(57)【要約】【課題】適度な粘弾性を保持し、触感に優れ、かつ表皮における角質間隙からの浸透が容易でヒアルロン酸産生促進および分解抑制作用をも有する、優れた性質を有する組成物を提供する。【解決手段】このような組成物は、重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩およびヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含む組成物を調製することで得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩およびヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩を含有する組成物。
【請求項２】
前記重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩の固形分含量が、０．１重量％以上１０重量％以下であり、前記ヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩の固形分含量が、０．１重量％以上１０重量％以下である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を２個含む４糖である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸オリゴ糖が、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を１個含む２糖、該１単位を２個含む４糖、該１単位を３個含む６糖、該１単位を４個含む８糖、および該１単位を５個含む１０糖からなる群より選択される少なくとも１または２以上の組合せである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
Ｂ型粘度計により、ローター回転数６０ｒｐｍ、２５℃で測定した粘度が１，０００ 〜 １０，０００ ｍＰａ・ｓである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
皮膚外用剤である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類であるヒアルロン酸および低分子のヒアルロン酸オリゴを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖単位が連結した多糖類であり、哺乳類の生体内で、関節、硝子体、皮膚、脳などの細胞外マトリックスを構成する天然高分子としても知られている。特に関節軟骨では、アグリカン、リンクタンパク質と非共有結合し超高分子複合体を作って、軟骨の機能維持に極めて重要な役割を果たしている。他方、粘弾性物質として眼球における空間の保持、関節における運動衝撃の緩和の能力もある。
【０００３】
ヒアルロン酸の分子量としては、数十万程度から１００万以上であるが、１０００〜２０，０００程度の低分子量のものなどもある。さらには、例えばヒアルロニダーゼの作用により調製される、二糖単位２〜２５個のヒアルロネートフラグメントの存在（非特許文献１）、ヒアルロン酸分解抑制剤としての二糖単位２個の４糖からなるＨＡ４（特許文献１）なども知られている。
【０００４】
ヒアルロン酸は、その生理活性により、サプリメント、注射剤、などを含む医薬品や化粧品の成分として利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１２６４５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Science, 第２２８巻第１３２４〜１３２６頁（１９８５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、皮膚に適用した場合に、触感がよく皮膚にも馴染み易く、かつ皮膚の内部までの浸透性に優れた新規な組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、下記組成物を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩およびヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩を含有する組成物に関する。
【００１０】
上記組成物において、上記重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩の固形分含量が、０．１重量％以上１０重量％以下であり、前記ヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩の固形分含量が、０．１重量％以上１０重量％以下であり得る。
【００１１】
上記組成物において、上記ヒアルロン酸オリゴ糖が、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を２個含む４糖であり得る。
【００１２】
上記組成物において、上記ヒアルロン酸オリゴ糖が、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を１個含む２糖、該１単位を２個含む４糖、該１単位を３個含む６糖、該１単位を４個含む８糖、および該１単位を５個含む１０糖からなる群より選択される少なくとも１または２以上の組合せであり得る。
【００１３】
上記組成物は、Ｂ型粘度計により、ローター回転数６０ｒｐｍ、２５℃で測定した粘度が１，０００ 〜 １０，０００ ｍＰａ・ｓであり得る。
【００１４】
上記組成物は、皮膚外用剤であり得る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組成物は、皮膚に適用した場合に、優れた浸透性を示し、細胞内でのヒアルロン酸産生能に優れ、保湿性が高い。また、有効成分としての重合平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸とヒアルロン酸オリゴ糖とに毒性や抗原性がほとんどないことから、組成物を皮膚に適用した場合のトラブルの可能性が極めて低く、特に皮膚外用剤を始めとする化粧品として好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例にかかる組成物のヒアルロン酸産生促進作用のヒト皮膚組織による検証を行うためのウェルの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の組成物には、重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸が含まれる。以下、本明細書においては、「高分子量のヒアルロン酸」ともいう。
【００１８】
ここで、多糖構造を有するヒアルロン酸は、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を多数含む多糖である。さらに、ヒアルロン酸の代わりにその薬学的に許容される塩を用いることもできる。薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などがあるが、特にヒアルロン酸ナトリウムであることが好ましい。
【００１９】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、７０万以上１５０万以下である。好ましくは、７５万以上、より好ましくは８０万以上であり、上限は特にはないが、１２０万以下が好ましく、１００万以下がより好ましい。
【００２０】
ここで、本明細書でいう重量平均分子量の測定は、第１５改正日本薬局方一般試験法（１０）の粘度測定法に従って極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔらの式により算出される値である。
【００２１】
重量平均分子量７０万以上１５０万以下のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、その固形分含量が、組成物全体の０．１重量％以上、好ましくは、０．５重量％以上である。上限は特にはないが、１０重量％以下、好ましくは、１重量％以下である。
【００２２】
このようなヒアルロン酸は、天然に存在する生物資源である、鶏冠、哺乳類動物の関節や皮膚、鯨の軟骨等からの抽出による工業的な製法で得ることができる。
【００２３】
さらに、ヒアルロン酸を産生する微生物から回収することで得ることもできる。このようなヒアルロン酸を産生する微生物としては、ストレプトコッカス属細菌に属するストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、パスツレラ・マルトシダなどの微生物の培養液から回収することができる。
【００２４】
本発明の組成物はまた、ヒアルロン酸オリゴ糖またはその薬学的に許容できる塩を含有する。
【００２５】
ここで、本発明でいう「ヒアルロン酸オリゴ糖」とは、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を任意の数で含む１０糖までのオリゴ糖、またはそれらの混合体をいう。その薬学的に許容できる塩とは、たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（nーブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであり得る。
【００２６】
すなわち、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を１個含む２糖（以下、ＨＡ２ともいう）、該１単位を２個含む４糖（以下、ＨＡ４ともいう）、該１単位を３個含む６糖、該１単位を４個含む８糖、および該１単位を５個含む１０糖からなる群より選択される少なくとも１種の糖を含み、場合により、これらの２以上の組合せを含む。
【００２７】
品質上好ましいのは、全ヒアルロン酸オリゴ糖の１５重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、さらに好ましくは６０重量％以上がこのような４糖であることである。
【００２８】
しかしながら、−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１，４−を１単位とし、該１単位を１個含む２糖、該１単位を３個含む６糖、該１単位を４個含む８糖、および該１単位を５個含む１０糖からなる群より選択される少なくとも１種の糖のいずれかを単独で含んでもよい。
【００２９】
その他に、限定はされないが、例えば、ＨＡ４を少なくとも１3重量％以上含むヒアルロン酸オリゴ糖、またはＨＡ２：ＨＡ４：その他の１０個までのとして、たとえば重量比で、３：２：２で含むヒアルロン酸オリゴ糖などを用いることもできる。
【００３０】
このようなヒアルロン酸オリゴ糖は、本発明の組成物のうち、０．１重量％以上含まれることが好ましく、より好ましくは、０．２重量％以上、さらに好ましくは、０．５重量％以上である。上限は特にはないが、好ましくは、１０重量％以下、より好ましくは１重量％以下、さらに好ましくは、０．８重量％以下である。
【００３１】
このようなヒアルロン酸オリゴ糖は、限定はされないが、分子量１０万から１５０万程度のヒアルロン酸を酵素分解法、アルカリ分解法、加熱分解法、超音波処理法等の公知の方法によって処理することによって、製造することができる。
【００３２】
このうち、例えば酵素分解法とは、具体的には、ヒアルロン酸分解酵素を、分子量１０万から１５０万程度のヒアルロン酸に反応させ、その反応時間等の条件を調整することなどにより、１０個までの単糖から構成される好適なオリゴ糖を調製することができる。ここで用いられるヒアルロン酸分解酵素には、睾丸由来ヒアルロニダーゼ、ストレプトマイセス由来ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどが含まれる。（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグルコサミノグリカンー」p244-248、1991年発行、東京化学同人参照）
【００３３】
アルカリ分解法としては、例えばヒアルロン酸の溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間１１０℃程度にまで加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロン酸を得る方法などが挙げられる。また、酸分解法としては、例えばヒアルロン酸の溶液に１Ｎ-０．５Ｎ程度の塩酸、メタスルフォン酸等の酸を加え、１５−２４時間  ７０−８０℃程度にまで加温して、低分子化させた後、塩基を加えて中和して、低分子量のヒアルロン酸を得る方法などが挙げられる。
【００３４】
本発明の組成物は、特に限定はされないが、Ｂ型粘度計により、ローター回転数６０ｒｐｍ、２５℃で測定した粘度が１，０００ 〜 １０，０００ ｍＰａ・ｓであることが好ましい。
【００３５】
本発明の組成物は、限定はされないが、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、皮膚に適用する為の皮膚外用剤とすることが好ましく、特に、皮膚適用の為の、化粧水、乳液、クリーム、シート状含水ゲル等の剤形として、調製される。
【００３６】
このような本発明に係る皮膚外用剤は、ヒアルロン酸オリゴおよび高分子量のヒアルロン酸の有効成分の他、一般的に肌用化粧料として含有されるその他の成分を含めることができる。その他の成分としては、多価アルコール、基剤、可溶化剤、保湿剤、乳化剤、溶解安定剤、防腐剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、けん化剤及び溶剤を挙げることができる。
【００３７】
そのような任意の成分としては、限定はされないが、具体的には、組成物が化粧水である場合には、好ましくは多価アルコールが挙げられる。このような多価アルコールとしては、ブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、イソペンチルジオール、エチルヘキサンジオール、グリコール、グリセリン、ジエチレングリコール、ジグリセリン、ジチアオクタンジオール、ＤＰＧ、チオグリセリン、デシレングリコール、トリエチレングリコール、トリメチルヒドロキシメチルシクロヘキサノール、フィタントリオール、フェノキシプロパンジオール、１，２−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブチルエチルプロパンジオール、ＢＧ、ＰＧ、１，２−ヘキサンジオール、ヘキシレングリコール、ペンチレングリコール、メチルプロパンジオール、メンタンジオール、ラウリルグリコール等が挙げられる。その他に、イノシトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトール等の糖アルコールなども挙げられる。
【００３８】
可溶化剤としては、としては、モノラウリン酸デカグリセリル、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテルなどを挙げることができる。
【００３９】
保湿剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセリン、キシリット、ソルビット、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（２００、４００、６００、１０００、２０００等）、高重合ポリエチレングリコール、メチルグルセス、Ｄ−マンニット、ヒドロキシプロリンなどを挙げることができる。
【００４０】
溶解安定剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、亜硫酸ナトリウムなどを挙げることができる。防腐剤としては、特に限定されないが、例えば、パラオキシ安息香酸エステル、塩酸クロルヘキシジン、オルトフェニルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン、トリクロカルバン、フェノキシエタノールを挙げることができる。抗酸化剤としては、特に限定されないが、例えば、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフェロール）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエンを挙げることができる。
【００４１】
ｐＨ調節剤としては、特に限定されないが、例えば、コハク酸、クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、アルギニン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸ナトリウムを挙げることができる。
【００４２】
基剤としては、特に限定されないが、例えば、ラノリン、セレシン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリン、ホホバ油、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、イソステアリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ミリスチン酸、高級アルコール（イソステアリルアルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、コレステロール、セタノール、ステアリルアルコール、デシルテトラデカノール、フィトステロール、ヘキシルデカノールなど）、パルミチン酸セチル、パルミチン酸オクチル、ラノリン酸イソプロピルを挙げることができる。
【００４３】
乳化剤としては、特に限定されないが、例えば、水素添加大豆リン脂質、ジステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ジステアリン酸ポリエチレングリコール、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、親油型モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、セスキイソステアリン酸ソルビタンなどのソルビタン脂肪酸エステル類；モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α’−オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸などのグリセリンポリグリセリン脂肪酸類；モノステアリン酸プロピレングリコールなどのプロピレングリコール脂肪酸エステル類；硬化ヒマシ油誘導体；グリセリンアルキルエーテル；ポリオキシエチレン・ポリアルキル（Ｃ1〜4）シロキサン；ジイソステアリン酸ジグリセリルなどが挙げられる。
【００４４】
けん化剤としては、特に限定されないが、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミンを挙げることができる。
【００４５】
また、他の成分としては、通常の化粧品に用いられる成分、たとえばコンディショニング成分、色素、顔料などの着色剤、粘度調整剤、ｐＨ調節剤、塩類、ビタミン剤、香料、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、金属封鎖剤、粘度調整剤、乳化安定剤などを挙げることができる。
【００４６】
本発明の組成物では、粘弾性が肌への適用に適した値である。すなわち、Ｂ型粘度計により、ローター回転数６０ｒｐｍ、２５℃で測定した粘度が１，０００ 〜 １０，０００ ｍＰａ・ｓであることが好ましい。
【００４７】
本発明の組成物は、例えば、豚表皮に適用した場合の接触角は、限定はされないが、６０度以上８０度以下であることが好ましい。この範囲であれば、組成物を皮膚に適用した場合に、肌への浸透が円滑であり、肌本来のしっとり感・すべすべ感が増強され、肌の潤いが維持される。接触角が５０〜７０度であればさらに好ましい。
【００４８】
本発明の組成物は、高分子量のヒアルロン酸またはその薬学的に許容し得る塩と、ヒアルロン酸オリゴ糖とを含有し、任意に通常化粧用として用いられる成分を付加することもできる。ヒアルロン酸を含む化粧品を実際に皮膚に適用した場合には、通常必ずしも皮膚内部にまで浸透するとは限らず、高い保湿性が発揮されない場合があるが、本発明の組成物は、適度な粘弾性を保持し、触感に優れ、かつ表皮における角質間隙からの浸透が容易である。ヒアルロン酸高分子同士の絡まりによる結合において、その絡まり部分にオリゴ糖が入り込み、いわば“ころ”のように滑らせることで結合を弱めるためと考えられる。さらに、ヒアルロン酸オリゴ糖は低分子量物質であるので皮膚に浸透しやすく、それ自体による効果も発揮される上に、ヒアルロン酸オリゴ糖によるヒアルロン酸産生促進および分解抑制作用も顕現される。本願発明の組成物は、皮膚内部までの保湿性に優れ、かつその作用が長時間続く。しかも本発明の組成物は、抗原性および毒性が低く、皮膚への負担が非常に少ない。
【実施例】
【００４９】
以下に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００５０】
実施例１
（組成物の調製）重量平均分子量８０万のヒアルロン酸（商品名FCH、紀文製）１００ｍｇ/ ９ mL水溶液を７０℃に加熱し、５０％塩酸を１mL添加し、撹拌し、１６時間処理した。その後、１０%水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６に調整した。分解した溶液は、高速クロマトグラフィー（HPLC）で測定し、ヒアルロン酸オリゴ糖の含有量をHPLCのチャートの面積ピークの比率を各ピークで求め、ヒアルロン酸４糖（ＨＡ４）が該当するピーク面積のが１４%重量比以上であることを確認して使用した。ヒアルロン酸オリゴ糖の含有量は、ヒアルロン酸の基本単位であるＤ−グルクロン酸−β−１，３−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−β−１を１：１で結合したヒアルロン酸２糖（HA2）と２糖が２つ結合したヒアルロン酸４糖（ＨＡ４）を含む分画の配合比を求め、全体のヒアルロン酸量との配合比で計算する。たとえば、HPLCでHA2が１５％、HA4が１５％の面積ピークが求められた場合は、HA2とHA4の和の３０%が収率と計算する。
【００５１】
オリゴ糖の測定に用いるＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
カラム：ポリアミンカラム（ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｓｕｇａｒ−Ｄ）
溶離液：リン酸二水素ナトリウム（０ → ０．８Ｍ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
試料濃度：１ｍｇ／ｍＬ
分析量１００μＬ
このようにして得られたヒアルロン酸オリゴ糖と、平均重合分子量  80万のヒアルロン酸ナトリウム（商品名 FCH 紀文製）とを、それぞれ、１重量％ずつ含有するように蒸留水で調節した。
【００５２】
比較例１
実施例１で得られたヒアルロン酸オリゴ糖を、１重量％となるように生理食塩水で調節した。
【００５３】
比較例２
分子量  ８０万のヒアルロン酸ナトリウム（商品名 FCH 紀文製）を、１重量％となるように生理食塩水で調節した。
【００５４】
上記実施例および比較例で得られた組成物を用いて、濃度は適宜に変化させるなどして、以下の評価を行う。
【００５５】
（ヒアルロン酸産生能の検討）
賦活対象細胞
測定対象の細胞としてHT1080（ヒト繊維肉腫細胞）を使用する。HT1080は理化学研究所より入手可能である。
【００５６】
実験方法
取得したHT1080細胞をトリプシン処理することで剥離した後、以下の条件でMEM培地に播種し、培養する(１×１０5個/ml、９６穴)。
１群 無添加
２群 実施例または比較例で得られた組成物を培地に添加し（ヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸オリゴ糖の合計量として１μg/ml）、２４時間インキュベート。
【００５７】
培養の後、冷メタノールで固定する。続いて、０．５%BSA（仔牛血清）添加PBS（BSA-PBS）にて洗浄後、ビオチン標識HABPでインキュベートした。インキュベートの条件は４℃にて２４時間とする。その後、BSA-PBSにて洗浄後、FITC標識ストレプトアビジンでインキュベートした（室温（２４℃）にて３０分）。インキュベート後、BSA-PBSにて洗浄する。
【００５８】
蛍光顕微鏡（ニコン社製）にて観察後、撮影する。また、顕微鏡下にて、ランダムに選択した３視野（２００倍）において、細胞表面に拡散性（diffuse）HA染色像を持つ細胞を数える。
【００５９】
（組成物の粘弾性測定）
レオメータにより、２０℃で測定される動的粘弾性を求める。周波数０．１Ｈｚにおける貯蔵弾性率Ｇは０．０１Ｐａ以上であり、損失弾性率が極大を示す周波数が１．０ Ｈｚ以上１００ Ｈｚ以下である。
【００６０】
（組成物の接触角測定）
【００６１】
クロムなめし剤により一般的な方法でなめされた豚皮（厚さ０．７５〜１．２５ｍｍ、液中熱収縮温度１０５〜１２０℃、脂肪分３．０〜４．５％、クロム含有量（Ｃｒ2Ｏ3）３．５〜５．０％、ｐＨ３．０〜４．５（日本工業規格Ｋ６５５０試験法により測定）；例えば「豚すあげＮｏ．１０３０」（（株）高橋商店製））を５．０ｃｍ×２．５ｃｍの大きさに切断した豚皮表面に、接触角計（例えば、ＦＡＣＥ接触角計ＣＡ−Ｄ型：協和界面科学（株）製）を用いて、実施例１、比較例１または２で得られた組成物１．０ｍｌ（半径１ｍｍの水滴）を滴下し、１０秒後に接触角を測定する（２３℃，６０％ＲＨ）。これを違う位置で５回測定し、その平均値を得る。さらに新たな豚皮についても同様に処理・測定を行って（合計５回）、５つの平均値を得る。それら５つの平均値をさらに平均することで得られた平均値を、本発明における接触角とする。
【００６２】
（組成物塗布後の皮膚モデルによるヒアルロン酸浸透量測定）
シャーレ（直径10 cm ガラス製）内にセロハン紙（６ｃｍ×６ｃｍ、ＭＳ(平判) ３００、フタムラ化学株式会社製）をおき、その上から実施例１、比較例１、または比較例２で得られた組成物を、５ｍｌ用いて、刷毛でなすりつけ、蓋をして乾燥しないように３７℃で一定時間おいた後、セロハンを取り除く。シャーレ内に５ｍｌの精製水を入れて６０分間震盪し、その洗浄水に含まれるヒアルロン酸量をカルバゾール硫酸法によって定量した。
【００６３】
（組成物のヒアルロン酸産生促進作用のヒト皮膚組織による検証）
皮膚組織
東洋紡株式会社製のTESTSKINTMLSEを使用する。TESTSKINTM LSEは、付属のアッセイ培地を用いて、付属の6ウェルプレートを用いて培養することで、ヒト皮膚組織モデルを構築することができる。なお、6ウェルプレートにおける１つのウェルの模式図を図１に示す。図１に示すように、6ウェルプレートにおける個々のウェルは、底面に透過膜１を備えたトランスウェル２から構成されている。TESTSKINTM LSEは、トランスウェル２内及びトランスウェル２の底面の下方空間３にアッセイ培地を充填することによって、トランスウェルの底面上に培養され、ヒト皮膚組織モデル４を形成することとなる。
【００６４】
先ず、以下のように群分けして、TESTSKINTM LSEを６ウェルプレートにて、37℃、５% CO2で２４時間培養する。コントロール群[ヒアルロン酸もＨＡ４も含まない]：アッセイ培地１．２mlを添加した６wellプレートに、TESTSKINTM LSEの入ったトランスウェルを設置し、トランスウェル内に1mlのアッセイ培地を添加した。
試験群[実施例および比較例に対応するヒアルロン酸またはヒアルロン酸オリゴ糖を含む]：１μg/mlの濃度でヒアルロン酸オリゴ糖および／またはヒアルロン酸を含むアッセイ培地１．２mlを添加した６wellプレートに、TESTSKINTM LSEの入ったトランスウェルを設置し、トランスウェル内に１μg/mlの濃度で、実施例１に対応する高分子ヒアルロン酸とヒアルロン酸オリゴ糖の混合、比較例１と２にそれぞれ対応する単独の有効成分を含むアッセイ培地1mlを添加する。
【００６５】
次に、トランスウェルを切り取り、OCTコンパウンドに包埋し、凍結切片を作製する（厚さ１０μm)。次に、ヒアルロン酸結合タンパク質(HABP)によるヒアルロン酸染色を実施する。
【００６６】
具体的には、凍結切片を４％パラホルムアルデヒド／PBSを用い、室温にて30分固定した、PBSで三回洗浄する。さらに、０．３％ H2O2／メタノールを用い、４℃にて３０分間処理し、内因性のペルオキシダーゼのブロッキングを行い、PBSで三回洗浄する。次に、内因性のビオチンを内因性アビジンビオチンブロッキングキット（ニチレイ）を用い、プロトコールどおりにブロッキングし、１００ mM Sodium acetate bufferを加え、37℃で15分インキュベートした後、各群から選ばれた陰性コントロール群には、20TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業）を添加し、６０℃で２時間インキュベートした。PBSで三回洗浄した後、１％ BSA/PBSを加え、室温で１時間ブロッキングする。ブロッキング剤を除き、１% BSA/PBSで２ ug/mlに希釈したビオチン標識HABP（生化学工業）を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄する。1% BSA/PBSで200ng/mlに希釈したストレプトアビジン-HRP（カルビオケム）を添加し、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した後、DAB（Zymed)で発色させ、顕微鏡下で観察する。
【００６７】
（組成物皮膚塗布による効果）
実験動物
生後七ヶ月齢の雌の肉用ブタ（LWD種）を使用する。実験動物は、温湿度自然環境下、及び照明時間１２時間（午前８時から午後８時）に設定された飼育室内で飼育する。飼育に際して、飲料水は自由摂取とし、飼料（ハイブリード７０)は一日二回の制限給餌とし、朝・夕刻時に豚房内を水洗する。
【００６８】
実施例１、比較例１および２と同様の有効成分の組成物で、ジメチルポリシロキサン（３５０ｍｍ２／ｓ）２重量％、スクワラン４重量％、パルミチン酸イソプロピル２重量％、パルミチン酸ヘキサデシル１．５重量％、ベヘニルアルコール０．５重量％、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル０．５重量％、フェノキシエタノール０．５重量％、ステアリルアルコール０．５重量％、モノステアリン酸グリセロール０．５重量％、ニコリピッド８１Ｓ  ３重量％、アミソフト０．５重量％、グリセリン３重量％、１，３−ブチレングリコール３重量％、および精製水７８．４重量％の組成からなる基材に、ヒアルロン酸とヒアルロン酸オリゴ糖の総量でそれぞれ２重量％となるように混合した塗布クリームとして準備する。
【００６９】
実験方法
飼育している実験動物の背部皮膚を２ｃｍの間隔で一区画３ｃｍ四方に区分けし、上記塗布クリームを一日一回０．１ｇずつ塗布した。塗布クリームの塗布は７日間行う。最終塗布の翌日に麻酔科にて放血致死させ、背部皮膚を脂肪層ごと摘出し、一部をOCTコンパウンドに包埋し、一部を凍結する。
【００７０】
（ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸染色実験）
OTCコンパウンドに包埋したブタ背部皮膚を用い、凍結切片を作製する（厚さ18μm)。切片を４%パラホルムアルデヒド/PBSを用い、室温にて３０分固定した、PBSで三回洗浄する。さらに、０．３% H2O2／メタノールを用い、４℃にて３０分間処理し、内因性のペルオキシダーゼのブロッキングを行い、PBSで三回洗浄する。次に、内因性のビオチンを内因性アビジンビオチンブロッキングキット（ニチレイ）を用い、プロトコールどおりにブロッキングする。次に、１００ mM Sodium acetate bufferを加え、３７℃で15分インキュベートした後、陰性コントロール群には、２０TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業）を添加し、６０℃で２時間インキュベートする。PBSで三回洗浄した後、１％BSA/PBSを加え、室温で１時間ブロッキングする。ブロッキング剤を除き、１% BSA/PBSで２ ug/mlに希釈したビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質（生化学工業）を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄する。1% BSA/PBSで200ng/mlに希釈したストレプトアビジン-HRP（カルビオケム）を添加し、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した後、DAB（Zymed)で発色させ、顕微鏡下で観察する。
【００７１】
（皮膚内ヒアルロン酸含量の測定実験）
ブタ皮膚を60℃にて一晩乾燥させ、１mgあたり１００ulの１%プロナーゼ（Merck)を添加し、40℃で17時間酵素消化する。１００℃で１０分しプロナーゼを不活化した後、１５０００rpmで１０分遠心し、上清をヒアルロン酸画分とした。
【００７２】
分子量７５万のHAを５０ mM クエン酸-リン酸バッファー（pH ５）で０．１ μg/mlになるよう調製し、アミノプレート（住友ベークライト）に５０μlずつ添加し、室温で１５分放置する。蒸留水で１０ mg/mlに調製した水素化シアノホウ素ナトリウム １０μlをプレートに添加し、室温で１時間放置する。TBSで三回洗浄後、２００μlのブロックエース（大日本住友製薬）で４℃にて３日ブロッキングする。ＰＢＳ／０．０５ % Tweenで三回洗浄し、１０倍に希釈したブロックエースで７５倍に希釈したブタ皮膚ヒアルロン酸画分を５０ul添加し、さらに１００ng/mlになるよう１０倍に希釈したブロックエースで調製したビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質（生化学工業）を５０μl添加し、３７℃で１時間インキュベートする。PBS/0.05 % Tweenで三回洗浄し、１００μlの１０倍希釈したブロックエースで４０００倍希釈したストレプトアビジン-HRP（Calbiochem)を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。PBS/0.05 % Tweenで三回洗浄し、１００μlのTMB(MOSS)を加え、発色させた後、１Nの塩酸で反応を停止させる。Ａ４５０／６３０ｎｍを測定する。
【図１】
2011057607.tif 000002