(57)【要約】【課題】従来知られているサンプル中の被検物質の測定方法は、高価で大型の分析装置を使用し、手技に熟練を必要とするマイクロピペットを使用するものであり、簡便な測定には不向きであった。また、安価で簡易なスポイトのような簡易検体採取具では、少量のサンプルを正確に採取することは困難である。簡易な採取具で採取した微量のサンプルを用いて測定する際に正確な測定値を得るため、サンプル採取量を正確に知る方法が求められている。【解決手段】本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、サンプルに混合する試薬に被検物質の測定に関与しない別の物質である内部標準物質を入れ、その内部標準物質を測定し、真のサンプルの採取量との誤差を補正することにより、正確な被検物質の定量値を得る電気化学的測定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルと試薬を混合して、サンプル中の被検物質を電気化学的に定量する測定方法において、サンプルの採取量の誤差を、該試薬中に被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ１を含有させ、該電子メディエータの電気的応答量を用いて補正することを特徴とする電気化学的測定方法。
【請求項２】
サンプル中の被検物質の電気化学的測定方法が、定電位電流測定法または定電位電荷量測定法であることを特徴とする請求項１記載の電気化学的測定方法。
【請求項３】
試薬中の被検物質の電気化学反応に関与しない電子メディエータ１の電気的応答量の測定方法が、微分パルスボルタンメトリー法、矩形波ボルタンメトリー法またはノーマルパルスボルタンメトリー法であることを特徴とする請求項１または２に記載の電気化学的測定方法。
【請求項４】
サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、サンプルの採取量の誤差補正のために電子メディエータ１の電気応答量を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項５】
サンプル中の被検物質を電子メディエータ１と異なる電子メディエータ２と、被検物質の酸化還元酵素を用いて測定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の電気化学測定方法。
【請求項６】
予め、サンプルの採取量と電子メディエータ１の電気応答量の関係式を求めておき、サンプルを測定して得られた電子メディエータ１の電気応答量を該関係式に代入し、サンプルの採取量を算出してサンプルの採取量を補正することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項７】
電子メディエータ１の式量電位と電子メディエータ２の式量電位が０．２Ｖ以上乖離していることを特徴とする請求項５または６に記載の電気化学的測定方法。
【請求項８】
電子メディエータ２がフェノチアジン類化合物であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項９】
電子メディエータ１がフェナジニウム類化合物であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１０】
サンプルの採取量が３０μＬ以下であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１１】
試薬にサンプル中の被検物質の電気化学的測定を妨害する成分を除去または妨害しない成分に変換する物質を含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１２】
被検物質が１，５−アンヒドログルシトールであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１３】
サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、３０秒以内にサンプルの採取量の誤差補正のための電子メディエータ１の電気応答量の測定をすることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルと試薬を混合してサンプル中の被検物質を電気化学的に測定する方法において、サンプルの採取量の誤差を補正する方法とそれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許第３２０６９９９号公報（特許文献１）には、サンプル希釈誤差の検出方法とサンプル希釈誤差の検出装置が開示されている。内部標準液法で希釈倍率誤差を検出する方法及び装置であり、２回の希釈工程で求めた測定値と予定した各希釈工程の希釈倍率を比較し、希釈誤差を検出する方法とその装置が開示されている
特開平３−２１４０５６号公報（特許文献２）には、内部標準物質を含むサンプル希釈液を収容したサンプル希釈容器と、サンプル及び前記サンプル希釈液から調整したサンプル希釈液の所定量を吸引して反応容器に分注する手段と、サンプル希釈液自体と希釈されたサンプル希釈混合液の内部標準物質の光学的測定結果から誘導されるサンプルの希釈倍率を算出して、原サンプル中の光学的測定分析成分濃度を算出する手段を備えてなる自動分析装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３２０６９９９号公報
【特許文献２】特開平３−２１４０５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの従来方法は、高価な大型の生化学自動分析装置を使用したり、ベッドサイドや家庭に常備されておらず手技に熟練を必要とするマイクロピペットを使用するものであり、ベッドサイドでの緊急検査や家庭での患者自身による測定には不向きであった。一方、安価で簡易なスポイトのような簡易検体採取具では、少量のサンプルを正確に採取することは困難である。簡易な採取具で採取した微量のサンプルを用いてサンプル中の被検物質を測定する際に正確な測定値を得るため、サンプルの採取量を正確に知る方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、サンプルに混合する試薬に被検物質の測定に関与しない別の物質である内部標準物質を入れ、その内部標準物質の量を電気化学的に測定し、それを用いて真のサンプルの採取量を求めることにより、被検物質の正確な定量をする方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下の（１）〜（１３）に関する。
（１）サンプルと試薬を混合して、サンプル中の被検物質を電気化学的に定量する測定方法において、サンプルの採取量の誤差を、該試薬中に被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ１を含有させ、該電子メディエータ１の電気的応答量を用いて補正することを特徴とする電気化学的測定方法。
【０００７】
（２）サンプル中の被検物質の電気化学的測定方法が、定電位電流測定法または定電位電荷量測定法であることを特徴とする前記（１）記載の電気化学的測定方法。
（３）試薬中の被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ１の電気的応答量の測定方法が、微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ法）、矩形波ボルタンメトリー法またはノーマルパルスボルタンメトリー法であることを特徴とする前記（１）または（２）に記載の電気化学的測定方法。
（４）サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、サンプルの採取量の誤差補正のために電子メディエータ１の電気応答量を測定することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
（５）サンプル中の被検物質を電子メディエータ２と被検物質の酸化還元酵素を用いて測定することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の電気化学測定方法。
（６）予め、サンプルの採取量と電子メディエータ１の電気応答量の関係式を求めておき、測定した電子メディエータ１の電気応答量を該関係式に代入し、サンプルの採取量を算出することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【０００８】
（７）電子メディエータ１の式量電位と電子メディエータ２の式量電位が０．２Ｖ以上乖離していることを特徴とする前記（５）または（６）に記載の電気化学的測定方法。
（８）電子メディエータ２がフェノチアジン類化合物であることを特徴とする前記（５）〜（７）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
（９）電子メディエータ１がフェナジニウム類化合物であることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
（１０）サンプルの採取量が３０μＬ以下であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
（１１）試薬にサンプル中の被検物質の電気化学的測定を妨害する成分を除去または妨害しない成分に変換する物質を含有することを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【０００９】
（１２）被検物質が１，５−アンヒドログルシトールであることを特徴とする前記（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
（１３）サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、３０秒以内にサンプルの採取量の誤差補正のための電子メディエータ１の電気応答量の測定をすることを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、簡易で安価なサンプル採取具を使用し熟練した手技がなくても、サンプルの採取量を正確に求めることができ、それを用いることによりサンプル中の被検物質の定量測定が簡便且つ正確に実施可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】サンプルの採取量と電子メディエータ１としてのフェノサフラニンの電気応答量との関係式を求めるためのグラフ
【図２】測定用センサチップの概略図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の電気化学的測定方法においてサンプルとしては、臨床検査に使用する全血、血漿、血清、尿、髄液などの体液、環境検査に使用する河川、汚水、雨水、工場からの排水などや、食品、水道水など特に限定されないが、臨床検査に使用する全血、血漿、血清、尿、髄液などの体液が好ましい。サンプル中に被検物質の電気化学的測定に干渉しなければ防腐剤、抗凝固剤等を含んでいてもよい。サンプルの採取量は特に限定されないが、後記の実施例に示すように、本発明の測定方法は採取量が３０μＬ以下であるときにも良好な結果が得られる。
【００１３】
本発明の電気化学的測定方法において被検物質とは、電気化学的に測定できる物質であれば特に限定されない。例えば、酸素、過酸化水素；グルコース、グリコヘモグロビンＡ１Ｃ、グリコアルブミン、フルクトサミン、ケトン体、乳酸、ピルビン酸、１，５−アンヒドログルシトール、シアル酸、ヒアルロン酸などの糖質関連物質；コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、中性脂肪、過酸化脂質などの脂質関連物質；クレアチニン、クレアチン、ホモシステインなどの窒素化合物；ビリルビン、ヘモグロビン、ポルフィリンなどの血色素関連物質；カリウム、カルシウム、マグネシウム、無機リン、鉛、銅、鉄、セレン、カドミウム、水銀、クロム、亜鉛、金、白金などの無機物；アセトアミノフェン、サリチル酸、ジゴキシン、フェノバルビタール、リドカイン、パラコート、エチルアルコール、シアン、馬尿酸、アンフェタミン、エフェドリン、コデインなどの薬剤や麻薬関連物質；エストラジオール、エストラジオール−３−グルコネイト、エストラジオール−３−サルフェート、エストリオール、エストリオール−３−グルコネイト、エストリオール−３−サルフェートなどの女性ホルモン類；ＰＣＢなどのダイオキシン類；ノニルフェノール、アルキルフェノールなどの界面活性剤類；フタル酸エステル類、ビスフェノールＡ，トリブチルスズ、ＰＣＢなどの環境ホルモン類；ドーパミンなどのカテコールアミン類などである。好ましいのは、サンプルが体液で被検物質がグルコース、グリコヘモグロビンＡ１Ｃ、グリコアルブミン、フルクトサミン、ケトン体、乳酸、ピルビン酸、１，５−アンヒドログルシトール、シアル酸、ヒアルロン酸などの糖質関連物質、コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、中性脂肪、過酸化脂質などの脂質関連物質、クレアチニン、クレアチン、ホモシステインなどの窒素化合物等である。
中でも特に好ましくは、血液中の１，５−アンヒドログルシトールである。
【００１４】
本発明の電気化学的測定方法において試薬とは、サンプル中に存在し被検物質の検出反応を妨害する物質を除去または妨害しない成分に変換する物質や、サンプルの希釈、ｐＨの調整、塩濃度の調整のために使用する物質、例えば、蒸留水や、緩衝剤、無機塩、酵素、有機酸などを含む蒸留水等が挙げられる。試薬は、液体であっても固体であってもよい。
例えば、血液中の１，５−アンヒドログルシトールを、１，５−アンヒドログルシトールを酸化する酵素を用いて測定する場合、血液中のグルコースが干渉する時には、予めグルコースを１，５−アンヒドログルシトールを酸化する酵素と反応しない物質に変換する物質も該試薬として使用することができる。該物質としては、例えば、グルコースオキシダーゼやヘキソキナーゼなどの酵素とその基質類が挙げられる。
【００１５】
本発明のサンプル中の被検物質の電気化学的測定方法としては、電気化学的に活性な酸素、過酸化水素、金属錯体、カテコールアミン類などは電気化学特性を利用して定電位電流測定法、定電位電荷量測定法、サイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ法）、微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ法）、矩形波ボルタンメトリー法、ノーマルパルスボルタンメトリー法などで電流応答を測定する方法が挙げられ、好ましく定電位電流測定法、定電位電荷量測定法が挙げられる。
【００１６】
グルコース、グリコヘモグロビンＡ１Ｃ、グリコアルブミン、フルクトサミン、ケトン体、乳酸、ピルビン酸、１，５−アンヒドログルシトール、シアル酸、ヒアルロン酸などは、それぞれの酸化還元酵素を利用して酸素消費量、過酸化水素増加量などを電気化学的に測定することができる。また、グルコース、グリコヘモグロビンＡ１Ｃ、グリコアルブミン、フルクトサミン、ケトン体、乳酸、ピルビン酸、１，５−アンヒドログルシトール、シアル酸、ヒアルロン酸などでは、それぞれの酸化還元酵素と電極の間に電子メディエータを介在させて測定することもでき、該電子メディエータを用いた定電位電流測定法、定電位電荷量測定法、サイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ法）、微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ法）、矩形波ボルタンメトリー法、ノーマルパルスボルタンメトリー法等で測定することができる。例えば、グルコースを測定する場合には、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼと、フェリシアン化カリウムなどの金属錯体（電子メディエータ２）を電極上に塗布乾燥したセンサにより測定できる。また、１，５−アンヒドログルシトールを測定する場合には、酸化還元酵素としてピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、Ｌ−ソルボースデヒドロゲナーゼなどを用いることができ、電子メディエータ２としては、例えば、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、チオニンアセテートなどを用いることができる。なお、本発明において便宜上、サンプルの採取量の誤差を補正するための電気化学的測定に用いる電子メディエータを電子メディエータ１、サンプル中の被検物質の電気化学的測定に用いる電子メディエータを電子メディエータ２として区別して記載している。
【００１７】
サンプル中の被検物質を電子メディエータ２を用いて定電位電流測定法で測定する場合、その測定時間は３０秒から１秒、好ましくは１０秒から１秒、より好ましくは５秒から１秒である。
【００１８】
本発明のサンプル中の被検物質の電気化学的測定に用いる電子メディエータ２としては、一般に酵素の酸化還元中心と電極との間の電子の授受を介在する機能を有する物質であれば特に限定されないが、酸化型メディエータまたは還元型メディエータが挙げられ、酸化型メディエータが好ましく、例えば、フェリシアン化物、キノン化合物、フェノチアジン化合物、フェロセン化合物、オスミウム（ＩＩＩ）錯体やルテニウム化合物若しくはそのポリマー体等が挙げられる。好ましくはフェノチアジン化合物やオスミウム（ＩＩＩ）錯体やキノン化合物であり、例えば、オスミウム（ＩＩＩ）錯体である［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）２Ｃｌ］Ｃｌ２等や２，６−ジメチルベンゾキノン等やメチレンブルー等が挙げられる。特に好ましくはフェノチアジン化合物であり、例えば、チオニンアセテート、チオニンクロリド、メチレンブルー、アズールＡ、アズールＣ等である。還元型メディエータとしてはフェロセン、フェロシアン化カリウム、オスミウム（ＩＩ）錯体が挙げられる。
【００１９】
本発明の電気化学的測定方法において、被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ１とは、以下の特性を持つ物質であればよい。
１．サンプル中の被検物質との電気化学測定に用いる電子メディエータ２や試薬に含有される各成分と相互作用しない物質。
２．電子メディエータ２の共存下では試薬に含有されている酵素の反応生成物と相互作用しない物質。
３．電子メディエータ２を用いた電気化学的測定と相互作用しない物質、または、電気化学的に可逆な変化のみを示す物質。
４．酸化還元電位が、電子メディエータ２を酸化的に測定する場合はより還元側にあり、電子メディエータ２を還元的に測定する場合はより酸化側にある物質。特に電子メディエータ２の酸化還元電位と０．２Ｖ以上乖離していることが望ましい。
電子メディエータ１は上記の条件を満たせば特に限定されない。
【００２０】
両電子メディエータの組合せとして特に好ましくは、電子メディエータ２としてフェノチアジン類化合物である場合、電子メディエータ１としてはフェナジニウム類化合物、例えば、サフラニンまたはフェノサフラニンが挙げられる。
【００２１】
本発明においてサンプルの採取量の誤差とは、ある特定の量を採取することを意図してキャピラリー等の簡易採取具を使用して採取したサンプルの実際の採取量と意図した採取量との乖離量のことである。一般に、意図する採取量が微量であるほど、採取器具が簡便であるほど採取量に対する乖離量の比は大きくなる傾向があり、サンプル中の被検物質の定量値への影響も大きくなる。
【００２２】
本発明の測定方法において、サンプルの採取量の誤差を補正するための該電子メディエータ１の電気的応答量を測定する方法としては、定電位電流測定法、定電位電荷量測定法、サイクリックボルタンメトリー法（ＣＶ法）、微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ法）、矩形波ボルタンメトリー法、ノーマルパルスボルタンメトリー法などを用いることができ、中でも微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ法）、矩形波ボルタンメトリー法、ノーマルパルスボルタンメトリー法等が好ましい。
サンプル中の被検物質をまず電気化学的に測定し、引き続きサンプル採取量の誤差を補正するための電気化学的測定法を行っても、測定の順序がその逆であってもよい。好ましくは、サンプル中の被検物質を電子メディエータ２を用いて電気化学的に測定し、引き続きサンプルの採取量の誤差を補正するために電子メディエータ１を用いて電気化学的に測定する方法である。特に被検物質を酸化還元酵素を用いて測定する場合は、該酵素との反応時間を正確にする必要があるので、電子メディエータ２の測定をまず最初に行う。
【００２３】
両電気化学的測定方法は異なる方法を使用するのが好ましく、例えば、サンプル中の被検物質を定電位電流測定法で測定し、引続き、定電位電流測定法の終了から好ましくは６０秒から０秒、さらに好ましくは１０秒から０秒でサンプル採取量の誤差を補正するためのＤＰＶ測定法を行えばよい。最初の定電位電流測定と引き続くＤＰＶ測定の間の時間が短いほど、電子メディエータ１による正確な測定が可能となる。
【００２４】
本発明の測定方法におけるサンプルの採取量の誤差を補正する方法とは、例えば、予めサンプル採取量と電子メディエータ１の電気応答量の関係式を求めておき、実際に測定した該電子メディエータ１の電気応答量を、予め求めた該関係式に代入して実際の採取量を計算で求め、それと電子メディエータ２を用いて得られる電気応答量からサンプル中の被検物質濃度を算出するものである。
被検物質の真の濃度は、試薬が固体の場合、
被検物質濃度＝電子メディエータ２の電気応答量から求めた被検物質の濃度×（意図したサンプル採取量／電子メディエータ１から求めた実際のサンプル採取量）で求めることができる。
試薬が液体の場合、
被検物質濃度＝電子メディエータ２の電気応答量から求めた被検物質の濃度×［｛意図したサンプル採取量／（意図したサンプル採取量＋試薬液量）｝／｛電子メディエータ１から求めた実際のサンプル採取量／（電子メディエータ１から求めた実際のサンプル採取量＋試薬液量）｝］で求めることができる。
【００２５】
更に、化学工場の排水処理場や過酸化水素を含む冷却剤の排液中の過酸化水素を測定する場合を例示する。まず、サンプルの採取量と電気応答量の関係式を求めておく。即ち、正確に濃度１ｍＭのサフラニンを含む試薬と、被検液が排水なので、排水液と主たる成分が等しいマトリックス液を用意し、一定量の試薬（例えば、２０ｍＬ）と、サンプルを採取する器具でおこりうる採取量のバラツキの範囲、例えば、市販の簡易スポイトで２０μＬを基準値として採取する場合には正確に、例えば、１５μＬ、１７．５μＬ、２０μＬ、２２．５μＬ、２５μＬのマトリックス液をメスピペットで量り、試薬と混合する。この混合液を、ＤＰＶ測定をしてサンプルの採取量と電気応答量の関係式を求める。なお、ＤＰＶ測定の際の使用溶液量は正確に規定する必要はない。
実際のサンプルの測定は、前記試薬が正確に２０ｍＬ入った容器を用意し、この容器に排水処理場から抜き取った排水を簡易ピペットで約２０μＬ入れ、この混合液をＤＰＶ測定し、次いで公知（市販）の過酸化水素電極でこの混合液中の過酸化水素濃度を測定する。ＤＰＶ測定値から上記関係式を用いて被検液の正確な採取量を求め、以下の式で被検液中の過酸化水素濃度を求めることができる。
被検液中の過酸化水素濃度＝過酸化水素電極の定量値×［｛２０μＬ／（２０ｍＬ＋２０μＬ）｝／｛ＤＰＶで求めた採取量（μＬ）／（２０ｍＬ＋ＤＰＶで求めた採取量（μＬ））｝］
【００２６】
また、全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定については後記の実施例に例示する。
【実施例】
【００２７】
実施例１
［１］試薬
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．７に調整した後の組成が、１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、７５Ｕ／ｍＬのグルコキナーゼ、２００Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のＮａＮ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）及び０．０６％のＢＳＡ（牛血清アルブミン）となるように１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。電子メディエータ１として１ｍＭのフェノサフラニンを加えた。
【００２８】
［２］センサチップ
ポリエチレンテレフタレートの基盤に作用極とリード部、対極とリード部をカーボンインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名カーボンペーストＴＵ１５ＳＴ）で、参照極とリード部を銀塩化銀インク（アチソン（株）製、製品ＥｌｅｃｔｒｏｄａｇＰＥ−４０９）で、厚さ１０μｍでスクリーン印刷し、１５０℃で４０分焼入れし、次いで電極部と、測定装置との接続部とをのぞく部分にレジストインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名ＣＲ１８Ｇ−ＫＦ）を厚さ２０μｍでスクリーン印刷し、１３０℃で１５分焼入れして図２に示す電極を作成した。
次に、１２０μＭのチオニンアセテート（電子メディエータ２；シグマ―アルドリッチ（株）製）、３Ｕ／ｍＬの１，５−ＡＧ脱水素酵素（国際公開第２００８／０７２７０２号パンフレット記載）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極用溶液を調製し、この電極の作用極に２μＬを塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサチップを作製した。
【００２９】
［３］サンプル
サンプルは、被検物質１，５−アンヒドログルシトール２０μｇ／ｍＬを含むセラサブを使用した。セラサブは、ＣＳＴテクノロジーズ社（米国）から販売されている擬似血清である。
【００３０】
［４］測定器：ポテンショスタットＨＺ−３０００（北斗電工（株）製）、ポテンショスタットＰＳ−０８（（株）東方技研製）
【００３１】
［５］測定法
（１）サンプル採取量とフェノサフラニンの電気応答量の関係式の作成
センサチップをポテンショスタットＰＳ−０８に接続し、センサチップの検出部に試薬１０μＬと１０、１５、２０、３０μＬの量の各サンプルを混合した液から１０μＬを載せ、センサチップの参照極を基準に作用極に０Ｖを印加し５秒後の電流値を計測した。センサチップをポテンショスタットＨＺ−３０００に接続し、ＤＰＶ測定を行い、フェノサフラニンのピーク電流値を計測した。ＤＰＶ測定のパラメーターは、初期電位−１Ｖ、最終電位０Ｖ、スキャン速度１０ｍＶ／秒、パルス周期２００ｍＶ／秒、パルス幅５０ｍ秒、パルス高さ５０ｍＶ、サンプル間隔１６．７秒に設定した。電気応答量は、ＤＰＶ測定のピーク電流値として求めた。求めたピーク電流値（Ｘ）とサンプル量（Ｙ）の関係式は、図１に示したようにＹ＝−０．０４６７Ｘ＋５９．８８４であった。
（２）採取量未知の検体の測定
センサチップをポテンショスタットＰＳ−０８に接続し、センサチップの検出部に前処理試薬１０μＬと凡そ２０μＬのサンプルを混合した液から１０μＬを載せ、センサチップの参照極を基準に作用極に０Ｖを印加し５秒後の電流値を計測した。引き続いて、速やかに（５秒間の定電位測定終了後３０秒以内）センサチップをポテンショスタットＨＺ−３０００に接続し、ＤＰＶ測定を行い、フェノサフラニンのピーク電流値を計測した。ＤＰＶ測定のパラメーターは、初期電位−１Ｖ、最終電位０Ｖ、スキャン速度１０ｍＶ／秒、パルス周期２００ｍＶ／秒、パルス幅５０ｍ秒、パルス高さ５０ｍＶ、サンプル間隔１６．７秒に設定した。結果を表１に示す。
【００３２】
比較例
［１］試薬
前記実施例１に同じ。
［２］センサチップ
前記実施例１に同じ。
［３］サンプル
前記実施例１に同じ。
【００３３】
［４］測定器：ポテンショスタットＰＳ−０８（（株）東方技研製）
【００３４】
［５］測定法
センサチップをポテンショスタットＰＳ−０８に接続し、センサチップの検出部に１０μＬの試薬と凡そ２０μＬのサンプルを混合した液（実施例１と同じ）から１０μＬを載せ、センサチップの参照極を基準に作用極に０Ｖを印加し５秒後の電流値を計測した。結果を表１に示す。
【００３５】
表１  採取量未知のサンプル測定結果
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＊Ａから求めた濃度Ｂは、電流値から濃度を求める検量式から算出した
＊＊ＤＰＶで補正したサンプル採取量は、前記実施例１の［５］の（１）の式より求めた
＊＊＊ＤＰＶで補正した濃度＝（Ｂ）×［｛２０／（２０＋１０）｝／｛（Ｙ／（Ｙ＋１０）｝］
【００３６】
２０μｇ／ｍＬの濃度のサンプルを、サンプルの採取量凡そ２０μＬ（約１０〜３０μＬ）で８回測定した。サンプルの採取量の平均値は２１．９μｇ／ｍＬであり、実施例におけるＣＶ（変動係数）は５．２％に対し、サンプル量を補正しない比較例のＣＶは１５．５％であった。本願発明により非常に改善していることは明らかである。
また、実施例における測定値は、最小が２０．６μｇ／ｍＬ、最大が２３．９μｇ／ｍＬで特異性１０３．０％〜１１９．５％に対し、比較例では最小１５．７μｇ／ｍＬ、最大２５．９μｇ／ｍＬで特異性７８．５％〜１２９．５％であり、格段に正確に測定ができたことは明らかである。
【００３７】
即ち、サンプルの採取量が未知であっても、定電位測定に引き続いて行うＤＰＶ測定によりサンプルの真の採取量を算出し、サンプルの採取量を補正することにより、正確に検体中の１，５−アンヒドログルシトール濃度を求めることができた。
【符号の説明】
【００３８】
１：絶縁性基盤
２：作用極
３：対極
４：参照極
５：絶縁層
６：試薬層
７：検体検出部位
８：端子部
【図１】
2011163934.tif 000003
【図２】
2011163934.tif 000004