(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経の成長および修復を調節するための組成物および方法を提供する。【解決手段】Trk受容体に結合し、Trk受容体に関連する活性を調節する環状ペプチドおよびペプチド模倣体からなる。中枢神経系の成長および／または修復を阻害する他の因子の効果をブロックまたは減少させる環状ペプチドおよびペプチド模倣体、これらの化合物を含有する医薬組成物および他の配合物を投与する方法及び、これらの環状ペプチドおよびペプチド模倣体を用いて、ニューロンの成長、生存および回復、軸索成長、神経突起成長、並びにシナプス可塑性を含む、Trk介在活性を調節するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ペプチドであって、該環状ペプチドの環状環内にアミノ酸配列：
Arg-Gly-Glu
を含み、Trk受容体介在活性を調節する環状ペプチド。
【請求項２】
Trk介在活性が：ニューロン成長、ニューロン生存、軸索成長、シナプス可塑性、および神経突起成長からなる群より選択される、請求項1に記載の環状ペプチド。
【請求項３】
神経突起成長を調節する請求項1に記載の環状ペプチド。
【請求項４】
Trk介在活性を阻害する請求項1に記載の環状ペプチド。
【請求項５】
Trk介在活性を強化する請求項1に記載の環状ペプチド。
【請求項６】
環状ペプチドが式：
【化１】
2011057685.tif 000017
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）X1およびX2は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項７】
環状ペプチド環のサイズが5ないし15アミノ酸の範囲である請求項6に記載の環状ペプチド。
【請求項８】
請求項6に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドが式：
【化２】
2011057685.tif 000018
を有する環状ペプチド。
【請求項９】
請求項8に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドがアミノ酸配列：
【表１】
2011057685.tif 000019
を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する環状ペプチド。
【請求項１０】
Trk介在活性を阻害する請求項6に記載の環状ペプチド。
【請求項１１】
請求項6に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドが式：
【化３】
2011057685.tif 000020
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
環状ペプチド。
【請求項１２】
環状ペプチド環のサイズが約8-50アミノ酸残基の範囲である請求項11に記載の環状ペプチド。
【請求項１３】
請求項11に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドが式：
【化４】
2011057685.tif 000021
を有する環状ペプチド。
【請求項１４】
請求項11に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドがアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する環状ペプチド。
【請求項１５】
Trk介在活性を強化する請求項11に記載の環状ペプチド。
【請求項１６】
請求項1、6、8-9、11および13-14のいずれか1項に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドが、アミノ末端残基上に、N-アセチル基、N-ホルミル基またはN-メシル基をさらに含む環状ペプチド。
【請求項１７】
請求項1、6、8-9、11、13-14および16のいずれか1項に記載の環状ペプチドであって、該環状ペプチドが、C末端残基上に、C-アミド基をさらに含む環状ペプチド。
【請求項１８】
Y1およびY2がジスルフィド結合によって共有結合する、請求項6、8、11および13のいずれか1項に記載の環状ペプチド。
【請求項１９】
Y1およびY2が：ペニシラミン；β,β-テトラメチレンシステイン；β,β-ペンタメチレンシステイン；β-メルカプトプロパン酸；β,β-ペンタメチレン-β-メルカプトプロパン酸；2-メルカプトベンゼン；2-メルカプトアニリン；2-メルカプトプロリン；およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項18に記載の環状ペプチド。
【請求項２０】
Y1およびY2が各々システインまたはそれらの誘導体である請求項19に記載の環状ペプチド。
【請求項２１】
Y1およびY2がアミド結合によって共有結合する、請求項6、8、11および13のいずれか1項に記載の環状ペプチド。
【請求項２２】
アミド結合が末端官能基の間に形成される請求項21に記載の環状ペプチド。
【請求項２３】
アミド結合が一方の末端官能基および一方の残基側鎖の間に形成される請求項２１に記載の環状ペプチド。
【請求項２４】
（a）Y1がリジン、オルナチンおよびそれらの誘導体からなる群より選択され；並びに
（b）Y2がアスパルテート、グルタミンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される、
請求項２２に記載の環状ペプチド。
【請求項２５】
（a）Y1がアスパルテート、グルタミンおよびそれらの誘導体からなる群より選択され；並びに
（b）Y2がリジン、オルナチンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される、
請求項22に記載の環状ペプチド。
【請求項２６】
Y1およびY2がチオエーテル結合によって共有結合する請求項6、8、11および13のいずれか1項に記載の環状ペプチド。
【請求項２７】
（a）Y1およびY2が各々トリプトファンまたはそれらの誘導体であり；並びに
（b）Y1およびY2間の共有結合がδ1δ1-ジトリプトファンまたはそれらの誘導体を形成する、
請求項6、8、11および13のいずれか1項に記載の環状ペプチド。
【請求項２８】
Trk受容体介在活性を調節する能力について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、候補化合物の三次元構造を、Trk受容体介在活性を調節する環状ペプチドの三次元構造と比較することを含み、
（a）該環状ペプチドが、それらの環状環内に、アミノ酸配列Arg-Gly-Gluを含み、並びに
（b）候補化合物の構造と環状ペプチドの構造との類似性がTrk受容体介在活性を調節する候補化合物の能力を示すものである、
方法。
【請求項２９】
環状ペプチドが式：
【化５】
2011057685.tif 000022
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）X1およびX2は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
環状ペプチドが式：
【化６】
2011057685.tif 000023
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
環状ペプチドが：
【表２】
2011057685.tif 000024
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する、請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
（a）環状ペプチドがTrk受容体介在活性を強化し、並びに
（b）候補化合物の構造と環状ペプチドの構造との類似性がTrk受容体介在活性を強化する候補化合物の能力を示すものである、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
（a）環状ペプチドがTrk受容体介在活性を阻害し、並びに
（b）候補化合物の構造と環状ペプチドの構造との類似性がTrk受容体介在活性を阻害する候補化合物の能力を示すものである、
請求項28に記載の方法。
【請求項３４】
Trk受容体介在活性を調節するペプチド模倣体であって、Trk介在活性を調節する環状ペプチドの三次元構造に類似する三次元構造を有し、該環状ペプチドが、それらの環状環内に、アミノ酸配列Arg-Gly-Gluを有するペプチド模倣体。
【請求項３５】
環状ペプチドが式：
【化７】
2011057685.tif 000025
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）X1およびX2は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項34に記載のペプチド模倣体。
【請求項３６】
環状ペプチドが式：
【化８】
2011057685.tif 000026
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項34に記載のペプチド模倣体。
【請求項３７】
環状ペプチドが：
【表３】
2011057685.tif 000027
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する、請求項34に記載のペプチド模倣体。
【請求項３８】
Trk受容体介在活性を強化する請求項34に記載のペプチド模倣体。
【請求項３９】
Trk受容体介在活性を阻害する請求項34に記載のペプチド模倣体。
【請求項４０】
Trk受容体介在活性を阻害するための方法であって、細胞を所定量の請求項4に記載の環状ペプチドまたは請求項39に記載のペプチド模倣体と接触させることを含み、細胞と接触させる環状ペプチドまたはペプチド模倣体の量はTrk受容体介在活性を有効に阻害する方法。
【請求項４１】
Trk受容体介在活性が：ニューロン成長、ニューロン生存、軸索成長、シナプス可塑性および神経突起成長からなる群より選択される請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
細胞を式：
【化９】
2011057685.tif 000028
を有する環状ペプチドと接触させる請求項40に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）X1およびX2は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項４３】
細胞を式：
【化１０】
2011057685.tif 000029
を有する環状ペプチドと接触させる請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
細胞をアミノ酸配列：
【表４】
2011057685.tif 000030
を有する環状ペプチドと接触させる請求項43に記載の方法であって、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する方法。
【請求項４５】
細胞を、式：
【化１１】
2011057685.tif 000031
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有するペプチド模倣体と接触させる請求項40に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）X1およびX2は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項４６】
ペプチド模倣体が、式：
【化１２】
2011057685.tif 000032
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
ペプチド模倣体が、アミノ酸配列：
【表５】
2011057685.tif 000033
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
Trk受容体介在活性を強化するための方法であって、細胞を所定量の請求項5に記載の環状ペプチドまたは請求項38に記載のペプチド模倣体と接触させることを含み、細胞と接触させる環状ペプチドまたはペプチド模倣体の量はTrk受容体介在活性を有効に阻害する方法。
【請求項４９】
Trk受容体介在活性が：ニューロン成長、ニューロン生存、軸索成長、シナプス可塑性および神経突起成長からなる群より選択される請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
細胞を式：
【化１３】
2011057685.tif 000034
を有する環状ペプチドと接触させる請求項48に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項５１】
環状ペプチドが式：
【化１４】
2011057685.tif 000035
を有する請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
環状ペプチドがアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含み、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
細胞を式：
【化１５】
2011057685.tif 000036
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有するペプチド模倣体と接触させる請求項48に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項５４】
ペプチド模倣体が式：
【化１６】
2011057685.tif 000037
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
ペプチド模倣体がアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含む環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
個体における中枢神経系（CNS）の成長または修復を強化するための方法であって、個体に所定量の請求項5に記載の環状ペプチドまたは請求項38に記載のペプチド模倣体を投与することを含み、投与される環状ペプチドまたはペプチド模倣体の量はCNSの成長または修復を有効に強化する方法。
【請求項５７】
環状ペプチドを個体に投与し、環状ペプチドが式：
【化１７】
2011057685.tif 000038
を有し、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
環状ペプチドが式：
【化１８】
2011057685.tif 000039
を有する請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
環状ペプチドがアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含み、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
ペプチド模倣体を個体に投与し、ペプチド模倣体が：
【化１９】
2011057685.tif 000040
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有し、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項56に記載の方法。
【請求項６１】
ペプチド模倣体が式：
【化２０】
2011057685.tif 000041
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
ペプチド模倣体がアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含む環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
（a）Trk受容体介在活性の調節に有効である量の請求項1に記載の環状ペプチドまたは請求項34に記載のペプチド模倣体；および
（b）1種類以上の薬学的または生理学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤、
を含有する医薬組成物。
【請求項６４】
環状ペプチドまたはペプチド模倣体がTrk受容体介在活性を強化する請求項63に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
環状ペプチドまたはペプチド模倣体がTrk受容体介在活性を阻害する請求項63に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
CNS阻害剤応答を減少させるための方法であって、細胞を所定量の請求項5に記載の環状ペプチドまたは請求項38に記載のペプチド模倣体と接触させることを含み、細胞と接触させる環状ペプチドまたはペプチド模倣体の量はCNS阻害剤応答を有効に減少させる方法。
【請求項６７】
CNS阻害剤応答にプロテインキナーゼA（PKA）またはホスホイノシチド-3キナーゼ（PI3K）によって調節される1つ以上の成分を含むシグナルカスケードが介在する請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
CNS阻害剤応答にRhoが関与するシグナルカスケードが介在する請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
CNS阻害剤応答が、MAG、Nogo-A、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質、NgR、GT1b、p75NTR、硫酸コンドロイチンプロテオグリカンまたはセマホリンが介在する応答である、請求項66に記載の方法。
【請求項７０】
細胞を式：
【化２１】
2011057685.tif 000042
を有する環状ペプチドと接触させる請求項66に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項７１】
環状ペプチドが式：
【化２２】
2011057685.tif 000043
を有する請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
環状ペプチドがアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含み、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
細胞を式：
【化２３】
2011057685.tif 000044
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有するペプチド模倣体と接触させる請求項66に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項７４】
ペプチド模倣体が式：
【化２４】
2011057685.tif 000045
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
ペプチド模倣体がアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含む環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
個体におけるCNS阻害剤応答を減少させるための方法であって、個体に所定量の請求項5に記載の環状ペプチドまたは請求項38に記載のペプチド模倣体を投与することを含み、投与される環状ペプチドまたはペプチド模倣体の量はCNS阻害剤応答を有効に減少させる方法。
【請求項７７】
CNS阻害剤応答にプロテインキナーゼA（PKA）またはホスホイノシチド-3キナーゼ（PI3K）によって調節される１つ以上の成分を含むシグナルカスケードが介在する請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
CNS阻害剤応答にRhoが関与するシグナルカスケードが介在する請求項76に記載の方法。
【請求項７９】
CNS阻害剤応答が、MAG、Nogo-A、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質、NgR、GT1b、p75NTR、硫酸コンドロイチンプロテオグリカンまたはセマホリンが介在する応答である、請求項76に記載の方法。
【請求項８０】
細胞を式：
【化２５】
2011057685.tif 000046
を有する環状ペプチドと接触させる請求項76に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項８１】
環状ペプチドが式：
【化２６】
2011057685.tif 000047
を有する請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
環状ペプチドがアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含み、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
細胞を式：
【化２７】
2011057685.tif 000048
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有するペプチド模倣体と接触させる請求項76に記載の方法であって、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
方法。
【請求項８４】
ペプチド模倣体が式：
【化２８】
2011057685.tif 000049
を有する環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
ペプチド模倣体がアミノ酸配列：
Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys（配列番号17）
を含む環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有し、共有結合が該アミノ酸配列内のN末端およびC末端システインを接続する請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
環状ペプチドであって、該環状ペプチドの環状環内に、Dアミノ酸配列：
dGlu-Gly-dArg
を含み、Trk受容体介在活性を調節する環状ペプチド。
【請求項８７】
神経突起成長を促進する請求項86に記載の環状ペプチド。
【請求項８８】
式：
【化２９】
2011057685.tif 000050
を含み、式中：
（a）Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された供給結合を有する、独立に選択されるアミノ酸であり；並びに
（b）X1およびX2は任意であり、存在する場合には、ペプチド結合によって接続される、独立に選択されるアミノ酸またはアミノ酸の配列である、
請求項86に記載の環状ペプチド。
【請求項８９】
Y1およびY2の間に形成される共有結合がペプチド結合である請求項88に記載の環状ペプチド。
【請求項９０】
アミノ酸配列：
dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer-dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer（配列番号40）
を有する請求項89に記載の環状ペプチド。
【請求項９１】
アミノ酸配列：
dCys-dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer-dAla-dAla-dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer-dCys（配列番号41）
を有する式を含み、末端システインがジスルフィド結合によって共有結合する、請求項86に記載の環状ペプチド。
【請求項９２】
アミノ酸配列：
Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu（配列番号39）
を有し、末端セリンおよび末端ロイシンがペプチド結合によって共有結合する、請求項8に記載の環状ペプチド。
【請求項９３】
阻害性環境においてCNSニューロン成長を促進するための方法であって、個体に治療上有効な量のp75受容体結合剤を投与することを含む方法。
【請求項９４】
p75受容体結合剤がニューロトロフィン結合性モチーフまたはそれらのペプチド模倣体を含む請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
p75受容体結合剤が、それらの環状環内にアミノ酸配列Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu（TDIKGKE）（配列番号42）を含む環状ペプチドまたはペプチド模倣体である、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
p75受容体結合剤がN-Ac-CTDIKGKEC-NH2（配列番号43）である請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
ニューロトロフィンを投与することをさらに含む請求項93に記載の方法。
【請求項９８】
p75受容体結合剤を、ニューロトロフィンを約10ないし約100倍上回る量で投与する、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
ニューロトロフィンがNGF、BDNF、NT-3、NT-4およびNT-5からなる群より選択される請求項97に記載の方法。
【請求項１００】
p75受容体結合剤がニューロトロフィン結合性モチーフまたはそれらのペプチド模倣体を含む請求項97に記載の方法。
【請求項１０１】
p75受容体結合剤が、それらの環状環内に、アミノ酸配列TDIKGKE（配列番号42）を含む環状ペプチドまたはペプチド模倣体である、請求項97に記載の方法。
【請求項１０２】
p75受容体結合剤がN-Ac-CTDIKGKEC-NH2（配列番号43）である請求項97に記載の方法。
【請求項１０３】
阻害性環境においてCNSニューロン成長を促進するための方法であって、個体に治療上有効な量のp75受容体結合剤を投与することを含み、p75受容体結合剤が阻害性環境において受傷ニューロンが発現するTrk受容体に結合しないニューロトロフィンである方法。
【請求項１０４】
p75受容体結合剤を他の異なるニューロトロフィンと組み合わせて投与し、該他の異なるニューロトロフィンが阻害性環境において受傷ニューロンが発現するTrk受容体に結合する、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
p75受容体結合剤がNGFであり、かつ他の異なるニューロトロフィンがBDNFである、請求項104に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願との相互参照
2003年9月10日出願の米国仮特許出願第60/501,864号；2004年4月5日出願の第60/559,898号；および2004年8月20日出願の第60/603,187号に対する35 U.S.C. 119（e）の下での優先権が主張される。これらの仮出願の内容は参照によりそれらの全体がここに組み込まれる。
【０００２】
２．技術分野
本発明は中枢神経系（CNS）の成長および修復を調節するための組成物および方法に関し、これにはニューロン生存、軸索成長およびシナプス可塑性のようなプロセスが含まれる。より具体的には、本発明は、ニューロン細胞の表面上に発現し、かつCNS成長および修復のようなプロセスを調節する、Trk受容体として知られる受容体の一ファミリーのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである（環状ペプチドおよびペプチド模倣性化合物を含む）化合物に関する。さらに、本発明は、p75結合剤を用いてCNS成長および修復を促進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．従来技術
中枢神経系（CNS）の損傷は、その環境におけるニューロンの再生能力が乏しいため、壊滅的な結果を有する可能性がある。これは、末梢神経系におけるニューロンの比較的良好な再生能力と著しく対照的である。例えば、Horner & Gage, Nature 2000, 407:963-970を参照のこと。少数の例を挙げると、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、頭部および脊髄外傷はすべてCNSの損傷に関連し、これらは重篤な場合が多く、弱まることはあっても、長期間持続するか、または恒久的ですらある。これらの状態に利用可能な治療は現時点では存在せず、対症的処置ですら欠いている。
【０００４】
３．１．ニューロトロフィン
ニューロンの成長および再生が少なくとも部分的にはニューロトロフィンまたは「NT」として知られる特定のポリペプチド成長因子によって調節されることが今や理解されており、これは内因性チロシンキナーゼ活性を有する細胞表面受容体に結合してそれを活性化する。ニューロトロフィンが結合すると、これらの受容体は1以上のアミノ酸残基で自己リン酸化した後、シグナル伝達に重要な細胞内分子と会合し始めるものと考えられる。その総説については、例えば、Ulrich & Schlessinger, Cell 1990, 61:203-212を参照のこと。
【０００５】
最初に同定されたニューロトロフィンは当該技術分野において神経成長因子（NGF）として知られ、末梢神経系の感覚および交感神経細胞の発達に対する顕著な効果を有する。Levi-Montalcini & Angeletti, Physiol. Rev. 1968, 48:534-569；Thoenen et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1987, 109:145-178；Thoenen & Barde, Physiol. Rev. 1980, 60:1284-1325；Whittemore & Seiger, Brain Res. 1987, 434:439-464；Angeletti & Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1971, 68:2417-2420；Angeletti et al., Biochemistry 1973, 12:100-115を参照のこと。NGFオルトログも、マウス、鳥類、爬虫類および魚類を含む幾つかの他の種において単離され、特徴付けられている（Scott et al., Nature 1983, 302:538-540；Schwartz et al., J. Neurochem. 1989, 52:1203-1209；およびHallbook et al., Neuron 1991, 6:845-858）。
【０００６】
幾つかの他のNTも当該技術分野において公知である。これらには脳由来神経栄養因子（BDNF）、別名ニューロトロフィン-２（NT-2）が含まれる。Leibrock et al., Nature 1989, 341:149-152を参照のこと。さらに別のNTには、元来は神経細胞因子（NF）と呼ばれ、現在は一般にはニューロトロフィン-３または「NT-3」と呼ばれる因子が含まれる（Ernfors et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87:5454-5458；Hohn et al., Nature 1990, 344:339；Maisonpierre et al., Science 1990, 247:1446；Rosenthal et al., Neuron 1990, 4:767；Jones & Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87:8060-8064；およびKaisho et al., FEBS Lett. 1990, 266:187）。ニューロトロフィン-４および-５（NT-4およびNT-5）も公知である。Hallbook et al., Neuron 1991, 6:845-858；Berkmeier et al., Neuron 1991, 7:857-866；Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89:3060-3064を参照のこと。1994年11月15日にRosenthalに発行された米国特許第5,364,769号も参照のこと。その後、それが前出のHallbrookらによって記載されるツメガエルNT-4の哺乳動物オルトログであることが判明したため、前出のBerkmeierらによって記載される哺乳動物NT-5分子は一般にNT-4/5とも呼ばれる。NTのBDNF、NT4、NT3、およびNGFの配置が図１に示される。
【０００７】
３．２．Trk受容体
ニューロトロフィンは、それらの効果に、ニューロン細胞の表面上に発現し、かつ集合的にTrk受容体と呼ばれる受容体チロシンキナーゼの一ファミリーを介して介在する。少なくとも３種類の異なるTrk受容体が当該技術分野において公知であり、かつ記載されている：TrkA、TrkBおよびTrkC。その総説については、すべてPresta らによる米国特許第5,844,092号；第5,877,016号；第6,025,166号；第6,027,927号；および第6,153,189号を参照のこと。これらの異なるTrk受容体の構造および配列は類似するが、代替スプライシングがこのファミリーの複雑性を高め、各受容体の幾つかの異なるアイソフォームを生じる。これらの異なるTrk受容体アミノ酸配列の配置が図2A-2Cに示され、これらは各受容体の様々なドメインのコンセンサス配列および境界を示す。米国特許第5,877,016号の図16A-16Cも参照のこと。
【０００８】
異なるTrk受容体の各々は、幾らかの重複はあるものの、異なるニューロトロフィンに対する結合特異性を示す。したがって、TrkAはNGFだけではなくNT-3およびNT-4/5にも結合するものと考えられる（しかしながら、BDNFには結合しない）。TrkBはBDNF、NT-3、NT-4およびNT-4/5には結合するが、NGFには結合しないものと考えられる。対照的に、TrkCはNT-3のみに結合し、他のニューロトロフィンのいずれにも結合しないものと考えられる。
【０００９】
幾つかの研究は脳修復のための治療的標的としてのTrk受容体を実証している。例えば、Liu et al., J. Neurosci. 1999, 19:4370-4387；Menei et al., Eur. J. Neurosci. 1998, 10:607-621；およびKobayashi et al., J. Neurosci. 1997, 17:9583-9595を参照のこと。Trk受容体およびそれらのリガンドは、リガンド−受容体結合複合体の三次元構造を得るため、Ｘ線結晶学を用いた研究もなされている。Wiesmann et al., Nature 1999, 401:184-188；Banfield et al., Structure（Camb）2001, 9:1191-1199。これらの、および他の研究は、Trk受容体に結合するニューロトロフィンが受容体モノマーの二量体化を誘導し、それが受容体の内在性チロシンキナーゼ活性の増加を生じることを示唆する。この活性の増加は、次に、ニューロン生存、軸索成長、およびシナプス可塑性を促進することによってニューロンに有益であるものと考えられるシグナル伝達カスケードを誘発する。Snider, Cell 1994, 77:627-638；Kaplan & Miller, Curr. Opin. Neurobiol. 2000, 10:381-391。
【００１０】
したがって、Trk受容体を標的として活性化する治療用化合物（すなわち、Trk受容体「アゴニスト」）が有益で望ましいものであるということがかなり認められている。例えば、Lindsay et al., Exp. Neurol. 1993, 124:103-118；Olson, Neurochem. Int. 1994, 25:1-3を参照のこと。さらに、特定のニューロトロフィン（例えば、BDNF）のレベルの増加も医学的状態、例えば、てんかんに関連する（Binder et al., Trends Neurosci. 2001, 24:47-53）。したがって、Trk受容体活性を阻害する化合物（すなわち、Trk受容体「アンタゴニスト」）さえも有益である。この長く感じられている必要性にもかかわらず、そのような化合物は最善でも理解しがたいものである。大分子であるため、ニューロトロフィンそれ自体の有効レベルの治療用送達は相当の、おそらくは克服できない挑戦を提示する。さらには、天然ニューロトロフィンは他の受容体、例えば、ニューロンにおけるp75受容体と相互作用し、これはニューロンのアポトーシスおよび成長円錐崩壊に関連する。Lee et al., Curr. Opin. Neurobiol. 2001, 11:281-286。
【００１１】
しかしながら、Trk受容体のペプチド模倣性アゴニストおよび／またはアンタゴニストを設計しようとする従来の努力も失敗に終わっている。例えば、ニューロトロフィンNGfのループ1から誘導される環状ペプチドはNGFの生存活性を適度に模倣することが報告されている。しかしながら、これらのペプチドはTrk受容体ではなくp75において依存的な方法で機能するように思われる。Long et al., J. Neurosci. Res. 1997, 48:1-17。幾つかのNGFループ4環状ペプチドはTrkアンタゴニストによって遮断されるNGF様生存活性を示すと言われる。しかしながら、それらのペプチドによって誘導される最大生存応答はNGFニューロトロフィンそれ自体によって促進される最大応答の10-15％に過ぎないものと報告されている。Xie et al., J. Biol. Chem. 2000, 275:29868-29874；およびMaliartchouk et al., J. Biol. Chem. 2000, 275:9946-9956を参照のこと。BDNFループ2ペプチドの二環式および三環式二量体版はBDNF様活性を有することが示されている。しかしながら、ここでも、それらが誘導する最大生存応答は天然ニューロトロフィンによって促進される最大応答の30％に過ぎないことが報告されている。O’Leary et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:25738-25744（Electronic publication May 2, 2003）。
【００１２】
したがって、ニューロンの成長および回復を調節（すなわち、増加または阻害）することができる組成物が絶えず強く求められている。ニューロンの成長および回復を有効に調節するプロセスおよび方法（治療法を含む）に対する必要性も存在する。
【００１３】
３．２１．p75受容体ニューロトロフィン受容体
p75受容体はシグナル伝達複合体においてニューロンのアポトーシスおよび成長阻害に対する役割を果たすことが知られている。Barker, Neuron 2004, 42:529-533。p75受容体は腫瘍壊死因子（TNR）スーパーファミリーの一員であり、その細胞外部分におけるシステインリッチドメイン（CRD）を特徴とする。これらのCRDはニューロトロフィン結合に必要であり、p75受容体はニューロトロフィン、例えば、NGF、BDNF、NT-3、およびNT-4に対する低親和性受容体として機能する。Huang and Reichardt, Annu. Rev. Biochem. 2003, 72:609-642。NGF、BDNF、NT-3およびNT-4はp75受容体への結合について互いに有効に競合し得る。阻害環境において、Trkシグナル伝達のみに依存する応答を明らかにするため、p75への互いの結合を競合除去するのにこれらのニューロトロフィンを用いることができる。Barker and Shooter, Neuron 1994, 13:203-215。
【００１４】
３．２２．p75受容体およびNGF TDIKGKEモチーフ
NGFの第1βヘアピンループを構成するTDIKGKEモチーフがp75受容体へのNGFの結合において重大な役割を果たすことが知られている。He and Garcia, Science 2004, 304:870-875；Ibanez et al., Cell 1992, 69:329-341。さらに、拘束されたTDIKGKEモチーフはp75受容体と相互作用し、この受容体へのニューロトロフィンの結合と競合するものと期待される。Longo et al., J. Neurosci. Res. 1997, 48:1-17。
【００１５】
NGFのループ1から誘導される環状ペプチドおよびペプチド模倣性化合物はNGFのニューロン成長促進活性を適度に模倣し（Saragoviらへの米国特許第6,017,878号を参照のこと）、これらのペプチドがp75受容体依存的な方法で機能するように思われる（Longo et al., J. Neurosci. Res. 1997, 48:1-17）ことが報告されている。幾つかのNGFループ4環状ペプチドはTrkアンタゴニストによって遮断されるNGR様ニューロン成長促進を示すと言われている。しかしながら、それらのペプチドによって誘導される最大応答はNGFニューロトロフィンそれ自体によって促進される最大応答の10-15％にすぎないことが報告されている。Xie et al., J. Biol. Chem. 2000, 275:29868-29874；およびMaliartchouk et al., J. Biol. Chem. 2000, 275:9946-9956を参照のこと。BDNFループ2ペプチドの二環式および三環式二量体版はBDNF様活性を有することが示されている。しかしながら、ここでもやはり、それらが誘導する最大応答は天然ニューロトロフィンによって促進される最大応答の30％にすぎないことが報告されている。O’Leary et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:25738-25744（Electronic publication May 2, 2003）。
【００１６】
３．３．阻害シグナル
損傷を修復する中枢神経系の限られた能力は、少なくとも部分的には、損傷を受けたミエリンに関連する阻害性物質を含む-軸索再生を防止する阻害性生成物の存在によるものと考えられる（Berry, Bibl. Anat. 1982, 23:1-11）。実際、中枢ミエリンに対する生化学的研究は細胞拡散に対する阻害活性を含む2種類のタンパク質画分を同定しており（Caroni & Schwab, J. Cell Biol. 1988, 106:1281-1288）、それらの画分に結合するモノクローナル抗体は、他の方法では神経突起成長の非許容的基質である培養された感覚および交感神経細胞の成長を強化する（Caroni & Schwab, Neuron 1988, 1:85-96）。これらと同じ抗体を用いる受傷動物における研究もミエリンに関連する阻害性分子の機能を遮断することによって機能的回復を得ることができることを示している（Bregman et al., Nature 1995, 378:498-501；Schnell & Schwab, Nature 1990, 343:269-272）。より強い再生応答がミエリンで免疫化したマウスにおいて得られており（Huang et al., 1999）、阻害因子を遮断することによってCNS回復および修復をイン・ビボで強化できることがさらに示される。
【００１７】
軸索成長の強力な阻害剤である少なくとも3種類のミエリン誘導分子が公知である：ミエリン関連糖タンパク質、別名「MAG」（McKerracher et al., Neuron 1994, 13:805-811；およびMukhopadhyay et al., Neuron 1994, 13:757-767が記載）；Nogo-A（Chen et al., Nature 2000, 403:434-439；GrandPre et al., Nature 2000, 403:439-444；およびPrinjha et al., Nature 2000, 403:383-384を参照）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（Wang et al., Nature 2002, 417:941-944）。Nogo受容体（別名、「NgR」）、ガングリオシドGT1bおよびp75ニューロトロフィン受容体（別名、「p75NTR」または「p75NTR」）はこれら阻害性分子の3種類すべてに対する応答の介在に関連付けられている。具体的には、NgRへの結合は3種類すべての阻害剤MAG、Nogo-Aおよびオリゴデンドロサイト糖タンパク質による阻害活性に必要であると言われている（Domeniconi et al., 2002；Liu et al., 2002；Wang et al., 2002b）。しかしながら、MAGはGT1b受容体に直接結合することもできる（Vyas & Schnaar, Biochimie 2001, 83:677-682）。さらに、GT1b受容体の抗体誘導クラスター形成はMAGによって生成される阻害応答を模倣することができる（Vinson et al, J. Biol. Chem. 2001, 276:20280-20285；およびVyas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99:8412-8417を参照のこと）。
【００１８】
p75受容体は3種類すべてのミエリン受容体に結合することができる以外に、多量体受容体複合体のシグナル伝達性化合物である。Domeniconi et al., Neuron 2002, 35:283-290；Liu et al., Science 2002, 297:1190-1993；Wang et al., Nature 2002, 417:941-944を参照のこと。NgRおよびp75NTR受容体の間の相互作用（Wang et al., 2002a；およびWong et al., 2002を参照）と同様に、GT1bおよびp75NTR受容体の間の相互作用が報告されている（Yamashita et al., 2002）。そのようなp75NTRとの相互作用は細胞膜全体にわたる（例えば、MAG、Nogo-Aおよび／またはオリゴデンドロサイト糖タンパク質からの）阻害シグナルの伝達において重要であるものと考えられる。例えば、MAGまたはNogo-AペプチドとNgRを発現する細胞との相互作用はp75NTRとRho-GDIとの会合を増加させ、その複合体からのRhoAの放出を誘導する（Yamashita & Tohyma, Nat. Neurosci. 2003, 6:461-471）。この工程は、例えば培養ニューロンにおけるミエリンの、RhoAの活性化および成長の阻害（Id）、並びにRhoAおよび／または阻害活性を有効に回避するRhoキナーゼ（RhoAの下流エフェクター）の阻害に予め必要である（例えば、Dergham et al., J. Neurosci. 2002, 22:6570-6577；Fournier et al., J. Neurosci. 2003, 23:1416-1423；およびLehmann et al., J. Neurosci. 1999, 19:7537-7547を参照のこと）。
【００１９】
上記のように、様々なニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3およびNT-4/5）が発達中のニューロン生存および軸索成長に対する劇的な効果を有する。ニューロトロフィンおよび阻害性分子（例えば、MAG、Nogo-Aおよびオリゴデンドロサイト糖タンパク質）がRho-GDIへのp75NTR受容体のカップリングに対する反対の効果を有し得ることが近年示されている（Yamashita & Tohyama, Nat. Neurosci. 2003, 6:461-467を参照のこと）。それにもかかわらず、現時点で、ニューロトロフィンを用いて強固な長期の軸索再生を促進することはいまだに可能ではない。これは、少なくとも部分的には、ニューロトロフィンが上述されるもののような阻害性シグナルを有効に相殺できないためであるものと考えられる。例えば、ニューロトロフィン、例えば、NGF、BDNFまたはGDNF（グリア誘導神経栄養因子）での培養ニューロンの処理は、阻害性シグナルへの露出に先立ってニューロトロフィンに数時間露出することによってまずニューロンを「初回刺激」しない限り、通常ミエリンの阻害活性を相殺することはない（Cai et al., Neuron 1999, 22:89-101）。しかしながら、そのような初回刺激は効果が限定され、時間を浪費し、適用が厄介であり、並びに臨床および他のイン・ビボ用途には実施不可能なものである。さらに（および上述のように）、大分子であるニューロトロフィンそれ自体の治療的送達は相当の、おそらくは克服不能の、技術的挑戦を提示する。さらに、ニューロトロフィンは、それらがp75受容体とのそれらの相互作用によって阻害性複合体に結合するため、再生を促進するそれらの能力を損なう可能性がある。p75受容体に結合しているニューロトロフィンは、Trk受容体に結合して阻害性シグナル伝達を克服し、ニューロン再生を促進することができない。
【００２０】
したがって、ニューロンの成長および回復に対する阻害性シグナルの効果を有効に調節することができる化合物−阻害性シグナル、例えば、MAG、Nogo-A、オリゴデンドロサイト糖タンパク質、NgR、GT1b、p75NTRおよび／またはこれらの信号伝達分子の下流エフェクターによって生成されるものの効果を有効に調節する化合物を含む−に対する必要性がさらに存在する。特には、そのような阻害性シグナルを有効に相殺し、および／またはニューロンの成長および回復を刺激することができる化合物に対する必要性が存在する。そのような阻害性シグナルの効果を調節するプロセスおよび方法（治療法を含む）、特には、そのような阻害性シグナルを相殺し、および／またはニューロンの成長および回復を刺激するプロセスおよび方法に対する必要性も存在する。
【００２１】
このセクションにおける、および本明細書全体を通しての参考文献の引用および／または考察は単に本発明の説明を明瞭にするために示されるものであり、あらゆるそのような参考文献がここで説明される発明の「先行技術」であることを認めるものではない。
【００２２】
【発明の概要】
【発明を解決するための手段】
【００２３】
４．発明の開示
本発明は、Trk受容体、例えば、TrkA、TrkBまたはTrkCが介在する活性を調節（例えば、強化または阻害）する化合物およびそれらの配合物を提供することにより、当該技術分野における上記問題に対する少なくとも部分的な解決をもたらす。例えば、一実施形態において、本発明は、Trkアンタゴニストであり、かつ、そのようなものとして、Trk介在活性を阻害する化合物を提供する。別の実施形態において、本発明は、Trkアゴニストであり、かつ、そのようなものとして、Trk介在活性を強化または増加させる化合物を提供する。
【００２４】
上記のように、Trk受容体およびそれらのリガンド（すなわち、ニューロトロフィン、例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5およびNT-4/5）は中枢神経系（CNS）の成長および修復に関与する。そのようなことから、本発明のTrk調節因子化合物は、ニューロンの成長および生存、軸索成長、神経突起成長、並びにシナプス可塑性のプロセスを含む、そのようなプロセスの調節に用いることができる。したがって、一態様において、本発明は、そのようなプロセスの調節（例えば、強化または阻害）に本発明のTrk調節因子化合物を用いる方法（治療法を含む）を提供する。
【００２５】
特定の一実施形態において、本発明は、Trk受容体介在活性を調節する環状ペプチド化合物を提供する。これらの環状ペプチドは、好ましくは、環状ペプチド環内に、アミノ酸配列：Arg-Gly-Gluを含む。より特別な実施形態において、この環状ペプチドは下記式を含む：
【化１】
2011057685.tif 000002
【００２６】
式Iにおいて、要素Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されたアミノ酸である。要素X1およびX2は任意であり、存在する場合には、独立に選択されるアミノ酸またはペプチド結合によって連結されたアミノ酸の配列である。好ましくは、X1および／またはX2は各々長さがゼロないし約10アミノ酸であり、より好ましくは、長さが約1、2、3、4または5アミノ酸である。さらにその上、X1およびX2は、好ましくは、環状ペプチド環のサイズが約5ないし約15アミノ酸の長さ、より好ましくは、約5-10アミノ酸の長さの範囲となるように選択される。
【００２７】
さらに、本発明は、特定の実施形態において、下記式を有する環状ペプチドを提供し：
【化２】
2011057685.tif 000003
式中、Y1およびY2は式Iについて上述される通りである。特に好ましい本発明の環状ペプチドは、アミノ酸配列：CSRRGEC（配列番号1）、N-Ac-CSRRGEC-NH2（配列番号2）、CARRGEC（配列番号3）、N-Ac-CARRGEC-NH2（配列番号4）、CFHRGEC（配列番号5）、N-Ac-CFHRGEC-NH2（配列番号6）、CSHRGEC（配列番号7）、N-Ac-CFHRGE-NH2（配列番号8）、CRGEC（配列番号9）、N-Ac-CRGEC-NH2（配列番号10）、N-Ac-KRGED-NH2（配列番号11）、H-C（O）-CRGEC-NH2（配列番号12）、CH3-SO2-NH-CRGEC-NH2（配列番号13）、N-Ac-CRGEC-Y-NH2（配列番号14）、H-C（O）-CRGEC-Y-NH2（配列番号15）およびCH3-SO2-NH-CRGEC-Y-NH2（配列番号16）（ここで、各々のアミノ酸配列の下線部は環状化されるペプチドの部分を示す）を含むものである。
【００２８】
上記式および配列の好ましい環状ペプチドはTrkアンタゴニストである。しかしながら、本発明は、別の実施形態において、Trkアゴニストである環状ペプチドも提供する。そのような環状ペプチドは、好ましくは、下記式を有する：
【化３】
2011057685.tif 000004
【００２９】
上記式IIにおいて、要素Y1およびY2は、Y1およびY2の間に形成された共有結合を有する、独立に選択されたアミノ酸である。要素Z1、Z2およびZ0は任意であり、存在する場合には、独立に選択されたアミノ酸またはペプチド結合によって連結されたアミノ酸の配列である。好ましくは、Z1、Z2および／またはZ0は、各々、長さが約10アミノ酸以下であり、より好ましくは、長さが約1、2、3、4、5または10アミノ酸のみである。さらに、Z1、Z2および／またはZ0の長さは、好ましくは、環状ペプチド環のサイズが約10-50アミノ酸の長さ、より好ましくは、約10-25または約15-20アミノ酸の長さの範囲となるように選択される。特に好ましい実施形態においては、要素Z1、Z2およびZ0は、式Iにおける縦列Arg-Gly-Glu配列が、それらが互いに隣接し、かつ逆平行である立体配座に適合するように選択される。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明は、下記式を有する式IIによる環状ペプチドを提供し
【化４】
2011057685.tif 000005
式中、要素Y1およびY2は式IIについて前に記載される通りである。式IIによる特に好ましいペプチドは、これらも本発明の一部であるが、アミノ酸配列：CSRRGELAASRRGELC（配列番号17）およびN-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2（配列番号18）（ここで、各々のアミノ酸配列の下線部は環状化されるペプチドの部分を示す）を含む環状ペプチドである。
【００３１】
本発明によると、環状ペプチドの環状環内にDアミノ酸配列：
dGlu-Gly-dArg
を含む環状ペプチドが提供され、ここで、該環状ペプチドはTrk受容体介在活性を調節する。Trk受容体介在活性を調節する、Dアミノ酸配列を含む好ましい環状ペプチドは、c［dLdEGdRdRdSdLdEGdRdRdS］（配列番号40）（ここで、アミノ酸配列の括弧でくくられた部分はペプチド結合によって環状化されるペプチドの部分を示す）およびAc-dCdLdEGdRdRdSdAdAdLdEGdRdRdSdC-NH2（配列番号41）である。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明はアミノ酸配列c［SRRGELSRRGEL］（配列番号39）を有する環状ペプチドを提供する。
【００３３】
環状ペプチドに加えて、本発明は、Trk受容体介在活性を調節するか、またはそのような活性を調節すると思われる他の化合物（すなわち、「候補化合物」）を同定するための方法も提供する。これらの方法は候補化合物の三次元構造を本発明の環状ペプチドの三次元構造と比較することを含む。候補化合物の構造と環状ペプチドの構造との類似は、Trk受容体介在活性を調節する候補化合物の能力を示すものである。したがって、環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する構造を有する候補化合物はTrk受容体介在活性を調節する化合物であるものと思われる。
【００３４】
上記方法はTrk受容体介在活性を調節するペプチド模倣性化合物の同定に理想的に適合する。したがって、本発明はTrk調節因子であるペプチド模倣性化合物を提供し、そのような化合物は本発明の別の態様と考えられる。特には、本発明のペプチド模倣性化合物は、本発明の環状ペプチド（すなわち、Trk介在活性を調節し、かつ、それらの環状環内に、アミノ酸配列Arg-Gly-Gluを含む環状ペプチド）の三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する化合物である。
【００３５】
本発明は、さらに、環状ペプチドおよびペプチド模倣性化合物を用いてTrk介在活性を調節する、治療法を含む方法を提供する。そのような実施形態の1つにおいて、本発明はTrk介在活性を阻害するための方法を提供する。そのような方法は、細胞（イン・ビボまたはイン・ビトロ）を、Trk介在活性を阻害する特定の量の本発明の環状ペプチドまたはペプチド模倣性化合物と接触させることを含む。細胞に接触させる環状ペプチドまたはペプチド模倣性化合物の量はTrk受容体介在活性を有効に阻害する量でなければならない。
【００３６】
別の実施形態において、本発明はTrk介在活性を強化するための方法を提供する。そのような方法は、細胞（イン・ビボまたはイン・ビトロ）を、Trk介在活性を強化する特定の量の本発明の環状ペプチドまたはペプチド模倣性化合物と接触させることを含む。細胞に接触させる環状ペプチドまたはペプチド模倣性化合物の量はTrk受容体介在活性を有効に強化する量でなければならない。
【００３７】
そのような方法によって調節（例えば、強化または阻害）することができるTrk介在活性の例には：ニューロンの成長および生存、軸索成長、神経突起成長並びにシナプス可塑性に加えて、中枢神経系（CNS）成長および／または修復の他のプロセスが含まれる。したがって、本発明は、個体における中枢神経系の成長または修復を強化するための方法をさらに提供する。これらの方法は、その個体に、Trk介在活性を強化する特定の量の本発明の環状ペプチドまたはペプチド模倣性化合物を投与することを含む。投与される環状ペプチドまたはペプチド模倣性化合物の量はCNSの成長または修復を有効に強化する量でなければならない。
【００３８】
本発明は、Trkアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、ニューロン成長、ニューロン生存、軸索成長、神経突起成長およびシナプス可塑性のようなプロセスを正常に阻害する応答を含む、CNS成長および修復を阻害する応答を調節する方法をさらに提供する。特には、本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストを阻害性因子および／またはそのような因子によって生成される阻害性シグナルの調節に用いることができる。例にはミエリンに関連する因子が含まれ、これにはミエリン関連糖タンパク質（MAG）、Nogo-Aおよびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質が含まれる。一般には、本発明は、Trk受容体によるシグナル伝達に関与する因子（1種類以上）によってそれ自体が調節される1種類以上の構成要素を含むシグナルカスケードが介在するCNS阻害応答の調節にTrkアゴニストおよび／またはアンタゴニストを用いる方法を提供する。これらには、例えば、タンパク質キナーゼA（PKA）および／またはホスホイノシチド-3キナーゼ（PI3K）によって調節されるRhoのような構成要素が含まれる。したがって、好ましい実施形態において、本発明はそのような「CNS阻害剤」応答を低下させるための方法であって、細胞を、CNS阻害剤応答を低下させるのに有効である量の本発明のTrkアゴニスト（例えば、環状ペプチドまたはペプチド模倣体）と接触させることによる方法を提供する。また、本発明は、個体におけるCNS阻害剤応答を低下させるための方法であって、その個体に、CNS阻害剤応答を有効に低下させる量の本発明のTrkアゴニスト（例えば、環状ペプチドまたはペプチド模倣体）を投与することによる方法も提供する。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明は治療法、例えば、上述のものにおいて用いることができる医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は特定の量の本発明の環状ペプチドまたはペプチド模倣体を薬学的におよび／または生理学的に許容し得る1種類以上の担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する。
【００４０】
さらに、本発明は、p75受容体へのニューロトロフィンの結合を妨害する薬剤が阻害性環境においてCNSニューロンの成長を促進するという発見に基づく。
【００４１】
Trk受容体およびそれらのリガンド（すなわち、ニューロトロフィン、例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4およびNT-5）はCNSニューロンの成長および修復に関与する。そのようなことから、ニューロトロフィンがTrk受容体に結合してそれを活性化するとき、Trk活性はニューロンの成長を促進するシグナル伝達カスケードを誘発する。しかしながら、p75受容体がニューロトロフィンを低い親和性で結合し、かつ、p75受容体が阻害性複合体内に拘束されているとき、この相互作用はCNSニューロンの成長を促進するニューロトロフィンの能力を損なう。本発明は、CNSニューロンの成長を促進するための方法であって、p75受容体へのニューロトロフィンの結合を妨害するp75受容体結合剤を用いる方法を提供する。
【００４２】
本発明によると、阻害性環境においてCNSニューロンの成長を促進するための方法であって、個体に治療上有効な量のp75受容体結合剤を投与することを含む方法が提供される。一実施形態において、p75受容体結合剤はニューロトロフィン結合モチーフまたはそれらのペプチド模倣体を含む。特定の実施形態においては、p75受容体結合剤は、それらの環状環内にアミノ酸配列Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu（TDIKGKE）（配列番号42）を含む環状ペプチドまたはペプチド模倣体を含む。好ましいp75受容体結合剤はN-Ac-CTDIKGKEC-NH2（配列番号43）である。個体は好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００４３】
本発明は、阻害性環境においてCNSニューロンの成長を促進するための方法であって、個体に治療上有効な量のp75受容体結合剤をニューロトロフィンとの組み合わせで投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、ニューロトロフィンはNGF、BDNF、NT-3、NT-4およびNT-5からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、p75受容体結合剤をニューロトロフィンの約10ないし約100倍多い量で投与する。本発明の一態様において、p75受容体結合剤は、p75受容体への別の異なるニューロトロフィンの結合は妨害するが、受傷ニューロン上に発現したTrk受容体への別の異なるニューロトロフィンの結合は妨害しないニューロトロフィンである。特定の実施形態においては、p75受容体結合剤はNGFであり、かつニューロトロフィンはBDNFであり、NGFはBDNFより約10ないし約100倍多い量で投与される。個体は好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
５．図面の簡単な記載
【図１】図１はNTのBDNF（配列番号19）、NT4（配列番号20）、NT3（配列番号21）、およびNGF（配列番号22）のアミノ酸配列配置を示す。成熟鎖はボールド体文字で示され、RGEモチーフには下線が付される。
【図２】図２Ａ〜２ＣはヒトTrkA（配列番号23）、TrkB（配列番号24）およびTrkC（配列番号25）受容体の完全長アミノ酸配列の配置を示す。受容体のコンセンサス配列が囲みに入れられ、受容体の様々なドメインの境界が垂直線でマークされる。Prestaらによる米国特許第5,844,092号も参照のこと。
【図３】図３Ａおよび３Ｂはペプチド模倣体内に存在し得る代表的な主鎖修飾を示す。WO 01/53331における図4Aおよび4Bも参照のこと。
【図４】図４はペプチド模倣体に組み込まれ得る代表的な異常アミノ酸およびジペプチド代替物を示す。WO 01/53331における図5も参照のこと。
【図５】図５はペプチド模倣体に組み込まれ得る代表的な二次構造模倣を示す。WO 01/53331における図6も参照のこと。
【図６】図６Ａ〜６ＣはTrk受容体と相互作用するリガンドの直線領域を同定するためのNT/Trk結晶構造の解析を示す。図6Aは、TrkB受容体に由来する2本の（鎖b1およびb2と呼ばれる）膜近位Igドメインとの複合体における（鎖a1およびa2と呼ばれる）NT-4二量体の（Banfield et al., Structure（Camb）2001, 9:1191-1199によって報告される）結晶構造のリボン画像を示す。図6Bは、a1およびb2鎖の間で接触する直線ペプチド配列（LIP）についてこの結晶構造（実線）および（Wiesman et al., Nature 1999, 401:184-188によって報告される）NGF/TrkA結晶構造（破線）を試験した結果を示す。図6Cは、a1およびb1鎖の間で接触するLIPについてNGF（破線）およびNT-4（実線）結晶構造を試験した結果を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは小脳ニューロンを3T3細胞単層上、対照培地またはNT-4もしくはBDNFを補足した培地中、様々なペプチドの存在下で18時間培養した後、固定してGAP-43について染色した実験からのデータを示す。最長神経突起の平均長を約100-120ニューロンから各々の培養条件下で決定した。図7Aは、様々な濃度のNT-4およびBDNFの神経突起成長に対する効果を試験する実験からのデータを示す。図7Bは、対照培地または指示されるように5ng/ml BDNFもしくは5ng/ml NT-4を含有する培地における環状ペプチドN-Ac-CRGEC-NH2の増加する濃度の効果を試験する実験からのデータを示す。図7Cは、5ng/ml BDNFと共に培養した小脳ニューロンにおけるNT-4誘導環状ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2（配列番号26）、NT-3誘導環状ペプチドN-Ac-CSHRGEC-NH2およびNGF誘導環状ペプチドN-Ac-CFHRGEC-NH2の効果を試験する実験からのデータを示す。図7Dは、図7Cに示されるものと同一であるが、小脳ニューロンを5ng/ml NT-4と共に培養した実験からのデータを示す。
【図８】図８は小脳ニューロンを3T3の単層上、対照培地もしくはNT-4、BDNF、FGF2（すべて5ng/ml）を補足した培地中でCG1受容体アゴニストWIN55,2122-2（0.2μM）と共に、またはトランスフェクトされたN-カドヘリン（NCAD）をそれらの細胞表面に発現する3T3細胞上で培養した実験から結果を示す。これらの実験は：（a）440μMの環状ペプチドN-Ac-CRGEC-NH2；（b）125μMの環状ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2 ；および（c）125μMの直鎖ペプチドN-Ac-SRRGELA-NH2（配列番号27）の存在下または不在下において行い、データをプロットした。
【図９】図９Ａ〜９ＣはBAGペプチドのモデル化構造を示す。図9Aは、NT-4/TrkB結晶構造におけるNT-4二量体の一方のモノマーに由来するSRRGELAモチーフの未変性構造を示す。その結晶構造におけるパートナーのNT-4モノマーに由来するASRRGEL（配列番号28）モチーフの未変性構造が図9Cに示される。これらの「縦列反復」モチーフを組み込むBAGペプチドN-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2のモデル化構造が図9Bに示される。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは一連の濃度のBAGペプチドN-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2を補足した培地において小脳ニューロンを培養した神経突起成長実験からの結果を示す。図10Aは1回の実験においてサンプリングされた100-120ニューロンから決定される絶対神経突起長さの平均値を示す。図10Bは、BAGペプチド（6μM）の効果を、指示されるようにNT-4、BDNF、およびFGF2（すべて5ng/ml）を含む、確立された成長促進剤に対する応答と比較する棒グラフを示す。
【図１１】図１１は対照培地または、指示されるように：（a）6μMの BAGペプチドN-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2；（b）125μMのTrkBアンタゴニストペプチドN-Ac-CSSRGEC-NH2（配列番号29）；（c）100nMのTrk特異的チロシンキナーゼ阻害剤K252a；または125μMのTrkBアンタゴニストペプチドN-Ac-SRRGELA-NH2の直鎖版を補足した培地において小脳ニューロンを培養した神経突起成長実験からの結果を示す。
【図１２】図１２は様々な作用物質の効果を試験する神経突起成長実験からの結果を表す棒グラフを示す。特には、小脳ニューロンをN-カドヘリン発現3T3細胞の単層上、可溶性MAG-Fc融合構築物を（グラフ中の各棒の下に示されるように）0、5または25μg/mlの最終濃度で補足した培地中で培養した。実験は対照培地（すなわち、MAG-Fcのみを補足した培地）およびRhoキナーゼ阻害剤Y27632（最終濃度10μM）、BAGポリペプチド（最終濃度6μM）またはBDNF（最終濃度5ng/ml）をさらに補足した培地において行った。培養を22時間維持した後、固定してGAP-43について染色した。最長神経突起の平均長を100-120ニューロンの各培養条件下での測定から決定した。グラフの各柱は（その柱の上に示される）独立した幾つかの実験からプールされた結果を表し、棒は平均の標準誤差（SEM）を示す。
【図１３】図１３は培養ニューロンにおけるMAG-Fc応答に対するBAGポリペプチドの用量応答曲線を示す。特には、各データ点は、N-カドヘリン発現3T3細胞上、MAG-Fc（最終の度25μg/ml）および横軸に示される最終濃度のBAGポリペプチドを補足した培地中で培養されたときの約120-150ニューロンから測定された平均長を示す。各点は1回の代表的な実験からのデータを示し、各点上の棒はSEMを示す。
【図１４】図１４はN-カドヘリンを発現しない3T3細胞の単層上、（図中に示されるように）最終濃度0または25μg/mlのMAG-Fcを補足した培地中で培養された小脳ニューロンにおける神経突起成長に対するBAGポリペプチドおよびBDNFの効果を試験する実験からの結果を表す棒グラフを示す。実験は対照培地（すなわち、MAG-Fcのみを補足した培地）およびBAGポリペプチド（最終濃度6μM）またはBDNF（最終濃度5ng/ml）をさらに補足した培地において行った。培養を22時間維持した後、固定してGAP-43について染色した。最長神経突起の平均長を約100-120ニューロンからの各培養条件下での測定から決定した。グラフの各柱は3つの独立した実験からプールされた結果を表し、棒は平均の標準誤差（SEM）を示す。
【図１５】図１５はN-カドヘリン発現3T3細胞上、（C）補足なしの対照培地、；（1）GT1bに対するモノクローナル抗体（最終濃度20μg/ml）を補足した培地；または（2）GT1b抗体（採取濃度20μg/ml）およびBAGポリペプチド（最終濃度6μM）の両者を補足した培地のいずれかにおいて培養した小脳ニューロンにおける神経突起成長に対するBAGポリペプチドの効果を試験する実験からの結果を表す棒グラフを示す。培養を22時間維持した後、固定してGAP-43について染色した。最長神経突起の平均長を約100ないし120ニューロンから各培養条件下で決定した。図中の各柱は7ないし10の独立した実験からプールされた結果を示し、各柱上の棒はSEMを示す。
【図１６】図１６はN-カドヘリン発現3T3細胞の単層上、補足なしの対照培地（柱C）またはp75NTRに対する抗体で予め処理された培地（柱1-4）のいずれかにおいて培養した小脳ニューロンにおける神経突起成長に対する様々な作用物質の効果を試験する実験からの結果を表す棒グラフを示す。これらの抗体処理ニューロンは、（1）補足なしの対照培地；（2）Rhoキナーゼ阻害剤Y27632（最終濃度10μM）；（3）BAGポリペプチド（最終濃度6μM）；または（4）BDNFニューロトロフィン（最終濃度5ng/ml）における処理の後に培養した。培養を22時間維持した後、固定してGAP-43について染色した。最長神経突起の平均長を約100ないし120ニューロンから各培養条件下で決定した。図中の各柱は上に示される数の独立した実験からプールされた結果を示し、各柱上の棒はSEMを示す。
【図１７】図１７は異なる条件下で培養された小脳ニューロンにおける神経突起の成長に対する様々なキナーゼ阻害剤の効果を試験する実験からの結果を表す棒グラフを示す。特には、小脳ニューロンは3T3細胞の単層上、最終濃度6μMのBAGポリペプチド（白抜き棒）、最終濃度5ng/mlのBDNFニューロトロフィン（斜線付き棒）または最終濃度5ng/mlのFGF2（黒塗り棒）のいずれかを補足した培地中で培養した。様々な作用物質の効果を試験するため、図中に示されるように、さらなる補足なしの対照培地を用いて、またはK252a（最終濃度100nM）、a PKA阻害剤（最終濃度200nMのKT5720もしくは最終濃度400nMのH-89）、もしくはPI3K阻害剤（各々最終濃度10μMのWortmanninもしくはLy294002）を補足した培地を用いて実験を行った。培養を18時間維持した後、固定してGAP-43について染色し、最長神経突起の平均長を約100ないし120ニューロンから各培養条件下で決定した。PKA阻害剤の各々およびPI3K阻害剤の各々で得られた結果についてデータをプールした（これらは同じ結果を生じた）。図中の各柱は少なくとも3つの独立した実験からプールされた結果を示し、各柱上の棒はSEMを示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは蒸留水（dH2O）中17μg/mlのポリリジン；ヤギ抗ヒトIgG（Fc特異的）およびフィブロネクチン（両者ともDMEM中10μg/ml）の混合物；並びにDMEM／10%FCS中0.25μg/mlのMAG-Fcでコートされたウェルの「阻害性環境」において培養された小脳ニューロンにおける神経突起成長に対する効果を試験する実験からの結果を表すグラフを示す。培養を27時間維持した後、固定してGAP-43について染色した。図18Aは、hriBAG2、hBAG2またはriBAGの存在下において成長した小脳ニューロンの平均神経突起長の用量-応答曲線を示す。図18Bは、BDNF、BAG、hriBAG2、hBAG2またはriBAGの存在下において成長した小脳ニューロンの平均神経突起長を表す棒グラフを示す。
【図１９】図１９は阻害性環境における様々な作用物質の効果を試験する神経突起成長実験からの結果を表す棒グラフを示す。特には、小脳ニューロンは、N-カドヘリン発現3T3細胞上、最終濃度25μg/mlの可溶性MAG-Fc融合構築体を補足した培地中で培養した。この培養に、BDNF（1ng/ml）、NGF（10ng/mlもしくは100ng/ml）、NGF（10ng/mlもしくは100ng/ml）と組み合わせたBDNF（1ng/ml）、100μg/mlのNGFループ1結合性モチーフ（N-Ac-CTDIKGKEC-NH2）（配列番号43）の拘束モノマー、またはBDNF（1ng/ml）と組み合わせたNGFループ1ペプチド（100μg/ml）をさらに補足した。培養を23時間維持した後、固定してGAP-43について染色した。最長神経突起の平均長を約100-120ニューロンの各培養条件下での測定から決定した。グラフの各柱は（その柱の上に示される）幾つかの独立した実験からプールされた結果を表し、棒は平均の標準誤差（SEM）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
6．発明の詳細な記載
上述のように、本発明は、Trk受容体、例えば、TrkA、TrkBおよびTrkCが介在する活性を調節（例えば、増加または減少）する、ペプチドおよびペプチド模倣体を含む、化合物を提供する。そのような化合物をここでは一般にTrk受容体調節因子化合物または「Trk調節因子」と呼ぶ。
【００４６】
本発明のTrk調節因子は、例えば、ニューロンの成長および生存、軸索成長、神経突起成長、シナプス可塑性のようなプロセス並びに、少なくとも部分的に、Trk受容体が介在する他のプロセスの調節に有用である。これらの用途には、イン・ビトロ（例えば、細胞培養物における）およびイン・ビボ（例えば、患者もしくは他の個体における）での中枢神経系の成長および修復の調節を含み得る治療法が含まれる。したがって、本発明のTrk調節因子は、少数の例を挙げると、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、頭部外傷、脊髄損傷、およびてんかんのような疾患の治療における有用性を有する。
【００４７】
出願人は、Trk受容体とそれらのニューロトロフィンリガンドとの鍵となる相互作用が成熟ニューロトロフィンアミノ酸配列のN末端に見出される3つのアミノ酸残基の保存短直鎖配列モチーフ-Arg-Gly-Glu（すなわち、一文字アミノ酸コードにおける「RGE」）を介して生じることを発見している。このRGEモチーフはすべてのニューロトロフィン中に存在し、Trk受容体に結合したとき、緊密なループと考えられるらせんの半分として存在する。
【００４８】
出願人は、小直鎖RGEモチーフの適正に拘束されたペプチド（例えば、環状ペプチド）が未変性NT構造との高い構造重複を有し、Trk受容体アンタゴニストとして機能できることも発見している。同様に、そのような拘束RGEペプチドとの高い構造重複を有するペプチド模倣性化合物も未変性NT構造と高い構造重複を有することが期待され、そのようなことから、Trk受容体アンタゴニストとして機能することもできる。
【００４９】
上述のように、RGEモチーフはすべてのニューロトロフィンの間で保存され、このモチーフとの相互作用はこれらのニューロトロフィンのそれらそれぞれのTrk受容体（1以上）への結合に重要である。したがって、RGEモチーフを含む拘束ペプチドおよびペプチド模倣体は、TrkA、TrkBおよびTrkCを含む様々なTrk受容体のアンタゴニストとして有用である。しかしながら、本発明のTrk調節因子は、好ましくは望ましいTrk受容体に結合する、NTリガンドから隣接アミノ酸配列を選択することにより、特定のTrk受容体を標的とすることもできる。好ましいTrkアンタゴニスト化合物（すなわち、Trk受容体介在活性を阻害するTrk調節因子化合物）において、そのような隣接残基は、好ましくは、長さが約0ないし10アミノ酸以下の範囲であり、約2-5または2-3アミノ酸残基のサイズが特に好ましい。さらに、環状ペプチド環（または対応するペプチド模倣体構造）のサイズは、好ましくは、僅かに約4ないし15アミノ酸残基の範囲であり、約5ないし10アミノ酸残基のサイズが特に好ましい。
【００５０】
出願人は、Trk受容体のそれらの結合ドメインとの複合体におけるNT二量体の結晶構造において、RGEモチーフがそのNT二量体内でそれ自体と逆平行であることも決定している。すなわち、第1 NT分子内のRGEらせんはその二量体における第2 NT分子内のRGEらせんと整列し、かつ逆平行の方向にある。特には、図6A-6Cを参照のこと。出願人は、さらに、RGEモチーフの縦列反復ペプチドまたはペプチド模倣体が（環状ペプチドまたはペプチド模倣体として）適正に拘束されているとき、それが同じ逆平行整列配座に適合し、未変性NT構造との高い構造重複を有すること発見している。そのような「縦列反復」RGE環状ペプチドおよびペプチド模倣体は、驚くべきことに、Trk受容体アゴニストとして機能することができる（すなわち、それらはTrk受容体が介在する活性を高めることができる）。そのようなことから、これらの化合物も本発明のTrk調節因子化合物のうちにある。
【００５１】
前述のRGEアンタゴニストと同様に、RGEモチーフの縦列反復を含む拘束ペプチドおよびペプチド模倣体は、TrkA、TrkBおよびTrkCを含む、様々なTrk受容体のアゴニストとして有用である。しかしながら、これらの化合物は、例えば、好ましくは望ましいTrk受容体に結合するNTリガンドから隣接アミノ酸配列を選択することにより、特定のTrk受容体を標的とすることもできる。好ましいTrkアゴニスト化合物（すなわち、Trk受容体介在活性を高めるTrk調節因子化合物）において、そのような隣接残基は、好ましくは、長さが約0ないし10アミノ酸残基以下の範囲であり、2-5または2-3のサイズがより好ましい。
【００５２】
本発明の縦列反復環状ペプチドおよびペプチド模倣体は、任意に、2つのRGEモチーフの縦列反復の間に位置する追加アミノ酸残基を含むことができる。したがって、そのような追加アミノ酸残基は、未変性NT構造（1以上）内のRGEモチーフと高い構造重複を有する逆平行整列配座に適合するような方法でそれら2つのRGEモチーフを共に連結する「スペーサー」部分として機能する。そのスペーサーアミノ酸残基（1以上）の正確な素性は重要ではなく、それらの素性は特定のニューロトロフィンにおいてRGEモチーフに隣接するアミノ酸残基の素性に対応していてもいなくてもよい。好ましくは、縦列反復環状ペプチドまたはペプチド模倣体内のスペーサー部分（存在する場合）は短く；例えば、長さが5アミノ酸残基以下であり、長さが約0-3アミノ酸残基のスペーサー部分がより好ましい。特に好ましいスペーサー部分は長さが僅かに約1または2アミノ酸残基である。
【００５３】
さらに、そのような「縦列反復」環状ペプチドおよびペプチド模倣体の合計サイズは、典型的には、本発明のTrkアンタゴニスト環状ペプチドまたはペプチド模倣体の約2倍である。したがって、ペプチド環（または対応するペプチド模倣体構造）の好ましいサイズは、好ましくは、長さが約8ないし30アミノ酸残基であり、長さが約10ないし20アミノ酸残基のサイズが特に好ましい。
【００５４】
RGEモチーフおよび／またはそれらの縦列反復を含む好ましい環状ペプチドは下記セクション6．1において説明される。次に、セクション6．2は、当業者が、例えばX線結晶学またはNMR分光学により、これらの、および他の環状ペプチドの三次元的「ファルマコフォア」構造を決定することができる定型的な実験法を説明し、そのようなファルマコフォア構造を用いて適切なペプチド模倣性化合物を設計する方法が下記セクション6．3に例示的ペプチド模倣体修飾と共に示される。本発明のTrk調節因子に対するさらなる修飾が、医薬配合物および医学的使用を含めて、セクション6．4において説明される。セクション6．5は、当業者が化合物、例えば、ペプチド模倣性化合物のTrk調節活性を立証することができる定型的なアッセイを説明する。次に、セクション6．6は、Trk介在活性、例えば、ニューロン生存、軸索成長およびシナプス可塑性を調節するための方法におけるそのような化合物の特定の好ましい例示的使用を説明する。そのような使用に特に適する（医薬配合物を含む）Trk調節因子の配合物がセクション6．7において説明される。本明細書は、セクション7で、本発明の特定の例示実施形態を示す一連の例で完結する。
【００５５】
本発明は、p75受容体結合剤を個体に投与するための方法であって、p75受容体結合剤が阻害性複合体に拘束されるp75受容体へのニューロトロフィンの結合を妨害し、したがって、Trk受容体へのニューロトロフィン結合を促進する方法も提供する。これらの方法は、CNSニューロンが損傷を受けているか受傷している状態、例えば、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷および脊髄損傷のような疾患の治療において有用である。
【００５６】
本発明は、部分的には、阻害性複合物に拘束されるp75受容体へのニューロトロフィンの結合を妨害するように設計された作用物質がニューロトロフィン介在CNS神経突起成長を促進するという発見に基づく。下記実施例セクションにおいて説明されるように、神経突起成長アッセイは培養ラット小脳ニューロンを阻害性環境において用いて行った。阻害性培養培地にはNGF、BDNFと組み合わせたNGF、NGF第1結合性ループの拘束モノマー（N-Ac-CTDIKGKEC-NH2）（配列番号43）、またはBDNFと組み合わせたNGFループ1ペプチドを補足した。培養を23時間維持し、固定してGAP-43について染色した。その後、最長神経突起の平均長を100-120ニューロンから各培養条件下で決定した。NGF単独および拘束モノマー単独は神経突起成長を促進しなかったが、NGFとBDNFとの10：1および100：1の比での組み合わせ並びに100μg/mlのNGFループ1ペプチドと1ng/mlのBDNFとは神経突起成長を促進することが見出された。これらの知見は、発現したTrk受容体に結合しないニューロトロフィンであるp75受容体結合剤を受傷ニューロン上に発現したTrk受容体に結合する他の異なるニューロトロフィンと組み合わせて投与することで阻害性環境におけるCNSニューロンの成長が生じることを示す。ここで、発現したTrk受容体に結合しないニューロトロフィン（すなわち、p75受容体結合剤）は発現したTrk受容体に結合するニューロトロフィン（すなわち、p75受容体結合剤ではない）より約10ないし約100倍多い量で投与した。これらの結果は、NGF第1結合性ループの拘束モノマー、非ニューロトロフィンp75受容体結合剤の投与がニューロトロフィン介在CNSニューロン成長を促進することも示す。
【００５７】
定義
以下の定義された用語は本明細書を通して用いられ、本発明の範囲および実施の理解の助けとなるはずである。
【００５８】
本明細書では、「阻害性環境」は損傷または受傷ニューロンの成長が阻害される環境を意味する。阻害性環境は損傷または受傷ニューロンを取り巻く環境に存在する。損傷または受傷ニューロンは、例えば、CNSに対する損傷またはその損なわれた機能に関連する疾患および障害を含む状態に存在する。例示的な状態には、これらに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷が含まれる。その代わりに、阻害性環境はp75受容体が阻害性複合体に拘束されている（すなわち、p75受容体がp75受容体に結合する分子、例えば、ミエリン誘導分子、例えば、MAGまたはNogo-Aに嵌号している）環境であり、この結合はニューロトロフィン介在ニューロン成長の阻害を生じる。
【００５９】
「治療上有効な」という用語は、それらを必要とする個体への投与で望ましい活性を生じるのに十分である化合物または医薬組成物の量を意味する。好ましくは、治療上有効な量は、その個体の活動、機能および応答における臨床上重要な不足を軽減または防止することができる。あるいは、治療上有効な量は、個体における治療上重要な状態の改善を生じるのに十分なものである。例えば、「治療上有効な」は、阻害性環境においてCNSにおけるニューロンの成長を促進するのに十分なp75受容体阻害剤の量または用量を意味する。
【００６０】
本明細書では、「薬学的に許容し得る」という句は、ヒトに投与したときに「一般に安全とみなされる」、例えば、生理学的に寛容であるか、または、典型的には、アレルギーもしくは類似の望ましくない反応、例えば、胃の不調、めまい等を生じることのない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書では、「薬学的に許容し得る」という用語は、米国薬局方または他の一般に承認された薬局方に列挙される連邦または州政府の監督機関によって動物、特にはヒトにおける使用が認可されていることを意味する。
【００６１】
「担体」という用語は、化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は無菌液体、例えば、水および油であり得、油には石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等が含まれる。水または生理食塩水溶液並びにデキストロースおよびグリセロール水溶液が担体として、特には注射用溶液に、好ましく用いられる。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。
【００６２】
「個体」または「患者」は、本明細書では、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトであるが、臨床試験もしくはスクリーニングまたは活性実験の脈絡における実験動物を含めて、あらゆる動物であり得る。したがって、当業者が容易に理解できるように、本発明の方法は、特には哺乳動物であって、これらに限定されるものではないが家畜、野生動物および研究動物を含む、あらゆる動物への投与に特に適する。
【００６３】
6．1．TRK受容体調節因子：環状ペプチド
「環状ペプチド」という用語は、本明細書では：（1）2つの非隣接残基の間の分子内共有結合；および（2）その環状ペプチドの環状環内に少なくとも1つのTrk受容体認識配列RGE（すなわち、Arg-Gly-Glu）を含むペプチドまたはそれらの塩を指す。Trk受容体アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能する本発明の好ましいペプチドは拘束されており、したがって、好ましくは環状ペプチドであることは理解される。しかしながら、非環状、すなわち、「直鎖」ペプチドも（例えば、本発明の環状ペプチドを製造するための中間化合物として）有用である。したがって、本願を通して説明される環状ペプチドの非環状版も本発明の一部と考えられる。
【００６４】
分子内結合はバックボーン−バックボーン、側鎖−バックボーンまたは側鎖−側鎖結合であり得る（すなわち、直鎖ペプチドの末端官能基および／または末端もしくは内部残基の側鎖官能基が連結して環化を達成することができる）。好ましい分子内結合には、これらに限定されるものではないが、ジスルフィド、アミドおよびチオエーテル結合が含まれる。ポリペプチドを環化するための様々な手段が、そのようなペプチドを製造することができる他の多くの修飾と同様に、当該技術分野において公知である。一般的な考察については、国際特許公開WO 01/53331およびWO 98/02452を参照のこと。そのような環状結合および他の修飾も本発明の環状ペプチドおよび誘導体化合物に適用することができる。便宜のため、好ましいものであり得るかどうかに関わらず、特定の環状結合を示す本発明の環状ペプチドが本明細書において頻繁に図示される。しかしながら、追加の、および／または代わりの環状結合を含むこれらの環状ペプチドの他の実施形態は当業者に明らかであり、したがって、本発明の一部と考えられる。
【００６５】
特定の実施形態のうちで、本発明の環状ペプチドは、好ましくは、N-アセチル基を含む（すなわち、ペプチドのアミノ末端残基に存在するアミノ基が、好ましくは環化に先立って、アセチル化される）。その代わりに、本発明の環状ペプチドはN-ホルミル基を含むことができる（すなわち、ペプチドのアミノ末端残基に存在するアミノ基が、好ましくは環化に先立って、ホルミル化される）。あるいは、ペプチドのアミノ末端残基に存在するアミノ基が、ここでもやはり好ましくは環化に先立って、メシル化されていてもよい。そのような末端基の存在は、例えば、特定の用途における環状ペプチドの活性または安定性を高めることがある。加えて、特定の実施形態のうちでは、本発明の環状ペプチドはC-アミド基を含むことができる。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明の好ましい環状ペプチドは一般式：
【化５】
2011057685.tif 000006
を満たし、式中、Y1およびY2はアミノ酸残基であって、その素性は独立に選択され、かつ残基Y1およびY2の間に共有結合を有する。要素X1およびX2は任意であり、存在する場合、それらはアミノ酸残基およびペプチド結合によって連結するそれらの組み合わせから独立に選択される。したがって、X1もしくはX2のいずれかまたはX1およびX2の両者は、存在する場合には、単一のアミノ酸残基であってもよく、あるいは、ペプチド結合によって連結する複数のアミノ酸残基を含む配列であってもよい。
【００６７】
好ましい実施形態において、上記式Iを満たす環状ペプチドは1以上のTrk受容体介在活性を調節する。例えば、特定の好ましい実施形態において、式Iを満たすペプチドは1以上のTrk受容体介在活性を阻害し、そのようなことから、Trkアンタゴニストである。他の実施形態においては、式Iを満たすペプチドは1以上のTrk介在活性を高め、そのようなことから、Trkアゴニストである。
【００６８】
RGEコンセンサス配列（1以上）に加えて、本発明の環状ペプチドは、一般には、少なくとも1つの追加残基を環状環内に含み、好ましくは、式IにおけるX1またはX2のいずれか一方が存在する。一般には、X1および／またはX2のサイズはその環状ペプチドの望ましい活性に依存する。例えば、Trkアンタゴニストである環状ペプチドが望ましい場合、より短いペプチド配列が好ましい。したがって、そのような実施形態においては、X1および／またはX2は、各々好ましくは、長さが0ないし約10アミノ酸であり、約1、2、3、4または5アミノ酸残基のサイズが特に好ましい。さらに、そのような実施形態においては、X1および／またはX2の長さは、好ましくは、環状ペプチド環のサイズが約5ないし約15アミノ酸残基、より好ましくは、長さが約5-10アミノ酸残基の範囲となるようにも選択される。長さが約5-7アミノ酸残基のペプチド環サイズが特に好ましい。そのような追加残基（すなわち、前記式IにおけるX1および／またはX2）はRGE配列のN末端もしくはC末端側に存在することができ、またはRGE配列の両側に存在することができる。
【００６９】
本発明の好ましい環状ペプチドにおいて、追加残基は、1以上の天然ニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5およびNT-4/5）内のRGE配列に隣接する配列から、アミノ酸置換および／または他の修飾の有無に関わらず誘導される。特には、ニューロトロフィンに由来する隣接配列の存在は環状ペプチドの標的を関心のある特定のTrk受容体とする助けとなり得る。したがって、特定のTrk受容体のアンタゴニストが望ましい実施形態において、本発明の環状ペプチドは、好ましくは標的Trk受容体に結合する、ニューロトロフィン内の隣接配列から誘導されるRGE配列のN末端、C末端またはその両者のいずれかに隣接するアミノ酸残基を含むことができる。
【００７０】
例としてであって限定を目的とするものではないが、下記表1は、その素性も表中に示される、特定のニューロトロフィンから誘導される追加アミノ酸残基を含む特定の好ましい環状ペプチドを列挙する。表1における右側の欄も、そのニューロトロフィンが好ましくは結合する（または、むしろ、最高結合親和性で結合する）、Trk受容体を示す。したがって、表1に列挙される各環状ペプチドを、一実施形態においては、表1の右欄内にそれに沿って示されるTrk受容体の阻害に用いることができる。しかしながら、当業者は、様々なTrk受容体に対する異なるニューロトロフィンリガンドの結合親和性に幾らかの重複が存在することを認めるであろう。したがって、表1に列挙される環状ペプチドは他のTrk受容体のアンタゴニストとして用いることもできる。特別な例としてであって限定を目的とするものではないが、下記実施例において、ニューロトロフィンNT-4に由来する追加残基を含む環状ペプチド N-Ac-CSRRGEC-NH2が、それぞれニューロトロフィンNT-3およびNGFに由来する追加残基を伴って設計された等価ペプチドであるペプチドN-Ac-CSHRGEC-NH2 およびN-Ac-CFRRGEC-NH2よりも強力なTrkBアンタゴニストであることが実証される。
【表１】
2011057685.tif 000007
【００７１】
好ましくはTrkアンタゴニストである、本発明の特に好ましい環状ペプチドには以下が含まれる：
【表２】
2011057685.tif 000008
【００７２】
前記アミノ酸配列の各々の下線部分は環化されているペプチドの部分を示す。「N-Ac」はアセチル化N末端アミノ基を表し、「NH2」はC末端アミド基を表す。
【００７３】
特定の実施形態のうちで、RGEコンセンサス配列に隣接する有意の配列を含まない本発明の比較的小さい環状ペプチドが特に好ましい。そのようなペプチドはN-アセチル基を含んでいてもいなくてもよく、C-アミド基を含んでいてもいなくてもよい。本発明の好ましい小環状ペプチドには以下が含まれる：
【表３】
2011057685.tif 000009
【００７４】
本発明の他の実施形態において、Trkアゴニストが望ましい場合、より長いペプチド配列が一般に好ましい。特には、Trkアゴニストである本発明の好ましい環状ペプチドは少なくとも1つのRGEモチーフの「縦列反復」を含む。したがって、そのような環状ペプチドが前記式Iを満たす場合、X1およびX2の少なくとも一方が存在し、かつ第2のRGE配列を含む。より具体的には、そのような本発明の環状ペプチドは、好ましくは、下記一般式を満たす：
【化６】
2011057685.tif 000010
【００７５】
式Iと同様に、Y1およびY2はアミノ酸残基であり、それらの素性は独立に選択され、かつ残基Y1およびY2の間に共有結合を有する。要素Z1およびZ2は任意であり、存在する場合、それらはアミノ酸残基およびペプチド結合によって連結するそれらの組み合わせから独立に選択される。要素Z0も任意であり、存在する場合、アミノ酸残基またはペプチド結合によって連結するそれらの幾つかの組み合わせである。したがって、Z1、Z2、Z0のいずれかまたはそれらのあらゆる組み合わせは、存在する場合、各々単一のアミノ酸残基であり得、またはその代わりに、各々ペプチド結合によって連結する複数のアミノ酸残基を含む配列であり得る。
【００７６】
RGEコンセンサス配列の縦列反復に加えて、本発明の環状ペプチドは一般に1個の追加残基を環状環内に含み、好ましくは、少なくともZ1、Z2および／またはZ0のいずれか1つが存在する。Trkアゴニストである環状ペプチドが望ましい実施形態においては、Z1、Z2および／またはZ0は、各々好ましくは、長さが約10アミノ酸残基以下であり、より好ましくは、長さが各々僅かに1、2、3、4または5アミノ酸残基である。さらに、Z1、Z2および／またはZ0の長さは、好ましくは、環状ペプチド環のサイズが約8-50アミノ酸残基、より好ましくは、約8-25もしくは約15-20アミノ酸残基の範囲となるように選択される。
【００７７】
式Iの環状ペプチドと同様に、式IIの好ましい環状ペプチドにおいて、追加残基（すなわち、Z1、Z2および／またはZ0）は1以上の天然ニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5またはNT-4/5）内のRGE配列に隣接する配列から、アミノ酸置換および／または他の修飾の有無に関わらず、誘導することができる。特には、特定のニューロトロフィンに由来する隣接アミノ酸残基の存在は環状ペプチドの標的を関心のある特定のTrk受容体とする助けとなり得る。したがって、特定のTrk受容体に対するアンタゴニストが望ましい実施形態においては、本発明の環状ペプチドは縦列反復RGE配列の一方または両者のN末端および／またはC末端に隣接するアミノ酸残基を含むことができ、これらの隣接配列は、好ましくは関心のある標的Trk受容体に結合する、ニューロトロフィンから誘導することができる。
【００７８】
上述のように、本発明の好ましい縦列反復環状ペプチド（式IIによる環状ペプチドを含む）は互いに逆平行に整列する2つのRGE配列を有する。したがって、式IIによる好ましい環状ペプチドにおいては、要素Z0が存在し、2つのRGE配列を共に逆平行整列配座で整列させる有効な「スペーサー部分」として機能することができる。好ましい実施形態において、Z0は長さが10アミノ酸残基以下であり、好ましくは、長さが5アミノ酸残基以下である。Z0の好ましいサイズは約1、2、3、4または5アミノ酸残基の長さである。Z0内のアミノ酸残基の正確な配列は重要ではない。そのようなことから、要素Z0は天然ニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5およびNT-4/5）内のRGEモチーフのN末端またはC末端のいずれかに由来する配列に相当するアミノ酸残基の配列を含んでいてもいなくてもよい。Z0がニューロトロフィンに由来する配列を含む場合、それらの配列はアミノ酸置換および／または修飾を含んでいてもいなくてもよい。
【００７９】
好ましくはTrkアゴニストである、本発明の特に好ましい環状ペプチドの例には以下が含まれる：
【表４】
2011057685.tif 000011
【００８０】
配列番号30、31、および32によって識別される環状ペプチド配列は、それぞれ、TrkA、TrkB、およびTrkCアゴニストである。配列番号30はNGFから誘導される。配列番号31はBDNFから誘導される。配列番号32はNT-3から誘導される。
【００８１】
ここで説明される環状ペプチドはL-アミノ酸、D-アミノ酸、またはそれらのあらゆる組み合わせを含むことができる。これらのアミノ酸は、分子中に少なくとも1つのアミノ基および少なくとも1つのカルボニル基が存在するのであれば、天然または非天然資源に由来するものであり得る。α-およびβ-アミノ酸が一般に好ましい。タンパク質中に通常見出される20のL-アミノ酸が本発明において特に好ましい。これらのアミノ酸は、ここでは、それらの通常の三文字および一文字略語によって識別され、それに対して対応するD-アミノ酸は接頭語「d」によって示される。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明の環状ペプチドは、ここで提供されるL-アミノ酸残基の配列と反対のものであるD-アミノ酸残基の配列を含むことができる。例えば、本発明は、ここでriBAG1およびhriBAG2（配列番号40-41）と呼ばれる特定のTrk受容体アゴニストポリペプチドを提供し、これらはBAGポリペプチド（配列番号17）と呼ばれる別のTrk受容体アゴニストポリペプチドの逆配列であるD-アミノ酸配列の配列を含む。したがって、前述のL-アミノ酸残基のポリペプチドに加えて、本発明はL-アミノ酸残基の逆配列を有するポリペプチドも考慮する。それ故、好ましい実施形態の1つにおいて、本発明のペプチドおよびペプチド模倣体は、前記Arg-Gly-Glu（すなわち、「RGE」）モチーフを含むL-アミノ酸残基の配列を含む。したがって、本発明は、代わりの実施形態において、短直鎖配列モチーフdGlu-Gly-dArg（すなわち、「dEGdR」）を含むD-アミノ酸残基の配列を含有するペプチドおよびペプチド模倣体も提供する。
【００８３】
環状ペプチドは、様々な側鎖修飾および／または置換（例えば、メチル化、ベンジル化、t-ブチル化、トシル化、アルコキシカルボニル化等）のいずれかの有無に関わらず、1種類以上の希少アミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシリジン）、有機酸もしくはアミドおよび／または一般アミノ酸の誘導体、例えば、エステル化（例えば、ベンジル、メチルもしくはメチルエステル）もしくはアミド化されたC末端カルボキシレートを有し、および／またはN末端アミノ基の修飾（例えば、アセチル化もしくはアルコキシカルボニル化）を有するアミノ酸を含むこともできる。好ましい誘導体には、（環化前の直鎖ペプチドのN末端を表すアミノ基がアセチル化されるように）N-アセチル基および／またはC末端アミド基（すなわち、環化前の直鎖ペプチドのカルボキシ末端がアミド化される）を有するアミノ酸が含まれる。環状ペプチドと共に存在し得る一般アミノ酸以外の残基には、これらに限定されるものではないが、ペニシラミン、β,β-テトラメチレンシステイン、β,β-ペンタメチレンシステイン、β-メルカプトプロピオン酸、β,β-ペンタメチレン-β-メルカプトプロピオン酸、2-メルカプトベンゼン、2-メルカプトアニリン、2-メルカプトプロリン、オルニチン、ジアミノ酪酸、α-アミノアジピン酸、m-アミノメチル安息香酸およびα,β-ジアミノプロピオン酸が含まれる。
【００８４】
ここで説明される環状ペプチドは組換えDNA法および化学合成を含む当該技術分野において周知の方法によって合成することができる。化学合成は、一般には、標準液相または固相ペプチド合成技術を用いて行うことができ、ここでは、1つのアミノ酸のα-アミノ基と他のアミノ酸のα-カルボキシ基との水分子の除去を伴う直接縮合によってペプチド結合が生じる。上で式化されるような、直接縮合によるペプチド結合合成は、第1アミノ酸のアミノ基および第2アミノ酸のカルボキシ基の反応性の抑制を必要とする。マスキング置換は、不安定なペプチド分子の分解を誘導することなしに、それらの容易な除去を可能にするものでなければならない。
【００８５】
液相合成においては、様々なカップリング法および保護基を用いることができる（Gross & Meienhofer, eds.,“The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,”Vol. 1-4（Academic Press, 1979）；Bodansky & Bodansky,“The Practice of Peptide Synthesis,”2d ed.（Springer Verlag, 1994）を参照のこと）。加えて、中間体精製および直線的なスケールアップが可能である。当業者なら、溶液合成が主鎖および側鎖保護基並びに活性化法の考慮を必要とすることを理解するであろう。加えて、セグメント縮合中のラセミ化を最小にするのに慎重なセグメント選択が必要である。特には、Phe-Glyのような残基をカップリングするときに高いパーセンテージのラセミ化が観察されることがある。しかしながら、そのような状況は希である。溶解性の考慮も要素の1つである。
【００８６】
固相ペプチド合成は有機合成中の支持体に不溶性ポリマーを用いる。ポリマー支持ペプチド鎖は、中間工程での骨の折れる精製の代わりに、単純な洗浄および濾過工程の使用を可能にする。固相ペプチド合成は、一般には、Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 1963,85:2149の方法に従って行うことができる。これらの方法は樹脂支持体上で保護アミノ酸を用いて直鎖ペプチド鎖を組み立てることを含む。固相ペプチド合成は、典型的には、BocまたはFmoc策のいずれかを利用する。Boc策は1％架橋ポリスチレン樹脂を用いる。α-アミノ官能性の標準保護基はtert-ブチルオキシカルボニル（Boc）基である。この基は強酸の希釈溶液、例えば、25％トリフルオロ酢酸（TFA）で除去することができる。次のBoc-アミノ酸を、典型的には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を用いてアミノアシル樹脂にカップリングさせる。組み立ての完了の後、そのペプチド−樹脂を無水HFで処理してベンジルエステル結合を開裂させ、フリーのペプチドを遊離させる。側鎖官能基は、通常、合成の間、ベンジル誘導ブロッキング剤によってブロックし、それもHFによって開裂する。その後、フリーのペプチドを適切な溶媒で樹脂から抽出し、精製して特徴付ける。新たに合成されたペプチドは、例えば、ゲル濾過、HPLC、分配クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製することができ、かつ、例えば、質量分析またはアミノ酸配列解析によって特徴付けることができる。Boc策においては、HFでの開裂でペプチドアミドを直接生じるベンズヒドリルアミンまたはメチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いて、C末端アミド化ペプチドを得ることができる。
【００８７】
上述の手順において、側鎖ブロッキング基およびペプチド−樹脂連結の選択性は酸分解性開裂の速度の差に依存する。側鎖ブロッキング基およびペプチド−樹脂連結が合成の各工程でα-保護基の除去に用いられる試薬に対して完全に安定であるオルトガノール系が導入されている。これらの方法の最も一般的なものには9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）アプローチが含まれる。この方法のうちでは、側鎖保護基およびペプチド-樹脂連結がN-α-Fmoc基の開裂に用いられる二級アミンに対して完全に安定である。側鎖保護およびペプチド−樹脂連結は穏やかな酸分解によって開裂する。塩基との反復接触はMerrifield樹脂をFmoc化学に対して不適切なものとし、樹脂に連結するp-アルコキシベンジルエステルが一般に用いられる。脱保護および開裂は、一般には、TFAを用いて達成する。
【００８８】
当業者であれば、固相合成においては、脱保護およびカップリング反応を完了させなければならず、かつ側鎖ブロッキング基がその合成全体を通して安定でなければならないことを認めるであろう。加えて、固相合成は、一般には、ペプチドを小規模に製造するときに最も適する。
【００８９】
N末端のアセチル化は、最終ペプチドを無水酢酸と反応させた後に樹脂から開裂することによって達成することができる。C-アミド化は、適切な樹脂、例えば、メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用い、Boc技術を用いて達成する。
【００９０】
直鎖ペプチドの合成に続いて、N-アセチル化および／またはC-アミド化の有無に関わらず、当該技術分野において周知の様々な技術のいずれかによって環化を達成することができる。一実施形態のうちでは、反応性アミノ酸側鎖の間に結合を生成することができる。例えば、様々な方法のいずれかを用いるペプチドの酸化により、2つのチオール含有残基を含む直鎖ペプチドからジスルフィド架橋を形成することができる。そのような方法の1つのうちでは、数日間にわたって塩基性または中性水性媒体を用いるチオールの空気酸化でジスルフィド結合を生成することができる。そのペプチドを高希釈で用いて凝集および分子間副反応を最小化する。この反応は遅いという不都合があるが、H2Oのみを副生物として生じるという利点を有する。その代わりに、強酸化剤、例えば、I2およびK3Fe（CN）6を用いてジスルフィド結合を形成することもできる。当業者なら、Met、Tyr、TrpまたはHisの感受性側鎖を酸化しないように注意を払わなければならないことを認識するであろう。この方法によって生じる環状ペプチドは標準技術を用いる精製を必要とするが、この酸化は酸性pHで適用可能である。
【００９１】
酸化剤は適切なS-保護直鎖前駆体の同時脱保護／酸化も可能にし、フリーのシステインの早期の非特異的酸化を回避する。
【００９２】
DMSOはI2およびK3Fe（CN）6とは異なって穏やかな酸化剤であり、上記の求核性アミノ酸の酸化性副反応を生じない。DMSOはすべての濃度でH2Oと混和性であり、酸性から中性のpHで有害な副生物なしに酸化を行うことができる。メチルトリクロロシラン-ジフェニルスルホキシドを酸化剤としてシステインのS-Acm、S-TacmまたはS-t-Buの同時脱保護／酸化に、他の求核性アミノ酸に影響を及ぼすことなしに、代わりに用いることができる。分子間ジスルフィド結合形成から生じるポリマー性生成物は存在しない。
【００９３】
そのような酸化法において用いるのに適するチオール含有残基には、これらに限定されるものではないが、システイン、β,β-ジメチルシステイン（ペニシラミンもしくはPen）、β,β-テトラメチレンシステイン（Tmc）、β,β-ペンタメチレンシステイン（Pmc）、β-メルカプトプロピオン酸（Mpr）、β,β-ペンタメチレン-β-メルカプトプロピオン酸（Pmp）、2-メルカプトベンゼン、2-メルカプトアニリンおよび2-メルカプトプロリンが含まれる。
【００９４】
これらの前述の代表的な式の各々のうちで、上記チオール含有残基のいずれをも列挙されるチオール含有残基の一方または両者の代わりに用いることができることは当業者には容易に明らかであろう。
【００９５】
さらなる実施形態のうちでは、環化をアミド結合形成によって達成することができる。例えば、ペプチド結合を末端官能基（すなわち、環化前の直鎖ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端）の間に形成することができる。そのようなペプチドの例には、c（SRRGE）配列番号33）、c（ARRGE）（配列番号34）、c（FHRGE）（配列番号35）およびc（SHRGE）（配列番号36）が含まれる。そのような環状アミド結合を有する特に好ましいペプチドの一例はペプチドc（SRRGELSRRGEL）（配列番号39）である。このペプチドは下記実施例において説明され、ここではhBAG2ペプチドと呼ばれる。別のそのような実施形態のうちでは、直鎖ペプチドがD-アミノ酸を含む。例えば、下記実施例ではhriBAG2ペプチドと呼ばれる別の好ましいペプチドが説明される。上述の環状アミド結合を含むこのペプチドは以下のDアミノ酸残基の配列を含む：c［dLdEdGdRdRdSdLdEdGdRdRdS］（配列番号40）。その代わりに、KRGED（配列番号37）またはKSRRGED（配列番号38）におけるように、N末端アセチル基および／またはC末端アミドの有無に関わらず、一方の末端および残余側鎖の連結により、または2つの側鎖を用いて環化を達成することもできる。ラクタム結合を形成することが可能な残基には、リジン、オルニチン（Orn）、α-アミノアジピン酸、m-アミノメチル安息香酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩が含まれる。
【００９６】
アミド結合の形成方法は当該技術分野において周知であり、十分に確立されている化学反応性の原理に基づく。そのような方法の1つのうちでは、O-アシル尿素の形成を生じ、それを直ちにフリーのアミノ基と反応させて環化を完成させることができる、カルボン酸とDCC、DIC、EDACまたはDCCIとの反応によってカルボジイミド介在ラクタム形成を達成することができる。O→N移動から生じる不活性N-アシル尿素の形成は、N-ヒドロキシ化合物、例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-ヒドロキシスクシンイミド、1-ヒドロキシノルボルネンカルボキサミドまたはエチル2-ヒドロキシミノ-2-シアノアセテートとの反応によってO-アシル尿素を活性エステルに変換することにより回避することができる。O→N移動を最小化することに加えて、これらの添加物は環化中の触媒としての役割も果たし、ラセミ化の減少を補助する。その代わりに、アルキルエステルからヒドラジドによって反応性アジド中間体を生成するアジド法を用いて環化を行うこともできる。末端エステルのヒドラジン分解はアセチル化成分中の側鎖カルボニル官能性の保護にt-ブチル基を用いることを必要とする。この制限は、カルボニル基との反応で直接アジドを提供するジフェニルホスホリル酸（DPPA）を用いることによって回避することができる。アジドの反応性の遅さおよびそれらの不均衡によるイソシアネートの形成はこの方法の有用性を制限する。反応副生物の除去が容易なため、ラクタム形成の混合無水物法が広く用いられる。無水物はカルボキシレートアニオンとアルキルクロロホルメートまたは塩化ピバロイルとの反応で形成される。その後、アルコキシ基の電子供給効果により、または誤ったカルボニル基に対する攻撃を妨害する塩化ピバロイルt-ブチル基の立体的かさ高さにより、アミノ成分の攻撃がアシル化成分のカルボニル炭素に導かれる。リン酸誘導体を伴う混合無水物も上手く用いられている。その代わりに、活性化エステルを用いて環化を達成することもできる。エステルのアルコキシ炭素上の電子吸引置換基の存在はアミノ分解に対するそれらの感受性を高める。p-ニトロフェノール、N-ヒドロキシ化合物およびポリハロゲン化フェノールのエステルの高い反応性はこれらの「活性エステル」をアミド結合の合成において有用なものとしている。最近の数年間で、ベンゾトリアゾリルオキシトリス-（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスホネート（BOP）およびその共生物が有利なカップリング試薬として開発されている。それらの性能は、一般に、十分に確立されているカルボジイミドアミド結合形成反応を凌いでいる。
【００９７】
さらなる実施形態のうちでは、チオール含有残基の側鎖と適切に誘導されたα-アミノ酸との間にチオエーテル結合を形成することができる。例として、リジン側鎖をカルボジイミドカップリング法（DCC、EDAC）によってブロモ酢酸にカップリングした後、上記チオール含有残基のいずれかの側鎖と反応させてチオエーテル結合を形成することができる。ジチオエーテルを形成するため、あらゆるチオール含有側鎖をジブロモエタンおよびジイソプロピルアミンとDMF中で反応させることができる。チオール含有結合の例には以下が含まれる：
【化７】
2011057685.tif 000012
および
【化８】
2011057685.tif 000013
式中、Xは（CH2）4、CH2または
【化９】
2011057685.tif 000014
であり得る。
【００９８】
環化は、以下に示されるように、δ1δ1-ジトリプトファン（すなわち、Ac-Trp-Gly-Gly-Trp-OMe）を用いて達成することもできる：
【化１０】
2011057685.tif 000015
【００９９】
ここで列挙される構造および式は単に説明のために示されるものであり、ここで説明される環状ペプチドの範囲を限定するものではない。
【０１００】
6．2．TRK-受容体ファルマコフォア
ペプチド模倣体の設計には、上記環状ペプチドの1つ以上のファルマコフォアの三次元構造を得ることが有益である。「ファルマコフォア」という用語は、標的タンパク質に相補的な様式で三次元空間に配置され、かつ標的タンパク質に結合する化合物の結果として生物学的活性の原因である、化合物上の官能基の集合を指す。有用な三次元ファルマコフォアモデルは標的の結晶学的または核磁気共鳴構造から最良に誘導されるが、関連標的の構造に基づく相同モデルまたは従来発見されている一連の活性化合物から誘導される三次元定量的構造−活性関係から誘導することもできる。
【０１０１】
本発明は特定の代表的な環状ペプチドのファルマコフォア（すなわち、そのようなペプチド内のニューロトロフィンコンセンサス配列RGEの三次元立体配座）を提供する。そのような三次元構造はペプチド模倣体の設計および最適化を最も効率的に方向付けるのに必要な情報を提供する。
【０１０２】
一実施形態において、環状ペプチドの三次元構造は、一般には、X線結晶学を用いて決定する。これらの技術は周知であり、当該技術分野における定型的な技術のうちにある。例えば、Cantor&Schimmel, Biophysical Chemistry 1980（Vols. I-III）W. H. Freeman and Company（特には、Vol. Iの第1-13章、およびVol. IIの第13章）を参照のこと。Macromolecular Crystallography, Parts A-B（Carter&Sweet, Eds.）In: Methods Enzymol. 1997, Vols. 276-277；Jan Drenth, Principles of Protein X-Ray Crystallography（New York: Springer-Verlag, 1994)も参照のこと。
【０１０３】
「結晶」という用語は、一般には、分子のあらゆる順序付けられた（または少なくとも部分的に順序付けられた）三次元整列を指す。好ましくは、結晶内の分子の順序付けは、分子の三次元構造を決定することができるように、少なくとも明瞭なX線回折パターンを生じるのに十分なものである。
【０１０４】
結晶内の分子はいかなるタイプのものであってもよく、結晶が1つのタイプのみの分子を含むことができ、または複数の異なるタイプの分子を含むことができることは理解されるであろう。好ましい実施形態において、本発明の結晶は少なくとも1種類の生体分子、例えば、セクション6．1において上述される環状ペプチドを含む。本発明の結晶は、さらに、2種類以上のタンパク質または他の生体分子の複合体または組立体を含むことができる。例えば、結晶は、受容体、例えばTrk受容体、の分子に結合するリガンド、例えばニューロトロフィン、の分子を含むことができる。典型的には、生物学的分子、例えばタンパク質、を含む結晶は他の分子、例えば溶媒（例えば、水分子）および／または塩の分子をも含む。他の分子、例えば、薬物、薬物候補またはタンパク質に結合する化合物が結晶内に存在していてもよい。
【０１０５】
実際、ニューロトロフィンと複合体を形成するTrk受容体の結合ドメインの結晶構造は既に当該技術分野において利用可能である。例えば、Wiesmann et al., Nature 1999, 401:184；およびBanfield et al., Sturcutre（Camb.）2001, 9:1191を参照のこと。これらのX線構造の配位は、例えば、<www.rcsb.orb>のProtein Data Bankから容易に得ることができる（それぞれ、寄託番号1wwwおよび1hcf）。したがって、下記実施例において実証される特に好ましい実施形態においては、適切なTrk受容体（またはそれらの断片）に結合するニューロトロフィンのX線結晶構造（1以上）を用いて本発明のファルマコフォア構造を決定する。その後、これらの三次元構造を本発明のペプチド模倣体、またはその代わりに、Trk調節因子であると思われるさらなる環状ペプチドの設計に用いることができる。
【０１０６】
代替法として、環状ペプチドの三次元構造は、一般には、当該技術分野において周知である核磁気共鳴（NMR）技術を用いて決定することができる。NMRデータの獲得は、好ましくは、関連構造が得られることを確実にするため、生理学的条件を緊密に模倣する水系において行う。簡潔に述べると、NMR技術は磁気モーメントまたはスピンを有する特定の原子核（例えば、1H、13C、15Nおよび31P）の磁気特性を用いてそのような核の化学的環境を探査する。NMRデータは分子内の原子間の距離を決定するのに用いることができ、それは三次元モデルまたは分子の誘導に用いることができる。
【０１０７】
環状ペプチド（および、以下で考察される、候補ペプチド模倣体）の三次元構造の決定には、プロトンNMRが好ましく用いられる。より具体的には、分子が強い磁場内に置かれているとき、水素原子の2つのスピン状態はもはや減退しない。場に対して平行に整列するスピンはより低いエネルギーを有し、場に対して逆平行に整列するスピンはより高いエネルギーを有する。平衡状態で、水素原子のスピンはBoltzmann分布式に従って定置する。このスピン集団の平衡は高周波（RF）パルスを印加することによって励起状態に攪乱することができる。これらの核が平衡状態に戻るとき、それらは測定可能なRF放射線を放射する。各核から放射される放射線の正確な周波数は核の分子環境に依存し、原子の各々で異なる（同じ分子環境を有する原子は除く）。参照シグナルに対してこれらの異なる周波数が得られ、それらは化学シフトと呼ばれる。印加されるRFパルスの性質、持続時間および組み合わせは大きく変化し得るものであり、当業者は適切なパルスの組み合わせを選択することにより異なる分子の特性を探査することができる。
【０１０８】
立体配座に関する限られた情報しか得ることができないため、三次元構造決定には一次元NMRスペクトルは一般に不十分である。一次元NMRは、一般には、分子内の接続性の確認に用いられ、ペプチド内の側鎖の方向に関する重要なデータをもたらす。二次元NMRスペクトルは、これに関してより有用であり、側鎖−側鎖相互作用およびペプチドバックボーンの立体配座の明瞭な決定を可能にする。
【０１０９】
二次元NMRスペクトルは、一般には、対角線が一次元NMRスペクトルに相当し、かつ対角線から外れる交差ピークが直接スカラー結合する水素原子間の相互作用から生じる、等高線プロットとして示される。二次元実験は、一般には、準備期間、XY面においてそれらの化学シフトに従って処理するためにスピンが「ラベル」される展開期間（evolution period）、他のスピンとの相関がなされる混合期間、および自由誘導減衰が記録される検出期間を含む。
【０１１０】
二次元NMR法は混合期間中に探索される相関の性質によって区別される。DQF-COSY（二量子フィルター相関分光法（double quantum filtered correlation spectroscopy））は1個以上の他の原子を介して共有結合する水素原子間のピークをもたらす。核オーバーハウザー効果分光法（Nuclear Overhauser effect spectroscopy）（NOESY）は、たとえ多数の介在原子を介して結合するとしても、空間内で共に近接する水素原子の対の間のピークをもたらす。全相関分光法（total correlation spectroscopy）（TOCSY）においては、それらが互いに直接結合しているかどうかに関わらず、結合パートナーを共有するすべてのプロトン間で相関が観察される。回転フレーム・オーバーハウザー分光（Rotating-frame Overhauser Spectroscopy）（ROESY）実験はNOESYの回転フレーム類似法と考えることができ、空間内で共に近接する水素原子の対の間のピークをもたらす。そのような方法の1つ以上を、水抑制技術、例えば、WATERGATEおよび水フリップ・バックと共に、環状ペプチドまたは候補ペプチド模倣体の三次元構造の決定に水性条件下で用いることができる。そのような技術は周知であり、NMRデータ獲得中の溶媒（HDO）の共鳴を抑制するのに必要である。
【０１１１】
例として、TOCSYおよびNOESYの両者を、立体配座および割り当てを決定する目的で、代表的な環状ペプチドに適用することができる。水溶媒共鳴はWATERGATE手順を適用することによって抑制することができる。水フリップバックパルスをTOCSYおよびNOESY実験の両者の混合期間の最後に適用し、水シグナルを平衡状態で維持し、この実験において用いられるほぼ中性のpH（すなわち、Ph6.8）でのそれらの急速交換によるアミドプロトン共鳴の損失を最小化することもできる。NMRデータは、両方向に沿ったコサイン二乗window関数を用いる分光器ソフトウェアを用いて処理することができる。基線相関はBruker多項法を用いてNOESY、ROESYおよびTOCSYスペクトルに適用することができる。
【０１１２】
NOESYデータは80msないし250msの範囲の幾つかの混合時間で獲得することができる。より短い混合時間のNOESYを獲得してより長い混合時間で獲得したNOESYスペクトルに拡散効果が存在しないことを確実なものとすることができる。プロトン間の距離は、一般には、250ms NOESYから決定することができる。プロトン共鳴の配列特異的割り当ては、TOCSYおよびNOESYデータの結果の両者を利用する標準法（Wuthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley & Sons, New York, 1986を参照のこと）によって決定することができる。
【０１１３】
立体配座の算出には、最初にNOE交差ピークを、NOE強度に関わりなく、1.8-5.0オングストロームの均一な距離上限および下限に変換することができる。NOE距離は、様々な混合時間での算出および実験NOEを比較することにより、反復して洗練することができる。この洗練はPEPFLEX-II法（Wang et al., Techniques in Protein Chemistry IV, 1993, Evaluation of NMR Based Structure Determination for Flexible Peptides: Application to Desmopressin p. 569）の精神において豊富であるかもしれないが、好ましくは、非常に緩やかな上限（例えば、5オングストローム）を有する初期のNOEベースの距離を用いて実験データと一致するより完全な立体配座の組の生成を可能にする。上反角拘束は3JCαHカップリング定数の値から導くことができる。40°の寛容値を上反角拘束の各々に加えてペプチドの立体配座柔軟性を説明することができる。ECEPP/2データベースにおいて提供される固定された結合距離および結合角を利用して距離幾何計算を行うことができる（Ni et al., Biochemistry 1992, 31:11551-11557）。ω角は一般には180°で固定されるが、他のすべての上反角は構造最適化中に変化し得る。
【０１１４】
拘束妨害が最低である構造に距離制限（distance-restrained）Monte Carlo法を用いてエネルギー最少化を施し（Ripoll & Ni, Biopolymers 1992, 32:359-365；Ni, J. Magn. Reson. B 1995, 106:147-155）、ECEPP/3力場を含むように修飾することができる（Ni et al., J. Mol. Biol. 1995, 252:656-671）。すべてのイオン化性基をECEPP/3エネルギーの拘束Monte Carlo最小化の間に荷電するように処理することができる。すべての電荷の間の静電的相互作用を距離依存性誘電体を用いることによってスクリーニングし、立体配座エネルギー計算における溶媒効果の不在を説明することができる。加えて、ファン・デル・ワールスおよび静電期間を完全強度に維持しながら、水素結合相互作用を総力の25％まで低下させることができる。これらの特別な処理は、立体配座探索の指針が主として実験NMR拘束によるものであり、かつ算出された立体配座が経験的な立体配座エネルギーのパラメータによってほとんど偏向を受けないことを確実なものとする助けとなる（Warder et al., FEBS Lett. 1997, 411:19-26）。
【０１１５】
Monte Carlo計算からのペプチドの低エネルギー立体配座をNOEシミュレーションにおいて用いて、観察可能なNOEを持たない近似プロトンおよび再校正を保証する距離上限の組を同定することができる。NOEを欠くことから導かれる距離下限を含む、洗練されたNOE距離の組を、Monte Carlo計算の次のサイクルにおいて、その結果生じる立体配座が実験的に観察されるものに近いNOEスペクトルをシミュレートするまで用いる（Ning et al., Biopolymers 1994, 34:1125-1137；Ni et al., J. Mol. Biol. 1995, 252:656-671）。理論的NOEスペクトルは、ペプチドの分子量および実験温度に基づき、1.5nsの反転相関時間を用いて算出することができる（Cantor& Schimmel（1980）Biophysical Chemistry, W. H. Freeman & Co., San Francisco）。すべての候補ペプチドの立体配座は等量で相互変換立体配座の集合平均緩和マトリックス解析に含まれる（Ni & Zhu, J. Magn. Reson. B 1994, 102:180-184）。NOEシミュレーションはメチル基の局所運動およびプロトン脱磁気化の不完全な緩和減衰の効果を説明するパラメータを組み込むこともできる（Ning et al., Biopolymers 1994, 34:1125-1137）。算出されたNOE強度は割り当ての化学シフトを用いて二次元FID（Ni, Magn. Reson. B 1995, 106:147-155）に変換し、分解されたプロトン共鳴の線幅およびカップリング定数を見積もる。算出されたFIDは、実験NOEデータ組に用いられるものと同じ処理手順を用いて、シミュレートされたNOESYスペクトルに変換することができる。
【０１１６】
6．3．TRK受容体調節因子：ペプチド模倣体
上述のように、ペプチド模倣体は、そのペプチド模倣体の三次元構造がRGE配列のものと実質的に同じままであるように、環状ペプチド内のRGE配列の少なくとも一部が修飾されている化合物である。ペプチド模倣体は、それら自体が1以上の置換または他の修飾をRGE配列内に含む環状ペプチドである、ペプチド類似体であり得る。その代わりに、その環状ペプチドの三次元構造が実質的に保持されるように、RGE配列の少なくとも一部が非ペプチド構造で置換されていてもよい。換言すると、RGE配列内の1、2もしくは3個のアミノ酸残基が非ペプチド構造によって置換されていてもよい。加えて、その環状ペプチドの他のペプチド部分が、必要なわけではないが、非ペプチド構造で置換されていてもよい。ペプチド模倣体（ペプチドおよび非ペプチジル類似体の両者）は特性が改善されていてもよい（例えば、タンパク分解の減少、保持の増加またはバイオアベイラビリティの増加）。ペプチド模倣体は、一般には、経口利用可能性が改善されており、これはそれらを癌のような状態の治療に特に適するものとする。ペプチド模倣体は類似する二次元化学構造を有していてもいなくてもよいが、共通の三次元構造的な特徴および幾何を共有する。各々のペプチド模倣体は1種類以上の独自追加結合性要素をさらに有することができる。本発明はペプチド模倣体を同定するための方法を提供する。ペプチド修飾の様々な修飾（上述のような環状ペプチドに対する修飾を含む）が当該技術分野において公知であり、ペプチド模倣体化合物の生成に用いることができる。例えば、国際特許公開WO 01/53331を参照のこと。そのような修飾は、本発明において、ペプチド模倣体化合物の生成の他に以下に説明される特定の修飾にも用いることができる。
【０１１７】
ここで提供されるすべてのペプチド模倣体は上記環状ペプチドの三次元構造に実質的に類似する三次元構造を有する。一般に、2つの三次元構造は、Molecular SimilarityモジュールをQUANTAプログラム（QUANTA、Molecular Simulations Inc.、San Diego、Calif.から入手可能）内で用いる算出で、それらのファルマコフォア原子配位が1オングストローム以下の根二乗平均偏差（RMSD）を有する場合に互いに実質的、構造的に類似であると言われる。ここで提供されるすべてのペプチド模倣体は上記環状ペプチドの少なくとも1つの低エネルギー三次元構造に実質的に類似する少なくとも1つの低エネルギー三次元構造を有する。
【０１１８】
低エネルギー立体配座は、例えばCHARMMプログラム（Brooks et al., J. Comput. Chem. 1983, 4:187-217）を用いる、立体配座エネルギー計算によって同定することができる。エネルギー用語は保証付きまたは保証なしの用語を含み、これには結合長さエネルギー、角エネルギー、上反角エネルギー、ファン・デル・ワース・エネルギーおよび静電エネルギーが含まれる。立体配座エネルギーは様々な他の商業的に入手可能な量子力学的または分子力学的プログラムのいずれかを用いて算出することもできることは明らかであろう。低エネルギー構造は50kcal/molの大域的最小値内にある立体配座エネルギーを有する。
【０１１９】
候補ペプチド模倣体の低エネルギー立体配座（1以上）を（例えば、NMRまたはX線結晶学によって決定された）環状ペプチドの低エネルギー立体配座と比較し、候補の立体配座が環状ペプチドのそれをいかに緊密に模倣しているかを決定する。そのような比較においては、極めて重大な側鎖に対応する要素の位置および方向に特別な注意を払わなければならない。候補低エネルギー立体配座のうちの少なくとも1つが環状ペプチドの溶液立体配座に実質的に類似する（すなわち、1オングストローム以下の根二乗平均偏差（RMSD）で異なる）場合、その候補化合物はペプチド模倣体と考えられる。そのような分析のうちでは、例えば、CHARMM分子力学および分子動力学プログラム（Brooks et al., J. Comput. Chem. 1983, 4:187-217）を、水分子を表すのに用いられるTIP3P水モデル（Jorgensen et al., J. Chem Phys. 1983, 79:926-935）と共に用いて、溶液中の候補ペプチド模倣体の低エネルギー立体配座を研究することができる。CHARM22力場を用いて設計されたペプチド模倣体を表すことができる。
【０１２０】
例として、2つの手順の組み合わせを用いて低エネルギー立体配座を同定することができる。第1の手順は模擬アニーリング分子動力学シミュレーションアプローチを含む。この手順においては、（設計されたペプチド模倣体および水分子を含む）系をほぼ室温、好ましくは、約600Kまで加熱して100ピコ秒（ps）間以上シミュレートし；次に、500Kまで徐々に低下させて100ps間以上シミュレートし；次に、400Kまで低下させて100ps間以上シミュレートし；300Kまで低下させて500ps間以上シミュレートする。分析のために軌道を記録する。この模擬アニーリング手順はその効率的な立体配座探索の能力で知られる。
【０１２１】
第2の手順は自己誘導分子動力学（SGMD）法（Wu & Wang, J. Physical Chemistry 1998, 102:7238-7250）の使用を含む。SGMD法は極度に強化された立体配座探索能力を有することが実証されている。SGMD法を用いて、シミュレーションを300Kで1000ps間以上行うことができ、分析のために軌道を記録する。
【０１２２】
立体配座解析はQUANTA分子モデリングパッケージを用いて行うことができる。まず、分子動力学シミュレーションから生成された軌道を用いてクラスター解析を行うことができる。各々のクラスターから最低エネルギー立体配座をこのクラスターの代表的立体配座として選択することができ、他の立体配座クラスターと比較することができる。クラスター解析で主要立体配座クラスターを同定することができ、環状ペプチド（1以上）の溶液立体配座と比較することができる。立体配座の比較はQUANTAプログラム内のMolecular Similarityモジュールを用いて行うことができる。
【０１２３】
構造の類似性はグラフィック形式で表示された三次元構造の視認比較、または様々なコンピュータによる比較のいずれかによっても評価することができる。例えば、ペプチド模倣体および環状ペプチド三次元構造において原子当量を定義することができ、フィッティング操作が類似性のレベルの確立に用いられる。本明細書では、「原子当量」は2つの構造において保存される原子の組である。「フィッティング操作」は候補化合物構造を移動および回転させて環状ペプチド構造との最適な一致を得るあらゆるプロセスであり得る。フィッティング操作は厳密なフィッティング操作であり得る（例えば、環状ペプチド三次元構造を厳密に保つことができ、ペプチド模倣体の三次元構造を移動および回転させて環状ペプチドとの最適な一致を得ることができる）。その代わりに、フィッティング操作は、移動する化合物の構造に適用しようとする移動および回転を指定された等価原子の対全体にわたる一致の根二乗平均の差が最小になるように算出する最小二乗フィッティングアルゴリズムを用いることもできる。好ましくは、利用者が原子当量を確立することができ、フィッティング操作は様々な利用可能なソフトウェアアプリケーション（例えば、QUANTA、Molecular Simulations Inc.、San Diego、Calif.から入手可能）のいずれかを用いて行う。実質的な類似性の確立において用いられる候補化合物の三次元構造は（例えば、上述のNMR技術またはX線結晶学を用いて）実験的に決定することができ、または、例えば、ここで提供される方法を用いてコンピュータ生成することができる。
【０１２４】
特定のペプチド模倣体を環状ペプチドの構造に基づいて設計することができる。例えば、そのようなペプチド模倣体は開裂性アミド結合周辺の局所的形態を模倣することができる（アミド結合アイソスター）。バックボーン修飾の例が図3Aおよび3Bに示される（WO 01/53331の図4A-4Bも参照のこと）。これらの模倣体は、結合部位との重要な接触を形成する官能性を保持しながら、しばしば原子−原子でペプチドバックボーンと一致する。アミド結合模倣体は非正常アミノ酸またはジペプチド代替物の組み込みを含むこともできる。そのような非正常アミノ酸およびジペプチド代替物の例はここに、図4において図示される（WO 01/53331の図5も参照のこと）。さらに他の例が当該技術分野において周知である（例えば、Gillespie et al., Biopolymers 1997, 43:191-217を参照のこと）。これらのタイプの模倣体に見出される立体配座的に厳密な構造要素は、立体配座的に柔軟なペプチド結合と比較して、非常に都合のよいエントロピー駆動力での結合を生じるものと考えられる。バックボーン修飾は、親ペプチドと比較して、ペプチダーゼ開裂に対する代謝安定性を付与することもできる。他のペプチド模倣体は二次構造模倣体である。そのようなペプチド模倣体は、一般には、特定の二次構造、例えば、β-ターン、β-シートおよびα-ターンの置換に非ペプチド構造を用いる（図5を参照のこと）。
【０１２５】
ペプチド模倣体を設計するため、経験を通して開発されている発見的規則を用いて環状ペプチドを系統的に修飾することができる。そのような修飾のうちで、反復洗練プロセスを通して様々な種類の経験的データが一般に集められる。上述のように、ペプチド模倣体の設計における最適効率はファルマコフォアの三次元構造を必要とする。
【０１２６】
ここで示されるファルマコフォアは、例えば上述のペプチド足場修飾による、構造ベースのペプチド模倣体設計を可能にする。ニューロトロフィンRGE立体配座と比較した1つ以上のファルマコフォアの視認検査により、特定のペプチド模倣体を同定することができる。ペプチド模倣体は、環状ペプチドの構造−活性関係の知識を用いる、環状ペプチドファルマコフォアと候補化合物の三次元構造との視認比較に基づいて設計することもできる。構造−活性研究は環状ペプチドにおける重要な結合要素を確立しており、かつファルマコフォアモデルの開発を可能にしている。この方法で設計されたペプチド模倣体はこれらの結合要素を保持するはずである。
【０１２７】
ペプチド模倣体はチオエーテル（--S--CH2--C(O)--）でのジスルフィド結合（--S--S--）の置換に関して設計することもできる。ジスルフィド結合は、一般には、酸性条件下で容易に還元できるため、非常に安定なものではない。ジスルフィド結合をチオエーテル部分（--S--CH2--C(O)--）で置換することでペプチドの安定性を、したがって、経口利用可能性を大きく改善することができる。
【０１２８】
視認検査による設計の代わりとして、組み合わせ化学技術を用いて（例えば、ヒダントインおよび／またはオキソピペラジン化合物を含む）ライブラリを作製することができる。組み合わせ化学技術は、規定された化学成分の系統的な添加により、非常に信頼性の高い化学反応およびロボット機器を用いて、有機化合物を平行合成することを可能にする。化合物の大ライブラリは一カ所で行うことができるすべての可能な反応と第2、第3またはそれ以上の場所で行うことができるすべての可能な反応との組み合わせの結果として生じる。組み合わせ化学法は、潜在的に、1000万ないし1億の新規化合物を混合物として、固体支持体に付着して、または個々の化合物として生じる可能性がある。
【０１２９】
ファルマコフォアは、そのような化学的ライブラリのスクリーニングを容易にするのに用いることができる。例えば、すべての可能な数のライブラリを生成する（これは扱いにくい数の化合物を生じる）代わりに、ライブラリ合成の焦点を標的と相互作用する確率が最大であるライブラリのメンバーに合わせることができる。構造ベースの設計および組み合わせ化学技術の統合適用は薬物発見の効率における相乗的な改善を生じ得る。
【０１３０】
さらなるペプチド模倣体は、元のペプチドとは無関係であるように思われるが、局所構造的模倣体として機能する非ペプチド足場上に位置する官能基を含む化合物である。このタイプのペプチド模倣体はここでは「非ペプチジル類似体」と呼ばれる。そのようなペプチド模倣体は大化学データベースのライブラリスクリーニングを用いて同定することができる。そのようなスクリーニングはファルマコフォアの三次元立体配座を用いてそのようなデータベースを三次元空間で検索する。1つの三次元構造をファルマコフォアモデルとしてそのような検索において用いることができる。その代わりに、複数の三次元構造内に存在する重大な化学構造の特徴を考慮することによってファルマコフォアモデルを生成することもできる。
【０１３１】
三次元構造の様々なデータベースのいかなるものもそのような検索に用いることができる。三次元構造のデータベースは、化合物のデータベースの三次元構造を生成し、その三次元構造を機械読み取り可能なデータで符号化されているデータ保存物質の形態で保存することによって用意することができる。これらの三次元構造は、図式的な三次元構造図を表示することが可能であり、かつそのデータを用いるための命令を備えてプログラムされている機械で表示することができる。好ましい実施形態のうちでは、三次元構造はその三次元構造を規定する一組の座標として供給される。
【０１３２】
好ましくは、3Dデータベースは少なくとも100,000の化合物を含み、比較的単純な化学構造を有する小さい非ペプチジル分子が特に好ましい。データベース内の化合物の3D座標が精密かつ正確に表されることも重要である。The National Cancer Institute（NCI）3Dデータベース（Milne et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1994, 34:1219-1224）およびAvailable Chemicals Directory（ACD：MDL Information Systems、San Leandro、Calif.から入手可能）が、上で論じられるように、分子モデル形成を用いて三次元構造のデータベースの生成に用いることができる2つの優れたデータベースである。幾つかの低エネルギー立体配座を有することができる柔軟な分子については、複数の立体配座を保存して検索することが望ましい。Chem-Xプログラム（Oxford Molecular Group PLC；Oxford UK）は柔軟な化合物について数千の、または数百万でさえ、立体配座を検索することが可能である。Chem-Xのこの可能性は複数の立体配座に適合し得る化合物を扱う上で現実的な利点をもたらす。このアプローチを用いて、NCI-3Dデータベースは現時点で合計465,000の化合物を含むが、数億の立体配座を3Dファルマコフォア検索プロセスにおいて検索することができる。
【０１３３】
ファルマコフォア検索は、典型的には、3つの工程を含む、第1工程はファルマコフォア照会の生成である。そのような照会は環状ペプチドの三次元構造における臨界距離の評価から生成することができる。関心のあるファルマコフォア照会を用いて距離ビットスクリーニングをデータベースに対して行い、必要とする幾何的拘束を満たす化合物を同定する。換言すると、指定された臨界対形成距離を満たす化合物を同定する。化合物がこの距離ビットスクリーニング工程を通過した後、プログラムは、次に、その化合物がファルマコフォア照会において指定された下位構造要件を満たすかどうかをチェックする。化合物がこの下位構造チェックを通過した後、最後に立体配座解析が施される。この工程においては、立体配座を生成し、ファルマコフォア照会において指定された幾何要件に関して評価する。幾何要件を満たす少なくとも1つの立体配座を有する化合物が「当たり」とみなされ、結果データベースに記録される。
【０１３４】
当業者に明らかである他の基準、例えば、化学構造の簡潔性、低分子量、化学構造多様性および水溶性も、特定の用途のための特定の化合物を検索するときに考慮される。そのような基準の適用は医薬品、計算および構造化学者によって十分理解される。
【０１３５】
化合物の構造をここで示されるスクリーニングを用いて最適化できることは明らかであろう。そのようなスクリーニングのうちで、環状ペプチドに対する三次元類似性を最適化するため、三次元構造に関する候補化合物の特定の変更の効果を評価することができる。そのような変更には、例えば、疎水性、立体的かさ高さ、静電特性、サイズおよび結合角の変化が含まれる。
【０１３６】
候補化合物の生物学的試験を用いてペプチド模倣活性を確認することができる。一般には、ペプチド模倣体は構造的に類似する環状ペプチドと実質的に類似する様式で機能するはずである。換言すると、環状ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2（配列番号2）のペプチド模倣体は、標準結合アッセイを用いる測定で、環状ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2（配列番号2）の親和性の少なくとも半分の親和性でTrkに結合するはずである。さらに、環状ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2（配列番号2）のペプチド模倣体は、ここで示される代表的なアッセイを用いて、N-Ac-CSRRGEC-NH2（配列番号2）を用いて達成される調節のレベルの少なくとも半分のレベルで、Trk介在機能を調節するはずである。
【０１３７】
ひとたび活性ペプチド模倣体が同定されると、関連類似体を二次元類似性検索を用いて同定することができる。そのような検索は、例えば、プログラムISIS Base（Molecular Design Limited）を用いて行うことができる。二次元類似性検索は他の利用可能な緊密に関連する化合物の同定を可能にし、それを容易にスクリーニングして生物学的活性を最適化することができる。
【０１３８】
6．4．TRK調節剤
上述のように、「Trk調節因子」という用語は、ここでは、ニューロトロフィンモチーフRGE（すなわち、Arg-Gly-Glu）を含む、少なくとも1つの本発明の環状ペプチドまたはペプチド模倣体を含むあらゆる分子を記述するのに用いられる。複数の環状ペプチドおよび／またはペプチド模倣体が本発明の調節剤中に存在していてもよい。さらに、追加RGE配列（例えば、RGE配列の縦列反復）が調節剤中に含まれ得る。
【０１３９】
リンカーを、（例えば、本発明の好ましいTrkアゴニストにおける）RGE配列の縦列反復を含めて、Trk調節因子におけるRGE配列の分離に用いても用いなくてもよい。リンカーは、以下で説明されるように、本発明の調節剤を固体支持体または物質に結合するのに用いることもできる。
【０１４０】
リンカーは、RGE配列を含まず、かつ少なくとも2つのペプチド配列および／またはペプチド模倣体に共有結合することができる、（ペプチドおよび／または非ペプチド配列に加えて単一のアミノ酸または他の分子を含む）あらゆる分子であり得る。リンカーを用いて、ペプチド模倣体および／もしくは他のペプチドまたはタンパク質配列を様々な方向で連結することができる。
【０１４１】
リンカーは、好ましくは、CAR配列および／またはペプチド模倣体の間に0.1ないし10,000nm、より好ましくは、約0.1-400nmの距離を生じる。認識部位間の分離距離は、一般には、その調節剤の望ましい機能に従って決定することができる。Trkアンタゴニストについては、リンカー距離は短くなければならない（0.1-400nm）。Trkアゴニストについては、リンカー距離は400-10,000nmでなければならない。そのような目的で用いることができるリンカーの1つが（H2N（CH2）nCO2H）mまたはそれらの誘導体であり、ここでnは1ないし約10の範囲をとり、mは1ないし約4000の範囲をとる。例えば、グリシン（H2NCH2CO2H）またはそれらの多量体がリンカーとして用いられる場合、各々のグリシン単位は、他のアミノ酸に連結したときのその最低エネルギー立体配座の分子モデル形成技術を用いた算出による決定で、約2.45オングストローム、すなわち、0.245nmの連結距離に相当する。同様に、アミノプロパン酸は約3.73オングストローム、アミノブタン酸は約4.96オングストローム、アミノペンタン酸は約6.30オングストロームおよびアミノヘキサン酸は約6.12オングストロームの連結距離に相当する。用いることができる他のリンカーは当業者に明らかであり、例えば、2,3-ジアミノプロパン酸、リジンおよび／またはオルニチンの反復単位に基づくリンカーが含まれる。2,3-ジアミノプロパン酸は、側鎖アミノまたは末端アミノが連結内に用いられるかどうかに依存して、2.51または3.11オングストロームのいずれかの連結距離をもたらすことができる。同様に、リジンは2.44または6.95オングストロームのいずれか、オルニチンは2.44または5.61オングストロームの連結距離をもたらすことができる。ペプチドおよび非ペプチドリンカーは、一般には、当該技術分野において公知のあらゆる適切な方法を用いて調節剤に組み込むことができる。
【０１４２】
Trkアンタゴニストである調節剤は1つ以上のペプチド模倣体を含むことができる。好ましくは、そのようなペプチド模倣体は互いに隣接するか（すなわち、介在配列なしに）、または密接に近接する（すなわち、ペプチドおよび／または非ペプチドリンカーによって分離されてペプチド模倣体間に約0.1ないし400nmの範囲の距離をもたらす）。上で論じられる他のニューロトロフィン配列を含むこともできることは明らかであろう。
【０１４３】
上述のように、調節剤は全体として1つ以上のペプチド模倣体からなるものであってもよく、または追加ペプチドおよび／または非ペプチド成分を含むこともできる。ペプチド部分は上述のように合成することができるか、または組換え法を用いて調製することができる。そのような方法のうちでは、調節剤のすべてまたは一部を、生細胞内で、その宿主細胞に適切であることが当業者に公知である様々な発現ベクターのいずれかを用いて合成することができる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類および他の動物細胞（例えば、ハイブリドーマ、CHO、ミエローマ）が含まれ得る。このような方法で発現したDNA配列は内在性ニューロトロフィンの一部をコードすることができる。そのような配列は既知Cdnaもしくはゲノム配列に基づいて、または既知カドヘリンの配列に基づいて設計されたプローブを用いる適切なライブラリのスクリーニングによって単離された配列から調製することができる。そのようなスクリーニングは、一般には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（およびそこに引用される参考文献）に記載されるように行うことができる。当該技術分野において周知の方法でオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて内在性ニューロトロフィンのすべてまたは一部をコードする核酸分子を単離することもできる。調節剤のペプチド部分をコードする核酸分子を生成するため、周知の技術を用いて内在性配列を修飾することができる。その代わりに、望ましい核酸配列の一部を周知の技術を用いて合成し、次に一緒にライゲートして調節剤の一部をコードする配列を形成することもできる。
【０１４４】
本発明のTrk調節剤は、NT配列に特異的に結合する抗体もしくはそれらの抗原結合性断片または、その代わりに、Trk受容体配列に特異的に結合する抗体もしくはそれらの抗原結合性断片をさらに含むことができる。本明細書では、抗体もしくはそれらの抗原結合性断片は、それが検出可能なレベルで（例えば、Newton et al., Develop. Dynamics 1993, 197:1-13によって記載されるELISA内で）その配列を含むペプチドと反応し、かつ異なるNTもしくはTrk配列を含むペプチドともNT（もしくはTrk）および／もしくは隣接配列内のアミノ酸の順序が変化している配列とも検出可能に反応することがない場合、（隣接アミノ酸の有無に関わりなく）NTもしくはTrk配列と「特異的に結合する」と言われる。
【０１４５】
抗体およびそれらの断片は標準技術を用いて調製することができる。例えば、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照のこと。そのような技術の1つにおいては、最初にNTまたはTrk配列を含む免疫原を様々な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射する。小免疫原（すなわち、約20 アミノ酸未満）が担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンに好ましく結合される。1回以上の注射の後、動物を周期的に出血させる。次に、NTもしくはTrk配列に特異的なポリクローナル抗体をそのような抗血清から、例えば、適切な固体支持体に結合されている調節剤もしくはそれらの抗原性部分を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１４６】
NT（もしくはTrk）配列に特異的なモノクローナル抗体を、例えば、Kohler & Milstein、（Eur. J. Immunol. 1976, 6:511-519）の技術またはそれらの改良法を用いて調製することができる。簡潔に述べると、これらの方法は、上述のように免疫化した動物から得られた脾臓細胞から所望の特異性を有する抗体を産生することが可能な不死細胞株を調製することを含む。これらの脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー、好ましくは、免疫化動物と同系のものとの融合によって不死化する。1つのコロニーを選択し、それらの培養上清を調節剤またはそれらの抗原性部分に対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１４７】
モノクローナル抗体は、成長するハイブリドーマコロニーの上清から、收率を高めるための当該技術分野において公知の様々技術を用いて、またはそれなしで、単離することができる。混入物は通常の技術、例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出によって抗体から除去することができる。所望の活性を有する抗体は、一般には、組織切片、細胞または標的カドヘリンが局在する他の試料の免疫蛍光分析を用いて同定することができる。
【０１４８】
特定の実施形態のうちでは、モノクローナル抗体は特定のNT、またはその代わりに、特定のTrk受容体に対して特異的であり得る。例えば、抗体はNGFに結合できるがBNDFには結合せず、その逆も同様である。別の例として、抗体はTrkBに特異的に結合してTrkAには特異的には結合せず、その逆も同様である。そのような抗体は、上述のように、（特定のNTに対する抗体を産生するため）RGE配列および所望の特異性を生成するのに十分な隣接配列（例えば、各々の側に5アミノ酸で一般に十分である）をも含む免疫源を用いて調製することができる。特定の抗体の特異性を評価するため、ここで説明される代表的なアッセイおよび／または通常の抗原結合アッセイを用いることができる。そのような抗体は、一般には、ここで説明されるように、治療、診断およびアッセイの目的で用いることができる。例えば、そのような抗体を薬物に連結させて哺乳動物に投与し、その薬物を特定のTrk発現性細胞、例えば、特定のニューロン細胞に向かわせることができる。
【０１４９】
特定の実施形態のうちでは、抗体の抗原結合性断片の使用が好ましいものであり得る。そのような断片にはFab断片が含まれ、これらは標準技術を用いて調製することができる。簡潔に述べると、免疫グロブリンをウサギ血清からプロテインAビーズカラムでのアフィニティクロマトグラフィー（Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；特には、309頁を参照）によって精製し、パパインによって消化してFabおよびFc断片を得ることができる。FabおよびFc断片はプロテインAビーズカラムでのアフィニティクロマトグラフィー（Harlow & Lane, 1988, pages 628-29）によって分離することができる。
【０１５０】
6．5．TRK調節因子活性の評価
上述のように、本発明のペプチド模倣体、環状ペプチドおよび他のTrk調節因子は、例えばニューロン生存、軸索成長およびシナプス可塑性を含む、Trk介在活性を調節（すなわち、強化または阻害）することが可能である。したがって、Trk介在活性を調節する調節剤（または推定調節剤）の能力を、一般には、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれかで、これらの効果の1以上をアッセイすることによって評価することができる。一般的に言うと、そのような代表的なアッセイのうちで、試験細胞と候補との接触が測定されるTrk介在活性の識別可能な崩壊を生じる場合、試験化合物はTrkアンタゴニストである。そのような代表的なアッセイのうちで、試験細胞と候補化合物の接触が測定されるTrk介在活性の識別可能な増加を生じる場合、候補化合物は、一般には、Trkアゴニストと考えられる。
【０１５１】
本発明の特に好ましい実施形態においては、Trk調節因子または候補化合物の活性をイン・ビボで神経突起成長アッセイにおいて評価する。下記実施例において実証される代表的な神経突起成長アッセイのうちでは、ニューロンを細胞（好ましくは、3T3細胞またはそれらから誘導される細胞株）の単層上で培養することができる。例として、3T3繊維芽細胞の単層を、8チャンバーウェル組織培養スライドの個々のウェルにおける細胞（好ましくは、約80,000）の一晩培養によって確立することができる。出生後第3日（PND3）のマウス脳から単離された約3,000の小脳ニューロンを、様々な単層上、対照培地（SATO/2%FCS）または様々な濃度の候補調節剤を補足した培地において18時間培養することができる。その代わりに、対照ペプチド（例えば、Trk調節因子環状ペプチドと同じアミノ酸配列を有する非環状直鎖ペプチド）またはニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5またはNT-4/5）を補足した培地において細胞を培養することもできる。
【０１５２】
次に、細胞培養物を固定し、GAP43について、またはニューロンもしくはそれらの神経突起に特異的に結合する幾つかの他の薬剤で染色することができる。その後、GAP43陽性ニューロンの各々の最長神経突起の長さを、好ましくはコンピュータ支援形態測定を用いて、測定することができる。Trk調節因子である化合物は、一般には、そのような細胞培養アッセイにおいて神経突起の成長を調節（例えば、阻害または強化）する。
【０１５３】
6．6．TRK受容体調節因子の使用
一般には、本発明の調節剤および組成物は、Trk受容体が介在する活性−TrkA、TrkBおよび／またはTrkCが介在する活性を含む−の調節（例えば、阻害または強化）に用いることができる。Trk受容体は中枢神経系（CNS）の成長および修復に関与し、少なくとも部分的には、ニューロン生存、軸索成長、神経突起成長、シナプス可塑性、および、より一般的には、神経学的成長のようなプロセスに介在する。したがって、本発明の調節剤および組成物はこれらのプロセスのいずれの調節にも用いることができる。そのような使用には、とりわけ、そのようなプロセスが関連する状態、疾患および障害を治療するための治療方法および医薬組成物が含まれる。例示的な状態、疾患および障害には、少数の例を挙げると、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、並びに頭部および脊髄損傷が含まれる。
【０１５４】
本発明の一実施形態において、本発明のTrkアゴニストをTrk受容体が介在する活性の増加または強化に用いることができる。したがって、本発明のTrkアゴニストは、例えば、CNSの成長および／または修復の増加または強化に、例えば、ニューロン成長、ニューロン生存、軸索成長、神経突起成長およびシナプス可塑性のようなプロセスを増加または強化することによって用いることができる。したがって、本発明のTrkアゴニストは、例えば、中枢神経系に対する損傷またはその損なわれた機能に関与するか、または他の様式で関連する疾患および障害を治療するための治療方法において有用である。これらには、とりわけ、上に列挙される疾患および障害が含まれる。
【０１５５】
他の実施形態において、本発明のTrkアンタゴニストをTrk受容体が介在する活性の減少または阻害に用いることができる。したがって、Trkアンタゴニストは、ニューロ成長、ニューロン生存、軸索成長、神経突起成長およびシナプス可塑性のようなプロセスを阻害することができる。Trkアンタゴニストは、例えば、Trk受容体活性の増加、またはTrk受容体に結合して活性化するニューロトロフィン（例えば、BDNF）の活性の増加のいずれかに関連する疾患および障害（例えば、てんかん）を治療または緩和する、治療方法において有用でもある。
【０１５６】
さらに他の実施形態においては、本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストを、ニューロン成長、ニューロン生存、軸索成長、神経突起成長およびシナプス可塑性のようなプロセスを阻害する応答を含む、CNS成長および修復を阻害する応答（すなわち、「CNS阻害因子」）の調節に用いることもできる。特に好ましい実施形態においては、本発明のTrkアゴニスト（例えば、BAGまたは他のアゴニストポリペプチドもしくはペプチド模倣体）をCNS阻害因子応答の遮断または減少に用いることができる。本発明の他の実施形態においては、Trkアゴニスト（例えば、BAGまたは他のアゴニストポリペプチドもしくはペプチド模倣体）を、阻害性環境、例えば、1種類以上のCNS阻害因子の存在下における投与でさえ、ニューロン成長および回復の強化および／または促進に用いることができる。
【０１５７】
特定の例として、上に列挙されるものを含む、CNS成長および修復のプロセスを阻害または防止さえし得る阻害性因子、例えば、ミエリンに関連するものが存在することは理解される。そのような阻害因子の例には、これらに限定されるものではないが、ミエリン関連糖タンパク質（別名、「MAG」）、Nogo-Aおよびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質が含まれる。そのような阻害剤のより完全な説明については、上記セクション3．3も参照のこと。本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストは、これらの、および他のCNS阻害因子によって生じる応答の調節に用いることができる。
【０１５８】
いかなる特定の作用理論または機構に限定されるものではないが、Trk受容体はCNS成長および修復を、少なくとも部分的には、プロテインキナーゼA（PKA）およびフォスフィノシチド3-キナーゼ（PI3K）を含む機構（1以上）によって調節することは理解される。したがって、本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストは、好ましい実施形態において、それ自体がPKAまたはPI3Kのいずれかによって調節される1種類以上の化合物が介在する阻害性シグナルの効果を調節することができる。一例としてであって限定を目的とするものではないが、PKAはRhoを、その分子のSer188に対する直接リン酸化によって活性化するものと理解される（Ellerbroek et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:19023-19031）。したがって、本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストはRhoを含む阻害性カスケードが介在する阻害性シグナルの調節に用いることができる。これらには、とりわけ、ミエリン阻害因子、例えば、MAG（およびMAG融合構築体、例えば、MAG-Fc）、Nogo-A、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質、NgR、GT1bおよびp75NTRが介在する阻害性シグナルが含まれる。Rhoを含む他のCNS阻害因子には、CNSグリア瘢痕に由来する硫酸コンドロイチンプロテオグリカンが介在するシグナル（Monnier et al., Neurosci. 2003, 22:319-330）が含まれ、そのようなことから、これらのCNS阻害因子も本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストによって調節することができる。別の非限定的な例として、PI3Kの活性化がセマホリンの阻害活性を克服するものと期待される（Eickholt et al., J. Cell Biol. 2002, 157:211-217）。したがって、本発明のTrkアゴニストおよびアンタゴニストは、さらに、これらのCNS阻害因子の調節に用いることができる。
【０１５９】
一般には、本発明の方法は、Trk受容体を発現する細胞（典型的には、ニューロン細胞）をTrk調節剤とイン・ビボまたはイン・ビトロのいずれかで接触させることを含む。投与されるTrk調節剤の量は「有効量」でなければならない-すなわち、関心のあるTrk介在活性を有効に調節する量、またはその代わりに、関心のあるCNS阻害因子を有効に調節する量でなければならない。Trk調節因子が治療方法の一部として投与される実施形態においては、投与される量は治療対象となる状態、疾患または障害を有効に緩和する（しかしながら、除去または治癒する必要はない）量でなければならない。その代わりに、投与される量は治療対象となる状態、疾患または障害に関連する1つ以上の症状を有効に緩和する（しかしながら、除去する必要はない）量であってもよい。
【０１６０】
特定の非限定的な例として、本発明のTrk調節剤は神経学的成長、例えば、神経突起成長の調節（例えば、阻害または強化）に用いることができる。そのような方法においては、ニューロンを1種類以上の本発明のTrkアゴニスト（例えば、環状ペプチドN-Ac-CSRRGELLAASRRGELC-NH2）と接触させることによって神経突起成長を強化および／または方向付けすることができる。その代わりに、ニューロンを1種類以上の本発明のTrkアンタゴニスト（例えば、環状ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2）と接触させることによって神経突起成長を阻害および／または低下させることができる。そのような方法のうちでの使用に好ましい調節剤は、好ましくは、ポリマーマトリックスまたは他の支持体に連結されており、前記セクション6．1において説明される環状ペプチドまたは（セクション6．3において説明される）それらのペプチド模倣体を含む。抗体またはそれらの断片を含む調節剤も、リンカーまたは支持物質の使用の有無に関わりなく、そのような方法において用いることができる。
【０１６１】
ニューロン細胞への接触を達成する方法および投与されるTrk調節剤の量は、そのニューロンの位置に加えて所望の成長の程度および性質（または、Trkアンタゴニストが投与される場合には、所望の阻害の程度および性質）に依存する。例えば、ニューロンを（例えば、移植により）支持物質、例えば、縫合糸、繊維神経ガイドまたは他の補綴装置に連結されている1種類以上のTrk調節剤と接触させ、神経突起成長をその支持物質に沿って方向付けることができる。その代わりに、神経ガイドの管腔が調節剤（1種類以上）を含有する組成物を含む管状神経ガイドを用いることもできる。イン・ビボで、そのような神経ガイドまたは他の支持された調節剤を周知の技術を用いて移植して、例えば、切断されたニューロン接続の成長を促進し、および／または脊髄損傷を治療することができる。支持体の構造および組成が治療する障害に適するものでなければならないことは当業者には明らかであろう。イン・ビトロでは、例えば米国特許第5,510,628号に記載されるように、ポリマーマトリックスを同様に用いてニューロンの成長をパターン化表面上に方向付けることができる。
【０１６２】
6．7．TRK受容体調節因子：配合物
特定の実施形態において、ここで説明される調節剤を、必ずしも必要ではないが、1つ以上のさらなる分子に連結させることができる。例えば、（必ずしも必要ではないが、同一であり得る）複数の調節剤を支持分子（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）または、ガラス、プラスチックもしくはセラミックスを含む様々な材料から調製することができる固体支持体、例えば、（膜もしくは微小構造、例えば、超薄膜として配合することができる）ポリマーマトリックス、容器表面（例えば、組織培養プレートの表面もしくはバイオリアクターの内面）、またはビーズもしくは他の粒子に連結することが特定の用途に有益であり得る。特定の用途には、生分解性支持材料、例えば、セルロースおよびそれらの誘導体、コラーゲン、スパイダーシルクもしくは様々なポリエステルのいずれか（例えば、ヒドロキシ酸および／またはラクトンから誘導されるもの）または縫合糸が好ましい（米国特許第5,245,012号を参照）。
【０１６３】
調節剤を支持物質に連結するのに適する方法は支持体の組成および目的とする用途に依存し、当業者には容易に明らかであろう。付着は、一般には、非共有結合性会合、例えば、吸着もしくは親和性、または、好ましくは、共有結合（これは調節剤と支持体上の官能基との直接連結であっても架橋剤もしくはリンカーによる連結であってもよい）によって達成することができる。吸着による調節剤の付着は、適切なバッファ中で、固体支持体と適切な時間接触させることによって達成することができる。接触時間は温度に伴って変化するが、一般には、約5秒ないし1日、典型的には、約10秒ないし1時間である。
【０１６４】
分子または固体支持体への調節剤の共有結合は、一般には、まず支持物質を、調節剤の官能基、例えば、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、ケトンもしくはアミノ基とも反応する二官能性試薬と反応させる。例えば、調節剤を適切なポリマー支持体またはコーティングにベンゾキノンを用いて、支持体上のアルデヒド基と調節剤上のアミンおよび活性水素の縮合により、または支持体上のアミノ基と調節剤上のカルボン酸との縮合により結合することができる。連結を生成する好ましい方法はグルタルアルデヒドを用いてアミノ基を介するものである。調節剤はエステル結合を介してセルロースに連結することができる。同様に、アミド結合が他の分子、例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは他の支持物質への連結に適するものであり得る。他のNTおよび／またはTrk受容体配列を含む複数の調節剤および／または分子を、例えば、等モル量のそのような分子がマトリックス支持体と混合され、かつ無作為にカップリングすることを許容する無作為カップリングによって結合することができる。
【０１６５】
ここで説明される調節剤は特定の組織または細胞（すなわち、ニューロン細胞および組織）に優先的に結合することができ、したがって、イン・ビボの所望の部位を標的とするのに十分なものであり得るが、さらなる標的化剤を含めることが特定の用途に有益であり得る。したがって、標的化剤をその上に、またはその代わりに、調節剤に連結させて1つ以上の特定の組織の標的化を促進することができる。ここで用いられる場合、「標的化剤」は、調節剤に連結したとき、標的組織への調節剤の移送を強化し、それにより調節剤の局所濃度を高めるあらゆる物質（例えば、化合物または細胞）であり得る。標的化剤には、抗体もしくはそれらの断片、受容体、リガンドおよび標的組織の細胞またはその近傍に結合する他の分子が含まれる。公知の標的化剤には、血清ホルモン、細胞表面抗原に対する抗体、レクチン、接着分子、腫瘍細胞表面結合性リガンド、ステロイド、コレステロール、リンホカイン、繊維素溶解酵素並びに所望の標的部位に結合する薬物およびタンパク質が含まれる。抗体標的化剤は無傷の（全）細胞、それらの断片、またはそれらの機能的等価物であり得る。抗体断片の例はF（ab’）2、-Fab’、FabおよびF[v]断片であり、これらは通常の方法または遺伝子もしくはタンパク質工学によって生成することができる。連結は一般に共有結合であり、例えば、直接縮合もしくは他の反応により、または二もしくは多官能性リンカーにより達成することができる。他の実施形態のうちでは、調節剤をコードするポリヌクレオチドを標的組織に差し向け、それにより調節剤の局所濃度を高めることも可能である。そのような標的化は、レトロウイルスおよびアデノウイルス感染を含む、周知の技術を用いて達成することができる。
【０１６６】
特定の実施形態については、その上、またはその代わりに、薬物を調節剤に連結することが有益であり得る。ここで用いられる場合、「薬物」という用語は、哺乳動物に投与して疾患または他の望ましくない状態を予防または治療しようとするあらゆる生体活性剤を指す。薬物には、ホルモン、成長因子、タンパク質、ペプチドおよび他の化合物が含まれる。本発明の脈絡内での特定の薬物の使用は以下で論じられる。
【０１６７】
本発明の特定の態様のうちでは、医薬組成物内にここで説明される1種類以上の調節剤が存在していてもよい。医薬組成物は1種類以上の調節剤を1種類以上の薬学的または生理学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤との組み合わせで含む。そのような組成物は、緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、キレート剤、例えば、EDTAもしくはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤を含むことができる。さらに他の実施形態のうちでは、本発明の組成物を凍結乾燥体として配合することができる。調節剤（単独で、または標的化剤および／もしくは薬物との組み合わせで）は、必ずしも必要ではないが、周知知技術を用いてリポソーム内に封入することができる。本発明の組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む、適切な投与方法用に配合することができる。特定の局所用途には、周知の成分を用いる、クリームまたはローションとしての配合物が好ましい。
【０１６８】
任意に、医薬組成物は、調節剤に連結していても組成物内でフリーであってもよい、1種類以上の薬物も含むことができる。事実上あらゆる薬物を、ここで説明される調節剤と組み合わせて、ここで説明される様々な目的で投与することができる。調節剤と共に投与することができる薬物のタイプの例には、これらに限定されるものではないが、鎮痛剤、麻酔剤、抗狭心剤、抗真菌剤、抗生物質、抗癌剤（例えば、タキソールもしくはマイトマイシンC）、抗炎症剤（例えば、イブプロフェンおよびインドメタシン）、駆虫剤、抗うつ剤、解毒剤、制吐剤、抗ヒスタミン剤、降圧剤、抗マラリア剤、微小管阻害剤（例えば、コルヒチンもしくはビンカアルカロイド）、抗偏頭痛剤、抗菌剤、抗精神病薬、解熱剤、防腐剤、抗シグナル伝達剤（例えば、プロテインキナーゼC阻害剤もしくは細胞内カルシウム流動の阻害剤）、抗関節炎剤、抗トロンビン剤、抗結核剤、鎮咳剤、抗ウイルス剤、食欲抑制剤、心作用性薬剤、化学依存性薬剤、下剤、化学療法剤、冠動脈、脳もしくは末梢血管拡張剤、避妊薬、抑制剤、利尿剤、去痰剤、成長因子、ホルモン剤、催眠剤、免疫抑制剤、麻薬性アンタゴニスト、副交感神経作動剤、鎮静剤、興奮剤、交感神経作動剤、毒素（例えば、コレラ毒）、トランキライザーおよび泌尿器抗感染剤が含まれる。
【０１６９】
画像形成の目的では、さまざまな診断薬のいずれかを、調節剤に連結させて、または組成物内でフリーのいずれかで、医薬組成物中に組み込むことができる。診断薬には、他の生理学的機能は一般に無影響のままとしながら、患者内の生理学的機能を照射するために投与されるあらゆる物質が含まれる。診断薬には、金属、放射性同位体および放射線不透過剤（radioopaque agents）（例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素およびリン含有化合物）、放射線透過性剤、コントラスト剤、色素（例えば、蛍光色素および発色団）並びに熱量もしくは蛍光定量反応を触媒する酵素が含まれる。一般には、そのような薬剤はここで説明される様々な技術を用いて付着させることができ、かつあらゆる方向で存在することができる。
【０１７０】
ここで説明される組成物は徐放性配合物（すなわち、投与に続く調節剤の徐放を達成するカプセルまたはスポンジのような配合物）の一部として投与することができる。そのような配合物は、一般には、周知技術を用いて調製することができ、かつ、例えば、経口、直腸もしくは皮下移植により、または所望の標的部位での移植により投与することができる。徐放性配合物は担体マトリックス中に分散され、および／または速度制御膜（例えば、欧州特許出願第710,491A号を参照）によって取り囲まれたリザーバ内に収容された調節剤を含むことができる。そのような配合物内で用いるための担体は生体適合性であり、生分解性であってもよい；好ましくは、配合物は比較的一定のレベルの調節剤放出をもたらす。徐放性配合物内に含まれる調節剤の量は、移植部位、放出の速度および期待される持続期間、並びに治療もしくは予防しようとする状態の性質に依存する。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は治療（または予防）しようとする疾患に適する方法で投与することができる。適切な投薬量並びに投与の持続期間および頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重症度並びに投与方法のような要素によって決定される。一般には、適切な投薬量および治療形態は治療および／または予防的利益をもたらすのに十分な量で調節剤（1種類以上）を提供する。本発明の特に好ましい実施形態のうちでは、ここで説明される調節剤または医薬組成物を、1回もしくは複数回1日用量の形態で、0.001ないし50mg/体重kg、好ましくは、0.1ないし20mg/kgの範囲の投薬量で投与することができる。局所投与については、クリームは、典型的には、0.00001％ないし1％、好ましくは、0.0001％ないし0.2％、より好ましくは、0.0001％ないし0.002％の範囲の量の調節剤を含む。液体組成物は、典型的には、約10ng/mlないし5mg/ml、好ましくは、約10.mu.gないし2mg/Mlペプチド模倣体を含む。適切な投薬量は、一般には、実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定することができる。一般には、有効な治療をもたらすのに十分である最少投薬量の使用が好ましい。一般には、当業者に馴染みのある、治療または予防する状態に適するアッセイを用いて患者を治療有効性について観察する。
【０１７２】
Trk受容体調節因子は下記セクション6．9に示される説明に従って配合することもできる。
【０１７３】
6．8．p75結合剤
「p75受容体結合剤」という用語は、ここでは、阻害性複合体内に拘束されているp75受容体に結合してp75受容体：ニューロトロフィン相互作用を妨害するが、ニューロトロフィン：Trk受容体相互作用は妨害しない、天然または合成（例えば、組換え）分子を記述するのに用いられる。したがって、p75受容体結合剤は阻害性環境におけるニューロトロフィン介在ニューロン成長を促進する。p75受容体は、それがnogo受容体およびミエリン関連タンパク質（例えば、MAG、Nogo-A、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質）のいずれかと相互作用するとき、阻害性複合体内に拘束される。p75受容体結合剤の例には、これらに限定されるものではないが、ニューロトロフィン、例えば、NGF、およびニューロトロフィンから誘導される作用物質、例えば、NGF結合性ループ誘導N-Ac-CTDIKGKEC-NH2（配列番号43）が含まれる。ニューロトロフィンは、それが他の異なるニューロトロフィンのp75受容体への結合を妨害し、かつ受傷ニューロン上に発現したTrk受容体とは相互作用しない場合、本発明によるp75受容体結合剤である。例えば、TrkBは発現するがTrkAは発現しないニューロンの場合、ニューロトロフィンNGFは、NGFがTrkBに結合するニューロトロフィン（例えば、BDNF）とp75受容体結合について競合する（すなわち、妨害する）が、TrkB受容体に結合するニューロトロフィン（例えば、BDNF）を妨害することはないため、p75受容体結合剤である。
【０１７４】
好ましい実施形態において、p75受容体結合剤は、環状ペプチドもしくはペプチド模倣性化合物の環状環内にNGFモチーフTDIKGKE（すなわち、Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu）（配列番号42）を含む、少なくとも1種類の環状ペプチドもしくはペプチド模倣性化合物を含む。特に好ましいp75受容体結合剤はN-Ac-CTDIKGKEC-NH2（配列番号43）である。前述のように、下線が付されたペプチド配列は最後の2つの下線が付された残基間の共有結合によって環化されているペプチドを表す。これらの例において、p75結合剤は、アセチル化およびアミドブロックされている2つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって環化した。p75受容体に結合する好ましいペプチドは拘束されており、したがって、好ましくは、環状ペプチドであることは理解される。ペプチドを環化するための方法は前記セクション6．1において説明される。
【０１７５】
複数の環状ペプチドおよび／またはペプチド模倣体がp75受容体結合剤中に存在していてもよい。さらに、追加のTDIKGKE配列（例えば、TDIKGKE配列の縦列反復）をp75受容体結合剤中に含めることもできる。
【０１７６】
p75受容体結合性配列の縦列反復を含めて、p75受容体結合剤中のp75受容体結合性配列を分離するのにリンカーを用いても用いなくてもよい。リンカーは、少なくとも2つのペプチド配列および／またはペプチド模倣体に共有結合することができ、かつp75受容体結合性配列を含まないあらゆる分子（ペプチドおよび／または非ペプチド配列に加えて単一アミノ酸または他の分子を含む）であり得る。リンカーを用いて、ペプチド模倣体および他のペプチドもしくはタンパク質配列を様々な方向で接合することができる。
【０１７７】
p75受容体結合剤は1種類以上のペプチド模倣体を含むことができる、好ましくは、そのようなペプチド模倣体は互いに隣接する（すなわち、介在配列なし）か、または密接に近接する（すなわち、ペプチドおよび／または非ペプチドリンカーによって分離されてペプチド模倣体間に約0.1ないし400nmの範囲の距離をもたらす）。p75受容体結合剤は全体的に1種類以上のペプチド模倣体からなるものでもよく、または追加ペプチドおよび／または非ペプチド成分を含んでいてもよい。ペプチド模倣体の製造方法は前記セクション6．2および6．3において説明される。
【０１７８】
p75受容体結合剤のすべてまたは一部を、特定の宿主細胞に適切である、当業者に公知の様々な発現ベクターのいずれかを用いて、生細胞において合成することができる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類および他の動物細胞（例えば、ハイブリドーマ、CHO、ミエローマ）が含まれ得る。この方法で発現したDNA配列は内在性ニューロトロフィンの一部をコードすることができる。そのような配列は既知cDNAもしくはゲノム配列に基づいて、または適切なライブラリーのスクリーニングによって単離された配列から調製することができる。そのようなスクリーニングは、一般には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（およびそこに引用される参考文献）に記載されるように行うことができる。当該技術分野における周知の方法においてオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて内在性ニューロトロフィンのすべてまたは一部をコードする核酸分子を単離することもできる。調節剤のペプチド部分をコードする核酸分子を生成するため、周知の技術を用いて内在性配列を修飾することができる。その代わりに、所望の核酸配列の一部を周知の技術を用いて合成し、次いで一緒にライゲートしてp75受容体結合剤の一部をコードする配列を形成することもできる。
【０１７９】
6．9．p75結合剤：CNS成長を促進するための方法
本発明はCNS成長を促進するための方法であって、p75受容体結合剤を投与することを含む方法を提供する。Trk受容体はCNSの成長および修復に関連付けられており、ニューロン生存、軸索成長、神経突起成長、シナプス可塑性、および、より一般的には、神経学的成長のようなプロセスに介在する。p75受容体はニューロトロフィンと低い親和性で結合し、この結合は、p75受容体が阻害性複合体内に拘束される状況において、Trk受容体を活性化するニューロトロフィンの能力を損なう。したがって、p75受容体へのニューロトロフィンの結合を妨害する方法はニューロトロフィンをTrk受容体に結合させてそれを活性化させ、したがって、阻害性環境におけるCNSニューロン成長を促進する。
【０１８０】
本発明の一態様において、治療上有効な量のp75受容体結合剤を少なくとも1種類のニューロトロフィンとの組み合わせで個体に投与することを含む方法が提供される。好ましいニューロトロフィンはNGF、BDNF、NT-3、NT-4またはNT-5である。一実施形態においては、p75受容体結合剤をニューロトロフィンよりも約10ないし約100倍多い量で投与する。別の実施形態においては、p75受容体結合剤はNGFであり、かつニューロトロフィンはBDNFである。本発明の方法は、CNSに対する損傷またはその損なわれた機能に関連する状態、疾患および障害の治療に用いることができる。例示的な状態には、これらに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷が含まれる。
【０１８１】
本発明の方法によると、ニューロトロフィンは、そのニューロトロフィンが阻害性複合体内に拘束されているp75受容体への他の異なるニューロトロフィンの結合は妨害するが受傷CNSニューロン上に発現したTrk受容体への他の異なるニューロトロフィンの結合は妨害しないとき、p75受容体結合剤である。例えば、TrkB受容体を発現するニューロンを有する個体にBDNFと共に同時投与された場合、NGFはp75受容体への結合についてBDNFと競合するが、TrkB受容体への結合についてはBDNFと競合しないため、NGFは本発明によるp75受容体結合剤である。
【０１８２】
ここで説明されるp75受容体剤は医薬組成物内に存在することができる。医薬組成物はp75受容体結合剤を1種類以上の薬学的または生理学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤との組み合わせで含有する。そのような組成物は、緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、キレート剤、例えば、EDTAもしくはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤を含むことができる。さらに他の実施形態のうちでは、本発明の組成物を凍結乾燥体として配合することができる。p75受容体結合剤を（単独で、または標的化剤および／または薬物との組み合わせで）、周知技術を用いて、リポソーム内に封入することができる。
【０１８３】
本発明の組成物は、例えば、局所、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む、あらゆる適切な投与方法用に配合することができる。p75受容体結合剤を含有する医薬組成物は、p75受容体結合剤を個体の体内のp75受容体に到達させて結合させるあらゆる手段によって投与することができる。
【０１８４】
p75受容体結合剤を含有する医薬組成物の無菌注射用形態は水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、当該技術分野において公知の技術に従い、適切な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いて配合することができる。無菌注射用調製品は非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒のうちにあるものは、無菌水、乳酸加リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として都合よく用いられる。この目的で、合成モノ−もしくはジ−グリセリドを含む、あらゆるブランドの不揮発性油を用いることができる。天然の薬学的に許容し得る油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特には、それらのポリオキシエチレン化体もそうであるが、脂肪酸、例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体が注射剤の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁液は長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含むこともできる。p75受容体結合剤は前記セクション6．7において示される説明に従って配合することもできる。
【０１８５】
p75受容体結合剤は局所投与することができる。例えば、p75受容体結合剤を、脊髄損傷後または述中の個体の露出された脊髄に局所的に塗布することができる。局所塗布には、医薬組成物を、1種類以上の担体中に懸濁または溶解されたp75受容体結合剤を含有する適切な軟膏の状態に配合することができる。p75受容体結合剤を局所投与するための担体には、これらに限定されるものではないが、鉱物油、液体ワセリン、白色ワセリン、乳化性ワックス、水、または吸収性物質、例えば、I型コラーゲンゲルもしくはゼラチン止血スポンジ（Gelfoam（登録商標）、Pharmacia & Upjohn、Kalamazoo、MI）が含まれる。
【０１８６】
適切な投薬量並びに投与の持続期間および頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重症度並びに投与方法のような要素によって決定される。一般には、適切な投薬量および治療形態は、治療的および／または予防的利益をもたらすのに十分な量でp75結合剤（1種類以上）を提供する。適切な投薬量を決定するための様々な考慮が、例えば、Gilman et al.（eds）, The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed.（1990）. Pergamon Pressに記載されている。適切な投薬量は、一般には、実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定することができる。一般には、有効な治療をもたらすのに十分である最少投与量の使用が好ましい。当業者に馴染みのある身体検査、画像形成研究、または治療もしくは予防する状態に適するアッセイを用いて、治療有効性について患者を観察することができる。用量調整は観察知見に基づいてなすことができる。例えば、腕の感覚の喪失に関連する脊髄損傷を患う個体を、本発明によるp75受容体結合剤の投与後、腕への感覚の回復について身体検査によって観察することができる。
【０１８７】
p75受容体結合剤を含有する組成物は徐放性配合物（すなわち、投与に続くp75受容体結合剤の徐放を達成するカプセルまたはスポンジのような配合物）の一部として投与することができる。そのような配合物は、一般には、周知技術を用いて調製することができ、かつ、例えば、皮下移植または所望の標的部位での移植によって投与することができる。徐放性配合物は、担体マトリックス中に分散され、および／または速度制御膜（例えば、欧州特許出願第710,491A号を参照）によって取り囲まれたリザーバ内に収容されたp75受容体結合剤を含むことができる。そのような配合物内で用いるための担体は生体適合性であり、生分解性であってもよい；好ましくは、配合物は比較的一定のレベルの結合剤放出をもたらす。徐放性配合物内に含まれる結合剤の量は、移植部位、放出の速度および期待される持続期間、並びに治療しようとする状態の性質に依存する。
【０１８８】
ここで説明されるp75受容体結合剤は特定の組織または細胞（すなわち、ニューロン細胞および組織）に優先的に結合することができ、したがって、イン・ビボの所望の部位を標的とするのに十分なものであり得るが、さらなる標的化剤を含めることが特定の用途に有益であり得る。したがって、標的化剤をp75受容体結合剤に連結させて1つ以上の特定の組織の標的化を促進することができる。ここで用いられる場合、p75受容体「標的化剤」は、p75受容体結合剤に連結したとき、標的組織（すなわち、受傷ニューロン）へのp75受容体結合剤の移送を強化し、それによりp75受容体結合剤の局所濃度を高めるあらゆる物質（例えば、化合物または細胞）であり得る。
【０１８９】
標的化剤には、抗体もしくはそれらの断片、受容体、リガンドおよび標的組織の細胞もしくはその近傍に結合する他の分子が含まれ得る。公知の標的化剤には、血清ホルモン、細胞表面抗原に対する抗体、レクチン、接着分子、腫瘍細胞表面結合性リガンド、ステロイド、コレステロール、リンホカイン、繊維素溶解酵素並びに所望の標的部位に結合する薬物およびタンパク質が含まれる。抗体標的化剤は無傷の（全）細胞、それらの断片、またはそれらの機能的等価物であり得る。例えば、MAG、Nogo-Aまたはミエリン糖タンパク質抗体が標的化剤であり得る、抗体断片の例はF（ab’）2、-Fab’、FabおよびF[v]断片であり、これらは通常の方法または遺伝子もしくはタンパク質工学によって生成することができる。連結は一般に共有結合であり、例えば、直接縮合もしくは他の反応により、または二もしくは多官能性リンカーにより達成することができる。他の実施形態のうちでは、結合剤をコードするポリヌクレオチドを標的組織に差し向け、それにより結合剤の局所濃度を高めることも可能である。そのような標的化は、レトロウイルスおよびアデノウイルス感染を含む、周知の技術を用いて達成することができる。
【０１９０】
特定の実施形態については、薬物をp75受容体結合剤に連結することが有益であり得る。p75受容体結合剤に連結するのに適する薬物の説明については、前記セクション6．7を参照のこと。
【０１９１】
7．実施例
本発明を以下の例によっても説明および実証する。しかしながら、これらの例および本明細書の何処かでの他の例の使用は説明だけのものであり、本発明または例示されるそれらの範囲および意味を決して制限するものではない。同様に、本発明はここで説明される特定の好ましい実施形態に限定されるものではない。実際、本発明の多くの変更および変形が本明細書を読むことで当業者に明らかであり得、そのような変形は精神または範囲の上で本発明から逸脱することなしになすことができる。したがって、本発明は、添付の請求の範囲に加えてそれらの請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲の条件によってのみ限定される。
【０１９２】
7．1．実験手順
7．1．1．神経突起成長アッセイ
親3T3細胞またはLK8細胞（生理学的レベルの幼鶏N-カドヘリンを発現する確立された形質移入3T3細胞株：Doherty et al., Neuron 1991, 6：247-258を参照）のいずれかの単層上での小脳ニューロンの同時培養をWilliamsら（Neuron 1994, 13：583-594）によって従来記述されるように確立した。これら細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したダルベッコ改変イーグル培地において維持した。
【０１９３】
同時培養を確立するため、約80,000の3T3細胞（またはLK8細胞）を、ポリ-L-リジンおよびフィブロネクチンをコートした8チャンバー組織培養スライドの個々のチャンバーに塗布した。塗布した細胞を10％FCSを補足したダルベッコ改変イーグル培地（「DMEM」）において一晩維持し、集密単層を形成させた。培地を除去し、約6,000の分離した小脳ニューロン（出生後第9日のラットから採取）を各ウェル内の2％FCSを補足したSATO培地中に塗布した。試験試薬を本文中で指示されるように添加し、同時培養を18時間維持した。次に、同時培養物を固定し、GAP-43免疫反応性について染色した。細胞当たりの最長神経突起の平均長を、ここでもやはりWilliamsら（Neuron 1994, 13：583-594）によって従来記述されるように、約120ないし150のニューロンについて測定した。
【０１９４】
7．1．2．Trk受容体−リガンド構造の分子モデル形成
NGF/TrkAおよびNT-4/TrkB複合体のX線結晶学的構造を分子モデル形成に用いた。これらの構造は従来記述されており（それぞれ、Wiesmann et al. Nature 1999, 401：184-188；およびBanfield et al. Structue（Camb）2001, 9：1191-1199を参照）、例えば、インターネットでProtein Data Bank（PDB）から（NGF/TrkAについて）寄託番号1wwwおよび（NT-4/TrkBについて）1hcfで容易にアクセスすることができる。スイスPDBソフトウェアパッケージを用いて様々なモチーフの構造を結晶の結合界面から単離し、Accelrysソフトウェアを用いて画像を生成した。
【０１９５】
接触プロフィールを、NT-4/TrkB結晶構造の様々なリガンド／受容体界面から、リガンド残基配列数に対するリガンド残基当たりの受容体接触の平均数を測定することによって生成した。平均は3残基窓（three residue window）でとり、接触数は所定のリガンドアミノ酸の5オングストローム内に存在する受容体残基の数である。
【０１９６】
7．1．3．試薬
組換えヒトFGF2、BDNFおよびNT-4/5はすべてR&D systems（Minneapolis、MN）から入手した。CB1カナビノイド受容体アゴニストWIN55,2122-2メシレートは従来記述されるように入手して用いた（Williams et al., J. Cell. Biol. 2003, 160：481-486を参照）。Trk受容体アンタゴニストK252aはCalbiochem（San Diego、CA）から入手した。PD173074 FGFRアンタゴニスト（Mohammadi et al., Embo J. 1998, 17：5986-5904）は、Skaperら（J. Neurochem. 2000, 75：1520-1527）およびHamby et al., J. Med. Chem. 1997, 40：2296-2303によって従来記述されるように合成して用いた。
【０１９７】
合成ペプチドはすべて商業供給者から入手した（Multiple Peptide Systems、San Diego、CA）。すべてのペプチドは定型法に従って逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって精製し、最高レベルの純度（すなわち、95％を上回る純度）で入手した。（本明細書を通して）ペプチド配列に下線が付されている場合、最後の2つの下線が付された残基間の共有結合によって環化されているペプチドを表す。これらの例において、ペプチドは、アセチル化およびアミドブロックされている2つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって環化した。
【０１９８】
7．2．TRKB受容体と相互作用するNT-4直鎖ペプチド配列の同定
このセクションは、Trk受容体における鍵となる部位に結合する天然ニューロトロフィンリガンドから適切な直鎖ペプチド（LIP）配列を同定する分子モデル形成実験を説明する。
【０１９９】
相当数の証拠が、Trk受容体の膜近位免疫グロブリン（Ig）ドメイン（D5）がNTの結合に直接関与することを示唆する。例えば、Perez et al., Mol. Cell Neurosci. 1995, 6：97-105；およびUrfer et al., Embo J. 1995, 14：2795-2805を参照のこと。NGF/TrkA複合体（Wiesmann et al., Nature 1999, 401：184-188）およびNT-4/TrkB複合体（Banfield et al., Structure（Camb）2001, 1191-1199）の結晶構造が解明されており、それらがこの観点を支持する。両構造において、1つのNT二量体がTrk受容体分子に嵌合し、次に、二量体内の各NT分子が各Trk受容体分子と相互作用していた。
【０２００】
両結晶構造を、受容体と相互作用するリガンド上の直鎖領域を強調するように設計されたアルゴリズムで分析した（Doherty et al., Mol. Cell Neurosci 2000, 16：283-295）。この分析を説明するため、NT-4/TrkB（D5）結晶構造を図6Aに示す。この複合体内で、（a1と表示される）個々のNTモノマーは（b1およびb2と表示される）TrB受容体モノマーの両者と直線接触をなす。これら2つの界面の両者を分析し、この分析を図6B-6Cに図示する。これらの図において、NGFおよびTrkA 受容体間の界面は破線で示され、それに対してNT-4およびTrkB間の界面は実線で示される。これら2つの図の検査から理解できるように、これら2つのリガンド−受容体複合体の界面はかなり重複している。
【０２０１】
この接触プロフィール分析は、NTリガンドのN末端がTrk受容体と最も密接な接触をなすことを示す（図6C）。さらに、この接触プロフィールにおける優勢ピークに位置する小直鎖モチーフ（SRRGE）はらせんの半分として存在し、緊密ループとみなすことができる。その配列はBDNF（ARRGE）（これもTrkB受容体に結合する）においてほぼ保存され、かつ、それぞれTrkAおよびTrkC受容体のリガンドである、NGF（FHRGE）およびNT-3（SHRGE）において部分的に保存される。興味深いことに、ニューロトロフィンのこの領域は未結合NTの結晶構造においては不規則であり（McDonald et al., Nature 1991, 354：411-414を参照）、したがって、従来ペプチド研究の主題にはなっていない。
【０２０２】
a1/b2界面接触プロフィールが図6に図示される。他者がNT/Trk相互作用に関連付けているNTループ1-4（LeSauteur et al., J. Biol. Chem. 1995, 270：6564-6569）が強調されている。しかしながら、これらのループのうちでa1/b1界面に図示されるものはなく、ループ1のみがa1/b2界面に関与する。
【０２０３】
7．3．TRKBアンタゴニストペプチドの開発
PND2の子ラットから単離した小脳ニューロンを、3T3線維芽細胞の単層上、対照培地または一連のBDNFおよび／またはNT-4濃度で補足した培地のいずれかにおいて培養した。16時間後、同時培養物を固定し、従来記述されているように平均神経突起長を決定した（Williams et al., J. Biol. Chem.2000, 275：4007-4012）。図7Aに図示されるそれらの結果は、両リガンドが用量依存性の様式で神経突起成長を刺激し、最大応答が約1ないし10ng/mlで見られたことを示す。
【０２０４】
前記セクション7．2における結果は、すべてのNTに存在する小直鎖RGEモチーフの適切に拘束されたペプチドが無傷のNT配列との高い構造重複を有し、それによりTrk受容体アンタゴニストとして機能することを示唆する。この仮説を試験するため、ジスルフィド結合によって拘束され、かつアミノ酸配列：N-Ac-CRGEC-NH2を有する、LIPの環状体を設計した。BDNFおよびNT-4応答に対するこのペプチドの効果を、両NTリガンドを5ng/mlの濃度で用いて、上記神経突起成長アッセイにおいて試験した。図7Bに図示されるこれらの結果は、このペプチドがBDNFおよびNT-4応答と拮抗し、BDNF応答については144±23μMで、NT-4応答については112±22μMで50％阻害が見られた。対照的に、約400μMを上回る濃度およびいかなる天然NTリガンドも存在しない状態で試験したとき、このペプチドは基本神経突起成長に対する効果がなかった。これらの結果は、環状ペプチドそれ自体にはニューロン生存および神経突起成長に対する特別な効果がないことを示唆する。
【０２０５】
7．4．NT-4 LIPはNT3およびNGF LIPよりも強力なTRKBアンタゴニストである
RGE配列モチーフはすべてのNTによって共有される。しかしながら、このモチーフに隣接するアミノ配列はTrkA、TrkBおよびTrkCリガンドの間で異なる。したがって、異なるNTリガンドの配列から設計された一連の「等価」ペプチドを試験し、TrkBリガンドからの伸長ペプチドがより活性のTrkB受容体アンタゴニストかどうかを決定した。
【０２０６】
分子モデル形成実験は、ペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2がNT-4や天然SRRGEモチーフと構造重複を共有することを示唆する。したがって、このペプチド配列を、NGF（N-Ac-CFHRGEC-NH2）およびNT-3（N-Ac-CSHRGEC-NH2）から誘導される等価ペプチドと平行して、前記セクション7．3において説明される神経突起成長アッセイにおいてBDNFおよびNT-4応答を阻害するそれらの能力について試験した。驚くべきことに、NT-4から誘導されるN-Ac-CSRRGEC-NH2はNGFおよびNT-3誘導ペプチドよりもBDNF応答の阻害時に約5倍良好であり、27±6μMで50％阻害が見られた。これらの結果を図7Cに図示する。
【０２０７】
上述のように、NT-4に由来する2つという少なさの隣接アミノ酸残基の付加がTrkB応答に対してペプチドの効力を5倍まで高める。NGFまたはNT-3のいずれかに由来する等価アミノ酸の付加は元の環状RGEペプチドの効力に対して識別可能な効果を有しておらず、NT結合の選択性が、少なくとも部分的に、RGEモチーフに直接隣接するアミノ酸残基の性質によって決定され得ることが示唆される。実際、相当数の一連の証拠が、Trk受容体結合の特異性がNTのアミノ末端配列によってコードされることを示唆する。例えば、Urfer et al., Embo J. 1994, 13：5896-5909；およびMcInnes & Sykes, Biopolymers 1997, 43：339-366を参照こと。これらの知見は、本発明の環状ペプチドおよびペプチド模倣体が、好ましくは所望のTrk受容体に結合する、NTリガンドに由来するRGE隣接アミノ酸配列を選択することによって特定のTrk受容体（すなわち、TrkA、TrkBまたはTrkC受容体）に向けられ得ることを示唆する。
【０２０８】
ペプチドをNT-4に対して試験したとき、前述と同じ定性的応答が見られた（図7Dを参照）。しかしながら、BDNFの50％阻害が僅かに約25μMのペプチドN-Ac-CSRRGEC-NH2で得ることができたのに対し、NT-4応答の同じレベルの阻害はペプチドを約55±4μMで用いることを必要とした。
【０２０９】
環状ペプチドN-Ac-CRGEC-NH2と同様に、N-Ac-CSRRGEC-NH2ペプチドもそのNGFもしくはNT-3等価物もNTリガンドを補足していない対照培地においては基本神経突起成長に対するいかなる効果もなかった。これらのペプチドを、N-カドヘリン、FGF2またはCB1受容体アゴニストを含む、他の作用物質によって刺激された神経突起成長応答を阻害する能力についても試験した。これらの作用物質によって生じる細胞成長応答は他所に記載されており（Williams et al., J. Cell Biol. 2003, 160：481-486）、特には、Trk受容体が関与するものとは考えられない。それらの実験からの結果を図8に示す。特には、環状ペプチドは、NT-4およびBDNF応答を完全に阻害する濃度で投与されたときでさえ、これらの応答のいずれをも阻害することがなかった。これらのデータは、本発明の環状ペプチドおよびペプチド模倣体が神経突起成長に対する非特異的な効果なしにTrk受容体機能を完全に阻害できることを確証する。
【０２１０】
直鎖ペプチドN-Ac-SRRGELA-NH2の効果をNT-4、BDNFおよび前述の他の作用物質に対する神経突起成長アッセイにおいても評価した。これらの結果も図8に示す。期待されるように、このペプチドの環状体がNT-4およびBDNF応答の両者の強力な阻害剤であったのに対して、直鎖ペプチドは、125μMまでの濃度で試験したときでさえ、いずれの応答をも阻害することがなかった。したがって、RGEモチーフを含むペプチドおよびペプチド模倣体は、機能的Trk受容体アンタゴニストであるために、例えばジスルフィド結合によって、拘束される必要がある。
【０２１１】
7．5．TRKBアゴニストペプチドの開発
NT-4/TrkB受容体複合体の結晶構造において、NT-4におけるSRRGEモチーフはNT-4二量体においてそれ自体と逆平行に伸びる。対応するモチーフはNGF/TrkA受容体複合体の結晶構造において同様の逆平行整列を示す。従来、「縦列反復」模倣アプローチがN-カドヘリンのペプチドアゴニストの開発に用いられている。Williams et al., J. Biol. Chem. 2002, 277：4361-4367を参照のこと。ニューロトロフィンにおけるRGEモチーフの逆平行整列は、「縦列反復」アプローチをTrk受容体アゴニストペプチドの開発に用いることもできることを示唆する。
【０２１２】
分子モデル形成は、NT-4 SRRGEL配列の縦列反復が環状ペプチドN-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2（このペプチドは、ここでは、「BAG」ペプチドとも呼ばれる）内で2つのTrkB受容体モノマーの同時巌合を許容する様式で拘束され得るという仮説を支持する。この点を強調するBAGペプチドのモデル化構造を図9に示す。したがって、神経突起成長に対するBAGペプチドの効果を前記セクション7．3において説明されるアッセイにおいて試験した。
【０２１３】
そのような実験からの結果を図10Aに図示する。ペプチドが神経突起成長を用量依存性の様式で刺激し、EC50が約300nMであり、約600Nmでほぼ最大応答であることを理解することができる。天然リガンドBDNFおよびNT-4と同様に、BAGペプチドに対する神経突起成長の応答は二相性である（図7Aおよび10Aを比較）。次に、軸索成長を刺激するBAGペプチドの能力を確立された成長促進性ペプチドと比較した。図10Bに図示されるこれらの実験からのデータは、6μMで、NT-R、BDNFおよびFGF2の最大活性濃度と同じ程度にBAGペプチドが軸索成長を促進することを示す。
【０２１４】
7．6．TRKBアンタゴニストはアゴニストペプチド応答を阻害する
BAGペプチドがモノマーペプチドアンタゴニストと同じ部位に結合することによってTrk受容体を活性化する（前記セクション7．3-7．4において説明される）ことを立証するため、実験を行ってペプチドアンタゴニストN-Ac-CSRRGEC-NH2が神経突起成長に対するBAGペプチドの効果を阻害できるかどうかを決定した。それらの結果を図11に示す。
【０２１５】
125μMで、TrkBアンタゴニストペプチドは最大活性濃度のBAGペプチドの活性を完全に阻害することができた。対照的に、このペプチドの直鎖体（すなわち、ペプチドN-Ac-SRRGELA-NH2）の神経突起成長アッセイにおけるBAGペプチド活性に対する効果は非常に僅かなものからまったくないものであった。比較的特異的なTrk受容体アンタゴニストであることが報告されている化合物であるK252a（Tapley et al., Oncogene 1992, 7：371-381）もBAGペプチドに対する神経突起成長の応答を完全に阻害した。しかしながら、特異的FGF受容体アンタゴニストであるPD17304はその応答を阻害することがなかった。
【０２１６】
これらのデータは、RGEモチーフに基づく「縦列反復」環状ペプチドおよびペプチド模倣体がTrk受容体の特異的かつ有効なアゴニストであることを証明する。
【０２１７】
7．7．TRKアゴニストはニューロン成長の阻害剤に打ち勝つ
この例は、ニューロン成長を通常は阻害する条件下でのTrk受容体アゴニストの効果を研究する追加実験を説明する。特には、これらの実験は、天然Trk受容体リガンドとは異なり、本発明のTrk受容体アゴニストが阻害性分子および／またはそれらの受容体の活性を相殺可能であることを実証する。
【０２１８】
7．7．1．材料および方法
試薬および培養処理。ここで別段の注記がない限り、このセクションにおいて記載される実験における試薬は前記セクション7．1．3以下に記載されるように入手した。特には、組換えヒトFGF2およびBDNFはR&D systems（Minneapolis、MN）から入手し、5ng/mlの最終濃度で用いた。Trk受容体アゴニストK252aはCalbiochem（San Diego、CA）から入手し、100nMの最終濃度で用いた。TrkアゴニストペプチドBAG（配列番号18）は商業供給者（Multiple Peptide Systems、San Diego、CA）から入手した。組換えMAG-FcキメラはR&D Systems（Minneapolis、MN）から入手し、5-25μg/mlの最終濃度で用いた。GT1bに対するモノクローナル抗体（クローンGMR5）はSeikagaku America（Falmouth、MA）から入手し、20μg/mlの最終濃度で用いた。p75NTRウサギポリクローナル抗体は、従来記述されるように（Huber & Chao, Dev. Biol. 1995, 167：227-238を参照）、その受容体の細胞外ドメインに対して生じさせ、血清の1：200希釈で用いた。公知PKA阻害剤KT5720およびH-89はCalbiochem（San Diego、CA）から入手し、それぞれ、200および400nMの最終濃度で用いた。公知PI3K阻害剤WortmnanninおよびLY294002もCalbiochem（San Diego、CA）から入手し、両者とも10μMの最終濃度で用いた。Rhoキナーゼ阻害剤Y27632はTocris（Bristol、UK）から入手し、10μM最終濃度で用いた。
【０２１９】
すべての試薬は同時培養培地で希釈し、一般には、ニューロンの塗布直前に培養に添加した。例外はp75NTR受容体に対して生じさせた抗血清であった。代わりに、高密度ニューロン懸濁液をその血清の1：200希釈で60分間処理した。その後、ニューロンを約20倍に希釈し、培養のために播種した。培養中のp75NTR抗体の残量は血清の約1：5000希釈であると見積もられる。別の対照実験は、1：1000の希釈でこの抗体が神経突起成長になんら効果がないことを立証しており、これらの実験に用いられた1：5000希釈は、最大でも、無視できる効果しかないことが証明される。
【０２２０】
神経突起成長アッセイ。神経突起成長アッセイは前記セクション7．1．1において説明される通りに行った。
【０２２１】
7．7．2．結果
Trk受容体アゴニストBAGはMAG阻害活性をブロックする。ミエリン関連糖タンパク質（MAG）は、従来、出生後第2-3日ラット小脳ニューロンからの神経突起成長応答を、細胞基質における形質移入分子としてそれらの細胞に提示されるとき（Mukhopadhyay et al., Neuron 1994, 13：757-767）または可溶性Fcキメラタンパク質として添加されるとき（Tang et al., Mol. Cell. Neurosci. 1997, 9：333-346）、阻害することが示されている。それらの研究の促進において、出生後第3日小脳ニューロンをLK8細胞、形質移入されたN-カドヘリンを発現し、かつ強い神経突起成長応答を促進することが従来示されている（Williams et al., Neuron 1994, 13：583-594）3T3線維芽細胞株、の単層上で培養した。細胞を、培養培地中に0、5または25μg/mlの濃度で存在する可溶性MAG-Fc融合タンパク質と共に培養した。期待されるように、MAG-Fcは神経突起成長を用量依存性の様式で阻害し、25μg/mlの濃度で培養培地中に存在するとき、約40％の阻害応答であった（図12を参照）。
【０２２２】
従来の報告は、MAGのような阻害剤がRhoAおよび／またはその下流エフェクターRhoキナーゼの活性化によってそれらの効果（1以上）に介在することを示唆している。例えば、Dergham et al., J. Neurosci. 2002, 22：6570-6570；Fournier et al., J. Neurosci. 2003, 23：1416-1423；およびLehmann et al., J. Neurosci. 1999, 19：7537-7547を参照のこと。これらの報告を確認するため、その上細胞を、10μMの濃度で培養培地に含まれる公知Rhoキナーゼ阻害剤Y27632（Narumiya et al., Methods Enzymol. 2000, 325：273-284；Davies et al., Biochem. J. 2000, 351：95-105）と共に培養した。期待されるように、MAG-Fcは、25μg/mlという高い濃度で培養培地中に存在するときでさえ、これらの条件下では神経突起成長を阻害することがない（図12）。
【０２２３】
存在するのであればMAGのような阻害剤に対するTrkアゴニストが有し得る効果が何であるのかを研究するため、追加神経突起成長実験を行った。これらの実験においては、6μMの濃度で培養培地中に存在するTrkアゴニストポリペプチドBAG（配列番号18、上記セクション7．5において説明される）と共にニューロンを培養した。驚くべきことに、MAG-Fcは、25μg/mlという高い濃度で培養培地中に存在するときでさえ、これらの条件下では神経突起成長を阻害することができなかった（図12）。対照的に、ニューロトロフィンBDNFが培養培地中に5ng/mlの濃度で存在するとき、MAG応答に対する測定可能な効果は存在しなかった−すなわち、MAG-Fcは神経突起成長を阻害し続けた（図12）。この結果は、ニューロン細胞がMAGおよびミエリンの阻害活性を回避するのにニューロトロフィンで「準備刺激」されなければならないとする従来の報告と一致する（Cai et al., Neuron 1999, 22：89-101を参照）。
【０２２４】
MAG阻害活性をブロックするBAGポリペプチドの能力をさらに研究するため、そのポリペプチドを神経突起成長アッセイにおいて様々な異なる培養培地中の濃度で試験した。これらの実験の結果を図13に図式的に示す。これらのデータは、BAGポリペプチドが、培養培地中に30nMという低い濃度で存在するとき、約100ないし200nMの濃度で存在するときの最大応答の半分でMAG阻害剤活性を有効にブロックすることを示す。
【０２２５】
これらの実験からの結果が神経突起成長においてN-カドヘリン化合物のあらゆる特異的MAG阻害によって生じないことを確認するため、形質移入N-カドヘリンを発現しない3T3線維芽細胞の単層上で培養されたニューロンも用いて実験を行った。これらの実験からのデータを示す棒グラフを図14に示す。これらの条件下で細胞を培養するときは基本神経突起成長応答が低いが、それに関わらずMAG-Fcは、25μg/mlで存在するとき、神経突起成長の測定可能かつ実質的な阻害を生じる。MAG-Fcが存在しない状態では、神経突起成長の基本レベルは既に強固なものであり、BAGポリペプチドは、培養培地中に6μMの濃度で存在するとき、実質的な効果を持たない。しかしながら、図14の検査はこの濃度でのTrk受容体アゴニストがMAG応答を有効にブロックすることを明らかにし、それ故、MAG-Fcは25μg/mlの最終濃度で存在するときに神経突起成長を阻害することができない。前と同様に、かつここでもやはりBAGの効果とは対照的に、ニューロトロフィンBDNFには、5ng/mlの濃度で存在するとき、MAG-Fcによって刺激された阻害応答に対する明らかな効果がない。
【０２２６】
これらの実験は、BAGポリペプチドなどのTrk受容体アゴニストを用いてMAGなどのシグナル分子によって生じる阻害性応答を有効に防止または低減できることを立証している。加えて、これらの実験からの結果は、Trk受容体アゴニスト（例えば、BAG）が、阻害性環境、例えば、分子MAGによる阻害性シグナル伝達の存在下において投与されたときでさえ、ニューロンの成長および回復を促進することを示す。
【０２２７】
BAGはGT1bによる阻害をブロックする。GT1bの阻害活性を回避するBAGポリペプチドの能力も神経突起成長アッセイにおいて処理した。従来の報告は、小脳顆粒細胞からの神経突起成長を阻害することができるGT1bに対する多価IgM抗体を記述している（Vinson et al., J. Biol. Chem. 2001, 276：20280-20285）。これらの報告を確認するため、小脳ニューロンをN-カドヘリン発現3T3細胞の単層上、対照培地および20μg/mlのGT1bに対するモノクローナル抗体を含有する培地の両者において培養した。これらの実験からのデータを図15の棒グラフに示す。従来の報告と一致して、これらの細胞と20μg/mlの抗体との同時培養はこれらの条件下で神経突起成長を強固に阻害する。図15において（1）と表示される柱を同じ図における柱Cと比較のこと。細胞と10μMのRhoキナーゼ阻害剤Y27632との同時培養はこの効果を有効に打ち消し、GT1b受容体がそのシグナルカスケードにおける下流エフェクターとしてのRhoキナーゼに関与するという従来の報告が確認される（Vinson et al., J. Biol. Chem. 2001, 276：20280-20285を参照）。驚くべきことに、Trk受容体アゴニストBAGが培養培地中に（6μM）GT1bに対する抗体と共に存在するとき、その抗体の阻害剤効果が有効に排除され、すなわち、抗体が培養培地中に存在しないときに見られるものに匹敵するレベルの神経突起成長が観察される。図15において（2）と表示される柱を同じ図における柱Cと比較のこと。
【０２２８】
これらの結果は、Trk受容体アゴニスト、例えば、BAGポリペプチドを用いてそのような受容体、例えば、GT1bによって生じる阻害活性を有効に低下または防止できることを示す。加えて、これらの実験からの結果は、Trk受容体アゴニスト（例えば、BAG）が、阻害性環境、例えば、GT1bによる阻害性シグナル伝達の存在下において投与されたときでさえ、ニューロンの成長および回復を促進することを示す。
【０２２９】
BAGはp75NTRによる阻害をブロックする。ミエリン中の阻害性分子は直接またはp75NTR受容体を介して間接的にシグナル伝達をするものと考えられるため、受容体の阻害活性を回避するBAGペプチドの能力も研究した。まずこの受容体からのシグナル伝達が神経突起成長を阻害することを検証するため、小脳ニューロンをN-カドヘリン発現3T3細胞の単層上、対照培地およびp75NTRに対するポリクローナル抗体（1：200血清希釈）を含有する培地の両者において培養した。
【０２３０】
これらの実験からのデータを図16に棒グラフで表す。抗体で60分の細胞の予備処理は、図16の棒グラフにおける（1）と表示される柱とCとを視認比較することによって理解できるように、引き続くニューロンの成長を有効に阻害する。MAGおよびGT1bと同様に、p75NTRに対する抗体は、抗体処理の直後にRhoキナーゼ阻害剤Y27632が10μMの最終濃度でニューロンに添加されるとき、阻害性応答を誘起しない（図16の柱（2）を参照）。同様に、6μMの最終BAGポリペプチド濃度でのニューロンの培養もp75NTR抗体の阻害効果を有効にブロックする。しかしながら、ニューロトロフィンBDNF（最終濃度5ng/ml）との細胞の培養には、p75NTR抗体によって誘発される阻害性応答に対する有意の効果がない。
【０２３１】
細胞培養物が処理後に幾らかの残留量の抗体（約1：5000血清希釈以下と見積もられる）を含み得るため、培地中に1：1000血清希釈のポリクローナル抗体と共に細胞を培養する対照実験を行った。このレベルでの抗体の存在には神経突起成長に対する測定可能な効果はなく、これらの実験において観察される効果が処理後に残留し得る非常に低レベルの残留抗体によっては生じないことが示される。
【０２３２】
これらの実験からの結果は、Trk受容体アゴニスト、例えば、BAGポリペプチドを用いて、p75NTR経路によって生じる阻害性応答を有効に低減または防止できることを示す。加えて、これらの結果は、Trk受容体アゴニスト（例えば、BAG）が、阻害性環境、例えば、p75NTRによる阻害性シグナル伝達の存在下で投与されるときでさえ、ニューロンの成長および回復を促進することを示す。
【０２３３】
BAGシグナル伝達にはPKAおよびPI3Kが介在する。Trk受容体アゴニストが阻害性シグナルをブロックできる機構をさらに研究するため、小脳ニューロンを3T3単層上、対照培地またはBAGポリペプチド（最終濃度6μM）、ニューロトロフィンBDNF（最終濃度5ng/ml）またはFGF2（最終濃度5ng/ml）のいずれかの最大活性濃度と決定されているものを補足した培地において18時間培養した。これらの実験からの知見を図17に棒グラフで表す。これらの条件下で、3種類の因子（BAG、BDNFおよびFGF2）の各々は神経突起長を対照培養と比較して約60-70％高める。比較的特異的なTrk受容体アンタゴニストであると報告されている化合物であるK252a（Tapley et al., Oncogene 1992, 7：371-381）を100nMの最終濃度で培養培地に含めたとき、BAGおよびBDNFの両者によって生成される成長応答は本質的に消失した。しかしながら、FGF2によって生成される成長応答は無影響であり、Trk受容体のものとは異なり、特には、PKAまたはPI3Kのいずれにも関与しないシグナル伝達カスケードによってFGF2が神経突起正当を促進することを示唆する報告を確証する（Williams et al., Cell Biol. 2003, 160：481-486を参照）。
【０２３４】
同様の実験において、ニューロン細胞をプロテインキナーゼA（PKA）阻害剤KT5720（最終濃度200nM）もしくはH-89（最終濃度400nM）またはホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）阻害剤Worthmannin（最終濃度10μM）もしくはLY294002（最終濃度10μM）のいずれかと共に対照培地で培養した。Trk受容体アンタゴニストと同様に、BAGおよびBDNFの両者に対する神経突起成長応答はこれらのキナーゼ阻害剤によって本質的に消失した。期待されるように、FGF2に対する神経突起成長応答は無影響であった。
【０２３５】
これらの結果は、活性化Trk受容体が、PKAおよびPI3Kの両者の活性化が関与する機構（1以上）によって神経突起成長を刺激することを示す。したがって、本発明のTrkアゴニスト（例えば、BAGポリペプチド）は様々な阻害性シグナルのブロックまたは低減に有効であり得る。特には、本発明のTrkアゴニストは、PKAまたはPI3Kのいずれかによって阻害または不活性化される1種類以上の成分を伴うシグナルカスケードが介在する阻害性シグナルのブロックに有効であり得る。
【０２３６】
一例としてであって限定としてではないが、PKAはRhoを、その分子のSer188の直接リン酸化によって不活性化することが報告されている（Ellerbroek et al., J. Biol. Chem. 2003, 278：19023-19031）。したがって、本発明のTrkアゴニストを用いて、Rhoが関与する阻害性カスケードが介在するシグナルをブロックまたは低減することができる。これらには、とりわけ、ミエリン阻害剤、例えば、MAG（またはMAG融合構築体、例えば、MAG-Fc）、Nogo-A、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質、NgR、GT1bおよびp75NTRが介在する阻害性シグナルに加えて、CNSグリア瘢痕に由来する硫酸コンドロイチンプロテオグリカンが介在するシグナルが含まれる（Monnier et al. Neurosci. 2003, 22：319-330）。別の非限定的な例として、PI3Kの活性化はセマホリンの阻害活性に打ち勝つものと期待される（Eickholt et al., J. Cell Biol. 2002, 157：211-217）。実際、ニューロトロフィンは、ニューロンにおけるTrk-PI3Kカスケードの活性化によるそのような阻害剤シグナル伝達に打ち勝つことが報告されている（Atwal et al., J. Neurosci. 2003, 23：7602-7609）。したがって、本発明のTrkアゴニストを用いてこれらの阻害性シグナルを同様にブロックまたは低減することができる。
【０２３７】
7．8．さらなるTRKアゴニスト化合物
この例は、先行する例において説明されるBAGポリペプチドに基づくか、またはそれから誘導されるさらなるペプチドおよびペプチド模倣性化合物を説明する。これらの新規化合物もTrk受容体アゴニストとしての活性を示すことを実証する生物学的アッセイからのデータも示す。
【０２３８】
7．8．1．新規Trk受容体アゴニスト
前記BAGポリペプチド−すなわち、CSRRGELAASRRGELC（配列番号17）のアミノ酸配列に基づいて以下のペプチドおよびペプチド模倣体を設計した。ここでhBAG2、riBAG1およびhriBAG2と呼ばれるこれらの新規化合物を下記表1に示す。
【０２３９】
【表５】
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【０２４０】
上記表1において、小文字の「c」は、アミノ末端アミノ酸残基をカルボキシ末端アミノ酸残基に接続するペプチドまたはアミド結合による環状化を表すのに用いられる。したがって、hBAG1ポリペプチド（配列番号39）は、好ましくは、N末端セリン残基をC末端ロイシン残基に接続するアミド結合を含む。同様に、ペプチドhriBAG2（配列番号41）は、好ましくは、N末端ロイシン残基をC末端セリン残基に接続するアミド結合を含む。
【０２４１】
表1におけるアミノ酸残基の前の小文字「d」は、その残基が（L-アミノ酸に対する）D-アミノ酸であることを表す。したがって、ポリペプチドriBAG1およびhriBAG2は、好ましくは、D-アミノ酸残基を含む。実際、これらのポリペプチドにおけるすべてのアミノ酸は（Lアミノ酸残基でもDアミノ酸残基でもないグリシン残基を除いて）、好ましくは、D-アミノ酸残基である。
【０２４２】
riBAG1およびhriBAG2アミノ酸配列（配列番号40および41）の視認検査で、これらの配列がBAGポリペプチド配列（配列番号17）の逆配列であることは容易に明らかである。特には、当業者に明らかなように、D-アミノ酸残基の配列を含む本発明のポリペプチドはL-アミノ酸の逆配列を含むポリペプチドの三次元立体配座に実質的に類似するか、または同一である三次元構造（すなわち、「立体配座」）に適合するものと期待される。したがって、前述のL-アミノ酸残基のポリペプチドに加えて、本発明はD-アミノ酸残基の逆配列を有するポリペプチドも考慮する。したがって、好ましい実施形態の1つにおいて、本発明のペプチドまたはペプチド模倣体は前記Arg-Gly-Glu（すなわち、「RGE」）モチーフを含むL-アミノ酸残基の配列を含む。したがって、本発明は、代わりの実施形態において、短い直鎖配列モチーフdGlu-Gly-dArg（すなわち、「dEGdR」）を含むD-アミノ酸残基の配列を含むペプチドおよびペプチド模倣体も提供する。
【０２４３】
そのようなD-アミノ酸残基を含む本発明のペプチドおよびペプチド模倣体はより安定であり、イン・ビボで、例えばタンパク分解酵素により、容易に分解することが少ないものと期待される。同様に、環状アミド結合、例えば、hBAG2およびhriBAG2ポリペプチドにおいて用いられるものもイン・ビボで容易に分解することが少ないもの期待される。短縮化ペプチド（例えば、BAGと比較して2個の末端システインおよび2個の中央アラニンを欠くhBAG）は血液−脳関門をより通過するものと思われる。したがって、そのようなペプチドは、例えば医薬組成物における使用および個体への投与に、より好ましいものであり得る。
【０２４４】
7．8．2．生物学的活性
hBAG2、riBAG1およびhriBAG2ポリペプチドを基質ベースのアッセイにおいて試験し、阻害性環境において神経突起成長を促進するそれらの能力を評価した。特には、上で論じられるように、ミエリン関連糖タンパク質（MAG）が神経突起成長応答を阻害することが従来示されている。例えば、Mukhopadhyay et al., Neuron 1994, 13:757-767；およびTang et al., Mol. Cell. Neurosci. 1997, 9:333-346を参照のこと。前述の例において示されるように、Trk受容体アゴニスト、例えば、BAGポリペプチドはMAG阻害活性をブロックし、その阻害性環境（すなわち、MAGの存在下）において神経突起成長を促進することが可能である。ここで説明される実験において示されるデータは、hBAG2、riBAG1およびhriBAG2ポリペプチドもMAG阻害活性をブロックし、神経突起成長を促進することを示す。
【０２４５】
材料および方法
簡潔に述べると、標準プラスチック8チャンバー組織培養スライドを、以下のように：（a）ポリリジン；（b）ポリリジン並びにヤギ抗ヒトIgGおよびフィブロネクチンの混合物；または（c）ポリリジン、ヤギ抗ヒトIgG（Fc-特異的）およびフィブロネクチンの混合物並びにMAG-Fcのいずれかでコートした。まず、スライドを蒸留水（「dH2O」）中17μg/mlのポリリジンを用いて室温で30分間コートする。ウェルを吸引した後、抗ヒトIgGおよび／またはフィブロネクチン（両者ともDMEM中10μg/ml）の混合物をそれらの化合物でコートしようとするウェルに添加し、120分間インキュベートする。それらのウェルを再度吸引し、（ウェルをMAG-Fcでコートするため）MAG-Fc（DMEMおよび10％FCS中0.25μg/ml）と共に60分間インキュベートする。次に、PND2/3ラット小脳ニューロンを15Kで各ウェルの、最終培地容積を各ウェルにおいて300μlとした、DMEM、10％FCS、25mM KClおよび5ng/ml FGF2中に添加する。小脳ニューロンを27時間培養した後、固定してGAP-43について染色する。ポリリジン、ヤギ抗ヒトIgG（Fc-特異的）およびフィブロネクチンはSIGMA（St. Louis、Missouri）から入手可能である。
【０２４６】
結果。ニューロン当たりの最長神経突起の平均長を決定した。約9μmの基本神経突起長がポリリジン基質で観測された。ポリリジン／フィブロネクチン基質では神経突起成長が約24μmに増加した。追加MAG-Fcコーティングを有するウェルにおいては神経突起成長が約15μmに減少した。図18Aは3種類のペプチド模倣体の用量応答曲線を示す。ペプチド模倣体hriBAG2（配列番号40）は阻害性環境において実質的な用量依存性神経突起成長を促進した。神経突起成長応答は約10μg/mlの用量で観察することができ、33μg/ml（試験した最高濃度）の用量でペプチド模倣体なしに阻害性環境において見られる値のほぼ倍である。hBAG2（配列番号39）は33μg/mlの用量で神経突起成長を促進する。riBAG（配列番号41）は同じ濃度では神経突起成長を促進することがない。
【０２４７】
図18Bは、BDNF、BAG、hriBAG2、hBAG2またはriBAGの存在下、阻害性環境における神経突起成長を表す棒グラフを示す。BDNFは10μg/mlおよび100μg/mlの濃度で神経突起成長に対する効果がない。BAGペプチドは10μg/mlおよび100μg/mlの両者の濃度で神経突起成長を促進する。33μg/mlの濃度のhriBAG2はあらゆる濃度のBDNF、BAGペプチド、並びにhBAG2およびriBAG1を実質的に上回る程度まで神経突起成長を促進した。33μg/mlの濃度のhBAG2は10μg/mlの濃度のBAGポリペプチドに匹敵する程度まで神経突起成長を促進した。
【０２４８】
これらの結果は、他のペプチドおよびペプチド模倣体、例えば、本出願のBAGペプチド誘導体が、阻害性環境において、BAGポリペプチドに匹敵するか、またはそれを上回る程度まで神経突起成長を促進できることを示す。
【０２４９】
7．9．p75受容体結合剤はニューロン成長の阻害を克服する
この例は、通常はニューロン成長を阻害する条件下でのp75受容体結合剤の効果を研究する実験を説明する。特には、これらの実験は、p75受容体結合剤が阻害性分子および／またはそれらの受容体の活性を相殺することを示す。
【０２５０】
神経突起成長アッセイ
親3T3細胞またはLK8細胞（生理学的レベルの幼鶏N-カドヘリンを発現する確立された形質移入3T3細胞株：Doherty et al., Neuron 1991, 6:247-258を参照）のいずれかの単層上での小脳ニューロンの同時培養をWilliamsら（Neuron 1994, 13:583-594）によって従来記述されるように確立した。これら細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したダルベッコ改変イーグル培地において維持した。これらの小脳ニューロンはTrkB受容体を発現し、機能的レベルのTrkA受容体は発現しない。
【０２５１】
同時培養を確立するため、約80,000の3T3細胞（またはLK8細胞）を、ポリ-L-リジンおよびフィブロネクチンをコートした8チャンバー組織培養スライドの個々のチャンバーに塗布した。塗布した細胞を10％FCSを補足したダルベッコ改変イーグル培地（「DMEM」）において一晩維持し、集密単層を形成させた。培地を除去し、約6,000の分離した小脳ニューロン（出生後第2/3ラットから採取）を各ウェル内の2％FCSを補足したSATO培地中に塗布した。試験試薬を本文中で指示されるように添加し、同時培養を23時間維持した。次に、同時培養物を固定し、GAP-43免疫反応性について染色した。細胞当たりの最長神経突起の平均長を、ここでもやはりWilliamsら（Neuron 1994, 13:583-594）によって従来記述されるように、約120ないし150のニューロンについて測定した。
【０２５２】
試薬
組換えヒトNGFおよびBDNFはR&D systems（Minneapolis、MN）から入手した。合成ペプチドはすべて商業供給者（Multiple Peptide Systems、San Diego、CA）から入手した。すべてのペプチドは定型法に従って逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって精製し、最高レベルの純度（すなわち、95%を上回る純度）で得た。
【０２５３】
p75受容体結合剤は阻害性環境におけるニューロトロフィン介在ニューロン成長を促進する。ミエローマ関連糖タンパク質（MAG）は、出生後第2-3日ラット小脳ニューロンからの神経突起成長応答を、それらの細胞に細胞基質内のトランスフェクトされた細胞として提示されるとき（Mukhopadhyay et al., Neuron 1994, 13:757-767）または可溶性Fcキメラタンパク質として添加されるとき（Tang et al., Mol. Cell. Neurosci. 1997, 9:333-346）、阻害することが従来示されている。それらの研究の推進において、出生後第3日小脳ニューロンを、形質移入N-カドヘリンを発現し、かつ強固な神経突起成長応答を促進することが従来示されている（Williams et al., Neuron 1994, 13:583-594）3T3線維芽細胞株であるLK8細胞の単層上で培養した。細胞は、培養培地中に0、5または25μg/mlの濃度で存在する可溶性MAG-Fc融合タンパク質と共に培養した。期待されるように、MAG-Fcは神経突起成長を用量依存性の様式で阻害し、培養培地中に25μg/mlの濃度で存在するとき、約40％の阻害応答であった、したがって、可溶性MAG-Fc融合タンパク質を含有するこの培養培地は阻害性培養培地である。
【０２５４】
この阻害性培養培地に、1ng/mlのBDNF、10ng/mlもしくは100ng/mlのNGF、NGF（10ng/mlもしくは100ng/ml）と組み合わせたBDNF（1ng/ml）、100μg/mlの、p75受容体に結合するNGF内のループ1モチーフの拘束モノマー（N-Ac-CTDIKGKEC-NH2）、またはBDNF（1ng/ml）と組み合わせたNGFループ1ペプチド（100μg/ml）をさらに補足した。MAG-Fcのみを含有する成長培地が対照であった。ニューロトロフィンBDNFが阻害性培養培地中に1ng/mlの濃度で存在するとき、MAG応答に対する測定可能な効果は存在しなかった−すなわち、MAG-Fcは神経突起成長を阻害し続けた。BDNFと同様に、10ng/mlまたは100ng/mlの濃度のNGFはMAG-Fcの存在下では神経突起成長を刺激することがなかった（図19）。個々の実験からのデータにおいて、10ng/mlおよび100ng/mlのNGFで得られた結果は明瞭に異なることはなく、したがって、これらのデータはプールされた。これらの結果は、MAGおよびミエリンの阻害活性を回避するにはニューロン細胞をニューロトロフィンで「準備刺激」しなければならないとする従来の報告と一致する（Cai et al., Neuron 1999, 22:89-101を参照）。
【０２５５】
NGFループ1結合性モチーフの拘束モノマーのみもMAG-Fcの存在下においては神経突起成長に対する効果がなかった（図19）。しかしながら、BDNFと組み合わせたNGFループ1ペプチドは有意の神経突起成長応答を生じた。加えて、BDNFおよびNGFを1：10または1：100（BDNF対NGF）の比で一緒に添加したときも（図19）、有意の神経突起成長応答が観察された。
【０２５６】
これらの実験からの結果は、NGFおよびBDNFが阻害性環境に投与されるとき、NGFがBDNFに神経突起成長を促進させることを示唆する。加えて、これらの結果は、NGF内の第1βヘアピンループの拘束モノマーの投与がBDNFに阻害性環境におけるCNSニューロンの成長を促進させることを示す。
【０２５７】
7．10．脊髄損傷の患者の治療
ある患者が胸髄損傷と診断され、足の感覚および運動活動を喪失している。その患者は胸椎を安定化する手術を受ける。軟組織および骨の壊死組織切除の後、損傷脊髄が露出される。p75受容体結合剤を含有する無菌薬用粉末を無菌正常生理食塩水と混合してゲルを形成する。外科医がそのp75受容体結合剤ゲルを脊髄の露出表面に局所塗布する。通常の方式で安定化手順を完了する。術後、下端の感覚および／または運動活動における改善について患者を観察する。
【０２５８】
8．引用参考文献
特許、特許出願および様々な刊行物を含む多くの参考文献が本発明の説明において引用および考察される。そのような参考文献の引用および／または考察は単に本発明の説明を明瞭にするために示され、あらゆるそのような参考文献がここで説明される発明の「先行技術」であることを承認するものではない。本明細書において引用および／または考察されるすべての参考文献（GenBank、PDBまたは他の公的データベースにおける生物学的配列または構造への参照を含む）は、参照によりそれら全体が、各々の参考文献が参照によりここに組み込まれる場合と同じ程度まで、ここに組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【外国語明細書】
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