(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的に結合する抗体に関する組成物および方法を提供する。【解決手段】ＴＧＦ−β結合タンパク質スクレロスチンと、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（骨形態形成タンパク質）との間の相互作用を妨害することによる骨ミネラル密度の変化に関係するスクレロスチン（ＳＯＳＴ）ポリペプチドを含む免疫原、あるいはＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害し、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体または前記その抗原結合フラグメントが、配列番号２、３、４、５、６、１２、１３、１４、１５、２１、２２、２５、２６、４７、４８、４９、および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、４７、４８、４９、および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを用いて非ヒト動物を免疫することによって産生される、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗体は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害し、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、４７、４８、４９、および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを用いて非ヒト動物を免疫することによって産生される、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗体は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害し、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、４１、４２、４３、５１、５２、５３、および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを用いて非ヒト動物を免疫することによって産生される、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体または前記その抗原結合フラグメントが、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体または前記その抗原結合フラグメントが、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを用いて非ヒト動物を免疫することによって産生される、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗体または該その抗原結合フラグメントは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、該抗体は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、およびハムスターモノクローナル抗体からなる群より選択される。請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。
【請求項１８】
前記抗体が、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。
【請求項２０】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、およびＦｖからなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
単鎖抗体を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに生理学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。
【請求項２４】
ＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の連続アミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を、非ヒト動物中で誘発し得、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、免疫原。
【請求項２５】
ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続アミノ酸かつ多くても５０個の連続アミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を、非ヒト動物中で誘発し得、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、免疫原。
【請求項２６】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、４７、４８、４９、および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを含む免疫原。
【請求項２７】
前記ペプチドが、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を非ヒト動物中で誘発し得る、請求項２６に記載の免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含む、免疫原。
【請求項２８】
前記抗体が、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する前記ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する、請求項２７に記載の免疫原であって、ここで、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、免疫原。
【請求項２９】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、４７、４８、４９、および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くてもの７５個のアミノ酸のペプチドを含む免疫原であって、ここで、該ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を非ヒト動物中で誘発し得、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害し、該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得、該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、免疫原。
【請求項３０】
配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを含む免疫原。
【請求項３１】
前記ペプチドが、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を非ヒト動物中で誘発し得る、請求項３０に記載の免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含む、免疫原。
【請求項３２】
前記抗体が、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、請求項３１に記載の免疫原。
【請求項３３】
配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、５１、５２、５３、および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸かつ多くても７５個のアミノ酸のペプチドを含む免疫原であって、ここで、該ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を非ヒト動物中で誘発し得、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、該抗体は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、免疫原。
【請求項３４】
ＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の連続アミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、該ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を非ヒト動物中で誘発し得る、免疫原。
【請求項３５】
ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続アミノ酸かつ多くても５０個の連続アミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、該ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合してＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を非ヒト動物中で誘発し得る、免疫原。
【請求項３６】
前記ペプチドが、キャリア分子と会合している、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項３７】
前記キャリア分子が、キャリアポリペプチドである、請求項３６に記載の免疫原。
【請求項３８】
前記キャリアポリペプチドが、キーホールリンペットヘモシアニンである、請求項３７に記載の免疫原。
【請求項３９】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、該方法は、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の免疫原で非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、（ａ）該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み；（ｂ）該抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位のうちの少なくとも１つに対する該ＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害し；（ｃ）該ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合し得；そして（ｄ）該ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；およびＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合し得る、方法。
【請求項４０】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、該方法は、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の免疫原で非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、該抗体は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、方法。
【請求項４１】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下および時間の間、配列番号１、２０、５８、６０、６２、および６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体と、配列番号２〜１９、および２１〜５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴポリペプチドとを接触させる工程；ならびに
（ｂ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出して、それにより、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
ＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰの結合を妨害する抗体を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下および時間の間、（ｉ）配列番号１、２０、５８、６０、６２、および６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）配列番号２〜１９、２１〜２８、および４７〜５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドとを接触させる工程；ならびに
（ｂ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出して、それにより、ＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰの結合を妨害する抗体の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下および時間の間、配列番号１、２０、５８、６０、６２、および６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）配列番号２９〜４６、および５１〜５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドとを接触させる工程；ならびに
（ｂ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出し、それにより、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
骨のミネラル含有量を増大させる抗体を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下および時間の間、（ｉ）配列番号１、２０、５８、６０、６２、および６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）配列番号２〜１９、および２１〜５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドとを接触させる工程；ならびに
（ｂ）抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出し、それにより、骨のミネラル含有量を増大させる抗体の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記抗体が、生物学的サンプル中に存在する抗体、および精製された抗体からなる群より選択される、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記精製された抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体の抗原結合フラグメントからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、配列番号５、６、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４８】
前記ペプチドが、配列番号５、６、１０、１１、１４、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４９】
前記ペプチドが、配列番号５、６、１０、１１、１４、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項５０】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、該方法は、請求項４９に記載の免疫原を用いて非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、該ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、２８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項５１】
前記ＳＯＳＴペプチドが、配列番号５、６、１０、１１、１４、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１、４２、および４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体的に、医薬品および方法、そしてさらに具体的には、骨のミネラル含有量を増大することに適している方法およびスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）特異的抗体に関する。このような組成物および方法は、例えば、骨減少症、骨粗鬆症、骨折、および骨ミネラル密度が低いことが疾患の特徴である他の障害を含む広い範囲の種々の状態を処置するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
個体の生涯全体にわたって、骨量が変化する時期は２または３期存在する（Ｒｉｇｇｓ， Ｗｅｓｔ Ｊ． Ｍｅｄ． １５４：６３−７７（１９９１）参照。）。第１期は男性と女性のいずれにも存在し、骨量がピークに到達するように進行する。この第１期は、軟骨成長板の直線方向の成長と、骨周辺の接合速度に応じた放射方向の成長とを通じて達成される。第２期は、骨梁（脊椎および骨盤のような扁平骨）についてはおよそ３０歳で、皮質骨（例えば、手足に見られる長い骨）についてはおよそ４０歳で始まり、老年期まで続く。この期はゆっくりとした骨量の減少が特徴的であり、男性および女性のいずれにも存在する。女性には、骨量が減少する第３期もまた存在し、これは、ほぼおそらく、閉経後のエストロゲンの不足が原因である。この期の間だけで、女性は皮質骨の骨量のさらに１０％を、そして骨梁部分からは２５％を失う（Ｒｉｇｇｓ，前出を参照のこと。）。
【０００３】
骨ミネラル含有量の減少は、広い範囲の種々の状態によって引き起こされ得、そして有意な医学的問題を生じる場合がある。例えば、骨粗鬆症は、ヒトにおいては衰弱性疾患であり、骨格の骨量とミネラル密度の顕著な減少、骨の構造の変質（骨微細構造の崩壊およびこれに対応する骨形成不全の増大を含む）、ならびに罹患個体の骨折しやすさによって特徴付けられる。ヒトの骨粗鬆症には、臨床的な骨減少症が先に生じ（若い成人の骨についての骨のミネラル密度の平均値より１標準偏差以上大きく２．５標準偏差未満である骨ミネラル密度）この状態は、米国においておよそ２５００万人に見られる。米国ではさらに７００〜８００万人の患者が臨床的な骨粗鬆症であると診断されている（若い成人の骨の骨ミネラル密度よりも２．５標準偏差以上大きい骨ミネラル密度として定義される）。骨粗鬆症は、医療制度に関して最も費用のかかる疾患の一つであり、米国においては毎年数十億ドルの負担となっている。医療に関するコストに加えて、長期間にわたる治療、および休業日数が、この疾患の財務費用および社会的費用を増大させている。世界中では、およそ７５００万人が骨粗鬆症のリスクを有している。
【０００４】
ヒトの集団における骨粗鬆症の頻度は年齢とともに増大する。白人については、骨粗鬆症は、女性に顕著であり、米国においては、骨粗鬆症患者の集団のうちの８０％を占める。高齢者における骨形成不全の増加と、骨格の骨の骨折しやすさは、この集団における不慮の落下のリスクがより大きいことによりいっそう追い討ちをかけられる。１５０万以上の骨粗鬆症に関連する骨折が、毎年米国において報告されている。腰、手首、および脊椎の骨折は、中でも、骨粗鬆症に関係している最も一般的なけがである。腰椎の骨折は特に、患者にとって極めて厄介であり、お金がかかり、女性にとっては死亡率および罹患率の高さと関係している。
【０００５】
骨粗鬆症は、骨量の減少が原因で骨折のリスクが増大すると認識されているが、成人の骨密度を実質的に増大させることができる骨障害について有効な処置は現在は存在していない。多くの医師の間では、成人において、特に、骨減少症や骨粗鬆症のリスクがある手首、脊柱、および腰の骨において、骨密度を増大させることができる薬剤が必要とされているとの強い認識がある。
【０００６】
骨粗鬆症の予防のための現在の方針は、個体にいくらかの利点をもたらし得るが、疾患の解決を確実にすることはできない。これらの方針には、高齢の始まりに伴う身体活動（特に、体重の負荷がかかる活動）を調節すること、食事に適正なカルシウムを供給すること、およびアルコールまたはタバコを含む製品の消費を避けることが含まれる。臨床的な骨減少症または骨粗鬆症を示している患者については、一般的な現行の治療薬と方針が、常時行われる骨再形成のプロセスについての自然なままの局面である骨吸収のプロセスを阻害することにより、骨量のさらなる減少を少なくするように行われる。
【０００７】
例えば、エストロゲンは、現在、骨量の減少を遅らせるために処方されている。しかし、患者が何らかの長期的な利点を獲得したかどうか、およびエストロゲンが７５歳以上の患者に対して全く効果がないのではないかという点に関して、いくつかの議論がある。さらには、エストロゲンの使用は、乳ガンおよび子宮内膜ガンのリスクを増大させると考えられている。カルシトニン、ビタミンＫを伴うオステオカルシン、またはビタミンＤを伴う高用量の食事療法用のカルシウム、ビタミンＤを伴わない高用量の食事療法用のカルシウムもまた、閉経後の女性について提案されている。しかし、高用量のカルシウムは、多くの場合に不快な胃腸の副作用を生じ得、血清カルシウム濃度と尿中カルシウム濃度を持続的にモニターしなければならない（例えば、Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０：９７８−９８２，１９９５を参照のこと）。
【０００８】
骨粗鬆症についての他の治療アプローチとしては、ビスホスフォネート（例えば、フォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ）ＴＭ、アクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ）ＴＭ、ボンビバ（Ｂｏｎｖｉｖａ）ＴＭ、ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）ＴＭ、オルパドロネート、ネリドロネート、スケリド（ｓｋｅｌｉｄ）、ボネフォス）、副甲状腺ホルモン、カルシウム拮抗分子（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃｓ）カルシウム受動体作動薬（ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃｓ）（例えば、シナカルセット）、スタチン、アナボリクステロイド、ランタン塩およびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが挙げられる。しかし、このような治療薬には、多くの場合、望ましくない副作用が伴い（例えば、骨密度は穏やかに増大させるが、カルシトニンやステロイドは吐き気を引き起こし、免疫反応を誘発する場合があり、ビスホスフォネートやフッ化ナトリウムは骨折の修復を阻害する場合がある）、これは、それらの有効な使用の妨げとなり得る（例えば、Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓｓ、前出を参照のこと）。
【０００９】
過剰なまたは不十分な骨鉱化作用に関係している状態、例えば、骨粗鬆症または骨鉱化作用が少ないことを特徴とする他の障害を処置するための現在行われている治療方針には、骨量を変化させる（すなわち、統計学的に有意な様式で増加もしくは減少させる）薬剤は含まれていない。特に、現行の方針では、新しい骨量の成長を治療的に刺激または増強させてはいない。本発明は、骨鉱化作用を増加させるために使用することができ、したがって、骨量の増加が望まれる広い範囲の種々の状態を処置するために使用されるであろう組成物および方法を提供する。本発明はまた、他の関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
簡潔に述べると、本発明により、ＴＧＦ−β結合タンパク質であるスクレロスチン（ＳＯＳＴ）に特異的に結合する抗体が提供され、骨形態形成タンパク質のようなＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーと相互作用するＳＯＳＴの領域に由来するＳＯＳＴペプチドを含む免疫原が提供される。１つの実施形態においては、本発明により、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。ＳＯＳＴポリペプチドには、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができる。ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合することができる。特定の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２〜６、１２〜１５、２１、２２、２５、２６、４７、４８、４９、または５０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、そして他の特定の実施形態においては、抗体は、配列番号５、６、または１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。
【００１１】
１つの実施形態においては、本発明により、配列番号２〜１９、２１〜２８、または４７〜５０のアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドで、非ヒト動物を免疫することによって産生される、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。ここで、抗体は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、ＳＯＳＴポリペプチドには、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチド（本明細書中に提供されるＧｅｎＢａｎｋ配列のいずれか１つに示される）に結合することができ、ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチド（本明細書中に提供されるＧｅｎＢａｎｋ配列のいずれか１つに示される）に結合することができる。特定の実施形態においては、抗体は、配列番号５、６、１０、１１、１４、または１８のアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドで、非ヒト動物を免疫することによって産生される。
【００１２】
本発明により、さらに、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合してＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。ＳＯＳＴポリペプチドには、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列が含まれ、抗体は、配列番号２９〜３１、３３〜３６、４１〜４３、または５１〜５４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。
【００１３】
別の実施形態においては、本発明により、配列番号２９〜４６、５１、５２、５３、または５４のアミノ酸配列を含む少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドで、非ヒト動物を免疫することによって産生される、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、抗体はＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する。
【００１４】
本発明の特定の具体的な実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体である。他の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体であり、これはマウス、ヒト、ラット、またはハムスターのモノクローナル抗体である。本発明により、また、モノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞または宿主細胞も提供される。本発明の他の実施形態においては、抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体である。本発明により、さらに、ヒト化抗体またはキメラ抗体を産生する宿主細胞が提供される。特定の実施形態においては、抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖフラグメントである。本発明により、また、単鎖抗体である抗体が提供され、そして単鎖抗体を発現することができる宿主細胞も提供される。別の実施形態においては、本発明により、このような抗体と生理学的に受容可能なキャリアを含む組成物が提供される。
【００１５】
本発明により、ＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の連続しているアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原が提供される。ここで、ＳＯＳＴポリペプチドには、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列が含まれ、ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を、非ヒト動物中で誘発することができる。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができ、ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができる。ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合することができる。
【００１６】
別の実施形態においては、免疫原には、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続しているアミノ酸であって、５０個を超えない連続しているアミノ酸を含むペプチドが含まれる。上記ＳＯＳＴポリペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含み、ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を、非ヒト動物中で誘発することができる。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチド（本明細書中に提供されるＧｅｎＢａｎｋ配列のいずれか１つに示される）に結合することができ、ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチド（本明細書中に提供されるＧｅｎＢａｎｋ配列のいずれか１つに示される）に結合することができる。
【００１７】
特定の実施形態においては、本発明により、配列番号２〜１９、２１〜２８、または４７、４８、４９、５０のアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドを含む免疫原が提供される。ペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を非ヒト動物中で誘発することができ、抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができ、ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができる。ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合することができる。特定の実施形態においては、本発明により、配列番号５、６、１０、１１、１４、または１８のアミノ酸配列を含む、少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドを含む免疫原が提供される。
【００１８】
本発明により、また、配列番号２９〜４６、５１、５２、５３、または５４のアミノ酸配列を含む少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドを含む免疫原が提供される。ペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を非ヒト動物中で誘発することができる。抗体は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する。別の実施形態においては、免疫原には、ＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の連続しているアミノ酸を含むペプチドが含まれる。ＳＯＳＴポリペプチドには、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列が含まれ、ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合してＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を非ヒト動物中で誘発することができる。特定の実施形態においては、本発明により、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８を含むＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個の連続しているアミノ酸であって、５０個を超えない連続しているアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原が提供される。ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合してＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を非ヒト動物中で誘発することができる。
【００１９】
特定の具体的な実施形態においては、本発明の免疫原は、キャリア分子と会合させられる。特定の実施形態においては、キャリア分子は、キャリアポリペプチドであり、特定の実施形態においては、キャリアポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニンである。
【００２０】
本発明により、また、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示される配列を有しているＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の連続しているアミノ酸のペプチド、あるいは、少なくとも２１個の連続しているアミノ酸であって５０個を超えない連続しているアミノ酸を含む免疫原で非ヒト動物を免疫することを含む、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法が提供される。この免疫原は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合して、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を、非ヒト動物中で誘発することができる。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができ、ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができ、ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４３２９（配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号７５）；Ｄ３８０８２（配列番号７６）；ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；またはＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができる。ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２５１１０（配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号８１）；Ｚ４８９２３（配列番号８３）；ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）；またはＮＭ＿００１２０４（配列番号８２）に示されるアミノ酸配列を含むＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドに結合することができる。別の実施形態においては、本発明により、配列番号２〜１９、２１〜２８、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸配列を含む少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドを含む免疫原で、非ヒト動物を免疫することを含む、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法が提供される。ペプチドは、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、非ヒト動物中で誘発することができる。抗体は、（ｉ）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、および（ｉｉ）ＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドに結合することができる。特定の実施形態においては、免疫原には、配列番号５、６、１０、１１、１４、または１８のアミノ酸配列を含む少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドが含まれる。
【００２１】
他の好ましい実施形態においては、本発明により、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８に示される配列を有しているＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の連続しているアミノ酸のペプチド、あるいは、少なくとも２１個の連続しているアミノ酸であって５０個を超えない連続しているアミノ酸を含む免疫原で非ヒト動物を免疫することを含む、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法が提供される。この免疫原は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合してＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害することができる抗体を、非ヒト動物中で誘発することができる。別の実施形態においては、本発明により、配列番号２９〜４６、５１、５２、５３、または５４のアミノ酸配列を含む少なくとも２０個のアミノ酸であって７５個を超えないアミノ酸のペプチドを含む免疫原で非ヒト動物を免疫することを含む、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法が提供される。ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合してＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を非ヒト動物中で誘発することができる。
【００２２】
本発明により、また、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するための方法が提供される。この方法には、配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、配列番号２〜１９、または２１〜５４のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドと、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下で、十分な時間の間、接触させること；ならびに、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出すること、そしてそれにより、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体の存在を検出することが含まれる。別の実施形態においては、本発明により、ＢＭＰのＳＯＳＴポリペプチドに対する結合を妨害する抗体を同定するための方法が提供される。この方法には、（ｉ）配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、（ｉｉ）配列番号２〜１９、２１〜２８、または４７〜５０のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドと、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下で、十分な時間の間、接触させること；ならびに、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出すること、そしてそれにより、ＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰの結合を妨害する抗体の存在を検出することが含まれる。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するため、およびＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰに結合を妨害する抗体を同定するための方法の特定の実施形態においては、ＳＯＳＴペプチドには、配列番号５、６、１０、１１、１４、または１８のアミノ酸配列が含まれる。
【００２３】
別の実施形態においては、本発明により、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を同定するための方法が提供される。この方法には、（ｉ）配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、（ｉｉ）配列番号２９〜４６または５１〜５４のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドと、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下で、十分な時間の間、接触させること；ならびに、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出すること、そしてそれにより、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体の存在を検出することが含まれる。
【００２４】
別の実施形態においては、本発明により、骨ミネラル密度を増大させる抗体を同定するための方法が提供される。この方法には、（ｉ）配列番号１、２０、５８、６０、６２、または６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、（ｉｉ）配列番号２〜１９、または２１〜５４のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＳＯＳＴペプチドと、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体を形成させるために十分な条件下で、十分な時間の間、接触させること；ならびに、抗体／ＳＯＳＴペプチド複合体の濃度を検出すること、そしてそれにより、骨ミネラル含有量を増大させる抗体の存在を検出することが含まれる。特定の実施形態においては、ペプチドには、配列番号５、６、１０、１１、１４、または１８のアミノ酸配列が含まれる。
【００２５】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するため、ＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰの結合を妨げる抗体を同定するため、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する抗体を同定するため、または骨ミネラル含有量を増大させる抗体を同定するためのある特定の実施形態においては、抗体は、生物学的サンプル中に存在するか、または抗体は精製された抗体である。特定の実施形態においては、精製された抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの抗体のいずれかの抗原結合フラグメントである。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明と添付の図面を参照して明らかにされる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、それぞれが個々に組み込まれているかのように、それらの全体に関して引用により本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＳＯＳＴポリペプチドとその最も近いホモログについて、特徴的なシスチンノットを含む領域のアラインメントを示す。シスチンノットを形成する３つのジスルフィド結合が実線で示される。点線で示されるそれ以外のジスルフィド結合は、このファミリーに特有のものであり、これにより３Ｄ構造中の２つのβ−ヘアピンチップを繋ぐ。示されるポリペプチドは、ＳＯＳＴ：スクレロスチン（配列番号９５）；ＣＧＨＢ：ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ（配列番号９６）；ＦＳＨＢ：卵胞刺激ホルモンβサブユニット（配列番号９７）；ＴＳＨＢ：甲状腺刺激ホルモンβ鎖前駆体（配列番号９８）；ＶＷＦ：フォン・ヴィレブランド因子（配列番号９９）；ＭＵＣ２：ヒトムチン２前駆体（配列番号１００）；ＣＥＲ１：ケルベロス１（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ １）（アフリカツメガエルホモログ）（配列番号１０１）；ＤＲＭ：グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）（配列番号１０２）；ＤＡＮ：（配列番号１０３）；ＣＴＧＦ：結合組織成長因子前駆体（配列番号１０４）；ＮＯＶ：ＮｏｖＨ（腎芽細胞種で過剰発現される遺伝子タンパク質ホモログ）（配列番号１０５）；ＣＹＲ６：（配列番号１０６）である。
【図２】図２は、ＳＯＳＴのコア領域の３Ｄモデルを示す。（ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ）
【図３】図３は、ＳＯＳＴホモ二量体のコア領域の３Ｄモデルを示す。
【図４Ａ】図４ＡおよびＢにより、５種類の動物に由来するノギンのアミノ酸配列のアラインメントが提供される：ヒト（ＮＯＧＧ＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１０７）；ニワトリ（ＮＯＧＧ＿ＣＨＩＣＫ、配列番号１０８）；アフリカツメガエル（ＮＯＧＧ＿ＸＥＮＬＡ、配列番号１０９）；ＮＯＧＧ＿ＦＵＧＲＵ、配列番号１１０）；およびゼブラフィッシュ（ＮＯＧＧ＿ＺＥＢＲＡ、配列番号１１１）；ならびに、ヒト由来のＳＯＳＴ（ＳＯＳＴ＿ＨＵＭＡＮ、配列番号１）、ラット（ＳＯＳＴ＿ＲＡＴ、配列番号２０）、およびマウス（ＳＯＳＴ＿Ｍｏｕｓｅ、配列番号１１２）。
【図４Ｂ】図４ＡおよびＢにより、５種類の動物に由来するノギンのアミノ酸配列のアラインメントが提供される：ヒト（ＮＯＧＧ＿ＨＵＭＡＮ（配列番号１０７）；ニワトリ（ＮＯＧＧ＿ＣＨＩＣＫ、配列番号１０８）；アフリカツメガエル（ＮＯＧＧ＿ＸＥＮＬＡ、配列番号１０９）；ＮＯＧＧ＿ＦＵＧＲＵ、配列番号１１０）；およびゼブラフィッシュ（ＮＯＧＧ＿ＺＥＢＲＡ、配列番号１１１）；ならびに、ヒト由来のＳＯＳＴ（ＳＯＳＴ＿ＨＵＭＡＮ、配列番号１）、ラット（ＳＯＳＴ＿ＲＡＴ、配列番号２０）、およびマウス（ＳＯＳＴ＿Ｍｏｕｓｅ、配列番号１１２）。
【図５】図５は、ノギン／ＢＭＰ−７複合体の構造を示す。ＢＭＰホモ二量体が、表面形態の図の下部に示される。ノギンホモ二量体は、漫画風に、ＢＭＰ二量体の上部に示される。円は、Ｎ末端結合領域、コア領域、およびＮ末端とコア領域との間のリンカーの輪郭である。
【図６】図６は、ＳＯＳＴ Ｎ末端領域に存在する可能性のあるＢＭＰ結合フラグメントの３Ｄモデルを示す。ＢＭＰ二量体が表面形態で示され、可能性のあるＢＭＰ結合フラグメントがスティック形態で示される。ＢＭＰ表面上の疎水性ポケットにフィットするフェニルアラニン残基が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明により、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、このような抗体を使用するための方法が提供される。本発明により、また、これらの抗体の作成および分析のために使用することができる、ＳＯＳＴポリペプチド免疫原も提供される。抗体は、ＴＧＦ−β結合タンパク質であるＳＯＳＴポリペプチドの、リガンド、具体的には、骨形態形成タンパク質に対する結合をブロックするかまたは妨害する、そしてさらに、１つ以上の他のリガンドに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合をブロックするかまたは妨害するために有用であり得る。
【００２９】
本発明は、ＢＭＰに対するスクレロスチンポリペプチドの結合を競合的に阻害することができる抗スクレロスチン抗体によって特異的に認識される特異的な短いペプチド配列を、スクレロスチンポリペプチド配列中で思いがけず発見したことに、一部関係する。このようなスクレロスチン−ＢＭＰ結合は、そうでなければ、ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位および／またはＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位を介して生じる。１つ以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の１つ以上のメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する抗体のような分子には、例えば、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーもしくはＢＭＰを活性化することができる分子、あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質への結合からＴＧＦ−βメンバーをはずすこと、もしくは妨げることによって、それらのそれぞれのレセプターに対する１つ以上のＢＭＰを含むＴＧＦ−βファミリーのメンバーの結合を可能にする分子が含まれることが理解されるはずである。
【００３０】
本発明により、また、ペプチドおよびポリペプチド免疫原が提供される。これらは、思いがけず、１つ以上のＢＭＰに対するＴＧＦ−β結合タンパク質であるＳＯＳＴの結合を阻害する、妨げる、または妨害する（例えば、統計学的に有意な様式で減少させる）ことができる抗体またはそのフラグメントを作成および／または同定するために使用することができる。例示的なペプチド免疫原には、本明細書中で提供されるようなスクレロスチンポリペプチド（またはその変異体）の、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、２０〜２５個、２１〜５０個、２６〜３０個、３１〜４０個、４１〜５０個、５１〜６０個、６１〜７０個、または７１〜７５個の連続しているアミノ酸が含まれ得る。このようなペプチドには、例えば、配列番号２〜１９、２１〜５３、および５４に示されるようなアミノ酸配列が含まれる。本発明により、また、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を阻害する、妨げる、または妨害することができる抗体またはそのフラグメントを作成および／または同定するために使用することができる、ペプチドおよびポリペプチド免疫原が提供される。本発明の抗体は、骨のミネラル含有量およびミネラル密度を増大させるために有用であり、それにより、骨が使用できないことになってしまう（例えば、骨折が原因で）疾患、遺伝的素因、事故を含む、骨のミネラル含有量の減少を生じる多数の状態を緩和する。本発明により、骨の再吸収に有効であるか、または骨形成細胞を死滅させ、そして正常な加齢を行う治療薬が提供される。
【００３１】
（骨硬化症）
骨硬化症は、ヒトにおいて異常な骨ミネラル密度に関係している疾患である。骨硬化症は、Ｈａｎｓｅｎによって、ファン・ブッヘム骨化過剰症と類似しているが、おそらく、骨の変化が放射線によって現れる点、ならびに、多くの症例においては人差し指および中指の非対称性の皮膚多合脂症が存在する点で異なる障害に対して、与えられた名前である（Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｋｌｅｒｏｓｔｅｏｓｅ ｉｎ：Ｏｐｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ，（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ １９６７）３５１−３５５）。骨硬化症は、現在は、成人の骨の広い範囲に広がる硬化性病変を特徴とする、常染色体不完全優性障害であると理解されている。この状態は進行性である。骨硬化症は、また、多合脂症（２本以上の指が互いに融合する）を伴うという局面を有する。骨硬化症症候群には高い身長が関係しており、多くの患者は、６フィート以上の身長に達している。さらに、この状態を有しているヒトの顎は、異常な四角の概観を有する。ホモ接合型の骨ミネラル含有量は、正常な個体よりも１倍から６倍高くなり得、骨ミネラル密度は、上記の正常な値よりも１倍から４倍高くなり得る（例えば、罹患していない兄弟と比較して）。
【００３２】
骨硬化症症候群は、最初に、南アフリカのオランダ人の家系であるアフリカ人に生じた。アフリカ人の集団においては、およそ１４０人に１人が変異した遺伝子（ヘテロ接合型）のキャリアである。この変異は１００％遺伝浸透度がある。事例報告では、高い骨ミネラル密度がヘテロ接合型において観察されているが、彼らは病気（例えば、多合脂症または頭蓋骨の過剰な成長）にはかかっていないことが示されている。
【００３３】
下垂体視床下部索の異常が、骨硬化症の患者において観察されていない。具体的には、成長ホルモンとコルチゾンの過剰な産生はなく、性ホルモンの濃度は患者においては正常である。骨の代謝回転のマーカー（例えば、骨芽細胞特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、１型プロコラーゲンＣプロペプチド（ＰＩＣＰ）、および全てのアルカリホスファターゼ（Ｃｏｍｉｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｒｈｅｕ．７：２４３（１９９５））は、非常に高い造骨活性がこの疾患に関係していることを示しているが、正常よりもわずかに低い破骨細胞の活性が、骨再吸収のマーカー（ピリジノリン、デオキシピリジノリン、Ｎ−テロペプチド、尿中のヒドロキシプロリン、血漿中の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ、およびガラクトシルヒドロキシリジン（Ｃｏｍｉｅｒ、前出を参照のこと））によって測定した際に観察される。
【００３４】
骨硬化症は、患者の生涯にわたる骨格の全体にわたる骨の持続的な堆積を特徴とする。ホモ接合型においては、骨ミネラルの持続的な堆積により、機械受容器が存在しない骨格の領域（例えば、頭蓋骨、顎骨、頭蓋）において骨の過剰な成長が導かれる。骨硬化症のホモ接合型においては、頭蓋骨の骨の過剰な成長により、脳幹に対する過剰な静水圧が原因で、頭蓋の圧迫が生じ、最終的には死に至る。一般的な広範性の硬化症は、骨格の他の部分の全てにおいて観察される。長骨の皮質領域は大幅に厚みを増し、その結果、骨の強度が実質的に増大する。小柱の連結部分は厚みを増し、これにより、次いで、骨梁の強度が高まる。硬化性骨は、異常なｘ線を通さないものとして現れる。
【００３５】
骨硬化症症候群の原因である稀な遺伝的変異は、ヒトの１７番染色体の領域に存在する。この領域内の遺伝子は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーの新規のメンバーをコードする（例えば、米国特許第６，３９５，５１１号、同第６，４８９，４４５号、および同第６，４９５，７３６号；Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：５７７−８９（２００１）を参照のこと）。したがって、スクレロスチンの濃度を変化させるかまたは調節することに関係する治療は、異常な骨の発達または損傷に関係している状態および疾患を処置することにおいて有用であり得る。以下にさらに詳細に記載されるように、このＴＧＦ−β結合タンパク質であるスクレロスチン（本明細書中では、ＢｅｅｒまたはＳＯＳＴとも記載される）に特異的に結合する抗体は、骨ミネラルの含有量を増加させるために使用することができ、したがって、多数の疾患の兆候を処置する、予防する、その進行を遅らせる、または緩和するために使用することができる。
【００３６】
（ＴＧＦ−βスーパーファミリー）
本明細書中で参照される重要な分子の中には、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの任意の既知のメンバーまたは新規のメンバーが含まれる。また、ＴＧＦ−βスーパーファミリーには、ＴＧＦ−βレセプター（これは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（ＢＭＰを含む）の特定のメンバーに特異的である１つ以上のレセプターをいうと理解されるはずである）、およびＴＧＦ−β結合タンパク質（これは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（ＢＭＰを含む）の特定のメンバーまたは複数のメンバーのサブセットに対して特異的結合親和性を有している１つ以上のポリペプチドをいうと理解されるはずである）も含まれる。ＴＧＦ−β結合タンパク質の特異的な例としては、スクレロスチン、すなわちＳＯＳＴが挙げられる。ヒトを含む種々の動物のＳＯＳＴおよびＳＯＳＴ変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中では、配列番号５５、５６、５７、５９、６１、６３、６５、および６７、および６９に提供される（コードされるポリペプチド配列は、配列番号１、２０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および７０にそれぞれ提供される）。（例えば、米国特許第６，３９５，５１１号、同第６，４８９，４４５号、および同第６，４９５，７３６号を参照のこと；また、例えば、Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５０：２３１；Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．Ｒｅｓ．１７：２６９；Ｋｈａｌｉｌ，１９９９ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．１：１２５５；Ｍｉｙａｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ８：１１；ｖｏｎ Ｂｕｂｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３９：１；Ｋｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．５２：３５４；Ｅｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｓｐｉｎｅ ２７（１６ Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１０；Ｂｏｎｄｅｓｔａｍ ２００２，Ｌｉｇａｎｄｓ ＆ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β Ｆａｍｉｌｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ Ｎｏ．１７も参照のこと）。
【００３７】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーには、共通の配列エレメントと、二次および三次の両方のレベルで構造モチーフを共有している種々の成長因子が含まれる。このタンパク質のファミリーは、広い範囲の生物学的応答を発揮し、これによって多くの種類の細胞型に影響を与える。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの多くは、胚発生の間のパターン形成と組織指定において重要な機能を有している。成体においては、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、例えば、創傷の治癒、骨の修復、および骨再形成に、さらには、免疫系の調節にも関係している。ＴＧＦ−βポリペプチドに加えて、このスーパーファミリーには、ＢＭＰ、アクチビン、インヒビン、成長および分化因子（Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ）（ＧＤＦ）、ならびに神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が含まれる。一次的な分類は、一般的なサブファミリーに特異的タンパク質を分類分けする一般的な配列の特徴を通じて行われる。サブファミリー内でのさらなる層化は、より小さいグループのメンバーの間での重点的な配列保存により可能である。場合によっては、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７のように、アミノ酸のパーセント同一性が、より小さいグループのメンバーの間で７５％程度の高い度合いの場合もある。この同一性のレベルにより、１つの代表的な配列について、より大きなファミリーの他のメンバーとそれを分けるサブグループの鍵となる生化学的エレメントを説明することができる。
【００３８】
ＴＧＦ−β２の結晶構造が決定されている。ＴＧＦ−β２単量体の通常の折り畳みには、３個のジスルフィド架橋によって形成される安定な、コンパクトなシステインノット様の構造が含まれる。１つのジスルフィド架橋によって安定化される二量体化は、逆平行である。
【００３９】
ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ヘテロ−オリゴマーレセプター複合体の形成を誘導することによって情報を伝達する。ＴＧＦ−βシグナル伝達の導入には、膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼレセプターＩ型およびＩＩ型の２つの異なるサブファミリーが関係している。少なくとも７個のＩ型レセプターと５個のＩＩ型レセプターが同定されている（Ｋａｗａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．９：４９−６１（１９９８）；Ｍｉｙａｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１１５−５７（２０００）を参照のこと）。ＴＧＦ−βファミリーのそれぞれのメンバーは、Ｉ型およびＩＩ型レセプターの特徴的な組み合わせに対して結合し、これらのいずれもがシグナル伝達に必要である。ＴＧＦ−βレセプターの活性化についての現行のモデルにおいては、ＴＧＦ−βリガンドは最初にＩＩ型レセプター（ＴｂＲ−ＩＩ）に結合し、これが次いで、Ｉ型レセプター（ＴｂＲ−Ｉ）を動員して、リガンド／ＩＩ型／Ｉ型三者複合体を形成する。Ｉ型レセプターは、ＴｂＲ−ＩＩが存在しない条件ではリガンドには結合できない。ＴｂＲ−ＩＩは、次いで、膜近傍の領域にあるグリシンとセリン残基を多く含むドメイン（ＧＳドメイン）中を優先的にＴｂＲ−Ｉをリン酸化し、それによってＴｂＲ−Ｉを活性化する。活性化されたＩ型レセプターキナーゼは、次いで、Ｓｍａｄファミリーのタンパク質の特定のメンバーをリン酸化し、これは、特異的な遺伝子の転写を調節する核に転移する。
【００４０】
（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）：骨ミネラル密度の鍵となる調節タンパク質）
骨形成の理解における主な前進は、ＢＭＰの同定であり、これは骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、生体内での軟骨および骨の分化を調節する。ＢＭＰ／ＯＰは、間葉幹細胞が骨組織によって再吸収されて置き換えられる軟骨構造を築く軟骨細胞へと分化する事象のカスケードを通じて、軟骨内の骨の分化を誘導する（Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５０：２３１−５０（２００２）を参照のこと）。したがって、このプロセスには、軟骨の形成、軟骨の肥大および鉱化作用、血管浸潤、骨芽細胞の分化、ならびに骨の形成が含まれる。上記のように、ＢＭＰ／ＯＰ（ＢＭＰ２−１４、ならびに骨形成タンパク質１および２、ＯＰ−１およびＯＰ−２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ１２６４３（ＢＭＰ−２）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ１２６４５（ＢＭＰ３）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ５５１０７（ＢＭＰ−３ｂ、成長／分化因子１０）（ＧＤＦ−１０））；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ１２６４４（ＢＭＰ４）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ２２００３（ＢＭＰ５）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ２２００４（ＢＭＰ６）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ１８０７５（ＢＭＰ７）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ３４８２０（ＢＭＰ８）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｑ９ＵＫ０５（ＢＭＰ９）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｏ９５３９３（ＢＭ１０）；ＧｅｎＢａｎｋ Ｏ９５３９０（ＢＭＰ１１、成長／分化因子１１前駆体（ＧＤＦ−１１））；ＧｅｎＢａｎｋ Ｏ９５９７２（ＢＭ１５））は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰ／ＯＰサブファミリーのメンバーの間での特筆すべき進化的保存は、これらが動物の正常な発達および機能において重要であることを示唆している。さらに、胎児以降の軟骨形成および骨形成に加えて、ＢＭＰ／ＯＰは、頭蓋顔面および歯の組織の発達を含む骨格形成において複数の役割を果たしている。種々のＢＭＰファミリーのメンバーは、また、単球、上皮細胞、間質細胞、および神経細胞を含む種々の他の細胞型中でも生物学的活性を有している。ＢＭＰは、細胞の増殖および分化、化学走査性、ならびにアポトーシスを調節し、また、基本的な役割、例えば、左右対称性、神経発生、中胚葉のパターン形成、および胚発生、ならびに、腎臓、消化管、肺、歯、手足、羊膜、および精巣を含む多数の器官形成の制御もしている（Ｂａｌｅｍａｎｓ、前出を参照のこと）。
【００４１】
ＢＭＰは、大きな前駆体タンパク質として合成される。二量体化の際に、ＢＭＰは細胞内でタンパク質分解的に切断されて、カルボキシ末端成熟タンパク質を生じ、これは次いで、細胞から分泌される。ＢＭＰは、他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーと同様に、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼレセプターの両方に対して協力して結合することによって、シグナル伝達を開始する。ＢＭＰがリガンドとして作用し得るＩ型レセプターとしては、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３としても知られている）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６としても知られている）、ＡＬＫ−１、およびＡＬＫ−２（ＡｃｔＲ−Ｉとしても知られている）が挙げられる。ＩＩ型レセプターのうち、ＢＭＰはＢＭＰ ＩＩ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＩ）、アクチビンＩＩ型（ＡｃｔＲ−ＩＩ）、およびアクチビンＩＩＢ型（ＡｃｔＲ−ＩＩＢ）に結合する（Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，前出、および本明細書中で引用されている参考文献を参照のこと）。ＢＭＰ Ｉ型レセプターポリペプチドのポリヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００４３２９（配列番号８５によってコードされる配列番号７１）；Ｄ８９６７５（配列番号８６によってコードされる配列番号７２）；ＮＭ＿００１２０３（配列番号８７によってコードされる配列番号７３）；Ｓ７５３５９（配列番号８８によってコードされる配列番号７４）；ＮＭ＿０３０８４９（配列番号８９によってコードされる配列番号７５）；およびＤ３８０８２（配列番号９０によってコードされる配列番号７６）に提供されている。Ｉ型レセプターの他のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に、例えば、ＮＰ＿００１１９４（配列番号７７）；ＢＡＡ１９７６５（配列番号７８）；およびＡＡＢ３３８６５（配列番号７９）に提供されている。ＢＭＰ ＩＩ型レセプターポリペプチドのポリヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに提供されており、例えば、Ｕ２５１１０（配列番号９１によってコードされる配列番号８０）；ＮＭ＿０３３３４６（配列番号９２によってコードされる配列番号８１）；ＮＭ＿００１２０４（配列番号９３によってコードされる配列番号８２）；およびＺ４８９２３（配列番号９４によってコードされる配列番号８３）が挙げられる。ＩＩ型レセプターのさらなるポリペプチド配列も、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに、例えば、ＣＡＡ８８７５９（配列番号８４）に提供されている。
【００４２】
ＢＭＰは、他のシスチンノットタンパク質と同様に、ホモ二量体構造を形成する（Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８７：１０３−１５（１９９９））。ＢＭＰ／ＴＧＦ−βファミリーについて行われた進化の軌跡の分析によれば、ＢＭＰ Ｉ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位は、ＢＭＰ構造の表面にマップされた（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８３９−４７（２０００））。ＢＭＰ上でのＩ型レセプター結合部位の位置は、ＢＭＰ−２／ＢＭＰレセプターＩＡ複合体のｘ線構造によって後に確認された（Ｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８３Ａ（Ｓｕｐｐｌ １（Ｐｔ １））：Ｓ７−Ｓ１４（２００１））。予想されるＩＩ型レセプター結合部位は、ＴＧＦ−β３／ＴＧＦ−β ＩＩ型レセプター複合体のｘ線構造とうまく一致している（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：２０３−２０８（２００２））。これは、ＢＭＰ／ＢＭＰレセプターＩＩＡシステムと非常によく類似している。
【００４３】
ＢＭＰおよびアクチビンサブファミリーは、ＴＧＦ−β結合タンパク質による有意な翻訳後調節に供される。複雑な細胞外制御システムが存在し、それによって、親和性の高いアンタゴニストが合成され、運び出され、その後、ＢＭＰまたはアクチビンと選択的に複合体を形成して、それらの生物学的活性を破壊する（Ｓｍｉｔｈ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１５：３−６（１９９９））。多数のこのようなＴＧＦ−β結合タンパク質が同定されており、配列の相違に基づくと、アンタゴニストは、一次配列が保存されていないことが原因で別々に進化したようである。脊椎動物においては、アンタゴニストとしては、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、コーディン様、フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、ＦＳＲＰ、ＤＡＮ／ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）タンパク質ファミリー、およびスクレロスチン（ＳＯＳＴ）が挙げられる（Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，前出、および本明細書中で引用されている参考文献を参照のこと）。アンタゴニズムの機構は、種々のアンタゴニストについて異なるようである（Ｉｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：９３３７−９３４２）。
【００４４】
ＢＭＰアンタゴニストであるノギン上のＩ型およびＩＩ型レセプター結合部位もまた、マップされている。ノギンはＢＭＰに対して高い親和性で結合する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ノギン／ＢＭＰ−７複合体の構造の研究により、これらの２つのタンパク質の間での結合相互作用が明らかにされた（Ｇｒｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２０：６３６−４２（２００２））。ＢＭＰシグナル伝達複合体のモデルにノギン−ＢＭＰ−７構造を重ね合わせることにより、ノギンの結合が、ＢＭＰ−７上の結合エピトープの両方の対（すなわち、ＢＭＰ Ｉ型およびＩＩ型レセプター結合部位）を効果的にマスクすることが示されている。ノギンのシステインを多く含む足場配列の前には、「クリップ」（残基２８〜４８）と呼ばれる約２０個のアミノ酸残基のＮ末端セグメントが存在する。Ｉ型レセプター結合部位は、ノギンのクリップドメインのＮ末端部分によってふさがれ、そしてＩＩ型レセプター結合部位は、クリップドメインのカルボキシ末端部分によってふさがれる。ノギンのＣ末端付近のコア領域中の２つのβ鎖もまた、ＩＩ型レセプター結合部位でＢＭＰ−７と接する。この結合形態により、ノギン二量体が、ＢＭＰ二量体上の全てのレセプター結合部位を効率よくブロックすることができる（２つのＩ型と２つのＩＩ型レセプター結合部位）。
【００４５】
（スクレロスチンポリペプチドおよびスクレロスチンコードポリヌクレオチド）
ＢＭＰアンタゴニストであるスクレロスチン（米国特許第６７，３９５，５１１号、同第６，４８９，４４５号、および同第６，４９５，７３６号；配列番号１、２０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および７０もまた参照のこと）は、ヒトＤＡＮ、ヒトグレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、およびヒトケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、およびＳＣＧＦと比較した場合にはほぼ同一のシステイン（ジスルフィド）足場を有しているが（米国特許第５，７８０，２６３）、ヌクレオチドレベルではほとんど相同性はない（背景情報については、一般的には、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １：６７３−６８３（１９９８）を参照のこと）。スクレロスチンはまた、このＴＧＦ−β結合タンパク質の変異体を含むと理解される（例えば、配列番号６０および６２）。本明細書中で使用される場合は、ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体ポリヌクレオチドは、配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９の修飾体である（１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換）アミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードする核酸分子をいう。このような変異体としては、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの自然界に存在している多型変異体または対立遺伝子変異体、さらには、これらのアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換体をコードする合成のポリヌクレオチドが挙げられる。当業者に公知の種々の基準は、ペプチドまたはポリペプチド中の特定の位置のアミノ酸が似ているかどうかを示す。例えば、類似のアミノ酸または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有しているアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有しているアミノ酸としては、塩基性の側鎖を有しているアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性の側鎖を有しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；電荷を有していない極性の側鎖を有しているアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性の側鎖を有しているアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分岐側鎖を有しているアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有しているアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）が挙げられる。プロリンは、分類がさらに難しいと考えられており、脂肪族側鎖を有しているアミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＡｌａ）と性質を共有している。特定の状況においては、グルタミン酸のグルタミンでの置換、またはアスパラギン酸のアスパラギンでの置換を、グルタミンおよびアスパラギンが、それぞれ、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で、類似の置換であると考えることができる場合もある。
【００４６】
ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのさらなる変異体形態は、本明細書中に記載されているヌクレオチド配列中に見られる１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含む核酸分子である。ＴＧＦ−β結合タンパク質の変異体または突然変異体は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の変化したバージョンが野生型のＴＧＦ−β結合タンパク質と競合するように構築することができ、またそのように同定することもできる。このような競合は、好ましくは、野生型ＴＧＦ−β結合タンパク質の活性をブロックし、それにより、骨密度を増大させるように導く。
【００４７】
単離されたポリヌクレオチドは、生物体のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていない核酸分子（ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが自然界の環境の一部ではないベクター中にクローニングされている場合に、単離されているとみなされる。例えば、真核生物細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物体のゲノム中に組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡであり得、また、核酸アナログの少なくとも一部を構成し得る。
【００４８】
ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下で配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列を有している核酸分子とハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定することができる。さらに、ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体ポリヌクレオチドは、システイン骨格を有しているタンパク質をコードする。ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体ポリヌクレオチドは、また、配列比較によっても同定することができる。本明細書中で使用される場合は、２つのアミノ酸配列は、最大と対応のなるように並べられた時に、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同じである場合に、「１００％のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列は、最大の対応となるように並べられた時に、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチドが同じである場合に、「１００％のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって製造されているＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ、またはＮＣＢＩウェブサイト（［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］＜：ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）で入手できるＢＬＡＳＴアルゴリズムに含まれるもののような、標準的なソフトウェアプログラムを使用して行うことができる。最適なアラインメントを決定することにより２つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ ａｎｄ Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７），Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），”Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ １２３−１５１（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７），ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照のこと）。
【００４９】
変異体ＴＧＦ−β結合タンパク質は、配列番号１、２０、５８、６０、６２、６４、６６、および６８に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するべきであり、好ましくは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％以上の同一性を有する。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体は、配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９に対して少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有することによって同定することができる。さらに、本発明により、配列番号５５または５７に対して７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の同一性を有しているＴＧＦ−β結合タンパク質ポリヌクレオチド変異体が意図される。ＴＧＦ−β結合タンパク質変異体ポリヌクレオチドまたは変異体ＴＧＦ−β結合タンパク質を同定するために使用される特定の方法に関わらず、そのような変異体を、例えば、タンパク質のＴＧＦ−βファミリーの選択されたメンバーに結合する、および／またはそのシグナル伝達を阻害するその能力、あるいは、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に特異的に結合するその能力によって機能的に特徴付けることができる。
【００５０】
本発明の状況においては、ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリヌクレオチドの「機能的フラグメント」とは、（１）本明細書中に記載される機能的活性を有しているか、または（２）抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に特異的に結合するかのいずれかであるＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドの部分をコードする核酸分子をいう。例えば、本明細書中に記載されるＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの機能的フラグメントには、配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のヌクレオチド配列の一部が含まれる。
【００５１】
「単離されたポリペプチド」は、本明細書中では、その自然界の環境から取り出されたポリペプチドをいう。例えば、自然界に存在しているタンパク質は、それが、自然界においてそのポリペプチドに付随している炭水化物、脂質、核酸、またはタンパク質様の不純物のような、自然界での系において同時に存在している物質のいくつかまたは全てから分離されている場合に、単離されている。好ましくは、このような単離されたポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋であり、さらに好ましくは、少なくとも約９５％純粋であり、そして最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋である。
【００５２】
（ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な抗体）
本発明により、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体が提供され、また、これらの抗体の作成および分析に使用することができるＳＯＳＴポリペプチド免疫原もまた提供され、そしてまた、このような抗体を使用するための方法も提供される。本明細書中に記載される本発明の抗体は、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、それによって、ＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰの結合をブロックするか、または阻害する、すなわち、ＢＭＰとＳＯＳＴとの間での相互作用を妨げるか、または妨害する。この相互作用をブロックすることの効果は、骨ミネラル密度を変化させる（統計学的に有意な様式で、増大させるかまたは減少させる）こと、好ましくは、骨ミネラル密度を増大させることである。
【００５３】
免疫および／またはＳＯＳＴ特異的抗体の分析に有用なポリペプチドまたはペプチドはも、また、当業者に公知であり、本明細書中に記載される方法に従って、宿主動物中で抗原性反応を生じる可能性が高いアミノ酸配列を決定するために、ＴＧＦ−β結合タンパク質の一次、二次、および三次構造を分析することによって選択することができる。例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７（１９９１）；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９３２−４０（１９８５）を参照のこと。モデリングおよびｘ線結晶解析のデータもまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質のどの部分またはどの領域がＢＭＰのようなＴＧＦ−β結合タンパク質リガンドの一部と相互作用するかを推定および／または同定するために使用することができる。相互作用の部分または領域内またはその周辺のアミノ酸配列を含むＴＧＦ−β結合タンパク質ペプチド免疫原を、設計し調製することができる。これらの抗体は、同じリガンドに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合をブロックするかまたは妨害するために有用であり得、また、１つ以上の他のリガンドに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合をブロックするかまたは妨害することもできる場合がある。
【００５４】
本発明によって想定される抗体またはその抗原結合フラグメントには、ＳＯＳＴに特異的に結合することができ、ＢＭＰのようなＴＧＦ−βポリペプチドのＳＯＳＴに対する結合を競合的に阻害することができる抗体が含まれる。例えば、本発明によって想定される抗体は、ＢＭＰ上のＢＭＰ Ｉ型レセプター部位に対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害するか、またはＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位に対するＳＯＳＴの結合を競合的に阻害するか、あるいは、ＢＭＰ上のＩ型レセプター結合部位とＩＩ型レセプター結合部位の両方に対するＳＯＳＴの結合を競合的に阻害する場合もある。いかなる理論にも束縛されることは望まないが、抗ＳＯＳＴ抗体がＢＭＰポリペプチドのＩ型および／またはＩＩ型結合部位のＳＯＳＴに対する結合を競合的に阻害し、それによってＳＯＳＴのアンタゴニスト活性をブロックする場合は、ＢＭＰ上のレセプター結合部位はＩ型レセプターおよびＩＩ型レセプターのいずれに対する結合にも利用され、それによって骨鉱化作用が増大する。ＳＯＳＴのようなＴＧＦ−β結合タンパク質とＢＭＰのようなＴＧＦ−βポリペプチドとの間での結合相互作用は、通常は、リガンド対のそれぞれがホモ二量体を形成する際に生じる。したがって、ＢＭＰに対するＳＯＳＴの結合を競合的に阻害することによってＢＭＰに対するＳＯＳＴの結合をブロックする、妨害する、または妨げるためにＳＯＳＴに特異的な抗体を使用する代わりに、あるいはそれに加えて、ＳＯＳＴ特異的抗体は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成をブロックする、または妨害するためにも使用することができる。
【００５５】
一例として、高い親和性でＢＭＰに結合する能力を有しているＢＭＰアンタゴニストであるヒトノギンの二量体の１つ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，前出）は、ヒトＢＭＰ−７の１つの二量体との複合体として単離され、多波長異常分散法（ＭＡＤ）によって分析された（Ｇｒｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２０：６３６−４２（２００２））。本明細書中で議論されるように、本研究により、ノギン二量体がＢＭＰ二量体上の全てのレセプター結合部位（２つのＩ型レセプター結合部位と２つのＩＩ型レセプター結合部位）を効率よくブロックすることができることが明らかにされた。ＢＭＰ−７と接するノギンのアミノ酸位置は、他のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えば、スクレロスチン（ＳＯＳＴ）とＢＭＰとの間での相互作用をモデル化することにおいて有用であり得、したがってこのような相互作用をブロックするかまたは妨害する抗体を作成するための免疫原として使用することができるペプチドの設計の助けとなり得る。
【００５６】
本発明の１つの実施形態においては、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＢＭＰ上に存在する骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型レセプター結合部位、およびＢＭＰ ＩＩ型レセプター結合部位の少なくとも１つまたはそれらの両方に対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を競合的に阻害する。これらの抗体が結合するＳＯＳＴ上のエピトープには、ＳＯＳＴポリペプチドのＮ末端に存在する連続しているアミノ酸配列（配列番号１の約１〜５６位）が含まれるか、または、エピトープはＳＯＳＴポリペプチドのＮ末端に存在する連続しているアミノ酸配列（配列番号１の約１〜５６位）に含まれる場合もある。ポリペプチドには、また、コア領域（例えば、配列番号４７（ヒト）および配列番号４８（ラット）において提供されているようなポリペプチド）に対してＮ末端領域を結合させる短いリンカーペプチド配列が含まれる場合もある。ヒトＳＯＳＴ（配列番号１）についての短い代表的なＮ末端ペプチド配列としては、配列番号２〜６、そして代表的なラットＳＯＳＴ（例えば、配列番号２０）についてのペプチド配列としては、配列番号１２〜１５が挙げられる。
【００５７】
ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合し、ＢＭＰに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を、例えば、Ｉ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位の１つ以上に対応するＢＭＰのアミノ酸に対する結合をブロックするかまたは阻害することによって、ブロックするかまたは競合的に阻害する抗体はまた、ＳＯＳＴのコア領域に対応するアミノ酸配列（配列番号１のおよそ５７〜１４６位のアミノ酸）を含むペプチドにも特異的に結合することができる。コア領域を含むポリペプチドには、また、例えば、キャリア分子に対してポリペプチドを結合させるために有用であり得るシステイン残基を含むように、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたはそれらの両方にさらなるアミノ酸の伸張を含めることができる。ヒトおよびラットのＳＯＳＴについての代表的なコアポリペプチドには、例えば、それぞれ、配列番号４９および配列番号５０に示されるアミノ酸配列が含まれる。このような抗体は、また、より短いポリペプチド配列に結合することができる場合もある。代表的なヒトＳＯＳＴコアペプチド配列は、配列番号２１〜２４に提供され、代表的なラットＳＯＳＴコア配列は、配列番号２５〜２８に提供される。
【００５８】
別の実施形態においては、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する（阻害する、妨げる、またはブロックする、例えば、統計学的に有意な様式で減少させる）。ＳＯＳＴとＢＭＰとの間での相互作用には、ＳＯＳＴのホモ二量体、およびＢＭＰのホモ二量体が関係しているため、ＳＯＳＴのホモ二量体の形成を妨げるかまたは妨害する抗体は、それによって、骨ミネラル密度を変化させる、好ましくは、骨のミネラル密度を増大させることができる。１つの実施形態においては、ＳＯＳＴのコア領域に結合する抗体は、ホモ二量体の形成を妨害する。このような抗体は、また、コア領域に対応する連続しているアミノ酸配列を含むペプチド、例えば、配列番号２９、３０、および５３（ヒトＳＯＳＴ）、ならびに配列番号３１、および５４（ラットＳＯＳＴ）にも結合することができる。ＳＯＳＴポリペプチドのＣ末端領域に存在するエピトープ（配列番号１または２０のいずれかのおよそ１４７〜１９０位のアミノ酸）に結合する抗体は、また、ホモ二量体の形成を妨害することができる。代表的なヒトＳＯＳＴおよびラットＳＯＳＴのＣ末端ポリペプチドには、例えば、それぞれ、配列番号５１および配列番号５２に示されるアミノ酸配列が含まれる。このような抗体は、また、より短いポリペプチド配列にも結合できる場合がある。代表的なヒトＳＯＳＴ Ｃ末端ペプチド配列は、配列番号３３〜３６に提供され、代表的なラットＳＯＳＴ Ｃ末端配列は、配列番号４１〜４３に提供される。
【００５９】
本明細書中で開示される、抗体が特異的に結合するＳＯＳＴポリペプチドおよびペプチドは、免疫原として有用である。本発明のこれらの免疫原は、体液性免疫応答を生じるように動物を免疫するために使用することができ、この体液性免疫応答により、ＳＯＳＴのＮ末端領域に由来するペプチドを含む、いずれもＢＭＰ上に存在するＩ型レセプター結合部位またはＩＩ型レセプター結合部位に特異的に結合する抗体の産生を生じるか、またはＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する場合もある。
【００６０】
免疫原として有用であるこのようなＳＯＳＴポリペプチドおよびペプチドは、また、抗体を含むサンプル、例えば、精製された抗体、抗血清、または細胞培養上清のサンプル、あるいはＳＯＳＴに特異的な１つ以上の抗体を含む任意の他の生物学的サンプルをスクリーニングするための方法において使用することができる場合もある。これらのペプチドは、また、生物学的サンプルから、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のＢ細胞を同定し、選択するための方法（例えば、プラーク形成アッセイなど）においても使用することができる場合もある。Ｂ細胞は、次いで、ＳＯＳＴ特異的抗体をコードするポリヌクレオチドの供給源として使用することができ、これは、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている組み換え分子生物学的技術によってクローニングすることができ、そして／または修飾することができる。
【００６１】
「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用される場合には、特定の実施形態においては、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体を含むサンプルを意味し、生物学的サンプルは、血液サンプル（それから血清または血漿を調製することができる）、生検標本、組織外植片、器官培養物、あるいは検体もしくは生物学的供給源に由来する任意の他の組織または細胞調製物を得ることによって、提供され得る。サンプルは、さらに、または形態学的完全性もしくは物理的状態が破壊されている、例えば、解剖、解離、可溶化、分画、ホモジナイゼーション、生化学的もしくは化学的抽出、粉砕、凍結乾燥、超音波処理、または検体もしくは生物学的供給源に由来するサンプルを処理するための任意の他の手段によって破壊されている、組織あるいは細胞調製物をも意味する。検体または生物学的供給源は、ヒト、または非ヒト動物、初代細胞培養物（例えば、生体外で免疫されたＢ細胞）、あるいは染色体に組み込まれたかまたはエピソーム組換え体である核酸配列を含むことができる遺伝子操作された細胞株、不死化細胞株または不死化することができる細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化した細胞株または分化させることができる細胞株、形質転換細胞株などを含むがこれらに限定されない培養に適応させられた細胞株であり得る。
【００６２】
ＳＯＳＴペプチド免疫原は、また、ＳＯＳＴポリペプチドの全ポリペプチド配列を全体として呈し、それぞれがその枠組みにおいて別のペプチドと共通しているＳＯＳＴアミノ酸配列の部分を有している、一連のペプチドを合成することによって調製することもできる。この重複部分は、好ましくは、少なくとも４個のアミノ酸であり、より好ましくは、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸である。それぞれのペプチドは、動物を免疫するために使用することができ、動物から血清が回収され、どの動物がＴＧＦ−βタンパク質に対するＳＯＳＴの結合を妨害するかまたはブロックする抗体を産生するかを同定するためのアッセイにおいて試験される。次いで、抗体は、このように同定された免疫された動物から、当該分野で公知であって本明細書中に記載される方法に従って調製される。
【００６３】
ＳＯＳＴのような、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、および他の非ペプチド分子が、本発明によって想定される。本明細書中で記載される場合は、分子は、それがＴＧＦ−β結合タンパク質と検出可能なレベルで反応し、無関係な配列または異なるＴＧＦ−β結合タンパク質の配列を含むペプチドおよびポリペプチドとは検出できるようには反応しない場合に、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対して「特異的に結合する」と言われる。好ましい結合分子としては、抗体が挙げられ、これは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、またはＣＤＲ移植免疫グロブリン、またはそのフラグメント、例えば、タンパク質分解によって作成されたかもしくは組み換えによって産生された免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、およびＦｄフラグメントであり得る。
【００６４】
配列番号１、２０、５８、６０、６２、６４、６６、または６８のＴＧＦ−β結合タンパク質に「特異的に結合する」が、ＤＡＮ、ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、ＳＣＧＦ，またはグレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）のような他のＴＧＦ−β結合タンパク質には結合しない、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体が特に有用である。抗体は、それらが、１０４Ｍ−１以上のＫａで結合する、より好ましくは、約１０５Ｍ−１以上のＫａで結合する、より好ましくは、約１０６Ｍ−１以上のＫａで結合する、なおさらに好ましくは、１０７Ｍ−１以上のＫａで結合する、そしてなおさらに好ましくは、１０８Ｍ−１以上のＫａで結合し、他のＴＧＦ−β結合タンパク質には結合しない場合に、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的に結合するか、または特異的なＴＧＦ−βファミリーのメンバーに特異的に結合すると理解される。その同種の抗原に対する抗体の親和性はまた、解離定数ＫＤとして一般的に表現され、抗ＳＯＳＴ抗体は、それが１０−４Ｍ以下のＫＤで結合する、より好ましくは、約１０−５Ｍ以下のＫＤで結合する、より好ましくは、約１０−６Ｍ以下のＫＤで結合する、なおさらに好ましくは、１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する、そしてなおさらに好ましくは、１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合に、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに特異的に結合する。さらに、本発明の抗体は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を、ブロックする、妨害する、または阻害する（例えば、統計学的に有意に減少させる）ことが好ましい。
【００６５】
抗体または結合パートナーの親和性、さらには、それに対する抗体の結合を阻害する程度は、従来技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２（１９４９））によって記載されている技術を使用して、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって当業者が容易に決定することができる。表面プラズモン共鳴については、標的分子が固相上に固定され、フロー細胞と共に動く移動層中にリガンドに曝される。リガンドの固定された標的に対する結合が生じると、局所的な屈折率の変化が生じ、これによりＳＰＲ角の変化が誘導される。これは、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムでモニターすることができる。ＳＰＲシグナルの変化率を分析することにより、結合反応の会合相と解離相についての見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比により、見かけの平衡定数（親和性）が得られる（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−６５（１９９３）を参照のこと）。
【００６６】
本発明の抗体は、いずれかの免疫グロブリンのクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＡに属する場合がある。これは、動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）および哺乳動物（これらとしては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または他の齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長類が挙げられるがこれらの限定されない）から得ることができ、またはそれらに由来するものでもあり得る。抗体は、インターナライジング抗体である場合もある。
【００６７】
当該分野で周知の方法を使用して、ＳＯＳＴのようなＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な抗体、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を作成することができる。抗体は、また、所望される特性を有するように設計された、遺伝子操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメントとして産生することもできる。例えば、例としてであって、限定ではないが、抗体としては、第１の哺乳動物種に由来する少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ドメインと、第２の別の哺乳動物種に由来する少なくとも１つの定常領域ドメインを有しているキメラ融合タンパク質である、組み換えＩｇＧが挙げられる。最も一般的には、キメラ抗体は、マウスの可変領域配列とヒトの定常領域配列を有する。このような、マウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、マウス抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を繋ぐことによって「ヒト化」することができ、これにより、ヒトに由来するＶ領域フレームワーク領域およびヒトに由来する定常領域中に、抗原に対する結合特異性を与えることができる。これらの分子のフラグメントは、タンパク質分解的消化によって、または状況によっては、タンパク質分解的消化に続いて、ジスルフィド結合の穏やかな還元とアルキル化によって、作成することができる。あるいは、このようなフラグメントは、また、組み換え遺伝子操作技術によっても作成することができる。
【００６８】
特定の好ましい抗体は、本明細書中に記載される生体外において、ＴＧＦ−β結合タンパク質の活性を阻害するかまたはブロックするそのような抗体である。ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体の結合特性は、通常、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫ブロット法、向流免疫電気泳動、放射免疫測定、ドットブロット法、阻害もしくは競合アッセイなどを含む免疫検出方法使用して評価することができる。これらは、当業者であれば容易に行うことができる（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号、および同第４，４８６，５３０号；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと）。
【００６９】
免疫原は、例えば、ＳＯＳＴポリペプチド、精製されたＳＯＳＴポリペプチドもしくは部分的に精製されたＳＯＳＴポリペプチド、またはそれらの変異体もしくはフラグメント（すなわち、ペプチド）、あるいはＳＯＳＴポリペプチドに由来するペプチドとして、ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞から構成される場合もある。このようなペプチドは、大きなポリペプチドのタンパク質分解的切断によって、組み換え分子方法によっても作成することができ、または化学的に合成することもできる。例えば、ＳＯＳＴポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書中で提供され、その結果、免疫原として使用するためのＳＯＳＴポリペプチドを当業者は日常的に行われる手順によって調製することが出来る。ペプチドは、本明細書中に記載されており、当該分野で公知である方法によって化学的に合成することができる。あるいは、ペプチドは、ＳＯＳＴポリペプチドのタンパク質分解的切断によって作成することができ、個々のペプチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または任意の回数の液体クロマトグラフィー、または他の分離方法のような、当該分野で公知の方法によって単離することができる。免疫原として有用なペプチドは、通常、本明細書中に記載されているようなＳＯＳＴポリペプチドのアミノ酸配列に由来する少なくとも４個または５個の連続しているアミノ酸のアミノ酸配列を有し得、好ましくは、ＳＯＳＴポリペプチドの６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、１９個、または２０個の連続しているアミノ酸を含む。特定の他の好ましいペプチド免疫原には、ＳＯＳＴポリペプチド配列の少なくとも６個であって１２個を超えない連続しているアミノ酸が含まれ、他の好ましいペプチド免疫原には、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２０個であって７５個を超えない連続しているアミノ酸が含まれ、そして、他の好ましいペプチド免疫原には、ＳＯＳＴポリペプチドの少なくとも２１個のアミノ酸であって５０個を超えない連続しているアミノ酸が含まれる。他の好ましいペプチド免疫原には、ＳＯＳＴポリペプチド配列の２１〜２５個、２６〜３０個、３１〜３５個、３６〜４０個、４１〜５０個、あるいは、２１個から１００個の間の任意の全整数個の連続しているアミノ酸、および１００個から１９０個の間の任意の全整数個の連続しているアミノ酸が含まれる。
【００７０】
ＳＯＳＴに特異的に結合するポリクローナル抗体は、本明細書中に記載されている当業者に周知に方法を使用して調製することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，”ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），ｐａｇｅｓ １−５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ｐａｇｅ １５（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと）。ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体は、例えば、発現ベクターのＴＧＦ−β結合タンパク質産物で動物を免疫することによって、または本明細書中に記載されているように、単離されたＴＧＦ−β結合タンパク質もしくはそのペプチドフラグメントで免疫することによって、得ることができる。ポリクローナル抗体は、通常は、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、またはヒツジのような動物中で惹起されるが、本発明の抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、非ヒト霊長類から得ることもできる。有用な抗体をヒヒにおいて診断的および治療的に惹起させるための一般的な技術は、例えば、ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０，１９９０に見ることができる。
【００７１】
動物に注射するための免疫原の調製には、別の免疫原性タンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのようなキャリアタンパク質に対するＴＧＦ−β結合タンパク質（またはその変異体もしくはフラグメント）の共有結合が含まれる。ポリペプチドまたはペプチド免疫原は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに１つ以上のさらなるアミノ酸を含む場合があり、これにより、結合手順が容易になる（例えば、ＫＬＨに対するペプチドの結合を容易にするためのシステインの付加）。ポリペプチドまたはペプチド中の他のアミノ酸残基は、キャリアポリペプチドに対する特定のアミノ酸位置での結合を防ぐために（例えば、ポリペプチド／ペプチドの内部の位置のシステインがセリン残基で置換される）、あるいは、可溶性を増大させるかまたは免疫原性を増大させるために、置換される場合もある。
【００７２】
免疫原として使用される、ＴＧＦ−β結合タンパク質ペプチド、ポリペプチド、またはＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞は、アジュバント、例えば、フロイトの完全なアジュバントもしくは不完全なアジュバント、またはＲｉｂｉアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）中に乳化させられる場合もある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，前出もまた参照のこと。免疫原は、腹腔内、筋肉内、眼内、皮内、または皮下を含む多数の種々の経路を介して動物に注射することができる。一般的には、最初の注射後、動物には、好ましいスケジュールに従って１回以上の追加免疫が行われる。これは、特に、抗原、アジュバント（存在する場合には）、および／または特定の動物種に応じて変化する。免疫応答は、動物から定期的に採血し、ＥＬＩＳＡまたはオクタロニー試験などのような免疫学的検定において血清を調製して分析し、特異的な抗体力価を決定することによってモニターされる。一旦、適切な抗体力価が確立されると、動物は、定期的に採血されてポリクローナル抗血清が蓄えられるか、または、放血させられる場合もある。ＴＧＦ−β結合タンパク質またはペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体が、次いで、このような抗血清から、例えばプロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質もしくはペプチド、または特定の免疫された動物種のＩｇ定常領域に特異的な抗体が適切な固体支持体上に固定されているアフィニティークロマトグラフィーを行うこともできる。
【００７３】
本発明で使用される抗体としては、本明細書中に記載されており当該分野で公知の従来の免疫および細胞融合手順により調製される、モノクローナル抗体が挙げられる。モノクローナル抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、種々の技術を使用して作成することができる。特異的抗原に結合するモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）；米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｐｉｃｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ”ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ ９３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと）。抗体フラグメントは、タンパク質分解的消化、または状況によっては、タンパク質分解的消化（例えば、パパインもしくはペプシンを使用する）の後、ジスルフィド結合の穏やかな還元およびアルキル化のような任意の適切な標準的な技術を使用して、それらから誘導することができる。あるいは、このようなフラグメントは、また、組み換え遺伝子操作技術によって作成することもできる。
【００７４】
簡潔には、モノクローナル抗体は、例えば、ラット、ハムスター、あるいは好ましくはマウスのような動物に、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子産物またはそのペプチドフラグメントを含む免疫原、当該分野で公知であり本明細書中に記載される方法に従って注射することによって得ることができる。特異的抗体が産生されたことは、最初の注射後（注射は、ポリクローナル抗体の作成について本明細書中に記載されるいくつかの経路のうちのいずれか１つによって投与される）、および／または追加の注射の後、血清サンプルを得、そして当該分野で公知であり本明細書中に記載されているいくつかの免疫検出方法のうちのいずれか１つを使用してＴＧＦ−β結合タンパク質またはペプチドに結合する抗体の存在を検出することによってモニターすることができる。ＴＧＦ−β結合タンパク質に結合する抗体を産生する動物から、脾臓またはリンパ節に由来する最も一般的な細胞であるリンパ系細胞が、取り出されて、Ｂリンパ球が得られる。Ｂリンパ球は、次いで、好ましくは、免疫された動物と同系であり、状況によっては、他の所望される特性（例えば、Ｉｇ遺伝子産物を内生的には発現できないこと、例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５８０）；ＮＳ０、ＳＰ２０）を有している、薬剤で感作された骨髄腫細胞の融合パートナーと融合させられて、不死化させられた真核生物細胞株であるハイブリドーマを生じる。リンパ球（例えば、脾臓）細胞と骨髄腫細胞が、数分間の間、膜融合促進剤、例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤と共に混合され、その後、ハイブリドーマ細胞の増殖をサポートするが、融合していない骨髄腫細胞についてはサポートしない選択培地上で低密度にプレートされる。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間、通常は、およそ１週間から２週間の後、細胞のコロニーが観察される。単一のコロニーが単離され、細胞によって産生された抗体がＴＧＦ−β結合タンパク質、またはその変異体もしくはフラグメントに対する結合活性について、当該分野で公知であって本明細書中に記載される種々の免疫学的検定のうちのいずれか１つを使用して試験され得る。ＳＯＳＴに対して高い親和性と特異性を有しているモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。したがって、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが、本発明によって想定される。ハイブリドーマがクローニングされ（例えば、限界希釈クローニングによるか、または柔寒天プラーク分離によって）、そして抗原に特異的な抗体を産生するポジティブクローンが選択され、培養される。ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対する結合をブロックする、阻害する、または妨害する抗体が好ましい。
【００７５】
ハイブリドーマ培養物に由来するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離することもできる。マウスモノクローナル抗体の産生のための別の方法は、同系のマウス、例えば、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するように処置された（例えば、プリスタンで感作された）マウスの腹腔に、ハイブリドーマ細胞を注射することである。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立されている技術によって単離し、精製することができる。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを使用するアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１−２．７．１２ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９−１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照のこと）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖または軽鎖のイソ型、結合特異性など）に基づいて選択された適切なリガンドを使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。固体支持体上に固定される適切なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、およびＴＧＦ−β結合タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体が挙げられる。
【００７６】
さらに、本発明の抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体である場合もある。ヒトモノクローナル抗体は、当業者がよく知っている任意の多数の技術によって作成することができる。このような方法としては、限定的ではないが、ヒト末梢血細胞（Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞の生体外での免疫、ヒト免疫グロブリン遺伝子が挿入されている免疫されたトランスジェニックマウスからの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、あるいは、当該分野で公知であり本明細書中の開示に基づく他の手順が挙げられる。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原でのチャレンジに応答して特異的ヒト抗体を生じるように操作されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４；米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−３５に記載されている。この技術においては、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性の重鎖および軽鎖遺伝子座が標的化されて破壊されている胚性幹細胞から誘導されたマウスの株に導入される（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８（１９９７）もまた参照のこと）。例えば、ヒトの免疫グロブリントランス遺伝子は、ミニ遺伝子構築物、または酵母の人工染色体上のトランス遺伝子座であり得、これは、Ｂ細胞特異的ＤＮＡ再配置、およびマウスのリンパ系組織でのハイパー変異を受ける。ヒトモノクローナル抗体は、次いで、抗原に特異的なヒト抗体を産生することができるトランスジェニックマウスを免疫することによって得ることができる。免疫されたトランスジェニックマウスのリンパ系細胞は、本明細書中に記載される方法にしたがって、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫された動物の血液から得ることができる。
【００７７】
ヒトＴＧＦ−β結合タンパク質特異的モノクローナル抗体を作成するための別の方法としては、ＥＢＶ形質転換によってヒト末梢血を不死化させることが挙げられる。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照のこと。ＴＧＦ−β結合タンパク質（またはその変異体もしくはフラグメント）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するこのような不死化Ｂ細胞株（またはリンパ芽球細胞株）は、本明細書中で提供されるような免疫検出方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって同定することができ、その後、標準的なクローニング技術によって単離することができる。抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体を産生するリンパ芽球細胞株の安定性は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｇｌａｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８：３７７−８９（１９８９）を参照のこと）にしたがって、マウス−ヒトハイブリッド細胞株を生じるようにマウス骨髄腫細胞と形質転換した細胞株を融合させることによって、改善することができる。ヒトモノクローナル抗体を作成するためのさらに別の方法は、生体外での免疫であり、これには、抗原でヒトの脾臓Ｂ細胞を感作すること、その後、ヘテロハイブリッド融合パートナーと感作したＢ細胞を融合させることが含まれる。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５を参照のこと。
【００７８】
特定の実施形態においては、抗ＳＯＳＴ抗体を産生するＢ細胞が選択され、軽鎖および重鎖可変領域が、当該分野で公知（ＷＯ９２／０２５５１；米国特許第５，６２７，０５２号；Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：７８４３−４８（１９９６））であり、本明細書中に記載される分子生物学的技術にしたがってＢ細胞からクローニングされる。好ましくは、免疫された動物に由来するＢ細胞が、脾臓、リンパ節、または末梢血サンプルから、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することによって、単離される。Ｂ細胞は、また、ヒトから、例えば、末梢血サンプルから単離することもできる。所望される特異性を有している抗体を産生する単一のＢ細胞を検出するための方法は当該分野で周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞分類、生体外での刺激、その後の特異的抗体の検出などによる。特異的抗体を産生するＢ細胞の選択のための方法としては、例えば、ＳＯＳＴまたはそのペプチドフラグメントを含む柔寒天中のＢ細胞の単細胞懸濁物を調製することが挙げられる。抗原に対する、Ｂ細胞によって産生された特異的抗体の結合により、免疫沈降物としてみることができる複合体の形成が生じる。特異的抗体を産生するＢ細胞を選択した後、特異的抗体遺伝子を、当該分野で公知であり本明細書中に記載される方法にしたがって、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、増幅することによりクローニングすることができる。
【００７９】
特定の用途については、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体のフラグメントが望まれる場合がある。抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄは、抗体全体の抗原結合部位を保持しており、したがって、同じエピトープに結合する。抗体に由来するこれらの抗原結合フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、例えば、従来の方法にしたがって抗体全体をペプシンまたはパパインで消化することによって、得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓフラグメントを生じるようにペプシンで抗体を酵素切断することによって産生することができる。このフラグメントは、さらに、３．５Ｓ Ｆａｂ’１価フラグメントを生じるように、チオール還元剤を使用して切断することができる。状況に応じて、切断反応は、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基についてのブロック基を使用して行うことができる。あるいは、パパインを使用する酵素切断により、２つの１価のＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが直接得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）によって；およびＣｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．８．１−２．８．１０ ａｎｄ ２．１０−２．１０．４によって記載されている。抗体を切断する、例えば、重鎖を分離して１価の軽−重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成させる、フラグメントのさらなる切断のための他の方法、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子的技術もまた、フラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りは、使用することができる。
【００８０】
抗体フラグメントは、また、それが特異的抗原に結合して複合体を形成する抗体と同様に作用する、任意の合成のタンパク質または遺伝子操作されたタンパク質である場合もある。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組み換えの単鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基から構成される最小認識単位が挙げられる。本発明の抗体には、好ましくは、少なくとも１つの可変領域ドメインが含まれる。可変領域ドメインは、任意の大きさまたは任意のアミノ酸組成のものであり得、そして一般的には、抗原の結合を担っており、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたはそれらとインフレームの関係にある少なくとも１つの超可変アミノ酸配列を含む。一般的な用語においては、可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重（ＶＨ）および／または軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの任意の適切な配置であり得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは１価の、ＶＨまたはＶＬドメインである場合もあり、これらは互いに独立して受容可能な親和性で抗原に結合することができる。あるいは、Ｖ領域ドメインは二量体である場合もあり、これらとしては、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体が挙げられる。好ましくは、Ｖ領域二量体には、少なくとも１つのＶＨと少なくとも１つのＶＬ鎖が含まれ、これらは非共有的に結合させられている（本明細書中では以後Ｆｖという）。所望される場合には、鎖を、直接、例えば、２つの可変ドメインの間のジスルフィド結合を介して、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してのいずれかで共有結合させて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）を形成させることもできる。
【００８１】
可変領域ドメインは、任意の自然界に存在している可変ドメイン、またはその操作されたバージョンである場合もある。操作されたバージョンによっては、組み換えＤＮＡ操作技術を使用して作成された可変領域ドメインが意味される。このような操作されたバージョンとしては、例えば、特異的抗体のアミノ酸配列中の、またはアミノ酸配列への挿入、欠失、または、変化によって特異的抗体可変領域から作成されたものが挙げられる。特定の例としては、第１の抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲおよび状況に応じて１つ以上のフレームワークアミノ酸と、第２の抗体に由来する可変領域ドメインの残りを含む、操作された可変領域ドメインが挙げられる。
【００８２】
可変領域ドメインは、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメントに対して、Ｃ末端アミノ酸で共有結合させることができる。したがって、例えば、可変領域ドメイン中に存在するＶＨドメインを、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそのフラグメントに連結させることができる。同様に、ＶＬドメインを、ＣＫドメインまたはそのフラグメントに連結させることができる。この方法では、例えば、抗体は、抗原結合ドメインがそれぞれＣＨ１およびＣＫドメインに対してそれらのＣ末端で供給結合された結合させられたＶＨおよびＶＬドメインを含む、Ｆａｂフラグメントであり得る。ＣＨ１ドメインは、例えば、Ｆａｂ’フラグメント中に見ることができるヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部を提供するように、あるいは、抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのようなさらなるドメインを提供するように、さらなるアミノ酸で伸張させることができる。
【００８３】
抗体フラグメントの別の形態は、単鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることができる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型として抗体を産生する細胞のｍＲＮＡを使用して、可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して、調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，１９９１；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照のこと）。
【００８４】
あるいは、抗体は、抗体の可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡの操作および再発現を含む組み換えＤＮＡ技術を使用することによって得られる、組み換え抗体または操作された抗体であり得る。このようなＤＮＡは公知であり、そして／または例えば、ファージ抗体ライブラリーを含むＤＮＡライブラリーから容易に入手することができるか（Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｔｉｂｔｅｃｈ．１０：８０−８４（１９９２）を参照のこと）、あるいは所望される場合には、合成することもできる。標準的な分子生物学的手順および／または化学的手順を使用して、ＤＮＡを配列決定し操作することができ、例えば、システイン残基を作成するためにコドンを導入することができ、また、所望される場合には他のアミノ酸またはドメインを修飾、付加、もしくは欠失させることもできる。
【００８５】
ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的なキメラ抗体には、ヒト化抗体が含まれ、これは、本発明にしたがって作成することもできる。キメラ抗体は、第１の哺乳動物種に由来する少なくとも１つの定常領域ドメインと、第２の異なる哺乳動物種に由来する少なくとも１つの可変領域ドメインを有している（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−５５（１９８４）を参照のこと）。好ましい実施形態においては、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体に由来する少なくとも１つの可変領域ドメイン、例えば、マウス、ラット、もしくはハムスターのモノクローナル抗体に由来する可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのヒト定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクター中にクローニングすることによって構築することができる（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９−７６（１９８９）；Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９（１９９３）を参照のこと）。例えば、マウスのモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクター中に挿入することができる。別のベクター中には、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする配列とインフレームでクローニングすることができる。選択される特定のヒト定常領域は、特定の抗体について所望されるエフェクター機能に応じて変化し得る（例えば、特定のＦｃレセプターに対する相補性固定、結合など）。好ましくは、構築されたベクターは、キメラ抗体の安定な発現のために真核生物細胞中にトランスフェクトされる。キメラ抗体を作成するための当該分野で公知の別の方法は、相同組み換えである（例えば、米国特許第５，４８２，８５６号）。
【００８６】
非ヒト／ヒトキメラ抗体は、さらに、「ヒト化」抗体を作成するために遺伝子操作することができる。このようなヒト化抗体は、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリンに由来する複数のＣＤＲ、少なくとも１つのヒトの可変フレームワーク領域、および少なくとも１つのヒト免疫グロブリン定常領域を含むことができる。ヒト化抗体を設計するための有用な方法論としては、例えば、例であって限定的ではないが、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域に最も相同であるヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられる。いかなる理論にも束縛されることは望まないが、このような方法論により、ヒト化抗体がＴＧＦ−β結合タンパク質に対して特異的結合親和性を保持する確実性を増大させることができ、いくつかの好ましい実施形態においては、これにより、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその変異体もしくはフラグメントについて実質的に同じ親和性を有することができ、特定の他の好ましい実施形態においては、ＴＧＦ−β結合タンパク質についてより大きい親和性を有することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５；Ｒｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７を参照のこと。したがって、このようなヒト化抗体の設計には、非ヒト可変領域のＣＤＲループ立体構造と構造決定基を、例えば、コンピュータによるモデル化によって決定すること、その後、既知のヒトＣＤＲループ構造および決定基とこのＣＤＲループおよび決定基を比較することが含まれる。例えば、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ ＦＡＳＥＢ ９：１３３−３９；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３７７−３８３を参照のこと。コンピュータによるモデル化はまた、配列相同性によって選択されるヒト構造の鋳型を、非ヒト可変領域と比較するために使用することもできる。例えば、Ｂａｊｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５−１０３；ＥＰ−０５７８５１５−Ａ３を参照のこと。非ヒトＣＤＲのヒト化により結合親和性が低下する場合は、コンピュータによるモデル化によって、部位特異的突然変異技術または他の突然変異技術により変化させて、部分的に、完全に、または状況に応じて上にまで親和性を回復させる（すなわち、ヒト化されていない抗体よりも大きいレベルにまで増大させる）ことができる特異的アミノ酸残基を同定するために役立てることができる。当業者は、これらの技術を十分に理解しており、このような設計方法論に対して多数のバリエーションおよび変更を容易に加えることができる。
【００８７】
ヒト化抗体を調製するための１つのこのような方法は、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）と呼ばれる。本明細書中で使用される場合は、用語「ベニヤＦＲ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ＦＲ）」および「組み換えによるベニヤＦＲ」は、自然界のＦＲポリペプチドの折りたたみ構造の実質的に全てを維持している抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、ヒトＦＲ残基で、例えば、齧歯類の重鎖または軽鎖Ｖ領域に由来するＦＲ残基を選択的に置き換えることをいう。ベニヤ技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が抗原結合表面内の重鎖および軽鎖ＣＤＲのセットの構造および相対的性質によって主に決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−７３，１９９０。したがって、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、それらの互いの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されているヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニヤ技術を使用することにより、免疫系と容易に接触する外側（例えば、溶媒露出）ＦＲ残基を、ヒト残基と選択的に置き換えて、弱い免疫原性であるかまたは実質的に免疫原性ではないベニヤ表面のいずれかを含むハイブリッド分子が得られる。
【００８８】
ベニヤリングのプロセスでは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ．，（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）によって集められたヒト抗体の可変ドメインについての入手可能な配列データ、Ｋａｂａｔデータベースのアップデート、ならびに他の利用できる米国および他国のデータベース（核酸とタンパク質の両方）を利用する。Ｖ領域のアミノ酸の溶媒露出度は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメントについての既知の三次元構造から推定することができる。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記で同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。最も相同であるヒトＶ領域が、次いで、対応するマウスのアミノ酸に対して１残基ずつ比較される。ヒトの対応物とは異なるマウスのＦＲ中の残基は、当該分野で周知の組み換え技術を使用してヒト部分中に存在する残基で置き換えられる。残基の交換は、少なくとも一部が露出している（溶媒露出）部分についてのみ行われ、Ｖ領域ドメインの三次構造に対して顕著な影響を及ぼす可能性があるアミノ酸残基、例えば、プロリン、グリシン、および電荷を有しているアミノ酸の置き換えには注意が払われる。
【００８９】
この様式では、得られる「ベニヤ」抗原結合部位は、したがって、齧歯類ＣＤＲ残基、実質的にＣＤＲに隣接している残基、埋まっているかまたはほぼ埋まっている（溶媒露出ではない）と同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインの間での非共有的な（例えば、静電気的および疎水的）接触に関与していると考えられる残基、ＣＤＲループの「標準的な」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存されている構造領域に由来する残基を保持するように設計される。これらの設計基準は、次いで、齧歯類の抗体分子の抗原特異性を示す組み換えヒト抗体を発現させるために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用することができる、ヒトの見かけ上のＦＲ中の抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲを併せ持つ組み換えヌクレオチド配列を調製するために使用される。
【００９０】
ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体を選択するための別の方法は、ファージディスプレイによる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０を参照のこと。ヒトまたはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子の組み合わせライブラリーは、ファージベクター中で作成することができ、これを、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、またはそれらの多量体）を選択するためにスクリーニングすることができる。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７２８−３２（１９８９）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９（１９９０）；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４３６３−６６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：４７−５２およびその中で引用されている参考文献を参照のこと。例えば、複数のＩｇ可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーを、糸状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３またはその変異体のゲノム中に、ファージコートタンパク質をコードする配列とインフレームになるように挿入することができる。融合タンパク質は、軽鎖可変領域ドメインと、および／または重鎖可変領域ドメインとのコートタンパク質の融合体であり得る。特定の実施形態によれば、免疫グロブリンＦａｂフラグメントをもまた、ファージ粒子上で提示することができる（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照のこと）。
【００９１】
重鎖および軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーは、また、λファージ、例えば、λＩｍｍｕｎｏＺａｐＴＭ（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐＴＭ（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、調製することができる。簡単に言うと、ｍＲＮＡはＢ細胞の集団から単離され、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクター中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを作成するために使用される。これらのベクターは、別々にスクリーニングすることができ、また、Ｆａｂフラグメントまたは抗体を形成するように同時に発現させることもできる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，前出を参照のこと；また、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，前出も参照のこと）。ポジティブなプラークが、続いて、非溶解性プラスミドに転換させられ得、これによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からモノクローナル抗体フラグメントを高いレベルで発現させることができる。
【００９２】
同様に、抗体の一部またはフラグメント、例えば、ＦａｂおよびＦｖフラグメントは、従来の酵素消化または組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むように構築することもできる。１つの実施形態においては、ハイブリドーマ中で、目的のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域が、ヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者が合成することができ、また、商業的な販売元から購入することもできる（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照のこと。ここで、特に、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ領域についてのプライマーを含む、マウスおよびヒトの可変領域についてのプライマーを販売している）。これらのプライマーは、重鎖または軽鎖の可変領域を増幅するために使用することができ、次いで、これは、それぞれ、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰＴＭＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰＴＭＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなベクター中に挿入することができる。これらのベクターは、次いで、発現させるために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、または哺乳動物に基づく系の中に導入することができる。ＶＨおよびＶＬドメインの融合体を含む大量の単鎖タンパク質を、これらの方法を使用して産生することができる（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８を参照のこと）。さらに、このような技術を使用して、抗体の結合特異性を変化させることなく非ヒト抗体のＶ領域をヒト化することができる。
【００９３】
本発明の特定の具体的な実施形態においては、組み合わせファージライブラリーを、非ヒト可変領域をヒト化するために使用することもできる。例えば、Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−１８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０−１５を参照のこと。ファージライブラリーは、当該分野で公知であり本明細書中に記載される免疫検出方法によって、目的のＩｇ可変領域フラグメントを選択するようにスクリーニングすることができ、そのように選択されたファージ中に挿入されている免疫グロブリン遺伝子のＤＮＡ配列を、標準的な技術によって決定することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。選択されたＩｇをコードする配列は、次いで、Ｉｇフラグメントを発現させるための別の適切なベクターにクローニングされるか、または場合によっては、免疫グロブリン鎖全体を発現させるために、Ｉｇ定常領域を含むベクターにクローニングされる。
【００９４】
特定の他の実施形態においては、本発明により、多量体抗体フラグメントであるＳＯＳＴ特異的抗体が想定される。有用な方法は、例えば、Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２０１−１２；Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３に一般的に記載されている。例えば、多量体抗体フラグメントは、ミニ抗体を形成させるためのファージ技術（米国特許第５，９１０，５７３号）またはダイアボディーを形成させるためのファージ技術（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１２８−１３０）によって作成することができる。
【００９５】
本発明の特定の実施形態においては、ＳＯＳＴに特異的な抗体は、細胞内タンパク質として発現される抗体であり得る。このような細胞内抗体は、また、イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）とも呼ばれ、これにはＦａｂフラグメントが含まれる場合があり、また、好ましくは、ｓｃＦｖフラグメントが含まれる（例えば、Ｌｅｃｅｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：４７６４−４９（２００１）を参照のこと）。ＣＤＲ領域に隣接するフレームワーク領域は、細胞内の還元性の環境においてイントラボディーの発現レベルと溶解性を改善するように修飾することができる（例えば、Ｗｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２７９５−８０３（２０００）を参照のこと）。イントラボディーは、例えば、細胞内の特定の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列に対して作動するように融合させることができるイントラボディーの可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することによって、特定の細胞位置または細胞小器官に向けることができる（例えば、Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：１１８２−９１（１９９５）；Ｌｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１１９６−２０５（２０００）を参照のこと）。イントラボディーは、遺伝子治療ベクターもしくは脂質混合物（例えば、Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによって製造されたＰｒｏｖｅｃｔｉｎＴＭ）を介することを含む当業者が利用することができる種々の技術によって、または光化学的インターナライゼーション法にしたがって、細胞中に導入することができる。
【００９６】
ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な免疫グロブリン分子中にアミノ酸変異を導入することは、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する特異性または親和性を増大させるため、あるいはエフェクター機能を変化させるために有効であり得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質に対して高い親和性を有している免疫グロブリンは、特定の残基の部位特異的突然変異誘発によって作成することができる。コンピュータ支援三次元分子モデリングを使用して、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する親和性を改善するために、変化させるアミノ酸残基を同定することができる。例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．１０：１−１４２を参照のこと。あるいは、ＣＤＲの組み合わせライブラリーをＭ１３ファージ中に作成し、親和性が改善された免疫グロブリンフラグメントをスクリーニングすることができる。例えば、Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９−１３；米国特許第５，７９２，４５６号を参照のこと。
【００９７】
エフェクター機能は、また、部位特異的変異誘発によって変化させることもできる。例えば、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３−６４；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−２４；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚｅｄｅｈ−Ｋｏｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：８３０−３４を参照のこと。例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分上のグリコシル化部位の変異により、相補性を固定する免疫グロブリンの能力を変化させることができる。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３２を参照のこと。定常領域ドメイン中の他の変異によっても、相補性を固定する、または抗体依存性の細胞性の細胞傷害性に影響を与える、免疫グロブリンの能力を変化させることができる場合もある。例えば、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３−６４；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−２４；Ｓｅｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１０１９−２９を参照のこと。
【００９８】
特定の実施形態によれば、本明細書中に記載されるＩｇ分子のいずれかの非ヒト、ヒト、またはヒト化重鎖および軽鎖可変領域は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドフラグメント（単鎖抗体）として構築することができる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３を参照のこと。多機能ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、インフレームで、種々の既知のエフェクタータンパク質のいずれかをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列と連結させることによって作成することができる。これらの方法は当該分野で公知であり、例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されている。例えば、エフェクタータンパク質には、免疫グロブリン定常領域配列が含まれる場合がある。例えば、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８８：１−７を参照のこと。エフェクタータンパク質の他の例は酵素である。限定的ではないが例として、このような酵素は、治療目的のために生物学的活性を提供することができる場合があり（例えば、Ｓｉｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：５１０−１９を参照のこと）、また、診断用途のための検出可能な活性、例えば、検出可能な生成物中の多数の周知の基質のいずれかの西洋ワサビペルオキシダーゼによって触媒される転換を提供する場合もある。ｓｃＦｖ融合タンパク質のさらに他の例としては、ｓｃＦｖポリペプチドが毒素に連結されているＩｇ−毒素融合体、または免疫毒素複合体が挙げられる。
【００９９】
本明細書中に記載されるｓｃＦｖまたは任意の抗体フラグメントは、特定の実施形態においては、融合タンパク質と抗原（例えば、ＴＧＦ−β結合タンパク質）との間の特異的結合の検出を可能にするペプチドまたはポリペプチドドメインに融合させることができる。例えば、融合ポリペプチドドメインは、当業者が十分に理解している種々の技術のいずれかによってＴＧＦ−β結合タンパク質に対するｓｃＦｖ融合タンパク質の結合を検出するための、親和性タグポリペプチドであり得る。ペプチドタグの例としては、アビジン、ストレプトアビジン、またはＨｉｓ（例えば、ポリヒスチジン）が挙げられる。検出技術としては、また、例えば、ビオチンに対するかまたはビオチン模倣配列に対するアビジンまたはストレプトアビジン融合タンパク質の結合（例えば、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびその中で引用されている参考文献を参照のこと）検出可能な部分（例えば、標識部分）との融合タンパク質の直接の共有結合による修飾、特異的な標識されたレポーター分子に対する融合タンパク質の非共有的な結合、酵素活性を有している部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素的修飾、あるいは、固相支持体上への融合タンパク質の固定（共有結合または非共有結合）を挙げることができる。ｓｃＦｖ融合タンパク質の構築のための他の有用な親和性ポリペプチドとしては、例えば、ＷＯ８９／０３４２２、米国特許第５，４８９，５２８号、米国特許第５，６７２，６９１号、ＷＯ９３／２４６３１、米国特許第５，１６８，０４９号、米国特許第５，２７２，２５４号に開示されているようなストレプトアビジン融合タンパク質、アビジン融合タンパク質（例えば、ＥＰ５１１，７４７を参照のこと）；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような酵素；ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡポリペプチドを挙げることができる。
【０１００】
本明細書中に記載されるようなＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知の発現ベクターを用いる核酸の切断、連結、形質転換、およびトランスフェクションについての種々の周知の手順のうちのいずれかにしたがって、増幅させ、発現させることができる。したがって、特定の実施形態においては、抗体フラグメントの発現が、原核生物宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５を参照のこと）中で行われることが好ましい場合がある。特定の他の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントの発現は、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）、または植物細胞を含む真核生物宿主細胞中で行われることが好ましい場合がある。適切な動物細胞の例としては、骨髄腫（例えば、マウスのＮＳＯ株）、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、およびコメの細胞が挙げられる。
【０１０１】
可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡを含む１つ以上の複製可能な発現ベクターを調製し、これを使用して、適切な細胞株、例えば、マウスＮＳＯ株のような非産生性骨髄腫細胞株、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌を形質転換することができる。これらの細胞の中では、抗体の産生が生じる。効率のよい転写および翻訳を得るために、それぞれのベクター中のＤＮＡ配列には、適切な調節配列、特に、可変ドメイン配列に動作可能に連結されたプロモーターおよびリーダー配列が含ませるべきである。この方法で抗体を産生するための特定の方法は、一般的に周知であり、日常的に使用されている。例えば、基本的な分子生物学的手順が、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．に記載されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１）もまた参照のこと）。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（ＰＮＡＳ ７４：５４６３（１９７７））およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されているように行うことができ、部位特異的突然変異誘発は、当該分野で公知の方法にしたがって行うことができる（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１，（１９８４）；Ｋｕｎｋｅｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７）；ｔｈｅ Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ ｈａｎｄｂｏｏｋ）。さらに、多数の刊行物によって、ＤＮＡの操作、発現ベクターの作成、および適切な細胞の形質転換による抗体の調製に適切な技術が記載されている（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ ａｎｄ Ａｄａｉｒ，Ｊ Ｒ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ（ｅｄ．Ｔｏｍｂｓ，Ｍ Ｐ，１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．Ｗｏ ９１／０９９６７）。
【０１０２】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は、それに結合させられた１つ以上のエフェクターまたはレポーター分子を含む場合がある。レポーター分子は、酵素、細胞毒性薬、または他のレポーター分子のような検出可能な部分もしくは標識であり得、これには、色素、放射性核種、発光団、蛍光団、もしくはビオチンなどが含まれる。ＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診断適用または治療適用のために放射標識することができる。抗体を放射標識するための技術は当該分野で公知である。例えば、Ａｄａｍｓ １９９８ Ｉｎ Ｖｉｖｏ １２：１１−２１；Ｈｉｌｔｕｎｅｎ １９９３ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３２：８３１−９を参照のこと。治療適用は、以下にさらに詳細に記載され、これには、他の治療薬と組み合わせて、ＴＧＦ−β結合タンパク質特異的抗体（またはそのフラグメント）を使用することが含まれ得る。エフェクターまたはレポーター分子は、結合または結合プロセスが、分子の有用性が損なわれるような結合特性に対する悪影響は及ぼさない限りは、抗体中に存在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖、末端アミノ酸、または炭水化物官能基のいずれかを介して抗体に結合させることができる。特定の官能基としては、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、またはアルデヒド基が挙げられる。抗体の、エフェクターおよび／またはレセプター分子（単数または複数）との結合は、このような基と、エフェクターまたはレポーター分子中の適切な官能基を介して行うことができる。連結は、直接的、あるいは、スペーサーまたは架橋基を介して間接的であり得る。
【０１０３】
エフェクター分子としては、例えば、抗腫瘍薬、毒素（例えば、細菌の酵素的に活性な毒素（例えば、シュードモナスアエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエクソトキシンＡ、植物に起源するものおよびそのフラグメント（例えば、リシンおよびそのフラグメント、植物ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、セイヨウスズメウリ（Ｂｒｙｏｎｉａ ｄｉｏｉｃａ）由来のブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ））などが挙げられる。例えば、Ｔｈｒｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４９−７１；Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：９２６−３２を参照のこと。さらなるエフェクター分子としては、生物学的に活性なタンパク質（例えば、酵素）、核酸およびそのフラグメント、自然界に存在している高分子および合成の高分子、例えば、多糖類およびポリ（エチレングリコール）のようなポリアルキレンポリマーならびにそれらの誘導体、放射性核種、特に、放射性同位元素、ならびにキレート金属が挙げられる。適切なレポーター基としては、キレート金属、蛍光化合物、または、ＮＭＲもしくはＥＳＲ分光分析によって検出することができる化合物が挙げられる。特に有用なエフェクター基は、カリカエミシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍｉｃｉｎ）およびその誘導体である（例えば、南アフリカ共和国特許明細書Ｎｏ．８５／８７９４号、同第８８／８１２７号、および同第９０／２８３９号を参照のこと）。
【０１０４】
多数の他の毒素（化学療法薬、抗有糸分裂薬、抗生物質、アポトーシスの誘導因子（すなわち、「アポトーシス刺激因子」、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｒｅｅｄ，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３０９−１３１２を参照のこと）などを含む）は当業者に公知であり、本明細書中で提供される例は、本発明の範囲および精神を説明するために意図され、限定するものではない。特定の抗新生物薬としては、細胞毒性薬および細胞増殖抑制剤、例えば、ナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロルエタミン、シクロホスファミド、またはウラシルマスタード）およびそれらの誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、フルオロウラシル、フロキシウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸、またはフルオロクエン酸）、抗生物質（例えば、ブレオマイシン（例えば、硫酸ブレオマイシン）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリカエミシンおよびそれらの誘導体、またはエスペラマイシンおよびそれらの誘導体；有糸分裂阻害因子（例えば、エトポシド、ビンクリスチンまたはビンブラスチンおよびそれらの誘導体）；アルカロイド（例えば、エリプチシン）；ポリオール（例えば、タキシシン−Ｉまたはタキシシン−ＩＩ）；ホルモン（例えば、アンドロゲン（例えば、ドロモスタノロンまたはテストラクトン）、プロゲスチン（例えば、酢酸メゲストロールまたは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロールニリン酸、リン酸ポリエストラジオール、またはリン酸エストラムスチン）、あるいは、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；アントラキノン（例えば、ミトキサントロン）、尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；ヒドラジン（例えば、プロカルバジン）；あるいはイミダゾール（例えば、ダカルバジン））が挙げられる。
【０１０５】
エフェクター分子として有用なキレート金属としては、２から８までの配位数を有している２価または３価の陽性金属のキレートが挙げられる。このような金属の特定の例としては、テクネシウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、およびスカンジウム（Ｓｃ）が挙げられる。一般的には、金属は、好ましくは放射性核種である。具体的な放射性核種としては、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄ、および４７Ｓｃが挙げられる。キレート金属は、例えば、任意の適切な多縮合キレート化剤、例えば、非環式ポリアミンまたは環式ポリアミン、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテルおよびそれらの誘導体）、ポリアミド；ポルフィリン；ならびに炭素環式誘導体でキレート化された上記のタイプの金属の１つであり得る。一般的には、キレート化剤のタイプは、使用される金属に応じて異なる。本発明にしたがう組み合わせにおいて、１つの特に有用なキレート化剤のグループには、しかし、非環式および環式ポリアミンが、特に、ポリアミノカルボン酸、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸およびその誘導体、ならびにマクロ環式アミン、例えば、環式トリ−アザおよびテトラ−アザ誘導体（例えば、国際公開番号Ｎｏ．ＷＯ９２／２２５８３号明細書に記載されているもの）；ならびにポリアミド、特に、デフォリオキサミンおよびその誘導体が含まれる。
【０１０６】
抗体中のチオール基が結合点として使用される場合には、エフェクター分子は、エフェクター分子またはレポーター分子中に存在するチオール反応基を用いて生じる反応により結合させることができる。このような基の例としては、a−ハロカルボン酸またはエステル（例えば、ヨードアセトアミド）、イミド（例えば、マレイミド）、ビニルスルフォン、またはジスルフィドが挙げられる。これらおよび他の適切な連結手順は、国際公開番号ＷＯ９３／０６２３１、同ＷＯ９２／２２５８３、同ＷＯ９０／０９１１９５、および同ＷＯ８９／０１４７６明細書に、一般的に具体的に記載されている。
【０１０７】
本発明により、また、本明細書中で提供されるＳＯＳＴポリペプチドまたはその変異体もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）を認識する抗イディオタイプ抗体の作成も想定される。抗イディオタイプ抗体は、本明細書中に記載される方法により、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体（またはその抗原結合フラグメント）を免疫原として使用して、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として作成することができる。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントはまた、上記の組み換え遺伝子操作方法のいずれかによって、あるいは、ファージディスプレイ選択によって作成することもできる。抗イディオタイプ抗体は、抗ＳＯＳＴ抗体の抗原結合部位と反応することができ、その結果、ＳＯＳＴポリペプチドに対する抗体の結合が競合的に阻害される。あるいは、本明細書中で提供される抗イディオタイプ抗体は、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体の結合を競合的に阻害できない場合もある。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態においては、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体は、ＳＯＳＴポリペプチドの発現を検出するために使用することができる。ある特定の実施形態においては、１つの抗体または抗体のパネルを、ＳＯＳＴポリペプチドを発現する細胞に曝して、ＳＯＳＴポリペプチドの発現を、アッセイにおいて最初に使用した抗体（単数または複数）以外の異なるエピトープに結合する別のＳＯＳＴ特異的抗体を使用して検出することによって、決定することができる。
【０１０９】
（骨密度を増大させる因子を選択するためのアッセイ）
上記で議論したように、本発明により、骨密度を増大させることができる因子を選択および／または単離するための方法が提供される。特定の好ましい実施形態においては、この因子は、ＳＯＳＴ（ＴＧＦ−β結合タンパク質）に特異的に結合する抗体、またはその変異体もしくはフラグメントである。例えば、本発明の１つの実施態様においては、因子が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定するための方法が提供される。この方法には、（ａ）候補の因子を、ＴＧＦ−β結合タンパク質とＴＧＦ−βファミリーのタンパク質のメンバーと接触させるか、または混合する工程、および（ｂ）候補の因子がＴＧＦ−βファミリーのタンパク質によるシグナル伝達を刺激するか、またはＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の１つ以上のメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を妨害するかもしくは阻害するかどうかを決定する工程が含まれる。特定の実施形態においては、因子は、間葉細胞の分化のポジティブな調節因子として作用するＴＧＦ−βの能力を増強する。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態においては、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するための方法が提供される。この方法には、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を、本明細書中に開示されるペプチドを含むがこれに限定されないＳＯＳＴペプチドと、抗体とＳＯＳＴ（抗体／ＳＯＳＴ）との複合体を形成させるために十分な条件下で、十分な時間の間、接触させること、ならびに、その後、ＳＯＳＴ／抗体複合体の濃度を検出（例えば、量を定量）して、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する抗体の存在を決定することが含まれる。この方法は、ＳＰＲ、または、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法などを含む当該分野で公知であり本明細書中で開示される多数の種々の免疫学的検定を使用して行うことができる。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路としては、ＢＭＰが細胞上のＩ型およびＩＩ型レセプターに結合して、骨のミネラル含有量を調節する経路を刺激するかまたは誘導する、シグナル伝達経路が挙げられる。本発明の特定の好ましい実施形態においては、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体が、骨のミネラル含有量を増大させる経路を刺激するか、または増強する。このような抗体は、ＳＯＳＴ特異的ペプチドに対する抗体の結合を検出するための本明細書中で開示される方法を使用して同定することができる。
【０１１１】
本発明の方法は、また、ＢＭＰが結合するＳＯＳＴ上の領域またはそのような領域の一部に存在するＳＯＳＴペプチド、例えば、ＳＯＳＴのアミノ末端のペプチド、およびアミノ末端アミノ酸残基を含むペプチド、およびＳＯＳＴのコア領域（ドッキングコア）の部分（例えば、配列番号２〜１９、２１〜２８、および４７〜５０）に対して抗体が結合するかどうかを検出することにより、ＳＯＳＴポリペプチドに対するＢＭＰの結合を妨害する、阻害する（競合的に阻害することを含む）、または妨げる抗体を同定するために使用することもできる。本発明の方法は、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害する、妨げる、もしくは阻害する抗体を同定するためにも使用することができる。ＳＯＳＴに特異的に結合するこのような抗体は、ＳＯＳＴのコア領域またはカルボキシ末端領域に由来するペプチド（例えば、配列番号２９〜４６および５１〜５４）に対する抗体の結合を検出することによって、同定することができる。
【０１１２】
本発明の他の実施形態においては、因子が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定するための方法が提供される。この方法には、（ａ）ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞に対して候補の因子を接触させる工程、および（ｂ）曝された細胞中でのＴＧＦ−β結合タンパク質の発現が低下するかどうか、またはＴＧＦ−β結合タンパク質の活性が低下するかどうかを決定し、それによって、化合物が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定する工程が含まれる。１つの実施形態においては、細胞としては、骨の生検による、自発的に形質転換されたまたは形質転換されていない正常なヒトの骨、あるいは、ラットの頭骨頭頂部の骨芽細胞を挙げることができる。
【０１１３】
免疫学的検定を、ＴＧＦ−β結合タンパク質の発現を検出し定量するために使用することができ、これには、例えば、等電点免疫電気泳動（Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＣＩＥＰ））、放射免疫測定、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法（例えば、ドットブロット法、ウェスタンブロット法、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイが挙げられる）（米国特許第４，３７６，１１０号、および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；また、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，前出も参照のこと）。このような免疫学的検定では、本明細書中に記載される抗スクレロスチン抗体のようなＴＧＦ−β結合タンパク質に特異的な抗体を使用することができる場合があり、また、ＴＧＦ−β結合タンパク質に結合させたレポーター分子に特異的な抗体を使用できる場合もある。ポリペプチドの発現レベルもまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質リガンドに結合するＴＧＦ−β結合タンパク質の量を定量することによって決定することができる。例えば、サンプル中のスクレロスチンのＢＭＰに対する結合は、表面プラズモン共鳴によって検出することができる。あるいは、特異的ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを定量することもできる。
【０１１４】
他の実施形態においては、ＳＯＳＴに特異的な抗体を、競合アッセイのような方法において使用することができる。ここで、候補の因子が、ＴＧＦ−β結合タンパク質への結合について、抗体と競合する因子を同定するためにスクリーニングされる。抗体とＴＧＦ−βタンパク質との間での相互作用は、当該分野で公知であり本明細書中に記載される免疫学的検定方法を使用して決定することができる。
【０１１５】
例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのファミリーメンバー（例えば、ＴＧＦ−β結合タンパク質）またはＴＧＦ−β結合タンパク質のリガンドであるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、最初に固相に結合させられ、その後、候補の因子が添加される。固相に結合させられているＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのリガンドは、同時に添加されるか、またはその後の工程で添加され、固相が洗浄され、ファミリーのメンバーに結合したリガンドの量が決定される。これは、候補の因子がＴＧＦ−βメンバーに対するリガンドの結合をブロックするかどうかを示す。あるいは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのリガンドを固相に結合させることもでき、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを、候補の分子と同時に、または候補の分子の添加の後に添加することができる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに結合するリガンドの量は、当該分野で公知であり本明細書中に記載される方法にしたがって検出可能な分子でリガンドを標識することによって測定することができる。あるいは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーへのリガンドの結合を、リガンドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントのような１つ以上の検出分子を添加し、リガンドに結合する分子の量を定量することによって測定することができる。本明細書中に記載されるような骨のミネラル含有量を増大させる用途に適している因子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるそのリガンドに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を、統計学的に有意な様式で減少させるそのような因子である。
【０１１６】
本発明の他の実施形態においては、因子が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定するための方法が提供される。この方法には、（ａ）ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞に対して候補の因子を接触させる工程、および（ｂ）曝された細胞によるＴＧＦ−β結合タンパク質の活性が変化するかどうかを決定し、それによって、化合物が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定する工程が含まれる。本明細書中に記載される方法と同様に、広範な種々の方法を、ＴＧＦ−β結合タンパク質を産生する細胞を選択された試験化合物に曝した際のＴＧＦ−β結合タンパク質の発現の変化を評価するために使用することができる。
【０１１７】
本発明の別の実施形態においては、因子が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定するための方法が提供される。この方法には、（ａ）候補の因子を、ＴＧＦ−β結合タンパク質とＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーと接触させる工程、および（ｂ）選択された因子がＴＧＦ−βタンパク質のファミリーのシグナル伝達をアップレギュレートするかどうか、またはＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害するかどうかを決定する工程が含まれる。特定の実施形態においては、分子は、間葉細胞の分化のポジティブな調節因子として作用するＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の能力を増強する。
【０１１８】
上記の方法と同様に、種々の方法を、ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体のような試験化合物によるＴＧＦ−βファミリーのメンバーの刺激を評価するために使用することができる。１つのこのような代表的な方法（Ｄｕｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏ．１３６：１３７４−１３８０もまた参照のこと）には、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー（例えば、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７））を、そのＫｄと等しい濃度で固相に結合させることが含まれる。解離定数（Ｋｄ）は、当該分野で公知の結合速度定数の決定方法、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器を使用する表面プラズモン共鳴により、当該分野で公知であって製造業者（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって記載されている技術にしたがって決定することができる。次いで、アンタゴニスト候補因子のコレクションが、固定された濃度（通常は、有機低分子のコレクションについては２０μＭ（単離された有機低分子とは、本明細書中で使用される場合は、当該分野で周知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）にしたがって決定した場合に９０％以上純粋である分子を意味し、候補の抗体については、１μＭ））で添加される。因子は、ＳＯＳＴに対するＢＭＰの結合を阻害する、すなわち、因子が存在しない条件下で観察されるＳＯＳＴに対するＢＭＰの結合レベルと比較して、少なくとも４０％、好ましくは５０％または６０％、より好ましくは、８０％または９０％の結合レベルの低下が観察される場合に、この相互作用のアンタゴニストであるとみなされる。このような因子は、さらに、その阻害定数およびＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性に対するその影響が決定される力価研究に基づいて、阻害因子としての可溶性を評価することができる。比較可能な特異性対照アッセイもまた、ＢＭＰリガンド作用に依存するアッセイを使用する実験（例えば、ＢＭＰ／ＢＭＰレセプター競合実験）にしたがって、同定されたアンタゴニストについての選択性のプロフィールを確立するために行うことができる。
【０１１９】
本発明のさらに他の実施形態においては、候補の因子が骨のミネラル含有量を増大させることができるかどうかを決定するための方法が提供される。この方法には、候補の因子が骨またはその類似体に対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害するかどうかを決定する工程が含まれる。本明細書中で使用される場合は、骨またはその類似体とは、ヒドロキシアパタイト、または骨の粉末状の形態から構成される表面、粉砕された骨、または完全な骨を意味すると理解されるべきである。本明細書中に記載されている方法と同様に、広範な種々の方法を、ＴＧＦ−β結合タンパク質の骨基質への局在化の阻害を評価するために使用することができる（例えば、Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．４７：２０６−１２（１９９５）を参照のこと）。
【０１２０】
本明細書中に記載される方法は、個々の候補の因子の分析について言及しているが、本発明はそのようには限定されるべきではない。具体的には、因子には、候補の因子の混合物中に含まれる場合がある。本明細書中で記載される場合には、候補の因子は、有機低分子である場合があり、また、抗体もしくはそのフラグメント、または他のペプチドもしくはポリペプチドである場合もある。抗体またはフラグメントは、抗体または抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができるか、あるいは本明細書中に記載されている方法によって調製することもできる。したがって、記載される方法には、さらに、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する因子を単離する工程が含まれる場合もある。
【０１２１】
本発明の１つの実施形態においては、ＳＯＳＴポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＯＳＴポリペプチドに対するＴＧＦ−βファミリーのメンバーの結合を競合的に阻害することができる。ＢＭＰのようなＴＧＦ−βファミリーのメンバーのＳＯＳＴに対する結合を妨害するかまたはブロックする抗体または抗体フラグメントの能力は、本明細書中に記載されている方法のいずれかにしたがって決定することができる。ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、ＳＯＳＴホモ二量体の形成を妨害することによってＳＯＳＴに対するＴＧＦ−βファミリーのメンバーの結合を妨害するか、ブロックするか、または妨げることができる。ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体は、また、ＢＭＰに対する結合からＳＯＳＴを阻害するかまたは妨害することによって、ＳＯＳＴの活性を同定するために使用することもできる。あるいは、抗体またはそのフラグメントは、抗体が活性を変化させる（統計学的に有意な様式で増大させるかまたは低下させる）かどうかを決定するための、ＳＯＳＴが定義された活性を有している、細胞をベースとするアッセイに、または動物モデルに組み入れることができる。ＳＯＳＴに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、シグナル伝達経路におけるそのような抗体の作用、およびそれによるシグナル伝達経路の調節（刺激または阻害）を試験するために使用することができる。好ましくは、ＳＯＳＴに対する抗体の結合により、シグナル伝達経路の刺激または誘導が生じる。
【０１２２】
（タンパク質の産生）
本明細書中で記載されるポリペプチドとしてはＴＧＦ結合タンパク質であるスクレロスチンおよびその変異体、ならびにスクレロスチンに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが挙げられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチドに対して（ならびに、適切である場合には、ポリヌクレオチドおよびそれらの誘導体によってコードされるペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質に対して）実質的に類似している誘導体が含まれる。本明細書中で使用される場合は、ヌクレオチド配列は、（ａ）ヌクレオチド配列が本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのコード領域に由来し、例えば、上記で議論された配列またはそのような配列の対立遺伝子変異体の一部、を含むか、あるいは、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子をコードする場合；（ｂ）ポリヌクレオチドが、中程度の、高い、または非常に高いストリンジェンシーの下で本明細書中で提供されるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる場合（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）；および／または（ｃ）ポリヌクレオチド配列が、（ａ）もしくは（ｂ）に記載されたポリヌクレオチド配列の特定のアミノ酸のコドン配列に関して縮重している場合に、「実質的に類似」しているとみなされる。さらに、本明細書中で開示される核酸分子には、配列が別な形式で本明細書中で示される基準を満たす場合には、相補配列および非相補配列の両方が含まれる。本発明の状況においては、高いストリンジェンシーは、標準的なハイブリダイゼーション条件を意味する（例えば、５×ＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、５５〜６５℃、あるいはそれと同等の条件；５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝１８０ｍＭの塩化ナトリウム：１０ｍＭのリン酸ナトリウム；１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）；５×デンハルト溶液（１００×デンハルト＝２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、２％（ｗ／ｖ）のＦｉｃｏｌｌ、２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）；および０．５％のＳＤＳ）。高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション後の洗浄は、通常、０．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）中で、または０．５×ＳＳＰＥ中で、５５〜６０℃で行われる。
【０１２３】
ＳＯＳＴをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物学的サンプル中の細胞、組織、または細胞株から単離することができ、そして任意の種々の技術を使用して調製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと）。例えば、ポリヌクレオチドは、適切な細胞または組織から調製したｃＤＮＡから増幅することができる。これらのポリヌクレオチドは、本明細書中に提供される配列に基づいて設計され、購入することも、合成することもできる、配列特異的プライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。ポリヌクレオチドは、また、配列特異的プローブおよびプライマーを使用して、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、得ることができる。ＰＣＲによってライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．）、ｐａｇｅｓ ２１１−２１５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）によって提供されている。さらに、関連遺伝子を単離するためにＰＣＲを使用する技術は、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎ，”Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ ３１７−３３７（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）に記載されている。
【０１２４】
ＴＧＦ−β結合タンパク質のｃＤＮＡの配列、またはＴＧＦ−β結合タンパク質のゲノムフラグメントの配列は、標準的な方法を使用して決定することができる。さらに、ＴＧＦ−β結合タンパク質のプロモーターまたは調節エレメントを含むゲノムフラグメントの同定は、欠失分析のような十分に確立されている技術を使用して行うことができる（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）を参照のこと）。
【０１２５】
あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の双方向へのプライミングを使用してＤＮＡ分子を合成することによって得ることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）ｐａｇｅｓ ８−８から８−９を参照のこと）。ＰＣＲがこの方法に組み入れられると、少なくとも２キロ塩基の長さのＤＮＡ分子を合成することができる（Ａｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１，１９９３；Ｂａｍｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２６６，１９９３；Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ ２６３−２６８，（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）；Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．４：２９９，１９９５）。
【０１２６】
変異体ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子は、本明細書中に記載される手順を使用して、配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、および６９をベースとするヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドプローブで、種々のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリヌクレオチド変異体はまた、合成によって構築することもできる。例えば、配列番号１、２０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のアミノ酸配列と比較した場合に、保存的アミノ酸変化を有しているポリペプチドをコードする核酸分子を設計することができる。すなわち、配列番号１、２０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０の１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体を得ることができる。ここで、アルキルアミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中のアルキルアミノ酸が置換されている；芳香族アミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中の芳香族アミノ酸が置換されている；硫黄を含むアミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中の硫黄を含むアミノ酸が置換されている；ヒドロキシル基を含むアミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中のヒドロキシル基を含むアミノ酸が置換されている；酸性アミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中の酸性アミノ酸が置換されている；塩基性アミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸が置換されている；またはニ塩基性の１個のカルボキシル基を有しているアミノ酸で、ＴＧＦ−β結合タンパク質のアミノ酸配列中のニ塩基性の１個のカルボキシル基を有しているアミノ酸が置換されている。
【０１２７】
一般的なアミノ酸間での、例えば、保存的アミノ酸置換は、以下のグループのそれぞれのアミノ酸の間での置換によって説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン（非極性のアルキル基を含む側鎖）；（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖）；（３）セリンおよびスレオニン（ヒドロキシル基側鎖）；（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸（カルボン酸基側鎖）；（５）グルタミンおよびアスパラギン（アミド基を含む側鎖）；ならびに（６）リジン、アルギニン、およびヒスチジン（アミノ基側鎖）。このような置換を行う際には、可能であれば、図１に概説されるシステイン骨格を維持することが重要である。
【０１２８】
ＳＯＳＴ中の保存的アミノ酸変化は、配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のいずれか１つに記載されているヌクレオチドについて、ヌクレオチドを置換することによって導入することができる。このような保存的アミノ酸変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャン突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する突然変異誘発などによって得ることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）ｐａｇｅｓ ８−１０から８−２２；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ｅｄ．），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９１）を参照のこと）。このような変異体の機能的な活性は、本明細書中に記載される標準的な方法およびアッセイを使用して決定することができる。あるいは、変異体ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドは、抗ＳＯＳＴ抗体に特異的に結合する能力を保持している。
【０１２９】
核酸分子について日常的に行われている欠失分析を行って、ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸分子の「機能的フラグメント」を得ることができる。例えば、配列番号５５〜５７、５９、６１、６３、６５、６７、または６９のいずれか１つのヌクレオチド配列を有しているＤＮＡ分子を、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで消化して、欠失がネストされている一連のものを得ることができる。次いで、フラグメントは、適切なリーディングフレームになるように発現ベクターに挿入され、発現されたポリペプチドが単離され、活性について、または抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に結合する能力について試験される。ヌクレアーゼ消化に代わるものは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用することであり、これによって所望されるフラグメントの産生を特異的に行うような欠失または終結コドンが導入される。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの特定のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して合成することができる。本明細書中で開示されるアッセイおよび方法に加えて、タンパク質の機能分析のための標準的な技術が、例えば、Ｔｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：１１３，１９９３；Ｃｏｎｔｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｎｔｅｌｌ（ｅｄ．）、Ｐａｇｅｓ ６５−７２（Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）；Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ，”Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１，Ｂｏｙｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）ｐａｇｅｓ １６９−１９９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）；Ｃｏｕｍａｉｌｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９２７０，１９９５；Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５２９１，１９９５；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１２９５，１９９５；およびＭｅｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３０：１，１９９６に記載されている。
【０１３０】
本明細書中に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドの構造は、例えば、Ｐ／Ｃ ＧｅｎｅまたはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の疎水性プロット関数を使用して、あるいはＫｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２）によって記載されている方法にしたがって、一次翻訳産物から推測することができる。ポリペプチドは、酸性または塩基性の塩の形態で、あるいは中性の形態で調製することができる。さらに、個々のアミノ酸残基を、酸化または還元によって修飾することができる場合もある。さらに、種々の置換、欠失、または付加を、アミノ酸または核酸配列に対して行うことができる場合もある。その正味の効果は、変異体または野生型タンパク質の生物学的活性を保持する、あるいはさらに増大させるかまたは低下させることである。好ましくは、ＳＯＳＴ変異体またはそのフラグメントは、ＳＯＳＴ特異的抗体に結合する能力を保持しているか、または高い結合能力を有している。さらに、遺伝子コードの縮重の理由から、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が大幅に変化する場合もある。
【０１３１】
本明細書中で提供されるタンパク質の他の誘導体としては、他のタンパク質またはポリペプチドとのタンパク質の結合体が挙げられる。これは、例えば、タンパク質の精製または同定を容易にするために付加することができる、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって行うことができる（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと；また、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８も参照のこと）。あるいは、ＦＬＡＧ（登録商標）／ＴＧＦ−β結合タンパク質のような融合タンパク質を、タンパク質の同定、発現、および分析に役立つように構築することができる。
【０１３２】
本明細書中で記載されるタンパク質は、本明細書中に記載される広範な種々の技術を使用して構築することができる。さらに、変異を、制限部位が隣接する変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入することができ、これにより、自然界に存在している配列のフラグメントに連結させることができる。連結後、得られた再構築された配列は、所望されるアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有している誘導体をコードする。
【０１３３】
あるいは、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発手順を使用して、置換、欠失、または挿入によって変更された特定のコドンを有している変更されたポリヌクレオチドを得ることができる。上記の変更を作成するための例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月、１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（前出）によって開示されている。タンパク質の欠失誘導体または短縮誘導体（例えば、可溶性の細胞外部分）は、また、所望される欠失に隣接している従来の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することによっても構築することができる。制限酵素での処理の後、突出部分が満たされ、ＤＮＡが再度連結させられる。上記のような変更を作成するための例示的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））によって開示されている。
【０１３４】
核酸分子中に作成される変異は、コード配列のリーディングフレームを保存することが好ましい。さらに、変異は、転写された際にループまたはヘアピンのようなｍＲＮＡの二次構造を生じるようにハイブリダイズできる相補領域を作成しないことが好ましい。このような構造は、ｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼす場合がある。変異部位は予め決定することができるが、変異自体の性質が予め決定されることは必ずしも必要ではない。例えば、所定の部位での変異体の最適な特徴について選択するためには、ランダムな突然変異誘発を標的コドンについて行って、生物学的活性の獲得、喪失、または保持について発現された変異体をスクリーニングすることができる。あるいは、自然界に存在している配列のフラグメントに対する連結を可能にする制限部位が隣接している変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、変異を特定の遺伝子座に導入することができる。連結後、得られた再構築された配列は、所望されるアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有している誘導体をコードする。本発明のタンパク質をコードする核酸分子は、また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による突然変異誘発、化学的突然変異誘発（Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６，１９８６）、強制的なヌクレオチドの誤った取り込み（例えば、Ｌｉａｏ ａｎｄ Ｗｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１，１９９０）、あるいは、ランダムに突然変異させたオリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７，１９８９）のような技術を使用して構築することもできる。
【０１３５】
本発明により、また、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドの操作および発現、ならびにそのようなポリヌクレオチドを発現することができるベクターを含む宿主細を培養することにより本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドの操作および発現も提供される。発現ベクターは、所望されるタンパク質の発現を指示することができる組み換え核酸構築物を意味する。ベクターには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、合成のリボ核酸またはｃＤＮＡに由来するリボ核酸（ＲＮＡ）、あるいは２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）が含まれ得る。ｃＤＮＡポリヌクレオチドは、通常、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子を転写することにより調製されるＤＮＡポリヌクレオチドを意味すると理解される。所望されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むこれらのベクターまたはベクター構築物は、適切な転写または翻訳調節エレメントに対して動作可能であるように連結されていることが好ましい。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆虫、または植物の遺伝子を含む種々の供給源に由来するものとすることができる。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に応じて異なり、これは当業者であれば容易に行うことができる。調節エレメントの例としては、転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、ならびに翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が挙げられる。状況に応じて、ベクターには、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ、あるいは当該分野で公知の任意の他のマーカー）を含めることができる。さらに、選択される宿主細胞と使用されるベクターに応じて、例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写誘導性を与える配列、および選択マーカーのような他の遺伝子エレメントもまた、本明細書中で記載されるベクター中に組み込むことができる。
【０１３６】
上記のタンパク質のいずれかをコードする核酸分子は、広範な種々の原核生物および真核生物である宿主細胞によって容易に発現させることができる。宿主細胞には、細菌、哺乳動物、酵母または他の真菌、ウイルス、昆虫、または植物細胞が含まれる。このような細胞を外来ＤＮＡを発現するように形質転換またはトランスフェクトするための方法は当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９−１９３３，１９７８；Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８０１，５４２；Ｕｐｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと；植物細胞については、Ｃｚａｋｏ ａｎｄ Ｍａｒｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−１０７１，１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２，１９９２を参照のこと）。
【０１３７】
本発明を実施するために適切である細菌宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ’、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＰ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、およびＥＲ１６４７（例えば、Ｂｒｏｗｎ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９１を参照のこと））；枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＢＲ１５１，ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０、およびＢ１７０（例えば、Ｈａｒｄｙ，”Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｌａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８５を参照のこと））；ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種々の種、さらには、当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
【０１３８】
細菌の発現ベクターには、宿主細胞中で機能するプロモーター、１つ以上の表現選択マーカー、および細菌の複製基点が含まれることが好ましい。代表的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーターおよびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８を参照のこと）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６，１９９０）、ｔｒｐプロモーター（Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５，１９８３）、およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２０：２３１，１９８２）が挙げられる。さらなるプロモーターとして、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６、およびＴ７ポリメラーゼを認識することができるプロモーター、バクテリオファージλのＰＲおよびＰＬプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒプロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃＺプロモーター、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のプロモーター、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられる。原核生物のプロモーターは、Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７，１９８７，Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｓ １９８７）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）によって概説されている。代表的な選択マーカーとしては、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子のような、種々の抗生物質耐性マーカーが挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適している多くのプラスミドは当該分野で周知であり、これには、特に、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２：９５，１９７７を参照のこと）、ｐＵＣプラスミドであるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７，１９８３、およびＶｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８，１９８２を参照のこと）、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。
【０１３９】
本発明を実施するために適している酵母および真菌宿主細胞としては、特に、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、またはクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびアスパラジラス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種々の種が挙げられる（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９３５，３４９号）。酵母および真菌に適切な発現ベクターとしては、特に、酵母についてはＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７４１９）、およびａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９，１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１０３５−１０３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８：１２１−１３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４−１０８，１９７８）、ならびにこれらの誘導体を挙げることができる。
【０１４０】
酵母での使用に好ましいプロモーターとしては、酵母の解糖系の遺伝子に由来するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０，１９８０；Ａｌｂｅｒ ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−４３４，１９８２）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐ．３５５、Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１，１９８３）が挙げられる。真菌ベクターについて有用なプロモーターの例としては、アスパラジラス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）解糖遺伝子に由来するプロモーター、例えば、ａｄｈ３プロモーターが挙げられる（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−２０９９，１９８５）。発現ユニットには、また、転写ターミネーターが含まれる場合もある。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，前出，１９８５）である。
【０１４１】
細菌ベクターを用いる場合には、酵母ベクターには、通常、選択マーカーが含まれる。この選択マーカーは、形質転換体が選択されることを可能にするためのそれについての表現形アッセイが存在している、優性表現形を示す多数の遺伝子のいずれか１つであり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補するもの、抗生物質耐性を提供するもの、または、細胞が特異的な炭素供給源を利用できるようにするものであり、これには、ｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，前出）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ８：１７，１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，前出）が含まれる。別の適切な選択マーカーは、ｃａｔ遺伝子であり、これは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与える。多くの酵母のクローニングベクターが設計されており、これらを容易に利用することができる。これらのベクターとしては、ＹＩｐ５のようなＹＩｐをベースとするベクター、ＹＲｐ１７のようなＹＲｐベクター、ＹＥｐ１３のようなＹＥｐベクター、ＹＣｐ１９のようなＹＣｐベクターが挙げられる。当業者は、広範な種々の適切なベクターを酵母細胞中での発現のために利用できることを理解している。
【０１４２】
真菌を形質転換するための技術は文献において周知であり、例えば、Ｂｅｇｇｓ（前出）、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９−１９３３，１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１７４０−１７４７，１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−１６９，１９８３）によって記載されている。宿主細胞の遺伝子型には、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって相補される遺伝子欠損が含まれる場合がある。特定の宿主と選択マーカーの選択は、十分に、当業者のレベルの範囲内にある。
【０１４３】
酵母の形質転換のためのプロトコールもまた、当業者に周知である。例えば、形質転換は、ＤＮＡを有する酵母のスフェロプラストを調製することによって（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８を参照のこと）、またはＬｉＣｌのようなアルカリ塩での処理によって（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３，１９８３を参照のこと）のいずれかにより容易に行うことができる。真菌の形質転換もまた、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ５：３６９，１９８７）によって記載されているように、ポリエチレングリコールを使用して行うことができる。
【０１４４】
ウイルスベクターとしては、上記のような所望されるタンパク質をコードする単離された核酸分子の発現を指示するプロモーターを含むベクターが挙げられる。広範な種々のプロモーターを本発明の状況において使用することができ、これらとしては、例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲのようなプロモーター；ＲＳＶ ＬＴＲ（例えば、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６７７７，１９８２）；Ｆｒｉｅｎｄ ＭｕＬＶ ＬＴＲ；アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−７８４，１９９４）；ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼプロモーター／エンハンサー；後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３，１９９４）；ヘルペスＴＫ（Ｈｅｒｐｅｓ ＴＫ）プロモーター（例えば、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３５５，１９８２）；ＳＶ４０プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４，１９８１））；メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター；マウスメタロチオネインＩ遺伝子（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３，１９８２）；マウス乳ガンウイルスプロモーター（一般的には、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ １６３−１８１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）を参照のこと）；サイトメガロウイルス前期初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス前期後期プロモーターが挙げられる。あるいは、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合には、バクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのような原核生物プロモーターを、哺乳動物細胞中でのＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の発現を制御するために使用することができる（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９，１９９０；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４４８５，１９９１）。
【０１４５】
本発明の特定の好ましい実施形態においては、プロモーターは組織特異的プロモーターである（例えば、ＷＯ９１／０２８０５；ＥＰ０，４１５，７３１；およびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと）。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例としては、神経特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子βプロモーター、骨形態形成タンパク質プロモーター、ヒトα１−キマエリンプロモーター、シナプシンＩプロモーターおよびシナプシンＩＩプロモーターが挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーター、さらにはＨＩＶプロモーターのような他のプロモーターを含む））、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌、または寄生虫（例えば、マラリア）特異的プロモーターを、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫に感染した特異的細胞または組織を標的化するために利用することができる場合もある。
【０１４６】
本発明を実施するために適している哺乳動物細胞としては、特に、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａＯＳ、骨肉種、ＫＳ４８３、ＭＧ−６３、初代骨芽細胞、およびヒトまたは哺乳動物の骨髄基質細胞が挙げられる。さらなる哺乳動物宿主細胞としては、アフリカミドリザルの腎臓細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）、ヒト胚性腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５４４）、イヌの腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ラットの下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラット肝ガン細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＳＶ４０で形質転換されたサルの腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、およびマウスの胚性細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）が挙げられる。
【０１４７】
本発明の実行に使用するための哺乳動物発現ベクターには、クローニングされた遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指示することができるプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。骨特異的プロモーターとしては、骨シアロタンパク質のプロモーター、およびオステオカルシンのプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前期初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０，１９８５）、サイトメガロウイルス前期後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４，１９８１）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞性のプロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，５７９，８２１号）、マウスＶκプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７０４１−７０４５，１９８３；Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４９６，１９８７）、およびマウスのＶＨプロモーター（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３，１９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、所望される発現のレベル、およびトランスフェクトされるレシピエント細胞株に一部依存する。
【０１４８】
このような発現ベクターには、プロモーターの下流であって、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置するＲＮＡスプライシング部位のセットが含まれる場合もある。好ましいＲＮＡスプライシング部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。発現ベクター中には、目的のコード配列の下流の位置にポリアデニル化シグナルもまた含まれる場合がある。適切なポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来する初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ、前出）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０，１９８１）が挙げられる。発現ベクターには、プロモーターとＲＮＡスプライシング部位の間に配置された、アデノウイルス２ ３部リーダーのような非コードウイルスリーダー配列が含まれる場合もある。好ましいベクターには、また、ＳＶ４０エンハンサーのようなエンハンサー配列もまた含まれる。発現ベクターには、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列も含めることができる。適切な発現ベクターは、市販の供給業者（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得ることができる。
【０１４９】
ＤＮＡ配列がクローニングされているベクター構築物は、例えば、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３，１９８１；Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２；４５６，１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；レトロウイルス、アデノウイルス、およびプロトプラスト融合媒介トランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前出を参照のこと）によって、培養された哺乳動物細胞中に導入することができる。裸のベクター構築物を、筋細胞または他の適切な細胞に取り込ませ、その後、哺乳動物（または他の動物）の筋肉に注射することもできる。クローニングされたＤＮＡを含むベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を同定するためには、一般的には、選択マーカーが目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞中での使用に好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅することができる選択マーカーである場合もある。好ましい増幅することができる選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーについては、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に概説されている。
【０１５０】
適切なベクターを含む哺乳動物細胞を、一定期間（通常は、１〜２日）増殖させて、目的のＤＮＡ配列（単数または複数）の発現を開始させることができる。次いで、薬剤選択を行って、安定な様式で選択マーカーを発現する細胞の増殖について選択する。増幅することができる選択マーカーでトランスフェクトされた細胞について、薬剤濃度を段階的な様式で増大させて、クローニングされた配列のコピー数の増大について選択することができ、これにより発現レベルを増大させることができる。導入された配列を発現する細胞が、所望される形態または所望される濃度での目的のタンパク質の産生について選択され、スクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローニングされ、産生のためにスケールアップされる。
【０１５１】
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞もまた、本発明に有用であり得る。例えば、バキュロウイルスを、異種ＤＮＡ配列を昆虫細胞中で発現させるためのベクターとして使用することができる（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４（１９９０））。バキュロウイルスシステムにより、クローニングされたＴＧＦ−β結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを昆虫細胞中に導入するために効率的な手段が提供される。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）をベースとする。これには、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）多核体病ウイルス前期初期遺伝子プロモーター（ｉｅ−１）、および後期初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーター、およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーターのような周知のプロモーターが含まれる。適切な昆虫宿主細胞としては、ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１に由来する細胞株、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）サナギ卵巣細胞株、例えば、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ、およびＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、さらにはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞が挙げられる。バキュロウイルスシステム中で組み換えタンパク質を産生させるための確立された技術は、Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ７：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｕｒｒａｙ（ｅｄ．），ｐａｇｅｓ １４７−１６８（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ２０５−２４４（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５），ｐａｇｅｓ １６−３７ ｔｏ １６−５７，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；およびＬｕｃｋｎｏｗ，“Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ １８３−２１８（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供されている。
【０１５２】
あるいは、多数の植物細胞が当該分野で公知であり、これらもまた、ポリヌクレオチドを発現させるために有効であり得る。例えば、アグロバクテリウム・リゾゲン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）である（Ｓｉｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８，１９８７）。発現ベクターはまた、植物のプロトプラスト、完全な植物組織、または単離された植物細胞中に導入することもできる。植物組織を培養する一般的な方法は、例えば、Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｇｉｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ６７−８８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）によって提供されている。
【０１５３】
本発明の関連する実施形態においては、本発明のタンパク質を、その生殖細胞および体細胞が、所望されるタンパク質をコードし、遺伝子の発現に効果的であるプロモーターに作動するように連結されている遺伝子を含む、トランスジェニック動物中で発現させることができる。あるいは、同様の様式で、所望される遺伝子を含まないトランスジェニック動物（例えば、「ノックアウト」マウス）を、調製することもできる。このようなトランスジェニックは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタを含む種々の非ヒト動物において調製することができる（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３，１９８５，Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４，１９８３，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４４３８−４４４２，１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５，１９８５、および米国特許第５，１７５，３８３号、同第５，０８７，５７１号、同第４，７３６，８６６号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２２１，７７８号、および同第５，１７５，３８４号を参照のこと）。簡単には、適切な位置に配置された発現制御配列とともに発現される核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、マイクロインジェクションによって、受精卵の前核に導入される。注入されたＤＮＡの組み込みは、組織サンプルに由来するＤＮＡのブロット分析によって指示される。導入されたＤＮＡが動物の子孫に継代されるように動物の生殖系に組み込まれることが好ましい。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用を通じて、またはメタロチオネイン遺伝子プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３、前出）のような誘導性プロモーターの使用を通じて行うことができ、これによりトランス遺伝子の発現が調節される。
【０１５４】
タンパク質は、具体的には、適切な宿主およびベクターシステムを培養することによって単離して、本発明の組み換え翻訳産物を産生させることができる。このような細胞株に由来する上清、またはタンパク質封入体、またはタンパク質が上清には分泌されていない細胞全体を、次いで、種々の精製手順によって処理して、所望されるタンパク質を単離することができる。例えば、上清を、最初に市販されているタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限界濾過ユニットを使用して濃縮することができる。濃縮後、濃縮物を適切な精製マトリックス、例えば、アフィニティーマトリックス（例えば、適切な支持体に結合させられた特異的抗体）にのせることができる。あるいは、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、あるいはサイズ排除マトリックスを使用してタンパク質を精製することができる。さらに別に、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を使用して、タンパク質をさらに精製することができる。本発明のタンパク質の他の単離方法は、当該分野で周知である。単離されたタンパク質またはポリペプチドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と、その後のクマシーブルー染色もしくは銀染色によって決定することができる。
【０１５５】
哺乳動物細胞システムによって外来タンパク質を発現させ、産生された外来タンパク質を回収するための一般的な方法は、例えば、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ １６３（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供されている。細菌システムによって産生されたタンパク質を回収するための標準的な技術は、例えば、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ，”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ Ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ５９−９２（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）によって提供されている。バキュロウイルスシステムから組み換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）によって記載されている。
【０１５６】
さらに一般的には、ＴＧＦ−β結合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの標準的な技術によって単離することができる。ＴＧＦ−β結合タンパク質の単離および精製におけるさらなるバリエーションを、当業者は工夫することができる。例えば、本明細書中に記載されるように得られる抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体を使用して、免疫親和性精製によって多量のタンパク質を単離することができる。本発明の抗体の精製は、本明細書中にさらに記載される。
【０１５７】
（検出可能な標識）
検出可能な標識は、診断に有用な分子を生じるように、ポリペプチド（抗体もしくはそのフラグメントを含む）またはポリヌクレオチドに結合させることができる分子あるいは原子である。検出可能な標識の例としては、キレート化剤、光活性因子、放射性同位元素、蛍光剤、常磁性イオン酵素、および他のマーカー部分が挙げられる。ＴＧＦ結合タンパク質、またはＴＧＦ結合タンパク質に特異的に結合する抗体、または上記の候補の分子は、例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種を含む種々の化合物で標識することができる。蛍光分子の代表的な例としては、フルオレセイン、フィコエリスリンのようなフィコビリタンパク質、ローダミン、テキサスレッド、およびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的な例としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のエクソトキシンＡが挙げられる。放射性核種の代表的な例としては、Ｃｕ−６４，Ｇａ−６７、Ｇａ−６８，Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２、およびＢｉ−２１２が挙げられる。さらに、上記の抗体もまた標識することができる場合があり、また、リガンド結合対の１つのパートナーに結合させることができる場合もある。代表的な例としては、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
【０１５８】
本明細書中に記載されている分子を、上記に記載された代表的な標識に結合させるか、またはそのような標識で標識するための方法は、当業者であれば容易に行うことができる（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，米国特許第４，７４４，９８１号；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，米国特許第５，１０６，９５１号；Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，米国特許第４，０１８，８８４号；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，米国特許第４，８９７，２２５号；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，米国特許第４，９８８，４９６号を参照のこと；また、Ｉｎｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３４，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ，Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．３０，１９７４も参照のこと；また、Ｗｉｌｃｈｅｋ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ，“Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２，１９８８も参照のこと）。免疫結合体は、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体またはその抗体フラグメントのような抗体と、検出可能な標識を含む組成物である。好ましくは、免疫結合体の抗体部分は、その同種抗原に特異的に結合して、結合後に結合前と同じ、またはわずかに低い結合親和性を有する。
【０１５９】
（薬学的組成物）
上記のように、本発明により、また、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する上記の分子のうちの１つを、薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤とともに含む、種々の薬学的組成物が提供される。当業者に公知である任意の適切なキャリアを、本発明の薬学的組成物中で使用することができる。治療的な使用のための単体は周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．（１９８５））に記載されている。一般的にはこのようなキャリアは、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。通常、このような組成物の調製は、治療薬を、緩衝液；アスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；炭水化物（マルトース、グルコース、スクロース、もしくはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；グルタチオン；ならびに他の安定剤および賦形剤と混合することを必然的に伴う。中性の緩衝化生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水が、例示的な希釈剤である。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方される場合もある。
【０１６０】
一般的には、キャリアのタイプは、投与の態様に基づいて選択される。薬学的組成物は、任意の適切な投与様式で処方することができる。これらとしては、例えば、局所、経口、鼻腔、髄腔内、直腸、膣、舌下、または全身投与（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、静脈内、外耳道内、尿道内注射または注入を含む）が挙げられる。薬学的組成物（例えば、経口投与または注射による投与のためのもの）は、液体の形態（エリキシル剤、シロップ剤、溶液、乳濁液、または懸濁液）である場合もある。液体の薬学的組成物には、例えば、以下の１つ以上が含めることができる：注射用の水のような滅菌の希釈剤、生理食塩溶液、好ましくは、生理食塩水、リンガーの溶液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油（これは、溶媒もしくは懸濁媒体となり得る）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；抗菌剤；酸化防止剤；キレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸のような緩衝液；ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調節のための薬剤。全身投与のための調製物は、アンプル、使い捨ての注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入することができる。生理食塩水の使用が好ましく、注射することができる薬学的組成物は、滅菌であることが好ましい。
【０１６１】
本明細書中に記載される組成物は、徐放用に処方することができる（すなわち、投与後に化合物をゆっくりと放出するカプセルまたはスポンジのような処方物）。このような組成物は、一般的には、周知の技術を使用して調製され、例えば、経口、直腸、皮下への移植によって、あるいは所望される標的部位への移植によって投与される。徐放処方物には、キャリアマトリックス中に分散させられた薬剤を含めることができ、徐放処方物は、速度制御膜によって周囲を囲まれた容器内に入れられる。このような処方物において使用される単体は、生体適合性であり、また、生分解性である場合もある。好ましくは、処方物により、比較的一定したレベルでの有効成分の放出が提供される。徐放処方物中に含まれる活性な化合物の量は、移植部位、放出速度と期待される時間、さらには、処置または予防される状態の性質に応じて変化する。この態様において有用な代表的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の代表的な徐放キャリアとしては、長分子バイオベクターが挙げられ、これは、脂質ではない親水性コア（例えば、架橋された多糖類またはオリゴ糖）と、必要に応じて、リン脂質のような両親媒性化合物を含む外層を含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号、およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２００７８、同ＷＯ／９４／２３７０１、および同ＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）。
【０１６２】
別の代表的な実施形態においては、生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリアセテート、ポリグリコレート）が、本発明の組成物についてのキャリアとして使用される。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号；および同第５，９４２，２５２号に開示されている。ＷＯ９９ ４０９３４およびその中で引用されている参考文献に記載されているような、修飾されたＢ型肝炎コアタンパク質キャリアシステムもまた、多くの用途に有用である。別の代表的なキャリア／送達システムでは、クラスＩ制限細胞傷害性Ｔリンパ球応答を宿主中で誘導することができる、米国特許第５，９２８，６４７号に記載されているような、粒子−タンパク質複合体を含むキャリアを使用する。
【０１６３】
別の代表的な実施形態においては、リン酸カルシウムコア粒子が、本発明の組成物用のキャリアまたは徐放マトリックスとして使用される。例示的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開特許出願番号ＷＯ／００４６１４７に開示されている。
【０１６４】
抗ＳＯＳＴ抗体および／または調節因子をコードするポリヌクレオチドを含む（その結果、ポリペプチドおよび／または調節因子が元の位置で作成される）薬学的組成物については、ポリヌクレオチドを、核酸と、細菌、ウイルス、および哺乳動物の発現ベクターを含む、当業者に公知の種々の送達システムのいずれかの中に存在させることができる。このような発現システム中にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９，１９９３に記載されているように、そしてＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９；１６９１−１６９２，１９９３によって概説されているように、「裸」でもあり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞へ効率よく輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡをコーティングすることによって増大させることもできる。
【０１６５】
例えば、経口、全身的、静脈内、鼻腔内、および筋肉内投与を含む種々の処置レジメおよび処方において、本明細書中に記載される特定の組成物を使用するための適切な投与量および処置レジメの開発は、当業者に周知であり、そのいくつかは、一般的な説明の目的のために以下で簡単に議論される。
【０１６６】
特定の用途においては、本明細書中に開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に投与することができる。この場合には、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに、または吸収される食用のキャリアとともに処方することができる。またはこれらは、ハード殻ゼラチンカプセルかまたはソフト殻ゼラチンカプセルの中に封入することもでき、またこれらは、食事療法用の食物とともに直接配合することもできる。
【０１６７】
特定の状況においては、本明細書中で開示される薬学的組成物を、全身的に、静脈内に、筋肉内に、あるいは、さらには腹腔内に投与することが望まれる。このようなアプローチは当業者に周知であり、そのいくつかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号、および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載されている。特定の実施形態においては、遊離の塩基または薬学的に受容可能な塩としての有効成分の溶液が、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水の中に調製され得る。分散物は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中に、および油中に調製され得る。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物には、一般的には、微生物の増殖を防ぐための保存料が含められる。
【０１６８】
注射可能な用途に適している代表的な薬学的形態としては、滅菌の水溶液または分散物、および滅菌の注射可能な溶液または分散物を即座に調製するための滅菌の粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、これらの形態は滅菌でなければならず、そして容易に注射器の中に入れることができる程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子の大きさを維持することによって、および／または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用からの防御は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって容易に行うことができる。多くの場合には、例えば、糖または塩化ナトリウムのような、等張化剤を含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期間の吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【０１６９】
１つの実施形態においては、水溶液の非経口投与のためには、溶液は、必要な場合には適切に緩衝化されなければならず、液体の希釈剤が最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張化させられる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。この組み合わせにおいては、使用することができる滅菌の水性媒体は、本発明の開示を参照して当業者に公知である。例えば、１用量が１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解させられ、これは、１０００ｍｌの皮下注入液に添加されるか、または注入が予定される部位に注射されるかのいずれかが行われる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ ｅｄ．，ｐｐ．１０３５−１０３８および１５７０−１５８０を参照のこと）。用量のいくつかのバリエーションが、処置される被験体の状態に応じて必然的に生じる。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、もちろん、滅菌性、発熱性、ならびに食品医薬品局による生物製剤の基準（ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄ）によって要求される一般的な安全性および純度の基準を満たすことが好ましい。
【０１７０】
本発明の別の実施形態においては、本明細書中で開示される組成物は、中性の形態または塩の形態で処方される場合もある。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸などを用いて形成される。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインのような有機塩基などから誘導することができる。処方の際には、溶液が、投与量処方物と適合する様式で、治療上有効であるそのような量で投与される。
【０１７１】
キャリアは、さらに、任意の全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーディング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなど野いずれか、またはそれらの全てを含むことができる。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤を有効成分と配合する場合を除いて、治療用組成物中でのその使用が想定される。相補活性成分もまた、組成物中に配合することができる。語句「薬学的に受容可能な」は、ヒトに投与された場合に、アレルギー性または同様の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物をいう。
【０１７２】
特定の実施形態においては、リポソーム、ナノカプセル、マイクロカプセル、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物体中に本発明の組成物を導入するために使用することができる。具体的には、本発明の組成物を、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかの中にカプセル化して、投与のために処方することができる。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面上に共有結合によって、または非共有的に結合させることもできる。
【０１７３】
薬剤のキャリアとなり得るリポソームおよびリポソーム様の調製物の処方および使用は、一般的には当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：３０７−２１，１９９８；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ５６（３）：６９１−９５，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３５（８）：８０１−０９，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１２（２−３）：２３３−６１，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号；および米国特許第５，７９５，５８７号を参照のこと；それらの全体を参照することにより、それぞれが具体的に本明細書中に組み込まれる）。リポソームは、他の手順によっては通常はトランスフェクトすることが困難である多数の細胞型（これには、Ｔ細胞懸濁物、初代肝細胞培養物、およびＰＣ１２細胞が含まれる）についてうまく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２７）：１６３３７−４２，１９９０；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９（３）：２２１−２９，１９９０））。さらに、リポソームについては、ウイルスをベースとする送達システムの典型であるＤＮＡの長さについての制限はない。リポソームを使用して、遺伝子、種々の薬物、放射線治療薬、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを、種々の培養された細胞株および動物に効率よく導入することができる。さらに、リポソームを使用することには、全身への投与後に自己免疫反応または許容できない毒性を伴うことはないようである。特定の実施形態においては、リポソームは、水性媒体中に分散させられ、多重膜同心円ニ重層である小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成するリン脂質から形成される。
【０１７４】
あるいは、他の実施形態においては、本発明により、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物が提供される。ナノカプセルは、通常、安定な再現性のある方法で化合物を捕捉することができる（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２４（１２）：１１１３−２８，１９９８を参照のこと）。細胞内への多因子の過負荷による副作用を回避するために、そのよな超微粒子（およそ０．１μｍの大きさ）が、生体内で分解されるポリマーを使用して設計される。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．５（１）：１−２０，１９８８；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４５（２）：１４９−５５，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５０（１−３）：３１−４０，１９９８；および米国特許第５，１４５，６８４号によって記載されているように作成することができる。
【０１７５】
さらに、本発明の薬学的組成物は、そのような薬学的組成物の使用に関する使用説明書を提供するパッケージング材料とともに、容器内に置かれる場合もある。一般的には、このような使用説明書には、試薬の濃度を記載する明確な表現、さらには、特定の実施形態においては、薬学的組成物の再構成に必要となる場合がある賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）の相対的な量を記載する明確な表現が含まれる。
【０１７６】
（処置方法）
本発明によって、また、骨のミネラル含有量およびミネラル密度を増大させるための方法が提供される。簡単に言うと、多数の状態によって、例えば、骨が使用できないことになってしまう（例えば、骨折が原因で）疾患、遺伝的素因、事故を含む、骨のミネラル含有量の減少が生じる。本発明により、骨の再吸収に有効であるか、または骨形成細胞を死滅させ、そして正常な加齢を行う治療薬もまた、提供される。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する本明細書中に記載される分子の使用により、このような状態が処置されるか、または予防される。本明細書中で使用される場合は、骨のミネラル含有量は、骨のミネラル含有量が選択される部位において有意な様式で増大した場合に、増大したと理解される。
【０１７７】
骨のミネラル含有量の減少が生じる広範な種々の状態は、本明細書中に記載される分子を用いて処置することができる。このような状態を有している患者は、周知の技術を使用して臨床的な診断によって同定することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。処置することができる疾患の代表的な例としては、骨の成長または発達が異常である形成不全が挙げられる。このような状態の代表的な例としては、軟骨形成不全症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性異骨症、ゴーシェ病、低リン酸血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫症、神経芽細胞種、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性外傷、骨折、歯周病、偽関節、および化膿性骨髄炎が挙げられる。
【０１７８】
処置または予防することができる他の状態としては、広範な種々の原因の骨減少症（すなわち、若い時のピークの骨格ミネラル含有量よりも１標準偏差以上低い骨のミネラル含有量または骨ミネラル密度を生じる状態）が挙げられる。このような状態の代表的な例としては、貧血状態、ステロイドが原因で生じた状態、ヘパリンが原因で生じた状態、骨髄疾患、壊血病、栄養失調症、カルシウム不足、突発性骨粗鬆症、先天性骨減少症または骨粗鬆症、アルコール依存症、慢性肝疾患、老齢、閉経後の状態、過少月経、無月経、妊娠、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、末端肥大症、性腺機能低下症、運動不足または非活動、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、一時的な局所性骨粗鬆症、および骨軟化症が挙げられる。
【０１７９】
本発明の１つの実施形態においては、骨のミネラル含有量または骨ミネラル密度は、ＳＯＳＴポリペプチドをＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対する結合から阻害する分子の治療有効量を、温血動物に投与することによって増大させることができる。処置することができる温血動物の例には、脊椎動物および哺乳動物の両方が含まれ、これらとしては、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスが挙げられる。治療用分子の代表的な例としては、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および本明細書中に記載されている抗体が挙げられる。
【０１８０】
本発明の他の実施形態においては、骨密度を増大させるための方法が提供される。この方法には、骨に帰る細胞中に、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＳＯＳＴの結合を阻害する分子の発現を指示するベクターを導入する段階、および、ベクターを含む細胞を温血動物に投与する段階が含まれる。簡単に言うと、骨に帰る細胞は、患者の骨（例えば、ＣＤ３４＋、骨芽細胞、骨細胞などのような骨髄から得られる細胞）、抹消血から、または培養物から直接得ることができる。適切なベクターの代表的な例としては、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）；アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９３／９１９１；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（１）：２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２４）：１１４９８−５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（６）：２８３８−４８，１９９３；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７，１９９３；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５（２）：２０７−２１６，１９９３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９，１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１，１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４，１９９３：Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８，１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０１（２）：１９５−２０２，１９９１）；アデノ随伴ウイルスベクター（ＷＯ９５／１３３６５；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−１０６１７，１９９３）；バキュロウイルスベクター；パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３，１９９４）；ポックスウイルスベクター（Ｐａｎｉｃａｌｉ ａｎｄ Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１，１９８２；およびＯｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６６０，１９９３）；ならびにレトロウイルス（例えば、ＥＰ ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９１／０２８５、ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８）のようなウイルスベクターが挙げられる。種々のウイルスまたはウイルス以外の供給源に由来する種々のエレメント（例えば、プロモーター、エンベロープ配列など）の混合物を含むウイルスベクターも、同様に、構築することができる。種々の実施形態においては、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかを、以下に記載される方法および組成物に使用できる場合もある。
【０１８１】
本発明の他の実施形態においては、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＳＯＳＴポリペプチドの結合を阻害する分子をコードする核酸分子自体が、種々の技術によって投与される場合もある。このような技術としては、例えば、ポリ−Ｌ−リジンＤＮＡ複合体と結合させたアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２１２２−９２１２６，１９３３）；死滅させたアデノウイルスに結合させたＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４，１９９２）；サイトフェクチン媒介導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ，Ｖｉｃａｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；直接的なＤＮＡ注射（Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８，１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕ ｅｔ ａｌ。Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４；１６９８５−１６９８７，１９８９）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７，１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．８９（１）：１３−２１，１９９４；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８４：７８５１−７８５５，１９８７）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２７２６−２７３０，１９９１）；およびタンパク質自体をコードする核酸の、単独（Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４，１９９３）またはＰＥＧ−核酸複合体のいずれかでの直接的な投与が挙げられる。
【０１８２】
骨のミネラル含有量の増加の決定は、Ｘ線の使用によって直接に（例えば、骨密度測定装置（Ｄｕａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｘ−ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙすなわち「ＤＥＸＡ」）、または、骨芽細胞特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、１型プロコラーゲンＣ’プロペプチド（ＰＩＣＰ）、および全アルカリホスファターゼのような骨の代謝回転マーカーからの推測によって（Ｃｏｍｉｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｒｈｅｕ．７：２４３（１９９５）を参照のこと）、あるいは、ピリジノリン、デオキシピリジノリン、Ｎ−テロペプチド、尿のヒドロキシプロリン、血漿の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ、およびガラクトシルヒドロキシリジンを含むがこれらに限定されない骨吸収のマーカーからの推測によって（Ｃｏｍｉｅｒ，前出を参照のこと）、直接決定することができる。骨量もまた、体重から、または他の方法を使用することによって計算することができる（Ｇｕｉｎｎｅｓｓ−Ｈｅｙ，Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ Ｄｉｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．５：１７７−１８１，１９８４を参照のこと）。
【０１８３】
当業者に明らかであるように、投与量および投与頻度は、もちろん、処置される適応症の性質および重篤度、所望される反応、患者の状態などのような要因に応じて変化する。通常は、組成物は、上記のような種々の技術によって投与され得る。
【０１８４】
以下の実施例は、説明のために提供され、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１８５】
（実施例１）
（スクレロスチンコア領域のモデル化）
相同性認識技術（例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７）、ＦＵＧＵＥ（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：２４３−５７（２００１））は、ＳＯＳＴのコア領域（ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ）が、シスチンノット折り畳み構造をとっていることを示唆した。ＦＵＧＵＥは、配列間と構造間の相同性を検出するための感度の高い方法である。ヒトの絨毛膜ゴナドトロピンβ（ｈＣＧ−β）は、その実験により決定された３Ｄ構造が既知であり、ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅの最も近いホモログとしてＦＵＧＵＥ（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，前出）によって同定された。したがって、ｈＣＧ−βを、ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅについて３Ｄモデルを作るための構造鋳型として使用した。
【０１８６】
ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅおよびその近いホモログのアラインメントを図１に示す。アラインメントに示したホモログのうち、ｈＣＧ−β（ＣＧＨＢ）だけが３Ｄ構造が既知であった。ＳＯＳＴ＿ＣｏｒｅとｈＣＧ−βとの間での配列同一性は、およそ２５％であった。８個のＣＹＳ残基が、ファミリー全体を通じて保存されており、これにより、ＳＯＳＴ＿ＣｏｒｅとｈＣＧ−βとの間の全体的な構造類似性が強調される。３対のシチイン（１−５、３−７、４−８）が、「ノット」立体構造中でジスルフィド結合を形成する（図１に実線で示す）。これは、シスチンノットの折り畳みに特徴的である。さらなるジスルフィド結合（２−６）が、図１に点線で示され、これはこのファミリーに特有であり、これにより、他のシスチンノットファミリー（例えば、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ）からタンパク質のファミリーを識別する。
【０１８７】
ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅを、ＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８（Ｐｔ ６ Ｐｔ１）：８９９−９０７（２００２））、ｅｎｔｒｙ １ＨＣＮを使用し、ｈＣＧ−β（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：５４５−５８（１９９４））の３Ｄ構造を、構造鋳型としてモデル化した。モデルを、ＭＯＤＥＬＥＲ（Ｓａｌｉ ＆ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｌ．２３４：７７９−８１５（１９９３））を用いて計算した。最良のモデルのスナップショットを図２に示す。
【０１８８】
ほとんどのシスチンノットタンパク質は二量体を形成する。なぜなら、単量体中には疎水性コアが存在しないからである（Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｕｔｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：４４５−５８（１９９３））；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，前出）。ＳＯＳＴは同じ法則に従い、ホモ二量体を形成してその安定性を増大させる。二量体を形成したＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ領域についてのモデルの構築により、いくつかの課題が示された。これらは、（１）ＳＯＳＴ＿ＣｏｒｅとｈＣＧ−βとの間での配列類似性が低い（２５％）こと；（２）ホモ二量体の代わりに、ｈＣＧ−βはｈＣＧ−αと二量体を形成すること；および（３）多数の異なる関連する単量体の立体構造が、異なるファミリー（例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ニューロトロフィン、ＩＬ−１７Ｆ、ゴナドトロピン）から二量体を形成したシスチンノットタンパク質において観察されたことが原因である。これにより、ＳＯＳＴの二量体立体構造がｈＣＧ−α／βヘテロ二量体立体構造とは有意に異なり得ることが示唆された。モデルを構築する際には、ｈＣＧ−αを、手作業での調整により組み合わせて構造重ね合わせ技術を使用してヘテロ二量体構造（１ＨＣＮ）に由来するｈＣＧ−βで置き換え、その後、ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅホモ二量体モデルを、偽ｈＣＧ−βホモ二量体構造にしたがって組み立てた。最終的なモデルを図３に示す。
【０１８９】
（実施例２）
（ＳＯＳＴ−ＢＭＰ相互作用のモデル化）
この実施例では、ＢＭＰとＳＯＳＴとの間での相互作用に関与しているＢＭＰ上のＩ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位のタンパク質モデル化について記載する。
【０１９０】
競合実験は、ＳＯＳＴがＢＭＰに対する結合についてＩ型レセプターおよびＩＩ型レセプターの両方と競合することを示した。ＥＬＩＳＡに基づく競合アッセイにおいては、ＢＭＰ−６は、スクレロスチンでコーティングされた表面（３００ｎｇ／ウェル）と高い親和性（ＫＤ＝３．４ｎＭ）で選択的に相互作用した。ＢＭＰレセプターＩＡ（Ｆｃ融合構築物）の増加量がＢＭＰ−６（１１ｎＭ）に対する結合についてスクレロスチンと競合した（ＩＣ５０＝１１４ｎＭ）。１０倍のモル過剰量のＢＭＰレセプターが、ＢＭＰ−６に対するスクレロスチンの結合をおよそ５０％減少させるには十分であった。この競合はまた、ＢＭＰレセプターＩＩ−ＦＣ融合タンパク質（ＩＣ５０＝３６ｎＭ）およびＤＡＮ（ＩＣ５＝４３ｎＭ）を用いても観察された。アッセイの特異性は、スクレロスチンと、アクチビンＲ１Ｂ−ＦＣ融合タンパク質（ＢＭＰには結合しないＴＧＦ−βレセプターファミリーのメンバー）との間では、ＢＭＰ−６に対する結合について競合が存在しないことによって示される。
【０１９１】
ＢＭＰポリペプチド上のＩ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位はマップされており、これらは空間的に隔てられている（Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，前出）。高い親和性でＢＭＰに結合する別のＢＭＰアンタゴニストであるノギンは、ノギンのＮ末端部分を介してＩ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位の両方で、ＢＭＰと接触する（Ｇｒｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，前出）。Ｃ末端付近のコア領域中の２つのβ−鎖もまた、ＩＩ型レセプター結合部位でＢＭＰと接触する。
【０１９２】
ノギンとＳＯＳＴの手作業で調整したアラインメントは、これらの２つのポリペプチドが、タンパク質のＮ末端部分の間、およびコア領域間に配列類似性を共有していることを示した。アミノ酸配列のアラインメントを図４に示す。特徴的なｃｙｓノットを形成するシステイン残基は、ノギンとＳＯＳＴとの間で保存されていた。全体的な配列の同一性は２４％であり、Ｎ末端結合領域（アラインメント位置１〜４５）内での配列同一性は３３％であった。ノギンのＮ末端結合領域中の２つの残基、すなわち、アラインメント位置２１のＬｅｕ（Ｌ）と位置２３のＧｌｕ（Ｅ）は、ＢＭＰの結合において重要な役割を旗することが報告されている（Ｇｒｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，前出）。いずれの残基も、ＳＯＳＴ中でも同様に保存されていた。コア領域（アラインメント位置１３１〜２２８）の配列類似性は約２０％であったが、ｃｙｓノット骨格は維持されており、十分な数の重要な残基が保存されており、このことにより、ノギンとＳＯＳＴとの間での相同性がサポートされる。
【０１９３】
ノギンの構造を、２つのＳＯＳＴ単量体がどのような二量体を形成するかを理解するために、ＳＯＳＴに対して比較した。図５に示すように、ノギンの構造は、Ｎ末端領域とコア領域の間のリンカーは２つの領域を繋ぐ役割だけではなく、２つのノギン単量体の間の二量体界面の一部をも形成する役割をも果たすことを示唆した。ノギンとＳＯＳＴとの間の１つの大きな違いは、Ｎ末端領域とコア領域との間のリンカーがＳＯＳＴにおいてははるかに短い点であった。
【０１９４】
ＳＯＳＴのＣ末端領域は、ＳＯＳＴの二量体化において役割を果たすこともできる。ノギンの配列はコア領域で終了し、一方、ＳＯＳＴは、さらなるＣ末端領域を有していた。ノギンの構造においては、ジスルフィド結合が２つのノギンの単量体のＣ末端を連結させる。したがって、ＳＯＳＴのＣ末端領域は、２つの単量体の界面で閉じ始め、これにより二量体化に関与することができる。さらに、二次構造の推定は、ＳＯＳＴのＣ末端領域のいくつかの部分が、ヘリックスを形成する傾向にあることを示す。ＳＯＳＴ中のこの領域は、二量体化活性を担う場合があり、これは、おそらく、ノギンのより長いリンカーの機能を模倣するヘリックス−ヘリックスパッキングを介して行われる。ノギンとＳＯＳＴの構造の間での別の相違点は、アラインメント位置１６９−１８５のＳＯＳＴコア領域中にアミノ酸の挿入が存在する点である（図４を参照のこと）。この挿入はβ−ヘアピンを伸張し、これは、ノギン構造中の二量体化界面を示す（図５に、単量体の中央部のループ領域として、Ｃ末端Ｃｙｓ残基の上に示す）。この伸張されたβ−ヘアピンもまた、ＳＯＳＴの二量体化に関与することができる。
【０１９５】
（実施例３）
（ＳＯＳＴペプチド免疫原の設計および調製）
この実施例は、動物を免疫し、ＢＭＰとＳＯＳＴとの間の相互作用をブロックしてＳＯＳＴ単量体の二量体形成を妨げる抗体を作成するために使用される、ＳＯＳＴペプチド免疫原の設計について記載する。
【０１９６】
（ＢＭＰ結合フラグメント）
ＳＯＳＴとノギンとの間での全体的な類似性、および２つのポリペプチドのＮ末端領域の間での類似性は、ＳＯＳＴがノギンと同様の様式でＢＭＰと相互作用できることを示唆している。すなわち、ＳＯＳＴのＮ末端領域は、ＢＭＰ上のＩ型レセプター結合部位およびＩＩ型レセプター結合部位の両方と相互作用することができ、コア領域の一部（図４のアミノ酸アラインメント位置１９０〜２２０）は、これらのＳＯＳＴ領域に特異的な抗体がＳＯＳＴに対するＢＭＰの結合をブロックするかまたは妨害できるように、ＩＩ型レセプター結合部位と相互作用することができる。
【０１９７】
ラットとヒトのＳＯＳＴについて、これらのＳＯＳＴポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列を以下に提供する。
【０１９８】
ＳＯＳＴ＿Ｎ＿リンカー：Ｎ末端領域（コア領域に連結する短いリンカーを含む）
【０１９９】
【化１】
2011105729.tif 000002
ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ＿Ｂｉｎｄ：そのＩＩ型レセプター結合部位でおそらくＢＭＰに接触するコア領域中の部分（ＣＹＳ残基アンカーを含むように両方の末端をわずかに伸ばした）
【０２００】
【化２】
2011105729.tif 000003
（ＳＯＳＴ二量体化フラグメント）
ＳＯＳＴのＣ末端領域は、おそらく、ＳＯＳＴホモ二量体の形成に関係している（実施例２を参照のこと）。伸張されたβ−ヘアピンもまた、ホモ二量体の形成において役割を担っている。このような領域に特異的に結合する抗体は、ＳＯＳＴ単量体の二量体化を妨げるかまたは妨害することができる。これは、次いで、ＳＯＳＴとＢＭＰと間での相互作用を妨害する。これらの領域に対応するラットおよびヒトＳＯＳＴ中のポリペプチドフラグメントは以下である。
【０２０１】
ＳＯＳＴ＿Ｃ：Ｃ末端領域
【０２０２】
【化３】
2011105729.tif 000004
ＳＯＳＴ＿Ｃｏｒｅ＿Ｄｉｍｅｒ：ＳＯＳＴの二量体化におそらく関係しているコア領域中の部分（Ｃｙｓ残基アンカーを含むように両方の末端をわずかに伸ばした）
【０２０３】
【化４】
2011105729.tif 000005
（ＳＯＳＴ Ｎ末端のＢＭＰ結合フラグメント）
ＳＯＳＴの鍵となるＮ末端結合領域（図４のアラインメント位置１〜３５）を、ノギン／ＢＭＰ−７複合体構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｅｎｔｒｙ Ｎｏ：１Ｍ４Ｕ）およびアミノ酸配列アラインメント（図４を参照のこと）に基づいてモデル化して、ＢＭＰとおそらく相互作用するであろうＳＯＳＴのＮ末端のアミノ酸残基を同定した。ＳＯＳＴのモデルを図６に示す。比較モデルにおいては、ＳＯＳＴ配列中のアラインメント位置８のフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）（矢印および添付のテキストを参照のこと）が、ＢＭＰ二量体の表面上の疎水性ポケットに突き出している。同じ「ノブが穴の中に入っている（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」特徴は、ＢＭＰとＩ型レセプター複合体構造においても観察されている（Ｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。ここで、レセプターのＰｈｅ８５が同じポケットにフィットし、これは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＴＧＦ−βファミリー、ＢＭＰファミリーなどを含む）のメンバーについてのリガンド−Ｉ型レセプター認識において重要な特徴である。モデルに従えば、ターンを指示するプロリン（Ｐｒｏ）もまた保存されており、これは、Ｎ末端結合フラグメントがＢＭＰ二量体表面に沿って縫うようにすすむことを可能にし、Ｉ型レセプター結合部位から、複合体の他方の側面上のＩＩ型レセプター結合部位へと移動させる。結合フラグメントのカルボキシ末端付近のＰｒｏによって指示される別のターンもまた保存されており、これは、次いで、リンカー領域に連結する。ＳＯＳＴとＢＭＰとの間の広い範囲での接触を、図６で明らかにする。
【０２０４】
（ペプチド免疫原）
ＢＭＰタンパク質との接触をもたらすと推定されるＳＯＳＴのＮ末端領域を含むペプチドを設計した。ペプチド配列を以下に示す。動物を免疫するためには、ペプチド配列を、重複するように設計し、別のシステインを、ＫＬＨに容易に架橋できるようにＣ末端に付加した。その後、ペプチドを免疫に使用した。免疫原のペプチド配列は以下である：
【０２０５】
【化５】
2011105729.tif 000006
ＢＭＰタンパク質との接触をもたらすと推定されるコア領域のアミノ酸部分を含むように、以下のペプチドを設計した。システインを、ＫＬＨに結合させるためにそれぞれのペプチドのＣ末端に付加し、結合させたペプチドを免疫に使用した。ドッキングコアＮ末端ペプチド中の内部システインを、ＫＬＨへの二重の結合を避けるためにセリンに変化させた。
【０２０６】
【化６】
2011105729.tif 000007
ＳＯＳＴホモ二量体を形成するように相互作用する可能性があるＳＯＳＴ内の２つの領域には、ノギン中には存在しないＳＯＳＴコア領域を有しているアミノ酸が含まれる。この配列を含むように設計したヒトＳＯＳＴペプチドは、ＫＬＨに結合させたＣ末端またはＮ末端Ｃｙｓを有する。ラットのＳＯＳＴペプチドについては、システインを配列のカルボキシ末端に付加した（配列番号３１）。ＫＬＨに結合させたペプチドを免疫に使用した。
【０２０７】
【化７】
2011105729.tif 000008
ＳＯＳＴホモ二量体を形成するように相互作用するであろうＳＯＳＴ中の第２の領域には、Ｃ末端領域が含まれる。ペプチド免疫原を、この領域内のアミノ酸配列を含むように設計した（下記を参照のこと）。ＫＬＨに結合させるために、システイン残基をＣ末端に付加し、結合させたペプチドを免疫のために使用した。
【０２０８】
【化８】
2011105729.tif 000009
（実施例４）
（ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体の結合を検出するためのアッセイ）
この実施例では、リガンド、例えば、抗体またはその抗体フラグメントの、スクレロスチンに対する結合を検出するためのアッセイについて記載する。
【０２０９】
ＦＬＡＧ（登録商標）−スクレロスチン融合タンパク質を、製造業者（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって提供されているプロトコールにしたがって、米国特許第６，３９５，５１１号に記載されているように調製した。９６ウェルマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを、抗ＦＬＡＧ（登録商標）モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングし、その後、ＰＢＳ中の１０％ＢＳＡでブロックした。融合タンパク質（２０ｎｇ）を１００μｌのＰＢＳ／０．２％のＢＳＡに添加し、９６ウェルプレート上に６０分間、室温で吸着させた。このタンパク質溶液を除去し、ウェルを洗浄して、結合していない融合タンパク質を洗い流した。ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、またはＢＭＰ−７を、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中で希釈し、１０ｐＭから５００ｎＭまでの範囲の濃度でそれぞれのウェルに添加した。室温で２時間のインキュベーションのあと、結合溶液を除去し、プレートを２００μｌの容量のＰＢＳ／０．２％ＢＳＡで３回洗浄した。スクレロスチンに対するＢＭＰの結合を、ＢＭＰに特異的なポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体、および適切な酵素結合第２段階試薬を使用して、標準的なＥＬＩＳＡ技術にしたがって検出した（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ２ １１．２．１−１１．２．２２（１９９８）を参照のこと）。特異的な結合を、全ての結合から非特異的な結合を引き算することによって計算し、ＬＩＧＡＮＤプログラムを使用して分析した（Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｄｂａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−３９（１９８０））。
【０２１０】
ＢＭＰに対するスクレロスチンの結合もまた、ホモジニアス時間分解蛍光検出によって検出した（Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，３：９１−９９（１９９８））。スクレロスチンをコードするポリヌクレオチド配列を、当該分野で公知であって本明細書中に記載されている方法にしたがって、組み換え核酸構築物中のヒト免疫グロブリン定常領域に動作可能であるように連結し、ヒトＦｃ−スクレロスチン融合タンパク質として発現させた。同様に、ＢＭＰリガンドを操作して、ＢＭＰ−マウスＦｃ融合タンパク質として発現させた。これらの２つの融合タンパク質を一緒にインキュベートし、Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．に記載されているようにアッセイを行った。
【０２１１】
（実施例５）
（ＴＧＦ−β結合タンパク質に対するＴＧＦ−βファミリーのメンバーの結合を阻害する抗体についてのスクリーニングアッセイ）
この実施例は、スクレロスチンに対するＴＧＦ−βファミリーのメンバーの結合を阻害する抗体を検出するための方法について記載する。ＥＬＩＳＡを、ＢＭＰの濃度をそのＫｄ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって決定した）に固定して保ったことを除いて、基本的には、実施例４に記載されているように行った。さらに、抗体、または抗体のライブラリーもしくはコレクションを、１μＭの濃度でウェルに添加した。抗体を、室温で２時間、ＢＭＰおよびスクレロスチンとともにインキュベートし、溶液を除去し、結合したＢＭＰを記載したように定量した（実施例４を参照のこと）。抗体が存在しない条件下で観察したＢＭＰの結合の４０％を阻害する抗体を、この相互作用のアンタゴニストとみなした。これらの抗体を、さらに、それらの阻害定数、およびＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性に対するそれらの効果を決定するために滴定実験を行うことによって、可能性のある阻害因子として評価した。比較できる特異性対照アッセイもまた行って、ＢＭＰリガンド作用に応じて変化するアッセイ（例えば、ＢＭＰ／ＢＭＰレセプター競合実験）を使用して、同定されたアンタゴニストについての選択性プロフィールを確立した。
【０２１２】
（実施例６）
（骨基質へのＴＧＦ−β結合タンパク質の局在化の阻害）
骨基質（ヒドロキシアパタイト）への局在化の阻害の評価を、Ｎｉｃｏｌａｓの方法に変更を加えて行った（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．５７：２０６−１２（１９９５））。簡単に言うと、１２５Ｉで標識したＴＧＦ−β結合タンパク質を、Ｎｉｃｏｌａｓ（前出）によって記載されているように調製した。ヒドロキシアパタイトを、ポリプロピレン濾過膜（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｎｃ，Ｗｅｙｍｏｕｔｈ ＭＡ）を取り付けた９６ウェルマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加した。ＰＢＳ緩衝液中の０．２％のアルブミン中に希釈したＴＧＦ−β結合タンパク質を、その後、ウェルに添加した。基質を含むウェルを、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％のアルブミンで３回洗浄した。吸着したＴＧＦ−β結合タンパク質を、０．３ＭのＮａＯＨを使用して溶出し、その後、定量した。
【０２１３】
スクレロスチンＴＧＦ−β結合タンパク質のヒドロキシアパタイトへの結合を阻害または妨害する抗体または他の因子を、抗体と共にＴＧＦ−β結合タンパク質をインキュベートし、上記に記載したように、基質に対してこの混合物を添加することによって、同定した。基質を、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％のアルブミンで３回洗浄した。吸着したスクレロスチンを、０．３ＭのＮａＯＨを用いて溶出し、その後、定量した。ヒドロキシアパタイトに対するスクレロスチンの結合のレベルを、抗体が存在しない条件下で観察した結合のレベルと比較して少なくとも４０％阻害する抗体を、骨局在化の阻害因子とみなした。このような抗体を、さらに、その阻害定数およびＴＧＦ−β結合タンパク質の結合親和性に対するその効果を決定するために、用量応答実験において特徴付けた。
【０２１４】
上記から、本発明の特異的な実施形態が説明の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の変更を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月7日(2011.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のスクレロスチンポリペプチドの多くても５０個の連続アミノ酸のペプチドを含む免疫原であって、ここで、該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸８６−１１１の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む前記免疫原。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号１のスクレロスチンペプチドの少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、請求項１に記載の免疫原。
【請求項３】
前記ペプチドは、配列番号２２の少なくとも４個の連続アミノ酸を含む、請求項１または請求項２に記載の免疫原。
【請求項４】
前記ペプチドは、キャリア分子と会合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項５】
前記キャリア分子が、キーホールリンペットヘモシアニンである、請求項４に記載の免疫原。
【請求項６】
請求項１、２、４または５のいずれか１項に記載の免疫原を含有する組成物。
【請求項７】
配列番号１のスクレロスチンポリペプチドの多くても７５個の連続アミノ酸のペプチドを含む第二の免疫原を更に含有する、ここで、該ペプチドは、配列番号２２の少なくとも４個の連続アミノ酸を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第二の免疫原のペプチドは、配列番号３３の少なくとも４個の連続アミノ酸を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号１のスクレロスチンポリペプチドの多くても７５個の連続アミノ酸のペプチドを含む第二の免疫原を更に含有する、ここで、該ペプチドは、配列番号３３の少なくとも４個の連続アミノ酸を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原又は請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物で動物を免疫することを含む前記方法。