(57)【要約】【課題】本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持できるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材、その製造方法、該基材を用いた弾性線維組織を含有する培養皮膚の製造方法等を提供する。【解決手段】架橋されたコラーゲンスポンジにＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液を含浸させ、その後に凍結乾燥することを特徴とする、ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材の製造方法等に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材の製造方法であって、架橋されたコラーゲンスポンジにＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液を含浸させ、その後に凍結乾燥することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記ＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液中、ＤＡＮＣＥタンパク質の濃度が１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌであり、コラーゲンの濃度が０．１〜１重量％である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液がさらにムコ多糖類を含有する請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法により製造されるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材。
【請求項５】
弾性線維組織を含有する培養皮膚を構築するために用いる請求項４に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材。
【請求項６】
ＤＡＮＣＥタンパク質を含有する、弾性線維組織を含有する培養皮膚構築用基材。
【請求項７】
弾性線維組織を含有する培養皮膚の製造方法であって、請求項４に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材に皮膚細胞を播種し培養することを特徴とする製造方法。
【請求項８】
前記請求項７に記載の方法で製造される弾性線維組織を含む培養皮膚。
【請求項９】
弾性線維組織を含有する皮膚を再生する方法であって、請求項４に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基に皮膚細胞を播種し培養することを特徴とする再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質を含有する組織再生用基材及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの生体組織の中でも肺や血管、皮膚等の組織は、弾性、伸縮性に富んだ組織であるが、加齢とともに血管が硬くなる、あるいは皮膚がたるむといった生体組織の弾性が失われていく加齢現象が生じる。これは、生体組織に存在する弾性線維という、ゴムのような柔軟性と弾力を有する線維組織が劣化してしまうためであると考えられている。この弾性線維は、劣化・分解しても再生されることはないとされており、このような弾性線維の再生についての研究が数多くなされている。
【０００３】
近年、弾性線維の形成能を有する細胞の無血清培養において、ＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）という分泌蛋白質を加えることにより効率よく弾性線維を再生できることが見出された（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、このＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持できる形態については十分に研究がなされておらず、その取り扱い性が非常に困難であった。そのため、これまでＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持できる基材を用いて、無血清培地中で弾性線維組織が再生された報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持できるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材及びその製造方法を提供することを目的とする。さらに、当該基材を足場として、弾性線維組織を効率的に再生させた培養皮膚の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持することができる基材に細胞を播種して培養することにより、弾性線維組織が効率的に再生された培養皮膚が作製できることを見いだした。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材、その製造方法等を提供する。
【０００９】
項１．ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材の製造方法であって、架橋されたコラーゲンスポンジにＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液を含浸させ、その後に凍結乾燥することを特徴とする製造方法。
【００１０】
項２．前記ＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液中、ＤＡＮＣＥタンパク質の濃度が１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌであり、コラーゲンの濃度が０．１〜１重量％である項１に記載の製造方法。
【００１１】
項３．前記ＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液がさらにムコ多糖類を含有する項１又は２に記載の製造方法。
【００１２】
項４．項１〜３のいずれかに記載の製造方法により製造されるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材。
【００１３】
項５．弾性線維組織を含有する培養皮膚を構築するために用いる項４に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材。
【００１４】
項６．ＤＡＮＣＥタンパク質を含有する、弾性線維組織を含有する培養皮膚構築用基材。
【００１５】
項７．弾性線維組織を含有する培養皮膚の製造方法であって、項４に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材に皮膚細胞を播種し培養することを特徴とする製造方法。
【００１６】
項８．項７に記載の方法で製造される弾性線維組織を含む培養皮膚。
【００１７】
項９．弾性線維組織を含有する皮膚を再生する方法であって、項４に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基に皮膚細胞を播種し培養することを特徴とする再生方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で用いられるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材は、ＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持することができる。また、該基材からＤＡＮＣＥタンパク質を徐放することも可能である。ムコ多糖類を加えることにより、ＤＡＮＣＥタンパク質の徐放性のスピードをコントロールすることもできる。該ＤＡＮＣＥタンパク質含有基材に、細胞を播種し、培養して得られる培養皮膚では効率よく弾性線維組織を再生できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１の方法で作製した基材を用いて、実施例２で作製された培養皮膚について、ＥＶＧ（Elastica Van Gieson）染色法を用いて弾性線維組織の存在を評価した像である。
【図２】図１の組織切片像のうち四角で囲んだ部分の拡大像である。
【図３】比較例１の方法で作製した基材を用いて、比較例２で作製された培養皮膚について、ＥＶＧ（Elastica Van Gieson）染色法を用いて弾性線維組織の存在を評価した像である。
【図４】図３の組織切片像のうち四角で囲んだ部分の拡大像である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持できるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材およびその製造方法に関するものであって、架橋したコラーゲンスポンジにＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン溶液を含浸させ、その後に凍結乾燥することによって作製される基材である。当該基材に線維芽細胞を播種し培養して培養皮膚を構築することができ、また、該培養皮膚を人又は動物に移植することにより、弾性線維組織を含有する皮膚を再生させることができるものである。
【００２１】
以下に、ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材、その製造方法、及び該基材を用いて調製される培養皮膚について詳細に説明する。
【００２２】
１．ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材
ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材は、コラーゲン溶液を凍結乾燥した後に架橋処理することによりコラーゲンスポンジを作製し、これにＤＡＮＣＥタンパク質を含有するコラーゲン水溶液を含浸させた後、さらに凍結乾燥して製造することができる。
【００２３】
コラーゲン溶液に用いられるコラーゲンとしては特に限定はなく、牛、豚等の皮膚や腱等に由来するものを用いることができる。抗原性を排除してより安全性を高める観点から、コラーゲンをプロテアーゼやペプシン等の酵素で処理して、テロペプチドをできる限り除去したアテロコラーゲンが好ましい。アテロコラーゲンには、Ｉ〜ＩＶ型があるが、適宜選択することができる。
【００２４】
コラーゲン溶液の溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等を挙げることができる。
【００２５】
コラーゲン溶液におけるコラーゲン濃度としては、０．１〜１重量％程度であることが好ましく、０．１〜０．５重量％程度であることがより好ましい。コラーゲン溶液の濃度が前記範囲にあることで、均一なコラーゲン溶液を作製できるため好ましい。
【００２６】
上記で得られたコラーゲン溶液を凍結乾燥（第１凍結乾燥）して、コラーゲンスポンジを製造する。第１凍結乾燥の条件は、例えば、コラーゲン溶液を-135〜-40℃に冷却して凍結し、−４０℃から４０℃まで温度を上昇させながら6〜24時間凍結乾燥を行うことができる。得られたコラーゲンスポンジは、熱架橋、化学架橋等の架橋処理をすることにより、生分解速度を遅延させて足場としての機能を発揮させることができる。熱架橋は、例えば、コラーゲンスポンジを、真空乾燥機を用いて100〜150℃程度で6〜24時間程度処理して実施することができる。化学架橋としては、例えば、コラーゲンスポンジをグルタルアルデヒド溶液に浸漬して実施することができる。具体的には、０〜１０℃（特に４℃程度）で、０．１〜１％（特に０．２％）のグルタルアルデヒド溶液に１〜５０時間（特に３〜１５時間）浸漬することによって実施できる。
【００２７】
得られたコラーゲンスポンジの孔径は、通常、0.1〜500μｍ、好ましくは1〜300μｍ、より好ましくは５〜１００μｍである。
【００２８】
ついで、架橋を行ったコラーゲンスポンジに、ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液を含浸させた後、凍結乾燥（第２凍結乾燥）することにより本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有基材を得る。
【００２９】
ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液とは、コラーゲンスポンジの製造の項で記載したコラーゲン溶液にＤＡＮＣＥタンパク質を加えて調製される溶液である。ここで、「ＤＡＮＣＥタンパク質」とは、ｆｉｂｕｌｉｎ−５とも呼ばれる分泌蛋白質であり、弾性線維を構成する分子であることが知られている。ＤＡＮＣＥタンパク質は、ヒト由来のヒトＤＡＮＣＥタンパク質、又は、そのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）を含む。ＤＡＮＣＥタンパク質のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス等が挙げられる。ＤＡＮＣＥタンパク質については、例えば、国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット等に記載されている。
【００３０】
ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液におけるＤＡＮＣＥタンパク質濃度は、特に限定されるものではなく、所望の濃度にすることができるが、例えば、１〜１０,０００ｎｇ／ｍＬ程度であることが好ましく、１０〜８，０００ｎｇ／ｍＬ程度であることがより好ましい。ＤＡＮＣＥタンパク質濃度が前記範囲内にあることで、希釈しすぎることによって生じるＤＡＮＣＥタンパク質の変性や、活性再現性の低下を防ぐことができるため好ましい。
【００３１】
ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度としては、０．１〜１重量％程度であることが好ましく、０．１〜０．５重量％程度であることがより好ましい。
【００３２】
ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水（蒸留水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を挙げることができる。これらの中でも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好ましい。
【００３３】
また、ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液にムコ多糖類を添加してもよい。これにより、基材からのＤＡＮＣＥタンパク質の徐放速度を制御することができる。これは、ムコ多糖類は親水基を有するため、該ムコ多糖類の添加量により基材の親水基の量をコントロールすることで含水率を制御できるためと考えられる。
【００３４】
ムコ多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸等を挙げることができる。これらの中でも、コラーゲンとの溶解性、安価に入手できる点から、コンドロイチン硫酸、ヘパリンが好ましい。
【００３５】
ムコ多糖類の添加方法としては、特に限定されるものではなく、コラーゲン溶液にムコ多糖類を直接添加することも可能であるが、取扱性の点から、ムコ多糖類を蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の溶媒に溶解した溶液にして、これをコラーゲン溶液に添加することが好ましい。ムコ多糖類の溶液の濃度としては、コラーゲン溶液中、通常、０．１〜５重量％程度、０．１〜１重量％程度が好ましい。
【００３６】
ムコ多糖類をＤＡＮＣＥタンパク質を含むラーゲン溶液に添加した場合、ＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液中のムコ多糖類の濃度は、通常、１〜５０重量％程度であり、好ましくは１〜３０重量％程度である。
【００３７】
架橋を行ったコラーゲンスポンジに、上述のＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液を含浸させる方法は特に限定はない。例えば、該コラーゲンスポンジ上の特定の箇所に該溶液を受ける部位（例えば、リング）を設け、その中にＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液を添加する方法、コラーゲンスポンジをＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液に浸漬し含浸させる方法等が挙げられる。
【００３８】
次いで、コラーゲン水溶液を含浸させたコラーゲンスポンジを-135〜-40℃に冷却して凍結し、−４０℃から４０℃まで温度を上昇させながら6〜24時間凍結乾燥（第２凍結乾燥）を行うことができる。これにより、ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材を得る。
【００３９】
得られたＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材中におけるＤＡＮＣＥタンパク質の含有量は、通常0.001〜1重量％程度、好ましくは0.01〜0.8重量％程度である。この範囲にすることにより、コラーゲンがDANCEタンパク質を効率よく保持できるため好ましい。
【００４０】
また、ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材を構成するコラーゲンスポンジの孔径は、通常、0.1〜500μｍ、好ましくは1〜300μｍである。
【００４１】
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材の製造方法では、ＤＡＮＣＥタンパク質を含まないコラーゲンスポンジを一旦架橋処理（熱架橋、化学架橋等）して、その後にＤＡＮＣＥタンパク質を添加し凍結乾燥して製造される。そのため、該基材を構成する架橋コラーゲンスポンジは組織再生のための足場として十分な強度を有すると共に、ＤＡＮＣＥタンパク質が変性することなく安定して該架橋コラーゲンスポンジに含有されている。このような製法ではなく、例えば、架橋処理をしていないコラーゲンスポンジにＤＡＮＣＥタンパク質を含むコラーゲン溶液を添加し凍結乾燥したスポンジ（基材）では、皮膚細胞の播種、培養後における分解速度が速いため、足場として必要な強度が得られない（例えば、比較例３及び４を参照）。
【００４２】
本発明で用いるＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材は、ＤＡＮＣＥタンパク質を安定に保持できる形態であり皮膚の再生等の用途に好適に用いられる。
【００４３】
２．培養皮膚
上記ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材に、皮膚細胞を播種し、培養することにより培養皮膚を調製することができる。これを、動物又は人に移植して、弾性線維組織が構築された皮膚を再生することができる。
【００４４】
播種する皮膚細胞は、例えば、ヒト皮膚由来のヒト線維芽細胞を用いることができる。ヒト皮膚由来のヒト線維芽細胞は、皮膚真皮組織から公知の方法に従って単離されたものを用いることができる。
【００４５】
線維芽細胞を培地（例えば、１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ培地等）にて培養し、フルコンフルエントになった細胞をトリプシン処理によって該細胞を回収する。得られたヒト線維芽細胞を培地（例えば、１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等）に懸濁し、線維芽細胞懸濁液を調製する。
【００４６】
ＤＡＮＣＥタンパク質含有組織再生用基材に該線維芽細胞懸濁液を添加した後、ＣＯ２インキュベーターで約３７℃にて１２〜２４時間培養して培養皮膚を得る。本発明で得られた培養皮膚は、弾性線維組織が三次元的に効率的に構築されているため、移植した部位の陥没やたるみを効果的に抑制することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１（基材作製）
コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、製品名Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．３重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。
【００４９】
この0.3％コラーゲン溶液を-135℃にて凍結した後、凍結乾燥機にて真空減圧下（0.1MPa）、-40℃から40℃まで昇温して凍結乾燥することによってコラーゲンスポンジを作製した。得られたコラーゲンスポンジを、140℃で14時間熱架橋を行った。
【００５０】
熱架橋で得られたコラーゲンスポンジに、直径10ｍｍのポリプロピレン製のリングを接着した。ポリプロピレン製のリングの中に、DANCEタンパク質（ヒト由来）を含有させた0.3％コラーゲン溶液80μlを添加した。これを-135℃で凍結した後に、凍結乾燥機を用いて真空減圧下（0.1MPa）、-40℃から40℃まで昇温して１４時間凍結乾燥することにより、厚さ１ｍｍのDANCEタンパク質含有コラーゲンスポンジを作製した。得られた基材であるコラーゲンスポンジの孔径は、15μｍであった。
【００５１】
実施例２（培養皮膚の作製）
細胞はヒト皮膚を処理することによって得られたヒト線維芽細胞を用いた。線維芽細胞を１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ培地にて培養し、フルコンフルエントになった細胞をトリプシン処理によって回収した。得られたヒト線維芽細胞を１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁し、線維芽細胞懸濁液を調製した。
【００５２】
前記線維芽細胞懸濁液を、実施例１で得られたDANCEタンパク質含有コラーゲンスポンジの直径10ｍｍのポリプロピレン製のリング内部に、線維芽細胞が１×１０６ｃｅｌｌｓとなるように添加した。
【００５３】
ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて１６〜１８時間培養して培養皮膚を構築した。その後、該培養皮膚をヌードマウスの背部皮下に埋植した。
【００５４】
移植後４週間目に移植した部位の組織を摘出し、ホルマリン固定した後にパラフィンブロックを作製した。
【００５５】
比較例１（DANCEタンパク質を含まない基材の作製）
コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、製品名Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．３重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。
【００５６】
この0.3％コラーゲン溶液を-135℃にて凍結した後、凍結乾燥機にて真空減圧下（0.1MPa）、-40℃から40℃まで昇温して凍結乾燥することによってコラーゲンスポンジを作製した。得られたコラーゲンスポンジを、140℃で14時間熱架橋を行った。
【００５７】
熱架橋で得られたコラーゲンスポンジに、直径10ｍｍのポリプロピレン製のリングを接着した。
【００５８】
ポリプロピレン製のリングの中に、0.3％コラーゲン溶液80μlを添加した。これを-135℃で凍結した後に、凍結乾燥機を用いて真空減圧下（0.1MPa）、-40℃から40℃まで昇温して１４時間凍結乾燥することにより、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質を含まないコラーゲンスポンジを作製した。得られた基材であるコラーゲンスポンジの孔径は、15μｍであった。
【００５９】
比較例２（培養皮膚の作製）
比較例１で得られたDANCEタンパク質を含まないコラーゲンスポンジを用いて、実施例２と同様にして培養皮膚の構築を試み、移植後４週間目に移植した部位の組織を摘出し、ホルマリン固定した後にパラフィンブロックを作製した。
【００６０】
比較例３（熱架橋していない基材の作製）
コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、製品名Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．３重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。
【００６１】
この0.3％コラーゲン溶液を-135℃にて凍結した後、凍結乾燥機にて真空減圧下（0.1MPa）、-40℃から40℃まで昇温して凍結乾燥することによってコラーゲンスポンジを作製した。得られたコラーゲンスポンジを、熱架橋することなく直径10ｍｍのポリプロピレン製のリングを接着した。
【００６２】
ポリプロピレン製のリングの中に、0.3％コラーゲン溶液80μl、または、DANCEタンパク質（ヒト由来）を含有させた0.3％コラーゲン溶液80μlを添加した。これを-135℃で凍結した後に、凍結乾燥機を用いて真空減圧下（0.1MPa）、-40℃から40℃まで昇温して１４時間凍結乾燥することにより、厚さ１ｍｍのDANCEタンパク質含有、またはＤＡＮＣＥタンパク質を含まないコラーゲンスポンジを作製した。得られた基材であるコラーゲンスポンジの孔径は、15μｍであった。
【００６３】
比較例４（培養皮膚の作製）
比較例３で得られた熱架橋を加えていないコラーゲンスポンジを用いて、実施例２と同様にして培養皮膚の構築を試みた。しかし、該スポンジに線維芽細胞懸濁液を添加した後、基材のスポンジはゲル状となってしまい、細胞を含有させることができなかったために、培養皮膚を構築することはできなかった。
【００６４】
比較例５（熱架橋していない基材の作製）
凍結乾燥されたＤＡＮＣＥタンパク質（ヒト由来）の粉末４μｇを蒸留水で溶解し、１０μｇ／ｍＬのＤＡＮＣＥタンパク質水溶液を作製した。
【００６５】
コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、製品名Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．３重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。
【００６６】
このコラーゲン水溶液１０ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液１００μＬを添加した溶液を、凍結乾燥用テフロンシャーレに流し込み、該テフロンシャーレを−１３５℃で凍結し、真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃〜４０℃で１４時間凍結乾燥して、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンスポンジを得た。
【００６７】
比較例６（培養皮膚の作製）
比較例５で得られた熱架橋を加えていないコラーゲンスポンジを用いて、実施例２と同様にして培養皮膚の構築を試みた。しかし、該スポンジに線維芽細胞懸濁液を添加した後、基材のスポンジはゲル状となってしまい、細胞を含有させることができなかったために、培養皮膚を構築することはできなかった。
【００６８】
試験例（培養皮膚の評価）
実施例２及び比較例２で作製された培養皮膚について、組織切片を作製しＥＶＧ（Elastica Van Gieson）染色法を用いて弾性線維組織の存在を評価した。図１は実施例２で作製された培養皮膚のＥＶＧ染色組織切片像であり、図２は図１の中で四角く囲まれた部分を拡大した組織切片像である。図３は比較例２で作製された培養皮膚のＥＶＧ染色組織切片像であり、図４は図３の中で四角く囲まれた部分を拡大した組織切片像である。
【００６９】
図１中、黒く繊維状に見える組織が弾性線維組織であり、真皮様組織の中に太い弾性線維組織が三次元的に構築されていることが確認された。
【００７０】
これに対し、図３では、ほとんど弾性線維は形成されておらず、ごく一部に弾性線維組織の様なものが構築されているだけであった。ＤＡＮＣＥタンパク質含有スポンジを用いた実施例２の方が、コラーゲンのみからなる比較例２と比べて、ＥＶＧ染色により染色された観察可能な太い弾性線維組織がはっきりと形成されており、また、厚みがある弾性線維組織含有層が形成されていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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