(57)【要約】【課題】本発明は、免疫増強効果を有するMIP-1α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）の誘導体eMIP及び安定剤を含む水溶液製剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、その結果、塩化ナトリウム、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも一つ以上の添加剤を添加することにより、eMIPの分解が抑制されることを見出した。また、pH5〜pH7のリン酸緩衝液が本eMIP 水溶性製剤におけるpH調節剤として好ましいことを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
eMIPを有効成分とする水溶性製剤であって、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、塩化ナトリウム、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも一つ以上の添加剤を含み、pH値が5〜7に調整されていることを特徴とするeMIP含有水溶性製剤。
【請求項２】
pH値の調整がリン酸緩衝液を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載のeMIP水溶性製剤。
【請求項３】
前記水溶性製剤において、前記有効成分eMIPの含有濃度が0.01〜6.5 mg/mlの範囲内であって、前記添加剤の濃度が5〜15mg/mlの範囲内であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のeMIP水溶性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫増強効果を有するMIP-1α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）の誘導体eMIP及び安定剤を含む水溶液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌や免疫異常その他の疾患で、生体から分離された生物活性のある蛋白質の遺伝子を分離し、これを発現系の細胞に導入・培養して、大量の蛋白質を得、これを精製して治療に用いる事は良く行われている。
【０００３】
アミノ酸70個からなるMIP-1α（Macrophage Inflammatory Protein-1α）は、C-Cケモカイン受容体であるCCR1およびCCR5のリガンドであり、これらの受容体を発現している末梢血中の単球、樹状細胞前駆体、T リンパ球、又はNK細胞など各種のリンパ球を遊走させる機能があることが知られている（非特許文献１）。また、この蛋白質の遺伝子を発現させた癌細胞の周辺にはTリンパ球や樹状細胞が誘導されることや、この蛋白質がTリンパ球からのインターフェロンの誘導を促し、さらに癌の転移を抑えたと報告されている（非特許文献２〜４）。また、MIP-1αを注射する事により、癌が縮小又は消失したという報告もある（特許文献２）。そのため、MIP-1αを癌疾患に用いる試みが検討されていた。
【０００４】
しかしながら、10mg/mlの濃度で簡単に沈殿してしまうというMIP-1αの溶解度の低さ、すなわち凝集沈殿のしやすさが、実際の治療に用いる際の問題点として挙げられていた。この問題を解決する一つの手段として、MIP-1αの構造遺伝子を改変し、２６番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、N末端のアラニンを除き、セリンから始まる全長が６９のアミノ酸配列とすることが行われた。この改変により得られた本蛋白質はＢＢ１００１０という名称で、癌化学療法中の骨髄の保全を目的に臨床試験が試みられた（非特許文献５及び６）。
【０００５】
上記ＢＢ１００１０は、本発明者らの下でeMIPと命名されて開発が進められ、凝集能の低下と共に、MIP-1αと同様の走化性誘導活性、細胞内カルシウム上昇作用などの活性が示されるとともに、癌局所放射線照射後に静脈内投与することにより、著しい癌増殖の抑制効果と放射線照射部位から遠距離にある癌の増殖抑制効果・アブスコパル効果が認められている（特許文献１）。
【０００６】
更に、ＢＢ１００１０即ちeMIPについては、樹状細胞前駆体の血中レベルを上昇させる作用があることが知られている（特許文献２）。
【０００７】
ＢＢ１００１０即ちeMIPの水溶性製剤については、例えば特許文献１（WO 2006/080171 A1）において、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール、ポリアルコール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM）を併用しても良い旨の記載がある。しかし、本文献には水溶性製剤におけるeMIPの安定性についての問題点及びその可決手段についての記載はない。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2006/080171 A1
【特許文献２】WO 2004/037288 A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】中野英樹、細胞工学  Vol. 19, No.9, 1304−1310(2000)
【非特許文献２】Yoneyama H. et al., J. Exp. Med., 193 (1), 35-49 (2001)
【非特許文献３】Zhang Y. et al., J. Natl. Cancer Inst., 96, 201-209 (2004)
【非特許文献４】McKay PF. et al., Eur. J. immunol., 34, 1011-1020 (2004)
【非特許文献５】E. Marshall et al., European Journal of Cancer, 34 (7), 1023-1029 (1998)
【非特許文献６】Hal E. Broxmeyer et al, Blood Cells, Molecules and Diseases, 24 (2), 14-30 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来蛋白質製剤は、当該蛋白質に特有の可溶化方法を取るのが普通であり、最終的には緩衝液に溶解させて使用される。eMIPは、非常に凝集沈殿しやすいMIP-1α蛋白質をアミノ酸置換することにより可溶化する性質を保持するが、MIP-1α蛋白質の凝集しやすい性質を内在しており、その注射又は点滴製剤化においては詳細な検討が必要である。
【００１１】
通常注射薬として使用される、酢酸、クエン酸、リン酸およびそれらの塩からなる緩衝液にeMIPを溶解すると析出する場合があった。また、本発明者らが本明細書にて明らかにするように、溶媒のpHを中性に保った場合でも、eMIPが時間経過とともに分解していくという問題点があった。さらに、eMIPはプラスチックや硝子の表面に簡単に吸着するという扱い難い性質も保持していた。
【００１２】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、免疫増強効果を有するMIP-1α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）の誘導体eMIP及び安定剤を含む水溶液製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した。
まず、水溶性製剤中のeMIPの溶解性に関するpHの寄与について検討を行なった。その結果、添加剤を添加しない場合には、pH5〜6 の弱酸性条件下では沈殿が形成され、pH を中性付近（pH7.2〜7.4）に保った場合には、沈殿はみられないことが明らかとなった。さらに、保存安定性試験を行なった結果、pH7付近ではeMIPの分解が起こりやすいことが明らかになった。
【００１４】
そこで、次に、eMIPの分解を抑制する溶媒環境を検討することを目的として、pH5及びpH7の水溶液において添加剤を添加し、eMIPの溶解性及び安定性を評価した。その結果、塩化ナトリウム、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも一つ以上の添加剤を添加することにより、eMIPの分解が抑制されることが明らかとなった。また、pH5〜pH7のリン酸緩衝液が本eMIP 水溶性製剤におけるpH調節剤として好ましいことがわかった。
【００１５】
さらに、eMIPのプラスチックや硝子の表面への吸着を抑制する添加物を実施例２に記載の方法により検討した。その結果、非イオン性界面活性剤である、低濃度のポリソルベート類を添加することによりプラスチックや硝子の表面へのeMIPの吸着を防ぐ事が明らかとなった。
【００１６】
即ち、本発明者らは安定したeMIP含有水溶液製剤を調製することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明は、より具体的には下記〔１〕〜〔３〕の発明を提供するものである。
〔１〕eMIPを有効成分とする水溶性製剤であって、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、塩化ナトリウム、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも一つ以上の添加剤を含み、pH値が5〜7に調整されていることを特徴とするeMIP含有水溶性製剤。
〔２〕pH値の調整がリン酸緩衝液を用いて行われることを特徴とする、〔１〕に記載のeMIP水溶性製剤。
〔３〕前記水溶性製剤において、前記有効成分eMIPの含有濃度が0.01〜6.5 mg/mlの範囲内であって、前記添加剤の質量パーセント濃度が5〜15mg/mlの範囲内であることを特徴とする、〔１〕又は〔２〕に記載のeMIP水溶性製剤。
【発明の効果】
【００１８】
eMIP水溶性製剤に上記添加剤を加えることにより、eMIPの分解が抑制されることが明らかとなった。即ち、本発明において用いられる添加剤はeMIP水溶性製剤の安定化に大きく寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】塩化ナトリウム添加における分解生成物に関するクロマトグラムを示す図である。塩化ナトリウム添加直後のクロマトグラムを示す。
【図２】塩化ナトリウム添加における分解生成物に関するクロマトグラムを示す図である。遮光、40℃保存条件下で1週間経過した際のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、免疫増強効果を有するMIP-1α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）の誘導体eMIP及び安定剤を含む水溶液製剤に関する。
【００２１】
本発明において「eMIP」とは、MIP-1α（Macrophage Inflammatory Protein-1α）と同様の走化性誘導活性、細胞内カルシウム上昇作用などの活性を示し、癌局所放射線照射後に静脈内投与することにより、著しい癌増殖の抑制効果と放射線照射部位から遠距離にある癌の増殖抑制効果・アブスコパル効果が認められる物質である。
【００２２】
「eMIP」は、MIP-１αの26番目のAspがAlaに置換され、アミノ末端がSerより始まる69アミノ酸よりなるMIP-1α変異体であって、著しく改善された抗凝集性を有すると共に野生型と同等の活性を有することが知られている（E. Marshall et al., European Journal of Cancer, 34 (7), 1023-1029 (1998)）。本発明において、「eMIP」は当業者に公知の方法により調製することが出来る。より具体的には、WO 2006/080171に記載された方法により調整することができるが、本方法に限定されるものではない。
【００２３】
本発明の水溶性製剤は、溶媒中のeMIPを安定化させることを目的として、添加物を添加することができる。本発明において添加される添加物としては、塩化ナトリウム、D-マンニトール、D-ソルビトール、精製白糖、グリシン、L-アラニン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-グルタミン酸ナトリウム、L-アスパラギン酸、L-リジン塩酸塩、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも１つ以上の添加剤を挙げることが出来る。また、より好ましくは、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも１つ以上の添加剤を挙げることも出来る。また、eMIPのプラスチックや硝子の表面への吸着を抑制することを目的として、非イオン性界面活性剤を添加してもよい。本発明において、非イオン性界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート類、より好ましくはポリソルベート80TMを例示することが出来る。
【００２４】
本発明の水溶性製剤は、緩衝液によりpH値が5〜7に調整されていてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液（リン酸＋リン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸＋酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム）、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができ、より好ましくはリン酸緩衝液をpH値の調整に用いることができる。
【００２５】
添加剤の濃度は特に限定されるものではないが、添加剤としてL-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、塩化ナトリウム、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも１つ以上の添加剤を用いる場合については、これらの添加剤の濃度が5〜15mg/ml（質量パーセント濃度が0.5〜1.5％）の範囲内であることが好ましい。また、添加剤としてポリソルベート類を用いる場合については、該添加剤の質量パーセント濃度が0.005〜0.1％であることが好ましい。
【００２６】
また、有効成分であるeMIPの濃度も特に制限されるものではないが、含有濃度が0.01〜6.5 mg/mlの範囲内であることが好ましい。
【００２７】
本発明の水溶性製剤は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、上述した添加剤の他に医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。
【００２８】
本発明は、前記水溶性製剤を含む免疫増強剤に関する。本発明の免疫増強剤は、癌転移の予防剤、又は癌治療剤として提供される。
【００２９】
本発明の免疫増強剤は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の免疫増強剤が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の免疫増強剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１〕eMIP含有水溶性製剤のpHの検討
まず、水溶性製剤中のeMIPの溶解性に関するpHの寄与について検討を行なった。
種々のpH の上記緩衝液中に、eMIPを1.0mg/mlの濃度にて溶解させたところ、pH5〜6 の弱酸性条件下では沈殿が形成された。そのため、pH を中性付近に保ち、長期間保存したところ、沈殿はみられなかったので、pH調整領域を一旦pH7.2〜7.4 に定めた。
その後、eMIPの保存安定性試験を行い、pH7付近ではeMIPの分解が起こりやすいことが明らかになった。
【００３２】
〔実施例２〕水溶性製剤中のeMIPの安定性に関する添加剤の寄与の検討
次に、eMIPの分解を抑制する溶媒環境を検討することを目的として、pH5及びpH7の水溶液において添加剤を添加し、eMIPの溶解性及び安定性を評価した。
溶解性及び安定性の評価については以下の手順により行なった。
【００３３】
（１）試料調製方法
（ａ）「eMIPが溶解している塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液において、限外ろ過フィルター（ザルトリウス、VIVASPIN20）を用いて溶媒をリン酸緩衝液（pH7、20 mM）に交換し、pH7、約2 mg/mlの溶液を調製した。
（ｂ）20 mMリン酸二水素ナトリウム（和光純薬、薬添規）溶液と20 mMリン酸水素ナトリウム水和物（和光純薬、局方品）溶液を混合しpH5又はpH7に調製した。これら2種類の溶液に、各種添加剤（表１及び表２に示した36種の添加剤）を表１及び表２に示した添加量の２倍量加え、添加後の溶液が正確にpH5又はpH7となるように調製した。
【００３４】
なお、本方法でpH5又はpH7の溶液を調製できなかった場合に、微量の100 mMリン酸（ナカライテスク、特級）水溶液、又は100 mM水酸化ナトリウム（ナカライテスク、特級）水溶液を加えてpH5あるいはpH7に溶液を調製した。
【００３５】
[表１]各種添加物とその添加量（１）
2011001273.tif 000002
【００３６】
[表２]各種添加物とその添加量（２）
2011001273.tif 000003
（ｃ）（ｂ）で調製した溶液に（ａ）で調製した溶液を等量ずつ加え混合し、バイアル（大和特殊ガラス，ホウ珪酸ガラスバイアル）に1 mlずつ分注し、打栓して、巻き締めを十分に行ってサンプルを作製した。
【００３７】
（２）保存条件
上記試料調製方法で作製したサンプルを、遮光、40℃保存条件下で1週間保存した。
【００３８】
（３）分解生成物試験
高速液体クロマトグラフィ（以下「ＨＰＬＣ」という。）用の移動相として移動相Ａと移動相Ｂとを２種類調製した。
【００３９】
移動相Ａは精製水1000 mlにトリフルオロ酢酸（和光純薬，高速液体クロマトグラフィ用）0.5 mlを加えたものである。
【００４０】
移動相Ｂはアセトニトリル（ナカライテスク，高速液体クロマトグラフィ用）800 mlに精製水200 ml及びトリフルオロ酢酸0.5 mlを加えたものである。
【００４１】
ＨＰＬＣに供する試料溶液として、上記保存条件で保存した36種類のサンプル各々100 μlにプラスチックや硝子の表面への吸着を避けるために0.01％ポリソルベート80TM溶液900μlを加えたものを用意した。
【００４２】
なお、0.01％ポリソルベート８０TM溶液は、ポリソルベート80を1 g秤量し、精製水を加えて100 mlとした。更にこの溶液1 mlに精製水を加えて100 mlとすることにより調製した。
【００４３】
逆相HPLCカラムはSymmetry300TM C-18（Waters社製; I.D. 4.6 mm × L. 150 mm，5 μm）を用い、試料溶液を注入し（0分）、上記移動相ＡとＢとを〔表３〕に示されているタイムプログラムにより1 ml／分で流出させた。保持時間5分から45分までのピークについて自動積分法によりピークを求めた。タイムプログラムが一周期終了したところで、今度は、別の任意の試料溶液を注入し、同様にタイムプログラムを開始した。このようにして、36種類の添加物の添加時と、添加後、遮光、40℃保存条件下で一週間経過時のeMIPの分解生成物の生成割合を調べた。
【００４４】
[表３]移動相Ａと移動相Ｂの混合のタイムプログラム
2011001273.tif 000004
【００４５】
ここでは、一例として、塩化ナトリウム添加における分解生成物に関するクロマトグラムについて、添加直後（開始時）と、遮光、40℃保存条件下で１週間経過したものを各々図１及び図２として示した。
【００４６】
これらのピークについて次式により主ピーク以外のピーク含量を算出した。
主ピーク以外のピーク含量
＝（ピーク面積の総和−主ピークの面積）／ピーク面積の総和×100      〔式１〕
【００４７】
ここで主ピークの面積が図１において斜線で示した部分である。この面積がeMIPの含量を示す。従って〔式1〕から求められる「主ピーク以外のピーク含量」とはeMIPの分解生成物の生成量である。
【００４８】
36種類の各々の添加物について、添加直後（開始時）と遮光、40℃保存条件下で1週間経過時のeMIPの分解生成物の生成割合を一覧表にしたものが〔表４〕及び〔表５〕である。
【００４９】
[表４]各種添加物とeMIP分解生成物の生成割合（１）
2011001273.tif 000005
【００５０】
[表５]各種添加物とeMIP分解生成物の生成割合（２）
2011001273.tif 000006
【００５１】
なお、添加剤を何も加えなかったものについても開始時と遮光、40℃保存条件下で1週間経過時のeMIPの分解生成物の生成割合を調べた。それが〔表４〕のNo. 0である。
〔表４〕及び〔表５〕によれば、添加物なしのものは、eMIPの分解生成物の増加割合は11.2％であるが、このeMIPの分解を顕著に抑制する添加剤は、塩化ナトリウム（和光純薬，局方品）、L-ヒスチジン（和光純薬，和光特級）、L-アルギニン（和光純薬，和光特級）、L-アルギニン塩酸塩（和光純薬，和光特級）、L-リジン塩酸塩（和光純薬，特級）、クエン酸（和光純薬，局方品）、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）（和光純薬，局方品，LotNo.WKG6966）である。
【００５２】
ここで、1％のポリソルベート８０（日本油脂，ポリソルベート80(HX)）を添加した場合のeMIPの分解生成物の増加割合は62.4％と極めて高い。
【００５３】
また、ブドウ糖（和光純薬，局方品）を添加した場合にもeMIPの分解物生成が51.8％と促進された。ブドウ糖輸液は点滴のベースとして汎用されるが、eMIPとブドウ糖との併用は禁忌であることがわかった。
【００５４】
以上の結果より、eMIP の溶解性が低いpH5の溶媒においては、塩化ナトリウムとクエン酸を添加することで、顕著な溶解性向上が認められた。
【００５５】
また、eMIP の溶解性は高いがeMIP の分解が生じるpH7の溶媒においては、塩化ナトリウムとクエン酸に加えてL-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）を添加することで、分解安定性を高まることが認められた。
【００５６】
従って、塩化ナトリウム、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、L-リジン塩酸塩、クエン酸、及びエデト酸ナトリウム（EDTA）から選択される少なくとも一つ以上の添加剤を添加することにより、eMIPの分解が抑制されることが明らかとなった。
【００５７】
また、pH5〜pH7のリン酸緩衝液が本eMIP 水溶性製剤におけるpH調節剤として好ましいことがわかった。
【００５８】
〔実施例３〕eMIP含有水溶性製剤における非イオン性界面活性剤の効果の検討
eMIPのプラスチックや硝子の表面への吸着を抑制する添加物を実施例２に記載の方法により検討した。
その結果、非イオン性界面活性剤である、ポリソルベート類を添加することによりプラスチックや硝子の表面への吸着を防ぐ事が出来たが、ポリソルベート類の濃度が高いとeMIPから分解物を生じる事が明らかになった（表５）。
【００５９】
そこで添加するポリソルベート類の濃度を検討したところ、ポリソルベート類の質量パーセント濃度を0.005〜0.1％とした場合には、eMIPの吸着や分解が抑制される事が明らかになった。
【００６０】
そこで、次に質量パーセント濃度0.01％のポリソルベート80TM存在下で、上記緩衝液のpH について検討したところ、pH5.0〜7.4まで、eMIPの沈殿も見られず、器材表面への吸着も妨げる事が明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本願発明によって、安定なeMIP含有注射製剤及び点滴製剤が提供された。
【図１】
2011001273.tif 000007
【図２】
2011001273.tif 000008