(57)【要約】【課題】酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法、並びに前記糖の製造方法により得られる糖を提供すること。【解決手段】草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物から、セルロースの結晶型を改変したセルロース画分を得るアルカリ処理工程と、該セルロース画分に含まれるセルロースを酵素により糖化する糖化工程と、を含むことを特徴とする糖の製造方法である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物から、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得るアルカリ処理工程と、
該セルロース画分に含まれる該セルロースＩＩ型及び該アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを酵素により糖化する糖化工程と、
を含むことを特徴とする糖の製造方法。
【請求項２】
アルカリ処理工程が、アルカリ処理物を洗浄する洗浄処理を含む請求項１に記載の糖の製造方法。
【請求項３】
アルカリ処理工程が、アルカリ処理物を乾燥させることなくセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得る工程である請求項１から２のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項４】
アルカリセルロースＩＶ型の含有量が、全セルロースの含有量に対して９０質量％以上である請求項１から３のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項５】
アルカリ処理工程が、アルカリ処理物の水分含有率を低下させることによりセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得る工程である請求項１から２のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項６】
セルロースＩＩ型の含有量が、全セルロースの含有量に対して９０質量％以上である請求項５に記載の糖の製造方法。
【請求項７】
アルカリ処理工程が、セルロース画分のｐＨを調整するｐＨ調整処理を含む請求項１から６のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項８】
酵素が、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼの少なくともいずれかを含む酵素群である請求項１から７のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の糖の製造方法で得られることを特徴とする糖。
【請求項１０】
請求項９に記載の糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の糖を発酵させて乳酸を得ることを特徴とする乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖及び糖の製造方法、並びにエタノールの製造方法及び乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃焼への世界的ニーズの高まりに対応して、世界的規模でバイオエタノールの製造技術の開発競争が繰り広げられている。特に、食料資源と競合しないセルロース系バイオマス原料の利用技術開発が、欧米のみならず我が国においても最も重要なブレイクスルーとなりうることが期待されている。
【０００３】
従来、バイオエタノールの原料としては、主にサトウキビなどの糖質や、穀物などのデンプン質が用いられていたが、これらの原料は食物や飼料としても利用可能なものが多いため、各原料を用いたバイオエタノールの生産量を増加させると、食料や飼料の供給に影響を及ぼすことが懸念される。
【０００４】
一方、草や樹木などは食料生産と競合しないため、エネルギー利用に有用なバイオマス原料である。植物に由来するセルロース系バイオマス原料は、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分として含む。前記セルロースは、グルコースがβ−１，４−グルコシド結合して直鎖状に形成されている繊維状の多糖類であり、植物の細胞壁を構成する主要な成分である。前記ヘミセルロースは、前記セルロースと共に植物の細胞壁などを構成する多糖類である。前記リグニンは、ヒドロキシフェニルプロパンを基本単位として重合した高分子物質である。これらの中でも、前記セルロースは、地球上で最も存在量の多い天然高分子である。
そこで、近年、草本系バイオマスや木質系バイオマスなどのセルロースを含む原料からエタノールを製造し、各種燃料や化学原料として利用しようとする試みが広く行われている。
【０００５】
セルロース系バイオマス原料からのエタノールの製造は、例えば、収集したバイオマス原料を酵素糖化により糖に分解した後、酵母などの微生物を用いて発酵し、エタノールに変換することにより行うことができる。
セルロース系バイオマス原料から糖を抽出するためには、植物体内に高分子で存在しているセルロース及びヘミセルロースを可溶化すると同時に、グルコースなどの単糖類に分解する必要がある。しかしながら、セルロース系バイオマス原料中の糖質は複雑な構造を有する細胞壁中に埋め込まれており、糖化に先立ち苛酷な条件、例えば、濃硫酸や濃塩酸などの強酸を用いて前処理を行い、糖質を分離する方法が用いられてきたが、環境負荷低減の観点からこれらの強酸の使用は避けることが望まれている。
【０００６】
そこで、近年、濃硫酸や濃塩酸などの強酸による糖化に代わる手段として、酵素を用いたバイオマス原料の糖化が広く研究されている。酵素による糖化は、環境負荷低減、生成物の選択性、及び収率の高さの観点から望ましい手段であるが、セルロース系バイオマス原料の糖化に用いられる酵素は、既に実用化されているデンプンの酵素糖化に必要なアミラーゼ添加量と比較して、セルロースを糖化するために必要なセルラーゼの添加量が著しく多いことから、糖変換コストの増大が問題となっている。
また、バイオマス原料の酵素糖化については、反応時間が２４時間〜１００時間以上かかることを想定しており、実用的なバイオエタノールの製造技術の開発がほとんど行われていないのが現状である。
【０００７】
更に、この酵素糖化は、バイオマス原料に対して直接行なっても効率のよい酵素糖化を行なうことはできない。自然界に存在するセルロースは、セルロースＩ型と呼ばれる平行鎖構造であり、隣り合うセルロース分子が同方向に並んでおり、分子内及び分子間の水素結合により頑丈な構造物を構築している。酵素糖化を行う際には、これらの水素結合を切断しつつセルロース分子を酵素活性中心部分に導く必要があり、その速度が遅いことから、酵素糖化効率が低くなるものと考えられている。
【０００８】
そこで、酵素糖化を行うために酵素を作用させ易くする目的から、予めバイオマス原料に対して前処理を行うことが必要となる。バイオマス原料の前処理方法としては様々な方法が知られているが、希硫酸、加圧熱水などによる蒸煮処理などが一般的である（特許文献１〜４参照）。しかしながら、前述したように硫酸の使用は好ましくない。また、バイオマス原料にこれらの前処理を行い、得られた処理物を酵素糖化に供する場合では、所望の程度の酵素糖化効率を得るためには該前処理を多段で行う必要があることや、２００℃以上の高温にしなければならないことなどの点で問題である。
【０００９】
バイオマス原料を物理的手段により微細に粉砕することにより、化学的、生物化学的反応性が向上することも知られているが、粉砕のみにより十分な酵素糖化効率を得ようとすると、粉砕工程に多大なエネルギーを要し、経済合理性を失うおそれがある点で問題である。
【００１０】
また、バイオマス原料を、有機アミンやアンモニアを用いて前処理することにより、その化学的、生物化学的反応性が向上することが報告（特許文献５参照）されているが、前記前処理されたバイオマスであっても、その酵素糖化効率は未だ十分とはいえない点で問題である。
【００１１】
更に、バイオマス原料を、超臨界アンモニア流体処理により前処理することで、セルロースの結晶型をセルロースＩ型からセルロースＩＩＩＩ型へと改変させ、酵素の加水分解を促進することも報告（特許文献６参照）されているが、この方法では、バイオマス原料の含水率を十分に低下させることが必要となり、熱エネルギー使用量が増すこと、高価なアンモニアの回収や再利用技術を合わせて開発する必要があること、バイオマス原料中のリグニンやヘミセルロースが残存するため廃液処理効率が悪く、スラリー濃度の確保が困難であり、酵素の非特異的吸着を促すため酵素の再利用率も低いものであり、最終段階となる廃液処理上の負荷が増すものと考えられる点で問題である。
【００１２】
したがって、より酵素糖化効率を高めることのできる酵素糖化技術の開発及び前記酵素糖化に適した草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の前処理技術の開発が、未だ望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−０７５００７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０５５号公報
【特許文献３】特開２００２−５４１３５５号公報
【特許文献４】特開２００２−１５９９５４号公報
【特許文献５】欧州特許公開第７７２８７号公報
【特許文献６】特開２００８−１６１１２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法、並びに前記糖の製造方法により得られる糖を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物から得られたセルロース画分は、酵素糖化の効率が非常に高いこと、前記セルロース画分には、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかに含まれるセルロースＩ型から改変された、該セルロースＩ型より結晶密度の低いセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかが含まれること、この結晶型の改変は、一定濃度以上のアルカリ水溶液中に数分間から数時間浸漬することにより行うことができること、前記改変後は水で洗浄を行なってもその結晶型が変化しないこと、前記セルロース画分の水分含有率を低下させるとセルロースＩＩ型への改変が起こり、前記セルロースＩＩ型を多く含むセルロース画分を得ることができること、セルロース画分を乾燥させることなく湿潤状態を維持することでアルカリセルロースＩＶ型を多く含む処理物を得ることができること、前記セルロースＩＩ型は前記セルロースＩ型と比較して酵素糖化の効率が向上し、前記アルカリセルロースＩＶ型は前記セルロースＩＩ型と比較して更に酵素糖化の効率が向上すること、したがって、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を格段に向上させることができるという知見である。
【００１６】
前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかにアルカリ処理を施すことにより、前記草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかに含まれる前記セルロースＩ型が前記アルカリセルロースＩＶ型へと改変し、乾燥後に前記セルロースＩＩ型に不可逆的に改変することは、本発明らによる新たな知見である。
【００１７】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物から、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得るアルカリ処理工程と、該セルロース画分に含まれる該セルロースＩＩ型及び該アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを酵素により糖化する糖化工程と、を含むことを特徴とする糖の製造方法である。
＜２＞アルカリ処理工程が、アルカリ処理物を洗浄する洗浄処理を含む前記＜１＞に記載の糖の製造方法である。
＜３＞アルカリ処理工程が、アルカリ処理物を固液分離する分離処理を含む前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜４＞セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかが、不溶性画分である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜５＞アルカリ処理工程が、アルカリ処理物を乾燥させることなくセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得る工程である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜６＞アルカリセルロースＩＶ型の含有量が、全セルロースの含有量に対して９０質量％以上である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜７＞アルカリ処理工程が、アルカリ処理物の水分含有率を低下させることによりセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得る工程である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜８＞アルカリセルロースＩＩ型の含有量が、全セルロースの含有量に対して９０質量％以上である前記＜７＞に記載の糖の製造方法である。
＜９＞アルカリ処理工程が、セルロース画分のｐＨを調整するｐＨ調整処理を含む前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜１０＞酵素が、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼの少なくともいずれかを含む酵素群である前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の糖の製造方法である。
＜１１＞前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の糖の製造方法で得られることを特徴とする糖である。
＜１２＞前記＜１１＞に記載の糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法である。
＜１３＞前記＜１１＞に記載の糖を発酵させて乳酸を得ることを特徴とする乳酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法、並びに前記糖の製造方法により得られる糖を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、微結晶セルロースのアルカリ処理後の糖化率を示した図である。
【図２】図２は、微結晶セルロースのアルカリ処理後の糖化率の経時変化を示した図である。
【図３】図３は、サトウキビバガス粉砕物及びイネワラ粉砕物のアルカリ処理後の糖化率を示した図である。
【図４】図４は、サトウキビバガス粉砕物のアルカリ処理後の糖化率の経時変化を示した図である。
【図５】図５は、サトウキビバガス粉砕物（草本系茎葉部原料）、コナラ粉砕物（広葉樹原料）、及びスギ粉砕物（針葉樹原料）のアルカリ処理後の糖化率を示した図である。
【図６】図６は、草本系茎葉部原料である各種植物のアルカリ処理後の糖化率を示した図である。
【図７Ａ】図７Ａは、微結晶セルロース（セルロースＩ型）のＸ線回折パターンを示した図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、微結晶セルロースをアルカリ処理した後、乾燥させて得られたセルロースＩＩ型のＸ線回折パターンを示した図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、微結晶セルロースをアルカリ処理した後、乾燥させることなく湿潤状態を維持することにより得られたアルカリセルロースＩＶ型のＸ線回折パターンを示した図である。
【図８】図８は、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の単位格子中における分子鎖配列の分子鎖軸の投影図を重ねて示した図である。
【図９Ａ】図９Ａは、サトウキビバガス粉砕物の未処理物（セルロースＩ型）のＸ線回折パターンを示した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、サトウキビバガス粉砕物をアルカリ処理した後、乾燥させて得られたセルロースＩＩ型のＸ線回折パターンを示した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、サトウキビバガス粉砕物のアルカリ処理後、乾燥させることなく湿潤状態を維持することにより得られたアルカリセルロースＩＶ型のＸ線回折パターンを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（糖の製造方法）
本発明の糖の製造方法は、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物から、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得るアルカリ処理工程と、該セルロース画分に含まれる該セルロースＩＩ型及び該アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを酵素により糖化する糖化工程と、を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００２１】
＜アルカリ処理工程＞
前記アルカリ処理工程は、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物から、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得る工程であり、必要に応じて、更にその他の処理を含む。前記アルカリ処理工程は、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかを直接処理することができる点で有利である。
【００２２】
＜＜原料＞＞
前記アルカリ処理工程で用いる原料としては、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、セルロースを多く含む原料が好ましく、セルロースＩ型を含む原料がより好ましい。前記セルロースＩ型を含む原料を用いると、糖を多く得ることができる点で有利である。
【００２３】
−草本系茎葉部原料−
前記草本系茎葉部原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ例えば、サトウキビバガス、ソルガムバガス、イネワラ、ムギワラ、オオムギ、ススキ、ジョンソングラス、ネピアグラス、スイッチグラス、エリアンサス、コーンストーバーなどが挙げられる。
【００２４】
−広葉樹原料−
前記広葉樹原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コナラ、ブナ、キリ、カエデ、クワ、クス、シイノキ、ナラ、カツラ、カバなどが挙げられる。
【００２５】
−使用−
前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料としては、前記各種草本系茎葉部原料及び前記各種広葉樹原料から、糖などの有価物を搾汁又は分離した残渣であってもよく、精製などを行うことにより得られたセルロースＩ型そのものであってもよい。また、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
なお、天然型セルロースであるセルロースＩ型は、セルロースＩα型とセルロースＩβ型とに分類されるが、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料に含まれるセルロースＩ型としては、これらのいずれかであってもよく、またこれらの両者であってもよい。
【００２６】
前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、収集されたものをそのまま使用してもよく、裁断、粉砕などにより適宜ある程度以下の大きさにしてから使用してもよく、搾汁後の残渣を使用してもよい。
【００２７】
前記裁断した前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかのサイズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、２０ｃｍ３以下が好ましく、１ｃｍ３以下がより好ましい。前記サイズが２０ｃｍ３を超えると、処理が不十分となったり、洗浄時に軟化した繊維が絡まったりすることがある。一方、前記サイズが前記好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用するアルカリ水溶液の容量を少なくできるなどの点で有利である。
前記粉砕した前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかのサイズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０ｍｍ径以下が好ましく、２ｍｍ径以下がより好ましい。前記サイズが前記好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用するアルカリ水溶液の容量を少なくできるなどの点で有利である。
なお、前記アルカリ処理物を濾過により固液分離し、不溶性画分として前記セルロース画分を得る場合、前記濾過に用いるスクリーンのメッシュサイズが０．５ｍｍ程度となることがある。このような場合、前記不溶性画分が、このメッシュサイズを通過しないサイズでとなることが好ましい。
【００２８】
＜＜処理方法＞＞
前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかに後述するアルカリ水溶液を添加し、所望の温度及び時間作用させる方法などが挙げられる。
【００２９】
前記アルカリ水溶液を添加する回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、所望の濃度のアルカリ水溶液を、１回だけ作用させる方法、複数回作用させる方法などが挙げられる。前記複数回作用させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、希アルカリ水溶液を作用させた後、濃アルカリ水溶液を作用させる、２段階でアルカリ水溶液を作用させる方法（以下、「２段階アルカリ処理法」と称することがある。）などが挙げられる。前記２段階アルカリ処理法を行うことで、前記アルカリ水溶液を効率よく再利用できる点で有利である。また、前記２段階アルカリ処理法は、木化の程度が進行した広葉樹原料を処理する場合に有効である。
【００３０】
前記アルカリ水溶液を作用させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置する方法、攪拌する方法などが挙げられるが、これらの中でも、攪拌する方法が、処理の効率がよくなる点で好ましい。
【００３１】
−アルカリ水溶液−
前記アルカリ水溶液としては、少なくともアルカリ性の水溶液であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
前記アルカリ水溶液の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。前記アルカリ水溶液は、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよい。これらの中でも、水酸化ナトリウムが、安価であり、環境負荷が少ない点で好ましい。
【００３２】
前記アルカリ水溶液中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸素などの酸化剤、水酸化カルシウムなどのアルカリ、界面活性剤などの有機性物質などが挙げられる。前記アルカリ水溶液が、前記その他の成分を含むと、処理の効率や前記アルカリ水溶液の回収効果を向上することができる点で有利である。
【００３３】
前記アルカリ水溶液の使用量としては、特に制限はなく、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかの使用量、大きさなどに応じて適宜選択することができるが、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかが１００質量部に対して５０質量部〜３，０００質量部が好ましく、１００質量部〜２，０００質量部がより好ましい。前記使用量が５０質量部未満であると、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかが十分に浸漬されず処理が不十分になり処理の効率が悪くなることがある。一方、前記使用量が前記好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できるなどの点で有利である。また、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかの水分含有率が極めて高い場合には、液量を増やさないよう、濃アルカリ水溶液を極小量加えることが好ましい。
【００３４】
前記アルカリ水溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記アルカリ処理を１回で行う場合、２Ｎ〜５Ｎが好ましく、３Ｎ〜５Ｎがより好ましい。前記濃度が、２Ｎ未満であると処理が不十分になることがあり、５Ｎを超えると処理の効率が悪くなることがある。一方、前記濃度が前記好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用するアルカリ水溶液の量を少なくできるなどの点で有利である。また、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかの水分含有率が極めて高い場合には、濃いアルカリ水溶液を極小量加えることが、液量を増やさず処理の効率を維持できる点で好ましい。
前記２段階アルカリ処理法を行う場合の前記希アルカリ水溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１Ｎ〜５Ｎが好ましく、０．３Ｎ〜２Ｎがより好ましい。前記２段階アルカリ処理法を行う場合の前記濃アルカリ水溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アルカリ処理を１回で行う場合のアルカリ水溶液と同じ濃度などが挙げられる。
【００３５】
前記アルカリ処理工程において前記アルカリ水溶液を使用することは、前記アルカリ処理工程により草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかから溶出したヘミセルロース、リグニン、及びその他の成分を燃焼した後、前記アルカリ水溶液を再利用することができる点、前記リグニンなどの物質の環境への放出を避けることができる点で有利である。
前記アルカリ水溶液を再利用する技術については、パルプ業界において豊富な知見が存在しており、例えば、常法を使用することができる。
【００３６】
−処理温度−
前記アルカリ処理工程において、前記アルカリ水溶液を作用させる温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、−４０℃〜１００℃が好ましく、０℃〜５０℃がより好ましい。前記温度が−４０℃未満であると、処理コストが増加することがあり、１００℃を超えると、副反応が起こりやすくなるとともに、処理コストが増加することがある。一方、前記濃度が、前記好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用するアルカリ水溶液の量を少なくできるなどの点で有利である。
【００３７】
−処理時間−
前記アルカリ処理工程において、前記アルカリ水溶液を作用させる時間としては、特に制限はなく、所望の程度の前記アルカリ処理物からセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得ることができる範囲内で適宜選択することができるが、１０分間〜２４時間が好ましく、３０分間〜４時間がより好ましい。前記時間が１０分間未満であると、所望の程度の前記アルカリ処理物からセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得ることができないことがあり、２４時間を超えると、全体として非効率となることがある。一方、前記時間が、前記好ましい範囲内であると、効率よく前記アルカリ処理物らセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を得ることができる点で有利である。
【００３８】
＜＜アルカリ処理物＞＞
前記アルカリ処理物は、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかに、前記アルカリ水溶液を添加し、前記した所望の温度及び時間作用させて得られた処理物である。
前記アルカリ処理物の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体の状態、固体の状態などが挙げられる。これらの中でも、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を高濃度得るためには、固体の状態が好ましい。
【００３９】
＜＜その他の処理＞＞
前記その他の処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、洗浄処理、分離処理、ｐＨ調整処理などが挙げられる。
【００４０】
−洗浄処理−
前記アルカリ処理工程は、前記アルカリ処理物を洗浄する洗浄処理を含むことが好ましい。前記洗浄処理は、前記アルカリ処理物中に含まれるリグニンなどの不要物質を除去できる点、前記アルカリ処理物のｐＨを中性にできる点で有利である。
前記洗浄に用いる溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、希アルカリ水溶液などが挙げられ、これらの中でも、水が、ｐＨを中性に調整できる点で好ましい。
前記洗浄に用いる溶液としては、既に洗浄に用いた水、希アルカリ水溶液などを使い回すこともできる。前記水、希アルカリ水溶液などを使い回すことにより、前記水の使用量を減らすことができる点で有利である。なお、前記水を使い回す場合は、洗浄により水中に溶解したアルカリや前記アルカリ処理物に含まれていたリグニンなどを除去して用いることが好ましい。前記アルカリやリグニンを除去する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、膜分離により分離する方法、イオン交換法、吸着法、燃焼し水蒸気を捕集する方法などが挙げられる。これらの中でも、燃焼し水蒸気を捕集する方法が、アルカリを再生できる点で有利である。
前記洗浄を行なう回数としては、洗浄後に前記アルカリ処理物を中性付近にすることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
−分離処理−
前記アルカリ処理工程は、前記アルカリ水溶液とアルカリ処理物とを固液分離する分離処理を含むことが好ましい。前記分離処理を行うと、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を高濃度確保できる点で有利である。
前記固液分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、遠心分離法、濾過法などが挙げられる。
前記分離処理を行う順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記洗浄処理の前、前記洗浄処理と同時、前記洗浄処理の後などが挙げられる。
前記分離処理により固液分離すると、固相に不溶性画分として前記アルカリ処理物が分離され、液相に水溶性画分として前記不要物質である前記リグニンなどの物質が分離される。
【００４２】
前記分離工程では、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかの内部において、近傍の不溶性のセルロースＩ型が相互作用することにより、隣接するセルロース間の結晶型の変換が行われるため、不溶性画分として大部分のセルロースを回収できる点で有利である。
また、前記液相は、廃液として燃焼することができるため、廃液処理が困難なリグニンの処理コストが抑えられる点、前記廃液の環境への放出を避けることができ環境への負荷が少ない点、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を高濃度確保できる点で有利である。また、後述する糖化工程に用いる酵素の回収率が高まる点でも有利である。
【００４３】
＜＜セルロース画分＞＞
前記セルロース画分は、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含む画分である。
前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかは、前記セルロースＩ型を含む草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかに前記アルカリ水溶液を作用させて得られた前記アルカリ処理物に、必要に応じて、洗浄処理、分離処理、更に必要に応じて、前記アルカリ処理物の水分含有量を低下させることにより、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料中に含まれるセルロースＩ型の少なくとも一部が、前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかへ改変したものであることが好ましい。
【００４４】
−含有量−
前記セルロース画分中の前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかが多いことが好ましく、これらの中でも、前記アルカリセルロースＩＶ型が多いことが、優れた糖化効率を発揮できる点でより好ましい。
また、前記セルロース画分は、前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれか以外にも、例えば、セルロースＩ型（セルロースＩα型、セルロースＩβ型）や、その他の成分、例えば、ヘミセルロース、リグニンなどが含まれていてもよい。ただし、酵素糖化の効率向上の観点から、リグニンは含まれない、あるいはその含有量が少ないことが好ましい。
【００４５】
前記アルカリセルロースＩＶ型は、前記セルロース画分を乾燥させることなく湿潤状態を維持することで好適に得ることができる。
前記湿潤状態としては、前記セルロース画分が水分を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記セルロース画分の水分含有率が、５質量％以上が好ましく、２０質量％以上がより好ましい。前記水分含有率が前記好ましい範囲内であると、前記セルロース画分に前記アルカリセルロースＩＶ型を高濃度含有させることができる点で有利である。
前記セルロース画分に、前記アルカリセルロースＩＶ型を高濃度含有させる場合、前記アルカリセルロースＩＶ型の全セルロースに対する含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９０質量％以上が、優れた糖化効率を発揮できる点で好ましい。また、前記セルロース画分を乾燥させないことは、コストや手間がかからない点において有利である。
【００４６】
前記セルロースＩＩ型は、前記セルロース画分の水分含有率を低下させることで好適に得ることができ、完全に乾燥させることで、よりセルロースＩＩ型を高濃度含有させることができる。
前記水分含有率を低下させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、加熱乾燥する方法、風力乾燥する方法、凍結乾燥する方法、減圧乾燥する方法、噴霧乾燥する方法、これらを組み合わせる方法などが挙げられる。
前記セルロース画分に、前記アルカリセルロースＩＩ型を高濃度含有させる場合、前記アルカリセルロースＩＩ型の全セルロースに対する含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９０質量％以上が好ましい。
【００４７】
−ｐＨ調整処理−
前記アルカリ処理工程は、前記セルロース画分のｐＨを調整するｐＨ調整処理を含むことが、後述する糖化を効率よく行なうことができる点で好ましい。
前記ｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ３〜ｐＨ１０が好ましく、ｐＨ５〜ｐＨ８がより好ましい。
前記ｐＨ調整に用いる溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、クエン酸、リン酸、二酸化炭素などが挙げられる。
【００４８】
−保存方法−
前記セルロース画分の保存方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アジ化ナトリウム水溶液中で保存する方法が好ましい。なお、前記セルロースＩＩ型は乾燥させた状態でも保存することができる。
前記アジ化ナトリウム水溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
−改変の確認−
前記セルロース画分において、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかのアルカリ処理物に含まれる前記セルロースＩ型の少なくとも一部が、前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかへと改変したことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｘ線回折、ＦＴ−ＩＲ、固体ＮＭＲなどにより確認することができる。
【００５０】
前記セルロースＩ型のＸ線回折のピークは、２θが２２°の位置に１つのピークを有する（例えば、図７Ａ）が、前記セルロースＩＩ型のＸ線回折のピークは、２θが１２°、２０°、及び２２°にピークを有する（例えば、図７Ｂ）。また、前記アルカリセルロースＩＶ型は、前記セルロースＩＩ型と同様に２θが２０°及び２２°にピークを有する他、前記セルロースＩ型及び前記セルロースＩＩ型が有さない２７°の位置に大きなピークを有する（例えば、図７Ｃ）。これらのピークの違いにより、前記改変したセルロースを確認することができる。
【００５１】
＜糖化工程＞
前記糖化工程は、前記セルロース画分に含まれる前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを酵素により糖化する工程である。前記セルロースＩＩ型及び前記アルカリセルロースＩＶ型の少なくともいずれかを含むセルロース画分を湿潤状態のまま酵素による糖化に用いることで、優れた糖化効率を発揮できる点で有利である。なお、前記セルロース画分は、前記糖化工程で再添加することも可能である。
【００５２】
＜＜酵素＞＞
前記糖化工程に用いる酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼの少なくともいずれかを含む酵素群であることが、優れた糖化効率を発揮できる点で好ましい。
前記セルラーゼとは、セルロースを加水分解する酵素の総称で、大きく分けて、セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオヒドロラーゼ、結晶セルロースは分解できないが、非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ、及びセロビオースや短い鎖（セロオリゴ糖）の末端からグルコースを生成するエキソ型のβ−グルコシダーゼの３種が存在し、更にそれぞれに多種類の酵素が存在する。
【００５３】
−入手方法−
前記セルラーゼ及び前記β−グルコシダーゼの少なくともいずれかを含む酵素群を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記セルラーゼ及び前記β−グルコシダーゼの少なくともいずれかを産生する菌を培養して入手する方法、市販品より入手する方法などが挙げられる。
前記セルラーゼ及び前記β−グルコシダーゼの少なくともいずれかを産生する菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、糸状菌、細菌、担子菌などが挙げられる。
【００５４】
−使用量−
前記セルラーゼ及び前記β−グルコシダーゼの少なくともいずれかを含む酵素群の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記セルロース画分１００質量部に対して０．０１質量部〜２０質量部が好ましく、０．１質量部〜５質量部がより好ましい。前記酵素の使用量が、０．０１質量部未満であると、酵素糖化が不十分となることがあり、２０質量部を超えると、酵素使用量が増大し効率が悪くなる。一方、前記酵素の使用量が前記好ましい範囲内であると、酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００５５】
−温度−
前記糖化工程における温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、４℃〜１００℃が好ましく、２５℃〜８０℃がより好ましい。前記温度が、４℃未満であると、酵素糖化が十分に進行しないことがあり、１００℃を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記温度が、前記好ましい範囲内であると、酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００５６】
−ｐＨ−
前記糖化工程におけるｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ｐＨ３〜ｐＨ１０が好ましく、ｐＨ５〜ｐＨ８がより好ましい。前記ｐＨが、３未満又は１０を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記ｐＨが、前記好ましい範囲内であると、酵素添加量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００５７】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかを裁断、粉砕する工程などが挙げられる。
【００５８】
＜＜裁断、粉砕する工程＞＞
前記アルカリ処理工程において、前記セルロースＩ型を含む前記草本系茎葉部原料及び前記広葉樹原料の少なくともいずれかが予め裁断、粉砕されていると、アルカリ水溶液による処理が効率的に進行する点で好ましい。
前記裁断、粉砕に用いる機器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウィレーミル、グラインダー、カッターミル、ハンマーミル、ピンミルなどを用いることができる。
【００５９】
＜用途＞
前記糖の製造方法は、酵素糖化を効率的に行うことができることから、後述する本発明のエタノールの製造方法及び乳酸の製造方法に好適も用いることができる。
【００６０】
（糖）
本発明の糖は、前記糖の製造方法により得られる糖である。前記糖は、多糖を酵素や酸などにより低分子化した物質である。前記糖の製造方法により得られる糖としては、セルロースを基質としたものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などが挙げられる。
【００６１】
＜用途＞
前記糖は、例えば、後述する本発明のエタノールの製造方法及び乳酸の製造方法に好適に用いることができる。
【００６２】
（エタノールの製造方法）
本発明のエタノールの製造方法は、前述した本発明の糖の製造方法により得られた糖を発酵させて、エタノールを得る工程（以下、「アルコール発酵工程」と称することがある。）を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００６３】
＜アルコール発酵工程＞
前記エタノールの製造方法において、前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記糖に酵母などのアルコール発酵微生物を添加して、アルコール発酵を行わせる方法が好ましい。
【００６４】
＜＜酵母＞＞
前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロマイセス属酵母などが挙げられる。なお、前記酵母は、天然酵母であってもよいし、遺伝子組換酵母であってもよい。前記エタノール発酵微生物の具体的な例としては、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、パチソレン・タンノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、カンジダ・グラビラータ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｇｌａｂｒａｔａ）などの酵母又はこれらの遺伝子組換体、ザイモモナズ・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ），クロストリジウム・ルジュングダーリ（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）などの細菌又はこれらの遺伝子組換体を用いることが出来る。
【００６５】
前記アルコール発酵工程における、前記酵母の使用量、発酵温度、ｐＨ、発酵時間などについては、特に制限はなく、例えば、アルコール発酵に供する糖の量、使用する酵母の種類などに応じて、適宜選択することができる。
【００６６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記アルコール発酵工程により得られたエタノールを分離精製する工程などが挙げられる。前記分離精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蒸留などが挙げられる。
【００６７】
＜用途＞
前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノールなどとして好適に利用可能である。前記エタノールは前記草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかから得ることができるので、前記草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかとなる植物を生産できる限りは再生産が可能であり、また、前記植物は栽培時に大気中の二酸化炭素を吸収するため、前記エタノールを燃焼させて二酸化炭素が発生したとしても、大気中の二酸化炭素濃度を増加させることにはならない。したがって、前記エタノールは、地球温暖化防止に望ましいエネルギー源ということができる。また、このようなエタノールは、近年特に、ガソリンに混合し、環境に優しい自動車燃料として使用することが期待されている。
【００６８】
本発明の糖の製造方法により得られる糖を、前記エタノールを産生する酵母などに代えて、それぞれ目的とするアルコール類を産生する微生物を使用して発酵せしめることにより、エタノール以外のアルコール類を製造することもできる。例えば、アセトン・ブタノール菌を使用した発酵を行うことにより、ブタノールを製造することができる。
【００６９】
（乳酸の製造方法）
本発明の乳酸の製造方法は、前述した本発明の糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、乳酸を得る工程（以下、「乳酸発酵工程」と称することがある。）を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００７０】
＜乳酸発酵工程＞
前記乳酸の製造方法において、前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記糖を含む溶液に乳酸菌などの乳酸発酵微生物を添加して、乳酸発酵を行わせる方法が好ましい。
【００７１】
＜＜乳酸菌＞＞
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラクトバチルス・マニホティヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔＩＶ型ｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などが挙げられる。なお、前記乳酸菌は、天然の乳酸菌であってもよいし、遺伝子組換乳酸菌であってもよい。
【００７２】
前記乳酸発酵工程における、前記乳酸菌の使用量、発酵温度、ｐＨ、発酵時間などについては、特に制限はなく、例えば、乳酸発酵に供する糖の量、使用する乳酸菌の種類などに応じて、適宜選択することができる。
【００７３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記乳酸発酵工程により得られた乳酸を分離精製する工程などが挙げられる。前記分離精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
＜用途＞
前記乳酸の製造方法により得られた乳酸は、例えば、化学的に重合させて、ポリ乳酸を製造することに好適に利用可能である。現在は、トウモロコシなどのデンプンから製造されることが多い乳酸を、食料には供し得ないセルロースを含む前記草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかから生産可能になることが望ましく、前記乳酸の製造方法によれば、このようなセルロースを含む前記草本系茎葉部原料及び広葉樹原料の少なくともいずれかからの効率的なポリ乳酸の製造を可能とすることができる。
【００７５】
本発明の糖の製造方法により得られる糖を、前記乳酸菌に代えて、それぞれ目的とする有機酸を産生する微生物を使用して発酵せしめることにより、乳酸以外の有機酸、例えば、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸などを製造することもできる。また、有機酸以外にも、ビタミン、アミノ酸、糖アルコールなどの食品素材、工業用アルコール原料などの化学原料など、多様な発酵工業製品を製造することができる。
【実施例】
【００７６】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７７】
（試験例１：セルロース結晶型の改変による糖化効率の向上）
＜アルカリセルロースＩＶ型の調製＞
セルロースＩ型である微結晶セルロース（フナセル；フナコシ株式会社製）１ｇを使用し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１５０ｍＬに分散させ、室温にて１時間ゆるやかに攪拌することによりアルカリ処理物を得た。前記アルカリ処理物を５，０００×ｇ、３分間遠心分離した後、上清を除去した。残渣に水１５０ｍＬを添加して分散させ水洗し、５，０００×ｇ、３分間遠心分離した。この水洗を前記アルカリ処理物が中性になるまで繰り返した後セルロース画分を調製し、乾燥させることなく湿潤状態を維持することでアルカリセルロースＩＶ型を調製した。
前記セルロース画分の一部を使用し、凍結乾燥を行ない、得られた固形分の質量を測定することにより、セルロース画分中の固形分濃度を求め、該濃度をアルカリセルロースＩＶ型の濃度とした。なお、セルロースＩＩ型とアルカリセルロースＩＶ型との固形分質量は同一である（Ｈｉｓａｏ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ａｎａｔｏｌｅ  Ｓａｒｋｏ，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  １９９１，  ２４，  ｐ．７７１−７７８参照）。
【００７８】
＜セルロースＩＩ型の調製＞
前記した方法と同様にして調製したセルロース画分を凍結乾燥することによりセルロースＩＩ型を調製した。
【００７９】
＜酵素糖化＞
前記したように調製したアルカリセルロースＩＶ型、セルロースＩＩ型、及び比較対照として微結晶セルロース（セルロースＩ型）をそれぞれ１０ｍｇ使用し、酢酸緩衝液（終濃度  ５０ｍＭ酢酸、０．０２質量％アジ化ナトリウム、ｐＨ４．５）を１ｍＬ添加し、終濃度を１．０質量％とした。次いで、セルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ；ノボザイムス・ジャパン社製）及びβ−グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  １８８；ノボザイムス・ジャパン社製）を、それぞれ終濃度０．１ｍｇ／ｍＬあるいは０．５ｍｇ／ｍＬになるように、前記各セルロースに添加し、サーモブロック回転機（ＳＮ−４８ＢＮ、株式会社日伸理化製）を用い、３７℃、１２ｒｐｍで２４時間反応させることにより酵素糖化を行なった。前記反応後、サーモブロックを１００℃にし、１５分間保持することで酵素反応を停止した。
【００８０】
＜糖化率の算出＞
＜＜グルコース濃度の測定＞＞
前記したように、酵素糖化の基質であるアルカリセルロースＩＶ型、セルロースＩＩ型、及び微結晶セルロース（セルロースＩ型）を酵素糖化した後、１０，０００×ｇ、５分間遠心分離し、上清中のグルコースをグルコーステストＣＩＩワコー（和光純薬株式会社製）により発色させ、グルコース濃度を紫外可視分光光度計（ＵＶｍｉｎｉ−１２４０；株式会社島津製作所製）にて測定した。このグルコース濃度より、酵素糖化基質１ｇあたりから遊離したグルコース量を算出した。
【００８１】
＜＜酵素糖化基質中のグルカン含有量の測定＞＞
酵素糖化の基質であるアルカリセルロースＩＶ型、セルロースＩＩ型、及び微結晶セルロース（セルロースＩ型）に含まれるグルカン含有量を、以下の方法で調べた。即ち、前記酵素糖化前の各セルロースをぞれぞれ２０ｍｇ使用し、７２質量％硫酸１ｍＬに分散させ、３０℃にて１時間処理後、純水で８倍希釈し、更に１００℃で２時間処理し、加水分解液を得た（以下、「２段階硫酸処理」と称することがある。）。この加水分解液の一部に炭酸カルシウム粉末を添加し、中和を行なった。次いで、１０，０００×ｇ、５分間遠心分離を行い、上清中のグルコース濃度を前記グルコースの測定方法と同様の方法で測定した。このグルコース濃度より、酵素糖化基質１ｇあたりのグルカン含有量を算出した。
【００８２】
＜＜糖化率の算出方法＞＞
前記酵素糖化基質１ｇあたりから遊離したグルコース量と、前記酵素糖化基質１ｇあたりのグルカン含有量とを用いて、下記計算式（１）より、糖化率を算出した。
糖化率（質量％）＝１００×（酵素糖化基質１ｇあたりから遊離したグルコース量×０．９）／酵素糖化基質１ｇあたりのグルカン含有量・・・計算式（１）
前記計算式（１）中、「０．９」は、多糖のグリコシド結合数を考慮した換算係数である。
【００８３】
＜結果＞
糖化率を図１に示す。図１より、セルロースＩ型、セルロースＩＩ型、及びアルカリセルロースＩＶ型はいずれも酵素濃度依存的に糖化されたが、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型は、セルロースＩ型と比較して糖化率が高く、アルカリセルロースＩＶ型の糖化率が特に高かった。
また、酵素群を０．５ｍｇ／ｍＬ用いた場合の糖化率の経時変化を図２に示す。セルロースＩ型の最初の１時間の糖化率は９質量％と低かった。一方、セルロースＩＩ型の最初の１時間の糖化率は１３質量％、アルカリセルロースＩＶ型の最初の１時間の糖化率は３１質量％と高かった。これらの結果より、セルロースＩＩ型は、セルロースＩ型と比較して糖化速度が速く、アルカリセルロースＩＶ型は更に速かった。
【００８４】
（試験例２：草本系茎葉部原料のアルカリ処理による糖化効率の検討）
＜アルカリセルロースＩＶ型の調製＞
草本系茎葉部原料として、サトウキビバガス及びイネワラを用いた。サトウキビバガス及びイネワラは粉砕し、２ｍｍメッシュフィルターを通過したものを使用した。このサトウキビバガス粉砕物及びイネワラ粉砕物をそれぞれ６ｇ使用し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１５０ｍＬを作用させ、時間を３時間にした以外は、試験例１と同様の方法でアルカリセルロースＩＶ型を調製した。
【００８５】
＜セルロースＩＩ型の調製＞
サトウキビバガス粉砕物及びイネワラ粉砕物をそれぞれ６ｇ使用した以外は、試験例１と同様の方法でセルロースＩＩ型を調製した。
【００８６】
＜超臨界アンモニア流体処理によるセルロースＩＩＩＩ型の調製＞
サトウキビバガス粉砕物及びイネワラ粉砕物をそれぞれ１ｇ使用し、３０ｍＬ容耐圧容器に入れて密閉し、冷却装置にて容器を−１３℃に冷却しながら、０．５ＭＰａの定圧で３０分間アンモニアを流入し、サトウキビバガス粉砕物及びイネワラ粉砕物をそれぞれ完全に液体アンモニアに浸漬させた。次いで、１４０℃にて１時間の加熱乃至加圧処理を行った。このとき、容器中の圧力は１１ＭＰａ以上になっていることを確認した。超臨界アンモニア流体処理後、アンモニアガスをリークした。前記処理後のセルロースを乾燥させることにより、前記超臨界アンモニア流体処理によりセルロースＩＩＩＩ型を調製した。
【００８７】
＜酵素糖化＞
前記したように調製したアルカリセルロースＩＶ型、及びセルロースＩＩ型を用い、試験例１の酵素群が０．５ｍｇ／ｍＬの場合と同様の方法で酵素糖化を行なった。また、比較対照として上述のようにして得られたセルロースＩＩＩＩ型、未処理のサトウキビバガス粉砕物（セルロースＩ型）、及び未処理のイネワラ粉砕物（セルロースＩ型）を用い、同様の方法で酵素糖化を行なった。
【００８８】
＜グルコース濃度の測定及び糖化効率の算出＞
アルカリセルロースＩＶ型、セルロースＩＩ型、セルロースＩＩＩＩ型、未処理のサトウキビバガス粉砕物（セルロースＩ型）、及び未処理のイネワラ粉砕物（セルロースＩ型）を酵素糖化した後、試験例１と同様の方法で酵素糖化基質１ｇあたりから遊離したグルコース量及び酵素糖化基質１ｇあたりのグルカン含有量を算出し、前記計算式（１）より糖化率を算出した。
【００８９】
＜結果＞
糖化率を図３に示す。図３より、未処理のサトウキビバガス粉砕物（セルロースＩ型）、及び未処理のイネワラ粉砕物（セルロースＩ型）では、ほとんど糖化が認められなかった。超臨界アンモニア流体処理を行ったセルロースＩＩＩＩ型は、サトウキビバガス粉砕物及びイネワラ粉砕物のどちらにおいても、その糖化率は２５質量％程度であり低かった。これに対し、アルカリ処理を行ったセルロースＩＩ型の糖化率は、５５質量％程度と良好な糖化率であった。更に、アルカリセルロースＩＶ型の糖化率は、サトウキビバガス粉砕物においては８０質量％程度であり、特に良好な値であった。
また、サトウキビバガス粉砕物の糖化率の経時変化を図４に示す。試験例１の結果と同様に、セルロースＩＩ型はセルロースＩ型と比較して糖化速度が速く、アルカリセルロースＩＶ型は更に速かった。
【００９０】
（試験例３：サトウキビバガス粉砕物のアルカリ処理による糖質回収率の検討）
＜方法＞
アルカリ処理工程において、洗浄を行なうと低分子の糖質や固形分の流出が起こることがあるため、試験例２でサトウキビバガス粉砕物より調製したセルロース画分を用いて糖質の回収率の検討を行った。
前記セルロース画分及び未処理のサトウキビバガス粉砕物（セルロースＩ型）をそれぞれ１０ｍｇ使用し、試験例１と同様の方法で２段階硫酸処理を行い、加水分解液を得た後、この加水分解液の一部に炭酸カルシウム粉末を添加し、中和を行なった。次いで、１０，０００×ｇ、５分間遠心分離を行い、上清中のグルコース及びキシロースを、前記した方法と同様の方法で測定した。測定したグルコース濃度より、各セルロース１ｇあたりのグルカン含有量を算出した。また、測定したキシロース濃度より、各セルロース１ｇあたりのキシラン含有量を算出した。
【００９１】
＜＜糖質回収率の算出方法＞＞
セルロース画分のグルカン回収率を下記計算式（２）より算出し、セルロース画分のキシラン回収率を下記計算式（３）より算出した。
グルカン回収率（質量％）＝１００×セルロース画分１ｇあたりのグルカン含有量／未処理サトウキビバガス粉砕物１ｇあたりのグルカン含有量・・・計算式（２）
キシラン回収率（質量％）＝１００×セルロース画分１ｇあたりのキシラン含有量／未処理サトウキビバガス粉砕物１ｇあたりのキシラン含有量・・・計算式（３）
【００９２】
＜結果＞
結果を下記表１に示す。表１より、アルカリ処理工程を経て得られたセルロース画分においてキシランの多くが流出していたものの、グルカンの流出はほとんどなかった。このことから、アルカリ処理工程は、グルカンを流出することがないため、セルロースの結晶型を効率よくセルロースＩ型からセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型に改変できることが示された。
【００９３】
【表１】
2011010597.tif 000003
【００９４】
（試験例４：草本系茎葉部原料、広葉樹原料、及び針葉樹原料に対するアルカリ処理の比較）
＜アルカリセルロースＩＶ型の調製＞
草本系茎葉部原料であるサトウキビバガス粉砕物、広葉樹原料であるコナラ粉砕物、及び針葉樹原料粉砕物であるスギをそれぞれ１ｇ使用し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２００ｍＬにした以外は、試験例１と同様の方法で、各原料のアルカリセルロースＩＶ型を調製した。
【００９５】
＜酵素糖化＞
上述のようにして得られた各原料のアルカリセルロースＩＶ型を用い、試験例１の酵素群が０．５ｍｇ／ｍＬの場合と同様の方法で酵素糖化を行なった。また、比較対照として未処理のサトウキビバガス粉砕物、コナラ粉砕物、及びスギ粉砕物を用い、同様の方法で酵素糖化を行なった。
【００９６】
＜グルコース濃度の測定及び糖化効率の算出＞
酵素糖化における反応後の各処理物について、試験例１と同様の方法でグルコース濃度を測定し、糖化率を算出した。
【００９７】
＜結果＞
糖化率を図５に示す。図５より、スギ（針葉樹原料）は、アルカリ処理後の糖化率がおよそ４０質量％程度であった。これに対し、サトウキビバガス（草本系茎葉部原料）及びコナラ（広葉樹原料）では、アルカリ処理を行い、アルカリセルロースＩＶ型に改変することで、糖化率が９０質量％前後又はそれ以上となり、飛躍的に向上した。これらの結果より、前記アルカリ処理は、草本系茎葉部原料及び広葉樹原料に対して、顕著な糖化効率の向上を示すことが認められた。
【００９８】
（試験例５：広葉樹原料に対する２段階アルカリ処理法の検討）
＜アルカリセルロースＩＶ型の調製＞
試験例４で調製したコナラ（広葉樹原料）粉砕物１ｇに対し、０．３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２０ｍＬ加え、耐圧容器内で１００℃、１時間処理した（１段目アルカリ処理）。次いで、５，０００×ｇ、３分間遠心分離し、上清を除去後、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（濃アルカリ）２００ｍＬ及びＮａＢＨ４を終濃度０．０１質量％となるように添加し、室温にて１時間ゆるやかに攪拌した（２段目アルカリ処理）。２段目アルカリ処理後、５，０００×ｇ、３分間遠心分離し、残渣に水４００ｍＬを添加して分散させ水洗し、５，０００×ｇ、３分間遠心分離した。この水洗を処理物が中性になるまで繰り返した。
なお、前記１段目アルカリ処理及び２段目アルカリ処理を行うことを、以下、「２段階アルカリ処理法」と称することがある。
【００９９】
＜酵素糖化＞
２段階アルカリ処理法により得られた各原料のアルカリセルロースＩＶ型を使用し、試験例１の酵素群が０．５ｍｇ／ｍＬの場合と同様の方法で酵素糖化を行なった。また、比較対照として各原料の未処理粉砕物を用い、同様の方法で酵素糖化を行なった。
【０１００】
＜グルコース濃度の測定及び糖化効率の算出＞
酵素糖化における反応後の各処理物について、試験例１と同様の方法でグルコース濃度を測定し、糖化率を算出した。
【０１０１】
＜結果＞
結果を下記表２に示す。表２より、２段階アルカリ処理法を行った場合、コナラ（広葉樹原料）では、酵素糖化反応２４時間における糖化率は約９０質量％であった。一方、１段目のアルカリ処理のみの場合の糖化率は約４０質量％であった。
【０１０２】
【表２】
2011010597.tif 000004
【０１０３】
試験例４〜５より、木化の程度が進行した広葉樹原料においては、５Ｎ水酸化ナトリウムによる処理によるセルロース結晶型の改変が有効であることが示された。２段階アルカリ処理法では、糖化率が良好であり、更に１段目の０．３Ｎ水酸化ナトリウムによる処理でリグニンの一部を除去することにより、リグニンなどの溶出物質による、２段目に用いる濃アルカリ（５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液）の汚染が防止され、濃アルカリを繰り返し利用することが可能となる点で有利である。また、５Ｎ水酸化ナトリウムによる処理における廃液を希釈し１段目に使用することで、アルカリ水溶液の使用量を低減させることができる点でも有利である。
【０１０４】
（試験例６：草本系茎葉部原料に対するアルカリ処理による糖化率の向上）
＜アルカリセルロースＩＶ型の調製＞
オオムギ（品種系統：シルキースノウ）、コムギ（品種系統：ユメシホウ）、ススキ（品種系統：八代系）、スイッチグラス（品種系統：Ｋｏｎｌｏｗ）、ジョンソングラス、ネピアグラス（品種系統：Ｍｅｒｋｅｒ）、エリアンサス（品種系統：ＫＯ１及びＫＯ２）の、８種の草本系茎葉部原料の粉砕物を純水で十分に洗浄し、６５℃で３日間乾燥させた後に再度粉砕を行なった。前記８種の草本系茎葉部原料の粉砕物を、ぞれぞれ１４０ｍｇ使用し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２．８ｍＬにした以外は、試験例１と同様の方法で各原料のアルカリセルロースＩＶ型を調製した。
【０１０５】
＜酵素糖化＞
前記したようにして調製した各原料のアルカリセルロースＩＶ型を使用し、試験例１の酵素群が０．５ｍｇ／ｍＬの場合と同様の方法で酵素糖化を行なった。また、比較対照として各原料の未処理粉砕物を用い、同様の方法で酵素糖化を行なった。
【０１０６】
＜グルコース濃度の測定及び糖化効率の算出＞
糖化工程における反応後の各処理物について、試験例１と同様の方法でグルコース濃度を測定し、糖化率を算出した。
【０１０７】
＜結果＞
糖化率を図６に示す。図６より、いずれの草本系茎葉部原料においてもアルカリ処理を行うことで、酵素糖化反応後のグルコース回収率が８０質量％〜９０質量％にまで向上した。
これらの結果より、草本系茎葉部原料の酵素糖化反応の前処理としてアルカリ処理を行っても、ほとんどグルカンの損失がなく、かつ酵素糖化反応の効率が飛躍的に向上するため、草本系茎葉部原料中のグルカンの大部分をグルコースとして回収することができることが認められた。
【０１０８】
（試験例７：セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型のＸ線回折の測定）
＜方法＞
試験例１において、微結晶セルロース（フナセル）から調製したセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型、並びに比較対照として未処理の微結晶セルロースをそれぞれ１００ｍｇ使用し、以下の条件でＸ線回折パターンの測定を行なった。
測定条件
測定装置：ＲＩＮＴ２０００（株式会社リガク製）
Ｘ線出力（Ｃｕ  Ｋα）：３８ｋＶ、５０ｍＡ
Ｘ線波長：λ＝０．１５４１８ｎｍ
走査範囲：２θ＝６°〜３０°、Δ２θ＝０．１°
各ステップにおける測定時間：２０秒間
スリット：ＤＳ＝０．５°、ＳＳ＝０．５°、ＲＳ＝０．１５ｍｍ
【０１０９】
図７Ａに未処理の微結晶セルロース（セルロースＩ型）のＸ線回折パターンを、図７Ｂにアルカリ処理後のセルロースＩＩ型のＸ線回折パターンを、図７ＣにアルカリセルロースＩＶ型のＸ線回折パターンを示す。
【０１１０】
図７Ｂに現れたセルロースに特徴的な赤道の３つのピーク（格子間隔（ｄ））は、Ｂｒａｇｇ式を用いて求めた。結晶子サイズ（Ｌ）は、それぞれの面に垂直な方向の面間隔であり、下記計算式（４）で表されるＳｃｈｅｒｒｅｒ式を用いて求めた。
Ｌ＝０．９λ／（Ｈｃｏｓθ）・・・計算式（４）
前記計算式（４）中、「Ｌ」は結晶サイズ、「λ」は前記Ｘ線波長、「Ｈ」は半値全幅、「θ」はＢｒａｇｇ角を表す。結晶化度（ＣｒＩ）は、結晶に基づく面積の、全面積に対する割合から算出した。結果を下記表３に示す。
【０１１１】
【表３】
2011010597.tif 000005
【０１１２】
＜結果＞
図７Ａ〜Ｃ及び表３より、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型では、セルロースＩ型のような低角度側の大きなピークは認められなかった。
セルロースＩＩ型には、格子間隔（ｄ）（低角度側の３つのピーク）が認められたが（図７Ｂ）、結晶サイズ（Ｌ）は、セルロースＩ型と同程度であった（表３）。
アルカリ処理後乾燥させることなく湿潤状態を維持したアルカリセルロースＩＶ型のＸ線回折パターンは、アルカリ処理後に乾燥を行なったセルロースＩＩ型と大きく異なっており、２θが２７°付近に大きなブロードのピークが認められた（図７Ｃ中、破線の楕円で示す。）。これは、余分な水による散漫散乱である。また、格子間隔（ｄ）の最も低角度側のピークが、セルロースＩＩ型と比較してブロードであり、低角度側に１°ずれていた（図７Ｃ中、矢印で示す。）。更に、結晶サイズ（Ｌ）は１．８ｎｍであり、セルロースＩ型及びセルロースＩＩ型と顕著に異なっていた。
【０１１３】
Ｘ線回折の結果より、図８にセルロースＩＩ型とアルカリセルロースＩＶ型の単位格子中における分子鎖配列の分子鎖軸の投影図を重ねて示した。図８中、ｃ軸は紙面より上向きを示す。疎水結合によって堆積したセルロース分子鎖シート（図８中、楕円で示す。）は、セルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型の両結晶型で保持されていた。しかし、アルカリセルロースＩＶ型は、水分子が間に挿入されているため、セルロースＩＩ型の（１  −１  ０）面の間隔は０．７２６ｎｍであったのに対し、アルカリセルロースＩＶ型の（１  −１  ０）面の間隔は０．７８７ｎｍであった（表３）。アルカリセルロースＩＶ型は、セルロースＩＩ型の（１  −１  ０）面の間隔を１００％としたとき、［１  −１  ０］方向（図８中、矢印で示す。）に８．４％膨潤していた。この分子鎖配列は、Ｈｉｓａｏ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ａｎａｔｏｌｅ  Ｓａｒｋｏ，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  １９９１，  ２４，  ｐ．７７１−７７８のアルカリセルロースＩＶ型と一致するものと考えられる。
表３において、［１  −１  ０］方向のアルカリセルロースＩＶ型の結晶サイズ（Ｌ）は１．８ｎｍであり、セルロースＩＩ型は４．２ｎｍであった。これは、セルロースＩＩ型は乾燥させることにより水分子が疎水性結合シートから放出され、［１  −１  ０］方向に縮むため、結晶サイズがアルカリセルロースＩＶ型の２倍以上になったと考えられる。
【０１１４】
（試験例８：サトウキビバガスアルカリ処理物のＸ線回折の測定）
＜方法＞
試験例２において、サトウキビバガス粉砕物から調製したセルロースＩＩ型及びアルカリセルロースＩＶ型、比較対照として未処理のサトウキビバガス粉砕物をそれぞれ１００ｍｇ用い、試験例７と同様の条件でＸ線回折パターンの測定を行なった。
【０１１５】
＜結果＞
図９Ａに未処理のサトウキビバガス粉砕物のＸ線回折パターンを、図９Ｂにアルカリ処理後のセルロースＩＩ型のＸ線回折パターンを、図９ＣにアルカリセルロースＩＶ型のＸ線回折パターンを示す。
これらの結果より、サトウキビバガス粉砕物をアルカリ処理した場合も、試験例７と同様に、アルカリ処理後乾燥を行なったセルロースＩＩ型は３つのピークが認められたが、アルカリ処理後乾燥させることなく湿潤状態を維持したアルカリセルロースＩＶでは、２θが２７°付近に大きなブロードのピークが認められ（図９Ｃ中、破線の楕円で示す。）、格子間隔（ｄ）の最も低角度側のピークが、セルロースＩＩ型と比較してブロードであり、低角度側に１°ずれていた（図９Ｃ中、矢印で示す。）。糖化効率を促進するアルカリセルロースＩＶ型は、Ｘ線回折においてセルロースＩＩ型とは異なるパターンを示し、セルロースＩＩ型とアルカリセルロースＩＶ型とは明らかに異なるものであることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の糖の製造方法は、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法に好適に用いることができる。
【図１】
2011010597.tif 000006
【図２】
2011010597.tif 000007
【図３】
2011010597.tif 000008
【図４】
2011010597.tif 000009
【図５】
2011010597.tif 000010
【図６】
2011010597.tif 000011
【図７Ａ】
2011010597.tif 000012
【図７Ｂ】
2011010597.tif 000013
【図７Ｃ】
2011010597.tif 000014
【図８】
2011010597.tif 000015
【図９Ａ】
2011010597.tif 000016
【図９Ｂ】
2011010597.tif 000017
【図９Ｃ】
2011010597.tif 000018