(57)【要約】【課題】日常的に摂取している天然物であるコーヒーの、生豆抽出物を用いて、脂肪細胞の数をコントロールし、脂肪組織を大きくしないようにすることができるメタボリックシンドローム予防剤を提供する。【解決手段】コーヒー生豆抽出物を含有するメタボリックシンドローム予防剤であって、抽出物中の関与成分が、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡ、５−ＣＱＡ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ、３−ＦＱＡ、４−ＦＱＡ、５−ＦＱＡからなる群から選ばれた少なくとも１種の成分であり、コーヒー生豆抽出物は、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有の抽出物である【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー生豆抽出物を含有する剤であって、抽出物中の関与成分が、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡ、５−ＣＱＡ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ、３−ＦＱＡ、４−ＦＱＡ、５−ＦＱＡからなる群から選ばれた少なくとも１種の成分であることを特徴とするメタボリックシンドローム予防剤。
【請求項２】
前記コーヒー生豆抽出物は、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のメタボリックシンドローム予防剤。
【請求項３】
超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する、メタボリックシンドローム予防剤。
【請求項４】
脂肪蓄積抑制作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のメタボリックシンドローム予防剤。
【請求項５】
前駆脂肪細胞から脂肪細胞に至るまでの脂肪細胞分化抑制による脂肪組織量減少促進作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のメタボリックシンドローム予防剤。
【請求項６】
脂肪細胞増殖抑制による脂肪組織量減少促進作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のメタボリックシンドローム予防剤。
【請求項７】
アポトーシス誘導による脂肪組織量減少促進作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のメタボリックシンドローム予防剤。
【請求項８】
超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する抗肥満剤。
【請求項９】
超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する脂肪蓄積抑制剤。
【請求項１０】
超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する、前駆脂肪細胞から脂肪細胞に至るまでの脂肪細胞分化抑制による脂肪組織量減少促進剤。
【請求項１１】
超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する、脂肪細胞増殖抑制による脂肪組織量減少促進剤。
【請求項１２】
超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する、アポトーシス誘導による脂肪組織量減少促進剤。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかにおいて、前記脂肪は、胴回り及び内臓に分布する白色脂肪であること。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれかにおいて、前記コーヒー生豆抽出物中の関与成分が、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡ、５−ＣＱＡ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ、３−ＦＱＡ、４−ＦＱＡ、５−ＦＱＡからなる群から選ばれた少なくとも１種の成分であること。
【請求項１５】
請求項２，３，８〜１２のいずれかにおいて、前記超臨界流体処理工程は、超臨界流体の二酸化炭素を用いて、圧力１０ ＭＰａ以上の高圧、６５〜８０℃の高温で、抽出処理されること。
【請求項１６】
請求項１５の超臨界流体処理工程において、原料となるコーヒー生豆は、粉砕径３〜５ｍｍとすること。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載の剤を含有する医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載の剤を含有する飲食品。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかに記載の剤を含有する化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織量を減少・適正化させることができ、肥満の解消・抑制、延いてはメタボリックシンドロームを予防し得る剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のライフスタイルの変化によって過栄養、運動不足を来たし、肥満や代謝異常が問題となっている。肥満、すなわち、脂肪組織における脂肪細胞の増加並びに肥大化は、インスリン抵抗性（血中のインスリン濃度に見合ったインスリン作用が得られない状態）が高くなり、また脂肪組織における炎症を引き起こし、さらには、アディポサイトカイン（脂肪細胞からの内分泌因子）の生産・分泌異常を招き、糖尿病、高血圧症、高脂血症、ひいては動脈硬化症の危険因子につながる（図１を参照）。
このようなリスクファクターの複数重なった状態は、メタボリックシンドロームとして定義されており、今日、その予防・対策が重要視されている。従って、メタボリックシンドロームに対する根本的な対策として、重要な病態である内臓脂肪蓄積の減少などを中心とした肥満の予防・解消の意義は極めて大きいと言える。
【０００３】
特に近来、細胞増殖に相反して作用するｐ２７とＳｋｐ２の二種類のノックアウトマウスを用いた解析により、脂肪細胞数の増加が脂肪組織の肥大化を通してメタボリックシンドロームの一因となり得ることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。このことからも、脂肪細胞の肥大化の抑制、数の増加の抑制を行うことがメタボリックシンドローム予防に有用であると考えられる。
【０００４】
一般に、抗肥満作用のある医薬品での治療は他の医薬品との併用上の制約があり、副作用を招くなどの危険を伴うため、日常的に摂取している天然物由来の抽出物で脂肪細胞の数をコントロールし、メタボリックシンドロームを予防できるものが望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】阪上浩  セラピューティック・リサーチ Vol.26 p.1578 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記状況に鑑みて、本発明は、日常的に摂取している天然物であるコーヒーの、生豆抽出物を用いて、脂肪細胞の数をコントロールし、脂肪組織を大きくしないようにすることができるメタボリックシンドローム予防剤を提供することを目的とする。
特に、コーヒー生豆の抽出物において、インスリン抵抗性を助長し得るカフェイン未含有のコーヒー生豆の抽出物を用いたメタボリックシンドローム予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成すべく、本発明のメタボリックシンドローム予防剤は、コーヒー生豆抽出物を含有するメタボリックシンドローム予防剤であって、抽出物中の関与成分が、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡ、５−ＣＱＡ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ、３−ＦＱＡ、４−ＦＱＡ、５−ＦＱＡからなる群から選ばれた少なくとも１種の成分であることを特徴とするものである。
ここで、コーヒー生豆抽出物は、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物であることが好ましい。インスリン抵抗性を助長しないからである。
【０００８】
また、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物であれば、カフェインが含まれず、かつ、クロロゲン酸（５−ＣＱＡ等）が十分に含まれており、好適にメタボリックシンドローム予防剤として利用できる。これらのメタボリックシンドローム予防剤は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞に至るまでの脂肪細胞分化抑制による脂肪組織量の減少促進作用を有する。また、脂肪蓄積抑制作用や、脂肪細胞増殖抑制による脂肪組織量の減少促進作用を有する。さらに、アポトーシス誘導による脂肪組織量の減少促進作用を有する。
【０００９】
また、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物は、好適に、抗肥満剤、脂肪蓄積抑制剤、脂肪細胞分化抑制による脂肪組織量減少促進剤、脂肪細胞増殖抑制による脂肪組織量減少促進剤、アポトーシス誘導による脂肪組織量減少促進剤に利用できる。
ここで、脂肪は、特に、胴回り及び内臓に分布する白色脂肪に効果的である。
【００１０】
本発明のメタボリックシンドローム予防剤における上述の超臨界流体処理工程は、超臨界流体の二酸化炭素を用いて、圧力１０ ＭＰａ 以上の高圧、６５〜８０℃の高温で、抽出処理されることを特徴とするものである。
超臨界流体の二酸化炭素を用いて、コーヒー生豆抽出物中のカフェインを溶出するときは、一般的に、超臨界流体の二酸化炭素の温度、圧力がそれぞれ高ければ高いほど抽出される。二酸化炭素は、約７．３
ＭＰａ・３１℃で、気体とも液体ともつかない状態になり（臨界点）、この臨界点を超える状態を超臨界流体の状態という。本発明の超臨界流体処理の条件としては、圧力１０
ＭＰａ以上、更に好ましくは４５ ＭＰａ以上であり、温度は６５〜８０℃である。温度が６５℃以下であるとカフェインは除去しにくく、８０℃以上にするとクロロゲン酸がコーヒー生豆から溶出、分解され始めるからである。仮に、８０℃で抽出した場合には１０％程度ロスが発生してしまう。
【００１１】
また、コーヒー生豆抽出物にカフェインが含まれないようにすべく、超臨界流体処理工程の前処理として、コーヒー生豆を浸水（調湿）し、コーヒー生豆に水分量を与える。この調湿をしない場合、コーヒー生豆からカフェインは抽出されないことになる。水分を５０％程度まで多くすると、機械に負担をかけることとなり、また、湿ったコーヒー生豆に微生物が増殖しやすい条件となり、その後のクロロゲン酸類抽出に影響を及ぼすので好ましくなく、調湿のための水分量は５０％未満とするのが好ましい。
【００１２】
また、上記の超臨界流体処理工程において、原料となるコーヒー生豆は、粉砕径３〜５ ｍｍとされることが好ましい態様である。一般的に、コーヒー生豆を超臨界流体処理してカフェインを取り除く場合、コーヒー生豆そのものが商品になるため粉砕はしないのが普通である。
本発明では、コーヒー生豆の抽出成分が商品（メタボリックシンドローム予防剤）になるため、抽出効率の向上を目的として豆を粉砕する方が好ましいのである。コーヒー生豆の粉砕径が３〜５ ｍｍとされるのは、３
ｍｍ未満とあまり細かくしすぎるとアルコール抽出工程、濾過工程で目詰りを起こすため好ましくなく、また５ ｍｍより大きいと抽出効率の向上の観点から好ましくない。特に、好ましくは、コーヒー生豆の粉砕径は４ ｍｍである。
【００１３】
上記のメタボリックシンドローム予防剤は、好適に、医薬品や医薬部外品などの医薬組成物、化粧品、飲食品（特に、コーヒー飲料）に利用される。
本発明のメタボリックシンドローム予防剤は、上記の超臨界流体処理工程を経て得られた抽出物をそのまま直接使用することもできるし、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造し、使用することもできる。また、医薬品として用いる場合、投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などによる経口投与、粉末飲料、液体飲料（ドリンク剤など）などの食品の形態、注射剤、坐剤などによる非経口投与を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のメタボリックシンドローム予防剤によれば、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制、脂肪細胞増殖抑制、アポトーシスの誘導による内臓や皮下の脂肪組織量の減少促進に繋がるといった効果を有する。
また、本発明のメタボリックシンドローム予防剤によれば、分化抑制効果やＴＧ（トリアシルグリセロール）蓄積抑制効果により、脂肪細胞や脂肪組織の大型化、さらにはそれらの機能破綻を防ぎ、アディポサイトカイン作用の増悪化を防ぎ得るといった効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】メタボリックシンドロームの説明図
【図２】超臨界流体二酸化炭素による処理工程を経て、カフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を製造する処理フローを示す図
【図３】分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養４８時間後におけるＣａｓｐａｓｅ−３活性についてコントロールを１．０とした時の各吸光度比率を示したグラフ
【図４】分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養２４時間後における増殖活性（ＯＤ４５０）を示したグラフ
【図５】分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養８日目におけるＴＧ蓄積量を示したグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、以下の実施例や参照する図中の説明では、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｄｅｃａｆｆｅｉｎａｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｃｏｆｆｅｅ  ｂｅａｎｓ）をＥＤＧＣＢと略記する。
【００１７】
先ず、超臨界流体二酸化炭素による処理工程を経て、カフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を製造する処理について、図２のフローを参照しながら各々の工程の説明を行う。
（１）コーヒー生豆を粉砕する工程（ステップＳ０１）
コーヒー生豆を平均粒子径が約４．０
ｍｍになるよう粉砕する。粉砕は、通常の機械的粉砕や凍結粉砕処理などで行うが、この粉砕する手段は特に限定されるものではない。
【００１８】
（２）コーヒー生豆を浸水（調湿）する工程（ステップＳ０２）
コーヒー生豆を粉砕したものに対し、水を添加し調湿を行う。カフェインを除くための条件としてコーヒー生豆の水分量を４３％（増減２％）にしている。
【００１９】
（３）コーヒー生豆を超臨界流体処理する工程（ステップＳ０３）
コーヒー生豆を７０℃以上、４５ ＭＰａ以上の状態にある超臨界流体二酸化炭素を用いて、Ｓ／Ｆ５０の条件の超臨界流体処理を施すことにより、所定時間、接触抽出を行い、コーヒー生豆からカフェインやその他の物質を抽出除去する。ここで、Ｓ／Ｆとは原料（コーヒー生豆）に対して流す二酸化炭素の重量比のことで、例えば、Ｓ／Ｆ＝５０であれば、コーヒー量が１（重量）に対して、二酸化炭素重量は、５０（重量）となる。
【００２０】
（４）含水アルコールにて抽出する工程（ステップＳ０４）
上記の超臨界流体処理する工程により、コーヒー生豆からカフェインやその他の物質を抽出除去した後、除去後のコーヒー生豆から、更に含水アルコールにて抽出、濃縮、乾燥して抽出物を得る。
なお、抽出溶媒としては、極性溶媒を使用できる。極性溶媒としては、水、または、アルコール類（例えば、エタノール、メタノールの低級アルコール、あるいは、プロピレングリコールなどの多価アルコール）などの極性有機溶媒が挙げられる。これらを単独あるいは２種以上を任意に組み合わせて使用することが可能である。好ましくは、水単独または水と極性有機溶媒の混合溶媒である。水と極性有機溶媒との混合溶媒の場合、水と極性有機溶媒の混合比は特に制限されないが、極性有機溶媒の容量比が５０％以上であるのが好ましい。水と混合する極性有機溶媒としては、低級アルコールが好ましく、メタノールまたはエタノールがより好ましい。また、抽出時間は特に制限されない。
【００２１】
（５）濃縮・乾燥する工程（ステップＳ０５）
抽出した液は、減圧下で加熱することなどにより溶媒を除去して濃縮した後、スプレードライ、フリーズドライなどの手法を用いて乾燥することでコーヒー生豆粉末を得る方法等が挙げられる。あるいは、抽出液に賦形剤等を添加して乾燥してもよい。
【実施例１】
【００２２】
１．コーヒー生豆抽出物の作製方法の具体例
本発明のメタボリックシンドローム予防剤におけるコーヒー生豆抽出物の作製方法について、以下の（ａ）〜（ｆ）に具体的に説明する。
（ａ）コーヒー生豆（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＡＰ−１／カフェイン含有量１．９４％）を平均粒子径４．０
ｍｍになるよう粉砕した。
（ｂ）コーヒー生豆を粉砕したもの８７．３
ｋｇに対し、水４３．２ ｋｇを添加し調湿を行った。
（ｃ）その後、このコーヒー生豆を８０℃、４５ＭＰａの状態にある超臨界流体二酸化炭素を用いて、Ｓ／Ｆ５０の条件にて２００分間接触抽出を行った。
（ｄ）次に、超臨界流体二酸化炭素処理後のコーヒー生豆１６０．０ ｋｇに対し、５６％（ｗ／ｖ）エタノール１６００
Ｌを添加し、バブリングを行いつつ、５０℃で１時間抽出を行った。
（ｅ）抽出物に対して固液分離を行なった後、５６％（ｗ／ｖ）エタノール８００
Ｌを添加し、バブリングを行いつつ、再度５０℃で１時間抽出を行った。
（ｆ）上記の２回の抽出で得られた抽出液を濾過、１２５℃、１分間殺菌した後、５０℃で減圧濃縮し、１８０℃でスプレードライを行ない、２７．８
ｋｇのコーヒー生豆抽出物を得た。
【００２３】
２．アポトーシス誘導効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を１×１０５
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％子牛血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
【００２４】
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、３〜４日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに、インスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ、０．２５ ｍＭ、１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
【００２５】
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを０．５、１．０
ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡを０．５、１．０ ｍＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４、５−ｄｉＣＱＡを０．５ ｍＭの最終濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２
μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで、陰性対照試験区ではＣａｓｐａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫを最終濃度５０μＭで添加し、培養を行った。
【００２６】
アポトーシス誘導効果を確認するために、Ｃａｓｐａｓｅ−３活性の測定を行った。測定は、４８時間の添加培養の後、ＣａｓｐＡＣＥ  Ａｓｓａｙ
Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＣａｓｐａｓｅ−３活性の測定を行った。なお、試験区間のＣａｓｐａｓｅ−３活性は４０５ ｎｍの吸光度をもとにコントロールを１．０として吸光度比率を算出し、比較を行った。
【００２７】
測定結果を図３に示す。図３は、分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養４８時間後におけるＣａｓｐａｓｅ−３活性について、コントロールを１．０とした時の各吸光度比率を示したグラフである。
【００２８】
測定結果は、コントロールに対してＥＤＧＣＢ
０．５ ｍｇ／ｍＬ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ ０．５ ｍＭ添加区において、有意な脂肪細胞のＣａｓｐａｓｅ−３活性亢進効果が認められた。また、繰り返し行った実験においても同様に、有意な脂肪細胞のＣａｓｐａｓｅ−３活性亢進効果が認められた。
【００２９】
３．脂肪細胞増殖抑制効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。
前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を５０
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％牛胎児血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
【００３０】
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、２〜３日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに、インスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ、０．２５ ｍＭ、１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
【００３１】
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを０．５、１．０
ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡを０．５、１．０ ｍＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４、５−ｄｉＣＱＡを０．５ ｍＭの最終濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２
μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで培養を行った。
【００３２】
脂肪細胞増殖活性を確認するために、２４時間の添加培養の後、Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ）を用いて増殖活性の測定を行った。なお、脂肪細胞増殖活性は、マイクロプレートリーダー（測定波長４５０
ｎｍ）の吸光度として間接的に測定した。
【００３３】
吸光度の測定結果を図４に示す。図４は、分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養２４時間後における増殖活性（ＯＤ４５０）を示したグラフである。
【００３４】
測定結果は、コントロールに対してＥＤＧＣＢ
１．０ ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡ １．０ ｍＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ ０．５ ｍＭ添加区において有意な脂肪細胞の増殖抑制効果が認められた。また、繰り返し行った実験においても同様に有意な脂肪細胞の増殖抑制効果が認められた。
【００３５】
４．脂肪細胞分化抑制効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。
前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を１×１０４
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％牛胎児血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
【００３６】
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、４〜５日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにインスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ、０．２５ ｍＭ、１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
【００３７】
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを０．２５、０．５０
ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡを０．５、１．０ ｍＭの濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２ μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで培養を行った。
【００３８】
脂肪細胞分化抑制効果を確認するために、ＧＰＤＨ活性の測定を行った。測定は、１１日間の添加培養の後、２回のＰＢＳでの洗浄を経て、グリセロール
３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性測定キット（タカラバイオ)を用いてＧＰＤＨ活性の測定を行った。得られた測定結果は上清のタンパク量で補正を行った。なお、タンパクの定量には、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ) を使用した。
ＧＰＤＨ活性の測定結果を下記の表１と表２に示す。
【００３９】
【表１】
2011057561.tif 000003
【００４０】
【表２】
2011057561.tif 000004
【００４１】
ＧＰＤＨ活性の測定結果は、ＥＤＧＣＢ
０．５０ ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡ １．０ ｍＭ添加区において、コントロールに対する有意な脂肪細胞のＧＰＤＨ活性抑制効果が認められ、この結果は繰り返し行った実験においても同様であった。
【００４２】
５．脂肪蓄積抑制効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を３×１０４
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％子牛血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
【００４３】
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、３〜４日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにインスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ，０．２５ ｍＭ，１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
【００４４】
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを１
ｍｇ／ｍＬの濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２ μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで培養を行った。
【００４５】
脂肪蓄積抑制効果を確認するために、ＴＧ蓄積量の測定を行った。測定は、８日間の添加培養の後、ＰＢＳで２回洗浄し、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０液中でセルスクレーパーを用いて細胞を回収した。３０分静置後、２回の凍結融解処理を行い、遠心分離後の上清に含まれるＴＧ蓄積量についてトリグリセライド
Ｅ−テストワコー（和光純薬工業）を用いて定量を行った後、上清のタンパク量で補正を行った。タンパクの定量にはＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ) を使用した。
【００４６】
ＴＧ蓄積量の測定結果を図５に示す。図５は、分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養８日目におけるＴＧ蓄積量を示したグラフである。
【００４７】
測定結果は、コントロールに対してＥＤＧＣＢ添加区において有意な脂肪細胞のＴＧ蓄積抑制効果が認められた。また、繰り返し行った実験においても同様、有意な脂肪細胞のＴＧ蓄積抑制効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、脂肪細胞分化抑制、脂肪蓄積抑制、脂肪細胞増殖抑制、アポトーシス誘導による脂肪組織量の減少促進の効果を有し、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品に有用である。
【図１】
2011057561.tif 000005
【図２】
2011057561.tif 000006
【図３】
2011057561.tif 000007
【図４】
2011057561.tif 000008
【図５】
2011057561.tif 000009