(57)【要約】【課題】  ヒト抗体に対する結合親和性が向上したタンパク質、およびその製造方法を提供すること。【解決の手段】  ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含んだポリペプチドを複数連結したタンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および前記ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いることで、ヒト抗体に対する結合親和性が向上したタンパク質を製造することができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の全体領域または概ね全体領域を含むポリペプチドを複数連結した、タンパク質。
【請求項２】
配列番号４または５に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を用いた、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗体に対する結合親和性の高いタンパク質、および遺伝子工学的手法を用いた前記タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターとは免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子である。個々の分子種は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＦｃ認識ドメインによって、単一の、あるいは同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の結合ドメインによって認識する。これによって一定の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動員されるかが決まってくる（非特許文献１）。Ｆｃレセプターは、さらにサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであり、単球とマクロファージ上に構成的に発現され、好中球および好酸球上においては誘導的に発現される。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸システインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００３】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００４】
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列は非特許文献３により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献４】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献５】Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｋ．等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，６７３，１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した通り、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのＩｇＧ分子Ｆｃ領域に対する結合親和性は平衡解離定数（ＫＤ）として１０−８Ｍ以下と極めて高いものの、血液中に含まれるＩｇＧ分子を捕捉・定量するためには、分子あたりの抗体結合性をさらに向上させる必要があった。そこで本発明は、ヒトＩｇＧ抗体に対する結合親和性が向上したタンパク質、および前記タンパク質の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の全体領域または概ね全体領域を含むポリペプチドを複数連結した、タンパク質。
【０００９】
（２）配列番号４または５に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【００１０】
（３）（１）または（２）に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００１１】
（４）（３）に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【００１２】
（５）（４）に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【００１３】
（６）（５）に記載の形質転換体を用いた、タンパク質の製造方法。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
１．本発明のタンパク質
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩタンパク質は図１に示すように、Ｎ末端側から１５アミノ酸のシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち−１５番目から−１番目までの領域）、２７７アミノ酸の細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７７番目までの領域）、２１アミノ酸の細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２７８番目から２９８番目までの領域）、６１アミノ酸の細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９９番目から３５９番目までの領域）からなる。このうち、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域と結合親和性を有するのは細胞外領域であり、当該領域でＩｇＧ抗体を直接捕捉している。
【００１６】
本発明のタンパク質における、複数連結するポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の全体配列（１番目から２７７番目までの領域）、または細胞外領域の概ね全体配列を含んでいればよく、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナル配列の全体または一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域の一部を含んでもよい。なお、細胞外領域の概ね全体配列とは配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の全体配列（１番目から２７７番目までの領域）のＮ末端側および／またはＣ末端側にある１から１０アミノ酸を削除した配列のことをいう。
【００１７】
本発明のタンパク質における、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含んだポリペプチドの連結数は、タンパク質の分子量が概ね１０万を超えると取り扱いが困難となることから、２つまたは３つが好ましい。また、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含んだポリペプチドを連結する際には、直接前記ポリペプチド同士を連結させてもよいし、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域に対する結合親和性、および菌体外に分泌可能なだけの可溶性を有する範囲で適宜リンカーペプチドを挿入してもよい。
【００１８】
本発明のタンパク質の一態様として、Ｎ末端側から１５アミノ酸のシグナルペプチド領域、１つ目の細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７４番目までの配列）、連結領域（２アミノ酸）、２つ目の細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち６番目から２７４番目までのアミノ酸）からなる配列番号４に記載のタンパク質をあげることができる。
【００１９】
本発明のタンパク質の別の態様として、Ｎ末端側から１５アミノ酸のシグナルペプチド領域、１つ目の細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７４番目までのアミノ酸）、連結領域（２アミノ酸）、２つ目の細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち６番目から２７４番目までのアミノ酸）、連結領域（２塩基）、３つ目の細胞外領域（２つ目の細胞外領域と同じアミノ酸）からなる配列番号５に記載のタンパク質をあげることができる。
【００２０】
２．本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質をコードするポリヌクレオチドのことをいう。なお、遺伝子組換え技術を用いて本発明のタンパク質を製造する場合は、前記タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際に、組換え対象宿主におけるコドンの使用頻度を考慮のうえ変換するのが好ましい。一例としてＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓを宿主とする場合は、セリン（Ｓｅｒ）ではＴＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡ、アルギニン（Ａｒｇ）ではＣＧＧ／ＡＧＡ／ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡへの変換をそれぞれ避けて変換するのが好ましい（特願２００８−０４６４３８号参照）。
【００２１】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一態様として、配列番号４に記載のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換した配列番号２に記載のポリヌクレオチド、および配列番号５に記載のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換した配列番号３に記載のポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２２】
３．本発明のタンパク質製造方法
本発明のタンパク質の製造方法としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩから適当な試薬を用いて細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含んだポリペプチドを調製し、前記ペプチド同士を直接またはリンカーペプチドを介したペプチド結合により製造する方法、および本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を設計し、前記ポリヌクレオチドから遺伝子工学的手法を用いて製造する方法があげられるが、後者の製造方法が、本発明のタンパク質を簡便かつ大量に生産できる点で好ましい。以下、後者の製造方法について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のタンパク質を遺伝子工学的手法を用いて製造するために必要な、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法としては、
（１）目的とする本発明のタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成して取得する方法、
（２）ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域（配列番号１に記載のヌクレオチド配列のうち５８番目から８８８番目までの配列）の全体配列または概ね全体配列を含むポリヌクレオチドを、直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した前記ポリヌクレオチドを適当な方法で連結し取得する方法、
が例示できる。
【００２４】
（１）の方法で取得する場合において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、前述したように、組換え対象宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。（２）の方法で取得する場合において、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩのヌクレオチド配列から直接人工的にヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含むポリヌクレオチドを調製する際は、組換え対象宿主におけるコドンの使用頻度を考慮のうえ、使用頻度が低いコドン、いわゆるレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）に該当する場合は、使用頻度の高いコドンにあらかじめ変換後、調製するのが好ましい（特願２００８−０４６４３８号参照）。
【００２５】
また、（１）、（２）いずれの方法で本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する場合においても、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全体配列または概ね全体配列を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチド同士を、または前記ポリヌクレオチドに発現ベクターを連結させるための制限酵素認識配列、もしくは発現したヒトＦｃγＲＩの簡便な精製・定量を可能にするためのタグ配列を付加してもよい。前記付加する制限酵素認識配列としては、ベクターおよび連結するＤＮＡ断片のポリヌクレオチド配列を考慮のうえ適切な配列を選択すればよい。前記付加するタグ配列としては、遺伝子工学で多用される、ポリヒスチジンタグやｃ−ｍｙｃタグといったオリゴペプチドをコードするヌクレオチド配列が例示できる。また、タグ配列を付加する箇所は前記ポリヌクレオチドの５’末端側に付加してもよいし、３’末端側に付加してもよい。
【００２６】
本発明のタンパク質を遺伝子工学的手法を用いて製造するために使用する発現ベクターとしては、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドおよび宿主中で発現ベクターを複製するための複製起点を有し、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであれば、適宜選択し使用できるが、通常は取り扱いの容易な発現プラスミドを用いる。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドとしては、乳糖プロモータ系、トリプトファンプロモータ系、ＧＡＬ４プロモータ系、ＳＶ４０プロモータ系、アデノウイルスプロモータ系に由来するポリヌクレオチドが例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよいが、宿主がＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞といった細胞の場合は、プロモーター系としてＳＶ４０プロモータ系に由来するポリヌクレオチドが好ましい。また、前記発現ベクターを用いて形質転換する操作にあたり、発現ベクターが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするために、発現ベクター中にアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのポリヌクレオチド（薬剤耐性遺伝子）を含んでいるのが好ましい。
【００２７】
本発明のタンパク質を遺伝子工学的手法を用いて製造するために使用する宿主としては、安定的にタンパク質を発現可能なＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）を例示することができる。また、前記細胞に、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んだ発現プラスミドを導入し、さらに特定の薬剤に対する耐性も付与した細胞について、薬剤に対する耐性の強さから前記細胞のスクリーニングを行なうことで、本発明のタンパク質を高発現する細胞を得ることができる。前記スクリーニングにおいて、薬剤としてはメソトレキセート（ＭＴＸ）、耐性濃度としては数μＭ以上がそれぞれ好ましい。ＭＴＸに対する耐性の付与方法は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）が含まれていればよい。
【００２８】
本発明のタンパク質はヒトＦｃγＲＩの細胞外領域から構成されているため、生産に用いた培養液または培養上清から、通常の生理活性タンパク質回収法によって分離精製することができる。分離精製方法としては、市販のＨＰＬＣやカラムクロマトグラフィーを例示することができる。また、培養液中から前記タンパク質を生産する際に、培養液中の他のタンパク質の減少、例えば、宿主が細胞の場合は、培養細胞を無血清培地で培養して前記タンパク質を発現させることにより分離回収の効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうちＩｇＧ抗体を直接捕捉する機能を有する細胞外領域の全体領域または概ね全体領域を含んだポリペプチドを、前記捕捉する機能を有したまま複数連結していることを特徴としており、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩ、およびヒトＦｃγＲＩの細胞外領域が１つのみからなるタンパク質と比較し、ＩｇＧ抗体に対する親和性が向上している。このことは、個体発生および免疫機構の研究、および前記成果に基づく治療診断薬等の開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、およびＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。
【００３０】
また、本発明のタンパク質を適切なクロマトグラフィー担体（例えば、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ＨｉｓＴｒａｐ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、トレシル基活性化ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ社製））に固定化することで、ヒトモノクローナル抗体といった抗体を精製するための吸着剤として用いることもできる。
【００３１】
さらに、本発明のタンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および前記ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、本発明のタンパク質を製造することで、ＩｇＧ抗体に対する結合親和性が向上したタンパク質を簡便かつ大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図。ＳＳはシグナルペプチド、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞質内領域をそれぞれコードする領域を示す。図の上部の数字は、それぞれの領域のアミノ酸数を示す。
【図２】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造を示す図。
【図３】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２の構造を示す図。
【図４】発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３の構造を示す図。
【図５】発現プラスミドの作製概略を示す図。
【図６】形質転換したＣＯＳ７培養上清の抗体結合活性を示す図。横軸は抗体固定化濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示す。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  発現プラスミドの作製（その１）
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域からなるタンパク質を発現可能なプラスミドの作製を、以下の方法で行なった。
（１）ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを以下の方法で調製した。
（１−１）Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号６（５’−ＧＡ［ＡＧＡＴＣＴ］ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＢｇｌＩＩサイト）と配列番号７（５’−ＣＧ［ＴＣＴＡＧＡ］ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ［ＡＣＴＡＧＴ］ＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＣ−３’：角かっこ部分はそれぞれ制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ヒトＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現させるタンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した。
（１−２）ＰＣＲ反応を、９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の条件で行なった。反応液組成を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2011115083.tif 000002
【００３６】
（１−３）ＰＣＲ反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動にて、設計通りのサイズに相当するバンドを確認した。
（１−４）目的産物に相当するバンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）し、ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを調製した。
（２）（１）で調製したポリヌクレオチドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献５）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２：タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（３）（２）の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを含むＬＢ培地により培養（３７℃、１８時間）し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）によりプラスミドを抽出した。
（４）抽出プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、０．９％のアガロース電気泳動に供した。
【００３７】
結果、インサートサイズから設計通りであることを確認し、これをｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒとした。図２にｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒの構造概略を示す。
【００３８】
実施例２  発現プラスミドの作製（その２）
実施例１で作製した発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図２）から、以下の方法で、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質を発現可能なプラスミドを作製した。
（１）ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を機能的に連結するため、Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号８（５’−ＣＧ［ＧＣＴＡＧＣ］ＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＴＧ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＮｈｅＩサイト）と配列番号９（５’−ＧＧ［ＡＣＴＡＧＴ］ＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣ−３’：角かっこ部分は、制限酵素ＳｐｅＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用しＰＣＲ反応によりポリヌクレオチドを増幅した。なお、ヒトＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現させるタンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した。また、ＰＣＲ反応の反応条件は実施例１と同様にして行なった。
（２）（１）で調製したポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｈｅＩとＳｐｅＩにより消化し、事前に制限酵素ＳｐｅＩにより消化したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図２）に挿入した。
（３）実施例１と同様の方法で大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、前記形質転換された大腸菌株からプラスミドを調製することで、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリヌクレオチドを２つ連結した発現プラスミドｐＥＣＦＦｃＲｄｈｆｒｎ２を作製した。図３にｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２の構造概略を示す。
（４）さらに（１）で調製したポリヌクレオチドを、事前に制限酵素ＳｐｅＩで消化したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２（図３）に挿入することにより、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリヌクレオチドを３つ連結した発現プラスミドｐＥＣＥＦｃＥｄｈｆｒｎ３を作製した。図４にｐＥＣＥＦｃＥｄｈｆｒｎ３の構造概略を示す。また、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３までの作製手順を図５に示す。
【００３９】
なお、本実施例と同様な方法で、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリヌクレオチドを４つ以上連結した発現プラスミドの作製を試みたものの、前記プラスミドを作製することはできなかった。
【００４０】
実施例３  発現プラスミドの塩基配列確認
実施例１および２で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図２）、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２（図３）、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３（図４）に挿入されている、ヒトＦｃγＲＩをコードするヌクレオチド配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（商品名、ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）において解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、配列番号１０（５’−ＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＴＣＧ−３’）と配列番号１１（５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＣ−３’）と配列番号１２（５’−ＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣ−３’）と配列番号１３（５’−ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣ−３’）に示すオリゴヌクレオチドを使用した。
【００４１】
解析の結果、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３に挿入されている、ヒトＦｃγＲＩをコードするヌクレオチド配列はいずれも設計通りであることを確認した。ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを２つ連結したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号２（ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２）に、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを３つ連結したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号３（ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３）に、それぞれ示す。
【００４２】
実施例４  発現したタンパク質の抗体結合活性の確認
実施例１および２で作製したｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２およびｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３プラスミドをリポフェクトアミン（インビトロジェン社製）によりＣＯＳ７細胞にそれぞれ導入し、１０％  ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養することで（３７℃、３日間）、一過的に細胞外へタンパク質を発現させ、培養後、培養液を回収した。回収した培養上清の抗体結合活性を以下の方法でＥＬＩＳＡ法により評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することによりガンマグロブリンを固相に固定化した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を行なった。
（３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、調製した培養上清を１００μＬ添加し、（１）で固定化したヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。
（４）（３）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（５）（４）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４３】
評価結果を図６に示す。図６の通り、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒ（図６に記載の単量体）、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２（図６に記載の２量体）、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３（図６に記載の３量体）により形質転換されたＣＯＳ７細胞の培養上清にいずれも抗体結合活性が検出された。すなわち、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ２、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒｎ３に挿入された、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質を得ることができ、かつ、当該タンパク質がヒト抗体への結合活性を保持していることを示している。なお、対照として、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒにより形質転換したＣＯＳ７培養液を使用した。
【００４４】
実施例５  発現したタンパク質の調製
以下の方法で、実施例４で得られた培養上清から、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質を分離精製した。
（１）実施例４で得られた、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質が含まれた培養上清約１Ｌを、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析し脱塩処理を施した。
（２）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した３００ｍＬのＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰゲル（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を備えた吸着流動床システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１０％グリセロール、１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出し、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチド複数連結したタンパク質が含まれた濃縮画分を調製した。
（３）（２）で得られた濃縮画分を、２０ｍＭ  イミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、同緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＨＳカラム（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、洗浄後、５００ｍＭ  イミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出することで、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質精製標品約５００μｇ得た。なお、タンパク質濃度の定量は、ウシガンマグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法に基づくプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行なった。なお、対照として、ｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒにより形質転換したＣＯＳ７細胞より調製した培養液から、上記方法と同様の方法でヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を１つのみ含むタンパク質を調製している。
【００４５】
実施例６  発現したタンパク質の表面プラズモン共鳴解析
実施例５で作製した精製タンパク質の抗体結合特性を表面プラズモン共鳴解析装置ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析した。
（１）ヒト抗体のチップ固定
ヒト抗体ＩｇＧ１（コスモバイオ社製）を、ランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰを用いて終濃度約５μｇ/ｍＬとなるように希釈した。次いで、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００の取扱説明書に従いセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に３９０ＲＵ固定した。
（２）精製ＦｃγＲＩのヒト抗体ＩｇＧ１の結合解析
抗体との結合解析を行なうために、ランニング緩衝液で任意に希釈した、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを複数連結したタンパク質を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００に供した。抗体との結合性（ＲＵ）は希釈したタンパク質濃度に従い変化した。この結果を用いて、上記解析装置の専用ソフトであるＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより前記タンパク質のヒト抗体への反応特性を解析した。
【００４６】
解析結果を表２に示す。表２の通り、今回作製したヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を複数連結したタンパク質は、細胞外領域を１つのみ含むヒトＦｃγＲＩ（表２に記載の単量体）と比較し、ヒト抗体に対する結合親和性が向上しており、平衡解離定数の比較で、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを２つ連結したタンパク質（表２に記載の２量体）で単量体の約１６倍、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の概ね全体配列を含むポリペプチドを３つ連結したタンパク質（表２に記載の３量体）で単量体の約８５倍、それぞれ向上していた。
【００４７】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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