(57)【要約】【課題】目視形態検査以外の方法で卵の評価を可能にすること。【解決手段】卵（５３）が浸漬されたチェンバー（１１）内の溶液に接触する第１の電極（４２）と、プローブ本体（２７）と、卵（５３）の細胞内に注入可能な精子（５２）を含む溶液が収容可能な精子収容部（２７ａ）と、卵（５３）の細胞内に刺し入れ可能な刺し入れ部（２８ａ）と、精子収容部（２７ａ）に一端が配置された第２の電極（３２）と、前記第２の電極の他端を精子収容部（２７ａ）の外に導出する電極導出部（２９ｂ）と、プローブ本体（２７）に形成され且つ精子を開口（２８ｂ）から押し出す圧力を付与するインジェクタ（２１）に接続される接続部（２９ｃ）と、を有するプローブ（２６）と、を備えた人工授精装置（１）。【選択図】図１
2011193771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵が浸漬された導電性の溶液が収容されるチェンバーと、
前記チェンバー内の溶液に接触する第１の電極と、
プローブ本体と、前記プローブ本体の内部に形成され且つ前記卵の細胞内に注入可能な精子を含む導電性の溶液が収容可能な精子収容部と、前記プローブ本体の端部に形成され且つ前記卵の細胞内に刺し入れ可能な刺し入れ部と、前記刺し入れ部に形成され且つ前記精子収容部からの前記精子が通過可能な開口と、前記精子収容部に一端が配置された第２の電極と、前記第２の電極の他端を前記精子収容部の外に導出する電極導出部と、前記プローブ本体に形成され且つ前記精子収容部の精子を前記開口から押し出す圧力を付与するインジェクタに接続される接続部と、を有するプローブと、
前記電極導出部から導出された前記第２の電極と前記第１の電極とに接続されて各電極の間の電位差を測定可能な電位差測定計であって、前記プローブの前記刺し入れ部が前記卵の細胞内に刺し入れられた状態における前記卵の細胞外と細胞内の電位差を測定可能な前記電位差測定計と、
前記電位差測定計で測定された電位差を表示する表示器と、
を備えたことを特徴とする人工授精装置。
【請求項２】
中空筒状のプローブ本体と、
前記プローブ本体の内部に形成され且つ卵の細胞内に注入可能な精子を含む導電性の溶液が収容可能な精子収容部と、
前記プローブ本体の端部に形成され且つ前記卵の細胞内に刺し入れ可能な刺し入れ部と、
前記刺し入れ部に形成され且つ前記精子収容部からの前記精子が通過可能な開口と、
前記プローブ本体に形成され且つ前記精子収容部の精子を前記開口から押し出す圧力を付与可能なインジェクタが接続される接続部と、
前記精子収容部に一端が配置され、且つ、前記卵が浸漬された導電性の溶液に接触する第１の電極との間で電位差を測定可能な第２の電極と、
前記第２の電極の他端を前記精子収容部の外に導出する電極導出部と、
を備えたことを特徴とする人工授精用のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵と精子とを人工的に受精させる人工授精装置および人工授精時に精子を卵に注入する人工授精用のプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
人の不妊治療や動物（例えば、牛等）の繁殖において、人工的に授精（配偶子の細胞融合、換言すれば卵への精子遺伝子導入）が行われることが広がっており、人工授精に利用されるART（Assisted  Reproductive Technology：生殖補助医療技術）の研究も盛んに行われている。前記ARTにおいて、卵に精子を導入する技術として、下記の特許文献１記載の技術が従来公知である。
【０００３】
特許文献１としての特開２００３−１２５７５０号公報には、卵子（Ｏ）に対して精子（Ｓ）を接触あるいは注入するためのマイクロピペット（１）が記載されている。特許文献１記載の技術では、まず、培養液（６）内の卵子（Ｏ）をホールド用マイクロピペット（Ｈ）で保持した状態で、培養液内に精子（Ｓ）を加え、内部が中空なマイクロピペット（１）の先端部（１２）を精子（Ｓ）に近づけて、マイクロピペット（１）に接続されたシリンジ（２３Ｒ）によりマイクロピペット（１）内の圧力を調整して精子（Ｓ）を培養液（６）とともにマイクロピペット（１）内に吸引する。そして、マニピュレータ（３Ｒ）を操作して、マイクロピペット（１）の先端を卵子（Ｏ）に近づけて、マイクロピペット（１）内の空気（Ａ）の圧力をシリンジ（２３Ｒ）により高くして、精子（Ｓ）を卵子（Ｏ）に接触、あるいは卵子（Ｏ）内に注入している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１２５７５０号公報（「００１２」〜「００１４」、図１〜図３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（従来技術の問題点）
前記特許文献１に記載の技術のような従来のARTが利用される体外受精（IVF：In Vitro Fertilization）や顕微授精（ICSI :Intra-cytoplasmic Sperm Injection）等の人工授精において、人工授精を行うために各個体から得られる精子、卵子は、機能的に均一ではなく、良好なものも不良のものも存在する。精子、卵子の質が受精、発生ひいては生まれた児の長期予後に至るまで大きく影響することは言を待たず、精子、卵子共に機能的に良好であることが望まれる。
人の不妊治療の場合、一度に取得できる精子は、100万匹以上であり、抜き取り検査による複数項目の観察が可能であり、複数の指標に基づいて良好と評価される精子を使用することが可能になりつつある。
【０００６】
一方で、一般的なART臨床においては、得られる卵は10個程度と比較的少数であり、これらを侵襲的に検査、評価することは困難である。これまで卵の品質については顕微鏡下における目視形態検査（すなわち、卵の「外形」が良さそうかどうか）が唯一の方法であった。しかしながら、顕微鏡観察による受精卵（胚）の形態のみでは、胚の質、すなわち、着床して発生を継続する能力等を判定することは困難である。
特に、長年、妊娠率の向上を目的として、複数胚を子宮に移植する方法が取られてきたが、形態のみでは胚の質の判定が困難であるため、しばしば、双胎、品胎等の多胎が発生した。多胎妊娠は、母子に負担があり、初産年齢の上昇も相まって、ハイリスク妊娠の発生頻度を上昇させることになる。このため、日本産科婦人科学会では、移植胚の個数を原則1個とするように求められており、このような現状では、移植される胚の品質評価の要求が高まってきている。
【０００７】
本発明は前記事情に鑑み、目視形態検査以外の方法で卵の評価を可能にすることを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記技術的課題を解決するために、請求項１に記載の発明の人工授精装置は、
卵が浸漬された導電性の溶液が収容されるチェンバーと、
前記チェンバー内の溶液に接触する第１の電極と、
プローブ本体と、前記プローブ本体の内部に形成され且つ前記卵の細胞内に注入可能な精子を含む導電性の溶液が収容可能な精子収容部と、前記プローブ本体の端部に形成され且つ前記卵の細胞内に刺し入れ可能な刺し入れ部と、前記刺し入れ部に形成され且つ前記精子収容部からの前記精子が通過可能な開口と、前記精子収容部に一端が配置された第２の電極と、前記第２の電極の他端を前記精子収容部の外に導出する電極導出部と、前記プローブ本体に形成され且つ前記精子収容部の精子を前記開口から押し出す圧力を付与するインジェクタに接続される接続部と、を有するプローブと、
前記電極導出部から導出された前記第２の電極と前記第１の電極とに接続されて各電極の間の電位差を測定可能な電位差測定計であって、前記プローブの前記刺し入れ部が前記卵の細胞内に刺し入れられた状態における前記卵の細胞外と細胞内の電位差を測定可能な前記電位差測定計と、
前記電位差測定計で測定された電位差を表示する表示器と、
を備えたことを特徴とする。
【０００９】
前記技術的課題を解決するために、請求項２に記載の発明の人工授精用のプローブは、
中空筒状のプローブ本体と、
前記プローブ本体の内部に形成され且つ卵の細胞内に注入可能な精子を含む導電性の溶液が収容可能な精子収容部と、
前記プローブ本体の端部に形成され且つ前記卵の細胞内に刺し入れ可能な刺し入れ部と、
前記刺し入れ部に形成され且つ前記精子収容部からの前記精子が通過可能な開口と、
前記プローブ本体に形成され且つ前記精子収容部の精子を前記開口から押し出す圧力を付与可能なインジェクタが接続される接続部と、
前記精子収容部に一端が配置され、且つ、前記卵が浸漬された導電性の溶液に接触する第１の電極との間で電位差を測定可能な第２の電極と、
前記第２の電極の他端を前記精子収容部の外に導出する電極導出部と、
を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
請求項１、２に記載の発明によれば、刺し入れ部が卵に刺し入れられた状態で、第１電極と第２電極との間で膜電位を測定して、卵を評価しつつ、人工授精が可能であり、目視形態検査以外の方法で卵の評価が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は実施例１の人工授精装置の説明図であり、図１Ａは全体説明図、図１Ｂはチェンバー部分の要部説明図である。
【図２】図２は実施例１の人工授精装置のインジェクション用のプローブ部分を分解した状態の要部説明図である。
【図３】図３は実施例１の人工授精用のインジェクション用のプローブの説明図であって、図３Ａは正面図、図３Ｂは図３Ａの要部断面図、図３Ｃは図３ＢのＩＩＩＣ部分の拡大図である。
【図４】図４はホールド用のプローブの説明図であり、図４Ａは正面図、図４Ｂは図４Ａの要部断面図、図４Ｃは図４ＢのＩＶＣ部分の拡大図である。
【図５】図５は実施例１の人工授精システムの作用説明図であり、図５Ａはインジェクションプローブに精子が吸引される前の状態の説明図、図５Ｂはインジェクションプローブに精子が吸引された後の状態の説明図、図５Ｃはホールディングプローブに卵が保持される前の状態の説明図、図５Ｄは卵がホールディングプローブに保持された状態の説明図である。
【図６】図６は実施例１の人工授精システムの作用説明図であり、図６Ａは図５Ｂに示すインジェクションプローブが図５Ｄに示す状態のチェンバーに浸漬された状態の説明図、図６Ｂはインジェクションプローブが卵に刺し入れられた状態の説明図、図６Ｃは精子が注入された状態の説明図である。
【図７】図７は膜電位の概略説明図である。
【図８】図８は膜電位の実験例の実験結果の説明図であり、横軸に膜電位［ｍＶ］をとり、縦軸に個数をとったヒストグラムである。
【図９】図９は膜電位測定中に薬物を投与する実験の実験結果の図であり、横軸に時間をとり、縦軸に膜電位［ｍＶ］をとったグラフである。
【図１０】図１０は実施例２のインジェクションプローブの説明図であり、実施例１の図３Ｂに対応する図である。
【図１１】図１１は実施例３のインジェクションプローブの説明図であり、図１１Ａは実施例１の図１Ｂに対応する図であり、図１１Ｂは実施例１の図３Ｂに対応する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に図面を参照しながら、本発明の実施の形態の具体例（以下、実施例と記載する）を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以下の図面を使用した説明において、理解の容易のために説明に必要な部材以外の図示は適宜省略されている。
【実施例１】
【００１３】
図１は実施例１の人工授精装置の説明図であり、図１Ａは全体説明図、図１Ｂはチェンバー部分の要部説明図である。
図１において、本発明の実施例１の人工授精システムＳでは、テーブルＴ上に人工授精装置１が配置されている。人工授精装置１は、観察装置の一例としての倒立顕微鏡２を有する。倒立顕微鏡２は、顕微鏡本体３と、顕微鏡本体３の中央部に配置されたステージ４とを有する。前記ステージ４の上方には、光源部６および集光レンズ７が配置されており、ステージ４の下方には、図示しない対物レンズを有する観察部８が配置され、観察部８には、ユーザが目視で観察するための接眼レンズ９が支持されている。
【００１４】
前記ステージ４の中央部には、底の浅い平皿（シャーレ）状のチェンバー１１が支持されると共に、ステージ４の左右両側には、操作部材の一例としての左右一対のマニピュレータ１２，１３が支持されている。前記チェンバー１１には、導電性の液体の一例としてのバース（Ｂａｒｔｈ）変法溶液が収容可能であり、人工授精を行う際には、バース溶液中に卵や精子を浸漬、放出可能である。
前記マニピュレータ１２，１３は、ホルダ支持部１２ａ，１３ａを有し、ユーザの操作に応じて前後、左右、上下方向に移動可能に構成されている。なお、前記マニピュレータ１２，１３は、従来公知の市販の装置を使用可能であり、例えば、特許文献１や特開平１１−３４７９７２号公報、特開２００１−３３０７８１号公報等にも記載されているため、詳細な説明は省略する。
【００１５】
前記ホルダ支持部１２ａ，１３ａには、それぞれ、中空円筒棒状のホルダ１６，１７が支持されている。前記ホルダ１６，１７の外端には、可撓性のチューブ１８，１９が接続されており、チューブ１８，１９は、それぞれ、テーブルＴ上に配置されたインジェクタ２１，２２に接続されている。前記インジェクタ２１，２２は、ユーザの操作に応じてチューブ１８，１９およびホルダ１６，１７内の圧力を調整可能に構成されている。
なお、前記インジェクタ２１，２２は、従来公知の市販の装置を使用可能であり、例えば、特許文献１や特開２０００−４８６９号公報、特開２００１−３１４５０３号公報等にも記載されているため、詳細な説明は省略する。
【００１６】
（インジェクション用のプローブの説明）
図２は実施例１の人工授精装置のインジェクション用のプローブ部分を分解した状態の要部説明図である。
図３は実施例１の人工授精用のインジェクション用のプローブの説明図であって、図３Ａは正面図、図３Ｂは図３Ａの要部断面図、図３Ｃは図３ＢのＩＩＩＣ部分の拡大図である。
図２において、各ホルダ１６，１７の内端には、ネジ山１６ａ，１７ａが形成されており、右側のホルダ１６には、インジェクションプローブ２６が支持されている。図２、図３において、前記インジェクションプローブ２６は、内部に精子収容部の一例としての気体や液体等の流体が収容可能な収容空間２７ａが形成された中空のプローブ本体２７を有する。前記プローブ本体２７は、チェンバー１１側のピペット部２８と、チューブ１８側のピペット支持部２９とを有する。
【００１７】
実施例１のピペット部２８は、中空円筒状のガラス製で構成されており、先端部には先細に形成された刺し入れ部２８ａが形成されている。実施例１の刺し入れ部２８ａの先端は、マニピュレータ１２の操作に応じて、卵の細胞壁を貫通して刺し入れ可能な程度の細さ（５μｍ〜７μｍ）に形成されているが、差し入れ対象の細胞壁の強度等に応じて、細さは任意に変更可能である。図３Ｃにおいて、前記刺し入れ部２８ａの先端には、精子が通過可能な径を有する開口２８ｂが形成されている。
前記ピペット支持部２９は、ピペット部２８の右部を支持する筒状の支持部本体２９ａと、筒状の支持部本体２９ａから斜め方向に分岐した筒形状の電極導出部の一例としての電極支持部２９ｂとを有する。前記支持部本体２９ａの右端部には、接続部の一例として、ホルダ１６のネジ山１６ａに対応するネジ溝部２９ｃが形成されており、ネジ溝部２９ｃにホルダ１６のネジ山１６ａがネジ嵌合することで、ピペット部２８およびピペット支持部２９の内部空間、すなわち収容空間２７ａと、右側のホルダ１６やチューブ１８の内部空間とが接続され、右側のインジェクタ２１により収容空間２７ａ内の圧力が調整可能になっている。
【００１８】
前記電極支持部２９ｂには、電極支持体の一例としてのコネクタ３１が支持されている。前記コネクタ３１には、コネクタ３１を貫通して、第２の電極の一例としての右側電極３２が支持されている。右側電極３２は、電極支持部２９ｂに沿って収容空間２７ａ内を伸びて途中から折れ曲がって、内端３２ａがピペット部２８の先端近傍まで延びると共に、外端３２ｂがコネクタ３１を貫通して外部に伸びている。
なお、実施例１の右側電極３２は、銀（Ａｇ）の表面が、電位測定の安定化のために塩化銀（ＡｇＣｌ）処理された線状の電極を使用している。なお、電極の材料は、銀に限定されず、使用可能な任意の材料を使用可能であるが、細胞に対して影響の少ない金（Ａｕ）やプラチナ（Ｐｔ）等の材料を使用することが望ましい。なお、塩化銀処理のように電圧を安定化させる処理をしない場合には、電圧が安定しなかったりオフセット電圧が発生することが予想されるが、後述する電圧計（４６）の方に補償回路を設けることで対応することも可能である。
【００１９】
（ホールド用のプローブの説明）
図４はホールド用のプローブの説明図であり、図４Ａは正面図、図４Ｂは図４Ａの要部断面図、図４Ｃは図４ＢのＩＶＣ部分の拡大図である。
図１、図４において、左側のホルダ１７のネジ山１７ａには、卵保持部材の一例としてのホールディングプローブ３６が支持されている。図４において、ホールディングプローブ３６は、インジェクションプローブ２６のプローブ本体２７、ピペット支持部２９、コネクタ３１および右側電極３２と同様に構成されたプローブ本体３７、ピペット支持部３９、コネクタ４１および第１電極の一例としての左側電極４２を有する。そして、実施例１のホールディングプローブ３６では、インジェクションプローブ２６のピペット部２８に替えて、先端部に卵を吸着した状態で保持可能なホールディングピペット部３８が支持されている。図４Ｃにおいて、ホールディングピペット部３８の先端の保持部３８ａには、卵の外形よりも小径で卵が通過不能な開口３８ｂが形成されている。また、左側電極４２の内端は、ホールディングピペット部３８の先端近傍まで延びている。
【００２０】
図１において、前記各電極３２，４２の外端には、電位差測定計の一例としての電圧計４６が接続されており、電圧計４６は、電極３２，４２間の電位差が測定される。
前記電圧計４６には、接続用のケーブルＣｂを介して、端末の一例としてのクライアントパソコンＰＣが接続されている。実施例１の前記クライアントパソコンＰＣは、いわゆる、コンピュータ装置により構成されており、コンピュータ本体Ｈ１と、表示器の一例としてのディスプレイＨ２と、キーボードＨ３やマウスＨ４等の入力装置、図示しないＨＤドライブ（ハードディスクドライブ）等により構成されている。そして、電圧計４６で測定された電極３２，４２間の電位差が、ディスプレイＨ２に表示されるように構成されている。
【００２１】
（実施例１の作用）
図５は実施例１の顕微授精システムの作用説明図であり、図５Ａはインジェクションプローブに精子が吸引される前の状態の説明図、図５Ｂはインジェクションプローブに精子が吸引された後の状態の説明図、図５Ｃはホールディングプローブに卵が保持される前の状態の説明図、図５Ｄは卵がホールディングプローブに保持された状態の説明図である。
前記構成を備えた実施例１の顕微授精システムＳでは、人工授精を行う場合、各プローブ２６，３６では、まず、インジェクタ２１，２２からオイルを注入して、図５Ａに示すように、プローブ２６，３６の収容空間２７ａ，３７ａの先端までオイルで満たされた状態にしておく。なお、インジェクタ２１，２２から注入せず、収容空間２７ａ，３７ａの先端側から吸引するようにして、先端までオイルで満たされた状態にすることも可能である。なお、オイルを使用することが望ましいが、オイルを使用せずに、流動パラフィンやシリコン、水銀等の液体や、気体（空気や窒素等の不活性ガスやその他のガス）等の流体を使用することも可能である。なお、先端部分の溶液（バース溶液）と混ざらなければ、任意の流体を使用可能であり、使用する溶液によっては生理食塩水や水を使用することも可能である。また、溶液と使用する流体との間にオイルを挟むことも可能である。
【００２２】
そして、導電性の電解質溶液の一例としてのバース溶液５１中に尾部を切断または挫滅した精子５２が放出された液体が収容されたチェンバー１１を、ステージ４に設置し、右側のマニピュレータ１２の操作により、オイルが注入されたインジェクションプローブ２６の先端部分を、図５Ａに示すように、チェンバー１１内に浸漬する。なお、このとき、ホールディングプローブ３６は左側のマニピュレータ１３の操作により、チェンバー１１から退避させている。
そして、右側のインジェクタ２１を操作して、インジェクションプローブ２６の収容空間２７内を負圧にして、図５Ｂに示すように、精子５２を含むバース溶液５１を吸引する。このとき、図５Ｂに示すように、バース溶液５１が、右側電極３２の先端部分に接触するように吸引する。
【００２３】
図５Ｃ、図５Ｄにおいて、次に、右側のマニピュレータ１２を操作して、インジェクションプローブ２６を上方に退避させた後、バース溶液５１に卵５３が浸漬された別のチェンバー１１をステージ４に設置し、左側のマニピュレータ１３を操作して、図５Ｃに示すように、ホールディングプローブ３６の先端部分をバース液５１に浸漬させる。そして、左側のインジェクタ２２を操作して、収容空間３７内を負圧にして、図５Ｄに示すように、ホールディングピペット部３８の開口３８ｂからバース液５１を吸引しながら、ホールディングピペット部３８の先端に卵５３を吸着、保持する。なお、このとき、図５Ｄに示すように、バース溶液５１が左側電極４２の先端部分に接触するように吸引する。
【００２４】
図６は実施例１の人工授精システムの作用説明図であり、図６Ａは図５Ｂに示すインジェクションプローブが図５Ｄに示す状態のチェンバーに浸漬された状態の説明図、図６Ｂはインジェクションプローブが卵に刺し入れられた状態の説明図、図６Ｃは精子が注入された状態の説明図である。
図６Ａにおいて、次に、右側のマニピュレータ１２を操作して、インジェクションプローブ２６の先端をチェンバー１１内に浸漬させる。
そして、右側のマニピュレータ１２を操作して、図６Ｂに示すように、インジェクションプローブ２６の先端を、ホールディングプローブ３６に保持された卵５３に刺し入れる。この状態では、ホールディングピペット３６の左側電極４２は、卵５３の外部のバース溶液５１に接触している状態であり、インジェクションプローブ２６の内部の右側電極３２は、卵５３の内部に電気的に接続された状態となる。よって、この状態で、電極３２，４２間の電位差を測定することで、卵５３の細胞外の電位を基準とした細胞内の電位、すなわち、膜電位が測定され、ディスプレイＨ２に表示される。
【００２５】
図７は膜電位の概略説明図である。
図７において、卵５３の内部には、カリウムイオン（Ｋ＋）や、マイナスにチャージしたアミノ酸、たんぱく質、リン酸イオン、塩素イオン等のさまざまな陰イオン（総称して、「Ａ−」と表記）が含まれている。前記膜電位は、細胞内と細胞外のイオン勾配によって形成されるネルンスト電位やナトリウムポンプによって細胞外へくみ出されるナトリウム電流等によって発生し、通常、マイナスの電位をもつ。卵５３の細胞膜は、図７に示す電気的等価回路５４によって表現される。図７において、等価回路５４における電気抵抗Ｒ１は細胞膜の持つイオン透過性を反映し、抵抗Ｒ１に並列に接続されたコンデンサＣ１は、細胞膜が有する電気的な容量成分を示す。そして、起電力Ｅｍが膜電位を示す。
仮に、細胞膜に何らかの傷が付くと、傷を通じて、イオンのシャント（あるべきルートとは別の流れ）が発生すると共に、細胞内外のイオン濃度勾配に変化が生じて膜電位Ｅｍの値がゼロに近づくことになる。また、細胞が障害を受けて細胞内のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）産生が低下した場合でも、ナトリウムポンプの機能不全により、細胞内カリウムイオン濃度が低下し、細胞内電位がゼロに近づく。
【００２６】
したがって、電極３２，４２間の電位差を測定することで、卵５３が傷ついていたり、障害を受けていたりしないか否かを判定することができる。例えば、実験や統計データ等により予め設定された閾値以上の電位差Ｅｍが測定された場合に、良好な卵５３と判定し、閾値未満の場合に、不良な卵５３と判定することが可能である。
そして、良好な卵５３であると判定された場合、右側のインジェクタ２１を操作して、インジェクションプローブ２６から精子５２を押し出して、卵５３の内部に精子５２を放出して、受精させる。
【００２７】
したがって、従来の技術では、一度に得られる個数が少なく、侵襲的な検査（結果的に卵を傷つける検査）や薬品等を使用した検査が困難であり、卵５３の外形を目視でしか判定ができなかったが、実施例１の顕微授精システムＳでは、膜電位を基準として卵５３の良・不良を判定することが可能となった。したがって、倒立顕微鏡２による卵５３の外的な形状の良・不良に加えて、内的な良・不良を基準として判定することが可能になった。そして、卵５３の良・不良を判定すると共に、良好である場合には、そのまま続けて、精子５２を注入することも可能であり、侵襲的な検査を行いながら人工授精の作業を効率的に行うことができる。
【００２８】
また、実施例１の各プローブ２６，３６は、ネジ溝部２９ｃ，３９ｃにより、容易に着脱可能に構成されており、使い捨て可能（ディスポーザブル）な構成となっており、滅菌操作が容易である。その結果、衛生的な使用が可能となっている。
さらに、実施例１の各プローブ２６，３６では、電極支持部２９ｂ，３９ｂが、支持部本体２９ａ，３９ａから斜め方向に分岐しており、電極支持部２９ｂ，３９ｂが後述する実施例２のように９０度の方向に分岐している場合に比べて、プローブ２６，３６の作製時に、電極３２，４２を電極支持部２９ｂ，３９ｂを通じて支持部本体２９ａ，２９ｂ内に挿入する作業が容易になっている。すなわち、プローブ２６，３６の作製や、メンテナンス（保守作業）が容易になっている。
【００２９】
（実験例）
次に、実施例１の効果を確かめるために、両生類（アフリカツメガエル）のメスから酵素的に単離した卵母細胞について実験を行った。
実験は、実施例１の構成のインジェクションプローブ２６を作製して、市販の倒立顕微鏡およびマニピュレータ（ナリシゲ社製）と、細胞内電位測定用のアンプとしてワーナー社製ＴＥＶ−２０００と、データ記録装置としてＰｏｗｅｒＬａｂ社製のＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓを使用した。なお、実験は全て室温でおこなった。
【００３０】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞は、次のようにして単離した。
（ｉ）アフリカツメガエル（メス）を氷冷水にいれて麻酔する。
（ii）腹部を切開し、卵胞をピンセットにより取り出す。
（iii）取り出した卵胞をコラゲナーゼ１０ｍｇ／ｍｌを含んだＣａ２＋freeＭＢＳ溶液に漬け、３０分〜６０分かけて、ゆっくり震盪する。
（iv）ばらばらになった卵母細胞をコラゲナーゼを含まないＭＢＳ溶液にいれ、１７℃インキュベータにて保存する。
なお、ＭＢＳ溶液は、バース変法溶液であり、８８ｍＭのＮａＣｌと、１ｍＭのＫＣｌと、０．４１ｍＭのＣａＣｌ２と、０．３３ＭのＣａ（ＮＯ３）２と、０．８２ｍＭのＭｇＳＯ４と、２．４ｍＭのＮａＨＣＯ３と、７．５ｍＭのTris−ＨＣｌとを含むｐＨ７．６の溶液を使用した。また、Ｃａ２＋freeＭＢＳ溶液は、８８ｍＭのＮａＣｌと、１ｍＭのＫＣｌと、２ｍＭのＭｇＳＯ４と、２．４ｍＭのＮａＨＣＯ３と、７．５ｍＭのTris−ＨＣｌとを含むｐＨ７．６の溶液を使用した。
【００３１】
実験は、酵素処理後のダメージの少ない細胞の膜電位と、一日経過してダメージを受けた細胞の膜電位とを測定し、それらを比較した。実験結果を図８に示す。
図８は膜電位の実験例の実験結果の説明図であり、横軸に膜電位［ｍＶ］をとり、縦軸に個数をとったヒストグラムである。
図８に示すように、酵素処理後（「Ｄａｙ０」）に対して、一日経過後（「Ｄａｙ１」）の卵の方がゼロに近い膜電位を持つことがわかった。
【００３２】
次に、障害を有する卵の膜電位がどのように変化するかを確認する実験を行った。実験は、薬物を含まないＭＢＳ溶液において、インジェクションプローブ２６を卵に刺し込んで、連続的に膜電位を測定中に、細胞に障害を与える薬物を投与することで、膜電位がどのように変化するかを測定した。投与する薬物は、ＡＴＰポンプを阻害することにより細胞障害性をもつ薬物であるOuabain  １０μＭを投与した。実験結果を図９に示す。
図９は膜電位測定中に薬物を投与する実験の実験結果の図であり、横軸に時間をとり、縦軸に膜電位［ｍＶ］をとったグラフである。
図９に示すように、細胞に障害を与える薬物を投与した後は、急激に膜電位がゼロに近づくことが確認され、障害のある卵は、障害のないものに比べて、膜電位が低下することが確認された。
図８、図９の結果から、膜電位を指標として、障害を受けた卵と正常な卵の区別が可能であり、実施例１のインジェクションプローブ２６を使用することで、卵の良、不良を、人工授精中にリアルタイムで判別しつつ、精子の注入も可能であることが確認された。
【実施例２】
【００３３】
次に、本発明の実施例２の説明を行うが、この実施例２の説明において、前記実施例１の構成要素に対応する構成要素には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
この実施例２は、下記の点で前記実施例１と相違しているが、他の点では前記実施例１と同様に構成されている。
図１０は実施例２のインジェクションプローブの説明図であり、実施例１の図３Ｂに対応する図である。
図１０において、実施例２のインジェクションプローブ２６′では、電極支持部２９ｂ′が、実施例１の電極支持部２９ｂに替えて、筒状の支持部本体２９ａに対して、直交する方向に延びている。
【００３４】
（実施例２の作用）
前記構成を備えた実施例２のインジェクションプローブ２６′では、電極支持部２９ｂ′が、支持部本体２９ａに対して直交する方向に延びており、電極３２から延びるケーブルがマニピュレータ１２等に干渉しないように配線することが容易になっている。
なお、インジェクションプローブ２６′だけでなく、ホールディングプローブ３６側も、実施例２のインジェクションプローブ２６′の電極支持部２９ｂ′と同様に構成することも可能である。また、インジェクションプローブ２６，２６′と、ホールディングプローブ３６，３６′とを設計や配線しやすさ等に応じて、例えば、インジェクションプローブは実施例１の構成としてホールディングプローブは実施例２の構成にするというように任意の組み合わせとすることも可能である。さらに、設計に応じて実施例１，２とは異なる角度方向に延びる電極支持部を有する構成とすることも可能である。
【実施例３】
【００３５】
次に、本発明の実施例３の説明を行うが、この実施例３の説明において、前記実施例１の構成要素に対応する構成要素には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
この実施例３は、下記の点で前記実施例１と相違しているが、他の点では前記実施例１と同様に構成されている。
図１１は実施例３のインジェクションプローブの説明図であり、図１１Ａは実施例１の図１Ｂに対応する図であり、図１１Ｂは実施例１の図３Ｂに対応する図である。
図１１において、実施例３のプローブ２６″，３６″では、ピペット部２８″，３８″の先端の刺し入れ部２８ａ″や保持部３８ａ″の部分が、ピペット部２８″，３８″の基端部分に対して折れ曲がるように傾斜している。なお、実施例３では、刺し入れ部２８ａ″や保持部３８ａ″は、基端部分に対して３０度傾斜するように設定されているが、傾斜角度は用途や設計等に応じて、任意の角度に変更可能である。
【００３６】
（実施例３の作用）
前記構成を備えた実施例３のプローブ２６″，３６″では、ピペット部２８″の刺し入れ部２８ａ″が傾斜している。図１Ｂに示すように、実施例１，２では、チェンバー１１の側壁が妨げとなって、卵５３に対して斜め方向からホールディングプローブ３６で保持した状態で、別の斜め方向からインジェクションプローブ２６を刺し入れる作業となり、インジェクションプローブ２６を刺し入れる方向とホールディングプローブ３６が吸引する方向が異なっていた。したがって、卵にインジェクションプローブ２６を刺し入れる際に、卵５３が動いたり、ずれたり、最悪の場合には卵５３が損傷する恐れがあった。
これに対して、実施例３では、図１１Ｂに示すように、プローブ２６″，３６″が、卵５３を挟んで対向するように配置可能であり、インジェクションプローブ２６を刺し入れる方向からホールディングプローブ３６が保持可能になっている。よって、インジェクションプローブ２６を刺し入れる際に、卵５３が動く等が低減される。
【００３７】
（変更例）
以上、本発明の実施例を詳述したが、本発明は、前記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内で、種々の変更を行うことが可能である。本発明の変更例（Ｈ01）〜（Ｈ05）を下記に例示する。
（Ｈ01）前記実施例において、ホールディングプローブ３６，３６′，３６″内に左側電極４２を内蔵する構成を例示したが、左側電極４２は、不関電極または参照電極としての機能を実現可能な形態であればどのような形態であっても構わないため、例えば、電極４２を単独でチェンバー１１内に浸漬することで溶液に接触させておき、ホールディングプローブは、従来公知のホールディングピペットを使用することも可能である。
【００３８】
（Ｈ02）前記実施例において、右側電極３２および電極支持部２９ｂ，２９ｂ′は、支持体本体２９ａに一体的に構成されたが、これに限定されず、例えば、ピペット部２８に電極支持部を設けて右側電極３２を外部に導出する構成とすることも可能である。
（Ｈ03）前記実施例において、ホルダ１６，１７と、プローブ２６，２６′，２６″，３６，３６′，３６″と、を別体で構成したが、一体構成として、１つのプローブとすることも可能である。この場合、電極支持部２９ｂ，２９ｂ′は、ホルダ１６，１７から分岐する構成とすることも可能である。また、ホルダ１６，１７に加えてチューブ１８，１９も一体構成として、１つのプローブとすることも不可能ではない。
【００３９】
（Ｈ04）前記実施例において、使用する溶液は、実施例に例示したものに限定されず、卵や精子等に応じて、使用可能な任意の溶液を使用可能である。
（Ｈ05）前記実施例において、ピペット部とピペット支持部とを別体の構成としたが、一体構成とすることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の人工授精システムＳは、人間の不妊治療において、妊娠率の向上に寄与するだけでなく、動物（牛等）の人工授精にも使用可能である。よって、例えば、牛に使用した場合には、障害が少なく、肉質のよい肉牛や、牛乳の質のよい乳牛を安定して生産することに寄与することが期待される。
【符号の説明】
【００４１】
１…人工授精装置、
１１…チェンバー、
２１…インジェクタ、
２６，２６′，２６″…プローブ、
２７…プローブ本体、
２７ａ…精子収容部、
２８ａ…刺し入れ部、
２８ｂ…開口、
２９ｂ、２９ｂ′…電極導出部、
２９ｃ…接続部、
３２…第２の電極、
４２…第１の電極、
４６…電位差測定計、
５１…溶液、
５２…精子、
５３…卵、
Ｈ２…表示器。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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