(57)【要約】【課題】被写体像の取得効率を向上させ得る合焦装置、合焦方法、合焦プログラム及び顕微鏡を提案する。【解決手段】対物レンズ１５よりも広い被写体深度となる大きさとされる開口４３Ａ，４３Ｂから、該開口４３Ａ，４３Ｂの後方にそれぞれ設けられるセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂによって撮像素子４５の撮像面に位相差像を形成する。そして位相差像における一方の基準像に対する他方の参照像の距離を画素単位で取得し、各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する。【選択図】図７
2011090222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズの主結像面とは別に予定され、該主結像面に形成される像の位相差像が結像される予定結像面を撮像面として設けられる撮像素子と、
上記撮像素子から、上記位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得する取得手段と、
各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する決定手段と
を有する合焦装置。
【請求項２】
上記決定手段は、
上記各画素の距離の最大値と最小値との差が、上記対物レンズの被写体深度を基準として設定される値以上となる場合、撮影範囲を、上記対物レンズの被写体深度に納まる複数の層に分割し、それら各層において焦点を合わせるべき位置を決定する
請求項１に記載の合焦装置。
【請求項３】
上記決定手段は、
上記撮影範囲のうち、奥行方向に被写体が途切れた部分以外を、上記対物レンズの被写体深度に納まる複数の層に分割する
請求項２に記載の合焦装置。
【請求項４】
上記位相差像は、生体サンプル部位の位相差像である
請求項１又は請求項２に記載の合焦装置。
【請求項５】
上記決定手段は、
距離の差が閾値よりも小さい値となる画素同士が隣接する領域のうち、最も大きい領域の重心位置を、焦点を合わせるべき位置とする
請求項１又は請求項２に記載の合焦装置。
【請求項６】
上記決定手段は、
上記各画素の距離の最大値と最小値との差が、上記対物レンズの被写体深度を基準として設定される値以上となる場合、上記対物レンズに対する被写体深度を広げるとともに、その拡大量に応じて、上記主結像面を撮像面として設けられる他の撮像素子に対する露光時間を長く設定する
請求項２に記載の合焦装置。
【請求項７】
対物レンズの主結像面とは別に予定され、該主結像面に形成される像の位相差像が結像される予定結像面を撮像面として設けられる撮像素子から、該位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得する取得ステップと、
上記取得ステップで取得される各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する決定ステップと
を有する合焦方法。
【請求項８】
コンピュータに対して、
対物レンズの主結像面とは別に予定され、該主結像面に形成される像の位相差像が結像される予定結像面を撮像面として設けられる撮像素子から、該位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得すること、
取得される各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定すること
を実行させるための合焦プログラム。
【請求項９】
対物レンズから入射する光を透過光と反射光とに分割するハーフミラーと、
上記対物レンズに結像され、上記ハーフミラーの透過側又は反射側の一方に投影される被写体像を撮像するための第１の撮像素子と、
上記ハーフミラーの透過側又は反射側の他方に投影される被写体像を後方にリレーするためのフィールドレンズと、
上記フィールドレンズの後方に一対を単位として設けられ、上記対物レンズの被写体深度よりも広い被写体深度となる大きさとされる開口と、
上記開口の後方にそれぞれ設けられ、上記フィールドレンズによってリレーされる予定結像面に対して位相差像を形成するためのセパレータレンズと、
上記予定結像面を撮像面として設けられる第２の撮像素子と、
上記第２の撮像素子から、上記位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得し、各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する決定手段と
を有する顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は合焦装置、合焦方法、合焦プログラム及び顕微鏡に関し、例えば組織切片を観察する場合に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
病理診では、組織切片はスライドガラスに固定され、染色過程及び封入過程を経てプレパラートとして作製される。一般に、プレパラートの保管期間が長期間となると、生体サンプルの劣化や退色等によりプレパラートに対する顕微鏡での視認性が悪くなる。また、プレパラートはそれを作製した病院等の施設以外の施設で鏡検されることもあるが、該プレパラートの受け渡しは一般に郵送であり、一定の時間を要する。
【０００３】
このような実情等に鑑み、生体サンプルを画像データとして保存する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。この装置では、撮像画像のコントラストに基づいて、生体サンプルに焦点を合わせる合焦技術が採用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１７５３３４公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで生体サンプルは厚みを有するものである。このため上述の合焦技術では、生体サンプルにおける厚み方向へ所定間隔ごとに焦点をずらし、これら焦点での撮像画像のコントラストに基づいて最適な焦点位置を探索する処理が必要となる。
【０００６】
例えば、プレパラートにおける生体サンプルの厚みが１０[μｍ]であり、該生体サンプルに集光する光学レンズの被写体深度が１[μｍ]である場合、おおよそ５０枚の撮像画像から最適な焦点位置を探索する処理が必要となる。
【０００７】
これでは、合焦するまでに相当の時間が必要となり、生体サンプルを画像データとして取得する効率が著しく低下することになる。
【０００８】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、被写体像の取得効率を向上させ得る合焦装置、合焦方法、合焦プログラム及び顕微鏡を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため本発明は、合焦装置であって、対物レンズの主結像面とは別に予定され、該主結像面に形成される像の位相差像が結像される予定結像面を撮像面として設けられる撮像素子と、撮像素子から、位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得する取得手段と、各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する決定手段とを有する。
【００１０】
また本発明は、合焦方法であって、対物レンズの主結像面とは別に予定され、該主結像面に形成される像の位相差像が結像される予定結像面を撮像面として設けられる撮像素子から、該位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得する取得ステップと、取得ステップで取得される各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する決定ステップとを有する。
【００１１】
また本発明は、合焦プログラムであって、コンピュータに対して、対物レンズの主結像面とは別に予定され、該主結像面に形成される像の位相差像が結像される予定結像面を撮像面として設けられる撮像素子から、該位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得すること、取得される各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定することを実行させる。
【００１２】
さらに本発明は、顕微鏡であって、対物レンズから入射する光を透過光と反射光とに分割するハーフミラーと、対物レンズに結像され、ハーフミラーの透過側又は反射側の一方に投影される被写体像を撮像するための第１の撮像素子と、ハーフミラーの透過側又は反射側の他方に投影される被写体像を後方にリレーするためのフィールドレンズと、フィールドレンズの後方に一対を単位として設けられ、対物レンズの被写体深度よりも広い被写体深度となる大きさとされる開口と、開口の後方にそれぞれ設けられ、フィールドレンズによってリレーされる予定結像面に対して位相差像を形成するためのセパレータレンズと、予定結像面を撮像面として設けられる第２の撮像素子と、第２の撮像素子から、位相差像における一方の像に対する他方の像の距離を画素単位で取得し、各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する決定手段とを有する。
【発明の効果】
【００１３】
位相差像における一方の像に対する他方の像の画素ごとの距離は、撮影範囲（対物レンズの結像面に映る領域）の凹凸状態を示す情報に相当する。本発明では、セパレータレンズの被写体深度は開口によって対物レンズよりも広くされているため、位相差像から、被写体の詳細な凹凸状態が合焦前に認識可能となる。しかも、合焦前かつ１回の撮影で、被写体の詳細な凹凸状態が認識可能となる。
【００１４】
したがって本発明では、被写体の凹凸状態と、対物レンズの被写体深度に応じたエリアとを考慮して、対物レンズの結像面に映る被写体全体が鮮明となる合焦位置と数を適切に決定することができる。
【００１５】
この結果、組織切片における奥行方向へ所定間隔ごとに焦点をずらしながら撮像し、その撮像画像のコントラストに基づいて焦点位置を探索する方式に比べて、撮影範囲の被写体に応じて無駄なく高速に焦点位置が決定可能となる。かくして被写体像の取得効率を向上させ得る合焦装置、合焦方法、合焦プログラム及び顕微鏡が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】顕微鏡の構成を示す概略図である。
【図２】組織切片の撮影対象像と位相差像を示す写真である。
【図３】組織切片の凹凸状態を示す概略図である。
【図４】位相差像の一方の像に対する他方の像の画素ごとの視差を示す概略図である。
【図５】平ら部分と、傾斜部分とでの焦点位置の決定の説明に供する概略図である。
【図６】対物レンズの被写体深度に応じた焦点位置の決定の説明に供する概略図である。
【図７】合焦位置決定処理手順を示すフローチャートである。
【図８】被写体深度の変更の説明に供する概略図である。
【図９】他の実施の形態における撮像範囲の分割例の説明に供する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
＜１．実施の形態＞
［１−１．顕微鏡の構成］
［１−２．合焦装置の構成］
［１−３．合焦位置決定処理手順］
［１−４．効果等］
＜２．他の実施の形態＞
【００１８】
＜１．実施の形態＞
［１−１．生体サンプル像取得装置の構成］
図１において、本一実施の形態による顕微鏡１を示す。この顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴが配される板状のステージ１１を有する。
【００１９】
プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織の切片を、所定の固定手法によりスライドガラスＳＧに固定し封入したものであり、該組織切片には必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色と呼ばれる染色のみならず、ＦＩＳＨ(Fluorescence  In-Situ  Hybridization)や酵素抗体法等の特殊染色と呼ばれる染色が含まれる。
【００２０】
ステージ１１にはステージ駆動機構１２が設けられる。このステージ駆動機構１２は、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）にステージ１１を駆動するものとされる。ちなみに、プレパラートＰＲＴが配される側のステージ面（以下、これをプレパラート配置面とも呼ぶ）には、一般に、プレパラートＰＲＴを定位置に抑止する抑止部（図示せず）が設けられる。
【００２１】
ステージ１１のプレパラート配置面とは逆の面側には光源１３が配される。光源１３は、一般染色が施された組織切片を照明する光（以下、これを明視野照明光とも呼ぶ）と、特殊染色が施された組織切片を照明する光（以下、これを暗視野照明光とも呼ぶ）とを切り換えて照射可能なものとされる。ただし、明視野照明光又は暗視野照射光のいずれか一方だけが照射可能なものであってもよい。光源１３とステージ１１との間には、プレパラート配置面における基準位置の法線を光軸とするコンデンサレンズ１４が配される。
【００２２】
ステージ１１のプレパラート配置面側には、ステージ面における基準位置の法線を光軸とする対物レンズ１５が配される。対物レンズ１５は、倍率の異なる複数の対物レンズのなかからレンズ切換機構又は手動により選択される。この対物レンズ１５の後方には、該対物レンズ１５の主結像面となる面を撮像面とする撮像素子１６が配される。
【００２３】
この顕微鏡１における制御系として、ステージ駆動機構１２にはステージ駆動制御部２１が、光源１３には照明制御部２２が、撮像素子１６には撮像制御部２３がデータ通信路を介して接続される。
【００２４】
これら制御系は、ＣＰＵ(Central  Processing  Unit)、ＲＯＭ(Read  Only  Memory)、ＣＰＵのワークメモリとなるＲＡＭ(Random  Access  Memory)及び演算回路などを含むコンピュータとされる。
【００２５】
ステージ駆動制御部２１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、コンデンサレンズ１４によって集められる集光部分にプレパラートＰＲＴの組織切片が割り当てられるようステージ面方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）にステージ１１を移動させる（走査させる）。
【００２６】
またステージ駆動制御部２１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、集光部分に割り当てられる組織切片の部位が対物レンズ１５の焦点に合うようステージ面の直交方向（Ｚ軸方向（つまり組織切片の奥行方向））にステージ１１を移動させる。
【００２７】
照明制御部２２は、明視野像を取得すべきモード（以下、これを明視野モードとも呼ぶ）又は暗視野像を取得すべきモード（以下、これを暗視野モードとも呼ぶ）に応じたパラメータを光源１３に設定し、該光源１３から照明光を照射させる。このパラメータは例えば照明光の強度や光源種類の選択などである。
【００２８】
なお、明視野モードにおける照射光は一般に可視光とされる。一方、暗視野モードにおける照射光は、特殊染色で用いられる蛍光マーカを励起する波長を含む光とされる。また暗視野モードでは蛍光マーカに対する背景部分はカットアウトされる。
【００２９】
光源１３から照明光が照射された場合、その照明光はコンデンサレンズ１４によって、ステージ１１におけるプレパラート配置面の基準位置に集められる。対物レンズ１５の結像面には、プレパラートＰＲＴにおける組織切片のうち、コンデンサレンズ１４によって集光される集光部分の像が拡大されて結像され、その拡大像が対物レンズ１５によって撮像素子１６の撮像面に被写体像として結像される。
【００３０】
撮像制御部２３は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを撮像素子１６に設定し、該撮像素子１６の撮像面に結像される被写体像のデータを取得する。このパラメータは例えば露光の開始タイミング及び終了タイミングなどである。
【００３１】
またこの顕微鏡１における制御系として、該顕微鏡１の全体の制御を司る制御部（以下、これを統括制御部とも呼ぶ）３０があり、これはステージ駆動制御部２１、照明制御部２２及び撮像制御部２３それぞれにデータ通信路を介して接続される。この統括制御部３０は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、演算回路及び記憶媒体などを含むコンピュータとされる。
【００３２】
統括制御部３０は、明視野モード又は暗視野モードの開始命令を待ち受け、該開始命令を受けた場合、その開始命令に対応するモードで制御を開始すべき指令をステージ駆動制御部２１、照明制御部２２及び撮像制御部２３に与える。
【００３３】
また統括制御部３０は、ステージ駆動制御部２１においてプレパラートＰＲＴの組織切片部位が割り当てられるたびに、撮像素子１６によって取得される組織切片部位における拡大像のデータを記憶媒体に記憶する。
【００３４】
そして統括制御部３０は、表示命令を待ち受け、該表示命令を受けた場合、その表示命令で指定される拡大像に対応するデータを記憶媒体から読み出し、これを表示命令の送出元に与える。
【００３５】
このようにこの顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴの組織切片を鏡検状態の画像として記憶することで、プレパラートＰＲＴ自体を保存する場合に比べて、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって組織切片に関する情報を保存できるようになされている。
【００３６】
［１−２．合焦装置の構成］
かかる構成に加えてこの顕微鏡１には合焦装置４０が設けられている。この合焦装置４０は、図１に示したように、ハーフミラー４１、フィールドレンズ４２、絞りマスク４３、セパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂ、撮像素子４５及び撮像条件決定処理部４６を含む構成とされる。
【００３７】
ハーフミラー４１は、ステージ面における基準位置の法線を光軸として、対物レンズ１５と撮像素子１６との間に配されており、該対物レンズ１５から入射する光を透過光と反射光とに分割する。
【００３８】
フィールドレンズ４２は、ハーフミラー４１の例えば反射側に投影される対物レンズ１５の被写体像を後方（予定される結像面）にリレーする。このフィールドレンズ４２では、ハーフミラー４１で反射される被写体光が集められるため、視野周辺における明度の低下が抑制される。
【００３９】
絞りマスク４３は、フィールドレンズ４２の後方に配され、該フィールドレンズ４２の光軸と直交する面のうちその光軸を境界として対称となる位置に一対の開口４３Ａ，４３Ｂを有する。これら開口４３Ａ，４３Ｂの大きさは、対物レンズ１５の被写体深度よりもセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂの被写体深度が広くなるよう調整される。
【００４０】
絞りマスク４３は、これら開口４３Ａ，４３Ｂによって、フィールドレンズ４２から入射する被写体光束を分割する。分割光束は、被写体光束の結像面で交差し、該結像面の前後で位置関係が入れ換わる光束となる。
【００４１】
セパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂは、一対の開口４３Ａ，４３Ｂの後方にそれぞれ個別に配される。このセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂは、対応する開口４３Ａ，４３Ｂによって分割される分割光束をアオリ結像（シフト）させ、フィールドレンズ４２によってリレーされる予定結像面に対して１組の被写体像（以下、これを位相差像とも呼ぶ）を形成する。
【００４２】
なお、セパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂがフィールドレンズ４２の口径蝕（ケラレ）に掛かると、分割光束の一部が欠損する。このためセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂは、口径蝕に掛からないようフィールドレンズ４２の中央側に寄せて配置される。
【００４３】
撮像素子４５は、ラインセンサーではなく、フィールドレンズ４２によってリレーされる被写体像の予定結像面を撮像面とするエリアセンサーとされる。
【００４４】
ここで、対物レンズ１５の主結像面に配される撮像素子１６で撮像される明視野像と、該対物レンズ１５の予定結像面に配される撮像素子４５で撮像される位相差像との写真を図２に示す。この図２からも分かるように、撮像素子１６の撮像面（主結像面）に結像される明視野像は、セパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂによって位相差像として撮像素子４５の撮像面（予定結像面）に結像される。
【００４５】
撮像条件決定処理部４６は、ＣＰＵに対してＲＯＭ、ＲＡＭ及び演算回路などを含むコンピュータとされ、ＲＯＭには、撮影条件を決定するためのプログラム（以下、これを撮影条件決定プログラムとも呼ぶ）が格納される。
【００４６】
撮像条件決定処理部４６は、統括制御部３０から撮影条件を決定すべき指令が与えられた場合、撮影条件決定プログラムにしたがって、図１に示してあるように、視差取得部５１及び撮影条件決定部５２として機能する。
【００４７】
視差取得部５１は、位相差像のうち基準とすべき一方の像（以下、これを基準像とも呼ぶ）における各画素を順に注目対象の画素（以下、これを注目画素と呼ぶ）として選択する。
【００４８】
また視差取得部５１は、注目画素を選択するたびに、位相差像のうち参照すべき他方の像（以下、これを参照像とも呼ぶ）から、その注目画素に対応する画素（以下、これを相対画素と呼ぶ）を検出し、該注目画素に対する相対画素の距離を取得する。この距離は視差に相当する。
【００４９】
なお、対応点の検出手法には、例えば、注目点を中心とする注目ブロックの画素値と最も類似度が高いブロックを、参照すべき位相差像の他方の像から正規化相関法により探索し、該ブロックの中心を対応点とする手法が適用される。
【００５０】
このように視差取得部５１は、基準像に対する参照像の距離（視差）を画素単位で取得するようになされている。
【００５１】
この距離（視差）は小さいほど対物レンズ１５の焦点が前方に位置し、これに対して大きいほど後方に位置する関係にある。したがって、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離は、図３に示すように、プレパラートＰＲＴにおける組織切片のうち、撮影範囲（対物レンズ１５の結像面に映る領域）ＡＲの凹凸状態を示す情報に相当するものとなる。
【００５２】
ここで、図２に示した組織切片の位相差像における基準像の各画素の位置と、当該画素に対する参照像の相対画素の距離との関係をグラフとして図４に示す。この図４におけるグラフの薄い部分は表側を、濃い部分は裏側を示すものである。この図４から、対物レンズ１５の結像面に投影される組織切片部位の凹凸状態が反映され、またその組織切片部位における一部の端がまくれた状態にあることが分かる。
【００５３】
合焦位置決定部５２は、基準像の各画素の位置と、当該画素に対する参照像の相対画素の距離とに基づいて、対物レンズ１５の焦点を合わせるべき位置（以下、これを合焦位置とも呼ぶ）を決定する。
【００５４】
具体的には、相対画素の距離の差（隔たり度）が閾値よりも小さい値となる画素同士が隣接する領域のうち、最も大きい領域の重心位置が、合焦位置とされる。すなわち、撮影範囲（対物レンズ１５の結像面に映る領域）において密集度が高く凹凸度が小さい部分が、合焦位置となる。
【００５５】
この焦点位置は統括制御部３０を経由してステージ制御部２１に与えられ、該ステージ制御部２１によって、該焦点位置に対する対物レンズ１５の焦点の移動量（以下、これをデフォーカス量）が計算されステージ１１が移動される。
【００５６】
ところで上述したようにセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂの被写体深度は対物レンズ１５よりも広く調整されている。このため、撮像素子１６の撮像面（主結像面）に対して撮影用として結像される組織切片像よりも、撮像素子４５の撮像面（予定結像面）に対して撮影条件決定用として結像される組織切片像の凹凸状態が詳細に表現される。
【００５７】
したがって、合焦位置決定部５２は、撮像素子４５の像（位相差像）を用いることで、撮像素子１６の像を用いる場合に比べて詳細に、対物レンズ１５の結像面に映る被写体像（組織切片像）全体が鮮明となる位置を合焦位置として決定できる。
【００５８】
ところが例えば図５に示すように、組織切片がうねった状態でスライドガラスとカバーガラスとの間に封入される場合がある。この場合、比較的平らな部分が撮影範囲（対物レンズ１５の結像面に映る領域ＡＲ）のときには（図５（Ａ））、合焦位置決定部５２によって決定される合焦位置は、撮影範囲の被写体像（対物レンズ１５の結像面に映る組織切片の部位像）全体が鮮明な状態となる。
【００５９】
しかしながら傾斜部分が撮影範囲のときには（図５（Ｂ））、その撮影範囲における被写体像の奥行き方向の幅（以下、これを撮影奥行幅とも呼ぶ）が対物レンズ１５の被写体深度よりも大きい。このため、合焦位置決定部５２によって決定される合焦位置に対して対物レンズ１５の焦点が移動されても、撮影範囲の被写体像の一部が欠落又はぼけた状態となってしまう。
【００６０】
したがって合焦位置決定部５２は、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離における最大値と最小値との差が、該差に対して設定される閾値よりも大きい場合、図６に示すように、当該撮影範囲に対して複数の焦点位置を決定するようになっている。
【００６１】
具体的には、撮影範囲を、対物レンズ１５の被写体深度に納まる複数の層（以下、これを撮影層とも呼ぶ）に分割し、それら撮影層において密集度が高く凹凸度が小さい部分を合焦位置として決定する。なお閾値は、対物レンズ１５に対する絞りの開口に対して設定される開口量（つまり被写体深度）に相当する値などとされる。
【００６２】
［１−３．合焦位置決定処理手順］
次に、撮像条件決定処理部４６における合焦位置決定処理手順を図７に示すフローチャートを用いて説明する。
【００６３】
撮像条件決定処理部４６は、撮影条件を決定すべき指令が与えられた場合、合焦位置決定処理手順を開始し、第１ステップＳＰ１に進んで、撮像素子４５から、対物レンズ１５の結像面に投影される被写体（組織切片）の位相差像を取得し、第２ステップに進む。撮像条件決定処理部４６は、第２ステップＳＰ２では、位相差像から、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離（視差）を取得し、第３ステップＳＰ３に進む。
【００６４】
撮像条件決定処理部４６は、第３ステップＳＰ３では、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離における最大値と最小値との差を求め、第４ステップＳＰ４に進んで、第３ステップＳＰ３で求めた差を閾値と比較する。
【００６５】
ここで、第３ステップＳＰ３で求めた差が閾値以上である場合、撮像条件決定処理部４６は、撮影範囲における被写体像の撮影奥行幅が対物レンズ１５の被写体深度よりも大きいものと判断し、第５ステップＳＰ５に進む。撮像条件決定処理部４６は、第５ステップＳＰ５では、撮影範囲を、対物レンズ１５の被写体深度に納まる層（撮影層）に分割し、第６ステップＳＰ６に進む。
【００６６】
一方、第３ステップＳＰ３で求めた差が閾値よりも小さい場合、撮像条件決定処理部４６は、撮影範囲における被写体像の撮影奥行幅が対物レンズ１５の被写体深度よりも小さいものと判断し、第５ステップＳＰ５を経ずに、第６ステップＳＰ６に進む。
【００６７】
撮像条件決定処理部４６は、第６ステップＳＰ６では、撮影範囲又はその撮影範囲を分割した各撮影層おいて密集度が高く凹凸度が小さい部分を合焦位置として決定し、合焦位置決定処理手順を終了する。
【００６８】
このようにして撮像条件決定処理部４６は、撮影範囲に対して１又は複数の合焦位置を決定するようになされている。
【００６９】
［１−４．効果等］
以上の構成において、この合焦装置４０は、対物レンズ１５よりも広い被写体深度となる大きさとされる開口４３Ａ，４３Ｂから、該開口４３Ａ，４３Ｂの後方にそれぞれ設けられるセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂによって撮像素子４５の撮像面に位相差像を形成する（図３参照）。
【００７０】
そして合焦装置４０は、位相差像における一方の基準像に対する他方の参照像の距離を画素単位で取得し（図４参照）、各画素の距離に基づいて焦点を合わせるべき位置と数とを決定する（図７参照）。
【００７１】
上述したように基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離は、撮影範囲（対物レンズ１５の結像面に映る領域）ＡＲの凹凸状態を示す情報に相当する（図３）。この合焦装置４０では、セパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂの被写体深度は開口によって対物レンズ１５よりも広くされているため、位相差像から、被写体の詳細な凹凸状態が合焦前に認識可能となる。しかも、１回の撮影で、被写体の詳細な凹凸状態が認識可能となる。
【００７２】
したがってこの合焦装置４０では、被写体の凹凸状態と、対物レンズ１５の被写体深度に応じたエリアとを考慮して、対物レンズ１５の結像面に映る被写体全体が鮮明となる合焦位置と数を適切に決定することができる。
【００７３】
この結果、組織切片における奥行方向へ所定間隔ごとに焦点をずらしながら撮像し、その撮像画像のコントラストに基づいて焦点位置を探索する方式に比べて、撮影範囲の被写体に応じて無駄なく高速に焦点位置が決定可能となる。
【００７４】
暗視野モードでは蛍光マーカにおける蛍光期間がある一定期間に制限されるものであるため、撮影範囲の被写体に応じて無駄なくかつ高速に焦点位置が決定できるということは、組織切片像の取得効率を向上させる観点では特に有用となる。
【００７５】
以上の構成によれば、撮影範囲の被写体に応じて無駄なくかつ高速に合焦位置を決定できるようにしたことにより、組織切片像の取得効率を向上させ得る合焦装置４０を実現できる。
【００７６】
＜２．他の実施の形態＞
上述の実施の形態では組織切片が生体サンプルとされた。しかしながら生体サンプルはこの実施の形態に限定されるものではない。例えば細胞や染色体等が生体サンプルとされてもよい。
【００７７】
上述の実施の形態では２枚のセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂが用いられた。しかしながらセパレータレンズ４４の数はこの実施の形態に限定されるものではない。１対のセパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂを単位（組）として、複数枚のセパレータレンズ４４を用いることができる。なおこの場合、絞りマスク４３に対して各組のセパレータレンズ４４に対応する開口を設けることを要する。
【００７８】
上述の実施の形態では、相対画素の距離の差（隔たり度）が閾値よりも小さい値となる画素同士が隣接する領域のうち、最も大きい領域の重心位置が合焦すべき位置として決定された。しかしながら合焦すべき位置の決定手法はこの実施の形態に限定されるものではない。
【００７９】
例えば、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離の平均値となる画素としてもよい。この画素が複数ある場合にはそれらがその重心とすることもできる。これら以外にも、対物レンズ１５の結像面に映る被写体像（組織切片像）全体が鮮明となる位置の決定手法が適用可能である。
【００８０】
上述の実施の形態では、焦点位置に対する対物レンズ１５の焦点の移動量（デフォーカス量）が、顕微鏡１におけるステージ制御部２１で計算された。しかしながらデフォーカス量の算出場所はこの実施の形態に代えて、合焦装置４０における合焦位置決定部５２とすることができる。
【００８１】
上述の実施の形態では、対物レンズ１５における被写体深度は固定とされたが可変としてもよい。可変とする場合、上述した第５ステップＳＰ５における処理を別の処理に変更すればよい。
【００８２】
具体的には、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離（視差）における最大値と最小値の差が、対物レンズ１５に対して許容し得る最大の被写体深度に相当する値未満であるが、対物レンズ１５に対して現に設定される被写体深度に相当する値以上となるか否かを判定する。
【００８３】
ここで肯定結果が得られた場合、撮像条件決定処理部４６は、図８に示すように、対物レンズ１５に対する絞り（図示せず）の開口を所定量だけ広げて対物レンズ１５の被写体深度を大きくする。このとき撮像条件決定処理部４６は、その拡大量に応じて撮像素子１６に対する露光時間を長く設定した後、第６ステップＳＰ６に進む。一方、否定結果が得られた場合には、対物レンズ１５に対する絞りを広げることなく、第６ステップＳＰ６に進む。
【００８４】
なお、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離（視差）における最大値と最小値の差が、対物レンズ１５に対して許容し得る最大の被写体深度に相当する値以上となる場合、上述した第５ステップＳＰ５における処理を実行する形態としてもよい。
【００８５】
このようにすれば、撮影範囲に対して、被写体像（対物レンズ１５の結像面に映る組織切片の部位像）全体が鮮明な状態となる１又は複数の合焦位置を、より一段と詳細に決定することが可能となる。
【００８６】
上述の実施の形態では、基準像の各画素に対する参照像の相対画素の距離（視差）における最大値と最小値との差が閾値以上となる場合、撮影範囲が、対物レンズ１５の被写体深度に納まる層（撮影層）に分割された。しかしながら分割態様はこの実施の形態に限定されるものではない。
【００８７】
例えば図９に示すように、撮影範囲のうち、組織切片において奥行方向に途切れた部分以外を、撮影層に分割するようにしてもよい。このようにすれば、途切れた部分に対して焦点を合わせて撮影する処理が除かれるため、被写体像の取得効率をより一段と向上させさせることが可能となる。
【００８８】
上述の実施の形態では、セパレータレンズ４４Ａ，４４Ｂによって位相差像が形成されたが、当該形成手法はこの実施の形態に必ずしも限定されるものではなく、他の既知のものが採用されてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、遺伝子実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用することができる。
【符号の説明】
【００９０】
１……顕微鏡、１１……ステージ、１２……ステージ駆動機構、１３……光源、１４……コンデンサレンズ、１５，４５……撮像素子、１６……対物レンズ、２１……ステージ駆動制御部、２２……照明制御部、２３……撮像制御部、３０……統括制御部、４０……合焦装置、４１……ハーフミラー、４２……フィールドレンズ、４３……絞りマスク、４３Ａ，４３Ｂ……開口、４４Ａ，４４Ｂ……セパレータレンズ、４６……撮像条件決定処理部、５１……視差取得部、５２……合焦位置決定部、ＰＲＴ……プレパラート。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図４】
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