(57)【要約】【課題】進行性前立腺がん細胞のモデルとして使用できる高骨転移性前立腺がん細胞株を提供すること。【解決手段】（ａ）安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞を、マウスの心腔内に注入し、ヒト前立腺がん細胞移植マウスを作製する工程；（ｂ）ルシフェリンを、上記ヒト前立腺がん細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から骨転移性ヒト前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；（ｃ）上記骨髄細胞を、上記マウスとは別のマウスの心腔内に注入し、骨髄細胞移植マウスを作製する工程；（ｄ）ルシフェリンを、上記骨髄細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から高骨転移性前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；の工程（ａ）〜（ｄ）により、高骨転移前立腺がん細胞株を樹立する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を順次備えることを特徴とする、高骨転移性前立腺がん細胞を調製する方法。
（ａ）安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞を、マウスの心腔内に注入し、ヒト前立腺がん細胞移植マウスを作製する工程；
（ｂ）ルシフェリンを、上記ヒト前立腺がん細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から骨転移性ヒト前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；
（ｃ）上記骨髄細胞を、上記マウスとは別のマウスの心腔内に注入し、骨髄細胞移植マウスを作製する工程；
（ｄ）ルシフェリンを、上記骨髄細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から高骨転移性前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；
【請求項２】
安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞が、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
マウスが、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって調製された高骨転移性前立腺がん細胞。
【請求項５】
請求項４記載の高骨転移性前立腺がん細胞を用いて、高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項６】
請求項５記載のスクリーニングする方法によって得られる、高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高骨転移性前立腺がん細胞株や、該高骨転移性前立腺がん細胞株の作製方法や、該高骨転移性前立腺がん細胞株を用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは、早期段階（ステージＡ）で発見され、手術にて切除された場合には、５年生存率が約８０％と比較的予後の良好ながんであるとされている。しかし、進行性（ステージＤ）の前立腺がんの場合には、約８０％の症例に骨転移が認められ、５年生存率も３０％と予後が悪化することが知られており、また、転移性の前立腺がんに対しては、手術又は放射線治療の他には有効な治療法は確立されていないのが現状である。このため、骨転移性前立腺がんの診断のためのマーカーや、骨転移性前立腺がんの治療薬の開発は非常に重要な研究課題であると考えられる。
【０００３】
これまでに、初期段階の前立腺がんを検出するための多数のマーカーが開発されており、なかでも、ＰＳＡは臨床的に広く使用されている。しかし、ＰＳＡレベルの上昇は、前立腺肥大症、及び前立腺炎を有する患者においても認められることが明らかにされており（非特許文献１）、さらに、ＰＳＡは悪性良性前立腺がんと、非転移性の良性前立腺がんを区別することができないことから、悪性の前立腺がんに特異的なマーカーの開発が求められている。
【０００４】
現在までに、いくつかの前立腺がん動物モデルが作製されており、前立腺がん発生のメカニズムやその修飾因子を解明するために用いられてきた（特許文献１、及び非特許文献２）。しかし、ＡＣＩ／Ｓｅｇ系ラットやローバンド−ウイスター系ラットで自然発生的な悪性腫瘍を高い頻度で発生する動物モデルを作るには約２０ケ月という長い潜在期を要することが知られており、悪性前立腺がんのマーカーや、治療のターゲットとなり得る遺伝子のスクリーニングに用いることのできる、転移能を有する前立腺がん細胞株の樹立が極めて重要な課題とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２３１４０２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gao et al., Prostate, 31: 264-281, 1997
【非特許文献２】Jpn. J. CancerRes.,76: 803-808, 1985
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、進行性前立腺がん細胞のモデルとして使用できる高骨転移性前立腺がん細胞株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者は、ルシフェラーゼ遺伝子安定発現株である前立腺がん細胞ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６をマウス心臓内に注入して、大腿骨に転移した上記細胞を回収する操作を２回繰り返すことにより、高骨転移性前立腺がん細胞株を樹立できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の高骨転移性前立腺がん細胞株をモデルとして用い、高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子のスクリーニングを行うことができる。
【００１０】
すなわち、本発明は（１）（ａ）安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞を、マウスの心腔内に注入し、ヒト前立腺がん細胞移植マウスを作製する工程；（ｂ）ルシフェリンを、上記ヒト前立腺がん細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から骨転移性ヒト前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；（ｃ）上記骨髄細胞を、上記マウスとは別のマウスの心腔内に注入し、骨髄細胞移植マウスを作製する工程；（ｄ）ルシフェリンを、上記骨髄細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から高骨転移性前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；の工程（ａ）〜（ｄ）を順次備えることを特徴とする、高骨転移性前立腺がん細胞を調製する方法や、（２）安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞が、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６であることを特徴とする上記（１）記載の方法や、（３）マウスが、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法や、（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法によって調製された高骨転移性前立腺がん細胞や、（５）上記（４）記載の高骨転移性前立腺がん細胞を用いて、高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子をスクリーニングする方法や、（６）上記（５）記載のスクリーニングする方法によって得られる、高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６のマウス心腔内への注射について示す図である。
【図２】ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６を心腔内注射（２回目）して、２８日後にＩｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行った結果を示す図である。
【図３】本発明の高骨転移性前立腺がん細胞におけるルシフェラーゼ活性と、親株であるＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞におけるルシフェラーゼ活性とを比較した結果を示す図である。
【図４】親株であるＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞（ａ）と、本発明の高骨転移性前立腺がん細胞（ｂ）の形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の高骨転移性前立腺がん細胞を調製する方法としては、（ａ）安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞を、マウスの心腔内に注入し、ヒト前立腺がん細胞移植マウスを作製する工程；（ｂ）ルシフェリンを、上記ヒト前立腺がん細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から骨転移性ヒト前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；（ｃ）上記骨髄細胞を、上記マウスとは別のマウスの心腔内に注入し、骨髄細胞移植マウスを作製する工程；（ｄ）ルシフェリンを、上記骨髄細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から高骨転移性前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；の工程（ａ）〜（ｄ）を順次備えるものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の高骨転移性前立腺がん細胞としては、（ａ）安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞を、マウスの心腔内に注入し、ヒト前立腺がん細胞移植マウスを作製する工程；（ｂ）ルシフェリンを、上記ヒト前立腺がん細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から骨転移性ヒト前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；（ｃ）上記骨髄細胞を、上記マウスとは別のマウスの心腔内に注入し、骨髄細胞移植マウスを作製する工程；（ｄ）ルシフェリンを、上記骨髄細胞移植マウスに投与してｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、ルシフェリンの発光が認められる大腿骨から高骨転移性前立腺がん細胞を含む骨髄細胞を採取する工程；の工程（ａ）〜（ｄ）を順次備える上記本発明の高骨転移性前立腺がん細胞の調製方法によって得られるものであれば特に制限されるものではない。上記安定的にルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞としては特に制限されないが、例えば、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６を好適に挙げることができ、また、上記マウスとしては特に制限されないが、免疫不全マウスであることが好ましく、例えば、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを好適に挙げることができる。
【００１３】
また、上記ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行うための装置としては、生きたままのマウスの発光・蛍光イメージを検出／解析できる装置であればどのような装置であってもよいが、例えば、1420 ARVOsx DELFIA Research Fluorometer（PerkinElmer社製）を好適に挙げることができる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法としては、上記本発明の高骨転移性前立腺がん細胞を用いて、高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子をスクリーニングする方法であれば特に制限されないが、例えば、上記本発明の高骨転移性前立腺がん細胞におけるｍＲＮＡ発現量と、同一の前立腺がん細胞株に由来する高骨転移性を有さない前立腺がん細胞におけるｍＲＮＡ発現量とを比較することにより、上記高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子をスクリーニングする方法を好適に挙げることができ、上記本発明のスクリーニング方法においてｍＲＮＡ発現を定量的に測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、マイクロアレイ法や、ＲＴ−ＰＣＲ法や、リアルタイムＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等を挙げることができ、なかでも、マイクロアレイ法であることが好ましい。また、本発明の高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子としては、上記本発明のスクリーニングする方法によって得られる遺伝子であれば特に制限されるものではなく、上記本発明の高骨転移性前立腺がん細胞に特異的に高発現又は低発現する遺伝子は、高骨転移性前立腺がんの診断マーカーや治療薬を開発するために用いることができる。
【００１５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
［材料と方法］
＜前立腺がん細胞の心腔内注射（１回目）＞  
心腔内注射には、ＳＶ４０プロモーターにより発現制御されるルシフェラーゼ遺伝子をヒト前立腺がん細胞株ＰＣ３Ｍに導入した、安定的ルシフェラーゼ発現ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Caliper Life Sciences社製）を用いた。１ｘ１０５個のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を、１００μｌのＰＢＳに懸濁し、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの心腔内に注入した（図１）。その後、ルシフェリンを投与して、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング装置エクスプローラー オプティクス（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、注入した細胞の転移部位の確認を行った。
【００１７】
＜骨転移部位からのＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞の回収＞
Ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングによって、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞の転移が認められたマウスの大腿骨を回収し、骨髄細胞を採取した。転移したがん細胞を含む骨髄細胞を、１０％ＦＢＳ及び２５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含むＭＥＭ培地を用いて培養した。３〜４週間の培養後、増殖した骨転移細胞のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイにより確認した。ルシフェラーゼアッセイには、Luciferase assay kit（Promega社製）を用い、ルシフェラーゼ活性の測定は1420 ARVOsx DELFIA Research Fluorometer（PerkinElmer社製）を用いて行った。
【００１８】
＜前立腺がん細胞の心腔内注射（２回目）＞  
ルシフェラーゼ活性が確認された転移がん細胞を、再度マウス心腔内に注入し、上記の１回目と同様の方法を用いて、転移したがん細胞を含む骨髄細胞を回収し、高転移性前立腺がん細胞株を樹立した。
【００１９】
＜ＤＮＡチップによる骨転移細胞株の遺伝子解析＞
得られた高骨転移性細胞株の遺伝子発現を、GeneChip Human Genome U133A 2.0 Array (Affymetrix社製)を用いて解析をし、親株であるＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６との比較を行なった。発現データの詳細な解析は、Gene Spring GX version 10.0.2 software (Agilent Technologies. Inc.)を用いて実施した。
【００２０】
［結果］
＜ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６の心臓内注入後の骨転移の評価＞
細胞の心臓内注入は、マウスの第２肋間の高さで正中から３ｍｍの部位を目標とし、約４５度の角度で行なった（図１）。２回目の注入後、約４週間で大腿骨及び下顎骨への転移が確認された（図２）。細胞注入後の骨転移の頻度は、１回目がマウス３匹中２匹で、２回目が６匹中３匹で認められ、いずれも５０％以上の骨転移率を示した（表１）。
【００２１】
＜骨転移細胞株の分離培養＞
２回目の注入を行った後、骨転移巣より回収された高転移性細胞のルシフェラーゼ活性は、親株よりも高い数値（約２倍）であることが明らかとなった(図３)。一方、転移株と親株の細胞の形態には大きな違いは認められなかった（図４）。表１に、骨転移頻度と転移部位を示す。
【００２２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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