(57)【要約】      （修正有）【課題】非インスリン産生細胞を、インスリン産生細胞の集団に転換する方法を提供する。【解決手段】非インスリン産生細胞を、ドクトカゲ（Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ  ｌｉｚａｒｄ）の唾液腺由来ペプチドであるＥｘｅｎｄｉｎ−４、実質的にＥｘｅｎｄｉｎ−４に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、またはそのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と接触させる工程を包含するプロセスによって作製される、インスリン産生細胞の集団。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非インスリン産生細胞を、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、実質的にＥｘｅｎｄｉｎ−４に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、またはそのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と接触させる工程を包含するプロセスによって作製される、インスリン産生細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非インスリン産生細胞を、グルカゴン様ペプチド−１（「ＧＬＰ−１」）、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、または関連したペプチドと接触させることにより、非インスリン産生細胞から分化したインスリン産生細胞の集団に関する。本発明はまた、インスリン産生細胞を得るための方法、および真性糖尿病の処置における治療的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の膵臓は、２つの異なる型の腺組織（腸内へ消化酵素を分泌する外分泌細胞および血流内へホルモンを分泌する内分泌細胞）から構成される。内分泌細胞は、神経堤から発達すると伝統的に考えられていたのに対して、外分泌細胞は、内胚葉から発達すると考えられていた。より最近の研究は、これらの２つの細胞型が、管の上皮性内層に沿って位置する共通の内胚葉前駆体細胞に由来し得ることを示唆する（非特許文献１参照）。内分泌細胞は末端で分化されて、そして新しい内分泌細胞を作るために分裂しないことに注意すべきである。膵臓内胚葉前駆体細胞は、新しい膵臓内分泌細胞を産生すると考えられる唯一の細胞である。
【０００３】
膵臓は管（これは腸へ外分泌酵素（アミラーゼおよびリパーゼ）を運搬する）；腺房細胞（これは外分泌酵素を産生する）；およびランゲルハンス島（これはインスリン、アミリン、およびグルカゴンを産生および分泌する内分泌細胞を含む）からなる。これらのホルモンは、著しく狭い範囲内で正常な血糖値を維持するのに役立つ。
【０００４】
これらの島細胞の中には、インスリンを産生および分泌するβ細胞がある。このβ細胞によるインスリン産生および分泌は、血糖値によって制御される。血糖値が上昇すると、インスリン放出は増大する。インスリンは、標的組織によるグルコースの取りこみを促進し、従って貯蔵のために組織へグルコースをシャトリングすることによって高血糖を防ぐ。
【０００５】
β細胞機能障害および付随するインスリン産生の低下は、真性糖尿病を生じ得る。１型糖尿病において、このβ細胞は、免疫系によって完全に破壊されて、インスリン産生細胞の欠損を生じる（非特許文献２参照）。２型糖尿病において、標的組織がグルコースの取りこみに対するインスリンの効果に抵抗性になると、このβ細胞は進行的に効率が低くなる。２型糖尿病は、進行性の疾患であり、そしてβ細胞機能は、現在利用可能ないかなる薬剤による継続処置にもかかわらず悪化し続ける（非特許文献３参照）。従って、β細胞は、１型糖尿病を有する人々において存在せず、そして２型糖尿病を有する人々において機能に障害がある。
【０００６】
β細胞機能障害は、現在いくつかの異なる方法で処置される。１型糖尿病または後期の２型糖尿病の処置において、インスリン代償療法が用いられる。たとえ連続注入または複数注射が、複雑な養生法で用いられても、インスリン治療は、命を救うが、正常血糖を回復しない。例えば、食後の血糖値は、インスリン代償療法の個人において引き続き過剰に高い。従って、インスリン代償療法は、毎日の複数の注射または連続注入により送達されなければならず、そしてこの効果は、高血糖、低血糖、代謝性アシドーシス、およびケトン症を避けるために、慎重にモニターされなくてはならない。
【０００７】
β細胞の置換は、膵臓移植により達成され得る。しかし、このような移植は、適合するドナーを見付けること、収集された組織を移植するための外科的手法、および移植片の受入れを必要とする。１型糖尿病を有する人々における移植後に、継続免疫抑制治療が必要とされる。なぜなら、β細胞上の細胞表面抗原は、本来β細胞を破壊した同じプロセスによって認識されそして攻撃されるからである。しかし、免疫抑制薬物（例えば、シクロスポリンＡ）は、感染の可能性の増大を含む、多数の副作用を有する。従って、移植は、多数の合併症を生じ得る。
【０００８】
２型糖尿病を有する人々は、一般にβ細胞からのインスリン産生および分泌を刺激する薬物で処置される。しかし、これらの薬物の主な不利益は、インスリン産生および分泌が、血糖値にかかわらず促進されることである。従って、食物摂取量は、低血糖または高血糖を避けるために、インスリン産生および分泌の促進に対して均衡が保たれなければならない。
【０００９】
近年、いくつかの新規の薬剤が、２型糖尿病を処置するために利用可能になった。これらは、メトホルミン、アカルボースおよびｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅを含む（非特許文献４参照）。しかし、これらの新規の薬剤によって得られたヘモグロビンＡ１ｃの低下は、決して十分ではなかった（非特許文献５参照）。このことは、これらが真性糖尿病の長期の制御を改善しないことを示唆する。
【００１０】
つい最近、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（通常は食物に応答して腸の神経内分泌細胞により分泌されるホルモン）は、２型糖尿病のための新たな処置として示唆された（非特許文献６および７参照）。この処置は、長年にわたる２型糖尿病を有する被験体でもβ細胞によるインスリン放出を増加させる（非特許文献８参照）。ＧＬＰ−１処置は、インスリン治療を超える利点を有する。なぜなら、ＧＬＰ−１は、血糖値が低下したときに遮断される、内因性インスリン分泌を刺激するからである。ＧＬＰ−１は、インスリン放出および合成を増加させ、グルカゴン放出を阻害し、そして胃排出（ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ）を低減させることにより、正常血糖を促進する（非特許文献８〜１２参照）。ＧＬＰ−１はまた、ヘキソキナーゼメッセンジャーＲＮＡレベルにおける増加を誘導する（非特許文献１３および１４参照）。ＧＬＰ−１は、β細胞に対して強力なインスリン分泌効果を有すること（非特許文献１５および１６参照）およびインスリン分泌細胞株に２４時間にわたり添加した場合、インスリン生合成およびプロインスリン遺伝子発現を増加させる（非特許文献１７および１８参照）ことが公知である。ＲＩＮ  １０４６−３８細胞を使用する研究において、ＧＬＰ−１での２４時間処置は、ＧＬＰ−１を１時間取り除き、そして細胞を数回洗浄した後ですらグルコース応答性を増大させた（非特許文献１９参照）。従って、ＧＬＰ−１は、β細胞に対して長期間の効果を有することが公知であるインスリン放出薬剤であり、そしてインスリン分泌性薬剤である（すなわち、インスリン合成を増加させる薬剤）。ＧＬＰ−１は、プログルカゴンの翻訳後修飾の産物である。ＧＬＰ−１の配列ならびにその活性フラグメントＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドは、当該分野で公知である（非特許文献２０参照）。
【００１１】
ＧＬＰ−１レセプターは、腸および膵島に存在することが示された（同書）。このレセプターは、グルカゴン、セクレチン、および血管作用性腸ペプチドレセプターを含むＧタンパク質連結レセプターのファミリーに属する。ＧＬＰ−１のそのレセプターに対する結合の後に、ランゲルハンス島のβ細胞においてｃＡＭＰの上昇がみられる（非特許文献２１参照）。このことは、このレセプターが、刺激Ｇタンパク質によりアデニルシクラーゼ系に共役することを示す。しかし、末梢組織（例えば、肝臓、脂肪および骨格筋）において、ＧＬＰ−１でのｃＡＭＰの増加はみられなかった。このことは、ＧＬＰ−１が末梢組織に対して異なる系を介して作用することを示唆する（非特許文献２２参照）。
【００１２】
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ドクトカゲ（Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ  ｌｉｚａｒｄ）（非特許文献２３参照）の唾液腺において生成されるペプチドである。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のアミノ酸配列は、当該分野で公知である（非特許文献２０参照）。これは、非哺乳動物遺伝子の独特の産物であり、唾液腺においてのみ発現されるようである（非特許文献２４参照）が、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１と５２％のアミノ酸配列相同性を共有し、そして哺乳動物においてＧＬＰ−１レセプターと相互作用する（非特許文献２３および２５参照）。インビトロでは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、インスリン産生細胞によるインスリン分泌を促進し、そして等モル量で与えられた場合は、インスリン産生細胞からのインスリン放出を引き起こすに、ＧＬＰ−１より強力であることを示した。
【００１３】
ＧＬＰ−１を用いるインビトロ研究は、１回のＧＬＰ−１のボーラス注射もしくは短期間の注入またはそれらの繰り返しおよびインスリン分泌効果の引き続く評価の使用に制限された。１つのこのような研究において、２時間にわたるＧＬＰ−１の注入を、ＧＬＰ−１が筋肉のグルコース取り込みおよび肝臓からのグルコース放出を促進する能力について、１型糖尿病を有する患者において試験した（非特許文献６参照）。インスリンの放出を増加させるためのＧＬＰ−１の治療的用途を、２型糖尿病について考えたが、１型糖尿病については考えなかった。なぜなら、１型糖尿病は、ＧＬＰ−１の公知の標的細胞であるβ細胞が存在しないことが顕著であるからである。さらに、ＧＬＰ−１は、糖尿病の処置における治療剤として制限されていることが公知である。なぜなら、ボーラス皮下注射によって与えられて（非特許文献２６参照）すら、短い生物学的半減期を有する（非特許文献１２参照）からである。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、インビボ研究において以前は使用されていなかった。従って、これまでの研究は、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４のいずれかが、１型糖尿病を有する人々の膵臓機能に対して治療的効果があることも、β細胞以外に膵臓においてＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４標的細胞が存在することも、全く示唆されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｅｉｔｅｌｍａｎ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ‐ｃｅｌｌ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｓｌｅｔ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｒｅｖ．  １２  ：  ９１‐１０２，１９９６
【非特許文献２】Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ［Ｔｙｐｅ  Ｉ］Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９８８
【非特許文献３】ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ，１９９５
【非特許文献４】Ｂｒｅｓｓｌｅｒ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｇ．  １９９７．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｎｏｎ‐ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ａｒｃｈ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  １５７  ：  ８３６‐８４８
【非特許文献５】Ｇｈａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ＮＩＤＤＭ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ４６  ：  ４３３‐４３９．  Ｃａｒｅ．  １５  ：  ２７０‐２７６
【非特許文献６】Ｇｕｔｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  （７‐３６）  ａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｎ  ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２６  ：  １３１６‐１３２２
【非特許文献７】Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  （７‐３６）  ａｍｉｄｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ‐２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１  ：  ３０１‐３０７
【非特許文献８】Ｏｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒｅｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎｉ  ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １１７  ：  １２２‐１２８
【非特許文献９】Ｅｌａｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  （ＧＩＰ）  ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  （７３７）  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  ５１  ：  ６３‐７４
【非特許文献１０】Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ，  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｌｉｑｕｉｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅａｌ  ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１‐  （７‐３６）  ａｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  （ｎｏｎ‐ｉｎｓｕｌｉｎ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８１  ：  ３２７‐３３２
【非特許文献１１】Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐ｌ‐  （７‐３７）  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．  １５  ：  ２７０‐２７６
【非特許文献１２】Ｄｅ  Ｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＧＬＰ‐１  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  ｏｌｄ  ｒａｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ．  Ｊ．  Ｇｅｒｏｎｔ．  ５２  ：  Ｂ２４５‐２４９
【非特許文献１３】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ＲＩＮ  １０４６‐３８  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １３６  ：  ４９１０‐４９１７
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  ＧＩＰ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ，  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｓ，  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＩＮ  １０４６‐３８  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｅｎｄｏ．  １１６  ：  ８１‐８７
【非特許文献１５】Ｔｈｏｒｅｎｓ．  １９９２．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏ‐ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９  ：  ８６４１‐８６４５
【非特許文献１６】Ｏｒｓｋｏｖ．  １９９２．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１，  ａ  ｎｅｗ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｔｅｒｏ‐ｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  ３５  ：  ７０１‐７１１
【非特許文献１７】Ｄｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ‐ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８４  ：  ３４３４‐３４３８
【非特許文献１８】Ｆｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｎｅｒ．  １９９２．  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  （７‐３７）  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ  ＢＴＣ‐１  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０  ：１５９‐１６６
【非特許文献１９】Ｍｏｎｔｒｏｓｅ‐Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＩＮ  １０４６‐３８  ｃｅｌｌｓ  ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １３５  ：  ５８９‐５９４
【非特許文献２０】Ｆｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ‐Ｉ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ‐Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．  １６  ：  ３９０‐４１０
【非特許文献２１】Ｗｉｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐Ｉｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  （ＧＬＰ‐１）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ＧＬＰ‐１  ａｎｄ４‐ｐｈｏｒｂｏｌ  １２‐Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３‐ａｃｅｔａｔｅ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １０  ：  ６２‐７５
【非特許文献２２】Ｖａｌｖｅｒｄｅ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ‐Ｐｅｎａｃａｒｒｉｌｌｏ．  １９９６．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＧＬＰ‐１  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ，  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｆａｔ．  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  １５７  ：  ３５９‐３６０
【非特許文献２３】Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｅｘｅｎｄｉｎ‐４  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｅｘｅｎｄｉｎ‐  （９‐３９）  ‐ａｍｉｄｅ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ＧＬＰ‐ｌ‐  （７‐３６）  ‐ａｍｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ‐ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｓ‐ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８；  １９６５０‐１９６５５
【非特許文献２４】Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｃｋｅｒ．  １９９７．  Ｔｉｓｓｕｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｃｏｄｅ  ｐｒｏ‐ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｒ  ｅｘｅｎｄｉｎ‐４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｚａｒｄ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２  ：  ４１０８‐４１１５
【非特許文献２５】Ｔｈｏｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＬＰ‐１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ：  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ‐４  ｉｓ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ｅｘｅｎｄｉｎ‐３  （９‐３９）  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ４２  ：  １６７８‐１６７２
【非特許文献２６】Ｒｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ，  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ，  ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎｏｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＧＬＰ‐１  ［７‐３６  ａｍｉｄｅ］  ａｆｔｅｒ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．  Ｄｏｓｅ‐ｒｅｓｐｏｎｓｅ‐ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  ３８  ：７２０‐７２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、非インスリン産生細胞と、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４に実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子とを接触させる工程を包含するプロセスにより作製されるインスリン産生細胞の集団を提供することによって、先行技術の有する上記の問題を克服または低減することである。さらに、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞へと分化させる方法が提供され、この方法は、非インスリン産生細胞と、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４に実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントとを接触させる工程を包含する。さらに、インスリン産生細胞の細胞集団を富化する方法が提供され、この方法は、細胞集団と、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する増殖因子とを接触させる工程を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１型糖尿病と診断された被験体において糖尿病を処置する方法もまた提供される。この方法は、少なくとも２４時間にわたる連続注入によって、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４に実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子を被験体に投与する工程を包含する。本発明はさらに、被験体における糖尿病を処置する方法を提供することにより先行技術を克服し、この方法は、以下を包含する：処置される被験体またはドナーから非インスリン産生細胞を得る工程；この非インスリン産生細胞と、上記の増殖因子とを接触させ、このことにより、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する工程；および非インスリン産生細胞から分化するように促進されたインスリン産生細胞を、糖尿病被験体に投与する工程を包含する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、非インスリン産生細胞を、グルカゴン様ペプチド−１（「ＧＬＰ−１」）、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、または関連したペプチドと接触させることにより、非インスリン産生細胞から分化したインスリン産生細胞の集団に関するものであり、さらに、インスリン産生細胞を得るための方法、および真性糖尿病の処置における治療的用途にも関するものである。それゆえ、本発明は、糖尿病の効果的な処置を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、３ヶ月齢および２２ヶ月齢の動物における血漿インスリンレベルを示す。ＧＬＰ−１（０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、絶食させ、麻酔した動物の静脈内に与えた。結果は、各年齢群中、６匹の動物の平均（±ＳＥＭ）である。
【図２】図２は、３ヶ月齢および２２ヶ月齢の動物におけるグルコース負荷（１ｇ／ｋｇ）の間の血漿グルコースレベルを示す。ＧＬＰ−１処置高齢動物には、１．５ｐｍｏｌ／ｋｇ／分で４８時間にわたる皮下注入により与えた。他のすべての動物には、４８時間にわたり生理食塩水を注入した。グルコース（１ｇ／ｋｇ）をｉｐにより与え、そして血糖を、示した時点で測定した。結果は、６匹の処置動物および６匹のコントロール動物の平均（±ＳＥＭ）である。０〜３０分からの分散の反復測定値分析は、ｐ＜０．０５という値を示した。コントロール若齢動物対コントロール高齢動物およびＧＬＰ−１処理対コントロールの高齢動物については、独立スチューデントｔ検定により決定されるように、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１である。
【図３】図３は、２２ヶ月齢の動物における腹腔内グルコース負荷（１ｇ／ｋｇ）の間の血漿グルコースレベルを示す。ＧＬＰ−１処置動物には、１．５ｐｍｏｌ／ｋｇ／分で４８時間にわたる皮下注入により与えた。コントロールには、生理食塩水を注入した。グルコース（１ｇ／ｋｇ）をｉｐにより与え、そして血清インスリンを、示した時点で測定した。結果は、６匹の処置動物および６匹のコントロール動物の平均（±ＳＥＭ）である。０〜３０分までの分散の反復測定値分析は、ｐ＜０．０５という値を示した。アスタリスクは、独立スチューデントｔ検定により決定されるように、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１である。
【図４】図４は、２２ヶ月齢ラットでの生理食塩水（コントロール、７匹の動物）またはＧＬＰ−１（１．５ｐｍｏｌ／ｋｇ／分、７匹の動物）の注入して４８時間後の島インスリン含量の増加倍数を示す。独立スチューデントｔ検定により**ｐ＜０．０１である。
【図５】図５は、コントロール、ＧＬＰ−１処理、Ｅｘ＋ＧＬＰ−１処理、およびＥｘ処理した２２ヶ月齢の動物由来の膵臓におけるインスリンｍＲＮＡレベルを示す。各サンプルは、個々の膵臓を表す（各処置群において４匹の動物を用いる）。４８時間にわたる通常生理食塩水（Ｃ）、ＧＬＰ−１（Ｇ）、ＧＬＰ−１＋Ｅｘｅｎｄｉｎ［９−３９］（Ｇ＋Ｅ）、およびＥｘｅｎｄｉｎ［９−３９］（Ｅ）での処理の、若齢および高齢の動物における膵臓ポリＲＮＡの投与方法を用いる、インスリンｍＲＮＡレベル、ＧＬＵＴ２、およびグルコキナーゼに対する効果を示す。ｃＤＮＡの蛋白コード領域ハイブリダイゼーションの画像をデンシトメトリーを用いて定量し、そしてポリＡのハイブリダイゼーションの画像で正規化した。データを、独立スチューデントｔ検定により、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１という値を割り当てたコントロールデータを用いて平均±ＳＥＭ（１群につき６匹の動物）として示す。
【図６】図６は、コントロール、ＧＬＰ−１処理、Ｅｘ＋ＧＬＰ−１処理、およびＥｘ処理した２２ヶ月齢の動物由来の膵臓におけるＧＬＵＴ２  ｍＲＮＡレベルを示す。個々の膵臓を表す（各処置群において４匹の動物を用いる）。４８時間にわたる皮下注入により処理された若齢および高齢のラットにおける総膵臓ＲＮＡ由来のインスリンｍＲＮＡのスロットブロット分析（Ｃ、通常生理食塩水を与えたコントロール動物；Ｇ、ＧＬＰ−１；Ｇ＋Ｅ、ＧＬＰ−１およびＥｘｅｎｄｉｎ［９−３９］を同時に与えた；Ｅ、Ｅｘｅｎｄｉｎ［９−３９］単独）を示す。各スロットは、個々の膵臓を示す。このブロットを、図５における分析に使用した。
【図７】図７は、コントロール、ＧＬＰ−１処置した、Ｅｘ＋ＧＬＰ−１処置した、およびＥｘ処置した２２月齢動物由来の膵臓におけるグルコキナーゼｍＲＮＡを示す。高齢動物の総膵島ＲＮＡ由来のインスリン、ＧＬＵＴ２、およびグルコキナーゼ（ＧＫ）ｍＲＮＡのスロットブロット分析の結果である。各サンプルは、個々の膵臓を表し、各処置群中に４匹の動物を有する。各ｍＲＮＡについて、上のパネル（Ｃ）は、通常の生理食塩水で処理された動物を示し、下のパネルは、ＧＬＰ−１（Ｇ）で４８時間処理された動物を示す。各スロットは、別々の島調製物由来である。
【図８】図８は、１００μｌ  ＮａＣｌ中のＧＬＰ−１（０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）の静脈内（ｉｖ）ボーラス後の、絶食し麻酔されたラットにおける血漿のインスリン濃度を示す。ＮａＣｌ（１００μｌ）もまた、コントロール群に対してｉｖで与えた。値を、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝６／群）。
【図９】図９は、示された濃度におけるｅｘｅｎｄｉｎ−４の静脈内ボーラスの２分後の、絶食し麻酔されたラットにおけるインスリン濃度を示す。値を、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝６／ｅｘｅｎｄｉｎ−４濃度）。
【図１０】図１０は、ランゲルハンス島中の細胞内ｃＡＭＰレベルに対する、ＧＬＰ−１（１ｎＭ）およびｅｘｅｎｄｉｎ−４（１ｎＭ）の１時間の処理の効果を示す。４回の実験の平均±ＳＥＭを示し、各々を三連で行った。ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１よりも、より有効であった（ｐ＜０．０１）。ペプチドの存在下での時間後に緩衝液中でいくつかの島を洗浄し、次いで、約１５分後にこの島を取り出した後、ｃＡＭＰレベルがベースラインに戻ったことに留意すること。
【図１１】図１１は、前回の床敷交換の２４時間後、毎日、腹腔内にｅｘｅｎｄｉｎ−４（２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはＮａＣｌを用いる処置の９週間後に得られた、糖尿病マウスを飼育する籠の写真を示す。糖尿病マウスを、１つの籠あたり２匹飼育した。床敷を、処置の最初の数週間後の糖尿病動物について、２４時間毎に交換した。右の籠には、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した動物を入れ、一方、左の籠には、ＮａＣｌで処置した動物を入れだ。
【図１２】図１２は、１２〜１３週間、毎日、腹腔内にｅｘｅｎｄｉｎ−４（２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）または通常の生理食塩水のいずれかを与えられた、糖尿病マウスまたは非糖尿病マウスにおけるヘモグロビンＡｌｃのレベルを示す。値を、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９〜１０／群）。
【図１３】図１３は、１２〜１３週間、毎日、腹腔内にｅｘｅｎｄｉｎ−４（２４ｎｍｏｌ／ｋｇ）または通常の生理食塩水のいずれかを与えられた、糖尿病マウスまたは非糖尿病マウスにおける、絶食時のグルコースまたはインスリン濃度を示す。値を、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝９〜１０／群）。
【図１４】図１４は、ＡＲ４２Ｊ細胞からのアミラーゼ放出のＣＣＫ濃度−応答曲線を示す。細胞を、５０分間、示される濃度においてＣＣＫで処理した。アミラーゼの値を、細胞のアミラーゼ活性全体に対する、培地中に放出されたアミラーゼの割合として表す。結果は、１５回の実験の平均±ＳＥＭである。
【図１５】図１５は、ＡＲ４２Ｊ細胞からのアミラーゼ放出に対する、グルカゴン（１０ｎＭ）、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）、およびインスリン（１００ｎＭ）±ＣＣＫ（１ｎＭ）の効果を示す。デキサメタゾン誘導ＡＲ４２Ｊ細胞を、ホルモンの存在下で５０分間インキュベートした。アミラーゼの値を、細胞のアミラーゼ活性全体に対する、培地中に放出されたアミラーゼの割合として表す。結果は、２０回の実験の平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、処理対非処理、ａ＝ｐ＜０．０１である。
【図１６】図１６は、ＡＲ４２Ｊ細胞からのアミラーゼ放出に対する、８−ブロモ−ｃＡＭＰ（１００ｎＭ）での５０分の処理の効果を示す。アミラーゼの値を、細胞のアミラーゼ活性全体に対する、培地中に放出されたアミラーゼの割合として表す。結果は、３回の実験の平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、処理対非処理である。
【図１７】図１７は、ＡＲ４２Ｊ細胞からのアミラーゼ放出に対する、ＣＣＫの存在下または非存在下におけるリアノジン（ＲＹ）およびタプシガーギン（ＴＧ）の効果を示す。アミラーゼの値を、細胞のアミラーゼ活性全体に対する、培地中に放出されたアミラーゼの割合として表す。ＲＹおよびＴＧを添加し、３０分後にＣＫＫを添加し、次いでＣＣＫを５０分間添加した。結果は、３回の実験の平均±ＳＥＭ、**ｐ＜０．０１である。
【図１８】図１８は、ＡＲ４２Ｊ細胞からのＣＣＫ（１ｎＭ）媒介性アミラーゼ放出に対する、バナジン酸塩（１ｍＭ）（白三角）およびゲニステイン（ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ）（３００μＭ）（黒丸）の作用の時間経過を示す。ＣＣＫ処理（１ｎＭ）（白丸）細胞またはコントロール（非処理）（白四角）細胞由来のアミラーゼ放出もまた、示す。アミラーゼの値を、細胞のアミラーゼ活性全体に対する、培地中に放出されたアミラーゼの割合として表す。結果は、４回の実験の平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、バナジン酸塩またはゲニステインならびにＣＣＫ処理対ＣＣＫ処理単独である。
【図１９】図１９は、単一ＡＲ４２Ｊ細胞中で細胞内に遊離した［Ｃａ2+］iに対する、ＣＣＫの効果を示す。棒は、３つの異なる細胞中での１０ｎＭ  ＣＣＫに対する曝露の時間を示す。図１９Ａは、少なくとも８５％の細胞において観察される代表的な［Ｃａ2+］i応答を示す。図１９Ｂは、ＣＣＫに対する［Ｃａ2+］i応答が、１０μＭ  リアノジン（ＲＹ）および５００ｎＭ  タプシガーギン（ＴＧ）への６０分の曝露後にほぼ完全に消滅したことを示す。図１９Ｃは、［Ｃａ2+］i一過性が、ＣＣＫへの曝露の間の細胞外Ｃａ2+の減少によって短縮されることを示す。
【図２０】図２０は、単一ＡＲ４２Ｊ細胞における、［Ｃａ2+］iおよびＣＣＫ誘導［Ｃａ2+］iの一過性に対するＧＬＰ−１の効果を示す。同じ細胞を、Ａ〜Ｃにおいて研究した。図２０Ａは、１ｎＭ  ＧＬＰ−１への曝露が、約５０％のＡＲ４２Ｊ細胞において小さく、緩慢な、長期の［Ｃａ2+］i一過性を誘導したことを示す。１０ｎＭ  ＣＣＫへの続く曝露の振幅における減少を、図２０Ｂに示す。図２０Ｃは、［Ｃａ2+］i一過性の振幅が、１０分未満のうちに適用されるＣＣＫへの２回目の曝露に応答してさらに減少したことを示す。
【図２１】図２１は、単一ＡＲ４２Ｊ細胞における、［Ｃａ2+］iに対するグルカゴンおよび８−ブロモ−ｃＡＭＰ（８ＢｃＡＭＰ）の効果を示す。図２１Ａは、グルカゴン（１０ｎＭ）が、約７０％の細胞において小さく、緩慢な、長期の［Ｃａ2+］i一過性を誘導したことを示す。図２１Ｂは、１０ｎＭ  グルカゴンで３〜１０分間処理した細胞において、１０ｎＭ  ＣＣＫによって誘導された引き続く［Ｃａ2+］i一過性が、遅い速度上昇ならびに長期の緩和相を示したことを示す。図２１Ｃは、１００ｎＭ  ８ＢｃＡＭＰへの短時間（１〜５分）の曝露が、ＣＣＫ誘導［Ｃａ2+］i一過性の緩和を弱くしたことを示す。
【図２２】図２２は、ＡＲ４２Ｊ細胞における細胞内ｃＡＭＰレベルに対する、５０分間のＧＬＰ−１（１０ｎＭ）、グルカゴン（１０ｎＭ）およびＣＣＫ（１ｎＭ）の処理±ＩＢＭＸ（１００ｎＭ）の効果を示す。結果は、３回の実験の平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５である。
【図２３】図２３は、ＡＲ４２Ｊ細胞およびラット膵臓におけるＧＬＰ−１レセプターのＲＴ−ＰＣＲを示す。ｃＤＮＡを、ラット膵臓ＧＬＰ−１レセプターの５’末端および３’末端におけるプライマーを使用して３０サイクルの間増幅した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で分離し、そして臭化エチジウムを使用して可視化した。左から右へ；レーン１、ＤＮＡマーカー；レーン２、ブランク；レーン３、ＡＲ４２Ｊ細胞；レーン４、ラット膵臓；レーン５、水コントロール。レレーン３および４において、本発明者らは、ＧＬＰ−１レセプターに対応する、予測された９２８ｂｐのバンドを観察する。
【図２４】図２４は、ＡＲ４２Ｊ細胞（レーン１、２）およびＲＩＮ  １０４６−３８細胞（レーン３、４）におけるＧＬＰ−１レセプター発現のウエスタンブロット分析を示す。細胞を可溶化し、そしてＧＬＰ−１レセプターを、ＧＬＰ−１レセプターのアミノ末端に対する抗体での免疫沈降およびウエスタンブロッティング後に検出した。ｋＤａでの分子量マーカーの位置は、右にある。６５および４６ｋＤａのバンドは、それぞれ、成熟およびコアグリコシル化（ｃｏｒｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＧＬＰ−１レセプターに対応することが示された（２８）。
【図２５】図２５は、種々の刺激に応答してのＡＲ４２Ｊ細胞におけるタンパク質のチロシンリン酸化を示す。示される（ｎ＝３）ように、未処理（コントロール）細胞および５分処理細胞由来の総細胞性タンパク質の例示的抗ホスホチロシンイムノブロット。ＣＣＫおよびフッ素化ナトリウム（ＮａＦ）によるチロシンリン酸化の増加である、４６ｋＤａ、６６ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび１９０ｋＤａのバンドに注意のこと。ＧＬＰ−１は、これらのタンパク質に対していかなる効果も有さなかった。インスリンは、リン酸化の増加である９７ｋＤａのバンドを生じた。このバンドは、インスリンレセプターβサブユニットに対応する。
【図２６】図２６は、ＡＲ４２Ｊ細胞の免疫細胞学を示す。ＡＲ４２Ｊ細胞を、グルタルアルデヒドで固定し、そしてＬｉｎｃｏ由来の抗インスリン抗体または抗グルカゴン抗体とともに１：３００希釈でインキュベートした。図２６Ａは、コントロールＡＲ４２Ｊ細胞、抗インスリン抗体を示す。図２６Ｂは、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）処理細胞（４８時間）、抗インスリン抗体を示す。図２６Ｃは、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）処理ＡＲ４２Ｊ細胞（７２時間）、抗インスリン抗体を示す。図２６Ｄは、ＲＩＮ  １０４６−３８インスリノーマ細胞、抗インスリン抗体を示す。図２６Ｅは、コントロール細胞、抗グルカゴン抗体を示す。図２６Ｆは、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）処理細胞（４８時間）、抗グルカゴン抗体を示す。
【図２７】図２７は、ＡＲ４２Ｊ細胞におけるＧＬＰ−１（１０ｎＭ）産生によるグルカゴンおよびインスリンの誘導に対する、時間の効果を示す。この実験のために、細胞を、本明細書中に記載のようにカバーガラス上にプレートした（全て同じ日）。次に、これらのカバーガラスを、示す日に抗インスリン抗体または抗グルカゴン抗体で染色した。ここで、これを異なる日に多数回（少なくとも５回）反復した。そしてインスリンおよびグルカゴンは既に存在している。
【図２８】図２８は、ＲＴ−ＰＣＲを使用する、インスリンおよびグルカゴンのｍＲＮＡの発現を示す。図２８Ａは、１８７ｂｐのインスリンｍＲＮＡを示す。図２８Ｂは、２３６ｂｐのグルカゴンｍＲＮＡを示す。ＧＬＰ−１（１ｎＭ）処理は、３日間であった。
【図２９】図２９は、１つの例示的実験から、ＡＲ４２Ｊ細胞におけるプロテインキナーゼＣインヒビターの存在下または非存在下での、ＧＬＰ−１およびｅｘｅｎｄｉｎ−４の効果を示す。この実験を、３回反復した。図２９Ａは、オートラジオグラムであり、そして図２９Ｂは、デンシトメトリーの読み（相対単位）を示す。細胞を、６０ｍｍディッシュ中に密度１０5／ウェルでプレートし、溶解させ、次いで、清澄化した溶解産物を、抗ＥＲＫ抗体を用いて免疫沈降した。この免疫ペレットを、本明細書中に記載されるように、ＥＲＫ活性について分析した。レーン１、コントロールＡＲ４２Ｊ細胞。レーン２、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）処理ＡＲ４２Ｊ細胞（３日間）。レーン３、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１ｎＭ）処理細胞（３日間）。レーン４、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）＋ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１ｎＭ）処理細胞（３日間）。レーン５、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）＋ｅｘｅｎｄｉｎ−４＋ＰＫＩ（３００μＭ）処理細胞（３日間）。レーン６、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１）＋ＰＫＩ（３００μＭ）処理細胞（３日間）。レーン７、ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）＋ＰＫＩ（３００μＭ）処理細胞（３日間）。ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１ｎＭ）は、ほぼＧＬＰ−１（１０ｎＭ）と等価であることに注意のこと。
【図３０】図３０は、デキサメタゾン処理ＡＲ４２Ｊ細胞からのアミラーゼ放出に対する、ＧＬＰ−１の用量依存性効果を示す。異なる濃度のＧＬＰ−１での３日間の処理後、ＡＲ４２Ｊ細胞を洗浄し、そして１ｎＭ  ＣＣＫを添加した。この細胞を、さらに５０分間インキュベートし、そしてサンプルをアミラーゼアッセイ用に収集した。Ｎ＝４、平均±ＳＥＭ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」は、１つ以上を意味し得る。
【００２０】
本発明は、以下の工程を包含するプロセスにより作製される、インスリン産生細胞の集団を提供する：非インスリン産生細胞を、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、実質的にこれらと相同であるアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と接触させる工程。以前には、ＧＬＰ−１レセプターを有すると考えられておらず、そしてインスリンを産生し得ると考えられていなかった非インスリン産生細胞（一次腺房細胞、腺房細胞株（例えば、ＡＲ４２Ｊ）、および幹細胞を含む）は、ＧＬＰ−１およびＥｘｅｎｄｉｎ４、実質的にこれらと相同であるアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントに対して、インスリン産生細胞へと分化することによって応答し得る。この効果は、インスリン産生細胞の数を増大することであり、これは、真性糖尿病の処置において望ましい効果である。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「インスリン産生細胞」とは、インスリンを、構成的様式または誘導性様式で、合成する（すなわち、インスリン遺伝子を転写し、プロインスリンｍＲＮＡを翻訳し、そしてこのプロインスリンｍＲＮＡをインスリンタンパク質へと修飾する）か、発現する（すなわち、インスリン遺伝子により保有される表現型特性を明らかにする）か、または分泌する（細胞外空間へとインスリンを放出する）、細胞を包含する。公知のインスリン産生細胞の例としては、β細胞が挙げられる。このβ細胞は、インビボで膵島に位置する。インスリンを分泌するために、インスリン産生細胞はまた、ＩＤＸ−１を発現しなければならない。
【００２２】
本発明により産生されたインスリン産生細胞の集団は、本発明の方法の使用を伴わずにインスリンを産生する細胞（例えば、β細胞）または他の細胞型を含み得る。本発明の組成物および方法の新規性は、インスリンを自然に産生する集団の細胞（例えば、β細胞）の存在によって否定されない。インスリン産生細胞の集団はまた、非インスリン産生細胞も含み得ることもまた、意図される。
【００２３】
「非インスリン産生細胞」とは、構成的または誘導的にインスリンを自然に合成せず、発現せず、もしくは分泌しない、いかなる細胞をも意味する。従って、本明細書中にて使用される用語「非インスリン産生細胞」は、β細胞を除外する。本発明の方法において使用され得る非インスリン産生細胞の例は、アミラーゼ産生細胞、腺房細胞、管状（ｄｕｃｔａｌ）腺癌細胞株の細胞（例えば、ＣＤ１８、ＣＤ１１、およびＣａｐａｎ−Ｉ細胞（Ｂｕｓｉｋら、１９９７；Ｓｃｈａｆｆｅｒｔら、１９９７を参照のこと）のような膵臓性非β細胞、ならびに幹細胞を含む。非膵臓性細胞（例えば、非膵臓性幹細胞および他の内分泌器官の細胞または外分泌器官の細胞（例えば、下垂体性細胞が挙げられる））もまた使用され得る。この非インスリン産生細胞は哺乳動物細胞であり得るか、またはさらにより具体的にはヒト細胞であり得る。哺乳動物の、膵臓性非島細胞、膵臓性アミラーゼ産生細胞、膵臓腺房細胞、および幹細胞を使用する本発明の方法の例を、本明細書中に提供する。幹細胞は、ＩＤＸ−１、Ｂｅｔａ  ２／ＮｅｕｒｏＤおよびＥ４７を生産するように促進された膵臓性幹細胞および非膵臓性幹細胞を包含し得る。膵臓性幹細胞は、島細胞および腺房細胞の両方を生じる管上皮前駆細胞を含む。
【００２４】
非インスリン産生細胞は、インスリン産生細胞へと分化させるために、ＧＬＰ−１レセプターまたは実質的にＧＬＰ−１レセプターと類似するレセプターを有さなければならない。好ましくは、この非インスリン産生細胞はまた、増殖因子との接触において、細胞内カルシウムの増加およびＥＲＫ／ＭＡＲＫ活性およびＰＫＣの活性化を示し得る。
【００２５】
本願にて使用される場合、「増殖因子」は、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞へと分化させ得る物質を意味する。好ましくは、この増殖因子は、インスリン産生性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）増殖因子の群のうちの１つであり、例えば、ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、βセルリン、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＳＦ）、およびアクチビン−Ａまたはそれらの組合わせが挙げられるが、βセルリンおよびアクチビンＡの一緒の使用ならびにＨＳＦおよびアクチビン−Ａの一緒の使用は除外する。好ましくは、この増殖因子との接触において、１０％よりも多くの非インスリン産生細胞がインスリン産生細胞に分化し、そして、より好ましくは、少なくとも、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％またはそれ以上の非インスリン産生細胞が、インスリン産生細胞に分化する。従って、本方法に従ってインビトロにて生成されるインスリン産生細胞の集団は、１１％程度の少なさおよび１００％までのインスリン産生細胞を包含し得る。
【００２６】
ＧＬＰ−１またはｅｘｅｄｉｎ−４に「実質的に相同なアミノ酸配列」とは、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化する能力に関して、機能的活性の消失をほとんど伴わずに、ＧＬＰ−１またはｅｘｅｄｉｎ−４と比較した場合に、ＧＬＰ−１またはｅｘｅｄｉｎ−４のアミノ酸配列において一個以上の付加的アミノ酸、アミノ酸の欠失、または置換を含む、ポリペプチドを意味する。例えば、その欠失は、ここに定義されている分化活性に必要不可欠でないアミノ酸から成り得、そして置換（一個または複数）は保存的であり得る（すなわち、塩基性、親水性または疎水性のアミノ酸が同じ性質をもつアミノ酸に代えて置換される）。従って、所望される場合、修飾および変化がＧＬＰ−１およびＥｘｅｄｉｎ−４のアミノ酸配列にてなされ得、そして類似した特徴を有するタンパク質がなお得られ得ることが、理解される。従って、生物学的な有用性または活性の消失をほとんど伴わず、そしておそらくそのような有用性または活性の増加を伴う種々の変化が、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列またはＥｘｅｄｉｎ−４のアミノ酸配列（または下線を引いた核酸配列）においてなされ得ることが意図される。  本明細書にて使用される用語「フラグメント」とは、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｄｉｎ−４またはこれらに実質的に相同的なアミノ酸配列を有する増殖因子に関して、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｄｉｎ−４またはそれらに実質的に相同的なアミノ酸配列を有する増殖因子のいずれかの、少なくとも五個連続したのアミノ酸のポリペプチド配列を意味し、ここでそのポリペプチド配列は、本明細書にて記載されるようなＧＬＰ−１およびＥｘｅｄｉｎ−４の分化機能を有する。このフラグメントは、抗原性、ＧＬＰ−１レセプターへの結合、ＤＮＡ結合（転写因子の場合のように）、ＲＮＡ結合（ＲＮＡの安定性または分解を調節する場合のように）を含み得るさらなる機能を有し得る。ＧＬＰ−１の活性フラグメントとしては、例えば以下が挙げられる：ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド。
【００２７】
【化１】
2011177181.tif 000002
【００２８】
ＧＬＰ−１の他のフラグメントおよび改変された配列は当該分野にて既知である（米国特許Ｎｏ．５，６１４，４９２；米国特許Ｎｏ．５，５４５，６１８；欧州特許出願、公報Ｎｏ．ＥＰ０６５８５６８Ａｌ；ＷＯ９３／２５５７９）。ｅｘｅｎｄｉｎ−４の類似したフラグメントおよび改変された配列が、容易に推定され得る。ＧＬＰ−１（上付き文字の残基番号）およびｅｘｅｄｉｎ−４（括弧書きかつ上付き文字の残基番号）内の以下の残基がフラグメントに含まれるべきであることが予期される。なぜならこれらの残基は、高度に保存されており、そしてレセプター結合に重要であるためである：Ｈ7(1)、Ｇ10(4)、Ｆ12(6)、Ｔ13(7)、Ｄ15(9)。従って、さらなるフラグメントまたは改変された配列が、これら５個以外のＧＬＰ−１およびｅｘｅｎｄｉｎ−４のアミノ酸を除外または変更して容易に生成され得る。本明細書にて開示されている分化活性を評価するのは容易であるため、フラグメントが本発明の範囲内であることの決定は、慣用的である。
【００２９】
本発明は、本明細書中に記載の方法によって作製されるインスリン分泌細胞の集団を提供する。ＩＤＸ−１発現は、細胞からのインスリン分泌に必要とされるので、インスリン分泌細胞を作製するために使用され得る非インスリン産生細胞は、構成的にか、または増殖因子での刺激の際にか、あるいは非インスリン産生細胞の増殖因子での処理前、処理の間または処理後にＩＤＸ−１をコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることによって、ＩＤＸ−１を発現する細胞を含むべきである。
【００３０】
本発明はまた、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化させ得る増殖因子を提供する。このような増殖因子としては、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、またはそれらに実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。分化は、非インスリン産生細胞の増殖因子との接触の際に、インビボまたはインビトロで生じ得る。この接触は、ボーラスによって１度であり得るか、連続注入によって１度であり得るか、またはボーラスまたは連続注入によって繰り返され得る。
【００３１】
本発明はまた、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化させる増殖因子のスクリーニング方法を提供する。より詳細には、このスクリーニング方法は、以下の工程を包含する：（１）スクリーニングされるべき増殖因子と非インスリン産生細胞とを接触させる工程、（２）インスリン産生細胞の特徴について、この非インスリン産生細胞を評価する工程、および（３）非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化させる増殖因子を同定する工程。インスリン産生細胞の好ましい特徴としては、インスリン遺伝子を転写する能力、インスリンｍＲＮＡを翻訳する能力、インスリンを放出または分泌する能力、インスリンを貯蔵する能力、グルコースレベルを感知する能力、および調節様式でインスリンを放出する能力が挙げられる。転写因子ＩＤＸ−１、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤおよびＥ４７の発現は、インスリンの産生に必要であると考えられるので、これらの因子はまた、本発明のインスリン産生細胞において、代表的に発現される。
【００３２】
「接触させる」とは、生理学的に有効なレベルの物質に対する、細胞の細胞外表面の曝露の例を意味する。細胞は、例えば、増殖因子を培養培地に添加すること（連続注入によるか、ボーラス送達によるか、またはその培地を増殖因子を含む培地に変更することによる）によって、あるいはインビボで増殖因子を細胞内液体に添加すること（局所送達、全身性送達、静脈内注射、ボーラス送達、または連続注入による）によって、増殖因子に接触され得る。細胞または細胞の群との「接触」の継続時間は、その物質（この場合では、増殖因子）が、培地中または細胞を浴する細胞外液体中で生理学的に有効なレベルで存在する時間によって、決定される。ＧＬＰ−１は、数分の短い半減期を有し、そしてＥｘｅｎｄｉｎ−４の半減期は、実質的により長く、数時間のオーダーである。従って、ＧＬＰ−１のボーラスは、数分間の細胞との接触を有するが、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のボーラスは、数時間細胞に接触する。
【００３３】
本発明の方法における接触工程は、インビトロで行われ得る。例えば、移植プロトコルにおいて、当該分野で周知の標準的なプロトコル（Ｇｒｏｍａｄａら、１９９８を参照のこと）に従って、エキソビボ方法が使用され得、その結果、非インスリン産生細胞は、ドナー（例えば、処置される被験体）から除去され、そして体外で維持される。体外で維持される間、細胞は、増殖因子と接触され得、そして細胞は、その後、当該分野で周知の方法を使用して、ドナー被験体またはドナー被験体とは異なる被験体内に、注入（例えば、受容可能なキャリア中で）または移植され得る。
【００３４】
あるいは、本発明の接触工程は、インビボで行われ得る。ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４または関連の増殖因子を投与するための方法が、本明細書中に提供される。ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４または関連の増殖因子は全身的に投与され、これには、例えば、以下によるものが含まれる：ポンプ、静脈内ライン、またはボーラス注射（Ｇｕｔｎｉａｋら、１９９２；欧州特許出願公開番号０６１９３２２  Ａ２；米国特許第５，６１４，４９２号；米国特許第５，５４５，６１８号）。ボーラス注射は、皮下経路、筋肉内経路または腹腔内経路を含み得る。
【００３５】
非インスリン産生細胞は、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、それらに実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、あるいはそれらのフラグメントとの約２４時間の接触後に、インスリン産生細胞に分化し始める。最大数の細胞のインスリン産生細胞への分化は、通常は、約７日の接触後に生じた。興味深いことに、新しいインスリン産生細胞は、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、そのフラグメントあるいは関連する増殖因子との接触が中断された後でさえ、インスリンを産生する能力を示し続ける。新しいインスリン産生細胞は、接触が中断された後少なくとも２週間まで、インスリンを産生する能力を示す。
【００３６】
従って、この接触工程は、代表的に少なくとも２４時間である。「少なくとも２４時間」とは、２４時間以上を意味する。詳細には、非インスリン産生細胞は、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０時間から、３、４、５、６、７日またはそれを越える日数の間、あるいは上記範囲内で数時間または数分の任意の特定の介入時間、増殖因子と接触され得る。好ましくは、非インスリン産生細胞は、７日間増殖因子と接触される。
【００３７】
本発明のインビボまたはインビトロの方法およびプロセスにおいて使用されるべき、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、それらの活性なフラグメントあるいは関連する増殖因子の用量は、好ましくは、連続投与について、約１ｐモル／ｋｇ／分〜約１００ｎモル／ｋｇ／分、およびボーラス注射について、約１ｎモル／ｋｇ〜約４０ｎモル／ｋｇの範囲である。好ましくは、インビトロ方法におけるＧＬＰ−１の用量は、１０ｐモル／ｋｇ／分〜約１００ｎモル／ｋｇ／分、およびインビボ方法において、約０．００３ｎモル／ｋｇ／分〜約４８ｎモル／ｋｇ／分である。より好ましくは、インビトロ方法におけるＧＬＰ−１の用量は、約１００ピコモル／ｋｇ／分〜約１０ナノモル／ｋｇ／分、およびインビボ方法において、約０．０３ナノモル／ｋｇ／分〜約４．８ナノモル／ｋｇ／分の範囲である。インビトロ方法におけるＥｘｅｎｄｉｎ−４の好ましい用量は、１ｐモル／ｋｇ／分〜約１０ｎモル／ｋｇ／分、およびインビボにおいて、ボーラス注射について約１ｐモル／ｋｇ〜約４００ｐモル／ｋｇである。インビトロ方法におけるＥｘｅｎｄｉｎ−４のより好ましい用量は、約１０ｐモル／ｋｇ／分〜約１ｎモル／ｋｇ／分、およびインビボにおいて、ボーラス注射について約１０ｐモル／ｋｇ〜約４０ｐモル／ｋｇの範囲である。
【００３８】
ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と、非インスリン産生細胞とを接触させることを包含する、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に分化させる方法が提供される。「非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に分化させること」により、影響を受けた細胞が、少なくとも、インスリンを産生する表現型特徴を有するような、非インスリン産生細胞の表現型の特徴における変化が意味される。影響を受けた細胞は、β細胞の表現型特徴の全てを有し得るか、あるいはβ細胞の表現型の特徴の全て未満を有し得る。影響を受けた細胞は、インスリンを産生し得るが、それ以外に非インスリン産生細胞の表現型の特徴を維持し得る。例えば、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４と接触された非インスリン産生細胞（例えば、膵アミラーゼ産生細胞（すなわち、膵臓の腺房細胞））、アミラーゼを発現し続け得るが（アミラーゼ産生細胞の典型）、代表的なアミラーゼ産生細胞とは異なり、インスリンもまた産生する。従って、完全な表現型の変化と単一の表現型の変化との間の連続性が可能である。実施例は、インスリン産生能が成熟した非インスリン産生細胞（例えば、腺房細部）に対して付与され得るという驚くべき結果を示す。非インスリン産生細胞の増殖の増加は、インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化に先行し得、そして「分化」は、インスリン産生の表現型への細胞の変化を伴う任意の増殖を除外することを意味しない。
【００３９】
インスリンの分泌におけるＩＤＸ−１、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤ、およびＥ２７の重要性のために、本発明はまた、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、または同様の増殖因子と非インスリン産生細胞とを接触させる前に、ＩＤＸ−１、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤ、および／またはＥ２７をコードする核酸を、非インスリン産生細胞にトランスフェクトするさらなる工程を包含する、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に分化させる方法を提供する。あるいは、さらなる工程は、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、あるいは同様の増殖因子と既に接触された細胞に、ＩＤＸ−１、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤ、および／またはＥ２７をコードする核酸をトランスフェクトすることを包含し得る。この接触された細胞がインビボである場合、トランスフェクションは、膵臓の分泌管中へのＩＤＸ−１についてのプラスミドＤＮＡの逆行性の灌流によって達成され得る（Ｇｏｌｄｆｉｎｅら、１９９７を参照のこと）。さらに、いくつかの場合、ＩＤＸ−１、Ｂｅｔａ２／ＮｅｕｒｏＤ、およびＥ４７の発現は、非ＩＤＸ発現細胞（例えば、幹細胞を含む）に対する特定のタンパク質の適用から生じ得る。
【００４０】
本発明は、インスリン産生細胞の細胞の集団を富化する方法を提供し、この方法は、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する増殖因子と上記の細胞の集団とを接触させることを包含する。このプロセスにより産生された細胞の集団は、多数のインスリン産生細胞に拡大され、そして本明細書中に記載される処置方法に使用され得る。
【００４１】
本発明はさらに、インスリンおよびアミラーゼの両方を産生する膵アミラーゼ産生細胞を促進する方法を提供し、この方法は、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と、膵アミラーゼ産生細胞とを接触させることを包含する。この方法の例は、実施例に提供される。
【００４２】
本発明はさらに、Ｉ型糖尿病と診断された被検体において、糖尿病を処置する方法を提供し、この方法は、少なくとも２４時間の持続性注入によって、ＧＬＰ−１、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子を被検体に投与することを包含する。あるいは、増殖因子は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択され得る。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１と比べてかなり長い半減期を有するので、これは、少なくとも１回ボーラスにより投与され得る。この処置方法は、Ｉ型糖尿病を患う被検体の糖尿病を処置するために効果的である。なぜなら、増殖因子は、本明細書中に詳細に記載されるように、被検体の非インスリン産生細胞がインスリン産生細胞に分化することを促進するからである。
【００４３】
本発明の被検体は、個々のヒト、飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタなど）、ペット（例えば、ネコおよびイヌ）を含み得る。
【００４４】
「糖尿病」によって、膵臓によるインスリン分泌の不全または非存在により特徴付けられる代謝性疾患である真性糖尿病が意味される。本明細書中で使用される場合には、本明細書中の他の箇所で記されない限り、「糖尿病」は、１型、２型、３型、および４型の真性糖尿病を含む。
【００４５】
本発明はまた、被検体における糖尿病を処置する方法を提供し、この方法は、処置されている被検体からまたはドナーから非インスリン産生細胞を得ること；非インスリン産生細胞を増殖因子とインビトロで接触させ、それによってインスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化を促進すること；ならびに非インスリン産生細胞から分化するように促進されたインスリン産生細胞を、糖尿病の被検体に投与することを包含する。上記の非インスリン産生細胞がドナー由来である、糖尿病を処置する方法において、このドナーは、死体であり得る。本発明のさらなる実施態様としては、非インスリン産生細胞は、増殖因子との接触の前に、インビトロで増殖することを可能にされ得る。好ましくは、インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化の促進は、インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の約２０％を超える分化を生じる。さらにより好ましくは、処理された細胞のうちの約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％よりも多くは、インスリン産生細胞に分化する。
【００４６】
インスリン産生細胞への非インスリン産生細胞の分化により得られるインスリン産生細胞の表面抗原の変更は、インスリン産生細胞が免疫応答を引き起こす見込みを減少し得る。次いで、変更された表面抗原を有する細胞は、糖尿病の被検体に投与され得る。これらの細胞表面抗原は、非インスリン産生細胞がインスリン産生細胞へと分化する前、その間、または後に変更され得る。
【００４７】
本発明はまた、内皮細胞を平滑筋細胞に分化させる方法を提供し、この方法は、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４、それらに対して実質的に相同なアミノ酸配列を有する増殖因子、およびそれらのフラグメントからなる群より選択される増殖因子と内皮細胞とを接触させることを包含する。
【００４８】
本発明は、ここで、以下の実施例を参照して例示される。
【実施例１】
【００４９】
培養されたインスリノーマ細胞中のＧＬＰ−１は、インスリン分泌、インスリン合成およびインスリンメッセンジャーＲＮＡに陽性の影響を与えることが知られているために、ＧＬＰ−１のウィスターラットの老化に対する効果を評価した。
【００５０】
材料。ＧＬＰ−１およびｅｘｅｎｄｉｎ［９−３９］（Ｅｘ）、ＧＬＰ−１のペプチドレセプターアンタゴニストをＢａｃｈｅｍ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）から購入した。他に記載しない限り、化学試薬はＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００５１】
動物。ＮＩＡのＷｉｓｔｅｒ  ｃｏｌｏｎｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）からの３ヵ月齢（若齢）および２２ヵ月齢（老齢）ウィスターラットを使用した。それらを、ラット用固形飼料で飼育し、自由に食餌させた。全てのラットは、ＮＩＡで保持される１０の創始ファミリーの子孫である。
【００５２】
プロトコル。老齢の動物が、ＧＬＰ−１に応答することが可能であることを保証するために、本発明者らは、ＧＬＰ−１の静脈内ボーラスを用いた急性の実験を行った。６匹の老齢（２２ヶ月）および６匹の若齢（３ヶ月）のウィスターラットを一晩絶食させた。５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールでの麻酔後、血液サンプリングのためにカテーテルを大腿動脈に配置し、ＧＬＰ−１のボーラス（０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ）を伏在静脈内に、３０秒に渡って投与した。血液（２、４、７および１０分でとられた）をインスリン測定のために採取した。
【００５３】
ラットに、肩甲骨間の領域に、４８時間の間、Ａｌｚｅｔミクロ浸透性ポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を移植した。処理されるグループにおいて、ＧＬＰ−１は、１．５ｐｍｏｌ／ｋｇ-1．分-1の速度で送達され、そしてＥｘは１５ｐｍｏｌ／ｋｇ-1．分-1の速度で送達された。ＧＬＰ−１のインシュリン分泌効果を防ぐために、Ｅｘの１０倍もの高い濃度が必要であることが示された（Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９５）。対照動物は、それらのポンプで、通常の生理食塩水を受け、そして同じ時間の長さの間、それらの注入を受ける。
【００５４】
グルコース耐性試験のために、ポンプを３６時間設置した後（対照およびＧＬＰ−１に対して、それぞれｎ＝６である）、ラットを一晩断食させ、５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールで麻酔し、そしてポンプを除去し、総ＧＬＰ−１を４８時間の注入時間で与えた。カテーテルを、血液サンプリングのために、大腿動脈に配置し、そして血液を、ＧＬＰ−１測定のために、採取した。ポンプを除去した後、腹腔内（ｉｐ）グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ，Ｉｇ／Ｋｇ  ＢＷ）を、１２０分間実施した。グルコースおよびインスリンレベルを評価するために、血液サンプルを１５、３０、４５、６０および９０分で得た。血液（２００μｌ）を、グルコースおよびインスリン決定のためにＥＤＴＡを含むヘパリン化された管に吸い出した。
【００５５】
インスリンの島細胞内含量のために、１４匹のラットを使用した。上記に記載されるように、７匹をＧＬＰ−１で処理し、そして７匹を生理食塩水で処理した。４８時間後、一晩の絶食後、動物を屠数し、ランゲルハンス島を、先に記載されるように採取した（Ｐｅｒｆｅｔｔｉら，１９９５；Ｅｇａｎら，１９９１）。次いで、本発明者らは、個々の膵臓からランダムに採取された５０の島内の島細胞内インスリン含量を測定した。採取された島を遠心分離し、いずれの残留媒質も除去し、ペレットを、氷冷した酸−エタノール（５００μｌ）に懸濁し、そして均質化した。このホモジェネートの遠心分離（１４００×ｇ、４℃）後、上澄みを、細胞内インスリンの測定のために収集した。ペレットを、ギ酸に溶解し、そしてタンパク質含量を決定した。
【００５６】
アッセイ。血漿グルコースをグルコースオキシダーゼ法によって測定した（Ｅｇａｎら、１９９１）。インスリンおよびＧＬＰ−１を、先に公開されたようにＲＩＡによって測定した（Ｗａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９５；Ｎａｔｈａｎら、１９９２）。細胞タンパク質の量を、ウシγ−グロブリンを標準として使用するＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用して測定した。
【００５７】
ＲＮＡ単離および内分泌膵臓ｍＲＮＡの定量。４８時間のＧＬＰ−１または生理食塩水の注入に供されたラットの膵臓全体を、全ＲＮＡを抽出するために使用した。一晩の絶食後、動物を屠数し、膵臓を除去し、そして液体窒素中で、できるだけ急速に凍結させた。ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネート中での均質化、続いて、５．７Ｍ塩化セシウムクッション上の超遠心分離によって、抽出した（Ｇｌｉｓｉｎら，１９７４；Ｃｈｉｇｗｉｎら，１９７９）。次いで、ポリ−Ａ  ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）カラム（Ｂｉｏｌａｂｓ  ＩＮＣ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、全ＲＮＡから調製した。ＲＮＡを、２６０ｎＭでの分光測光法分析によって定量化した。ポリ−Ａ  ＲＮＡを使用するスロット−ブロット分析を、グルコキナーゼのｍＲＮＡレベルの定量化のために使用し、これは、β細胞（Ｍａｔｓｃｈｉｎｓｋｙ，１９９０）、３つのヘキソキナーゼ、ＧＬＵＴ２、β細胞の主なグルコーストランスポーター（Ｍｕｅｃｋｌｅｒ，１９９０）およびインスリンの主要なグルコースセンサーである。４ミリグラムのポリ−Ａ  ＲＮＡを、５０μｌ  ＴＥ緩衝溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ７．４）、２０μｌの３７％ホルムアルデヒド、および２０μｌの１０ｘＳＳＣに溶解した。サンプルを、６０℃で１５分間インキュベートし、次いで、１ｍｌの氷冷１０ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５クエン酸ナトリウムである）に溶解した。スロット−ブロットミニホルダーの各ウェルを、氷冷１０ｘＳＳＣで１回リンスし、次いで、ウェル当たり３００μｌのサンプルを膜上に３連で充填した。膜を通してサンプルを排出するために、減圧を適用し、続いて、氷冷１０ｘＳＳＣで３回ウェルを洗浄した。最終的に、ＲＮＡの架橋のために、膜を、減圧オーブン中、８０℃で２時間焼いた。
【００５８】
ｃＤＮＡプローブ（Ｄｒ．Ｓ．Ｊ．Ｇｉｄｄｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯからのラットインスリンＩＩ；Ｄｒ．Ｍ．Ａ．Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮからのラットグルコキナーゼ；Ｄｒ．Ｍ．Ｊ．Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡからのラットＧＬＵＴ２；およびＤｒ．Ｊ．Ｅ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅａｓｔ  Ｌａｎｃｉｎｇ，ＭＩからのヘキソキナーゼＩ，ＩＩ，ＩＩＩ）とのハイブリダイゼーションを、先に記載されたように実施した（Ｗａｎｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９５；Ｗａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９６）。全てのｃＤＮＡプローブを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用するランダムプライミング手順によって、［32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で標識した。ｍＲＮＡのポリ−Ａテールに相同であるオリゴヌクレオチド（５’ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’）、を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＤＮＡシンセサイザーで合成しそして全細胞ｍＲＮＡの定量のために使用した。ほぼ等しい量のＲＮＡが、各サンプルに対して使用されたことを確かめるために、オリゴｄＴ20とのハイブリダイゼーションを実施した。オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、［32Ｐ］γＡＴＰで、末端標識した。オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを上記に記載のように実施し（Ｗａｎｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９５；Ｗａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９６）、そしてＢｅｔａｓｃｏｐｅ  ６０３ブロットアナライザー（Ｂｅｔａｇｅｎ，Ｗａｌｔｈｍａｎ，ＭＡ）を使用して定量した。
【００５９】
ランゲルハンス島におけるＲＮＡの単離およびｍＲＮＡの定量化。全膵臓に見出される変化を確認するために、ＲＮＡを上記のようにＧＬＰ−１で処理した動物のランゲルハンス島から単離した。島を単離し、そしてＲＮＡを上記（Ｐｅｒｆｅｔｔｉら、１９９５）のマイクロ方法（ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄ）を使用して抽出した。約５μｇの総島ＲＮＡは、１個の膵臓に由来する。スロット−ブロットＳｌｏｔ−Ｂｌｏｔ分析を実施し、ヘキソキナーゼ、ＧＬＵＴ２、およびインスリンのｍＲＮＡレベルを定量化した。
【００６０】
統計分析。このデータを平均±ＳＥＭとして表現した。ＩＰＧＴＴから得られたインスリンおよびグルコースのデータの重要性を、ＳＡＳ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．；Ｃａｒｙ，ＮＣ）による分散の反復測定分析を使用して試験した。有意な相互作用が実証された場合（ｐ＜０．０５）、単一時点での値を、片側スチューデントのｔ‐検定により比較した。他の全てのデータを不対のスチューデントのｔ‐検定を使用して分析した：ｐ＜０．０５は、有意と判断した。
【００６１】
急性ｉｖ  ＧＬＰ−１ボーラスに対する応答。高齢のおよび若齢の絶食した動物は、３０秒にわたって送達された０．２ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−１のボーラスに対して十分等しく応答した。それらのインスリン応答は、重なり可能であった（図１）。ボーラス完了２分後において、インスリン応答は、若齢動物（３７３．３±４３．７ｐｍｏｌ／ｌ）および高齢動物（３４７．７±２５．７ｐｍｏｌ／ｌ）の両方で最大値であり、両方のグループにおいて、インスリンのレベルは、１０分でベースラインまで戻った。
【００６２】
グルコース耐性試験。高齢動物は、ＩＰＧＴＴの間、若齢動物と比較した場合、明らかなグルコース不耐性を有する（図２）。空腹時グルコース（空腹内グルコースの直前に取る）は、処置した動物とコントロール動物との間に違いがなかった。グルコース耐性試験の間、ＧＬＰ−１で処置した動物における血液グルコースは、１５分（９．０４±０．９２対１１．６１±０．２３ｍｍｏｌ／ｌ）および３０分（８．６１±０．３９対１０．３６±０．４３ｍｍｏｌ／ｌ）の時点でのコントロール動物と比較した場合、十分に低かった（図２）。高齢動物はまた、若齢動物と比較した場合、もはやグルコース不耐性ではなかった。同じ時間でのインスリン応答を再検討する場合、１５分でのインスリン応答は、コントロールと比較してＧＬＰ−１で処置した動物において、有意に良好であった（図３）。特に生理食塩水で処置したラットは、３０分にピークのインスリンレベルを有し、一方ＧＬＰ−１で処置した動物は、１５分でピークに達した。この鋭いインスリン応答は、処置した動物において血液グルコースの低下の原因であった（図２）。一晩絶食したインスリンのレベルは、ＧＰＬ−１で処置した動物において、より高いが、しかし大きな動物内（ｉｎｔｒａｎｉｍａｌ）変化のために、コントロール（１９２±４７対１３４±４５ｐｍｏｌ／ｌ）と有意に異ならなかった。２２月齢のウィスターラットへのＧＬＰ−１の４８時間の注入は、ＩＰＧＴＴへのインスリン応答を増強する。この現象は、ＧＬＰ−１注入の完了後さえ観察され、このことは、ＧＰＬ−１が、インスリン放出の調節に勝る長期間の変化を誘導し得ることを示す。インスリン応答曲線の主な変化は、グルコース充填後の初期のインスリン放出であり、ＧＬＰ−１処置ラットにおいて、最大インシュリン分泌が、グルコース注入の３０分後から唯一１５分まで、コントロールで観測されるようにシフトすることにより誘導される。
【００６３】
島内インスリン含量。老齢の動物から予想されるように、各々独立した膵臓の島間にインスリンの量の変化が存在する（図４）。しかし、処置された動物（ｐ＜０．０１）の島に一貫してより多いインスリンが存在する。コントロールおよびＧＬＰ−１処置したラットのインスリンは、それぞれ、全膵臓のタンパク質１ｕｇ当たり５．３１±１．１９対１９．６８±３．６２ｎｇのインスリンを有した。
【００６４】
ＧＬＰ−１プラスマレベル。本発明者らは、安定状態のＧＬＰ−１レベルに達したことの保障、そしてペプチドが正確に注入されたことの確認の両方を行うためにＧＬＰ−１注入の開始６時間後の３匹の動物中のプラスマＧＰＬ−１を測定した。６時間でのプラスマＧＬＰ−１レベルは、１０６．７±１７．６であり、一方４８時間では１２５．０±４１．４ｐｍｏｌ／ｌであった。グルコース耐性試験の開始前は、プラスマＧＬＰ−１は、アッセイの検出レベル以下であった。コントロールウィスターラットにおける空腹時ＧＬＰ−１レベルは、１０〜２０ｐｍｏｌ／ｌであった。若齢動物と高齢動物との間のＧＬＰ−１の空腹時レベルにおいて、差異はなかった。従って、本発明のＧＬＰ−１の注入により、プラスマＧＬｐ−１レベルは空腹時レベルの約６倍まで上昇した。ウィスターラットにおける満腹レベル（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５）およびヒトにおける満腹レベル（Ｇｕｔｎｉａｋら、１９９２）は、食事後約２倍になることが報告されているため、ポンプで達成されるプラスマレベルは、薬理学的であった。
【００６５】
遺伝子発現に対するＧＬＰ−１の効果。本発明者らは、β細胞中のグルコース媒介インスリン放出およびインスリン代謝の初期段階に関与する、インスリンｍＲＮＡと他の因子のｍＲＮＡレベルとの存在比を測定した。結果を、デンシトメトリーにより定量化し、オリゴｄＴハイブリダイゼーションを使用して規格化し、若齢ラットを１の値として相対的な関係で表現した。図６は、６匹の若齢動物および１２匹の高齢動物における全膵臓のインスリンｍＲＮＡのブロット、および図５に示される全動物による組み合わせた結果を示す。図７は、高齢動物の３個の単離した島ＲＮＡ調製物のブロットを示す。
【００６６】
インスリンｍＲＮＡのレベルは、高齢動物対若齢動物において約５０％に増加した（図５、ｐ＜０．０５、および図６）。ＧＬＰ−１は、コントロールと比較して若齢動物と高齢動物の両方においてインスリンｍＲＮＡを増加させた（図５、ｐ＜０．０１、および図６）。同様の結果が、単離した島調製物において見出され得る（図７）。この増加は、動物をＥＸ、すなわち自分のレセプターに結合するＧＬＰ−１のインヒビターと同時に処置する場合、全体的に妨げられる。Ｅｘ単独で、またはＧＬＰ−１と共にＥｘで処理した動物において、インスリンｍＲＮＡレベルがコントロール（ｐ＜０．０１）より低かったという事実は、非常に興味深い。インスリンｍＲＮＡレベルは、Ｅｘ単独の存在下で平均６０％下がった。
【００６７】
高齢動物でのＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡレベルは、若齢コントロールと比較して７０％まで減少し、これにより、ＧＬＰ−１処置（図５Ｂ、ｐ＜０．００１）まで全体的に戻された。高齢動物において、ＧＬＰ−１によるＧＬＵＴ２ｍＲＮＡレベルの増加は、両方の島（図７）および全膵臓調製物（図６）において見出され得る。若齢動物において、ＧＬＰ−１は、ＧＬＵＴ２ｍＲＮＡレベルに有意に影響を及ぼさなかった。このレベルは、Ｅｘ単独の存在下で５０％まで下がった（図５Ｂ、ｐ＜０．０５）が、ＥｘおよびＧＬＰ−１で処置した動物においては下がらなかった（図５Ｂ）。
【００６８】
若齢動物と高齢動物間でグルコキナーゼｍＲＮＡレベルの差異は存在しなかった（図５Ｃ）。ＧＬＰ−１は、若齢動物においてグルコキナーゼレベルを有意に増加させた（図５、ｐ＜０．０５）が、高齢動物においてさらに多く増加させた（図５Ｃ、ｐ＜０．００１、図７）。同様の結果が、単離した島調製物での高齢動物において見出された（図７）。Ｅｘは、グルコキナーゼｍＲＮＡの増加に導くＧＬＰ−１を完全に阻止する。
【００６９】
全調製物について、膵臓からの結果が、この島において示された。ヘキソキナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩｍＲＮＡレベルは、全膵臓および島において非常に低く、そしてＧＬＰ−１処置によって変化しないようであった。本発明者はまた、高齢ラット（ｎ＝６）へＧＬＰ−１（５ｄ）を注入し、そして４８時間注入と同じ結果を見出した。
【００７０】
ＧＬＰ−１を用いる続く連続注入により、膵臓は、コントロールの膵臓よりも驚くほどより大きくなった。処置した動物の膵臓は、コントロール動物の膵臓よりも２６％重くなった。
【００７１】
また驚くことに、インスリン分泌は、ＧＬＰ−１の外因性源の除去後でさえ改善されたままであった。血液中でのＧＬＰ−１のインスリン分泌性作用の生物学的な半減期は、６〜８分であり（Ｅｌａｈｉら、１９９４）、そしてＧＬＰ−１注入は、グルコース耐性試験を実施する前に少なくとも２時間で完了したので、少なくとも短期間での高ＧＬＰ−１レベルの連続した存在は、老齢のウィスター動物においてグルコース耐性を改良する必要性がなかった。
【００７２】
以前に示されたように、ＧＬＰ−１は、インスリノーマ細胞において、インビボでのインスリン生合成およびインスリンｍＲＮＡレベルを増大する（Ｗａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９５）。ＧＬＰ−１はまた、膵臓において、インスリンのｍＲＮＡレベルを正常に維持するために必要なようである。Ｅｘのみを与えられた動物において、Ｅｘは、ＧＬＰ−１のインスリンｍＲＮＡに対する影響を阻害しただけでなく、インスリンｍＲＮＡの減少も引き起こした。Ｅｘは、ＧＬＰ−１のレセプターと結合するＧＬＰ−１の競争的なインヒビターであり、ＧＬＰ−１のインスリン分泌効果を阻害するには１０倍高い濃度のＥｘが必要であり（Ｗａｎｇら、Ｊ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５）、従っておそらく、Ｅｘが、Ｅｘのみを受容する動物において、内因性ＧＬＰ−１の結合を阻害する。これは、ＧＬＰ−１がインスリンｍＲＮＡレベルを生理学的範囲に維持することに影響していることを意味する。
【００７３】
２型糖尿病において、インスリンのβ細胞貯蓄は限界レベルより下に下がり、これはグルコース誘発インスリン応答の続く減少を引き起こすことが提案された（Ｈｏｓｏｋａｗａら、１９９６）。本発明者らのデータが示すように、ＧＬＰ−１は、膵島内のインスリン含量を増加し得、そして単にボーラスによってよりむしろ、連続的に与えられた場合に、単純なインスリン分泌に対するその影響を越えるβ細胞機能に有利な変化もまた引き起こし得る。
【実施例２】
【００７４】
ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ドクトカゲの唾液腺で産生されるペプチドである。本実施例において、発明者らは、ウイスターラット（国立老化研究所（ＮＩＡ）で飼育される）において、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、いくつかの様式で、ＧＬＰ−１よりはるかに効能が大きいインスリン分泌薬であることを報告する。本発明者らは、２型糖尿病の齧歯動物モデルおいて、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は糖尿病制御の持続した改良をもたらすことをさらに報告する。
【００７５】
材料。ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＧＬＰ−１を、Ｂａｃｈｅｍ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）から購入した。他に記載がなければ、化学試薬はＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【００７６】
動物。ＮＩＡ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）のウィスターコロニーからの４月齢のウィスターラットを、ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＧＬＰ−１の効果の重要な実験のために使用した（実施例１を参照のこと）。これらのラットを標準的な実験用食に維持し、そして自由に食物を与えた。長期の実験のために、４週齢のレプチンレセプターを欠く糖尿病のマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−Ｌｅｐｒdb／Ｌｅｐｒdb）ならびにそれらの糖尿病でない同腹子を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。これらを、１ケージに２匹づつ入れ、そして任意に食物を与えた。同じマウスを研究の間、ケージに共に入れた。ウィスターラットを、針金のケージに入れたが、このマウスの床敷は紙製品「Ｃａｒｅｆｒｅｓｈ」（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｃｏ．，Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ，ＷＡ）であった。
【００７７】
プロトコル。ウィスターラットを一晩絶食させた。５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔した後、血液採取のために大腿動脈にカテーテルを入れた。ｅｘｅｎｄｉｎ−４またはＧＬＰ−１のいずれかのボーラスを、１２匹の動物に、３０秒かけて伏在静脈（ｉｖ）に与え、一方、正常生理食塩水（ＮａＣｌ）のボーラスを、他の６匹に与えた。注射の順を循環させた。血液（−５、０、２、５、１５、３０、６０、１２０および１８０分で採取した）を、インスリン測定のために、ＥＤＴＡおよびアプロチニンを含むヘパリン処理したチューブに吸い取った（実施例１を参照のこと）。動物を、少なくとも２日間、その設備に慣らした。
【００７８】
その後、１１匹の糖尿病の動物および１０匹の糖尿病でない動物は、２４ｎｍｏｌ／ｋｇのｅｘｅｎｄｉｎ−４を腹腔内に毎日（午前７〜９時）受け、一方、１０匹の糖尿病の動物および１０匹の糖尿病でない動物は、腹腔内にＮａＣｌを受けた。続いて、マウスにおいて、後眼窩洞から採取した全血のグルコースレベルを、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（Ｂａｙｅｒ）を使用して測定した。このレジメを、１２〜１３週間続けた。８日目に、２匹の糖尿病でないマウス（ケージメイト）が、そして１４日目に１匹の糖尿病マウスが、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を受けた直後に死んだ。動物を毎週計量した。このレジメの１週間後、インスリンおよびグルコースレベルを測定するために、再び血液サンプルを後眼窩洞から採取した。このレジメの終了時に、グルコースおよびインスリンレベルのために空腹時の血液サンプルを４グループから得、そして同日に、ＥＤＴＡを含む全血をヘモグロビンＡ１ｃ（Ｈｂ  Ａ１ｃ）についてアッセイした。
【００７９】
別のグループの１４週齢の８匹の糖尿病のマウスにおいて、本発明者らは、その各グループの４匹に、５日間毎日、２４ｎｍｏｌ／ｋｇのｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＮａＣｌを腹腔内に与えた。
【００８０】
ｃＡＭＰ測定。ランゲルハンス島をウィスターラットから収集し（Ｐｅｒｆｅｔｔｉら、１９９５）、次いで２５島のバッチを、３７℃で１時間、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、５ｍＭ  グルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、緩衝液（ｐＨ  ７．４）および０．１％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中でインキュベートした。この後、これらを、ＧＬＰ−１（１ｎＭ）またはｅｘｅｎｄｉｎ−４（１ｎＭ）の存在下、同じ緩衝液中で１時間インキュベートした。次いで、島のバッチのいくつかを氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、そして氷冷した０．６ｍＭ過塩素酸１ｍＬで溶解した。他のバッチを３７℃の緩衝液で３回洗浄してペプチドを除去し、さらに１５分間放置し、その後、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、続いて過塩素酸で溶解した。次いで、この溶解物（９５０μｌ）をマイクロ遠心分離管に移し、ｃＡＭＰ［3Ｈ］アッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、上記のように（実施例１を参照のこと）ｃＡＭＰを測定した。細胞タンパク質を、基準としてウシｙ−グロブリンを使用するブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍａｎｄ，ＣＡ）を使用してアッセイした。
【００８１】
アッセイ。血漿グルコースを、グルコースオキシダーゼ法によって測定した（Ｗａｎｇら、１９９７）。インスリンを、上記に記載のように、ＲＩＡによって測定した（実施例１を参照のこと）。Ｈｂ  Ａｌｃを、溶血した血液由来のヘモグロビンサブタイプおよび変異体を分離するために、勾配溶出と組み合わせて、低圧陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する、ＢＩＯ−ＲＡＤ（Ｈｅｒｃｕｌａｓ  ＣＡ）ＤｉａＳＴＡＴ器機を使用して、アッセイした。これらの分離したヘモグロビン画分を、４１５ｎｍでの光の吸収によってモニターした。
【００８２】
統計的方法。全ての結果を、平均±ＳＥＭとして得る。Ｔ検定は、２つの平均の分散の同等性を見るＦ検定の結果に基づいた。これらの分散が、統計的に有意に異なる場合、ｔ検定は、等しくない分散に基づいた。ＥＣ50の決定のために、基底の血漿インスリンレベルを、減算し、そして各濃度で残存する活性を、最大活性（過剰のペプチドによって達成される）の割合として表現した。次いで、これを、ｌｏｇｉｔ形式へ変換し（ここで、ｌｏｇｉｔ＝ｌｎ（％活性／［１００−％活性］））、そしてこの化合物のｌｏｇ濃度の関数としてプロットした。
【００８３】
ＷｉｓｔａｒラットにおけるＥｘｅｎｄｉｎ−４の効果。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、静脈へ与えられた場合、ＧＬＰ−１よりも数レベル強力なインスリン分泌剤であった。本発明者らのＷｉｓｔａｒラットにおける最大インスリン応答は、０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ  ＧＬＰ−１で見られる（Ｄｅ  Ｏｒｅら、１９９７）。この同一ｅｘｅｎｄｉｎ−４濃度での最大インスリン応答は、約２倍である（図８）。インスリンレベルは、ＧＬＰ−１を用いると１０分までにベースラインへ戻るが、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を用いると、ベースラインより下へ実際に下がり、そして６０分までにベースラインへ戻った。インスリン放出のためのＥＣ50濃度は、ＧＬＰ−１を用いた場合よりも、低く、そしてｅｘｅｎｄｉｎ−４によって分泌されるインスリンの最大量は、ＧＬＰ−１を用いた場合よりも高い。ＥＣ50は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４対ＧＬＰ−１（実施例１を参照）について、それぞれ、０．０１９（図９）対０．１９ｎｍｏｌ／ｋｇであった。ｅｘｅｎｄｉｎ−４を与えた動物は、この研究の期間、尿排出が明らかに増加し（本発明者らは、尿の容量を定量しなかった）、なぜならば、これらの動物は、循環する血液量を減少させる貧血にもかかわらず、この研究の間、頻繁に排尿し続けたからであり、一方ＧＬＰ−１で処置された動物は、この研究の間、もしも有るならば、微量だけ排尿した。
【００８４】
単離された島におけるｃＡＭＰレベルに対するｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＧＬＰ−１の効果。ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、等モル濃度のＧＬＰ−１よりも、単離された島においいて、ｃＡＭＰレベルをより増加させた。ＧＬＰ−１は、濃度依存様式でｃＡＭＰを増加し、最大ｃＡＭＰ応答は１ｎＭのときであった。ｅｘｅｎｄｉｎ−４のこの濃度で、ｃＡＭＰレベルは、ＧＬＰ−１を用いた場合よりも、約３倍（図１０）高かった。このことは、おそらく、ｅｘｅｎｄｉｎ−４がＧＬＰ−１よりも高い最大インスリン放出を生じる理由を説明する。ｅｘｅｎｄｉｎ−４またはＧＬＰ−１がＧＬＰ−１レセプター上に残存し得、従って緩衝溶液からのペプチド除去後もｃＡＭＰが増加し続けるかどうかを理解するための試みにおいて、本発明者らは、新鮮な緩衝液中での３回の洗浄によっていくつかの島からペプチドを除去し、次いで、１５分後にｃＡＭＰを測定した。両方のペプチドを用いた場合、ｃＡＭＰレベルは、少なくとも１５分までにはベースラインへ戻った。
【００８５】
マウスにおけるｅｘｅｎｄｉｎ−４を用いた慢性的処置の効果。ｅｘｅｎｄｉｎ−４の生物学的活性（血糖を低下させるその能力によって測定した）は、糖尿病の動物の腹腔または皮下に与えた場合、本発明者が予想したよりもはるかに長かった。予備的実験において、本発明者らは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した糖尿病のマウスは、腹腔内（ｉｐ）注射および皮下（ｓｃ）注射後２４時間、より低い血糖を有していたが、ＧＬＰ−１注射では、血糖はベースラインへ戻るということを見出した。このことは、本発明者らを、ｅｘｅｎｄｉｎ−４での長時間の実験を設計させた。マウスにおける毎日の皮下（ｉｐ）ｅｘｅｎｄｉｎ−４レジメの開始で、空腹時血中グルコースは、非糖尿病マウスにおいては１４５±５１ｍｇ／ｄｌ、そして糖尿病マウスにおいては２３２±３８ｍｇ／ｄｌであった。処置の１週間後、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した非糖尿病マウスにおける空腹時グルコースレベルは、７０±２５ｍｇ／ｄｌであり、ＮａＣｌで処置した非糖尿病動物おける空腹時グルコースレベル（１３５±５ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．０５））よりも有意に低かった。これらの糖尿病の動物は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４への非常に有意な応答を有した。グルコースレベルは、ＮａＣｌで処置した動物における２３８±５１ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．００２）から、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した動物における９０±１１ｍｇ／ｄｌへ降下した（表１）。本発明者らは、ＮａＣｌまたはｅｘｅｎｄｉｎ−４を受容した糖尿病の動物における空腹時インスリンレベルを測定した。これらのレベルは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を受容した動物においての方がより高かった（ｐ＜０．００２）。これらのデータに基づいて、本発明者らは、動物を毎日ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置し続けた。床敷き（ｂｅｄｄｉｎｇ）は、排尿が増加すると次第に暗く変化するペーパーベース製品であったので、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した糖尿病の動物のケージは、ＮａＣｌで処置した糖尿病の動物のケージよりも、交換後２４時間、常に明らかに乾燥していたことは明らかであった（しかし、非糖尿病のケージがそうであったように完全に乾燥はしていなかった）（図１１、処置後９週間で撮った写真）。本発明者らは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した糖尿病のマウスにおける減少した排尿が、より低い血中グルコースを原因とするより少ない浸透圧利尿に起因したと結論付けた。
【００８６】
糖尿病の動物は、非糖尿病の動物よりも明らかに重い。９週間後、非糖尿病の動物の体重は、約２８グラム（ｇ）のプラトーに達し、一方、糖尿病の動物は、体重が増加し続けた。処置の１３〜１４週で、ＮａＣｌで処置した動物は、体重が減少し始め（３８．７ｇ）、一方、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した動物は、それらの体重を維持した（４６．７ｇ）。
【００８７】
本発明者らは、Ｈｂ  Ａｌｃ決定のために、生理食塩水で処置した動物の全血およびｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した動物の全血をアッセイし、そして本発明者らは、一晩の絶食後の、グルコース濃度およびインスリン濃度について血漿を測定した（図１２）。これら全てのパラメータは毎日のｅｘｅｎｄｉｎ−４での処置によって有意に変化したことが分かり得る。Ｈｂ  Ａｌｃは、ＮａＣｌで処置した糖尿病の動物において８．８％であったのに対して、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した動物において４．７％であった（ｐ＜０．０００１）。Ｈｂ  Ａｌｃはまた、非糖尿病の動物においてより低かった（ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した非糖尿病の動物対ＮａＣｌで処置した非糖尿病の動物において、それぞれ、３．５対３．１％（ｐ＝０．０００２））。グルコースレベルは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した糖尿病の動物において、有意により低く（２７８．７±３０．０対５１７±５９ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．００５）、そしてインスリンレベルは有意により高かった（４，６００±１，１１４対７０７．２±１６９．７ｐｍｏｌ／ｌ、ｐ＜０．０２）（図１３）。グルコースおよびインスリンにおける傾向は、顕著ではなかったが、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置された非糖尿病の動物における傾向と同一であった（図１３）。
【００８８】
それらの処置を始めたときに１４週齢であった８匹の糖尿病のマウスにおいて、５日後、血糖は、ＮａＣｌで処置した動物においては６４０±３７ｍｇ／ｄｌであり、そしてｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置した動物において３５５±２１ｍｇ／ｄｌであった。これらのインスリンレベルは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４処置対ＮａＣｌ処置において、それぞれ、６，９０４±７０５対１，０７２±５４ｐｍｏｌ／ｌであった。
【００８９】
皮下および腹腔内ｅｘｅｎｄｉｎ−４に続いて、糖尿病マウス中の血糖は、さらに良好な延長した生物学的応答（ここで、血糖は、ｉｖ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４に対するインスリン応答から期待したよりも低く長いままであった（腹腔内投薬後、２４時間まで））を有し、腹腔内注射のグルコース低下効果は、皮下よりも変動が低かった。これはおそらく、皮下技術のより大きな変動が原因であり、そして幾つかの場合において注射の間にペプチドの損失までも起こり得た。
【００９０】
１週間、毎日、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（腹腔内）を腹腔内注射することに関する研究において、１日に１回のみの注射の結果としての空腹時血糖は、実際、糖尿病でない動物の血糖よりも低かった。これは、ケージが常により乾燥していたので、糖尿病の動物がｅｘｅｎｄｉｎ−４を受容した各朝にこれらのケージを見れば明らかでもあった。この効果はまた、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を受領した非糖尿病の動物においても見られた。
【００９１】
平均血糖が６４０ｍｇ／ｄｌであった糖尿病の動物にｅｘｅｎｄｉｎ−４を毎日、５日間与えた実験において、血糖を下げる顕著な影響もあり、そしてインスリンレベルは明らかに増加した。これは、おそらく、β細胞塊の増殖に起因する見込みはなく、そしてこのような顕著な高血糖の局面においてでさえ、糖尿病ラットのβ細胞が依然としてｅｘｅｎｄｉｎ−４に対して応答することを示唆する。
【００９２】
ｅｘｅｎｄｉｎ−４の１２週間後でさえも、血糖はＮａＣｌ−処置動物における血糖よりも低かった。典型的な一次抗体は、１４〜２１日まで続けた腹腔内注射後に応答し、そして、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、いずれの評価（ｒａｔｅ）においても弱いハプテンである。従って処置の最初の数週間、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の生物学的効果は抗体によって中和されることが期待されない。この事に関連して、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の生物学的効果は、非常に低い濃度においてであり、従って、おそらく、ペプチドは、その特定の抗体に関する親和性よりも、ＧＬＰ−１レセプターに関してより高い親和性を有し、その結果、抗体によって全体的に中和されなくてもよい。ｅｘｅｎｄｉｎ−４が中和されない理由に関する他の可能性は、まだ同定されていないげっし歯類において産生されるｅｘｅｎｄｉｎ−４様ペプチドが存在すること、またはｅｘｅｎｄｉｎ−４型分子がげっ歯類において製作されることであり、これによってｅｘｅｎｄｉｎ−４耐性成熟動物を得る。
【００９３】
本研究者らは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を低濃度（１ｎｍｏｌ／Ｋｇ）で、糖尿病マウスの腹腔内に１週間、与えた。これは、この実施例において報告される大量での効果と同程度に血糖を下げる点で効果的であった。
【００９４】
マウスの挙動に対する、毎日の注射の有害作用は観察されなかった。本研究者等は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の注射の最初の３〜４日間に、動物の体重が減少することを観察したのだが、それは第７日目までであり、ＮａＣｌ処置動物と同程度まで戻った。本研究者等の長期研究において、週毎に重量を測ったので、その初期の減少を逃した。明らかに乾燥している敷き藁（ｂｅｄｄｉｎｇ）を除いて、各朝処置される糖尿病動物において、本研究者らは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の、これらの動物に対する、顕著な有害な効果を全く検出することができなかった。従って、本研究者らは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４がヒトにおける２型糖尿病に対する処置としてＧＬＰ−１よりも優れているかもしれないことを示唆する。
【実施例３】
【００９５】
実施例１のプロトコルを使用して、ＧＬＰ−１を連続的に注射することによって、１〜５日間、若年および老年のラットに投与し、対して、コントロールラットは比較として生理食塩水注射を受けた。対照的に、ｅｘｅｎｄｉｎ−４を１日に１回、５日間、実施例２のプロトコルに従って、腹腔内に投与した。
【００９６】
ＧＬＰ−１で処置した膵臓における細胞の約２０％は、５日間でＰＣＮＡに対してポジティブであった。同時点で、小島において細胞が増殖した。さらに、菅を裏打ちする増殖細胞が存在し、そしてさらに驚くべきことに、腺房組織において、ある領域は一般に、幹細胞が全くないと考えられる。また、驚くべきことに、多数のインスリン陽性細胞が、腺房組織の中でも小島の外側で発見された。ここでは、インスリン陽性細胞は期待されない。
【００９７】
これらの結果は、ＧＬＰ−１の連続注射、または少なくとも２日間のＥｘｅｎｄｉｎ−４の繰り返し腹腔内注射によって、インスリン陽性細胞の全体数が増加し、かつ、インスリンＩＤＸ−１陽性細胞への腺房細胞の分化が生じることを示す。これらの結果は、ＧＬＰ−１およびｅｘｅｎｄｉｎ−４によって細胞の増殖が増加すること、特に、腺房組織におけるインスリン産生細胞の増殖の増加をさらに示唆する。
【００９８】
ＧＬＰ−１の連続注射によって、２４時間より長期にわたって非インスリン産生細胞とＧＬＰ−１を接触させると、非インスリン産生細胞のインスリン産生細胞への分化が促進される。この効果は早くも１日目に観測され、そして早くも７日目に最大の効果であった。このような分化は驚くべきことであった。なぜなら、先行技術はβ細胞においてインスリン向性の結果（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｓｕｌｔ）のみを示したからであった。さらに、本発明は驚くべきものであった。なぜなら、腺房細胞（これは、インスリンを産生し得ることは全く分かっていなかった）が促進されて、ＧＬＰ−１との接触時にインスリンを分泌する。インスリン産生細胞の増加数は、処置を止めた後、少なくとも２週間の間、変化しないままである。インスリン産生細胞への分化は、ターミナルイベント（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｖｅｎｔ）であるので、さらに後の時点で、非インスリン産生細胞へ戻る脱分化（ｄｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は起こりそうもない。従って、この効果は、永久的である。
【００９９】
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、本発明において、非インスリン産生細胞からインスリン産生細胞からインスリン産生細胞を分化する際に、ＧＬＰ−１と同様の効果を有することを示す。驚くべきことに、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１よりも長い半減期を有することが示される。インスリン産生細胞数の増加は、従って、２日間にわたるＥｘｅｎｄｉｎ−４の連続注射によってではなくて、毎日のボーラス注射によって達成され得る。注射の２日後、小島の外側にインスリン産生細胞が観測される。最大効果は７日間までに達成される。ＧＬＰ−１に関して、この効果は少なくとも２週間、おそらくは、永久的に持続し、Ｅｘｅｄｉｎ−４との接触後でさえ、停止する。
【０１００】
ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４に対して実質的に相同性であるアミノ酸配列およびそのフラグメントを有する増殖因子は、インビボおよびインビトロでの非インスリン産生細胞の分化に影響を及ぼす。さらに、幹細胞および腺房細胞を含む種々の非インスリン産生細胞が促進されて、インスリン産生細胞へと分化し得る。先行技術を凌ぐこれらの利点によって、糖尿病を処置するための方法が提供され、従って、インスリン産生細胞は、患者への成長因子の投与によって、またはインビトロで非インスリン産生細胞を接触させることによって数が増加する。
【実施例４】
【０１０１】
本研究の目的は、ＧＬＰ−１および島ホルモン、グルカゴンおよびインスリンが腺房組織に影響を及ぼすかどうかを決定することであった。本発明者は、腺房組織のモデルとして、ラット膵臓外分泌腫瘍由来のＡＲ４２Ｊ細胞（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，１９９４）を使用した。次いで本発明者は、ＧＬＰ−１がすでにβ細胞内で作用することが公知である（Ｇｏｋｅら，１９９３；Ｈｏｌｚら、１９９５；Ｙａｄａら、１９９３）、シグナル伝達系の幾つかの局面を調べた。
【０１０２】
材料。ＧＬＰ−１、グルカゴン、ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびｅｘｅｎｄｉｎ９−３９をＢａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ＣＡ）から得た。コレストキニン（Ｃｈｏｌｅｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）（ＣＣＫ）、インスリン、ゲネスチン（ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ）およびバナジン酸塩をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ラット膵臓細胞株、ＡＲ４２ＪをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。抗チロシン抗体をＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入した。
【０１０３】
細胞培養。ＡＲ４２Ｊ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンで補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地中で維持した。継代２３−３６からの細胞を本研究を通して使用した。細胞を、１２ウェルクラスターディッシュ内で約１０5細胞／ｍｌで慣用的にプレートし、３７℃の、９５％空気および５％ＣＯ2を含む加湿したインキュベーター内でインキュベートした。ＡＲ４２Ｊ細胞がＣＣＫに対して不十分に応答したため、本発明者は、これが濃度依存様式でＣＣＫ応答性を誘発することが公知であったため（Ｌｏｇｓｄｏｎら、１９８７）、使用前に、慣用的に１０ｎＭデキサメタゾンと共に細胞を４８時間インキュベートした。
【０１０４】
アミラーゼアッセイ。アミラーゼ分泌のために、細胞を２ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で媒体なして洗浄した。次いで、インキュベーションを、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２％ウシ胎仔血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％大豆トリプシンインヒビターを含むＤＭＥＭ中で実施した。目的のホルモンおよび薬剤を５０分間３７℃で加えた。次いで、インキュベーション媒体をアミラーゼ定量のために即座に除去し、そしてこの細胞を再び２ｍｌ氷冷ＰＢＳ中で洗浄した。１３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ2、７５ｍＭのＮａＣｌおよび０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶解物緩衝液（ｐＨ８．０）を細胞に加え、次いでこの溶解物を全アミラーゼ活性のために収集した（Ｃｅｓｋａら、１９６９）。放出したアミラーゼを、細胞の全アミラーゼ活性のパーセンテージとして表した。
【０１０５】
ｃＡＭＰの測定。細胞を１２ウェルディッシュ内で増殖し、上記のようにホルモンおよび薬剤±ＩＢＭＸで処理した。次いでそれらを氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄し、１ｍｌの氷冷した０．６ｍＭ過塩素酸で溶解した。この溶解物（９５０μｌ）をミクロ遠心分離管に移し、５Ｍ  Ｋ2ＣＯ3を使用してｐＨを７．０に調節した。１０4ｒｐｍでの５分間の遠心分離後、上清を真空乾燥し、次いで２００μｌのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中で回復させた。０．１５ｍＭのＮａ2ＣＯ3（５０μｌ）および０．１５ｍＭのＺｎＳＯ4（５０μｌ）の添加後、氷上で１５分間インキュベーションし、塩沈降物を３．５×１０3ｒｐｍにおける１５分間の遠心分離によって除去し、５０μｌの上清をｃＡＭＰ［3Ｈ］アッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）、（Ｓｔｅｉｎｅｒら、１９７２）を使用してアッセイした。細胞タンパク質を、標準としてウシγグロブリンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用して測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６）。
【０１０６】
細胞内カルシウム［Ｃａ2+］Iの測定。ＡＲ４２Ｊ細胞を、蛍光性Ｃａ2+プローブであるｉｎｄｏ−１アセトキシメチルエステル（ｉｎｄｏ−１／ＡＭ）で負荷した。この負荷溶液は、５０μｇのｉｎｄｏ−１／ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）、３０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および５μｌの２５％（ｗ／ｗ、ＤＭＳＯ中）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔ  Ｃｏｒｐ．）から構成された。この混合物を、２．０ｍｌのハンクス平衡塩類溶液中の細胞に添加し（ｉｎｄｏ−１の最終濃度２５μＭ）、そして振盪プレート（ｓｈａｋｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）上で１時間、穏やかに混合した。次いで、これらの細胞を４００×ｇで６０秒間遠心分離し、（ｍＭで）１３７  ＮａＣｌ；５  ＫＣｌ；１．３  ＭｇＳＯ4；５  ＣａＣｌ2；２０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節する）からなる標準浴溶液（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂａｔｈｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁させ、そして使用前に少なくとも１時間、貯蔵した。ｉｎｄｏ−１による負荷および実験の両方を、室温（２２〜２４℃）で実施した。この細胞懸濁液を、倒立蛍光顕微鏡のステージ上のチャンバに置いた（Ｓｐｕｒｇｅｏｎら、１９９０）。発光場を、単一の細胞に制限した。ｉｎｄｏ−１を３５０±５ｎｍで５ｍｓごとに励起させ、そして蛍光発光を４１０±５ｎｍおよび４９０±５ｎｍの波長帯域に分離した。自己蛍光について補正した、４１０：４９０の蛍光比（比Ｆ４１０／Ｆ４９０）を、当該分野において周知の方法論を使用して、［Ｃａ2+］Iの指標として使用した（Ｓｐｕｒｇｅｏｎら、１９９０）。細胞の自己蛍光を、同じバッチからの多数のｉｎｄｏ−１非負荷細胞において評価した。代表的な実験において、標準浴溶液を、細胞に近く接近して置かれたマイクロピペットから注入される試験溶液の１つと素早く（＜２００ｍｓ）交換した（Ｊａｎｃｚｅｗｓｋｉら、１９９３；Ｋｏｎｎｅｒｔｈら、１９８６）。慣用的に、これらの細胞を、試験溶液に２４０〜３００秒間曝露した。その後、試験溶液を洗浄によって除去し、一方で［Ｃａ2+］Iをさらに１２０〜１８０秒間モニタした。これらの試験溶液は、ホルモンを標準浴溶液に添加することによって、この実験の直前に調製した。
【０１０７】
ＧＬＰ−１結合。ＡＲ４２Ｊ細胞を、上述のようにプレートし、そして培養した。結合実験の開始時に、細胞を無血清ＤＭＥＭと共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞を、（ｍＭで）１２０  ＮａＣｌ、１．２  ＭｇＳＯ4、１３  酢酸ナトリウム、５  ＫＣｌ、１０  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６を含有する結合緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した。次いで、細胞を、２％ＢＳＡ、５００Ｕ／ｍｌ  アプロチニン、１０ｍＭグルコース、ある範囲の濃度のＧＬＰ−１（０．０３ｎＭ〜１００ｎＭ）および３０，０００ｃｐｍ  125Ｉ−ＧＬＰ−１（２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）を補充した０．５ｍｌの結合緩衝液と共に、４℃で一晩インキュベートした。本発明者らは、参照日から２週間以内の、新たに調製した125Ｉ−ＧＬＰ−１のみを使用した。インキュベーションの終了時に、補充物を処分して、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、０．５ｍｌ  ０．５Ｎ  ＮａＯＨ／０．１％ＳＤＳで、３０分間室温で溶解した。放射能を、溶解液中で、ＩＣＮ  Ａｐｅｃシリーズγ線計数器で測定した。特異的結合を、５００ｎＭ  ＧＬＰ−１に存在する非特異的結合を全結合から減算することによって、決定した。この方法は、以前には、ＧＬＰ−１レセプターを過剰発現するＣＨＯ細胞において、および３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、ＧＬＰ−１結合を特徴付けるために、使用されてきた（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７；Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９７）。
【０１０８】
ＧＬＰ−１レセプターのＲＴ−ＰＣＲ。相補のＤＮＡを、全細胞ＲＮＡから、マロネイマウス白血病ウイルス逆トランスクリプターゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびランダムヘキサヌクレオチド（ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、合成した。ＰＣＲ増幅（３０サイクル）を、第一鎖ｃＤＮＡから、組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃｅｔｕｓ）を使用して実施した（Ｓａｉｋｉら、１９９７）。オリゴヌクレオチドプライマーは、膵臓ＧＬＰ−１レセプター配列の５’末端および３’末端であった（Ｔｈｏｒｅｎｓ、１９９２）（それぞれ、5'ＡＣＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＣＣ3'および5'ＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＧＴＧＣＣ3'）。次いで、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロミドを使用して可視化した。これらのＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングし、そして鎖終結技術およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０キット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用して、配列決定した。このＰＣＲ産物の特異性をまた、Ｂｓｔｘｌ制限酵素によって決定した。
【０１０９】
ＧＬＰ−１レセプターの免疫沈降およびウェスタンブロット。ＡＲ４２Ｊ細胞およびインスリノーマ細胞株（ＲＩＮ  １０４６−３８細胞）を、上述のように６０ｍｍディッシュで増殖させた。これらの細胞が８０％コンフルエンスに達したら、これらの細胞を、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するクレブス−リンガー緩衝液で２回洗浄し、そして液体窒素で凍結させた。この凍結した細胞を切屑して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％  デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、２０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１ｍＭ  Ｎａ−オルトバナジン酸塩、１ｍＭ  ベンズアミジンを含有するＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。不溶性物質を、１５，０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離することにより除去し、そして免疫沈降およびウェスタンブロットのために上澄みを回収した。Ｎ末端に対する抗ＧＬＰ−１−Ｒ抗体（Ｄｒ．Ｊｏｅｌ  Ｈａｂｅｎｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＭＡにより提供）を、１：２５０で、４０μｌのタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇと共に各チューブに添加した。免疫沈降を、４℃で一晩実施し、そして免疫複合体を、ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄し、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１ｍＭ  Ｎａ−オルトバナジン酸塩）でさらに２回洗浄し、次いで免疫複合体ペレットを、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で、７０℃で１０分間可溶化した。免疫沈降したタンパク質を、小型樹脂カラムで溶出し、そして４〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルをＰＶＤＦ膜に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）させた後、ブロットをＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１３７ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％脱脂乳で、室温で１時間ブロックし、次いで１：１５００でＧＬＰ−１−レセプターに対する抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＶＤＦ膜を、ＴＢＳＴで３回洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化抗ウサギ二次抗血清と共に、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ中での一連の洗浄の後、ブロットを、ＥＣｌ化学発光検出システムを使用して現像した。オートラジオグラフを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓレーザー濃度計のＩｍａｇｅ−ＱｕａｎｔTMソフトウェア（第３．３版）を使用して、定量した。この実験において、インスリン産生細胞株ＲＩＮ１０４６−３８細胞を、ＧＬＰ−１レセプターの存在のポジティブコントロールとして使用した。清澄な細胞溶解液のアリコート（２０μｌ）を使用してタンパク質濃度を決定し、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）によって評価した。
【０１１０】
チロシンのリン酸化の研究。ＡＲ４２Ｊ細胞を、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するクレブス−リンガー平衡緩衝液（ＫＲＢＢ）中、３７℃で２時間、前インキュベートした。次いで、培地を除去し、そして新しいＫＲＢＢを添加し、細胞を３７℃のホットプレート上に５分間置いた。５分間にわたって様々な試薬（図２４を参照のこと）を添加した後に、これらのディッシュを液体窒素に浸漬することによって、この反応を終結させた。凍結した細胞を切屑し、ＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。不溶性物質を、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって除去し、そして免疫沈降および免疫ブロット法のために、上澄みを回収した。清澄な溶解液からのホスホチロシン含有タンパク質を、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体と共に免疫沈降させ、還元条件下４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって分離し、次いでＰＶＤＦ膜に電気移動させ、そしてポリクローナル抗ホスホチロシン抗体によって免疫ブロット法を行った。これらのブロットを、ＥＣＬ化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して現像した。清澄な細胞溶解液中の全タンパク質含有量を、ブラッドフォード法を使用してアッセイした（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）。
【０１１１】
統計的分析。ここでは、適用可能な結果は、平均±ＳＥＭとして表現され、独立スチューデントｔ検定に供される。群内で、比較を、一元（ｏｎｅ−ｗａｙ）分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０１１２】
アミラーゼ放出。ＣＣＫは、アミラーゼ放出の強力な刺激物であった。最大刺激は、１０ｎＭで見られた（図１４）。グルカゴン（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）は、単独ではアミラーゼ放出に対して効果を有しないが、ＣＣＫと組み合わされた場合、グルカゴンはＣＣＫ誘発アミラーゼ放出を阻害したが、完全には無くさなかった（図１５；ｎ＝２０、ｐ＜０．０１）。ＧＬＰ−１およびインスリンは、単一でもＣＣＫと組み合わせても、アミラーゼ放出に影響を与えなかった（図１５）。本発明者らはまた、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（１０ｐＭ〜１０ｎＭの濃度範囲）を、アミラーゼ放出に対する潜在的効果について調べ、ＧＬＰ−１と同様、ｅｘｅｎｄｉｎ−４はアミラーゼ放出に影響しないようであった。ＧＬＰ−１およびグルカンは、ＡＲ４２Ｊ細胞のｃＡＭＰレベルを上げると予期され得るので、本発明者らは、特異的ｃＡＭＰ効果を探すためにｃＡＭＰアナログである８−ブロモ−ｃＡＭＰ（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）のアミラーゼ放出に対する効果を観察した。単独で与えられる場合、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰはアミラーゼ放出に効果を有しないようである一方で、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰはＣＣＫ誘発アミラーゼ放出を減少させた（図１６）。本発明者らはまた、タプシガーギンおよびリアノジン、リアノジンレセプター／ＥＲ  Ｃａ2+放出チャネルの特異的インヒビターおよびＥＲ  Ｃａ2+ポンプの特異的インヒビターをそれぞれ、単独でおよびＣＣＫと組み合わせて使用し、アミラーゼ放出に対する細胞内カルシウムの上昇の役割を調べた。タプシガーギンおよびリアノジンの組み合わせはＣＣＫ誘発アミラーゼ放出を減少させたが、完全には阻害しなかった（図１７；ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）。ＮａＦ（腺房組織のアミラーゼ放出に対するＣＣＫの効果を模倣する（Ｖａｊａｎａｐｈａｎｉｃｈら、１９９５））は、ＡＲ４２Ｊ細胞においてと同様であった。チロシンキナーゼインヒビターであるゲネスタイン（Ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ）（３００μＭ）は、ＣＣＫ媒介アミラーゼ放出を、特にＣＣＫ処理の初期の時点において減少させたが、一方で、チロシンホスファターゼインヒビターであるバナジン酸塩は、基底アミラーゼ放出およびＣＣＫ媒介アミラーゼ放出を有意に増加させた（図１８）。本発明者らは、膵臓のβ細胞をＧＬＰ−１で２４時間処理した場合、グルコース媒介インスリン放出およびＧＬＰ−１媒介インスリン放出の増加があることを示した（Ｗａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９５）。従って、本発明者らは、ＧＬＰ−１がアミラーゼ放出に対して有し得る任意の長期の効果を探した。ＧＬＰ−１（１０ｎＭ）およびインスリン（１００ｎＭ）を用いた８、２４、４８または７２時間のＡＲ４２Ｊ細胞のプレインキュベーションは、基底アミラーゼ放出もＣＣＫ（１ｎＭ）誘発アミラーゼ放出も増加させなかった。
【０１１３】
ＡＲ４２Ｊ細胞におけるＣＣＫに対する［Ｃａ2+］I応答。この実験の条件下では、ＡＲ４２Ｊ細胞の大部分（８５％；ｎ＝３５）が、１ｎＭ  ＣＣＫに応答して［Ｃａ2+］Iを一時的に増加させた。図６Ａは、ＣＣＫ誘発［Ｃａ2+］Iトランジエント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の代表的な例を示し、ＣＣＫへの暴露後５〜２５秒後に始まり、次の５〜１５秒でピークとなる。ピークインド−１（ｉｎｄｏ−１）蛍光比（ＩＦＲ）から評価したピーク［Ｃａ2+］Iは、静止ＩＦＲを２．５〜３．５倍超えた。［Ｃａ2+］Iトランジエントの緩和は、ピークに続いてすぐに始まり、通常、初期の素早いフェーズ、引き続くプラトーフェーズおよびよりゆっくりとした最終フェーズからなっていた。［Ｃａ2+］Iトランジエントの後、ベースライン［Ｃａ2+］Iが静止［Ｃａ2+］Iのレベルより下に減少し、ＣＣＫに対する暴露の前に測定された（図１９Ａ）。引き続く静止の間、ベースライン［Ｃａ2+］Iは、漸進的な増加を示したが、通常、１０分以内でコントロールレベルには完全には回復しなかった。静止［Ｃａ2+］Iの完全な回復の前にＣＣＫに対して繰り返される暴露によって誘発される［Ｃａ2+］Iトランジエントは、先の［Ｃａ2+］Iに対して３０〜４０％減少した。
【０１１４】
ＣＣＫ誘発［Ｃａ2+］Iトランジエントは、１０μＭリアノジンおよび５００μＭタプシガーギンで前処理された細胞中でほとんど完全に消滅した（図１９Ｂ；Ｎ＝７）。これらの結果は、腺房細胞において、ＥＲがＣＣＫによって誘発される［Ｃａ2+］Iの変化の主要な源であるという考えを支持する（Ｍｕａｌｌｅｍら、１９８８；Ｏｃｈｓら、１９８３）。この考えと一致して、名目上、ＣＡ2+の無い灌流溶液に添加されるＣＣＫに対する暴露（図１９）は、［Ｃａ2+］Iトランジエントの上昇率または大きさに明らかには影響しなかった（ｎ＝５）。しかし、図１９Ｃに示されるように、細胞外Ｃａ2+の減少は、［Ｃａ2+］Iトランジエントの期間を短くした。このことは、以前（Ｍｕａｌｌｃｍら、１９９８；Ｏｃｈｓら、１９８３）に示されるように、細胞外Ｃａ2+がＣＣＫ誘発ＥＲ  Ｃａ2+放出によって開始される［Ｃａ2+］Iトランジエントの遅延した成分の維持において役割を演じ得ることを示唆する。
【０１１５】
ＡＲ４２Ｊ細胞のＧＬＰ−１に対する［Ｃａ2+］I応答。ＧＬＰ−１に対する暴露は、ＡＲ４２Ｊ細胞の約５０％（ｎ＝２７）の［Ｃａ2+］I応答を誘発した。ＧＬＰ−１誘発トランジエント（図２０Ａ）は、かなりの変動性を示したが、通常、ＣＣＫに対する［Ｃａ2+］I応答よりも遅い速度で発生し、そしてＣＣＫに対する［Ｃａ2+］I応答よりも小さな大きさ（静止ＩＦＲに対して１．５から２．５倍の増加）で得られた。さらに、ＧＬＰ−１誘発［Ｃａ2+］Iトランジエントが、ＣＣＫによって誘発される速度よりも遅い速度で緩和した（図２０Ａ対１９Ａおよび２０Ｂ、Ｃ）。図２０Ｂは、同じ細胞内のＧＬＰ−１に対する暴露の後１０分未満で適用されるＣＣＫの［Ｃａ2+］Iに対する効果を示す。この種の実験において、ＣＣＫ誘発トランジエントは、その特徴的配置を保持するが（図１９Ａに示されるように）、より小さな大きさに達した。後者の効果は、ベースラインＩＦＲの減少、および／またはＥＲ  Ｃａ2+含有量の部分的枯渇によって示され、［Ｃａ2+］I含有量の減少に少なくとも部分的に起因し得る（図１９を参照のこと）。二回目のＣＣＫへの暴露では、大きさはより小さくさえなった（図２０Ｃ）。リアノジン（１００μＭ）およびタプシガーギン（５００μＭ）での前処理は、ＧＬＰ−１に対する［Ｃａ2+］I応答を実質的に消滅させた。まとめると、これらの結果は、ＣＣＫおよびＧＬＰ−１がＣａ2+の同じ細胞内プール（おそらくＥＲ）にアクセスしているが、多分異なるメカニズムでＣａ2+を放出することを示す。ヒーラモンスター由来の（Ｇｉｌａ  ｍｏｎｓｔｅｒ）ＧＬＰ−１ホモログであるｅｘｅｎｄｉｎ−４は、［Ｃａ2+］IのＧＬＰ−１と同じ効果を有したが、大きさが約１桁強力であった。ＧＬＰ−１アンタゴニストであるｅｘｅｎｄｉｎ９−３９（Ｇｏｋｅら、１９９３）は、ＧＬＰ−１よりも１０倍高い濃度で使用される場合、ＧＬＰ−１誘発カルシウムトランジエントを阻害した。
【０１１６】
［Ｃａ2+］IＡＲ４２Ｊ細胞に対するグルカゴンおよび８−ブロモ−ｃＡＭＰの効果。グルカゴン（１０ｎＭ）への暴露は、ＡＲ４２Ｊ細胞の７０％（ｎ＝１２）の［Ｃａ2+］I応答を誘発した。［Ｃａ2+］Iトランジエントは、グルカゴンへの暴露のすぐあとに始まり、比較的ゆっくりした速度で発生し、静止ＩＦＲレベルの２００〜２５０％でピークとなり、延長されたゆっくりした緩和を示した（図２１Ａ）。グルカゴンで処理したすぐ後でＣＣＫによって誘発された（または同時に添加された両方の処理での）［Ｃａ2+］Iトランジエントは、減少した上昇速度および非常に遅い緩和速度を示した（図２１Ｂ）。同様に、ｃＡＭＰの膜透過性形態である０．１μＭ  ８−ブロモ−ｃＡＭＰに対して短い（６０〜３００秒）暴露は、通常、ＣＣＫ誘発［Ｃａ2+］Iトランジエントの上昇速度に顕著には影響しないが、それらの緩和速度を顕著に遅くした（図２１Ｃ）。ＣＣＫ存在下でのジブチリルｃＡＭＰのアセトキシメチルエステルを用いる細胞内動員の減少は、以前に腺房細胞において示されている（Ｋｉｍｕｒａら、１９９６）。
【０１１７】
ＧＬＰ−１結合。５００μＭ非標識ＧＬＰ−１の存在による合計の結合の置換によって決定される場合の、特異的な125Ｉ−ＧＬＰ−１は、添加された放射能の合計のうちの０．６４±０．１６％（ｎ＝９、特異的な結合の量は、ゼロより有意に大きかった、ｐ＜０．０１）であり、結合の合計のうちの２７±３．２％（ｎ＝９）であった。低い特異的結合のために、全体のスキャッチャード分析を行わなかった。
【０１１８】
ｃＡＭＰレベル。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＡＲ４２Ｊ細胞において、ＣＣＫ（１ｎＭ）の存在下または非存在下で、ＧＬＰ−１（０．１〜１００ｎＭ）またはＩＢＭＸ（１００ｎＭ）での１時間処理、あるいはＣＣＫ（０．１〜１００ｎＭ）のみでの１時間の処理では変わらなかった。ＩＢＭＸは、ｃＡＭＰレベルのわずかな増加を引き起こしたが、これは３つの実験において、非ＩＢＭＸ処理細胞と統計的に異ならなかった。グルカゴン（１０ｎＭ）は、ＣＣＫの存在下および非存在下でｃＡＭＰレベルの２倍の増加を引き起こした（図２２）。ｅｘｅｎｄｉｎ−４（０．１〜１０ｎＭ）は、ｃＡＭＰレベルを変化させなかった。
【０１１９】
ＧＬＰ−１レセプターのＲＴ−ＰＣＲ。ＧＬＰ−１レセプターｍＲＮＡの存在は、ＲＴ−ＰＣＲを用いることによってＡＲ４２Ｊ細胞において検出された。図２３は、公知の膵臓ＧＬＰ−１レセプター配列（Ｔｈｏｒｅｎｓ，１９９２）と同一のプライマーを用いて、推定された大きさのＰＣＲ産物（ｂｐ９２８；Ｅｇａｎら，１９９４を参照のこと）がＡＲ４２Ｊ細胞およびラット膵臓において検出され得るが、水コントロールのＰＣＲにおいては検出されないことを示す。ゲノムＤＮＡ混入が全く存在しないことは、本発明者らのプライマーが１．８Ｋ塩基のＰＣＲバンドを生じるイントロン配列に及ぶことから証明される。混入しているゲノムＤＮＡ  ＰＣＲに対応するさらなるバンドは本発明者らのＰＣＲ反応において観察されなかった。このＰＣＲ反応物をクローニングし、部分的に配列決定し、そしてβ細胞ＧＬＰ−１レセプターであると同定された。
【０１２０】
ＧＬＰ−Ｉ発現のウェスタンブロット分析。ＧＬＰ−１レセプターのＮ末端領域に対する抗体を用いて、特異的バンドが、ポジティブコントロール細胞であるＲＩＮ  １０４６−３８細胞において、およびＡＲ４２Ｊ細胞において６５ｋＤａおよび４５ｋＤａで得られた。これらはそれぞれ、成熟ＧＬＰ−１レセプターおよびコアグリコシル化ＧＬＰ−１レセプターに対応することが示された（図２４）。
【０１２１】
チロシンリン酸化研究。何の刺激も存在しない場合、いくつかのタンパク質が、ＣＣＫおよびＮａＦの存在下では増加したがＧＬＰ−１の存在下では増加しなかった基底レベルのリン酸化を示した（図２５）。４つのタンパク質（４６ｋＤａ、６６ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび１９０ｋＤａ）は、ＣＣＫの存在下で最も明らかに影響を受け、これらのタンパク質のリン酸化レベルは少なくとも２倍増加した。ゲニステインは、図１８において既に示したように、ＣＣＫによって誘導されるチロシンリン酸化を減少させ、そしてＣＣＫ媒介アミラーゼ放出を減少させた。
【０１２２】
ＡＲ４２Ｊ細胞は、濃度依存様式でのアミラーゼ放出の誘導、および細胞内カルシウムの増加によって実証されるように、ＣＣＫに対して生理学的様式で応答する。ＣＣＫはまた、以前に示された（Ｌｕｔｚら，１９９３）ように、タンパク質チロシンリン酸化を誘導した。ＣＣＫは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した場合の見かけの分子量に基づいて１９０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６６ｋＤａおよび４６ｋＤａのチロシンリン基質（ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）のかなりの増加を誘導した。これらのリン酸化のうちの２つである１２０ｋＤａおよび６６ｋＤａは、既に記載されている（同書）。ゲニステインによるチロシンリン酸化の阻害は、アミラーゼ放出を阻害し、そしてまたチロシンリン酸化事象を減少させた。このことは、ＡＲ４２Ｊ細胞においては、腺房細胞においてのように、チロシンリン酸化が、調節されたアミラーゼ分泌に関与することを示唆する。インスリンは、それ自体のレセプターβサブユニットである可能性が最も高い９７ｋＤａでのリン酸化を誘導した。周知のＧタンパク質のアクチベーターであるＮａＦ（Ｒｉｖａｒｄら，１９９５）は、腺房細胞においてアミラーゼ放出を増加させ、そしてチロシンキナーゼ活性を増加させる（同書）という点で、腺房細胞におけるＣＣＫの効果を模倣することが以前に示されている。ＮａＦは、ＡＲ４２Ｊ細胞におけるチロシンリン酸化事象に対するＣＣＫの効果を模倣し、それゆえ、ＣＣＫレセプターとチロシンリン酸化との間の変換器として機能するフッ化物感受性Ｇタンパク質が存在するという仮説（同書）に信頼性を与える。
【０１２３】
ＧＬＰ−１は、ＡＲ４２Ｊ細胞中で単独でまたはＣＣＫとともに用いたとき、細胞内カルシウムを明らかに増加させたが、アミラーゼ放出を増加させないようであった。ｃＡＭＰの増加は、ＧＬＰ−１の存在下では実証されなかったが、グルカゴンを用いた場合は明らかであった。Ｍａｌｈｏｔｒａら（１９９２）は、ラット腺房細胞を用いて、ＧＬＰ−１に相同であるドクトカゲ（Ｇｉｌａ  ｍｏｎｓｔｅｒ）毒であるｅｘｅｎｄｉｎ−４が、ＣＣＫ誘導性アミラーゼ放出を増強し、そして細胞ｃＡＭＰを増加させたと述べたが、Ｍａｌｈｏｔｒａら（１９９２）はＧＬＰ−１効果については考察しなかった。しかし、ｃＡＭＰの増加は、１０-8Ｍのｅｘｅｎｄｉｎ−４が用いられるまでは観察されず、その濃度では、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、他のレセプターを介して相互作用してい得る（同書）。同様に、ＣＣＫ誘導性アミラーゼ放出を増強することに対する効果（ＣＣＫ単独によって放出される総アミラーゼの１２％から、それに対してｅｘｅｎｄｉｎ−４およびＣＣＫを一緒に用いる場合の１６％）が１０-8Ｍのｅｘｅｎｄｉｎ−４を用いて見られ、そしてＣＣＫに１時間暴露した時間経過のうちの１５分間の時点でのみ統計学的有意に達した（ｐ＜０．０２）。この方法は、生じたとしてもＧＬＰ−１またはｅｘｅｎｄｉｎ−４のこのような非常に小さくかつ時間特異的な効果を捕らえるのに充分になほど感受性ではないかもしれず、そして再度、Ｍａｌｈｏｔｒａらによって示された分泌に対する効果は、他のレセプターとの相互作用に起因し得る。膵臓のβ細胞では、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、１０-10Ｍ程度の低い濃度で、ｃＡＭＰおよびインスリンの分泌を増加させる（Ｇｏｋｅら，１９９３）。あるいは、低いレセプター親和性に起因して、ＧＬＰ−１を用いてのｃＡＭＰレベルの小さく急な変化は検出されていないかもしれない。
【０１２４】
ＡＲ４２Ｊ細胞の応答は、末梢細胞（肝臓、脂肪および骨格筋）において見られる応答と類似する。この応答はどちらでも、ｃＡＭＰレベルの上昇を示さない（Ｖａｌｄｅｒｄｅ  Ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ−Ｐｅｎａｃａｒｒｉｌｌｏ，１９９６）。ＧＬＰ−１は、β細胞におけるＧタンパク質サブタイプとは異なるＧタンパク質サブタイプまたは他のＧタンパク質サブタイプのいずれかと共役し得るようである。ＣＣＫレセプターは、腺房細胞においてＧiサブタイプならびにＧqサブタイプと共役していることが示された（Ｓｃｈｎｅｆｅｌら，１９９０）。ＡＲ４２Ｊ細胞では、ＧＬＰ−１は、少なくとも１つのＧiサブタイプ、およびおそらく他のＧタンパク質αサブユニットと共役し得る。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞では、ＧＬＰ−１が脂質合成およびグルコース取り込みを増加させており、このＧＬＰ−１レセプターがＧiサブタイプに共役している可能性が最も高いこと（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７）およびＧＬＰ−１レセプターを過剰発現するＣＨＯ細胞では、このＧＬＰ−１レセプターが他のαサブユニットと共役していること（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９７）が示されている。
【０１２５】
ＣＣＫと同様に、ＧＬＰ−１によって誘導される細胞内カルシウムの上昇は、小胞体に由来した。しかし、カルシウム勾配のパターンは、ＣＣＫを用いた場合と同じではなかった。このことは、ＣＣＫによるカルシウムの放出へのシグナル伝達が、グルカゴンおよびＧＬＰ−１によるものとはおそらく異なることを意味する。ＧＬＰ−１は、チロシンリン酸化事象を増加させなかった。このことは、調節されたアミラーゼ放出についてのチロシンリン酸化の重要性を再度実証する。これはまた、細胞内カルシウムの上昇とは独立した経路が、アミラーゼの分泌に重要であることを実証する。これはさらに、タプシガーギンおよびリアノジンの存在下で得られた結果によって強調される。これらは、これらが減少させた細胞内カルシウムの上昇を全て防止したが、ＣＫ誘導性アミラーゼ放出を完全には防止しなかった。それゆえ、細胞内カルシウムの上昇が、ＣＣＫ誘導性アミラーゼ放出の完全発現に必要であるが、それ自体の上昇は明らかに、ＡＲ４２Ｊ細胞におけるアミラーゼ放出を誘導するためには充分ではない。
【０１２６】
任意の細胞型が、ＧＴＰ結合タンパク質の多様なβサブユニットを含み得る（ｖｏｎ  Ｗｅｉｚｓａｃｋｅｒら，１９９２）。このことは、活性化されるサブタイプ（すなわち、ＣＣＫもしくはＧＬＰ−１によるＧq、グルカゴンもしくはＧＬＰ−１によるＧs、またはＣＣＫおよびＧＬＰ−１の両方によるＧi）に依存して、異なるＧβyサブユニットが放出され得ることを意味し得る。次いで、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化について既に記載されたように（Ｈａｗｅｓら，１９９５）、特異的Ｇβyが、ＡＲ４２Ｊ細胞において観察されるチロシンリン酸化事象のために必要とされ得る。これはまた、２つの異なるＧβyサブユニットが１つのホルモンの作用によって放出されるならば、これらは種々の下流の事象に対して相加的なまたは拮抗的な効果を有し得るという可能性を生じる。
【０１２７】
ＧＬＰ−１レセプターは、ＡＲ４２Ｊ細胞に存在する。ＧＬＰ−１およびｅｘｅｎｄｉｎ−４によるそれらの活性化は、おそらくＥＲからの、細胞内カルシウムの増加を導く。しかし、それらの活性化は、アミラーゼ放出の増加を導かず、そしてＣＣＫ誘導性アミラーゼ放出は増強されない。
【実施例５】
【０１２８】
実施例４に議論されるように、ＧＬＰ−１レセプターは、ＡＲ４２Ｊ細胞上に存在し、そしてＧＬＰ−１によるＡＲ４２Ｊ細胞の急性処理は、細胞中の細胞内カルシウムを増大させる。さらに、以前の研究により、デキサメタゾンはＡＲ４２Ｊ細胞が腺房様細胞となることを促進した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ、１９９４）が、βセルリンおよびアクチビンＡはＡＲ４２Ｊ細胞の約１０％をインスリン産生細胞に転換する（Ｍａｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６）ことが示された。同様に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、肝細胞（ｈｅｐｔｏｃｙｔｅ）錯乱因子（ＨＳＦ）としても知られる）への曝露後、ＡＲ４２Ｊ細胞の約３％がインスリンポジティブであった；それに対して、ＨＧＦおよびアクチビンＡへの曝露は、約１０％のインスリンポジティブ細胞を生じた（Ｍａｓｈｉｍａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９６）。ＧＬＰ−１またはｅｘｅｎｄｉｎ−４のいずれかに関しては上記研究のいずれについて何も述べられていない。さらに、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４のいずれも、アクチビンＡおよびβセルリンによる組み合わせ処置あるいはＨＧＦおよびアクチビンＡによる組み合わせ処置よりもはるかに大多数で、ＡＲ４２Ｊ細胞をインスリン産生細胞に変換し得る。ＧＬＰ−１またはｅｘｅｎｄｉｎ−４による効果の機構は、ＥＲＫ活性化の阻害がインスリンおよびグルカゴン産生を防止したので、最終工程としてＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路の活性化に関与し得る。
【０１２９】
材料。ＡＲ４２Ｊ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得られた。ＧＬＰ−１、ｅｘｅｎｄｉｎ−４およびｅｘｅｎｄｉｎ−９−３９（ＧＬＰ−１レセプターアンタゴニスト）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）からであった。抗インスリン抗体および抗グルカゴン抗体は、Ｌｉｎｃｏ（Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ）からであった。抗ラットＥＲＫ１／２抗体（ＥＲＫ１−ＣＴ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から購入された。インスリンラジオイムノアッセイ試薬は、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）からであった。タンパク質測定試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から得られた。ペルオキシダーゼＡＢＣキットは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から得られた。ＴｉａｎTM  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲシステムは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入された。デオキシリボヌクレアーゼＩは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から得られた。ガラス製カバーガラスは、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）からであった。タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター１−ｏ−ヘキサデシル−２−ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロール（ＰＫＩ）、およびＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）インヒビター、ＰＤ９８０５９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からであった。
【０１３０】
細胞培養。ＡＲ４２Ｊ細胞を、１０％胎児仔牛血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンで補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。継代２３〜３５からの細胞を、この研究に使用した。細胞を、慣用的に、約１０5細胞／ｍｌの濃度で、１２ウェルのクラスターディッシュまたはカバーガラスにプレートし、そして９５％空気および５％ＣＯ2、３７℃で加湿インキュベーター中にてインキュベートした。
【０１３１】
免疫細胞化学分析。細胞を、ガラス製カバーガラス上で培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、血清を除去し、そしてＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定した。細胞を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間、透過させ、残りの手順を加湿チャンバ中、室温で行った。吸引を、各工程間の試薬を除去するために使用したが、標本の乾燥は避けた。十分な試薬を、各標本をカバーするために使用した（約１または２滴が通常、適切である）。カバーガラスを、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ2Ｏ2中で３０分間、インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、そしてＰＢＳ（３回）洗浄し、続いて、ＰＢＳ中の２％ヤギ血清とともに３０分間、インキュベートし、ＩｇＧの非特異的結合をブロックした。過剰の血清を、ブロッティングによって除去した。特異的１次ポリクローナル抗血清（抗インスリン  １：３００；抗グルカゴン  １：３００）を使用した。抗体を、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳ中に希釈した。これを、カバーガラスに付与し、そして室温で１時間、インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳで３回洗浄し（各回５分間）、次いで、ビオチン標識した２次抗体とともに１時間インキュベートし、そしてＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ中のアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を、３０分間適用した。イムノペルオキシダーゼ標識を、Ｖｅｃｔｏｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて行った。ＰＢＳ中の広範囲の洗浄を４〜５回（各５分間）した後、カバーガラスを、ＰＢＳ中のジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）中で、０．０１％過酸化水素とともに、３分間、インキュベートした。この反応を、カバーガラスをＰＢＳ中で洗浄することによって停止させ、そして光学顕微鏡で検査した。特異的染色を確かめるために、予め吸収された１次抗体とともにインキュベートしたサンプルを、ネガティブコントロールとして使用し、そしてインスリン産生細胞株ＲＩＮ  １０４６−３８細胞を、本発明者らの実験のためのポジティブコントロールとして使用した。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（ＡＢＣ）手順を、当該分野において公知の方法（Ｈｓｕら、１９８１）に従って行った。
【０１３２】
免疫反応性インスリンの測定。ＡＲ４２Ｊ細胞を、１２ウェルのクラスタープレート中で、既に述べたように培養した。細胞が６０％集密に達したとき、これらをＧＬＰ−１で３日間、処理した。実験開始時に、培地のアリコートを、培地中のインスリン蓄積をアッセイするために、採取した。次いで、この細胞を、Ｋｒｅｂのリンガーバランス緩衝液（ＫＲＢＢ）で２回、洗浄し、そして１０ｍＭグルコースを含有する同じ緩衝液において、さらに１時間、インキュベートした。この培地を回収し、そしてインスリンレベルをＲＩＡによってアッセイするまで、−２０℃に保った（実施例１；Ｗａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９５を参照のこと）。この細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして０．２５％チプシン（ｔｙｐｓｉｎ）および０．０２％ＥＤＴＡを用いて分離（ｄｅｔａｃｈ）させた。細胞ペレットを回収し、そして標準物質としてウシ−グロブリンを使用するＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）によるタンパク質測定のために、ギ酸で溶解させた。
【０１３３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。総ＲＮＡを、処理されたＡＲ４２Ｊ細胞から、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）の方法によって単離した。総ＲＮＡサンプルを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ  ＫＣｌ中のＤＮＡｓｅによって予め処理し、微量の汚染ゲノムＤＮＡを除去した。ＲＴ−ＰＣＲを、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００μＭの各ｄＮＴＰ、ラットインスリンＩおよびＩＩに対する０．４μＭの各センスおよびアンチセンスプライマー（インスリンセンスプライマー＝５’ＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴ３’；インスリンアンチセンスプライマー＝５’ＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡ３’）を含有する緩衝液（容量５０μｌ）中で実施した。増幅を、変性温度９４℃（１分間）、アニーリング温度６０℃（４５秒間）および伸長温度７２℃（１分間）、２５サイクルで行った。ＲＩＮ  １０４６−３８細胞由来のｍＲＮＡを、ポジティブコントロールとして使用した。グルカゴンＲＴ−ＰＣＲの場合において、変性および伸長の温度は、アニーリング温度が６５℃で１分間（グルカゴンセンスプライマー＝５’ＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧ３’；アンチセンスプライマー＝５’ＣＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣ３’）であることを除いては、インスリンに類似していた。ＲＴ−ＰＣＲ手順を、２％アガロースゲル上の臭化エチジウム染色によって視覚化した。
【０１３４】
ＭＡＰキナーゼ活性。処理後、８０％集密細胞の６０ｍｍディッシュを、溶解緩衝液（ｍＭで示す）：５０  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＰＨ８、１５０  ＮａＣｌ、５  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．２５％  デオキシコール酸ナトリウム、１  ＮａＦ、１０  ピロリン酸ナトリウム、０．１  ＰＭＳＦ、１  オルトバナジン酸ナトリウム、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、および１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン中４℃で溶解した。この細胞溶解液を、１６，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離により清澄化した。この清澄化した細胞溶解液を、４．５μｇのＥＲＫ１−ＣＴ抗体および４０μｌのパックされたプロテインＧ＋プロテインＡアガロース樹脂（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）とともに回転しながら、４℃で一晩免疫沈降した。この免疫ペレットを、基質としてＭＢＰを用いてＭＡＰＫ活性についてアッセイした。ＭＢＰ（１８．６μｇ）を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０μＭ非標識ＡＴＰおよび４０μＣｉ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）［32Ｐ］−ＡＴＰを含む６０μｌの最終容量中１０分間２０℃でリン酸化した。この反応は、２５μｌの３×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液の添加、および７０℃で１０分間加熱することにより停止した。ＭＡＰＫ活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより評価した。このオートラジオグラムをデンシトメトリーにより定量化した。
【０１３５】
アミラーゼアッセイ。アミラーゼ測定のために、細胞を、２ｍｌ  ＰＢＳで培地のないように洗浄した。次いで、インキュベーションを、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２％ＢＳＡおよび０．０１％大豆トリプシンインヒビターを含むＤＭＥＭ中で実施した。ＣＣＫ（１ｎＭ）を、３７℃で５０分間添加した。次いでこのインキュベーション培地を、アミラーゼ測定のために即座に取り出し、そしてこの細胞を再び２ｍｌの氷冷ＰＢＳ中で洗浄した。（ｍＭで示す）１３０  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０  ＣａＣｌ2、７５  ＮａＣｌ、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ｐＨ８．０）を含む溶解物緩衝液を細胞に添加し、次いで溶解物を総アミラーゼのために集めた（Ｃｅｓｋａら、１９６９）。放出されたアラーゼは、細胞中の総アミラーゼの百分率として表した。
【０１３６】
統計学。すべてのデータ値は、平均±ＳＥＭとして示され、そして処理された群間の差異は、１因子ＡＮＯＶＡ分析により分析した。処理細胞と非処理細胞との間の差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５は、有意な差異であると考えられた。
【０１３７】
インスリンおよびグルカゴンの発現に対するＧＬＰ−１の影響。ＧＬＰ−１またはｅｘｅｎｄｉｎ−４処理の後、ＡＲ４２Ｊ細胞は、インスリン含有細胞に変換する．抗インスリン抗体を用いると、強い免疫染色がＡＲ４２Ｊ細胞中に存在した。対照的に、ＧＬＰ−１で処理されなかったＡＲ４２Ｊでは免疫染色が観察されなかった。過剰のインスリンおよびグルカゴンでの抗体の予備吸収は染色を防いだ（図２６）。
【０１３８】
１ｎＭ  ＧＬＰ−１で、３日後に、約１０％が、インスリン陽性細胞に転換した。１０ｎＭ  ＧＬＰ−１または０．１ｎＭ  ｅｘｅｎｄｉｎ−４を３日間用いた場合、約２５％のＡＲ４２Ｊ細胞が、インスリン陽性細胞に転換した。スライドのいくつかの領域で、隣接する細胞の全体のシートがインスリンについて陽性になった。２４時間程度の早期にグルカゴン陽性細胞が時々出現した。４８時間までに、すべての処理されたＡＲ４２Ｊ細胞の２０％がグルカゴン陽性であり、約６％の細胞がインスリン陽性であった。７２時間までにすべての処理された細胞の半分には十分の細胞がグルカゴンを含んでいた。グルカゴンを含んだ細胞の数は、その後減少したが、少なくとも７日間の間、なお約２５％の細胞がインスリン陽性のままであった（図２７）。培養培地中のデキサメタゾンの存在または不在は、ＧＬＰ−１の存在下で「内分泌」細胞に転換した細胞の数にいかなる方法によっても影響しなかった。ＥＲＫをリン酸化および活性化するＭＥＫの選択的インヒビターであるＰＤ９８０５９（５０μＭ）、またはＰＫＩ（３００μＭ）がＧＬＰ−１と同時に添加されたとき、細胞の転換は生じなかった。
【０１３９】
インスリン放出。１ｎＭ  ＧＬＰ−１でＡＲ４２Ｊ細胞を処理する３日の期間の後、インスリンは、ラジオイムノアッセイにより培養培地中で容易に検出された。３つの別の培養にわたって、５．１±０．４ｐｇインスリン／μｇタンパク質（平均±ＳＤ）が、６０〜７２時間の期間から細胞培養培地中に存在した。グルコースが、３日−ＧＬＰ−１−処理および非処理細胞からインスリン分泌を誘導し得るか否かを調査するために、培地を除去し、そして細胞をグルコースを含まないＫＲＢＢで３回洗浄した。これに続いて、１０ｍＭグルコースを含むＫＲＢＢを１時間添加し、そしてこの細胞を３７℃で維持した。インキュベーション緩衝液を集め、そしてインスリンを測定した。コントロール細胞からはインスリンはゼロであった。その一方、ＧＬＰ−１の３日に先に見られた細胞の緩衝液中には０．６５±０．１５ｐｇインスリン／μｇタンパク質が存在した。インスリン分泌は、２００μＭ  ＰＫＩの存在下、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）の存在下でわずかに検出された。
【０１４０】
ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、３日の間、ＧＬＰ−１処理ＡＲ４２Ｊ細胞において、１８７ｂｐのラットインスリンＩおよびＩＩ  ｍＲＮＡを示した。ＲＩＮ細胞を陽性コントロールとして用いた。この実験では、ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅで前処理し、推定された長さをもつインスリンＩおよびＩＩのｍＲＮＡフラグメントのみを増幅し、それ故、１８７ｂｐに出現したバンドは、特異的なインスリンｍＲＮＡ産物であった（図２８Ａ）。対照的に、陰性コントロール中または非−ＧＬＰ−１−処理細胞中ではＲＴ−ＰＣＲ産物は検出されなかった。ＧＬＰ−１−刺激ＡＲ４２Ｊ細胞のノザンブロット分析は、かすかに陽性であり、そしてそれ故このバンドは乏しく走査された。２３６ｂｐのグルカゴンｍＲＮＡは、４８時間のＧＬＰ−１−処理ＡＲ４２Ｊ細胞中で検出された（図２８Ｂ）。
【０１４１】
ＭＡＰキナーゼ活性。ＥＲＫ活性化はＡＲ４２Ｊ細胞中で容易に検出された。その活性は、ＧＬＰ−１で顕著に増加し、アメリカドクトカゲ毒液ペプチドであるｅｘｅｎｄｉｎ−４は、これはＧＬＰ−１に対して５２％相同であり、そしてインスリンの分泌促進物質であることが示された（Ｇｏｋｅら、１９９３）。ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１に比べ約１００倍より能力があった（図２９Ａおよび２９Ｂ）。ＰＫＩ（３００μＭ）単独は、ＭＡＰＫ活性をコントロール細胞のそれより少なく減少させた。
【０１４２】
アミラーゼ変化。ＡＲ４２Ｊをデキサメタゾンと７２時間インキュベートすることは、非デキサメタゾン処理細胞（１．８８Ｕ／ｌ）と比較して、細胞においてアミラーゼ含量を６．６倍（１２．５７Ｕ／ｌ）増加させた。ＧＬＰ−１をデキサメタゾンと一緒に添加したとき、総アミラーゼ含量は、デキサメタゾンン処理単独に比べて減少した（７．７６Ｕ／ｌ）。ＣＣＫ（１ｎＭ）に対する急性応答はまた、ＧＬＰ−１で７２時間前処理した細胞中で減少した（図３０）。
【０１４３】
ＧＬＰ−１は、膵臓内分泌細胞に、またはまさに少なくとも、内分泌形質を有する細胞に分化するようにＡＲ４２Ｊ細胞を誘導する。この所見と共に、同じパターンが、発生中の胎性膵臓で生じる（Ｇｕｚら、１９９５）。グルカゴンが、検出された第一のホルモンである（Ｒａｌｌら、１９７３）。グルカゴンを含有する細胞は、種々の他のタイプの島内分泌細胞の前駆細胞であること、およびそれらは、順に、管上皮から生じたことが仮定される（Ｇｕｚら、１９９５）。しかし、膵臓ホルモン産生細胞の形成および分化を調節する機構は、なお大部分は未決定である。ＧＬＰ−１は、ＡＲ４２Ｊ細胞において非常に早期にグルカゴン産生を開始させ、そしてこれは、次いで、インスリン産生へと密に続く。最終的に、「内分泌」ＡＲ４２Ｊ細胞の大部分は、グルカゴン産生が弱まるのでインスリン産生細胞である。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＡＲ４２Ｊ細胞におけるインスリン産生のための因子としてＧＬＰ−１よりずっと強力であった。いくつかのインスリン含有細胞を、１０-11モル濃度程度の濃度のｅｘｅｎｄｉｎ−４の存在下で見られた。ＧＬＰ−１（および／またはＧＬＰ−１様ペプチド、おそらくｅｘｅｎｄｉｎ−４に類似する）は、島のための胚における分化因子であり得る。このようなペプチドは、膵臓が原始腸管から形成するので、高濃度で局所的に存在することが予期される。
【０１４４】
グルカゴンは、細胞増殖の減少および巨大分子合成の変化に至るｃＡＭＰを増加し、β細胞表現型に達することにより、β細胞の分化のためのシグナルであると仮定されている。（Ｒａｌｌら、１９７３）。これはなお、ＡＲ４２Ｊ細胞中に適用可能であり得る。グルカゴンが本発明者らの系で最初に見られたホルモンであるので、それは、インスリン産生のためのシグナルであり得る。原始腸管で産生されたＧＬＰ−１は、グルカゴン発現（および続くインスリン発現）のためのシグナルであり得、これは、内分泌細胞のさらなる形成および島様構造に至る。
【０１４５】
ＡＲ４２Ｊ細胞ならびに他の細胞型における「内分泌」細胞分化への最終の共通経路は、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路を通ってであるようである。ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４は、ＡＲ４２Ｊ細胞においてほとんどまたは全くインスリン染色を生じず、そしてＥＲＫ活性が阻害されるとき培地中にインスリンを生じない。ＧＬＰ−１およびＰＫＣインヒビターの存在下でほとんどまたは全くインスリンがないことが、観察される。ＧＬＰ−１レセプターはＧタンパク質結合性であり、ＡＲ４２Ｊ細胞に存在し、そしてＡＲ４２Ｊ細胞中に細胞内カルシウムを上昇させることが知られているので（実施例４を参照のこと）、リガンド結合によるその活性化は、おそらく、ＰＫＣ活性化、および未だ決定されていない下流の事象のような他の事象に至る（Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ、１９８４；Ｚａｍｐｏｎｉら、１９９７）。ＰＫＣは、順に、ＭＡＰＫ経路を活性化する因子の１つであることが示されている（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓら、１９９３；Ｓｉｄｄｈａｎｔｉら、１９９５）。従って、ＧＬＰ−１によるＰＫＣ活性化のブロッキングは、おそらく、ＭＡＰＫ活性の消失に至り、そして「内分泌」細胞表現型の発生を防止した。
【０１４６】
さらに、全ての細胞が、７日程度のインキュベーションを伴ってでさえ、ＧＬＰ−１を有する「内分泌」細胞に変換するわけではない。処理されたＡＲ４２Ｊ細胞は、未処理ＡＲ４２Ｊ細胞について記載されるように、外分泌特性および神経内分泌特性の両方を有する（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ、１９９４を参照のこと）。形態学的には、処理細胞の種々の集団は、同じではないようである。従って、細胞の亜集団は、未処理ＡＲ４２Ｊ細胞に存在し得る。詳細には、これらの集団のいくつかは、ＧＬＰ−１レセプターを有するかもしれず、そして他は有さないかもしれない。ＡＲ４２Ｊ細胞の全集団から作製された細胞集団は、ウェスタンブロッティング、ＰＣＲ分析、および部分配列決定によってＧＬＰ−１レセプターを有する。配列決定の際に、レセプターは、β細胞に見出され、そして既に十分に特徴付けられているものと同一である（実施例４を参照のこと）。さらに、ＡＲ４２Ｊ細胞の少なくとも５０％は、ＧＬＰ−１に応答して細胞内カルシウムを増大させる。従って、ＧＬＰ−１は、おそらく、細胞内カルシウムの増加、および今のところ他のこれまで未知の因子（これは、ＡＲ４２Ｊ細胞に明確に存在し、そしてそれらが「内分泌」細胞になるように方向付ける）を必要とする一連の事象を活性化する。
【実施例６】
【０１４７】
１型糖尿病と診断された被験体は、ＧＬＰ−１またはｅｘｅｎｄｉｎ−４での処置について選択され得る。Ｇｕｔｎｉａｋら、１９９２の処置方法は、ＧＬＰ−１が肘前静脈中にカニューレによって少なくとも２４時間投与されるように改変され得る。カニューレは、０．０３〜４．８０ｎｍｏｌ／ｋｇ／分ＧＬＰ−１の間でポンプ注入するインスリン注入システムに接続され得る。血中グルコースレベルが、当該分野で周知の方法を用いて、ＧＬＰ−１の投与の間およびＧＬＰ−１投与の２４時間の期間後、定期的にモニタリングされ得る。ＧＬＰ−１注入の２４時間後、被験体は、正常レベルに接近し、そしてインスリン療法の必要性を減少させた血中グルコースのレベルを示す。
【０１４８】
あるいは、１型糖尿病を有する被験体は、単回の皮下注射によって、または０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜０．４ｎｍｏｌ／ｋｇの毎日の繰り返し皮下注射によって、ｅｘｅｎｄｉｎ−４で処置され得る。血中グルコースレベルは、ｅｘｅｎｄｉｎ−４の投与後、定期的にモニタリングされ得る。インスリン置換療法の必要性が減少し、そして血中グルコースレベルは正常なレベルに近づく。
【０１４９】
前述の実施例は、本発明を例証することを意図するが、限定することは意図しない。それらは、用いられ得る発明の典型ではあるが、当業者に公知の他の手順は、代替的に使用され得る。
【０１５０】
上記のように、細胞をＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４と接触させることにより、ＧＬＰ−１またはＥｘｅｎｄｉｎ−４の両方、実質的に相同な配列、またはそれらのフラグメントがともに使用され得ることが理解される。
【０１５１】
本願を通して、種々の刊行物が言及されている。これらの刊行物の開示は、その全体が、本発明が属する技術分野の水準をより十分に記載するために、本明細書によって本願に参考として援用される。
【０１５２】
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２９．  Ｊａｎｃｚｅｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｌａｋａｔｔａ．  １９９３．  Ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｆｌｕｘ  ｂｙ  ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ‐ｐｉｇ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４７１  ：  ３４３‐３６３．
３０．  Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎｉ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７  ：  ９１７‐９２５．
３１．  Ｋｏｎｎｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６．  Ｎｏｎｓｙｎａｐｔｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ
ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｉ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｉｚｕｒｅｌｉｋｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｌｏｗ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．  ５６  ：  ４０９‐４２３．  
３２．  Ｌｏｇｓｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２  ：  １５７６５‐１５７６９．
３３．  Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８  ：  １１１１９‐１１１２４．
３４．  Ｍａｌｈｏｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｅｘｅｎｄｉｎ‐４，  ａ  ｎｅｗ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ  ｖｅｎｏｍ，  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｍｙｌａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎｉ．  Ｒｅｇｕｌ．  Ｐｅｐｔ．  ４１  ：  １４９‐１５６．
３５．  Ｍａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ａｍｙｌａｓｅ‐ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ＡＲ４２Ｊ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ‐ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９７  ：  １６４７‐１６５４．
３６．  Ｍａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６，  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ‐Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ａｃｉｎａｒ  ＡＲ４２Ｊ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７  ：  ３９６９‐３９７６．
３７．  Ｍａｔｓｃｈｉｎｓｋｙ．  １９９０．  Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ６‐ｃｅｌｌｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ３９  ：  ６４７‐６５２．
３８．  Ｍｏｎｔｒｏｓｅ‐Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｈｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２  ：２１２０１‐２１２０６．
３９．  Ｍｏｎｔｒｏｓｅ‐Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＩＮ  １０４６‐３８  ｃｅｌｌｓ  ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １３５  ：  ５８９‐５９４．
４０．  Ｍｏｎｔｒｏｓｅ‐Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ＧＬＰ‐１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｇ‐ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６  ：  ０７２４ａ  （Ａｂｓｔｒ．）
４１．  Ｍｏｎｔｒｏｓｅ‐Ｒａｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｎｏｖｅｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ３Ｔ３‐Ｌ１  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １７２  ：  ２７５‐２８０．  
４２．  Ｍｕａｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  Ａｇｏｎｉｓｔ‐ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｏｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌ．  Ｉ．  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５５  ：  Ｇ２２１‐２２８．
４３．  Ｍｕｅｃｋｌｅｒ．  １９９０．  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ‐ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ３９  ：  ６‐１１．
４４．  Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐ｌ‐  （７‐３７）  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．  １５  ：  ２７０‐２７６．
４５．  Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  （７‐３６）  ａｍｉｄｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ‐２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１  ：  ３０１‐３０７．
４６．  Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ｂｙ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  （７‐３６）  ａｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  （ｎｏｎ‐ｉｎｓｕｌｉｎ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  ３６  ：  ７４１‐７４４．
４７．  Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ．  １９８４．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：  ６９３‐６９８．
４８．  Ｏｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒｅｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎｉ  ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １１７  ：  １２２‐１２８．
４９．  Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ‐ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＭＡＰ）  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃａｒｂａｃｈｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２９４  ：  ５４５‐５５０．
５０．  Ｏｒｓｋｏｖ．  １９９２．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１，  ａ  ｎｅｗ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｔｅｒｏ‐ｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  ３５  ：  ７０１‐７１１．
５１．  Ｐｅｒｆｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ａｇｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｔｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６９  ：  Ｅ９８３‐９９０．
５２．  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｙｐｅ  ＩＪ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ：  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９８８．  
５３．  Ｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９７３．  Ｅａｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ；  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｇｌｕｃａｇｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  
Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓ  ｃｉ．  ＵＳＡ  ７０  ：  ３４７８‐３４８２．
５４．  Ｒｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ，  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ，  ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎｏｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＧＬＰ‐１  ［７‐３６  ａｍｉｄｅ］  ａｆｔｅｒ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．  Ｄｏｓｅ‐ｒｅｓｐｏｎｓｅ‐ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  ３８  ：
７２０‐７２５．
５５．  Ｒｉｖａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６９  ：  Ｇ３５２‐Ｇ３６２．
５６．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  Ｐｒｉｍｅｒ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９  ：  ４８７‐４９１．
５７．  Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｎ‐Ｇｌｙｃａｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔ  ’Ｉ  Ｊ  Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ  ２１：  ２１  ‐２９．
５８．  Ｓｃｈｎｅｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｇｊｌ‐，  Ｇｊ２‐，  Ｇｊ３‐ａｎｄ  ｓｅｖｅｒａｌ  Ｇｓ‐ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２６９  ：
４８３‐４８８．
５９．  Ｓｉｄｄｈａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １３６  ：  ４８３４‐４８４１．
６０．  Ｓｐｕｒｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｓ＋，  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２５８  ：  Ｈ５７４‐Ｈ５８６．
６１．  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９７２．  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＩＩ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，  ５’‐ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ３’，  ５’‐ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４７  ：  １１１４‐１１２０．
６２．  Ｔｅｉｔｅｌｍａｎ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ‐ｃｅｌｌ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｓｌｅｔ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｒｅｖ．  １２  ：  ９１‐１０２，１９９６．  
６３．  Ｔｈｏｒｅｎｓ．  １９９２．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏ‐ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９  ：  ８６４１‐８６４５．
６４．  Ｔｈｏｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＬＰ‐１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ：  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ‐４  ｉｓ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ｅｘｅｎｄｉｎ‐３  （９‐３９）  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ４２  ：  １６７８‐１６７２．
６５．  Ｔｈｏｒｅｎｓ  ａｎｄ  Ｗａｅｂｅｒ．  １９９３．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ＮＩＤＤＭ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ４２  ：  １２１９‐１２２５．
６６．  ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．  １９９５．  ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ  １６  ：  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ６  ｙｅａｒｓ’ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ：  Ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ４４  ：  １２４９‐１２５８．
６７．  Ｖａｊａｎａｐｈａｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｃｒｏｓｓ‐ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｃＡＭＰ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９６  ：３８６‐３９３．
６８．  Ｖａｌｖｅｒｄｅ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ‐Ｐｅｎａｃａｒｒｉｌｌｏ．  １９９６．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＧＬＰ‐１  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ，  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｆａｔ．  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  １５７  ：  ３５９‐３６０．
６９．  ｖｏｎ  Ｗｅｉｚｓａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ；  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｔａ‐ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃＤＮＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １８３  ：  ３５０‐３５６．
７０．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ‐１  ｃａｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｈｅ  ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９  ：  ２８８３‐２８８９．
７１．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ＲＩＮ  １０４６‐３８  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １３６  ：  ４９１０‐４９１７．  
７２．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  ＧＩＰ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ，  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｓ，  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＩＮ  １０４６‐３８  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｅｎｄｏ．  １１６  ：  ８１‐８７．
７３．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  ｉｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｉｎ  ｒａｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５  ：  ４１７‐４２１．
７４．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ，  ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｍａｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８１  ：  １７６‐１８４．
７５．  Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｗｅ．  １９８８．  Ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ  ｔｅｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２３  ：  １００８‐１０１３．
７６．  Ｗｉｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐Ｉｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１  （ＧＬＰ‐１）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ＧＬＰ‐１  ａｎｄ４‐ｐｈｏｒｂｏｌ  １２‐Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３‐ａｃｅｔａｔｅ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １０  ：  ６２‐７５．
７７．  Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ，  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｌｉｑｕｉｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅａｌ  ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１‐  （７‐３６）  ａｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  （ｎｏｎ‐ｉｎｓｕｌｉｎ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８１  ：  ３２７‐３３２．
７８．  Ｙａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１‐  （７‐３  ６）  ａｍｉｄｅ  ａｎｄ  ａ  ｒｉｓｅ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，  ５’‐ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｆｒｅｅ  Ｃａ２＋  ｉｎ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｂ‐ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｃａ２＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３  ：  １６８５‐１６９２．
７９．  Ｚａｍｐｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  １  ｓｕｂｕｎｉｔ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８５  ：  ４４２‐４４６．
８０．  Ｓｃｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ５１  ：  ７６．
８１．  Ｗａｒｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３４  ：  ５５．
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明は、医薬分野、特に糖尿病治療用医薬の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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