(57)【要約】【課題】肺病態を治療するために現在利用できる組成物と方法を改善すること。【解決手段】本発明は、肺の炎症前または炎症時の肺組織の破壊を防止するための製薬組成物、ならびにこのような組成物を作製して使用する方法に関する。本発明は、肺の病態を治療し、肺炎の負の効果を軽減するための組成物および方法を提供する。このような組成物および方法は、プロテアーゼ阻害剤および肺表面活性剤の混合物を使用する。前記組成物および方法はまた、リパーゼ阻害剤（例えば、ホスホリパーゼ阻害剤）および抗酸化剤も含むことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
【化１】
2011001383.tif 000037
からなる肺表面活性ポリペプチド、および、
ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、ビクニン、Ｃ−反応性蛋白質、エラフィン、ヒトプロテアーゼ阻害剤３、ｂトラッピン−２、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤、またはそれらの組合わせから選択される少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤、
を含む、肺の炎症の治療または予防のための液体組成物またはエアロゾル化組成物であって、ただし、該肺表面活性ポリペプチドが、配列番号１で示されるものである場合、該プロテアーゼ阻害剤はエラフィンではない、液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エラフィン（ｅｌａｆｉｎ）である、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項３】
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤である、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項４】
前記プロテアーゼ阻害剤が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２３からなるポリペプチドを含む、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項５】
前記肺表面活性ポリペプチドが、
【化２】
2011001383.tif 000038
である、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項６】
前記組成物が、０．１から１０パーセントの前記肺表面活性ポリペプチドを含む、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項７】
前記組成物は、少なくとも１種のリン脂質をさらに含む、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項８】
前記リン脂質は、前記組成物の５０から９５乾燥重量パーセントを構成する、請求項７に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項９】
前記リン脂質が、４：１から２：１のモル比でジパルミトイルホスファチジルコリン、およびパルミトイル、オレオイルホスファチジルグリセロールを含む、請求項７または８に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、展着剤をさらに含む、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１１】
前記展着剤が、前記組成物の２から２５乾燥重量パーセントを構成する、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１２】
前記展着剤が、少なくとも１０個の炭素原子の脂肪族アシル鎖長を有する脂肪酸または脂肪族アルコールである、請求項１０または１１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１３】
前記展着剤が、チロキサポールをさらに含む、請求項１０または１１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、液体組成物であり、該液体組成物は、気管支肺胞洗浄、経口、静脈内、非経口またはボーラス投与により投与されることを特徴とする、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、液体組成物であり、該液体組成物は、肺の炎症の治療または予防のために投与される、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１６】
前記肺の炎症が、肺高血圧症、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常症、慢性閉塞性肺疾患、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫、気管支梢炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏症、間質性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、アレルギー性喘息、医原性喘息、嚢胞性線維症、肺胞蛋白症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、または特発性肺線維症と関連する、請求項１５に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１７】
前記液体組成物が、エアロゾル化組成物であり、該エアロゾル化組成物は、液体組成物である、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１８】
前記液体組成物が、エアロゾル化組成物であり、該エアロゾル化組成物は、乾燥組成物である、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項１９】
前記液体組成物が、エアロゾル化組成物であり、該エアロゾル化組成物は、１μｍから５μｍの質量中央空気動力学的径を有するエアロゾル粒子を含む、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項２０】
前記液体組成物が、エアロゾル化組成物であり、該エアロゾル化組成物は、喘息治療用に製剤化されている、請求項１に記載の液体組成物またはエアロゾル化組成物。
【請求項２１】
以下のアミノ酸配列：
【化５】
2011001383.tif 000039
からなる肺表面活性ポリペプチド、および、
ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、ビクニン、Ｃ−反応性蛋白質、エラフィン、ヒトプロテアーゼ阻害剤３、ｂトラッピン−２、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤、またはそれらの組合わせから選択される少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤、
の治療有効量を含む、哺乳動物における肺の炎症を治療するための組成物であって、ただし、該肺表面活性ポリペプチドが、配列番号１で示されるものである場合、該プロテアーゼ阻害剤はエラフィンではない、組成物。
【請求項２２】
前記肺の炎症が、肺高血圧症、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常症、慢性閉塞性肺疾患、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫、気管支梢炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏症、間質性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、アレルギー性喘息、医原性喘息、嚢胞性線維症、肺胞蛋白症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、または特発性肺線維症と関連する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記プロテアーゼ阻害剤が、エラフィンである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記プロテアーゼ阻害剤が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または、配列番号２３からなるポリペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、肺の炎症前または炎症時の肺組織の破壊を防止するための製薬組成物、ならびにこのような組成物を作製して使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
リパーゼおよび蛋白分解酵素などの内因性分解酵素は、侵入生物、抗原−抗体複合体、およびもはや生物に不要な、または有用ではない特定の脂質ならびに蛋白質の分解に寄与する。正常に機能している生物において、このような酵素は、限定された量で産生され、阻害剤の合成によりある程度調節される。
【０００３】
酵素とそれらの阻害剤との間のバランスの乱れにより、酵素を媒介とした組織破壊に至ることがある。このような破壊は、炎症、肺気腫、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋ジストロフィー症、腫瘍侵襲および他の種々の病的状態など種々の状態において発生し得る。ある状況において、例えば、敗血症または急性白血病などの重篤な病的過程において、存在する遊離の蛋白分解酵素量は、分泌細胞からの酵素遊離のため増加する。このような異常状態が存在する生物においては、分解酵素の作用を制御する処置が取られない限り、前記生物に対する重篤な損傷が発生し得る。
【０００４】
ヒトにおける肺は、この哺乳動物の体容積の６％を含み、多数の小さい気嚢、すなわち肺胞からなる。肺の主要目的は、全身循環によるガス交換を促進することである。したがって、肺胞は、新鮮な肺胞ガスのガス交換をするため混合静脈血を、肺上皮性および内皮性関門を越えて運ぶ広範囲の毛細血管網により灌流される。肺胞膜は、１００ｍ２を超える全表面積および１μｍ未満の厚さを有する。肺胞膜関門の破壊を引き起こす疾患または病態は、肺胞中への液体漏出をもたらし、肺機能の喪失となり得る。
【０００５】
例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）とは、重篤なガス交換障害（特に動脈低酸素血症）に関連するが、病因を異にする多数の急性び慢性浸潤性肺病変部に適用される記述用語である。ＡＲＤＳは、「漏出性」毛細血管応答に関連することが多い。用語の「急性呼吸窮迫症候群」は、多数の臨床的かつ病理学的特徴が乳児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）と共通するために用いられる。ＩＲＤＳは、肺表面活性物質欠損に関連するが、ＡＲＤＳは、肺表面活性物質機能障害に関連する。死亡率は５０〜６０％であり（Ｓｈｕｓｔｅｒ  Ｃｈｅｓｔ  １９９５年、１０７巻：１７２１−２６ページにおける調査）、ＡＲＤＳ患者の予後は不良である。
【０００６】
肺疾患を予防または治療するために、気管支肺胞洗浄法、気管経由の液体ボーラス投与または薬物溶液のエアロゾル薬物溶液（例えば、噴霧器の使用による）によって、またそれに続いて薬物含有エアロゾル液滴の吸入によって薬物を疾患組織に直接送達し得る。しかしながら、薬物溶液を肺に送っても、薬物またはその投与がどれほど有効であるかは事実上不確かである。例えば、薬物は、ある領域では高濃度で存在し得るが、他の領域では薬物を殆どまたは全く受容せず、肺中の薬物の半減期は、分解または血管系への吸収のため比較的短いと思われる。また、薬物に対するエアロゾル化の効果にも問題がある。薬物は、噴霧器の噴霧作用により分解するか、あるいは酸化により不活化する可能性がある。また、宿主の肺または他の器官への有害作用なしで期間を延長して有効用量を維持できるかは不確かである。乾燥粉末形態での送達用に製剤化された蛋白質は、その生物学的活性を保持するかどうかも予測できない。
【０００７】
幾つかの低分子量薬物を含有する製薬組成物（とりわけベータアンドロゲン作用アンタゴニスト）が、喘息を治療するために、肺投与により送達されている。コルチコステロイド類およびクロモリンナトリウムなどの他の低分子量非蛋白質様化合物は、肺吸収を経て全身に投与されている。しかしながら、低分子量薬剤の全てが、肺経由により有効に投与できるとは限らない。例えば、全身作用を目的としたアミノグリコシド抗生物質、抗ウィルス剤および抗癌剤の肺投与は、成果がまちまちである。幾つかの場合において、前記薬物は、刺激性があり、気管支収縮性であることが判明した。したがって、低分子量物質によっても、このような化合物の肺送達が有効な投与手段であるという予測は全く立てられない。一般的には、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｖ．Ｌｅｅ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９９０年、１−１１ページを参照されたい。薬物自体に固有の種々の因子、製薬組成物、送達装置、および特に肺、またはこれらの因子の組合わせが、肺投与の成果に影響を及ぼし得る。
【０００８】
このゆえに、肺病態を治療するために現在利用できる組成物と方法を改善する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、概して肺病態を治療するための組成物と方法に関する。前記組成物は、炎症の間に有効な少なくとも１種の肺表面活性剤ポリペプチドおよび少なくとも１種の組織破壊媒介物阻害剤を含む。炎症の間に有効な組織破壊媒介物としては、炎症応答の一部として哺乳動物体により生成され、かつ哺乳動物組織に損傷を与え、破壊し得る化合物、酵素、または他の因子のいずれかが挙げられる。組織破壊のこのような媒介物の例としては、プロテアーゼ類、リパーゼ類、酸化物などが挙げられる。このような媒介物の阻害剤は、例えば、プロテアーゼ阻害剤、抗酸化剤、リパーゼ阻害剤またはホスホリパーゼ阻害剤であり得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
肺表面活性ポリペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤を含む肺の炎症の治療、または予防を目的とする液体組成物。
（項目２）
前記プロテアーゼ阻害剤が、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＩＸａ、カテプシンＧ、ヒト白血球エラスターゼまたはヒト分泌白血球プロテアーゼの阻害剤である項目１に記載の液体組成物。
（項目３）
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、アルファ１−プロティナーゼ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、ビクニン、Ｃ−反応性蛋白質またはそれらの組合わせである項目１に記載の液体組成物。
（項目４）
前記プロテアーゼ阻害剤が、エラフィン（ｅｌａｆｉｎ）である項目１に記載の液体組成物。
（項目５）
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤である項目１に記載の液体組成物。
（項目６）
前記プロテアーゼ阻害剤が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３を含むポリペプチドを含む項目１に記載の液体組成物。
（項目７）
前記肺表面活性ポリペプチドが、１０個から６０個の間のアミノ酸残基を有し、かつ式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互の疎水性アミノ酸残基領域および親水性アミノ酸残基領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、式中、
Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、ａは平均値が１〜５の整数であり、ｂは平均値が３〜２０の整数であり、ｃは約１から約１０の整数であり、およびｄは約０から約３の整数である項目１に記載の液体組成物。
（項目８）
Ｚが、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリンまたは３−ヒドロキシプロリンである項目７に記載の液体組成物。
（項目９）
Ｕが、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸などのα−アミノ脂肪族カルボン酸である項目７に記載の液体組成物。
（項目１０）
Ｕが、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸である項目７に記載の液体組成物。
（項目１１）
前記肺表面活性ポリペプチドが、アミノ酸配列：
【化１】
2011001383.tif 000002
を含む項目１に記載の液体組成物。
（項目１２）
前記肺表面活性ポリペプチドが、
【化２】
2011001383.tif 000003
である項目１に記載の液体組成物。
（項目１３）
前記肺表面活性ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９を含む項目１に記載の液体組成物。
（項目１４）
前記組成物が、約０．１から１０パーセントの前記肺表面活性ポリペプチドを含む項目１に記載の液体組成物。
（項目１５）
前記組成物が、約５０から約９５乾燥重量パーセントのリン脂質をさらに含む項目１に記載の液体組成物。
（項目１６）
前記リン脂質が、約４：１から約２：１のモル比でジパルミトイルホスファチジルコリン、およびパルミトイル、オレオイルホスファチジルグリセロールを含む項目１５に記載の液体組成物。
（項目１７）
前記組成物が、約２から約２５乾燥重量パーセントの展着剤を含む項目１に記載の液体組成物。
（項目１８）
前記展着剤が、少なくとも１０個の炭素原子の脂肪族アシル鎖長を有する脂肪酸または脂肪族アルコールである項目１７に記載の液体組成物。
（項目１９）
前記展着剤が、チロキサポールをさらに含む項目１７に記載の液体組成物。
（項目２０）
前記組成物が、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤をさらに含む項目１に記載の液体組成物。
（項目２１）
前記リパーゼ阻害剤が、ホスホリパーゼＡ２阻害剤である項目２０に記載の液体組成物。
（項目２２）
前記リパーゼ阻害剤が、臭化ｐ−ブロモフェナシル、チエロシン（ｔｈｉｅｌｏｃｉｎ）Ａ１ベータ、リポコルチン、アネキシンＩまたはガラガラヘビ属ホスホリパーゼＡ２阻害剤である項目２０に記載の液体組成物。
（項目２３）
前記リパーゼ阻害剤が、ＬＹ１１−７２７である項目２０に記載の液体組成物。
（項目２４）
前記抗酸化剤が、カタラーゼ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、プロシステイン、アルファ−トコフェロール、ローズマリー葉抽出物、２，４−ジアミノピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン、アスコルビン酸、ロイテイン（ｌｅｕｔｅｉｎ）、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ビオラキサンチン、カロテンジオール、ヒドロキシカロテン、ヒドロキシリコペン、アロキサンチン、またはデヒドロクリプトキサンチンである項目２０に記載の液体組成物。
（項目２５）
前記液体組成物が、気管支肺胞洗浄、経口、静脈内、非経口またはボーラス投与により投与される項目１に記載の液体組成物。
（項目２６）
肺表面活性ポリペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤を含む肺の炎症の治療または予防を目的とするエアロゾル化組成物。
（項目２７）
前記プロテアーゼ阻害剤が、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＩＸａ、カテプシンＧ、ヒト白血球エラスターゼまたはヒト分泌白血球プロテアーゼの阻害剤である項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目２８）
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、アルファ１−プロティナーゼ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、ビクニン、Ｃ−反応性蛋白質またはそれらの組合わせである項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目２９）
前記プロテアーゼ阻害剤が、エラフィンである項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３０）
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤である項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３１）
前記プロテアーゼ阻害剤が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３を含むポリペプチドを含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３２）
前記肺表面活性ポリペプチドが、１０個から６０個の間のアミノ酸残基を有し、かつ式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互の疎水性アミノ酸残基領域および親水性アミノ酸残基領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、式中、
Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、ａは平均値が１〜５の整数であり、ｂは平均値が３〜２０の整数であり、ｃは約１から約１０の整数であり、およびｄは約０から約３の整数である項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３３）
Ｚが、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリンまたは３−ヒドロキシプロリンである項目３２に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３４）
Ｕが、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸などのα−アミノ脂肪族カルボン酸である項目３２に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３５）
Ｕが、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸である項目３２に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３６）
前記組成物が、約０．１から１０パーセントの前記肺表面活性ポリペプチドを含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３７）
前記肺表面活性ポリペプチドが、アミノ酸配列：
【化３】
2011001383.tif 000004
を含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３８）
前記肺表面活性ポリペプチドが、
【化４】
2011001383.tif 000005
である項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目３９）
前記肺表面活性ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９を含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４０）
前記組成物が、約５０から約９５乾燥重量パーセントのリン脂質をさらに含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４１）
前記リン脂質が、約４：１から約２：１のモル比でジパルミトイルホスファチジルコリン、およびパルミトイル、オレオイルホスファチジルグリセロールを含む項目４０に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４２）
前記組成物が、約２から約２５乾燥重量パーセントの展着剤を含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４３）
前記展着剤が、少なくとも１０個の炭素原子の脂肪族アシル鎖長を有する脂肪酸または脂肪族アルコールである項目４２に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４４）
前記展着剤が、チロキサポールをさらに含む項目４２に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４５）
前記組成物が、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤をさらに含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４６）
前記リパーゼ阻害剤が、ホスホリパーゼＡ２阻害剤である項目４５に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４７）
前記リパーゼ阻害剤が、臭化ｐ−ブロモフェナシル、チエロシンＡ１ベータ、リポコルチン、アネキシンＩまたはガラガラヘビ属ホスホリパーゼＡ２阻害剤である項目４５に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４８）
前記リパーゼ阻害剤が、ＬＹ１１−７２７である項目４５に記載のエアロゾル化組成物。
（項目４９）
前記抗酸化剤が、カタラーゼ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、プロシステイン、アルファ−トコフェロール、ローズマリー葉抽出物、２，４−ジアミノピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン、アスコルビン酸、ロイテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ビオラキサンチン、カロテンジオール、ヒドロキシカロテン、ヒドロキシリコペン、アロキサンチン、またはデヒドロクリプトキサンチンである項目４５に記載のエアロゾル化組成物。
（項目５０）
前記組成物が、液体組成物である項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目５１）
前記組成物が、乾燥組成物である項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目５２）
前記組成物が、約１μｍから約５μｍの空気動力学的径質量中央値を有するエアロゾル粒子を含む項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目５３）
前記組成物が、喘息治療用に製剤化されている項目２６に記載のエアロゾル化組成物。
（項目５４）
プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における肺の炎症を治療する方法。
（項目５５）
前記肺の炎症が、肺高血圧症、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常症、慢性閉塞性肺疾患、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫、気管支梢炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏症、間質性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、アレルギー性喘息、医原性喘息、嚢胞性線維症、肺胞蛋白症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、または特発性肺線維症と関連する項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記プロテアーゼ阻害剤が、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＩＸａ、カテプシンＧ、ヒト白血球エラスターゼまたはヒト分泌白血球プロテアーゼの阻害剤である項目５４に記載の方法。
（項目５７）
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、アルファ１−プロティナーゼ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、ビクニン、Ｃ−反応性蛋白質またはそれらの組合わせである項目５４に記載の方法。
（項目５８）
前記プロテアーゼ阻害剤が、エラフィンである項目５４に記載の方法。
（項目５９）
前記プロテアーゼ阻害剤が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３を含むポリペプチドを含む項目５４に記載の方法。
（項目６０）
前記リパーゼ阻害剤が、ホスホリパーゼＡ２阻害剤である項目５４に記載の方法。
（項目６１）
前記リパーゼ阻害剤が、臭化ｐ−ブロモフェナシル、チエロシン（ｔｈｉｅｌｏｃｉｎ）Ａ１ベータ、リポコルチン、アネキシンＩまたはガラガラヘビ属ホスホリパーゼＡ２阻害剤である項目５４に記載の方法。
（項目６２）
前記抗酸化剤が、カタラーゼ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、プロシステイン、アルファ−トコフェロール、ローズマリー葉抽出物、２，４−ジアミノピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン、アスコルビン酸、ロイテイン（ｌｅｕｔｅｉｎ）、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ビオラキサンチン、カロテンジオール、ヒドロキシカロテン、ヒドロキシリコペン、アロキサンチン、またはデヒドロクリプトキサンチンである項目５４に記載の方法。
（項目６３）
前記組成物が、非経口的、経口的または静脈内投与される項目５４に記載の方法。
（項目６４）
前記組成物が、気管支肺胞洗浄、吸入または液体ボーラス投与により肺に投与される項目５４に記載の方法。
（項目６５）
組成物が、１０個から６０個の間のアミノ酸残基を有し、かつ式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互の疎水性アミノ酸残基領域および親水性アミノ酸残基領域のアミノ酸配列を含む肺表面活性ポリペプチドをさらに含み、式中、
Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、ａは平均値が１〜５の整数であり、ｂは平均値が３〜２０の整数であり、ｃは約１から約１０の整数であり、およびｄは約０から約３の整数である項目５４に記載の方法。
（項目６６）
前記組成物が、約０．１から１０乾燥重量パーセントの前記肺表面活性ポリペプチドを含む項目６５に記載の方法。
（項目６７）
Ｚが、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリンまたは３−ヒドロキシプロリンである項目６５に記載の方法。
（項目６８）
Ｕが、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸などのα−アミノ脂肪族カルボン酸である項目６５に記載の方法。
（項目６９）
Ｕが、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸である項目６５に記載の方法。
（項目７０）
前記肺表面活性ポリペプチドが、アミノ酸配列：
【化５】
2011001383.tif 000006
を含む項目６５に記載のエアロゾル化組成物。
（項目７１）
前記肺表面活性ポリペプチドが、
【化６】
2011001383.tif 000007
である項目６５に記載の方法。
（項目７２）
前記肺表面活性ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９を含む項目６５に記載の方法。
（項目７３）
前記組成物が、約５０から約９５乾燥重量パーセントのリン脂質をさらに含む項目６５に記載の方法。
（項目７４）
前記リン脂質が、約４：１から約２：１のモル比でジパルミトイルホスファチジルコリン、およびパルミトイル、オレオイルホスファチジルグリセロールを含む項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記組成物が、約２から約２５乾燥重量パーセントの展着剤をさらに含む項目６５に記載の方法。
（項目７６）
前記展着剤が、少なくとも１０個の炭素原子の脂肪族アシル鎖長を有する脂肪酸または脂肪族アルコールである項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記展着剤が、チロキサポールをさらに含む項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記リパーゼ阻害剤が、ＬＹ１１−７２７である項目５４に記載の方法。
（項目７９）
前記プロテアーゼ阻害剤が、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤である項目５４に記載の方法。
【００１０】
一態様において、本発明は、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤と共に肺表面活性剤ポリペプチドを含む組成物を含む。リパーゼ阻害剤、ホスホリパーゼ阻害剤および／または抗酸化剤もまた、前記組成物に含むことができる。本組成物は、気管支肺胞洗浄、ボーラス投与液滴、吸入などにより肺に直接投与できる。
【００１１】
他の態様において、本発明は、吸入により患者に活性剤を送達するためのエアロゾル化組成物を含む。前記組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤と共に少なくとも１種の表面活性剤ポリペプチドを含むエアロゾル粒子を含む。リパーゼ阻害剤、ホスホリパーゼ阻害剤および／または抗酸化剤もまた、前記組成物に含むことができる。
【００１２】
本発明の組成物および方法に使用されるプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、ホスホリパーゼ阻害剤および抗酸化剤は、いずれも当業者に利用できるような阻害剤または抗酸化剤であり得る。
【００１３】
幾つかの実施形態において、前記プロテアーゼ阻害剤は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤またはセリンプロテアーゼ阻害剤である。例えば、前記プロテアーゼ阻害剤は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＩＸａ、コラゲナーゼ、カテプシンＧ、ヒト白血球エラスターゼまたはヒト分泌白血球プロテアーゼを阻害し得る。前記プロテアーゼ阻害剤は、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、アルファ１−プロティナーゼ阻害剤、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、カテプシンＧ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、Ｃ−反応性蛋白質、エラフィン（ｅｌａｆｉｎ）またはそれらの組合わせであってよい。幾つかの実施形態において、前記プロテアーゼ阻害剤は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２を含むポリペプチドを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、前記リパーゼ阻害剤は、ホスホリパーゼＡ２阻害剤である。前記リパーゼ阻害剤はまた、例えば、臭化ｐ−ブロモフェナシル、チエロシン（ｔｈｉｅｌｏｃｉｎ）Ａ１ベータ、リポコルチン、アネキシンＩまたはガラガラヘビ属ホスホリパーゼＡ２阻害剤であり得る。
【００１５】
前記抗酸化剤は、例えば、カタラーゼ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、プロシステイン、またはアルファ−トコフェロールであり得る。例示的抗酸化剤はまた、ＥＵＫ１３４を含む。
【００１６】
上記のとおり、肺投与の組成物は、肺表面活性剤ポリペプチドを含有する。前記肺表面活性剤ポリペプチドは、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互の疎水性アミノ酸残基領域および親水性アミノ酸残基領域のアミノ酸配列を有する約１０個から約６０個の間のアミノ酸残基を有し得、式中、Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、「ａ」は約１〜約５の整数であり、「ｂ」は約３〜約２０の整数であり、「ｃ」は約１から約１０の整数であり、および「ｄ」は約０から約３の整数である。単一（または複数）阻害剤および／または抗酸化剤は、製剤の１から８０乾燥重量パーセント、典型的には２〜５０乾燥重量パーセント調合し得る。
【００１７】
例示的肺表面活性剤ポリペプチドにおいて、Ｚが、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリンおよび／または３−ヒドロキシプロリンであり、Ｕが、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸またはα−アミノヘキサン酸などのα−アミノ脂肪族カルボン酸である。
【００１８】
表面活性剤蛋白質の一クラスが、配列：
【００１９】
【化７】
2011001383.tif 000008
【００２０】
を有する。
【００２１】
肺投与用組成物は、（ｉ）５０〜９５乾燥重量パーセントのリン脂質、（ｉｉ）肺表面の内層内へのリン脂質の取り込みおよび分布を促進するために有効な２〜２５乾燥重量パーセントの展着剤、および（ｉｉｉ）０．１から１０乾燥重量パーセントの肺表面活性剤ポリペプチド、の表面活性剤混合物を含有することができる。
【００２２】
特定の例示的実施形態において、前記表面活性剤混合物のリン脂質は、４：１と２：１との間のモル比でジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびパルミトイル、オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）を含む。例示的展着剤は、パルミチン酸またはセチルアルコールなどの少なくとも１０個の炭素原子の脂肪族アシル鎖長を有する脂肪酸または脂肪族アルコールである。
【００２３】
エアロゾル粒子は液体懸濁液から形成されるが、表面活性剤製剤は水性エアロゾル液滴に懸濁し得る。前記粒子が乾燥粉末の形態である場合は、前記粒子を脱水し、または実質的に脱水する。前記エアロゾル粒子は、１〜５μｍサイズ範囲で質量中央空気動力学的径を有することができる。
【００２４】
本発明はまた、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における肺の炎症を治療する方法を提供する。当業者は、組成物を直接肺組織に投与（例えば、気管支肺胞洗浄、ボーラス液滴または気管内投与）することを選択できるが、前記組成物はまた、他の経路、例えば、非経口投与、経口投与または静脈内投与経路により投与できる。肺投与が使用される場合、少なくとも１つの肺表面活性剤ペプチドが組成物に含まれる。
【００２５】
本法により治療される肺の炎症は、例えば、肺高血圧症、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常症、慢性閉塞性肺疾患、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫、気管支梢炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏症、間質性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、アレルギー性喘息、医原性喘息、嚢胞性線維症、肺胞蛋白症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、または特発性肺線維症と関連し得る。
【００２６】
他の態様において、本発明は、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤および抗酸化剤などの活性剤を患者に投与する方法を含む。気管支肺胞洗浄、ボーラス液滴投与または吸入による投与があり得る。この方法は、前記薬剤を（ｉ）５０〜９５乾燥重量パーセントのリン脂質、（ｉｉ）肺表面の内層内へのリン脂質の取り込みおよび分布を促進するために有効な２〜２５乾燥重量パーセントの展着剤、および（ｉｉｉ）０．１から１０乾燥重量パーセントの肺表面活性剤ポリペプチド、からなる表面活性剤混合物に取り込ませることを含む。後者の成分は、１０個から６０個の間のアミノ酸残基を含有し、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互の疎水性アミノ酸残基領域および親水性アミノ酸残基領域のアミノ酸配列を有しており、式中、Ｚは親水性アミノ酸残基であり、Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、「ａ」は平均値が１〜５の整数であり、「ｂ」は平均値が３〜２０の整数であり、「ｃ」は１から１０の整数であり、および「ｄ」は０から３の整数である。生じた製剤は、活性剤の１から８０乾燥重量パーセント、または２〜５０乾燥重量パーセントを含有する。
【００２７】
前記製剤は、粒子が１〜５μｍの質量中央空気動力学的径を有する粒子組成物に変換できる。前記粒子は、エアロゾル組成物の形態で治療的有効量を患者の気道に投与する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、前記製剤は、肺への気管支肺胞洗浄により、または例えば、気管チューブを介しての直接的ボーラス投与による投与のための水性製剤である。他の実施形態において、前記製剤の活性剤および他の成分を水性溶媒、有機溶媒または混合溶媒であり得る溶媒中に溶解または懸濁させることにより前記製剤を調製する。前記製剤は、所望の１〜５μｍ  ＭＭＡＤサイズ範囲を有する乾燥粒子を製造するのに有効な条件下で混合物をスプレー乾燥することによりエアロゾル投与用の粒子組成物に変換できる。他の実施形態において、前記製剤は、液体組成物を凍結乾燥して乾燥させ、その乾燥混合物を粉砕して所望のサイズ範囲の乾燥粒子を形成することにより、エアロゾル投与用の粒子組成物に変換できる。
【００２９】
液体（例えば、水性）組成物を、気管支肺胞洗浄またはボーラス投与により肺に直接投与できる。液体または乾燥粒子を、エアロゾル形態での吸入により投与できる。前記製剤はまた、水性懸濁形態、例えば、それに懸濁される懸濁製剤粒子を有する液滴を形成するためにエアロゾル化されるリポソーム懸濁液であってもよい。
本発明のこれらの他の目的および特徴は、付随する図面と関連させて本発明の以下の詳細な説明を読むことで、より十分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明のある一定の態様を実施する上で使用される種々の処理工程間の関連を図示する工程系統図である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、本発明において実施され得る追加の処理工程を図示している。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、非晶質（３Ａ）および結晶性（３Ｂ）脂質本体の顕微鏡写真である。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、ゼロ時間における表面活性剤の存在（＋）および表面活性剤の不在（−）下で送達される薬物の沈着と展着（図４Ａ）、および肺における経時的細胞内取り込みと浸透性を増強する能力に及ぼす展着効果（図４Ｂ）を図示している。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、ゼロ時間における表面活性剤の存在（＋）および表面活性剤の不在（−）下で送達される薬物の沈着と展着（図４Ａ）、および肺における経時的細胞内取り込みと浸透性を増強する能力に及ぼす展着効果（図４Ｂ）を図示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の種々の薬物−送達の有利な点がどのようにして達成されるかの方法を図示している。
【図５Ａ】図５Ａは、標準量（０．１２５μｇ）のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）に添加された公知のセリンエラスターゼ阻害剤の対数量を混合物の対応するＯＤ４１０に対してプロットする阻害曲線である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＲＤＳ患者から回収したＢＡＬ液量とエラスターゼ活性の比色アッセイにおけるＯＤ４１０との間の用量−応答を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、３ｍｇの抗−ＢＳＡ／ｋｇ（ウサギ６０９８と６０９９）または５ｍｇの抗−ＢＳＡ／ｋｇ（ウサギ６１００〜６１０３）を気管内に点滴注入して処理し、さらに１０ｍｇのＢＳＡを静脈内投与（６０９８〜６１０１）してから６時間後のウサギの肺から取られたＢＡＬ液におけるエラスターゼ活性を示している（斜線バー）。比較として、公知のセリンエラスターゼ阻害剤の１００μｇ／ｍｌ添加後のこれらのＢＡＬ液におけるエラスターゼ活性も示している（交差平行線バー）。エラスターゼ活性は、４１０ｎｍにおいて対応するＯＤを与えるヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）の濃度として表される。
【図６Ｂ】図６Ｂは、肺傷害を受けているウサギからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液によるヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）活性の阻害を示している。ＢＡＬ液は、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）および抗−ＢＳＡを気管内投与された（全動物）３時間後（ウサギ６３１５および６３１６）または６時間後（６３１３、６３１４、６３１７および６３１８）のウサギから取られ；６３１７と６３１８のウサギは３時間目に１０ｍｇ／ｋｇのＢＳＡをさらに投与された。ＢＡＬ液は、単独で（交差平行線バー）または１μｇ／ｍｌ  ＨＮＥの添加後（斜線バー）に試験した。空白バーは、ＢＡＬ液添加なしのＨＮＥ活性を示している。かなりの遊離エラスターゼが、ウサギ６３１７に存在し；他の動物は全てはエラスターゼ阻害剤の存在を示した。
【図７Ａ】図７Ａは、正常ウサギ（５群）または細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）と酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）によって傷害を受けたウサギ（１群）、また表面活性剤混合物モデルで治療を受けたウサギ（２群）、公知のセリンエラスターゼ阻害剤で治療を受けたウサギ（３群）または表面活性剤混合物モデルとセリンエラスターゼ阻害剤との組合わせで治療を受けたウサギ（４群）の終末洗浄液（傷害６時間後）における平均蛋白値を示している。使用量および処理時間に関しては実施例８を参照されたい。エラーバーは、ＳＥＭを示している。３群における１匹の動物は、大きなエラーバーに反映して異常に高い蛋白値を有し、この群の蛋白値としては他の場合に考えられたものよりも歪みが大きかった。異常値を除外すると３群に関しては平均値が１．７２となるはずである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＬＰＳ／ＰＭＡ誘導肺損傷を有するウサギから得られたＢＡＬ液のウェスタンブロット分析の図である。基底膜蛋白質がこれらのＢＡＬ液に存在するかどうかを検出するために、基底膜蛋白質に向けられた抗体が使用された。第１の（いちばん左）レーンは、対照として約８０，０００ｋＤａからそれより大きいサイズの範囲の基底膜蛋白質を含有した。より低分子量（約１０，０００）の基底膜蛋白質ならびにより高分子量の基底膜蛋白質が、ＬＰＳおよびＰＭＡ単独で処理されたウサギのＢＡＬ液に存在した（２レーン、１群）。ＬＰＳ／ＰＭＡ損傷ウサギが、表面活性剤混合物モデル（２群）、セリンエラスターゼ阻害剤（３群）、および表面活性剤混合物モデルとセリンエラスターゼ阻害剤との両方（４群）で治療を受けると、いくらか少ない量の基底膜蛋白質が存在した。正常で無傷のウサギの洗浄液は、低分子量基底膜蛋白質が殆どないか、全くなかった（最後のいちばん右のパネル、５群）。１〜４群の７０，０００ＭＷに存在する大きなバンドは、使用された抗血清の不純物として存在するアルブミンである。９０，０００ＭＷ超のバンドは、基底膜に特異的であり、正常なウサギ血漿中には存在しない（データは示していない）。低ＭＷバンド（＜１０，０００ＭＷ）は、基底膜の断片を表している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＬＰＳおよびＰＭＡで損傷を受け、種々の方法で治療を受けた動物の終末洗浄液（傷害６時間後）における平均赤血球数（ＲＢＣｓ）を示している。治療を受けなかった正常なウサギ群（５群）の２匹のウサギは、対照として使用した。さらに、ＬＰＳおよびＰＭＡで損傷を受け、治療を受けなかったウサギ（１群）は、最も高い赤血球数を有した。表面活性剤混合物モデルで治療を受けたＬＰＳ／ＰＭＡ損傷ウサギ（２群）は、ＲＢＣ数がより少なかった。エラスターゼ阻害剤（３群）または表面活性剤混合物モデルとエラスターゼ阻害剤（４群）で治療を受けた動物は、洗浄液におけるＲＢＣ数がさらに少なかった。
【図８】図８は、表面活性剤混合物モデル（最終濃度２ｍｇ／ｍｌ）、公知のセリンエラスターゼ阻害剤（１００μｇ／ｍｌ）、または表面活性剤混合物モデルとセリンエラスターゼ阻害剤との両方一緒によるＨＮＥの公知量（０．０２μｇ）の阻害を示している。
【図９】図９は、実施例１２に記載されている治療群の終末洗浄液におけるエラスターゼ阻害の程度を示している。
【図１０】図１０は、抗−ＢＳＡ抗体の気管内投与により誘導された肺傷害に罹っているウサギからの洗浄液に、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）が存在することを図示している。ＰＬＡ２基質、パルミトイル、オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）から遊離されたオレイン酸量（“ピーク高さ）を、時間の関数としてプロットされた。遊離オレイン酸量は、示されるように０から約４０分で急速に増加した。
【図１１】図１１は、２．５ｍｇ／ｍｌの抗−ＢＳＡ抗体（動物６０１１と６０１２）、５．０ｍｇ／ｍｌの抗−ＢＳＡ抗体（動物６０１３と６０１４）または１２．５ｍｇ／ｍｌの抗−ＢＳＡ抗体（動物６０１５と６０１６）を投与した動物から単離された終末洗浄液におけるホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性の量をグラフとして図示している。図示されるように、動物が抗−ＢＳＡ抗体を増量して投与された場合、終末洗浄液中のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性は増加する。
【図１２】図１２は、２．５ｍｇ／ｍｌの抗−ＢＳＡ抗体（動物６０１１と６０１２）、５．０ｍｇ／ｍｌの抗−ＢＳＡ抗体（動物６０１３と６０１４）または１２．５ｍｇ／ｍｌの抗−ＢＳＡ抗体（動物６０１５と６０１６）を投与した動物から単離された終末洗浄液に存在するリノレン酸量（交差平行線バー）とリノール酸量（斜線バー）をグラフとして図示している。洗浄液中の遊離脂肪酸（リノレン酸とリノール酸）の存在は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）が、これらの動物の傷害肺組織に有効であることを示している。遊離脂肪酸量もまた図示されるように、より多量の抗−ＢＳＡ抗体が投与された動物において増加した。
【図１３】図１３は、洗浄液中のＰＬＡ２活性が、ＰＬＡ２阻害剤の添加により用量依存様式で減少することをグラフとして図示している。洗浄液（ウサギ６０１５から得られた）との温置３０分後のＰＯＰＧ基質からのオレイン酸の遊離は示されるように、間接的にＬＹ３１１７２７阻害剤量に比例していた。言い換えると、阻害剤量を増加させて添加すると、ＰＬＡ２活性量の減少が見られた。
【図１４】図１４は、阻害剤濃度の対数関数としてＢＡＬ液からのＰＬＡ２活性をグラフとして図示している。ＢＡＬ液のＰＬＡ２活性は示されるように、阻害剤濃度が増加すると著しく低下する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、肺表面活性剤ポリペプチド（単数または複数）と、炎症の間に生じる組織破壊過程に対する種々のタイプの阻害剤との組合わせを含む組成物に関する。肺内における組成物の送達および分散を促進させるために、他の成分、例えば、リン脂質および展着剤を含むことができる。
【００３２】
（定義）
以下の用語は、他に指定されない限り、以下の意味を有する。
【００３３】
「アミノ酸」とは、蛋白質を構成するアミノ酸残基を称して言う。アミノ酸類は、通常は天然のＬ−体であるが；しかしながら、Ｄ−アミノ酸、置換アミノ酸（例えば、修飾側鎖基を有するアミノ酸類）、アミノ酸代謝物および異化産物、「レトロ」主鎖を有するアミノ酸類、およびアミノ酸擬似体または類縁体もまた、本発明の使用に考慮されており、したがって、本発明により包含されている。標準的ポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３巻：ｐ．３５５７−５９、１９６９年に従って、より一般的なアミノ酸残基に対する略語は、以下の対応表に示されるとおりである：
【００３４】
【化８】
2011001383.tif 000009
【００３５】
他に指定しない限り、本明細書中、式により表されるアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の従来の方向で左から右配向を有することに注意すべきである。さらに、熟語「アミノ酸残基」は、対応表に掲げたアミノ酸類を含めて広く定義されており、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）（４）に掲げたものなどの修飾アミノ酸および希なアミノ酸は、参照として本明細書に組み込まれている。熟語「アミノ酸残基」はまた、Ｄ−アミノ酸、置換アミノ酸類（例えば、修飾側鎖基を有するアミノ酸類）、修飾アミノ酸類（例えば、アミノ酸代謝物、異化産物、および「デザインされた」側鎖を有するアミノ酸類）およびアミノ酸擬似体または類縁体を含めて広く定義されている。
【００３６】
さらに、アミノ酸残基配列の始端または末端のダッシュ記号は一般に、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端におけるＨおよびＯＨ（水素および水酸基）などの基に対する結合、または１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列を示すことを注意すべきである。さらに、残基配列の右手末端の斜線（／）は、前記配列が次の行に続けられていることを示すことに注意すべきである。
【００３７】
「製薬的に許容できる」は、ヒトに投与された際、アレルギー反応または同様の有害反応を生じさせない分子本体および組成物を称する用語である。
【００３８】
「蛋白質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」は、アミノ酸またはアミノ酸類縁体サブユニット、典型的にはペプチドインターサブユニット結合、あるいは酵素基質または受容体結合リガンド相互作用と調和する他のインターサブユニット結合により結合された、生物学的蛋白質に見出される通常２０個のＬ−アミノ酸類の幾つかまたは全部からなるバイオポリマーである。蛋白質は、そのサブユニット配列によって表される一次構造を有し、また二次的な螺旋状またはひだ構造、ならびに全体的三次元構造を有し得る。「蛋白質」は通常、比較的大きなポリペプチド、例えば、３０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドを言うが、「ペプチド」はより小さなポリペプチドを言い、または「ポリペプチド」はより小さなポリペプチドを言い、これらの用語もまた、本明細書では互換可能に用いられる。すなわち、用語の「蛋白質」は、より大きなポリペプチド、例えば、３０個より多くのアミノ酸、を称してもよいが、必ずしもより小さなポリペプチドを除外する必要はなく、用語の「ポリペプチド」は、より小さなペプチド、例えば、３０個より少ないアミノ酸類を称してもよいが、またより大きな蛋白質を含んでもよい。
【００３９】
「表面活性物質活性」とは、単独または他の有機分子と組合わせて脂質と組み合せた際に、空気／水界面の表面張力を低下させる有機分子、蛋白質またはポリペプチドなどの任意の物質の能力を称す。この測定法は、ビルヘルミーはかりまたはインビトロアッセイによる脈動性気泡サーファクトメーターにより実施できる。例えば、Ｋｉｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２３巻：ｐ．７１５−７２６（１９７２）の測定法、または蛋白質またはポリペプチドがリン脂質と混合される際の空気−水界面における表面張力の測定を利用する、本明細書に例示されるアッセイを参照されたい。さらに、肺に入る所与の空気圧におけるコンプライアンスまたは空気流増加のインビボ測定は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｌｕｎｇ、１５８巻：ｐ．５７−６８（１９８０）のアッセイなどで容易に実施できる。このアッセイにおいて、評価すべきサンプルを、気管内チューブによりウサギ胎仔または帝王切開（Ｃａｅｓａｒｉａｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）による早産子羊に投与する。（これらの「早産仔」は、自身の肺表面活性物質を欠損しており、ベンチレータに維持される）。肺コンプライアンス、血液ガスおよび換気装置圧の測定値は活性の指標を提供する。脈動性気泡の表面張力を低下させる能力として評価される表面活性物質活性のインビトロアッセイ、および本明細書に報告されているウサギ胎仔を利用するインビボアッセイは、Ｒｅｖａｋら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１３４巻：ｐ．１２５８−１２６５（１９８６）により詳細に記載されている。
【００４０】
「表面活性剤分子」とは、表面活性物質活性を有する有機分子を言い、製薬的に許容できる脂質と混合された場合、より低いΔＰ値により立証されているように、脂質単独よりも大きな表面活性物質活性を有する表面活性物質を形成する。
【００４１】
「天然肺表面活性物質」とは、成熟哺乳動物の肺の肺胞上皮を裏打ちする肺表面活性物質（ＰＳ）を称す。天然または自生ＰＳは、肺の空気−液体界面における表面張力を減じるように相互作用するリン脂質とアポ蛋白の双方を含有するため、「リポ蛋白複合体」として記載されてきた。天然の表面活性物質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が主成分である数種の脂質種を含有する。少なくとも４種の蛋白質が、天然の肺表面活性物質、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｄに典型的に存在する。これら４種のうち、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは、異なっており、恐らくバルク相の層状構成から空気−水界面への脂質移動を促進することにより、また呼気の間の脂質単層を安定化することにより、表面活性物質のリン脂質混合物の表面活性特性を高めることが示されてきた低分子量の比較的疎水性の蛋白質である。ＳＰ−Ｂの構造は、荷電アミノ酸類（主として塩基性）が、他の場合には疎水性残基である延伸内で適切な規則正しい間隔で配置されている点で異例である。自生のＳＰ−Ｂ配列の５９〜８０の残基からなるドメインに関して、これらの荷電基は、生物学的活性に必要であることが示されていた。さらに、ＤＰＰＣとＰＧとで組合される際に、この疎水性−親水性ドメインに形成される天然および合成ペプチド類は、良好な表面活性物質活性を示す。
【００４２】
天然の表面活性物質の蛋白質は、層状体の形態で肺上皮細胞に保存され、移出後、構造的転移を受けて管状ミエリンを形成し、空気−水界面に単層を生じさせる。肺表面活性物の蛋白質ＳＰ−Ａ、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは、これらの構造的転移を促進し、肺胞の拡張と収縮の間の脂質単層を安定化することが提案されていたが；分子レベルにおける脂質−蛋白質相互作用の完全な理解を現在欠いている。
【００４３】
「肺投与」とは、製薬的に有効な物質を肺のいずれかの表面に送達する任意の投与様式を言う。この送達様式としては、限定はしないが、気管内投与、すなわち一般に液体懸濁液の点滴として、乾燥粉末「粉剤」または点滴として、またはエアロゾルとして好適なものを挙げることができる。肺投与は、製薬的に有効な物質の局所および全身双方の送達に利用できる。
【００４４】
「肺表面横断輸送」とは、肺の曝露表面を透過または浸透する任意の通過様式を言う。これは、肺胞表面（ガス交換が生じる）、細気管支表面およびこれら任意の表面間の通過を含む任意の肺表面を介する通過を含む。局所作用を目的として肺組織に直接的に、または全身作用を目的として肺組織を経由して循環内への通過があり得る。
【００４５】
「リン脂質」とは、無極性疎水性尾部、グリセロール部またはスフィンゴシン部、および極性頭部からなる両親媒性脂質を言う。前記無極性疎水性尾部は、通常飽和または不飽和脂肪酸基である。前記極性頭部は、しばしば窒素含有塩基に結合しているホスフェート基を有する。
【００４６】
「展着剤」とは、肺表面内層内へのリン脂質（類）の取り込みおよび分配を促進する、すなわち、肺表面内層における空気／液体界面でのリン脂質の展着を促進する化合物を意味する。
【００４７】
「活性剤」とは、所望の治療成績または目的あるいは診断成績または目的を達成するために投与される治療用または診断用化合物を言う。製薬的に有効な薬剤とは、医学的または獣医学的疾患または外傷を治療し、医学的または獣医学的疾患を予防し、またはヒトまたは動物の生理機能を調節するために有用な生物学的に活性な合成または天然物質である薬剤を言う。有効化合物の範囲は、下記に考慮されている。
【００４８】
「空気動力学的径」は、特性化された粒子と同じ沈降速度を有する単位密度の等しい球形粒子の直径として定義される。すなわち、粒子の形状またはサイズにかかわらず、前記粒子は、単位密度の球体に変換されると考える。その球体の直径が、空気力学径である。したがって、１〜５ミクロンサイズの空気動力学的径を有する粒子は、１〜５ミクロンサイズ範囲の直径を有する単位密度の球形粒子と同じ空気動力学的性質を有する。粒子の空気動力学的性質は、カスケード衝突、エルトリエータまたは沈降細胞などの従来法を用いて実験的に測定できる。しばしば使用される測定法は、エアロゾルが使用される状況に最もよく類似しているものである。
【００４９】
粒子採取の「空気動力学的径質量中央値」とは、粒子質量の空気動力学的粒子径中央値（ＭＭＡＤ）を言う。すなわち、粒子質量の半分がＭＭＡＤ以下であり、半分がそれを超える。エアロゾル粒子のヘテロ分散性は、幾何標準偏差（ＧＳＤ）により定義できる。全ての粒子が同一のサイズおよび形状である場合、ＧＳＤは１である。３．５のＧＳＤは、高いヘテロ分散性の粒子採取を示す。本発明の好ましいエアロゾル粒子は、１と２．５との間、好ましくは１〜２のＧＳＤを与える条件下で形成される。
【００５０】
「モデル表面活性剤混合物」または「スルファキシン（Ｓｕｒｆａｘｉｎ（登録商標））」とは、実施例１および２に述べられた表面活性剤混合物成分を用いて、本発明に従って調製された表面活性剤混合物を称す。
【００５１】
（活性剤）
本発明の表面活性剤の担体は、肺または病態を治療する目的で活性剤の範囲を投与するために使用できる。このような病態としては、肺高血圧症、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫、気管支梢炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏症、間質性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、アレルギー性喘息、医原性喘息、嚢胞性線維症、肺胞蛋白症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、および、特発性肺線維症が挙げられる。前記活性剤は、肺組織、または肺組織内の病原性生物に直接作用できる。
【００５２】
肺炎症性疾患を治療するために用いられる治療剤としては、プロテアーゼ阻害剤、抗酸化剤、ホスホリパーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤およびそれらの組合わせが挙げられる。これらの薬剤は、蛋白質、ペプチド、核酸類、多糖類、炭水化物、脂質、糖蛋白質、ならびに有機および無機化合物類の形態であり得る。
【００５３】
本発明によれば、プロテアーゼ類は、炎症の間の肺組織損傷を悪化させ得る。このようなプロテアーゼ活性は、肺の炎症患者または動物モデルから得られた肺組織または洗浄液中に検出できる。基底膜蛋白質濃度の上昇は、急性呼吸窮迫症候群を患っている患者の洗浄液において、また、肺損傷に罹っている動物モデルで検出できる。炎症性肺組織中で活性なプロテアーゼのタイプは、特異的プロテアーゼ活性の検出、プロテアーゼ特異的抗体を用いる抗原プロテアーゼの検出、プロテアーゼ活性産生物の検出などを含む、当技術分野に利用できる方法により同定できる。
【００５４】
プロテアーゼ活性は、阻害剤により調節および制御できる。プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼの活性部位を占有し、それにより正常基質による占有を防ぐことにより標的プロテアーゼの蛋白分解活性を調節できる。プロテアーゼ阻害剤は、幾つかの関連のない構造クラスに分類されるが、多くの実施形態において、前記阻害剤は、露出ループ（「阻害剤ループ」、「反応性コア」、「反応性部位」、または「結合ループ」と種々呼ばれる）を有することができ、これはループにフランキングする残基と蛋白質コア間との分子内相互作用により安定化される（ＢｏｄｅおよびＨｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４巻：ｐ．４３３（１９９２））。阻害剤と酵素間との相互作用は安定な複合体を産生でき、これは極めて緩やかに分離して未開裂阻害剤、または結合ループの切断可能な結合で開裂される修飾阻害剤のいずれかを放出する。
【００５５】
本発明は、本発明の組成物および方法において任意の利用できるプロテアーゼ阻害剤の使用を考慮している。プロテアーゼ阻害剤の１つのファミリーであるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、凝固因子ＸＩａおよびＩＸａ、およびカテプシンＧの阻害剤が挙げられる。当業者は、プロテアーゼの他のファミリーとしてセリンプロテアーゼを認識している。セリンプロテアーゼとしては、エラスターゼ（例えば、ヒト白血球エラスターゼ）、カテプシンＧ、プラスミン、Ｃ−１エステラーゼ、Ｃ−３コンバターゼ、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、アクロシン、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、因子Ｘａおよびカリクレイン類のような酵素類が挙げられる。他の阻害剤ファミリーとしては、任意のメタロプロテイナーゼ１〜１３のようなメタロプロテイナーゼの阻害剤が挙げられる。
【００５６】
したがって、本発明の組成物および方法に使用できるプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、クニッツ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤およびセリンプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【００５７】
１つ以上のクニッツドメインを含むプロテアーゼ阻害剤としては、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ−２）、アミロイドβ−蛋白前駆体（ＡβＰＰ）、アプロチニンおよび胎盤ビクニンが挙げられる。ＴＦＰＩ、外因性経路阻害剤および天然の抗凝固剤は、直列結合した３つのクニッツ阻害剤ドメインを含有する。アミノ末端クニッツドメインは、因子ＶＩＩａ、プラスミンおよびカテプシンＧを阻害し；第２のドメインは、因子Ｘａ、トリプシン、およびキモトリプシンを阻害し；および第３のドメインは、公知の活性を有さない（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５巻：ｐ．３１０（１９９６））。ＴＦＰＩ−２は、ヒト因子ＶＩＩａ−組織因子複合体、因子ＸＩａ、血漿カリクレイン、およびプラスミンのアミド分解活性および蛋白分解活性の阻害剤であることが示されている（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国９１巻：ｐ．３３５３（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５巻：ｐ．２６６（１９９６））。
【００５８】
アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）は、凝固カスケードの活性化を防止することが示されている広範囲のスペクトルのクニッツタイプのセリンプロテイナーゼ阻害剤である。ＤａｖｉｓおよびＷｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ、Ｄｒｕｇｓ４９巻：ｐ．９５４（１９９５）；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３７巻：ｐ．９２（１９８９）；Ｗｅｓｔａｂｙ、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５５巻：ｐ．１０３３（１９９３）；Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０６巻：ｐ．１（１９９３））。アプロチニンは、血漿カリクレインまたはプラスミンを阻害できる（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻：ｐ．２５４１１（１９９５））。胎盤ビクニンは、２つのクニッツドメインを含有するセリンプロテイナーゼ阻害剤である（Ｄｅｌａｒｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：ｐ．１２２０９（１９９７））。ビクニンの個々のクニッツドメインが発現しており、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、因子ＸＩａ、ならびに組織カリクレインと血漿カリクレインの強力な阻害剤であることが示されている（Ｄｅｌａｒｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：ｐ．１２２０９（１９９７））。
【００５９】
本発明に使用できるエラスターゼ阻害剤の特定の例としては、例えば、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤、エラフィン（ｅｌａｆｉｎ）およびアルファ１−プロテイナーゼ阻害剤が挙げられる。他の好適なプロテアーゼ阻害剤としては、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤、アルファ１−抗トリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシン、Ｃ−反応性蛋白質およびそれらの組合わせが挙げられる。
【００６０】
これらプロテアーゼ阻害剤の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野、例えば、ＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。例えば、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤に関する１つのアミノ酸配列は、登録番号Ｐ３０７４０（ｇｉ：２６６３４４）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。この配列は、下記のとおり提供される（配列番号１４）。
【００６１】
【化９】
2011001383.tif 000010
【００６２】
ヒトアルファ−１−抗トリプシンに関するアミノ酸配列は、受託番号Ｐ０１００９（ｇｉ：１７０３０２５）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。この配列は、下記のとおり提供される（配列番号１５）。
【００６３】
【化１０】
2011001383.tif 000011
【００６４】
ヒトビクニンに関するアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ０６６９２５（ｇｉ：１０８６３９０９）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。この配列は、下記のとおり提供される（配列番号１６）。
【００６５】
【化１１】
2011001383.tif 000012
【００６６】
ヒトエラフィンに関するアミノ酸配列は、受託番号１ＦＬＥＩ（ｇｉ：１９４２６８０）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。この配列は、下記のとおり提供される（配列番号１７）。
【００６７】
【化１２】
2011001383.tif 000013
【００６８】
このようなヒトエラフィンに関連した多くのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースに見ることができる。例えば、ヒトプロテアーゼ阻害剤３（皮膚由来）はエラフィンに関連し、受託番号ＮＰ００２６２９（ｇｉ：４５０５７８７）を有する。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトプロテアーゼ阻害剤３に関するこの配列は、下記のとおり提供される（配列番号１８）。
【００６９】
【化１３】
2011001383.tif 000014
【００７０】
ヒトエラフィンと同様の配列を有する阻害剤の他の例は、受託番号ＣＡＡ１１１８４（ｇｉ：２７６４７８６）を有するウシｂトラッピン−２（ｂｏｖｉｎｅ  ｂＴｒａｐｐｉｎ−２）である。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ウシｂトラッピン−２に関するこの配列は、以下に提供される（配列番号１９）。
【００７１】
【化１４】
2011001383.tif 000015
【００７２】
本発明はまた、組成物および方法においてメタロプロテイナーゼ阻害剤の使用を考慮している。多数のヒトメタロプロテイナーゼが存在する。本発明は、任意のヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤の使用を考慮している。例えば、メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）類の組織阻害剤のような阻害剤が、本発明に利用できる。ヒトＴＩＭＰ−１に関する配列は、受託番号Ｐ０１０３３（ｇｉ：１３５８５０）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＴＩＭＰ−１に関するこの配列は、以下に提供される（配列番号２０）。
【００７３】
【化１５】
2011001383.tif 000016
【００７４】
ヒトＴＩＭＰ−２に関する配列は、受託番号ＮＰ００３２４６（ｇｉ：４５０７５１１）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＴＩＭＰ−２に関するこの配列は、以下に提供される（配列番号２１）。
【００７５】
【化１６】
2011001383.tif 000017
【００７６】
ヒトＴＩＭＰ−３に関する配列は、受託番号ＮＰ０００３５３（ｇｉ：４５０７５１３）でＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＴＩＭＰ−３に関するこの配列は、以下に提供される（配列番号２２）。
【００７７】
【化１７】
2011001383.tif 000018
【００７８】
他のヒトＴＩＭＰ類に関する配列もまた、公的に利用できる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。
【００７９】
ヒト分泌白血球プロテアーゼに関するアミノ酸配列もまた、受託番号ＮＰ００３０５５（ｇｉ：４５０７０６５）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。この配列は、下記のとおり提供される（配列番号２３）。
【００８０】
【化１８】
2011001383.tif 000019
【００８１】
ゆえに、本発明は、本発明の組成物および方法に利用できる種々のプロテアーゼ阻害剤を提供する。
【００８２】
ホスホリパーゼ酵素類は、ホスホグリセリド類からの脂肪酸残基の除去を触媒する。具体的には、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、膜リン脂質のグリセロール部分の２位でエステル基を開裂し、等モル量のアラキドン酸とリゾリン脂質とを生じる。ＰＬＡ２は、リン脂質からアラキドン酸を優先的に開裂するが、アラキドン酸は、Ｓ１の中間体、ホスホリパーゼＣ−およびホスホリパーゼＤ−活性化経路から二次的に生成される。ＰＬＡ２阻害剤としては、臭化ｐ−ブロモフェナシルなどの化学分子が挙げられる。他のＰＬＡ２阻害剤としては、真菌類により生産されるチエロシンＡ１ベータ（Ｔａｎａｋａら（１９９５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２７９巻：ｐ．１４３−８）、あるいはリポコルチンまたはアネキシンＩ（ＮＣＢＩ受託番号ｇｉ：７１７５６；Ｗａｌｌｎｅｒら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ，  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ３２０巻（６０５７）、ｐ．７７−８１（１９８６））、ガラガラヘビ属ホスホリパーゼＡ２阻害剤（ＣＮＦ）（ＮＣＢＩ受託番号ｇｉ：５０１０５０；Ｆｏｒｔｅｓ−Ｄｉａｓ  ＣＬら１９９４年；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９巻：ｐ．１５６４６−５１）などの生体分子が挙げられる。グルココルチコイドなどの非特異的ＰＬＡ２阻害剤もまた使用できる。本発明の使用に好適なホスホリパーゼＡ２阻害剤はまた、ＬＹ１１−７２７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）を含む。
【００８３】
Ｆｏｒｔｅｓ−Ｄｉａｓ  ＣＬら（１９９４年；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９巻：ｐ．１５６４６−５１）は、南米ガラガラヘビ、ガラガラヘビ属デュリサステリフィカス（ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ）の血漿からＰＬＡ２阻害剤を単離し、特性化している。ガラガラヘビ属中和因子（ＣＮＦ）と名付けられたこの２０〜２４ｋＤａ蛋白質は、６〜８オリゴマー凝集体として自己会合していると思われる。ＣＮＦが中和するクロトキシン分子は、二量体としてのみ活性であり、ＰＬＡ２の２つの塩基性イソ体（ＣＢ１およびＣＢ２）のうちの１つと会合した酸性分子（ＣＡ）からなる。実際、ＣＮＦがＣＡに取って代わり、ＣＢ分子の１つと安定な会合を形成する。この置換により、クロトキシンの神経毒、心毒、筋毒、抗凝集活性および血小板活性化活性が不活化される。
【００８４】
ＣＮＦの完全長８４０  ｂｐ  ｃＤＮＡは、ガラガラヘビ属肝組織からクローン化された。このヌクレオチド配列は、１９の残基シグナルペプチドおよび１６のシステイン、５．４５のｐ１、およびＮ１５７におけるグリコシル化部位の可能性を有する１８１の残基成熟蛋白質をコードする。Ｆｏｒｔｅｓ−Ｄｉａｓは、ｃＤＮＡが非コード配列を含有し、想定されるポリアデニル化部位を欠損していることを述べている。阻害アッセイにおいて、酸性ＣＮＦ分子はまた、ハチ毒活性を阻害し、血漿中において１００倍過剰の、ブタ膵臓ＰＬＡ２を阻害する。
【００８５】
プロテアーゼ阻害剤およびリパーゼ阻害剤に加えて、前記組成物および方法または本発明は、抗酸化剤を使用することができる。炎症は、大量のスーパーオキシド（Ｏ２・−）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を産生する多形核白血球およびマクロファージを刺激し得る（Ｂａｂｉｏｒ，Ｂ．Ｍ．ら［１９７３］Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５２巻：ｐ．７４１−７４４；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂら［１９９９］Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。ニューヨーク州オックスフォード：Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード大学プレス）。これらラジカル類の有害作用は、鉄の存在下、およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）などの他の反応性中間体が引き続き形成されることにより増幅され得る。
【００８６】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、すなわち膜会合電子伝達鎖蛋白質は、炎症の間に活性となり、直接Ｏ２を還元してＯ２・−にする。次にスーパーオキシドは、スーパーオキシドジスムターゼにより不均化してＨ２Ｏ２を産生できる。スーパーオキシドは、第２鉄（Ｆｅ３＋）から第１鉄（Ｆｅ２＋）へなど、遷移金属を還元し得る。次いで還元金属イオンは、Ｈ２Ｏ２と反応して高酸化性のＯＨ・ラジカル種を生成できる。ヒドロキシルラジカルは、幾つかの生体分子に対してインビボで著しい損傷を起こすことが広く想定されている。
【００８７】
このような酸化種により損傷され得る生体分子としては、ＤＮＡ、蛋白質および膜脂質が挙げられる。酸化されたＤＮＡは、断片化され得る。酸化された蛋白質と膜脂質は、機能の減少または変化が生じ、破壊の標的となり得る。酸化生成物の存在および肺組織の酸化作用は、洗浄液の調査または肺組織の採取により検出できる。例えば、対照動物およびＬＰＳ損傷モデル動物からの肺組織が採取でき、このような酸化生成物に関して試験できる。本明細書に記載されているように、モデル動物（例えば、ウサギ）に、細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）を気管内投与して肺の炎症を引き起こし、シミュレートすることができる。
【００８８】
このようなＬＰＳ処理モデル動物から採取した洗浄液および肺組織は、種々の方法で分析できる。例えば、ＤＮＡ損傷は、組織サンプルまたはＤＮＡ単離体におけるＤＮＡ分子の末端を標識することにより評価できる。次に断片化ＤＮＡは、有効な標識が組織切片の細胞核に存在するか、また標識された、低分子量バンドは、肺組織から単離された標識ＤＮＡの電気泳動分離後に検出されるかどうかを検出することにより観測される。このような低分子ＤＮＡバンドの存在は、ＤＮＡが断片化されたことを示している。バンドのサイズは、公知の分子量を有するＤＮＡマーカーとの比較により評価される。
【００８９】
酸化の他の生体マーカー（単数または複数）、例えば、遊離鉄、全体的抗酸化状態、８−イソプロスタン（８−イソ−ＰＧＦ２α）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）、グルタチオン濃度、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、Ｃ−反応性蛋白質、脂質ヒドロペルオキシダーゼ（ＬＯＯＨ）、ミエロペルオキシダーゼ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ジチロシン、および８−ヒドロキシグアニン、またはそれらの組合わせなどが、モニターできる。肺膜中の不飽和リン脂質は、逆相ＨＰＬＣにおけるリゾリン脂質、アシル側鎖の脂肪酸（ｆａｔｌｙ  ａｃｉｄ）切断断片の出現により、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）−結合物質の発現により、および共役ジエンの生成により確認されるＨ２Ｏ２に対する曝露の際に過酸化的変化を受け得る。ゆえに、洗浄液中のリゾリン脂質、チオバルビツール酸−結合物質、共役ジエンなどの存在は、酸化脂質の指標として使用できる。
【００９０】
肺組織に対する酸化作用を減じるために、抗酸化剤を、本発明の組成物および方法に組み込むことができる。好適な抗酸化剤としては、カタラーゼ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、プロシステイン、ローズマリー葉抽出物、アルファ−トコフェロール、２，４−ジアミノピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン、アスコルビン酸およびロイテイン（ｌｅｕｔｅｉｎ）、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ビオラキサンチン、カロテンジオール、ヒドロキシカロテン、ヒドロキシリコペン、アロキサンチン、およびデヒドロクリプトキサンチンなどのカロテノイド化合物、それらの誘導体などが挙げられる。例えば、アスコルビン酸のエステル誘導体およびルテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ビオラキサンチン、カロテンジオール、ヒドロキシカロテン、ヒドロキシリコペン、アロキサンチン、およびデヒドロクリプトキサンチンなどのカロテノイド化合物のエステル誘導体が、本発明に使用できる。
【００９１】
プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤および抗酸化剤は、非経口、肺、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮（局所）、経粘膜、経皮下、皮下、経皮、または直腸経路などの任意の利用できる経路により投与できる。幾つかの実施形態において、本発明の活性剤は、肺送達により投与されるが、しかし、活性剤の肺送達と組み合わせた静脈内送達は、本組成物の有利な作用を増加させ得る。
【００９２】
他の化合物、すなわち肺病態の治療に調和するものまたは好適なものなどを、本発明の組成物に含むことができる。共投与できる薬剤としては、抗アレルギー剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗真菌剤および抗ウィルス剤などの抗微生物剤、抗生物質、免疫調節剤、造血薬、キサンチン類、交感神経作用アミン類、粘液溶解薬、コルチコステロイド類、抗ヒスタミン類、およびビタミン類が挙げられる。他の例としては、アルブテロール、キソペネックス、テルブタリン、サルメテロール、ホルモテロール、および製薬的に許容できるそれらの塩類などの気管支拡張薬、臭化イプラトロピウムなどの抗コリン作用薬、クロモリンナトリウムおよびネドクロミルなどのいわゆる「肥満細胞安定化薬」、フルニソリド、フルチカゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、およびそれらの塩類などのコルチコステロイド類、ＩＮＦ−アルファ、ベータおよびガンマなどのインターフェロン類、Ｎ−アセチルシステインおよびグアイフェネシンなどの粘液溶解薬、ザフィルカストおよびモンテルカストなどのロイコトリエンアンタゴニスト、ホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、プロテグリン、デフェンシンおよびトブラマイシンなどの抗生物質、リバビリン、ＲＳＶモノクローナル抗体、ＶＰ１４６３７などの抗ウィルス剤、イソニアジド、リファンピンおよびエタンブトールなどの抗結核薬、およびアンホテレシンＢなどの抗真菌剤が挙げられる。
【００９３】
（肺表面活性剤ポリペプチド類）
表面活性剤ポリペプチドは、交互の荷電アミノ酸残基領域および非荷電アミノ酸残基領域を有するアミノ酸残基配列を含んでいるポリペプチド類である。交互に疎水性アミノ酸残基領域および親水性アミノ酸残基領域を有するアミノ酸残基配列を含むポリペプチド類もまた、本発明によれば好ましい。これらの編成のうち特に好ましい表面活性剤ポリペプチド類は、少なくとも約４つ、より好ましくは少なくとも約８つ、さらにより好ましくは少なくとも約１０のアミノ酸残基を有するものとしてさらに特徴付けられ、一般に長さが約６０以下のアミノ酸残基であるが、さらにより長い完全長自生肺表面活性物質たんぱく質も考慮されている。
【００９４】
好ましくは、本発明の表面活性剤ポリペプチド類は、式［（荷電）ａ（非荷電）ｂ］ｃ（荷電）ｄにより表される荷電アミノ酸残基および非荷電アミノ酸残基の交互の編成により構成されており、式中、「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；および「ｄ」は０から３である。単にアミノ酸残基だけから構成されてはいない有機表面活性剤分子は、荷電および非荷電（または親水性／疎水性）構成分子の交互の編成により構成される同様の構造を有することが好ましい。
【００９５】
当業者に公知のように、アミノ酸類は、主としてアミノ酸側鎖の物理化学的性質に依存する種々のクラスに分類できる。例えば、幾つかのアミノ酸類は、一般に荷電、親水性または極性アミノ酸類であることが考慮されており、他のアミノ酸類は、非荷電、疎水性または非極性アミノ酸類であることが考慮されている。極性アミノ酸類としては、酸性、塩基性または親水性側鎖を有するアミノ酸類が挙げられ、非極性アミノ酸類としては、芳香族または疎水性側鎖を有するアミノ酸類が挙げられる。非極性アミノ酸類をさらに細分化すると、中でも脂肪族アミノ酸類が挙げられる。本明細書に用いられるクラスの定義は以下のとおりである：
「非極性アミノ酸」とは、極性ではなく、一般に水溶液により撥水され、生理的ｐＨで非荷電である側鎖を有するアミノ酸を称す。遺伝子的にコードされた疎水性アミノ酸の例としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。幾つかの実施形態において、システインは、非極性アミノ酸である。遺伝子的にコードされていない非極性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡ、Ｃｈａ、ノルロイシン、および／またはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸などのα−アミノ脂肪族カルボン酸が挙げられる。
【００９６】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π−電子系（芳香族基）を有する少なくとも１つの環を含有する側鎖を有する非極性アミノ酸を称す。前記芳香族基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルホニル基、ニトロ基およびアミノ基、ならびにその他の基などの置換基でさらに置換できる。遺伝子的にコードされた芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。通常、よく見られる遺伝的にコードされていない芳香族アミノ酸類としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【００９７】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和直鎖、分枝鎖または環状炭化水素側鎖を有する非極性、非荷電アミノ酸を称す。遺伝子的にコードされた脂肪族アミノ酸類の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられる。遺伝子的にコードされていない脂肪族アミノ酸類の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
【００９８】
「極性アミノ酸」とは、生理的ｐＨで荷電または非荷電で、２個の原子により共有される電子対が原子の１個によってより近接して保持される結合を有する側鎖を持つ親水性アミノ酸を称す。極性アミノ酸類は、一般に親水性であり、それらが水溶液により引き寄せられる側鎖を持つアミノ酸を有することを意味している。遺伝子的にコードされた極性アミノ酸類の例としては、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンが挙げられる。幾つかの実施形態において、システインは極性アミノ酸である。遺伝子的にコードされていない極性アミノ酸類の例としては、シトルリン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが挙げられる。
【００９９】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を称す。酸性アミノ酸は、水素イオンの欠失のために生理的ｐＨで陰電荷の側鎖を典型的に有する。遺伝子的にコードされた酸性アミノ酸類の例としては、アスパラギン酸（アスパルテート）およびグルタミン酸（グルタメート）が挙げられる。
【０１００】
「塩基性アミノ酸」とは、７以上の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を称す。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの会合のために生理的ｐＨで陽電荷の側鎖を典型的に有する。遺伝子的にコードされた塩基性アミノ酸類の例としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。遺伝子的にコードされていない塩基性アミノ酸類の例としては、非環状アミノ酸オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
【０１０１】
「イオン性アミノ酸」または「荷電アミノ酸」とは、生理的ｐＨで荷電できるアミノ酸を称す。このようなイオン性または荷電アミノ酸類としては、酸性および塩基性アミノ酸類、例えば、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒドロキシリジン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒドロキシリジン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−３−ヒドロキシプロリンが挙げられる。
【０１０２】
当業者により認識されるであろうが、上記の分類は絶対的ではない。幾つかのアミノ酸類は、１つを超える特性を示し、したがって、１つを超えるカテゴリに含まれ得る。例えば、チロシンは、非極性芳香族環と極性ヒドロキシル基との両方を有する。したがって、チロシンは、非極性、芳香族および極性として記載され得る幾つかの特性を有する。しかしながら、非極性環が優勢であり、それゆえ、チロシンは一般に、非極性であると考えられる。同様に、ジスルフィド結合を形成できることに加えて、システインは非極性の性質も有する。このように、疎水性または非極性アミノ酸として厳密には分類されないが、多くの場合、システインは、ペプチドに疎水性または非極性を与えるものとして使用できる。
【０１０３】
上記の遺伝子的にコードされ、またコードされていないアミノの分類は、例示のみを目的としており、本明細書に記載された肺表面活性剤ポリペプチドを含み得るアミノ酸残基の完全なリストであるとを意味しない。本明細書に記載される肺表面活性剤ポリペプチドの製造に有用である他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９年、ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、およびそれに引用されている文献に見ることができる。アミノ酸残基の他の供給源は、ＲＳＰ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ｉｎｃ．のウェブサイト（ｗｗｗ．ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ．ｃｏｍ）により提供される。本明細書に特に記載されていないアミノ酸類は、特に同定されたアミノ酸と比較した、公知の挙動および／または特徴的な化学的および／または物理的性質に基づいて上記のカテゴリに従来どおり分類できる。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、表面活性剤ポリペプチドは、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互編成のアミノ酸残基を有する配列を含み、式中、Ｚは荷電アミノ酸であり、Ｕは非荷電アミノ酸であり；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；および「ｄ」は０から３である。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、Ｚは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および／または３−ヒドロキシプロリンであり、およびＵは、バリン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、および／またはα−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、またはα−アミノヘキサン酸などのα−アミノ脂肪族カルボン酸である。
【０１０６】
他の実施形態において、本発明の好ましいポリペプチド類は、式（ＢａＵｂ）ｃＢｄにより表される交互編成またはアミノ酸残基領域を有しており、式中、Ｂは、Ｈ、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンよりなる群から独立して選択されるアミノ酸残基であり；およびＵは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、およびＦよりなる群から独立して選択されるアミノ酸残基である。１つの好ましい変型において、Ｂは、コラーゲン由来のアミノ酸であり、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンよりなる群から選択されることが好ましく；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；および「ｄ」は０から３である。
【０１０７】
さらに他の実施形態において、本発明の表面活性剤ポリペプチド類は、式（ＢａＪｂ）ｃＢｄにより表される交互編成のアミノ酸残基を有する配列を含み、式中、Ｂは、ヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンよりなる群から独立して選択されるアミノ酸残基であり；およびＪは、α−アミノ脂肪族カルボン酸であり；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；および「ｄ」は０から３である。
【０１０８】
関連式における「Ｊ」を含む種々の実施形態において、Ｊは、合わせて４個から６個の炭素を有するα−アミノ脂肪族カルボン酸である。他の好ましい変型において、Ｊは、合わせて６個以上の炭素を有するα−アミノ脂肪族カルボン酸である。さらに他の変型において、Ｊは、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、およびα−アミノヘキサン酸よりなる群から選択されることが好ましい。
【０１０９】
他の実施形態は、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄにより表される交互編成のアミノ酸残基を有する配列を含む表面活性剤ポリペプチドを含有し、式中、Ｚは、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫよりなる群から独立して選択されるアミノ酸残基であり；Ｕは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、およびＦよりなる群から独立して選択されるアミノ酸残基であり；またはＬおよびＣよりなる群から独立して選択されるアミノ酸残基であり；「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；および「ｄ」は０から３である。
【０１１０】
前述の式において、ＺとＵ、ＺとＪ、ＤとＵ、およびＢとＪは、各発生時に独立して選択されるアミノ酸残基である。さらに、前述式の各々において、一般に「ａ」は約１から約５の平均値を有し；「ｂ」は約３から約２０の平均値を有し；「ｃ」は１から１０であり；および「ｄ」は０から３である。
【０１１１】
前述の実施形態の一変型において、ＺおよびＢは荷電アミノ酸残基である。他の好ましい実施形態において、ＺおよびＢは、親水性または陽電荷のアミノ酸残基である。一変型において、Ｚは、Ｒ、Ｄ、Ｅ、およびＫよりなる群から選択されることが好ましい。関連実施形態において、Ｚは、ＲおよびＫよりなる群から選択されることが好ましい。さらに他の好ましい実施形態において、Ｂは、Ｈ、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンよりなる群から選択される。１つの好ましい実施形態において、ＢはＨである。他の好ましい実施形態において、Ｂは、コラーゲン構成アミノ酸残基であり、５−ヒドロキシリジン、（δ−ヒドロキシリジン）、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンよりなる群から選択される。
【０１１２】
種々の開示実施形態において、ＵおよびＪは、非荷電アミノ酸残基であることが好ましい。他の好ましい実施形態において、ＵおよびＪは、疎水性アミノ酸残基である。一実施形態において、Ｕは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ、およびＦよりなる群から選択されることが好ましい。他の好ましい実施形態において、Ｕは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、およびＦよりなる群から選択される。さらに他の好ましい実施形態において、Ｕは、ＬおよびＣよりなる群から選択される。種々の好ましい実施形態において、ＵはＬである。
【０１１３】
同様に種々の実施形態において、Ｂは、Ｈ、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンよりなる群から選択されるアミノ酸であることが好ましい。あるいは、Ｂは、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、および３−ヒドロキシプロリンを含むコラーゲン由来アミノ酸類よりなる群から選択されてもよい。
【０１１４】
本発明の他の実施形態において、荷電および非荷電アミノ酸類は、修飾アミノ酸類の群から選択される。例えば、１つの好ましい実施形態において、荷電アミノ酸は、２，３の例を示せばシトルリン、ホモアルギニン、またはオルニチンよりなる群から選択される。同様に種々の好ましい実施形態において、非荷電アミノ酸は、α−アミノブタン酸、α−アミノペンタン酸、α−アミノ−２−メチルプロパン酸、およびα−アミノヘキサン酸よりなる群から選択される。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態において、単位「ａ」、「ｂ」、「ｃ」および「ｄ」は、荷電または非荷電残基（または親水性または疎水性残基）数を示す数である。種々の実施形態において、「ａ」は約１から約５、好ましくは約１から約３、より好ましくは約１から約２、さらにより好ましくは１の平均値を有する。
【０１１６】
種々の実施形態において、「ｂ」は、約３から約２０、好ましくは約３から約１２、より好ましくは約３から約１０、さらにより好ましくは約４〜８の範囲の平均値を有する。１つの好ましい実施形態において、「ｂ」は、約４である。
【０１１７】
種々の実施形態において、「ｃ」は１から１０、好ましくは２から１０、より好ましくは３〜８または４〜８の範囲、さらにより好ましくは３から６である。１つの好ましい実施形態において、「ｃ」は、約４である。
【０１１８】
種々の実施形態において、「ｄ」は０から３または１から３である。１つの好ましい実施形態において、「ｄ」は０から２または１から２であり；他の好ましい実施形態において、「ｄ」は、１である。
【０１１９】
アミノ酸残基、例えばＺまたはＵにより表される残基が独立して選択されることを述べることによって、各発生時において、特定の群からの残基が選択されることを意味する。すなわち、「ａ」が２である場合、例えば、Ｚにより表される各々の親水性残基は、独立して選択され、したがって、ＲＲ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＫ、ＤＲ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＫなどを含むことができる。「ａ」および「ｂ」が平均値を有することを述べることによって、反復配列（例えば、ＺａＵｂ）内の残基数は、ペプチド配列内でいくらか変わり得るが、「ａ」および「ｂ」の平均値が、それぞれ約１から約５および約３から約２０になるであろう。
【０１２０】
例えば、下表１において「ＫＬ８」と名付けられるペプチドに関する式（ＺａＵｂ）ｃＺｄを用いて、前記式は、Ｋ１Ｌ８Ｋ１Ｌ８Ｋ１Ｌ２として書き直すことができ、式中、「ｂ」の平均値は、６［すなわち、（８＋８＋２）／３＝６）］、「ｃ」は３であり、「ｄ」はゼロである。上記式の例示的な好ましいポリペプチド類を下表１に示す：
【０１２１】
【表１】
2011001383.tif 000020
【０１２２】
１呼称は、示されたアミノ酸残基配列の略語である。
【０１２３】
肺胞との相互作用を最大にする構造を有する約４から６０のアミノ酸残基の複合ポリペプチドもまた好適である。複合ポリペプチドは、本質的にアミノ末端配列およびカルボキシ末端配列からなる。上記式に定義されるように、前記アミノ末端配列は、本発明の疎水性領域ポリペプチドまたは疎水性ペプチド、好ましくは疎水性ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。カルボキシ末端配列は、従属のカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸残基配列を有する。
【０１２４】
天然の表面活性物質蛋白質（ＳＰ）のものと類似の特性に由来するかまたは類似の特性を有する蛋白質およびポリペプチド類は、本法に有用である。特記したように、任意の哺乳動物種から単離されたＳＰは、利用できるが、ウシ、ブタおよびヒト表面活性物質は特に好ましい。
【０１２５】
天然の表面活性物質蛋白質としては、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｄ、あるいはそれらの断片の、単独または脂質と組合わせたものが挙げられる。好ましい断片は、ＳＰ−Ｂのアミノ末端残基１〜２５である。
【０１２６】
このような天然の表面活性物質蛋白質と関連するアミノ酸配列の多くは、ＮＣＢＩデータベースに見ることができる。例えば、ヒト肺表面活性物質と会合する蛋白質Ａ１の配列は、受託番号ＮＰ  ００５４０２（ｇｉ：１３３４６５０４）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＳＰ−Ａ１に関するこの配列は、下記のとおり提供される（配列番号２５）。
【０１２７】
【化１９】
2011001383.tif 000021
【０１２８】
ヒト肺表面活性物質と会合する蛋白質Ａ２のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ  ００８８５７（ｇｉ：１３３４６５０６）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＳＰ−Ａ２に関するこの配列は、下記のとおり提供される（配列番号２６）。
【０１２９】
【化２０】
2011001383.tif 000022
【０１３０】
ヒト肺表面活性物質と会合する蛋白質Ｂのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ  ０００５３３（ｇｉ：４５０６９０５）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＳＰ−Ｂに関するこの配列は、下記のとおり提供される（配列番号２７）。
【０１３１】
【化２１】
2011001383.tif 000023
【０１３２】
さらに、ヒトＳＰ１８（ＳＰ−Ｂ）表面活性物質蛋白質は、本明細書に記載されているように利用し得る。例えば、米国特許第５，４０７，９１４号明細書；米国特許第５，２６０，２７３号明細書；および米国特許第５，１６４，３６９号明細書を参照されたく、これらの開示は、本明細書に参照として組み込まれている。
【０１３３】
ヒト肺表面活性物質と会合する蛋白質Ｃのアミノ酸配列は、受託番号Ｐ１１６８６（ｇｉ：１３１４２５）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＳＰ−Ｃに関するこの配列は、下記のとおり提供される（配列番号２８）。
【０１３４】
【化２２】
2011001383.tif 000024
【０１３５】
ヒト肺表面活性物質と会合する蛋白質Ｄのアミノ酸配列は、受託番号Ｐ５０４０４（ｇｉ：１７０９８７９）としてＮＣＢＩデータベースに見ることができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のウェブサイトを参照されたい。ヒトＳＰ−Ｄに関するこの配列は、下記のとおり提供される（配列番号２９）。
【０１３６】
【化２３】
2011001383.tif 000025
【０１３７】
関連ペプチドは、配列スクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−アミド（配列番号３０）を有するＷＭＡＰ−１０ペプチド（Ｍａｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）である。本明細書に記載されているように、代わりとなるペプチド類は、リン脂質の混合物において表面張力の低下を誘導するリジン、アルギニンまたはヒスチジンのポリマーである。
【０１３８】
さらに他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ゼロ未満、好ましくは−１未満か−１に等しい、より好ましくはくは−２未満か−２に等しい複合疎水性を持つアミノ酸残基配列を有する。ペプチドに関する複合疎水性値の測定は当技術分野に公知であり、米国特許第６，０１３，６１９号明細書を参照されたく、この開示は、参照として本明細書に組み込まれている。これらの疎水性ポリペプチド類は、ＳＰ１８の疎水性領域の機能を実行する。このように、１つの好ましい実施形態において前記アミノ酸配列は、荷電および非荷電、あるいは疎水性および親水性のＳＰ１８の残基のパターンを模倣する。
【０１３９】
しかしながら、本発明のポリペプチド類および他の表面活性剤分子は、自生ＳＰ−Ｂ（ＳＰ１８）のような配列を有する分子に限定しないことを解すべきである。それどころか、本発明のいくつかの最も好ましい表面活性剤分子は、同様の表面活性剤の活性および交互の荷電／非荷電（または疎水性／親水性）残基配列を有すること以外、特定のアミノ酸残基配列に関してＳＰ１８に殆ど似ていない。
【０１４０】
本発明の１つの開示された実施形態は、塩基性極性リジン（Ｋ）残基により結合された４つの疎水性ロイシン（Ｌ）残基の反復単位からなるヒトＳＰ−Ｂの模倣物である２１−残基ペプチドのペプチド含有製剤を含む。「ＫＬ４」として本明細書に略されているこの例示的ペプチドは、以下のアミノ酸残基配列を有する：
【０１４１】
【化２４】
2011001383.tif 000026
【０１４２】
（配列番号１）
１つの好ましい実施形態において、ＫＬ４は、リン脂質ジパルミトイルホスファチジルコリンとパルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセロール（３：１）とパルミチン酸とで組合わせて、そのリン脂質−ペプチド水性分散物は、「ＫＬ４−表面活性剤」と命名されており、一般にそのような様式で本明細書に称される。ＫＬ４−表面活性剤は、名称モデル表面活性剤混合物で市販されている。種々の実験および臨床試験におけるＫＬ４−表面活性剤の有効性は、以前に報告されており、例えば、Ｃｏｃｈｒａｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：ｐ．５６６−５６８（１９９１）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：ｐ．８３９５−８４０１（１９９１）；Ｃｏｃｈｒａｎｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  ＆  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１５２巻：ｐ．４０４−４１０（１９９６）；およびＲｅｖａｋら、Ｐｅｄ．Ｒｅｓ．、３９巻：ｐ．７１５−７２４（１９９６）を参照されたい。
【０１４３】
本発明の種々の実施形態において、ポリペプチド：リン脂質の重量比は、約１：５から約１：１０，０００、好ましくは約１：７から約１：５，０００、より好ましくは約１：１０から約１：１，０００、最も好ましくは約１：１５から約１：１００の範囲である。特に好ましい実施形態において、ポリペプチド：リン脂質の重量比は、約１：３７である。
【０１４４】
本発明による担体表面活性剤組成物の調製に好適な合成ポリペプチド類は、ポリペプチド当業者に公知の方法によりアミノ酸類から合成できる。多くの利用できる方法の優れた概要は、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｄおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、サンフランシスコ、１９６９年、および固相ペプチド合成に関してＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ＨＯＲＭＯＮＡＬ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ、２巻、ｐ．４６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク）、１９８３年、および古典的溶液合成に関してＥ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｋｕｂｋｅ、ＴＨＥ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ、１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク）、１９６５年に見ることができる。
【０１４５】
一般に、これらの方法は、１つ以上のアミノ酸残基または好適に保護されたアミノ酸残基の、成長しているペプチド鎖への連続付加を含む。標準的には、第１のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを、適切で選択的に除去できる保護基により保護する。種々の選択的に除去できる保護基は、反応性側鎖基を含有するアミノ酸（例えば、リジン）に利用される。
【０１４６】
実施例１は、表面活性剤ペプチドの固相合成を例示する。簡潔に述べると、保護または誘導アミノ酸を、その非保護カルボキシル基またはアミノ基を介して不活性固体支持体に結合する。次に、アミノ基またはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、好適に保護された補足（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を混合し、固相支持体に既に結合している残基とアミド結合を形成するために好適な条件下で反応させる。次いでアミノ基またはカルボキシル基の保護基を、この新たに添加したアミノ酸残基から除去してから、次のアミノ酸（好適に保護された）を加えるなどする。所望のアミノ酸全てを適切な配列で結合した後、残りの末端基および側鎖基の保護基（およびいずれの固体支持体）のいずれも、連続的または同時に除去して最終ポリペプチドを得る。次いで、そのポリペプチドを低級脂肪族アルコール中に溶解することにより洗浄し、乾燥する。所望ならば、乾燥表面活性剤ポリペプチドを、公知の方法によりさらに精製できる。
【０１４７】
本発明の表面活性剤蛋白質およびポリペプチド類はまた、組み換えＤＮＡ法により製造し得る。植物または動物宿主から蛋白分子を誘導する方法は、一般に当技術分野に公知である。Ｊｏｂｅら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．、１３６巻：ｐ．１０３２（１９８７）；Ｇｌａｓｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３巻：ｐ．１０３２６（１９８８）を参照されたい。一般に、好適なプロモーターおよび／またはシグナルペプチドの制御下で蛋白質またはポリペプチド類をコードする遺伝子配列を、宿主細胞の形質移入のためにプラスミドまたはベクターに挿入する。発現蛋白質／ポリペプチドは、細胞培養物から単離され得る。
【０１４８】
本明細書に開示された多くの有用なポリペプチド類、例えばＫＬ４ポリペプチド（配列番号１）は、ペプチド結合を経て結合される「Ｌ」体の天然由来のアミノ酸を含むことが認識されるが、アミノ酸側鎖類縁体、非アミド結合（例えば、異なる主鎖）を含む分子はまた、著しい表面活性剤活性を示し、そのうえ他の利点を有し得ることも解されるべきである。例えば、容易に分解されない分子（例えば、表面活性剤組成物に使用のため）を構築することが所望であるならば、一連のＤ−アミノ酸を含むポリペプチド分子を合成することを望むことができる。「レトロ」主鎖を経て結合された一連のアミノ酸を含む分子、すなわち、カルボキシ末端からアミノ末端への逆方向で構築された内部アミド結合を分子はまた、分解することがより困難であり、したがって本明細書に記載されている種々の適用に有用であり得る。例えば、以下の式は、主鎖における「レトロ」結合を有する例示的分子を例示している：
【０１４９】
【化２４ａ】
2011001383.tif 000027
【０１５０】
他の変型において、より「堅固な」コンフォメーションを採用する分子を構築することを所望することができ；このことは、アミノ酸のα炭素原子にメチル基または他の基の付加を達成し得ることを意味する。
【０１５１】
上記のとおり、ＣＨ３基のほかに他の基を、炭素原子に付加でき、すなわち、本発明の表面活性剤分子は、α炭素にＣＨ３のみを組み込むものに限定されない。例えば、上記の側鎖および分子のいずれも、α炭素成分における示されたＣＨ３基に代えて置換し得る。
【０１５２】
本明細書に使用される用語で、ポリペプチド類およびアミノ酸残基の「類縁体」および「誘導体」は、アミノ酸類の代謝産物および異化産物、ならびに「天然由来の」Ｌ−体アミノ酸類と呼ばれるものに通常見出されるものとは異なる結合、主鎖、側鎖または側鎖基を含む分子を包含することを意図している。（用語の「類縁体」および「誘導体」はまた、本明細書では交互に都合よく使用し得る）したがって、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸を模倣する分子および「デザインされた」側鎖を有するアミノ酸（すなわち、表面活性剤活性を有する分子中の１つ以上のアミノ酸の代わりに置換できるもの）もまた、本明細書の用語の「類縁体」および「誘導体」により包含されている。
【０１５３】
１つ以上の延伸または置換Ｒ基またはＲ’基を有するアミノ酸を含む有用な表面活性剤分子の広い組合わせも、本発明により包含されている。再度、当業者は、個々のアミノ酸、結合、および／または鎖それ自体に種々の修飾をなし得ることをこの開示から認識すべきであり、生じた分子が本明細書に記載された表面活性剤活性を有する限り、修飾は本発明の範囲内に入る分子を製造することとなる。
【０１５４】
前記組成物は、他の成分を含むことができる。例えば、本発明の表面活性剤混合物は、（ｉ）５０〜９５乾燥重量パーセントのリン脂質、（ｉｉ）リン脂質を肺の表面内層中への取り込みを促進させるのに有効な２〜２５乾燥重量パーセントの展着剤、（ｉｉｉ）０．１〜１０乾燥重量パーセントの肺表面活性剤ポリペプチドを含むことができる。上記に示したように、前記成分は、乾燥、溶液、または粒子懸濁液形態で混合してもよく、治療剤の添加前に前製剤化しても、または薬剤と共に製剤化してもよい。
【０１５５】
本発明の組成物に有用なリン脂質としては、自生および／または合成リン脂質が挙げられる。使用され得るリン脂質としては、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジン酸、およびホスファチジルエタノールアミン類が挙げられる。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）Ｃ１２：０、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）Ｃ１４：０、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）（Ｃ１８：１）、ジパルミトオレオイルホスファチジルコリン（Ｃ１６：１）、リノレオイルホスファチジルコリン（１８：２））、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）大豆レシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジン酸などの例示的リン脂質ホスファチジルコリン類。
【０１５６】
特に、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであって、これらのジアシル基は、対称、非対称であり得、鎖長が３個から２８個の炭素の範囲の種々のタイプの飽和または不飽和脂肪酸および６つまでの不飽和結合を含有し得る。
【０１５７】
好ましいリン脂質の１つはＤＰＰＣである。ＤＰＰＣは、現在までに調べられた全哺乳動物種における主要なリン脂質である。ＤＰＰＣは気腔の上皮細胞（肺胞の２型肺胞細胞および気道のまだ同定されていない細胞）によって合成される。ＤＰＰＣは細胞内層へ分泌され、展着して肺胞上に単分子膜を形成する。空気−細胞内層界面におけるＤＰＰＣ膜は、その正常な機能の根拠となる一定の独特な性質を有している。すなわち、（１）展着して全表面を覆う前記膜は、圧縮時、例えば呼気時に、極めて低い表面張力を達成し、それによって正味の力を減少させ、気腔内への液体移動を助ける；（２）気道または肺胞の大きさが減少するにつれ、表面張力は比例して減少し、それによって構造間の圧力平衡を達成し、崩壊を防ぐ；（３）前記膜は、その両性的構造のため、疎水性部分と親水性部分の双方と緩い化学的会合を形成し、またその高い圧縮性のため、これらの会合は、膜圧縮時に切断でき、それによって、界面から前記分子を遊離する；（４）これらの緩い化学的結合は、膜上の電荷分布を変更できる表面活性剤系に見られる他の化合物（例えば、ＰＧ）の添加によって変更でき、それによって、前記部分（上記（３）に述べた）が前記膜から遊離する速度を変更する。
【０１５８】
本発明の種々の実施形態において、前記脂質部分は、表面活性剤担体組成物の約５０から約９０重量パーセントを構成するＤＰＰＣである。本発明の他の実施形態において、ＤＰＰＣは、表面活性剤組成物の約５０から約７５重量パーセントを構成し、残りは、不飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、トリアシグリセロール類、パルミチン酸、スピンゴミエリンまたはそれらの混合物を含む。本発明のさらに他の実施形態において、前記脂質分子は、約４：１と２：１との間の重量比におけるＤＰＰＣとＰＯＰＧとの混合物である。好ましい一実施形態において。前記脂質成分は、約３：１の重量比におけるＤＰＰＣとパルミトイル−オレオイル  ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）との混合物である。
【０１５９】
ＤＰＰＣと上記脂質およびリン脂質は、商品として入手できるか、または一般に当業界に公知の公表されている方法にしたがって調製できる。前記混合物のリン脂質成分は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジル酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）などの１種以上のリン脂質を含む。前記リン脂質における脂肪族アシル鎖は、長さが少なくとも７個の炭素原子であることが好ましく、典型的には、長さが１２〜２０個の炭素原子であって、完全に飽和されていてもよいし、部分的に不飽和であってもよい。
【０１６０】
前記リン脂質は、前記表面活性剤混合物の５０〜９５乾燥重量パーセントを構成し、好ましくは、前記混合物の８０〜９０の間の乾燥重量パーセントである。
【０１６１】
ＤＰＰＣなどのリン脂質は、単独で投与された場合、空気−細胞内層界面に比較的ゆっくりと吸収され、吸着されるとゆっくり拡散することが知られている。
【０１６２】
展着剤の目的は、表面活性剤混合物脂質の粒子形態から単層形態への移行を促進し、肺表面上への展着、肺表面に沿った、および肺表面内への分布を達成することである。したがって、例えば、表面活性製剤を、リポソーム形態で肺に送達する場合、展着剤は、肺表面におけるリポソーム二重層から平坦な単層形態へのリポソームリン脂質の移行促進に効果的である。同様に表面活性製剤を、非晶質または結晶性の脂質粒子として肺に送達する場合、展着剤は、肺表面の平坦な単層形態への表面活性剤混合物のリン脂質の移行促進に効果的である。
【０１６３】
展着剤の例としては、限定はしないが、脂質二重層または脂質単層形成に適合性ではあるが、単独で脂質二重層形成を支持することはできない、非リン脂質の脂質が挙げられる。展着剤の例としては、リゾリン脂質、脂肪酸、脂肪族エステル、および脂肪族アルコールならびに他の単一長鎖脂肪族アシル化合物が挙げられる。好ましい展着剤としては、少なくとも約１２個の炭素原子のアルキル鎖長、好ましくは鎖長が１５〜２０個間の炭素原子を有する脂肪酸および脂肪族アルコールが挙げられる。好ましい展着剤の１つは、パルミチン酸であり、他の１つはセチルアルコールである。展着剤は、前記表面活性剤混合物の２〜２５乾燥重量パーセントを構成し、好ましくは、前記混合物の１０〜１５乾燥重量パーセントを構成する。８４．５％の乾燥重量パーセントで、ＤＰＰＣ：ＤＯＰＧ（３：１）もまた含有する１つの例示的混合物は、１２．７５乾燥重量パーセントのパルミチン酸を含有する。
【０１６４】
本発明に用いられる展着剤は、商品供給者から購入できる。例えば、パルミチン酸（ＰＡ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバマ州バーミンガム）から入手できる。前記展着剤はまた、一般に当業界に公知の公表されている方法にしたがって調製できる。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、前記組成物は、展着剤としてＳｔｅｒｌｉｎｇ−ＷｉｎｔｈｒｏｐおよびＲｏｈｍ  およびＨａａｓなどの種々の会社から幾つかの商標で購入できるチロキサポールを含み得る。チロキサポールは、ホルムアルデヒドとオキシランを有する４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール）のポリマーである。チロキサポールは、３０年以上に亘ってヒト医薬品製剤に用いられてきた（Ｔａｉｎｔｅｒ  ＭＬら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９５５）２５３巻：ｐ．７６４−７６７）。チロキサポールは比較的非毒性であり、他の洗剤が溶血性である濃度の１０００倍の濃度においても赤血球を溶血しない（Ｇｌａｓｓｍａｎ  ＨＮ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９５０）１１１巻：ｐ．６８８−６８９）。
【０１６６】
（治療方法）
呼吸器系の多くの病態および疾患が肺表面活性物質性能の低下および炎症の原因となる。本明細書で用いられる用語、「呼吸器病態および疾患」は、肺胞ならびに肺胞への空気通路に関与する病態および疾患を包含する。このような病態および疾患としては、肺高血圧症、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫、気管支梢炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏症、間質性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、アレルギー性喘息、医原性喘息、嚢胞性線維症、肺胞蛋白症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、および特発性肺線維症が挙げられる。活性剤は、肺組織に直接作用し得るか、肺組織内の病原性生物に作用し得る。
【０１６７】
肺表面活性物質の欠乏が、未熟児や幼児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の原因であることは、一般に認識されている。このような欠乏は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発現における主要要因ではないが、この疾患の病態生理学に著しく寄与し得る。ＲＤＳは、未熟児における死亡および障害の主要な原因である。また、毎年１５万例のＡＲＤＳが報告されており、死亡率は６０〜８０％である。ＡＲＤＳを引き起こす機構は部分的に理解されているだけである。しかし、多くの場合、それは酸素の毒性から生じ、前記症候群は、過酸化物、スーパーオキシド、ヒドロキシル、一重項酸素、その他などの大量の酸素由来フリーラジカルおよび求核剤によって引き起こされる。肺実質に対するフリーラジカルに誘導された損傷は炎症および「漏出」毛細管応答を生じる。この応答は、肺伸展性の低下、低酸素症およびシャンティングを特徴とするＡＲＤＳへと進行し得る。
【０１６８】
炎症は、呼吸器疾患に伴う浸透性の症状であり、局所損傷、細菌感染、ウィルス感染、アレルギー反応および免疫原性反応などに応答して生じる。気道の炎症部位に集合した炎症細胞、特に白血球は、肺表面活性物質成分の分泌を引き起こすか、または遮断でき、また、肺を内張りしている上皮細胞を破壊することもできる伝達物質を遊離し、細胞質成分の遊離を生じさせる。この後者のクラスの伝達物質には、セリンプロテアーゼ、特に白血球エラスターゼ、ホスホリパーゼＡ２およびスーパーオキシドおよびヒドロキシラジカルなどの反応性酸素種が含まれる。例えば、嚢胞性線維症における気道の感染は、疾患の重症化を招き得る気道分泌の輸送異常に関連している（Ｅ．Ｐｕｃｈｅｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１５巻：ｐ．３８９−３９４，１９８５年）。
【０１６９】
本発明の治療法では、本発明の製剤中の活性剤としてプロテアーゼ阻害剤、ホスホリパーゼ阻害剤、または抗酸化剤、またはこれらの２種以上の混合物を有する表面活性剤混合物が用いられる。前記製剤は、例えば、気管支肺胞洗浄、経口、血管内、ボーラスまたは他の投与のために有用な液体製剤であり得る。また、前記製剤は患者へ投与するためエアロゾル化もできる。投与される製剤量は、典型的には約１ｍｇ〜１００ｍｇ／用量、５ｍｇ〜２０ｍｇ／用量、例えば１０ｍｇ／用量であり、１回用量における活性剤の量は、治療的有効量、例えば、約０．０１ｍｇから５０ｍｇの薬剤または約０．０１ｍｇから５ｍｇの薬剤である。活性剤の用量は、先ず、前記製剤が肺の単層に展着した際の所望の薬剤濃度を算出し、この用量を、好適な量の表面活性剤製剤において投与することによって決定できる。治療効果を最適化するため、また副作用を最小化するための用量の調製は、肺炎症の動物モデルおよび／または肺の炎症病態を有するヒト患者における臨床試験を含み得る公知の手順にしたがって決定できる。
【０１７０】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物における肺の炎症を治療するために、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤を含む治療的有効量の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法を考慮している。
【０１７１】
幾つかの実施形態において、前記方法は、肺洗浄による本発明の組成物の投与を含む。肺洗浄を行う手順は当業界において利用できる。例えば参照のため、本明細書に組み込んでいる米国特許第６，０１３，６１９号明細書を参照されたい。肺洗浄は、例えば以下のとおり実施できる：
ａ）  ベンチレータによりガス呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）を調節圧力、好ましくは約４ｃｍ水から２０ｃｍ水で哺乳動物の肺区域内へ適用する；
ｂ）  製薬的に許容できる水性媒体中の希釈表面活性剤を含有する洗浄組成物を前記肺の１つ以上の葉または区域に点滴注入する；および
ｃ）  短い間隔で気管−気管支吸引を用い、好ましくは、約２０ｍｍから１００ｍｍ水銀の陰圧を用いて、肺から生じた肺流体を除去する。
【０１７２】
典型的には、ＰＥＥＰを点滴注入ステップ（ｂ）の前の予め選択された時間、好ましくは約３０分まで適用し、また、ＰＥＥＰは典型的には、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間に連続的に、または除去ステップ（ｃ）の後に予め選択された時間、好ましきは約６時間まで適用する。肺の異なった区域を独立して治療できる。
【０１７３】
他の実施形態において、前記組成物は、液体ボーラス投与によって投与できる。例えば、前記組成物の液滴を肺組織に送達するために気管内チューブを配置してもよい。幾つかの実施形態において、ボーラス投与は肺の一箇所になされて、他の箇所にはなされないか、または肺の異なった部分が異なった時にボーラス液滴投与によって治療できる。
【０１７４】
さらに、他の実施形態において、前記組成物は吸入投与できる。さらなる実施形態において、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤および／または抗酸化剤を、経口または非経口投与できる。経口または非経口（非肺）送達が考慮される場合、前記組成物は、前記表面活性剤混合物を含む必要はない。しかし、本発明によれば、表面活性剤混合物と前記阻害剤との組合わせは、肺疾患の治療に驚くべき効果をあげる。ゆえに、肺病態を有利に治療するためには、表面活性剤−阻害剤の組合わせは相乗的に作用し得る。
【０１７５】
それゆえに、本発明は、肺の疾患治療のために表面活性剤担体に担持されたプロテアーゼ阻害剤を含む医薬品組成物を提供する。
【０１７６】
例示的一実施形態において、前記組成物は、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤を含有する。ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）は、好中球のアズーレ親和性顆粒に存在する蛋白質分解酵素である。このプロテアーゼは、炎症部位で遊離した後、エラスチンやコラーゲンなどの重要な結合組織成分を加水分解できる。この酵素は、壊死組織および微生物を貪食するそれらの機能にとって必須である。同時に、この酵素は身体にとって顕著な挑戦となる。なぜならば、それらの非抑制的遊離は、健康な組織および循環蛋白質の破壊を導き得るからである。生じた組織の損傷が成人呼吸窮迫症候群（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄ．、３０４巻：ｐ．１９２−１９６、１９８１年および肺気腫（Ｊａｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎ：ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＩＯＮ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＣＯＲＲＥＬＡＴＥＳ，Ｇａｌｌｉｎ，Ｊ．Ｉ．ら編集、ｐ．８０３−８１４、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８年）の病因に寄与することが示唆されている。
【０１７７】
本発明によるプロテアーゼおよびリパーゼ阻害および／または肺組織内の酸化減少により、血管基底膜への損傷が減少し、蛋白質漏出と出血が減少する。平行試験において、外因性表面活性剤による気管支肺胞洗浄もまた、基底膜への損傷、蛋白質漏出および出血を減少させた。しかし、表面活性剤混合物単独による治療では、プロテアーゼ活性またはリパーゼ活性は有意に阻害されず、有意な抗酸化活性も提供されなかった。本発明によれば、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤および／または抗酸化剤を含有する本発明の表面活性製剤による肺の炎症病態の治療は、基底膜損傷、蛋白質漏出および肺血管出血の防止に効果的である。前記治療は、血管の蛋白質漏出および出血を最適に減少させることにより、自生の表面活性物質の不活化および重篤な肺機能の損失、多臓器不全および患者の３０〜４０％に死をもたらす肺における炎症性滲出液の発現も防ぐことができる。
【０１７８】
プロテアーゼ阻害剤としては、ヒト白血球エラスターゼ阻害剤などのエラスターゼ阻害剤、ヒト分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、アルファ１−プロティナーゼ阻害剤（またはアルファ１−抗トリプシン）および他のクニッツ阻害剤またはセリンプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。本発明の使用に好適なさらなるプロテアーゼ阻害剤は上に記載している。
【０１７９】
抗酸化剤の例としては、ＥＵＫ１３４、カタラーゼ、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、プロシステイン、アルファ−トコフェロール、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、天然フラビジン類（例えば、２，７−ジヒドロキシ９，１０−ジヒドロフェナントロ−４,５−ｂｃｄ−ピラン（米国特許第６，５０３，５５２号明細書を参照）およびこれらの化合物の誘導体が挙げられる。ホスホリパーゼＡ２阻害剤の一例はＬＹ１１−７２７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）である。
【０１８０】
プロテアーゼ活性阻害における前記医薬品組成物の治療的有効性を例示するために実験を行った。試験は最初、ウサギおよび／またはヒト気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液におけるエラスターゼ活性の測定に関するアッセイを設定した（実施例３）。ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）活性を有するサンプルにおいて生じた比色シグナルは４１０ｎＭにおける光学密度（ＯＤ４１０）と直線的に相関する。次にＨＮＥを阻害するエラスターゼ阻害剤の能力を試験した（実施例４）。前記混合物のＯＤ４１０と加えた阻害剤の量の対数との間の相関は直線的であり（図５Ａ）、ＨＮＥ活性が、セリンエラスターゼ阻害剤によりインビトロで阻害されていることを立証している。
【０１８１】
次に、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）を有するヒトおよび実験的に誘導した呼吸窮迫を有するウサギから採取したＢＡＬ液におけるエラスターゼ活性を確立された比色アッセイにより測定した。図５Ｂは、ＢＡＬ量とＯＤ４１０との間の直線的相関を示しており、エラスターゼ活性が比色アッセイによって測定できること、また、エラスターゼがＡＲＤＳを有するヒトのＢＡＬ液中に存在することを立証している。
【０１８２】
同様に、誘導された肺損傷を有するウサギから採取した気管支肺胞（ＢＡＬ）液について、比色アッセイを実施した（実施例６）。１００μｇ／ｍｌのセリンエラスターゼ阻害剤添加後の各ＢＡＬ液についても、比色アッセイを実施した。図６Ａは、ＢＡＬ液単独における、また、セリンエラスターゼ阻害剤を添加したＢＡＬ液におけるエラスターゼ活性を示している。エラスターゼ活性は、対応するＯＤ４１０を与えるＨＮＥ濃度として表される。エラスターゼ活性は全てのウサギＢＡＬ液において見られ、この活性はセリンエラスターゼ阻害剤の添加により、６つのＢＡＬ液のうち５つにおいて阻害された。添加されたセリンエラスターゼ阻害剤は、公知のＨＮＥ阻害剤（実施例４）であるため、測定されたエラスターゼ活性はＨＮＥによるものと思われる。
【０１８３】
洗浄液は外因性エラスターゼ阻害剤を含有し得ることに注意する必要がある。これはα１−プロテアーゼ阻害剤、α２−マクログロブリン、ＳＬＰＩ、または他のエラスターゼ阻害剤であり得る。このような阻害剤の存在は、誘導された肺の損傷を有するウサギの気管支肺胞（ＢＡＬ）液のインビトロアッセイによって示すことができる（実施例６）。図６Ａを参照して、ウサギに細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）および抗ＢＳＡを気管内投与した（全ウサギ）３時間後（ウサギ６３１５および６３１６）または６時間後（６３１３、６３１４，６３１７および６３１８）ウサギからＢＡＬ液を採取した。ウサギ６３１７と６３１８には、３時間目に、１０ｍｇ／ｋｇのＢＳＡを追加投与し、また、抽出されたＢＡＬ液は単独で試験したか（交差平行線）、または１μｇ／ｍｌのＨＮＥと混合後に試験した（黒い実線）。ウサギ６３１７のＢＡＬ液には、かなりの量の遊離エラスターゼが存在し、他の全てのウサギの液はエラスターゼ阻害剤、特にＨＮＥ阻害剤の存在を示した。したがって、ウサギＢＡＬ液における遊離エラスターゼ活性の不在は、サンプル中のエラスターゼの不在を示すのではなく、エラスターゼは存在しているが阻害されていると思われる。区別するために免疫学的アッセイを実施できた。
【０１８４】
モデル表面活性剤混合物、セリンエラスターゼ阻害剤および双方の組合わせが、肺の炎症に及ぼす効果を、ＡＲＤＳウサギモデルで評価した。これらの実験は実施例８から１２に詳細に記載されている。本試験のために２０匹のウサギを５つの群に分けた。細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、３時間後にフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による洗浄によって刺激し、１群〜４群のウサギに肺の炎症を誘導した。さらに、治療として２群のウサギには、モデル表面活性剤混合物、３群のウサギにはセリンエラスターゼ阻害剤、４群のウサギにはモデル表面活性剤混合物とセリンエラスターゼ阻害剤の双方を投与した。５群のウサギは、正常なウサギであり、対照として用いた。前記ウサギを６時間目に殺処理し、右下葉を３回洗浄し、洗浄液は、各ウサギについてプールした（最終洗浄）。損傷の程度および治療効果は、最終洗浄液中に見られる基底膜蛋白質断片と赤血球の量によって測定した。
【０１８５】
図７Ａは、肺損傷を有するウサギから採取した最終洗浄液中に存在する蛋白量の増加を示している。見られた蛋白量は、血漿蛋白質を肺胞空間内へ漏出させる基底膜マトリックスに対する損傷の程度を示し、蛋白量が多いほど肺に存在する損傷が多い。モデル表面活性剤混合物を単独投与された２群ではＬＰＳおよびＰＭＡ損傷から生じる蛋白量（略２．５ｍｇ／ｍｌ）が減少し、モデル表面活性剤混合物とエラスターゼ阻害剤双方を投与された４群では、さらに減少したことを結果は示している。エラスターゼ阻害剤を単独投与された３群が蛋白質レベルの減少を示さなかったのは、恐らくその群の１匹のウサギから得られた異常な高値によるものと思われた。このウサギを除外すれば、３群の平均値は、モデル表面活性剤混合物単独で治療された２群で得られた値に略等しくなる。
【０１８６】
図７Ｂは、最終洗浄液中に見られる蛋白質のＳＤＳ−ゲル分析に関して、基底膜マトリックス蛋白質に対して、モルモット内で産生された抗体を用いて実施されたウェスタンブロット分析を示している。ウサギ肺基底膜の蛋白質成分は、左枠に提示している。ＬＰＳおよびＰＭＡだけで処理されたウサギ、モデル表面活性剤混合物の添加により治療されたウサギ、セリンエステラーゼ阻害剤添加により治療されたウサギ、およびモデル表面活性剤混合物とセリンエステラーゼ阻害剤双方の添加により治療されたウサギのＢＡＬ液中の蛋白質成分は、各々、１群から４群の枠に提示されている。正常の未損傷のウサギのＢＡＬ液中の蛋白質成分は５群の枠に示されている。これらの枠において、９０，０００分子量超のバンドは、基底膜に特異的で正常なウサギ血漿に存在しない（データは示していない）。１〜４群の７０，０００分子量に存在する大きなバンドは、使用された抗血清中の不純物として存在するアルブミンである。低分子量バンド（＜１０，０００分子量）は、基底膜の断片を表す。モデル表面活性剤混合物、エラスターゼ阻害剤、または双方の組合わせのいずれかで治療を受けた動物において、基底膜損傷の改善が見られ定量化できる。
【０１８７】
動物における損傷の程度の他の尺度は、最終洗浄液中に現れる出血または赤血球（ＲＢＣｓ）数量である。ＲＢＣｓの存在は、蛋白質の存在に較べると、血球全体がマトリックスに生じた孔を通過できる、損傷の程度がさらに大きいことを示している。図７Ｃは、最終洗浄液中のＲＢＣ数を示している。ＲＢＣｓ数のわずかな低下は、モデル表面活性剤混合物が添加された場合に、損傷のいくらかの改善が見られたことを示唆しており、エラスターゼ阻害剤が添加された場合は損傷のより大きな減少が見られた。モデル表面活性剤混合物とエラスターゼ阻害剤双方の添加もまた、損傷の著しい減少をもたらした。
【０１８８】
ナイトロジェンマスタードによる処理で循環好中球を欠失したウサギがＬＰＳおよびＰＭＡに曝露した際に、有意な損傷を現さないことが以前示されていた。このことは最終洗浄液におけるこれらのウサギの蛋白質、ＲＢＣｓおよびエラスターゼがないことにより立証されている（Ｃｏｃｈｒａｎｅ，ＣＧら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．ａｎｄ  Ｃｒｉｔｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１６３巻：ｐ．１３９、２００１年）。このことは、インビボでのエラスターゼ源が好中球であることを強く示唆する。ヒト好中球エラスターゼ活性を阻害するモデル表面活性剤混合物単独、セリンエラスターゼ阻害剤単独、および双方の組合わせの能力を評価した。図８は、エラスターゼ阻害剤によるＨＮＥ活性の著しい阻害を、モデル表面活性剤混合物のさらなる存在の有無に関して示している。モデル表面活性剤混合物は、エラスターゼを阻害するエラスターゼ阻害剤の能力を妨害しないが、それ自体で直接エラスターゼを阻害もしない。
【０１８９】
最終ＢＡＬ液におけるエラスターゼ阻害剤の残余の活性を、既知量のＨＮＥと共に前記ＢＡＬ液をインキュベートすることによって評価した（実施例１２）。その結果を図９に示している。ＯＤ４１０により測定した場合、ＨＮＥ活性の著しい低下が２〜４群に見られる。ＨＮＥ活性の低下は、１つ以上のエラスターゼ阻害剤の存在を示している。３群および４群の洗浄液に見られるエラスターゼ阻害は著しいが、これらの群の動物は静脈内経路および気管内経路の双方にとって公知のエラスターゼ阻害剤が投与された。しかし、モデル表面活性剤混合物群（２群）に見られたエラスターゼ阻害もまた、ウサギにおけるＳＬＰＩまたはアルファ−１プロテアーゼ阻害剤またはある組合わせなどの内因性エラスターゼ阻害剤による可能性が考えられる。正常なウサギ（５群）およびＬＰＳ／ＰＭＡ陽性の損傷ウサギ（１群）は、この実験において、それらの最終洗浄液中にエラスターゼ阻害剤の存在を示さなかった。しかし、ウサギ＃５５４１（１群）は最終ＢＡＬ液中に遊離エラスターゼの存在を示した。正常ウサギのＢＡＬ液（５群）には検出されなかった。
【０１９０】
誘導された肺の炎症を有するウサギの肺に見られる蛋白質分解性損傷の源は、白血球から遊離されたエステラーゼの可能性が強いことが、上記の試験によって示された。急性の肺損傷は、肺血管基底膜の分解および血漿蛋白質と赤血球の肺胞空間内への放出を生じさせた。前記動物をモデル表面活性剤混合物、またはセリンエラスターゼ阻害剤または双方の組合わせによって治療することにより、損傷程度が低下した。したがって、モデル表面活性剤混合物およびセリンエラスターゼ阻害剤を含有する医薬品組成物は、肺の炎症損傷の予防および治療に好結果を生じると考えられる。
【０１９１】
上に特記したように、本発明は、炎症成分が関与していない肺病態を含む種々の肺病態の治療に有利である。喘息およびそれに関連した気管支収縮病態は、アルブテロール、テルブタリン、サルメテロール、フォルモテロールおよび薬理学的に許容できるそれらの塩などの気管支拡張剤を含有する表面活性剤製剤の投与によって有利に治療できる。
【０１９２】
気管支炎や結核などの肺の細菌感染は、活性剤として抗生物質を含有する表面活性剤によって有利に治療できる。
【０１９３】
嚢胞性線維症は、デオキシリボヌクレアーゼ送達用に調製された本発明の表面活性製剤の投与によって有利に治療できる。
【０１９４】
ゆえに、本組成物は、他の有用な薬剤も含むことができる。例えば、以下の薬剤を含み得る：気管支拡張剤、抗生物質、デオキシリボヌクレアーゼ、鎮痛剤またはサイトカインおよびペプチドホルモンなどのポリペプチド。
【０１９５】
（分布および取り込みの改善）
本節では、肺における薬剤の分布と取り込みの改善に寄与する、上記の表面活性製剤により提供された因子を記載する。薬剤分布の改善は、（ｉ）肺表面における薬剤の展着および散剤の改善、実際には薬剤が肺内へおよび肺を通って移行する有効表面積の増大、および（ｉｉ）肺表面における脂質単層を安定化し、したがって肺表面における有利な薬剤移行界面の維持などの因子の組合わせによるものと思われる。
【０１９６】
図４Ａと４Ｂは、脂質粒子において、肺に送達された活性剤の沈積と展着を脂質展着の有無に関して図示している。図４Ａは、展着がある場合（＋、白円）およびない場合（−、部分陰影円）の双方における沈積直後の脂質粒子のサイズを図示している。時間が増加するにつれ（図４Ｂ）、展着粒子が拡張しつづけ、融解して沈積領域に広い面積の覆いを形成するため、覆われた面積差はより明白となる。展着がない場合、前記粒子は分離して局在化したままであり、それらの内容物を狭く局在化した面積にのみ放出する。
所与のサイズの所与の量の脂質粒子によって覆うことのできる総面積は、粒子脂質により表される単層総面積に関して算出できる。一例として、表面活性剤製剤の１μｍサイズの粒子１０ｍｇの算出面積は、６０ｃｍ２であり、すなわち、肺の表面積の０．００１２５パーセントである。粒子中のリン脂質が単層形態にて分散される展着が存在すると、前記製剤（脂質中に分散した活性剤を含むと考えられる）によって覆われた総面積は肺の表面積の３４％と算出される。このように、展着によって、肺の中へ、または肺のいたるところへの薬剤移行のために利用できる肺の総表面積は少なくとも略４桁のオーダーで増加する。
【０１９７】
薬剤送達のための肺表面積を大きく増加させることに加えて、本発明の表面活性製剤は、圧力下での崩壊に抗して単層を安定化することによって、より効率的な取り込みを促進し、単層を不安定化することなく、肺の単層表面内への脂質取り込みを可能にする。
【０１９８】
図４Ｃは、これらの特徴が、患者の肺領域に送達された活性剤の細胞取り込みおよび浸透を増大させる様子を図示している。図の左では、肺表面に沈積した局在化脂質粒子が効果的に覆っているのは、粒子自体の狭い表面積のみであることが示されている。この粒子による薬剤送達は、粒子からの薬剤の拡散速度および／または粒子の溶解速度によって限定されることになる。
【０１９９】
図の右の図示は、本発明の表面活性製剤を有する粒子における脂質展着の効果を示している。前記図は、粒子の脂質および関連した薬剤が肺表面の単層／空気界面において、より広い表面積にわたって展着したことを示すことが意図されている。そして、薬剤は小嚢浸透、傍細胞浸透または経細胞浸透などの機構による直接的取り込みのため、肺のより広い表面積にわたって分布する。小嚢輸送は、細胞の表面に生じる多数の複雑な機構のかなり粗い表現である。肺胞内の細胞膜は薬剤を含む小嚢を作り出すが、薬剤粒子と細胞膜との間のこのような様式は、自発的に生じ得る。薬剤、特に高分子はこのような経路により、細胞膜を越えて輸送される。傍細胞の取り込みにおいて、活性剤は、循環内への取り込みのため上皮細胞間の傍細胞空間を通って拡散する。経細胞取り込みと浸透は、肺上皮内へ、肺上皮を通って、および肺上皮の外から循環内への直接的取り込みを意味する。
【０２００】
また、図３Ｃは、薬剤送達における展着および単層安定化が肺の病原体、この場合は、肺表面上の細菌に対する治療を増強し得る様子を示している。展着がない場合、脂質粒子は病原体粒子に接触できたり、できなかったりする。展着がない場合、薬剤送達は接触箇所でのみ、または薬剤の拡散作用によって生じる。一方、脂質分散は、病原体を飲み込むことができ、病原体の外表面全体にわたって病原体に薬剤を取り込ませることができる。
【０２０１】
ここで検討した特徴は、ポリペプチド活性剤が、肺組織に広く分布される必要のある肺の炎症病態の治療に用いられるプロテアーゼ阻害剤、またはホスホリパーゼ阻害剤および抗酸化剤などの化合物を投与する上で特に有用である。さらに、このような特徴は、肺の広い部分に影響を与える肺病態の治療に有用である。なぜならば、投与された薬剤は肺の広い表面積に亘って素早く利用できるからである。また、これらの特徴は、それ自体では容易に拡散できないポリペプチドやペプチドの投与に有用である。肺内の感染部位に浸透する必要のあるペプチド抗生剤などの抗生剤は、効率的に投与され、投与後に肺表面の細菌を攻撃するために容易に利用し得る。
【０２０２】
（組成物）
プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、抗酸化剤および本発明の表面活性剤混合物は、種々の許容できる組成物へと製剤化できる。このような医薬品組成物は、選択された投与経路、すなわち、洗浄、経口、または非経口、静脈内、筋肉内、肺または吸入経路に適合させた種々の形態でヒト患者などの哺乳動物宿主へ投与できる。
【０２０３】
化合物、例えば、抗酸化剤およびポリペプチド阻害剤または他の化合物が十分に塩基性または酸性であって、安定な非毒性の酸性塩または塩基性塩を形成する場合、塩としてこのような化合物を投与することが適切であり得る。製薬的に許容できる塩の例は、生理学的に許容できるアニオンを形成する酸によって形成された有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタール酸塩、およびα−グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩などの好適な無機塩もまた形成できる。製薬的に許容できる塩は、当業界に周知の標準的な方法を用いて、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物を生理学的に許容できるアニオンを供給する好適な酸と反応させることによって得られる。カルボン酸のアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、またはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた作成される。
【０２０４】
ポリペプチドの製薬的に許容できる塩としては、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成）が挙げられる。また、遊離のカルボキシル基により形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【０２０５】
このように、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、または抗酸化剤を含有する本発明の組成物は、不活性希釈剤または同化できる食用担体などの製薬的に許容できる媒体と組合わせて、全身的に、例えば経口で投与できる。これらは、硬殻または軟殻のゼラチンカプセルで包含でき、錠剤へと圧縮でき、または患者の食事の食物に直接組み込むことができる。経口治療投与のためには、前記組成物は、１つ以上の賦形剤と組合わせることができ、消化可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で用いることができる。このような組成物および製剤は少なくとも０．１％の有効化合物を含有する必要がある。前記組成物および製剤のパーセンテージは、もちろん変えることができ、所与の単位剤形の重さの約２％から約６０％の間が便利であり得る。このような治療上有用な組成物におけるプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、または抗酸化剤の量は、有効な用量濃度が得られるような量である。
【０２０６】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下のものも含有し得る：トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームなどの甘味剤またはペパーミント、ウインターグリーン油またはチェリーフレーバリングなどの芳香剤を加えてもよい。単位剤形がカプセルの場合、上記のタイプの物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有できる。被覆剤として、あるいは固体の単位剤形の物理的形態を変更するために、他の種々の物質が存在できる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖などで被覆できる。シロップ剤またはエリキシル剤は、有効化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、染料およびチェリー芳香またはオレンジ芳香などの芳香剤を含有できる。もちろん、いずれの単位剤形の調製に用いられるいずれの物質も製剤的に許容できるものであり、使用量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、前記有効化合物を徐放製剤および徐放装置に組み込んでもよい。
【０２０７】
前記有効化合物は、注入または注射により静脈内に、または腹腔内に投与することもできる。活性剤の液剤は、水中で調製でき、場合によっては、非毒性の界面活性剤と混合できる。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物中で、および油中で調製できる。通常の貯蔵条件および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。
【０２０８】
注射または注入に好適な製薬剤形としては、無菌注射、または注入液剤または分散剤の即席製剤のために適合させ、場合によってはリポソームに封入した有効成分を含む滅菌水性液剤または分散剤または無菌散剤を挙げることができる。全ての場合において、最終的な剤形は無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定である必要がある。液体担体または液体媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または液体分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散剤の場合は、必要な粒子サイズの保持により、または界面活性剤の使用により維持できる。微生物作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって実現できる。多くの場合、等張性試剤、例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の吸収波長は、前記組成物中における吸収を遅延化する試剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって実現する。
【０２０９】
滅菌注射溶液は、必要ならば、上記に列挙された種々の他の成分と共に適切な溶媒中、必要な量のプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤を組み込み、次いでろ過滅菌することにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥法および凍結乾燥法であり、これらにより、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤プラス予め滅菌ろ過した溶液に存在する任意の追加所望成分の粉末が生成する。
【０２１０】
本発明のプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤の有用な用量は、動物モデルにおけるそれらのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することにより決定できる。マウス、および他の動物の、ヒトに対する有効用量の外挿法は、当業界に公知であり；例えば、米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
【０２１１】
一般に、液体組成物中の本発明のプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤の濃度は、約０．０１〜２５重量％、または約０．１〜１０重量％である。
【０２１２】
治療使用に必要なプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤、またはそれらの有効塩類または誘導体の量は、選択された特定の塩のみならず、投与経路、治療している病態の性質、患者の年齢および状態によって変わり、最終的には主治医および臨床医の自由裁量となる。
【０２１３】
しかしながら一般に、好適な投薬量は、約０．１から約１００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、１日当たりレシピエントの１キログラム体重当たり１から５０ｍｇなどの１日約１．０から約７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または約３から約９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、または約５から約６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる。
【０２１４】
プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤は；例えば、単位剤形当たり有効成分が５から１０００ｍｇ、好適には１０から７５０ｍｇ、最も好適には５０から５００ｍｇを含有する単位剤形で投与することが好適である。
【０２１５】
理想的には、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤は、肺病態の最適治療を達成するように投与すべきである。経口、静脈内または非経口的に投与される場合、活性剤のピーク血漿中濃度は、約０．５から約７５μＭ、または約１から５０μＭ、または約２から約３０μＭで達成できる。これはまた、例えば、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤の場合によっては生理食塩水中、０．０５から５％溶液の静脈内注射、またはプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤の約１〜１００ｍｇを含有するボーラスとして経口投与によって達成できる。所望の血中レベルは、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤の約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒを供する連続注入、または約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇを含有する間欠注入により維持できる。
【０２１６】
所望の投薬量は、単一用量または適切な間隔、例えば、１日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の副次的用量で投与される分割用量で好適に提供できる。この副次的用量自体を、例えば、注入器からの頻回吸入、または複数点眼の適用のような多くの不連続の厳密ではない間隔投与にさらに分割できる。
【０２１７】
幾つかの実施形態において、抗酸化剤は細胞に入り、反応性酸素種と反応することにより、細胞内の反応性酸素種の濃度を減少させる。代わりの実施形態において、抗酸化剤は細胞に入るか、周囲の細胞外環境に存在して、反応性酸素種から発生する過酸化物と反応する。
【０２１８】
本発明の使用に考慮されたプロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤を、関心対象部位（肺）に直接送達して、肺の炎症症状を直ちに軽減させることができる。このような送達は、気管支肺胞洗浄、気管内投与、吸入またはボーラス投与により可能である。これらの場合、表面活性剤混合物が含まれる。
【０２１９】
肺洗浄を実施する方法は当業界で利用できる。例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第６，０１３，６１９号明細書を参照されたい。例えば、肺洗浄は以下のとおり洗浄できる：
ａ）  ベンチレータによるガス呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）を、調節圧、好ましくは約４から２０ｃｍ水で哺乳動物の肺区域に適用すること；
ｂ）  製薬的に許容できる水性媒体中の希釈表面活性剤を含有する洗浄組成物を肺の１つ以上の葉または区域に点滴注入すること；および
ｃ）  短い間隔の気道気管支吸引、好ましくは約２０から１００ｍｍ水銀陰圧を用いて、生じた肺液体を肺から除去すること。
【０２２０】
典型的には、ＰＥＥＰは、点滴注入ステップ（ｂ）前の予め選択された時間、好ましくは約３０分まで適用し、さらにＰＥＥＰは、典型的にはステップ（ｂ）と（ｃ）の間、および除去ステップ（ｃ）後の予め選択された時間、好ましくは約６時間まで連続的に適用される。
【０２２１】
吸入による送達を、さらにここに記載する。代わりの送達手段としては、限定はしないが、静脈内、経口、吸入、カニューレ挿入、腔内、筋肉内、経皮、および皮下投与が挙げられる。
【０２２２】
本発明の治療組成物は、有効成分として溶解または分散されている、本明細書に記載の表面活性剤混合物、プロテアーゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤または抗酸化剤と共に生理学的に耐容性のある担体を含有する。好ましい実施形態において、治療組成物は、治療目的のために哺乳動物またはヒト患者に投与された場合に免疫原性ではない。
【０２２３】
組成物に溶解または分散された有効成分を含有する製薬組成物の調製は、当業界によく理解されており、製剤に基づいて限定する必要はない。典型的にはこのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射液として調製されるが、使用前の液体中の溶液または懸濁液に好適な固体形態も調製できる。この製剤は乳化もできる。
【０２２４】
前記有効成分は、製薬上許容でき、有効成分と適合でき、本明細書に記載された治療法の使用に好適な量の賦形剤と混合できる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合わせである。さらに所望ならば、前記組成物は、活性剤の効果を高める湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助剤を含有することができる。
【０２２５】
液体担体の例は、活性剤および水の他に物質を含有しないか、あるいは生理的ｐＨ値でリン酸ナトリウムのような緩衝剤、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水のような両方を含有する滅菌水溶液である。さらに、水性担体は、２種以上の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有できる。
【０２２６】
幾つかの実施形態において、液体担体はトロメタミン緩衝系であり、本質的に以下のとおり調製できる。酢酸（ＡＲ  Ｓｅｌｅｃｔ、ＡＣＳ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、ケンタッキー州パリス）を用いてｐＨ７．２±０．５に調整されたｐＨを有する０．３７ｍｌのトロメタミン溶液（トロメタミン注射液、ＮＤＣ００７４−１５９３−０４、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州ノースシカゴ）を、０．３３ｍｌ生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と０．３０ｍｌ水（注射液用滅菌水、ＵＳＰ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とに混合する。この溶液は滅菌ろ過により滅菌できる。
【０２２７】
（肺送達用エアロゾル製剤の調製）
本節は、表面活性剤製剤を被験者の肺表面に投与するための乾燥粉剤または液滴エアロゾルを製造するための方法および装置を考慮している。
【０２２８】
図１は、本発明による加工ステップおよび製剤の概要を提供している。枠１０表示の「表面活性剤混合物」とは、リン脂質、展着剤、および肺表面活性蛋白質の混合物を言う。前記表面活性剤混合物は、リポソーム懸濁液のような脂質本体製剤に加工し得る。枠１２表示の「表面活性剤製剤成分」とは、表面活性剤混合物の他の成分を言う。活性剤は、製剤に組み込まれている。
【０２２９】
図１に見られるように、活性剤は、予め形成された表面活性剤混合物、例えば、予め形成されたリポソームに加えて表面活性剤製剤を形成でき、または１２でのように表面活性剤製剤成分に直接加えて、枠１４によって示される表面活性剤製剤を直接製造できる。前記表面活性剤製剤は、十分に規定された脂質本体、例えば、活性剤を取り込むリポソーム、表面活性剤混合物および活性剤成分の双方を含有する脂質−結晶性または非晶質本体、有機溶媒または有機／水性共溶媒中の上記成分の溶液、またはそれら幾つかのいくらかが脂質−本体形態である懸濁液、および溶質形態の他の成分であり得る。下記から認識されるように、表面活性剤製剤の組成物のみおよびそのものの構造的要件は、上記脂質および薬物成分の全てを含有する好適なエアロゾル粒子形に変換または加工できる。
【０２３０】
本発明により考慮される種々の加工ステップをここで考慮すると、枠１６標識の「凍結乾燥粒子」とは、好ましくは脂質本体の水性懸濁液としての表面活性剤製剤を凍結乾燥して乾燥した塊を形成し、次に例えば、摩砕することにより微粉砕して、１〜５μｍサイズ範囲の質量中央空気動力学的径を有する乾燥粉末粒子を含有する組成物を形成する。枠１６で示された乾燥粉末粒子を、次に保存し、好適なエアロゾル化装置を用いて、吸入治療（枠２６）に、または粒子懸濁液としてエアロゾル化（枠２４）に好適な溶媒中の懸濁液に好適な乾燥粒子エアロゾルを製造する。
【０２３１】
他の実施形態において、本発明は、脂質本体形態で表面活性製剤を含有する水性液滴エアロゾルを生成するために、使用者制御のネブライザまたはエアロゾライザによって枠２０に示された液体表面活性製剤を加工することを考慮している。この実施形態の表面活性製剤成分は、エアロゾル液滴に懸濁された規則的な結晶または非晶質脂質粒子に存在し得る。
【０２３２】
さらに他の実施形態において、表面活性製剤は、枠１８に示されるようにスプレー乾燥により加工して、所望の１〜５μｍサイズの質量中央空気動力学的径を有するスプレー乾燥粒子を製造する。次に、前記スプレー乾燥粒子を保存して、吸入療法のために上記のエアロゾル化装置で使用者により使用される。粉末粒子は示されるように、乾燥粉末エアロゾルとして送達できるか、または粒子を水性液滴形態におけるエアロゾル化用に水性媒体に懸濁できる。あるいは、枠１４と２６との間の直接連結により示されるように、液体形態における好適な表面活性製剤、例えば、揮発性生体適合性液体に含まれる製剤溶液または懸濁液は、形成された粒子が活性剤の治療的送達のために直ちに吸入されるエアロゾル化過程で形成し得る。
【０２３３】
本発明の表面活性製剤のエアロゾル投与による薬物送達の基本原則およびこれらの利点を達成するために好適なエアロゾル形成方法を、さらに以下に記載する。活性剤を送達する上で種々の療法または診断法における肺道に対する本発明の適用も以下に考慮されている。
【０２３４】
上記のように、本発明の製剤は、溶液製剤または粒子製剤として調製できる。この液体成分または治療薬または双方は、水性溶媒、有機溶媒または混合溶媒に懸濁されたリポソーム、結晶または非晶質脂質本体に取り込むこともできる。
【０２３５】
リポソーム懸濁液（脂質小胞）は、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｊｒ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９巻：ｐ．４６７−５０８、１９８０年に詳述されるものなど種々の方法により作製できる。本発明のリポソーム表面活性剤組成物は、一般に滅菌リポソーム懸濁液である。これらリポソームは、複数のコンパートメントまたは多層状小胞、単一コンパートメント小胞およびマクロ小胞であり得る。多層状小胞が一般に最も一般的である。多層状小胞（ＭＬＶ）類は、好ましくは滅菌条件下で簡便な液体−フィルム水和法により形成できる。
【０２３６】
リポソーム表面活性剤組成物を製造する１つの方法は、表面活性ポリペプチドを選択されたリン脂質と一緒に溶解すること、次いで生じた溶液を水性緩衝液と組合わせることを含む。次に生じた懸濁液を透析して有機溶媒を除く。あるいは、有機溶媒は、蒸発および／または真空に曝露することにより除去できる。このように製造された乾燥脂質／ポリペプチド混合物を、水性緩衝液系に再度水和してリポソームを製造する（Ｏｌｓｏｎ，Ｆ．、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、５５７巻：ｐ．９−２３、１９７９年）。
【０２３７】
使用される好適な緩衝液としては、トリス緩衝液、トロメタミン緩衝液系などが挙げられる。トロメタミンは、トリス、トロメタミン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても知られている。種々の好ましい実施形態において、前記組成物は、約６．５〜８．０のｐＨ範囲を有する。
【０２３８】
前記リポソームは、選択された均一のポアサイズを有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことによりサイジングされ得る。特にこの調製は、同じサイズの膜を２回以上通して押し出される場合、膜のポアサイズは、この膜を通って押し出されたことによって生成されたリポソームの最も大きなサイズに一致する。このように製造されたリポソームは、０．０３から５ミクロンの範囲にあり得る。均質化法および超音波処理法もまた、１００ｎｍ以下の平均サイズまでのリポソームのダウンサイジングに有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｉｎ：ＳＰＥＣＩＡＬＩＺＥＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ−ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、Ｐ．Ｔｙｌｅ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、ｐ．２６７−３１６、１９９０年）。
【０２３９】
リポソーム形成前に治療薬をリポソームに取り込ませることを所望する場合、これは標準的な技術により行うことができる。例えば、リポソームを脂質水和により形成する場合、疎水性薬物を水和される脂質混合物に含ませることができ、また親水性薬物を水和溶液に取り込ませることができる。親水性化合物、例えば、蛋白質の高封入化効率は、逆蒸発相法を使用することにより達成でき、その方法では薬物含有水性媒体を部分的に蒸発した脂質構造に加える。
【０２４０】
親水性薬物のために高封入化効率を達成する他の方法は、溶媒注入によるものであり、揮発性有機溶媒、例えば、エーテル中の脂質溶液を、薬物の水溶液に注入する。脂質溶液を高脂質濃度への連続注入により、極めて高い封入率、例えば５０％以上が達成し得る。
【０２４１】
溶媒注入法は、図２Ａにより一般的に例示されており、この図は、親水性薬物の水溶液または疎水性薬物の有機溶液の、脂質の共溶媒分散液（表面活性剤混合物成分を含有する）への添加、水性希釈液の同時またはその後の添加、および有機溶媒の蒸発によって、取り込まれたまたは封入された薬物を含む脂質粒子（例えば、リポソーム）のバルク製剤を形成することを示している。
【０２４２】
あるいは、活性剤は、予め形成されたリポソームに添加してもよい。この場合、表面活性ポリペプチド−脂質混合物は、予め形成されたリポソームを含む。化合物が疎水性化合物である場合、前記化合物を、水相媒体の分配により二層膜中への取り込みのため、単にリポソームと接触できる。イオン性で親水性および両親媒性化合物に関して、予め形成されたリポソーム中への高内部封入は、利用できる方法にしたがって、ｐＨまたは他のイオン勾配、例えば、アンモニウム勾配に対する薬物充填により達成できる。
【０２４３】
図１の２０に示されるように、リポソーム形成により、水性液滴形態でのエアロゾル化のために液体懸濁液として保存できるか、または図１の１６、２２に示されるように、リポソーム形成により凍結乾燥、粉末化でき、乾燥粉末エアロゾルとして投与できる。あるいは、リポソーム懸濁液は、１８のとおりスプレー乾燥でき、粉末エアロゾルとして投与するために粉末形態で乾燥脂質粒子を形成する。
【０２４４】
冷凍乾燥（凍結乾燥）は、溶液または懸濁液から乾燥粉末を製造するための１つの標準的な方法である。例えば、Ｆｒｅｉｄｅ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１１巻：ｐ．１１７−１２２、１９９３年；Ｓａｒｂｏｌｏｕｋｉ，Ｍ．Ｎ．およびＴ．Ｔｏｌｉａｔ、ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、５２巻（１）：ｐ．２３−２７、１９９８年）。凍結乾燥後、乾燥表面活性剤製剤を、例えば摩砕または他の従来の手段により微粉砕して所望のサイズの粒子を形成する。
【０２４５】
最近、液化ガスの臨界特性を使用できる方法が、治療用蛋白質を含有する微粒子および粉末の生成に使用されている（Ｎｉｖｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｉｎ：ＭＯＤＵＬＴＥＤ  ＤＲＵＧ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＷＩＴＨ  ＩＮＨＡＬＡＴＩＯＮ  ＡＥＲＯＳＯＬＳ：ＲＥＶＩＳＩＴＥＤ、Ａ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）。好ましい結晶の晶へきおよび吸入目的に好適な特性を有する粒子は、これらの方法により調製できる。例示的超臨界流体加工法としては：超臨界流体の迅速展開（ＲＥＳＳ）、粒子を調製するためのガス−逆溶剤（ＧＡＳ）沈降の使用、および超臨界流体の溶液−強化分散液（ＳＥＤＳ）が挙げられる（米国特許第５，３０１，６４４号明細書；米国特許第５，７０７，６３４号明細書；米国特許第５，７７０，５５９号明細書；米国特許第５，９８１，４７４号明細書；米国特許第５，８３３，８９１号明細書；米国特許第５，８７４，０２９号明細書および米国特許第６，０６３，１９８号明細書を参照）。
【０２４６】
スプレー乾燥はまた、所望のサイズの乾燥脂質粒子を製造するために有利に使用できる。（Ｍａｓｔｅｒ，Ｋ．、ＳＰＲＡＹ  ＤＲＹＩＮＧ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ、第５版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１年；Ｍａａ，Ｙ．Ｆ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５巻（５）：ｐ．７６８−７７５、１９９８年；Ｍａａ，Ｙ．Ｆ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２（３）：ｐ．２１３−２２３、１９９７年を参照）。種々のスプレー乾燥法は、特許文献に記載されている、例えば、米国特許第６，１７４，４９６号明細書；米国特許第５，９７６，５７４号明細書；米国特許第５，９８５，２８４号明細書；米国特許第６，００１，３３６号明細書；米国特許第６，０１５，２５６号明細書；米国特許第５，９９３，８０５号明細書；米国特許第６，２２３，４５５号明細書；米国特許第６，２８４，２８２号明細書；および米国特許第６，０５１，２５７号明細書を参照されたい。
【０２４７】
使用され得る１つのスプレー乾燥装置は、乾燥タンクを有するサイクロンドライヤーである。液体混合物を乾燥タンクに給送し、温ガス（例えば空気または窒素）または他の不活性ガスをタンクの上部に圧入する。給送液体をタンクに入ったときに分解し、これをタンクの底部に運ばれたときに温ガスにより乾燥し、そこから採取ユニットに運ばれる。公知の加工パラメータに従って、溶媒、注入速度、温ガス流速を調整して所望のサイズの乾燥粒子を製造できる。この場合、例えば１〜５μｍ範囲で平均流体力学的径を有する粒子を使用できる。この手順において、乾燥温度は、少なくとも約３７℃、好ましくは４０℃超で、１００℃超も良好であり得る。採取チャンバ内の温度は、加熱空気よりも実質的に低い。この一般法は、図２Ｂに例示され、この図は、表面活性剤混合物成分も含んでいる好適な共溶媒溶液に加えられた疎水性または親水性薬物を示している。生じた混合物をスプレー乾燥してバルク粉末製剤中の所望のサイズ乾燥粒子を製造する。次いでこれらの粒子を包装して、好ましくは乾燥条件下で乾燥粒子を肺に投与するためにエアロゾライザに使用されるまで貯蔵できる。
【０２４８】
図３Ａおよび３Ｂは、この方法により製造できるタイプの乾燥脂質粒子の顕微鏡写真である。図３Ａは、全て狭いサイズ範囲ではあるが、種々の形態を有する非晶質粒子を示している。図３Ｂに示される粒子は、よく規定された結晶形状を有する結晶性粉末粒子である。両タイプの粒子は、本発明に好適ではあるが、しかし、２つの状態間の遷移が、有効製薬成分の物理化学的安定性に影響を及ぼす可能性があり、また吸入器から分散されて解凝集される粉末の能力に直接影響を及ぼす可能性があることから一旦形成された粒子は、最初の状態で維持されることが好ましい。これらの変化はまた、粒子の薬物動態特性に影響を及ぼす可能性がある。一般に、非晶質粉末が結晶形への遷移を起こす傾向に影響を及ぼす因子としては、湿気、親水性薬剤、不純物、温度および時間が挙げられる。非晶質粉末が結晶状態への遷移を起こす傾向を減じ得る因子は、蛋白質とポリマー類、および疎水性物質の存在である。遷移に影響を及ぼすこれら幾つかの因子の中で、温度と湿気が最も重要であり、エアロゾル化前に適度の保存温度下での乾燥状態で粒子を保存する必要性を強調する。
【０２４９】
懸濁粒子または乾燥粒子を形成する方法にかかわらず、粒子は、１〜５ミクロンの範囲で所望のＭＭＡＤを得る条件下で形成される。肺の深い組織に影響を及ぼす肺の病態（例えば、肺気腫）の治療のためなど、粒子を活性剤を肺深くに送達させることを意図する場合、前記粒子は、主として１〜３または１〜２ミクロンＭＭＡＤサイズ範囲であることが好ましい。薬物送達が気道を標的にする場合、より大きな粒径、例えば３〜５ＭＭＡＤサイズ範囲がより適切となり得る。
【０２５０】
前記製剤は、リポソームまたは他の脂質粒子の水性懸濁液であるが、種々の市販のネブライザは、所望のエアロゾル粒子を製造するために使用できる。噴霧操作は、典型的には約１０〜５０ｐｓｉｇの圧で実行され、形成される水性粒子は、典型的には約２〜６ミクロンの範囲である。装置は、公知の操作変数により、エアロゾル化リポソームまたは脂質ベースの粒子の測定量を生じるように制御され得る。
【０２５１】
リポソームの水性懸濁液、および好ましくは約２５％〜３０％未満の封入水性容量を含有する比較的希釈された懸濁液をエアロゾル化するために好適な他の装置は、担体流体を細かいミストの水性粒子に分解するために超音波エネルギーを使用する。超音波ネブライザ装置は、粒径が圧縮エアネブライザにより形成されるものと同一、すなわち約２〜６ミクロンの間にあるリポソームエアロゾルミストを生じることが見出された。
【０２５２】
水溶性のリポソーム−透過性薬物の送達のために使用されるタイプの濃縮リポソーム分散液をエアロゾル化するために、分散液を最初に担体溶媒と混合して、エアロゾル化され得る希釈分散液を形成する。前記担体溶媒は水性媒体であってもよく、その場合、分散液は希釈されるか、または空気式または超音波ネブライザによるなど、スプレーするのに好適な形態に適合させる。加えられる添加物量は、分散液をスプレーするのに好適にするのに十分であり、例えば、約３０％未満の全封入容量を含有する。前記分散液が全分散容量の７０〜７５％の初発封入容量を有していると仮定すると、所与の容量の分散液は、少なくとも１容量および２容量の希釈剤で希釈しなければならない。
【０２５３】
あるいは、表面活性剤成分を、下記に挙げたように好適な揮発性で生体適合性の溶媒中に溶解または懸濁して、（ｉ）最初スプレー乾燥粒子を形成し、および（ｉｉ）たった今形成された粒子の肺への吸入を導く条件下で好適なエアロゾライザ装置からスプレーできる。
【０２５４】
本節は、乾燥脂質粒子の風媒性懸濁液を製造するためにデザインされた種々の自給式送達装置を記載する。本明細書に定義される「自給式」とは、粒子エアロゾルが、加圧フルオロクロロ炭素系噴射剤の放出、または使用者によってその装置を通して吸い込まれる、または装置内に生成される空気流のいずれかによる異なる圧により噴射される自給式装置に生じることを意味する。乾燥粉末に対する従来の粉末用エアロゾライザが好適であることも認識されよう。
【０２５５】
脂質粒子／噴射剤懸濁液。この装置またはシステムは、噴射剤に懸濁されている乾燥脂質粒子の計量された量を送達するための従来の加圧噴射剤スプレー装置を使用する。前記システムは、好適な噴射剤中の脂質粒子、例えば、リポソームの長期に亘る懸濁液を必要とすることから、前記懸濁液の脂質粒子および噴射剤成分は、貯蔵時の安定性のために選択しなければならない。
【０２５６】
数種のフルオロクロロ炭素系噴射剤溶媒は、自給式吸入装置に使用されているか、あるいは提案されている。代表的溶媒としては、「フレオン１１」（ＣＣｌ３Ｆ）、「フレオン１１」（ＣＣｌ２Ｆ２）、「フレオン２２」（ＣＣＨｌＦ２）、「フレオン１１３」（ＣＣｌ２ＦＣＣｌＦ２）、ならびにその他が挙げられる。脂質粒子／噴射剤懸濁液を形成するために、乾燥脂質粒子を、選択された噴射剤または噴射剤混合物に加えて、全噴射剤の重量パーセントの約１から３０重量パーセント、好ましくは、約１０〜２５重量パーセントの間の最終脂質粒子濃度にする。薬物が、噴射剤懸濁液の乾燥脂質粒子に封入されたままである水溶性化合物である場合、噴射剤中の脂質粒子の最終濃度を調整して、所与のエアロゾル懸濁液容量で薬物の選択された計量投与量を得る。このように、例えば、リポソームが、１ｍｇ乾燥リポソーム製剤当たり０．０５ｍｇ薬剤を含有するように製剤化されて、投与される薬剤の選択された投与量が１ｍｇである場合、この懸濁液は、エアロゾル１回投与当たり２０ｍｇの乾燥リポソームを含有するように製剤化される。
【０２５７】
脂質溶解性薬物、すなわち、噴射剤溶媒に容易に溶解するものに関して、２つの製剤化アプローチが可能である。第１に、薬物を最初に、乾燥脂質粒子を形成するのに使用される脂質に含ませ、次にこれらを、上記の薬物／噴射剤容量の選択された濃度を与える量で噴射剤に加える。あるいは、薬物を、選択された薬物濃度で最初に溶媒に加えてもよい。この製剤中の脂質粒子は、エアロゾル形成および溶媒蒸発時に薬物のための脂質貯蔵所として作用する「空の」乾燥粒子である。空の脂質粒子の最終濃度を、薬物の計量された量を保持するのに好適な都合のよい全脂質用量を与えるように調整する。
【０２５８】
噴射剤中の脂質粒子の飛沫同伴。この装置、またはシステムにおいて、薬物の計量投与量を含有する乾燥脂質粒子を、送達用パケット中脱水形態で予め包装される。前記パケットは、噴射剤スプレー装置と共に使用されて、リポソーム粒子の風媒性懸濁液中のパケットのリポソーム内容物を噴出させる。
【０２５９】
空気中の脂質粒子の飛沫同伴。送達装置またはシステムの第３のタイプは、乾燥脂質粒子を飛沫同伴させ、これらを使用者の気道に引き込ませるために、使用者の吸入により生じた空気流を利用する。操作において、好ましくは、上記のパケットの「内部」端でシールを破裂させ、パケットの他端を開封する様式で、パケットをノズル上に配置する。ここで使用者は、マウスピースの近くに唇を置き、力強く吸入して、吸入器のパイプ内にかつパイプを通して迅速に空気を引き込む。パイプに引き込まれた空気をノズルで濃縮されて、パケットから対流領域内に脂質粒子を運ぶ高速度の空気流を引き起こす。前記空気流と飛沫同伴されたリポソームをパドルに当てて、回転を起こさせて対流性流れを設定する。したがって、脂質粒子は、吸入により使用者の気道に引き込まれる直前に、より均等かつより広い断面積にわたり分布される。
【０２６０】
あるいは、脂質粒子は、患者の吸入呼吸と独立して粉末を分散し、エアロゾル化するのに必要な力を提供する装置内に保持できるあろう。吸入操作内での投与時機はまた、送達系内に取り込まれたセンサーにより制御され得る。
【０２６１】
以下の実施例は、限定はしないが、本発明を例示するように意図されている。
【実施例】
【０２６２】
（実施例１：表面活性蛋白質／ポリペプチドの調製）
本発明の表面活性ポリペプチド、例えば、ＫＬ４の合成は、種々の公知の合成法に従って実施できる。以下の方法を例示として記載する。
【０２６３】
あるいは、以下の方法もまた、ここに記載されているように使用される。表面活性ポリペプチドの合成バッチ、例えば、ＫＬ４ペプチドのバッチに有用な化学物質および試薬としては、以下のものが挙げられる：
ｔ−Ｄｏｃ−Ｌ−リジン（Ｃ１−Ｚ）ＰＡＭ−樹脂（ｔ−Ｂｃｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）；
ａ−Ｂｏｃ−ε−（２−クロロ−ＣＢＺ）−Ｌ−リジン（Ｂａｃｈｅｍ、カ  リフォルニア州サンディエゴ）；
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−Ｈ２Ｏ（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ；Ｂａｃｈｅｍ）；
ジクロロメタン（ＤＣＭ；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州ギッブスタウン、またはＦｉｓｈｅｒ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）；
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ）；
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；Ａｌｄｒｉｃｈ、ミシガン州アルドリッチ）；
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州ギッブスタウン）；
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ａｌｄｒｉｃｈ）；
Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；Ｂｕｒｄｉｃｋ  Ｊａｃｋｓｏｎ、ミシガン州ムスケゴン）；
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ；Ａｌｄｒｉｃｈ）；
１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；Ａｌｄｒｉｃｈ）；
無水酢酸（Ａｃ２Ｏ：Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、ミズーリ州セントルイス）；
フッ化水素（ＨＦ；Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ペンシルバニア州、アレン  タウン）。
【０２６４】
ＫＬ４ペプチドの１つの合成手段は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用いてカップラー２９６ペプチドシンセサイザ（Ｖｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アリゾナ州ツーソン）上で実施される。「典型的」合成は、以下に記載する。鎖延長は、下表２に記載されている方法により１００ｇのリジンＰＡＭ−樹脂上で実施された。ステップ７、１０および１１以外の全ステップは、自動的になされた。
【０２６５】
【表２】
2011001383.tif 000028
【０２６６】
ペプチド−樹脂が脱保護され、適切なアミノ酸誘導体が作製された。適切なアミノ酸を１リットルのＮＭＰに溶解した。透明な溶液が得られた後、ＨＯＢｔを溶液に加えた。ＨＯＢｔを溶解したら、ＤＣＣを溶液に加えた。この溶液を室温で１時間攪拌を続けた。この攪拌１時間の間、副産物のジシクロヘキシル尿素（白色沈殿）が形成された。この副産物を、Ｗｈａｔｍａｎの＃１ろ紙を用いてブフナーロートを通してろ過した。次にろ液を手動で、ステップ番号７でのＶｅｇａ２９６反応容器の内容物に加えた。
【０２６７】
次にシンセサイザをステップ番号９の完了後中止させるようにプログラム化した。ペプチド樹脂の一定分割量をＳａｒｉｎらの定量的ニンヒドリン試験に供した。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  ｕｓｅｒ  ｍａｎｕａｌ，添付資料Ａ）。カップリング効率は、全合成を通して良好であった。未反応のペプチド樹脂を、ロイシン１２（サイクル９）およびロイシン５（サイクル１６）の後アセチル化した。各アセチル化後、ペプチド樹脂をジクロロメタンで洗浄した（表２、ステップ１１を参照）。
【０２６８】
合成の終わりに、完了ペプチド樹脂をプログラムのステップ１〜３を完了することにより脱保護（Ｂｏｃ基の除去）した（表２参照）。次いで脱保護ペプチド樹脂を十分な量の無水エタノールで洗浄し、Ｐ２Ｏ５により真空乾燥した。脱保護ペプチド樹脂の乾燥重量は２５６．４８グラムであった。このバッチは、０．６４ミリモル／グラムの置換で１００ｇのｔ−Ｄｏｃ−Ｌ−リジン（Ｃ１−Ｚ）ＯＣＨ２ＰＡＭ−樹脂によって開始したことから、充填量は６４ミリモルに相当した。最初の１００グラムの樹脂を差し引くと、この重量は１５６．４８グラムであった。新生保護ペプチドの分子量（樹脂上に固定されたＣ−末端リジンを除いて）は、３０１１．６０４ｇ／モルであった。
【０２６９】
ＨＰ開裂。ペプチド樹脂の２５６．４８グラムロットを、３つの大きな一定分割量でフッ化水素（ＨＦ）で処理した。Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州ベルモント）からのタイプＶ  ＨＦ−反応装置を、液体フッ化水素を用いてペプチド樹脂の開裂のために用いた。使用前にアニソールを蒸留した。ＨＦは、何ら処理することなく、用いた。ドライアイス、イソプロパノールおよび液体窒素を冷却目的で必要とする。
【０２７０】
最初のＨＦに関して、略８８ｇのＫＬ４ペプチド樹脂を、磁気攪拌バー付の１リットル反応容器に入れた。２５ｍｌの蒸留アニソールをペプチド樹脂に加えた。全システムを組立てリーク試験が終わったら、全レベルが約３００ｍｌに達するまでＨＦを反応容器に凝縮させた。樹脂からペプチドの開裂は、−４℃で１時間進行させた。ＨＦの部分的除去は、１〜２時間水アスピレータによりなされた。１〜２時間後、ＨＦの残りを高度真空（機械的真空ポンプ）により１〜２時間除去した。反応容器の温度は、ＨＦ除去工程を通して−４℃に維持した。
【０２７１】
次にＨＦ装置を大気圧と平衡させて、油状スラッジが反応容器の底部に見られた。冷無水エーテル（７００ｍｌ、予め−２０℃に冷却）を反応容器の内容物に加えた。樹脂凝集塊をガラスロッドを用いてエーテルで粉砕した。樹脂を沈降させた後エーテルをデカントした。次に樹脂を５００ｍｌの室温のエーテルで洗浄するために約５分間攪拌した。樹脂を沈降させた後エーテルをデカントした。樹脂が易流動性になるまで洗浄した（全部で４〜５回洗浄）。この樹脂を換気フードに残し、一晩乾燥した。
【０２７２】
生じた乾燥ＨＦ処理樹脂を次に秤量し、フリーザーに保存した。１．０２１ｇの乾燥ＨＦ処理樹脂を取り出し、５０ｍｌの５０％酢酸／水で抽出するために３０分間攪拌した。樹脂をあら目焼結ガラスロートを通してろ過し、ろ液を凍結乾燥ジャーに採取した。ろ液を略２００ｍｌの水で希釈し、シェル凍結して凍結乾燥器に置いた。１グラムの抽出されたＨＦ処理樹脂は、５６９ｍｇの粗製ペプチドを生じた。下表（表３）は、残りのＫＬ４ペプチド樹脂の大スケールのＨＦ処理を要約している。全てのＨＦ処理樹脂をフリーザーに保存した。
【０２７３】
【表３】
2011001383.tif 000029
【０２７４】
精製。前記ペプチドは、Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒ法Ｂ分取ＨＰＬＣ（Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒ社、コネチカット州ミルフォード）を用いて精製した。このユニットは、Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２０４分光光度計およびＫｉｐｐおよびＺｏｎｅｎデュアルチャネルレコーダに接続した。この分取用ＨＰＬＣは、１５〜２０ミクロン、および３００ＡポアサイズのＶｙｄａｃ  Ｃ４支持体（Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州ヘスペリア）が詰められた放射状圧縮１０×６０ｃｍカートリッジ、を含有するＷａｔｅｒｓ  ＫＩＬ２５０  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）と接続した。溶媒「Ａ」は、水中０．１％ＨＯＡｃからなり、溶媒「Ｂ」は、アセトニトリル中０．１％ＨＯＡｃからなった。流速は、４００ｍｌ／分に設定し、カートリッジは、１５０〜２００ｐｓｉに圧縮し、分取用ＨＰＬＣシステムバック圧は、５５０〜６００ｐｓｉであった。
【０２７５】
最初のＤｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒ操作に関して、２０ｇのＨＦ＃１からのＨＦ処理樹脂を、５００ｍｌの氷酢酸中５分間抽出した。水（５００ｍｌ）を樹脂／酢酸混合物に加えた。この５０％酢酸／水溶液をさらに２５分間攪拌した。樹脂をあら目焼結ガラスロートを通してろ過した。ペプチド含有ろ液を保存して、Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒ上に充填した。用いられたＨＰＬＣ勾配は、４５分の１〜４０％「Ｂ」であり、次いで７分間、一定組成で保持した。この時点で、パーセント「Ｂ」を１分当たり１％増加し、４４％の最終パーセントに増加した（示さず）。
【０２７６】
フラクションを手動で集めて、ＨＰＬＣにより分析した。≧９５％の純度に合致する全てのフラクションを一緒にプールし、大きなガラス容器に保存した。引き続きこの物質を「ＢＰＳ＃１」と称した。９５％以上の純度に合致しないが、所望の成分を有した全てのフラクションを集めて後でリサイクルした。少なくとも１０回の追加の分取ＨＰＬＣ操作を、Ｄｏｒｒ−Ｏｌｉｖｅｒユニット上で実施した（データは示さず）。
【０２７７】
逆浸透、凍結乾燥。ＢＰＳ＃１の全量は、略６０リットルであった。逆浸透は、最終２リットル容量にペプチド溶液を濃縮するために用いられた。ペプチドを保持するＲ７４Ａ膜付のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｏｄｅｌ  ６０１５  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｏｓｍｏｓｉｓ  Ｕｎｉｔを用いた。生じた２リットルのＢＰＳ＃１を、２枚のＷｈａｔｍａｎの＃１ろ紙を用いてブフナーロートを通してろ過し、凍結乾燥用ジャーほぼ１１台分に分けて、等容量の水で希釈した。前記凍結乾燥用ジャーをシェル凍結して凍結乾燥した。この手順の最後の乾燥ＫＬ４ペプチドの全重量は、４０．２５ｇであった。
【０２７８】
再凍結乾燥。異なる凍結乾燥条件（例えば、ペプチド濃度、凍結乾燥される溶媒組成、凍結乾燥ステップの長さ、シェル温度など）は、異なる溶解度特性を有する乾燥製剤を生じ得ることが判明した。乾燥ＫＬ４ペプチドが１ｍｇ／ｍｌでクロロホルム：メタノール（１：１）溶液に溶解性であり、１０ｍｇ／ｍｌで≧９０％溶解性であることが望ましい。これらの評価基準が、上記の凍結乾燥の最終段階で合致しない場合、このペプチドは再凍結乾燥し得る。
【０２７９】
典型的な再凍結乾燥を以下に記載する。略５ｇのペプチドを、ガラスフラスコ中で攪拌している２リットルのアセトニトリルに徐々に加える。略１分後、３リットルのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、次いで５０ｍｌの酢酸（酢酸の最終濃度＝１％）を加える。これを３７℃で３日間攪拌して、ブフナーロート中のＷｈａｔｍａｎの＃１ろ紙を通してろ過し、凍結乾燥用ジャーに入れる。次いでドライアイスとイソプロピルアルコールとを用いてシェル凍結して凍結乾燥器に置いた。凍結乾燥時間は、３日から７日に変えることができる。次に最終乾燥生成物を秤量し、包装し、溶解度分析および化学分析用に一定分割量を取る。
【０２８０】
（実施例２：モデル表面活性剤混合物の調製）
材料。１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、およびパルミチン酸（ＰＡ）を、Ａｖａｎｙｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバマ州バーミンガム）から入手した。アミノ酸配列
【０２８１】
【化２５】
2011001383.tif 000030
【０２８２】
（配列番号１）を有するＫＬ４ポリペプチドを、本明細書中に記載されたように合成するか、またはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ペンシルバニア州ドイルスタウン）から入手した。使用した全ての塩類、緩衝剤および有機溶媒類は、特級を入手できた。
【０２８３】
表面活性剤組成物のストック溶液を、以下の式：
ＰＬＴ＝総リン脂質＝ＤＰＰＣ＋ＰＯＰＧ
３ＤＰＰＣ：１ＰＯＰＧ
１ＰＬＴ：０．１５ＰＡ：０．０２７ＫＬ４ペプチド
に基づく組成物と共に４０ｍｇ／ｍｌの総リン脂質を含有するように製剤化した。
【０２８４】
前述式を用いて、可変量のパルミチン酸（ＰＡ）および１ｍＬ当たり２．５から３０ｍｇの総リン脂質中のＫＬ４ペプチドを含んだ表面活性剤組成物を作製した（表４）。
【０２８５】
【表４】
2011001383.tif 000031
【０２８６】
モデル表面活性剤混合物は、以下のとおり作製された。ＫＬ４ペプチド（９ｍｇ）、ＤＰＰＣ（２２５ｍｇ）、ＰＯＰＧ（７５ｍｇ）およびＰＡ（４５ｍｇ）を２．５ミリリットル（ｍｌ）の９５％エタノール中４５℃で溶解した。次にこの溶液を、迅速に渦巻かせながら７．５ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏに加え、２ｍｌの５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．２を加えた。生じた乳白色の懸濁液を３７℃で１５分間攪拌してから、存在するエタノールを、１００容量の１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスアセテートｐＨ７．２緩衝液に対し３７℃で透析（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ２；１３，０００分子量をカットオフ）により除去した。透析は、透析溶液を２回変えて４８時間続けた。
【０２８７】
さらに前記組成物は、最終生成物の１ｍＬ当たり以下の組成を有する緩衝系／懸濁液をさらに含み得る（表５）。
【０２８８】
表５
成分                       １ｍＬ当たりの量                
トロメタミン、ＵＳＰ        ２．４２ｍｇ
氷酢酸、ＵＳＰ              トロメタミン緩衝液をｐＨ７．７に
またはＮａＯＨ、ＮＦ      調整するのに十分な量
ＮａＣｌ、ＵＳＰ            ７．６ｍｇ
注射用水、ＵＳＰ            １．０ｍＬまで十分量
このサム（Ｔｈａｍ）緩衝液系は、本質的に以下のとおり調製された。酢酸（ＡＲ  Ｓｅｌｅｃｔ、ＡＣＳ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、ケンタッキー州パリス）を用いてｐＨ７．２±０．５に調整されたｐＨを有する０．３７ｍｌのサム（Ｔｈａｍ）溶液（トロメタミン注射液、ＮＤＣ００７４−１５９３−０４、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州ノースシカゴ）を、０．３３ｍｌ生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と０．３０ｍｌ水（注射液用滅菌水、ＵＳＰ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とに混合した。この溶液は滅菌ろ過した。
【０２８９】
（実施例３：ヒト好中球エラスターゼに関する比色アッセイ）
次の配列ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ（配列番号２４）を有するペプチドは、エラステターゼ基質として使用された。配列番号２４のペプチド基質の１００μＬの０．４２５ｍＭ溶液を一連のミクロ滴定プレートウェルに入れた。種々の量のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）をミクロ滴定プレートウェルに入れた。４１０ｎＭ（ＯＤ４１０）での光学密度を用いてエラスターゼ活性を測定し、観測された光学密度を、検量線を作り出すために加えたＨＮＥ量に対してプロットした。
【０２９０】
（実施例４：エラスターゼ阻害剤によるヒト好中球エラスターゼの阻害）
セリンエラスターゼ阻害剤がヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を阻害する能力を試験するために、標準量の０．１２５μｇＨＮＥを、増加する量のセリンエラスターゼ阻害剤と混合してから実施例３に記載されたエラスターゼ基質を添加した。図５Ａにプロットされる阻害曲線は、阻害剤対数量と生じたＯＤ４１０との間の直線応答を示している。
【０２９１】
（実施例５：ＡＲＤＳ患者からのＢＡＬ液中のエラスターゼ活性）
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）のヒトから回収した。エラスターゼ活性に関する比色アッセイを、ＢＡＬ液の種々の量を用いて実施した。サンプルに添加されたＢＡＬ量とＯＤ４１０との間の用量−応答曲線は、図５Ｂにプロットされている。
【０２９２】
他のＡＲＤＳ患者からの洗浄液は、エラスターゼ活性の変量を有した。
【０２９３】
（実施例６：ウサギＢＡＬ液中のエラスターゼ活性）
６匹のウサギを３ｍｇ抗ＢＳＡ／ｋｇ（ウサギ６０９８および６０９９）で処理するか、または５ｍｇ抗ＢＳＡ／ｋｇ（ウサギ６１００〜６１０３）を気管内滴下し、呼吸窮迫を誘導するために１０ｍｇのＢＳＡを静脈内投与（６０９８〜６１０１）した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を、処理６時間後にこれらウサギの肺から取り、エラスターゼ活性の比色アッセイを、これらのＢＡＬ液に対して実施した。エラスターゼ活性を、４１０ｎｍにおける対応するＯＤを与えるＨＮＥの濃度として表される。
【０２９４】
さらに、同じアッセイを、ＢＡＬ液に対して１００μｇ／ｍｌのセリンエラスターゼ阻害剤の添加後に実施した。本試験に用いられたセリンエラスターゼ阻害剤は、特異的にＨＮＥを阻害する。図６Ａは、これらの成績をグラフとして例示している。全ての場合、エラスターゼ活性を阻害し、測定された蛋白分解活性がＨＮＥによるものであることを確認した。
【０２９５】
（実施例７：ウサギＢＡＬ液中のエラスターゼ阻害剤の証明）
６匹のウサギは、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）と抗ＢＳＡとを気管内に与えて呼吸窮迫を誘導した。動物６３１７および６３１８に３時間目に１０ｍｇ／ｋｇのＢＳＡをさらに与えた。ＢＡＬ液は、最初の抗ＢＳＡ投与後３時間目にウサギ６３１５および６３１６から取り、６時間目にウサギ６３１３、６３１４、６３１７および６３１８から取った。ＢＡＬ液を、単独（交差平行線）または１μｇ／ｍｌ  ＨＮＥの添加後（中空）試験した。これらの結果は、グラフとして図６Ｂに表している。有意の遊離エラスターゼが動物６３１７に存在し；他の全ては、エラスターゼ阻害剤の存在を示した。
【０２９６】
（実施例８：モデル表面活性剤混合物およびセリンエラスターゼ阻害剤は、炎症時肺のＢＡＬ液中に検出された蛋白量を減じる）
材料：
ＬＰＳ：Ｍｉｎｎ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）。５ｍｇバイアル。動物を、８ｍｌ／ｋｇ中１２０μｇ／ｋｇを残す定量的洗浄液により処理した。
【０２９７】
ＰＭＡ：（Ｓｉｇｍａ）５μｇ／ｍｌに対して生理食塩水またはモデル表面活性剤混合物で希釈した。洗浄のために２０ｍｌ／ｋｇ／ウサギを用い、動物に用量の２０％を残した。
【０２９８】
モデル表面活性剤混合物：（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｓ）１０ｍｇ／ｍｌ。洗浄のために２０ｍｌ／ｋｇ／ウサギを用い、動物に用量の２０％を残す。
【０２９９】
セリンエラスターゼ阻害剤：Ｅｌａｆｉｎ（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）３ｍｇ／ｍｌストック、アジドを除去するために生理食塩水に対し透析：１．３ｍｌ／ｋｇ  Ｅｌａｆｉｎを１．５時間目に静脈内投与し、０．３３ｍｌ／ｋｇを３時間目に気管内投与し（×２側面）、および０．６６ｍｌ／ｋｇを４．５時間目に静脈内投与した。
【０３００】
１２５Ｉ−ＢＳＡ：（ＮＥＮ）２００μｇ／ｍｌＢＳＡ／生理食塩水中で、２０μＣｉ／ｍｌに希釈した。殺処理３０分前に０．４ｍｌ／ｋｇを静脈内に使用した。
【０３０１】
ウサギ：１０匹のＮＺＷウサギ、雌雄、２．０〜２．５Ｋｇ。
【０３０２】
手順：
２０匹のＮＺＷウサギを、各４匹の動物による５つの処理群に分けた。肺損傷を、２つの生理食塩中のＬＰＳ洗浄液および洗浄液により投与３時間目に１つのＰＭＡ処理により誘導する。セリンエラスターゼ阻害剤とモデル表面活性剤混合物とを別々に、また一緒に試験をして、これらの因子が炎症の症状を減じ得る程度を確認した。異なる群により受けた処理は以下のとおりである：
１群：動物は、生理食塩中の２つのＬＰＳ洗浄液および洗浄液により投与３時間目に１つのＰＭＡ処理を受けた。１２５Ｉ−ＢＳＡを５．５時間目に静脈内に投与され、６時間目に動物を殺処理した。
【０３０３】
２群：動物は、生理食塩中の２つのＬＰＳ洗浄液、洗浄液により投与３時間目に１つのＰＭＡおよびモデル表面活性剤混合物の治療を受けた。１２５Ｉ−ＢＳＡを５．５時間目に静脈内に投与され、６時間目に動物を殺処理した。
【０３０４】
３群：動物は、生理食塩中の２つのＬＰＳ洗浄液および洗浄液により投与３時間目に１つのＰＭＡ処理を受けた。セリンエラスターゼ阻害剤の３回の投与は、１．５時間目、３．０時間目および４．５時間目に行われ、１２５Ｉ−ＢＳＡを５．５時間目に静脈内に投与された。６時間目に動物を殺処理した。
【０３０５】
４群：動物は、生理食塩中の２つのＬＰＳ洗浄液および洗浄液により投与３時間目に１つのＰＭＡおよびモデル表面活性剤混合物の治療を受けた。セリンエラスターゼ阻害剤の３回の投与は、１．５時間目、３．０時間目および４．５時間目に行われ、１２５Ｉ−ＢＳＡを５．５時間目に動物の静脈内に投与された。６時間目に動物を殺処理した。
【０３０６】
５群：正常な動物を対照として用いた。この動物を、１２５Ｉ−ＢＳＡ投与を受けた３０分後に殺処理した。
【０３０７】
全ての動物を、低換気圧で室内空気を受ける換気装置で維持した。洗浄直後、動物が、約８０以上のＳａＯ２を維持するためのより高い圧および／または酸素を必要とする場合、より高い呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）および／または酸素療法を時間ごとに実施した。
【０３０８】
動物を殺処理した後、肺を切除し、左主気管支を結んだ。右側下葉を、各回１０ｍｌの生理食塩水で３回洗浄した。３回の洗浄液（最終洗浄液）を各動物についてプールし、５μｌの２０ｍＭ  ＢＨＴを各々プールした洗浄液に加えて酸化を防止した。最終洗浄液プール中の細胞を１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去した。次に表面活性剤ペレットおよび蛋白質に富んだ上澄み液を４０，０００ｇで１５分間の遠心分離により調製した。左肺区域をホルマリン中に保存し、その他は冷凍した。蛋白含量および最終洗浄液中の赤血球（ＲＢＣ）を分析した。
【０３０９】
最終洗浄液中の蛋白含量は、血漿蛋白質が肺胞空間を通ってリークできる基底膜マトリックスに対する損傷レベルを示す。最終洗浄液中の蛋白量が増加すると、肺損傷が増えていることが見られる。各治療群で最終洗浄液中で見られた蛋白量は、図７Ａにグラフとして表している。この結果は、ＬＰＳおよびＰＭＡ損傷から生じた蛋白量（略２．５ｍｇ／ｍｌ）は、モデル表面活性剤混合物を与えた群では減少し、モデル表面活性剤混合物およびエラスターゼ阻害剤を投与された群ではさらに減少したことを示している。蛋白レベルの減少を示すエラスターゼ阻害剤単独を投与した３群の不成功は、主として群の中の１匹の動物で得られた異常な高い値のためと考えられる（説明図を参照）。この動物を除外すると、３群の平均値は、１．７２ｍｇ／ｍｌとなり、モデル表面活性剤混合物単独で治療した２群で得られた値と略等しい。エラーバーはＳＥＭを示す。
【０３１０】
（実施例９：炎症時肺のＢＡＬ液に存在する基底膜蛋白断片）
ウサギにおけるＬＰＳおよびＰＭＡ損傷は、実施例８に示され、蛋白質の遊離および蛋白分解断片を生じる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分離後、ウェスタンブロット分析を、試験ウサギの最終洗浄液に存在する蛋白質に対して実施した。基底膜マトリックス蛋白質に対してモルモットで産生した抗体を用いて、洗浄液中の基底膜蛋白質の存在を可視化して確認した。
【０３１１】
この結果を図７Ｂに示す。肺基底膜マトリックスの成分は、左パネルに示している。ＬＰＳおよびＰＭＡ単独で治療（１群）、またはモデル表面活性剤混合物の添加により治療（２群）、またはエラスターゼ阻害剤で治療（３群）、またはモデル表面活性剤混合物およびエラスターゼ阻害剤の双方の治療（４群）をされた代表的ウサギのＢＡＬ液中の蛋白質および蛋白質断片を、２〜４群パネルに示す。正常で未損傷のウサギ洗浄液を、５群パネルに示す。未損傷の基底膜マトリックスおよび５群パネルに存在しない低分子量バンド（＜１０，０００分子量）は、基底膜の断片を表す。１〜４群の７０，０００分子量に存在する大きなバンドは、使用される抗血清中の不純物として存在するアルブミンである。９０，０００分子量以上のバンドは、基底膜に特異的で正常なウサギ血漿に存在しない（データは示さず）。
【０３１２】
（実施例１０：モデル表面活性剤混合物およびセリンエラスターゼ阻害剤は、炎症時の肺ＢＡＬ液中の赤血球数を減少させる）
最終洗浄液に現れる出血または赤血球（ＲＢＣｓ）の量は、動物における損傷の他の指標である。洗浄液中の増加蛋白質の存在は、基底膜マトリックスに対する損傷の程度を示すことができるが、ＲＢＣｓの存在は、血球細胞全体がマトリックスに生じた孔を通過できる、さらに大きな程度の損傷を示している。
【０３１３】
ＲＢＣ数の計測は実施例８で得られた最終洗浄液について行われ、各群２匹の動物で得られた結果の平均を図７Ｃにプロットした。ＲＢＣ数の僅かな減少はモデル表面活性剤混合物が存在する場合に、損傷の幾らかの改善が見られたことを示唆しているが、セリンエラスターゼ阻害剤が存在する場合は損傷のより大きな減少が見られた。モデル表面活性剤混合物とセリンエラスターゼ阻害剤の双方の添加により、最終洗浄液中に存在するＲＢＣｓの数を測定した場合、損傷の有意な減少が生じた。
【０３１４】
（実施例１１：ヒト好中球エラスターゼの阻害）
０．０２μｇのヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を、２ｍｇ／ｍｌのモデル表面活性剤混合物、１００μｇ／ｍｌのセリンエラスターゼ阻害剤またはモデル表面活性剤混合物とセリンエラスターゼ阻害剤の双方と共に温置した。残っているＨＮＥ活性を、上記の比色アッセイを用いてアッセイした。その結果を図８にグラフとして例示している。
【０３１５】
セリンエラスターゼ阻害剤を添加した場合は、モデル表面活性剤混合物の追加存在があっても、なくても著しい阻害が見られた。モデル表面活性剤混合物は、エラスターゼを阻害するセリンエラスターゼ阻害剤の能力を妨害しないし、またそれ自体で直接エラスターゼを阻害しないことを、このデータは示している。
【０３１６】
（実施例１２：ＢＡＬ液中エラスターゼ阻害剤によるＨＮＥの阻害）
上記実施例８から１０に示されたデータは、ＬＰＳおよびＰＭＡによる損傷後６時間でウサギ肺に生じる基底膜マトリックス損傷は、セリンエラスターゼ阻害剤および／またはモデル表面活性剤混合物によりインビボで防止し得ることを示唆した。最終洗浄液（実施例８の記載どおりに調製）中のエラスターゼ阻害剤（単数または複数）（または残存している活性）の存在を調べた。
【０３１７】
０．０２μｇのヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を、各実験群（１群〜５群）の代表のウサギ１匹の最終洗浄液５０μｌと共に温置した。ＨＮＥ活性を、実施例１に記載したとおり比色アッセイを用いてアッセイする。そのアッセイ結果を図９にグラフとして例示している。
【０３１８】
ＢＡＬ液によるＨＮＥ活性の顕著な阻害が２群、３群または４群の動物で見られた。静脈内および気管内経路の双方により公知のエラスターゼ阻害剤を投与された３群および４群の洗浄液で見られたＨＮＥエラスターゼ阻害は極めて顕著であった。モデル表面活性剤混合物群（２群）に見られたエラスターゼ阻害はＳＬＰＩまたはアルファ１プロテアーゼ阻害剤またはそれらのある組合わせなど、ウサギ内の内因性エラスターゼ阻害剤によるものであったと考えられる。正常なウサギ（５群）およびＬＰＳ／ＰＭＡ陽性の損傷動物（１群）は、この実験において、それらの最終洗浄液にエラスターゼ阻害剤の存在を示さなかった。しかし、ウサギ＃５５４１（１群）は、最終ＢＡＬ液中に遊離エラスターゼの存在を示した。正常ウサギのＢＡＬ（５群）には何も検出されなかった。
【０３１９】
（実施例１３：洗浄液中ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の検出）
材料と方法
ＢＳＡに対して向けられた部分的精製抗体（抗ＢＳＡ抗体）の気管内投与により開始された肺損傷を受けているウサギから最終洗浄液を採取した。洗浄液中のＰＬＡ２活性を検出するための基質として、パルミトイル、オレオイルホスホチジルグリセロール（ＰＯＰＧ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ）を洗浄液中に添加した。ＰＯＰＧ基質の添加前に、前記混合物を１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌおよび２５ｍＭ  トリス−Ｃｌ、ｐＨ８．５の最終濃度に調整した。この混合物を３７℃で温置した。経時的に一定分割量を取り、ＰＯＰＧ基質から遊離したオレイン酸の量を高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により測定した。遊離したオレイン酸量は、Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムからの溶出時間４．５９分でのピーク高さを２０７ｎｍにおける吸光度で測定して定量した。
【０３２０】
結果
図１０は、ウサギ６０１５の洗浄液によるＰＯＰＧからのオレイン酸遊離速度を図示している。図示されているように、オレイン酸は使用条件下で約４０分間、速やかに遊離する。ＰＯＰＧからのこのようなオレイン酸遊離はＰＬＡ２が洗浄液中に存在していることを示した。
【０３２１】
（実施例１４：洗浄液ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性は、抗ＢＳＡの気管内投与量と関連する）
材料と方法
ＢＳＡを、６匹のウサギに静脈内投与した。ウサギを１６ｍｌ／ｋｇ生理食塩水で１度洗浄し、次いで以下のように抗ＢＳＡ抗体量を変えて気管内滴下を実施した：
ウサギ６０１１および６０１２−２．５ｍｇ／ｋｇ抗ＢＳＡ抗体
ウサギ６０１３および６０１４−５．０ｍｇ／ｋｇ抗ＢＳＡ抗体
ウサギ６０１５および６０１６−１２．５ｍｇ／ｋｇ抗ＢＳＡ抗体
最終洗浄液を集め、前の実施例に記載された最終洗浄液で生じたオレイン酸の検出によりＰＬＡ２活性に関して評価した。
【０３２２】
インビボＰＬＡ２活性はまた、集めた最終洗浄液中の遊離脂肪酸（オレイン酸以外）の内因性出現を観測することにより検出した。特にリノレン酸およびリノール酸は、オレイン酸と容易に識別される炭素−炭素二重結合を３セットおよび２セット有し、ＨＰＬＣにより定量化された。
【０３２３】
結果
図１１は、ウサギ６０１１、６０１２、６０１３、６０１４、６０１５および６０１６から得られた洗浄液と温置３０分後ＰＯＰＧからのオレイン酸の遊離を示している。オレイン酸の遊離量が示されるように、ＰＬＡ２活性度は、動物の気管内に投与された抗ＢＳＡ抗体製剤量に直接比例している。言い換えれば、２．５ｍｇ／ｋｇだけの抗ＢＳＡ抗体を投与されたウサギは、５．０または１２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＢＳＡ抗体を投与されたウサギよりもＰＬＡ２活性のレベルが低かった。したがって、ＰＬＡ２活性度は、肺損傷のレベルが増えると増加する。
【０３２４】
図１２は、リン脂質が、損傷の肺組織内でインビボ分解することを例示している。特に、図１２は、ウサギ６０１１、６０１２、６０１３、６０１４、６０１５および６０１６から得られた最終洗浄液中に見られる内因性組織からのリノレン酸およびリノール酸の遊離を示している。リノレン酸およびリノール酸の遊離量が示されるように、ＰＬＡ２活性度は、再び動物の気管内に投与された抗ＢＳＡ抗体製剤量に直接比例している。
【０３２５】
（実施例１５：洗浄液中のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性の阻害）
材料と方法
ＢＳＡと抗ＢＳＡ抗体とをウサギ６０１５に投与し、洗浄液を前の実施例に記載されたとおり、ウサギ６０１５から得た。化合物３−［３−（２−オキソエチル）−２エチル−１−（フェニルメチル）−１Ｈ−インドール−５−イル］オキシ］プロピルリン酸（ＬＹ３１１７２７、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社、イリノイ州インディアナポリス）を、ＰＬＡ２阻害剤として用いて、洗浄液中の脂肪酸の出現が、ＰＬＡ２活性のためで、肺の炎症に有効な治療開発を促進することをさらに確認した。ＬＹ３１１７２７阻害剤がＰＬＡ２活性を調節する能力を、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２およびトリス緩衝液、ｐＨ８．５の存在下で６０１５ウサギからの一定の洗浄液量に対して前記阻害剤量を増やしながら添加して試験した。この混合物を３７℃で１５分間温置してからＰＯＰＧ基質を加えた。ＰＬＡ２活性を、前の実施例で記載したとおり、溶出オレイン酸のＨＰＬＣピークの高さを用いて測定した。
【０３２６】
結果
図１３は、ウサギ６０１５から得られた洗浄液と温置３０分後ＰＯＰＧからのオレイン酸の遊離が、ＬＹ３１１７２７阻害剤の量に間接的に比例していることを示している。言い換えれば、前記阻害剤の添加量が増すとＰＬＡ２活性量が減少することが見られた。
【０３２７】
図１４は、阻害剤濃度の対数の関数としてＰＬＡ２活性をグラフとして例示している。示されるように、阻害剤濃度が増加するとＰＬＡ２活性が有意に落下する。
【０３２８】
（実施例１６：抗酸化剤は炎症時の肺の損傷を防ぐ）
材料と方法
用いられた方法は、前述の実施例において用いられたものと同様であった。生理食塩水中５μｇ／ｍｌの細菌ＬＰＳを２０ｍｌ／ｋｇの投与量を用いて気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって、ウサギ（１．０〜１．５ｋｇ）の肺損傷を誘導した。ＬＰＳ投与２．５時間後に、前記ウサギは、気管支肺胞洗浄により２０ｍｌ／ｋｇのフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を投与された。表６および７に示すように、ウサギを各群２匹から６匹の４つの治療群に分けた。ＬＰＳ投与２．５時間後、１群のウサギは気管内に抗酸化剤カタラーゼを投与した。２群のウサギは、気管内および静脈内にカタラーゼを投与した。３群のウサギは、気管内および静脈内にカタラーゼを投与し、ならびに５ｍｇ／ｍｌのモデル表面活性剤混合物（ＫＬ４）を気管内投与した。４群のウサギはさらなる治療を受けなかった。（対照）。前記ウサギを、ＰＩＰＩ  ＰＥＥＰ  ３ｃｍＨ２Ｏ圧で換気した。この試験は６時間で終了した。表６および７の値は、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【０３２９】
結果
結果は表６および７に示している。表面活性剤プラスカタラーゼを投与された動物数が非常に少ないため、決定的な結論は下せないが、幾つかの因子により示されるようにカタラーゼの投与により、肺の機能は著しく改善した。
【０３３０】
【表６】
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【０３３１】
【表７】
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【０３３２】
＊０〜４の評価段階にて
表６および７のデータに示されるように、抗酸化剤カタラーゼによる治療は、炎症の破壊的作用から肺組織を防御する。特にカタラーゼの投与は、一般に血中ガスを改善した（一般に、非治療動物よりも治療動物の方がＰａＯ２が高く、またＰａＣＯ２が低い）。さらに、治療動物の最終洗浄液中のアルブミン量および赤血球細胞量および湿った肺から乾燥肺の重量は、非治療動物で観察されたものよりも少なかった。最後に、治療動物の肉眼的病理および組織学的病理学は、概して非治療動物よりも良好であった。したがって、肺組織炎症時の抗酸化剤の使用は、炎症に関連する肺組織に対して傷害を制限するか、または減少し得る。
【０３３３】
（参考文献）
【０３３４】
【表８】
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公表文献および特許の全ては、参照として個々に組み込まれているように、参照として本明細書に援用されている。
【０３３５】
特定の実施形態および実施例を含む前述の明細書は、本発明の例示的なものを意図しており、限定することを意図していない。多くの変化および修飾は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく達成できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図４Ｃ】
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【図７Ｃ】
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【図１０】
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【図１２】
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【配列表】
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