(57)【要約】【課題】インビボの誘導光信号の位置又は分布を判断するために周辺光でゲート光学検波器を使用するためのシステム及び方法を提供する。【解決手段】周辺光の存在の下で体内の目標組織を検出及び定位する方法であって、光学造影剤が投与され、コントラストでラベル付けされた診断される目標組織内に機能的に定位した状態にされる。光源は、コントラストでラベル付けされた目標組織を包含する可能性を有する組織領域と光学的に結合される。ゲート光検出器は、組織領域と光学的に結合され、周辺光と比較して目標信号において実質的に強化された光を検出するために配置され、目標信号は、コントラストでラベル付けされた組織領域の中に送られて造影剤によって変更された光である。コンピュータは、検出器から信号を受信し、これらの信号を蓄積及び記憶のためにメモリに送り、次に造影剤の定位及び分布を判断するために画像処理エンジンに送る。【選択図】図１
2011115658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
周辺光において生体対象内の目標組織を検出する方法であって、
（ａ）光源からの追加光を用いて周辺光において対象を照明し、目標組織が前記照明光と相互作用して前記照明光を変更し得るように前記光源が選択されている段階と、
（ｂ）ゲート光検出器を準備する段階と、
（ｃ）前記光検出器を前記対象と光学的に結合させる段階と、
（ｄ）前記変更された光において前記周辺光に対して実質的に強化された光を前記検出器が検出するように実行される、前記検出器をゲート制御する段階と、
（ｅ）前記ゲート制御段階により更に正確又は確実に決定可能である前記目標組織の測定可能なパラメータを、前記検出された光の分析を用いて決める段階と、
（ｆ）前記決定に応答して出力信号を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記検出器は、画像化デジタルカメラであり、前記出力信号は画像であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出器のゲート制御と同期した短い光パルスで照明する追加光を用いて照明する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
目標細胞の弱い自然信号を強化することにより、周辺光において生体対象内の目標細胞を画像化する方法であって、
(ａ)インビボの目標細胞に対して測定可能なコントラストをもたらすように選択された光学造影剤を対象に投与する段階と、
(ｂ)前記造影剤が体内で十分に機能的な分布及び定位を達成するまで待機する段階と、  (ｃ)インビボの前記造影剤が前記照明光と相互作用して前記照明光を変更し得るように選択され、強度が時間的に可変であるように更に構成された光源からの光で前記対象を照明する段階と、
(ｄ)前記対象と光学的に結合された時間ゲート制御カメラを設け、前記対象をモニタリング又は画像化するために前記カメラを使用する段階と、
(ｅ)前記カメラが前記変更光において周辺光に対して強化された光を検出するように、光源強度の前記時間的変動の関数として前記カメラをゲート制御する段階と、
(ｆ)前記造影剤の分布及び定位の機能に基づき、前記検出光を使用して前記目標細胞の測定可能なパラメータを決める段階と、
(ｇ)前記決定に応答して出力信号を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、インビボの誘導光信号の位置又は分布を判断するために周辺光でゲート光学検波器を使用するためのシステム及び方法に関するものであり、更に詳しくは、侵襲性癌手術又は誘導腫瘍生体組織検査中に暗くした手術室を必要とせずに、人体に微量で存在する癌細胞をインビボ及びリアルタイムで検出及び画像化するために、室内光には鈍感なゲート強化電荷結合素子画像化カメラの使用を目標蛍光造影剤及び同期照明レーザの使用と結合させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの疾患のリアルタイム検知、診断、及び、画像化をもたらす光学画像化システム及び方法は、当業技術では公知である。リアルタイムの医療又は外科処置中のインビボでのこのようなシステムの適用は、不十分なＳＮ比によって制限されている。この低いＳＮ比は、目標組織から生じる光信号の低強度又は不在、あらゆる周辺光からの高レベルの背景ノイズ、検出された光信号の不十分な感度及び特異性の結果として生じるものである。
【０００３】
ＳＮ比に関する問題の大きさは、手術室内の組織表面からの反射放射照度が、明るい手術用前照灯及び頭上スポットライトの元では１０ミリワット／平方センチメートル又はそれ以上まで高くなる可能性があることを考えれば最もよく理解される。通常の手術室照明では、この数値は、毎秒で各１平方センチメートルの組織から反射される１０18（１×１０億×１０億）の光子になる。これとは対照的に、自然蛍光は、入射光よりも低い１０7のオーダーであり、約１０9光子／平方センチメートル／秒又はそれ以下であり得る。これは、微量の疾患の検出を周辺光では困難にしている。上述の例で光子カウントを使用すると、周辺光は、１平方センチメートル当たりで１ミリメートルの腫瘍からの検出可能な自然蛍光信号の１０億倍強く、又は、１平方センチメートル当たりで１００ミクロンの腫瘍からの信号の１兆倍強い。問題を更に複雑にすることには、一部の目標組織又は疾患状態は、非特定な信号を有するか、又は、検出可能な光信号が全くない場合がある。
従って、室内光での微量の目標組織の検出では、ＳＮ比を背景周辺光によって導入されるノイズを低減するか、又は、目標信号の強度及び特異性を増すか、又は、その両方により、当業技術で現在教示されているものを超えて１０4から１０9倍の範囲で改良する必要がある。
【０００４】
周辺光排除によるＳＮ比の改善に関しては、公知の光診断システム及び方法の大部分では、室内光を単に無視するか、背景を取り去るか、又は、消灯する。種々の例には、カテーテル、ニードル、及び、トロカール（例えば、米国特許第５，６０１，０８７号）などの光学装置を備えた大半の侵襲性装置、並びに、生体組織の光学的形態を外部的に画像化又は測定する非侵襲性装置（例えば、米国特許第５，９３６，７３１号、ＷＯ９８／１０６９８、Ｓｗｅｅｎｙ他著「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９９９年、９６（２１）：１２０４４〜１２０４９、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ他「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ」１９９９年、３７５〜３７８）を含む。しかし、医療処置中の照明の消灯、又は、暗色の掛布を使用する患者の視野の遮断は不利であり、特に極めて重要な外科的処置中には恐らくは危険である。一方、周辺光の単なる無視又は背景除去による処理では、検出器のオーバーフロー及び／又は微量の組織からの弱い信号が背景ノイズ内で埋没するという危険が生じる。従って、このような単純化した手法では、周辺光が特に排除されない限り、医療処置中のリアルタイムフィードバックの可能性が小さくなる。
【０００５】
真の周辺光排除の方法は公知であり、帯域通過フィルタ、時間的信号変調、及び、耐用年数解析の使用を含む。しかし、このような方法は、周辺光で失敗することが多い。例えば、インビボの生物学的蛍光信号の大多数を通過させるのに十分な幅を有する帯域通過フィルタ幅は、それでも周辺光の少なくとも５％を同じく通過させることになり、弱い自然蛍光を暴露させるのに必要とされるＳＮ比の必要な１０4から１０9の増加には全く不足である。組織画像化において背景排除をもたらすために時間的方法を準備することができるが、しかし、振幅変調（例えば、米国特許第５,２１３,１０５号、米国特許第５,６４８,２６９号、及び、米国特許第５,８６５,７５４号）、及び、飛行時間型測定（例えば、米国特許第５,９１９,１４０号，ＷＯ９８／１０６９８）などの手法は、従来的に、周囲信号を排除するのではなく、その代わりに光子が組織を横切るか又は蛍光分子から出るのに必要とされる時間に関する時間的情報を測定するように構成されてきた。更に、このような時間的手法は、目標信号が十分に強くて時間的応答（飛行時間上昇又は下降時間、位相シフト、蛍光耐用年限）を正確に推定することができる時にしかうまく機能せず、従って、微量の目標組織のみが存在する時や周辺光が強い時にはリアルタイムで作動することはできない。
【０００６】
上述のシステム及び方法の全ては、相当量の背景放射排除に失敗し、暗い状態の下でのみ作動し、強力な目標信号を必要とし、又は、リアルタイムの使用を不可能にする長い集積時間を必要とするために、通常レベルの周辺光か存在する場合に微量の目標組織を確実に検出することはできない。
上述の欠点にもかかわらず、周辺光排除の改善だけでは、手術室条件でインビボで使用されるリアルタイムシステムを達成するには不十分であろう。一部の大きな癌は、自然信号を使用して検出可能とすることができるが（例えば、米国特許第５,６４７,３６８号）、多くの生理学的又は病理学的な条件では、検出可能な自然光信号が存在しないか、又は、特に微量の疾患が検出される時には弱いか又は非特定の光学的兆候しかない。
【０００７】
インビボで固有又は自然信号が存在しないか又は弱い時は、医療モニタリング及び画像化には、これまでは造影剤が使用されてきた。造影剤は、それ以外の方法では検出可能性が低い組織に強力な識別可能信号を与える機能がある。この点に関して、光学造影剤が当業技術において知られている。公知の光学造影剤の大部分は目標を定めないものである（例えば、米国特許第５,６７２,３３３号、米国特許第５,９２８,６２７号、ＷＯ９７／３６６１９、Ｌａｍ他著「Ｃｈｅｓｔ」１９９０年、９７（２）：３３３〜３３７、及び、Ｈｕｂｅｒ他著「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ」１９９８年、９：２４２〜２４９）。このような無目標造影剤は、それらを特定の組織に非特定に区分けするに当たって、主として、脂肪対水における溶解度などの造影剤の物理的特性、又は、細胞の新陳代謝に依存する。無目標染料は、広範囲に分布されかつ非特定信号を生成するので、インビボで統計的に明瞭な信号を生成するためには、染色処理された大量の組織を必要とし、つまり、少量又は微量の目標組織量からは、背景ノイズを不十分にしか上回らない弱い信号を生成する傾向がある。例えば、光力学療法用造影剤は、特定の癌細胞において蓄積されるが（Ｌａｍ他、Ｈｕｂｅｒ他）、正常な組織にも蓄積される。上述の光学的造影方法及び装置のどれも、高度に特異な目標剤の使用を通じてインビボで稀少細胞を目標にすることを教えておらず、従って、インビボの微量の目標組織の検出に対する使用には失敗することになる。
【０００８】
より局所的な染料の目標化に対応する幾つかの薬剤が知られている。例えば、Ｓｗｅｅｎｙ他は、体外で培養したか又は育てた細胞を遺伝的に変質させ、その後にこれらの細胞を画像化のために体内に挿入する処理を教示している。細胞のこのような摘出及び再挿入は、変質させて患者の体内に再挿入すべきではない癌などの自然発生的疾患に罹患した患者への使用には無意味な場合がある。更に、形質転換細胞は成長し続けるので、光に対して誘導可能な成分（ストロボを使用して誘導された蛍光など）がなく、従って周辺光のゲート制御による排除を用いることにより何らかの強化が可能としてもほんの僅かである。Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ他（「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ」１９９９年、１７：３７５〜３７８）は、局所的に活性化ざれるという意味で目標にされる別の染料を教示しており、一方、ＷＯ  ９８／４８８４６では、インビボで使用される光学染料を作る複数の方法が示唆されている。これらの手法の各々は、ゲート検出器を使用する周辺光の特定の排除を提供することなく実現されており、従って、インビボ及び周辺光が存在する場合の微量の目標組織の検出における使用には対応しないことになる。
【０００９】
要約すると、上述の手法のいずれも実質的に周辺光を排除する検出器のゲート制御を示唆しておらず、また、ゲート周辺光無反応画像化装置、高電力同期光源、及び、高度に特異で組織を目標にした造影剤を、室内光で微量の目標組織を検出及び画像化する結合性を有するシステムに組み合わせることを示唆してもいない。従って、現時点の技術で教示される装置及び方法では、小さな原発性癌、早期転移性疾患、局所的炎症状態、又は、不安定冠状壁額などの微量疾患を、周辺光条件下においてインビボ及びリアルタイムで検出して突き止めることが多くの場合に失敗することになる。誘導又は造影剤の影響を受けた目標組織信号をインビボ及び周辺光で検出又は画像化するリアルタイム光学システム及び方法はこれまでのところ教示されておらず、そのようなツールの商業化も成功に至っていない。
【００１０】
必要とされるが未だに示唆又は教示されていないものは、インビボ及びリアルタイムで微量の癌などの組織の検出、画像化、目標化、及び、処置を行うための光学システムを製造するために、恐らくは弱い自然信号を強化する（又は、自然信号が以前に存在しなかった場所にそれを作り出す）段階を含む、高レベルの周辺光の存在にもかかわらずインビボ及びリアルタイムで微量の組織からの信号を検出する方法及び光学システムである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明によりゲート画像化装置を目標化された造影剤の使用と連携させるシステムの概略図である。
【図２】図１に示すシステムによってユーザに表示される対象の画像、コントラストマップ、及び、融合画像を示す図である。
【図３Ａ】光源及び検出器の可能な構成を示す図である。
【図３Ｂ】光源及び検出器の可能な構成を示す図である。
【図３Ｃ】光源及び検出器の可能な構成を示す図である。
【図３Ｄ】光源及び検出器の可能な構成を示す図である。
【図３Ｅ】光源及び検出器の可能な構成を示す図である。
【図３Ｆ】光源及び検出器の可能な構成を示す図である。
【図４Ａ】１００ミクロン腫瘍モデルのコンピュータ生成画像示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａの画像を通る横断面光子強度を示すグラフである。
【図５Ａ】室内光においてゲート制御なしで点光源から収集されたカメラ画像を示す図である。
【図５Ｂ】室内光において１００マイクロ秒のゲート制御で点光源から収集されたカメラ画像を示す図である。
【図５Ｃ】室内光において１０マイクロ秒のゲート制御で点光源から収集されたカメラ画像を示す図である。
【図５Ｄ】室内光において３００ナノ秒のゲート制御で点光源から収集されたカメラ画像を示す図である。
【図６Ａ】図５のゲート制御なしの強度を示す画像を通る線形横断面に対する各画素におけるカメラ強度を示すグラフである。
【図６Ｂ】図５の１００マイクロ秒のゲート制御での強度を示す画像を通る線形横断面に対する各画素におけるカメラ強度を示すグラフである。
【図６Ｃ】図５の３００ナノ秒のゲート制御での強度を示す画像を通る線形横断面に対する各画素におけるカメラ強度を示すグラフである。
【図７】インビボで１ミリメートル、３００ミクロン、及び、１００ミクロン径の染料でラベル付けされた腫瘍に対して予想される大きさ及びピーク信号と画素当たりの大きさ及びピーク輝度が同等である染料含有のチューブ及び小滴の蛍光画像を示す図である。
【図８】染料の位置及び強度を示す色の重ね合わせに統合された抗体と結合されたＣｙ７のチューブを持つ手の白黒画像を示す図である。
【図９Ａ】マウスの腹部における染料の非侵襲性重ね合わせ画像を示す図である。
【図９Ｂ】マウスの腹部における染料の侵襲性重ね合わせ画像を示す図である。
【図１０】マウスの皮膚の中に段階的に一連の染料が注入されたマウスの非侵襲性重ね合わせ画像を示す図である。
【図１１Ａ】染料含有組織の大部分に対するコントラスト誘導式摘出手術前の抗体向け染料でラベル付けされた組織の重ね合わせ画像を示す図である。
【図１１Ｂ】染料含有組織の大部分に対するコントラスト誘導式摘出手術中の抗体向け染料でラベル付けされた組織の重ね合わせ画像を示す図である。
【図１１Ｃ】染料含有組織の大部分に対するコントラスト誘導式摘出手術後の抗体向け染料でラベル付けされた組織の重ね合わせ画像を示す図である。
【図１２Ａ】埋没した光学ラベルの画像を示す図である。
【図１２Ｂ】埋没した光学ラベルの画像を示す図である。
【図１３】２つの造影剤が組織モデルにおいて追跡された二重ラベル研究を示す図である。
【図１４】異なる発光スペウトルを有する２つの「Ｃｙ染料」のスペクトルを示す図である。
【図１５Ａ】検出スペクトルに対する目標組織の深さの影響を示す図である。
【図１５Ｂ】検出スペクトルに対する目標組織の深さの影響を示す図である。
【発明の概要】
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、目標化された光学造影剤の存在の有無を問わず、周辺光が存在する場合にインビボ及びリアルタイムで微量の目標組織の迅速な検出、画像化、定位、又は、目標化に対応するために光学検出器又は光学画像化カメラのゲート制御に依存する。
本発明の顕著な特徴は、特定の短い間隔中にのみ到着する光に感応するように検出システム又は画像化システムをゲート制御することによって周辺光を実質的に排除（＞１０4の排除）することができ、また、自然信号又は造影剤影響下目標信号がこれらの短い間隔中により大きな強度で生成された場合、このような周辺光を排除すると結果的に背景信号が低減されて周辺光ノイズに対して目標信号が相対的に強化されるということを認識した点である。
【００１３】
別の顕著な特徴は、目標化された造影剤を使用して、弱いか又は不在の目標信号を強度、特異性、又は、その両方において強化することができ、また、光学システム及び方法を使用してこの強化されたコントラスト信号をゲート式検出と同期して誘導及び検出することができ、従って、やはり目標とする医療処置及び療法中のリアルタイム検出又は画像化を向上させることができるということである。
【００１４】
（発明の目的）
従って、本発明の目的は、周辺光における光学的検出又は画像化を用いて、選択された組織の検出、定位、画像化、又は、目標化を行うためのシステム及び方法を提供することであり、そうではなく従来の非ゲート検出器を使用すれば、非常に暗くされた手術室、容認できないほどの長い集積時間、又は、大規模な平均化及び背景除去を必要とするであろう。
【００１５】
別の目的は、背景周辺光を実質的に排除（＞１０4の排除）して同時に目標信号を比較的保存することにより、結果的に得られる検出光を背景光ノイズの低減に対して目標信号において強化することである。
別の目的は、照明源を検出器ゲート制御と同期化させることができて、短期間の照明を使用する高いピーク照明出力に対して準備し、また、低い平均照明出力を使用した強力な誘導目標信号をもたらすということである。
別の目的は、癌、血管疾患、脈管形成による新血管新生、及び、感染などの微量組織を高感度でリアルタイムで検出及び画像化することができるということである。本発明のいくつかの実施形態においては、インビボ及びリアルタイムで僅か１００個又はそれ以下の細胞を検出することが可能な場合がある。
【００１６】
別の目的は、目標化された光学造影剤を使用して弱いか又は不在組織信号を任意選択的に強化することができて、この目標化された造影剤は、検出器ゲート制御に関連して誘導及び検出することができ、その結果、背景ノイズに対して目標組織信号が改善されるということである。このような光学造影は、内生的組織成分とすることができるか、又は、対象に対して投与されて検出又は画像化に対して十分な分布及び定位を許す期間が与えられた外生的光学造影剤とすることができる。造影剤は、活性的な形態か、又は、代謝的活性化を必要とするプレアクティブなプロドラッグとして投与されてもよい。コントラストは、抗体、抗体断片、蛋白質又は合成ペプチド、又は、受容体類似物質などの目標化部分を通じて理想的に目標化されるか、又は、周囲組織の強化を最小か又は皆無にして信号の大部分が目標組織から生じるように、代謝処理段階を通じて局所的に活性化又は変質させることができる。
【００１７】
別の目的は、周辺光無反応検出器又はカメラ、目標化された外生的造影剤、及び、同期化された照明源を組み合わせることにより、検出された光信号が医療的な意味を持つ領域まで達することを可能にするように周辺光背景信号と比較して特定目標組織に対する信号の十分な強化を生じさせることができることである。
別の目的は、造影剤の特異性及び目標組織を多くの異なる目標組織のメニューから選択して同時に実質的に類似の画像化プラットフォームシステムに留まることができるように、造影剤の目標化部分を造影剤製造中に変更又は変質することができることである。
【００１８】
別の目的は、造影剤の波長及び光学特性を実質的に類似の目標組織及び目標組織感度を保持しながら変更することができるように、造影剤の染料部分を造影剤製造中に変更又は変質することができることである。
別の目的は、目標信号の検出、定位、又は、画像化を用いて侵襲性処置中にフィードバックを供給し、切除処理のような収集又は処置のいかなる処理に対しても制御をもたらすことができるということである。
別の目的は、視覚ガイダンス表示又は正しい配置を知らせる警報ベルを用いるなどして人間の反応を開始することができるか、又は、医療装置に取り付けられた出力信号などを通じて処置が完了した時にインターロックによる決断を開始することができる決断点をこのモニタリングが表すことができるということである。
【００１９】
別の目的は、目標組織に対する侵襲性医療器具の定位を行うことができるということである。この定位は、目標組織までの装置の距離又は方向の判断という形とすることができるか、又は、１つ又はそれ以上の寸法を用いて空間に器具を配置することができる。このような情報は、医療器具を目標位置に誘導することを目的として誘導信号を作成するのに使用することができる。代替的に、定位は、腫瘍、正常前立腺、前立腺カプセル外の残余前立腺細胞のような装置が現在配置されている組織区画の決定、又は、皮膚、筋肉、又は、血管などの組織の種類による決定の形とすることができる。
【００２０】
別の目的は、目標組織の公知の光学スペクトル特性又は配置中に遭遇すると予想される組織（これは、装置又は器具に参照用として記憶させることができる）などの同時的又は演繹的知識、内科医が治療している身体の区域（距離が離れている組織を解析に考慮する必要がないように）、又は、他の医療走査（ＣＴ又はＭＲＩ走査など）からの情報により、システム及び方法を増強することができるということである。この光学的手法は、超音波プローブと標準的な超音波画像上に光学画像の重ね合わせを生み出す光学機器との組み合わせのように、他のリアルタイム手法と組み合わせることができる。このような組み合わせは、構造的（超音波）及び生化学的（光学）画像の両方を同時にもたらすであろう。
【００２１】
別の目的は、解釈し易いように処理された画像、進行を説明する表示された言葉、音色のピッチ又は速さ又は強さの変化を通じて腫瘍の処置の進行を示す可変アラーム、又は、他の表示方法などの幾つかの方法により、検出、定位、又は、画像化情報をユーザが処置又は療法の進行の段階的理解を得ることを可能にする方法でユーザに提示することができることである。
別の目的は、検出システムが、化学療法剤により処置中の腫瘍の成長などの生理学的、病理学的、又は、薬学的処理の非侵襲性モニタリングを提供するために動物実験で使用することができることであり、以下の目標、すなわち、動物使用の低減、データ品質の改善、試験サイクルの短縮、開発費の軽減、及び、ＦＤＡ又は品質管理上の目的及び／又は医薬の研究及び試験の目的でのデータ収集のうちの１つ又はそれ以上を有する。
【００２２】
最後の目的は、骨走査及び癌再発部位に対する奥深い瘢痕組織のスクリーニングのような従来のモニタリング又は画像化システムが特異性を欠くことがある場合に、本発明の精神の範囲内の実施形態を、リアルタイムフィードバックを失う犠牲を払う可能性があっても、人体内に深く埋没している疾患を検出するために比較的に長い集積時間に亘って使用することができるほど、検出又は画像化システムが十分な感度を有するということである。
【００２３】
説明されたシステム及び方法は多数の利点を有する。１つの利点は、本システムがインビボ及びリアルタイムで手術中に室内光で使用することができるということである。別の利点は、微量で存在する組織に対してさえもリアルタイムで画像を生成することである。別の利点は、説明の通り本システムは、プラットフォームシステムであり、目標組織が造影剤製造時点で可変であるということである。別の利点は、本システムは、動物使用量又は動物実験における研究の長さの軽減を可能にすることができることである。最後の利点は、本システムは、集積時間が長くなり本発明のリアルタイムの一面が失われることがあるが、高い特異性により、奥深く埋没した過程の検出のためにインビボで使用する用途を有することができるという点である。
【００２４】
信号を強化する目標化された光学造影剤の有無を問わず、周辺光が存在する場合に組織の光学特性をモニタリング又は画像化するシステムが提供される。一実施例において、本システムは、レンズ及びフィルタを通じて組織に光学的に結合されて手術台上方に配置されたゲートデジタル画像化装置、及び、組織を照明し、ゲートカメラと同期されたレーザ光源を有する。カメラは、組織を通過してインビボで造影剤と相互作用したレーザ光の一部分を検出する。造影剤を使用すると、目標組織からの弱い信号又は不在信号を強化することによって本システムの感度が改善される。ゲート検出器は、造影剤からの信号を残しながら背景周辺光のかなりの部分を排除することによって本システムの感度を改善する。コンピュータは、光源及びゲートカメラを制御し、メモリに記憶することができるゲート検出器からの信号を受信する。画像プロセッサは、コンピュータからの生データを表す信号を受信し、目標組織を識別及び画像化し、医療器具又は療法を体内の特定部位に向けて目標を定め、侵襲性器具の配置精度を判断し、又は、療法進行に関するユーザへのフィードバック信号を供給するのに使用されるコントラスト定位画像を準備する。周辺光が存在する場合に組織内の造影剤を画像化する方法もまた説明される。
本発明の利用及び利点の範囲は、実施例により、また、現在作動中及びモデルシステム、組織培養、及び、動物及び人間において試験された製作装置の作動状況の詳細な説明により最も良く理解される。本発明の上記及び他の利点は、添付の図面、実施例、及び、詳細な説明を参照すれば明らかになるであろう。
【００２５】
定義
本発明のために以下の定義を準備する。
リアルタイム：測定結果に基づく処置又は療法計画の変更を可能にする１０秒又はそれ以下、好ましくは、１秒未満で行われる測定。
対象：哺乳動物、特に人間に重点を置いた生体動物、植物、ウイルス、又は、バクテリア対象。
インビボ：生体対象内の組織に対して行われる測定。
目標組織：検出又は画像化される組織又は細胞の種類。前立腺手術に関しては、目標組織は、手術限界を越えた残余前立腺細胞としてもよい。胸部手術に関しては、目標組織は、リンパ節床に存在する任意の胸部組織としてもよい。
【００２６】
目標組織信号：目標組織に特定の光信号。この信号は、目標化された造影剤を使用して強化することができる。
周辺光：対象に入射する背景光。手術室台上の対象に関しては、周辺光には少なくとも室内光が含まれ、頭上灯、外科医のヘッドバント灯、及び、他の光源を含むことができる。内部的には、周辺光は内視鏡からの光を含むことができる。
ＳＮ比：背景ノイズに対する目標信号の強度の割合。これは、目標信号を改善するか、又は、背景ノイズを低減することによって増加させることができる。本発明においては、主な背景ノイズ発生源は周辺光であるが、他の発生源には、以下のノイズ発生源がコントラストの供給源として使用されない限り、造影剤、検出器、検出器の散弾ノイズ、自己蛍光、及び、他の影響の非特定的結合が含まれる。
【００２７】
誘導信号：電磁輻射の供給源による照明に対象が露出されることによって誘導される信号であり、その輻射と内生的又は外生的なコントラスト供給源との相互作用の直接的な結果である。これには、染料による光の吸収、励起光に応答する生体分子の蛍光又は燐光、又は、外部電磁場に応答する内部レポータからの光の放射さえも含まれる。非誘導信号の例は、蛍におけるもののように発光酵素に基づく過程であり、発光のエネルギは、輻射源に応答するものではなく、生物学的なエネルギ源（生体発光）に基づいている。
コントラスト：背景信号と区別することができる、組織の内生的成分又は外生的薬剤の識別可能及び測定可能な信号。
【００２８】
光学造影剤：光学的照明輻射と相互作用してそれを変質させ、測定可能なコントラスト信号を形成する薬剤。造影剤は、他の組織に対して目標組織部位に差別的コントラストをもたらすことが理想的である。造影剤は、その差別的コントラストを達成するために生物活性化又は生物不活性化を必要とする場合があり、この差別的コントラストは、投与の経路、投与量、及び、投与及び画像化間の時間的遅延に多かれ少なかれ依存するであろう。
発光レポータ：適切な基材と結合された時に、生物発光蛋白質発光酵素などの外部エネルギ源がなくても自然に光を発する薬剤。光源による照明に直接的に応答して光を発するように刺激された生物発光分子は、発光レポータではなく、光学造影剤として機能する。
【００２９】
目標化された光学造影剤：目標化部分を通じて目標組織に優先的に誘導される光学造影剤。この目標化部分は、抗体、受容体類似物質、少なくとも２つのアミノ酸から成る蛋白質又は合成ペプチド、抗体断片、又は、当業技術で公知の他の目標化部分とすることができる。
実質的強化：検出又は画像化が医療的に意味のある領域に到達することを可能にする、周辺光排除及び／又はコントラスト強化後のＳＮ比の強化。手術室での処置に対しては、これはリアルタイムで優先的に行われ、恐らくは最小の周辺光排除及び１０4のＳＮ比の改善を必要とする。通常、これは、１０6から１０8のＳＮ比の改善を必要とすると予想される。
外科用器具：手術実施時に主して組織の切開又は除去、又は、組織の再付着を行うのに使用される装置。
画像化装置：医学的画像を形成する装置。手術中に枕元の上にある画像化カメラ又は手持式画像化プローブは、外科用器具ではなく画像化装置である。
【００３０】
光：紫外線から赤外線まで、すなわち、１０ナノメートルから１００ミクロンの間の波長を有する電磁放射線で、特に２００ナノメートルから２ミクロンの間の波長を有するもの。
光源：光の供給源。単純な電球、レーザ、懐中電灯、又は、別の光源又は光源の組合せから成るとしてもよく、又は、ゲート可能又はトリガ可能な電子機器、光源、フィルタ部材、光ファイバーなどの伝送部材、反射プリズムなどの誘導部材、及び、発光器からの光と検査中の皮膚又は組織との光結合を強化するように意図された他の部材を含む複雑な形態としてもよい。光源は、連続式、パルス式、又は、時間、周波数、又は、空間的に分解されるものとして解析される光源であってもよい。発光器は、単一又は多重発光素子から成るとすることができる。
光検出器：検出器に入射する光に応答して測定可能な信号を生成する検出器。
上述のように、単一又は多重、単純又は複雑なものとしてもよい。光検出は、反射、透過、又は、断層撮影的に行うことができる。集められた光は、透過、吸収、散乱、蛍光、燐光、又は、照明放射の造影剤との他の光学的相互作用に影響された光であろう。検出には、時間、周波数、又は、空間的に分解された測定を含むことができる。
【００３１】
ゲート検出器：集光がゲート制御されることを可能にするように構成された、すなわち、迅速に電源を入切りされる光検出器。周辺光無反応ゲート化システムにおいては、ゲートの主機能は周辺光を排除することである。周辺光排除は、オフ時間対オン時間のゲート制御の比の関数として発生する。このようなゲート制御は、１キロヘルツから１メガヘルツ以上の速度で発生する可能性がある。その例としては、入力ゲート電圧によって入射光子に感応又は無反応となるように構成されたゲート強化ＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラ及びアバランシェ・フォトダイオードが含まれる。
光結合：光源（又は、検出器）からの光が組織に伝達され（又は、組織から検出され）、組織を通る通過及び造影剤との相互作用の可能性を許すような光源（又は、光検出器）の構成。これには、レンズ、フィルタ、溶解繊維エキスパンダ、コリメータ、コンセントレータ、集光器、光ファイバー、プリズム、鏡、又は、鏡面などの光学部材の使用を必要とする場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
ここで、本発明のシステム及び方法の一実施形態について説明する。本システムは試験済みであり、一実施形態の説明の後にシステムの実施例が提供される。
図１に示す装置又はシステムにおいて、光は、高強度パルス光源１０５（この場合、７４２ナノメートルパルスレーザ、型番ＬＤＸ−３１１５−７４０−ＨＨＬ、ＬＤＸオプトロニクス製、米国テネシー州メアリービル所在）によって放射される。光源１０５は、内蔵ビーム成形光学装置（様々な円筒状成形レンズ、エドマンド・サイエンティフィック製、米国ニュージャージー州バリントン所在）を有し、光を光結合器１１３に通して、結合器１１３からの光を使用して対象１３３の組織領域１３１を照明する。結合器１１３は、光ファイバーとすることができるか、又は、照明光源１０５と組織領域１３１との間の空域とすることができる。領域１３１は、目標組織１３７の細胞を含む。目標組織１３７は、組織１３７を通して分布されて図２の画像１９４内で蛍光を発するように示されている光学造影剤でラベル付けされる。再度図１を参照すると、ゲート検出器１４５（Ｇｅｎ−４ゲートＩＣＣＤカメラ、「Ｉ−ｍａｘ  ６１２／Ｄ」モデル、ローパー・サイエンティフィック製、米国ニュージャージー州トレントン所在）は、変更光が光結合器１４０及び高効率帯域通過フィルタ１４１を通過した後に変更光１４４を対象１３３から受信する。フィルタ１４１によりレーザ光を実質的に阻止することができ（約１０6〜１０8）、室内光の大部分も阻止することができる（＞９０％）。任意選択的に、フィルタ１４１は、Ｎ個のフィルタを使用して構成することができ、そのいずれか１つは、複数の染料に対する感度又は組織領域１３１内の染料放出の深さに対する感度を生み出すように検出器１４５の前に配置することができる。
【００３３】
検出器１４５及び光源１０５の両方は、コンピュータ１８１によって制御されているタイミング発生器１５６にケーブル１５７、１５８、及び、１６８を通じて結合される。コンピュータ１８１は、光源が対象内に信号を引き起こした時に限り光を集めるように検出器１４５をトリガし、従って、高レーザ電力が頻繁に使用されないように準備する。これによって２つの目標が達成される。第１に、統合された測定期間は短く、その結果、周辺光の大部分が除外される。第２に、弱い誘導信号の強度が最大化され、その結果、信号の強度が改善される。コンピュータ１８１による検出器１４５のトリガは、光源１０５によって与えられる照明と同期させてもよく、又は、信号改善のために信号減衰動力学を利用するように僅かに遅延させてもよい。
【００３４】
代替的に、光源１０５は、短い測定時間に加えて非常に低い周辺光の背景でデータをナノ秒単位で収集することができる十分な電力を有するような「アレキサンドライト」レーザ（「ＬＡＩ−１０１」モデル、ライト・エージ製、米国ニュージャージー州サマーセット所在）のような非常に明るい光源であってもよい。
また、光源１０５は、ファイバー結合又はレンズ結合され（自由空間ではなく）、検出器と共線的か又は当業技術で標準的な他の変更を施されたＮ個の多重光源１０５Ａ〜１０５Ｎ（様々な波長を有する異なるダイオードなど）で構成してもよい。任意選択的な基準ファイバー１６９は、光源１０５の光学特性をモニタリングする時に使用される組織又はサンプルを迂回する。同様に、検出器１４５は、Ｍ個の多重検出器経路１５１Ａ〜１５１Ｍであってもよい。
【００３５】
目標グリッドは、グリッドレーザ１７３を使用して組織フィールド上に投射することができる。レーザ１７３からの光は、ホログラフィックフィルタ１７５を通過し、外科医が見ることができるほかグリッドレーザ１７３がオン時に画像内で見ることができるグリッドを創出する。このグリッドは、ユーザが組織上でみるものをユーザに表示されるどの画像でも見られるものと共に視覚的に同時登録する方法を提供する。このような定位グリッドは、外科医がビデオ画面上などの出力装置上に提示された画像にリアルタイムで応答する上で必須のものであろう。
【００３６】
検出器１４５からの未処理（生）画像は、リンク１６７を通じてコンピュータ１８１制御下でダウンロードされ、ケーブル１８３を通じてメモリ１７４に記憶される。多数の生画像をメモリ１７４に記憶することができ、後の統合、平均化、背景除法、エッジ検出及び鮮鋭化、及び、機器応答又は表示改善のための他の画像修正技術を可能にする。また、メモリ１７４は、画像化されて後で比較される組織の多重領域を可能にする。各生画像は、コンピュータ１８１制御下でリンク１８３及び１８５を通じてコントラスト画像処理エンジン１８４に通され、生画像は、そこで処理され、解析され、組み合わされて、造影剤の分布及び定位の尺度である出力をもたらす。
【００３７】
ここで、処理エンジン１８４について以下で検討する。エンジン１８４による造影剤１４１の定位及び分布の判断は、解析ルーチンを有して構成され、収集されたデータに基づいて造影剤の定位及び分布の尺度を提供するように配置されたコンピュータによって行われる。しかし、エンジン１８４はまた、組織又はコントラストの位置出力を提供するように構成された計算機又は他の装置とすることができるであろう。上述のように、コンピュータ１８１は、エンジン１８４で使用されるものとは異なるコンピュータであってもよいし、同一のコンピュータを両方の機能に使用してもよい。この好ましい実施形態においては、処理エンジン１８４は、２つの機能、すなわち、画像処理及び統計解析を行うように構成されたコンピュータである。
【００３８】
画像処理に関して、エンジン１８４は、ａ）対象画像と呼ぶ、室内光でユーザに表示された時の組織領域１３１の画像、ｂ）照明画像と呼ぶ、ソースレーザ１０５がオン時の領域１３１のゲート制御画像、及び、ｃ）背景画像と呼ぶ、ソースレーザ１０５がオフ時の領域１３１のゲート制御画像を収集する。対象画像は、試験される組織の位置に対してユーザを方向付けるのを助けるため、また、任意の特定された目標組織の位置を識別するために使用され、一方、背景画像は、背景修正サンプル画像と呼ぶ背景修正組織画像を生成するために、光源１０５からの光がない場合に背景信号に対する照明画像を修正するのに使用される。各画素において背景画像の値を照明画像内の各画素から差し引くことにより、エンジン１８４は、コントラストマップを生成する。照明画像及び背景画像の各々は、当業技術において知られている手法を使用してエンジン１８４によって統合、円滑化、平均化、又は、蓄積することができる。代替的又は追加的に、反復する対象画像及びサンプル画像は、複数のゲート制御及びレーザ照明期間中にＣＣＤチップ自体において収集及び統合することができる。このことは、ＩＣＣＤから読み取られたノイズの相対的大きさを低減し、実施例２から実施例５までに使用された。別個の画像が各パルスで収集された場合、これらの画像の加算は、複数の収集期間及び複数のレーザパルスの間にエンジン１８４によって数学的に行うことができる。サンプル及び背景画像の収集は、連続的に発生してもよく、又は、複数のサンプルは、連続する画像収集の各々でレーザを交互にオン／オフすることで平均化のために交互配置してもよい。この処理手法に、エッジ検出、画像鮮鋭化、又は、フラットフィールド修正（後者は、不均一な照明及び反射の影響の低減に使用される）などの標準的な画像処理手法を追加することができる。例えば、画像は、画像の不規則ノイズの大部分を除去するために、画像標準偏差の調節可能な倍数においてクリップすることができる。
【００３９】
図２に示すように、エンジン１８４は、次に、コロニー化された背景修正組織画像及びグレースケール室内光対象画像を取り、これらの２つの画像を１つの画像に融合する。これを達成するために、対象画像１９１は、最適なコントラストが得られるようにスケーリングされ、グレースケール画像１９３に変換される。
背景修正組織画像１９４は、処理及びスケーリング後に疑似色画像１９５に変換される。画像１９３及び１９５が融合された時、結果的に得られる表示画像１９７は、目標組織の位置、深さ、及び／又は、細胞数を示すカラー組織画像によって重ね合された患者の白黒画像（グリッドレーザ１７３が対象画像収集中に使用された場合は可視グリッドで）を示す。画像１９７の色は、１平方センチメートル当たり１００個を超える癌細胞を有する細胞の集まりを示すなどの定性的のものか、又は、その特定画素に関して１平方センチメートル当たりの癌細胞数又は目標信号の平均深さを示すなどの定量的なものとしてもよい。
任意選択的に、エンジン１８４は、実施例１０で後述するように、信号深さを判断するために造影剤からの分光信号を使用してもよい。これは、組織が不均等に光の異なる波長を散乱させるので可能である。また、エンジン１８４は、種類別に組織を識別するために、造影剤からの分光信号又は近くの組織からの自然信号を使用することができ、これを行う方法は当業技術で公知である。
【００４０】
エンジン１８４が光源１０５内のあらゆる勾配又はホットスポットに対して修正を行うために、次に、レーザからの照明だけの画像を手術前に収集し、上述のように背景に関して修正された照明分布画像を生成することができる。代替的に、予め選択された波長での反射強度を使用して反射率画像を作成してもよい。その後、背景修正組織画像の各強度点は、背景修正照明分布画像の対応する強度点で割算され、照明修正組織画像を生成することができる。
【００４１】
統計処理に関しては、エンジン１８４は、組織領域１３１に位置する目標化された造影剤によって生成された信号のような（もしあれば）誘導信号の位置、存在、数、深さ、及び、画像の識別に必要な統計的処理段階を実行する。照明、背景、背景修正組織、及び、コントラスト画像に関して計算された統計値には、平均値、標準偏差、検出信号の統計的有意性、ＳＮ比強化、及び、腫瘍容積などが含まれる。最終画像内のノイズに対する指定上限値でのクリッピングは、実施例４に示すように小さな癌を見ることを可能にする。
【００４２】
コントラストの定位は、判断に至るために一組の判断基準（１つ又はそれ以上の波長での蛍光強度、２つ又はそれ以上の波長での強度比、スペクトルの一次微分、又は、分類上の決定を下す元となる閾値などのスペクトル又はスペクトルの特徴）に対する計算的比較を用いることにより改善することができる。このような基準値は、スペクトルの意味のより良い理解に到達するように経時的に更新することができ、各センサがある特定の組織セットに関して又はある特定の診断手続きに関して較正された状態になるようにセンサ自体に組み込むことさえできる。これらの基準値をセンサに組み込む１つの方法は、画像化装置の回路内への読出し専用メモリ（ＲＯＭ）チップの搭載であろう。同様に、当業技術で公知のように、識別は、背景修正及び機器応答機能の修正によって改善し得る。蛍光測定及びスペクトル解析の公知の手法は、それらが周辺光においてインビボの目標化された造影剤の位置及び分布の尺度を判断するのに使用される時は常に、特に人間の組織などの散乱媒体内の腫瘍の位置を判断するのに使用される時は、本発明の範囲に該当する。また、このような目標化及び定位には、組織の化学的、物理的、又は、受容体に基づく解析を可能にする方法を含むことができ、光学データのヘモグロビン、水分、及び、脂肪などの濃度への分解を可能にする。このような識別を使用して、癌、神経、動脈、血管、リンパ節、白血球、及び、筋肉などの体内の組織を特定することができる。
【００４３】
更に、コントラストエンジン１８４は、任意の時間に使用されている１つよりも多い造影剤を検出できるように構成することができ、従って、実施例９に示すような二重又は三重のラベル付け検査における場合のように、複数の造影剤を使用することができる。このような場合には、目標は、１つよりも多い目標化された特徴の同時の存在を表示するか、又は、他ではなく１つの目標化された特徴を表示する組織としてもよい。また、単一又は複数の造影剤を使用して、実施例１０に示すように信号の深さも同じく測定することができる。
【００４４】
画像解析の結果はコンピュータ１８１に伝えられ、コンピュータはそれに応答して出力１９５を生成する。ここで、出力１９５について更に詳しく検討する。
出力は、ユーザが造影剤の分布及び定位に関する情報を取得することを可能にする予め処理された信号である。好ましい実施形態において、出力は、目標組織の存在、位置、程度、及び／又は、深さを示す色の重ね合わせと組み合わされた組織の白黒室内光画像から成る融合画像である。この表示は、絶対的な表現（例えば、正確に配置されているか否か）、又は、相対的な表現（処置される組織からの距離及び角度）のいずれかで目標組織の位置、分布、及び、深さと、その目標組織に対する近くの任意の手術器具の相対位置とを示すことができる。検出された信号に基づいた造影剤の分布及び定位の尺度であるこの計算結果が出力１９５である。
【００４５】
好ましい実施形態の本説明において、コンピュータ１８１は、対象画像及びコントラストマップを融合してユーザに示されることになる表示画像を生成する。
しかし、この結果は、診断上の分類（実施例１に示すような特定の造影剤又は目標組織の有無など）、表（実施例２、３、及び、９に示すようなピーク目標強度、平均目標強度、背景ノイズ、ＳＮ比、検出信号のｐ値、又は、１つ又はそれ以上の造影剤又は目標組織の存在など）、グラフ（実施例１及び２に示すような時間又は距離に亘る造影剤又は目標組織の有無など）、数字（実施例１及び２に示すような造影剤又は目標組織までの距離、又は、ピークコントラスト強度など）、画像（実施例１から５までに示すような造影剤の位置、分布、及び、深さと、歩哨節などの目標組織など）、処置の終了を示すフィードバック信号、又は、ツールの作用を停止するインターロックとしてもよい。
【００４６】
システム作動の説明
予定された処置又は療法の約７日前、対象１３３は、抗体を目標にした造影剤の静脈注射を受ける。注射と画像化のこの時間差は、オクトペプチドなどの小さい分子を使用した時の方がかなり短くなる可能性があり（数分から数時間まで）、同じく染料が局所活性化を必要とする時の方が短くなる場合もあり、その結果、本システムで検出不可能な目標組織に到達しなかった循環するコントラストをもたらす。どちらの種類の目標化分子が使用されても、造影剤は、インビボで必要な目標細胞に対して測定可能なコントラストをもたらすように選択される。この実施形態において、染料は、抗体と共有結合的に結合された蛍光分子「Ｃｙ７」（Ｎｙｃｏｍｅｄ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製、英国バッキンガムシャー所在）である。注射後であるが画像化前の期間において、造影剤は、目標組織に集中することによって体内で十分な分布及び定位に到達し、かつ、新陳代謝又は他の場所で排泄されるための十分な時間を有する。このようにして、造影剤は、目標組織部位対他の組織に関して異なるコントラストを提供し、目標組織からの信号を強化する。
【００４７】
対象１３１が手術台上に載った状態で、説明された画像化システムに電源が投入される。画像収集開始時に、光源１０５は電源オフのままである。初期対象画像で可視となる目標グリッドを投影するようにグリッドレーザ１７３に電源が投入される。長い集積時間を掛けて、周辺光を使用して対象画像を収集する。代替的に、グリッド画像及び対象画像を個別に収集し、その後に単一の対象画像に融合してもよい。この対象画像は、コンピュータ１８１によってメモリ１７４に記憶される。後の時点で、対象及びグリッドのこの画像は、検索されて白黒で表示されることになり、コントラストマップの色の重ね合わせは、特定された任意の目標組織の位置、深さ、及び／又は、細胞数を示す。
【００４８】
次に、コンピュータ１８１は、光源１０５からの光をトリガして対象１３３の組織領域１３１を照明する。レーザ光源１０５は、１００ナノ秒間に亘ってパルスを送る。また、実質的に同時に、検出器１４５は、１００ナノ秒間に亘ってゲート制御され、光源１０５による組織領域１３１の照明と同期する方法でカメラが得られた誘導信号を収集することを可能にする。この実施例において、光源１０５及び検出器１４５のトリガは実質的に同時であるが、幾つかの実施形態に関しては、検出器１４５のゲート制御は、目標信号の最大化及び／又は背景ノイズの低減のために、光源１０５よりもタイミング的にオフセットされるか、又は、異なる長さの時間に亘ってオンにされる必要があるであろう。画像は、サンプル画像として蓄積され、コンピュータ１８１によってメモリ１７４に記憶される。
【００４９】
次に、第３の画像は、グリッドレーザ１７３がオフ、及び、レーザ光源１０５がオフの状態で背景画像として収集される。この画像に関しては、光源１０５は、検出器１４５が１００ナノ秒間に亘ってゲート制御される間オフのままであり、その結果、この場合はカメラであるゲート検出器１４５は、対象画像収集中に使用したものと類似のタイミングを用いて領域１３１から背景画像を収集することができる。背景画像は蓄積され、コンピュータ１８１によってメモリ１７４に記憶され、後の時点で背景修正サンプル画像の生成に使用される。代替的に、背景光は、背景画像の収集及びサンプル画像の背景修正が安全に省略し得るほど弱いとしてもよい。
対象画像及びサンプル画像は、それぞれ可視グリッドの有無を問わず、また、背景修正の有無を問わず、次に、上述の通り色の重ね合わせが目標組織（もしあれば）の存在、位置、細胞数、及び／又は、深さを示す対象の白黒画像を生成するように融合される。この融合されたコントラストマップは、出力装置１９５で表示されるようにコンピュータ１８１に送られる。
【００５０】
この実施例は、蛍光造影剤の使用を示している。しかし、他の特徴を使用して、コントラストでラベル付けされた組織１３７の位置を得ることができる。例えば、造影剤は吸収性染料であってもよく、光源１０５は、多数の波長で放射する広帯域スペクトル光源とすることができ、一方、ゲート検出器１４５は、戻り光のスペクトル分布に感応するように構成することができる。染料の深さ判断の例を実施例１０に示す。このようなスペクトル的分解検知法の技術は公知であり、標準的な分光測光法、超スペクトル画像化、時間分解分光法、周波数領域分光法、蛍光寿命、及び、他の手段が含まれる。測定される特徴は、強度、波長、時間的経過、平均光学距離、周波数シフト、分極化、及び、旋光度などの任意の光学的測定値とすることができる。このような手段が不透明又は散乱組織上又は組織内での使用と結びつき、また、周辺光を排除することを目的としてゲート画像化システムの使用と結びつくことを条件として、このような代替手段は、本発明の精神の範囲内である。
【００５１】
上述のように、検出システムは、非侵襲性又は侵襲性であってもよく、また、医療装置に組み込まれてもよい。非侵襲性検出器の例は、組織の表面を貫通するのではなく、組織の表面の上方から画像化するように構成されたカメラである。
この場合、検出器１４５及びレーザ１０５の両方は、対象１３３からある距離だけ離れた位置に配置されてもよく、画像は、図３Ａに示すように検出器１４５が画像化カメラ２４５である場合で示す上述の画像化アルゴリズムを使用して再構築される。代替的に、レーザ１０５又は検出器１４５、又は、その両方を組みたて、図３Ｂに示すように組織領域１３３の組織表面２５７に接触させて配置されたプローブ２５５などの医療又は手術用プローブにすることができる。侵襲性検出器の例は、発光素子、検出素子、又は、その両方が医療プローブ、ニードル、又は、カテーテルに組み込まれ、その後、しれらが体内で内部的に使用される場合であろう。このような場合、測定の再現性を助けるために、組織に対してファイバーを安定させることが肝要であろう。侵襲性システムの例は、図３Ｃに示すように、結合器１１３としての発光器ファイバー、結合器１４０としての検出器ファイバー、注入ポート２６２、及び、切端２６７を有するニードル２６０である。図３Ｄに示すようなカテーテル２７０は、拡張可能なニードル２７２がワイヤ２７３によって制御され、注射器取付ポーチ２７５を有し、結合器１４０としての発光器ファイバー１１３及び検出器ファイバーがニードルの中に内蔵される（ニードル２６０に関して示したものと類似の方法で）。複数の発光器ファイバー１０５Ａから１０５Ｎ及び複数の検出器ファイバー１５１Ａから１５１Ｍが画像化に対応するために外科用メス２８０の切端２８３に内蔵された外科用メス２８０を図３Ｅに示す。結合器１１３としての発光器ファイバー及び結合器１４０としての検出器ファイバーが、コントラストでラベル付けされた組織を同時にモニタリング及び除去するために、それぞれジョー２９２及び２９３に内蔵されたニブラー２９０を図３Ｆに示す。このような複数の発光器及び検出器ファイバーは、図３Ａの画像化カメラ２４５を組織と直接的に結合する光学画像化素子を生み出すように束ねることができ、ある距離にあるレンズを使用して達成可能な結合効率を遥かに高めることができる。外部画像化装置は、進行中の観血療法処置をリアルタイムでモニタリングする場合に便利であり、一方、外面プローブは、例えば、リンパ節切除直前に初期介入部位を特定し易いように利用することができ、その結果、瘢痕が小さくなり病気死亡率が下がる。最後に、内部ニードル又はカテーテルは、状況を探し当てて処置するのに使用される侵襲性又は最小限侵襲性のツールに対するフィードバックを提供することができるであろう。
【００５２】
検出器、光源、又は、その両方は、進行中の組織測定、及び、出力１９５に基づいたフィードバック又はインターロック制御をもたらすために侵襲性器具に作動的に結合されてもよい。例えば、ニードルプローブは、組織を測定し、かつ、計算又は絶対閾値レベルを上回るコントラスト信号の上昇によって示されるような注入の適正位置に達するまで組織をモニタリングするニードル２６０（図３Ｃ）、又は、組織内に残るコントラスト信号が消えるまで腫瘍を削り取り除去するニブラー２９０（図３Ｆ）のようなコントラスト検出又は画像化装置からのフィードバックに基づいて適正な組織が識別された時に治療物質を注入するように設計することができる。削り取りプローブ２９０は、モールスレーティング・ジョーを使用して組織を除去し、洗浄及び吸入チャンネル２９６がジョー２９２及び２９３を取り囲んでいる。組織がコントラストを含有すると識別された場合、その組織は、小さなモールスレーテッド片として除去される。このように、切除の境界部は、疾患がない状態にされて、同時に正常な組織をできるだけ安全にそのまま取っておくことができる。これは、光学コントラスト誘導に基づく最小限侵襲性外科的処置を可能にするであろう。例えば、胸部プローブを使用して胸部腫瘍を小さな穴を通じて削り取り、侵襲性処置を最小限侵襲性の乳腺腫瘤摘出に変えることができる。代替的に、ジョー２９２及び２９３は、除去ファイバー、組織ホモジナイザー、又は、他の手法などの他の組織除去機構と置き換えることができる。表面走査法はまた、外部的に使用されるバンド、ディスク、又は、パッチを含む場合がある。
【００５３】
外科用器具が目標組織に向かって誘導される場合、基準データベースは、プローブ位置及び／又は配置精度の判断に使用するために、メモリ１７４内に内部参照用として記憶されるか、又は、プログラマブルプローブメモリ内に含めてメモリ１７４に伝送することができる。基準データベースは、造影剤と他の信号との区別に使用される主要な特徴など位置決定をするのに必要な様々な情報を含み、また、任意選択的には、以前に識別された組織からの特徴的な差別的形態のライブラリを含むことができる。このデータベースの情報は、その後、エンジン１８４によりカメラ又はプローブ位置の判断に使用される。
【００５４】
注意する点として、非侵襲性又は侵襲性システムからの光が組織内を貫通する時、光源と光検出器との間を伝わる光子は広範囲な経路を辿る。本装置は、散乱が平均化及び容積サンプリング機能をもたらすためにこの効果を利用する。検出された照明が、光子が放射された時間とその後に検出された時間との間に組織を通った実質的に非平行多重経路に亘り組織を通って伝播した後で測定された時、単に放射と検出との間の狭い線上の組織だけではなく、組織の多くの領域をサンプリングすることができる。これは、小さな腫瘍などの小さいが重要な形態を検出することを、それが光源と光検出器との間にちょうど存在する線の外側で発生した場合でさえも可能にする。
【００５５】
実施例
本発明の利用範囲は、実施例によって最も良く理解されるが、そのうちの１０個の実施例が以下に与えられる。これらの実施例は、決して本装置の全ての用途及び応用を含むことを意図したものではなく、単に当業者がこのような装置を利用する方法又はその範囲をより良く理解できる事例研究として役立つように意図されている。
実施例１：数学的シミュレーション
光学カメラシステムをゲート制御する効果をモデル化するために、その目的にために開発されたコンピュータモデルを使用して組織及び癌に関する光学のシミュレーションを行った。このモデルは、手術室の測定された光レベル、露出した人間の組織からの測定された光の反射、光学コントラスト及びフィルタ特性、及び、公知の収集損失及び測定収集損失の両方に関するデータを組み込んでいる。
手術室にはかなりの背景光がある。手術室内の人間の皮膚が測定され、最大３ミリワット／平方センチメートル、又は、約１０14光子／秒／平方ミリメートルの典型的な放射照度を得た。この背景反射光における標準偏差又はノイズは、光子カウント値の平方根に関連し、つまり、１秒の測定に対して約１０7光子である。
【００５６】
ここで、特定の細胞表面の受容体を目標にした造影剤の結合を使用してマーキングされた球形の幅１ミリメートルの腫瘍を考察する。このような腫瘍は、恐らくは約１００，０００個の腫瘍細胞を含む。大部分の腫瘍細胞は、細胞当たり１０5から１０7のコピーの濃度で表される表面受容体を有する。核医学用（放射能でラベル付けされた）薬剤での経験から、抗体の１，０００から４，０００コピーに造影剤を加えたものを静脈注射によって各細胞に妥当に供給できることが明らかになっている。この数字は、アミノ酸ニ量体（２種類のアミノ酸を有する）から十量体（１０種類のアミノ酸を有する）までのような小さなペプチドを使用して目標化された薬剤に対してはおそらくもっと大きいであろう。最悪の事例として抗体を目標にした染料の事例を使用して、１から２０個までの間の蛍光染料分子が、ＩｇＧ又はＩｇＭ型の各抗体上に、ＩｇＧに対して抗体当たり染料分子が２〜４個の通常範囲で配置された。４染料分子／ＩｇＧ抗体及び１細胞当たり２，５００抗体が供給されたと仮定すると、これにより、細胞当たりに供給された１０，０００染料分子がもたらされる。１ミリメートルの腫瘍の場合、これは、１立方ミリメートルの球に総数１０9染料分子、又は、３．２ナノモルの染料になる。
【００５７】
室内光において、平均電力１ミリワットを有するＣＷ（連続波）ダイオードレーザ、及び、０．２８の量子効率を有する染料による付加的照明の下で、これらの分子は、３×１０8光子／秒を放射するであろう。これは、室内光と比較すると不十分であり、室内光は、染料信号を大きさの桁数で５桁以上上回るであろう。信号及びノイズにこのような格差があると、収集された１，０００，０００個の周辺光子の各々に対して５０個の染料光子しか検出されないであろう。このような状況では、１２ビット強化カメラは、染料光子を何も検出しない前にオーバーフローしてしまい、一方、高品質１６ビット強化カメラは、僅か３個の染料光子を検出すればオーバーフローすることになる。これらのカメラのいずれに関しても、１ミリメートル幅の目標球は確実には検出されないであろう。尚、周辺光子と染料光子との間のこの格差により、ＳＮ比の改善が行なわれていない場合に、周辺光における背景除去も効果的でなくなることに注意する必要がある。
【００５８】
ＳＮ比を改善させる２つの重要な方法は、ａ）弱い目標信号を保存しながら強い周辺光を実質的に排除すること、及び、ｂ）インビボで弱い又は不在目標信号を強化することである。これらの方法のいずれか一方又はその両方を使用した改善は、ノイズと比較した時に信号が十分に強化された測定（＞１０4、又は、恐らく１０6〜１０8）を直ちにもたらすことになり、手術室の条件下における人体への使用に対して最適化されたリアルタイム光学システムに向けた貴重な一歩となるであろう。
【００５９】
以上を考慮して、短いレーザパルス幅及び狭いゲート時間をゲートカメラと併用することができる。これにより、検出周辺光を毎秒１マイクロ秒ゲート当たり１×１０8光子／秒／平方ミリメートルに減じるか、又は、毎秒使用された１０ナノ秒ゲート当たり１×１０6光子／秒／平方ミリメートルまでにさえも減じることができる。上述の実施例において１秒間に亘って供給されるのと同じ総数の照明光子をゲート期間に亘って供給することができる場合、検出信号が背景光子に対して目標光子において強化されることになり、目標組織は、何の平均照明出力を上げることもなく十分に検出される。更なる室内光を遮断するために狭帯域フィルタを追加することにより、検出可能（ゲート制御）室内光を僅か２×１０4光子／秒／平方ミリメートル、つまり、目標蛍光の強度をかなり下回る数値まで減少させることができるであろう（しかし、ゲート制御なしのフィルタだけの使用では、目標信号を十分に検出するには不十分であると思われる）。
【００６０】
ここで、幅１ミリメートルではなく幅１００ミクロンの腫瘍を考察する。１００ミクロンの腫瘍は、１ミリメートルの腫瘍の０．１％に当たる容積を有する。
ゲート制御なしの周辺光において、３×１０5光子／秒の１００ミクロン腫瘍からの信号は、周辺光カウントの標準偏差さえもかなり下回り、ノイズの中に失われることになる。これとは対照的にこの低レベルの光は、ゲート検出器を使用した時には周辺光を上回ったままの状態に留まる。
【００６１】
組織の公知の光学特性、２ミリワット／平方センチメートルのピーク反射放射照度及び１ミリワット平均照明出力を有する公知の周辺光レベル、及び、カメラ光子捕捉及びレンズ透過からの予想損失を用いた、１００ミクロン腫瘍の光学画像のコンピュータ生成シミュレーションが示されている（図４Ａ）。この画像において、１００ミクロン腫瘍である腫瘍３０７は、１秒の集積時間を用いてはっきりと見ることができる。図４Ａの腫瘍３０７を通る断面によって判断される予想光子カウントの背景修正グラフを図４Ｂに示す。カメラ及びレンズからの収集損失（捕捉及び透過の０．０３％）の後、反射周辺光画像は、平均値±１標準偏差である５２１±２３カウント（ｎ＝３，１３６画素）を有し、これは、背景除法後は１±３２カウントに落ちる。比較すると、背景除法後の周辺光における腫瘍は、腫瘍光ピーク３１３で示すように、１３６±３６カウント（ｎ＝１６画素）の値を有する。これらの２つの領域は、統計的に異なるものである（ｐ＜０．０００１）。このモデルは、僅か１００個又はそれ以下の細胞が、１秒に亘る周辺光において合計１０ナノ秒ゲート制御時間を使用してリアルタイムで検出可能であることを予想する。
【００６２】
実施例２：実際の画像化システムによるコンピュータモデル予測の確認
実施例１に示したコンピュータモデルを使用して生成した画像の有効性を試験するために、好ましい実施形態の下で説明されたような現用ゲートカメラ及びレーザシステムが作製され、腫瘍モデルに関してこのシステムが試験された。
この実験において、薄暗くした部屋の反射背景光は、０．３７５ナノワット／平方センチメートル、すなわち、７５００万光子／秒／画素に調節された。このレベルの光は、手術室で見出されるものを十分に下回るが、ゲート制御の使用を通じて達成された改善を確認するためにゲート制御及び非ゲート制御の両方のモードでカメラを試験するという希望から低レベルの周辺光が必要であった。より明るく照明した部屋においては、その周辺光は、カメラをオーバーフローさせてしまい、周辺光においてゲート制御及び非ゲート制御の両方でＳＮ比を比較することを困難にしたであろう。
【００６３】
腫瘍モデルに関しては、ピークＬＥＤ波長で較正されたＥＸＦＯ光度計を用いた国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）による公知の光子数を放射するファイバー型発光ダイオード（ＬＥＤ）システムが作製された。２００ミクロン・コア／２４０ミクロン・クラッド緩衝の「ＮＡ０．３７Ｖｉｓｉｂｌｅ／ＮＩＲ」光ファイバー（ポリミクロ製、米国アリゾナ州フェニックス所在）からの１００万光子／秒、又は、コントラストによってラベル付けされた１２５ミクロン染料ラベル付け腫瘍から予想されるほぼ同数の光子を発するようにファイバー光源が調節された。試験カメラ内のＣＣＤチップは、５１２×５１２画素として構成され、ｆ／０．８「ニコン」レンズを使用する画像視野は、１５センチメートル×１５センチメートルであった。従って、画像内の各画素は、３００ミクロン×３００ミクロンの視野を表す。これらの状況において、ファイバーの画像内の光の大部分は、約４つの画像画素に入るはずである。
【００６４】
カメラは、較正されたモデル腫瘍光源の先端を画像化するように焦点が合わせられた。４つの画像の各々について、「腫瘍オフ」背景サンプルは周辺光でのみ撮影され、「腫瘍のみ」画像は、周辺光がない状態でＬＥＤを使用して収集され、最後に「腫瘍オン」画像が周辺光で収集された。試験画像を生成するために、腫瘍オフ背景画像が、腫瘍オン周辺光画像から差し引かれた。これらの試験画像は、手術室の状況を再現し、その場合、周辺光ではなく照明光源の電源を入り切りすることができる。更に、腫瘍のみ画像は、画像化モデル計算の確認ができるように予想光子数と検出光子数との比較を可能にした。
【００６５】
各画像セットについては、ゲート時間は、３００ナノ秒から始まって１０マイクロ秒、１００マイクロ秒、１ミリ秒と段階的に上がり、最後にはゲート制御なしで１秒間完全に開くように上げられた（ＣＷ）。各画像は、１秒間に亘る合計１００回の可変カメラゲート制御時間を用いて正確に１秒間に亘って収集された（１０ミリ秒ゲート制御を用い、従って１００×１０ミリ秒、又は、毎秒１秒オンタイムに亘って収集され、これにより毎秒受信した全ての光子が収集された完全開放画像を除く）。画像化中、光源は１００パルス／秒に分割され、各パルスは２０ナノ秒続き、その結果、腫瘍モデルは、カメラのゲート制御オン時間中に一定の総数の光子を放った。このようにして、ゲートが開いていた間に検出器に到達した腫瘍モデル光子の数は試験間では変動せず、一方、検出可能な背景光子の総数は大きく変動した。各画像は収集するのに１分を必要としたが、一方、表示は収集後にほぼ瞬時であった（＜１００ミリ秒）。
この実験からの４つの画像を図５Ａから図５Ｄまでに示す。ゲート制御なし（ＣＷモード、図５Ａ）及び１００マイクロ秒ゲート制御（図５Ｂ）では、腫瘍信号を見ることはできず、一方、腫瘍画像３７５は、１０マイクロ秒ゲート時間でちょうど見えるようになり（図５Ｃ）、腫瘍画像３８１は、３００ナノ秒ゲートではっきりと見ることができ、かつ検出可能である（図５Ｄ）。
【００６６】
図５Ａから図５Ｄまでに示す画像は、画素カウントに変換され、グラフにプロットされて統計的に解析された。図５内の画像のうちの３つの各々を通る線形断面の画素強度を図６Ａから図６Ｃに２次元図形の形で示す。腫瘍は、ＣＷ画像に対して表示されたカウントでは見ることはできず、一方、腫瘍ピーク４１０は、図６Ｂに示す１０マイクロ秒断面で見ることができ、腫瘍ピーク４１６は、図６Ｃに示すように０．３ミクロングラフで見ることができる。腫瘍のみ画像（図示せず）は、類似の数の光子が各設定で検出可能であったことを確認するために、ＩＣＣＤによって測定されたレーザ信号の強度の測定に使用された。下表（表１）は、図５Ａから図５Ｃまでに示す３次元画像及び図６Ａから図６Ｃまでのグラフプロット、及び、図示されていない画像の画像統計データをまとめたものである。
【００６７】
（表１）異なるゲート制御時間で周辺光において画像化された、インビボで染料タグ付き腫瘍に対して予想された光レベルを発する腫瘍モデルのカメラカウント。ゲート制御なし（ＣＷモード）及び１０００マイクロ秒ゲート制御では、腫瘍信号は統計的には検出可能ではないが、１０マイクロ秒及び０．３マイクロ秒ゲート制御でははっきりと見ることができ、かつ検出可能である。
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【００６８】
実際には、腫瘍モデルから収集された光子総数は一定であることを意図していたが、表１の短いゲート時間でのより低い目標信号カウントで示すように、信号の減少が短いゲート制御時間で認められた。これは、電力低減中の較正された光源の１マイクロ秒放出「テール」によるものであることがわかり、これは、ゲート制御時間が短くなりにつれてだんだんとクリップされて消失し、その結果、低い目標信号カウントが生じた。収集されたデータに関しては、このテールは、実際に上記の結果をさらに顕著なものにしているが、それは、強度が小さくなった目標を使用することによって生じた誤差が、短いゲート時間では腫瘍の検出可能性を上げずに下げただけであると思われるからである。
【００６９】
次に、腫瘍モデルの検出可能性が評価された。５１２×５１２画素画像においては、２５６，０００個の画素がある。腫瘍が検出される場合には、約１個から４個までの画素のみを満たす２００ミクロン腫瘍を検出するために、画像全体の数個の画像のみを腫瘍としてマーキングすることができる。これが発生するためには、腫瘍閾値は、背景を上回る５．０７Ｓ．Ｄ．（標準偏差）で配置されなければならない。標準的なカメラモード（ＣＷ）を使用すれば、４４７カウント（暗闇で測定時）の腫瘍信号は、周辺光（３６，８１０±３９３カウントの周辺背景）における画像化中に大きなノイズの中に消失する。その結果、腫瘍と類似か又はそれ以上の強度を有する画像には３，５２７個の画素がある。この画像のＳＮ比は、０．２２であるが、ここで、ＳＮ比は、ピーク腫瘍信号強度を５．０７で割り背景強度のＳ．Ｄを掛けたものと定義されている。同様に、腫瘍は、０．５６のＳＮ比では広いゲート（１００ヘルツで１０００マイクロ秒）を使用すれば確実には検出されない。それに比べて、ゲート幅が１００ヘルツで０．３マイクロ秒の時、光源信号（４９１カウント）は、周辺光（２５±１３．５カウント）を上回って容易に見える。ここでは、ＳＮ比は２９７：１であり、光源信号を除いて、背景の５．０７Ｓ．Ｄ．を上回るか又はそれに等しいカウントを有する画像内の他の画素はない。
【００７０】
ゲート制御による検出可能性の改善は、検出されたサンプル内の背景信号光子に対する目標信号部分の強化の結果である。この例において、強化度は、ゲート制御なしの１倍（強化なし）から１００ヘルツでの０．３マイクロ秒ゲート制御がある７，４５３倍に上がる（上述の表１）。
この情報は、幾つかの方法でユーザに提示することができる。例えば、５．０７Ｓ．Ｄ．に等しいか又はそれ以上の画素は、明色でマーキングして対象の白黒画像に重ね合わせることができる。代替的に、２、３、４、及び、５Ｓ．Ｄ．での画素には、各々、重要度の低い順に冷たい青から熱い赤までなど、人工的な色を割り当てることができる。代替的に、「腫瘍」という語をモニタ上に表示することができる。更なる代案としては、腫瘍の存在を示すｐ値を表示することができるであろう。
【００７１】
尚、注意する点として、画像化装置で捕捉される光子数は、腫瘍モデルから放射される数を下回る。これは、主として、レンズ及び距離損失によるものである。例えば、サンプルから３０センチメートル上方に配置された２５ミリメートルレンズは、レンズの品質に関係なく、全方向に放射された光の僅か約０．１３％を収集し、前方を向いたファイバーから放射される光では更にほんのごく僅かである。更に、レンズコーティング、反射損失、焦点面から出る光子、及び、他のレンズに関する問題が組み合わさり、レンズ効率は約７５％になる（すなわち、レンズ前面に入射した集光の３／４がレンズを通ってレンズの他方の側の画像増強装置に達する）。また、他の損失が理論値よりも低い信号強度の一因となっている。例えば、ＩＣＣＤカメラはまた、光子が増強装置開口に当たる時間の１０％から４０％で増強装置において光電子を生成する効率曲線を有する。また、増強装置内のゲインは、１未満から１，０００を超えるユーザ設定値によって変動する可能性がある。この実施例に対して試験されたシステムにおいては、ＩＣＣＤは、ＮＩＳＴ帰属可能規格を使用して較正され、画像増強装置の光電陰極表面に入射する３光子毎に１カメラカウントを生成することがわかった。レンズ光子捕捉の公知の０．２６％効率と組み合わされて、上述のシステムの光子捕捉の全体効率は、ほんの０．０５％である。これは、０．０４〜０．０５％という測定効率（実ＩＣＣＤカウントを腫瘍標準によって放射される１００万光子／秒で割ったもの）と合致する。
【００７２】
光子損失を減らす方法が存在する。例えば、ＩＣＣＤは、融合ファイバーアレーによって組織に直接結合することができる。自由空間移動と直接結合した信号のぼかしを低減するために、ファイバーアレー上にフィルタを直接配置することができる。これにより、２桁以上光子捕捉量が増えるであろう。このような改善は、本発明の精神の範囲内と思われる。
この例において、腫瘍モデルは、１０4未満の信号強化で十分に検出される。
この低い強化がこの実験で成功したのは、主として、ＣＷ画像試験中にＣＣＤカメラがオーバーフローになるのを防止するために周辺光量が低減されたからである。実際には、手術領域は、ここで行われた実験よりも明るく、すなわち、最大１０，０００倍又はそれ以上の周辺光で照明される。背景光レベルが手術室で予想される数値まで上げられた時、標準的な強化カメラは、表１に示す実験で示すものよりも腫瘍検出能力が劣ってしまう。狭帯域通過フィルタを追加すると、この実験で使用された場合よりも１０倍から１００倍明るくなるように検出光が低減され、一方、短いゲート時間は、比較的に弱いレーザを使用して１００ミクロン腫瘍つまり１００個の細胞が見えるように、１０マイクロ秒ゲート又はそれ以下を使用した良好な周辺光排除及び良好なＳＮ比を可能にする。
【００７３】
実施例３：周辺光において生体外で抗体に結合された染料の画像化
実施例２で説明したカメラシステムを使用して、同期レーザ光源が追加され、抗体目標化染料を使用してラベル付けされた類似の大きさの腫瘍に関してインビボで予想されるものと同一の濃度及び容積で存在する微量の抗体結合染料を画像化するシステムの能力が明らかにされた。
実施例１で説明したように、腫瘍内での染料濃度は、約３．２ナノモルの染料である。この実施例においては、抗体でラベル付けされた腫瘍内で認められると予想されるものと同一数の単位堆積当たり染料分子数が得られるように、連続希釈法を用いて遊離酸の形で「Ｃｙ７」染料（「Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ」製、英国バッキンガムシャー所在）が希釈された。染料の中間希釈は、分光光度計を使用し、７６０ナノメートル、つまり、「Ｃｙ７」の消散係数が約２００，０００／センチメートル／モル溶液である波長で測定して確認された。
【００７４】
次に、直径１２．５ミリメートル（１．００ミリリットル）、４ミリメートル（３５マイクロリットル）、１．２５ミリメートル（１マイクロリットル）、０．９０ミリメートル（０．４０マイクロリットル）、及び、０．２５ミリメートル（１０ｎＬ）の腫瘍と大きさ及び染料内容が同等である染料の測定量が配置された。背景光は、外科医ヘッドランプ及び頭上スポットライトを除き、十分に照明された手術室内の周辺光と同等になるまで実施例２で説明した実験で使用されたレベルから増加された。また、レーザのみの暗い画像がカウント予想値の精度を確認するために収集された。画像は、次に背景除去され（レーザオンからレーザオフを差し引く）、７７０ヘルツで１秒間、１０マイクロ秒のゲート幅で集積された。
【００７５】
スライド上の一連の小滴の画像を図７に示すが、１２．５ミリメートル腫瘍は４４１、４ミリメートル腫瘍は４４３、１．２５ミリメートル腫瘍は４４５、及び、０．２５ミリメートル腫瘍は４４７で示す。また、画像はＩＣＣＤカウントに変換されて統計的に解析された。わずか１個から４個までの画素が照らされた実施例２の実験とは対照的に、この実施例では各腫瘍の大きさについてｐ値が計算できるように様々な数の画素が照らされた。下表（表２）は、この実験による画像統計データをまとめたものである。
【００７６】
（表２）抗体目標化染料を使用して生きた動物内で予想される濃度と同等の濃度での蛍光染料の立方体及び球に関するカメラカウント。このデータから推定して、０．１７ミリメートルまでの腫瘍は、この特定のレーザダイオード及び染料を使用する平均背景から５．０７Ｓ．Ｄ．を上回るピーク値を有することになる。
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【００７７】
ピーク値対腫瘍サイズのプロット（図示せず）により、上表２に示すピーク値と腫瘍サイズとの対数関係がわかる。この関係を用いて、少なくとも０．１１ミリメートルまでの腫瘍は、統計的に検出可能なピーク値を有するが、一方、０．１７ミリメートルまでの腫瘍は、この特定のレーザダイオード及び染料を使用した平均背景から５Ｓ．Ｄ．のピーク値を有することになると結論された。この実験から、僅か０．１７ミリメートルまでの腫瘍が、目標化染料でラベル付けされた時にはこの実験で確実に検出可能であろうと結論された。このような腫瘍の細胞数は、僅か５００個又はそれ以下である。
【００７８】
特に信号強化光学コントラストの使用から生じるいくつかの利点がある。一つの利点は、固有の光学コントラストをほとんど有していない種類の組織又は細胞に検出可能な光信号を与えることである。この光信号は、ＭＲＩやＣＲ向けの造影剤と比較すると、又は、ＰＥＴや核医学用の発光器と比較すると非常に明るい可能性がある。例えば、目標化された蛍光造影剤からの局所的コントラストは、同様に目標化されたラジオエミッタから達成されるコントラスト信号の１，０００，０００倍を超えるものになり得る。これにより、造影剤を比較的少量に抑えつつ信号発生を高めることができ、ラベル付けされた微量の組織、理論的には１００個又はそれ以下までをインビボ及びリアルタイムで検出するのに必要とされるＳＮ比が得られる。
【００７９】
この実施例において、コントラストから検出された信号は蛍光信号であった。
好ましい実施形態において説明したように、蛍光は、画像化システムには理想的であるが、光学造影剤は、幾つかの方法でそのコントラストを達成するという点において有利である。コントラストをもたらす照明光との相互作用には、吸収、偏光、旋光度、散乱、蛍光、ラマン効果、燐光、又は、蛍光衰滅などを含むことができ、コントラスト効果の尺度には、これらの効果の１つ又はそれ以上を含むことが合理的であろう。光学造影剤の例には、イソスルファンブルー造影剤又は他の吸収造影剤と、インドシアニングリーン、ポルフィリン、シアニン染料、又は、他の蛍光体と、メチルレッド（ｐＨ反応染料）又は他の生物反応染料と、着色又は蛍光蛋白質及び他の遺伝子製品と、ナノクリスタル、量子ドット、及び、他の分光区別物理的コクストラクトと、コントラスト充填ミセルとが含まれる。従って、コントラストを検出する方法には、システムが周辺光で作動するように構成することができることを条件として、散光測定、ゲート制御時間分解又は周波数分解法、及び、超スペクトル検出又は画像化などを含むことができる。
【００８０】
光学造影剤は、プレアクティブ（プロドラッグ）の形で対象に投与することができ、コントラストの生成は、その後、造影剤がその自然信号を生成、低減、又は、変更する前に生物学的相互作用を通じた活性化を必要とする、生体活性化の段階によって達成される。このような相互作用には、酵素による処理、構造変化、受容体結合、及び、遺伝子表現などが含まれる。例えば、構造変化は、ｐＨ変化又は、結合に応答して信号を増減し、蛍光消光グループを所定に位置にするか又は所定の位置から外す結合事象の結果とすることができる。同様に、酵素による処理は、蛍光消光部分を造影剤から除去して強力な信号をオンにする不可逆性分裂としてもよい。最後に、生物活性化段階を使用し、生物学的事象に応答してコントラストを遮断することができる。
【００８１】
光学コントラストの別の利点は、造影剤がＭＲＩやＣＴ又はその他のような他の画像化種類に対してコントラスト機能を有し得るということである。これにより、１度に１つよりも多い種類別にモニタリングすることができる。
別の利点は、造影剤を慎重に選択することにより、自然な光信号（自然ポルフィリンなど）と著しく異なる光信号を画像化用に選択することができ、非目標組織（通常の組織に既に少量存在してポルフィリンに代謝されたＡＬＡ及び光力学的治療先駆物質など）内にあるレベルで既に存在している組織成分に基づいて、造影剤に関して存在しているものよりも低い背景信号を与えるということである。
【００８２】
実施例４：周辺光での生体外の抗体結合染料の画像化
抗体に結合された「Ｃｙ７」染料のサンプルは、生体外で画像化されたものである（図８）。この実施例において、手４６３は、１０ミリグラム／ミリリットルの抗体結合「Ｃｙ７」染料４６７のうち２０マイクロリットルが入ったマイクロ試験管４６５を保持している。手４６３及び試験管４６５は、白黒画像対象画像を作るためにレーザ及びＩＣＣＤゲート制御グリッドがオフの状態で画像化された。次に、蛍光サンプル画像を収集するためにレーザが照明された。次に、レーザはオフ状態のままにして、サンプル画像の背景修正を準備するために手の第３の画像が収集された。このサンプル画像は、染料信号の強度を表す擬似カラースケールを使用してカラー化された。最後に、図８に示すように、染料の位置を示す色の重なりを有する白黒画像を形成するために２つの画像（対象及び背景修正サンプル）を融合させた。
【００８３】
この実施例において、染料と抗体との結合は、蛍光信号を生成する染料の能力を妨げるものではなかった。実際にこの場合、放射を移動させて照明波長から更に遠ざけることにより、抗体によって染料の検出可能性が上がったのである。
光学コントラストを使用する強みは、造影剤自体が非常に小さいことが可能であり、ほぼいかなる組織又は細胞領域をも含む特定の組織部位への供給、又は、それを目標にすることを可能にするということである。この実施例においては、染料は目標にする抗体と結合された。システム、染料、及び、方法が人間において効果的であることが明らかにされると、染料・抗体結合の目標組織は、単に新しい抗体をカセットに入れる（置き換える）ことによって変更することができ、用途開発において大きな柔軟性をもたらす。
【００８４】
様々なコントラスト目標化方法が存在する。この実施例においては、目標化部分は抗体であったが、造影剤は、化学的又は物理的手段によってその定位を達成することができ、このような目標化方法は、当業者には公知である。例えば、コントラストは、溶解性、拡散性、及び、輸送蛋白質親和性に基づいて分布してもよく、又は、コントラストは、イオン的に又は共有結合的に抗体、抗体断片、受容体、又は、トランスロケータ結合部位又は物質などの定位部分に結合されてもよい。代替的に、造影剤は、マイクロバブル又はリポソーム構造の中などに結合させるか又はカプセル化することができ、次に周囲構造が表面構造を用いて目標化されてもよい。目標部位の例には、ＰＭＳＡ抗体によって目標化された前立腺癌、「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ」抗体によって目標化された乳癌、及び、ソマトスタチン受容体オクトペプチド類似物質によって目標化された肺癌などが含まれる。
いくつかの癌の目標化された受容体結合シーケンスは、所定の癌に対して及び他の疾患に対しても同じく、人体に存在することが知られている。
【００８５】
実施例５：周辺光でのインビボの抗体結合染料の画像化
先に説明したように、最良の従来の画像化方法でさえも直径１センチメートルより小さい腫瘍を見落とすことが多く、一方、優れた病理学者は、約３０％の割合で切除された外科サンプル内の１〜２ミリメートルの腫瘍を見落とす（１ミリメートルの腫瘍は、約１００，０００個の腫瘍細胞を含み、癌の再発をもたらすには十分以上である）。
外科医が体内の腫瘍を探して定量化し易くする本発明の能力を試験するために、インビボで抗体に結合された染料の画像化が明らかにされた。
【００８６】
まず、染料がマウスに注射された。抗体−染料結合は、マウス肝臓によって急速に吸収され、小腸に排出されて図９に示すマウスの腹部全体の画像を得ることを可能にする。この画像は、インビボの造影剤の定位に対する許容度を明らかにするものである。この画像において、マウス５２０は白黒で示され、一方、検出された抗体結合染料５３１はカラーで示されている。これは、この場合は抗体結合染料である目標化された染料をこの場合は腹部である生体の体内の領域に供給して機能的に定位させることができるか、また、このような染料を生体動物内で検出及び画像化することができるかを明らかにする。信号が腹部全体に亘っている証拠を図９Ｂに示すが、ここでは、図９Ａに示すのと同じ動物の腹部の皮膚が切開されて横に移動させられ、腹部の内臓が表に現れている。注射部位５４３における信号、並びに、小腸５４６からの信号があり、肝臓排液管の遠位近くで生じている。
【００８７】
次に、３つの異なる濃度の染料を使用して一連の段階的な皮内注射を画像化し、その結果、図１０に示すように、インビボで染料信号を定量化する能力を明らかにした。定量的な手法を明らかにするために、３つの注射は、注射量に関連した比のピークカウントを示すはずであり、この場合は期待比１：１０：３０である。図１０において、マウス５４３は、５５１では４．１マイクロモル、５５３では０．４１マイクロモル、５５５では０．１３マイクロモルで０．１０ｃｃの染料の注射を受けている。そのシリーズからのデータはデジタル化され、全光信号対染料注射量に関してプロットされた。これらのデータは、染料負荷を定量的にモニタリングすることができ、本発明が目標組織を検出及び画像化するだけではなく、組織又は腫瘍容積も同じく定量化することができる可能性を生むことを示している。この実験からのピークカウントを下表３に示す。
【００８８】
（表３）実際の染料濃度と比較した異なる染料濃度による光子カウント数。染料分子カウントが上がるにつれて光子カウントの直線的な増加がある。
2011115658.tif 000005
【００８９】
この実施例において、目標化された薬剤は局所的に注射された。しかし、光学コントラストの１つ利点は、光学造影剤の投与は幾つかの方法で行うことができるということである。造影剤は、注射、摂取、又は、遺伝機構又はカプセル化されたバイオファクトリーを使用して対象内で合成することさえもできる。遺伝子の例において、コントラストは、遺伝子として供給することができ、また、対象内で合成された遺伝子生成物は、照明光フィールドと相互作用する蛋白質又は生成物である。更に、ウイルス粒子の含有物を生体哺乳動物細胞内に供給する各種の方法が知られているので、造影剤又は造影剤に対して符号化を行う遺伝子を、組織を造影剤で「感染させる」ウイルスによって対象に供給することができる。このウイルスを通じて供給された造影剤は、活性化を必要とするプロドラッグになることができ、また、特定の蛋白質又はリボ核酸シーケンスを含む細胞に入れられた時に活性化される。これは、目標組織上に存在する識別用の細胞表面受容体がない場合でさえも特定の内部遺伝形質を表す細胞内でのコントラストの生成を可能にするものである。発光酵素エミッタ・レポータシステム内で使用される蛋白質でさえも、照明された時に造影剤として反応的に発光するように作ることができる。
【００９０】
第２の例として、コントラストは、噴霧するか、又は、侵襲性器具先端から供給し、例えば、図３Ｃに示すニードルを使用して器具先端近傍で組織を浸すか又は注入するのに使用することができる。次に、このコントラストからの信号は、局所的にモニタリングして組織境界部分を定義するか、又は、腫瘍などの特定組織の種類を検出することができる。このような手法は、特に組織を除去するツールを誘導する方法として強力なものとなることができ、組織は、造影剤の局所的な注入がもはや組織の光信号を生成しない時に排除されたとみなすことができる。
【００９１】
最後の例として、光学コントラストは、リポソームにカプセル化することができ、多数の染料分子を単一の部位に供給することができる。
コントラストは、供給された状態で、組織内で定位を達成する時間を必要とする場合がある。例えば、血液で運ばれる造影剤は、注射時に光学的に不活性でない場合、目標組織内で蓄積される時間、並びに、血流から出て拡散する時間を必要とすることになる。目標部位で染料が活性化された場合、他の組織部位からの染料の損失は、不活性化染料は背景信号を生成しないため、それほど関係しない。
【００９２】
このような目標化染料システムの別の重要な使用は、動物実験であろう。染料を使用すれば、種々の動物実験を行うのに必要とされる時間が実質的に低減されるばかりではなく、各実験を行うのに必要とされる動物の数も低減される可能性がある。例えば、癌治療を将来必要とする癌が研究所で特定されると、動物（一般的にマウス）で試験される。新薬を研究するために、大規模なグループの動物に癌が移植される。治療の各時点において、複数の器官及び部位の病理学的な研究ができるように一群の動物が犠牲にされる。各々の動物は移植時に若干異なる癌を有することになるので、各時点における研究のために多くの動物が必要とされ、これらのマウスの一部が各時点で殺されて研究される。更に、一部の癌の研究では、細胞の成長及びその分布を完全に理解することができるまで、何週間又は何ヵ月にも及ぶ研究が必要とされるであろう。
【００９３】
動物実験での使用の例として、罹患した癌について処置されている５匹のマウスが各時点で殺された場合、その時点が６ヵ月間で２週間毎に発生する場合、その総数は、処置の評価に必要とされる６０匹に加えて対照として働く同一数があり、６ヵ月間毎にマウスの総数は１２０匹である。注意する点として、病理学上、一般的に標準的な病理学を用いて癌を検出するためには１０，０００から１００，０００個の腫瘍細胞が必要とされる。これとは対照的に、癌に対して抗体を作ることができ、染料結合抗体の分布が画像化される場合は、各マウスは、画像化の３日から５日前（ペプチド目標化薬剤を使用する場合は短くなる）に造影剤注射を受けることになる。各時点において、薬物試験用に５匹の動物の各々、及び、５匹の対照動物の各々を画像化することができる。しかし、動物は殺されないので、１０匹のマウスの全ては、次の時点で使用することができ、以後同様である。更に、各時点において同じマウスが使用された時の方が疾患モデルの変動が少ないことから、試験に関する統計データが改善される。最後に、目標化された染料は、病理学的に見つけられるよりもかなり前に非常に速い段階で癌を検出することができることから、研究の継続時間が短くなり、より良い統計結果が得られる。すなわち、この実施例において、目標化された光学染料による手法は、動物使用数を１２０匹から１０匹に減少させ、データの質が改善される上に、研究期間が６ヵ月から恐らくは４週間から６週間までにも短縮させるであろう。
このデータはまた、以下の３つの実施例において論じるように、手術時の誘導、診断方法、及び、治療手段にも関連がある。
【００９４】
実施例６：きれいな境界部分のための侵襲性手術の誘導
リアルタイムで癌などの目標組織を検出することができないということは、癌診断及び治療に大きな影響を与える。大半の固形癌の治療の中心は、依然として外科的切除及び除去である。癌を識別することができないために、外科医は、手術中に保守的な側に誤りを犯し、完全な腫瘍切除の確率を高めるためにできる限り正常な組織内に大きな境界部分を作る傾向がある。これにもかかわらず、手術中に小さな癌の島々を見落とし、手術による切除部の外側に残留癌細胞を残してしまうことがよくある。これらの残留細胞は、陽性外科的余地といい、多くの癌手術の１０％から４０％に発生する。残留罹患部を有する患者は、他の患者よりも再発の可能性が遥かに高くなって死亡する場合が多い。罹患器官内の疾患の境界部分を正確に知ることは、正常な組織の最大量を残すと同時に、疾患を完全に除去することを可能にするであろう。
【００９５】
染料の皮下注射を用いて示した実験（上記の実施例５）の結果、染料が表面近くに位置する時にインビボの光信号の明るさの可能な程度が明らかにされた。腫瘍は、外科医が腫瘍を切除している時には同様に表面に近い場合が多い。この場合、外科医の目標は、腫瘍の切除部にきれいな境界部分を生成することである。
数秒又はそれ以下毎に更新される画像は、外科医が手術の進行がある時にそれに影響を与えるようにフィードバックとしてその情報を使用することを可能にするであろう。
【００９６】
染料からの信号を使用して、きれいな境界部分を得ることができることが明らかにされる。この実施例において、抗体と結合した１００マイクロリットルの染料が０．４グラムの均質化された牛のレバーペーストに注射された。リアルタイム画像において、２つの染料領域、つまり、領域６０６及び６０７の数及び位置は、図１１Ａに示すように十分に視覚化される。次に、表示された組織は、ラベル付けされた組織を除去する指示を受けているが病巣の数又は位置を知らない目隠しされた観察者によって切除された。観察者は、全ての染料が除去されるまで１秒間に２回更新されるフィードバック及び画像化カメラ表示からの誘導に頼っていた。病巣６１３の切除中の組織の図を図１１Ｂに示すが、器具６１５が生の画像で見える。尚、ラベル付けされた組織６０７は、完全に除去されて窪み６１６が残っている。染料処理された組織の外科的除去後は、染料を含む組織の痕跡のみが残り、図１１Ｃに示すように、染料を部位６３１では全く検出することができなかった。
【００９７】
次に、手術部位は、拡大されて残りの組織内に残留染料がないか試験された。
この実験においては、筋肉内の残留染料は分光法によっては検出不可能であり、従って有効な処置誘導及びフィードバックが得られたことが確認された。
この種の誘導は、前立腺、転移性癌を有するリンパ節、及び、胸部内腫瘍切除の外科的除去に直接適用することができる。これらの場合の各々において、陽性余地数の減少は、恐らく局所的な再発の減少と、５年及び長期生存率の改善とをもたらすであろう。
【００９８】
造影剤を癌に目標化する多くの方法を利用することができる。例えば、いくつかの種類の細胞は、癌細胞が隣接細胞が有していない表面受容体を持ち得るように表面マーカーを有することが知られている。これは、乳癌に「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ」受容体、又は、前立腺に対してＰＳＭＡ又はＰＣＳＡ抗原を使用するなどにより、造影剤が特定部位に目標化されることを可能にする。感光剤（例えば、蛍光ポルフィリン中間物への変換によって癌性組織内に優先的に蓄積されるＡＬＡ）の使用による非特定の目標化は、これらの感光剤からの信号が多くの組織で発見される可能性があり、広く出回っている造影剤に関して稀な細胞の背景ノイズに対する検出を困難にするのでその有益性が落ちる。
【００９９】
染料が組織に目標化され、組織に定位する十分な時間が許された状態で、目標信号の検出、定位、又は、画像化を用いて非侵襲性処置中にフィードバックを得ることができる。例えば、外科的ツールを使用して腫瘍を削り取ることができ、また、更なるコントラスト信号が残っていない状態になり、腫瘍が効果的に除去されて外科的余地がきれいであることを示すまで処置を続行することができる。この場合、画像化システムは、外科的器具ではなくてモニタリング及び画像化システムである。同様に、光学画像化システムは、ツールが特定の区域にコントラストがなくなるまでに限って削るが、その後は他の区域を削ることを可能にし、腫瘍だけが腫瘍部位から除去されることをもたらす結果になるように、インターロックを通じて外科的器具と結合させることができる。最後に、このフィードバックは、目標化組織からのコントラストフィードバックを使用して切除処理などの細胞破壊のあらゆる処理を制御するために用いることができる。これはまた、従来の画像誘導手術などの他の手法と本発明とを組み合わせることを可能にすると同時に、組織誘導型フィードバックの結果として手術の小さな手順修正を可能にする。これにより、以前に修正された画像を、位置の変化などの経時的に発生したか、又は、侵襲性器具の使用又は配置の結果として発生する組織の変化を反映することなく画像誘導手術に対して使用した時に生じる誤差を低減することができる。
【０１００】
組織誘導型介入という用語は、本明細書では画像誘導手術に対比させて使用されている。画像誘導手術においては、医療器具の位置は、ＣＴスキャン又はＭＲＩスキャンなどの標準的な医療画像と関連させて空間的に判断される。このようにして、外科医は、ＣＴ又はＭＲＩ画像を道路地図として使用し、手術を誘導することができる。これに比較すると、組織誘導型介入の間は組織自体が信号を提供し、手術又は処置は、組織のリアルタイム解析によって誘導される。本発明においては、組織誘導信号は、目標化された造影剤によってラベル付けされた目標細胞の画像化によって与えることができ、その結果、処置を患者に適合させることができる。更に、組織誘導及び従来の画像誘導は、同じ患者に同時に行うことができる。
【０１０１】
実施例７：生体組織検査の誘導
生体組織検査は、ガンの診断において行われることが多い。光学的に誘導された生体組織検査が有益と思われる領域は、乳癌及び前立腺癌である。
前立腺癌においては、例えば、５人に１人はこの疾患に罹患するが、これは女性の乳癌の罹患さえも上回るものである。標準的な診断方法は、前立腺生体組織検査である。前立腺生体組織検査を行う時、盲目的に癌を見つけようとしてニードルが無作為に組織に挿入されるが、存在する癌をこれによって見落とす可能性は２０％である。従って、繰り返し生体組織検査試験が必要とされる場合が多い。前立腺癌は現行の画像化方法（例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、又は、超音波）では十分に見つけられないので、前立腺生体組織検査は、実際には盲目的に行われている。生体組織検査を誘導して微量の前立腺ガンの有無を検出することができれば、不必要かつ盲目的な生体組織検査が減り、同じく偽陰性率も下がるであろう。同様に、手術後に患者が追跡治療を受ける時、癌成長の発生の有無及びその場所の特定は困難である。微量の残留組織又は腫瘍再成長を特定することができれば、その疾患を管理し易くなるであろう。
【０１０２】
従って、目標組織の非侵襲性検出及び定位は、診断及び治療ガイダンスを可能にする。例えば、生体組織検査結果を収集すべき組織部位の定位は、目標部位に集まるコントラストを使用すればやり易くなるであろう。このような装置はまた、どの領域において生体組織検査結果を収集すべきかを示すことにより、前立腺生体組織検査には有益なものであろう。このような装置はまた、前立腺手術追跡治療にも有益であろう。前立腺手術を受けた患者は、癌再発がないかを追跡される。ここでは、組織構造（超音波）及び組織の発ガン性の有無（光学的重ね合わせ）の両方を示すために、光学スキャンを前立腺の画像化に既に使用されている超音波スキャナと組み合わせることができるであろう。同様に、乳癌患者が追跡治療を受ける時、光学スキャンを行って胸部又はリンパ節部位における手術部位での局所的な再発を検出することができる。
【０１０３】
前立腺などの器官全体は、外部検出プローブを使用すれば走査することができる。例えば、現行の画像化システムが、造影剤の投与及びその定位後に直腸内及び前立腺近傍に配置される直腸プローブと結合されたファイバーアレーとして再構成し得る場合である。前立腺の透照診断中に造影剤のスペクトルが見られるか又は検出された場合、癌を検出することができ、一方、スペクトルが何も見られない場合は、癌が存在しないわけである。このような検出試験の後に、診断を目的としたコントラスト誘導による生検ニードル、癌除去を目的としたコントラスト誘導による削り取りツール、又は、前立腺内での腫瘍の分布及び腫瘍負荷を画像化するコントラスト感応画像化システムを使用することができる。
【０１０４】
他の形態の検出プローブを想定することができる。例えば、画像化カメラの使用の代わりに、発光器及び検出器を生検ツール自体に配置することができ、染色された領域までの器具の目標化された供給を可能にする。更に、侵襲性器具が介入ツールである場合、切除治療などの目標介入を実行し、目標部位において光学的にモニタリングすることができるであろう。
この検出及び定位からの情報は、特定種類の組織の有無を示す語の表示、表（１つ又はそれ以上の造影剤に対して生じる信号の割合など）、深さ別のコントラストで染色された組織の識別、グラフ（上述のような経時的な組織種類の有無、又は、目標部位までの距離など）、数字（対象までの距離など）、画像（目標組織の位置など）、定位（目標組織の角度及び距離の測定値など）、又は、造影剤の位置及び濃度によって変わる表示語を含む、幾つかの方法で提示することができる。異なる処理画像を表示することができ、本明細書で提示された実施例で示した画像の選択による不適切な制限は意図されていない。
【０１０５】
この実施例で使用された造影剤は、結合時に活性化又は「オン」するか、又は、前立腺癌内への内在化が更に強化されたコントラストを与える造影剤とすることができたであろう。任意の光学造影剤又はレポータは、光学的光源及び検出器がその信号を検出するように構成されていることを条件として、この場合に使用することができる。光源及び検出器の構成には、蛍光、及び、時間又は周波数分解データなどを検出する能力が含まれる。このような測定値は、誘導のために使用することができ、それは、外科用メスを目標組織に接触させるためにどこに移動すべきかを示すだけの簡単なものであり得る。
他の種類の出力を考慮してもよいが、信号が組織の存在、位置、又は、分布に関する情報の機能を表すコントラストに基づく誘導信号であるか、又は、検出周辺光対目標信号の比を低減するような方法で収集された自然信号からの信号又は内生的な目標化されたコントラストからの信号に基づいてプローブ又は装置を体内の位置に誘導するのに使用される場合には本発明の範囲に該当する。
【０１０６】
この実施例における解析では、造影剤又は目標組織の定位又は分布の尺度を抽出するために、フィルタを通る単一波長帯域の信号が使用される。従って、コントラスト誘導アルゴリズムは、見掛け上は単純であり得る。例えば、コントラスト信号が背景を上回って５Ｓ．Ｄ．を超える場合、組織は、画像内で目標組織としてマーキングされる。しかし、他のアルゴリズムを考慮することができる。例えば、光が組織を通る時、波長が短いほど（より青い）、部分的には組織内で波長の短い光ほど散乱度が高くなるために優先的に散乱し吸収される傾向があり、一方、波長が長いほど（より赤い）、より簡単に通過する傾向がある。２つの波長で測定することによって（１つの染料の発光スペクトルから２つの領域を測定するか、又は、目標組織と同様に結合する２つの異なる染料からのピーク領域を測定することによって）、深さ信号を生成することができる。この種の２波長システムに関しては、長い波長（λL）での光の短い波長（λS）での光に対する比は、目標組織の平均深さに関係すると思われる。
【０１０７】
ニードル、トロカール、カテーテル、無線周波数アンテナ、冷凍手術プローブ、レーザ手術ビーム、内視鏡、ビデオカメラ、及び、ファイバーなどを含む、様々な形態のプローブを考慮することができる。時間ゲート手持式プローブを使用し、皮膚に沿って前後に移動させ、正しい光学パターンが検出された時に警報を発することにより、陽性リンパ節を探してもよい。侵襲性プローブを生検ニードル又はカテーテルを使用して作製することもできる。
最後に、癌以外の他の組織を画像化することができる。例えば、白血球に対する抗体を使用して、炎症性疾患の画像化方法を得ることができ、一方、冠動脈内の不安定な血小板の露出した表面に対する抗体を使用して、将来的な血管疾患の可能性がある部位を画像化することができる。
【０１０８】
実施例８：胸部リンパ切開の誘導
実施例６で示したきれいな境界部分に関する手術の誘導、又は、実施例７で示した疾患に向かうニードルの誘導とは対照的に、外科的決断は、そもそも手術するか否かということであろう。例えば、乳癌の処置には、腫瘍の等級及び広がりの判断が必要とされ、これはステージングと呼ばれる処理である。リンパ節への広がりの判断が、適正な処置選択及び生存率増加の鍵である。リンパ節のステージングは、多くの乳癌手術で最も時間が掛かる部分であり、また、ほとんどの術後の痛み及び処置の複雑化を発生する部分である。しかし、この侵襲性手術後、女性の６８％は、除去されたリンパ節には癌がないことが判明し、従って、（後で考えると）大きな外科的処置が不必要に行われたわけである。癌に侵された可能性が最も高いリンパ節の存在及び位置を手術前に検出することができれば、女性の２／３が外科的生体組織検査を省くことができ、一方、光学スキャンでリンパ節にガンがある女性に対しては、遥かに小さな目標化された外科的切開と、より小規模な外科的処置とを可能にする。
【０１０９】
リンパ節ステージング手術では、腋窩（脇の下）リンパ節の除去を伴う。場合によっては、歩哨リンパ節のみが識別されて生体組織検査される。歩哨節は、腫瘍を排泄する主たるリンパ節である。その領域は、現在、ガイガーカウンタ（例えば、従来技術の節で検討した米国特許第５,８４６,５１３号）によって追跡される放射能物質の注射、又は、注射後に１つ又は複数の歩哨リンパ節に移動してそれらを青色に染色する腫瘍近傍の青色染料（イソスルファンブルー、「Ｌｙｍｐｈａｚｕｒｉｎ（登録商標）」、ＵＳ・サージカル・コーポレーション製、米国コネチカット州ノーウォーク所在）の注射によって識別される。「Ｌｙｍｐｈａｚｕｒｉｎ」は、癌に関与するリンパ節の追跡を含め、リンパ管を描写するのに使用する皮下投与に関して米国食品医薬品局によって承認された無菌性水溶液である。この青色染料は、リンパ節が発見された状態では見つけやすいが、切開なしでは見つけるのが困難である。
リンパは、目標化されたリンパコントラストを使用すれば外部的に定位することができることが示唆される。サンプル組織内のコントラスト量を増すにつれてインビボ光信号が直線的に強まることが既に明らかにされた。また、光信号が組織の深部を通り、光学コントラストを使用して定位及び分布と共に変動する信号を生成できることもこれまでに明らかにされた。
【０１１０】
ここで、実験的試験において、組織のイソスルファンブルー含有領域が外部的に定位され、光学的手段を使用して目標化することができることを明らかにする。実験室では、まず、イソスルファンブルーのコントラストがヘモグロビン及び造影剤の混合物において検出できることが明らかにされた。５５０から９００ナノメートルの間の体内の主たる吸収体はヘモグロビンであるから、ヘモグロビンとイソスルファンとの混合物が測定され、イソスルファンブルーをヘモグロビンから区別することができる独特な特徴が見出された。これらの独特な特徴を用いて、イソスルファンブルーの痕跡は、６９７ナノメートル近傍の勾配、つまり一次微分信号の値を利用してヘモグロビン混合物から抽出することができた。
【０１１１】
次に、この一次微分信号手法を用いて、組織モデルにおいてコントラスト陽性リンパ節の外部画像が生成された。この研究用の走査検出器は、発光及び検出に多数のファイバーを使用するものであり、傷内又は皮膚上で走査することができる計器のモデルとして働く。イソスルファンブルー目標は、濾紙にイソスルファンを置くことによって作り出された。２ミリメートル×３ミリメートルで０．２０マイクロリットルのコントラスト（４ナノモルのイソスルファンブルー）を含有する１枚の濾紙が、走査面から２センチメートル下にインビボで配置された。
モニタリングする区域に亘って検出ファイバーを走査することによりデータが収集された。３０×３０ミリメートルの区域を走査し、１０個のスペクトルを各走査画素に対して収集した。この場合、ファイバーは単一のものであったが、１次元直線アレー又は２次元アレーであれば、十分に同様に働くか又はそれ以上に働いたであろう。上述の実験からのデータは、データの格子を集めるために組織上を表面プローブで走査することによって２次元で収集された。図１２Ａの画像６３３は、イソスルファンブルー目標の位置をコントラスト信号ピーク６３５としてはっきりと示している。図１２Ａの俯瞰図を図１２Ｂに示すが、十分に取り囲まれた区域６３９がイソスルファンブルー並びに目標組織の位置及び分布を示すことを画像６３７において見ることができる。従って、組織の陽性歩哨節のマッピングは達成可能である。
【０１１２】
この実験は、光学コントラストを使用して、定位及び分布によって変動する埋めた物体の信号を生成できることを明らかにする。このような信号は、センサをコントラスト発生源に近づけるように移動する時の信号の増加を検出するプローブを目標にするなど、手術を誘導するのに使用することができる。この実験はまた、このようなシステム及び方法が、不透明な組織を通る光を測定するために、外部的使用又は内部的使用を問わず、医療器具を通じてインビボで画像を形成するように機能することができることを確認する。この実施例においては、走査されたファイバーは、実施例１から実施例５までに上述の通り、ＣＣＤ検出器を含むカメラ又はプローブと置き換えることができる。多数の画素を迅速かつ同時に画像化することができるように、表面取付式ＬＥＤで照明光源及びファイバーを置換することができる。このようなシステムは、コントラストマップの再構成、並びに、光学的有効化侵襲性器具を使用して人間のコントラスト陽性節に向かう誘導を可能にするであろう。
【０１１３】
最後に、染料の代わりに蛍光コントラストを使用することができ、蛍光は、同様の方法で画像化することができる。例えば、イソスルファンブルーは、優先的にリンパ系を通過するので、イソスルファンブルーと共有結合した蛍光染料は、インビボの差別的コントラストの供給源として機能することができ、すなわち、造影剤を取り込んだ組織は、類似量の造影剤を取り込まなかった組織とはその蛍光が異なって現れることになる。このような差別的コントラストはまた、造影剤を目標部位で生物活性化させ、目標とする組織においてのみ「オン」又は「オフ」にすることによって達成することができる。
【０１１４】
実施例９：多色コントラストによるラベル付け
光学コントラスト使用の固有の利点は、各々がインビボで区別可能な光学的痕跡を有する多数の造影剤を追加して、異なる親和性及び受容体に対する同時で多数のラベル付けの力をもたらすことができるということである。二重又は多重のコントラストラベル付けは、細胞学又は他の生体外の実験室専門分野において使用されることが多い技術である。この技術においては、追加情報を抽出するために異なる造影剤が同じサンプルに追加される。
【０１１５】
このような二重ラベル付けは、インビボの検出及び画像化との関連性を有する場合がある。例えば、多くの異なる組織は、その各々が第１の造影剤の受容体を有するので、第１の造影剤を取り込むことができる。更に、組織の異なる組み合わせは、その異なる組織の各々がまた第２のマーカーの受容体を有するので、第２の造影剤を取り込むことができる。癌は、両方の受容体を有するか、又は、一方の受容体の存在があって第２がないか、又は、いずれかのマーカーの存在によって識別することができる。このような場合には、２つ又はそれ以上の造影剤を同時に使用して検出、定位、画像化、及び、目標化する能力は、人間の試験においても関連がある可能性が高い。２つ又はそれ以上の異なる受容体を表す細胞の種類を画像化するためには、１つよりも多い造影剤が必要とされるであろう。
【０１１６】
ここで、異なる光学特性を有する２つの光学染料で始まり、ファイバーベースのニードルを使用して両方の染料を検出し、二重ラベル付け手法をインビボで適用することができるという見方を確認するデータについて検討する。この実験に対して、吸光曲線が異なる２つの異なる染料、つまり、赤色コントラスト（「ＦＤ＆Ｃ  Ｒｅｄｓ」４０及び３、シリング製、米国メリーランド州ハント・バレー所在）、又は、実施例８で説明した青色染料の「Ｌｙｍｐｈａｚｕｒｉｎ（登録商標）」が利用された。
【０１１７】
組織モデルは、厚くして均質化した牛肉を使用して作り出した。多量のコントラスト（組織ホモジェネート１立方センチメートル当たり３マイクロリットルのイソスルファンブルー、及び、１４マイクロリットルの赤色コントラスト）がこのモデルの選択された領域の中に混入され、異なる光学特性を有する領域を作り出した。層状の構造が、染料を含まないいくつかの領域、赤色染料又は青色染料のみを含むいくつかの領域、及び、赤色及び青色の両方の染料を含むいくつかの領域を有して作り出された。
内蔵された光ファイバーを有する侵襲性ニードルが組織に挿入された。ニードルが異なる組織層を通る時に、複数のスペクトル的特徴が記録された。これは、例えば、異なる光源で照明することによるか、又は、検出器上で異なるフィルタを使用することにより達成することができる。次に、各染料からの光信号の強度を計算するためにデータが処理された。
【０１１８】
各造影剤に対する計算コントラスト信号強度が図１３にプロットされている。
図ではｙ軸上で１単位だけオフセットされている赤色コントラスト強度曲線６５１は、５５６ナノメートルでの差別的吸光度の特徴を用いて計算され、一方、青色コントラスト強度曲線６５３は、７００ナノメートル近傍の差別的吸光度の特徴を用いて計算された。同時発生曲線６５６は、閾値を用いて両方の造影剤が存在する時を示す。赤色染料を含む領域は、サンプル番号６２から１３３に対してピーク６７１として見ることができ、青色コントラストだけを含む領域は、サンプル番号１５９から２１８に対してピーク６７３として見ることができ、一方、青色及び赤色の両方のコントラストを含む領域は、サンプル番号２５１から３３５に対して同時発生ピーク６７６から見ることができる。第１及び第２の両方の造影剤を有する領域は、明確に検出可能である。同様の方法を用いて３つ又はそれ以上の造影剤を解析することができる。
【０１１９】
このデータは、図１３に示すようにグラフとして表すことができ、又は、生データを以下に示すような表の形式で列挙することができる。
【０１２０】
（表４）図１３にグラフで示したデータの一部の数表
2011115658.tif 000006
【０１２１】
また、吸光度が異なる２つの染料ではなく、異なる蛍光スペクトル、及び、異なる蛍光寿命などの光学特性が異なる２つの蛍光染料を使用することによっても同一の効果を達成することができる。一例として、２つの蛍光染料、つまり、「Ｃｙ７」及び抗体を有する「Ｃｙ７」のスペクトルを図１４に示すが、ここで、スペクトル７１２及び７１４は、抗体なしと抗体ありの２つの形態の「Ｃｙ」染料をそれぞれ表している。
更に多くの染料を使用することができ、それらの濃度は、一連の強度測定値をＮ個の連立方程式として解くことによって画像化することができる。ここで、Ｎは染料数であり、Ｎ−１は必要とされる追加フィルタ数である。注意すべき点として、染料発光帯域が十分に離散的である場合、幾つかの帯域通過フィルタを通じて得られる画像を使用して各染料を検出してもよい。
【０１２２】
実施例１０：比色分析による深さの判断
エンジン１８４は、信号深さを判断するために造影剤からの分光信号を使用することができる。これは、組織が不均等に光の異なる波長を吸収するので可能である。例えば、造影剤から伝達された信号は、増加する組織の厚みを信号が通過する時に形状が変わることになるので、これを利用すれば、１つ又はそれ以上の造影剤を使用して深さ信号を生成することができる。光の基本的な特徴は、波長が長い光は波長が短い光よりも散乱が小さい傾向があるということである。その結果、より青色の波長の光は、組織を通って遠くまで伝わり、相対的に吸収される量も増える傾向がある。更に、人体は、青から緑の波長における光吸収体を有しており、それは、組織にこれらの波長の光を更に強力に吸収させる。この不均等な散乱及び吸光度のために、伝達される信号の波長が短い（より青い）ほど、距離が増すにつれて相対的に吸収される量が増える傾向がある。この結果、短い波長は、信号が組織を通って遠くに伝わるほどますます表示されにくくなる。そのために、組織を通って伝達される光のスペクトルは、信号発生源の深さと共に変わる。
【０１２３】
組織通過前の発光器のスペクトルを知ることにより、この効果を使用して、目標信号の近似又は重み付き平均深さを判断することができる。実際には、これは、素早く連続して２つ又はそれ以上の異なるフィルタを使用するなど、異なる波長領域において目標信号を測定することによって判断してもよい。同じ結果は、同じ部位に目標化された２つ又はそれ以上の染料を使用し、各々の相対輝度を測定することによっても得ることができる。コントラスト探知器によって使用される解析方法は、ピーク波長、スペクトル領域の勾配、又は、波長比などのスペクトル的特徴を伴うであろう。
【０１２４】
すなわち、深さ測定の１つの簡単な種類は、２つの波長における伝達信号の比である。この場合、短い波長が優先的に吸収され、長い波長の短い波長に対する比を信号の深さが増すにつれて増加させる。例えば、図１５Ａは、検出前に赤色光が光散乱脂肪乳液の増大する深さを通過する時の、赤色発光ダイオード（蛍光マーカーによって放射された赤色又は近赤外光に対するモデル）の測定された一次微分信号を示す。検出スペクトルの一次微分プロットは、部分的には異なる測定値間の基線の変化の影響に対して補正するために使用される。この実施例において、赤色ダイオードの検出スペクトルは、光源からの深さと共に変わり、光源から０．５センチメートル離れた浅い深さのスペクトル８０８から、１．０及び１．５センチメートルの深さにおけるそれぞれ中間スペクトル８０９及び８１０まで、最終的には光源から深さ２センチメートルの更に大きい深さのスペクトル８１２まで変わる。６６９ナノメートルでの一次微分（又は、吸光度の勾配）信号を６３５ナノメートルでの一次微分信号で割った値の検出器からの信号深さに対するレシオメトリックなプロットを図１５Ｂに示す。この図において、比応答曲線８２３は、短い波長が相対的に減衰されるほど、短い波長に対する長い波長の値の比が信号深さの増加と共に大きくなることを示す。この比曲線８２３を用いると、同様の波長プロフィールを有する蛍光源の深さは、信号強度とは独立して、６３５ナノメートルに対する６６９ナノメートルでの信号比を利用して推定することができる。
【０１２５】
発光スペクトルの２つ又はそれ以上の領域における単一染料の蛍光強度の測定値はまた、各染料の種類で決定された比応答曲線と共に、目標組織の深さの目安として使用することができる。注意すべき点として、同じ種類のレシオメトリックな方法を２つの染料を使用して行うことができ、その場合、ピーク間隔が更に離され、従って、ピークが血液のような可変濃度の身体成分の局所的最大値に対応しないことを条件として、比の変化は深さと共に増加する。
【０１２６】
光源による照明後に身体から放射された光を使用して、生体組織から誘導された光信号を測定し、室内光において人体内のコントラスト強化組織の検出、定位、画像化、及び、目標化を可能にする改良された方法及び装置が見出された。本発明に従って構成されたシステムが製作され、その方法が種々の構成のモデル、動物、及び、人間において試験されており、これらは、医療及び産業の両面における幾つかの重要な問題に対してすぐに応用することができ、従って当業技術における重要な進歩を成すものである。
【図１】
2011115658.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月21日(2011.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
周辺光において生体対象内の目標組織を検出する方法であって、
（ａ）光源からの追加光を用いて周辺光において対象を照明し、目標組織が前記照明光と相互作用して前記照明光を変更し得るように前記光源が選択されている段階と、
（ｂ）ゲート光検出器を準備する段階と、
（ｃ）前記光検出器を前記対象と光学的に結合させる段階と、
（ｄ）前記変更された光において前記周辺光に対して実質的に強化された光を前記検出器が検出するように実行される、前記検出器をゲート制御する段階と、
（ｅ）前記ゲート制御段階により更に正確又は確実に決定可能である前記目標組織の測定可能なパラメータを、前記検出された光の分析を用いて決める段階と、
（ｆ）前記決定に応答して出力信号を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記検出器は、画像化デジタルカメラであり、前記出力信号は画像であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出器のゲート制御と同期した短い光パルスで照明する追加光を用いて照明する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
人を除く生体対象の目標細胞の弱い自然信号を強化することにより、周辺光において生体対象内の目標細胞を画像化する方法であって、
(ａ)インビボの目標細胞に対して測定可能なコントラストをもたらすように選択された光学造影剤を対象に投与する段階と、
(ｂ)前記造影剤が体内で十分に機能的な分布及び定位を達成するまで待機する段階と、  (ｃ)インビボの前記造影剤が前記照明光と相互作用して前記照明光を変更し得るように選択され、強度が時間的に可変であるように更に構成された光源からの光で前記対象を照明する段階と、
(ｄ)前記対象と光学的に結合された時間ゲート制御カメラを設け、前記対象をモニタリング又は画像化するために前記カメラを使用する段階と、
(ｅ)前記カメラが前記変更光において周辺光に対して強化された光を検出するように、光源強度の前記時間的変動の関数として前記カメラをゲート制御する段階と、
(ｆ)前記造影剤の分布及び定位の機能に基づき、前記検出光を使用して前記目標細胞の測定可能なパラメータを決める段階と、
(ｇ)前記決定に応答して出力信号を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。