(57)【要約】【課題】検出器を複数配設することなく、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生する蛍光を複数の波長域に分離して個別に検出可能な微小粒子分析装置の提供。【解決手段】微小粒子Ｐに光を照射する光源１と、前記光の照射により微小粒子Ｐから発生する蛍光を回折させる音響光学変調器８と、音響光学変調器８からの回折光のうち、回折中心波長域の回折光のみを透過させるスリット９と、スリット９を透過した回折中心波長域の回折光を検出する検出器７と、を備える微小粒子分析装置を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子に光を照射する光源と、
前記光の照射により微小粒子から発生する蛍光を回折させる音響光学変調器と、
音響光学変調器からの回折光のうち、回折中心波長域の回折光のみを透過させるスリットと、
スリットを透過した回折中心波長域の回折光を検出する検出器と、を備える微小粒子分析装置。
【請求項２】
前記音響光学変調器に、周波数を非連続的に切り替えて音波を印加する制御手段を備える請求項１記載の微小粒子分析装置。
【請求項３】
前記光の照射により微小粒子から発生する散乱光を検出する検出器を備え、
前記制御手段は、散乱光を検出する検出器からの検出信号の入力に基いて、前記音響光学変調器に印加される周波数を非連続的に切換える請求項２記載の微小粒子分析装置。
【請求項４】
光の照射により微小粒子から発生する蛍光を、回折中心波長域を検出蛍光波長域に一致させた音響光学変調器により回折させ、
音響光学変調器からの回折光を、回折中心波長域の回折光のみを透過させるスリットに透過させて、
スリットを透過した回折中心波長域の回折光を検出する手順を含む微小粒子分析方法。
【請求項５】
前記音響光学変調器に印加する音波の周波数を非連続的に切換える手順を含む請求項４記載の微小粒子分析方法。
【請求項６】
前記光の照射により微小粒子から発生する散乱光が検出される間において、
前記音響光学変調器に印加される周波数を非連続的に切換える請求項５記載の微小粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小粒子分析装置及び微小粒子分析方法に関する。より詳しくは、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子の特性を光学的に分析する微小粒子分析装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、フローセル内やマイクロチップ上に形成された流路内を通流する微小粒子に光を照射し、微小粒子からの散乱光や、微小粒子そのものあるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生する蛍光を検出して、微小粒子の光学特性を測定する微小粒子分析装置が用いられている。この微小粒子分析装置では、光学特性の測定の結果、所定の条件を満たすと判定されたポピュレーション（群）を、微小粒子中から分別回収することも行われている。このうち、特に微小粒子として細胞の光学特性を測定したり、所定の条件を満たす細胞群を分別回収したりする装置は、フローサイトメータあるいはセルソータ等と呼ばれている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、「互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定の周期および互いに異なる位相で照射する複数の光源と、複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導光部材とを備えたフローサイトメータ」が開示されている。このフローサイトメータは、互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する複数の光源と、前記複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導光部材と、前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子を励起して生じた蛍光を検出し、蛍光信号を出力する複数の蛍光検出器と、を備えるものである（当該文献請求項１・３、図１・３参照）。
【０００４】
特許文献１に開示されるような従来の微小粒子分析装置は、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生する蛍光を、波長フィルタやダイクロイックミラーを用いて複数の波長域の蛍光に空間的に分割し、分割された各波長域の蛍光を個別の検出器によって検出している。
【０００５】
図６に、従来の微小粒子分析装置における蛍光検出のための光学経路を模式的に示す。図中、符号１１で示す光源からの光（励起光）は、コリメータレンズ１２及びミラー１３を経て、集光レンズ１４によりフローセル内やマイクロチップ上に形成された流路内を通流する微小粒子Ｐに照射される。図中、矢印Ｆは、フローセル等内におけるシース流の送流方向を示す。
【０００６】
励起光の照射によって、微小粒子Ｐあるいは微小粒子Ｐに標識された蛍光物質から発生した蛍光は、集光レンズ１５を経て、複数の波長フィルタ１６１〜１６４に順に透過される。このとき、各波長フィルタにおいて、所定波長域の蛍光が分光される。そして、各波長フィルタで分光された蛍光が、波長フィルタ毎に設けられた検出器１７１〜１７４によって検出され、電気信号に変換される。図７に、検出器１７１〜１７４によって検出される蛍光の波長域の一例を示す。ここでは、検出器１７１によっては波長域λ１の蛍光が、検出器１７２〜１７４によってそれぞれ波長域λ２〜４の蛍光が検出される場合を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−４６９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
図６に示すような蛍光検出経路を備える従来の微小粒子分析装置では、空間的に分割された各波長域の蛍光を個別に検出するため、複数の検出器が必要となっていた。そのため、従来の装置では、装置が大型化し、装置の製造コストも高いという問題があった。
【０００９】
そこで、本発明は、微小粒子分析装置において、検出器を複数配設することなく、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生する蛍光を複数の波長域に分離して個別に検出可能な装置を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、微小粒子に光を照射する光源と、前記光の照射により微小粒子から発生する蛍光を回折させる音響光学変調器と、音響光学変調器からの回折光のうち、回折中心波長域の回折光のみを透過させるスリットと、スリットを透過した回折中心波長域の回折光を検出する検出器と、を備える微小粒子分析装置を提供する。
この微小粒子分析装置は、さらに、前記音響光学変調器に、周波数を非連続的に切り替えて音波を印加する制御手段を備える。
また、この微小粒子分析装置は、前記光の照射により微小粒子から発生する散乱光を検出する検出器を備え、前記制御手段は、散乱光を検出する検出器からの検出信号の入力に基いて、前記音響光学変調器に印加される周波数を非連続的に切換えるように構成されることが好適となる。
【００１１】
本発明は、また、光の照射により微小粒子から発生する蛍光を、回折中心波長域を検出蛍光波長域に一致させた音響光学変調器により回折させ、音響光学変調器からの回折光を、回折中心波長域の回折光のみを透過させるスリットに透過させて、スリットを透過した回折中心波長域の回折光を検出する手順を含む微小粒子分析方法を提供する。
この微小粒子分析方法は、前記音響光学変調器に印加する音波の周波数を非連続的に切換える手順を含む。
また、この微小粒子分析方法は、前記光の照射により微小粒子から発生する散乱光が検出される間において、前記音響光学変調器に印加される周波数を非連続的に切換えることが好適となる。
【００１２】
本発明において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。対象とする細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、微小粒子分析装置において、検出器を複数配設することなく、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生する蛍光を複数の波長域に分離して個別に検出可能な装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る微小粒子分析装置の蛍光検出経路を説明するための模式図である。
【図２】音響光学変調器８により回折され、スリット９面に配置される各波長の蛍光を説明するための模式図である。
【図３】振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆと、回折角度θ方向に回折される回折中心波長λとの関係を説明するための模式図である。
【図４】振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆと、検出器７により検出される蛍光の波長域との関係を説明するための模式図である。
【図５】振動数制御部６による周波数ｆの切換えのタイミングと、検出器７による蛍光検出時間のタイミングを説明するためのチャート図である。
【図６】従来の微小粒子分析装置における蛍光検出のための光学経路を説明するための模式図である。
【図７】従来の微小粒子分析装置に複数備えられた検出器のそれぞれにおいて検出される蛍光の波長域を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１６】
図１に、本発明に係る微小粒子分析装置の蛍光検出経路を模式的に示す。
【００１７】
図中、符号１で示す光源からの光（励起光）は、コリメータレンズ２、ミラー３及び集光レンズ４等から構成される照射系によって、フローセル内やマイクロチップ上に形成された流路内を通流する微小粒子Ｐに照射される。図中、矢印Ｆは、フローセル等内におけるシース流の送流方向を示す。微小粒子Ｐに光を照射するための光照射系は、従来公知の微小粒子分析装置と同様の構成とでき、図に示す構成に限定されないものとする。
【００１８】
励起光の照射によって、微小粒子あるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生した蛍光は、集光レンズ５１を経て、音響光学変調器８、集光レンズ５２、スリット９及び検出器７等から構成される検出系に導光される。また、本発明に係る微小粒子分析装置の検出系には、従来公知の微小粒子分析装置と同様に構成された、微小粒子からの散乱光を検出するための検出器と、該検出器に散乱光を導光するためのミラーやフィルタ等が含まれる（図示省略）。
【００１９】
音響光学変調器８に入射した蛍光は、音響光学変調器８内のブラッグ回折格子により回折され、集光レンズ５２によりその焦点面に配設されたスリット９に集光される。音響光学変調器８より回折された蛍光は、回折格子のピッチに応じて回折効率が最大となる回折中心波長の光を中央にして、各波長の蛍光がスリット９面に配置される。図１中、符号θは、回折中心波長の光の回折角度を示している。
【００２０】
図２に、音響光学変調器８により回折され、スリット９面に配置される各波長の蛍光を模式的に示す。
【００２１】
音響光学変調器８の結晶内部には、振動数制御部６により印加される、周波数ｆ、音波速度ｖの音波により、ピッチｄがｖ／ｆである回折格子が形成される。このとき、回折格子へ入射する蛍光の入射角度をθ／２とすると、回折角度θ方向に回折効率が最大となる回折中心波長λは、ブラッグ条件の回折式により下記式（１）のように示される。
【００２２】
【数１】
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（式中、ｍは、回折次数を示す。）
【００２３】
スリット９には、回折中心波長λの光を中央にしてスリット９面に配置された各波長の蛍光のうち、回折中心波長λを含む、波長幅Δλ１の波長域の蛍光のみを透過させる矩形開口が形成されている。図中、符号ｗは、スリット９の開口幅を示している。
【００２４】
この開口により、スリット９は、音響光学変調器８により回折された蛍光のうち、波長λ−Δλ１／２からλ＋Δλ１／２までの回折中心波長域の蛍光のみを検出器７（図１参照）に透過させる。このとき、回折中心波長λからずれた光の回折効率の低下は、回折格子へ入射する蛍光の入射角度θ／２を小さくすることにより最小限に抑えることができる。
【００２５】
検出器７は、スリット９の開口を透過した回折中心波長域の蛍光を検出して、電気信号に変換する。検出器７及び散乱光を検出するための検出器（不図示）は、従来公知の微小粒子分析装置と同様の構成とでき、例えば、ＰＭＴ（ｐｈｏｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ）や、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子などとされる。検出器７及び散乱光を検出するための検出器により変換された電気信号は、微小粒子Ｐの光学特性の測定のために供される。光学特性測定のためのパラメータは、従来公知の微小粒子分析装置と同様に、例えば、微小粒子Ｐの大きさを判定する場合には前方散乱光が、構造を判定する場合には側方散乱光が、微小粒子Ｐに標識された蛍光物質の有無を判定する場合には蛍光等が採用される。
【００２６】
ここで、上記式（１）において、回折次数ｍを１とし、回折格子へ入射する微小粒子Ｐから発生した蛍光の入射角度（θ／２）が十分に小さいとすると、回折角度θ方向に回折効率が最大となる回折中心波長λは、下記式（２）のように示される。
【００２７】
【数２】
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【００２８】
式（２）において、音波速度ｖは、音響光学変調器８の結晶依存で一定であるため、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆを変化させることにより、回折角度θ方向に回折される回折中心波長λを制御することが可能となる。
【００２９】
図３に、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆと、回折角度θ方向に回折される回折中心波長λとの関係を示す。
【００３０】
図に示すように、振動数制御部６によって音響光学変調器８に周波数ｆ１の音波が印加されている場合、回折角度θ方向に回折効率が最大となる回折中心波長はλ１であるものとする。このとき、例えば、音響光学変調器８に印加する音波の周波数をｆ２に変化させると、回折中心波長はλ２に変化する。同様に、音響光学変調器８に印加する音波の周波数をｆ３、ｆ４に変化させることにより、回折中心波長はλ３、λ４に変化する。
【００３１】
このように、回折角度θ方向に回折される回折中心波長λは、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆによって任意に制御することができる。また、このとき、回折中心波長λの回折方向（角度θ）は、ブラッグ条件により常に一定に保たれる。従って、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆを変化させることにより、音響光学変調器８により回折された蛍光のうち、スリット９の開口を透過する蛍光（波長λ−Δλ１／２からλ＋Δλ１／２までの回折中心波長域の回折光）の波長域を任意に制御することができる。そして、これにより、検出器７により検出される蛍光の波長域を、任意の波長域（検出蛍光波長域）に設定することが可能となる。
【００３２】
また、このとき、検出器７により検出される蛍光の波長幅Δλ１は、スリット９の開口幅ｗ（図２参照）を適宜変更することによって、任意に設定できる。すなわち、スリット９の開口幅ｗを広げると、検出器７においてより広波長帯域の蛍光を検出することができ、逆に狭めるとより狭波長帯域の蛍光が検出されるようになる。なお、スリット９の開口幅ｗは、全ての検出蛍光波長域の蛍光に対して、最も有効と考えられる幅に設定されることが好適となる。
【００３３】
図４に、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆと、検出器７により検出される蛍光の波長域との関係を示す。図中、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆの変化を実線で、検出器７により検出される蛍光の波長域の変化を点線で、検出器７による各波長域の蛍光の検出時間をバーで示す。
【００３４】
図に示すように、振動数制御部６によって音響光学変調器８に周波数ｆ１の音波が印加されている場合、回折角度θ方向に回折効率が最大となる回折中心波長はλ１となり、検出器７では、λ１を中心波長とする波長幅Δλ１の蛍光が検出される。一方、音響光学変調器８に印加する音波の周波数をｆ２に変化させると、回折中心波長はλ２に変化する。そのため、検出器７で検出される蛍光は、λ２を中心波長とする波長幅Δλ１の蛍光となる。このとき、検出器７においてλ２を中心波長とする波長幅Δλ１の蛍光が検出される時刻は、印加する音波の切換え後、音響光学変調器８内の回折格子が安定するまでの時間だけ遅延する。
【００３５】
同様に、音響光学変調器８に印加する音波の周波数をｆ３、ｆ４と非連続的に変化させることにより、検出器７で検出される蛍光はλ３、λ４をそれぞれ中心波長とする波長幅Δλ１の蛍光に順に変化する。
【００３６】
このように、検出器７により検出される蛍光の波長域は、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆによって任意に制御することができる。従って、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆを、検出したい任意の検出蛍光波長域に応じて非連続的に変化させることにより、一つの検出器７によって、微小粒子Ｐから発生する蛍光のうち、複数の波長域の蛍光を分離して個別に検出することが可能となる。
【００３７】
また、このとき、振動数制御部６による、音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆの切換え中には、検出器７における蛍光検出を行わず、かつ、検出器７における蛍光検出時間を、音響光学変調器８に印加する音波の切換え後、音響光学変調器８内の回折格子が安定するまでの時間だけ遅延させて蛍光の検出を行うことで、各波長域の蛍光を実時間で検出することが可能となる。
【００３８】
図５を参照して、本発明に係る微小粒子分析装置における振動数制御部６及び検出器７の制御方法を説明する。図５中（Ａ）は微小粒子からの散乱光を検出する検出器からの検出信号、（Ｂ）は振動数制御部６及び検出器７に出力されるトリガ信号、（Ｃ）は振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆ、（Ｄ）は検出器７による蛍光検出時間を示す。
【００３９】
フローセル内やマイクロチップ上に形成された流路内を通流する微小粒子Ｐが、光源１からの光照射スポットを通過すると、微小粒子Ｐからの散乱光が、散乱光を検出するための検出器により検出される。この散乱光の検出信号（図５（Ａ）参照）は、微小粒子Ｐが光源１からの光照射スポットを通過する間、全体制御部に出力される。なお、ここで、検出される散乱光は、前方散乱、側方散乱、レイリー散乱やミー散乱等であってよい。
【００４０】
全体制御部は、この散乱光の検出信号の出力を受けて、振動数制御部６及び検出器７にトリガ信号（図５（Ｂ）参照）を出力する。
【００４１】
振動数制御部６は、このトリガ信号の出力を受けて、音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆの非連続的に変化させ、検出蛍光波長域の切換えを開始する。また、同時に、トリガ信号の出力を受けた検出器７が、切り換え後の各検出蛍光波長域の蛍光の検出を開始する。このとき、検出器７は、音響光学変調器８による周波数ｆの切換え後、音響光学変調器８内の回折格子が安定するまでの所定時間だけ遅延しながら、各検出蛍光波長域の蛍光の検出を行っていく。
【００４２】
このように、微小粒子Ｐが光源１からの光照射スポットを通過する間に、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆを非連続的に変化させて、検出蛍光波長域を高速に切換えながら、微小粒子Ｐから発生する蛍光の検出を行うことで、各微小粒子Ｐについて複数の波長域の蛍光特性を効率よく、確実に取得することが可能となる。なお、図には周波数ｆを４段階に変化させる例を示したが、周波数ｆの切換え回数は特に限定されない。
【００４３】
また、このとき、振動数制御部６による、音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆの切換え中には、検出器７における蛍光検出を行わず、かつ、検出器７における蛍光検出開始時刻を、音響光学変調器８内の回折格子が安定するまでの時間だけ遅延させることで、各波長域の蛍光を実時間で検出し、微小粒子Ｐの蛍光特性を高精度に測定することが可能となる。
【００４４】
ここでは、微小粒子Ｐが光源１からの光照射スポットを通過するのに同期させて、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆを非連続的に切換える例を説明した。しかし、本発明に係る微小粒子分析装置において、振動数制御部６により音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆは、微小粒子Ｐに同期させることなく、常時高速切換えを行うことも当然に可能である。
【００４５】
最後に、本発明に係る微小粒子分析装置の各構成の具体的数値を例示する。
音響光学変調器８内の結晶としてＴｅＯ２を用い、音波速度ｖを４，２６０ｍ／ｓ、回折中心波長の光の回折角度θを６３ｍｒａｄとすると、音響光学変調器８に印加される音波の周波数ｆが４５０ＭＨｚのとき、回折中心波長λは６００ｎｍとなる（図２参照）。
結晶に直径２ｍｍの蛍光ビームを入射して、回折光を焦点距離２５ｍｍの集光レンズ５２で集光すると、波長幅Δλ１が４０ｎｍを満たすスリット９の開口幅ｗは１０６μmと計算される。このときの回折中心波長の切り替え時間は０．４７μｓｅｃとなる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明に係る微小粒子分析装置は、音響光学変調器に印加される音波の周波数を、検出したい任意の検出蛍光波長域に応じて非連続的に変化させることにより、一つの検出器によって、微小粒子から発生する蛍光のうち、複数の波長域の蛍光を分離して個別に検出することができる。従って、本発明に係る微小粒子分析装置では、検出器を複数配設する必要がなく、フィルタやミラー等の数も大幅に減らして、装置を小型化することが可能となる。また、高速応答性を有する汎用デバイスである音響光学変調器を用いることで、装置の製造コストを抑えることも可能である。
【符号の説明】
【００４７】
１  光源
２  コリメータレンズ
３  ミラー
４，５１，５２  集光レンズ
６  周波数制御部
７  検出器
８  音響光学変調器
９  スリット
Ｐ  微小粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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