(57)【要約】【課題】遺伝子情報よりリコンビナントＥｒｏ１を取得し、Ｅｒｏ１によるＰＤＩの再生がもたらすグルテン形成ならびに製パン性向上作用を応用した小麦加工製品の製造技術を提供することを目的とする。【解決手段】配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（ｒＥｒｏ１）と、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と、を主成分とする、小麦加工製品の改質剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（ｒＥｒｏ１）と、
プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）と、
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と、
を主成分とする、小麦加工製品の改質剤。
【請求項２】
前記プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）が、配列番号：２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ｒＰＤＩ）である、請求項１に記載の小麦加工製品の改質剤。
【請求項３】
前記小麦加工製品が、パン類である、請求項１又は２に記載の小麦加工製品の改質剤。
【請求項４】
配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（ｒＥｒｏ１）と、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と、を主成分とする小麦加工製品の改質剤を小麦粉に添加して生地を形成する、小麦加工製品の製造方法。
【請求項５】
前記プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）が、配列番号：２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ｒＰＤＩ）である、請求項４に記載の小麦加工製品の製造方法。
【請求項６】
前記小麦加工製品が、パン類である、請求項４又は５に記載の小麦加工製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小麦加工製品の改質剤及び小麦加工製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小麦粉は水を加えて練ることで他の穀類には見られない独特の粘弾性を示す生地を形成することから、パンや麺、菓子など様々な食品に加工されている。この生地独特の物性は小麦特有の貯蔵タンパク質であるグリアジンとグルテニンが水和することで形成するグルテンの性質によるもので、その性質は小麦粉中のこれらタンパク質の量によって左右されるといわれている。
【０００３】
グルテンの形成には様々な結合や分子間相互作用が関与すると考えられるが、特にジスルフィド結合（ＳＳ結合）によるタンパク質分子間の架橋形成が最も重要であるとされている。ＳＳ結合が生地混捏時のような非加熱条件で形成するためには何らかの酸化機構の存在が推定される。本発明者らの一連の研究で、小麦粉生地形成にＳＳ結合形成を触媒する酵素であるプロテインジスルフィドイソメラーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ：以下「ＰＤＩ」という。）の関与が示唆されている。
【０００４】
しかしながら、ＰＤＩは小麦の開花時に活性のピークを迎えた後は活性が低くなり、小麦種子中には微量にしか存在しない。また、小麦からＰＤＩを抽出する工程も複雑であることに加え、それ自体不安定で容易に失活することから、ＰＤＩを取得するためには多大なコストと時間を要していた。
【０００５】
このような問題を解決するために、例えば、国際公開ＷＯ９８／３５０４９号公報には、酵母由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子で酵母を形質転換し、形質転換した宿主細胞を培地のｐＨを中性近傍に保ちながら培養することにより、宿主細胞外へプロテインジスルフィドイソメラーゼを活性な状態で分泌させる、酵母ＰＤＩの製造方法が提案されている（特許文献１）。
【０００６】
酸化型のＰＤＩはタンパク質にＳＳ結合を形成させ、グルテンの物性発現に関与すると考えられるが、この触媒反応によって自らは還元型ＰＤＩとなる。小麦粉生地中においてＳＳ結合の形成が滞りなく進行するためには、還元型ＰＤＩを酸化型ＰＤＩへと再生する必要がある。この再生に関与する酵素として、エンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ１：以下「Ｅｒｏ１」という。）が知られているが、Ｅｒｏ１についてはこれまでにヒトや酵母等での報告はみられるものの、高等植物においてはイネのみであり小麦でのＥｒｏ１の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９８／３５０４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、小麦粉生地形成および製パン性に対する小麦ＰＤＩの作用性を解析するため、遺伝子情報よりリコンビナントＥｒｏ１（以下「ｒＥｒｏ１」という。）を取得し、ｒＥｒｏ１によるＰＤＩの再生がもたらすグルテン形成向上作用を応用した小麦加工製品の製造技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はかかる知見に基づくものであり、配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ１：ｒＥｒｏ１）と、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と、を主成分とする、小麦加工製品の改質剤を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（ｒＥｒｏ１）と、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と、を主成分とする小麦加工製品の改質剤を小麦粉に添加して生地を形成する、小麦加工製品の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の小麦加工製品の改質剤及び小麦加工製品の製造方法によれば、小麦粉生地中においてＳＳ結合形成量を増加させることができるため、グルテン形成量の増加によって品質が向上する小麦加工製品の品質を向上することができる。また、グルテン形成量が少なく、これまで小麦加工製品の小麦として適切ではない小粉を使用する場合等であっても好適な小麦粉に改質することができるため、小麦粉の適用範囲を広げることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ジスルフィド結合（ＳＳ結合）によるタンパク質分子間の架橋形成とそれに関与する触媒反応を説明するための図である。
【図２】リコンビナント小麦Ｅｒｏ１を取得する工程の概略を示すフローチャートである。
【図３】全長ｒＥｒｏ１発現タンパク質の不溶化を示す電気泳動パターンである。
【図４】形質転換体のカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図５】図４の未吸着画分、１０ｍＭイミダゾール画分及び５０ｍＭイミダゾール画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンである。
【図６】ＦＡＤの退色によりｒＥｒｏ１の活性を検討した結果を示す図である。
【図７】Ｏ２の濃度変化によりｒＥｒｏ１の活性を検討した結果を示す図である。
【図８】パンの製造方法及び試験の順序を示す図である。
【図９】焼成後のパンの比容積を比較した結果を示す図である。
【図１０】焼成後のパンの官能評価の結果を示す図である。
【図１１】ＰＤＩおよびｒＥｒｏ１による小麦タンパク質中のＳＳ結合形成能を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の小麦加工製品の改質剤及び小麦加工製品の製造方法の好ましい実施形態について説明する。本発明において、「小麦加工製品」とは、小麦粉を主成分とする食品をいい、例えば、食パン、菓子パン、イーストドーナツなどのパン類；中華麺、うどん、そば、パスタなどの麺類；饅頭、麩饅頭、中華饅頭などの菓子類；餃子、シュウマイ、春巻の皮などの皮類、その他：お麩、竹輪麩等を挙げることができる。
【００１４】
図１は、ジスルフィド結合（ＳＳ結合）によるタンパク質分子間の架橋形成とそれに関与する触媒反応を説明するための図である。
【００１５】
小麦加工製品の基質となる小麦タンパク質は、生地混捏時にＳＨ基が架橋してＳＳ結合することによってグルテンを形成する。その際、酸化型ＰＤＩが基質のＳＨ基を酸化しＳＳ結合を形成させ、自身は還元型ＰＤＩとなる。しかし、それだけではＰＤＩの反応が一方的になり、やがて酸化型ＰＤＩの量が少なくなると、酸化型ＰＤＩを追加しない限りＳＳ結合は進行しなくなる。
【００１６】
そこでこの還元型ＰＤＩを酸化し、酸化型ＰＤＩに再生する反応を触媒するＥｒｏ１が必要となる。Ｅｒｏ１は酸化型Ｅｒｏ１が還元型ＰＤＩを酸化し、還元型Ｅｒｏ１となる。これにより酸化型ＰＤＩが再びＳＳ結合を触媒することができる。一方、還元型Ｅｒｏ１はＦＡＤと反応し酸化型Ｅｒｏ１となり、ＦＡＤはＦＡＤＨ２に変化する。但し、ＦＡＤＨ２はＯ２と反応することでＦＡＤに再生することができる。
【００１７】
本実施形態の小麦加工製品の改質剤に使用されるエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ１：Ｅｒｏ１）は、配列番号：１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたリコンビナントエンドプラズミックレティキュラムオキシドレダクターゼ１（ｒＥｒｏ１）である。
【００１８】
ｒＥｒｏ１は、天然のＥｒｏ１のＮ末端側に存在し、小胞体の膜に付着するための疎水性の高い膜貫通領域を欠落したものであり、図１におけるＥｒｏ１と同様、ＰＤＩの酸化還元反応を触媒する役割を有する。なお、本実施形態においては、この膜貫通領域が存在した塩基配列を使用して形質転換を行っても、可溶性画分へｒＥｒｏ１を得ることができない（図３）。
【００１９】
本実施形態の小麦加工製品の改質剤に使用されるＰＤＩは、小麦などの天然物から抽出したＰＤＩを使用しても、ｒＰＤＩを使用してもよい。ｒＰＤＩは、例えば、配列番号：２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドで形質転換した形質転換細胞から産生されたｒＰＤＩを使用することができる。得られたｒＰＤＩは２００〜６３２Ｕ／タンパク質１ｍｇものＰＤＩ活性を有し、温度安定性及びｐＨ安定性が小麦由来の天然ＰＤＩよりも優れているので好ましい。
【００２０】
本実施形態の小麦加工製品の改質剤に使用されるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）は、補酵素型のビタミンＢ２であり、ｒＥｒｏ１の酸化還元反応の際の水素の授受に関与する。
【００２１】
本実施形態の小麦加工製品の製造方法は、上述した改質剤を小麦粉に添加して生地を形成するものである。
【００２２】
前記改質剤を小麦粉に添加して生地を形成することにより、生地中のジスルフィド結合の形成が促進され、例えばパンにおいては比容積が増加し柔らかい口当たりのパンを製造することができる。
【００２３】
本実施形態の小麦加工製品の製造方法においては、前記ｒＥｒｏ１の添加量は、小麦加工製品の生地におけるＰＤＩとの会合性を考慮すれば、前記ＰＤＩのモル比の２〜２０倍量であることが好ましい。ｒＥｒｏ１の添加量は多ければ多いほどＰＤＩとの会合性もより高くなると考えられるが、実際に小麦加工製品を製造した結果では、ＰＤＩのモル比の１０倍量のｒＥｒｏ１を添加すれば十分本発明の効果を得ることができる。
【実施例】
【００２４】
１．小麦ｒＰＤＩおよび小麦ｒＥｒｏ１の発現と取得
（１）小麦ｒＰＤＩ
小麦ｒＰＤＩの発現は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）より、小麦ＰＤＩ遺伝子情報を検索取得し、２種の小麦ＰＤＩ遺伝子情報をＢｉｏ−Ｅｄｉｔ上でアライメントした。アライメント後、配列番号：２で表わされる塩基配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域の３’末端側および５’末端側の外側でプライマーを作製し、小麦根より抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写し得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＤＩのＯＲＦをＰＣＲにて増幅後、発現ベクターｐＥＴ２１ａに挿入し、発現宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質として発現させた。次に、菌体を超音波処理にて破砕、ｒＰＤＩを抽出後、コバルトカラムにて精製した。
【００２５】
（２）小麦ｒＥｒｏ１
図２はリコンビナント小麦Ｅｒｏ１を取得する工程の概略を示すフローチャートである。小麦Ｅｒｏ１の発現は、小麦Ｅｒｏ１の塩基配列の報告がないことから、ＤＤＢＪよりヒトおよび酵母Ｅｒｏ１の遺伝子情報を検索取得し、Ｂｉｏ−Ｅｄｉｔ上でアライメントした。アライメント後、共通配列からプライマーを作製し、３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥにより小麦Ｅｒｏ１の両末端の配列を明らかにした。さらに、小麦Ｅｒｏ１のＯＲＦ領域の３’末端側および５’末端側の外側でプライマーを作製し、小麦根より抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写し得られたｃＤＮＡを鋳型としてＥｒｏ１のＯＲＦをＰＣＲにて増幅後、発現ベクターｐＥＴ２１ａに挿入し、発現宿主大腸菌ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに形質転換し、ｒＰＤＩと同様に発現・精製した。しかしながら、得られた全長ｒＥｒｏ１は、可溶性画分への発現がみられなかった（図３）。そこで、Ｎ末端側に存在する疎水性の高い膜貫通領域を欠落させ、配列番号：１で表わされる塩基配列を作成した。そして、上記と同様の操作で配列番号：１で表わされる塩基配列を発現させることにより、可溶性画分へ４９ｋＤａのｒＥｒｏ１が発現し取得に成功した（図４及び図５参照）。
【００２６】
ｒＥｒｏ１の活性は、Ｅｒｏ１の補酵素であるＦＡＤの還元による退色を経時的に測定し、また生成したＦＡＤＨ２とＯ２が反応しＨ２Ｏ２になる際のＯ２の濃度減少を測定することにより確認した。ＦＡＤの退色の結果を図６に示し、Ｏ２の濃度変化の結果を図７に示す。
【００２７】
図６に示すように、ｒＥｒｏ１の活性確認は、Ｅｒｏ１がフラビン還元酵素であることから、ＤＴＴにて還元型ｒＥｒｏ１としＦＡＤに作用させ、ＦＡＤＨ２へと還元されることに伴う黄色の退色を測定し、活性を有していることを確認した。また、図７に示すように、生成したＦＡＤＨ２がＯ２へ電子を供与しＨ２Ｏ２へ変換されることに伴うＯ２消費量を測定し、ｒＥｒｏ１濃度依存的にＯ２消費速度が増加することも確認した。
【００２８】
２．製パン性に及ぼすｒＰＤＩおよびｒＥｒｏ１の影響
ｒＰＤＩおよびｒＥｒｏ１添加による製パン性への影響を解析するため、パン用小麦粉に比べ製パン性が低い中力粉（日清製粉社の「雀」（商品名））を試料に用い、ｒＰＤＩ、ｒＥｒｏ１及びＦＡＤ添加による製パン試験を行った。なお、参考例として、中力粉を使用し、本発明の改質剤を添加しないパンと、強力粉（日清製粉社の「カメリア」（商品名））を使用し、本発明の改質剤を添加しないパンについても製造した。このとき、参考例１の純水の添加量は１３７ｍｌとした。
【００２９】
図８にパンの製造方法及び試験の順序を示す。ｒＰＤＩは５０Ｕ／小麦粉２００ｇ（０．２５Ｕ／小麦粉１ｇ）または５００Ｕ／小麦粉２００ｇ（２．５Ｕ／小麦粉１ｇ）、約４．３ｎｍｏｌ／小麦粉２００ｇ（０．０２２ｎｍｏｌ／小麦粉１ｇ）、タンパク質として２４３μｇ／小麦粉２００ｇ相当を添加した。なお、ｒＰＤＩは比活性２０５．４Ｕ／ｍｇ、分子量５６６００で計算した。
【００３０】
ｒＥｒｏ１はｒＰＤＩと同モルまたは、モル比で１０倍量を、約４．３ｎｍｏｌ／小麦粉２００ｇまたは４３ｎｍｏｌ小麦粉２００ｇ（０．０２２ｎｍｏｌもしくは０．２２ｎｍｏｌ）／小麦粉１ｇ）、タンパク質として２０８．６μｇもしくは２０８６μｇ／小麦粉２００ｇ相当を添加した。なお、ｒＥｒｏ１は分子量４８５００で計算した。
【００３１】
ＦＡＤは５μｍｏｌ／小麦粉２００ｇ（０．０２５Ｕ／小麦粉１ｇ）を添加した。これは生地中におけるｒＥｒｏ１との会合性を考慮し、過剰量のＦＡＤを添加したものである。
【００３２】
焼成後のパンの比容積を比較した結果を図９に示す。焼成後のパンの比容積は菜種置換法を用いた。菜種置換法とは、一定容量の容器に満杯に詰めた菜種の体積から、同じ容器に試料と菜種を詰めて満杯にしたときの菜種の体積を差引き、試料の体積を求める方法である。
【００３３】
その結果、中力粉で製造したパン（参考例２）の比容積と比較して、ｒＰＤＩ  ５０Ｕ／小麦粉２００ｇに加えｒＥｒｏ１を４．３ｎｍｏｌ（ｒＰＤＩ  ５０Ｕと同じモル比）およびＦＡＤ  ５μｍｏｌを添加したパン（実施例１）は、約２．１％の増加、ｒＰＤＩ  ５０Ｕ／小麦粉２００ｇに加えｒＥｒｏ１を４３．０ｎｍｏｌ（ｒＰＤＩ  ５０Ｕのモル比で１０倍量）およびＦＡＤ  ５μｍｏｌを添加したパン（実施例２）は約７．４％の増加、ｒＰＤＩ  ５００Ｕ／小麦粉２００ｇに加えｒＥｒｏ１を４３．０ｎｍｏｌ（ｒＰＤＩ  ５０Ｕのモル比で１０倍量）およびＦＡＤ  ５μｍｏｌを添加したパン（実施例３）は約５．０％の増加が認められた。
【００３４】
このことから、ｒＰＤＩ、ｒＥｒｏ１およびＦＡＤとの共存によって、還元型ｒＰＤＩの酸化型への再生機構が補完され、小麦粉グルテンのＳＳ結合形成が進行したことが推察された。
【００３５】
１０名の成人健常者をパネラーとして、官能検査を実施した。総合評価以外は、コントロール（参考例２）を３点として主観的に５点評価法にて行い、優れているものに５点、やや優れているものに４点、コントロールと同等を３点、やや劣るものを２点、劣るものを１点とした。総合評価は順位法で行い、１位５点、２位４点、３位３点、４位２点、５位１点として点数化した。
【００３６】
結果を表１及び図１０に示す。表１及び図１０において、「Control」は中力粉で製造したパン（参考例２）を意味し、「比較例１」はｒＰＤＩを５０Ｕ／小麦粉２００ｇ添加して製造したパンを意味し、「比較例２」はｒＰＤＩ  ５０Ｕ／小麦粉２００ｇ及びｒＥｒｏ１を４３．０ｎｍｏｌ（ｒＰＤＩ  ５０Ｕのモル比で１０倍量）を添加して製造したパンを意味する。表１及び図１０に示すように、実施例２のパンは何れの項目も高い評価を得て、良好なパンであることが示された。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
３．小麦ＰＤＩおよびｒＥｒｏ１によるＳＳ結合形成能の解析
ＰＤＩおよびｒＥｒｏ１による小麦タンパク質中のＳＳ結合形成能の解析を行うため、小麦粒（ハルユタカ；北海道産）より調製したＰＤＩ粗酵素液（ＰＤＩ活性５．０Ｕ、タンパク質濃度５．３ｍｇ／ｍｌ、ＰＤＩとして０．２ｎｍｏｌ）へｒＥｒｏ１（２．０ｎｍｏｌ）およびＦＡＤ（２０．０ｎｍｏｌ）を添加し、３７℃、３時間加温後、試験液中のＳＨ量の変化をＮＢＤ−Ｃｌ法にて測定し、ＳＨ基減少量よりＳＳ結合形成量を算出した。
【００３９】
結果を図１１に示す。図１１に示すように、粗酵素液のみでは、ＳＳ結合形成量は０．１６μｍｏｌ／タンパク質ｇであったが、これにｒＥｒｏ１およびＦＡＤを添加すると、ＳＳ結合形成量は１．７μｍｏｌ／タンパク質ｇと約１１倍に増加した。このことから、ＰＤＩとｒＥｒｏ１、ＦＡＤが共存することによって、小麦タンパク質中にＳＳ結合の形成が促進されることが明らかとなった。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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