(57)【要約】【課題】  メタボリックシンドローム治療又は予防薬を提供する。また、脂肪細胞分化抑制方法を提供する。【解決手段】  メタボリックシンドローム治療又は予防薬は、前駆脂肪細胞におけるグルタチオン（ＧＳＨ）代謝を活性化し脂肪細胞への分化を抑制する親電子性物質前駆体又は親電子性物質を有効成分として含有する。ここで親電子性物質前駆体又は親電子性物質は、第２相酵素のうち、Ｇｓｔａ２、Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、及びＡｂｃｃ１の発現をより強く誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化するものとすることができる。脂肪細胞分化抑制方法は、親電子性物質前駆体又は親電子性物質を前駆脂肪細胞に接触させて前駆脂肪細胞のＧＳＨ代謝を活性化させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆脂肪細胞におけるグルタチオン（ＧＳＨ）代謝を活性化し脂肪細胞への分化を抑制する親電子性物質前駆体又は親電子性物質を有効成分として含有することを特徴とするメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項２】
前記親電子性物質前駆体が、第２相酵素の発現を誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化することを特徴とする請求項１に記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項３】
前記親電子性物質前駆体が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  サブユニットα−２（Ｇｓｔａ２）、グルタミン酸システインリガーゼ  触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ）、ＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー４（Ａｂｃｃ４）、及びＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー１（Ａｂｃｃ１）を含む第２相酵素の発現を誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化することを特徴とする請求項１又は２に記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項４】
前記親電子性物質前駆体が、カルノシン酸（ＣＡ）、カルノソール（ＣＳ）及びこれらの薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項５】
前記親電子性物質前駆体が、内臓脂肪の蓄積を抑制するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項６】
前記親電子性物質前駆体が、脂肪肝を抑制するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項７】
前記親電子性物質前駆体が、皮下脂肪を低減するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項８】
前記親電子性物質前駆体が、血糖値を低減するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項９】
前記親電子性物質前駆体が、インスリン抵抗性を抑制するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項１０】
前記親電子性物質前駆体が、糖尿病を治療又は予防するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項１１】
前記親電子性物質前駆体が、肝臓組織の炎症反応を抑制するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項１２】
前記親電子性物質前駆体が、肝障害を抑制するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項１３】
前記親電子性物質前駆体が、血中の中性脂肪量を低減するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項１４】
前記親電子性物質前駆体が、血中のコレステロールを低減するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のメタボリックシンドローム治療又は予防薬。
【請求項１５】
親電子性物質前駆体又は親電子性物質を前駆脂肪細胞に接触させて前記前駆脂肪細胞のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝を活性化させることを特徴とする脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項１６】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  サブユニットα−２（Ｇｓｔａ２）、グルタミン酸システインリガーゼ  触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ）、ＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー４（Ａｂｃｃ４）、及びＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー１（Ａｂｃｃ１）を含む第２相酵素の発現を誘導することによって前記ＧＳＨ代謝を活性化することを特徴とする請求項１５に記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項１７】
前記Ｇｓｔａ２を低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白（Ｌｒｐ）の２倍以上の発現量に最も強く発現誘導し、前記Ｌｒｐに続き前記Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１をＮｉｄｏｇｅｎ  １（Ｎｉｄ１）の発現量以上に発現誘導させることを特徴とする請求項１６に記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【請求項１８】
前記親電子性物質前駆体が、カルノシン酸（ＣＡ）、カルノソール（ＣＳ）及びこれらの薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれかに記載の脂肪細胞分化抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメタボリックシンドローム治療又は予防薬、及び脂肪細胞分化抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞レベルでの肥満は、脂肪組織の線維芽細胞様前脂肪細胞から分化した脂肪細胞の数と大きさの増加を特徴とし［例えば非特許文献１、２参照］、これは、脂肪細胞の肥大と、前駆細胞からの新たな脂肪細胞の生成によって誘導される。分化は、２つの特徴的な段階で構成されると考えられている。すなわち、決定（線維芽細胞から脂肪細胞前躯体へ）とコミットメント（脂肪細胞前躯体から脂肪細胞へ）である［例えば非特許文献３参照］。マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞は非常に特徴がはっきりしており、前脂肪細胞から脂肪細胞へのコミットメントを研究する場合に信頼できるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルであることを、多くの報告書が示唆している［例えば非特許文献４参照］。
【０００３】
メタボリックシンドロームの治療又は予防に有用な物質となり得ることから、前駆脂肪細胞としてのマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞から脂肪細胞への分化を抑制する可能性がある物質を、多くの研究者が探し求めてきた［例えば、特許文献１、非特許文献５、６参照］。しかしながら、安全性が高く実質的に有効なメタボリックシンドローム治療又は予防薬は未だ見出されていないという現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−７５６４０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔ．Ｌ．  Ｖｉｓｓｃｈｅｒ，  Ｊ．Ｃ．  Ｓｅｉｄｅｌｌ，  Ｔｈｅ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ．，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ２２  （２００１）  ｐｐ．３５５−３７５．
【非特許文献２】Ｐ．Ｇ．  Ｋｏｐｅｌｍａｎ，  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４  （２０００）  ｐｐ．６３５−６４３．
【非特許文献３】Ｍ．Ｄ．  Ｌａｎｅ，  Ｑ．Ｑ．  Ｔａｎｇ，  Ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｏ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ．，  Ｂｉｒｔｈ．  Ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｒｅｓ．  Ａ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｅｒａｔ．  ７３  （２００５）  ｐｐ．４７６−４７７．
【非特許文献４】Ｒ．Ｍ．  Ｃｏｗｈｅｒｄ，  Ｒ．Ｅ．  Ｌｙｌｅ，  Ｒ．Ｅ．Ｊｒ．  Ｍｃｇｅｈｅｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  １０  （１９９９）  ｐｐ．２−１０．
【非特許文献５】Ｓ．  Ｒａｙａｌａｍ，  Ｍ．Ａ．  Ｄｅｌｌａ−Ｆｅｒａ，  Ｃ．Ｆ．  Ｂａｉｌｅ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９  （２００８）  ｐｐ．７１７−７２６．
【非特許文献６】Ｃ．Ｌ．  Ｈｓｕ，  Ｇ．Ｃ．  Ｙｅｎ，  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｍｏｌ．  Ｎｕｔｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．５２  （２００８）  ｐｐ．５３−６１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かかる現状に鑑みてなされた本発明の目的は、メタボリックシンドローム治療又は予防薬を提供すること、また、脂肪細胞分化抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明によるメタボリックシンドローム治療又は予防薬は、前駆脂肪細胞におけるグルタチオン（ＧＳＨ）代謝を活性化し脂肪細胞への分化を抑制する親電子性物質前駆体又は親電子性物質を有効成分として含有することを特徴とする。このような脂肪蓄積抑制剤において、親電子性物質前駆体又は親電子性物質が、第２相酵素の発現を誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化するものであることが好ましく、また、親電子性物質前駆体が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  サブユニットα−２（Ｇｓｔａ２）、グルタミン酸システインリガーゼ  触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ）、ＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー４（Ａｂｃｃ４）、及びＡＴＰ−結合カセット、サブファミリーＣメンバー１（Ａｂｃｃ１）を含む第２相酵素の発現を誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化するものであることが好適である。そして、親電子性物質前駆体として、カルノシン酸（ＣＡ）、カルノソール（ＣＳ）及びこれらの薬学的に許容される塩から１以上選択することができる。
【０００８】
また、上記目的を達成するため、本発明による脂肪細胞分化抑制方法は、親電子性物質前駆体又は親電子性物質を前駆脂肪細胞に接触させて前記前駆脂肪細胞のグルタチオン（ＧＳＨ）代謝を活性化させることを特徴とする。この脂肪細胞分化抑制方法において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  サブユニットα−２（Ｇｓｔａ２）、グルタミン酸システインリガーゼ  触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ）、ＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー４（Ａｂｃｃ４）、及びＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー１（Ａｂｃｃ１）を含む第２相酵素の発現を誘導することによって前記ＧＳＨ代謝を活性化することが好ましく、また、Ｇｓｔａ２を低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白（Ｌｒｐ）の２倍以上の発現量に最も強く発現誘導し、前記Ｌｒｐに続き前記Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１をＮｉｄｏｇｅｎ  １（Ｎｉｄ１）の発現量以上に発現誘導させることが好適である。そして、親電子性物質前駆体が、カルノシン酸（ＣＡ）、カルノソール（ＣＳ）及びこれらの薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のメタボリックシンドローム治療又は予防薬は、天然物から抽出、精製することによって得ることが出来、細胞毒性は十分に低く、安全性が高い上、内臓組織、特に肝臓組織においても脂肪の蓄積を抑制することができる。また、経口投与することができるという優れた効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の親電子性物質前駆体を含有するシソ科植物からの抽出物について高速液体クロマトグラフ法による分析結果の一例を示すクロマトグラフである。
【図２】本発明の親電子性物質前駆体による前駆脂肪細胞の分化抑制効果の一例を示す図面代用写真であり、（Ａ）は親電子性物質前駆体非添加の非分化培地で、（Ｂ）は親電子性物質前駆体非添加の分化培地で、（Ｃ）及び（Ｄ）は夫々実施例１及び２の親電子性物質前駆体を添加した分化培地で培養した細胞について染色後に顕微鏡観察した例である。
【図３】シソ科植物に含まれる本発明の親電子性物質前駆体（実施例１、２）及びその他の化合物について前駆脂肪細胞に対する分化抑制効果を比較する用量反応曲線の一例を示すグラフである。
【図４】前駆脂肪細胞を本発明の親電子性物質前駆体に暴露することにより、Ｎｒｆ２が核内に移行することを確認するウェスタンブロット法による泳動像の一例を示す図面代用写真である。
【図５】シソ科植物に含まれる本発明の親電子性物質前駆体及びその他の化合物について、ルシフェラーゼアッセイの結果の一例を示すグラフである。
【図６】シソ科植物に含まれる本発明の親電子性物質前駆体及びその他の化合物について、ＧＳＨ分析の結果の一例を示すグラフである。
【図７】本発明の親電子性物質前駆体による第２相酵素遺伝子の誘導試験の結果の一例を示すＲＴ−ＰＣＲの図面代用写真である。
【図８】本発明の親電子性物質前駆体による抗肥満作用の作用機序を提案するフロー図である。
【図９】レプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス）に本発明の親電子性物質前駆体を投与する場合の肝臓内中性脂肪蓄積に対する抑制効果の一例を示すグラフである。
【図１０】レプチン欠損マウスに本発明の親電子性物質前駆体を投与する場合の体重増加の抑制効果の一例を示すグラフである。
【図１１】レプチン欠損マウスに本発明の親電子性物質前駆体を添加した食餌を自由に与える場合に、食餌摂取量の一例を示すグラフである。
【図１２】レプチン欠損マウスに本発明の親電子性物質前駆体を投与する場合に血中ＡＬＴの低減効果の一例を示すグラフである。
【図１３】レプチン欠損マウスに本発明の親電子性物質前駆体を投与した場合における、耐糖能改善効果の一例を示すグラフである。
【図１４】レプチン欠損マウスに本発明の親電子性物質前駆体を投与する場合における白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び肝臓組織（Ｌｉｖｅｒ）の組織所見の一例を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態例について、詳細に説明する。この実施形態におけるメタボリックシンドローム治療又は予防薬は、前駆脂肪細胞におけるグルタチオン（ＧＳＨ）代謝を活性化する親電子性物質前駆体又は親電子性物質を有効成分として含有するものである。本実施形態の前駆脂肪細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養系或はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脂肪細胞に分化し得る細胞であれば当該細胞の由来となる動物種、組織・部位など特に限定されない。分化誘導の安定性、効率が高い点では、前駆線維芽細胞が好ましく、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞がより好ましい。親電子性物質前駆体は、当該物質自体は親電子性を有するものではなく、酸化されることによって親電子性となる物質である。そして、このような親電子性物質前駆体又は親電子性物質の内、前駆脂肪細胞のＧＳＨ代謝を活性化する物質を有効成分として含有する。親電子性物質前駆体又は親電子性物質は、ジハイドロキノン又はキノンを活性基とする化合物であることが好ましく、パラ型又はオルソ型のジハイドロキノン又はキノンを活性基とする化合物であることがより好ましい。そして、上記親電子性物質前駆体、親電子性物質の内では、パラ型又はオルソ型のジハイドロキノン又はキノンを活性基とする親電子性物質前駆体が好ましく、パラ型又はオルソ型のジハイドロキノンを活性基とする親電子性物質前駆体がより好ましい。上記親電子性物質前駆体の内、テルペン骨格をもつ、パラ型又はオルソ型のジハイドロキノンを活性基とする親電子性物質前駆体が好ましく、また、ジテルペン骨格をもつ、パラ型又はオルソ型のジハイドロキノンを活性基とする親電子性物質前駆体がより好ましく、パラ型又はオルソ型のジハイドロキノンを活性基とするカルノシン酸（ＣＡ）又はカルノソール（ＣＳ）又はこれらの誘導体がさらに好ましい。そして、さらに好ましいのは、オルソ型のジハイドロキノンを活性基とするＣＡ又ＣＡの誘導体である。また、ここで、親電子性物質前駆体が、転写因子Ｎｒｆ２を活性化するものであることが好ましく、親電子性物質前駆体が、タンパク質のチオール基へ共有結合するものであることが好適である。本実施形態の親電子性物質前駆体は、後述する実施例にて確認したように、前駆脂肪細胞におけるＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化を介してＧＳＨ代謝を活性化するものとすることができる。このＧＳＨ代謝活性化による前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制が、生体内における内臓脂肪低減や脂肪蓄積抑制、特に肝臓組織の脂肪蓄積抑制作用を介したメタボリックシンドローム治療又は予防薬としての機能の一部を担っている。
【００１２】
ここで、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路は、調節タンパク（遺伝子）であるＫｅａｐ１（ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ  ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）と、抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ：ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合する転写因子であるＮｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ２）で構成される［Ｋ．イトウ（Ｋ．Ｉｔｏｈ）ら、フリー  ラジカル  バイオロジー＆メディシン（Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３６巻、１０号（２００４）、ｐｐ．１２０８−１２１３．］、［Ｐ．タラレイ（Ｐ．Ｔａｌａｌａｙ）、バイオファクターズ（ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ）、第１２巻、（２０００）ｐｐ．５−１１．］。親電子性物質が、Ｋｅａｐ１タンパク質の必須なシステイン残基と反応して付加物を形成するとＫｅａｐ１のシステインチオール基がＳ−アルキル化され［Ｔ．サトウ（Ｔ．Ｓａｔｏｈ）ら、トレンズ  イン  ニューロサイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第３０巻、第１号（２００７）、ｐｐ．３８−４５．］、この系が乱されてＮｒｆ２が安定化するため、細胞質から細胞核へのＮｒｆ２の移行が可能となり、Ｎｒｆ２は細胞核でＡＲＥに結合し、第２相酵素の発現を刺激することが示唆されている。本実施形態の親電子性物質前駆体は、前駆脂肪細胞において上述の反応経路と同様の経路を介して第２相酵素の発現を誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化するものであることが好ましい。
【００１３】
また、この場合、本実施形態の親電子性物質前駆体は、第２相酵素（遺伝子）の内、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  サブユニットα−２（Ｇｓｔａ２：ＮＭ＿００８１８２）、グルタミン酸システインリガーゼ  触媒サブユニット（Ｇｃｌｃ：ＢＣ０１９３７４）、ＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー４（Ａｂｃｃ４：ＢＢ２９１８８５）、及びＡＴＰ−結合カセット、サブファミリーＣメンバー１（Ａｂｃｃ１：ＮＭ＿００８５７６）を含む第２相酵素（遺伝子）の発現をより強く誘導するものであることがより好ましい。そして、親電子性物質前駆体は、Ｇｓｔａ２を低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白（Ｌｒｐ：ＮＭ＿００８５１２）の２倍以上の発現量に最も強く発現誘導し、前記Ｌｒｐに続き前記Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１をＮｉｄｏｇｅｎ  １（Ｎｉｄ１：Ｘ１４４８０）の発現量以上に発現誘導させるものであることがさらに好ましい。ここで、Ｇｓｔａ２は、親電子性物質によってＧＳＨの抱合を触媒し、ＧｃｌｃはＧＳＨの合成に関連し、Ａｂｃｃ１とＡｂｃｃ４はＧＳＨ抱合された求電子化合物の能動輸送を行う。このような遺伝子の誘導によってＧＳＨ代謝が亢進され、酸化ストレスに対する耐性が上昇するものと考えられる。しかし、ＧＳＨ濃度の単なる上昇が重要な生理学的意味を持っているのではなく、後述の実施例によって確認されるように、ＧＳＨ代謝の持続的な亢進が重要であり、すなわち細胞レドックスのこのような全体的な調節が、脂肪細胞の分化に影響している可能性がある。なお、親電子性物質前駆体による第２相酵素の発現誘導は、例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現量をコントロールとしてマイクロアレイ解析により各誘導倍率（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆｏｌｄ）を算定することができる。
【００１４】
この実施形態における親電子性物質前駆体は、上述のとおり酸化されることにより親電子性物質となるものであれば特に限定されない。具体的には、例えば、カルノシン酸（ＣＡ）やカルノソール（ＣＳ）の他、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、４−メチルカテコール（４−Ｍｅｔｈｙｌ−ｃａｔｅｃｈｏｌ）、３−メチルカテコール（３−Ｍｅｔｈｙｌ−ｃａｔｅｃｈｏｌ）、２−メチルヒドロキノン（２−Ｍｅｔｈｙｌ−ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）等を挙げることができる。これらの内、細胞毒性は十分に低く、安全性が高い点ではＣＡ及びＣＳが好ましい。ＣＡ、ＣＳ及びこれらの薬学的に許容される塩から１以上選択することができる。薬剤として化学的安定性が高い場合がある点、また、脂肪細胞分化抑制能が高い場合がある点ではＣＡがより好ましく、ＣＡ、及びＣＡの薬学的に許容される塩から１以上選択することができる。なお、ＣＡ及びＣＳは公知の化学合成法や半合成法により得られたものであっても良いが、その合成工程は煩雑であり、また、合成中間体や異性体を含む副生成物などの分離除去に手間を要し、また、これら不純物が充分に除去できず含有される場合がある点では、ロスマリヌス  オフィキナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．；ローズマリー）、サルビア  オフィキナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．；セイジ）などのようなシソ科植物から抽出、精製したものが好ましい。
【００１５】
ＣＡ又はＣＳのシソ科植物からの抽出方法は、対象植物の栽培品種、利用部位、前処理条件の他、抽出溶媒、抽出条件などを含め特に限定されない。例えば、市販のローズマリー粉末やセイジ粉末などを用いて抽出後、精製したり、また、市販のローズマリー抽出物やセイジ抽出物を用い精製してＣＡ又はＣＳを得ることもできる。精製法についても特に限定されないが、比較的短時間の内に再現性良く精製できる場合がある点では、順相系又は逆相系の液体クロマトグラフ法を用いて単離することが好ましい。例えば、既報［コサカ．Ｋ（Ｋ．Ｋｏｓａｋａ）ら、バイオロジカル＆ファーマシューティカルブレチン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＆ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ、第２６巻（２００３）、ｐｐ．１６２０−１６２２．］に準じて効率良く抽出、高純度に精製することができる。すなわち、ここではローズマリーの乾燥葉を３乃至５倍（Ｖ／Ｗ）の無水エタノール（９９．５％以上：Ｖ／Ｖ）乃至８０％（Ｖ／Ｖ）エタノール・水混液に浸漬、３０℃乃至５０℃の温度条件下、１２時間乃至７２時間抽出し、抽出液を１／１０乃至１／３０容量になるまで濃縮して不溶物を濾過して除き、濾液に１乃至３倍（Ｖ／Ｖ）の水を加えて析出物を濾取し乾燥することで、使用乾燥葉に対して１乃至３重量％の収率でローズマリー抽出物を得ることができる。このローズマリー抽出物を用い順相系液体クロマトグラフ法によりＣＡ及びＣＳを単離し、夫々の単離物を非極性溶媒から再結晶することによって、使用乾燥葉に対して０．０１乃至０．０６重量％の収率でＣＡ、また、０．００４乃至０．０３重量％の収率でＣＳを得ることができる。順相系液体クロマトグラフ法は、シリカゲルを充填したカラム、溶離液は酢酸エチルとヘキサンの混液を用いることが好ましい。再結晶の非極性溶媒にはヘキサンが好適に使用できる。このようにして得られるＣＡ及びＣＳは、夫々液体クロマトグラフ法により単一ピークを示し、日本薬局方一般試験法、電気滴定法のような絶対定量により９５％以上、通常９８％以上の純度（乾燥品換算）を有し、医薬品原体としても適用可能なものとすることができる。
【００１６】
後述する実施例に示すとおり、レプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス、５週齢）を用い、上述のような親電子性物質前駆体としてＣＡを添加（０．０３％）した食餌を６週間経口投与し（治療群）、ＣＡ非含有食餌投与群（コントロール群）と共に、（総）食餌摂取量、体重、肝臓組織内中性脂肪量、随時血糖、血中総中性脂肪、血中総コレステロール、血中遊離脂肪酸、血中ＡＬＴ（アラニンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ：ＧＰＴ）、腹腔内糖負荷試験、白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び肝臓組織についての組織学的試験（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）などを行なった。この結果、総食餌摂取量及び血中遊離脂肪酸については、治療群とコントロール群との間に有意差が認められなかった。体重は、１回目の実験では６週間後において両群間に有意差が認められなかったが、２回目の実験ではコントロール群に対して治療群は３乃至５週間後までの経時的変化において、その増加が有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。肝臓組織内中性脂肪量は、コントロール群に対して治療群で有意（ｐ＜０．００１）に低下していた。随時血糖、血中総コレステロールは、コントロール群に対して治療群で有意（ｐ＜０．０５）に低下していた。血中ＡＬＴは、コントロール群に対して治療群で有意（ｐ＜０．０５）に低下し、肝障害の抑制効果が期待できる。腹腔内糖負荷試験では、糖負荷後２時間における血糖値がコントロール群に対して治療群で有意（ｐ＜０．０５）に低下し、耐糖能の改善が認められた。ＷＡＴの組織所見ではコントロール群に対して治療群で細胞の小型化が認められた。肝臓の組織所見では、肝細胞内脂肪量の顕著な低下が認められた。以上の結果から、本実施形態の親電子性物質前駆体は、メタボリックシンドロームの治療又は予防において、或はメタボリックシンドロームの治療又は予防の他、次に示す具体的機能を有し、各機能に対応する治療又は予防薬として有用であることが確認された。
【００１７】
すなわち、本実施形態の親電子性物質前駆体は、ヒトを含む哺乳類動物に投与することにより、（１）内臓脂肪の蓄積を抑制する。したがって、内臓脂肪蓄積抑制剤として有用である。（２）肝臓組織における脂肪の蓄積を抑制する。したがって、脂肪肝予防薬として有用である。（３）内臓脂肪を低減する。したがって、内臓脂肪分解薬として有用である。（４）血糖値を低減し、（５）インスリン抵抗性を抑制する。したがって、（６）糖尿病の治療又は予防薬、また、糖尿病による合併症の発症予防薬として有用である。また、（７）肝臓組織の炎症反応を抑制し、（８）肝臓細胞の傷害を抑制する。したがって、糖尿病の予防の他、肝障害抑制薬として有用である。さらに、（９）血中の中性脂肪量を低減し、（１０）血中のコレステロールを低減する。したがって、動脈硬化予防薬、心筋梗塞予防薬、脳梗塞予防薬としても有用となり得る。なお、このような親電子性物質前駆体の投与経路は、特に限定されるものではない。例えば、経口の他、静注、皮下注、経皮などの投与経路を挙げることができる。また、剤型についても特に限定されない。具体的には、例えば、日本薬局方製剤総則に準じて、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、注射剤、軟膏、坐剤とすることができる。さらには、健康用食品や化粧品、動物用餌として医薬品以外の用途に利用することもできる。
【００１８】
また、本実施形態による脂肪細胞分化抑制方法は、親電子性物質前駆体を前駆脂肪細胞に接触させて前駆脂肪細胞のＧＳＨ代謝を活性化させるものである。この脂肪細胞分化抑制方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下における細胞培養の他、ヒトを含む哺乳類動物に上述のような剤型、投与経路で投与し、生体内において前駆脂肪細胞に親電子性物質前駆体を接触させることも包含する。この脂肪細胞分化抑制方法において、Ｇｓｔａ２（ＮＭ＿００８１８２）、Ｇｃｌｃ（ＢＣ０１９３７４）、Ａｂｃｃ４（ＢＢ２９１８８５）、及びＡｂｃｃ１（ＮＭ＿００８５７６）を含む第２相酵素の発現を誘導することによってＧＳＨ代謝を活性化することが好ましい。Ｇｓｔａ２を低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白（Ｌｒｐ：ＮＭ＿００８５１２）の２倍以上の発現量で最も強く発現誘導し、Ｌｒｐに続きＧｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１をＮｉｄｏｇｅｎ  １（Ｎｉｄ１：Ｘ１４４８０）の発現量以上に発現誘導させることがより好ましい。ここで、親電子性物質前駆体は、ＣＡ、ＣＳ及びこれらの薬学的に許容される塩から１以上選ばれたものであることが好適である。上記各第２相酵素及びＬｒｐ、Ｎｉｄ１には、夫々の公的ＩＤ（ｐｕｂｌｉｃ  ＩＤ）を付記した。なお、上記脂肪細胞分化抑制方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下の細胞培養の場合、前駆脂肪細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を増殖の後、前駆脂肪細胞への分化が決定付けられた細胞であれば特に限定されない。このような前駆脂肪細胞の培養において、上記親電子性物質前駆体を加えた分化培地を用いて培養する工程を加えることにより、前駆脂肪細胞のＧＳＨ代謝を活性化させて、脂肪細胞への分化を抑制することができる。前駆脂肪細胞がマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、分化培地や培養条件は、例えば既報［イトウＡ．（Ａ．Ｉｔｏ）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８２巻（２００７）、ｐｐ．２５４４５−２５４５２．］に準じたものとすることができる。ここでは、５乃至１５％ＦＢＳ加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、０．１５乃至０．３５μＭデキサメタゾン、０．２５乃至０．７５ｍＭイソブチル−３−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５乃至１５μｇ／ｍｌ  インスリン、及び０．５乃至１．５μＭ  ピログリタゾンを添加した分化培地を用いた。培養条件は、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下３７℃で３日間維持してコンフルエントに達するような密度で複数穴を有する培養プレートに前駆脂肪細胞を播種し、２日間維持した後、親電子性物質前駆体としてＣＡ又はＣＳを１μＭ乃至１０μＭを分化培地に加えて培養を続け、３日目に、デキサメタゾンとＩＢＭＸを除き、インスリンを培地に残してさらに２日間維持する工程を含んで構成する。また、前駆脂肪細胞は、以上の細胞培養工程の前後に増殖ＤＭＥＭ培地を用い５％ＣＯ２の加湿雰囲気下３７℃で維持することが好ましい。増殖ＤＭＥＭ培地は、例えば、１５乃至３５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭに、５乃至１５％仔ウシ血清、８０乃至１２０Ｕ／ｍＬペニシリン、８０乃至１２０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１乃至３ｍＭのＬ−グル��ミンを添加したものを用いることができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明によるメタボリックシンドローム治療又は予防薬、及び脂肪細胞分化抑制方法ついて、実施例、比較例を示して具体的に説明するが、これによって本発明を限定するものではない。
【００２０】
［実験１：脂肪細胞分化抑制の検討（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ）］  
〔１−１．化学物質〕
ＣＡ（実施例１）及びＣＳ（実施例２）は、既報［コサカ．Ｋ（Ｋ．Ｋｏｓａｋａ）ら、バイオロジカル＆ファーマシューティカルブレチン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＆ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ、第２６巻（２００３）、ｐｐ．１６２０−１６２２．］に準じてローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．）の葉から抽出、精製した。すなわち、ここではローズマリーの乾燥葉（５ｋｇ）を２Ｌの無水エタノール（９９．５％以上：Ｖ／Ｖ）に浸漬、４０℃の温度条件下、２４時間抽出し、抽出液を１Ｌになるまで濃縮して不溶物を濾過して除き、濾液に２Ｌの水を加えて析出物を濾取し乾燥することで、使用乾燥葉に対して２．１重量％の収率でローズマリー抽出物（１０５ｇ）を得た。このローズマリー抽出物を用い順相系液体クロマトグラフ法によりＣＡ及びＣＳを単離し、夫々の単離物をヘキサンから再結晶することによって、使用乾燥葉に対して０．０３重量％の収率でＣＡ（１．５ｇ）、また、０．００４乃至０．０３重量％の収率でＣＳ（０．８ｇ）を得た。順相系液体クロマトグラフ法は、シリカゲルを充填したカラム、溶離液は酢酸エチル・ヘキサン混液（４：１）を用いた。得られたＣＡ及びＣＳは１３Ｃ及び１Ｈ−ＮＭＲにより構造を確認した。夫々の純度は、液体クロマトグラフ法で単一ピークを示し、絶対定量の結果９８％以上であった。
【００２１】
ローズマリーに含まれるＣＡ、ＣＳ以外の化合物（公知生理活性物質）は、シグマ−アルドリッチ  ケミカル社（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。
すなわち、ここでは、主なローズマリー含有生理活性物として、（比較例１）フラボノイドとしてのルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、（比較例２）ゲンクワニン（ｇｅｎｋｗａｎｉｎ）、（比較例３）親水性化合物としてのロズマリン酸（ｒｏｓｅｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、（比較例４）カフェ酸（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及び（比較例５）ベルベノン（ｖｅｒｂｅｎｏｎｅ）とした。
【００２２】
イソブチル−３−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、インスリン、ピログリタゾンおよびオイルレッドＯは、シグマ−アルドリッチ  ケミカル社から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、仔ウシ血清、およびペニシリン−ストレプトマイシン溶液は、ライフテクノロジーズ社（旧インビトロジェン社）（米国カリフォルニア州カールズバッド）から購入した。
【００２３】
〔１−２．ローズマリー抽出物のＨＰＬＣ分析〕
ローズマリーの乾燥葉粉末を５０（ｖ／ｖ）％エタノール液（エタノール・水混液）に浸漬し、４０℃で１時間攪拌してインキュベートした。抽出物中の物質を、次の条件下でＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ法）により分析した。
カラム＝ｍｉｃｒｏＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（米国マサチューセッツ州ミルフォード、ウォーターズコーポレーション）；ＨＰＬＣシステム＝ＬＣ１０Ａｖｐ（日本国京都、島津製作所）；検出器＝フォトダイオードアレイ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ；使用溶媒＝２％酢酸溶液（Ａ液）とアセトニトリル溶液（Ｂ液）の割合を直線的に変えてグラジエント溶出、１０％Ｂ（０分）〜７０％Ｂ（６０分）；流量＝１ｍｌ／分。
【００２４】
上記ＨＰＬＣ分析の結果は、クロマトグラムを図１に示すとおりであり、比較例４、比較例３、比較例１、比較例５、比較例２、実施例２、実施例１の化合物順に溶出し、夫々分離検出された。保持時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）が長いほど化合物の疎水性が高くなっている。この分析条件によっても、各化合物の単離精製、純度検定が可能である。
【００２５】
〔１−３．細胞培養〕
前駆脂肪細胞としてマウス３Ｔ３−Ｌ１を用い既報［イトウＡ．（Ａ．Ｉｔｏ）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８２巻（２００７）、ｐｐ．２５４４５−２５４５２．］に準じて細胞培養（脂肪細胞分化または分化抑制）を行った。すなわち、ここでは、マウス３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞を、２５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭに入れ、１０％仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを添加（増殖ＤＭＥＭ培地）して、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下３７℃で維持した。細胞は、３日間でコンフルエントに達するような密度で６穴プレートに播種した。この時点（０日目）で細胞を分化培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、０．２５μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、１０μｇ／ｍＬ  インスリンおよび１μＭ  ピログリタゾン）に移し、２日間維持した。その後細胞を、様々な濃度のＣＡ、ＣＳ、その他の化合物（比較例１〜５）を添加した分化培地によって処理した。３日目に、デキサメタゾンとＩＢＭＸを取り除き、インスリンを細胞培地に残してさらに２日間維持した。その後、細胞を元の増殖ＤＭＥＭ培地で維持し、培地は２日ごとに交換した。なお、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭは、ＧＩＢＣＯ社、製品番号１１９６５を用いた。
【００２６】
〔１−４−１．培養細胞の染色〕
実験〔１−３〕の培養条件により、ＣＡ又はＣＳを含有する分化培地、または含有しない分化培地によって３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化させた。ＣＡ又はＣＳの分化培地の添加濃度は夫々３μＭとし、０日目に添加した。脂質の蓄積と細胞核を視覚化するため、オイルレッドＯ（赤色）と４′，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：青色）で細胞を染色した。すなわち、ここでは、培養細胞を氷冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、４％ホルマリンで固定して室温で１時間静置した後、０．２％オイルレッドＯイソプロパノール液で１０分間染色した。その後、ＰＢＳ（−）に５μＭ溶解したＤＡＰＩで染色し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ＰＢＳ（−）は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋（−）リン酸塩緩衝生理食塩水である。画像は、オリンパス社（日本国東京）製顕微鏡により得た。
【００２７】
上記細胞染色の結果は、得られた画像（顕微鏡写真）を図２（Ａ〜Ｄ）に示したとおりである。（Ａ）はＣＡ、ＣＳ非添加の非分化培地で、（Ｂ）はＣＡ、ＣＳ非添加の分化培地で、（Ｃ）及び（Ｄ）は夫々ＣＡ及びＣＳを添加した分化培地で培養した細胞についての染色結果である。（Ｃ）のスケールバーは２５μｍを示している。（Ａ）では脂質の蓄積が一切認められなかった。対照的に、分化培地でインキュベートした細胞は大量の脂質を生成し（Ｂ）、細胞全体の２７．５±３．５％が、蓄積した脂質小滴を有していた。しかし、ＣＡとＣＳのいずれも、脂質を蓄積する細胞の数を著しく減少させた（ＣとＤ）。
【００２８】
〔１−４−２．脂肪細胞抑制効果の比較〕
実験〔１−３〕の細胞培養条件により、ローズマリーに含有される、ＣＡ（実施例１）、ＣＳ（実施例２）、及び比較例１〜５の各化合物の様々な濃度（０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ）の存在下で３Ｔ３−Ｌ１細胞をインキュベートした。得られた各培養細胞につき、実験〔１−４−１〕に準じて染色し、化合物による抑制効果を定量化するため、脂質を蓄積する細胞（２７．５％）の比率を１００％に設定し、各化合物の効果をこの数値と比較した。
【００２９】
上記結果から求めたローズマリー由来化合物の用量反応曲線を図３に示したとおり、ＣＡおよびＣＳは、その細胞質に脂質を蓄積する細胞の数を強力に、かつ用量依存的に減少させた。比較例１〜５の各化合物についてはこれらが脂肪細胞の分化を抑制しないことが確認されたことは、この抑制作用が、ローズマリー由来の化合物の中でもＣＡおよびＣＳなどのカテコール系ジテルペンに極めて特異なものであることを示唆するものである。
【００３０】
〔１−５．ＣＡ又はＣＳによるＮｒｆ２の核移行〕
実験〔１−３〕の培養条件に準じて、ＣＡ（実施例１）又はＣＳ（実施例２）を様々な濃度（０、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ）で添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（２５ｍＭグルコース添加）培地で３Ｔ３−Ｌ１細胞を１時間培養した。細胞分画法によって核内のＮｒｆ２タンパク質の濃度を調べた後、各培養細胞につき核抽出キット（米国イリノイ州ロックフォード、ＰＩＥＲＣＥ社製  ＮＥ−ＰＥＲ）によって核抽出物を調製した。夫々得られた核抽出物は、１０００倍に希釈したラット抗Ｎｒｆ２モノクローナル抗体（弘前大学  Ｋ．イトウ（伊藤健）より提供）、および１０００倍に希釈したヤギ抗ラミンＢポリクローナルＩｇＧ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ、サンタクルーズバイオテクノロジー社製ｓｃ６２１６）を用い、ウェスタンブロット法によって解析した。コントロールとしてのラミンＢは核抗原である。なお、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭは、ＧＩＢＣＯ社、製品番号１１９６５を用いた。
【００３１】
この実験結果は、ＣＡについてのウェスタンブロット法による泳動イムノブロット像を図４に示したとおり、前駆脂肪細胞がＣＡに曝露すると、Ｎｒｆ２タンパク質の核内濃度が上昇するとの仮説が事実であることが確認された。この結果は、Ｎｒｆ２が実際にＣＡによって活性化されることを示唆するものである。
【００３２】
〔１−６．ＣＡ又はＣＳによるＡＲＥ活性化とＧＳＨ代謝〕
Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路に応答する転写エレメントであるＡＲＥの活性化を、ＡＲＥ（ＧＳＴＹａ）−ルシフェラーゼでトランスフェクションした３Ｔ３−Ｌ１細胞を用い、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを行うことによって調べた。また、ＧＳＨ分析を行なった。なお、ＡＲＥ分析、ＧＳＨ分析は、［サトウ  Ｔ（Ｔ．  Ｓａｔｏｈ）ら、ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３７１巻（２００４）、ｐｐ．１−５．］、［サトウ  Ｔ（Ｔ．  Ｓａｔｏｈ）ら、バイオケミカル＆バイオフィジカル  リサーチ  コミニュケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）第３７９巻（２００９）、ｐｐ．５３７−５４１．］に説明したように実施した。すなわち、ここでは、ＣＡ（実施例１）、ＣＳ（実施例２）及び比較例１〜５の各化合物を添加する５時間前に、ＡＲＥ−ルシフェラーゼ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）によってトランスフェクトした。トランスフェクトは、３Ｔ３−Ｌ１細胞を４ｘ１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２  の細胞密度で４８穴プレートに播種、１０００ｎｇの（ＡＲＥ（ＧＳＴＹａ）−ルシフェラーゼ）レポーター構築物及びＴｒａｎｓｆａｓｔ（商品名：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含有するＰＢＳ（−）中にて５時間インキュベーションすることにより行った。トランスフェクション効率は、ｐＳＶ−β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性で基準化した。レポーター遺伝子アッセイ用に、上記レポーター構築物と２００ｎｇのｐＳＶ−β−ｇａｌを１時間インキュベーションした。得られた細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＣＡ、ＣＳ及び比較例１〜５の化合物を夫々添加（３μＭ）した培養液中にて２４時間インキュベーション後に細胞溶解産物を得た。９６穴白色プレート（ファルコン社製）に細胞溶解産物を１０μｌ／穴、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）７５μｌ／穴を加え（トータル８５μｌ／穴）、ルミノメーター（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、製品番号Ｅ１９１０、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で発光測定した。β−ガラクトシダーゼ活性の測定は、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。
【００３３】
ＧＳＨ分析の操作条件は次に示すとおりとした。すなわち、実験〔１−３〕の培養条件に準じ、６穴プレートに３Ｔ３−Ｌ１細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２  で播種して、４時間インキュベートした後、ＣＡ、ＣＳ及び比較例１〜５の化合物を各化合物を最終濃度（３μＭ）になるよう必要量添加した。さらに２４時間インキュベートした後、培地を除去した。氷冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後トリプシンで細胞を剥がし採取した。採取した細胞数を数え、４℃、３００×ｇで１０分間遠心後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞数２〜５×１０６につき冷却し、５％メタ燐酸（ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）５００μｌを添加してマイクロ遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）内で懸濁、細胞溶解させた。これを４℃、１５０００×ｇで５分間遠心し、上清を採取した。上清にトリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：約２５０μＬ）を加えて中和し細胞溶解液サンプルを得た。この細胞溶解液サンプルにつき、コスモバイオ社製グルタチオンアッセイキット（製品番号：７５１１−１００−Ｋ）を用いて総グルタチオン（還元型ＧＳＨ及び酸化型ＧＳＳＧ）濃度を測定した。５０μＬの細胞溶解液サンプルに１５０μＬの反応混合液を加え、この液に１ｕｎｉｔ／ｍＬのＧＳＨ還元酵素を添加することによって反応を開始させた。反応混合液は、１４３ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、６．３ｍＭのＮａ４ＥＤＴＡ、６ｍＭの５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）［５，５′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）］、及び０．２５ｍｇ／ｍＬのＮＡＤＰＨが混合含有されたものとした。反応開始後、４０５ｎｍにおける発色をマイクロプレートリーダにより１分ごとに測定するカイネティックモード（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅ）でモニターした。標準ＧＳＨ、又はＧＳＳＧ５０μＬに１×Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒを９６穴プレートに入れ、段階希釈しグルタチオンスタンダードカーブを作成した。サンプルは１×Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１０倍、２０倍、４０倍に希釈し、９６穴プレートへ５０μｌずつ分注した。サンプル吸光度とスタンダードカーブから、ＧＳＨ量を求めた。なお、遠心分離器は日立工機社製、ＣＴ１５ＲＥ型、マイクロプレートリーダーはＤＳファーマバイオメディカル社製、ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＨＴ  ＢＴ−ＳＡＩＦＲＤＮ型を用いた。また、各細胞溶解液サンプルの蛋白含量はＢＳＡを標準品として、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を使用して測定を行なった。
【００３４】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図５に示したとおり、ＣＡ又はＣＳはＡＲＥに基づく転写活性を用量依存的に数倍（ａｂｏｕｔ  ｆｏｌｄ）刺激したが、比較例１〜５の各化合物の作用は皆無であった。この結果は、ＡＲＥの活性がＣＡおよびＣＳによる分化抑制と緊密に相関していることを示唆するものである。また、ＧＳＨ分析の結果を図６に示したとおり、対照細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）のＧＳＨ含有量は、タンパク質１ｍｇ当たり２６．９ｎｍｏｌであった。ＣＡとＣＳのいずれも、夫々２．５６倍及び２．４５倍を限度としてＧＳＨ濃度を上昇させたが、比較例１〜５の各化合物による上昇はみとめられなかった。この結果は、ＣＡおよびＣＳがＡＲＥを活性化することによってＧＳＨ代謝を刺激することを示唆するものである。なお、以上の結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）として示している。データはＳＡＳソフトウェアを用いて解析した。分散分析はｔ検定法を用いた。＊及び＊＊は、コントロールとの有意差（夫々、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示している。
【００３５】
〔１−７．オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析〕
ＧＳＨ代謝が分化抑制に何らかの役割を果たしているのであれば、ＣＡによって第２相酵素が有意に誘導されるはずであるとの推測のもと、この可能性を調べるため、３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いてＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。すなわち、ここでは、溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）又はＣＡ（１０μＭ）で処理（２４時間インキュベート）した３Ｔ３−Ｌ１細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（商品名：米国カリフォルニア州カールズバッド、インビトロジェン社製）により総ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩシステム（商品名：インビトロジェン社製）を用い、Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）プライマーによりｃＤＮＡを合成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりビオチン標識ｃＲＮＡを調製し、１００ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウムと３０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸マグネシウムを含有する４０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）により９４℃で３５分インキュベートして断片化した。断片化したｃＲＮＡは、３９０００を超える転写を含むＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０  ２．０アレイ（商品名：米国カリフォルニア州サンタクララ、アフィメトリクス社製）に４５℃で１６時間対合させて雑種形成（ハイブリダイゼーション）を行った。プローブアレイを洗浄し、Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（商品名：米国カリフォルニア州サンタクララ、アフィメトリクス社製）を用いて染色した後、ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー３００ｏ（商品名：米国カリフォルニア州サンタクララ、アフィメトリクス社製）で走査した。解析には、アフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐオペレーティングソフトウェア（ＧＣＯＳ  ｖ１．４：商品名）を用いた。データの信頼性を高めるため、検出したｐ値が対照（溶媒で処理しなかった細胞）と比較して＜０．００１であった遺伝子を一覧にした。ＣＡ（１０μＭ）によって誘導された上位１０位の遺伝子を表１に示す。その結果、ＣＡによって発現が上昇した遺伝子の大半（ＣＡ誘導遺伝子上位５位のうち４つ）が、第２相酵素（Ｇｓｔａ２、Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１）をコードしており、そのすべてがＧＳＨ代謝に関連していることが分かった（［イトウ  Ｋ（Ｋ．  Ｉｔｏｈ）ら、フリーラジカルバイオロジー＆メディシン（Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３６巻（２００４）、ｐｐ．１２０８−１２１３．］、［タラレイ  Ｐ（Ｐ．  Ｔａｌａｌａｙ）ら、バイオファクターズ（Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ）第１２巻（２０００）、ｐｐ．５−１１．］参照）。なお、表１には、遺伝子名、公的ＩＤ（Ｐｕｂｌｉｃ  ＩＤ）、誘導倍率（Ｆｏｌｄ；実験群／対照群）、および対照細胞のｐ値を示している。太字は、第２相酵素遺伝子を示しているが、そのすべてがＧＳＨ代謝に関連していると考えられる。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
〔１−８．ＣＡ又はＣＳによる第２相酵素遺伝子の誘導（ＲＴ−ＰＣＲ）〕
第２相酵素をコード化する遺伝子の５′上流プロモーター領域に存在する特異的転写エレメントである抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）は、このような酵素の誘導において中心的役割を果たしている（［イトウ  Ｋ（Ｋ．  Ｉｔｏｈ）ら、フリーラジカルバイオロジー＆メディシン（Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３６巻（２００４）、ｐｐ．１２０８−１２１３．］、［タラレイ  Ｐ（Ｐ．  Ｔａｌａｌａｙ）ら、バイオファクターズ（Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ）第１２巻（２０００）、ｐｐ．５−１１．］参照）。第２相酵素（Ｇｓｔａ２、Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１）遺伝子の誘導を検出するため、ＣＡ（実施例１）又はＣＳ（実施例２）によって前処理を施した３Ｔ３−Ｌ１細胞からの総ＲＮＡを用い、既報［サトウ  Ｔ（Ｔ．  Ｓａｔｏｈ）ら、ニューロサイエンスレターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第４３４巻（２００８）、ｐｐ．２６０−２６５．］に準じて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。すなわち、ここでは、１０μＭのＣＡ又はＣＳで０、８又は２４時間処理した３Ｔ３−Ｌ１細胞から、実験〔１−７〕の場合と同様に総ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡテンプレートとして以下のプライマーを用い、夫々以下に示したサイクルによりＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲにおけるサーマルサイクラーの操作条件は、熱変性９４℃（２分）の後、熱変性９４℃（１５秒）→アニール５５℃（３０秒）→ポリメラーゼ反応７２℃（１分）を１サイクルとし、以降に述べるそれぞれのプライマーに対するサイクル数で増幅を繰返した後、４℃に冷却した。なお、ＲＴ−ＰＣＲの反応組成は、ｃＤＮＡ  ２μＬ（ＲＮＡ量は合成されたｃＤＮＡ２μＬに対し１７０ｎｇ使用）、Ｆ−ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）１μＬ（１０ｐｍｏｌ）、Ｒ−ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）１μｌ（１０ｐｍｏｌ）、ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ  ２５μＬ、及び滅菌蒸留水２１μＬで総計５０μＬとした。
【００３８】
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ：１４９ｂｐ）については、１４、１６、１８、２０、２２のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡ−３′（ｒＲＮＡ−Ｆ：配列番号１）、及び、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３′（ｒＲＮＡ−Ｒ：配列番号２）を用いた。
【００３９】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ  サブユニットα−２（ｇｓｔａ２：３９７ｂｐ）については、３０、３２、３４、３６、３８のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣ−３′（ｇｓｔａ２−Ｆ：配列番号３）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣ−３′（ｇｓｔａ２−Ｒ：配列番号４）を用いた。
【００４０】
グルタミン酸システインリガーゼ  触媒サブユニット（ｇｃｌｃ：５６１ｂｐ）については、２２、２４、２６、２８、３０のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＧＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣ−３′（ｇｃｌｃ−Ｆ：配列番号５）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＧＴＡＧＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧ−３′（ｇｃｌｃ−Ｒ：配列番号６）を用いた。
【００４１】
ＡＴＰ−結合カセット  サブファミリーＣメンバー４（ａｂｃｃ４：４１２ｂｐ）については、３０、３２、３４、３６、３８のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＧＴＴＡＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＣＴＣ−３′（ａｂｃｃ４−Ｆ：配列番号７）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＣＣＣ−３′（ａｂｃｃ４−Ｒ：配列番号８）を用いた。
【００４２】
ＡＴＰ−結合カセット、サブファミリーＣメンバー１（ａｂｃｃ１：４５７ｂｐ）については、２６、２８、３０、３２、３４のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧ−３′（ａｂｃｃ１−Ｆ：配列番号９）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＣＣＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧ−３′（ａｂｃｃ１−Ｒ：配列番号１０）を用いた。
【００４３】
ヘムオキシゲナーゼ−１（ｈｏ−１：６１７ｂｐ）については、２２、２４、２６、２８、３０のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴ−３′（ｈｏ−１−Ｆ：配列番号１１）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＡＴＣＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＡ−３′（ｈｏ−１−Ｒ：配列番号１２）を用いた。
【００４４】
ＮＡＤＰ（Ｈ）キノン酸化還元酵素１（ｎｑｏ１：９２３ｂｐ）については、２２、２４、２６、２８、３０のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＡＴＣＴＣＴＡ−３′（ｎｑｏ１−Ｆ：配列番号１３）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＣＡＡＣＧＡＡＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＧＧ−３′（ｎｑｏ１−Ｒ：配列番号１４）を用いた。
【００４５】
グルタミン酸システインリガーゼ、調節サブユニット（ｇｃｌｍ：５９８ｂｐ）については、２２、２４、２６、２８、３０のＰＣＲサイクルとし、プライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ：５′−ＡＧＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＴ−３′（ｇｃｌｍ−Ｆ：配列番号１５）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５′−ＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴ−３′（ｇｃｌｍ−Ｒ：配列番号１６）を用いた。
【００４６】
上記ＲＴ−ＰＣＲ法により得られたＣＡによる第２相酵素遺伝子の誘導試験の結果を、図７に示した。内部陽性対照としてｒＲＮＡ遺伝子を用いたが、その発現レベルはＣＡによって変化することはなかった。インキュベーションの８〜２４時間後にはＣＡによってすべての遺伝子が増加したが、これらの遺伝子間の誘導パターンにはわずかな違いが認められた。表１に示した以外の、その他の確実な第２相酵素遺伝子（ｈｏ−１、ｎｑｏ１、ｇｃｌｍ）も、ＣＡによって誘導された。ＣＳによる結果は、ＣＡと同様であった（データは示さず）。
【００４７】
〔実験１：脂肪細胞分化の抑制因子としてのＣＡの機能について〕
ＣＡは、おそらく、膵リパーゼを阻害することで消化管による脂質吸収を減少させることにより、オリーブオイル負荷マウスにおける血中トリグリセリドの上昇を抑制すると報告されている［ニノミヤ  Ｋ（Ｋ．  Ｎｉｎｏｍｉｙａ）ら、バイオオーガニック＆メディシナルケミストリーレターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第１４巻（２００４）、ｐｐ．１９４３−１９４６．］。同研究は、ＣＡの投与によって体重がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて減少することを明らかにしている。したがって、少なくともＣＡは、消化管での脂質摂取の阻害を通じて抗肥満作用を有している可能性がある。しかし最近の報告は、体脂肪が蓄積する上での重要な事象の一つは、脂肪組織における前脂肪細胞の脂肪細胞への分化であると指摘している（非特許文献３、４、５参照）。したがって、このような分化の抑制がｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗肥満作用の一因である可能性があると推測した。実験〔１−４−２〕の結果は、ＣＡが極めて低い濃度（ＩＣ５０＝０．８６μＭ）で脂肪細胞の分化を抑制することを示した。つまりＣＡは、２つの経路である脂質吸収の阻害、および脂肪細胞分化の抑制によって体脂肪を減少させることを見いだした。
【００４８】
〔実験１：ＧＳＨの機序について〕
〔実験１〕から、３点の重要な知見が得られた。
１）ＣＡおよびＣＳは脂肪細胞の分化を抑制した。
２）ＣＡは第２相酵素を誘導し、その酵素のすべてがＧＳＨ代謝に関連していた。
３）ＣＡおよびＣＳは細胞内ＧＳＨ量を増加させた。
これらの知見を考慮に入れ、図８に示すように、ＣＡまたはＣＳによる抗肥満作用の機序を見いだした。その最も重要な論拠は、ＧＳＨ代謝の亢進が脂肪細胞の分化の抑制につながっている可能性があるという点である。実験〔１−７〕の結果、Ｇｓｔａ２、Ｇｃｌｃ、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｃ１をコード化している４つの第２相酵素遺伝子が、ＣＡ誘導遺伝子の上位５位に入ることを見出した。Ｇｓｔａ２は、親電子性物質によってＧＳＨの抱合を触媒し、ＧｃｌｃはＧＳＨの合成に関連し、Ａｂｃｃ１とＡｂｃｃ４はＧＳＨ抱合された求電子化合物の能動輸送を行う。このような遺伝子の誘導によってＧＳＨ代謝が亢進され、酸化ストレスに対する耐性が上昇するはずである。しかし、ＧＳＨ濃度の単なる上昇が重要な生理学的意味を持っているのではなく、ＧＳＨ代謝の持続的な亢進が重要ではないかと考えられる。すなわち細胞レドックスのこのような全体的な調節が、脂肪細胞の分化に影響している可能性がある。では、ＧＳＨ代謝の持続的な亢進によって、なぜ脂肪細胞の数が減少するのか、考えられる一つの答えは、活性酸素種が分化を促進する作用があり、ＧＳＨ代謝の亢進が、そのような分化の促進を抑制している可能性がある、というものである。
【００４９】
また、転写因子Ｎｒｆ２は、第２相酵素の発現を調節するのみならず、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の濃度も調節している可能性があり［シン  Ｓ（Ｓ．  Ｓｈｉｎ）ら、モルキュラー＆セルラーバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２７巻（２００７）、ｐｐ．７１８８−７１９７．］、これが、脂肪細胞分化に対するＣＡ誘導抑制の一因になっていると考えられる。ＡｈＲはダイオキシン型リガンドに対する受容体であり、ダイオキシンは３Ｔ３−Ｌ１細胞の異物応答配列（ＸＲＥ）を活性化することによって脂肪細胞分化を抑制すると報告されている［フィリップス  Ｐ．（Ｍ．  Ｐｈｉｌｉｐｓ）ら、ジャーナル  オブ  セル  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１０８巻（１９９５）、ｐｐ．３９５−４０２．］。しかし、どの経路が主としてＣＡによる抑制の一因となっているのかについては、依然として不明である。したがって、３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪細胞分化に対するＣＡ誘導抑制について、考えられる２つの機序を考慮した。すなわち一方は、図８に示すように、ＧＳＨが仲介する経路であり、他方はＡｈＲが仲介する経路で、Ｎｒｆ２→ＡＲＥ→ＸＲＥ活性化→脂肪細胞分化の抑制、というものである。
【００５０】
［実験２：肥満自然発症マウスに対するＣＡ投与による作用について］  
〔２−１．肝臓内中性脂肪蓄積に対するＣＡの抑制効果〕
〔２−１−１．肥満自然発症マウスの入手及び飼育条件〕
肥満を自然発症するレプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス；ジャクソンラボラトリー（ＴＪＬ）由来）、雄、４週齢を日本チャールスリバー社より購入した。ｏｂ／ｏｂマウスは室温、湿度がコントロールされ、１２時間毎の明暗サイクルに照明管理した環境の室内にて飼育を行なった。５週齢６匹を３匹ずつ無作為に２群（コントロール群および治療群）に分け、コントロール群にはＣＡ非含有食餌、治療群にはＣＡ０．０３％含有食餌を夫々各６週間投与した。食餌摂取量、体重を経時的に測定した。
〔２−１−２．ＣＡの精製および食餌の作成方法〕
ローズマリー末（高砂薬業株式会社製）２ｋｇにエタノールを１０Ｌ加え、４０℃で攪拌しながら３時間抽出操作を行った。濾過し不溶物を除去後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラム（溶出液：ヘキサン・酢酸エチル混液（９：１））にかけ、１１ｇのＣＡ（実施例１化合物：親電子性物質前駆体）を得た。得られたＣＡをマウス用餌ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社製）に混ぜＣＡ０．０３％含有餌を作製した。
〔２−１−３．肝組織内の中性脂肪の測定〕
６週後にマウスを犠死させ、肝の一部を採取し、重量を測定後に直ちに−８０℃に凍結し中性脂肪測定に供した。凍結した肝臓を１００ｍｇ量りとり、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍｌ加えた。これをポリトロンミキサーにかけて粉砕した後、さらに凍結融解操作（−８０℃で３０分間放置することによって凍結後、３７℃で融解）を２回行うことによって肝組織破壊物を得た。得られた肝組織破壊物をエッペンドルフ社製チューブに入れ、１００００ｒｐｍ、２５℃、３分間遠心操作を行うことによって不溶物を除去した。不溶物除去後の上清（５μＬ）中の中性脂肪量を測定キット（トリグリセライドＧ−テストワコー（商品名）：和光純薬工業株式会社製）にて測定した。結果は、コントロール群の中性脂肪量を１００％として算出した。
【００５１】
実験〔２−１〕の結果は以下のとおりであった。
総食餌摂取量：治療群２０９±７．７ｇ（平均±標準偏差）、コントロール群２２０±１４．３ｇで、両群間に有意の差は認められなかった。
体重：犠死時の体重は、治療群５５．２±１．４ｇ（平均±標準偏差）、コントロール群５８．１±３．２ｇで、両群間に有意差は認められなかった。
肝組織内中性脂肪（ＴＧ：Ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）量：コントロール群１００．０±５．２％（平均±標準誤差）に対して治療群６０．３±６．８％で、治療群で有意（ｐ＜０．００１）に低下していた（表２、図９）。なお、統計解析は、スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）にて行なった。各測定値は、特記したもの以外は、平均値（Ｍｅａｎ）±標準誤差（ＳＥ）で示した。
【００５２】
【表２】
2011057654.tif 000003
【００５３】
〔２−２．体重変化、血清生化学項目試験、糖負荷試験、組織学的試験〕
〔２−２−１．体重変化及び総食餌摂取量〕
肥満自然発症マウスの入手及び飼育条件（体重変化及び食餌摂取量を含む）、並びにＣＡの精製および食餌の作成方法については、〔２−１−１〕及び〔２−１−２〕の場合と共通（同様）とし、統計解析法についても実験〔２−１〕の場合と同様に行なった。
【００５４】
〔２−２−２．血清生化学項目試験〕
コントロール群にはＣＡ非含有食餌、治療群にはＣＡ０．０３％含有食餌を各６週間投与、６週後にマウスを犠死させ、心臓穿刺によって血液を採取、血清を調製した。得られた血清を用い、随時血糖、総中性脂肪、総コレステロール、遊離脂肪酸、ＡＬＴ（アラニンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ：ＧＰＴ）の測定を行なった（盛岡ＳＲＬ社に試験委託）。
【００５５】
〔２−２−３．腹腔内糖負荷試験（耐糖能試験：ＧＴＴ）〕
１８時間絶食させた後に、ブドウ糖を腹腔内に体重ｇあたり１．５ｍｇ負荷し、経時的（３０分、６０分、１２０分）に血糖値（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｇ／ｄＬ）を測定した。血糖値の測定には、グルコメータ（サノフィ−アベンティス社製）を用いた。
【００５６】
〔２−２−４．組織学的試験〕
犠死させたマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）、及び肝臓組織をパラフィンで包埋、５μｍ厚に薄片化した後、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオジン（ｅｏｓｉｎ）により染色し、組織学的試験（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）を行なった。
【００５７】
実験〔２−２−１〕の結果は、コントロール群（ＣＡ−）及び治療群（ＣＡ＋）についての体重変化を図１０に示したとおり、コントロール群に対して治療群は３乃至５週間後までの経時的変化において、その増加が有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。また、コントロール群（ＣＡ−）及び治療群（ＣＡ＋）についての食餌摂取量（Ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ：ｇ／マウス／日）を図１１に示したとおり、両群間に有意差が認められなかった。
【００５８】
実験〔２−２−２〕の結果は、コントロール群（ＣＡ−）及び治療群（ＣＡ＋）について、随時血糖（ｍｇ／ｄＬ）、総中性脂肪（ｍｇ／ｄＬ）、総コレステロール（ｍｇ／ｄＬ）、遊離脂肪酸（μＥＱ／Ｌ）の測定値を表３に示した。また、ＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）の測定値は図１２に示したとおりである。遊離脂肪酸は両群間に有意差が認められなかったが、随時血糖（ｐ＜０．０１）、総中性脂肪（ｐ＜０．０１）、血中総コレステロール（ｐ＜０．０５）、ＡＬＴ（ｐ＜０．０５）は、夫々コントロール群に対して治療群で有意に低下していた。
【００５９】
【表３】
2011057654.tif 000004
【００６０】
実験〔２−２−３〕の結果は、コントロール群（ＣＡ−）及び治療群（ＣＡ＋）について、夫々の血糖値の経時変化を図１３に示した。糖負荷後２時間における血糖値がコントロール群に対して治療群で有意（ｐ＜０．０５）に低下し、耐糖能の改善が認められた。
【００６１】
実験〔２−２−４〕の結果は、コントロール群（ＣＡ−）及び治療群（ＣＡ＋）について、夫々ＷＡＴ及び肝臓組織（Ｌｉｖｅｒ）の組織所見（顕微鏡写真）を図１４に示した。ＷＡＴの組織所見ではコントロール群に対して治療群で細胞の小型化が認められた。肝臓の組織所見では、肝細胞内脂肪量の顕著な低下が認められた。
【図１】
2011057654.tif 000005
【図３】
2011057654.tif 000006
【図５】
2011057654.tif 000007
【図６】
2011057654.tif 000008
【図８】
2011057654.tif 000009
【図９】
2011057654.tif 000010
【図１０】
2011057654.tif 000011
【図１１】
2011057654.tif 000012
【図１２】
2011057654.tif 000013
【図１３】
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【図２】
2011057654.tif 000015
【図４】
2011057654.tif 000016
【図７】
2011057654.tif 000017
【図１４】
2011057654.tif 000018
【配列表】
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