(57)【要約】【課題】制癌剤のみならず、高分子量の水溶性物質も所望の標的組織（特に腫瘍組織）に選択的に送達し、且つ徐放性を有する中空構造体キャリアを提供する。【解決手段】本発明にかかる中空構造体キャリアは、特定のブロックコポリマーと金属錯体とを含んでなるブロックコポリマー−金属錯体複合体が会合してなることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部の側鎖にカルボキシル基を有するポリマー鎖(A)と、非荷電性親水性ポリマー鎖(B)とを構成成分として含むブロックコポリマーであって、
ポリマー鎖(A)の一方の末端側に複数本のポリマー鎖(B)が結合してなることを特徴とする、前記コポリマー。
【請求項２】
ポリマー鎖(A)のもう一方の末端側に疎水性基が結合してなる、請求項１記載のコポリマー。
【請求項３】
ポリマー鎖(A)が、ポリアミノ酸、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（リンゴ酸）からなる群より選ばれる少なくとも１種のポリマー鎖である、請求項１又は２記載のコポリマー。
【請求項４】
ポリアミノ酸が、ポリ（グルタミン酸）及び／又はポリ（アスパラギン酸）である、請求項３記載のコポリマー。
【請求項５】
ポリマー鎖(B)が、ポリエチレングリコール、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル及びポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）からなる群より選ばれる少なくとも１種の親水性ポリマー鎖である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコポリマー。
【請求項６】
ポリマー鎖(B)が、ポリエチレングリコールである、請求項５記載のコポリマー。
【請求項７】
疎水性基が、脂肪族化合物、芳香族化合物及び脂環式化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種に由来する基である、請求項２〜６のいずれか１項に記載のコポリマー。
【請求項８】
疎水性基が、コレステロールに由来する基である、請求項７記載のコポリマー。
【請求項９】
ブロックコポリマーが、下記一般式(1)： 
【化２０】
2011105792.tif 000023
〔式(1)中、R1はそれぞれ独立して水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は連結基を表し、R2は疎水性基又は水素原子を表し、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表す。mは2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数であり、pは2〜5の整数である。なお、pの値は、L1に結合している下記式(a)：
【化２１】
2011105792.tif 000024
で示されるポリマー鎖の本数を表す。〕
で示されるものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコポリマー。
【請求項１０】
ブロックコポリマーが、下記一般式(1’)：
【化２２】
2011105792.tif 000025
〔式(1’)中、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、R5は下記式(b)：
【化２３】
2011105792.tif 000026
で示されるコレステロールに由来する基又は水素原子を表す。mは2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数である。〕
で示されるものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のコポリマー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコポリマーと、金属錯体とを含んでなる、ブロックコポリマー−金属錯体複合体。
【請求項１２】
前記金属錯体に１分子に対して、前記コポリマーが複数分子結合してなるものである、請求項１１記載の複合体。
【請求項１３】
前記コポリマー中のカルボキシル基と、前記金属錯体とが結合してなるものである、請求項１１又は１２記載の複合体。
【請求項１４】
前記金属錯体が抗腫瘍活性を有する金属錯体である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記金属錯体の中心金属が白金である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記金属錯体が、シスプラチン及び／又はダハプラチンである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
ブロックコポリマー−金属錯体複合体が、下記一般式(2)：
【化２４】
2011105792.tif 000027
〔式(2)中、R1はそれぞれ独立して水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は連結基を表し、R2はそれぞれ独立して疎水性基又は水素原子を表し、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、R6は下記式(c)又は(d)：
【化２５】
2011105792.tif 000028
（式(b)及び(c)中、Mは白金、銅、金又は鉄の金属原子を表す。）
で示される金属錯体を表す。mはそれぞれ独立して2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数であり、pはそれぞれ独立して2〜5の整数である。なお、pの値は、L1に結合している下記式(a)：
【化２６】
2011105792.tif 000029
で示されるポリマー鎖の本数を表す。〕
で示されるものである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
ブロックコポリマー−金属錯体複合体が、下記一般式(2’)：
【化２７】
2011105792.tif 000030
〔式(2’)中、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、R5はそれぞれ独立して下記式(b)：
【化２８】
2011105792.tif 000031
で示されるコレステロールに由来する基又は水素原子を表し、R7は下記式(c’)又は(d’)：
【化２９】
2011105792.tif 000032
で示される金属錯体を表す。mはそれぞれ独立して2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数である。〕
で示されるものである、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の複合体が会合してなる、中空構造体キャリア。
【請求項２０】
前記複合体が会合してなる構造中に、単体の疎水性化合物が含まれている、請求項１９記載のキャリア。
【請求項２１】
会合した前記複合体が膜構造を形成したものである、請求項２０記載のキャリア。
【請求項２２】
小胞体状の形状である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２３】
水溶性物質を内包可能なものである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２４】
高分子量の水溶性物質を内包可能なものである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２５】
水溶性タンパク質を内包可能なものである、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２６】
徐放性を有するものである、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２７】
平均粒径が50〜1,000 nmである、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２８】
腫瘍組織選択性を有するものである、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項２９】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のキャリアを含む、癌治療用医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のキャリアを含む、癌診断用医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のキャリアを含む、腫瘍組織検出用組成物。
【請求項３２】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のキャリアを用いることを特徴とする、腫瘍組織検出方法。
【請求項３３】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のキャリアを含む、腫瘍組織イメージング用組成物。
【請求項３４】
in vivoイメージングに用いることができるものである、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のキャリアを用いることを特徴とする、腫瘍組織イメージング方法。
【請求項３６】
in vivoイメージング方法である、請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性物質を内包し得る中空構造体キャリア、並びに当該キャリアを構成するブロックコポリマー及びブロックコポリマー−金属錯体複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
一本鎖ポリエチレングリコール（PEG）-ポリアミノ酸ブロック共重合体と白金系制癌剤とが金属錯体形成することにより形成される自己会合体は、制癌剤／ポリアミノ酸錯体をコアとし、周囲がPEGシェルで覆われた高分子ミセルとなる（非特許文献１〜９）。この制癌剤内包高分子ミセルは、長期血中滞留性に基づく腫瘍組織集積性を有し、優れた抗腫瘍効果を示すことが知られている。しかしながら、高分子ミセルは何らかのメカニズムにより内核に凝集力を持たせる必要があるため、キャリアと相互作用のない水溶性物質を内包するのは困難である。
一方、リポソームのような中空構造体を用いた場合は、水溶性物質を内包する送達システムを得ることはできるが、タンパク質及び核酸等の高分子量の水溶性物質を内包する送達システムを得ることは困難である。また、送達物質の放出は、リポソームの構造体の崩壊によるため、徐放性を持たせることはできない。
【０００３】
近年、中空構造体として、両親媒性高分子の疎水性相互作用を駆動力とした自己会合体をキャリア化しようとする試みが注目を集めている。このような自己会合体としては、例えば、内部水相に比較的水溶性である低分子薬剤（ドキソルビシン）が封入され、かつ構造体壁内には疎水性低分子薬剤（パクリタキセル）が充填され、それぞれを徐放できることが報告されている（非特許文献２）。また、マウスを用いたin vivo実験により、この自己会合体が長期血中滞留性（循環性）を示し、複数の薬剤の相乗的な抗腫瘍効果を示すことも見出されている。
しかしながら、高分子量の水溶性物質を制癌剤と共に送達し、徐放した例は従来知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】M. Yokoyama, T. Okano, Y. Sakurai, S. Suwa and K. Kataoka, Introduction of cisplatin into polymeric micelle, Journal of Controlled Release, 39 (1996) 351
【非特許文献２】N. Nishiyama, M. Yokoyama, T. Aoyagi, T. Okano, Y. Sakurai, K. Kataoka, Preparation and characterization of self-assembled polymer-metal complex micelle from cis-dichlorodiammineplatinum(II) and poly(ethylene glycol)-poly(a,b-aspartic acid) block copolymer in an aqueous medium, Langmuir 15 (1999) 377.
【非特許文献３】N. Nishiyama, K. Kataoka, Preparation and characterization of size-controlled polymeric micelle containing cis-dichlorodiammineplatinum(II) in the core, J Contrl. Rel. 74 (2001) 83.
【非特許文献４】Y. Mizumura, Y. Matsumura, T. Hamaguchi, N. Nishiyama, K. Kataoka, T. Kawaguchi, W. J. M. Hrushesky, F. Moriyasu, T. Kakizoe, Cisplatin-incorporated polymeric micelles eliminate nephrotoxicity, while maintaining antitumor activity, Jpn. J. Cancer Res. 92 (2001) 328.
【非特許文献５】N. Nishiyama, Y. Kato, Y. Sugiyama, K. Kataoka, Cisplatin-loaded polymer-metal complex micelle with time-modulated decaying property as a novel drug delivery system, Pharm. Res. 18 (2001) 1035.
【０００５】
【非特許文献６】N. Nishiyama, S. Okazaki, H. Cabral, M. Miyamoto, Y. Kato. Y. Sugiyama, K. Nishio, Y. Matsumura, K. Kataoka, Novel cisplatin-incorporated polymeric micelles can eradicate solid tumors in mice, Cancer Res. 63 (2003) 8977.
【非特許文献７】H. Uchino, Y. Matsumura, T. Negishi, F. Koizumi, T. Hayashi, T. Honda, N. Nishiyama, K. Kataoka, S. Naito, T. Kakizoe, Cisplatin-incorporating polymeric micelles (NC-6004) can reduce nephrotoxicity and neurotoxicity of cisplatin in rats, British journal of cancer, 93 (2005) 678-68
【非特許文献８】H. Cabral, N. Nishiyama, S. Okazaki, H. Koyama, K. Kataoka, Preparation and biological properties of dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum(II) (DACHPt)-loaded micelles, J Control Rel. 101 (2005) 223
【非特許文献９】H. Cabral, N. Nishiyama, K. Kataoka, Optimization (1,2-diaminocyclohexane)platinum(II)-loaded polymeric micelles directed to improved tumor targeting and enhanced antitumor activity, J Control Rel. 121 (2007) 146
【非特許文献１０】Ahmed, F.; Pakunlu, R. I.; Srinivas, G.; Brannan, A.; Bates, F.; Klein, M. L.; Minko, T.; Discher, D. E. Mol. Pharmaceutics2006, 3, 340-350.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下において、制癌剤のみならず、高分子量の水溶性物質も所望の標的組織（特に腫瘍組織）に選択的に送達し、且つ徐放性を有するキャリアの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ブロックコポリマー、ブロックコポリマー−金属錯体複合体、中空構造体キャリア、癌治療用医薬組成物、癌診断用医薬組成物、腫瘍組織検出用組成物、腫瘍組織検出方法、腫瘍組織イメージング用組成物、及び腫瘍組織イメージング方法を提供するものである。
【０００８】
（１）少なくとも一部の側鎖にカルボキシル基を有するポリマー鎖(A)と、非荷電性親水性ポリマー鎖(B)とを構成成分として含むブロックコポリマーであって、ポリマー鎖(A)の一方の末端側に複数本のポリマー鎖(B)が結合してなることを特徴とする、前記コポリマー。
本発明のブロックコポリマーは、例えば、ポリマー鎖(A)のもう一方の末端側に疎水性基が結合してなるものが挙げられる。ここで、疎水性基は、例えば、脂肪族化合物、芳香族化合物及び脂環式化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種に由来する基が挙げられ、中でもコレステロールに由来する基が好ましく挙げられる。
【０００９】
本発明のブロックコポリマーは、ポリマー鎖(A)が、例えば、ポリアミノ酸、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（リンゴ酸）からなる群より選ばれる少なくとも１種のポリマー鎖であるものが挙げられる。ここで、ポリアミノ酸は、例えば、ポリ（グルタミン酸）及び／又はポリ（アスパラギン酸）が挙げられる。
本発明のブロックコポリマーは、ポリマー鎖(B)が、例えば、ポリエチレングリコール、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル及びポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）からなる群より選ばれる少なくとも１種の親水性ポリマー鎖であるものが挙げられる。特に、ポリマー鎖(B)が、ポリエチレングリコールであるものが好ましく挙げられる。
【００１０】
本発明のブロックコポリマーは、例えば、下記一般式(1)： 
【化１】
2011105792.tif 000002
〔式(1)中、R1はそれぞれ独立して水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は連結基を表し、R2は疎水性基又は水素原子を表し、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表す。mは2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数であり、pは2〜5の整数である。なお、pの値は、L1に結合している下記式(a)：
【化２】
2011105792.tif 000003
で示されるポリマー鎖の本数を表す。〕
で示されるものが挙げられる。より具体的には、本発明のブロックコポリマーは、例えば、下記一般式(1’)：
【化３】
2011105792.tif 000004
〔式(1’)中、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、R5は下記式(b)：
【化４】
2011105792.tif 000005
で示されるコレステロールに由来する基又は水素原子を表す。mは2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数である。〕
で示されるものが挙げられる。
【００１１】
（２）上記(1)に記載のコポリマーと、金属錯体とを含んでなる、ブロックコポリマー−金属錯体複合体。
本発明の複合体は、例えば、前記金属錯体に１分子に対して、前記コポリマーが複数分子結合してなるものが挙げられる。当該複合体は、前記コポリマー中のカルボキシル基と、前記金属錯体とが結合してなるものが挙げられる。
本発明の複合体は、前記金属錯体が、例えば、抗腫瘍活性を有する金属錯体であるものが挙げられ、具体的には、前記金属錯体の中心金属が白金であるものが挙げられ、例えば、シスプラチン及び／又はダハプラチンが挙げられる。
【００１２】
本発明のブロックコポリマー−金属錯体複合体は、例えば、下記一般式(2)：
【化５】
2011105792.tif 000006
〔式(2)中、R1はそれぞれ独立して水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のC1-12アルキル基を表し、L1は連結基を表し、R2はそれぞれ独立して疎水性基又は水素原子を表し、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、R6は下記式(c)又は(d)：
【化６】
2011105792.tif 000007
（式(b)及び(c)中、Mは白金、銅、金又は鉄の金属原子を表す。）
で示される金属錯体を表す。mはそれぞれ独立して2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数であり、pはそれぞれ独立して2〜5の整数である。なお、pの値は、L1に結合している下記式(a)：
【化７】
2011105792.tif 000008
で示されるポリマー鎖の本数を表す。〕
で示されるものが挙げられる。より具体的には、本発明のブロックコポリマー−金属錯体複合体は、例えば、下記一般式(2’)：
【化８】
2011105792.tif 000009
〔式(2’)中、R3はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、R4はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、R5はそれぞれ独立して下記式(b)：
【化９】
2011105792.tif 000010
で示されるコレステロールに由来する基又は水素原子を表し、R7は下記式(c’)又は(d’)：
【化１０】
2011105792.tif 000011
で示される金属錯体を表す。mはそれぞれ独立して2〜1,000の整数であり、m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000の整数であり且つ(m1 + m2) = mを満たす整数であり、nはそれぞれ独立して2〜20,000の整数である。〕
で示されるものが挙げられる。
【００１３】
（３）上記(2)に記載の複合体が会合してなる、中空構造体キャリア。
本発明のキャリアは、例えば、前記複合体が会合してなる構造中に、単体の疎水性化合物が含まれているものが挙げられる。
本発明のキャリアは、例えば、会合した前記複合体が膜構造を形成したものが挙げられ、具体的には、小胞体状の形状であるものが挙げられる。
本発明のキャリアは、例えば、水溶性物質、特に高分子量の水溶性物質を内包可能なものが挙げられ、具体的には、水溶性タンパク質を内包可能なものが挙げられる。
本発明のキャリアは、例えば、徐放性を有するものが挙げられる。
本発明のキャリアは、例えば、平均粒径が50〜1,000 nmであるものが挙げられる。
本発明のキャリアは、例えば、腫瘍組織選択性を有するものが挙げられる。
【００１４】
（４）上記(3)に記載のキャリアを含む、癌治療用医薬組成物。
（５）上記(3)に記載のキャリアを含む、癌診断用医薬組成物。
（６）上記(3)に記載のキャリアを含む、腫瘍組織検出用組成物。
（７）上記(3)に記載のキャリアを用いることを特徴とする、腫瘍組織検出方法。
（８）上記(3)に記載のキャリアを含む、腫瘍組織イメージング用組成物。
本発明のイメージング用組成物は、例えば、in vivoイメージングに用いることができるものが挙げられる。
（９）上記(3)に記載のキャリアを用いることを特徴とする、腫瘍組織イメージング方法。
本発明のイメージング方法は、例えば、in vivoイメージングに用いることができるものが挙げられる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、例えば、癌治療用医薬組成物、癌診断用医薬組成物、腫瘍組織検出用組成物、腫瘍組織検出方法、腫瘍組織イメージング用組成物、及び腫瘍組織イメージング方法に用いることのできる中空構造体キャリア、並びに当該キャリアの構成成分となるブロックコポリマー及びブロックコポリマー−金属錯体複合体を提供することができる。
本発明の中空構造体キャリアは、制癌剤のみならず、高分子量の水溶性物質も内包することができるものであり、内包物質等を所望の標的組織（特に腫瘍組織）に選択的に送達することができ、且つ徐放性を有するキャリアとして、極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-someの調製及び物性評価の結果を示す図である。図１Ａは、Pt-some形成の模式図で、poly(glutamic acid)のカルボン酸ユニットと金属原子（ここではPt）との錯体形成による会合体形成を示す図である。
【図１Ｂ】本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-someの調製及び物性評価の結果を示す図である。図１Ｂは、動的光散乱測定により求めたPt-someの粒径分布を示す図である。
【図１Ｃ】本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-someの調製及び物性評価の結果を示す図である。図１Ｃは、Pt-someを酢酸ウラニルにより染色し、透過型電子顕微鏡で観察した像を示す図である。スケールバーは100nmである。
【図１Ｄ】本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-someの調製及び物性評価の結果を示す図である。図１Ｄは、FITC-dextranを内包したPt-someとFITC-dextran単体をゲル浸透クロマトグラフィーにより検出した図である。上：FITC-dextran内包Pt-someの220nmの吸収、中：FITC-dextran内包Pt-someの蛍光検出。下：FITC-dextran単体の蛍光検出。
【図１Ｅ】本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-someの調製及び物性評価の結果を示す図である。図１Ｅは、異なるブロックコポリマーとDACHPtとから形成される会合体のTEM像を示す図である。図１Ｅａは、DACHPtとPEG-b-P(Glu)-Cholとの会合体に対する酢酸ウラニル染色によるTEM像で、高分子ミセルは白い点として観察された。図１Ｅｂは、DACHPtとPEGasus-b-P(Glu)との会合体に対する無染色TEM像で、大きな凝集体の中でPtは黒い点として観察された。スケールバーは100nmである。
【００１７】
【図２Ａ】Pt-someの物理化学的特性に関する結果を示す図である。図２Ａは、Pt複合体の徐放によりPt-some膜透過性が向上し、Pt-someの内包物質が放出されることを示す模式図である。
【図２Ｂ】Pt-someの物理化学的特性に関する結果を示す図である。図２Ｂは、Pt-someからのPt複合体の徐放プロファイルを示す図である。
【図２Ｃ】Pt-someの物理化学的特性に関する結果を示す図である。図２Ｃは、FITC-dextran内包Pt-someからのFITC-dextranの徐放プロファイルを示す図である。
【図２Ｄ】Pt-someの物理化学的特性に関する結果を示す図である。図２Ｄは、動的光散乱測定より求めた生理的環境下（150ｍM NaCl濃度、10ｍM PBSバッファー）でのPt-someのサイズ変化を示す図である。
【図２Ｅ】Pt-someの物理化学的特性に関する結果を示す図である。図２Ｅは、Pt-someの凍結位相差電子顕微鏡像を示す図である。生理的環境下0時間(左)および48時間後(右)である。スケールバーは25nm。矢印はPt-someのP(Glu)-Chol/DACHPt層を示す。
【００１８】
【図３Ａ】Pt-someの体内動態に関する結果を示す図である。図３Ａは、オキサリプラチン（□）およびPt-some（■）経静脈投与後の血しょうからのPtの消失プロファイルを示す図である。
【図３Ｂ】Pt-someの体内動態に関する結果を示す図である。図３Ｂは、FITC-dextran単体(□)、FITC-dextran単体とPt-someの共投与（黒■）、およびFITC-dextran内包Pt-some（灰色■）の経静脈投与後の血しょうからの消失プロファイルを示す図である。
【図３Ｃ】Pt-someの体内動態に関する結果を示す図である。図３Ｃは、オキサリプラチン（□）およびPt-some（■）の経静脈投与後のPtの腫瘍集積プロファイルを示す図である。
【図３Ｄ】Pt-someの体内動態に関する結果を示す図である。図３Ｄは、FITC-dextran担体 (□)、FITC-dextran単体とPt-someの共投与（黒■）、およびFITC-dextran内包Pt-some（灰色■）の経静脈投与後のFITCの腫瘍集積プロファイルを示す図である。
【図３Ｅ】Pt-someの体内動態に関する結果を示す図である。図３Ｅは、Alexa680-dextranおよびAlexa680-dextran内包Pt-someの経静脈投与24時間後のin vivo蛍光イメージングを示す図である。
【００１９】
【図４Ａ】Pt-someの制癌活性に関する結果を示す図である。図４Ａは、相対腫瘍体積を示す図である。
【図４Ｂ】Pt-someの制癌活性に関する結果を示す図である。図４Ｂは、相対体重変化を示す図である。(×)コントロール、(□)オキサリプラチン8 mg/kg、（◇）オキサリプラチン10 mg/kg、Pt-some 6 mg/kg(■)。＊毒性死6/6マウス、± S.E.M. n = 6
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００２１】
１．本発明の概要
ナノ構造材料を創出し、それを操作することはナノテクノロジーの目標である。ナノ構造材料を、治療、バイオイメージング、医療診断のような医療用ナノデバイスとして適用する際、生体適合性、生体環境下での構造安定性、大きさ、形状は重要な因子となる。その観点において、中空ナノ構造体であるポリマーソームは多機能型バイオナノデバイスとして優れた特性を有している（Ahmed, F. et al., Mol. Pharmaceutics, 2006, vol. 3, p. 340-350；Ranquin, A. et al., Nano Lett., 2005, vol. 5, p. 2220-2224；Ben-Haim, N. et al., Nano Lett., 2008, vol. 8, p. 1368-1373；Koide, A. et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, vol. 128, p. 5988-5989；Kishimura, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2007, vol. 46, p. 6085-6088）。ポリマーソームは、厚い疎水性平膜と大きな親水性の空間を有するため、疎水性分子だけでなく親水性分子をも同時に担持することが可能であり、デリバリー担体として非常に有用である。さらに、ポリマーソームは分子設計により、血中滞留性とEPR（enhanced permeability and retention）効果に基づく腫瘍集積性を付与することが可能であり、治療係数の低い制癌剤、診断用薬剤、併用療法のための種々薬剤を腫瘍へ送達することができるキャリアシステムとして注目を集めている（Ahmed, F.et al., J. Control. Rel., 2006, vol. 116, p. 150-158；Ahmed, F. et al., Mol. Pharmaceutics , 2006, vol. 3, p. 340-350；Cheng, Z. et al., Langmuir, 2008, vol. 15, p. 8169-8173；Ghoroghchian, P.P. et al., Proc. Natl. Ac. of Sci. of the United States of America, 2005, vol. 102, p. 2922-2927）。これまでに、より効果的な薬物、診断用薬剤の送達を目的とし、サイズ制御、外部刺激応答性、膜透過性、力学特性向上、体内動態の制御のための化学構造および超分子レベルでの分子設計が行われてきた。
【００２２】
しかしながら、多くのポリマーソームは両親媒性ブロック共重合体で構成されるため、膜透過性に限界があり、内包する親水性薬物の放出が困難であった。また、ポリマーソーム形成が有機溶媒中で行われるため、タンパク質、オリゴ核酸、DNAのような変性及び分解のしやすい生理活性物質を内包することが困難であった。このような問題点から、ポリマーソーム創製の新しいアプローチが求められていた。
これに対し、本発明の中空構造体キャリアは、前述した通り、タンパク質等の高分子量の水溶性物質でも容易に内包することができるものであり、内包物質等を所望の標的組織（特に腫瘍組織）に選択的に送達することができ、且つ徐放性を有するものである。
複数の薬剤を搭載し送達可能な本発明の中空構造体キャリアは、種々の制癌剤の同時送達による併用療法や、イメージング剤を同時に運ぶことで治療効果をリアルタイムに診断する、といった新しい治療戦略も可能とするものである
【００２３】
疾患診断、薬剤送達を併せ持つ総合型ナノ治療システムの創製は、治療効果をモニターしつつ適切な治療方針を施す医療、ひいては個人個人に合わせたテーラーメイド医療を可能とするものである。この点において、本発明の中空構造体キャリアは、調製法が簡便であり、in vivo及びin vitroにおいて優れた特性を有するため、診断と治療を同時に可能とするナノ医療デバイスの基盤となり得るものである。また、本発明の中空構造体キャリアは、低分子や高分子、もしくはナノ粒子を同時に送達することが可能であるため、複数の薬剤を投与するという煩雑性を排除することができる。さらに、本発明の中空構造体キャリアは、当該キャリアを構成するブロックコポリマーに化学的修飾を施すことにより、多機能化することもでき、ドラッグデリバリーシステムを用いた医療のさらなる展開も可能とするものである。
【００２４】
２．中空構造体キャリア
本発明の中空構造体キャリアは、特定のブロックコポリマーと金属錯体とを含んでなるブロックコポリマー−金属錯体複合体が会合してなるものである。以下に、本発明の中空構造体キャリアの各構成成分、調製方法、用途等について説明する。
【００２５】
（１）ブロックコポリマー−金属錯体複合体
(a) ブロックコポリマー
本発明のブロックコポリマーは、少なくとも一部の側鎖にカルボキシル基を有するポリマー鎖(A)と、非荷電性親水性ポリマー鎖(B)とを構成成分として含むブロックコポリマーであって、ポリマー鎖(A)の一方の末端側に疎水性基又は水素原子が結合し、もう一方の末端側に複数本のポリマー鎖(B)が結合してなることを特徴とするものである。
本発明のブロックコポリマー中、少なくとも一部の側鎖にカルボキシル基を有するポリマー鎖(A)としては、限定はされないが、例えば、ポリアミノ酸、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（リンゴ酸）等のアニオン性ポリマーに由来するものが好ましく挙げられ、中でも、ポリアミノ酸に由来するものがより好ましく、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）に由来するものがさらに好ましい。
【００２６】
本発明のブロックコポリマー中、非荷電性親水性ポリマー鎖(B)としては、限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル及びポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）等の親水性ポリマーに由来するものが好ましく挙げられ、中でも、ポリエチレングリコールに由来するものがより好ましい。
【００２７】
ポリマー鎖(A)の一方の末端側に結合しうる疎水性基としては、限定はされないが、脂肪族化合物、芳香族化合物及び脂環式化合物に由来する基が好ましく挙げられる。
脂肪族化合物に由来する基としては、限定はされないが、例えば、未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のC1-12アルキル基が好ましく挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、デシル基、ウンデシル基等が挙げられる。
芳香族化合物に由来する基としては、限定はされないが、例えば、フェニル化合物、ナフタレン化合物、アントラセン化合物、ピレン化合物、ペリレン化合物、トリフェニレン化合物等が挙げられる。
脂環式化合物に由来する基としては、限定はされないが、例えば、コレステロール、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン等に由来する基が挙げられる。
当該疎水性基としては、上記列挙した中でも、脂環式化合物に由来する基がより好ましく、具体的にはコレステロール及びその誘導体に由来する基がさらに好ましい。
【００２８】
本発明のブロックコポリマーとしては、具体的には、下記一般式(1)で示されるものが例示できる。
【化１１】
2011105792.tif 000012
【００２９】
上記式(1)中、R1はそれぞれ独立して水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖状若しくは分枝状のC1-12アルキル基（炭素数1〜12のアルキル基）を表す。
炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
またアルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。
置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；-CHO）に転化することができる。また置換基がホルミル基、カルボキシル基又はアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその断片又はその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質等を結合させることもできる。
【００３０】
上記式(1)中、L1は、ポリマー鎖(A)とポリマー鎖(B)とのリンカー部分（連結基）を表す。
L1は、具体的には、限定はされず、任意の連結基を選択することができるが、例えば、式：-(CH2)j-NH-〔式中、jは1〜12（好ましくは1〜8）の整数を表す。〕で示される基、及び、式：-L2-(CH2)k-L3-〔式中、L2は、CH2CHCH2O、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3は、NHを表す。kは1〜5（好ましくは2〜3）の整数を表す。〕で示される基が好ましく挙げられる。
上記式(1)中、R2は疎水性基又は水素原子を表し、疎水性基としては、前述した例示と同様である。
上記式(1)中、R3はそれぞれ独立してメチレン基（-CH2-）又はエチレン基（-CH2- CH2-）を表す。
上記式(1)中、R4はそれぞれ独立して水素原子又はカルボン酸の塩を表す。カルボン酸の塩としては、限定はされないが、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００３１】
上記式(1)中、mの値は、ポリマー鎖(A)に相当するポリマー鎖部分の平均重合度を表し、具体的には、2〜1,000（好ましくは5〜500、より好ましくは10〜100）の整数である。m1及びm2の値は、それぞれ独立して0〜1,000（好ましくは0〜500、より好ましくは0〜100）の整数であり、且つ「(m1+m2) = m」を満たす整数である。nの値は、ポリマー鎖(B)に相当するPEG由来ポリマー鎖部分の平均重合度を表し、具体的には、それぞれ独立して2〜20,000（好ましくは40〜4,000、より好ましくは100〜1,000）の整数である。pの値は、連結基であるL1に結合しているPEG由来ポリマー鎖の本数、すなわち下記式(a)で示されるポリマー鎖がL1に結合している本数を表し、具体的には、2〜5（好ましくは2〜3）の整数である。
【化１２】
2011105792.tif 000013
【００３２】
上記式(1)で示されるブロックコポリマーの平均分子量（Mw）は、限定はされないが、400〜1,000,000であることが好ましく、より好ましくは2,500〜250,000である。また、個々のブロック部分については、ポリマー鎖(B)に相当するPEG由来ポリマー鎖部分の平均分子量（Mw）は、限定はされないが、ポリマー鎖１本当たり、100〜880,000であることが好ましく、より好ましくは1,800〜180,000であり、さらに好ましくは44,000〜440,000であり、ポリマー鎖(A)に相当するポリマー鎖部分の平均分子量（Mw）は、限定はされないが、750〜75,000であることが好ましく、より好ましくは1,500〜15,000である。
【００３３】
上記式(1)で示されるブロックポリマーの製造方法は、限定はされないが、概略を述べると、例えば、(a) R1とPEG由来のポリマー鎖部分とを含むセグメント（PEGセグメント；連結基であるL1を含む）を予め合成しておき、(b1) このPEGセグメントの片末端（R1と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖がカルボキシル基を含むように置換若しくは変換するか、又は (b2) 上記PEGセグメントと、カルボキシル基を含む側鎖を有するポリマー鎖部分とを予め合成してこれらを互いに連結し、その後、(c) 必要に応じて、カルボキシル基を含む側鎖を有するポリマー鎖部分のもう一端に所望の疎水性基を結合させる方法が挙げられる。当該製法において、各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。当該製造方法の具体例としては、後述する実施例に記載の合成スキームを参照することができる。なお、上記PEGセグメントは、例えば、WO 96/32434号公報、WO 96/33233号公報又はWO 97/06202号公報に記載のブロックコポリマーのPEGセグメント部分の製法を用いて調製することができる。
【００３４】
本発明においては、上記式(1)で示されるブロックコポリマーの具体例として、下記一般式(1’)で示されるコポリマーを挙げることができる。
【化１３】
2011105792.tif 000014
【００３５】
上記式(1’)中、R3及びR4については、前記式(1)の場合と同様である。
上記式(1’)中、R5は下記式(b)で示されるコレステロールに由来する基又は水素原子を表す。
【化１４】
2011105792.tif 000015
また上記式(1’)中、m、m1、m2及びnの値及び説明は、前記式(1)の場合と同様である。
【００３６】
(b) ブロックコポリマー−金属錯体複合体
本発明のブロックコポリマー−金属錯体複合体は、前記本発明のブロックコポリマーと金属錯体とを含んでなる複合体であり、後述する本発明の中空構造体キャリアの直接の構成成分となるものである。
本発明の複合体は、本発明のブロックコポリマー中のカルボキシル基（ポリマー(A)鎖の側鎖由来のカルボキシル基）と、金属錯体とが結合してなるものが好ましく、また、金属錯体に１分子に対して、当該ブロックコポリマーが複数分子結合してなるものであることが好ましい。
金属錯体としては、限定はされないが、例えば、抗腫瘍活性を有する金属錯体を用いることが好ましい。
また金属錯体としては、中心金属が、例えば、白金、銅、ニッケル、バナジウム、亜鉛、金又は鉄の金属原子であるものが好ましく、中でも白金が好ましい。金属錯体として、抗腫瘍活性を有する金属錯体を用いる場合は、中心金属が白金であるシスプラチン及びダハプラチンを用いることが好ましい。
【００３７】
本発明のブロックコポリマー−金属錯体複合体としては、下記一般式(2)で示される複合体を例示することができる。
【化１５】
2011105792.tif 000016
【００３８】
上記式(2)中、R1、L1、R2、R3及びR4については、それぞれ前記式(1)の場合と同様である。
上記式(2)中、R6は、本発明のブロックコポリマー同士を連結させる金属錯体由来の部分であり、下記式(c)又は(d)で示される構造を有する。
【化１６】
2011105792.tif 000017
上記式(b)及び(c)中、Mは白金、銅、金又は鉄の金属原子を表し、中でも白金が好ましい。
また上記式(2)中、m、m1、m2、n及びpの値及び説明については、前記式(1)の場合と同様である。
【００３９】
上記式(2)で示されるブロックコポリマー−金属錯体複合体において、ブロックコポリマーと金属錯体由来のR6との結合態様については、上記式(2)で示した態様はその一例であって、これに限定はされない。例えば、式(2)中、点線の楕円で囲った基であれば、結合可能なあらゆる態様でR6との結合を形成することができる。具体的には、当該結合態様は、(i) 式(2)で示すように2分子のブロックコポリマーがR6を介して分子間結合している態様でもよいし、(ii) ブロックコポリマー1分子内の点線で囲った基同士がR6を介して分子内結合している態様でもよいし、(iii) 上記分子間結合や分子内結合ではなく点線で囲った1つの基が1分子のR6と結合している態様でもよいし、(iv) これら(i)〜(iii)の態様が任意に混在している態様でもよく、特に限定はされないが、本発明の複合体においては、少なくとも上記(i)の結合態様を含むことが好ましい。ここで説明した上記式(2)中のブロックコポリマーとR6との結合態様については、本願明細書及び特許請求の範囲に記載の全ての一般式(2)（点線の楕円を記載がないものも含む）の複合体において同様に適用される。
【００４０】
さらに、上記式(2)中の、ブロックコポリマーと金属錯体由来のR6との結合態様については、ブロックコポリマーとR6との結合の数は、特に限定はされない。なお、上記式(2)では、2分子のブロックコポリマー中の「m1」の平均重合度を有するポリマー鎖同士が、R6と直接結合している表記となっているが、本発明において、この表記は、当該ポリマー鎖中の全ての側鎖がR6と結合しているということのみを意味するものではなく、当該ポリマー鎖中の少なくとも1つの側鎖がR6と結合しているということを意味するものである。この定義は、ブロックコポリマー中の他のポリマー鎖がR6と結合する場合も、同様に適用される。
【００４１】
本発明においては、上記式(2)で示されるブロックコポリマー−金属錯体複合体の具体例として、下記一般式(2’)で示される複合体を挙げることができる。
【化１７】
2011105792.tif 000018
【００４２】
上記式(2’)中、R3及びR4については、前記式(1)の場合と同様であり、R5については、前記式(1’)と同様である。
上記式(2’)中、R7は、前記式(2)中のR6と同様、本発明のブロックコポリマー同士を連結させる金属錯体由来の部分であり、下記式(c’)又は(d’)で示される構造を有する。なお、下記式(c’)はシスプラチン由来の構造であり、下記式(d’)はダハプラチン由来の構造である。
【化１８】
2011105792.tif 000019
また上記式(2’)中、m、m1、m2及びnの値及び説明は、前記式(1)の場合と同様である。
【００４３】
上記式(2’)で示される複合体において、ブロックコポリマーと金属錯体由来のR7との結合態様についての説明は、前記式(2)におけるブロックコポリマーとR6との結合態様の説明と同様である。上記式(2’)中のブロックコポリマーとR7との結合態様については、本願明細書及び特許請求の範囲に記載の全ての一般式(2’)（点線の楕円を記載がないものも含む）の複合体において同様に適用される。
【００４４】
（２）中空構造体キャリア
本発明の中空構造体キャリアは、前記本発明のブロックコポリマー−金属錯体複合体が会合して形成された形態のキャリアである。当該キャリアは、具体的には、会合した上記複合体が、膜構造を形成してなるものであることが好ましく、全体として、内部が中空の小胞体状の形状を有するキャリアであることが好ましい。このように、内部に中空の領域を有することにより、所望の物質を容易に内包することができる。
本発明の中空構造体キャリアは、膜構造の表面、すなわち外側及び内側のいずれの表面にも非荷電性親水性ポリマー鎖(B)（PEG由来のポリマー鎖等）が存在しており、膜構造の内部では、ポリマー鎖(A)と金属錯体との結合により膜構造が安定化され、また少なくとも一部に疎水性基が存在するため、膜全体の構造、ひいてはキャリア全体の構造が非常に安定性に優れている。そのため、本発明のキャリアは、従来のキャリアでは困難であった水溶性物質、特に高分子量の水溶性物質（具体的には、水溶性タンパク質）であっても内包することができるという特徴を有するものである。
【００４５】
本発明の中空構造体キャリアは、前記本発明のブロックコポリマーと、金属錯体とをそれぞれ溶解させ攪拌することで調製することができる。すなわち、本発明の中空構造体キャリアは、結果的には、本発明のブロックコポリマーと金属錯体との複合体が会合した形態を有する構造体であるが、当該複合体を予め調製しておいてそれを会合させて得られたものではなく、当該複合体の形成時における本発明のブロックコポリマーと金属錯体との結合反応を駆動力として、当該複合体の形成とともに会合体の形成もなされ、前述したような形状の中空構造体キャリアとして最終的に形成されたものである。
【００４６】
なお、本発明の中空構造体キャリアの調製に用いるブロックコポリマーとしては、前記ポリマー鎖(A)に疎水性基が結合しているものが少なくとも一部含まれていればよく、限定はされないが、例えば、使用するブロックコポリマーの総分子数に対して、ポリマー鎖(A)に疎水性基が結合しているブロックコポリマーの分子数が、1〜99％であることが好ましく、より好ましくは3〜60％である。ポリマー鎖(A)に疎水性基が結合しているブロックコポリマーの割合が上記の範囲であると、中空構造体のキャリアが安定して得られやすい。また、本発明の中空構造体キャリアの調製の際は、ブロックコポリマーと金属錯体との反応系に、予め又は反応の進行と共に、疎水性化合物を単体で添加してもよい。当該単体の疎水性化合物としては、ポリマー鎖(A)に結合し得る疎水性基として例示した基の由来化合物、具体的には脂肪族化合物、芳香族化合物及び脂環式化合物並びにそれらの誘導体が挙げられ、中でも脂環式化合物が好ましく、特にコレステロールまたはその誘導体が好ましい。上記反応系への疎水性化合物の添加量は、限定はされず、中空構造体の安定形成を考慮して適宜設定することができる。
【００４７】
本発明の中空構造体キャリアの単離及び精製は、常法により、水性媒体中から回収することができる。典型的な方法としては、限外濾過法、ダイアフィルトレーション、透析方法等が挙げられる。
また、本発明の中空構造体キャリアは、徐放性を有するものである。具体的には、形成された本発明のキャリアが、例えばNaCl等の塩化物イオンの存在下におかれると、本発明のブロックコポリマーと金属錯体との結合が徐々に解かれ、内包物質が徐放される。本発明のキャリアの徐放性のレベルは、限定はされないが、例えば、1分〜1ヶ月の期間で徐放可能である。
本発明の中空構造体キャリアの平均粒径は限定されないが、50〜1,000nmである。EPR効果による腫瘍組織選択性（腫瘍組織集積性）持たせるためには、例えば、動的光散乱測定法（DLS）による粒径が50〜200nmであることが好ましい。
【００４８】
３．癌治療用医薬組成物、癌診断用医薬組成物
本発明においては、前記本発明の中空構造体キャリアを含むことを特徴とする、癌治療用及び／又は癌診断用医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、中空構造体キャリアに内包する物質（抗腫瘍活性を有するタンパク質等）や、キャリアを構成する膜内に存在する金属錯体（例えばシスプラチンやダハプラチン）と、キャリア自身の特性である腫瘍組織選択性（腫瘍組織集積性）を利用することにより、癌（悪性腫瘍）の治療手段、及び／又は癌（悪性腫瘍）の診断・検出手段として使用することができる。また、キャリアの内包物質として、放射線のターゲットとなる感受性物質用いれば、放射線療法の手段として用いることもできる。腫瘍の種類は、限定はされず、公知の各種癌種を挙げることができる。
本発明の医薬組成物において、中空構造体キャリアの含有割合は、限定はされず、内包する物質の種類や抗腫瘍効果を勘案して適宜設定することができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態のほか、組成物の使用目的に応じて、適宜設定することができる。例えば、抗腫瘍用効果を得ることを目的として、ヒトに静脈内投与をする場合の用量は、実験動物またはボランティアによる小実験を行い、それらの結果を考慮して、さらには患者の状態を考慮して専門医が決定するのが好ましく、限定はされないが、一般には、１日１回、1.0〜1,000 mg/m2（患者の体表面積）とすることができ、また、10〜200 mg/m2（患者の体表面積）を１日１回、数日間連続投与し、一定期間休薬するか、あるいは、50〜500 mg/m2（患者の体表面積）を１日１回投与した後、数日間休薬する等、投与スケジュールにより、適当な用量を選択することができる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、抗腫瘍用といった用途を勘案し、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
本発明においては、また、前記本発明の中空構造体キャリアを患者に投与することを特徴とする癌の治療及び／又は診断方法、癌の治療及び／又は診断をするための前記本発明の中空構造体キャリアの使用、並びに、癌の治療及び／又は診断用の薬剤を製造するための前記本発明の中空構造体キャリアの使用、さらには前記本発明の中空構造体キャリアを含む癌の治療及び／又は診断用キット等に係る発明についても同様に提供することができる。
【００５１】
４．腫瘍組織検出用組成物、腫瘍組織イメージング用組成物
本発明においては、前記本発明の中空構造体キャリアを含むことを特徴とする、腫瘍組織検出用及び／又は腫瘍組織イメージング用組成物が提供される。本発明の組成物は、中空構造体キャリアに内包する物質として腫瘍組織の検出やイメージングに有効な物質を選択し、キャリア自身の特性である腫瘍組織選択性（腫瘍組織集積性）を利用することにより、腫瘍組織の検出やイメージング手段として使用することができる。腫瘍組織の検出やイメージングに有効な物質としては、限定はされないが、各種蛍光タンパク質などの蛍光検出及び蛍光イメージング技術において用いられる各種タンパク質を用いることができ、好ましくはGFP（緑色蛍光タンパク質）若しくはルシフェラーゼ又はそれらの誘導体や変異体を用いることができる。検出やイメージングの対象となる腫瘍の種類は、限定はされず、公知の各種癌種を挙げることができる。なお、本発明の組成物は、in vivoでの腫瘍組織の検出やイメージングにも好適に用いることが可能である。
【００５２】
本発明の組成物において、中空構造体キャリアの含有割合は、限定はされず、内包する物質の種類等を勘案して適宜設定することができる。
本発明の組成物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物における腫瘍組織の検出及びイメージングに適用することができ、限定はされない。当該検出及びイメージングを行う際は、被験動物への投与が必要となるが、投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態のほか、組成物の使用目的に応じて、適宜設定することができる。
本発明の組成物は、抗腫組織の検出及びイメージング用という用途を勘案し、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することもできる。また、本発明の組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
【００５３】
本発明の組成物の投与後における、腫瘍組織の検出及びイメージングに用いる装置は、特に限定はされず、蛍光顕微鏡やFACS等の従来蛍光イメージング技術において汎用されている装置等を適宜組合せて用いることができる。
本発明においては、また、前記本発明の中空構造体キャリアを用いる（具体的には被験動物に投与する）ことを特徴とする腫瘍組織の（in vivoでの）検出及び／又はイメージング方法、前記本発明の中空構造体キャリアを含む癌の治療及び／又は診断用キット等に係る発明についても同様に提供することができる。
【００５４】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
１．材料及び方法
＜PEGasus-b-P(Glu)-Cholの合成＞
下記のスキームの手順に従い、本発明のブロックコポリマーに相当するPEGasus-b-P(Glu)-Chol（化合物6）を合成した。なお、スキーム中のm及びnの値及び説明は、前述した一般式(1)等と同様である。
【化１９】
2011105792.tif 000020
【００５６】
Fuchs-Farthing法により、g-benzyl L-glutamate のN-carboxy anhydride（BLG-NCA；化合物2）を得た。PEGasus-b-poly(g-benzyl L-glutamate)（PEGasus-b-PBLG；化合物3）は、末端をアミノ化したPEGasus-NH2（Mw 20k；化合物1）を開始剤としたNCAの開環重合により得た。PEGasus-b-PBLG（化合物3）の分子量分布はGPC測定より求めた。PBLG（poly(g-benzyl L-glutamate)）の分子量は1H-NMRよりPEGのメチレンユニットの水素とPBLGのフェニル基の水素の比から算出し、20量体と見積もられた。PEGasus-b-PBLG（化合物3）のアミノ基末端に、室温にて、cholesteryl chloroformate（化合物4）を反応させ、PEGasus-b-PBLG-Chol（化合物5）を得た。コレステロール含有率は1H-NMRより求めた。PEGasus-b-PBLG-Chol（化合物5）を室温にて0.5 N NaOHと反応させることでPBLGセグメントの脱保護を行い、PEGasus-b-P(Glu)-Chol（化合物6）を得た。脱保護反応は1H-NMRより完全に進行したことを確認した。以上より、本発明のブロックコポリマーに相当するPEGasus-b-P(Glu)-Chol（化合物6）を得た。得られたPEGasus-b-P(Glu)-Cholは、PEG鎖の平均分子量（Mw）が20,000、ポリグルタミン酸の平均重合度が20であった。
【００５７】
＜Pt-someの調製＞
本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-someを調製し、その物性を確認した。
DACHPt(NO3)2 (5 mM)を蒸留水に溶解させ、これにPEGasus-b-P(Glu)-Chol ([Glu] = 5 mM)も溶解させて120時間攪拌することで、中空構造体キャリアに相当するPt-someを得た。得られたPt-someは、透析及び分画分子量300,000の限外濾過膜を用いて精製した。
FITC-dextran又はAlexa 680-dextranを内包するPt-someは、それぞれ、2mg/mlのFITC-dextran又はAlexa 680-dextranの存在下で、PEGasus-b-P(Glu)-CholとDACHPtとを反応させることにより調製した。精製は透析により未反応のDACHPtを除去し、限外濾過により内包されなかったdextranを除去した。dextranのPt-someへの内包は、GPCを用い、Pt-someを220nmの吸収で、FITC-dextranを蛍光検出（励起495nm、発光521nm）することにより確認した。蛍光dextranの内包量は、紫外可視分光光度計を用い、色素の吸収より求めた。
【００５８】
＜DACHPt及び蛍光ラベル化dextranの徐放挙動＞
DACHPtの徐放は透析法を用いて検討した。1mlのPt-some溶液を透析袋（MWCO:2,000）に入れ、37℃で10mM PBS及び150mM NaClの溶液99mlに対し透析を行った。一定時間毎に外液をサンプリングし、ICP-MS（誘導結合プラズマ質量分析装置）によりPt濃度を測定した。Pt-someからのAlexa 680-dextranのリリースは限外濾過により見積もった。Alexa 680-dextranを内包したPt-some溶液3mlと、20ｍM PBS及び300ｍM NaCl溶液3mlとを混合し、一定時間毎に蛍光強度を測定した。
【００５９】
＜体内動態＞
体内動態は、C-26細胞(1 x 106cells/ml)をCDF1マウス(female, n=6) に皮下移植し、14日後のマウス（担癌モデルマウス）に対して行った。Pt換算で100μg/mouseのオキサリプラチン又はPt-someを尾静脈より投与した。また内包物質の送達を検討するため、FITC-dextran 0.25mg/mlを内包したPt-someも同様に尾静脈より投与した。コントロールとして、FITC-dextranのみ（0.25mg/ml）と、空のPt-some及びFITC-dextran（0.25mg/ml）とを投与した。投与後1、4、24時間後にマウスを犠牲死させ、腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓の組織を取り出した。血漿は下大静脈より血液を採取、ヘパリン化し、遠心することで得た。Pt集積量は、組織を硝酸に溶解、乾燥後、塩酸に再溶解させ、ICP-MSによりPt濃度を測定した。FITC-dextranの集積量は、ホモジナイズした各組織の蛍光強度より測定した。蛍光のバックグラウンドとして未処理のマウスの各臓器の蛍光強度を測定した。
【００６０】
＜Alexa 680-dextran内包Pt-someによるin vivoイメージング＞
上記と同様に作製した担癌モデルマウスに対し、Alexa 680-dextranのみ又はAlexa 680-dextran内包Pt-someを投与した。IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, USA)を用い、in vivoイメージングを行った。
【００６１】
＜制癌活性＞
C-26細胞皮下移植後、1週間経過後（腫瘍サイズ: 30 mm3）のマウスに対し、2日おきに3度オキサリプラチン（8、10mg/kg、Pt換算）及びPt-some（6mg/kg、Pt換算）を投与した。制癌活性は腫瘍体積（V = a×b2/2；a:長軸、b:短軸）から求めた。全身毒性の指標としてマウスの体重を測定した。
【００６２】
２．結果及び考察
＜Pt-someの調製＞
本発明の中空構造体キャリアに相当するPt-some（メタロソーム）は、制癌剤オキサリプラチンの活性体であるダハプラチン（DACHPt）のPtと二本鎖PEG-ポリグルタミン酸-コレステロール基(Y-shaped poly(ethylene glycol)-poly(glutamic acid)-cholesterol, PEGasus-b-P(Glu)-Chol)におけるグルタミン酸残基のカルボン酸との間の高分子-金属間錯体形成により水中で形成された（PEGasus；Mw 20,000Da, P(Glu)重合度；20、［COOH］＝5ｍM）(図1A)。動的光散乱測定（DLS）から、形成されたPt-someは約120nmを中心とする狭くかつ単一な粒径サイズ分布を有することが確認された（図1B）。PEG-P(Glu)とDACHPtからなる高分子ミセルのサイズが35nmであることから、この構造体は高分子ミセルではない別のものであることが示された。この構造体の透過型電子顕微鏡（TEM）観察では、球殻がつぶれた様な形態がみられ（図1C）、この構造体が中空であることが示された。PEG-P(Glu)とDACHPtからなる高分子ミセルのTEM像は球状の点として観測されることから(図1E a)、この構造体は高分子ミセルとは明らかに異なるものであることがわかる。また凍結位相差TEM像(図2E)では、明確な膜構造が観測され、これにより中空構造であることが支持された。膜構造は電子密度の高いP(Glu)-Chol/DACHPt層によるものであると推測され、膜厚はおよそ10nmと見積もられた。以上のことからPt-someが中空構造体であるベシクル構造であることが示された。
【００６３】
中空構造体であるPt-someは、コレステロール(Chol)基のないPEGasus-b-P(Glu)とDACHPtとの組み合わせや、一本鎖PEG（Mw 12k）からなるブロック共重合体との組み合わせ（PEG-P(Glu)-Chol/DACHPt）では形成されない（図1E）ことから、ベシクル構造形成には、少なくとも2本のPEG鎖と、疎水性基が必要であると考えられた。おそらく、二本鎖PEGによる大きな排除体積がPEG相とP(Glu)/Pt/Chol層との界面を押し広げた結果、界面曲率の大きい高分子ミセル構造ではなくラメラ構造になったものと考えられた。二本鎖PEGと、疎水性が高く潜在的に液晶形成する傾向にあるコレステロール基がPEGasus-b-P(Glu)-Cholに配置されていることによってPt-someのラメラ構造が安定化し、ベシクル形成に寄与しているものと考えられた。
【００６４】
Pt-someがベシクル構造であることは内部空間への親水性物質の内包ができたことからも支持された。FITCをラベル化したデキストラン（FITC-dextran 10,000 Da）存在下でPEGasus-b-P(Glu)-CholとDACHPtとからPt-someを調製した。Pt-someに内包されなかったFITC-dextranは限外濾過により除去した。FITC-dextranのベシクル内への内包の確認はGPCを用い、UV吸収検出器及び蛍光検出器により検討した。FITC-dextran(フリー)のみでは遅い溶出時間(35分)であったが、ベシクル内に内包されたFITC-dextranの蛍光はPt-someと同じ早い溶出時間（13分）に観測された(図1D)。この結果はFITC-dextranがPt-some内に内包されていることを示すもので、Pt-someの中空構造を支持するとともに、親水性物質のキャリアとしてのPt-someの高いポテンシャルを示すものであった。
Pt-some中のDACHPtとFITC-dextranとの内包量をICP-MSおよび蛍光分光光度計を用いて検討した。Pt-someの膜中のDACHPt内包量はポリマーの10wt％と見積もられた。これは、P(Glu)のカルボン酸のおよそ50％がPtとコンプレックス化されていることになる。また、Pt-some調製時に加えたDACHPtの10％がPt-someに取り込まれたことになる。Pt-someへのFITC-dextranの内包量は、ポリマーの20wt％と見積もられ、これはPt-some調製時に加えたFITC-dextranの24％が実際に内包されたことになる。
【００６５】
＜DACHPt及び蛍光ラベル化dextranの徐放挙動＞
Pt-someは、表面がPEGに覆われており、またサイズが120nmであることから長期血中滞留性とEPR効果に基づく腫瘍への高集積性（高選択性）が期待された。またPt-someの形成駆動力は金属錯形成であるため、塩化物イオン非存在下での高い構造安定性による薬剤担持と、標的サイトでの持続的徐放特性が期待された(図2A)。すなわち、Pt-someは水中においてDACHPt、内包デキストランを放出しないものの、塩化物イオン存在下ではカルボン酸と塩化物イオンとの配位子交換反応により、DACHPtを徐放し、続いて内包物質を徐放することが期待された。実際、10mM PBS, 150mM NaCl, pH 7.4, 37°Cの生理条件下においてPt-someからのPtの徐放が認められ、96時間後に初期搭載量の50％以上のPtの放出が確認された(図2B)。また、Pt-some内水相に内包されたFITC-dextranは、12時間の誘導時間の後、徐放された(図2C)。初期の誘導時間はPtとP(Glu)との解離反応によるもので、P(Glu)-Chol/DACHPt層からDACHPtが抜けることで膜透過性が向上し、内包デキストランの徐放が始まったものと考えられた。この誘導時間は、キャリアの腫瘍への集積の後に内包物質の徐放が始まることとなり、腫瘍選択的送達という点で非常に有用な特性であると考えられた。また、FITC-dextranの数日間にわたる徐放プロファイルから、Ptがかなり抜けた後もPt-some構造が保たれていることが示された。これは生理条件下においてPt-someが長期にわたり粒径80〜90nmを維持していることからも支持された(図2D)。さらに凍結位相差TEM観察から、生理条件下48時間後においてもPt-someの膜構造が観察され、ベシクル構造が保持されていることが確認できた（図2E）。また、凍結位相差TEM観察において、生理条件下に0時間及び48時間おいたものではP(Glu)-Chol/DACHPt層のコントラストが異なっていた。これはTEM像においてコントラストはPt濃度に大きく依存することから、NaClとの48時間接触によるDACHPtの徐放により、P(Glu)-Chol/DACHPt層のコントラストが低下したものと考えられた。徐放プロファイルからは、48時間後において初期内包量の40％が放出されたと見積もられた(図2B)。
【００６６】
＜体内動態＞
Pt-someの構造安定性と血中での長期滞留性は、制癌剤のみならず親水性薬物の同時送達を可能とする新規全身投与型キャリアとして期待された。そこで固形癌へのDACHPtとFITC-dextranとの同時送達（co-delivery）を試みた。マウス大腸癌（C-26）を皮下移植したCDF1マウスに対し、DACHPtとFITC-dextranとを内包したPt-someの体内動態を検討した。Pt濃度をICP-MSにより、FITC-dextranを蛍光測定により集積性を検討した。Pt-someを尾静脈より投与後、一定時間毎に血液および腎臓、肝臓、脾臓、腫瘍の各組織を採取し、Pt量とFITCの蛍光強度を測定した。血中滞留性評価では、オキサリプラチンおよびFITC-dextranの単独投与では投与後速やかに血中より消失するのに対し(図3A、図3B)、Pt-someに内包し投与した場合、投与後24時間においてもPt濃度で投与量の5％以上(図3A)、蛍光強度で投与量の10％以上(図3B)が、血中より観測された。また、空のPt-someとFITC-dextranとを共に投与したときの血中滞留性は（FITC蛍光強度を観測）、FITC-dextran単独投与と同様の結果となり、長期血中滞留性はFITC-dextranがPt-someに内包されていることに起因していることが示された。続いて、腫瘍組織のPt濃度およびFITCの蛍光強度からPt-someの腫瘍集積性を評価した。フリーのオキサリプラチン、FITC-dextranでは腫瘍選択的集積は認められなかったが、Pt-someにおいては時間と共に腫瘍への選択的集積が認められた（図3C、図3D）。これはEPR効果によるものと推察され、Pt-someの高い血中滞留性を示すものである。各臓器に対するPt-someの組織集積性は、わずかに肝臓にPtが観測されるものの、腫瘍への選択的集積性が認められた。特にPt-someに内包したFITC-dextranでは腫瘍選択的送達が認められた（表１参照）。
【００６７】
【表１】
2011105792.tif 000021
【００６８】
＜Alexa 680-dextran内包Pt-someによるin vivoイメージング＞
癌の診断において腫瘍を非侵襲的にイメージングすることは重要である。Pt-someのもつ高い腫瘍集積性は、非侵襲的な腫瘍選択的イメージングを可能とするものと考えられた。マウス尾静脈よりAlexa680-dextran（10,000Da）を内包したPt-someおよびAlexa 680-dextran単独を投与し、in vivo近赤外領域の蛍光イメージングを行った。その結果、Alexa 680-dextran単独投与では腎臓に強い蛍光が観測されたが、腫瘍には蛍光が観測されなかった。一方Alexa680-dextranを内水相に担持したPt-someの投与は、腫瘍選択的にイメージングが認められた（図3E）。これは固形癌を診断及び検出するナノデバイスとしてPt-someの高い資質を示すものであった。
【００６９】
＜制癌活性＞
Pt-someは、in vitro実験で示されるように、DACHPt徐放による細胞毒性を示した（表２参照）。したがって、Pt-someは腫瘍イメージングと共に、制癌活性が期待できると考えられた。
【表２】
2011105792.tif 000022
【００７０】
C-26担癌マウス（CDF1）に対し、フリーのオキサリプラチン（Pt換算8、10 mg/kg）およびPt-some（Pt換算6mg/kg）を2日おきに3回尾静脈より投与し、制癌活性を調べた。フリーのオキサリプラチンではどちらの投与量においても腫瘍増殖の抑制を示さず（図4A）、投与量10 mg/kgでは毒性のため3度目の投与（8日目）で死亡してしまった（図4B）。一方、Pt-some（6 mg/kg）は明らかな腫瘍増殖抑制効果がみられ（図4A）、かつ全身毒性に基づく大きな体重減少は認められなかった（図4B）。これはPt-someのEPR効果に基づく高い腫瘍選択性（腫瘍集積性）のためであると考えられた。複数の薬剤を搭載、送達できるPt-someは、種々の制癌剤の同時送達による併用療法や、イメージング剤を同時に運ぶことで治療効果をリアルタイムに診断するといった新しい治療戦略が可能となり、今後大きな期待が持たれるものと考えられた。
【図１Ａ】
2011105792.tif 000033
【図１Ｂ】
2011105792.tif 000034
【図１Ｃ】
2011105792.tif 000035
【図１Ｄ】
2011105792.tif 000036
【図１Ｅ】
2011105792.tif 000037
【図２Ａ】
2011105792.tif 000038
【図２Ｂ】
2011105792.tif 000039
【図２Ｃ】
2011105792.tif 000040
【図２Ｄ】
2011105792.tif 000041
【図２Ｅ】
2011105792.tif 000042
【図３Ａ】
2011105792.tif 000043
【図３Ｂ】
2011105792.tif 000044
【図３Ｃ】
2011105792.tif 000045
【図３Ｄ】
2011105792.tif 000046
【図３Ｅ】
2011105792.tif 000047
【図４Ａ】
2011105792.tif 000048
【図４Ｂ】
2011105792.tif 000049