(57)【要約】      （修正有）【課題】変形性関節症などの骨・関節疾患を検査する方法を提供する。【解決手段】HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域に存在する一塩基多型（SNP）が変形性関節症の発症に関連、これらの多型を調べることにより変形性関節症などの骨・関節疾患の発症リスクや発症の推定を正確に実施できる。１０塩基以上の特定の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。特定の配列において、特定の塩基番号の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLA遺伝子座または第15染色体長腕25.1領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査する方法。
【請求項２】
前記一塩基多型が、配列番号１、２または３の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
骨・関節疾患が変形性関節症である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１、２または３の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。
【請求項５】
配列番号１、２または３の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は変形性関節症などの骨・関節疾患を予測または判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨や関節の病気は世界中で深刻な問題であり、その中でも変形性関節症（osteoarthritis；OA）は最も多い疾患の一つである。OAは慢性の関節炎を伴う骨・関節疾患（bone and joint diseases）で、軟骨の退行変性により軟骨の破壊と骨や軟骨の増殖性変化をきたす病気である。しかしながら、その原因はいまだ不明であり、環境的要因と遺伝的要因の両方の関与が予想されている。
これまでに、OA感受性遺伝子が遺伝子相関解析によって同定されているが、機能的にも裏付けられ、結果の再現性が得られたのはごくわずかである（特許文献１〜５、非特許文献１，２）。
大規模なゲノムワイド相関解析がアジアと欧州のいくつかのグループで報告された（非特許文献３〜６）。しかしながら、ゲノム全体で十分な有意性を示したのはごくわずかであった。
そして、これまでのところ、HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域の多型と骨・関節疾患との関係は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2006-042735号公報
【特許文献２】特表2009-509505号公報
【特許文献３】特表2002-526122号公報
【特許文献４】特表2002-526121号公報
【特許文献５】再表2006/014013号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nat. Genet. 37, 138-144 (2005).
【非特許文献２】Nat. Genet. 39, 529-533 (2007).
【非特許文献３】Hum. Mol. Genet. 14, 1009-1017 (2005).
【非特許文献４】Arthritis Rheum. 54, 524-532 (2006).
【非特許文献５】Nat. Genet. 40, 994-998 (2008).
【非特許文献６】Am. J. Hum. Genet. 82, 1231-1240 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、変形性関節症などの骨・関節疾患の発症リスクや発症を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域に存在する一塩基多型（SNP）が変形性関節症の発症に関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより変形性関節症などの骨・関節疾患の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）HLA遺伝子座または第15染色体長腕25.1領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査する方法。
（２）前記一塩基多型が、配列番号１、２または３の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、（１）の方法。
（３）骨・関節疾患が変形性関節症である、（１）または（２）の方法。
（４）配列番号１、２または３の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。
（５）配列番号１、２または３の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、これまで予測が困難であった変形性関節症などの骨・関節疾患の発症リスクを正確かつ簡便に予測することができる。また、骨・関節疾患の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は骨・関節疾患の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト第6染色体HLA CLASS II-CLASS III領域のケース-コントロール相関解析及び連鎖不平衡（LD）マップを示す図。 (a) LDマップ。(b) HLA CLASS II-CLASS III領域のゲノム構造。(c) HLA CLASS II-CLASS III領域に含まれるSNPｓと変形性関節症との相関。P値（-log10）をｙ軸に示す。
【図２】ヒト第15染色体78.37-78.47 Mb領域のケース-コントロール相関解析及び連鎖不平衡（LD）マップを示す図。 (a) LDマップ。(b) 第15染色体78.37-78.47 Mb領域のゲノム構造。(c) 第15染色体78.37-78.47 Mb領域に含まれるSNPｓと変形性関節症との相関。P値（-log10）をｙ軸に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、HLA遺伝子座または第15染色体長腕25.1領域に含まれるSNPを分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査する方法である。「骨・関節疾患」としては、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、滑膜炎などが挙げられる。なお、本発明において、「検査」とは骨・関節疾患の発症リスクの検査及び骨・関節疾患の発症の有無の検査を含む。
【００１１】
HLA遺伝子座はHLA遺伝子産物をコードする遺伝子を包含するヒト第6染色体上の領域である。HLA遺伝子座としてより好ましくは、ヒト第6染色体上のBTNL2遺伝子（GenBank Accession No.NC_000006.10の32470491〜32482878）からHLA-DQA2遺伝子（GenBank Accession No.NC_000006.10の32817141〜32823199）に至るまでの領域を意味し、より具体的にはGenBank Accession No.NC_000006.10の32470491〜32823199の領域を意味する。
HLA遺伝子座に存在する具体的なSNPとしては、ヒトrs7775228およびrs10947262を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。
第15染色体長腕25.1領域としてより具体的にはGenBank Accession No.NC_000015.8の78413278〜78426619の領域を意味する。第15染色体長腕25.1領域に存在する具体的なSNPとしては、ヒトrs3848196を挙げることができる。
【００１２】
rs7775228はHLA-DQB1遺伝子の23.6-kb上流に存在する。HLA-DQB1遺伝子はHLA class II 分子であるHLA-DQβ鎖をコードし、B細胞、樹状細胞、マクロファージなどの抗原提示細胞に発現しており、免疫系における重要な役割を果たしている（Molecular biology of the cell - Fifth edition. Garland Science, New York,USA (2007)）。
【００１３】
rs7775228はGenBank Accession No. NT_007592.14の23516329番目の塩基におけるチミン（T）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がTである場合は骨・関節疾患の可能性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs7775228がTT＞TC＞CCの順で骨・関節疾患の可能性が高い。なお、後述の実施例では相補鎖を解析しているのでアデニン（A）/グアニン（G）のうち、Aをリスクアレルと記載している。
【００１４】
rs10947262はBTNL2遺伝子のイントロン１に存在する。BTNL2 はbutyrophilin ファミリーのメンバーであるbutyrophilin-like 2の略称である。BTNL2 は小腸やパイエル板（Peyer's patches）で多く発現しており、CD28やCTLA-4とは異なる未知の受容体を介してT細胞の活性化を調節することが報告されている（J. Immunol. 178, 1523-1533 (2007)）。
【００１５】
rs10947262はGenBank Accession No. NT_007592.14の23231562番目の塩基におけるT／Cの多型を意味し、この塩基がCである場合は骨・関節疾患の可能性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs10947262がCC＞CT＞TTの順で骨・関節疾患の可能性が高い。
【００１６】
rs3848196はLOC283688遺伝子の3.6-kb上流に存在する。LOC283688は蛋白質(GenBank Accession No.XP_001132532.1)をコードすることが予測される仮想遺伝子である。
【００１７】
rs3848196はGenBank Accession No. NT_010194.16の51428069番目の塩基におけるアデニン（A）/グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がAである場合は骨・関節疾患の可能性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs3848196がAA＞AG＞GGの順で骨・関節疾患の可能性が高い。なお、後述の実施例では相補鎖を解析しているのでチミン（T）/シトシン（C）のうち、Tをリスクアレルと記載している。
【００１８】
なお、rs7775228、rs10947262およびrs3848196について、SNP塩基及びその前後60bpの領域を含む合計121bpの長さの配列を、それぞれ配列番号１、２および３に示した。それぞれ61番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトHLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
【００１９】
上記SNPの塩基の種類を調べることによって、骨・関節疾患を検査することができる。検査するSNPの数は、一種類でもよいし、複数（ハプロタイプ解析）でもよい。なお、HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８の関係を満たす塩基をいう。
【００２０】
HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域に含まれるSNPの解析に用いる試料としては、染色体DNAを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２１】
HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域に含まれるSNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめSNP部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００２３】
また、PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００２４】
また、SNP部位を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、ＨＬＡ遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域に含まれる目的のSNPを含むDNAを増幅し、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２５】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（RFLP法）。この場合、まず、DNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
このようにしてSNPがいずれの塩基であるかを決定することで、骨・関節疾患を検査するためのデータを得ることができる。
【００２６】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、骨・関節疾患を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、HLA遺伝子座における上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１または２において塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さはより好ましくは、１５〜３５塩基であり、さらに好ましくは２０〜３５塩基である。
【００２７】
また、プライマーとしては、HLA遺伝子座および第15染色体長腕25.1領域における上記多型部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１、２または３の塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２９】
まず、OA感受性を決定する遺伝子変異を同定するために、日本人の検体を用いてゲノムワイド相関解析（GWAS）を行った。
【００３０】
解析に用いたOAサンプルの特徴は表１に示すとおりである。
GWASに用いたOAサンプルは日本国内のいくつかの医療機関から集められた（Nat. Genet. 39, 529-533 (2007)、Nat. Genet. 40, 994-998 (2008)）。
膝関節OA（knee OA）と股関節OA（hip OA）はNat. Genet. 39, 529-533 (2007)、Nat. Genet. 40, 994-998 (2008)に記載された基準に従って診断された。
3,396人分のコントロール（非OA）のサンプルは、東京大学医科学研究所のBioBank Japan （Clin. Adv. Hematol. Oncol. 5, 696-697 (2007)）にOAとは関係ない疾患の患者として登録されたサンプルと大阪御堂筋ロータリークラブのボランティアのサンプルを用いた。
Replicationスタディには、三重県大台町と南伊勢町の住民のサンプルを用いた。
本研究は東京大学医科学研究所、理化学研究所および各参加研究機関の倫理委員会によって承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【００３１】
【表１】
2011010607.tif 000002
【００３２】
HumanHap550 BeadChip（Illumina）を用いて膝関節OAの患者899人とコントロール3,396人を解析した。459,393 個のSNPs を患者とコントロールの間でFisher's exact test （allelic, dominant およびrecessiveの3モード）により比較した。
次に、GWASで得られたSNPsの中からP値の低い上位15個の SNPs (最小P値 < 1 x 10-5)を選択し、replication スタディを行った。replication スタディでは、multiplex PCR-based invader assay (Third Wave Technologies)またはABI 3700 DNA analyzers (Applied Biosystems)を用いた直接シークエンスにより、別の日本人膝関節OA患者167人とコントロール347人において、SNPsのジェノタイピングを行った。
【００３３】
Replication studyとGWASを合わせた有意性レベルの基準をallele-based テストにおいてP <1.09 x 10-7 (459,393回のテストに基づくBonferroni 補正後のP = 0.05 に相当) と設定した。その結果、rs7775228 (P = 2.43 x 10-8; オッズ比= 1.34; 95% CI =1.21-1.49) とrs10947262 (P = 6.73 x 10-8; オッズ比=1.32; 95% CI = 1.19-1.46) の２つのSNPsがOAと有意な相関を示した(表２)。また、上記有意性レベルの基準を満たさないもののOAとの相関が示唆されるSNPとしてrs3848196 (P = 2.58 x 10-7; オッズ比= 1.53; 95% CI =1.29-1.79)を検出した。
【００３４】
【表２】
2011010607.tif 000003
オッズ比とP値はMantel-Haenszelの方法により算出した。
a：２×２アレル頻度表からのリスクアレルのオッズ比
b： Pearsonのχ2テスト（アレルモード）のP値
c：Breslow-Dayテストの結果
d：２つのスタディのメタ分析
【００３５】
なお、表2の結果について、ロジスティック回帰モデルを用いて性別およびbody mass index (BMI)で調整したところ、調整後も同様の相関が認められ、上記SNPｓは性別やBMIに関係なくOAに相関を示すことがわかった。
【００３６】
rs7775228およびrs10947262はBTNL2, HLA-DRA, HLA-DRB5, HLA-DRB1, HLA-DQA1 及び HLA-DQB1を含む340-kb の領域に存在していた(図１)。
そして、Haploview softwareを用いてrs7775228とrs10947262の間のペアワイズ連鎖不平衡インデックス（D'）を計算したところ、両SNPの間に強い連鎖不平衡が見られた(D' = 0.82)。
【００３７】
次に、Haploview software （Bioinformatics 21, 263-265 (2005)）を用いてrs7775228 と rs10947262のハプロタイプ解析を行った。その結果、それらは２つの頻度の高いハプロタイプ(ハプロタイプI およびII：両ハプロタイプで約９０％）を形成していることがわかった。そして、表3に示されるように、ハプロタイプIはひざOAに強い相関を示した。すなわち、ハプロタイプIは最も頻度が高く、リスクハプロタイプ (P = 1.48 x 10-8; オッズ比 = 1.33;95% CI = 1.20-1.46)であることがわかった。そして、このP値とオッズ比はrs7775228 およびrs10947262単独のP値及びオッズ比（OR）と類似していた。
【００３８】
【表３】
2011010607.tif 000004
* rs7775228 (A/G) とrs10947262 (C/T) のアレルをこの順で記載した。
** 各ハプロタイプ vs. その他のハプロタイプ
【００３９】
次に、rs7775228 及びrs10947262 が股関節のOAに相関を示すかについて調べた。930人分の股関節OAのサンプルを用いてジェノタイピングを行い、ゲノムワイド相関解析で得られたコントロールのデータと比較した。その結果、表4に示されるように、rs10947262 が股関節OAと強い相関を示した (P = 0.011)。一方、rs7775228 と股関節OAとの相関はごくわずかであった (P =0.058)。また、結果を臼蓋形成不全（AD）の有無で分類したところ、臼蓋形成不全を伴わない股関節OAの群で相関を認めた。
【００４０】
【表４】
2011010607.tif 000005
*コントロール群としてGWASのコントロールを用いた。
【図１】
2011010607.tif 000006
【図２】
2011010607.tif 000007
【配列表】
2011010607000001.app