(57)【要約】【課題】  効率良く４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法を提供すること。【解決手段】  （１）（イ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とアルデヒドを接触させる工程、及び（ロ）次いで前記ニトリルをニトリルヒドラターゼによりアミド化する工程、を含む４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。（２）（イ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とアルデヒドを接触させる工程、（ロ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とコバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は錯体を接触させる工程、及び（ハ）工程（イ）及び（ロ）の後に、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼによりアミド化する工程、を含む４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
（イ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とアルデヒドを接触させる工程、及び
（ロ）次いで、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼによりアミド化する工程
【請求項２】
下記工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
（イ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とアルデヒドを接触させる工程、
（ロ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とコバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は錯体を接触させる工程、（ハ）工程（イ）及び（ロ）の後に、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼによりアミド化する工程
【請求項３】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアニドドナーとから、ハロヒドリンエポキシダーゼの作用により製造されたものである請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドは、カルニチンの原料（カルニチン製造の際の中間体）として重要である。４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法としては、例えば、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを水和する方法が挙げられる。当該水和反応は、（Ｉ）塩酸などの鉱酸やアルカリを使用する方法、（ＩＩ）アルカリと過酸化水素を併用する方法などにより行われている。しかしながら、これらの方法は工程が煩雑である、対応する酸が副生し収率が低下するといった問題がある（特許文献１参照）。また、生物学的反応としては、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させて、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法が知られている（特許文献２参照）。
【０００３】
一方、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの前駆体である４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法としては、（ｉ）エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法（特許文献３参照）、（ｉｉ）エピハロヒドリンと青酸を反応させる方法（特許文献４参照）、（ｉｉｉ）１，３−ジハロ−２−プロパノールに青酸又は青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法（特許文献５参照）、（ｉｖ）エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩とを酵素触媒下で反応させる方法（特許文献６参照）、（ｖ）１，３−ジハロ−２−プロパノールと青酸又は青酸のアルカリ金属塩とを酵素触媒下で反応させる方法（特許文献７〜１０参照）が知られている。酵素反応で使用する酵素としては、ハロヒドリンエポキシダーゼが使用されている。当該酵素反応によれば、生成する４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが光学活性体であり、特に有用である。
【０００４】
このようにして製造された４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む反応液中には、未反応の青酸及びその他の原料が残存する。引き続いてニトリルヒドラターゼによりアミド化反応を実施しようとする場合、残存している青酸及びその他の原料によりニトリルヒドラターゼが失活するため、反応効率が非常に低くなる。
【０００５】
従って、通常、上述の製造方法によって生成した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、反応液から有機溶媒で抽出し、減圧下に溶媒を青酸と共に除去し、必要によりさらに蒸留するという公知の方法により精製した後、ニトリルヒドラターゼによる４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミド製造工程に供される。
【０００６】
しかし、上述の方法では有機溶媒の使用並びに抽出及び蒸留精製にかかるコスト面・環境面の負担が大きく、工業的に好適であるとはいえなかった。また、蒸留などの方法により青酸及びその他の原料を除去しても、アミド化反応の反応速度が非常に遅く、反応速度を上昇させるためには大量のニトリルヒドラターゼを必要とする場合があった。
【０００７】
そこで、本発明者は、ニトリル化合物中に極微量に含まれる青酸を金属やアルカリ処理による化学的方法により低減させる方法（特許文献１０参照）や、ニトリル化合物に加熱処理を行うことによりアミド化反応を効率的に進行させる方法（特許文献１１参照）を提案しているが、未だ反応効率は不十分であり、更に効率を高くすることが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０１−２８７０６５号公報
【特許文献２】特開平０４−３６５４９１号公報
【特許文献３】特開昭６３−３１６７５８号公報
【特許文献４】特開２００２−２４１３５７号公報
【特許文献５】特開平０５−２１９９６５号公報
【特許文献６】特開平０３−０５３８９０号公報
【特許文献７】特開平０３−０５３８８９号公報
【特許文献８】特開２００１−０２５３９７号公報
【特許文献９】特開２００８−０１７８３８号公報
【特許文献１０】特開２００８−１３１８６１号公報
【特許文献１１】特開平１１−１２３０９８号公報
【特許文献１２】特開２００８−６７６２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、効率良く４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液と、（ａ）アルデヒド、又は（ｂ）アルデヒドと、コバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は錯体とを接触させることにより、効率良く４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法に関する；（イ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とアルデヒドを接触させる工程、及び
（ロ）次いで、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼによりアミド化する工程。また、本発明は、以下の工程を含む４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法に関する；（イ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とアルデヒドを接触させる工程、（ロ）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液とコバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は錯体を接触させる工程、
（ハ）工程（イ）及び（ロ）の後に、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼによりアミド化する工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、効率良く４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
本発明で使用する４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、市販されているものを使用することもできるし、公知又は新規な方法で製造したものを使用することもできる。
【００１４】
公知の方法としては、例えば、（イ）特開昭６３−３１６７５８号公報に示されるような、エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法；（ロ）特開２００２−２４１３５７号公報に示されるような、エピハロヒドリンと青酸を反応させる方法；（ハ）特開平５−２１９９６５号公報に示されるような、１，３−ジハロ−２−プロパノールに青酸または青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法；（ニ）特開平０３−０５３８９０号公報に示されるような、エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩とを酵素触媒下で反応させる方法；（ホ）特開平０３−０５３８８９号公報、特開２００１−０２５３９７号公報、特開２００８−０１７８３８号公報に示されるような、１，３−ジハロ−２−プロパノールと青酸または青酸のアルカリ金属塩とを酵素触媒下で反応させる方法を挙げることができる。
【００１５】
これらの中でも、（ハ）で得られる４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを好適に使用することができる。当該方法によれば、収率が高く、また、不純物も抑制された４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを使用することができるからである。
【００１６】
上記４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの光学活性の種類は限定されない。例えば、光学的に純粋なＬ体又はＲ体の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、ラセミ体の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、光学活性に偏りがある（Ｌ体又はＲ体のどちらかがもう一方よりも多く含まれる）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを使用することができる。好ましくは、Ｒ−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
【００１７】
本明細書において、エピハロヒドリン、１，３−ジハロ−２−プロパノール、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの「ハロ」とは、ハロゲン元素を示す。より詳細にはフッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）、ヨウ素原子（Ｉ）を示す。好ましくは塩素、臭素であり、より好ましくは塩素である。
【００１８】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとしては、(Ｒ)−４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、(Ｒ)−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、(Ｒ)−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、(Ｒ)−４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリルが挙げられる。好ましくは、(Ｒ)−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、(Ｒ)−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルであり、より好ましくは(Ｒ)−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
【００１９】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液中の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの濃度は、後の工程で十分なアミド化が行われれば限定されない。例えば、０．１〜５０質量％が好ましく、より好ましくは５〜４０質量％、更に好ましくは１０〜３０質量％とすればよい。
【００２０】
上記方法により得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、反応終了後の溶液（反応液）をそのまま使用することができる。また、上記反応液を濃縮した濃縮液、反応終了後の溶液からニトリルを抽出した抽出液、更にカラムクロマトグラフィー等の常法により精製された精製物等、いずれも使用することができる。どの状態のものを選択するかは、アミド化反応の際に使用するニトリルヒドラターゼの反応速度及び酵素の使用量等を考慮し、適宜選択することができる。
【００２１】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが酵素反応により製造されたものである場合、溶媒（溶液）中には使用した酵素由来の固形物が存在する。この場合は、当該固形物が残存したまま使用しても良いし、除去してから使用することもできる。当該固形物を除去する場合には、ろ過や遠心分離といった公知の方法によって行うことができる。
【００２２】
溶液中のシアンイオンは、極力低減することが好ましい。例えば、その濃度は１０００ｐｐｍ以下とすることが好ましい。１００ｐｐｍ以下とすることがより好ましく、１０ｐｐｍ以下とすることが更に好ましい。１０００ｐｐｍ以下とすることにより、後の工程のアミド化反応において酵素活性の阻害を防ぐことができる。溶液中のシアンイオン濃度が１０００ｐｐｍ以上である場合には、蒸留することにより濃縮し、シアンイオンを除去することができる。
【００２３】
濃縮を行う際、シアンイオンの除去効率を上げ、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐために、蒸留ボトムを中性ないし酸性に維持することが好ましい。蒸留ボトムのｐＨは７以下が好ましく、５以下がより好ましい。ｐＨの下限については特に限定されないが、ｐＨは０以上とすることが好ましく、２以上とすることがより好ましい。
【００２４】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液の溶媒の種類は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが十分に溶解し、且つ、後の工程のアミド化反応において十分な効率が得られれば限定されない。水、有機溶媒又はこれらの混合物を使用することができる。後の工程で酵素反応を行うことから、水が好ましい。例えば、上述したように得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む水溶液を、そのまま使用することができる。また、必要に応じて、濃縮等により濃度を調整したり、精製したりしてから使用することも可能である。
【００２５】
有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、オクタンなどの炭化水素系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、メタクリル酸メチルなどのエステル系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テロラヒドロフラン、ジメチルスルフォキシド等の有機溶媒が挙げられる。
【００２６】
有機溶媒は単一のものを単独で用いることもできるし、複数のものを混合して用いることもできる。複数の溶媒を混合して用いる場合、その種類や混合比は限定されず、適宜選択することができる。水と有機溶媒の混合物を溶媒として使用する場合も、その混合比等は限定されない。
【００２７】
（２）（ａ）アルデヒド、又は（ｂ）アルデヒドとコバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は錯体との添加  
本発明では、上記４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液（以下、単に「溶液」と呼ぶことがある。）にアルデヒドを添加した後に、アミド化反応を行う。または、上記溶液に、アルデヒドと、コバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は錯体（以下、「金属塩等」ということがある。）とを添加した後に、アミド化反応を行う。効率よくアミド化反応が進行するからである。
【００２８】
（２−１）アルデヒド
本発明で使用するアルデヒドとしては、溶媒に溶解し、アミド化反応を促進できるアルデヒドであれば特に限定されない。ホルムアルデヒド（ホルマリン）、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド等の脂肪族アルデヒド、又は、ベンズアルデヒド、サリチルアルデヒド等の芳香族アルデヒドが挙げられる。これらのアルデヒドの中でも、水溶性が高い、取り扱い、安い等の点からホルムアルデヒド（ホルマリン）が好ましい。
【００２９】
アルデヒドは、溶液の撹拌下に添加することもできるし、添加してから撹拌することもできる。撹拌速度及び撹拌時間もまた限定されず、実施条件などに応じて適宜選択することができる。アルデヒドは、一度に全量を反応液に添加することもできるし、分割して添加してもよい。
【００３０】
アルデヒドを添加する量は特に限定されず、アミド化反応を実施する際に、ニトリルヒドラターゼの失活が生じない範囲の量を添加することができる。アルデヒドとしてホルムアルデヒド（ホルマリン）を用いる場合、ホルムアルデヒドの濃度が、アミド化反応における反応液中において、０．１〜１０，０００ｐｐｍとすることが好ましく、より好ましくは１〜２,０００ｐｐｍ、更に好ましくは１０〜５００ｐｐｍとなるように添加する。
【００３１】
アルデヒドを添加する際の溶液のｐＨは６〜９とするのが好ましく、より好ましくは７〜８．５である。ｐＨを６以上とすることにより、アミド化反応を促進させることができるので好ましい。また、ｐＨを９以下とすることにより、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐことができるので好ましい。
【００３２】
ｐＨ調整の時期は特に限定されず、アルデヒドの添加の前であってもよく後であってもよい。
【００３３】
ｐＨの調整に用いるアルカリは、金属シアン化物を使用せず、ハロゲン化水素と塩を形成し、その塩を含む水溶液において酵素活性が充分に発揮されるｐＨ領域に調整できるものであれば特に限定されない。例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニアの弱酸との塩が挙げられる。中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。アルカリの使用形態は特に限定されないが、取り扱いの容易さから水溶液とすることが好ましい。アルカリの使用形態は特に制限されないが、取り扱いの容易さから水溶液とすることが好ましい。
【００３４】
アルデヒドの添加の際、溶液の温度は特に限定されないが、例えば０〜５０℃が好ましく、０〜３０℃がより好ましい。この温度範囲内にある場合には、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの安定性が保たれるからである。
【００３５】
アルデヒドを全量添加した後、アミド化反応に供するまでの処理時間については、特に限定されない。例えば、アルデヒドを添加し終えてから５分以上経過してからアミド化に供するのが好ましく、１０分以上経過してからアミド化反応に供するのがより好ましい。処理時間の上限は特に限定されないが、１年以内とすることができ、１ヶ月以内がより好ましい。
【００３６】
アルデヒドを添加した後、ｐＨを７〜８．５に調整し、維持したままアミド化反応に供することが好ましい。アルデヒドを添加した後、ｐＨが７未満に低下した場合はアルカリを添加することによりｐＨを７〜８．５に調整し、１秒以上、好ましくは５分以上この範囲に維持したままアミド化反応に供すればよい。
【００３７】
ｐＨが６未満の状態でニトリルヒドラターゼを添加しアミド化反応を開始することも可能であるが、その場合は、反応開始後１時間以内にｐＨを７〜８．５に調整することが好ましく、より好ましくは３０分以内、更に好ましくは１５分以内にｐＨを７〜８．５に調整すればよい。
【００３８】
（２−２）金属塩及び／又は金属錯体
本発明では、アミド化酵素反応を効率良く進行させるために、アルデヒドだけでなく、必要に応じて金属塩等を添加することもできる。
【００３９】
添加する金属塩等としては、コバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩及び／又は金属錯体が好ましい。金属塩等の形態としては、特に限定されないが、例えば、ハロゲン化物塩、硝酸塩、カルボン酸塩、アクア錯体、アンミン錯体等が挙げられる。より詳細には、塩化コバルト、塩化コバルト(II)六水和物、硫酸アンモニウムコバルト(II)六水和物、酢酸コバルト、酢酸コバルト(II)四水和物、塩化クロロペンタアンミンコバルト(III)、硝酸コバルト、硝酸コバルト(II)六水和物、塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、塩化ニッケル、塩化ニッケル(II)六水和物、硝酸ニッケル、硫酸ニッケル(II)アンモニウム六水和物、塩化ヘキサアンミンニッケル(II)、酢酸ニッケル(II)四水和物、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛一水和物、酢酸亜鉛二水和物、硝酸亜鉛六水和物等が挙げられる。こられは単独で使用することもできるし、２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００４０】
これら金属塩等を使用する形態は限定されない。固体として溶液に添加することもできるし、水溶液として添加することもできる。上記金属塩等は、反応液の撹拌下に添加することもできるし、添加してから撹拌することもできる。撹拌速度及び撹拌時間もまた限定されず、実験条件などに応じて適宜選択することができる。金属塩等の添加方法としては、一度に全量を反応液に添加することもできるし、分割して添加してもよい。
【００４１】
金属塩等を添加する量は、アミド化反応が促進されれば特に限定されない。例えば、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（基質）に対して、１〜５０，０００ｐｐｍとするのが好ましく、より好ましくは５〜１０，０００ｐｐｍ、更に好ましくは１０〜２，０００ｐｐｍとすればよい。１ｐｐｍ以上とするのは、アミド化反応が促進されるためである。５０，０００ｐｐｍ以下とするのは、金属塩等によるニトリルヒドラターゼの失活を防ぐためである。
【００４２】
また、溶液のｐＨを調整する時期は特に限定されず、上記金属塩等の添加の前であっても後であってもよい。金属塩を添加する際又は添加した後の溶液のｐＨは、例えば６〜９とするのが好ましく、より好ましくは７〜８．５とすればよい。ｐＨを６以上とすることにより、アミド化反応を十分に促進することができる。また、ｐＨを９以下とすることにより、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの分解を防ぐことができる。
【００４３】
金属塩を添加する際にｐＨの調整に用いるアルカリの種類、ｐＨを調整する際の溶液の温度は、上述のアルデヒドを添加する際の条件と同様にすればよい。
【００４４】
（２−３）アルデヒドと金属塩等との併用
アルデヒドと金属塩等を組み合わせて使用する場合には、添加する順序は特に限定されず、アルデヒドを添加した後に金属塩等を添加してもよく、その逆でもよい。また、これらを同時に添加することもできる。
【００４５】
先にアルデヒドを添加してからその後に金属塩等を添加する場合、およびアルデヒドと金属塩等とを同時に添加する場合は、添加時の溶液のｐＨは、アルデヒドを添加する場合の条件に合わせればよい。一方、先に金属塩等を添加してからアルデヒドを添加する場合には、金属塩等を添加した後に、アルデヒドを添加する条件に合わせてから、アルデヒドを添加することができる。
【００４６】
また、アルデヒドを先に添加した場合、金属塩等を先に添加した場合又は両者を同時に添加した場合のいずれの場合でも、それらを４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル溶液に作用させる時間は、上述した通りとすればよい。
【００４７】
（３）ニトリルヒドラターゼによるアミド化反応
（３−１）ニトリルヒドラターゼ
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのアミド化反応において使用される酵素としては、ニトリルヒドラターゼが挙げられる。ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物の水和反応によるアミド化合物の生成を触媒する酵素をいい、国際的な酵素分類ではリアーゼに属する酵素である。
【００４８】
本発明において使用するニトリルヒドラターゼは、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのニトリルをアミドへ変換する反応を触媒することができればその期限や種類については限定されない。
【００４９】
例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ディーツィア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディナ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シクタリジウム（Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ）属、ツカムレラ（Ｔｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属、に属する微生物が産生するニトリルヒドラターゼである。
【００５０】
より詳細には、アースロバクター  グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ  １２１３８、ブレビバクテリウム  ヘルボラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｌｖｏｌｕｍ）ＡＴＣＣ１１８２２、コリネバクテリウム  フラベシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ  １６４２、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ  １２５４０及びＩＦＯ  １２５３９、ストレプトマイセスアルボグリセルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａＬＢｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）ＨＵＴ  ６０４５、ストレプトマイセス  クリゾマルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓ）ＨＵＴ  ６１４１、ストレプトマイセス  シネレオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｅｒｅｏｕｒｕｂｅｒ）ＨＵＴ６１４２、ストレプトマイセス  ヂアスタチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＨＵＴ  ６１１６、ストレプトマイセス  オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ＨＵＴ  ６０６１、ストレプトマイセス  ルブロシアノヂアスタチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｒｏｃｙａｎｏｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＨＵＴ  ６１１７、クレブシエラ  ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ  １２０１９、ＩＦＯ  ３３１９、ＩＦＯ１２０５９、ＩＡＭ  １０６３、クレブシエラ  ニュウモニアエ  サブスピーシズ  ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＨ−３６Ｔ２株、セラチア  ピリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＩＦＯ  ３０５５、セラチア  マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＩＡＭ  １１０５、エルビニア  キャロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）ＩＦＯ  ３０５７、ツカムレラ  ポーロメタボラム（Ｔｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）ＪＣＭ  ３２２６、ゴルドナ  ルブロペルチンクタス（Ｇｏｒｄｏｎａ  ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）ＪＣＭ  ３２２７、モルガネラ  モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ  ３８４８、プロテウス  ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＩＦＯ  ３１６７、エンテロバクター  エアロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ  １２０１０、ミクロアスカス  デスモスポラス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ  ｄｅｓｍｏｓｐｏｒｕｓ）ＩＦＯ６７６１、キャンディダ  グイリエモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＮＨ−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５０号）、パントエア  アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＮＨ−３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３４９号）などが産生するニトリルヒドラターゼである。
【００５１】
なお、ＡＴＣＣ番号が付与された微生物菌株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。ＩＦＯ番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所（ＩＦＯ）発行の「Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、第８版、第１巻（１９８８）」に記載されており、現在は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課から入手できる。ＩＡＭ番号の付された微生物は東京大学応用微生物学研究所から入手できる。ＪＣＭ番号の付された微生物は、理化学研究所  系統微生物保存機関発行の「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｔｒａｉｎｓ  第４版（１９８９）」に記載されており、理化学研究所  系統微生物保存機関より入手できる。ＨＵＴ番号の付された微生物は、日本微生物保存連盟（ＪＦＣＣ）発行の「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、第４版（１９８７）」に記載されており、広島大学工学部から入手できる。ＦＥＲＭ番号の付された微生物は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターから入手できる。
【００５２】
さらに山田らが土壌より分離したロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８号〕、及び本出願人らの一部が土壌より分離したアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＳＫ１０３〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３００号〕、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＢＣ２３〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１２６１号〕、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＢＣ１５−２〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３２０号〕、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＳＫ３１〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３１０号〕、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＳＫ８７〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３１１号〕、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＳＫ１３〔ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３２５号〕、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＳＫ７０  〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３０４号〕、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＨＲ１１〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３０６号〕およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＳＫ４９〔ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３０３号〕などが産生するニトリルヒドラターゼも挙げられる。これらの微生物は、それぞれ上記寄託番号にて独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００５３】
また、上記微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子をクローニングし、形質転換（導入）した微生物も、上記のニトリルヒドラターゼを産生する微生物として含まれる。例えば、米国特許第５８０７７３０号に記載のシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属のニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換した大腸菌ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５）、特許３５３１９９７号公報記載のアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ−１０７７０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７５６）、特許３１６２０９１号公報記載のロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種のニトリルヒドラターゼで形質転換した微生物などが挙げられる。
【００５４】
中でも、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来するニトリルヒドラターゼが好ましく、より好ましくはロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種由来のものであり、特に好ましくはロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株由来のものである。
【００５５】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を培養するための培地組成としては、微生物が生育でき、所望の酵素を産生するのであれば特に限定はない。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸類などの天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩などが使用でき、このほか、無機塩、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて適宜使用される。また場合により、酵素活性を誘導させるために、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドなどの各種アミド化合物などを培地に添加しても良い。上記微生物の培養は常法によればよく、例えば、ｐＨを４〜１０とすることが好ましく、より好ましくは５〜９、更に好ましくは６〜８である。温度は１０〜４５℃とすることが好ましく、より好ましくは１５〜４０℃、更に好ましくは２０〜３５℃である。培養時間は、好気的条件で１０〜１８０時間とすることが好ましく、より好ましくは１５〜１５０時間、更に好ましくは２０〜１２０時間培養することができる。培養は液体培養、固体培養のいずれでも行うことができる。
【００５６】
（３−２）アミド化反応
上記のようにして得た微生物菌体は、培養液そのまま、遠心分離などにより得た菌体の懸濁液、菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体抽出物など）、常法により固定化した菌体または菌体処理物、粗精製した酵素、精製酵素として、ニトリルヒドラターゼとしてアミド化反応に使用することができる。
【００５７】
本工程においては、ｐＨの調整を容易にするために緩衝液を使用することもできる。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス緩衝液あるいはグッド緩衝液等が例示される。ただし、青酸とその塩によってのみ構成される緩衝液は、ニトリルヒドラターゼの活性を著しく阻害するため、本工程においては使用できない。
【００５８】
アミド化反応を行う際、菌体懸濁液に４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を添加しても良いし、当該溶液に菌体懸濁液を添加することもできる。
【００５９】
反応液中の基質濃度は特に限定されないが、（１）で述べたのと同様にすればよい。すなわち、０．１〜５０質量％程度とすることが好ましく、より好ましくは５〜４０質量％、更に好ましくは１０〜３０質量％である。０．１質量％以上とすることにより、効率良くアミド化反応が進行するからである。また、３０質量％以下とするのは、それ以上基質の濃度を高くしても更なる効果が得られにくいからである。
【００６０】
反応温度もアミド化反応が進行すれば特に限定されないが、例えば、０〜５０℃程度とすることが好ましく、より好ましくは０．１〜４０℃程度、更に好ましくは１〜３０℃程度である。０℃以上とすることにより、効率よくアミド化反応が進行するからである。また、５０℃以下とすることにより、酵素活性の低下を回避することができるからである。
【００６１】
反応液のｐＨもアミド化反応が効率良く進行すれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ６〜９の範囲とすることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．５〜８．８、更に好ましくは７〜８．５である。当該範囲内において、効率良くアミド化反応を進行させることができるからである。
【００６２】
反応時間は基質濃度、菌体（酵素）濃度、その他の反応条件によって適宜選択することができる。例えば、０．１〜１２０時間とすることが好ましく、０．２〜１００時間がより好ましく、０．５〜２４時間程度が更に好ましい。０．１時間以上とするのは十分な量のアミド化合物を得るためである。１２０時間以下とするのは、副反応等を防ぐことができるからである。
【００６３】
その他、アミド化反応は、撹拌下に行っても良い。また、密閉系又は開放系のどちらの条件下でもよく、大気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下のどちらでもよく、減圧下、常圧下、加圧下のどの条件下で行っても良い。
【００６４】
反応系内の４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの、濃度及び光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の公知の方法又は装置によって測定・定量することができる。本発明により得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドは、必要に応じて精製することもできるし、そのまま後に続く反応に供することもできる。
【実施例】
【００６５】
［分析方法］
ＨＰＬＣ分析（１）：化学純度分析
４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下、「ＣＨＢＮ」という）及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド（以下、「ＣＨＢＡ」という）の化学純度は、下記ＨＰＬＣ定量結果より算出した。
【００６６】
本発明において使用したＨＰＬＣは日本分光製ＬＣ−２０００シリーズであり、詳細を以下に示す。なお、ＣＨＢＮの標品は、アヅマックス株式会社製（化学純度９８．９％）を用いた。ＣＨＢＡの標品は、前記アヅマックス株式会社製ＣＨＢＮを原料とし、ニトリルヒドラターゼを用いて合成した。合成後、酢酸エチルにより抽出後、シリカゲルカラムにより精製したＣＨＢＡを用いた。
【００６７】
［ＨＰＬＣ分析条件］
・試料調製方法：反応液を移動相に溶解
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、  粒径５μｍ：ＧＬサイエンス製）
・カラムオーブン温度：  ４０℃
・移動相：５％  アセトニトリル，０．１％  リン酸水溶液，１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器：示差屈折計（日本分光製ＲＩ−２０３１）
・保持時間：ＣＨＢＮ    ９．５ｍｉｎ
・ＣＨＢＡ    ５．１ｍｉｎ。
【００６８】
ＨＰＬＣ分析（２）：光学純度分析
(Ｒ)-ＣＨＢＮの光学純度は、以下のようにして測定した。(Ｒ)-ＣＨＢＮ１μＬにジクロロメタン２０μＬ、ピリジン２０μＬを加えた後、(Ｒ)-α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（ＭＴＰＡ）２μＬを添加し、そのまま室温で５時間撹拌を行った。
【００６９】
反応終了液にジイソプロピルエーテル３００μＬを添加し、続いて１Ｎ  ＨＣｌ水溶液３５０μＬを用いて洗浄した後、有機層を回収した。さらに有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３５０μＬで洗浄し、有機層を減圧乾燥、残渣をイソプロパノールに溶解させ、これをＨＰＬＣで分析を行った。
【００７０】
光学純度の分析に用いたＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【００７１】
［ＨＰＬＣ分析条件］
・カラム：Ｐａｒｔｉｓｉｌ−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ：ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・カラムオーブン温度：  ４０℃
・移動相：ヘキサン：イソプロパノール＝９９：１
・流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出器：ＵＶ  ２５４ｎｍ
・保持時間：(Ｒ)-ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル  １１．９ｍｉｎ
（Ｓ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル  １３．０ｍｉｎ。
【００７２】
シアンイオン分析
反応液中におけるシアンイオン濃度については、「毒物又は劇物を含有する物の定量方法を定める省令」（昭和四十一年一月八日厚生省令第一号）の「別表第一  シアンイオン標準溶液に係る吸光度の測定」の項に記載の、ｐ−ジメチルアミノベンジリデンロダニンを指示薬とした硝酸銀試液による滴定の方法を参考にして、下記のように測定した。
【００７３】
２００ｍＬ三角フラスコに、測定に係る液を正確に秤取し、必要に応じてイオン交換水又は蒸留水を加えて約１００ｍＬとした後（測定に係る液が１００ｍＬある場合は加えない）、苛性アンモニア水（４％水酸化ナトリウムを含む５％アンモニア水）を１０ｍＬ加えた後（測定に係る液が強酸性の場合、ｐＨ＞９となるまで増量する）、さらにｐ−ジメチルアミノベンジリデンロダニン０．０２ｇにアセトンを加えて溶解した溶液（１００ｍＬ）を０．５ｍＬ加え、硝酸銀水溶液（０．１Ｎ、又は必要に応じて０．０１Ｎ）で、液が赤色に変わるまで滴定した。滴定に要した硝酸銀水溶液の量（ｍＬ）から下記のいずれかの式によりシアンイオン濃度を算出した。
【００７４】
（シアンイオン濃度）（質量％）＝Ｘ×Ｙ×５２．０４／Ｚ×１００
（シアンイオン濃度）（ｐｐｍ）＝Ｘ×Ｙ×５２．０４／Ｚ×１００００００
式中、Ｘは滴定に要した硝酸銀水溶液の量（ｍＬ）、Ｙは硝酸銀水溶液の濃度（Ｎ）、Ｚは測定に係る液の重量（ｍｇ）を意味する。
【００７５】
＜参考例１＞  ニトリルヒドラターゼの調製（Ｊ−１菌）
ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）を、３０Ｌ容ジャーファーメンター（高杉製作所社製）にてグルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス０．３質量％、塩化コバルト０．０５質量％を含む、２０Ｌの培地（ｐＨ７．０）に植菌し、温度３０℃で好気的に６０時間培養した。培養して得た菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．７）にて２回洗浄後、懸濁することで保存菌体液とした。
【００７６】
＜参考例２＞  (Ｒ)-ＣＨＢＮの合成
１，３−ジクロロ−２−プロパノールと青酸からハロヒドリンエポキシダーゼを用いて、 (Ｒ)-ＣＨＢＮを合成した。以下に詳細を示す。
【００７７】
ハロヒドリンエポキシダーゼの調製
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＪＭ１０９／ｐＳＴ１１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２０６５；特開平５−３１７０６６号参照）を、ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）を１００ｍＬ入れた５００ｍＬ容三角フラスコに植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。前記培養菌体を遠心分離により集菌し、集菌した菌体を５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で懸濁することで保存菌体液とした。
【００７８】
(Ｒ)-ＣＨＢＮの合成
上で調製した菌体（大腸菌）液０．２５ｇを５０ｍＭ  トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１１ｍＭであった。
【００７９】
ｐＨ電極及びｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した３００ｍＬ４つ口フラスコに、水１２７．５５ｇ、ＨＣＮ４．４１ｇ（０．１６３２ｍｏｌ）を入れ、３０％ＮａＯＨ  ０．６５ｇ（０．００４９ｍｏｌ）で、ｐＨ７．５に調整した。１，３−ジクロロ−２−プロパノール１０．００ｇ（０．０７７５ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
【００８０】
菌体液２０．０ｇを加え、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するよう、３０％ＮａＯＨを投入するようにｐＨコントローラーを設定し、投入されたＮａＯＨとほぼ等モルの割合で１，３−ジクロロ−２−プロパノール，ＨＣＮを追加していくことで、系内の１，３−ジクロロ−２−プロパノールの濃度を０．５ｍｏｌ／ｋｇを超えないよう、また、系内のシアンイオン濃度を１．１ｍｏｌ／ｋｇを超えないようにした。
【００８１】
２３時間後、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを０．７５３ｍｏｌ／ｋｇ蓄積することができ、その光学純度は９４．８％ｅ．ｅ．の(Ｒ)-体過剰であった。反応により消費された１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの収率は９６．３％であった。この反応液を、３５％塩酸を用いてｐＨ＝２．０に調整した後、釜内温６０℃、１４０ｔｏｒｒで濃縮することで、(Ｒ)-ＣＨＢＮの濃度が２０％の水溶液を取得した。反応系内のシアンイオン濃度を滴定により、８ｐｐｍであることを確認した。
【００８２】
＜実施例１＞
（１）ホルムアルデヒド水溶液の調製
ホルマリン（ホルムアルデヒド濃度：３７質量％）１．００ｇを、合計１０．００ｇとなるように水で希釈した水溶液を調整し、ホルムアルデヒド水溶液（ホルムアルデヒド濃度：３．７質量％）とした。
【００８３】
（２）アミド化反応
参考例２で合成した(Ｒ)-ＣＨＢＮ水溶液を、３０質量％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、水を加えて(Ｒ)-ＣＨＢＮが１３．５質量％となるように濃度調整した（以下、「基質溶液」ということがある）。
【００８４】
この水溶液２０ｇを採取し、２℃に冷却した後、ホルムアルデヒド水溶液（ホルムアルデヒド濃度：３．７質量％）４３μＬを添加し、２時間攪拌した（反応液中のホルムアルデヒドの濃度は８０ｐｐｍ）。
【００８５】
この水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。
【００８６】
分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応１時間及び反応４時間における(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率を下記式により求めた。結果は表１に示す。
【００８７】
(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率（％）＝{［反応前の(Ｒ)-ＣＨＢＮの濃度（質量％）−反応後又は反応中の(Ｒ)-ＣＨＢＮの濃度（質量％）］／反応前の(Ｒ)-ＣＨＢＮの濃度（質量％）}×１００。
【００８８】
＜実施例２＞
（１）プロピオンアルデヒド水溶液の調製
プロピオンアルデヒド０．３７ｇを、合計１０．００ｇとなるように水で希釈した水溶液を調整し、プロピオンアルデヒド水溶液（プロピオンアルデヒド濃度：３．７質量％）とした。
【００８９】
（２）アミド化反応
実施例１で用いたのと同様の基質溶液を採取し、２℃に冷却した後、プロピオンアルデヒド水溶液（プロピオンアルデヒド濃度３．７質量％）４３μＬを添加し、２時間攪拌した（反応液中のプロピオンアルデヒドの濃度は８０ｐｐｍ）。
【００９０】
この水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応１時間および反応４時間における(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率を求めた。
【００９１】
＜実施例３及び４＞
（１）塩化コバルト（II）水溶液の調整
塩化コバルト（II）六水和物を０．２４２ｇ採取し、６０ｇの水に溶かした溶液を調整し、塩化コバルト（II）水溶液とした。
【００９２】
（２）アミド化反応
実施例１で用いたのと同様の基質溶液を２０ｇ採取し、（１）で調整した塩化コバルト水溶液（II）を１０８μＬ添加し、４℃で一晩静置した（基質に対する塩化コバルトの濃度は９０ｐｐｍ）。
【００９３】
実施例３では、この水溶液を２℃に冷却し、実施１で調製したホルムアルデヒド水溶液（ホルムアルデヒド：濃度３．７質量％）４３μＬを添加し、１時間攪拌した（反応液中のホルムアルデヒドの濃度は８０ｐｐｍ）。
【００９４】
実施例４では、この水溶液を２℃に冷却し、実施２で調製したプロピオンアルデヒド水溶液（プロピオンアルデヒド濃度：３．７質量％）４３μＬを添加し、１時間攪拌した（反応液中のプロピオンアルデヒドの濃度は８０ｐｐｍ）。
【００９５】
それぞれの水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応１時間及び４時間における(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率を求めた。結果は表１に示す。
【００９６】
＜実施例５及び６＞
実施例１で用いたのと同様の基質溶液を２０ｇ採取し、（１）で調整した塩化コバルト水溶液（II）を２１６μＬ添加し、一晩４℃で静置した（基質に対する塩化コバルトの濃度は１８０ｐｐｍ）。
【００９７】
実施例５では、この水溶液を２℃に冷却し、実施１で調製したホルムアルデヒド水溶液（ホルムアルデヒド濃度：３．７質量％）６５μＬを添加し、２時間攪拌した（反応液中のホルムアルデヒドの濃度は１２０ｐｐｍ）。
【００９８】
実施例６では、この水溶液を２℃に冷却し、実施２で調製したプロピオンアルデヒド水溶液（プロピオンアルデヒド濃度：３．７質量％）６５μＬを添加し、２時間攪拌した（反応液中のプロピオンアルデヒドの濃度は１２０ｐｐｍ）。
【００９９】
この水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応１時間及び４時間における(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率を求めた。結果は表１に示す。
【０１００】
＜比較例１＞
実施例１で用いたのと同様の基質溶液２０ｇを採取し、２℃に冷却した後、アルデヒド及び金属塩を添加することなく、２時間攪拌した。
【０１０１】
この水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応４時間の(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率を求めた。結果は表１に示す。
【０１０２】
＜比較例２＞
実施例１で用いたのと同様の基質溶液２０ｇを採取し、そこに実施例３の（１）で調整した塩化コバルト（II）水溶液を２１６μＬ添加し、一晩４℃で静置した（基質に対する塩化コバルト（II）の濃度は１８０ｐｐｍ）。更に、この水溶液を２℃に冷却した後、アルデヒドを添加することなく２時間攪拌した。
【０１０３】
参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応１時間及び４時間における(Ｒ)-ＣＨＢＮの転化率を求めた。結果は表１に示す。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
＜参考例３＞
エピクロロヒドリンと青酸とからＣＨＢＮを合成し、酢酸エチルによる抽出、単蒸留により精製した。以下に詳細を示す。
【０１０６】
ＣＨＢＮの合成
攪拌機、温度計、ジムロート冷却菅を備えた３Ｌセパラブルフラスコに、エピクロロヒドリン２７８ｇ（３．００ｍｏｌ）、水１２８４ｇ、硫酸ナトリウム１９２ｇ（１．３５ｍｏｌ）を仕込み、温水浴中で攪拌しながら内温５０〜６０℃でシアン化水素７２．３ｇ（２．７０ｍｏｌ）を１時間かけて反応液中に直接供給した。その後、内温５０〜６０℃で熟成を６時間行った。
【０１０７】
精製
反応液を水浴で冷却した後、酢酸エチル１Ｌで抽出を行った。抽出した有機層は、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を留去後、釜内温１２０℃〜１４０℃、４〜６Ｔｏｒｒで単蒸留することにより精製を行うことで、ＣＨＢＮの精製品１７０ｇを取得した。取得したＣＨＢＮの純度は、９９．４重量％であった。また、取得したＣＨＢＮのシアンイオン濃度を滴定により、２０ｐｐｍであることを確認した。
【０１０８】
＜実施例７及び８＞
参考例３で合成したＣＨＢＮを使用して、ＣＨＢＮが２０質量％の水溶液を調製した。調製した水溶液を、４％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５とした後、水を加えてＣＨＢＮ濃度が１３．５質量％の水溶液となるように濃度調整した（以下、「基質溶液」ということがある）。
【０１０９】
実施例７では、この水溶液２０ｇを採取し２℃に冷却した後、ホルムアルデヒド水溶液（ホルムアルデヒド濃度：３．７％）６５μＬを添加し、２時間攪拌した（反応液中のホルムアルデヒドの濃度は１２０ｐｐｍ）。また、実施例８では、この水溶液２０ｇを採取し２℃に冷却した後、プロピオンアルデヒド水溶液（プロピオンアルデヒド濃度３．７％）６５μＬを添加し、２時間攪拌した（反応液中のホルムアルデヒドの濃度は１２０ｐｐｍ）。
【０１１０】
この水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨ７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応１時間および４時間におけるＣＨＢＮの転化率を求めた。結果は表２に示す。
【０１１１】
＜比較例３＞
実施例７で用いたのと同様の基質溶液２０ｇを採取し、２℃に冷却した後、アルデヒド及び金属塩を添加することなく、２時間攪拌した。この水溶液に、参考例１で調整したＪ−１菌を８０μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応中は、４％水酸化ナトリウム水溶液を随時添加することで、ｐＨを７．８〜８．２に維持した。分析は、０．２ｇずつ採取することで、反応４時間のＣＨＢＮの転化率を求めた。結果は表２に示す。
【０１１２】
【表２】
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