(57)【要約】【課題】簡便、省スペース、低工数で大量の生理活性タンパク質、特に抗体を精製する技術を提供することを課題とする。【解決手段】  以下の工程（１）〜（３）を少なくとも含み、工程（１）〜（３）の所要時間が４時間以下である生理活性タンパク質の精製方法。（１）生理活性タンパク質を１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌの濃度で含み、かつ前処理していない試料と、生理活性タンパク質に対する親和性物質が結合した磁性微粒子とを混合し、混合液とする工程（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により磁性微粒子を分離する工程（３）工程（２）で分離した磁性微粒子から生理活性タンパク質を溶出させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）を少なくとも含み、工程（１）〜（３）の所要時間が４時間以下である生理活性タンパク質の精製方法。
（１）生理活性タンパク質を１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌの濃度で含み、かつ前処理していない試料と、生理活性タンパク質に対する親和性物質が結合した磁性微粒子とを混合し、混合液とする工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により磁性微粒子を分離する工程
（３）工程（２）で分離した磁性微粒子から生理活性タンパク質を溶出させる工程
【請求項２】
生理活性タンパク質の収率が６０〜９９．９％である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）において、生理活性タンパク質を含み、かつ前処理していない試料の容量が１５ｍｌ以上である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
磁性微粒子の平均粒子径が０．３〜１０μｍである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
磁性微粒子１ｇ当りの生理活性タンパク質の精製量が５０〜１０００μｇである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生理活性タンパク質が抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前処理が、細胞の分離、硫安沈殿、フェノールレッド除去、脱塩、陰イオン交換および陽イオン交換からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生理活性タンパク質に対する親和性物質が、プロテインＡまたはプロテインＧである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性微粒子を用いた生理活性タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発達により、種々の生理活性タンパク質が安定した供給量で提供されるようになった。特に、抗体医薬分野は、治療効果が高く副作用が少ないなどの効果があり、多様な薬剤をターゲットにできることや、テーラーメード医療への適用が期待されており、製薬分野で注目されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質の精製においては、宿主ＤＮＡ、目的の生理活性タンパク質以外のタンパク質、固形物およびフェノールレッドのような材料特異的な不純物等の夾雑物を除去する必要がある。一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有するサンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、またはこれらの組合せで処理することにより夾雑物を除去している。
【０００４】
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテインＡまたはプロテインＧを固定化した担体やアパタイト担体をカラムに充填したカラム法により精製している（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかしながら、このようなカラム法は、サンプルの清澄化（硫安沈殿、カプリル酸沈殿、遠心およびフィルターろ過等）、サンプルの脱塩およびバッファー交換といった前処理が必要であり、かつ当該前処理には時間、労力、コストを要する。また、抗体を大量に精製する場合、巨大なカラムや巨大なサンプラーを必要とするため広い作業スペースが必要であり、かつ多大な時間を要するという問題点があった。
【０００６】
また、近年、リガンドが固定された磁性微粒子を目的のタンパク質を含むサンプルに添加し、該リガンドに結合する目的のタンパク質を吸着した後、磁性微粒子を回収し、目的物質を磁性微粒子から分離、回収する方法が知られている。例えば、ビオチン及びアビジンから選ばれた１種以上が下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマーを介して磁性微粒子に固定された温度応答性磁性微粒子と磁石の磁力を用いた生体物質の精製方法が開発されている（例えば、特許文献３参照）。しかし、磁性微粒子を用いた精製方法では、大量のタンパク質、特に抗体を、簡便かつ低コストで精製することは困難であった。
【０００７】
したがって、より高収率で実施コストの低い、生理活性タンパク質、特に抗体を精製する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０６−１０７６７９号公報
【特許文献２】特開平０５−３１０７８０号公報
【特許文献３】国際公開第０２／１６５７１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】抗体医薬の最前線、２００７年７月、植田充美監修
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、従来と比較して、格段に簡便、省スペース、低工数で大量の生理活性タンパク質、特に抗体を精製する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、以下の構成を採用することにより、本発明の課題を解決することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下のとおりである。
１．以下の工程（１）〜（３）を少なくとも含み、工程（１）〜（３）の所要時間が４時間以下である生理活性タンパク質の精製方法。
（１）生理活性タンパク質を１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌの濃度で含み、かつ前処理していない試料と、生理活性タンパク質に対する親和性物質が結合した磁性微粒子とを混合し、混合液とする工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により磁性微粒子を分離する工程
（３）工程（２）で分離した磁性微粒子から生理活性タンパク質を溶出させる工程
２．生理活性タンパク質の収率が６０〜９９．９％である前項１に記載の方法。
３．工程（１）において、生理活性タンパク質を含み、かつ前処理していない試料の容量が１５ｍｌ以上である前項１または２に記載の方法。
４．磁性微粒子の平均粒子径が０．３〜１０μｍである前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．磁性微粒子１ｇ当りの生理活性タンパク質の精製量が５０〜１０００μｇである前項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
６．生理活性タンパク質が抗体である前項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．前処理が、細胞の分離、硫安沈殿、フェノールレッド除去、脱塩、陰イオン交換および陽イオン交換からなる群から選ばれる少なくとも１種である前項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．生理活性タンパク質に対する親和性物質が、プロテインＡまたはプロテインＧである前項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生理活性タンパク質の精製方法は、磁性微粒子を用いた精製方法であるため、カラム法に必要な前処理が不要であり、生理活性タンパク質の大量精製をする場合にカラム法のような大きな装置が不要である、という利点がある。また、本発明の生理活性タンパク質の精製方法は、従来の磁性微粒子を用いた方法と比較して、大量の生理活性タンパク質、特に抗体を短時間で精製できる、という利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図３】磁性微粒子およびＩｇＧの反応速度を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図６】ゲル層を持つ磁性微粒子の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法は、以下の工程（１）〜（３）を少なくとも含み、工程（１）〜（３）の所要時間が４時間以下である生理活性タンパク質の精製方法である。
（１）生理活性タンパク質を１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌの濃度で含み、かつ前処理していない試料と、生理活性タンパク質に対する親和性物質が結合した磁性微粒子とを混合し、混合液とする工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により磁性微粒子を分離する工程
（３）工程（２）で分離した磁性微粒子から生理活性タンパク質を溶出させる工程
【００１５】
以下、各工程について説明する。
（１）生理活性タンパク質を１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌの濃度で含み、且つ前処理していない試料と、生理活性タンパク質に対する親和性物質が結合した磁性微粒子とを混合し、混合液とする工程
この工程は、生理活性タンパク質を含む試料と磁性微粒子とを混合し、生理活性タンパク質（タグ融合タンパク質を含む。）に対する親和性物質（以下、単に「リガンド」ということがある。）と生理活性タンパク質との親和性を利用して、生理活性タンパク質を磁性微粒子に結合させる工程である。
【００１６】
混合操作は、適当なバッファー中で生理活性タンパク質と磁性微粒子が接触し得るならば、制限はない。例えば、生理活性タンパク質を含む試料および磁性微粒子が供されたチューブを軽く転倒攪拌または振とうさせる程度で十分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて混合する操作が挙げられる。
【００１７】
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られるものが含まれる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、または該アミノ酸配列の１若しくは複数を欠失、置換、または付加したもので前記生物学的活性を有するものが含まれる。
【００１８】
生理活性タンパク質としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、インシュリンおよびプロラクチン等のタンパク質ホルモン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)およびトロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１およびＩＬ−６等のサイトカイン、組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)、インスリン並びに副甲状腺ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体がより好ましい。
【００１９】
タグ融合タンパク質とは、遺伝子工学技術などを利用して人為的に導入した標識を持つタンパク質である。タグ融合タンパク質は、例えば、目的のタンパク質分子の一部に、特定のアミノ酸配列を持つペプチド鎖、または酵素活性および／若しくは特定の物質に対する結合能を持つタンパク質を標識として導入することで、作製することができる。目的のタンパク質に当該標識を導入することで、該タンパク質の分離や検出が容易になる。
【００２０】
タグ融合タンパク質のタグとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＨＳＶタグ、チオレドキシンタグ、アルカリフォスファターゼタグおよびリン酸化タンパク質タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
生理活性タンパク質に対する親和性物質としてプロテインＡまたはプロテインＧを用いる場合は、生理活性タンパク質としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体としては、ＩｇＧが好ましい。なお、ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスがあり、マウスＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のサブクラスがある。本発明では、これらを使用することがより好ましい。
【００２２】
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、アフリカミドリザル腎臓由細胞（ＣＯＳ細胞）およびヒト由来の細胞が挙げられる。
【００２３】
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、抗原に感作させた免疫細胞を通常の細胞融合法によってミエローマ細胞と融合させて作成したハイブリドーマから生産することができる。
【００２４】
また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。さらに、トランスジェニック動物（ある特定の遺伝子を個体レベルで付加した遺伝子操作動物のこと。）およびファージディスプレイ等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
【００２５】
生理活性タンパク質を含む試料としては、例えば、生理活性タンパク質を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地およびこれに部分的精製などの一定の処理を施したもの、血清、血漿、腹水、リンパ液および尿が挙げられる。
【００２６】
本発明の生理活性タンパク質の精製方法によれば、生理活性タンパク質を１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０−５〜１０−２ｍｏｌ／ｌという高濃度で含む試料から、磁性微粒子を用いて生理活性タンパク質を精製することができる。生理活性タンパク質の濃度は、例えば、ブラッドフォード法、ＢＣＡ法、２８０ｎｍの吸光度の測定および電気泳動により、測定することができる。
【００２７】
磁性微粒子と混合する生理活性タンパク質を含む試料の容量は、１ｍｌ以上が好ましく、１５ｍｌ以上がより好ましい。また、５０ｌ以下が好ましく、１０ｌ以下がより好ましい。この範囲とすることで、４時間以下の生理活性タンパク質の精製が可能になる。
【００２８】
工程（１）に供する生理活性タンパク質を含む試料は前処理していない試料である。生理活性タンパク質を含む試料の前処理としては、例えば、カラム法によりタンパク質を精製する際に必要である前処理が挙げられる。該前処理としては、例えば、細胞の分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、硫酸デキストラン沈殿、ポリビニルピロリドン沈殿、活性炭によるフェノールレッド除去、並びに脱塩およびバッファー交換（例えば、ゲル濾過、透析および限外濾過）が挙げられる。細胞を分離する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過、および限外ろ過が挙げられる。
【００２９】
本発明の方法は生理活性タンパク質を含む試料の前処理を経なくてもよいため、生理活性タンパク質の精製に要する時間を短縮することができる。前処理に要する時間は、生理活性タンパク質の種類および量等により異なるが、通常、１５〜３０時間である。例えば、遠心分離により夾雑物である細胞を分離する場合、通常約３０分〜１時間の所用時間である。また、生理活性タンパク質を含む試料が血清の場合、硫安沈殿および脱塩をする必要があるが、例えば、血清の量が１５〜１０００ｍｌの場合、その所要時間は、通常約３０分から１時間である。また、生理活性タンパク質を含む試料が培養上清の場合、フェノールレッド除去を必要に応じてする必要があるが、培養上清が１５〜１０００ｍｌの場合その所要時間は、通常約１時間である。
【００３０】
本発明の方法に用いる磁性微粒子は、平均粒子径（キュムラント解析）が、０．１〜１００μｍであることが好ましく、０．３〜１０μｍであることがより好ましい。磁性微粒子の平均粒子径をこの範囲とすることで、４時間以下の生理活性タンパク質の精製が可能になるからである。平均粒子径（キュムラント解析）は、例えば、レーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））を用いて測定することにより算出する。
【００３１】
磁性微粒子の素材としては、例えば、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石およびヘマタイトなどの鉄酸化物が挙げられる。
【００３２】
磁性微粒子の調製方法は特に限定はないが、例えば、オレイン酸とドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いて、マグネタイトを二重のミセルとし、水溶液中に分散させる、マグネタイトの調製方法を挙げることができる［バイオカタライシス（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁］。
【００３３】
磁性微粒子は、有機物と鉄酸化物との複合体であってもよい。有機物としては、例えば、多糖および合成高分子が挙げられる。多糖および合成高分子としては、例えば、アガロースおよびポリエチレングリコールの架橋体が好ましく挙げられる。
【００３４】
本発明の方法に用いる磁性微粒子は、その表面がフレキシビリティーを有することが好ましい。磁性微粒子の表面がフレキシビリティを有することで生理活性タンパク質と磁性微粒子に固定化されたリガンドの反応効率が良好になるからである。ここで、「フレキシビリティー」とは、柔軟性、融通性のことを意味する。具体的には、「フレキシビリティーを有する」とは、材料表面に依存する立体障害を受けない状態にすることであり、リガンドと生理活性タンパク質との相互作用（結合定数）を阻害しないことを示す。
【００３５】
例えば、磁性微粒子と疎水性物質との複合体を形成させ、該複合体の表面を、複数の親水性モノマーからなる共重合体を架橋してなるゲルで被覆することにより、磁性微粒子の表面のフレキシビリティーを増大することができる。ここで「被覆」とは、磁性微粒子の外側を覆って、磁性微粒子の最外にゲル層が形成されてなることを指す。
【００３６】
疎水性物質としては、例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルチミン酸、パルミトイル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、（９，１２，１５）−リノレン酸、（６，９，１２）−リノレン酸、（６，９，１２）−リノレン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸およびリグノセリン酸が挙げられる。
【００３７】
親水性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、グリシジルメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリルエチルメタクリレートとポリエチレングリコールジアクリレートおよびＮ−（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅが挙げられる。
【００３８】
また、例えば、架橋剤の添加量や親水性モノマー側鎖の分子量を大きくすることによっても、磁性微粒子の表面のフレキシビリティを増大させることができる。
【００３９】
生理活性タンパク質に対する親和性物質としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、アビジン、グルタチオン、レクチンおよび抗体を磁性微粒子に表面修飾することで、それらに対する特異的吸着作用を有する生理活性タンパク質と特異的に結合できる。該親和性物質がビオチンの場合は、アビジンとの特異的な結合を介してビオチン化された検出対象のタンパク質と、またビオチン化された抗体を用いてそれらの抗原である種々の生理活性タンパク質と更に結合することが可能である。
【００４０】
本発明の方法では、市販されているアビジンまたはビオチン化タンパク質が利用でき、ビオチン化は、当該技術分野で周知の方法に従えばよい。生理活性タンパク質に対する親和性物質がグルタチオンの場合は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という。）を含有するタンパク質と特異的に結合できる。このようなＧＳＴ含有タンパク質の調製は当該技術分野で周知の方法に従えばよい。
【００４１】
磁性微粒子は適当な分散媒に分散させた状態で使用することが好ましい。分散媒としては、例えば、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸バッファー、１，４−ピペラジンジエタンスルフォン酸バッファー（以下、「ＰＩＰＥＳバッファー」という。）、ホウ酸バッファーおよび酢酸バッファーが挙げられる。
【００４２】
磁性微粒子は、生理活性タンパク質を含む試料に、好ましくは１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１０−５〜１０−２ｍｏｌ／ｌとなるように加えることが好ましい。この範囲とすることで、４時間以下の生理活性タンパク質の精製が可能になる。
【００４３】
精製すべき生理活性タンパク質と磁性微粒子の質量比は１：１〜１：１０００であることが好ましく、１：１０〜１：１００であることがより好ましい。この範囲とすることで、４時間以下の生理活性タンパク質の精製が可能になる。
【００４４】
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により磁性微粒子を分離する工程
この工程は、工程（１）で得られた混合液から、生理活性タンパク質の結合した磁性微粒子を磁力により分離する工程である。具体的には、例えば、生理活性タンパク質と磁性微粒子との結合を適当なチューブ内で行った場合、チューブの側壁に磁石を外側から近づけることによって磁性微粒子をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を排出することによって、生理活性タンパク質が結合した磁性微粒子を分離することができる。
【００４５】
磁性微粒子の分離に用いる磁石等の磁力は、用いる磁性微粒子の有する磁力の大きさによって異なる。磁力は、目的の磁性微粒子を磁集可能な程度の磁力を適宜使用できる。磁石の素材としては、例えば、上述した磁性微粒子の素材で構成されたものを使用することができる。例えば、ネオジム磁石（マグナ社製）等が利用できる。ネオジム磁石の磁力は、３８００ガウス以上がより好ましい。
【００４６】
（３）工程（２）で分離した磁性微粒子から生理活性タンパク質を溶出する工程
この工程は、工程（２）で磁性分離により分離した磁性微粒子から、目的とする生理活性タンパク質を分離し、回収する工程である。生理活性タンパク質の特性に従い、当該技術分野で周知の方法によって磁性微粒子から生理活性タンパク質を分離する。
【００４７】
具体的には、例えば、チューブ内に適当な溶出液を加えることによって、生理活性タンパク質を磁性微粒子から溶出させる。そして、溶出後、チューブの側壁に磁石を外側から近づけて磁性微粒子をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を採取することによって、磁性微粒子に結合していた生理活性タンパク質を回収することができる。
【００４８】
生理活性タンパク質を溶出させる溶出液としては、生理活性タンパク質とリガンドとの親和性を低下させる効果がある液体が好ましい。当該液体としては、例えば、塩酸、イミダゾール、グルタチオンおよびビオチンを含むバッファーが挙げられる。バッファーとしては、例えば、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸塩バッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ホウ酸バッファーおよびグリシン塩酸バッファーが挙げられる。
【００４９】
尚、磁性微粒子から生理活性タンパク質を溶出させる前に磁性微粒子を洗浄し、夾雑物を除去してもよい。具体的な洗浄方法としては、例えば、０．５質量％のＴｗｅｅｎ２０（ユニヒェマ  ヒェミー  ベスローテン  フエンノートシャップ社の登録商標：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）を含むリン酸ナトリウムバッファー中に生理活性タンパク質−磁性微粒子複合体を加え、再分散を繰り返すことで疎水性相互作用で結合や巻き込みにより磁性微粒子中に取り込まれていた夾雑物を取り除く方法が挙げられる。
【００５０】
上記工程（１）〜（３）を経ることによって、生理活性タンパク質を含む試料から目的の生理活性タンパク質を精製することができる。本発明の方法による、生理活性タンパク質の収率は、６０〜９９．９％であることが好ましく、８０〜９９％であることがより好ましい。
【００５１】
本発明の方法において、上記工程（１）〜（３）の所要時間は、４時間以下であることが好ましく、３．５時間以下であることがより好ましい。また、生理活性タンパク質の種類、生理活性タンパク質を含む試料の量および生理活性タンパク質を含む試料中の生理活性タンパク質の濃度などにより適宜調整することができるが、上記工程（１）〜（３）の所要時間は、通常、３分以上であることが好ましく、１０分以上であることがより好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
磁気分離とは、磁性微粒子等を磁石等の磁力によって、液体から収集することをいう。なお、磁気分離には、株式会社二六製作所製ネオジム磁石を使用した。
精製水とは，ミリポア社製純水製造装置「Ｄｉｒｅｃｔ−ＱＴＭ」によって精製された導電率１８ＭΩｃｍの水であり、ＭｉｌｌＱ水と呼ばれることもある。
【００５３】
実施例１
＜表面にゲル層を持つ磁性微粒子の製造方法＞
２００ｍｌ容のフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を１００ｍｌ入れ、メカニカルスターラー（ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＨＩＧＨＴ  ＰＯＷＥＲ  ＭＩＸＥＲ、ＡＳＯＮＥ社製）で攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、２８質量％アンモニア水溶液５．０ｍｌを滴下し、１時間程度攪拌した。この操作で、平均粒子径が約５ｎｍのマグネタイトが得られた。得られたマグネタイトを精製水で３回洗浄し、乾燥した後メタノールにて２０ｍｇ/ｍｌに調製した。マグネタイト分散液１００ｍｌに対し、オレイン酸ナトリウム３ｇを加え８０℃で１２時間還流操作を行った。遠心分離（１００００ｇ、３０分、２５℃）して過剰なオレイン酸ナトリウムを除き、再びメタノールに分散し２０ｍｇ／ｍｌに調製し、マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体のメタノール溶液を得た。
【００５４】
マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体（磁性微粒子）のメタノール溶液１００ｍｌにメタクリル酸グリシジル２５ｇ、ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）１ｇおよびポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）０．１ｇを加え、室温で２時間攪拌した後、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを０．２５ｇ加え、７０℃に加熱し６時間反応させた。得られた反応混合物を室温に戻した後、磁気分離（ネオジム磁石、株式会社二六製作所製）し、メタノールで２回洗浄することで、表面にゲル層を持つ磁性微粒子のメタノール分散液を得た。前記磁性微粒子のメタノール分散液から、磁気分離（ネオジム磁石、株式会社二六製作所製）によりメタノールを除き、精製水に置換し一晩回転混合によりゲル層を膨潤させた。その後、１ｍｌの分散液を分取し、磁気分離を行い上清を除き、水を含有する磁性微粒子の質量を測定し、乾燥（６０℃、６時間、恒温・乾燥器  ＤＫＮ４０２、ヤマト科学社製）させた後、乾燥後の磁性微粒子の質量を測定した。その結果、ゲル層を有する磁性微粒子の含水率は８３質量％であった。
【００５５】
得られた磁性微粒子の平均粒子径をレーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））により測定したところ、５２５ｎｍであった。
【００５６】
実施例２
＜ストレプトアビジン固定化磁性微粒子によるビオチン化抗体の分離＞
（ストレプトアビジン固定化磁性微粒子の調製）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ２５ｍＭのＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ、ｐＨ４．７５）１ｍｌを加えて再分散させた。ストレプトアビジン（１０ｍｇ／ｍｌ）を２５μｌ添加し、３時間回転混合した。磁気分離を行い、上清を除いた後１ｍｌの１００ｍＭ  ＴＢＳ（ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）を加えて１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ  ＰＢＳ（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子を得た。
【００５７】
（ストレプトアビジン固定化磁性微粒子によるビオチン化抗体の分離）
ストレプトアビジン固定化磁性微粒子１００μｌに対してビオチン化ＩｇＧ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｆｃ）、Ｒａｂｂｉｔ、Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ、Ｂｉｏｔｉｎ）１０μｇを添加し５分間回転混合した。その後１５μｌを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の略。）による電気泳動のＴｏｔａｌサンプルとした。２分間磁気分離し、上清から１５μｌを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の上清（ｓｕｐ）サンプルとした。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、上清を除去後１５μｌの１００ｍＭＰＢＳを添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。
【００５８】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図１に示す。図１に示したように、Ｔｏｔａｌサンプルに存在するＩｇＧに由来するバンドがｓｕｐサンプルでは消失し、磁性微粒子側（ｐｐｔサンプル）に結合していることがわかった。この結果から、本発明によるストレプトアビジン固定化磁性微粒子により、効率的にビオチン化ＩｇＧを回収できることがわかった。
【００５９】
実施例３
＜プロテインＡ固定化磁性微粒子による抗体の精製＞
（プロテインＡ固定化磁性微粒子の調製）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し、上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ１ｍｌの２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え再分散した。２５μｌのプロテインＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３時間回転混合した。磁気分離を行い、上清を除いた後、１ｍｌの１００ｍＭ  ＴＢＳを加えて１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、プロテインＡ固定化磁性微粒子を得た。
【００６０】
（プロテインＡ固定化磁性微粒子を用いたウサギおよびヒト血清からのＩｇＧの分離）
プロテインＡ固定化磁性微粒子１００μｌに対してウサギおよびヒト血清１０μｌを添加し５分間、ＭＴＲ−１０３（ＡＳ  ＯＮＥ社製）によって回転混合させた。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ  ＰＢＳを加えて再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し再分散させた。磁気分離の後、上清を除去し、９０μｌの１００ｍＭグリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．０）加え３分間振とう混合することでＩｇＧを溶出させた（１回目）。
磁気分離の後、上清を分離し、分離した上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル１とした。
【００６１】
再び９０μｌの１００ｍＭグリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．０）加え、３分間振とう混合して、ＩｇＧを溶出させた（２回目）。分離した上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル１とした。磁気分離の後、上清を分離し、上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル２とした。
【００６２】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図２に示す。図２に示すように、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子を用いて、ウサギ血清およびヒト血清のいずれからでもＩｇＧを分離・溶出できることがわかった。
【００６３】
実施例４
＜プロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子と従来製品との比較＞
（ＩｇＧの分離）
実施例３と同様に、プロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子を調製した。各３ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子及プロテインＧ固定化磁性微粒子を２００μｇのＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を含む１００μｌの１００ｍＭ  ＰＢＳ溶液に添加し２５℃で１５分間、ＭＴＲ−１０３（ＡＳ  ＯＮＥ社製）によって回転混合させた。２分間磁気分離の後、上清を除去して２００μｌの１００ｍＭ  ＰＢＳ−Ｔ（０．０５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）を加え、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し再分散させた。さらに２回洗浄操作を行い、上清を除去した。４５μｌの１００ｍＭ  グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．７）を加え、ピペットにより混合した。ボルテックスを５分間行い、磁気分離の後に上清を回収した。さらに再度抽出操作を行い、得られた２回分の上清を混合し、８μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加え中和した。中和した各上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。
【００６４】
電気泳動の結果はＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。なお、検量線は、ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒａｂｂｉｔを用いて作成した。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＧ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。
【００６５】
電気泳動の結果、プロテインＡ固定化磁性微粒子は、１５８．４μｇのＩｇＧを分離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡは、３６．８μｇのＩｇＧを分離した。また、プロテインＧ固定化磁性微粒子は、９７．４μｇのＩｇＧを分離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＧは、２７．３μｇのＩｇＧを分離した。
【００６６】
上記の結果から、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＧを用いた場合に対して、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子では、最大４．３倍、プロテインＧ固定化磁性微粒子では、３．６倍のＩｇＧを分離できることが分かった。
【００６７】
（希薄溶液からのＩｇＧの分離）
プロテインＡ固定化磁性微粒子を実施例３と同様に調製した。１ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子を５０μｇのＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏf  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を含む５０ｍｌの希薄溶液に添加し３０分間回転混合させた。磁気分離の後、上清を除去し１ｍｌの１００ｍＭ  ＰＢＳを加えて磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し、磁性微粒子を再分散させた。磁気分離の後、上清を除去し、磁性微粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した。
【００６８】
電気泳動の結果をＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。なお、検量線の作成はＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒａｂｂｉｔを用いて行った。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。
【００６９】
その結果、プロテインＡ固定化磁性微粒子により２５μｇのＩｇＧが分離できた。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡにより６μｇのＩｇＧが分離できた。この結果から、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子はＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡと比較して、希薄溶液から約４倍のＩｇＧを分離できることがわかった。
【００７０】
（磁性微粒子とＩｇＧの反応速度の比較）
プロテインＡ固定化磁性微粒子を実施例３と同様に調製した。１０ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子を２５μｇのＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社）を含む５００μｌのＰＢＳ溶液に添加し、０．５、１、５、１０、２０、３０分の反応の後に磁気分離を行い、上清を１５μｌ分取し、電気泳動を行った。
【００７１】
電気泳動の結果は、ＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。プロテインＧ固定化磁性微粒子についても同様に比較を行った。その結果を図３に示す。
【００７２】
図３の上図に示すように、プロテインＡ固定化磁性微粒子は、約０．５分でほぼ１００％のＩｇＧを分離した。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡは、３０分で８５％のＩｇＧを分離した。また、図３の下図に示すように、プロテインＧ固定化微粒子は、０．５分でほぼ１００％のＩｇＧを分離した。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＧは、３０分で２７％のＩｇＧを分離した。これらの結果から、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子およびプロテインＧ固定化磁性微粒子は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＧと比較して、ＩｇＧとの反応速度が速いことがわかった。
【００７３】
実施例５
＜ハイブリドーマ培養上清５０ｍｌからのプロテインＡ固定化磁性微粒子によるＩｇＧ２ａの分離＞
（処理１）
５０ｍｌのハイブリドーマ培養上清を３００ｍｌ容積の三角フラスコに分注し、１０質量％  Ｔｗｅｅｎ２０を２５０μｌ加えた（最終濃度：０．０５質量％）。そこへ、実施例３と同様に調製した４ｍｌのプロテインＡ固定化磁性微粒子(１０ｍｇ／ｍｌ)を加え、室温で１時間、泡立たぬ程度に振とう機（９０回／分、ＭＳ−１  Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ、ＩＫＡ社製）によりインキュベートした。
【００７４】
（処理２）
５０ｍｌ遠心チューブ２本に均等に移し、磁気分離を室温にて１０分間行った。上清を三角フラスコに戻し、再度４ｍｌのプロテインＡ固定化磁性微粒子を加え、１時間同様にインキュベートした。
【００７５】
（洗浄操作）
処理１で磁気分離した磁性微粒子に３ｍｌのＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＰＢＳ）を加え、十分に分散させた後、２ｍｌのマイクロチューブに２本に移した。空になった遠心チューブに再度１ｍｌのＰＢＳ−Ｔを加え、壁面を洗い、上記の２ｍｌマイクロチューブへ０．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔを加えた。磁気分離装置（マグナスタント−８、マグナビート株式会社製）にセットし、氷水中で５〜１０分間静置し磁気分離した。上清を除去し、再びＰＢＳ−Ｔを添加して磁性微粒子を分散させ、５〜１０分間磁気分離を行い、上清を除去した。洗浄操作を再び行い、上清を除去した。
【００７６】
（抽出操作）
各チューブに４５０μｌの１００ｍＭ  グリシン塩酸バッファー(ｐＨ２．７)加え、十分に混合させた。マクロチューブをフロートへ指し、氷水中に装着し、ソニケーター（Ｓ３０Ｈ  Ｅｌｍａｓｏｎｉｃ、Ｅｌｍａ社製）に浮かべ、超音波洗浄を行った。超音波洗浄は、１０秒間行った後、１０秒間休止し、これを洗浄操作のサイクルとし、これを５分間繰り返した。磁気分離操作の後、上清を分離し、新しいマイクロチューブに移し、８０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨを加え中和し、精製ＩｇＧ２ａを得た。抽出操作をさらにもう一度行った。再度（処理２）プロテインＡ固定化磁性微粒子を加え分離操作を行ったものは、同様に洗浄・抽出操作を行った。
【００７７】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図４に示す。
図４に示したように、上清の洗浄液には、ＩｇＧに由来するバンドはなく溶出液にのみＩｇＧに由来するバンドが見られた。この結果から、本発明による磁性微粒子を用いた操作により、ＩｇＧを特異的に精製することができることがわかった。また、回収率は９３％であり、所要時間は約４時間であった。
【００７８】
実施例６
＜ＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子によるＨｉｓ−プロテインＡの回収＞
（ＡＢ−ＮＴＡの固定化）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１０ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し上清を除いた。そこへ１０ｍｌの精製水を添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ１０ｍｌの１００ｍＭ  ホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えて磁性微粒子を再分散させた。１００ｍｇのＡＢ−ＮＴＡ  ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ（ＤＯＪＩＤＯ社製）を添加し、１２時間回転混合した。磁気分離の後、上清を除去し、１０ｍｌの精製水を加えて磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに３回行い、ＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子を得た。
【００７９】
（ニッケルとの複合体の形成）
１０ｍｌのＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子を磁気分離の後、上清を除去し、１０ｍｌの１Ｍ濃度硫酸ニッケル溶液に懸濁し、６時間撹拌した。その後、磁気分離を行い、上清を除去し、１０ｍｌの精製水を加えて磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに３回行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に再懸濁しＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を保存した。
【００８０】
（Ｈｉｓ−プロテインＡの回収）
Ｈｉｓ−ｔａｇをＮ−末端に有するＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ（フナコシ社製）１００μｇを含む１０μｌのＧｏａｔ血清に、１ｍｇのＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を添加した。５分間の反応の後、上清を除去した。そこへＴｗｅｅｎ２０を０.１質量％含むＰＢＳを１ｍｌ添加して、Ｎｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を再分散させた。同様にＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＰＢＳ１ｍｌで５回洗浄操作を行った。磁気分離の後、上清を除去し、５０μｌの５００ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液を添加して溶出操作を行った。１５μｌの上清を分取しＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図５に示す。
【００８１】
図５に示したように、溶出液にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰｒｏｔｅｉｎＡに由来するバンドがみられた。この結果から、本発明によるＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子により、Ｈｉｓタグを有するタンパク質を特異的に分離できることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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