(57)【要約】【課題】本発明は、医療および医薬品開発の分野等において有効なツールとなり得る検出可能に標識した糖ペプチド誘導体及びその製造方法等を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、下記式（Ｉ）で表される検出可能に標識した糖ペプチド誘導体を提供するものである。【化１】2011231293.tif 000006                                                            （Ｉ）［式中、Ｒの少なくとも一つは標識物質を表し、その他は水素原子を表す。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される検出可能に標識した糖ペプチド誘導体。
【化１】
2011231293.tif 000005
（Ｉ）
［式中、Ｒの少なくとも一つは標識物質を表し、その他は水素原子を表す。］
【請求項２】
全てのＲが標識物質である、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
【請求項３】
前記標識物質が、蛍光物質である、請求項１又は２に記載の糖ペプチド誘導体。
【請求項４】
前記蛍光物質が、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ダンシル、ピレン、アントラニロイル、ニトロベンゾキサジアゾール、シアニン系色素、蛍光タンパク質、フルオレセイン、及びフィコエリスリンからなる群より選択される、請求項３に記載の糖ペプチド誘導体。
【請求項５】
請求項１に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチドを含む沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物を脱塩する脱塩工程、及び
標識物質を前記糖ペプチドのペプチド中のリジン残基のアミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程
を含む方法。
【請求項６】
標識物質導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程をさらに含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記水溶性有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコール、エーテル、ニトリル、ケトン、アミド、及びスルホキシドのいずれかから選択される溶媒を少なくとも一種以上含有する請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記水溶性有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコールである請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記アルコールが、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールからなる群より選択される請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記脱塩工程が、前記沈殿物を樹脂に保持させて水で洗浄する工程を含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記樹脂が、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂が、化学結合型シリカゲル樹脂である請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記化学結合型シリカゲル樹脂を構成するシリカが、ジメチルオクタデシル、オクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、ドコシル、トリアコンチル基からなる群から選択される基と化学結合している請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記脱塩工程が、さらに有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含む請求項５〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記有機溶媒水溶液の濃度が０．１〜２０％(ｖ／ｖ)である、請求項１４または１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記抽出工程が、鳥類卵脱脂卵黄を水で抽出する工程であり、前記沈殿工程に用いる水溶性有機溶媒がエタノールであり、前記脱塩工程が、前記沈殿物をＯＤＳ樹脂に保持させて水で洗浄する工程を含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体を含む、インフルエンザウイルス検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検出可能に標識された糖ペプチド誘導体及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、核酸やタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。糖鎖は、単糖が縮合して形成されるため、構成糖の種類や数の違い、配列の順序、結合部位・様式、分岐様式、全体の高次構造の違い等によって、極めて多様な構造が存在する。その結果、特定構造の糖鎖と他の物質の特異的な結合を介して、生体内で様々な情報が伝達される。
【０００３】
例えば、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスは、細胞表面の特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。インフルエンザウイルス感染は、ウイルス表面のヘマグルチニンが喉や肺表面にある特定の糖鎖に特異的に結合することで開始される。
また、生体内にはレクチンや糖鎖受容体など、特定構造の糖鎖と特異的に結合するタンパク質が存在し、当該結合に応答して様々な反応が惹起される。
【０００４】
従って、特定構造を有する糖鎖、特に生体内に存在する構造を有する糖鎖を検出可能に標識すれば、例えば、試料に含まれる当該糖鎖と特異的に結合する物質を検出又は測定することができるので診断、検査、研究等に有用である。
【０００５】
鶏卵卵黄中にはインフルエンザウイルスの受容体であるヒト型糖鎖と同一のシアリルオリゴ糖が存在することが報告されている。従って、かかる糖鎖を単離精製し、検出可能に標識すれば、上記診断等にも用いることができる。
これまでにも鶏卵卵黄中からヒト型糖鎖を単離する方法が報告されている。しかし、生体内における糖鎖は多様な構造を有するだけでなく、存在量も微量であり、タンパク質などと結合して存在することも多いことから、一般にその精製は数多くの工程を経る必要があることが多く、糖鎖の抽出・精製操作は難しいことが知られている。
【０００６】
特許文献１には、鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）から１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドおよび糖鎖アスパラギンを調製することが開示されている。特許文献２には、脱脂卵黄をタンパク質分解酵素とペプチド分解酵素で順次処理した後、糖鎖アスパラギンに脂溶性保護基を導入し、クロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する方法が開示されている。特許文献３には、シアル酸類含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄から水もしくは塩溶液で抽出することにより製造する方法が開示されている。特許文献４には、１種又は２種以上の糖鎖アスパラギンの混合物に脂溶性保護基を導入し、クロマトグラフィーに供して、各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する方法が開示されている。
また、非特許文献１には、鶏卵の可溶画分より糖鎖ペプチド（ＳＧＰ：シアリルグリコペプチド）が得られることが開示されている。このＳＧＰは、１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端に、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖のペプチド残基が結合した化合物である。
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示された逆浸透膜による濃縮とイオン交換樹脂を用いて調製されるシアリルオリゴ糖ペプチドは純度が９０％程度であり、純粋な糖鎖ペプチドを単離しているとはいえない。また、脱脂卵黄５０ｋｇから、モノシアリルオリゴ糖ペプチド及びジシアリルオリゴ糖ペプチドが１３．８ｇしか得られておらず、収率が十分ではない。
特許文献２及び４の方法も、酵素により糖鎖アスパラギンを得てからクロマトグラフィーで分離するため工程が多い。
特許文献３に開示された方法は、限外ろ過を用いたシアル酸含有オリゴ糖を工業的に製造する方法であり、酵素処理によりシアル酸が１残基以上オリゴ糖に共有結合しかつアミノ酸を含まない低分子性のオリゴ糖鎖を遊離させている。
こうして得られるオリゴ糖鎖は遊離アミノ基を含有しないために、シアル酸を温存したままで蛍光標識を簡便に導入することが出来ない。
また、非特許文献１に開示された方法では、鶏卵卵黄１個から１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを約８ｍｇ得ているが、５種類のカラムクロマトグラフィーによる精製を経るため大量処理には不向きである。
【０００８】
このような事情から、これまで鶏卵卵黄中からヒト型糖鎖を有する糖ペプチドを単離精製することが困難であったため、これを検出可能に標識した糖ペプチド誘導体も得られなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開９６／２２５５号パンフレット
【特許文献２】国際公開０４／７００４６号パンフレット
【特許文献３】特開平８−９９９８８号公報
【特許文献４】特開２００３−１２８７０３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Akira Seko, Mamoru Koketsu, Masakazu Nishizono, Yuko Enoki, Hisham R. Ibrahin, Lekh Raji Juneja, Mujo Kim, Takehiko Ymamoto, Biochim. Biophys. Acta, 1997, Vol.1335, p.23-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、医療および医薬品開発の分野等において有効なツールとなり得る検出可能に標識した糖ペプチド誘導体及びその製造方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程と、当該抽出液を水溶性有機溶媒に加えて糖ペプチドを含む沈殿物を得る工程と、当該沈殿物を脱塩する脱塩工程と、を行うことによって純度の高い糖ペプチドを得られること、さらに脱塩工程で得られた糖ペプチドに蛍光標識を導入することで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記式（Ｉ）で表される検出可能に標識した糖ペプチド誘導体；
【化１】
2011231293.tif 000002
（Ｉ）
［式中、Ｒの少なくとも一つは標識物質を表し、その他は水素原子を表す。］
〔２〕全てのＲが標識物質である、上記〔１〕に記載の糖ペプチド誘導体；
〔３〕前記標識物質が、蛍光物質である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の糖ペプチド誘導体；
〔４〕前記蛍光物質が、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ダンシル、ピレン、アントラニロイル、ニトロベンゾキサジアゾール、シアニン系色素、蛍光タンパク質、フルオレセイン、及びフィコエリスリンからなる群より選択される、上記〔３〕に記載の糖ペプチド誘導体；
〔５〕上記〔１〕に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法であって、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程、前記抽出液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチドを含む沈殿物を得る沈殿工程、前記沈殿物を脱塩する脱塩工程、及び標識物質を前記糖ペプチドのペプチド中のリジン残基のアミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む方法；
〔６〕標識物質導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程をさらに含む、上記〔５〕に記載の製造方法；
〔７〕前記水溶性有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコール、エーテル、ニトリル、ケトン、アミド、及びスルホキシドのいずれかから選択される溶媒を少なくとも一種以上含有する上記〔５〕又は〔６〕に記載の製造方法；
〔８〕前記水溶性有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコールである上記〔７〕に記載の製造方法；
〔９〕前記アルコールが、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールからなる群より選択される上記〔８〕に記載の製造方法；
〔１０〕前記脱塩工程が、前記沈殿物を樹脂に保持させて水で洗浄する工程を含む、上記〔５〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の製造方法；
〔１１〕前記樹脂が、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂である上記〔１０〕に記載の製造方法；
〔１２〕前記逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂が、化学結合型シリカゲル樹脂である上記〔１１〕に記載の製造方法；
〔１３〕前記化学結合型シリカゲル樹脂を構成するシリカが、ジメチルオクタデシル、オクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、ドコシル、トリアコンチル基からなる群から選択される基と化学結合している上記〔１０〕に記載の製造方法；
〔１４〕前記脱塩工程が、さらに有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含む上記〔５〕〜〔１３〕のいずれかに記載の製造方法；
〔１５〕前記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１種である上記〔１４〕に記載の製造方法；
〔１６〕前記有機溶媒水溶液の濃度が０．１〜２０％(ｖ／ｖ)である、上記〔１４〕または〔１５〕に記載の製造方法；
〔１７〕前記抽出工程が、鳥類卵脱脂卵黄を水で抽出する工程であり、前記沈殿工程に用いる水溶性有機溶媒がエタノールであり、前記脱塩工程が、前記沈殿物をＯＤＳ樹脂に保持させて水で洗浄する工程を含む、上記〔５〕に記載の製造方法；及び
〔１８〕上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体を含む、インフルエンザウイルス検出用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る糖ペプチド誘導体によれば、試料中に含まれる、その糖鎖に特異的に結合する物質、例えばインフルエンザウイルスを可視化して検出又は測定することができる。
また、本発明に係る糖ペプチド誘導体の製造方法によれば、高品質な糖ペプチド誘導体を工業的規模で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの１Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】実施例１において製造されたフルオレセイン標識−糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】実施例２において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図６】実施例２において製造されたダンシル標識−糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣチャートを示す。
【図７】実施例３において製造されたローダミン標識−糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１７】
（糖ペプチド誘導体）
本実施の形態において、糖ペプチド誘導体とは、下記式（Ｉ）で表される検出可能に標識された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドをいう。
【化１】
2011231293.tif 000003
（Ｉ）
［式中、Ｒの少なくとも一つは標識物質を表し、その他は水素原子を表す。］
【００１８】
式（Ｉ）に示されるとおり、本実施の形態の糖ペプチド誘導体の糖鎖は、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖であり、２ヶ所の非還元末端にシアル酸を有する。
【００１９】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）からなるペプチド鎖が結合している。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。
【００２０】
本実施の形態の糖ペプチドとは、特にことわりがない限り、上記式（Ｉ）で表される糖ペプチド誘導体において、３つのＲがすべて水素原子であるもの、即ち、下記式（ＩＩ）で表される糖ペプチドをいう。
【化２】
2011231293.tif 000004
（ＩＩ）
【００２１】
本実施の形態の「検出可能に標識された」とは、本実施の形態の糖ペプチド誘導体の糖鎖のリジン残基中の３ヶ所のアミノ基に、検出装置を使用して又は使用しないで可視化できる標識物質が結合していることを意味する。
標識物質は、３ヶ所のアミノ基の少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３ヶ所に結合している。標識物質の結合数が多いほど、標識の強度が上昇し、検出しやすい。
【００２２】
本実施の形態の標識物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125I、131I、35S、3H等の放射性物質、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ピレン、アントラニロイル、ニトロベンゾキサジアゾール、シアニン系色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、フィコエリスリン、テトラメチルローダミン、蛍光タンパク質（オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質、造礁サンゴ由来蛍光タンパク質、フルーツ蛍光タンパク質等）、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質の他、量子ドットなどのナノ粒子が挙げられる。
また、ビオチンで標識し、これと酵素等で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを結合させることによっても可視化することができ、これらの物質も本発明の標識物質に含まれる。
【００２３】
標識物質としては、特に蛍光物質が好ましく、中でもフルオレセイン、ダンシルやローダミン、蛍光タンパク質が好ましい。
【００２４】
（糖ペプチド誘導体の製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の製造方法は、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程、前記抽出液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチドを含む沈殿物を得る沈殿工程、前記沈殿物を脱塩する脱塩工程、および標識物質を糖ペプチドのペプチド中のリジン残基のアミノ基に導入する導入工程を含む。
【００２５】
本実施の形態の製造方法によれば、抽出工程、沈殿工程、及び脱塩工程により、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で選択的に、安価且つ簡便に糖ペプチドを精製することができるので、これに標識物質を導入して、安価且つ簡便に工業的規模で高純度の糖ペプチド誘導体を製造することができる。
【００２６】
（抽出工程）
抽出工程とは、鳥類卵脱脂卵黄を、水又は塩溶液に懸濁し、糖ペプチドの混合物などを抽出して、糖ペプチドの粗精製物である抽出液を得る工程である。ここでいう糖ペプチドは、本実施の形態の上記式（ＩＩ）で表される糖ペプチド以外の糖ペプチドも含む。
鳥類卵脱脂卵黄としては、市販の脱脂卵黄を用いてもよく、鳥類卵から調製した鳥類卵脱脂卵黄を用いてもよい。
鳥類卵としては、特に限定されるものではないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモ、ダチョウ、及びハトなどの卵が挙げられ、卵黄内に含まれる糖ペプチドの量が多いので、鶏卵などが好ましい。
鳥類卵としては、生の卵であってもよく、乾燥して得られる卵の乾燥粉末であってもよく、鶏卵卵黄又は鶏卵卵黄粉末などを用いることが好ましい。
【００２７】
鳥類卵脱脂卵黄は、例えば、鳥類卵の全卵又は卵黄を、有機溶媒により脱脂処理することにより得ることができる。
脱脂処理する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類卵に有機溶媒を添加して、沈殿物と有機溶媒層を分離する方法などが挙げられる。
脱脂処理に用いられる有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールなどが挙げられ、これらの溶媒は単独で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
脱脂処理において、鳥類卵に添加する有機溶媒の量としては、特に限定されるものではないが、鳥類卵に対して、質量で１〜５倍の有機溶媒を用いることにより脱脂処理を行うことができる。
また、脱脂処理を行う温度としては、特に限定されるものではないが、０〜２５℃で行うことができる。
【００２８】
鳥類卵に有機溶媒を添加した後、有機溶媒と鳥類卵とをよく撹拌することにより、有機溶媒により鳥類卵に含まれる脂分を除去することができる。
有機溶媒と沈殿物とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
有機溶媒を用いた脱脂処理は、２〜６回行うことが好ましい。
【００２９】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加して、鳥類卵脱脂卵黄から糖ペプチドを含む抽出液を抽出する方法は、特に限定されるものではないが、抽出工程において用いられる塩溶液としては、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液などが挙げられる。これらの塩溶液は単独で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
塩溶液の濃度は、０．０００１〜２．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、鳥類卵脱脂卵黄に添加する水又は塩溶液の量は、特に限定されるものではないが、鳥類卵脱脂卵黄に対して、質量で、０．１〜５０倍の水又は塩溶液を用いることができる。
また、糖ペプチドの抽出を行う温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。糖ペプチドの抽出を行うｐＨは、特に限定されるものではないが、ｐＨ５〜ｐＨ９で行うことができる。
【００３０】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加した後、鳥類卵脱脂卵黄と水又は塩溶液とをよく撹拌することにより、糖ペプチドを含む抽出液を抽出することができる。
水又は塩溶液で抽出した糖ペプチドを含有する抽出液と鳥類卵脱脂卵黄とを分離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
水又は塩溶液を用いた抽出処理は、２〜６回行うことが好ましい。
抽出工程は、水を用いて行うことが好ましい。
【００３１】
（沈殿工程）
沈殿工程とは、抽出工程で得られた、糖ペプチドを含む抽出液を水溶性有機溶媒に添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得る工程である。沈殿工程においては、抽出液に水溶性有機溶媒を添加して粗精製物として、沈殿物を沈殿させてもよい。
本実施の形態において、水溶性有機溶媒とは、水と相溶性を有する有機溶媒であれば特に限定されないが、例えば、水と相溶性を有する炭素数１〜５の有機溶媒などが挙げられる。炭素数１〜５の有機溶媒とは、溶媒分子中の炭素数が１〜５であることを意味する。
該溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリン等のアルコール系、あるいはジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル系、あるいはアセトニトリル等のニトリル系、アセトン等のケトン系、ジメチルホルムアミド等のアミド系、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系からなる群から選択される溶媒が挙げられる。これら低分子量溶媒は、１種で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
水溶性有機溶媒としては、炭素数１〜５のアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、抽出液をアルコールに添加してアルコール沈殿する工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）であり、抽出工程で得られた、糖ペプチドを含有する抽出液をアルコールに添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。
【００３２】
以下、沈殿工程をアルコール沈殿工程として説明するが、アルコール以外の炭素数１〜５の水溶性有機溶媒を用いた沈殿工程においても同様に実施することができる。用いる水溶性有機溶媒量や沈殿させる際の溶媒温度などの条件は、溶媒ごとに適宜選択することができるが、以下に例示するアルコール沈殿工程と同様に設定することができる。
【００３３】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量は、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で２〜２０倍のアルコールを用いることができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールは、炭素数１〜５個のアルコールであればよく、好ましくは炭素数１〜３個のアルコールである。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、中でもエタノールが好ましい。
本実施の形態において、アルコール沈殿工程において用いるアルコールは１種類であってもよいし、アルコールの混合物又は他の溶媒との混合物であってもよい。
アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００３４】
糖ペプチドを含む沈殿物を分離する温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００３５】
アルコール沈殿工程で用いる、先の抽出工程により得られた抽出液は、ろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮した抽出液として用いてもよい。
【００３６】
アルコール沈殿工程において、糖ペプチドを含む沈殿物を分離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖ペプチドを含む沈殿物を、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された沈殿物を得ることができる。
【００３７】
（脱塩工程）
脱塩工程とは、沈殿工程で得られた糖ペプチドを含有する沈殿物から塩を除去する工程である。
脱塩工程は、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができるが、例えば、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することも可能である。脱塩工程としては、例えば、沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂に保持させて水で洗浄することにより脱塩することもできる。
【００３８】
沈殿物を樹脂に保持させる方法は、吸着、担持など公知の結合様式を利用した方法とすることができる。また、沈殿物は、水で洗浄する際に沈殿物が洗浄液と共に流出しない程度に、保持されていればよい。
また、樹脂としては、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂等が挙げられ、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂とは、シリカゲル系、ポリマー系を代表的とする樹脂を意味しポリ(スチレン／ジビニルベンゼン)ポリマーゲル樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂、スチレンビニルベンゼン共重合体樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、化学結合型シリカゲル樹脂などが挙げられる。
化学結合型シリカゲル樹脂とは、例えば、多孔性シリカゲルにジメチルオクタデシルクロロシランの様なシランカップリング剤を反応させて製造するＯＤＳ樹脂などが挙げられ、シリカゲルに対し、同様の手法で異なるシリル化剤を用いることで、オクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル基からなる群から選択される基を化学結合させることで得られる樹脂等も挙げられる。あるいは炭素数２２のドコシル基又は炭素数３０のトリアコンチル基を結合して得られる樹脂であってもよい。
【００３９】
脱塩工程は、脱塩した後も樹脂に保持されている上記式（ＩＩ）で表される糖ペプチドを、有機溶媒水溶液により溶出する工程を含むことが好ましい。樹脂に保持された糖ペプチドを水で洗浄することで脱塩した後、溶出工程を行うことにより糖ペプチドの純度を向上させることができる。また水洗浄の工程では、糖ペプチドができるだけ水と共に流出せず、有機溶媒水溶液による溶出工程によって溶出することが好ましい。
溶出工程では、例えば、糖ペプチドを保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることができる。
水洗浄による脱塩工程後における溶出工程に用いる有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有するものが挙げられる。有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であり、好ましくは０．５〜２０％(ｖ／ｖ)であり、より好ましくは１０％(ｖ／ｖ)以下、さらに好ましくは５％(ｖ／ｖ)以下である。
有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００４０】
脱塩工程又は溶出工程を行う温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００４１】
また、脱塩工程は、前記の樹脂を用いた脱塩工程以外にも、例えば分離膜を用いることにより沈殿工程で得られた沈殿物から脱塩することが可能である。
斯かる脱塩工程としては、例えば、限外ろ過膜又は逆浸透膜を用いることで沈殿物の脱塩を行うことができる。
脱塩工程に用いる膜としては、例えば、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリビニリデンフルオライド、ポリテトラフルオロエチレン、芳香族ポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコールを構成基材とする平膜又は中空糸膜、スパイラル膜又はチューブラー膜であってもよい。さらにはイオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜あるいは逆浸透膜で脱塩することも可能である。
【００４２】
樹脂を用いた脱塩方法以外で（例えば分離膜による方法で）脱塩工程を行った後の処理液中に含まれる糖ペプチドを精製する方法としては、公知のペプチド、糖質、糖ペプチド等の精製方法を用いることができるが、例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル、ドコシル、トリアコンチル基などを充填剤表面に固定化したものが用いられるが、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００４３】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖ペプチド中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖ペプチドを添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖ペプチドの脱塩を行うことができる。
【００４４】
以上のとおり、本発明においては、（１）鳥類卵脱脂卵黄を、水又は塩溶液に懸濁し、糖ペプチドの混合物などを抽出して、糖ペプチドの粗精製物である抽出液を得る抽出工程、（２）抽出工程で得られた糖ペプチドを含む抽出液を水溶性有機溶媒に添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得る沈殿工程、及び（３）沈殿工程で得られた糖ペプチドを含有する沈殿物から塩を除去する脱塩工程を含み、この脱塩工程において化学結合型シリカゲル樹脂を用いた場合は糖ペプチドが樹脂に保持されるために有機溶媒水溶液により溶出する溶出工程を含むことがある。
ここで（３）の脱塩工程においては、樹脂を用いた脱塩以外の方法、例えば膜を用いて脱塩した場合、公知の糖ペプチドの精製方法を用いて更に糖ペプチドを精製することができる。この際には当然の事ながら、化学結合型シリカゲル樹脂を用いて精製しても良い。
【００４５】
溶出された糖ペプチドは、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチドとして得ることができる。
本実施の形態において、得られた糖ペプチドは、再度アルコール沈殿工程あるいは脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。
【００４６】
（導入工程）
導入工程とは、標識物質を糖ペプチドのペプチド部分に存在する３個のアミノ基に導入する工程のことである。用いる標識物質の量、反応液のｐＨ、反応時間、反応温度などの反応条件を選択することにより、３個のアミノ基に対し標識物質を１〜３ヶ所に導入することができる。標識強度の増加による検出感度向上のために、標識物質は３ヶ所全てのアミノ基に導入することが好ましい。
標識物質は、本実施の形態の糖ペプチド誘導体で説明したものと同様のものを使用することができる。
【００４７】
標識物質が蛍光物質である場合、蛍光物質をペプチドのアミノ基に導入するにあたり、色素に導入された官能基を活用してもよい。すなわち、色素に導入されたコハク酸イミド基、イソシアナート基、スルホニルクロリド基、カルボニルクロリド基、カルボニルフルオリド基、イソチオシアネート基を利用することで糖ペプチドに対し簡便に蛍光標識を行うことができる。
蛍光物質を糖ペプチドのアミノ基に導入するためには、蛍光物質を、例えば必要に応じて、標識試薬を溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の有機溶媒と水との混合溶媒中で有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液あるいは炭酸緩衝液などの無機塩基の存在下、氷冷下もしくは室温下で１５分〜１８０分反応させることで良い。
この際、添加する蛍光物質を糖ペプチドのアミノ基（ペプチド１モルあたり３モルのアミノ基を有する）に対して過剰量、例えば総アミノ基のモル数に対して１．１倍から５倍のモル数の蛍光物質を添加することで、糖ペプチドの全アミノ基に蛍光標識を導入することができる。
【００４８】
糖ペプチド誘導体を精製するためには、アセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程および脱塩工程を組み合わせることで達成される。脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液で溶出することにより糖ペプチド誘導体を得ることができる。糖ペプチド誘導体を添加して、糖ペプチドを保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることにより高純度の糖ペプチド誘導体を製造することができる。
【００４９】
有機溶媒水溶液としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種の有機溶媒の水溶液などが挙げられ、有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜７０％(ｖ／ｖ)であり、好ましくは１〜５０％(ｖ／ｖ)である。有機溶媒水溶液により糖ペプチド誘導体を溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００５０】
溶出された糖ペプチド誘導体は、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチド誘導体として得ることができる。本実施の形態において、得られた糖ペプチド誘導体は、再度アルコール沈殿工程あるいは脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。
【００５１】
本発明によって製造される糖ペプチド誘導体は、例えば、ウイルス感染症の検査・診断のために用いることができる。特にヒトインフルエンザウイルスの確認を高感度に行うために活用される。
インフルエンザウイルスはウイルス表面に存在するヘマグルチニン（ＨＡ）が、本実施の形態に係る糖ペプチドの糖鎖と同一の糖鎖を認識する。従って、本実施の形態に係る糖ペプチド誘導体を用いれば、試料中のインフルエンザウイルスを標識によって可視化し、検出することが可能である。
例えば、被検者から採取した咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、肺胞洗浄液等のサンプルに、本実施の形態に係る糖ペプチド誘導体を添加し、標識を検出することによって、サンプル中のインフルエンザウイルスを検出又は測定することができる。
また、本発明によって得られる糖ペプチド誘導体は、当該糖ペプチドの糖鎖が特異的に結合する糖鎖受容体やレクチンの検出にも有用である。
【００５２】
（インフルエンザウイルス検出キット）
本実施の形態において、糖ペプチド誘導体を含むインフルエンザウイルス検出キットは、被検者から採取したサンプル中のインフルエンザウイルスを迅速に検出又は測定するためのキットである。
当該キットは、糖ペプチド誘導体のほか、被検者からサンプルを採取するための綿棒、反応容器等を適宜備えてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００５４】
［ＨＰＬＣ分析］
１）１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ  ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００５５】
２）ＦＩＴＣ−標識糖ペプチド誘導体の分析例
測定条件：
グラジエント；３０％→９０％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
３）Ｄａｎ−標識糖ペプチド誘導体の分析例
測定条件：
グラジエント；３０％→４５％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
［１Ｈ−ＮＭＲ測定］
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの分析例
Ｄ２Ｏ  ０．４ｍＬに試料  ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で１Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００５６】
[ＬＣ／ＭＳ測定]
以下の測定条件でＬＣ／ＭＳ測定を行った。用いたＬＣ及びＭＳのシステムは以下のとおりである。
１）Ｆｍｏｃ−１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの分析例
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２６２ｎｍ
グラジエント；４０％→１００％（３０ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
２）ＦＩＴＣ−１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの分析例
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；３０％→７０％（２０ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ
３）Ｄａｎ−１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの分析例
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；２％→１００％（３０ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ
４）ＴＡＭＲＡ−１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの分析例
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；２０％→７０％（３０ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ
【００５７】
［実施例１］フルオレセイン−標識糖ペプチド誘導体の製造
（１）糖ペプチドの精製
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（ＩＩ）で表される構造であることが分かった。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。上記実施例１で得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。
【００５８】
（２）フルオレセイン導入工程
（１）で得られた糖ペプチド１０ｍｇをアセトン−水（１／１：体積比）１ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後ＦＩＴＣ試薬１４ｍｇ（ＦＩＴＣ−Ｉ，Fluorescein-4-isothiocyanate、同仁化学製）のアセトン溶液０．５ｍＬを加え遮光下で１時間反応を行い、エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬを加え粗精製フルオレセイン標識−糖ペプチド誘導体を沈殿させた。３，５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド誘導体１０．５ｍｇを得た。
この沈殿物を水に溶解し、Waters製Sep-Pak Plus C18カートリッジを用いて樹脂に保持させた後、水で洗浄しその後２０％アセトニトリル水溶液で溶出することでフルオレセイン標識−糖ペプチド誘導体８．１ｍｇを得た。
得られたフルオレセイン標識−糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図４に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、７．２分に検出されるピークは検出イオンが1345.2 ([M+3H]3+)推定分子量4032.6、また検出イオンが1343.2 ([M-3H]3-)推定分子量4032.6であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のフルオレセインが導入された化合物であることが推定された。
【００５９】
［実施例２］ダンシル−標識糖ペプチド誘導体の製造
（１）糖ペプチドの精製
鶏卵卵黄５０個にアセトン１．１Ｌを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール７００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を２回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄５００ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄５００ｇに水６００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水４００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、４００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール２Ｌに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド９．０ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）５０ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド９．０ｇを水８０ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水２００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３８９ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図５に示す。ＨＰＬＣによる純度では９６％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（ＩＩ）で表される構造であることが分かった。
（２）ダンシルクロライド導入工程
（１）で得られた糖ペプチド２４ｍｇをジメチルホルムアミド−水（４／１：体積比）２．５ｍＬに加え、さらに０．２ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後ダンシルクロライド２０ｍｇ（Ｄａｎ−Ｃｌ：Dancyl Chloride、5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl Chloride、東京化成製）のジメチルホルムアミド溶液０．５ｍＬを加え、遮光下で１．５時間反応を行い、エタノール−アセトン（２／１：体積比）１０ｍＬを加え、粗精製Ｄａｎ標識−糖ペプチド誘導体を沈殿させた。
３，５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノール−アセトン（２／１：体積比）１０ｍＬに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド誘導体４１．４ｍｇを得た。
この沈殿物を水に溶解し、Waters製Sep-Pak Plus C18カートリッジを用いて樹脂に保持させた後、水で洗浄しその後２０％アセトニトリル水溶液で溶出することでダンシル標識−糖ペプチド誘導体８．８ｍｇを得た。
得られたダンシル標識−糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図６に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、３．５分に検出されるピークは検出イオンが1783.3 ([M+2H]2+)推定分子量3564.6であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のダンシル基が導入された化合物であることが推定された。
【００６０】
［実施例３］ＴＡＭＲＡ−標識ペプチド誘導体の製造
実施例２の（１）で得られた糖ペプチド７ｍｇを水１ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後5-Carboxytetramethyl-rhodamine, succinimydylester, singleisomer５ｍｇ（５−ＴＡＭＲＡ、ＳＥ、EMP Biotech GmbH）のジメチルホルムアミド溶液０．３ｍＬを加え遮光下で２時間反応を行い、エタノール−アセトン−ジエチルエーテル（１／１／１：体積比）９ｍＬを加え粗精製ＴＡＭＲＡ標識−糖ペプチド誘導体を沈殿させた。
８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノール−アセトン−ジエチルエーテル（１／１／１：体積比）９ｍＬに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド誘導体６ｍｇを得た。
得られたローダミン標識−糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図７に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、１０．５分に検出されるピークは検出イオンが1368.3 ([M+3H]3+)推定分子量4101.9であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のＴＡＭＲＡが導入された化合物であることが推定された。また９．６分に検出されるピークは検出イオンが1230.8 ([M+3H]3+)推定分子量3689.4であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に２個のＴＡＭＲＡが導入された化合物であることが推定された。
【図１】
2011231293.tif 000007
【図２】
2011231293.tif 000008
【図３】
2011231293.tif 000009
【図４】
2011231293.tif 000010
【図５】
2011231293.tif 000011
【図６】
2011231293.tif 000012
【図７】
2011231293.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月14日(2010.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基（Ｌｙｓ    −Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号１））からなるペプチド鎖が結合している。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。