(57)【要約】      （修正有）【解決手段】抗原と抗体との親和性の測定において、抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞を用いるとともに、B/F分離を遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行う事を特徴とする、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法、および、その測定方法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体をアッセイまたはスクリーニングする方法を提供する。【効果】蛍光色素で標識した２次抗体を用いた簡便なアッセイ方法によれば、細胞膜表面抗原とそれに対する抗体との結合親和性を高感度で測定でき、抗体や医薬品等の研究開発および製造の分野において利用ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）該抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞に被測定抗体を結合させ、（ｂ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、（ｃ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を結合させ、（ｄ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、（ｅ）該物質の標識を検出することを含む、被測定抗体と細胞膜表面抗原との結合親和性を測定する方法であって、（ｂ）及び（ｄ）の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
（ｂ）及び（ｄ）の分離を、遠心分離により行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）及び（ｄ）の分離を、細胞を通さないフィルターにより行う請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞が正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作された動物細胞株である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をアッセイする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体や接着分子などの細胞膜上に発現する分子は、不溶性の膜貫通部分を有するため分子全体を培養細胞から分離精製するかまたは細胞外ドメインを遺伝子組換により調製するのが一般的である(非特許文献１)。
【０００３】
しかしながら、受容体や接着分子はその性状や発現様式により、その抗原としての調製が必ずしも容易ではないものがある。例えば、細胞膜抗原分子は、単量体ではなく複合体を形成することが多く、また他の膜分子と連携してその機能をはたす事例が多数報告されている。例えば、CD3/TCR、CD11a/CD18、CD49b/CD29などである。従って、ナチュラルな状態で提示される抗原のエピトープや立体構造を認識するモノクローナル抗体を作製するためには、大腸菌や酵母を宿主とした遺伝子組換で調製された分子を抗原として用いる方法では適当ではないかも知れない。また、こうした細胞膜抗原には膜貫通部分ばかりでなく細胞外ドメインも不溶性または可溶化し難いものがあり、その立体構造は動物細胞の細胞膜表面にあってはじめてナチュラルな状態と同様に提示されるかも知れない。例えば、CD20, FcεRIやMDR1がこれらに該当すると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Francois Baneyx (Editor), Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, BIOS Scientific Publishers, April 1, 2004. ; Barry Steven Selinsky (Editor), Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Characterization., Methods in Molecular Biology, V.228, Clifton, N.J., June 1, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法、および、その測定方法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ねたところ、蛍光色素で標識した２次抗体を用いた簡便なアッセイ方法によれば、細胞膜表面抗原とそれに対する抗体との結合親和性を高感度で測定できることが判明した。本発明は、これらの知見に基づき、完成されたものである。
【０００７】
本発明は、以下のものに関する。
（１）（ａ）該抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞に被測定抗体を結合させ、（ｂ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、（ｃ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を結合させ、（ｄ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、（ｅ）該物質の標識を検出することを含む、被測定抗体と細胞膜表面抗原との結合親和性を測定する方法であって、（ｂ）及び（ｄ）の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行うことを特徴とする方法。
（２）（ｂ）及び（ｄ）の分離を、遠心分離により行う（１）に記載の方法。
（３）（ｂ）及び（ｄ）の分離を、細胞を通さないフィルターにより行う（１）に記載の方法。
（４）細胞が正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作された動物細胞株である（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれか1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をアッセイする方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の測定法によれば、細胞膜表面抗原に対する抗体の親和性を高感度で測定でき、また、これを利用して抗体をアッセイまたはスクリーニングする方法も提供される。本発明の測定法は、特に、一般的な方法では結合親和性測定が困難である細胞膜表面抗原またはその細胞外ドメインのナチュラルなエピトープに対して結合するモノクローナル抗体の親和性の測定に適している。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】イメージアナライザーによる測定結果（中間調画像の写真）を示す。
【図２】飽和曲線を示す。（X軸：添加抗体量(ng)、Y軸：蛍光強度）
【図３】スキャッチャード解析結果を示す。（X軸：結合量nM、Y軸：結合量 / 遊離量）
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の親和性測定法
本発明の親和性測定法は、（ａ）該抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞に被測定抗体を結合させ、（ｂ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、（ｃ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を結合させ、（ｄ）該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、（ｅ）該物質の標識を検出することを含む、被測定抗体と細胞膜表面抗原との結合親和性を測定する方法であって、（ｂ）及び（ｄ）の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行うことを特徴とする。
【００１１】
本発明の親和性測定法は、抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞を用いること、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を用いること、結合したものと遊離のものの分離（B/F分離）を遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行うことの他は、通常の、抗原と抗体との親和性を測定する方法と同様でよいが、浮遊細胞の量は、この測定系において１チューブ当たり5×105個前後にすることが好ましい。また、抗体を直接RI標識せずに、二次抗体を用いて測定することが可能である。
【００１２】
たとえば、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質としては、被測定抗体に対する抗体（たとえば、Fc部位に対する抗体）、プロテインAやプロテインGなどが挙げられる。標識としては、蛍光物質、磁気ビーズなどが挙げられる。
【００１３】
本発明の親和性測定法においては、分離方法が同じであることが好ましい。
【００１４】
用いる細胞は、標的とする抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞である限り、特に限定されないが、正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作された動物細胞株であることが好ましい。
【００１５】
具体的な手順の例としては、次のものが挙げられる。（１）浮遊細胞とマウスモノクローナル抗体（一次抗体）を反応後、（２）遊離（フリー）の一次抗体を洗浄および遠心により除去し、（３）蛍光標識された抗マウス二次抗体を反応させ、（４）洗浄および遠心により遊離の二次抗体を除去し、その後（５）細胞に一次抗体を介して結合した二次抗体の蛍光量を蛍光イメージアナライザーで測定する。さらに（６）用いた蛍光標識二次抗体について濃度と蛍光量を測定することで検量線を作成し、測定値を濃度に換算することで結合した二次抗体量を求め、添加抗体量から結合量を引くことで遊離の抗体量を算出する。
【００１６】
より具体的な手順の例としては、以下に記載するステップよりなる方法が挙げられる。
１）細胞膜上の抗原発現量が多い細胞または細胞株を選択し、充分な細胞数が得られるまで培養する。
２）遠心により該細胞を回収し洗浄する。
３）被検モノクローナル抗体又は陽性コントロール抗体を含む溶液中に細胞を懸濁する。
４）一定時間振とう反応させた後、遠心して細胞を回収し、すばやく洗浄する。
５）回収した細胞を蛍光標識二次抗体を含む溶液中に懸濁する。
６）一定時間振とう反応させた後、遠心して細胞を回収し、洗浄する。
７）細胞を再度懸濁して９６ウエルプレートのウエルに移し、蛍光強度をイメージアナライザーで検出する。
８）検出後、結合した抗体量とフリーの抗体量を画像から数値化し、スキャッチャ−ド・プロットから解離定数（Kd値）を求める。
【００１７】
本方法においては、細胞をホルムアルデヒドなどの架橋剤で固定せずに用いるため、細胞表面上の立体構造を維持したままの標的とする細胞膜表面抗原とモノクローナル抗体との親和性を測定することが可能である。
【００１８】
本発明の親和性測定法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をアッセイしたり、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をスクリーニングしたりすることができる。アッセイ及びスクリーニングの方法は、親和性測定法として本発明の親和性測定法を利用する他は、通常の、親和性測定方法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をアッセイする方法、及び、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法と同様でよい。
【００１９】
親和性測定において、浮遊細胞を用いることにより感度が上昇する理由としては、固定化すると固相表面の面積により細胞量が限定される一方、浮遊細胞では細胞数を多くすることができるためと考えられる。また浮遊状態での細胞には表面全体の抗原に抗体が結合可能であるのに対し、固定化すると抗体が結合可能な細胞表面積が減少することも理由の一つである。加えて、細胞を架橋して固相化する場合には、固相化に伴いエピトープが消滅したり、その立体構造が変化したりする可能性があり、ナチュラルな状態の抗原に対する親和性が測定できなかったり、親和性が低く評価される恐れがあるが、本発明の親和性測定法においてはこのような恐れがない。
【実施例１】
【００２０】
結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現しているヒトB細胞株由来の浮遊細胞Raji及び、CD20抗原を発現していない細胞としてヒトT細胞株由来の浮遊細胞Jurkatを用いた。共にRPMI1640（ナカライ、Cat.No.30264-85、Lot L4K2844）に10%ウシ胎仔血清FCS(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04-001-1A、Lot 815242、補体成分を非働化するためあらかじめ５６度30分加温したもの) を添加した培地で37度CO2濃度5%のCO2インキュベーター (SANYO MCO-175M)で培養、週2回の継代により維持した。
【００２１】
細胞数の測定は、Burker-Turk血球計算盤(ヱルマ販売(株)Cat.No.03-303-1)を用いて行った。
【００２２】
継代後3〜4日目のコンフルエントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機LX-120 (TOMY)で室温、3000r.p.m.で3分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用いた回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条件である。細胞の表面に残った培地及びFCSを除くため（洗浄）、回収した細胞をDulbecco’s Phosphate Buffered Saline(-) without Ca and Mg [PBS(-) 、（NaCl：Wako、Cat.No.191-01665、Na2HPO4：Wako、Cat.No.197-02865、Lot ASF2635、KCl：Wako、Cat.No.163-0334T、Lot CEQ7122 、KH2PO4：Wako、Cat.No.169-0425、Lot ELG7616]で懸濁後、3000 r.p.m.で3分間遠心して上清を除く操作を２回行った。洗浄を終えた細胞を1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483 )-PBS溶液で懸濁し、細胞密度を5x106個/mlに調整した。
【００２３】
一次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体(2B8)  15, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200 ng  (1.5〜5μl)を各々、1.5mlチューブ（ビーエム機器、BMリングロックチューブ Cat.No.BM-15）に分注し、同時に抗体を入れないチューブも4本用意した。また、各々の試験抗体あたり3点のサンプルを準備した。そこに、1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483 )-PBS溶液で懸濁液を100μl（細胞数5x105個）ずつ加えて混和し、室温で１時間振とう反応させた。
【００２４】
反応後、微量高速冷却遠心機MX-100（TOMY）で室温、3000 r.p.m.３分間遠心分離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため200μlのPBSで懸濁し、3000 r.p.m.で３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
【００２５】
次に細胞に結合した一次抗体を検出するため、細胞と結合した一次抗体に対して過剰量（500ng）のFITC標識抗マウスIgG (H&L)二次抗体 〔GOAT Anti-mouse IgG(H&L) Fluorescein conjugated,  affinity purified Secondary antibody、Chemicon、Cat.No.AP124F、 Lot 24021014〕 1% BSA-PBS溶液100μl（500ng/100μl） を上記細胞に添加・懸濁し、遮光、室温のもと１時間振とう反応した。反応後、3000 r.p.m.で3分間遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応のFITC標識抗マウスIgG (H&L)抗体を除くため、200μlのPBSで懸濁し3000 r.p.m.で3分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
【００２６】
こうして得た細胞を100μl PBSで懸濁し、96ウエル平底プレート（住友ベークライトELISA PLATE Cat.No.8496F）へ移した。二次抗体の蛍光量をTyphoon9210イメージアナライザー(Amersham Bioscience)を用いて、Fluorescense mode,  600v,  526SP/green(532nm)、Focus底面+3mmの検出条件で測定した。この際、FITC標識二次抗体を0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng添加したPBS溶液100μlを検量線作成用のコントロールとして用いた。
【００２７】
検出後、画像を画像解析ソフトImage Quant （Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、ＰＢＳ溶液、および細胞に非特異的に結合したFITC標識二次抗体に由来するバックグラウンド値として、細胞とFITC標識二次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その４点の平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合したFITC標識二次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度のFITC標識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している二次抗体の量（モル数または重量）を求めた。各一次抗体とFITC標識二次抗体が１：２の割合で反応していると仮定し、結合している一次抗体量を算出した。また遊離の一次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する際、モノクローナル抗体の分子量を150000とした。
【００２８】
添加する一次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達することを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数（Kd値）を算出するため、スキャッチャード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生物学研究のための新培養細胞実験法；羊土社、実験医学別冊バイオマニュアルUPシリーズ改訂第２版、212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて3点の値の平均値を用いた。
【００２９】
試験抗体：リガンド（L）と細胞表面抗原：レセプター（R）の結合はリガンド・レセプター複合体（LR）と次の反応式で示される。
L+R←→LR
遊離リガンド濃度〔L〕、非結合型レセプター濃度〔R〕、レセプターと結合したリガンド濃度〔LR〕として、平衡下での解離定数Kdは
Kd = 〔L〕〔R〕/ 〔LR〕  ・・・・I
用いるリガンドの全量〔L total〕は遊離型とレセプターに結合したものとの和になる。
〔L total〕=  〔L〕＋〔LR〕・・・・II
一方、レセプターも総量〔R total〕はリガンドに結合していないものと結合したものとの和になる。
〔R total〕=  〔R〕＋〔LR〕・・・・III
このレセプターの数〔R total〕（試験抗体の最大結合量）とレセプターとリガンドとの親和性をScatchard解析で推定する。上記I,II,IIIの式を変形、代入すると、
〔LR〕/〔L〕 = - 1/Kd〔LR〕 + 〔R total〕/ Kd
〔LR〕をB (bound) 、〔L〕をF (free)  で表し、〔R total〕をB max（定数）で示すと
B / F = - 1 / Kd B + Bmax / Kd
が得られる。この式はB/Fをｙ軸にBをx軸にとる一次関数となる。直線の傾きからKd値を得、y切片からBmaxを得ることができる。Kd値は濃度の次元をもち、低い値ほど高い親和性を示す。（結合定数Ka = 1/ Kd）
【００３０】
＜結果＞
陽性コントロール（2B8）、試験抗体A及び試験抗体Bを用いて親和性測定を行った場合の、イメージアナライザー画像を図１に、飽和曲線を図２に、スキャッチャード（Scatchard）解析の結果を図３に示す。また、上記スキャッチャード解析より得られた一次関数の傾きより、解離定数 (Kd値) を求めた。同様の実験を繰り返し行い、得られたKd値（平均）は以下のとおりであった。
【００３１】
【表１】
2011090008.tif 000002
【００３２】
陽性コントロールとして用いた抗体2Ｂ8について得られたKd値は6.8nMであった。Mitchell ER et al., Blood 1994; 82:435-445に報告されている2Ｂ8のKd値は3.5nMであるので、近似したKd値が本発明の親和性測定法でも得られた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、抗体や医薬品等の研究開発および製造の分野において利用可能である。
【図１】
2011090008.tif 000003
【図２】
2011090008.tif 000004
【図３】
2011090008.tif 000005