(57)【要約】【課題】支持細胞を使用することなくES細胞又はiPS細胞を内胚葉系へと分化誘導することを可能とするような新規なES細胞又はiPS細胞の分化誘導方法を提供すること。【解決手段】生合成基底膜培養基質上で哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞を増殖因子の存在下で培養することを含む、ES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生合成基底膜培養基質上で哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞を増殖因子の存在下で培養することを含む、ES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導する方法。
【請求項２】
生合成基底膜培養基質が、支持体上で基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された生合成基底膜培養基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生合成基底膜培養基質が、糖鎖を備えた支持体上で基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された生合成基底膜培養基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糖鎖がβ−Ｄ−グルコピラノース非還元末端又は２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース非還元末端をもつ糖鎖である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
生合成基底膜培養基質が、ヒトラミニン-511アイソフォームの基底膜緻密層構造体（lamina densa）からなるものである、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
コラーゲン支持体を、疎水性コポリマーに共有結合した糖鎖で塗布し、次いで、基底膜形成能を有する細胞を播種して培養することにより合成される基底膜を生合成基底膜培養基質として使用する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
基底膜形成能を有する細胞が、組み換えラミニン-511（ラミニンα5, β1 及びγ1）を過剰発現する細胞である、請求項２から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞が、マウス又はヒト由来のES細胞又はiPS細胞である、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
生合成基底膜培養基質上でマウス由来のES細胞を又はiPS細胞を、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, アクチビンA及びbFGFの存在下で培養し、次いで、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, HGF, デキサメタゾン, 及びオンコスタチンM の存在下で培養することにより肝臓系細胞へと分化誘導を行う、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
生合成基底膜培養基質上でヒト由来のES細胞を又はiPS細胞を、アクチビンA、LY294002、酪酸ナトリウム、HGF、デキサメタゾン, 及びオンコスタチンMを含む培地で培養した後に、上記試薬を除いた培地で培養することにより肝臓系細胞への分化誘導を行う、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
生合成基底膜培養基質上でES細胞を又はiPS細胞を、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ウシ胎仔アルブミン,アクチビンA及びbFGFの存在下で培養し、次いでレチノイン酸の存在下で培養し、その後、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ウシ胎仔アルブミン,ニコチンアミド, グルカゴン様ペプチド-1（GLP1）の存在下で培養することにより、膵臓系細胞への分化誘導を行う、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ES細胞又はiPS細胞から、膵臓系又は肝臓系の未分化な前駆細胞、膵臓系又は肝臓系の未熟な細胞、又は膵臓系又は肝臓系の成熟細胞の何れかへと分化誘導する、請求項１から１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れかに記載の方法により得られる、ES細胞又はiPS細胞から分化誘導された膵臓系又は肝臓系細胞。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れかに記載の方法によってES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下でES細胞又はiPS細胞を培養し、被験物質の非存在下でES細胞又はiPS細胞を培養した場合における膵臓系又は肝臓系細胞への分化誘導の程度と、被験物質の存在下でES細胞又はiPS細胞を培養した場合における膵臓系又は肝臓系細胞への分化誘導の程度とを比較することを含む、ES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
被験物質が成長因子又は低分子化合物である、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
膵臓系又は肝臓系細胞で発現するマーカーの発現量を指標として、膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導の程度を測定する、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ES細胞及びiPS細胞の分化誘導方法に関する。より詳細には、本発明は、支持細胞を使用することなく生合成基底膜培養基質を用いてES細胞又はiPS細胞を内胚葉へと分化誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹(ES)細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。インビトロ手法では、胚様体を形成して、肝臓再生に必要な誘導性微小環境を模倣するか（非特許文献１及び２）、肝細胞分化に必須な特異的増殖因子及びサイトカインでの処理を行っている（非特許文献３）。ES細胞を胚性間葉系細胞と一緒に培養すると、ＥＳ細胞は肝系統に向かうことが示されている（非特許文献４から６）。ＥＳ細胞由来肝細胞のインビトロでの作成は、BMP4を用いて報告されている（非特許文献７）。
【０００３】
本発明者らは、支持細胞を用いる方法を開発し、平面培養によりES細胞から胚性内胚葉性の呼吸器・消化器官への高効率分化誘導技術を確立した（特許文献１及び２、並びに非特許文献８）。Ｍ１５細胞のプロトコールを用いることによって、ＥＳ細胞は、インビボでの初期胚誘導現象に類似した態様で、インビトロで中内胚葉、胚体内胚葉、及び最終の領域特異的な胚体内胚葉由来の器官に順番に誘導される（非特許文献９）。Ｍ１５フィーダーも、３つの胚葉（即ち、神経外胚葉、中胚葉、及び胚体内胚葉）に属するＥＳ細胞由来の系統特異的な細胞種を作成すための有用な道具である（非特許文献１０）。分化したＥＳ細胞は、ERKシグナル伝達カスケードのFGF刺激を受け、自己再生から系統への拘束へと転換する。その後、アクチビン及び／又はp38 MAPKが、分岐を中内胚葉系列に誘導する。後で、アクチビンは、中内胚葉の分岐を胚体内胚葉に誘導する。胚体内胚葉の樹立後、肝細胞又は膵細胞への領域特異化が、培養条件を修正することによって操作することができる。
【０００４】
領域特異的な胚体内胚葉へのこの最終段階の分化のみが、Ｍ１５細胞との直接の接触を必要とすることも、培養におけるトランスフィルターアッセイで示された（非特許文献９）。アルデヒドで固定したM15細胞層であっても、膵分化の誘導能を保持することが示されたため（非特許文献９）、M15細胞層周囲に沈着した細胞外マトリックス（基底膜構成成分）の役割は、胚体内胚葉の領域特異的系統への分化を案内する上で役割を担っているものと考えられた。しかしながら、これらの方法は、生きた支持細胞を利用する方法であり、将来ヒトへの応用を考える上では無細胞の系による方法を開発することが望ましい。
【０００５】
一方、フィーダー細胞を使用しない代替の培養モデルを確立することは、肝分化の分子解析のために非常に有用である。以前に、本発明者らは、不死化した２型肺胞上皮(SV40-T2)細胞をMatrigelと一緒にインビトロで共培養することによって細胞直下に基底膜構造体を形成する方法（非特許文献１１）、及び、その後界面活性剤とアルカリ溶液による穏和な処理でSV40-T2細胞のみを除き、細胞直下に形成された基底膜構造体に損傷を与えること無く露出させることで、新奇な基底膜培養基質(sBM substratum：synthesized Basement Membrane substratum)を調製する方法、更には、この基底膜培養基質上で気管上皮基底細胞を培養すると線毛細胞に最終分化することを報告している（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１２６５７４号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／１４９８０７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Asahina K, Fujimori H, Shimizu-Saito K, et al. Expression of the liver-specific gene Cyp7a1 reveals hepatic differentiation in embryoid bodies derived from mouse embryonic stem cells. Genes Cells. 2004;9:1297-1308
【非特許文献２】Heo J, Factor VM, Uren T, et al. Hepatic precursors derived from murine embryonic stem cells contribute to regeneration of injured liver. Hepatology. 2006;44:1478-1486
【非特許文献３】Teratani T, Yamamoto H, Aoyagi K, et al. Direct hepatic fate specification from mouse embryonic stem cells. Hepatology. 2005;41:836-846
【非特許文献４】Ishii T, Yasuchika K, Fujii H, et al. In vitro differentiation and maturation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes. Exp Cell Res. 2005;309:68-77
【非特許文献５】Saito K, Yoshikawa M, Ouji Y, et al. Promoted differentiation of cynomolgus monkey ES cells into hepatocyte-like cells by co-culture with mouse fetal liver-derived cells. World J Gastroenterol. 2006;12:6818-6827
【非特許文献６】Soto-Gutierrez A, Navarro-Alvarez N, Zhao D, et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells to hepatocyte-like cells by co-culture with human liver nonparenchymal cell lines. Nat Protoc. 2007;2:347-356
【非特許文献７】Gouon-Evans V, Boussemart L, Gadue P, et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2006;24:1402-1411
【非特許文献８】Shiraki N, Umeda K, Sakashita N, et al. Differentiation of mouse and human embryonic stem cells into hepatic lineages. Genes Cells. 2008;13:731-746
【非特許文献９】Shiraki N, Yoshida T, Araki K, et al. Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells. 2008;26:874-885
【非特許文献１０】Shiraki N, Higuchi Y, Harada S, et al. Differentiation and characterization of embryonic stem cells into three germ layers. Biochem Biophys Res Commun. 2009;381:694-699
【非特許文献１１】Furuyama A and Mochitate K. Assembly of the exogenous extracellular matrix during basement membrane formation by alveolar epithelial cells in vitro. J. Cell Sci.2000;113: 859-868
【非特許文献１２】Hosokawa T, Betsuyaku T, Nishimura M, et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 2007;48:9-18
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、支持細胞を使用することなくES細胞又はiPS細胞を内胚葉系へと分化誘導することを可能とするような新奇なES細胞又はiPS細胞の分化誘導方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ES細胞又はiPS細胞を生合成基底膜培養基質上で培養することによって、支持細胞を使用することなく、内胚葉系へと分化誘導できることを見出した。即ち、本発明では、生合成基底膜培養基質（ｓＢＭ(培養)基質）を用いて、培地を改変することで、ＥＳ細胞は、肝臓系又は膵臓系に効率的かつ選択的に分化誘導することができた。同様に、ｉＰＳ細胞も、ｓＢＭ基質上で培養することにより、ＥＳ細胞と同じプルトコールを用いて膵細胞に誘導することができた。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  生合成基底膜培養基質上で哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞を増殖因子の存在下で培養することを含む、ES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導する方法。
（２）  生合成基底膜培養基質が、支持体上で基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された生合成基底膜培養基質である、（１）に記載の方法。
（３）  生合成基底膜培養基質が、糖鎖を備えた支持体上で基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された生合成基底膜培養基質である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  糖鎖がβ−Ｄ−グルコピラノース非還元末端又は２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース非還元末端をもつ糖鎖である、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
【００１１】
（５）  生合成基底膜培養基質が、ヒトラミニン-511アイソフォームの基底膜緻密層構造体（lamina densa）からなるものである、（１）から（４）の何れかに記載の方法。
（６）  コラーゲン支持体に、疎水性コポリマーに共有結合した糖鎖を塗布し、次いで、基底膜形成能を有する細胞を播種して培養することにより生合成される基底膜を生合成基底膜培養基質として使用する、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
（７）  基底膜形成能を有する細胞が、組み換えラミニン-511（ラミニンα5, β1 及びγ1）を過剰発現する細胞である、（２）から（６）の何れかに記載の方法。
（８）  哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞が、マウス又はヒト由来のES細胞又はiPS細胞である、（１）から（７）の何れかに記載の方法。
【００１２】
（９）  生合成基底膜培養基質上でマウス由来のES細胞を又はiPS細胞を、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ウシ胎仔アルブミン、アクチビンA及びbFGFの存在下で培養し、次いで、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, HGF（hepatocyte growth factor／肝細胞増殖因子）, デキサメタゾン, 及びオンコスタチンM の存在下で培養することにより肝臓系細胞へと分化誘導を行う、（１）から（８）の何れかに記載の方法。
（１０）  生合成基底膜培養基質上でヒト由来のES細胞を又はiPS細胞を、アクチビンA、LY294002（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI 3-kinase）阻害剤）、酪酸ナトリウム、HGF、デキサメタゾン, 及びオンコスタチンMを含む培地で培養した後に、上記試薬を除いた培地で培養することにより肝臓系細胞への分化誘導を行う、（１）から（９）の何れかに記載の方法。
【００１３】
（１１）  生合成基底膜培養基質上でES細胞を又はiPS細胞を、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ウシ胎仔アルブミン、アクチビンA及びbFGF（basic fibroblast growth factor／塩基性線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養し、次いでレチノイン酸の存在下で培養し、その後、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ニコチンアミド, グルカゴン様ペプチド-1（GLP1）の存在下で培養することにより、膵臓系細胞への分化誘導を行う、（１）から（１０）の何れかに記載の方法。
（１２）  ES細胞又はiPS細胞から、膵臓系又は肝臓系の未分化な前駆細胞、膵臓系又は肝臓系の未熟な細胞、又は膵臓系又は肝臓系の成熟細胞の何れかへと分化誘導する、（１）から（１１）の何れかに記載の方法。
【００１４】
（１３）  （１）から（１２）の何れかに記載の方法により得られる、ES細胞又はiPS細胞から分化誘導された膵臓系又は肝臓系細胞。
（１４）  （１）から（１２）の何れかに記載の方法によってES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下でES細胞又はiPS細胞を培養し、被験物質の非存在下でES細胞又はiPS細胞を培養した場合における膵臓系又は肝臓系細胞への分化誘導の程度と、被験物質の存在下でES細胞又はiPS細胞を培養した場合における膵臓系又は肝臓系細胞への分化誘導の程度とを比較することを含む、ES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。
（１５）  被験物質が成長因子又は低分子化合物である、（１４）に記載のスクリーニング方法。
（１６）  膵臓系又は肝臓系細胞で発現するマーカーの発現量を指標として、膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導の程度を測定する、（１４）又は（１５）に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
ES細胞及びiPS細胞は無限に増殖できるとともに、あらゆる細胞組織に分化できる多能性を有することに特徴がある。世界的にES細胞から肝細胞および膵細胞への分化を開発しているが、機能を十分にもち成熟した肝膵細胞として認知できる細胞はいまだに得られていない。本発明では、フィーダー細胞（支持細胞）を用いない方法により、肝臓細胞及び膵臓細胞への分化誘導を制御する技術を確立することに成功した。本発明の方法は、新薬の安全性評価といった創薬の基盤研究に応用できるモデル細胞の創製、並びに再生医療の移植細胞源の創製に有用であり、特に本発明の方法によるES細胞やiPS細胞からの成熟肝細胞及び成熟膵細胞への分化誘方法は創薬・再生医療の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、Ｍ１５フィーダー細胞層上におけるＥＳ細胞の肝臓又は膵臓系統への分化についての模式図である。M15細胞は、培養条件に応じてＥＳ細胞を膵臓及び肝臓の両方に分化させる能力を有している。
【図２】図２は、ヒトラミニン−５１１（hLN-511）アイソフォーム-sBM基質で培養したＥＳ細胞が、フィーダー無しで胚体内胚葉細胞に分化できることを示す。A) 分化実験の模式図。B) sBM基質又はM15フィーダー層で分化したES細胞をフローサイトメトリーで分析した。分化マーカーのE-カドヘリン及びCxcr4 を発現した胚体内胚葉細胞（E-カドヘリン+/Cxcr4+）が、sBM 基質上の培養では２７％、 M15フィーダー細胞層上での培養では５０．９％で、ＥＳ細胞の培養８日目に現れた。C)リアルタイムPCR分析により、Foxa2（胚体内胚葉マーカー）の発現が、sBM基質及びＭ１５フィーダー層で生育したＥＳ細胞に誘導されることを確認した。sBM基質で１４日間分化させたES細胞は、Ｍ１５上で８日間生育させた細胞とほぼ同じFoxa2の発現量を示した。Foxa2の発現は、βアクチンを用いて標準化した。ＥＳ細胞は、実験方法に記載した膵臓分化のための培養条件で分化させた。
【図３】図３は、Afp及びAlb1の発現は、sBM基質上で培養した２４日目のＥＳ細胞に誘導されることを示す。sBMで生育させたES細胞を、肝臓分化のための培養条件で分化させ、リアルタイムRT-PCRによりAfp及びAlb1の発現を測定した。遺伝子発現は、βアクチンを用いて標準化した。SBM基質上で培養したES細胞は、M15フィーダー細胞層で生育したES細胞と比較して、Afpの発現は高かったが、Alb1の発現は低かった。
【図４】図４は、sBM 基質上におけるkhES-1及びkhES-3細胞の肝臓系統への分化を示す。A) M15細胞層におけるkhES-1及びkhES-3細胞の肝臓系統への分化は、酪酸ナトリウムで促進された。酪酸ナトリウムの添加により、Alb1転写物の発現量は２０日目に増大した。B) sBM上での分化も酪酸ナトリウムにより同様に促進された。酪酸ナトリウムの添加により、Afp及びAlb1転写物の発現量は４０日目に増大した。
【図５】図５は、sBM基質上でPdx1/GFP発現細胞に分化したSK7 ES cellsを示す。SK7 ES細胞株は、sBM基質上に直接播種した。Pdx1/GFP発現は１０日目に検出できるようになり、その後徐々に増加し、１５日目に最大になった。１５日目以降、Pdx1/GFP発現細胞は、密集した大きなクラスターを３次元的に形成し始めた。２８日目に、強いPdx1/GFP発現が分化した細胞塊（クラスター）で観察された。
【図６】図６は、細胞塊を形成する（クラスターを有する）分化中のＥＳ細胞における成熟膵マーカー遺伝子の発現を示す。A) 成熟膵内分泌及び外分泌マーカーの発現。レーン：E13.5胎児胎盤組織から抽出したRNAを陽性コントロールとした。M15: Ｍ15フィーダー上で分化したES細胞。DE d8: ８日目におけるE-カドヘリン/CXCR4を発現する胚体内胚葉細胞。d28: ２８日目における分化の全ES細胞。sBM: sBM基質上で分化したＥＳ細胞; d10, d15及びd28: 分化培養中の示した日数における全ES細胞。ｃＤＮＡの量は、βアクチンの発現量を用いて標準化した。インスリン１転写物は、sBM上で培養したES細胞において２８日目に検出されるようになるが、Ｍ１５フィーダー上のES細胞では検出されないという結果が示された。Pdx1, Pancreatic duodenum homeodomein 1; Ins1, インスリン1; Gcg, グルカゴン; Sst, ソマトスタチン; Ptf1a, pancreas specific transcription factor 1a; Amy, アミラーゼ.  B) 未成熟(NeuroD1, Nkx2-2, Nkx6-1, Pax4, Pax6)及び成熟(Isl1, Glut2, IAPP)β細胞マーカーの発現。NeuroD1, neurogenic differentiation 1; Nkx2-2, NK2 transcription factor related locus 2; Nkx6-1, NK6 ホメオボックス1; Pax4, paired box gene 4; Pax6, paired box gene 6; Isl1, ISL1転写因子; Glut2, グルコーストランスポーター2型; IAPP, isletアミロイドポリペプチド.C) Pdx1 and インスリン1転写物の発現をRT-PCRで解析した。Un iPS, 未分化のiPS細胞; d16, d20 及びd28, sBM基質上の分化の培養期間。
【図７】図７は、Pdx1を発現する膵原始細胞の増大を示す。Ａ）継代前後におけるPdx1/GFP発現細胞の画像を示す。Ｂ）継代前後におけるPdx1/GFP発現細胞の細胞割合を示す。各培養における４つの別個のサンプルからの分化細胞の細胞割合をフローサイトメトリーで測定した。
【図８】図８は、sBM基質上で分化したマウスiPS細胞のインビボ分化の進行を示す。マウスiPS細胞を、sBM基質上で２５日間、２回継代して、膵臓系統に分化誘導した後、回収し、ＳＣＩＤマウス腎被膜に移植した。移植組織におけるインビボ分化後、sBM上で培養したiPS細胞由来細胞から回収した移植物を分析した。移植物の凍結切片を、成熟膵マーカーに対する抗体で染色し（マジェンダ）、ＤＡＰＩで対比染色した（青）。Ins, 抗インスリン染色; SS, 抗ソマトスタチン; Amy, 抗アミラーゼ染色, DBA, フジマメ(Dolichos) biflorusアグルチニン。
【図９】図９は、sBM基質を用いたヒトiPS細胞の分化を示す。sBMを用いて、ヒトiPS細胞を8日間（d8）、20日間（d20）および30日間（d30）培養したものについてRT-PCRによる遺伝子発現解析を行った。
【図１０】図１０は、ｓＢＭ基質上でのヒトES細胞の肝細胞への分化誘導を示す。khES3株をsBM上に播種して、翌日から分化培地に切り替えて内胚葉分化を開始した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明においては、生合成基底膜培養基質を用いる方法により、ES細胞又はiPS細胞から、胚性内胚葉、アルブミン陽性肝細胞、Pdx1陽性膵臓前駆細胞、インスリン陽性膵β細胞を分化誘導することができる。従来の方法では支持細胞であるM15細胞を用いる方法により、ES細胞から肝臓又は膵臓への分化誘導を行ってきたが、本発明によれば、フィーダー細胞（支持細胞）を用いることなく分化誘導が可能になった。さらに、本発明の方法は、膵前駆細胞の成熟化に有用であった。細胞をコラーゲン基質の上で培養すると、細胞が細胞外に「細胞外基質」を分泌する。この分泌した細胞外基質は細胞の種類によって異なり、またこれらの細胞外基質には種々の成長増殖因子も捕捉され、細胞の分化などに大変適した固相環境を作り上げていく。このような環境を作成したあと、細胞を表面活性剤とアルカリ溶液などで処理したのち、細胞の残骸をのぞき、基底膜を露出させたものが生合成基底膜培養基質である。
【００１８】
本発明は、ES細胞又はiPS細胞から膵臓系又は肝臓系細胞へと分化誘導する方法であって、生合成基底膜培養基質上で哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞を増殖因子の存在下で培養することを特徴とする方法である。
【００１９】
本発明の分化誘導方法では、支持細胞を用いることなく生合成基底膜培養基質上においてES細胞又はiPS細胞から肝臓又は膵臓などの内胚葉に由来のする消化器の細胞を分化誘導することができる。支持細胞を用いることなく、肝細胞又は膵臓細胞を分化誘導することはこれまで報告がなく、本発明により初めて達成された。本発明では、生合成基底膜培養基質上において培養することによって、ES細胞又はiPS細胞は分化誘導しやすい状態にある。そのため、特定の成長増殖因子を添加すると、さらに分化誘導が促進される。従って、本発明の方法は、未知の分化誘導因子のスクリーニングとしても利用できる。
【００２０】
本発明で用いるES 細胞は、哺乳動物由来のES細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のES細胞などを使用することができる。ES細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Pdx1遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Pdx1座位にlacZ遺伝子を組み込んだ129/Sv由来ES細胞株R1、J1又は、Pdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンをもつES細胞SK7株などを使用することができる。あるいは、Hnf3β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のmRFP1レポータートランスジーン及びPdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンを有するES細胞PH3株を使用することもできる。
【００２１】
哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができ、例えば、所望によりフィーダー細胞としてのマイトマイシンC処理マウス胚線維芽細胞（MEF）の存在下において、白血病阻害因子（LIF，ESGRO 1000単位/ml、Chemicon製）を添加した分化培地（10％ウシ胎児血清（FBS）、0.1mM 2-メルカプトエタノール、100μM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、シグマ製））で維持することができる。
【００２２】
iPS細胞（人工多能性幹細胞：induced pluripotent stem cell）とは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Rudolf Jaenisch)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（James Thomson）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Konrad Hochedlinger）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。人工多能性幹細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として大きな期待を集めている。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【００２３】
本発明で用いるiPS細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。
【００２４】
本発明で言うiPS細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明における人工多能性幹細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【００２５】
体細胞からiPS細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してiPS細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
（ii）Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
（iii）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
（iv）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
【００２６】
本発明では、ES細胞又はiPS細胞を生合成基底膜（sBM）基質上で培養する。本発明で用いる生合成基底膜（sBM）基質としては、ES細胞又はiPS細胞を内胚葉系細胞へと分化誘導できるものであれば、特に限定されない。生合成基底膜（sBM）基質の具体例としては、特許第3785532号（基底膜の調製方法）、特許第3829193号（基底膜標品又は人工組織）、特許第4023597号（基底膜標品を用いた再構築人工組織及びその製造方法）、及び特開2003-093053号公報（基底膜標品の作製方法）などに記載の方法により製造されるものを挙げることができる。上記の特許公報に記載の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。
【００２７】
例えば、特許第3785532号には、基底膜形成能を有する細胞の基底面に、基底膜構成成分の集積作用を有するレセプターを局在化させることができる、β−Ｄ−グルコピラノース非還元末端又は２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース非還元末端をもつ糖鎖を備えた支持体上で、基底膜形成能を有する細胞を培養することを特徴とする基底膜の調製方法が記載されており、当該調製方法で製造される基底膜を本発明で使用することができる。
【００２８】
生合成基底膜（sBM）基質上で哺乳動物由来のES細胞又はiPS細胞を培養する方法は特に限定されない。例えば、未分化のES細胞又はiPS細胞をトリプシンで解離させ、生合成基底膜（sBM）基質上に播種し、分化培地中で生育させる。以下、数日間培養することにより、肝臓細胞及び膵臓細胞などの内胚葉系細胞へと分化誘導を行うことができる。
【００２９】
本発明の分化誘導方法においては、生合成基底膜（sBM）基質上においてES細胞又はiPS細胞を培養する際に、増殖因子を添加して、培養する。例えば、マウス由来のES細胞を又はiPS細胞を、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ウシ胎仔アルブミン、 アクチビンA及びbFGFの存在下で培養し、次いで、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, HGF, デキサメタゾン, 及びオンコスタチンM の存在下で培養することにより肝臓系細胞へと分化誘導を行うことができる。あるいは、ヒト由来のES細胞を又はiPS細胞を、アクチビンA、LY294002、酪酸ナトリウム、HGF、デキサメタゾン, 及びオンコスタチンMを含む培地で培養した後に、上記試薬を除いた培地で培養することにより肝臓系細胞への分化誘導を行うことができる。また、ES細胞を又はiPS細胞を、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）,ウシ胎仔アルブミン、アクチビンA及びbFGFの存在下で培養し、次いでレチノイン酸の存在下で培養し、その後、ITS（インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム）, ウシ胎仔アルブミン、ニコチンアミド, グルカゴン様ペプチド-1（GLP1）の存在下で培養することにより、膵臓系細胞への分化誘導を行うことができる。
【００３０】
本発明による生合成基底膜（sBM）基質上でのES細胞又はiPS細胞の分化誘導方法によれば、ES細胞又はiPS細胞から、未分化な内胚葉の前駆細胞、内胚葉由来器官の未熟な細胞、又は内胚葉由来器官の成熟細胞の何れかへと分化誘導することができる。内胚葉由来器官としては、膵臓、肝臓などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、ES細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉に特異的なマーカーの発現量を測定することにより確認することができる。
【００３１】
さらに本発明によれば、生合成基底膜（sBM）基質上において哺乳動物由来のES細胞を培養することによってES細胞又はiPS細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下でES細胞又はiPS細胞を培養し、被験物質の非存在下でES細胞又はiPS細胞を培養した場合における内胚葉系細胞への分化誘導の程度と被験物質の存在下でES細胞を培養した場合における内胚葉系細胞への分化誘導の程度とを比較することを含む、ES細胞又はiPS細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。被験物質としては、成長因子又は低分子化合物などを使用することができる。この際、内胚葉で発現するマーカーの発現量を指標として、内胚葉系細胞へと分化誘導の程度を測定することが可能である。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１
（実験方法）
（１）ＥＳ細胞株
Pdx1/GFP遺伝子についてホモ接合のトランスジェニックマウスから得た胚盤胞を培養することによって、Pdx1 プロモーター誘導GFPレポーター導入遺伝子を有するマウスES細胞株SK7を樹立した（Shiraki N, Yoshida T, Araki K, et al. Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells. 2008;26:874-885）。SK7 ES細胞株は、1000 units/ml白血病阻害因子(LIF; Chemicon), 15% ノックアウト血清リプレースメント(KSR; Gibco), 1%胎児ウシ血清(FBS; Hyclone), 100μM 非必須アミノ酸(NEAA; Invitrogen), 2 mM L-グルタミン(L-Gln; Invitrogen), 1 mM ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen), 50 units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシン(PS; Invitrogen)及び100μM β-メルカプトエタノール(β-ME; Sigma)を補充したGlasgow最小必須培地(Invitrogen)中で、マウス胎児線維芽細胞（MEF）フィーダー上で維持した。
【００３４】
ヒトES細胞(KhES-1及びKhES-3)（Suemori H, Yasuchika K, Hasegawa K, et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem Biophys Res Commun. 2006;345:926-932）は、Dr. N. Nakatsuji及びDr. H. Suemori (京都大学)から供与してもらい、日本政府のヒトＥＳ細胞ガイドラインに従って使用した。未分化のヒトES細胞は、20% KSR, L-Gln, NEAA及びβ-MEを補充したDMEM/F12 (Sigma)中でMEFのフィーダー層上で3% CO2下で維持した。ヒトES細胞を継代するために、ヒトES細胞コロニーを、20% KSR 及び1 mM CaCl2を含むPBS中の0.25%トリプシン及び0.1 mg/ml コラゲナーゼIVで37℃5分間処理することによって、フィーダー層から剥離し、培地を添加し、数回穏やかにピペッティングすることによりＥＳ細胞の塊を小片（5-20細胞）に解離させた。
【００３５】
２９３細胞由来の組み換えヒトラミニン-511 (rLN-10) は、Karolinska Institute（スウエーデン）のMasayuki Doi 及びKarl Tryggvason から供与された （Doi M, Thyboll J, Kortesmaa J, et al. Recombinant human laminin-10 (α5β1γ1): Production, purification, and migration-promoting activity on vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 2002; 277: 12741-12748）。
【００３６】
（２）支持細胞
中腎細胞株M15 （Larsson SH, Charlieu JP, Miyagawa K, et al. Subnuclear localization of WT1 in splicing or transcription factor domains is regulated by alternative splicing. Cell. 1995;81:391-401）は、Dr. T. Nose (三菱化学生命科学研究所、東京、日本) 及びDr. M.Rassoulzadegan (University of Nice-Sophia Antipolis, Antipolis, France)から供与され、使用前に、10μg/mlのマイトマイシンＣで２．５時間培養処理した（非特許文献８から１０）。M15は、ゼラチン塗布した６ウエル又は２４ウエルプレートに、ウエル当たり8 x 105 細胞又は2 x 105 細胞の濃度で播種した。
【００３７】
（３）増殖因子及び阻害剤
試薬は購入し、以下の濃度で使用した。
組み換えヒトアクチビン-A (R&D Systems), 20 ng/ml;
組み換えヒトｂFGF (Peprotech), 50 ng/ml;
組み換えヒト肝細胞増殖因子(HGF, Peprotech), 10 ng/ml;
デキサメタゾン(Dex, Sigma), 1 μM;
組み換えヒトオンコスタチンM (OsM, Sigma), 10 ng/ml;
酪酸ナトリウム(Na-Bu, Sigma-Aldrich), 1 mM;
Y-27632 (Rock inhibitor, Wako), 10μM;
ニコチンアミド(NA, Sigma-Aldrich), 10mM;
グルカゴン様ペプチド1 (GLP-1, Sigma-Aldrich), 10 nM.
【００３８】
（４）生合成基底膜（sBM）培養基質の調製
sBM基質は、直径3μmの孔径を有するPET多孔膜を有する６ウエル培養インサート上で作製した(BD, # 3091)。線維性コラーゲン基質（“fib”と表記する）（Ｉ型コラーゲン線維の堅いマトリックス）を、多孔膜上で先ず調製した （Hosokawa T, Betsuyaku T, Nishimura M, et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 2007;48:9-18）。次に、線維性コラーゲン基質（fib）を、スチレン−無水マレイン酸疎水性共重合体(MAST)に共有結合したオリゴ-N-アセチルグルコサミン （oligo-GlcNAc） リガンドで、少なくとも１日間DMEM培地中で10-20μg/mlの濃度で塗布した（Mochitate,K.：Method of preparing basement membrane, method of constructing basement membrane specimen, reconstituted artificial tissue using the basement membrane specimen and process for producing the same.  US Patent No. 7,399,634）。fibにMAST-GlcNAcを塗布した後、過剰のMAST-GlcNAcリガンド（コラーゲン線維に一時的に吸着しているか、又は依然として遊離している分子）を、新しいDMEMで数時間リンスした。次いで、MAST-GlcNAc を塗布したコラーゲン線維基質(fib)上に、rLN-10細胞を、6-wellタイプのfib当たり9.6x106個の細胞量で播種し、1% FBS及び0.2 mM アスコルビン酸-2-リン酸を含むＤＭＥＭ中で２週間培養した。培養後、rLN-10細胞層を、50 mM NH4OH, 0.1% Triton X-100, 及びプロテアーゼインヒビターカクテルを含むD-PBS(-)溶液処理で除去し（Hosokawa T, Betsuyaku T, Nishimura M, et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 2007;48:9-18）、ヒトラミニン-511アイソフォームの再構成した緻密層構造体（lamina densa）を傷つけること無く露出させた。de novo 合成した基底膜 (sBM)培養基質は、保存溶液に浸した状態で、使用するまで-75℃で凍結保存した。
【００３９】
（５）Ｍ１５上でのＥＳ細胞の分化
Ｍ１５上での肝臓又は膵臓系統への分化実験は、既報の通り行った（非特許文献８及び９。即ち、ＥＳ細胞を、M15細胞を予め播種した２４ウエル又は６ウエルの培養プレート(Nunc)に、ウエル当たり5,000 又は20,000個の細胞数で播種した。細胞は、アクチビンＡ (20 ng/ml)及びbFGF (50 ng/ml), 10%FBS及び4,500 mg/L グルコースを補充した分化培地で培養した。肝臓への分化のためには、ＥＳ細胞からアクチビンＡ及びbFGFを取り除き、４日目から２４日目にHGF (10 ng/ml), Dex (1μM), OsM (10 ng/ml), 10% KSR 及び2,000 mg/L グルコースに切り替えた。膵臓への分化のためには、ＥＳ細胞を、１３日目まで、Activin A (20 ng/ml)及びbFGF (50 ng/ml)を補充した10% FBSを含む培地で培養し、その後、ITS培地, 1,000 mg/Lグルコース, 10 mM NA、及び10 nM GLP-1に切り替えた。
【００４０】
ヒトＥＳ細胞の場合は、KhES-1又はKhES-3 細胞を、前以てM15細胞で播種し細胞層を形成した２４ウエル又は６ウエルの培養プレートに、ウエル当たり20,000 又は80,000の細胞数で播種した。ＥＳ細胞は、２０日目まで分化培地 (10% KSR, 4,500 mg/L グルコース, NEAA, L-Gln, ペニシリン及びストレプトマイシン及び2-MEを補充したDMEM) で培養した。アクチビンA (20 ng/ml) 及びLY294002 (10μM) を、分化の０日目から１０日目まで添加した。Na-Bu (1mM), HGF (10 ng/ml), Dex (1μM) 及びOsM (1μM)を０日目から１０日目まで添加した。培地は、増殖因子を補充した新しい分化培地に２日毎に交換した。
【００４１】
（６）ｓＢＭ培養基質上におけるES細胞の肝臓系統への分化
−７５℃で保存したｓＢＭ基質を、使用の前日に冷蔵庫でゆっくり解凍した。ＭＥＦ上で生育させたES細胞を解離し、ｓＢＭ基質１枚につき10,000の細胞量で播種した。肝臓への分化のために、ES細胞は、ITS, ウシ胎仔アルブミン(アルブマックスII, 2.5mg/ml)、アクチビンA (20 ng/ml)及びbFGF (50 ng/ml)及び4,500 mg/L グルコースを補充した分化培地で０日目から８日目まで培養し、８日目に、ITS, HGF (10 ng/ml), Dex (1μM), OsM (10 ng/ml), 10% KSR 及び2,000 mg/L グルコースを補充した培地に切り替え、２４日目まで培養した。ヒトＥＳ細胞の場合は、KhES-1又はKhES-3 細胞を、Y-27632（強力なRock阻害剤）で１２時間前処理した。その後、ＥＳ細胞を、0.25% トリプシン-EDTAを用いて解離し、sBM基質１枚当たり100,000の細胞量で播種した。ＥＳ細胞は、４０日目まで分化培地 (10% KSR, 4,500 mg/L グルコース, NEAA, L-Gln, ペニシリン及びストレプトマイシン及び2-MEを補充したDMEM) で培養した。アクチビンA (20 ng/ml) 及びLY294002 (10 μM) を、分化の０日目から１０日目まで添加した。Na-Bu (1mM), HGF (10 ng/ml), Dex (1μM) 及びOsM (1μM)を０日目から１０日目まで添加した。培地は、増殖因子を補充した新しい分化培地に２日毎に交換した。
【００４２】
（７）ｓＢＭ培養基質上におけるES細胞の膵臓系統への分化
膵臓分化のために、ＥＳ細胞は、０日目から１０日目までは、ITS, ウシ胎仔アルブミン,アクチビンA(20 ng/ml) 及びbFGF (50 ng/ml) 及び4,500 mg/L グルコースを補充した分化培地で培養し、１０日目から１３日目に、1μMレチノイン酸を添加し、１３日目から２８日目は、ITS, 10mM NA, 10 nM GLP1及び1,000 mg/L グルコースを補充した培地に切り替えた。継代培養では、１５日目までのsBM基質上の分化誘導細胞を、0.25%トリプシンで解離し、解離した細胞の３分の２を新しいｓＢＭ基質上に再播種した。継代後、上記した１３日目から２８日目までの培地と同じ培地を使用した。継代の１０日後（即ち、２５日目）、培養細胞を0.25%トリプシンで回収し、分化の解析に用いた。
【００４３】
（８）フローサイトメトリー分析
以下の抗体の何れかを使用した。ビオチン結合抗E-カドヘリンモノクローナル抗体 (mAb) ECCD2（Shirayoshi Y, Nose A, Iwasaki K, et al. N-linked oligosaccharides are not involved in the function of a cell-cell binding glycoprotein E-cadherin. Cell Struct Funct. 1986;11:245-252） 又はフィコエリトリン(PE)結合抗Cxcr4モノクローナル抗体(mAb)2B11 (BD Biosciences Pharmingen)。染色した細胞をFACS Canto (BD)で分析するか、FACS Aria (BD)で回収した。データは、BD FACS Diva Software program (BD) で記録し、Flowjo program (Tree Star)を用いて解析した。
【００４４】
（９）RT-PCR分析
RNA抽出、逆転写反応、PCR分析、及びリアルタイムPCR分析は、既報の通り行った（非特許文献８から１０）。各プライマーセットのプライマー配列は、以下に示す。
プライマー配列：
Mouse Foxa2-F: TGGTCACTGGGGACAAGGGAA  （配列番号１）
Mouse Foxa2-R: GCAACAACAGCAATAGAGAAC  （配列番号２）
Mouse Afp-F: TCGTATTCCAACAGGAGG  （配列番号３）
Mouse Afp-R: AGGCTTTTGCTTCACCAG  （配列番号４）
Mouse Alb1-F: CTTAAACCGATGGGCGATCTCACT  （配列番号５）
Mouse Alb1-R: CCCCACTAGCCTCTGGCAAAAT  （配列番号６）
Human beta-actin-F: GTGATGGTGGGAATGGGTCA  （配列番号７）
Human beta-actin-R: TTTGATGTCACGCACGATTTCC  （配列番号８）
Human Afp-F: TGCCAACTCAGTGAGGACAA  （配列番号９）
Human Afp-R: TCCAACAGGCCTGAGAAATC  （配列番号１０）
Human Alb1-F: GATGTCTTCCTGGGCATGTT  （配列番号１１）
Human Alb1-R: ACATTTGCTGCCCACTTTTC  （配列番号１２）
Human Gapdh-F: CGAGATCCCTCCAAAATCAA  （配列番号１３）
Human Gapdh-R: CATGAGTCCTTCCACGATACCAA  （配列番号１４）
Mouse Pdx1-F: CCAAAACCGTCGCATGAAGTG  （配列番号１５）
Mouse Pdx1-R: CTCTCGTGCCCTCAAGAATTTTC  （配列番号１６）
Mouse Ins1-F:CAGCCCTTAGTGACCAGCTA  （配列番号１７）
Mouse Ins1-R:ATGCTGGTGCAGCACTGATC  （配列番号１８）
Mouse Gcg-F: ACTCACAGGGCACATTCACC  （配列番号１９）
Mouse Gcg-R: CCAGTTGATGAAGTCCCTGG  （配列番号２０）
Mouse Sst-F: CCGTCAGTTTCTGCAGAAGT  （配列番号２１）
Mouse Sst-R: CAGGGTCAAGTTGAGCATCG  （配列番号２２）
Mouse Ptf1a-F:TGCAGTCCATCAACGACGC  （配列番号２３）
Mouse Ptf1a-R:GGACAGAGTTCTTCCAGTTC  （配列番号２４）
Mouse Amy-F: CAGGCAATCCTGCAGGAACAA  （配列番号２５）
Mouse Amy-R: CACTTGCGGATAACTGTGCCA  （配列番号２６）
Mouse NeuroD1-F: GGAGTAGGGATGCACCGGGAA  （配列番号２７）
Mouse NeuroD1-R: CTTGGCCAAGAACTACATCTGG  （配列番号２８）
Mouse Nkx2-2-F: AACCGTGCCACGCGCTCAAA  （配列番号２９）
Mouse Nkx2-2-R: AGGGCCTAAGGCCTCCAGTCT  （配列番号３０）
Mouse Nkx6-1-F: TACTTGGCAGGACCAGAGAG  （配列番号３１）
Mouse Nkx6-1-R: CGCTGGATTTGTGCTTTTTC  （配列番号３２）
Mouse Pax4-F: AACAGAAGAGCCAAATGGCG  （配列番号３３）
Mouse Pax4-R: TGAGCAATGGGTTGATGGCA  （配列番号３４）
Mouse Pax6-F: CAGTCACAGCGGAGTGAATC  （配列番号３５）
Mouse Pax6-R: CGCTTCAGCTGAAGTCGCAT  （配列番号３６）
Mouse Isl1-F: GACTGAGAGGGTCTCCAGCTC  （配列番号３７）
Mouse Isl1-R: AGCAAGAACGACTTCGTGATG  （配列番号３８）
Mouse Glut2-F: ACAGAGCTACAATGCAACGTGG  （配列番号３９）
Mouse Glut2-R: CAACCAGAATGCCAATGACGAT  （配列番号４０）
Mouse IAPP-F: GATTCCCTATTTGGATCCCC  （配列番号４１）
Mouse IAPP-R: CTCTCTGTGGCACTGAACCA  （配列番号４２）
Mouse b-actin-F: GTGATGGTGGGAATGGGTCA  （配列番号４３）
Mouse b-actin-R: TTTGATGTCACGCACGATTTCC  （配列番号４４）
【００４５】
各サイクルのＰＣＲ条件：
９６℃で３０秒間の変性；６０℃で２秒間のアニーリング；及び７２℃で４５秒間の伸長；
【００４６】
RT-PCR産物は、5%未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、SYBR Green I (Molecular Probes)で染色し、Gel Logic 200 Imaging System (Kodak)により可視化した。リアルタイムPCR条件は以下の通りである。９５℃で１５秒間の変性、６０℃で６０秒間のアニーリング及び伸長を４０サイクルまで。任意単位で表示した各標的mRNA量を、標準曲線法で測定した。
【００４７】
（１０）腎臓被膜移植
２５日目に、ｓＢＭ基質上の分化細胞を0.25%トリプシンで溶解し、回収した細胞をMPC塗布２４ウエルプレート（Nunc）で更に１日間培養した。細胞濃度は5x105細胞／ウエルとした。翌日、浮遊細胞を遠心により回収し、5x105細胞/10μlの濃度で2.1 mg/mlコラーゲン溶液に懸濁した。コラーゲン溶液は、Cellmatrix（登録商標）Type I-A collagen kit (Nitta Gelatin, Japan)からプロトコールに従って調製した。次いで、10μlのゲルに懸濁した5x105 細胞を、インスリン注射器(29G, BD)を用いて、C.B-17/Icr-scid/scid Jclマウス(CLEA-Japan, Japan)の腎臓被膜下に注入した。注入の４週後に、移植マウスを殺した。移植物を腎臓から回収し、4% PFAで固定し、免疫組織化学分析に供した。
【００４８】
（１１）免疫組織化学
以下の抗体を購入した。ヤギ抗アミラーゼ(Santa Cruz Biotechnology; SCB)、ビオチン結合Dolichos biflorus agglutinin (DBA)レクチン(Sigma)、マウス抗インスリン(Sigma)、ヤギ抗ソマトスタチン(SCB)。二次抗体としては、Alexa 568-結合抗体(Molecular Probes)を使用した。細胞はDAPI (Roche)で対比染色した。
【００４９】
（結果）
（１）rLN10-sBM基質で生育したES 細胞は、胚体内胚葉細胞の分化に向かった。
本発明者らは、中胚葉由来細胞株M15を用いてマウス及びヒトES細胞から肝臓系統への誘導する共培養法を確立した。
【００５０】
図１は、既報の通り（非特許文献８及び９）、Ｍ１５フィーダー細胞層上で培養したＥＳ細胞を培養条件に依存して肝臓及び膵臓系統に向けることができることを示す模式図である。
【００５１】
以前、本発明者らは、線維性コラーゲンマトリックス(fib)上でSV40-T2細胞をMatrigel（登録商標）と共培養することで、Matrigelに由来するマウスラミニン−１１１アイソフォームを有する基底膜緻密層が露出した新奇の培養基質（「生合成基底膜培養基質（sBM）」と命名）の使用を報告した（Furuyama A and Mochitate K. Assembly of the exogenous extracellular matrix during basement membrane formation by alveolar epithelial cells in vitro. J. Cell Sci.   2000; 113: 859-868；及びHosokawa T, Betsuyaku T, Nishimura M, et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 2007;48:9-18）。本実施例では、rLN-10細胞により構成したlaminin-511アイソフォームのヒトsBM基質（rLN10-sBM）を用いて、ＥＳ細胞の胚体内胚葉（DE)への分化を開始する能力について試験した。
【００５２】
図２Ａは、実験計画の模式図を示す。基質は、６ウエル培養プレートに設置し、ＥＳ細胞を基質上に播種した。平行して、M15細胞も別の培養プレートに播種し、ＥＳ細胞を既報の通りＭ１５単層上に直接播種した。
【００５３】
アクチビンＡ及びbFGFの添加により胚体内胚葉分化が促進されることが報告されている。従って、アクチビンＡ及びbFGFを、rLN10-sBM基質上でのＥＳ細胞培養にも添加した。ＥＳ細胞のE-カドヘリン+/Cxcr4+ 胚体内胚葉細胞への分化は、フローサイトメトリーで定量した。８日目にアッセイした際、sBM基質上で生育した全ES細胞培養の27.6%が、E-カドヘリン+/Cxcr4+ 胚体内胚葉細胞であった。一方、M15フィーダー層で生育した全ＥＳ細胞培養の50.9%が胚体内胚葉細胞であった（図２Ｂ）。リアルタイムPCR分析により、sBM基質又はM15フィーダー層で分化したES細胞における、Foxa2（胚体内胚葉マーカー）の発現を確認した。sBM基質上で内胚葉への分化を８日間誘導したＥＳ細胞におけるFoxa2の発現量は、M15フィーダー層上で生育したES細胞における最大発現量の約１／５であった。しかし、発現は徐々に増加し、最終的に１４日目にはＭ１５上で生育した場合と同様の発現量に達した（図２Ｃ）。Ｍ１５細胞を使用しなくてよいという意味からも、rLN10-sBM基質は、ES細胞を胚体内胚葉に分化させるためのより良い基質であることが示された。
【００５４】
（２）hLN-511 アイソフォーム-sBM基質上で生育したＥＳ細胞は、肝臓に分化できた。
Afp (α-feto-蛋白質)及びAlb1 (アルブミン1) の発現を、リアルタイムRT-PCRによって２４日目にrLN10-sBM上で培養したＥＳ細胞において検出した（図３）。基質上で培養した細胞は、Ｍ１５細胞上で生育した細胞と比較して、約２倍の量のAfpを発現し、約１／３の量のAlb1を発現していた。これらの結果は、ＥＳ細胞は、ｓＢＭ上で肝臓系統に分化したが、成熟の程度は、Ｍ１５細胞で生育した細胞よりも低いことを示している。
【００５５】
高度の成熟を達成するために、操作の更なる最適化を図った。酪酸ナトリウム（図４Ａ、Ｂ）の添加の効果（図４Ａ、Ｂ）について、Ｍ１５上で培養したヒトＥＳ細胞株khES-1及びkhES-3について試験した。リアルタイムＰＣＲで検出したAlb1転写物の発現は、khES-1及びkhES-3細胞に酪酸ナトリウムを添加することによって増大した(図４Ａ)。酪酸ナトリウムによる肝臓への分化能は、rLN10-sBM基質上で培養した場合も同様に検出され、Afp 及びAlb1の発現量の上昇がRT-PCRで確認された(図４Ｂ)。ＥＳ細胞を肝臓系統に分化させるというsBM基質の能力は、それが胚体内胚葉系統への分化に適した細胞外マトリックス構造の固体環境としての役割を担っていることを示唆している。
【００５６】
（３）sBM 培養基質上で生育したマウスES細胞は膵臓に分化できた。
胚体内胚葉からの膵臓系統への分化も調べた。GFP発現がPdx1プロモーター下で誘導されるSK7 ES 細胞株を、rLN10-sBM基質上に直接播種し、他の分化条件下で培養した（Shiraki N, Yoshida T, Araki K, et al. Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells. 2008;26:874-885）。Pdx1/GFP発現は、１０日目までにSK 7 ES細胞で検出されるようになり、１５日目に最大に達した (図５)。１５日の誘導後、Pdx1/GFP発現細胞は、立体的細胞塊として凝集し始めた。２８日目に、Pdx1/GFP発現は依然として分化細胞の細胞塊中に観察された。Pdx1/GFP陽性細胞はフローサイトメトリーで分析した。細胞比率は、１５日目に全ＥＳ細胞の8.12%であった（図７）。成熟膵臓マーカー遺伝子の発現をRT-PCRによって培養物を用いて分析した（図６Ａ）。Ins1(インスリン1)転写物の発現は、sBM基質上で培養したＥＳ細胞において２８日目に検出されるようになったが、Ｍ１５フィーダー上で生育した細胞では検出されなかった（図６Ａ）。一方、他の内分泌マーカー（Gcg: グルカゴン, Sst: ソマトスタチン）及び外分泌マーカー（Amy:アミラーゼ, 膵臓特異的転写因子1a(Pancreas specific transcription factor 1a): Ptf1a） は、sBM基質及びＭ１５フィーダー上で分化したＥＳ細胞で検出された（図６Ａ）。未成熟(Neurod1, Nkx2-2, Nkx6-1, Pax6)及び成熟(Isl1, Glut2, IAPP) β細胞マーカーも、両条件で分化させたＥＳ細胞で発現していた。しかし、成熟マーカーの発現量は、胎児膵臓よりも低かった（図6B）。rLN10-sBM 基質は、ＥＳ細胞が、インスリン発現β細胞を含む膵臓の内分泌系統に分化するのを助けていることが分かった。分化したＥＳ細胞は、未成熟内分泌膵臓の幾つかのマーカーを依然として発現していた。
【００５７】
（４）sBM培養基質で生育したマウスiPS細胞も、膵臓に分化できた。
４因子（Klf4, Sox2, Oct3/4 及びc-myc）を導入したマウスiPS 細胞（Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007;448:313-317）についても、sBM基質が細胞を膵臓系統に誘導するのに有効かどうかについて試験した(図6C)。Pdx1発現細胞は１６日目までにsBM基質上で培養したマウスiPS細胞から誘導でき、インスリン発現細胞は、２８日目までに誘導できた。分化中のiPS細胞からPdx1及びIns1を発現する細胞の出現という同様の現象から、rLN10-sBM基質上でのマウスiPS細胞及びSK7ＥＳ細胞の性質が類似していることが示唆される。
【００５８】
rLN10-sBM基質上で１５日間生育させた分化したＥＳ細胞を、0.25%トリプシンで解離し、新しいsBM基質上に再度播種し、２５日目まで培養した。Pdx1/GFP発現細胞の割合は、１５日目の8.12%から、２５日目には13.5 %まで増大した。sBM 基質は、マウスES細胞及びiPS細胞に由来するPdx1発現細胞の割合を増幅するのに有用であることが分かった。
【００５９】
（５）sBM基質上で生育したマウスiPS細胞由来の胚体内胚葉細胞は、マウス腎被膜下で膵臓系統への分化を進めることができた。
以前、本発明者らは、SCIDマウスの腎被膜下での移植により、未成熟な膵臓原始細胞の成熟が誘導されることを報告している（図８）。ｓＢＭ基質上で分化したiPS細胞が、膵臓系統に分化する能力があるかどうかを確認するために、更にインビボで細胞について移植実験を行った。膵臓原始細胞を増やすために、sBM基質上で１５日間分化させたマウスiPS細胞を回収し、新しいsBM基質上に再度播種し、更に１０日間培養した。２５日目に、分化したiPS細胞を回収し、SCIDマウスの腎被膜の下に移植した。移植の４週間後、移植物を回収し、膵臓の内分泌、外分泌及び導管細胞として陽性の細胞について分析した。図８は、インスリン (Ins)- 又はソマトスタチン(SS)-陽性内分泌細胞、又はDBA陽性導管細胞が高頻度に見られることを示す。アミラーゼ(Amy)陽性細胞も見られたが、低頻度であった。これらの結果は、rLN10-sBM基質上で分化したiPS細胞由来の胚体内胚葉細胞が、膵臓系統に分化できることを示している。
【００６０】
（実施例のまとめ）
本発明で用いたsBM基質は、HEK293細胞におけるヒトラミニン-511（ラミニンα5, β1 及びγ1）組み換え体が分泌する過剰のヒトラミニン-511及び他の主要基底膜構成成分がMAST-GlcNAcを塗布したfib上に集積することにより構築されたものである。本実施例では、rLN10細胞を使用した。このrLN10−sBMを用いて、ＥＳ細胞又はiPSを肝臓系統及び膵臓系統に誘導できた。分化の効率は高く、得られた分化細胞は、成熟型の細胞（膵臓の内分泌、外分泌及び導管細胞）にさらに分化できた。
【００６１】
実施例２：ｓＢＭ上でのヒトiPS細胞を膵前駆細胞への分化誘導
（方法）
培養8日目、20日目、30日目のサンプルよりそれぞれRNAをRNeasyR Micro/Mini Kit（Qiagen）のプロトコルに従って抽出し、Oligo dT primers（Toyobo）及びReverTra Ace（Toyobo）を用いて20μlの系でcDNAを合成した。得られたcDNAを10倍希釈後、その1μlをPCR反応の鋳型として使用した。プライマーは下記のとおりである。
hGAPDH-U, CGAGATCCCTCCAAAATCAA；（配列番号４５）
hGAPDH-D, CATGAGTCCTTCCACGATACCAA；（配列番号４６）
hOct3/4-U, AGGTGTGGGGGATTCCCCCAT；（配列番号４７）
hOct3/4-D, GCGATGTGGCTGATCTGCTGC; （配列番号４８）
hFoxa2-U, GCAGATACCTCCTACTACCA; （配列番号４９）
hFoxa2-D, GAAGCAGGAGTCTACACAGT; （配列番号５０）
hPdx1-U, GGATGAAGTCTACCAAAGCTCACGC; （配列番号５１）
hPdx1-D, CCAGATCTTGATGTGTCTCTCGGTC; （配列番号５２）
【００６２】
(結果)
sBMを用いて、ヒトiPS細胞（京大再生研より分与された201B7株）を8日間（d8）、20日間（d20）および30日間（d30）培養したものについてRT-PCRによる遺伝子発現解析を行った。未分化ヒトES細胞（khES-3）（ネガティブコントロール）、ヒト成体膵のcDNA（Clontech Human pancreas total RNAより逆転写したもの）（ポジティブコントロール）。結果を図９に示す。未分化細胞マーカーであるOct3/4の発現は培養が進むにつれて減少し、内胚葉マーカーであるFoxa2の発現はd8より観察され、d20-30にかけて減少する。d20よりPdx1（膵前駆細胞のマーカー遺伝子）の発現が上昇する。Adult panc.を除いた各サンプルのcDNA量はGAPDH発現量で補正している。
【００６３】
実施例３：ｓＢＭ上でのヒトES細胞の肝細胞への分化誘導
khES3株をsBM上に播種して、翌日から分化培地に切り替えて内胚葉分化を開始した。結果を図１０に示す。Activin 100ng/mlおよびB27を含むRPMI1640培地で10日間培養することでSox17陽性の内胚葉細胞が分化誘導された。培養１０日目から、Dex, HGF, DMSO, OsMを含む無血清培地で培養し、培地は一日おきに交換した。培養２０日目にAFP1陽性の未熟な肝細胞が分化誘導され、３０日目にはALBUMIN陽性の肝細胞が誘導された。更に肝臓の機能を評価するために、インドシアニングリーンの取り込み実験を行うと、30分の処理でICGを取り込む肝細胞が確認できた。また、リファンピシン２日間添加により、薬物代謝酵素CYP3A4の誘導効果を確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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