(57)【要約】【課題】本発明は、特定のマイクロＲＮＡを下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法、下咽頭がんの判定方法、下咽頭がんの判定キット等を提供することを目的とする。【解決手段】miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡを下咽頭がんのバイオマーカーとして使用することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡを下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法。
【請求項２】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を備えたことを特徴とする下咽頭がんの判定方法：
（Ａ）下咽頭の検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：
（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375から選択される１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：
（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：
【請求項４】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項３に記載の下咽頭がんの判定方法。
【請求項５】
抽出したＲＮＡ中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p及びmiR-130b*からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に下咽頭がんであると評価することを特徴とする請求項３又は４に記載の下咽頭がんの判定方法。
【請求項６】
抽出したＲＮＡ中の、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に下咽頭がんであると評価することを特徴とする請求項３又は４に記載の下咽頭がんの判定方法。
【請求項７】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを下咽頭がんの判定に使用する方法。
【請求項８】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、下咽頭がんの判定に使用する方法。
【請求項９】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする下咽頭がんの判定キット。
【請求項１１】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする下咽頭がんの判定キット。
【請求項１２】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の判定キット。
【請求項１３】
以下の工程を含むことを特徴とする下咽頭がん治療薬のスクリーニング方法：
（Ａ）下咽頭がんに罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：
（Ｂ）前記非ヒト動物における下咽頭がん組織中又は血液中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：
（Ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：
【請求項１４】
miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下咽頭がんにおけるマイクロＲＮＡ（microＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）の発現プロファイルとその用途に関する。より詳細には、特定のマイクロＲＮＡを下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法、下咽頭がんの判定方法、下咽頭がんの判定キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
下咽頭がんは、喉頭の後方から両側方にかけて存在する腔である下咽頭にできるがんである。下咽頭がんの原因の詳細は明らかとなっていないが、過度の飲酒や喫煙との関連が指摘されており、そのため、食道がん、胃がん等との多重がんとなるケースも多く見られる。下咽頭がんは、症状が現れにくく、嚥下時痛、嚥下困難あるいはリンパ節転移の頸部腫脹等の症状が現れる頃に、すでに進行がんの状態で見つかることが多い。
【０００３】
下咽頭がんの治療は、主に病期と病理組織学的所見により決定されており、手術、放射線療法、化学療法（抗がん剤治療等）が用いられる。特に、進行がんの場合は、手術、放射線療法、化学療法等を併用する集学的治療を行っても、根治性は非常に低く、また、転移し易いため、予後が悪い。また、進行がんの手術では、下咽頭だけでなく、喉頭の摘出も伴うため、患者は発声の能力を喪失する上、食道を腸管などで再建する必要がある。そのため、手術の侵襲は身体的・心理的に大きく、患者のＱＯＬ（Quality of Life）は、大幅な低下を来してしまう。下咽頭がんの末期では、患者は食事を経口摂取することができず、さらには、呼吸苦を伴う。また、下咽頭がんが頸動脈などに浸潤すると、出血死するおそれも生じる。
【０００４】
これらのことから、下咽頭がんの治療については、その早期診断及び早期発見が特に重要であるといえる。例えば、特許文献１には、生体試料中の、特定のアルド−ケト−リダクターゼ活性を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することによって、肺、喉頭、咽頭、舌、子宮、胃、腎、大腸、脳、膵および膀胱の癌を判定する方法が記載されている。しかし、この方法は十分に実用的とは言えず、下咽頭がんの早期診断や早期発見の手法の開発は、主要な他のがんと比較して遅れている。例えば、下咽頭がんの早期がんマーカーは知られていない。また、下咽頭ファイバースコープを用いた検査は有効ではあるが、医療機関における普及率がかなり低い。そこで、この下咽頭ファイバースコープの代わりに、普及率の高い上部消化管内視鏡（胃カメラ）を用いて検査することも考えられるかもしれない。しかし、下咽頭は押し潰された形状となっているため、送気しながら観察しない限り、診断することが難しい。また、胃カメラは左側臥位で行うことが多いため、左下咽頭へは胃カメラが通るとしても、逆側である右下咽頭のがんは見逃される可能性が高い。
【０００５】
ところで、マイクロＲＮＡは、細胞内に存在し、タンパクへの翻訳がなされない、長さ２２塩基程度の１本鎖ＲＮＡである（非特許文献１参照）。１９９３年に線虫C.elegansにおいて、その後、２００１年には脊椎動物でも発見され、種を越えて保存されている。現在、ヒトゲノム上には１０００種類近くのマイクロＲＮＡの存在が予測され、これまでに７００種類以上のマイクロＲＮＡがクローニングされている。また、マイクロＲＮＡは、ゲノム上のタンパク翻訳領域の３０％に対し遺伝子制御を行っていると推測されており（非特許文献２参照）、それ故、マイクロＲＮＡの機能破綻は各種の疾患を引き起こす可能性がある。しかしながら、現在までに、その生物学的役割が明らかになったものはごく僅かに過ぎず、今後の解析が待たれている。頭頸部腫瘍に関するマイクロＲＮＡの報告として、腫瘍細胞株を用いたものは散見されるが（非特許文献３、４参照）、下咽頭がん患者の臨床検体を用いての報告は現在まで行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１８９２２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Barbarotto E, Schmittgen TD, Calin GA. microRNAs and cancer:profile, profile, profile. IntJ Cancer. 2008; 122(5): 969-977.
【非特許文献２】Zeng Y, Yi R, Cullen BR. miRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc Nat Acad Sci. 2003; 100: 9779-9784.
【非特許文献３】Tran N, McLean T, Zhang X, Zhao CJ, Thomson JM, O'Brien C, Rose B.  microRNA expression profiles in head and neck cancer cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 358: 12-17.
【非特許文献４】Jiang J, Lee EJ, Gusev Y, Schmittgen TD. Real-time expression profiling of microRNA precursors in human cancer cell lines. Nucleic Acids Res. 2005; 28: 5394-5403.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、特定のマイクロＲＮＡを下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法、下咽頭がんの判定方法、下咽頭がんの判定キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述したように、頭頸部腫瘍に関するマイクロＲＮＡの報告として、腫瘍細胞株を用いたものは散見されるが、下咽頭がん患者の患者臨床検体を用いての報告は現在まで行われていない。腫瘍細胞株は、臨床検体のように組織を構成せず、また、他の組織からの生体分子の影響を受けない等の理由のため、腫瘍細胞株における遺伝子等の発現プロファイルは、その細胞株に対応するがん細胞の臨床検体における発現プロファイルとは異なることが知られている。したがって、細胞株の発現プロファイルから、臨床検体の発現プロファイルを予測することは基本的に不可能である。このような状況下で、本発明者らは、下咽頭がん組織のマイクロＲＮＡと下咽頭正常組織のマイクロＲＮＡとを対比し、特定のマイクロＲＮＡが下咽頭がん組織において異常発現していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡを下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法や、（２）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（３）以下の工程を備えたことを特徴とする下咽頭がんの判定方法：（Ａ）下咽頭の検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375から選択される１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：や、（４）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（３）に記載の下咽頭がんの判定方法や、（５）抽出したＲＮＡ中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p及びmiR-130b*からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に下咽頭がんであると評価することを特徴とする上記（３）又は（４）に記載の下咽頭がんの判定方法や、（６）抽出したＲＮＡ中の、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に下咽頭がんであると評価することを特徴とする上記（３）又は（４）に記載の下咽頭がんの判定方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（７）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを下咽頭がんの判定に使用する方法や、（８）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、下咽頭がんの判定に使用する方法や、（９）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（７）又は（８）に記載の方法に関する。
【００１３】
さらにまた本発明は、（１０）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいることを特徴とする下咽頭がんの判定キットや、（１１）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えたことを特徴とする下咽頭がんの判定キットや、（１２）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（１０）又は（１１）に記載の判定キットに関する。
【００１４】
またさらに本発明は、（１３）以下の工程を含むことを特徴とする下咽頭がん治療薬のスクリーニング方法：（Ａ）下咽頭がんに罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）前記非ヒト動物における下咽頭がん組織中又は血液中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：や、（１４）miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375が、それぞれ配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡであることを特徴とする上記（１３）に記載のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の下咽頭がんの判定方法や、下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法によると、迅速かつ正確に下咽頭がんを判定することができる。また、本発明の下咽頭がんの判定キットや、下咽頭がんの判定に使用する方法によると、下咽頭がんであるかどうかを迅速かつ正確に判定することができる。さらに、本発明の下咽頭がん治療薬のスクリーニング方法によると、下咽頭がん治療薬を効率的にスクリーニングすることができる。なお、本件マイクロＲＮＡ等についてさらに研究が進めば、下咽頭がんの発症・進展・予後予測や治療が可能となることで、現在の下咽頭がん臨床のさまざまな問題点を解決する突破口となることが期待できる。また、マイクロＲＮＡの発現は組織特異的であることが知られており、下咽頭原発不明がんの原発部位の特定にも有用となる可能性がある。さらに治療に際しては、薬剤や放射線治療への抵抗性が診断できれば、患者個人ごとに有効な治療法を選択する個別化治療にまで発展させ得る可能性を含んでいる。正確な診断や予後の予測は、余計な検査や患者の必要以上の通院を減らすことが期待でき、医療経済効果も大きいと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】マイクロＲＮＡの発現プロファイル解析のサンプルの概要をまとめた図である。
【図２】サンプル由来のトータルＲＮＡについて行なった、ＵＶを用いた品質検査の結果を示す図である。
【図３】サンプル由来のトータルＲＮＡについて行なった、Bio-Analyzer RNA6000を用いた品質検査の結果を示す図である。
【図４】下咽頭がん組織で発現が増加するマイクロＲＮＡ（miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*）の、各サンプルにおけるそれらのマイクロＲＮＡの相対的発現量を示す図である。
【図５】下咽頭がん組織で発現が低下するマイクロＲＮＡ（miR-190、miR-199b-5p、miR-375）の、各サンプルにおけるそれらのマイクロＲＮＡの相対的発現量を示す図である。
【図６】下咽頭の正常組織あるいはがん組織における、miR-15a、miR-15b及びmiR-16の相対的発現量を示す図である。
【図７】下咽頭の正常組織あるいはがん組織における、miR-17-92 clusterの相対的発現量を示す図である。
【図８】下咽頭の正常組織あるいはがん組織における、let-7 familyの相対的発現量を示す図である。
【図９】下咽頭の正常組織あるいはがん組織における、miR-34a、miR-34c-5pの相対的発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法としては、miR-107（マイクロＲＮＡ-107）、miR-187（マイクロＲＮＡ-187）、miR-196b（マイクロＲＮＡ-196b）、miR-301b（マイクロＲＮＡ-301b）、miR-331-5p（マイクロＲＮＡ-331-5p）、miR-424（マイクロＲＮＡ-424）、miR-517a（マイクロＲＮＡ-517a）、miR-579（マイクロＲＮＡ-579）、miR-758（マイクロＲＮＡ-758）、let-7f-1*（マイクロＲＮＡ let-7f-1*）及びlet-7g*（マイクロＲＮＡ let-7g*）、miR-106b*（マイクロＲＮＡ-106b*）、miR-206（マイクロＲＮＡ-206）、miR-519b-3p（マイクロＲＮＡ-519b-3p）、miR-130b*（マイクロＲＮＡ-130b*）、miR-190（マイクロＲＮＡ-190）、miR-199b-5p（マイクロＲＮＡ-199b-5p）、miR-375（マイクロＲＮＡ-375）からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡ（以下、「本件マイクロＲＮＡ」ともいう。）を、下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法である限り特に制限はされず、具体的には、本発明の下咽頭がんの判定方法や、本発明の下咽頭がんの判定に使用する方法や、本発明の下咽頭がん治療薬のスクリーニング方法を例示することができる。上記の下咽頭がんの種類としては、特に制限されず、初発又は再発の下咽頭がんを例示することができ、初発の下咽頭がんをより好適に例示することができる。
【００１８】
本件マイクロＲＮＡの由来となる生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。ヒト由来の本件マイクロＲＮＡ（hsa-miR）であるmiR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p、miR-130b*、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375の各ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１〜１８に示される。マイクロＲＮＡの配列は特に哺乳動物間では保存性が高く、上記の本件マイクロＲＮＡはヒト以外の哺乳動物においてもヒトと同様の発現プロファイルを示すと考えられる。
【００１９】
また、本件マイクロＲＮＡには、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなり、かつ、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するＲＮＡが便宜上含まれる。上記の「１若しくは２個以上」としては、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましく、１〜２個が特に好ましく、１個がさらに好ましい。なお、上記の欠失等されたヌクレオチド配列からなるＲＮＡが、下咽頭がん組織又は下咽頭がん被検体の血液においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するかどうかは、例えば後述のマイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法により容易に確認することができる。なお、ヒト以外の上記の各生物からの本件マイクロＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている情報に基づいて確認又は特定することができる。また、上記の下咽頭がん被検体とは、下咽頭がんに罹患した被検体を意味する。本明細書における「被検体」としては、対象となるヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
【００２０】
本発明の下咽頭がんの判定方法としては、（Ａ）下咽頭の検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、本件マイクロＲＮＡ量を測定する工程：（Ｃ）コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織（好適には下咽頭の正常組織）又は被検体と同種の正常被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を備えている限り特に制限されないが、抽出したＲＮＡ中の、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p及びmiR-130b*からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に下咽頭がんであると評価し、及び／又は、抽出したＲＮＡ中の、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に下咽頭がんであると評価する方法を好適に例示することができる。なお、上記工程（Ａ）において下咽頭の検体組織を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、検体組織と同種の非がん組織（好適には下咽頭の正常組織）を用い、上記工程（Ａ）において被検体の血液を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、被検体と同種の正常被検体の血液を用いる。また、本明細書におけるマイクロＲＮＡの発現量としては、サンプル間のばらつきを補正するために適切な内部標準遺伝子で補正した相対発現量を用いることがより正確な判定を行なう観点から好ましい。内部標準遺伝子としては特に制限されないが、ＲＮＵ４８、ＲＮＵ６ｂ、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、及び、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を例示することができる。
【００２１】
上記（Ａ）工程におけるＲＮＡを抽出する方法としては、下咽頭の検体組織中又は被検体の血液中から、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡを抽出する方法である限り特に制限されず、例えば、mirVana miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることによって、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出する方法を好適に例示することができる。上記の下咽頭の検体組織としては、下咽頭がんの判定の対象となる生物由来の下咽頭の組織である限り特に制限されず、上記生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
【００２２】
上記（Ｂ）工程における本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法としては、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡ中の本件マイクロＲＮＡ量を同定し得る方法である限り特に制限されず、例えば本発明の下咽頭がんの判定キット、すなわち、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを含んでいる下咽頭がんの判定キットや、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを備えた下咽頭がんの判定キットや、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを備えた下咽頭がんの判定キットを用いる方法や；本発明の下咽頭がんの判定に使用する方法、すなわち、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを下咽頭がんの判定に使用するマイクロアレイ法や、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを下咽頭がんの判定に使用する定量ＰＣＲ法や、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを、下咽頭がんの判定に使用する定量ＰＣＲ法（蛍光プローブ法）；を好適に例示することができる。
【００２３】
上記のマイクロアレイ法としては、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されないが、組織から抽出したＲＮＡをラベル（好ましくは蛍光ラベル）で標識し、そのＲＮＡを、同定対象とするマイクロＲＮＡに相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイを洗浄して、マイクロアレイ上に残ったマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法を例示することができる。
【００２４】
上記の核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本発明における所定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における所定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１０〜４０ｍｅｒであることがより好ましい。なお、上記のポリヌクレオチド又はその一部は、当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
【００２５】
上記のポリヌクレオチド又はその一部を固定するアレイとしては特に制限されないが、ガラス基板やシリコン基板等を好適に例示することができ、ガラス基板をより好適に例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部をアレイに固定する方法としては特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
【００２６】
また、本発明のマイクロアレイを含んでいる下咽頭がんの判定キットには、前述のマイクロアレイの他に、例えばＲＮＡのラベル化反応に用いる試薬、ハイブリダイゼーション反応に用いる試薬、洗浄に用いる試薬、組織からのＲＮＡ抽出に用いる試薬等の、マイクロアレイ法に用いる試薬などの任意の要素をさらに含んでいてもよい。
【００２７】
そして、マイクロアレイ法としては、Agilent Human miRNAV2 (Agilent Technologies社製)をAgilent Technologies社のmiRNA Microarray protocol Version 1.5に記載の方法に従って用い、DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies社製)でマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法や、TaqMan（登録商標）Human MicroRNA Array v2.0 (Applied Biosystems社製)をそれに添付されたプロトコールの方法に従って用い、Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社製)でマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法をより具体的に例示することができ、中でも、後者の方法は、TaqMan（登録商標）プローブを使用する方法であって、定量性に優れているため、より好ましく例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイは、測定対象とする本件マイクロＲＮＡの配列情報に基づいてポリヌクレオチドを合成し、それを市販のアレイに固定するなどして作製することができる。
【００２８】
上記の定量ＰＣＲ法としては、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、かつ、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されず、アガロース電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法等の通常の定量ＰＣＲ法を用いることができるが、定量の精度や信頼性の点で、蛍光プローブ法が最も好ましい。
【００２９】
定量ＰＣＲ法におけるプライマーセットとは、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマー（ポリヌクレオチド）の組合せを意味する。上記プライマーとしては、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得る限り特に制限されないが、本発明における所定のマイクロＲＮＡの配列の５’側の一部の配列からなるプライマー（フォワードプライマー）と、そのマイクロＲＮＡの配列の３’側の一部の配列に相補的な配列からなるプライマー（リバースプライマー）とからなるプライマーセットを例示することができる。ここで、５’側とは、成熟型マイクロＲＮＡの配列において比較した場合に、リバースプライマーに対応する配列よりも、５’側であることを意味し、３’側とは、成熟型マイクロＲＮＡの配列において比較した場合に、フォワードプライマーに対応する配列よりも、３’側であることを意味する。
【００３０】
マイクロＲＮＡの５’側の配列として、好ましくは、そのマイクロＲＮＡの配列の中央の核酸よりも５’側の配列を例示することができ、マイクロＲＮＡの３’側の配列として、好ましくは、そのマイクロＲＮＡの配列の中央の核酸よりも３’側の配列を例示することができる。また、それぞれのプライマーの長さとしては、マイクロＲＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、７〜１０ｍｅｒのポリヌクレオチドであることが好ましい。なお、上記プライマーであるポリヌクレオチドのヌクレオチドの種類としては、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。
【００３１】
上記の蛍光プローブとしては、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含んでいる限り特に制限されず、TaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブを好適に例示することができ、特にTaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）に用いうる蛍光プローブをより好適に例示することができる。TaqMan（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものを除く）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブとしては、５’側に蛍光色素を標識し、３’側に消光物質を標識した蛍光プローブを例示することができ、特に好ましいプローブとして、Applied Biosystems社製のPart Number 4373154（miR-107用）、4373111（miR-187用）、4373103（miR-196b用）、4395503（miR-301b用）、4395344（miR-331-5p用）、4373201（miR-424用）、4373243（miR-517a用）、4381023（miR-579用）、4395180（miR-758用）、4395528（let-7f-1*用）、4395229（let-7g*用）、4395491（miR-106b*用）、4373092（miR-206用）、4395495（miR-519b-3p用）、4395225（miR-130b*用）、4373110（miR-190用）、4373100（miR-199b-5p用）、4373027（miR-375用）、4373278（miR-34a用）、4373036（miR-34c-5p用）等のプローブを例示することができ、ＦＲＥＴ原理を利用した蛍光プローブとしては、５’側と３’側に、それぞれドナー色素とアクセプター色素を標識した蛍光プローブを例示することができる。上記の蛍光色素、消光物質、ドナー色素、アクセプター色素等は、市販のものを適宜使用することができる。
【００３２】
上記の蛍光プローブにおける核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本件マイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り、特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における所定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り、特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０ｍｅｒ以上であることが好ましく、１５ｍｅｒ以上であることがより好ましく、対象とするマイクロＲＮＡの全長のヌクレオチド数から１〜３ｍｅｒ少ないヌクレオチド数であることがさらに好ましい。
【００３３】
上記プライマーセットや、上記の蛍光プローブは、その配列情報に基づき当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。上記のプライマーセットや蛍光プローブを用いた定量ＰＣＲの具体的な方法としては、TaqMan（登録商標）マイクロＲＮＡ Assays（Applied Biosystems社製）を、添付のプロトコールにしたがって使用する方法を好適に例示することができる。また、プライマーセットと蛍光プローブとを備えた本発明の下咽頭がんの判定キットには、前述のプライマーセットの他に、例えばポリメラーゼ等の定量ＰＣＲ反応に用いる試薬などの任意の要素をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
上記（Ｃ）工程のコントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織（好適には下咽頭の正常組織）又は被検体と同種の正常被検体の血液（例えば被検体がヒトである場合は、下咽頭がんではないヒトの血液）におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する方法におけるコントロールとしては、より正確な評価が可能となることから、検体組織と同一個体の組織（正常部位）であることが好ましい。なお、コントロールとしての検体組織と同種の正常組織又は被検体と同種の正常被検体の血液は、検体組織を採取する際にかならずしも採取する必要はなく、非がん組織中（好適には正常組織中）又は正常被検体の血液中の本件マイクロＲＮＡの発現量についてあらかじめ検量線を作成し、それとの比較・評価を行なってもよい。
【００３５】
このように検体組織中又は被検体の血液中のＲＮＡに含まれるマイクロＲＮＡの発現量に基づいて、その検体組織又はその被検体が下咽頭がんであるかどうか（その検体組織が下咽頭がんであるか、又は、その被検体が下咽頭がんに罹患しているかどうか）を判定することができる。前記のように、本件マイクロＲＮＡのうち、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p及びmiR-130b*ついては、コントロールと比較してその発現量が増加している場合に下咽頭がんであると判定することができ、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375については、コントロールと比較してその発現量が低下している場合に下咽頭がんであると判定することができる。
【００３６】
本件マイクロＲＮＡの中でも、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3pは、下咽頭の正常組織における発現が少なく、特にmiR-107、miR-187、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-106b*、miR-206は、下咽頭の正常組織における発現がほとんど見られないため、下咽頭がんであるかどうかをより正確に判定することが可能である点で好ましい。また、２種類以上の本件マイクロＲＮＡの発現量を測定してコントロールと比較・評価することにより、下咽頭がんであるかどうかをより正確に判定することが可能となる点で好ましい。なお、本発明者らの別発明に関するＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＪＰ２００９／００２６２９（バイオマーカーとしてのマイクロＲＮＡを用いた頭頸部腫瘍の診断・治療選択）では、被検体が頭頸部腫瘍に罹患している場合に、被検体の血液中の濃度も変化するマイクロＲＮＡ（例えばmiR-196aなど）が実際に見い出された。下咽頭がん組織において発現が増加又は低下する本件マイクロＲＮＡの中にも、被検体が下咽頭がんに罹患している場合に被検体の血液中の濃度も変化するマイクロＲＮＡが存在する可能性はきわめて高いと考えられる。本件マイクロＲＮＡの中でも、被検体が下咽頭がんに罹患している場合に、被検体の血液中の濃度も変化するマイクロＲＮＡは、採取が極めて容易な血液サンプルを利用することができるため、下咽頭がんのバイオマーカーとして使用する方法や、下咽頭がんの判定方法等における迅速性や簡便性が特に優れている点で、極めて好ましい。本件マイクロＲＮＡの中で、被検体が下咽頭がんに罹患している場合に被検体の血液中の濃度も変化するものがいずれであるかは、下咽頭がんに罹患している被検体の血液中の本件マイクロＲＮＡ濃度と、下咽頭がんに罹患していない正常被検体の血液中の本件マイクロＲＮＡ濃度を比較することによって、容易に見い出すことができる。
【００３７】
下咽頭がんであると判定する場合の本件マイクロＲＮＡの発現量の増加の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは１００％以上の増加であることを挙げることができ、下咽頭がんであると判定する場合の本件マイクロＲＮＡの発現量の低下の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上の低下であることを挙げることができる。
【００３８】
また、本発明の下咽頭がんの判定方法は、上記（Ａ）〜（Ｃ）工程に加えて、さらに（Ｄ）抽出したＲＮＡ中のlet-7 family、miR-17-92 cluster、miR-15、及びmiR-16からなるマイクロＲＮＡ群から選ばれる１又は２種以上のマイクロＲＮＡの発現量を測定し、コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織（好適には下咽頭の正常組織）又は被検体と同種の正常被検体の血液における前記マイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を含むことができる。上記let-7 familyとしては、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7gを好適に例示することができ、上記miR-17-92 clusterとしては、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92aを好適に例示することができ、上記miR-15としては、miR-15a、miR-15bを好適に例示することができる。ヒト由来の上記各マイクロＲＮＡ（let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92a、miR-15a、miR-15b、miR-16）としては、それぞれ配列番号１９〜３４に示されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡを特に好適に例示することができる。
【００３９】
この（Ｄ）工程における各マイクロＲＮＡ（let-7 family、miR-17-92 cluster、miR-15、及びmiR-16）は、下咽頭がんを以外の腫瘍において異常発現が認められるため、（Ｂ）工程の同定・評価の結果、検体組織又は被検体が下咽頭がんであると判定された場合に、さらに（Ｄ）工程におけるマイクロＲＮＡの異常発現が認められるときは、下咽頭がん以外の腫瘍巣が存在すると判定することができる。なお、マイクロＲＮＡ let-7 familyは肺腫瘍組織で、miR-15及びmiR-16は慢性リンパ性白血病あるいは膵臓腫瘍組織で発現が減少することが知られており、miR-17-92 clusterはＢ細胞リンパ腫あるいは肺腫瘍組織で発現が増加することが知られている。
【００４０】
本発明の下咽頭がん治療薬のスクリーニング方法としては、（ａ）下咽頭がんに罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）前記非ヒト動物における下咽頭がん組織中又は血液中の、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する工程：（ｃ）コントロールとしての、被検物質を未投与の場合におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を含んでいる限り特に制限されず、上記非ヒト動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を好適に例示することができ、中でもマウス、ラットをより好適に例示することができる。また、下咽頭がんに罹患した非ヒト動物としては、下咽頭がんを自然に罹患した非ヒト動物であってもよいし、発がん物質で下咽頭がんを誘導した非ヒト動物であってもよい。
【００４１】
上記（ｂ）工程における本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法としては、前述の本件マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法を用いればよく、また、上記（ｃ）工程において比較・評価する方法としては、本件マイクロＲＮＡのうち、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p及びmiR-130b*については、コントロールと比較して低下している場合に、その被検物質が下咽頭がん治療薬である可能性が高いと判定することができ、miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375については、コントロールと比較して増加している場合に、その被検物質が下咽頭がん治療薬である可能性が高いと判定することができる。マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡに結合するなどして、その遺伝子の発現を抑制するなどの性質が報告されているため、下咽頭がん組織における上記マイクロＲＮＡの異常発現を正常化方向にシフトさせるような被検物質は、下咽頭がん治療薬として用いうる可能性が高いと考えられる。
【００４２】
なお、（ｃ）工程に代えて、（ｄ）コントロールとしての、下咽頭組織と同種の非がん組織（好適には下咽頭の正常組織）又は下咽頭がん被検体の血液におけるマイクロＲＮＡの発現量と比較・評価する工程：を採用することができる。（ｄ）工程において比較・評価する方法としては、本件マイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して有意差がない場合に、その被検物質が下咽頭がん治療薬である可能性が高いと判定することができる。
【００４３】
本件マイクロＲＮＡの中でも、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3pは、下咽頭の正常組織における発現が少なく、特にmiR-107、miR-187、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-106b*、miR-206は、下咽頭の正常組織における発現がほとんど見られないため、下咽頭がん治療薬である可能性をより正確に判定することが可能である点で好ましい。また、上述のマイクロＲＮＡを２種類以上、下咽頭がんのバイオマーカーとして併用すると、下咽頭がん治療薬である可能性をより正確に判定することが可能となる点で好ましい。
【００４４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
［サンプル組織の採取］
慶應義塾大学医学部ならびに佐野厚生総合病院の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院又は佐野厚生総合病院の耳鼻咽喉科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、３人の各対象者の下咽頭から、合計５種類のサンプル組織（図１の“Sample ID”3046, 3043, 3109, 3112, 3191）を採取した。なお、Sample ID 3046と3043は、同一患者であり、Sample ID 3109と3112は、同一患者である。これら５種類のサンプル組織における組織の種類及び状態（図１の“tissues”の項目）としては、下咽頭の正常組織（hypopharynx）、下咽頭がん（hypopharyngeal cancer）の２種類である。各下咽頭がんサンプルの進行度は、図１の“stage”の項目に記載したとおりであり、これらの下咽頭がんは初発の下咽頭がんである。  
【００４６】
採取したこれらの組織のそれぞれの一部を、RNAlater（登録商標）（Applied Biosystems社製）が分注されたチューブに入れて冷凍保存し、組織内のＲＮＡを安定化した。なお、各サンプルの組織の状態（がん又は正常）は、採取した組織の他の一部について病理学検査を実施し、確定診断を行った。
【実施例２】
【００４７】
［サンプル組織からのＲＮＡの抽出及びその質的評価］
後述の網羅的発現解析に用いるため、実施例１で冷凍保存した各組織からＲＮＡを抽出した。具体的には、mirVana miRNAIsolation Kit（Applied Biosystems社製）を添付のプロトコールにしたがって用いて、前述の各組織から、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出した。
【００４８】
次に、後述の網羅的発現解析で十分な精度が得られることを確認するために、抽出したＲＮＡの質的評価を行った。具体的には、得られたＲＮＡの濃度を蒸留水にて約３０ｎｇ／μＬに調整し、分光光度計にてＯＤ２６０／２８０（ＯＤ２６０の計測値をＯＤ２８０の計測値で割った数値）等を計測及び算出した。その結果を図２に示す。図２に示されているように、ＯＤ２６０／２８０はいずれも約１．７〜２．１の範囲内に入っており、タンパク質やフェノールの混入の少ない、質の良いＲＮＡであることが分かった。また、抽出したトータルＲＮＡのＲＩＮ（RNA Integrity Number）を、Bio-Analyzer RNA6000（Agilent Technologies社製）にて計測し、ＲＮＡの分解の程度を調べた。その結果を図２及び図３に示す。図２及び図３に示されているように、各サンプルのＲＩＮは十分に高いレベルを保持しており、質の良いＲＮＡであることが分かった。
【実施例３】
【００４９】
［各組織におけるマイクロＲＮＡの発現解析］
TaqMan（登録商標）Human MicroRNA Array v2.0 (AppliedBiosystems社製)を用いて、ヒトのマイクロＲＮＡ６６７種類につき定量PCRを用いた網羅的発現解析を行った。この定量PCR用のTaqManプローブとしては、それぞれPart Number 4373154（miR-107用）、4373111（miR-187用）、4373103（miR-196b用）、4395503（miR-301b用）、4395344（miR-331-5p用）、4373201（miR-424用）、4373243（miR-517a用）、4381023（miR-579用）、4395180（miR-758用）、4395528（let-7f-1*用）、4395229（let-7g*用）、4395491（miR-106b*用）、4373092（miR-206用）、4395495（miR-519b-3p用）、4395225（miR-130b*用）、4373110（miR-190用）、4373100（miR-199b-5p用）、4373027（miR-375用）のプローブ（Applied Biosystems社製）を用いた。解析の方法は、前述のTaqMan（登録商標）Human MicroRNAArray v2.0に添付されたプロトコールの方法にしたがった。具体的には、以下のような方法で行った。
【００５０】
TaqMan（登録商標）Human MicroRNA Array v2.0に添付されたMegaplex RT Primersを用いて、実施例２で得られたトータルＲＮＡ中のマイクロＲＮＡについて逆転写反応を行い、マイクロＲＮＡのｃＤＮＡを調製した。このマイクロＲＮＡのｃＤＮＡの希釈物と、TaqMan（登録商標）Universal PCR Master Mixとを混合した後、TaqMan（登録商標）Human MicroRNA Array v2.0に添付されたプレートに負荷した。このプレートを、Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムPCRシステム(AppliedBiosystems社製)にセットしてＰＣＲを行い、６６７種類のマイクロＲＮＡについて定量を行った。
【００５１】
６６７種類のマイクロＲＮＡのうち、下咽頭の正常組織（Sample ID 3046 (normal), 3109 (normal)）と、下咽頭がん組織（Sample ID 3043 (cancer), 3112 (cancer), 3191 (cancer)）とを比較して、発現量（シグナル強度）に大きな差が見られる複数のマイクロＲＮＡを見出した。各サンプルにおけるそれらのマイクロＲＮＡのシグナル強度を図４及び５に示す。図４には、下咽頭がん組織で発現が増加するマイクロＲＮＡ（miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3p及びmiR-130b*）を示し、図５には、下咽頭がん組織で発現が低下するマイクロＲＮＡ（miR-190、miR-199b-5p及びmiR-375）を示す。これらのマイクロＲＮＡは、下咽頭がん組織において、下咽頭の正常組織とは異なる発現（異常発現）していることから、これらのマイクロＲＮＡは、下咽頭がん組織のマーカーとして用いることができる。また、miR-107、miR-187、miR-196b、miR-301b、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-758、let-7f-1*、let-7g*、miR-106b*、miR-206、miR-519b-3pは、下咽頭の正常組織における発現が少なく、特にmiR-107、miR-187、miR-331-5p、miR-424、miR-517a、miR-579、miR-106b*、miR-206は、下咽頭の正常組織における発現がほとんど見られないため、下咽頭がんであるかどうかをより正確に判定することが可能である点で好適に用いることができる。
【００５２】
なお、他のがんにおいて異常発現することが知られるmiR-15（miR-15a、miR-15b）及びmiR-16；miR-17-92 cluster（miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92a）；let-7 family（let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g）；についての発現を各サンプルにて確認したが、下咽頭がんにおいては特に異常発現は見られなかった（図６、図７、図８）。また、がん化の抑制に関与すると考えられているmiR-34（miR-34a、miR-34c-5p）についての発現を、各サンプルについて確認したが、下咽頭がんにおいては特に異常発現は見られなかった（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、下咽頭がんの判定の分野や、下咽頭がん治療薬のスクリーニング方法の分野において好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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