち、ペプチドの尿素誘導体（米国特許５，１１６，８３５）；非ペプチド結合で連結されたアミノ酸（米国特許５，１１４，９３７）；ジおよびトリペプチド誘導体（米国特許５，１０６，８３５）；アミノ酸およびその誘導体（米国特許５，１０４，８６９および５，０９５，１１９）；ジオールスルホンアミドおよびスルフィニル類（米国特許５，０９８，９２４）；改変されたペプチド（米国特許５，０９５，００６）；ペプチジルβアミノアシルアミノジオールカーバメート類（米国特許５，０８９，４７１）；ピロールイミダゾロン類（米国特許５，０７５，４５１）；フッ素および塩素のスタチンまたはスタトンを含有するペプチド（米国特許５，０６６，６４３）；ペプチジルアミノジオール類（米国特許５，０６３，２０８および４，８４５，０７９）；Ｎ−モルホリノ誘導体（米国特許５，０５５，４６６）；ペプスタチン誘導体（米国特許４，９８０，２８３）；Ｎ−複素環アルコール類（米国特許４，８８５，２９２）；レニンに対するモノクローナル抗体（米国特許４，７８０，４０１）；および種々の他のペプチドおよびその類似体（米国特許５，０７１，８３７、５，０６４，９６５、５，０６３，２０７、５，０３６，０５４、５，０３６，０５３、５，０３４，５１２および４，８９４，４３７）である。
【００７６】
特定の実施形態においては、試験被験体は本発明の薬剤を用いた治療を現時点で別段必要としない見かけ上は健康な被験体である。例えば特定の薬剤を用いた治療が酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の上昇したレベルに基づいて生じる場合は、患者は、ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子の上昇したレベルを有する症状以外には、その薬剤（または薬剤が属する薬剤の範疇）を用いた治療を要する症状を有さない。一部の実施形態においては、被験体は薬剤の前述した範疇の何れかの組合せまたは全てのうちの何れかの１つを用いた治療を要する症状を別段有さない。例えば、抗炎症剤に関しては、被験体は慢性関節リューマチ、慢性背部痛、自己免疫疾患、血管疾患、ウィルス疾患、悪性疾患等を有さない。別の実施形態においては、被験体は、酸化ａｐｏＡ−Ｉ関連生体分子１つ以上の上昇したレベルを有する以外は、有害な心臓血管事象の上昇した危険性を有さない（例えばこのような事象の家族歴を有さない被験体、非喫煙者の被験体、非高脂血症の被験体、全身炎症マーカーの上昇したレベルを有さない被験体）。
【００７７】
一部の実施形態においては、被験体は非高脂血症の被験体である。「非高脂血症の」とは非高コレステロール血症および／または非高トリグリセリド血症の被験体である被験体である。「非高コレステロール血症の」被験体とは高コレステロール血症の被験体に関する確立された現在の基準に合致しない者である。「非高トリグリセリド血症の」被験体とは高トリグリセリド血症の被験体に関する確立された現在の基準に合致しない者である（例えばＨａｒｒｉｓｏｎ‘ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．参照、以降「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ」と称する）。高コレステロール血症の被験体および高トリグリセリド血症の被験体は早期の冠動脈心疾患の増大した発生率と関連している。高コレステロール血症の被験体は＞１６０ｍｇ／ｄＬ、または＞１３０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬレベル、および、男性、早期冠動脈心疾患の家族歴、喫煙（１日１０本超）、高血圧、低ＨＤＬ（＜３５ｍｇ／ｄＬ）、真性糖尿病、高インスリン血症、腹部肥満、高リポタンパク質（ａ）、および脳血管疾患または閉塞性末梢血管疾患の家族歴よりなる群から選択される少なくとも２つの危険因子を有する。高トリグリセリド血症の被験体は＞２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド（ＴＧ）レベルを有する。即ち、非高脂血症の被験体は、自身のコレステロールおよびトリグリセリドのレベルが高コレステロール血症および高トリグリセリド血症の被験体の両方に関して上記した通りの限界の値より低値である者として定義される。
【実施例】
【００７８】
（Ａ．タンパク質試験）
（材料）
Ｌ−［１３Ｃ６］チロシンおよびＬ−［１３Ｃ９，１５Ｎ１］チロシンをＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）より購入した。組織培養用の培地および添加剤はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）より購入した。ＲＡＷ２６４．７細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手した。［３Ｈ］コレステロールはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手し、使用前にエタノールに再懸濁した。他の試薬は全て特段の記載が無い限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。
【００７９】
（方法）
（一般的方法）
パーオキシニトライトは記載に従って（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｉｓｃｈｉｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｗ，Ｊ．Ｐ．１９９４．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３３：２２９−２４０）合成し、定量した。Ｌ−３−［１３Ｃ６］ニトロチロシンはＬ−［１３Ｃ６］チロシンおよびパーオキシニトライトから合成し、使用前に残存ＮＯ２−を除去するために逆相ＨＰＬＣにより単離した（Ｗｕ，Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．１９９９．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｎｉｔｒａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  ｎｉｔｒａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７４：２５９３３−２５９４４）。タンパク質含有量は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてＭａｒｋｗｅｌｌ変法のＬｏｗｒｙタンパク質試験  （Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．，Ｈａａｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｉｅｂｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｎ．Ｅ．１９７８．Ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｏｗｒｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｔｏ  ｓｉｍｐｌｉｆｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．８７：２０６−２１０）により測定した。試薬Ｈ２Ｏ２の濃度は分光光度計により測定した（ε２４０＝３９．４Ｍ−１ｃｍ−１；参考文献（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｉｅｓｏｗ，Ｌ．Ａ．１９７２．Ｅｎｔｈａｌｐｙ  ｏｆ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｂｙ  ｃａｔａｌａｓｅ  ａｔ  ２５  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ（ｗｉｔｈ  ｍｏｌａｒ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｈ２Ｏ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＶ）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４９：４７４−４７８）。ミエロペルオキシダーゼ（ドナー：過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．１１．１．７）はまずＲａｋｉｔａの記載の通り逐次的レクチンアフィニティーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによりヒト白血球の洗剤抽出液から精製し（Ｒａｋｉｔａ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｂ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，Ｈ．１９９０．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２９：１０７５−１０８０）、そして次に、スルホプロピルセファデックスカラムを通すことにより痕跡量の夾雑好酸球パーオキシダーゼを除去した（Ｗｅｖｅｒ，Ｒ．，Ｐｌａｔ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈａｍｅｒｓ，Ｍ．Ｎ．１９８１．Ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．１２３：３２７−３３１）。単離したＭＰＯの純度は＞０．８４（Ａ４３０／Ａ２８０）のＲＺ、クーマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびゲル内テトラメチルベンジジンパーオキシダーゼ染色により明らかにした（ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｍ．Ｗ．，Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ，Ｃ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｅｔｔｌｅ，Ａ．Ｊ．１９９７．Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｓ  ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．３２７：４８７−４９２）。酵素濃度はＭＰＯの８９０００Ｍ−１ｃｍ−１／ヘムの消光係数を利用して分光光度計により測定した（Ａｇｎｅｒ，Ｋ．１９７２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ．３２９−３３５）。脱脂および精製したａｐｏＡ−ＩはＢｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｃｏ、ＭＥ）より購入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色分析による純度およびオンラインタンデム質量スペクトル分析と組み合わせたＨＰＬＣにより有意な遊離脂肪酸の非存在を確認した後に更に精製することなく使用した（Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｈｅｎ，Ｚ．，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｎｄａ，Ｃ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．２０００．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：４６１１６−４６１２２）。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ；１．０１９＜ｄ＜１．０６３ｇ／ｍｌ画分）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ；１．０６３＜ｄ＜１．２１ｇ／ｍｌ画分）は逐次的超遠心分離により新鮮血漿から単離した（Ｈａｔｃｈ，Ｆ．Ｔ．１９６８．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：１−６８）。最終調製物は５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２００μＭジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）に対して十分透析し、そして使用時までＮ２下に保存した。ＬＤＬは無水酢酸を用いてアセチル化した（Ｇｌｏｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｏ，Ｙ．Ｋ．，Ｂａｓｕ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．１９７９．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍａｓｓｉｖ���  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．７６：３３３−３３７）。ＮＯ２Ｔｙｒ免疫染色は文献記載の通り実施した（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｍｈａｉｒ，Ｓ．Ａ．，Ｅｒｚｕｒｕｍ，Ｓ．Ｃ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，Ｍ．Ｆ．，Ｋａｖｕｒｕ，Ｍ．Ｓ．，Ｓａｍｏｓｚｕｋ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．２００１．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ａｒｅ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｔｏ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６６：５７６３−５７７２）。ＮＯ２Ｔｙｒに対する免疫染色の特異性は（ｉ）抗体−抗原インキュベーションの間に存在する１０ｍＭニトロチロシンを用いた競合試験における；および（ｉｉ）ジチオナイトによるサンプルの還元の場合の染色の消失を示すことにより確認した。
【００８０】
（臨床標本−血清）
血清中の総タンパク質、ＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒのａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＢ−１００の含量の質量スペクトル分析依存定量を用いた試験のために、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎで治療を受けている心臓血管疾患（ＣＶＤ）の逐次的患者（ｎ＝４５）および広告に応募した健常者ボランティア（ｎ＝４５）を参加させた。ＣＶＤは冠動脈疾患、末梢動脈疾患または脳血管疾患として臨床的に定義される。ＣＶＤを有する被験体は安定であり心臓症状を有していなかった。参加前１ヶ月以内に心筋梗塞または卒中を経験した患者は不適格とした。ＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒのＨＤＬのレベルをＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出活性に相関付ける試験をＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃの治療を受けている既知（ＣＶＤ）を有さない個別の逐次的セットの被験体（ｎ＝１２）に対して実施した。全参加者は書面による同意書を提出し、ｔｈｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの倫理調査委員会は試験プロトコルを認可した。臨床調査はヘルシンキ宣言の原則に従って実施した。医療上の履歴および記録の検討を実施することにより冠動脈の危険因子、例えば真性糖尿病（空腹時血糖値＞１２５ｍｇ／ｄｌまたは血糖低化剤使用）、高血圧（血圧＞１４０／９０または既知心疾患非存在下の抗高血圧剤使用）、早期の冠動脈心疾患の家族歴（主観的報告により６０歳未満の冠動脈疾患を有する一等親）、高コレステロール血症の病歴（空腹時ＬＤＬコレステロール＞１６０ｍｇ／ｄｌまたは既知心疾患非存在下の脂質低下剤使用）および喫煙（試験前１年以内の喫煙）を明らかにした。空腹時の血液サンプルは血清分離試験管を用いて得た。血清を単離し、少量をブチル化ヒドロキシトルエン（１００μＭ最終）およびＤＴＰＡ（２ｍＭ最終、ｐＨ７．０）よりなる抗酸化剤カクテルを添加したクリオバイアル内に入れ、アルゴン被覆し、そして分析時まで−８０℃に急速冷凍した。
【００８１】
（ニトロ化タンパク質の免疫アフィニティー精製）
ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアルブミン／ＩｇＧ枯渇血清からニトロ化タンパク質をアフィニティー精製した。慨すれば、製造元の推奨法に従い、ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてヒト血清（４５μｌ）をアルブミンおよびＩｇＧ枯渇させた。合成オクタペプチド（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＯ２Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＯ２Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）に対して作成したアフィニティー精製した抗ニトロチロシン抗体をプロテインＡに結合させ、ジメチルピメリミデートと交差結合させた。アルブミン／ＩｇＧ枯渇患者血清は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ７．２中に希釈し、カラムに適用した。未結合のタンパク質画分を２０ｍｌのＰＢＳおよび１０ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶離させた。結合タンパク質は０．５Ｍ  ＮａＣｌ中５ｍＭ  ３−ニトロチロシンで溶離させた。結合画分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐフィルター装置（ＹＭ−１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、０．１Ｍ尿素に対して透析し、Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  （Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて小容量まで乾燥した。画分中のタンパク質は標準物質としてＢＳＡを用いながらビシンコニン酸試験（Ｐｉｅｒｃｅ）によりモニタリングした。
【００８２】
（２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
透析後、タンパク質約５０μｇをサンプル再水和緩衝液１５５μｌに添加し、７ｃｍのｐＨ３〜１０の非線形ＩＰＧ  ＺＯＯＭストリップ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に一夜吸着させた。等電点電気泳動は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＺＯＯＭ  ＩＰＧランナーシステムおよびＢｉｏｒａｄ  ３０００Ｖ電源を用いながら、以下の電圧ステッププロトコル、即ち、１００Ｖ３０分、２００Ｖ２０分、４５０Ｖ１５分、７５０Ｖ１５分および２０００Ｖ３０分を用いて実施した。第２次元用には、フォーカスしたＩＰＧストリップをＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中ＮＵＰＡＧＥサンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下１５分間平衡化させ、そしてＬＤＳサンプル緩衝液中１２５ｍＭヨードアセトアミドの存在下１５分間更にインキュベートした。ストリップを４〜１２％ビストリスゲル中に入れ、０．５％アガロース（ｗ／ｖ）中に包埋した。コロイド状ブルーまたは銀染色のいずれかを用いてタンパク質についてゲルを染色した。イムノブロッティングのために、ゲルを０．２μｍ  Ｉｍｍｕ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移した。
【００８３】
（臨床標本−組織）
ＬＤＬ様およびＨＤＬ様の粒子を生検で得られた大動脈および大腿動脈の組織からアテローム性動脈硬化症患部を単離した（組織採取は死亡後１０時間以内）。死亡後の人為的要因は重要でないことを確認するための対照試験では血管手術時に新鮮採取された血管組織（ｎ＝５）を利用した。正常なヒト大動脈組織を移植ドナーから得た。全ての組織は迅速に１００μＭ  ＤＴＰＡ添加氷冷リン酸塩緩衝食塩水ですすぎ、そして急速に緩衝液Ａ（６５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１００μＭ  ＤＴＰＡ、１００μＭブチル化ヒドロキシトルエン）中Ｎ２下−８０℃で分析時まで凍結した。
【００８４】
（ＬＤＬおよびＨＤＬ様粒子の単離および正常ヒト大動脈組織およびヒトアテローム性動脈硬化症患部からの特徴付け）
ＬＤＬおよびＨＤＬ様粒子はＳｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｕｇｈｅｅｄの方法の変法（Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ，Ｕ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，Ｍ．１９９２．Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｉｎｔｉｍａ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ＆  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．１２：６０８−６２５）を用いて逐次的密度超遠心分離（「患部ＬＤＬ」に関してはｄ＝１．０１９〜１．０７０ｇ／ｍｌ画分、「患部ＨＤＬ」に関してはｄ＝１．０６３〜１．２１ｇ／ｍｌ画分）によりヒト胸大動脈の脂肪線条および中間患部から記載（Ｋｒｕｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．，Ｋｅｔｔｌｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ｃｌｏｕｓｅ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ，Ｇ．１９９２．Ｌｅｎｇｔｈｓ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  （ａｐｏＢ）  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１８９：１０６９−１０７６）に従って単離した。「対照大動脈ＬＤＬ」および「対照大動脈ＨＤＬ」様粒子も同様に移植ドナー由来の目視可能なアテローム性動脈硬化症プラークを有さない残余の大動脈組織から単離した。金属キレート形成剤（１００μＭ  ＤＴＰＡ）、ミエロペルオキシダーゼインヒビター（１０ｍＭ  ３−アミノトリアゾール）および、ＰＭＳＦおよびＳｉｇｍａプロテアーゼインヒビターカクテル（カタログ番号Ｐ８３４０）よりなるプロテアーゼカクテルをリポタンパク質単離に使用した全溶液中に含有させた。対照の大動脈および患部ＬＤＬおよびＨＤＬはウサギ抗ヒトａｐｏＢ−１００抗血清（Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｗ．１９９７．３−Ｃｈｌｏｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ｉｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｉｎｔｉｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．９９：２０７５−２０８１）またはヤギ抗ヒトａｐｏＡ−Ｉ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）の何れかをそれぞれ用いたウエスタンブロット分析と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０．Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ．２２７：６８０−６８５）に付した。ａｐｏＢ−１００に対するポリクローナル抗体を用いた対照大動脈および患部ＬＤＬ様粒子の分析では未損傷のアポリポタンパク質Ｂ１００の質量である５００ｋＤａのタンパク質が検出された。前述（Ｋｒｕｌ，Ｅ．Ｓ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．，Ｋｅｔｔｌｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ｃｌｏｕｓｅ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ，Ｇ．１９９２．Ｌｅｎｇｔｈｓ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  （ａｐｏＢ）  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１８９：１０６９−１０７６）の通り、凝集／交差結合の低分子質量の形態の免疫反応性のタンパク質はともに血管組織から単離したＬＤＬ様粒子中にも存在した。同様のウエスタン分析を対照大動脈および患部ＨＤＬ様粒子に対してもａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を用いて実施し、ａｐｏＡ−Ｉの存在を確認した。高分解能サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（タンデムＳｕｐｅｒｏｓｅ６および１２カラム；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）による対照大動脈および患部ＬＤＬ様粒子の分析によれば、免疫反応性のａｐｏＢ−１００、総コレステロールおよびタンパク質質量の大部分は血漿から単離されたＬＤＬのものと同様の見かけ上のＭｒを示していた。対照大動脈および患部ＨＬＤ様粒子調製物中に存在した主要タンパク質成分としてのａｐｏＡ−Ｉの同定もまたクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出してタンデムＭＳ配列分析により行った。
【００８５】
幾つかの対照実験によれば死亡後の変化はａｐｏＡ−Ｉのニトロ化および塩素化に寄与する可能性が低いことが示されている。第１に対照試験は血管手術（患部）時に採取された新鮮動脈組織および移植用に採取された臓器（正常／非患部動脈組織）に対して実施した。これらの新鮮採取血管組織内では、剖検で得られたものと比較して、ＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒの同等のレベルが観察された。第２に、液体窒素温度においてステンレス製の乳鉢と乳棒を用いて粉末化した大動脈組織の作成の後、大動脈組織粉末（ＰＢＳに懸濁）を室温で１０時間ＭＰＯ（１００ｎＭ）と共にインキュベートしたところ、質量スペクトル分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析（ＮＯ２Ｔｙｒに対して）の両方でモニタリングされたとおり、ＮＯ２ＴｙｒまたはＣｌＴｙｒのレベルの上昇はできなかった。第３に、対照試験はＬ−［１３Ｃ６］チロシンを添加し、室温で１０時間インキュベートし、そして次に質量スペクトル分析に付した上記した大動脈組織粉末／ＭＰＯ混合物中の３−［１３Ｃ６］ＣｌＴｙｒまたは３−［１３Ｃ６］ＮＯ２Ｔｙｒの有意な形成を示していなかった。
【００８６】
（質量スペクトル分析によるタンパク質の同定）
タンパク質の同定は以前に記載されている通り実施した（Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎ．２０００．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｂ．Ｂ．，Ｒｕｓｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｋｅｉｇｈｔｌｅｙ，Ｊ．Ａ．，Ｂｏｎｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．２００３．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｉｔｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７５：２３７０−２３７６）。慨すれば、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからバンドを切り出し、ＤＴＴで還元し、そしてヨードアセトアミドでアルキル化した。次にトリプシンを添加することによりタンパク質をゲル内消化し、ペプチドを抽出し、次に流量２００ｎＬ／分でナノスプレーイオン化発生源を装着したＬＣＱＤｅｃａイオントラップ質量スペクトル分析システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上でキャピラリーカラムＨＰＬＣタンデム質量スペクトル分析により分析した。消化ペプチドはＮｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）より購入した１０μｍ先端の付いた５０μｍ内径のカラムを用いた逆相キャピラリーＨＰＬＣにより分離した。カラムには〜６ｃｍのＣ１８パッキン材（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を充填し、５０ｍＭ酢酸中漸増量のアセトニトリル（２〜７０％）の４５分間勾配を用いて溶離した。タンパク質の同定は単回の試行において質量スペクトルおよびＣＩＤスペクトルの両方を獲得するデータ依存性の分析を用いて実施した（Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎ．２０００．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｂ．Ｂ．，Ｒｕｓｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｋｅｉｇｈｔｌｅｙ，Ｊ．Ａ．，Ｂｏｎｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．２００３．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｉｔｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７５：２３７０−２３７６）。検索プログラムＳｅｑｕｅｓｔおよびＭａｓｃｏｔをタンパク質同定のために使用した。マニュアルの配列分析は選択された重水素リッチ化ペプチドに対して水素重水素交換質量スペクトル分析の間に実施した。
【００８７】
（ニトロチロシンおよびクロロチロシンの分析）
タンパク質結合ニトロチロシンおよびクロロチロシンを、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｒｉａ  ＬＸ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣマルチプレクシングシステム（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）とインターフェイス接続した３重４極質量スペクトル分析器（ＡＰＩ  ４０００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上の安定同位体希釈の液体クロマトグラフィータンデム質量スペクトル分析（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｗ．，Ｆｕ，Ｘ．，Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｒｏｓｔ，Ｈ．，Ｖａｄｓｅｔｈ，Ｃ．，Ｎａｒｉｎｅ，Ｌ．，Ｌｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｅ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：１７４１５−１７４２７）により定量した。合成［１３Ｃ６］標識した標準物質をサンプル（血清の一部、組織／患部ホモジネート、またはコロイドブルー染色してＰＶＤＦメンブレン上で可視化し、次に切り出したバンド）に添加し、そして天然存在比の分析対象の定量のための内標準として使用した。同時に、ユニバーサルの標識前駆体アミノ酸［１３Ｃ９、１５Ｎ１］チロシンを添加した。タンパク質をメタンスルホン酸中アルゴン雰囲気下で加水分解し、そして次にサンプルをミニ固相Ｃ１８抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ  ＬＣ−Ｃ１８−ＳＰＥミニカラム；３ｍｌ；Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｅ，ＰＡ）上に通し、その後質量スペクトル分析に付した。結果は同じインジェクション内においてモニタリングした前駆体アミノ酸チロシンの含有量に対して規格化した。ニトロ［１３Ｃ９、１５Ｎ］チロシンおよびクロロ［１３Ｃ９、１５Ｎ］チロシンの両方のクロマト中の形成は日常的にモニタリングしたが、使用条件下では無視できるものであった（即ち観察された天然存在比の産物のレベルの＜５％）。
【００８８】
（統計学的分析）
検出力の計算は臨床試験におけるＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒの以前に報告されている平均および標準偏差に基づいて実施した。４０％を検出するために８０％の検出力を有するためには各群において少なくとも３０人の患者が必要であることがわかった。
【００８９】
（実施例１．血清中のニトロ化タンパク質としてのアポリポタンパク質Ａ−Ｉの同定）
タンパク質結合ニトロチロシンの血清中レベルは被験体におけるアテローム性動脈硬化症の危険性および負荷の予測因子として機能（Ｓｈｉｓｈｅｈｂｏｒ，Ｍ．Ｈ．，Ａｖｉｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｆｕ，Ｘ．，Ｇｏｏｒｍａｓｔｉｃ，Ｍ．，Ｐｅａｒｃｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｇｏｋｃｅ，Ｎ．，Ｋｅａｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｊｒ．，Ｐｅｎｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｔｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．ＪＡＭＡ．２８９：１６７５−１６８０）し、特定のタンパク質のニトロ化がアテローム性動脈硬化症の過程に寄与するかどうかの疑問が生じる。この疑問を解明する第１の工程として、本発明者らは血清中のニトロ化タンパク質の実体を調べた。ＣＶＤを有する患者および対照より得たサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、抗ニトロチロシン抗体を用いたウエスタンブロット分析およびタンパク質に対するクーマシーブルー染色の両方により可視化した。ウエスタンブロットで観察された免疫反応性のパターンとタンパク質染色の比較によれば、血清中タンパク質の全てが等しくニトロ化されているわけではないことがわかった。低値の存在比と旺盛なニトロ化の間の不一致の例は２９ｋＤａタンパク質において再現性を伴って観察された。このタンパク質バンドをクーマシーブルー染色ゲルから切り出し、トリプシン消化し、そしてタンパク質配列の９６％に相当する＞３０ペプチドの検出と配列決定に基づけばａｐｏＡ−Ｉ（ＮＣＢＩアクセッション番号２５３３６２）であると明確に同定された。ニトロ化されたタンパク質としてのａｐｏＡ−Ｉの実体は、ニトロチロシンに対する固定化抗体よりなるカラムに血清を通し、カラムを高濃度塩で洗浄し、その後５ｍＭニトロチロシン添加高濃度塩で溶離することにより更に確認された。２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびキャピラリーＬＣタンデム質量スペクトル分析系配列決定によるサンプルの分析により、ａｐｏＡ−Ｉは回収されたタンパク質であることが確認された（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによれば＞９０％相当）。２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析による抗ニトロチロシンカラム溶出物（高濃度塩＋５ｍＭニトロチロシン）のその後の検査により、インビボのニトロ化タンパク質としてのａｐｏＡ−Ｉの別の補足的証拠が得られた。
【００９０】
（実施例２．血清中並びに心臓血管疾患有無の被験体におけるニトロ化および塩素化の好ましい標的としてのアポリポタンパク質Ａ−Ｉの実証）
血清のような組織内に標的が大量に存在し、そして複合生物学的マトリックス内の反応性窒素物質種に対して比較的短い拡散距離があるとすれば、血清中タンパク質内のａｐｏＡ−Ｉの見かけ上の選択的ニトロ化はインビボのリポタンパク質の近接部におけるＮＯ誘導酸化剤の酵素的原料の存在を強力に示唆するものである。１つの可能性のある候補は酵素ＭＰＯで有るが、その理由は最近の研究においてこの酵素がインビボにおけるタンパク質のニトロ化を触媒すること（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｗ．，Ｆｕ，Ｘ．，Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｒｏｓｔ，Ｈ．，Ｖａｄｓｅｔｈ，Ｃ．，Ｎａｒｉｎｅ，Ｌ．，Ｌｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｅ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：１７４１５−１７４２７，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｈｅｎ．Ｚ．，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｎｄａ，Ｃ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．２００２．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：４６１１６−４６１２２，Ｂａｌｄｕｓ，Ｓ．，Ｅｉｓｅｒｉｃｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａｎｉ，Ａ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ｌ．，Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．，Ｃｈｕｍｌｅｙ，Ｐ．，Ｍａ，Ｗ．，Ｔｏｕｓｓｏｎ，Ａ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｕｌｌａｒｄ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ＥＣＭ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｎｉｔｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１０８：１７５９−１７７０，Ｇａｕｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｙｕｎ，Ｊ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．Ｄ．，Ｌａｕｂｅｒ，Ｗ．Ｍ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｂｅｌａａｏｕａｊ，Ａ．，ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｗ．２００２．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｎｉｔｒａｔｉｎｇ  ｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１０９：１３１１−１３１９）並びに炎症部位における細胞外コンパートメント内のような特定の状況下においてＮＯ誘導酸化剤��生成に主要な役割を果たすこと（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｗ．，Ｆｕ，Ｘ．，Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｒｏｓｔ，Ｈ．，Ｖａｄｓｅｔｈ，Ｃ．，Ｎａｒｉｎｅ，Ｌ．，Ｌｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｅ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：１７４１５−１７４２７）の両方が可能であることが判明したためである。インビボの選択的ａｐｏＡ−Ｉニトロ化のための可能な酵素的触媒としてＭＰＯが作用するという仮説を検討し、かつａｐｏＡ−ＩがＣＶＤを有する被験体内においてより高水準までニトロ化されるかどうかを定量的に評価するために、明確化されたＣＶＤを有しながら心臓科に来院した逐次的患者（ｎ＝４５）および健康な対照被験体（ｎ＝４４）に同意を求め、その血清サンプルを採取して分析に付した。ＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒの両方の含有量は、オンライン電子スプレーイオン化タンデム質量スペクトル分析と組み合わせた安定同位体希釈ＨＰＬＣ（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）を利用して総血清中タンパク質、単離されたａｐｏＡ−Ｉおよび単離されたａｐｏＢ−１００内において同時に定量した。表２は検査した被験体の臨床上および検査値上の特徴を示している。推測された通り、ＣＶＤを有する患者は既知のＣＶＤ危険因子、例えば糖尿病歴、高血圧、喫煙、ＣＶＤの家族歴および高脂血症の病歴を有する可能性がより高かった。ＣＶＤを有する被験体はより低値のＬＤＬコレステロールレベルを有し、心臓科へのＣＶＤ被験体の組み入れと確認の偏位に起因する特徴であるスタチン療法を受けている可能性がより高かった。
【００９１】
【表２】
2011002460.tif 000003
データは記載の通りパーセントまたは平均±標準偏差の何れかで表示する。
ＣＶＤ＝心臓血管疾患；ＨＤＬｃ＝高密度リポタンパク質コレステロール；Ｈｘ＝病歴；ＬＤＬｃ＝低密度リポタンパク質コレステロール；ＴＣ＝総コレステロール；ＴＧ＝トリグリセリド。
【００９２】
最近発表された研究（Ｓｈｉｓｈｅｈｂｏｒ，Ｍ．Ｈ．，Ａｖｉｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｆｕ，Ｘ．，Ｇｏｏｒｍａｓｔｉｃ，Ｍ．，Ｐｅａｒｃｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｇｏｋｃｅ，Ｎ．，Ｋｅａｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｊｒ．，Ｐｅｎｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｔｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．ＪＡＭＡ．２８９：１６７５−１６８０）と合致して、血清中のＮＯ２Ｔｙｒ含有量はＣＶＤを有する被験体においては健常者対照群のものと比較して約１．５倍の有意な上昇があった（ｐ＜０．００１）（表３）。同様の結果（ＣＶＤｖｓ対照で２倍上昇；ｐ＝０．００１、表３）は、単離されたａｐｏＢ−１００のＮＯ２Ｔｙｒ含有量、ＬＤＬの主要タンパク質成分およびインビトロでＭＰＯに結合することが報告されているリポタンパク質を分析した場合にも観察された（Ｃａｒｒ，Ａ．Ｃ．，Ｍｙｚａｋ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｒ．，ＭｃＣａｌｌ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｆｒｅｉ，Ｂ．２０００．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．４８７：１７６−１８０，Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｇｕ，Ｚ．Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｒａｔｓ，Ａ．Ｊ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｌ．Ｋ．，Ｗｅｌｔｙ，Ｓ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｖ．１９９９．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏＢ−１００  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４０：６８６−６９８）。著明な点は、血清中総タンパク質および単離されたａｐｏＢ−１００と比較して血清中ａｐｏＡ−ＩにおいてはＮＯ２Ｔｙｒ含有量の７０倍リッチ化が観察された。更にまた、ａｐｏＡ−ＩのＮＯ２Ｔｙｒ含有量の有意な上昇はＣＶＤと健常者対照群の被験体の血清を比較した場合にも観察された（ｐ＝０．００５；表２）。ＭＰＯ触媒酸化に特異的なタンパク質改変であるＣｌＴｙｒの含有量に関するサンプルの平行分析（Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｓｕ，Ｆ．Ｆ．，Ｇａｕｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｗ．，１９９９．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ  ｂｙ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３００：８８−１０５，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｗ．，Ｆｕ，Ｘ．，Ｓｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｒｏｓｔ，Ｈ．，Ｖａｄｓｅｔｈ，Ｃ．，Ｎａｒｉｎｅ，Ｌ．，Ｌｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｅ．，Ｂｏｒｃｈｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｅ��ｏｘｉｄａｓｅｓ  ｉｎ  ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：１７４１５−１７４２７，Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｗ．１９９７．３−Ｃｈｌｏｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ｉｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｉｎｔｉｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．９９：２０７５−２０８１，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．，Ｓｈｉｈ，Ｄ．，Ｑｕ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｍｅｈｔａ，Ａ．，Ｌｉｍ，Ｌ．，Ｓｈｉ，Ｗ．，Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｊａｃｏｂ，Ｊ．，Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｊ．，Ｈｅｉｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｌｕｓｉｓ，Ａ．Ｊ．２００１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：４１９−３０）によれば血清中の総タンパク質および単離ａｐｏＢ−１００においては比較的低レベルであったのに対し、単離されたａｐｏＡ−ＩにおいてはＣｌＴｙｒ含有量の１００倍超のリッチ化が判明した（表２）。更に、ＣＶＤを有する被験体におけるＣｌＴｙｒの含有量の上昇の傾向は総タンパク質および単離されたａｐｏＢ−１００において観察されたが、これらの差は統計学的な有意差には達していなかった。一方、ＣｌＴｙｒ含有量の有意な上昇が血清から回収されたａｐｏＡ−Ｉにおいては観察された（ｐ＜０．００１；表３）。
【００９３】
（表３）
（アポリポタンパク質Ａ−Ｉは血清において、そして、心臓血管疾患において、ニトロ化および塩素化の好ましい標的である）
【００９４】
【表３】
2011002460.tif 000004
表２の全コホート（ＣＶＤおよび健常者対照被験体）由来の血清の一部（１００ｕｇタンパク質）は直接分析（総タンパク質）するか、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＢ−１００に相当するバンドを可視化し、切り出し、次に安定同位体希釈ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにより「方法」で記載した通り分析した。示した結果は親アミノ酸に対する酸化アミノ酸のモル比として示した総血清中タンパク質または記載したリポタンパク質のニトロチロシンおよびクロロチロシン含有量の中央値および４分位範囲である。記載したｐ値は相当する記載したタンパク質における対照群とＣＶＤ群の間のＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒ含有量の比較を示す。ａｐｏ＝アポリポタンパク質；ＣＶＤ＝心臓血管疾患；ＩＱＲ＝４分位範囲。
【００９５】
血清由来の総タンパク質および単離されたａｐｏＡ−ＩにおけるＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒの含有量の間の関係の強度は更に、全コホート（ＣＶＤ＋対照）において検討した。表４（上）に示す通り、ＮＯ２Ｔｙｒ含有量の上昇には、総血清中タンパク質または血清由来の単離されたａｐｏＡ−Ｉの何れかにおいてモニタリングされる通り、ＣＶＤの発生率の上昇が伴った。更にまた、高値ｖｓ低値のレベルのＮＯ２Ｔｙｒ（第３対第１の３分位）を有する被験体の間の比較では、総タンパク質または血清由来の単離されたａｐｏＡ−Ｉの何れを調べた場合でも、ＣＶＤを有する者についてオッズの約６倍上昇が示されていた（表３、下）。一方、単離されたａｐｏＡ−ＩのＣｌＴｙｒ含有量のみがコホート内のＣＶＤ発生率またはオッズの上昇を伴っており、総血清タンパク質（またはａｐｏＢ−１００、図示せず）のＣｌＴｙｒ含有量では伴っていなかった。注目すべき点として、高値（最高３分位）のａｐｏＡ−Ｉ  ＣｌＴｙｒ含有量を有する被験体は低値（最低３分位）のａｐｏＡ−Ｉ  ＣｌＴｙｒ含有量を有する者よりもＣＶＤを有する可能性が１６倍高値であった（表４、下）。
【００９６】
（表４）
（血清中総タンパク質およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉのニトロチロシンおよびクロロチロシン含有量と心臓血管疾患罹患性の間の関係）
【００９７】
【表４】
2011002460.tif 000005
表示は（上）全コホートの各３分位内の心臓血管疾患の罹患の発生率；および（下）ＣＶＤの予測因子としての最低（第１）３分位と比較した第２および第３の３分位のオッズ比および９５％信頼区間。ａｐｏ＝アポリポタンパク質；ＣＩ＝信頼区間；ＣｌＴｙｒ＝クロロチロシン；ＣＶＤ＝心臓血管疾患；ＮＯ２Ｔｙｒ＝ニトロチロシン。
【００９８】
（実施例３  ヒトアテローム性動脈硬化症患部内のニトロ化および塩素化の好ましい標的としてのアポリポタンパク質Ａ−Ｉの実証）
ＮＯ−およびＭＰＯにより生成された酸化剤によるａｐｏＡ−Ｉの優先的なターゲティングがヒトアテローム中で生じたかどうかを調べるために、ヒト大動脈組織から回収した総タンパク質、ａｐｏＢ−１００およびａｐｏＡ−Ｉを検査する別の試験を実施した。ＬＤＬ様およびＨＤＬ様粒子を示差浮力密度遠心分離により正常大動脈組織およびアテローム性動脈硬化症組織の両方から単離し、次に「方法」の項で記載したとおりａｐｏＢ−１００またはａｐｏＡ−Ｉのいずれかに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタン分析によりコレステロールと適切なアポリポタンパク質調製物の両方においてリッチ化されていることを確認した。アテローム性動脈硬化症患部由来のＨＤＬ様粒子から回収したａｐｏＡ−Ｉの大部分は単量体であった。大動脈および患部の総タンパク質およびａｐｏＢ−１００において観察されたものと相対比較した場合の正常大動脈および患部組織から回収したａｐｏＡ−ＩのＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒの含有量のより定量的な試験は安定同位体希釈ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析により行い、その結果は表４に示す通りである。注意すべき点は、正常大動脈組織およびヒトアテローム性動脈硬化症患部から回収した総タンパク質、ａｐｏＢ−１００およびａｐｏＡ−ＩにおけるＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒの含有量は血清中で観察されるものよりも高値であり（表３と５を比較）、ＮＯおよびＭＰＯにより生成された酸化剤は、血管内（血液）コンパートメントと比較して動脈壁内、特にアテローム性動脈硬化症の患部内に優先的に存在することを示唆している。血清および血清由来の単離リポタンパク質において観察された通り、患部ａｐｏＡ−Ｉ中のＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒ両方の含有量は患部総タンパク質および患部ａｐｏＢ−１００と相対比較して劇的選択的にリッチ化されていることを示していた（表５）。同様に、正常血管組織よりも罹患組織に由来する総タンパク質および単離リポタンパク質において、より高値のレベルが観察されている。
【００９９】
（表５）
（アポリポタンパク質Ａ−Ｉはヒト大動脈アテローム性動脈硬化症の患部におけるニトロ化および塩素化の好ましい標的である）
【０１００】
【表５】
2011002460.tif 000006
正常ヒト大動脈（ｎ＝１０被験体）およびヒト大動脈アテローム性動脈硬化症組織（ｎ＝２２被験体）の標本を外膜除去し、次に液体窒素温度においてステンレス製の乳鉢と乳棒を用いて粉末化し、ニトロチロシンおよびクロロチロシンの含有量を安定同位体希釈ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにより「方法」で記載した通り分析した。バイオマーカーの総タンパク質含有量は粉末ヒト血管組織を用いて確認した。正常大動脈およびアテローム性動脈硬化症患部に由来するａｐｏＢ−１００およびａｐｏＡ−Ｉにおける酸化されたアミノ酸の含有量は粉末血管組織からＬＤＬ様およびＨＤＬ様粒子を単離した後に、逐次的浮力密度遠心分離してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより更に分割することにより確認し、ＰＶＤＦメンブレンに移行させ、次にａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＢ−１００に相当するバンドを可視化し、切り出し、安定同位体希釈ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにより「方法」で記載した通り分析した。示した結果は親アミノ酸に対する酸化アミノ酸のモル比として示した正常大動脈および患部の総タンパク質または記載したリポタンパク質のニトロチロシンおよびクロロチロシン含有量の中央値および４分位範囲である。記載したｐ値はヒト正常大動脈およびアテローム性動脈硬化症患部由来の記載した単離されたリポタンパク質中のニトロチロシンまたはクロロチロシン含有量を正常または患部の大動脈組織の総タンパク質において観察された相当する含有量と対比させたものである。＊患部ａｐｏＡ−Ｉと正常大動脈組織ａｐｏＡ−Ｉの比較に関してＰ＜０．００１。
【０１０１】
本試験は動脈壁におけるニトロ化および塩素化の優先的標的としてのＨＤＬの主要タンパク質成分であるａｐｏＡ−Ｉの最初の直接の証拠並びにＨＤＬのプロアテローム形成性形態の発生のための潜在的機序を与えるものである。ヒトアテローム性動脈硬化症患部および全身循環の両方において観察されたａｐｏＡ−ＩのＮＯ２ＴｙｒおよびＣｌＴｙｒ含有量の顕著な選択的リッチ化は、ＮＯ誘導酸化剤およびＭＰＯ触媒反応が酸化的改変についてリポタンパク質を選択的にターゲティングすることを示している。本発明者らは患部ａｐｏＡ−Ｉにおいて５，５００μｍｏｌのｏｘ−アミノ酸（ｏｘ−ＡＡ）／ｍｏｌ  Ｔｙｒの複合ｏｘ−ＡＡ含有量を観察した（表５）。ａｐｏＡ−Ｉ当たり７チロシン残基およびＨＤＬ粒子当たり４個以下のａｐｏＡ−Ｉ分子が存在するとすれば、ヒト大動脈患部から回収したＨＤＬ様粒子の平均およそ１５％が少なくとも１つの酸化的改変を保有していると本発明者らは計算している（即ち５．５ｏｘ−ＡＡ／１０３Ｔｙｒ  ｘ  ７Ｔｙｒ／ａｐｏＡ−Ｉ  ｘ  ４ａｐｏＡ−Ｉ／ＨＤＬ粒子＝１５．４％）。１０，０００〜２５，０００μｍｏｌ  ｏｘ−ＡＡ／ｍｏｌ  Ｔｙｒの範囲の複合ｏｘ−ＡＡ含有量を示す最高の４分位値の場合、この最高の４分位値における患部ＨＤＬの注目すべき２８％〜５０％がＣｌＴｙｒまたはＮＯ２Ｔｙｒ残基のいずれかを保有する。ＭＰＯ、ＨＯＣｌ改変タンパク質およびａｐｏＡ−Ｉは全て内皮下のコンパートメントの保護された環境内に共局在化しているため、この数値は一部の位置においては更に高値となることは想像に難くない。ＭＰＯにより生成される酸化生成物の選択的リッチ化はＣＶＤを有する個体の循環ＨＤＬおよびヒトアテローム性動脈硬化症患部において最も顕著であったが、明らかなリッチ化はまた健常者被験体の血清および移植ドナー大動脈組織から回収したａｐｏＡ−Ｉにおいても観察され、ａｐｏＡ−ＩのＭＰＯ結合およびＭＰＯにより形成された酸化剤の捕獲のための潜在的な生理学的抗炎症／抗酸化剤の役割を示唆している。
【０１０２】
（Ｂ．ａｐｏＡ−Ｉペプチドフラグメント研究）
本研究はａｐｏＡ−ＩのＭＰＯ媒介改変に関連する分子事象を明らかにし、そしてａｐｏＡ−Ｉの機能の改変にこれらの事象を特に相関付ける。本発明者らは、タンデム質量スペクトル分析によりＭＰＯ媒介ニトロ化および塩素化の部位をマッピングしており、そして今回タンパク質の２つの領域の特定の改変を明らかにする。本発明者らはまた改変の階層構造を明らかにし、そして、ヘリックス８領域におけるＭＰＯ相互作用部位によるＭＰＯ触媒塩素化およびニトロ化の両方により改変された好ましい残基の共局在を報告する。ａｐｏＡ−ＩのＭＰＯ媒介部位特異的改変の用量依存的進行とＡＢＣＡ１−依存性逆コレステロール輸送およびａｐｏＡ−Ｉ脂質結合の抑制の両方との間には強力な相関が観察されている。本発明者らのデータはＭＰＯ触媒部位特異的ａｐｏＡ−Ｉ改変とＨＤＬの重要な抗アテローム性動脈硬化症機能の消失との間の繋がりを示唆している。即ち、動脈壁におけるａｐｏＡ−ＩのＭＰＯ触媒酸化的改変はＭＰＯと心臓血管疾患の間の臨床的関連性に寄与していると考えられる。
【０１０３】
（実験手順）
（ＨＤＬおよびａｐｏＡ−Ｉの改変反応）
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの倫理調査委員会により認可された試験プロトコルに関する同意書を提出した健常者ドナーより全血を採取した。示差超遠心分離を用いてＨＤＬをヒト血漿から単離（密度範囲−１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．２１０ｇ／ｍＬ）し、４℃暗所において１００μＭジエチレントリアミン４酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中で十分透析した。脱脂質化され精製されたａｐｏＡ−ＩはＢｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｃｏ，ＭＥ）より購入し、更に精製することなく使用した。
【０１０４】
ＭＰＯ媒介改変反応は１００μＭ  ＤＴＰＡ、１ｍｇ／ｍＬタンパク質（ａｐｏＡ−Ｉ）、５７ｎＭ精製ヒトＭＰＯ（ドナー：過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．１１．１．７；Ａ４３０／Ａ２８０比０．７９）および１ｍＭ亜硝酸（ニトロ化反応用）または１００ｍＭ塩化物（塩素化反応用）のいずれかを含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０中で実施した。ミエロペルオキシダーゼ反応は種々の濃度（０〜２００μＭ）において過酸化水素を添加することにより開始し、そして１時間３７℃で実施した。これらの反応条件はＭＰＯ、塩化物および亜硝酸の生理学的に該当する量、および生理学的〜病理学的の範囲にわたる過酸化水素濃度を包含する。
【０１０５】
パーオキシニトライトおよびＨＯＣｌの反応は０〜２００μＭの終濃度を与えるように添加されたパーオキシニトライトおよびＨＯＣｌと共に１００μＭ  ＤＴＰＡを含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０中で１時間３７℃で同様に実施した。
【０１０６】
全反応において、重要な反応体の濃度は、ＭＰＯについては４３０ｎｍにおいて１７０ｃｍ−１ｍＭ−１、過酸化水素については２４０ｎｍにおいて３９．４ｃｍ−１Ｍ−１、ＨＯＣｌ（ＮａＯＣｌ）については２９２ｎｍにおいて３５０ｃｍ−１Ｍ−１、そして、パーオキシニトライトについては３０２ｎｍにおいて１６７０ｃｍ−１Ｍ−１のモル消光係数を用いて分光光度計分析により確認した。
【０１０７】
改変されたタンパク質を採取し、即座に下記ａｐｏＡ−Ｉ機能試験に付した。各反応物少量を取り出し、アセトンで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して質量スペクトル分析実験に付した。
【０１０８】
（質量スペクトル分析実験）
（タンパク質消化）
タンパク質バンドをゲル内消化の手順に従って消化した（Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎ．Ｅ．（２０００）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。慨すれば、タンパク質バンドをゲルから切り出し５０％エタノール／５％酢酸で洗浄した後に室温で一夜、改変配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）でトリプシン消化した。ペプチドをゲルから抽出し、蒸発乾固させ、１％酢酸または０．１％ギ酸の何れかで再調製し、キャピラリーカラムＨＰＬＣ電子スプレーイオン化質量スペクトル分析に付した。
【０１０９】
（改変部位の同定）
ニトロ化および塩素化の部位の詳細なマッピングおよび検出はナノスプレーイオン化発生源（Ｐｒｏｔａｎａ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を装着したＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量スペクトル分析システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて実施した。発生源は２００ｎｌ／分の流量でマイクロスプレー条件下に運転した。消化物はＮｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）より購入した１５μｍ内径の先端の付いた５０μｍ内径のカラムを用いた逆相キャピラリーＨＰＬＣにより分析した。カラムには〜６ｃｍのＣ１８パッキン材（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を充填し、５０ｍＭ酢酸中漸増量のアセトニトリル（２〜７０％）の４５分間勾配を用いて溶離した。データはデータ依存性のモードで獲得し、反復サイクルにおいて質量スペクトルおよび３つの衝突誘導解離（ＣＩＤ）スペクトルを記録した（Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎ．Ｅ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。プログラムＳｅｑｕｅｓｔを用いて全ての記録されたＣＩＤスペクトルをヒトａｐｏＡ−Ｉの配列（ＮＣＢＩアクセッション番号２２９５１３）と比較し、そして塩素化については＋３４Ｄａおよびニトロ化については＋４５Ｄａのチロシン残基質量の適切な変化を考慮した。
【０１１０】
（タンパク質改変の部位特異的定量）
部位特異的定量実験はオートインジェクターを有するＣａｐＬＣ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を装着したＱＴｏＦｍｉｃｒｏ質量スペクトル分析システム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で実施した。電子スプレーイオン化発生源は６００ｎＬ／分の流量でマイクロスプレー条件下で運転した。消化物は内径１９μｍのナノスプレー発生源キャピラリーを有する内径７５μｍのカラムを用いた逆相キャピラリーＨＰＬＣにより分析した。カラムには１０μｍのＣ１８パッキン材（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）〜１５ｃｍを充填し、そして０．１％ギ酸中漸増量のアセトニトリル（２〜７０％）の４５分間勾配を用いて溶離した。定量は選択イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）において翻訳後改変の部位特異的定量のために開発されたＮａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ法（３８，３９）を用いることにより行った。ＳＩＭ実験のためには、ＱＴｏＦ機器の飛行時間型（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）質量分析器および目的の種々のペプチドイオンのｍ／ｚ値に基づいて構築された質量クロマトグラムを用いてｍ／ｚ３００〜ｍ／ｚ１６００のフルスキャンを得た。ａｐｏＡ−ＩペプチドＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫ配列番号９およびＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫ配列番号１０をネイティブの比較参照ペプチドとして使用した。各分析対象の相対量は比較参照ペプチドのクロマトグラフィーピーク面積でその分析対象ペプチドのクロマトグラフィーピーク面積を割ることにより求めた。
【０１１１】
（ａｐｏＡ−Ｉの機能の試験）
（コレステロール流出）
コレステロール流出実験は確立された手順に従って実施した（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｇｒｉｇａｕｘ，Ｃ．，Ｓｈｍｏｏｋｌｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｐｌｕｍｐ，Ａ．Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０６４７−３０６５５，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，１１３５８−１１３６３）。２４穴ディッシュ中のサブコンフルエントのＲＡＷ２６４．７細胞にコレステロール負荷し、［３Ｈ］コレステロール標識アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）を含有するＤＧＧＢ（５０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンおよび０．２％ＢＳＡ添加ＤＭＥＭ）０．５ｍＬ中で一夜標識した。［３Ｈ］コレステロール標識ＡｃＬＤＬはＡｃＬＤＬと共に３７℃で３０分間［３Ｈ］コレステロールをインキュベートすることにより調製し、そして、０．３３μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］コレステロールを含有する５０μｇ／ｍｌ  ＡｃＬＤＬの終濃度となるようにＤＧＧＢで希釈した。標識の翌日、細胞をＰＢＳ、０．２％ＢＳＡで３回洗浄し、１６時間０．１ｍＭ  ８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下または非存在下にＤＧＧＢ  ０．５ｍｌと共にインキュベートした。１６時間インキュベートした後、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下または非存在下のＤＧＧＢ  ０．５ｍＬ中のＨＤＬタンパク質５０μｇ／ｍＬを各ウェルに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、培地１００μＬを採取し、遠心分離し、培地中の流出コレステロールの尺度として放射能を計数した。各ウェルの該当する細胞をヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ：ｖ）で抽出し、細胞中に保持されているコレステロールの尺度として放射能を測定した。流出したコレステロールのパーセンテージは総放射能（培地中放射能＋細胞放射能）で割った培地中の放射能として計算した。
【０１１２】
（脂質の結合）
ＬＤＬ凝集試験は以前に記載された試験の変法によりａｐｏＡ−Ｉ脂質結合を試験するために使用した（Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｓｃｒａｂａ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｙａｎ，Ｒ．Ｏ．（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１６，２７−３３）。９６穴の試験プレート中、ＬＤＬ  ７５μｇを最終容量２００μｌの反応緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）中３μｇの対照または改変ａｐｏＡ−Ｉの存在下または非存在下に混合した。各反応は３連で実施した。次にプレートを１０分間３７℃でＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）中インキュベートした。１時間で凝集を誘導するのに十分なバチルス・セレウス由来の希釈ホスホリパーゼＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７１４７）または緩衝液対照の２０μｌ区分を各ウェルに添加してリン脂質の極性先端基を加水分解することによりＬＤＬ表面を疎水性とし、凝集を開始した。３７℃における凝集は４７８ｎｍにおける吸光度でモニタリングし、１時間に渡り２分おきに読み取った。ａｐｏＡ−Ｉ脂質結合活性はＬＤＬ凝集の抑制をもたらし、短時間の遅れの後に起こる急速段階の間の凝集速度（ΔＯ．Ｄ．／分）から計算した。改変ａｐｏＡ−Ｉに関する凝集速度はネイティブのａｐｏＡ−Ｉの速度に対して規格化した。
【０１１３】
（ヒトアテローム中の改変ａｐｏＡ−Ｉの検出）
（ａｐｏＡ−Ｉの単離）
ヒトアテローム組織を死亡１０時間以内に剖検時に得られた大動脈から単離した。組織を１００μＭ  ＤＴＰＡ添加氷冷リン酸塩緩衝食塩水中で即座にすすぎ、そして即座に−８０℃窒素下、１００μＭ  ＤＴＰＡおよび１００μＭブチル化ヒドロキシトルエン含有６５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４中で分析時まで凍結した。
【０１１４】
ヒト胸大動脈の脂肪線条および中間患部を液体窒素温度においてステンレス製の乳鉢と乳棒を用いて粉末化し、１００μＭ  ＤＴＰＡおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（ＳｉｇｍａカタログＮｏ  Ｐ８３４０）を含有するＰＢＳと１０時間４℃で混合した。懸濁患部サンプルを遠心分離し、上澄みをａｐｏＡ−Ｉの精製に使用した。精製においては、ａｐｏＡ−Ｉを抗ＨＤＬ  ＩｇＹ樹脂（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に結合させ、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶離し、そして溶出液を１Ｍトリス（ｐＨ８．０）に添加することにより中和した。中和したサンプルを加熱することなくサンプル負荷緩衝液中に溶解し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で泳動し、クーマシーブルー染色により検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によればカラムから回収されたタンパク質の＞９０％がａｐｏＡ−Ｉであることがわかった。
【０１１５】
（ＬＣタンデムＭＳ分析）
免疫アフィニティー単離ａｐｏＡ−Ｉバンドをゲルから切り出し、上記した通りトリプシンで消化した。ＬＣタンデムＭＳ実験ではＳｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣポンプおよびオートサンプラーシステムを有するＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱリニアイオントラップ質量スペクトル分析器を使用した。サンプルは１０ｃｍ  ｘ  ７５μｍ内径のキャピラリーカラムに注入し、これを約１μＬ／分で５０ｍＭ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配により溶離させた。選択反応モニタリング実験（ＳＲＭ）を用いてマッピング実験において特徴付けられた各改変チロシン残基を含有するペプチドの分子イオンの生成物イオンスペクトルを記録した。これらのペプチドのクロマトグラムは、該当するＣＩＤスペクトル中で最も大量の生成物イオンへの分子イオンのフラグメント化をプロットすることにより再構築した。適切なペプチドの検出はその保持時間において記録されたＣＩＤスペクトルにより確認した。
【０１１６】
（統計学的分析）
統計学的有意差はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較試験を用いた一元分散分析またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の何れかにより求めた。統計学的有意差はｐ＜０．０５の場合に報告する。
【０１１７】
（実施例４  ａｐｏＡ−Ｉにおけるニトロ化および塩素化の部位のマッピング）
初期の実験は種々の濃度の過酸化水素を用いた酵素改変系（ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−）および種々の濃度のパーオキシニトライトを用いた非酵素系の両方でＨＤＬを処理することにより生産したａｐｏＡ−Ｉにおけるチロシンニトロ化部位を検出することに着目していた。各処理の後、ＨＤＬ中のタンパク質を冷アセトンで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてａｐｏＡ−Ｉバンドをゲルから切り出してトリプシンによるゲル内消化に付した。消化物はイオントラップ質量スペクトル分析システムのデータ依存性モードを用いてキャピラリーカラムＨＰＬＣタンデム質量スペクトル分析により分析した。約２０００のＣＩＤスペクトルが記録され、これらのスペクトルは改変ペプチドのスペクトルについて検索した。検索作業はａｐｏＡ−Ｉのアミノ酸配列に着目し、ニトロ化ペプチドのスペクトルを発見するために＋４５Ｄａのチロシン残基質量差を用いた。これらの分析ではタンパク質配列の９５％に相当するペプチドが検出され、それには成熟ａｐｏＡ−Ｉ配列内のチロシン残基７個全てを含有していたペプチドも含まれていた。ニトロチロシン残基（Ｙ１９２およびＹ１６６）を含有する２ペプチドが過酸化水素濃度＜５０μＭにおいてＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−で処理したＨＤＬ中に検出された。より高い過酸化水素濃度（＞１００μＭ）においては、別のニトロチロシン（Ｙ２９およびＹ２３６）含有ペプチドも検出された。３残余チロシン残基はこれらの分析において検出され配列決定されたペプチドに含有されていたが、試験した如何なる反応条件下においても相当するニトロ化形態は検出されなかった。比較として１００μＭパーオキシニトリルとのＨＤＬの同様の反応では３チロシン残基；Ｙ１６６、Ｙ１８およびＹ２３６におけるａｐｏＡ−Ｉのニトロチロシン改変が生じた。ここでもまた、残余のチロシン残基は未ニトロ化形態においてのみこれらの分析で検出された。
【０１１８】
５ニトロ化ペプチドのＣＩＤスペクトルを図１に示す。各ペプチドに付き該当するＣＩＤスペクトルに記録された生成イオンのシリーズにより同一性が確立される。これらのＣＩＤスペクトルの成分はニトロチロシン部分の特徴的残基質量である（２０８Ｄａ）。全体として、ペプチド分子量測定、ＣＩＤスペクトルにおけるペプチド配列情報および既知ａｐｏＡ−Ｉアミノ酸配列の組合せにより、ニトロチロシン位置の明確な帰属が可能となる。
【０１１９】
その後の実験においてはＨＤＬを改変するための酵素的（ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−）および非酵素的（ＨＯＣｌ）反応の両方による相補タンパク質塩素化系を使用した。塩素化のための４部位、即ちＹ１９２、Ｙ１６６、Ｙ２９およびＹ２３６がこれらの反応の両方において検出された。これらはＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−反応によりニトロ化されたチロシン残基と同様であった。ニトロ化部位で観察されたとおり、Ｙ１９２およびＹ１６６の塩素化は過酸化水素濃度＜５０μＭで検出されたのに対し、Ｙ２９およびＹ２３６の塩素化は＞１００μＭ過酸化水素を必要とした。パーオキシニトライト処理で観察されたＹ１８ニトロ化部位はＭＰＯ−またはＨＯＣｌ−媒介反応の何れによっても塩素化されなかった。図２は４塩素化ペプチドのＣＩＤスペクトルを含む。これらのＣＩＤスペクトルはクロロチロシンの残基質量を含むフラグメント化パターンを特徴とする（より大量の３５Ｃｌ同位体については１９７Ｄａ）。ニトロ化ペプチドについて上記した通り、ペプチド分子量、ＣＩＤスペクトルにおける情報およびａｐｏＡ−Ｉアミノ酸配列の組合せによりクロロチロシン位置の明らかな帰属が可能となる。
【０１２０】
（実施例５．定量的分析による好ましい改変部位の同定）
ａｐｏＡ−Ｉにおけるニトロ化および塩素化部位の包括的な地図を図３に示す。初期マッピング実験の間に行われた１つの観察は種々の改変の潜在的階層構造であり、ＭＰＯ媒介ニトロ化／塩素化部位の２つは、他の２つ、即ちパーオキシニトライトで改変されなかった１ＭＰＯ媒介改変部位およびＭＰＯで改変されなかった１パーオキシニトライト改変部位より先に改変された。その結果、ニトロ化および塩素化の部位の順序を特に決定するために定量的な実験を設計した。
【０１２１】
これらの定量的な実験はトリプシン消化により形成されるそれぞれのチロシン含有ペプチドとして示されるａｐｏＡ−Ｉの種々の領域の消失を追跡するための以前に本発明者らが記載したＮａｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ法を用いた（Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｂ．Ｂ．，Ｒｕｓｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｋｅｉｇｈｔｌｅｙ，Ｊ．Ａ．，Ｂｏｎｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５，２３７０−２３７６，Ｒｕｓｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｂ．，Ｊｉｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｈａａｓ，Ｔ．，Ｋｉｎｔｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｏｎｄ  Ｍ．（２００２）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４，１６５８−１６６４）。ＨＤＬはＭＰＯ媒介反応においてＨ２Ｏ２漸増量、または非酵素的反応においてパーオキシニトライトおよびＨＯＣｌの漸増量でニトロ化または塩素化条件下に処理した。反応は−２０℃のアセトンでタンパク質を沈殿させることにより停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ａｐｏＡ−Ｉバンドを切り出してトリプシン消化に付し、そして消化物はキャピラリーカラムＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ａｐｏＡ−Ｉの個々の部位のＭＰＯ媒介改変の進行は各チロシン含有ペプチドの質量クロマトグラムをプロットし、そして未改変のネイティブの比較参照ペプチドとの相対比較における各々のピーク面積比を計算することによりモニタリングした。図４Ｂおよび５Ｂに示す通り、ａｐｏＡ−Ｉの各部位におけるＨ２Ｏ２の漸増濃度によるＭＰＯ媒介改変の進行は消化物中の各々の未改変ペプチドの回収率低下をもたらす。これらのデータはＹ１９２が好ましいＭＰＯ触媒ニトロ化および塩素化の部位として作用し、それに続くものがＹ１６６およびＹ２９であり、そして酸化剤のより高濃度においてもＹ２３６の改変は極少程度のみであった。酸化的改変の匹敵するパターンもまたＨＯＣｌ反応において観察された。注目すべき点はＨＯＣｌ反応の相対的有効性はＭＰＯ触媒塩素化反応のものよりも有意に低値であった。特にＭＰＯ触媒酸化反応はモル等量のＨＯＣｌと相対比較して検討したＨ２Ｏ２の各濃度においてより高値の改変をもたらした。一方、パーオキシニトライト反応の用量応答特性は改変反応の効率およびＹ１８のニトロ化の明確な優先性およびＹ１９２におけるニトロ化の非存在の両方において異なっていた。
【０１２２】
（実施例６．酸化的に改変されたａｐｏＡ−Ｉの機能的な障害）
図４Ａおよび５ＡはＡＢＣＡ１媒介コレステロール流出特性に対するＨＤＬの改変の用量依存的作用を示す。ＨＤＬはＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−系、パーオキシニトライト、ＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−系またはＨＯＣｌで処理した。次に８Ｂｒ−ｃＡＭＰによる前処理の存在下および非存在下においてコレステロール負荷マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞と共に処理サンプルをインキュベートすることによりコレステロールの流出を測定した。８Ｂｒ−ｃＡＭＰの非存在下においては、ＲＡＷ２６４．７細胞はＡＢＣＡ１のかなりのレベルを発現することはなく、そしてＨＤＬへのＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出を支援するがａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出はない（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｇｒｉｇａｕｘ，Ｃ．，Ｓｈｍｏｏｋｌｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｐｌｕｍｐ，Ａ．Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０６４７−３０６５５，Ｒｅｍａｌｅｙ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｏｎｉｋ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｍｏｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｅ．Ｂ．，Ｂｏｃｈａｒｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｖｉｓｈｎｙａｋｏｖａ，Ｔ．Ｇ．，Ｅｇｇｅｒｍａｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｐ．，Ｄｕｖｅｒｇｅｒ，Ｎ．Ｊ．，Ｓａｎｔａｍａｒｉｎａ−Ｆｏｊｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｈ．Ｂ．，Ｊｒ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８０，８１８−８２３，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．，Ｉｍａｚａｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４９２，３８５−３９４，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｗｅｌｃｈ，Ｃ．，Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ａ．，Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ，Ａ．Ｒ．，Ｔａｂａｓ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｔａｌｌ，Ａ．Ｒ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３５６４−４３５６９）。ＲＡＷ２６４．７細胞の８Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理はＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質を誘導し、ＨＤＬへの約２倍高値のコレステロール流出および脂質非含有ａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出の顕著なレベルを可能にしている（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｇｒｉｇａｕｘ，Ｃ．，Ｓｈｍｏｏｋｌｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｐｌｕｍｐ，Ａ．Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０６４７−３０６５５，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，１１３５８−１１３６３，Ｒｅｍａｌｅｙ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｏｎｉｋ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｍｏｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｅ．Ｂ．，Ｂｏｃｈａｒｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｖｉｓｈｎｙａｋｏｖａ，Ｔ．Ｇ．，Ｅｇｇｅｒｍａｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｐ．，Ｄｕｖｅｒｇｅｒ，Ｎ．Ｊ．，Ｓａｎｔａｍａｒｉｎａ−Ｆｏｊｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｈ．Ｂ．，Ｊｒ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８０，８１８−８２３，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．，Ｉｍａｚａｔ��，Ｔ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４９２，３８５−３９４）。従って、８Ｂｒ−ｃＡＭＰ前処理の存在または非存在はＡＢＣＡ１依存性および非依存性のコレステロール流出の両方の測定を可能にする。図７Ａおよび８Ａに示す通り、ＭＰＯ媒介のニトロ化および塩素化の反応、および、ＨＯＣｌ処理はＨＤＬへのＡＢＣＡ１非依存性の流出に影響することなくＨＤＬへのＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出の用量依存的な損失をもたらした。全体として、種々の改変反応による機能的障害に関する効率の順位付けはＭＰＯ媒介塩素化＞ＨＯＣｌ塩素化＞ＭＰＯ媒介ニトロ化＞＞パーオキシニトライトニトロ化であった。
【０１２３】
Ｈ２Ｏ２のみにより処理されたＨＤＬの対照反応はＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出の低下を示さず、ＭＰＯ触媒パーオキシダーゼ反応の重大な性質を示した。同じチロシン残基もまた改変され、そして、完全ＭＰＯ媒介改変系により処理した脂質非含有ａｐｏＡ−Ｉを用いた対照試験で低減されたＡＢＣＡ１依存性コレステロール流出の同じパターンが観察された（データ示さず）。これらの結果は脂質の改変ではなくタンパク質の改変と合致しており、流出活性の損失の原因である。
【０１２４】
ａｐｏＡ−Ｉの脂質結合特性に対するＭＰＯ媒介改変の作用もまた試験した。これらの実験はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）で処理したＬＤＬの凝集を抑制するａｐｏＡ−Ｉの能力をモニタリングすることによりａｐｏＡ−Ｉの脂質結合活性を測定している。ａｐｏＡ−Ｉの抑制はａｐｏＡ−Ｉ媒介コレステロール流出における初期工程である脂質結合過程を介した改変疎水性ＬＤＬをコーティングするその能力によるものである。図６に示す通り、ＰＬＣで処理したＬＤＬは未改変のａｐｏＡ−Ｉまたは過酸化水素単独で前処理したａｐｏＡ−Ｉの脂質結合活性により有意に低減された時間依存性凝集をもたらしている（図９Ａ）。ＭＰＯ媒介のニトロ化および塩素化の系（それぞれＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／ＮＯ２−およびＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／Ｃｌ−）によるａｐｏＡ−Ｉの前処理はこの還元を有意に抑制し、ニトロ化反応は１０％抑制をもたらし、塩素化反応は３５％抑制をもたらした。同一の改変または対照のａｐｏＡ−Ｉの製剤をＡＢＣＡ１依存性脂質流出レセプター活性に関して試験し、そして、ａｐｏＡ−Ｉの脂質結合活性の低下はＡＢＣＡ１依存性流出レセプター活性の観察された損失と直接相関していた（図９Ｂ）。
【０１２５】
（実施例７．インビボで観察される特異的ａｐｏＡ−Ｉ改変部位）
上記したＭＰＯによるインビトロで改変されたａｐｏＡ−ＩのＬＣタンデムＭＳ試験ではインビボの評価のための一連の改変部位が得られた。図７はヒトアテローム組織から単離したａｐｏＡ−ＩのＬＣタンデムＭＣ分析から得られたＳＲＭクロマトグラムのシリーズを示す。２つの一次ニトロ化部位Ｙ１９２およびＹ１６６においてニトロ化を含有するペプチドの溶離は、それぞれ図７Ａおよび７Ｃのクロマトグラムに示す通りである。これらの保持時間において記録されたＣＩＤスペクトル（それぞれ図１０Ｂおよび１０Ｄ）はこれらのニトロ化ペプチドの正確な同一性の明確な証明を与えている。未改変ペプチドと相対比較した場合のニトロ化されたペプチドの量は各クロマトグラフィーピーク面積を積分することによりＹ１９２含有ペプチドで９％、そしてＹ１６６含有ペプチドで０．２％と推定できる。これらの数値はニトロ化対未ニトロ化のペプチドの相対的ＬＣ−ＭＳ応答が測定されていないため、推定値とみなすべきである。インビトロの実験を介して同定された二次ニトロ化部位をターゲティングする同様の実験ではニトロ化された形態においてＹ２９およびＹ２３６含有ペプチドを検出することができなかった（データ示さず）。これらのニトロ化ペプチドを検出することが不可能であったことは、これらの部位のＭＰＯ媒介ニトロ化の比較的不良な効率と合致している。
【０１２６】
本発明者らは部位特異的塩素化ペプチドの存在を確認する試みを行った。Ｙ１９２位に塩素化を含有するペプチドは、この部位がインビトロモデルにおける塩素化の好ましい部位として同定されたにもかかわらず、検出されなかった（データ示さず）。Ｙ１６６位において塩素化を含有するペプチドは、ＣＩＤスペクトル（下パネル図７Ｄ）がＹ１６６の塩素化およびＹ１６６の酸化を含有するペプチドイオンが重複したスペクトルを示し、トリヒドロキシフェニルアラニンを示しているにも関わらず、検出されなかった（下パネル図７Ｂ）。この酸化ペプチドは相当する塩素化物質種より２Ｄａ小さい分子量を有する。しかしながら二重に荷電したイオンであるため、塩素化および酸化のペプチドは質量スペクトル分析器のｍ／ｚスケールにおいては１Ｄａの差となる。このｍ／ｚ差はイオントラップ検出器の質量分析の第１段階の２Ｄａ許容度のウインドウにおいては識別不可能である。得られた単一荷電のフラグメントイオンは２Ｄａ差が有り、ＣＩＤスペクトルにおいて識別可能である。
【図１】
2011002460.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図６】
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