(57)【要約】【課題】合焦位置の誤検出を抑制する。【解決手段】顕微鏡１は、サンプルＳＰを保持するステージ１１と対物レンズ１５との距離を変動させ、対物レンズ１５により拡大されるサンプルＳＰを撮像する。顕微鏡１は、撮像される撮像領域ＣＡに対応する画像において、部分的に選択された選択領域であるＡＦ検出枠ＡＡにおける輝度信号Ｙから、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する。このとき、顕微鏡１は、サンプルＳＰが呈すべき基準色（基準色差信号ＣＳ）から乖離する色（色差信号Ｃ）を有する領域のコントラストを低く評価する。そして、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズ１５がサンプルＳＰに対して合焦する合焦位置を決定する。【選択図】図６
2011090221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを拡大する対物レンズと、
上記サンプルを保持する保持部と、
上記保持部と上記対物レンズとの距離を変動させる距離変動部と、
上記対物レンズにより拡大されるサンプルを撮像する撮像素子と、
上記撮像される画像において、部分的に選択された選択領域における画素値から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出部と、
上記ＡＦ評価値に基づいて、上記対物レンズが上記サンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定部と
を有する顕微鏡。
【請求項２】
上記算出部は、
輝度信号から上記ＡＦ評価値を算出する
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
上記算出部は、
隣接する画素間における上記輝度信号の２次微分値を上記ＡＦ評価値として算出する
請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記算出部は、
上記基準色から乖離する色を有する画素の上記２次微分値をを小さくすることにより、上記基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する
請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記算出部は、
上記基準色からの色の乖離度合いに応じて、対応する画素の上記２次微分値を小さくする
請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
上記算出部は、
上記ＡＦ評価値の算出単位ごとに、上記コントラストを補正する
請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
ユーザによる操作入力に応じて、上記基準色を設定する基準色設定部
をさらに有する請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
上記サンプルにおける少なくとも一部の領域の色差信号の平均値を上記基準色として設定する基準色設定部
をさらに有する請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項９】
上記合焦位置において、上記サンプルを撮像する撮像部と
をさらに有する請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
上記算出部は、
ＲＧＢ信号から上記ＡＦ評価値を算出する
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
上記算出部は、
上記ＲＧＢ信号の上記基準色からの差分の分散度合いの相関値に応じて上記コントラストを低く評価するよう補正することにより、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する
請求項１０に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
上記算出部は、
上記基準色から乖離する色を有する画素の輝度信号の値を小さくすることにより、上記基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する
請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながら上記サンプルを撮像する撮像ステップと、
撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、
上記ＡＦ評価値に基づいて、上記対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップと
を有する合焦位置検出方法。
【請求項１４】
顕微鏡を制御するコンピュータに対して、
サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながら上記サンプルを撮像する撮像ステップと、
撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、上記サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、
上記ＡＦ評価値に基づいて、上記対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップと
を実行させる合焦位置検出プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムに関し、例えば生体サンプルを拡大して観察する分野に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプルは、組織切片等をスライドガラスに固定し、必要に応じて染色を施した後に保管される。一般に、保管期間が長期間となると、組織切片の劣化や退色等により生体サンプルに対する顕微鏡での視認性が悪くなる。また、生体サンプルは、作成された病院等の施設以外の施設で診断されることもあるが、該生体サンプルの受け渡しは一般に郵送であり、一定の時間を要する。
【０００３】
このような実情等に鑑み、生体サンプルを画像データとして保存する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−２２２８０１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、この種の装置では、プレパラートを作製する際、又は作製後において、プレパラートの内部への気泡、塵及び異物など（以下、これらを異物類と呼ぶ）の混入又はプレパラート表面に対する異物類の付着が避けられない。
【０００６】
このような異物類が存在すると、サンプルに対する合焦位置を検出するオートフォーカス処理において、異物類に対する合焦位置を誤ってサンプル位置に対する合焦位置として誤検出してしまうという問題があった。
【０００７】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、合焦位置の誤検出を抑制し得る顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムを提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため本発明の顕微鏡は、サンプルを拡大する対物レンズと、サンプルを保持する保持部と、保持部と対物レンズとの距離を変動させる距離変動部と、対物レンズにより拡大されるサンプルを撮像する撮像素子と、撮像される画像において、部分的に選択された選択領域における画素値から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出部と、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定部とを設けるようにした。
【０００９】
これにより、顕微鏡は、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減できる。
【００１０】
また本発明は、サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながらサンプルを撮像する撮像ステップと、撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップとを設けるようにした。
【００１１】
これにより、合焦位置検出方法は、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減できる。
【００１２】
また本発明は、顕微鏡を制御するコンピュータに対して、サンプルを保持する保持部と対物レンズとの距離を変動させながらサンプルを撮像する撮像ステップと、撮像された画像において、部分的に選択された選択領域における輝度信号から、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルが呈すべき基準色から乖離する色を有する領域のコントラストを低く評価する算出ステップと、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズがサンプルに対して合焦する合焦位置を決定する合焦位置決定ステップとを設けるようにした。
【００１３】
これにより、合焦位置検出プログラムは、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減できる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、サンプルとは異なる色を有する異物類についてのコントラストを低く評価できるため、ＡＦ評価値に対する異物類の影響を低減でき、かくして合焦位置の誤検出を抑制し得る顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】顕微鏡の構成を示す略線図である。
【図２】撮像領域を示す写真である。
【図３】合焦位置の探索の説明に供する略線図である。
【図４】ＡＦ処理部の構成を示す略線図である。
【図５】異物類の混入の説明に供する略線図である。
【図６】異物類の影響によるＡＦ評価値の変化の説明に供する略線図である。
【図７】撮像処理手順の説明に供するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．実施の形態（異物類の影響を低減した合焦位置の検出）
２．他の実施の形態
【００１７】
＜１．実施の形態＞
［１−１．顕微鏡の構成］
図１において、本実施の形態による顕微鏡１を示す。この顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴが配される板状のステージ１１を有する。
【００１８】
プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織の切片を、所定の固定手法によりスライドガラスＳＧに固定し封入したものであり、該組織切片には必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色と呼ばれる染色などが含まれる。
【００１９】
ステージ１１にはステージ駆動機構１２が設けられる。このステージ駆動機構１２は、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）にステージ１１を駆動するものとされる。ちなみに、プレパラートＰＲＴが配される側のステージ面（以下、これをプレパラート配置面とも呼ぶ）には、一般に、プレパラートＰＲＴを定位置に抑止する抑止部（図示せず）が設けられる。
【００２０】
ステージ１１のプレパラート配置面とは逆の面側には光源１３が配される。光源１３は、一般染色が施された組織切片を照明する光（以下、これを明視野照明光とも呼ぶ）を照射可能なものとされる。ただし、明視野照明光及び特殊染色が施された組織切片を照明する光（以下、これを暗視野照射光と呼ぶ）を切り換えて照射可能なものであってもよい。光源１３とステージ１１との間には、プレパラート配置面における基準位置の法線を光軸とするコンデンサレンズ１４が配される。
【００２１】
ステージ１１のプレパラート配置面側には、ステージ面における基準位置の法線を光軸とする対物レンズ１５が配される。対物レンズ１５は、倍率の異なる複数の対物レンズのなかからレンズ切換機構又は手動により選択される。この対物レンズ１５の後方には、該対物レンズ１５の結像面を撮像面とする撮像素子１６が配される。
【００２２】
この顕微鏡１における制御系として、ステージ駆動機構１２にはステージ駆動制御部２１が、光源１３には照明制御部２２が、撮像素子１６には撮像制御部２３がデータ通信路を介して接続される。
【００２３】
これら制御系は、ＣＰＵ(Central  Processing  Unit)、ＲＯＭ(Read  Only  Memory)、ＣＰＵのワークメモリとなるＲＡＭ(Random  Access  Memory)及び演算回路などを含むコンピュータとされる。
【００２４】
ステージ駆動制御部２１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、コンデンサレンズ１４によって集められる集光部分にプレパラートＰＲＴの組織切片が割り当てられるようステージ面方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）にステージ１１を移動させる。
【００２５】
またステージ駆動制御部２１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、集光部分に割り当てられる組織切片の部位が対物レンズ１５の焦点に合うようステージ面の直交方向（Ｚ軸方向（つまり組織切片の厚み方向））にステージ１１を移動させる。
【００２６】
照明制御部２２は、明視野像を取得すべきモード（以下、これを明視野モードとも呼ぶ）に応じたパラメータを光源１３に設定し、該光源１３から照明光を照射させる。このパラメータは例えば照明光の強度や光源の切り換えなどである。なお、明視野モードにおける照射光は一般に可視光とされる。
【００２７】
光源１３から照明光が照射された場合、その照明光はコンデンサレンズ１４によって、ステージ１１におけるプレパラート配置面の基準位置に集められる。対物レンズ１５の結像面には、プレパラートＰＲＴにおける組織切片のうち、コンデンサレンズ１４によって集光される集光部分の像が拡大されて結像され、その拡大像が対物レンズ１５によって撮像素子１６の撮像面に被写体像として結像される。
【００２８】
撮像制御部２３は、明視野モードに応じたパラメータを撮像素子１６に設定し、該撮像素子１６の撮像面に結像される被写体像のデータを取得する。このパラメータは例えば露光の開始タイミング及び終了タイミングなどである。
【００２９】
またこの顕微鏡１における制御系として、該顕微鏡１の全体の制御を司る制御部（以下、これを統括制御部とも呼ぶ）３０があり、これはステージ駆動制御部２１、照明制御部２２及び撮像制御部２３それぞれにデータ通信路を介して接続される。この統括制御部３０は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、演算回路及び記憶媒体などを含むコンピュータとされる。
【００３０】
統括制御部３０は、明視野モードの開始命令を待ち受け、該開始命令を受けた場合、撮像処理を開始し、制御を開始すべき指令をステージ駆動制御部２１、照明制御部２２及び撮像制御部２３に与える。
【００３１】
このとき、図２に示すように、統括制御部３０は、プレパラートＰＲＴを複数の撮像領域ＣＡに分割し、当該撮像領域ＣＡごとに検出合焦位置を検出するオートフォーカス処理を実行する。統括制御部３０は、撮像領域ＣＡごとに決定された検出合焦位置において撮像を繰り返すことにより、プレパラートＰＲＴのほぼ全域に亘って撮像する。
【００３２】
また統括制御部３０は、ステージ駆動制御部２１においてプレパラートＰＲＴの組織切片部位が割り当てるたびに、撮像素子１６によって取得される組織切片部位における拡大像のデータを記憶媒体に記憶する。
【００３３】
そして統括制御部３０は、表示命令を待ち受け、該表示命令を受けた場合、その表示命令で指定される拡大像に対応するデータを記憶媒体から読み出し、これを表示命令の送出元に与える。
【００３４】
このようにこの顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴの組織切片を鏡検状態の画像として記憶することで、プレパラートＰＲＴ自体を保存する場合に比べて、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって組織切片を保存できるようになされている。
【００３５】
［１−２．オートフォーカス処理］
次に、合焦位置を自動的に検出するオートフォーカス処理について説明する。
【００３６】
具体的に、図３に示すように、顕微鏡１の統括制御部３０は、顕微鏡１における各部を制御することにより、撮像領域ＣＡごとに複数の焦点位置で画像を撮像する。このときの、光軸方向の撮像間隔は、例えば被写界深度と同程度、又は被写界深度未満に設定される。
【００３７】
統括制御部３０は、撮像領域ＣＡにおける部分的な領域（例えば中心部分）をＡＦ検波枠ＡＡとする。統括制御部３０は、ＡＦ検波枠ＡＡにおけるコントラスト（画像における明暗の強度）などをＡＦ評価値として比較し、当該ＡＦ評価値の最も高い焦点位置を合焦位置ＦＰとして検出する。
【００３８】
一般的に、ＡＦ評価値は、ＡＦ検出枠ＡＡ内のすべての画素についての和として、輝度信号Ｙを用いた２次微分（ラプラシアン）によって算出される。例えば、（１）式に示すように、画像の任意の点(x,y)における上下左右の隣接する画素の輝度値Ｙ同士の２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）が算出される。
【００３９】
【数１】
2011090221.tif 000003
【００４０】
そして、（２）式に従って、ＡＦ検出枠ＡＡ内のすべての画素についての２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）の和として、ＡＦ評価値が算出される。
【００４１】
【数２】
2011090221.tif 000004
【００４２】
一般的に、画像では、合焦していれば隣接画素間の輝度信号Ｙの差分が大きくなり、コントラストが大きくなる。このため、統括制御部３０は、ＡＦ評価値が最大となる焦点位置を検出合焦位置として検出する。
【００４３】
図４に示すように、細胞組織でなるサンプルＳＰは、一般的に、スライドガラスＳＧとカバーガラスＣＧとの間に挟まれ、包理剤ＬＱによって固定されたスライドＳＧとして顕微鏡１のステージ１１上に設置される。
【００４４】
このとき、スライドガラスＳＧの表面やカバーガラスＣＧの表面には、肉眼では確認できない微細な塵が多数付着している。また、包理剤ＬＱの内部にも、スライドＳＤの作成時に混入した気泡や微細な塵、異物など（以下、これらをまとめて異物類ＯＤと呼ぶ）が混入してしまう。
【００４５】
図５に示すように、ＡＦ検波枠ＡＡ内に異物類ＯＤが混入していた場合、異物類ＯＤによりＡＦ評価値が上昇し、合焦位置を誤検出する可能性が生じる。
【００４６】
ところで、一般的に、細胞組織をサンプルＳＰとして顕微鏡観察を行う場合、当該サンプルＳＰに対して染色処理が施されていることが多い。このため、観察対象となるサンプルＳＰそのものを撮像した場合、染色に応じた限定された色域において像が変化する画像となる。
【００４７】
一方で、異物類ＯＤは、ほとんど染色されないことから、サンプルＳＰとは異なる色域において像が変化する画像となる。
【００４８】
そこで本実施の形態による顕微鏡１では、色差信号Ｃ（Ｃｒ及びＣｂ）を用いて２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を重み付けすることにより、ＡＦ評価値における異物類ＯＤの影響を低減させるようになされている。
【００４９】
顕微鏡１の統括制御部３０は、ユーザの操作入力に応じて基準色の設定要求がなされると、基準色設定部４４（図１）に予め記憶されている色テーブルを読み出し、想定される染色種類の一覧を表示部（図示しない）に表示する。この色テーブルには、染色種類と対応づけて色差信号が記憶されている。この色差信号は、染色種類における平均的な色を表すものである。
【００５０】
基準色設定部４４は、ユーザによって染色種類が選択されると、当該染色種類に対応付けられた色差信号Ｃを基準色差信号ＣＳ（ＣｂＳ及びＣｒＳ）に決定し、これをＡＦ処理部４１の補正部４５に供給する。
【００５１】
図６に示すように、補正部４５は、（３）式に従って、各画素のコントラストを表す２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を算出する。すなわち、補正部４５は、色差信号Ｃｂ及びＣｒから基準色差信号ＣｂＳ及びＣｒＳを減算した差分値を２乗して加算し、平方根をとることにより、差分値を加重し、加重差分値を算出する。色差信号Ｃｂ及びＣｒの最高値が２５５であることから、当該加重差分値を２×２５５の平方根で除算して正規化して正規化値を算出する。当該正規化値を１から減算して補正係数を算出し、算出された補正係数に対し、２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を乗算する。
【００５２】
【数３】
2011090221.tif 000005
【００５３】
２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）に乗算される補正係数は、基準色差信号ＣｂＳ及びＣｒＳを減算した差分値が大きいほど小さくなり、「１」よりも小さくなる。一方、差分値が小さいほど大きくなり、「１」に近づく。すなわち、染色された領域では「１」に近い補正係数が乗算されて補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）が算出されるのに対し、異物では「１」よりもかなり小さい補正係数が乗算され、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）が算出される。
【００５４】
補正部４５は、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）をＡＦ評価値算出部４６に供給する。ＡＦ評価値算出部４６は、（４）式に従って、ＡＦ評価値を算出する。なお、（４）式は、（２）式の２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）に置き換えたものである。
【００５５】
【数４】
2011090221.tif 000006
【００５６】
すなわち、染色されたサンプルＳＰでは、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）の和であるＡＦ評価値が殆ど補正されない一方、異物類ＯＤの領域では、ＡＦ評価値が小さくなるように補正される。
【００５７】
合焦位置決定部４７は、ＡＦ評価値の最も高い画像の撮像された焦点位置を検出合焦位置に決定する。このとき、合焦位置決定部４７は、異物類ＯＤの領域ではＡＦ評価値が小さく補正されているため、サンプルＳＰに対する合焦位置を検出号証位置として適切に決定することができる。
【００５８】
このように、顕微鏡１は、染色に使用された色から乖離する色を有する領域を異物類ＯＤとみなし、当該異物類ＯＤに対するＡＦ評価値の値を低減することにより、異物類ＯＤがＡＦ評価値に与える影響を小さくすることができる。この結果、顕微鏡１は、異物類ＯＤに合焦したことによってＡＦ評価値が上昇することによる検出合焦位置の誤検出を防止し得るようになされている。
【００５９】
［１−３．処理手順］
次に、撮像プログラムに従って実行される撮像処理手順について、図７のフローチャートを用いて説明する。
【００６０】
顕微鏡１は、ユーザの操作入力に応じた明視野モードの開始命令を認識すると、撮像処理手順ＲＴ１を開始し、ステップＳＰ１へ移る。
【００６１】
ステップＳＰ１において、顕微鏡１は、一の撮像領域ＣＡにおいて複数の焦点位置で撮像を実行すると、次のステップＳＰ２へ移る。
【００６２】
ステップＳＰ２において、顕微鏡１は、（３）式に従って色差信号Ｃによる重み付けを行い、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）を算出すると、次のステップＳＰ３へ移る。
【００６３】
ステップＳＰ３において、顕微鏡１は、（４）式に従って、ＡＦ検出枠ＡＡ内についてのコントラストの大きさを表すＡＦ評価値を算出すると、次のステップＳＰ４へ移る。
【００６４】
ステップＳＰ４において、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて検出合焦位置を決定すると、次のステップＳＰ５へ移る。
【００６５】
ステップＳＰ５において、顕微鏡１は、検出合焦位置において撮像を実行すると、次のステップＳＰ６へ移る。
【００６６】
ステップＳＰ６において、顕微鏡１は、すべての撮像領域ＣＡに対して撮像処理を実行したか否かについて判別する。ここで否定結果が得られると、顕微鏡１は、ステップＳＰ１へ戻り、次の撮像領域ＣＡに対する処理を実行する。
【００６７】
これに対して、ステップＳＰ７において否定肯定結果が得られると、顕微鏡１は、終了ステップへ移り、撮像処理手順ＲＴ１を終了する。
【００６８】
［１−４．動作及び効果］
以上の構成によれば、顕微鏡１は、サンプルＳＰを保持するステージ１１と対物レンズ１５との距離を変動させ、対物レンズ１５により拡大されるサンプルＳＰを撮像する。顕微鏡１は、撮像される撮像領域ＣＡに対応する画像において、部分的に選択された選択領域であるＡＦ検出枠ＡＡにおける輝度信号Ｙから、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する。このとき、顕微鏡１は、サンプルＳＰが呈すべき基準色（基準色差信号ＣＳ）から乖離する色（色差信号Ｃ）を有する領域のコントラストを低く評価する。そして、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズ１５がサンプルＳＰに対して合焦する合焦位置ＦＰを検出合焦位置として決定する。
【００６９】
これにより、顕微鏡１は、サンプルＳＰとは相違する色を呈する異物類ＯＤのコントラストを低く評価することができるため、検出合焦位置の検出精度を向上させることができる。
【００７０】
顕微鏡１は、２次微分値を補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）として算出することにより、基準色差信号ＣＳから乖離する色差信号Ｃを有する画素の２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）の値を小さくして補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）を算出する。これにより、顕微鏡１は、基準色差信号ＣＳから乖離する色差信号Ｃを有する領域のコントラストを低く評価する。
【００７１】
これにより、顕微鏡１は、異物類ＯＤを表す２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）の値を小さくできるため、異物類ＯＤのＡＦ評価値を低減することができる。また、顕微鏡１は、２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を補正するだけの簡易な処理で基準色差信号ＹＳから乖離する色差信号Ｃを有する領域のコントラストを低く評価することができる。
【００７２】
顕微鏡１は、基準色差信号ＣＳからの色差信号Ｃの乖離度合いに応じて、対応する画素の補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）の値を小さくする。これにより、顕微鏡１は、異物類ＯＤか否かを検出することなく、異物類ＯＤである可能性に応じてＡＦ評価値の値を調整でき、ＡＦ評価値の信頼性を向上させることができる。また、顕微鏡１は、２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）に対して補正係数を乗算するだけの簡易な計算により、補正２次微分値Ｌｃ（ｘ，ｙ）を算出できる。
【００７３】
顕微鏡１は、ユーザによる操作入力に応じて、基準色差信号ＣＳを設定する。これにより、顕微鏡１は、染色方法に応じた適切な基準色差信号ＣＳを設定することができる。
【００７４】
以上の構成によれば、顕微鏡１は、サンプルを保持するステージ１１と対物レンズ１５との距離を変動させながらサンプルＳＰを撮像する。顕微鏡１は、撮像された画像において、部分的に選択されたＡＦ検出枠ＡＡにおける輝度信号Ｙから、コントラストを表すＡＦ評価値を算出する際、サンプルＳＰが呈すべき基準色差信号ＣＳから乖離する色差信号Ｃを有する画素に隣接する領域のコントラストを低く評価する。そして、顕微鏡１は、ＡＦ評価値に基づいて、対物レンズ１５がサンプルＳＰに対して合焦する検出合焦位置を決定する。
【００７５】
これにより、顕微鏡１は、異物類ＯＤに起因するＡＦ評価値を低く設定できるため、異物類ＯＤに対する合焦位置ＯＰをサンプルＳＰに対する検出合焦位置として検出することを極力防止できる。かくして、本発明は、合焦位置ＦＰの誤検出を抑制し得る顕微鏡、合焦位置検出方法及び合焦位置検出プログラムを実現できる。
【００７６】
＜２．他の実施の形態＞
なお、上述した実施の形態においては、ユーザによる操作入力に応じて、基準色差信号ＣＳを設定するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、顕微鏡１が基準色差信号ＣＳを設定するようにしても良い。例えば、顕微鏡１が、サンプルＳＰ１における少なくとも一部の領域の色差信号ＣＳの平均値を算出し、これを基準色差信号ＣＳとして設定するようにとしてもよい。例えば一つの焦点位置において複数の撮像領域ＣＡを撮像し、基準色差信号ＣＳが算出されても良い。
【００７７】
これにより、顕微鏡１は、ユーザに染色方法などを指定させるなどの操作をさせることなく、基準色差信号ＣＳを設定でき、ユーザの利便性を向上させ得る。
【００７８】
また、プレパラートの上に貼り付けられたラベルやバーコード情報、もしくはＲＦチップなどから染色種類を自動的に読取り、基準色差信号ＣＳを自動的に設定することも可能である。これにより、プレパラートの経年劣化や退色による影響を基準色差信号ＣＳに対して自動的に反映させることができる。
【００７９】
さらに、上述した実施の形態においては、サンプルＳＰが染色されているようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、均一な色の特徴を有するようなすべてのサンプルについて、本発明を適用することができる。もちろん、サンプルとして生体サンプル以外のサンプルを撮像することも可能である。
【００８０】
また、上述した実施の形態においては、オートフォーカス処理の後、検出合焦位置において、サンプルＳＰを撮像するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、少なくともオートフォーカス処理を実行すれば良く、必ずしも撮像する必要はない。
【００８１】
さらに、上述の実施の形態では、生体サンプルＳＰＬにおける所望の部位を撮像範囲に移動させる場合、ステージ１１が追従された。しかしながら追従させるべき対象は、対物レンズ１５とするようにしてもよい。このようにしても上述の実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００８２】
さらに、上述した実施の形態においては、画素ごとに２次微分値Ｌ（ｘ，ｙ）を補正するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えばＡＦ検出枠ＡＡごとにＡＦ評価値を補正しても良い。例えば、ＡＦ検出枠ＡＡにおける基準色差信号ＣＳと色差信号Ｃとの差分の最大値に応じてＡＦ評価値を補正しても良い。
【００８３】
さらに、上述した実施の形態においては、画素値が輝度信号Ｙ及び色差信号Ｃで表されるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、信号ＳＲ、ＳＧ及びＳＢからなるＲＧＢ信号についても本発明を適用することが可能である。
【００８４】
この場合、ＡＦ検波枠ＡＡ内で（５）式に従ってＲＧＢ各信号の相関係数Ｃを算出する。この相関係数Ｃは、ＡＦ検波枠ＡＡ内でのＲＧＢ信号間の相関を表している。次式において、Ａ及びＢはＲＧＢ各信号（ＳＲ、ＳＧ及びＳＢ）の値であり、ＡＳ及びＢＳは、基準色の値であり、例えばＡＦ検波枠ＡＡ内でのＲＧＢ信号の平均値である。すなわち、相関係数Ｃは、各信号（ＳＲ、ＳＧ及びＳＢ）をＡ及びＢにそれぞれ代入した３つの組み合わせそれぞれについて算出される。
【００８５】
【数５】
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【００８６】
相関係数Ｃは、ＡＦ検波枠ＡＡ内でのＲＧＢ各信号間の変化（すなわち平均値からの分散度合い）がどの程度の相関関係にあるかを示している。染色されたサンプルＳＰは、特有の色相における濃淡の変化を伴う情報になるため、ＲＧＢ各信号間の変化は相関が弱くなり、相関係数Ｃが小さくなる。
【００８７】
一般に、染色されていない異物類ＯＤによる画像信号間は、濃淡（白黒）の変化を伴うため、ＲＧＢ各信号が強い相関となり、相関値Ｃが大きくなる。
【００８８】
例えば顕微鏡１は、各ＲＧＢ信号間の相関係数Ｃが高くなる場合において、ＡＦ評価値が小さくなるように補正をかけることで、ＡＦ評価値における異物類ＯＤによる影響を軽減できる。顕微鏡１は、例えば２つ又は３つの相関値Ｃの平均値が閾値以上であればＡＦ評価値を補正する。
【００８９】
さらに、上述した実施の形態においては、基準色からの乖離に応じてＡＦ評価値を補正するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、例えば補正された輝度信号Ｙｃに基づいてＡＦ評価値を算出しても良い。
【００９０】
この場合、補正部は、基準色差信号ＣＳを（６）式に従って重み付けし、補正輝度信号Ｙｃを算出する。（６）式において、基準色差信号ＣＳと色差信号Ｃの差分を１から引いた値を輝度信号Ｙに乗算するため、基準色差信号ＣＳと異なる色差信号Ｃほど、補正輝度信号Ｙｃが小さくなる。すなわち、染色されている領域については、輝度信号Ｙが殆ど補正されないまま補正輝度信号Ｙｃとして算出される。一方、染色されていない異物類ＯＤについては、輝度信号Ｙが大きく補正され、補正輝度信号Ｙｃの値が小さくなる。
【００９１】
【数６】
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【００９２】
補正部は、補正輝度信号ＹｃをＡＦ評価値算出部４６に供給する。ＡＦ評価値算出部４６は、（７）式に従って、ＡＦ検出枠ＡＡについてのＡＦ評価値を算出し、合焦位置決定部４７に供給する。なお、（７）式は、（１）式の輝度信号Ｙを補正輝度信号Ｙｃに置き換えたものである。
【００９３】
【数７】
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【００９４】
合焦位置決定部４７は、ＡＦ評価値の最も高い画像の撮像された焦点位置を検出合焦位置に決定する。
【００９５】
ここで、補正輝度信号Ｙｃは、異物類ＯＤの値が小さくなるように算出されている。従って、ＡＦ評価値算出部４６は、異物類ＯＤに関する隣接画素間の差分をも小さくすることができるため、異物類ＯＤに関するＡＦ評価値を全体として小さくすることができる。このため、合焦位置決定部４７は、異物類ＯＤに合焦したときの焦点位置ではなく、サンプルＳＰに合焦したときの焦点位置を検出合焦位置に高い精度で決定することができる。
【００９６】
さらに、上述した実施の形態においては、（４）式に従ってＡＦ評価値を算出するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、ＡＦ評価値の算出方法に制限はない。例えば、隣接する上下左右の画素に加えて、斜め上下左右の画素についても差分をとるようにしても良い。この場合であっても、上述した実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００９７】
さらに、上述した実施の形態においては、複数の撮像領域ＣＡごとにオートフォーカス処理が実行されるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、プレパラートＰＲＴを１回で撮像する場合についても、本発明を適用することができる。また、撮像領域ＣＡの全域をＡＦ検出枠ＡＡとしても良い。
【００９８】
また上述の実施の形態では、１つの対物レンズ１５が用いられた。しかしながら対物レンズは複数であってもよい。また、複数の対物レンズを、レボルバー等を適用して倍率が可変できるようにしてもよい。さらに、対物レンズに加えて、接眼レンズを設けることもできる。
【００９９】
さらに、上述した実施の形態においては、撮像プログラム等をＲＯＭ又はハードディスクドライブなどに予め格納しているが、本発明はこれに限らず、メモリースティック（ソニー株式会社の登録商標）などの外部記憶媒体からフラッシュメモリなどにインストールするようにしても良い。また、撮像プログラムなどをＵＳＢ（Universal Serial Bus）やＥｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）（Institute of Electrical and Electronics Engineers）８０２．１１ａ／ｂ／ｇなどの無線ＬＡＮ（Local Area Network）を介して外部から取得し、さらに、は地上ディジタルテレビジョン放送やＢＳディジタルテレビジョン放送により配信されるようにしても良い。
【０１００】
また上述の実施の形態では、撮像処理により得られるサンプルデータは、例えば、ローカルエリアネットワークやインターネット、ディジタル衛星放送等の有線又は無線の通信媒体としてもよい。
【０１０１】
さらに、上述した実施の形態においては、対物レンズとしての対物レンズ１５と、位置変動部としてのステージ１１と、撮像素子としての撮像素子１６と、算出部としての補正部４５及びＡＦ評価値算出部４６と、合焦位置決定部としての合焦位置決定部４７とによって顕微鏡としての顕微鏡１を構成するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる対物レンズと、位置変動部と、撮像素子と、算出部と、合焦位置決定部とによって本発明の顕微鏡を構成するようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【符号の説明】
【０１０３】
１……顕微鏡、１１……ステージ、１３……光源、１５……対物レンズ、１６……撮像素子、３０……統括制御部、４１……ＡＦ処理部、４４……基準色設定部、４５……輝度補正部、４６……ＡＦ値算出部、４７……合焦位置決定部、ＰＲＴ……プレパラート、ＳＧ……スライドガラス、ＳＰ……サンプル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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