(57)【要約】【課題】本発明は、融合ポリペプチドを用いて、豊富ではないか、または培養物中では純粋な形態で得るのが困難であり、供給不足（例えば、ヒト細胞）であるか、または短い寿命である細胞を増殖するための方法および組成物を提供する。【解決手段】融合ポリペプチドは、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１領域、および細胞不死化活性を有するポリペプチド、テロメラーゼ特異的活性を有するポリペプチド、またはテロメラーゼ遺伝子活性化活性を有するポリペプチドを有する第２領域を有する。本発明の得られた細胞は、細胞治療の使用に適する。【選択図】図１
2011057715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、組織移植に関する。より詳細には、本発明は、細胞治療
に適した細胞を産生するために、一過性不死化または一過性テロメア化によって
、正常に静止している細胞（例えば、正常な体細胞）の複製能力を増加する方法
に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞治療は、医療的障害の処置についての新たな分野である。種々の組織源か
らの細胞が、疾患の処置あるいは組織または器官置換のために、哺乳動物（ヒト
を含む）レシピエントへの移植のために意図されている。移植のための初代細胞
の使用は、新鮮な組織供給源への連続的なアクセスを必要とする。しかし、これ
は、特にヒト細胞が望ましい場合、問題である。正常なヒト体細胞は、適切な増
殖因子の存在にもかかわらず、増殖の休止によって特徴付けられる５０〜１００
回の集団倍加の有限の複製能力を示す。複製能力は、これらの細胞がインビトロ
で培養物中に置かれた場合、かなり少なく（１０〜５０回の集団倍加）あり得る
。このインビトロでの複製の休止は、細胞の老化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ、ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｇｉｎｇ）と種々に呼ばれる。
【０００３】
治療的用途のために十分な量で組織を生成するために、細胞は、非制限的な複
製能力を得るためおよび細胞老化を防ぐために、通常不死化される。不死化遺伝
子の同定および遺伝子移入方法論の開発は、十分な量を得るのが困難であるかま
たは培養物中において短い寿命を有する細胞型から細胞株を生成することを可能
にする。これらの不死化遺伝子は、典型的には、不死化遺伝子を含むウイルスま
たはプラスミドの移入によって生成される。細胞不死化は、細胞の寿命（特に、
複製増殖条件下での培養物中において）増加し、その結果、得られる細胞株が、
元の初代細胞よりも多い回数継代され得る。
【０００４】
しかし、細胞治療における不死化細胞の使用は、患者に重篤な危険を提出し得
る。なぜなら、不死化細胞が、多くの場合において腫瘍形成性であるからである
。さらに、細胞を形質転換し得る核酸を含む外因性ＤＮＡは、通常、感染性ウイ
ルス（例えば、レトロウイルスベクター）を使用して細胞に挿入される。ウイル
スで感染された細胞はまた、患者に重篤な危険（例えば、ベクター産生の間の複
製コンピテントウイルスの生成の可能性；治療ウイルスと内因性レトロウイルス
ゲノムとの間の組換えの可能性、新規な細胞特異性、宿主範囲または病原性およ
び細胞毒性の増加を有する感染性因子を生成する可能性；腫瘍形成性挿入事象の
危険を増加する、多数の細胞への独立した組込みの可能性）を提出する。
【０００５】
これらの危険を避けるためのアプローチは、標的細胞の分化が望ましい場合、
遺伝エレメントの除去に焦点が当てられている。１つのこのようなアプローチに
は、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系の使用が挙げられる。
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ手順において、不死化遺伝子または癌遺伝子は、挿入のための
リコンビナーゼ認識（ｌｏｘＰ）部位に隣接し、引き続き隣接遺伝子セグメント
のＣｒｅ媒介欠失によって除去される。しかし、残りの不死化遺伝子の非存在を
証明することは非常に困難である。残りの不死化遺伝子のいずれかが、細胞治療
のレシピエントに重篤な危険を提出する。なぜなら、これによってこれらの細胞
が移植後に宿主において増殖を続け得、腫瘍を形成し得るからである。従って、
この様式で生成された細胞由来の組織は、細胞治療にあまり望ましくない。
【０００６】
このように、細胞治療に使用される細胞中への外因性不死化遺伝子を組み込む
ことに関連する危険を避ける細胞増殖の方法に対する必要が当該分野に存在する
。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、量が豊富でないか、初代培養物において純粋な形態で得ることが困
難であるか、供給不足であるか（例えば、ヒト細胞）、または培養では寿命が短
期間である細胞を生成するための方法および組成物を提供する。本発明は、従来
の一過性の細胞増殖の方法に関する。ここで、不死化またはテロメア化（ｔｅｒ
ｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、外部から供給した分子の作用により開始され、そ
してこれらの外部から供給した分子の除去により終了される。細胞寄託のために
細胞がインビトロで増殖され、そして外因性の不死化またはテロメア化融合タン
パク質を除去する際に、それらの非増殖状態に戻る。本発明の方法により生成さ
れた細胞は、移植および細胞治療に適切である。本発明の方法を用いて、任意の
増殖するように誘導され得る正常に静止している細胞（例えば、正常体細胞）を
増殖し得る。また、本発明は以下を提供する：
（項目１）  融合ポリペプチドであって、以下：
（ｉ）ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１ポリペプチド、および
（ｉｉ）第２ポリペプチドであって、以下：
（ａ）細胞不死化活性を有するポリペプチド、
（ｂ）テロメラーゼ特異的活性を有するポリペプチド、および
（ｃ）テロメラーゼ遺伝子活性化活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択される、第２ポリペプチド、
を含む、融合ポリペプチド。
（項目２）  項目１に記載の融合ポリペプチドであって、ここで、前記細胞不死化活性を有するポリペプチドが、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、アデノウイルスＥ１Ａ、パピローマウイルスＥ６、パピローマウイルスＥ７、エプスタイン−バーウイルス、エプスタイン−バー核抗原−２、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、リスザルヘルペスウイルス、変異ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃおよびＭｄｍ２からなる群から選択される、融合ポリペプチド。
（項目３）  項目１に記載の融合ポリペプチドであって、ここで、前記テロメラーゼ特異的活性を有するポリペプチドが、テロメラーゼ、ｐ１４０、ｐ１０５、ｐ４８、およびｐ４３からなる群から選択される、融合ポリペプチド。
（項目４）  細胞を一過性不死化する方法であって、以下の工程：
融合タンパク質を含む増殖培地において該細胞を増殖させる工程であって、該融合タンパク質が、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１ポリペプチドおよび
細胞不死化活性を有する第２ポリペプチドを含む工程を包含し、
ここで、該融合タンパク質が、該細胞によって取り込まれ、該細胞の増殖を生じ；そして
ここで、該融合タンパク質を含まない増殖培地において該不死化細胞を増殖させる工程が、該融合タンパク質の増殖効果を終了させる、方法。
（項目５）  項目４に記載の方法であって、ここで、前記細胞不死化活性を有する第２ポリペプチドが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、アデノウイルスＥ１Ａ、パピローマウイルスＥ６、パピローマウイルスＥ７、エプスタイン−バーウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、リスザルヘルペスウイルス、変異ｐ５３、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｒａｓ、ｓｒｃ、ｍｙｂ、およびＭｄｍ２からなる群から選択される、方法。
（項目６）  細胞をテロメア化する方法であって、以下の工程：
融合タンパク質を含む増殖培地に該細胞を曝露させる工程であって、該融合タンパク質が、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１ポリペプチドおよび染色体末端においてテロメアＤＮＡを合成する第２ポリペプチドを含む工程、を包含し、
ここで、該融合タンパク質を含まない増殖培地において該不死化細胞を増殖させる工程が、該融合タンパク質のテロメア化効果を終了させる、方法。
（項目７）  項目６に記載の方法であって、ここで、前記テロメラーゼ特異的活性を有するポリペプチドが、テロメラーゼ、ｐ１４０、ｐ１０５、ｐ４８、およびｐ４３からなる群から選択される、方法。
（項目８）  細胞の複製能力を増加させる方法であって、該方法が、以下の工程：
増殖培地において該細胞を増殖させる工程であって、該増殖培地が：
（ｉ）ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１ポリペプチドおよび細胞不死化活性を有する第２ポリペプチドを含む第１融合タンパク質、および
（ｉｉ）ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１ポリペプチドおよびテロメラーゼ特異的活性を有する第２ポリペプチドを含む第２融合タンパク質、
を含む工程、を包含し、
ここで、該第１および第２融合タンパク質を含まない増殖培地において該細胞を増殖させる工程が、該融合タンパク質の不死化およびテロメア化効果を終了させる、方法。
（項目９）  項目８に記載の方法であって、ここで、前記細胞不死化活性を有するポリペプチドが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、アデノウイルスＥ１Ａ、パピローマウイルスＥ６、パピローマウイルスＥ７、エプスタイン−バーウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、リスザルヘルペスウイルス、変異ｐ５３、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｒａｓ、ｓｒｃ、ｍｙｂ、およびＭｄｍ２からなる群から選択される、方法。
（項目１０）  項目９に記載の方法であって、ここで、前記テロメラーゼ特異的活性を有するポリペプチドが、テロメラーゼ、ｐ１４０、ｐ１０５、ｐ４８、およびｐ４３からなる群から選択される、方法。
【０００８】
本発明において、ヘルペスウイルスＶＰ２２、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）ＴＡＴに由来するか、またはそのホモログもしくはフラグメントに由来する輸
送ポリペプチドのアミノ酸配列を、細胞不死化タンパク質に由来するアミノ酸配
列と組合わせて有する融合タンパク質が提供される。細胞不死化のためのタンパ
ク質またはポリペプチドの例としては、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓお
よび１３Ｓ産物、ＳＶ４０スモールＴ抗原およびラージＴ抗原（サブフラグメン
トおよび短縮型バージョン）、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイ
ン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、
ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ、ヘル
ペスウイルス  Ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異ｐ５３、および癌遺伝子（ｍｙ
ｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ
−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、およびＭｄｍ２）由来のタンパク
質が挙げられる。本発明において、テロメラーゼ特異的活性を有するタンパク質
またはそのフラグメントに由来するアミノ酸配列とともに、ヘルペスウイルスＶ
Ｐ２２、ＨＩＶ  ＴＡＴ、またはそのホモログもしくはフラグメント由来の輸送
ポリペプチドのアミノ酸配列を有する融合タンパク質もまた提供される。テロメ
ラーゼ特異的活性を有するタンパク質またはそのフラグメントの例としては、テ
ロメラーゼ、ｐ１４０、ｐ１０５、ｐ４８およびｐ４３が挙げられる。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、正常に静止している細胞は、これらの細胞
を増殖するために、一過性に不死化される。ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク
質またはＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチド、お
よび細胞不死化活性を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の存在下
で目的の細胞を培養する。融合タンパク質は、細胞の核に輸送され、そして細胞
を不死化する。不死化細胞は、融合タンパク質の存在下で増殖される。一旦十分
な細胞が得られると、融合タンパク質は増殖培地から除去され、そして細胞は、
それらの本来の分化した、非不死化状態に戻るまで培養される。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、正常に休止している細胞は、これらの細胞を
一過性にテロメア化することにより増殖される。ヘルペスウイルスＶＰ２２タン
パク質またはＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチド
、およびテロメラーゼ特異的活性を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパ
ク質の存在下で目的の細胞を培養する。融合タンパク質は、細胞の核に輸送され
、ここで、この融合タンパク質は、染色体末端においてテロメアＤＮＡを合成し
、それによって複製老化（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）を
妨げる。テロメア化細胞は、融合タンパク質の存在下で増殖される。一旦十分な
細胞が得られると、融合タンパク質は増殖培地から除去され、そして細胞は、外
因性の不死化もしくはテロメア化融合タンパク質の非存在下で標準的な様式で培
養される。
【００１１】
本発明のなお別の実施形態において、輸送タンパク質（例えば、ＶＰ２２また
はＴＡＴ）および不死化タンパク質（例えば、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０など）は共
に混合され、そして細胞に適用される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態において、通常に休止している細胞は、これらの
細胞を一過性にテロメア化することにより増殖される、目的の細胞は、以下の２
つの融合タンパク質の存在下で培養される：（１）ヘルペスウイルスＶＰ２２タ
ンパク質またはＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチ
ド、および細胞不死化活性を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質；
（２）ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質またはＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の
輸送機能を有する第１のポリペプチド、およびテロメラーゼ特異的活性を有する
第２のポリペプチドを含む融合タンパク質。この細胞は、１つを超える型のＶＰ
２２不死化融合物またはＴＡＴ不死化融合物の存在下で培養され得る。この細胞
は、寿命が長くなった十分な細胞が得られるまで、融合タンパク質の存在下で増
殖される。この融合タンパク質は、次に、増殖培地から除去され、そしてこの細
胞は、それら本来の分化した非不死化状態に戻るまで、培養される。
【００１３】
本発明の方法により生成された細胞は、永久的に不死であるわけではなく（従
って、腫瘍形成性でもなく、形質転換もされない）、そしてウイルス感染しない
。従って、これらの細胞は、外因性の不死化融合タンパク質またはテロメア化融
合タンパク質を除去すると、細胞治療における移植および使用のために適切であ
る。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、細胞不死化は、テロメラーゼの逆転写酵素
の直接転写活性化により達成され、ＶＰ２２−ｍｙｃ融合タンパク質の付加によ
って媒介される（Ｗａｎｇら、１２  Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．１７６９−１７７４（
１９９８））。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、細胞中の特定の遺伝子は、一過性に活性化さ
れて、目的の内因性遺伝子の発現を特異的に活性化し、そして目的の対応するタ
ンパク質を発現させる。目的のタンパク質としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：ヒト増殖ホルモン（ｈＧＣ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）
、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン、レプチ
ン、ｈＧＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、およ
び組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｐＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−１９０１のプラスミドマップである。
【図２】図２は、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によるＶＰ２２−ｈＴＥＲＴおよびＶＰ２２−ｃＭｙｃキメラタンパク質の検出を示す写真である。Ｃｏｓ細胞をプラスミドＤＮＡなし（パネルＡおよびＢ）、ｐＶＰ２２−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）−１０９０コントロールベクター（パネルＣおよびＤ）、ｐＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）−１０９５（パネルＥおよびＦ）、ならびにｐＶＰ２２−ｃＭｙｃ−（ＨＩＳ−ＴＡＧ）−１１０１ベクター（パネルＧおよびＨ）で一過性にトランスフェクトした。一次抗ｃＭｙｃ抗体（ｃ−Ｍｙｃ  Ａｂ）をパネルＡ、Ｃ、Ｅ、およびＧにおいて添加したが、パネルＢ、Ｄ、Ｆ、およびＨにおいては、一次抗ｃＭｙｃ抗体を添加しなかった。
【図３】図３は、ＣＯＳにおいて発現されたＶＰ２２ベースのキメラタンパク質のウェスタンブロット分析である。パネル。それぞれ、ｐ１１０１およびｐ１０９０におけるＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）融合タンパク質およびコントロールＶＰ２２−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）タンパク質を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳにおいて発現した。使用した抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの抗ｃＭｙｃ抗体であった。矢印は、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）、ＶＰ２２−ｃＭｙｃ−（ＨＩＳ−ＴＡＧ）、およびＴＡＧの分子量を示す。
【図４Ａ】図４は、１セットのチャートである。図４Ａは、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ細胞株の反復性連続継代により決定されるように、１０９１−ＭＤＸ０１についての集団倍加曲線を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ細胞株の反復性連続継代により決定されるように、ｍＭＬＶ−ｈＴＥＲＴ不死化ＭＤＸ１２（黄色曲線）  対  親初代ＭＤＸ０１細胞（紫色曲線）の集団倍加曲線を示す。
【図５】図５は、ＴＲＡＰにより決定されるように、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴキメラタンパク質のテロメラーゼ触媒活性を示すゲルのセットである。図５Ａでは、発現ベクターｐ１０９０、ｐ１０９１、およびｐ１０９５において、それぞれＶＰ２２、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ、およびＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）融合構築物で一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの細胞溶解物に対してＴＲＡＰアッセイを行った。ＴＲＡＰにおけるｈＴＥＲＴ触媒活性についての陽性コントロールとして２９３Ｔ細胞を含めた。図５Ｂでは、安定なポリクローナルｐ１０９１／ＭＤＸ１細胞、陰性コントロールとしてＭＤＸ１、および陽性コントロールとしてＭＤＸ１２に対してＴＲＡＰアッセイを行った。
【図６】図６は、ＩＣＣによりｐ１０９１／ＭＤＸ１においてテロメラーゼの存在を検出したことを示す写真のセットである。ＩＣＣは、抗ｈＴＥＲＴ抗体であるαｈＴＥＲＴ（Ｃ−２０）Ａｂを用いてｐ１０９１／ＭＤＸ１安定細胞に対して行ったが、ＭＤＸ１細胞（図６Ａおよび６Ｂ）およびＭＤＸ１２細胞（図６Ｃおよび６Ｄ）を、それぞれｈＴＥＲＴ陰性コントロールおよびｈＴＥＲＴ陽性コントロールとして使用した。一次抗ｈＴＥＲＴ抗体を６Ａ、６Ｃ、および６Ｅにおいて添加したが、６Ｂ、６Ｄ、および６Ｆにおいては、一次抗ｈＴＥＲＴ抗体を添加しなかった。
【図７】図７は、ＭＤＸ１２および１０９１−ＭＤＸ０１の不死化細胞株においてＲＴ−ＰＣＲにより測定されるように、内因性ｈＴＥＲＴおよびＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現を示すゲルのセットである（さらなる図示有り）。ＭＤＸ１２（ｈＴＥＲＴ不死化）および１０９１−ＭＤＸ０１（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ不死化）細胞株から単離したｍＲＮＡに対して、内因性ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図７Ａ）。ＭＤＸ１２（ｈＴＥＲＴ不死化）および１０９１−ＭＤＸ０１（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ不死化）細胞株から単離したｍＲＮＡに対して、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図７Ｂ）。＋ＲＴは、逆転写酵素の添加を示し、そして−ＲＴは、逆転写酵素添加なしのＰＣＲを示す；＋ＲＴ＊は、異なる銘柄の逆転写酵素の使用を示す。
【図８】図８は、ＭＤＸ１２および１０９１−ＭＤＸ０１不死化細胞株におけるＲＴ−ＰＣＲにより測定されるように、内因性ｈＴＥＲＴおよびＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現を示すゲルのセット（さらなる説明有り）である。ＭＤＸ１２（ｈＴＥＲＴ不死化）および１０９１−ＭＤＸ０１（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ不死化）細胞株から単離したｍＲＮＡに対して、ｍＭＬＶ−ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図７Ａ）。ＭＤＸ１２（ｈＴＥＲＴ不死化）および１０９１−ＭＤＸ０１（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ不死化）細胞株から単離したｍＲＮＡに対して、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図７Ｂ）。＋ＲＴは、逆転写酵素の添加を示し、そして−ＲＴは、逆転写酵素添加なしのＰＣＲを示す；＋ＲＴ＊は、異なる銘柄の逆転写酵素の使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
（導入。）初代哺乳動物細胞の条件的不死化における使用のための、本発明の
方法および組成物。本発明は、ＶＰ２２またはＴＡＴの、癌遺伝子または不死化
遺伝子への結合を提供し、その結果、真核生物細胞または原核生物細胞は、融合
タンパク質を効率的に産生し得る。ヒトテロメラーゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）は、
初代ヒト線維芽細胞を、その細胞が「形質転換」されることなく不死化させ得る
（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１、１１
５〜１１８頁、１９９９；Ｊｉａｎｇ，Ｘ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ  ２１、１１１〜１１４頁、１９９９）。本発明者らは、ＶＰ２２タンパ
ク質が、適切に露出させた細胞の細胞膜を横切ってヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲ
Ｔ）タンパク質を運ぶことにより、同じ目的の役に立ち得ることを仮定した。類
推に基づいて、任意の不死化タンパク質（例えば、ＳＶ４０、ｃＭｙｃ、Ｅ１Ａ
、Ｅ６、Ｅ７、ｒａｓなど）を、ＶＰ２２タンパク質のカルボキシ末端に付着さ
せ得、そしてこれらの融合タンパク質は、露出された初代細胞の核内に効率的に
輸送される。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、ヒトβ細胞の条件的不死化（例えば、Ｓ
Ｖ４０  ＴＡＧ、ｍｙｃ、ｒａｓなどによる）を、一過性の様式（短時間または
細胞の増殖および発現の間のみにわたる）で、ＶＰ２２融合タンパク質またはＴ
ＡＴ融合タンパク質が細胞に提供される間、提供する。従って、本発明は、条件
的不死化を、ＤＮＡトランスフェクションまたはウイルス形質導入の直接的な使
用なしで、可能にする。
【００１９】
産生細胞由来かまたは産生細胞を含む、上清、抽出物、または同時培養物を使
用して、癌遺伝子、不死化タンパク質、または目的の他のタンパク質を、選択し
た細胞へと送達し得る。あるいは、融合タンパク質を精製し、そして培養培地に
、培地補充物として添加し得る。分化した最終細胞を得るために、融合タンパク
質添加物は、単に、培地から除去される。
【００２０】
このアプローチの利点は、多数であり得る。これらの利点としては、目的のヒ
ト細胞株の、ウイルス性形質導入またはプラスミドトランスフェクションの排除
が挙げられる。ＶＰ２２融合タンパク質を、補充物として、組織培養増殖培地に
単に添加し得る。この様式で、細胞は、癌遺伝子配列または不死化遺伝子配列で
の細胞の永続的な遺伝子改変を必要とせずに、培養物中で不死化シグナルに直接
曝露される。
【００２１】
別の利点は、このように不活化された哺乳動物細胞のゲノムから導入された不
死化遺伝子配列の、それぞれ不活化および排除のための、遺伝子切り替えに基づ
く系およびＣｒｅ／ｌｏｘ不活化に基づく系の排除である。不死化遺伝子配列は
、いずれも決して初代ヒト細胞に導入されないので、免疫化／形質転換癌遺伝子
の発現をオフにするため、またはＣＲＥレコンビナーゼの添加による癌遺伝子の
後の切り出しのために免疫化遺伝子をｌｏｘＰ部位に隣接させるために、複雑な
遺伝子スイッチ（ｔｅｔ、エクジソンなど）を添加する必要はない。ＶＰ２２ま
たはＴＡＴ融合タンパク質を用いて、組織培養培地から、細胞増殖の原因となる
タンパク質を単に除去し、そして不死化シグナルの細胞輸送が停止される。安全
の観点から、潜在的に形質転換されたヒト細胞を、患者集団に移入することに対
する考慮は、かなり少ない。対照的に、古典的な遺伝子トランスフェクション／
形質導入方法を用いて、形質転換遺伝子配列が「完全に」排除されたかまたはオ
フにされたことを示すことは、非常に困難である。換言すれば、現在使用される
、伝統的な遺伝子形質転換アプローチを使用して、移植された細胞に最初に挿入
された不死化遺伝子の全ての最後の１つを完全に不活化することは、決して確認
し得ない。
【００２２】
本発明の別の利点は、ＶＰ２２またはＴＡＴ融合タンパク質の、増殖細胞培養
培地からの除去の際に、増殖中の細胞を完全に分化された表現型まで、より効率
的かつ迅速に復帰する可能性を発生させ得る、増加した見込みである。
【００２３】
本発明の別の利点は、タンパク質が、細胞への遺伝子送達の必要なしに、核に
直接輸送され得ることである。本発明は、ヒト初代細胞（例えば、膵臓β細胞、
肝実質細胞、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞、脳細胞または脂肪細胞）
の条件的不死化のために、特に有利である。効率的な核輸送の結果として、本発
明はまた、任意の細胞株における特異的な内因性遺伝子の、一過性の遺伝子活性
化のために使用され得る。融合タンパク質が、内因性タンパク質の特異的遺伝子
発現を転写的に活性化するポリペプチド配列を含む場合には、本発明はまた、そ
の遺伝子またはタンパク質のためのコード配列を使用せずに、目的の任意のタン
パク質の産生のために使用され得る。ＶＰ２２またはＴＡＴ融合タンパク質の使
用により内因的に活性化され得る遺伝子の例は、ＥＰＯ、第ＶＩＩＩ因子、レプ
チン（ｌｅｐｔｉｎ）、ｈＧＨ、インスリンなどである。従って、本発明を使用
して、任意の用途のために上記タンパク質を産生するために、任意の初代細胞ま
たは不死化細胞を一過性に遺伝子活性化し得る。
【００２４】
本発明の使用は、一過性であり得、任意の細胞を用いて達成され得、そして遺
伝子の上流のプロモーター領域へのＤＮＡ挿入を必要としない。本発明者らは、
正確な特異的な遺伝子活性化タンパク質の配列情報を何も必要としない。このこ
とは、特定のプロモーター配列の遺伝子活性化の使用を回避する。さらに、転写
アクチベーターについてのスクリーニングの開発が可能であり、これは、ＶＰ２
２またはＴＡＴとともに使用して、目的の任意のタンパク質を、アクチベーター
についてスクリーニングし得る。
【００２５】
別の実施形態において、ＶＰ２２またはＴＡＴを、テロメラーゼに結合する。
ＶＰ２２−テロメラーゼ融合タンパク質またはＴＡＴ−テロメラーゼ融合タンパ
ク質は、目的の細胞に一過性に送達される。この融合タンパク質の、培地からの
除去の際に、送達プロセスが停止される。ただし、染色体先端を一過性に「テロ
メア化」させ、そしての複製細胞寿命を５０回より多い集団倍加以上に延長させ
た後である。この送達プロセスは、本発明者らのいずれの最終生成物においても
、送達された遺伝子配列の保持を必要としない。従って、本発明は、最終的な細
胞またはデバイスの製品において、ウイルス、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、ＳＶ４０、また
はテロメラーゼの保持を回避する。
【００２６】
別の実施形態において、ＶＰ２２またはＴＡＴは、ｃ−ｍｙｃ（これは、転写
活性化によって、テロメラーゼ活性を特異的に誘導する）に結合され、その結果
、テロメラーゼ融合タンパク質を必要としない（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ
＆  Ｄｅｖｅｌ．１２、１７６９〜１７７４頁、１９９８）。
【００２７】
（ＶＰ２２の輸送機能を有するポリペプチド。）ＶＰ２２は、単純ヘルペス１
型ウイルス（ＨＳＶ）において見出される構造的タンパク質である。ヘルペスウ
イルスＨＳＶ−１ビリオンタンパク質ＶＰ２２は、異常な細胞内転送機構を有す
る（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／０５２６５；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’
Ｈａｒｅ、８８  Ｃｅｌｌ  ２２３−２３３（１９９７）を参照のこと）。この
タンパク質は、非古典的なゴルジ非依存性の機構により、細胞の膜を通してそれ
自体を効率的に輸送し得る。ＶＰ２２タンパク質は、内因性合成および分泌の結
果としてか、または神経細胞への外因性の適用の後に、周囲の細胞内にそれ自体
を輸送し得る。ＶＰ２２は、非発現細胞の単層にわたって拡散し得、これによっ
てＶＰ２２は、発現細胞の細胞質から隣接する細胞内へと輸送される。興味深い
ことに、ＶＰ２２タンパク質は、核に自然に標的化され、ここで、このタンパク
質は、染色質に直接結合し、そして細胞分裂の後に、娘細胞に分離する。さらに
、種々の他のタンパク質に融合する場合には、ＶＰ２２タンパク質は、この融合
タンパク質を、細胞膜を横切って輸送し得、従って、付着したタンパク質を核内
に運ぶ。より重要なことには、ＶＰ２２融合タンパク質は、そのキメラ状態にお
いて生物学的活性を維持すること、およびこの活性を、高効率な様式で、曝露さ
れた細胞内に直接送達することが示された。このＶＰ２２融合タンパク質輸送能
は、最近、種々の異なるタンパク質（グリーン蛍光タンパク質（２７Ｋｄａ蛍光
マーカータンパク質）（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、６  Ｇｅｎｅ  Ｔ
ｈｅｒａｐｙ  １４９−１５１、１９９９）、Ｐ−５３（５３Ｋｄａ細胞周期調
節タンパク質）（Ｐｈｅｌｅａｎら、１６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ  ４４０−４４３、１９９８）；チミジンキナーゼ（遺伝子治療試行に
おいて慣用的に使用されるプロドラッグ自殺タンパク質の組合せにおいて転換酵
素として作用する、５２Ｋｄａ酵素）；（Ｄｉｌｂｅｒら、６  Ｇａｎｅ  Ｔｈ
ｅｒａｐｙ  １２−２１（１９９９））、およびβ−ガラクトシダーゼ（遺伝子
発現研究においてレポータータンパク質として広範にわたって使用される、１１
６Ｋｄａ細菌酵素）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる）に対して実証され
た。これらの研究の全てにおいて、キメラＶＰ２２融合タンパク質は、融合タン
パク質に曝露された細胞内に効率的に輸送され、そして最も重要なことには、Ｖ
Ｐ２２０ＴＫ系について、インビトロおよびインビボでの両方で、各結合したタ
ンパク質に関する生物学的効果を実証した。
【００２８】
他の種々のタンパク質は、膜転座配列（ＭＴＳ）の付加により、細胞膜を透過
する能力を有する（Ｒｏｊａｓら、１６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ  ３７０−３７５（１９９８））。ＭＴＳ（疎水性領域（ｈ−領域））を
使用して、種々のペプチドおよびタンパク質（カーゴ（ｃａｒｇｏ））を、細胞
膜を横切って、非分解的な様式で送達する。ＨＩＶ−１  ＴＡＴ（Ｅｎｓｏｌｉ
ら、６７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  １７７−２８７（１９９３）；Ｆａｗｅｌｌら、９
１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６６４−６６８（１９９
４）；Ｓｈｗａｒｚｅら、２８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５６９−１５７２（１９
９９））および他の少数の非ウイルス性タンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、８９  
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６９１−１０６９５（１
９９２））もまた、細胞内転送特性の原因であったが、変性／再生したＴＡＴタ
ンパク質以外には、ＶＰ２２ほど顕著にこの現象を実証しないようである。ＶＰ
２２のさらに重要な特性は、細胞単層の媒体に外因的に適用される場合に、ＶＰ
２２が、トランスフェクトされていない細胞により取り込まれ得、ここで細胞核
内に蓄積することである。
【００２９】
用語「ＶＰ２２」は、ＨＳＶ（例えば、ＨＳＶ１）のタンパク質ＶＰ２２、な
らびにその輸送活性フラグメントおよびホモログ（他のヘルペスウイルス（水痘
帯状ヘルペスウイルスＶＺＶ、ウマヘルペスウイルスＥＨＶおよびウシヘルペス
ウイルスＢＨＶが挙げられる）由来の輸送活性ホモログを含む）；これらとの相
同性およびＨＳＶ１のＶＰ２２の輸送機能に対応する輸送機能を有する改変およ
び変異されたタンパク質および融合ポリペプチド、ならびに結合生成物を示し；
そして文脈によりまた、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡの形態であれ、ベクターの形
態であれ、より大きな核酸配列（サブ配列のような配列を含む）の形態であれ、
上記のいずれかをコードする核酸配列に関する。
【００３０】
輸送活性を有するヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質の部分配列、およびこ
れらを試験する方法が、他の場所に記載されている。例えば、ＰＣＴ国際特許出
願ＷＯ９７／０５２６５、ＷＯ９８／０４７０８、およびＷＯ９８／３２８６６
（この各々が、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。輸送活性を
有するヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質の部分配列は、完全ＨＳＶ１  ＶＰ
２２配列（１〜３０１）のアミノ酸６０〜３０１および１５９〜３０１に対応す
る、ポリペプチドを含む。ＶＰ２２配列のアミノ酸残基（「ａａ」）１７５〜３
０１からなるポリペプチドは、顕著により小さい輸送活性を有し、そして本発明
と関係するとより好ましくない。従って、本発明は、１つの局面において、以下
：好ましくはおよそａａ１５９（またはネイティブのＶＰ２２配列においては、
もっとＮ末端側）から始まりおよそａａ３０１までの配列を含み、かつＶＰ２２
配列の少なくとも一部の少なくとも１つの欠失（例えば、Ｎ末端から言及される
開始点まで広がり得る（例えば、およそａａ１〜１５８の配列のすべてまたは一
部の欠失））を（完全ＶＰ２２配列と比較して）有する、ＶＰ２２の部分配列、
を含む結合タンパク質および融合タンパク質に関する。より好ましくないことに
は、このような欠失は、Ｃ末端方向で、例えば、およそａａ１７５までさらに広
がり得る。例えば、およそａａ６０〜３０１からおよそａａ１５９〜３０１の範
囲の部分配列が、好ましい。
【００３１】
ＶＰ２２配列は、本明細書中で意図される場合、他のヘルペスウイルス由来の
ＶＰ２２タンパク質ホモログの配列に基づいて、相同なタンパク質およびフラグ
メントまで広がる。例えば、対応する誘導体およびＶＰ２２ホモログ配列は、Ｖ
ＺＶから（例えば、配列ａａ１〜３０２のすべてまたは相同な部分）、ＭＤＶか
ら（例えば、配列ａａ１〜２４９のすべてまたは相同な部分）、およびＢＨＶか
ら（例えば、配列ａａ１〜２５８のすべてまたは相同な部分）から得られている
（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９７／０５２６５、ＷＯ９８／０４７０８、およびＷ
Ｏ９８／３２８６６を参照のこと）。ＨＳＶ２由来、ＶＺＶ由来、ＢＨＶ由来、
およびＭＤＶ由来の対応するタンパク質の配列は、公のタンパク質／核酸配列デ
ータベースにて利用可能である。従って、例えば、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋデ
ータベースにおいて、ＨＳＶ２由来のＶＰ２２配列が、ＨＳＶ２  ＨＧ５２株の
完全ゲノムを含む、登録番号Ｚ８６０９９の下で、遺伝子項目（ｉｔｅｍ）ＵＬ
４９として利用可能であり；相同遺伝子／タンパク質を含む、ＶＺＶの完全ゲノ
ムが、登録番号Ｘ０４３７０、同Ｍ１４８９１、同Ｍ１６６１２の下で利用可能
であり；ＢＨＶ由来の対応するタンパク質配列が、登録番号Ｕ２１１３７の下で
、「ウシヘルペスウイルス１ビリオン被膜タンパク質」として利用可能であり：
そしてＭＤＶ由来の対応する配列が、「ニワトリ属ヘルペスウイルス１型相同配
列遺伝子」についての登録番号ＬＩ０２８３の下で、遺伝子項目ＵＬ４９として
利用可能である。これらのタンパク質（特に、ＨＳＶ２およびＶＺＶ由来のもの
）において、例えば、ＨＳＶ１由来のＶＰ２２のａａ１〜１５９に相同な配列の
対応する欠失が、作製され得る。これら言及される配列は、本明細書中に参考と
して援用される。これらの間の相同性は、例えば、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９５
／１２６７３（９頁）に言及されるような、標準的アルゴリズムおよびソフトウ
ェアの使用によって、容易に理解可能である。
【００３２】
ＶＰ２２配列は、本明細書中で意図される場合、ＶＰ２２と類似する特性を有
するタンパク質由来の配列（例えば、Ｋａｒｐｏｓｉ線維芽細胞増殖因子由来の
ＭＴＳの１２アミノ酸（膜トランスロケーション配列）およびＨＩＶ  ＴＡＴタ
ンパク質の類似の１１アミノ酸領域（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、２８５  Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ  １５６９〜１５７２（１９９９））に広がる。
【００３３】
さらに、キメラＶＰ２２タンパク質およびタンパク質配列（例えば、その一部
の代わりに、別のヘルペスウイルスの対応するＶＰ２２ホモログ由来の相同配列
で置換されている、ＨＳＶ１のＶＰ２２由来のタンパク質配列）もまた、本発明
の状況において有用である。例えば、ＨＳＶ１のＶＰ２２由来のポリペプチド１
５９〜３０１の配列中に、ＨＳＶ２のＶＰ２２由来またはＢＨＶのＶＰ２２ホモ
ログ由来のＣ末端配列が、置換され得る。
【００３４】
ＨＳＶ１のＶＰ２２由来の３４アミノ酸Ｃ末端配列の欠失が、輸送活性を完全
破壊することが報告されている（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９７／０５２６５、Ｗ
Ｏ９８／０４７０８、およびＷＯ９８／３２８６６を参照のこと）。従って、こ
の配列領域は、輸送活性に必須のエレメントを含む。本発明の好ましい実施形態
に従って、以下：ａ）細胞不死化のためのタンパク質またはポリペプチド；（ｂ
）テロメラーゼ特異的活性を有するタンパク質またはポリペプチド；あるいは（
ｃ）特定の内因性遺伝子の活性化のためのタンパク質またはポリペプチド、に由
来する配列とともに、ＶＰ２２またはその改変体由来の３４アミノ酸Ｃ末端配列
を含む、結合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドが提供される。これらは、例
えば、タンパク質の形態で、それらを取り込む細胞に投与することによる使用の
ために、提供される。ＨＳＶ１  ＶＰ２２のＣ末端の３４アミノ酸配列と比較し
て、少なくとも１つの変異挿入または欠失を有する、改変された末端フラグメン
トの結合産物もまた、提供される。本発明の代替の好ましい実施形態に従って、
その融合ポリペプチドは、ＶＰ２２またはその改変体由来の３４アミノ酸Ｃ末端
配列を、以下：（ａ）細胞不死化のためのタンパク質またはポリペプチド；（ｂ
）テロメラーゼ特異的活性を有するタンパク質またはポリペプチド；あるいは（
ｃ）特定の遺伝子の活性化のためのタンパク質またはポリペプチド、をコードす
る、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とともに、含む。
【００３５】
輸送活性に必要な配列もまた、ＨＳＶ１または他のヘルペスウイルスのＶＰ２
２のＣ末端配列由来の１つもしくは複数のアミノ酸配列モチーフまたはそのホモ
ログを含むことが報告されおり、このモチーフまたはそのホモログは、ＲＳＡＳ
Ｒ、ＲＴＡＳＲ、ＲＳＲＡＲ、ＲＴＲＡＲ、ＡＴＡＴＲから選択され得、そして
この中で、３番目または４番目の残基Ａは、例えば、ＲＳＡＡＳＲにおけるよう
に、繰り返され得る。
【００３６】
（融合タンパク質）使用において、本明細書中に記載される組成物の多くは、
細胞の標的集団の第１の部分にて融合タンパク質として発現され得、そこから外
に輸送され得、そして収集され得る。次いで、この融合タンパク質は、増殖培地
中に位置し、そこでそのタンパク質を直接には産生しない細胞の標的集団の第２
の部分により取り込まれる。
【００３７】
本明細書中に記載されるような融合ポリペプチドは、その融合ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドまたは他のベクターを細胞の第１の集団に（例えば
、トランスフェクションまたはマイクロインジェクションによって）導入し、そ
の融合ポリペプチドを産生するコードポリヌクレオチドを発現して、それにより
その融合ポリペプチドが細胞の第１の集団から外に輸送されることを引き起こす
ことによって、細胞の標的集団に運ばれ得、収集され得、そして増殖培地を介し
て細胞の第２の集団に導入され得る。
【００３８】
ＶＰ２２またはＴＡＴ、あるいはその機能的部分配列は、必要に応じて結合の
ためのさらなるポリペプチドテールとともに、任意の公知の適切な標準的様式で
の化学的結合によって、他のタンパク質または核酸に連結され得る。ＶＰ２２タ
ンパク質またはＴＡＴタンパク質の輸送機能を有するアミノ酸配列の結合または
融合は、言及される種のタンパク質に有用な細胞送達構築物を提供し得る。
【００３９】
用語「融合タンパク質」は、「結合タンパク質」、「結合産物」および「融合
産物」のような用語を、包含する。好ましくは、この結合タンパク質は、融合タ
ンパク質であり、この融合タンパク質は、公知の適切な宿主細胞においてほぼイ
ンフレームに融合された遺伝子コード配列から都合良く発現され得る。対応する
ポリヌクレオチド配列は、公知かつ標準的な組換えＤＮＡ技術の要素およびその
容易に利用可能な適合を使用して、調製および操作され得る。しかし、化学的に
結合した産物は、所望の場合に、特定の適用に使用され得、そして当該分野で公
知の種々の化学的結合技術のいずれかに従って、個別のタンパク質成分から調製
され得る。
【００４０】
融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術に類似するかまたはそれらから容
易に適合可能な様式で、形成および使用され得る。そのポリヌクレオチドは、適
切なプロモーター配列に作動可能に連結されたオープンリーディングフレームに
て含まれ得、そして例えば、プラスミド中に保有されるそのポリヌクレオチドを
含む、発現ベクターの一部を形成し得る。この発現ベクターは、例えば、組換え
ウイルスベクターであっても、または非ウイルス性トランスフェクションベクタ
ーであってもよい。このベクターは、例えば、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９７／０
５２６５にて言及もしくは記載されるベクター、あるいはＰＣＴ国際特許出願Ｗ
Ｏ９７／０５２６３、ＷＯ９４／２１８０７、またはＷＯ９６／２６２６７にて
言及もしくは記載されるベクターの、アナログまたは例であり得る。機能的ポリ
ペプチドを産生するように転写および翻訳され得るヌクレオチド配列について、
遺伝コードの縮重は、同じポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列を
生じる。本発明は、このような配列すべてを包含する。
【００４１】
本明細書中に記載される産物は、例えば、上述の種由来のＶＰ２２に結合され
たポリペプチド配列に対応するエフェクター機能がその産物を取り込んだ標的細
胞内にて生じ得るように、細胞の標的集団により取り込まれ得る輸送可能なタン
パク質として、本発明に従って使用され得る。従って、例えば、その標的細胞は
、そのポリペプチド配列またはヌクレオチド配列が不死化因子由来である場合に
、不死化され得るし、あるいはそのポリペプチド配列またはヌクレオチド配列が
テロメラーゼもしくはテロメラーゼアクチベーター由来である場合に、長期の複
製寿命を入手し得る。使用において、本明細書中に記載される産物の多くは、細
胞の標的集団の第１の部分にて融合タンパク質として発現され得、そこから外に
輸送され得、そして収集され得る。次いで、その融合タンパク質は、増殖培地中
に位置し、そこで、その融合タンパク質は、そのタンパク質を直接には産生しな
い、細胞の標的集団の第２の部分により取り込まれる。
【００４２】
融合タンパク質は、本明細書中に記載される場合、その融合ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチドまたは他のベクターを（例えば、トランスフェクションま
たはマイクロインジェクションによって）細胞の標的集団の第１の部分に導入し
、そのコードポリヌクレオチドをその融合ポリペプチドを産生するように発現し
、それによりその融合ポリペプチドが上記標的集団の上記第１の部分から外に輸
送されるのを引き起こすことによって、細胞の第１の集団に運ばれ得、収集され
、そして増殖培地を介して標的集団の第２の部分に導入され得る。融合タンパク
質（化学的に結合された産物を含む）はまた、その融合タンパク質の調製物に細
胞を直接曝露し、それによりその標的細胞がその調製物を取り込むのを引き起こ
すことによって、細胞の標的集団中に運ばれ得る。
【００４３】
本発明の局面によって、輸送活性物質として、および輸送される物質との結合
のため、本明細書中の他の場所に示される目的で、使用され得るＶＰ２２の誘導
体には、ＶＰ２２のＣ末端部由来の輸送活性機能性配列を含むペプチドがある。
【００４４】
ＶＰ２２に基づく結合産物または融合タンパク質は、一定範囲の分子サイズを
有し得る。この産物は、実際問題として、例えば、約７０ｋＤａ以上までであり
得、例えば、ＶＰ２２に結合または融合されるタンパク質のサイズの関しては、
９０ｋＤａまたは１００ｋＤａであり得る。本発明の実施形態は、その融合ペプ
チドが少なくとも約１３残基長、すなわち約１２アミノ酸残基長より長い、例を
包含する。融合されるタンパク質はまた、時には、約２７ｋＤａまたは３２ｋＤ
ａより長くあり得る。ＶＰ２２成分を含む、結合ポリペプチドまたは融合タンパ
ク質は、１２０ｋＤａを超えるサイズ（例えば、約１８０ｋＤａまたは２００ｋ
Ｄａまで）を有し得る。
【００４５】
ＶＰ２２配列は、そのＮ末端が、本明細書中に記載された種類のうち１つの選
択された他のタンパク質の配列に融合されることが時々好ましい。Ｃ末端融合物
も同様に時々好ましい。
【００４６】
本発明のポリペプチドにおいて、構成アミノ酸配列の変異は、融合ポリペプチ
ドおよび他の結合体化タンパク質において取り込まれ得る。変異した配列を有す
るタンパク質は、対応する親配列を有するタンパク質と相同（例えば、配列、機
能；および抗原特性または他の機能）を保持するようにここに含まれる。このよ
うな変異は、好ましくは、例えば、保存的なアミノ酸変化（例えば、おおまかに
類似の分子特性のアミノ酸間の変化）をともなう変異である。例えば、脂肪族で
あるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン内の置換は、保存的である
とみなされ得る。時々これらのうちの１つとグリシンとの置換はまた、保存的で
あるとみなされ得る。脂肪族であるアスパルテートおよびグルタメート内の置換
はまた、保存的であるとみなされ得る。アミド基であるアスパラギンおよびグル
タミン内の置換はまた、保存的であるとみなされ得る。ヒドロキシ基であるセリ
ンおよびトレオニン内の置換はまた、保存的であるとみなされ得る。芳香族であ
るフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン内の置換はまた、保存的で
あるとみなされ得る。塩基性基であるリシン、アルギニンおよびヒスチジン内の
置換はまた、保存的であるとみなされ得る。硫黄含有基であるメチオニンおよび
システイン内の置換はまた、保存的であるとみなされ得る。時々メチオニンおよ
びロイシン内の置換はまた、保存的であるとみなされ得る。好ましい保存的置換
基は、アスパルテート−グルタメート；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロ
イシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；およ
びリシン−アルギニンである。その他の点では、変異した配列は挿入を含み得、
その結果、全てのアミノ酸配列は長くされるが、このタンパク質は輸送特性を保
持する。さらに、変異した配列は、全てのアミノ酸配列を短くする、ランダムま
たは設計された内在的な欠失を含み得るが、このタンパク質は輸送特性を保持す
る。
【００４７】
変異されたタンパク質配列は、さらに、または、あるいは親タンパク質をコー
ドする天然に存在するポリヌクレオチドの適切な鎖を用いてストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードし得、そして親タ
ンパク質に関連する公知の機能試験においてポジティブな結果について試験され
得る。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして異なる環境にお
いて異なる。一般的には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度お
よびｐＨで特異的な配列に関して熱融点（ＴM）よりも約５℃低いように選択さ
れ得る。ＴMは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が
完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。代表的には、ストリ
ンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７で少なくとも０．０２Ｍであり、そして温
度が少なくとも約６０℃である条件である。他の因子（特に、相補鎖の、塩基組
成および大きさを含む）が、ハイブリダイズのストリンジェンシーに影響を与え
得る場合、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチの程度、パラメーターの組み合
わせは、いずれか１つの決定的な測定よりも重要である。
【００４８】
ＶＰ２２融合タンパク質またはＴＡＴ融合タンパク質は、ポリＨｉｓ（ポリヒ
スチジン）タグを使用して容易に精製され得る。ポリＨｉｓタグ含有融合タンパ
ク質の産生ための系は、市販されている（Ｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ；ＨｉｓＴｒａｐ  ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  
Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【００４９】
（不死化タンパク質との結合体化）。細胞の寿命を延長する一般的な研究は、
１つ以上の不死化遺伝子を含むウイルスまたはプラスミドを移入することである
。細胞の不死化は、細胞の寿命を延ばし、そして得られる細胞株は、本来の細胞
よりもはるかに多くの時間を継代し得る。しかし、不可逆的に形質転換された腫
瘍形成ヒト細胞は、ソフト寒天においてコロニーを形成し得、そしてヌードマウ
スにおいてもまた腫瘍を形成し得る。これらの細胞は、直接的な細胞治療または
完全に分化された細胞機能の任意のアッセイに不適切である。
【００５０】
本発明の１つの有用なクラスの実施形態において、ＶＰ２２は、細胞の不死化
を引き起こす公知のタンパク質またはポリペプチドと結合体化され得る。不死化
遺伝子は、当該分野において周知である。例えば、Ｋａｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５７：６９−９１（１９９８）を参照のこと。
不死化タンパク質またはポリペプチドとしては、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の
１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ＳＶ４０スモールＴ抗原およびラージＴ抗原、パ
ピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エ
プスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（
ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ、リスザルヘルペスウイルス（ＨＶＳ）
、変異体ｐ５３、および癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、
ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ
、ｎ−ｍｙｃ、およびＭｄｍ２）由来のタンパク質が挙げられるが、これらに限
定されない。
【００５１】
細胞の不死化に関連する本発明の実施例において、ＶＰ２２は、オンコタンパ
ク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍｙｃ（ｖ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ）と結合
体化される。従って、本発明の１つの実施形態に従って、ヘルペスウイルスＶＰ
２２タンパク質の輸送機能を有するアミノ酸配列およびｍｙｃの不死化機能性を
有する配列を含む融合タンパク質が提供される。好ましい実施形態において、融
合タンパク質は、実質的に全長ｍｙｃ配列および実質的に全長ＶＰ２２配列を含
む。
【００５２】
ＶＰ２２との融合は、ｍｙｃのような不死化の因子の送達のために使用される
。本明細書中に与えられた説明が、ｍｙｃおよび関連ペプチドをいう場合；文脈
を承認する場合、別の不死化因子（例えば、ｍｙｃアナログおよび本明細書中に
記載および参照される他の不死化因子）はまた、より一般的には、本明細書中に
記載されるその他の型の任意の、ＶＰ２２のための別の融合パートナーまたは結
合体化パートナーであるように考慮される。発現細胞の部分集団において一旦発
現され、収集され、そして増殖培地に投与される、このようなタンパク質は、Ｖ
Ｐ２２輸送機構によって、標的の正常な体細胞の有意な部分へ輸送され得、次い
で外来付着ポリペプチド（ｆｏｒｅｉｇｎ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐ
ｔｉｄｅ）は、これらの正常な細胞を不死化する。
【００５３】
ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質の輸送機能を有する配列およびｍｙｃの
ヒトまたはその他の哺乳動物の細胞増殖機能を有する配列を含む、融合ポリペプ
チドをコードする対応するポリヌクレオチドもまた、本発明のこの局面によって
提供される。このポリヌクレオチドは、適切なプロモーター配列に作動可能に連
結されるオープンフレームにおいて含まれ得る。
【００５４】
このポリヌクレオチドは、本発明の実施例に従って、発現ベクターの一部を形
成し得る（例えば、プラスミドにおいて保有されているポリヌクレオチドを含む
）。この発現ベクターは、例えば、ウイルス感染ベクターまたは非ウイルス感染
ベクターであり得る。
【００５５】
（テロメラーゼとの結合体化）。テロメラーゼは、真核生物の染色体の末端の
構造に特殊化され、そして染色体の安定化、位置決定、および複製において機能
するようである。ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＳｚｏｓｔａｋ，５３  Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３−１９４（１９８４）；Ｚａｋｉａｎ，２３  Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５７９−６０４（１９８９）；Ｂｌａｃｋｂ
ｕｒｎ，３５０  Ｎａｔｕｒｅ  ５６９−５７３（１９９１）。全ての脊椎動物
において、テロメアは、数百から数千の５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列の縦列反
復および関連タンパク質からなる（３５０  Ｎａｔｕｒｅ  ５６９−５７３（１
９９１）；Ｍｏｙｚｉｓら、８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６
６２２−６６２６（１９８８））。染色体末端制限フラグメント（ＴＲＦ）のサ
ザンブロット分析は、細胞集団における全てのテロメアの複合長を提供する（Ｈ
ａｒｌｅｙら、３４４５  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８−４６０（１９９０）；Ａｌｌ
ｓｏｐｐら、８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１１
４−１０１１８（１９９２）；Ｖａｚｉｒｉら、５２  Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６６１−６６７（１９９３））。現在までに試験された全て
の正常な体細胞において、ＴＲＦ分析は、染色体が、細胞分裂あたりテロメア配
列の約５０〜２００ヌクレオチドが欠失することを示し、これは、ＤＮＡポリメ
ラーゼが、直鎖状ＤＮＡを最後まで複製し得ないことと一致する（Ｗａｔｓｏｎ
，２３９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９７−２０１（１９７２
））。
【００５６】
このテロメアの短縮化は、細胞が、それらの分裂数を数える有糸分裂時刻機構
（ｃｌｏｃｋ）であることを提案し（Ｈａｒｌｅｙ，２５６  Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．
２７１−２８２（１９９１））、そして十分に短いテロメアは、正常な細胞にお
ける複製配列のためのシグナルであり得る（Ｈａｓｔｉｅら、３４６  Ｎａｔｕ
ｒｅ  ８６６−８６８（１９９０）；Ｌｉｎｄｓｅｙら、２５６  Ｍｕｔ．Ｒｅ
ｓ．４５−４８（１９９１）；ＷｒｉｇｈｔおよびＳｈａｙ，８  Ｔｒｅｎｄｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９３−１９７（１９９２））。対照的に、現在までに試
験された大部分の不死化細胞は、細胞分裂によるテロメア長またはテロメア配列
の正味の損失を示さず、このことは、テロメアの維持が、複製の老化を回避する
ためおよび永久に増殖するために細胞に必要であることを示唆している（Ｃｏｕ
ｎｔｅｒら、１１  ＥＭＢＯ  １９２１−１９２９（１９９２）；Ｃｏｕｎｔｅ
ｒら、９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２９００−２９
４０，１９９４）。
【００５７】
テロメラーゼ（独特なリボ核タンパク質ＤＮＡポリメラーゼ）は、この酵素の
構成要素であるＲＮＡ内に含まれる配列を鋳型として用いて染色体末端でテロメ
アＤＮＡを合成することが公知である唯一の酵素である（Ｇｒｅｉｄｅｒおよび
Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，４３  Ｃｅｌｌ  ４０５−４１３（１９８５）；Ｇｒｅｉ
ｄｅｒおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ，３３７  Ｎａｔｕｒｅ  ３３１−３３７（１
９８９）；Ｙｕら、３４４  Ｎａｔｕｒｅ  １２６−１３２（１９９０）；Ｂｌ
ａｃｋｂｕｒｎ，６１  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３−１２９（１
９９２））。ヒト細胞およびヒト組織に関して、テロメラーゼ活性は、不死化細
胞株および卵巣癌腫において同定されているが、死ぬべき運命の（ｍｏｒｔａｌ
）細胞株または正常な非生殖細胞組織においては検出されていない（Ｍｏｒｔｉ
ｎ，５９  Ｃｅｌｌ  ５２１−５２９，１９８９）。ＴＲＦ分析とともに、これ
らの結果は、テロメラーゼ活性が、テロメアの維持に直接関与しており、この酵
素が、細胞の不死化に関連していることを示唆する。
【００５８】
ヒトテロメラーゼ触媒成分（ｈＴＥＲＴ）の発現は、最近ヒト体細胞において
研究されている（Ｊｉａｎｇら、２１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１
１−１１４（１９９９））。正常な体細胞におけるテロメラーゼの発現は、悪性
の表現型に関連する変化（例えば、異常な増殖制御または癌遺伝子の形質転換）
を誘導しないようであった。癌関連変化の欠失はまた、テロメラーゼで不死化し
たヒト線維芽細胞において報告された。Ｍｏｒａｌｅｓら、２１  Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５−１１８（１９９９）。テロメラーゼの正常なヒト
体細胞への導入が、形質転換体の増殖を導かないこと、細胞周期誘導チェックポ
イント制御をバイパスしないこと、およびこれらの細胞のゲノムの不安定性を導
かないことが実証された。テロメラーゼ長およびテロメラーゼ活性を制御または
測定することによる細胞の老化および不死化の治療または診断のための方法と組
み合わせる、テロメラーゼ活性を検出するための方法およびテロメラーゼ活性を
調節するかまたはテロメラーゼ活性に作用する、化合物またはペプチドを同定す
るための方法はまた、記載されている（ＰＣＴ国際特許出願  ＷＯ  ９３／２３
５７２を参照のこと）。テロメラーゼ活性に影響する化合物の同定は、ヒト疾患
の処置の努力に重要な利点を提供する。テロメラーゼ活性を刺激または活性化す
る化合物（例えば、ｍｙｃ）は、細胞の老化を阻害するためおよび細胞の寿命を
延ばすためにＶＰ２２またはＴＡＴに融合され得る。
【００５９】
本発明の実施形態のさらなるクラスにおいて、ＶＰ２２、ＴＡＴまたはそれら
の機能配列は、同様の目的のために適用可能であるとして公知であるテロメラー
ゼまたは他の酵素もしくはそれらの機能フラグメントと、有用にカップリングさ
れるか融合され得る。このカップリング産物は、処理されるべき細胞中に透通さ
れ得る。これらのＶＰ２２−テロメラーゼカップリング産物は、標的細胞の複製
寿命の延長において使用される。このテロメラーゼは、細胞のテロメラーゼを安
定化し、そして細胞の老化を抑止するために機能する。例えば、米国特許第５，
８３７，８５７号を参照のこと。
【００６０】
（細胞の一過性の不死化およびテロメア化）本発明の１つの局面に従って、正
常に静止している細胞は、これらの細胞を増幅するために一過性に不死化される
。目的の細胞は、ヘルペスウィルス性のＶＰ２２タンパク質またはＨＩＶ  ＴＡ
Ｔタンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチドおよび細胞不死化活性を有
する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の存在下で培養される。この融合
タンパク質は、細胞の核に輸送され、そして細胞を不死化する。この不死化細胞
は、融合タンパク質の存在下で増大される。一旦、十分な細胞が得られると、融
合タンパク質は、増殖培地から取り除かれ、そして細胞は、これらの細胞がそれ
らの元の非不死化状態に戻るまで培養される。１つ以上の癌遺伝子または不死化
フラグメントが、必要とされ得る。
【００６１】
本発明の別の局面に従って、正常に静止している細胞は、これらの細胞を一過
性に不死化することにより増殖された。目的の細胞は、ヘルペスウイルス性ＶＰ
２２タンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチドおよびテロメラーゼ特異
的活性を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の存在下で培養される
。この融合タンパク質は、これが染色体の末端でテロメアＤＮＡを合成する細胞
の核に輸送され、これにより複製老化を予防する。一旦、十分な細胞が得られる
と、融合タンパク質は、増殖培地から取り除かれ、そしてこの細胞は、融合タン
パク質の非存在下で標準技術に従って培養される。
【００６２】
本発明のさらに別の局面に従って、正常に静止している細胞は、これらの細胞
を一過性に不死化し、そしてテロメア化することにより増殖された。目的の細胞
は、以下の２つの融合タンパク質の存在下で培養される：（１）ヘルペスウイル
ス性ＶＰ２２タンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチドおよび細胞不死
化活性を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質；および（２）ヘルペ
スウイルス性ＶＰ２２タンパク質の輸送機能を有する第１のポリペプチドおよび
テロメラーゼ特異的活性またはテロメラーゼ遺伝子活性化活性を有する第２のポ
リペプチドを含む融合タンパク質の存在下で培養される。この細胞は、十分な細
胞が得られるまで融合タンパク質の存在下で増大される。次いで、この細胞は、
引き続き融合タンパク質の非存在下で標準の技術に従って、培養される。
【００６３】
（一過性の遺伝子活性化）本発明の別の実施形態では、細胞中の特定の遺伝子
が、一過性に活性化され、目的の内在性遺伝子の発現を特異的に活性化する。こ
の目的の遺伝子としては、ｈＧＨ、ＦＡＣ、ＶＩＩＩ、ＦＡＣ、ＶＩＩ、ＦＡＣ
ＩＸ、ＦＡＣ  Ｘ、ＥＰＯ、インシュリンおよびＴＰＡが挙げられるが、これ
らに限定されない。
【００６４】
（等価物）前述の本発明の特定の実施形態の詳細な説明より、正常に静止して
いる細胞の複製能力を増加する独自の方法が記載されていることが明らかとなる
べきである。特定の実施形態が詳細に本明細書中に記載されているが、これは、
例示のみの目的のための例として為されたものであり、前述の添付の特許請求の
範囲について限定することを意図しない。特に、種々の置換、変更および改変が
、特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することな
く、本発明に対して為され得ることが、発明者により意図される。例えば、ヘル
ペスウイルスＶＰ２２タンパク質の輸送機能を有する特定のポリペプチド、また
は細胞不死化活性を有する特定のポリペプチド、またはテロメラーゼ特異的活性
を有する特定のポリペプチドの選択は、本明細書中に記載される実施形態の知識
を有する当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。
【００６５】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、上記の添付の説明中に記述されている
。本明細書中に記載される方法および物質に類似または等価である任意の方法お
よび物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法お
よび物質は、ここに記載される。本発明の他の特色、目的および利点が、記載お
よび特許請求の範囲より明らかとなる。明細書および添付の特許請求の範囲にお
いて、文脈が他に明確に指示しない限り、１つの形態は、複数の参考文献を含む
。他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および化学用
語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される場合と同じ意味を有す
る。本明細書中で引用される全ての特許および刊行物は、参考として援用される
。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために提示
される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲により規定されるような本発
明の範囲を限定するようには決して解釈されない。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合物の構築）
（物質）Ｔａｑポリメラーゼおよび全ての制限酵素、改変酵素および酵素をＬ
ｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）か
ら購入した。発現ベクターｐＣＥＰ４、ＴＡキットおよびＣｌｏｎｉｎｇキット
をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．
，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。ヒト精巣、リンパ腫およびＨｅＬａ細胞由来の
Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ、ＧＣ−Ｍｅｌｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃならびに
ｃＤＮＡ  ＰＣＲキットを、ＣｌｏｎＴｅｃｈ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ）から購入した。ＴＲＡＰｅｚｅアッセイキットをＯｎｃｏｒ（Ｂａｓｅ
ｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。
【００６８】
（オリゴヌクレオチド）以下のオリゴヌクレオチドを、ｈＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ
のクローニングにおけるＰＣＲプライマーとしての使用のために、注文合成した
（Ｌｉｆｅ−ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）：
５’−ＡＴＡＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣ
ＣＧＣＴＧＣＣ−３’（配列番号１）
５’−ＡＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＧＴ
ＣＴＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）。
【００６９】
これらのプライマーと共にＴａｑポリメラーゼを使用する２９３Ｔ  ｃＤＮＡ
のＲＴ−ＰＣＲ増幅は、３４１７塩基対の産物を生成した。診断制限消化パター
ンは、この３４１７−ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物が実際にｈＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ由
来であることを確認した。この産物を、引き続き、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング
キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、ｐＣＲ２．１中へサブ
クローン化した。得られたクローン（ｐＣＲ２．１−ｈＴＥＲＴ−１００７）の
ヌクレオチド配列決定は、公開されたｈＴＥＲＴヌクレオチド配列と比較した場
合、このクローンｈＴＥＲＴが正確なヌクレオチド配列を有することを実証した
。Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１５９５０。
【００７０】
（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴキメラ融合遺伝子の構築）インタクトなｈＴＥＲＴ  
ｃＤＮＡを含む３４１６−ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ｈ
ＴＥＲＴ−１００７から切り出し、そして発現ベクターｐＶＰ２２−１０９０（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＥｃｏＲＩ部位においてインフレームにサブクロー
ン化した。得られたクローンをｐＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−１０９１と命名した（
図１）。
【００７１】
（ｐ１０９１／ＢＨＫ安定細胞株の生成）ｐＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−１０９１
発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ
−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することにより、ＢＨＫ細胞中へ安定にトラン
スフェクトした。簡潔には、選択薬物Ｇ４１８をトランスフェクションの２４時
間後にトランスフェクトしたＢＨＫ細胞へ添加した。安定にトランスフェクトし
たｐ１０９１／ＢＨＫ細胞を繊維芽細胞増殖培地（ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ
）ならびに１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で２週間増殖した。１００万個のｐ１０９
１／ＢＨＫ細胞を１つのＴ−７５フラスコ中に播種し、そして２４時間１２ｍｌ
のＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳで２回パルスした。回収した馴培地をＮｕｎｃ０
．２２μｍフィルターを通して濾過滅菌し、そして初代ヒト繊維芽細胞（ＭＤＸ
１（Ｍｏｄｅｘ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅｓ  ＳＡ））上に、６ウェルプレ
ート中の１ウェル当たり５０，０００細胞でオーバーレイした。繊維芽細胞増殖
培地の最終濃度は、２５％、５０％、７５％または１００％のいずれかであった
。ｐ１０９１／ＢＨＫ馴化培地への曝露の初めの２４時間後、この培地を除去し
、そして２４時間パルスしたｐ１０９１／ＢＨＫ馴化培地の第２のバッチで置換
した。第２の２４時間の曝露後、ＭＤＸ１細胞をトリプシン処理により回収し、
そしてプレーティングした。
【００７２】
（テロメラーゼアッセイ）Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  Ｒｅｐｅｒａｔ  Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＴＲＡＰ）アッセイを、製造業者のプロ
トコール（ＴＲＡＰｅｚｅ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｉｏｎ  Ｋｉｔ
，Ｏｎｃｏｒ）に従って行った。簡潔には、５０，０００細胞のペレットを、２
００Ｕ／ｍｌにてＲｎａｓｅＯｕｔを含む５０μｌの１×ＣＨＡＰ溶解緩衝液（
Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に再懸濁した。細胞懸濁液を
、３０分間氷上でインキュベートし、そして直ちに１５分間４℃にて１５，００
０ＲＰＭにて遠心分離した。この上清を直ちにＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｇ管に移した。製造業者のプロトコールに従って、細胞抽出物を２００
個の細胞からの細胞抽出物をＴＲＡＰアッセイに使用するために、１：１０に希
釈した。反応混合物の１０マイクロリットルを、２時間１５０ボルトで０．５×
ＴＢＥ緩衝液中で１２．５％非変性ＰＡＧＥを介して分離した。このＤＮＡの梯
子をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）に
おける染色により視覚化した。
【００７３】
（結果）ＭＤＸ１初代ヒト繊維芽細胞は、ＴＲＡＰアッセイによりモニターさ
れるような検出可能なテロメラーゼ酵素活性を有さなかった。従って、ｐＶＰ２
２−ｈＴＥＲＴ−１０９１／ＢＨＫから馴化培地に曝されたＭＤＸ１細胞由来の
任意の検出されたテロメラーゼ酵素活性は、安定なｐＶＰ２２−ｈＴＥＥＲ−１
０９１／ＢＨＫ細胞により分泌され、そして引き続き初代ヒト繊維芽ＭＤＸ１細
胞により取り込まれたキメラＶＰ２２−ｈＴＥＲＴタンパク質に起因し得る。Ｐ
ＡＧＥの結果は、ｐＶＰ２２−ｈＴＥＥＲ−１０９１／ＢＨＫ細胞から馴化培地
へ曝されたＭＤＸ１細胞由来のテロメラーゼ活性を示した。５０％培地混合物中
のポジティブな梯子形成は、ｐＶＰ２２−ｈＴＥＥＲ−１０９１／ＢＨＫ細胞か
ら分泌されたキメラｐＶＰ２２−ｈＴＥＥＲが初代ヒト繊維芽細胞により取り込
まれたことを示した。
【００７４】
（実施例２）
（一過性不死化技術）
この実施例の目的は、ヒト初代細胞の一過性不死化のためのキメラタンパク質
転座系の可能性を確認することである。
【００７５】
（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合カセットおよび発現ベクターの構築）：基本のＶ
Ｐ２２発現ベクターをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、そしてｐＶＰ２２−（
ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）−１０９０と新たに命名した。ｃＭｙｃおよびＨＩ
Ｓは、ＶＰ２２のＣ末端で融合されるｃＭｙｃタグおよびＨＩＳタグを示す。Ｖ
Ｐ２２に融合される第１遺伝子は、ヒト初代線維芽細胞の増殖能力を高めるため
に首尾よく使用されるｈＴＥＲＴとなるように選択した。Ｃ末端タグがｈＴＥＲ
Ｔ触媒活性を妨げ得るという考慮に起因して、２つのＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合
カセットを作製することを決定した：（１）ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴは、融合タン
パク質のＣ末端において、ｃＭｙｃおよびＨＩＳタグを有さないＶＰ２２とｈＴ
ＥＲＴとの間のインフレームの融合を含み、そして（２）ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ
（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）は、融合タンパク質のＣ末端において、ｃＭｙｃ
およびＨＩＳタグを有するＶＰ２２とｈＴＥＲＴとの間のインフレームの融合を
含む。ｃＭｙｃおよびＨＩＳタグは、哺乳動物細胞の内側の融合タンパク質を同
定し、そして大量の融合タンパク質を精製し得るのに必要であるため、Ｎ末端に
おいて含まれた。
【００７６】
ｈＴＥＲＴを含む３．４−ｋｂ  ＥｃｏＲＩ挿入物は、ｐ１００７から切除し
、ＥｃｏＲＩにおいて、ｐＶＰ２２−ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−１０９０にサブクロー
ン化し、そしてＮ末端ＶＰ２２とＣ末端ｈＴＥＲＴとの間のインフレームの融合
を生じた。この新規の構築物を、ｐＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−１０９１と命名した
（表１を参照のこと）
【００７７】
【表１】
2011057715.tif 000003
ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−ＴＡＧ）融合タンパク質を生成す
るために、本発明者らは、ｈＴＥＲＴコード配列の末端で、終止コドンＴＧＡを
除去した。簡潔には、ＴＧＡ終止コドンを含まない３’９００−ｂｐ  ＭｌｕＩ
／ＮｏｔＩフラグメントを生成するために、オリゴヌクレオチドを使用するＰＣ
Ｒによって、ｈＴＥＲＴ中の３’９００−ｂｐ  ＭｌｕＩ／ＮｏｔＩフラグメン
トを再生した。ＴＧＡ終止コドンを用いずに産生される３’９００−ｂｐ  Ｍｌ
ｕＩ／ＮｏｔＩ  ｈＴＥＲＴ  ＰＣＲを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニング
ベクターに直接クローン化し、そして得られたプラスミドをｐＣＲ２．１−ＴＯ
ＰＯ−ｈＴＥＲＴ（−）ＴＧＡ−１０９３と命名した。ｐ１０９３中のＰＣＲ挿
入物のヌクレオチド妥当性は、ヌクレオチド配列決定反応によって１００％正確
であることが確認された。ｐＶｐ２２−ｈＴＥＲＴ−１０９１中の３’９００−
ｂｐ  ＭｌｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、ＶＰ２２、ｈＴＥＲＴ、ｃＭｙｃエ
ピトープタグ、およびＨＩＳエピトープタグのインフレーム融合を生じるｐ１０
９３由来のもので置換した。得られた発現ベクターを、ｐＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ
−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−Ｔａｇ）−１０９５と命名した。
【００７８】
（ＶＰ２２−ｃＭｙｃ融合カセットおよび発現ベクターの構築）：ＶＰ２２−
ｃＭｙｃ融合カセットは、融合タンパク質のＣ末端において、ＨＩＳタグのみを
含む。ＶＰ２２およびｃＭｙｃコード配列をインフレームで容易に融合するため
に、ｃＭｙｃコード配列全体を、それぞれ、ｐＣＲ２．１−ｃＭｙｃ−ＰＣＲ１
−１０９７および−１０９９を生じることによって、５’７９０−ｂｐおよび３
’５４９−ｂｐフラグメント中で再生した。ｐ１０９７およびｐ１０９９中のＰ
ＣＲ挿入物のヌクレオチド妥当性は、ヌクレオチド配列決定反応によって１００
％正確であることが確認された。５’７９０−ｂｐおよび３’５４９−ｂｐ  ｃ
Ｍｙｃフラグメントを、３’５４９−ｂｐ  ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩをｐ１０９９
からＴＧＡ終止コドンを有さない全長ｃＭｙｃを生成するｐ１０９７中のＣｌａ
Ｉ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングすることによって、結合した。このプラ
スミドをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃＭｙｃ−（−）ＴＧＡ−１１００と命名し
た。続いて、ＴＧＡ終止コドンを有さない全長ｃＭｙｃを、ＥｃｏＲＩおよびＮ
ｏｔＩ制限消化によって、ｐ１１００からｐＶＰ２２−ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−１１
０１を生成するｐ１０９０にサブクローニングした。
【００７９】
（ＩＣＣ分析によるＶＰ２２−ｈＴＥＲＴおよびＶＰ２２−ｃＭｙｃ融合タン
パク質の検出）：ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴおよびＶｐ２２−ｃＭｙｃ融合遺伝子が
適切に構築されたことを示すために、免疫細胞学（ＩＣＣ）分析を、ｐ１０９５
またはｐ１１０１のいずれかを用いて一過性トランスフェクトされたＣＯＳ細胞
につて行った。コントロールのＶＰ２２ベクター、ｐＶＰ２２−（ｃＭｙｃ−Ｈ
ＩＳ−ＴＡＧ）−１０９０が含まれた（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照のこ
と）。ＶＰ２２、ｈＴＥＲＴおよびｃＭｙｃは核タンパク質であるため、一過性
トランスフェクトされたｐ１０９０、ｐ１０９５およびｐ１１０１の透明核染色
が、抗ｃＭｙｃ抗体を使用するＩＣＣによって明確に示された。このデータはま
た、融合ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ（図３Ｅおよび３Ｆを参照のこと）、およびＶＰ
２２−ｃＭｙｃ（図３Ｇおよび図３Ｈを参照のこと）融合遺伝子が正確に構築さ
れ、そしてそれぞれの融合タンパク質が適切に合成され、そして予想どおりに核
タンパク質の核に輸送されたことを示した。
【００８０】
（ウエスタンブロッド分析によるＶＰ２２−ｈＴＥＲＴおよびＶＰ２２−ｃＭ
ｙｃ融合タンパク質の検出）：ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴおよびＶｐ２２−ｃＭｙｃ
融合タンパク質が正確な分子量サイズを有することを証明するために、本発明者
らは、ｐ１０９５またはｐ１１０１のいずれかを用いて一過性トランスフェクト
されたＣＯＳ細胞由来の細胞溶解産物全体について、ウエスタンブロッド分析を
行った。期待される分子量を有する融合タンパク質は、抗ｃＭｙｃ抗体によって
明確に検出され、従って、融合ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ（図３Ａを参照のこと）、
およびＶＰ２２−ｃＭｙｃ（図３Ｂを参照のこと）融合遺伝子が正確に構築され
たことをさらに確認した。
【００８１】
増強された増殖能力の証明：ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴで安定にトランスフェクト
した細胞株は、図４に示される増加した集団倍加曲線によって証明されるように
、完全に不死化された表現型を示す。正常な不死化されていない初代ＭＤＸ０１
細胞は、同じ培養条件下で１３−２０ＰＤを示す。
【００８２】
（ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質による触媒酵素活性の証明）：Ｎ末端
ＶＰ２２融合タンパク質がＣ末端融合したｈＴＥＲＴ酵素の触媒活性に影響を与
えないことを示すために、ｐ１０９１またはｐ１０９５のいずれかを用いて一過
性トランスフェクトされたテロメラーゼ陰性ＭＤＸ１細胞由来の全細胞抽出物に
ついて、ＴＲＡＰ酵素アッセイを行った。ｐ１０９１およびｐ１０９５の両方は
、透明ラダー形成を示し、このことはＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質にお
けるテロメラーゼ触媒活性の保存を明確に示す（図４Ａを参照のこと）。
【００８３】
発現プラスミドｐ１０９１によりコードされるＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合タン
パク質がテロメラーゼ陰性のヒト初代線維芽細胞株を不死化し得るか否かを決定
するために、これらの構築物をｈＴＥＲＴ−陰性ＭＤＸ１細胞に安定にトランス
フェクトした。５０ｎｇ／ｍｌでＧ４１８を選択した５週間後、Ｇ４１８耐性Ｐ
１０９１／ＭＤＸ１の小さなコロニーを選択し、そしてさらなる集団倍加研究の
ために増殖させた。Ｐ１０９１／ＭＤＸ１についてのＴＲＡＰアッセイは、ｈＴ
ＥＲＴ酵素活性を明確に示した（図５Ｂを参照のこと）。さらに、抗ｈＴＥＲＴ
抗体を使用するＩＣＣは、ｐ１０９１／ＭＤＸ１細胞における陽性核染色を明確
に示した（図６を参照のこと）。このような結果は、Ｐ１０９１／ＭＤＸ１中の
「テロメラーゼ」タンパク質の存在を示し、そしてＴＲＡＰアッセイによるＰ１
０９１／ＭＤＸ１におけるテロメラーゼ活性の検出と一致する。Ｐ１０９１／Ｍ
ＤＸ１安定細胞は、ハイグロマイシン感受性ではなくＧ４１８耐性であることを
示し、このことは、これらがハイグロマイシン耐性のｍＭＭＬＶ  ｈＴＥＲＴ不
死化線維芽細胞の陽性コントロール細胞株であるＭＤＸ１２株由来の「不純物」
細胞ではないことを示す。
【００８４】
しかし、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の強制的な発現に起因して正確
に不死化される代わりに、ｐ１０９１／ＭＤＸ１細胞が自然に形質転換したＭＤ
Ｘ１細胞由来である可能性が残る。この問題を解決するために、ＭＤＸ０１、ｐ
１０９１−ＭＤＸ０１（不死化されたＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ）、およびＭＤＸ１
２（不死化されたｍＭＬＶ−ｈＴＥＲＴ）細胞株から単離した全ｍＲＮＡについ
て、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。図７Ａに示すように、５’非翻訳タンパク質お
よび内因性ｈＴＥＲＴ遺伝子のコード領域に特異的なオリゴヌクレオチド対を使
用して、ＲＴ−ＰＣＲが行われる場合、ｍＭＬＶ−ｈＴＥＲＴまたはＶＰ２２−
ｈＴＥＲＴ不死化細胞株からＰＣＲシグナルは得られない。ＶＰ２２およびｈＴ
ＥＲＴコード領域に特異的なオリゴヌクレオチドの対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行
う場合、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ不死化１０９１−ＭＤＸ０１細胞株のみが陽性で
ある（図７Ｂ）。さらに、図８Ａにおいて、ｍＭＬＶおよびｈＴＥＲＴコード領
域に特異的なオリゴヌクレオチド対を使用してＲＴ−ＰＣＲを行う場合、ｍＭＬ
Ｖ−ｈＴＥＲＴ不死化ＭＤＸ１２細胞株のみが陽性シグナルを示すことがさらに
確認された。
【００８５】
従って、ｐ１０９１／ＭＤＸ０１細胞抽出物についてＴＲＡＰにより検出され
るように、テロメラーゼ酵素活性の同定は、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合ｍＲＮＡ
に起因し得、内因的に活性化されたｈＴＥＲＴタンパク質には起因し得ない。こ
のことは、構成的に発現されたｍＭＬＶ−ｈＴＥＲＴ、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ不
死化１０９１−ＭＤＸ０１を用いて不死化したＭＤＸ０１細胞と類似の細胞がま
た、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合ｍＲＮＡ、それ故タンパク質の発現によって十分
に不死化されることを示す。
【００８６】
（要約）
１．ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−Ｔ
ＡＧ）、およびＶＰ２２−ｃＭｙｃ−（ＨＩＳ−ＴＡＧ）融合遺伝子は、配列決
定反応によって、配列違いを含まず、そしてそれぞれ、ＶＰ２２とｈＴＥＲＴコ
ードドメイン、またはＶＰ２２、ｈＴＥＲＴ、ｃＭｙｃ−ＴＡＧとＨＩＳ−ＴＡ
Ｇコードドメイン、またはＶＰ２２、ｃＭｙｃとＨＩＳ−ＴＡＧコードドメイン
との間で正確にインフレームで融合されていることが確認された。
【００８７】
２．ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩＳ−Ｔ
ＡＧ）、およびＶＰ２２−ｃＭｙｃ−（ＨＩＳ−ＴＡＧ）融合遺伝子は全て、Ｉ
ＣＣおよび一過性トランスフェクトされたＣＯＳ細胞のウエスタンブロッド分析
によって示されるように、インタクトな融合タンパク質を発現し得る。
【００８８】
３．ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ、およびＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ−（ｃＭｙｃ−ＨＩ
Ｓ−ＴＡＧ）融合タンパク質のテロメラーゼ触媒活性は、ＴＲＡＰアッセイによ
りインビボで結論的に証明された。
【００８９】
４．ＲＴ−ＰＣＲによるＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現、および集団
研究分析による不死化された表現型は、ＶＰ２２−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質が
、初代線維芽細胞の不死化に関して機能性であることを首尾良く証明する。
【００９０】
上記の説明は例示の目的のみのために示され、本発明を、添付の特許請求の範
囲ではなく、開示される詳細な形態により制限されることを意図しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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