(57)【要約】【課題】新たな原料からのエタノール生産を可能にする。グルコン酸又はその塩もしくはイオンを含有する産業廃液などを有効利用する。さらに具体的には、グルコン酸又はその塩もしくはイオンを含有する原料を用いてエタノールを製造する方法を提供する。【解決手段】グルコン酸又はグルコン酸塩もしくはグルコン酸イオンを含む原料を、エタノール生産性大腸菌と接触させることにより、原料中のグルコン酸又はグルコン酸塩もしくはグルコン酸イオンをエタノールに転換する工程を含むことを特徴とする、エタノール製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコン酸又はグルコン酸塩もしくはグルコン酸イオンを含む原料を、エタノール生産性大腸菌と接触させることにより、原料中のグルコン酸又はグルコン酸塩もしくはグルコン酸イオンをエタノールに転換する工程を含むことを特徴とする、エタノール製造方法。
【請求項２】
前記エタノール生産性大腸菌が、大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ−５５１２４）である、請求項１記載のエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコン酸などからのエタノール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコン酸（（2R,3S,4R,5R）-2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキサン酸）は、アルドン酸の一種であり、グルコースを酸化（発酵）することによって得られる安全性の高い有機酸（カルボン酸）である。グルコン酸又はその塩は、様々な産業分野において使用されている。グルコン酸又はその塩は、食品添加物であり、食品産業においては酸味料又はｐＨ調整剤として利用される。また、工業的には、金属塩沈殿の除去や、金属の洗浄などにおいて、金属表面処理剤、有機酸洗浄剤、コンクリートの硬化遅延剤などとしても使用される。さらに、アミド類、エステル類などの誘導体の原料としても使用されている。
【０００３】
したがって、広範な産業分野において、グルコン酸又はその塩を含有する廃液が発生している。このような廃液は、主に活性汚泥法、オゾン分解法、あるいはメタン発酵法などの方法で処理されている。
【０００４】
しかし、廃液中のグルコン酸は、メタン発酵法ではメタンに変換されて回収され、気体燃料として利用されることができるが、より主流である活性汚泥法、オゾン分解法による処理では、単に酸化分解されて炭酸ガスと水に分解されるだけで、有効に利用されることなく廃棄されている。そこで、メタン発酵以外の方法によっても、廃液中のグルコン酸を有用な物質に変換して有効利用することが望まれる。
【０００５】
エタノールは、工業的に生産されるほか、近年では、再生可能なエネルギーとして、いわゆる「カーボンニュートラル」な原料である糖質を原料としたバイオエタノールに注目が集まっている。従来の最も一般的なバイオエタノール製造法はS． cerevisiaeを使ったエタノール発酵を利用する。S． cerevisiaeは、グルコースやフルクトースといったＣ６糖（ヘキソース）の発酵能は高いものの、Ｃ５糖（ペントース）の発酵能がほとんど欠落している。そのため、生産効率の点から有利な原料として、サトウキビ、トウモロコシなどの食糧資源がエタノール生産に使用されてきた。しかし、世界的な食糧不足の問題から、近年では可食部分でない原料からのエタノール生産が求められている。
【０００６】
フロリダ大学のIngramと太田らは、ヘキソースかペントースかを問わず利用することができる大腸菌に、エタノール生産に関与するZymomonas mobilisの遺伝子を導入することにより、アルコール生産性組換え大腸菌の作出に成功した（特許文献１、２、及び非特許文献１）。この組換え大腸菌は、ＫＯ１１株と呼ばれ、ヘキソース及びペントースを含むリグノセルロース糖液からエタノールを生産できる有用な微生物として、広く利用されている。
【０００７】
このように、ＫＯ１１株は、グルコース、キシロースから特異的にエタノールを生産する微生物であることから、糖からエタノールを製造することについての研究が集中的に行われてきた。しかし、糖以外の原料からＫＯ１１株によりエタノールを製造することについては、報告例が見当たらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５００００００号
【特許文献２】米国特許第５４２４２０２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ohta et al. （1991） Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新たな原料からのエタノール生産を可能にすること、グルコン酸又はその塩もしくはイオンを含有する産業廃液などを有効利用すること、さらに具体的には、グルコン酸又はその塩もしくはイオンを含有する原料を用いてエタノールを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＫＯ１１株がグルコン酸を発酵してエタノールを産生することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明によれば
〔１〕  グルコン酸又はグルコン酸塩もしくはグルコン酸イオンを含む原料を、エタノール生産性大腸菌と接触させることにより、原料中のグルコン酸又はグルコン酸塩もしくはグルコン酸イオンをエタノールに転換する工程を含むことを特徴とする、エタノール製造方法；
〔２〕  前記エタノール生産性大腸菌が、大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ−５５１２４）である、前記〔１〕記載のエタノール製造方法
が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、グルコン酸含有液、特に廃液を有効利用し、有用物質であるエタノールを製造する方法が提供される。すなわち、エタノール製造技術において、食糧と競合しない新たな原料が提供される。特に、本発明によれば、これまで利用されずに廃棄されていた原料からでも、常温常圧で、エネルギーを消費せずに液体燃料を回収できるようになる。
【００１４】
また、本発明の方法に使用する大腸菌ＫＯ１１株は、好気的条件下での培養で良好にエタノールを生産し、嫌気的条件を必要としないため、一般的なファーメンターで通常の条件で培養することができる。したがって、本発明の方法は、従来の他の方法と比較して少なくとも同等の簡便な工程で実施することができるため、工程管理が容易である、経済的に有利である等の利点を含む、非常に高い工業生産適性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＫＯ１１株による種々の濃度のグルコン酸含有液からのエタノールの生産を表す図である。
【図２】図２は、ＫＯ１１株による種々の濃度のグルコン酸含有溶液から生産されたエタノールの生成率を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のエタノール製造方法は、グルコン酸又はその塩もしくはイオンを含む原料を用いてエタノールを製造することを最大の特徴とする。
【００１７】
本発明の方法は、発酵工程を必須とする。その他の工程は必要に応じて存在してもしなくてもよい。用いる原料の特性に応じて多少異なるが、たとえば、本発明の方法は、必要に応じてそれぞれの原料に適した前処理工程を含むことができる。したがって、本発明の方法は、基本的には、必要に応じて前処理工程、発酵工程から構成でき、一般的にはさらに、必要に応じて濃縮（蒸留）工程及び脱水工程などの後処理工程を含む。
【００１８】
本発明の方法によりエタノールに変換されるべき物質は、グルコン酸、及びグルコン酸塩、グルコン酸イオンなど（以下、これらを総称して「グルコン酸等」ということがある）である。グルコン酸等は、水溶液中では一部がグルコノデルタラクトンとなり、この物質との平衡混合物として存在する場合がある。この場合、グルコン酸等がエタノールに変換されることにより、平衡がグルコノデルタラクトンからグルコン酸等に移行する方向に動き、結局、グルコノデルタラクトンもエタノールに変換されることになる。
【００１９】
本発明の方法にしたがってエタノールの製造を行う際の原料は、これらの物質を含有するもの（グルコン酸等含有原料）であれば、特に制限なく使用することができる。たとえば、グルコン酸やグルコン酸ナトリウムの水性溶液を使用することができるが、特に、各種産業において利用された後、廃棄処分されるようなグルコン酸等含有廃液を用いることもできる。原料として使用可能なグルコン酸等含有原料の具体的な例としては、無菌米飯やパルプ製造により生じた廃液が挙げられる。
【００２０】
一般に、グルコン酸等含有廃液は、そのまま使用することができる場合もあるが、必要に応じて、希釈又は濃縮したり、適当な酸又はアルカリを用いたりすることにより、適宜好適な条件に調整することができる。
【００２１】
原料中のグルコン酸等の含有量は、０．１％（W/V）〜２０％（W/V）程度が好ましい。最も好ましくは０．５％（W/V）〜１０％（W/V）のものである。なお、当初の含有率が０．１％（W/V）に満たないものは、濃縮して０．１％（W/V）以上として利用することも可能である。
【００２２】
原料が不純物を多く含んでいる場合は、必要に応じて前処理を行うことができる。たとえば、無菌米飯製造廃液のようにデンプンなどの不純物を含有している場合は、予め公知の方法でβ−アミラーゼ処理を行うことによりデンプンをグルコースとすることで、エタノール生産効率を増大させることができる。また、パルプ廃液の場合には、アルカリ条件下での酸素処理やオゾン処理などにより糖をグルコン酸にするとともに、フェノール環を含むリグニン等を無害化することができる。
【００２３】
本発明の方法は、発酵工程を必須とする。発酵工程は、上記のようなグルコン酸等の原料廃液そのもの又は前処理された原料を用いて行う。発酵工程は、回分方式、連続方式又はそれらの変形の方式のいずれの方式であってもよい。したがって、従来公知のエタノール製造プロセスの枠組みにおいて、発酵基質がグルコン酸等であり、発酵工程にエタノール生産性大腸菌を用いるものは、本発明の方法である。
【００２４】
発酵工程は、原料と大腸菌とを接触させることにより開始される。大腸菌との接触によりグルコン酸等がエタノールに転換される。発酵工程は、好気的条件下で行うことができる。
本発明に使用される大腸菌は、一般にエタノールを生産することができる大腸菌であればよく、特に、大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ−５５１２４）を用いることが有利である。ＫＯ１１株は、標準株ＡＴＣＣ  ５５１２４株として市販されており、容易に入手可能である。また、ＫＯ１１株は、一般的な大腸菌と同様の条件下で良好に培養することができる。培養条件は公知であるが、具体例としては、後述するエタノール製造における発酵工程と同様の条件が挙げられる。
【００２５】
発酵工程は、ｐＨ４以上、特にｐＨ５．５以上で好適に行うことができ、少なくともｐＨ８までは良好に発酵が進行する。汚染防止、発酵歩合、他の工程との条件変更の少なさ等を勘案すると、ｐＨ５〜７、特にｐＨ５．５〜６．５で行うことが有利である。
【００２６】
また、温度条件は、２０℃以上であればよく、４０℃までは発酵工程を好適に行うことができる。発酵歩合、他の工程との条件変更の少なさ等を勘案すると、３０℃〜４０℃、特に３５℃〜４０℃で行うことが有利である。
【００２７】
したがって、発酵工程の最適ｐＨ及び温度条件は、ｐＨ５．５〜６．５及び３５〜４０℃である。反応時間は、一般に、６〜７２時間であるが、用いる原料液の特性等に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
発酵工程終了後、発酵液中には生産されたエタノールが含有されている。発酵工程で生産されたエタノールは、一般に、蒸留工程及び脱水工程を経て発酵液から回収・精製される。これらの工程の実施条件等については周知である。エタノールを含有する発酵液から、その後の付加的な工程、たとえば蒸留工程や脱水工程等、を経て得られる高純度に精製されたエタノールまでを、便宜上、包括的にエタノール含有溶液と総称する。
【００２９】
本発明の方法においては、発酵工程の後に、もろみの固液分離工程を行うことが好ましい。もろみの固液分離工程は公知であり、手法としては、たとえば、濾過（濾布、スクリーン、膜等）、遠心分離、デカンテーション等が挙げられる。
このようなエタノール製造の各種工程については、たとえばBioresource Technology 98 (2007) 2415-2457等に記載されている。
【００３０】
なお、ここで「精製エタノール」とは、日本薬局方による「エタノール」、すなわち１５℃で９５．１〜９５．６％（V/V）のエタノールを含有する水溶液を指す。これは、工業的には、酢酸エチルの製造等のための原料等として有用である。また、日本薬局方による「無水エタノール」は、１５℃で９９．５％（V/V）以上のエタノールを含有する水溶液であり、工業的には、燃料用等として使用される。
【００３１】
本発明の方法によって得られたエタノールは、燃料（石油代替エネルギー、ガソリン添加剤等）として使用できるほか、工業用原料（化学原料）、食品添加物等として使用することができ、また、食品（飲料も含む）、医薬品や衛生用品等の製造において使用することができる。
【実施例】
【００３２】
グルコン酸からのエタノール生産試験
方法
（１）微生物
微生物としては、大腸菌（Escherichia coli）ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ-５５１２４）及びコントロールとして酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ｓ２８８ｃ株を使用した。
【００３３】
各菌体は、以下のとおりに調製した。培養には、ＹＰＤ培地（Difco社製、Lot No. 7242780）を使用した。５００ml容の三角フラスコにＹＰＤ培地１００mlを分注し、寒天培地から１コロニーを無菌的に接種した。三角フラスコの蓋にはアルミキャップを使用した。回転式振とう培養機（株式会社高杉製作所製、モデルTS-RS12L（24）型）を使用して、ＫＯ１１株は３７℃、Ｓ２８８ｃ株は３０℃で、１２０rpmで２０時間培養した。培養液を高速冷却遠心機（TOMY社製、モデルMX−305型）で３，５００rpm、５分間遠心処理して、菌体と培地とを分離した。得られた菌体ペレットを生理食塩水２５mlで洗浄し、以下の発酵試験に用いた。
【００３４】
（２）発酵試験
発酵試験の基質（モデル廃液）として、グルコン酸ナトリウム水溶液を使用した。具体的には、グルコン酸ナトリウム（（関東化学社製、１級、純度９５％、Lot No. 103U1626）を蒸留水に溶解し、孔径０．２μmのメンブレン（NALGENE社製  ボトルトップフィルター）でろ過した。グルコン酸ナトリウム濃度は、０．５、１．０、２．０、４．０、１０．０％（W/V）の５段階とした。
【００３５】
５０ml容のポロプロピレン製遠沈管（CORNING社製）にグルコン酸ナトリウム水溶液を１０ml入れ、前述の各菌体（湿重量で０．２g）を分散させた。回転式振とう培養機（株式会社高杉製作所製、モデルTS-RS12L型）を使用し、３０℃、１２１rpmの条件で４８時間発酵させた。
【００３６】
発酵終了後、遠心機（TOMY社製、モデルMX−305型）を使用し、５，０００rpm、５分間の遠心処理をして上清と菌体とを分離し、以下のようにして上清中のエタノール濃度を測定した。
【００３７】
（３）エタノールの測定
上記（２）で得られた上清を試料とし、これらの試料を、エタノール濃度が０．２〜１．０%（V/V）の範囲内になるように１〜２０倍希釈して、検体として使用した。
【００３８】
各検体を、エタノール分析用ガスクロマトグラフ装置(GL Sciences社製)に供して分離定量した（Porapak Type Rカラムを使用、キャリアーガスは窒素、流速６０mL/min）。別途、エタノール（関東化学社製、特級、Lot  No.002XI222）を同じ条件で分離し、測定面積とエタノールの重量とが直線性に優れた標準曲線となる条件を設定した。内部標準にはイソプロパノールを使用し、内部標準に対するエタノールの一次回帰分析から換算係数を求めた。
なお、各発酵試験条件につき２検体を測定し、エタノール測定値の平均を求めた。
【００３９】
エタノール生成率は、以下のようにして算出した。
式：
エタノール生成率（％）＝（発酵終了後のエタノール濃度（％））÷（発酵開始時のグルコン酸ナトリウム濃度（％））×１００（％）
【００４０】
なお、使用したグルコン酸ナトリウム試薬の純度は９５．０％であったため、エタノール生成率算出の際は、純度に応じてグルコン酸ナトリウム濃度を換算した（例えば、２．０％（W/V）グルコン酸ナトリウム溶液の場合、２．０×０．９５で、実際は１．９％（W/V）が発酵基質となる。１．９％から０．５３％のエタノールを生産した場合、０．５３÷１．９で生成率２７．９％とした）。
【００４１】
結果を表１、図１及び図２に示す。
【００４２】
【表１】
2011177146.tif 000002
【００４３】
これらの結果からわかるように、エタノール生産性大腸菌は、好気的条件下でも、グルコン酸からエタノールを生産することができ、その生成率は実用的な工業的生産に利用可能な程度であった。
【図１】
2011177146.tif 000003
【図２】
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