(57)【要約】【課題】菌数検査などに用いられ、操作性、密閉性に優れる微生物培養シートを提供する。【解決手段】基材シートと前記基材シート上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートとからなり、ヒンジ部を介して開閉自在に前記基材シートと前記カバーシートとが連接された微生物培養シートであって、前記基材シートおよび／またはカバーシートに、これら基材シートとカバーシートの間おいてカバーシートを閉めた状態を維持するためのロック機構が備えられていることで、密閉性がよい微生物培養シートを提供できる。【選択図】図１
2011072279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材シートと前記基材シート上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートとからなり、ヒンジ部を介して開閉自在に前記基材シートと前記カバーシートとが連接された微生物培養シートであって、
前記基材シートおよび／またはカバーシートに、これら基材シートとカバーシートの間おいてカバーシートを閉めた状態を維持するためのロック機構が備えられていることを特徴とする微生物培養シート。
【請求項２】
ロック機構が基材シートおよび／またはカバーシートの切込みによることを特徴とする請求項１記載の微生物培養シート。
【請求項３】
ロック機構が基材シートまたはカバーシートいずれかに設けられた切込みが、切込みが設けられていないもう一方の基材シートまたはカバーフィルムの縁に係止可能に形成されていることを特徴とする請求項２記載の微生物培養シート。
【請求項４】
切込みの形状がヒンジ部方向に対して凸状の図形の切込みであることを特徴とする、請求項３記載の微生物培養シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌数検査などに用いられ、コンパクトかつ扱いが簡便なシート状の微生物培養シートに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の存在を確認し、または微生物数を測定する方法として、寒天平板混釈法があり、予め滅菌したシャーレに形成した寒天培地が使用される。この方法は、寒天培地を高圧蒸気滅菌するためのオートクレーブや、微生物検査を無菌的に行うことのできる検査室が必要であり、微生物のサンプリングから試料液の調整、分注、培地との混釈、培養、計数に至る微生物検査の操作には熟練を要する。そこで、高度の熟練を必要とすることなく簡便に微生物検査を行える微生物培養シートとして、乾燥培地が開発されている。
例えば、支持体の上部表面上に形成された水ベース接着剤組成物層と上記接着剤組成物層に付着されたゲル化剤を含む冷水溶解性粉体と前記冷水溶解性粉体を被覆するカバーシートとからなる培養基装置がある（特許文献１）。カバーシートを剥がし、水性テストサンプルを、冷水溶解性粉体層の上に置くとゲル化剤が素早く水和し、微生物の増殖を維持する再構築培地を形成し、カバーシートを被覆し所定時間インキュベートすると、コロニーを透明なカバーシートを通して計数することができる、という。
【０００３】
また、１個以上の吸水部を有し、前記吸水部以外の部分が撥水性となっている基材と、前記吸水部を密封するフィルムとからなるシート状培養用容器もある（特許文献２）。培地及び吸水性樹脂が塗布されたシート状の基材と、基材側に吸水性樹脂が形成された透明なフィルムとからなり、培地及び吸水性樹脂に微生物を接種し、その上にフィルムを貼り付けることにより培養することができるため、従来のペトリ皿やシャーレと比較して、軽く、嵩張らないという利点がある、という。フィルムを剥がしてすべての吸水部が漬かるように容器を液体培地に浸漬してから引き上げると、吸水部のみに液体培地が吸収され、吸水部以外の撥水性部分には液体培地が付着しないため、独立した培地が容易にかつ確実に得られ、所望の微生物を培地に接種した後にフィルムで吸水部を密封すれば、この状態で微生物の培養を観察することができる。
また、防水性の基材シートと該基材シート上に被せられるカバーシートとを有し、少なくとも基材シート上には培地混合物の層が設けられてなる微生物の微生物培養シートにおいて、前記培地混合物層の上に、接種する被検液の広がりを一定にするための疎水性インキによる外枠層を設けたことを特徴とする微生物培養シートもある（特許文献３）。実施例では、基材シートとして厚さ１００μｍの透明な２軸延伸ポリエステルフィルムを用い、その上に培地混合物層用塗工液をコンマコーターにより乾燥時の塗工量が３０ｇ／ｍ2となるように塗工し、前記培地混合物層の上に、内径５０ｍｍ、外径７０ｍｍのドーナッツ状パターンを、疎水性インキＲＡＭ（セイコーアドバンス社製）でスクリーン印刷して外枠層を形成している。
【０００４】
更に、方形の粘着シート上に円形の多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを積層し、上部に方形の透明フィルムを配設した微生物培養器もある（特許文献４）。多孔質マトリックス層上に試料液を添加すると、試料液が多孔質マトリックス層に保持され、この保持された水によって多孔質マトリックス層に接した水溶性高分子化合物層が溶解し、生じた水溶性高分子化合物水溶液と生育栄養成分によって微生物の生育しうる環境となる。この微生物培養器では、微生物は水溶性高分子化合物層内部までは侵入せず、更に多孔質マトリックス層の表面まで押し上げられるため、多孔質マトリックス層の表面または表面近傍にコロニーが形成され、透明フィルムからなるカバーシートが粘着シートと接着することでシート状微生物培養器として利用でき、軽量で嵩が低く取り扱いを容易にできる。この場合、カバーシートと粘着シートによって微生物が生育する領域の周囲を密封している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許公報３３８３３０４号公報
【特許文献２】特開平７−２８９２３５号公報
【特許文献３】特開平８−２８０３７７号公報
【特許文献４】国際公開 ＷＯ０１／０４４４３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
所望の微生物を培地に接種した後にカバーシートで吸水部を密封する必要が有る。
基材シートがフレキシブルなシート、フィルムから構成されている場合、カバーシートの浮きや弛み、培地が設けられている基材シートのカール等の変形により、カバーシートと基材シート間の密封性が低下し、培地への空気の流入量の変化に由来する観測すべきコロニーの発育に影響を与える可能性を有する。
【０００７】
前述の特許文献４のように粘着シートを用いて密封性を向上させてもよいが、菌の培養開始時において、カバーシートと粘着シートをはがす作業が生じ、作業性を悪くするという問題が生じる。また、菌液を滴下した後カバーシートを被せた後その周囲を扱いて粘着させる必要がある。また、培地の厚みに起因するカバーシートの皺が生じやすく、一度皺の状態でカバーシートを粘着してしまった場合、一度剥がして、再度皺がないように張りなおす必要が生じる。
【０００８】
またその他の従来例において、微生物生育領域の水分を含んだ培地領域とカバーシート濡れにより実質的に密着させている場合もあるものの、培地の水分量の変化やカバーシートや基材シートの変形に対抗するだけの密着強度としては十分でない可能性がある。
【０００９】
よって、培養開始前に、容易に作業者がカバーシートと基材シートが開放され、菌液を滴下した後、カバーシートと基材シートとの間での密封の完了感が得られその後、菌の培養中は密封性が維持できるようにロックできることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を鑑み、操作性よく、簡易に培養に必要な密封性を得られるために詳細に検討した結果、以下の発明を完成させた。
すなわち本発明は、基材シートと前記基材シート上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートとからなり、ヒンジ部を介して開閉自在に前記基材シートと前記カバーシートとが連接された微生物培養シートであって、前記基材シートおよび／またはカバーシートに、これら基材シートとカバーシートの間おいてカバーシートを閉めた状態を維持するためのロック機構が備えられていることを特徴とする微生物培養シートを提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
粘着シートを用いていないので、培養開始前に、作業者が容易にカバーシートと基材シートが開放でき作業性がよい。菌液を滴下した後、カバーシートと基材シートとの間での密封の完了感が得られその後、菌の培養中は密封性が維持できるようにロックが可能となる。
さらに本発明をロック機構が基材シートおよび／またはカバーシートの切込みによる構成とすることによって、粘着シートを用いることに比較して、培養開始前はヒンジ部を介してカバーシートを開放するのみの作業であり作業性もよく、基材シートおよび／またはカバーシートを用いて切り込みによるロック機構を構成することも粘着シートを用いることに比べ別段コストの上昇なく微生物培養シートが提供できる。
ロック機構が基材シートまたはカバーシートいずれかに設けられた切込みが、切込みが設けられていないもう一方の基材シートまたはカバーシートの縁に係止可能に形成されていることで、基材シートまたはカバーシートいずれか切り込み加工を入れるだけでロック機構が構成され、粘着シートを用いることに比べ別段コストの上昇なく微生物培養シートが提供できる。
切り込みの形状がヒンジ部方向に対して凸状の図形の切込みであることで、ロックのし易さ、ロックをした後も外れにくく、ロックの性能高い微生物培養シートが提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】カバーシートを開いた状態での微生物培養シートの斜視図である。
【図２】カバーシートを開いた状態での微生物培養シートの正面図である。
【図３】図２における微生物培養シートのＡ−Ａ線の断面図である。
【図４】ロック機構の一例によりカバーシートと基材シートが閉じた状態で係止されている微生物培養シートの背面図である。
【図５】カバーシートを閉じた状態で、まだ切込みを基材シートの縁に係止していない状態での微生物培養シートの正面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（１）微生物培養シートの構成
本発明の微生物培養シートの好適な態様の一例を図１に示す。図１はカバーシートを開いた状態での斜視図であり、図2はカバーシートを開いた状態での微生物培養シートの正面図である。図３は図２における微生物培養シートのＡ−Ａ線の断面図である。
【００１４】
図１は、方形の基材シート（１０）の略中央に培養層（３０）が形成され、かつ前記培
養層（３０）を被覆するように、方形のカバーシート（４０）が設けられている態様を示
す。またカバーシート（４０）上であって、基材シートとカバーシートを閉じたときに、培養層が形成されている領域をはさんで、ヒンジ部に対向する位置にロック機構である切込み（５０）が設けられている。本態様では基材シート（１０）上に培養層（３０）がパターン形成されており、基材シート（１０）は２層からなる多層シートであってもよく、更に、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、培養層（３０）が２以上の多層で構成されるものであってもよい。
【００１５】
パターン形成で調製された培養層（３０）の形状は、図１に示す円形に限定されるもの
ではなく、正方形、長方形、その他の多角形、不定形であってもよい。この点は、基材シート（１０）の形状も同様である。
【００１６】
本発明の微生物培養シートは、基材シート（１０）上のみに培養層（３０）が設けられていることに限定されず、基材シート（１０）とカバーシート（４０）の双方に設けられてもよく、培養層（３０）とバインダー成分と培地成分や栄養成分その他の成分とを含有する特定成分層（図示せず、以下同様）とが、それぞれ対向して当接するように形成されていてもよい。
例えば、培養層（３０）と、前記特定成分層との双方にゲル化剤が含まれている場合には、基材シートの上の培養層（３０）と、カバーシート（４０）に設けられた特定成分層とが対向して配設させることで、基材シート（１０）の上の培養層（３０）に被検液を接種した後にカバーシート（４０）で培養層（３０）を被覆すると、前記被検液が培養層（３０）と特定成分層とに吸水され、培養層（３０）と特定成分層との双方で微生物を観察することができる。また、培養層（３０）を構成する培地基材は、ゲル化によって培養層（３０）が粘着性を発揮してカバーシート（４０）に密着するため粘着シートなどを形成することなく、カバーシート（４０）を基材シート（１０）側に固着することができる。これにより、培養層（３０）の乾燥を防止することができる。また、特定成分層に発色指示薬を含む場合、カバーシート（４０）上の特定成分層内で微生物によって指示薬が発色することで、カバーシート（４０）側からの微生物の検出を容易にすることができる。
また本発明の微生物培養シートは、図２の正面図および図２におけるＡ−Ａ線の断面図を表す図３に示すように、基材シート（１０）上の略中央に培養層（３０）を形成し、前記培養層の外周に円形の枠層（２０）を形成したものであってもよい。枠層（２０）によって培養層（３０）に接種した被検液の吸水範囲を限定することができる。なお、枠層（２０）の形状も円形に限定されるものではなく、方形、楕円形、多角形、不定形などいずれであってもよいが、培養層（３０）に接種した被検液の吸水範囲が所定の面積を確保しうるように枠層が形成されることが好ましい。なお図１、図2、図5において、培養層（３０）はその配置されている領域のみを図示している。
培養層（３０）は、基材シート（１０）の上に複数存在してもよい。
前記培養層（３０）の等価円の直径は、２０〜８０ｍｍ、より好ましくは３０〜７０ｍｍである。微生物培養シートに滴下する被検液は一般に１ｍｌであり、上記範囲で、十分に被検液を吸水することができる。
【００１７】
（２）基材シート
本発明で使用する基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、培養層を形成する際の熱による乾燥処理を伴う場合は耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、２層以上の積層シートであってもよい。
【００１８】
基材シートが単層の場合には、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックシートを好適に使用できる。これらのプラスチックシートは、透明性に優れるため、基材シートからの透過光によっても微生物コロニーを観察することができ、視認性を高めることができ、また、計測方法の選択幅を広げることができる。具体的には、本発明の微生物培養シートは、培養層で生育させたコロニーを観察、計数するものであるが、基材シートやカバーシートが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、側面からの入射光で観察することもできる。したがって、カバーシート側からも基材シート側からも観察および計数することができる。ただし、発泡により白色を呈するもの、いずれかに着色されたものも使用することもできる。培養菌によっては、透明に限定されず、着色により生育させたコロニーを計数し易い点場合があり、適宜選択することができる。
また、基材シートは、上記プラスチックシートの２種以上を積層したものでもよい。
なお合成樹脂を主原料として紙のようにシート化された、いわゆる合成紙も上記プラスチックシートとして使用することができる。
本発明で使用する基材シートは、培養層との密着性を向上させるため、予め培養層をパターン形成する側に、表面処理をおこなったものであってもよい。このような表面処理としては、コロナ放電処理、オゾン処理、酸素ガス若しくは窒素ガス等を用いた低温プラズマ処理、グロー放電処理、化学薬品等を用いて処理する酸化処理、その他の前処理などがある。また、培養層との密着性を向上のため、基材シートの表面に、予めアンカーコート剤を塗布し、表面処理することもできる。
基材シートは、カールなどがなく平坦であることが好ましく、その厚さは、特に限定はされないが、通常、２５〜１５００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍである。
【００１９】
（３）培養層
本発明において、基材シートに設ける培養層は、特に限定されないが、好ましい例を以下に示す。
【００２０】
本発明において、基材シートに設ける培養層は、ポリビニルピロリドン溶液にゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤および基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有する培地液をパターン形成して調製されることが好ましい。ポリビニルピロリドン溶液を選択すると、濃度を調整することでゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤および基質からなる群から選択される少なくとも１種を均一に分散させることができ、しかも、容易に粘度調整が可能になるため、得られた培地液を用いてパターン形成を行うことができるからである。しかも、パターン形成後に溶媒を除去すると、ポリビニルピロリドンは皮膜性が高いため、ゲル化剤や栄養成分、その他成分を取り込んで成膜可能であり、かつ基材とも良好な密着性を有するため、接着剤を使用せずに培養層を形成することができる。なお、ポリビニルピロリドンの皮膜は硬くもろい場合があり、可塑剤を添加してもよい。添加しうる可塑剤としては、エーテルエステル誘導体系可塑剤、グリセリンやグリセリン誘導体系可塑剤、プロピレングリコールやグリコール誘導体系可塑剤、グリコールエーテル誘導体系可塑剤、ポリヒドロキシカルボン酸誘導体系可塑剤、フタル酸誘導体系可塑剤などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
（ｉ）ポリビニルピロリドン溶液
本発明では、ポリビニルピロリドン溶液に使用する溶媒としては、ポリビニルピロリドンを溶解しうるものであれば、特に制限はない。一方、溶媒としてアルコールを好適に使用することができる。
アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコールが好適であり、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどの１種または２種以上の混合液を使用することもできる。本発明では、これらの中でも、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールを好適に使用することができる。従来は、培地成分を溶解するために水やトルエンなどの高沸点溶媒が使用されていたが、溶媒除去のために高温で加熱する必要があり、培養層に含まれる成分の熱分解を招く恐れがあった。また、溶媒除去に過剰の熱エネルギーを使用する必要があり、コスト上昇の一因となり、また、溶媒除去時間も長くなるため生産効率低下の一因ともなっていた。本発明では、ポリビニルピロリドンを使用し、その溶媒として上記アルコールを使用することで、培養層に含まれる成分の熱変性を回避し、並びに生産効率を向上することができる。なお、上記趣旨を損なわない範囲で、アルコールにクロロホルムなどの副溶媒を混合した溶媒を使用することもできる。
ポリビニルピロリドンに対する溶媒の割合は、使用する溶媒によって適宜選択しうるが、一般には、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して溶媒１００〜１００００質量部、より好ましくは３００〜２０００質量部、特に好ましくは６００〜１１００質量部である。１００００質量部を超えると、ゲル化剤などの分散性が著しく低下し、一方、１００質量部を下回ると混合液の粘度があがり、パターン形成に対する適性が低下するからである。
【００２２】
（ｉｉ）ゲル化剤
本発明では、ポリビニルピロリドン溶液に、ゲル化剤を配合することができる。培養層がゲル化剤を含有する場合には、被検液を培養層に接種すると増粘もしくはゲル化するため、菌の育成に良好な粘度を確保することができ、増粘後にカバーシートに密着しうるため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。
【００２３】
このようなゲル化剤としては、高分子多糖類を好適に使用することができ、カラギーナン、グアーガム、キタンサンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ローカストビーンガム、アルギンなどを例示することができる。本発明では、これらの中でも、グアーガムを好適に使用することができる。なお、グアーガムは、一年生の豆科植物、グアーの種子の胚乳部より製造される。グアーガムは、低濃度で極めて高い整粘度を呈するため少量で菌の発育に適した環境を作れ、特に好適である。
本発明において、培地液を構成するゲル化剤は、パターン形成が可能であればポリビニルピロリドン溶液に溶解している必要はない。このため、本発明では、ゲル化剤を粉末で添加することができる。粉末で添加する場合のゲル化剤の平均粒子径は５〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。５００μｍを超えると分散性が低下し、パターン形成適性が損なわれる場合がある。ただし、これらを溶媒に溶解し、上記ポリビニルピロリドン溶液に混合して培地液としてもよい。
ゲル化剤の配合量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して１００〜６００質量部、より好ましくは２５０〜４００質量部である。１００質量部を下回ると、培養層の粘度が不足する場合があり、一方、６００質量部を超えると培養層が硬くなり、菌の発育が低下する場合がある。
【００２４】
（ｉｉｉ）栄養成分
本発明の培養層には、上記ポリビニルピロリドン溶液およびゲル化剤に加えて、栄養成分を配合することができる。
栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等や、これらにリン酸二カリウム及び／または塩化ナトリウムを加えた混合物が、大腸菌・大腸菌群検査用としては、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム等が、ブドウ球菌用としては、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が、ビブリオ用としては酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁等が、腸球菌用としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム等が、真菌用としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種またはそれ以上を選択し、混合して使用
することができる。なお、微生物を含有する被検液に、微生物の栄養成分を含む水を加えることで、微生物の生育しうる培地としてもよい。
これらの成分は、粉末で添加してもよく、これらを溶媒に溶解し、上記ポリビニルピロ
リドン溶液に混合して培地液としてもよい。
【００２５】
（ｉｖ）発色指示薬、選択剤、基質など他の成分
本発明の培養層には、上記ポリビニルピロリドン溶液およびゲル化剤に加えて、発色指示薬、選択剤、基質など他の成分を配合して、培養層を形成することができる。
【００２６】
発色指示薬は、培養過程で発育する微生物に代謝され、コロニーが着色されるため、コロニー数の計数を極めて容易にする効果がある。このような発色指示薬として具体的には、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下ＴＴＣと表示）、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ペテトリルテトラゾリウムブルーなどのテトラゾリム塩やニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、チモールブルー混合物などのｐＨ指示薬がある。微生物の生育に伴い、発色または変色して
微生物の生育が見やすくなり、また、特定の微生物が有する酵素の発色または蛍光酵素基質を加えておくことで、特定の微生物が検出できる。
さらに検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤を加えてもよく、また特定の微生物を検出するために発色または蛍光酵素基質を加えてもよい。このような選択剤としては、抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が例示でき
、合成抗菌剤としては、サルファ剤、ナリジクス酸、オラキンドックス等が例示できる。また、色素としては、静菌または殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等が例示できる。また、界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩等が例示できる。また、無機塩類としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、高濃度の塩化ナトリウム等が例示できる。これら以外にもタウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩等を用いることができる。
【００２７】
これらの成分は、粉末で添加してもよく、これらを溶媒に溶解し、上記ポリビニルピロリドン溶液に混合して培地液としてもよい。
【００２８】
なお、発色指示薬の種類によっては滅菌処理時に着色が目立つものもあり、培養層に含
有させず、被検液に発色指示薬を含んだものを使用して発色させる培地にしてもよい。
本発明の培養層では、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）とゲル化剤（ｉｉ）とを含有すれば、更に栄養成分(ｉｉｉ)および／または発色指示薬、選択剤、基質など他の成分（ｉｖ）を含有してもよい。
また、本発明では、培養層を１層で形成する場合に限定されず、２層以上の多層で構成することができる。例えば、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）を含有する培地液で第１培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）と栄養成分(ｉｉｉ)を含有する培地液で第２培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。また、第１培養層のみにゲル化剤を配合してもよく、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）を含有する培地液で第１培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液（ｉ）に栄養成分(ｉｉｉ)を含有する培地液で第２培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。
また、発色指示薬や選択剤の組合せによっては混合によって反応を起こす場合があり、これらを別の層に含有させることで混合反応を防ぐことができる。また、発色指示薬を最上層に形成することでコロニーの視認性を向上させることができる。従って、たとえば栄養成分に混合反応を形成する成分ＡとＢとが含有される場合には、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋栄養成分(ｉｉｉ)からＡ成分を除去した第１培養層と、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋発色指示薬（ｉｖ）＋栄養成分(ｉｉｉ)からＢ成分を除去した第２培養層との２層を積層して培養層としてもよく、また、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋栄養成分(ｉｉｉ)からＡ成分を除去した第１培養層、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋栄養成分(ｉｉｉ)からＢ成分を除去した第２培養層、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）＋ゲル化剤（ｉｉ）＋発色指示薬(ｉｖ)からなる第３培養層との３層を順次積層して培養層としてもよい。また、混合反応は、栄養成分に含有される場合に限定されず、選択剤や発色指示薬との関係で生じる場合もある。いずれの場合でも、成分ＡとＢとを別の層に区分することで、混合反応を回避することができる。
なお、本発明では、培養層が多層で構成される場合に、多層構造を構成するいずれかの培養層において、ポリビニルピロリドン溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤および基質からなる群から選択される少なくとも１種を含有する培地液がパターン形成されたものであればよく、他の層の組成は上記に限定されるものではなく、パターン形成  の方法も問わない。
【００２９】
（ｖ）パターン形成
本発明で使用する培養層は、前記培地液を基材シートにパターン形成して調製される。本発明において、「パターン形成」とは、上記培地液を基材シートの予定した形状に印刷や塗布、塗工、噴霧できるものであれば、特に制限はない。したがって、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェットなどによる塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコートなどの塗工、スプレー方式などの噴霧、その他の方法を使用することができる。
また、少なくとも、基材シートに培養層をパターン形成できればよく、培養層が２層以上の多層である場合に、その全てが同じパターン形成方式で形成される必要はない。したがって、第１培養層をディスペンサーによる塗布でパターン形成し、第２培養層をスクリーン印刷でパターン形成してもよい。
【００３０】
本発明において、基材シートの上に形成する培養層の厚さは、乾燥時５０〜１０００μｍ、より好ましくは２００〜６００μｍである。また、塗布量は、乾燥時５〜４００ｇ／ｍ2、より好ましくは１００〜３００ｇ／ｍ2である。上記範囲で、菌の発育に最適な粘度の培養層とすることができる。
【００３１】
（４）カバーシート
カバーシートは、培養中の落下菌などによる汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。カバーシートは、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察および計数できるように、透明であることが好ましく、例えば、前記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックシートを使用することができる。なお、カバーシートの開け閉め等の作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムまたは易剥離性ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。また、カバーシートには、基材シートの項で記載したコロナ放電処理などの表面処理がなされていてもよい。なお、カバーシートは、培養する微生物の種類により、適した気体透過性、主に酸素透過性、または酸素非透過性を有することが好ましく、この点も考慮して選定することができる。
カバーシートは、被検液を接種するために基材シートから持ち上げる際に、適度の柔軟性が確保されることが好ましい。従って、カバーシートの厚さは、１０〜２００μｍ程度が好ましく、２０〜７０μｍ程度が更に好ましい。また、ロック機構カバーシートを付与するときは、カバーシートに適度な強度、コシが必要である。なお、カバーシートは、どのような形状であってもよいが、雑菌の進入を防ぐために、培養層を被覆できるよう、培養層よりも大きいサイズとする必要がある。
本発明では、カバーシートに、基材シートに形成された培養層と対向する位置に、バインダー溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤および基質からなる群から選択
される１種以上を含有する特定成分溶液を塗布してなる特定成分層（図示せず）を有していてもよい。
なお、特定成分液は、ゲル化剤を含むものであってもよい。なお、上記特定成分層は、一層である場合に限定されず、２層以上の多層であってもよい。
なお、基材シートに枡目印刷柄が印刷されていない場合、カバーシートに、予め水に不溶性で微生物の生育に影響を与えないインキで枡目印刷柄が印刷されていてもよい。印刷の版式は、基材シートと同様に、着色剤、樹脂、溶剤などの選択範囲が広い点でグラビア印刷などが好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。
【００３２】
（５）枠層
本発明では、培養層の上または外周に疎水性樹脂からなる枠層を形成してもよい。これにより、被検液の漏れを防止することができる。枠層を図3に示すように培養層（３０）の外周に２重の土手状に設けることにより、さらに被検液の漏れを防止することができる。枠層の形成は上記培養層の上に形成されても、基材シートの上に形成されてもよいが、基材シートの上で培養層の外周を囲むように形成するのが好ましい。
枠層の幅は、均一幅に限定されるものではないが、最細部が幅０．５〜５．０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１．０〜３．０ｍｍである。上記範囲であれば、培養層が吸水した場合でも、培養層の形状を維持でき、かつ枠層の内側と外側との区切り部として機能することができる。また、一般には枠層の高さは、培養層の厚さにも依存するが、好ましくは基材シートを基点として６００〜１０００μｍである。６００μｍを下回ると、被検液を広げた際、枠層からはみ出しやすくなる。一方、１０００μｍを超えていると、吸水後の培養層の上部に空間部が発生しやすくなり、カバーシートとの密着性を確保することが困難となる。
また、疎水性材料のくりぬき品を培養層の外周の基材シートに接着して枠層とすることもできる。
さらに、基材シートとしてエンボス加工品を使用する方法もある。例えば枠層の形状に凸状が形成されたエンボス加工品であれば、前記凸状の内側に培養層を形成すればよく、一方、培養層を形成する箇所を凹部で形成し、これより凸状で形成される残部を枠層として使用することができる。
更に、基材シートとして厚い疎水性基材を使用し、培養層を形成する部分を凹状に削って、残部を枠層とする方法や、または枠層の形状に凸状を形成し、この凸状の内側に培養層を形成すれば、前記凸状を枠層として使用することができる。ただし、これらに限定されるものではない。
なお、使用する疎水性樹脂としては、ＵＶ硬化インキ、ホットメルト、熱発泡インクやＵＶ発泡剤などを好適に使用することができる。特にＵＶ硬化インキ、ホットメルトが目的とする高さの枠層を形成することができ、特に好ましい。
（６）ヒンジ部
本発明の微生物培養シートは、培養層に被検液を接種した後にカバーシートで培養層を被覆し、これを培養するため、一連の操作を容易とするためにカバーシートの一部が基材シートに開閉自在に連設する。この連接機能を有する部分をヒンジ部（６０）とする。よって、ヒンジ部は微生物培養シートの端部に形成される。
具体的な連接機能を付与する手段としては、別個に作成したカバーシートと基材シート同士をヒートシールやラミネート接着、接着テープ、その他によって手段によって連接して形成される。
同一のシート上、つまり、カバーシートと基材シートとを連設したまま基材シート（１０）となる領域に枠層（２０）と培養層（３０）とを形成し、基材シート（１０）の領域とカバーシートとなる領域との間で折り曲げて、実質折り曲げ部分をヒンジ部として微生物培養シートを形成してもよい。
（7）ロック機構
本発明のロック機構はヒンジ部を介して開閉自在に前記基材シートと前記カバーシートとが連接された微生物培養シートの培養層に菌液を滴下した後カバーシートを被せた後に、カバーシートと基材シートが密着している状態を維持するための構造、つまり、基材シートおよび／またはカバーシートに設けられた構造をロック機構という。
具体的なロック機構を設ける位置としては、基材シートとカバーシートを閉じたときに、培養層が形成されている領域をはさんで、ヒンジ部に対向する位置に設けることが効果的であるが、これに限定されない。
具体的なロック機構はプラスチック製の咬合部材をカバーシートと基材シートの間に設けることができる。プラスチック製の咬合部材は包装用袋用途として「ラミジップ（株式会社日本生産社：登録商標）」として知られているものが例示できる。
この場合は菌液を滴下後、培養層にカバーシートを被せた後、咬合部材の部分を押すことで、咬合せを完了させることが必要となる。
その他カバーシートと基材シートの辺縁の形状により、お互いを係合させることも可能である。
その他ロック機構としては、ロック機構が基材シートおよび／またはカバーシートの切込みを入れ、その切込みに対向する部分のもう一方のシート一部を挿入し、係止をすることが可能である。切込みの形状は特に限定されないが、線状のみならず、孔状、線状と孔上の組み合わせでもかまわない。
ロック機構としては、１例として、図１、図2、図4、図５において、切込み（５０）が形成れている。この切込み（５０）は、基材シートの縁に係止可能な位置に形成され、切込みの形状がヒンジ部方向に対して凸状の図形の切込みとなっている。図５はカバーシートを閉じた状態で、まだ切込みを基材シートの縁に係止していない状態での微生物培養シートの正面図である。微生物培養シートは未使用状態ではこの図５に示す状態で供給される。使用者はこの状態からカバーシート（４０）をめくり上げ、現れた培養層（３０）の表面に被検液たる菌液を培養層に接種すると増粘もしくはゲル化するため、菌の育成に良好な粘度を確保することができ、増粘後にカバーシートに密着させることができる。子の後、使用者は、凸状の切込みの先端を基材シート（１０）の裏面にまわりこませ、カバーシートを基材シートに係止させる。
図４はこの一例によりカバーシートと基材シートが閉じた状態で係止されている微生物培養シートの背面図であり、切込みが基材シート（１０）の裏面方向にまわり基材シートの縁で係止されている。この場合、カバーシートは、基材シートの縁よりもやや長くなり、切込み（５０）の起点となる位置が、基材シートとカバーシートを閉じたときに、基材シートの縁上から、外側（基材シート上にない位置）の領域が起点となることが必要である。さらに、凸状の図形の頂上部分が、基材シートとカバーシートを閉じたときに、基材シート上の領域になる必要がある。この条件をみたして、つまり切込みの形状がヒンジ部方向に対して凸状の図形の切込みを設けることで、カバーシートと基材シートの間が密着状態での確実なロック機構となり、ロックされたかどうか使用者に一目瞭然である。
なお、カバーシートを、基材シートの縁よりもやや長く、形成することで、長く形成された領域を持つことで、カバーシートのみを持ち上げやすく、カバーシートを開いた状態にしやすくなる効果もある。
【００３３】
凸状の形状に関しては同様の作用効果を示せばよく、直線からなる場合や、曲線となる場合、これらの組み合わせ、複数の凸状図形から形成されてもよい。
【００３４】
切込みが線状のみならず、孔状、これらの組み合わせからなっていてもかまわない。
本ロック機構によれば、容易に作業者がカバーシートと基材シートが自在に開放され、菌液を滴下した後、カバーシートと基材シートとの間での密封の完了感、つまり係止が完了されたことが一目瞭然であり、ロック機構が強固であり、人為的にロックを解除しないかぎり、多少のカバーシートの浮きや弛み、培地が設けられている基材シートのカール等の変形があったとしても密封性が維持できる。
なお、図１で図示したロック機構以外にも基材シートとカバーシートのロック機構の役割を入れ替えてもかまわない。つまり、基材シートをカバーシートより長めに形成して、切込みを基材シート側に形成するような構成をいう（図示せず）。
しかしこの構成によって、基材シートに形成された凸状の切込みを、カバーシートの縁に係止させる際には、以下のようなデメリットがある。係止の際には、使用者が凸状の切込み近辺のシートを変形させる必要があり、さらに菌液の滴下時にカバーシートをめくりあげる操作を考えると、基材シートより長く形成された領域を持ち、さらに、基材シートに比較して柔らかい材料を選択することが多いカバーシートに切込みを設けておくことが好ましい。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３６】
（実施例１）
ＵＶ硬化インク（十条ケミカル社製、商品名「レイキュアーＧＡ  ４１００−２」）をポリエチレンテレフタラートフィルム（帝人デュポン製、商品名「テイジンテトロンフィルム」）の上にディスペンサーによって幅１．０ｍｍ、高さ７５０μｍ、直径５２ｍｍの
円状の枠層を形成し、水銀ランプにより積算光量２５０ｍＪ／ｃｍ2で照射し枠層を硬化させた。
ついで、メタノール２１０ｍｌにポリビニルピロリドン  Ｋ−９０  ２０ｇを溶解し、これにグアーガム粉末（三晶社製、商品名「ＮＥＯＶＩＳＣＯ  Ｇ」、４００メッシュタ
イプ）６０ｇを分散し、更に栄養成分としてトリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  社製、商品名「ＢＡＣＴ  ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）５．１６ｇ、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品名「ＹＥＡＳＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ」）２．５８ｇ、ブドウ糖（和光純薬社製、商品名「Ｄ−（＋）−ＧＬＵＣＯＳＥ」）１．０３ｇを混合して塗布液を調整した。
【００３７】
この栄養成分、ゲル化剤を含んだ塗布溶液を前記の枠層を形成した基材の枠内にディスペンサーによって塗布した。ついで、塗布した層を５０℃で１５分間乾燥して培養層を形成した。乾燥時の層の厚さは、２５０μｍであった。
ついで、カバーシートとしては厚さ４０μｍのＯＰＰフィルム（東セロ社製、型番ＯＰ  Ｕ−１（片面コロナ放電処理）を用いた。あらかじめカバーシートには基材シートの縁部に係止するように切込みをヒンジ部方向に対して凸状の図形となるように、図１に示す図形ように設けておいた。前記枠層と培養層を形成したＰＥＴの基材シートの上に積層し、図の１に示すように端部を接着しヒンジ部とし、γ線で滅菌して本発明の微生物培養シートとした。得られた枠層の高さは７５０μｍ（培養層の高さとの差＋５００μｍ）、幅は１ｍｍであった。
実施例１では切込みを設け、図４に示したようなロックをおこなうことで、操作性も良好、カバーシートと基材シートの間の密着性も良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、菌数検査などに用いられ、コンパクトかつ扱いが簡便で、シート状の微生物培養シートに関し、有効に利用できる。
【符号の説明】
【００３９】
１０  基材シート
２０  枠材層
３０  培養層
４０  カバーシート
５０  切込み
６０  ヒンジ部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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